Université Cadi Ayyad Marrakech Au Maroc, Sous La Direction De Monsieur Abdel-Illah QATIBI

UNIVERSITÉ DE PAU ET DES UNIVERSITÉ CADI AYYAD PAYS DE L’ADOUR MARRAKECHTable des matières ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES EXACTES CENTRES D'ÉTUDES DOCTORALES (CED) ET DE LEURS APPLICATIONS (ED 211) SEMLALIA

PAU - FRANCE MARRAKECH - MAROC

THÈSE EN COTUTELLE Présentée et soutenue

Par EL HOUARI Abdelaziz

Pour obtenir le grade de DOCTEUR Spécialité : Physiologie et biologie des organismes - populations - interactions

PRODUCTION ET ÉLIMINATION DES SULFURES PRODUITS LORS DE LA BIOMÉTHANISATION DE BOUES DE STATION DE TRAITEMENT DES EAUX USÉES DOMESTIQUES : PROCÉDÉS BIOLOGIQUES DE SULFOOXYDATION PAR DES THIOBACILLES ANAÉROBIES FACULTATIFS (PROJET SULFOX)

Le 30 Août 2018

Après avis des rapporteurs et devant la commission d’examen formée de :

Mme Agnès Hirschler-Réa (Professeur, Université d’Aix-Marseille, Marseille)

Mme Laila Mandi (Professeur, Faculté des sciences Semlalia, Marrakech)

M. Nicolas Bernet (DR CNRS, Laboratoire de Biotechnologie de l’Environnement, Narbonne)

La thèse a été réalisée sous la direction de :

M. Abdel-Ilah Qatibi (Professeur, Université Cady Ayyad) M. Rémy Guyoneaud (Professeur, Université de Pau et des Pays de l‘Adour)

N° Ordre : ______

THÈSE EN COTUTELLE Présentée et soutenue

Par EL HOUARI Abdelaziz

Pour obtenir le grade de DOCTEUR Spécialité : Physiologie et biologie des organismes - populations - interactions

Le 30 Août 2018

Après avis des rapporteurs et devant la commission d’examen formée de :

Mme Agnès Hirschler-Réa (Professeur, Université d’Aix-Marseille, Marseille)

Mme Laila Mandi (Professeur, Faculté des sciences Semlalia, Marrakech)

M. Nicolas Bernet (DR CNRS, Laboratoire de Biotechnologie de l’Environnement, Narbonne)

La thèse a été réalisée sous la direction de :

M. Abdel-Ilah Qatibi (Professeur, Université Cady Ayyad) M. Rémy Guyoneaud (Professeur, Université de Pau et des Pays de l‘Adour)

À LA MÉMOIRE DE MON PÈRE

La réussite d’un fils, la fierté d’un père. Vous n’êtes plus là où vous étiez,

mais vous êtes partout

là où je suis.

Ce travail est dédié à mon père, décédé trop tôt, témoignage de ma réussite et de mon affection.

À l’âme de mon père, Puisse Dieu, le tout puissant, l’avoir en sa sainte miséricorde !

À MA CHÈRE MÈRE

Aucune dédicace ne saurait exprimer mon amour éternel pour celle qui m’a donné la vie et ma considération pour tout le soutient et l’amour que vous me portez depuis mon enfance et j’espère que votre bénédiction m’accompagne toujours.

Que ce modeste travail soit l’exaucement de vos vœux tant formulés, le fruit de vos innombrables sacrifices. Puisse Dieu, le Très Haut, vous accorde santé, bonheur et longue vie !

Ce travail de recherche a été réalisé dans le cadre du Partenariat Hubert Curien PHC- TOUBKAL nommé « SULFOX », programme de coopération scientifique bilatéral porté par les ministères français de l’Europe et des Affaires étrangères (MEAE) et de l’Enseignement supérieur, de la Recherche et de l’Innovation (MESRI), d’une part, et le Ministère marocain de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique. Je remercie les deux organismes financeurs Centre Nationale pour Recherche scientifique et technique (CNRST-Rabat) et Campus France finançant conjointement ma mobilité entre le Maroc et la France dans le cadre du PHC Maghreb pendant les années de la thèse.

Ce travail a été dirigé successivement :

Dans le laboratoire Équipe Environnement et Microbiologie (EEM) qui fa partie du laboratoire IPREM (Institut des Sciences Analytiques et de Physico-Chimie pour l‘Environnement et les Matériaux), UMR 5254 IPREM, au sein de l’université de Pau et des Pays de l’Adour en France, sous la direction de Monsieur Rémy GUYONEAUD.

Dans le laboratoire Équipe de Microbiologie des Anaérobies (EMA E02B26) au sein de la faculté des sciences et techniques de l’université Cadi Ayyad Marrakech au Maroc, sous la direction de Monsieur Abdel-Illah QATIBI.

Je tiens d’abord à remercier mes directeurs de thèse. Les plus grandes leçons ne sont pas tirées d’un livre mais d’un enseignant tel que vous. Merci d’avoir pris le temps de m’aider au cours de ces années et de m’avoir accompagné dans la maîtrise de mes connaissances.

Je remercie Monsieur Rémy GUYONEAUD, Professeur à l’Université de Pau et des Pays de l’Adour et directeur de la partie française du projet Toubkal, qui m’a ouvert les portes de son laboratoire, d’avoir m’intégrer au sein de son équipe, m’avoir confié ce travail de recherche et pour ses qualités professionnelles et humaines, ces précieux conseils au cours de la thèse, pour sa sympathie, sa disponibilité, ses idées, ses conseils, son orientation et son encadrement tout le long de ce travail. Je tiens à vous écrire un « grand Merci » sincère pour votre soutien, votre encadrement et vos conseils tout au long de la thèse.

Je remercie Monsieur Abdel-Ilah QATIBI, Professeur de l’enseignement supérieur et directeur de la partie marocaine du projet Toubkal, de m’avoir accueilli au sein de son équipe et pour la confiance qui m’a accordé depuis le stage de mon master. J’ai pu apprécier non seulement vos qualités d’expert sur votre spécialité de microbiologie anaérobie, mais

aussi, vos qualités d’écoute et vos capacités de formation et d’encadrement. Vous êtes le professeur qui a réussi non seulement à me donner confiance en moi et en l’avenir mais aussi qui a réussi à me donner l’envie d’apprendre. Un grand MERCI pour tout ce que vous avez fait et j’espère avoir été à la hauteur de tous vos pensées.

Je tiens également à remercier mes rapporteurs, C’est un immense privilège que de pouvoir soumettre à leur expertise le fruit de mon travail. Je tiens à remercier Madame Agnès HIRSCHLER-RÉA, Maître de Conférences à l’Université d’Aix-Marseille, Madame Laila MANDI Professeur et Directrice du Centre National de l’étude et de la recherche sur l’eau et l’énergie de l’université Cady Ayyad Marrakech et Monsieur Nicolas BERNET, Directeur de recherche du Laboratoire de Biotechnologie de l’Environnement à l’INRA de Narbonne, d’avoir accepté d’être rapporteurs de ce travail.

Je tiens à remercier tous les membres –Professeurs, étudiants, techniciens ou administratifs- des deux équipes, Équipe de Microbiologie des Anaérobies au Maroc et Équipe Environnement et Microbiologie en France, que je ne peux pas tous citer. Je vous remercie tous d’avoir participé de près ou de loin à la réalisation de ce travail. J’adresse une pensée particulière au membre du projet SULFOX : Rhizlane Bennisse, Radia Bouterfas, Marisol Goni et Anthony Ranchou-Peyruse.

À tous mes frères et Sœurs : Mohamed, Darifa, Badiaa, Naima, Driss et Dalal. Je vous remercie tous et je vous offre aujourd’hui cette pensée témoignage d’affection et de l’importance que vous avez à mes yeux et de la place unique que chacun de vous occupe dans ma vie. À toi, Mon frère Driss, tu trouveras ceci étrange, mais je te rassure, il y a en moi, une envie de te dire au combien je suis fière d’un frère comme toi. Il arrive parfois que l’on ressente le besoin de dire les choses, de démontrer ses sentiments, voilà la raison qui me pousse à venir vers toi, en ce moment si particulier, et révéler toute ma reconnaissance et tous mes sentiments à ton égard. En ce moment si particulier, à Toi Badiaa, je t’adresse ce mot pour te dire « Nous marchons ensemble sur la chemin de la guérison, Sur chemin de la Bonne Santé afin de nous aimer encore jusqu'à l'éternité, Le chemin de la guérison se trouve dans l'amour et l'affection des siens». Courage ! Je t'aime de tout mon être et je te souhaite un prompt rétablissement.

À toi Khalti Najat, vous étiez pour moi une maman dans sa tendresse, un enseignent dans l’éthique, une sœur dans le conseil et l’orientation qui guide ma vie. Comme vous le savez,

j’ai traversé des moments si difficiles que plus d’une fois j’ai pensé que je ne verrais jamais le bout du tunnel. À chacun de ces moments, vous étiez là pour me réconforter et m’aider à avancer. Je ne vous remercierais jamais assez pour tout ce que vous avez fait pour moi. J’ai toujours pu compter sur vous. Je voulais que vous sachiez à quel point votre soutien a été d’une grande aide pour moi. Alors du fond du cœur...merci pour votre confiance et votre soutien.

Je remercie également le plus chaleureusement possible Ibtissam, qui était toujours là à mes côtés dans les moments les plus difficiles dans ma vie, « La reconnaissance est la plus belle fleur qui jaillit de l’âme ». C’est de tout mon cœur que je te remercie. Merci pour que tout ce que tu as fait pour moi. Un grand merci à toi Loubna « mon Manager ! » Merci...c’est un mot trop simple. Ce que je souhaiterai exprimer est au-dessus de cela. Je suis à la fois touché et reconnaissant pour ta confiance... Une chose est sure : je n’oublierais jamais. Une pensée particulière à Khalti Naima et Professeur Rhizlane Belbaraka, à ce moment si particulier de ma vie, vous est un véritable cadeau que mon cœur en est profondément reconnaissant.

Je te remercie en particulier Cyril Noel pour ta gentillesse, ta disponibilité et ton aide en Bio- info et traitement des donnés. Je te remercie Elisabeth Carlier, pour ton aide, ton soutient surtout les premiers jours au Labo. Une pensée particulière à Zeina Bourhane arrivée à ma derinière année de thèse, Merci pour tes « Rakwé du café ! », Merci pour tous les bons moments passés ensemble, je te souhaite bon courage et plein de succés. Merci à toi Ibtissem Guerfrachi et Ismail Adoumaz, bon courage et bonne continuation à vous. Un grand merci à Claire, Florance, Marion, Anne et Magali pour votre aide et votre contribution. À tous les thésards passés et actuels, Merci Marine, Théo, Cynthia, Bousaad, Claudie, Élise, Etienne, Manu, Claudie, Vanessa et Mathilde pour les moments qu’on a passé ensemble. Une pensé à mes amis de galère Idar Morabit, Lahcen Idouhamou, Hassan Boulahyaoui, Mohamed Bourouache et Abderrahim Outman pour tous ce qu’on a vécu ensemble. Je garde une place toute particulière pour toi Sara Bouilla et Tima Berbère. Je ne peux pas finir mes remerciements sans remercier le plus chaleureusement posible, Mr. Naoufel Lazrak, Driecteur de la Sté Translab, un grand MERCI pour tout ce que vous avaez fait, pour votre soutien, votre encouragement et votre aide pour finir ma thèse dans les bonnes conditions.

Finalement, je remercie tous les membres des deux écoles doctorales, personnels et administratifs, aussi bien qu’en France qu’au Maroc, et toute personne que je n’ai pas cité ayant participé au près ou du loin dans la réalisation de ce travail.

INTRODUCTION GÉNÉRALE ------17 CHAPITRE I : SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE ------5 1. BIO-MÉTHANISATION ET CONTEXTES ÉNERGÉTIQUE ET ENVIRONNEMENTAUX ------6

1.1. LES GRANDES ÉTAPES DE LA DIGESTION ANAÉROBIE (DA) ------6 1.1.1. Hydrolyse ------8 1.1.2. Acidogénèse ------9 1.1.3. Acétogénèse ------10 1.1.4. Méthanogénèse ------10 1.1.5. Relation entre méthanogénèse et sulfato-réduction dans le processus de la digestion anaérobie 13 1.2. PARAMÈTRES PHYSICO-CHIMIQUES INFLUENÇANT LA DIGESTION ANAÉROBIE ------15 1.2.1. Température ------15 1.2.2. pH ------17 1.2.3. Rapport carbone/azote (C/N) ------18 1.2.4. Demande Chimique en Oxygène (DCO) ------19 1.2.5. Besoins nutritionnels ------19 1.2.6. Temps de rétention ------20 1.2.7. Sulfures : Composés inhibiteurs de la digestion anaérobie ------21 1.3. ÉVOLUTION DE LA TECHNOLOGIE DES BIORÉACTEURS POUR LA PRODUCTION DURABLE DE BIOGAZ --- 22 1.3.1. “Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor” (UASBR) ------25 1.3.2. “Upflow Anaerobic Filter Process Reactor” (UAFPR) ------25 1.3.3. “Anaerobic Fluidized-Bed Reactor” (AFBR) ------26 1.3.4. “Two-phase Methane Production” (TPMP) ------27 2. IMPORTANCE DU CYCLE DU SOUFRE DANS LA DIGESTION ANAÉROBIE ------27

2.1. CYCLE MICROBIOLOGIQUE DU SOUFRE ------27 2.1.1. Généralités ------27 2.1.2. Transformations biologiques dans le cycle du soufre ------28 2.2. MICROBIOLOGIE DES BACTÉRIES SULFATO-RÉDUCTRICES ------29 2.2.1. Rôle des bactéries sulfato-réducteurs (BSR) dans l’environnement ------29 2.2.2. Diversité des bactéries sulfato-réductrices ------30 2.2.3. Métabolisme énergétique des bactéries sulfato-réductrices ------33 2.2.3.1. La voie de sulfato-réduction ------33 2.2.3.2. Réduction du thiosulfate, sulfite ou soufre élémentaire------35 2.2.3.3. Disproportionation des composés soufrés------35 2.2.3.4. Autres accepteurs d’électron, fermentation et le métabolisme syntrophique ------36 2.2.3.5. Comportement des BSR vis-à-vis du stress oxydatif ------37 2.2.4. Métabolisme du carbone chez les bactéries sulfato-réductrices ------38 2.2.4.1. Acétate et autres acides gras aliphatiques : propionate, butyrate, lactate, et pyruvate ------39 2.2.4.2. Les acétones, les alcools, les aldéhydes et les composés aromatiques ------41 2.3. MICROBIOLOGIE DES BACTÉRIES SULFO-OXYDANTES (BSO) ------41 2.3.1. Diversité ------41 2.3.2. Eco-physiologie ------44 2.3.2.1. Donneurs d’électrons ------45 2.3.2.1.1. Les phototrophes------45 2.3.2.1.2. Les chimiolithotrophes ------46 2.3.2.2. Accepteurs d’électrons ------47 2.3.2.3. pH et température de croissance ------47 2.3.3. Mécanismes biologiques d'oxydation des sulfures ------49 2.3.3.1. En conditions aérobies ------49 2.3.3.2. En conditions dénitrifiantes ------49 2.3.4. Facteurs influençant l’oxydation biologique des sulfures ------50 2.3.4.1. Concentration initiale en sulfures ------50 2.3.4.2. Rapport molaire azote/soufre ------51

2.3.4.3. Variations de pH et du taux de charge en azote et soufre ------51 2.4. APPLICATIONS TECHNOLOGIQUES DES BSO POUR LA DÉSULFURISATION DU BIOGAZ ------52 2.4.1. Le sulfure d'hydrogène dans le biogaz ------52 2.4.2. Élimination du sulfure d'hydrogène du biogaz ------52 2.4.2.1. Oxydation abiotique des sulfures ------53 2.4.2.2. Oxydation biotique des sulfures ------53 2.4.2.2.1. Bio-oxydation aérobie des sulfures------53 2.4.2.2.2. Bio-oxydation anaérobie des sulfures ------55 3. MICROBIOLOGIE DES MÉTHANISEURS : APPROCHES MOLÉCULAIRES ET APPROCHES CULTURALES ------58

3.1. APPROCHES MOLÉCULAIRES ------58 3.1.1. Étude de la diversité microbienne ------59 3.1.2. Étude de la dynamique microbienne ------61 3.1.3. Quantification microbienne ------62 3.1.4. Fonctionnement microbien ------63 3.2. LES APPROCHES DE CULTURE ET D’ISOLEMENT DES MICROORGANISMES EN ÉCOLOGIE MICROBIENNE 65 3.2.1. Généralités ------65 3.2.2. Mise en culture des micro-organismes ------66 3.2.2.1. Composition d'un milieu de culture ------66 3.2.2.2. La relation à l’oxygène ------66 3.2.3. Les limites de l'approche culturale et son amélioration ------67 3.2.3.1. Concentration des substrats ------68 3.2.3.2. Maintien de la communication cellulaire in vitro ------68 3.2.3.3. Temps d'incubation et taille de l'inoculum ------69 3.2.4. Procédures d'enrichissement ------69 3.2.4.1. Le dénombrement traditionnel des bactéries cultivables ------69 3.2.4.2. Techniques de culture haut débit ------70 CHAPITRE II : PROCÉDURES EXPÉRIMENTALES ------71

1. DESCRIPTION DU SITE D’ÉTUDE ------72

1.1. STATION DE TRAITEMENT ET D’ÉPURATION DES EAUX USÉES (STEP) ------72 1.2. DÉCHARGE PUBLIQUE ------72 1.3. STRATÉGIE D’ÉCHANTILLONNAGE ------73 1.3.1. La STEP de Marrakech ------73 1.3.2. La décharge publique de Marrakech ------75 1.4. DESCRIPTION DES DIFFÉRENTS POINTS D’ÉCHANTILLONNAGE ------75 1.4.1. Ligne d’eau : Décantation primaire ------76 1.4.2. Ligne de boue : Épaississeurs et méthaniseurs ------76 3.2.4.3. Épaississeurs ------76 3.2.4.4. Méthaniseurs ou digesteurs anaérobies ------77 1.4.3. Ligne de biogaz : Bioréacteur de désulfurisation ------78 2. APPROCHES CULTURALES : CULTURE, ISOLEMENT ET CONSERVATION ------79

2.1. COMPOSITION ET PRÉPARATION DU MILIEU DE CULTURE EN ANAÉROBIOSE ------79 2.1.1. Techniques de l’anaérobiose ------79 2.1.2. Préparation du milieu de culture de base pour bactéries anaérobies ------80 2.1.3. Création et maintien de l'anaérobiose des milieux de culture : Fiole de Widdel ------81 2.2. COMPOSITION ET PRÉPARATION DU MILIEU DE CULTURE DE BASE POUR BACTÉRIES AÉROBIES ------82 2.3. SOLUTIONS STOCKS UTILISÉES POUR LES MILIEUX DE CULTURE ------83 2.3.1. Solutions mères utilisées pour les substrats carbonés ------83 2.3.2. Solutions mères utilisées pour les substrats soufrés ------83 2.3.3. Solution d’oligo-éléments ------83 2.3.4. Solution de rézasurine ------84

2.3.5. Solution de vitamines ------84 2.4. TECHNIQUES D’ISOLEMENT ET DE PURIFICATION ------84 2.4.1. Numération des bactéries par la méthode NPP (Nombre le Plus Probable) ------84 2.4.2. Isolement des souches ------85 2.4.3. Purification des souches ------86 2.4.4. Conservation des souches ------86 3. CARACTÉRISATION MORPHOLOGIQUE ET PHYSIOLOGIQUE DES SOUCHES PURES --- 86

3.1. SUIVI DE LA CROISSANCE BACTÉRIENNE ------87 3.2. CARACTÉRISATION MORPHOLOGIQUE ------87 3.2.1. Etude de la morphologie ------87 3.2.2. Recherche de formes de résistance à la chaleur ------87 3.3. ÉTUDE DES PROPRIÉTÉS MÉTABOLIQUES ------88 3.3.1. Donneurs d’électrons ------88 3.3.2. Accepteurs d’électrons ------88 3.3.3. Sources de carbone ------88 3.3.4. Besoins en facteurs de croissance ------89 3.3.5. Test d’anaérobiose ------89 3.4. ETUDE DES INTERACTIONS MÉTABOLIQUES ENTRE LES BACTÉRIES SULFATO-RÉDUCTRICES (BSR) ET SULFO-OXYDANTES (BSO) ------89 3.4.1. Effet de l’oxygène sur la croissance des BSR en cultures pures ------89 3.4.2. Établissement des co-cultures stables entre BSR et BSO ------90 4. TECHNIQUES ANALYTIQUES : LES APPROCHES CHIMIQUES ET BIOCHIMIQUES DU DOSAGE ------90

4.1. MÉTHODES DE DOSAGE DES ANIONS ------90 4.1.1. Dosage des sulfures ------90 4.1.2. Dosage des sulfates (AFNOR NF T90-040) ------91 4.1.3. Dosage des thiosulfates et des sulfites ------92 4.2. MÉTHODES DE DOSAGE DES PRODUITS DE DÉGRADATION ------92 4.2.1. Dosages des acides organiques, sucres, alcools et acide gras volatiles par HPLC ------92 4.2.2. Dosage du dioxyde de carbone CO2 et de l’hydrogène H2 ------92 4.3. MÉTHODES DE DOSAGE BIOCHIMIQUES ------93 4.3.1. Étude de la composition en base de l’ADN (% G+C) ------93 4.3.2. Hybridation ADN/ADN------93 4.3.3. Analyse de la composition cellulaire en acides gras et des quinones membranaires ------93 5. APPROCHES MOLÉCULAIRES ------94

5.1. ÉTUDE DES SOUCHES ISOLÉES ------94 5.1.1. Extraction des acides nucléiques des cultures pures et électrophorèse d'ADN sur gel d'agarose 94 5.1.2. Identification des souches par Réaction de Polymérisation en chaîne (PCR) ------94 5.1.2.1. Amplification du gène codant pour l’ARNr 16S ------94 5.1.2.2. Amplification des gènes dsrAB par PCR ------94 5.1.2.3. La recherche de la nitrate réductase : Amplification des gènes nirS, nirK, nosZ et narG ------95 5.1.3. Purification des amplicons (produits de PCR), dosage de la quantité de l’ADN et séquençage -- 97 5.1.4. Analyses phylogénétiques ------97 5.2. ÉTUDE DES COMMUNAUTÉS MICROBIENNES ------98 5.2.1. Extraction des ADNs génomiques des différents échantillons prélevées de la STEP Marrakech - 98 5.2.2. Amplification de la région V4-V5 de l’ADN 16S par PCR ------98 5.2.3. Analyse de la diversité par séquençage haut débit Illumina MiSEQ ------99 5.2.4. Traitement bio-informatique des données de séquençage illumina MiSEQ ------101 5.2.4.1. Pipeline FROGS: Find Rapidly OTU with Galaxy Solution ------101 5.2.4.2. Pipeline QIIME : Quantitative Insight Into Microbial Ecology ------103 5.2.5. Études statistiques des communautés microbiennes ------103

5.2.5.1. Analyse de la diversité alpha ------103 5.2.5.2. Analyse de la diversité beta et tests statistiques ------104 CHAPITRE III: REPRESENTATIVES AND ISOLATION OF A NOVEL MEMBER OF THE SYNERGISTACEAE FAMILY FROM A MUNICIPAL ANAEROBIC SEWAGE SLUDGE DIGESTER: CAENICOLA NITRITIREDUCENS GEN NOV., SP. NOV., AN AMINO-ACID-FERMENTING STRAIN ------104 1. PRÉAMBULE ------105 2. REPRESENTATIVES AND ISOLATION OF A NOVEL MEMBER OF THE SYNERGISTACEAE FAMILY FROM A MUNICIPAL ANAEROBIC SEWAGE SLUDGE DIGESTER: CAENICOLA NITRITIREDUCENS GEN NOV., SP. NOV., AN AMINO-ACID-FERMENTING STRAIN ------107

