Patología E Inmunología De Camarones Penaeidos

GUÍA TÉCNICA

PATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA DE CAMARONES PENAEIDOS

Editores: Vielka Morales Q. Jorge Cuéllar-Anjel

Autores:

Jorge Cuéllar-Anjel Carlos Pantoja Donald V. Lightner Alitiene Moura Lemos Pereira Emiko Shinozaki Mendes, Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira Verónica Arns Da Silva Andreia Benedita Poletto María Soledad Morales-Covarrubias Bruno Gómez Gil R. Margherita Anna Barracco Luciane Maria Perazzolo Rafael Diego Da Rosa Ignacio De Blas Giral Ana Muniesa Del Campo Vielka Morales Q. Cornelio Lara Oscar García Suárez Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Esta publicación ha sido posible gracias al Organismo Regional Internacional de Sanidad Agropecuaria a través de su Coordinación Regional de Inocuidad de Alimentos.

Todos los derechos reservados. Se autoriza la reproducción y difusión de material contenido en esta Guía Técnica para fines educativos u otros fines no comerciales sin previa autorización escrita de los titulares de los derechos de autor. Se prohíbe la reproducción de material contenido en esta Guía Técnica para reventa u otros fines comerciales sin previa autorización escrita de los titulares de los derechos de autor y del Organismo Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria. Derechos reservados: © 2014 Vielka Morales Q. y Jorge Cuéllar-Anjel (507) 6747-2159 / (507) 6949-1976 [email protected] [email protected] Panamá Segunda edición en español • Octubre 2014 Tiraje: 1000 ejemplares • Distribución gratuita Impreso en Guatemala por Publicidad & Diseño Gómez (correo: [email protected]) ISBN versión impresa: 978-9962-8500-7-6 ISBN versión PDF: 978-9962-8500-8-3

Esta obra se citará de la siguiente manera: Todo el libro: Morales, V. y J. Cuéllar-Anjel (eds.). 2014. Guía Técnica – Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos. OIRSA, Panamá, Rep. de Panamá. 382 pp.

Ejemplo para citar un capítulo: Pantoja, C. y D. V. Lightner. 2014. Enfermedades virales. p. 99-164. En: Morales, V. y J. Cuéllar-Anjel (eds.). 2014. Guía Técnica – Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos. OIRSA, Panamá, Rep. de Panamá. 382 pp.

Como citar los 4 temas insertos en los diferentes capítulos: Morales-Covarrubias, M.S. 2014. Montajes en Fresco. p. 29-47. En: Morales, V. y J. Cuéllar-Anjel (eds.). 2014. Guía Técnica – Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos. OIRSA, Panamá, Rep. de Panamá. 382 pp. Pereira, A.M.L., E.S. Mendes, T.C.V. Gesteira, V.A. Silva, y A.B. Poletto. 2014. Mionecrosis infecciosa viral – IMNV y sus implicaciones en el cultivo de camarón brasileño. p. 139-148. En: Morales, V. y J. Cuéllar-Anjel (eds.). 2014. Guía Técnica – Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos. OIRSA, Panamá, Rep. de Panamá. 382 pp. Pantoja, C. y D. V. Lightner. 2014. Espiroplasmosis en Camarones. p. 189-191. En: Morales, V. y J. Cuéllar-An- jel (eds.). 2014. Guía Técnica – Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos. OIRSA, Panamá, Rep. de Panamá. 382 pp. Pantoja, C. y D. V. Lightner. 2014. EMS/AHPND Descripción de la enfermedad en Asia y América. p.172-177. En: Morales, V. y J. Cuéllar-Anjel (eds.). 2014. Guía Técnica – Patología e Inmunología de Camarones Penaei- dos. OIRSA, Panamá, Rep. de Panamá. 382 pp.

Diseño: New Concept Publications, Inc. (507) 226-7694 Panamá

Fotos cortesía de: Daniel Ho – portada, contraportada, páginas 4, 6, 19, 97, 165, 195, 223, 235 y 307 Camaronera de Coclé, S.A. (CAMACO) - Panamá - páginas 327 y 380

2 Agradecimientos

AGRADECIMIENTOS

Los editores agradecen a la Coordinación Regional de Inocuidad de Alimentos del OIRSA, en su momento representada por el Dr. Oscar de Jesús García, quien apoyó la realización de esta publi- cación y su participación constante en la actualización de los temas de normativas internacionales para medicamentos. A la Coordinación Regional de Salud Animal del OIRSA a través de su Coordinación Regional de Sanidad Acuícola, por el esfuerzo económico y logístico para la actualización de la Guía Técnica – Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos como 2da edición. Especial agradecimiento al Dr. Abelardo De Gracia por su visión de incorporar dentro del OIRSA el Programa de Sanidad Acuícola, así como su apoyo en la creación del Grupo Ad hoc de especialistas acuícolas del OIRSA, donde se cuenta con la participación de excelentes y reconocidos profesionales en el campo de la acuicultura con diversas especialidades. Al Grupo CALESA a través de su Vicepresidente Ejecutivo, Lic. Hans Hammerschlag, por el apoyo constante que brinda al OIRSA, permitiendo que su equipo técnico participe en las actividades del Grupo ad hoc en Sanidad Acuícola. Se agradece la colaboración incondicional del Ing. Roberto Chamorro (Licencia de intérprete público autorizado del Ministerio de Gobierno y Justicia de Panamá, Resolución Nº28, de 8 de marzo de 1984) por la traducción del portugués al español del capítulo de 6 “Inmunología del camarón” y del tema “Mionecrosis infecciosa viral (IMNV) y sus implicaciones en los cultivos de camarones brasileños” del capítulo 2 de Enfermedades Virales. Igualmente se les agradece a todos los autores y coautores que han logrado enriquecer esta nueva versión de la Guía Técnica, en particular al Dr. Carlos Pantoja, a la Dra. María Soledad Morales Covarrubias, a la Dra. Margherita Barracco, al Dr. Bruno Gómez Gil, a la Dra. Alitiene Pereira Moura, al Dr. Oscar García, al Ing. Cornelio Lara y muy especialmente al Dr. Ignacio de Blas, quien aportó un nuevo capítulo a la Guía. La autora María Soledad Morales-Covarrubias, desea agradecer su apoyo y comprensión a Ignacia Covarrubias Flores, Martha Silvia Morales Covarrubias, Pedro Antonio Morales Covarrubias, Ángel Eduardo Morales Ramos y Gael Iñaqui Morales Ramos. Finalmente, queremos reconocer y agradecer el apoyo que nos ha brindado el Ing. Dario López de Farallón Acuacultura, al facilitarnos ejemplares vivos para las fotos de portada y entre pá- ginas, de esta Guía Técnica de Patología e Inmunología de camarones penaeidos y al Lic. Reinaldo Morales por su revisión en los datos estadísticos y apoyo constante en la consecución de información.

3 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

4 Prólogo

PRÓLOGO

De acuerdo con la FAO (2014), la producción acuícola mundial alcanzó el máximo histórico de 90.4 millones de toneladas en 2012, de las cuales 66.6 millones de toneladas corresponden a pescado comestible, incluida la producción de camarón de cultivo que representó el 9.7% (6.4 millones de toneladas) y el 22.4% en valor, los cuales a su vez corresponden al 15% del valor total de los productos pesqueros comercializados a nivel internacional. En los países que conforman OIRSA, la evolución de los volúmenes de producción indica que la camaronicultura tuvo un crecimiento ponderado del 214% entre 2000 y 2011. El sector presentó una tendencia ascendente sostenida hasta 2008, cuando el aumento llegó hasta el 269% y desde entonces presentó un comportamiento fluctuante (FAO FishStat, 2014). Si bien los resultados de la producción de la acuicultura y en especial de los camarones cultivados son de alta importancia, la industria se ha visto afectada en diferentes épocas por el aparecimiento de enfermedades. Tal es el caso de Centroamérica, que en la década de los 90 fue fuertemente impactada por la aparición de patologías como el Síndrome de Taura y el Síndrome de la Mancha Blanca, causando significativas pérdidas en la producción, la generación de ingresos y empleos. En 2012 y con mayor énfasis en 2013, se evidenció una disminución de los volúmenes en la producción mundial de camarón cultivado, debido principalmente a problemas relacionados con enfermedades como la Enfermedad de la Necrosis Aguda del Hepatopáncreas (AHPND o EMS) en algunos países de Asia, así como otras patologías similares en ciertos países de América Latina, lo cual incrementó los precios del camarón en todo el mundo y afectó el consumo en los mercados tradicionales. Debido al alto riesgo que representan las enfermedades tanto para las poblaciones en cultivo como para los organismos silvestres, el sector acuícola se ha visto en la necesidad de implementar nuevas tecnologías, de aplicar las “buenas prácticas de manejo” en sus cultivos y también de capaci- tar de forma continua al personal técnico y de campo. El Organismo Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria (OIRSA), como ente rector de la sanidad agropecuaria en la región, tiene entre sus compromisos el facilitar el desarrollo econó- mico y social de los países miembros mediante la producción agropecuaria sana y de calidad. Con dicho propósito, OIRSA tiene el honor de presentar la Guía Técnica de Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos, la cual recoge las técnicas de identificación y características de las principales enfermedades de los camarones y que le permitirá a la región contar con una camaronicultura que cumpla los estándares de calidad y sea altamente productiva.

EFRAÍN MEDINA GUERRA Director Ejecutivo OIRSA, 2014

5 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

6 Introducción

INTRODUCCIÓN

La Guía Técnica – Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos, primera edición, fue creada gracias al Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED). Este es un programa internacional multilateral de cooperación científica y tecnológica de ámbito iberoamericano con carácter horizontal y a través de la Red denominada FORO PARA LA GESTIÓN DE CONOCIMIENTOS Y TRANSFERENCIA DE TECNOLOGÍAS SOBRE EL CULTIVO DE PENAEUS VANNAMEI: RED VANNAMEI, se publicó en el 2008 bajo la Coordinación de la Lic. Vielka Morales como responsable de esta red temática y co-editora del libro. La presente actualización y publicación de la 2da edición de esta Guía Técnica, ha sido posible gracias al Organismo Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria (OIRSA), a través de la Coordinación Regional de Salud Animal, su Coordinación de Inocuidad de los Alimentos, su Progra- ma Regional de Sanidad Acuícola y del Grupo ad hoc en Sanidad Acuícola, coordinado este último por el Dr. Jorge Cuéllar-Anjel, co-editor y co-autor del libro. El OIRSA como entidad interguberna- mental especializada en materia de sanidad agroalimentaria, tiene el objetivo de mejorar y alcanzar el estatus sanitario de la Región, para que sea reconocido internacionalmente, permitiendo así el acceso a mercados internacionales y contribuyendo con la seguridad alimentaria. El Grupo Ad hoc del Programa de Sanidad Acuícola dentro de la Coordinación Regional de Salud Animal, está dividido en tres sub grupos: “Peces” liderado por el Dr. Víctor Vidal del CIAD de México, “Moluscos” liderado por el Dr. Jorge Cáceres del CICESE de México y “Crustáceos” liderado por el Dr. Cuéllar-Anjel del sector privado de Panamá. Así mismo, el Programa cuenta con un Grupo “Network” de apoyo, compuesto por grandes especialistas en diversos temas de la sanidad acuícola, dentro y fuera de la región del OIRSA. Estos tres sub grupos, interesados en apoyar al sector acuícola de la Región, han contribuido en diversas oportunidades con capacitaciones y material científico que sirve como instrumento de referencia en pro de una producción acuícola sana en la Región. El OIRSA ha dado inicio a través de su Coordinación Regional de Salud Animal y su Programa de Sanidad Acuícola y con el apoyo de su Grupo ad hoc, a una serie de actividades relacionadas con la sanidad acuícola, entre ellas varias capacitaciones técnicas y temáticas, manuales, conferencias y, de forma destacada, la Campaña de Alerta Temprana sobre la nueva enfermedad conocida como Síndrome de Mortalidad Temprana (EMS por sus siglas en Inglés) o Enfermedad de la necrosis aguda del hepatopáncreas (AHPND por sus siglas en Inglés). Por tal motivo, se ha hecho un gran esfuerzo para poder reproducir la 2da edición de esta Guía Técnica, con la ayuda de los mismos autores de su primera edición y la contribución de nuevos autores, logrando así un documento actualizado, moderno y con nuevas enfermedades incorporadas. Este documento servirá como material básico de consulta para estudiantes, profesores, profesionales acuícolas, investigadores, empresas privadas o mixtas y entidades estatales, que se dediquen al cultivo de camarones marinos. El compromiso desinteresado de cada uno de los autores, es uno de los mejores aportes al sector camaronero y a quienes los editores agradecen por haber depositado su confianza en el Programa Regional de Sanidad Acuícola del OIRSA. Extendemos a estos autores, amigos y compañeros, un cordial agradecimiento por toda su colaboración, así como al Coordinador Regional de Salud Animal y al Coordinador Regional de Inocuidad de los Alimentos del OIRSA, por su apoyo incondicional y su confianza depositada en nosotros para este gran proyecto que es la 2da edición de la Guía Técnica de Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos.

VIELKA MORALES Q. JORGE CUÉLLAR-ANJEL Coordinadora del Programa Camaronera de Coclé, S.A. y Regional de Sanidad Acuícola Coordinador del Grupo del OIRSA ad hoc del OIRSA en Sanidad Acuícola 7 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

ÍNDICE

Prólogo 5 Introducción 7 Reseña de los Editores y Autores 11 Capítulo 1 Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos (Jorge Cuéllar-Anjel) 21 1.1 Anamnesis 22 1.2 Examen clínico 23 1.3 Microscopía directa (análisis en fresco) 26 1.4 Montajes en fresco (María Soledad Morales-Covarrubias) 29 1.5 Bacteriología 48 1.6 Histología 52 1.7 Pruebas con anticuerpos 59 1.8 Métodos moleculares 64 1.9 Parámetros inmunológicos 78 1.10 Microscopía electrónica de transmisión 84 1.11 Bioensayos 87 1.12 Referencias bibliográficas 92 Capítulo 2 Enfermedades virales del camarón (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner) 99 2.1 Principales enfermedades y métodos de diagnóstico. 100 2.2 Virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (Infectious hypodermic and hematopietic necrosis virus, IHHNV). 103 2.3 Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (White spot syndrome virus, WSSV) 111 2.4 Virus del Síndrome de Taura (Taura syndrome virus, TSV) 121 2.5 Virus del síndrome de la cabeza amarilla (Yellow head syndrome virus, YHV) 130 2.6 Virus de la mionecrosis infecciosa (Infectious myonecrosis virus, IMNV) 135 2.7 Mionecrosis infecciosa viral – IMNV y sus implicaciones en el cultivo de camarón brasileño (Alitiene Moura Lemos Pereira, Emiko Shinozaki Men- des, Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira, Veronica Arns da Silva, Andreia Benedita Poletto) 139 2.8 Penaeus vannamei nodavirus (PvNV) 149 2.9 Referencias bibliográficas 152

8 Índice de Contenido

Capítulo 3 Enfermedades bacterianas de camarones (María Soledad Morales-Covarru- bias y Bruno Gomez-Gil) 167 3.1 Síndrome de la Mortalidad Temprana (EMS) o Enfermedad de la Necrosis Aguda del Hepatopáncreas (AHPND) - Situación de México 167 3.2 EMS/AHPND Descripción de la enfermedad en Asia y América (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner) 172 3.3 Necrosis séptica del hepatopáncreas (NSHP) 178 3.4 Hepatopancreatitis necrotizante (NHP) 180 3.5 Síndrome de Zoea II 182 3.6 Enfermedad de luminiscencia 184 3.7 Erosión bacteriana del caparazón 185 3.8 Estreptococosis 187 3.9 Spiroplasma penaei (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner) 189 3.10 Referencias Bibliográficas 192 Capítulo 4 Parásitos en camarones (Jorge Cuéllar-Anjel) 197 4.1 Gregarinas 197 4.2 Microsporidios 202 4.3 Haplosporidios 209 4.4 Epicomensales 210 4.5 Metazoarios 217 4.6 Referencias bibliográficas 221 Capítulo 5 Enfermedades causadas por hongos (Carlos R. Pantoja y Donal V. Lightner) 225 5.1 Micosis 225 5.2 Fusariosis 228 5.3 Referencias bibliográficas 232 Capítulo 6 Avances en la Inmunología del Camarón (Margherita Anna Barracco, Lucia- ne María Perazzolo y Rafael Diego Rosa) 237 6.1 Sistema circulatorio, hemolinfa y coagulación 239 6.2 Las células del sistema inmune 241 6.3 Mecanismos de reconocimiento y señalización celular 245 6.4 Mecanismos líticos y microbicidas 258 6.5 Defensas antivirales 267 6.6 Inmunoestimulantes 277 6.7 Parámetros hemato-inmunológicos como indicadores de salud 282

9 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

6.8 Conclusiones y Perspectivas 287 6.9 Referencias bibliográficas 289 Capítulo 7 Vigilancia epidemiológica en Camaronicultura (Ignacio de Blas y Ana Muniesa) 309 7.1 Generalidades sobre vigilancia epidemiológica 310 7.2 Investigación de brotes de enfermedad 313 7.3 Vigilancia epidemiológica para detectar enfermedad 317 7.4 Vigilancia epidemiológica para estimar prevalencia 321 7.5 Conclusión 327 7.6 Referencias bibliográficas 327 Capítulo 8 Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Pe- naeus (Litopenaeus) vannamei (Boone, 1931) (Jorge Cuéllar-Anjel, Vielka Morales, Cornelio Lara y Oscar García) 331 8.1 Aspectos a considerar en las Buenas Prácticas de Manejo 332 8.2 Sistema de disposición de desechos según su clasificación y posibilidad de reciclaje 357 8.3 Uso de energía 357 8.4 Planes de contingencia 357 8.5 Registros en una granja camaronera 358 8.6 Trazabilidad 358 8.7 Referencias Bibliográficas 359 Abreviaturas 361 Glosario 364

10 Reseña de los Editores

RESEÑAS

DE LOS EDITORES

VIELKA MORALES Q. Coordinadora Programa Regional de Sanidad Acuícola [email protected]

Licenciada en Biología. Experiencia de 14 años en el tema de larvicultura, maduración, zooplancton y fitoplancton en laboratorio de camarones de Pa- namá. Durante 15 años como coordinadora técnica de la Organización del Sector Pesquero y Acuícola de Centroamérica - OSPESCA. Consultora para FAO y PRADEPESCA-UE. Cuenta con más de 17 publicaciones en temas de camarones. Ha participado en redes del CYTED relacionada a camarones y moluscos. Actualmente Coordinadora del Programa de Sanidad Acuícola, de la Coordinación Regional de Salud Animal de la Organización Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria – OIRSA.

JORGE CUÉLLAR-ANJEL Director del Departamento de Patología e Investigación Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO) Aguadulce, Coclé, República de Panamá [email protected]

Médico Veterinario (U.D.C.A., Bogotá), Máster en Microbiología con énfasis en Inmunología (Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá). Actualmente Patólogo e Investigador de CAMACO y Coordinador del Grupo ad hoc del OIRSA en Sa- nidad de Organismos Acuáticos. Experiencia de 21 años en las áreas de cultivo de camarón marino Litopenaeus vannamei, diseño y montaje de laboratorios de patología para camarones (bioensayos, microbiología, histopatología y bio- logía molecular), diagnóstico y capacitaciones para la detección de enfermedades en camarones penaeidos y en peces marinos y dulceacuículas, docencia universitaria e investigación aplicada en Patología, Inmunología, Toxicología y Nutrición de camarones y peces, con desempeño profesional en Centro y Sudamérica.

11 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

DE LOS AUTORES

MARIA SOLEDAD MORALES-COVARRUBIAS Centro de Investigaciones en Alimentación y Desarrollo, A.C. Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental México, [email protected]

Maestría y Doctorado en Patología de crustáceos, Licenciatura en Biología Pes- quera. Actualmente es profesor titular en CIAD. Sus principales trabajos de investigación están enfocados en sanidad y fisiología de camarones penaeidos en ambiente marino y de baja salinidad; imparte cursos en sanidad acuícola, transferencia tecnológica, capacitación y consultoría en sanidad de crustáceos en México y en el extranjero. Miembro del Grupo Ad hoc del OIRSA.

JORGE CUÉLLAR-ANJEL Director del Departamento de Patología e Investigación Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO) Aguadulce, Coclé, República de Panamá [email protected]

La reseña de este autor ha sido citada previamente en “Reseña de los Editores”

CARLOS PANTOJA School of Animal and Comparative Biomedical Sciences The University of Arizona Tucson, Arizona, USA [email protected]

Ingeniero Bioquímico en Explotación de Recursos Acuáticos (Tec de Monterrey, Campus Guaymas, México). Maestría en Acuacultura (Tec de Monterrey, Campus Guaymas, México). Doctorado en Patobiología (The University of Arizona). Ac- tualmente es profesor investigador asociado en el laboratorio de patología acuícola de la Universidad de Arizona. Principales áreas de trabajo en patología morfoló- gica, caracterización de nuevas enfermedades y agentes infecciosos de camarones peneidos, desarrollo de métodos de detección de agentes infecciosos y diagnóstico de enfermedades. Provee servicios de consultoría a la industria camaronícola en el área de patología y da entrenamiento técnico en el área de diagnóstico de enfermedades a través de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero.

12 Reseña de los Autores

DONALD V. LIGHTNER School of Animal and Comparative Biomedical Sciences The University of Arizona Tucson, Arizona, USA [email protected]

PhD en Patología y Biología Pesquera, Maestría en Biología Pesquera y su Li- cenciatura en Biología Pesquera. Su experiencia está dirigida a la patología y enfermedades de los cultivos de crustáceos y peces, enfermedades de invertebrados, marinos y de agua dulce, enfermedades infecciosas, virología, histolo- gía, microscopio electrónico, desarrollo de métodos de diagnósticos, nutrición de animales acuáticos y toxicología acuática. Provee servicios de consultorías a la industria camaronícola en el área de patología y da entrenamiento técnico en el área de diagnóstico de enfermedades a través de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero.

BRUNO GÓMEZ GIL R. Laboratorio de bacteriología y de Genómica Microbiana CIAD, A.C. Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental México [email protected]

Biólogo con doctorado en mirobiología por la Universidad de Stirling, Esco- cia. Investigador de tiempo completo en la líneas de biodiversidad de bacterias acuáticas y enfermedades bacterianas de organismos acuáticos. Ha publicado mas de 60 artículos científicos, diversos capítulos en libros y formado estudiantes de licenciatura, maestría y doctorado. Es miembro de la American Society for Microbiology, Association of Vibrio biologists y de la Academia Mexicana de Ciencias. Además de investigación científica, realiza servicios de diagnóstico y bioensayos a la industria camaronícola.

MARGHERITA ANNA BARRACCO Universidad Federal de Santa Catalina (UFSC), Laboratorio de Inmunología Aplicada a la Acuicultura (LIAAq), Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG), Florianópolis, SC, Brasil [email protected]

Doctorado en Inmunología de Invertebrados y Licenciatura en Ciencias Bioló- gicas. Profesora Titular de Biología Celular, con participación en los programas de Postgrado en Acuicultura y Biotecnología. Investigadora en el área de inmu- nología de crustáceos y moluscos de interés para la acuicultura, con implicaciones en la sanidad y en el monitoreo ambiental. Sus principales trabajos de investigación están enfocados en el estudio de la respuesta inmunológica a infecciones, la produccion de antibióticos naturales, el desarrollo de parámetros hemato-inmonológicos para el monitoreo de condiciones de salud y el efecto de sustancias inmunoestimulantes en camarones y bivalvos marinos.

13 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

LUCIANE MARIA PERAZZOLO Universidad Federal de Santa Catalina (UFSC), Laboratorio de Inmunología Aplicada a la Acuicultura (LIAAq), Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG), Florianópolis, SC, Brasil [email protected]

Doctorado en Biología y Fisiología Celular, Maestría en Inmunología de Crustá- ceos Marinos y Licenciatura em Ciencias Biológicas. Investigadora en el Labora- torio de Inmunología Aplicada a la Acuicultura (UFSC) con participación en los programas de Postgrado en Acuicultura y en Biología Celular y del Desarrollo. Sus principales áreas de investigación están enfocadas en los mecanismos de defensa antiviral y en la busca de marcadores moleculares de resistencia de los camarones a las enfermedades.

RAFAEL DIEGO DA ROSA Universidad Federal de Santa Catalina (UFSC), Laboratorio de Inmunología Aplicada a la Acuicultura (LIAAq), Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG), Florianópolis, SC, Brasil [email protected]

Doctorado en Inmunogenética de Moluscos Bivalvos, Maestría en clonaje y caracterización de péptidos antimicrobianos de camarones. Licenciatura en Ciencias Biológicas. Profesor investigador en el Laboratorio de Inmunología Aplicada a la Acuicultura de la Universidad Federal de Santa Catarina. Sus principales trabajos de investigación están enfocados en la inmunología de crustá- ceos y moluscos bivalvos, en especial en los péptidos antimicrobianos, respuestas intestinales e interacciones microorganismo-hospedador

ALITIENE MOURA LEMOS PEREIRA Embrapa Meio-Norte, Parnaíba, PI, Brasil, [email protected]

Tecnóloga en Acuicultura, con Maestría y Doctorado en Acuicultura. Investi- gadora de la Empresa Brasileña de Investigación Agropecuaria (Embrapa). Res- ponsable por el Laboratorio de Patología de Organismos Acuáticos (LAPOAq). Responsable por proyectos en patología, diagnóstico y monitoreo sanitario de camarones y peces cultivados.

14 Reseña de los Autores

EMIKO SHINOZAKI MENDES, Universidade Fed. Rural de Pernambuco, Recife, PE, Brasil [email protected]

Médica Veterinaria, con Maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Doc- torado en enfermedades tropicales. Profesora Asociada del Departamento de Medicina Veterinaria, y en los programas de pos-grado en Veterinaria y de los Recursos Pesqueros y Acuícolas, ambos de la Universidad Federal Rural de Per- nambuco. En la actualidad, profesora asociada en la Universidad Federal Rural de Pernambuco, con experiencia en el campo de la Medicina Preventiva Vete- rinaria, con énfasis en la inspección de productos de origen animal y sanidad animal acuática. Coordinadora de la Red Temática del camarón Red Nacional de Investigación en Salud (RECARCINA), financiado por FINEP.

TEREZA CRISTINA VASCONCELOS GESTEIRA Universidade Fed. do Ceará, LABOMAR, CE, Brasil [email protected]

Bióloga con Maestría en Zoología por la Universidad Federal de Rio de Janeiro y PhD en Biología por la Universidad de New Brunswick – Canadá. Trabaja en el área de histología y en histopatología de camarones penaeidos. Está actualmente como profesor jubilado de la Universidad Federal de Ceará. Miembro fundador del Centro para la Enfermedad Diagnóstico de Organismos Acuáti- cos -CEDECAM/LABOMAR/UFC. Consultora “ad hoc” del Consejo Nacional de Desarrollo Tecnológico y CNPq. Miembro de la Asociación brasileña de Patólogos de Organismos Acuáticos- ABRAPOA. Experiencia en el área de los recursos pesqueros y de la ingeniería de la pesca, con énfasis en el cultivo de camarón, que actúa sobre los siguientes temas: el camarón marino, biología penaeidos y la histopatología.

VERONICA ARNS DA SILVA Universidade Fed. Rural de Pernambuco, Recife, PE, Brasil [email protected]

Licenciada en Veterinaria por la Universidad Federal Rural de Pernambuco (UFRPE). Especialización en Vigilancia Sanitaria y Gestión de Calidad de los Alimentos por SPEI. Maestría en Acuicultura y Recursos Pesqueros y Doctorado en Ciencias Veterinarias, con énfasis en la salud del camarón marino cultivado por la Universidad Federal Rural de Pernambuco.

15 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

ANDREIA BENEDITA POLETTO Embrapa Meio-Norte, Bolsista PNPD/CAPES Parnaíba, PI, Brasil, [email protected]

Licenciada en Ciencias Biológicas PUC-Campinas, Master en Ciencias Bio- lógicas (Genética) de la UNESP-Botucatu-SP (2005) y doctorado en Ciencias Biológicas (Genética) de la UNESP-Botucatu - SP (2009), Post-doctorado en la Embrapa Meio-Norte, Piaui. Experiencia en el área de la genética, diagnóstico molecular, cultivo celular e histología. Con estudios de patología del cama- rón de cultivo Litopenaeus vannamei. Actualmente es consultora Ad Hoc de la Fundación para el Apoyo a la Investigación del Estado de Maranhão (FAPEMA).

CORNELIO LARA Jefe del Programa de Sanidad Acuícola Ministerio de Desarrollo Agropecuario Panamá [email protected]

Licenciado en Ingeniería Agronómica, con Magíster en Ciencias Ambientales con énfasis en Manejo de Recursos Naturales. Jefe del Programa de Sanidad Acuícola de la Dirección Nacional de Salud Animal, Ministerio de Desarrollo Agropecuario. Más de 30 años de experiencia en el Sector Acuícola; Consultor Privado del Sector Acuícola, nacional e internacional. Punto focal de la OIE para animales acuáticos, miembro del Grupo Ad hoc para organismos acuáticos de la Organismo Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria (OIRSA) y miembro Ad Honorem del Comité Consultivo Agropecuario Nacional.

OSCAR GARCÍA SUÁREZ Coordinador Regional de Inocuidad de Alimentos del Organismos Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria – OIRSA [email protected]

Médico Veterinario con Maestría en Medicina Veterinaria Higiene Animal, Doc- torado en Higiene de los Alimentos de la Universidad de Leipzig, Alemania. Actualmente ocupa el cargo de Coordinador Regional de Inocuidad en OIR- SA. Presidente de la Red Panamericana de Inspección, Control de Calidad y Tecnología de Productos Pesqueros (2013-2014). Miembro del Grupo Asesor Internacional Escuela Virtual de Inspección de Alimentos en América Central y República Dominicana. Delegado de OIRSA ante la Comisión del Codex Alimentarius.

16 Reseña de los Autores

VIELKA MORALES Q. Coordinadora Programa Regional de Sanidad Acuícola bajo la Coordinación Regional de Salud Animal del Organismo Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria OIRSA [email protected]

La reseña de este autor ha sido citada previamente en “Reseña de los Editores”

IGNACIO DE BLAS GIRAL Facultad de Veterinaria Universidad de Zaragoza España, [email protected]

Doctor en Veterinaria (programa de Patología Animal: Sanidad Animal) y Licen- ciatura en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza. Profesor Titular en el De- partamento de Patología Animal de la Universidad de Zaragoza. Es responsable del área de Epidemiología del Laboratorio de Ictiopatología de la Universidad de Zaragoza. Es responsable de la docencia de la asignatura Epidemiología y Bioestadística. Su investigación está orientada a la epidemiología de especies acuáticas: peces, moluscos y crustáceos, con énfasis en el diseño y análisis de experimentos y estudios observacionales, así como en el desarrollo y eva- luación de tratamientos terapéuticos y profilácticos (antibióticos, probióticos, vacunas…).

ANA MUNIESA DEL CAMPO Facultad de Veterinaria Universidad de Zaragoza España, [email protected]

Maestría en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias y Licenciatura en Veterinaria por la Universidad de Zaragoza. En la actualidad es becaria de investigación en el Departamento de Patología Animal de la Universidad de Zaragoza y está realizando su Doctorado en el programa de Medicina y Sa- nidad Animal de la Universidad de Zaragoza. Su investigación se centra en el desarrollo de nuevas herramientas orientadas a mejorar los programas de vigilancia epidemiológica en acuicultura. Ha participado como docente en cursos de formación en epidemiología y bioseguridad acuícola.

17 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

18 Capítulo 1

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

20 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Capítulo 1

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Jorge Cuéllar-Anjel Director del Departamento de Patología e Investigación Camaronera de Coclé, S.A. (CAMACO) Coordinador del Grupo ad hoc del OIRSA en Sanidad Acuícola Panamá

Introducción En este Capítulo se revisan y detallan los principales métodos que sirven como herramienta para realizar el diagnóstico de enfermedades en camarones, con base en las técnicas recientes más utilizadas para la detección de agentes patógenos. Aunque algunos de estos procedimientos pueden ser realizados por los mismos productores en los laboratorios de maduración y/o larvicultura o en las fincas camaroneras, la mayoría deben ser hechos por profesionales en sanidad acuícola o por Médicos Veterinarios especialistas. Se debe recordar siempre que el diagnóstico no lo da una prueba de laboratorio como tal, sino la interpretación que hace el especialista en Sanidad, con base en sus conocimientos y en la información recopilada de las pruebas de campo y de laboratorio de cada caso en particular. Se incluye dentro de este capítulo, la participación de María Soledad Morales-Covarru- bias con la explicación del tema “Montajes en Fresco”.

Pasos para el diagnóstico: • Anamnesis (información histórica del caso, datos relacionados con el evento) • Examen clínico • Microscopía (análisis con microscopio de luz directa, contraste de fase o campo oscuro, con montajes en fresco de tejidos teñidos o sin coloraciones, barridos o montajes en fresco de tiras fecales) • Bacteriología (de tejidos de camarones o de sustratos relacionados como agua, sedimento y otros organismos acuáticos) • Histología de especimenes fijados • Pruebas basadas en anticuerpos para la detección de patógenos utilizando anticuerpos policlonales (PAbs por sus siglas en inglés) o anticuerpos monoclonales (MAbs por sus siglas en inglés) • Métodos moleculares ◊ Sondas de ADN en pruebas de hibridación dot blot directamente con muestras frescas de tejido o con ADN extraído ◊ Sondas de ADN o de ARN en pruebas de hibridación in situ con cortes histológicos de tejidos fijados

21 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

◊ PCR, RT-PCR, PCR en tiempo real o LAMP para pruebas directas con muestras de tejido fresco o con ADN o ARN extraído • Parámetros inmunológicos (hemogramas y medición de perfiles inmunes) • Microscopía electrónica de barrido o de transmisión • Bioensayos con portadores sospechosos o subclínicos, utilizando hospederos altamente susceptibles (estadios del animal o especies) como indicadores de la presencia del patógeno.

1.1 Anamnesis En la medida de lo posible, el profesional en sanidad acuícola responsable de realizar el diag- nóstico de una enfermedad en una población de camarones, debe incluir una visita a la instalación afectada (maduración, larvicultura o finca de engorde). Para poder llegar a un correcto diagnóstico confirmatorio que permita la toma de decisiones acertadas, una de las actividades más importantes que el especialista en sanidad acuícola debe realizar durante su visita a la granja afectada, es una correcta anamnesis. Como concepto, la anamnesis se refiere a la recopilación de datos clínicos relevantes y a información histórica que proporciona el productor acerca del estanque afectado. Esta información se debe ordenar y analizar como parte de los procedimientos para emitir un diagnóstico. Durante la visita, el especialista debe recopilar toda la información relacionada con la aparición del brote de enfermedad. Para ello, deberá realizar preguntas al productor, relacionadas al menos con los siguientes puntos (entre otros): • Condición actual del estanque (¿qué le ocurre?, ¿desde cuándo?, ¿a qué cree que se debe?, ¿cuántos estanques tienen el problema?, ¿hay alguna granja vecina afectada?) • Densidad de siembra • Días de cultivo • Procedencia de las postlarvas sembradas en el estanque • Supervivencia actual estimada • Crecimiento semanal • Alimentación de los camarones ◊ Tipo de alimento ◊ Frecuencia y método de suministro del alimento ◊ Cambios recientes en el tipo, consumo o suministro del alimento ◊ Tiempo de almacenamiento del alimento en la finca • Parámetros ambientales y físico-químicos del estanque afectado • Tipos y procedimientos de fertilización del fondo y el agua • Brotes similares que se han presentado anteriormente en esta u otras granjas vecinas • Relato ordenado de los sucesos o problemas clínicos que ha presentado el estanque • Descripción del productor en términos no técnicos, de los signos de enfermedad detectados, su progresión en la población y la duración que han tenido • Hacer preguntas al productor, le ayuda a recordar información que no creyó importante mencionar, pero que puede ayudar a la hora del diagnóstico

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• Tránsito de personas foráneas (uso de “servidumbres”) o de equipos por las instalaciones de la finca • Presencia de animales foráneos en el sistema (perros, aves, roedores, vacas, etc.) • Productos químicos o biológicos utilizados durante el cultivo incluidos antibióticos y probióticos • Toda aquella información adicional que sea relevante y que pueda estar relacionada con la población afectada La edad del cultivo es importante, ya que algunas enfermedades afectan más a camarones de cierta edad que de otra. Los animales jóvenes presentan más frecuentemente patologías causadas por agentes infecciosos como virus, bacterias y hongos; los adultos aunque son más resistentes a enfermedades, pueden presentar parasitosis internas (gregarinas) o externas (epicomensales), lesiones degenerativas o en algunos casos tumores. Realizar una adecuada anamnesis acompañada de una correcta exploración física, puede conducir a un diagnóstico certero o a definir en cuanto a las pruebas especiales de laboratorio, cuáles sí y cuáles no se deben realizar con muestras del estanque afectado. Debe llevarse un registro de la información obtenida en la granja, para después ponerla en orden de prioridad con el fin de preparar el listado de posibles diagnósticos que acompañados por los datos recogidos en la valoración clínica de campo, ayudará a preparar los exámenes complementarios necesarios para un correcto diagnóstico y un eventual tratamiento. Los métodos de diagnóstico nunca pueden sustituir la información obtenida mediante una anamnesis completa y una buena valoración clínica. Es importante considerar que una anamnesis correcta no debe centrarse exclusivamente en el motivo de la visita técnica al estanque, ya que a veces existen otros problemas no reportados por el productor y que podrían ser incluso más importantes que el motivo inicial por el cual se solicita la asistencia del especialista en sanidad acuícola.

1.2 Examen clínico Cuando se trate de un brote de una enfermedad, durante la visita a las instalaciones deben evaluarse las unidades de producción (tanques o estanques) que presenten problemas. Se deben realizar capturas de camarones in situ y hacer una revisión individual de animales, para formarse una idea aproximada de la proporción del problema: qué tanta población está afectada (prevalencia en %), grado de severidad de las afecciones observadas en los organismos enfermos y qué tipo de enfermedad puede estar causando el brote. El examen clínico debe incluir un recorrido manual y visual muy cuidadoso de los camarones que sean revisados, los cuales no deben ser capturados al azar, sino seleccionados por presentar alguna manifestación de enfermedad. Con base en los hallazgos de esta valoración clínica, es factible en algunos casos hacer un diagnóstico presuntivo, el cual se debe confirmar con pruebas complementarias de laboratorio. El número de animales que se debe tomar para realizar un estudio sobre la etiología de enfermedades, está afectado por la habilidad de reconocer camarones enfermos en exámenes generales, la naturaleza del problema presente y por la experiencia del profesional especialista en sanidad acuí- cola. Cuando se eligen camarones que presenten signos clínicos, 5 a 10 por población examinados individualmente, serán suficientes. La recolección de camarones para realizar un examen que busca determinar la presencia de enfermedad, debe realizarse procurando el mínimo de estrés durante la captura y manipulación de los animales (Fig. 1.2.1).

23 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Si el examen clínico debe ser realizado en un lugar diferente al de la captura y los camarones deben ser transportados hacia otra parte, la movilización debe hacerse en recipientes con agua del mismo estanque, limpia (sin lodo ni trozos de vegetales), con adecuada aireación y teniendo una densidad baja (para evitar el estrés). Si los camarones van a permanecer un período de tiempo en el recipiente antes de ser examinados, deben tener buena aireación y, en lo posible, se debe bajar la temperatura a 25-27ºC mediante la adición de bolsas con hielo (selladas). En estudios de camarones presumiblemente enfermos, se deben seleccionar animales moribundos, descoloridos, con comportamiento inusual o que presenten anormalidades macroscópicas con las cuales se sospeche de una enfermedad (Fig. 1.2.2 y 1.2.3). Las principales observaciones que se deben realizar en camarones enfermos durante una valoración clínica, son las siguientes: • Color del animal • Tamaño del cuerpo comparado con el resto de la población (“enanismo”) • Expansión de cromatóforos • Deformidades en rostro, abdomen o apéndices • Flexión del músculo abdominal (calambre) • Color de las branquias (amarillas, marrón o negras) • Color de los apéndices (pereiópodos, pleópodos y urópodos) • Color de las antenas • Edema (presencia anormal de líquido) en apéndices u otras partes del cuerpo • Transparencia de los músculos del abdomen y del cefalotórax • Repleción intestinal (porcentaje del intestino que se encuentra lleno) • Textura del exoesqueleto (duro o blando) • Tono del músculo abdominal (firme o flácido) • Presencia de moco sobre la cutícula (resbaloso o áspero al tacto) • Manchas, laceraciones, heridas, zonas oscuras u opacas, “astillas” • Color del esófago y estómago (anaranjado sugiere canibalismo por mortalidad) En cuanto a manifestaciones de enfermedad en condiciones naturales en los tanques o estanques, las siguientes son observaciones frecuentes en camarones enfermos: • Nado errático (en círculo o en línea recta sin rumbo) • Letargia y debilidad • Pérdida del reflejo de huida (permiten ser capturados sin ejercer resistencia) • Vulnerabilidad a predadores (aves) • Nado superficial (“barbeo”) • Susceptibilidad a la hipoxia • Disminución en la alimentación Cuando se realicen muestreos aleatorios intencionales para estimar la prevalencia de una enfermedad en una población, los camarones deben ser tomados al azar (no escogidos). El tamaño de la muestra para estudios de enfermedades en camarones, es revisado en detalle por el Dr. Ignacio de Blas en el capítulo 7 (Vigilancia epidemiológica).

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Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

EXAMEN CLÍNICO

Figura 1.2.1. Captura de camarones en un estanque de cultivo mediante el uso de una atarraya, para ser sometidos a un examen clínico.

Figura 1.2.2. Muestra de camarones P. vannamei sanos, enfermos y muertos observados en un recipiente de fondo blanco, después de su captura en un estanque de cultivo. Se observan algunos camarones muertos sin apéndices (pereiópodos o pleópodos), debido a que han sido canibalizados por otros camarones.

Figura 1.2.3. Camarones P. vannamei que están siendo observados luego de haber sido capturados en un estanque de cultivo, durante un procedimiento de examen clínico. En el caso de estos 5 camarones, no se observan manifestaciones clínicas de enfermedad.

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1.3 Microscopía Directa (Análisis en fresco) Esta técnica está basada en la observación bajo el microscopio de tejidos o partes de camarones visiblemente afectados (Fig. 1.3.1), con el fin de establecer en la medida de lo posible, un diagnóstico presuntivo. Las partes más comúnmente examinadas bajo el microscopio, son: hepa- topáncreas, branquias, contenido intestinal (heces), músculo esquelético y contenido gástrico (Fig. 1.3.2 hasta Fig. 1.3.7). Para una evaluación sanitaria con microscopía directa, deben examinarse las muestras lo más pronto posible después del muestreo y después de la preparación del montaje en un portaobjetos. Se deben utilizar organismos vivos siempre que sea posible, o usar muertos frescos que han sido mantenidos en frío (refrigerados o enhielados), o muestras fijadas en formalina 10% tamponada, cuando no sea posible trabajar con camarones vivos. Si se puede contar con un laboratorio del campo adecuado, debe usarse para procesar y examinar las muestras lo más cerca del sitio del muestreo. Una aplicación importante del método de microscopía, es el examen del contenido gástrico en camarones. Para ello, deben ser sacrificados al menos 10 animales capturados al azar en una po- blación determinada (estanque o tanque). Se extrae cuidadosamente el estómago luego de hacer una disección del mismo utilizando tijeras y pinzas pequeñas. Se realiza una incisión por la línea media con las tijeras y se extrae el equivalente a una gota de contenido gástrico. Se ubica sobre una lámina portaobjetos y se añade una gota de solución salina. Se coloca luego una lámina cubreobjetos y se hace presión con la pinza cuidadosamente, con el fin de separar los componentes gástricos. Se observa luego la muestra bajo el microscopio utilizando los objetivos de 4X y 10X, registrando la proporción estimada de alimento artificial (pellets), microalgas, zooplancton, sedimento y otros componentes que se observen. Se promedian los porcentajes estimados en los 10 camarones para cada una de estas observaciones y se obtienen los valores estimados para dicha población. Este método permite conocer factores que estén afectando el crecimiento, así como realizar ajustes en la ración diaria de alimento de los camarones.

MICROSCOPÍA (Montajes en fresco)

Figura 1.3.1. Camarones P. vannamei bajo observación durante un examen clínico. Nó- tese la presencia de una zona oscura en la parte media del cefalotórax y superior de las branquias (flechas). La opacidad generalizada del músculo abdominal puede deberse al tiempo que han estado fuera del agua (estrés por hipoxia). No se observan manifestaciones adicionales de enfermedad.

26 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

MICROSCOPÍA (Montajes en fresco)

Figura 1.3.2. Camarón juvenil P. vannamei en el cual se está levantando la cutícula posterior del cefalotórax, para extraer muestras del hepatopáncreas, las branquias y heces del intestino medio, a partir de las cuales se va a preparar un montaje en fresco.

Figura 1.3.3. Preparación de un montaje en fresco de un camarón P. vannamei en donde ya se han colocado bajo el cubreobjetos muestras de hepatopáncreas (izquierda) y branquias (centro). Las heces están siendo extraídas del intestino medio con la ayuda del borde de unas tijeras.

Figura 1.3.4. Muestra de hepatopáncreas de un camarón subadulto P. vannamei preparada mediante un montaje en fresco. Se observa gran cantidad de vacuolas lipídicas (reservas de grasa) de colores amarillo y gris y con tamaños variados (todas normales). En el centro hay un proceso de melanización (color marrón) de un túbulo del hepatopáncreas, el cual está rodeado por varias capas de hemocitos (“halo” blanco alrededor del túbulo melanizado) y presenta una forma alargada siendo más ancho hacia la izquierda. Sin tin- ción. Amplificación: 100X.

27 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

MICROSCOPÍA (Montajes en fresco)

Figura 1.3.5. Muestra de branquias de un juvenil P. vannamei preparada mediante un montaje en fresco. Se observan 2 lamelas branquiales bifurcadas en su extremo (superior), las cuales presentan melanización de origen tóxico. Sin tinción. Amplificación: 100X.

Figura 1.3.6. Montaje en fresco preparado a partir de una muestra de heces de un ca- marón subadulto P. vannamei. Se observan dos trofozoitos de gregarina Nematopsis sp., uno de ellos con el extremo posterior bifurcado. Estos protozoarios están formados por 3 células (arriba) y por 2 células (centro), respectivamente. Se puede diferenciar la célula anterior (protomerito) y la célula posterior (deutomerito). Sin tinción. Amplificación: 200X.

Figura 1.3.7. Montaje en fresco preparado a partir de heces de una postlarva (pl-10) de P. vannamei, en la que se observan trofozoitos de la gregarina Paraophioidina sp. (probablemente P. scolecoides). Cada trofozoito está compuesto por una única célula con el núcleo visible. Este parásito tiene la particu- laridad de formar grupos en los cuales varios organismos se adhieren a uno. Sin tinción. Amplificación: 100X.

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Los detalles relacionados con la técnica de montajes en fresco, son estudiados a continuación por la Dra. María Soledad Morales-Covarrubias.

1.4 Montajes en fresco (María Soledad Morales-Covarrubias) Introducción Las enfermedades representan el mayor obstáculo en camaronicultura, generando considera- bles pérdidas económicas a los productores, propiciando la disminución de inversiones en el sector acuícola y pérdidas de empleos. Debido a la complejidad de causas que ocasionan las enfermedades en el camarón, es necesario conocer las condiciones de cultivo, el ambiente y los patógenos. Para lograr detecciones tempranas, prevenir y tratar las enfermedades, se requiere obtener información del organismo, edad, fuente de la postlarva, cambios de comportamiento, alteraciones en exoesqueleto, calidad de agua, cantidad consumida de alimento, crecimiento, sistema de producción, densidad, mortalidad, descripción del caso, problemas previos, programas sanitarios, fármacos utilizados y análisis realizados. El análisis en fresco es la técnica que se utiliza para monitorear el estado de salud de los organismos y realizar diagnósticos presuntivos en laboratorio y campo. Consiste en la observación y di- sección del camarón en todos sus estadíos, para observar alteraciones y patógenos que presenten sus órganos y tejidos. Su sensibilidad depende de la característica de la técnica, de la carga infectante, de la biología de los parásitos, del conocimiento del hospedero, del transporte, de la preparación de la muestra, de la implementación de equipos adecuados y de la disponibilidad de tiempo y experiencia de los observadores.

Órganos y Tejidos para revisión de Análisis en Fresco Externos El camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei y el camarón azul Penaeus (Litopenaeus) stylirostris, son crustáceos decápodos que pertenecen a la familia Penaeidae. Presentan cabeza y tórax unidos en un único bloque, llamado cefalotórax, en el que destacan el rostro alargado con dientes, los ojos, las antenas y anténulas, las piezas bucales y los apéndices torácicos o pereiópodos. El abdomen es alargado (el segundo segmento montado sobre la parte posterior del primero) con los apéndices abdominales (especializados para la natación) o pleópodos y el telson alargado y de forma triangular (Fig. 1.4.1) los cuales cumplen diferentes funciones (Tabla 1).

Tabla 1. Función principal de los órganos y tejidos externos de los camarones peneidos (Modificada de Brock y Main, 1992).

Órgano/tejido Función

Contracciones rápidas para escapar de los Músculo abdominal estriado depredadores Antenas Sensores táctiles (detección de depredadores)

Anténulas Quimiorreceptores

Exoesqueleto Soporte y barrera protectora

Branquias Respiración, excreción, osmorregulación y fagocitosis

Sensores táctiles, para tomar las partículas de alimento Mandíbulas, palpo mandibular y escafognatito y movimiento de agua sobre las branquias.

Pereiópodos y pleópodos Locomoción y quimiorrecepción

29 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 1.4.1. Órganos y tejidos externos del camarón blanco (P. vannamei).

Internos En la parte interna se encuentra el hepatopáncreas, principal órgano digestivo en camarones, sus funciones incluyen la secreción y síntesis de enzimas digestivas, retención temporal o cíclica de reservas y absorción de nutrientes. El hepatopáncreas es un conjunto de túbulos y cada túbulo posee una red de fibras musculares que permiten los movimientos peristálticos, posee células especializa- das que tienen funciones específicas y el intestino que se considera como un tubo interno dividido en tres partes: estomodeo o intestino anterior, mesenterón o intestino medio y proctodeo o intestino posterior (Fig. 1.4.2). El estomodeo y el proctodeo están cubiertos de quitina. El estomodeo es una estructura con funciones digestivas mecánicas y extracelulares. El mesenterón regula los movimientos de lo ingerido dentro del hepatopáncreas, donde la digestión tiene lugar, y los movimientos peristál- ticos del proctodeo expulsan las heces.

Figura 1.4.2. Órganos y tejidos internos del camarón blanco (P. vannamei).

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SELECCIÓN Y TOMA DE MUESTRA Para analizar una población se requiere la selección y la toma adecuada de la muestra; ésta se elige de acuerdo con el estado de salud de los organismos o ante la sospecha de alguna enfermedad. La intensidad del muestreo (número de muestreos en el tiempo hasta la cosecha) dependerá de la necesidad de la información, de la historia de la granja, del origen de los organismos y de la densidad de organismos sembrados en el cultivo. Dependiendo del propósito del estudio, el muestreo puede ser aleatorio o no aleatorio (Para más detalles sobre tipos de muestreos, ver el capítulo 7).

Muestreo aleatorio Cuando solamente se quiere determinar el estado de salud o cuando se busca la presencia de algunos patógenos, se colectarán los organismos al azar y deberán tomarse de cuatro áreas diferentes del estanque (Fig. 1.4.3). El tamaño mínimo de la muestra o submuestra debe garantizar el 95% de confianza que, de existir una infección, ésta se incluirá en la muestra; para la prevalencia, el muestreo dependerá de la presencia estimada del patógeno y del nivel de confianza elegido (Tabla 2). Los camarones seleccionados se depositan en contenedores con aireación (debe procurarse crearles el menor estrés posible) y se trasladan de inmediato al laboratorio para su análisis.

Figura 1.4.3. Estanque de cultivo de camarón donde se observan las cuatro áreas para la selección de organismos en muestreo aleatorio.

31 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Tabla 2. Selección del tamaño de muestra con base en la prevalencia esperada de un patógeno en una población determinada (Tomada de Lightner, 1996 y modificada de Amos, 1985).

Cálculo de tamaño de muestra con base en una prevalencia estimada de la enfermedad* Tamaño de la población 2% 5% 10% 20% 30% 40% 50%

50 50 35 20 10 7 5 2

100 75 45 23 11 9 7 6

250 110 50 25 10 9 8 7

500 130 55 26 10 9 8 7

1,000 140 55 27 10 9 9 8

1,500 140 55 27 10 9 9 8

2,000 145 60 27 10 9 9 8

4,000 145 60 27 10 9 9 8

10,000 145 60 27 10 9 9 8

>/= 10,000 150 60 30 10 9 9 8

*Prevalencia= Porcentaje de individuos de una especie de hospedero infectada con una especie particular de parásito/número de hospederos examinados (Margolis et al., 1982)

Esta tabla servirá de referencia para otros capítulos en donde se hará mención de la misma.

Muestreo no aleatorio Involucra solamente organismos enfermos. Este tipo de muestreo se realiza cuando se tiene la sospecha de la presencia de alguna enfermedad o síndrome en el estanque. Se seleccionan por lo menos 10 organismos que presenten señales clínicas, tales como: decoloración, melanización y necrosis en la cutícula, así como anorexia (falta de apetito), letargia (reducción de la actividad normal), coloración rojiza de los pleópodos y telson, o cualquier otra alteración evidente. Los organismos con estas características generalmente se encuentran en la compuerta de salida y entrada de los estanques (Fig. 1.4.4). Las muestras deberán procesarse inmediatamente, de acuerdo con los procedimientos que se hayan elegido para la detección del agente causal de la enfermedad. Los organismos habrán de ser preservados en las soluciones fijadoras adecuadas, congelados o enviados vivos a los laboratorios de diagnóstico.

32 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Figura 1.4.4. Estanque de cultivo de camarón donde se observa la compuerta de salida, área para la selección de organismos en muestreo no aleatorio.

Otras muestras Muchas enfermedades infecciosas (como las virales) de impacto significativo en la producción de camarones, tienen un amplio rango de especies hospederas dentro de los crustáceos, por lo que éstos deben ser considerados como portadores potenciales de los agentes etiológicos de dichas enfermedades (Fig. 1.4.5), a menos que se demuestre que son refractarios a ciertos patógenos, o que las condiciones ambientales no son propicias para la transmisión/virulencia de los mismos.

Figura 1.4.5. Especie hospedera (camarón de agua dulce) de patógenos infecciosos que tienen que incluirse en los muestreos.

33 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Transporte de organismos Los organismos son depositados en cajas con bolsas de plástico con agua del mismo estanque y aire para su transporte. Se debe de mantener la misma temperatura del agua del estanque durante la movilización de los organismos, por lo que es necesario en algunos lugares adicionar hielo encima de las bolsas con aire antes de cerrar las cajas (Fig. 1.4.6).

Figura 1.4.6. Caja con bolsa de plástico, organismos y agua del estanque para transporte.

MATERIAL Y EQUIPO PARA EL ANÁLISIS EN FRESCO Para la realización del análisis en fresco se requiere contar con espacio limpio en donde se tenga el siguiente material y equipo (Fig. 1.4.7): Bata Blanca (laboratorio) Goteros Agua corriente Portaobjetos Cubreobjetos Cajas de petri Tijeras con punta fina Pinzas con punta fina Guantes de látex Microscopio compuesto, con objetivos de 4X, 20X, 40X, 60X y 100X Tabla de disección Pizetas Agua de mar estéril o filtrada Jeringas desechables (1 ml, 3 ml y 5 ml) Contenedores para muestras Equipo para suministrar aire a las muestras 34 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Hoja de reporte (Tabla 3) Manuales Solución de Davidson (AFA, alcohol-formaldehído-ácido acético)* Solución de Davidson modificada (AFA, alcohol-formaldehído-ácido clorhídrico)* Etanol absoluto* Etanol al 70%*

Todos estos reactivos se adquieren en las casas proveedoras de productos químicos

Figura 1.4.7. Material y equipo necesario para realizar el análisis en fresco.

35 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Tabla 3. Hoja de reporte para el análisis en fresco.

Fecha:______Procedencia:______Especie:______No. Estanque:______Tamaño de la muestra:______No. de muertos:______No. de examinados:______Estado de vida:______Peso promedio:______Tamaño promedio:______

Características externas Observaciones Características internas Observaciones Actividad de los Hepatopáncreas camarones Coloración del organismo Tamaño

Contenido del intestino Coloración Presencia de heces Presencia de los virus en forma de cadena o BP y MBV discontinua Presencia de epicomensales, bacterias y Deformación de los hongos en la cutícula del túbulos camarón Nódulos hemocíticos Características de la y/o Encapsulación de cutícula hemocitos Melanización (color café Presencia de cúmulos de claro). bacterias Deformidades en el rostrum, antenas Túbulos melanizados y/o abdomen, telson, necróticos uropódos y pleópodos Coloración anormal de los Cantidad de lípidos apéndices Apéndices rotos Intestino

Branquias Presencia endoparásitos Presencia Coloración de cianobacterias Cuerpos de oclusión de Presencia de ectoparásitos BP Nódulos hemocíticos en Músculo las lámelas branquiales Micosis (hifas, conidios) Textura

Melanización Color

Necrosis Microsporidios Síndrome del acalambramiento

36 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

DESARROLLO DE LA TÉCNICA DE ANÁLISIS EN FRESCO

Recepción de los organismos en laboratorio • Al recibir los organismos en laboratorio se toman los parámetros del agua que contiene los organismos • Se miden y se pesan para obtener el peso y el tamaño promedio (Fig. 1.4.8)

Figura 1.4.8. Determinación del peso en una balanza (A) y medición de la longitud (B) de un camarón.

• Se toma una muestra de urópodos (Fig. 1.4.9) y se deposita en el portaobjetos con una gota de solución salina para detectar estadío de muda (Fig. 1.4.10).

Figura 1.4.9. Muestra de urópodos para revisar estadío de muda.

37 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 1.4.10. Estadíos de muda generales: A: intermuda, se observa una pequeña separación entre la cutícula vieja y la nueva; B, por histología se observa fragmentación de la cutícula vieja e hipertrofia de la epidermis subyacente; C: premuda: formación completa de la nueva cutícula, separación mayor entre la vieja y la nueva cutícula; D, histología, formación de exocutícula (nueva cutícula), alarga- miento de la epidermis subyacente; E: muda; formación completa de la nueva cutícula, separación total entre la vieja y la nueva cutícula; F, histología, formación completa de exocutícula y alargamien- to de la epidermis subyacente; G: No se observa ninguna separación, ni formación de nueva cutícula; H, histología, cutícula nueva con sus cuatro capas bien diferenciadas; la epicutícula, exocutícula, endocutícula y la capa membranosa.

Se revisa el organismos para detectar cambios de su color normal blanco translúcido (Fig. 1.4.11) a las siguientes coloraciones: coloración amarillenta, opacidad muscular, transparencia (Fig. 1.4.12), coloración rojiza (Fig.1.4.13), melanización y necrosis (Fig. 1.4.14), así como también se pueden observar edemas, cutícula delgada (o suave) y deformaciones en el rostrum y en abdomen.

Figura 1.4.11. Espécimen adulto de P. vannamei con coloración aparente normal (blanco translúcido). 38 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Figura 1.4.12. Juveniles de P. vannamei con coloración amarillenta (A), opacidad muscular (B) y transparencia (C), en cefalotórax y abdomen.

Figura 1.4.13. Juveniles de P. vannamei con coloración rojiza total en cefalotórax y abdomen (A), rojiza con erosiones en abdomen (B) y rojiza en urópodos, telson y sexto segmento (C).

39 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 1.4.14. Juvenil de P. vannamei con melanización multifocal en cefalotórax y abdomen.

DISECCIÓN DEL ORGANISMO Del organismo se toman pequeñas muestras de:

Región oral De la región oral (Fig. 1.4.15 y Fig. 1.4.16), con tijeras finas, se toma una pequeña porción y se coloca en un portaobjetos, luego se vierten unas gotas de agua de mar y se deposita en el cubreobjetos para la búsqueda de bacterias filamentosas (Leucothrix mucor) Flexibacter sp., melanización y detritus del fondo de los estanques.

Figura 1.4.15. Región oral de juvenil de P. vannamei (flecha).

40 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Figura 1.4.16. Región oral de juvenil de P. vannamei con melanización y necrosis multifocal.

Branquias Con las tijeras finas, se elimina el exoesqueleto que cubre las branquias, se toma una peque- ña porción y se coloca en el portaobjetos (Fig. 1.4.17) para buscar: cambios en la coloración de los filamentos branquiales (como: melanización, necrosis, áreas blanquecinas bien definidas), presencia de protozoarios como: Zoothamnium sp., Epistylis sp., Acineta, Ascophris, Bodo sp. (Tablas 4 y 5), bacterias filamentosas (Leucothrix mucor), Flexibacter sp., detritos del fondo de los estanques, restos de microalgas, hongos, aglomerados de bacterias, melanizaciones y deformaciones. Para detectar cuerpos de inclusión viral en las branquias por improntas, es necesario fijarlas en solución David- son modificada (AFA, alcohol-formaldehído-ácido clorhídrico) si van a ser procesadas de manera inmediata; si este no es el caso, se pueden fijar en la solución de Davidson (AFA, alcohol-formalde- hído-ácido acético), que se utiliza para fijar organismos para histología.

Figura 1.4.17. Con tijeras finas, se elimina el exoesqueleto que cubre las branquias de juvenil de P. vannamei (1), se toma una pequeña porción (2) y se coloca en el portaobjetos (3) para buscar cambios en la coloración de los filamentos branquiales 41 (4). Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Tabla 4. Principales ectoparásitos en camarones penaeidos.

NOMBRE Y DESCRIPCIÓN FOTOGRAFÍA

Leucothrix mucor. Organismos gram negativos, aeróbicos, constituidos por largos filamentos no ramificados, compuestos de pequeñas células ovoides o cilíndricas.

Zoothamnium sp. Protozoario ciliado colonial, fijo mediante un pedúnculo contráctil, con mionema continuo, donde todas las ramificaciones del tallo con sus individuos se contraen al mismo tiempo.

Epistylis sp. Ciliado periférico sésil. Tiene cuerpo en forma de campana invertida y se encuentran montados encima de un pedúnculo ramificado no contráctil pues carecen de mionema.

Vorticella sp. Ciliado que vive generalmente en aguas dulces con gran contenido orgánico, solitario o formando grupos. El cuerpo tiene forma de campana o vesícula y está unido al sustrato mediante un pedúnculo contráctil.

Acineta sp. Presenta forma cónica, cuya célula se encuentra rodeada por una lórica, los tentáculos se agrupan en fascículos, situados a ambos lados del cuerpo.

Ascophrys sp. Ciliado apostomado que posee cilios para su locomoción y captura de alimento.

Ephelota sp. Ciliado sésil, generalmente pedunculado, con tentáculos en el extremo libre. Adultos sin cilios, pero presentes en los estadíos larvarios nadadores.

42 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Tabla 5. Principales ectoparásitos y endoparásitos en camarones penaeidos.

NOMBRE Y DESCRIPCIÓN FOTOGRAFÍA

Bodo sp. Ciliado con flagelos en forma de látigos los cuales utilizan para nadar.

Lagenophrys sp. Organismo sésil, con muy pocos ciliados en el cuerpo.

Microsporidios. Como su nombre indica, se caracterizan por sus esporas de tamaño mínimo, de 2 a 20 µm. Ameson, produce esporas individuales (1.2 x 2 µm) a partir del esporonte.

Lagenidium spp y el Sirolpidium spp son hongos que pertenecen al grupo de los ficomicetos; atacan principalmente a larvas y poslarvas de camarones y provocan altas mortalidades en los laboratorios de todo el mundo.

Fusarium solani. Microconidad ovoides que pueden tener tabique y su tamaño oscila entre 8-16 x 2-4,5 µm y microconidias cuyo tamaño aproximado es de 28-65 x 4-6 µm.

Gregarinas. Son protozoarios parásitos presentes en todo el mundo. Pueden encontrarse inter o intra celularmente en su huésped y aunque las células huésped individuales son destruidas por las fases intracelulares del parásito, la mayoría de las especies (Nematopsis sp., Cephalolobus sp. y Paraophioidina sp.) no son consideradas como de alta patogenicidad en Penaeus duorarum, Penaeus setiferus y Penaeus vannamei. La única especie reportada como causante de daños en camarones es la denominada Nematopsis penaei.

43 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Hepatopáncreas Eliminar todo el exoesqueleto del cefalotórax para descubrir el hepatopáncreas y el estómago. Se observa la coloración, el tamaño del hepatopáncreas para decidir si hay atrofia (reducción de tamaño) o hipertrofia (aumento de tamaño) del órgano. Con unas pinzas se retira la membrana que cubre el hepatopáncreas y con un bisturí se parte por la mitad (longitudinalmente) para observar bajo el microscopio la coloración del fluido, textura, melanización y necrosis tubular. Se toma una peque- ña muestra y se coloca en un portaobjetos para buscar: Baculovirus penaei, Monodon baculovirus, cúmulos de bacterias, deformación tubular, nódulos hemocíticos, encapsulación, melanización y necrosis de los túbulos (Fig. 1.4.18). Para la realización de improntas e histología es necesario fijar los órganos y tejidos conforme al diagnóstico elegido.

Figura 1.4.18. Juvenil de P. vannamei con hepatopáncreas expuesto (1), con pinzas se retira la membrana que cubre para ver su coloración (2), se toma una pequeña muestra y se coloca en un portaobjetos (3) para buscar cúmulos de bacterias, deformación tubular, nódulos hemocíticos y en- capsulación (4).

Intestino El abdomen se separa del cefalotórax, del telson y se retiran los urópodos para facilitar la extracción del intestino. Por la parte posterior se localiza el intestino (que puede contener o no hilo fecal); con ayuda de una pinza fina, se extrae con cuidado y se coloca en el portaobjetos, procurando extenderlo. Luego se vierten unas gotas de agua de mar y se presiona ligeramente al poner el cubreobjetos. Al observar la muestra en el microscopio, se buscarán: gregarinas (diferentes estadios, distribución y porcentaje de adherencia en el intestino), inflamación (Fig. 1.4.19), nemátodos, cuerpos de oclusión de Monodon baculovirus y Baculovirus penaei.

44 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Figura 1.4.19. Extracción del intestino (1) para colocarse en portaobjetos, procurando extenderlo (2) para observar inflamación (3), gregarinas en sus diferentes estadios (4), distribución y porcentaje de adherencia en el intestino (5).

Músculo y gónadas Se toma una pequeña muestra de músculo y de las gónadas (especialmente, aquel tejido que muestre opacidad de tipo lechoso). Se coloca en un portaobjetos y se presiona para facilitar la bús- queda de microsporidios. Si estos tejidos fueron parasitados, se deben observar las esporas que de acuerdo con su tamaño y forma indican el tipo de parásito que los está afectando. También en músculo se debe hacer un corte transversal y ponerlo entre dos portaobjetos y observar a 4X para buscar larvas de helmintos y nemátodos anisáquidos (hacen zoonosis en humanos).

Revisión de muestras Las muestras ya preparadas se analizan en el microscopio, iniciando con el objetivo de menor aumento y finalizando con el de mayor. Debido a su rápida descomposición, la primera muestra que se analiza es hepatopáncreas; después se estudian las branquias, región oral, intestino y finalmente el músculo. En la hoja de reporte se anota todo lo que se observa. Luego se calcula el porcentaje de prevalencia y se determina el grado de severidad (Tablas 6, 7, 8 y 9), que presente la muestra analizada. Se finaliza con el diagnóstico y el reporte final.

45 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Tabla 6. Guía general para dar un valor numérico cualitativo del grado de severidad a la infección, infestación y síndrome (Adaptado de Lightner, 1996).

Grado de severidad Signos clínicos

No presentan signos de infección por el agente patógeno, parásito o epicomensal. 0 No presentan lesiones características de la enfermedad.

Trazas Presencia de parásitos o epicomensales apenas por encima del límite de detección

Presencia muy baja del patógeno, parásito o epicomensal. En aquellos en los que 1 se tiene un número estándar permitido, éste se encuentra justo arriba del límite normal. Se observan muy pocas lesiones características de la enfermedad.

Se observa la presencia baja y moderada del patógeno, parásito o epicomensal. 2 Se observan lesiones ligeras o moderadas, características de la enfermedad. Incremento en la mortalidad si no se aplica tratamiento (cuando existe tratamiento).

Se observa la presencia moderada del patógeno, parásito o epicomensal. Se 3 observan lesiones de moderadas a severas, características de la enfermedad. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento (cuando existe tratamiento).

Se observa gran cantidad del patógeno, parásito o epicomensal. Se observan 4 severas lesiones características de la enfermedad. Muy letal con altas mortalidades.

Esta tabla servirá de referencia para otros capítulos en donde se hará mención de la misma.

Tabla 7. Guía para dar un valor numérico cualitativo del grado de severidad a la deformación tubular en hepatopáncreas con análisis en fresco (Tomado de Morales-Covarrubias 2013).

Grado de severidad Signos clínicos

No presentan signos de infección. No presentan deformación tubular ni 0 rugosidad. Organismo sano

Presencia muy baja de deformación tubular (1-5/campo/organismo). Se observa 1 muy poco desprendimiento celular. Fase (0), infección.

Se observa la presencia moderada de deformación tubular (6-10/campo/ organismo), atrofia, melanización y necrosis tubular. Se presenta mortalidad si 2 no se aplica tratamiento. Fase (1), inicial.

3 Se observa presencia alta de deformación tubular (11-16/campo/organismo), con lesiones de moderadas a severas, con melanización, necrosis, desprendimiento celular y atrofia tubular. Letal si no se aplica tratamiento. Fase (II), aguda. Se observa gran cantidad de túbulos deformes (más de 16/campo/organismo), con severas lesiones con melanización, necrosis, atrofia tubular y túbulos 4 vacíos. Presencia de hemocitos alrededor de túbulos atrofiados, melanizados y necróticos. Fase (III), crónica.

46 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Tabla 8. Guía para dar un valor numérico cualitativo del grado de severidad a la infestación por gregarinas utilizando análisis en fresco. (Tomado de Morales-Covarrubias, 2013).

GRADO DE SEVERIDAD SIGNOS CLÍNICOS

No presentan signos de infección por el parásito. No presentan lesiones 0 causadas por el parasitismo. Presencia muy baja del parásito (1-15/intestino/organismo), con muy poca 1 inflamación.

Se observa la presencia moderada del parásito (16-50/intestino/organismo). Incremento en las lesiones causadas por el parasitismo como reducción 2 de la mucosa, deformación del intestino, inflamación, melanización y formación de nódulos hemocíticos. Se observa mortalidad si no se aplica tratamiento.

Se observa alta presencia del parásito (51-100/intestino/organismo). Se 3 observan lesiones moderadas a severas causadas por el parasitismo, como reducción de la mucosa, deformación del intestino, inflamación, melanización y formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento. Se observa gran cantidad del parásito (más de 100/intestino/organismo). Se observan severas lesiones causadas por el parasitismo, como reducción de la 4 mucosa, deformación del intestino, inflamación, melanización y formación de nódulos hemocíticos. Muy letal, con altas mortalidades.

Tabla 9. Guía para dar un valor numérico cualitativo del grado de severidad a la infestación por epicomensales en lamelas branquiales (Tomado de Lightner, 1996 y modificado por Morales-Covarrubias, 2013)

Grado de severidad Signos clínicos

No presentan signos de infección por protozoario. No presentan lesiones 0 causadas por epicomensales. Presencia muy baja de protozoarios (1-5/lamela/organismo), muy pocas 1 lesiones causadas por los epicomensales, como inflamación. Se observa la presencia moderada de protozoarios (6-10/lamela/organismo), incremento en las lesiones causadas por los epicomensales, como 2 inflamación, melanización y formación de nódulos hemocíticos. Se observa mortalidad si no se aplican medidas de corrección. 3 Se observa alta presencia de protozoarios (10-15/lamela/organismo), lesiones moderadas a severas causadas por los epicomensales, como inflamación, áreas multifocales melanizadas y formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se toman medidas de corrección.

Se observa gran cantidad de parásitos (más de 15). Severas lesiones causadas por los epicomensales, como inflamación, formación de nódulos 4 hemocíticos, áreas multifocales melanizadas y necroticas. Muy letal, con altas mortalidades.

47 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

1.5 Bacteriología Objetivo. El objetivo de la bacteriología en camarones, es cuantificar la cantidad y el tipo de las bacterias presentes en la hemolinfa, otros tejidos o larvas y postlarvas, así como en agua para / de cultivo. Descripción. La bacteriología es un conjunto de métodos que se utiliza como apoyo en el diag- nóstico de enfermedades en camarones, cuando se sospecha que la causa de la enfermedad está relacionada con presencia de bacterias patógenas en el agua de cultivo o dentro del organismo de los animales. Consiste en la siembra de muestras en diferentes medios de cultivo, para determinar si hay crecimiento o no de bacterias potencialmente patógenas. Metodología. Después de definir qué poblaciones afectadas se van a examinar, se debe determinar el tipo de muestreo con base en el objetivo del estudio. El tamaño de muestra dependerá de si la captura es aleatoria o, de si se escogen sólo animales enfermos para la evaluación (ver Capítulo 7 “Vigilancia Epidemiológica en camaroniculura” para más detalles sobre tipo y tamaño de muestreo). Los camarones que se van a someter a pruebas de bacteriología, deben estar siempre vivos; no debe realizarse ninguna prueba bacteriológica con camarones muertos, debido a que los resultados estarán sesgados por los cambios autolíticos (post-mortem), con los cuales se alteran las poblaciones bacterianas presentes en los tejidos, así como su crecimiento. Antes de iniciar cualquier procedimiento bacteriológico, se deben tener previamente esterilizados todos estos elementos y hay que trabajar en una superficie esterilizada o en una cámara de flujo laminar (Fig. 1.5.2). El material de vidrio se envuelve en papel kraft y se esteriliza por la técnica de calor seco mediante un horno a una temperatura de 180oC durante un lapso de dos horas. El agua destilada y los medios líquidos de cultivo como el agua peptonada deben ser esterilizados por vapor húmedo mediante un autoclave a 15 libras de presión (121oC) durante quince minutos (Fig. 1.5.2). Las asas de platino se esterilizan directamente por calor seco mediante la llama del mechero. El momento en el cual el asa se encuentra estéril sucede cuando ésta se torna de un color rojo incandescente. El colador con ojo de malla fino se debe desinfectar dejándolo inmerso en una solución de hipoclorito de sodio concentrado por 5 minutos. Posteriormente se lava con agua estéril hasta que desaparezca el olor producido por el hipoclorito. La toma de muestra para análisis bacteriológico de agua de transporte (de nauplios) y de nauplios, se debe realizar, si es posible, en el momento de recibir los animales y directamente en las bolsas o cajas de transporte. La toma de muestra de agua en tanques de larvicultura, se debe realizar al menos en 2 puntos: la entrada del tanque y en el centro del mismo. En el caso de larvas o postlarvas, se debe tomar una cantidad conocida o estimada (lo más confiable posible) de animales, con el fin de emitir los resultados en función de unidades formadoras de colonia (UFC) por animal o por gramo de larvas/postlarvas. La muestra debe ser lavada con agua de mar estéril utilizando una malla fina o un colador pequeño de cocina, previamente desinfectado con yodo, formalina o etanol 70%. Las muestras deben ser luego maceradas en un recipiente este- rilizado y agregando una cantidad conocida (en mL) de agua de mar estéril o solución salina estéril para la dilución del macerado. En el caso de camarones juveniles, subadultos o reproductores, se recomienda desinfectar el área de punción (seno cardíaco –dorsal– o seno hemolinfático –ventral–) con trozos de algodón im- pregnado con etanol 70%. Con una aguja de insulina (1 mL) nueva y estéril que tenga aguja hipodér- mica (muy delgada), se extraen al menos 100 mL de hemolinfa. Es importante que si las posibilidades del laboratorio lo permiten, se utilice algún anticoagulante (ej.: citrato de sodio 10% en relación 1:1), cuyo volumen dentro de la jeringa se debe considerar antes de emitir los resultados de los conteos bacterianos en UFC.

48 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Tanto en el caso de macerado de larvas/postlarvas, hemolinfa de camarones mayores (anticoagulada o no) o agua de cuerpos de agua en estudio, se deben sembrar 100 mL en un medio sólido para el aislamiento de bacterias (cultivo primario). Esta siembra puede hacerse en agar TCBS (tiosulfato citrato bilis sal sacarosa), el cual es un medio selectivo principalmente para bacterias marinas de la familia Vibrionaceae (género Vibrio), aunque también crecen especies bacterianas de los géneros Pseudomonas, Plesiomonas, Aeromonas, Flavobacterium y enterobacterias, entre otras (Fig. 1.5.3 y 1.5.4). Para cultivos primarios existen medios no selectivos en los cuales crecen “bacterias totales” (la mayor parte de las bacterias presentes en agua o en los camarones), tales como TSA (agar tripticasa soya) y Agar Marino. Una vez se inoculan los 100 mL de muestra sobre el agar elegido y en condiciones asépticas (ambiente estéril con mecheros y/o en una cámara de flujo laminar [Fig. 1.5.1]), se extiende circular- mente mediante el uso de un asa de Drigalski (varilla de vidrio tipo “stick de hockey”). De esta manera, se obtiene una distribución homogénea del inóculo. Seguidamente, se invierte la caja de Petri y se incuba de esta manera a una temperatura de 30ºC por 24-48 horas. Para determinar la morfología de las bacterias que han crecido, se realiza un extendido de una colonia representativa sobre una lámina portaobjetos, habiéndola diluido antes en solución salina estéril hasta obtener un grado de 0.5 en la escala de McFarland. Luego se deja secar y se colorea con tinción de Gram. Las bacterias del género Vibrio se observarán como bacilos Gram negativos bipolares. En caso de que haya crecimiento de bacterias, se deben contar las colonias para lo cual existen métodos de observación directa (a trasluz) o utilizando un equipo especial para conteo de colonias (Fig. 1.5.5). Los valores se dan en UFC; en el caso de larvas o postlarvas será UFC/g o por cada “X” número de animales. En el caso de hemolinfa o de agua, el resultado se da en UFC/mL. Si las bacterias aisladas sugieren ser la causa de una enfermedad en los camarones (bacteriosis), se realizan pruebas de sensibilidad a antibióticos (antibiogramas), para establecer qué productos antibacterianos comerciales son capaces de eliminar dichas bacterias aisladas. Una vez determinado el antibiótico más efectivo, se puede realizar una prueba para medir la concentración mínima inhibitoria (MIC) de dicho antibiótico, capaz de matar la mayor parte de las bacterias. El resultado del MIC será utilizado como referencia para la medicación de la población afectada de camarones. Tanto el antibiograma como el MIC, se deben realizar en medios de cultivo sólidos cuyos componentes no in- terfieran con el crecimiento bacteriano, como por ejemplo el agar Müeller Hinton. La concentración del antibiótico que se vaya a utilizar en el alimento para la terapia de los camarones, debe corresponder al resultado del MIC (en ppm), multiplicado por 2, 5 o hasta 10 veces. Esto se hace con el fin de asegurar que los camarones obtengan una concentración efectiva que sea suficiente. El tiempo de coagulación de la hemolinfa, es una herramienta de campo fácil de aplicar y que pudiera ser indicativo de condiciones de estrés o de infecciones bacterianas, particularmente cuando hay presencia de células bacterianas circulando por la hemolinfa de los camarones (bacteremia). Es- tudios recientes en Centroamérica con camarones preadultos P. vannamei de cultivo, indicaron que hay una muy alta correlación entre tiempos de coagulación de 25 segundos o más y la presencia de bacteremia sembrando hemolinfa en agar TCBS. A su vez, tiempos de coagulación de 24 segundos o menos, concordaron con camarones en los que no se presentó crecimiento bacteriano en la hemolinfa (Cuéllar-Anjel, no publicado). Finalmente, se debe tener en cuenta que de acuerdo con la normativa internacional en Sa- nidad Animal, el Médico Veterinario es quien decide si se debe medicar o no una población de camarones en cultivo, donde se sospeche de bacteriosis intra o extracelular. Toda medicación en un estanque, debe estar soportada por un documento impreso con el diagnóstico (enfermedad bacteriana) y con la prescripción veterinaria, preferiblemente apoyados por antibiograma y MIC.

49 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

BACTERIOLOGÍA

Figura 1.5.1 Cabina de flujo laminar, utilizada durante la siembra de muestras de camarones, agua o sedimento en medios de cultivo, para evitar la contaminación con bacterias presentes en el ambiente. En su parte superior, la cabina posee un sistema que filtra el aire que ingresa al área de trabajo. Estos equipos están dotados con entradas de agua, gas y sistemas de vacío, así como luz blanca y luz ultravioleta.

Figura 1.5.2. Autoclave horizontal utilizado para esterilizar elementos, materiales y reactivos que se utilizan en bacteriología. Funcio- na con alta presión producida por vapor de agua, lo que eleva la temperatura a 121ºC, a la cual se exponen los materiales por 15 minutos.

50 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

BACTERIOLOGÍA

Figura 1.5.3. Siembra (inoculación) de hemolinfa anticoagulada de un camarón P. vannamei en agar TCBS. Se está utilizando un mechero de alcohol cerca del medio de cultivo, para procurar tener un ambiente estéril alrededor de la zona de siembra. El inóculo de 100 mL aplicado con una micropipeta gra- duada volumétricamente, será esparcido por todo el medio utilizando una barra metálica especial para tal fin.

Figura 1.5.4 Plato Petri con agar TCBS en el cual se observa crecimiento de bacterias Su- crosa positiva (colonias amarillas). La muestra pertenece a hemolinfa de un camarón P. vannamei y fue incubada durante 24 horas a 30ºC. El amarillo del medio (y no verde que es el original del agar TCBS) se debe al cambio de pH producido por el uso de la Sucrosa por parte de las bacterias predominantes.

Figura 1.5.5. Contador de colonias con pantalla digital, utilizado para la cuantificación de las colonias en los platos Petri donde se presentan crecimientos bacterianos. Cada colonia procede de una bacteria, la cual constituye una unidad formadora de colonia (UFC).

51 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

1.6 Histología Objetivo. La histología es la rama del saber científico que se ocupa del estudio de los rasgos morfoló- gicos de los tejidos, por medio de instrumentos amplificantes. La histopatología es entoncesla ciencia que estudia las modificaciones patológicas de las células y tejidos. En camarones, es una herramienta de diagnóstico que permite identificar cambios a nivel celular en cortes de tejidos que han sido sometidos a procesos físicos y tinciones rutinarias o especiales. Esta técnica permite detectar factores de mortalidad, bajo crecimiento, alteraciones de comportamiento y otros aspectos durante el cultivo en laboratorios de larvicultura, fincas de engorde e instalaciones de maduración de reproductores. Descripción. La histopatología permite identificar en la mayoría de los casos, la etiología de la enfermedad de la población de camarones bajo estudio; se logra generalmente hacer el diagnóstico de todas las enfermedades virales reportadas en camarones (por ejemplo las causadas por IHHNV, TSV, WSSV, HPV, YHV, BP, IMNV y PvNV), necrosis hepatopancreática (NHP), necrosis aguda del hepa- topáncreas (EMS/AHPND), bacteriosis crónicas, gregarinas, protozoarios epicomensales, nemátodos, enteritis hemocítica y necrosis muscular idiopática, entre otras enfermedades. Para esto, se requiere que las láminas histológicas sean perfectamente preparadas y examinadas bajo el microscopio por el ojo de un patólogo entrenado. La autolisis es un proceso post-mortem que se presenta en los crustáceos extremadamente rápido y que consiste en la ruptura celular, salida de enzimas y componentes celulares, pérdida de la arquitectura de los tejidos y destrucción de los órganos. Por esta razón, los camarones deben morir por efecto de la inyección del fijador y por la inmersión en el mismo, el cual debe ofrecer una rápida penetración en los tejidos. El hepatopáncreas es el órgano más susceptible a la autolisis. Durante la fijación, la solución debe penetrar el órgano rápidamente o los cambios post-mortem conducirán a la pérdida de estructuras tisulares, eliminando zonas de tejido importantes para el diagnóstico. Si existe interés en estudiar problemas de morfología externa en camarones como es el caso de deformidades en post-larvas o presencia de epibiontes (epicomensales) adheridos a las branquias, también se obtienen buenos resultados si los animales son fijados vivos por inmersión en una solu- ción de formalina al 10%. Metodología. El fijador de Davidson (Humason, 1979) es el más utilizado y sugerido para los procedimientos de rutina, cuando se van a preparar muestras de camarones para análisis histopatológico. Además de ofrecer buen nivel de detalle en el núcleo de las células, el ácido acético del fijador des- calcifica la cutícula, evitándose así pasos adicionales de descalcificación del exoesqueleto durante el proceso histológico. La preparación del fijador de Davidson debe realizarse con base en la siguiente fórmula:

Para 1 litro de fijador de Davidson: Etanol 95%: 330 mL Formaldehído 39%: 220 mL Ácido acético glacial: 115 mL Agua (corriente): 335 mL

Para la realización de un estudio histológico en camarones, se requiere de un proceso siste- mático que incluye fijación, deshidratación, inclusión en parafina, corte de segmentos ultradelgados (3 micras de espesor) y tinción. Cada etapa de éstas tiene sus propios pasos y tiempos cuya finalidad

52 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos es preservar el tejido lo más intacto posible y obtener láminas de óptima calidad, las cuales permitan nitidez óptica en la organización celular de los tejidos, cuando sean estudiados bajo el microscopio. Fijación. Corresponde a la preservación de los tejidos en las mismas condiciones estructurales y morfológicas del momento de la muerte del camarón, lo cual como ya se mencionó debe ser a causa de la inyección del fijador (Davidson). Los camarones deben ser fijados vivos o moribundos, nunca muertos y el procedimiento se debe realizar en espacio abierto o utilizando una cabina de extracción de gases (Fig. 1.6.2). La fijación pretende desnaturalizar los componentes proteicos de las células. Durante la fijación, se debe inyectar abundante fijador de Davidson en el hepatopáncreas, resto del cefalotórax y en el músculo (Fig. 1.6.1). Luego, el camarón se debe sumergir en el mismo fijador en relación 1:10 (10 veces el volumen del fijador respecto al de la muestra). En el caso de pls, se deben sumergir directamente en el fijador. Camarones con más de 12 g se deben someter a un corte lateral y longitudinal de la cutícula para facilitar el ingreso del fijador. El tiempo óptimo de fijación depende del tamaño del camarón, requiriéndose 12-24 horas para postlarvas y juveniles, 48 horas para pre-adultos y 72 horas para reproductores. Luego de estos tiempos, el fijador debe ser sustituido completamente por etanol 70%, el cual deberá reemplazarse a los 15 días si los camarones aún no han sido procesados, para evitar la acidificación de los órganos y tejidos. Deshidratación e inclusión en parafina. Consiste en eliminar la mayor parte del agua tisular y reem- plazara con parafina líquida. Se realiza con un equipo automático y programable llamado “procesador de tejidos” (Fig. 1.6.3). Durante el proceso, los tejidos pasan por 12 recipientes estando 1 hora en cada uno, los cuales contienen etanol 70% (2), etanol 80% (2), etanol 95% (2), etanol 100% (2), aclarante (2) (Xilol o “Hemo-De”) y finalmente parafina líquida a temperatura controlada (2). Bloqueo. Terminada la inclusión en parafina, los tejidos son ubicados en moldes (metálicos o plásti- cos) para formar un bloque el cual al enfriarse se solidifica, conteniendo el tejido en su interior. En la actualidad, existen “unidades de bloqueo” (Fig. 1.6.4) que consisten en equipos que manejan simul- táneamente superficies con varias temperaturas diferentes, las cuales permiten tener parafina líquida, superficies de trabajo calientes y planchas con escarcha (hielo pulverizado) para el enfriamiento final de la parafina al terminar de hacerse el bloque. Los moldes plásticos disponibles para bloqueo, permiten además servir como base para el montaje de los tejidos en la unidad de corte (micrótomo). Corte. Esta es la parte del proceso histológico en la cual se utiliza un equipo altamente especializado llamado “micrótomo” (Fig. 1.6.5), nombre dado debido a que permite realizar cortes de tejido con un espesor de 1 a 15 micras. Luego de ajustar el grosor deseado en este equipo, se realizan los cortes mediante giros de una manivela y cada vez que se le da una vuelta, el bloque de parafina avanza la cantidad de micras programada, hacia una cuchilla con un filo y calidad especial para histotecnia. Recuperación del corte. Las tiras de parafina que contienen el tejido cortado, son puestas sobre un equipo llamado “baño de recuperación de tejidos” (Fig. 1.6.6), el cual contiene agua moderadamente caliente con temperatura controlada (40-50ºC aprox.), y puede contener una pequeña concentración de gelatina neutra. Las tiras se expanden al entrar en contacto con el agua caliente y así se elige la que presente una estructura más completa del tejido en cuestión. Separada de los segmentos no deseados mediante el uso de un pincel delgado, la porción seleccionada es recuperada con una lámina portaobjetos, en la cual quedará adherida de manera permanente y sobre la cual se hará la tinción final. Tinción. En camarones, el método de tinción más frecuente es el de Hematoxilina de Mayer-Bennett y Floxina/Eosina (H&E). Esta tinción involucra las siguientes soluciones y reactivos: Hemo De, etanol, agua destilada, hematoxilina, agua corriente, Floxina/Eosina y medio de montaje (Fig. 1.6.7). Una vez teñidas las láminas histológicas, se sellan utilizando una gota de medio de montaje sobre el tejido y un cubreobjetos para proteger la muestra permanentemente (Fig. 1.6.8). Los tiempos para cada paso pueden ser consultados en Lightner, 1996.

53 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Los colorantes (o tinciones) son sustancias químicas complejas, a menudo de comportamien- to variable. Pueden ser de uso general para teñir tanto núcleo como citoplasma, o más específicos respecto a algún componente particular. Son sales neutras con radicales tanto ácidos como básicos. El colorante es básico cuando la propiedad de tinción está en el radical básico y las estructuras que tiñe se denominan basófilas. Las estructuras basófilas son químicamente ácidas; tal es el caso de los ácidos nucleicos del (ADN) y los componentes ácidos del citoplasma (ARN). El colorante es ácido cuando la propiedad de tinción está en el radical ácido de la sal neutra; tal es el caso del citoplasma y en este caso las estructuras teñidas con colorante ácido son llamadas acidófilas. La tinción H&E marca y define bien el núcleo, el citoplasma y la membrana celular por afinidad de electrones, resultando en la coloración azul oscuro del núcleo y la pared de las membranas por efecto de la hematoxilina y, el citoplasma de color rosado por efecto de la eosina. Los tejidos se tiñen para aumentar el contraste natural y hacer más evidentes los diversos componentes celulares, tisulares y material extrínseco. Además de ver la célula individualmente, la tinción H&E permite observar en conjunto las células de los órganos o tejidos, ofreciendo una buena diferenciación. Existen otras tinciones especiales que resaltan ciertas partes de los tejidos u organelos celulares, como el ácido periódico de Shiff (PAS) que resalta de rojo magenta el citoplasma de las células que contienen carbohidratos (músculo). Para teñir hongos de negro, se utiliza la tinción de Groccott ya que contienen sales de plata. Aunque las tinciones para hongos suelen tener sales de plata, también se utilizan para detectar bacterias como espiroquetas (Levaditi) y bacilos ácido-alcohol resistentes (Zihel-Neelsen). Otras tinciones para camarones incluyen la de Gram (bacterias), Brown & Brenn (rickettsias), Steiner & Steiner (espiroquetas y rickettsias), Giemsa (bacterias), Wright (rickettsias), Pinkerton (rickettsias), Kinyoun (bacterias ácido-alcohol resistentes), McManus´PAS (glicógeno y hongos), Feulgen (ADN) y Tricromo de Masson (contrastes especiales). Montaje. El exceso de colorante después de la tinción se elimina con agua o alcohol y se deshidrata el corte con alcoholes a concentraciones crecientes, pasando después de alcohol absoluto a una solución de agente aclarante. Posteriormente, se coloca una gota de bálsamo de Canadá (medio de montaje) y se cubre con el cubreobjetos dejándose secar. El corte obtenido, generalmente de no más de 3 micras de espesor, estará listo para ser observado a través de un microscopio óptico. Lectura e interpretación. Una adecuada interpretación de un corte observado al microscopio óptico, depende de factores como el plano del corte, la tinción utilizada y la interpretación funcional. Res- pecto al plano, es fundamental reconstruir la estructura tridimensional de células, tejidos y órganos a partir de cortes bidimensionales. La tinción es también fundamental ya que debe ser elegida correctamente con base en las estructuras microscópicas que queremos estudiar. En cuanto a la interpretación funcional, es importante establecer las correlaciones entre estructura y función de lo observado, tratando de transformar mentalmente las condiciones estáticas del corte en las dinámicas de la vida (Fig. 1.6.9 al 1.6.11). Es fundamental para una correcta interpretación de hallazgos histopatológicos, que la observación sea hecha por un ojo entrenado en patología y, en particular, en los tejidos específicos de la especie que se va a estudiar. No es suficiente tener láminas preparadas con gran acierto y que ofrecen excelente calidad óptica bajo el microscopio, si quien las examina no tiene habilidad para diferenciar tejidos sanos de órganos o tejidos con lesiones (Fig. 1.6.11). Durante la preparación de los cortes histológicos, pueden presentarse alteraciones denominadas “artefactos”, los cuales deben ser reconocidos y diferenciados de áreas conservadas de tejidos. Generalmente, se deben a errores en el empleo de sustancias en la preparación del tejido, defectos en la cuchilla que se traducen en muescas en la preparación, contaminación de los colorantes o, errores de montaje como pliegues.

54 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

HISTOLOGÍA

Figura 1.6.1 Fijación de un camarón P. vannamei. La solución que se está inyectando al animal aún vivo, es Davidson - AFA. Nótese el cambio de color del hepatopáncreas que pasó de amarillo (normal) a anaranjado, por efecto del fijador luego de haber sido in- yectado. Se observa el uso indispensable de guantes para la manipulación de esta solu- ción fijadora.

Figura 1.6.2 Cabina para extracción de gases, utilizada para la manipulación de muestras que han sido fijadas para procesamiento histológico. Se observa un vidrio de seguridad en el frente, a través del cual se pueden ver las muestras que se manipulan y el cual protege la cara de salpicaduras de reactivos irritantes. También cuenta con fuente de agua para lavado de elementos o partes del cuerpo en donde haya caído algún reactivo histoló- gico.

Figura 1.6.3 Procesador de tejidos para histo- logía. Este equipo cuenta con 10 vasos de 1 L cada uno, donde se hace la deshidratación de los tejidos y se incorpora parafina líqui- da a temperatura controlada (2 vasos con termostatos, de color blanco ubicados a la derecha). Cuando esta se enfría, da textura firme al tejido y permite realizar cortes con el micrótomo sin que se deformen por el paso de la cuchilla.

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Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

HISTOLOGÍA

Figura 1.6.4 Central de bloqueo. Esta unidad posee superficies y compartimentos con temperaturas controladas electrónicamente (T1, T2 y T3) y permite preparar los bloques de parafina con los tejidos incluidos. Durante este proceso, el tejido en parafina es ubicado en un cassette plástico y cubierto con parafina líquida obtenida a través de un dispositivo especial (P), para formar un bloque. Este se solidifica luego de estar por unos minutos sobre una superficie con escarcha que posee el mismo equipo (E).

Figura 1.6.5 Corte de tejidos en el micró- tomo. Se observa un cassette (blanco) con un corte de cefalotórax (anaranjado) siendo montado en la base móvil de un micrótomo, antes de que sean cortadas las secciones a 3 micras de grosor.

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Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

HISTOLOGÍA

Figura 1.6.6 Baño de recuperación de tejidos, en el cual las tiras de parafina con tejido que se han obtenido con el micrótomo, son puestas en flotación en agua caliente. La parafina se expande con el calor y se elige el mejor corte, capturándolo con una lámi- na portaobjetos y ubicándolo sobre esta en la posición en la cual va a quedar de forma definitiva.

Figura 1.6.7 Batería de tinción con hematoxilina y eosina, en la cual se agregan los colorantes a los tejidos para obtener el contraste entre las diferentes células y entre las distintas partes de cada una. En la foto se observan los reactivos utilizados para la tinción de rutina, donde se puede apreciar la canasta con láminas siendo inmersa en eosina.

Figura 1.6.8 Lámina portaobjetos con cortes histológicos de un camarón juvenil P. vannamei, los cuales han sido teñidos con H&E. Se observa un corte longitudinal de cefalotórax (C), uno transversal de abdomen (A) y uno longitudinal de branquias (B).

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Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

HISTOLOGÍA

Figura 1.6.9 Corte histológico de un segmen- to del corazón de un camarón subadulto P. vannamei. Se observa la válvula aórtica de un animal sano (flechas), en el lugar donde la hemolinfa ingresa a la arteria aorta (A). H&E. Amplificación: 100X.

