1. Résultats et Discussion
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Cette troisième section rassemble les résultats obtenus au cours de ce travail. Une première étude a été consacrée à une enquête ethnobotanique qui nous a permis de sélectionner les plantes les plus souvent citées par les tradipraticiens comme ayant des propriétés dépigmentantes. Une deuxième enquête s’est focalisée sur les pratiques de la dépigmentation volontaire dans la ville de Kigali et a permis de constater un usage fréquent et intensif d’agents dépigmentants souvent déviés de leur usage strictement médical.
Dans la troisième partie du travail, différents extraits de plantes sélectionnées par la première étude ont été évaluées quant à leur effet modulateur de la pigmentation en utilisant différentes approches. Les meilleurs extraits ont ensuite subi un fractionnement bioguidé, l’extrait à l’acétate d’éthyle de Protea madiensis et de Sesamum angolense en particulier. Le but en était double : identifier les molécules actives présentes dans les différents extraits dans l’espoir d’en trouver non décrites jusqu’ici et de proposer l’utilisation de préparations efficaces et non toxiques à base d’extraits de plantes pour concurrencer voire supplanter l’utilisation incontrôlée de molécules chimiques dépigmentantes.
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ARTICLE 1: An ethnobotanical survey of medicinal plants used in Rwanda for voluntary depigmentation
Léocadie Kamagaju, Elias Bizuru, Védaste Minani, Renato Morandini, Caroline Stévigny, Ghanen Ghanem, Pierre Duez
Publié dans Journal of Ethnopharmacology150 (2013) 708–717
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4.1. Enquête ethnobotanique sur les plantes médicinales utilisées au Rwanda pour la dépigmentation volontaire.
Cette enquête nous a permis de rassembler les plantes utilisées au Rwanda pour la dépigmentation volontaire et de sélectionner les plantes à étudier au laboratoire dans le but d’isoler des molécules dépigmentantes.
L’enquête a été menée dans dix districts du Rwanda (Huye, Muhanga, Rusizi, Rubavu, Musanze, Gicumbi, Bugesera, Nyagatare, Nyarugenge et Gasabo) choisis de façon à couvrir les réalités de la médicine traditionnelle sur tout le territoire national. Le Rwanda est un petit pays d’Afrique centrale, composé de cinq provinces (Nord, Sud, Est, Ouest et la Ville de Kigali), nous avons donc choisi 2 districts par province.
Les tradipraticiens ont été choisis au sein de leurs associations professionnelles. En effet, au Rwanda, les tradipraticiens sont organisés en associations sous la supervision du Ministère de la Santé en Collaboration avec l’Institut de Recherche Scientifique et Technologique (IRST). Chaque association nous a proposé un ou plusieurs représentants censés connaître la dépigmentation volontaire et pouvoir nous indiquer les plantes qu’ils utilisent ainsi que celles utilisées par d’autres membres de leur association. Nous avons retenu au final 5 tradipraticiens par district. Dans trois districts où il n’y avait pas d’association de tradipraticiens (Rusizi, Nyagatare, Gicumbi), cinq tradipraticiens ont été choisis suivant leur réputation locale d’utilisation de plantes à des fins cosmétiques. La dépigmentation volontaire étant à priori pratiquée en ville, nous avons retenu 11 autres tradipraticiens dans la ville de Kigali.
Nous avons donc interrogé 61 tradipraticiens parmi lesquels les femmes âgées étaient plus nombreuses (62 %). La dépigmentation volontaire concerne, effectivement plutôt les femmes que les hommes. D’autre part, au Rwanda, la majorité des tradipraticiens se situe entre 41 et 70 ans ; donc la médecine traditionnelle n’intéresse que peu les jeunes, ce qui constitue un facteur de risque quant à sa disparition.
D’après, les tradipraticiens, les gens qui se dépigmentent aujourd’hui n’utilisent pas les plantes, mais préfèrent des produits blanchissants qu’ils trouvent sur le marché. Les tradipraticiens nous ont donc indiqué, soit les plantes qui étaient utilisées quand ils étaient encore jeunes ou bien des plantes qui ont des usages en médecine traditionnelle contre les maladies de la peau pigmentantes
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(élimination des taches hyperpigmentées). Les tradipraticiens intérrogés ont une expérience de plus de dix ans, ce qui constitue un avantage quant à la fiabilité des informations reçues auprès d’eux.
Nous avons inventorié au final 28 plantes appartenant à 19 familles1. Ces plantes sont, assez curieusement, utilisées toutes seules, ce qui est assez rare en médecine traditionnelle. La famille des Fabaceae apparait la plus représentée ; ce constat est en accord avec la littérature qui mentionne 51 plantes de la famille des Fabaceae ayant soit des usages traditionnels en cosmétique ou contre les problèmes de la peau, soit des propriétés d’inhibition de la tyrosinase et/ou de la mélanogenèse2.
Pour toutes les plantes citées, les tradipraticiens nous ont donné le nom vernaculaire, ainsi qu’une partie aérienne de la plante. Ces deux informations nous ont permis, à l’aide d’un collègue botaniste et des herbiers présents à l’Herbarium National du Rwanda (NHR), d’identifier les différentes plantes3.
Ce travail nous a également permis de connaître le point de vue des tradipraticiens sur la dépigmentation volontaire. Les tradipraticiens estiment que les adeptes de la dépigmentation volontaire ne s’intéressent plus aux plantes. Ils préfèrent les produits vendus sur le marché car ces derniers éclaircissent plus vite que les plantes.
Les 5 plantes retenues pour ce travail sont celles ayant reçu un pourcentage de citation supérieur ou égal à 50 %. Ces plantes seront étudiées au laboratoire pour vérifier leur effet sur le processus de biosynthèse de la mélanine.
1 Les noms scientifiques, vernaculaires, la partie utilisée et les herbiers consultés sont donnés dans le tableau 2 du premier article. 2 Les différentes plantes, les parties utilisées et le test ou non sur la tyrosinase sont donnés dans le tableau 3 du premier article. 3 Le Tableau 1 du premier article, nous donne les différentes parties de plante récoltées en présence du tradipraticien, les critères d’identification à partir de ces parties reçues et les références bibliographiques indiquant la correspondance nom vernaculaire - noms scientifique.
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ARTICLE 2: Survey on Skin Lightening Practices and Cosmetics in Kigali, Rwanda
Léocadie Kamagaju, Françoise Gahongayire, Renato Morandini, Caroline Stévigny, Ghanen Ghanem, Pirotte Gauttier, Pierre Duez
Publié dans International Journal of Dermatology (en cours)
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4.2. Enquête sur les pratiques de la dépigmentation volontaire et cosmétiques dans la ville de Kigali, au Rwanda.
