UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE ET ECOLOGIE VEGETALES MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME D’ETUDE APPROFONDIE EN BIOLOGIE ET ECOLOGIE VEGETALES (D.E.A) OPTION : PHYSIOLOGIE VEGETALE

SUBSTITUTION DES PHYTOHORMONES SYNTHETIQUES PAR DES ADDITIFS ORGANIQUES SUR LA MICROPROPAGATION DE « antennophor a et Bulbophyllum peyrotii », DEUX ESPECES D’ORCHIDEES ENDEMIQUES, MENACEES DU SITE M INIER D’AMBATOVY

Présenté par Mamisitraka Théo Gloriat DINAHARILALA

Maître-ès Sciences

Soutenu publiquement le : 11 décembre 2012

Devant la commission d’examen composé e de :

Président : Professeur Isabelle RATSIMIALA RAMONTA Rapporteur : Docteur Nivohanintsoa RAMANAMPAMONJY née RAVONIARISON Examinateur : Docteur Rodolphe RASOLOARIVONY

REMERCIEMENTS

Nous adressons nos plus vifs remerciements ainsi que notre profonde reconnaissance à tous les membres du jury : ‹ Madame RATSIMIALA RAMONTA Isabelle, Professeur à la Faculté des Sciences, Responsable de la formation du Troisième Cycle en Physiologie Végétale au sein du Département de Biologie et Ecologie Végétales, qui nous a fait l’honneur de bien vouloir présider le jury de ce mémoire malgré ses multiples occupations. Veuillez trouver ici le témoignage de notre haute considération. ‹ Madame RAMANAMPAMONJY Nivohanintsoa, Maître de Conférences à la Faculté des Sciences, Chef du Laboratoire de Physiologie Végétale, qui nous a encadrés et qui n’a pas ménagé ses efforts et ses attentions pour nous diriger et qui a accepté d’être le rapporteur de ce mémoire. Que vous trouvez ici l’expression de notre profonde reconnaissance. ‹ Monsieur RASOLOARIVONY Rodolphe, Maître de Conférences à la Faculté des Sciences, qui, malgré ses nombreuses responsabilités, a bien voulu accepter à examiner ce travail. Les critiques constructives qu’il a apportés ont améliorée notre travail. Veuillez trouver ici le témoignage de notre haute considération. ‹ Nos remerciements s’adressent aussi à Monsieur RAKOTOARIMANANA Vonjison, Professeur à la Faculté des Sciences, Enseignant chercheur, statisticien, pour l’aide qu’il nous a apportée dans le traitement statistique des données. ‹ Nos remerciements s’adressent également à tous les Enseignants Chercheurs au sein de la Faculté des Sciences pour leurs supports pédagogiques pendant notre cursus universitaire. Ce travail est le fruit d’une collaboration entre le Département de Biologie et Ecologie Végétales de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo et le projet Ambatovy Minerals. ‹ Nous tenons à remercier le projet Ambatovy (AMSA) pour son soutien financier et matériel dans la réalisation de ce travail. Ainsi, nous adressons notre profonde reconnaissance aux responsables de ce projet, plus spécialement à Monsieur Paul ANDRIANAIVOMAHEFA, Surintendant Environnement-Mine et Monsieur RAZAFIMAMONJY Angelo, Superviseur de la restauration écologique au Département Environnement-Mine. Veuillez trouver ici nos sincères remerciements. ‹ Tout le personnel du Département Environnement-Mine, les guides et la communauté locale d’Ambatovy, nous ont servis amicalement pendant nos travaux sur terrain. Nous tenons à exprimer ici notre profonde reconnaissance. ‹ Nos sincères remerciements vont à toute l’équipe du Laboratoire de Physiologie Végétale, Unité Régénération des Plantes, pour l’ambiance chaleureuse qui règne dans cette équipe. Plus spécialement au Docteur RAHELIVOLOLONA Raharitiana, Chercheur, pour tous les conseils et les encouragements qu’elle nous a apportés tout au long de ce travail. Veuillez trouver ici nos sincères remerciements. ‹ Nous exprimons ici notre reconnaissance à tous ceux qui de près ou de loin ont contribué à la réalisation de ce mémoire et apporté leurs encouragements : les techniciens du Laboratoire de Physiologie Végétale et notre famille.

GLOSSAIRE

Acclimatation : adaptation progressive des vitroplants aux conditions naturelles. Additifs organiques : extraits de produits végétaux utilisés en culture in vitro . Capsule : fruit sec déhiscent, provenant de la transformation d’un ovaire à plusieurs carpelles soudés s’ouvrant suivant des fentes longitudinales laissant échapper les graines. Caulogenèse : formation des axes ou des tiges. Culture in vitro végétale : culture d’explants dans des récipients en verre, sur un milieu synthétique dans des conditions aseptiques. Différenciation : changements physiologiques et morphologiques dans une cellule, un tissu ou un organe durant le développement du stade juvénile à l'âge adulte. Dormance : période de repos des plantes qui se caractérise par une réduction des activités métaboliques et une résistance aux mauvaises conditions extérieures. Explant : partie d’une plante utilisée pour la culture in vitro . Germination asymbiotique : germination qui ne nécessite aucune association avec d’autres organismes. Keiki : jeune pousse ou rejet qui se développe sur la plante d’Orchidée à l'emplacement d'une feuille ou sur la hampe florale Mycorhize : association symbiotique bénéfique entre un champignon et les racines d'une plante. Organogenèse : formation des organes. Phytohormone : régulateur de croissance synthétisé par la plante ou synthétique et qui régit la croissance et le développement. Protocormes : premier stade de développement d’une orchidée à partir d’une graine ou d’un méristème avant et au moment de sa différenciation en bourgeon foliaire et en radicule. Rhizogenèse : formation de racines. SOC : espèces n’existant que sur l’empreinte de la mine ou seulement sur un ou deux autres sites à Madagascar. Totipotence : propriété qu'ont les cellules végétales de pouvoir se dédifférencier, puis de régénérer une plante entière si elles sont cultivées sur un milieu approprié.

LISTE DES ABREVIATIONS

°C : Degré Celsius 2,4-D : Acide 2,4-Dichlorophénoxyacétique AIA : Acide Indole-3-Acétique AIB : Acide Indole-Butyrique ANA : Acide Naphtalène Acétique APG III : Angiosperms Phylogeny Groupe, 3 ème version BAP : 6-Benzylaminopurine CITES : Convention on Internationl Trade for Endangered cm 3 : Centimètre cube

CO 2 : Dioxyde de carbone g : Gramme Ga3 : Acide Gibbérellique A3 HCl : Acide Chlorhydrique l : Litre MBG : Missouri Botanical Garden mm : Millimètre min : Minute NaOH : Hydroxyde de Sodium SOC : Species Of Concerns UV : Ultra Violet

TABLE DES MATIERES INTRODUCTION ...... 1 1ère partie : GENERALITES A- LES ORCHIDEES...... 3 1- Répartition géographique ...... 3 2- Morphologie ...... 3 a- Racine ...... 4 b- Structure florale ...... 4 c- Graines ...... 5 3- Multiplication des Orchidées ...... 6 a- Multiplication végétative ...... 6 b- Multiplication par voie sexuée ...... 7 B- BIOTECHNOLOGIE DE LA MICROPROPAGATION ...... 8 1- Asepsie ...... 8 2- Milieu de culture ...... 9 a- Sels minéraux ...... 9 b- Sucre ...... 9 c- Vitamines ...... 10 d- Régulateurs de croissance ...... 10 e- Additifs organiques ...... 10 f- Antioxydants ...... 11 g- Solidifiants ...... 11 2ème partie : MATERIEL ET METHODES A- MATERIEL BIOLOGIQUE ...... 12 1- Site de récolte des explants ...... 12 a- Climat ...... 13 b- Flore et végétation ...... 14 2- Classification botanique ...... 14 3- Description morphologique ...... 15 a- Aeranthes antennophora ...... 15 b- Bulbophyllum peyrotii ...... 15 B- METHODES ...... 16 1- Récolte des capsules ...... 17 2- Préparation du milieu de culture ...... 17 3- Germination asymbiotique ...... 18 a- Milieux de germination ...... 18 b- Désinfection des capsules ...... 19 c- Ensemencement ...... 19 d- Paramètres étudiés ...... 20 4- Différenciation de protocorme en plantule ...... 20 a- Milieux de culture ...... 21 b- Echantillonnage et repiquage ...... 22 c- Paramètres étudiés ...... 22 5- Multiplication par bourgeonnement ...... 22 a- Milieux de culture ...... 23 b- Echantillonnage et repiquage ...... 23 c- Paramètre étudié ...... 24 6- Conditions de culture ...... 24 7- Acclimatation des plantules ...... 25 a- Echantillonnage et mise en acclimatation ...... 25 b- Paramètre étudié ...... 26 8- Traitement des données ...... 27 3ème partie : RESULTATS ET INTERPRETATIONS A- GERMINATION ASYMBIOTIQUE...... 28 1- Taux de contamination ...... 28 2- Influences de type de milieu de culture sur la vitesse de germination ...... 28 3- Influences de la composition des milieux de culture sur le taux de germination ...... 29 B- ORGANOGENESE ...... 32 1- Influences des additifs organiques sur l’apparition de feuille ...... 32 2- Influences des additifs organiques sur la vitesse d’apparition de racine ...... 33 3- Influences des additifs organiques sur le nombre de racines néoformées ...... 34 4- Influences des additifs organiques sur la croissance des plantules ...... 35 C- COMPARAISON DES INFLUENCES DES ADDITIFS ORGANIQUES ET DES PHYTOHORMONES SYNTHETIQUES SUR LA MULTIPLICATION ...... 39 D- ACCLIMATATION ...... 42 4ème partie : DISCUSSIONS 1- Désinfection des capsules ...... 44 2- Germination asymbiotique ...... 44 3- Effet des additifs organiques sur l’organogenèse ...... 45 4- Multiplication ...... 45 5- Acclimatation ...... 46 CONCLUSION ET PERSPECTIVES ...... 47 BIBLIOGRAPHIES et WEBOGRAPHIES ...... 47

LISTE DES FIGURES Figure 1 : Structure d’une fleur de elata ...... 5 Figure 2 : Diagramme ombrothermique du site minier d’Ambatovy ...... 14 Figure 3 : Vitesse de germination d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii sur les différents milieux de culture ...... 29 Figure 4 : Taux de germination d’ Aeranthes antenophora et de Bulbophyllum peyrotii après 2 mois d’ensemencement in vitro selon les milieux étudiés...... 30 Figure 5 : Vitesse d’apparition de la première feuille d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii selon les additifs organiques étudiés ...... 33 Figure 6 : Vitesse d’apparition de racines d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii selon les additifs organiques étudiés ...... 34 Figure 7 : Nombre de racines néoformées chez Aeranthes antennophora et chez Bulbophyllum peyrotii (après 16 semaines de culture) ...... 35 Figures 8 : Cinétique de croissance des plantules d’ Aeranthes antennophora pendant 16 semaines sur les milieux de différenciation ...... 38 Figures 9 : Cinétique de croissance des plantules de Bulbophyllum peyrotii pendant 16 semaines sur les milieux de différenciation ...... 38 Figure 10 : Nombre de pousses produites par explant chez Bulbophyllum peyrotii et chez Aeranthes antennophora après 3 mois de repiquage dans les milieux de multiplication ...... 40

LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Classification botanique d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii ...... 15 Tableau 2 : Composition des milieux de germination d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii selon les concentrations de BAP, d’ANA et de lait de coco vert...... 18 Tableau 3 : Composition de différents types de milieu de différenciation de protocormes d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii selon les concentrations des additifs organiques...... 21 Tableau 4 : Composition de différents types de milieux de multiplication d’Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii selon le type de régulateurs de croissance ou d’additifs organiques et leurs concentrations ...... 23 Tableau 5 : Taux de contamination de culture d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii ...... 28 Tableau 6 : Taux de survie des plantules d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii une semaine après acclimatation ...... 42

LISTE DES PHOTOS Photo 1: Orchidées à croissance sympodiale avec pseudobulbes ( Bulbophyllum analamazaotrae ) ...... 3 Photo 2: Orchidées à croissance monopodiale ( Cypripedium ) ...... 3 Photo 3 : Formation de keikis sur la plante mère ( Dendrobium sp .)...... 6 Photo 4 : Capsule mûre d’ Aeranthes antennophora ...... 12 Photo 5 : Capsule mûre de Bulbophyllum peyrotii ...... 12 Photo 6 : Aeranthes antennophora au stade de floraison ...... 16 Photo 7 : Fleur d ’Aeranthes antennophora ...... 16 Photo 8 : Bulbophyllum peyrotii au stade de floraison ...... 16 Photo 9 : Inflorescence de Bulbophyllum peyrotii ...... 16 Photos 10 : Désinfection des capsules de Bulbophyllum peyrotii...... 19 Photos 11 : Ensemencement in vitro de graines de Bulbophyllum peyrotii sur le milieu de germination ...... 20 Photo 12 : Protocormes vertes de Bulbophyllum peyrotii au moment de repiquage ...... 22 Photo 13 : Plantules de Bulbophyllum peyrotii issues de milieu de différenciation au moment du repiquage ...... 24 Photo 14 : Manipulation sous hotte à flux laminaire...... 25 Photo15 : Chambre de culture à conditions contrôlées ...... 25 Photos 16 : Pousses enracinées d’ Aeranthes antennophora prêts à l’acclimatation ...... 26 Photos 17 : Pousses enracinées de Bulbophyllum peyrotii prêts à l’acclimatation ...... 26 Photos 18: 10 ème jour d’acclimatation d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii, couverture en plastique perforée par 2 trous ...... 26 Photos 19: 30 ème jour d’acclimatation d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii , entièrement en contact avec l’atmosphère ...... 26 Photos 20 : Protocormes d’ Aeranthes antennophora après 2 mois de semis sur le milieu additionné de 2mg/l d’ANA (G4) ...... 31 Photos 21 : Protocormes d’ Aeranthes antennophora après 2 mois de semis sur le milieu additionné de 150ml/l de LCV (G1) ...... 31 Photos 22 : Protocormes de Bulbophyllum peyrotii après 2 mois de semis sur le milieu additionné de 150ml/l de LCV (G1) ...... 31 Photos 23 : Protocormes de Bulbophyllum peyrotii après 2 mois de semis sur le milieu additionné de 2mg/l d’ANA (G4) ...... 31 Photos 24 : Plantules de Bulbophyllum peyrotii sur le milieu additionné d’homogénat de banane verte (R2) après 16 semaines de repiquage de protocorme ...... 36 Photos 25 : Plantules d’ Aeranthes antennophora sur le milieu additionné d’homogénat de banane verte (R2) après 16 semaines de repiquage de protocorme ...... 36 Photos 26 : Pousses d’ Aeranthes antennophora produites après 3 mois de repiquage, sur MS/2 + 100g/l d’homogénat de banane verte (R2) ...... 41 Photos 27 : Pousses d’ Aeranthes antennophora produites après 3 mois de repiquage sur MS/2 + 0,2mg/l d’ANA et 2mg/l de BAP (B2) ...... 41 Photos 28 : Pousses de Bulbophyllum peyrotii produites après 3 mois de repiquage sur MS/2 + 100g/l d’homogénat de banane verte (R2) ...... 41 Photos 29 : Pousses de Bulbophyllum peyrotii produites après 3 mois de repiquage sur MS/2 + 0,2mg/l d’ANA et 1mg/l de BAP (B1) ...... 41 Photos 30 : Plantules d’ Aeranthes antennophora bien acclimatées (après 6 semaines) ...... 43 Photos 31 : Plantules de Bulbophyllum peyrotii bien acclimatées (après 6 semaines) ...... 43