Figura 1.6.10 Corte histológico de hepato- páncreas sano en un camarón subadulto P. vannamei. Se observan túbulos normales compuestos por diferentes tipos de células y con un lumen en el centro. No hay evidencia de lesiones que sugieran presencia de una enfermedad degenerativa. H&E. Amplifica- ción: 200X.

Figura 1.6.11 Corte histológico del órgano linfoide de un camarón adulto P. vannamei, con nódulos melanizados a causa de una bacteriosis sistémica. Los principales hallazgos histopatológicos son agregación hemocítica localizada en borde superior (in- flamación), melanización de varios nódulos y necrosis en las zonas afectadas. H&E. Am- plificación: 60X.

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1.7 Pruebas con anticuerpos

ELISA Objetivo. La prueba de ELISA (enzyme linked immunosorbant assay) es una prueba rápida de laboratorio, en la cual un anticuerpo conocido se une a un antígeno (viral o bacteriano) presente en una muestra de camarón, con el fin de detectar la presencia o no de dicho agente patógeno en la muestra. Esta prueba que utiliza anticuerpos para el diagnóstico de enfermedades en camarones, se llama en español “inmunoanálisis ligado a enzimas” o también “enzimoinmunoanálisis de adsorción” (EIA). Descripción. La técnica de ELISA utiliza anticuerpos específicos para la identificación de antígenos también específicos, los cuales son componentes estructurales (usualmente proteínas) de agentes patógenos o, proteínas únicas producidas o inducidas por ellos. Esta prueba provee una estrategia de diagnóstico la cual es potencialmente muy rápida (en algunos casos sólo tarda 1 hora), de buena sensibilidad y adaptable a un gran número de muestras en un pe- queño espacio tanto en laboratorio como en condiciones de campo. La prueba de ELISA puede ser realizada con base en anticuerpos policlonales o monoclonales. Metodología. La prueba de ELISA combina la especificidad de anticuerpos con la sensibilidad de pruebas enzimáticas simples, usando anticuerpos o antígenos acoplados a una enzima fácilmente detectable. La ELISA puede proporcionar un sistema útil para la medición de la concentración de un antígeno o de un anticuerpo. Hay dos variaciones principales en este método: la ELISA puede usarse para detectar la presencia de antígenos que son reconocidos por un anticuerpo o para detectar anticuerpos que reconocen un antígeno. Una prueba de ELISA es un procedimiento que involucra cinco pasos generales: 1) cobertura de los pozos de la microplaca con el antígeno; 2) bloqueo de todos los sitios no cubiertos por el antí- geno, para evitar resultados falsos positivos; 3) adición de anticuerpos a los pozos de la microplaca; 4) adición de anticuerpos conjugados con una enzima; 5) reacción de un substrato con la enzima para producir un producto coloreado, indicando así una reacción positiva. Hay muchos tipos diferentes de ELISA. Uno de los tipos más comunes es la ELISA “sandwich”. La siguiente es la metodología general para realizar una prueba de ELISA. Algunos pasos, reactivos y cantidades podrán cambiar según se requiera para cada protocolo asociado con un antígeno en particular. Una microplaca para ELISA se debe cubrir con el antígeno apropiado, llenando los pozos con 100 mL del antígeno diluido. Se incuba toda la noche a 4ºC y se lava el antígeno no adherido en la microplaca mediante golpes suaves. Luego se llenan los pozos con agua destilada y se vacían de nuevo con un golpe suave; se repite esto 2 veces más utilizando con PBS-Tritón. Se debe bloquear la unión no específica agregando 200m L de BSA/PBS 1% y se incuba luego por 30-60 minutos a temperatura ambiente. Se lava la microplaca como se mencionó anteriormente y se agregan 100 mL de las muestras diluidas en los respectivos pozos de la microplaca. Hay que asegurarse de incluir siempre controles positivo y negativo y, si es necesario, una curva estándar. Se incuba por 1 hora a temperatura ambiente y se repite luego el paso del lavado. Luego se prepara la dilución apropiada del segundo paso del anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rábano (los anticuerpos deben ser titulados para buscar obtener una dilución óptima). Se deben agregar luego 100 mL del anticuerpo del segundo paso a los pozos y se incuba por 1 hora. Hay que repetir nuevamente el paso del lavado. Se prepara la solución del substrato y se agregan 100 mL a los pozos, incubando luego a temperatura ambiente por 60 minutos. Finalmente se agrega la solución de parada en cantidad suficiente y se leen las microplacas en un lector de ELISA (Fig. 1.7.1 a 1.7.3). 59 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

INMUNOCROMATOGRAFÍA Es una técnica de detección basada en un inmunoensayo de flujo lateral de un solo paso, en la cual los resultados se establecen visualmente y sin el uso de ningún tipo de instrumento. El sistema emplea una prueba con anticuerpos monoclonales para identificar selectivamente el agente en cues- tión, con un alto grado de sensibilidad y de especificidad. El principio se basa en una prueba de tipo “sándwich”, montada en un dispositivo plástico con una membrana. Por el momento, sólo existe de manera comercial para la detección del virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV). Consiste en un anticuerpo monoclonal conjugado anti-WSSV marcado con oro coloidal, ubicado sobre una al- mohadilla en donde se coloca la muestra. La membrana está cubierta con un anticuerpo monoclonal anti-WSSV diferente en la zona de “prueba” (T) y con un anticuerpo Inmunoglobulina-G (IgG) en la zona “control” (C) (Fig. 1.7.7). En ausencia de WSSV en la muestra de camarón, el anticuerpo conjugado con oro coloidal se mueve con la muestra por capilaridad a lo largo de la membrana a través de la zona de T hasta llegar a la zona C. En este punto, el anticuerpo conjugado con oro coloidal reacciona con el anticuerpo IgG para producir una banda de color rosado visible. Cuando se forma sólo una banda de color rosado en la zona C y no hay banda en la zona T, significa que el resultado es “no detectado” (negativo, para efectos de campo). Cuando el WSSV está presente en la muestra de camarón, el anticuerpo conjugado con oro coloidal reacciona con el virus WSSV para producir un complejo antígeno-anticuerpo que se mueve hasta la zona T. En este punto, el complejo reacciona con el anticuerpo monoclonal diferente anti-WSSV para producir una banda de color rosado visible. Un remanente de anticuerpo conjugado con oro coloidal en estado libre, pasa a través de la zona T hasta la zona C. En este punto, el anticuerpo reacciona con el anticuerpo IgG para producir una banda de color rosado visible (Fig. 1.7.7). Cuando la banda de color rosa aparece tanto en la zona T como en la zona C, significa “positivo” (Fig. 1.7.4 a 1.7.7).

60 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

PRUEBAS CON ANTICUERPOS Y PARÁMETROS INMUNOLÓGICOS (ESPECTROFOTOMETRÍA)

Figura 1.7.1 Procedimiento de ELISA en microplaca de 96 pozuelos. Se fijan anticuerpos y se agrega el antígeno complementario. Esta unión se detecta agregando un segundo anticuerpo contra el mismo antígeno, marcado con una enzima. Esta, en contacto con un substrato, produce color cuya intensidad es proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra. Foto: Cultek S.L.U.

Figura 1.7.2 Microplacas de ELISA con 96 pozuelos, utilizadas para pruebas con anticuerpos y en mediciones de parámetros in- munológicos de camarones. Son montadas en un lector de ELISA para detectar por colo- rimetría la cantidad existente de un antígeno de interés. Foto: Cultek S.L.U.

Figura 1.7.3 Lector de microplacas de ELISA con 96 pozuelos. Colorímetro que permite hacer lecturas de punto final, funcionando de manera independiente o conectado a un computador para registro y análisis de datos. Tiene capacidad para almacenar 100 ensayos y 20 microplacas de datos. Foto: Cultek S.L.U.

61 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

INMUNOCROMATOGRAFÍA

Figura 1.7.4 Representación del principio de inmunocromatografía, a partir de anticuerpos monoclonales conjugados. Ilustración de Mechanizumu. Fuente: FUJIKURA KASEI CO., LTD.

Figura 1.7.5 Ilustración del procedimiento para una prueba de inmunocromatografía a partir de muestras de camarones. Fuente: FU- JIKURA KASEI CO., LTD.

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Figura 1.7.6 Interpretación de resultados en una prueba de inmuno- cromatografía a partir de muestras de camarones. Fuente: FUJIKURA KASEI CO., LTD. Figura 1.7.7 Foto de una prueba con un kit comercial de inmunocromatografía para la detección del virus WSSV en muestras de camarón, mediante el uso de anticuerpos monoclonales conjugados. Las marcas de referencia (letras) corresponden a la siguiente descripción: “T”= orificio donde se deposita el macerado de tejido de camarón con un buffer de lisis; “M”= banda de la muestra que aparece sólo si es positiva al virus WSSV; “C”= banda control que siempre debe aparecer si el kit de detección está funcionando bien.

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1.8 Métodos moleculares La hibridación es una de las principales metodologías que se utiliza actualmente en los laboratorios de biología molecular. Unas de estas técnicas se han diseñado para identificar secuencias específicas en los ácidos nucleicos. La hibridación se refiere al apareamiento específico que ocurre entre cadenas de ácidos nucleicos con secuencias complementarias, proceso que es análogo a la reacción antígeno-anticuerpo, pero con la diferencia de que en la hibridación en lugar de anticuerpos se emplean sondas genéticas. Éstas son fragmentos cortos de ADN o ARN sintetizados in vitro y que se marcan con sustancias ra- diactivas, fluorescentes o de otro tipo, a fin de hacer posible su posterior detección y de esta manera la identificación de la secuencia de ADN o ARN de interés. En camarones, las principales técnicas de biología molecular utilizadas como apoyo para la detección de agentes patógenos en muestras de animales afectados, son: dot blot, hibridación in situ, PCR, RT-PCR y PCR en tiempo real (real-time PCR), esta última principalmente en investigación más que en diagnóstico. De éstas, las que presentan mayor sensibilidad y especificidad son las relacionadas con PCR. • Dot blot Objetivo. Detección de patógenos (ej.: virus) en una muestra de tejido de camarón, mediante el reconocimiento de la presencia de su ADN a través de un proceso de lisis (ruptura) celular, extracción del ADN, hibridación y revelado. En camarones existen sondas para detectar virus como WSSV o IHHNV y para detectar bacterias intracelulares como la alfa Proteobacteria causante de la NHP. Descripción. El dot blot es una técnica de hibridación en la cual el ADN se ubica directamente sobre una membrana de nylon o de nitrocelulosa. Su nombre se debe a que sobre la membrana donde se ubican las muestras del ADN extraído, se forman círculos o puntos. Esta técnica involucra sondas genéticas en su procedimiento, las cuales son pequeños fragmentos de ADN (oligonucleótidos), que son complementarios de regiones que nos interesan en el ADN que se está buscando en una muestra (ej.: virus). De esta manera, si en una muestra problema se produce la hibridación entre la sonda y el ADN viral, se puede concluir que el virus en cuestión se encuentra presente. Las sondas genéticas para camarones son marcadas utilizando moléculas como la biotina o la digoxigenina, las cuales son luego detectadas mediante enzimas como la fosfatasa alcalina, produciendo una reacción colorimétrica y de esta manera detectable por el ojo humano. Las sondas genéticas son específicas para un único tipo de microorganismo. En la actualidad, es factible conseguir sondas genéticas en kits comerciales. Este tipo de prueba es muy útil cuando se quiere estudiar un gran número de muestras, pero tiene la limitante de no ofrecer muy alta sensibilidad, además de que su revelado final es por colorimetría. Metodología. El procedimiento de dot blot en camarones, inicia con una muestra de hemolinfa o de otro tipo de tejido de un animal sospechoso de una enfermedad (ej.: virus WSSV). Cabe recordar que se debe utilizar una sonda específica para el tipo particular de microorganismo que se va a buscar. La muestra es macerada mecánicamente con un tampón (buffer) de lisis, con lo cual se busca romper las células y permitir la salida de las moléculas de ADN hacia la solución del macerado. Luego, una cantidad de macerado (inferior a una gota) es puesta sobre una membrana de nylon (o de nitrocelulosa). El ADN es luego desnaturalizado, es decir, se separan las cadenas de la doble hebra y luego se coloca la sonda previamente calentada. Dicha sonda ha sido modificada, habiéndosele unido una molécula de digoxigenina.

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Se incuban las muestras con la sonda y si esta encuentra regiones del ADN viral que sean complementarias (guardando el concepto de complementariedad de los nucleótidos A-T y C-G), se produce anillado o hibridación (unión entre la sonda y el ADN viral), que es una molécula estable de ADN híbrida de doble cadena. Luego de incubar, se realiza un lavado y se agregan anticuerpos anti-digoxigenina, que han sido previamente marcados con la enzima fosfatasa alcalina. Si la sonda está presente en las muestras, se formará un complejo “antígeno-anticuerpo” con la digoxigenina. Se hace un último lavado y se agrega una solución reveladora (BCIP-NBT), la cual reacciona con la fosfatasa alcalina y produce una reacción colorimétrica. La intensidad del color morado que se produce, es proporcional a la cantidad de microorganismos presentes en la muestra (partículas virales de WSSV en el caso de este ejemplo) (Fig. 1.8.1). • Hibridación in situ (HIS) Objetivo. Este método permite detectar el ADN o ARN problema en el interior de las células, permea- bilizándolas de tal forma que se permita la entrada de una sonda. Entre las principales aplicaciones de la HIS, está la detección de ARN o ADN de origen viral o, ADN de origen bacteriano, en tejidos de camarones fijados y procesados mediante inclusión en parafina. Por lo tanto, también es útil para realizar estudios retrospectivos en material de archivo fijado e incluido en parafina varios años atrás. Los patógenos o enfermedades en camarones que pueden ser detectados en la actividad mediante HIS, son IHHNV, TSV, YHV, WSSV y NHP. Descripción. Es un método histoquímico que emplea la biología molecular, de la misma manera que la inmunohistoquímica utiliza los métodos de la inmunología. Al igual que en el caso de la hibrida- ción dot blot, la especificidad de la HIS se basa en la unión recíproca de una sonda (secuencia de oli- gonucleótidos), con un fragmento complementario de ARN o ADN dentro de una muestra de tejido. A diferencia del dot blot, la HIS utiliza como matriz un corte histológico de un camarón previamente fijado y procesado mediante inclusión en parafina, el cual ha sido adherido (al igual que en la histología) sobre una lámina portaobjetos, pero en este caso la lámina debe tener una carga positiva. En vez de realizar el proceso de tinción como en histología, se realiza la aplicación de la sonda y los demás componentes para la detección genómica de un agente patógeno específico. Metodología. El procedimiento de hibridación in situ en camarones, se inicia a partir de un bloque de parafina con una muestra de camarón, igual al que es utilizado para histología de rutina. El bloque es ubicado en un micrótomo y se corta una sección no mayor a 4 micras de espesor, la cual debe ser recuperada por flotación en una lámina portaobjetos cargada positivamente. La lámina con la muestra en parafina debe ser calentada para eliminar la parafina y posteriormente re-hidratada utilizando xilol (o algún substituto), etanol en concentraciones descendentes (100%, 95%, 80% y 50%), agua destilada y buffer TNE. La lámina se incuba luego con proteinasa K en una cámara húmeda, se sumerge luego en formaldehído y se lava con un buffer. Se aplica entonces la solución de hibridación y se incuba en cámara húmeda. Si el ADN o ARN del patógeno que se está buscando se encuentra presente en la muestra, en este momento se realiza el anillado o hibridación que como ya se explicó en la técnica de dot blot, es una unión entre la sonda y fragmentos del genoma viral o bacteriano, que forma así una molécula estable. Para los virus IHHNV, HPV y TSV, la sonda se diluye en la solución de hibridación y es puesta directamente sobre la muestra. En el caso de BP, MVB, WSSV y NHP, se requiere de un calentamiento previo de la muestra para desnaturalizar el ADN baculoviral de doble cadena (dsDNA). La muestra

65 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos se debe incubar en cámara húmeda toda la noche; para el caso de IHHNV y HPV a 37ºC, para BP, MVB, WSSV, NHP y TSV a 42ºC. Posteriormente las muestras deben ser sometidas a varios lavados con buffers distintos y luego se aplican los anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina. Se incuban y posteriormente se hacen nuevos lavados con soluciones buffer. Se aplica la solución de desarrollo y se frena luego la reacción cuando sea ya necesario de acuerdo con criterios colorimétricos, lavando con soluciones buffer y después con agua destilada. Las muestras se someten luego a tinción con el colorante “Bismark Brown Y” y se deshidratan posteriormente utilizando etanoles ascendentes (95% y 100%) y xilol (o algún substituto). Sin dejar secar la muestra en este momento (y en ninguno de los procesos anteriores), se pone una gota de medio de montaje sobre el tejido y se cubre con una laminilla o lámina cubreobjetos. Se deja secar y se observa luego en un microscopio de campo oscuro, para detectar depósitos intracelulares de precipitado negro o azul oscuro y/o alguna citopatología específica que haya sido marcada por la sonda (Fig. 1.8.2). La interpretación de los resultados varía en cada muestra, según el patógeno que se está buscando y, por consiguiente, las células de los tejidos “blanco” que se espera hayan sido infectados por el agente viral o bacteriano. En el caso del virus TSV, debe considerarse que una manipulación incorrecta antes de la prueba, puede arrojar resultados falsos negativos. Adicionalmente, las muestras para TSV deben ser manejadas en ambientes y con reactivos libres de RNAsas; el personal debe ser entrenado en el manejo de muestras con patógenos cuyo genoma es RNA y en este tipo de ambientes libres de RNAsas. • Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Objetivo. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés - polymerase chain reaction), es un método enzimático de amplificación de secuencias específicas de ADN, que permite la síntesis in vitro de un fragmento de ADN de forma tal que, en cada ciclo del proceso, se duplica el número de moléculas. De esta manera, se utiliza para la detección genómica de ciertos microorganismos patógenos como virus (ADN y RNA) y bacterias, en muestras de camarones o de organismos relacionados. La PCR es utilizada en camarones para la detección de los virus WSSV, IHHNV, BP, MBV, SMV, YHV (grupo), IMNV, TSV y PvNV, así como de las bacterias causantes de las enfermedades NHP (Hepatobacter penaei) y EMS/AHPND (cepa de Vibrio parahaemolyticus). Descripción. El principio de la PCR se basa en determinar la secuencia genómica de interés y utilizar pequeños segmentos de nucleótidos llamados iniciadores o cebadores (“primers” en Inglés), complementarios con una pequeña porción de la secuencia de nucleótidos de los extremos opuestos de las cadenas que flanquean a dicha secuencia en el genoma de nuestro patógeno de interés, a partir de los cuales se inicia la elongación o síntesis de nuevas cadenas en el extremo 3’ de cada iniciador. La PCR se realiza en forma de ciclos. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN, por lo que permite obtener hasta un millón de copias de un solo fragmento en pocas horas. Los elementos necesarios para llevarla a cabo se comercializan en forma de kits. En esta técnica se consideran importantes los siguientes parámetros: un suministro abundante de iniciadores y de desoxinucleótidos trifosfatados (dNTPs); una fuente renovada de ADN polimerasa (enzima encargada de la síntesis de las cadenas complementarias) y los ciclos periódicos de cambios de temperatura. Estos últimos consisten en: desnaturalización del ADN a 100ºC, alineamiento de los

66 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos iniciadores con las secuencias de interés entre 50ºC y 60ºC y, síntesis del ADN a 72ºC. Estas temperaturas pueden variar de acuerdo con las condiciones de la reacción. El poder de la amplificación con PCR es tan alto que los más pequeños contaminantes pueden dar resultados falsos positivos, por lo que el material y las soluciones a emplear deben ser muy cuidadosamente manipulados y almacenados. Metodología. La reacción en cadena de la polimerasa imita el fenómeno de replicación del ADN que ocurre de forma natural en las células vivas. El ADN es de doble cadena (es decir, cada cadena de ADN está apareada con otra complementaria). La aplicación de muchas técnicas moleculares para el estudio del genoma (ADN o ARN), depende grandemente de la habilidad para extraer dichos ácidos nucléicos. Siendo la extracción de ADN más frecuente que la de ARN, se debe considerar que la calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los elementos más importantes en ese tipo de análisis. Si se desea obtener ácidos nucleicos muy purificados y que no contengan contaminantes inhibidores de la reacción de PCR, se deben aplicar métodos de extracción adecuados para tal fin. Algunos de los inhibidores más frecuentes reportados en la literatura, son los siguientes: Dodecilsul- fato sódico >0,005%, Fenol >0,2%, Etanol >1%, Isopropanol >1%, Acetato de sodio >5 mM, Cloruro de sodio >25 mM, EDTA >0,5 mM, Hemoglobina >1 g/mL, Heparina >0,15 UI/mL, Urea >20 mM y Mezcla de reacción >15%. También se ha considerado que los ojos de las postlarvas pequeñas de camarón, contienen inhibidores de la PCR, por lo que se recomienda extraerlos mecánicamente antes de someter dichos organismos a macerado para extracción de ADN o ARN. Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico, se debe provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de las células. Un acertado procedimiento de lisis debe ser lo suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (tejidos, por ejemplo), pero los suficientemente suave como para preservar el ácido nucleico que estamos buscando extraer. Los principales procedimientos de lisis incluyen: a) rotura mecánica (ma- ceración, lisis hipotónica, b) tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles) y c) digestión enzimática (Proteinasa K, etc.). Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo, usando una solución que contenga detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. Luego de la lisis celular y de la inactiva- ción de las nucleasas, los restos celulares se eliminan fácilmente mediante filtración o precipitación. Para purificar los ácidos nucleicos se suelen aplicar combinaciones de varias de las siguientes técnicas: • Extracción/precipitación • Cromatografía • Centrifugación • Separación por afinidad

Algunas veces se hace extracción con disolventes para eliminar los contaminantes de los áci- dos nucleicos. Tal es el caso cuando se usa una combinación de fenol y cloroformo, con el objetivo de eliminar las proteínas. Para concentrar los ácidos nucleicos suele hacerse una precipitación con isopropanol o con etanol. Si la cantidad de ácido nucleico a extraerse es escasa, puede añadirse a la mezcla un portador inerte como el glucógeno, lo cual ayudará a favorecer la precipitación; esta última también puede realizarse de manera selectiva, con concentraciones salinas elevadas (precipi- tación salina) o con precipitación de proteínas usando cambios de pH. Teniendo el ácido nucleico extraído, se da inicio a la reacción de PCR. Durante la replicación, las dos cadenas se separan y una enzima especializada llamada polimerasa, hace una copia de cada

67 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos una de las cadenas, utilizando la original como plantilla o modelo. Normalmente este proceso de copia tiene lugar cuando la célula se divide y da lugar a la formación de un par de cadenas hijas. La polimerasa necesita otros tres ingredientes para copiar ADN. El primero es una reserva de los cuatro bloques básicos que constituyen la molécula de ADN, llamados nucleótidos o bases. El segundo es una fibra corta de ADN copiado, que se llamacebador oligonucleotídico o primer, el cual está formado por varios nucleótidos que inician la replicación. El tercero es el cofactor MgCl2, sin el cual la enzima no puede funcionar. La PCR utiliza estos mismos ingredientes para copiar ADN en un microtubo de ensayo (Fig. 1.8.3). La reacción tiene lugar en tres fases. Durante la primera o desnaturalización, la plantilla o fragmento original de ADN se calienta hasta una temperatura de 90°C a 95°C durante 30 segundos; esto provoca la separación de las dos cadenas. En la segunda fase, llamada anillaje, la temperatura de la mezcla se baja hasta 55°C durante 20 segundos para que los cebadores oligonucleotídicos se enlacen con el ADN escindido. En la tercera fase o de polimerización, la temperatura de la mezcla se eleva hasta 75°C para que la polimerasa copie rápidamente la molécula de ADN. Estas tres fases tienen lugar en el mismo tubo de reacción y constituyen un ciclo completo de PCR, que se realiza en menos de dos minutos (Fig. 1.8.5). Teóricamente, el ciclo de PCR se puede repetir sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadores, deben renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos de tres horas, bastan para producir millones de copias de ADN. Cuando la muestra contiene un agente patógeno cuyo genoma es ARN, se debe utilizar antes de la PCR un paso adicional. Consiste en adicionar a la muestra (ARN extraído) una enzima llamada transcriptasa reversa, la cual transcribe el RNA en ADN complementario (cDNA), molécula que es un ADN de doble cadena y, por consiguiente, susceptible de ser amplificada mediante una reacción normal de PCR. Este proceso enzimático que se requiere para los virus ARN, ha hecho que la PCR que lo utiliza se llame “PCR con transcriptasa reversa” (RT-PCR). La polimerasa utilizada actualmente en una PCR tradicional, es termoestable, no se inactiva por las elevadas temperaturas de la primera reacción y es llamada Taq, debido a que proviene de Thermus aquaticus, una bacteria termófila. Debido a que la polimerasa Taq no resulta destruida por las elevadas temperaturas a las que transcurre la PCR, basta con añadirla una vez, al principio de la reacción. La polimerasa Taq se fabrica ahora con bacterias modificadas genéticamente. El uso de la PCR exige mucho cuidado. Lo más importante es evitar la contaminación de la mezcla reactiva. Es tan sensible, que permite multiplicar accidentalmente cantidades mínimas de ADN contaminante. Se utilizan procedimientos especiales para evitar la contaminación (Fig. 1.8.3 y 1.8.4). La electroforesis en gel (de agarosa o de poliacrilamida), es una técnica que se emplea para separar los ácidos nucleicos luego del proceso de amplificación mediante la PCR. La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y masa. Cuando una muestra biológica como el ADN se mezcla en una solución tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan conjunta- mente. La corriente eléctrica de un electrodo repele las moléculas, al tiempo que el otro electrodo las atrae. La fuerza de fricción del material de gel actúa como «tamiz molecular», separando las molécu- las en función de su tamaño (Fig. 1.8.6). Durante la electroforesis, las macromoléculas son empujadas a través de los poros y su tasa de migración por el campo eléctrico depende de los siguientes factores: • Fuerza del campo • Tamaño y forma de las moléculas • Hidrofobicidad relativa de las muestras • Fuerza iónica y temperatura del tampón en que se desplazan las moléculas

68 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

La velocidad de una molécula cargada en un campo eléctrico, depende del gradiente de potencial, la carga y la fuerza de fricción de la molécula y se conservan a temperatura ambiente. Existe asimismo una resistencia de fricción que hace más lento el desplazamiento de las moléculas cargadas, lo cual sucede en función de los siguientes factores: • Tamaño hidrodinámico de la molécula • Forma de la molécula • Tamaño de poro del medio en que tiene lugar la electroforesis • Viscosidad del tampón

El TBE se utilizaba inicialmente a una concentración de trabajo de 1x en el caso de la electroforesis en gel de agarosa. No obstante, una solución de trabajo de 0,5x proporciona un poder más que suficiente y en la actualidad, prácticamente todas las electroforesis en gel de agarosa se practican utilizando esta concentración. Un fragmento de ADN de un tamaño determinado migra a diferentes velocidades a través de los geles según la concentración de agarosa. En función de la concentración de agarosa o tampón, se pueden separar segmentos de ADN que contengan de 20 a 50.000 pb. En los geles horizontales, la agarosa se emplea por lo general en concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 % (Fig. 1.8.6). La observación de las bandas luego de la electroforesis, se realiza extendiendo el gel en un transiluminador de luz ultravioleta (UV), proceso durante el cual se debe reconocer el patrón de bandas positivas del Control utilizado, para comparar sobre dicha línea de avance las bandas de las muestras que se han corrido durante la electroforesis. Se consideran como “positivas” aquellas en las que la ubicación de la banda coincida con la banda del control positivo. De igual manera, se debe verificar que el control negativo no haya presentado ninguna banda. Es importante obtener un registro fotográfico de cada gel de agarosa observado en el transiluminador UV, con el fin de conservar evidencia impresa (o digital) de los resultados de cada análisis por PCR (Fig. 1.8.7 y 1.8.8). • PCR Multiplex Partiendo de la base que la PCR tradicional utiliza un solo par de iniciadores (primers) para amplificar una secuencia específica (un único patógeno, por ejemplo WSSV), la PCR Múltiplex utiliza varios y diferentes pares de iniciadores para amplificar muchas secuencias simultáneamente (varios patógenos a la vez a partir de una misma muestra). La presencia de muchos iniciadores de PCR en un solo tubo de reacción, podría tener muchos inconvenientes como el aumento de la formación de productos de PCR con errores de cebado, dímeros de iniciadores y la discriminación de la amplifica- ción de fragmentos más largos de ADN. Para este tipo de amplificación por PCR, se utilizan iniciadores con temperaturas de hibrida- ción similares. Las longitudes de los productos amplificados deben ser muy parecidas. Si hay grandes diferencias entre las longitudes de las moléculas de ADN, se favorece la amplificación de la molécula diana más corta, respecto a la más larga; esto implica diferencias en el rendimiento de los productos amplificados. De igual manera, los tampones de PCR Multiplex contienen un aditivo de la Taq polimerasa que reduce la competencia entre los productos de amplificación (amplicones) y la discriminación de fragmentos más largos de ADN durante este tipo especial de PCR. Los productos de amplificación pueden seguir hibridándose con una sonda genética específica con el objeto de hacer una verifica- ción confirmativa.

69 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

• PCR en tiempo real (real time PCR, qPCR) Objetivo. La prueba de PCR en tiempo real se utiliza para determinar la cantidad de ADN en tiempo real durante el proceso de amplificación, usando sondas marcadas fluorescentes. Descripción. En biología molecular, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, también es llamada la reacción en cadena en tiempo real cuantitativa de la polimerasa (QRT-PCR) o reacción en cadena cinética de la polimerasa. La PCR en tiempo real es una técnica de laboratorio que permite cuantificar y amplificar simultáneamente una parte específica de una molécula dada de ADN o ARN. Se utiliza para determinar si una secuencia específica está o no presente en una muestra; si está presente, la técnica permite conocer el número de copias en la muestra. Es la versión en tiempo real de la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (qPCR), así como una modificación de la tradicional reacción en cadena de la polimerasa. Para llevar a cabo la detección en tiempo real de un genoma de interés, existen varios métodos pero casi todos basados en la utilización de otro fragmento de ADN (sonda) complementario a una parte interna del ADN que queremos amplificar. Esta sonda lleva adherida una molécula fluorescente y otra molécula que inhibe esta fluorescencia (“quencher”), de tal forma que sólo cuando la sonda es desplazada de su sitio por acción de la ADN polimerasa, la molécula fluorescente se libera de la ac- ción del “quencher” y emite fluorescencia al ser iluminada con un láser. La cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR, será proporcional a la cantidad de ADN que se está amplificando. En general, para que sea válida esta técnica, requiere realizar en paralelo una curva patrón en las mismas condiciones, para conocer la cantidad total de ADN que se está amplificando. Las diferentes formas de detección de la PCR en tiempo real como TaqMan o “Molecular Bea- con”, se han vuelto herramientas populares para la detección de agentes infecciosos. Estas nuevas pruebas tienen varias ventajas sobre las PCR clásicas (un paso) o anidadas (2 pasos). Sólo es utilizado un par de iniciadores (primers), los cuales proporcionan con frecuencia una sensibilidad similar o igual a la de PCR anidada, pero con un mucho menor riesgo de contaminación. La fluorescencia que indica la presencia del producto amplificado, es medida en el mismo tubo de reacción, por lo que no es necesaria la manipulación post-PCR de los productos amplificados. La lectura de la fluorescencia es automatizada, por lo que se evitan resultados subjetivos. Estos procedimientos consumen una cantidad de tiempo considerablemente menor comparados con la PCR tradicional, ya que no es necesario detectar el fragmento amplificado mediante electroforesis en geles de agarosa, seguidos por la tinción con bromuro de etidio y, de nuevo, el riesgo de contaminación es reducido. El uso de un formato de bandeja con 96 pozuelos sin necesidad de hacer una PCR anidada, permite que el procedimiento sea automatizado. Metodología. Los equipos requeridos para realizar una PCR en tiempo real, son de forma combinada un termociclador, un fluorómetro y un monitor. El termociclador efectúa la PCR en muestras que contienen fluorocromo fluorescente proporcional a la cantidad de DNA, cantidad que dobla de ciclo en ciclo. Un rayo láser excitador es transmitido a la muestra por una fibra óptica. La emisión fluorescente inducida es enviada al fluorómetro que la analiza a diferentes longitudes de onda. A menudo, la misma fibra transmite el rayo excitador y recibe la fluorescencia. El monitor indica, después de cada ciclo, la fluorescencia leída dentro de la longitud de onda elegida para la muestra (Fig. 1.8.9 y 1.8.10). A partir de este momento, la señal dobla de ciclo en ciclo. Se observará aparecer en el computador una curva creciente, ya que la fluorescencia de cada tubo es medida en cada ciclo. El número de ciclos a partir del cual la curva comienza a crecer, es proporcional a la concentración inicial de ADN (Fig. 1.8.11).

70 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

PCR isotérmica (LAMP) El método de PCR isotérmica (LAMP por sus siglas en inglés - Loop-mediated isothermal amplification), consiste en una reacción en cadena de la polimerasa a una temperatura constante y con similares resultados a los de una PCR tradicional realizada en un termociclador. El proceso está basado en el principio de síntesis de ADN por desplazamiento de cadena, que se lleva a cabo por una polimerasa con alta actividad de desplazamiento de cadena y un sistema de dos cebadores (primers) internos y dos cebadores externos, para reconocer 6 secuencias distintas del ADN blanco. Este método que fue publicado por Notomi y colaboradores en 2000, ha sido revisado y ajustado frecuentemente desde entonces, para mejorar la posibilidad de detección molecular de virus, bacterias, hongos y protozoarios. En la actualidad, existen kits de PCR LAMP comerciales para la detección de patógenos virales y bacterianos comunes en camarones penaeidos de cultivo. Descripción de los principios del método LAMP. En los pasos iniciales de la reacción, son utilizados los cuatro cebadores y al completarse un ciclo, sólo se usan los cebadores internos para la síntesis del ADN; los internos se llaman “Forward Inner Primer” (FIP) y “Backward Inner Primer” (BIP), respectivamente y cada uno contiene dos secuencias distintas que corresponden a las secuencias sentido y antisentido del ADN blanco, uno para cebar en la primera etapa y el otro para auto-cebarse en etapas posteriores. Las secuencias en ambos extremos de la región blanco para la amplificación en un ADN se conocen como F2c y B2, respectivamente. Dos secuencias internas son designadas F1c y B1 y dos secuencias externas a los extremos de F2c y B2 son llamadas F3c y B3. Una muestra de ADN que contiene la secuencia blanco y los cuatro cebadores, se desnaturaliza con calor y rápidamente se enfría en hielo. La reacción de LAMP se inicia después por la adición de un fragmento considerable de ADN polimerasa Bst (Bacillus stearothermophylus) y se eleva a 65ºC por 1 hora. El cebador interno FIP se une a F2c en el ADN blanco e inicia la síntesis de la hebra complementaria. El cebador externo F3, se une lentamente a F3c en el ADN blanco e inicia la síntesis de ADN por desplazamiento de la hebra. Al liberar una cadena complementaria unida a FIP, puede formar una estructura enrollada “en bucle” en un extremo. Esta hebra sencilla de ADN se usa como molde para la síntesis de ADN iniciada por BIP y la subsiguiente síntesis de ADN por desplazamiento de la hebra a partir del cebador B3, comenzando así la producción de un ADN en forma de “doble asa”. Este es convertido a una forma de bucle “en tallo” por la síntesis de ADN del autocebador. Esta forma sirve de inicio para los ciclos de la segunda etapa de la reacción de LAMP. Los ciclos de LAMP, comienzan con la unión de FIP a la estructura en herradura de ADN, iniciándose de esta manera la síntesis por desplazamiento de la hebra. Esto produce una separación intermedia en la estructura en herradura de ADN con una copia invertida adicional de la secuencia blanco en la base y un asa o bucle formada en el extremo opuesto a través de la secuencia BIP. Pos- teriormente, la síntesis de ADN por desplazamiento de la hebra, produce una estructura complementaria a la herradura de ADN original y un ADN en herradura reparado con una base elongada dos veces y un bucle en el extremo opuesto. Los dos productos son entonces utilizados como molde para un cebador BIP en los ciclos posteriores de la reacción por desplazamiento de la hebra. De éstos, una parte se llama elongación y la otra reciclaje. De esta manera, la secuencia original de LAMP es amplificada tres veces cada medio ciclo. El uso de cuatro cebadores al inicio del LAMP y de dos cebadores durante los siguientes pasos, asegura un proceso de amplificación con alta especificidad. La detección del producto de amplificación se puede hacer de manera visual por turbidez, visual por fluorescencia, visual por sustancias que se integran al producto, en tiempo real por turbidez y por electroforesis. Como ventajas del método LAMP, tenemos que: a) no requiere reactivos especiales, b) no se utilizan equipos sofisticados y de manejo complicado, c) no requiere sistemas complejos para el control de la temperatura y d) el molde puede ser detectado fácilmente mediante la presencia del producto amplificado (Fig. 1.8.12 a 1.8.14). 71 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

PRUEBAS MOLECULARES - DOT BLOT

Figura 1.8.1 Resultados de una prueba de dot blot para WSSV sobre una membrana de nitrocelulosa. Cada cuadro pequeño (1 cm2) corresponde a un camarón. La intensidad de la mancha morada en cada cuadro, es proporcional a la cantidad de ADN viral presente en las células analizadas de cada camarón. En esta membrana se pueden observar muestras con severidad baja (círculo amarillo), media (círculo azul) y alta (círculo rojo). En la parte inferior (centro) se observan los resultados del control con 3 cuadros, siendo de izquierda a derecha “negativo” (ausencia de color), positivo leve (una “+”, color morado tenue) y positivo más fuerte (dos “++” y color morado más intenso).

PRUEBAS MOLECULARES - HIBRIDACIÓN IN SITU

Figura 1.8.2 Corte de tejido de epitelio cuticular de estómago de un camarón juvenil P. vannamei infectado con el virus WSSV. La sonda reaccionó fuertemente con el ADN viral presente en los cuerpos de inclusión intranucleares, mediante la prueba de hibri- dación in situ utilizando una sonda de ADN marcada con digoxigenina. La coloración obtenida es producto de la reacción entre la sonda marcada y Bismark Brown. Amplifica- ción: 1000X (modificada de Lightner, 1996).

72 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

PRUEBAS MOLECULARES - PCR

Figura 1.8.3 Procedimiento de extracción de ADN, mediante la utilización de un kit comercial con base en soluciones de lisis celular. Nótese el uso de puntas de micropipeta protegidas con un filtro (blanco) en su base, para evitar la contaminación de la micropipeta y el paso de ADN viral de una muestra a otra (contaminación cruzada).

Figura 1.8.4 Cámara de trabajo para PCR. Dentro de ella, circula aire ultrafiltrado y se utiliza para la preparación de los reactivos que se utilizarán en las pruebas de amplifi- cación (PCR). Los elementos que se utilizan dentro de la cámara, no deben salir de la misma y deben estar marcados según sean utilizados en diferentes tipos de muestras o para diferentes tipos de agentes patógenos.

73 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

PRUEBAS MOLECULARES - PCR

Figura 1.8.5 Termociclador (“aparato de PCR”) con 96 pozos para igual número de tubos de 0.2 mL. En este equipo se realiza propiamente la PCR dentro de los tubos que contengan el ADN de la muestra y los reactivos de amplificación. Su función es realizar mediante un comando computarizado programable, muchos ciclos a diferentes temperaturas y con diferentes tiempos.

Figura 1.8.6 Cámara de electroforesis (izquierda) y fuente de poder (derecha), que permiten la migración del ADN amplificado en un gel de agarosa y mediante un flujo eléctrico continuo. Después de este proceso, las muestras migradas en el gel, están listas para ser observadas en un transiluminador UV.

74 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

PRUEBAS MOLECULARES - PCR

Figura 1.8.7 Transiluminador de luz ultravioleta utilizado para revelar la presencia de bandas de ADN, producto de la amplifica- ción por PCR y que migraron en una cáma- ra de electroforesis. La tapa que se observa color púrpura, posee un filtro que protege al operario de la luz uv. Nótese el uso de guantes por parte del operario, mientras manipu- la el gel de agarosa para ser puesto sobre el transiluminador.

Figura 1.8.8 Gel de agarosa con productos de amplificación de ADN obtenidos mediante PCR, vistos a través de un transiluminador de luz ultravioleta. La columna de la izquierda posee un marcador de peso molecular; las columnas siguientes (1 a 5) poseen muestras que fueron amplificadas. Las bandas blancas que se observan en éstas, corresponden a resultados positivos en la búsqueda de un agente patógeno de una muestra mediante PCR.

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Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

PRUEBAS MOLECULARES - PCR EN TIEMPO REAL

Figura 1.8.9 Equipo utilizado para realizar PCR en tiempo real (qPCR), lo cual incluye un módulo térmico o equipo de qPCR (termociclador) y un computador para el procesamiento y análisis de los datos suministrados por los el equipo. En el monitor se realiza la visualización de los resultados que se van obteniendo en cada ciclo y en tiempo real.

Figura 1.8.10 Termociclador utilizado para la prueba de PCR en tiempo real. Se observa un panel de control con comandos (botones) verdes y azules para la programación del equipo, así como una pequeña pantalla para visualizar la información correspondiente a la programación y al avance de los ciclos de amplificación y cuantificación.

Figura 1.8.11 Visualización de una gráfica con datos de productos amplificados durante una prueba de PCR en tiempo real. Cada lí- nea de color corresponde a una muestra analizada y al control utilizado.

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Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

PRUEBAS MOLECULARES - LAMP

Figura 1.8.12 Resultados de amplificación mediante PCR LAMP. Los dos microtubos de la izquierda (A) son visualizados mediante turbidez siendo positivo el izquierdo y negativo el derecho. La detección en los dos de la derecha (B) es mediante la adición de “SYBR Green” y uso de fluorescencia. Foto: PubMed Central (PMC), U.S. National Library of Medi- cine. URL: http://openi.nlm.nih.gov/

Figura 1.8.13 Comparación de la sensibilidad entre la prueba de PCR LAMP (A) y la técnica de PCR convencional (B), utilizando gDNA de una línea transgénica de caña de azúcar. (A) Pro- ductos del LAMP detectados mediante 1000X SYBR Green I. (B) Detección de los productos del LAMP mediante electroforesis en gel de agarosa teñido con Bromuro de Etidio. (C) Productos de la PCR detectados mediante electroforesis en gel de agarosa teñido con Bromuro de Etidio. En el método (A) y en el (B), las muestras 3, 4, 5 y 6 fueron positivas; en el método (C) sólo las 3 y 4, siendo la 5 positiva muy leve. Las muestras 1, 2, 7 y 8 fueron negativas con los 3 métodos. Foto: Scientific Reports. URL: www.nature.com.

Figura 1.8.14 Equipos y materiales utilizados por el sistema comercial “IQ PlusTM AHP- NS/EMS Kit” para la detección de la bacteria causante de la enfermedad HPND/EMS en camarones, mediante la prueba de PCR LAMP. Foto: Shrimp News International. URL: www.shrimpnews.com.

77 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

1.9 Parámetros inmunológicos Este tema será tratado con mayor profundidad en el punto “3” (parámetros hemato-inmuno- lógicos como indicadores de salud) del Capítulo “Inmunología” (Margherita Barracco et al.). Por esta razón, sólo se hará en éste capítulo una mención general de las principales técnicas inmunológicas, como herramientas para el diagnóstico de enfermedades en camarones. La medición de algunos parámetros inmunológicos en los camarones, permite evaluar y determinar en un momento dado, las condiciones sanitarias de un grupo de animales o de una población en un sistema comercial de cultivo. Estos parámetros están relacionados con la capacidad de respuesta inmune de los organismos, frente a la invasión de agentes bioagresores (virus, bacterias y hongos), o elementos inertes que entran en contacto con los animales. Los principales parámetros inmunes de los camarones que se pueden medir en la hemolinfa, son los siguientes: Hemograma: los hemocitos constituyen la barrera celular del sistema inmune, que defiende al cama- rón de agresores que ingresan al organismo para causar infección celular y posteriormente enfermedad. El hemograma consiste en realizar un conteo total o diferencial de los hemocitos en la hemolinfa, para establecer una relación entre los valores obtenidos y las condiciones de salud de los camarones examinados (o de sus poblaciones de origen). Para realizar un hemograma, se extrae hemolinfa con un anticoagulante protector de hemocitos (por ejemplo solución de Alsever (AS) o “SSS”) conteniendo una concentración de NaCl apropiada para animales marinos (de 330 a 450 mM NaCl), o simplemente una solución de citrato de sodio o de EDTA) y se monta sobre una cámara de Neubauer para realizar el conteo (Fig. 1.9.1 a 1.9.5). El valor final debe incluir los cálculos correspondientes a la dilución con el anticoagulante y la profundidad y área de la cámara utilizada. Los resultados se dan en hemocitos (totales, granulares, semigranulares o hialinos) por cada mm3 de hemolinfa. Los valores promedio de hemocitos totales/mm3 más frecuentes en camarones preadultos sanos, se encuentran entre 25.000 y 35.000. Como se mencionará más adelante, deben tenerse en cuenta las condiciones propias del camarón (muda, sexo y edad) y del medio de cultivo (temperatura, salinidad y oxígeno disuelto, entre otras), ya que éstas afectan los valores obtenidos en los conteos de hemocitos. Concentración de proteínas plasmáticas: este parámetro es utilizado para evaluar el estado sanitario de los camarones. Sin embargo, entre el 60 y el 97% de las proteínas plasmáticas totales está compuesto por hemocianina (pigmento extracelular que transporta el oxígeno a los tejidos del camarón). Por esta razón, cambios importantes en la concentración de la hemocianina, afectan directamente los valores obtenidos para proteínas plasmáticas. Adicionalmente, la concentración de las proteínas plasmáticas puede verse influenciada por condiciones de tipo infeccioso, ambiental o fisiológico. Cuando el camarón está infectado, puede haber una lisis celular y destrucción de sus tejidos afectados, lo que genera un aumento en la concentración proteica de la hemolinfa. Todo lo anterior sugiere que deben realizarse estudios más profundos, para poder utilizar este parámetro inmunológico como un verdadero criterio para conocer el estado sanitario de los camarones. Para determinar las proteínas plasmáticas totales en una muestra de hemolinfa de camarón, se pueden utilizar métodos de rutina como el de Lowry, Biuret o Bradford. De manera general, el nivel de proteínas plasmáticas totales en camarones se determina a partir de muestras de suero. Luego de extraer la hemolinfa, se deja coagular a 4ºC por al menos 12 horas y luego se centrifuga para recuperar el suero. Se agrega un volumen de suero a una microplaca y se hace reaccionar con el reactivo del método utilizado. De esta manera se obtiene la formación de un complejo coloreado el cual es medido con un lector de microplacas utilizando un filtro con una longitud de onda determinada para cada método (ej.: 546 nm para Biuret). Finalmente, se extrapola

78 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos la concentración de proteínas totales en el plasma de la muestra, a partir de una curva de calibración con una solución stock de BSA estándar (1mg/mL). Capacidad de hemoaglutinación: con este método es posible determinar las condiciones sanitarias de los camarones, mediante la medición de la capacidad de las proteínas de reconocimiento de patrones (PRPs) (especialmente las de reconocimiento de lipopolisacáridos), presentes de manera natural en la hemolinfa. Sus funciones incluyen reconocer y aglutinar cuerpos invasores. Por como- didad, se usan en los ensayos eritrocitos de diferentes mamíferos, por ser células extrañas al camarón y, sobretodo, por ser células con coloración natural, facilitando así la observación a simple vista de la reacción. El estudio de estas proteínas y sus mecanismos de reconocimiento, comienza a ser una herramienta muy potente para las estrategias de selección de animales genéticamente resistentes a enfermedades. La actividad hemoaglutinante de la hemolinfa, podría constituirse en un indicador de salud y de adaptación del camarón, ya que por ejemplo existe una relación directa entre los títulos de hemoaglutinación y la calidad reproductiva de los machos (índice de espermatogénesis). Igual- mente, la sensibilidad de la actividad hemoaglutinante ante el estrés, demuestra que los títulos de hemoaglutinación pueden ser usados tanto como indicadores sanitarios, como de adaptación de los animales a sus condiciones de vida. La prueba de hemoaglutinación se realiza utilizando eritrocitos humanos o de otros mamíferos (principalmente de roedores que son particularmente reconocidos por las aglutininas de camarón) en microplacas de 96 pozuelos con fondo en forma de “U” y en presencia de suero. Se determina así visualmente la presencia de aglutinación y el título aglutinante. Cuanto mayor es el título, mayor será la cantidad de PRP en la hemolinfa del camarón. Actividad de la fenoloxidasa: la enzima fenoloxidasa (PO por sus siglas en Inglés), se encuentra confinada en el interior de los hemocitos del camarón y juega un papel crucial en la cascada inmu- nológica que se activa cuando es reconocida una substancia como cuerpo extraño (antígeno). La PO se encuentra en forma de enzima inactiva (zimógeno) llamada profenoloxidasa (proPO). En condiciones de infección, esta enzima inactiva es exocitada de los hemocitos hacia el plasma del camarón y es convertida en PO mediante el efecto de la Enzima Activadora de la proPO (AEproPO), la cual es una serin-proteasa. Las reacciones que culminan con la transformación de proPO en PO y con la subsecuente melanización, son consideradas como un componente que integra los mecanismos de reconocimiento y de defensa de los crustáceos. En pruebas hechas in vitro, se ha observado que el paso de proPO a PO se produce incubando la muestra con Tripsina (serin-proteasa comercial). La actividad total de la PO se mide utilizando L-DOPA como sustrato. La determinación de la actividad de la PO, permite tener una idea de la capacidad de respuesta inmune de un camarón, frente a la presencia de agentes patógenos en el organismo. Para su medición, se parte de la reacción en la que se utiliza suero de los camarones o un lisado de sus hemocitos, que son la fuente de la enzima PO y se incuba con la L-DOPA y tripsina (activador de proPO). En presencia de oxígeno, se forma un compuesto colorido (rojo-coral) que presenta su máxima absorbancia a 490 nm y puede ser detectada espectrofotométricamente con un lector de microplacas. Actividad antibacteriana de los hemocitos por la producción de intermediarios reactivos de oxígeno (fagocitosis): en condiciones normales, las células fagocíticas de los camarones se encuentran en estado inactivo. La presencia de partículas extrañas sobre la superficie de estas células, cambia de inmediato su situación pasando a un incremento en la actividad metabólica; esta se llama choque respiratorio o metabolismo oxidativo. La transición celular de un estado inactivo a uno activo, involucra cambios característicos como incremento en el consumo de oxígeno por la enzima NADPH oxidasa, que se encuentra en la superficie celular y también en las membranas de vacuolas intracelulares (lisosomas). En este proceso que se inicia con la activación de la NADPH oxidasa, ocurre la produc- ción de muchos reactivos intermediarios de oxígeno altamente tóxicos como el anión superóxido, peróxido de hidrógeno y oxígeno singlete (“singlet oxygen”).

79 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Estos productos resultantes del choque respiratorio, están relacionados con la actividad antimicrobiana en el camarón y con la destrucción de los agentes infectantes. La producción del anión superóxido puede ser medida a partir de una muestra de hemolinfa, mediante la estimulación de los hemocitos y la capacidad de este anión para reducir el nitro blue tetrazolium (NBT). Esta reacción produce un depósito de color azul que se puede cuantificar utilizando un lector de microplacas, con un filtro que tenga una longitud de onda de 620 nm. Actividad antibacteriana del plasma: existen en la hemolinfa del camarón diferentes péptidos con efectos antimicrobianos. Entre mayor sea la concentración y tipo distinto de éstos en un camarón cuando se presenta el ataque de bioagresores, mayores serán las posibilidades de defensa y, por ende, de supervivencia. La prueba de la actividad antibacteriana del plasma permite medir la inhibición del crecimiento bacteriano, por la acción de péptidos que poseen propiedades microbicidas y que están presentes en la hemolinfa de los camarones. Con base en lo anterior, medir la actividad antibacteriana del plasma/suero de camarones, permite estimar la capacidad de respuesta frente a una eventual infección por bacterias. Para realizar la evaluación, se deben tener cultivos de cepas bacterianas Gram positivas y negativas en pozos de una microplaca y se hacen diluciones seriadas del plasma/suero de camarones frente a estas bacterias. Se analiza la inhibición del crecimiento bacteriano causada por el plasma diluido seriadamente y se calcula luego el título de inhibición. La medición se hace por medio de un método turbidimétrico, cuyo principio está basado en la determinación espectrofotómetrica de la turbidez causada por las suspensiones bacterianas; si la turbidez de la muestra de bacterias disminuye en presencia de plasma, sugiere destrucción bacteriana por presencia de los péptidos antibacterianos. La cuantificación se realiza mediante comparación espectrofotométrica del cultivo control (sin plasma/suero) y del cultivo con la muestra de plasma/suero, utilizando un lector de microplacas.

Cuantificación de laα 2 Macroglobulina plasmática: en invertebrados, se ha sugerido que esta enzima regula la activación del sistema de la proPO, inhibiendo a la Enzima Activadora de la proPO (EApro- PO), razón por la cual se le considera mediador del sistema inmune. Los inhibidores de las proteasas no sólo participan en las acciones de protección contra microorganismos patógenos, sino que tam- bién juegan un papel importante en otros procesos de defensa como la coagulación. La cuantifica- ción de la α2Macroglobulina plasmática, se realiza basándose en que reacciona con las proteasas sin bloquearles el sitio activo, siendo así protegidas las proteasas e impidiendo el acceso de substratos (proteínas) grandes. Sin embargo, péptidos pequeños como BAPNA, sí pueden ser degradados por las proteasas que han sido atrapadas. Esta degradación produce un compuesto de color amarillo, el cual puede medirse con un lector de microplacas usando un filtro con una longitud de onda de 415 nm. Cuantificación de BGBP en hemolinfa: La presencia de compuestos microbianos en el sistema inmune puede activar directamente las funciones celulares de defensa tales como fagocitosis, melani- zación, encapsulación y coagulación; las proteínas reconocedoras presentes en el plasma, amplían ese estímulo. La purificación de los componentes del sistema proPO de crustáceos, ha permitido demostrar la presencia de dos proteínas directamente relacionadas con la comunicación celular entre hemocitos. Una de ellas es la proteína de unión al β-1,3-Glucano (BGBP del inglés β-1,3-Glucan Binding Protein) presente en el plasma. La BGBP es una PRP tal como las aglutininas, capaz de reconocer componentes de la pared de los hongos. La BGBP fue identificada en el plasma del camarón Penaeus californiensis por Vargas-Albores et al. (1996). Esta proteína reacciona con los β-glucanos y el complejo glucano BGBP induce a la degranulación y activación del sistema proPO. La otra molécula es la proteína de unión a los lipopolisacáridos de la pared de bacterias Gram negativas (LBP del inglés Lipopolysaccharide Binding Protein), la cual es una PRP que reconoce LPS. La proteína LBP ha sido descrita como aglutinina y se ha probado su capacidad para aglutinar bacterias. Una vez reacciona con el LPS o con bacterias, la proteína se une a los hemocitos y estimula 80 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos la fagocitosis. La BGBP y la LBP estimulan las funciones celulares solamente después de reaccionar con los β-glucanos y con los LPS, respectivamente. La cuantificación de estas PRPs plasmáticas del camarón, se realiza con el método de la inhibición de ELISA, el cual permite eliminar las reacciones inespecíficas observadas entre los inmuno-reactantes y la hemolinfa. Los anticuerpos contra BGBP reaccionan de manera específica con sus respectivos antígenos. Con base en esto, la prueba para su detección consiste en inmovilizar antígeno (dichas proteínas) en una microplaca de poliestireno, agregando luego los anticuerpos e incubando para que éstos reac- cionen. Después se usa un sustrato revelador para detectar y cuantificar las PRPs. Si se ha presentado unión antígeno-anticuerpo, la aplicación del sustrato en presencia del anticuerpo producirá una re- acción colorimétrica medible mediante espectrofotometría, utilizando un lector de microplacas con una longitud de onda apropiada según el método. Concentración de hemocianina en la hemolinfa: la hemocianina es una proteína presente en la hemolinfa de los camarones, responsable del transporte de por lo menos el 90% del oxígeno hacia los órganos y tejidos. Esta proteína también participa en las actividades inmunológicas del camarón, ya que los hemocitos pueden convertir porciones de la hemocianina en una enzima similar a la fenoloxidasa. Adicionalmente, posee homología con varias proteínas del sistema inmune. Es posible que estímulos antigénicos desencadenen reacciones donde la hemocianina genera varias moléculas inmunorreactivas. La medición de esta proteína a partir de muestras de hemolinfa, permite estimar las condiciones fisiológicas del camarón y, en parte, de su capacidad de respuesta inmune. La cuan- tificación de la hemocianina se puede realizar a través de métodos de espectrofotometría, utilizando un lector de microplacas. Concentración de óxido nítrico sintasa: una nueva prueba reportada en 2006 por Hernández et al., hace referencia a la medición de óxido nítrico sintasa (NOS) como criterio para medir la actividad de los hemocitos dentro de las acciones de defensa de un camarón. El óxido nítrico (NO) es el producto de la oxidación del aminoácido L-arginina a L-citrulina mediado por la NOS. Este gas transmisor de señales producido por una célula, penetra a través de la membrana celular y regula la función de otras células. El NO es altamente inestable transformándose rápidamente en nitritos (NO2) y nitratos

(NO3). El NO es extremadamente tóxico y por lo tanto altamente microbicida. Su producción por los hemocitos le otorga un papel de gran importancia en el control de infecciones. El NO puede ser analizado por quimioluminescencia, aunque debe ser liberado de la muestra y la recuperación no siempre es adecuada. Un método para detectar y cuantificar NO, se basa en la transformación del

NO a NO2 y NO3. Para medir la concentración total de nitratos y nitritos (NOx), se pueden usar dos métodos: la reducción química con cadmio o la reducción enzimática utilizando nitrato reductasa. Otra forma de detectar la presencia de NOS en muestras biológicas, es utilizando anticuerpos contra la proteína. Para ello se utilizan anticuerpos de conejo anti-iNOS (NOS inducible presente en los hemocitos), los cuales reconocen la NOS de camarón, pudiéndose así ser utilizados para implementar un método indirecto de ELISA. Se han probado diferentes diluciones de anti-NOS y combinaciones de conjugado anti-conejo, habiendo sido las mejores 1:1000 y 1:40000, respectivamente.

Consideraciones generales sobre parámetros inmunológicos La interpretación de resultados obtenidos con todas las pruebas mencionadas anteriormente, debe hacerse considerando factores que interfieren directamente sobre cada uno de los parámetros inmunes. En los camarones, están principalmente la edad, sexo, estado de muda, estrés (ambiental, nutricional o séptico) y condiciones sanitarias (presencia o ausencia de enfermedad); en el agua de cultivo está principalmente la temperatura, salinidad, pH, oxígeno disuelto y presencia de substancias tóxicas (de origen químico o biológico).

81 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

PRUEBAS MOLECULARES - HEMOGRAMA

Figura 1.9.1 Elementos para el montaje de hemolinfa cuando se hace conteo de hemocitos. De izquierda a derecha se observa una caja con puntas de micropipeta (20-200 mL), micropipeta con volumen graduable (20-200 mL), microtubos de 1.5 mL con tapa y contador de células.

Figura 1.9.2 Punción para la extracción de hemolinfa del seno hemolinfático ventral, ubicado en la unión entre el cefalotórax y el abdomen, ventralmente. Nótese el uso de una jeringa desechable de 1 mL (tipo insulina), la cual contiene una solución anticoagulante.

Figura 1.9.3 Montaje de 20 mL de hemolinfa anticoagulada en una cámara de Neubauer (he- matocitómetro). Debido a que esta cámara posee dos campos de conteo, se pueden montar muestras de 2 animales diferentes al mismo tiempo.

82 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

PRUEBAS MOLECULARES - HEMOGRAMA

Figura 1.9.4 Observación de hemolinfa anticoagulada en cámara de Neubauer, utilizando un microscopio de contraste de fases y el objetivo de 40X.

Figura 1.9.5 Hemocitos de un camarón prea- dulto P. vannamei observados en cámara de Neubauer, utilizando microscopio de contraste de fases y objetivo de 40X. Se pueden observar encerradas en cuadros amarillos, 3 células características de los tipos diferentes de hemocitos que hay reportados: granulares (G), semigranulares (S) y hialinos (H). Sin tin- ción. Amplificación: 400X.

83 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

1.10 Microscopía electrónica de transmisión Objetivo. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) en camarones, tiene el propósito de acceder a lesiones microscópicas en tejidos afectados, con el fin de detectar la presencia o ausencia de agentes infecciosos muy pequeños. Su uso está indicado en la búsqueda de agentes patógenos o lesiones dentro de las células de tejidos afectados. Descripción. La TEM es una herramienta poderosa en el diagnóstico de virus específicos, rickettsias, bacterias intracelulares y otros muy pequeños microorganismos que están asociados y que causan lesiones particulares en las células (Fig. 1.10.1). En las preparaciones para TEM, el patólogo examina las estructuras internas de las células y los organelos celulares, en busca de anormalidades. Una fijación o almacenamiento inadecuado de muestras para TEM, puede ocasionar grandes artefactos o cambios en las células estudiadas, con lo cual se afecta la calidad de la búsqueda y la obtención de resultados concluyentes. Por esta razón, la preparación, seccionamiento, tinción e interpretación de material mediante TEM, es una actividad altamente especializada y debe ser realizada por personal bien entrenado (Fig. 1.10.2). Metodología. Durante el proceso de preparación del fijador así como durante los eventos de fijación y de muestras y su manipulación, siempre deben usarse guantes y gafas protectoras. Para preparar una solución fijadora de trabajo aproximadamente al 6%, se utilizan 10 mL de glutaraldehído 50% grado microscopía electrónica (EM), los cuales se añaden a 76 mL de buffer fosfato 0.15M. Esta so- lución se debe almacenar a 4ºC y se debe utilizar dentro de los siguientes 90 días posteriores a la preparación. Luego de este tiempo, la solución fijadora que no se ha utilizado aún, se debe descartar. Se deben agregar sal y sucrosa a la solución, para ajustarla a la osmolaridad similar a la de los camarones (700 a 800 mmol/kg). Las soluciones de glutaraldehído comercial generalmente vienen en concentraciones de 25%, 50% y 70%. La de 25% es grado histológico y por eso es la más utilizada para TEM en camarones, consiguiéndose en botellas ámbar de 500 mL. Las concentraciones 50% y 70% se consiguen en ampollas de 5 mL. La siguiente tabla adaptada de Lightner (1996), sugiere las cantidades de glutaraldehído y buffer a utilizar, partiendo de las 3 concentraciones comerciales disponibles de glutaraldehído y según la concentración final de la solución fijadora que se quiera preparar:

Glutaraldehído Actividad fijadora en % stock Actividad por ampolla Volumen stock (mL) / Buffer requerido (mL) % activo 1% 4% 6% 25% n/a 4 / 96 16 / 84 24 / 76 50% 2.5 g/5 mL 5 / 245 5 / 57.5 5 / 42 70% 3.5 g/5 mL 5 / 345 5 / 82.5 5 / 53.5

Al igual que en muestras que se preparan para diagnóstico histopatológico, la preservación de los tejidos debe hacerse de manera rápida y a temperatura baja, para evitar cambios en las muestras a causa de la degeneración. En el caso de larvas o postlarvas, éstas deben ser fijadas mediante inmer- sión directa en la solución fijadora de glutaraldehído al 6%, excediendo una relación de fijador-tejido de 10:1. Las muestras deben permanecer fijadas al menos por 24 horas antes de ser procesadas para TEM.

84 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

En juveniles y camarones inferiores a 6 g, se debe inyectar fijador en diferentes partes cubrien- do el hepatopáncreas, región del estómago, región del intestino medio y músculo abdominal. Con tijeras de disección y por debajo de la cutícula (sin atravesar tejido blando), se debe hacer un corte longitudinal por la línea media a los dos lados, para asegurar una adecuada penetración del fijador. Los tejidos de camarón se deben preservar mediante la inyección de solución fijadora de glu- taraldehído al 6% en animales vivos, la cual se debe tener a una temperatura de 4ºC. No se deben fijar camarones muertos y los camarones vivos deben morir por el efecto del fijador en el momento de su inyección. En camarones de más de 6 g, se deben extraer los órganos o tejidos de interés, debiéndolos cortar rápidamente con una cuchilla y manteniéndolos inmersos en la solución fijadora de glutaral- dehído 6% fría. Los cortes deben ser en trozos de pocos milímetros de espesor (máximo 1 x 2 mm). Los camarones o sus partes para TEM, deben ser fijados sin exceder un volumen de tejido mayor a 1 cm3. Los trozos deben ser luego transferidos a frascos rotulados y que contengan solución fijadora fría, buscando una relación de fijador-tejido de 10:1. Estos trozos fijados deben mantenerse por 24 a 48 horas antes de ser procesados para TEM. Luego, se debe eliminar la solución fijadora de glutaral- dehído 6% y debe ser reemplazada por buffer fosfato 0.15M. Esta nueva fijación de tejidos se debe mantener a 4ºC. Los procedimientos posteriores pueden realizarse siguiendo los protocolos estándar para TEM. Las muestras de tejido de camarón pueden ser guardadas por varias semanas en una solución de glu- taraldehído 6% con buffer fosfato, a temperatura de refrigerador. Se deben preparar nuevas soluciones de fijador y de buffer fosfato cada tres meses. Si se requiere mantener muestras de camarones fijadas por tiempo indefinido, se pueden preservar a 4ºC en soluciones de glutaraldehído de 0.5% a 1%.

85 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (TEM)

Figura 1.10.1 Microscopio Electrónico de Trans- misión (HITACHI 8100-TEM). Gobernado por un Microprocesador y funciona con emisión termoiónica entre 75KV y 200 KV. Permite observaciones de 50X hasta 600.000X, con alta capacidad de resolución. Permite gran inclinación del espécimen (+/- 45 grados) de pieza polar. Permite experimentos de calentamiento in situ con una etapa de calentamiento que llega hasta 900 grados. Posee un sistema crio-TEM con un crio-sujetador hasta -170 grados. Su sistema visual posee una cámara CCD tasa TV Gatan de alta calidad para imágenes de hasta 0.5 nm de resolución y la difracción tiene gran inclinación con soporte doble. Las principales aplicaciones son: organización de células y tejidos, estudio de organelos celulares, estudio de especialización morfología de virus, estudios de micropartículas y nanopartículas y, estructura interna de láminas delgadas.

Figura 1.10.2 Microfotografía de un corte de tejido de Penaeus monodon infectado con el virus YHV. Se observan inclusiones citoplásmicas de virus YHV envueltos de manera organizada. También se observan (aunque menos fácilmen- te) inclusiones virales muy delgadas parecidas a fibras con forma de bastón, de nucleocápsides sin envoltura del virus YHV cerca de la membrana. Ampliación: ~50.000X. Foto: Lightner, 1996 (Cortesía de T.W. Flegel, Bangkok, Tailandia).

86 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

1.11 Bioensayos Objetivo. Determinar si el agente causal de una enfermedad es de origen infeccioso (virus, bacterias, hongos, etc.), tóxico (toxinas químicas o biológicas) o, descartando lo anterior, de origen ambiental o por manejo. También se utilizan los bioensayos para evaluar la patogenicidad de una cepa viral o bacteriana inyectada o suministrada vía oral a camarones libres de dichos agentes patógenos. Descripción. Los bioensayos son estudios realizados con seres vivos, camarones en este caso, durante los cuales se busca reproducir una enfermedad detectada en camarones de una población determinada, utilizando como organismos “blanco” camarones sanos y susceptibles a dicha enfermedad. Éstos pueden ser “libres de patógenos específicos” (SPF por su sigla en inglés) o simplemente libres de la enfermedad que se pretende reproducir. La susceptibilidad de los camarones que se utilizan en los bioensayos, hacen referencia a la especie y talla de los animales. La manera de buscar su eventual infección es utilizando batido (macerado) de camarones enfermos y los cuales presentaban manifestaciones de la enfermedad (sacrificados en fase aguda). La aparición de la enfermedad en los camarones susceptibles utilizados en un bioensayo, deberá corresponder al tiempo estimado de aparición de los signos clínicos en los camarones que se enferman en condiciones naturales. Metodología. Los bioensayos son pruebas de desafío, en las cuales se utiliza tejido infectante para realizar de manera experimental, una infección per os (vía oral) en camarones susceptibles. El material infectante debe provenir de camarones vivos (enfermos avanzados o moribundos), que hayan presentado los mismos signos clínicos de la enfermedad en cuestión y procedentes de una misma población (edad y talla similar). La capacidad infectante de este batido de tejido de camarones enfermos, depende de la carga viral o bacteriana que tenga (cantidad de microorganismos por gramo de aquellos que causan la enfermedad) y de la cantidad de tejido que se suministre a los camarones “blanco”. Si existen pruebas moleculares disponibles para el agente etiológico del estudio, se puede establecer de manera semi-cuantitativa (PCR con diluciones seriadas del ADN extraído) o cuantitativa (PCR en tiempo real), la carga del patógeno presente en cada gramo de tejido infectante. Los camarones que van a ser infectados experimentalmente per os, deben estar libres de la enfermedad que se pretende reproducir. Para ello, deben proceder de una población libre de pató- genos conocidos, SPF si es posible y que no hayan presentado o estén presentando signos clínicos de ninguna enfermedad (completamente sanos). Si existen herramientas moleculares de diagnóstico para la enfermedad en cuestión, se debe someter a prueba un grupo de camarones procedentes de la población de donde se utilizarán los animales “blanco” para el estudio. Éstos, deben ser negativos (“no detectado”) al patógeno del cual es objeto el bioensayo. Cuando el objetivo del bioensayo incluye trabajar con un patógeno desconocido y para el cual no existen en el momento pruebas de diagnóstico moleculares, los camarones “blanco” deben ser SPF para que los resultados de la prueba sean concluyentes. Los bioensayos deben realizarse en instalaciones cerradas, con condiciones controladas y con parámetros físico-químicos estables (Fig. 1.11.1 a 1.11.3). Los principales factores que deben mantenerse bajo control durante un bioensayo, son los siguientes: • Calidad del agua: filtrada, recambio constante o frecuente, uso de biofiltros, condiciones bacte- riológicas apropiadas ◊ Temperatura: del agua y del aire de la sala de bioensayos ◊ Luminosidad ◊ Oxígeno disuelto

87 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

◊ pH ◊ Salinidad ◊ Metabolitos potencialmente tóxicos: nitritos, nitratos, amonio y fósforo ◊ Materia orgánica: sedimentada y como partículas en suspensión • Unidades experimentales (UE): acuarios, tinas o tanques (tamaño, forma, transparencia) ◊ Densidad experimental: camarones por L, sin exceder 2.8 g/L de biomasa ◊ Material de las UE: plástico, vidrio, acrílico, fibra de vidrio, concreto, etc. ◊ Volumen de las UE: capacidad de operación ◊ Cercanía a zonas con condiciones térmicas o lumínicas intensas (ventanas, calentadores, congeladores o tragaluces) • Fuente del agua de recambio: reservorio de tierra, tanque sin o con filtración, recirculación, etc. Antes de realizar un bioensayo, debe tenerse un plan de trabajo bien definido, con el protocolo de operación claramente comprendido por la o las personas que participarán en la prueba y definiendo los momentos para cada fase del estudio, tales como fecha de inicio, fecha de infección, pruebas confirmatorias de diagnóstico para la enfermedad en estudio, criterios de decisión para establecer las conclusiones finales y fecha (o condiciones particulares) para dar por terminada la prueba (ej.: luego de 2 días en los que se haya estabilizado la mortalidad). Las cantidades de camarones de cada UE deben ser conocidas el día de la infección experimental, ya que este valor será el 100% de la población de partida. Con base en estos datos, se podrá establecer al finalizar la prueba, la supervivencia en porcentaje. Los datos de mortalidad diaria deben ser observados con rigurosidad y registrados en un formato diseñado para tal fin. Éstos permitirán conocer la tasa de mortalidad diaria y el momento de mayor mortalidad de la prueba, entre otra información de interés.

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

BIOENSAYOS

Figura 1.11.1 Vista de una sala de bioensayos, en la cual se utilizan tanques de vidrio con capacidad para 30 L. En las partes superior e inferior de los tanques, se observa la tubería de aire a través de la cual se conectan las mangueras de aireación para cada uno. Los tanques de arriba están con agua y tienen mangueras de aireación y piedras difusoras en sus extremos (dentro de cada tanque).

88 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

BIOENSAYOS

Figura 1.11.2 Revisión de parámetros físi- co-químicos en un tanque de vidrio durante la realización de un bioensayo. Se observa dentro del tanque el electrodo del equipo, con el cual se obtienen datos de temperatura, salinidad y oxígeno disuelto.

Figura 1.11.3 Alimentación dosificada de camarones P. vannamei durante la realiza- ción de un bioensayo. Nótese la presencia de una cubierta de malla que está siendo levantada para la alimentación y la cual evita pérdida de camarones por saltos hacia el exterior del tanque o hacia otros tanques vecinos.

89 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Recomendación general Es importante hacer una eliminación adecuada de todos los productos de desecho procedentes de pruebas de diagnóstico, así como de camarones que han sido utilizados para extracción de muestras o para bioensayos. Esto, para evitar la contaminación de entornos acuáticos comerciales o silvestres y del propio ambiente.

Apéndice

Métodos para la detección de los principales agentes virales en camarones penaeidos (modificado de Lightner y Pantoja, 2001. En: USDA-UCA, 2001).

Método WSSV IHHNV BP MBV BMN SMV YHV* TSV IMNV PvNV

Directa BF / LM / ++ - +++ +++ ++ - ++ + - - PH / DF

Histopatología ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ ++ ++

Bioensayos ++ + + - + - + ++ + +

TEM / SEM + + + + + ++ + + + +

ELISA CON PAb - - + - + - - ++ - - / MAb Sondas ADN / +++ +++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ + + DBH / ISH

PCR / RT-PCR +++ +++ +++ + - +++ +++ +++ +++ +++

*Grupo YHV. La información sobre los virus IMNV y PvNV, fue suministrada por el Dr. Carlos Pantoja de la Universidad de Arizona, USA (2008).

Definiciones de aplicación de los métodos para cada virus

- = método desconocido o cuya aplicación no está publicada + = método cuya aplicación es conocida o está publicada, pero no frecuentemente practicada o difícilmente disponible ++ = método cuya aplicación provee suficiente exactitud de diagnóstico o sensibilidad en la detección de patógenos para la mayoría de las aplicaciones +++ = método que provee un alto grado de sensibilidad en la detección de patógenos

90 Capítulo 1 - Métodos para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Penaeidos

Abreviaturas para los métodos BF = microscopía de luz de campo brillante para el análisis de improntas de tejidos, montajes húmedos o montajes enteros teñidos. LM = microscopía de luz PH = microscopía con contraste de fases DF = microscopía de campo oscuro EM = microscopía electrónica de secciones o de virus purificados o emipurificadoss ELISA = prueba de enzimas marcadas inmunoabsorbentes PAb = anticuerpos policlonales MAb = anticuerpos monoclonales DBH = hibridación mancha-punto (dot blot) ISH = hibridación in situ

Métodos para vigilancia y diagnóstico de patógenos virales en camarones penaeidos (modificado de Lightner y Pantoja, 2001. En: USDA-UCA, 2001).

Agente Vigilancia Diagnóstico

TSV RT-PCR RT-PCR, sondas de ADN, AB, histopatología

PCR, sondas de ADN, AB, histopatología, WSSV PCR, AB bioensayos RT-PCR, sondas de ADN, AB, histopatología, YHV RT-PCR bioensayos Microscopía directa, histopatología BMN Histopatología

PCR, microscopía directa, histopatología BP/MBV PCR, microscopía directa, histopatología

PCR, sondas de ADN, histopatología IHHNV PCR, sondas de AND

SMV Sondas de ADN Sondas de ADN, histopatología, bioensayos

RT-PCR, sondas de ADN, histopatología IMNV RT-PCR, sondas de ADN

PvNV RT-PCR, sondas de ADN RT-PCR, sondas de ADN, histopatología

La información sobre los virus IMNV y PvNV, fue suministrada por el Dr. Carlos Pantoja de la Universidad de Arizona, USA (2008).

91 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

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96 Capítulo 2

Enfermedades virales del camarón Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

98 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

CAPÍTULO 2

Enfermedades virales del camarón

Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner The University of Arizona Aquaculture Pathology Laboratory 1117 E. Lowell St. Tucson, Arizona 85721 USA

Introducción En poco menos de 40 años, la camaronicultura mundial se ha desarrollado desde sus inicios a nivel experimental, hasta volverse una industria con ingresos de billones de dólares, proveyendo de empleo, directa e indirectamente, a cientos de miles de personas. En los años de 1970 a 1990, la industria dependía completamente de la captura de postlarva silvestre o de postlarva producida a partir de reproductores capturados en el océano. La mayoría de las veces, estos animales eran capturados cerca de la región en donde serían cultivados. Los sistemas de cultivo eran relativamente simples, se usaban tasas muy altas de recambio de agua y las medidas de bioseguridad eran mínimas o no existentes. En esa época se sabía de muy poco de las enfermedades del camarón y todavía menos sobre los mecanismos de defensa humoral y celular especialmente contra agentes virales. Había muy pocos especialistas en enfermedades de camarón y la capacidad de diagnóstico era muy pequeña en la mayoría de las regiones. El uso de antibióticos y agentes quí- micos era práctica común, tanto en los laboratorios de producción de postlarvas como en las granjas. No fue sino hasta 1987, cuando el aumento explosivo de la industria camaronícola fue acompañado de pandemias virales, que rápidamente se puso de manifiesto que las enfermedades ocasionadas por virus eran una de las mayores amenazas para la industria. También, rápidamente se puso en evidencia que la dispersión de esas enfermedades, fue el resultado del traslado sin control tanto de postlarvas como de reproductores. La industria camaronícola del presente ha sido transformada por la necesidad de un mejor control de las enfermedades. Como resultado de los cambios rápidos que comenzaron a principios de los 90’s, la dependencia de la industria sobre el suministro de postlarva silvestre, o de postlarva derivada de reproductores silvestres, ha disminuido bastante. Desde hace algunos años hasta la fecha, poblaciones domesticadas de Penaeus vannamei (también llamado Litopenaeus vannamei) han reemplazado a P. monodon como la principal especie cultivada y se encuentran ya en progreso varios programas para la domesticación de otras especies. Se han descrito ya muchas enfermedades importantes y aunque se han desarrollado métodos para su diagnóstico, existen todavía algunos problemas relativos a su implementación y estandarización. Las medidas de bioseguridad aplicadas a los sistemas intensivos de cultivo se vuelven más comunes cada día. El uso de probióticos se ha vuelto también común tanto en los laboratorios de producción de postlarva como en granjas y se investi- gan ya medidas sofisticadas de control biológico. Como resultado de esto, el uso de antibióticos ha disminuido y se ha vuelto más responsable. Estudios de biología molecular están ayudando a lograr un mejor entendimiento de la relación entre el camarón y los agentes patógenos que lo atacan. El resultado de todos estos avances ha sido un incremento continuo de la producción mundial de ca- marón cultivado. 99 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

En el futuro, se espera que la industria camaronícola mundial tenga fácil acceso a una variedad de especies de camarón domesticadas, genéticamente mejoradas y libres de los patógenos más importantes. Métodos para el diagnóstico de estas enfermedades, tanto en el laboratorio como en el campo, estarán disponibles en el mercado en forma de kits y se mejorarán los mecanismos para su estandarización. De la misma manera, se espera una mejora en los métodos de bioseguridad, los cuales serán aplicados en todos los tipos de sistemas de cultivo, aunque aquellos con mayor control (sistemas intensivos y súper-intensivos) serán más competitivos que los sistemas más tradicionales y extensivos. En general, la eficiencia en la producción y el desarrollo de métodos intensivos de cultivo se verán facilitados a través del mejor entendimiento del camarón, sus patógenos, la ecología microbiana, y el uso de agentes antibacterianos y antivirales ambientalmente seguros.

2.1 Principales enfermedades y métodos de diagnóstico. Las enfermedades que afectan a los camarones de cultivo incluyen síndromes con etiologías infecciosas y no infecciosas (Tabla 1 y Tabla 2). Dentro de las enfermedades infecciosas de importancia económica están aquellas ocasionadas por virus, bacterias, (incluyendo rickettsias), hongos, protozoarios y parásitos metazoarios. Existen también un número de enfermedades no infecciosas de importancia para la industria y dentro de ellas, están incluidas aquellas ocasionadas por extremos ambientales, desbalances nutricionales, agentes tóxicos y desordenes genéticos.

Procedimientos de diagnóstico para la detección de agentes patógenos específicos. En el caso del camarón, se cuenta con herramientas o procedimientos de diagnóstico de dos tipos. Métodos clásicos. Dependiendo del tipo de enfermedad, estos métodos pueden ser lo suficientemente específicos y/o sensitivos para alcanzar un diagnóstico definitivo. • Historial del caso • Apariencia externa y signos clínicos • Examen directo al microscopio • Microbiología (aislamiento y cultivo) • Histología y pruebas histoquímicas • Microscopía electrónica Métodos moleculares. Cuando los métodos clásicos no son lo suficientemente específicos y/o sensitivos, es necesario complementarlos con uno o más de los siguientes métodos moleculares. • Pruebas serológicas con anticuerpos monoclonales o policlonales ◊ Anticuerpos fluorescentes (AF) ◊ ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) • Sondas genéticas (con agente localizador radioactivo o no radioactivo) ◊ Hibridaciones tipo “dot blot” (en membrana de nylon) ◊ Hibridaciones tipo in situ (en cortes histológicos) ◊ Amplificación de ácidos nucleicos (ADN o ARN) por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés)

100 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Tabla 1. Enfermedades de mayor importancia en la camaronicultura del Indo-Pacífico y Este asiático Enfermedades de origen Enfermedades de origen viral Otras enfermedades bacteriano/fúngico WSSV (White spot syndrome virus disease) YHV (Yellow head virus disease) Vibriosis Epicomensales BMN (Baculoviral midgut gland - sistémica/entérica (incluyendo - Leucothrix mucor necrosis virus disease) Síndome de mortalidad - Protozoarios MBV (Monodon baculovirus temprana o EMS) peritrichidos disease) - vibriosis larvaria IHHNV (Infectious hypodermal Gregarínidos and hematopoietic necrosis virus Rickettsia disease) HPV (Hepatopancreatic parvovirus disease)

IMNV (Infectious myonecrosis virus Micosis larvaria Desbalances nutricionales disease)

Fusariosis Síndromes tóxicos

Microsporidios Síndromes ambientales

Fuente: Adaptado a partir de: Lightner D.V. 1996. A handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for diseases of cultured penaeid shrimp. World Aquaculture Society, Baton Rouge, Lousiana, USA.

Tabla 2. Enfermedades de mayor importancia en la camaronicultura de las Américas Enfermedades de origen Enfermedades de origen viral Otras enfermedades bacteriano/fúngico WSSV (White spot syndrome virus disease) Vibriosis TSV (Taura syndrome virus disease) - sistémica/entérica (incluyendo Síndome de mortalidad Epicomensales BP (Baculovirus penaei disease) temprana o EMS) - Leucothrix mucor - vibriosis larvaria - Protozoarios YHV (Yellow head virus disease) peritrichidos IHHNV (Infectious hypodermal NHP (Necrotizing and hematopoietic necrosis virus hepatopancreatitis disease) Gregarínidos disease) Espiroplasmosis (?) HPV (Hepatopancreatic parvovirus disease) IMNV (Infectious myonecrosis virus Micosis larvaria Desbalances nutricionales disease) PvNV (Penaeus vannamei nodavirus Fusariosis Síndromes tóxicos disease)

Microsporidios Síndromes ambientales

Síndrome de Zoea II

101 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Muestreo

Muestreo aleatorio Cuando se requiera muestrear al azar a una población para determinar el estado de salud o la presencia de algún patógeno, el número de camarones que será necesario colectar va a depender de la prevalencia estimada de dicho patógeno y del nivel estadístico de confianza deseado. En este aspecto, la Tabla de Selección de tamaño de muestras tomada de Lightner 1996, es usada con frecuencia como una guía para determinar el tamaño muestral. (ver Tabla 2 en Capítulo 1, página 32 y ver capítulo 7 de Vigilancia epidemiológica del Dr. Ignacio de Blas).

Muestreo no aleatorio En situaciones en las que los camarones presentan claramente signos externos de la enfermedad, se deben seleccionar por lo menos 5-10 camarones que muestren signos característicos de la enfermedad de la que se sospecha o bien alguna otra anormalidad. Para asegurar un diagnóstico acertado, las muestras deben de ser procesadas de inmediato, o a la brevedad posible, de acuerdo al procedimiento o procedimientos que se hayan seleccionado. Los especímenes deberán ser preservados con solución fijadora adecuada o bien empacados en hielo o congelados dentro de un contenedor estéril (por ejemplo, bolsas de plástico).

Preparación de las muestras Al momento de tomar las muestras, también es necesario recabar cierta información y entre- garla al laboratorio que examinará los especímenes. Esto con el objeto de facilitar un diagnóstico acertado, así como también para documentar apropiadamente la epizootiología de la enfermedad, la distribución geográfica y las especies de camarón afectadas. La información recabada debe incluir por lo menos lo siguiente: • Historial del caso. Una explicación breve del porqué se están enviando las muestras. Esto deberá de incluir una descripción de las anormalidades observadas tales como mortandades, crecimiento lento, comportamiento anormal de nado o de alimentación, lesiones externas, cambios de coloración en el exoesqueleto, etc. Si no hay problemas aparentes y las muestras se están colectando para hacer una evaluación de rutina, esto también se debería mencionar. • Especie. Especie (o especies) de camarón de que se trata • Estadío de vida. en el caso de muestras de larvas • Origen de cada grupo de muestras. Esto se refiere al país de origen, nombre de la granja o laboratorio, número de tanque o estanque, etc. • Fecha. en que la muestra fue colectada y fijada • Fijación. Método de fijación o el nombre de la solución fijadora (por ejemplo, Davidson, alcohol etílico al 90-95%, glutaraldehído, formalina al 10%, congelado, etc.)

102 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Preparación de muestras para análisis histológico Las muestras que serán destinadas para un análisis histológico deberán ser de camarones vivos. Los camarones ya muertos son inservibles. Los camarones deberán ser fijados por medio de inyección y/o inmersión cuando aún se encuentren vivos. • Muestras de larvas o postlarvas tempranas. Fijar por inmersión en un volumen de solución fijadora aproximadamente 10 veces la del volumen de la muestra (proporción de 10:1). En cuanto el tamaño del animal lo permita, el cefalotórax de las postlarvas deberá ser pinchado con una aguja de jeringa de insulina para facilitar la penetración del fijador. Posteriormente fijar por inmersión por un lapso de 12 a 24 horas.

Grados de severidad Una forma de documentar de manera semicuantitativa las observaciones que servirán para alcanzar un diagnóstico, es a través de la asignación de grados de severidad. Dicha asignación puede referirse a una lesión en particular o al proceso infeccioso en general. Ver referencia de la Tabla 6 del Capítulo 1, página 46 (Lightner, 1996), donde se ilustra el criterio que se utiliza para la asignación de los grados de severidad. El valor numérico asignado también es útil para determinar tendencias y para la toma de decisiones de manejo tales como: cuándo aplicar un tratamiento, cuándo cosechar, etc.

2.2 Virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (Infectious hypodermic and hematopietic necrosis virus, IHHNV). Nuevo método de PCR para ayudar a diferenciar entre IHHNV infeccioso y no infeccioso en P. monodon. Métodos moleculares (PCR) recomendados por OIE.

Nombre de la enfermedad Necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (enfermedad IHHN); síndrome de la deformidad y enanismo (“runt deformity syndrome” o RDS).

Nombre del agente etiológico Virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (IHHNV).

Características del agente IHHNV es un pequeño parvovirus (diámetro promedio de 22 nm) constituido por una cadena sencilla de ADN (monocatenario).

Métodos preferidos actualmente para la detección del patógeno • PCR usando hemolinfa o tejidos homogenizados tomados a partir de camarones sospechosos u otro tipo de muestras • Histología de rutina, con tinción de hematoxilina/eosina (H&E), en especímenes que muestren signos de la enfermedad de IHHN ◊ Aplicado a muestras histológicas fijadas en solución de Davidson (AFA)

103 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

◊ Aplicado a muestras histológicas tomadas después de 15-30 días de potenciamiento de la enfermedad Existen otros métodos, tales como el uso de sondas genéticas con marcadores de digoxigenina (BS4.5, BA402), las cuales pueden ser aplicadas en formato de hibridación in situ o en “Dot-blot”. Sin embargo, estos métodos tienen mayor aplicación en la investigación.

Rango geográfico de distribución y especies afectadas

Rango geográfico • Ampliamente distribuido en instalaciones de cultivo en las Américas y Asia incluyendo: ◊ América: sureste de los Estados Unidos, México, América Central, Ecuador, Perú, Brasil y numerosas islas del Caribe ◊ Pacífico Central: Hawái, Guam, Tahití y Nueva Caledonia ◊ Asia e Indo-Pacífico: Singapur, Filipinas, Tailandia, Malasia e Indonesia • Se presume que IHHN es enzoótico en camarones penaeidos silvestres del Indo-Pacífico; ha sido detectado también en camarones silvestres del Ecuador, la costa occidental de Panamá y la costa occidental de México • Se ha demostrado la existencia de diferencias a nivel de genoma entre cepas de IHHNV de distintas regiones geográficas (Tang, K.F.J., et al., 2003). Asimismo se ha reportado la existencia de la integración de una porción del genoma de IHHNV al genoma de una población silvestre de Penaeus monodon en África (Tang, K.F.J. & Lightner, 2006). Se desconoce hasta este momento si este fenómeno de integración de una porción del genoma de IHHNV pudiera haber ocurrido en otras poblaciones de P. monodon o en otras especies de camarones penaeidos. En el caso del IHHNV integrado al genoma del camarón, la porción integrada no es infecciosa. Por lo tanto, ha sido necesario desarrollar un método de PCR (Tang et al., 2007) para poder diferenciar camarones infectados con IHHNV (IHHNV infeccioso) y camarones no infectados por IHHNV (IHHNV parcialmente integrado al genoma del camarón = No infeccioso).

Especies afectadas • Se han observado infecciones naturales en: P. stylirostris, P. vannamei, P. occidentalis, P. californiensis, P. monodon, P. semisulcatus y P. japonicus • Debido a que otras especies de camarones penaeidos (P. setiferus, P. duorarum, y P. aztecus) han podido ser infectadas en condiciones de laboratorio, es probable que también ocurran infecciones naturales en otras especies • Especies tales como P. indicus y P. merguiensis parecen ser refractarias a IHHNV • Aparentemente los miembros sobrevivientes de poblaciones que han sido infectadas por IHHNV pueden volverse portadores del virus de por vida y transmitirlo a su progenie y a otras poblaciones por medio de transmisión de tipo vertical y horizontal

104 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Signos clínicos de importancia diagnóstica

P. stylirostris IHHN es una enfermedad de tipo agudo que puede ocasionar altas mortandades en juveniles de esta especie. Larvas y postlarvas infectadas verticalmente no se muestran enfermas sino hasta alcanzar aproximadamente el estadío de PL35 o un poco después. Una vez alcanzada esta edad, es posible observar signos externos, los cuales son seguidos por mortandades masivas. En animales infectados horizontalmente, el período de incubación y la severidad de la infección dependen, hasta cierto punto, del tamaño/edad, siendo los juveniles pequeños los más severamente afectados. Los adultos raramente presentan signos de la enfermedad o mortandades. Los signos externos de la enfermedad no son específicos de IHHN, pero en la etapa aguda de la infección, los juveniles de P. stylirostris muestran una marcada reducción en el consumo de alimento, lo cual es seguido por cambios en el comportamiento y la apariencia. Durante la fase aguda, se ha observado que los camarones de esta especie nadan lentamente hacia la superficie en donde se quedan completamente quietos, se voltean con el vientre hacia arriba, y luego se hunden lentamente hasta el fondo del estanque. Se ha visto que los camarones que muestran esta conducta, pueden hacerlo por horas hasta que se vuelven demasiado débiles para continuar o hasta que son canibalizados por sus congéneres más sanos. En este estadío de la infección, P. stylirostris puede llegar a exhibir una coloración blanquecina con manchas de color crema, lo cual le da al camarón una apariencia moteada (Fig. 2.2.1) Este patrón moteado no es definitivo y tiende a desaparecer un poco más adelante. También se ha observado frecuentemente que en P. stylirostris y en P. monodon infectados por IHHNV, se tiende a adquirir una coloración azulosa bastante distintiva y una opacidad de la musculatura abdominal. Si la enfermedad progresa hasta alcanzar una fase crónica, P. stylirostris también puede sufrir de lo que se conoce como síndrome de las deformaciones y el enanismo (RDS).

P. vannamei En esta especie, IHHN es típicamente una enfermedad de tipo crónico. El síndrome de las deformidades y el enanismo (“Runt Deformity Syndrome” o RDS) que afecta a esta especie ha sido ligado a IHHNV (Fig. 2.2.2). Típicamente, los juveniles afectados por RDS exhiben rostros doblados o deformes, antenas arrugadas, caparazón áspero o rugoso, y otras deformidades (Fig. 2.2.3). Las poblaciones de juveniles con RDS, exhiben típicamente una distribución de tallas relativamente amplia con una proporción de tallas pequeñas (enanos) mucho mayor de lo normal. El coeficiente de varia- ción (CV=La desviación estándar dividida entre el promedio de diferentes grupos de tallas dentro de una población dada) de una población con RDS es típicamente mayor de 30% y puede incluso llegar al 50%, mientras que en poblaciones de juveniles de P. vannamei libres de IHHNV (y por lo tanto sin RDS) los CVs son de entre 10% y 30%.

Procedimientos de diagnóstico en casos de enfermedad

Diagnóstico presuntivo • Presencia de signos clínicos • Historial de las instalaciones de cultivo, de las especies cultivadas, o de la región, que indique la posibilidad de infección por IHHNV

105 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Diagnóstico definitivo A través de los siguientes métodos es posible alcanzar un diagnóstico definitivo tanto a nivel individual como a nivel de poblaciones: • Histopatología directa • Potenciamiento seguido por histopatología o pruebas de hibridación in situ • Bioensayos utilizando P. stylirostris libre de patógenos específicos (“Specific Pathogen Free”/SPF) como la especie indicadora • Pruebas con sondas genéticas, u otras sondas adecuadas en los siguientes formatos: ◊ Hibridación en “Dot-Blot” ◊ Hibridación “in situ” (histología) • El PCR también puede ser utilizado para la detección del virus en muestras de hemolinfa o de tejidos tomadas de camarones sospechosos

Método de histopatología directa para la detección de IHHNV Se basa en la demostración histológica de cuerpos de inclusión intranucleares tipo Cowdry A (CAIs), bastante prominentes (Fig. 2.2.4 y Fig. 2.2.5), eosinofílicos (en preparaciones de especímenes fijados con soluciones que contengan ácido acético, tales como la solución de Davidson AFA y la so- lución de Bouin, y que han sido teñidas con H&E), los cuales a su vez están rodeados de un anillo de cromatina dentro de núcleos hipertrofiados en células de tejidos de origen ectodérmico (branquias, epidermis, epitelio hipodérmico de la parte anterior y posterior del tracto digestivo, cordón nervioso ventral y ganglios asociados) y mesodérmico (órganos hematopoyéticos, glándula antenal, gónadas, órgano linfoide, tejido conectivo y músculo estriado). Cuando son teñidos con el método de Feulgen, estos cuerpos de inclusión son de coloración variable dependiendo del estado de virogénesis y de la cantidad de ADN presente. Por lo tanto, los CAIs en desarrollo pueden ser Feulgen negativos, mientras que aquellos que han alcanzado la madurez mostrarán una reacción positiva en esta prueba. Durante los estadíos larvales de mysis o de postlarva temprana, es posible encontrar CAIs dentro de las células del epitelio del intestino. Es posible encontrar cuerpos de inclusión CAIs dentro de las células epiteliales de los túbulos del hepa- topáncreas, pero esto ocurre muy raramente y es por lo general acompañado de infecciones severas en otros de los tejidos ya mencionados.

Pruebas de hibridación con sondas genéticas específicas para IHHNV • Hibridación tipo “Dot blot” usando sondas genéticas no radio activas con marcadores de digoxigenina (DIG) En el procedimiento tipo “Dot-blot” para el diagnóstico de IHHNV, las muestras de tejido homogenizado son inmovilizadas por adsorción en una membrana de nitrocelulosa o nylon y luego hibridadas con sondas genéticas de ADN (por ejemplo la sonda BS4.5 u otras específicas para IHHNV) marcadas con DIG (digoxygenin-11-dUTP). Después de la hibridación y de la reacción de revelado, las muestras de tejido positivas se observan marcadas por la presencia de un precipitado de color azul-negro o púrpura, el cual varía en intensidad dependiendo de la concentración del virus en la muestra (Fig.2.2.6). La presencia de manchas de color rosado o salmón, son debidas a la reacción no específica de la sonda con componentes desconocidos en el tejido del camarón. Para evitar confusión en la interpretación de los resultados de esta prueba, se deberán incluir siempre los controles apropiados.