Comme c’est le cas dans de nombreuses régions du monde, la dépigmentation volontaire est une pratique bien connue en Afrique sub-saharienne. Différents enquêtes menées dans plusieurs pays (Sénégal, Mali, Togo, Tanzanie,……) ont permis de mettre en lumière la problématique de la dépigmentation volontaire.
Au Rwanda, la pratique existe aussi et est intitulée ‘Kwitukuza’. Elle apparaît bien répandue mais, à notre connaissance, aucune étude n’a été réalisée à ce jour sur cette pratique au Rwanda. Nous avons donc mené une enquête dans la ville de Kigali. Celle-ci a débuté chez les vendeurs des produits cosmétiques dans le but d’identifier les crèmes dépigmentantes vendues sur le marché Rwandais.
Après avoir identifié ces crèmes, nous avons à l’aide d’un questionnaire d’enquête (annexe 5), interrogé une série de personnes sur leur lieu de travail. La disponibilité et la volonté de participer à l’enquête étaient les seuls critères d’inclusion. Notre population d’étude est composée de 150 personnes dont 120 femmes et 30 hommes. En effet, les femmes sont plus concernées par la dépigmentation volontaire que les hommes. L’âge de notre population d’étude varie de 15 à 60 ans. Ce choix a été fait en se référant à la littérature qui stipule que la dépigmentation volontaire commence à la fin de l’adolescence (Morand et al., 2007). Le profil professionnel de notre population d’étude est diversifié. Nous avons 65 étudiants, 10 conducteurs de taxi-moto, 35 employés, 19 commerçants et tailleurs et 21 cultivateurs et chômeurs.
Pour pourvoir entrer directement en contact avec les adeptes de la dépigmentation volontaire mais aussi apprécier les effets secondaires éventuels liés à cette pratique, nous avons contacté 3 dermatologues, 5 médecins généralistes et 8 infirmiers à l’aide d’un questionnaire spécifique (annexe 5).
Enfin une étude sociologique des motivations des adolescents (15 à 20 ans) a été réalisée dans deux écoles secondaires et deux centres d’accueil, un pour les orphelins et un autre pour les enfants de la rue. Les critères d'inclusion étaient basés sur l'utilisation actuelle de cosmétiques qui comprennent des actifs dépigmentants. Cette étude nous a permis d’avoir une approche sociologique des adolescents sur cette pratique.
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Trente cinq pourcent (35 %) de notre population d’étude utilisent des produits qui comprennent des actifs dépigmentants et 27% déclarent utiliser le produit dépigmentant pour ses propriétés dépigmentantes. Les autres ont été entraînés à utiliser la crème mais ne semblent pas chercher nécessairement son activité dépigmentante. C’est le cas des hommes qui utilisent les crèmes de leurs femmes sans savoir si elles sont ou non dépigmentantes.
Nous estimons donc que la proportion des pratiquants de la dépigmentation volontaire à Kigali atteint 27 %. Ce pourcentage ne s’écarte pas de celui qu’on rencontre dans d’autres pays comme le Sénégal (Raynaud et al., 2001) et à Mayotte (Levang et al., 2009).
Notre enquête nous montre aussi que la dépigmentation volontaire est influencée par plusieurs facteurs, entre autres le lieu de naissance. En effet, 55,8 % des utilisateurs de produits dépigmentants sont nés et ont grandi dans des villages et sont venus à Kigali après. De cela, nous déduisons que, arrivés en ville, ces gens veulent ressembler aux citadins en essayant de cacher leur origine. En effet, dans les villages, les gens travaillent plus au dehors (dans les champs) et sont donc plus exposés au soleil. Plus foncés que les citadins qui, eux, sont moins exposés au soleil (travail dans les bureaux) ils tendraient à vouloir s’éclaircir. Nous avons la même observation pour les gens nés à Kigali mais qui eux font des travaux qui les exposent au soleil. Nous avons constaté aussi une influence par les pratiques des pays voisins, par exemple le cas de la République Démocratique du Congo (RDC) où la pratique est fort développée (M'bemba- Ndoumba, 2004).
Comme dit supra, la dépigmentation volontaire est influencée par le sexe, les femmes étant plus concernées comme dans tous les pays où on trouve cette pratique. Cela n’empêche qu’il y ait un pourcentage non négligeable (23,3%) des hommes qui pratiquent la dépigmentation volontaire.
Notre enquête nous a aussi permis de constater que la plupart des gens qui pratiquent la dépigmentation volontaire se trouvent dans la tranche d’âge de 25 à 34 ans, âge d’indépendance financière.
En ce qui concerne les produits utilisés, notre enquête nous a montré que Caro Light®, une crème à base d’hydroquinone fabriquée en RDC, est la plus appréciée (28,8 % d’utilisateurs).
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ARTICLE 3: Tyrosinase modulation by five Rwandese herbal medicines traditionally used for skin treatment
Léocadie Kamagaju, Renato Morandini, Elias Bizuru, Polycarpe Nyetera, Jean Baptiste Nduwayezu, Caroline Stévigny, Ghanen Ghanem, Pierre Duez
Publié dans Journal of Ethnopharmacology 146 (2013) 824–834
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4.3. Modulation de la tyrosinase par cinq plantes de la médecine traditionnelle Rwandaise utilisées pour le traitement des problèmes de la peau.
Notre enquête ethnobotanique nous a permis de choisir 5 plantes suivant les pourcentages de citation. Ces plantes sont : Brillantaisia cicatricosa Lindau (Acanthaceae): 50%, Chenopodium ugandae (Aellen) Aellen (Chenopodiaceae): 52 %, Dolichopentas longiflora Oliv. (Rubiaceae) : 70%, Protea madiensis Oliv. (Proteaceae) : 80 %, Sesamum angolense Welw. (Pedaliaceae):56%.
De ces cinq plantes, nous avons préparé 27 extraits de polarités différentes, successivement avec du n-hexane, chloroforme/acétate d’éthyle, méthanol et eau. Cette étude vise à vérifier l’effet de ces différents extraits sur la tyrosinase et/ou sur la mélanogenèse par différentes méthodes. Notre étude a commencé par un screening phytochimique pour identifier les composants majoritaires de ces 5 plantes.
L’étude de la cytotoxicité par le test MTT nous a permis de dégager les concentrations de nos différents extraits de plantes utilisables sur les cellules (mélanocytes malins) sans risque de toxicité. Ces concentrations ont été testées sur les mélanocytes malins (HBL) afin de vérifier l’effet des 27 extraits de plantes sur la mélanogenèse.