LISTE DES CARTES Carte 1 : Localisation du site minier d’Ambatovy (Berner et al., 2009) ...... 13

LISTE DES ANNEXES Annexe I : Prix des phytohormones synthétiques en 2010 ...... i Annexe II : Aire de répartition des pieds mère sources d’explant (graines) au sein de l’empreinte minière d’Ambatovy ...... i Annexe III : Variation mensuelle de la précipitation et de la température en 2010 du site Ambatovy ...... i Annexe IV : Composition de milieu de base de MURASHIGE et SKOOG modifié (1962) ... ii Annexe V : Compositions chimiques des additifs organiques ...... iii

INTRODUCTION

Introduction

Madagascar est l’un des pays les plus riches en Orchidées avec environ 1000 espèces, dont 90% sont endémiques (Cribb.et Hermans, 2009; http://1). Malheureusement , cette richesse risque d’être perdue à cause de la destruction massive et alarmante du patrimoine forestier, et principalement de la perturbation de l’écosystème par des facteurs anthropiques et physiques (Ingram et Dawson, 2005). C’est ainsi que toutes les espèces d’Orchidées malgaches figurent dans l’annexe II de la CITES (CITES, 2002). Les Orchidées méritent une attention particulière parce qu’elles appartiennent à la famille la plus menacée par rapport aux grandes familles des plantes à fleur (Bechtel et al, 1992). Pour sa valeur ornementale, bon nombre de ces espèces sont actuellement menacées d’extinction à cause de la collecte intensive dans la nature pour la vente locale et pour l’exportation (Ministère de l’environnement, 1997). D’autres problèmes d’origine biologique exercent également une pression sur la pérennité des Orchidées. Dans son milieu naturel, la régénération naturelle des Orchidées est difficile. La multiplication végétative donne un rendement très faible dont 1 à 2 rejets par cycle végétatif (Andriananjamanantsoa, 2007). En plus, la germination des graines nécessite une association symbiotique avec des champignons du genre Rhizoctonia. Dans la nature, cette association est aléatoire car moins de 1% de graines dans une capsule germe pour donner naissance à une nouvelle plante (Arditti, 2000). Aeranthes antennophora et Bulbophyllum peyrotii ayant respectivement une croissance monopodiale et sympodiale font partie des Orchidées endémiques malgaches menacées d’extinction. Elles sont classées parmi les espèces floristiques préoccupantes ou SOC (Species Of Concern) qui n’existent que sur l’empreinte minière du site d’exploitation d’Ambatovy ou seulement sur un ou deux autres sites à Madagascar. Les espèces SOC sont menacées par l’exploitation minière effectuée par le projet Ambatovy, qui exploite du nickel et du cobalt sous une couverture forestière (Phillipson et al, 2010). Ayant constaté les problèmes qui pèsent sur la biodiversité de la forêt dense humide sempervirente d’Ambatovy, le projet minier a établi des programmes de gestion de la biodiversité comme la création d’une zone de conservation et d’une zone de compensation (carte 1) afin d’éviter toute perte nette. Par ailleurs, un programme de réhabilitation, de préservation et de propagation des espèces SOC y ont été mis en œuvre (Dickinson et Berner, 2010). Parmi les stratégies de gestion de la flore, le projet Ambatovy collabore avec le laboratoire de Physiologie Végétale, Unité de Régénération des Plantes du Département de Biologie et Ecologie Végétales de la Faculté des Sciences afin de sauvegarder et de multiplier ces espèces SOC.

1

Introduction

La maîtrise de différentes techniques de vitropropagation s’avère nécessaire pour pallier aux problèmes sur la conservation et la multiplication d’Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii. Plusieurs espèces d’Orchidées ont fait l’objet de travaux de recherche publiés (Ramanampamonjy, 2004 ; Rahelivololona , 2005 ; Joseph et al, 2006 ; Jawan et al, 2007 ; Roy et al 2007 ; Ng et al, 2010). L’optimisation des compositions du milieu de culture est une approche importante afin de mettre au point et d’améliorer la micropropagation des Orchidées depuis la germination asymbiotique in vitro jusqu’à la régénération des plantules (Mogens, 1972 ; De Pauw et al, 1994 ; Ichihashi et Islam, 1999 ; Roy, 2001 ; Rabe, 2004 ; Yan, 2005 ; Anjum et al, 2006 ; Coello et al, 2010). La proposition de substitution de régulateurs de croissance synthétiques dont les prix ont des marges trop élevés (annexe I) par rapport à ceux des produits naturels ou additifs organiques (lait de coco vert, jus d’ananas, jus de pomme de terre et homogénat de banane verte ) apporte un double intérêt tel que la diminution du coût de production de vitroplant et la valorisation des produits locaux. La plupart des additifs organiques contient des macroéléments, des microéléments, des composés organiques et des phytohormones (Margara, 1989). Ces éléments sont indispensables au développement et à la croissance des plantes. Le présent travail a pour objectifs spécifiques de : ‹ chercher les milieux de culture favorables pour la germination asymbiotique d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii ; ‹ déterminer les additifs organiques appropriés pour la différenciation de protocormes en plantule; ‹ comparer les influences des additifs organiques et des phytohormones synthétiques sur la multiplication de ces deux espèces ; ‹ comparer le comportement de vitroplants d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii vis-à-vis de l’acclimatation.

Le travail est divisé en quatre grandes parties. La première concerne les généralités suivie par le matériel et méthodes dans la seconde partie. Les résultats et leurs interprétations sont décrits en troisième partie. Les discussions constituent la quatrième partie.

2

1ère partie : GENERALITES

Généralités

A- LES ORCHIDEES.

1- Répartition géographique Les Orchidées peuvent être considérées comme cosmopolites. Elles sont donc partout, hormis dans les régions polaires (Carbone, 1996). Les régions du globe les mieux pourvues sont les régions tropicales et subtropicales de climat chaud et humide (http://2; http://7). A Madagascar, les Orchidées sont présentes dans tous les types de végétation : dans les savanes, les forêts sèches, les forêts humides et les marécageux (Rapanarivo, 2001). Elles sont mieux représentées dans les forêts humides de moyenne altitude (700 à 1500m) où les épiphytes dominent (Rahelivololona, 2005).

2- Morphologie Les Orchidées sont des plantes herbacées, vivaces, dont la taille peut varier de quelques millimètres ( Chamorchis alpina ) jusqu’ à plus d’un mètre (Dactylorhiza elata) (Bergerot, 1998). Suivant leur port, deux types d’Orchidées peuvent être distingués (Broly, 1982) : - celles à tige horizontale ou Orchidées à croissance sympodiale : elles poussent dans plusieurs directions. Elles produisent de nouvelles pousses sur son rhizome qui s'allonge d'un segment chaque année en formant une succession de tiges dressées épaissies appelées pseudobulbes. De chaque pseudobulbe émerge une ou deux feuilles (photo 1) ; - celles à tige verticale ou Orchidées à croissance monopodiale : elles ont une croissance à partir d'un seul point. Chaque année, les feuilles s'ajoutent à l'apex au fur et à mesure que la tige s'allonge. Elles n'ont ni pseudobulbe, ni rhizome (photo 2).

Photo 1: Orchidées à croissance Photo 2: Orchidées à croissance sympodiale avec pseudobulbes monopodiale ( Cypripedium ) (Bulbophyllum analamazaotrae ). (Source : Dinaharilala, 2010) (Source : Dinaharilala, 2010) 3

Généralités

Comme les Orchidées appartiennent à la classe des Monocotylédones, elles sont caractérisées par des feuilles simples, entières, engainantes et à nervures parallèles (http://7), des fleurs de type trois et un ovaire infère. Mais elles possèdent aussi des caractères particuliers qui les distinguent des autres plantes monocotylédones. Ces caractères qui ne se rencontrent que dans la famille des Orchidées, s’observent au niveau de la racine, de la structure de la fleur et des graines (Dressler, 1990).

a- Racine Les Orchidees épiphytes ou lithophytes possèdent des racines aériennes pour s'accrocher au support (tronc et branches d'un arbre, rochers) (http://2). Les racines sont enveloppées par un tissu composé de plusieurs couches de cellules mortes spongieuses, appelé velamen. Ce dernier capte l’humidité atmosphérique et limite l’évaporation (http://5 ; http://7). Elles sont assimilatrices, les cellules à l'extrémité de la racine contiennent encore de la chlorophylle (http://7). Chez les espèces terrestres, les racines sont adventives et souvent épaissies en pseudobulbes (http://6).

b- Structure florale Les fleurs sont généralement zygomorphes, hermaphrodites, solitaires ou disposées en épi, grappe ou panicule (Bergerot, 1998). Elles sont très belles, richement colorées et peuvent durer longtemps. Leur couleur est très différente suivant les variétés et les parfums qu’elles dégagent varient également suivant les espèces (http://3). Deux caractères spéciaux différencient la fleur d’Orchidées (Figure 1 ) : - la fusion de pistil et les étamines en une seule pièce appelée colonne. Ces étamines produisent des pollinies (pollen agglutiné), au lieu de libérer du pollen (Bergerot, 1998 ; http://5, http://7); - la présence d’une pièce appelée labelle, qui n’est autre que le pétale dorsal ayant subi une transformation. Cette transformation concerne la taille, la forme, la couleur, et quelquefois la présence d’un prolongement basal appelé éperon (Christopher, 2002 ; http://4 ; http://5 ; http://6 ; http://7 ; http://8).

4

Généralités

Figure 1 : Structure d’une fleur de Dactylorhiza elata

(Source : http://5 )

c- Graines Les graines d’Orchidées sont minuscules voire microscopiques (http://6 ; http://7 ; http://9). Une gra ine peut mesurer entre 0,05 à 6mm de long sur 0,01 à 0,9 mm de large (Arditti et al, 2000). Elles sont produites en tr ès grand nombre de l’ordre de 1 000 à 4 000 000 graines par capsule (Arditti et al, 2000). Du point de vue structurale, la graine d’Orchidée est enveloppée d’une couche de cellule morte appelée testa ( Pierik, 1987 ; Dressler , 1990). Elle est dépourvue de cotylédons et d’albumen ( Arditti 1992 ; Satinder et al, 1997). La plupart d es espèces d’Orchidées possède des g raines à embryon indifférencié (Arditti , 1967). La germination de graines d’Orchidées est difficile à cause de ses caractères particuliers puisqu’une graine doit rencontrer un champignon microscopique et instaurer une symbiose av ec lui pour germer ( http://8). L’étude des caractéristiques des graines d’O rchidées en conservation a indiqué qu’elles appartiennent plus ou moins à la catégorie de « conservation orthodoxe ». Une réduction de la teneur en humidité et de la température de conservation améliore généralement leur longévité (Philip, 2000).

5

Généralités

3- Multiplication des Orchidées Les Orchidées présentent deux voies de multiplication : multiplication végétative et multiplication par voie sexuée.

a- Multiplication végétative La multiplication végétative est un procédé selon lequel la plante se reproduit à partir de fragments d’organe ou d’une partie de la plante mère. Ce type de reproduction se traduit par l’apparition de plantes qui sont génétiquement identiques entre elles et à la plante mère (Boutherin et al, 1989). • Multiplication par éclat de souche Pour ce type de multiplication, il faut qu'une plante soit assez grande et possède le nombre de pseudobulbes suffisant, soit 6 au minimum, avec 3 par plante. Les vieux pseudobulbes ou les plantes mères servent de réservoir de nourriture pour les nouvelles pousses (http://12). • Multiplication par keikis La formation de « keikis » (bébés en hawaïen) se produit souvent par suite d'une erreur de culture. A faible luminosité, les boutons floraux se transforment en plantules car au départ les cellules sont indifférenciées (http://10). Les keikis peuvent être séparés de la plante mère (Photo 3). C'est le cas des Phalaenopsis et des Dendrobium .

Photo 3 : Formation de keikis sur la plante mère ( Dendrobium sp .) (Source : http://10)

6

Généralités

• Multiplication par bouturage Le bouturage peut être réalisé avec divers organes comme la racine, la tige, la feuille (Dominique et al, 1989). On peut aussi utiliser comme bouture le pseudobulbe ou la hampe florale (http://11).

b- Multiplication par voie sexuée

• Pollinisation Deux types de pollinisation existent chez les Orchidées : ‹ l’autopollinisation si la surface stigmatique est directement accessible aux pollinies, c’est le cas de Cephalantera et Cypripedium (Boullard, 1985) ; ‹ la pollinisation croisée, si les appareils reproducteurs mâle et femelle sont soudés, ce qui rend l’autopollinisation difficile. Pour se reproduire, la majorité des Orchidées nécessite obligatoirement l'intervention des insectes pollinisateurs (abeille, papillon, mouche, etc.). On les dit entomogames. 90% des Orchidées malgaches sont pollinisées par des Sphingidae (Rabakonandrianina, 1998). Après la fécondation, les innombrables ovules dans l’ovaire se transforment en graines sans cotylédon et albumen (Arditti, 1992 ; Bergerot, 1998)

• Germination de graines d’Orchidées Les graines des Orchidées sont de très petite taille, et sont produites en très grand nombre. Elles peuvent être facilement transportées par le vent, c’est à dire les minuscules graines sont disséminées par anémochorie (Arditti et al, 2000). En fait, elles ne possèdent pas des réserves nutritives suffisantes pour engendrer la germination. Pour germer, elles ont besoin de trouver de la nourriture dans le monde extérieur (http://15).

- Germination symbiotique À la fin du 19 ème siècle, un botaniste français Noël Bernard réussit à démontrer la symbiose entre les Orchidées et le champignon du genre Rhizoctonia (Singh, 1993 ; Barbier, 1994 ; Sneh et al, 1998 ; http://12 ; http://13) . Le champignon détruit l'enveloppe très résistante de la graine, et permet à celle-ci de germer puis de se développer. De plus, le champignon fournit à la graine de l’eau, des éléments énergétiques, des matières nutritives (sels minéraux, vitamines) indispensables à sa germination (Takahashi, 2001 ; Umata, 2001). La graine va alors se développer et devenir une protocorme. Cette protocorme se différencie 7

Généralités par la suite en méristème caulinaire et rhizoïde, dans des directions opposées. En échange, le champignon dépend des racines de la plante pendant toute la vie de celle-ci. Dépourvu de chlorophylle, il est incapable de faire la photosynthèse, c’est l’Orchidée qui va donc l’alimenter en hydrates de carbone (http://12 ; http://13).

- Germination asymbiotique En culture in vitro , la germination des graines d'Orchidées sans la présence du champignon Rhizoctonia est possible, c’est la germination asymbiotique (http://14). Cette méthode consiste à semer des graines sur des milieux nutritifs stériles, sous des conditions de culture bien contrôlées (photopériode, température, lumière). Ce milieu est composé de l’eau, de sels minéraux, du sucre et d'autres éléments permettant la germination et le développement des jeunes plantules d'Orchidées. Les milieux de base les plus utilisés en culture in vitro des Orchidées sont le milieu Murashige et Skoog (1962), de Vacin et Went, de Lindemann, de Lorenzen et de Van Waes (Edwin et al, 1987 ; Kumaria et Tendon, 1991). Les graines germent, forment des protocormes (stade intermédiaire) puis évoluent pour former des plantules.