106 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Tales controles pueden ser: tejido de camarón SPF (control negativo); tejido de camarón IHHNV positivo (control positivo); y un grupo de muestras cuya condición IHHNV sea desconocida así como un control negativo, y uno positivo sujetos a una prueba de hibridación sin sonda, únicamente expuestos al anticuerpo y al substrato de revelado. • Hibridación in situ La prueba de hibridación in situ para la detección de IHHNV (en cualquier fase de la infección) puede aplicarse sin ningún problema a especímenes de camarón fijados en formalina o solución de Davidson (AFA) y bañados en parafina. Por medio de esta prueba, es posible observar la formación de un precipitado azul-negro o púrpura en cualquier lugar del cuerpo del camarón en donde el ADN del virus IHHN (y presumiblemente mARN) se encuentre presente (Fig.2.2.7). En una prueba típica de hibridación in situ, las células con CAIs, muestran una intensa reac- ción nuclear a la sonda, especialmente en la cromatina marginada o en la superficie interna de la membrana nuclear. Mediante esta prueba se ha demostrado con frecuencia, que los núcleos picnó- ticos y núcleos de células aparentemente normales también pueden contener ácidos nucleicos de IHNNV. Muchas células positivas para IHHNV también muestran acumulaciones citoplasmáticas densas del virus. De la misma manera, se puede observar con frecuencia una reacción positiva a la sonda asociada a los fragmentos de células necróticas, en el debris extracelular y en el contenido de los fagolisosomas de los fagocitos del corazón, branquias y otros tejidos. Comúnmente, la porción acelular de la cutícula del camarón (infectado por IHHNV o no) toma una coloración azul debido a la reacción no específica de la sonda. Esta coloración azul es debida a la presencia de la quitina, un polímero complejo de n-acetilglucosamina, el cual se adhiere (tal vez electrostáticamente) al ADN de la sonda.

Procedimientos no letales para el análisis de reproductores Animales reproductores de las especies P. vannamei, P. stylirostris y P. monodon pueden ser examinados individualmente para determinar la presencia de IHHNV por medio de una biopsia no letal.

Muestra La muestra consiste de un apéndice, tal como el segundo o tercer pleópodo, un proceso branquial, o uno de los maxilípedos. Después de obtener el apéndice, este debe ser preservado ya sea por congelación, en solución de Davidson o en alcohol etílico al 95% y finalmente procesado de acuerdo al método de diagnóstico de preferencia. Cuando se utiliza hemolinfa como tejido para muestreo, debe ser procesada ya sea inmediatamente o preservada por congelación o fijación en alcohol al 95% y subsecuentemente procesada.

Pruebas de diagnóstico Dos de las pruebas más apropiadas para examinar este tipo de biopsias son PCR e hibridación in situ con la sonda genética BS4.5 específica para IHHNV (u otras sondas para IHHNV). Aunque menos sensitiva, la hibridación en formato “Dot blot” también pueden utilizarse para analizar este tipo de muestras.

107 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Histología de rutina El diagnóstico de esta enfermedad está basado en la presencia de inclusiones intranucleares patognomónicas (CAI). El corte histológico del apéndice es hecho en el plano longitudinal medio para de esta manera proveer una panorámica tan amplia como sea posible de los tejidos presentes (epidermis, subcutis y fibras nerviosas). El corte resultante es examinado para determinar la presencia de inclusiones intranucleares tipo CAI (las cuales aparecen como cuerpos elongados en las células de las fibras nerviosas). Mediante esta técnica es posible detectar muchos de los animales infectados en una población, sin embargo, se desconoce la sensibilidad del procedimiento y por lo tanto no es recomendable para certificar la condición SPF de una población.

Método de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) Originalmente, los métodos de PCR recomendados por la OIE para la detección de IHHNV incluían dos pares de iniciadores (o cebadores) conocidos como 392F/R y 389F/R (Krabsetsve et al., 2004; Tang y Lightner, 2002). Estos son considerados como los más adecuados para detectar todas las variantes genéticas conocidas, incluidos los tipos 3A y 3B, que son los que se encuentran integrados en el genoma de P. monodon de la zona Indo-Pacífica occidental,África oriental, Australia y la India (Tang y Lightner, 2006; Tang et al., 2007). Afortunadamente, existe un par de iniciadores (309F/R; Tang y Lightner, 2006; Tang et al., 2007) que reconoce únicamente los tipos 1 y 2 (infeccioso), pero no los tipos 3A y 3B (no-infeccioso) y que puede ser utilizado para diferenciar entre ambos. La necesidad de contar con un método de PCR que pueda ayudar a distinguir entre los tipos 3A-3B (no infeccioso) y los tipos 1 y 2 (infeccioso) es de particular interés en aquellas zonas en donde se presenta comúnmente el fenómeno de la integración, pero en donde se desea al mismo tiempo excluir este virus. Por ejemplo, si se desea utilizar un grupo de camarones silvestres P. monodon del Océano Indico como candidatos para desarrollar una población libre de IHHNV, un resultado positivo usando los iniciadores 392F/F y/o 389F/R, sería inconcluso ya que no se podría saber si son portadores de IHHNV infeccioso o no-infeccioso. Para poder determinar el tipo, se necesitaría analizar las muestras positivas con los iniciadores 309F/R. Un resultado positivo indicaría que los camarones son portadores de IHHNV infeccioso (tipos 1 ó 2). Se han desarrollado también métodos de PCR en tiempo real (qPCR) para IHHNV (Dhar et al., 2001; Tang y Lightner, 2001), los cuales son altamente sensibles y con un límite teórico de detección de una sola partícula viral. Sin embargo, estos no pueden distinguir entre los tipos 3A-3B y 1-2 y un resultado positivo en muestras originarias de las regiones antes mencionadas, aún tendría que ser sometido a la prueba con los iniciadores 309F/R para determinar el tipo. De acuerdo a la OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal; www.oie.int) PCR es el mé- todo recomendado para la vigilancia dirigida y destinada a la declaración de la ausencia de IHHNV, principalmente por motivos de utilidad, disponibilidad, sensibilidad y especificidad diagnósticas.

108 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Enfermedades virales del camarón IHHNV

Figura 2.2.1 Especimenes de P. stylirostris durante la fase aguda de la enfermedad causada por IHHNV. Nótese el patrón anormal de coloración en los segmentos abdominales impartiéndole al camarón una apariencia bandeada o moteada. Tanto el camarón en la esquina superior izquierda (solamente se observan los pleópodos) como el de la esquina inferior derecha (solamente se observa la cabeza), se econtraban extremadamente letárgicos (postrados de lado) y posiblemente moribundos

Figura. 2.2.2 Ejemplos adicionales de deformaciones corporales en P. vannemei a consecuencia de la enfermedad causada por IHHNV (síndrome de las deformaciones y el enanismo). Nótese la deformación del sexto segmento abdominal en 3 de los 4 camarones que se muestran.

Figura. 2.2.3 Se muestran varios ejemplos de rostrums deformados en P. vannamei con IHHNV en fase crónica (síndrome de las deformaciones y el enanismo). El rostrum puede llegar a mostrar desviaciones prácticamente en cualquier dirección.

109 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura. 2.2.4 Fotomicrografía a bajo aumen- to de un corte histológico de un juvenil de P. stylirostris en la etapa aguda de la enfermedad causada por IHHNV (G4=grado severo). La pre- paración muestra un corte hecho a través del epitelio cuticular y el tejido conectivo subcuticular, en la parte dorsal del cuerpo, justo posterior al corazón. Se pueden observar numerosas células necróticas con núcleos picnóticos o con cuerpos de inclusión intranucleares eosin- ofílicos de tipo patognomónico (inclusiones de Cowdry tipo A o CAI). Las flechas señalan algunos ejemplos. Tinción; H&E de Mayer-Bennett. Magnifiación: 830X.

Figura. 2.2.5 Fotomicrografía de una lamela branquial mostrando tres células adyacentes con cuerpos de inclusión intranuclear de IHHNV tipo CAI, dentro de los núcleos hipertrofiados (varios ejemplos marcados por las flechas). Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnifi- cación: 1,800X.

Figura. 2.2.6 Resultados de una prueba de hi- bridación en formato de punto-mancha (“Dot- blot”) para IHHNV. Se utilizó una sonda de ADN, marcada con DIG, específica para la de- tección de IHHNV. Las muestras de hemolinfa positivas presentan la deposición de un precipitado de color azúl o púrpura, mientras que las muestras negativas no muestran precipitado alguno

110 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Figura. 2.2.7 Resultados de una prueba de hibri- dación in situ para IHHNV. Se utilizó una sonda de ADN, marcada con DIG, específica para la detección de IHHNV. Corte medio-sagital de un juvenil de P. vannamei con síndrome RDS (RDS=“Runt deformity syndrome” o Síndrome de las deformaciones y el enanismo). Se puede observar una reacción positiva de la sonda en varios CAIs y restos celulares así como también en la hemolinfa. Tinción: Bismarck Brown y sonda genética marcada con DIG. Magnifica- ción: 600X.

2.3. Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (White spot syndrome virus, WSSV) Nueva distribución geográfica. Métodos moleculares (PCR) recomendados por OIE. Resisten- cia significativa contra WSSV en líneas panameñas de P. vannamei.

Nombre de la enfermedad Síndrome de la mancha blanca

Agente etiológico Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) En la literatura (principalmente la referente a los primeros reportes de esta enfermedad) se hace mención a por lo menos tres “virus” dentro del complejo del síndrome de la mancha blanca (WSSV). Hoy en día se sabe que todos son en realidad el mismo agente.

Agente • HHNBV = “Hypodermal & hematopoietic necrosis baculovirus” (baculovirus de la necrosis he- matopoyética e hipodérmica); SEED= “Shrimp Explosive Epidermic Disease” (enfermedad ex- plosiva de la epidermis del camarón); “China virus disease” (enfermedad del virus de la China) • RV-PJ = “Rod-shaped nuclear virus of Penaeus japonicus” (virus intranuclear cilíndrico de Pe- naeus japonicus) • SEMBV = “Systemic ectodermal and mesodermal baculovirus” (baculovirus sistémico del ecto- dermo y del mesodermo); enfermedad roja; enfermedad de las manchas blancas • WSBV = “White spot baculovirus” (baculovirus de la mancha blanca); síndrome de la mancha blanca; enfermedad de la mancha blanca Hoy en día también se sabe que no se trata realmente de un baculovirus sino de un virus completamente diferente, con características propias y para el cual el Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) ha asignado WSSV al género Whispovirus (género único) dentro de una nueva familia

111 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos que lleva el nombre de familia Nimaviridae. Aunque se han identificado un sinnúmero de cepas geo- gráficas de WSSV con variabilidad genotípica, todas ellas están clasificadas como una única especie dentro del género Whispovirus (Lo et al., 2012). WSSV es un virus de doble cadena de ADN (bicatenario), presenta forma elíptica a cilíndrica, membrana trilaminar y los viriones tienen un tamaño de 80-120 x 250-380 nm. En preparaciones teñidas negativamente, es posible observar la presencia de un apéndice o “cola”. El genoma tiene un tamaño aproximado de 290 kbp, lo cual lo hace uno de los virus más complejos que infectan al camarón.

Métodos preferidos actualmente para el diagnóstico de WSSV: • Métodos histológicos de rutina con tinción de hematoxilina/eosina (H&E) • Método rápido de campo para la tinción de improntas • Hibridación in situ con sondas genéticas específicas • Hibridación en formato “dot blot” con sondas genéticas específicas • PCR con pares de iniciadores específicos para la detección de WSSV (por ejemplo, el método reconocido por la OIE y kits comerciales).

Rango geográfico de distribución y especies afectadas

Rango geográfico Después de su aparición en 1992-1993 en el noroeste de Asia, WSSV se dispersó rápidamente a través de la mayoría de las regiones camaronícolas de Asia y del Indo Pacífico incluyendo China, Japón, Corea, Tailandia, Indonesia, Taiwán, Vietnam, Malasia e India. Sin embargo, debido a que la industria depende mucho del transporte regional e internacional de camarón vivo, la distribución de éste y otros virus ha continuado su expansión. En noviembre de 1995, ocurrió el primer caso confirmado de WSSV en el hemisferio occidental. En este caso, se trataba de camarones cultivados (P. setiferus) en una granja del sur del estado de Texas. En la vecindad de la granja afectada se encontraba una planta procesadora de camarón, la cual se sospecha pudo haber sido el foco de la infección, ya que era uno de los mayores importadores y reprocesadores de camarón proveniente de zonas afectadas por WSSV en Asia. Más adelante, a finales del año 1999, ocurrió el primer caso confirmado de WSSV en América Central. Hoy en día, la enfermedad se ha dispersado a México, Nicaragua, Honduras, Costa Rica, Panamá, Ecuador, Perú, Colombia y Brasil. Más recientemente, se han confirmado por primera vez la presencia de brotes de WSSV en Arabia Saudita (2010), Mozambique (2011) y en la costa oeste de Madagascar (2012) (Tang et al., 2012, 2013).

Especies afectadas Infecciones naturales. Se han observado infecciones naturales en las siguientes especies: Penaeus monodon, P. japonicus, P. chinensis (=orientalis), P. indicus, P. merguiensis, P. setiferus, P. stylirostris y P. vannamei. Infecciones experimentales. En estudios de laboratorio, una cepa de virus originaria de Tailandia resultó altamente patogénica para las siguientes especies: P. vannamei, P. stylirostris, P. aztecus, P. duorarum y P. setiferus.

112 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Existen muy pocos casos documentados que demuestren resistencia significativa a la infección con WSSV. Una de las excepciones es la resistencia reportada en tres familias de P. vannamei originarias de un programa de selección en Panamá (Cuéllar-Anjel et al., 2012). En este estudio, después de 17 días de haber sido expuestos a WSSV por el método per os, estas tres familias resultaron con sobrevivencias de 23%, 26% y 57%. No se detectó WSSV en los sobrevivientes al ser analizados por medio de PCR.

Signos clínicos de importancia diagnóstica • Se ha reportado que durante la fase aguda de la enfermedad, los camarones tienden a mostrar una reducción en el consumo de alimento, se vuelven letárgicos, la cutícula se desprende fácil- mente y presenta manchas blancas (de ahí el nombre dado a la enfermedad) de aproximadamente 0.5 a 2.0 mm de diámetro, las cuales son más conspicuas en la parte interna del caparazón. Es posible que las manchas blancas representen depósitos anormales de sales de calcio en el epitelio cuticular • En muchos casos, como sucede con los penaeidos americanos, los camarones moribundos presentan una coloración rosada a rojiza (de ahí el nombre de la “enfermedad roja”) debido a la ex- pansión de cromatóforos del epitelio cuticular. En estos casos, la presencia de manchas blancas es limitada o ausente (Fig. 2.3.1, 2.3.2 y 2.3.3) Las poblaciones de camarón que presentan estos signos clínicos tienden a exhibir altas tasas de mortandad acumulada, alcanzando hasta el 100% de 3 a 10 días después de que se observan los primeros signos.

Factores ambientales Se ha reportado una marcada influencia de la temperatura del agua en la manifestación de la enfermedad (Vidal et al., 2001, Granja C.B. et al., 2003). Las temperaturas medias situadas entre los 18°C y los 30°C predisponen a los camarones a brotes de WSSV y a mortandades subsecuentes.

Procedimientos de diagnóstico en casos de enfermedad

Diagnóstico presuntivo • La presencia de signos clínicos tal y como se describió anteriormente • Historial de las instalaciones de cultivo, de la especie cultivada, o de la región, que indique la posibilidad de que haya una infección por WSSV (por ejemplo, la importación previa de camarones penaeidos, ya sea PLs, reproductores, etc., desde una región en donde recientemente haya habido un brote de WSSV) • Demostración de núcleos hipertrofiados y vacuolizados, visibles en preparaciones o improntas de tejido epitelial y tejido conectivo del estómago y/o de las branquias, en camarones que exhi- ban signos clínicos de la enfermedad tal y como se describió anteriormente

Diagnóstico definitivo Para llegar a un diagnóstico definitivo de WSSV, se pueden utilizar cualquiera de los siguientes métodos:

113 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Métodos histológicos de rutina • El diagnóstico histológico de WSSV está basado en la demostración de inclusiones intranucleares prominentes, de color eosinófilo a basófilo pálido (con tinción de H&E), Feulgen positivas, las cuales se encuentran dentro de núcleos hipertrofiados, comúnmente en las células epiteliales y el tejido conectivo y con menos frecuencia en el epitelio de la glándula antenal, en las células parenquimales del órgano linfoide, en el tejido hematopoyético y en los fagocitos fijos localizados dentro del corazón (Fig. 2.3.4, 2.3.5 y 2.3.6) • Durante la fase temprana de desarrollo, los cuerpos de inclusión de WSSV son eosinofílicos, centro-nucleares, rodeados de un halo claro y un anillo de cromatina, lo cual los hace muy parecidos a los cuerpos de inclusión de IHHNV. En este estadío es difícil distinguir entre ambos, a menos que se utilice hibridación in situ con sodas genéticas específicas (Fig. 2.3.7 y 2.3.8) • Sin embargo, durante la etapa más avanzada de la infección de WSSV, los tejidos infectados presentan cuerpos de inclusión más grandes y más desarrollados, no muestran un halo y son de un color basofílico pálido, lo cual los hace fácilmente distinguibles de los cuerpos de inclusión de IHHNV. Usualmente los núcleos de las células infectadas por WSSV presentan una sola inclu- sión, pero ocasionalmente se pueden llegar a observar inclusiones múltiples (Fig. 2.3.9)

Método rápido de campo para la tinción de preparaciones en húmedo. Este método está basado en la visualización de cuerpos de inclusión intranucleares de WSSV, a partir de tejidos previamente fijados en solución de Davidson. Las piezas de tejido fijado son re- hidratadas, teñidas con hematoxilina-eosina de Mayer-Bennet y examinadas con un microscopio compuesto. Este protocolo fue diseñado originalmente en China y luego modificado en la Universidad de Arizona para la detección rápida de WSSV. Con este método, el biólogo encargado de cualquier laboratorio de producción de postlarvas o granja, puede efectuar un diagnóstico definitivo si previamente se ha familiarizado con la apariencia microscópica de las lesiones causadas por WSSV (como se observan por medio de histología con tinción H&E) (Fig. 2.3.10). En el libro titulado “A handbook of pathology and diagnostic procedures for the major diseases of penaeid shrimp” (Lightner, 1996) es posible encontrar referencias fotográficas, otros métodos de diagnóstico y una descripción de las signos clínicos y de las lesiones causadas por WSSV a nivel histológico.

Materiales y equipo: A continuación se proporciona una lista del material necesario: • Microscopio compuesto • Pipetas Pasteur o gotero • Tijeras y navaja fina o bisturí • Pinzas de punta fina • Portaobjetos y cubreobjetos de vidrio • Solución fijadora de Davidson • Papel filtro o bolsas de té vacías (para envolver las piezas de tejido) • Seis contenedores pequeños (25-100 ml de capacidad) o cajas de Petri • etanol al 50 y 70% • Hematoxilina (de Mayer/Bennett) • Eosina “Y” al 2% (solución acuosa) • Agua corriente • Agua destilada 114 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Selección de la muestra: Para llevar a cabo esta prueba se deben de utilizar únicamente animales moribundos o que muestren signos agudos de la infección (por ejemplo, letargia, coloración café obscura o rojiza, altas tasas de mortandad, etc.). Al menos en el caso P. vannamei o P. stylirostris no es común observar las manchas blancas que característicamente se observan de manera más conspicua en otras especies tales como P. monodon.

Fijación: Este protocolo ha sido diseñado para su uso con camarones o partes de camarón que han sido previamente fijados con solución de Davidson AFA (4-24 horas) y luego transferidos a alcohol etílico al 70%.

Procedimiento: • Tome la muestra y fíjela con la solución de Davidson siguiendo el método usual • Prepare seis contenedores con las siguientes soluciones: a) etanol 70% d) hematoxilina b) etanol 50% e) agua corriente c) agua destilada f) eosina “Y” al 2% (Para prevenir evaporación mantenga los contenedores cubiertos) • Después de un período mínimo de fijación de 4 horas para postlarvas y juveniles pequeños (o piezas de tejido) y de 24 horas para juveniles grandes y adultos, remueva el estómago y ambas cubiertas de las branquias (la capa de cutícula que recubre a la cámara branquial). Envuelva los tejidos en papel poroso o colóquelos dentro de una bolsa de té vacía para evitar perderlos durante los lavados • Sumerja el paquete de tejidos en el alcohol al 70% por un período de 1 hora y media. Haga un cambio de alcohol fresco al 70% y deje los tejidos en el mismo por otra hora y media. Nota: no deje que los paquetes se sequen durante ninguna de las fases de este procedimiento • Escurra bien el paquete al sacarlo del alcohol al 70%, y transfiéralo aún húmedo al alcohol al 50%, en donde deberá de permanecer por 15 minutos • Escurra el paquete y transfiéralo al contenedor con agua destilada por un período de tiempo de 5 minutos. Reemplace el agua 6 veces durante este lapso de tiempo. Escurra el exceso de agua del paquete y transfiéralo a la hematoxilina por un período de tiempo de 25 minutos • Escurra la hematoxilina y sumerja el paquete en agua corriente por un período de 25 minutos. Reemplace el agua 6 veces durante este lapso de tiempo • Escurra el exceso de agua y coloque el paquete en la solución de eosina al 2% por un período de tiempo de 1-2 minutos • Enjuague el paquete brevemente con agua destilada • Coloque la muestra sobre una gota de agua destilada en un portaobjetos limpio. Examine por separado los tejidos de un solo animal • Con la ayuda de unas pinzas de punta fina, desprenda de la cutícula del estómago (o de la cubierta de las branquias) la capa de epitelio y colóquela en el portaobjetos. Resulta un poco más difícil desprender la capa de epitelio del estómago, pero éste es uno de los mejores órganos para la detección de los cuerpos de inclusión de WSSV. Usando una navaja de rasurar, es posible

115 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

cortar el estómago en piezas pequeñas (en cuadros de 2-3 mm) las cuales son colocadas en el portaobjetos y con pinzas finas se les puede desprender la capa de epitelio • Una vez que se han obtenido los fragmentos de tejido epitelial, se agrega un poco de agua si es necesario y se le coloca encima un cubreobjetos • Examine los tejidos con la ayuda de un microscopio compuesto (con aumentos de 20 o 40X). Los organismos infectados por WSSV presentan cuerpos de inclusión bastante prominentes, de tinción variable (de eosinofílico a basofílico), los cuales son aproximadamente 2-3 veces más grandes que el tamaño del núcleo y generalmente muy numerosos. Los cuerpos de inclusión tempranos tienen un parecido muy grande a los cuerpos de inclusión tipo Cowdry A que aparecen a consecuencia de la infección por IHHNV. Los cuerpos de inclusión de WSSV más tardíos o maduros tienden a aparecer más basofílicos (generalmente de color morado) y de forma variable (de circular a irregular)

Diagnóstico de WSSV usando sondas genéticas • En varios países tales como, China, Japón, Tailandia, y los Estados Unidos, se han desarrollado sondas genéticas para la detección de WSSV • Los detalles de los procedimientos para el uso de estas sondas están disponibles a través de las compañías o grupos distribuidores de las sondas o de los estuches (“kits”) completos para efectuar las pruebas. El Manual Acuático de la OIE también proporciona detalles del procedimiento • Las células de los tejidos infectados por WSSV se tiñen intensamente en los lugares en donde la sonda se ha hibridado con el material genético del virus (Fig. 2.3.7 y 2.3.8) • El virus WSSV es “reconocido” únicamente por la sonda específica para WSSV. Ninguna de las otras sondas (por ejemplo para IHHNV, BP, HPV, etc.) reacciona con WSSV

Detección de WSSV por medio de la reacción de anticuerpos monoclonales Se ha reportado también el desarrollo de varios métodos para la detección y diagnóstico de WSSV utilizando anticuerpos monoclonales (B. Poulos et al., 2001; Y. Takahashi et al., 2003) (Fig. 2.3.9). Estos anticuerpos reaccionan con una de las proteínas estructurales del virus y pueden ser aplicados a muestras de especímenes fijados en solución de Davidson (Pouloset al., 2001) o en membranas a través de flujo lateral (Y. Takahashiet al., 2003). Para el uso de los anticuerpos de acuerdo al método desarrollado por Poulos et al., 2001, no es necesario impregnar los especímenes en parafina (aunque el método también funciona en cortes histológicos en parafina). En el caso del “Shrimple”, desarrollado por Y. Takahashi et al., 2003, se requiere de tejido fresco o congelado, pero no se puede usar tejido fijado.

Método de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) Existen hoy en día un sinnúmero de métodos de PCR para la detección de WSSV, los cuales utilizan iniciadores o cebadores diseñados a partir de diferentes regiones del genoma del virus. El protocolo que ha sido recomendado por la OIE es el protocolo anidado, o de dos pasos, publicado originalmente por Lo et al., 1996. Sin embargo, más recientemente se ha publicado otro método, el cual ha sido validado por medio de la comparación con el de Lo et al., 1996, y que consiste en un solo paso, acortado la duración de la prueba pero al mismo tiempo manteniendo la especificidad y sensibilidad (Nunan & Lightner, 2011). Otro protocolo recomendado por OIE es el de PCR de tiempo real (Durand y Lightner, 2002), el cual tienen un límite de detección de cuatro partículas virales.

116 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

La OIE también considera aceptable el uso de kits comerciales de PCR para la detección de WSSV siempre y cuando hayan sido validados de acuerdo a sus lineamientos. Para una lista de kits certificados por la OIE para este fin se puede consultar el siguiente sitio web (http://www.oie.int/en/ our-scientific-expertise/certification-of-diagnostic-tests/the-register-of-diagnostic-tests/). De acuerdo a la OIE el PCR anidado y la secuenciación son los dos métodos recomendados para declarar la ausencia de la enfermedad. Esta prueba debe utilizarse únicamente con muestras de juveniles y adultos. En estadíos más tempranos, tales como huevo, larva y postlarva, la infección puede estar presente a niveles por debajo de los límites de detección del método, pudiendo resultar en falsos negativos. Enfermedades virales del camarón WSSV

Figu 2.3.1. Cuatro juveniles P. monodon mostrando signos de la infección por WSSV. El camarón de la parte superior y el de la derecha casi no muestran manchas blancas, pero se puede distinguir una coloración rosada a café-rojiza causada por la expansión de los cromatóforos subcuticulares. Es posible que ésta coloración rojiza sea más aparente durante la etapa aguda de la enfermedad. El camarón de la izquierda y el de la parte inferior muestran las manchas blancas que característicamente aparecen en ésta especie al pasar la etapa aguda de la infección.

Figura 2.3.2. Caparazón de un juvenil de P. monodon con la enfermedad de la mancha blanca (WSSV). Las manchas blancas son de- pósitos calcáreos localizados en la porción interna del exoesqueleto. Fotografía cortesía P. Saibaba (S.K.B.R. College, Amalapuram, India).

117 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Enfermedades virales del camarón WSSV

Figura 2.3.3. Caparazón de un juvenil de P. vannamei con la enfermedad de la mancha blanca (WSSV). Se a observado que en el caso de las especies de camarones peneidos americanos, la presencia de manchas blancas no es una característica muy común durante las epizootias de WSSV. Sin embargo, se pueden llegar a presentar, como se observa en el espécimen que se muestra en esta figura.

Figura 2.3.4. Microfotografía de un corte his- tológico a través del estómago de un juvenil P. chinensis infectado con WSSV. Se observa una abundacia de cuerpos de inclusión intranuclear prominentes, ubicados en el epitelio cuticular y el tejido conectivo sub-cuticular (algunos ejemplos son señalados por las flechas). Las células muestran cuerpos de inclusión intranuclear en diferentes fases de la infección. Predominando en este fotogra- fía se pueden observar cuerpos de inclusión en la fase temprana de la infección, los cuales están localizados en la parte central del núcleo, son eosinofílicos y rodeados de un halo claro creado por un artefacto de fijación que los separa de las membranas nucleares y la cromatina marginada (lo cual los hace muy similares a los cuerpos de inclusión de IHHNV). Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnificación 900X.

Figura 2.3.5. Corte histológico a través del estómago de un juvenil P. stylirostris infectado experimentalmente con WSSV. Se puede observar una abundacia (grado G4) de cuerpos de inclusión intranucleares característi- cos de WSSV (algunos ejemplos señalados con flechas). Tinción: H&E de Mayer-Benne- tt. Magnificación: 900X.

118 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Figura 2.3.6. Corte histológico a través del estómago de un juvenil P. vannamei infectado experimentalmente con WSSV. Se puede observar una abundacia (grado G4) de cuerpos de inclusión intranucleares característi- cos de WSSV. Tinción: H&E de Mayer-Benne- tt. Magnificación: 900X.

Figura 2.3.7. Corte histológico a través del estómago de un juvenil P. vannamei, el cual ha sido sometido a una prueba de hibrida- ción in situ con una sonda de ADN, marcada con DIG, específica para la detección de este virus. La sonda ha reaccionado intensamente con cuerpos de inclusión intranucleares (los cuales contienen WSSV) en varios tejidos del camarón incluyendo el epitelio cuticular del estómago. Tinción: Bismarck Brown y sonda genética marcada con DIG. Magnificación: 900X.

Figura 2.3.8. Corte histológico a través de la glándula antenal de un juvenil P. vannamei, el cual ha sido sometido a una prueba de hibridación in situ con una sonda de ADN, marcada con DIG, específica para la detec- ción de este virus. Se muestra una reacción bastante intensa a la sonda dentro de los nú- cleos de las células infectadas en el epitelio de la glándula antenal. Tinción: Bismarck Brown y sonda genética marcada con DIG. Magnificación: 450X.

119 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 2.3.9. Ejemplo de los resultados obtenidos al usar anticuerpos monoclonales para la detección de WSSV en muestras de tejidos rehidratados, previamente fijados en solución de Davidson’s. Esta fotomicrografía muestra una porción de una lamela branquial y la deposición de un precipitado azúl obscuro dentro de los núcleos de las células infectadas por WSSV en donde los anticuerpos han reaccionado con las partículas virales. Tin- ción: Bismarck Brown.

Figura 2.3.10. Ejemplo del método rá- pido de campo para la tinción de preparaciones en húmedo para el diagnóstico de WSSV. Esta microfotografía ilustra el resultado final después de la tinción con H&E de Mayer-Bennett. El tejido que se muestra es epitelio cuticular de la cubierta de la cámara branquial. Se pueden observar claramente los cuerpos de inclu- sión intranuclaer característicos de WSSV (Flecha).

120 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

2.4. Virus del Síndrome de Taura (Taura syndrome virus, TSV)

Nombre de la enfermedad Síndrome de Taura (TS); enfermedad de Taura; enfermedad de la cola roja.

Agente etiológico Virus del Síndrome de Taura (TSV)

Agente El virus del síndrome de Taura (TSV) tiene una morfología icosahédrica, las partículas tienen un diámetro promedio de 30-32 nanómetros, con una densidad de 1.337 g/ml, el tipo de replicación es citoplásmico, los sitios de replicación son Feulgen negativos, contiene ARN monocatenario con una longitud de aproximadamente 10 kb, y la cápside está compuesta de tres proteínas estructurales principales (49, 36.8 y 23 kDa) y dos secundarias (51.5 y 52.5 kDa). El Comité Internacional de Ta- xonomía de Virus (ICTV) en su 9° informe, ha asignado a TSV dentro del género Aparavirus, familia Dicistroviridae.

Métodos preferidos actualmente para la detección y el diagnóstico • Histología de rutina con tinción de H&E • Hibridación in situ con sondas genéticas específicas para TSV • Bioensayos en combinación con histología utilizando camarones juveniles SPF P. vannamei como indicadores de la presencia de TSV • Detección del virus por medio de RT-PCR

Rango geográfico de distribución y especies afectadas

Rango geográfico • El síndrome de Taura fue reconocido por primera a vez como una enfermedad única en granjas camaroneras en la cercanía de la boca del río Taura en Guayaquil, Ecuador, en junio de 1992 • Sin embargo, a través de un análisis retrospectivo de muestras de camarón tomadas en la región de Taura en Ecuador en septiembre de 1991, se demostró que la enfermedad ya estaba presente en esta región antes de 1992. De la misma manera, algunos granjeros de la región sospechan que la enfermedad ya estaba presente a mediados de 1990, cuando se observaron pérdidas inexpli- cables durante la fase de crianza de P. vannamei forzando a varios granjeros a abandonar el uso de estanques de crianza y adoptando en su lugar la práctica de “siembra directa” de postlarvas a densidades relativamente bajas en los estanques de engorda • Análisis retrospectivos de muestras de P. vannamei tomadas en Colombia en febrero de 1990 también han revelado la presencia de lesiones similares a las observadas en casos de síndrome de Taura (Laramore, 1995) • A partir de 1992, el síndrome de Taura se ha dispersado a muchas de las regiones del continente americano, en donde ha sido observado tanto en camarones silvestres como cultivados. Se ha reportado la presencia de TSV prácticamente en todas las regiones camaronícolas de las Amé-

121 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

ricas, incluyendo Ecuador, Colombia, Perú, Brasil, El Salvador, Guatemala, Honduras, Belice, México, Nicaragua, Panamá, Costa Rica, Venezuela y en los Estados Unidos (Carolina del Sur, Florida, Hawái y Texas) • A finales de la década de los 90s, TSV era considerado como un virus del hemisferio occidental, hasta que en 1998 hizo su aparición en Taiwán y más recientemente en Tailandia, Myanmar, China, Corea e Indonesia. Uno de los últimos brotes en una región nueva ha sido en Arabia Saudita (Tang et al., 2012) • Es posible que la distribución geográfica del síndrome de Taura continúe expandiéndose debido a la tendencia de la industria a transportar camarones vivos (reproductores, postlarvas) tanto a nivel regional como internacional

Especies afectadas • El rango de especies afectadas no se conoce completamente • Se han documentado infecciones en poblaciones silvestres de P. vannamei, P. stylirostris y P. setiferus • Se ha logrado infectar experimentalmente postlarvas y juveniles de P. setiferus, postlarvas de P. aztecus y juveniles de P. chinensis • En el estadío de postlarva (de ~PL-12 en adelante) y de juvenil de P. vannamei TSV causa infecciones serias y altas mortandades en poblaciones de camarón cultivado • Los estadíos de postlarva y de juvenil de P. aztecus y P. duorarum parecen ser resistentes a esta enfermedad

Signos clínicos de importancia diagnóstica El síndrome de Taura es muy conocido como una enfermedad que se presenta durante la fase de crianza de P. vannamei, lo cual ocurre de los 14 a los 40 días después de la siembra de las postlarvas en los estanques. Por lo tanto, los camarones afectados tienden a ser típicamente juveniles de aproximadamente 0.05 g. a menos de 5 g. Los camarones más grandes también pueden ser afectados, especialmente si nunca han sido expuestos al virus. La enfermedad exhibe una fase aguda, una fase de transición y una fase crónica, las cuales pueden distinguirse a simple vista (Fig. 2.4.1). Fase aguda: En los camarones moribundos, durante la fase aguda de la enfermedad, los signos observables a simple vista incluyen expansión de los cromatóforos rojos, lo cual le imparte al camarón una coloración general que va de rosada a rojiza y a los urópodos una coloración roja (de ahí el nombre de la enfermedad de la cola roja). Los animales en la fase aguda tienden a morir durante la ecdisis (el proceso de muda). En estos animales, cuando se examina con más detenimiento el epitelio cuticular, por ejemplo de un apéndice (en la punta de los urópodos o de los pleópodos, por ejemplo), es posible observar evidencia de necrosis multifocal del epitelio (Fig. 2.4.2 y 2.4.3). Los camarones que muestran estos signos agudos, generalmente también tienen la cutícula suave, el intestino vacío y se encuentran en el estadío “D” del ciclo de muda (Fig. 2.4.9). Los animales con infección aguda severa mueren típicamente durante la ecdisis, lo cual sugiere que el proceso de muda es una parte importante de la patogénesis del síndrome de Taura.

122 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Fase de recuperación: a este etapa se le conoce como de transición ya que comparte características de la fase aguda y de la fase crónica. En condiciones experimentales, si el camarón sobrevive la fase aguda, generalmente entra a la fase de transición aproximadamente a los 4 días después de haber sido infectado. Es en la etapa de transición cuando es posible observar manchas melanizadas en todo el cuerpo (Fig. 2.4.4). Las características histológicas de la etapa de transición se describen más adelante. Fase crónica: en esta etapa los camarones no presentan ninguna lesión externa evidente. Los camarones en esta fase de la enfermedad puede o no que presenten cutícula blanda y expansión de los cromatóforos rojos. Es posible observar a tales camarones comportándose y alimentándose normalmente. Aunque una epizootia de síndrome de Taura puede resultar en mortandades acumuladas que van del 80% al 90% de la población en un estanque (en líneas de camarón susceptibles), los sobrevivientes típicamente muestran sobrevivencias de 60% o más al tiempo de la cosecha.

Procedimientos de diagnóstico en casos de enfermedad

Diagnóstico presuntivo • La presencia de signos clínicos tal y como se describió anteriormente • Un historial ya sea de las instalaciones de cultivo, de la especie cultivada o de la región, que indique la posibilidad de infección por TSV (por ejemplo la importación de P. vannamei originario de Ecuador o de otras regiones en donde se sabe que existe TSV) • Preparaciones húmedas de apéndices (urópodos, escamas antenales, pleópodos, etc.) que muestren necrosis multifocal del epitelio cuticular en animales juveniles durante la fase aguda de la enfermedad.

Métodos para la detección y el diagnóstico definitivo del virus Para llegar a un diagnóstico definitivo de TSV, tanto en camarones individuales como en poblaciones enteras, se puede utilizar cualquiera de los siguientes métodos:

Métodos histológicos de rutina • El diagnóstico histológico de la enfermedad (con tinción H&E), durante la fase aguda, se basa en la demostración de áreas de necrosis multifocal en el epitelio cuticular del caparazón, apéndi- ces, branquias, esófago, estómago e intestino posterior (Fig. 2.4.5) ◊ Sólo muy raramente el epitelio de los túbulos de la glándula antenal se ve afectado ◊ Con frecuencia, el tejido conectivo subcuticular y las fibras adyacentes de músculo estriado también se ven afectadas • Las lesiones cuticulares multifocales son muy conspicuas en la fase aguda y consisten de lo siguiente: ◊ El citoplasma de las células afectadas muestra un incremento en la eosinofilia ◊ La picnosis nuclear y cariorrexis son una característica común en las lesiones del síndrome de Taura ◊ En ocasiones es posible observar la presencia de inclusiones citoplásmicas y frecuentemente una abundancia extrema de cuerpos esféricos (de 1 a 20 µm de diámetro) que van de eosinofílico a basofílico pálido

123 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

◊ Los núcleos picnóticos y cariorrécticos dan una reacción positiva con la tinción de Feulgen (para ADN), lo cual los distingue de las inclusiones citoplásmicas eosinófilas/basófilas páli- das que no contienen ADN ◊ La ausencia de infiltración hemocítica, o de otro tipo de respuesta inflamatoria, distingue la fase aguda de la fase de recuperación o crónica de la enfermedad • La presencia de núcleos picnóticos y cariorrécticos así como de las inclusiones citoplásmicas generalmente esféricas, le dan a las lesiones de la fase aguda/peraguda una apariencia aperdigonada o apimentada, lo cual es considerado como una característica patognomónica de la enfermedad (Fig. 2.4.6) • Durante la fase de transición es posible observar algunas lesiones de tipo agudo, pero además se comienzan a observar infiltrados hemocíticos en el epitelio acompañados de melanización. Estas lesiones cuticulares se asemejan a aquellas ocasionadas por infección bacteriana del exoesqueleto (“shell disease”) (ver figuras adjuntas) ◊ Estas lesiones pueden llegar a presentar erosión de la cutícula, colonización bacteriana superficial e invasión de la cutícula por presuntas especies de Vibrio ◊ Una marcada infiltración hemocítica, la cual puede o no estar melanizada, se encuentra con frecuencia en posición basal con respecto a las lesiones cuticulares melanizadas • La fase crónica de la enfermedad se caracteriza por la ausencia de necrosis del epitelio (a como se describió en la fase aguda). De la misma manera, las manchas melanizadas desaparecen. Es común observar la presencia de estructuras dentro del órgano linfoide conocidas como “esferoides” (Fig. 2.4.7). Se ha observado que en camarones durante la fase crónica de la enfermedad estos esferoides son el único rastro de la infección, los cuales muestran una reacción positiva a la sonda genética para la detección de TSV, sugiriendo una relación estrecha con el proceso de la enfermedad.

Diagnóstico de TSV usando sondas genéticas Se han desarrollado sondas genética de ADN complementario (cADN) las cuales proveen excelente sensibilidad diagnóstica en casos de infección por TSV. Este método se emplea principalmente en investigación o en casos en que se requiere la confirmación con un método adicional. • La sonda genética, no radioactiva y marcada con digoxigenina (DIG), puede ser usada en ensayos de hibridación in situ • La prueba de hibridación in situ puede ser aplicada a muestras de tejido fijadas de acuerdo al procedimiento explicado en la sección sobre toma y preparación de muestras • Cuando son sujetas a la prueba de hibridación in situ con las sondas cADN, las lesiones de TSV muestran una reacción positiva bastante prominente en la forma de un precipitado que va de azul a negro y el cual está localizado en el citoplasma de las células afectadas (Fig. 2.4.8) • Los fragmentos nucleares picnóticos y cariorrécticos que contribuyen a la apariencia aperdigonada o apimentada de las lesiones patognomónicas, no reaccionan con la sonda genética

Hibridación en formato “Dot blot” • El ensayo de hibridación en formato de “dot blot” ha sido aplicado solamente a nivel experimental para el diagnóstico con sondas no radioactivas marcadas con DIG y usando muestras de hemolinfa y virus semipurificado

124 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

• Problemas relacionados con la estabilidad del ARN monocatenario (el cual constituye el genoma de TSV) durante la prueba de “dot blot” ha limitado el desarrollo y la aplicación de este tipo de kits de campo basados en el uso de sondas cADN marcadas con DIG para la detección de este agente

Método de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa) para la detec- ción de TSV Uno de los métodos de RT-PCR recomendados por OIE es el publicado por Nunan et al., 1998. Este método utiliza un par de iniciadores (9992F y 9195R) que amplifican un fragmento de 231 pares de bases. A pesar de haber sido diseñado hace 16 años, este método sigue siendo uno de los mejores debido a su alta sensibilidad y a que es capaz de detectar todas las variantes geográficas de TSV que continúan apareciendo alrededor del mundo. TSV provoca una infección de tipo sistémico en el camarón y por lo tanto las muestras idóneas para el análisis por medio de RT-PCR pueden ser hemolinfa o tejido (p.ej. pleópodo, branquias, etc.). No se recomienda el análisis de huevecillos, larvas, o postlarvas menores a PL10, utilizando el méto- do de RT-PCR ya que durante esos estadíos, la infección puede estar presente a niveles por debajo del límite de detección y existe el riesgo de obtenerse resultados falsos negativos. De acuerdo a la OIE, el método de RT-PCR es el recomendado para la vigilancia dirigida y para la declaración de la ausencia de la enfermedad.

Tasa de mutación de TSV En un estudio en donde se compararon diferencias en el genoma de 83 cepas de TSV originarias de 16 países, colectadas durante un período de 16 años, se estimó una tasa de mutación de aproximadamente 2.37x10-3 nucleótidos sustituidos/sitio/año (Wertheim et al., 2009). Esta tasa de mutación es comparable a la de otros virus de ARN de evolución rápida tales como la enfermedad vesicular porcina (3.4x10-3 nucleótidos sustituidos/sitio/año), enterovirus humano (3.4x10-3 nucleó- tidos sustituidos/sitio/año) y el virus humano de la inmunodeficiencia adquirida tipo-1 (2.5x10-3 nu- cleótidos sustituidos/sitio/año). En retrospectiva, esta tasa de mutación tan alta ayudaría a explicar situaciones tales como el cambio en la susceptibilidad de P. stylirostris a este virus. En un principio, cuando TSV recién había hecho su aparición en México, la industria comenzó a utilizar P. stylirostris en lugar de P. vannamei debido a que el primero, a pesar de ser afectado por la enfermedad mostraba una mayor sobrevivencia. Este camarón fue comercializado como “Supershrimp”. Sin embargo, des- pués de algunos años, P. stylirostris comenzó a presentar mortandades debido a TSV al mismo nivel que P. vannamei. Es muy probable que esto haya obedecido a la aparición de una nueva cepa de TSV (producto de la alta tasa de mutación del virus) que resultó ser mucho más virulenta para P. stylirostris. Las implicaciones de la rápida tasa de mutación de TSV para la industria camaronícola están relacionadas principalmente con el desarrollo de líneas de camarón resistentes a TSV. En muchos países se ha utilizado esta estrategia para el manejo de TSV, principalmente en aquellas regiones en donde se ha vuelto endémico. Sin embargo, una línea de camarón resistente a TSV el día de hoy, tal vez pudiera dejar de serlo el próximo año. Esto significa que el desarrollo de líneas de camarón resistentes a TSV deberá de ser un esfuerzo continuo. Un ejemplo de esto es el reciente descubrimiento de una cepa de TSV en Colombia ocasionando altas mortandades en fincas cultivando P. vannamei “resistente” a la enfermedad (Aranguren et al., 2013). Respecto a los métodos moleculares para la detección del virus (p.ej., RT-PCR), afortunadamente los métodos preponderantes (incluyendo el recomendado por la OIE) están diseñados para amplificar una zona conservada del genoma viral, excluyendo la posibilidad de obtener resultados falsos negativos. 125 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Enfermedades virales del camarón TSV

Figura 2.4.1. Figura esquemática mostrando el progreso hipotético de la enfermedad de TSV en P. vannamei. Inmediatamente después de la infección inicial, sobreviene una viremia que dispersa las partículas virales a través del hemo- celoma del camarón. Durante los estadíos de muda previos a la ecdisis, las células altamente activas del epitelio cuticular proveen un blanco ideal para el virus y, una vez infectadas, TSV comienza a replicarse a expensas de las funciones normales de estas células (por ejemplo, la secreción de la cutícula, y la transferencia de calcio entre la cutícula nueva y la que será reemplazada). La etapa aguda de la infección se manifiesta con mayor intensidad durante los estadíos críticos de la ecdisis y, debido a la inte- rrupción resultante, muchos camarones mueren durante esta etapa. Los camarones que sobrevi- ven a la muda entran en la etapa crónica o de recuperación y generalmente exhiben lesiones melanizadas de la cutícula en aquellos lugares en donde las lesiones de TSV se encuentran en vías de recuperación. Los camarones afectados de esta manera pueden sufrir otro episodio agudo de la infección durante la siguiente muda o bien puede que lleguen a mudar normalmente y recuperarse. Durante esta etapa de recupera- ción los camarones pueden ser portadores del virus pero se ignora por cuanto tiempo.

126 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Enfermedades virales del camarón TSV

Figura 2.4.2. Dos ejemplares de camarón cultivado P. vananmei colectados en Ecua- dor. Ambos especímenes se encontraron moribundos y con signos de la fase aguda del síndrome de Taura. Durante la etapa aguda los camarones se encuentran generalmente aletargados, tienen una cutícula blanda y los urópodos pueden llegar a tomar una colora- ción rojiza.

Figura 2.4.3. Fotografía, a mayor aumento, de los urópodos de uno de los camarones de la Fig. 2.4.2. Usando una lupa, o una cámara fotográfica con lente de acercamiento, es posible observar la irregularidad de los bordes del epitelio cuticular de los urópodos (seña- lado por la flecha). Estas irregularidades en el epitelio son la manifestación de la necrosis causada en este tejido por el virus de TSV. Magnificación: aproximadamente 10X.

Figura 2.4.4. Juvenil de P. vannamei captu- rado en un estanque de cultivo en Ecuador. Este ejemplar se encuentra en la etapa de re- cuperación, de TSV. Se pueden observar múl- tiples focos de melanización que señalan los sitios de la cutícula en donde el epitelio necrosado por la infección de TSV se encuentra en vías de recuperación.

127 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Enfermedades virales del camarón TSV

Figura 2.4.5. Corte histológico a través del estómago de un juvenil P. vannamei en la etapa aguda de infección por TSV. Se muestran áreas necróticas prominentes (la flecha gruesa señala un ejemplo) en el epitelio cuticular, el cual normalmente secreta la parte acelular de la cutícula. Adyacente a las lesiones necróticas focales es posible observar células epiteliales aparentemente normales (la flecha delgada señala algunos ejemplos). Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnifica- ción 300X.

Figura 2.4.6. Microfotografía de alto aumento mostrando una lesión clásica de TSV. Este tipo de lesiones consiste de necrosis del epitelio cuticular y del tejido conectivo sub-cuticular, con células mostrando núcleos picnóticos o cariorrécticos, así como tam- bién una marcada eosinofilia e inclusiones citoplasmáticas con propiedades variables de tinción. Las inclusiones citoplasmáticas y los núcleos picnóticos y cariorrécticos le imparten a la lesión su apariencia caracte- rística (patodiagnóstica) aperdigonada (“buc- kshot-riddled”) o apimientada (“peppered”). Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnifica- ción: 900X. Figura 2.4.7. Corte medio-sagital a través del órgano linfoide (OL) de un juvenil P. vannamei infectado experimentalmente con TSV. Al momento de la fijación, el espécimen se encontraba en la fase crónica de la enfermedad. Las lesiones patognomónicas de TSV nunca ocurren en el OL sin embargo la infección por TSV induce lesiones de otro tipo en este órgano. Entremezclado con los cordones de tejido normal del OL, los cuales se caracterizan por su arquitectura de varias capas de células arregladas concéntricamen- te alrededor de un conducto central para la hemolinfa (se señala un ejemplo con una flecha delgada), se encuentran acumulaciones desorganizadas de células, las cuales forman estructuras a las que se les ha llamado “esferoides” del OL (EOL). Los EOL caracen de un conducto central y consisten de células que muestran kariomegalia, vacuolas citoplas- máticas bastante prominentes e inclusiones citoplasmáticas de tamaño y forma irregular (la flecha gruesa muestra un ejemplo de un esferoide). Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnificación: 450X.

128 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Figura 2.4.8. Corte histológico a través de uno de los apéndices de una postlarva de P. vannamei en la fase aguda de infección por TSV. Este ejemplar ha sido sometido a una prueba de hibridación in situ con una sonda genética de cADN marcada con DIG, espe- cífica para la detección de TSV. La sonda ha reaccionado intensamente con células infectadas en donde es posible observar un precipitado azúl obscuro o negro dentro del citoplasma de células del epitelio cuticular y del tejido conectivo sub-cuticular. La sonda no ha reaccionado con los núcleos picnóticos o kariorrécticos, lo cual es de esperarse ya que TSV es un virus citoplásmico. Los restos de los núcleos contribuyen a dar la apariencia apimientada típica de las lesiones de TSV. Tinción: Bismarck Brown y sonda genética marcada con DIG. Magnificación: 900X

Figura 2.4.9. Preparación en húmedo que muestra la porción de un urópodo de una postlarva de P. vannamei en la etapa aguda de la infección por TSV. Este espécimen se encontraba en el estadío D4 del ciclo de muda (según la separación que se puede observar entre la cutícula “vieja” y la “nueva”). La flecha de la izquierda señala un área ne- crótica en el epitelio cuticular (área desorga- nizada y con una abundancia de pequeñas esferas refráctiles. las cuales son en realidad núcleos picnóticos y cariorrécticos) mientras que la flecha en la esquina superior derecha señala una porción de epitelio cuticular aparentemente normal. Se pueden observar también algunos cromatóforos rojos en el tejido conectivo sub-cuticular del urópodo. Tinción: Preparación en húmedo sin teñir. Magnificación: 300X

129 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

2.5 Virus del síndrome de la cabeza amarilla (Yellow head syndrome virus, YHV)

Nombre de la enfermedad Enfermedad de la cabeza amarilla, enfermedad (YH) o enfermedad de la cabeza amarilla de P. monodon.

Agente etiológico Virus de la cabeza amarilla (YHV). Inicialmente algunos investigadores tailandeses reportaron que YHV era un baculovirus cito- plásmico Tipo B (virus de la granulosis) o un virus similar a un baculovirus y le asignaron el nombre de baculovirus de la cabeza amarilla o YHB. Sin embargo, al llevar a cabo una caracterización detallada se encontró que se trataba de un virus completamente nuevo, para el cual hubo necesidad de crear una nueva familia, conocida con el nombre de familia Roniviridae.

Agente • YHV no es un baculovirus ya que no contiene cdADN (cadena doble de ADN) sino csARN (cadena sencilla de ARN) • El virus de la cabeza amarilla es un virus de ARN monocatenario (ssARN), tiene forma cilíndrica, presenta una envoltura y es de replicación citoplásmica • Los viriones tienen forma cilíndrica y varían en tamaño en un rango de 150 nm a 200 nm de longitud por 40 nm a 50 nm de ancho. Las estructuras que posiblemente sean las nucleocápsi- des (y/o formas aberrantes de nucleocápsides) miden aproximadamente 15 nm de diámetro con longitudes variables de hasta aproximadamente 800 nm de largo • YHV es realmente uno de los seis genotipos del grupo conocido como el complejo de virus de la cabeza amarilla y se le conoce como el genotipo 1. Los otros genotipos se les ha encontrado en P. monodon de la costa Este de África, en Asia y en Australia, en donde aparentemente no tienen efecto dañino en el hospedero. El único genotipo que parece ser patogénico es el genotipo 1

Métodos preferidos actualmente para el diagnóstico • Historial y signos clínicos de YHV • Métodos histológicos de rutina con tinción H&E • Tinción de hemocitos con el método de rutina de Wright-Giemsa • Detección del virus por medio de RT-PCR • Hibridación in situ con sondas genéticas específicas para la detección de YHV

Rango geográfico de distribución y especies afectadas

Rango geográfico Aparentemente YH es una enfermedad ampliamente distribuida en poblaciones de P. monodon. Aunque hasta hace relativamente poco la enfermedad de la cabeza amarilla fue reconocida y descrita por primera vez en camarones de Tailandia, es probable que YHV haya sido el mismo síndrome que ha venido afectando a la industria del cultivo de P. monodon por casi una década. Es posible que YHV haya sido responsable del hundimiento de la industria de Taiwán en 1986-1987, y

130 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón de epizootias más pequeñas, pero serias, en regiones de Indonesia, Malasia, China y Filipinas que cultivan P. monodon. Hace relativamente poco, se reportó la presencia de YHV en el continente americano (Loh et al., 1998), sin embargo, el hallazgo nunca pudo ser confirmado y es probable que se haya tratado más bien de un diagnóstico erróneo.

Especies afectadas • YHD es una enfermedad importante en sistemas intensivos de cultivo de P. monodon en el sureste de Asia e India • A través de bioensayos con P. monodon como especie indicadora, se encontró que camarones de agua salobre de las especies Palaemon styliferus y Acetes sp. (presentes en los estanques de camarón) son portadores de YHV (Flegel et al., 1995) • Aunque resistentes a la enfermedad cuando se encuentran en los estanques, se ha observado que P. merguiensis y Metapenaeus ensis pueden ser infectados experimentalmente durante pruebas de reto (Flegel et al., 1995) • Se ha demostrado experimentalmente que YHV puede infectar y causar infecciones serias en los estadíos juveniles de los camarones penaeidos americanos de las especies P. vannamei, P. stylirostris, P. setiferus, P. aztecus y P. duorarum. En estos mismos estudios, se observó que los estadíos de postlarva de las mismas especies eran relativamente resistentes

Signos Clínicos de Importancia Diagnóstica Existen ciertos signos clínicos característicos que pueden ser observados en P. monodon cuando éste ha sido infectado por YHD. Durante varios días, los juveniles y los subadultos (especialmente durante los 50-70 días de cultivo) en estanques intensivos de cultivo muestran un incremento anormal y abrupto en el consumo de alimento. Posteriormente, los animales dejan de alimentarse completamente y dentro de un plazo de un día es posible observar algunos camarones moribundos nadando lentamente cerca de la superficie en las orillas de los estanques. Estos camarones moribundos pueden llegar a exhibir una coloración amarillenta del cefalotórax (Fig. 2.5.1). El número de camarones mostrando signos similares, incrementa dramáticamente en el segundo día y para el tercero, después de haber cesado de alimentarse, comienza una mortandad masiva la cual típicamente resulta en la pérdida total del estanque. Los camarones moribundos pueden llegar a presentar con frecuencia uno o más de los siguientes signos: palidez corporal generalizada en combinación con una coloración amarillenta del cefalotórax; branquias blanquecinas o de color amarillo pálido a café; hepatopáncreas de color amarillo pálido. Se ha reportado que en una ocasión en que incidentalmente se encontraron postlarvas de P. merguiensis en el mismo estanque en que se hallaba una población de P. monodon infectado por YHV, las postlarvas de P. merguiensis no presentaban ningún signo de la enfermedad.

Procedimientos de diagnóstico en casos de enfermedad Diagnóstico presuntivo

Historial y signos clínicos • Presencia de los signos clínicos descritos previamente • Un historial que indique la posible presencia de YHV en las instalaciones de cultivo, en la región o en las especies de camarón usadas para el cultivo

131 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Diagnóstico definitivo El diagnóstico definitivo se basa en el historial, la presencia de signos clínicos descritos anteriormente y la confirmación por medio de histopatología.

Histopatología La histopatología se caracteriza por una necrosis generalizada, de multifocal a difusa, con presencia prominente de picnosis y cariorrexis. En los tejidos afectados es posible observar inclusiones citoplasmáticas perinucleares basofílicas, generalmente esféricas. Entre los tipos de células o tejidos afectados se incluyen los hemocitos, órgano linfoide, tejido hematopoyético, células pilar y epiteliales de las lamelas branquiales, tejido conectivo esponjoso del subcutis, músculo, intestino, glándula antenal, gónadas, cordón y ganglios nerviosos, etc. (Fig. 2.5.2 y 2.5.3). Entre los cambios celulares tempranos ocasionados por YHV se incluye la hipertrofia nuclear, disminución y marginación de la cromatina y desplazamiento lateral del nucléolo. Respuesta inflamatoria, en forma de infiltración hemocítica, agrupamiento, y encapsulación puede llegar a ocurrir pero es más bien difusa y no muy conspicua, a menos de que al mismo tiempo se presente una infección bacteriana secundaria. Existe un tipo único de célula que se presenta con frecuencia en camarones infectados con YHV y que puede servir como ayuda para el diagnóstico histológico de esta enfermedad. Este tipo de célula se presenta en cantidades muy variables, pero no es del todo rara. Generalmente se le puede observar en los espacios hemales existentes en varios tejidos tales como branquias, glándula antenal, hepatopáncreas, corazón etc.; este tipo de célula es generalmente esférica, presenta citoplasma de apariencia uniforme, pálidamente basofílico y con un núcleo esférico y central. Es probable que estas células sean en realidad hemocitos inmaduros liberados prematuramente por los órganos hematopo- yéticos en respuesta a la hemocitopenia causada por la infección de YHV. Es importante tener en cuenta que infecciones severas de WSSV pueden llegar a ocasionar una necrosis del órgano linfoide casi idéntica a la ocasionada por YHV (Pantoja y Lightner, 2001) (Fig. 2.5.4). Esta similitud puede ocasionar confusión y resultar en un diagnóstico erróneo de YHV. Sin embargo, en el caso de WSSV dicha necrosis del órgano linfoide es acompañada por la presencia de los cuerpos intranucleares característicos de WSSV. De cualquier manera, si hay razón para sospechar la presencia de YHV en muestras de camarón procedentes de regiones afectadas por WSSV, se debe recurrir a pruebas de hibridación in situ (con la sonda para YHV) y/o de RT-PCR para determinar el estatus real de YHV en los animales en cuestión (Fig. 2.5.5).

Fenómeno de interferencia viral. El fenómeno de interferencia viral entre YHV y TSV fue reportado por Aranguren et al., 2012. En un estudio bajo condiciones controladas de laboratorio, los investigadores indujeron primero una infección con TSV a nivel crónico en camarones SPF P. vannamei, para después exponerlos a YHV. Las diferencias en sobrevivencia a YHV entre grupos de camarones pre expuestos a TSV y no expuestos a TSV fue estadísticamente significativa, con las supervivencias más altas en los grupos previamente expuestos a TSV. Mediciones de la concentración de partículas virales de YHV mostraron niveles mucho más altos en los camarones no expuestos a TSV. Este fenómeno de interferencia viral tal vez ayude a explicar la aparente ausencia de brotes de YHV en las Américas, en donde TSV se encuentra ampliamente distribuido. Resulta interesante que aunque ha habido reportes de la presencia de YHV en el Pacífico mexicano y otros países de Latinoamérica, los brotes no han alcanzado la magnitud que de otras enfermedades tales como WSSV.

132 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Métodos moleculares para detección de YHV. El manual de la OIE para enfermedades de animales acuáticos menciona la existencia de tres protocolos de RT-PCR para la detección de YHV. El primer protocolo es un método de RT-PCR de un solo paso (Wongteerasupaya et al., 1997) que es específico para el genotipo 1 (patogénico). Los otros dos protocolos son utilizados principalmente para distinguir entre los diferentes genotipos requiriendo ambos la secuenciación del producto amplificado para determinar el genotipo. Existen también en el mercado kits comerciales para la detección de YHV y otros miembros del complejo del virus de la cabeza amarilla. De acuerdo a la OIE, el método recomendado para declarar la ausencia de la enfermedad es el protocolo 3 de RT-PCR de dos pasos (Wijegoonawardane et al., 2008) en combinación con la secuenciación confirmatoria del producto amplificado. También se hace hincapié, en que aquellos casos en donde no pueda confirmarse la presencia de virus por medio de la secuenciación, estos serán considerados negativos.

Enfermedades virales del camarón YHV

Figura 2.5.1. Los tres specimens de P. monodon del grupo de la izquierda muestran los signos externos de la enfermedad causada por YHV. Nótese la coloración amarillenta o café-amarillenta del cefalotórax en general, lo cual le dió el nombre a la enfermedad (fo- tografía cortesía del Dr. T.W. Flegel, Bagok, Tailandia).

Figura 2.5.2. Corte histológico a través de las branquias de un juvenil P. monodon infectado por YHV. Se puede observar una necrosis generalizada y difusa en las células de las lamelas branquiales, dentro de las cuales es aparente la presencia de núcleos picnóticos y cariorrécticos (algunos ejemplos son seña- lados por las flechas). Dentro de las células señaladas también es posible observar un citoplasma bastante basofílico y la presencia de inclusiones citoplasmáticas basofílicas perinucleares. Dichas células son posiblemente hemocitos que han sido liberados prematuramente en respuesta a la hemocitopenia inducida por la infección con YHV. Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnifica- ción: 1,000X.

133 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Enfermedades virales del camarón YHV

Figura 2.5.3. Corte histológico a través del órgano linfoide (OL) de un juvenil P. monodon en la fase aguda de infección por YHV. Se puede observar una necrosis generalizada y difusa de las células del OL. Las células afectadas muestran núcleos picnóticos y cariorrécticos. Las flechas señalan algunas células con cuerpos de inclusión citoplasmáticos perinucleares, los cuales varían en coloración de basofílico pálido a obscuro. Esta marcada necrosis durante la fase aguda de la infección por YHV la distingue de TSV que causa lesiones similares en otros tejidos pero no en el OL. Recientemente se ha comprobado que infecciones severas por WSSV pueden causar también este tipo de necrosis en el OL, sin embargo, en el caso de WSSV se pueden observar los cuerpos de inclusión intranucleares en combinación con la necrosis severa del órgano. La necrosis severa del OL no debe tomarse por si sola como evidencia concluyente de infección por YHV. Para poder confirmar el diagnóstico de YHV, es necesario llevar a cabo pruebas adicionales (como por ejemplo, hibridación in situ con sondas especí- ficas para la detección de YHV o RT-PCR). Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnificación: 525X.

Figura 2.5.4. Corte histológico a través de las branquias de un juvenil P. duorarum infectado experimentalmente con YHV. Se puede observar una necrosis severa (grado G4), de multifocal a difusa, caracterizada por la presencia de células con un incremento en la eosinofilia del citoplasma y núcleos picnóti- cos. Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magni- ficación: 1,000X.

Figura 2.5.5. Corte histológico a través del órgano linfoide de un camarón P. monodon infectado por YHV. El espécimen fue sujeto a una prueba de hibridación in situ con una sonda genética marcada con DIG, específica para la detección del virus de la cabeza amarilla (YHV). Se puede observar una intensa reacción positiva (deposición de un precipitado azúl obscuro o negro) a la sonda dentro del citoplasma de las cé- lulas parenquimales de un esferoide en el órgano linfoide. Aparentemente las estructuras conocidas como “esferoides” del órgano linfoide (EOL) son una respuesta no específica del sistema imunológico del camarón contra una variedad de agentes patógenos. Además de YHV, se han observado EOLs durante la fase crónica o de recuperación de TSV (ver sección 3.4.4.2) y también durante algunas enfermedades bacterianas. Los EOL no deben de tomarse como una ca- racterística diagnóstica definitiva de ninguna enfermedad. La precencia de EOL debe ser interpretada dentro del contexto histórico de las muestras y la sospecha de una determinada enfermedad viral debe ser confirmada por medio de otros métodos, por ejemplo, hibridación in situ con la sonda ge- nética apropiada. Tinción: Bismarck Brown y sonda genética marcada con DIG. Magnificación: 100X. 134 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

2.6. Virus de la mionecrosis infecciosa (Infectious myonecrosis virus, IMNV)

Nombre de la enfermedad Mionecrosis infecciosa; Necrosis infecciosa del músculo.

Agente Etiológico Virus de la mionecrosis infecciosa (IMNV)

Agente IMNV es un virus tentativamente clasificado como un totivirus (Familia Totiviridae). Los viriones son de forma icosahédrica, con un diámetro de aproximadamente 40 nm y una densidad de 1.366 en gradientes de cloruro de cesio. El genoma consiste de una sola molécula de ARN de doble cadena (dsRNA). El genoma consiste de 7,560 pares de bases.

Rango geográfico y de especies afectadas IMNV infecta camarones penaeidos. Infecciones naturales han sido observadas únicamente en P. vannamei. Infecciones experimentales han sido logradas con P. stylirostris y P. monodon. IMNV es una enfermedad que se descubrió por primera vez en la costa del nordeste de Brasil. Posteriormente se diseminó al sureste de Asia (Java, Indonesia) en donde se piensa fue introducido a través de la im- portación de camarones P. vannamei infectados. La transmisión de la enfermedad puede ocurrir horizontalmente a través del agua y canibalismo. Se piensa que la transmisión vertical es bastante probable, pero no ha sido demostrada experimentalmente. La enfermedad de IMN no es la misma que la conocida como “enfermedad de la cola blanca”. Ambas enfermedades resultan en la necrosis del músculo esquelético y aparentemente los signos son muy similares. Sin embargo, la enfermedad de las colas blancas es causada por un virus completamente diferente a IMNV (ver PvNV, más adelante). Los estadíos de vida del camarón afectados por IMNV incluyen postlarvas, juveniles y adultos.

Signos clínicos de importancia diagnóstica

Tejidos/órganos afectados Típicamente se incluyen el músculo esquelético (y el cardiaco con menor frecuencia), tejido conectivo, hemocitos, y las células parenquimales del órgano linfoide.

Lesiones observadas a nivel macroscópico Los camarones infectados presentan áreas necróticas en el músculo estriado (esquelético) del abdomen (cola). Estas áreas necróticas son multifocales en sus inicios y posteriormente se vuelven más difusas, incrementando en tamaño hasta que se expandan abarcando casi la totalidad de la cola (Fig. 2.6.1). En estadíos avanzados de la enfermedad, las zonas necróticas adquieren una coloración anaranjada-rojiza (Fig. 2.6.2). Los camarones continúan alimentándose a pesar de estar infectados severamente. Si estos camarones son estresados (por ejemplo, al ser capturados con una atarraya,

135 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos o debido a cambios drásticos en la salinidad, temperatura, etc.) se pueden volver moribundos y la mortandad puede sobrevenir rápidamente y continuar por varios días. Si se hace una disección en fresco para exponer el órgano linfoide, se puede observar que ambos lóbulos se encuentran hipertrofiados, adquiriendo un tamaño 3-4 veces mayor de lo normal.

Lesiones observadas a nivel microscópico Preparaciones de músculo en fresco ya sea teñidas o sin teñir, muestran la presencia de anormalidades (por ejemplo, ausencia de estriaciones, fibras deformes o fragmentadas, etc.). Prepara- ciones del órgano linfoide en fresco, pueden poner de manifiesto la presencia de masas esféricas (esferoides), entre los túbulos normales.

Procedimientos de diagnóstico

Diagnóstico presuntivo. Basado en historial del caso y signos clínicos descritos anteriormente.

Diagnóstico confirmatorio. Basado en uno o más de los siguientes métodos: Histopatología. Utilizando técnicas de rutina con tinciones de hematoxilina-eosina (H&E), se puede observar que en los camarones infectados se presenta una necrosis de tipo coagulativo en las fibras musculares estriadas acompañada frecuentemente por edema (Fig. 2.6.3). En algunos casos, es posible observar una combinación de lesiones “nuevas” o agudas y “viejas” o crónicas. El progreso de las lesiones parece ir de los niveles más agudos en donde predomina la necrosis coagulativa, hasta los estadios más crónicos en donde se observa primero infiltración hemocítica y posteriormente una matriz suelta de fibrocitos y fibras de tejido conectivo mezcladas con fibras musculares recién rege- neradas. El análisis histológico también puede poner de manifiesto la hipertrofia del órgano linfoide ocasionada por la acumulación de esferoides. Esta lesión se presenta de manera muy consistente en camarones durante las fases agudas y crónicas de la enfermedad. Con frecuencia, estos esferoides se pueden observar también en otras partes del cuerpo del camarón, incluyendo el corazón, branquias, glándula antenal, cordón ventral nervioso, tejido conectivo, etc. El análisis histológico también puede poner de manifiesto, la presencia de cuerpos de inclusión intracitoplásmicos en las células del mús- culo esquelético, órgano linfoide y/o tejido conectivo (Fig. 2.6.4). RT-PCR. Utilizando los métodos descritos por Poulos et al., 2006, o bien alguno de los “kits” disponibles en el mercado (por ejemplo, IQ2000). Debido a la gran similitud entre las lesiones producidas por IMNV y por PvNV (ver más adelante), es aconsejable combinar el análisis histológico con el RT-PCR, o con pruebas de hibridación in situ y sondas genéticas específicas, para poder obtener un diagnóstico confirmatorio confiable (Fig. 2.6.5)

136 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Enfermedades virales del camarón IMNV

Figura 2.6.1. Signos clínicos de la enfermedad causada por IMNV. Camarones P. vannamei tomados de un estanque de cultivo. La necrosis del músculo es evidente en forma de áreas opacas de color blanquecino.

Figura 2.6.2. Signos clínicos de la enfermedad causada por IMNV. En estadíos más avanzados, el músculo necrosado puede adquirir una coloración anaranjada/rojiza, como se puede observar en el especimen superior.

Figura 2.6.3. Necrosis de tipo coagulativo acompañada de inflamación hemocítica y fibrosis. Como referencia, se puede observar una porción de músculo esquelético normal en la esquina superior derecha. Tinción: He- matoxilina/eosina-floxina de Mayer-Bennett. Barra= 50 µm.

137 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 2.6.4. Las flechas muestran algunos ejemplos de cuerpos de inclusion intraci- toplásmicos, de tipo basófilo, dentro de un grupo de células del músculo. Tinción: He- matoxilina/eosina-floxina de Mayer-Bennett. Barra= 20 µm

Figura 2.6.5. Corte histológico de músculo esquelético sometido a una prueba de hibri- dación in situ con una sonda genética espe- cífica para la detección de IMNV. El precipitado de color azúl obscuro indica los lugares en donde la sonda ha reaccionado con el virus. Tinción de contraste: Café de Bismarck. Barra= 50 µm.

138 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

2.7 mionecrosis infecciosa viral – IMNV y sus implicaciones en el cultivo de camarón brasileño

Alitiene Moura Lemos Pereira¹, Emiko Shinozaki Mendes², Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira³, Veronica Arns da Silva², Andreia Benedita Poletto4

¹Embrapa Meio-Norte, BR 343, km 35, C.P.341, Parnaíba, PI, Brasil, [email protected] ²Universidade Fed. Rural de Pernambuco, Av. Dom Manoel de Medeiros, s/n. Recife, PE, Brasil, esmendes@dmv. ufrpe.br ³Universidade Fed. do Ceará, LABOMAR, Av. da Abolição, 3207, Fortaleza, CE, Brasil, [email protected] 4PNPD/CAPES, Embrapa Meio-Norte, BR 343, km 35, C.P.341, Parnaíba, PI, Brasil, [email protected]

Traducido del Portugués al Español por: Roberto Chamorro, Interprete Público Autorizado Panamá.

Introducción El cultivo de camarón brasileño concentró sus esfuerzos en el desarrollo de un sistema de producción con la especie P. vannamei nativa del Océano Pacífico, luego de problemas de baja productividad y adaptación al medio ambiente con especies nativas y exóticas en los años 90. Esta especie ampliamente estudiada, demostraba un buen desempeño zootécnico, rusticidad y adapta- bilidad, además de que ya se conocía su tecnología de producción y formulación para alimento balanceado, con base en sus requerimientos nutricionales. El factor decisivo para la escogencia de esta especie, fue el incremento exponencial de producción obtenido en Brasil, a partir del dominio de la tecnología para producción en cautiverio, resultando en aumento de divisas para el sector productivo. (Figura 2.7.1). A pesar de las mejoras económicas y del crecimiento de la producción (70% al año), pasando de 2.880 toneladas en 1996 a 25.000 toneladas en 2000, el sistema de cultivo utilizado con esta nueva especie presentó fallas, debido a problemas de adaptación, ausencia de técnicas adecuadas de cultivo y aumento de la intensificación del sistema de producción, lo cual no fue acompañado de un aumento importante del área cultivada (MAPA, 2001).

Figura 2.7.1: Desempeño de la industria Brasileña de camarón cultivado, 1997-2012. Fuente: Asociación Brasileña de Criadores de Camarón - ABCC (Rocha, 2013).

139 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

El sistema intensivo de cultivo de camarón, fue empleado en muchos casos con instalaciones inadecuadas, sin el monitoreo y conocimiento técnico necesarios. La inexistencia de medidas de seguridad permitió el libre tránsito de larvas y reproductores entre los diversos estados, sin el mínimo control sanitario para el transporte de camarones. Considerando que las enfermedades infecciosas ocurren con frecuencia en los cultivos de todo el mundo y nuevas epizootias de origen viral son identificadas a cada año, ya habían sido registradas enfermedades causadas por virus, bacterias y protozoarias en las fincas camaroneras brasile- ñas, sin reportes de pérdidas importantes (Gesteira, 2006). Sin embargo, la competencia con el aparecimiento de mionecrosis infecciosa viral (IMNV, Infectious Myonecrosis Virus), problemas cambiantes ambientales observados en los años de 2005 hasta 2009, provocaron una caída de la producción, según la Asociación Brasileña de Criadores de Camarón –ABCC, la camaronicultura brasileña presentó signos de crecimiento en 2010, cuando se produjeron 75.000 toneladas (Rocha, 2013) (Fig. 2.7.1).

Surgimiento de la Mionecrosis Infecciosa Viral El primero reporte de IMNV en Brasil, se dio en septiembre de 2002 en una camaronera del Estado del Piauí y diagnosticada después en otros estados del nordeste brasileño, con registros de mortalidad diaria, principalmente a partir de 7g en animales que presentaron como principal signo clínico, la opacidad en el músculo abdominal (Nunes et al., 2004; Andrade et al., 2007; Pinheiro et al., 2007). La ocurrencia de la mionecrosis permaneció restringida a esta región hasta la confirmación de su presencia en Indonesia (Senapin et al., 2007). Existen dudas sobre una posible ocurrencia previa de esta enfermedad, debido a que signos semejantes habían sido reportados hace 35 años y diferentes autores ya relacionaban la necrosis muscular con factores climáticos o con situaciones de extremo estrés tales como lluvias intensas, elevaciones bruscas de temperatura y salinidad, reducción del nivel de oxígeno, alta densidad de población y la presencia de polución química en el agua (Lakshmi et al., 1978; Lightner, 1988). Esas enfermedades, en aquel momento llamadas Necrosis Muscular Idiopática, fueron diagnosticadas en P. aztecus en EUA en 1970 (Rigdon & Baxter, 1970) y en México en 1978, y relaciona con cambios de temperatura y salinidad, mostrando similitud con la enfermedad observada en los EUA (Lakshmi et al., 1978). Fue también reportada en la especie nativa Farfantepenaeus subtilis en la zona costera del estado de Piauí en los años 80 (Lightner, 1988). Ninguno de los reportes anteriores presentaba una mortalidad de 70% y la ocurrencia de estos brotes fue considerada como una “enfermedad de manejo”, la cual sería solucionada con una mejora de las condiciones ambientales y la corrección de las eventuales fallas técnicas realizadas por los técnicos de campo. Así como otras enfermedades, esta también parecía ser multifactorial (Thrusfield, 2004), habiendo un agente principal en el caso del virus de la mionecrosis infecciosa. Fueron emitidas algunas hipótesis sobre la causa de esta mionecrosis, como por ejemplo la ocurrencia de la enfermedad del algodón causada por un microsporidio y que provoca pérdida de la transparencia del músculo abdominal, el síndrome del encalambramiento (CMS) o, desequilibrio mineral en el alimento. Debido a la falta de precisión para determinar la causa de la enfermedad, esta pasó a ser llamada Necrosis Idiopática Muscular (NIM); es decir, de causa desconocida. En los primeros meses de 2003 y durante el invierno, los estados del Ceará y Piauí, se vieron afectados por precipitaciones elevadas, con caídas bruscas de la salinidad (de 50 ppt a 10 ppt), temperaturas elevadas y elevada afloración de cianobacterias en los estanques. Estas condiciones ambientales agravaron la aparición de los signos clínicos observados anteriormente en camarones

140 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón cultivados en Piauí y se hicieron los primeros registros de camarones enfermos en camaroneras del estado de Ceará (Nunes et al., 2004). Se hicieron cambios en la metodología de cultivo y en los tratamientos para la mionecrosis, tales como incremento del recambio diario de agua (>20%), aplicación de cal en los estanques (150 a 300 kg/ha) y reducción de la densidad de cultivo. Sin embrago, la utilización de esas medidas, la elevación de la salinidad por disminución de las lluvias, no logró eliminar la mionecrosis del país. Según la Asociación Brasileña de Criadores de Camarón – ABCC, las pérdidas debido a IMNV fueron estimadas en 20 millones de dólares sólo durante 2004.

Diseminación de la enfermedad Varios profesionales y productores del Nordeste de Brasil, registraron las alteraciones más comunes en los ambientes de cultivos y su relación con la evolución de la enfermedad. Sin embargo, como se trataba de una nueva enfermedad, fue difícil su caracterización. A pesar de lo anterior, el intercambio de información entre el sector científico y productivo del país fue mínimo y la mayoría de los productores no sabía lo que estaba ocurriendo. Para agravar la situación, la ausencia de barreras sanitarias en la actividad acuícola del país, permitió la rápida diseminación de la enfermedad entre las camaroneras de la Región Nordeste de Brasil, mucho antes de que se conociera la verdadera dimensión del problema. Con la diseminación de la enfermedad en ambientes adversos, el rango de los brotes se fue ampliando llegando a afectar sistemas de producción con las siguientes condiciones: • Fases de pre-cría con densidades de 35 a 120 Pls/l • Fase de engorde con camarones de 3 g promedio • En densidades de 15 a 80 camarones/m2 • Camarones procedentes de diferentes laboratorios de producción de post-larvas • Cultivos que utilizan variadas marcas de alimentos comerciales • En cultivos con la variables físicas y químicas aceptables para la especie • La supervivencia promedio obtenida fue de 30 a 40% con un FCA (factor de conversión alimenticia )> 2:1 Algunos productores cultivaron P. vannamei en agua dulce durante el período de gran incidencia de mionecrosis y no reportaron problemas con la enfermedad. Pero el virus puede presentarse también en animales cultivados en agua dulce y afectar todos los estadios de desarrollo.

Etiología • Bioensayos realizados en laboratorio, por Graf et al. (2003), exponiendo individuos presumiblemente saludables a tejidos de camarones con signos clínicos de mionecrosis, mostraron que el mayor vector de transmisión de esa patología, fue la ingestión directa de los tejidos contaminados, caracterizando por tanto, su transmisión horizontal. • Después de la confirmación de la naturaleza infecciosa, a través de desafíos por inyecciones y preparación de tejidos contaminados en individuos libres de patógenos conocidos (SPF, Spe- cific Pathogen Free) el agente causante de IMN fue identificado como un virus perteneciente a la Familia Totiviridae (Lightner & Pantoja, 2004). La purificación y caracterización del virus denominado virus de la mionecrosis infecciosa, fueron efectuadas por Poulos et al. (2006). La partícula viral tiene forma icosahédrica y mide 40 nm de diámetro. Su genoma está formado por una molécula de RNA de doble cadena (dsRNA) de 7.560 bp.

141 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

• Silva et al (2014) señaló que machos y hembras sexualmente maduros después de desafiados con IMNV en L. vannamei, presentaran el virus en ovario y espermatóforo, después de diagnóstico por PCR, lo que indica una ruta vertical de la transmisión para la infección. • Esta enfermedad conocida como IMNV (Necrosis Infecciosa Muscular o Mionecrosis Infecciosa Viral), tuvo su primer registro en los estados del Nordeste de Brasil y más recientemente en P. vannamei cultivado en Indonesia (Senapin et al., 2007). La detección fue hecha utilizando un kit comercial de RT-PCR y análisis subsecuentes revelaron que la muestra del IMNV de Indonesia tenía 99,6% de similitud con la secuencia del ácido nucleico del IMNV brasileño registrado en GeneBank. Según algunos autores y como información extra oficial, hubo entrada irregular de reproductores provenientes del Brasil, en la Isla de Java. • Además del diagnóstico de la enfermedad en todas las fases de cultivo (post-larva, juvenil y adul- to) de la especie P. vannamei, también se han mostrado susceptibles al virus IMNV, camarones de las especies P. stylirostris y P. monodon, presentando signos clínicos y alteraciones en los tejidos característicos de la enfermedad (Tang et al., 2005). Coelho et al. (2009) en especímenes de Far- fantepenaeus subtilis sometidos a pruebas de desafío con el virus de IMNV por un período de 30 días, mostró susceptibilidad probada por análisis histopatológico y molecular.

Métodos de Diagnóstico El diagnóstico puede ser presuntivo con base en la sintomatología observada macroscópi- camente, siendo el foco principal la pérdida de transparencia del músculo abdominal. También se puede detectar la enfermedad a través de estudios histopatológicos, cuando son investigadas posibles alteraciones en los órganos internos y tejidos. La hibridación in situ fue desarrollada y optimizada como una herramienta de diagnóstico por Tang et al. (2005). Otro método molecular para la detec- ción del virus es la RT-PCR Andrade et al. (2007) mostraron que el RT-PCR usado con sondas TaqMan resulta ser un método de diagnóstico de alta sensibilidad. Puthawibool et al. (2009), sugirieron que un diagnóstico rápido y práctico del IMNV puede realizarse a través de la técnica loop-mediated isotermic amplification (LAMP) del material genómi- co, con alta especificidad y sensibilidad, garantizando un diagnóstico seguro y el monitoreo de las enfermedades en las camaroneras. Los autores también demostraron que la combinación de la transcriptasa reversa y LAMP (RT-LAMP) seguida por la detección del ácido nucleico usando un “cromato- graphic lateral flow dipstick”(LFD), permite un diagnóstico en un intervalo del tiempo de 75 minutos. Sin embargo, estas técnicas son más sofisticadas y dependen de laboratorios y técnicos de alto nivel.

Signos Clínicos En el inicio del brote de la IMNV, los camarones presentan opacidad focal o multifocal del músculo del abdomen (Fig. 2.7.2) y en casos de mayor severidad, se tornaban rojizos, principalmente en el último segmento (Fig. 2.7.3). Los individuos quedaban aletargados, presentando baja conver- sión alimenticia, abdomen encalambrado (en algunos casos), expansión de los cromatóforos, reduc- ción de la tasa de crecimiento y tiempo elevado de coagulación de la hemolinfa. De acuerdo con lo reportado por Gesteira (2006), los grados de infección pueden cambiar y presentar cuadros clínicos diversos: • Leve a moderado – baja mortalidad y menos de 10% de los camarones cultivados presentan signos clínicos. • Aguda - elevada mortalidad, más de 10% de la población cultivada presenta signos clínicos con nivel de severidad de medio a alto.

142 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

• Crónica – mortalidad baja, pero persistente y signos clínicos perceptibles en menos de 5% de los individuos. En ese estado se pueden presentar signos agudos, cuando se presentan fallas de manejo o cualquier otro evento que produzca en los camarones una condición de inmunosu- presión. Aparentemente, la mionecrosis es una enfermedad que surge como consecuencia de fallas de manejo, o en sistemas sobrecargados de materia orgánica. Todos los eventos han tenido en común el desequilibrio de condiciones de cultivo, denominadas “detonantes” por muchos autores, las cuales desencadenan la enfermedad e incluyen el exceso de lluvias, presencia elevada de plancton, infes- tación elevada de parásitos como gregarinas o, acción de bacterias oportunistas como los vibrios. Como consecuencia de la enfermedad, las fincas camaroneras han adoptado buenas prácticas de manejo que incluyen bajar las densidades de siembra y buen tratamiento de suelo entre los ciclos de cultivo, entre otras. Con éstas, se obtienen buenos resultados de producción final, a pesar que se detecten lesiones sugestivas de mionecrosis durante el análisis presuntivo o confirmatorio durante el ciclo. La presencia de putrefacción en el último segmento abdominal que se observó al principio de los brotes en Brasil (2003), prácticamente no se observan en la actualidad. Apolinário (2009) realizó estudios en camaroneras del Estado de Ceará en las estaciones de lluvia y seca, encontrando las mayores ocurrencias de individuos portadores de IMNV en el periodo lluvioso, concordando con los datos colectados por Morales-Covarrubias et al. (2011) en el Estado de Piauí. Pero Silva et al. (2010), estudiando la ocurrencia en el Estado de Pernambuco, no encontró camarones con presencia de IMNV en el período de lluvia. Estos datos indican que el gatillo para la presencia de la infección se correlaciona con más de un factor ambiental. Análisis de datos, procedentes de estos tres estados, indicaron que la presencia de esta enfermedad está correlacionada a la variación de salinidad, altas proporciones de amonio, pH, materia orgánica en el suelo (Figura 2.7.4), afloraciones de cianobacterias y al tiempo de cultivo.

Enfermedades virales del camarón IMNV

Figura 2.7.2. Camarón portador de IMNV presentando opacidad del músculo abdominal. Foto Cortesía de A. Pereira.

143 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 2.7.3. Camarones con mionecrosis infecciosa. Foto Cortesía de A. Pereira.

Figura 2.7.4. Suelo de estanque después de la cosecha, presentando elevado contenido de materia orgánica (> 2%). Foto Cortesía de A. Pereira.

Aunque la presencia de esta enfermedad ha llegado a 33% de los camarones diagnosticados por histopatología, la mayoría era asintomática, sin registro de mortalidades elevadas (por arriba de 30%). Según Tsai et al. (1999), un virus considerado inicialmente como altamente patógeno puede sufrir mutaciones y tornarse menos agresivo, elevando la supervivencia de los animales cultivados.

Histopatología Los exámenes histopatológicos muestran diferentes alteraciones en órganos y tejidos afectados por el IMNV, dependiendo del grado de severidad de la enfermedad. El aumento en la talla del órgano linfoide es común y también es frecuente observar esferoides en este órgano (lymphoid organ spheroids- LOS) (Fig. 2.7.5). Pueden ser encontrados LOS ectópicos en tejido conjuntivo, músculo del corazón (Fig. 2.7.6 y 2.7.7) y próximos a los túbulos de las glándulas antenales. Las lesiones del tejido muscular dependen del grado de severidad de la infección, pudiéndose presentar en la fase inicial una infiltración hemocítica (Fig. 2.7.8 y 2.7.9). La fase aguda se caracteriza por ser una necrosis de coagulación, con presencia de edema y un elevado daño en las fibras musculares, muchas veces sustituidas por tejido conjuntivo (Fig. 2.7.10). En esta fase, se observan cuerpos de inclusión típicos de enfermedades virales, detectados en células musculares, tejido conectivo y hemocitos con necrosis de licuefacción (Fig. 2.7.11), con infiltración hemocítica en músculo afectado (inflamación) y fibrosis, ocurre en camarones en fase crónica de la enfermedad, cuando los LOS ectópicos son más común- mente visualizados (Fig. 2.7.12) (Lightner & Pantoja, 2004; Lightner et al., 2004; Gesteira, 2006).

144 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Enfermedades virales del camarón IMNV

Figura 2.7.5. Órgano linfoide mostrando la presencia de esferoide (flecha). H & E. Foto cortesía: T.C.V. Gesteira.

Figura 2.7.6. Corte histológico de bajo aumento con presencia de múltiples LOS en tejido cardiaco (flechas). Tinción H&E, am- plificación 40X. Foto cortesía de A. Pereira.

Figura 2.7.7. Corte histológico mostrando la presencia de esferoides ectópicos en la región cardiaca (flechas). Tinción H&E, am- plificación 400X. Foto cortesía de A.Pereira.

145 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 2.7.8 y 2.7.9. Mionecrosis en la fase aguda, acompañada de infiltración hemocí- tica y fibrosis. Foto cortesia: T.C.V. Gesteira.

Figura 2.7.10. Lesiones coagulativas musculares resultantes de la acción del virus de la mionecrosis H & E. Foto cortesía: T.C.V. Ges- teira.

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Algunos camarones asintomáticos presentaron diagnóstico positivo por RT-PCR para IMNV, sin lesiones en el abdomen, pero sí en la parte inferior del cefalotórax, con lesiones coagulativas focales bien definidas (Fig. 2.7.13), caracterizando también como una fase crónica de la infección.

Figura 2.7.11. Necrosis de licuefacción resultante de la acción del virus de la mionecrosis infecciosa. H & E. Foto cortesía de A. Pereira.

Figura 2.7.12. Sección longitudinal del tejido muscular del camarón P. vannamei mostrando la fase crónica de la infección, mostrando fibrosis y presencia de LOS (flechas) Foto cor- tesía: D. F. Apolinario (2008).

Figura 2.7.13. Corte longitudinal del cefalo- tórax presentando lesiones coagulativas focales. Foto cortesía: A.B. Poletto.

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Diagnóstico diferencial La necrosis muscular en el abdomen de los camarones, es una lesión que puede ocurrir como consecuencia de estrés, bajas de oxígeno, alta densidad de siembra, cambio brusco de temperatura o salinidad (Lakshmi et al., 1978; Rigdom & Baxter, 1970) y también puede ser resultante de la acción de un agente infeccioso, como el caso de la IMNV. A pesar de la importancia de la histopatología como herramienta de diagnóstico confirmatorio, el uso de sondas geonómicas, como hibridación in situ o PCR, garantizan una mayor sensibilidad y especificidad en el diagnóstico. Un ejemplo es la necrosis muscular detectada en camarones de la especie P. vannamei procedentes de Belice. Segundo Tang et al, (2007), los individuos presentaban la misma opacidad muscular en el abdomen, con características histopatológicas similares a aquellas observadas en portadores de IMNV. Después del examen utilizando las técnicas de hibridación in situ y RT-PCR, los resultados fueron negativos para IMNV, sugiriendo que la enfermedad era causada probablemente por otro virus RNA. Los autores encontraron 69% de similitud de este virus de Belice con el nodavirus del Macrobrachium rosenbergii, adoptando este nuevo virus la denominación de PvNV (Penaeus vannamei nodavirus). Además de agentes virales, las bacterias también pueden causar opacidad muscular que se asemeja a la observada en IMNV (Lightner, 1996), como por ejemplo los vibrios y las pseudomonas. La diferencia puede ser vista a través de histopatología (ausencia de cuerpos de inclusión) o mediante pruebas moleculares como RT-PCR.

Consideraciones finales Considerando las características del sistema inmune de los camarones, no existe un tratamien- to específico para la IMNV. Como cualquier enfermedad, las medidas preventivas son las más econó- micas y eficaces. Un buen manejo de los cultivos debe incluir la adopción de normas de bioseguridad para evitar la entrada y establecimiento de nuevos patógenos y permitir una mejor supervivencia en la presencia de enfermedades. Actualmente, en muchas fincas camaroneras algunas de las prácticas de manejo de cultivos fueron cambiadas principalmente por reducción de la densidad de siembra (10 a 40 camarones/m2), tratamientos del suelo entre los cultivos, preparación y fertilización de los estanques y vaciado sanitario entre los ciclos de cultivo. En algunos laboratorios productores de Pls, fueron implementados programas de mejoramien- to genético, inclusive con importación de reproductores SPF y SPR (resistente a patógenos específi- cos - Specific Pathogen Resistence) que podrían proporcionar Pls de buena calidad y con menores posibilidades de enfermedad por IMNV. En otros laboratorios, a pesar de no tener implementada esas prácticas, han sido cuidadosos con la bioseguridad y por ello, en cultivos que son bien manejados, no se detecta una incidencia elevada de IMN. En la actualidad, a pesar de que en Brasil se pueden observar lesiones sugestivas de mionecrosis durante análisis presuntivos o confirmatorios en camarones, la supervivencia promedio es de 70%, a proporcionar ingresos al sector productivo. Todavía queda la pregunta: ¿El aumento de la supervivencia y la disminución de la severidad de los signos clínicos son evidencia de acomodación viral o el resultado directo de la utilización de las mejores prácticas de producción?

148 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

2.8 Penaeus vannamei nodavirus (PvNV)

Nombre de la enfermedad Enfermedad de la cola blanca.

Agente Etiológico Penaeus vannamei nodavirus.

Agente PvNV es un virus tentativamente asignado a la Familia Nodaviridae. Los viriones son de forma icosahédrica, con un diámetro de aproximadamente 22 nm. El genoma consiste de dos moléculas de ARN de cadena sencilla (ssRNA).

Rango geográfico y de especies afectadas Infecciones naturales han sido observadas únicamente en P. vannamei. Infecciones experimentales han sido logradas con P. monodon. PvNV fue descubierto por primera vez en Belice y aunque se sospecha que pueda estar presente en otros países de Centro y Sudamérica; hasta la fecha no se sabe de brotes en otros países los cuales hayan sido debidamente confirmados. La transmisión de la enfermedad puede ocurrir horizontalmente a través de canibalismo y posiblemente a través del agua. Existe la posibilidad de transmisión vertical, pero no ha sido demostrada experimentalmente. Hasta el momento, los estadíos de vida del camarón que se sabe son afectados por PvNV incluyen juveniles y sub-adultos. Se ignora el efecto de la enfermedad en adultos reproductores, estadíos larvales.

Signos clínicos de importancia diagnóstica

Tejidos/órganos afectados Típicamente se incluyen el músculo esquelético, tejido conectivo, hemocitos, y las células parenquimales del órgano linfoide.

Lesiones observadas a nivel macroscópico Al igual que con IMNV, los camarones infectados presentan áreas necróticas en el músculo estriado (esquelético) del abdomen (cola). En sus inicios, las áreas necrosadas son relativamente peque- ñas y multifocales posteriormente aumentando su tamaño hasta coalescer abarcando casi la totalidad de la cola (Fig.2.8.1). Aunque no muy frecuentemente, en estadíos avanzados de la enfermedad, las zonas necrosadas pueden volverse rojizas. Los camarones continúan alimentándose a pesar de estar infectados severamente. Si estos camarones son estresados (por ejemplo, al ser capturados con una atarraya, o debido a cambios drásticos en la salinidad, temperatura, etc.) se pueden volver moribundos y la mortandad puede sobrevenir rápidamente y continuar por varios días. Si se hace una disección en fresco para exponer el órgano linfoide, es posible observar hipertrofia en ambos lóbulos, adquiriendo un tamaño 3-4 veces mayor de lo normal.

149 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Histopatología. Utilizando técnicas de rutina con tinciones de hematoxilina-eosina (H&E), se puede observar que en los camarones infectados se presenta una necrosis de tipo coagulativo en las fibras musculares estriadas acompañada frecuentemente por edema. En algunos casos, es posible observar una combinación de lesiones “nuevas” o agudas y “viejas” o crónicas. El progreso de las lesiones parece ir de los niveles más agudos en donde predomina la necrosis coagulativa, hasta los estadios más crónicos en donde se observa primero infiltración hemocítica y posteriormente una matriz suelta de fibrocitos y fibras de tejido conectivo mezcladas con fibras musculares recién rege- neradas. El análisis histológico también puede poner de manifiesto la hipertrofia del órgano linfoide ocasionada por la acumulación de esferoides. Esta lesión se presenta de manera muy consistente en camarones durante las fases agudas y crónicas de la enfermedad. Es posible también observar cuerpos basófilos intracitoplásmicos dentro de las células del músculo esquelético, el órgano linfoide y el tejido conectivo. RT-PCR. Utilizando los métodos descritos por Poulos et al. 2006, o bien alguno de los “kits” disponibles en el mercado (por ejemplo, IQ2000). Debido a la gran similitud entre las lesiones producidas por IMNV y por PvNV, es aconsejable combinar el análisis histológico con el RT-PCR, o con sondas genéticas específicas por medio de hibridación in situ, para poder obtener un diagnóstico confirmatorio confiable.