L’effet de nos différents extraits de plantes sur la tyrosinase a été vérifié d’une part sur la tyrosinase humaine contenue dans les extraits cellulaires totaux issus de mélanocytes normaux (NM034), d’autre part sur la tyrosinase de champignon, la réaction étant faite (i) sur la plaque CCM ; (ii) en solution en plaque multipuits et sur la fonction tyrosine hydroxylase en utilisant la tyrosine tritiée.
Le screening phytochimique nous a permis de constater que toutes nos plantes contiennent des terpènes-stéroïdes. Les feuilles de Chenopodium ugandae contiendraient des alcaloïdes. Les autres plantes contiennent soit des flavonoïdes, des anthraquinones, des saponines et/ou des tanins. Toutes nos plantes ne sont pas cytotoxiques, à part Dolichopentas longiflora (IC50 de l’extrait hexanique des feuilles, 4 µg/ml sur les MM028 et 4.5 µg/ml sur les MM001; IC50 de l’extrait à l’acétate d’éthyle des racines, 0.8 µg/ml sur les MM028 et 3.9 µg/ml sur le MM001).
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L’effet de notre extrait de plantes sur l’ensemble du processus de mélanogenèse en cellules intactes (Overall pigmentation effect on whole cells melanogenesis), a révélé que la plupart de nos extraits sont des inhibiteurs de pigmentation ; un extrait hexanique de feuilles de Dolichopentas longiflora augmente cependant la production de la mélanine.
Le test d’inhibition de tyrosinase humaine issue d’extraits de mélanocytes nous a permis aussi de prouver que dans nos différents extraits de plantes se trouvent des inhibiteurs et des activateurs de la tyrosinase.
: Activateur de la mélanogénèse
: Inhibiteur de la mélanogénèse CO : extrait aqueux de Chenopodium ugandae
PO : extrait aqueux de Protea madiensis
ZRO : extrait aqueux de Dolichopentas
longiflora
Figure 29: Photo d’une plaque multipuits démontrant sur extraits cellulaires les différentes activités possibles. La figure présente un contrôle sans extrait de plante (ctrl), l’acide kojique (AK) qui est un inhibiteur, trois extraits de plantes (CO, PO, ZRO) à chaque fois trois concentrations (C1, C2, C3) C3 étant la plus élevée et en quadriplicat. Nous constatons que le CO n’est actif à aucune concentration. Le PO montre une inhibition à la troisième concentration et le ZRO montre un effet inverse (activation) à la troisième concentration. NB : Cette figure ne fait pas partie de l’article 3.
D’une manière générale, l’étude de l’inhibition de la tyrosinase de champignon par nos différents extraits de plantes aboutit aux mêmes conclusions que les tests sur extraits protéiques de cellules de mélanome à la seule différence que l’extrait à l’acétate d’éthyle de Sesamum angolense montre une activation de la tyrosine hydroxylase encore plus élevée. Cela nous a poussé à entreprendre le processus de fractionnement de cet extrait.
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Cette étude nous a permis de cibler, parmi 27 extraits de plantes, ceux qui seraient intéressants pour le fractionnement chromatographique bioguidé et d’émettre des perspectives quant aux études ultérieures à ce sujet.
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ARTICLE 4: Tyrosinase modulators from Protea madiensis Oliv. (Proteaceae) and Sesamum angolense Welw. (Pedaliaceae)
Léocadie KAMAGAJU, Caroline STÉVIGNY, Renato MORANDINI, Laurent POTTIER, Mustafa AVCI, Ghanem GHANEM, Michel LUHMER, Jean-Claude BRAEKMAN, Pierre DUEZ
Article à soumettre
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4.4. Les modulateurs de la tyrosinase à partir Protea madiensis Oliv. (Proteaceae) et Sesamum angolense Welw. (Pedaliaceae)
A partir des résultats des différents tests réalisés sur les extraits des 5 plantes (article 3), deux extraits se sont montrés particulièrement actifs. L’extrait à l’acétate d’éthyle de Protea madiensis et de Sesamum angolense ont montré, respectivement, une forte inhibition et activation de la tyrosinase de champignon.
L’extrait à l’acétate d’éthyle de Protea madiensis a été soumis à une suite de fractionnements bio-guidés sur colonne ouverte, sur flash-chromatographie et sur CCM préparative. L’inhibition de la tyrosinase étant suivie par CCM-bioautographie telle que décrite dans l’article 3. Ce fractionnement a permis d’isoler trois composés purs. L’analyse par la RMN et la masse a permis de montrer que ces trois composés sont : la 2-tridécanone, l’acide oléique et le β-sitostérol.
L’extrait à l’acétate d’éthyle de Sesamum angolense a été également soumis à une suite de fractionnements bio-guidés sur flash-chromatographie et à la purification par CCM préparative. A partir de cet extrait, nous avons isolé un composé pur identifié par analyse RMN et en spectrométrie de masse comme étant l’acide ursolique.
La 2-tridécanone et l’acide oléique ont montré une inhibition de la tyrosinase humaine dans les extraits cellulaires, avec des pourcentages d’inhibition respectivement de 19.7 et 13.3 %. La 2- tridécanone a aussi montré une inhibition de la tyrosinase de champignon en utilisant la tyrosine tritiée (méthode de Pomerantz): de la fonction tyrosine hydroxylase). La 2-tridécanone et l’acide oléique sont deux inhibiteurs déjà connu de la tyrosinase (Tang et al., 2009; Shigeta et al., 2004; Ebanks et al., 2009). Le β-sitostérol n’a pas montré d’inhibition de la tyrosinase ; cependant, il a été isolé comme inhibiteur de la tyrosinase dans d’autres études (Issa et al., 2008; Munoz et al., 2013).
L’acide ursolique a montré une activation de l’activité de la tyrosinase de champignon sur la plaque de CCM. Cependant, la littérature décrit cette molécule tantôt comme inhibiteur, tantôt comme activateur de la production de la mélanine (article 4). Partant du fait que certains
150 modulateurs ont déjà montré ces deux activités suivant les concentrations (Solano et al., 2006), nous avons étudié l’activité de l’acide ursolique sur la tyrosinase de champignon à différentes concentrations. Ce test nous a permis de constater que l’acide ursolique était un inhibiteur faible à forte concentration et un activateur faible à faible concentration. En comparant notre activité inhibitrice avec celle de l’acide kojique qui est un inhibiteur standard, nous avons constaté qu’il serait difficile de comparer ces deux molécules car l’une (acide kojique) est soluble en milieu aqueux et l’autre (acide ursolique) soluble en solvant organique.