B- BIOTECHNOLOGIE DE LA MICROPROPAGATION La biotechnologie de la micropropagation des plantes repose principalement sur la culture in vitro . Elle consiste à reproduire un type parental donné, à partir d’un organe ou fragment d’organe qu’on appelle « explant » placé en conditions stériles et très contrôlées, grâce à la totipotence cellulaire (Boutherin et al, 1989 ; Boxus, 1991). Leurs applications sont nombreuses aujourd’hui tant dans le domaine de l’horticulture (Ting-Yu et al, 2002) que dans celui de la recherche (notamment en amélioration des plantes), ou encore pour conserver la diversité variétale et sauvegarder des espèces menacées (Rasoanadrasana, 2010).

1- Asepsie La première condition de la réussite d’une culture in vitro est l’asepsie. Le maintien des cultures en conditions aseptiques sous entend la stérilisation des milieux de culture, des instruments de dissection, d’eau de rinçage, d’hotte à flux laminaire et des explants (Zryd, 1988). Les milieux de culture, les instruments de dissection et l’eau de rinçage sont stérilisés par autoclavage en phase vapeur à 120°C pendant 20mn (Boxus, 1995). Seule une température aussi élevée permet de détruire de bactéries résistantes.

8

Généralités

Avant chaque manipulation, la hotte à flux laminaire est stérilisée à laide d’un rayon U.V. pendant 15 min, suivi par un passage d’alcool 70° sur la paroi. Afin d’obtenir une culture aseptique, les tissus végétaux à mettre en culture doivent être stérilisés en surface, c’est-à-dire débarrassés des bactéries ou spores, des champignons (moisissures) qui adhèrent à leur surface (Alvarez-Pardo et al, 2006). L’objectif est de désinfecter l’explant sans compromettre sa survie. La désinfection de matériel végétal se fait à l’aide des agents oxydants (Boxus, 1995).

2- Milieu de culture Le milieu de culture a pour rôle d’assurer la nutrition, le développement et la croissance des explants. C’est une solution aqueuse qui contient principalement de sels minéraux, du sucre, des composants vitaminiques, des phytohormones ou des extraits de produit végétaux et des antioxydants (Singh, 1993). Cette solution aqueuse est souvent solidifiée au moyen de solidifiant (Auge et al, 1989).

a- Sels minéraux Les besoins des explants en éléments minéraux ont été étudiés par différents auteurs, le fruit de leurs recherches a donné lieu à différentes compositions minérales utilisées actuellement. Ces formulations portent souvent le nom de leurs auteurs tels que Gamborg (Canada), Gautheret (), Heller (France), Murashige et Skoog (Etats-Unis), White (Etats-Unis), Morel (France), etc. Pour les Orchidées, le milieu de culture de Murashige et Skoog (1962) est le plus utilisé, à cause de son caractère très riche que ce soit en macroéléments qu’en microéléments (Kew, 1999).

b- Sucre Les tissus végétaux en culture in vitro sont très peu performants au niveau photosynthétique. Ils produisent de la chlorophylle comme des tissus normaux, mais leur faible capacité à produire des sucres par photosynthèse est due à la faible concentration en gaz carbonique (CO 2) des contenants (Margara, 1982 ; Anonyme, 1999). C’est ainsi qu’il faut ajouter au milieu de culture des glucides sous forme de saccharose afin que la plante les utilise comme source de carbone (Collins et Genovesi, 1982 ; Zryd, 1988 ; Margara, 1989 ; Druart et Samyn, 1995 ; Lydiane et Kleyn, 1996).

9

Généralités

En absence de sucre, la germination asymbiotique des graines des Orchidées est inhibée. La concentration optimale en sucre du milieu de culture a été comprise entre 15 et 20g/l (Homes et Espen, 1973 ; Rahelivololona, 2005).

c- Vitamines Les vitamines sont des substances organiques reconnues pour stimuler la croissance des cultures in vitro (Boccon-Gibbod, 1980). Les vitamines les plus fréquemment utilisées sont la thiamine HCl (vitamine B1), la pyridoxine HCl (vitamine B6), l’acide nicotinique (vitamine PP), le myo-inositol (Auge et al, 1989 ; Margara, 1982).

d- Régulateurs de croissance Les régulateurs de croissance sont des composés organiques utilisés à des doses très faibles de l’ordre de 0,01mg/l à 10mg/l (Norstog, 1961). Ils constituent l’un des principaux facteurs de l’organogenèse (Sharmistha et al, 2005). Le choix de régulateurs de croissance utilisés ainsi que leur quantité dans le milieu de culture varient généralement suivant les objectifs. Les deux principaux groupes de régulateurs de croissance fréquemment utilisés sont les auxines et les cytokinines (Auge et al, 1989). La réaction d’un explant mis en culture dépend du rapport auxine/cytokinine dans le milieu de culture. Si ce rapport est inférieur à l’unité, on obtient la néoformation de bourgeons. Par contre, s’il est supérieur à l’unité, on s’attend à la néoformation de racines. Enfin, le rapport est voisin de l’unité, il y a formation de cals (Frett, 1977 ; Walker et al., 1979 ; Druart, 1992 ; Hobbie, 1998 ; Abrie et Van Staden, 2001 ; Compton et al., 2001 ; Tang et Guo, 2001 ; Crete, 2009) .

e- Additifs organiques De nombreux extraits de produits végétaux sont utilisés en culture in vitro . Ces produits naturels sont apportés comme compléments au milieu de culture ou comme substituant de phytohormones (Rahelivololona, 2005 ; Ramanamidona, 1998). Le lait de coco vert, des extraits de fruits et légumes comme le jus de tomate, d’ananas, de pomme de terre et de pomme ; l’homogénat de banane verte et d’igname sont les plus utilisés en culture in vitro (Syoichi et al, 1999 ; Roslina et al, 2007 ; Tawaro et al 2008).

10

Généralités

f- Antioxydants Le charbon actif et l’acide ascorbique sont fréquemment utilisés en culture in vitro . Ce sont des substances adsorbantes qui permettent d’adsorber les produits phénoliques exsudés par les explants dans le milieu de culture (Van Waes, 1987).

g- Solidifiants Dans le cas de milieu de culture solide, un produit solidifiant comme la gélose ou l’agar peut être utilisé. Les agents gélifiants sont des polysaccharides ajoutés au milieu de culture permettant de réaliser un complexe colloïdal. Ce complexe a un pouvoir de rétention d’ions assez faible et une forte capacité de rétention d’eau (Auge et al, 1989). Il existe aussi des produits naturels permettant de solidifier les milieux de culture tels les amidons (Rasoloniaina, 1997).

11

2ème partie : MATERIEL ET METHODES

Matériel et Méthodes

A- MATERIEL BIOLOGIQUE L’étude s’est focalisée sur les deux espèces d’0rchidées ; Aeranthes antennophora et Bulbophyllum peyrotii qui font partie des espèces SOC du site minier d’Ambatovy. Les graines utilisées ont été obtenues à partir de capsules mûres non déhiscentes de ces deux espèces . En maturité, les capsules d’Aeranthes antennophora et du Bulbophyllum peyrotii sont respectivement de couleur jaune (Photo 4) et rougeâtre (Photo 5).

Photo 4 : Capsule mûre d’ Aeranthes Photo 5 : Capsule mûre de antennophora [barre=1cm] Bulbophyllum peyrotii [barre=0,5cm]

(Source : Dinaharilala, 2010) (Source : Dinaharilala, 2010)

1- Site de récolte des explants Le site d’exploitation minière Ambatovy se trouve dans la partie Centre-Est de Madagascar, dans la région Alaotra Mangoro et dans le District de Moramanga. Il s’étend sur 1800 ha et est situé à 25km au Nord-Nord-est de Moramanga (Carte 1). Il est compris entre la longitude Est 48° 18’ 00’’ et la latitude Sud 18° 49’ 0,12’’ (http://17).

12

Matériel et Méthodes

Carte 1 : Localisation du site minier d’Ambatovy ( Berner et al., 2009)

a- Climat Ambatovy présente un bioclimat oriental humide. L’humidité relative annuelle moyenne est de 95%. En effet, le vent d’Alizé qui souffle dans la direction Est -Sud-Est apporte une humidité considérable ( http://18). La précipitation moyenne annuelle est de 1400mm. Les mois les plus pluvieux se situent de décembre en mars , avec un maximum au mois de décembre durant lequel la précipitation moyenne est de 255,3mm. Les mois les plus secs vont d’avril à novembre (http://18). (Figure 2). La température moyenne est de 17°C. Les maxima sont observés en février avec 28,4°C, et les minim a en juillet avec 13,6°C ( http://18). (Figure 2). La variation mensuelle de la précipitation et de la température du site Ambatovy est en annexe III.

13

Matériel et Méthodes

300 150 250 125 200 100 150 75 100 50 Température(°C) Pluviométrie (mm) 50 25 0 0 Juil Jan Avr Fev Oct Sep Dec Mai Juin Nov Août Mars Mois

Pluviométrie Temp. moyen.

Figure 2 : Diagramme ombrothermique du site minier d’Ambatovy (http://18).

b- Flore et végétation Ambatovy est situé au cœur de l’une des régions particulièrement riches en espèces végétales dans l’extrémité Sud du corridor forestier de l’Est. Ce site héberge 1580 espèces végétales. Parmi ces espèces, environ 12% ont été classées parmi les SOC (Species Of Concerns). La végétation est caractérisée par une forêt dense humide sempervirente. (Phillipson et al., 2010).

2- Classification botanique La famille des Orchidées figure parmi les végétaux supérieurs les plus évolués (http://4). Selon la classification phylogénétique APG III (Angiosperms Phylogeny Groupe, 3ème version) en 2009, cette famille se divise en six sous-familles: Apostasioideae, Cypripedioideae, , , Codonorchidoideae, Vanilloideae (http://1 ; http://16). D’après ce système de classification, l’appartenance d’Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii est consignée dans le tableau 1.

14

Matériel et Méthodes

Tableau 1 : Classification botanique d’Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii Règne : VEGETAL Règne : VEGETAL Embranchement : SPERMATOPHYTES Embranchement : SPERMATOPHYTES Sous embranchement : ANGIOSPERMES Sous embranchement : ANGIOSPERMES Classe : MONOCOTYLEDONES ou Classe : MONOCOTYLEDONES ou LILIOPSIDA LILIOPSIDA Ordre : Ordre : ASPARAGALES Famille : Famille : ORCHIDACEAE Sous-familles : EPIDENDROIDEAE Sous-familles : EPIDENDROIDEAE Genre : Aeranthes Genre : Bulbophyllum espèce : antennophora espèce : peyrotii

3- Description morphologique

‹ Aeranthes antennophora C’est une plante acaule, de 6 à 7 feuilles largement ligulées et bilobées au sommet, à lobe obtus et fortement inégaux. Ces feuilles font 30 à 40cm de long sur 2 à 3,5cm de large. Les inflorescences grêles naissent à l’aisselle des feuilles (Photo 6). Elles portent une grande fleur de couleur blanche verdâtre à son extrémité. Les sépales sont très longs (9 à 12cm), acuminées en très longue pointe filiforme (Photo 7). Les 2 pétales sont semblables au sépale médian, mais de taille réduite. Le labelle est ovale, de 2cm de large. Aeranthes antennophora est un épiphyte qui pousse sur les arbres de forêt de moyenne altitude. Elle fleurit au mois d’avril (Perrier, 1939 ; Peter et al, 2008).

‹ Bulbophyllum peyrotii C’est une Orchidée épiphyte, à rhizome ramifié, de 0,5 à 0,6mm de diamètre. Elle peut gazonner et revêtir les branches. Les pseudobulbes sont rapprochées, bifoliées, aplaties, oblongues, 1,5 à 1,8mm de long sur 1,3 à 1,6mm de large, jaune verdâtre, (Photo 8). Ces feuilles font 18 à 30mm de long sur 13 à 16mm de large, elles sont peu épaisses et elliptiques. Les inflorescences sont en épi dont les fleurs sont contiguës au sommet de la hampe florale (Photo 9) (Perrier, 1939). Bulbophyllum peyrotii pousse sur les arbres de forêt de moyenne altitude. Elle fleurit au mois de février.

15

Matériel et Méthodes

Photo 6 : Aeranthes antennophora au stade de Photo 7 : Fleur d’Aeranthes floraison [barre = 2cm] antennophora [barre = 1cm] (Source : Dinaharilala, 2009) (Source : Dinaharilala, 2009)

Photo 8 : Bulbophyllum peyrotii au stade de Photo 9 : Inflorescence floraison [barre = 0,5cm] de Bulbophyllum peyrotii

[barre = 0,5cm] (Source : http://6 ) (Source : http://6 )

B- METHODES Cette étude consiste à faire la micropropagation de deux espèces SOC d’Orchidées en optimisant le milieu de culture par l’utilisation des additifs organiques appropriés en vue de substituer les régulateurs de croissance synthétiques. Elle entre dans le cadre de la conservation et la multiplication des espèces d’Orchidées menacées de disparition. Pour ce faire, l’étude sur la germination asymbiotique des graines, la régénération de protocorme et la multiplication des plantules, ainsi que l’acclimatation d’Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii a été effectuée.

16

Matériel et Méthodes

1- Récolte des capsules Des capsules mûres, saines, non déhiscentes d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii (Photos 6 et 7) ont été récoltées dans des zones de défrichement du site d’exploitation minière Ambatovy. La récolte a été faite au mois de décembre 2010. Le pédoncule d’une capsule au stade de maturation a été coupé à l’aide d’un sécateur. Chaque capsule a été placée dans un sac en plastique muni d’un code du pied mère. Le code correspondant à chaque pied mère et leurs coordonnées géographiques sont dans l’annexe II. Le code du pied mère a été gardé depuis l’ensemencement de graines jusqu’à ce que ces plantules soient définitivement réintroduites in situ , afin de suivre la traçabilité des espèces.

2- Préparation du milieu de culture Pour toutes les expérimentations, le milieu de base de Murashige et Skoog modifié (1962), dilué de moitié (MS/2), additionné de vitamines (thiamine-HCl, pyridoxine-HCl, acide nicotinique et myo-inositol), de 20g/l (p/v) de saccharose, et solidifié par 8g/l (p/v) d’agar a été utilisé. Les tableaux relatifs à la proportion de ces éléments constitutifs sont consignés en annexe IV. La préparation suit les 4 étapes suivantes : 1ère étape : Préparation des solutions mères Afin de mieux gérer le temps à chaque préparation du milieu de culture, des solutions mères ont été préparées au préalable, puis conservées au réfrigérateur. Seul, le Myo-inositol a été pesé et additionné au moment de la préparation du milieu de culture. 2ème étape : Ajustement du pH Lorsque tous les éléments constitutifs du milieu de culture ont été mélangés sauf l’agar, le pH a été ajusté de 5,5 à 5,6 avec une solution normale de NaOH ou HCl, à l’aide d’un pH-mètre. 3ème étape : Cuisson et coulage Après l’addition de l’agar, le mélange a été porté à ébullition, en agitant soigneusement jusqu’à ce qu’il présente une solution homogène. Le milieu est réparti en fractions de 5ml dans des tubes à essais (pour le milieu de germination) ou de 10ml dans des flacons de culture (pour le milieu de différenciation et de multiplication). 4ème étape : Stérilisation du milieu de culture La stérilisation du milieu de culture se fait par autoclavage en phase gazeuse à une température de 120°C et sous une pression de 1bar pendant 20mn.