2.1. ABSTRACT------108 2.2. INTRODUCTION ------109 2.3. MATERIALS AND METHODS ------110 2.3.1. Sampling strategy ------110 2.3.2. Extraction of genomic DNA and high throughput sequencing ------110 2.3.3. Processing of sequencing data from Illumina Miseq and statistical analyses ------110 2.3.4. Cultivation and isolation ------111 2.3.5. Phylogenic identification of pure cultures ------111 2.3.6. Morphology, cellular fatty acids and G+C composition ------111 2.3.7. Temperature, pH and NaCl requirements for growth ------112 2.3.8. Substrates utilization ------112 2.3.9. Fermentation products and gas phase analysis ------113 2.3.10. Electron acceptors, gas phase effect on growth and antibiotic resistance ------113 2.3.11. Nitrate or nitrite reductase research ------113 2.4. RESULTS AND DISCUSSION ------114 2.4.1. Characterization of the Synergistaceae microbial diversity using NGS in anaerobic wastewater sludge 114 2.4.2. Enrichment and isolation of Synergistaceae ------116 2.4.3. Morphology and physiology ------116 2.4.4. Phylogenetic analysis ------122 2.4.5. Description of Caenicola gen. nov. ------124 2.4.6. Description of Caenicola nitritireducens sp. nov. ------124 2.5. FUNDING INFORMATION ------125 2.6. ACKNOWLEDGEMENTS ------125 2.7. REFERENCES ------126 3. CONCLUSION ------133 CHAPITRE IV: MICROBIAL COMMUNITIES AND SULFATE REDUCING MICROORGANISMS DIVERSITY IN MUNICIPAL ANAEROBIC SEWAGE SLUDGE DIGESTERS FROM A WASTEWATER TREATMENT PLANT (MARRAKECH, MOROCCO) ------134 1. PRÉAMBULE ------135 2. MICROBIAL COMMUNITIES AND SULFATE REDUCING MICROORGANISMS DIVERSITY IN MUNICIPAL ANAEROBIC SEWAGE SLUDGE DIGESTERS FROM A WASTEWATER TREATMENT PLANT (MARRAKECH, MOROCCO) ------137

2.1. ABSTRACT------138 2.2. INTRODUCTION ------139 2.3. MATERIAL AND METHODS ------140 2.3.1. Sampling strategy and operating condition ------140 2.3.2. Extraction of genomic DNA and high throughput sequencing ------142 2.3.3. Processing of sequencing data from illumina MiSEQ and statistical analyses ------142

2.3.4. Growth and isolation of sulfate reducing microorganisms, phylogenetic identification ------143 2.3.5. Quantitative PCR (qPCR) ------143 2.4. RESULTS AND DISCUSSION ------144 2.4.1. Global analysis of microbial communities in WWTP of Marrakech ------144 2.4.2. Microbial Communities in anaerobic digesters------147 2.4.3. Diversity of sulfate reducing prokaryotes OTUs ------152 2.4.4. Phylogenic relationship of sulfate reducing communities in anaerobic digesters with isolated sulfate reducing strains from anaerobic digesters sludge ------155 1.1. CONCLUSION ------158 1.2. FUNDING INFORMATION ------159 1.3. ACKNOWLEDGEMENTS ------159 1.4. SUPPLEMENTARY DATA ------160 1.5. REFERENCES ------163 2. CONCLUSION ------172 CHAPITRE V: DESULFOBULBUS OLIGOTROPHICUS SP. NOV., A SULFATE-REDUCING AND PROPIONATE-OXIDIZING BACTERIUM ISOLATED FROM A MUNICIPAL ANAEROBIC SEWAGE SLUDGE DIGESTER ------174 1. PRÉAMBULE ------175 2. DESULFOBULBUS OLIGOTROPHICUS SP. NOV., A SULFATE-REDUCING AND PROPIONATE-OXIDIZING BACTERIUM ISOLATED FROM A MUNICIPAL ANAEROBIC SEWAGE SLUDGE DIGESTER ------177

2.1. ABSTRACT------178 2.2. INTRODUCTION ------179 2.3. MATERIAL, METHODS AND RESULTS ------179 2.3.1. Sampling strategy, Cultivation and isolation ------179 2.3.2. Morphology ------180 2.3.3. Phylogenetic analysis and G+C composition ------181 2.3.4. Cellular fatty acids and quinones ------182 2.3.5. Physiology ------186 2.3.6. Description of Desulfobulbus oligotrophicus sp. nov. ------189 2.4. FUNDING INFORMATION ------190 2.5. ACKNOWLEDGEMENTS ------190 2.6. SUPPLEMENTARY DATA ------191 2.7. REFERENCES ------193 3. CONCLUSION ------197 CHAPITRE VI: MICROBIAL DIVERSITY OF SULFUR-OXIDIZING PROKARYOTES IN ANAEROBIC DIGESTERS AND THIOPAQ BIOREACTOR FROM A WASTEWATER TREATMENT PLANT (MARRAKECH, MOROCCO) ------200 1. PRÉAMBULE ------201 2. MICROBIAL DIVERSITY AND COMMUNITY STRUCTURE OF SULFUR-OXIDIZING MICROORGANISMS IN ANAEROBIC DIGESTERS AND THIOPAQ BIOREACTOR FROM A WASTEWATER TREATMENT PLANT (MARRAKECH, MOROCCO) ------202

2.1. ABSTRACT------203 2.2. INTRODUCTION ------204 2.3. MATERIAL AND METHODS ------205 3.1.1. Sampling strategy and operating conditions ------205 3.1.2. Extraction of genomic DNA and high throughput sequencing ------207 3.1.3. Processing of sequencing data from illumina Miseq and statistical analyses ------207 3.1.4. Growth and isolation of Sulfur-oxidizing bacteria, phylogenetic identification ------208

2.4. RESULTS AND DISCUSSION ------208 2.4.1. Global analysis of microbial diversity in WWTP of Marrakech ------208 2.4.2. Microbial taxonomic analysis of sulfur oxidizing prokaryotes at the OTU level ------210 2.4.3. Distribution of sulfur oxidizing prokaryotes OTUs and isolated strains from anaerobic digester 214 2.5. CONCLUSION ------219 2.6. FUNDING INFORMATION ------220 2.7. ACKNOWLEDGEMENTS ------220 2.8. REFERENCES ------221 3. CONCLUSION ------229 CHAPITRE VII: SYNTHÈSE GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES ------230 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ------237

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ADN/DNA : Acide désoxyriboNucléique / DeoxyriboNucleotic Acid AFBR: Anaerobic Fluidized-Bed Reactor AGV/VFA: Acides Gras Volatils / Volatile Fatty Acids ANOVA: ANalysis Of VAriance ARN/RNA: Acide Ribonucléique / Ribonucleic Acide ATP: Adénosine Tri-Phosphate BET: Bromure d‘Ethydium BF/BF: Boue Floculée / Flocculated Sludge BHI: Broth Heart Infusion BP/PS: Boue Primaire / Primary Sludge BSO/SOB: Bactéries Sulfo-Oxydantes / Sulfur Oxizizing Bacteria BSR/SRB: Bactérie sulfato-réductrice/Sulfate reducing bacteria C/N: Rapport Carbone/Nitrogen DA/AD : Digestion Anaérobie / Anaerobic Digestion DCO : Demande Chimique en Oxygène DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DMS : diméthylsulfure DMSO : Diméthylsulfoxyde DO : Densité Optique DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen dsrA: Dissimilatory sulfide reductase A FISH: Fluorescent in situ Hybridization FROGS: Find Rapidly OTU with Galaxy Solution GC: Gas Chromatography GES : Gaz à Effet de Serre

H2S: Sulfure d’hydrogène HPLC : High Performance Liquid Chromatography HRT: Hydrolic Retention Time JCM: Japan Collection of Microorganisms mcrA: Methyl coenzyme M reductase A MDP : Mécanisme du Développement Propre, MPM : Microorganismes Produisant le Méthane

NGS : Next-Generation Sequencing / Séquençage de Nouvelle Génération NPP : Nombre le Plus Probable OLR: Organic Loading Rate OTU : Operational Taxonomic Units ou Unités Taxonomiques Opérationnelles PCA : Principal Component Analysis / Analyses de Correspondance Principales PCR : Polymerase Chain Reaction ou Amplification en Chaîne par Polymérase PCR : Réaction de Polymérisation en chaîne QIIME: Quantitative Insight Into Microbial Ecology qPCR : PCR quantitative RISA : Ribosomal Intergenic Spacer Analysis soxB : Thiosulfate-oxidizing enzyme gene SRT: Solide Retention Time SS: Solides en Suspension SSCP : Single-Strand Conformation Polymorphism STEP : Station de traitement et d’épuration des eaux usées SV: Suspension Volatile TPMP: Two-Phase Methane Production T-RFLP: Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism TSB: Tryptic Soy Broth UAFPR: Upflow Anaerobic Filter Process Reactor UASBR: Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor UFC: Unités Formant Colonies WWTP: WasteWater Treatment Plant

LISTE DES FIGURES CHAPITRE I

Figure I. 1: Flux de carbone à l'intérieur d’un digesteur anaérobie et les microorganismes impliqués dans les différentes étapes de la DA (adapté de Gujer and Zehnder, 1983) ……..…7

Figure I. 2: Les voies biochimiques produisant le CH4 à partir des différents produits initiaux (Goswami et al., 2016) …………………………………………………………..…….……..12

Figure I. 3: Interaction microbienne entre les bactéries sulfato-réductrices et les méthanogènes vis-à-vis de l’acétate et l’hydrogène (Gerardi, 2003)…………………………15

Figure I. 4: Composition en AGV en fonction du pH au cours de la digestion anaérobie (Fang and Liu, 2002) …………………………………………………………………….………….18

Figure I. 5: Effet de la SRT sur la stabilité et la performance de la digestion anaérobie (Kwietniewska and Tys, 2014).. AGVs= Acides gras volatiles ; SV= Suspension volatile …21

Figure I. 6 : Représentation schématique des différents types de bioréacteurs (Goswami et al., 2016) ...……………………………………………………………………………………….24

Figure I. 7: Les transformations biologiques dans le cycle du soufre en conditions oxiques et anoxique (Muyzer and Stams, 2008)…………………………………………………………29

Figure I. 8: Les relations phylogénétiques et les principales propriétés physiologiques des genres de bactéries sulfato-réductrices et Archea (Rabus et al., 2015)………………………32

Figure I. 9: Le mécanisme enzymatique de la réduction dissimilatrice du sulfate en sulfures chez PRS (Rabus et al., 2015)………………………………………………………...………35

Figure I. 10: Mécanismes de réponse des BSR au stress oxydative de l'oxygène (Rabus et al., 2015)………………………………………………………………………………………… 37

Figure I. 11: Une synthèse des diverses capacités cataboliques du carbone chez les BSR (Rabus et al., 2015)………………………………………………………..………………….39

Figure I. 13 : Schéma du processus biotechnologique pour la désulfuration du biogaz (Janssen et al., 2009)……………………………………….…………………………………55

Figure I. 14: Principales approches moléculaires utilisées pour étudier la structure communautaire microbienne, les interactions et les fonctions dans les digesteurs anaérobies (Cabezas et al., 2015)…………………………………………………………………………58

Figure I. 15: Possibilités d'analyse multi-"omics" des communautés microbiennes complexes (Cabezas et al., 2015)…………………………………………………………………………64

CHAPITRE II

Figure II. 1: Photographie de la décharge publique où sont rejetées les boues déshydratés provenant de la station de traitement des eaux usées de la ville de Marrakech………………73

Figure II. 2: Photographie de la station de traitement des eaux usées de la ville de Marrakech. 1, Pilotage de la STEP ; 2, Décanteurs primaires ; 3, Épaississeurs ; 4, Digesteurs anaérobies; 5, Clarificateurs ; 6, Gazomètres ; 7, Bioréacteur de désulfurisation……………………….74

Figure II. 3: Répartition des échantillons de boue dans les cryotubes ; flacon de prélèvement de boues dans les digesteurs, les boues primaires et les boues floculées………………..……75

Figure II. 4: Coupe longitudinale d'un décanteur primaire. Nombre d’ouvrage : 3 ; Diamètre unitaire (m) : 39 ; Surface unitaire (m²) :1195 ; Volume unitaire (m3) :3971 ; Temps de séjours des boues : 2h ; MES (g.l-1) : 40-100 ; DCO (mg.l-1) : 800-1100………………...…..76

Figure II. 5: Coupe longitudinal d'un épaississeur gravitaire. Nombre d’ouvrages : 2 ; Diamètre unitaire (m) : 15 ; Surface unitaire (m²) : 177 ; Volume unitaire (m3) : 600 ; Hauteurs cylindrique (m) : 3.5 ; Temps de séjours des boues : 2h ...………………….……..77

Figure II. 6: Coupe longitudinal d'un digesteur anaérobie de type mésophile de la STEP Marrakech. Nombre d’ouvrages 4 ; Diamètre unitaire (m) : 24 ; Surface unitaire (m²) : 1848 ; Volume unitaire (m3) : 6000 ; Temps de séjours : 21j ………………………………………78

Figure II. 7: Représentation schématique de principe du procédé de Thiopaq pour désulfuration du biogaz. Laveur à gauche ; Bioréacteur au milieu ; Séparateur de soufre à droite.…………………………………………………………………………………………79

Figure II. 8: Systèmes de type (A) Hungate (écrasement d’un bouchon grâce à un pas de vis) ou (B) Balch (écrasement du bouchon par un anneau de sertissage en aluminium)…….……80

Figure II. 9: Préparations du milieu de culture en anaérobiose. A) Ajustement du pH sous agitation du milieu de culture anaérobie de base ; B) Création des conditions d'anaérobiose par dégazage du milieu de culture de base ; C) Technique de répartition de milieu d de culture de base en anaérobiose.……………………………………………………………………….81

Figure II. 10: Fiole de Widdel ..……………………………………………………………..82

Figure II. 11 : Technique d’isolement par la méthode des "roll-tubes"……………….……..86

Figure II. 12: Représentation schématique des différentes étapes du test de sporulation…...87

Figure II. 13: Courbe d’étalonnage pour le dosage des sulfures.……………………………91

Figure II. 14: Courbe étalon pour le dosage des sulfates ……………………………………92

Figure II. 15: Principales étapes de l’approche de séquençage par la technologie de synthèse Illumina (modifié d’après Mardis, 2008)…………………………………………….…… 100

Figure II. 16: Description des étapes utilisées pour le traitement des données de séquençage Illumina des séquences de l’ARNr 16S bactérien et archéen par FROGS (modifié d’après de ric Escudie et al., (2017))……………………………………………………………………102

CHAPITRE III

Figure III. 1: Heatmap of the Synergistaceae OTUs for the V4-V5 region of 16S rRNA gene. The legend shows the relative abundances. The samples clusterization was on the top of the heatmap. Evolutionary dendrogram and taxonomic affiliation of each OTU were shown on left and right of the heatmap, respectively ...………………………………………………..115

Figure III. 2: Phase-contrast photomicrograph of strain DZ-S4T cells, grown on 0.2% (w/v) yeast extract, 0.2% (w/v) typtone, 0.2% (w/v) casamino acid and supplemented with 20 mM each cysteine, arginine and histidine. Depicting their curved-rod shape. Bar, 4 µm..………117

Figure III. 3: Evolutionary dendrogram based on partial 16S rRNA gene sequences constructed by the neighbour-joining method showing the affiliation of Synergistaceae isolates (Strain DZ-S4T and DZ-S5) and OTUs sequences found in the samples with their closest relative reference sequences (all > 1367 bp) obtained from NCBI Genbank database. Desulfobulbus oligotrophicus Prop6T (KU845305) was used as outgroup to root the tree. Bootstrap values are represented at nodes. Bar, 0.05 substitutions per site. The red lozenge

corresponds to the OTU sequences; the isolated strains are represented in in bold format and by green circles ……….…… ………….……………… ………….…………….…………123

CHAPITRE IV

Figure IV. 1: Relative abundance of prokaryotes 16S rRNA gene of dominant phyla (relative abundance >1%) observed in all samples collected from the wastewater treatment plant in Marrakech in July 2015……………………………………………………………………...146

Figure IV. 2: Venn diagram representing the OTUs richness (based on V4-V5 16S rRNA gene) shared between the four anaerobic digesters A, B, 1 and 2 ...………………………..147

Figure IV. 3: Heatmap of the 30 most abundant OTUs for the V4-V5 region of 16S rRNA gene. The legend shows the relative abundances. The samples clusterization was on the top of the heatmap. Evolutionary dendrogram and taxonomic affiliation of each OTU were shown on left and right of the heatmap, respectively…………………………………………………..149

Figure IV. 4: Abundances of (a) dsrB gene of sulfate reducing prokaryotes and (b) mcrA gene of Archaea methanogens in the anaerobic digesters (up and down) and primary and flocculated sludges. Abundances are given in number of copies per g of sludge. Error bars represent the standard deviation (triplicates)………………………………………………..151

Figure IV. 5: Heatmap of V4-V5 16S rRNA gene of the sulfate reducing prokaryotes families present into the four anaerobic digesters. The legend shows the relative abundances. Evolutionary dendrogram of SRP OTUs, taxonomic affiliation and samples clusterization were showed in the left, right and top of heatmap, respectively…………………………….154

Figure IV. 6: Evolutionary dendrogram constructed by the neighbour-joining method showing the affiliation of isolates of sulfate reducing bacteria and OTUs found in the samples with their closest relatives reference sequences obtained from the SILVA database (version 128). The archaeal sulfate reducing microorganisms were used as outgroup to root the tree. Bootstrap values are represented at nodes. Bar, 0.05 substitutions per site. The red lozenge corresponds to the OTU sequences; the isolated strains are represented by green circles….156

20.06 % of the variability, respectively. b) The same analysis only for the four digesters 1, 2, A and B. The PC1 and PC2 axes accounted for 41.28 % and 19.78 % of the variability, respectively………………………………………………………………………………….162

CHAPITRE V

Figure V. 1: Transmission electron micrograph of strain Prop6T grown on 20 mM propionate and 20 mM sulfate showing amphitrichous flagella………………………………………...181

Figure V. 2: Neighbour-joining phylogenetic tree based of 16S rRNA gene sequences (1177bp) showing the position of strain Prop6T among the members of the genus Desulfobulbus. Bootstrap values are represented at nodes. Bar, mean number of substitutions per site……………………………………………………………………………………….183

CHAPITRE VI

Figure VI. 1: Comparison of flocculated sludge, primary sludge, the four anaerobic digesters and Thiopaq bioreactor microbial communities (Bacteria and Archaea) by principle coordinate analysis of the weighted UniFrac β-diversity metric. The PC1 and PC2 axes accounted for 57.37 % and 17.37 % of the variability, respectively………………………..209

Figure VI. 2: Relative abundance of sufur-oxidizing microorganisms 16S rRNA gene of dominant families (relative abundance >1%) observed in samples collected from the wastewater treatment plant in Marrakech…………………………………………………...211

Figure VI. 3: Heatmap of the 30 most abundant sufur-oxidizing microorganisms OTUs for the V4-V5 region of 16S rRNA gene. The legend shows the relative abundances. The samples clusterization was on the top of the heatmap. Evolutionary dendrogram and taxonomic affiliation of each OTU were shown on left and right of the heatmap, respectively………..213

Figure VI. 4: Evolutionary dendrogram constructed by the neighbour-joining method showing the affiliation of isolates of sulfur-oxidizing bacteria and OTUs found in the samples with their closest relatives reference sequences obtained from the NCBI database. Methanomicrobia genus was used as outgroup to root the tree. Bootstrap values are represented at nodes. Bar, 0.05 substitutions per site. The red lozenge corresponds to the OTU sequences; the isolated strains are represented by green circles…………………………….216

LISTE DES TABLEAUX

CHAPITRE I

Tableau I. 1: Composition de la communauté BSO basée sur l'information taxonomique des gènes ARNr 16S et soxB (Zhang et al., 2017)…………………………………….………….44

Tableau I. 2: Conditions de croissance de quelques BSO photolithotrophes et chimiolithotrophe (Tang et al., 2009) ...……………………………………………….……..48

Tableau I. 3: Conditions de fonctionnement et bio-cinétique de l'élimination des sulfures dans divers bioréacteurs avec des BSO chimiolithotrophes (Tang et al., 2009)…………..….55

CHAPITRE II

Tableau II. 1: Caractéristiques des différents couples d'amorces utilisés lors des PCRs. NGS ; Next-Generation Sequencing (séquençage de nouvelle génération)………………………….96

CHAPITRE III

Table 1: Characteristics that can discriminate between strain DZ-S4T (present study) and the most-closely related type strain of Synergistaceae species. .………………………………..118

Table III. 2: Fermentation products from substrates that support growth of strain DZ-S4T in basal medium…...... 120

Table III. 3: Cellular fatty acid profiles (%) of strain DZ-S4T, Cloacibacillus porcorum CL- 84T and Cloacibacillus evryensis 178T, grown on BHIAH medium………………………..121

CHAPITRE IV

Table IV. 1: Physicochemical parameters of the four anaerobic digesters of wastewater treatment plant of Marrakech, Morocco. The diameter of reactors was 24 m and the average retention time was 21 days…………………………………………………………………..141

Table IV. 2: Number of sequences, OTUs and diversity indexes calculated for all the samples. Results for one sample are the mean of three replicates…………………………..142

Table IV. S1: Treatment capacity of the wastewater treatment plant (WWTP) Marrakech. The mean flow is 90720 m3.day-1. Data are from Autonomous Board of Distribution of Water and Electricity in Marrakech (RADEEMA) ...…………………………………………………..161

CHAPITRE V

Table V. 1: Main characteristics of strain Prop6T and the most closely related type strains of species of the genus Desulfobulbus..………………………………………………………..184

Table V. 2. Cellular fatty acids contents (percentages) of strain Prop6T and the most closely related type strains of species of the genus Desulfobulbus. ……………………………… ..186

Table V. S1. Effects of electron acceptors on utilization of substrates by strain Prop6T…...192

CHAPITRE VI

Table VI. 1: Biogas quality and physicochemical operation data of Thiopaq bioreactor of

WWTP Marrakech…………………………………………………………………………..206

Introduction générale

La consommation et la demande en énergie dans le monde ne cessent d'augmenter. La plupart des ressources utilisées comme le pétrole, le gaz naturel ou le charbon ne sont pas des sources d'énergie durables. Un grand nombre de pays dans le monde passent actuellement par la phase critique de l'explosion démographique et la population croissante exige plus d'intrants énergétiques. Par conséquent, l'exigence de l'énergie durable et écologique dans le monde, pour satisfaire la demande en énergie, est inévitable. La production de biogaz est l’une des façons de produire de l'énergie propre et de coupler cette production à la gestion des déchets et leurs sous-produits de dégradation. Le biogaz est une source durable d'énergie car il est (1) pleinement autonome en énergie (il produit lui-même la chaleur et l'électricité pour exécuter le processus) ; (2) indépendant de tout combustible fossile ; (3) renouvelable. De plus, la production du biogaz permet de maîtriser et in fine réduire l'émission de gaz à effet de serre (GES) dans l'environnement. La gestion des déchets, les soins de santé réduits du fait de la gestion des déchets, la production de fumier valorisable et la création d'emplois durables sont parmi les avantages du système de biogaz. En gardant cela à l'esprit, au moins 25% de toute la bioénergie à l'avenir pourrait provenir du biogaz (Holm-Nielsen et al., 2009).

La technologie du biogaz semble prometteuse pour atteindre des rendements énergétiques durables sans nuire à l'environnement lorsque l’énergie est produite par la digestion anaérobie (appelée également bio-méthanisation) et récupérée correctement (Chojnacka et al., 2015; Qiang et al., 2012). Cette énergie est récupérée sous forme d’un biogaz composé de 50-75% de méthane (d’où le nom bio-méthanisation), 25-50% de dioxyde de carbone, 0-10% d'azote, 0-3% d'hydrogène sulfuré, 0-1% d'hydrogène et des traces d'autres gaz. Le terme «anaérobie» indique que le processus se produit en l'absence de dioxygène. Le processus produit du CH4 par décomposition des déchets et réduit la pollution environnementale (Ward et al., 2008). La digestion anaérobie comporte quatre étapes essentielles : l’hydrolyse, l’acidogénèse, l’acétogénèse et la méthanogenèse. Au cours du processus de production du biogaz, la vitesse de la quatrième étape (méthanogenèse) est souvent l'étape limitante du processus. Comme la production du méthane est le résultat de l'action de plusieurs microorganismes sur la matière organique, les connaissances sur leur écophysiologie aident à comprendre leurs rôles particuliers. L'effet d'un microorganisme dans le consortium ne peut être complètement compris que s'il peut être cultivé in vitro. Bien qu'il existe plusieurs avis disponibles sur différents aspects de la production de biogaz, il existe un manque de connaissances liées aux communautés microbiennes impliquées dans les différentes étapes. Le rôle qu'elles jouent à chaque étape, les principaux gènes impliqués et la 1

Introduction générale façon de contrôler ces communautés microbiennes (Wirth et al., 2012) sont autant de paramètres clés pour permettre une production optimale de biogaz.