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Tyrosinase modulators from Protea madiensis Oliv. (Proteaceae) and Sesamum angolense Welw. (Pedaliaceae)
Léocadie KAMAGAJUa,b, *, Caroline STÉVIGNYa , Renato MORANDINIc , Laurent POTTIERa, Mustafa AVCIa, Ghanem GHANEMc, Michel LUHMERd, Jean-Claude BRAEKMANa, Pierre DUEZa,e
a Laboratoire de Pharmacognosie, de Bromatologie et de Nutrition Humaine, Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles (ULB), Campus de la Plaine—CP205/9, Bd du Triomphe, B-1050 Bruxelles, Belgique b Programme de Recherche en Phytomédicaments et Sciences de la Vie, Institut de Recherche Scientifique et Technologique (IRST), B.P. 227 Butare, Rwanda c Laboratoire d’Oncologie et de Chirurgie Expérimentale, Université Libre de Bruxelles (ULB) - Institut Jules Bordet-CP401, rue Héger-Bordet1, 1000 Bruxelles, B-1200 Bruxelles, Belgique d Laboratoire de Résonance Magnétique Nucléaire Haute Résolution (RMN-HR), Université Libre de Bruxelles (ULB)— CP 160/08, 50 av. F.-D. Roosevelt, 1050 Bruxelles, Belgique e Service de Chimie Thérapeutique et Pharmacognosie, Université de Mons, Bâtiment Mendeleïev, 19, Avenue Maistriau, B - 7000 MONS, Belgique
* Corresponding author at: Laboratoire de Pharmacognosie, de Bromatologie et de Nutrition Humaine, Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles, CP 205/09, Bd du Triomphe, 1050 Bruxelles, Belgique. Tel.: +32 26505172; fax: +32 26505430. E-mail address: [email protected] (L. KAMAGAJU); [email protected] (P. DUEZ).
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Abstract
Modulation of skin pigmentation is pursued all over the world. Notably, in, the depigmentation vogue currently observed in sub-Saharan Africa, a clear skin is considered as an important beauty criterion that corresponds to certain African traditions; to achieve this end, people exploit cosmetic and pharmaceutical products with many potential health hazards. By contrast, a tanned skin is considered desirable in the Western culture, despite warnings about the consequences of excessive sun or UV exposure. Melanin accumulation as pigmented patches might also become an esthetic problem for light-tone skins. Traditional herbal medicines may provide an interesting, largely unexplored source for the development of natural new drugs and skin-care cosmetics that effectively modulate the skin pigmentation.
Two medicinal plants, Protea madiensis Oliv. (Proteaceae) root barks and Sesamum angolense Welw. (Pedaliaceae) leaves, were selected for their topical uses as skin actives in Rwandan traditional medicine. Ethyl acetate extracts were retained according to their respective inhibition and activation of tyrosinase, a key enzyme in the melanogenesis pathway, with the goal to isolate depigmenting and hyperpigmenting molecules.
The ethyl acetate extract of Protea madiensis yielded 2 active compounds, 2-tridecanone and oleic acid. The 2-tridecanone and oleic acid inhibited tyrosinase from crude human melanocytes cellular extracts at 19.7 % (0.24 mM) and 13.3 % (0.14 mM), respectively. From the ethyl acetate extract of Sesamum angolense, ursolic acid was obtained; this compound increased the tyrosinase activity on TLC (1 mg/ml) and may present an activating or inhibiting activity according to concentration.
The isolated active compounds are quite apolar, which probably justifies the traditional topical use of these herbs in mixtures with butter. The isolated compounds have a low activity compared to kojic acid, a reference tyrosinase inhibitor (88.9 % inhibition at 6.3 mM). Their low solubility in water however precludes testing them at the same concentration as kojic acid.
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1. Introduction
Tyrosinase (E.C. 1.14.18.1), a copper-containing enzyme, widely distributed in microorganisms, animals and plants (Kim et al., 2005), is a key enzyme in melanin biosynthesis. This enzyme catalyzes two different reactions involving molecular oxygen: the hydroxylation of tyrosine by monophenolase action and the oxidation of 3, 4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) to o- dopaquinone by diphenolase action (Chang, 2009). These two steps are most critical in the melanogenesis pathway as the rest of the reaction sequence is spontaneously carried out at physiological pH (Halaban et al., 2002). The enzyme extracted from the mushroom Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach is highly similar to the mammalian one. This makes it well suited as a model for studies on melanogenesis. In fact, almost all studies on tyrosinase inhibition conducted so far have used mushroom tyrosinase because the enzyme is commercially available (Chang, 2009).
Melanin plays an important role in protecting human skin from the harmful effects of UV sun radiation and in scavenging toxic drugs and chemicals (Villareal et al., 2013). However, the accumulation of an abnormal melanin amount in different specific parts of the skin as more pigmented patches (melasma, freckles, ephelide, senile lentigines etc.) might become an esthetic problem, notably in light-skin subjects. In addition, to obtain a tanned skin is still considered desirable in the Western culture, despite warnings about the consequences of excessive sun or UV exposure. The artificial tanning business has strongly expanded in the last decades (Smit et al., 2009). In Asia, the practice of whitening the skin is widely extended by traditional beliefs (Solano et al., 2006), a century long tradition whereby a light complexion is regarded as equivalent to youth and beauty (Smit et al., 2009). In certain African traditions, a clear skin is considered as a beauty criterion and to achieve this end, people exploit cosmetic and pharmaceutical products with many potential health hazards (Morand et al., 2007). Traditional herbal medicines may provide an interesting, largely unexplored source for the development of natural new drugs and skin-care cosmetics that effectively modulate the skin pigmentation.
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Our recent survey of 61 Rwandese traditional healers for plants used in skin pigmentation problems indicated 5 herbs highly cited, Brillantaisia cicatricosa Lindau (Acanthaceae) (50 % citation), Chenopodium ugandae (Aellen) Aellen (Chenopodiaceae) leaves (52 %), Dolichopentas longiflora Oliv. (Rubiaceae) leaves and roots (70 %), Protea madiensis Oliv. subsp. madiensis (Proteaceae) root barks (70 %) and Sesamum angolense Welw. (Pedaliaceae) leaves (56 %) (Kamagaju et al., 2013a). In a study of tyrosinase modulation by crude extracts of these five herbs (Kamagaju et al., 2013b), the ethyl acetate extract of Protea madiensis strongly inhibited tyrosinase whereas the ethyl acetate extract of Sesamum angolense showed a notable activation of the enzyme. These results led us to fractionate these two extracts to isolate and characterize depigmenting and hyperpigmenting compounds Protea madiensis Oliv. (Proteaceae) is a 1-3 m high shrub (Troupin, 1978) spread in intertropical Africa, over a vast territory stretching from Nigeria to Mozambique (Arbonnier, 2009). In Rwanda, two varieties (madiensis and elliottii) are described (Troupin, 1978) but their botanical status is not certain (Kew, 2013); according to the classification of Troupin, our plant corresponds to the madiensis variety. In traditional medicine, the root barks have many uses and are notably used for hypopigmenting properties (Kamagaju et al., 2013a; Kamagaju et al., 2013b). Sesamum angolense Welw. (Pedaliaceae), a suffrutescent herb of 0.8-3 m height, grows on slopes and in fallows in Southern and Eastern tropical Africa, in Rwanda and Democratic Republic of Congo (Troupin, 1985). The leaves have many traditional indications; they were formerly used in topical application to lighten the skin of future brides (Kamagaju et al., 2013a; Kamagaju et al., 2013b).