17

Matériel et Méthodes

3- Germination asymbiotique Le principe de base est de faire germer les graines d’Orchidées dans des conditions stériles, sur un milieu de culture synthétique, afin d’obtenir des protocormes vertes. Les protocormes sont des masses cellulaires indifférenciées formées au début du développement des Orchidées. Des recherches sur les milieux de culture favorables pour la germination asymbiotique in vitro d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii ont été menées.

a- Milieux de germination Le lait de coco vert a été fréquemment additionné dans le milieu de germination des Orchidées. Il a amélioré la capacité germinative de plusieurs espèces (Rasmussen, 1995; Kishor et Sharma, 2009) et c’est pourquoi cet additif organique a été choisi pour le milieu de germination. La méthode de la germination asymbiotique d’ Oncidium sp . utilisée par Kalimuthu et al, en 2007 a été adoptée. Les graines sont ensemencées sur 5 types de milieu de culture. Les milieux se diffèrent entre eux par la présence de lait de coco vert et par la composition en régulateurs de croissance. Les régulateurs de croissance sont constitués d’une cytokinine qui est le 6-Benzylaminopurine (BAP) et d’une auxine, l’Acide Naphtalène Acétique (ANA). Les compositions de différents types de milieu de germination sont consignées dans le tableau 2. Tableau 2 : Composition des milieux de germination d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii selon les concentrations de BAP, d’ANA et de lait de coco vert.

TYPES DE TRAITEMENTS MILIEUX BAP (mg/l) ANA (mg/l) LCV (ml/l) G0 (témoin) - - - G - - 150 G1 1 - - G2 2 - - G3 - 1 - G4 - 2 - ANA : Acide Naphtalène Acétique ; BAP: 6-Benzylaminopurine; LCV : Lait de coco vert; G : milieu de germination.

18

Matériel et Méthodes

b- Désinfection des capsules La méthode de désinfection effectuée a été similaire à celle utilisée par Rahelivololona, (2005) sur la vitropropagation d’ Eulophiella roempleriana Rolfe et de Grammangis Lind. Après le nettoyage de capsule à l’eau savonneuse (photo 10a), la désinfection est réalisée sous hotte à flux laminaire (photo 10b). Les capsul es ont été trempées dans une solution de mancozè be 1% (p/v) pendant 1h, dans l’éthanol 70° pendant 5 min, puis dans une solution d’hypochlorite de sodium à 70% (p/v) pendant 20m in. Après chaque trempage, 4 rinçages successifs à l’eau distillée stérile ont été effectués (photo 10 c). Pour que les désinfectants agissent mieux, il suffit d’ajouter que lques gouttes de tween 20.

Photos 10 : Désinfection des capsules de Bulbophyllum peyrotii. a : nettoyage à l’eau savonneuse ; b : désinfection sous hotte à flux laminaire ; c : rinçages à l’eau distillée

stérile

(Source : Dinaharilala, 2010)

c- Ensemencement Après la désinfection, la capsule a été coupée transversalement à l’aide d’un scalpel stérile (photo 11a) . Lorsque la capsule est ouverte, les graines ont été ensemencées à la surface du milieu de culture à raison de 100 graines par tube à essais (photo11b) . Chaque tube a été fe rmé avec du papier aluminium et scellé avec du parafilm (photo s 11 c).

19

Matériel et Méthodes

Photos 11 : Ensemencement in vitro de graines de Bulbophyllum peyrotii sur le milieu de germination . a : dissection transversale de la capsule ; b : semis sur le milieu de

germination ; c : couverture et scellage du tube

(Source : Dinaharilala, 2010)

Pour chaque espèce, le s graines ont été reparties dans 25 tubes de culture représent ant 5 traitements c'est-à-dire 5 types de milieu de culture. Chaque traitement a été répété 5 fois soit un total de 3000 graines par espèce y compris celles cultivées dans le milieu témoin .

d- Paramètres étudiés ‹ Taux de contamination Chaque semaine, l’apparition des infections fongiques et bactérienne s sur les cultures a été suivie. Le nombre de cultures contaminé es a été considéré afin d’évaluer le taux de contamination pour chaque espèce. Le taux de contamination correspond au pourcentage de cultures contaminées. ‹ Vitesse et taux de germination Afin d’ évaluer la vitesse et le taux de germination des graines dans ch aque milieu testé, l’évolution de la couleur de graines et l’obtention de protocormes vertes ont été notées à la fin de chaque semaine. La vitesse de germination est définie comme le temps mis par les g raines pour germer. Les graines ont été levées lorsqu’il y a apparition de protocormes vertes sur le milieu de germination. Le taux de germination est le pourcentage des graines ayant germé .

4- Différenciation de protocorme en plantule Cette étude a pour objectif d’ obtenir des plantules complètes à partir des protocormes. 4 types d’additifs organiques ont été étudiés afin de déterminer celui ou ceux qui est (sont) favorable(s) pour la caulogenèse, la rhizogenèse et la croissance des plantules régénérées.

20

Matériel et Méthodes

a- Milieux de culture Des meilleurs résultats sur la régénération de protocorme en plantule ont été obtenus en utilisant des additifs organiques tels que le lait de coco vert, l’homogénat de banane verte et le jus de pomme de terre (Lo et al, 2004 ; Sinha et Roy 2004 ; Tawaro et al, 2008). Par ailleurs, le jus d’ananas a été utilisé par Ramanamidona (1998) sur la culture in vitro de Sesbania rostrata . Les 4 types d’additifs organiques étudiés sont le lait de coco vert, d’homogénat de banane verte, de jus de pomme de terre et de jus d’ananas. Les compositions chimiques de ces additifs organiques sont en annexe V. Les additifs organiques ont été préparés juste au moment de la confection de milieu culture, excepté le lait de coco vert qui peut être extraire à partir d’une noix de coco vert et conservé au congélateur. L’homogénat de banane a été obtenu en broyant la pulpe de banane verte (Musa acuminata ). La concentration utilisée (100g/l) est similaire à celle utilisée par Rahelivololona en 2005 sur la micropropagation d’ Eulophiella roempleriana Rolfe et de Grammangis Lind. Le jus de pomme de terre a été obtenu en trempant 100g de morceaux de 1cm 3 de pomme de terre fraîche, dans 100ml d’eau distillée bouillante pendant 5mn. Le fruit d’ananas mûr a été broyé, pressé puis filtré pour obtenir un jus d’ananas (Ramanamidona, 1998). Le tableau suivant montre les différents types de milieu de différenciation de protocormes d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii .

Tableau 3 : Composition de différents types de milieu de différenciation de protocormes d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii selon les concentrations des additifs organiques. TYPES DE TRAITEMENTS MILIEUX LCV (ml/l) HBV (g/l) JP (ml/l) JA (ml/l) R - - - - R1 150 - - - R2 - 100 - - R3 - - 200 - R4 - - - 200 LCV : lait de coco vert ; HBV : homogénat de banane verte ; JP : jus de pomme de terre ; JA : jus d’ananas ; R : milieu de différenciation (régénération).

21

Matériel et Méthodes

b- Echantillonnage et repiquage Les protocormes vertes âgées de 2 mois, provenant de milieu de germination (G) ont été utilisées comme explants (Photo 12). Les protocormes vertes de 0,5mm de diamètre ont été repiquées sur 4 types de milieu de différenciation. Ces explants ont été repiqués à raison de 15 protocormes par flacon de culture. 4 traitements ont été effectués dont chacun a fait l’objet de 5 répétitions soit un total de 375 protocormes par espèce y compris celles cultivées dans le milieu témoin.

Photo 12 : Protocormes vertes de Bulbophyllum peyrotii au moment du

repiquage [barre=0,25cm]

(Source : Dinaharilala, 2011)

c- Paramètres étudiés Des observations et des mesures hebdomadaires ont été effectuées afin d’évaluer le développement des protocormes. Les paramètres suivants ont été considérés : ‹ la vitesse d’apparition de la première feuille et des racines sur les protocormes. ‹ le nombre moyen de racines par explant ; ‹ la longueur moyenne des plantules obtenues.

5- Multiplication par bourgeonnement L’objectif de cette expérimentation est de comparer les influences des additifs organiques et des phytohormones synthétiques sur la multiplication d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii.

22

Matériel et Méthodes

a- Milieux de culture D’après les résultats obtenus sur l’étude de la différenciation des protocormes, les additifs organiques montrant une influence positive ont été retenus. De ce fait, le lait de coco vert et l’homogénat de banane verte ont été gardés. Les concentrations de phytohormones synthétiques (ANA/BAP) sont identiques à celles utilisées par Broly en 1982 et Sinha et al en 2004 sur le bourgeonnement et la régénération de l’espèce Phalaenopsis et Vanda teres respectivement . La composition en additifs organiques ou en régulateurs de croissance dans le milieu de multiplication est mentionnée dans le tableau 4.

Tableau 4 : Composition de différents types de milieux de multiplication d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii selon le type de régulateurs de croissance ou d’additifs organiques et leurs concentrations TYPES DE TRAITEMENTS MILIEUX LCV HBV ANA BAP (ml/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) B0 (témoin) - - - - R1 150 - - - R2 - 100 - - B1 - - 0,2 1 B2 - - 0,2 2 LCV : Lait de coco vert ; HBV : homogénat de banane verte ;ANA : Acide Naphtalène Acétique ; BAP : 6- Benzylaminopurine ; B : milieu de bourgeonnement ; R : milieu de régénération

b- Echantillonnage et repiquage Des plantules vertes de 5mm de longueur, issues de milieu de différenciation (R2) ont été transférées dans les milieux de multiplication (Photo 13). Les plantules débarrassées de leurs racines ont été repiquées à raison de 3 plantules par flacon de culture. 4 traitements ont été effectués dont chacun a fait l’objet de 5 répétitions. Au total, 75 plantules par espèce, y compris celles cultivées dans le milieu témoin, ont été utilisées.

23

Matériel et Méthodes

Photo 13 : Plantules de Bulbophyllum peyrotii issues de milieu de différenciation au moment du repiquage [Barre=0,5cm] (Source : Dinaharilala, 2011)

c- Paramètre étudié : Pour évaluer le taux de multiplication des explants, des observations et des comptages hebdomadaires ont été effectuées . Ce taux a été calculé à partir de la moyenne des nouvelles pousses formées à la base de chaque explant.

6- Conditions de culture La désinfection de capsu les, l’ensemencent de graines, le repiquage de protocormes et de plantules ont été effectuées sous hotte à flux laminaire horizontale au voisinage de la flamme d'un bec bunsen (Photo 14 ). Les cultures sont placées dans une chambre de culture à conditions contrôlées à une température de 25°C, sous une intensité lumineuse de 3000Lux fourni e par des tubes fluorescents Mazda fluor, et une photopériode de 16h lumière / 8h obscurité (Photo 15).

24

Matériel et Méthodes

Photo 14 : Manipulation Photo15 : Chambre de culture à conditions sous hotte à flux laminaire contrôlées (Source : Dinaharilala, 2010) (Source : Dinaharilala, 2010)

7- Acclimatation des plantules Cette dernière étape consiste à habituer, d’une manière progressive, les vitroplants aux conditions naturelles de culture.

a- Echantillonnage et mise en acclimatation Les vitroplants de 10mm de longueur, ayant trois à cinq racines ont été acclimatés (Photos 16 et 17). Après lavage des racines, les vitroplants ont été repiqués dans des pots remplis d’un mélange de litière (2/3) et de sciure de bois (1/3). De plus, l’utilisation des mousses comme couverture de substrat permet de maintenir l’humidité nécessaire pour la survie des vitroplants d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii . Chaque pot contient 3 plantules. Les pots contenant les vitroplants ont été placés dans un bac d’acclimatation et recouverts par un plastique transparent pour maintenir une humidité relative élevée avoisinant de celle dans les conditions in vitro soit environ de 90%. Le bac d’acclimatation a été déposé dans une serre vitrée. Trois bacs d’acclimatation ont été utilisés (3 répétitions) : un bac contient 50 pots dont 25 par espèce. Au total, 225 vitroplants par espèce ont été utilisés. Pour éviter la dessiccation des vitroplants, une diminution d’humidité relative de façon progressive a été effectuée (Photos 18). Il s’agit d’une perforation de 2cm de diamètre de la couverture en plastique tous les 5 jours jusqu’au 30 ème jour d’acclimatation. Puis, les

25

Matériel et Méthodes vitroplants ont été laissé s entièrement en contact avec l’atmosphère par enlèvement total de la couverture (Photos 19 ). La m éthode d’acclimatation menée par Ramanampamonjy , (2004) chez Aeranthes grandiflora Lind. a été adoptée.

b- Paramètre étudié Le taux de survie d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii a été évalué à partir du nombre de vitroplant survivant une semaine après l’ enlèvement total de la couverture.

Photos 1 6 : Pousses enracinées Photos 17 : Pousses enracinées de d’ Aeranthes antennophora prêts à Bulbophyllum peyrotii prêts à

l’acclimatation [barre=0,5cm] l’acclimatation [barre=0,5cm]

(Source : Dinaharilala, 2011) (Source : Dinaharilala, 2011)

Photos 18 : 10 ème jour d’acclimatation Photos 19 : 30 ème jour d’acclimatation d’ Aeranthes antennophora et de d’ Aeranthes antennophora et de

Bulbophyllum peyrotii, couverture en Bulbophyllum peyrotii , plants pl astique6- perforée par 2 trous entièreme nt en contact avec l’atmosphère (Source : Dinaharilala, 2011) (Source : Dinaharilala, 2011)

26

Matériel et Méthodes

8- Traitement des données Pour l’analyse des données, l’analyse de variance et la comparaison des moyennes ont été effectuées en utilisant le logiciel STAT-ITCF. Cette méthode a pour objectif de savoir s’il existe des différences significatives entre les milieux testés et entre les espèces étudiées. Le principe est basé sur le test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%. Tous les traitements ayant les mêmes paires de moyennes sont regroupés dans une même classe. La classe représente un caractère des explants dans des milieux de culture. L’évolution de la culture est évaluée par un indice de probabilité P associé à deux facteurs étudiés qui sont le milieu de culture et l’espèce. Les résultats seront interprétés selon les considérations suivantes : Si P > 0,05 : il n’y a pas une différence significative entre les milieux de culture testés. Si 0,01 < P < 0,05 : il y a une différence significative entre les milieux de culture testés. Si P < 0,01 : il y a une différence hautement significative entre les milieux de culture testés.

27

3ème partie : RESULTATS ET INTERPRETATIONS

Résultats et Interprétations

A- GERMINATION ASYMBIOTIQUE

1- Taux de contamination Les taux de contamination de culture d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii sont résumés dans le tableau 5. Les taux de contamination obtenus sont de 6,6% pour Aeranthes antennophora et de 5% pour Bulbophyllum peyrotii . Ces faibles taux de contamination ont montré l’efficacité de la méthode de stérilisation de surface effectuée. Le trempage des capsules de ces deux espèces dans une solution d’hypochlorite de sodium à 70% (p/v) pendant 20mn a été optimal pour la stérilisation de surface des capsules.