Enfermedades virales del camarón PvNV

Figura 2.8.1. Signos clínicos de la enfermedad causada por PvNV. Camarones P. vannamei mostrando focos de necrosis en el músculo esquelético, causada por Penaeus vannamei nodavirus, PvNV (ejemplos marcados con flechas).

150 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

Figura 2.8.2. Lesiones observadas a nivel histológico. A) Necrosis del músculo esquelético, acompañada de in- filtración hemocítica. B) Cuerpos de inclusion intracitoplámicos, de tipo basofílico, en células del músculo es- quelético. D) Cuerpos de inclusion intracitoplámicos, de tipo basofílico, en células del órgano linfoide. Tinción: Hematoxilina/eosina-floxina de Mayer-Bennett. Barras= 25 µm.

151 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

2.9 Referencias bibliográficas

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152 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

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162 CAPÍTULO 2 - Enfermedades virales del camarón

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163 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

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164 Capítulo 3

Enfermedades bacterianas de camarones Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

166 Capítulo 3 - Enfermedades bacterianas de camarones

Capítulo 3

Enfermedades bacterianas de camarones

María Soledad Morales-Covarrubias y Bruno Gómez-Gil Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A. C. Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental. Mazatlán, Sinaloa. [email protected]; [email protected]

Introducción Las fluctuaciones de temperatura, salinidad, oxígeno, pH, nutrientes orgánicos e inorgánicos, influyen en las comunidades bacterianas presentes en los estanques de cultivo, dando como resultado un aumento en el número o haciendo que proliferen patógenos nocivos provocando mortalidades en los organismos cultivados. Los factores ambientales detonan la rápida multiplicación de las bacterias oportunistas, localizadas sobre todo en el tracto digestivo, branquias y cutícula. El exoesqueleto provee una barrera física efectiva para los patógenos que tratan de penetrar la superficie externa de los crustáceos, así como el intestino en la región anterior y posterior. Sin embargo, Vibrio sp. está entre las bacterias quitinoclásticas asociadas con la enfermedad del exoesqueleto y puede ingresar a través de las heridas. Las branquias parecen ser susceptibles a la penetración de bacterias debido a que están cubiertas por exoesqueleto delgado, pero éstas se limpian debido al constante movimiento de las dendobranquias. El intestino medio que incluye a la glándula digestiva o hepatopáncreas no está revestido por un exoesqueleto y, por consiguiente, parece ser el sitio probable de penetración de patógenos presentes en el agua, alimento y sedimentos. Las enfermedades de origen bacteriano reportadas en los sistemas de cultivo son causadas principalmente por Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus, V. penaeicida, V. nigripulchritudo, V. campbellii, Micrococcus sp. y Streptococcus sp.

3.1. Síndrome de la Mortalidad Temprana (EMS) o Enfermedad de la Necrosis Aguda del Hepa- topáncreas (AHPND) - Situación de México Recientemente, ha sido reportada esta enfermedad en camarón, causada por algunas cepas de V. parahaemolyticus, el cual produce una toxina capaz de destruir el tejido y provocar disfunción en el hepatopáncreas. El agente presumiblemente se transmite por vía oral y coloniza el tracto gastrointestinal de los camarones causando mortalidad masiva durante los primeros 30 días de cultivo. Fue reportada por primera vez a principios del 2009 cuando se detectaron, repentinamente, casos de mortalidades masivas (60-80%) de camarones juveniles de cultivo en China. Como hasta ese momen- to era desconocido el agente causal de esta enfermedad, se le asignó el nombre de Síndrome de Mor- talidad Temprana (EMS por sus siglas en inglés). Posteriormente, durante 2010 y 2011, se registraron mortalidades similares en Vietnam y Malasia; y estos nuevos casos compartían algunas características con lo ocurrido en 2009. Durante el 2012, Tailandia también se vio afectada por la presencia de EMS con mortalidades de camarón de cultivo de 20 a 30%. En América en agosto de 2013, el doctor Do- nald Lightner confirmó, en la “Sexta Reunión del Comité Interamericano de Sanidad de los Animales Acuáticos”, llevada a cabo en Yucatán, la presencia de la enfermedad en México desconociéndose hasta la fecha la vía por la cual llegó al país causando mortalidades altas en producción de camarón de cultivo. 167 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

A inicios de abril del 2013, en Nayarit México, se presentaron mortalidades masivas en camarones cultivados en los primeros 20 días de sembrados en granjas de cultivo semi-intensivo e intensivo. Casi de manera simultánea las mortalidades se presentaron por toda la región noroeste (Sinaloa, Sonora y Nayarit), que comprende más del 90% de la producción de camarón cultivado en México. Existe evidencia de que actualmente se presenta en cultivos en Chiapas, Colima, y Baja California (valle de Mexicali), estos dos últimos cultivos en agua de muy baja sanilidad. El diagnóstico de AHPND se realiza de manera presuntiva a nivel de hallazgos en el estanque (signos clínicos) y de manera confirmatoria partir del estudio histopatológico en camarones afectados de manera individual y por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por histopatología presenta una fase aguda, con desprendimiento progresivo de las células de los túbulos del hepatopáncreas, que avanza de la parte interna (proximal al intestino), hacia la externa (distal), quedando libres en la luz de los conductos tubulares, presentando infiltración hemocítica moderada, disfunción de las cé- lulas R, B, F y E que conforman el epitelio tubular, notándose en éstas últimas cariomegalia (aumento nuclear) y una disminución marcada en sus actividades de formación de nuevas células (mitosis). En fase terminal, se observa encapsulación de células y túbulos, infiltración hemocítica severa, presencia de aglomerados de bacterias en lumen de los túbulos, nódulos hemocíticos con y sin melanización en las paredes de los túbulos melanizados y necróticos con infección bacteriana secundaria severa. Los organismos colectados durante los eventos de mortalidad presentaron signos clínicos y daños severos en hepatopáncreas muy parecidos a los reportados para AHPND los cuales se describen a continuación:

Signos clínicos Los organismos presentaron nado errático, encontrándose la mayoría en el fondo, con hepato- páncreas de coloración pálida o blanquecina, debido a pérdida de la pigmentación de la membrana que recubre al órgano (Fig. 3.1.1) y atrofia severa. Intestino con presencia entrecortada de alimento y algunos sin alimento con una secreción blanquecina y el músculo abdominal opaco con exoesqueleto suave.

Diagnóstico Por análisis en fresco, la enfermedad presenta tres etapas de desarrollo (fases inicial, aguda y terminal). La fase inicial, con hepatopáncreas de color normal con deformación tubular (Fig.3.1.2), túbulos vacíos de la región apical los cuales van aumentando al entrar en fase aguda (Fig.3.1.3), en esta etapa el hepatopáncreas es de color pálido o blanquecino y al realizar la disección longitudinal la parte central del órgano esta licuefactivo y en fase terminal, el hepatopáncreas se observa color blanquecino, atrofiado (Fig.3.1.4) con túbulos melanizados, necrosis y presencia de cúmulos de bacterias en los nódulos y encapsulaciones (Fig.3.1.5). El intestino se observa sin alimento con una secreción blanquecina (Fig. 3.1.4).

168 Capítulo 3 - Enfermedades bacterianas de camarones

Figura 3.1.1. Juvenil de P. vannamei con hepatopáncreas de coloración pá- lida (flecha negra) ablanquecina (flecha roja), debido a pérdida de la pigmen- tación de la membrana que recubre al órgano.

Figura 3.1.2. Montaje en fresco de he- patopáncreas de P. vannamei deforma- ción tubular.

Figura 3.1.3. Montaje en fresco de he- patopáncreas de P. vannamei con tú- bulos vacíos de la región apical.

169 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 3.1.4. Camarón con hepatopán- creas expuesto atrofiado de color blanquecino (flecha roja) y el intestino sin alimento (flecha negra) con secreción blanquecina.

Figura 3.1.5. Montaje en fresco de he- patopáncreas de P. vannamei donde se observan túbulos melanizados encap- sulados.

Por histología, las muestras de camarones tomadas de estanques con mortalidad atípica presentaron: fase inicial, células epiteliales elongadas hacia el lumen sin infiltración hemocítica (Fig.3.1.6), con agregados de bacterias en las setas del molino gástrico (criba) (Fig.3.1.7), en fase aguda, se presentó desprendimiento progresivo de las células de los túbulos del hepatopáncreas, que avanza de la parte interna (proximal), hacia la externa (distal), quedando libres en la luz de los conductos tubulares (Fig. 3.1.8) con infiltración hemocítica moderada, disfunción de las células R, B, F y E que conforman el epitelio túbular, notándose en éstas últimas aumento nuclear. En fase terminal, se observa encapsulación de células y túbulos, infiltración hemocítica severa, presencia de aglomerados de bacterias en lumen de los túbulos, nódulos hemocíticos con y sin melanización, en las paredes de los túbulos melanizados y necróticos con infección bacteriana secundaria severa.

170 Capítulo 3 - Enfermedades bacterianas de camarones

Figura 3.1.6. Corte histológico e hepa- topáncreas de P. vannamei, donde se observa la fase inicial de necrosis severa del hepatopáncreas (NSHP), con célu- las epiteliales elongadas hacia el lumen sin infiltración hemocítica. Tinción de hematoxilina-eosina.

Figura 3.1.7. Corte histológico del Mo- lino gástrico con agregados de bacterias (criba). Tinción Giemsa.

Figura 3.1.8. Corte histológico de P. vannamei en fase aguda de necrosis severa del hepatopáncreas (NSHP), con desprendimiento progresivo y agudo de las células de los túbulos del hepato- páncreas, que avanza de la parte interna (proximal), hacia la externa (distal), quedando libres en la luz de los conductos tubulares. Tinción de hematoxilina-eosina. 171 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

3.2 EMS/AHPND Descripción de la enfermedad en Asia y América ( Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner)

Nombre de la enfermedad Necrosis hepatopancreática aguda; síndrome de la mortalidad temprana (Early mortality syndrome, EMS).

Agente Etiológico Vibrio parahaemolyticus.

Agente El agente causante de AHPND ha sido identificado como una cepa patógena deVibrio parahaemolyticus, un miembro del clade Vibrio harveyi. Hasta este momento no se ha publicado información sobre las características del genoma de esta cepa, sin embargo, es posible que contenga genes especí- ficos para la producción de una toxina hasta el momento no identificada y posiblemente diferente a las ya conocidas. Aparentemente, el mecanismo de acción de esta bacteria es a través de la colonización de las partes bucales, esófago y/o estómago, en donde al alcanzar un cierto número se desencadena la producción de la toxina(s) que al llegar al hepatopáncreas resulta en la descamación severa de los túbulos y la necrosis del órgano (Tran et al., 2013a). De acuerdo a Tran et al. 2013(b), algunas cepas de V. parahaemolyticus producen dos toxinas termoestables conocidas como TDH y TRH, las cuales pueden causar gastroenteritis en humanos al consumir alimentos contaminados. Sin embargo, la cepa de V. parahaemolyticus causante de AHPND no produce estas toxinas y no representa un riesgo para la salud humana.

Rango geográfico de distribución y especies afectadas

Rango geográfico La enfermedad fue reconocida por primera vez al sur de China en 2009. Posteriormente, se ha confirmado su presencia en Vietnam (2010), Malasia (2011), Tailandia (2012) y más recientemente en el Pacífico mexicano (2013). Como se ha observado en el caso de otras enfermedades infecciosas de los camarones penaeidos, es posible que el rango siga extendiéndose debido a la tendencia de la industria al transporte regional e internacional de camarones vivos con propósitos de reproducción.

Especies afectadas Penaeus vannamei y Penaeus monodon.

Signos clínicos de importancia diagnóstica Esta enfermedad se presenta típicamente dentro de las primeras 4-5 semanas después de haber sembrado los estanques y por lo tanto, los camarones afectados tienden a ser juveniles de tallas peque- ñas. En algunos casos, se han observado brotes de la enfermedad después de 7-10 días de la siembra. Los signos observados comúnmente incluyen nado errático, tasa de crecimiento reducida, coloración pálida o blanquecina del hepatopáncreas y pérdida de la consistencia del órgano, atrofia notable del hepatopáncreas, cutícula blanda, intestino y estómago vacío o parcialmente lleno (Fig. 3.2.1), túbulos melanizados dentro del hepatopáncreas. Los camarones moribundos se hunden al fondo del estanque. Las mortandades pueden alcanzar hasta 100% en unos cuantos días.

172 Capítulo 3 - Enfermedades bacterianas de camarones

Procedimientos de diagnóstico en casos de enfermedad

Diagnóstico presuntivo Basado en un historial de la granja/región y la presencia de los signos clínicos mencionados anteriormente.

Diagnóstico definitivo Histopatología. La enfermedad presenta tres fases distintivas con las siguientes características histoló- gicas, notablemente diferentes de un hepatopáncreas con estructura normal (Fig. 3.2.2):

Fase aguda: Pérdida de la función de las células que recubren los túbulos del hepatopáncreas (células “R”, “B”, “F” y “E”); desprendimiento agudo severo de las células de los túbulos del hepato- páncreas con distribución proximal a distal; es común observar células desprendidas con núcleos aun intactos; ausencia de infección bacteriana (de cualquier tipo) dentro del hepatopáncreas; ausencia de inflamación intertubular o bien inflamación muy leve. Estas lesiones se consideran diagnósticas de AHPND y no se les ha observado en ningún otro tipo de infección bacteriana de camarones penaeidos (Fig. 3.2.3). Fase de transición: Inflamación intertubular; melanización de las áreas más afectadas, principalmente en la región proximal de los túbulos (las áreas más cercanas al intestino medio). Se puede observar los inicios de infección bacteriana. Continúa el desprendimiento de las células de los túbu- los (Fig. 3.2.4). Fase terminal: Inflamación intertubular muy marcada; melanización multifocal extensa de los túbulos necrosados; infección bacteriana secundaria masiva por especies oportunistas de Vibrio sp. En esta etapa, es muy difícil diferenciar entre una vibriosis entérica común severa y AHPND (Fig. 3.2.5).

Métodos moleculares (PCR) Hasta este momento, la enfermedad AHPND no se encuentra incluida todavía en la lista de la OIE para enfermedades de animales acuáticos y por lo tanto no hay un método recomendado por esta organización para la detección del patógeno y el diagnóstico de la enfermedad. Sin embargo, existen ya métodos de PCR que proveen resultados consistentes y cuya sensibilidad y especificidad han sido comprobadas. Nunan et al. (2014) ha diseñado un método específico para la detección de V. parahaemolyticus causante de AHPND, el cual amplifica un fragmento de 470pb a partir de una secuencia que se presenta únicamente en cepas de esta bacteria, pero no en otras cepas de V. parahaemolyticus. En Junio 2014, el Dr. Timothy Flegel, de la Universidad de Mahidol, en Tailandia reportó en Shrimp News (www.shrimpnews.com) la disponibilidad de un método de PCR, nuevo y mejorado, para la detección del patógeno causante de AHPND. Este método fue desarrollado por investigadores del Centro de Investigación para la Salud de Animales Acuáticos CENTEX en Tailandia. Los detalles del método, incluyendo las secuencias de los iniciadores que están disponibles en el mismo anuncio publicado en Shrimp News. Existe también ya un kit comercial, el cual es distribuido por la compañía GeneReach Biote- chnologies.

173 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Diagnóstico diferencial para las Américas Existen otras dos enfermedades bacterianas en las Américas que también afectan al hepa- topáncreas y aunque algunos de los signos clínicos pudieran llegar a parecerse, las características histológicas son muy distintas. Estas otras dos enfermedades son Hepatopancreatitis necrotizante causada por Hepatobacter penaei (Necrotizing hepatopancreatitis, NHP) y Necrosis hepatopancreática séptica, causada por Vibrio spp. (Septic hepatopancreatic necrosis, SHPN) H. penaei es una bacteria intracelular y por lo tanto las lesiones observables en el hepatopán- creas a nivel histológico son muy distintas a las que se presentan en casos de AHPND y SHPN. Las células infectadas por H. penaei incrementan de tamaño debido a la proliferación bacteriana dentro de su citoplasma y esta abundancia de bacterias resulta en un incremento marcado en la basofilia (con tinciones de hematoxilina/eosina) de las células. Esto no ocurre con AHPND y SHPN (ver Tabla 1). En el caso de SHPN, a pesar de ser causada por bacterias de tipo Vibrio, las lesiones son muy distintas a las de AHPND, al menos durante las etapas iniciales de la enfermedad en donde es posible encontrar presencia de bacterias en SHPN, así como inflamación y melanización multifocal (lo cual no sucede en el caso de AHPND en la etapa inicial). La Tabla 1 muestra un resumen del diagnóstico diferencial para AHPND en las Américas.

174 Capítulo 3 - Enfermedades bacterianas de camarones SHPN (Necrosis NEGATIVO NEGATIVO Vibrio spp.) Vibrio AFIRMATIVO hepatopancreática séptica, causada por SHPN (Necrosis NEGATIVO NEGATIVO Vibrio spp.) Vibrio AFIRMATIVO ENFERMEDAD hepatopancreática séptica, causada por NHP penaei) NEGATIVO NEGATIVO AFIRMATIVO por Hepatobacter (Hepatopancreatitis necrotizante causada la etapa aguda. bacteriana intracelular. de los túbulos del HP. Las células de los túbulos del HP. basofílico debido a la replicación del HP durante la fase aguda. Ausencia de Ausencia la fase aguda. del HP durante células conservan la morfología normal del células conservan desprendidas muestran un citoplasma desprendidas muestran un citoplasma eosinófilo acompañado de picnosis del núcleo. La presencia Desprendimiento crónico de las células núcleo al momento de desprenderse. Ausencia Ausencia núcleo al momento de desprenderse. inflamación durante la etapa aguda. Avance de Avance la etapa aguda. inflamación durante Desprendimiento agudo, masivo, de las células Desprendimiento agudo, masivo, los túbulos del HP. Debido al proceso de los túbulos del HP. las lesiones en sentido proximal a distal durante las lesiones en sentido proximal a distal durante bacterias sueltas dentro de los túbulos del de los túbulos del hepatopáncreas (HP). Muchas de los túbulos del hepatopáncreas (HP). Muchas HP es común a lo largo de la enfermedad. de colonización bacteriana dentro los túbulos Desprendimiento crónico de las células necrosis, las células desprendidas muestran necrosis, las células desprendidas muestran EMS TIPO DE LESION (Síndrome de la mortalidad temprana) Tabla 1. Histopatología de la enfermedad de la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND). Diagnóstico diferencial para las Américas las 1. Histopatología de la enfermedad necrosis hepatopancreática aguda (AHPND). Diagnóstico diferencial para Tabla

175 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Enfermedades bacterianas de camarones AHPND

Figura 3.2.1. Penaeus vannamei con signos clínicos de AHPND. El camarón de la izquierda muestra estómago e intestinos vacíos así como una coloración pálida y atrofia de la glándula digestiva (hepatopáncreas). Estos signos clínicos son típicos del Síndrome de la mortandad temprana, también conocido como Síndrome de la necrosis hepatopan- creátidca aguda. El camarón de la derecha esta libre de la enfermedad. Ambos camarones fueron colectados en una granja en Vietnam (Foto cortesía del Dr. Loc Tran)

Figura 3.2.2. Hepatopáncreas normal de un camarón peneido (P. vannamei) mostrando túbulos intactos con una abundancia de cé- lulas vacuoladas (células tipo “R”) así como ausencia de infiltración hemocítica (inflama- ción) y melanización. Tinción Hematoxili- na-Eosina de Mayer-Bennett. Magnificación 50X.

176 Capítulo 3 - Enfermedades bacterianas de camarones

Enfermedades bacterianas de camarones AHPND

Figura 3.2.3. Fase aguda de AHPND. Nótese la ausencia de células tipo “R” y el desprendimiento o descamación masivo de las célu- las que recubren los túbulos del hepatopán- creas. Uno de los túbulos muestra la porción distal aún intacta, ilustrando la progresión de las lesiones en dirección proximal a distal. En esta fase no se observa colonización bacteriana dentro del órgano. Tinción Hematoxi- lina-Eosina de Mayer-Bennett. Magnificación 50X.

Figura 3.2.4. Fase de transición de AHPND. Continúa la descamación de los túbulos (porción central de la fotografía) en donde muchas de las células desprendidas aun muestran núcleos intactos. La zona de des- camación esta flanqueada por dos túbulos melanizados (áreas rojizas) los cuales muestran indicios de colonización bacteriana e infiltración hemocítica (inflamación). Tin- ción Hematoxilina-Eosina de Mayer-Bennett. Magnificación 50X.

Figura 3.2.5. Fase terminal de AHPND. La gran mayoría de los túbulos se encuentran necrosados y se observa una marcada infla- mación y melanización. Es evidente también la presencia de infección bacteriana masiva, probablemente por especies oportunistas de Vibrio spp., incluyendo la misma bacteria causante de AHPND. Tinción Hematoxili- na-Eosina de Mayer-Bennett. Magnificación 50X.

177 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

3.3. Necrosis séptica del hepatopáncreas (NSHP) Esta enfermedad también conocida como SHPN por sus siglas en inglés (SEPTIC HEPATOPAN- CREATIC NECROSIS) se encuentra distribuida en las instalaciones de cultivo de todo el mundo; se observa con mayor presencia en los laboratorios de producción de postlarvas y en granjas camaroneras. Afecta a todas las especies de camarón de acuicultura, ya que pueden ser susceptibles a la infección cuando se encuentran en condiciones de estrés. Las cepas reportadas como causantes de mortalidades en larvas, postlarvas, juveniles y adultos son: V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. penaeicida y V. campbellii. De manera ocasional en laboratorios y granjas de camarón son reportadas: Photobacterium damsela (antes clasificada como V. damsela), V. fluvialis y Vibrio sp.

Principales signos de NSHP Los camarones moribundos afectados por esta bacteria se encuentran en la superficie y nadando en las orillas de los estanques, por lo que son presa fácil de las aves marinas, que se alimentan de ellos; debido a esto en algunas regiones de América le llaman “síndrome de la gaviota”. Cuando la enfermedad se encuentra en fase inicial se observan algunos organismos con opacidad muscular y tracto digestivo vacío; en fase aguda, se presenta expansión de los cromatóforos, hepatopáncreas inflamado, luminiscencia, coloración café en la parte ventral (Fig.3.3.1) y heces de color blanco; y en fase crónica, el hepatopáncreas se observa atrofiado. En los laboratorios de pro- ducción larvaria las zoeas, mysis, larvas y postlarvas que presentan infección bacteriana, con o sin luminiscencia, tienen intestino vacío, nado errático, acumulación de materia orgánica en branquias, melanización y necrosis de los apéndices y cutícula, las mortalidades reportadas con luminiscencia son de 40 a 100 %.

Figura 3.3.1. Camarón con coloración café en la región ventral.

178 Capítulo 3 - Enfermedades bacterianas de camarones

Diagnóstico Se realiza de manera presuntiva por análisis en fresco, la enfermedad presenta tres etapas de desarrollo (fases inicial, aguda y terminal), con deformación tubular progresiva, gran cantidad de hemocitos, cúmulos de bacterias, desprendimiento celular, nódulos hemocíticos (Fig.3.3.2) y túb- ulos melanizados y necróticos. De manera confirmatoria por histopatología con tinción de hematoxilina-eosina, la mayoría de los túbulos normales (Fig.3.3.3) desaparecen y se observan secciones del hepatopáncreas con infiltración de hemocitos, hipertrofia del lumen, desprendimiento celular, nódulos hemocíticos, melanización, necrosis y atrofia de moderada a severa (Fig.3.3.4). La infil- tración de hemocitos y la formación de nódulos hemocíticos con presencia de cúmulos de bacterias, los cuales pueden o no estar melanizados, se aprecian también en corazón, branquias, órgano linfoide, glándula antenal, tejido y cordón nervioso, tejido conectivo, telson, estómago, esófago, apéndices, músculo y ciegos hepáticos. Por análisis de bacteriología es necesario aislar la bacteria en especial de organismos moribundos que muestren una gran colonización de bacterias. El aislamiento se realiza en agar TCBS sembrando el macerado de los organismos previamente desinfectados. Al obtener los resultados en las placas se observa gran cantidad de colonias luminiscentes de color verde.

Figura 3.3.2. Montaje en fresco de hepatopáncreas de P. vannamei donde se observa nódulo hemocítico.

Figura 3.3.3. Corte histológico de hepatopáncreas de P. vannamei con túbulos normales. Tinción de hematoxilina-eosina.

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Figura 3.3.4. Corte histológico de hepatopáncreas con infiltración de hemocitos, hipertrofia del lumen, desprendimiento celular, nódulos hemocíticos, melanización, necrosis. Tinción de hematoxilina-eosina.

3.4. Hepatopancreatitis necrotizante (NHP) La necrosis del hepatopáncreas (NHP), es una enfermedad producida por una Alpha-Proteo- bacteria, pleomorfica similar a las ricketsias, Gram negativa, intranuclear obligada. Es un bacilo que no presenta flagelos, de 0.25 por 0.90 micrones y se multiplica en el citoplasma de las células del hepatopáncreas. Su identificación se propuso recientemente como Candidatus Hepatobacter penaei. Las principales fuentes de trasmisión de NHP son el canibalismo de camarones infectados y la cohabitación de camarones sanos con camarones infectados. A nivel experimental se trasmite por inyección con material infectado, por cohabitación entre organismos infectados y no-infectados, y por alimentación de hepatopáncreas infectado fresco y congelado a organismos no infectados. Se ha propuesto el nombre de Hepatobacter penaei para esta bacteria causante de NHP. NHP es una enfermedad que fue reportada por primera vez por Johnson (1990) como hepa- topáncreas granulomatoso (por la formación de granulomas), causando altas mortalidades en las granjas de la parte central y sur de Texas; mas tarde fue reportado en Perú, Costa Rica, Panamá, Brasil, Venezuela, Ecuador, México, Colombia, Belice, Nicaragua y Honduras, provocando mortalidades entre 20 y 95 % en los sistemas de cultivo de P. vannamei (camarón blanco) y P. stylirostris (camarón azul). NHP también se ha detectado en camarón blanco cultivado de Eritrea (África), con mortalidades en cultivo de 15 a 30 % durante el primer y segundo año de su introducción. NHP afecta a P. vannamei, P. stylirostris, P. setiferus y P. aztecus. P. monodon y P. chinensis son susceptibles en infecciones experimentales. NHP se asocia con factores medioambientales como temperatura y salinidad elevadas, durante periodos prolongados, ya que se tienen reportes que esta enfermedad se hace presente cuando se tienen temperaturas de 29 a 35º C, por un periodo de 45 a 50 días, así como de salinidades entre 20 a 38 ppm en los sistemas de cultivo. NHP es una enfermedad que provoca altas mortalidades en los camarones si no es detectada a tiempo, ya que ataca al hepatopáncreas, órgano básico del camarón que realiza varias funciones, entre ellas almacenar temporalmente, digerir y metabolizar el alimento y producir proteínas que se encargan de funciones vitales, como la que realiza la hemocianina, que se encarga de transportar el oxígeno a todas las células del camarón. Debido a esto NHP afecta de manera directa los procesos fisiológicos en camarón hasta provocarle debilidad y desnutrición.

180 Capítulo 3 - Enfermedades bacterianas de camarones

Principales signos de NHP En fase aguda, las postlarvas tardías, juveniles y adultos presentan marcada reducción en el consumo de alimento hasta dejar de comer por completo. Posteriormente, se observa la aparición de camarones moribundos nadando cerca de la superficie, en la compuerta de salida y en las orillas de los estanques. Los camarones moribundos muestran palidez generalizada del cuerpo, con un color café amarillento, branquias de color amarillo pálido a café oscuro y el hepatopáncreas puede o no estar atrofiado, con coloración amarillenta a café oscuro (Fig.3.4.1), provocando que sea fácil de confundir con enfermedades virales en esta fase se observan las mas altas mortalidades.

Diagnóstico Se realiza de manera presuntiva por análisis en fresco, la enfermedad presenta 4 etapas de desarrollo (fases de infección, inicial, aguda y terminal), sin presencia de hemocitos en la etapa de in- fección e inicial, en fase aguda se observa gran cantidad de hemocitos, deformación tubular, túbulos vacíos, melanizados, necróticos y formación de cápsulas. De manera confirmatoria por histopatolo- gía con tinción de hematoxilina-eosina, la mayoría de los túbulos normales desaparecen en la etapa aguda y se observa desprendimiento celular severo, atrofia y melanización de los túbulos; formación multifocal de cápsulas envolviendo a uno o más túbulos, las células epiteliales dentro de los túbulos en algunos casos están hipertrofiadas conteniendo en el citoplasma cúmulos de bacterias (Fig.3.4.2). Las células de los túbulos cercanos a los atrofiados y con presencia de cápsulas presentan atrofia, con núcleos picnóticos, muy pocas vacuolas de lípidos (células R) y vacuolas secretoras (células B). También es posible observar que el epitelio columnar de estos túbulos se ve afectado, pues la atrofia de las células lo convierte en epitelio cuboidal.

Control Debido a que es una enfermedad endémica en muchos países, sólo se puede evitar su disemi- nación mediante medidas de bioseguridad impuestas por cada empresa cultivadora de camarones. Esto implica evitar movilización de especímenes vivos infectados entre zonas de cultivo, realizar muestreos semanales para detectar oportunamente casos sospechosos y realizar montajes en fresco de hepatopáncreas para evaluar nivel de vacuolas lipídicas, presencia y severidad de túbulos melanizados. Las medidas terapéuticas sólo se deben utilizar cuando el patógeno haya revasado las medidas profilácticas. Los antibióticos se utilizan para controlar la infección en casos de NHP. Uso de alimentos medicados con Oxitetraciclina (2 a 5 Kg/Ton de alimento) y Florfenicol (1 a 1.5 Kg/Ton de alimento) por un periodo de 10 a 14 días, buscando concentraciones de 2,000 a 5,000 ppm y de 200 a 300 ppm, respectivamente, de principio activo. Para esto, hay que considerar el tiempo de retiro (días sin el producto que se deben esperar antes de la cosecha). Se deben desarrollar programas de reproductores libres de NHP, para evitar la posible transmi- sión de la bacteria a las nuevas generaciones, lo cual conllevaría a la continuidad de la enfermedad en estanques de cultivo.

181 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 3.4.1. P. vannamei con color café amarillento en abdomen y branquias color a café oscuro

Figura 3.4.2. Corte histológico de he- patopáncreas de un P. vannamei con desprendimiento celular severo, atrofia de los túbulos; formación multifocal de cápsulas envolviendo a los túbulos, las células epiteliales dentro de los túbulos contienen en el citoplasma cúmulos de bacterias. Tinción de hematoxilina-eosina.

3.5. Síndrome de Zoea II Es enfermedad que provoca altas mortalidades en el estadío de Zoea II de camarones blancos y camarones azules; ataca el hepatopáncreas y los intestino medio y posterior. En 1993 se reportó por primera vez en cultivos larvarios de P. vannamei en Ecuador, México y Estados Unidos, pero fue hasta 1995 cuando se manifestó en todos los laboratorios de América Latina. En Ecuador se reportó que el agente causal de esta enfermedad es V. harveyi. Esta enfermedad también se conoce como el síndrome de las bolitas blancas, debido al desprendimiento de las células de los túbulos del hepato- páncreas. Signos clínicos Se presentan altas mortalidades después de 36-48h de haber transcurrido la metamorfosis de Zoea I a Zoea II. Las sintomatologías más importantes de los organismos infectados son: anorexia (falta de apetito), rápida evacuación del contenido intestinal, letargo (disminución de la actividad normal) con nado errático y permanencia en el fondo del tanque de los organismos infectados.

182 Capítulo 3 - Enfermedades bacterianas de camarones

Diagnóstico Se realiza mediante la elaboración de placas en fresco de Zoeas II, donde se observa hepato- páncreas de tamaño normal con desprendimiento celular, atrofia del hepatopáncreas con desprendimiento celular o hepatocitos hipertrofiados y redondos llamados “bolitas blancas,” inflamación y presencia de células del hepatopáncreas viajando a través del intestino (Fig.3.5.1). Se piensa que las bolitas blancas son una reacción a la presencia de toxinas bacterianas (Vibrio sp.). En organismos con la enfermedad de bolitas blancas, el diagnóstico por histología de rutina con tinción de hematoxilina-eosina se basa en la inspección del hepatopáncreas para buscar la presencia de células (bolitas blancas) viajando por el lumen del túbulo del hepatopáncreas (Fig.3.5.2) y del intestino de la Zoea II, hepatocitos hipertrofiados y, en algunos casos, infiltración hemocítica y formación de nódulos.

Figura 3.5.1. Muestra de Zoea II de P. vannamei en fase inicial; se observa hepatopáncreas normal con desprendimiento celular viajando por el intestino (flecha).

Figura 3.5.2. Corte histológico de he- patopáncreas de P. vannamei con desprendimiento celular (bolitas blancas), al lumen del túbulo e infiltración de hemocitos en tejido conectivo. Tinción hematoxilina-eosina.

183 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

3.6. Enfermedad de luminiscencia Es causada por bacterias luminiscentes y ha sido responsable de altas mortalidades (80%) en los laboratorios de larvicultura de muchos países de América Latina. La bacteria más predominante que se ha aislado en esta enfermedad es V. harveyi o V. campbellii.

Signos clínicos Los organismos infectados con esta bacteria se observan con luminiscencia (Fig.3.6.1), letargo (disminución de la actividad normal), nado errático, permanencia en el fondo del tanque y mortalidades masivas.

Diagnóstico El diagnóstico por montaje en fresco, se realiza mediante la elaboración de placas en fresco de larvas, donde se observa en fase inicial colonización masiva de las bacterias en los apéndices, tracto digestivo y región oral. Pero conforme avanza la enfermedad y entra en la fase aguda se observa colonización en el intestino medio y posterior y en hepatopáncreas hasta llegar a colonizar todos los órganos y tejidos del organismo y tener una septicemia generalizada con mortalidades altas. Por bacteriología es necesario aislar la bacteria en especial de organismos moribundos que muestren una gran colonización de bacterias. El aislamiento se realiza en agar TCBS sembrando el macerado de los organismos previamente desinfectados. Al obtener los resultados en las placas se observa gran cantidad de colonias luminiscentes de color verde (V. campbellii) o amarillas (V. harveyi). En organismos con la enfermedad de luminiscencia se diagnostica por histopatología con tinción de hematoxilina-eosina, y se busca la presencia de colonias de bacterias, infiltración de hemocitos, nódulos hemocíticos en apéndices, tracto digestivo, intestino y hepatopáncreas (Fig.3.6.2).

Figura 3.6.1. Mysis de P. vannamei con luminiscencia en ojo y melanización en pereiópodos.

184 Capítulo 3 - Enfermedades bacterianas de camarones

Figura 3.6.2. Corte histológico de he- patopáncreas de mysis de P. vannamei, con células del hepatopáncreas con cúmulos de bacterias localizadas en el lumen (flecha). Tinción de hematoxilina-eosina.

3.7 Erosión bacteriana del caparazón Esta enfermedad se presenta en juveniles y adultos de todas las especies de camarones penaeidos. Se manifiesta en forma de manchas cafés o negras en el exoesqueleto, siendo las heridas las que permite la entrada de bacterias quitinolíticas como Vibrio spp., y de bacterias oportunistas (Aeromonas sp., Spirillum sp. y Flavobacterium sp.), estas manchas se producen por la acumulación de melanina, que es el producto final de la respuesta inflamatoria en crustáceos. Cuando las lesiones no alcanzan a afectar a las membranas internas y al músculo, por lo general éstas desaparecen con la muda. Esta afección se considera una infección secundaria, ya que para manifestarse se necesita que el organismo presente heridas en el caparazón. Las erosiones bacterianas también son causadas por infección de las heridas en la cutícula de los camarones, y se dan por lo regular cuando se tienen organismos en altas densidades o por condiciones ambientales extremas o toxicidad química. Esta enfermedad debe ser controlada, ya que puede convertirse en una infección grave denominada “astillas negras”, la cual penetra al músculo dañándolo severamente o puede llegar hasta una vibriosis sistémica atacando todos los órganos y tejidos del camarón.

Signos clínicos Se observan en la cutícula manchas de color cafés o negras (Fig.3.7.1) en áreas que han sido erosionadas por acción de bacterias quitinolíticas. Cuando la infección progresa se observa el mús- culo melanizado, con secciones de necrosis y atrofia muscular.

Diagnóstico Al realizarse el análisis en fresco de muestras de cutícula y músculo, se observan con clari- dad las manchas rojas, cafés y negras, así como secciones del músculo con erosiones melanizadas y hemocitos rodeando la lesión (Fig.3.7.2). En organismos con esta enfermedad por histopatología con tinción de hematoxilina-eosina, se observa en algunas secciones de la cutícula y músculo, me- lanización, necrosis con infiltración de hemocitos, atrofia de los paquetes musculares y presencia de nódulos hemocíticos con cúmulos de bacterias (Fig.3.7.3).

185 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 3.7.1. Camarón P. vannamei, con necrosis multifocal en el exoesqueleto.

Figura 3.7.2. Montaje en fresco de músculo de camarón P. vannamei, con erosión melanizada rodeada por hemocitos.

Figura 3.7.3. Corte histológico de mús- culo de P. vannamei; con melaniza- ción infiltración hemocítica, necrosis, atrofia de los paquetes musculares y nódulos hemocíticos melanizados. Tinción de hematoxilina-eosina.

186 Capítulo 3 - Enfermedades bacterianas de camarones

3.8. Estreptococosis Es causada por Streptococus sp., relacionadas a S. uberis y S. parauberis, provocando altas mortalidades en camarones de cultivo de Penaeus vannamei (80%). Existen muy pocos reportes de infecciones por cocos gram positivos en crustáceos; solo se encuentran documentados la enfermedad del músculo blanco en langostino Macrobrachium rosembergii causada por Lactococcus lactis y L. gar- vieae que están incluidas en la familia Streptococcaceae. En México, en 2011 y 2012 se observaron mortalidades altas juveniles de camarón blanco en cultivos en agua a baja salinidad, los organismos presentaron desprendimiento celular severo de los túbulos del hepatopáncreas, atrofia tubular con infiltración hemocítica severa causando mortalidades del 40%, la bacteria caracterizadas fue Strep- tococcus sp.. Este brote presentó una prevalencia del 25% con 30 días de observación; período durante el cual los organismos frenaron su tasa de crecimiento y se afectó la sobrevivencia. Se cree que existió una aceleración en la dinámica del patógeno por la condición hipotónica del cultivo, la elevada densidad y nitritos altos.

Signos clínicos Los organismos infectados con esta bacteria se observan en fase inicial con músculo blanquecino y ciego hepático posterior opaco (Fig.3.8.1) y en fase aguda el organismos se encuentra totalmente blanquecino con letargo (disminución de la actividad normal), nado errático, permanencia en el fondo del tanque y mortalidades masivas.

Diagnóstico Se realiza de manera presuntiva por análisis en fresco, en hepatopáncreas hay deformación tubular progresiva (Fig.3.8.2), gran cantidad de hemocitos, cúmulos de bacterias, desprendimiento celular, nódulos hemocíticos y túbulos melanizados y necróticos. De manera confirmatoria por his- topatología con tinción de hematoxilina-eosina, la mayoría de los túbulos normales desaparecen y se observan secciones del hepatopáncreas con infiltración de hemocitos, hipertrofia del lumen, desprendimiento celular, nódulos hemocíticos, melanización, necrosis y atrofia de moderada a severa. También se observan numerosos cocos libres dentro de la hemolinfa y en mayor presencia en el lumen de los túbulos del órgano linfoide (Fig.3.8.3) en muestras histológicas teñidas con hematoxilina eosina y Giemsa. El aislamiento se realiza en agar sangre sembrando de macerado de hepatopáncreas. Al obtener los resultados en las placas se observa gran cantidad de colonias en cadena de forma esférica (2 micrómetros de diámetro).

187 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 3.8.1. P. vannamei, con opacidad en musculo (flecha roja) y en cefa- lotórax y abdomen (flecha negra).

Figura 3.8.2. Muestras en fresco de hepatopáncreas con desprendimiento celular severo, túbulos vacíos, necrosis tubular con células muertas en el interior del lumen de juvenil de P. vannamei con infección de Streptococcus sp.

Figura 3.8.3. Corte histológico de ór- gano linfoide de P. vannamei; con estreptococos en el lumen del túbulo. Tinción Giemsa.

188 Capítulo 3 - Enfermedades bacterianas de camarones

3.9 Spiroplasma penaei (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner)

Nombre de la enfermedad Espiroplasmosis.

Agente Etiológico Spiroplasma penaei.

Agente Las bacterias incluidas dentro del género Spiroplasma (Clase Mollicutes) se caracterizan por carecer de una pared celular y por tener una morfología helicoidal. Los espiroplasmas son motiles a pesar de carecer de flagelos. Históricamente, los espiroplasmas han sido asociados a enfermedades de plantas y de artrópodos, principalmente insectos y garrapatas, pero más recientemente se han encontrado a miembros de este género infectando a algunas especies de cangrejos de agua dulce (Eriocheir sinensi) y los camarones alvinocáridos de las chimeneas hidrotermales en el fondo del océano (Rimicaris exoculata) en donde parece no causar enfermedad alguna, sino más bien, parece ser parte de la microflora normal. Spiroplasma penaei es el primer espiroplasma patogénico que ha sido aislado a partir de un crustáceo marino (Fig. 3.9.1).

Rango geográfico y de especies afectadas Infecciones naturales han sido reportadas únicamente en P. vannamei. S. penaei fue descubier- to por primera vez en una granja camaronícola de Colombia, en la costa del Caribe, en condiciones de baja salinidad. La transmisión de la enfermedad puede ocurrir horizontalmente a través de canibalismo y posiblemente a través del agua. Existe la posibilidad de transmisión vertical, pero no ha sido demostrada experimentalmente. Hasta el momento, los estadíos de vida del camarón que se sabe son afectados por S. penaei incluyen juveniles y sub-adultos. Se ignora el efecto de la enfermedad en adultos reproductores, estadíos larvales.

Signos clínicos de importancia diagnóstica

Tejidos/órganos afectados Típicamente se incluyen el cordón ventral nervioso, músculo esquelético, corazón, glándula antenal, órgano linfoide, tejido conectivo fibroso dentro del hepatopáncreas, tejido conectivo esponjoso perigástrico, filamentos branquiales y subcutis en el caparazón y apéndices corporales.

Lesiones observadas a nivel macroscópico Los camarones infectados no presentan lesiones distintivas que sean aparentes a simple vista. Los cromatóforos pueden encontrarse expandidos en algunos casos. Se ha reportado también la con- dición llamada “síndrome de los camarones parados” en la cual los camarones muertos tienden a flotar en la superficie como si estuvieran balanceándose en la punta de la cola y mirando hacia el cielo.

189 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Procedimientos de diagnóstico Diagnóstico presuntivo. Basado en historial del caso y signos clínicos descritos anteriormente. Diagnóstico confirmatorio. Basado en uno o más de los siguientes métodos: Histopatología. Las lesiones causadas por este espiroplasma son las características de una enfermedad bacteriana de tipo sistémico. Utilizando técnicas de rutina con tinciones de hematoxilina-eosina (H&E) los camarones moribundos presentan reacciones inflamatorias sistémicas multifocales, moderadas a severas, en forma de congestión hemocítica, coagulación de hemocitos, formación de nód- ulos hemocíticos (Fig.3.9.2), fagocitosis (algunas veces acompañada de melanización) y fibrosis. Los órganos afectados incluyen (en orden de severidad): cordón ventral nervioso, músculo esquelético, corazón, glándula antenal, órgano linfoide, tejido conectivo fibroso dentro del hepatopáncreas, tejido conectivo esponjoso perigástrico, filamentos branquiales y subcutis. El desarrollo de las lesiones parece ser como sigue: (1) Presencia de células necróticas con núcleos picnóticos. (2) Mi- gración y congregación de células fagocíticas en el área necrosada. (3) Fagocitosis de las células necrosadas y restos celulares y formación de nódulos hemocíticos. (4) Melanización de nódulos hemocíticos. (5) Inflamación fibrocítica. PCR. Utilizando los métodos descritos por Nunan et al., 2004. Debido a la gran similitud entre las lesiones producidas por S. penaei y otras enfermedades bacterianas tales como vibriosis sistémi- ca, es aconsejable combinar el análisis histológico con PCR, o con pruebas de hibridación in situ (Fig.3.9.3), para poder obtener un diagnóstico confirmatorio confiable.

190 Capítulo 3 - Enfermedades bacterianas de camarones

ESPIROPLASMOSIS Spiroplasma penaei

Figura 3.9.1. Microfotografía electró- nica de barrido mostrando la forma helicoidal de S. penaei. Barra=1µm.

Figura 3.9.2. Lesiones observadas a nivel histológico. En la parte central de la fotografía se muestran ejemplos de la formación de nódulos hemo- cíticos y de la fagocitosis de células necróticas entre fibras musculares del corazón. Tinción: Hematoxilina/ eosina-floxina de Mayer-Bennett. Ba- rra=10 µm.

Figura 3.9 .3. Ejemplo del uso de la sonda genética específica para la de- tección de S. penaei La presencia de un precipitado de color azul obscuro a negro indica los lugares en donde la sonda a reconocido la presencia de la bacteria entre los túbulos del órgano linfoide. Tinción de contraste: Café de Bismarck. 191 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

3.10. Referencias Bibliográficas

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192 Capítulo 3 - Enfermedades bacterianas de camarones

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194 Capítulo 4 - Parásitos en camarones

Capítulo 4

Parásitos en camarones

195 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

196 Capítulo 4 - Parásitos en camarones

CAPÍTULO 4

Parásitos en camarones

Jorge Cuéllar-Anjel Director del Departamento de Patología e Investigación Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO) Coordinador del Grupo ad hoc del OIRSA en Sanidad Acuícola Panamá

Introducción Un parásito puede ser considerado como todo organismo vegetal o animal que vive a costa de otro de distinta especie, alimentándose de las sustancias que este consume o elabora y pudiéndole o no perjudicar, aunque sin llegar necesariamente a producirle la muerte. Los parásitos se clasifican en endoparásitos y ectoparásitos, según si habitan en el interior o en el exterior de sus hospederos. La afección de un animal por parásitos, es llamada parasitosis. Los principales parásitos de camarones son gregarinas, epicomensales (protozoarios, algas y bacterias filamentosas), microsporidios, haplosporidios y metazoarios (nemátodos o tremátodos). Los protozoarios son los que más co- múnmente afectan a los camarones, pudiendo ser observados en branquias, apéndices, exoesqueleto y tracto digestivo (intestino medio y eventualmente hepatopáncreas).

4.1 Gregarinas

Nombre de la enfermedad Gregarinas, parasitismo por gregarinas o enfermedad de gregarinas.

Etiología Las gregarinas (Protozoa, Apicomplexa) son parásitos protozoarios de diversos tipos, ampliamente distribuidos en la naturaleza y comunes en muchos grupos de invertebrados, especialmente artrópodos, anélidos y moluscos. En éstos, las gregarinas pueden aparecer ínter o intracelularmente y aunque las células hospedero individuales son destruidas por el estadío intracelular, muchas especies no son consideradas como de alta patogenicidad. Sin embargo, cada especie de gregarina suele ser específica de una única especie de hospedero. Las gregarinas pueden ser encontradas tanto en camarones silvestres, como en sistemas de cultivo. Todos los camarones penaeidos son hospederos conocidos o potenciales de las gregarinas. Por lo menos dos géneros, Nematopsis y Cephalolobus, cada uno con diversas especies, aparecen de manera frecuente en los camarones penaeidos con una distribución geográfica mundial. Un tercer género llamado Paraophioidina, se ha observado esporádicamente en postlarvas de P. vannamei bajo condiciones de cultivo. Debido a que se considera que existen múltiples especies de gregarinas con distribución geo- gráfica aún sin definir en todo el mundo, es recomendable realizar monitoreos sanitarios cuando van

197 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos a ser movilizados camarones procedentes de regiones aisladas, ya que éstas pueden poseer poblaciones nativas de estos parásitos.

Agente etiológico y hospederos más comunes Las gregarinas que se presentan con más frecuencia en camarones P. vannamei de cultivo, son del género Nematopsis spp. Pueden trasmitirse al camarón mediante la ingestión de poliquetos como la Polydora cyrrhosa o a través de la ingestión de materia fecal de este segundo hospedero del protozoario. Otros hospederos son algunos moluscos bivalvos, que al igual que los poliquetos, ingieren las zigosporas que son las formas infestantes del protozoario. Otros dos géneros que también se han observado en camarones penaeidos de cultivo son Paraophioidina y Cephalolobus, aunque con menor frecuencia. Las siguientes son algunas de las características de los 3 géneros mencionados: Nematopsis: el trofozoito está compuesto de 2 células: un protomerito largo provisto de un collar muscular, unido a un deuteromerito más largo y más angosto. La forma del trofozoito se asemeja al de un champiñón. El paso de esporozoito a trofozoito lo realiza en el intestino medio. Paraophioidina: en estado adulto se presenta como una sola célula alargada con un solo núcleo en zona media. En su parte anterior presenta estructuras de fijación mediante las cuales se adhiere al hospedero o a otras gregarinas congéneres. Al igual que el género anterior, el paso de esporozoito a trofozoito lo realiza en el intestino medio. Cephalolobus: se caracteriza por tener un englobamiento en la porción anterior, haciendo semejanza con una falsa “cabeza”. El ciclo de vida y las características morfológicas generales excepto la dilata- ción cefaloide, son similares a las descritas para Nematopsis sp. A diferencia de los géneros anteriores, el paso de esporozoito a trofozoito lo lleva a cabo en la zona posterior del estómago.

Ciclo de vida En los camarones, la ingestión de un hospedero intermediario que contenga esporas de gregarina, trae como consecuencia la infestación. Las esporas ingeridas “germinan” para llegar a ser esporozoitos, los cuales se adhieren a la capa de quitina de las paredes y a los pliegues terminales del filtro gástrico. También pueden invadir o unirse al intestino medio o a las células epiteliales del ciego anterior, con su proceso especializado de epimeritos. Una vez adheridos, se desarrollan a trofozoitos que se caracterizan por su epimerito especializado y consisten en la forma inicial del protomerito, con un núcleo diferenciado y localizado centralmente (Fig. 4.1.2). De cada uno pueden generarse al menos tres trofontes. Los trofontes se separan de su unión al estómago o intestino medio, para convertirse en esporadio y pasar al intestino posterior, alojándose en sus pliegues. De cada célula individual de esporadio, se desarrolla un gametocisto. Algunas de estas células darán paso a la fase sexual de la reproducción del parásito, formando microgametos (gametos masculinos) y macrogametos (gametos femeninos). Cuando hay ruptura de los gametocistos, los gametos se entrecruzan y fusionan para formar cigotos, los cuales son liberados al medio externo. Las zigosporas son consumidas por bivalvos y poliquetos. En el interior de estos segundos hospederos, ocurre la esporogonia en las células del epitelio intestinal. Posteriormente, el camarón ingiere los poliquetos o sus heces y se infesta. Dentro del tracto gastrointestinal del camarón, se libe- ran los esporozoitos, ocupando el estómago posterior o el intestino medio, adhiriéndose a la cutícula o penetrando las membranas de las células del hospedero. Los esporozoitos son desarrollados a trofozoitos en el intestino medio, posterior o en el propio estómago (Fig. 4.1.1).

198 Capítulo 4 - Parásitos en camarones

Mecanismos de transmisión Debido a la necesidad de varios hospederos dentro del ciclo de vida de las gregarinas, se cree que la transmisión de un camarón a otro no es frecuente. Algunos ensayos de transmisión en acuarios han mostrado que eliminando el segundo hospedero una vez están infestados los camarones, desaparecen los protozoarios del tracto intestinal en pocos días. Aunque los moluscos bivalvos han sido implicados tradicionalmente como hospederos intermediarios de las gregarinas para camarones penaeidos, el poliqueto Polydora cirrhosa, anélido muy común que vive en el fondo de las piscinas camaroneras, fue encontrado como un importante hospedero intermediario para el Nematopsis sp. según estudios realizados en Ecuador, en estanques de cultivo de P. vannamei.

Signos clínicos Los camarones con infestaciones muy altas (más de 100 trofozoitos por cm de intestino medio), pueden mostrar una coloración amarillenta del intestino medio. En los casos en los que la in- festación es severa e involucra a una gran parte de la población de cultivo, se puede presentar bajo crecimiento de los camarones y aumento en el factor de conversión alimenticia. Los camarones con niveles bajos o moderados de infestación por gregarinas, pueden no presentar signos clínicos y tener una apariencia general equivalente a camarones aparentemente sanos.

Diagnóstico Montaje en fresco: pueden ser observados esporozoitos, trofozoitos o gametocistos en heces de camarones extraídas del intestino medio y examinadas bajo el microscopio, utilizando objetivos de 10x y 20x. No se requieren tinciones para la diferenciación del parásito. Su apariencia será pálida cuando esté inmaduro y tendiente a color marrón oscuro entre más cercano esté de ser adulto. En algunos casos se observan gregarinas con su extremo distal bifurcado en forma de “Y”. Cada “segmento” (célula) que conforma el organismo, tiene su núcleo visible y de fácil diferenciación cuando se usa el ajuste micrométrico de foco en el microscopio (Fig. 4.1.3 a 4.1.5). Histopatología: se observan parásitos en el intestino medio y con frecuencia en la luz del ciego anterior, así como en los conductos primarios del hepatopáncreas; estómago anterior y porción inicial del tracto digestivo anterior. Las lesiones significativas aparecen típicamente en infestaciones severas y consisten en taponamiento mecánico del lumen intestinal, reducción del grosor de la mucosa del intestino medio, hiperplasia del epitelio intestinal formando pliegues tipo “vellos” y, perforaciones de la mucosa intestinal. Éstas, pueden proporcionar una ruta de entrada a Vibrio spp. u otras especies de bacterias extracelulares, que son agentes potenciales causantes de bacteremia por oportunistas.

Medidas de control Los aumentos en la intensificación de los sistemas de producción, han venido acompañados por aumentos en la incidencia de gregarinas en las explotaciones de camarón. Con el fin de mantener los niveles de gregarinas por debajo de los grados considerados como de riesgo para el crecimiento (y eventualmente supervivencia), muchos productores realizan monitoreos periódicos para gregarinas y han comenzado a incorporar anticoccidiales veterinarios en los alimentos balanceados, con las dosis recomendadas para avicultura y ganadería bovina, teniendo resultados variables que son medidos a través de muestreos de rutina. Sin embargo, se debe considerar que los ingredientes activos conocidos como coccidiostáticos y según el Reglamento No. 37/2010 de la Comisión Europea, no están autorizados para especies acuáticas sino únicamente para las especies establecidas en dicho reglamento.

199 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Otras técnicas de control incluyen la eliminación del organismo hospedero (Polydora sp. y moluscos bivalvos), mediante la adición de cal en niveles adecuados al fondo del estanque luego de la cosecha, para destruir estos vectores potenciales del protozoario.

Figura 4.1.1. Ciclo de vida de las gregarinas en camarones. Adaptado de Johnson (1978). A. El camarón ingiere las esporas con detritus orgánicos del fondo. B. Los esporozoitos emergen dentro del intestino del camarón. C. Los esporozoitos se adhieren a la pared intestinal y crece en trofozoitos; algunos trofozoitos no se adhieren a las paredes sino entre sí, formando estructuras inusuales. D. Estas formas inusuales se desarrollan y se adhieren a la parte final del intestino (recto) para formar gametocistos. E. Los gametocistos sufren múltiples divisiones para producir gimnosporas que quedan libres luego de la ruptura del gametocisto. F. Las gimnosporas son engolfadas por células de la superficie del tejido blando de las almejas. G. Dentro de las almejas, se desarrollan hasta formar esporas. H. Las esporas (con esporozoitos en su interior) son luego liberadas por al almeja adheridas a masas de moco.

GREGARINAS

Figura 4.1.2. Microfotografía del epitelio intestinal de un camarón P. vannamei mostrando dos trofozoitos de gregarina Nematopsis sp. de diferente tamaño, adheridos a las células epiteliales dentro del lumen del intestino medio. Tinción: H&E de Mayer-Bennett. Magnificación: 1,500X.

200 Capítulo 4 - Parásitos en camarones

Figura 4.1.3. Montaje en fresco de gregarinas Nematopsis sp. en el intestino medio de un P. vannamei. Los organismos presentes son formas tempranas de trofozoitos de 2 células. Sin tin- ción. Magnificación: 800X.

Figura 4.1.4. Montaje en fresco de gregarinas Nematopsis sp. en el intestino medio de un P. vannamei. Los organismos presentes son formas maduras de trofozoitos de 3 y 5 células. Sin tin- ción. Magnificación: 500X.

Figura 4.1.5. Montaje en fresco de trofozoitos de gregarinas Paraophioidina sp. en el intestino medio de una postlarva de P. vannamei. Sin tin- ción. Magnificación: 100X.

201 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

4.2 Microsporidios

Nombre de la enfermedad Microsporidiosis, enfermedad del camarón algodonoso, enfermedad del camarón lechoso o enfermedad del Nosema (entre otras).

Etiología Anteriormente se sostenía que la microsporidiosis era una enfermedad parasitaria producida en camarones penaeidos por protozoarios intracelulares miotrópicos, pero ahora se sabe que el agente causal de la enfermedad pertenece a los hongos, de acuerdo con estudios moleculares a partir de secuenciación del RNA ribosomal. Los principales géneros son Agmasoma (anteriormente Thelohania), (A. penaei y A. duorara), Ameson (anteriormente Nosema) (A. nelsoni) y Pleistophora (anteriormente Plistophora) (P. penaei). Un nuevo género Tuzetia, fue reportado en 2002 e incluye la especie T. weidneri. Las especies de microsporidios observadas en los tejidos de los camarones, pueden ser diferenciadas según el tamaño de las esporas (1 a 8 µm), el número de esporas producidas y el número de giros del túbulo polar.

Especies afectadas Probablemente todas las especies de camarones penaeidos puedan ser infestadas por una o más especies de microsporidios. Los tejidos afectados están típicamente inflamados. Las células que son parasitadas, presentan hipertrofia tanto del citoplasma como del núcleo y poseen esporas del protozoario que pueden verse esféricas o cilíndricas. Estos parásitos protozoarios intracelulares afectan a artrópodos, peces y también al hombre. Poseen reproducción sexual por esporogamia (en el hospedero) y asexual por fisión múltiple (esqui- zogamia). La enfermedad del camarón algodonoso en P. vannamei, se presenta cuando el músculo estriado es invadido por el protozoario Ameson sp. Los procesos de reproducción asexual culminan con la producción de gran cantidad de esporas que se localizan dentro de las células en tejido muscular del camarón.

Ciclo de vida y vías de transmisión El parásito tiene un ciclo de vida indirecto que involucra dos hospederos: los camarones (hospederos intermediarios) y los peces (hospederos definitivos). Algunos estudios también han demostrado que los copépodos y cladóceros son utilizados como hospederos intermediarios por parte de los microsporidios, incluyendo las especies del género Tuzetia. En el medio natural, los peces adquieren los microsporidios cuando se alimentan de camarones que tienen esporas del parásito, colonizando así sus tejidos. Estudios realizados en Tailandia durante 1994, revelaron que las especies de peces Priacanthus tayenus y Scatophagus aarhus son portadoras de las esporas de microsporidios. Estas esporas continúan su desarrollo en el intestino de los peces y eventualmente el estadio infectante es liberado al medio natural en las heces del pez. Los camarones probablemente ingieren estas formas infectantes del parásito en el momento en que se están alimentando con detritos orgánicos del fondo. El parásito se localiza entonces en las células del músculo estriado (u otros tejidos) y se divide de manera eficiente, produciendo esporas que desplazarán las células musculares (Fig. 4.2.1) Especies de microsporidios como las que pertenecen al género Ameson, han sido detectadas en reproductores silvestres de P. vannamei. En condiciones de cultivo en estanques, es muy raro ver brotes de microsporidiosis y aún menos frecuentes son en tanques de levantamiento o mantenimiento

202 Capítulo 4 - Parásitos en camarones de reproductores. Sin embargo, se tienen reportes de un brote de la enfermedad que se dio en camarones cultivados en tanques, los cuales fueron puestos en contacto con agua o sedimento de peces que habían sido alimentados con camarones silvestres.

Ciclo de vida de los microsporidios

Figura 4.2.1. Adaptada y modificada después de Johnson 1978 por el Dr. Kenneth W. Hasson. Partes de la figura fueron tomadas directamente de Canning y Lom 1986, Perkins 1991 y Putz y McLaughlin 1970.

Métodos de diagnóstico El examen clínico permite detectar presencia de manchas blancas en cefalotórax, gónadas, tracto digestivo y/o músculo esquelético en abdomen o cefalotórax, las cuales pueden sugerir in- fección con el hongo (Fig. 4.2.2 a 4.2.4). Estos hallazgos también pueden estar acompañados por opacidad u oscurecimiento generalizado del camarón. El montaje en fresco a partir de tejido muscular afectado sin teñir o coloreado con la técnica de Giemsa, permite observar las esporas del parásito bajo el microscopio (400x). Son características las masas de esporas refringentes que de acuerdo con su tamaño y forma, indican el tipo de organismo que se encuentra presente en los tejidos afectados (Fig. 4.2.5 y 4.2.6). El análisis histológico realizando tinciones con H&E, Giemsa o ácido-alcohol resistente (“acid fast”), permite visualizar las esporas de los microsporidios claramente dispuestas en colonias dentro de los tejidos afectados (Fig. 4.2.7 y 4.2.8). En la Tabla 1 se describen las características de las esporas de cada especie, según los nuevos esquemas taxonómicos y mediante el uso de microscopía electrónica de transmisión (TEM):

203 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Tabla 1: Características de las esporas de cada especie.

Esporas de cada especie Tamaño de esporas Observaciones Son producidas individualmente a Ameson Esporas de 1.2 x 2 mm partir de esporontes Presentes de 16 a más de 40 en Pleistophora Esporas de 2.1 x 2.6 mm cada esporonte Agmasoma penaei Esporas de 2.0 x 5.0 o de 5.0 x 8.2 mm Con 8 por esporonte

Agmasoma duorara Esporas de 3.6 x 5.4 mm Con 8 por esporonte

Para la detección de especies de microsporidios del género Agmasoma en tejidos afectados de camarones penaeidos, ha sido desarrollada una sonda genética marcada con Digoxigenina, así como primers para pruebas de PCR. Estos últimos se han obtenido a partir de una secuencia conservada de una pequeña subunidad ribosomal de RNA, perteneciente a otra microsporidia, de la cual se posee un mayor conocimiento.

Signos clínicos de importancia diagnóstica Los signos evidentes de microsporidiosis, incluyen como principal característica opacidad difusa y lechosa de la musculatura abdominal, con apariencia de camarón cocido. Los camarones severamente afectados son en algunos casos más pequeños que sus compañeros de estanque y presentan además una coloración típica azulosa y oscura. También se puede presentar letargia y debilidad. En fase temprana de la infección, se observa opacidad multifocal de la musculatura. De las cuatro especies mencionadas anteriormente, tres infestan y terminan reemplazando el músculo estriado de los camarones afectados, causando la típica coloración opaca y blanquecina. La especie Agmasoma penaei afecta gónadas, corazón, vasos hemolinfáticos, branquias, hepatopán- creas e intestino medio, produciendo opacidad blanquecina y agrandamiento de las gónadas y con frecuencia zonas de inflamación blanquecinas parecidas a tumores tanto en las branquias, como en tejido subcuticular y apéndices. En la Tabla 2 se describen los tejidos infectados de las especies afectadas por microsporidios o haplasporidios. En los casos en los que los camarones están severamente afectados por la enfermedad, la cutí- cula se torna de color azulada y oscura debido a la expansión de los melanóforos cuticulares. La importancia de esta enfermedad en sistemas comerciales de producción de camarones, radica en que al afectarse la musculatura abdominal, se inhabilita la comercialización de los individuos con infección severa. De esta manera, se reducen las posibilidades de obtener una utilidad económica en el cultivo, en proporción directa con la prevalencia y la severidad del brote en el momento de la cosecha. Otro aspecto importante en la producción relacionado con la microsporidiosis, es que los reproductores infestados pueden llegar a ser estériles en los casos en los que las gónadas han sido afectadas.

204 Capítulo 4 - Parásitos en camarones

Tabla 2. Microsporidios y haplosporidios en camarones penaeidos. Adaptado de Lightner, 1996.

Microsporidios o Eporas/ Tamaño de las Especies afectadas Tejidos infectados haplosporidios esporontes esporas (µm) P. aztecus Músculo estriado 1 1.2 x 2.0 Ameson (=Nosema) nelsoni P. duorarum P. setiferus P. vannamei Metapenaeus Músculo estriado 1 No reportado Nosema sp. monoceros P. esculentus No reportado P. latisulcatus No reportado P. merguiensis No reportado P. semisulcatus No reportado Vasos sanguíneos, intestinos anterior Agmasoma P. setiferus 2.0 x 5.0 y y posterior, 8 (Thelohania) penaei P. vannamei 5.0 x 8.2 gónadas y músculo Vasos sanguíneos, intestinos anterior Agmasoma P. monodon y posterior, 8 No reportado (Thelohania) sp. P. merguiensis gónadas y músculo Agmasoma (= P. duorarum Músculo 8 3.6 x 5.4 Thelohania) duorara P. aztecus P. brasiliensis P. esculentus Músculo estriado 8 No reportado Thelohania sp. P. latisulcatus P. merguiensis P. semisulcatus Músculo, corazón, intestino anterior, P. aztecus 16 to 40+ 2.1 x 2.6 branquias y Pleistophora sp. hepatopáncreas P. setiferus P. stylirostris P. duorarum

Haplosporidios P. vannamei Hepatopáncreas -- -- P. monodon Hepatopáncreas -- --

205 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Mecanismos de control No se conocen tratamientos específicos para el control de la microsporidiosis en sistemas de producción. Por esta razón, solamente se puede tratar de evitar el contacto entre los camarones expuestos a riesgo de infestación (hospederos intermediarios), los peces requeridos como hospederos definitivos para cerrar el ciclo y, el parásito en sí. Por lo anterior, se hace evidente la importancia de realizar planes de exclusión de predadores de camarones (peces), tanto de los estanques de cultivo, como de los canales de suministro de agua (reservorios). Los camarones afectados por el parásito, deben ser descartados durante el cultivo en estanques y durante el momento de la cosecha. De igual manera, deben extremarse cuidados para evitar la dise- minación de reproductores de P. vannamei infestados con alguna de las especies de microsporidios, en regiones geográficas en donde el parásito no se encuentre o no haya sido reportado. No se deben utilizar camarones infectados o sospechosos de microsporidiosis, en sistemas de maduración.

MICROSPORIDIOS

Figura 4.2.2. Camarón P. vannamei infectado con Ameson (arriba) y presentando la enfermedad del camarón algodonoso. En contraste, camarón sano (abajo). Nótese en el camarón enfermo, la apariencia blanquecina del músculo estriado (flechas), así como su coloración oscura y su pigmenta- ción azulosa tenue.

Figura 4.2.3. Camarón P. vannamei infectado con Ameson presentando signos de la enfermedad del camarón algodonoso. Nó- tese la apariencia blanquecina del músculo estriado en el primer segmento abdominal (flecha gruesa) y en el cefalotórax (flechas delgadas), así como la pigmentación azulosa generalizada.

206 Capítulo 4 - Parásitos en camarones

Figura 4.2.4. Secciones de abdomen de un camarón P. vannamei infectado con Ame- son y padeciendo la enfermedad del cama- rón algodonoso (izquierda) y de un cama- rón sano (derecha). Nótese en el enfermo la apariencia blanquecina del músculo estriado abdominal, indicándose que se trata de una infección por un microsporodio miotrópico.

Figura 4.2.5. Montaje en fresco de músculo estriado de un camarón P. duorarum infectado con Agmasoma. Cada esporonte confi- gurado en forma de vesícula, contiene ocho esporas (flechas). Magnificación 1000X. Foto: Jan Landsberg y Yasu Kiryu. Florida Fish and Wildlife Conservation Commis- sion, USA.

Figura 4.2.6. Montaje en fresco sin tinción de músculo estriado de un camarón P. vannamei infectado con Ameson. Se observa un esporonte conteniendo muchas peque- ñas esporas. Magnificación 2000X.

207 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 4.2.7. Corte sagital en baja magni- ficación (400X) de músculo abdominal de un camarón P. vannamei infectado con Ameson. Las fibras de músculo estriado del centro del corte, han sido completamente reemplazadas por masas levemente basofí- licas de esporas del hongo (flechas). H&E. Magnificación 400X.

Figura 4.2.8. Corte histológico de corazón de P. vannamei infectado con Ameson. La infección del hongo ha producido una respuesta inflamatoria circundando el área afectada por agregación de hemocitos (flechas delgadas) alrededor de la masa de esporas de microsporidios (flecha gruesa). H&E. Magnificación 1200X.

208 Capítulo 4 - Parásitos en camarones

4.3 HAPLOSPORIDIOS

Nombre de la enfermedad Haplosporidiosis hepatopancreática, infección por haplosporidios o haplosporidiosis.

Etiología Se cree que las afecciones en camarones penaeidos son producidas por varios posibles haplosporidios. Algunos de estos parásitos reportados en cultivos de camarón en Asia y México, no han sido lo suficientemente estudiados y tampoco han sido demostradas esporas del parásito como para poder ser ubicados taxonómicamente dentro del phylum Haplosporea. Para ello, se requerirán estudios a partir de TEM con el fin de utilizar las características de su ultraestructura en una correcta clasificación. Sin embargo, recientemente ha sido propuesto (Painhealth Medical References) que los haplosporidios sean clasificados en el orden sporozoa como protozoarios del phylum Ascetospora, clase Stellatosporea, con reproducción asexual mediante esquisogonias y que producen esporas pero no flagelos, pudiendo tener seudópodos.

Distribución geográfica y rango de la enfermedad Los haplosporidios han sido observados en camarones P. vannamei silvestres y de cultivo, tan- to en Cuba como en Nicaragua. También se han reportado en P. stylirostris en México, en P. monodon en Indonesia y en Filipinas. Fue reportado un caso presuntivo de haplosporidiosis en P. monodon en el norte de Australia, pero sin confirmar. El reporte de haplosporidiosis en P. stylirostris en México, correspondió en la realidad a camarones que se encontraban en fase terminal por microsporidiosis, causada esta por una especie del género Ameson. Debido a que en los camarones afectados, los parásitos han sido observados en células de los túbulos del HP, se presume que la vía de infección es por ingestión, aunque aún no se tiene claro cual es el mecanismo de transmisión de estos protozoarios en los camarones.

Métodos de diagnóstico Análisis histológico para demostrar la presencia intracelular del protozoario en las células epiteliales de los túbulos del HP. En infecciones típicas, el protozoario se aprecia api- calmente o lateralmente al núcleo, como si fuera un plasmodio multinu- cleado que puede fragmentarse en es- tadíos mononucleados. Estas células mononucleadas pueden ser encontradas en el lumen de los túbulos del HP, presumiblemente después de haber Figura 4.3.1. Corte histológico de hepatopáncreas (HP) de un juvenil sido liberadas por células necróticas. P. monodon infectado con haplosporidios. En la foto se ilustran los Los plasmodios pueden ser observa- diferentes estadios de infección en las células epiteliales de los túbulos dos en cortes histológicos teñidos con del HP (flechas). Tinción: Mayer-Bennett H&E. Magnificación: 1800X. hematoxilina y eosina o con Wol- Foto cortesía del Lic. A. Varela, a partir de la colección histológica del Laboratorio de Patología Acuática de la Universidad de Arizona bach’s Giemsa (Fig. 4.3.1). (Tucson, EE.UU.).

209 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

En los casos de infecciones muy severas, los túbulos del HP con alta presencia de haplosporidios se observan rodeados por masas de hemocitos, los cuales están encapsulando y melanizando activamente las porciones afectadas de los túbulos. Al realizar estudios mediante TEM a partir de células epiteliales de túbulos afectados del HP, se observa la presencia de haplosporosomas dentro del parásito cuyo tamaño aproximado es de 29- 140 nm x 130-603 nm.

Signos clínicos No han sido reportados signos de enfermedad en camarones penaeidos afectados por el pa- rásito, que puedan ser asociados con presencia de haplosporidios en sus tejidos. Sin embargo, los camarones afectados podrían presentar bajo crecimiento.

Estrategias de control Los camarones infectados con haplosporidios deben ser removidos del sistema de producción y eliminados adecuadamente para destruir el parásito. Las instalaciones de cultivo deben ser desinfectadas de manera cuidadosa y los camarones (en cualquier estadio) infectados o sospechosos, no deben ser movilizados ni entre fincas, ni entre regiones geográficas.

4.4 EPICOMENSALES Los camarones penaeidos cultivados en sistemas de producción semiintensivos, intensivos o sobreintensivos, con altas densidades de siembra en los estanques o aguas de baja calidad, frecuentemente desarrollan formas de enfermedad causadas por microorganismos o agentes que se adhieren a las branquias o a la superficie del animal. La mayoría de éstos, viven en estado libre en el agua y no son patógenos verdaderos. Debido a que utilizan al camarón como un substrato para adherirse, son llamados organismos epicomensales o epibiontes. En la mayor parte de los casos, estos organismos no causan daños directos al camarón, aunque sí producen problemas indirectamente al adherirse a las branquias (compitiendo por el oxígeno disuelto), o a las superficies cuticulares de apéndices y otras partes del cuerpo.

Nombre de la enfermedad Enfermedad de las branquias, enfermedad de branquias filamentosas, enfermedad bacteriana de las branquias, branquias sucias, branquias negras, branquias cafés o, branquias con adherencias de protozoarios.

Etiología La enfermedad por adherencia de epicomensales en camarones, se presenta cuando se afectan las funciones respiratorias, alimenticias o locomotoras de los animales, a causa de colonización excesiva de la cutícula principalmente por bacterias filamentosas, bacterias con forma de bastón (bacilos), protozoarios, diatomeas y algas filamentosas verde-azules. Los siguientes son los agentes más comunes en camarones (Fig. 4.4.1 a la 4.4.9): • Organismos tipo Leucothrix (Leucothrix like-organisms-LLO): Leucothrix mucor, Leucothrix spp. y Thiothrix sp. • Bacterias que forman muy pequeños filamentos (“small little filaments”-SLF): Vibrio sp., Fla- vobacterium sp., Cytophaga sp. y Flexibacter sp. Existen posiblemente otras bacterias aún no identificadas.

210 Capítulo 4 - Parásitos en camarones

• Protozoarios • Perítricos ciliados con colonias: Zoothamnium sp., Epistylis sp. y Vorticella sp. • Apostoma ciliados: Ascophrys spp. y otros • Loricados ciliados: Lagenophrys spp. y Cothurnia spp. • Suctorianos: Acineta spp., Ephelota spp. y otros • Flagelados: flagelados tipo Bodo y Chrysidella sp. • Algas • Diatomeas (“pennales”): Nitzschia spp., Amphiprora spp. y Navicula spp. • Algas verdes: Enteromorpha spp. y otras algas verdes filamentosas • Algas filamentosas verde-azules: Spirulina subsala, Lyngbya spp. y Schizothrix spp. • Agentes abióticos: sales de hierro

Diagnóstico Las enfermedades por organismos epicomensales, son diagnosticadas mediante la observa- ción de preparaciones en fresco de los microorganismos, tanto en larvas y postlarvas, como en secciones de branquias y apéndices orales de camarones juveniles o adultos afectados. En sistemas intensivos y sobreintensivos, debe ser una práctica frecuente el monitoreo de camarones y su examen bajo un microscopio, para determinar la prevalencia y severidad de la enfermedad. De esta manera, se proporciona información significativa sobre las condiciones sanitarias de las branquias con base en la adherencia de epibiontes en los camarones. Las decisiones para implementar sistemas de control en los casos de enfermedades por organismos epicomensales, están basadas en los datos obtenidos a partir de estos monitoreos. Los camarones para los análisis de rutina, no deben ser seleccionados aleatoriamente de una población bajo estudio. El mejor procedimiento es seleccionar individuos que estén decaídos, con las branquias manchadas o que tengan la musculatura opaca (sospechosos de hipoxia), ya que el propósito principal de este examen es decidir si se necesita algún tipo de tratamiento y qué clase de químico o manejo debe ser utilizado para salvar la población. Normalmente, de cinco a diez camarones de un tanque o estanque, deben ser seleccionados y sometidos a un examen microscópico. Utilizando cortes histológicos en parafina teñidos con H&E, pueden detectarse y usualmente identificarse organismos epicomensales del cuerpo, branquias y apéndices. Además, el grado de severidad de la infestación por organismos epicomensales, es con frecuencia fácilmente determinado, especialmente por cortes que proporcionan un panorama de las branquias.

Rango geográfico y especies afectadas La presencia de epicomensales puede ser observada en cualquier región del mundo donde se cultiven camarones penaeidos. Todas las especies de camarones son potencialmente susceptibles a adherencias de epicomensales, tanto en sistemas extensivos, como semi-intensivos e intensivos. También pueden ser observados en otras especies de decápodos bentónicos que sirven como hospederos o vectores. De igual manera, enfermedad por epibiontes pueden presentarse en todos los estadios del ciclo de vida de los camarones.

211 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

A pesar de su amplia distribución geográfica, pueden presentarse cepas o especies únicas y que son propias de determinadas regiones. Éstas, pueden significar un peligro para instalaciones de cultivo de otros lugares donde no existan, en caso de que se realice una importación con camarones infestados. En este sentido, deben tomarse medidas preventivas para excluir parásitos epicomensales potencialmente exóticos.

Efecto en los camarones afectados Estos organismos se presentan generalmente sobre la superficie de cutícula en las branquias principalmente. No se consideran como patógenos verdaderos para los camarones, ya que sólo los utilizan como sustrato para adherirse al exoesqueleto donde viven y se alimentan de los nutrientes del medio acuático. Por esta razón, se les conoce como epicomensales o epibiontes. Sin embargo, pueden causar daño a los camarones cuando colonizando en grandes cantidades, se ubican en las lamelas branquiales e interfieren con el intercambio gaseoso (liberación de CO2 y captación de O2). Los organismos epicomensales pueden llegar a matar al camarón, por el impedimento que causan al flujo normal de agua a través de las branquias, dificultando en casos extremos el intercambio gaseoso en las lamelas branquiales (hipoxia). Igualmente, pueden interferir con los procesos de muda, aprehensión del alimento y movimientos básicos de los animales severamente afectados, cuando colonizan severamente los apéndices motrices, natatorios o alimentarios. De la misma manera, algunos organismos epicomensales producen exotoxinas, que podrían causar algún grado de lesión en los tejidos colonizados y adyacentes. Con frecuencia, las infestaciones involucran poblaciones mixtas de organismos, existiendo una especie dominante. A este respecto, las bacterias cortas y largas con forma de bastón, son las de mayor prevalencia en los laboratorios de larvicultura de camarón. A su vez, las bacterias filamentosas y los protozoarios perítricos son generalmente las causas principales de enfermedad en juveniles y adultos de P. vannamei. En síntesis, la enfermedad causada por epicomensales en camarones puede producir bajo crecimiento, disminución en el consumo de alimento, comportamiento de nado anormal, intolerancia al ejercicio (y al estrés), intolerancia a condiciones de bajo oxígeno disuelto y cambios en la coloración de las branquias.

Signos clínicos Las lamelas de las branquias son el lugar más frecuente para la infestación en juveniles y camarones mayores. Por esta razón, el examen visual de camarones afectados mostrará cambio de coloración de las branquias, constituyéndose así en un examen muy valioso para la detección de enfermedad por epicomensales. La presencia de coloración amarilla, café o negra en las branquias, está relacionada con colo- nización de epicomensales y pueden ser debida a material detrítico o lodo atrapado por los microorganismos que están adheridos a las lamelas. Si se observa coloración verde o verdosa de las branquias, puede deberse a colonización de las lamelas branquiales por una o varias especies de algas. Algunos camarones pueden tomar una apariencia de “peluche”, algodonosos o como si estuvieran colonizados por hongos, lo cual corresponde en realidad a una fuerte colonización de organismos epicomensales sobre la superficie del animal.

212 Capítulo 4 - Parásitos en camarones

Una invasión desde moderada hasta alta, puede inhibir la respiración del animal. Los camarones pueden aparecer exteriormente normales pero mueren rápidamente durante o inmediatamente después del ejercicio, manipulación (muestreos o transferencias) o exposiciones a condiciones de oxígeno bajo en el agua. En infestaciones de larvas o postlarvas, con frecuencia se ven involucrados los apéndices natatorios, ojos y algunas partes de la boca. Como se mencionó anteriormente, los animales afectados pueden mostrar dificultades para moverse y alimentarse. Cuando los camarones se encuentran severamente afectados por epicomensales, pueden morir durante la muda, encontrándose luego en el fondo con apariencia “limpia” del exoesqueleto, pero con la cutícula suave. Teniendo las branquias fuertemente colonizadas por epibiontes, las condiciones de oxígeno disuelto bajo durante las madrugadas pueden potencializar el ambiente hipóxico del camarón que de por sí se está presentando por la enfermedad en las branquias. Tanto los hallazgos mediante montajes en fresco como a través de análisis histológicos, deben ser registrados para establecer la prevalencia y severidad del problema. Los grados de severidad pueden ser estimados en la escala de 0 a 4 de acuerdo con la Tabla propuesta por Lightner (1996), ver Tabla 6 del capítulo 1 (pág. 46).

Vías de transmisión Todos los agentes epicomensales son habitantes normales del medio acuático marino. Estos organismos son parte de la flora natural asociada con la cutícula de los crustáceos marinos y de esta manera, infestaciones menores causan pequeña o ninguna pérdida de las funciones o signos de enfermedad. Cuando las condiciones medioambientales son convenientes, puede desencadenarse la adherencia de organismos epicomensales, los cuales generarán enfermedad por adherencias en los camarones de cultivo. El hacinamiento en las piscinas y el aporte de nutrientes mediante el alimento suministrado, contribuyen a las condiciones eutróficas en los tanques o estanques de cultivo de ca- marón.

Estrategias de control La prevención de enfermedades causadas por organismos epicomensales, requiere de condiciones ambientales óptimas de cultivo, que permitan el sano crecimiento de los camarones. Sin embargo, no existen lineamientos específicos disponibles, concernientes a los niveles de requerimientos nutricionales mínimos, manipulación precisa del medioambiente y factores de manejo que alteren los niveles de infestación. Por esta razón, los cambios en las condiciones que predisponen la presencia de estas enfermedades, deben ser manejados hasta el momento, de manera intuitiva aunque con fundamentos técnicos. Los factores básicos que pueden ser alterados, incluyen el aumento en el recambio de agua, mejoramiento de la circulación del cuerpo de agua, disminución en la densidad de cultivo o re- ducción de la biomasa (raleo), uso de alimentos balanceados y fertilizar el terreno adecuadamente, teniendo en cuenta la proporción P:N para evitar la acumulación de materia orgánica y proliferación de protozoarios. Si el control no puede mantenerse a través del manejo del agua y del alimento o del saneamiento del tanque o estanque, se ha reportado efectividad en el uso de Neomicina, realizando baños durante la noche a 10 ppm en tanques de larvicultura. Para el caso de juveniles y adultos, se ha utilizado sulfato de cobre (Cutrine plus: 0.2 - 0.5 ppm Cu, baños de 4 horas) y Formalina (50 - 100 ppm, baños de 1 hora).

213 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

EPICOMENSALES

Figura 4.4.1. Montaje en fresco de branquias de P. vannamei con una colonia de Epistylis sp. (flecha). Es característica en este protozoario la ausencia de mionema. Sin tinción. Magnificación 400X.

Figura 4.4.2. Corte histológico de una lamela branquial de P. vannamei con una colonia de Epistylis sp. sobre la cutícula del extremo de la lamela. Debido a que esta colonia carece de mionema, se sugiere que se trata de Epistylis sp. H&E. Magnificación 400X.

Figura 4.4.3. Montaje en fresco del extremo de una lamela branquial de P. vannamei con una colonia de Zoothamnium sp. Ad- herida a su extremo. Es notable la existencia de mionema en el tallo de este parásito (flecha). Sin tinción. Magnificación 400X.

214 Capítulo 4 - Parásitos en camarones

Figura 4.4.4. Corte histológico de branquia de P. vannamei infestado con Zoothamnium sp. Es característica la presencia de mionema en el centro del tallo del protozoario (flecha), el cual es una fibra retráctil que da movimiento al organismo. H&E. Magnifica- ción 600X. Cortesía del Dr. Ken Hasson y Dra. Barbara Lewis.

Figura 4.4.5. Montaje en fresco del sucto- riano Acineta sp. Sobre lamelas branquiales de P. vannamei. El organismo tiene apariencia similar a copa de vino y posee un nú- cleo central, esférico y oblongo. Sin tinción. Magnificación 400X.

Figura 4.4.6. Corte histológico de branquias de P. vannamei con presencia de Acineta sp. Es característica la forme de copa de vino y tentáculos apicales (flecha). H&E. Magnificación 600X. 215 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 4.4.7. Montaje en fresco de branquias de P. vannamei, con colonización moderada por bacterias filamentosas Leu- cothrix mucor (flechas). Sin tinción. Magni- ficación 400X.

Figura 4.4.8. Montaje en fresco de branquias de P. vannamei con colonización moderada por microalgas (diatomeas) Nitzschia sp. (flecha). Sin tinción. Magnificación 400X.

Figura 4.4.9. Adherencias severas del alga verde filamentosa Enteromorpha sp. sobre la cutícula del cefalotórax de un reproduc- tor P. vannamei, mantenido en un tanque externo de concreto. A pesar de la coloni- zación externa, las branquias no presentaban adherencias y tampoco se observaron lesiones histológicas en órganos o tejidos de este animal.

216 Capítulo 4 - Parásitos en camarones

4.5 Metazoarios

Agente causal Las parasitosis producidas por metazoarios en los camarones, son causadas por larvas de céstodos (gusanos planos como tenias), nemátodos (gusanos redondos) o tremátodos (platelmintos o gusanos con forma de hoja). Estos organismos infestan de manera ocasional diferentes tipos de tejidos en los camarones penaeidos. Rara vez se asocian con problemas de enfermedad o mortalidad masiva en cultivos de camarones, debido a la dificultad en que se cierre el ciclo de vida dentro de los estanques de producción y durante el tiempo de engorde de los camarones. Céstodos. También llamados gusanos planos (como la tenia), están generalmente asociados con infestaciones en el hepatopáncreas. Se encuentran usualmente incorporados en el tejido de esta glándula digestiva o cerca de ésta bajo su tejido capsular. En los camarones, los céstodos se encuentran bajo formas inmaduras del parásito, mientras que las firmas adultas (maduras) se encuentran en las rayas. Además de los géneros Prochristianella, Parachristianella y Renibulbus que son los más frecuentes en camarones, también existe un gusano con forma de pera que se ubica en el intestino y pertenece al grupo cyclophyllidea. Los gusanos planos se encuentran más comúnmente en camarones silvestres que en camarones de cultivo. La diferenciación entre los grupos de los gusanos planos, se hace con base en la forma general del cuerpo y en la armadura tentacular (Fig. 4.5.1). Nemátodos. Los gusanos redondos se observan con más frecuencia en camarones silvestres que en camarones bajo sistemas de cultivo. Esta diferencia en el grado de infestación, puede estar relacionada con la ausencia de hospederos alternativos en los sistemas de cultivo. Cuando se presentan, las infestaciones por nemátodos pueden darse dentro o alrededor de la mayoría de los órganos del ca- marón así como en su tejido muscular. Los nemátodos más frecuentes en camarones son Spirocama- llanus pereirai, Leptolaimus sp., Ascaropsis sp. e Hysterothylacium reliquens (Fig. 4.5.2, 4.5.4 y 4.5.6). Tremátodos. Los platelmintos se encuentran presentes en los camarones bajo las formas inmaduras llamadas metacercaria, enquistados en varios tejidos del animal. En instalaciones comerciales de cultivo de camarón, se han reportado especies pertenecientes a las familias Opecoelidae, Micro- phallidae y Echinostomatidae. Unas de las especies más frecuentes, son Opecoeloides fimbriatus, Helicometrina nimia y Microphallus sp. (Fig. 4.5.3).

Especies afectadas y estadios susceptibles Los metazoarios pueden ser encontrados en tejidos de camarones subadultos hasta reproductores, potencialmente en la mayoría de las especies de penaeidos y en la mayor parte de los países tropicales y subtropicales productores de camarón de cultivo.

Ciclo de vida En el medio natural, los camarones P. vannamei sirven como hospederos intermediarios para muchos parásitos metazoarios incluyendo nemátodos y tremátodos. En el tejido del camarón, se desarrolla un estadío intermediario de la larva como parte del ciclo de vida del organismo, requiriendo de otro hospedero para completar su ciclo. Este hospedero final generalmente no está presente en los estanques de cultivo de camarón y por lo tanto, no es frecuente observar larvas de metazoarios en camarones de cultivo, siendo más fácil encontrarlos en tejidos de reproductores silvestres.

217 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura. 4.5.1. Ciclo de vida del céstodo Prochristianella penaei. El camarón se come un copépodo u otro pequeño crustáceo infestado con la larva del parásito (A), la larva se desarrolla a un estado larval avanzado en los tejidos del camarón (B), una raya ingiere a los camarones infestados (C), el tremátodo se convierte en adulto en el intestino (válvula espiral) de la raya y comienza a liberar sus huevos (D), los huevos salen por las heces de la raya y son consumidos por copépodos (E), los huevos eclosionan y las larvas del gusano se desarrollan dentro del cuerpo de los copépodos (F). Adaptado de Johnson, 1995.

Figura 4.5.2. Ciclo de vida del nemátodo Hysterothylacium relinquens. El camarón se come un copépodo u otro pequeño crustáceo infestado con larvas de estas lombrices intestinales (A), el nemátodo se desarrolla en etapa larval avanzada en los tejidos del camarón (B), un pez tipo “pejesapo” ingiere los camarones infestados (C), el nemátodo se desarrolla hasta hacerse adulto en el intestino del pez (D) y al liberarse en las heces (E) son comidos por los co- pépodos (F). Adaptado de Johnson, 1995.

218 Capítulo 4 - Parásitos en camarones

Figura 4.5.3. Ciclo de vida del tremátodo (platelminto) Opecoeloides fimbriatus. La forma infecciosa o cercaria ingresa al camarón (A), la cercaria migra hacia el tejido y se enquista hasta formar una etapa más avanzada llamada metacercaria (B), los camarones infestados con metacercarias son comidos por peces (perca plateada, corvina, sargo o varios otros) (C). El camarón es digerido dentro del pez y se libera así la metacercaria (D), la cual se desarrolla dentro del mismo pez hasta alcanzar su estado adulto (E). Los huevos puestos por estos adultos salen en las heces de los peces. Se libera entonces un estado infeccioso llamado miracidio, el cual ingresa a un caracol y se multiplica dentro de esporocistos (F). Dentro de los esporocistos se desarrollan las cercarías y cuando estén completamente desarrolladas, sale del esporocisto y del caracol y nadan en la búsqueda de un camarón (G). Si al poco tiempo logran llegar hasta un camarón, se completa el ciclo del parásito. Adaptado de Johnson, 1995.

Signos clínicos Aunque no se han reportado signos clínicos ocasionados por estos parásitos, es posible hallar muchos de ellos en un solo camarón y tal vez podrían llegar a afectar la tasa de supervivencia de poblaciones infestadas de camarones en cultivo. De igual manera, podrían disminuir la tasa reproductiva en padrotes severamente parasitados.

Diagnóstico El método más común y rápido para diagnosticar la presencia de metazoarios en camarones, es mediante montajes en fresco de tejidos sospechosos, observando (luego de liberarlos de su cápsu- la) los organismos muy activos en hepatopáncreas y en contenido intestinal. En los parásitos se puede observar un tubo digestivo notorio, mediante movimientos con el ajuste micrométrico del microscopio y en los nemátodos se nota un extremo anterior (curvo y romo) y uno posterior (agudo). Mediante histopatología, se pueden observar cortes longitudinales, sagitales y/o transversales de parásitos, enquistados generalmente en tejido perigástrico, aunque también se observan los organismos o parte de ellos en hepatopáncreas y contenido intestinal.

Estrategias de control Las medidas sanitarias más indicadas para el manejo de instalaciones en las que exista un riesgo importante de padecer infestaciones por metazoarios, deben estar centradas en evitar la introduc- ción de reproductores silvestres, si éstos se encuentran altamente infestados con larvas de parásitos. En casos de infestaciones severas en estanques de producción en los cuales los metazoarios estén causando problemas, además de excluir reproductores silvestres, debe determinarse cuáles son los hospederos definitivos y eliminarlos del sistema de producción para cortar el ciclo del parásito.

219 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

METAZOARIOS

Figura 4.5.4. Montaje en fresco de hepa- topáncreas de P. vannamei, quedando expuesto por ruptura completa de los túbu- los, un gusano redondo (nemátodo). En un extremo se puede observar la gónada del parásito (flecha gruesa) y en el centro a lo largo del organismo se encuentra el tubo digestivo (flecha delgada). Especie no identificada. Sin tinción. Magnificación 100X.

Figura 4.5.5. Montaje en fresco de heces de P. vannamei, con presencia de un pará- sito tubular con extremos romos y segmentos en su interior (flecha). Especie sin identificar. Sin tinción. Magnificación 100X.

Figura 4.5.6. Corte histológico de tejido perigástrico de P. vannamei, con un quiste de un nematodo (flechas), en la región próxima al estómago. No se observa respuesta inflamatoria alrededor del tejido del parásito. H&E. Magnificación 200X.