2. Material and methods
2.1. Plant material The roots of Protea madiensis were harvested in Nyaruguru (southern of Rwanda) on an uncultivated hill, with traditional healers. The roots were washed with water, peeled with a knife to remove the cortical layer and then barked. The leaves of Sesamun angolense were also harvested with the help of a traditional healer in Huye in a fallow field. The material was dried at ambient temperature protected from sunlight and powdered. Both plants were identified by
155 trained botanists and voucher specimens were deposited in 3 different herbariums (Kamagaju et al., 2013a; Kamagaju et al., 2013b).
2.2. Preparation of ethyl acetate extracts
The Protea madiensis root bark powder (4.11 kg) was exhaustively extracted by maceration of 24 hours, with n-hexane (10 L), then ethyl acetate (15 L). The ethyl acetate extract was evaporated to dryness (reduced pressure, 40°C) to yield 40 g of raw extract. The same protocol of extraction was applied for Sesamum angolense leaves (1.5 kg; 4 L of hexane and 9 L ethyl acetate, yielding 50 g of extract).
2.3. Chemicals The mushroom tyrosinase (MT; 5.370 U/mg), L-tyrosine, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L- DOPA), kojic acid, 2-tridecanone (Sigma W338818-100G-K) and ursolic acid (93.2 % purity) were purchased from Sigma; the phosphate buffered saline (PBS), culture medium and additives were obtained from Invitrogen (USA). The cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail was from Roche Diagnostics. Solvents and other chemicals were of analytical grade level or of the highest available quality.
2.4. Modulation of mushroom tyrosinase visualized by TLC-bioautography
According to (Kamagaju et al., 2013b), 5 µl of tested sample were applied on a silicagel plate and eluted as described in the results section; some plates were not eluted as the reaction was effected on applied spots. Plates were dried, sprayed successively with mushroom tyrosinase solution (0.02 U/ml [aq.]; 0.5 ml/cm2) and with a solution of 4 mM L-dopa – 7 mM L-tyrosine ([aq]; 0.5 ml/ cm2) and examined after 5, 10, 15 and 20 min. Spots corresponding to tyrosinase inhibitors or activators appear whitish and blackish, respectively, against a brownish purple background. This fast and practical method has been used for bioguided fractionation as it does not impose constraints on dissolution media.
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2.5. Fractionation and purification bioguided by modulation of mushroom tyrosinase Protea madiensis As shown in Figure 1, 6 x 6.5 g of the Protea madiensis crude extract were fractionated by column chromatography on silica gel (40 - 63 μm, i.d. 2.5 x 30 cm, Merck, Germany) using progressive gradient from dichloromethane (CH2Cl2) to methanol (MeOH). All the fractions containing tyrosinase inhibitors were assembled in 16 larger fractions (PM I to PM XVI). Fractions PM II (175 mg) and PM IV (307 mg) were retained for their strong inhibition of tyrosinase and their appreciable weights. These fractions were each submitted to flash chromatography on pre-packed silica gel (40 – 63 μm) polyethylene cartridge (SuperFlash 15 –
12 g, Interchim, Montluçon, France), eluting with CH2Cl2-MetOH gradients (0 – 100 % methanol) to yield subfractions PMII 26, 27, 28, 29 and PM IV 3 which contained strong inhibitor(s) of tyrosinase.
These active subfractions were purified by preparative TLC (TLC silica gel 60 F254, 20x20, E. Merck, Germany) using dichloromethane and methanol (99:1) as mobile phase, yielding 3 compounds : compound 1 (12.5 mg), from subfractions PMII 26, 27, 28, 29 and compounds 2 (12.8 mg) and 3 (1.5 mg) from subfraction PM IV 3.
Sesamum angolense Two 1.5 g aliquots of the ethyl acetate extract of Sesamum angolense were fractionated by flash chromatography with a gradient of n-hexane and ethyl acetate (0 – 100 % ethyl acetate). Fractions V-VIII were purified by preparative silicagel TLC, using a n-hexane and ethyl acetate (60:40) mobile phase, to yield a hyperpigmenting product, compound 4 (5 mg).
2.6. Spectral analyses 1H and 13C NMR spectra were recorded on either Bruker Avance 300 MHz or 400MHz or Varian
600 MHz instruments, using CDCl3 as solvent for the 3 compounds isolated from Protea madiensis and CD3OD for the compound isolated from Sesamum angolense. A Shigemi tube was used for compound 3. High resolution mass spectra in positive mode were recorded using a 6520 series quadrupole time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer (Agilent, Palo Alto, CA, USA) fitted with an electrospray ionization (ESI) and APCI source in positive mode.
157
2.7. Measurements of cytotoxicity and pigmentation modulation The cytotoxicity of isolated compounds was measured by a MTT assay for cell viability according to (Kamagaju et al., 2013b) on two human melanoma cell lines, LOCE-MM001 (known as HBL) and LOCE- MM028. The overall pigmentation effect on whole cells melanogenesis was tested on cells cultured in HAM F10 medium supplemented with L-tyrosine (217 mM) to stimulate pigmentation and with plant extracts at a concentration corresponding to 10 % cytotoxicity (IC10); L-tyrosine (217 µM) and kojic acid (1mM) were the negative and positive control, respectively. After 10 days incubation with renewal of test medium every 3 days, cell pellets were recovered by centrifugation (2000g, 10 min), washed twice in PBS and visually compared (Kamagaju et al., 2013b).
The tyrosinase inhibition was estimated both on crude cellular extracts of normal human melanocytes (LOCE-NM034) and on mushroom tyrosinase by spectrophotometric measurement of a late end-point (pigmentation) as previously described (Kamagaju et al., 2013b). To determine whether observed effects effectively rely on tyrosinase inhibition and if there is a competition for the active site, the method of Pomerantz was applied using tritiated tyrosine (Kamagaju et al., 2013b).