Tableau 5 : Taux de contamination de culture d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii Taxons Taux de contamination (%) Aeranthes antennophora 6,6 Bulbophyllum peyrotii 5

2- Influences des types de milieu de culture sur la vitesse de germination Les effets du lait de coco vert, de BAP et d’ANA sur la vitesse de germination d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii sont résumés sur la figure 3. La vitesse de germination varie suivant le type du milieu et de l’espèce. L’analyse de variance a révélé des effets hautement significatifs (P<0,01) des 5 types de milieu de culture étudiés sur la vitesse de germination de ces deux espèces. Concernant l’espèce Aeranthes antennophora , la présence du lait de coco vert et/ou de phytohormones dans le milieu de culture a accéléré la germination des graines (2 à 5 semaines) alors qu’en milieu témoin G0, la vitesse de germination a été de 8,2 semaines. Par ailleurs, cette vitesse a varié en fonction du type de phytohormone dans le milieu de culture. Elle a été accélérée (2 semaines) sur les milieux additionnés de 1 et 2mg/l d’ANA (G3 et G4) alors que sur les milieux additionnés de 1 et 2 mg/l de BAP (G1 et G2), la germination a été observée après 3 à 4 semaines. D’un autre côté, pour l’espèce Bulbophyllum peyrotii , la germination des graines n’a pas besoin d’un apport exogène de phytohormone. Sur les milieux de culture sans BAP ni ANA (G0 et G), elle a été accélérée. Les graines ont été levées après 5 semaines. En revanche,

28

Résultats et Interprétations en présence de BAP ou d’ ANA , les graines ont germé lentement. Au fur et à mesure que la concentration de phytohormones a augmenté, la vitesse de germination a été de plus en plus lente (G1, G2, G3, G4). L’ajout de 2mg/l d’ANA dans le milieu a retardé la germination des graines jusqu’à 8 semaines (G4) .

2g G4 8a

2g G3 7b

4e G2 6c

3,2f S101 G1 5d S32 Milieu Milieu culture de 5d G 5d

8,2a G0 5d

0 2 4 6 8 10 Vitesse de germination (semaine) Figure 3 : Vitesse de germination d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii sur les différents milieux de culture (semaine) S101: Aeranthes antennophora ; S32 : Bulbophyllum peyrotii G0: MS/2 (témoin) ; G: + 150ml/l de LCV ; G1: + 1mg/l BAP ; G2: + 2mg/l BAP ; G3: + 1mg/l ANA ; G4: + 2mg/l ANA. Les valeurs suivies de lettre différente présentent une différence significative d’après le test de N ewman et Keuls au seuil de 5%.

3- Influences de la composition de milieux de culture sur le taux de germination La figure 4 représente le taux de germination d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii après 2 mois de culture sur les différents types de milieu de culture. Les deux espèces étudiées se comportent différemment sur les milieux de culture testés. En effet, la di fférence de taux de germination obtenu avec les 6 types de milieu est hautement significative (P<0,01) d’après le test de Newman-Keuls. Concernant l’espèce Aeranthes antennophora , l’addition d e lait de coco vert ou de phytohormones dans le milieu de culture a amélioré sa germination. L’ANA a donné un taux de germination élevé par rap port au BAP. D’après la figure 4, l’addition d e 1 et 2mg /l d’ANA dans les milieux de culture (G3 et G4) a donné le taux de germination le plus éle vé, soit respectivement de 95,5% et 96,3 %. Les milieux additionnés de 150ml/l de lait de coco vert ou de BAP (G, G1 et G2) ont donné d es taux de germination élevés qui sont respectivement de

29

Résultats et Interprétations

90,6%, 75% et 73,7 %. Pour cette espèce, le plus faible taux (32, 4%) a été obtenu dans le milieu témoin (G0). Pour Bulbophyllum peyrotii , le taux de germination le plus élevé (90,1%) est obtenu sur le milieu additionné de lait de coco vert (G) suivi de 73,9% sur le milieu témoin (G0). En présence de phytohormones, le taux de germination a été inférieur à celui obtenu sur le milieu témoin (G0). De plus, il a augment é avec la concentration en BAP c’est à dire aux doses de 1 et 2mg/l, les tau x ont été respectivement de 50,6 % et 71.3%. Néanmoins, le taux de germination a diminué avec la concentration d’ANA car à la concentration de 1mg/l (G3), 51,5% des graines ont germé alors qu e ce taux a été de 36,5% à la dose de 2mg/l (G4).

120

90,6b 95,5a 96,3a 100 90,1b

75c 73,7c 80 73,9c 71,3c

60 50,6d 51,5d S101 36,5e 40 32,4f S32 Taux deTaux germination (%) 20

0 G0 G G1 G2 G3 G4 Milieu de culture

Figure 4 : Taux de germination d’ Aeranthes antenophora et de Bulbophyllum peyrotii après 2 mois d’ensemencement in vitro selon les milieux étudiés. S101: Aeranthes antennophora ; S32 : Bulbophyllum peyrotii G0: MS/2 (témoin) ; G: + 150ml/l de LCV ; G1: + 1mg/l BAP ; G2: + 2mg/l BAP ; G3: + 1mg/l ANA ; G4: + 2mg/l ANA. Les valeurs suivies de lettre différente présentent une différence significative d’après le test de Newman et Keuls au seuil de 5%.

Les photos 20 ; 21 et 22 ; 23 montrent respectivement les différences entre l’effet de lait de coco vert et de phytohormones synthétiques sur le taux de germination d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii.

30

Résultats et Interprétations

Photo 20 : Protocormes Photo 21 : Protocormes d’ Aeranthes antennophora d’ Aeranthes antennophora après 2 mois de semis sur le après 2 mois de semis sur le milieu additionné de 2mg/l milieu additionné de 150ml/l d’ANA (G4) de LCV (G1)

(Source : Dinaharilala, 2011) (Source : Dinaharilala, 2011)

Photo 22 : Protocormes de Photo 23 : Protocormes de Bulbophyllum peyrotii après 2 Bulbophyllum peyrotii après 2 mois de semis sur le milieu mois de semis sur le milieu additionné de 150ml/l de LCV additionné de 2mg/l d’ANA (G) (G4)

(Source : Dinaharilala, 2011) (Source : Dinaharilala, 2011)

31

Résultats et Interprétations

B- ORGANOGENESE Les protocormes issues de la germination des graines ont été repiquées sur le milieu de culture additionné des différents additifs organiques. Le lait de coco vert (150ml/l), l’homogénat de banane verte (100g/l), le jus de pomme de terre (200ml/l), et le jus d’ananas (200ml/l) ont été additionnés séparément aux milieux de culture afin d’étudier leurs effets sur la différenciation de protocormes en plantules.

1- Influences des additifs organiques sur l’apparition de feuille La figure 5 représente la vitesse d’apparition de feuilles sur les protocormes d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii selon les types de milieu de différenciation testé. Concernant l’espèce Bulbophyllum peyrotii , la première feuille est apparue entre 2 à 3,6 semaines après le repiquage de protocormes. Cette variation dépend du type d’additif organique présent dans le milieu de différenciation. La première feuille a été observée dès la deuxième semaine de repiquage sur les milieux additionné d’homogénat de banane verte et du jus de pomme de terre (R2 et R3). Quant au lait de coco vert (R1), elle a été visible au bout de la troisième semaine. Cependant, l’addition du jus d’ananas sur le milieu de culture (R4) a retardé l’apparition de la première feuille qui a été enregistrée après 3,6 semaines. Pour Aeranthes antennophora , l’apparition de feuille a été observée au bout de 2,6 semaines après le repiquage de protocormes sur le milieu additionné d’homogénat de banane verte (R2). Le lait de coco vert (R1) et le jus de pomme de terre (R3) n’ont pas d’effet significatif sur l’apparition de feuille car elle n’a été observée que vers les 5,2 et 5,8 semaines de repiquage. Sur le milieu de culture additionné de jus d’ananas (R4), la première feuille a été observée plus tardivement et seulement vers la septième semaine de repiquage.

32

Résultats et Interprétations

7a 5,8b S101 2,6de 5,2b R4 5,6b R3 R2 Espèces 3,6c 2,2e S32 2e R1 3cd R0 2,6de

0 2 4 6 8 Vitesse d'apparition de feuille (semaine) Figure 5 : Vitesse d’apparition de la première feuille d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii selon les additifs organiques étudiés (semaine) S101: Aeranthes antennophora S32: Bulbophyllum peyrotii ; R0: MS/2 (témoin) ; R1: + 150ml/l de lait de coco vert; R2: + 100g/l d’homogénat de banane verte; R3: + 200ml/l de jus de pomme de terre ; R4: + 200ml/l de jus d’ananas Les valeurs suivies de la même lettre ne présentent pas une différence significative d’après le test de Newman et Keuls au seuil de 5%.

2- Influences des additifs organiques sur la vitesse d’apparition de racine Les effets des 4 types d’additif organique sur la vitesse d’apparition de racine d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii sont représentés sur la figure 6. Pour Bulbophyllum peyrotii , tous les traitements ont amélioré l’apparition de racine sauf le traitement au jus d’ananas. Aussi, par rapport au témoin (R0), le meilleur résultat a été obtenu avec l’homogénat de banane verte (R2). Elle y a été de 3,4 semaines contre 5,2 semaines pour le témoin. L’apparition de racines a été enregistrée à 4,2 et 5 semaines après le repiquage sur les milieux contenant respectivement du jus de pomme de terre (R3) et du lait de coco vert (R1). Les résultats obtenus ont montré que la vitesse d’apparition de racine a été retardée dans le milieu de culture contenant du jus d’ananas (R4). De ce fait, les racines ne sont apparues qu’après 5,6 semaines de repiquage de protocormes. Concernant l’espèce Aeranthes antennophora , la vitesse d’apparition de racines a été de 9,6 semaines après le repiquage de protocormes en présence de lait de coco vert (R1) ou l’homogénat de banane verte (R2). Elle a été de 12,6 semaines en présence de jus de pomme de terre (R3), contre 14,8 semaines sur le milieu témoin (R0). D’un autre côté, le jus d’ananas a montré un effet inhibiteur sur le développement racinaire (R4) car les pousses y ont été restées sans racine.

33

Résultats et Interprétations

12,6b S101 9,6c 9,6c 14,8a R4 R3

Espèces 5,6d 4,2fg R2 S32 3,4h R1 5ef 5,2e R0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 Vitesse d'apparition de racine (semaine)

Figure 6 : Vitesse d’apparition de racines d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii selon les additifs organiques étudiés S101: Aeranthes antennophora S32: Bulbophyllum peyrotii ; R0: MS/2 (témoin) ; R1: + 150ml/l de lait de coco vert; R2: + 100g/l d’homogénat de banane verte; R3: + 200ml/l de jus de pomme de terre ; R4: + 200ml/l de jus d’ananas Les valeurs suivies de lettre différente présentent une différence significative d’après le test de Newman et Keuls au seuil de 5%.

3- Influences des additifs organiques sur le nombre de racines néoformées Les résultats concernant le nombre moyen de racines néoformées après 16 semaines de repiquage de protocormes sont consignés dans la figure 7. Le nombre de racines produites a varié suivant le type de milieu étudié et de l’espèce. L’analyse de variance a révélé une différence significative des effets des additifs organiques sur la production de racine chez ces deux espèces. Chez Aeranthes antennophora , l’analyse de variance a permis de distinguer les trois classes de milieux de culture : ‹ la première classe, représentée par le milieu additionné d’homogénat de banane verte (R2), qui a permis d’obtenir 2,6 racines par plantule; ‹ la seconde classe, regroupant le milieu témoin (R0) et les milieux pourvus de lait de coco vert (R1) et de jus de pomme de terre (R3), qui ont produit une racine par plantule ; ‹ la troisième classe incluant le milieu contenant du jus d’ananas (R4) dans lequel la rhizogenèse est inhibée car aucune racine n’a été obtenue.

34

Résultats et Interprétations

L’effet de l’homogénat de banane verte sur la production de racines de Bulbophyllum peyrotii a été moins intense par rapport à celui du lait de coco vert. Les plantules ont respectivement 4 et 2,6 racines dans les milieux contenant du lait de coco vert et de l’homogénat de banane verte (R1, R2). 1,6 racines ont été formées sur le milieu témoin (R0) et sur le milieu contenant de jus de pomme de terre (R3). D’un autre côté, le nombre de racines produites a été d’autant plus réduit que le milieu de culture renferme du jus d’ananas. Après 16 semaines de repiquage, une seule racine par plantule a été formée.

4,5 4a 4 3,5 3 2,6b 2,6b R0 2,5 R1 2 1,6c 1,6c R2 1,5 1,2d 1,2d 1d 1d R3 1 R4 0,5 0 0 Nombremoyende racinespar explant S101 S32 Espèces

Figure 7 : Nombre de racines néoformées chez Aeranthes antennophora et chez Bulbophyllum peyrotii selon les additifs organiques étudiés (après 16 semaines de culture) S101: Aeranthes antennophora S32: Bulbophyllum peyrotii ; R0: MS/2 (témoin) ; R1: + 150ml/l de lait de coco vert; R2: + 100g/l d’homogénat de banane verte; R3: + 200ml/l de jus de pomme de terre ; R4: + 200ml/l de jus d’ananas Les valeurs suivies de la même lettre ne présentent pas une différence significative d’après le test de Newman et Keuls au seuil de 5%.

4- Influences des additifs organiques sur la croissance des plantules Les figures 8 et 9 montrent la cinétique de croissance des plantules sur les différents types de milieux de différenciation pendant16 semaines. Les plantules obtenues après la différenciation de protocormes n’ont pas eu la même croissance. La vitesse de croissance des plantules a varié selon le type de milieu et de l’espèce (photos 24 et 25).

35

Résultats et Interprétations

Photos 24 : Plantules de Bulbophyllum peyrotii sur le milieu additionné d’homogénat de banane verte (R2) après 16 semaines de repiquage de protocorme [barre=0,5cm]

(Source : Dinaharilala, 2011)

Photos 25 : Plantules d’ Aeranthes antennophora sur le milieu additionné d’homogénat de banane verte (R2) après 16 semaines de repiquage de protocorme [barre=0,5cm]

(Source : Dinaharilala, 2011)

36

Résultats et Interprétations

Les courbes de la figure 8 et 9 forment 3 groupes homogènes distincts : Le premier groupe représente la croissance des plantules sur les milieux additionnés de lait de coco vert ou d’homogénat de banane verte (R1 et R2). Sur ces milieux, la croissance des plantules de Bulbophyllum peyrotii a été la plus importante atteignant respectivement 14mm et 14,5mm au bout de 16 semaines. Pour l’espèce Aeranthes antennophora , la vitesse de croissance a été de 4,7mm en présence de lait de coco vert et de 5mm dans le milieu pourvu d’homogénat de banane verte. Le second groupe montre la même cinétique de croissance des plantules sur le milieu témoin et le milieu contenant de jus de pomme de terre (R0 et R3). La vitesse de croissance de ces deux espèces y a été moins performante par rapport au premier groupe. Au bout de 16 semaines, les plantules ont de longueur moyenne respective de 8,5mm et 8,9mm pour Bulbophyllum peyrotii mais de 3mm et 3,4mm pour Aeranthes antennophora . Le troisième groupe représente la vitesse de croissance des plantules sur le milieu additionné de jus d’ananas (R4). Une faible croissance des plantules s’est manifestée traduisant ainsi un effet inhibiteur du jus d’ananas. Au bout de 16 semaines, leurs longueurs ont été de 7mm pour Bulbophyllum peyrotii et seulement de 0,8mm pour Aeranthes antennophora .