La digestion anaérobie de la matière organique est réalisée par l'action concertée de divers groupes trophiques de bactéries. Les composés organiques solubles sont dégradés en

CH4, CO2 et H2S par une interaction syntrophique de bactéries fermentaires et acétogènes avec des archées méthanogènes ou des procaryotes sulfato-réducteurs. Il est donc indispensable de comprendre le rôle de ces microorganismes, impliqués à la fois dans le cycle du carbone (responsable de la dégradation de la matière organique) et celui du soufre (responsable de l’élimination ou la production des sulfures) au cours du processus de la digestion anaérobie. Ainsi, pour améliorer la vitesse de production globale dans un tel procédé de bio-méthanisation, il est nécessaire de comprendre la physiologie en lien avec les paramètres majeurs de l’environnement des microorganismes impliqués dans les différentes étapes de dégradation, afin d’assurer le contrôle et l'optimisation de l'ensemble du procédé. Étant donné que la plupart des populations microbiennes impliquées dans la digestion anaérobie ne sont pas cultivables, il serait envisageable de tenter de concevoir des milieux idéaux et d'optimiser les conditions de croissance des microorganismes détectés par des méthodes méta-génomiques. Ainsi, des recherches approfondies pourraient être réalisées et pourraient s’avérer rentables pour l’amélioration de l’ensemble du processus (Ali Shah et al., 2014; Cabezas et al., 2015).

La digestion anaérobie est souvent confrontée à des disfonctionnements opérationnels qui entraînent des coûts d'exploitation élevés. Parmi ces perturbations figurent la production de mousses et d'écumes, l'acidification liée à la production massive des acides gras volatils et des perturbations toxiques liées à de fortes émanations malodorantes causés par la production de sulfures (Gerardi, 2003). En effet, les sulfures produits lors de la digestion anaérobie sont essentiellement liés à la réduction dissimilatrice des composés soufrés présents dans les boues par un groupe hétérogène de microorganismes procaryotes appelé bactéries sulfato-réductrices (BSR). Ils ont la capacité d'utiliser du sulfate, ainsi que d'autres composés soufrés oxydés (soufre élémentaire, thiosulfate, sulfite), comme accepteur d'électrons terminaux pour l'oxydation de composés organiques simples ou de l'hydrogène, dans un processus respiratoire qui aboutit à une production élevée de sulfures (Rabus et al., 2015).

- 2- Cette activité des BSR, au travers de la production massive de sulfures (H2S, HS , S ) inhibant la croissance des microorganismes, constitue un obstacle à la production de biogaz.

Introduction générale

De plus, ces microorganismes rentrent en compétition avec les archées méthanogènes vis à vis des substrats indispensables pour la production de méthane (tels que l’acétate et l’hydrogène, le méthanol …). Elle constitue également un obstacle à l’utilisation directe du biogaz, en étant responsable de phénomènes de corrosion pour les stations de traitement et des unités de cogénération d’électricité. Cela induit un coût de purification du biogaz visant à éliminer ces sulfures. Les bactéries sulfo-oxydantes (BSO) constituent les plus communs et les plus importants moyen par lequel les sulfures peuvent être ré-oxydés. Ces deux groupes bactériens peuvent cohabiter de manière favorable créant un cycle du soufre. L’utilisation des BSR et des BSO dans des conditions soigneusement contrôlées pourrait résoudre ces problèmes de production de sulfure d’hydrogène. C’est la raison pour laquelle l’objectif de ce travail présenté dans ce mémoire est d’étudier la diversité des populations des BSR et des BSO retrouvées dans les boues de la station d’épuration de la ville de Marrakech (quatrième ville du Maroc et compte plus d’un million d’habitants en 2017). Cette étude globale se réalisera par des méthodes moléculaires dans un premier temps. Par la suite, l’objectif est d’isoler le plus de représentants possible de ces deux groupes et d’explorer la faisabilité d’une co-culture entre les deux ("mini" cycle du soufre), afin de démontrer que cette coexistence entre les deux bactéries est possible au sein même des boues et est exploitable en vue de réduire les quantités de sulfure dans le biogaz.

L’ensemble de ce travail présenté dans ce manuscrit s'articule autour de sept chapitres. Un exposé bibliographique (Chapitre I) offre dans sa première partie un état de l’art sur la place de la bio-méthanisation dans la problématique énergétique et environnementale à travers la discussion de l’aspect microbiologique et technologique des différentes étapes de la production du biogaz, les facteurs influençant ce processus pour développer des installations de production de biogaz plus intelligentes. Il essayera également de nous concentrer essentiellement sur la diversité (à travers des approches moléculaires et culturales) des communautés microbiennes qui constituent l'aspect central de la production de biogaz. La deuxième partie de la revue bibliographique portera sur l’importance du cycle de soufre dans la digestion anaérobie, la microbiologie des BSR et des BSO, et finalement sur l’exploitation technologique de ces micro-organismes pour la désulfurisation du biogaz. Le Chapitre II couvre les procédures expérimentales mises en œuvre et développées au cours de ce travail, à travers la description du site d‘étude et des analyses effectuées pour répondre aux objectifs fixés dans ce projet. Ce travail de recherche s’articule autour de trois objectifs : (1) caractérisation moléculaire de la diversité des organismes intervenant dans la bio-

Introduction générale méthanisation, des sulfato-réducteurs gênant dans le cadre de la production de biogaz et sulfo- oxydants colonisant les boues de station d’épuration de la ville de Marrakech et potentiellement impliqués dans l'élimination de ces sulfures par oxydation ; (2) Isolement et caractérisation des organismes sulfato-réducteurs, sulfo-oxydants et fermentaires colonisant des boues de méthanisation et (3) l’évaluation des conditions optimales de la mise en place d’un biotraitement des sulfures. Cette étape se réalise à travers des études préalables en microcosmes, fermenteurs pour définir les meilleures conditions pour la mise en œuvre de ce type de traitements. Le Chapitre III est consacré à la description et la caractérisation d’une souche Caenicola nitritireducens DZ-S4T, qui présente un nouveau genre au sein de la famille des Synergistaceae, isolée à partir d'un des quatre digesteurs anaérobies municipaux de boues d'épuration mésophiles de la station d’épuration de la ville de Marrakech. De plus, ce chapitre donnera un aperçu sur l’abondance et la diversité de ce groupe de microorganismes anaérobies et fermentaire impliqués dans la dégradation de la matière organique (protéines en particulier) au cours de la digestion anaérobie des boues d’épuration.

Le Chapitre IV présente l’étude de la diversité et de la distribution des microorganismes, notamment des sulfato-réducteurs et des archées, en vue de l'évaluation de leur rôle dans la production de sulfures et de méthane, respectivement, lors de la digestion anaérobie. Cette étude est effectuée à travers le séquençage à haut débit de la région V4-V5 du gène ARNr 16S et par PCR quantitative (qPCR). La diversité et l'abondance pour les sulfato-réducteurs est étudiée à travers la combinaison des deux approches moléculaires et culturales (isolement et caractérisation) des communautés microbiennes trouvées dans le processus de production de biogaz dans la station d'épuration (STEP) de Marrakech. Le chapitre V présente les résultats de la description de la souche Desulfobulbus oligotrophicus Prop6T, nouvelle espèce, isolée à partir d'un digesteur de boues d'épuration anaérobies municipales et membre du genre Desulfobulbus appartenant au groupe des bactéries sulfato- réductrices responsables de la production massive des sulfures au cours du processus de production du biogaz. Le Chapitre VI illustre la diversité et l’abondance des microorganismes sulfo-oxydants, potentiellement impliqués dans le processus d’oxydation biologique des sulfures et dans la désulfurisation du biogaz. L’étude des PSO a été menée à travers l’approche moléculaire (séquençage à haut débit) et l’approche culturale (isolement et caractérisation) des souches sulfo-oxydantes isolées des boues de digestion anaérobie de la STEP de la ville de Marrakech. L‘ensemble des conclusions, discussions et perspectives sera repris dans le chapitre VII où une discussion générale de ce projet sera également proposée.

Chapitre I : Synthèse bibliographique

1. Bio-méthanisation et contextes énergétique et environnementaux

1.1. Les grandes étapes de la digestion anaérobie (DA)

La production de biogaz est un processus uniquement biologique, impliquant plusieurs métabolismes. Les fonctions de la majorité des gènes de microorganismes impliqués dans les différents stades de la DA sont encore à explorer (Demirel and Scherer, 2008; Narihiro and Sekiguchi, 2007; Weiland, 2010). Bien qu'il existe plusieurs avis disponibles sur différents aspects de la production de biogaz, il existe un manque de connaissances liées aux différentes communautés microbiennes impliquées dans les différentes étapes, le rôle qu'elles jouent à chaque étape, les principaux gènes impliqués et la façon de contrôler ces communautés microbiennes pour obtenir une production optimale de biogaz (Wirth et al., 2012).

Le procédé de biogaz comprend quatre étapes majeures (hydrolyse, acidogénèse, acétogénèse, méthanogénèse) qui sont catalysées par des microorganismes différents et spécialisés (Figure I. 1). Bien que le processus de la DA soit réalisé depuis des décennies, les connaissances sur les consortiums microbiens impliqués dans ce processus sont limitées en raison du manque de données phylogénétiques et métaboliques sur les micro-organismes prédominants incultivables(Sträuber et al., 2012). En raison de la grande variété de produits de départ, un ensemble complexe d'espèces microbiennes est impliqué dans le processus de la bio-méthanisation, y compris certains organismes syntrophes obligatoires (Chojnacka et al., 2015; Wirth et al., 2012).

L'étape d'hydrolyse correspond à la dégradation des matières organiques insolubles et des composés de haut poids moléculaire tels que les lipides, les polysaccharides, les protéines et les acides nucléiques, en substances organiques solubles. Les composés formés au cours de l'hydrolyse sont encore dégradés pendant l'acidogénèse, la deuxième étape. Les acides gras volatiles sont produits par des bactéries acidogènes (ou fermentaires) avec de l'ammoniac

(NH3), du CO2, du H2S et d'autres sous-produits. La troisième étape de la DA est l'acétogénèse, où les acides organiques et les alcools produits par l'acidogénèse sont digérés par des acétogènes pour produire principalement de l'acide acétique ainsi que du CO2 et du

H2. Finalement, le dernier stade de la méthanogénèse produit du méthane par deux groupes de microorganismes méthanogènes : le premier acétotrophe et le deuxième hydrogénotrophe (Appels et al., 2008).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Figure I. 1: Flux de carbone à l'intérieur d’un digesteur anaérobie et les microorganismes impliqués dans les différentes étapes de la DA (adapté de Gujer and Zehnder, 1983).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

1.1.1. Hydrolyse

La toute première étape de la DA est très importante d’autant que les polymères organiques ne sont pas facilement absorbables. Dans cette étape, plusieurs micro-organismes sécrètent des enzymes qui clivent ces macromolécules complexes (Cirne et al., 2007; Doi, 2008). Il a été reporté que cette première étape est l'étape limitante de la vitesse dans la DA (Zeeman and Sanders, 2001). L'hydrolyse implique la solubilisation et la dégradation de polymères organiques en monomères ou dimères (Kim et al., 2003). La biodégradabilité et le potentiel de la production de biogaz dépendent de la teneur en glucides, protéines et lipides présents dans un substrat (Angelidaki and Sanders, 2004; Noike, 1992; Rittmann, 2008).

Les microorganismes impliqués dans l'hydrolyse produisent des enzymes hydrolytiques pour assimiler les substrats complexes (Vavilin et al., 2008). Certains de ces organismes ont différentes enzymes combinées en cellulosomes (complexes multienzymatiques, grands, stables et spécialisés dans l'adhérence et de la dégradation de la cellulose) qui sont situées sur l’enveloppe cellulaire de l'organisme (Liang et al., 2014). Les enzymes extracellulaires telles que les cellulases, les protéases et les lipases sécrétées par les bactéries hydrolytiques catalysent l’hydrolyse des macromolécules qui sont le point initial de la dégradation (Song et al., 2005). Deux stratégies ont été résumés par Batstone et al., 2002:

i. La sécrétion d'enzymes hydrolytiques dans le milieu par les consortiums microbiens qui décomposent des fragments ou des substrats solubles (Jain et al., 1992).

ii. Les espèces microbiennes se fixent et sécrètent des enzymes qui hydrolysent les particules à hydrolyser et produisent des produits solubles (Vavilin et al., 1996, 2008).

Les organismes actifs dans un procédé d'hydrolyse comprennent différents groupes bactériens tels que les Bacteroidetes, Clostridium, Acetivibrio, Coprothermobacter, connus pour effectuer cette étape dans des réacteurs hydrolytiques / acidogènes opérant dans des conditions mésophiles et thermophiles (Cirne et al., 2007; Etchebehere et al., 1998; O’Sullivan et al., 2005; Sträuber et al., 2012; Yang et al., 1990). Les matières organiques générées dans cette étape deviennent les substrats de la phase acidogène suivante et les espèces bactériennes concernées ne sont pas limitées uniquement à cette étape, mais peuvent rester actifs dans la phase acidogène (Doi, 2008; Heeg et al., 2014).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Les facteurs environnementaux tels que le pH, l'humidité, la taille des particules, l'accumulation des produits d'hydrolyse et la température peuvent influencer la vitesse et le degré de l'hydrolyse des substrats (Liotta et al., 2014; Sanders et al., 2000). Il est donc important de tenir compte de ces facteurs lors de la conception et de l'exploitation des réacteurs en bio-méthanisation ; ainsi les innovations dans le domaine de la biotechnologie devraient se concentrer sur les moyens d'amélioration de l'hydrolyse, phase limitante de la DA.

1.1.2. Acidogénèse

Les produits organiques issus de l'hydrolyse (monomères et dimères…) sont décomposés de manière intracellulaire au cours de l’acidogénèse. Les bactéries impliquées dans cette étape, en plus de celles actives au cours de l'étape d'hydrolyse, comprennent des membres de la classe des Clostridia, de la famille des Bacteroidaceae et des membres des Actinomycetes et des Proteobacteria (Balk et al., 2002). La famille des Anaerolineacea dans le phylum des Chloroflexi et les genres Bifidobacterium et Paludibacter dans le phylum des Bacteroidetes sont connus pour être exclusivement actifs dans la phase acidogène (Ueki et al., 2006). Ces bactéries ont des taux de croissance plus élevés que les acétogènes et les méthanogènes (Ahring et al., 2001; Solera et al., 2002).

Les substrats et les produits de cette étape sont variables, selon le substrat de départ.

Les produits peuvent être des intermédiaires inorganiques (tels que H2 et CO2) ou des intermédiaires organiques, tels que des acides gras volatils (AGV) à chaîne courte [des composés en C1-C5 tel que l’acétate, le propionate, le butyrate, le valérate et l’iso-valérate…] et des alcools. Selon certains auteurs (Mao et al., 2015). L’acide lactique est aussi considéré comme un AGV à chaine courte. Les composés formés pendant l’acidogénèse dépendent du substrat, des conditions environnementales du processus, ainsi que des microorganismes présents (Mao et al., 2015). Ces nouveaux produits ne peuvent pas être utilisés directement par des bactéries méthanogènes et doivent être transformés par acétogénèse. Parmi les produits de l'acidogénèse, l'ammoniac et le sulfure d'hydrogène issus de la dégradation des protéines donnent une odeur désagréable intense à cette phase du processus doivent également être mentionnés (Claassen et al., 1999; Conrad, 1999; Ntaikou et al., 2010). Les bactéries acidogènes anaérobies facultatives utilisent de l'oxygène introduit dans le procédé, créant des conditions favorables au développement des microorganismes anaérobies obligatoires (Ali Shah et al., 2014).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

1.1.3. Acétogénèse

La troisième étape du processus de la DA est l'acétogénèse. Dans cette étape, les produits de fermentation sont oxydés en des formes plus simples. Selon Heeg et al., 2014, cette étape exige une coopération étroite entre les microorganismes qui réalisent l'oxydation (tel que les microorganismes sulfato-réducteurs) et les méthanogènes qui sont actifs dans l'étape suivante (qui produisent effectivement le méthane). Les substrats pour l’acétogénèse se composent de divers acides gras, des alcools, des acides aminés et des composés aromatiques.

Cette voie est nécessaire car certains produits de l’acidogénèse, tels que les AGVs à courte chaine comme le propionate et le butyrate ne peuvent pas être directement utilisés par les méthanogènes. Ceux-ci doivent d'abord être transformées en acétate, formate et H2 et CO2. Les acétogènes sont à l'origine de ce processus (Heeg et al., 2014). Les genres les plus fréquemment rapportés responsables de la dégradation du butyrate appartiennent aux Syntrophomonas et Syntrophus des Firmicutes et des Proteobacteria (Sousa et al., 2007; Zhang et al., 2005). Il a été rapporté que les microorganismes dégradant le propionate ont été identifiés dans la classe des Deltaproteobacteria (de Bok et al., 2001; Boone and Bryant, 1980; McInerney et al., 2008; Müller et al., 2010) et des Clostridia (De Bok et al., 2005; Imachi et al., 2002; Plugge et al., 2002). Les travaux sur les propriétés génomiques et les mécanismes de réaction de ces processus sont résumés dans une revue de Müller et al., 2010.

Les bactéries acétogènes poussent aussi beaucoup plus rapidement que les méthanogènes (Shigehisa and Takane, 1994). L'interaction entre les bactéries de cette étape et les archées méthanogènes impliquées dans la méthanogénèse est connue comme la syntrophie. En plus de l'hydrogène, ces microorganismes forment principalement de l'acétate et du dioxyde de carbone. Syntrophomonas, Syntrophus, Clostridium et Syntrophobacter sont des exemples de genres capables d’effectuer l’acétogénèse en syntrophie avec des organismes hydrogénotrophe (McInerney et al., 2008).

1.1.4. Méthanogénèse

La méthanogénèse est l'étape finale de la réaction de dégradation anaérobie, produisant du méthane comme principal produit final (Goswami et al., 2016). Les six substrats principaux utilisés sont le dioxyde de carbone, l'acide formique, l'acide acétique, le méthanol, la méthylamine et le diméthylsulfure. La voie la plus commune convertit le dioxyde de carbone en méthane grâce à l’hydrogène (Slonczewski and Foster, 2013). Les cinq autres

Chapitre I : Synthèse bibliographique voies peuvent converger en deux selon différents cofacteurs méthanogènes spécifiques. La voie qui conduit à la production de méthane dépend uniquement du consortium méthanogène et la disponibilité des substrats appropriés qui favorise le processus de digestion. Le méthane est, donc, un sous-produit de ce processus de décomposition anaérobie qui vise à briser les acides organiques et produire de l’énergie pour les microorganismes présents dans l'environnement (Wang et al., 2011). Par conséquent, les trois principales voies (Figure I. 2) sont les suivants :

1. Méthanogénèse méthylotrophe, à savoir, la production de méthane par décarboxylation du méthyl- alcools/méthyl-amines, méthyl-sulfures, etc., (Figure I. 2A),

2. Méthanogénèse hydrogénophile ou hydrogénotrophe, à savoir, la production de

méthane par la réduction de CO2 en présence d’hydrogène (Figure 1. 2B) ; et,

3. Méthanogénèse acétoclastiques ou acétotrophique, à savoir, la production de méthane par décarboxylation d'acétate (Figure I. 2C).

Le véritable processus de méthanogénèse est beaucoup plus complexe et nécessite des substrats et des cofacteurs spécifiques. Les deux substrats des méthanogènes les plus courants sont le dioxyde de carbone et l'acétate. Dans la voie de dioxyde de carbone

(méthanogénèse hydrogénotrophe), le CO2 est transformée en méthane par le passage du carbone dans une série de cofacteurs. Le dioxyde de carbone est fixé à l'aide d'hydrogène dans méthanofurane. Le carbone est ensuite transmis à travers trois cofacteurs, tétrahydrométhanoptérine (H4MPT), Coenzyme F420 ou 8-hydroxy-5-déazaflavine (F420), et l’acide 2-mercaptoéthanesulfonique ou coenzyme M (HS-CoM), jusqu'à ce que le carbone atteigne le coenzyme B (HS-CoB), qui sert comme d’accepteur terminal d'électrons (Slonczewski and Foster, 2013). La méthanisation à partir d'acétate (méthanogénèse acétoclastique) nécessite le couplage des concentrations H2 et un potentiel de sodium pour produire et utiliser les cofacteurs HS-CoM (coenzyme M) et HS-CoB (coenzyme B) afin de produire du méthane (Goswami et al., 2016; Slonczewski and Foster, 2013).

Les méthanogènes sont les microorganismes responsables de ce processus. Ces microorganismes strictement anaérobies obligatoires appartiennent au domaine Euryarchaeota (Ali Shah et al., 2014). Les méthanogènes appartiennent à sept ordres euryarchéens (Methanococcales, Methanopyrales, Methanobacteriales, Methanomicrobiales,

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Methanosarcinales, Methanomassiliicoccales et Methanocellales) et sont unifiées par leur capacité unique à gagner de l'énergie à partir de la production de méthane (Borrel et al., 2013). Les archées méthanogènes les plus répandus dans les systèmes de la DA comprennent quatre ordres (Liu and Whitman, 2008).

Figure I. 2: Les voies biochimiques produisant le CH4 à partir des différents produits initiaux (Goswami et al., 2016). A) Méthanogénèse méthylotrophe. B) Méthanogénèse hydrogénotrophe. C) Méthanogénèse acétoclastique.

2− Abréviations: MF, methanofuran; CHO-MF, formylmethanofuran; Fdred , reduced ferrodoxin; Fdox, oxidized ferredoxin; FDM (W/Mo-FMD), (tungsten/molybdenum-dependent) formylmethanofuran dehydrogenase; H4MPT, tetrahydromethanopterin; FTR, Formylmethanofuran: tetrahydromethanopterin formyltransferase; 5 10 CHO–H4SPT, formylmethanofuran; MCH, N ,N -methenyl tetrahydromethanopterin cyclohydrolases; + CH≡H4SPT , methenyl tetrahydromethanopterin; F420H2, reduced cofactor F420; MTD, coenzyme F420- 5 10 dependent N , N -methylene tetrahydromethanopterin dehydrogenase; CH2=H4SPT, methylene 5 10 tetrahydromethanopterin; MER, N ,N -methylene tetrahydromethanopterin reductase; CH3–H4SPT, methyl tetrahydromethanopterin; CoM–SH, coenzyme M; MTR, N5-methyl tetrahydromethanopterin: Coenzyme M methyltransferase; CH3–S–CoM, methyl coenzyme M; CoB–SH, coenzyme B; MCR, methyl coenzyme M reductase; CoM–S–S–CoB, coenzyme M-HTP heterodisulfide.

Les quatre ordres sont théoriquement séparés en trois groupes basés sur des caractéristiques phylogénétiques et phénotypiques (Anderson et al., 2009; Bapteste et al., 2005). Trois de ces ordres sont des méthanogènes hydrogénotrophes: Methanobacteriales, Methanomicrobiales et Methanococcale. L'ordre des Methanosarcinales contient les familles acétoclastiques des Methanosaetaceae et des Methanosarcinaceae. Le quatrième ordre,

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Methanosaetaceae comprend un seul genre Methanosaeta qui utilise uniquement l'acétate comme source d'énergie, tandis que les différents groupes de genre dans les

Methanosarcinaceae sont capables d’utiliser à la fois H2 et acétate comme source d'énergie (Boone et al., 1993).

un cinquième ordre, les Methanopyrales, qui contient une seule espèce, Methanopyrus kandleri (Kurr et al., 1991), hyperthermophile peut également être présente dans les systèmes de DA (Boone, 2001). La digestion anaérobie hyperthermophile (70°C) digesteur anaérobie fonctionnant à s'est avérée être une alternative fiable pour les méthodes de prétraitement habituellement nécessaires avant la digestion des déchets solides comme les déchets solides municipaux. L'étape de digestion anaérobie hyper-thermophile de deux jours a aidé à solubiliser le mélange de co-digestion, fournissant des matériaux plus faciles à digérer et augmente le rendement de production de biogaz (Alqaralleh et al., 2016; Lee et al., 2009).

Les méthanogènes sont sensibles aux facteurs environnementaux et se révèlent dépendants de la température, de la croissance et des taux d'utilisation/d’affinité du substrat. Les taxons Methanomicrobia, Methanobacteria et Methanosarcinales semblent dominer les boues anaérobies (Nelson et al., 2011). Par contre, Methanosaeta se développe dans les systèmes digestifs anaérobies stables (McHugh et al., 2003); une forte affinité pour les substrats leur permet de dominer Methanosarcina à faible concentration en acétate (Conrad, 1999; Raskin et al., 1995). Les méthanosarcines sont favorisées dans les environnements à haute teneur en acétate et en hydrogène (par exemple lorsqu'on applique un taux de charge organique élevé à un système, (Daniels et al., 1984; Zinder, 1993), ils sont considérés comme étant plus performants que Methanosaeta (Leclerc et al., 2004).

Le bon fonctionnement du consortium archéo-méthanogène est nécessaire pour s'assurer que les quantités fortes d'acétate et d'hydrogène ne s'accumulent pas dans le réacteur en inhibant d’autres groupes trophiques. Une concentration élevée d'acides gras volatils dans le réacteur peut limiter la méthanogénèse. L'accumulation des AGV peut se produire en période de stress, comme des taux de charge plus élevés, et conduit à une chute du pH de la méthanogénèse (Griffin et al., 1998).