158
6 x 6.5 g ethyl acetate extract of
Protea madiensis
Bioguided fractionation by successive column chromatography,
gradient with increasing polarity CH2Cl2/MeOH
PM I PM II 175 mg …… PM IV 307 mg ... PM XVI ...
Flash chromatography on pre-packed silica gel,
with gradient of increasing polarity: CH2Cl2/MeOH
Ss.F10 -22 139 mg
Flash chromatography with gradient PM II26 PM II27 PM II28 PM II29 of increasing polarity: 8.8 mg 10.7 mg 8.4 mg 7.5 mg CH2Cl2/MeOH.
PM IV3 30 mg
Preparative TLC silicagel with Preparative TLC with CHCl3-acetone-
CH2Cl2 – MeOH (99 : 1) isopropanol (90:9:1) + basified by 2
drops of NH4OH
PM IV3a 12.8 mg PM IV3b 1.5 mg 25 mg
MS and RMN structure determination
2-tridecanone 12.5 mg (1) Oleic acid 12.8 mg (2) β-sitosterol 1.5 mg (3)
mg
Figure 1 Bio-guided purification scheme applied to the Protea madiensis ethyl acetate extract.
159
3. Results 3.1. Isolated compounds. The Protea madiensis bioguided fractionation yielded 3 compounds that were identified as 2- tridecanone (1), oleic acid (2) and β-sitosterol (3). From the ethyl acetate extract of Sesamum angolense, ursolic acid (4) was obtained.
Compound 1: 2-tridecanone was isolated as white granules (12.5 mg). Positive ESI-MS: [MH+]: 13 198.1975 (MH+ calculated mass: 198.1984, error: -4.19 ppm) compatible with C13H26O; C 1 NMR (CDCl3, 75 MHz) see Table 1; H NMR (CDCl3, 300 MHz), δ (ppm), J (Hz), δ = 2.15 (3H, 3 3 s, 1); δ = 2.43 (2H, t, 3, J3-4 = 7.4); δ = 1.58 (2H, m); δ = 1.27 (16H, m); δ = 0.89 (3H, t, 13, J12-
13 = 6.6).
Compound 2: Oleic acid was isolated as pale yellow oil (12.8 mg). ESI-MS: m/z : 282.2559 13 (MH+ calculated mass: 282.2548, error: -3.97 ppm) compatible with C18H34O2; C NMR 1 (CDCl3, 75 MHz) see Table1 H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ (ppm), J (Hz); δ = 5,32 (2H, m, 9 & 3 10); δ =2.33 (2H, t, 2, J2-3 = 7,5); δ =2.00 (4H, m, 8 & 11); δ =1.61 (2H, m, 3); δ =1.29 to 1.23 (20H, m, 4, 5, 6, 7, 12, 13, 14, 15, 16 & 17); δ =0.86 (3H, m, 18).
Compound 3: β-sitosterol was isolated as white powder (1.5 mg) APCI-MS: m/z 414.3862 13 (MH+, calculated mass : 414.3858, error: -0.89 ppm) compatible with C29H50O; C NMR 1 (CDCl3, 100 MHz) see Table1 H NMR (CDCl3, 400 MHz, δ (ppm) J (Hz) ) δ = 5.33 (1H, m, 6); 3.50 (1H, m, 3); 2.27 (1H, dd, J = 8, J = 4); 2.21 (1H, t, J = 8); 2.00 to 1.94 (2H, m); 1.84 to 1.81 (2H, m); 1.64 (1H, h, J = 4); 1.53 (9H, bs); 1.49 to 1.41 (5H, m); 1.33 to 1.26 (6H, m); 1.24 (2H, bs); 1.21 to 1.11 (5H, m); 1.09 to 1.01 (3H, m); 0.99 (3H, bs); 0.98 to 0.92 (1H, m); 0.91 (4H, d + m; J = 4); 0.89 to 0.85 (1H; m); 0.84 to 0.81 (5H, m); 0.79 (3H, d, J = 4); 0.78 to 0.75 (1H, m); 0.66 (3H, s).
Compound 4: Ursolic acid was isolated as white powder (5 mg) ESI-MS: m/z 456.3603 (MH+, 13 calculated mass: 456.359, error: -2.88 ppm) compatible with C30H48O3; C NMR (CD3OD, 1 150.56 MHz): see Table1; H NMR (CD3OD, 300 MHz, δ (ppm), J (Hz)) δ = 5.23 (1H, t, 12,
160
3 3 3 J11-12 = 6); δ = 3.15 (1H, dd, 3, J2-3 = 9, J2-3 = 6); δ = 2.21 (1H, bd, J = 12); δ = 2.03 (1H, td); δ = 1.94 (1H, td); δ = 1.93 (1H, -); δ = 1.92 (1H, -); δ = 1.70 (1H, dm); δ = 1.67 (1H, dm); δ = 1.64 (1H, dm); δ = 1.64 (1H, dm); δ = 1.63 (1H, tm); δ = 1.57 (1H, -); δ = 1.56 (1H, tm); δ = 1.56 (1H, dm); δ = 1.55 (1H, tm); δ = 1.50 (1H, -); δ = 1.41 (1H, tm); δ = 1.36 (1H, -); δ = 1.35 (1H, dm); δ = 1.35 (1H, dm); δ = 1.12 (3H, s); δ = 1.08 (1H, dt); δ = 1.06 (1H, td); δ = 0.98 (1H, -); δ = 0.98 (3H, s); δ = 0.97 (3H, -); δ = 0.96 (3H, s); δ = 0.88 (3H, d); δ = 0.86 (3H, s); δ = 0.78 (3H, s); δ = 0.75 (1H, bd).