220 Capítulo 4 - Parásitos en camarones

4.6 Referencias bibliográficas Barrera, M.F. (2006). Antecedentes sanitarios de Samastacus spinifrons en Chile y otros parastácidos en el mundo. Monografías Electrónicas de Patología Veterinaria 3: 33-45. Facultad de Cien- cias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile. ISSN 0718-0780. http://www.patologia- veterinaria.cl/Monografias/MEPAVET1-2006/html/Barrera Baticados, M.C.L., (1988). Diseases of Prawns in the Philippines. SEAFDEC Asian Aquaculture 10: 1-8. Baticados, M.C.L., E.R. Cruz-Lacierda, M.C. De la Cruz, R.C. Duremdez-Fernandez, R.Q. Guacutan, C.R. Lavilla-Pitogo y G.D. Lio-Po. (1990). Diseases of Penaeid Shrimp in the Philippines. Aquaculture Extension Manual No. 16. Aquaculture Department, Southeast Asian Fisheries Development Center (SEAFDEC), Tigbauan, Iloilo, Philippines. 46 pp. Brock, J.A. y K.L. Main. (1994). A guide to the common problems and diseases of cultured Penaeus vannamei. The Oceanic Institute. Honolulu, HI. 242 pp. Burri L., B. Williams, D. Bursac, T. Lithgow and P. Keeling. (2006). Microsporidian mitosomes retain elements of the general mitocondrial targeting system. PNAS, 103:15916-15920. Carpio, B. (2007). Enfermedades en camarones penaeidos: Microsporidiosis en Penaeus (Litopenaeus) vannamei (Parte II). CENAIM Informa. Boletín informativo No. 145. Canning, E.U. and J. Lom (Editors). (1986). The microsporidia of vertebrates. Academic Press, Orlan- do, FL. Canning E., A. Curry and R. Overstreet. (2002). Ultrastructure of Tuzetia weidneri sp.n. (Microspo- ridia: Tuzetiidae) in Skeletal Muscle of Litopenaeus setiferus and Farfantepenaeus aztecus (Crustacea: Decapoda) and new data on Perezia nelsoni (Microsporidia: Pereziidae) in L. setiferus. Acta Protozool. 41:63-77. Clifford H.C. and H. L. Cook. (2002). Disease Management in Shrimp Culture Ponds (Parts 1, 2 and 3). Aquaculture Magazine. Couch, J.A. (1978). Diseases, parasites and toxic responses of commercial penaeid shrimp of the Gulf of México and South Atlantic Coasts of North America. Fishery Bulletin 76: 1-44. Couch, J.A. (1983). Diseases caused by protozoa. pp. 79-111. In: A.J. Provenzano, Jr. (ed). The Biology of Crustacea, Vol. 6. Academic Press, N.Y. Cuéllar-Anjel, J. (1996). Identificación de las principales enfermedades y determinación de su prevalencia, en camarones penaeidos cultivados en Colombia. Tesis de Maestría. Pontificia Universidad Javeriana. Santafé de Bogotá, D.C. Cuéllar-Anjel, J., L.F. Aranguren, J.A. Brock, R.F. Bador e I. Bernier. (1998). Manual para el diag- nóstico de las principales enfermedades en camarones penaeidos cultivados en Colombia: técnicas de campo y de laboratorio para el procesamiento de muestras y el diagnóstico de enfermedades. CENIACUA, Colombia. Cuéllar-Anjel, J., J.A. Brock, L.F. Aranguren, R.F. Bador, F. Newmark y J.A. Suárez. (1998). A survey of the pathogens and diseases in penaeid shrimp farmed in Colombia. Book of abstracts, Conference of the World Aquaculture Society “Aquaculture ‘98”. Las Vegas, USA. 126 pp. Cuéllar-Anjel, J., V. Pacheco, J. Diez, E. De León, Z. Vega y H. Salazar. (2000). Principales Enferme- dades de Camarones Penaeidos Cultivados en Panamá. Memorias del 4° Congreso latinoa- mericano de acuicultura y exhibición. Panamá. Cuéllar-Anjel, J. (2002). Técnicas para el Diagnóstico de Enfermedades en Camarones. Memorias del 4° Congreso Panameño de Medicina Veterinaria. Los Santos, Panamá. Cuéllar-Anjel, J. (2006). Enfermedades de Camarones producidas por Parásitos. Libro de resúmenes de la Jornada Científica de Parasitología y Ambiente. Universidad Nacional de Panamá, sede Aguadulce. República de Panamá. Cuéllar-Anjel, J. (2008). Parásitos en camarones. En: Morales, V. y J. Cuéllar-Anjel (eds.). 2008. Guía Técnica de Patología e Inmunología de Camarones. Programa CYTED Red II-D Vannamei, Panamá, Rep. de Panamá. 258 pp. 221 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

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222 CAPÍTULO 5 - Enfermedades causadas por hongos

Capítulo 5

Enfermedades causadas por hongos

223 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

224 CAPÍTULO 5 - Enfermedades causadas por hongos

CAPÍTULO 5

Enfermedades causadas por hongos

Carlos R. Pantoja y Donal V. Lightner The University of Arizona Aquaculture Pathology Laboratory 1117 E. Lowell St. Tucson, Arizona 85721 USA

Introducción Prácticamente todos los estadíos de vida del camarón son susceptibles a enfermedades causadas por hongos. Independientemente de la especie de camarón de que se trate, los estadíos larvarios son susceptibles a este tipo de infecciones y por lo tanto, es común y necesario el uso de tratamientos profilácticos para poder controlarles. Se desconoce si las especies de hongos que afectan los estadíos larvarios del camarón son todas de distribución mundial, pero la micosis larvaria es un problema que se presenta tanto en el hemisferio oriental como el occidental. Por otro lado, los esdadíos de vida más avanzados (postlarva, juvenil, adulto) también son susceptibles a enfermedades causadas por hongos, siendo Fusarium solani la especie más común. F. solani es un patógeno oportunista y como tal se establece con mayor facilidad en camarones que se encuentran ya debilitados por otras(s) enfermedades, o que se encuentran estresados por condiciones ambientales extremas, o por haber sido expuestos a agentes químicos irritantes, o que han sufrido heridas por trauma físico (por ejemplo, heridas causadas por el rostrum de otros camarones). Una vez iniciada la infección por F. solani, las heridas causadas en el camarón facilitan el ataque de otros patógenos oportunistas, tales como Vibrio spp.

5.1 MICOSIS

Nombre de la enfermedad Micosis larvaria.

Agente Etiológico Lagenidium spp., Sirolpidium spp.

Agente La mayoría de los casos de micosis larvaria son debidos a hongos phycomycetos Lagenidium spp. (L. callinectes es la especie más común) y Sirolpidium spp. Otras especies, tales como Phytium spp., Leptolegnia marina y Haliphthoros milfordensis, se pueden llegar a presentar ocasionalmente causando enfermedades.

225 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Rango geográfico y de especies afectadas La micosis larvaria en general es aparentemente cosmopolita, presentándose en todos aquellos lugares en donde haya actividad camaronícola. Sin embargo, no se sabe si específicamente Lageni- dium spp. y Sirolpidium spp. son cosmopolitas o no. Todas las especies de camarones penaeidos son susceptibles a la micosis larvaria.

Signos clínicos de importancia diagnóstica Los signos clínicos incluyen: • Mortandades súbitas durante los estadíos larvarios o durante los estadíos de postlarvas temprana • Las infecciones ocasionadas por Lagenidium spp. ocurren más comúnmente en los estadíos de huevo, nauplio, protozoea y mysis • Las infecciones debidas a Sirolpidium spp. ocurren con mayor frecuencia en los estadíos de mysis y postlarvas tempranas • Las infecciones producidas por estas dos especies de hongos en las larvas y postlarvas resultan en micosis progresivas, pueden ir a acompañadas de una ligera respuesta inflamatoria o no infla- mación del todo. Las infecciones son generalmente letales y pueden ir acompañadas de vibriosis durante los estadíos terminales

Tejidos/órganos afectados Típicamente el micelio invade completamente el cuerpo del camarón reemplazando todos los órganos y tejidos.

Lesiones observadas a nivel macroscópico No hay lesiones distintivas, pero en los estadíos avanzados de la enfermedad, las larvas dejan de alimentarse, se aletargan y adquieren una coloración opaca blanquecina.

Procedimientos de diagnóstico

Diagnóstico presuntivo Basado en historial del caso y signos clínicos descritos anteriormente.

Diagnóstico confirmatorio Basado en uno o más de los siguientes métodos:

Preparaciones en fresco Las larvas son examinadas en fresco utilizando un microscopio de luz con objetivos de por lo menos 20X. Las larvas infectadas muestran la presencia de un micelio extensivo, sin septas y altamente ramificado invadiendo el cuerpo y los apéndices de la larva. Las hifas reemplazan prácticamente todos los tejidos y órganos de las larvas o postlarvas y son de una coloración pálida verde-amarillenta y contienen numerosos inclusiones pequeñas que refractan la luz. Un tipo de hifa especializada forma tubos de descarga, los cuales pueden o no presentar una vesícula terminal en su parte distal y se les puede observar empujando hacia afuera a través de la cutícula. En el caso de Sirolpidium spp.,

226 CAPÍTULO 5 - Enfermedades causadas por hongos las zoosporas mótiles pueden ser observadas al ser liberadas a través de los tubos de descarga (los cuales son más cortos que los de Lagenidium spp.y no protruyen a través de la cutícula). En el caso de Langenidium spp., las zoosporas se desarrollan dentro de la vesícula apical prominente en el ápice de un túbulo de descarga relativamente largo.

Análisis histológico El diagnóstico histológico se basa en la demostración de las hifas y los tubos de descarga que protruyen conspicuamente (en el caso de Lagenidium spp.) o no (en el caso de Sirolpidium spp.) a través de la cutícula (Fig. 5.1.1 y 5.1.2).

Información adicional Debido a la implementación de medidas profilácticas a las cuales son sometidos tanto los huevecillos como los nauplios, la frecuencia de casos de micosis larvaria ha tenido una tendencia a disminuir en la camaronicultura moderna. Probablemente, entre estas medidas, las más efectivas han sido la colecta de nauplios basada en la respuesta fototáctica positiva y el uso de tratamientos con treflan durante las primeras fases del cultivo larvario.

ENFERMEDADES CAUSADAS POR HONGOS

MICOSIS LARVARIA

Figura 5.1.1. Preparación en fresco mostrando una larva de P. setiferus en estadío avanzado de infestación con Lagenidium callinectes. Las flechas indican los túbulos de descarga que protruyen a través de la cutícula. Cuando los nutrientes se han ago- tado y el cuerpo de la larva ha sido con- sumido completamente, el hongo inicia la esporogénesis. Magnificación 70X.

227 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 5.1.2. Preparación en fresco de una larva mysis de P. vannamei infestada severamente con Sirolpidium sp. Se muestra una porción del ojo compuesto el cual, al igual que el resto del cuerpo (no mostrado), se encuentra completamente invadido por el micelio (flecha gruesa). El tubo de -descar ga corto, característico de Sirolpidium sp., es evidente protruyendo a través de la cutícula (flecha delgada). Magnificación: 300X.

5.2 FUSARIOSIS

Nombre de la enfermedad Fusariosis, enfermedad de las branquias negras (en P. japonicus).

Agente etiológico Fusarium spp.

Agente Hongo imperfecto Fusarium solani y posiblemente otras especies del mismo género, incluyendo F. moniliforme. Los hongos phycomycetos Atkinsiella dubia y Haliphthoros spp., raramente causan enfermedades en camarones penaeidos, pero se les ha encontrado asociados a lesiones en las branquias o en la cutícula, las cuales son muy similares a las causadas por Fusarium.

Rango geográfico y de especies afectadas Fusarium spp. es de distribución cosmopolita. Se le encuentra comúnmente en plantas terres- tres, suelo y ambientes de agua dulce y salobre. Todas las especies de camarones penaeidos son susceptibles a la fusariosis. En la mayoría de las especies, los estadíos de sub-adulto y adulto son afectados con mayor severidad y frecuencia. Algunas especies de camarones penaeidos son bastante susceptibles a esta enfermedad, aún en los estadíos de juvenil, principalmente cuando son sometidos a condiciones de cultivo en sistemas intensivos y superintensivos. Ejemplos de especies altamente susceptibles son P. japonicus y P. califor-

228 CAPÍTULO 5 - Enfermedades causadas por hongos niensis. Ejemplos de especies moderadamente susceptibles son P. stylirostris y P. vannamei. Ejemplos de especies relativamente resistentes son P. monodon y P. merguiensis.

Signos clínicos de importancia diagnóstica. Los signos clínicos incluyen: Lesiones con una respuesta inflamatoria muy intensa (melanización). Las lesiones melanizadas tienden a ser bastante extensas, comúnmente con un borde rojizo y necrótico y pueden localizarse con frecuencia en los apéndices, tales como escamas de las antenas, flagelos antenales, pedúnculos oculares, pereiópodos, urópodos y telson (Fig. 5.2.1). No es raro que lesiones en la cutícula debidas a raspaduras, pérdidas de apéndices y punciones con la espina rostral, se infecten posteriormente con Fusarium.

Tejidos/órganos afectados Cualquier parte externa del cuerpo, incluyendo branquias y cámara branquial. Fusarium tiene tendencia a infectar la base coxal de los pereiópodos para posteriormente invadir el tejido branquial adyacente causando melanización intensa. De la misma manera, tiene tendencia a invadir las porciones basales de la cabeza y los apéndices de la cola, desde donde se dispersa a zonas adyacentes.

Lesiones observadas a nivel macroscópico Necrosis cuticular y melanización intensa muy dispersa.

Procedimientos de diagnóstico

Diagnóstico presuntivo Basado en historial del caso y signos clínicos descritos anteriormente.

Diagnóstico confirmatorio Basado en uno o más de los siguientes métodos:

Preparaciones en fresco Examen en fresco de raspados de lesiones melanizadas. El análisis microscópico a magnifica- ciones de 100X o 200X revela la presencia de las hifas del hongo. Estas preparaciones son también útiles en la demostración de las macroconidias, las cuales tienen una forma de canoa. La demostra- ción de las macroconidias proporciona un diagnóstico definitivo (Fig. 5.2.2).

Análisis histológico El análisis con tinciones de H&E revela la presencia de lesiones granulomatosas bastante prominentes, acompañadas de una multitud de nódulos hemocíticos con centros melanizados. Tinciones especiales (por ejemplo, PAS y tinciones de plata basadas en la técnica de PAS) demuestran claramente la presencia de las hifas y de las macroconidias, las cuales se tiñen de color rosa o rojo (PAS) o negro (tinciones de plata basadas en la técnica de PAS) (Fig. 5.2.3 y 5.2.4).

229 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Información adicional Fusarium solani es un patógeno oportunista que ataca camarones debilitados por otras enfermedades, por exposición a agentes químicos irritantes o a ciertos metales pesados, o por amontona- miento a densidades altas. El principal mecanismo para el establecimiento de la infección es la presencia de lesiones (pe- queñas o grandes) en la cutícula. La infección puede comenzar en varias partes del cuerpo al mismo tiempo y pueden llegar a cubrir hasta un 10% de la superficie corporal. Una vez hecha su aparición, la enfermad progresa con un porcentaje de recuperación de solo un 30% aproximadamente. Las lesiones producidas por Fusarium también sirven como puerta de entrada para otros patógenos oportunistas, tales como Vibrio spp.

ENFERMEDADES CAUSADAS POR HONGOS FUSARIOSIS

Figura 5.2.1. Lesiones melanizadas (negras) dentro de la cámara branquial de un cama- rón Penaeus sp. causadas por infestación con Fusarium solani.

Figura 5.2.2. Preparación en fresco, sin te- ñir, de un raspado obtenido de una lesión causada por F. solani. Las hifas del hongo son bastante evidentes dentro de la masa de tejido necrosado, inflamado y melanizado. Magnificación: 1,000X.

230 CAPÍTULO 5 - Enfermedades causadas por hongos

Figura 5.2.3 Fotografía a bajo aumento de un corte histológico a través de una le- sión causada por F. solani. Se muestra una porción de la pared corporal y el músculo subyacente. Masas de hemocitos han infil- trado la zona y encapsulado las hifas de Fu- sarium. Algunas de las hifas encapsuladas, principalmente cerca de la pared corporal han sido melanizadas (ejemplos señalados con flechas). Tinción: Hematoxilina/eosina-floxina de Mayer-Bennett. Magnifica- ción: 300X.

Figura 5.2.4. Fotografía a alto aumento de un corte histológico a través de una lamela branquial de un camarón juvenil P. vannamei, la cual ha sido infestada por F. solani. Las hifas y las condias (ejemplos señala- dos con flechas) son bastante evidentes. Tinción: PAS de McManus y verde claro. Magnificación: 600X.

231 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

5.3 Referencias bibliográficas

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233 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

234 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

Capítulo 6

Avances en la Inmunología del Camarón

235 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

236 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

Capítulo 6

Avances en la Inmunología del Camarón

Margherita Anna Barracco, Luciane María Perazzolo y Rafael Diego Rosa Laboratorio de Inmunología Aplicada a la Acuicultura (LIAA) http://www.liaaq.ccb.ufsc.br/ Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG) Universidad Federal de Santa Catarina (UFSC) Florianópolis, SC, Brasil Traducido del Portugués al Español por: Roberto Chamorro, Intérprete Público Autorizado Panamá.

Resumen Los camarones poseen una relevancia especial dentro del grupo de los crustáceos, dada su gran importancia económica en la acuicultura mundial. Sin embargo, el éxito de esta actividad viene sufriendo graves limitaciones, debido al constante surgimiento de nuevas enfermedades, principalmente de origen viral, que causan mortalidades masivas y producen perjuicios económicos incalculables. El siguiente capítulo ofrece una visión general y actualizada del sistema inmune de los crustáceos, en especial de los camarones, con base en el progreso recientemente logrado en la elucidación de los diferentes mecanismos de defensa de estos animales contra los patógenos. En el capítulo son discutidas las reacciones celulares y humorales desencadenadas en respuesta a los agentes infecciosos, los procesos de reconocimiento y los diferentes mecanismos inmunoefectores. Se da un énfasis especial a las defensas antivirales, una vez que los virus constituyen los principales agentes infecciosos que amenazan seriamente la sostenibilidad de la camaronicultura mundial. Fi- nalmente, el capítulo discute además de la utilización y eficacia de compuestos inmunoestimulantes, la utilización de inmunoparámetros como indicadores de las condiciones de salud de los camarones. En esta nueva edición hubo una importante actualización de los temas relacionados a los péptidos antimicrobianos, el papel de las lectinas en los mecanismos de reconocimiento y como moléculas inmunoefectoras, la modulación de genes inmunológicos durante infecciones y principalmente los diferentes mecanismos antivirales existentes en camarones, con relevancia especial en la vía del RNA de interferencia (RNAi). Principales abreviaturas: ALF: factor anti-liposacárido; AMPs: péptidos antimicrobianos; α2M: α2-macroglobulina; BGBP: proteína que se une a los β-glucanos; CP: proteína de coagulación; CRD: dominio para el reconocimiento de carbohidratos; CTLs: lectinas calcio-dependientes; DHC: conteo diferencial de hemocitos; dsRNA: DNA doble cadena; Dscam: Down syndrome cell adhesion molecule (implicada en el reconocimiento); FREPs: lectinas con un dominio semejante al fibrinógeno; GBP: proteína que se une a los β-glucanos; HGG: hemocito con gránulos grandes; HGP: hemocito con gránulos pequeños; HH: hemocitos hialinos; hRNA: hairpin RNA de origen endógena; IFN: inter- ferón; LGBP: proteína que se une a los β-glucanos y LPS; LPS: lipopolisacáridos; LTA: ácido lipoteicoico; NLR: NOD-like receptor; NOS: óxido nítrico sintasa; miRNA: microRNA de origen endógena; PAMPs: patrones moleculares presentes en los patógenos; PEN: penaeidina; PGNs: peptidoglicanos; proPO/PO: pro-fenoloxidasa/fenoloxidasa; PRPs/PRRs: proteínas/receptores de reconocimiento pa- trón; PS: polisacáridos sulfatados; RLR: RIG-I-like receptor; RNAi: RNA de interferencia; RNIs: radicales de nitrógeno; ROIs: radicales de oxígeno; siRNA: RNA de interferencia de cadena corta (short) de

237 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos origen viral; SOD: superóxido dismutasa; THC: conteo total de hemocitos; TLR: Toll-like proteins de vertebrados; VP19 Y VP28: proteínas de la membrana del WSSV.

Introducción Los crustáceos pertenecen a un antiguo y exitoso grupo zoológico, constituido por más de 65 mil especies vivientes, muchas de las cuales son muy apreciadas para consumo humano, como son los camarones, langostas, langostinos de agua dulce, cangrejos y jaibas. El cultivo de crustáceos, principalmente de camarones (camaronicultura), sobresale en este contexto como una importante alternativa para la rápida producción y en gran escala, como alimento para el consumo humano, contribuyendo además a la preservación de las poblaciones naturales de una extracción excesiva. Actualmente, cerca del 50% de los camarones consumidos en el mundo son provenientes del cultivo, siendo los penaeidos Penaeus (Litopenaeus) vannamei, Penaeus monodon y Fenneropenaeus chinensis las especies marinas más cultivadas (FAO, 2010). Actualmente, la camaronicultura es responsable de millones de empleos en países tropicales, siendo los cinco principales productores mundiales, China, Tailandia, Vietnam, Indonesia e India. En las Américas los tres mayores productores son Ecuador, México y Brasil (FAO, 2010). Hoy en día, el principal factor limitante para el éxito de la camaronicultura mundial, consiste en el control de las infecciones principalmente las de origen viral. Las altas densidades poblacionales usualmente utilizadas en los cultivos, propician la rápida propagación de agentes infecciosos, resultando generalmente en mortalidades masivas y consecuentemente, causando perjuicios económicos incalculables. Actualmente, la profilaxis y el control de las enfermedades en los cultivos se limitan básicamente al manejo adecuado y a la disminución de condiciones de estrés, considerando que los factores que determinan el estado de salud de los camarones son todavía poco conocidos. En este contexto, el estudio del sistema inmunológico de los crustáceos sobresale como una estrategia novedosa y promisoria, pues permite conocer las bases de la susceptibilidad y de la resistencia de estos animales a los microorganismos patógenos y parásitos, además de proporcionar aportes valiosos para el establecimiento de parámetros de salud e inmunomarcadores para la selección genética de animales más resistentes a las infecciones y al desarrollo de compuestos inmunoestimulantes. Los camarones están en constante contacto, en su ambiente natural, con una gran diversidad de microorganismos, incluyendo múltiples virus, que pueden constituir una seria amenaza a su sobrevivencia. No obstante, el evidente éxito de este grupo zoológico a lo largo de más de 500 millones de años de su historia evolutiva, confirma la presencia de un sistema inmunológico eficiente y capaz de protegerlos contra la invasión de los agentes causantes de enfermedades. Los principales sistemas de defensa actualmente reconocidos en los crustáceos son: (1) reconocimiento del no-propio por proteínas de reconocimiento patrón y Dscam; (2) señalización y activación de los hemocitos; (3) respuestas inmunocelulares (fagocitosis, formación de cápsulas y nódulos, infiltración y trampas extracelulares deácidos nucleicos); (4) producción de moléculas antimicrobianas (especies reactivas de oxígeno y nitrógeno y péptidos antimicrobianos); (5) melanización mediada por el sistema de activación de la pro-fenoloxidasa (proPO) y (6) defensas antivirales (citocinas análogas a interferones, sistema RNA de interferencia, apoptosis y autofagia). En esta nueva versión del capítulo, fueron actualizadas varias informaciones, en especial los temas que se refieren a los péptidos antimicrobianos, a las lectinas y su papel como moléculas de reconocimiento e inmunoefectoras, a la generación de diversidad del gene Dscam y su implicación en el reconocimiento, a las vías de señalización celular (Toll, Imd y JAK/STAT), a la modulación de

238 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón genes inmunológicos durante infecciones y principalmente a las defensas antivirales de camarones, con relevancia al sistema de RNA de interferencia o RNAi. Introducimos además, varias referencias bibliográficas recientes en los diferentes tópicos de la inmunología de crustáceos.

6.1. Sistema circulatorio, hemolinfa y coagulación La primera línea de defensa de estos animales es proporcionada por la presencia de un capara- zón externo rígido o exoesqueleto, que funciona como una barrera fisicoquímica protectora. Además de ello, todo el tracto digestivo de estos animales, que es la principal vía de entrada de los microorganismos, también está revestido por una capa quitinosa y aún ofrece un ambiente ácido y lleno de enzimas y efectores antimicrobianos (Soonthornchai et al., 2010), capaz de inactivar y digerir la mayoría de los microorganismos que no son parte de su microbiota natural. Cuando estas barreras son traspasadas, siendo insuficientes para impedir la penetración de los patógenos, se desencadenan en el hospedero una serie de reacciones inmunológicas internas/sistémicas complejas con el objetivo de neutralizar y eliminar los agentes invasores. A ejemplo de otros invertebrados, los camarones disponen solamente de un sistema inmune innato, diferente de los vertebrados que además de esto, tienen también un sistema inmune adaptativo. El sistema inmune innato es filogenéticamente más antiguo, encontrado en todos los organismos multicelulares, incluyendo invertebrados y plantas, mientras que el sistema inmune adaptativo sólo se encuentra en los vertebrados. Este último se caracteriza por la presencia de una infinidad de receptores y anticuerpos altamente específicos y por la inducción de células de memoria, que garantizan una respuesta de defensa altamente eficiente y específica para los más diversos patógenos. Esta respuesta transcurre de la presencia de una línea celular linfocítica, presente solamente en los vertebrados, donde se apoyan todos los mecanismos de especificidad y de memoria inmunológica. De esta forma, su ausencia en los invertebrados inviabiliza cualquier tentativa de desarrollo de vacunas, en su concepto clásico de la palabra, disminuyendo así de manera sustancial, la posibilidad de la prevención y control de infecciones en los camarones. El sistema circulatorio de los camarones es de tipo abierto o semi-abierto, por donde transita un tejido fluido denominado hemolinfa, correspondiente a la sangre de los vertebrados (Fig. 6.1.1). La hemolinfa de los crustáceos presenta un color azul, debido a la presencia de la proteína respi- ratoria hemocianina, que posee cobre en su principio activo. Esta corresponde a más del 90% de las proteínas totales del plasma (Ro- chu y Fine, 1978) que, además de participar del transporte del oxí- geno, también puede participar de las respuestas de defensa de camarones. La fragmentación de esa proteína multifuncional puede generar, por ejemplo, fragmentos proteicos con actividad antimi- Figura 6.1.1: Sistema circulatorio abierto/semi-abierto de camarón y ór- crobiana o que participan en los ganos asociados. C: corazón; HP: hepatopáncreas; OHA: órgano hema- procesos de melanización (Coates topoyético antenal; OHD: órgano hematopoyético dorsal; OHV: órgano y Nairn, 2014). hematopoyético ventral; OL: órgano linfoide; VD: vaso dorsal (adaptado de Bachère et al., 2004).

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En la hemolinfa son transportados continuamente nutrientes, excretas, oxígeno, hormonas y otras moléculas importantes para los diferentes órganos de esos animales. Debido a su fluidez y por la capacidad de llegar directamente a todos los tejidos de los crustáceos, la hemolinfa contiene además todos los componentes del sistema inmunológico. La hemolinfa está compuesta por una fracción celular, representada por las células circulantes o hemocitos y por una fracción líquida constituida por el plasma que contiene diferentes factores humorales. Las respuestas inmunocelulares y humorales actúan de forma integrada en los crustáceos, protegiéndolos contra la invasión de microorganismos y parásitos, garantizando así su integridad corporal y homeostática. La coagulación de la hemolinfa es un mecanismo inmunológico esencial para la supervivencia de animales invertebrados con un sistema circulatorio abierto o semi-abierto como los crustáceos. La formación de coágulos previene tanto la pérdida de la hemolinfa, como la diseminación de los patógenos por la cavidad corporal del animal. En los invertebrados son reconocidos dos diferentes mecanismos de coagulación (Jiravanichpaisal et al., 2006; Cerenius y Söderhäll, 2011). El primero es una cascada proteolítica activada por componentes microbianos, como los lipopolisa- cáridos (LPS) de la pared de bacterias Gram negativas y los β-1,3-glucanos de los hongos, ocurriendo en limúlidos y el segundo es una reacción de coagulación dependiente de la enzima transglutaminasa (TGasa), ocurriendo en insectos y crustáceos (Cere- nius y Söderhäll, 2011). En el caso de la coagulación de los crustáceos, un componente clave en el proceso de gelificación del plasma es la proteí- na de coagulación (CP), que forma coágu- los estables por medio de una reacción de unión cruzada entre sus moléculas, mediadas por la TGasa. Las TGasas son enzimas Ca2+-dependientes, usualmente comparti- mentalizadas dentro de los hemocitos de los crustáceos, capaces de formar uniones entre residuos de glutamina y lisina (Fig. 6.1.2) presentes en ciertas proteínas, como la proteína de coagulación del plasma de crustáceos y de algunos insectos (Jiravani- chpaisal et al., 2006; Cerenius y Söderhäll, 2011). La CP fue aislada y caracterizada en varias especies de penaeidos, como en P. monodon y M. japonicus (Yeh et al., 1998), L. vannamei (Montaño-Pérez et al., 1999) y F. paulensis (Perazzolo et al., 2005). Las Figura 6.1.2: Reacción de coagulación en crustáceos, mediada CPs de los crustáceos son lipoproteínas por la formación de ligaciones cruzadas entre residuos de lisina (Jiravanichpaisal et al., 2006). Secuencias y glutamina de las proteínas de coagulación, a través de la ac- aminoacídicas completas de la CP fueron ción de la TGasa y calcio. 240 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón determinadas en los camarones P. monodon (Yeh et al., 1999) y M. japonicus (Cheng et al., 2008), siendo que el RNAm correspondiente es expresado en el hepatopáncreas y en varios otros tejidos (Yeh et al., 2007; Cheng et al., 2008), con excepción de los hemocitos y de los músculos. Interesantemen- te, el tejido epidérmico sub-cuticular de M. japonicus demostró ser el principal sitio de la síntesis de la CP, justamente resaltando la importancia de la coagulación durante la muda del animal, cuando eso se vuelve potencialmente más expuesto a las lesiones y ataques microbianos (Cheng et al., 2008). Excepto por la similitud funcional, las CPs de los crustáceos no tienen ninguna característica molecular en común con el fibrinógeno de los mamíferos, o con el coagulógeno de los limúlidos, lo que sugiere que la CP de los crustáceos representa un tipo distinto de proteína formadora de coágu- los. Curiosamente, las CPs de crustáceos pertenecen a la clase de las lipoproteínas de densidad muy alta (VHDL) y están evolutivamente relacionadas con las vitelogeninas (VTG) (Jiravanichpaisal et al., 2006; Cheng et al., 2008; Cerenius y Söderhäll, 2011). La VTG es la principal precursora de vitelo en hembras ovíparas y no está relacionada con reacciones de coagulación. Sin embargo, tanto la CP como la VTG, tienen una región similar en el dominio D del factor von Willebrand, implicado en la coagulación de la sangre de los mamíferos (Sadler, 1991).

6.2. Las células del sistema inmune

Hemocitos: las células inmunocompetentes de camarones Las respuestas inmunocelulares de los crustáceos están básicamente relacionadas con las cé- lulas de la hemolinfa o hemocitos e incluyen la fagocitosis de microorganismos y la formación de cápsulas y nódulos en torno a los invasores. Los patógenos son neutralizados por una amplia variedad de moléculas líticas y/o microbicidas, usualmente producidas por las células de la hemolinfa. Muchas de estas moléculas se encuentran almacenadas dentro de las vesículas o gránulos de ciertas poblaciones de hemocitos de donde son liberadas/secretadas durante las infecciones actuando como inmunoefectores en diferentes respuestas de defensa y cascadas inmunológicas. Otras son constitutivamente liberadas a la hemolinfa, mientras otras son producidas transitoriamente durante las infecciones. Además de actuar en las respuestas de defensa, los hemocitos también participan en la reparación de heridas, esclerotización de la cutícula y se cree que también están relacionados con el metabolismo y transporte de carbohidratos (Jiravanichpaisal et al., 2006). La comprensión de las reacciones inmunocelulares de los crustáceos está fuertemente relacionada a la identificación y la caracterización de sus células inmunocompetentes. A pesar de no haber todavía una uniformidad en la clasificación de los hemocitos, tres tipos de células son usualmente reconocidos y descritos en los crustáceos (Fig. 6.2.1 A-F): hemocitos hialinos (HHs), hemocitos semi-granulares o con gránulos pequeños (HGPs) y hemocitos granulares o con gránulos grandes (HGGs) (Bauchau, 1981; Hose et al., 1990; Jiravanichpaisal et al., 2006). La falta de homogeneidad en la identificación de los hemocitos se debe principalmente al hecho de que esas células son muy frágiles y reactivas, alterando rápidamente sus características morfofisiológicas in vitro, lo que torna su estudio más difícil, que en el caso de los leucocitos de los vertebrados. La activación de los hemocitos de los crustáceos resulta generalmente en su estiramiento y degranulación o ruptura, ocurriendo la liberación de una gran variedad de efectores inmunológicos para el plasma. De una manera general, los HHs de los crustáceos son usualmente descritos como los menores hemocitos, con una alta relación núcleo-citoplasma y conteniendo pocos o ningún gránulo (Fig. 6.2.1 A, D). De acuerdo con algunos autores, los HHs pertenecen a una línea celular distinta de los hemocitos granulares y están esencialmente relacionados con los mecanismos de coagulación (Hose et al., 1990). Otros autores consideran que los HHs son las principales células fagocitarias (Johansson

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et al., 2000) y que ese tipo celular es una forma intermedia de la línea de hemocitos granulares (van de Braak et al., 2002a). Por otra parte, los hemocitos granulares (HGPs y HGGs) son descritos como cé- lulas de citoplasma más abundante y ricos en gránulos de diversos tamaños y contenidos (Fig. 6.2.1 B, C, E, F). Algunos autores señalan los HGPs como formas intermedias, que luego de su maduración se transfor- man en HGGs (Bauchau, 1981; Hose et al., 1990; Gargioni y Barracco, 1998). En cuanto a la función de los hemocitos granulares, esta parece estar relacionada principalmente con la fagocitosis de microorganismos, en la formación de cápsu- las y nódulos y también con la producción y almacenamiento de moléculas tóxicas y microbicidas (Hose et al., 1990; Gar- gioni y Barracco, 1998; van de Braak et al., 2002b). Nuevos hemocitos son Figura 6.2.1: Tipos de hemocitos (A-F) y reacciones celulares de defensa en producidos y liberados en la cir- crustáceos (G-J). A, D: hemocitos hialinos (HHs) de camarones observados al microscopio de contraste de fase y eletrónico de transmisión, respectiva- culación a partir de los tejidos mente; B, E: hemocitos con gránulos pequeños (HGPs); C, F: hemocitos con hematopoyéticos (Johansson et gránulos grandes (HGGs). G: fagocitosis de una levadura por un hemocito de al., 2000; van de Braak et al., L. vannamei; H: encapsulamiento in vitro del nemátodo Panagrellus redivirus 2002a; Söderhäll et al., 2003; por hemocitos de Macrobrachium rosenbergii; I: encapsulamiento in vitro de hifas del hongo Ganoderma sp. por hemocitos de Farfantepenaeus paulensis, Jiravanichpaisal et al., 2006). con fuerte reacción de melanización; J: nódulo hemocítico en el hepatopán- Esos tejidos son generalmente creas de L. vannamei con agregados bacterianos en el centro (reproducido constituidos por lóbulos densos, de Morales-Covarrubias, 2004). situados en la región dorsal y dorso-lateral del estómago y del intestino anterior (región epigástrica), así como en la base de los maxilípedos en el caso de los camarones penaeidos (van de Braak et al., 2002a) (Fig. 6.1.1). Los tejidos hematopoyéticos presentan una alta tasa de proliferación celular y son los responsables por la diferenciación y la maduración de los hemocitos que serán liberados en la hemolinfa (Lin y Söderhäll, 2011). La identificación de uno o más progenitores celulares, así como la diferenciación de las líneas hemocíticas producidas, es todavía controvertida (Bauchau, 1981; van de Braak et al., 2002a; Söder- häll et al., 2003; Bachère et al., 2004). A pesar de que los tejidos hematopoyéticos son los principales responsables por la producción de los hemocitos, hay algunas evidencias reportadas de división de

242 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón esas células en la hemolinfa de camarones penaeidos, como en Marsupenaeus japonicus (Sequeira et al., 1996) y Farfantepenaeus paulensis (Gargioni y Barracco, 1998), aunque la frecuencia de división es muy baja. El órgano linfoide (Fig. 6.1.1), ausente en muchas especies de crustáceos decápodos, se localiza en la parte anterior del hepatopáncreas de los camarones y parece participar en los procesos de eliminación y depuración de agentes patógenos, ocurriendo en muchos casos la formación de cuerpos esferoidales durante las infecciones. No está claro si el proceso de la fagocitosis ocurre principalmente en ese órgano o si los hemocitos conteniendo los microorganismos ya fagocitados migran a dicho lugar, para realizar la depuración (van de Braak et al., 2002b).

Reacciones inmunocelulares de defensa Luego de la invasión por microorganismos en la cavidad corporal de los camarones, estos son reconocidos como agentes extraños por los hospederos y los hemocitos migran a los sitios de infec- ción (infiltración), generando una respuesta inflamatoria clásica. En estos sitios de infección ocurre entonces la fagocitosis de los microorganismos y/o la formación de agregados celulares densos en torno de las partículas invasoras (nódulos y cápsulas) hasta la formación de trampas extracelulares de ácidos nucleicos (un tipo nuevo de muerte celular asociada al sistema inmune de vertebrados e invertebrados). Esas respuestas pueden culminar con la liberación de diferentes moléculas inmunoefectoras, capaces de neutralizar y degradar los agentes invasores (Jiravanichpaisal et al., 2006) como será descrito en la Sección 6.4. Además de actuar en las respuestas de defensa, los hemocitos también participan en la reparación de heridas, esclerotización de la cutícula y se cree que también están relacionados con el metabolismo y transporte de carbohidratos (Jiravanichpaisal et al., 2006).

◆◆ Fagocitosis y formación de cápsulas y nódulos

En el proceso de fagocitosis, el agente extraño es reconocido, englobado e interiorizado por la célula dentro de una vacuola fagocítica o fagosoma, que luego se funde con las vesículas/gránulos presentes en el citoplasma (Fig. 6.2.1 G). La fagocitosis de microorganismos fue bien demostrada en diferentes especies de crustáceos y camarones (Hose et al., 1990; Gargioni y Barracco, 1998; Muñoz et al., 2002). Aunque todavía existan controversias en la literatura en lo que se refiere a los tipos de hemocitos relacionados con los procesos de fagocitosis en los crustáceos, se sabe que ese mecanismo, extremadamente importante, constituye la primera línea de defensa celular para el control de la invasión de microorganismos. Luego de la fagocitosis de los microorganismos, estos son capturados en las vacuolas fagocí- ticas intracelulares que se unen con los gránulos citoplasmáticos y lisosomales. Los gránulos lisosomales se caracterizan por su pH ácido (estabilizado por bombas de protones) y por la presencia de una amplia variedad de enzimas hidrolíticas capaces de degradar a la gran mayoría de los microbios invasores (Fig. 6.2.2). Entre estas se destaca la lisozima, una enzima capaz de romper polisacáridos complejos o peptidoglicanos (PGNs) de las paredes bacterianas. Las lisozimas representan aproximadamente 4% de las proteínas totales de los hemocitos de camarones (Sotelo-Mundo et al., 2003) y poseen una actividad lítica potente contra un amplio espectro de bacterias Gram-positivas y negativas, incluyendo especies de vibrios marinos (Hikima et al., 2003; de la Vega et al., 2006). Cuando la cavidad corporal de los crustáceos es invadida por una cantidad masiva de microorganismos o por partículas/patógenos de gran tamaño, cuya fagocitosis no es posible, se desencadena entonces la formación de nódulos y cápsulas celulares, respectivamente. La formación de cápsulas se caracteriza por la agregación de varias capas de hemocitos alrededor del patógeno de gran tamaño, como hifas de hongos nematodos y determinadas formas de protozoarios, capturándolos para su pos-

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Figura 6.2.2: Mecanismos degradativos y microbicidas asociados a los hemocitos de crustáceos durante el proceso de fagocitosis. AMPs: péptidos antimicrobianos; RNI: especies reactivas de nitrógeno; ROI: especies reactivas de oxígeno. terior destrucción (Fig. 6.2.1 H, I). La formación de nódulos, por otro lado, ocurre alrededor de una gran cantidad de invasores (pequeños) como bacterias, que también son capturados dentro de agregaciones celulares (Covarrubias, 2004) (Fig. 6.2.1 J), semejantes a las cápsulas. Esta reacción evita su diseminación por todo el cuerpo del camarón y la producción de una septicemia. En las regiones más centrales de los nódulos, es común observar la fagocitosis de microorganismos por los hemocitos que están en contacto más próximo de los microorganismos (Bauchau, 1981; Hose et al., 1990; Jiravanichpaisal et al., 2006). Ambas reacciones, la de encapsulamiento y la formación de nódulos, no solamente llevan al aprisionamiento de los patógenos, sino también limitan y localizan las respuestas inmunológicas solamente en la región donde se encuentran los agentes invasores. Esta respuesta inmune localizada, ayuda a proteger los tejidos del hospedero de los daños causados por las moléculas tóxicas y degradativas producidas y liberadas durante el proceso inflamatorio y que serán explicadas posteriormente. En general, las regiones más centrales de esas agregaciones de hemocitos, se tornan fuertemente pigmentadas por una coloración oscura, conocida como melanización, como resultado de la liberación de los compuestos inmunoefectores presentes en los hemocitos que serán discutidos más adelante.

◆◆ Infiltración El número de hemocitos libres en la hemolinfa puede disminuir drásticamente durante una infección como resultado de su infiltración en los tejidos infectados y su utilización en la formación de los nódulos y cápsulas. En la reciente grave enfermedad causada por la bacteria Vibrio parahaemolyticus denominada inicialmente EMS (síndrome de mortalidad temprana) y después de AHNPS (síndrome de la necrosis hepatopancreática aguda), los análisis histopatológicos en L. vannamei y P. monodon mostraron lesiones características en el hepatopáncreas, causadas por las toxinas bacterianas y con infiltraciones hemocíticas típicas del proceso inflamatorio en las regiones inter e intra tubulares de la glándula (Tran et al., 2013).

244 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

◆◆ Trampas extracelulares de ácidos nucleicos Las trampas extracelulares de ácidos nucleicos o ETs (del inglés, extracelular traps) constituyen un nuevo mecanismo de defensa del sistema inmune innato, el cual fue inicialmente descrito en neutrófilos de mamíferos (Brinkmann et al., 2004). Esas trampas son formadas por DNA, histonas y proteínas antimicrobianas, que son liberadas al medio extracelular (después del rompimiento de la membrana plasmática) en respuesta a un determinado estimulo microbiano. La formación de esas redes extracelulares es dependiente de la generación de radicales libres por la célula y sirve como una barrera física que limita la diseminación de los agentes invasores en el hospedero, además de neutralizar y destruir los patógenos por intermedio de las histonas y proteínas antimicrobianas liberadas por el citoplasma (Brinkmann et al., 2004). Ese mecanismo fue recientemente descrito en el camarón L. vannamei (Ng et al., 2013). Según los autores, después de un estímulo con PMA (phorbol myristate acetate), LPS o con la bacteria Escherichia coli, los hemocitos son capaces de formar redes extracelulares compuestas por DNA e histonas, así como los neutrófilos de mamíferos (Brinkmannet al., 2004). No obstante, los mecanismos moleculares y celulares envueltos en la producción de ETs por los hemocitos de camarones necesitan aún ser aclarados.

6.3. Mecanismos de reconocimiento y señalización celular Proteínas/Receptores de Reconocimiento de Patrones Moleculares (PRPs/PRRs) El primer paso para desencadenar cualquier reacción inmunológica se refiere al reconocimien- to de los cuerpos extraños invasores del hospedero. Como se dijo anteriormente, los invertebrados, incluyendo los camarones, no producen moléculas de reconocimiento altamente específicas como los anticuerpos, ni contienen las células antígeno-específicas como los linfocitos de los vertebrados. Sin embargo, ellos poseen moléculas capaces de diferenciar eficientemente lo propio de lo no-propio y, así, desencadenar mecanismos que resultan en la neutralización y/o destrucción de los patógenos invasores. Las respuestas de defensa en los camarones son desencadenadas a partir del contacto con el patógeno, o con sus componentes (Fig. 6.3.1). Esas reacciones son iniciadas por el reconocimiento del agente invasor por proteínas de reconocimiento patrón, presentes en el hospedero. El término “proteínas/receptores de reconocimiento patrón” o PRPs/PRRs (del inglés, patter- n-recognition proteins/receptors), hace alusión al hecho de que el sistema inmunológico reconoce primariamente patrones moleculares presentes en los microorganismos o M/PAMPs (del inglés, microbe or pathogen-associated molecular patterns) (Janeway y Medzhitov, 2002). En el texto utilizaremos preferencialmente los términos PRPs y PAMPs. Las PRPs son moléculas producidas por el hospedero que reconocen y se unen a los PAMPs y pueden ser secretadas hacia el plasma, o estar localizadas en la membrana de las células, principalmente las del sistema inmune o aún estar libres en el citosol. En los invertebrados, los principales PAMPs reconocidos por PRPs son los LPS de la superficie de las bacterias Gram-negativas, los peptidoglicanos PGNs y LTA de la pared de las Gram-positivas, los β-1,3-glucanos de la pared de hongos, el dsRNA (del inglés, double-stranded RNA) producido durante la replicación de varios virus, el ssRNA viral (del inglés, single-strand RNA) y motivos CpG (DNA no-metilado) de microorganismos (Wang y Wang, 2013a). Estos PAMPs, característicos de microorganismos y ausentes en el hospedero, son esenciales para la supervivencia de los microorganismos, lo que significa que estos blancos de la inmunidad innata no pueden sufrir mutaciones o ser evolutivamente descartados por los microbios, para evadirse del reconocimiento por el hospedero. Una vez dentro del hospedero, los patrones moleculares del patógeno son reconocidos y unidos a sus respectivas PRPs y/o PRRs y en el caso de los crustáceos, inician la activación principalmente de los hemocitos, desencadenando una respuesta inmune celular o la producción/liberación de una serie de moléculas inmunoefectoras/inmunoreguladoras por degranulación o, aún más, por modular la expresión de genes inmunológicos específicos (Figura 6.3.1).

245 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 6.3.1: Respuestas inmunológicas inducidas en los hemocitos, después del reconocimiento de patógenos, vía PRPs plasmáticas o celulares y subsecuente activación (1) desgranulación, con liberación de diferentes inmunoefectores e inmunoreguladores; (2) inducción y/o represión de genes inmunológicos; (3) activación de respuestas celulares como fagocitosis y formación de nódulos y cápsulas.

Varias PRPs fueron identificadas y caracterizadas en la hemolinfa de los crustáceos, tales como las que se unen a los LPS (LBP), β-1,3-glucanos (βGBP y GBP), LPS y β-1,3-glucanos (LGBP y proteí- nas “mas-like”) y a diferentes azúcares presentes en la superficie de los microorganismos invasores (varios tipos de lectinas) (Wang y Wang, 2013a). Además de esas, los camarones poseen también PRPs de la familia de las Dscam, las cuales presentan un amplio espectro de reconocimiento debido a mecanismos de recombinación somática (Armitage et al., 2014). No obstante, distintos de otros invertebrados (Steiner, 2004), los crustáceos no poseen la clásica proteína de reconocimiento PGNs, la PGRP (del inglés, peptidoglycan recognition proteins) (Wang y Wang, 2013). En el genoma completo de un crustáceo, el del braquiópodo Daphnia pulex, ningún gene codificado para PGRP fue encontrado (McTaggart et al., 2009). Recientemente, fue demostrado que las proteínas QM (tumor suppressor gene) y lectinas del tipo FREP son las responsables por el reconocimiento de PGNs en camarones (Udompetcharaporn et al., 2014). Curiosamente el sistema de activación de la pro-fenoloxidasa (proPO) del cangrejo de río P. leniusculus puede ser activado vía PGNs a través de la partici- pación de dos proteínas homólogas a la serino-proteasa y una LGBP, pero no por la PGRP (Liu et al., 2011), como ocurre en los insectos. Algunas de las diferentes PRPs identificadas en los crustáceos se presentan en la Tabla 1.

246 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

Tabla 1: Las principales proteínas de reconocimiento patrón (PRPs) de camarones.

PRP Reconocimiento (PAMP) Microorganismos

βGBP β-1,3-glucanos Hongos

GBP β-1,3-glucanos Hongos

LGBP LPS y β-1,3-glucanos Hongos y bacterias Gram-negativas

Mas-like LPS y β-1,3-glucanos Hongos y bacterias Gram-negativas

Lectinas Azúcares variados Diferentes microorganismos

LBP LPS Bacterias Gram-negativas

Dscam nd Diferentes microrganismos

Nd = no determinada.

◆◆ Proteínas que se unen a los β-1,3-glucanos: βGBP y GBP

Las proteínas que reconocen exclusivamente los β-glucanos tienen la capacidad de unirse a los componentes de la pared celular de los hongos y fueron caracterizadas en muchas especies animales, denominándose de manera general como βGBP y GBP. En los crustáceos existen por lo menos estas dos clases de proteínas que reconocen y se unen a los β-glucanos. La primera está representada por una lipoproteína de alta densidad, la βGBP (Yepiz-Plascencia et al., 1998), sintetizada en el hepatopáncreas (Romo-Figueroa et al., 2004) y constitutivamente presente en la hemolinfa de estos animales. La segunda clase está compuesta por pequeñas proteínas, la GBP (Sritunyalucksana et al., 2002) y la LGBP (Du et al., 2007; Liu et al., 2009a), sintetizadas por los hemocitos y/o el hepatopán- creas de los crustáceos. La βGBP fue inicialmente aislada/clonada y caracterizada en el cangrejo de río P. leniusculus (Duvic y Söderhäll, 1990) y en seguida en varios otros crustáceos (Duvic y Söderhäll, 1993; Thör- nqvist et al., 1994), incluyendo varias especies de camarones como F. californiensis (Vargas-Albo- res et al., 1996), L. vannamei (Jiménez-Vega et al., 2002; Romo-Figueroa et al., 2004), L. stylirostris (Vargas-Albores et al., 1997), F. chinensis (Lai et al., 2011) y más recientemente en F. paulensis y L. schmitti (Gonçalves et al., 2012). Bioquímicamente, las βGBPs son glicolipoproteínas conteniendo en su estructura oligosacáridos ricos en manosa y un alto porcentaje de lípidos (aproximadamente 50%), siendo los fosfolípidos la clase lipídica predominante (Ruiz-Verdugo et al., 1997). Estas proteínas contienen un motivo de adhesión celular RGD (arginina-glicina-aspartato) y/o RGE (arginina-glicina-glutamato) (Wang y Wang, 2013a). Fue demostrado que la βGBP del cangrejo de río es idéntica a una lipoproteína de alta densidad (LP1) presente en la hemolinfa de los machos y hembras del camarón Penaeus semisulcatus y que estaba relacionada con el transporte de lípidos hacia el ovario, en el caso de las hembras (Lubzens et al., 1997). También fue demostrado en camarones, que la βGBP y la HDL (del inglés, high density lipoprotein) eran de hecho la misma proteína (Yepiz-Plascencia et al., 1998). Así, se considera que las βGBPs de los crustáceos tienen una doble función: transportar lípidos como una HDL y participar en el sistema inmune como una PRP.

247 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

La interacción de la βGBP con los β-1,3-glucanos lleva a la formación de un complejo que se une a una proteína asociada a la superficie celular, un superóxido dismutasa (SOD) oauna β-integrina de superficie, a través del motivo RGD (Jiravanichpaisal et al., 2006). Luego de esta unión, ocurre la activación celular, que resulta en la adhesión y degranulación parcial de los hemocitos granulares (Barracco et al., 1991). La exocitosis del material granular promueve la liberación de las moléculas del sistema proPO, entre otras moléculas, ocurriendo una posterior activación de este sistema por los mismos β-1,3-glucanos (Jiravanichpaisal et al., 2006). Fue también demostrado que la βGBP puede actuar como una opsonina, aumentando la fagocitosis de levaduras por los hemocitos de los cangrejos de río (Cerenius et al., 1994). También se demostró recientemente que las βGBP de los camarones F. paulensis y L. schmitti presentan una actividad aglutinante contra levaduras confirmando nuevamente su multifuncionalidad (Gonçalves et al., 2012). Otra proteína que se une a los β-glucanos, es la GBP, que fue clonada de los hemocitos del ca- marón P. monodon (Sritunyalucksana et al., 2002) y no del hepatopáncreas como las demás bGBPs. La GBP es una proteína constitutivamente expresada en los hemocitos y reconoce específicamente hongos, por unirse a los β-1,3-glucanos (curdlan y zymosan) de su pared. Así como la bGBP, la GBP también induce la activación del sistema proPO de los crustáceos luego de unirse a los β-1,3- glucanos (Jiravanichpaisal et al., 2006).

◆◆ Proteínas que se unen a los LPS y β-1,3-glucanos: LGBP

PRPs que se unen a ambos, LPS y β-1,3-glucanos (LGBPs), fueron identificadas en crustáceos e insectos y presentan un importante papel en las respuestas inmunes innatas. Las LGBPs de los crus- táceos son proteínas pequeñas (36-46 kDa) producidas en los hemocitos (Liu et al., 2009a) y/o en el hepatopáncreas de estos animales (Roux et al., 2002; Cheng et al., 2005). La primera LGBP aislada y caracterizada en los crustáceos, fue en el cangrejo de río P. leniusculus (Lee et al., 2000). Esta LGBP está presente en los hemocitos, pero ausente en el plasma y tiene la propiedad de unirse tanto a los LPS como a los β-1,3-glucanos, pero no a los PGNs mostrando su especificidad para bacterias Gram- negativas y hongos. Una vez unida a sus respectivos PAMPs, la LGBP así como la βGBP, lleva a la activación del sistema proPO del cangrejo. En los camarones penaeidos, existen algunas referencias sobre la clonación del gene de la LGBP: en L. stylirostris (Roux et al., 2002), L. vannamei (Cheng et al., 2005) y F. chinensis (Du et al., 2007; Liu et al., 2009a). Así como las PRPs descritas anteriormente, las LGBPs participan también en la activación del sistema proPO del cangrejo de río (Lee et al., 2000) y de los camarones L. stylirostris (Roux et al., 2002) y P. monodon (Amparyup et al., 2012). Sin embargo, la proteína del cangrejo de río debe estar simultáneamente unida a los dos PAMPs para que ocurra una completa activación del sistema proPO (Lee et al., 2000). El análisis de la expresión diferencial de la LGBP de L. stylirostris infectados con WSSV, demostró que ocurre una súper expresión del gene en respuesta a la infección viral, sugiriendo que la LGBP sea una proteína inducible de fase aguda, importante no solamente para las infecciones bacterianas y de hongos, sino también en las infecciones virales (Roux et al., 2002). A pesar de que las LGBP y GBP tienen dominios de adhesión celular (RGD) como la BGBP, estas PRPs difieren de la BGBP por contener también sitios característicos semejantes a las β-glucanasas (dominio GLU) bacterianas, lo que no ocurre en la βGBP (Wang y Wang, 2013a). El dominio GLU es un sitio de fragmentación de ligaciones glucosídicas (β-1,3 e β-1,4). Debido a la presencia de este dominio característico y común en la GBP y LGBP (así como en proteínas de insectos y otros invertebrados) fue propuesto agrupar PRPs con sitios GLU en una clase especial, denominada BGRP (del inglés, β-1,3-glucanase-related proteins) (Wang y Wang, 2013a) en la cual la BGBP no está incluida.

248 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

◆◆ Proteínas “mas-like”

La mas-like es una proteína de reconocimiento patrón multifuncional descrita en insectos y crustáceos. En el cangrejo de río P. leniusculus la mas-like se une a las bacterias Gram-negativas y levaduras y, consecuentemente, a los LPS y β-1,3-glucanos, semejante a la LGBP. Luego del reconocimiento de lo no-propio, esta PRP promueve la activación del sistema proPO, la adhesión celular y el aumento de la fagocitosis (Jiravanichpaisal et al., 2006). La mas-like de P. leniusculus (Huang et al., 2000; Lee y Söderhäll, 2001) fue así denominada debido a su similitud con la masquerade de la Drosophila, presente durante su embriogénesis, en el desarrollo larval y en el estadio de pupa (Muru- gasu-Oei et al., 1995). Wang y Wang (2013a) proponen denominar las mas-like de los crustáceos/insectos como SPHs (del inglés. serine protease homologs) debido a su homología molecular con las serino-proteasas, aunque sin actividad hidrolítica. La mas-like del cangrejo de río existe en los hemocitos bajo una forma inactiva. Esta proteína es exocitada de los hemocitos aun en su forma inactiva y después de su unión a microorganismos específicos es fragmentada por una proteasa todavía desconocida, produciendo así varios fragmentos peptídicos. Uno de ellos promueve la adhesión celular en el cangrejo de río (Jiravanichpaisal et al., 2006). Por otro lado, in vitro la mas-like funciona como una opsonina, estimulando la fagocitosis por los hemocitos del cangrejo de río. Otra clase de mas-like, homóloga a las serino-proteasas, fue identificada también enP. leniusculus (Sricharoen et al., 2005) y en P. monodon (Amparyup et al., 2007). Estas proteínas hemocitarias presentan homología con los factores de activación de la proPO (del inglés, FAPPs) de insectos, a diferencia de la mas-like descrita anteriormente, que parece ser una PRP.

◆◆ Aglutininas y/o Lectinas

Las lectinas son proteínas sin actividad catalítica, con capacidad de unirse a carbohidratos específicos de la superficie de diferentes células, incluyendo microorganismos, causando su agluti- nación. Debido a esta característica, inicialmente se consideró que las lectinas de los invertebrados eran análogas funcionales de las inmunoglobulinas de los vertebrados, pero hoy se sabe que son estructural y funcionalmente distintas. Actualmente, las lectinas, tanto de vertebrados como de invertebrados, son preferencialmente definidas como proteínas de reconocimiento o PRPs, una vez que son capaces de reconocer y unirse a los azucares específicos de la superficie de patógenos y entonces causar su aglutinación. La propiedad de aglutinación deriva del hecho de que estas moléculas son por lo menos biva- lentes, presentando dos o más sitios de unión con los carbohidratos específicos, denominados dominios para el reconocimiento de carbohidratos o CRDs (del inglés, carbohydrate recognition domain) (Marques y Barracco, 2000). Usualmente la presencia de lectinas es investigada a través de pruebas de hemaglutinación, razón por la cual estas proteínas son también conocidas por hemaglutininas o aglutininas. En estas pruebas se utilizan eritrocitos de diferentes vertebrados, por presentar una variedad de azúcares es- pecíficos en su superficie y sobre todo por tener coloración roja natural, lo que facilita la visualiza- ción del fenómeno de aglutinación a simple vista. Sin embargo, en estas pruebas se pueden utilizar también diferentes tipos de bacterias y/o levaduras, que también presentan azúcares específicos en su superficie. Por otro lado, la reacción de aglutinación no es tan fácilmente observable como en el caso de los eritrocitos.

249 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

La mayoría de las lectinas relacionadas con el sistema inmune de crustáceos pertenece a la superfamilia de las lectinas del tipo-C o CTLs (del inglés, C-type lectins), siendo así denominadas por el hecho de su actividad biológica ser calcio-dependiente. Estas CTLs son comúnmente producidas de forma constitutiva en el hepatopáncreas de los crustáceos, son secretadas hacia el plasma y reconocen generalmente azúcares N-acetilados, en especial derivados del ácido siálico y sialoglicocon- jugados. Hay también lectinas que reconocen otros azúcares como los galactósidos, conocidos como galectinas, los manósidos, y las lectinas relacionadas con el fibrinógeno, llamadas de FREPs (Wang y Wang, 2013b). En este capítulo trataremos solamente de las CTLs y de las FREPs. Las primeras lectinas a ser bioquímicamente purificadas de la hemolinfa de crustáceos fueron las de la langosta Homarus americanus hace más de 30 años (Hall y Rowlands, 1974) y desde entonces, otras varias lectinas han sido detectadas y aisladas en diferentes crustáceos. Recientemente varias CTLs fueron identificadas y caracterizadas por abordaje molecular (clo- nación y producción en sistema recombinante) en camarones (Tabla 2). La gran mayoría de estas lectinas son producidas por el hepatopáncreas de forma constitutiva y parecen funcionar como PRPs, debido a que tienen la propiedad de unirse a diferentes PAMPs, como PGN, ácido lipoteicoico y principalmente LPS de la superficie de bacterias. Es importante resaltar que las lectinas se diferencian funcionalmente de las LGBPs, que también reconocen LPS (y beta-glicanos), porque no solamente actúan en el reconocimiento, sino que también causan la aglutinación de las células portadoras de LPS, lo que no ocurre con las LGBPs. Además, aparte de estar relacionadas al reconocimiento y aglu- tinación de patógenos invasores, las lectinas pueden presentar funciones inmunológicas adicionales actuando como verdaderas moléculas inmunoefectoras. En el camarón F. chinensis, por ejemplo, fueron clonadas y caracterizadas cinco lectinas (FcL1-FcL5). Las cinco CTLs son producidas de forma constitutiva en el hepatopáncreas, son secretadas hacia el plasma y más allá de funcionar como PRPs presentan además actividades inmunológicas adicionales. Todas las lectinas de F. chinensis tienen la capacidad de unirse y aglutinar diferentes especies de bacterias Gram positivas y Gram negativas y tienen su expresión génica inducida des- pués del desafío con bacterias (Vibrio anguillarum) y/o virus (WSSV). Las FcL1, FcL3 y FcL4 poseen un único tipo de CRD con afinidad para manosa (FcL1 y FcL3) (Sunet al., 2008; Wang et al., 2009a) o para galactosa (FcL4) (Wang et al., 2009b). Curiosamente, la FcL1 presenta una fuerte actividad antimicrobiana contra ciertas bacterias y varios hongos (Sun et al., 2008), lo que no es común entre las lectinas. Por otro lado, la FcL3 tiene la propiedad de unirse e interactuar con la proteína de la envoltura viral VP28 del virus de la mancha blanca (Wang et al., 2009a). Ya la FcL4 se une fuertemente a la superficie de V. anguillarum y facilita su eliminación del hospedero infectado. Interesantemente, la FcL4 presenta una mayor homología molecular con las lectinas de insectos que con las de los camarones, inclusive con las propias lectinas de F. chinensis (Wang et al., 2009b). Por otro lado, las FcL2 y FcL5 presentan dos CRDs distintos en la misma molécula, uno con afinidad para manosa y otro para galactosa (Zhang et al., 2009a; Xu et al., 2010). La actividad aglutinante de la FcL5 está más dirigida contra bacterias Gram negativas que contra Gram positivas (Xu et al., 2010). Por otro lado, los dos CRDs de la FcL2 se unen a bacterias distintas y probablemente deban trabajar en sinergismo in vivo durante las infecciones. Esto parece ser confirmado, por el hecho de que la actividad de los fragmentos de la molécula (producidos a través del sistema recombinante) conteniendo apenas uno de los CRD de esta lectina es menor que la actividad de la molécula completa (Zhang et al., 2009a).

250 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

Tabla 2: Caracterización de las principales lectinas (CTLs) recientemente identificadas en camarones peneidos.

Lectina Expresión Ligandos *Aglutinación Modulación (Función) Referencia

Fenneropenaeus chinensis Bac (+) WSSV(+) FcLec1 HP, St Man, LPS, PGN G+/G Sun et al., 2008 (AMP) Gal, Man, PGN, V. ang. (+) Zhang et al., FcLec2 HP, St G+/G- LPS, LIA WSSV(+) 2009a V. ang. (+) Wang et al., FcLec3 HP Man, PGN G+/G- WSSV(+) 2009a (receptor de VP28 WSSV) V. ang. (+) Wang et al., FcLec4 HP, St, Br, Int PGN G+/G- (eliminación bac) 2009b

Gal, Man, PGN, V. ang. (+) FcLec5 HP G+/G- Xu et al., 2010 LPS, LIA WSSV (+) Penaeus vannamei

GalNAc, LvL(#) nd GlucNAc, G- nd Sun et al., 2007 NeuAc, LPS LvLT HP Man, Gal nd WSSV(-) Ma et al., 2007 WSSV(+) Zhao et al., LvCTL1 HP, ST Man nd (se une al WSSV) 2009 Zhang et al., LvLec Hem Man E. coli nd 2009b Penaeus monodon WSSV(+) PmAV Hp Man Luo et al., 2003 (antivirus) Hp, Int, Hem, PmLec Gal, LPS G+/G- V. harveyi (opsonina) Luo et al., 2006 St WSSV(-) PmLT Hp Man, Gal nd Ma et al., 2008 (encapsulación) Marsupenaeus japonicus nd Song et al., MjLecA Hep, Hem GlucNAC, LPS G+/G- (se une al WSSV) 2010 Man, GlucNAC, nd Song et al., MjLecB Hep, Hem G+/G- LPS (se une al WSSV) 2010 nd Song et al., MjLecC Hp GalNAC, LPS G+/G- (se une al WSSV) 2010

Modula la expresión de Wang et al., MjHeCL Hem nd nd péptidos antimicrobianos y controla la microbiota 2014

*La aglutinación de eritrocitos fue omitida; Br: branquias; (#) lectina purificada bioquímicamente; AMP: péptido antimicrobiano; Gal: galactosa; GalNAC: N-acetil galactosamina; GlucNAC: N-acetil glucosamina; G+: bacterias Gram positivas; G-; bacterias Gram negativas; Hem: hemocitos; Hp: hepatopáncreas; Int: intestino; LIA: ácido lipoteicoico; LPS: lipopolisacáridos; Man: manosa; NeuAC: ácido N-acetil neuramínico; nd: no descrito; PGN: peptidoglicanos; St: estómago; V. ang: Vibrio anguillarum; (+): expresión aumentada; (-): expresión disminuida.

251 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

En L. vannamei también fueron detectadas y caracterizadas diferentes CTLs por abordaje bio- química (aislamiento) y molecular (clonación). Una lectina con alta afinidad por azúcares N-acetilados y con capacidad de unirse a LPS y aglutinar bacterias Gram negativas fue purificada del plasma de L. vannamei (LVL) (Sun et al., 2007). Otra lectina denominada LvLT fue clonada a partir del hepa- topáncreas de esta misma especie (Ma et al., 2007). La LvLT presenta dos CRDs distintos, uno para manosa y otro para galactosa y su expresión es modulada durante infecciones con el WSSV. Posterior- mente, Zhao et al., (2009) clonaron otra lectina también del hepatopáncreas, denominada LvCTL-1, conteniendo un CRD con afinidad para manosa. Interesantemente, la LvCTL-1 tiene la capacidad de unirse a diferentes proteínas de la envoltura del virus WSSV y fue mostrado que esta unión resultaba en una disminución de la infección de los camarones por este virus. Estos resultados sugieren así, que además de su función en el reconocimiento de lo no-propio, la LvCTL1 presenta también una función antiviral (Zhao et al., 2009). Finalmente una nueva lectina con afinidad para manosa (LvLec) fue clonada a partir de los hemocitos (y no del hepatopáncreas) de L. vannamei (Zhang et al., 2009b). No obstante, esta lectina está expresada principalmente en el cerebro de los camarones y apenas de forma moderada en los hemocitos y hepatopáncreas. La LvLec tiene actividad aglutinante contra E. coli y parece estar implicada en reacciones de defensa contra bacterias Gram negativas. En P. monodon fueron descritas tres CTLs. La primera, denominada PmAV fue clonada a partir del hepatopáncreas de camarones resistentes a WSSV y contiene apenas un CRD para manosa (Luo et al., 2003). Los autores refieren que la PmAV presenta una fuerte actividad antiviral y que esta actividad no deriva de la inhibición de la unión del virus a los receptores de la célula hospedera. Poste- riormente, Luo et al., (2006) purificaron otra CTL del plasma de P. monodon (PmLec) con capacidad de unirse específicamente a los LPS de bacterias Gram negativas (Luoet al., 2006). En consecuencia, la PmLec tiene la propiedad de aglutinar fuertemente varias especies de bacterias Gram negativas y funciona además como opsonina facilitando la fagocitosis de E. coli por los hemocitos. La PmLec fue posteriormente clonada y caracterizada molecularmente, mostrando contener un CRD con afinidad para galactosa (Luo et al., 2006). Una tercera CTL, conteniendo dos CRDs (manosa y galactosa) fue también clonada a partir del hepatopáncreas de P. monodon y denominada PmLT (Ma et al., 2008). La expresión de la PmLT es modulada durante las infecciones con WSSV, pero no con bacterias Gram negativas. Interesantemente, la PmLT estimula fuertemente el encapsulamiento de cuerpos extraños por los hemocitos, mostrando una vez más, que más allá de funcionar como molécula de reconocimiento, las lectinas presentan además otras funciones inmunológicas. También en M. japonicus fueron caracterizadas, tres CTLs (MjLecA, MjLecB y MjLecC), todas expresadas en el hepatopáncreas y conteniendo un único CRD, con capacidad de aglutinar algunas especies de bacterias (Song et al., 2010). Las tres lectinas tienen afinidad por azúcares N-acetilados (N-Acetil-glicosamina) y LPS, confirmando una vez más su función de PRP. Más allá de unirse a LPS, las tres CTLs tienen además la capacidad de unirse a diferentes proteínas de la envoltura del WSSV, debiendo por consiguiente estar también implicadas en la defensa antiviral (Song et al., 2010). Una cuarta CTL, MjHeCL, producida por los hemocitos (y no por el hepatopáncreas) fue recientemente identificada como molécula-llave en la regulación de la expresión de péptidos antimicrobianos en la hemolinfa y en la manutención de la microbiota endobionte de M. japonicus (Wang et al., 2014). Además de las lectinas descritas arriba, varias otras fueron caracterizadas en otros penaeidos como en Fenneropenaeus merguiensis (Rittidach et al., 2007), F. californiensis (Vargas-Albores et al., 1993) L. schmitti (Cominetti et al., 2002) y L. setiferus (Alpuche et al., 2005). Así como las otras lectinas de crustáceos, la mayoría de estas CTLs asocian la función de PRP con otras funciones inmunoló- gicas, confirmando su importante papel inmunoefector en la detección y eliminación de patógenos. Aparte de las CTLs, otras clases de lectinas fueron también identificadas en crustáceos. Las FREPs (del inglés, fibrinogen-related proteins), por ejemplo, son proteínas denominadas así por con-

252 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón tener un dominio altamente conservado semejante al fibrinógeno y un dominio de la superfamília de las inmunoglobulinas (Igs). Son también conocidas como inmunolectinas una vez que unen a carbohidratos de diferentes células y llevan a una reacción de aglutinación/coagulación. Las FREPs son universalmente encontradas en vertebrados e invertebrados (Dong y Dimopoulos, 2009). En el cangrejo de río P. leniusculus fueron descritas dos FREPS, llamadas ficolinas capaces de unirse a diferentes bacterias Gram positivas y Gram negativas, además de auxiliar en la eliminación de bacterias Gram negativas (Wu et al., 2011). También en M. japonicus fue identificada una FREP (MjFREP1), expresada en las branquias y cuya expresión es aumentada en la presencia de bacterias Gram positivas, Gram negativas y del virus WSSV. La MjFREP1 tiene incluso la propiedad de aglutinar diferentes bacterias Gram-positivas y es capaz de unirse a PGNs, LPS y hasta a la VP28 del WSSV (Wang y Wang, 2013a). De manera interesante una FREP denominada Proteína Inhibidora de Melanización fue recientemente identificada en P. leniusculus y en el camarón P. monodon (Söderhäll et al., 2009; Angthong et al., 2010). En P. leniusculus se sugiere que esta FREP actué como un regulador de la inducción de la melanización por patógenos. Así que, las FREPs o inmunolectinas, funcionan no solamente como PRPs en el reconocimiento de patógenos pero también como importantes inmunoefectores envueltos tanto en la regulación de mecanismos de defensa (proceso de melanización) como en el control de infecciones por diferentes microorganismos.

◆◆ Proteínas Dscam: - esperanza de alta especificidad y memoria inmunológica

En nuestra opinión, entre los descubrimientos más intrigantes y promisorios de estas últimas décadas, en el campo de la Inmunología de Invertebrados está el que se refiere a la identificación del gene/proteínas Dscam en insectos y crustáceos. Este gene (y sus productos) fue descubierto inicialmente en humanos (1998) y recibió esta denominación debido a su asociación con el Síndrome de Down (del inglés: Down syndrome cell adhesion molecule). Poco tiempo después (2000), un gene homólogo también fue identificado en D. melanogaster (ver revisión de Armitage et al., 2014). El gen/proteínas Dscam pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas (lgs) o anticuerpos y además de poseer varios dominios lg en su estructura molecular, posee además dominios FN (fibronectina, molécula de adhesión celular). El gene Dscam es expresado en el sistema nervioso de los mamíferos e insectos y asume un papel importante en la formación de circuitos neuronales (Armitage et al., 2014). Además del sistema nervioso, el gene Dscam de Drosophila está también expresado en las células de su sistema inmunológico (hemocitos) y el cuerpo graso (órgano principal de la síntesis y almacenamientos de los insectos). Las proteínas Dscam ocurren en las membranas de estas células, pero además son secretadas hacia la hemolinfa. La gran sorpresa en relación a la Dscam es que este gene y sus productos combinan una amplia variabilidad, tanto a nivel genotípico, como somático, generando una diversidad de isoformas, a través de splicing alternativo mutuamente excluyente, principalmente en la región extracelular de la molécula (así como también en los dominios transmembranas), responsable por el reconocimiento. Estas sorprendentes características se asemejan mucho al sistema inmune adaptativo de los vertebrados, donde los linfocitos T/B generan variabilidad en sus anticuerpos y receptores altamente específi- cos, a través de un proceso muy similar. En Drosophila, por ejemplo, ya fueron referenciados más de 18,000 isoformas posibles de Dscam, aunque este número puede ser muy superior (Sun et al., 2013; Armitage et al., 2014). Esta diversidad no tiene precedentes en la historia de los invertebrados, donde es comúnmente aceptado, como se menciona arriba, que el reconocimiento de patógenos se da a través de PRPs, cuya capacidad de reconocimiento es limitada apenas a patrones moleculares característicos de clases de microorganismos/parásitos, pero sin posibilidad de distinguir patógenos relacionados. Es evidente

253 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos que la magnitud del número de isoformas generadas por la Dscam de Drosophila es muy inferior a lo que ocurre con los receptores/anticuerpos de los vertebrados, pero ciertamente esa variabilidad ines- perada representa una forma mucho más compleja y eficiente de reconocimiento del que se juzgaba podría existir en este grupo zoológico. Además de la alta diversidad, sorprende el hecho de que la expresión de Dscam puede ser inducida por patógeno y las múltiples isoformas generadas por recombinación somática pueden ligarse específicamente a su inductor. Además estas mismas isoformas tienen la capacidad de estimular la fagocitosis del microorganismo inductor, una vez que su silenciamiento génico, a través de la técnica del RNA de interferencia (ver abajo), disminuye significativamente el proceso fagocítico (ver revisiones de Wang y Wang, 2013a; Armitage et al.; 2014). Todas estas características representan una revolución conceptual en el sistema inmune de los invertebrados, que pasa a ser actualmente considerado como un sistema adaptativo alternativo (ver revisión de Armitage, 2014), en contraposición al sistema adaptativo de los vertebrados. Tal como se esperaba, proteínas Dscam también fueron identificadas en crustáceos, como en los camarones L. vannamei (Chou et al., 2009), P. monodon (Chou et al., 2011),en el cangrejo de río P. leniusculus (Watthanasurorot et al., 2011) y en el cladócero Daphnia (Brites et al., 2008). La Dscam de L. vannamei (LvDscam) tiene la capacidad de producir por lo menos 9.000 isoformas distintas y parece además estar implicada en la defensa antiviral contra el WSSV (Chou et al., 2009). Por su parte la Dscam de P. leniusculus (PlDscam) puede generar más de 22.000 isoformas y su ex- presión es inducida por la inyección de LPS, pero no por PGN o WSSV. De manera interesante, la PlDscam produce isoformas con sitios de ligaciones capaces de reconocer específicamente diferentes bacterias, además de promover su fagocitosis y eliminación del hospedero, en un mecanismo semejante a la opsonización (Watthanasurorot et al., 2011). No obstante, todavía no fueron identificados los receptores específicos para Dscam en las células fagocitarias de crustáceos/insectos, para validar el evento de una opsonización verdadera. Es importante señalar, sin embargo, que no siempre la Dsacm es expresada después de una ex- posición a patógenos en las diferentes especies de insectos/crustáceos estudiados. Además, en algunos casos puede ocurrir inducción de su expresión después del desafío con algunos microorganismos y/o parásitos, pero no con otros. Por ejemplo, la exposición al WSSV lleva a un aumento de los niveles de Dscam en L. vannamei (Chiang et al., 2013) pero no ocurre en P. leniusculus (Watthanasurorot et al., 2009). Como el descubrimiento de la Dscam es muy reciente, las evidencias disponibles son todavía limitadas y no permiten generalizaciones definitivas. Futuros estudios llevarán ciertamente a una comprensión mayor de este sistema y sus implicaciones prácticas en el control de infecciones en crustáceos de importancia comercial. Otro aspecto intrigante en relación a la Dscam se refiere a su envolvimiento con una posible memoria inmunológica, o sea, con la capacidad del sistema inmune de almacenar y recordar informaciones sobre un patógeno previamente encontrado, respondiendo a él de forma más rápida y eficiente en una segunda infección. Este fenómeno, bien conocido en los vertebrados, es llamado specific immune priming en los invertebrados. No obstante, evidencias del evento de un priming en insectos/crustáceos son todavía muy iniciales y poco conclusivas. Aún no han sido realizados estudios inequívocos probando la hipótesis del envolvimiento de la Dsam en la generación de una memoria inmunológica altamente específica. Poco se sabe también a respecto del “tiempo” de duración de las isoformas Dscam en la hemolinfa de los insectos/crustáceos después de un desafío inmunológico y si existiría una posible expansión clonal de las células inmunológicas de respuesta como ocurre en los vertebrados (Armitage et al., 2014).

254 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

El evento de una memoria inmunológica de largo plazo en crustáceos, sería tal vez una de las propiedades más deseables para el éxito de la camaronicultura, pues abriría la posibilidad de una real vacunación de los animales, en el sentido clásico de la palabra. Esta perspectiva altamente promisoria permitiría controlar efectivamente las infecciones de forma específica, eficiente y sobre todo a largo plazo, lo cual todavía no se ha mostrado en la actividad camaronera.

Vías de señalización del sistema inmune Así como en los mamíferos, el reconocimiento de agentes invasores dentro de la cavidad corporal de los invertebrados lleva a la activación de diferentes respuestas inmunológicas, con el objetivo de controlar y eliminar infecciones. Los diferentes estímulos externos son integrados, in- ternamente, por vías de señalización celular. Tales vías son responsables por la activación de importantes factores de transcripción, que orquestan la expresión de diferentes genes envueltos en las respuestas inmunológicas. En insectos, fueron caracterizadas tres principales vías de señalización celular implicadas en la activación del sistema inmune: Toll, Imd e JAK/STAT (Hoffmann y Reichhart, 2002). Esas mismas vías fueron posteriormente identificadas en camarones y otros crustáceos a través de estudios transcriptómicos. (Fig. 6.3.2).

Figura 6.3.2: Vías de señalización celular asociadas a la activación de las respuestas de defensa de camarones (adaptado de Tassanakajon et al., 2013).

255 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

◆◆ Vía Toll Los receptores Toll son proteínas de la superficie de células que fueron primeramente identificados en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y revelaron inicialmente tener una importante función en la determinación del eje dorso-ventral en el desarrollo embrionario de este insecto (Anderson y Nusslein-Volhard, 1984). Todavía, además de su importante papel en la embriogénesis, los receptores Toll mostraron estar también crucialmente implicados en las respuestas inmunológicas de esta mosca (Lemaitre et al., 1996). Más tarde, proteínas semejantes a los receptores Toll de D. melanogaster fueron también identificadas en vertebrados y denominadas TLRs (del inglés, Toll-like receptors). Los TLRs están implicados en el sistema inmune innato de los vertebrados y actúan de forma esencial en el reconocimiento de PAMPs. Los receptores Toll y TLRs son glicoproteínas trans- membranales (PRRs) caracterizadas por presentar un dominio extracelular rico en residuos de leucina o LRR (del inglés, leucine-rich repeat) y por un dominio de señalización citoplasmático homólogo al del receptor de interleucina 1, denominado de TIR (del inglés, Toll/interleucin-1 receptor domain) (Yamamoto y Takeda, 2010). Los TLRs de mamíferos tienen regiones de unión a los PAMPs en su dominio LRR y luego de la activación, inducen a la expresión de citocinas inflamatorias importantes como los interferones y otras moléculas activas de la respuesta inmune adaptativa (Akira, 2006; Yamamoto y Takeda, 2010). En mamíferos, ya fueron identificados más de diez TLRs distintos, todos implicados en el reconocimiento directo de PAMPs, como LPS (TLR4), lipoproteínas (TLR2), dsRNA (TLR3), flagelina (TLR5), DNA CpG (TLR9) y varios otros componentes virales (TLR7) (Akira, 2006; Yamamoto y Takeda, 2010). La vía Toll de invertebrados es semejante a la vía TLR de mamíferos, pero a diferencia de esa, el receptor responsable por la transducción de la señal (Toll) no reconoce directamente los PAMPs, pero sí la citocina Spätzle. Esa citocina se encuentra en el plasma en una forma inactiva que es procesada, vía una cascada proteolítica, en su forma activa después del reconocimiento de bacterias Gram-positivas y/o hongos. Esos microorganismos son reconocidos a través de proteínas que reconocen peptidoglicanos (PGRP-SA e PGRP-SD) y proteínas que se unen a bacterias Gram- negativas (GNBP-1 y GNBP-3). La unión de Spätzle con el receptor Toll lleva al reclutamiento de las proteínas intracelulares adaptadoras MyD88, Pelle y Tube, que activan la fosforilación y subsecuente degradación de Cactus, el inhibidor de dos factores de transcripción de la familia de los NF-κB, Dif y Dorsal. En la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, después de la degradación de Cactus, los NF-κB son translocados para el núcleo donde promueven la transcripción de los AMPs drosomicina y metchnikovina (Leclerc & Reichhart, 2004; Tanji et al., 2007). Respecto a los camarones, apenas recientemente fueron identificados receptores del tipo Toll en las células de los penaeidos L. vannamei (lToll) (Yang et al., 2007), P. monodon (PmToll) (Arts et al., 2007), M. japonicus (MjToll) (Mekata et al., 2008) y F. chinensis (FcToll) (Yang et al., 2008). Esos receptores presentan una alta homología con los “Tolls” de D. melanogaster (dToll y dToll5) y de otros insectos y limúlidos. A ejemplo de los Tolls y TLRs conocidos, los Tolls de camarones también tienen dominios LRR y TIR conservados. Sin embargo, no contienen regiones de unión para los PAMPs en el dominio LRR, como los TLRs de vertebrados, pareciéndose una vez más a los “Tolls” de Droso- phila. Recientemente fue clonada la primera proteína Spätzle en camarones F. chinensis (Fc-Spz) (Shi et al., 2009). Los autores mostraron que el dominio activo de la Fc-Spz (producido en sistema recombinante) es capaz de inducir la expresión de una crustina en el cangrejo de río Procambarus clarkii. La similitud de estos receptores de camarones con los “Tolls” de Drosophila, que inducen la transcripción del AMP drosomicina (dToll), lleva a la suposición de que esas proteínas pueden estar también implicadas en la inmunidad innata de los camarones penaeidos, inclusive en sus respuestas antivirales como en Drosophila.

256 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

Además de los receptores Toll y de su ligando Spätzle, otros componentes de esa vía también fueron identificados en camarones, como las proteínas adaptadoras MyD88, Pelle y Tube, el activador TRAF6, el inhibidor de NF-κB (IκB) Cactus y el factor de transcripción NF-κB Dorsal (Li y Xiang, 2013). Estudios con la técnica de IRNA de interferencia o RNAi (ver abajo) mostraron que la activa- ción de la vía Toll en camarones induce la expresión de péptidos antimicrobianos, así como ocurre en insectos (Li et al., 2012). De manera interesante, 40 genes del virus WSSV poseen en sus promotores sitios de vinculación de NF-κB, los cuales pueden ser activados por la vía Toll. Además de eso, existe en el genoma de ese virus un homólogo de la proteína Tube de camarones, que consigue activar la vía Toll y regular la expresión de genes virales (Wang et al., 2011). Fue mostrado en L. vannamei, que el silenciamiento del IToll por la técnica del RNAi no afecta la respuesta antiviral de este camarón contra WSSV, sugiriendo que el IToll no esté implicado en la defensa antiviral de esta especie (Labreuche et al., 2009). Por otro lado, otros estudios mostraron que la expresión del FcToll (Yang et al., 2008) y del IToll (=LvToll) (Han-Ching Wang et al., 2010) es fuertemente inducida después del desafío con V. anguillarrum y V. harveyi, respectivamente. Corrobo- rando estos resultados, fue referido que el silenciamiento del IToll (=LvToll) por la técnica del RNAi resulta en un aumento significativo de la mortalidad de los camarones desafiados conV. harveyi, pero no aquellos desafiados con WSSV, confirmando que el IToll está de hecho implicado en la defensa antibacteriana y no en la antiviral (Wang et al., 2010).

◆◆ Vía Imd Al contrario de la vía Toll, la vía lmd de insectos es activada a través del reconocimiento de moléculas de PGN conteniendo ácido diaminopimélico (DAP-type PGN), que son encontrados solamente en la pared celular de bacterias Gram-negativas. Las moléculas de DAP-type PGN son recono- cidas por PGRPs que interactúan con la proteína intracelular lmd que al complejarse con la proteína Fadd, activa la caspasa Dredd. Esa caspasa puede entonces actuar tanto en la activación del NF-κB Relish como en la fragmentación del propio lmd (Paquette et al., 2010). Después de la fragmen- tación, Imd puede asociarse con un complejo de ubiquitinación (Iap2, Bendless, Effete y Uev1a), resultando en la activación de Tak1 (MAPKKK) y Tab2. La activación del complejo Tak1/Tab2 puede llevar tanto a la activación de la vía JNK (MAPK envuelta en la activación del factor de transcripción AP-1) como de la vía de degradación de Relish (NF-κB) (Silverman et al., 2003). Para la degradación de Relish, el complejo Tak1/Tab2 necesita activar dos quinasas inhibidoras de κB (IKK), Ird5 (IKKβ) y Kenny (IKKγ). Esas IKK fosforilan directamente Relish, que es fragmentado, liberando su región N-terminal que contiene un dominio RHD. Al ser translocado para el núcleo, ese dominio es responsable por la transcripción de los AMPs diptericina, cecropina y atacina (Marmaras y Lampropoulou, 2009). Comparativamente a la vía Toll, poco ha sido descrito a respecto de la vía Imd de camarones. Hasta el momento, fueron identificados el adaptador Imd, las quinasas IKKβ y IKKε y el factor de transcripción NF-κB Relish (Li y Xiang, 2013; Wang et al., 2013). Estudios in vitro mostraron que la vía Imd en camarones está envuelta en la modulación de la expresión de lisozimas, peneidinas y crustinas (Wang et al., 2013).

◆◆ Vía JAK/STAT La vía Jak/Stat (del inglés, Janus kinase/signal transducer and activator of transcription) está asociada a la inducción de genes del citoesqueleto, algunos AMPs y de la TEP1 (del inglés, Thioester- containing Protein 1), proteína responsable por la opsonización, ya que está envuelta en la fagocitosis de microrganismos por los hemocitos. En D. melanogaster, esa vía puede ser inducida tanto por un estímulo microbiano como por lesiones en los tejidos, que promueven la unión de la citocina Upd (Unpaired) al receptor Domelles. Esa unión lleva a la dimerización de ese receptor que fosforila la JAK tirosina quinasa Hopscotch (Hop). La fosforilación de Hop crea un sitio de unión para las proteínas

257 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

STAT que, al ser fosforiladas, dimerizan y son translocadas para el núcleo donde activan la transcrip- ción de genes (Gupta et al., 2009). En camarones, todavía se conoce poco a respecto de vía JAK/STAT y su implicación en la modulación de genes asociados al sistema inmune. Fue demostrado que la proteína STAT es capaz de inducir la expresión del gene ie1 (immediate-early gene) del virus WSSV (Liu et al., 2007) y que, durante una infección, ocurre un aumento en la activación y translocación de la proteína STAT del citoplasma para el núcleo (Chen et al., 2008).

6.4. Mecanismos líticos y microbicidas

Producción de radicales de oxígeno (ROIs) y de nitrógeno (RNIs) Además de la destrucción de los microorganismos invasores por las enzimas lisosomales, se observa, durante las reacciones inmunocelulares, en especial en la fagocitosis, la producción y libe- ración de moléculas altamente tóxicas, que auxilian en la lisis y degradación del agente invasor. En ese momento, ocurre un importante aumento en el consumo de oxígeno a nivel intracelular, llamado choque respiratorio o estrés oxidativo, que resulta en la producción de una variedad de radicales libres altamente reactivos de oxígeno conocidos como ROIs (del inglés, reactive oxygen intermediates). Pueden formarse además otros compuestos tóxicos y reactivos como los RNIs (del inglés, reactive nitrogen intermediates). Los ROIs poseen electrones libres o no pareados en su órbita más externa, lo que les confiere una elevada capacidad de reaccionar con y dañar las estructuras y compuestos próximos, tales como las membranas celulares, proteínas y ácidos nucleicos (DNA y RNA) de los patógenos invasores. Siendo así, funcionan como agentes microbicidas potentes, destruyendo o inhibiendo el crecimiento de los invasores. La producción de esos radicales está ligada a la activación de un complejo enzimático denominado NADPH oxidasa, localizado en la membrana celular y en la superficie de los gránulos lisosomales (Fig. 6.4.1). Este complejo es activado por componentes microbianos, tales como los lipopolisacáridos (LPS), lipoproteínas de bacterias y β-glucanos de hongos (Bogdan et al., 2000). La - activación de esta enzima resulta en la reducción del oxígeno molecular al anión superóxido (O2 ). Este compuesto tóxico y microbicida puede dismutarse, espontáneamente o a través de la enzima intracelular superóxido dismutasa (SOD), en peróxido de hidrogeno (H2O2). El H2O2 es un compuesto igualmente tóxico y, si no es destruido por la catalasa del peroxisoma, puede difundirse y llegar al - medio extracelular. El O2 puede también ser convertido en otros componentes citotóxicos, como en el radical hidroxilo (OH.) y en aniones hidroxilo (OH-) por la reacción de Haber-Weiss o, luego de 1 la dismutación en H2O2, en ácido hipocloroso (HOCl), oxígeno singlet ( O2) y en cloraminas por la acción de la mieloperoxidasa (MOP) (Bogdan et al., 2000; Abele y Puntarulo, 2004) (Fig. 6.4.1). Cabe resaltar que todas estas moléculas son químicamente muy inestables y su decaimiento espontáneo ocurre en fracciones de segundo. Es importante destacar que la producción de estas moléculas altamente tóxicas, aunque muy inestables e importantes en la destrucción de los patógenos invasores, puede también provocar graves daños a los tejidos del hospedero. Para evitar esta autoagresión, el hospedero cuenta básicamente con tres mecanismos de protección o defensas antioxidantes. Los primeros dos mecanismos son en- dógenos e incluyen la presencia de enzimas antioxidantes intracelulares, como la SOD, la catalasa y la glutationa peroxidasa, capaces de degradar/neutralizar a las ROIs y, también las enzimas de repa- ración que pueden restablecer los daños provocados por las ROIs en el DNA, membranas y proteínas del hospedero (Abele y Puntarulo, 2004). El tercer mecanismo comprende la acción de compuestos antioxidantes de origen exógeno, como el ácido ascórbico (vitamina C), la glutationa y el α-tocoferol

258 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

(vitamina E), que pueden interactuar directamente con los radicales libres neutralizándolos (Abele y Puntarulo, 2004). Es conveniente resaltar que los antioxidantes de origen exógeno, asumen especial importancia en los cultivos de camarones, una vez que pueden ser adicionados a las dietas en dosis apropiadas. La producción in vitro de ROIs por los hemocitos inmunoestimulados por componentes microbianos, ya fue descrita en varios camarones penaeidos, como en P. monodon (Song y Hsieh, 1994; Sung et al., 1994), L. vannamei (Muñoz et al., 2000; Campa-Córdova et al., 2002a), Litopenaeus setiferus (Rosas et al., 2004) y en las especies nativas brasileñas, F. paulensis y L. schmitti (Guertler et al., 2010). La cuantificación in vitro de la producción del anión superóxido por los fagocitos puede ser realizada a través del método de reducción del NBT (del inglés, nitroblue tetrazolium), o por la técni- ca de la quimioluminiscencia. Esta evaluación permite determinar el grado de estrés oxidativo de los animales, como consecuencia de diferentes factores de estrés como infecciones, destacándose como un valioso inmunoparámetro para la determinación del estado inmunológico de los camarones. La producción del anión superóxido también viene siendo muy utilizada en los camarones para evaluar el efecto de substancias consideradas inmunoestimulantes, como los β-glucanos de hongos y los polisacáridos sulfatados (PS) de algas, que pueden ser adicionados a la dieta (Fu et al., 2007; Cantelli, 2009), o en el agua a través de baños de inmersión (Campa-Córdova et al., 2002a y b; Chang et al., 2003), o también administrados en forma de inyección (Hou y Chen, 2005; Cantelli, 2009). Un estudio del nuestro grupo, demostró que juveniles de L. vannamei alimentados por 1 mes con balanceado adicionado con PS de alga Gracillaria birdiae podría aumentar la producción intrace- - lular del anión superóxido (O2 ) y aumentar la tasa de sobrevivencia (11%) de camarones infectados con una baja carga viral de WSSV (Cantelli, 2009). Además de las ROIs, los hemocitos de los crustáceos pueden también producir intermediarios reactivos de nitrógeno o RNIs, como el óxido nítrico (NO) y el radical peroxinitrito (ONOO-), compuestos altamente citotóxicos y microbicidas (Abele y Puntarulo, 2004; Palumbo, 2005; Gao, 2009). La producción del gas NO tiene origen en la enzima óxido nítrico sintasa o NOS (del inglés, nitric oxide synthase), presente en el citoplasma de varios tejidos animales, incluyendo las células del sistema inmunológico. En estas últimas, la NOS es inducida por situaciones de estrés (iNOS) y produce NO. En los otros tejidos, la NOS es expresada de forma constitutiva. La NOS es capaz de generar NO a partir del aminoácido L-arginina y del oxígeno molecular. Una vez producido, el NO puede - reaccionar con el O2 originado durante el choque respiratorio y formar el peroxinitrito (ONOO ) que también es altamente tóxico (Abele y Puntarulo, 2004; Gao, 2009) (Figura 6.4.1). En los vertebrados, están bien documentadas las actividades antivirales, antibacterianas y antiparasitarias de las RNIs, que igual que las ROIs causan daños al DNA, a varias enzimas y a las membranas de los patógenos, directa o indirectamente (Palumbo, 2005; Gao, 2009). En crustáceos existen todavía pocos estudios a este respecto, pero algunos trabajos más recientes vienen apuntando al importante papel de los RNIs en la defensa antimicrobiana. Entre estos, un trabajo que investigó la producción de NO en los hemocitos de camarones F. chinensis y M. japonicus después del desafío con WSSV (Jiang et al., 2006). Los autores observaron que hubo un aumento evidente de la producción de NO en los hemocitos de M. japonicus desafiados, pero no en F. chinensis donde el aumento de la producción de NO fue mucho menos acentuado y de corta duración. Además, camarones de la especie F. chinensis murieron mucho más rápidamente que los de la especie M. japonicus después del desafío con WSSV. Los autores especularon que las diferencias de susceptibilidad de ambos penaeidos a WSSV podría deberse a la diferencia de actividad de las NOS de los hemocitos de ambas especies. Interesantemente, dos NOS fueron muy recientemente

259 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Figura 6.4.1: Producción de especies reactivas de oxígeno (ROIs) y nitrógeno (RNIs) por los hemocitos de crustáceos durante el proceso de fagocitosis y otras reacciones celulares. CAT: catalasa; iNOS: óxido nítrico sintasa inducible; SOD: superóxido dismutasa. Las especies reactivas tóxico-microbicidas están representadas en rojo. clonadas a partir de los hemocitos de la langosta Panulirus argus (Rodríguez-Ramos et al., 2010) y de las branquias de M. japonicus (Inada et al., 2010). La expresión de ambas enzimas fue inducida des- pués de inyección con LPS (en los hemocitos de langosta) y con Vibrio penaeicida (en las branquias de camarones), sugiriendo una vez más que esta enzima esté implicada en la defensa antimicrobiana de crustáceos. Es importante resaltar que la utilización de la producción de RNIs como inmunoparámetros para evaluar el estado inmunológico de los camarones de cultivo, es una herramienta todavía muy poco utilizada, a pesar de su potencial promisorio. Se espera que estos resultados recientes estimu- len en un futuro próximo una mayor utilización de este parámetro como indicador de salud y/o de inmunoestimulación.

Péptidos antimicrobianos (AMPs) Los péptidos antimicrobianos o AMPs (del inglés, antimicrobial peptides) son componentes esenciales del sistema inmune innato ampliamente distribuidos entre los diferentes reinos de los seres vivos, siendo encontrados desde bacterias hasta en plantas y animales (vertebrados e invertebrados). Esas moléculas pueden presentar una actividad microbicida rápida y potente contra un amplio espectro de microorganismos, incluyendo bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, hongos filamentosos, levaduras y en algunos casos también contra protozoarios y virus envueltos (Guaní-Guerra et al., 2010). Los AMPs fueron inicialmente identificados en la hemolinfa de la mariposa Hyalophora cecropia (Steiner et al., 1981) y desde entonces, más de mil diferentes péptidos han sido aislados y caracterizados en los más variados organismos (Smith et al., 2010). Esos efectores son clásicamente descritos como moléculas anfipáticas y catiónicas de bajo peso molecular (<10 kDa, entre 15-100 residuos de aminoácidos). La gran mayoría de los AMPs son productos génicos transcritos y traducidos por las células sanguíneas y epiteliales (mucosas) que están potencialmente expuestas a microorganismos. Sin embargo, otros grupos de moléculas antimicrobianas que no presentan las características

260 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón de los AMPs clásicos fueran también descritos, como péptidos aniónicos, proteínas mayores que 10 kDa y péptidos generados a partir de la hidrólisis de una proteína precursora multifunctional (Yount et al., 2006). El mecanismo de acción de los AMPs se manifiesta generalmente a nivel de la membrana del microorganismo, provocando su desestabilización. Presentan en general una actividad detergente o formadora de poros, a través de la interacción electrostática con los fosfolípidos aniónicos de la membrana celular, llevando a un desequilibrio de sus funciones. Eso se debe a sus características anfipáticas, presentando una región altamente catiónica y una región hidrofóbica, lo que facilita su interacción e inserción en las membranas de los microorganismos. Es importante señalar que fosfolí- pidos aniónicos son característicos de los microorganismos, en especial de las bacterias, y no son comúnmente encontrados en la superficie de las células eucariotas normales y organismos pluricelulares. También pueden insertarse en la bicapa lipídica, formando grandes poros, lo que lleva a un flujo descontrolado de solutos y extravasión del contenido citoplasmático, resultando en la muerte del microorganismo (Bulet et al., 2004; Yount et al., 2006). Otras clases de AMPs pueden ser interio- rizadas e interferir con diferentes vías metabólicas esenciales al ciclo de vida de los microorganismos (Yount et al., 2006). A la fecha, 15 distintas familias de AMPs fueran identificadas en crustáceos y fueron recientemente clasificadas en cuatro diferentes grupos de acuerdo con sus características estructurales y com- posición aminoacídica: (1) péptidos α-hélice linear anfipáticos y péptidos ricos en un tipo particular de aminoácido, (2) péptidos contiendo uno o más puentes de cisteína, (3) péptidos con múltiplos dominios moleculares y (4) péptidos non convencionales, incluyendo proteínas multifuncionales y fragmentos peptídicos generados a partir de la hidrólisis de proteínas precursoras (Rosa y Barracco, 2010). Por cuestiones de interés económico, las tres familias de AMPs mejor conocidas en crustáceos fueron principalmente caracterizadas en camarones penaeidos: peneidinas, crustinas y los factores anti-lipopolisacáridos (ALFs) (Rosa y Barracco, 2010; Tassanakajon et al., 2010) (Tabla 3).