1.1.5. Relation entre méthanogénèse et sulfato-réduction dans le processus de la digestion anaérobie

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Des interactions ont été observées entre les méthanogènes et les autres populations microbiennes. La dégradation de produits comme le propionate et le butyrate n'est thermodynamiquement possible que lorsque la pression partielle d'hydrogène est faible (Schink, 1997). Par conséquent, les acétogènes producteurs d'hydrogène ne se développeront qu'en collaboration avec les consommateurs d'H2 pour faciliter le transfert d'hydrogène entre espèces (Stams and Plugge, 2009). Les Archaea méthanogènes, les bactéries homoacétogènes et les bactéries sulfato-réductrices (en particulier dans des conditions riches en sulfate) sont responsables du maintien d'une faible pression partielle d'hydrogène dans les systèmes de DA (Ariesyady et al., 2007; Stams and Plugge, 2009; Zehnder, 1988). Le maintien d'une faible pression partielle d'hydrogène est essentiel car l'accumulation d'hydrogène peut inhiber l'action des acétogènes.

La possibilité d'utilisation de différentes sources de carbone organique par les sulfato- réducteurs a été établie par Widdel, 1980 qui isola et décrivit de nouveaux genres et espèces de bactéries sulfato-réductrices capables de se développer sur acétate, propionate, butyrate, acides gras (C14, C16) et benzoate, et dont certains peuvent réaliser une oxydation complète de la matière organique jusqu'à la formation de CO2. Cependant, Le genre Desulfovibrio peut participer, en utilisant du sulfate et du lactate, à la formation de l’acétate et de l’hydrogène dans le processus de respiration anaérobie, on parle d’oxydation incomplète. Les bactéries sulfato-réductrices entrent en compétition avec les méthanogènes en utilisant le même substrat (hydrogène ou acétate) et produisent des sulfures et inhibant la formation de méthane comme le montre la Figure I. 3.

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Figure I. 3: Interaction microbienne entre les bactéries sulfato-réductrices et les méthanogènes vis-à-vis de l’acétate et l’hydrogène (Gerardi, 2003).

Beaucoup de groupes bactériens dans un digesteur anaérobie rivalisent souvent pour le même substrat et accepteur d'électrons. Le méthane est produit à partir de l’acétate et l’H2 par des microorganismes méthanogènes ; cependant, l'hydrogène est utilisé en présence du sulfate 2- (SO4 ) par les bactéries sulfato-réductrices et le sulfure d'hydrogène (H2S) est produit (Ali Shah et al., 2014).

1.2. Paramètres physico-chimiques influençant la digestion anaérobie

La DA des matières organiques est un processus complexe, impliquant un certain nombre d’étapes de dégradation réalisées par différents membres du consortium microbien. Ainsi, un certain nombre de facteurs influent sur la croissance microbienne qui affecte à son tour le processus de la DA et par conséquent, les rendements de production de biogaz (Mathew et al., 2015). Les bactéries hydrolytiques / acidogènes et archées méthanogènes diffèrent largement dans leur conditions de croissance préférées, tels que le pH optimum et les besoins en nutriments. Le succès de tout effort d'optimisation des processus dépend essentiellement de la mesure dans laquelle la croissance, le métabolisme de tous les microorganismes impliqués est pris en charge (Heeg et al., 2014).

1.2.1. Température

Chapitre I : Synthèse bibliographique

La DA est appliquée à différentes gammes de températures, à savoir en psychrophilie (<20 °C), en mésophilie (25-40 °C), en thermophilie (45-60 °C) (Khalid et al., 2011; Mathew et al., 2015) et en hyperthermophilie (>70°) (Alqaralleh et al., 2016; Lee et al., 2009). Les structures des communautés microbiennes actives à deux optimums de température sont très différentes. Un passage d’une température mésophile à une température thermophile (ou vice versa) peut entraîner une forte diminution de la production de biogaz (Chae et al., 2008). La production de biogaz dans un régime thermophile est beaucoup plus élevé que pour les deux autres régimes mésophiles et psychrophiles. Les bioréacteurs thermophiles modernes peuvent produire 2-6 m3 de biogaz par m3 d'installation, ce qui revient à 5-15 kg de de masse sèche (ou 50-150 kg de masse humide) (Goswami et al., 2016). Pour les installations de biogaz mésophiles, ces valeurs sont de 0,2-0,4 m3 par m3 d'installation et de 0,5-1 kg sur une base de masse sèche (ou 5-10 kg de masse humide). Les réacteurs à biogaz, fonctionnant dans des conditions thermophiles, peuvent être introduits dans les exploitations agricoles où le nombre d'animaux est supérieur à 5 (Wu et al., 2006).

La DA thermophile présente un avantage de vitesse par rapport à la digestion mésophile en raison de ses vitesses de réaction plus élevées et de sa capacité de charge plus élevée. Cependant, une acidification peut se produire pendant la DA thermophile, inhibant la production de biogaz. D'autres inconvénients tels que la diminution de la stabilité, une toxicité et une sensibilité accrue aux conditions environnementales, des investissements plus importants et un apport énergétique net plus élevé ont également été identifiés (Mao et al., 2015). Ce processus est plus sensible aux changements environnementaux que le processus mésophile. Bien que les systèmes mésophiles présentent une meilleure stabilité du procédé et une plus grande richesse en bactéries, ils offrent de faibles rendements en méthane et souffrent d'une biodégradabilité médiocre et d'inconvénients liés au déséquilibre des nutriments (Bowen et al., 2014).

Par conséquent, les conditions optimales pour la DA seraient une hydrolyse/acidogénèse thermophile et une méthanogénèse mésophile, ce qui est compatible avec un procédé d’une DA à deux phases. La température ambiante/saisonnière a également été utilisée pour traiter les intrants organiques (Mao et al., 2015). Ce procédé ne nécessite pas d'apport supplémentaire de chaleur, mais présente une production de méthane plus faible et une stabilité inférieure au processus mésophile dû aux changements de température dans l'environnement. La DA hyper-thermophile présente une plus grande résilience dans le traitement des co-substrats contenant des concentrations élevées de protéines, de lipides et de 16

Chapitre I : Synthèse bibliographique matières solides non biodégradables {Citation}. Cependant, les microorganismes impliqués dans le processus de la DA sont très sensibles aux changements de température affectant la production d'hydrogène et de méthane, et la décomposition des matières organiques. La diminution de la température entraîne une diminution du taux de production d'AGV, de la concentration en ammoniac, du taux d'utilisation du substrat (Bowen et al., 2014), de la croissance des microorganismes et une augmentation des temps de «démarrage», ce qui diminue les rendements. L'augmentation du pH, l'hydrolyse des particules organiques et le potentiel de méthane ont été obtenus en augmentant la température du digesteur (Wang et al., 2014). De plus, des corrélations linéaires entre l’ammoniac total et la température (20-60 °C) ; et la production de biogaz entre les températures de 10 °C et 20 °C ont été observées (Hill et al., 2001).

1.2.2. pH

Le pH opérationnel dans un digesteur anaérobie affecte directement la digestion et les produits. La gamme de pH idéal pour la DA est de 6,8-7,4 (Mao et al., 2015). Le taux de croissance des micro-organismes est significativement affecté par le changement de pH. Une augmentation de l'abondance relative des espèces microbiennes a été observée dans des pH de 4 à 7 à (Fang and Liu, 2002). À un pH de 6 la population bactérienne dominante est Clostridium butyricum, alors qu'à pH 8, les espèces du genre Propionibacterium semblent régner pendant l'acidogénèse anaérobie avec une culture continue (Horiuchi et al., 1999). Pour réduire la toxicité de l'ammoniac due à une concentration accrue d'ammoniac libre, le contrôle du pH représente une méthode possible (Dinamarca et al., 2003). La composition des AGVs au cours de la DA est sensiblement affectée par le pH, comme le montre la Figure I. 4 (Fang and Liu, 2002). Dans une autre étude, lorsque le pH a été fixé à 6, l'activité des enzymes hydrolytiques était plus élevée, ce qui a donné la plus forte concentration d'AGVs, avec une concentration de DCO forte (Demande chimique en oxygène soluble) et un rapport AGV/DCO faible (Jiang et al., 2013).

Une corrélation positive significative a également été observée entre l'hydrolyse et le pH (Zhang et al., 2009). Par conséquent, on considère que la constante de vitesse d'hydrolyse dépend du pH. La méthanogénèse est la plus efficace à pH de 6,5-8,2 avec un optimum de 7,0 (Lee et al., 2009). Le taux de croissance des méthanogènes est fortement réduit à des niveaux de pH inférieurs à 6,6 impliquant une diminution de l'activité des microorganismes méthanogènes à un pH plus élevé ou plus bas (Zhang et al., 2009).. Le pH optimum de

Chapitre I : Synthèse bibliographique l'acidogénèse était compris entre pH 5,5 et 6,5 (Kim et al., 2003), ce qui explique pourquoi un processus de DA à deux étapes séparant les processus d'hydrolyse/acidification et d'acétogénèse/méthanogénèse est le mode de fonctionnement préféré (Mao et al., 2015).

Figure I. 4: Composition en AGV en fonction du pH au cours de la digestion anaérobie (Fang and Liu, 2002).

1.2.3. Rapport carbone/azote (C/N)

Le rapport C/N dans la matière organique joue un rôle crucial dans la digestion anaérobie (Mathew et al., 2015). Ce rapport C/N reflète les niveaux de nutriments d'un substrat de digestion. Les systèmes de digestion sont sensibles au rapport C/N ; un rapport C/N élevé induit un faible taux de solubilisation des protéines et conduit à des faibles concentrations d’ammoniac total et d’acides gras totaux dans un système. Ainsi, l'inhibition de l’émission de l'ammoniac peut être évitée en optimisant le rapport C/N dans le processus de DA (Mao et al., 2015). Les substrats avec un rapport C/N excessivement faible augmentent le risque d'inhibition par l'ammoniac, qui est toxique pour les méthanogènes et provoque une utilisation insuffisante des sources de carbone. Cependant, un rapport C/N excessivement élevé est insuffisant pour maintenir la biomasse cellulaire et conduit à une dégradation rapide 18

Chapitre I : Synthèse bibliographique de l'azote par les populations microbiennes, ce qui entraîne une production de biogaz plus faible et vice versa (Lee et al., 2009; Mathew et al., 2015). Le rapport C/N optimal pour la digestion anaérobie s'est avéré être compris entre 20 et 30 ou entre 20 et 35, un ratio de 25 étant le plus couramment utilisé (Punal et al., 2000; Yen and Brune, 2007; Zhang et al., 2009).

Des quantités insuffisantes de carbone ou d'azote peuvent limiter les performances de La DA. L'addition de matière glucidique améliore sensiblement la conversion des protéines et l'activité protéase (Yen and Brune, 2007). Des études ont montré que l'ajustement du rapport C/N pour la digestion du fumier de porc permet une production maximale de méthane avec une addition d'urée (source d’azote) ou de glucose (source de carbone) (Hills, 1979; Mao et al., 2015).

1.2.4. Demande Chimique en Oxygène (DCO)

La DCO décrit la quantité d'oxygène nécessaire pour oxyder complètement les échantillons en présence d’oxygène, et est déterminée expérimentalement en mesurant la quantité d'un agent oxydant chimique nécessaire pour oxyder complètement un échantillon (Manariotis et al., 2010). Dans cette situation, la DCO est éliminé par transformation de composés organiques en méthane (CH4), une quantité significative de CO2, H2 et des quantités négligeables d'autres gaz tels que H2S (Mathew et al., 2015). Par conséquent, le potentiel-méthane est liée au potentiel d’oxydoréduction des matières organiques (DCO) dans un échantillon et à l'efficacité du système.

1.2.5. Besoins nutritionnels

L'exigence d'éléments nutritifs est une préoccupation majeure pour le fonctionnement stable du processus de la DA (Mathew et al., 2015). La croissance des méthanogènes dépend de nombreux ions tels que le sodium, le nickel, le cobalt, le fer, le zinc, le magnésium, le calcium, le potassium, les cations de molybdate ou de tungstate et des anions phosphate. À l'exception de sodium, qui est nécessaire pour coupler la méthanogénèse avec la phosphorylation de l'ADP, tous les autres ions sont nécessaires pour la synthèse des enzymes, des groupes prosthétiques, et des coenzymes (Hattori et al., 2009; Kaster et al., 2011). Il a été également rapporté que les conditions optimales en Fe, Co et Ni ont été identifiées comme 200, 6 et 5,7 mg/kg de DCO éliminée pour une méthanogénèse des intrants alimentaires (Qiang et al., 2012). Chez des méthanogènes, Les concentrations cellulaires supérieures à

Chapitre I : Synthèse bibliographique

1,32, 1,13, 0,12, 4,8, et 30 g.l-1 ont été trouvés limité par une concentration de Fe à 5 mg.l-1, Zn à 1 mg.l -1, Cu à 0,1 mg.l-1, Ni à 1,2 mg.l-1, et Co à 4,8 mg.l-1, respectivement (Zhang et al., 2008b).

1.2.6. Temps de rétention

Le temps de rétention est le temps requis pour compléter la dégradation de la matière organique. Elle est associée à la vitesse de croissance microbienne et dépend de la température du procédé, de la composition du substrat et de la charge organique (OLR, Organic Loading Rate) (Mao et al., 2015). On distingue deux types de temps de rétention : le « Solide Retention Time » (SRT), qui est défini comme le temps moyen que les bactéries passent dans un digesteur, et le « Hydrolic Retention Time » (HRT) qui est défini par l'équation suivante :

HTR = V/Q (Ekama and Wentzel, 2008), où V est le volume du réacteur biologique et Q la vitesse d'écoulement d’un effluent.

En résumé, un faible OLR et un HRT long fournissent la meilleure stratégie pour obtenir des rendements de méthane constants et maximaux. Les variations de SRT déstabilisent et dégradent la performance des systèmes anaérobies (Figure I. 5).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Figure I. 5: Effet de la SRT sur la stabilité et la performance de la digestion anaérobie

(Kwietniewska and Tys, 2014).. AGVs= Acides gras volatiles ; SV= Suspension volatile.

Un temps de rétention moyen de 15 à 30 jours est nécessaire pour traiter les échantillons dans des conditions mésophiles. L'obtention d'un HTR efficace dépend de la composition du substrat et du taux de charge organique OLR ; typiquement, quelques semaines sont nécessaires. La diminution du HTR conduit habituellement à l'accumulation des AGVs, alors qu’une augmentation conduit à l'utilisation insuffisante (élution) des composants du digesteur. Pour une biomasse algale par exemple, un HRT inférieur à 10 jours entraîne une faible productivité du méthane (Kwietniewska and Tys, 2014).

Une augmentation de la SRT de 10 à 20 jours a entraîné une diminution de 25% de la production de biogaz (Bolzonella et al., 2005). La production de biogaz obtenue à un SRT de 12 jours a été triplée par rapport à celle observée pour une SRT de 35 jours. Le déséquilibre du procédé est observé à cause de la formation de mousse, à l'accumulation de AGVs et à l'alcalinité accrue à un SRT de 9 jours pendant la digestion des boues d'épuration déshydratées (Nges and Liu, 2010).

1.2.7. Sulfures : Composés inhibiteurs de la digestion anaérobie

Les sulfures produits par les bactéries sulfato-réductrices peuvent, en phase liquide, inhiber les activités d'autres espèces bactériennes en fermentation anaérobie, en particulier des

Chapitre I : Synthèse bibliographique bactéries acétogènes syntrophes et des méthanogènes (Wiemann et al., 1998). Les sulfures peuvent également réagir avec des métaux qui sont des composants importants des enzymes fonctionnels, comme le fer, ce qui affecte leur activité (Chen et al., 2010). La forme non dissociée du sulfure d'hydrogène dissous est toxique car elle peut se diffuser à travers la membrane cellulaire et inhiber l'activité cellulaire. L'inhibition se manifeste par la dénaturation de protéines indigènes par formation de liaisons croisées sulfures ou disulfures entre les chaînes polypeptidiques (Chen et al., 2008).

Les sulfures sont toxiques pour les microorganismes à l'état non dissocié, la toxicité des sulfures est associée à l'apparition de formes de dissociation individuelles du soufre sulfuré en rapport avec les valeurs du pH. La valeur de pKa pour cette balance est autour de 7 et dépend de la température ; une température plus élevée diminue la valeur de pKa. Un tel changement de pH affecte la proportion entre la forme non dissociée (H2S, sulfure d’hydrogène) et la forme dissociée (HS-, ion sulfhydrile) (McCartney and Oleszkiewicz, 1991). L'augmentation du pH de 7 à 8 réduit la proportion de forme non dissociée de 50% à

9% et donc la proportion de H2S gazeux. La valeur optimale pour les bactéries anaérobies, en particulier pour les méthanogènes sensibles, est cependant d'environ pH 7 (Pokorna and Zabranska, 2015).

D’un point de vue technique, une fois dans la phase gazeuse (dans le biogaz), à des concentrations de 500 ppmv à 20000 ppmv (0,5 à 2%), il cause non seulement de graves problèmes sensoriels et toxiques, mais corrode également le béton (Okabe et al., 2007) et des structures en acier dans les stations de production de biogaz (Zhang et al., 2008a) telles que les tuyaux et les pompes (Burgess et al., 2001). De plus, il raccourcit considérablement la durée de vie des moteurs à gaz des unités de cogénération, où il dégrade l'huile lubrifiante (Gayh et al., 2010). La combustion de biogaz avec des concentrations plus élevées de sulfure d'hydrogène provoque également des problèmes avec des émissions de SOx excessives. Outre l'effet inhibiteur dans le processus biologique, ce sont les principales raisons pour lesquelles il est nécessaire d'éliminer le sulfure d'hydrogène du biogaz avant son utilisation pour la production d'énergie (Pokorna and Zabranska, 2015).

1.3. Évolution de la technologie des bioréacteurs pour la production durable de biogaz

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Un bioréacteur peut se référer à tout dispositif fabriqué ou conçu ou un système qui prend en charge un environnement biologiquement actif (Wu et al., 2006). Pour la production de biogaz, la recherche et les efforts de développement ont été dirigés pour conserver une forte densité de microorganismes utiles, pour obtenir un traitement rapide et efficace, avec l'objectif d'améliorer le système conventionnel. À cet effet, les progrès technologiques considérables ont permis d’une part la formation de flocs microbiens et d’autre part l'adhérence microbienne sur des supports ; ce qui maintient les cellules dans le réacteur. Concernant la productions des flocs microbiens, le système de boue anaérobie (upflow anaerobic sludge blanket reactor, UASBR) (Lettinga et al., 1980) s'est révélée utile ; tandis que pour le deuxième cas (adhérence bactérienne), le procédé de filtration anaérobie (upflow anaerobic filter process reactor, UAFPR) (Rajathi, 2013; Young and McCarty, 1969) et le réacteur anaérobie à lit fluidisé (anaerobic fluidized-bed reactor, AFBR) (Buffière et al., 2000; Jeris, 1983) ont été développés. Dans tous ces procédés récemment développés, l’acidogénèse peut se produire plus rapidement que la méthanogénèse, ce qui conduit à l'accumulation de produits inhibiteurs tels que des acides gras volatils. Le processus de la digestion anaérobie à deux phases (two-phase methane production, TPMP) ont été alors développées pour résoudre ce problème (Bowker, 1983; Sharma et al., 2012).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Figure I. 6 : Représentation schématique des différents types de bioréacteurs (Goswami et al., 2016). 24

Chapitre I : Synthèse bibliographique

1.3.1. “Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor” (UASBR)

La construction d'un processus UASBR capable de favoriser l'autogranulation (floculation) des microorganismes anaérobies a été rapporté par Lettinga et al., 1980. Dans ce type de bioréacteur, l'eau contenant des intrants organiques entrant par le fond du réacteur passe à travers un lit de boue où les matières organiques sont décomposées par voie anaérobie. Le gaz produit est ensuite séparé par un séparateur gaz-liquide et le liquide clarifié est évacué sur un déversoir, tandis que la boue granulaire se dépose naturellement au fond (Pol et al., 2004; Singh and Viraraghavan, 1998) (Figure I. 6A). Des réacteurs UASB à grande échelle sont désormais opérationnels en Europe, aux États - Unis et au Japon, avec plus de 100 stations récemment construites au Japon (Ziemiński and Frąc, 2012).

On constate divers paramètres importants pour le bon fonctionnement des UASBR à savoir le diamètre des flocs, la densité microbienne et la structure du séparateur gaz-solide qui retient efficacement les granulés microbiens à l'intérieur du réacteur. Les critères suivants doivent être respectés pour obtenir un fonctionnement idéal des UASBR : (a) la sélection d'une eau usée appropriée capable de former une auto-granulation ; (b) le fonctionnement du réacteur sans agitation mécanique ; (c) le démarrage à une charge de DCO relativement faible ; (d) la prévention de la croissance microbienne filamenteuse. La formation des granules dans un système UASB est influencée par la croissance de Methanothrix, archées méthanogènes qui produit des granules sphériques (Goswami et al., 2016).

1.3.2. “Upflow Anaerobic Filter Process Reactor” (UAFPR)

Les systèmes UAFPR ont été initialement développés par Young and McCarty, 1969 en utilisant des pierres et des matières plastiques pour la fixation microbienne. Ces systèmes ont été appliqués à la production de biogaz à partir des eaux usées domestiques et des eaux usées industrielles contenant des niveaux relativement faibles de matières organiques. Ce type de bioréacteur contient un «milieu», et un support microbien (Figure I. 6 B). Des microorganismes existent non seulement dans les espaces au sein du milieu, mais sont aussi associées à la surface du support. Par conséquent, une population microbienne à haute densité est retenue dans le réacteur, ce qui crée un mélange de flocs microbiens et aussi de l'adhérence. Afin d'éviter l'écoulement en court-circuit à travers la colonne garnie, un distributeur est monté en bas pour fournir un courant ascendant homogène des eaux usées. Au sommet, les eaux usées sont traités et leur biogaz produit est récupéré (Goswami et al., 2016).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Une étude sur les systèmes d’UAFPR à grande échelle montre que des eaux usées de distillerie d’alcool peuvent être traitées à une HRT de 7,8 jours avec 74% de DCO. L’application de ce procédé au traitement des eaux usées domestiques, en utilisant des anneaux de Raschig (2,5 cm) en tant que supports microbiennes, a entraîné l'élimination d’une DCO de 50 à 60% et l'élimination des solides en suspension (SS) de 70 à 80%, à un HRT allant de 5 à 33h (Young and McCarty, 1969).

Les effets des caractéristiques physiques, comme la taille et la forme des supports, sur l'élimination de la DCO ont été étudiés en utilisant des blocs modulaires ondulés, des anneaux de Pall, et des sphères perforées. Lors d'une charge DCO de 2 kg/m/jour, les blocs modulaires ondulés présentent une qualité supérieure, en supprimant 88% de la DCO. En plus des matériaux en plastique, de la terre cuite et des bouchons fondus se sont également avéré utiles dans des expériences de laboratoire sur la méthanogénèse du formate, de l'acétate, et du méthanol. La pierre ponce a été utilisé comme un support microbien pour la méthanogénèse de l'eau riche en méthanol provenant d’un condensat d'évaporation à partir d'une usine de pâte (COD charge : 12 kg/m3/jour, élimination de la DCO : 96%) (Youngsukkasem et al., 2013).

1.3.3. “Anaerobic Fluidized-Bed Reactor” (AFBR)

Dans ce système, les microorganismes anaérobies se développent sur la surface du support, induisent l'expansion de son volume ; par conséquent, ce réacteur est également désigné un «réacteur à lit élargi». L'utilisation d'eaux usées artificielle dans un AFBR (Figure I. 6 C), a donné lieu à l’élimination d’une DCO supérieure à 80%, à 20 °C pour une charge de DCO de 2 à 4 kg/m3/jour. Ce système est tolérant aux chocs des changements de température de 13 à 35°C et de 35 à 13°C. Dans le cas d’une charge DCO de 1,3 à 24 kg/m3/jour, un état d'équilibre est établi après 6 jours (Buffière et al., 2000; Jeris, 1983).

L’AFBR semble donc être capable de traiter des eaux usées à des températures relativement basses avec des DCO faibles ou élevées dans des changements de chocs de températures. Des améliorations d'ordre technique qui peuvent potentiellement réduire la puissance mécanique nécessaire pour la fluidisation comprennent la réduction du volume expansé et le choix d'un milieu à faible densité pour une surface spécifique élevée. Des milieux tels que le sable, le quartzite, l'alumine, l'anthracite, le charbon actif granulaire, ou

Chapitre I : Synthèse bibliographique de cristobalite ayant une taille de particule d'environ 0,5 mm sont habituellement utilisés (Goswami et al., 2016).