37

Résultats et Interprétations

6 R0 5 R1 4

3 R2

2 R3

1 R4 Longueurde plantules (mm) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Temps (semaine) Figures 8 : Cinétique de croissance des plantules d’ Aeranthes antennophora pendant 16 semaines sur les milieux de différenciation R0: MS/2 (témoin) ; R1: + 150ml/l de lait de coco vert; R2: + 100g/l d’homogénat de banane vert; R3: + 200ml/l de jus de pomme de terre ; R4: + 200ml/l de jus d’ananas

16 14 12 10 R0 8 R1 6 R2 4 R3 2

Longueurde plantules (mm) R4 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Temps (semaine)

Figures 9 : Cinétique de croissance des plantules de Bulbophyllum peyrotii pendant 16 semaines sur les milieux de différenciation R0: MS/2 (témoin) ; R1: + 150ml/l de lait de coco vert; R2: + 100g/l d’homogénat de banane verte; R3: + 200ml/l de jus de pomme de terre ; R4: + 200ml/l de jus d’ananas

38

Résultats et Interprétations

C- COMPARAISON DES INFLUENCES DES ADDITIFS ORGANIQUES ET DES PHYTOHORMONES SYNTHETIQUES SUR LA MULTIPLICATION L’apparition de plantules filles à la base de plantules a été observée sur les milieux de culture appropriés pour la multiplication. Les bourgeons se sont développés pour former des pousses feuillées. La figure 10 représente le nombre moyen de pousses néoformées à la base des plantules de ces deux espèces 3 mois après le repiquage des plantules. Chez Aeranthes antennophora , tous les traitements ont favorisé la formation des pousses. Un nombre maximum de plantules filles (7 pousses par explant) a été obtenu sur le milieu ajouté de 0,2mg/l d’ANA et 2mg/l de BAP (B2). En moyenne, 5 pousses par explant ont été observées en présence de 100g/l d’homogénat de banane verte (R2), ainsi que de 0,2mg/l d’ANA et 1mg/l de BAP (B1). Le lait de coco vert (R1) a permis l’obtention de 2,6 pousses par explant. Chez Bulbophyllum peyrotii , l’homogénat de banane verte (R2) a donné le maximum de pousses néoformées (3,4 pousses par explant). En moyenne, 2,2 pousses par explant ont été obtenues en présence de 0,2mg/l d’ANA et 2mg/l de BAP (B2). Le milieu contenant du lait de coco vert (R1), ou celui renfermant 0,2mg/l d’ANA et 1mg/l de BAP (B1) n’ont pas été favorables pour la multiplication de cette espèce (en moyenne une pousse par plantule). Les différences entre le nombre de pousses produites sur les milieux (R1, B1) et le milieu témoin (B0) ne sont pas significatives d’après l’analyse statistique.

39

Résultats et Interprétations

8 7a 7 6 5,2b 5b 5 B0 4 3,4c R1 2,6d 3 2,2d R2 2 1,2e 1e 1,2e 1e B1 1 B2 Nombrepoussesde parexplant 0 S32 S101 Espèces

Figure 10 : Nombre de pousses produites par explant chez Bulbophyllum peyrotii et chez Aeranthes antennophora après 3 mois de repiquage dans les milieux de multiplication S32: Bulbophyllum peyrotii ; S101: Aeranthes antennophora ; B0: milieu MS/2 (témoin) ; R1: MS/2 + 150ml/l de lait de coco vert; R2: MS/2 + 100g/l d’homogénat de banane verte; B1 : MS/2 + 0,2mg/l d’ANA et 1mg/l de BAP ; B2 : MS/2 + 0,2mg/l d’ANA et 2mg/l de BAP. Les valeurs suivies de la même lettre ne présentent pas une différence significative d’après le test de Newman et Keuls au seuil de 5%.

Les photos 26 ; 27 et 28 ; 29 montrent respectivement les différences entre les effets d’homogénat de banane verte et des phytohormones synthétiques sur la multiplication d’Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii .

40

Résultats et Interprétations

Photos 26 : Pousses d’ Aeranthes Photos 27 : Pousses d’ Aeranthes antennophora produites après 3 mois de antennophora produites après 3 mois de repiquage sur MS/2 + 100g/l d’homogénat repiquage sur MS/2 + 0,2mg/l d’ANA et de banane verte (R2) [barre=0,5cm] 2mg/l de BAP (B2) [barre=0,5cm]

(Source : Dinaharilala, 2011) (Source : Dinaharilala, 2011)

Photos 28 : Pousses de Bulbophyllum Photos 29 : Pousses de Bulbophyllum peyrotii produites après 3 mois de repiquage peyrotii produites après 3 mois de repiquage sur MS/2 + 100g/l d’homogénat de banane sur MS/2 + 0,2mg/l d’ANA et 1mg/l de verte (R2) [barre=0,5cm] BAP (B1) [barre=0,5cm]

(Source : Dinaharilala, 2011) (Source : Dinaharilala, 2011)

41

Résultats et Interprétations

A- ACCLIMATATION b Les plantules enracinées d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii , issues de la multiplication ont été acclimatées. L’acclimatation a pour but d’adapter progressivement les vitroplants aux conditions de l’environnement naturel. Les résultats obtenus une semaine après l’acclimatation c’est-à-dire après l’enlèvement total de la couverture sont consignés dans le tableau 6. Les deux espèces étudiées ont un taux de survie élevé. Les conditions d’acclimatation ont été optimisées et les taux élevés de vitroplants survivants en découlent. Dans les mêmes conditions d’acclimatation, l’adaptabilité des plantules d’ Aeranthes antennophora ne sont pas très différents de celui de Bulbophyllum peyrotii. Une décoloration du feuillage suivi de la mort de quelques vitroplants a été observée. En effet, le taux de survie de la plantule de Bulbophyllum peyrotii a été de 88,3%, ce qui est légèrement supérieur à celui d’ Aeranthes antennophora (86,6%).

Tableau 6 : Taux de survie des plantules d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii une semaine après acclimatation Taxons Taux de survie des plantules (%) Aeranthes antennophora 86,6 Bulbophyllum peyrotii 88,3

Les photos 30 et 31 montrent les plantules d’Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii acclimatées.

Photo 30 : Plantules d’ Aeranthes Photo 31 : Plantules de Bulbophyllum antennophora bien acclimatées (après 6 peyrotii bien acclimatées (après 6

semaines). semaines).

(Source : Dinaharilala, 2011) (Source : Dinaharilala, 2011)

42

4ème partie : DISCUSSIONS

Discussions

1- Désinfection des capsules La présence du sucre et des sels minéraux dans le milieu de culture a favorisé le développement des microorganismes. La désinfection de capsule ou de graines des Orchidées est donc nécessaire avant l’ensemencement in vitro afin que la germination des graines ne soit pas gênée par la présence des infections fongiques et bactériennes du milieu de culture (Alvarez-Pardo et al, 2006). D’après les résultats obtenus, les taux de contamination de culture d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii ont été relativement faibles (6,6 et 5%). Rabe en 2004 a mentionné que le taux de contamination est faible si les graines sont issues de capsule non déhiscente. Les graines contenues dans une capsule peuvent être exemptes de toute contamination, par conséquent, la stérilisation de surface de la capsule paraît suffisante. Le tégument de la capsule a empêché l’entrée des agents contaminants.

2- Germination asymbiotique Les graines issues de capsule mûre non éclatée ont donné les meilleurs résultats par rapport aux graines stockées et celles issues de capsule verte. En effet, les graines issues de capsule mûre indéhiscente gardent encore l’humidité à l’intérieur et leur embryon est encore non dormant (Rabe, 2004 ; Rahelivololona, 2005 ; Andriananjamanatsoa, 2007). Les graines de ces deux espèces étudiées ont germé sur les 4 types de milieux testés. La durée et le taux de germination ont varié selon l’espèce. Les graines d’ Aeranthes antenophora ont un taux de germination élevé (jusqu’à 96%) par rapport au Bulbophyllum peyrotii (jusqu’à 71%) . Ces résultats corroborent ceux obtenus par Rahelivololona en 2005 sur la germination de 51 espèces d’Orchidées endémiques malgaches. Il a été trouvé que la capacité de germination in vitro des graines des Orchidées varie suivant l’espèce. Cette variation pourrait être due au caractère génétique de l’espèce et/ou par la qualité des graines. Pour cette dernière, les graines à l’intérieur d’une capsule sont constituées par des graines fécondées et des graines stériles sans embryon. Alors, le taux de germination dépend du nombre des graines fécondées dans la capsule. L’addition de lait de coco vert dans le milieu de culture a permis d’obtenir une forte capacité de germination d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii . Ce résultat confirme ceux obtenus sur la germination de Dendrobium malones « Victory » (Anjum et al 2006 ). Le lait de coco est riche en macroéléments, microéléments, vitamines, substances de croissance et acides aminés (Grimwood, 1976). Ces éléments pourraient être impliqués dans le processus de germination des graines de ces espèces.

44

Discussions

Le BAP et l’ANA ont amélioré la capacité de germination de graines d’ Aeranthes antenophora . Des résultats similaires ont été rapportés par Kalimuthu et al, en 2006 chez Oncidium sp . En outre, l’effet bénéfique de phytohormones sur la germination d’Orchidée a été signalé par certains auteurs. D’après De Pauw en 1994, l’addition de 0,8 mg/l de BAP a été favorable à la germination de Cypripedium candidum .

3- Effet des additifs organiques sur l’organogenèse D’après les résultats, la présence de lait de coco vert ou d’homogénat de banane verte dans le milieu de culture a montré une différenciation de protocormes et une croissance des plantules plus rapide. C’est pourquoi, l’utilisation du lait de coco vert et de l’homogénat de banane verte pour l’étude ultérieure sera recommandée. Dans nos expérimentations, l’homogénat de banane verte et le lait de coco vert ont favorisé le développement et la croissance d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii. Ce résultat est en accord avec ceux de Ramanampamonjy en 2004 en utilisant de lait de coco vert sur l’étude de la croissance in vitro d’ Aeranthes grandiflora et de Rahelivololona en 2005 chez Eulophiella roempleriana . Cela nous conduit à affirmer que l’homogénat de banane verte et le lait de coco vert pourraient substituer les régulateurs de croissance synthétiques (ANA et ou BAP). Néanmoins, le développement de ces deux espèces a été inhibé en présence de jus d’ananas. Il semble que les composés organiques tels que les acides organiques (acide malique, acide citrique, acide succinique, acide oxalique) et des sucres (saccharose, glucose, fructose), très abondants dans le jus d’ananas (Gamborg et al, 1970 ; Py et al 1984 ; Kermasha et al 1987) pourraient être impliqués dans l’inhibition du développement d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii . Ces composés étant osmotiquement actifs, ils sont à origine d’un problème d’équilibre osmotique entre le milieu et l’explant (protocorme) et inhibent ainsi l’absorption des éléments nutritifs (Brownd et al, 1978 ; Couto et al, 2011).

4- Multiplication Aeranthes antennophora et Bulbophyllum peyrotii se multiplient végétativement in vitro par culture de plantules issues de la germination asymbiotique. Chez Bulbophyllum peyrotii , le taux de multiplication élevé a été obtenu sur le milieu additionné de 100g/l d’homogénat de banane verte. Les pousses ont apparu à défaut de phytohormones synthétiques. Par contre, l’apport en phytohormones dans le milieu de culture a fortement stimulé l’apparition des nouvelles pousses chez Aeranthes antennophora.

45

Discussions

Les doses de 2mg/l de BAP et de 0,2mg/l d’ANA ont amélioré la capacité de débourrement de bourgeon d’ Aeranthes antennophora. Le BAP est indispensable au développement des bourgeons axillaires en plantules filles. Le nombre de bourgeons néoformés a augmenté avec la concentration en BAP dans le milieu de culture. Aeranthes antennophora a montré des résultats comparables à ceux trouvés chez le Dendrobium cv. (Khosravi et al, 2008). Par ailleurs, Broly en1982 a mentionné qu’il y a une synergie des effets des deux hormones (BAP et ANA) sur le débourrement de bourgeon chez Cymbidium . Au cours de la phase de multiplication, les cytokinines (BAP) sont généralement présentes en dose plus élevée que les auxines dans le milieu de culture. Ceci s’explique par le fait que les cytokinines s’opposent à la dominance apicale et stimulent la croissance de bourgeons axillaires ou adventifs (Najiba et al, 2003 ; El Kbiach et al, 2003).

1- Acclimatation Au cours de l’acclimatation des plantules d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii , les taux élevés de survie supérieurs à 86% ont été enregistrés. Des résultats similaires ont été obtenus par Ramanampamonjy, 2004 sur l’acclimatation d’ Aeranthes grandiflora. Le taux de survie de Bulbophyllum peyrotii a été supérieur à celui d’ Aeranthes antennophora. Il semble que le pseudobulbe de Bulbophyllum peyrotii formerait un réservoir d’eau et de nutriments évitant ainsi la dessiccation et la carence en éléments nutritifs des vitroplants pendant la phase d’acclimatation.

46

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Conclusion et Perspectives

L’utilisation des additifs organiques sur la micropropagation d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii en vue d’une substitution des phytohormones synthétiques était l’objectif de notre étude. La culture in vitro est un moyen efficace pour la germination asymbiotique de graines d’Orchidées, pour la régénération des protocormes en plantule, ainsi que pour la multiplication de cette dernière. C’est aussi une alternative permettant de pallier les problèmes de régénération naturelle des Orchidées. Quatre types d’additifs organiques déjà utilisés en culture in vitro ont été étudiés afin de pouvoir choisir ceux qui pourraient substituer les hormones synthétiques sur la micropropagation de ces deux espèces d’Orchidées. Il s’agit du lait de coco vert, d’homogénat de banane verte, du jus de pomme de terre et du jus d’ananas.

L’étude sur la germination asymbiotique a permis de mettre en exergue que : - Aeranthes antennophora a une capacité germinative plus élevée par rapport au Bulbophyllum peyrotii . - l’apport de phytohormone dans le milieu de germination de Bulbophyllum peyrotii n’est pas nécessaire. Cependant, le lait de coco vert s’est avéré favorable pour sa germination . Pour la germination d’ Aeranthes antennophora, l’apport de 2mg/l d’ANA est recommandé. Donc, la germination asymbiotique des Orchidées varie selon la composition du milieu de culture et de l’espèce.

Concernant la différenciation des protocormes des deux espèces, il ressort de cette étude que : V d’une part, la différenciation de protocormes de Bulbophyllum peyrotii est plus précoce par rapport à celle d’ Aeranthes antennophora ; V d’autre part, l’homogénat de banane verte (100mg/l) et le jus de pomme de terre (200ml/l) sont les additifs organiques favorables pour l’apparition de feuilles. En présence de ces additifs organiques, la première feuille a été observée dès la deuxième semaine du repiquage. Quant à la rhizogenèse, l’homogénat de banane verte (100mg/l) et le lait de coco vert (150ml/l) a favorisé l’apparition et le développement de racines. Par ailleurs, le jus d’ananas (100ml/l) a montré un effet inhibiteur sur la différenciation des protocormes en plantules de ces deux espèces.

47

Conclusion et Perspectives

D’un autre côté, Aeranthes antennophora et Bulbophyllum peyrotii se multiplient in vitro à l’issue de la germination asymbiotique. L’apport de régulateurs de croissance synthétiques dans le milieu de culture n’est pas nécessaire pour la multiplication de Bulbophyllum peyrotii . L’ajout de 100mg/l d’homogénat de banane verte a permis d’obtenir le maximum de pousses néoformées. Toutefois, l’apport de régulateurs de croissance dans le milieu de multiplication est à recommander pour Aeranthes antennophora . Pour cette espèce, le nombre maximum de plantules (7 pousses par explant) a été obtenu sur le milieu additionné de 0,2mg/l d’ANA et 2mg/l de BAP.

Ainsi, pour Bulbophyllum peyrotii, les résultats obtenus sur la germination asymbiotique, la différenciation de protocormes ainsi que sur la multiplication de plantules ont démontré que l’homogénat de banane verte et le lait de coco vert pourraient substituer les phytohormones synthétiques.

Les conditions sont adéquates pour l’acclimatation de ces deux espèces. Il est mis en évidence que l’aération progressive par des trouaisons a permis d’optimiser les conditions d’acclimatation des vitroplants de ces deux espèces. Une perforation de 2cm de diamètre de la couverture en plastique tous les 5 jours jusqu’au 30 ème jour d’acclimatation a permis d’obtenir un taux élevés de survie qui est supérieur à 86% pour les deux espèces.