Tabla 3: Familias de péptidos antimicrobianos (AMPs) expresadas en los hemocitos de camarones penaeidos.

AMP Actividad antimicrobiana Estructura

ALF Bacterias Gram+, Gram- y hongos filamentosos

Crustina Bacterias Gram+ y Gram- nd

Peneidina Bacterias Gram+ y hongos filamentosos

Stilicina Hongos filamentosos nd

nd: no determinada 261 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Las peneidinas (5 a 8 kDa) son péptidos con múltiples dominios inicialmente aislados y caracterizados a partir de la hemolinfa del camarón L. vannamei. Son moléculas altamente catiónicas, compuestas por una región N-terminal rica en residuos de prolina y una región C-terminal conteniendo seis residuos de cisteína, unidos por tres puentes disulfídicos (Destoumieux et al., 1997; Yang et al., 2003) (Tabla 3). Las peneidinas son AMPs exclusivos de camarones penaeidos y están subdivididas en cuatro subgrupos (PEN2, PEN3, PEN4 y PEN5), siendo que cada una contiene varias isoformas distintas (Cuthbertson et al., 2002; Gueguen et al., 2006; Kang et al., 2007). El subgrupo PEN1, inicialmente aislado de la hemolinfa de L. vannamei (Destoumieux et al., 1997), fue posteriormente clasificado como una variante del subgrupo PEN2 (Cuthbertson et al., 2002). Interesantemente, los subgrupos PEN2 y PEN4 fueron encontrados apenas en camarones occidentales mientras que lo subgrupo PEN5 es exclusivo de camarones asiáticos (Tassanakajon et al., 2010). Las peneidinas son expresadas constitutivamente en los hemocitos granulares y semigranulares donde son almacenadas en sus gránulos (Destoumieux et al., 2000). Las peneidinas presentan una actividad potente contra bacterias Gram-positivas y hongos filamentosos (Destoumieux et al., 1999). Además, los diferentes subgrupos pueden presentar actividades antimicrobianas distintas (Cuthbertson et al., 2008). Algunas isoformas de peneidina tienen todavía un motivo molecular de unión a la quitina en su región C-terminal, que también es encontrado en algunas lectinas de plantas y en varios péptidos anti fúngicos (Destoumieux et al., 2000). Las crustinas (7 a 14 kDa) son también AMPs con múltiples dominios y fueron inicialmente aisladas de los hemocitos granulares del cangrejo Carcinus maenas (Relf et al., 1999). Esas moléculas antimicrobianas son constitutivamente expresadas en hemocitos y se caracterizan por la presencia de un dominio WAP (del inglés, whey acidic protein) en su región C-terminal (Smith et al., 2008). “WAP” es una familia general de proteínas normalmente encontradas en la leche de mamíferos con posible función de inhibir a las proteasas (Ranganathan et al., 1999). Basado en sus características estructurales, las crustinas fueron categorizadas en tres principales tipos (crustinas de Tipo I, II y III) (Smith et al., 2008). Las crustinas de Tipo I son compuestas por una región rica en residuos de cisteína antes del domino WAP y pueden ser encontradas en camarones (Dai et al., 2009; Sun et al., 2010), mas son especialmente frecuentes en cangrejos y langostas (Smith et al., 2008; Rosa y Barracco, 2010). Por otro lado, el Tipo II presenta además de esos dominios una región N-terminal rica en residuos de glicinas y es más frecuente en camarones penaeidos (Tassanakajon et al., 2014). Las crustinas de Tipo III, también conocidas como proteínas single-whey domain (SWD), presentan apenas una pequeña región N-terminal rica en residuos de prolina/arginina y la región C-terminal contiendo el dominio WAP. Esas crustinas son encontradas en camarones penaeidos y en el cangrejo del río (Smith et al., 2008). La actividad antimicrobiana de los distintos tipos de crustinas abarca esencialmente bacterias Gram-positivas, pero también algunos vibrios marinos (Smith et al., 2008; Rosa y Barracco, 2010). Además de sus actividades antimicrobianas, las crustinas de Tipo III también mostraran una actividad antiproteasa fuerte (Rosa y Barracco, 2010). Durante los procesos inflamatorios, esas moléculas pueden ejercer un papel fundamental en la inactivación de las proteasas producidas por los microorganismos invasores o en la regulación de cascadas proteolíticas endógenas del hospedero, como del sistema proPO (ver abajo). Los factores anti-lipopolisacáridos o ALFs (del inglés, anti-lipopolysaccharide factors) son mo- léculas de aproximadamente 10 kDa, inicialmente aisladas de limúlidos (Tanaka et al., 1982). En camarones, los ALFs fueron primeramente identificados por biología molecular (Gross et al., 2001; Supungul et al., 2002) y mostraron contener dos residuos conservados de cisteína comprometidos en la formación de una estructura terciaria en forma de grapa (β-hairpin) como en los ALFs de limúlidos (Yang et al., 2009) (Tabla 3). Basado en sus características moleculares y estructurales, los ALFs de camarones fueron categorizados en cuatro grupos: ALF Group A, B, C y D (Rosa et al., 2013). El ALF

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Group B es el más catiónico, mientras que el ALF Group D es el más aniónico. De forma interesante, los ALFs aniónicos son encontrados apenas en camarones occidentales mientras que los otros grupos son encontrados en camarones occidentales y asiáticos (Rosa et al., 2013). Los ALFs son moléculas constitutivamente expresadas en los hemocitos granulares y presentan una actividad antimicrobiana potente y de amplio espectro, siendo activas contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (incluyendo patógenos de camarones), hongos filamentosos y también virus humanos envueltos (Tassa- nakajon et al., 2014). Su actividad antimicrobiana está asociada a su propiedad de unirse al LPS y al ácido lipoteicoico (LTA), componentes de la superficie de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, respectivamente (Somboonwiwat et al., 2008). De forma interesante, los ALFs aniónicos no son capaces de unirse al LPS y tampoco presentan actividad antimicrobiana (Rosa et al., 2013). Además de estos tres principales AMPs, una nueva familia de AMPs, llamada stilicina (8,9 kDa), fue recientemente identificada en camarones penaeidos. En contraste a los otros AMPs, las stilicinas son péptidos aniónicos compuestos por una región N-terminal rica en residuos de prolina/ arginina y una región C-terminal conteniendo trece residuos de cisteína (Rolland et al., 2010). Como los otros péptidos de camarones, las stilicinas son expresadas constitutivamente en los hemocitos. Esos AMPs presentan una actividad potente contra hongos filamentosos y la capacidad de unirse a los LPS (Rolland et al., 2010). En adición a las familias de AMPs constitutivamente producidas en los hemocitos, otros grupos de moléculas antimicrobianas, como proteínas multifuncionales y péptidos originados a partir de la hidrólisis de proteínas precursoras, también fueron encontrados en camarones. Entre éstos se destacan las histonas y sus fragmentos (Patat et al., 2004) y péptidos derivados de la proteína plasmática hemocianina (Destoumieux-Garzón et al., 2001). Las diferentes histonas (y fragmentos relacionados) presentan actividad contra bacterias Gram-positivas, mientras que los fragmentos de hemocianina (de características aniónicas) presentan una actividad restringida a los hongos filamentosos. La expresión de las peneidinas, crustinas y ALFs se inician en las primeras fases del desarrollo ontogenético de los camarones (nauplios, zoea y mysis) (Muñoz et al., 2003; Jiravanichpaisal et al., 2007; Tassanakajon et al., 2010). Además, en los hemocitos de adultos, esas moléculas se presentan en grandes cantidades, cerca de 20% de todas las secuencias transcritas (Gross et al., 2001; Supungul et al., 2002; Robalino et al., 2009). Durante infecciones causadas por diferentes tipos de patógenos, ocurre la modulación de la expresión de diferentes familias de AMPs (Bachère et al., 2004; de la Vega et al., 2007; Robalino et al., 2007a; Rosa y Barracco, 2010). En camarones desafiados con bacterias Gram-negativas del género Vibrio, por ejemplo, ocurre una disminución significativa de los niveles de expresión de peneidinas, crustinas y stilicinas en las primeras horas luego de la inyección. Esta disminución es seguida por el retorno a los niveles basales de esas moléculas luego de 12 horas y por un aumento significativo en los niveles de expresión luego de 72 horas de inyección, sugiriendo, una inducción tardía de estas moléculas durante las infecciones (de Lorgeril et al., 2008). Sin embargo, en camarones susceptibles a infecciones por el hongo Fusarium solani, la expresión de los AMPs disminuye fuertemente (Gonçalves et al., 2014). Fue también demostrado, que en las primeras horas de la infección, cuando el nivel de expre- sión de las peneidinas disminuye drásticamente, ocurre simultáneamente un aumento en sus concentraciones plasmáticas (Destoumieux et al., 2000). Se cree que este aumento sea proveniente de la liberación de estos AMPs por los hemocitos que se encuentran próximos a los sitios de infección (Bachère et al., 2004). Por otro lado, la expresión de ALFs parece mostrar una cinética contraria a las otras dos familias de AMPs de crustáceos. En distintas especies de camarones, los niveles de expre- sión de ALFs aumentan significativamente en las primeras horas luego de una infección con Vibrio y vuelven a sus niveles basales cerca de 48 horas después del inicio del proceso inflamatorio (Supungul et al., 2004; de Lorgeril et al., 2008).

263 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

El papel in vivo de algunos AMPs de camarones fue recientemente investigado vía el RNAi (ver abajo). El silenciamiento de la crustina en el camarón L. vannamei resulta curiosamente en un aumento significativo de su susceptibilidad a infecciones con la bacteria Gram-negativa V. penaeicida, pero no con el hongo F. oxysporum (Shockey et al., 2009). Por otro lado, en esa misma especie de camarón, el ALF parece estar implicado en las defensas contras las dos enfermedades (de la Vega et al., 2008). Es importante resaltar que la presencia de diferentes familias de AMPs en crustáceos, junto a la ocurrencia de innumerables isoformas de un mismo subgrupo, probablemente con actividades antimicrobianas distintas, sugiere una actuación sinérgica de estas diferentes moléculas inmunoefectoras, que pueden así eliminar un amplio espectro de agentes patógenos simultáneamente (Rosa y Barracco, 2010).

Sistema de activación de la pro-fenoloxidasa (proPO) Como se dijo anteriormente, la formación de nódulos y cápsulas hemocíticas en crustáceos es frecuentemente acompañada por una reacción de melanización en la región más central. La melani- zación es también observada durante la cicatrización de heridas, donde la coagulación de la hemolinfa y la migración de los hemocitos al lugar de la lesión permiten la formación de un tapón celular hasta que una nueva cutícula sea reconstituida (Jiravanichpaisal et al., 2011). La biosíntesis de la melanina en los artrópodos es un proceso complejo que comprende una serie de reacciones químicas en cascada, denominadas “sistema de activación de la pro-fenoloxidasa o sistema proPO” (Figuras 6.4.2 y 6.4.3). Este sistema está compuesto por varios zimógenos de proteasas, por la pro-fenoloxidasa, por inhibidores de proteasas, además de proteínas asociadas de reconocimiento de patrón o PRPs y proteínas de señalización y amplificación (Cerenius et al., 2010; Amparyup et al., 2013). El sistema proPO es reconocido como una de las principales respuestas inmunoefectoras de los crustáceos desencadenada por componentes de la superficie de microorganismos, como los LPS de bacterias Gram-negativas y los β-1,3-glucanos de hongos (Jiravanichpaisal et al., 2006; Amparyup et al., 2013). Durante las infecciones, estos compuestos se unen a receptores de los hemocitos granulares directamente o a través de las PRPs presentes en el plasma e inducen su activación. Una vez activados, ocurre la degranulación y/o lisis de los hemocitos con la liberación de varias moléculas inmunoefectoras, entre las cuales están las moléculas del sistema proPO. Una vez liberadas, ocurre la activación de este sistema por los propios componentes de los microorganismos presentes en la hemolinfa. La presencia del sistema proPO y de algunas moléculas asociadas en los hemocitos granulares (HGPs y HGGs) fue especialmente estudiada en el cangrejo de río P. leniusculus (Jiravanichpaisal et al., 2006), y también en varios camarones como P. monodon (Kondo et al., 1992), Farfantepenaeus californiensis (Hernández-López et al., 1996), L. stylirostris (Le Moullac et al., 1997), F. paulensis (Pe- razzolo y Barracco, 1997) y L. vannamei (Lai et al., 2005). Análisis moleculares y bioquímicas de la proPO de crustáceos revelaron que esta proteína (76-78 kDa) presenta similitud con la hemocianina, una vez que las dos presentan sitios de unión para el cobre (Jiravanichpaisal et al., 2006). Además de ello, las proPOs de camarones presentan una región tiol-éster (GCGWPRHM), como las proteínas C3 y C4 del sistema del complemento de los vertebrados y las α2-macroglobulinas (Aspán et al., 1995; Sritunyalucksana et al., 1999a; Lai et al., 2005; Liu et al., 2006). La activación de la forma inactiva o proPO hacia la enzima activa o fenoloxidasa (PO), ocurre por la acción de serino-proteasas denominadas enzimas activadoras de la proPO o PPAEs (del inglés, proPO-activating-cascade enzymes), iniciando una cascada proteolítica cuyo producto final es la melanina (Fig. 6.4.3). En crustáceos, una PPAE llamada ppA fue purificada (Aspán y Söderhäll, 1991) y posteriormente clonada (Wang et al., 2001) en los hemocitos de P. leniusculus. La ppA es sintetizada

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y mantenida como un zimógeno (pro-ppA) en los hemocitos, siendo activada luego de su exocitosis, como consecuencia de una lesión o infección microbiana. Su activación ocurre por un clivaje pro- teolítico, por parte de una proteasa aún desconocida (Amparyup et al., 2013). La forma activa PO es una óxido reductasa que cataliza dos reacciones sucesivas: la primera, de hidroxilación de un monofenol a ο-difenol (actividad monofenoloxidásica) y, la segunda, de oxida- ción del ο-difenol a ο-quinona (actividad difenoloxidásica) (Fig. 6.4.2). La producción de o-quinonas resulta en la síntesis de la melanina a través de una cascada de reacciones químicas intermedias, siendo la mayoría espontánea, no mediadas por enzimas (Fig. 6.4.3). La producción de quinonas lleva también a la esclerotización de la cutícula de los crustáceos, fenómeno esencial en los períodos de muda (Jiravanichpaisal et al., 2006; Vavricka et al., 2010). Con relación al papel inmunológico del sistema proPO, se conoce que ésta vía genera transitoriamente moléculas altamente tóxicas, como las quinonas, hemiquinonas (Figura 6.4.3) y radicales libres de oxígeno (ROIs), una vez que ocurre el consumo de oxígeno molecular, que llevan a una des- trucción de los patógenos invasores, mas también pueden dañar los tejidos del hospedero. El pigmen- to oscuro e insoluble o melanina parece tener una actividad fungistática (Cerenius y Söderhäll, 2004) y puede todavía funcionar como “scavenger” de radicales libres (Nappi y Vass, 1993; Vavricka et al., 2010), minimizando así los efectos deletéreos de estas moléculas altamente tóxicas para el organismo del hospedero. Debe ser resaltado que la melanina, per se, no es la molécula inmunoefectora más importante durante la activación del sistema proPO, siendo los compuestos citotóxicos intermedios los más efectivos (Nappi y Vass, 1993; Vavricka et al., 2010). De esta manera, la melanización representa, más específicamente, el final de un potente proceso inmunoefector.

Figura 6.4.2: Liberación de diferentes efectores inmunológicos y moléculas inmunoreguladoras, después de la acti- vación de los hemocitos por patógenos. Todavía no está confirmado si la TGase es liberada por hemocitos granulares o hialinos.

265 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Cabe resaltar que concomitante con la liberación de los componentes del sistema proPO, otras varias molé- culas son también exocitadas por los hemocitos inmunoestimulados. Una de ellas es la peroxinectina (76 kDa) que es una peroxidasa, homologa a la mieloperoxidasa humana y que actúa en la adhesión celular manteniendo también su actividad peroxidásica. Esta proteína gana su actividad biológica concomi- tantemente a la activación del sistema proPO en el plasma y promueve el encapsulamiento de parásitos, luego de unirse al receptor SOD de la membrana de los hemocitos, mencionado anteriormente (Jiravanichpaisal et al., 2006). Por otro lado, la peroxinectina induce además una fuerte degranula- ción de los hemocitos, llevando a la liberación de más compuestos inmunoefectores y consecuentemente a una acentuada amplificación de la respuesta inmunológica del hospedero. Otras moléculas son también exocitadas durante la activación he- mocítica, como la enzima transglutaminasa (TGasa) que induce el proceso de coagulación, algunos inhibidores de proteasas, PRPs como la “mas-like”, AMPs y otras moléculas inmunoefecto- Figura 6.4.3: Reacción de melanización en crustáceos. A: Herida ras/inmunoreguladoras (Bachère et al., melanizada (flecha) en el camarón Farfantepenaeus paulensis; B: Principales pasos de la biosíntesis de melanina desencadenados 2004; Jiravanichpaisal et al., 2006). por la enzima fenoloxidasa (PO) en presencia de substratos fenóli- La activación del sistema proPO cos (adaptado de Nappi y Vass, 1993). debe ser estrictamente regulada para evitar una activación/melanización no deseada o generalizada en el organismo del crustáceo, evitando así los daños a los tejidos del cama- rón. Para eso, los animales poseen inhibidores de proteasas en el plasma y/o hemocitos. Entre ellos podemos destacar la pacifastina, los inhibidores de la familia Kazal, la serpina y la α2-macroglobulina (Jiravanichpaisal et al., 2006; Cerenius et al., 2010; Amparyup et al., 2013). El inhibidor más eficiente de la ppA del cangrejo de río, es la pacifastina (Jiravanichpaisal et al., 2006; Cerenius et al., 2010). Esta molécula pertenece a una nueva clase de inhibidores de serino proteasas denominada “pacifastina-like”, que también regulan el sistema proPO de insectos (Simonet et al., 2002). Otro importante inhibidor de proteasas en crustáceos es la proteína plasmática α2-macroglobulina (α2M), que es constitutivamente sintetizada por los hemocitos de estos animales. La α2M es un inhibidor de proteasas de amplio espectro (serino, aspartato, cisteína y métalo-proteasas) que inhibe tanto las proteasas del propio hospedero, como aquellas producidas por el patógeno durante el proceso infeccioso. Una característica fundamental de estos inhibidores es la presencia en la molécula de una región tiol-éster,

266 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón como ocurre en las proteínas C3 y C4 del sistema del complemento de los vertebrados y en la proPO como fue mencionado arriba (Jiravanichpaisal et al., 2006; Amparyup et al., 2013). La α2M de los crustáceos es una glicoproteína que fue aislada y caracterizada en los camarones L. vannamei (Góllas-Galván et al., 2003) y F. paulensis (Perazzolo et al., 2011). La secuencia codificante para la α2M de penaeidos fue determinada en M. japonicus, P. monodon, L. vannamei, L. schmitti y F. paulensis (Rattanachai et al., 2004; Lin et al., 2007; 2008; Rosa et al., 2008). El papel inmunomodulador de la α2M en los crustáceos, todavía no está bien establecido. Análisis de la ex- presión génica de la α2M de crustáceos a través de la técnica de PCR en tiempo real, revelaron que su expresión es aumentada durante infecciones por el virus de la mancha blanca (Tonganunt et al., 2005) o por el hongo Fusarium solani (Perazzolo et al., 2011), y también después del tratamiento de los animales con LPS (Vaseeharan et al., 2007) o PGNs bacterianos (Lin et al., 2007; 2008). Estos hallazgos son relevantes, ya que sugieren que la α2M participa de las respuestas inmunológicas, siendo tal vez capaz de inhibir proteasas de patógenos y/o regular la activación del sistema proPO y sus moléculas tóxicas, minimizando así la agresión del patógeno y/o los daños causados a los tejidos del hospedero.

6.5. Defensas antivirales Como se mencionó anteriormente, las enfermedades virales constituyen actualmente, la más seria amenaza para la industria de la camaronicultura a nivel mundial y el principal riesgo para la sostenibilidad de la actividad. Más de veinte diferentes enfermedades virales han sido descritas hasta el momento, en peneídos marinos y camarones de agua dulce (Bonami, 2008), siendo que las de mayor impacto están notificadas por la Organización Mundial de Salud Animal (OIE). La primera enfermedad viral que afectó seriamente la industria del camarón, ocurrió en las Américas a inicios de los años 80, causada por el virus de la necrosis infecciosa hipodérmica y he- matopoyética o IHHNV (del inglés infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus), también conocido como densovirus de Penaeus stylirostris (PstDNV) (Tattersall et al., 2005), y que resultó en mortalidades masivas. Otros brotes graves de enfermedades virales siguieron al IHHNV, destacándose el virus de la cabeza amarilla o YHV (del inglés, yellow head virus) en Asia, el virus del síndrome del Taura o TSV (del inglés, Taura síndrome virus) en las Américas y por fin el surgimiento del virus del sín- drome de la mancha blanca o WSSV (del inglés, white spot síndrome virus) que alcanzó proporciones catastróficas principalmente en Asia (a inicio de los años 90) y seguidamente en las Américas (al final de los años 90) (Lightner, 2011; Flegel, 2012). El WSSV se tornó el virus más desastroso de la historia de la camaronicultura a nivel mundial, causando un índice elevado y persistente de mortalidad que ha llevado y todavía lleva a pérdidas económicas incalculables. En el año 2002, una nueva enfermedad fue relatada en juveniles y sub adultos de L. vannamei cultivados en el Nordeste brasileño, con señales de necrosis muscular progresiva y que llevaban a una mortalidad acumulada de 40 a 70% (Nunes et al., 2004). Esa enfermedad fue llamada mionecrosis infecciosa o NIM (del inglés, Infectious myonecrosis) y el agente etiológico fue denominado Virus de la Mionecrosis Infecciosa o IMNV (del inglés, infectious myonecrosis virus) (Lightner et al., 2004). Algunos años después esa virosis fue también encontrada en L. vannamei cultivados en Indonesia (Senapin et al., 2007). Las pandemias causadas por los WSSV y TSV, y en menor escala por los IHHNV, IMNV y YHV, han causado colectivamente perjuicios de billones de dólares a la industria camaronera, con pérdidas relevantes en las cosechas, empleos y el ingreso de exportación (Lightner, 2011; Flegel, 2012). Los impactos sociales y económicos causados por estos patógenos han sido sobresalientes en países cuya actividad camaronera es importante. Siendo así, la contribución más urgente y esperada en la industria de la camaronicultura es indiscutiblemente el control de las infecciones virales.

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En los vertebrados, las infecciones virales inducen a varias respuestas inmunológicas, que en última instancia buscan controlar la multiplicación y propagación de los virus y los daños celulares causados por ellos. Entre estas respuestas se destacan, (1) la destrucción de las células infectadas por los linfocitos NKs (del inglés, natural killer) y linfocitos T citotóxicos (CTLs), (2) la producción de anticuerpos neutralizantes para virus y, (3) la inducción de proteínas del sistema interferón (IFN) que generan un estado antiviral. Además de estos procesos íntimamente ligados al sistema inmune, ocurren otros mecanismos de origen más fisiológico y evolutivamente más antiguos, que asumen gran importancia en la defensa antiviral de los vertebrados y también de los invertebrados. Estos son: (4) el silenciamiento de genes virales por la vía del RNA de interferencia (RNAi), (5) la apoptosis celular y, (6) la autofagia. Como ya se mencionó anteriormente, los crustáceos tienen apenas un sistema inmune innato, y por lo tanto no pueden contar con los dos primeros mecanismos antivirales que son dependientes de la línea celular linfocítica. Los demás mecanismos se indican más adelante (Fig. 6.5.1).

Figura 6.5.1: Esquema representativo de los principales mecanismos celulares antivirales de crustá- ceos.

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Sistema interferón

◆◆ Vertebrados En los vertebrados, los interferones (IFNs) son citocinas conocidas principalmente por su capacidad de interferir en la replicación viral y en inducir un estado antiviral en el hospedero. En la realidad, los IFNs son más que simples proteínas antivirales y ejercen un amplio espectro de otras funciones biológicas, siendo la mayoría relacionada con el sistema inmune. En vertebrados se conocen tres tipos de interferones (Tipo I, II y III), pero solamente los interferones tipo I (IFN-α e IFN-β) son realmente importantes para la defensa antiviral (Samuel, 2001; Donnelly y Kotenko, 2010). La producción de IFN-α/β es inducida por las infecciones virales y estimulan la expresión de una serie de genes participantes en las respuestas antivirales. Durante las infecciones virales, las células del hospedero reconocen PAMPs específicos producidos por los virus a través de cuatro principales tipos de PRPs o PRRs: los TLRs (ya comentados anteriormente), los RLRs (del inglés, Retinoic acid-inducible gene o RIG-I-like receptors), los NLRs (del inglés, nucleotide oligomerization domain NOD-like receptors) y los PKRs (del inglés, RNA-activated protein kinase) (McAllister y Samuel, 2009; Takeuchi y Akira, 2009). Mientras que los TLRs son pro- teínas transmembranas y detectan PAMPs en el espacio extracelular y en las vesículas intracelulares denominadas endosomos, los NLRs, RLRs y PKRs son sensores citosólicos que detectan los PAMPs virales presentes en el citoplasma de la célula hospedera. Los TLRs, RLRs y PKRs son particularmente importantes en el desencadenamiento de la pro- ducción de interferones IFN-α/β, de varias citocinas pro-inflamatorias y en la activación de la apoptosis (Takeuchi y Akira, 2009). Por su parte, los NLRs no inducen la producción de IFN-α/β, pero están relacionados también al proceso inflamatorio y apoptosis (Kanneganti, 2010). Como mencionamos anteriormente, los TLRs de mamíferos son homólogos a la proteína Toll inicialmente identificada enDrosophila y que induce una respuesta inmunológica contra los hongos y bacterias Gram-positivas. Entre los diferentes TLRs, algunos reconocen particularmente PAMPs de virus, siendo el TLR3 uno de los más importantes por reconocer el dsRNA, producido durante la re- plicación de muchos virus de RNA y DNA. Entre los RLRs se destacan las helicasas RIG-1 y MDA5 (del inglés, melanoma differentiation-associated gene 5). Mientras que la RIG-1 reconoce ssRNA 5’trifosfatados y dsRNA de secuencias cortas (hasta 1 kb), el MDA5 reconoce dsRNAs de secuencia larga (>2kb), generados durante la replicación viral (Takeuchi y Akira, 2009). Y finalmente, el reconocimiento de largos dsRNA también es realizado por los NLRs. Luego de la internalización de los virus en la célula de un mamífero, sus ácidos nucleicos son liberados por el sistema endósomo/fagolisósomo y reconocido por los diferentes TLRs. Los TLRs activan una compleja cascada de señalización intracelular, induciendo la transcripción de una variedad de genes, incluyendo los IFN-α/β (Uematsu y Akira, 2006; 2007). Por su parte, los IFN-α/β, desencadenan la activación de múltiples vías intracelulares que interfieren con muchas de las etapas del ciclo de vida de los virus, limitando la amplificación y la diseminación de los virus, atenuando así el proceso infeccioso. Los IFNs secretados participan en la activación de la señalización intracelular JAK/STAT, que resulta en la inducción de múltiples genes que codifican diversas proteínas implicadas en las respuestas antivirales. Entre ellas se destacan la PKR (del inglés, serine/threonin protein kinase), la OAS (del inglés, 2´-5´-oligoadenylate synthetase), la RNase L, la ADAR (del inglés, RNA-specific adenosine desaminase) y la Mx (del inglés, myxovirus-resistance protein GTPase). Estas proteínas afectan principalmente la multiplicación de los virus en la célula infectada, generando un estado antiviral inespecífico en las células del hospedero (Samuel, 2001).

269 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

◆◆ Camarones Hasta muy recientemente las proteínas del sistema IFN eran consideradas moléculas presentes desde los cordados inferiores hasta los mamíferos, no encontrándose en los invertebrados, principalmente en el ramo de los protóstomos que incluye los crustáceos. Además, en los genomas completos disponibles de varios insectos, que están íntimamente ligados a los crustáceos, y del crustáceo branquiópodo Daphnia pulex (McTaggart et al., 2009) no fueron encontradas secuencias génicas homólogas para IFNs. Sin embargo, recientemente la expresión de una proteína homologa al IFN-α de los mamíferos fue reportada por primera vez en un invertebrado, en los hemocitos del penaeido M. japonicus (He et al., 2005). De forma interesante, esta proteína denominada IntlP (del inglés, interferon-like protein; GenBank AY695938) sólo se expresa en camarones supervivientes a la infección por WSSV y no en camarones sanos. La identificación de este producto génico en 2005 provocó gran optimismo, una vezque implicaba en la presencia de un sistema antiviral inespecífico en crustáceos basado en IFN, como en los vertebrados. Los autores produjeron IntlP en un sistema recombinante y mostraron que esta proteína tenía de hecho una actividad antiviral, una vez que confería protección celular contra los efectos citopáticos causados por el virus del pez SGIV (del inglés, Singapore grouper iridovirus). Más recientemente fue relatado que la forma recombinante de la IntlP de M. japonicus, además de una actividad antiviral, también presentaba una actividad antibacteriana contra tres especies de vibrios marinos (Mai et al., 2009). Infelizmente, estos resultados parecen no corresponder a la realidad una vez que en los análi- sis moleculares realizados en nuestro laboratorio fue demostrado que el IntlP corresponde de hecho a una subunidad molecular del complejo proteico ATP sintetasa mitocondrial (cadena β de la porción F0) de ocurrencia universal entre los organismos aeróbicos, y no a una proteína del sistema interfe- rón. Se trata por consiguiente de una proteína expresada constitutivamente, independiente de la presencia de infecciones virales y bacterianas que fue detectada en varios penaeidos (Rosa y Barracco, 2008; Barracco y Rosa, 2009). Siendo así, sus actividades antivirales y antibacterianas parecen muy dudosas. Se debe resaltar, que a pesar de la aparente ausencia de moléculas homólogas a los IFNs de mamíferos en penaeidos, la inducción de un estado antiviral inespecífico fue inequívocamente mostrado en los camarones L. vannamei, un poco antes del reporte de la IntlP por He et al., (2005). En 2004, Robalino et al., demostraron que la inyección de secuencias inespecíficas de dsRNA en camarones, causaba un aumento significativo de su resistencia a la infección por dos virus no relacionados, el TSV y el WSSV. Estos resultados mostraron, por primera vez en crustáceos, la inducción de un estado antiviral inespecífico, independiente de la secuencia de dsRNA inyectada y por tanto muy semejante al estado antiviral producido por los IFNs de mamíferos (Robalino et al., 2004). Poco después, otros autores demostraron que también pequeños RNAs de doble cadena eran capaces de inducir una protección antiviral inespecífica en camarones (Westenberg et al., 2005). Estos resultados, aliados a la reciente demostración de la presencia de receptores Toll en los hemocitos de varios camarones penaeidos llevaron a la suposición natural de la existencia de citocinas semejantes a IFNs en camarones (Harpeni, 2011). Ante estos resultados, es razonable suponer que citocinas análogas y no homólogas a los IFNs de vertebrados, deben de hecho existir en camarones (Figura 6.5.1). y serían las responsables por la producción del estado antiviral inespecífico relatado por los autores citados. La identificación de estas citocinas todavía no descritas en crustáceos, llevará ciertamente a una mayor comprensión de los mecanismos antivirales de los camarones y podrá abrir nuevas perspectivas para la estimulación

270 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón de un estado antiviral general en camarones de cultivo, buscando un mayor control de los brotes de infecciones virales.

Sistema RNA de interferencia (RNAi) Además de inducir al sistema IFN en los vertebrados, el patrón molecular dsRNA viral es tam- bién capaz de desencadenar otras vías intracelulares que también llevan a otras respuestas antivirales. Entre ellas, se destaca el mecanismo de silenciamiento post-transcripcional de genes, conocido por RNA de interferencia o RNAi (Robalino et al., 2007b; Obbard et al., 2009). El RNAi representa un antiguo y bien conservado mecanismo de defensa natural contra virus y transposones, presente en todos los organismos pluricelulares, incluyendo plantas, hongos, protozoários, invertebrados y vertebrados. De manera diferente al sistema IFN, que es inducido inespecíficamente por cualquier secuencia de dsRNA (patrón molecular), la protección antiviral basada en la vía RNAi es secuencia-específica. En animales, este mecanismo fue primeramente descrito en el nematodo C. elegans (Fire et al., 1998), donde fue demostrado que inyecciones de dsRNAs podían silenciar los genes endógenos del gusano, cuyas secuencias transcritas eran complementarias a aquellas de las cadenas del RNA introducido. Posteriormente, se demostró en Drosophila que además del papel fisiológico de regula- ción génica, el RNAi tenía además un importante papel en la defensa antiviral, formando parte del sistema inmune innato de los animales (Li et al., 2002). Mayores informaciones sobre la implicación del sistema RNAi en las respuestas antivirales de los mamíferos e invertebrados se pueden obtener en las revisiones de Obbard et al., (2009), Sabin y Cherry (2013) y Sidahmed et al., (2014). La activación del sistema RNAi de una célula ocurre en el citosol y se inicia por el reconocimiento de dsRNA largos, provenientes de la replicación viral (origen exógena), o regiones de RNA de cadena simples en forma de horquillas (hairpin RNAs o hRNA), de origen endógena, por la ribonu- cleasa Dicer. Esta enzima los fragmenta en pequeños RNAs dúplex (19-25 pb) denominados siRNAs (del inglés, short interfering RNA) en el caso del dsRNA (Aliyari y Ding, 2009) y miRNAs (microRNAs) en el caso del hRNA (Aliyari y Ding, 2009; Castanotto y Rossi, 2009). En el caso de una infección viral, los siRNAs son conocidos también por viRNA (del inglés, viral RNA). Los miRNAs son moléculas producidas en el núcleo en la forma de largos transcriptos primarios conocidos como pri-miRNAs que, a su vez, son fragmentados en pré-miRNAs (70-80 pares de bases) por una RNAsa III nuclear, denominada Drosha (Lee et al., 2003). Los pré-miRNAs formados son entonces exporta- dos al citosol vía exportina-5 para, entonces, ser fragmentados por la RNAsa III citosólica, Dicer, en miRNAs. En conclusión, la Dicer fragmenta dsRNAs presentes en el citosol, sean oriundos de un miR- NA endógeno o de la replicación viral. Conviene recordar que los dsRNA son considerados PAMPs virales y por lo tanto la Dicer se comporta, en ese caso, como una PRP para virus. Los pequeños RNAs resultantes del clivaje por la Dicer son incorporados al complejo multi- proteico de silenciamiento inducido por RNA o RISC (del inglés, RNA-induced silencing complex) que llevará a la degradación específica o a la represión de la traducción del RNAm con regiones complementarias a la secuencia del dsRNA/hRNA desencadenante (Castanotto y Rossi, 2009). De forma resumida se puede decir que después de la asociación de los siRNAs/miRNAs al RISC citosólico, sus dos cadenas serán separadas y la cadena anti sentido (o secuencia guía) será utilizada como molde por el RISC para encontrar y degradar el RNAm-blanco de secuencia complementaria (Fig. 6.5.1). El núcleo catalítico del RISC (AGO2) es miembro de una familia altamente conservada de proteínas, denominado argonauta (Liu et al., 2004). Los pequeños RNAs dúplex son producidos por diferentes enzimas Dicers (Dcr1 y Dcr2), que actúan predominantemente con distintos argonautas (AGO1 y AGO2) (Förstemann et al., 2007). Estudios recientes, no obstante, demuestran algún tipo de cross talk entre esas vías (Okamura et al, 2011).

271 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Aunque los miRNAs sean reconocidos por participar en el silenciamiento pos-transcripcional en el citoplasma, también se demostró con evidencias que algunos miRNAs regulan la expresión génica, vía transcripción, a nivel nuclear. El silenciamiento génico dirigido por los pequeños RNAs puede ocurrir bajo dos formas: (i) represión de la traducción en el citosol, mecanismo conocido por silenciamiento génico pos transcripcional o PTGS (del inglés, post-transcriptional gene silencing), o (ii) represión de la transcripción en el núcleo, conocido por silenciamiento génico transcripcional o TGS (del inglés, transcriptional gene silencing) (Castanotto y Rossi, 2009; Moazed, 2009). El PTGS resulta en la degradación del RNAm-blanco en el citoplasma, sin causar daños a la transcripción nuclear del gene correspondiente y puede ocurrir a través de dos mecanismos: por clivaje directa de la secuencia-específica del RNA o por la represión de la traducción y degradación del RNA (Castanotto y Rossi, 2009). Clivajes directas de secuencias específicas ocurren cuando el RNAm- blanco es perfectamente complementario al siRNA y su degradación se da inmediatamente después de la clivaje sitio-específica por la RISC. Por otro lado, la represión de la traducción y degradación del RNA ocurre cuando la secuencia guía del miRNA (en los nucleótidos 2 a 8 de la extremidad 5’) posee apenas una complementariedad parcial al RNAm-blanco llevando a un emparejamiento incompleto entre la secuencia guía y el RNAm. Ese emparejamiento parcial bloquea la traducción y promueve la degradación del RNAm en regiones electrodensas del citosol, denominadas cuerpos P (Castanotto y Rossi, 2009). Conviene señalar que ese mecanismo es utilizado específicamente por los miRNAs. El TGS es un mecanismo de silenciamiento hace poco comprendido, pero a diferencia del PTGS, actúa a nivel nuclear y no directamente sobre la molécula de RNAm. El TGS promueve alteraciones en la estructura de la cromatina inhibiendo la transcripción de genes específicos, habiendo sido inicialmente descubierto en plantas, donde pequeños RNAs producidos de transgenes promo- vían la metilación de secuencias homólogas de DNA endógeno y de histonas (Alló y Kornblihtt, 2010). Posteriormente el TGS fue también detectado en levaduras, células de mamíferos (Alló y Kornblihtt, 2010), Drosophila y C.elegans (Moazed, 2009).

◆◆ Camarones En lo que se refiere al papel antiviral del RNAi, la primera evidencia de la existencia de una defensa antiviral específica en camarones fue demostrada por Robalinoet al., (2005) en L. vannamei. Los autores mostraron que después de inyectar secuencias específicas de dsRNA de proteínas virales (WSSV o TSV) había una protección antiviral prácticamente completa contra infecciones por estos virus (Robalino et al., 2005). De manera semejante, secuencias específicas de dsRNA fueron también capaces de suprimir la replicación del virus YHV en células en cultivo de P. monodon (Tirasophon et al., 2005). Con base en estos resultados, se volvió evidente que el mecanismo antiviral modulado por RNAi ocurría efectivamente en camarones y su eficiencia y especificidad fueron claramente demostradas. Mayores informaciones sobre la implicación del sistema RNAi en las respuestas antivirales en los camarones se pueden obtener en la revisión de Labreuche y Warr (2013). Muchos estudios han sido realizados para identificar los principales componentes de la vía RNAi en camarones, siendo que algunos de los genes que codifican para proteínas-llave, como Dicer y argonauta, ya fueron identificados y clonados en varios peneidos (ver revisión de Labreuche y Warr, 2013), como en P. monodon (Unajak et al., 2006; Dechklar et al., 2008; Su et al., 2008) y L. vannamei (Labreuche et al., 2010; Yao et al., 2010; Chen et al., 2011). Es importante señalar que el trabajo de Robalino et al., (2005) fue el primero en demostrar que la inducción del sistema RNAi en camarones puede darse por vía sistémica, o sea, por la inyección de dsRNA. La incorporación del dsRNA por las células y el fenómeno de propagación sistémica del silenciamiento ya fue confirmado enC. elegans y D. melanogaster y parece estar ligado a dos mecanismos distintos: (a) transferencia del dsRNA al citosol por un canal proteico transmembrana denominado

272 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

SID-1 (del inglés, systemic interference defective) y (b) endocitosis del dsRNA, utilizando receptores del tipo scavengers de reconocimiento patrón (Huvenne y Smagghe, 2010). La propagación sistémica del efecto RNAi en camarones es todavía un fenómeno no comprendido. No obstante, muy recientemente, un homólogo del SID-1 fue identificado en L. vannamei (Lv-Sid1) (Labreuche et al., 2010). De manera interesante, la expresión de este receptor aumenta sustancialmente después de inyecciones de cualquier dsRNA (independientemente de su secuencia), sugiriendo así que la captación de dsRNAs por las células del camarón debe ocurrir vía SID-1, a ejemplo de otros invertebrados. En estudio reciente en nuestro laboratorio, la inyección de juveniles L. vannamei con dsRNA- VP28 (proteína de la envoltura del WSSV) antes de un desafío letal con WSSV (mortalidad de 100% en 5 días) activó el sistema RNAi, mejoró las condiciones inmunológicas generales de los animales y los llevó a una sobrevivencia de 73% de los animales desafiados, durante 30 días (Guertler et al., 2013). Más interesante todavía es el hecho que 80% de esos animales sobrevivientes no presentaba el virus en su organismo. En camarones tratados con dsRNA, el hemograma disminuyó hasta 6 horas después del desafío, seguido por aumento y alcanzando su nivel normal en 72 horas. De esta forma, el tratamiento con dsRNA-VP28 limitó la infección en los camarones por WSSV, restaurando sus condiciones inmunológicas y promoviendo el “clearance” viral en la mayoría de los sobrevivientes. Estos hallazgos son extremadamente relevantes, una vez que demuestran que el tratamiento previo de camarones juveniles con dsRNA-VP28 puede llevar a la restitución de las buenas condiciones inmu- nológicas de animales desafiados con WSSV, al control de la infección viral en sufase inicial, además de promover una limpieza viral en la mayoría de los sobrevivientes. De esa forma, la utilización de dsRNA-VP28 podría representar una potencial terapia antiviral de carácter preventivo contra el WSSV, en camarones juveniles infectados con una carga viral alta. Es importante destacar, que a pesar de que la tecnología del RNAi pudiera ser considerada actualmente como la estrategia más promisoria contra las virosis de camarones, la necesidad de inyectar los animales individualmente con dsRNA de secuencia-específica, asociada al alto costo de la técnica, constituye todavía un factor limitante para su utilización en gran escala dentro de la camaronicultura. Inyecciones con dsRNA/siRNA son inviables en granjas de camarones y la búsqueda de vías alternativas de administración y de disminución de costos son urgentes e imperativas. Uno de los métodos alternativos a ser evaluados sería la administración oral de bacterias pro- ductoras de dsRNA de secuencia específica (bacterias transformadas, deficientes en RNAsa III, conteniendo un plásmido que sintetiza ambas cadenas del dsRNA), método ya bien establecido para C. elegans (Timmons et al., 2001). Un primer estudio de este tipo fue realizado por Sarathi et al. (2008), en P. monodon, utilizando dos formas diferentes de administración oral: (1) alimento cubierto con bacterias (E. coli) transformadas con plásmidos productores de dsRNA-VP28 o, (2) nanopartículas de quitosano conteniendo el dsRNA-VP28. Los autores encontraron tasas expresivas de sobrevivencia de los camarones desafiados con WSSV después de un mes de tratamiento (70% y 40%, respectivamente) (Sarathi et al., 2008). Un punto relevante a ser considerado en ese abordaje es que la activación del sistema RNAi depende de la entrada del dsRNA/siRNA en las células del hospedero y por tanto, la administración oral debe garantizar que los dsRNA/siRNA atraviesan el tracto digestivo del camarón sin ser degradados y alcancen los diferentes tejidos de los animales, incluyendo los potencialmente infectados. Para eso, es imperativo tener una comprensión muy clara de la fisiología del tracto intestinal de los camarones, que posibilite delinear metodologías eficaces de transferencia del dsRNA/siRNA del intestino hacia los tejidos. Estudios de este tipo son todavía muy escasos o ausentes, a pesar de la

273 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos fuerte demanda de investigaciones en esta área para validar o no la vía de administración oral de estas construcciones. Otro método que parece muy promisorio y merece ser mejor investigado se refiere a la utili- zación de vectores plasmidiales que expresen RNAs en forma de horquilla (hRNAs), que pueden ser de secuencias largas (lhRNA:, del inglés, long-hairpin RNA) o cortas (shRNA:, del inglés, short-hairpin RNA). La mayoría de las aplicaciones terapéuticas basadas en el RNAi introducen directamente en el organismo el dsRNA/siRNA. Todavía los efectos de esas moléculas son transitorios, una vez que ellas pueden ser degradadas en el organismo. Por otro lado, la inserción de un sistema de vectores plasmidiales o virales expresando hRNAs, puede llevar a un silenciamiento específico y potente, una vez que promueven la transcripción de los precursores de RNA doble cadena para ser procesado vía RNAi. Cabe destacar que tales estrategias permiten una entrega continua del hRNA al organismo, superando así la limitación de la acción transitoria de los siRNAs (Lambeth et al., 2010). Según Cas- tanotto y Rossi (2009), la utilización de un promotor que induce la expresión de hRNAs o miRNAs podría promover un silenciamiento de largo plazo, con apenas una única aplicación. Ese método ten- dría ciertamente una fuerte función práctica para la acuicultura, una vez que dispensaría eventuales refuerzos de inyección de los dsRNA/siRNA virales para proteger los animales. El primer estudio en camarones, utilizando una construcción de DNA expresando lhRNA, fue realizado por Krishnan et al., (2009). En ese estudio, construcciones plasmidiales expresando lhRNA- VP28 o lhRNA-VP19 fueron producidas e inyectadas en P. monodon, en diferentes concentraciones. Después del desafío con WSSV, los animales tratados con lhRNA-VP28 presentaron una alta tasa de sobrevivencia (75%) después de un mes de la inyección (35 µg). Análisis de PCR en tiempo real (qPCR) indicaron una disminución significativa en el número de copias virales en estos animales, resultando que los autores atribuyeron a la biodisponibilidad continua y funcionalidad de la cons- trucción, que fue detectada en varios tejidos del animal, hasta por un mes del tratamiento (Krishnan et al., 2009). Mayores informaciones sobre la aplicación de la técnica de RNAi contra virus causando enfermedades en animales acuáticos, pueden ser encontradas en la revisión de Reshi et al., (2014). En conclusión, el uso de dsRNA para activar la inmunidad antiviral en camarones despunta en el momento actual como una alternativa terapéutica de las más promisorias en el combate a las virosis, una vez que ese patrón molecular induce simultáneamente respuestas secuencia-inespecíficas, a través de un sistema interferon-like y secuencia-específicas, a través de la vía RNAi. Por otro lado, la inducción del sistema RNAi por dsRNA/vectores expresando hRNA vía sistémica y eventualmente por vía oral, implican una atrayente posibilidad de desarrollarse terapias antivirales, de forma compatible con la camaronicultura.

Apoptosis celular: ¿mecanismo antiviral o pro-viral? La muerte celular programada o apoptosis es un proceso bien conocido con implicaciones variadas en la regulación de la homeostasis de un organismo, actuando tanto en el desarrollo embrionario, como en el control de los tejidos en general y también en las respuestas inmunológicas contra células alteradas y/o infectadas por patógenos intracelulares como los virus. Es en sí, un mecanismo filogenéticamente antiguo y bien conservado entre los diferentes grupos de seres vivos. La inducción de apoptosis se inicia en respuesta a una variedad de estímulos, incluyendo las infecciones virales y envuelve varias alteraciones morfológicas celulares, como la condensación de la cromatina, la fragmentación del núcleo, el blebbing de la membrana, el achicamiento celular y finalmente la fragmentación de la célula en pequeñas vesículas revestidas por la membrana, denominadas cuerpos apoptóticos, que son en general rápidamente fagocitados por las células vecinas o por macrófagos (Fig. 6.5.2). Las alteraciones bioquímicas subyacentes a estas alteraciones morfológicas, incluyen la activación de enzimas nucleasas y proteasas, dentro de las cuales se destaca la familia de las caspa-

274 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón sas (iniciadoras y ejecutoras). Éstas tienen un papel crucial en el proceso apoptótico, pues catalizan muchos de los diferentes pasos en la muerte celular (Chowdhury et al., 2008). Muchas proteínas y componentes virales perturban la fisiología celular y proporcionan señales celulares que inducen la muerte celular por apoptosis. En mamíferos, ya fue demostrado que algunos componentes de las vías pro-apoptóticas pueden ser activados por el dsRNA viral (Gantier y Williams, 2007). Luego, durante una infección viral, el dsRNA estaría implicado tanto en la señalización intracelular activando los sistemas de RNAi e interferón, como también estaría induciendo la apoptosis celular (Fig. 6.5.2).

Figura 6.5.2: Apoptosis celular. Representación de la apoptosis de una célula, con la formación de cuerpos apop- tóticos endocitados por una célula saludable (A). Núcleos apoptóticos (B) y no-apoptóticos (C) de hemocitos de L. vannamei infectados con el virus de la mionecrosis infecciosa (IMNV), teñidos con bis-benzimida.

Es importante señalar que la inducción de la apoptosis en estadio precoz de la infección viral, puede efectivamente limitar la producción de partículas virales y reducir o eliminar la propagación de la progenie viral para otros tejidos. Sin embargo, una apoptosis tardía puede, por lo contrario, favorecer la infección viral. De hecho muchos virus desarrollaron, a lo largo de la evolución, un mecanismo de inhibir o retardar el proceso apoptótico, como forma de evadirse de esta respuesta antiviral y garantizar su replicación en el hospedero (Roulston et al., 1999). La apoptosis celular, en estadio final del ciclo de la replicación viral, ofrece muchas ventajas a los virus. Durante este proceso, todo el contenido celular, incluyendo la progenie del virus, es empacado en los cuerpos apoptóticos. Los virus son así indetectables para el sistema inmune, estando protegidos dentro de los cuerpos apop- tóticos. Evitan de esta manera las respuestas inflamatorias y su inactivación por anticuerpos (en los vertebrados) y proteasas del hospedero. Estos cuerpos apoptóticos, alojando innumerables virus repli- cados, son rápidamente fagocitados por las células vecinas e irónicamente garantizan así la propaga- ción y la infección viral. O sea, la inducción de una apoptosis tardía parece ser una óptima estrategia de propagación para los virus que evolutivamente no desarrollaron todavía defensas anti-apoptóticas u otros mecanismos de evasión inmunológica (Roulston et al., 1999).

275 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

En camarones, la inducción de la apoptosis en infecciones virales viene siendo activamente investigada en estos últimos años. En P. monodon infectados por WSSV (Sahtoutd et al., 2001; Won- gprasert et al., 2003) o por YHV (Khanobdee et al., 2002) ocurre un aumento progresivo de la apoptosis hasta niveles muy altos, comprometiendo así varios tejidos y pareciendo ser la principal causa de la muerte de los camarones. También en M. japonicus infectados por WSSV, la incidencia de la apoptosis se mostró muy alta, resultando en elevadas mortalidades de sus células y por consiguiente de los animales (Wu y Muroga, 2004). Estos resultados sugieren que en las infecciones virales severas en los camarones, ocurre la inducción de una apoptosis tardía, llevando a una fuerte propagación de la progenie viral y resultando en la muerte del camarón por exceso de apoptosis en sus tejidos. Varias caspasas (proteasas que desencadenan la apoptosis celular) ya fueron identificadas y clonadas en camarones, como la caspasa efectora del tipo 3 descrita en F. merguiensis (Phongdara et al., 2006), en P. monodon (Wongprasert et al., 2007) y en L. vannamei (Rijiravanich et al., 2008). En los dos primeros casos, estas proteasas son inducidas durante infecciones por el WSSV. También en M. japonicus fue clonada una caspasa iniciadora (Pjcaspasa) homóloga a las caspasas del tipo 8 y 10 (Wang et al., 2008) y su silenciamiento llevó a una inhibición significativa de la apoptosis inducida por el WSSV, resultando en un aumento de las copias virales en el animal. Muy recientemente fueron clonados cuatro genes codificantes para nuevas clases de caspasas en L. vannamei, denominadas Lvcaspase2, 3, 4 y 5 (Wang et al., 2013). El silenciamiento de las Lv- caspase2, 3 y 5 promovió un aumento significativo en la expresión ég nica de la VP28 del WSSV, sugiriendo la participación de estas caspasas en la defensa antiviral en camarones (Wang et al., 2013). Estos resultados en conjunto sugieren, por lo tanto que la apoptosis es de hecho un importante mecanismo antiviral en camarones. Sin embargo, ya fue claramente demostrado que el WSSV contiene en su genoma un gen que codifica una proteína anti-apoptótica denominada AAP-1 (conocida también por WSSV449 o ORF 390) (Wang et al., 2004). Esta proteína viral es capaz de unirse a una caspasa efectora de P. monodon, inhibiendo su actividad pro-apoptótica y demostrando así, su actividad anti apoptótica (Leu et al., 2008). Estos resultados sugieren que la fuerte capacidad infecciosa del WSSV deba estar relacionada a su efecto anti-apoptótico.

Autofagia como defensa antiviral La autofagia es la principal vía intracelular de degradación y reciclaje de macromoléculas de vida larga y de organelas defectuosas y/o inoperantes de la célula, utilizando para ello la vía lisoso- mal. De manera semejante a la apoptosis, la autofagia es un mecanismo fisiológico filogenéticamente antiguo y conservado, que actúa en los procesos de diferenciación, desarrollo, homeostasis y sobrevivencia de los organismos multicelulares (Mizushima, 2007; Sumpter y Levine, 2010). La autofagia es activada en respuesta a una variedad de estímulos intra y extracelulares, incluyendo privación de nutrientes, tratamiento hormonal o terapéutico, presencia de agregados proteicos mal doblados, organelas inoperantes e infección microbiana. Estudios recientes han demostrado que la autofagia en mamíferos está íntimamente implicada en la remoción de patógenos intracelulares, estando así asociada al sistema inmune de estos animales (Figura 6.5.1). Actualmente se reconoce que la autofagia contribuye con el sistema inmune de tres formas: (a) eliminación directa de patógenos intracelulares (virus, bacterias y parásitos) a través de su empaque y degradación en autolisosomos; (b) entrega de productos/componentes microbianos para los receptores de reconocimiento patrón intracelulares, proceso referido como “inversión topológi- ca”, activando respuestas inmune efectoras y; (c) como un efector antimicrobiano, eliminando los patógenos intracelulares a partir del reconocimiento de los PAMPs por los receptores Toll-like y otros PRRS (Delgado et al., 2009).

276 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

El proceso de autofagia envuelve acciones coordinadas de varios genes denominados ATG (autophagy-related genes). Estos genes están primariamente implicados en el re-arreglo estructural de las endomembranas para permitir el proceso autofágico natural de la célula (Sumpter y Levine, 2010). Entretanto, estos genes están también implicados en la protección in vivo contra infecciones por pa- tógenos intracelulares del tipo bacteriano y viral. En mamíferos, los ATGs pueden tanto estimular la producción del interferón tipo I, como también regular la entrega de los ssRNA al TLR7 presente en los endósomos de las células dendríticas durante ciertas infecciones virales (Lee et al., 2007). En Drosophila ya fue demostrado que los genes ATGs están implicados en la protección contra infecciones virales en insectos adultos. De hecho, cuando ciertos ATGs son silenciados (ATG 7, 12 o 18), los insectos se tornan susceptibles a las infecciones virales y mueren (Shelly et al., 2009). En crustáceos, estudios sobre el papel inmunológico de la autofagia son todavía inexistentes. Sin embargo, se piensa que, así como en los insectos y mamíferos la autofagia debe estar implicada en la defensa antiviral de camarones. Se espera que en un futuro próximo, el estudio de este proceso pueda contribuir para una mayor comprensión de la interacción patógeno-hospedero y para el desarrollo de terapias alternativas que lleven a un mayor control de las virosis de camarones.

Concepto de acomodación viral en camarones Una forma alternativa para enfrentar los brotes virales y el control de infecciones virales en camarones, se refiere al concepto de la acomodación viral propuesto por Flegel en 1998 y recientemente actualizado por el mismo autor (Flegel y Pasharawipas, 1998; Flegel, 2007; 2009). Este concepto propone que los crustáceos se adaptan a los nuevos virus patógenos que surgen, desarrollando una especie de memoria inmunológica específica. La propuesta se basa en el hecho que luego de brotes virales graves en los cultivos de camarones, la severidad del problema regularmente se atenúa de forma relativamente rápida, en términos evolutivos (cerca de 1 a 2 años), a pesar de haber una alta prevalencia de estos virus en camarones de apariencia saludable. Todo indica que los camarones supervivientes desarrollan una tolerancia a los virus y se vuelven portadores de infección persistente, sin ningún efecto negativo aparente o signo de enfermedad. Esta situación contrasta con el concepto de resistencia viral de los vertebrados, que implica en una eliminación/depuración del agente causante de la infección por los supervivientes que se vuelven resistentes/tolerantes a una nueva re-infección. La condición de tolerancia adquirida por los camarones supervivientes, permanece por toda su vida y es transferida en baja dosis para toda su progenie que también desarrolla infecciones virales persistentes, sin todavía desencadenar la enfermedad. Este concepto encuentra soporte en el hecho de que infecciones virales dobles, triples y múl- tiples son frecuentemente detectadas en camarones de apariencia saludable. En 2007, Flegel propone que el camarón puede convivir con los virus sin haber efectos negativos, debido a un proceso combinado virus-hospedero, que comprende la reducción del proceso apoptótico en el hospedero inducido por los virus. Esta hipótesis fue reforzada, al ser evidenciado que los camarones sin signos de enfermedad, pero con infección viral persistente, no presentaban apoptosis en sus células (Wongprasert et al., 2003). Por otro lado, durante los brotes virales, los niveles de apoptosis aumentan drásticamente en camarones moribundos, pudiendo llegar a valores muy altos (hasta 40% de muerte celular) y que la muerte del camarón sería una consecuencia de este exceso de apoptosis (Sahtout et al., 2001). Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a la tolerancia a los virus patógenos por el camarón, eran todavía desconocidos y probablemente distintos de la tolerancia inmunológica de los vertebrados.

277 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Más recientemente, Flegel (2009) re-examina su hipótesis de acomodación viral en camarones y propone una nueva explicación para este fenómeno, que en nuestra opinión es más interesante y persuasiva, que la supresión de la apoptosis hipotetizada anteriormente. En esta nueva propuesta, el autor postula que, durante las infecciones virales los crustáceos consiguen reconocer los RNAm virales y desarrollan un mecanismo de inserción de pequeños fragmentos aleatorios del genoma viral en forma de DNA complementaria o cDNA) en su propio genoma. Esta inserción sería modulada por las transcriptasas reversas (RT) e integrasas (IN) endógenas, que son abundantes en las células del propio camarón. Algunos de estos fragmentos insertados generarían secuencias de RNA antisense, que Fle- gel denomina RNA inmunoespecífico (imRNA) y serían capaces de generar dsRNA con secuencias correspondientes al RNAm viral. Como consecuencia, los dsRNA producidos estimularían el sistema RNAi del camarón, suprimiendo/limitando la propagación del virus y llevando a una infección viral persistente, sin síntomas de la enfermedad. Para reforzar su hipótesis, Flegel reporta la presencia, ya demostrada, de secuencias del genoma viral (no provenientes de retrovirus) del IHHNV y del WSSV, en genomas de camarones penaeídos (Tang y Lightner, 2006; Flegel, 2009). Flegel sugiere además, que la gran cantidad de secuencias de RT-like expresadas en camarones favorece la posibilidad de que estas estén implicadas en un mecanismo fisiológico de reconocimiento del no-propio (PRPs/PRRs), semejante al reconocimiento de PAMPs del sistema inmune innato. Sin embargo, diferentemente de las respuestas desencadenadas por PAMPs, el proceso que genera el imRNA es un proceso altamente específico y supuestamente heredable. En esta nueva proposición, Flegel postula que caso realmente exista una heredabilidad del imRNA, un mayor entendimiento de este proceso podría permitir desarrollar vacunas para camarones, basadas en construcciones virales apropiadas, capaces de insertarse de forma natural en sus genomas, sin la necesidad de producir camarones artificialmente resistentes, genéticamente modificados. En nuestra opinión, la nueva hipótesis de Flegel (2009) para explicar el fenómeno de acomo- dación viral, parece más consistente que la anterior, basada en la supresión del proceso apoptótico. Sin embargo, cabe resaltar que la heredabilidad de esta resistencia/tolerancia por la progenie de los camarones permanece poco fundamentada y bastante cuestionable, una vez que las secuencias virales deberían insertarse en las células germinativas de las gónadas de los camarones para garantizar su transmisión. Infelizmente el autor explica poco este punto crucial de su hipótesis, que permanece esencial para su validación. En caso haya efectivamente una heredabilidad en el proceso de producción de imRNA en camarones, una nueva clase de agentes terapéuticos antivirales podría realmente ser desarrollada, basada en construcciones virales apropiados, capaces de insertarse en los genomas de los animales. Estos nuevos agentes terapéuticos serían entonces capaces de conferir una protección específica y de largo plazo a los camarones y su progenie, contribuyendo de modo importante y decisivo en el control de las virosis de camarones, que tanto se anhela en la camaronicultura. Cabe además resaltar que Flegel (2009) defiende todavía la ocurrencia de una “inmunidad adaptativa” en crustáceos, a ejemplo de lo que ocurre en vertebrados, una vez que el sistema RNAi está basado en una respuesta celular secuencia-específica. Sin embargo, en nuestra opinión, esta respuesta no debe ser confundida con las respuestas inmune adaptativas de los vertebrados, cuya organización, complejidad y especificidad son fenómenos claramente distintos del sistema RNAi. Respuestas secuencia-específicas del tipo RNAi en infecciones virales son comunes en camarones y en todos los organismos pluricelulares, incluyendo plantas y hongos y constituyen un típico ejemplo del sistema inmune innato.

278 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

Mecanismos de evasión viral Como se ha explicado anteriormente, en los vertebrados, luego de la entrada de los virus en el organismo, éstos son generalmente reconocidos como partículas extrañas e inician una serie de respuestas inmunológicas que tratan de impedir su entrada en las células, su replicación y su pro- pagación. Luego de su reconocimiento, ocurre en el hospedero una cascada de respuestas celulares y humorales ya discutidas anteriormente que incluyen la activación de células NKs y de linfocitos T citotóxicos (CTLs), la producción de anticuerpos específicos neutralizadores, la producción de varias citocinas señalizadoras, como los IFNs, que interactúan con los linfocitos y suprimen o expanden sus funciones inmunológicas. Los virus pueden utilizar diferentes mecanismos para evadirse de las defensas inmunológicas del hospedero en el caso de los vertebrados, siendo las principales: (1) la modulación de las funciones del complejo mayor de histocompatibilidad que presenta los antígenos virales, (2) la inhibición/ modulación de diferentes quimiocinas y citocinas señalizadoras incluyendo los IFNs, (3) la evasión de los CTLs y NKs, (4) la inhibición de la apoptosis y (5) la interferencia la vía RNAi (Abbas et al., 2007). En los crustáceos, los mecanismos de evasión viral no son todavía conocidos, aunque deben incluir la inhibición/modulación de varias respuestas inmunológicas envolviendo la activación del sistema proPO, la expresión de citocinas implicadas en la respuesta antiviral (moléculas interferon -like), la expresión de moléculas antivirales como la PmAV y ALF, la expresión de PRPs u otros receptores celulares utilizados en la interiorización del virus, la activación de la vía del RNAi y del proceso apoptótico. Muchos virus producen supresores virales de RNAi como el VSRs (del inglés, viral suppressors of RNAi) los cuales incluyen proteínas supresoras de silenciamiento o SSPs (del inglés silencing suppressor proteins) (Li y Ding 2006; Bortolamiol et al., 2008; Labreuche y Warr, 2013). Esos VSRs son capaces de interferir en varias etapas del proceso de silenciamiento, optimizando así la replicación viral y propiciando la propagación viral en el organismo hospedero. (Labreuche y Warr, 2013). Entre los mecanismos de evasión viral en los camarones, los más destacados actualmente son el retardo/supresión del proceso apoptótico en la célula infectada, la modulación de la expresión del ALF y supresión/retraso del silenciamiento de los productos génicos virales, vía-RNAi, como mencionado anteriormente. La comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a estos dos procesos está apenas en sus inicios y ciertamente deberán proporcionar, herramientas útiles para el control de las infecciones virales en los camarones en un futuro próximo.

6.6. Inmunoestimulantes El gran interés en compuestos inmunoestimulantes surgió de la necesidad de tratar el cáncer en los humanos, buscando compuestos capaces de activar las células del sistema inmunológico (ma- crófagos, células NKs, linfocitos B y T), para aumentar su capacidad de destruir los tumores. Por otro lado, además de proporcionar una mayor protección contra los tumores, la activación de las células inmunológicas lleva todavía a una mayor resistencia a las infecciones por diferentes microorganismos, como virus, bacterias, hongos y otros parásitos. Sustancias inmunoestimulantes son obtenidas a partir de varias fuentes naturales y también por síntesis química con base en la estructura molecular de los propios productos naturales. Entre estos compuestos, se encuentran muchos derivados de microorganismos o de algas, destacándose los componentes de la pared celular de diferentes bacterias, hongos, micro algas y macro algas. Los principales principios activos de estos componentes capaces de generar una inmunoestimulación son:

279 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos fragmentos de PGN, LPS, lipopéptidos, polisacáridos sulfatados (PS), β-glucanos, acil-oligopéptidos y péptidos bacterianos específicos (Song y Huang, 2000). Con relación a los camarones, muchas sustancias descritas como inmunoestimulantes han sido utilizadas con el propósito de aumentar la resistencia natural, en vista de la imposibilidad de va- cunar estos animales. Sin embargo, existe una falta casi completa de información sobre el mecanismo de acción de estos compuestos a nivel del sistema inmune de los camarones, además de no haber consenso sobre su real eficacia y sobre la reproducibilidad de los resultados. Está bien establecido que la mejor forma de prevenir las infecciones en los cultivos de camarones, depende esencialmente de las buenas prácticas de manejo, que incluyen una buena calidad del agua, adecuada densidad poblacional, buena nutrición y reducción de los factores ambientales potencialmente estresantes (principalmente las variaciones bruscas de salinidad, temperaturas y oxígeno). El uso de sustancias capaces de aumentar la inmunocompetencia de los camarones, en paralelo a un buen manejo del cultivo, apunta ciertamente como una herramienta promisoria en la búsqueda de una mayor protección inmunológica contra el desarrollo de infecciones. Existe una real necesidad de maximizar la inmunocompetencia de los camarones cultivados, minimizando el uso de agentes terapéuticos químicos, como antibióticos, que contaminan la carne del animal y el ambiente y también inducen el aparecimiento de microorganismos resistentes. Muchas sustancias consideradas inmunoestimulantes han sido utilizadas en los cultivos de camarones, para aumentar su resistencia inmunológica y sería imposible cubrir en este capítulo, la infinidad de referencias que existen a este respecto. Entre los compuestos más utilizados en los cultivos se destacan los β-1,3/1,6-glucanos de hongos o algas, PGN de bacterias Gram-positivas, LPS de bacterias Gram-negativas, PS de algas y algunas proteínas virales (Smith et al., 2003). Entre estos inmunoestimulantes, los β-glucanos son tal vez los más ampliamente utilizados para camarones y los presumiblemente más inmunoefectivos y compatibles con la práctica de la camaronicultura (Dalmo y Bogwald, 2008). Además de estos compuestos de la superficie de microorganismos y de algas, otros productos también se muestran aparentemente inmunoefectivos para los camarones, como los extractos de diferentes hierbas (Citarasu et al., 2006; Balasubramanian et al., 2008; Yeh et al., 2009), bacterinas (bacterias, principalmente vibrios, inactivadas por calor, formol o liofilizadas), probióticos (Tseng et al., 2009) y suplementos nutricionales (astaxantina y ácido ascórbico polifosfatado) (Song y Huang, 2000). Varios de estos compuestos son actualmente vendidos comercialmente, otros están en fase experimental y otros todavía no cuentan con financiamiento para una producción comercial. Los inmunoestimulantes son usualmente utilizados en los cultivos de camarones sobre formas de baño (inmersión de los animales), como suplemento en la dieta o, más raramente, sobre forma de inyección (aparentemente más eficaz). Se torna evidente, que entre estos métodos, la adición del inmunoestimulante en la ración, es más viable para la utilización en las granjas de cultivo. Las otras dos formas de administración (inyección y baños) son menos viables, pero pueden ser útiles para el tratamiento de larvas y reproductores, o para experimentos en laboratorio cuyo principal objetivo sea comprender el mecanismo de acción de estos compuestos. Se debe resaltar que el efecto inmunoestimulante real de estos productos, es todavía bastante controvertido y poco fundamentado, dado que varios trabajos relatan resultados opuestos sobre el efecto de un mismo inmunoestimulante. Los buenos resultados obtenidos en algunos casos, no son muchas veces reproducibles. Como ejemplo entre muchos, se puede citar el uso de los β-glucanos, que en algunos casos confieren efectos benéficos para los camarones tratados (aumento deldes- empeño e inmunoestimulación) (Dalmo y Bogwald, 2008) y otros, no afecta o hasta perjudica a los animales (Scholz et al., 1999; Sritunyalucksana et al., 1999b). Informaciones más detalladas sobre el

280 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón efecto de diferentes inmunoestimulantes en camarones pueden ser encontradas en Dalmo y Bogwald (2008). La comprensión del mecanismo de acción de estos productos, es por lo tanto de crucial importancia para que su uso pueda ser efectivamente validado. Otro punto importante que debe ser considerado, es referente a la administración de los inmunoestimulantes en la dieta de los camarones. La cuestión es: ¿Cómo explicar la resistencia de estos compuestos a la digestión por las enzimas del tracto digestivo o su absorción aparentemente intacta por el epitelio/cutícula del intestino para llegar a la hemolinfa a fin de activar el sistema inmunológico del camarón? Alternativamente, ¿existen receptores específicos o moléculas señalizadoras presentes en el intestino/cutícula capaces de reconocer específicamente patrones moleculares en estos inmunoestimulantes y transmitir la señalización para la hemolinfa? Debe ser claramente observado, que la búsqueda de una activación de las respuestas inmu- nológicas en el camarón tratado con inmunoestimulantes, no es deseable como forma de prevenir infecciones. ¿Cuál sería el propósito de activar el sistema inmune del camarón, induciendo una lisis y/o degranulación de sus hemocitos, con liberación de todo su arsenal inmunológico en un momento inoportuno, en la ausencia de patógenos? La presencia de tantas moléculas tóxicas potentes, como las quinonas/hemiquinonas y los radicales libres (ROIs y RNIs) en la ausencia de un proceso infeccioso, lleva ciertamente a una so- brecarga energética cara e inútil para los animales, además de provocar serios daños a sus propios tejidos. Siendo así, las referencias que reportan la activación de estos parámetros hemato-inmunoló- gicos en camarones tratados con diferentes inmunoestimulantes en la ausencia de infecciones, deben ser observadas con reserva. Lo que se busca de hecho en el cultivo de camarones, no es un sistema inmunológico continuamente activado como parece querer ser demostrado en varios relatos, sino un fortalecimiento del sistema inmune capaz de generar un estado de mayor inmunocompetencia de los animales, que les proporcione mayor capacidad y rapidez en la respuesta, cuando se presenta una infección. Otro punto crucial y cuestionable se refiere al momento y al tiempo de la administración de los inmunoestimulantes y al período de protección inmunológica (“memoria”) otorgado. Qué sería lo más apropiado: ¿administrar los inmunoestimulantes desde fases más tempranas del desarrollo de camarones y/o inmediatamente antes de un desafío, o aún luego de iniciado el desafío? Aquí también, muchas publicaciones reportan resultados contradictorios y poco convincentes (Smith et al., 2003). Algunos trabajos muestran que la administración de inmunoestimulantes por períodos prolongados lleva a un aumento del desempeño de los camarones y a una mayor inmunocompetencia por un cierto período de días (Sung et al., 1996; Takahashi et al., 2000), aumentando la sobrevivencia de camarones desafiados con el WSSV (Citarasu et al., 2006; Balasubramanian et al., 2008; Cantelli, 2009; Yeh et al., 2009); entre tanto, otros trabajos no refieren aumentos en el desempeño/inmunidad de los camarones (Scholz et al., 1999). En nuestra opinión, lo que sería deseable en la inmunoestimulación, es poder potencializar las defensas naturales del camarón sin costo fisiológico importante, elevando, por ejemplo, el número de células inmunológicas (hemocitos) y de proteínas de reconocimiento y también modulando los niveles de las moléculas inmunoefectoras e inmunoreguladoras, de forma tal que permita dejar los animales en una condición óptima de inmunocompetencia para reaccionar con eficiencia a una eventual invasión por los patógenos. En este sentido, la posibilidad actual de cuantificar, con preci- sión, los niveles de expresión de diferentes inmunomarcadores por PCR en tiempo real, puede traer una importante contribución en la evaluación del estado de inmunocompetencia de los animales, mediante el tratamiento con inmunoestimulantes.

281 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

6.7. Parámetros hemato-inmunológicos como indicadores de salud Una práctica común, en la medicina humana y veterinaria, es la utilización de parámetros hematológicos y bioquímicos para evaluar las condiciones de salud de los individuos y también para auxiliar en el diagnóstico de diferentes enfermedades. En la camaronicultura, estas herramientas vienen siendo utilizadas como indicadores de salud, a pesar de la gran variedad en los valores de referencia de estos parámetros, en una misma población, en función del sexo, proceso de muda y estadío de desarrollo. Los parámetros hemato-inmunológicos más comúnmente empleados en crus- táceos son: (1) hemogramas (conteo total y diferencial de hemocitos), (2) tiempo de coagulación de la hemolinfa, (3) actividad de la enzima PO, (4) índice de fagocitosis, (5) producción de ROIs, (6) actividad antimicrobiana, (7) título aglutinante del plasma y (8) concentración de proteínas totales de la hemolinfa. Otros parámetros comienzan a ser implementados como la actividad de la lisozima hemolinfática, la producción de RNIs y la actividad del inhibidor de la proteasa α2M (Tabla 4).

Tabla 4: Principales parámetros hemato-inmunológicos utilizados en la evaluación del estado de salud de camarones y otros crustáceos.

Parámetro Determinación Utilidad hemato-inmunológico en campo*

Hemogramas Esencial (muy variables) Sí Índice fagocítico Buena No Producción de ROI Esencial No Producción de RNI Análisis todavía iniciales No Núcleos apoptóticos Buena (para virus) Sí Tiempo de coagulación Buena (para animales muy estresados/enfermos) Sí Proteína total de la hemolinfa Razonable (para animales muy estresados/enfermos) Posible Actividad da la PO Esencial (muy variable) Posible Actividad de otras enzimas/ proteínas (SOD, lisozima, α2M, Razonable a buena (muy variable) No etc.) Actividad antibacteriana Buena No Actividad aglutinante del plasma Razonable (no varía mucho) Posible Expresión de proteínas Esencial No inmunológicas (PCR-tiempo real)

* Los análisis viables mostrados en esta tabla pueden ser realizados por funcionarios entrenados de las propias fincas de cultivo, necesitando de infraestructura media (microscopios, espectrofotómetro, reactivos, entre otros). Los análisis que aparecen como no viables necesitan del apoyo de laboratorios externos (equipos y reactivos especiales) con profesionales calificados.

Entre los parámetros citados, las alteraciones más evidentes en los animales (principalmente camarones) infectados/estresados se refieren a la modulación del número total de hemocitos o THC (del inglés, total hemocyte count) y la disminución de la capacidad coagulante de la hemolinfa. Es bien conocido, en la práctica de los cultivos, el aumento en el tiempo de coagulación de la hemolinfa en crustáceos sobre estrés fisiológico o durante infecciones (Song et al., 2003; Sarathi et al., 2007; Balasubramanian et al., 2008). La técnica clásica para evaluar este parámetro, es la obtención de la hemolinfa con un capilar de vidrio (Sarathi et al., 2007) y registrar el tiempo de gelificación de la hemolinfa. Es una técnica muy simple y si se efectúa bien, puede generar información útil sobre el estado de salud de los animales. Como se explicó anteriormente, el proceso de coagulación envuelve varios factores: la proteína de coagulación (CP), la enzima hemocitaria TGasa y la concentración

282 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón plasmática de Ca2+. No se conoce claramente cuál de estos factores es el responsable por el aumento en el tiempo de coagulación en animales estresados/infectados. Evidencias sugieren que hay una interacción de todos estos factores. Camarones L. vannamei infectados con TSV tienen una capacidad disminuida de coagulación y presentan una actividad significativamente reducida de TGasa en los hemocitos, además de un decrecimiento en la concentración de calcio plasmático (Song et al., 2003). Recientemente, fue demostrado que el silenciamiento pos-transcripcional tanto de la TGasa como de la CP lleva a un aumento significativo en la tasa de mortalidad de M. japonicus infectados con Vibrio penaecida o WSSV, indicando un fuerte envolvimiento de estas moléculas en la respuesta inmune de estos animales contra infecciones bacterianas y virales (Maningas et al., 2008). En otro estudio, se observó un agotamiento en la expresión de la TGasa (hasta 24 horas) después de un desafío con WSSV, tanto en F. chinensis (Liu et al., 2007) como en L. vannamei (Guertler, 2010), pudiendo haber un aumento en la expresión del gene para esta enzima más tardíamente (72 horas después del desafío) (Guertler, 2010). Efectivamente, una disminución de la capacidad de coagulación es común- mente observado en camarones severamente infectados por WSSV (Sahul Hameed et al., 2006; Sara- thi et al., 2007), lo que es compatible con una expresión disminuida de TGasa y/o CP. Estos resultados sugieren que ambas proteínas relacionadas al proceso de coagulación deben ser importantes en la defensa de los crustáceos frente a las infecciones virales. El conteo total de hemocitos circulantes (THC), de por sí es uno de los inmunoparámetros más utilizados para expresar las condiciones de salud de los crustáceos, así como ocurre con los hemogramas en los mamíferos. La modulación de la THC es utilizada en diferentes especies de camarones sobre condiciones de estrés ambiental y/o fisiológico y durante las infecciones (Jiravanichpaisal et al., 2006; Sarathi et al., 2007; Ai et al., 2009; Cantelli, 2009; Guertler, 2010). La THC puede aumentar o disminuir sus valores, dependiendo del tipo y tiempo de exposición a los agentes causantes del estrés. Es común que se observe una disminución de la THC, fenómeno conocido por hemocitopenia, durante las primeras horas de un proceso infeccioso, que puede ser seguido por un aumento de hemocitos en fases más tardías, pero solamente cuando se trata de infecciones moderadas. Esta disminución inicial se debe probablemente a una migración y/o infiltración de los hemocitos en los tejidos infectados o heridos, de una baja reposición de las células por el tejido hematopoyético (Jiravanichpaisal et al., 2006) y/o hasta muerte celular por apoptosis celular (Sarathi et al., 2007). La mayoría de los autores concuerda que un aumento en el THC debe proporcionar una mayor protección de los camarones contra infecciones, una vez que los hemocitos son los principales responsables por las diferentes reacciones inmunocelulares y son los sitios de expresión de las diferentes moléculas de defensa. Curiosamente, la alteración en la proporción de los tipos de hemocitos o DHC en camarones, no es muy observada durante situaciones de estrés o durante infecciones (Rodrı́guez y Le Moullac, 2000; Vogan y Rowley, 2002). Sin embargo, en algunos casos fue referida una variación en el porcentaje de los tipos celulares, en especial de hemocitos granulares (HGP y HGG) bajo condiciones de estrés y/o infecciones. En L. vannamei por ejemplo, mantenidos en bajas salinidades (15 ppt) e infectados con V. alginolyticus fueron registradas disminuciones significativas en el número de HHs (79%) y HGs (65%) (Li et al., 2010). También durante las infecciones virales, como por el WSSV, el porcentaje de HGs puede alterarse ya en los primeros días/horas pos-infección (Maldonado et al., 2003; Cantelli, 2009). Estos resultados no son sorprendentes, una vez que los HGs son las principales células inmunocompetentes de los camarones, siendo selectivamente infectadas por el WSSV (Wang et al., 2002), lo que explicaría la caída de esta población hemocitaria ya en los primeros días pos infección. La producción de ROIs por los hemocitos de crustáceos, medida principalmente por la pro- - ducción de aniones superóxido (O2 ), se ha constituido en uno de los inmunoparámetros más utilizados para estimar el estado de inmunocompetencia de los camarones. La evaluación de la producción

283 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

- intracelular de O2 por los hemocitos fagocitarios, es usualmente determinada por el método de reducción del NBT, o por la técnica de la quimioluminiscencia, utilizando componentes de la superficie de microorganismos, como LPS oβ -1,3-glucanos (laminarina, zymosan, curdlan) para estimula- ción de los hemocitos in vitro. Este inmunoparámetro es también muy utilizado para evaluar el efecto de sustancias inmunoestimulantes en camarones (Maldonado et al., 2003; Yeh et al., 2006; Fu et al., 2007; Balasubramanian et al., 2008; Cantelli, 2009). La primera referencia de producción de ROIs en camarones fue publicada en P. monodon (Song y Hsieh, 1994), siendo realizados desde entonces estudios con otras especies, cuyas metodologías fueron adaptadas. Existen sin embargo, diferencias fundamentales entre los protocolos experimentales utilizados por los diferentes grupos que estudian los crustáceos, lo que resulta frecuentemente en resultados conflictivos y poco comparables. Como ejemplo, se puede citar el trabajo de Muñoz et al. (2000) en L. vannamei, que indica un porcentaje muy bajo de estimulación de los hemocitos por el zymosan (30%), luego de 2 horas de incubación, mientras que en nuestro laboratorio ocurre una alta estimulación hemocitaria (80%) en la misma especie, en apenas 15 minutos de incubación con el mismo inductor (Guertler et al., 2010). En este trabajo, nuestro grupo discute estas inconsistencias de metodologías y propone algunas estrategias para uniformar la evaluación de la producción de ROIs en camarones. Uno de los primeros estudios a evaluar la alteración de los ROIs en camarones infectados por bacterias fue realizado en L. vannamei desafiados con diferentes especies de Vibrio (Muñoz et al., 2000). Curiosamente, las especies V. alginolyticus y V. anguillarum fueron capaces de estimular la producción del anión superóxido en camarón, mientras que el V. harveyi no causó ninguna alteración en la producción de este radical lo que podría explicar su patogenicidad de esta bacteria para los camarones. Con relación a las infecciones causadas por virus, existen relatos de disminución significativa en la producción de ROIs en L. vannamei infectados con WSSV, así como en la actividad fagocítica, y actividad de la SOD (Chang et al., 2003). En contraste, se observó un aumento de la producción de ROIs en camarones infectados con TSV (Song et al., 2003), WSSV y/o IHHNV (Sarathi et al., 2007; Cantelli, 2009). Estos resultados parecen indicar que algunos parámetros hemato-inmunológicos pueden alterarse de modo distinto conforme la infección viral. La actividad antimicrobiana de la hemolinfa de los crustáceos viene también siendo utilizada como un inmunoparámetro durante las infecciones y otras situaciones de estrés (Song et al., 2003; Costa et al., 2009). Variaciones en esta actividad en el plasma/suero de los camarones puede ser correlacionada con la presencia de infecciones o a una inmunodepleción de los animales. En camarones L. vannamei infectados con IMNV ocurre un aumento en la hemolinfa de la actividad antimicrobiana contra la bacteria Gram positiva Micrococcus luteus, pero no contra la Gram negativa V. harveyi (Costa et al., 2009). En contraste, actividad antimicrobiana contra V. harveyi aumenta en L. vannamei infectados con TSV (Song et al., 2003). En relación a la capacidad aglutinante de la hemolinfa, es conocido el hecho de que las infecciones y otras situaciones de estrés, pueden resultar en la alteración de los títulos aglutinantes de la hemolinfa de los crustáceos que usualmente son determinados por la aglutinación de eritrocitos de mamíferos. Como ejemplo, podemos citar el aumento de actividad aglutinante del plasma de P. monodon infectado por Vibrio vulnificus(Ratanapo y Chulavatnatol, 1992), de Macrobrachium rosenbergii y P. monodon infectados por WSSV (Pais et al., 2007) y L. vannamei por el virus de la mionecrosis infecciosa (IMNV) (Costa et al., 2009). Por otro lado, en hembras adultas de L. vannamei, sometidas al proceso de ablación unilateral para la maduración ovariana, ocurre una reducción significativa del título aglutinante de su hemolinfa, probablemente en respuesta a esta práctica mutiladora (Maggioni et al., 2004). Es importante resaltar que los niveles de la actividad aglutinante no varían siempre de forma significativa en respuestas a las infecciones o situaciones de estrés; por ejemplo, enF. paulensis

284 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón no hubo alteración de los títulos aglutinantes en animales mantenidos a bajas salinidades o luego de la ablación (Perazzolo et al., 2002), así como en L. vannamei sometidos a una infección leve por WSSV (Cantelli, 2009). La concentración de proteínas totales del plasma de crustáceos es también un parámetro que puede auxiliar en la evaluación del estado de salud de los camarones. A pesar de este parámetro poder ser afectado por factores ambientales y fisiológicos (Rosas et al., 2000; Sánchez et al., 2001), por infecciones y lesiones (Perazzolo et al., 2002; Vogan y Rowley, 2002) o por la administración de PS de algas (Yeh et al., 2010), el significado de esta variación necesita ser todavía mejor comprendido. Debemos considerar que el pigmento respiratorio hemocianina representa cerca de 90-95% de las proteínas totales del plasma de crustáceos (Rochu y Fine, 1978) y las fluctuaciones en su concentra- ción se refleja directamente en este tipo de parámetro hematológico. A pesar de la hemocianina estar relacionada con la inmunología de crustáceos, una vez que su clivaje pueda generar fragmentos con función de PO o de péptido antimicrobiano, como se mencionó anteriormente, la utilización de los niveles de esta proteína como inmunoparámetro debe ser todavía mejor investigada. La modulación de la actividad de la PO representa tal vez el principal inmunoparámetro utilizado actualmente para evaluar el estado de salud de los camarones y sería imposible citar en este capítulo los innumerables trabajos que utilizan la actividad de esta enzima para expresar la condición inmunológica de estos animales. Varios estudios demuestran la modulación de la actividad de la PO durante un estrés ambiental y/o fisiológico (Perazzolo et al., 2002; Hsu y Chen, 2007; Li et al., 2010), o durante infecciones y lesiones (Mathew et al., 2007; Sarathi et al., 2007; Li y Chen, 2008; Li et al., 2010). Recientemente, la utilización de técnicas de biología molecular ha auxiliado de forma crucial la comprensión de las respuestas inmunológicas desencadenadas en crustáceos y los mecanismos relacionados con la interacción patógeno-hospedero, todavía poco conocidos. Estas técnicas relacio- nan básicamente la identificación y cuantificación de la expresión de diferentes moléculas inmunoló- gicas e incluyen en especial: (1) la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, (2) la SSH (del inglés, suppression subtractive hybridization), (3) la DD-PCR (del inglés, differential display PCR) y (4) análisis de cDNA por microarrays. La infección por WSSV, por ejemplo, parece modular la expresión de varios genes en camarones, incluyendo proteínas antimicrobianas y antivirales, transductores de señal intracelulares, componentes del sistema RNAi, factores de transcripción, reguladores de apoptosis, proteasas e inhibidores de proteasas, proPO, proteínas de estrés oxidativo y moléculas de adhesión celular (Rojtinnakorn et al., 2002; Roux et al., 2002; Tonganunt et al., 2005; Ai et al., 2009; Liu et al., 2009b; Guertler 2010). Infecciones bacterianas y por hongos también modulan la expresión génica de moléculas inmunológicas. Camarones P. monodon infectados con V. harveyi presentan un aumento en la ex- presión de lisozima y ALF y una disminución de la expresión de serpinas (Somboonwiwat et al., 2006). Por otro lado, en juveniles de L. vannamei inyectados con LPS, ocurre una disminución de la expresión de varios AMPs (PEN2-4 y crustinas), siendo esta disminución dosis-dependiente (Okumu- ra, 2007). Ya, en F. paulensis desafiado con el hongo filamentoso Fusarium solani fue observado el aumento significativo en la expresión del inhibidor de proteasa α2M (Perazzolo et al., 2011). En un trabajo interesante, se analizó la expresión diferencial de genes en camarones L. vannamei seleccionados genéticamente, en cuanto a su susceptibilidad y resistencia a la infección por WSSV (Zhao et al., 2007). Varios genes fueron expresados diferencialmente en el hepatopáncreas de los camarones resistentes al WSSV. Hubo una mayor expresión constitutiva de hemocianina, lectinas CTLs, lisozimas, proteínas apoptóticas, enzimas oxidativas, proteínas reguladoras de la ecdisis, quitinasas, lacasas, catepsina L y zinco-proteinasas, en estos animales en relación a los camarones

285 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos susceptibles. Es interesante notar que la infección experimental de animales resistentes a WSSV es capaz de aumentar mucho más la expresión de algunos de estos genes, relacionados directa o indirectamente a las respuestas inmunes. En un estudio realizado por nuestro grupo, fueron evaluados los niveles de expresión de genes relacionados al sistema inmune de camarones (L. vannamei) susceptibles a infecciones por el WSSV y por el hongo F. solani (Gonçalves et al., 2014). A través de la tecnología de PCR cuantitativa en sistema de micro fluidos (fluidigm microfluidics dynamic arrays), fueron caracterizadas las funciones inmunológicas más afectadas en camarones durante infecciones por esos dos patógenos. Uno de los resultados más interesantes fue la identificación de firmas(signatures) de expresión génicas comunes a los dos patógenos, así como también de firmas(signatures) específicas para el virus y para el hongo. Mientras que una infección letal de WSSV indujo la expresión de diferentes genes relacionados a la respuesta antiviral, los niveles de expresión de diferentes genes del sistema inmune (especialmente aquellos relacionados con las respuestas antimicrobianas) fueron drásticamente disminuidos en infecciones con el hongo F. solani (Gonçalves et al., 2014). Factores ambientales estresantes también pueden modular la expresión de ciertos genes inmu- nológicos en camarones. La hipertermia parece inhibir la expresión de proPO y lisozima en juveniles de P. monodon, lo que puede implicar una menor resistencia a las infecciones en aguas más calientes (de la Vega et al., 2007). La expresión de la lisozima en esta especie, también es inhibida cuando los camarones son sometidos a estrés osmótico. Por otro lado, la hemocianina es súper-expresada en estos animales con estrés osmótico y su expresión es disminuida en condiciones de hipertermia e hipoxia (de la Vega et al., 2007). Un punto particularmente interesante se refiere al uso de inmunoestimulantes y la expresión de genes inmunológicos en camarones. En un estudio con L. vannamei, Ji et al. (2009) mostraron la modulación de varios genes de defensa después de la estimulación de los animales con varios PAMPs (laminarina, LPS y poly I:C). La estimulación con laminarina (β-1,3 glucanos), por ejemplo, fue capaz de aumentar la expresión de una lectina y de las enzimas antioxidativas SOD y catalasa. Ya la lisozima es modulada positivamente por los LPS de las bacterias Gram negativas, pero también, y curiosamente, por el PAMP viral, poly I: C. Por otro lado, la expresión de la proPO en los hemocitos disminuye drásticamente después de la inyección de cualquiera de los PAMPs mencionados en los camarones, lo que podría ser explicado por la disminución de los HGs circulantes en función de la presencia de los PAMPs (Ji et al., 2009). Recientemente, Yeh et al. (2010) mostraron que la inmersión previa de L. vannamei en compuestos extraídos del alga Gracillaria tenuistipitata tenía la capacidad de aumentar la resistencia de los animales a condiciones ambientales estresantes, como salinidad media (25 ppt) y todavía llevaba a un aumento significativo de la expresión de algunos genes inmunológi- cos, como la LGBP, la peroxinectina y la α2M. En resumen, el establecimiento de parámetros hemato-inmunológicos como indicadores de salud en crustáceos y los análisis moleculares de la expresión génica de moléculas inmunológicas, pueden proporcionar en conjunto, informaciones valiosas del estado de salud de los camarones cultivados, así como de los mecanismos relacionados en la interacción patógeno-hospedero. A pesar de representar todavía un campo relativamente nuevo, esta área merece ser desarrollada y mejor utilizada en la camaronicultura. En los últimos años ha ocurrido un considerable progreso en el estudio del sistema inmune de los crustáceos, a pesar de no poder contar todavía con un grupo de parámetros hemato-inmunológi- cos seleccionados, realmente sensible y de respuesta inequívoca, capaces de expresar con precisión las condiciones de salud de estos animales. Estudios de este tipo deberían ser fuertemente estimu- lados, en especial para crustáceos de interés económico como los camarones, que no pueden ser vacunados. Conviene resaltar, que varios factores limitan una interpretación segura e inequívoca de

286 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón los análisis de los parámetros hemato-inmunológicos en crustáceos. Uno de los principales factores se refiere a las enormes diferencias en los valores fisiológicos considerados “normales” o de “referencia” para una determinada especie. Estas diferencias están posiblemente relacionadas al tipo de ambiente en los que los animales se encuentran, la salinidad, temperatura, estado nutricional, edad, maturación sexual y estados de muda. Por otro lado, no existe todavía una estandarización de las técnicas utilizadas para evaluar estos parámetros en crustáceos y esto también lleva a resultados muchas veces conflictivos lo que dificulta comparaciones dentro de la misma especie o entre especies. Sería de fundamental importancia, buscar una padronización de estas técnicas entre los diferentes grupos de investigación que estudian a los crustáceos, para que se obtengan resultados más homogéneos y comparables.

6.8. Conclusiones y Perspectivas Como se ha mencionado varias veces en esta exposición, el principal factor limitante que amenaza la sostenibilidad de la camaronicultura a nivel mundial, son las enfermedades y principalmente las de origen viral. Se ha logrado mucho progreso últimamente, en llegar a una mejor comprensión de los mecanismos inmunológicos en crustáceos, destacándose la identificación de varias proteínas de reconocimiento de patrón (PRPs), la producción de varias familias de antibióticos naturales (AMPs) y los mecanismos de defensa antiviral, como la vía RNAi. Falta todavía aclarar muchos otros aspectos importantes, como las bases moleculares de la señalización celular y de la transducción de la señal, mecanismos ya razonablemente aclarados en algunos artrópodos como Drosophila y limúlidos, pero todavía poco conocidos en crustáceos. Las respuestas inmunológicas contra infecciones bacterianas y hongos, ya son relativamente bien comprendidas en crustáceos, como la activación del sistema proPO, el sistema de coagulación y la producción de ROIs. Por otro lado, la reciente identificación de diferentes AMPs de amplio espectro antimicrobiano, como el ALF está abriendo nuevas perspectivas con relación a los programas de selección genética (o transgénesis) de reproductores que expresan preferencialmente determinados tipos de AMPs, así como en el desarrollo de nuevos antibióticos para camaronicultura, capaces de evitar la inducción de resistencia en microorganismos y eliminar el riesgo de contaminación ambiental. El reciente descubrimiento del gene Dscam y su capacidad de generar una vasta diversidad de isoformas por recombinación somática, mediante desafío con patógenos implica en la inespera- da existencia de un sistema de reconocimiento inducido, específico y diversificado en crustáceos. Todavía no hay evidencias hasta el momento del papel de la Dscam en la memoria inmunológica de estos animales. En caso que esto sea verdadero, se abre la perspectiva de una vacunación específica y de largo plazo. Esto sería talvez uno de los principales aportes inmunológicos para la prevención y control de infecciones en la camaronicultura. En lo que se refiere a las respuestas antivirales, la detección reciente de un sistema RNAi y de moléculas semejantes funcionalmente a interferones de vertebrados en camarones, deberá en un futuro próximo orientar nuevas estrategias de terapia antiviral (basadas en dsDNA, por ejemplo) y en un control más eficiente de infecciones. Esfuerzos deberán ser realizados en el sentido de desarrollar técnicas de administración de dsRNA virales a los camarones (vía oral o uso de sistema de vectores plasmidiales o virales expresando hRNAs), que sean de bajo costo y compatibles con la camaronicultura, a fin de estimular el sistema de RNAi de los camarones de forma continua. Por otro lado, sería de gran interés confirmar si fragmentos génicos virales se insertan de hecho en el genoma de los camarones y resultan en la producción de dsRNAs de secuencia específica, como se ha divulgado por la hipótesis de acomodación viral de Flegel. Sin embargo, la heredabilidad de esta condición por la progenie de los camarones permanece dudosa y constituye un punto frágil de esta teoría.