1.3.4. “Two-phase Methane Production” (TPMP)

Les bioréacteurs de production du biogaz comme l’UASBR, UAFPR, et l'expérience des AFBR révèlent des problèmes lorsqu'ils fonctionnent à des charges élevées de DCO, en raison du fait que le taux de croissance global de bactéries acidogènes est plus rapide que celui des méthanogènes. Lorsque cela se produit, les produits inhibiteurs tels que des acides gras volatils et de l’H2 s’accumulent dans le réacteur, ce qui ralentit l'ensemble du processus. Pour y remédier, les processus à deux phases (Figure I. 6D) consistant en fermentations acidogènes et méthanogénèse ont été étudiés (Berni et al., 2014; Bowker, 1983; Heeg et al., 2014; Sharma et al., 2012; Xie et al., 2012).

En outre, puisque les substances en suspension dans les eaux usées influencent grandement le rendement de l'UASBR ou l’UAFPR, une fermentation acidogène dans une première phase, en combinaison avec une seconde phase (UAFP ou UASB) est utile pour réduire les substances en suspension. Un système à deux phases consistant en une UAFP pour la première phase et une UAFP horizontale pour la seconde phase a été également proposé, avec lequel il doit être possible de traiter les eaux usées (COD 800-2600 mg/l) à une HRT de 2 -5.5 h avec une teneur élevée en méthane (~ 90%) (Berni et al., 2014).

2. Importance du cycle du soufre dans la digestion anaérobie

2.1. Cycle microbiologique du soufre

2.1.1. Généralités

Le cycle du soufre est un cycle biogéochimique majeur et complexe au sein duquel interviennent des bactéries aérobies et anaérobies de nature métaboliques très diverses. Dans ce cycle, trois groupes d’organismes peuvent être définis (Caumette, 1985): i) Les bactéries sulfato et sulfo-réductrices anaérobies qui produisent des sulfures (Rabus et al., 2015) ; ii) les sulfobactéries phototrophes pourpres et vertes anaérobies qui oxydent les sulfures en soufre élémentaire et sulfates et iii) les bactéries sulfo-oxydantes aérobies strictes ou anaérobies facultatives qui oxydent les sulfures par chimiolithotrophie ou par chimioorganotrophie (Pokorna and Zabranska, 2015).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Les sulfures sont produits généralement selon deux voies : soit par une réduction dissimilatrice en anaérobiose des sulfates par les bactéries sulfato-réductrices, du soufre élémentaire par les bactéries sulfo-réductrices et du thiosulfate par les bactéries thiosulfato- réductrices (Barton and Fauque, 2009) ; soit par la dégradation des acides aminés soufrés en sulfures (Muyzer and Stams, 2008). Par ailleurs, le H2S est également produit par la réduction assimilatrice du sulfate par toutes les bactéries aussi bien en aérobiose qu’en anaérobiose pour la synthèse des acides aminés soufrés (Tang et al., 2009). Cette réduction, dite assimilatrice, génère du soufre réduit qui est immédiatement utilisé pour la biosynthèse des acides aminés et des protéines. Cette réduction assimilatrice ne conduit donc pas à l'excrétion immédiate des sulfures (Rabus et al., 2015).

2.1.2. Transformations biologiques dans le cycle du soufre

Le cycle de soufre peut être divisé en deux parties ; anaérobie et aérobie (Figure I. 7). En anaérobiose, le cycle du soufre est entièrement microbien et le sulfure d’hydrogène est principalement issu de l’activité des bactéries sulfato-réducteurs (BSR). Elles utilisent le 2- sulfate (SO4 ) comme accepteur terminal d'électrons dans la dégradation de la matière organique, ce qui entraîne la production d'hydrogène sulfuré (H2S) (Rabus et al., 2015). D'autres transformations, sont effectuées par des groupes de micro-organismes spécialisés, entraînent une réduction du soufre (par exemple Desulfuromonas spp.) et une disproportionation du soufre (par exemple Desulfovibrio sulfodismutans).

En anaérobiose les sulfures sont oxydé par les bactéries phototrophes anoxygéniques en présence de lumière (Janssen et al., 2009; Pokorna and Zabranska, 2015; Tang et al., 2009) et par les bactéries sulfo-oxydantes anaérobies facultatives tel que Thiobacillus denitrificans (Sublette and Sylvester, 1987). En aérobiose, le cycle du soufre n’est microbien qu’en partie et le sulfure d’hydrogène peut être oxydé par les bactéries sulfo-oxydantes aérobies (BSO) chimiolithotrophes (Robertson and Kuenen, 2006). Ces bactéries sulfo-oxydantes constituent un filtre biologique très important (Friedrich et al., 2005).

Cette diversité métabolique au sein du cycle du soufre correspond dans l’environnement à une parfaite cohabitation entre les BSR et les BSO. Mais quand les parties réductrices et oxydantes de ce cycle ne sont pas en équilibre cela peut entraîner l'accumulation de composés intermédiaires tels que le soufre, le sulfure de fer et le sulfure d'hydrogène.

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Cependant l’utilisation des BSR et des BSO dans des conditions soigneusement contrôlées pourrait résoudre ces problèmes environnementaux (Muyzer and Stams, 2008).

Figure I. 7: Les transformations biologiques dans le cycle du soufre en conditions oxiques et anoxique (Muyzer and Stams, 2008).

2.2. Microbiologie des bactéries sulfato-réductrices

2.2.1. Rôle des bactéries sulfato-réducteurs (BSR) dans l’environnement

La sulfato-réduction microbienne est un processus d'une grande importance environnementale et biogéochimique, qui est principalement associée aux environnements marins en raison de leurs niveaux élevés de sulfate. La réduction microbienne du sulfate en sulfure initie et soutient le cycle du soufre et est l'un des principaux processus biologiques dans les sédiments marins (Muyzer and Stams, 2008; Slots, 1982). La sulfato-réduction microbienne induit un grand fractionnement massif entre le sulfate et le sulfure et constitue le 29

Chapitre I : Synthèse bibliographique principal processus de détermination des fractionnements d'isotopes du soufre conservés dans les archives géologiques qui fournissent des informations sur l'état d'oxydation de l'atmosphère terrestre à partir du début du Protérozoïque (Farquhar et al., 2000; Johnston, 2011). Pour ces raisons, les BSR jouent un rôle clé dans notre compréhension des cycles biogéochimiques du soufre et du carbone.

Les BSR sont un groupe hétérogène d'organismes anaérobies qui ont la capacité d'utiliser le sulfate comme accepteur terminal d'électrons pour l'oxydation des composés organiques ou de l'hydrogène, dans un processus dissimulateur qui conduit à la production élevée de sulfures. L'activité des BSR a un impact économique et environnemental important, principalement par la production de sulfures, à la fois toxique et corrosif. La corrosion microbienne des surfaces d'acier, de béton et de fer est un problème ayant des conséquences économiques énormes pour lesquelles les BSR ont été impliquées, en particulier dans les structures techniques maritimes (Barton and Fauque, 2009) et des stations de traitement des eaux usées (Janssen et al., 2009; Pokorna and Zabranska, 2015). L’acidification de pétrole et de gaz dû à l'action des BSR est également un problème sérieux en particulier pour l'industrie pétrochimique, étant également associé à des questions de biocorrosion et de sécurité du personnel (Tang et al., 2009; Youssef et al., 2009). Les BSR peuvent également aboutir à des processus bénéfiques ; elles sont utilisées dans plusieurs applications biotechnologiques, y compris le traitement du drainage acide des mines ; la réduction et l'immobilisation de métaux toxiques et/ou radioactifs, la récupération de métaux précieux et la biodégradation de composés organiques (Lens et al., 2008; Liamleam and Annachhatre, 2007; Wall and Krumholz, 2006).

Les BSR sont presque omniprésents dans les environnements anoxiques, à la fois naturels et modifiés, y compris les sédiments marins, les suintements d'hydrocarbures marins, les sources hydrothermales profondes, les eaux marines et d'eau douce, les rizières, les sols, les lacs sodiques, les fumerolles volcaniques, les champs d'épuration et les eaux usées industrielles, les zones humides et les environnements profonds du sous-sol (Brune et al., 2000; Hoehler and Jørgensen, 2013; Holmer and Storkholm, 2001; Orcutt et al., 2011). Les BSR sont également membres des communautés microbiennes complexes qui vivent en symbiose avec des hôtes animaux y compris l’Homme (Fröhlich et al., 1999; McFall-Ngai et al., 2013).

2.2.2. Diversité des bactéries sulfato-réductrices

Chapitre I : Synthèse bibliographique

La capacité de croissance par la sulfato-réduction est présente dans plusieurs lignées phylogénétiques qui appartiennent principalement au domaine des bactéries, avec seulement quelques sulfato-réducteurs archées rapportés à ce jour (Castro et al., 2000; Rabus et al., 2015). Beaucoup de BSR appartiennent à la classe des Deltaproteobacteria (y compris les Desulfovibrionales, Desulfobacterales, Desulfarculales et Syntrophobacterales), suivis par les organismes Gram-positifs sporulants dans les classes des Negativicutes et des Clostridia (y compris les membres des Peptococcaceae, des Thermoanaerobacteraceae et des Thermodesulfobiaceae) (Figure I. 8). D'autres lignées bactériennes comprennent les genres Thermodesulfobacterium et Thermodesulfatator de la classe des Thermodesulfobacteria et le genre Thermodesulfovibrio sont retrouvées dans la classe des Nitrospira.

Les sulfato-réducteurs archées comprennent le genre Archaeoglobus des Euryarchaeota (Klenk et al., 1998). Deux autres Archaea, Caldivirga maquilingensis (Itoh et al., 1999) et Thermoproteus tenax (Siebers et al., 2011) des Crenarchaeota, ont été signalés comme des microorganismes ayant la capacité à utiliser du sulfate dans leur métabolisme énergétique. Cependant, ces deux organismes n'ont pas les gènes qmo conservés chez tous les autres BSR et jugés essentiels pour la réduction du sulfate (Pires et al., 2003; Zane et al., 2010). Pour cette raison, la classification de ces organismes doit être considérée comme provisoire, jusqu'à la confirmation de leur croissance avec sulfate. Plusieurs espèces du genre Pyrobaculum (comprenant Pyrobaculum aerophilum, Pyrobaculum oguniense, Pyrobaculum arsenaticum, Pyrobaculum calidifontis) contiennent également l'ensemble minimum de gènes requis pour la réduction du sulfate (sat, AprBA, dsrABCMK), mais pas les gènes qmo, et aucun de ces organismes n'a été signalé capable de croître en présence du sulfate. Ceci suggère que les genres Caldivirga, Thermoproteus et Pyrobaculum peuvent réduire le thiosulfate ou le sulfite, mais pas le sulfate. Si c’est le cas, il y a des implications importantes pour l'évolution des BSR, puisque Archaeoglobus, le seul genre archée ayant une capacité confirmée de réduction des sulfates, a obtenu cette capacité par transfert latéral de gènes bactériens (Friedrich, 2002; Klein et al., 2001; Larsen et al., 1999; Meyer and Kuever, 2007). Cependant, à ce stade, il n'est pas possible de rejeter la possibilité que C. maquiligensis et T. tenax aient un jeu de protéines travaillant comme donneurs d'électrons à l’APS réductase et soient des vrais BSR.

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Figure I. 8: Les relations phylogénétiques et les principales propriétés physiologiques des genres de bactéries sulfato-réductrices et Archea (Rabus et al., 2015).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Certains genres des BSR sont thermophiles tel que les genres Thermodesulfovibrio (Nitrospiraceae), Thermodesulfobacterium (Thermodesulfobacteriaceae) Desulfovirgula (Thermoanaero-bacteraceae), Thermodesulfobium (Thermodesulfobiaceae), Thermodesulfo- rhabdus (Syntrophobacteraceae). Le genre Desulfotomaculum et les archées sont modérément thermophiles. La plupart des BSR se développent de manière optimale à pH neutre, mais quelques espèces acidophiles ont été décrites, à partir du phylum des firmicutes (Sanchez et al., 2013), y compris Desulfosporosinus acidiphilus, Desulfosporosinus acididurans et Thermodesulfobium narugense (Alazard et al., 2010; Mori et al., 2003; Pester et al., 2012).

Le premier génome séquencé d'une BSR était celui de l'archeaon Archaeoglobus fulgidus (Klenk et al., 1998), suivi du modèle PRS Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (Heidelberg et al., 2004) et de la psychrophile Desulfotalea psychrophila (Rabus et al., 2004). Une comparaison précoce entre ces génomes et celle de Desulfovibrio alaskensis G20 (anciennement Desulfovibrio desulfuricans G20) a révélé des différences significatives dans les gènes du métabolisme énergétique, plus particulièrement dans les cytochromes c périplasmiques et les complexes membranaires associés (Pereira et al., 2007; Strittmatter et al., 2009), qui sont abondamment exprimés chez les organismes Desulfovibrio, mais absents chez Archaeoglobus fulgidus ou Desulfotalea psycrophila. Le nombre de génomes séquencés a régulièrement augmenté, avec plus de 100 génomes de microorganismes actuellement identifiés comme des organismes capables de réduire du sulfate (http://genomesonline.org; http://img.Jgi.doe.gov/cgi-bin/w/main.cgi). Une liste non exhaustive de génomes des BSR publiés met en évidence la diversité génomique actuellement disponible. Une analyse génomique comparative comprenant 25 génomes de BSR a révélé les principaux gènes de la sulfato-réduction qui sont conservés chez tous les organismes, à savoir ceux impliqués pour le transport de sulfate, l'adénosine triphosphate nucléotide (ATP) sulfurylase (sat), les pyrophosphatases, l'APS reductase (aprBA), la sulfite réductase dissimilatrice et les protéines associées (dsrABCD), les complexes Qmo et Dsr associés à la membrane (qmoAB et dsrMK) et la ferrédoxine (Pereira et al., 2007).

2.2.3. Métabolisme énergétique des bactéries sulfato-réductrices

2.2.3.1. La voie de sulfato-réduction

La réduction dissimilatrice du sulfate par les BRS est un processus intracellulaire qui 2- implique la réduction du sulfate SO4 en sulfures, avec du bisulfite comme intermédiaire

Chapitre I : Synthèse bibliographique

(Barton and Fauque, 2009; Rabus et al., 2004). En raison de la stabilité de l’anion sulfate, sa - réduction en sulfites (HSO3 ) se fait à un potentiel d'oxydoréduction très bas (-526 mV) (Thauer et al., 2007) et le sulfate doit d'abord être activé par une réaction avec l'ATP pour former l'APS (adénosine phosphosulfate) (Eq. 1). Cette réaction est catalysée par l'enzyme ATP sulphurylase, également connue sous le nom d'adényltransférase sulfate (Sat). Cette réaction endergonique (Thauer et al., 1977) est possible par l'hydrolyse du pyrophosphate inorganique (PPi) en orthophosphate (Pi) par une pyrophosphatase (Eq. 2). Cela signifie que l'activation du sulfate consomme deux liaisons riches en énergie, équivalent de deux ATPs :

2- + SO4 + ATP + 2H  APS + PPi ΔG°= + 46 kJ/mol (1)

PPi + H2O  2Pi ΔG°= -22 kJ/mol (2)

Le couple APS/HSO3- possède un potentiel rédox E°= -60 mV, cette réduction à deux électrons est réalisée par l'enzyme APS réductase (AprBA) comme illustré dans la réaction (3) :

- + - APS + 2 e + 2H HSO3 + AMP ΔG°= -69 kJ/mol (3)

Enfin, le bisulfite est réduit en sulfure (Eq. 4) par la sulfite réductase dissimilatrice (DsrAB) avec l'implication de la petite protéine DsrC et du complexe membranaire DsrMKJOP (ou seulement DsrMK dans certains organismes) (Rabus et al., 2015). Le couple - - HSO3 /HS a un potentiel d’oxydoréduction de E°= -116 mV :

- + - HSO3 + 6 e- + 6H  HS + 3H2O ΔG°= -172 kJ/.mol (4)

Le mécanisme enzymatique proposé pour la réduction de l'APS et du sulfite implique les complexes conservés QmoABC et DsrMK, respectivement (Figure I. 9). Après l'activation du sulfate, l'APS est réduit par AprBA (Ramos et al., 2012).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Figure I. 9: Le mécanisme enzymatique de la réduction dissimilatrice du sulfate en sulfures chez PRS (Rabus et al., 2015)

La réduction du sulfite implique DsrAB, DsrC et DsrMK. La DsrAB catalyse la réduction du sulfite, générant un intermédiaire DsrC. Le module DsrMK du complexe DsrMKJOP participe à la réduction de cet intermédiaire, éventuellement avec des équivalents réducteurs provenant du menaquinol (MQH2) à travers la sous-unité catalytique DsrK (Oliveira et al., 2008). D'autres protéines liées à HdrD ou HdrB, pourraient être impliquées dans la réduction de DsrC (Rabus et al., 2015).

2.2.3.2. Réduction du thiosulfate, sulfite ou soufre élémentaire

La plupart des BSR peuvent également utiliser le thiosulfate et le sulfite ou soufre comme accepteurs d'électrons alternatifs (Barton and Fauque, 2009; Thauer et al., 2007) ou comme substrats pour la disproportionation (Bak and Cypionka, 1987; Bak and Pfennig, 1987; Finster, 2008). En présence de thiosulfate, la réduction du sulfate est inhibée (Jørgensen, 1990). La réduction du thiosulfate avec le menaquinol comme donneur d'électrons est un processus endergonique dû au faible potentiel redox du couple thiosulfate/sulfite (E° 2- 2- - S2O3 /SO3 + HS = -402 mV). D’autre part, le sulfite est un accepteur favorable pour les PRS. Le sulfite est un intermédiaire réactionnel de la sulfato-réduction, et ne nécessite pas une dépense énergétique pour son activation (Muyzer and Stams, 2008; Rabus et al., 2015).

2.2.3.3. Disproportionation des composés soufrés

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Plusieurs PRS sont également capables de disproportionner les composés soufrés, à savoir le thiosulfate, le sulfite et / ou le soufre élémentaire (Finster, 2008). Ce processus, décrit pour la première fois par Bak and Cypionka, 1987, est appelé fermentation inorganique, car l'énergie est générée en utilisant un seul composé comme donneur et accepteur d'électrons simultanément. La disproportionation du thiosulfate (équation 5) et du sulfite (équation 6) est à la fois exergonique dans des conditions standard, tandis que la dismutation du soufre élémentaire est endergonique (équation 7) et n'est thermodynamiquement favorable que dans des conditions environnementales où le sulfure produit est éliminé par des oxydes de fer et de manganèse (Finster, 2008; Thamdrup et al., 1993).

2- 2- - + S2O3 + H2O  SO4 + HS + H ΔG°=-22 Kj/mol (5) 2- + 2- - 4 SO3 + H  3SO4 + HS ΔG°= -59 Kj/mol (6) 0 2- - + 4 S + 4H2O  SO4 + 3HS + H ΔG°= + 10 kJ/mol (7)

Beaucoup des BSR sont capables de disproportionner le thiosulfate et le sulfite, mais seuls quelques-uns peuvent l'associer à la croissance, la plupart appartiennent au genre Desulfovibrio (Finster, 2008; Krämer and Cypionka, 1989). La croissance couplée à la disproportionation du soufre élémentaire est plus restreinte et se trouve principalement dans la famille Desulfobulbaceae et est souvent couplée à l’autotrophie (Finster et al., 2013).

2.2.3.4. Autres accepteurs d’électron, fermentation et le métabolisme syntrophique

Beaucoup de BSR peuvent également utiliser d'autres accepteurs d'électrons en plus du sulfate et/ou peuvent croître de manière fermentaire en l'absence d'accepteurs d'électrons (Muyzer and Stams, 2008; Rabus et al., 2006). Plusieurs BSR, y compris des membres des genres Desulfovibrio, Desulfobulbus, Desulfotomaculum, Desulfobacterium et Thermodesulfovibrio, peuvent respirer les nitrates en utilisant le procédé d'ammonification des nitrates (Fritz et al., 2005; Moura et al., 2007), où le nitrate est converti en nitrite qui est à ce tour est convertit en ammoniac (Rabus et al., 2015; Simon and Klotz, 2013). Les BSR peuvent aussi fermenter certains acides organiques, le plus souvent le pyruvate. Sous cette condition, une partie du pyruvate est convertie en fumarate (Rabus et al., 2015). Une partie du fumarate formé peut etre utilisée comme accepteur d'électrons et réduite en succinate et l'autre partie oxydée en acétate et CO2 donne de l'ATP par phosphorylation au niveau du substrat (Keller et al., 2014; Meyer et al., 2014). Les composés soufrés organiques, tels que le

Chapitre I : Synthèse bibliographique diméthylsulfoxyde (DMSO) peuvent être également utilisés comme accepteur d’électrons et transformés en diméthylsulfure (DMS) par des procaryotes sulfato-réducteurs (Muyzer and Stams, 2008).

2.2.3.5. Comportement des BSR vis-à-vis du stress oxydatif

Bien que les BSR sont souvent décrits comme anaérobies stricts, en habitats naturels, ils se trouvent fréquemment dans des environnements qui sont régulièrement ou périodiquement en contact avec l'oxygène (Cypionka, 2000). La tolérance des BSR à l'oxygène a été étudiée chez des cultures pures d'organismes modèles dont beaucoup sont capables de survivre à l'exposition à l'oxygène (Cypionka et al., 1985; Lobo et al., 2007). Beaucoup de BSR sont capables de maintenir leur croissance en présence d'oxygène, cependant, il n’a pas été signalé qu’ils soient capables de l'utiliser comme accepteur terminal d'électrons pour la respiration, même si beaucoup ont des oxydases terminales codées dans leur génome. Afin de tolérer l'oxygène, les BSR ont une série de stratégies de défense qui permettent sa réduction et celle de ses dérivés réactifs (Figure I. 10).

Figure I. 10: Mécanismes de réponse des BSR au stress oxydative de l'oxygène (Rabus et al., 2015). Abréviations: Hase, hydrogenase; Cyd, bd quinol oxidase; Cox, haem-copper cytochrome c oxidase; Roo, rubredoxin:oxygen oxidoreductase; Sod, superoxide dismutase; Kat, catalase; Rbr1 and Rbr2, rubrerythrins; Ngr, nigerythrin; Sor, superoxide reductase; MCP, methyl-accepting chemotaxis protein; Trx, thioredoxin; TrxR, thioredoxin reductase; Glr, glutaredoxin;

Chapitre I : Synthèse bibliographique

MsrA and MsrB, methionine sulphoxide reductases; MetSO, methionine sulphoxide; MetSO2, methionine sulphone; Met, methionine; FeS, iron sulphur cluster.

Les mécanismes des PRS pour réduire l'O2 et répondre au stress oxydatif sont multiples. Ces mécanismes sont classés selon les protéines impliquées : la réduction de l'oxygène (par des réductases), la détoxification (peroxydases et catalases), la réparation des dommages et la réponse comportementale (Coulter et al., 1999; Pierik et al., 1993; Rabus et al., 2015).

Un autre mécanisme implique des stratégies comportementales pour éviter ou protéger les cellules du contact avec l'oxygène (Sass and Cypionka, 2007). Dans ce cas, des phénomènes de formation d'agrégats et de migration loin de (ou parfois vers) l'oxygène ont été rapportés chez les PRS (Cypionka, 2000; Eschemann et al., 1999; Sigalevich et al., 2000). Les protéines de la famille methyl-accepting chemotaxis (MCP), telles que DcrA, ont été proposées pour fonctionner comme capteurs d'oxygène ou comme capteurs de potentiel d'oxydo-réduction ; ces protéines ont été jugées être régulées positivement, jouant probablement un rôle majeur dans le mécanisme de transduction du signal lors du contact avec l’oxygène(Fu et al., 1994).

Un mécanisme impliqué dans la réponse cellulaire de BSR à l'exposition à l'oxygène implique des protéines responsables de la réparation des dommages. Ce système devient plus important que le système de détoxication lorsque les conditions d'oxydation sont plus sévères (Fournier et al., 2006; Mukhopadhyay et al., 2007; Pereira, 2008; Zhang et al., 2006). Le système de réparation des dommages joue un rôle dans (i) la réduction des liaisons disulfure dans les protéines et autres thiols intracellulaires par l'action des thiorédoxines, des thiorédoxines réductases et des glutarédoxines; (ii) la réduction des méthionines oxydées par les methionine sulphoxide réductases (MsrA et MsrB); Et (iii) la biosynthèse ou la réparation des ensembles de Fe-S par un homologue NifU. La plupart des gènes codant pour ces protéines se sont révélés être hautement régulés chez D. vulgaris après exposition oxydante (Mukhopadhyay et al., 2007; Pereira, 2008).

2.2.4. Métabolisme du carbone chez les bactéries sulfato-réductrices

Des études antérieures sur le métabolisme général du carbone, la gamme de substrats organiques, les stœchiométries sous-jacentes, les enzymes impliquées et les aspects thermodynamiques ont été décrit chez les BSR (Rabus et al., 2015). Une synthèse des diverses capacités cataboliques du carbone sont résumé sur la (Figure I. 11).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Figure I. 11: Une synthèse des diverses capacités cataboliques du carbone chez les BSR (Rabus et al., 2015).