En perspective, des investigations plus approfondies méritent d’être entreprises : - élargissement de cette étude sur d’autres espèces d’Orchidées ou d’autres familles botaniques afin de réduire le coût de production et de valoriser les produits naturels locaux ; - étude approfondie sur la multiplication de protocorme qui constitue une autre voie de multiplication des espèces d’Orchidées ; - mise au point de la réintroduction in situ des ces espèces, un domaine complémentaire de la culture in vitro.

48

BIBLIOGRAPHIES et WEBOGRAPHIES

Bibliographies et Webographies

A- BIBLIOGRAPHIES 1- ABRIE, A. L. et VAN STADEN, J., 2001. Micropropagation of the endangered Aloe polyphylla . Growth Regulation, 33: 19 - 23. 2- ALVAREZ-PARDO, V. M.; FERREIRA, A.G.; NUNES, V.F.,2006. Seed disinfestation methods for in vitro cultivation of epiphyte orchids from Southern Brazil. Horticultura Brasileira, 24: 217-220. 3- ANDRIANANJAMANATSOA, H. N., 2007. Etude de la population des Orchidées de Talatakely, Parc National Ranomafana, et germination in vitro des graines. Mém. DEA en Physiologie Végétale, Département de Biologie et Ecologie Végétales, Univ. Antananarivo. 60p. 4- ANJUM, S., ZIA, M., CHAUDHARY, F., 2006. Investigations of different strategies for high frequency regeneration of Dendrobium malones ‘Victory’. African Journal of Biotechnology 5: 62 – 68.

5- ANONYME, 1999. Micropropagation pour l’entreprise serricole. Cahier de références techniques. CIDES (Centre d’Information et de Développement Expérimental en Serriculture). 6- ARDITTI, J., 1967. Factors affecting the germination of orchid seeds. The botanical review, 33: 1 – 97. 7- AUGE, R., BEAUCHESNE, G. et BOCCON-GIBOD, J., 1989. La culture in vitro et ses applications horticoles. Tec. Doc. Lavoisier, Paris. 152 p. 8- BARBIER, R., 1994. La multiplication des orchidées. Société Française d’Orchidophile, bull, 110 : 2 – 10. 9- BARTOVA, V. et BARTA, J., 2009. Chemical composition and nutritional value of protein concentrates isolated from potato ( Solanum tuberosum L.) fruit juice by precipitation with ethanol or ferric chloride, 57(19): 9028 – 9034. 10- BERGEROT, J. N., 1998. Les Orchidaceae. Botanique Lorraine. INIST. ISSN. 0931- 3519. pp 32 – 40. 11- BERNER, P. O., DICKINSON, S. et ANDRIANARIMISA, A., 2009. The Ambatovy project, BBOP pilot project, Business and Biodiversity Offsets Programme (BBOP), Case Study. 120p

49

Bibliographies et Webographies

12- BOCCON-GIBBOD, J., 1980. Régénération du Crosne du Japon ( Stachys sieboldii Miq. ) par culture de méristème : multiplication et conservation in vitro des clones. In : Congrès sur l’application de la culture in vitro à l’amélioration des plantes potagères EUCARPIA section légumes, Versailles. pp31-41. 13- BOULAY, M., 1984. Aspects pratiques de la manipulation in vitro des essences forestières. Ann. Rech. Sylv., 4 : 9 – 44. 14- BOUTHERIN, D., BRONG, 1989. Multiplication des plantes horticoles. Tec. et Doc., Lavoisier, Paris. pp 145 – 173. 15- BOXUS, P., 1989. La multiplication in vitro : une biotechnologie pour le développement, ses perspectives industrielles. Ann. Gembloux, 95 : 163 – 181. 16- BOXUS, P., 1991. Multiplication végétative : micropropagation, embryogenèse somatique. C.R.A. Gembloux, Belgique . pp. 17 – 92 . 17- BOXUS, P., 1995. Biotechnologies végétales. Multiplication végétative : micropropagation. Annales de Gembloux, 95. pp. 5 - 58. 18- BROWND, D., LEUNG, D. et THORPE, T., 1978. Role of sucrose as an osmotic agent during shoot formation in tobacco callus. In : Bases de la multiplication végétative. Tec. et Doc. Lavoisier, Paris. pp 208 – 210. 19- CHAUSSAT, R. et BIGOT, C., 1980. La multiplication végétative des plantes supérieures. Gauthier-Villars, Paris. 277 p. 20- CITES., 2002. Rapport annuel de 2002: organe de gestion CITES de Madagascar, Antananarivo. 21- COELLO, C. Y., MICELI, C. L., ORANTES, C., DENDOOVEN, L. et GUTIERREZ, F. A., 2010. Plant growth regulators optimization for in vitro cultivation of the orchid Guarianthe skinneri (Bateman). Gayana Bot., 67(1): 19 – 26. 22- COLLINS, G. B. et GENOVESI, A. D., 1982. Anther culture and its application to crop improvement. Plant cell culture, Ontario, Canada. pp 203 – 207 . 23- COMPTON, E. M., PIERSON, B. L, et STAUB, J. E., 2001 . Micropropagation for recovery of Cucumis hystrix . Plant Cell Tissue and Organ Culture, 64 : 63 – 67. 24- COUTO, D. S., CABRAL, L. M. C., DA MATTA, V. M., DELIZA, R. et FREITAS, D. G. C., 2011. Concentration of pineapple juice by reverse osmosis: physicochemical characteristics and consumer acceptance. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 31(4) : 905 – 910. 25- CRETE, P., 2009. La transgénèse végétale. LGBP (Laboratoire de Génétique et de Biophysique des plantes), UMR6191, Faculté des Sciences de Luminy. 61p.

50

Bibliographies et Webographies

26- CRIBB, P.et HERMANS, J., 2009. Field guide to the Orchids of Madagascar. Kew Publishing. 440p. 27- DE PAUW, M. A., REMPHREY, W. R., PALMER C. E., 1994. The Cytokinin Preference for in vitro Germination and Protocorm Growth of Cypripedium candidum. Annals of Botany 75: 267-275. 28- DICKINSON, S., BERNER, 2010. Ambatovy project: Mining in a challenging biodiversity, exploration, and conservation of the natural habitats associated with the Ambatovy project. Eds S. M. Goodman & V. Mass. Malagasy Nature, 3: 2 – 13. 29- DRUART, P. H. et SAMYN, G., 1995. Carbohydrates and in vitro organogenesis. Bull.Rech.Agron.Gembloux, 30(1-2): 1-3. 30- DRUART, P. H., 1992. In vitro culture and micropropagation of plum ( Prunus spp ) “Biotechnology in Agriculture and forestry” V (18) High -Tech and micropropagation II Y.P.S Bajaj (Ed.) Springer–Verlag, Berlin Heidelberg. pp 279-301. 31- DYNATEC CORPORATION., 2006. Etude d’Impact Environnemental (EIE) d’Ambatovy. INRA Paris. 262p. 32- EDWIN, F. A., PUTTOCK, D. J. M. B. et GEORGE, H. J., 1987. Pant culture media: formulation and uses. 567p. 33- EL KBIACH, M. L., LAMARTI, A., ABDALI, A., BADOC, A., 2003. Culture in vitro des bourgeons axillaires de chêne-liège ( quercus suber l.). Bull. Soc. Pharm. Bordeaux , 141: 73 – 88. 34- FRETT, 1977 FRETT, J., 1977. Influence of nutrient salts, auxins and cytokinins on the in vitro growth of Salvia greggie . Plant Cell Tissue and Organ Culture, 9: 89 -102. 35- HOBBIE, L . J., 1998 . Auxin molecular genetic approaches in Arabidopsis . Plant Physiology and Biochemestry, 36 (1): 91 -102. 36- HOMES, J. et ESPEN, N.V-V., 1973. Effets du saccharose et de la lumière sur le développement et la morphologie de protocormes d'orchidées cultivées in vitro. Bulletin de la Société Royale de Botanique de Belgique , T. 106, Fasc., 1 : 89 – 106. 37- ICHIHASHI, S. et ISLAM, M. O., 1999. Effects of complex organic additives on callus growth in three orchid genera, Phalaenopsis , Doritaenopsis , and Neofinetia . J. Japan. Soc. Hort. Sci, 68 (2): 269 – 274. 38- INGRAM, J. et DAWSON, P., 2005. Inter annual analysis of deforestation hotspot in Madagascar from high temporal resolution satellite observations. International journal of remote sensing, 26 (7): 1447 – 1461.

51

Bibliographies et Webographies

39- JAWAN, R., GANSAU, J. A. et ABDULLAH, J. O., 2007. In Vitro Culture of Borneo’s Endemic Orchid , Vanda dearei. AsPac J. Mol. Biol. Biotechnol, 1 (18). 203 – 207. 40- JUDD, J., CAMPBELL, C., KELLOG, A. E. et STEVENS, P., 1999. Plant systematic, a phytogenetic approach. USA. 464p. 41- KALIMUTHU, K. R. SENTHILKUMAR, R. et VIJAYAKUMAR, S., 2007. In vitro micropropagation of orchid, Oncidium sp (Dancing Dolls). African Journal of Biotechnology, 6 (10) : 1171-1174. 42- KERMASHA, S., BARTHAKUR, N. N., Alli, I. et MOHAN, N. K., 1987. Changes in chemical composition of the kew cultivar of pineapple fruit during development. Journal of the Science of Food and Agriculture, 39: 317 – 324. 43- KISHOR, R. et SHARMA, G. J., 2009. Intergeneric hybrid of two rare and endangered Orchids, imschootiana Rolfe and Vanda coerulea Griff. ex L. (Orchidaceae): Synthesis and characterization. Euphytica, 165:247–256 44- KUMARIA, S. et TENDON, P., 1991. Asymbiotique germination of Dendrobium fimbriatum var. oculatum Hk. F. seeds on different media. Proc. Indian natn. Sci. Acad. B57 Nos, 3 et 4: 277 – 479. 45- LO, S-F., NALAWADE, S. M., KUO, C-L., CHEN, C. L. et TSAY, H-S., 2004. Asymbiotic germination of immature seeds, plantlet development and ex vitro establishment of plants of Dendrobium tosaense Makino-a medicinally important Orchid. Society for in Vitro Biology. pp 528 – 532. 46- LYDIANE, K., et KLEYN, J., 1996. Plant from test tube, an introduction to micropropagation, 3 è éd. Portland, Oregon. 240p. 47- MARGARA, F., 1982. La multiplication in vitro d’Orchidaceae. In : les bases de la multiplication végétative. Ed INRA. pp 142 – 150. 48- MARGARA, F., 1989. Bases de multiplication végétative : les méristèmes et l'organogenèse. INRA Paris, 262p. 49- MINISTERE DE L’ENVIRONNEMENT/ANGAP/ ONE., 1997. Monographie Nationale sur la Biodiversité. Antananarivo Madagascar. 324p. 50- MOTA, R. V. D., LAJOLO, F. M., CORDENUNSI, B. R. et CIACCO, C., 2000. Composition and Functional Properties of Banana Flour from Different Varieties. Starch – Stärke, 52 (2-3): 63 – 68. 51- MURASHIGE, T. et SKOOG, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 15: 473 – 497.

52

Bibliographies et Webographies

52- NAJIBA, B., ABDELHADI, A., DOU, E. W. et DOHA, B., 2003. Effet du milieu de culture sur le microbouturage de l’olivier ( Olea europeae L.) cv. Picholine Marocaine. Biotechnol. Agron. Soc. Environ, 7. pp 177 – 182. 53- NG, C-Y., SALEH, N. M. et ZAMAN, F. Q., 2010. In vitro multiplication of the rare and endangered slipper orchid, Paphiopedilum rothschildianum (Orchidaceae) . African Journal of Biotechnology, 9(14) : 2062-2068. 54- NORSTOG, K., J., 1961. The growth and differentiation of cultured barley embryos. Amer. J. Bot., 48: 876-884. 55- PETER, B. P. et LUCILE, A. 2008. Plante de Madagascar. Les éditions Eugen Ulmer, 8 rue blanche 75009 Paris. 224p. 56- PHILLIPSON, P. B., LOWRY, II P. P., ANDRIAMAHEFARIVO, L., ANTILAHIMENA P. et BIRKINSHAW, C., 2010. Floristic inventory of the Ambatovy-Analamay mine site and comparison to other sites in Madagascar. In Biodiversity, exploration, and conservation of the natural habitats associated with the Ambatovy project, S. M. Goodman & V. Mass. (eds.) Malagasy Nature, 3: 44-76. 57- RABE ANDRIANANDRASANA, H., 2004. Germination et croissance asymbiotique de deux espèces d’Orchidées malagasy : Cymbidiella flabellata (Thouars) Lindl. et Aerangis platyphylla Schltr. Mém. DEA en Physiologie Végétale, Département de Biologie et Ecologie Végétale, Univ. Antananarivo. 56p. 58- RAHELIVOLOLONA, R., 2005. Mise au point de techniques de vitropropagation d’Orchidées malgaches : Eulophiella roempleriana Rolfe et de Grammangis Lind. (Rchb). Thèse de Doctorat en Sciences de la vie. Option Physiologie Végétale, Univ. Antananarivo. 128 p. 59- RAMANAMIDONA, H J-Y., 1998. Etude de l’utilisation des jus de fruits en tant que substituant partiel ou entier du milieu artificiel (MS) sur la culture in vitro de Sesbania rostrata . Mém. DEA en Physiologie Végétale, Département de Biologie et Ecologie Végétales, Univ. Antananarivo. 31p. 60- RAMANAMPAMONJY, R. N., 2004. Conservation des ressources génétiques d’Orchidées : création d’une banque de gène in vitro d’ Aeranthes grandiflora Lind. et mise en place d’une aire de conservation in situ à l’Ile Sakatia (Nosy Be Hell ville). Thèse de Doctorat en Sciences de la vie. Option Physiologie Végétale, Univ. Antananarivo. 182 p. 61- RAPANARIVO, H., 2001. Malagasy orchids and ecology APOC 7-OSB-6-3. Mars 2001, Japon. 55p.