287 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Cabe nuevamente resaltar, que la ausencia de líneas celulares permanentes de crustáceos, limita seriamente la realización de muchos análisis experimentales importantes, en especial los ensayos in vitro de infección y de actividad antiviral. Infelizmente, los esfuerzos para el desarrollo de estas líneas celulares de crustáceos, no han alcanzado todavía el éxito esperado. Se espera que en un futuro próximo esta limitación pueda ser superada y que líneas celulares de crustáceos puedan venir a sustituir definitivamente a la de peces marinos, actualmente empleados en ensayos biológicos de crustáceos, aun cuando no sean apropiadas. La utilización de sustancias inmunoestimulantes para llegar a un estado de mayor inmunocompetencia en crustáceos de interés económico, sobresale como una herramienta valiosa, una vez que estos animales no pueden ser vacunados. Sin embargo, el mecanismo de acción de estos compuestos es todavía pobremente comprendido y su efecto no es siempre reproducible. Se espera que, en un futuro próximo, la acción inmunológica de estos compuestos sea mejor comprendida y que la camaronicultura pueda disfrutar de una variedad de sustancias inmunoestimulantes realmente eficaces que puedan ser absorbidas por el intestino y ser desprovistas de efectos colaterales. Como se ha mencionado, la evaluación del estado de salud de los crustáceos, a través del examen de su hemolinfa, no suele ofrecer resultados precisos y seguros, como ocurre con el examen de sangre de mamíferos. En estos últimos, existe un patrón homogéneo y confiable de normalidad, que permite el establecimiento de valores de referencia para los diferentes parámetros hemato-inmu- nológicos. Contrariamente, en los camarones, los valores de referencia de sus parámetros pueden ser muy variables, hasta dentro de una misma población, mismo sexo o mismo estadío de desarrollo. Esto dificulta sobremanera el establecimiento de índices de referencia o de un patrón de normalidad en crustáceos, aún en el caso de simples hemogramas, tan utilizados en mamíferos. Como consecuencia, la comparación de los índices hemato-inmunológicos de los crustáceos saludables e infectados y/o estresados, no presenta muchas veces significancia estadística, lo que es frecuentemente observado en publicaciones. La actual posibilidad de poder cuantificar la expresión génica de inmunomarcadores en crus- táceos a través de PCR en tiempo real, puede ofrecer, a pesar de su alto costo, un cuadro más claro y confiable del estado de salud de los camarones durante la aparición de brotes infecciosos o situaciones de estrés. Vale entretanto resaltar, que la cuantificación de la expresión de los genes inmunológi- cos (transcritos génicos bajo la forma de RNAm) no sustituye la evaluación de los parámetros fisioló- gicos de la hemolinfa, una vez que la expresión de los genes (producción de RNAm) no garantiza su traducción (total o parcial) en inmunoefectores. Siendo así, es recomendable, si es posible, conjugar los análisis moleculares (expresión géni- ca) y fisiológicas (parámetros inmunológicos de la hemolinfa), a fin de llegar a resultados más confiables sobre la condición de salud de los animales. Desde un punto de vista aplicado, el conocimiento del sistema inmune de los crustáceos puede traer importantes subsidios y abrir nuevas perspectivas para: (1) desarrollar técnicas de diag- nóstico confiables para diferentes patologías; (2) establecer marcadores inmunológicos que indiquen precozmente la presencia de infecciones o de condiciones ambientales adversas; (3) validar el uso de terapias específicas para infecciones virales, bacterianas o para otras enfermedades; (4) desarrollar compuestos inmuno-estimulantes, y (5) auxiliar programas de selección genética de reproductores, a través de la identificación de animales más resistentes a las infecciones. Finalmente, vale resaltar, que no existe actualmente ningún genoma completo disponible de camarones. Sería verdaderamente interesante que el camarón L. vannamei pueda ser seleccionado como especie modelo para la secuenciación genómica completa, al ver su importancia económica en la camaronicultura mundial.

288 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

6.9 Referencias bibliográficas

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290 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

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304 CAPITULO 6 - Avances en la inmunología del camarón

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306 Capítulo 7 - Vigilancia epidemiológica en Camaronicultura

Capítulo 7

Vigilancia epidemiológica en Camaronicultura

307 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

308 Capítulo 7 - Vigilancia epidemiológica en Camaronicultura

Capítulo 7

Vigilancia Epidemiológica en Camaronicultura

Ignacio de Blas y Ana Muniesa Unidad de Enfermedades Infecciosas y Epidemiología, Laboratorio de Ictiopatología Departamento de Patología Animal Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza España

Introducción La camaronicultura supone una de las producciones acuáticas más importantes a nivel mundial, de forma que un foco de una enfermedad altamente contagiosa en una determinada región podría ocasionar graves perjuicios económicos y sociales por las mortalidades registradas y por las consecuencias que conllevaría el cierre del comercio internacional (FAO, 2014). La intensificación de la producción camaronera, la generalización de los movimientos de animales y alimentos a nivel local, regional e internacional y el cambio climático son factores que condi- cionan la diseminación de las enfermedades conocidas y la aparición de patologías emergentes. Por lo tanto, el control de las enfermedades que afectan a la acuicultura es de vital importancia y es necesario contar con herramientas que permitan prevenir y controlar posibles brotes de enfermedad (OIE, 2013). La FAO en su publicación “Sistema de prevención de emergencia de plagas y enfermedades transfronterizas de los animales y de las plantas” alerta sobre la importancia que tiene la prevención de las patologías en la acuicultura, ya que la falta de control de los movimientos comerciales de los animales acuáticos a nivel mundial está causando graves brotes de enfermedades, y una vez que se introduce un agente patógeno y se establece en el ambiente natural es difícil tratarlo o erradicarlo. De esta forma, el control de las enfermedades que afectan a las poblaciones acuáticas se convierte en una tarea compleja que debe realizarse con criterios rigurosos, y en la que se debe optimizar la detección precoz de las enfermedades de manera eficiente (Peeleret al., 2006). En un momento tan delicado como en el que nos encontramos actualmente, es de vital importancia que se implementen sistemas eficientes de vigilancia epidemiológica. La Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) es la responsable de definir las directrices para establecer programas de control, erradicación y vigilancia epidemiológica de una serie de enfermedades relevantes en acuicultura en lo que respecta a aspectos sanitarios y económicos que regulan el comercio internacional. Para ello publica y actualiza periódicamente dos documentos fundamentales: el Código Sanitario para los Animales Acuáticos (OIE, 2013) y el Manual de Pruebas de Diagnóstico para los Animales Acuáticos (OIE, 2014), más conocidos como el Código Acuático y el Manual Acuático respectivamente. La vigilancia epidemiológica en acuicultura tiene dos enfoques fundamentales: la detección de la enfermedad (como parte clave en los programas de detección precoz y de erradicación) y el cálculo de prevalencia (para evaluar la eficacia de los programas de control). Estas actividades se llevan a cabo frecuentemente en las explotaciones acuícolas, pero desafortunadamente a nivel regional o nacional son menos habituales debido a los altos costes económicos que conllevan y a su complejidad.

309 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

7.1. Generalidades sobre vigilancia epidemiológica La sanidad animal tiene una importancia creciente en la gestión de las producciones acuíco- las, por ello debemos conocer mejor la realidad epidemiológica de las poblaciones acuáticas, tanto cultivadas como silvestres, ya que el estado sanitario de unas puede repercutir en el estado de las otras (Subasinghe et al., 2004). Hay que tener en cuenta que en la mayoría de las investigaciones epidemiológicas no resulta eficiente ni viable trabajar con toda la población por razones logísticas (duración del estudio, disponibilidad de mano de obra, complejidad del estudio y/o difícil acceso a toda la información) y econó- micas (elevado coste del estudio, métodos de muestreo destructivos y/o baja rentabilidad esperada), y en consecuencia es necesario trabajar con muestras representativas de la población. El otro factor que debemos considerar es la capacidad de diferenciar los animales sanos de los enfermos. El diagnóstico laboratorial ha evolucionado notablemente en los últimos años, pero no podemos asumir que sean completamente fiables, incluso en el caso de las pruebas técnicamente más complejas y avanzadas. Por tanto al diseñar cualquier estudio epidemiológico deberemos llegar a un equilibrio entre el valor teórico deseable y el coste económicamente y logísticamente viable.

Finalidad Los estudios epidemiológicos pueden tener múltiples objetivos: identificar las enfermedades presentes en la población estudiada, determinar la extensión y localización de la enfermedad, establecer la importancia de las diferentes enfermedades que pueden afectar a una población, priorizar la utilización de los recursos disponibles para implementar programas de control y/o erradicación, diseñar planes de contingencia para hacer frente a la aparición de brotes de enfermedad y disponer de información veraz y actualizada para comunicar a organismos internacionales como la OIE (Klaucke et al., 1988). A nivel oficial se habla frecuentemente de vigilancia epidemiológica (surveillance), seguimien- to o monitoreo (monitoring) y estudios epidemiológicos observacionales (survey). En todos los casos se trata de técnicas de recogida sistemática de información epidemiológica que posteriormente es analizada y utilizada para gestionar más eficazmente las enfermedades estudiadas en una determinada población (Cameron, 2002; Thrusfield, 2005). Así pues, se hace preciso definir claramente cada uno de estos términos, aunque las bases metodológicas expuestas posteriormente sean válidas para todos ellos y en todos los casos son sistemas basados en la recogida y análisis sistemático y continuado de información sanitaria en una población, difieren en los objetivos planteados (Subasinghe et al., 2004). El objetivo específico de la vigilancia epidemiológica es establecer que una población está libre de una determinada infección o enfermedad, o detectar la introducción de una enfermedad nueva u exótica con el objetivo de establecer rápidamente medidas de control y erradicación. Los programas de seguimiento tienen como finalidad conocer el comportamiento y evolución de una determinada infección o enfermedad que está presente, mediante la descripción y reporte de brotes y la estimación de la prevalencia y/o la incidencia. Los estudios observacionales tienen objetivos más amplios y buscan conocer mejor el comportamiento de la enfermedad y sus relaciones con otros factores dependientes del agente, del hospedador o del ambiente.

310 Capítulo 7 - Vigilancia epidemiológica en Camaronicultura

Según los Centros de Control de Enfermedades de EE.UU. (CDC), un buen sistema de vigilancia epidemiológica debería reunir las siguientes características: rapidez en la obtención de resultados (toma de datos y posterior procesado), sensibilidad y especificidad, representatividad, aplicabilidad de los resultados a la toma de decisiones, simplicidad y flexibilidad (Klaucke et al., 1988).

Clasificación de los sistemas de vigilancia epidemiológica Según la intensidad de los esfuerzos realizados en la recogida de información podemos diferenciar entre sistemas de vigilancia pasiva y vigilancia activa (Cameron, 2002; Corsin et al., 2009). En los sistemas de vigilancia pasiva los responsables de realizar el estudio no programan ninguna actividad para tomar los datos, tan sólo establecen mecanismos para que los productores y otros agentes implicados (veterinarios, biólogos, técnicos…) informen de la existencia de brotes de enfermedad o de la aparición de síndromes y/o mortalidades anormales en las poblaciones estudiadas, tanto cultivadas como silvestres. A pesar de que los sistemas de vigilancia pasiva presentan múltiples limitaciones derivadas de la infranotificación de los brotes de enfermedad, proporcionan una importante información sanitaria ya que permiten identificar las enfermedades presentes en la población (previa confirmación laboratorial) y localizar los brotes de enfermedad para actuar frente a ellos. De esta forma, se convierten en uno de los elementos básicos de cualquier sistema de notificación de enfermedades de declaración obligatoria. En el caso de la vigilancia activa los responsables del sistema llevan la iniciativa, diseñan y ejecutan la recogida periódica de información mediante encuestas epidemiológicas, inspecciones sanitarias y/o toma de muestras para diagnóstico laboratorial. Cuando deseamos controlar una determinada enfermedad es necesario implementar este tipo de sistemas de vigilancia recopilando las características de la población estudiada (censos de explotaciones, movimientos de animales…), así como la información sanitaria que defina correctamente la situación real de la enfermedad. Por otra parte según la especificidad del estudio también pueden clasificarse como sistemas de vigilancia general o dirigida (Thrusfield, 2005; Corsin et al., 2009). Los sistemas de vigilancia general estudian de forma global cualquier enfermedad susceptible de aparecer en la población, con especial énfasis en las que figuran en las listas de la OIE, mientras que en la vigilancia dirigida, los esfuerzos se centran en conocer el estatus de una infección en la población, por lo que es preciso disponer de técnicas laboratoriales específicas y estandarizadas. Normalmente la vigilancia pasiva suele ser general, mientras que la vigilancia activa suele ser dirigida por lo que a veces se utilizan indistintamente ambas denominaciones como equivalentes (pasiva-general y activa-dirigida).

Nuevos enfoques La aplicación de los sistemas de vigilancia clásicos en poblaciones acuáticas presenta numerosas limitaciones relacionadas con la dinámica de poblaciones (movimientos comerciales y movimientos migratorios de animales silvestres), la heterogeneidad de las poblaciones (condiciones de producción, variabilidad en la susceptibilidad y relaciones ecológicas complejas), la exposición cam- biante a un conjunto variable de factores de riesgo y la interacción entre patógenos. Por esas razones, se hace necesario mejorar los sistemas de vigilancia epidemiológica y adaptarlos a cada situación.

311 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Entre los enfoques alternativos propuestos para aumentar la eficiencia, hay que destacar la vigilancia epidemiológica basada en riesgo y la vigilancia sindrómica. Estos sistemas son complementarios a los sistemas existentes y no pretende sustituirlos, y buscan cubrir, en la medida de lo posible, las lagunas que eventualmente quedan, tanto en vigilancia como en control. Los sistemas de vigilancia basada en el riesgo (risk-based surveillance) tienen como finalidad aumentar la vigilancia en aquellas explotaciones que tengan mayor riesgo sanitario. Esta metodología fue propuesta por la OIE y su implementación ha supuesto un gran avance en sanidad acuícola. El análisis de riesgo permite identificar los patógenos que pueden amenazar a una población y analizar las probabilidades de que cada patógeno se introduzca en la población, se establezca y se disemine, así como sus consecuencias. En función del nivel de riesgo se diseña un programa de vigilancia específico para cada situación priorizando la utilización de los recursos disponibles en los eventos más relevantes desde el punto de vista sanitario. Según el Código Acuático (OIE, 2013), el análisis del riesgo comprende varias fases. En primer lugar se debe identificar la amenaza o peligro (hazard), determinando las enfermedades que deben ser objeto de vigilancia, así como sus consecuencias en la sanidad animal y la salud pública. A conti- nuación, se procederá a la evaluación del riesgo estimando el riesgo asociado a cada amenaza. Una evaluación cualitativa puede ser suficiente en la mayoría de los casos, pero como mínimo se deben identificar y evaluar los distintos factores relacionados con los riesgos de entrada, establecimiento y diseminación del patógeno así como con las consecuencias biológicas y económicas derivadas de la enfermedad. En función del nivel de riesgo estimado para cada enfermedad se propondrán medidas de gestión del riesgo, distribuyéndose los recursos disponibles de forma proporcional al riesgo de cada enfermedad a vigilar, y se marcarán las pautas para seleccionar las poblaciones y los individuos más adecuados (con mayor riesgo). El último elemento es la comunicación del riesgo entre todos los posibles involucrados. En general este tipo de sistemas mejoran notablemente la relación coste-beneficio, son muy eficientes y son adecuados para la vigilancia de enfermedades emergentes y exóticas. Sin embargo, en muchas ocasiones no se dispone de la información suficiente, y la metodología no está estanda- rizada ni validada. Otra limitación importante de los sistemas de vigilancia clásicos es la necesidad de diagnosticar numerosas muestras, lo que supone un alto coste económico y requiere una importante infraestructura de laboratorios diagnósticos. Por este motivo, para determinadas enfermedades se han establecido redes de alerta sanitaria basadas en sistemas de vigilancia sindrómica (también denominados de sistemas de detección temprana de eventos), donde se pretende identificar la aparición de los patógenos, y predecir su evolución, en función de variables relacionadas con el consumo de fárma- cos, las consultas sanitarias o la productividad. Un ejemplo de este tipo de vigilancia es el Sistema de Alerta Epidemiológico y de Manejo Acuícola (SAEMA) desarrollado en Ecuador (Bayot et al., 2008). Un punto importante de estos sistemas es que la definición del caso es deliberadamente ines- pecífica con el fin de aumentar la sensibilidad del sistema. Es decir, en la vigilancia sindrómica se buscan síndromes en lugar de enfermedades diagnosticadas y confirmadas. Se basan en el registro informatizado de datos que se analizan en tiempo real. Los sistemas informáticos en los que se alma- cena la información detectan automáticamente cambios o aberraciones en la información acumulada que desencadenen una alerta del sistema. Por tanto, una adecuada implementación de estos sistemas permiten identificar la aparición muy precoz de patógenos emergentes, predecir su evolución y optimizar recursos (personal, diag- nóstico…).

312 Capítulo 7 - Vigilancia epidemiológica en Camaronicultura

7.2. Investigación de brotes de enfermedad La investigación de un brote es un elemento fundamental de los programas de vigilancia pasiva, ya que ante cualquier notificación de mortalidades anómalas o crecimientos disminuidos se debe proceder a la toma de muestras para confirmar la causa del brote y/o descartar que se trate de una enfermedad de declaración obligatoria. Es importante unificar criterios a la hora de notificar un brote y se debe incluir información relativa a tres cuestiones básicas (tiempo, lugar y población). Se define caso, como cualquier individuo de la población que presenta una enfermedad, alteración del estado de salud o una determinada característica. Según el procedimiento utilizado para identificar el caso, la definición puede variar, de manera que podemos basarnos en observaciones clínicas (aparición de síntomas y lesiones), pruebas diag- nósticas y/o análisis laboratoriales, pudiendo establecer rangos de valores normales de referencia. Con el fin de estandarizar criterios a la hora de realizar la notificación oficial a los organismos sanitarios correspondientes, CDC publicó una clasificación de los casos según su definición (Whar- ton et al., 1990), de forma que se debe diferenciar entre: • Caso compatible clínicamente: cuando el individuo presenta síntomas y lesiones propias de la enfermedad • Caso asociado epidemiológicamente: cuando el individuo ha mantenido contacto con uno o más casos (actuales o pasados) o se ha expuesto a una fuente de infección, pudiendo existir mecanismos de transmisión plausibles. Permiten establecer la cadena de transmisión de la enfermedad y la identificación del origen de la enfermedad • Caso confirmado por laboratorio: cuando se obtienen resultados positivos por uno o varios mé- todos laboratoriales oficialmente reconocidos para esa enfermedad. Es necesario considerar la fiabilidad de la prueba diagnóstica utilizada Además, a efectos de notificación oficial de enfermedades de declaración obligatoria, y para garantizar el correcto funcionamiento de los sistemas de alerta sanitaria, también se establecen otras categorías: • Caso confirmado: cuando reúne todos los criterios establecidos en la definición • Caso probable: reúne bastantes criterios diagnósticos pero son insuficientes. Normalmente se trata de individuos con fuertes evidencias clínicas y epidemiológicas que están pendientes de una confirmación laboratorial • Caso sospechoso: hace referencia al individuo que cumple alguno de los criterios y que precisa de un estudio más detallado para obtener más información Hay que tener en cuenta que a veces se utiliza el término caso para hacer referencia a la apa- rición de la enfermedad por primera vez en un determinado lugar, lo cual genera confusión con las definiciones relativas a un individuo enfermo o infectado. Por esta razón, el término adecuado e internacionalmente aceptado, para referirse a la aparición de la enfermedad (o infección) en un nuevo lugar (sin casos previos) es brote epidémico (outbreak).

Método de muestreo Cuando las autoridades sanitarias son alertadas sobre un brote de enfermedad (manifestado como un incremento anormal de la mortalidad o una disminución del crecimiento) se debe proceder a realizar una investigación epidemiológica para establecer su etiología.

313 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

De forma general se recomienda realizar un muestreo no probabilístico seleccionando pre- ferentemente camarones moribundos o enfermos, y descartando los animales muertos. La muestra debe ser conservada en las condiciones adecuadas y remitirse a la mayor brevedad a los laboratorios diagnósticos.

Tamaño de muestra necesario Normalmente se estima que en estas condiciones con 8-10 animales es suficiente para poder identificar la causa del problema, aunque no se descarta la toma de muestras adicionales en caso de que sea necesario. Mientras se esperan los resultados laboratoriales se implementarán medidas extraordinarias de bioseguridad en la explotación afectada y se restringirán completamente los movimientos de animales, tanto de entrada como de salida.

Fiabilidad diagnóstica Toda investigación epidemiológica requiere conocer el estado de salud o enfermedad (o de infección) de los individuos de la población estudiada. Tradicionalmente la diferenciación de sanos y enfermos se llevaba a cabo mediante la emisión de juicios clínicos basados en la observación de síntomas y lesiones (diagnóstico clínico y anatomopatológico); sin embargo, en los últimos años ha evolucionado hacia el estudio de la infección, es decir, la detección de individuos infectados por un determinado agente (diagnóstico etiológico). A pesar de ello se continúa utilizando el término de enfermedad, que la propia OIE define como “infección con o sin sintomatología clínica” (OIE, 2013). Uno de los principales retos de la epidemiología moderna es asumir que los protocolos diag- nósticos son imperfectos, y que debe evaluarse su fiabilidad. Los dos parámetros que determinan la calidad del diagnóstico son la sensibilidad y la especificidad. La sensibilidad es la probabilidad de detectar correctamente a un individuo enfermo (es decir, que no existan falsos negativos), y la especificidad es la probabilidad de detectar correctamente a un individuo sano (es decir, que no existan falsos positivos). Los expertos en diagnóstico de laboratorio también utilizan los términos de sensibilidad y especificidad, pero haciendo referencia a conceptos distintos aunque relacionados. Normalmente definen sensibilidad de una prueba diagnóstica, como el número de organismos patógenos que la prueba es capaz de detectar por unidad de muestra, y en este caso sería más apropiado hablar de nivel umbral de detección. De la misma forma, definen una prueba como específica cuando está diseñada para un patógeno concreto, y que se ha evaluado frente a patógenos similares obteniéndose resultados negativos. Efectivamente, esos ensayos dan idea de la especificidad de la prueba diagnós- tica pero no cuantifican dicho valor, y además no suelen ser los suficientemente exhaustivos para garantizar que la prueba sea completamente específica para el patógeno estudiado (de Blaset al., 2007). Otro factor a considerar es que habitualmente sólo se evalúa la fiabilidad diagnóstica de la téc- nica laboratorial. Sin embargo, hay que valorar que se trata de un protocolo diagnóstico en el que las muestras para realizar la investigación epidemiológica son recogidas en condiciones de campo y es necesario tener en cuenta cómo influye el tipo de tejidos seleccionados, el transporte y conservación del material patológico, así como la recepción y posterior procesado del mismo. Por otra parte, una adecuada prueba diagnóstica debería reunir las siguientes propiedades: reproductibilidad (que corresponde con el grado de repetibilidad y fiabilidad de los resultados obtenidos al aplicarse en situaciones similares), validez (que indica la exactitud y precisión obtenida al aplicar la prueba), fiabilidad (es la capacidad de la prueba para predecir correctamente la situación del

314 Capítulo 7 - Vigilancia epidemiológica en Camaronicultura individuo, es decir si el resultado se corresponde con el valor real) y aplicabilidad (es la posibilidad de utilizar una prueba teniendo en cuenta una serie de criterios que permiten estimar su eficacia y eficiencia como son la rapidez en la obtención de resultados, la sencillez de ejecución de la técnica, el coste económico y la existencia de efectos secundarios) (Thrusfield, 2005). Está claro que es inevitable la utilización de pruebas diagnósticas en una investigación epi- demiológica, y como hemos indicado presentan el inconveniente de que son imperfectas. En consecuencia, se deberá evaluar la fiabilidad de una determinada prueba y para ello necesitamos disponer de una prueba de referencia con cual compararla, que denominamos prueba de oro (gold standard) en la que todos los animales enfermos son diagnosticados como positivos, y todos los animales sanos como negativos. Para el diagnóstico de algunas enfermedades de los camarones se ha considerado el diagnóstico histopatológico como prueba de oro, a pesar de que sus resultados dependen del tiempo invertido en buscar determinadas lesiones (por ejemplo cuerpos de inclusión para WSSV) y que la ausencia de esas lesiones no implica necesariamente la ausencia de infección. En los últimos años la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en la prueba de oro para el diagnóstico de infección. En algunos casos se puede reemplazar la prueba de oro, por un diseño experimental que nos permita crear el grupo de animales enfermos mediante infección experimental, aplicando los pos- tulados de Henle-Koch (mediante la exposición de animales susceptibles a altas concentraciones de un determinado patógeno en las condiciones ambientales adecuadas) y el grupo de animales sanos utilizando camarones SPF (Specific Pathogen Free). Para validar o evaluar una determinada prueba diagnóstica, construiremos una tabla de contingencia que resuma los resultados obtenidos al aplicar simultáneamente sobre un grupo de camarones la prueba de oro y la prueba a evaluar (Tabla 1) (Thrusfield, 2005).

Tabla 1. Tabla de contingencia para la evaluación de una prueba diagnóstica.

Prueba de oro Positivos (enfermos) Negativos (sanos)

Positivos Verdaderos positivos (a) Falsos positivos (b) Prueba a evaluar Negativos Falsos negativos (c) Verdaderos negativos (d)

En esta tabla de contingencia observamos que existen coincidencias en el diagnóstico (verdaderos positivos y verdaderos negativos), pero también pueden existir discrepancias (falsos positivos y falsos negativos). Estos resultados incorrectos puede deberse tanto a errores en la elección y apli- cación de la prueba diagnóstica, como en el método de obtención, selección y conservación de la muestra analizada (sobre todo en el caso de los falsos negativos) (de Blas et al., 2007). A partir de la tabla de contingencia anteriormente descrita podemos calcular los dos pará- metros principales que definen la fiabilidad de una prueba diagnóstica: sensibilidad y especificidad. La sensibilidad es la probabilidad de detectar correctamente (diagnóstico positivo) a un individuo enfermo y se puede calcular como el cociente entre el número de verdaderos positivos (enfermos detectados por la prueba evaluada) y el número total de enfermos reales:

315 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Es evidente que una prueba muy sensible dará pocos falsos negativos y por tanto tendrá utilidad para descartar la presencia de enfermedad. En el caso particular de la investigación de brotes de enfermedad no suelen presentarse problemas de sensibilidad, ya que se suelen seleccionar camarones enfermos en fase aguda, cuyos tejidos presentan elevadas concentraciones del patógeno. La especificidad, es la probabilidad de detectar correctamente (diagnóstico negativo) aun individuo sano y se calculará como el cociente entre el número de verdaderos negativos (sanos detectados por la prueba evaluada) y el número total de sanos reales:

De forma análoga, una prueba muy específica tendrá pocos falsos positivos y por eso permitirá confirmar la presencia de enfermedad. En las poblaciones de animales acuáticos, incluidos los camarones, es habitual encontrar co- infecciones por varios patógenos lo que puede afectar a la especificidad del diagnóstico. A continuación planteamos como ejemplo un experimento diseñado para evaluar una nueva prueba diagnóstica frente a un determinado patógeno. En primer lugar se infectaron experimentalmente 100 camarones y tras un periodo de incubación de 7 días se tomaron muestras de todos ellos resultando 85 positivos y el resto negativos. Adicionalmente se procesaron 200 camarones SPF obteniendo 10 resultados positivos y 190 negativos (Tabla 2).

Tabla 2. Ejemplo de evaluación de una prueba diagnóstica.

Prueba de oro (Grupos experimentales)

Enfermos (infectados Negativos experimentalmente) (SPF)

Positivos 85 10 Prueba a evaluar Negativos 15 190

En este ejemplo la sensibilidad será 85% (85 resultados positivos de 100 camarones enfermos) y la especificidad será 95% (190 resultados negativos de 200 camarones sanos). Para terminar este apartado, indicaremos que una estrategia frecuentemente utilizada en la investigación de las enfermedades, es la combinación de varias pruebas diagnósticas con el objetivo de incrementar la fiabilidad del diagnóstico final. Se pueden aplicar dos métodos para combinar los diagnósticos: en serie y en paralelo (Thrusfield, 2005; de Blas et al., 2007). El diagnóstico en serie tiene como objetivo reducir los falsos positivos con el consiguiente aumento de la especificidad, lo que permite confirmar la enfermedad (un resultado positivo será una evidencia muy concluyente de la presencia del patógeno ya que apenas existirán falsos positivos). En esta estrategia, sólo se consideran positivos aquellos casos que resultaron positivos por ambas técnicas y como negativos a todos los demás. Normalmente en este tipo de combinación, las pruebas diagnósticas se aplican de forma secuencial: inicialmente se utiliza la prueba diagnóstica más eco-

316 Capítulo 7 - Vigilancia epidemiológica en Camaronicultura nómica y/o rápida, y en segundo lugar se aplica la otra prueba diagnóstica (más costosa o laboriosa) sólo a las muestras positivas. De esta forma, se logra una importante reducción de la carga de trabajo laboratorial y de los costes económicos. Sin embargo, la sensibilidad se reducirá. En el diagnóstico en paralelo se busca minimizar los falsos negativos de manera que se incre- mente la sensibilidad, y en consecuencia se pueda descartar la enfermedad (un resultado negativo permitirá afirmar con gran seguridad que se trata de un animal sano, ya que el número de falsos negativos será muy bajo). En este caso, se clasifican como negativas todas las muestras que son negativas con las dos técnicas diagnósticas, mientras que el resto se consideran positivas. A diferencia de la combinación en serie, la aplicación secuencial no aporta ninguna ventaja en la combinación en paralelo, y es preferible aplicarlas de forma simultánea para reducir los tiempos de obtención de resultados. Dada la urgencia existente en el diagnóstico de un brote de enfermedad, esta estrategia sería de elección ya que se aumenta la sensibilidad y se obtienen resultados más rápidamente, a pesar de que la especificidad empeora.

7.3. Vigilancia epidemiológica para detectar enfermedad

Objetivo Todos los programas oficiales de sanidad acuícola deben constar de un sistema de detección precoz de enfermedades que proporcione las evidencias necesarias para la adecuada certificación de los movimientos de animales y sus productos, la notificación de enfermedades a organismos internacionales y la verificación del estatus de libre de enfermedades. Además, cualquier programa de vigilancia epidemiológica debe estar respaldado por un plan de contingencia para saber cómo actuar en caso de emergencia ante un brote o la detección de un patógeno (Subasinghe et al., 2004). Con el fin de obtener el estatus de libre de enfermedad, y posteriormente mantenerlo, se debe implementar un plan de vigilancia adecuado. Por una parte, se incluirán medidas de tipo pasivo general para detectar las enfermedades emergentes y exóticas, así como, para monitorear los brotes de las endémicas. Pero el componente fundamental en estos programas es la inclusión de acciones de vigilancia activa y dirigida.

Método de muestreo El objetivo de este tipo de programas de vigilancia epidemiológica es maximizar la posibilidad de detectar la presencia de un determinado patógeno en los animales de la población en estudio, y su eficacia dependerá de que se aplique un método de muestreo adecuado y se tome un número suficiente de animales en las distintas poblaciones estudiadas (especialmente los nuevos lotes intro- ducidos en la explotación). Los métodos de muestreo que se deben utilizar serán de tipo no probabilístico, y se caracterizan porque cada individuo de la población tiene una probabilidad desconocida y variable de formar parte de la muestra, es decir, no hay intervención del azar en el proceso de selección que puede estar dirigido por el investigador (Cameron, 2002). Este tipo de muestreos son de ejecución simple y rápida, y no es preciso conocer el censo completo de los individuos de la población. Sin embargo, las muestras obtenidas no suelen ser representativas ya que están fuertemente sesgadas y no permiten describir adecuadamente la población estudiada. Siempre que sea posible, se aplicará un muestreo basado en criterios objetivos relacionados con características intrínsecas del animal (especie, sexo, edad…) o extrínsecas, tanto ambientales (temperatura, salinidad, oxígeno disuelto…) como zootécnicas (densidad de animales, intensifica-

317 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos ción, crecimiento…). Además, habrá que tener en cuenta que podemos encontrar dos posibles situaciones en función de la presencia o no de camarones con sintomatología clínica. En consecuencia, primero deberemos seleccionar animales sospechosos con síntomas y lesiones externas compatibles con la enfermedad estudiada, y en el caso de que no haya camarones sintomáticos seleccionaremos los animales en función de la presencia de factores de riesgo asociados con la infección por el pató- geno (ejemplos: muestrear cuando la temperatura del agua sea inferior a 28ºC para detectar WSSV o seleccionar camarones de peso inferior a 3 g para la detección del Vibrio parahaemolyticus causante del EMS/AHPND). Otra práctica habitual es establecer cuotas de muestreo donde se selecciona un número determinado de individuos perteneciente a unos estratos preestablecidos. Por ejemplo, cuando una muestra de 150 camarones se selecciona sin tener en cuenta la población de cada estanque y se toman 30 animales de 5 estanques diferentes. En este caso, se toma el mismo número de animales en un estanque con 100.000 individuos que en uno con 300.000 individuos, por lo que la muestra no es homogénea. Además de los métodos de muestreo basado en criterios objetivos y por cuotas, existen otros métodos no probabilísticos habitualmente utilizados en camaronicultura que están contraindicados por distintos motivos. Uno de ellos es el muestreo de conveniencia en el que el investigador selecciona a los individuos más accesibles, esto es lo que ocurre cuando se obtienen todos los camarones mediante el lanzamiento de una atarraya en un mismo punto del estanque más accesible. Otro méto- do es el muestreo de voluntarios, donde los individuos investigados deciden voluntariamente formar parte del estudio. Un ejemplo clásico de este tipo de muestreos ocurre cuando se ofrece alimento a los animales y se captura a los primeros que se acercan a comer. De esta forma aumentan las posibilidades de seleccionar animales sanos, que es justo el objetivo contrario al deseado.

Tamaño de muestra necesario El objetivo de este tipo de estudios es detectar la presencia de al menos un animal enfermo (o infectado) en una población donde se sospeche que una enfermedad está presente con una determinada prevalencia. En función de la prevalencia se puede calcular el número de animales enfermos esperados en esa población, como el producto de la prevalencia y el tamaño de la población. El tamaño de muestra estará directamente relacionado con el número esperado de enfermos, de forma que, cuantos más enfermos haya en la población, más probable es que seleccionemos a uno de ellos, y por lo tanto disminuirá el tamaño de muestra necesario. El cálculo del tamaño de la muestra necesario se realiza utilizando la siguiente fórmula (Can- non, 2001) donde n es el tamaño de la muestra necesario, NC es el nivel de confianza (habitualmente se establece en 95%, lo que equivale a un error a igual a 0.05), S es la sensibilidad de la prueba diag- nóstica, d es el número esperado de animales enfermos o infectados (se puede calcular multiplicando la mínima prevalencia esperada y el tamaño de la población) y N es el tamaño de la población. El resultado obtenido deberá siempre redondearse al alza.

Planteamos un primer ejemplo en el que se desea determinar, con un 95% de nivel de confianza, si un tanque con 10.000 postlarvas está infectado con WSSV. Se establece una prevalencia míni- ma del 2% (asumimos que el virus está presente en al menos el 2% de los animales de la población, es decir, d=200). Si sustituimos esos datos en la fórmula, y asumiendo que el diagnóstico es perfecto (S=1), será necesario tomar una muestra mínima de 148 postlarvas.

318 Capítulo 7 - Vigilancia epidemiológica en Camaronicultura

Con el fin de adquirir el estatus de explotación autorizada (libre de determinadas enfermedades) la OIE establece que para detectar la enfermedad hay que tomar una muestra adecuada dos veces al año en función de la prevalencia esperada. En poblaciones acuáticas (con miles de animales) suele asumirse una prevalencia mínima del 2% y con un 95% de confianza por lo que se recomienda una muestra de 150 animales (que se corresponde aproximadamente con los 148 animales calcula- dos en el ejemplo anterior). Como resultado de aplicar esta fórmula a prevalencias de 5 y 10%, se obtienen los tamaños de muestra de 60 y 30 animales respectivamente, que con frecuencia son los utilizados en estudios epidemiológicos. Es importante ser consciente de que al trabajar con poblaciones grandes el tamaño de la muestra se estabiliza de manera que la fracción de muestreo se va reduciendo drásticamente. Esta característica es muy interesante cuando trabajamos con piscinas de engorde, pero sin embargo, se convierte en un gran problema cuando trabajamos con reproductores ya que suelen ser grupos poco numerosos donde la fracción de muestreo puede alcanzar valores superiores al 50%. A menudo, esto es inviable debido al elevado valor económico de estos animales y a que los diagnósticos utilizados suelen ser de tipo destructivo (requieren el sacrificio de los camarones), por eso lo más adecuado es tratar de detectar la enfermedad en la descendencia, ya que en las especies acuáticas se caracteriza por ser muy numerosa.

Fiabilidad diagnóstica Otro factor importante que rara vez se tiene en cuenta al diseñar el muestreo de los programas de vigilancia epidemiológica es la fiabilidad diagnóstica, especialmente la falta de sensibilidad. Sirva como ejemplo la repercusión que tendría sobre el tamaño muestral en el caso anterior, la utilización de una prueba diagnóstica con una sensibilidad del 90% donde el tamaño de muestra aumentaría a 164 (un incremento del 11%). Tal y como hemos comentado anteriormente la fiabilidad de la prueba diagnóstica es un factor determinante, ya que el objetivo es la detección del patógeno. En este caso seleccionaremos la prueba que nos ofrezca el valor más alto de sensibilidad para minimizar el número de falsos negativos, y así evitar en lo posible el riesgo sanitario que conlleva no detectar un animal infectado en la población estudiada. Hay que tener en cuenta que determinadas prácticas diagnósticas influyen en los resultados finales obtenidos, por ello, hay que insistir que se debe conocer las características del protocolo diagnóstico completo (no sólo de la técnica diagnóstica llevada a cabo en el laboratorio) y valorar determinadas prácticas generalizadas en el diagnóstico, como son la utilización de muestras combi- nadas (pools). La utilización de pools se ha convertido en una práctica habitual en el diagnóstico de enfermedades de camarones y otras especies acuáticas, e incluso está recomendada por la OIE (2014). Esta estrategia permite aumentar el número de muestras procesadas para detectar un patógeno, disminuyendo notablemente el tiempo de procesado y los costes económicos. Sin embargo, el principal problema de utilizar muestras diagnósticas constituidas por tejido procedente de más de un animal, es la aparición del efecto dilución que puede disminuir la sensibilidad de la prueba original cuando se aplica de forma individual. Este efecto puede manifestarse cuando se trabaja con bajas prevalencias de enfermedad, cargas de patógeno reducidas (por ejemplo, al tratarse de portadores asintomáticos) o excesivo número de muestras en un mismo pool (Muniesa et al., 2014).

319 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

En este contexto las técnicas de diagnóstico molecular contribuyen a identificar los patóge- nos de forma rápida y fiable, incluso cuando hay muy pocas copias del genoma del patógeno en una muestra. A pesar del excelente nivel umbral de detección, hay que ser consciente de la posible pérdida de sensibilidad debida al efecto dilución. En la Figura 1 se aprecia este efecto, y cómo para una prueba diagnóstica con un nivel de detección de 104 organismos/g pueden generarse falsos negativos al reducirse la concentración de patógenos por debajo de dicho nivel de detección, y en consecuencia disminuir la sensibilidad (Corsin & de Blas, 2010). En el primer caso el resultado del pool sería positivo, pero en el segundo caso sería negativo al ser la concentración final inferior a nivel de detección.

105 0 0 0 0 0 0 0 0 0 = 104

104 0 0 0 0 0 0 0 0 0 = 103

Figura 1. Efecto de la dilución en la sensibilidad de una prueba diagnóstica en relación con el nivel de detección.

Cálculo de resultados En el caso de que todas las muestras de una población sean negativas, no se puede afirmar que la enfermedad está ausente en dicha población. Se deberá calcular la máxima prevalencia aparente posible a partir del máximo número de positivos (D) que pueden quedar en una población, utilizando la siguiente fórmula (Thrusfield, 2005):

En esta ecuación n corresponde con el tamaño de la muestra seleccionado (todas ellas presentando resultados negativos), NC es el nivel de confianza yN es el tamaño de la población. Una vez obtenido el máximo número de positivos, lo dividiremos por el tamaño de la pobla- ción para conocer la prevalencia máxima posible (Pmax). Como comentaremos en el siguiente apartado se trata de una prevalencia aparente, y a partir de la misma se podría estimar la prevalencia real conociendo la sensibilidad y especificidad de la prueba diagnóstica:

Por ejemplo, en un determinado estanque se han analizado tan sólo 20 camarones, ya que por razones económicas no se ha podido realizar más pruebas diagnósticas. En todos los diagnósticos se han obtenido resultados negativos de forma que al sustituir en la fórmula anterior, encontramos que con un 95% de confianza la prevalencia máxima posible podría ser todavía de 13,9%, lo cual es insuficiente para poder afirmar que el estanque está libre de enfermedad (a pesar de que los 20 camarones analizados eran negativos).

320 Capítulo 7 - Vigilancia epidemiológica en Camaronicultura

7.4. Vigilancia epidemiológica para estimar prevalencia

Objetivo Una vez que un patógeno es detectado, se requiere establecer un programa de vigilancia es- pecífico para definir la distribución espacial, la evolución temporal y la magnitud del problema, con el fin de evaluar la viabilidad de las medidas de control disponibles y, donde se considere oportuno, demostrar el éxito de los programas de control y erradicación (Subasinghe et al., 2004). En el caso anterior, la finalidad de la vigilancia epidemiológica era detectar la enfermedad y los resultados posibles eran sólo dos: presencia o ausencia. Sin embargo, en los sistemas de monitoreo o seguimiento, el objetivo es describir la situación sanitaria de una población mediante el cálculo de la probabilidad de que los individuos estén infectados.

Método de muestreo Cuando se desea conocer la prevalencia de una determinada enfermedad en una población es fundamental que la muestra sea representativa para que los resultados de la misma sean extrapolables a toda la población. Esta representatividad implica que la muestra cumpla dos requisitos: homogeneidad y aleatoriedad. Una muestra se considera homogénea con la población cuando las características de los individuos de la muestra no difieren de las que tiene la población. Es decir, si en nuestra población la distribución por sexos es 50% machos y 50% hembras, se esperaría encontrar una proporción similar de machos y hembras en la muestra obtenida. El otro requisito es que los individuos tienen que ser seleccionados al azar, y por tanto todos los individuos de la población tendrán igual probabilidad de formar parte de la muestra. Por lo tanto, para obtener una muestra representativa tendremos que seleccionar un número suficiente de unidades (dependiendo del objetivo del estudio) con un método de muestreo probabi- lístico. Básicamente hay dos métodos probabilísticos: el muestreo simple o aleatorio puro y el muestreo sistemático (Martin et al., 1990). El muestreo simple consiste en la selección de las unidades de una población utilizando un sistema de loterías (o tablas de número aleatorios) aplicado sobre el listado completo de las unidades de la población (censo). Este método es difícil de aplicar en grandes poblaciones de animales ya que supone tener identificados a priori e inequívocamente a todos los individuos (sólo ocurriría en algunos casos con los reproductores), implica elevados costes económicos en la obtención de la muestra (sobre todo con poblaciones muy dispersas) y no suele representar adecuadamente a los estratos minoritarios de la población. Sin embargo, en camaronicultura este método sería el de elección para seleccionar estanques en una explotación cuando la unidad muestral sea el estanque, por ejemplo cuando se desea conocer la proporción de estanques infectados. Como alternativa se puede utilizar el muestreo sistemático que se considera un método pro- babilístico aunque no es propiamente un muestreo aleatorio puro. Se aplica cuando no se dispone de sistema de identificación individual ni listados completos de la población, pero sin embargo, se pueden ordenar los individuos (ejemplo, el orden en el que son capturados los camarones) y aplicar un patrón periódico para seleccionar los individuos de la muestra. El procedimiento a seguir es muy simple, en primer lugar se ordenan todos los individuos de la población (N) y se determina el tamaño de muestra necesario (n). A continuación se calcula el

321 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos intervalo de selección, dividiendo el número total de individuos en la población por el tamaño de la muestra (N/n) y se fija el punto de inicio del muestreo eligiendo al azar un número comprendido entre el 1 y el intervalo de selección (redondeando al entero inferior). Finalmente se procede a seleccionar el individuo inicial y se recorre la lista ordenada de individuos seleccionando un nuevo individuo como parte de la muestra, cada N/n individuos, hasta completar la muestra. En poblaciones con muchos individuos se puede aplicar este método aprovechando determinadas prácticas de manejo (transferencias, pescas…). Durante una transferencia de camarones se puede realizar un muestreo sistemático en función de la duración del procedimiento y estableciendo intervalos de muestreo de igual duración (por ejemplo, 1 camarón cada 15 segundos). A partir de estos dos métodos básicos se pueden diseñar otras estrategias de muestreo más complejas que pueden implicar un aumento del tamaño de muestra. Una de las variantes más utilizadas es el muestreo estratificado, en que se necesita conocer a priori como se distribuyen los individuos según los estratos utilizados (tamaño, sexo, especie…) que deben ser mutuamente excluyentes (un individuo no puede pertenecer a dos estratos a la vez) y exhaustivos (todos los individuos debe pertenecer obligatoriamente a un estrato). La muestra se distri- buirá proporcionalmente entre los distintos estratos según el tamaño de los estratos poblacionales, lo que contribuye a mejorar la homogeneidad de la muestra (y por tanto garantizar su representatividad). Este método no se debe confundir con el muestreo por cuotas (no probabilístico) donde la homogeneidad de la muestra no se cumple. Por ejemplo, si queremos conocer la proporción de estanques infectados en una región donde sabemos que hay un 60% de estanques de producción intensiva, 30% semiextensivos y 10% extensivos, y el tamaño de muestra calculado es de 200 estanques, usando el método estratificado deberemos seleccionar al azar 120 intensivos, 60 semiextensivos y 20 extensivos. Otra alternativa, es el método de muestreo multietápico donde la población está organizada en distintas subpoblaciones (por ejemplo, una región está dividida en zonas, en las que hay varias camaroneras, que a su vez están formadas por estanques). En este caso se seleccionarán al azar varias zonas, dentro de estas comarcas se escoge un número variable de camaroneras, y de forma análoga en cada camaronera se muestrean determinados estanques. Este método permite reducir considerablemente los costes del estudio, especialmente cuando se trabaja con poblaciones muy dispersas. Sin embargo, tiene el inconveniente de que garantizar la representatividad de la muestra es complicado, ya que la probabilidad de seleccionar una determinada zona dependerá del número de estanques que haya, y de igual forma al seleccionar las camaroneras.

Tamaño de muestra necesario El otro elemento importante al diseñar un muestreo para conocer la prevalencia de enfermedad es el tamaño de muestra necesario. Tradicionalmente se utiliza una fórmula derivada de la utilizada para estimar la media de una variable cuantitativa con distribución normal (Lwanga & Lemeshow, 1991) donde el tamaño de muestra necesario (n) se calcula en función del nivel de confianza deseado ¸ (Zα/2 que tiene un valor de 1,96 para un 95% de confianza), la prevalencia esperada (P) y el error absoluto deseado o precisión (E). En este caso también se debe redondear al alza el resultado obtenido.

322 Capítulo 7 - Vigilancia epidemiológica en Camaronicultura

Como se puede deducir de esta fórmula el tamaño máximo de la muestra se obtendrá cuando trabajemos con una proporción de 0.5 (50%). Además observamos que los tamaños de muestra para proporciones complementarias (por ejemplo, 0.3 y 0.7) serán los mismos. De esta forma, para calcular el número de camarones que hay que tomar de un estanque para conocer la prevalencia de IHHNV (con una precisión de ± 5% y un nivel de confianza del 95%) primero debemos establecer la prevalencia esperada de la enfermedad. Si ésta es desconocida utilizaremos el valor del 50% (que ofrece el máximo tamaño de muestra) obtendremos un tamaño de muestra de 385 camarones. Si en nuestro ejemplo tenemos resultados preliminares que indican que esta prevalencia se sitúa entre 15 y 28%, tomaremos el valor del intervalo más próximo a 50% (es decir, 28%) de forma que el tamaño de muestra se reduce a 310. El problema aparece cuando las prevalencias esperadas son muy bajas o muy altas, ya que ésta fórmula asume que el intervalo de confianza se basa en una distribución normal, cuando realmente se debería calcular en función de una distribución binomial. Vallejo et al. (2013) proponen un mé- todo alternativo de cálculo del tamaño de muestra basado en el método Score de Wilson (1927) que corrige la subestimación que se produce. Para estimar la prevalencia de la población, asumiendo una prevalencia esperada del 10%, una precisión del 5% y un nivel de confianza del 95%, el tamaño de muestra es de 139 individuos con el método tradicional, cuando realmente se deberían seleccionar como mínimo 189 individuos. Finalmente hay que indicar que cuando se trabaja con poblaciones pequeñas, puede ser que el tamaño de muestra calculado sea superior al tamaño de la población, ya que las fórmulas asumen muestreo con reemplazo, es decir, un mismo individuo puede ser seleccionado más de una vez en un mismo estudio. Con el fin de ajustar el tamaño de muestra (na) en un muestreo sin reemplazo (que es el que habitualmente se utiliza ya que ningún individuo es seleccionado más de una vez) se realiza un ajuste siempre que la fracción de muestreo (n/N) sea superior al 5% (Daniel, 2000):

Cálculo de resultados La presencia de enfermedades en una población pueden estimarse transversalmente (generalmente referida a un momento concreto del tiempo) o longitudinalmente (durante un periodo de tiempo definido). Las medidas transversales de la enfermedad que indican su importancia en una población son la morbilidad, la mortalidad y la letalidad, y nos proporcionan una valiosa información de carácter pronóstico (de Blas et al., 2007). La morbilidad (también denominada prevalencia puntual) es la probabilidad de que los individuos de una población sean considerados un caso (estar enfermos o infectados) en un momento o periodo de tiempo determinado. Se calcula dividiendo el número de casos por el número de individuos en riesgo de convertirse en caso en ese momento o periodo de tiempo:

323 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

La morbilidad nos da una idea aproximada de la capacidad de propagación de la enfermedad, aunque existen otros parámetros más útiles para este fin, como los obtenidos en estudios longitudinales (incidencias). La mortalidad es la probabilidad de que los individuos de la población mueran a consecuencia de una determinada enfermedad en un momento o periodo de tiempo. Se calcula como el cociente entre el número de muertes causadas por la enfermedad en el periodo de tiempo estudiado y la población en riesgo de morir por esa enfermedad en ese mismo periodo:

La mortalidad resume el impacto de la enfermedad en la población y tiene menor valor pro- nóstico individual que la morbilidad y la letalidad, aunque es de gran importancia para evaluar las repercusiones económicas de la enfermedad. La letalidad es la probabilidad de que un caso muera en un periodo de tiempo determinado, y es el cociente entre el número de muertos por la enfermedad y el número de individuos enfermos en un periodo de tiempo establecido:

La letalidad suele ser un parámetro constante para cada enfermedad, pudiéndose detectar diferencias entre las letalidades específicas, es decir, según características intrínsecas (edad, sexo…) o extrínsecas al individuo (estación del año, patogenicidad de la cepa...). Obviamente las enfermedades con letalidad alta tienen un pronóstico peor. Pongamos como ejemplo, un estanque con 20.000 camarones, donde a lo largo de una sema- na se han detectado 2.000 enfermos, de los cuales han muerto 500. En este caso estamos ante una enfermedad que cursa con una morbilidad semanal del 10% (= 2.000/20.000) una letalidad del 25% semanal (=500/2.000) y una mortalidad semanal del 2,5% (=500/20.000). Existe una relación entre estos tres parámetros, de forma que:

En los estudios longitudinales de enfermedad se puede calcular tanto la prevalencia como la incidencia. La prevalencia equivale al concepto de morbilidad, pero contabilizando los individuos enfermos al inicio del estudio y los nuevos enfermos a lo largo del periodo estudiado, y dividiendo por la población en riesgo promedio (ya que deben tenerse en cuenta las variaciones de la población a lo largo del tiempo). La incidencia describe la velocidad con que la enfermedad se propaga en la población e indica el flujo de individuos sanos a enfermos. Se calcula como el número de nuevos casos de enfermedad que se presentan en una población durante un periodo determinado de tiempo dividido por la población susceptible de padecer la enfermedad. Para determinar la incidencia, se deben realizar siempre dos mediciones en la población a estudiar, una medición al principio del estudio, en la que se determinarán los animales sanos, y una segunda durante el periodo de estudio o al final del mismo,

324 Capítulo 7 - Vigilancia epidemiológica en Camaronicultura que determinará cuantos animales inicialmente sanos han adquirido la enfermedad (nuevos casos). En sanidad acuícola, casi nunca se trabaja a nivel individual con incidencias, aunque su utilización podría ser muy interesante para estudiar la aparición de brotes considerando la piscina camaronera como unidad de estudio. En este punto hay que hacer una consideración importante, como regla general los datos obtenidos a partir de estudios dirigidos a la detección de enfermedad (diagnosticar al menos un animal positivo) no pueden utilizarse para estimar la proporción de enfermedad (conocer el porcentaje de animales enfermos), ya que el tamaño de la muestra suele ser insuficiente y se utilizan métodos de muestreo no probabilísticos. Sin embargo, los estudios para conocer la prevalencia son válidos para detectar la enfermedad, aunque son menos eficientes. Otro aspecto importante a tener en cuenta es que las pruebas diagnósticas utilizadas son imperfectas. De forma que estamos calculando una prevalencia aparente, y lo que queríamos saber es la prevalencia real (Thrusfield, 2005). La prevalencia aparente, es el porcentaje de resultados positivos, o dicho de otra forma, la probabilidad de ser diagnosticado positivo. En ocasiones se le denomina prevalencia estimada y se calcula dividiendo número total de individuos positivos por el número total de individuos.

La prevalencia real o verdadera, mide la frecuencia de aparición de una enfermedad en una población y equivale al porcentaje de enfermos en la población (prevalencia detectada por la prueba de oro) o probabilidad de estar enfermo, y su cálculo es el cociente entre número total de enfermos y el número total de individuos. También recibe el nombre de prevalencia teórica.

La prevalencia aparente, normalmente se calcula a partir de los resultados diagnósticos pro- porcionados por el laboratorio, y a partir de ella es posible estimar la prevalencia real utilizando los valores de sensibilidad y especificidad (Thrusfield, 2005):

En un estudio se han tomado 50 muestras para diagnosticar la infección por WSSV en un estanque, y las hemos remitido a un laboratorio donde disponen de dos técnicas diagnósticas (A y B), con las características que se muestran en la Tabla 3. En el caso de la prueba A se obtienen 37 positivos mientras que con la prueba B son 27 positivos. ¿Cómo se explica esta discordancia en los resultados? La razón es que ninguna de las dos pruebas diagnósticas es perfecta y lo que hemos calculado es la prevalencia aparente, por lo que se debe calcular la prevalencia real antes de llegar a ninguna conclusión. Efectivamente tras realizar los cálculos oportunos se observa que la prevalencia real es del 10% en ambos casos, y que al utilizar pruebas diagnósticas que no son completamente fiables estábamos sobreestimando la infección por WSSV en el estanque estudiado.

325 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Tabla 3. Prevalencias correspondientes a dos pruebas diagnósticas.

Prueba Prevalencia aparente Sensibilidad Especificidad Prevalencia real A 18,5% 95% 90% 10% B 13,5% 90% 95% 10%

Desafortunadamente apenas hay información disponible sobre la sensibilidad y especificidad de los protocolos utilizados para diagnosticar las enfermedades de los camarones. Ya hemos establecido previamente que la medición de la enfermedad en una población suele realizarse sobre una muestra representativa de la misma, de forma que la estimación resultante se pueda extrapolar a la población. En función de los datos muestrales se pueden calcular unos márge- nes de error y establecer un intervalo de confianza definido por unos límites (inferior y superior) entre los que se encontrará el valor real de la medida (por ejemplo, la prevalencia) con una probabilidad definida por el nivel de confianza (generalmente el 95%) (Daniel, 2000; de Blas et al., 2007). Las medidas de enfermedad descritas son proporciones y de forma genérica se puede calcular el intervalo de confianza en función de la proporción calculada a partir de la muestra (p), el tamaño de la muestra (n) y el nivel de confianza (Z ) (Daniel, 2000): α/2

Sin embargo, esta fórmula está basada en la distribución normal y tiende a sobrestimar el ta- maño de muestra cuando la proporción esperada está próxima al 50% (0,5) y a subestimarlo cuando los valores están próximos al 0 y al 100%. Por eso, es más adecuado calcular los intervalos de confianza asumiendo una distribución binomial mediante el método Score de Wilson (1927):

Al estimar la prevalencia aparente de enfermedad en una población a partir de una muestra de 149 animales donde 3 han resultado positivos podremos comprobar la diferencia en los resultados obtenidos por ambos métodos. La prevalencia muestral será del 2,01% y si estimamos la prevalencia poblacional con el método clásico se encontraría entre -0,24 y 4,27% con un 95% de probabilidad (obsérvese que pueden obtenerse valores negativos). Sin embargo, con el método Score de Wilson estimamos que la prevalencia poblacional estaría entre 0,69 y 5,75%. Ya comentamos anteriormente que la utilización de pools está limitada por el efecto de dilu- ción, y puede alterar notablemente la sensibilidad de la prueba diagnóstica. Lo habitual al diagnosticar las enfermedades víricas de los camarones es que se recomiende la utilización de pools de 5 ó 10 animales (OIE, 2014), aunque en algunas pruebas basadas en la PCR se llega a recomendar la utilización de muestras de hasta 50 postlarvas por pool. Cuando se desea estimar la prevalencia de infección o enfermedad en la población a partir de pools surgen problemas de interpretación de los resultados. Aparentemente el único resultado viable que se puede calcular es el porcentaje de pools positivos, sin embargo, existe una fórmula que

326 Capítulo 7 - Vigilancia epidemiológica en Camaronicultura permite estimar la prevalencia individual en la población, siempre y cuando se hayan utilizado pools de igual tamaño (Kline et al., 1989).

En un estudio donde se han tomado 30 pools de 5 camarones (150 animales en total) para hacer diagnóstico de WSSV por PCR, 4 pools han resultado positivos a WSSV, es decir, el 13,3% de los pools son positivos. Al sustituir en la fórmula anterior, tendríamos que la prevalencia individual sería 2,82%, es decir, estimamos que en la población estarán infectados casi el 3% de los individuos.

7.5. Conclusión El diseño de planes de vigilancia epidemiológica a nivel regional puede llegar a ser una actividad muy compleja debido a la multitud de factores que se deben considerar: estructura de la pobla- ción, disponibilidad de datos censales de calidad, errores y sesgos en el muestreo y desconocimiento de la fiabilidad diagnóstica. Además, la información obtenida debe procesarse con las herramientas estadísticas y epide- miológicas adecuadas a cada situación para conocer de forma fidedigna el estatus sanitario de las poblaciones estudiadas y poder realizar una correcta toma de decisiones.

7.6. Referencias bibliográficas Bayot, B., S. Sonnenholzner, X. Ochoa, J. Guerrerro, T. Vera, J. Calderon, I. de Blas, M.D. Corne- jo-Grunauer, S. Stern & F. Ollevier. (2008). An online operational alert system for the early detection of shrimp epidemics at the regional level based on real-time production. Aquacul- ture, 277(3-4): 164-173. Cameron, A. (2002). Survey toolbox for aquatic animal diseases. A practical manual and software package. ACIAR Monograph No. 94, Camberra, Australia. 375 pp. Cannon, R.M. (2001). Sense and sensitivity – designing surveys based on an imperfect test. Preventive Veterinary Medicine, 49: 141-163. Corsin, F. & de Blas, I. (2010). Shrimp epidemiology: Applying population-based methods to shrimp health managment. En: Alday, V. (ed). The Shrimp Book. Nottinghan University Press. Not- tinghan, Reino Unido. 713-749. Corsin, F., M. Georgiadis, L. Hammell & B. Hill. (2009). Guide for aquatic animal health surveillance. Office International des Epizooties (OIE), París, Francia. 114 pp. Daniel, W.W. (2000). Daniel, W.W., 2000. Biostatistics: A Foundation for analysis in the health sciences (7ª edición). John Wiley & Sons, Inc. 755 pp. de Blas, I., I. Ruiz-Zarzuela, B. Bayot & C. Ferreira C. (2007). Manual de Epidemiología Veterinaria. Universidad de Zaragoza, España. 180 pp. FAO. (2014). The state of world fisheries and aquaculture. Roma, Italia. 223 pp. Klaucke D.N., J.W. Buehler, S.B. Thacker, R.G. Parrish, F.L. Trowbridge, R.L. Berkelman & the Survei- llance Coordination Group. (1988). Guidelines for Evaluating Surveillance Systems. Morbi- dity and Mortality Weekly Report (MMWR), 37(S-5); 1-18.

327 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

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328 Capítulo 8

Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei (Boone, 1931) Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

330 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei

CAPÍTULO 8

Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei (Boone, 1931)

Jorge Cuéllar-Anjel1, Vielka Morales2, Cornelio Lara3 y Oscar García4 1 Camaronera de Coclé S.A. - Grupo Ad hoc del OIRSA en Sanidad Acuícola 2 Programa Regional y Grupo Ad hoc del OIRSA en Sanidad Acuícola 3 Programa de Sanidad Acuícola - MIDA – Grupo Ad hoc del OIRSA en Sanidad Acuícola 4 Coordinador Regional de Inocuidad de Alimentos del OIRSA

Introducción La pesca y la acuicultura realizan contribuciones importantes al bienestar y la prosperidad de los países que realizan estas actividades. En los últimos 50 años, el suministro de productos pesqueros destinados al consumo humano ha superado el crecimiento de la población mundial; actualmente, el pescado constituye una fuente esencial de alimentos nutritivos y proteínas animales para gran parte de la población, además de proporcionar medios de vida e ingresos, tanto directa como indirectamente. La producción acuícola mundial ha seguido creciendo en el nuevo Milenio, aunque más lentamente que en los decenios de 1980 y 1990. En el transcurso de medio siglo aproximadamente, la acuicultura ha pasado de ser casi insignificante a equipararse totalmente a la producción de la pesca de captura en cuanto a la alimentación de la población en el mundo. Este sector también ha evolucionado respecto a la innovación tecnológica y la adaptación para satisfacer las necesidades cambiantes (FAO, 2012). El cultivo de camarón es el rubro de la acuicultura con más rápido crecimiento en Asia y La- tinoamérica y recientemente en África. El 88% de los camarones (penaeidos) proviene de Asia y los cinco mayores productores (China, Tailandia, Vietnam, Indonesia y la India) suministran el 81%. En Centroamérica el cultivo del camarón marino corresponde a 12.8%, siendo con tilapia los de mayor desarrollo en el sector acuícola. La captura de camarón fue estratégica para Centroamérica hasta el 2000, pero cada año es menor debido a sobreexplotación de la pesquería, pese a las medidas de ordenación implantadas. Es así que la producción se redujo de 15,017 TM en 2000 (3.8% de la producción regional) a 8,775 TM en el 2007 (2% del total Regional), mientras que el cultivo de este mismo recurso aumentó de 25,380 TM (5.73% de la producción) a 72,774 TM (16.4% del acumulado regional) durante el mismo período; sin embargo, la producción disminuyó de 2007 al 2010 (71,188 TM) de 11.18% a un 10.93% (Tabla 1), por problemas de enfermedad, que se iniciaron en Asia desde 2009 (FAO, 2014).

331 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

TABLA 1: Producción de camarón de cultivo (TM) en países centroamericanos Período 2000-2010.

Año Belice * Costa Rica El Salvador Guatemala Honduras Nicaragua Panamá Totales

2000 3,637 1,300 196 1,492 12,041 5,422 1,292 25,380 2001 4,460 1,800 363 2,500 16,718 5,698 2,997 34,536 2002 4,354 4,102 372 5,400 18,149 6,102 4,768 43,247 2003 11,157 5,056 473 3,773 25,427 7,019 6,092 58,997 2004 11,065 5,081 435 3,964 27,748 7,849 6,520 62,662 2005 10,254 5,719 240 4,564 28,385 9,633 8,394 67,189 2006 7,235 5,730 336 8,436 35,811 10,860 9,317 77,725 2007 2,472 5,278 160 14,864 30,367 11,097 8,536 72,774 2008 2,280 5,269 219 17,883 17,803 14,690 7,788 65,932 2009 2,300 3,545 382 17,034 23,753 17,362 6,863 71,239 2010 6,669 3,216 394 15,944 22,273 16,587 6,105 71,188

Gran Total 65,883 46,096 3,570 95,854 258,475 112,319 68,672 - - -

FUENTE: FAO, 2014; * Departamento de Pesca de Belice, 2013 (entrevista personal con Claudia Beltrán-Consultora de FAO)

Las granjas de camarón deben cumplir con las regulaciones nacionales e internacionales respecto al tema ambiental, sanitario, de inocuidad, social, laboral y de tenencia de tierras. Las Buenas Prácticas no son procedimientos cuantitativos ni estáticos, no pueden ser codificados como una re- gulación permanente y pretenden guiar la actividad camaronera para maximizar su eficiencia, garantizar sostenibilidad y minimizar impactos ambientales y sociales, considerando siempre la inocuidad del producto final para el consumo humano.

8.1 Aspectos a considerar en las Buenas Prácticas de Manejo

Aspectos sociales El enfoque social de las empresas camaroneras, debe estar dirigido a desarrollar y operar granjas en una forma responsable, que beneficie a la misma empresa, a las comunidades locales y al país, contribuyendo de manera efectiva con el desarrollo rural y, particularmente, al alivio de la pobreza en las áreas costeras, sin comprometer el ambiente. Las granjas camaroneras están localizadas cerca de comunidades costeras por lo que no deben negar el acceso a miembros de estas comunidades que se han dedicado por año a la extracción de algunos recursos (moluscos, pesca artesanal, madera) y deben colaborar con las autoridades competentes, las cuales tienen la responsabilidad de regular el uso de los recursos hidrobiológicos y costeros de estas áreas. Todo trabajador de la granja camaronera debe recibir como mínimo, el salario, seguros laborales y médicos establecidos por ley. Deben recibir capacitación permanente y deben contar con un programa de asistencia médica ocupacional, que incluya visita de médicos, odontólogos y trabajadores sociales, dando la oportunidad al personal de ser atendido al menos una vez por año. No deben existir prácticas discriminatorias, políticas o de exclusión para contratar personal, ni se deben contratar menores de edad.

332 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei

Las granjas camaroneras deben brindar a sus trabajadores instalaciones básicas dignas y de- centes, bien ventiladas y con buenas instalaciones de duchas, baños y servicios sanitarios (letrinas en campo), así como poder brindarles alimentos balanceados y nutritivos, fuentes de agua potable, sistemas de comunicación a través de telefonía convencional o de radioteléfonos, transporte gratuito y seguro desde y hasta los lugares de residencia. En cuanto a la Responsabilidad Social, las granjas deben proyectar actividades dirigidas hacia la comunidad, involucrando a sus trabajadores en la identi- ficación de problemas de índole social, ambiental, salud, educación, sanidad y comunicación, entre otros. También, convertirlos en actores de la búsqueda de soluciones. La empresa debe involucrarse en actividades sociales que desarrollan las comunidades y aportan al bienestar de sus empleados.

Aspectos ambientales La camaronicultura sostenible debe estar enfocada hacia el desarrollo de sistemas de cultivo en forma integrada, ordenada e incluyente, articulando las capacidades económicas, ambientales y sociales con la tecnología, el conocimiento, los esfuerzos institucionales y el marco jurídico nor- mativo. Las granjas tienen la responsabilidad en la implementación de la gestión ambiental definida en el Estudio de Impacto Ambiental, desde la fase de construcción y durante su establecimiento y operación. El sitio seleccionado para la ubicación de la granja, debe estar en una zona donde la operación de la misma no cree conflictos ambientales ni sociales, de acuerdo con la planificación y el marco legal y haciendo uso eficiente de los recursos agua y suelo. Se deben conservar la biodiversidad, los hábitats ecológicamente sensibles y las funciones del ecosistema, así como reconocer otros usos posibles del suelo y qué otras personas y especies dependen de estos mismos ecosistemas. Entre los factores que se deben considerar a la hora de seleccionar un terreno adecuado para el cultivo de camarón, están los siguientes: eficiencia costo-beneficio y la salud ambiental, valor del sitio donde se va operar una granja de camarón en relación con el valor intrínseco previo (costo oportunidad), efectos en la economía local y regional, cambios en el valor de otros sitios dentro del mismo ecosistema como resultado del cultivo. La calidad del agua es esencial para cubrir los requerimientos físico-químicos y biológicos de la especie en cultivo y la selección del sitio debe contemplar los planes de desarrollo de la zona en cuanto a crecimiento agrícola, industrial o turístico, entre otros. Mientras más lejos estén las granjas de asentamientos humanos, más fácil será controlar la contaminación de patógenos que afecten la inocuidad del producto final. La industria camaronera, gracias al avance de la tecnología, ha amplia- do la posibilidad de utilizar no sólo las áreas de albinas, sino también áreas arenosas y tierras dulces para la localización de las granjas. Ante estas posibilidades del uso de tierra, se deben tener en cuenta los impactos ambientales, como consecuencia de la construcción y operación de las granjas. El diseño debe incorporar elementos que protejan las estructuras de la granja de las inundaciones y que, a la vez, eviten obstruir las corrientes naturales de agua que mantienen los hábitats circunvecinos. Se recomienda construir estanques en áreas con mínima cobertura vegetal como son las albinas (Fig. 8.1.1), pues los costos de construcción se reducen y la probabilidad de que el sitio sea un área ambientalmente sensitiva es menor. Para el diseño de estructuras y de canales de agua se debe tomar en cuenta las variaciones estacionales del clima e hidrología; en base a los estudios di- mensionar las diferentes estructuras hidráulicas internas y externas de la granja. Los suelos potencialmente ácidos y con sulfatos deben ser excluidos en la selección para la construcción de camaroneras, al igual que aquellos con contenido de materia orgánica. Sin embargo, los suelos moderadamente ácidos pueden ser tratados para mejorar su pH, mediante el proceso de encalado con Carbonato de calcio.

333 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

La textura del suelo deberá ser de composición apropiada y se debe encontrar a una profundidad de por lo menos 50 cm por debajo del fondo del estanque. Debe tener un alto contenido de arcilla y limo, para reducir la pérdida de agua por infiltración y facilitar la compactación de los muros, reduciendo la erosión. Los suelos arenosos pueden seleccionarse siempre y cuando se utilice tecnología que impida la infiltración del agua (“liners”) (Fig. 8.1.2), considerando aspectos técnicos apropiados. Se deben construir granjas en áreas que no han sido expuestas previamente a actividades agroindustriales, así como tampoco a desarrollos urbanos o que estén sujetas a la influencia de drenajes agrícolas. Las granjas de camarón cultivado no deben estar construidas dentro de los bosques de man- glar, humedales o cualquier otro ecosistema frágil. Un buen conocimiento de los principios de di- seño, construcción y tecnologías de cultivo, pueden ayudar con tres objetivos: protección de los recursos naturales, eficiencia operativa y reducción de los costos de construcción. En cuanto a las estructuras de bombeo de la granja deben ser compactas, tener seguridad en su diseño para soportar y operar el equipo de bombeo y, facilitar la logística operativa y de mantenimiento; también deben ser diseñadas bajo un enfoque ambiental, que evite el derrame de hidrocarburos y otros contaminante a las aguas estuarinas. La selección del tipo de bombas a utilizar, debe tomar en cuenta aspectos de eficiencia, costo, durabilidad (vida útil) y riesgo ambiental asociado con su uso. Las bombas lubricadas por aceite, son un riesgo potencial de contaminación de las aguas estuarinas, por lo que es preferible utilizar las que son lubricadas por agua. En el caso de la selección de motores, debe considerarse la eficiencia en el uso y tipo de energía requerida. En la planeación de la construcción de las granjas, los canales no deberán crear barreras a las corrientes naturales de agua, ya que alterar los cursos hídricos naturales puede impactar áreas sensibles. Por esta razón, los estudios topográficos del área y el estudio de su hidrología antes de la construcción, permitirán detectar en dónde están los cursos naturales de agua en riesgo. Las vías de acceso deberán tener instaladas estructuras de tamaño adecuado para prevenir el estancamiento de agua dulce y la alteración del flujo de agua salobre. A veces se hace necesario contar con caminos altos en áreas donde se construyen estanques camaroneros. Un camino puede actuar como una represa y causar inundaciones, a menos que se asegure su drenado mediante el uso de estructuras del tamaño adecuado. En casos extremos, el camino corre el riesgo de ser barrido por las aguas.

Figura 8.1.1. Proceso de construcción de estanque, en Figura 8.1.2. Estanques cubiertos con liners para evitar zona de albina con alto contenido de arcilla y limo la filtración por efecto de la composición arenosa del para la buena compactación de los muros. Foto corte- suelo. Foto cortesía del Ing. C. Lara. sía del Dr. J. Cuéllar-Anjel. 334 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei

El diseño y construcción de los canales de abastecimiento de agua, deben ser con base en la estimación de la demanda máxima diaria de agua de la granja, incluyendo las pérdidas por evapora- ción, filtración y fugas. Debe ser estimada la carga de sedimento del agua entrante y las dimensiones requeridas para un área de sedimentación o trampa de sedimento. Los canales de drenaje deben tener en su diseño una sección hidráulica para el eficiente manejo de efluentes de la granja y aportes hídricos naturales. Hay que contemplar la posibilidad de hacer estructuras de control para el drenaje y aislamiento de la influencia de las mareas como una opción de bioseguridad, que podría reducir los costos de operación. Todos los actores en las granjas deben asimilar y poner en práctica la ges- tión ambiental y debe haber un enfoque hacia disminuir desechos en el proceso de construcción y durante la producción. El alimento balanceado requiere un adecuado manejo durante su almacenaje y distribución en campo, debiendo estar protegido de la humedad, luz solar directa y del ataque de plagas. La práctica de reducir, reutilizar y reciclar, debe ser una regla en la granja en función del ambiente y de los costos. La granja debe contar con un sistema eficiente de control de entradas y salidas de personal y equipo rodante con un sistema de desinfección para éstos, diseñado para que no pueda ser obviado. Igualmente, la granja debe contemplar el diseño y construcción de infraestructura y se- ñalización para la implementación de medidas de seguridad, higiene y bioseguridad.

Aspectos del Proceso productivo Un aspecto importante en el manejo de la granja, es que desde la primera fase se establezca y mantengan las condiciones ambientales óptimas en el estanque, para que las postlarvas o juveniles se desarrollen normalmente. Esto implica la implementación de vacíos sanitarios, preparación del fondo del estanque, una adecuada eliminación de depredadores y competidores, reducción de las posibilidades de estrés y manejo de la productividad natural. a. Preparación de los estanques El vaciado sanitario aplicado en toda la granja o en una parte de esta, permite tener el tiempo necesario para un buen secado y preparación de los estanques. Esto contribuye al desarrollo de camarones sanos ya que favorece un equilibrio químico, físico y biológico en el estanque. El drenado, secado, manejo de sedimentos, limpieza, evaluación del estado del fondo y encalado, son actividades que contribuyen a disminuir los riesgos de enfermedades en los estanques. El estanque debe ser drenado totalmente una vez finalizada la cosecha. Las áreas que no puedan ser drenadas totalmente deben ser desinfectadas con hipoclorito de sodio (calcio) u óxido de calcio (cal viva). Una vez finali- zado el drenaje, las compuertas de entrada y salida de agua de los estanques deben ser selladas para evitar la entrada de agua durante las mareas altas, permitiendo de esta manera que el sol y el viento realicen el proceso de secado total. Los canales de drenaje que cuentan con estructuras de control, deben sellarse herméticamente para evitar la entrada de las mareas y hacer efectivo el secado y pre- paración del estanque luego de la cosecha. Es necesario dejar reposar o restaurar el medio ambiente en granjas camaroneras, mediante la interrupción de la producción; durante la estación seca se puede conseguir un secado total y en la estación lluviosa un secado parcial dadas las condiciones del clima. Esta estrategia llamada vacío sanitario, tiene el objetivo de romper los ciclos de reinfección, eliminando así las fuentes de una enfermedad en los estanques y reservorios. Las unidades de producción y estructuras de abastecimiento de agua, deben ser sometidas a un período prudente de secado por la acción del sol y viento en la estación seca, hasta que el fondo desarrolle cuarteaduras. Esto permite oxidar sustancias reducidas

335 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

(sulfuros inorgánicos presentes en el suelo del estanque), acelerar la descomposición de la materia orgánica y desinfectar el fondo. La presencia de materiales extraños dentro de los estanques (alam- bres, troncos, piedras, palos, etc.), puede afectar el buen desarrollo de las actividades de producción, así como la integridad física de los trabajadores. Por ejemplo, durante los muestreos biométricos se puede alterar la efectividad de las capturas con atarraya; pueden ocasionar accidentes a los operarios o, se pueden convertir en refugios de organismos que inciden en los resultados de producción. Luego se debe realizar la limpieza y desinfección de compuertas de entrada y salida, tuberías, tablas y bastidores. Hay que tener en cuenta en el manejo de desechos, que existen materiales que por su naturaleza o composición físico-química son fácilmente degradados por el ambiente y por lo tanto sólo necesitan tener un lugar o sitio adecuado para su disposición. Se debe evitar la incineración debido a la liberación de residuos contaminantes para el ambiente. Se deben establecer programas rutinarios de toma de muestras de suelo para el análisis de laboratorio y con base en los resultados, aplicar la cantidad requerida del insumo que se necesite (cal o fertilizante) para cada estanque. Un análisis de suelo debe incluir información básica sobre com- posición de materia orgánica (%), pH, nitrógeno, fósforo, sulfatos, hierro, calcio, magnesio y potasio. Si el suelo del estanque presenta condiciones ácidas (pH<7), se debe aplicar cal agrícola (carbonato de calcio) para subir el pH, ver tabla 2.

Tabla 2. Requerimiento de cal agrícola para tratar el fondo de los estanques (Boyd, 1992).

pH Carbonato de calcio (cal agrícola) (kg/ha)

< 5 < 3,000

5 - 6 < 2,000

6 - 7 < 1,000

Otra evaluación importante es el grado de contaminación por presencia de plantas invasoras (malezas marinas) y crustáceos como el camarón fantasma o (Lepidophthalmus spp.) y Tanaidacea. En caso de su presencia, se deben aplicar prácticas de manejo tendientes a reducirlos o eliminarlos, pues podrían afectar negativamente la producción de camarones. El uso de plaguicidas o sustancias químicas para erradicar o controlar dichos organismos, deberá indicarse como último recurso. Esta práctica se debe realizar de manera responsable y siguiendo estrictamente las indicaciones del fabricante, bajo el aval y dirección de las Autoridades Competentes. Un problema mayor es la acumulación de sedimento suelto, ya sea de fuentes externas al lugar o del sitio mismo. Las granjas camaroneras deben almacenar o disponer de los sedimentos removidos de los estanques, canales y estanques de sedimentación, de tal forma que no causen impacto ambiental o de salinización de la tierra y aguas cercanas. Una práctica común es extraer la capa de sedimento acumulada en el fondo después de varios ciclos de cultivo y usarla para restaurar las secciones transversales de los muros, mejorando los taludes, la altura y la corona. En esta operación se debe hacer una buena compactación, para evitar que este material contamine el estanque por erosión o deslizamientos. El encalado utilizando Carbonato de Calcio, se lleva a cabo para subir el pH en el caso de suelos ácidos y para mejorar la alcalinidad del agua. Muchos suelos son ácidos por naturaleza, ya que tienen bajas concentraciones de iones básicos o altas cantidades de materia orgánica. En el cultivo

336 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei de camarón, el encalado es altamente efectivo para neutralizar los ácidos del suelo y se constituye en una actividad de manejo útil y económicamente viable (Fig. 8.1.3 y 8.1.4). Es recomendable el roturado (arado o volteado) del fondo de los estanques cada uno o dos años, según las condiciones propias de cada estanque o de la empresa. Con esto, se logra dar mejores condiciones al suelo para garantizar un ambiente apropiado para el engorde del camarón (aireación, mineralización, desinfec- ción y oxidación).

Figura 8.1.3. Encalado manual de un estanque en forma Figura 8.1.4. Encalado mecánico de un estanque en for- uniforme. Fotos cortesía del Ing. C. Lara. ma uniforme en menos tiempo y con mayor seguridad. Foto cortesía del Ing. C. Lara.

Para lograr un resultado eficiente de la operación de roturación del suelo, este debe tener una adecuada humedad ya que en suelos extremadamente húmedos o excesivamente secos, no se logra un rendimiento adecuado del equipo, ni del proceso de roturación como tal. Se debe aprovechar la faena de roturación de un estanque, para incorporar cal u otros insumos destinados al mejoramiento de las características del suelo. Esta condición del suelo favorece la incorporación y acción de los insumos que son aplicados durante la preparación; así también, ofrecerá un fondo que facilitará algunas de las actividades fisiológicas del camarón (ej.: muda). El proceso de llenado del estanque debe ser lento y con supervisión estricta, para garantizar un filtrado puntual (limpieza de mallas y bolsos). Los filtros no deben ser removidos de las estructuras de entrada y salida durante los primeros 30 días de cultivo, con el fin de evitar la fuga accidental de las postlarvas. Se debe establecer un plan de manejo de filtros y bolsos, que contemple la reducción de entrada de organismos no deseables al sistema de producción, los cuales afectan los rendimientos por ser fuentes de depredación, competición y contaminación con patógenos. El buen manejo de los filtros, evitará la necesidad de períodos cortos de remplazo por deterioro de los mismos, lo cual se traduce en ahorro de materiales (principalmente madera) y mano de obra, así como reducción del riesgo de ingreso de organismos silvestres al estanque o pérdida de camarones por fuga. Durante el llenado se debe hacer un análisis de las condiciones físico-químicas del agua del estanque, con base en lo cual se establece un programa de fertilización. Este permitirá promover el desarrollo de fitoplancton (principalmente diatomeas) y por ende zooplancton, lo cual servirá como alimento inicial a las postlarvas una vez sean sembradas. Con la fertilización del agua de los estanques, se debe buscar un equilibrio iónico y bioquímico que favorezca el crecimiento de la productividad natural (fitoplancton, fitobentos, zooplancton y zoobentos) y del camarón. Se recomienda mantener una relación de N: P de 8: 1 (ej.: N= 0.56 ppm y P= 0.07 ppm); la relación de Ca:Mg:K que sea de 1:3:1 (ej.: Ca= 400 ppm, Mg= 1,200 ppm y K= 400 ppm); el Sílice se debe mantener en 1.0 ppm y la alcalinidad en >80.0 mg/L.

337 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Antes de proceder con la siembra de las postlarvas, se debe realizar un análisis microbiológico del agua del estanque, para determinar si es necesario aplicar melaza, probióticos u otros insumos dirigidos a promover o corregir el crecimiento de microorganismos relacionados con el desempeño de las postlarvas del camarón. De esta manera, promover un equilibrio microbiano en el estanque. b. Siembra del estanque El proceso de siembra de los estanques, es definitivo para el éxito del cultivo y, por consiguiente, se deben tomar en consideración todas las recomendaciones relacionadas con la fuente y calidad de las postlarvas, aclimatación y siembra de las mismas en los estanques. La granja debe coordinar oportunamente con el Centro de Producción Larval (CPL), la fecha, hora, cantidad, edad y condiciones para el transporte de las postlarvas. Cuando se ha hecho un tratamiento del agua del estanque (ej.: fertilización, aplicación de melaza, probióticos, etc.) o se ha cerrado el ingreso de agua por haber alcanzado el nivel de operación, se deben esperar 3 días antes de hacer la siembra de las postlarvas para permitir que se estabilicen las condiciones del mismo. De igual manera, se debe confirmar con anticipación mediante monitoreos periódicos de parámetros físico-químicos y biológicos, que las condiciones del agua de los estanques son aceptables para recibir las postlarvas. La Tabla 3 presenta los niveles sugeridos de estos parámetros que deben tener los estanques en el momento de la siembra:

Tabla 3: Parámetros físico-químicos y biológicos del agua del estanque para la siembra (Adaptado de Cuéllar-Anjel et al., 2010).

Bacterias pH O.D. Parámetro Alcalinidad Amonio Diatomeas UFC/mL (a.m.) (a.m.) TCBS TSA Lumi

>80.0 7.0 a <0.10 > 4.0 >15,000 Rango ≤102 ≤103 Cero mg/L 8.0 mg/L mg/L cel/mL

La producción masiva de postlarvas de alta calidad y viabilidad, es la clave para una acuicultura moderna de camarón. Se debe mantener un registro de la fuente y compra de postlarvas, cuántas y dónde fueron sembradas. Es decir, mantener un registro de trazabilidad. Antes de sembrar, las postlarvas deben ser examinadas para detectar signos de enfermedad, evaluar su calidad y establecer su fortaleza durante pruebas de estrés. Las granjas deben adquirir postlarvas solamente de establecimientos que tengan vigilancia sanitaria por parte de la Autoridad Competente. Cuando éstas sean importadas, deben tener una certificación sanitaria de su país de origen, que incluya por lo menos los principales agentes pató- genos tales como: Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV), Virus de la Necrosis Infecciosa Hipodérmica y Hematopoyética (IHHNV), Virus del Síndrome de la Cabeza Amarilla (YHV), Virus del Síndrome de Taura (TSV), Nodavirus del Penaeus vannamei (PvNV), Baculovirus penaei (BP) y Virus de la Mionecrosis Infecciosa (IMNV) y, bacterias como el Hepatobacter penaei causante de la Hepa- topancreatitis Necrotizante (NHP), el Vibrio penaeicida y la cepa de V. parahaemolyticus causante de la enfermedad de la Necrosis Hepatopancreática Aguda (AHPND). Las postlarvas de buena calidad, deben estar libres de organismos infecciosos (WSSV, IHHNV, YHV, TSV, PvNV, BP, IMNV , NHP y AHPND) y presentar un buen estado de salud general. Además, deben presentar un buen desarrollo branquial y tener un desarrollo morfológico acorde con su edad (estadio vs. longitud en mm). Es necesario conocer la historia clínica de cada lote de postlarvas a

338 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei comprar. Para esto se sugiere buscar el apoyo del técnico a cargo del cultivo larvario. El comprador debe estar en contacto con los proveedores al menos 7 días antes de que se efectúe la compra de postlarvas. Para asegurar la calidad de las postlarvas, debe realizarse una evaluación microscópica y molecular, así como una revisión macroscópica para determinar tamaño, presencia de deformidades, homogeneidad de tallas, actividad, contenido y movimiento intestinal, presencia de epibiontes, opacidad muscular, desarrollo branquial, cambios de color y melanización de apéndices. (Fig.8.1.5 y 8.1.6). De igual manera, se debe hacer una prueba de estrés y se recomienda observar las postlarvas en la oscuridad, con el fin de detectar posible bioluminiscencia. Las variables más importantes a monitorear durante el proceso de aclimatación de postlarvas de camarón, son salinidad, temperatura y oxígeno disuelto. Durante la aclimatación se debe evitar el estrés por cambios ambientales rápidos. La importación de nauplios y postlarvas deberá hacerse de acuerdo con la regulación nacional. En ausencia de una regulación apropiada, se deberán seguir los lineamientos internacionales de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) (Código Sanitario para los Animales Acuáticos). Se debe evitar la introducción de enfermedades a través de animales vivos, muertos congelados o de subproductos. Las postlarvas de camarón constituyen uno de los insumos más costosos en la producción de camarón de cultivo. La manipulación y manejo de las postlarvas incluyendo su cosecha, empaque en el laboratorio, transporte, recepción en granja, aclimatación y siembra en los estanques, son suma- mente críticos para su supervivencia. Durante el proceso de aclimatación, se debe reducir el estrés para evitar la mortalidad de las postlarvas mientras se adaptan gradualmente a las nuevas condiciones de calidad de agua de los estanques. Una aclimatación exitosa contribuye a asegurar el éxito econó- mico del ciclo de cultivo. Antes del inicio del proceso de siembra se debe garantizar que el estanque reúna una serie de condiciones que favorezcan un buen desarrollo del cultivo. Éstas se enmarcan en un nivel hídrico adecuado del estanque, buena concentración de fitoplancton (principalmente diatomeas) y paráme- tros físico-químicos normales; esto no excluye monitorear dichos parámetros durante el proceso de aclimatación y en el momento de la siembra. Es importante que en la medida de lo posible, la granja tenga su propio historial bacteriológico para cada estanque (principalmente especies de los géneros Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas, Plesiomonas, Flavobacterium y Streptococcus), con lo cual tenga establecido el rango de bacterias (unidades formadoras de colonia - UFC) frecuentes en cada estación

Figura 8.1.5. inspección macroscópica del estado de las Figura 8.1.6. inspección microscópica y registro de ha- larvas para determinar su calidad y condiciones sanita- llazgos a partir de muestras de camarones enfermos. Foto rias. Foto cortesía del Ing. H. Pérez. cortesía del Ing. C. Lara.

339 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos del año (seca y lluviosa). Con base en esto, se debe verificar la carga bacteriana de un estanque antes de su siembra, para asegurar una buena calidad microbiológica del agua que no ponga en riesgo la viabilidad de las postlarvas. Idealmente, la siembra se debe realizar durante el período más fresco del día (6 a.m. – 8 a.m., o durante la noche), cuando se encuentran las menores temperaturas y, por consiguiente, se reduce el estrés en las postlarvas y se podría hacer menor el tiempo de aclimatación. Se recomienda liberar las postlarvas en los estanques tan pronto como sea posible. La determinación de una densidad de siembra adecuada depende de la talla y edad proyectada para cosechar, calidad del agua, diseño del estanque, tasas de recambio hídrico, posibilidad de aireación mecánica, experiencia del personal y capacidad técnica general de la granja. Cada empresa camaronera debe establecer la biomasa sostenible para cada estanque, de acuerdo con las condiciones propias, individuales y el historial de producción. Bajo estas premisas y considerando el punto de equilibrio económico de la granja y las condiciones de mercado, se puede definir la densidad de siembra óptima para el sistema de produc- ción, sin afectar los beneficios económicos proyectados. Definidas las densidades a utilizar de acuerdo con el sistema de cultivo establecido y finali- zado el proceso de aclimatación, las postlarvas deben ser liberadas procurando hacerlo del lado del estanque que está en favor del viento; de esta manera, las olas ayudarán a dispersar los animales des- pués de la siembra evitando su agrupación en la orilla. Se recomienda monitorear la supervivencia de las postlarvas sembradas a las 24 y 48 horas. La implementación de infraestructuras de acondicionamiento de postlarvas en las granjas, es una actividad importante para lograr un manejo adecuado de dichos camarones antes de su siembra en los estanques. En estas estructuras, las postlarvas pueden ser manejadas y acondicionadas por un período de tiempo prudencial, de acuerdo con los protocolos de la granja, mediante una buena nu- trición, hasta alcanzar un tamaño apropiado para su buen desempeño en los estanques de engorde. Este sistema también ayuda a reducir los ciclos de producción y al control de enfermedades. c. Manejo del alimento La nutrición del camarón está basada en alimentos artificiales suministrados por el granjero y, por una importante variedad de organismos (algas, pequeños invertebrados bentónicos, etc.) y detritos orgánicos, que son parte de la productividad natural y del ambiente marino. No es recomendable almacenar alimento en la granja más de tres meses, así como tampoco utilizarlo para alimentar a los camarones, debido a la pérdida de su calidad nutricional y a los riesgos microbiológicos inherentes. Esto implica que los depósitos de almacenamiento reúnan las condiciones mínimas que garanticen el mantenimiento de la calidad del alimento, así como el funcionamien- to de un sistema de inventario separando y registrando la llegada de cada lote de alimento, así como la salida de los mismos según la fecha de llegada. El primero en llegar debe ser el primero en salir. El alimento para los camarones debe estar en óptimas condiciones; todo alimento contami- nado con hongos (enmohecido) que se detecte en el depósito de la granja, debe ser retirado y destruido. El suministro de alimento para camarones, debe ser racional, dosificado, bajo determinada frecuencia y con una correcta distribución, para evitar el deterioro de las condiciones físico-químicas y microbiológicas del agua y del fondo del estanque. El alimento debe ser periódicamente evaluado por técnicos de la granja, para asegurar su calidad y evitar riesgos en su uso por deterioro físico o microbiológico. Se deben tomar muestras al azar de todos los embarques de alimento enviados a la granja y realizar inspecciones para determinar la presencia de humedad u hongos. Las muestras de alimento deben ser enviadas periódicamente a laboratorios independientes conservando una contra-muestra, para la determinación de su composición nutricional y características físicas, permitien-

340 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei do esto su comparación con los valores suministrados por el fabricante. De cada lote de alimento recibido en la granja, se debe retener en anaquel y refrigerar una muestra de 1 kg hasta que se haya utilizado todo el lote, para ser usado en caso de reclamos o de análisis de laboratorio requeridos para pruebas especiales de calidad. Se recomienda que las granjas implementen un programa de depósitos cerca de los estanques, con capacidad para abastecer la ración por un máximo de tres días. De esta manera, se libera la mano de obra y la flota de vehículos, disminuyendo el deterioro de los caminos. Se debe considerar durante los cálculos de las raciones diarias de alimento, que los camarones en estadios de pre-muda, muda y post-muda, disminuyen notablemente el consumo y, por consiguiente, la dosis diaria debe estar sujeta a la población que se encuentra en inter-muda, para evitar el desperdicio de parte de la ración. En el cultivo semi-intensivo, las tasas de alimentación son usualmente bajas y la fertilización por esta vía no debería ser un problema. La sobrealimentación, pueden llevar a niveles abundantes de fitoplancton, zooplancton y microorganismos no benéficos y a una alta demanda de oxígeno disuelto durante la noche. El uso de tablas de alimentación ha sido uno de los métodos más utilizados para el control del suministro de alimento, basado en muestreos de crecimiento y de supervivencia para determinar la biomasa del estanque. El uso de bandejas de alimentación es una buena herramienta que sirve de apoyo para estimar cuánto están consumiendo los camarones diariamente. Para ello, su “lectura” e interpretación de los resultados, debe ser hecha con responsabilidad y conocimiento por personal bien entrenado. La alimentación debe realizarse cuando la temperatura no sea baja (mín. 26°C) y las concentraciones de oxígeno disuelto en el agua del estanque sean adecuadas (mín. 4.5 mg/L). Si las concentraciones de oxígeno disuelto son bajas durante un tiempo prolongado (días o semanas), las raciones diarias de alimentación son probablemente excesivas para la capacidad asimilativa de los camarones en dicho estanque, por lo que es recomendable reducirlas o suspenderlas hasta normali- zar la situación. Como una medida prioritaria de las empresas cultivadoras de camarón, todo el personal invo- lucrado en el proceso de clasificación, pesaje, distribución y suministro del alimento, debe ser super- visado por técnicos responsables para asegurar que las raciones diarias sean debidamente calculadas y aplicadas. De igual manera, el número de personas destinadas a estas labores, debe ser suficiente para cumplir eficazmente con las jornadas diarias de alimentación. d. Manejo de la calidad del agua La calidad del agua del estanque, es un punto crítico en el proceso de producción y debe ser controlada en los parámetros físicos, químicos y biológicos. En caso contrario, la población de cultivo podría pasar a tener bajo crecimiento, proliferación de patógenos con brotes de enfermedad, eventuales mortalidades y baja calidad del producto final. Es importante recordar que los estanques de cultivo de camarón son cuerpos de agua muy dinámicos en los cuales interactúan íntimamente factores físico-químicos como pH, salinidad, temperatura y oxígeno disuelto. De igual manera participan nutrientes orgánicos e inorgánicos afectando a las poblaciones microbianas propias del estanque. Éstas son susceptibles a cambios dados entre estos factores pudiéndose afectar su número y composición. Algunas variables del ambiente acuático como el pH, la temperatura y la salinidad, poseen rangos ideales para ciertas especies de bacterias. Cambios en estos factores favorece la proliferación de determinadas especies, alterando el equilibrio con la consecuente dominancia de microorganismos patógenos.