2.2.4.1. Acétate et autres acides gras aliphatiques : propionate, butyrate, lactate, et pyruvate

Le lactate appartient aux substrats de croissance les plus largement utilisés par les BSR connus (cultivés) et souvent utilisé pour des cultures, il peut être considéré comme un substrat "universel". La première étape de la dégradation du lactate est l'oxydation NAD+- indépendante en pyruvate catalysée par une D- ou L-lactate déshydrogénase (iLdh). Des études préliminaires avec D. desulfuricans ont indiqué que cette enzyme était localisée sur le 39

Chapitre I : Synthèse bibliographique côté interne de la membrane cytoplasmique (Hansen, 1994; Stams and Hansen, 1982; Steenkamp and Peck, 1981). Dans le cas d’une oxydation complète du lactate, le pyruvate subit la décarboxylation oxydante via l’enzyme pyruvate déshydrogénase NAD+-dépendant en impliquant une ferredoxine à faible potentiel comme accepteur d'électrons (Suh and Akagi, 1966) par le cycle TCA ou plus communément la voie Wood-Ljungdahl pour la production d'énergie via la phosphorylation du transport d'électrons. Inversement, dans le cas d’une oxydation incomplète, l'acétyl-CoA formé, est converti par la phosphotransacétylase et l’acétate kinase en acétate (excrétée) pour permettre la génération d'ATP au niveau du substrat(Brown and Akagi, 1966). L'utilisation de l'acétate et sa transformation en CO2 par un PRS a été signalée pour une première fois chez les isolats suivants : Desdulfobacter acetoxidans (Widdel and Pfennig, 1977) et Desulfobacter postgatei (Widdel and Pfennig, 1981); il a été démontré que ce processus est effectué via le cycle TCA (Brandis-Heep et al., 1983).

Les intermédiaires du cycle TCA, le succinate, le fumarate et le malate sont des substrats répandus chez les BSR (Widdel, 1988). Les premières études par Odom and Peck, (1981) ont indiqué une association membranaire de succinate déshydrogénase (Sdh) chez D. gigas. L'oxydation du succinate au fumarate s'accompagne de la réduction à deux électrons de la ménaquinone membranaire chez de nombreux organismes, et la réaction inverse (respiration fumarate catalysée par la fumarate réductase) permet la conservation de l'énergie (Lancaster, 2002; Lemos et al., 2002). La dégradation du propionate a été étudiée à l'origine avec Desulfobulbus propionicus (Kremer and Hansen, 1988) et Desulfococcus multivorans (Stieb and Schink, 1989). Ces études ont démontré par des mesures d'activité enzymatique que l’oxydation du propionate implique la voie méthylmalonyl-CoA (Rabus et al., 2015). La dégradation des acides gras à longue chaine se fait en fonction de la longueur (paire ou impaire), les acides gras seront successivement tronqués par β-oxydation par des fractions acétyl-CoA, donnant finalement l'acétyl-CoA ou le propionyl-CoA, respectivement. La dégradation des acides gras ramifiés, tels que l'isobutyrate, a été étudiée chez D. multivorans et a montré qu'elle se déroulait via la voie méthylmalonate semialdéhyde et méthylmalonyl- CoA (Stieb and Schink, 1989). Certains procaryotes sulfato-réducteurs sont également connus pour leur capacité d’utiliser des sucres comme sources d’énergie : une vaste gamme ont été décrits au cours des 25 dernières années et ont la capacité de se développer sur différents substrats, y compris les sucres (Ollivier et al., 1988; Sass et al., 2002).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

2.2.4.2. Les acétones, les alcools, les aldéhydes et les composés aromatiques

La dégradation anaérobie des acétones a été rapporté chez D. multivorans (Widdel, 1988), Desulfococcus biacutus (Platen et al., 1990) et Desulfobacterium cetonicum (Galushko and Rosanova, 1991). Plus récemment, on a pu constater que D. biacutus utilise effectivement une carbonylation dépendante de l'ATP et de la TPP, ce qui donne l'acétoacétaldéhyde comme premier intermédiaire, qui est ensuite oxydé et activé en acétoacétyl-CoA (Acosta et al., 2013). L'acétoacétyl-CoA pourrait ensuite être clivé en deux acétyl-CoA. L'utilisation d'alcools primaires (éthanol et plus) est répandue chez les BSR et implique habituellement des déshydrogénases alcooliques classiques (Kremer and Hansen, 1988), supposées fonctionnellement liées à une aldéhyde déshydrogénase contenant un cofacteur de molybdoptérine (Romão et al., 1995). La croissance avec des alcools secondaires, comme le 2-propanol, peut nécessiter la capacité de métaboliser les cétones (Rabus et al., 2015). Les composés aromatiques sont principalement dégradés via l'oxydation complète associée aux Desulfobacteraceae. Un aperçu des organismes et de leur gamme de substrats de croissance aromatique a été précédemment compilé par (Philipp and Schink, 2012; Rabus et al., 2006).

2.3. Microbiologie des bactéries sulfo-oxydantes (BSO)

2.3.1. Diversité

La capacité de croissance lithoautotrophe (chimiolithoautotrophe ou photolithoautotrophe) avec des composés soufrés réduits est largement répartie au niveau des phylums procaryotes (Figure I. 12). La présence de ce potentiel entre les Archaea et plusieurs lignées bactériennes indique l'origine ancienne d'un tel mode de croissance. L'oxydation phototrophe du sulfure est un processus anaérobie qui est réalisé par des bactéries vertes sulfureuses telles que le genre Chlorobium, et des bactéries sulfureuses violettes comme le genre Allochromatium (Madigan, 2006). Ces bactéries utilisent l’H2S comme donneur d'électrons pour la réduction du CO2 lors d’une réaction photosynthétique (Janssen et al., 1999). Cependant, l’oxydation lithoautotrophe des sulfures est plus répandue parmi les lignées les plus récentes de la classe des Proteobacteria, avec la plupart des BSO aérobies autotrophes obligatoires appartenant aux Gamma- et Beta-proteobacteria, qui comprend un groupe de BSO, connu sous le nom de "Thiobacilli" et dont certains ont été récemment reclassés en plusieurs genres indépendants (Janssen et al., 1999). Ces bactéries sont les plus pertinentes pour le processus d’oxydation biologique des sulfures (Pokorna and Zabranska,

Chapitre I : Synthèse bibliographique

2015). En fait, un membre du genre Halothiobacillus (anciennement connu sous le nom de Thiobacillus neapolitanus) a été identifié comme une espèce dominante des BSO dans un bioréacteur micro-aérophile oxydant les sulfures (Visser, 1997; Visser et al., 1997). Les Epsilon-proteobacteria contiennent principalement des BSO autotrophes marins microaérophiles et réducteurs des nitrates et de l'oxygène. Ils peuvent être pertinents pour l'élimination des sulfures dans des conditions anaérobies. Les Alphaproteobactéries ne comprennent que des représentants facultatifs autotrophes et lithohétérotrophes qui pourraient être importants dans la désulfuration du soufre inorganique et des composés organiques (Robertson and Kuenen, 1983, 2006). Les BSO Alpha-, Beta- et Gamma-proteobacteria utilisent la voie Calvin-Benson pour l'assimilation du CO2 (Shively et al., 1998), tandis que les espèces d’Epsylon-proteobacteria dépendent du cycle TCA inverse (Hügler et al., 2005; Takai et al., 2005).

Un autre paramètre important pour l'application de désulfuration est l'extrémophilie vis-à-vis du pH et de la salinité des espèces de BSO (Sorokin, 2011; Sorokin et al., 2000). La sous classe Gammaproteobacteria contient toutes les espèces halophiles et haloalcalophiles connues jusqu'ici (Sorokin and Kuenen, 2005; Sorokin et al., 2006). Les sous-classes Alpha, Beta et Epsylon contiennent surtout des espèces non-extrémophiles. Les BSO haloalcaliphiles pourraient être particulièrement intéressants pour le procédé d'élimination biologique des sulfures (Janssen et al., 2009; Pokorna and Zabranska, 2015; Tang et al., 2009).

Figure I. 12: Répartition du potentiel sulfo-oxydant parmi les différentes lignées phylogénétiques des procaryotes chimiotrophes, sur la base de l'analyse des séquences des gènes 16S-ARNr (Janssen et al., 2009). Les noms en rouge indiquent les autotrophes obligatoires et les autotrophes facultatifs en noir. Les lettres grecques indiquent les sous-classes des Proteobactéries; G+ : bactéries Gram positives; Lignées DL : bactéries profondes; CA : Crenarchaeota. Symboles : étoiles : pH-dépendance (rouge-neutrophiles, jaune-acidiphiles, noir-alkaliphiles); Carrés : Température-dépendance (mésophiles en bleus, thermophiles en rouges); Cercles : dépendance au sel (vert-eau douce, bleu- marine, noir-haute tolérance au sel).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Une étude a exploré la structure de la communauté, la diversité et l'abondance des BSO simultanément par séquençage à haut débit du gène ARNr 16S et PCR quantitative du gène soxB (Tableau I. 1) des échantillons de carottes provenant de la mer de Chine orientale (Zhang et al., 2017).

Tableau I. 1: Composition de la communauté BSO basée sur l'information taxonomique des gènes ARNr 16S et soxB (Zhang et al., 2017).

OTUs Abondance totale (%) Familles 16S rRNA soxB 16S rRNA soxB Spirochaetaceae 30 8 0.03–0.69 0.85–5.04 Chlorobiaceae – 2 – 0.13–13.08 Helicobacteraceae 5 – 0.02–4.57 – Rhodospirillaceae 42 5 0.24–1.43 0.12–3.75 Rhodobacteraceae 27 20 0.27–3.32 1.33–14.74 Bradyrhizobiaceae 1 35 0–0.01 15.79–36.26 Hyphomicrobiaceae 16 2 1.38–2.67 0.01–3.51 Rhizobiaceae 1 – 0–0.01 – Neisseriaceae 1 – 0–0.03 – Comamonadaceae 7 3 0.02–0.15 0.05–2.88 Ectothiorhodospiraceae 10 2 0.07–0.56 0.09–6.38 Thiotrichaceae 7 2 0–0.07 0.06–1.60 Piscirickettsiaceae 44 4 0.52–13.67 0–3.38 Burkholderiaceae – 6 – 0.13–4.82 Oxalobacteraceae – 1 – 0–4.36 Hydrogenophilaceae – 1 – 0–0.44 Chromatiaceae – 18 – 0.25–7.39 Halothiobacillaceae – 2 – 0–1.42

2.3.2. Eco-physiologie

Les BSO constituent un groupe éco-physiologique de procaryotes, qui possèdent la capacité d'oxyder divers composés soufrés réduits. Il comprend deux grands sous-groupes : les phototrophes et les chimiotrophes (Janssen et al., 2009). Ces derniers sont indépendants de la lumière et utilisent l'énergie chimique par l'oxydation des composés soufrés réduits pour leur croissance. En fonction de la capacité de croissance autotrophe et de l'utilisation de l'énergie générée lors de l'oxydation de composés soufrés, les BSO chimiotrophes peuvent être divisés en quatre sous-groupes : deux d'entre eux comprennent des organismes capables de croître en utilisant des composés soufrés comme source d'énergie. Parmi ceux-ci, on inclut des chimiolithotrophes obligatoires et d’autres autotrophes facultatives (c'est-à-dire capables de se développer à la fois en tant qu'organismes chimiolithoautotrophes et organohétérotrophes). La physiologie et la biochimie de ces bactéries ont été couvertes de

Chapitre I : Synthèse bibliographique manière exhaustive (Friedrich, 2002; Kelly et al., 1997). Les deux autres groupes sont des hétérotrophes obligatoires, qui ne peuvent pas croître sans source de carbone organique. Ceux-ci sont appelés BSO chimio-hétérotrophes et se trouvent principalement parmi les Alphaproteobacteria et produisent du sulfate comme produit d'oxydation final. En revanche, le second groupe d'hétérotrophes, capable d'oxyder le thiosulfate ou les sulfures de manière incomplète en tétrathionate (principalement des Gammaproteobacteria), sans en tirer de l’énergie (Sorokin, 2003).

2.3.2.1. Donneurs d’électrons

2.3.2.1.1. Les phototrophes

Comme leur nom l'indique, les organismes phototrophes ont besoin de lumière comme source d'énergie (Tang et al., 2009). Le sulfure d'hydrogène est oxydé en soufre élémentaire, tandis que le CO2 est réduit et incorporé sous forme des composés organiques (Cork et al., 1985; Syed et al., 2006). Le principal problème lié à l'utilisation de BSO phototrophe pour l’oxydation des sulfures consiste en leur taux de croissance lent, et que la source de lumière doit être suffisamment forte (induisant des coûts d'exploitation)(Oh et al., 1998). La croissance de ces bactéries est aussi organotrophe; elles peuvent utiliser certains composés organiques comme source de carbone , et d'énergie (Madigan, 2006; Madigan et al., 2017). Parmi les BSO phototrophes on distingue des bactéries vertes et des pourpres. Les BSO vertes oxydent les sulfures par l'intermédiaire du soufre élémentaire en sulfates même à des conditions d'intensité lumineuse très faible (Tang et al., 2009). Elles comprennent des espèces telles que Chlorobium, Chloroherpeton, Prosthecochloris, Pelodictyon et Ancalochloris capables d'effectuer la photosynthèse dans des conditions anaérobies (Stanier et al., 1986). Les BSO (Allochromatium, Chromatium, Thioalkalicoccus, Thiorhodococcus, Thiococcus, Thiocystys, Thiospirillum ...) produisent des granules de soufre sous forme de particules sphériques à l’intérieur des cellules. Certaines espèces de BSO pourpres (Ectothiorhodospira, Halorhodospira, Thiorhodospira) sont capables de produire du soufre en dehors de la cellule. Par la suite, l'oxydation a lieu et les sulfates produits sont libérés de la cellule. Les BSO pourpres sont également capables d’utiliser des composés organiques (Tang et al., 2009).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

2.3.2.1.2. Les chimiolithotrophes

Les BSO chimiolithotrophes dites incolores utilisent l'énergie issue de l’oxydation des composés soufrés inorganiques réduits (sulfure d'hydrogène, thiosulfates, sulfites, soufre élémentaire, tetrathionate, thiocyanate pour certaines (T. thioparus par exemple), et dans certains cas des composés organiques soufrés (méthanethiol, diméthyl-sulfure…) (Cattaneo et al., 2003), en utilisant le dioxyde de carbone comme une source de carbone. Les BSO incolores sont Gram-négatifs, et en fonction des exigences de croissance, ils diffèrent considérablement, même au sein des différentes espèces d'un même genre. Les températures de croissances varient en fonction des espèces de 4 à 90 °C et les pH vont de 1 à 9. La plupart des bactéries chimiolithotrophes étudiés se développent mieux dans des conditions mésophiles ou thermophiles (Thiobacillus, Sulfolobus, Thermothrix) (Tang et al., 2009).

Les BSO chimiolithotrophes sont classées en deux groupes distincts morphologiquement et taxonomiquement ; le premier est représenté par le genre Thiobacillus qui sont de petits bâtonnets courts (Thiobacillus thioparus, Thiobacillus denitrificans ou Thiobacillus thiooxidans) et le deuxième où se retrouve des bactéries filamenteuses du genre 0 Beggiatoa et Thiothrix. Les bactéries filamenteuses oxydent l’H2S en soufre élémentaire (S ), qu'ils stockent à l'intérieur de la cellule, et il peut être ensuite oxydé en sulfates (Janssen et al., 1999). Lorsque la concentration en sulfure d'hydrogène est suffisante, le soufre est stocké à 0 l'intérieur de la cellule, mais en cas de manque d’H2S, le S est oxydé en sulfates solubles capable de passer à travers les parois des cellules (Schmidt et al., 1987). Les BSO chimiolithotrophes sont classés selon la source de carbone et d'énergie en quatre groupes (Pokorna and Zabranska, 2015; Tang et al., 2009) :

i. Les chimiolithotrophes obligatoires : utilisent du dioxyde de carbone comme source de carbone et différents composés soufrés inorganiques comme source d'énergie (certaines espèces de Thiobacillus, Thiomicrospira).

ii. Les chimiolithotrophes facultatives : en plus de l’utilisation du CO2 (comme source de carbone), elles sont capables d'utiliser aussi des composés organiques (plusieurs espèces de Paracoccus denitrificans, Thiobacillus, Thermotrix ou Sulfolobus). iii. Les chimiolithohétérootrophes capables de gagner de l'énergie par oxydation de

composés soufrés réduits, mais qui sont incapable d’utiliser le CO2 (plusieurs espèces de Beggiatoa et Thiobacillus).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

iv. Les chimioorganotrophe oxydant les composés soufrés sans obtenir de l'énergie à partir ces réactions (Thiobacterium, Thiothrix).

2.3.2.2. Accepteurs d’électrons

En aérobiose, l'oxygène est un accepteur d'électrons universel utilisé par les BSO. Cependant, le degré d'aérobiose diffère en fonction différentes espèces (Tang et al., 2009). Les électrons produits lors de l'oxydation des composés soufrés sont transférés à l'oxygène dissous et l'O2 qui est réduit en H2O (Madigan, 2006). Cependant, En anaérobiose, divers BSO peuvent utiliser le nitrate ou le nitrite comme accepteurs terminaux d'électrons. L’oxydation biologique des sulfures en présence des nitrates ou des nitrites pourrait être un procédé utile pour l'élimination des sulfures à partir des gaz pollués et des eaux. Cette méthode de désulfurisation est basée sur l'activité des bactéries, qui comprennent principalement T. denitrificans, Thiomicrospira denitrificans, Thiobacillus versutus, Thiosphaera pantotropha et Paracoccus. denitrificans. L’application technologique de la dénitrification autotrophe dans le traitement des eaux usées apporte une diminution substantielle des coûts d'exploitation et la production de boues activées deux à trois fois inférieure (Chung et al., 1996; Kleerebezem and Mendezà, 2002; Sublette and Sylvester, 1987; Visser, 1997).

L'oxydation du sulfure dans des conditions dénitrifiantes pourrait conduire à la formation de soufre, de sulfate et de nitrite ou d'azote. L'oxydation du soufre et du thiosulfate peut être effectuée aussi en dénitrification. Ces bactéries peuvent utiliser une variété de 2- 0 2 - 2 - 2- formes réduites inorganiques du soufre (S , S , S2O3 , S4O6 , SO3 ) pour leur croissance chimiolithotrophe avec réduction simultanée de nitrate ou de nitrite (Cardoso et al., 2006). Les produits finaux de l'oxydation des sulfures sont le soufre élémentaire ou du sulfate dans des conditions dénitrifiantes conduit à la production de l'azote gazeux ou des nitrites comme intermédiaires (Tang et al., 2009). La présence de certaines substances organiques, tels que l'acide acétique servant de source de carbone supplémentaire, peut augmenter le taux de dénitrification totale (An et al., 2010; Cardoso et al., 2006).

2.3.2.3. pH et température de croissance

Les BSO incolores sont diverses en ce qui concerne le pH et la température de croissance (Janssen et al., 2009). Une croissance à des valeurs de pH de 1 à 9 et des températures allant de 4 à 90 °C a été rapporté (Tang et al., 2009). Les BSO acidophiles telles

Chapitre I : Synthèse bibliographique

que Acidothiobacillus ferrooxidans et Thiobacillus acidophilus sont abondantes dans les drainages miniers acides et sont capables d’effectuer une croissance mixotrophe sur les composants soufrés de fer et de la pyrite. Sulfolobus et Acidianus sont d’autres BSO qui jouent un rôle important dans le processus de bio-lixiviation des minéraux sulfurés. Le genre le plus commun et le plus étudié est Thiobacillus sp. De nombreuses espèces sont acidophiles avec un pH optimal 1-6 ou Thiobacillus ferrooxidans et Thibacillus thiooxidans peuvent se développer dans des conditions extrêmes de pH inférieures à 1. Les espèces Thiobacillus denitrificans et Thiobacillus Novellus sont neutrophile et leur gamme de pH optimal est de 6- 8. Thibacillus thioparus croît dans une large gamme de pH (5-9) avec un optimum est de 7,5. Thioalkalispira micro-aerophila est un micro-organisme alcalophile avec un pH optimum de 10 (Janssen et al., 2009; Pokorna and Zabranska, 2015; Vlasceanu et al., 1997).

La majorité des BSO chimiolithotrophes sont mésophiles, le genre Thiobacillus étant le seul genre englobant à la fois des mésophiles et des thermophiles. D'autres genres thermophiles importants incluent Sulfolobus, Acidianus et Thermothrix. Les exigences de température des différentes BSO sont également différentes. La plupart sont mésophiles ou thermophiles, mais certaines espèces (Thermothrix azorensis) ont une température optimale de croissance de 76 à 86°C (Odintsova et al., 1996; Syed et al., 2006). Les conditions de croissance de certains BSO photolithotrophes et chimiolithotrophes sont représentées dans le Tableau I. 2.

Tableau I. 2: Conditions de croissance de quelques BSO photolithotrophes et chimiolithotrophe (Tang et al., 2009).

BSO pH Température (°C) Source (s) de carbone Gamme Optimum Gamme Optimum Photolithotrophes

Chlorobium limicola 6.5 –7.0 6.8 – 25–35 CO2 Chlorobium tepidum – 6.8–7.0 32–52 47–48 CO2 Allochromatium vinosum 6.5–7.6 7.0–7.3 25–35 CO2

Chimiolithotrophe

Acidithiobacillus thiooxidans 0.5 –5.5 2.0–3.0 10–37 28–30 CO2 Acidithiobacillus ferrooxidans 1.3–4.5 2.5 10–37 30–35 CO2 Thiobacillus thioparus 4.5–7.8 6.6–7.2 – 28 CO2 Thiobacillus denitrificans – 6.8–7.4 – 28–32 CO2 Thiomicrospira denitrificans – 7.0 – 22 CO2 Thiomicrospira denitrificans sp. CVO 5.5–8.5 – – 5–35 CO2, acétate Acidianus ambivalens 1.0–3.5 2.5 – 80 CO2

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Acidianus brierleyi 1.0–6.0 1.5–2.0 45–75 70 YE,CO2,YE,Pept, Trypt,Casa

Solfolobus metallicus 1.0–4.5 – 50–75 65 CO2 Solfolobus acidocaldarius 1.0–6.0 2.0–3.0 55–85 70–75 Pept,Trypt,Casa, sucres

Thermothrix thiopara 6.0–8.5 – 73 60–80 CO2, composés organiques Thermothrix azorensis 6.0–8.5 7.0–7.5 76–78 60–87 CO2

2.3.3. Mécanismes biologiques d'oxydation des sulfures

2.3.3.1. En conditions aérobies

Au cours de l'oxydation biologique du sulfure d'hydrogène, les premiers produits de formation sont les polysulfures (Tang et al., 2009), ces derniers sont oxydés en soufre élémentaire S0 et sulfate en présence d'oxygène en tant que principal accepteur d'électrons, qui

est réduit en H2O (Díaz et al., 2010). Les réactions importantes impliquées dans l'oxydation biologique du sulfure, du soufre et du thiosulfate dans des conditions aérobies sont résumées dans les équations suivantes :

Réaction ΔGo (KJ/réaction)

2− + (1) H2S + 2 O2→ SO4 + 2 H −798,2 0 (2) H2S + 0,5 O2→ S + H2O −209,4 0 2− + (3) S + 1,5 O2+ H2O → SO4 + 2 H −587,1 2− 2− (4) S2O3 + H2O + 2 O2→ 2 SO4 + 2 H+ −818,3

Le suivi de la cinétique d'élimination des sulfures par une biomasse BSO a confirmé que le produit final de l'oxydation des sulfures dépend de la proportion d'oxygène dissous et de la concentration des sulfures. Si la dose d'oxygène est maîtrisé de façon adéquate, les BSO chimiolithotrophes sont capables d'oxyder des composés soufrés en soufre élémentaire (Tang et al., 2009). Avec un faible débit d'air (0,7 à 0,9 m3/ (m3 d)), on atteint une forte baisse de la

concentration en H2S dans le biogaz tandis que les concentrations de sulfates de sortie ne sont pas enregistrées. Cela suggère la formation de soufre élémentaire dans le réacteur (Van der Zee et al., 2007). Etant donné que la bio-oxydation des sulfures consiste en une séquence de réactions d'oxydation successives, il est clair que les BSO sont capables d'oxyder les composés soufrés réduits, qui sont des produits intermédiaires de l'oxydation complète des sulfures (Pokorna and Zabranska, 2015).