53

Bibliographies et Webographies

62- RASMUSSEN, H. N., 1995.Terrestrial orchids – from seed to mycotrophic plant. Cambridge University Press, New York. 444 p. 63- RASOANADRASANA, R., 2010. Technique pour la culture aseptique initiale de Prunus africana Hook.f (Kalkman, 1986). Mém. DEA en Physiologie Végétale, Département de Biologie et Ecologie Végétales, Univ. Antananarivo. 46p. 64- RASOLONIAINA, N. I., 1997. Etude du remplacement des solidifiants classiques par un produit naturel et mise en évidence de ses propriétés par la culture in vitro d’ Aeschynomene uniflora sur des milieux nutritifs variables. Mém. DEA en Physiologie Végétale, Département de Biologie et Ecologie Végétales, Univ. Antananarivo. 50p. 65- RAZAFIMANDIMBY, 1978. Fianarana momba ny sakafon’olona. Sekoly Fambolena sy Fiompina F.L.M. Tombotsoa Antsirabe. 24p. 66- SHARMISTHA, M., SAMIT, R. et NIRMALYA, B., 2005. The role of plant growth regulators on direct and indirect plant regeneration from various organs of Leucaena leucocephala . Acta Physiologiae Plantarum, 27 (4). pp. 473 – 480. 67- SINGH, F., 1993. In vitro orchid seed germination and cloning of orchids. A success story. Plant Biotechnology: commercial prospects and problems, 9(14) : 62 – 68. 68- SINHA, P. et ROY, S. K., 2004. Regeneration of an Indigenous Orchid, Vanda teres (Roxb.) Lindl. Through In vitro Culture. Plant Tissue Culture, 14(1) : 55-61. 69- SKOOG, G. et MILLER, C., 1957. Chemical regulator of growth and organ formation. In plant tissues culturated in vitro . Symp. Soc. Exp. Biol., 11. 118 – 131. 70- SYOICHI, I., OBAIDUL, M. I., 1999. Effect of complex additives on callus growth in three orchid genera, Phalaenopsis , Doritaenopsis , and Neofinetia. J. Japan. Soc. Hort. Sci., 68. 269 – 274. 71- TANG, W. et GUO, Z., 2001. In vitro propagation of loblolly pine via direct somatic organogenesis from mature cotyledons and hypocotyls. Plant Growth Regulation. 33: 25 - 31. 72- TAWARO, S., SURANINPONG, P. et CHANPRAME, S., 2008. Germination and Regeneration of Cymbidium findlaysonianum Lindl. on a Medium Supplemented with Some Organic Sources. Walailak J Sci & Tech 2008; 5(2): 125-135 . 73- TECHNIQUE ET PRECISION, 2010. Facture proforma. 74- TING-YU, C., JEN-TSUNG C. et WEI-CHIN, C., 2002. Multiple shoot formation and plant regeneration from stem nodal explants of Paphiopedilum orchids. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant , 6 (38). 595-597.

54

Bibliographies et Webographies

75- WALKER, K. A., WENDEL, M. L. et JAWARSKI, E. G., 1979. Organogenesis in callus tissue of Medicago sativa , the temporal repartition of induction process from differentiation process. Plant Science Letters, 16: 23-30. 76- YONG, J. W. H., GE, L., NG, Y. F. et TAN, S. N., 2009. The Chemical Composition and Biological Properties of Coconut ( Cocos nucifera L.) Water. Molecules 2009, 14 : 5144 - 5164. 77- ZRYD, J. P., 1988 . Culture de cellules, tissus et organes végétaux. Ed. Press.Polytechniques Romandes Suisse, 308p.

B- WEBOGRAPHIES 1- http://fr.wikipedia.org/wiki/Orchidaceae 2- http://www.aujardin.info/fiches/orchidees_general.php 3- http://www.tresnature.stools.net/nomenclaturegarde/orchidee.html 4- http://nicolas.helitas.pagesperso-orange.fr/la_famille_des_orchidees.htm 5- http://www.orchidees.fr/botanique/index.php3 6- http://www.botanique.org/1/classification-549/description-diffrents- taxons/descriptions-familles/orchidaceae-famille-orchidees/description-botanique- orchidaceae-article24262 7- http://www.cosmovisions.com/orchidees.htm 8- http://pm.blais.pagespro-orange.fr/famille.html 9- http://fr.wikipedia.org/wiki/Orchidaceae 10- http://www.aujardin.info/fiches/orchidees_multiplication.php 11- http://bernard.lagrelle.pagesperso.orange.fr/AA%20culture/Multiplication/multiplicati on%20asexu%E9e/Bouturage%20in%20vitro.htm 12- http://www.aujardin.info/fiches/orchidees-multiplication-semis.php 13- http://bernard.lagrelle.pagesperso- orange.fr/AA%20multiplication/version%20lift%E9e/No% 14- http://www.rbgkew.org.uk/ksheets/sainsbury2.html 15- Propagation orchids. http://www.easyorchids.co.uk/propagation/sainsbury2.html 16- http://fr.wikipedia.org/wiki/classification APG III 17- http://www.infomine.com/minesite/ambatovy.html 18- http://fr.getamap.net/cartes/madagascar/toamasina/_ambatovy/

55

ANNEXES

Annexes

Annexe I : Prix des phytohormones synthétiques en 2010

Phytohormones synthétiques Prix (Ar/g) Acide 2,4-Dichlorophénoxyacétique 10.092 Acide Indole-Butyrique 67.858 Acide Indole-3-Acétique 166.053 Acide Naphtaléne Acétique 12.408 6-Benzylaminopurine 85.247 Furfurylamino-6-purine 441.300 Acide Gibberellique A3 118.724 (SOURCE : Technique et Précision, 2010)

Annexe II : Coordonnées geographiques des pieds mère sources d’explants (graines) au sein de l’empreinte minière d’Ambatovy

Aeranthes antennophora Code Latitude Longitude Altitude S101-Rv-Z22-5 18° 50' 16,3’’ 48° 18' 07,7’’ 1095 Bulbophyllum peyrotii Code Latitude Longitude Altitude S 32-Fc-Z19-2 18° 50' 43,0’’ 48° 18' 12,9’’ 1041 S32-Ch-Z19-3 18° 50' 36,8’’ 48° 18' 11,7’’ 1081 S32-Fc-Z20-1 18° 51' 22,4’’ 48° 17' 16,3’’ 1004

Annexe III : Variation mensuelle de la précipitation et de la température du site Ambatovy Mois Jan. Fev. Mars Avr. Mai Juin Juil. Août Sep. Oct. Nov. Dec Pluviométrie 253 227,2 173,4 68,2 44,4 38,4 58 50,2 28 60,9 143,6 255,3 Température 21 21,4 20,6 18,7 16,2 14,3 13,6 13,9 15,2 17,3 18,5 20,2 moyenne (SOURCE : http://18) (2009 à 2011)

i

Annexes

Annexe IV : Composition de milieu de base de MURASHIGE et SKOOG (1962) Macroéléments (mg/l) CaCl 2, 2 H 2O 440

KH 2PO 4 170

KNO 3 1 900

MgSO 4, 7 H 2O 370

NH 4NO 3 1 650 Microéléments (mg/l) CoCl 2, 6 H2O 0,025

CuSO 4, 5H2O 0,025

H3BO 3 6,2 KI 0,83

MnSO 4, 4H 2O 22,3

Na 2MoO 4, 2H 2O 0,25

ZnSO 4, 7H 2O 8,6 Ions chélateurs (mg/l) FeSO 4, 7 H2O 27,8

Na 2EDTA 37,3 Vitamines (mg/l) Acide nicotinique 0,5 Glycine 2 Myo-inositol 100 Pyridoxine 0,5 Thiamine 0,1 (SOURCE : Murashige et Skoog, 1962)

ii

Annexes

Annexe V : Compositions chimiques des additifs organiques Compositions chimiques de la pulpe de banane Composition minérale (g/100g) Calcium 0,02-0,04 Phosphore 0,08-0,13 Potassium 1,00-2,50 Sodium 0,15 Hydrates de carbone (g/100g) Amylose 19-23 Protéines 2,5-3,3 Lipides 0,3-0,8 Vitamines en ppm de matière fraîche Carotène 1,50-0,87 Thiamine 0,34-0,60 Riboflavine 0,23-0,87 Pyridoxine 3,20 Acide nicotinique 0,70 Acide folique 0,95 Acide ascorbique 2-2,40 Vitamine K Trace (SOURCE : Mota et al, 2000)

iii

Annexes

Composition chimique du lait de coco vert

Hydrates de carbone (mg/100ml) Saccharose 9,18 Glucose 7,25 Fructose 5,25 Mannitol 0,8 Sorbitol 15 Myo-inositol 0,01 Protéines 0,72 Lipides 0,2 (SOURCE : Yong et al, 2009)

Macroéléments et microéléments (mg/100ml) Calcium 24 Fer 0,29 Magnésium 25 Phosphore 20 Potassium 250 Sodium 105 Zinc 0,1 Cuivre 0,04 Manganèse 0,142 Chlore 183 Soufre 24 (SOURCE : Yong et al, 2009)

Substances de croissance (mg/ml) Auxine 0,07 Cytokinine Présent (SOURCE : Yong et al, 2009)

Vitamines (mg/100ml) Acide ascorbique 2,4 Thiamine 0,03 Riboflavine 0,057 Acide pantothénique 0,043 Pyridoxine 0,032 Acide folique 0,03 (SOURCE : Yong et al, 2009)

iv

Annexes

Acides aminés (g/100ml) Alanine 0,037 Arginine 0,118 Acide aspartique 0,07 Cystine 0,014 Acide glutamique 0,165 Glycine 0,034 Histidine 0,017 Isoleucine 0,028 Leucine 0,053 Lysine 0,032 Méthionine 0,013 Phénylalanine 0,037 Proline 0,03 Serine 0,037 Tyrosine 0,022 Tryptophane 0,008 Thréonine 0,026 Valine 0,044 (SOURCE : Yong et al, 2009)

Composition chimique des tubercules de pomme de terre Eléments Quantité (%) Eau 75,80 Amidon 19,90 Sucre 0,40 Protéine 2,80 Matière grasse 0,20 Fibre 1,10 Cendre 0,92 (SOURCE : Bartova et al, 2009) Vitamines en mg par 100g de matière Carotène 5 Thiamine 0,07 Riboflavine 0,07 Acide ascorbique 13 (SOURCE : Razafimandimby, 1978)

v

Annexes

Composition chimique du jus d’ananas Hydrates de carbone Carbohydrates 6.02 -9.24% Protéines 0,21-0,69%, Acides organiques 55,5-102mg/ 100 g Fructose 5.0% Glucose 2.4% Saccharose 1.2% Eléments minéraux (mg/100g) Potassium 31,33 Phosphore 3,13 Calcium 3,92 Sodium 2,63 Iode 3,22 Zinc 0,55 Cuivre 0,06

(SOURCE : Kermasha et al 1987)

vi

DEA en Biologie et Ecologie Végétales Option : Physiologie Végétale

Titre : SUBSTITUTION DES PHYTOHORMONES SYNTHETIQUES PAR DES ADDITIFS ORGANIQUES SUR LA MICROPROPAGATION DE « Aeranthes antennophora et Bulbophyllum peyrotii », DEUX ESPECES D’ORCHIDEES ENDEMIQUES, MENACEES DU SITE MINIER D’AMBATOVY

Auteur : Mamisitraka Théo Gloriat DINAHARILALA

RESUME

Les Orchidées figurent parmi les taxa menacés d’extinction. C’est ainsi que toutes les espèces d’Orchidées sont classées dans l’annexe II de la CITES. Du fait des menaces qui pèsent sur les espèces d’Orchidées SOC, de leur faible régénération naturelle, du coût élevé des phytohormones synthétiques et de la valorisation des produits locaux, des recherches sur les milieux de culture favorables pour la micropropagation d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii issues du site minier d’Ambatovy ont été menées. La germination asymbiotique des graines de ces espèces a été effectuée sur le milieu MS/2 additionné de 150ml/l de lait de coco vert, de phytohormones synthétiques BAP ou ANA à deux niveaux de concentration (1 ou 2mg/l). Les protocormes ont été régénérées sur des milieux de différenciation additionnés séparément de 150ml/l de lait de coco vert, 100mg/l d’homogénat de banane verte, 200ml/l de jus de pomme de terre, 100ml/l de jus d’ananas. Les plantules régénérées ont été multipliées dans des milieux contenant de 150ml/l de lait de coco vert ou de 100mg/l d’homogénat de banane verte ou de BAP (1 ou 2mg/l) combiné avec 0,2mg/l d’ANA. Les vitroplants bien enracinés ont été acclimatés par une aération progressive d’une enceinte fermée. La capacité germinative des graines d’ Aeranthes antennophora a été plus élevée (96,4%) que celles de Bulbophyllum peyrotii (90%). Pour cette dernière , 150ml/l de lait de coco vert a permis la germination des graines au bout de 5 semaines après l’ensemencement. Quant à Aeranthes antennophora, la vitesse de germination la plus rapide (2 semaines) a été enregistrée sur un milieu pourvu de 2mg/l d’ANA. La meilleure différenciation de protocormes d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii en plantules a été obtenue en présence de 100mg/l d’homogénat de banane verte ou de 150ml/l de lait de coco vert. L’ajout de 100mg/l d’homogénat de banane verte a permis d’obtenir le maximum de pousses néoformées chez Bulbophyllum peyrotii (3 pousses par explant). D’un autre côté, la combinaison hormonale de 0,2mg/l d’ANA et 2mg/l de BAP a permis la prolifération d’ Aeranthes antennophora (7 pousses par explant). Les résultats sur l’acclimatation d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii ont montré l’efficacité de la méthode entreprise, avec un taux élevé de survie de 88,3% et de 86,6% respectivement. La substitution de phytohormones synthétiques par des additifs organiques est donc possible en culture in vitro d’ Aeranthes antennophora et de Bulbophyllum peyrotii .

Mots clés : Aeranthes antennophora ; additifs organiques ; Bulbophyllum peyrotii ; micropropagation ; phytohormones.

Encadreur : Docteur Nivohanintsoa RAMANAMPAMONJY née RAVONIARISON

DEA in Plant Biology and Ecology Option: Plant Physiology

Title: SUBSTITUTION OF PLANT GROWTH REGULATORS SYNTHETIC BY ORGANIC ADDITIVES ON THE MICROPROPAGATION OF " Aeranthes antennophora and Bulbophyllum peyrotii ", TWO ORCHID SPECIES, ENDEMIC, ENDANGERED IN AMBATOVY MINE SITE

Author: Mamisitraka Théo Gloriat DINAHARILALA

ABSTRACT

Orchids are among the threatened taxa to extinction. Thus all species of Orchids are listed in appendix II of CITES. Because of the threats to the species of Orchids SOC, its low natural regeneration, the high cost of synthetic growth regulators and the promotion of local products, research on favorable medium for micropropagation of Aeranthes antennophora and Bulbophyllum peyrotii from the Ambatovy mine site were undertaken. Asymbiotic germination of these species seeds was performed on MS/2 medium supplemented with 150ml/l green coconut water, growth regulators BAP or NAA at two levels (1 or 2mg/l). The protocorms were regenerated on differentiation media added separately with 150ml/l green coconut water, 100mg/l homogenate of green banana, 200ml/l potato juice, 100ml/l pineapple juice. The regenerated plantlets were grown in media containing 150ml/l green coconut water or 100mg/l homogenate of green banana or BAP (1 or 2mg/l) combined with 0,2mg/l NAA. The deep-rooted plantlets were acclimatized by progressive enclosure ventilation. Germination capacity of Aeranthes antennophora ’s seeds was higher (96,4%) than Bulbophyllum peyrotii (90%). For the later, 150ml/l of green coconut water allowed seed germination 5 weeks after sowing. About Aeranthes antennophora , the fastest speed germination (2 weeks) was recorded on a medium provided with 2mg/l NAA. The best differentiation of protocorms of Aeranthes antennophora and Bulbophyllum peyrotii into plantlets was obtained in the presence of 100mg/l homogenate of green banana or 150ml/l green coconut water. The addition of 100mg/l homogenate of green banana yielded maximum neoformed shoots in Bulbophyllum peyrotii (3 shoots per explant). On the other hand, 0,2mg/l NAA and 2mg/l BAP resulted in the proliferation of Aeranthes antennophora (7 shoots per explant). Results on the acclimatization of Aeranthes antennophora and Bulbophyllum peyrotii showed the effectiveness of the method applied with a high survival rate of 88,3% and 86,6% respectively. Therefore, the substitution of synthetic plant growth regulators by organic additives is possible for in vitro culture of Aeranthes antennophora and Bulbophyllum peyrotii .

Keywords: Aeranthes antennophora ; Bulbophyllum peyrotii ; growth regulators; micropropagation; organic additives.

Advisor: Doctor Nivohanintsoa RAMANAMPAMONJY née RAVONIARISON