161
Table 1 13C assignment of compounds 1 to 4
Position 2-tridecanone (1) oleic acid (2) β-sitosterol (3) Ursolic acid (4) δ (ppm) group δ (ppm) group δ (ppm) group Isolated Commer Group δ (ppm) cial δ (ppm)
1 30.0 -CH3 179.6 COO- 36.9 -CH2- 39.8 39.8 -CH2-
2 209.5 -CO 34.1 -CH2- 31.6 -CH2- 27.9 27.9 -CH2-
3 44.0 -CH2- 32.1 -CH2- 71.7 -CHOH 79.7 79.7 -CHOH
4 32.0 -CH2- 31.8 -CH2- 42.3 -CH2- 40.4 40.4 -CH2-
5 29.7 -CH2- 29.9 -CH2- 140.7 -C- 56.7 56.7 -CH-
6 29.7 -CH2- 29.8 -CH2- 121.6 -CH- 19.5 19.5 -CH2-
7 29.6 -CH2- 29.7 -CH2- 32.2 -CH2- 34.3 34.3 -CH2-
8 29.5 -CH2- 29.6 -CH2- 32.1 -CH- 40.8 40.8 -CH-
9 29.4 -CH2- 130.2 =CH- 50.1 -CH- 48.8 _ -CH-
10 29.3 -CH2- 129.9 =CH- 36.7 -C- 38.1 38.1 -C-
11 24.03 -CH2- 29.5 -CH2- 21.3 -CH2- 24.1 24.1 -CH2-
12 22.8 -CH2- 29.3 -CH2- 39.6 -CH2- 126.9 126.9 =CH-
13 14.3 -CH3 29.2 -CH2- 42.2 -C- 139.7 139.6 =CH2-
14 29.1 -CH2- 56.6 -CH- 43.2 43.2 -C-
15 27.4 -CH2- 26.3 -CH2- 29.2 29.2 -CH2-
16 24.8 -CH2- 28.9 -CH2- 25.3 25.3 -CH2-
17 22.8 -CH2- 56.3 -CH- _ _ -C-
18 14.2 -CH3 36.3 -CH- 54.4 54.4 -C-
19 19.2 CH3 40.4 40.4 -CH-
20 34.2 -CH2- 40.0 40.0 -CH-
21 26.3 -CH2- 31.8 31.8 -CH2-
22 45.7 -CH- 38.2 38.1 -CH2-
23 23.3 -CH2- 28.8 28.8 -CH3
24 12.2 CH3 16.4 16.4 -CH3
25 29.3 -CH- 16.0 16.0 -CH3
26 20.1 CH3 17.6 17.7 -CH3
27 19.6 CH3 24.4 24.4 -CH3
28 19.0 CH3 181.8 181.6 -COOH
29 12.0 CH3 17.6 17.8 -CH3
30 21.6 21.6 -CH3
162
2-tridecanone (C13H26O) (1)
Oleic acid (C18H34O2) (2)
β-sitosterol (C29H50O) (3)
Ursolic acid (C30H48O3) (4)
Figure 2 Structures of compounds 1 to 4.
163
3.2. Modulation of mushroom tyrosinase visualized by TLC-bioautography
The inhibitory activity of our compounds was tested on mushroom tyrosinase by TLC- bioautography. Figure 3 gives different pictures of TLC plates with successively 2-tridecanone, oleic acid, β-sitosterol and ursolic acid.
Legend to Figure 3 TLC bioautography test: modulation of mushroom tyrosinase activity by 2-tridecanone, oleic acid, β-sitosterol and ursolic acid (10 µg/ml). Sprayed with mushroon tyrosinase and L-dopa/L- tyrosine solution. A. Mobile phase is hexane : ethyl acetate 9:1 for 2-tridecanone; B. Mobile phase is dichloromethane : methanol 95:5 for oleic acid (PMIV3) in comparison with crude extract (ethyl acetate extract of Protea madiensis); C. Mobile phase is hexane : ethyle acetate 7:3 for β-sitosterol (1: plate sprayed with vanillin – sulfuric acid 3 %; 2: plate sprayed with mushroon tyrosinase and L-DOPA/L-tyrosine). D. Comparison of the effects for ursolic acid commercial (urso) and isolated (XIA) (spot not eluted).
164
2-tridecanone in 4 Protea Oleic acid in Protea β-sitosterol ursolic acid madiensis active fractions madiensis active fraction (inactive) (spot test; no elution)
Hexane/ethyl acetate 9 :1 CH2Cl2/MeOH (95 :5) 1 2
2-tridecanone
β-sitosterol Ursolic acid
Oleic acid
Figure 3: Pictures of TLC bioautography with successively 2-tridecanone, oleic acid, β-sitosterol and ursolic acid (10 µg/ml)
165
3.3. Tyrosinase inhibition in crude cellular extracts The 2-tridecanone and oleic acid isolated from the ethyl acetate extract of Protea madiensis were tested in crude cell extracts for their tyrosinase inhibitory activity . Table 2 compares the 2 compounds with kojic acid (positive control) and DMSO (dissolution solvent)
Table 2 Human tyrosinase inhibition by 2-tridecanone and oleic acid in raw cell extracts. Kojic acid is the positive control and DMSO the dissolution solvent.
Effector Concentration (mM) % of inhibition CV (%) 6.3 88.9 4.3 Kojic acid 12.5 97.9 4.7 25.0 98.9 5.5 2.8 0.1 1.3 DMSO 5.5 0.3 1.6 11.0 0.6 1.9 0.06 8.1 4.9 2-tridecanone 0.12 8.0 4.4 0.24 19.7 4.2 0.035 4.1 4.7 Oleic acid 0.070 6.3 4.5 0.14 13.3 5.5
3.5. Cytotoxicity of 2-tridecanone
The cytotoxicity of 2-tridecanone was tested on two cell lines MM001 and MM028 with different pigmentation levels. Figure 4 exemplifies the negative data obtained for the 2 cell lines over 48 h.
166
120
100
80
60
% control 40
20
0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 2-tridecanone (µg/ml)
Figure 4: Cytotoxicity of 2-tridecanone on MM001
3.6. 2-tridecanone inhibits melanogenesis in a whole cells model
2-Tridecanone was tested on whole cells melanogenesis; Figure 5 compares the pellets obtained from cells treated with 2-tridecanone, untreated cells (control), and cells treated with kojic acid.
2-tridecanone Control Kojic acid (0.01 µM) (1 mM)
Figure 5: Cell pellets after 10 days of treatment with 2-tridecanone (0.01µM) and kojic acid (1mM)
167
3.7. 2-tridecanone inhibit the tyrosine hydroxylase activity of the mushroom tyrosinase
Figure 6: Activity of the tyrosine hydroxylase activity of the mushroom tyrosinase (Pomerantz test) in the presence 2-tridecanone (0.03 mM), kojic acid (1 mM), the control and DMSO (1 %) as dissolution solvent.