341 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Adicional a niveles inadecuados de parámetros físicos, químicos y biológicos en el estanque, existen contaminantes en el agua que podrían comprometer la producción de camarones. Éstos po- drían incluir hidrocarburos, plaguicidas, desechos tóxicos industriales, aguas servidas de poblaciones cercanas y metales pesados, entre otros. Los monitoreos se deben realizar en las unidades de produc- ción (tanques o estanques), en los canales reservorios, estaciones de bombeo y fuentes de suministro de agua (rías o estuarios). Existen varias acciones que permiten mantener o mejorar la calidad del agua en un estanque, entre las que se incluyen el uso de cal (óxido, hidróxido y carbonato de Calcio), filtración, fertiliza- ción (y otros tratamientos químicos), uso de probióticos, prebióticos, melaza, manejo adecuado del alimento, aireación y recambio de agua. La granja debe contar con un plan para el monitoreo de los parámetros físicos, químicos y biológicos de los estanques, en el cual se definan los procedimientos a seguir con cada uno de ellos. Algunos parámetros de calidad del agua se pueden medir en el laboratorio de la granja. Debe existir una rutina de calibración de los aparatos utilizados para medir parámetros, con el propósito de garantizar certeza y confiabilidad en los datos obtenidos. De manera complementaria, es importante contar con un buen soporte técnico para garantizar el correcto funcionamiento de los mismos. El monitoreo de la calidad del agua debe involucrar: a) medición de los parámetros físi- co-químicos, b) elaborar y mantener cuidadosamente registros con los valores obtenidos, c) análisis e interpretación frecuente de los datos obtenidos y d) aplicación de las conclusiones en función de una mejora en las prácticas de cultivo. Se deben establecer puntos específicos para la medición de los parámetros en cada estanque, con el fin de mantener condiciones similares en el tiempo y que no se afecten los datos obtenidos en los muestreos. Las muestras que van a ser sometidas a pruebas de laboratorio, deben ser manejadas adecuadamente hasta el momento de su análisis. Además de monitorear los estanques, sus entradas y salidas de agua, es útil para una industria mantener un programa de monitoreo de ecosistemas para seguir los parámetros ambientales en el tiempo y en un rango geográfico más amplio. Esto es particularmente útil en áreas donde el ambiente y por supuesto, el cultivo del camarón, pueden ser vulnerables a otras influencias, tales como otras industrias, la agricultura, los cambios climáticos, etc. El registro de datos es un aspecto fundamental dentro del proceso de monitoreo de los estanques, los cuales debidamente ordenados y analizados, permitirán realizar pruebas estadísticas cuyos resultados apoyen una correcta toma de decisiones. En sistemas de cultivo semiintensivos, los aireadores deben ser utilizados sólo si son estrictamente necesarios para asegurar la sobrevivencia de los camarones; de lo contrario, habrá un desperdicio de energía y un incremento en los costos de producción. La decisión para su uso, está marcada por la concentración de oxígeno disuelto en el estanque, misma que es dependiente de la densidad de población (biomasa), la con- centración de fitoplancton y la profundidad del estanque. Cuando se trata de sistemas intensivos de cultivo de camarón, se debe tener en cuenta que los aireadores deben estar encendidos casi de manera permanente, para mantener estables los sistemas bacterianos (flóculos o “bioflocs”) y Figura 8.1.7. Aireadores de paleta en un sistema intensivo las condiciones físico-químicas requeridas por de cultivo, ubicados de forma que permitan una corriente continua del agua para evita estratificación. Foto cortesía los camarones (Fig. 8.1.7). En estos casos, el ho- del Ing. H. Pérez.

342 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei rario de encendido y apagado de aireadores debe estar sujeto a los requerimientos metabólicos de las cepas bacterianas utilizadas, para mantener las condiciones óptimas dentro del estanque, aunque los sistemas heterotróficos requieren generalmente aireación continua. Es recomendable minimizar el recambio de agua sin afectar la producción y manteniendo niveles aceptables de los parámetros físico-químicos que se manejan durante el cultivo. Se recomienda hacer recambios de agua en un estanque, cuando las variables físico-químicas del agua se encuentren por debajo de los niveles mínimos aceptables. La reducción en el volumen del recambio en un estanque, ayudará a reducir costos en combustible, mantenimiento de los equipos de bombeo y cantidad de nutrientes en los efluentes. Durante el verano, se debe reponer el agua perdida por evaporación, para evitar que suba demasiado la salinidad y que descienda drásticamente el nivel de operación de los estanques. Si algún estanque de la granja presenta problemas de enfermedades, éste deberá ser manejado con cero recambios agregando agua sólo para reponer niveles perdidos por evaporación. La fertilización y manejo de la productividad debe ser utilizada bajo principios técnicos propios de cada producto y con conocimiento del tipo de nutriente y dosis que se requiere para cada caso. Es importante que el tipo y dosis del fertilizante a usar en los estanques, este basado en un aná- lisis de los niveles de nutrientes y que se busque mantener las relaciones requeridas entre ellos (ej.: N:P:Si, Ca:Mg:K, C:N). Lo anterior, para obtener buena producción primaria, un apropiado equilibrio microbiano, un balance iónico aceptable y un buen crecimiento de los camarones. La fertilización contiene nutrientes que promueven el crecimiento del fitoplancton, y la misma debe estar dirigida a promover el crecimiento de las algas de mayor beneficio para el cultivo, como son las diatomeas (Fig. 8.1.8). Cuando las poblaciones de fitoplancton son excesivas, la respiración del mismo causará baja concentración de OD durante la noche. También, por complejas razones limnológicas, las poblaciones densas de algas pueden morir rápidamente (“crash” de algas), causando un alto consumo de oxígeno por su rápida descomposición. Este proceso reduce el oxígeno para los camarones y puede causar mortalidades masivas por hipoxia prolongada. Ciertas especies de algas verde-azules pueden ser tóxicas para el camarón y producir compuestos que dan olores y sabores no característicos o desagradables al producto, haciéndolo inaceptable para los consumidores (Fig. 8.1.9).

Figura 8.1.8. Diatomeas, Navícula (izquierda) y Chaetoceros (derecha). Constituyen la principal fuente de alimento del zooplancton que es consu- mido por los camarones. Fotos corte- sía de la Dra. E. Wright.

Figura 8.1.9. Dinoflagelados, Peridi- nium (izquierda) y Cianófitas (derecha). Productores de metabolitos que afectan la calidad de los camarones. Foto cortesía de la Dra. E. Wright.

343 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Esto es generalmente producido por los metabolitos secundarios (2-metilisoborneol (MIB) y geosmina (GSM), que son sintetizados por diferentes microorganismos presentes en el agua y suelo como las cianobacterias (Oscillatoria, Anabaena y Microcystis sp.), actinobacterias (Actinomycetes, Streptomyces y Nocardia sp.), bacilariófitas, clorófitas, crisófitas, dinoflagelados y otros microorganismos como los hongos. Antes de hacer una aplicación de fertilizantes, se debe verificar que el estanque se encuentra cerrado; es decir, sin recambio de agua en ese momento. Esto evitará pérdida del producto, descargas al ambiente y se conseguirá buena efectividad del mismo en el estanque. Debe permitirse al fertilizante actuar por lo menos 24 horas, sin realizar en este tiempo recambios hídricos. Para logar un rápido efecto, es preferible utilizar fertilizantes líquidos. Si se utilizan fertilizantes granulados, se deberá asegurar su completa dilución antes de su aplicación en el agua y no aplicarlos directamente en forma granulada. En el caso de los fertilizantes fosforados, si se utilizan en forma granulada, se precipitan hacia el fondo donde se disuelven muy lentamente y se pierde gran cantidad de fósforo pues es rápidamente absorbido por el sedimento. Por esta razón, pasa muy poco a la columna de agua como nutriente y casi no es utilizado por las algas. En aguas con altas concentraciones de calcio y un elevado pH, el fósforo se precipita como Fosfato de Calcio acumulándose en el fondo sin ser aprovechado por las algas. Debido a que el fósforo es de difícil dilución, es recomendable aplicarlo durante varios días para un mejor aprovechamiento por parte del fitoplancton. Los fertilizantes granulados pueden ser aplicados en plataformas sumergidas, disueltos en barriles o toneles y la mezcla aplicarse a la superficie del estanque; también, el fertilizante puede ser colocado en bolsas porosas colgadas en las compuertas de entrada. El uso en estanques de fertilizantes orgánicos es menos deseable que los fertilizantes inorgá- nicos, ya que su contenido de nutrientes es altamente variable y su descomposición puede causar problemas en la calidad del agua. Si el administrador quiere usar fertilizantes orgánicos, es preferible el uso de alimentos y productos vegetales baratos de plantas en lugar del estiércol animal. Los fertilizantes deben ser almacenados en lugares limpios y secos, lejos de chispas eléctricas y sus derrames deben ser evitados. Algunos fertilizantes como el nitrato de amonio y nitrato de sodio, son altamente explosivos y no deben estar en contacto con aceites o chispas eléctricas. La humedad tiende a provocar que los fertilizantes formen terrones, por lo que se recomienda su almacenamiento en áreas seguras, limpias y secas. Si se utilizan sacos de fertilizantes granulados, estos deben estar estibados en parrillas de madera y separados entre sí. Este almacén debe estar debidamente rotulado y si es posible, contar con una ducha de agua para cualquier peligro de intoxicación. En el tema de manejo de depredadores y competidores deben ser considerados los problemas que traen en la productividad de las granjas camaroneras, ya que pueden reducir la población de camarones, propagar y difundir enfermedades, competir por el alimento de los camarones y, en casos donde los depredadores son caimanes o cocodrilos, se pueden poner en riesgo vidas humanas. Es preferible implementar medidas de exclusión para disminuir la presencia de depredadores y competidores en la granja. Éstas incluyen el uso de mallas de filtración, cercas perimetrales, recolección y destrucción de organismo muertos dentro y alrededor de la granja, no dejar alimento a la intemperie o regado en las bordas y evitar la exposición de basuras o desechos orgánicos, entre otras. La depre- dación por aves debe ser minimizada por métodos no letales, usando mecanismos inofensivos para el ambiente, pero que al mismo tiempo sean eficientes. Otra medida a considerar es prevenir las fugas de los camarones los cuales por ningún motivo deben escapar al ambiente, siendo una medida que tiene repercusión económica y ambiental. Para ello las estructuras con mallas deben estar en buenas condiciones de mantenimiento y ser adecuadas al tamaño del camarón en las compuertas de entrada y salida de los estanques y de los canales de dre-

344 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei naje; para lo cual es conveniente ubicar redes o filtros en las cajas de cosecha y utilizar bolsas de captura y conos de pesaje con redes nuevas o en buen estado. Hay que estar pendientes de su revisión y reparación oportuna durante y después de cada cosecha. De la misma manera, se debe contar con reemplazos de estos implementos de cosecha, para la sustitución inmediata en caso de ser necesario. Uno de los mayores impactos ambientales potenciales durante la operación de una granja de cama- rón, es la descarga del agua de un estanque con alta carga de nutrientes que podría producir eutroficación del cuerpo de agua receptor. Algunas de las técnicas de manejo más recientes incluyen el reciclaje o recircu- lación de agua a través de un sistema de estanques, el cual permite que el agua se depure y pueda volver a ser usada; esta práctica de bioseguridad de la granja, permite reducir efluentes de los estanques, disminuir la entrada de agua proveniente del estero (riesgo de introducción de predadores, camarón silvestre y posibles enfermedades), bajar el costo de combustibles y evita la pérdida de la productividad natural de los estanques. Se debe agregar agua sólo para reponer el nivel perdido por evaporación, infiltración o fugas. Como un gesto de responsabilidad de los productores durante episodios patológicos, se debe evitar la descarga de efluentes en el momento de su identificación, así como inmediatamente después de una aplicación de insumos destinados al control de dicho problema sanitario. De igual manera, no se debe hacer recambio justo cuando se hacen aplicaciones de productos tendientes a mejorar la calidad del agua de los estanques. Con la implementación de un manejo técnico basado en un protocolo definido, se tienen muchas posibilidades de mantener cerrados los estanques por mayor tiempo durante el ciclo de producción y disminuir considerablemente los recambios de agua con la consecuente disminución del volumen de efluentes. Así mismo, disminuye el consumo de hidrocarburos para el bombeo de los recambios y se reducen los impactos al ambiente. e. Manejo de enfermedades en los camarones La falta de evaluaciones frecuentes de la salud de los camarones puede facilitar la disemina- ción de enfermedades entre estanques de la misma granja y de una granja a otra de la misma zona o región. La pérdida casi total de una población de camarones a causa de una infección, pudiera incluso pasar desapercibida si no se realizan evaluaciones semanales meticulosas del estado de salud de los camarones. Muchas enfermedades se presentan después de períodos de estrés. Un dogma general de la acuicultura es que el ataque de enfermedades epidémicas se debe a prácticas de manejo deficientes, las cuales debilitan la resistencia de animales cultivados. La prevención consiste en evitar las condiciones de estrés en el cultivo, la introducción de enfermedades emergentes y la implementa- ción de buenas prácticas. Las condiciones de estrés en el estanque pueden presentarse por problemas crónicos de la calidad del agua, tales como frecuentes niveles bajos de OD, altas concentraciones de amonio no ionizado, altas densidades de camarón, temperaturas extremas durante el transporte o el manejo, o una dieta deficiente. El monitoreo de la salud de los camarones permite una temprana detección de las enfermedades. A la par, se deben diseñar e implementar procedimientos que ayuden a controlar la propagación de la enfermedad cuando esta se presente. La siguiente tabla 4, sugiere una guía para la interpre- tación de la carga bacteriana en hemolinfa y hepatopáncreas de camarones de cultivo, a partir de siembras en agar TCBS:

345 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Tabla 4: Guía para la interpretación de resultados de crecimiento bacteriano en agar TCBS en camarones juveniles y adultos (adaptado de Gómez-Gil, 2006).

Hemolinfa Hepatopáncreas Tipos de UFC (UFC/mL) (UFC/g) > 103 < 103 > 105 < 105

Verdes Luminiscentes 100% Muy grave Grave Grave Grave

Verdes > 50% Grave Serio Serio Serio

Verdes < 50% Serio Serio – Normal Serio Serio - Normal

Amarillas Serio Normal Normal Normal

En caso de cualquier infección causada por virus, bacterias, hongos, parásitos u otros pató- genos, se debe activar el plan de manejo sanitario de la granja aplicado para cada enfermedad en particular, principalmente la fijación de muestras para análisis de laboratorio, con lo cual se podrá realizar histopatología, prueba de la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) y análisis microbio- lógicos. Esto ayudará a identificar las condiciones que facilitaron el surgimiento del brote. Sumado a lo anterior, se deben tomar medidas inmediatas de bioseguridad tales como: a) notificación a la autoridad competente, b) informar adecuadamente a las empresas vecinas, c) controlar la entrada y salida de personal y de camarones a la empresa y d) minimizar el recambio hídrico y la consecuente descarga de efluentes al ambiente. Las granjas de camarón deben contar con protocolos para el manejo de enfermedades, incluyendo planes de emergencia para enfermedades emergentes. Se debe tener y poner en práctica un plan de manejo preventivo de las enfermedades, que incluya monitoreos frecuentes de campo para evaluar el estado sanitario de las poblaciones, reduc- ción de factores de estrés, manipulación cuidadosa, densidades de siembra según la capacidad de la granja, manejo de la calidad del agua, manejo apropiado de los alimentos, higiene, control de plagas y aves y, cualquier otra entidad potencialmente transmisora de enfermedades. En caso de sospecha de una enfermedad transfronteriza, emergente o de declaración obligatoria de la OIE, se debe notificar a la autoridad competente del país. Es prioritario determinar la causa o agente patógeno de la enfermedad, así como su naturaleza y extensión, para así definir una estrategia de manejo y un plan de acción, el cual permita a los téc- nicos decidir sobre la mejor alternativa o solución para el problema. Se debe contar con laboratorios de patología de organismos acuáticos nacionales, para que diagnostiquen las enfermedades de los camarones, o, en caso necesario, laboratorios de referencia en el exterior. De acuerdo con la OIE, los métodos para la confirmación de enfermedades que presentan mayor sensibilidad y especificidad, incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en Inglés). En la actualidad, existen kits comerciales de PCR para la detección de las principales enfermedades infecciosas en camarones. Si se detecta un brote, se debe activar el plan de emergencia implementado por la autoridad competente e imponer de manera inmediata restricciones al movimiento de personas y animales hacia dentro y fuera del área afectada, mientras el contagio persista. f. Uso de medicamentos veterinarios, productos químicos y biológicos Un gran número de químicos son usados en acuicultura, pero sólo unos cuantos tienen efectos benéficos. Las enfermedades de camarones con índices altos de morbilidad y mortalidad y que son de naturaleza viral, no se deben tratar con antimicrobianos porque éstos no tienen ningún efecto sobre

346 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei los virus. En caso de confirmar una infección bacteriana secundaria, se pueden utilizar antimicrobianos para el control de dichas cepas, habiendo comprobado su susceptibilidad al producto y en la medida en la que éstos sean aprobados para tal fin. Algunos químicos pueden causar efectos adversos a la biota de los cuerpos de agua receptores, tales como toxicidad o bio-acumulación. El uso cuidadoso de los químicos permitirá bajar costos y prevenir efectos dañinos secundarios. El uso de medicamentos veterinarios y químicos como fertilizantes, plaguicidas, etc., debe hacerse para fines específicos como el control de enfermedades acertadamente diagnosticadas o para el manejo de la calidad del agua de los estanques. Además, las concentraciones utilizadas no deben producir daños ambientales. Se debe solicitar a los distribuidores de los productos químicos y biológicos utilizados en las granjas, las respectivas fichas técnicas, hojas de seguridad y certificados de registro sanitario para cada país. Así mismo, los productores deben seguir las recomendaciones en cuanto a dosis y manejo, que el fabricante establece para cada presentación. Los mismos deben usarse sólo bajo prescripción de un médico veterinario u otro profesional con competencias aprobadas (CAC/GL71-2009). Para cada producto químico o biológico a utilizar, la granja debe contar con un plan de contingencia y suministrar a los operarios los medios de protección recomendados en cada caso para evitar accidentes. Esto debe ir acompañado siempre de un período de capacitación previo al uso del producto. g. Normativas Internacionales para medicamentos Los sistemas de producción de camarones deberían diseñarse y gestionarse para asegurar que la exposición a medicamentos veterinarios de los animales destinados a la producción de alimentos, no represente un riesgo para la salud humana. En el caso de los medicamentos veterinarios, su uso constante (como “profiláctico”) puede causar problemas en la salud humana, induciendo resistencia en las bacterias que se están tratando de combatir. Además, la liberación de estos productos en el ambiente, puede afectar negativamente a otros organismos acuáticos. Por esta razón, cabe recalcar que los antimicrobianos sólo se deben utilizar como tratamientos curativos cuando se confirme una enfermedad bacteriana y nunca deben ser usados con la idea de hacer prevención. Es mandatorio respetar los tiempos de retiro antes de proceder con la cosecha de los camarones, so pena de estrictas sanciones internacionales. La lista de drogas autorizadas para su uso en acuicultura por la FDA (Food and Drug Admi- nistration) y EMEA (European Agency for the Evaluation of Medicinal Products) para ser empleados dentro del territorio norteamericano y europeo, brindan una guía para los países productores que dependen de estos mercados para comercializar sus productos. Si bien, la prohibición legal que pueda existir para algún antibiótico en los EE.UU. o en Eu- ropa, no se extiende para nuestra industria dentro de la legislación nacional, esta influye significativamente en el manejo que debe dársele al fármaco por parte de los productores y exportadores. Por ejemplo, aquellos antibióticos prohibidos por la FDA y EMEA para su empleo en cualquier industria productora de animales comestibles, como el cloramfenicol, nitrofuranos y fluorquinolonas (ejemplos: enrofloxacina, danofloxacina, etc.) no deberían ser utilizados por empresas acuícolas conscien- tes de las nefastas consecuencias que podría tener el hallazgo de residuos de estos medicamentos en camarón, peces o moluscos para nuestra industria acuícola. La FDA establece que es ilegal utilizar una droga no autorizada, a menos que esté calificada como una “nueva droga para investigación animal” (por sus siglas en inglés, INAD). Esta excepción se aplica tan sólo durante el tiempo empleado para generar la información necesaria y obtener la apro- bación del fármaco bajo la supervisión de la FDA. Una vez completados los requisitos, se obtiene la denominada “aprobación para una nueva droga animal” (por sus siglas en inglés, NADA).

347 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Los criterios sobre los cuales se evalúan las medicinas veterinarias en la Comunidad Económi- ca Europea (CEE) son los de calidad, eficacia y seguridad. Este mismo autor califica a la regulación europea y la norteamericana como muy similares, señalando que probablemente la única diferencia se observa en la rigidez como se establecen los límites máximos de residuos (LMR) por parte de la CEE, contrastando con el enfoque de niveles tolerables que se les brinda en los EE.UU. La EMEA establece que no podrá autorizarse la puesta en el mercado de un medicamento veterinario, con excepción de los inmunológicos, para ser administrado a animales cuya carne o productos sean destinados al consumo humano si no tiene establecido el correspondiente LMR (LMR: contenido máximo de residuos resultante de la utilización de un medicamento veterinario autorizado en la Comunidad como admisible en un producto alimenticio) tal y como está previsto en el Regla- mento (UE) N0. 37/2010 de 22 de diciembre de 2009 relativo a las sustancias farmacológicamente activas y clasificación por lo que se refiere a los límites máximos de residuos en los productos alimenticios de origen animal. El nuevo Reglamento UE introduce varias novedades, como son: • Se crean únicamente dos listas en lugar de los cuatro anexos anteriores: LMRs para sustancias permitidas, y lista de sustancias prohibidas • Se introduce información acerca de la clasificación terapéutica de las sustancias, así como posibles condiciones o restricciones de su utilización. En la tabla 5 se presentan las Sustancias farmacológicamente activas y su clasificación por lo que se refiere a los límites máximos de residuos (LMR)

Tabla 5. Sustancias autorizadas (del Reglamento 37/2010).

Sustancia farmacoló- Residuo Otras disposiciones Reg. Clasificación Especie animal LMR Tejidos diana gicamente marcador 470/2009 Terapéutica Activa

Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 100 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 50 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ cido oxolínico cido oxolínico Á Á a la producción 150 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 150 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces. Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 50 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 50 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Amoxicilina Amoxicilina a la producción 50 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 50 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces.

Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 50 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 50 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Ampicilina Ampicilina a la producción 50 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 50 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces.

Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 50 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y Bencilpeni- cies destinadas 50 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Bencilpenicilina cilina a la producción 50 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 50 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces. Antiparasitarios/ Cipermetrina Músculo y piel Agentes activos Cipermetrina (suma de los Salmónidos 50 μg/kg en proporciones Nada frente a los ecto- isómeros) normales parásitos

348 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei

Sustancia farmacoló- Residuo Otras disposiciones Reg. Clasificación Especie animal LMR Tejidos diana gicamente marcador 470/2009 Terapéutica Activa

Para los peces, el LMR en el Todas las espe- músculo se refiere a «músculo y Suma de medi- 100 μg/kg Músculo cies destinadas piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Clortetraciclina camento base y 300 μg/kg Hígado a la producción Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos su 4-epímero 600 μg/kg Riñón de alimentos y el riñón no se aplican a los peces. Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 300 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 300 g/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Cloxacilina Cloxacilina μ a la producción 300 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 300 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces.

Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 150 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 150 g/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Colistina Colistina μ a la producción 150 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 200 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces.

Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 100 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 50 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Danofloxacino Danofloxacino a la producción 200 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 200 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces. Antiparasitarios/ Músculo y piel Agentes activos Deltametrina Deltametrina Peces 10 μg/kg en proporciones Nada frente a los ecto- normales parásitos Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 300 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 300 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Dicloxacilina Dicloxacilina a la producción 300 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 300 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces. Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 300 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 100 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Difloxacino Difloxacino a la producción 800 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 600 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces. Antiparasitarios/ Músculo y piel Agentes activos Diflubenzurón Diflubenzurón Salmónidos 1000 μg/kg en proporciones Nada frente a los ecto- normales parásitos Antiparasitarios/ Músculo y piel Emamectina Agentes activos Emamectina Peces 100 μg/kg en proporciones Nada B 1a frente a los ecto- normales parásitos Para los peces, el LMR en el Suma de Enro- Todas las espe- 100 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y floxacino cies destinadas 100 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Enrofloxacino Y Ciprofloxa- a la producción 200 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos cino de alimentos 200 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces.

349 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Sustancia farmacoló- Residuo Otras disposiciones Reg. Clasificación Especie animal LMR Tejidos diana gicamente marcador 470/2009 Terapéutica Activa

Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 200 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 200 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Eritromicina Eritromicina A a la producción 200 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 200 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces. Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 300 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y Espectinomi- Espectinomi- cies destinadas 500 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ cina cina a la producción 1000 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 5000 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces. Músculo y piel Antiinfecciosos/ Peces 1000 μg/kg en proporciones Nada Antibióticos Suma de naturales florfenicol y de sus metabolitos Para los peces, el LMR en el Florfenicol medidos en Todas las espe- 100 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y florfenicola- cies destinadas 200 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales» Antiinfecciosos/ mina a la producción 2000 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 300 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces Músculo y piel Antiinfecciosos/ Peces 600 μg/kg en proporciones Nada Antibióticos naturales Para los peces, el LMR en el Flumequina Flumequina Todas las espe- 300 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 500 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ a la producción 1000 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 5000 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces. Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 100 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 50 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Lincomicina Lincomicina a la producción 500 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 1500 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces. Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 500 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y Neomicina cies destinadas 500 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ (incluida Frami- Neomicina B a la producción 500 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos cetina) de alimentos 5000 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces. Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 300 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 300 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Oxacilina Oxacilina a la producción 300 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 300 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces. Para los peces, el LMR en el Todas las espe- músculo se refiere a «músculo y Suma de medi- 100 μg/kg Músculo Oxicetetraci- cies destinadas piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ camento base y 300 μg/kg Hígado clina a la producción Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos su 4-epímero 600 μg/kg Riñón de alimentos y el riñón no se aplican a los peces. Para los peces, el LMR en el Todas las espe- músculo se refiere a «músculo y 500 μg/kg Músculo cies destinadas piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Paromomicina Paromomicina 1500 μg/kg Hígado a la producción Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos 1500 μg/kg Riñón de alimentos y el riñón no se aplican a los peces.

350 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei

Sustancia farmacoló- Residuo Otras disposiciones Reg. Clasificación Especie animal LMR Tejidos diana gicamente marcador 470/2009 Terapéutica Activa

Músculo y piel Antiinfecciosos/ Sarafloxacino Sarafloxacino Salmónidos 30 μg/kg en proporciones Nada Antibióticos naturales Sulfonamidas Para los peces, el LMR en el (todas las Todas las espe- 100 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y Antiinfecciosos/ sustancias que Medicamentos cies destinadas 100 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Quimioterapéu- pertenecen al base a la producción 100 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado ticos grupo de sulfo- de alimentos 100 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los namidas) peces. Antiparasitarios/ Músculo y piel Agentes activos Teflubenzurón Teflubenzurón Salmónidos 500 μg/kg en proporciones Nada frente a los ecto- naturales parásitos Para los peces, el LMR en el Todas las espe- músculo se refiere a «músculo y Suma de medi- 100 μg/kg Músculo cies destinadas piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Tetraciclina camento base y 300 μg/kg Hígado a la producción Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos su 4-epímero 600 μg/kg Riñón de alimentos y el riñón no se aplican a los peces. Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 50 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 50 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Tianfenicol Tianfenicol a la producción 50 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 50 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces. Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 50 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 50 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Tilmicosina Tilmicosina a la producción 1000 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 1000 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces. Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 100 μg/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y cies destinadas 100 μg/kg Grasa piel en proporciones naturales». Antiinfecciosos/ Tilosina Tilosina A a la producción 100 μg/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado Antibióticos de alimentos 100 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces. Para los peces, el LMR en el Todas las espe- 50 g/kg Músculo músculo se refiere a «músculo y μ Antiinfecciosos/ cies destinadas 50 g/kg Grasa piel en proporciones naturales». Trimetoprima Trimetoprima μ Quimioterapéu- a la producción 50 g/kg Hígado Los LMR en la grasa, el hígado μ ticos de alimentos 50 μg/kg Riñón y el riñón no se aplican a los peces.

Fuente: Reglamento 37/2010.

Esta normativa 37/2010 entró en vigor a partir del 12 de Enero de 2010, quedando prohibido el uso de medicamentos veterinarios que contengan sustancias farmacológicamente activas mencionadas en la siguiente tabla 6 en animales productores de alimentos. Esta misma normativa es aplicable a los productos de acuicultura.

351 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Tabla 6. Sustancias prohibidas

Sustancia farmacológicamente activa LMR

Aristolochia spp. y sus formulaciones No puede establecerse LMR.

Cloramfenicol No puede establecerse LMR.

Cloroformo No puede establecerse LMR.

Clorpromazina No puede establecerse LMR.

Colchicina No puede establecerse LMR.

Dapsona No puede establecerse LMR.

Dimetridazol No puede establecerse LMR.

Metronidazol No puede establecerse LMR.

Nitrofuranos (incluida la furazolidona) No puede establecerse LMR.

Ronidazol No puede establecerse LMR.

Fuente: Reglamento 37/2010.

Tabla 7. Drogas aprobadas para uso en acuicultura por la FDA.

ESPECIE MEDICAMENTO TOLERANCIA (LMR) MATRIZ

Bagre de canal y Florfenicol salmónidos criados en 1,0 ppm Músculo agua dulce

Oxitetraciclina Peces y Langosta 2.0 ppm Músculo

Sulfamerazina Trucha No se permiten residuos

Sulfadimetoxina/ Salmónidos y bagre 0.1 ppm por cada una Tejido comestible ormetoprim combinación

Fuente: Guía de Peligros y Controles de Pescados y de Productos Pesqueros. FDA Cuarta Edición Abril 2011.

352 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei

Tabla 8. Drogas PROHIBIDAS por la FDA para uso en medicación veterinaria.

PRODUCTO NIVEL

Medicamentos veterinarios prohibidos para su uso fuera de las indicaciones en los animales (extra-etiqueta) - no se permiten residuos: Cloramfenicol Clenbuterol Todos los peces Dietilestilbestrol (DES) Dimetridazole; Ipronidazole y otros Nitroimidazoles Furazolidona; Nitrofurazone, y otros nitrofuranos Fluoroquinolonas Glicopéptidos

Fuente: Guía de Peligros y Controles de Pescados y de Productos Pesqueros. FDA Cuarta Edición Abril 2011. h. Manejo de desechos domésticos La composición de los desechos domésticos generados en una granja es variable y depende de la cantidad de personas que residen y trabajan en la misma, así como de los hábitos de ellas. Entre los desechos característicos se incluyen productos como pilas y otros componentes eléctricos, algunos de los pueden contener mercurio; contenedores con residuos de aceite, pinturas, materiales cáusticos, agentes esterilizantes, lejías, medicinas, pañales desechables, heces de animales y basura asociada, junto con productos alimenticios desechados que se degradan rápidamente y emiten olor desagradable. La recogida, transporte o eliminación de los desechos domésticos, pueden tener efectos ambientales adversos como contaminación atmosférica y olores desagradables; posibles peligros para la salud por la acumulación de agua contaminada que es medio de cría para mosquitos y atrae a moscas y alimañas, entre otras plagas; pérdida de tierra productiva debido a la presencia de productos de len- ta degradación, contaminación del suelo y de aguas subterráneas y superficiales por lixiviación con los consiguientes efectos ambientales o riesgos para la salud y contaminación del medio marino por descarga de desechos. Las aguas servidas (o de desecho) deben ser tratadas para no contaminar las áreas circunvecinas, ya que éstas contienen microorganismos que pueden ser dañinos para la salud del ser humano, animales domésticos y silvestres. El uso de fertilizantes orgánicos no tratados y de alimentos sin una buena cocción (como alimento para los camarones) para levantar las poblaciones de fitoplancton, podrían causar problemas de salud pública por presencia de Escherichia coli, Salmonella spp. y otros organismos patógenos para el hombre. Los sanitarios e instalaciones afines de las granjas deben tener sistemas bioseguros de manejo para las aguas servidas, que eviten su infiltración hacia cuerpos de agua utilizados para la producción de los camarones o, aún peor, para consumo humano. i. Manejo durante la cosecha Antes de iniciar la cosecha, se debe elaborar un plan donde quede definido en cada paso, quién, cuándo, cómo y dónde deben cumplirse las actividades de la operación, personal, materiales y equipo; además, para asegurar la preparación de los estanques y el cumplimiento de los tiempos de retiro de los alimentos medicados. Para proceder con la cosecha, los camarones deben reunir ciertas condiciones tales como: tamaño apropiado, buen estado sanitario (ausencia de enfermedades en ese momento), características organolépticas apropiadas y condiciones físicas aceptables según las exi-

353 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos gencias del mercado. Para lograr estas condiciones, se recomienda que antes de 15 días de la fecha de cosecha, se realicen muestreos para determinar estas características, tomando acciones anticipadas en caso de ser necesario. Una situación que afecta la calidad del camarón, son las altas concentraciones de bacterias y algas, principalmente las cianobacterias (Oscillatoria, Anabaena, Microcystis, entre otras) y actinobacterias (Actinomycetes, Streptomyces y Nocardia). Se recomienda retirar la alimentación entre 24 y 48 horas antes de la cosecha, para evitar que la repleción por alimento en descomposición dentro del camarón luego de la cosecha, cause problemas en el hepatopáncreas durante el procesamiento. Durante el proceso de cosecha, es de gran importancia tener personal con experiencia y entrenado para dirigir las acciones, que no presente condiciones de salud deteriorada (heridas, infecciones respiratorias o digestivas y otras infectocontagiosas) y llevar registros adecuados por cada recipiente de cosecha, con respecto a la cantidad de hielo, cantidad de camarón, tiempo de llenado, tiempo de captura por cada alzada y cantidad de metabisulfito. Estos registros son parte de la trazabilidad y permitirán hacer correcciones oportunas en caso de pérdida de la calidad del producto. Los camarones cosechados deben ser enhielados de forma inmediata y en la medida en que van saliendo del estanque, de manera que éstos mueran por choque térmico. Las dosis de metabisulfito de sodio deben estar basadas en los requerimientos de los mercados de destino. En cuanto a la degradación del metabisulfito en el ambiente, los métodos para determinación de biodegradabilidad no son aplicables para sustancias inorgánicas. Sin embargo, de acuerdo con la ficha técnica del producto, no es de esperarse una bioacumulación en el ambiente, aunque puede tener un efecto perjudicial sobre organismos acuáticos (Fig. 8.1.10). Las soluciones con metabisulfito de sodio que han sido utilizadas en camarones así como las que han quedado sin utilizarse, deben ser neutralizadas antes de su descarte. Para ello, se pueden tratar con Carbonato de sodio como neutralizante, de acuerdo con las dosis de manejo que han sido establecidas por el fabricante. También se puede neutralizar el metabisulfito de sodio utilizando 0.34 kg de carbonato de calcio (CaCO3) por cada kg de metabisulfito presente en la solución. Por otro lado, se puede bajar a valores inferiores a 25% la concentración del metabisulfito de sodio antes de descartarlo, mediante la dilución con agua en el recipiente con el producto. El camarón cosechado se debe manejar de manera rápida y eficiente y que muera por choque térmico para no afectar su calidad. Además, por ningún motivo se debe romper la cadena de frío durante el transporte a las plantas de proceso o mercados. Todas las actividades o acciones que se ejecuten durante la cosecha y post-cosecha de un estanque, deber estar debidamente registradas, así como el pesaje del camarón, en un sistema de trazabilidad. j. Bioseguridad

Figura 8.1.10. Proceso de enhielado inmediato durante una cosecha en una granja camaronera, produciendo la muerte de los camarones por choque térmico e iniciando de esta manera la cadena de frío. Foto cortesía del Ing. C. Lara.

354 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei

Las medidas de bioseguridad deben ser estrictamente aplicadas por todo el personal de la granja, así como por personas ajenas a la granja que por alguna razón deban ingresar o pasar por dentro de las instalaciones de la misma. Cada granja debe contar con programas de capacitación y tener un responsable del cumplimiento de dichas medidas, quien mediante protocolos y registros asegure su aplicación constante y sistemática. Para disminuir el riesgo de introducción de enfermedades y facilitar la trazabilidad de un problema de inocuidad, se debe contar con un sistema eficiente de control de entrada y salida de personal y equipo rodante, así como un sistema de desinfección de los mismos diseñado de manera que no pueda ser obviado en ninguna circunstancia. Se debe tener una única puerta de acceso, con una caseta (garita) de control para a) el control de ingreso sólo para quienes estén autorizados, b) registro de los datos de vehículos y personas que ingresan, c) desinfección de éstos antes del ingreso a las instalaciones (rodiluvios y pediluvios) e) revisión respetuosa y ágil de vehículos y personas que abandonen la empresa (para evitar el hurto de materiales, equipos o camarón) y f) registro manual de éstos al salir de la granja. Las visitas deben ser dotadas de indumentaria de seguridad como botas de caucho, gorra y bata (preferiblemente desechables), así como con un carnet de visitante que debe ser portado en lugar visible y de manera permanente dentro de la granja. La limpieza y desinfección de instalaciones de cultivo, conlleva la eliminación total de los camarones vivos o refrigerados y la desinfección de toda la instalación. Antes de proceder con la desinfección total de instalaciones, se deben tomar en cuenta lo siguientes aspectos: • Coordinación de un plan de desinfección total de las instalaciones • Se debe planificar un programa de cosechas, que permita que los camarones en cultivo alcancen una talla comercial razonable y definir un período prudencial hasta las nuevas siembras de postlarvas. Este lapso de tiempo entre cosecha y siembra, permitirá implementar un vacío sanitario en el estanque para realizar su limpieza y desinfección • Manejo apropiado de los camarones a desechar, que son aquellos animales vivos que quedan enterrados o en charcos en los estanques de cultivo después de las cosechas. Los camarones muertos que quedan tras la cosecha, deben ser recogidos totalmente y enterrados aplicando capas de hidróxido de calcio (“cal apagada”) u óxido de calcio (“cal viva”) Una vez que todos los camarones han sido eliminados de las unidades de cultivo, se debe proceder a la desinfección, asumiendo que toda la granja está contaminada. Los siguientes desinfectantes son de uso común en la limpieza de las instalaciones de cultivo de camarones: Cloro (como hipoclorito de calcio o como hipoclorito de sodio). Este compuesto es altamente tóxico para organismos acuáticos; su concentración letal media (LC50) a 96 horas varía según la especie entre 0.04 y 0.5 mg/L-1; yodo usado en su forma estable para desinfectar equipo; cal (como óxido de calcio o hidróxido de calcio); luz UV (ultravioleta), desecación (luz solar), detergentes o compuestos orgáni- cos, entre otros. El cloro y el yodo son muy tóxicos, se recomienda neutralizar estos productos con tiosulfato de sodio (cinco moles de tiosulfato neutralizan cuatro moles de cloro). Las proporciones moleculares son las mismas para el yodo. Por lo tanto, para inactivar el cloro, la cantidad de tiosulfato usada debe ser 2.85 veces la cantidad de cloro (expresada en gramos): número de gramos de tiosulfato = 2.85 × número de gramos de cloro. Para el yodo, la cantidad de tiosulfato debe ser 0.78 veces la cantidad de yodo expresada en gramos: Número de gramos de tiosulfato = 0.78 × número de gramos de yodo. También es posible preparar una solución de tiosulfato al 1% por peso, en cuyo caso los volúmenes son los siguientes (en mL): para el cloro: 28.5 × [número de litros de la solución desinfectante × con- centración de mg/litro] / 100; para el yodo: hay que multiplicar por 7.8 en vez de por 28.5.

355 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Para los estanques de tierra, el vacío sanitario es una medida de desinfección que permite mediante condiciones naturales (sol y viento) y con ayuda de la cal, disminuir la carga de organismos patógenos en el fondo de los estanques. Esta es una práctica eficiente y económica de desinfección, para las granjas camaroneras. Se debe realizar un drenado completo del estanque y luego, mientras el fondo aún mantiene cierta humedad, hay que cubrir toda la superficie del fondo con cal a razón de 1,000 kg/ha (si se usa óxido de calcio) o 1,500 kg/ha (si se usa hidróxido de calcio). El estanque debe dejarse reposar por varias semanas o al menos hasta que el fondo del estanque se haya secado hasta el punto de presentar grietas de al menos 10 centímetros de profundidad. El estanque debe permanecer seco hasta que la instalación entera ha sido totalmente desinfectada. Durante la estación lluviosa, también es importante el proceso de desinfección de los estanques, aunque por las condiciones de humedad, el mismo se dificulta y sólo se puede recurrir a un drenado máximo posible y la posterior aplicación de cloro en los charcos, e hidróxido u óxido de calcio sobre todo el fondo. Este mismo procedimiento de desinfección hay que aplicar a todos los tanques de plástico, concreto o fibra de vidrio deben ser drenados y dejados secar. Después, todas las superficies interiores y exteriores deben ser rociadas con una solución de cloro y dejadas así por varias horas. Estas superficies deben cepillarse hasta dejarlas limpias de todo residuo adherido a sus paredes. Los tanques deben llenarse totalmente con agua limpia, a la cual se debe agregar hipoclorito de calcio hasta lograr una concentración mínima de 200 ppm de cloro libre residual por toda una noche. El agua debe luego ser drenada en su totalidad y los tanques se deben enjuagar y dejar secar. Los equipos pueden agruparse en dos categorías: desechables y no desechables. Se consideran desechables los equipos y utensilios relativamente baratos y de fácil adquisición tales como mallas, redes y mangueras aireadoras. Todos los implementos que se puedan poner en remojo tales como tuberías removibles, piezas plásticas de plomería, jaulas para transferencia, cajas de cosecha, mesas de cosecha, discos Secchi, cristalería de laboratorio, etc., deben hacerlo en una solución de 200 ppm de cloro libre residual por 24-48 horas. El equipo usado en actividades de cultivo a campo abierto, también debe ser puesto en remojo en una solución de 200 ppm de cloro libre residual y luego secado al sol. Los equipos eléc- tricos y motorizados tales como tractores, camiones, herramientas eléctricas, deben ser desinfectados con soluciones comerciales comunes; lavados previamente y después deben ser rociados con una solución de 200 ppm de yodo. Equipos pequeños tales como balanzas, básculas, instrumentos de medición y pequeñas herramientas eléctricas deben ser limpiados con una esponja impregnada con yodo. Los equipos de medición electrónicos de alta precisión no deben ser expuestos al cloro ya que la corrosión puede dañarlos. Igualmente hay que considerar la desinfección de oficinas cuya contaminación comúnmente ocurre a través del tráfico de personas desde áreas contaminadas hacia áreas administrativas. Todos los pisos deben ser lavados con detergentes comunes y después enjuagados con una solución de 200 ppm de yodo, al igual que todos los mobiliarios presentes. Se deben desinfectar otras infraestructuras de la finca, considerando limpieza previa con desinfectantes comunes, el siguiente paso consiste en la cloración. La persona que aplique el cloro en forma de gas, debe usar un traje impermeable, más- cara anti-gas para cloro y anteojos protectores; también debe asegurarse de sellar todas las paredes y secciones del techo del edificio que pudieran permitir escapes de gas de cloro durante su aplicación. Las superficies que no admitan limpieza con cloro, deben ser desinfectadas con una esponja impregnada en yodo 200 ppm. Los pisos pueden ser inundados hasta una profundidad de 5 centímetros con 200 ppm de cloro libre residual, solución que deberá dejarse reposar por al menos 48 horas, para después ser enjuagada con agua dulce limpia.

356 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei

Para un adecuado control y erradicación de plagas en una granja, es importante considerar las condiciones de higiene y limpieza en las que se mantiene el entorno de la misma. Es responsabilidad de la granja definir un programa de control de plagas, en el cual se incluyan procedimientos, alcances, medidas de seguridad y parámetros de control, así como un adecuado sistema de registro y verificación. Para esto, se debe contratar una compañía de control de plagas certificada y debidamente registrada ante la Autoridad Competente. El procedimiento más relevante dentro del programa de control y erradicación de plagas, es la aplicación de medidas preventivas tales como recoger diariamente toda la basura que se genera y ubicar los desechos orgánicos en un lugar apropiado (o ser enterrados con cal). Todas las actividades realizadas con la bioseguridad de una granja camaronera, deben estar documentadas mediante registros completos y actualizados. Por consiguiente, deben existir formula- rios diseñados para la captación de datos según las diferentes necesidades de la granja y en función de las variables monitoreadas como parte de la bioseguridad. La verificación debe determinar el grado en que las actividades relacionadas con la producción se realizan conforme a las medidas de bioseguridad, siguiendo un calendario preestablecido que debe ser dado a conocer a los evaluadores y evaluados con suficiente anticipación. La verificación debe estar basada en un documento que defina las buenas prácticas, el cual debe estar disponible para consulta y aplicación del personal.

8.2. Sistema de disposición de desechos según su clasificación y posibilidad de reciclaje Las granjas deben implementar un plan de gestión ambiental que debe tener como principios la cultura de reducir, reusar y reciclar. En cada área de generación de desechos, se deben disponer recipientes de acuerdo con su clasificación y posibilidad de reciclaje. A pesar de que no existe una clasificación internacional para los colores de los recipientes de los desechos según sus caracterís- ticas, se propone la siguiente: verdes para la colecta de vidrio, amarillos para aceites reciclables, blancos para otro material reciclable, rojos para residuos químicos y biológicos peligrosos, azul para papel y cartón y gris para materiales orgánicos (biodegradables). La basura, desperdicios, desechos humanos y de cualquier otro tipo que se produzca en la granja, deben ser descartados cumpliendo las disposiciones nacionales, utilizando letrinas portátiles, rellenos sanitarios o sitios claramente definidos para tal fin, donde no se produzcan problemas de olor o presencia de animales salvajes.

8.3. Uso de energía El uso de energía eléctrica dentro de las granjas de camarón, es todavía indispensable para su funcionamiento y productividad. En función de la economía y de la protección del ambiente, se debe evitar el desperdicio de la misma. El uso de combustibles hidrocarburados (gasolina o diesel) debe hacerse de manera racional, pues en las actividades de producción este es uno de los renglones que más incide en los costos de una granja camaronera. Es importante entonces que las empresas dedicadas al cultivo del camarón, consideren la posibilidad de acceder a fuentes alternativas de energía tales como la solar, eólica, geotérmica y biomasa.

8.4. Planes de contingencia Debe ser operativo y expresar claramente lo que hay que hacer, por quién y cuándo. Los planes de contingencia cubren situaciones principalmente en el campo operativo y ambiental; son necesarios para minimizar daños al personal, al ambiente y a la infraestructura, ocasionados por accidentes o emergencias ocurridas dentro de la granja camaronera.

357 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

En caso de accidentes, como el derrame de aceite o combustible en los estanques, canales o lagunas de sedimentación, se debe contar con medidas de mitigación que aseguren procedimientos específicos a desarrollar hasta que se resuelva el problema y las actividades normales de la granja. Dentro del plan de contingencia, deben estar especificados los mecanismos de notificación oportuna del problema a las autoridades ambientales. También deben estar bien establecidos qué cargos dentro de la empresa son los responsables de poner en marcha cada una de las fases del plan de contingencia. Un buen plan debe ser exhaustivo aunque no demasiado detallado, bien estructurado, de fácil lectura y comprensión y, fácil de actualizar.

8.5. Registros en una granja camaronera Los registros del proceso de producción desde la siembra hasta la cosecha, permiten estandarizar y rastrear los procedimientos operacionales (trazabilidad) en cada paso del proceso, así como mantener un control de insumos y seguimiento a las variables físicas, químicas y biológicas del sistema de producción durante el ciclo de cultivo. Los registros que se deben llevar en una granja camaronera, incluyen todos aquellos que estén relacionados con bioseguridad, producción (muestreos semanales de peso y supervivencia, monitoreos sanitarios, consumo de alimento, medicaciones, aplicación de insumos, cosecha, etc.), almacenes (materiales, insumos, alimento, repuestos, madera, etc.), depósitos de combustible, talleres, adquisición y mantenimiento de equipos (vehículos, bombas, cosechadoras, oxímetros, microscopios, etc.), reuniones, visitas técnicas, capacitación, jornadas médicas, aspectos del personal (incapacidades, permisos, vacaciones, promociones, evaluaciones, bonificaciones, amonestaciones, etc.) y todas aquellas actividades que permitan hacer un análisis retrospectivo en la empresa.

8.6. Trazabilidad Entre las normas de carácter horizontal, el Reglamento Nº178/2002, artículo 18 del Consejo del Parlamento Europeo, sentó las bases para la puesta en marcha de métodos de trazabilidad por parte de todos los operadores de la cadena alimentaria. Esta disposición entró en vigor en febrero de 2002 y el artículo fue aplicable a partir del 1 de enero de 2005. La trazabilidad debe sustentarse en un proceso fiable de recopilación y gestión de los datos generados en todas las actividades inherentes a la inocuidad del producto cosechado, que se desarrollen en la granja. Este proceso puede basarse en registros impresos o informatizados. Su aplicación presenta amplias ventajas tanto para el productor, como para los consumidores y la Autoridad Com- petente. La trazabilidad como herramienta para rastrear el origen del producto y sus insumos dentro de la cadena de abastecimiento de alimentos, permite identificar y registrar cada producto desde su origen hasta el final de la cadena de comercialización. Desde el punto de vista productivo, los sistemas de trazabilidad mejoran la gestión de la unidad productiva (CPLs, granjas, plantas de procesamiento, transporte y distribución), al disponer de registros sistematizados y funcionales conforme a las necesidades de cada unidad. Un buen sistema de trazabilidad en la cadena alimentaria, no sólo juega un importante papel en la protección de los intereses del consumidor, sino que aporta grandes beneficios para las empresas.

358 CAPÍTULO 8 - Buenas prácticas y bioseguridad para el cultivo del camarón blanco Penaeus (Litopenaeus) vannamei

8.7. Referencias Bibliográficas

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359 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

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360 Abreviaturas

ABREVIATURAS

Acrónimo Nombre original Nombre traducido

ADN Ácido desoxirribonucleico ARN Ácido ribonucleico AFA Alcohol, formol, ácido acético (Fijador de Davidson-AFA) A-T Adenina - Timina BAPNA N-benzoil-arginina-p-nitroanilida (bromo-chloro-indol) dihydrogen phosphate Solución BCIP/NBT utilizada para reacciones BCIP/NBT [BCIP] / nitro-blue tetrazolium [NBT] colorimétricas BGBP β-1,3-Glucan Binding Protein Proteína de unión al β-1,3-Glucano BP Baculovirus penaei BPM Buenas prácticas de manejo Solución BSA/PBS [Bovine Serum Albumin / BSA= albúmina de suero bovino; PBS= BSA/PBS Phosphate buffered saline] fosfato salino tamponado Cuerpos de inclusión intranucleares de CAIs Cowdry tipo “A” cc Centímetro cúbico Centro para el Control y la Prevención de CDC Centers for Disease Control and Prevention Enfermedades CEE Comunidad Económica Europea C-G Citosina - Guanina CPLs Centros de producción larval CV Coeficiente de variación Órganos o tejidos “target”, a donde se DIANA dirigen ataques de agentes patógenos DIG Digoxigenina EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Ácido etildiaminotetraacético EIA Enzyme Immunoassays Inmunoanálisis ligado a enzimas Prueba de enzimas marcadas ELISA Enzyme linked immunosorbant assay inmunoabsorbentes EM Electron Microscopy Microscopía electrónica European Agency for the Evaluation of EMEA Agencia Europea de Medicamentos Medicinal Products EMS Early Mortality Syndrome Síndrome de mortalidad temprana EOL Esferoides del órgano linfoide EUA Estados Unidos de América. Food and Agriculture Organization of the Organización de las Naciones Unidas para la FAO United Nations. Alimentación y la Agricultura FCA Factor de conversión alimenticia FDA Food and Drug Administration Agencia de Medicamentos y Alimentos GAA Global Aquaculture Alliance Alianza Mundial de la Acuicultura Análisis de Riesgos y Puntos Críticos de HACCP Hazard Analysis of Critical Control Points Control H&E Hematoxilina y eosina HIS In situ hibridization Hibridación in situ

361 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Acrónimo Nombre original Nombre traducido

Infectious Hypodermal and Hematopoietic Virus de la Necrosis Infecciosa Hipodérmica IHHNV Necrosis Virus y Hematopoyética IMNV Infectious Myonecrosis Virus Virus de la Mionecrosis infecciosa INAD Investigation New Animal Drug Nueva Droga para Investigación Animal Organización Mundial para la ISO International Standards Organization Estandarización Amplificación isotérmica de ácidos nucleicos LAMP Loop-mediated isothermal amplification [Amplificación isotérmica mediada por vueltas/bucles] Proteína de unión a los lipopolisacáridos de LBP Lipopolysaccharide Binding Protein la pared de bacterias Gram negativas LC50 Lethal Concentration 50 Concentración Letal media (50%) L-DOPA L-3,4-dihydroxyphenylalanine L-3,4-dihidroxifenilalanina LMR Límites máximos de residuos LPS Lipopolisacáridos MAbs Monoclonal antibodies Pruebas de anticuerpos monoclonales MIC Concentración mínima inhibitoria MO Materia orgánica mL Mililitro N Nitrógeno Proceso para la aprobación de una nueva NADA New Animal Drug Application droga (antimicrobiano) para uso animal NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NaCl Cloruro de sodio (sal pura) Hepatopancreatitis necrotizante (causada por NHP Necrotizing hepatopancreatitis Hepatobacter penaei) NOS Óxido nítrico sintasa NSHP Necrosis Séptica del Hepatopáncreas OD Oxígeno disuelto OIE Organización Mundial de Sanidad Animal Organismo Internacional Regional de OIRSA Sanidad Agropecuaria OL Órgano linfoide OPS Organización Panamericana de la Salud Organización del Sector Pesquero y Acuícola OSPESCA del Istmo Centroamericano P Fósforo PAbs Polyclonal antibodies Pruebas de anticuerpos policlonales PAS Periodic acid-Schiff Ácido periódico de Shiff pb PCBs Policlorbifenilos o bifenilos policlorados PCR Polymerase Chain Reaction Reacción en Cadena de la Polimerasa PLs Postlarvas Procedimientos Operacionales POES Estandarizados de Saneamiento

362 Abreviaturas

Acrónimo Nombre original Nombre traducido ppm Partes por millón (uL/L, mg/Kg o g/Ton) PRPs Patrones de reconocimiento de proteínas PvNV Penaeus vannamei nodavirus Nodavirus del Penaeus vannamei Prueba de PCR en tiempo real, cuantitativa o qPCR Quantitative PCR/Real Time PCR reacción en cadena cinética de la polimerasa RDS Runt Deformity Syndrome Síndrome de deformidad y enanismo RT-PCR PCR con transcriptasa reversa SANCO (DG European Commission’s Directorate-General Dirección General de Salud y Consumidores SANCO) for Health and Consumer de la Comisión Europea Sistema de Alerta Epidemiológica y de SAEMA Manejo Acuícola Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y SENASICA Calidad Agroalimentaria Necrosis séptica del hepatopáncreas (NSHP) SHPN Septic hepatopancreatic necrosis (causada por Vibrio spp.) SICA Sistema de la Integración Centroamericana SPF Specific Pathogen Free Libre de patógenos específicos SPR Specific Pathogen Resistant Resistente a patógenos específicos Bacteria marina de profundidad que vive en Taq Thermus aquaticus las termales submarinas TBE Tris/Borate/EDTA Solución tampón Tris Borato EDTA TCBS Agar tiosulfato, citrato, bilis, sacarosa TEM Transmission electron microscopy Microscopía electrónica de transmisión TNE TNE buffer Solución tampón TNE TSA Trypticase soy agar Agar tripticasa soya TSV Taura Syndrome Virus Virus del Síndrome de Taura UE Unión Europea UFC Unidades formadoras de colonias UV Ultravioleta WSSV White Spot Syndrome Virus Virus del Síndrome de la Mancha Blanca YHV Yellow Head Virus Virus de la Cabeza Amarilla

363 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Glosario

Abiótico Agente no biológico. Abonera Letrina. Acelular Significa “sin células” y hace referencia a tejidos conformados por capas o estructuras orgánicas sin presencia de células (ej: cutícula del camarón). Ácido Compuesto orgánico o inorgánico que reacciona con un metal des- prendiendo hidrógeno; reacciona con una base para formar una sal; se disocia en disolución acuosa dando iones hidrógeno (hidrogenio- nes); tiene un pH menor que 7 y neutraliza medios básicos o alcalinos aceptando un par de electrones de la base y formando un enlace covalente entre el ácido y la base. Se dividen en ácidos orgánicos e inorgánicos minerales; orgánicos son aquellos que presentan carbono (C) en su estructura. Adsorción Propiedad de adherirse. Proceso por el cual átomos, iones o molé- culas son atrapados o retenidos en la superficie de un material en contraposición a la absorción, que es un fenómeno de volumen. Es decir es un proceso en el cual un contaminante soluble (adsorbato) es eliminado del agua por contacto con una superficie sólida (adsor- bente). El proceso inverso a la adsorción se conoce como desorción. Aflatoxinas Son toxinas producidas por el hongo Aspergilus flavus. Aforar Añadir disolvente (agua por ejemplo) a un recipiente que tiene una marca que nos indica el volumen conocido y precisamente medido que cabe en dicho recipiente hasta esa marca. Agar Medio de cultivo sólido que se utiliza para el aislamiento de bacterias. Agente patógeno Es toda aquella entidad biológica capaz de producir enfermedad o daño en la biología de un hospedero (humano, animal, vegetal, etc.) sensiblemente predispuesto. Agudo Proceso patológico o aparición de enfermedad que se presenta poco tiempo después de la infección. Alcalino Compuesto cuyo pH es superior a 7. Aldehído Son compuestos orgánicos caracterizados por poseer el grupo funcional –CHO. Aleatorio Realizado al azar, sin hacer escogencia o selección de organismos. Alícuota Es el volumen o cantidad de masa que se va a emplear en una prueba de plataforma o de laboratorio. Se suele medir en mililitros (mL) o gramos diluidos (g). Aminoácido Los aminoácidos son los elementos con los que se construyen las pro- teínas. Son moléculas que contienen un grupo Carboxilo (-COO) y un grupo amino (-NH2) libre.

364 Glosario

Anaeróbico Organismo capaz de sobrevivir, crecer o funcionar en ambientes que no tienen oxígeno. Análisis histológico Estudio de tejidos previamente fijados y procesados mediante técni- cas estandarizadas, con el fin de observar cambios microscópicos en células, tejidos u órganos, causados por enfermedades infecciosas, ambientales, tóxicas o idiopáticas. Estos estudios se hacen a partir de láminas histológicas preparados en laboratorios especializados. Anamnesis Parte del examen clínico que reúne todos los datos históricos de la enfermedad, anteriores al brote en estudio. Es suministrada por el personal técnico de campo o por el granjero. Antibiótico Medicamento que se utiliza para tratar una infección bacteriana, y que por su efecto, mata o impide el crecimiento de ciertas clases de bacterias, pero que normalmente es inofensivo para el hospedero. Anticuerpo Anticuerpo marcado con una enzima que le ha sido adherida como la conjugado peroxidasa o la fosfatasa alcalina. Antimicrobiano Compuestos químicos o naturales (antibióticos) obtenidos de microorganismos, plantas o por vía sintética, utilizados para matar (bacteri- cidas) o inhibir el crecimiento (bacteriostáticos) de microorganismos como bacterias, hongos y protozoarios. Su uso en acuicultura debe estar sujeto a la susceptibilidad del agente a tratar y a la aprobación que exista para ser utilizado en terapias curativas. Antiséptico Son sustancias antimicrobianas que se aplican a un tejido vivo o sobre la piel para reducir la posibilidad de infección, sepsis o putrefacción. Apéndice En los artrópodos, se denomina apéndice a las estructuras anatómicas pares formadas por elementos articulados entre sí, que se insertan en todos o algunos de los metámeros del cuerpo. Apoptosis Función que controla la muerte de las células, de forma programada. ARN monocatenario Es un ácido ribonucleico de cadena sencilla (una sola hebra de ARN), el cual es común en cierto tipo de virus (ej.: TSV en camarones). Aséptico Es la “condición libre de microorganismos que producen enfermedades o infecciones”. El término puede aplicarse tanto a situaciones qui- rúrgicas como médicas. La práctica de mantener en estado aséptico un área, se denomina técnica aséptica. Atrofia En términos biológicos consiste en una disminución importante del tamaño de la célula y del órgano del que forma parte, debido a la pérdida de masa celular. Autoclave Dispositivo que sirve para esterilizar material médico o de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura. Bacilo Son bacterias con forma de bastón cuando son observadas en un microscopio. Bacterias Microorganismos unicelulares en forma de filamentos, cocos y estructuras espirales: No poseen clorofila.

365 Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos

Bacterias Gam Las que se tiñen de rosa o rojo con la tinción de Gram (violeta de negativas metilo-safranina). Bacterias patógenas Las que causan enfermedades tanto a los animales, vegetales y al hombre. Bactericida Sustancia que tiene la propiedad de destruir las bacterias. Bases (nitrogenadas) También conocidas como bases nucleicas o nucleobases, son compuestos orgánicos cíclicos con dos o más átomos de nitrógeno, que constituyen la parte fundamental de los nucleótidos, nucleósidos y ácidos nucleicos. Existen cinco bases nitrogenadas principales que se clasifican en purínicas (derivadas de la estructura de la purina) y pirimidínicas (derivadas de la estructura de la pirimidina). La adenina (A) y la guanina (G) son purínicas, mientras que la timina (T), la citosina (C) y el uracilo (U) son pirimidínicas. Las cuatro primeras se encuentran en el ADN, mientras que en el ARN en lugar de timina existe el uracilo. Basofílico (basófilo) Coloración azul-morada (clara u oscura) que toman ciertas estructuras ácidas de las células (ej.: el núcleo), luego de ser teñidas con colorantes básicos como la Hematoxilina. Bacteriemia Presencia de bacterias en la hemolinfa. Bioacumulación Es la acumulación de metales pesados, hidrocarburos clorados u otras sustaancias percistentes, en los órganos y tejidos de los organimsos acuáticos u otros seres vivos. Estos elementos se pueden encontrar en concentraciones muy altas dentro de los tejidos, a pesar de encontrarse extremadamente diluidos en el medio acuático circundante. Bioensayo Experimento que se hace utilizando organismos vivos, bajo condiciones y ambientes controlados. Biopsia Toma y examen de una pequeña parte del tejido o liquido corporal del organismo para completar un diagnóstico sobre su estado de salud. Bioseguridad Según la FAO y la OIE, consiste en el estado ideal en el que se establecen medidas para prevenir la introducción y la propagación de la enfermedad, o el enfoque o los principios utilizados para lograr esta circunstancia. Las medidas de bioseguridad deben ser implementadas para minimizar los riesgos del ingreso de enfermedades a las unidades de producción individual (bioexclusión), así como para evitar los riesgos de transmisión hacia afuera (biocontención) y hacia adelante a través de la cadena del mercado. Biótico Organismos que comparten un mismo ambiente en un tiempo determinado. Biotipo Forma típica de organismos vivos que puede considerarse modelo de su especie, variedad o raza.

366 Glosario

Brote Aparición de dos o más casos de una misma enfermedad, en los que se observa una relación con un agente etiológico común, establecién- dose esta relación en términos de tiempo, lugar y tipo de organismos afectados. Calambre Proceso de fatiga muscular que implica una contracción rígida del músculo esquelético, producida por un período de hipoxia prolongado. Calidad del agua Complejo de variables fisicoquímicas del agua relacionadas con la acuicultura. Camaronicultura Cultivo de camarones. Cápside Estructura proteica formada por una serie de monómeros llamados capsómeros. En el interior de esta cápside se encuentra siempre el material genético del virus. Cariorrexis Fragmentación de la cromatina y su distribución por el citoplasma como resultado de la desintegración nuclear. Cefalotórax “Cabeza” del camarón; estructura que contiene órganos y tejidos propios del tórax y de la cabeza. Cepa En microbiología se puede definir como un conjunto de especies bacterianas que comparten al menos una característica. Citopático Efecto dañino o destructivo que un tóxico químico o biológico ejerce sobre las células. Citoplasma Es la parte del protoplasma que en una célula eucariota, se encuentra entre el núcleo celular y la membrana plasmática. Citosol También llamado hialoplasma, es el gel acuoso que está en el interior de la célula y que se encuentra fuera de las membranas internas cuando estas existen. Corresponde a más de la mitad del volumen celular y está presenta tanto en células procariotas como en eucariotas. Coagulación Mecanismo fisiológico utilizado por los organismos para evitar perdida de sangre o hemolinfa, mediante la activación de factores que detienen su salida a través de una herida. Coalescer Es la posibilidad de que dos o más materiales se unan en un único cuerpo. Conspicuas Características o condiciones (patológicas en este caso) que son sobresalientes, llamativas o más frecuentemente visibles. Contingencia Posibilidad de que algo suceda o no suceda. Control Muestra que se excluye de un análisis experimental, para que sirva de referencia en la evaluación de resultados de la parte analizada. Control biológico Es un método de control de plagas, enfermedades que consiste en utilizar organismos vivos con el objeto de controlar las poblaciones de otro organismo.

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Copépodo Son una subclase de crustáceos maxilópodos de tamaño muy peque- ño, muchas veces microscópicos, que se encuentran abundantemen- te, tanto en agua dulce como salada. Cromatina Es el conjunto de ADN, histonas y proteínas no histónicas que se encuentra en el núcleo de las células eucariotas y que constituye el cromosoma eucariótico. Cromatóforos Son células con pigmentos en su interior que reflejan la luz. Crónico Se llama enfermedad crónica a aquella patología de larga duración, cuyo fin o curación no puede preverse claramente o no ocurrirá nunca. Cuarentena Es la acción de aislar o apartar a animales durante un período de tiempo, para evitar o limitar el riesgo de que extiendan una determinada enfermedad contagiosa. Cutícula Es la capa más exterior del tegumento, inmediatamente por encima de la epidermis (epitelio cuticular) y segregada por ésta. Es una forma- ción rígida, acelular (sin células), de estructura compleja y compuesta por quitina y calcio entre otras sustancias. Debris Desechos, detritos o residuos orgánicos microparticulados, como resultado de la descomposición de una masa sólida en pequeñas partí- culas que pueden flotar en el cuerpo de agua o precipitarse al fondo. Degradación Transformación de una sustancia compleja en otra de estructura más sencilla. Diagnóstico Conocimiento y estudio de los signos de una enfermedad, para la determinación del carácter y causa de la misma. Diagnóstico Conocimiento final sobre la o las causas de una enfermedad, obteni- definitivo o do después de realizar y analizar información histórica y de campo, confirmatorio pruebas de campo y pruebas de laboratorio. Diagnóstico Es la causa probable de una enfermedad, cuyo conocimiento debe presuntivo aún profundizarse más mediante pruebas adicionales para llegar a un diagnóstico definitivo o confirmatorio. Diagnóstico en Combinación de pruebas diagnósticas en las que sólo se consideran paralelo como resultados negativos aquellos que han sido negativos para ambas pruebas, y como positivos el resto. Digestión Proceso de transformación de los alimentos que son ingeridos en sustancias más sencillas para ser absorbidos. Ectodermis Es el comienzo de un tejido que cubre las superficies del cuerpo. Emerge primero y forma la capa externa de las capas germinativas. Ectoparásito Parasito que vive sobre la superficie del hospedero. Ectópico Que se produce o está fuera de su lugar habitual. En camarones sucede cuando los esferoides del órgano linfoide, se producen y manifies- tan en otros órganos o tejidos diferentes.

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Edema Es la acumulación de líquido en el espacio tisular intercelular o inters- ticial y también en las cavidades del organismo, debido al incremento en la transudación de los líquidos capilares. ELISA Técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo marcado con una enzima, la cual es capaz de generar un producto detectable por cambio de color o por algún otro tipo de reacción medible u observable. Encapsulación Formación de una cápsula aislante alrededor de un cuerpo extraño. Se puede dar a nivel celular o tisular. Endémico Una enfermedad que se presenta sistemáticamente, de manera regular y sin variaciones apreciables de población afectada dentro de un segmento demográfico. Endocitosis Proceso mediante el cual una célula captura sustancias extracelulares y las pasa a su interior mediante englobamiento e invaginación de la membrana citoplasmática. Endoparásito Parásito que se encuentra en el interior de los animales. Enfermedad Proceso mórbido definitivo, el cual tiene una cadena de signos carac- terísticos que pueden afectar el cuerpo entero o alguna de sus partes y su etiología, patología y pronóstico, pueden ser conocidos o desconocidos. Enfermedad Aguda Aquellas enfermedades que tienen un inicio y un fin claramente definidos. Generalmente son de corta duración, aunque no hay un consenso en cuanto a que plazos definen a una enfermedad como aguda y cual como crónica. Enfermedad Designa una enfermedad grave recién identificada, de causa determi- emergente nada o aún indeterminada, que puede ser propagada a y entre poblaciones, por medio del comercio de animales acuáticos y/o productos de animales acuáticos. Código Acuático, OIE 2009. Enfermedad Consiste en una enfermedad que afecta a una o más especies anima- enzoótica les en un determinado territorio, por causa o influencia local. Normal- mente este tipo de enfermedades se mantiene con una prevalencia estable dentro de una población animal y dentro de un área geográ- fica determinada. Enfermedad Son aquellas de gran importancia económica y comercial para la se- transfronteriza guridad alimentaria en un considerable número de países; se pueden propagar fácilmente a otros países y alcanzar proporciones de epidemia y exigen la cooperación entre naciones para su manejo y control, incluida su exclusión. Anteriormente eran llamadas “enfermedades exóticas”. Enzima Son sustancias de naturaleza proteica que catalizan reacciones quími- cas siempre que sea termodinámicamente posible (si bien no pueden hacer que el proceso sea más termodinámicamente favorable). Las enzimas sirven para controlar las reacciones químicas, acelerándolas.

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Eosina Es un colorante ácido de color rosado oscuro usado en preparaciones histológicas, cuya propiedad está basada en su polaridad negativa lo que le permite enlazarse con constituyentes celulares de carga positiva (alcalinos). Eosinofílico Coloración roja (clara u oscura) que toman ciertas estructuras básicas (eosinófilo) de las células (ej.: citoplasma), luego de ser teñidas con colorantes ácidos como la Eosina. Epicomensal Parásito que se adhiere a la parte externa de las hospederos, utilizán- doles como sustrato. Epidemia En su definición tradicional, es una enfermedad ampliamente extendi- da que afecta a muchos individuos en una población. Epitelio Es el tejido formado por una o varias capas de células yuxtapuestas que recubren todas las superficies libres del organismo, y constituyen el recubrimiento interno de las cavidades y órganos. Los epitelios también forman el parénquima de muchos órganos. Epizootia Es una enfermedad contagiosa que ataca a un número inusual de animales al mismo tiempo y lugar y se propaga con rapidez. El término epizootia está cayendo gradualmente en desuso puesto que en la actualidad se prefiere el término epidemia. Esclerotización Es el endurecimiento y oscurecimiento de la quitina en el exoesqueleto. Especificidad Capacidad de una prueba de diagnóstico para determinar de confiable un agente infeccioso específico, sin riesgos mayores de reacción cruzada con otro patógeno distinto. Probabilidad de detectar correctamente un animal sano. Espécimen Es aquel individuo o parte de un individuo que se toma como muestra, especialmente el que se considera representativo de los caracteres de la población a la que pertenece. Espermatóforo Es una cápsula o masa creada por los especimenes macho de varios invertebrados, que contienen espermatozoides, siendo integralmente introducida al órgano sexual femenino durante la cópula. Esterilización Procesos físicos o químicos mediante los cuales se elimina el 100% de los microorganismos contaminantes presentes en un sustrato. Estrés Es toda demanda física o fisiológica que se le haga al organismo. Pue- de ser causada por enfermedades o ser de origen séptico, nutricional o ambiental.

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Estuario Es la parte más ancha y profunda en la desembocadura de los ríos, en los mares abiertos o en los océanos, en aquellas zonas donde las mareas tienen mayor amplitud u oscilación. La desembocadura en estuario está formada por un solo brazo o curso fluvial muy ancho y profundo, aunque también suele tener a modo de playas a ambos lados en las que la retirada de las aguas permite crecer algunas especies vegetales que soportan aguas salinas. Etiología Agente o parámetros que de manera individual o conjunta, causan una enfermedad. Exoesqueleto Es el esqueleto externo continuo que recubre toda la superficie de los animales del filo artrópodos (arácnidos, insectos, crustáceos y otros grupos relacionados), donde cumple una función protectora y otra mecánica, proporcionando el sostén necesario para la eficacia del aparato muscular. También se llama exoesqueleto a la base. Falsos negativos Animales enfermos o infectados detectados incorrectamente por la prueba diagnóstica como negativos. Falsos positivos Animales sanos o no infectados detectados incorrectamente por la prueba diagnóstica como positivos. Fagocitosis Proceso por el cual un cuerpo extraño o un desecho celular es ingerido por células especiales (fagocito) mediante invaginación. Es un tipo de endocitosis por el cual algunas células rodean con su membrana citoplasmática a una sustancia extracelular (un sólido generalmente) y la introducen al interior celular. Esto se produce gracias a la emisión de pseudópodos alrededor de la partícula o microorganismo hasta englobarla completamente y formar alrededor de él una vacuola, la cual fusionan posteriormente con lisosomas para degradar la sustancia fagocitada, la cual recibe el nombre de fagosoma. Farmacoterapia Tratamiento de las enfermedades mediante fármacos (medicamentos). Fiabilidad Capacidad de una prueba diagnóstica para discriminar entre indivi- diagnóstica duos sanos y enfermos. Fibrosis Proliferación de tejido fibroso adicional o en reemplazo de zonas de tejidos u órganos afectados por alguna enfermedad infecciosa, tóxica o por algún traumatismo. Fijación Preservación de tejidos de un organismo, mediante la inyección y/o inmersión del mismo en una solución que evita cambios autolíticos. Fracción de muestreo Proporción de individuos de la población estudiada que forman parte de la muestra. Genoma Es todo el material genético contenido en las células de un organismo en particular. Por lo general, al hablar de genoma en los seres eucarió- ticos nos referimos sólo al ADN contenido en el núcleo, organizado en cromosomas.

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Genotipo Conjunto de genes característicos de cada especie vegetal o animal. La manifestación visible de un genotipo en un determinado ambiente, constituye un fenotipo (características físicas del individuo). Giemsa Tinción utilizada en el examen de frotis sanguíneos y otro tipo de muestras biológicas, que permite la coloración diferencial de zonas con un alto contenido de ADN y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en microscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas durante la mitosis y, en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial. Glutaraldehído Fijador utilizado para microscopía electrónica de transmisión. Gram Coloración para diferenciar bacterias. Hematopoyético Proceso de formación de las células sanguíneas. Hematoxilina Materia colorante del palo campeche muy utilizada en histología. Hemocele Canales intersticiales a través de los cuales circula la hemolinfa Irri- gando los órganos y tejidos del cuerpo del camarón. Hemocitopenia Disminución en el número de hemocitos circulantes. Hemocitos Células plasmáticas de los crustáceos (como el camarón), encargadas de funciones relacionadas con el sistema inmune. Hemograma Determinación del número total o diferencial de hemocitos en un camarón. Hemolinfa Tejido sanguíneo de los camarones que irriga los órganos y tejidos llevando oxígeno y nutrientes. Hepatopáncreas Glándula digestiva del camarón, encargada de producir enzimas y hormonas, principalmente. Hibridación dot blot Dot Blot es una técnica de biología molecular para detectar biomo- léculas. En un dot blot las biomoléculas para ser detectados no son separadas por cromatografía. En cambio, una gota que contiene la molécula para ser detectada se aplica directamente sobre una membrana. Esto es seguido por la detección por sondas de nucleótidos o anticuerpos. El dot blot sólo puede confirmar la presencia o ausencia de una biomolécula o biomoléculas que pueden ser detectados por las sondas de ADN o el anticuerpo. Hibridación in situ Está basada en la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADN o ARN, que resulta complementaria con otra secuencia. Su utilidad reside en la capacidad de poder demostrar mediante la uti- lización de una sonda (formada por una secuencia de ADN previamente conocida) marcada con un isótopo radiactivo, la presencia de determinada secuencia de ADN o ARN complementaria, en la muestra a estudiar.

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Hiperplasia Es el aumento de tamaño de un órgano o de un tejido, provocado debido a que sus células han aumentado en número. Puede producirse en los tejidos cuyas células se pueden multiplicar. Hipertrofia Es el nombre con que se designa un aumento del tamaño de un órga- no cuando se debe al aumento correlativo en el tamaño de las células que lo forman; de esta manera el órgano hipertrofiado tiene células mayores, y no nuevas. Hipoxia Es un trastorno en el cual el cuerpo por completo (hipoxia generalizada), o una región del cuerpo (hipoxia de tejido), se ve privado del suministro adecuado de oxígeno. Histología Es la ciencia que estudia todo lo referente a los tejidos orgánicos: su estructura microscópica, su desarrollo y sus funciones. La Histología se identifica a veces con lo que se ha llamado anatomía microscópica. Histopatología Estudio de las lesiones celulares y tisulares mediante el uso de la his- tología. Histoquímica Conjunto de técnicas que permiten la identificación, localización y cuantificación de una sustancia en un tejido o en una célula Hospedero Es a aquel organismo que alberga a otro en su interior o lo porta sobre sí, ya sea un parásito, un comensal o un mutualista. Hospedero definitivo Designa un ser vivo que es imprescindible para el parásito ya que este desarrollará principalmente su fase adulta en el anfitrión. Hospedero Designa a un hospedador igualmente imprescindible en el ciclo vital intermediario del parásito, donde este desarrolla alguna o todas las fases larvales o juveniles. A veces se confunde con el término vector y se considera como hospedador intermediario al invertebrado que participa en el ciclo vital, siendo en muchas ocasiones el hombre y los vertebrados los anfitriones intermedios, y los invertebrados los definitivos. Huésped Agente invasor que vive a expensas de un hospedero, parasito externo (ectoparásito) o parasito interno (endoparásito). Icosaédrico Es la forma que tiene la cápside (cubierta) de un virus, cuando sus capsómeros (monómeros de tipo proteico) están dispuestos en forma de icosaedro (poliedro formado por 20 caras). Idiopática Enfermedad de origen desconocido o sin causa determinada. Hace referencia a la irrupción espontánea de un trastorno o una enfermedad (aparición de signos clínicos), sin que se pueda atribuir a una etiología conocida. Algunas enfermedades calificadas inicialmente como “idiopáticas”, pueden recibir luego un diagnóstico específico al descubrirse su etiología. In situ Que se realiza en el mismo sitio.

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Infección Estado o condición en que el cuerpo o una parte de éste es invadido por un agente infeccioso, como bacterias, virus u hongos La infección no implica necesariamente que el organismo esté enfermo, puesto que enfermo se refiere a mostrar signos clínicos. Infestación Es la invasión de un organismo vivo por agentes parásitos externos (ectoparásitos) o internos (endoparásitos). Por esta razón, el término “infección” debe restringirse sólo a la acción de bacterias, virus y hongos. La infestación puede incluir ectoparásitos como protozoarios y artrópodos y endoparásitos como metazoarios y algunos protozoos. Infiltración Migración de hemocitos a un tejido en donde hay presencia de un hemocítica agente patógeno. Inflamación Reacción de los tejidos a daños caracterizados por tumefacción, en- rojecimiento y dolor; se manifiesta por dilatación, hiperhemia, acu- mulación de hemocitos, exudación del fluido y depósito de fibrina. Iniciadores También llamados “cebadores” o “primers”, son pequeñas cadenas de nucleótidos a partir de las cuales la ADN polimerasa inicia la síntesis de una molécula nueva de ADN. Se utilizan principalmente en pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Inmune Protegido contra ciertas enfermedades. Inmunología Es una rama amplia de la biología y de las ciencias biomédicas que se ocupa del estudio del sistema inmunitario en todos los organismos, entendiendo como tal al conjunto de órganos, tejidos y células que en los vertebrados o invertebrados tienen como función biológica el reconocer elementos extraños o ajenos dando una respuesta inmune. Integumento Es el sistema orgánico más extenso de un animal ya que lo recubre por completo, tanto externamente, como numerosas cavidades internas. Su función es la de separar, proteger e informar al animal del medio que le rodea; en ocasiones actúa también como exoesqueleto. Intervalo de Rango de valores en el que se incluye el valor real del parámetro es- confianza tudiado con una cierta seguridad (nivel de confianza). Intracitoplasmático Cuya ubicación es dentro del citoplasma. Invaginación Es doblar hacia adentro los pseudópodos luego de estar envuelto en un cuerpo extraño. Esto ocurre en las células. Como ejemplo tenemos las crestas mitocondriales. Kit conjunto de materiales y reactivos que se venden en conjunto, para la realización de una o varias pruebas de laboratorio. Algunas veces están autoabastecidas para la ejecución completa de la prueba y otras veces requieren de equipos o elementos adicionales no incluidos en el kit. Lamela Ramificación secundaria de los branquias de los camarones.

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Larva Animal en estado de desarrollo, cuando ha abandonado las cubiertas del huevo y es capaz de nutrirse por sí mismo o de su vitelo, pero aún no ha adquirido la forma y la organización propia de los adultos de su especie. Larvicultura Fase del cultivo de camarón relacionado con el desarrollo de larvas y postlarvas. Lesión Daño o detrimento corporal causado por una herida, un golpe o una enfermedad. Lesión multifocal Que se encuentra localizada en múltiples órganos y tejidos de un mismo animal enfermo. Letalidad Probabilidad de que un caso (enfermo o infectado) muera en un determinado periodo de tiempo. Letargia Condición presente en varias enfermedades nerviosas, infecciosas o tóxicas, caracterizada por un estado de somnolencia profunda y ale- targamiento. Conduce en camarones a perdida del reflejo de huída. Ligando Es una molécula, compuesto o ion capaz de formar enlaces químicos con un receptor o de ser reconocida por otra molécula, provocando una respuesta biológica. Un ejemplo de ligandos son las hormonas implicadas en la señalización intercelular, o los ligandos que actúan como reguladores de la actividad enzimática uniéndose a las enzimas que modulan. En los enlaces se emplean únicamente los electrones del ligando; en la transmisión de información biológica mediante el reconocimiento molecular, el ligando es el agente pasivo. Lipopolisacárido Azúcar propio de la membrana celular de las bacterias. Lisis Ruptura de las células a causa de agentes químicos o físicos. Macerado Es un proceso de extracción sólido-líquido. El producto sólido (materia prima) posee una serie de compuestos solubles en el líquido extractante que son los que se pretende extraer. Macroscópico Hallazgo que se puede observar a simple vista. Maduración Término utilizado en camaronicultura para hacer referencia a los procesos de manutención de reproductores en cautiverio y obtención de larvas de camarón a partir de cruces controlados o indiscriminados entre éstos. Melanina Pigmento de color negro o pardo negruzco en forma de gránulos que existe en el protoplasma de ciertas células de los vertebrados; en invertebrados es producto de la activación del sistema inmune (cascada proPO) y se da para encapsular a un agente agresor (melanización). Metabolismo Es el conjunto de reacciones y procesos físico-químicos que ocurren en una célula. Estos complejos procesos interrelacionados son la base de la vida a nivel molecular y permiten las diversas actividades de las células: crecer, reproducirse, mantener sus estructuras, responder a estímulos, etc.

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Metazoarios Animal formado por una gran cantidad de células (pluricelulares), algunos de ellos microscópicos pero la gran mayoría se pueden observar a simple vista, al menos en su estado adulto. Se distinguen entre sí por su forma, estructura y función. Incluyen los platelmintos, nema- telmintos y artrópodos, entre los que se encuentran los vertebrados, moluscos, gusanos, etc. También se conocen como metazoos. Micosis Enfermedad producida por algún tipo de hongo. Microbiología Ciencia que estudia los microorganismos y su organización. Microscópico Es un objeto que por su tamaño, es imposible verlo a simple vista, se necesitan aparatos como microscopios para poder verlo o detectarlo. Micrótomo Es un dispositivo mecánico que permite la elaboración de cortes finos de muestras para su observación al microscopio. Morbilidad Probabilidad de que un individuo de una población sea un caso en un momento dado. Mortalidad Probabilidad de que un individuo muera como consecuencia de cierta enfermedad en un periodo de tiempo. Muda Desprendimiento periódico de la cubierta externa, como el exoesqueleto en Artrópodos (camarones, cangrejos, langostas), para permitir el crecimiento (aumentar en tamaño) de los tejidos blandos internos. Después de la muda, los especimenes son especialmente vulnerables a la depredación. Muestra Subconjunto representativo de la población estudiada que se selecciona para obtener información. Muestreo aleatorio o Método de selección donde cada individuo de la población tiene la probabilístico misma probabilidad de formar parte de la muestra y esta probabilidad es conocida. Muestreo no Método de selección donde cada individuo de la población tiene una probabilístico probabilidad desconocida y variable de formar parte de la muestra. Mutación Es una modificación que se produce en los datos genéticos deun organismo viviente. Dicha alteración, que puede resultar hereditaria, implica una modificación de sus características. Mysis Estado intermedio de larva pelágica entre la protozoea (zoea) y los estados de postlarva. Nauplio Primeros estados larvales de un crustáceo; exhibe el tipo más simple de región anterior con tres pares de apéndices, primera antena unirra- ma, segunda antena birrama y mandíbulas. Aunque la larva nauplius es típica, no aparece en todos los crustáceos. Es común en las formas inferiores, pero en muchas de las formas superiores ocurre durante el desarrollo en el huevo, y los juveniles eclosionan ya diferenciados y larvas más avanzadas.

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Necrobiosis Muerte natural y fisiológico del los célula de un organismo, por enve- jecimiento de las mismas. Necrosis Es la muerte patológica de un conjunto de células o de cualquier tejido del organismo, provocada por un agente nocivo que ha provocado una lesión tan grave que no se puede reparar. Una vez que se ha producido y desarrollado la necrosis, es irreversible. Neutralizar Debilitar el efecto o hacer neutra una sustancia química, mediante la adición de otra sustancia diferente u opuesta. Los ácidos se neutralizan con sustancia alcalinas y viceversa. Nivel de confianza Probabilidad de que el valor real de la población se encuentre dentro de ciertos límites (intervalo de confianza). Nivel de detección Sensibilidad de una prueba diagnóstica definida como el número de patógenos que la prueba es capaz de detectar por unidad de muestra patológica. Nódulo Pequeña protuberancia situada en diversos tejidos. Nucleocápside Material genético envuelto en su cápside. La cápsida o cápside ví- rica es una estructura proteica formada por una serie de monóme- ros llamados capsómeros. En el interior de esta cápside se encuentra siempre el material genético del virus. Puede estar rodeada por una envoltura. Cada capsómero puede estar constituido por una o varias proteínas distintas. Nucleótidos Monómeros de los ácidos nucleicos, integrado por la combinación de una base nitrogenada (purina o pirimidina), un azúcar (ribosa o desoxirribosa) y un grupo fosfato. Se obtiene como producto de la hidrólisis de ácidos nucleicos por acción de nucleasas. Los nucleóti- dos se conocen como ribonucleótidos cuando el azúcar es la ribosa, o como desoxirribonucleótidos cuando el azúcar es la desoxirribosa. Osmorregulación Capacidad de los seres vivos para mantener en sus tejidos y fluidos corporales una determinada presión osmótica, mediante un proceso fisiológico que regula el equilibrio del agua y los electrolitos. Patogénesis Origen y evolución de una enfermedad con todos los factores que están involucrados en ella. Patogenicidad Capacidad de un agente patógeno, de causar daño en un hospedero susceptible. Patógeno Es toda aquella entidad biológica capaz de producir enfermedad o daño en la biología de un hospedero (humano, animal, vegetal, etc.) sensiblemente predispuesto. El mecanismo de la patogenicidad ha sido muy estudiado y tiene varios factores, algunos de los cuales son dependientes del agente patógeno y otros del hospedero. Patognomónico Signo clínico que caracteriza y define una determinada enfermedad, diferenciándolo del resto de patologías.

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Patología Es la parte de las ciencias médicas, humanas y animales encargada del estudio de las enfermedades en su más amplio sentido, es decir, como procesos o estados anormales de causas conocidas o descono- cidas. Patólogo Especialista en patología o enfermedades. Pediluvio Estructura destinada a contener una solución desinfectante para el lavado del calzado en instalaciones que manejan programas de bioseguridad. Penaeido Nombre común para los miembros de la familia de crustáceos Pe- naeidae, comúnmente denominados camarones o gambas. Un cultivo económicamente importante originario de aguas marinas y salo- bres de áreas tropicales o subtropicales. Ciclo vital caracterizado por varias etapas iniciales del desarrollo de las cuales nauplios (5 etapas sucesivas), zoea (3), mysis (3) y postlarva (hasta 22). Pereiópodos Apéndices motrices (“patas”) de los camarones utilizados para cami- nar sobre superficies sólidas; debido a que el camarón tiene 10, se le llama decápodo. Período de Es el lapso de tiempo que transcurre desde que se presenta una inva- incubación sión de un microorganismo patógeno (virus, bacteria, protozoo) en un hospedero, hasta el comienzo de la manifestación de signos clínicos de la enfermedad causada por dicho microorganismo en el hospedero. Per os Vía oral, “por la boca”. Suele usarse este método cuando se hace una infección experimental de camarones y son alimentados vía oral con tejido infectante de otros camarones enfermos. Picnosis Compactación de la cromatina nuclear como parte del proceso de necrosis (muerte celular). Polisacáridos Son biomoléculas formadas por la unión de muchos monosacáridos. Se encuadran entre los glúcidos, y cumplen funciones diversas, sobre todo de reserva energética y estructural. Pool Grupo de muestras que son obtenidas y/o procesadas de forma combinada para reducir el tiempo de procesado y el coste económico. Postlarva Estado que ocurre después del estado larval, parecido al juvenil pero aún le faltan algunas características. Para crustáceos: el estado siguiente a la metamorfosis de larva zoea a juvenil. En camarones penaeidos, normalmente se cuentan los días después de la aparición de las características de postlarva. Ej., PL12 indica que la postalarva ha vivido 12 días desde su metamorfosis desde el estado de mysis. Post-mortem Cambios naturales que ocurren a nivel bioquímico y morfológico en un organismo después de su muerte. Postmuda Fase del proceso de muda de los crustáceos que sigue a la ecdisisi o “muda”.

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Prevalencia Es la proporción de individuos de un grupo o una población que presentan una característica o evento determinado en un momento, o periodo de tiempo (“prevalecía de periodo”), determinado. Prevalencia aparente Proporción de individuos positivos en una población, o probabilidad de ser diagnosticado como positivo. Prevalencia real Frecuencia de aparición de una enfermedad en una población, o prevalencia detectada con una prueba de oro. Probiótico Se considera alimento probiótico aquel que contiene microorganismos vivos presentes en un alimento que permanecen activos en el intestino y ejercen importantes efectos fisiológicos. Ingeridos en cantidades suficientes tienen efecto muy beneficioso, como contribuir al equilibrio de la flora bacteriana intestinal del hospedero y potenciar el sistema inmunológico. Son capaces de atravesar el tubo digestivo, recuperarse vivos en las heces y adherirse a la mucosa intestinal. No son patógenos. Profilaxis Procedimientos que buscan prevenir una infección. Progenie Descendencia, organismos derivados de una pareja de progenitores o de organismos con capacidad de reproducción mediante parteno- génesis. Protozoarios Organismos unicelulares que poseen una hilera de cilios alrededor de peritríchidos (o la boca, tienen cuerpo en forma de vaso o de campana y se adhieren perítricos) a un sustrato sólido o a un hospedador animal mediante un tallo, pudiendo crecer solos o en colonia; algunos poseen una fibra retráctil (mionema) que les da movimientos de contracción para atrapar el alimento. Prueba de oro Prueba diagnóstica de referencia que no registra falsos positivos ni falsos negativos. Pseudópodos Elongaciones de la membrana de las células que se asemejan a “ex- tremidades”. Quitinosis Melanización multifocal de la cutícula de origen bacteriana. Relación costo- Es el análisis de ingresos y egresos de un proyecto para determinar beneficio cuáles son los beneficios por cada unidad monetaria que se invierta. Repleción Cantidad de heces que se encuentran en el intestino medio de un camarón. Respiración Se entiende al proceso fisiológico indispensable para la vida de orga-

nismos aeróbicos, consistente en capturar O2 del medio y en eliminar

CO2. Respuesta innata También conocida como inmunidad inespecífica; consiste en un sistema de mecanismos de defensa con el que cuenta un organismo y que lo protege contra bioagresores. Impide que ingrese a los tejidos, materiales dañiños u organismos patógenos.

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Rodiluvio Estructura destinada a contener una solución desinfectante para el lavado de las llantas de los vehículos en instalaciones que manejan programas de bioseguridad. Sensibilidad Capacidad de una prueba de diagnóstico para detectar un agente (microorganismo) de interés que está presente en mínimas cantidades en una muestra. Probabilidad de detectar correctamente un animal enfermo. Septicemia Se define ya sea como “la presencia de organismos patógenos o sus toxinas en la sangre y los tejidos” o “el estado de envenenamiento que resulta de la presencia de gérmenes patógenos o sus toxinas. También se le conoce como Sepsis. Séptico Que produce putrefacción o es causado por ella, por presencia de bacterias. Signo Se entiende por signo clínico a cualquier manifestación objetivable consecuente a una enfermedad o alteración de la salud, y que se hace evidente en la biología del organismo enfermo. Síndrome Es un cuadro clínico o conjunto sintomático con cierto significado y que por sus características posee cierta identidad; es decir, un grupo significativo de síntomas y signos, que concurren en tiempo y forma, caracterizando un estado morboso determinado o enfermedad. Síntoma Es la referencia subjetiva que da un organismo enfermo por la percep- ción o cambio que puede reconocer como anómalo o causado por un estado patológico o enfermedad. Sistémico Enfermedad que se encuentra en todo el cuerpo. Sonda genética Fragmento de ADN que es complementario a una parte del genoma de un organismo y es utilizada para la detección genómica de dicho organismo en una muestra. Taxonomía En su sentido más general, la ciencia de la clasificación. Por lo general, se emplea el término para designar la taxonomía biológica, la ciencia de ordenar a los organismos en un sistema de clasificación compuesto por una jerarquía de taxones anidados. Tóxico Es toda sustancia química que, administrada a un organismo vivo, tiene efectos nocivos. El estudio de los venenos es conocido como toxicología. Transmisión Forma de transmisión de una enfermedad mediante el canibalismo horizontal entre organismos o ingesta de alimento infectado. Transmisión vertical Transmisión de una enfermedad de padres a sus progenies. Trofozoito Es la forma vegetativa activada que se alimenta –generalmente por fagocitosis– y se reproduce, a diferencia del quiste, el cual es la forma vegetativa infectante y de resistencia, en el ciclo de vida de los pará- sitos protozoarios, como los gregarinas.

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Urópodos Son la parte final del cuerpo de los crustáceos; están a continuación del abdomen o pleon y normalmente son laminares o aplanados, presentando forma de abanico por lo que se le denomina abanico caudal. Vacuolas lipídicas Glóbulos de grasas almacenados en el hepatopáncreas de crustáceos y utilizados como reserva de energía. Verdaderos negativos Animales sanos o no infectados detectados correctamente por la prueba diagnóstica como negativos. Verdaderos positivos Animales enfermos o infectados detectados correctamente por la prueba diagnóstica como positivos. Vibriosis Enfermedad bacteriana causada por especies del género Vibrio, que afecta a los crustáceos y que es favorecida en condiciones de estrés. Vigilancia Designa una serie de investigaciones que se llevan sistemáticamente a cabo en una población de animales acuáticos determinada para detectar, a efectos profilácticos, la presencia de enfermedades y que pueden consistir en someter a prueba una población (Código Sanita- rio para los Animales Acuáticos, OIE 2013). Viremia Condición donde virus entran al torrente sanguíneo (hemolinfa) y logran así una fácil diseminación por todo el organismo. Virión Partícula vírica morfológicamente completa e infecciosa. Virus completo. Virulencia Designa el carácter patogénico, nocivo y violento de un microorganismo, como una bacteria, hongo o virus, o en otras palabras, la capacidad de un microbio de causar enfermedad. Virulencia deriva del latín virulentus que significa «lleno de veneno». Virus Es una entidad biológica capaz de autorreplicarse utilizando la ma- quinaria celular. Es un agente potencialmente patógeno compuesto por una cápside (o cápsida) de proteínas que envuelve al ácido nu- cléico, que puede ser ADN o ARN. Zooplancton Es la fracción “animal” del plancton, constituida por seres que se alimentan mediante ingestión, de materia orgánica ya elaborada. Inclu- ye protistas, fagótrofos que engloban el alimento fagocitándolo, larvas de esponjas, gusanos, equinodermos, moluscos, crustáceos y de otros artrópodos acuáticos, así como pequeños alevines (peces jóvenes muy pequeños).

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La Guía Técnica – Patología e Inmunología de Camarones Penaei- dos, 1era edición, fue creada gracias al Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) a través de su RED VANNAMEI. La presente actualización y publicación de la 2da edición de esta Guía Técnica, ha sido posible gracias al Organismo Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria (OIRSA) con el apoyo incondicional de los mismos autores de su primera edición y la contribución de nuevos autores, logrando así un documento actualizado, moderno y con nuevas enfermedades incorporadas, como es el caso de la Enfermedad de la Necrosis Aguda del Hepa- topáncreas (AHPND o EMS) en algunos países de Asia, así como otras patologías similares en ciertos países de América Latina. Esta Guía servirá como material básico de consulta para estudiantes, profesores, profesionales acuícolas, investigadores, empresas privadas o mixtas y entidades estatales, que se dediquen al cultivo de camarones marinos.