2.3.3.2. En conditions dénitrifiantes

Chapitre I : Synthèse bibliographique

L'oxydation biologique des sulfures en présence des nitrates ou nitrites est un processus connu sous le nom de dénitrification. La nature des produits finaux de ce processus et le taux d'élimination des deux anions dépend du rapport Azote/Soufre, et de la concentration initiale de sulfures (Janssen et al., 2009; Tang et al., 2009). Les réactions importantes impliquées dans l'oxydation chimiolithotrophe du sulfure et du soufre dans des conditions dénitrifiantes sont résumées dans les équations suivantes (Pokorna and Zabranska, 2015):

Réaction ΔGo (KJ/réaction)

2− − + (1) S + 0,4 NO3 + 2,4 H → S° + 0,2 N2 + 1,2 H2O −191,0 − 2− + (2) S° + 1,2 NO3 + 0,4 H2O → SO4 + 0,6 N2+ 0,8 H −547,6 2− − + 2− (3) S + 1,6 NO3 + 1,6 H → SO4 + 0,8 N2+ 0,8 H2O −743,9 2− − 2− − (4) S + 4 NO3 → SO4 + 4 NO2 −501,4 2− − + − (5) S + NO3 + 2 H → S° + NO2 + H2O −130,4 − − + 2- (6) 5 HS + 8 NO3 + 3 H → 5 SO4 + 4 N2 + 4 H2O −919,6 − − + 0 2- (7) 5 HS + 5 NO3 + 5 H → 2,5 S + 2,5 SO4 + 2,5 N2 + 5 H2O −612,8 − − + 0 (8) 5 HS + 2 NO3 + 7 H → 5 S + N2 + 6 H2O −302.1 2− − + 0 (9) S + 0,67 NO2 + 2,67 H → S + 0,33 N2+ 1,33 H2O −240,3 2− − + 2− (10) S + 2,67 NO2 + 2,67 H → SO4 + 1,33 N2 + 1,33 H2O −920,3 − 2− + (11) S° + 1.2 NO3 + 0.4 H2O → SO4 + 0.6 N2 + 0.8 H −547.6 2− − 2− + (12) S2O3 + 1.6 NO3 + 0.2 H2O → 2 SO4 + 0.8 N2 + 0.4 H −765.7

2.3.4. Facteurs influençant l’oxydation biologique des sulfures

2.3.4.1. Concentration initiale en sulfures

La bio-oxydation des sulfures avec des nitrates comme accepteurs se produit d'une manière similaire à celle de l'oxygène. Les Thiosulfates en tant que produits intermédiaires de l'oxydation des sulfures sont présents seulement au début de l'oxydation, et seulement en petites concentrations (Pokorna and Zabranska, 2015). Les taux d'élimination du sulfure en présence de nitrates (à une concentration de 10 mM) ont été observés à des concentrations de sulfure de 2,1, 6,3, 10,7 et 16,3 mM. Le taux d’oxydation augmente de façon linéaire avec des concentrations initiales de sulfure jusqu'à 10,7 mM. Une augmentation supplémentaire de la concentration de sulfures à 16,3 mM a entraîné une augmentation de la phase de latence

Chapitre I : Synthèse bibliographique impliquant une diminution significative du taux d’oxydation et, qui a été provoqué par l'effet inhibiteur des sulfures sur les BSO dénitrifiantes autotrophes (An et al., 2010; Cardoso et al., 2006; Chen et al., 2008, 2010).

2.3.4.2. Rapport molaire azote/soufre

Le produit final de l'oxydation d'un composé soufré dépend du rapport molaire azote/soufre et le type du composés soufré utilisé lui-même (An et al., 2010; Cai et al., 2008; Cardoso et al., 2006; Gadekar et al., 2006). En présence des nitrates en excès (azote/soufre = 4), bien que les sulfures soient complètement transformés en sulfates, la réduction des nitrates, toutefois, conduit à une formation de nitrites comme produit intermédiaire de la réaction. Lorsque le rapport azote/soufre = 1, on observe à la fois une oxydation incomplète des sulfures en soufre élémentaire et une réduction des nitrates en nitrites (Gommers et al., 1988; Reyes-Avila et al., 2004). L’étude des différents rapports azote/soufre a démontré que le rapport azote/soufre = 1 est le plus utilisé, tous les sulfures sont oxydés en soufre (An et al., 2010). Si les nitrates sont en excès par rapport aux sulfures (stœchiométrie), les produits finaux de leur réduction sont les nitrites (An et al., 2010; Mahmood et al., 2007). Il est donc clair qu’il est possible d’influencer les produits finaux de l'oxydation des sulfures et la dénitrification par la sélection et le contrôle du rapport azote/soufre.

2.3.4.3. Variations de pH et du taux de charge en azote et soufre

Le processus d’oxydation des sulfures peut être influencé par une variation brusque de la charge des deux anions. Jing et al., (2009) ont testé le changement de pH et la charge en sulfures et en nitrates dans un réacteur anaérobie des stations d'épuration des eaux usées. La culture de l’inoculum de ce digesteur a été adaptée à des concentrations de sulfures (520 ppm) et nitrates (92 ppm) sur une période de 4 mois. Les concentrations en sulfures et nitrate dans l'effluent était de 0,51 ppm et 8,92 ppm en sulfures et nitrates respectivement, tandis que les nitrites ne sont pas détectés. Les concentrations des deux premiers anions dans l'affluent du réacteur a été ensuite portée à 2, 2,5 et 3 fois les valeurs initiaux et le pH a été progressivement augmenté de 7,0 à 8,0 puis à 9,0 et enfin à 10,0. Il a été constaté que les populations microbiennes étaient plus sensibles au changement de pH et par conséquent à une augmentation de la concentration des sulfures dans les effluents. A pH 10,0, l’augmentation était d’un facteur de 31 par rapport au pH 7. La valeur du pH a été ainsi avéré

Chapitre I : Synthèse bibliographique

être important dans le maintien de l'efficacité du processus (Jing et al., 2009; Pokorna and Zabranska, 2015; Tang et al., 2009).

2.4. Applications technologiques des BSO pour la désulfurisation du biogaz

2.4.1. Le sulfure d'hydrogène dans le biogaz

La concentration de sulfure d'hydrogène dissous (HS-, S2-) dans un liquide est en

équilibre avec la concentration de sulfure d'hydrogène gazeux (H2S) ; cette concentration varie en fonction du pH, de la pression, de la température et de la concentration totale en sulfures totaux. La concentration de sulfure d'hydrogène dans le biogaz peut atteindre des valeurs très importantes allant de 500 ppmv à 20 000 ppmv (Pokorna and Zabranska, 2015). A ces concentrations, les sulfures provoquent non seulement de graves problèmes organoleptiques et toxiques, mais corrodent aussi le béton (Okabe et al., 2007) et des structures en acier dans les station de biogaz (Zhang et al., 2008a), endommagent les tuyaux et les pompes (Burgess et al., 2001) et raccourcissent considérablement la durée de vie des moteurs à gaz des unités de cogénération (Gayh et al., 2010). La combustion du biogaz avec des concentrations plus élevées de sulfure d'hydrogène provoque également des problèmes d’émissions de SOx en excès. En plus de l'effet inhibiteur direct dans le processus de digestion anaérobie ce sont les principales raisons pour lesquelles il est nécessaire d'éliminer le sulfure d'hydrogène du biogaz avant son utilisation pour la production d'énergie (Janssen et al., 2009).

2.4.2. Élimination du sulfure d'hydrogène du biogaz

Il existe de nombreuses méthodes différentes pour éliminer le sulfure d'hydrogène du biogaz selon le type de méthanisation et la quantité de composés soufrés dans le substrat d'entrée. Des méthodes biologiques, chimiques et/ou physico-chimiques de précipitation, le lavage ou l'absorption ont déjà été largement utilisées et appliquées avec succès depuis longtemps (Pokorna and Zabranska, 2015). Cependant, ils sont toujours associés à des coûts élevés d'exploitation (énergie et produits chimiques), et parfois avec la production de résidus qui doivent encore être traités. En outre, certains produits chimiques agressifs (des catalyseurs, des adsorbants ou des produits chimiques) utilisés provoquent une corrosion rapide des équipements et doivent être régénérées périodiquement ou remplacés (Henshaw and Zhu, 2001).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

2.4.2.1. Oxydation abiotique des sulfures

Plusieurs méthodes physicochimiques de désulfurisation du biogaz sont disponibles. L’augmentation du pH est l’une des méthodes appliquées. En effet, à des pH supérieur à 9 la forme H2S est négligeable, ce qui permet d’éliminer les nuisances olfactives des sulfures. D’autre part ces pH élevés ont un effet inhibiteur sur les bactéries sulfato-réductrices (Nemati et al., 2001; Zhang et al., 2008a). L’élimination chimique des sulfures par addition des sels de fer est une autre méthode de désulfurisation. Le fer a été largement utilisé pour précipiter les sulfures selon les réactions suivantes (Pagella and De Faveri, 2000) :

Fe2+ + HS-  FeS + H+ ΔG°= -21Kj/mol 2Fe3+ + HS- 2Fe2+ + S° + H+ ΔG°= -160Kj/mol

L’addition de produits chimiques oxydants tels que le peroxyde d'hydrogène (H2O2), la chlorine ou le permanganate de potassium est également largement appliquée pour les procédés de désulfurisation chimiques. L’ H2O2 est ajouté dans les eaux usées ; il est capable d’oxyder les sulfures solubles. L'inconvénient est sa courte durée de vie (moins de 90 min), par conséquent il peut être nécessaire d'ajouter le produit à plusieurs points tout le long des égouts (Zhang et al., 2008a). Le chlorine oxyde le sulfure en sulfate ou en soufre élémentaire en fonction du pH. Son efficacité est souvent faible en raison de ses réactions avec d'autres composants dans les eaux usées. Il peut être ajouté sous forme d'une solution aqueuse (sodium d'hypochlorite), ou directement sous forme de gaz. La réaction d'oxydation chimique est plus lente à des concentrations faibles de sulfure (Tomar and Abdullah, 1994). Le permanganate de potassium (KMnO4) est un agent oxydant fort, qui convertit le sulfure en sulfate (Cadena and Peters, 1988). Le coût élevé est son principal inconvénient.

L'oxydation chimique de sulfure a lieu en parallèle avec l'oxydation biologique et peut affecter positivement l'activité biologique de BSO en diminuant la concentration inhibitrice de sulfures. Il s’effectue spontanément dans un milieu alcalin aqueux en présence d'oxygène et conduit à la formation de produits intermédiaires comme les polysulfures, les sulfites et thiosulfates (Sorokin, 2003).

2.4.2.2. Oxydation biotique des sulfures

2.4.2.2.1. Bio-oxydation aérobie des sulfures

La stratégie en présence d’oxygène est l’une des voies de bio-oxydation des sulfures. Le sulfure d'hydrogène est capturé par lavage à partir du biogaz en milieu aqueux. La 53

Chapitre I : Synthèse bibliographique composition et le pH du milieu utilisé dépend du type de la population de BSO, qui peut être acidophiles ou alcalophile. En raison de l’absorption meilleure et rapide du sulfure d'hydrogène en milieu alcalin, des systèmes avec un pH élevé sont prédominants (Krischan et al., 2012; Pokorna and Zabranska, 2015). Le milieu aqueux avec des sulfures capturés est introduit dans le bioréacteur de culture de BSO où les procédures de lavage et biooxydation sont couplés dans le même réacteur (Figure I. 13) (Syed et al., 2006; Tang et al., 2009).

Le dosage direct de l'air ou de l'oxygène comme agent oxydant est utilisée par des procédés, où les BSO sont cultivées soit dans une culture en suspension ou sous forme de biofilms (Fortuny et al., 2008; Li et al., 2008; Midha et al., 2012). Ces procédés sont efficaces même pour des concentrations très élevées en sulfure d'hydrogène dans le biogaz (jusqu'à 20.000 ppmv). Ces méthodes sont des alternatives viables aux procédés chimiques et leur application a été prouvée à l'échelle industrielle (Thiopaq® ou Sulfothane TM). Il est évident que la capacité d'adaptation des BSO à des concentrations élevées de sulfure d'hydrogène apporte la possibilité d'application large de désulfuration biologique de biogaz ou d'autres gaz contenant du sulfure d'hydrogène (Pokorna and Zabranska, 2015).

Les méthodes biologiques sont moins chères, ne nécessitent pas de produits chimiques coûteux et ne causent pas de pollution secondaire de l'environnement (Sublette and Sylvester, 1987). Il est seulement nécessaire de laver le sulfure d'hydrogène gazeux à partir du biogaz à l'eau, le mettre en contact avec la culture des BSO et d'assurer la demande en éléments nutritifs. Les produits finaux de la bio-oxydation des sulfures ne sont pas plus dangereux ; le soufre élémentaire peut être retiré complètement du système en raison de sa faible solubilité dans l'eau et l’utiliser dans l'industrie ou comme engrais (Beristain Cardoso et al., 2008); tandis que les sulfates peuvent être rejetés directement dans les eaux de‐ surface.

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Figure I. 13 : Schéma du processus biotechnologique pour la désulfuration du biogaz (Janssen et al., 2009).

2.4.2.2.2. Bio-oxydation anaérobie des sulfures

La bio-oxydation en condition anaérobie est une autre stratégie de désulfurisation. Des cellules en suspension libre ont été cultivées dans un fermenteur à échelle de laboratoire à un pH de 7,4 et à une température de 32 ° C (McComas et al., 2001). Ce fermenteur a été inoculé par une culture d'enrichissement anaérobie provenant de l'eau produite du champ pétrolifère (Canada) dominée par Thiomicrospira sp. CVO et contenait une autre espèce, Arcobacter sp.

FWKO B. La charge maximale de sulfure manipulée par le système était de 5,8 mM de H2S/g de biomasse qui était comparable à celle obtenue dans un autre système avec T. denitrificans dans des conditions similaires. La culture d'enrichissement, était plus tolérante aux pH, températures et salinité élevés. Le soufre élémentaire semblait être le principal produit de l'oxydation des sulfures dans une culture de Thiomicrospira sp. CVO et Arcobacter sp. FWKO B. Selon (Gevertz et al., 2000) la souche CVO oxyde le sulfure en sulfate lorsque les concentrations de sulfure sont faibles et le nitrate n'est pas limitatif, mais la souche FWKO B oxyde le sulfure en soufre élémentaire seulement.

Une étude de Gadekar et al., (2006) a rapporté la cinétique de la réaction et la stœchiométrie de l'oxydation anaérobie du sulfures par Thiomicrospira sp. CVO dans les systèmes discontinus et continus. En utilisant le NO3 comme accepteur d'électrons, la souche CVO a été capable d'oxyder les sulfures à des concentrations aussi élevées que 19 mM. Wang et al., (2005) ont étudié la désulfuration et la dénitrification simultanée par Thiobacillus denitrificans. L'objectif de cette étude était de maximiser la production de soufre élémentaire

Chapitre I : Synthèse bibliographique par une souche T. denitrificans, appelé D4, à partir des sulfures et d'étudier l'effet de la concentration de sulfures (100, 200, 300, 400 et 500 ppm) sur sa croissance. En utilisant un 2- - rapport S / NO3 de 5:3 et une concentration initiale en sulfure de 100 ppm, 99% de sulfures ont été éliminés, tandis qu'avec 300, 400 et 500 ppm de sulfures, le pourcentage d'élimination était de 67,9, 22,9 et 17,2 %, respectivement. L'oxydation des sulfures dans des conditions dénitrifiantes a également été étudiée dans en culture discontinue par Cardoso et al., (2006). La culture utilisée dans cette étude provient d'un réacteur de lit de boue anaérobie à flux ascendant (UASB) fonctionnant à un pH de 7,0 et à une température de 30 °C. Le Tableau I. 3 résume les données de la littérature sur l'élimination biologique du sulfure par des BSO chimiolithotrophes (Tang et al., 2009).

Chapitre I : Synthèse bibliographique Tableau I. 3: Conditions de fonctionnement et bio-cinétique de l'élimination des sulfures dans divers bioréacteurs avec des BSO chimiolithotrophes (Tang et al., 2009). Bacteria or culture Matrix for Source Bioreactor biofilm Carbon Electron Temerature pH Treated Volume removal End product establishment source acceptor (°C) influent rate (g/(L h)) (s) Co-culture of Thiobacillus denitrificans and floc Stirred tank reactor with – CO2 O2 (from air) – – H2S gas: 1% 0.11 Sulfate forming heterotrophs Biomass recycle Co-culture of Thiobacillus Sulfide solution:

denitrificans and floc Uplflow bubble column – CO2 O2 (from air) 30 – 0.017 g/L 0.43–0.52 Sulfate forming heterotrophs with biomass recycle

Mixed culture of Thiobacilli Fluidized-bed – Bicarbonate O2 (from air) 25–30 7.8 Sulfide solution: 0.06 S° and small from activated sludge 0.48 g S/L amount of sulfate

Pig manure Packed-bed with three Pig manure and Pig manure O2 (from air) 25 8.4–6.8 H2S 0.045 S° modules saw dust and saw dust Thiomonas Packed-bed Activated 0.01 mg H2S/min sp. – O2 (from air) – – H2S Activated carbon – Filter Carbon loaded with cells

Thiobacilli consortium Recirculation – Bicarbonate O2 (from air) 30 7.0–7.5 Sulfide solution: 0.15 S° and sulfate Reactor system 2 g/L Thiomicrospira denitrificans, Fluidized-bed Sand Organic – – Sulfide solution: 0.24 – NO3 and O2 Thiothrix, sulfide oxidizing content of 0.02 g/L symbionts waste stream

Thiobacillus denitrificans Reverse fluidized-bed Polyethylene Bicarbonate O2 (from air) – 8.0 Sulfide solution: with added clay 0.25 g/L 1.11 S° and sulfate

Activated sludge Horizontal biotrickling Activated – O2 (from air) filter carbon 25–30 4.5 H2S gas: 92 ppm 0.11 Sulfate Acidithiobacillus Packed-bed – – H2S gas: thiooxidans filter Porous ceramic CO2 O2 (from air) 2200 ppm 0.67 – Thiobacillus denitrificans Packed-bed Activated carbon Bicarbonate 30–35 6.8–7.4 H2S gas: 0.02 S° O2 (from air) 110–120 ppm

Sediments and water from Biotrickling NOVAINERT Glucose and O2 (from air) 70 4.0–5.0 H2S gas: 3.5% 0.04 – hot pools of a lake filter packing glutamate Thiobacillus Batch stirred – 30 7.0 0.18 0.26 g/h g Sulfate – CO2 NO3 H2S gas: 0.5–1% –

denitrificans tank biomass – Thiomicrospira sp. Fed batch – CO2 NO3 32 7.4 H2 S gas: 1% Sulfate and small

CVO 0.05 amount of S° – Thiomicrospira sp. Continuous – Bicarbonate NO3 22 7.0 Sulfide solution: 0.1 S°

CVO flow stirred tank 0.57 g/L 57

Chapitre I : Synthèse bibliographique

3. Microbiologie des méthaniseurs : approches moléculaires et approches culturales

3.1. Approches moléculaires

La composition microbienne de la boue de digestion anaérobie est très diverse et présente une redondance élevée. Cela signifie que plusieurs micro-organismes sont métaboliquement flexibles et capables d'effectuer le même travail. Cette caractéristique est l'une des raisons de la robustesse des processus de digestion anaérobie (Fernández et al., 1999; Zumstein et al., 2000). Pour étudier ces écosystèmes très complexes, il existe aujourd'hui des outils moléculaires différents (Figure I. 14).

Il est très important de choisir l'outil adéquat pour répondre aux questions formulées dans chaque expérience (Cabezas et al., 2015). En ce qui concerne la composition

Chapitre I : Synthèse bibliographique microbienne et la fonction des communautés dans les bioréacteurs méthanogènes, quatre questions principales sont habituellement formulées : 1-Qui est là ?, 2-Comment la communauté microbienne évolue-t-elle au fil du temps ?, 3-Combien de microorganismes des différents groupes sont présents ?, 4-Quelles sont les fonctions spécifiques des microorganismes au sein de la communauté et leurs rapports les uns avec les autres ?

Les techniques d'écologie moléculaire ont évolué au cours des dernières années pour donner des réponses à ces questions et un éventail d'options sont disponibles. Cette partie illustrera les principales approches moléculaires utilisées pour lier la structure communautaire microbienne (Clonage et séquençage de Sanger, Next generation sequencing, biopuces à ADN…) les interactions (DGGE, T-RFLP, SSCP…) et la fonction (FISH, q- PCR..) dans les digesteurs anaérobies en utilisant de nouvelles techniques moléculaires.

3.1.1. Étude de la diversité microbienne

L'information sur la diversité et l'identité des micro-organismes impliqués dans le processus de digestion anaérobie est importante pour comprendre le fonctionnement du bioréacteur, en particulier lorsqu'il s'agit de nouveaux processus métaboliques. La découverte de microorganismes impliqués dans l'oxydation anaérobie de l'ammonium [procédé + - Anammox ; (NH4 + NO2 → N2 + 2H2 -358 kJ/réaction] est un bel exemple (Jetten et al., 1999; Ni and Zhang, 2013). D'autres processus clés importants tels que l'oxydation syntrophique des acides organiques (McInerney et al., 2008), la dégradation de composés récalcitrants comme les détergents (Okada et al., 2014) et l'oxydation anaérobie du méthane (Fernandez et al., 2009) ont été étudiés.

Pour attribuer l'identité des microorganismes impliqués dans une communauté microbienne, la technique la plus utilisée est basée sur l'analyse du gène de l’ARNr 16S. Ce gène a été proposé comme un marqueur génétique domestique pour étudier la phylogénie et la taxonomie microbienne pour plusieurs raisons. Sa fonction dans le temps n'a pas changé, suggérant que les changements de séquences aléatoires sont une mesure plus précise du temps (évolution). De plus, le gène de l'ARNr 16S (1500 pb) est assez important pour des études informatiques (Patel, 2001). De nos jours, il est possible de déterminer le genre et l'espèce d'une bactérie ou d'une archée par séquençage du gène 16S d'ARNr et comparer la séquence avec les bases de données disponibles (NCBI Genbank, Silva Database). Cette

Chapitre I : Synthèse bibliographique technique a été adaptée pour étudier la composition microbienne d'un échantillon comme cela sera expliqué ci-dessous.

L'application des technologies de séquençage à haut débit a fourni une résolution accrue pour l'étude des communautés microbiennes dans les digesteurs anaérobies à grande échelle (Lee et al., 2012; Werner et al., 2011). Les analyses de corrélation entre la composition de la communauté et les conditions opérationnelles telles que la température et la charge d'alimentation ont montré une forte influence sur la structure de la communauté (Sundberg et al., 2013; Zhang et al., 2008b; Ziganshin et al., 2013). La résolution accrue du séquençage à haut débit a également révélé des niveaux de diversité précédemment non reconnu (Nelson et al., 2011; Sundberg et al., 2013). Par exemple, les communautés microbiennes dans les digesteurs anaérobies examinées avec des banques de clones ont révélé seulement 69 unités taxonomiques opérationnelles (OTU) (Riviere et al., 2009), alors que deux études portant sur des digesteurs anaérobies à grande échelle avec séquençage à haut débit ont conduit à la découverte de milliers d'OTUs (Lee et al., 2012; Werner et al., 2011).

Une étude utilisant le pyroséquençage, technique rapide et moins onéreuse que le séquençage par la méthode de Sanger, a été réalisée pour analyser la communauté microbienne des réacteurs anaérobies traitant des eaux usées de boissons gazeuses. Cette étude a montré que l’analyse du gène de l'ARNr 16S sur un total de 25 échantillons de biofilm a généré 98057 séquences, qui ont été regroupées en 2882 unités taxonomiques opérationnelles (OTU). Les communautés étaient dominées par les Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes qui peuvent dégrader les composés organiques dans les processus de traitement des eaux usées (Narihiro et al., 2015). L’étude de la dynamique à long terme des réseaux d'association microbienne dans les processus de digestion anaérobie a été réalisée par séquençage de la région V4 du gène d'ARNr 16S ; cette étude a montré que les Clostridiales ont également été identifiés comme des populations clés jouant un rôle dans la dynamique d'interaction microbienne des digesteurs anaérobies (Wu et al., 2016). Une autre étude de la dynamique de la communauté microbienne dans un digesteur anaérobie mésophile traitant les intrants alimentaires a été effectuée par pyroséquençage. Les résultats ont montré que l'abondance relative des bactéries productrices d'acides et des bactéries syntrophiques oxydants les acides gras volatils a augmenté de manière spectaculaire, tandis que les méthanogènes dominants ne se sont pas déplacés des groupes acétoclastes aux groupes hydrogénotrophes. Ceci est intéressant dans la mesure où classiquement près de 70% de 60

Chapitre I : Synthèse bibliographique méthane produit dans un digesteur anaérobie provient classiquement à partir de l’acétate (Li et al., 2015).