4. Discussion
2-tridecanone Two-tridecanone belongs to the class of long-chain aliphatic methyl ketones; as shown in Figure 3, 2- tridecanone showed inhibitory effects on mushroom tyrosinase. Comparison of spot intensities (i;e. strength of inhibition) indicates that, at the same concentration (1 mg/ml), 2-tridecanone is a stronger inhibitor than oleic acid. This ketone also inhibits human tyrosinase in total cellular extracts (Table 2). The solubility of the compound however precluded testing concentrations over 0.24 mM; and so, compared to the inhibition achieved with 6.3 mM kojic acid, the effect of 2-tridecanone appears lower. A previous study reported 2-tridecanone as an insect tyrosinase inhibitor, active on Micromelalopha troglodyte (Lepidoptera: Notodontidae) (Tang et al., 2009). For the first time, we demonstrated the inhibitory activity of 2-tridecanone in human cell extracts. The literature describes 2-tridecanone in plants as an allelochemic, i.e. a non-nutritional chemical produced by an individual of one species that affects the growth, health, behaviour, or population biology of another species (Kennedy, 1984); its toxicity (210.5/µg/cm2) has been shown in wild tomatoes (Dimock et al., 1982). In order to guide the choice of concentrations used for modulating
168
melanogenesis in whole cells, the cytotoxicity of 2-tridecanone was tested on two cell lines MM001 and MM028 with different pigmentation levels. As shown in Figure 4, at the concentrations tested (0 - 10 µg/ml: 0 - 0.05 µM), 2-tridecanone is not cytotoxic on both cell lines over 48 h. When tested over 10 days at 0.01 µM, 2-tridecanone visibly inhibits the formation of melanin in a whole cells overall pigmentation assay (Figure 5), the most comprehensive test that reflects the entire pathway of melanogenesis (Brozyna et al., 2008). The test on the inhibition of the tyrosine hydroxylase function (Figure 6) indicates that 2-tridecanone inhibits the enzymatic activity at a very low concentration (0.03 µM). As mentioned in (Kamagaju et al., 2013b), this test allows to confirm that 2-tridecanone acts on the active site of tyrosinase in competition with the substrate (Tyrosine).
Oleic acid On TLC, oleic acid, an unsaturated fatty acid, showed a weak inhibition of mushroom tyrosinase compared to the 2-tridecanone (Figure 3). On human tyrosinase in crude cell extract (Table 2), as for the 2-tridecanone, oleic acid was tested at a low concentration for dissolution reasons and it showed an inhibition of 13.3 % at 0.14 mM. The literature shows that some unsaturated acids such as linoleic acid (C18:2), α-linolenic acid (C18:3) and oleic acid (C18:1), effectively inhibit melanogenesis and tyrosinase activity (Ebanks et al., 2009; Shigeta et al., 2004); while saturated fatty acids such as palmitic acid (C16:0) or stearic acid (C18:0) are known to rather activate melanogenesis (Ebanks et al., 2009). Given the problems of dissolution, oleic acid was not tested on whole cells pigmentation. Oleic acid does not inhibit tyrosine hydroxylase activity at the highest solubilized concentration (0.03 mM).
β-sitosterol
β-sitosterol was isolated as it was quite close to oleic acid on TLC; however β-sitosterol is not active on the mushroom tyrosinase TLC tests (Figure 3) and so the molecule was not further tested. It is interesting to note that β-sitosterol was isolated as mushroom tyrosinase inhibitor in others studies (Issa et al., 2008; Munoz et al., 2013).
Ursolic acid
In TLC tests (Figure 3), by contrast with tyrosinase inhibitors (kojic acid appears as a white spot on a darkish background), ursolic acid spots appear slightly darker compared to the plate background. This corresponds to an increase of mushroom tyrosinase activity.
169
The literature is not consistent with the effect of ursolic acid on tyrosinase. In fact, in their search for tyrosinase inhibitors, Issa et al., 2008 and Munoz et al., 2013 isolated ursolic acid and β-sitosterol (Issa et al., 2008; Munoz et al., 2013). But their study does not prove their activity by a test at different concentrations. In a research about elastase and tyrosinase inhibitors from Morinda citrifolia L. seeds, Masuda et al. (2009) isolated ursolic acid and demonstrated its inhibitory activity on elastase but not on tyrosinase. In their search for tyrosinase inhibitors in Formosan apple (Malus doumeri var. formosana (Kawak. & Koidz. ex Hayata) S.S. Ying, a synonym of Malus doumeri (Bois) A. Chev.), Lin et al., 2007 have shown on a human melanocytes model that ursolic acid is inactive on cellular tyrosinase activity and on melanin reduction (Lin et al., 2007). By contrast, Pinon et al (2011) have shown that ursolic acid can increase melanin synthesis and its release (Pinon et al., 2011). Such dual effects were described for other types of compounds. For example quercetin in vitro showed tyrosinase inhibition and has been described as a strong inductor of melanogenesis in normal and malignant human melanocytes. Other modulators are known among triterpenes, Lupenone increases melanogenesis by increasing tyrosinase expression (Villareal et al., 2013)) and glycyrrhizin shows either increase or decrease of melanogesis according to tested concentration (Solano et al., 2006).
Based on this literature, the modulation of mushroom tyrosinase was tested at different concentrations of ursolic acid. The test shows that, ursolic acid is a very weak inhibitor at higher concentrations (0.14 mM; inhibition of 5.2 ± 2.3 %) and a weak activator at lower concentrations (0.001mM; inhibition of - 3.4 ± 2.1 %). The positive control, kojic acid, showed inhibition of 92.2 ± 5.4 % at 4.5 mM and 30.4 ± 2.1 % at 0.02 mM.
5. Conclusion
We have isolated for the first time from the ethyl acetate extract of Protea madiensis roots, 3 compounds (2-tridecanone, oleic acid and β-sitosterol).
The 2-tridecanone inhibited tyrosinase in crude cellular extracts from human melanocytes (19.7 % at 0.24 mM) and the melanogenesis in malignant melanocytes after 10 days of incubation. The 2- tridecanone also showed a significant inhibition of the tyrosine hydroxylase function of the mushroom tyrosinase.
Oleic acid showed a weak inhibition of tyrosinase in crude cellular extracts from human melanocytes and showed no inhibitory effect on tyrosine hydroxylase. Although we could not measure a tyrosinase
170
inhibitory activity for β-sitosterol, this compound was isolated as tyrosinase inhibitors in others studies (Issa et al., 2008; Munoz et al., 2013).
We have isolated for the first time in the leaves of Sesamum angolense, ursolic acid, a molecule with several possible therapeutic properties. On TLC, ursolic acid showed activation of mushroom tyrosinase. Based on the literature which characterizes occasionally ursolic acid as inhibitor of tyrosinase and activator of melanogenesis, the activity of ursolic acid may be dose-dependent. Ursolic acid effectively showed a low inhibition and activation of mushroom tyrosinase at high and low concentrations, respectively.
In comparison with kojic acid tested concentrations, our molecules are tested at very low concentrations, which could justify their apparently low activities.
Acknowledgments
We are grateful to the Belgium Technical Cooperation (BTC), to the Foundation Alice & David Van Buuren and to the Commission Universitaire pour le Développement (CUD) grant for financial support of this work. The technical help of M. Faes, O. Vaillant and the scientific help of C. Delporte are gratefully acknowledged. The authors wish to thank the support from F.N.R.S. (grant n°3.4553.08: LC-MS QTOF).
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