Une caractérisation de la communauté microbienne dans un digesteur anaérobie thermophile traitant le fumier porcin a été effectué par pyroséquençage de la région V4-V5 de l'ARNr 16S ; L'analyse intégrée de 21 bandes DGGE, 126 clones et 8506 séquences de pyrosequençage a révélé que les Clostridia du phylum Firmicutes représentent les bactéries les plus dominantes. En outre, cette analyse a également identifié des nouveaux qui n’avaient pas identifiés par d’autres analyses, notamment des membres des phyla bactériens Synergistestes, Planctomycetes, Armatimonadetes, Chloroflexi et Nitrospira qui pourraient également jouer un rôle dans le digesteur anaérobie thermophile. La plupart des séquences d'ARNr 16S archées pourraient être attribuées à l'ordre Methanobacteriales au lieu de Methanomicrobiales. En outre, cette étude a rapporté que le genre Methanothermobacter a été trouvé dans un digesteur anaérobie thermophile (Tuan et al., 2014) .

Le séquençage Illumina HiSEQ a été utilisé pour caractériser la structure de la communauté microbienne de boue de digestion anaérobie d'une station de traitement des eaux usées municipales à grande échelle. L'analyse taxonomique a indiqué que les bactéries étaient gloalement les plus dominantes (~ 93%), alors qu'une abondance considérable d'archaea (~ 6%) a également été détectée dans les boues de digestion anaérobie. Les populations bactériennes les plus abondantes se sont révélées être des Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes et Actinobacteria (Gao et al., 2016). L'analyse de la diversité de la communauté microbienne d'un échantillon de boues par sequençage Illumina Miseq de la région V5-V6 de l’ARNr 16S a montré que les genres bactériens les plus dominants étaient Saccharicrinis, Syntrophus, Anaerotruncus et Thermanaerothrix. Parmi les archées, les acétoclastiques Methanosaeta représentent 56,0%, et les hydrogénotrophes Methanospirillum, Methanoculleus, Methanothermus et Methanolinea ont représenté 41,3% de tous les archées méthanogènes (Gao et al., 2016).

3.1.2. Étude de la dynamique microbienne

Différents paramètres de fonctionnement du réacteur, tels que la vitesse de charge organique appliquée, le temps de rétention hydraulique ou la température de fonctionnement et le pH sont fréquemment testés pour déterminer les conditions opératoires optimales pour le processus de digestion anaérobie. Afin d'expliquer comment ces paramètres opératoires

Chapitre I : Synthèse bibliographique peuvent influencer les performances du réacteur, il est nécessaire de surveiller la composition de la communauté microbienne pendant le fonctionnement (Cabezas et al., 2015). Lorsque l'objectif de la recherche est de tester différentes configurations de réacteur, différentes sources d'inoculum, ou différents substrats, la comparaison de la microbiologie des différents systèmes est nécessaire. Dans tous ces cas, de nombreuses structures communautaires pourraient être obtenues et l'application d'une technique d'empreintes digitales telle que DGGE, T-RFLP ou SSCP est un choix approprié (Boon et al., 2002; Pereira et al., 2014; Ramos et al., 2014). Les méthodes d'empreintes les plus couramment utilisés incluent Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP), Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) et Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (RISA). Ces méthodes sont basées sur l'analyse de produits PCR amplifiés à partir des gènes 16S d'ARNr (DGGE, SSCP et T-RFLP) ou de la région intergénique ribosomale entre les gènes 16S et 23S d'ARNr (RISA) (Whang et al., 2015; Zumstein et al., 2000).

3.1.3. Quantification microbienne

Dans le processus de la digestion anaérobie il est important de quantifier certains groupes clés, en particulier la densité et la proportion de méthanogènes en raison de leur pertinence pour assurer un processus méthanogène efficace. Pour cela, des techniques qui quantifient différents groupes de microorganismes présents dans une communauté complexe telle que Fluorescent in situ Hybridization (FISH) ou la PCR quantitative (q-PCR) sont adéquates.

La PCR quantitative (q-PCR) ou la PCR en temps réel (RT-PCR) est une technique moléculaire qui détecte et quantifie les molécules d'ADN en solution au moyen de la détection du signal fluorescent. Une région cible de l'ADN matrice est amplifiée avec des amorces spécifiques, les produits sont détectés dans chaque cycle pendant la phase exponentielle du processus (Higuchi et al., 1992). Les deux méthodes de détection les plus utilisées en microbiologie environnementale sont : (1) l'addition de colorants fluorescents intercalants (par exemple, SYBR Green I), qui n'émet de fluorescence que lorsqu'elle se lie à l'ADN bicaténaire (Wittwer et al., 1997) ou (2) des sondes oligonucléotidiques spécifiques de séquences (complémentaires d'une séquence interne) marquées avec un fluorophore et avec un inhibiteur (par exemple TaqMan) (Gudnason et al., 2007).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Dans le domaine de la recherche sur les boue anaérobies, la q-PCR a été appliquée principalement pour surveiller la communauté méthanogène. La stratégie consiste à cibler le gène de l'ARNr 16S (Yu et al., 2005) ou le gène mcrA (Alvarado et al., 2014). En ciblant le gène 16S de l'ARNr, certaines études ont montré un lien entre la méthanogénèse hydrogénotrophique et la méthanogénèse acétoclastique lorsque des conditions stressantes telles que la température ou l'ammoniac sont appliquées à des réacteurs à l’échelle de laboratoire (Jang et al., 2014; Lee et al., 2009; Song et al., 2010; Town et al., 2014; Traversi et al., 2012). D'autre part, une corrélation directe entre l'activité méthanogène spécifique et le nombre de copies du gène mcrA a été signalée récemment (Morris et al., 2014). Les principaux avantages de cette technique de quantification sont les faibles limites de détection (il est possible de détecter une seule molécule d'ADN en fonction de l'efficacité de la réaction), la possibilité d'effectuer plusieurs échantillons en même temps et le temps nécessaire pour obtenir des résultats. Les analyses q-PCR donnent accès à une quantification absolue et complètent ainsi très bien le séquençage et les données FISH qui donnent une abondance relative de micro-organismes ciblés (Cabezas et al., 2015).

3.1.4. Fonctionnement microbien

Les techniques "omics" (génomique, transcriptomique, protéomique et métabolimique) ont d'abord été utilisées pour l'étude et la caractérisation des isolats cultivables. Avec le développement d'outils d'instrumentation et de bioinformatique plus puissants, l'application de ces techniques a été étendue à des écosystèmes plus complexes. Ceci est important parce que l'interaction interspécifique et les réponses aux conditions environnementales, qui entraînent de multiples comportements communautaires, ne peuvent être identifiées que si l'écosystème est évalué dans son ensemble (Vanwonterghem et al., 2014). Des méthodes telles que la "SIP" et les techniques avancées d'imagerie permettent d'analyser la structure-fonction dans les écosystèmes, mais uniquement associées à un trait physiologique particulier. Les techniques "omics", d'autre part, ont le potentiel de révéler l'image complète des fonctionnalités microbiennes dans un écosystème (Figure I. 15).

Les techniques métaomiques - métagénomique, métatranscriptomique, métaprotéomique et métabolomique - peuvent être appliquées aux écosystèmes pour décomposer la composition et la fonction des microorganismes cultivables et aussi non cultivables (Cabezas et al., 2015; Vanwonterghem et al., 2014).

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Figure I. 15: Possibilités d'analyse multi-"omics" des communautés microbiennes complexes (Cabezas et al., 2015).

 L'analyse par métagénomique fournit des informations sur la taxonomie (basée sur les séquences de gènes ARNr 16S récupérées) et sur les gènes métaboliques (voies métaboliques fonctionnelles potentielles) présents dans le métagénome (Hassa et al., 2018).

 La métatranscriptomique permet d'étudier l'ARN ribosomique et l'ARN messager activement transcrits d'une communauté, en donnant une meilleure idée de la fraction active de la communauté ; Il peut être utilisé pour étudier comment les communautés et l'expression des gènes changent en réponse aux changements environnementaux (Hassa et al., 2018).

 La métaprotéomique est un excellent outil pour étudier la fonctionnalité dans un écosystème car les protéines sont directement responsables du phénotype cellulaire et sont donc plus informatives que l'identification de gènes fonctionnels ou leurs ARN messagers correspondants (Hassa et al., 2018).

 La métabolomique a été récemment introduite dans les approches de la biologie des systèmes et étudie l'ensemble complet de métabolites formés par l'ensemble de la

Chapitre I : Synthèse bibliographique

communauté microbienne en raison de son interaction avec les facteurs biotiques et abiotiques de son environnement (Cabezas et al., 2015).

3.2. Les approches de culture et d’isolement des microorganismes en écologie microbienne

3.2.1. Généralités

Cultiver les microorganismes revient à les placer dans des conditions suffisamment favorables pour permettre leur croissance. Lors de la mise en culture d’un échantillon, les microorganismes présents se retrouvent donc dans un nouvel environnement autre que celui où ils se trouvaient naturellement. Les conditions de croissance incluent la définition de paramètres physicochimiques (température, pH, salinité, oxygénation) et métaboliques : les cellules doivent avoir accès à une source d’énergie et de carbone ainsi qu’à d’autres nutriments nécessaires à leur croissance. Que cela soit réalisé sur un milieu liquide ou solide, le choix du milieu est primordial (Bertrand et al., 2015). La liste des milieux de culture en présentés comme plus ou moins sélectifs ou plus ou moins riches, s’est allongée ; et ces milieux sont largement utilisés. Les milieux de culture dits « classiques » peuvent être de composition définie, lorsque les composants sont connus, ou complexes lorsqu’ils contiennent des substances à composition mal définie (extraits de levure, peptone, tryptone, bouillon de culture etc). Cependant, comme n’importe quel environnement, tout milieu est nécessairement sélectif, car certains micro-organismes ne pourront pas s’y développer. De même, il ne peut à priori être avec certitude déclaré absolument spécifique au sens propre dans la mesure où les capacités des microorganismes peuvent être très variables au sein même d’une espèce (Atlas, 2010).

Pour optimiser les chances de succès d’une culture, les conditions doivent s’approcher au plus près de celles des conditions de l’environnement d’origine des microorganismes à cultiver. L’optimisation est évidement plus délicates avec les milieux complexes en raison de leur composition imparfaitement connue ; cependant les milieux définit présentent l’avantage de pourvoir être maîtrisés car leur composition peut être adaptée, modifiée et modulée (Dionisi et al., 2012). Dans le cadre d’une étude de la diversité la plus exhaustive possible de microorganismes qui doivent être cultivés, il est donc nécessaire de choisir au mieux des conditions de culture. Ce choix exige au préalable la connaissance des principales

Chapitre I : Synthèse bibliographique caractéristiques d’environnement d’origines afin de chercher à les reproduire pour tenter de limiter la sélectivité du milieu choisi (Bertrand et al., 2015).

Malgré toutes les précautions ce biais de sélectivité subsistera. Les choix techniques ne peuvent pas être illimités (combinaison de plusieurs milieux de culture et plusieurs températures, pH, etc.). En outre, la stratégie de mise en culture elle-même est un facteur de sélection (milieu solide, liquide, culture en batch). Le développement actuel d’autres pratiques (technique alternatives, culture continue…) montre à quel point, la culture, base de la microbiologie, est encore un champ d’exploration (Grady Jr et al., 2011).

3.2.2. Mise en culture des micro-organismes

3.2.2.1. Composition d'un milieu de culture

L’isolement des micro-organismes en laboratoire requiert de connaître les conditions spécifiques et essentielles pour le développement des micro-organismes (sources de carbone, sources énergétiques, vitamines, potentiel redox, pH, ...). Les éléments indispensables à leur croissance peuvent être déterminés en calculant la composition de la biomasse microbienne. Les éléments requis à de fortes concentrations sont qualifiés de macroéléments (carbone, oxygène, hydrogène, azote, soufre, phosphore, potassium, calcium, fer, magnésium, chlore, et sodium). Ils constituent approximativement 95% de la composition de la matière sèche des micro-organismes et leur présence est donc impérative dans les milieux de culture synthétiques (Plugge, 2005). D'autres éléments sont essentiels à de bien plus faibles concentrations et sont regroupés sous le terme micro-éléments ou oligo-éléments. Même s'il est plus difficile de prouver leur importance, ces oligo-éléments peuvent être impliqués dans des réactions enzymatiques essentielles. Ils comprennent le fluor, le zinc, le strontium, le cuivre, le vanadium, le sélénium, le lithium, le manganèse, l'iode, le tungstène, le molybdène, le nickel, le chrome, le cobalt et le silicium. Toutefois, l'utilisation de ces micro-éléments peut inhiber certains processus biochimiques. Par exemple, la fixation de l'azote chez les spirochètes est inhibée en présence de tungstène dans le milieu de culture (Leadbetter, 2003; Plugge, 2005).

3.2.2.2. La relation à l’oxygène

Dans l’environnement, les concentrations en O2 sont très variables. Les microorganismes peuvent être classés en fonction de leur besoin en oxygène en différent

Chapitre I : Synthèse bibliographique groupes en allant de ceux qui peuvent croître en présence d’oxygène à ceux qui ne peuvent croître qu’en absence totale de de dioxygène. Ainsi, il y a lieu de distinguer parmi les microorganismes (Bertrand et al., 2015; Grady Jr et al., 2011):

i. Les aérobies obligatoires qui ont besoin d’O2 pour se développer ; leur respiration est de type aérobie.

ii. Les micro-aérophiles, également à respiration aérobie, mais qui ne peuvent se

développer qu’en présence d’une concentration d’O2 (2 à 10%) inférieure à celle du niveau atmosphérique (20%). iii. Les anaérobies facultatifs, qui sont capable de croitre soit en présence, soit en absence

d’O2 en présence d’un autre accepteur d’électrons tel que le nitrate pour les bactéries dénitrifiantes. iv. Les anaérobies aéro-tolérants, qui tolèrent l’O2 et se développent en sa présence, c’est le cas de certaines bactéries fermentative.

v. Les anaérobies stricts ou obligatoires, qui sont inhibés où tués par l’O2. Ces microorganismes tirent leur énergie par fermentation ou par respiration anaérobie.

L’anaérobiose peut être obtenue par : (i) L’élimination de l’air qui est remplacé par de l’azote souvent enrichi avec du CO2. Cette opération est effectuée soit dans une enceinte hermétiquement fermée ; soit dans des tubes bien particuliers qualifiés « tubes de Hungate » qui sont fermés par un bouchon en caoutchouc permettant les prélèvements et les transferts en conditions anaérobies. Ces tubes sont utilisés pour le dénombrement des bactéries anaérobies par la méthode NPP (nombre le plus probable) et pour la mesure de leur activité (Botheju and Bakke, 2011; Li et al., 2011). (ii) L’addition des agents réducteurs de l’oxygène dans le milieu tels que la cystéine ou le thioglycolate. (iii) La suppression du dioxygène par catalyse dans une « jarre anaérobie » ou l’hydrogène et le CO2 sont injectés ; l’hydrogène en présence de du palladium, qui sert comme catalyseur, réagit avec l’O2 qui se trouve ainsi éliminé (Aranki and Freter, 1972; Bertrand et al., 2015). (iv) L’utilisation d’une « hotte anaérobie » contenant une atmosphère totalement anaérobie dont l’aire est remplacée le plus souvent avec le diazote. C’est une technique plus efficace qui s’impose dans les laboratoires spécialisé dans l’étude des microorganismes anaérobies (Slots, 1982).

3.2.3. Les limites de l'approche culturale et son amélioration

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Les micro-organismes identifiés par les outils moléculaires comme dominants ou métaboliquement actifs dans un écosystème sont rarement, pour ne pas dire jamais, isolés in vitro. La suppression de la communication cellulaire, la dormance cellulaire due aux substrats limitants ou d'autres stress, les fortes concentrations de nutriments, les temps d'incubation trop courts, la sélectivité du milieu de culture et notre compréhension incomplète des conditions physiques, chimiques et nutritionnelles indispensables à la croissance microbienne expliqueraient en grande partie la faible efficacité de culture.

Certains microbiologistes considèrent que les micro-organismes qualifiés de "non- cultivés" ou "non-cultivables" possèdent des propriétés biologiques inconnues et pourraient en réalité être cultivés grâce à de simples modifications des conditions de mise en culture (Alain and Querellou, 2009; Giovannoni, 2007). Au cours de ces dernières années, des efforts ont ainsi été menés pour limiter les biais inhérents à la culture traditionnelle (Nichols, 2007) et ont permis d’accroître l'efficacité de culture et notamment d'isoler des microorganismes auparavant non-cultivés (Giovannoni, 2007).

3.2.3.1. Concentration des substrats

Traditionnellement, la concentration des substrats dans les milieux de culture synthétiques est plusieurs fois supérieure aux concentrations mesurées dans l'environnement. La transition d'un écosystème naturel à un milieu de culture artificiel peut donc représenter un stress pour les micro-organismes (Bruns et al., 2003; Hahn, 2004). Les micro-organismes oligotrophes sont adaptés à de faibles concentrations en substrats et peuvent représenter une part importante des procaryotes récalcitrants à la culture in vitro. De plus, de fortes teneurs en nutriments peuvent promouvoir le développement d'organismes qualifiés d'opportunistes, capables de former des colonies visibles, des biofilms ou une turbidité (Ferrari et al., 2005), au détriment d'espèces qualifiées d'oligotrophes. Afin de limiter le stress lié à une exposition massive au substrat, le milieu de culture initial peut être dilué (Janssen et al., 2002). Cette technique a permis d'isoler de nouveaux micro-organismes, mais l'incubation des cellules avec de faibles concentrations en nutriments présente le désavantage de générer une faible biomasse microbienne. Une alternative consiste à incuber les cellules avec des molécules complexes. Ces polymères sont progressivement hydrolysés au cours du temps et fournissent de façon continue de faible quantité de substrats (Davis et al., 2005; Sait et al., 2002).

3.2.3.2. Maintien de la communication cellulaire in vitro

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Reproduire au mieux les conditions physico-chimiques rencontrées in situ peut, dans certains cas, être insuffisant. La séparation des cellules microbiennes les unes des autres implique la suppression des communications intercellulaires. Ces interactions complexes prennent place dans les habitats naturels et font intervenir des populations microbiennes interdépendantes les unes des autres (Giovannoni, 2007). La combinaison de deux organismes ou plus peut assurer une réaction biologique inexistante chez un micro-organisme en culture pure (symbiose, co-métabolisme...). Des molécules signal sont produites et actives à de très faibles concentrations de l'ordre du picomolaire. Au sein des bactéries Gram positives, les molécules signal produites sont des protéines et des polypeptides. La protéine Rpf sécrétée par Micrococcus luteus augmente le taux de viabilité des cellules par 100 et peut aussi stimuler la croissance des cellules (Mukamolova et al., 1998).

3.2.3.3. Temps d'incubation et taille de l'inoculum

L'incubation des cultures peut être également un point critique pour l'isolement des microorganismes. Les temps d'incubation sont généralement compris entre 1 semaine et 1 mois. Cependant, des études ont montré que les micro-organismes rarement cultivés sont souvent isolés lorsque les temps d'incubation sont supérieurs à 1 mois. Une longue période d'incubation permet le développement de micro-organismes à faible taux de croissance ou présentant une longue phase de latence due à un milieu de culture non-optimal (Janssen et al., 2002).

3.2.4. Procédures d'enrichissement

L'étape d'enrichissement a pour but de multiplier les conditions de croissance ou de favoriser la croissance d'un groupe fonctionnel particulier sous-représenté, ou des microorganismes présentant des caractéristiques bien spécifiques (température, pH, potentiel redox, concentration en sels, carbone, énergie, accepteur d'électron, facteur de croissance, inhibiteur…). La culture traditionnelle est sélective et une fraction inconnue de la diversité microbienne totale est directement sous-estimée (Keller and Zengler, 2004). Un milieu de culture ne peut pas assurer le développement de tous les micro-organismes présents in situ. Afin d'accroitre la fraction microbienne cultivée, des procédures d'enrichissement sont souvent menées sur l'échantillon initial.

3.2.4.1. Le dénombrement traditionnel des bactéries cultivables

Chapitre I : Synthèse bibliographique

Le dénombrement des bactéries cultivables peut se réaliser au moyen de milieux de culture liquide ou solide. Dans le cas du milieu liquide, le dénombrement des bactéries cultivables peut se faire par la méthode "NPP". Cette méthode est utilisée pour estimer la concentration bactérienne par une approche statistique (McInerney et al., 1979; Vester and Ingvorsen, 1998). Le nombre de cultures positives déterminé pour une série de tubes ensemencés par différentes dilutions avec plusieurs réplicats par dilution permettant ensuite de calculer le NPP de bactéries présentes dans l’échantillon de départ par l’utilisation de tables statistiques (Bertrand et al., 2015; Rożej, 2003). Cependant, dans le cas du milieu solide réparti en boite de Pétri, un volume d’échantillon est étalé à la surface de ce milieu. Après incubation dans des conditions recherchées, les unités formant colonies (UFC) sont calculées à l’œil nu afin de déduire le nombre de bactéries cultivables présente dans l’échantillon étudié. En fonction de la charge microbienne dans l’échantillon, une dilution ou une concentration pourrait être nécessaire. Il est recommandé de ne retenir que les boites contenant entre 30 à 300 UFC (Bertrand et al., 2015; Patureau et al., 2000).

3.2.4.2. Techniques de culture haut débit

De nouvelles techniques de culture ont récemment été développées et ont contribué à isoler de nouveaux taxons microbiens jusqu'alors non cultivés. Ces techniques innovantes permettent d'isoler et cultiver les micro-organismes à haut débit (micromanipulation au laser, système microdrop® (Bruns et al., 2003), cytométrie de flux (Porter et al., 1993), FACS) (Park et al., 2005). Le système MicroDrop® produit de façon très reproductible des gouttes de 150-200 µl afin d'inoculer des microplaques dans un milieu de culture défini. Cette technique haut débit assure l'ensemencement d'une microplaque 96 puits en moins d'une minute tout en évitant une dilution initiale des échantillons (Bruns et al., 2003). De plus, la technique s'avère être statistiquement plus reproductible que les méthodes du type NPP. Plus récemment, une boîte de Pétri subdivisée en millions de compartiments a été développée dans laquelle les nutriments sont fournis au travers d'une membrane poreuse. Cette technique assure la croissance et le criblage de millions de souches et constitue une manière efficace de supprimer les effets de compétitions intercellulaires (Ingham et al., 2007).

Chapitre II : Procédures expérimentales

1. Description du site d’étude

1.1. Station de traitement et d’épuration des eaux usées (STEP)

La STEP (Figure II. 2) est situé à 13 km au nord-ouest sur la rive gauche de l’Oued Tensift (Marrakech, Maroc). Elle repose sur une superficie de 17 hectares et traite 120 000 m3 d’eaux usées par jour. Le traitement de ces effluents liquides se déroule en trois phases importantes. Une première phase de prétraitement, traitement primaire et traitement des boues. La deuxième phase consiste en un traitement secondaire, un traitement tertiaire. La dernière phase est consacrée au traitement des boues (par digestion anaérobie), désodorisation et cogénération. La station dispose de quatre grands réacteurs méthanogènes effectuant la digestion anaérobie et produisant le biogaz. Une unité de cogénération fonctionnant au biogaz produit par la méthanisation des boues issues du processus d’épuration des eaux usées, et permet d’assurer 45% de ses besoins en énergie électrique contribuant ainsi à la réduction de l’émission de 60 000 tonnes de gaz à effet de serre (GES). La STEP est équipée d’un laboratoire d’analyse des eaux usées et d’une salle de contrôle et supervision dotée de moyens et logiciels de gestion informatique de la maintenance de l’établissement des bilans et de suivi en temps réel du fonctionnement de la station. De ce fait, distinguée par sa technologie innovante, elle a été enregistrée par les Nations Unies au Mécanisme du Développement Propre (MDP), chargé au titre du protocole de Kyoto de lutter contre le changement climatique et le réchauffement planétaire.

1.2. Décharge publique

Elle est située du côté nord de l’Oued Tensift à 2 km de la STEP en contrebas de la route principale reliant les villes de Marrakech et Safi. Elle reçoit en moyenne 450 tonnes de déchets urbains par jour constitués majoritairement de matière fermentescible, dont une grande partie provient de boue déshydratée après digestion anaérobie (Figure II. 1). Ces matières organiques (65 à 70% en poids humide) constituent une source potentielle de pollution des eaux de la nappe phréatique et de l’Oued Tensift situés près de la décharge.

La STEP a pour rôle d’éliminer la pollution contenue dans les effluents domestiques et industriels (tanneries, huileries, papeteries) avant leur rejet dans le milieu naturel. En revanche, la pollution initiale se trouve stockée et concentrée dans la boue déshydratée issues des diverses étapes de traitement de l’eau. Les boues déshydratées sont riches en éléments

Chapitre II : Procédures expérimentales traces métalliques et organiques. Contrairement aux polluants organiques susceptibles de se dégrader, les éléments traces métalliques peuvent être nocifs à l’environnement (ressources en eaux, le sol et l’air) du fait de leur stabilité et de leur persistance dans la nature. La principale voie d’élimination de ces boues est la mise en décharge, cela en effet peuvent provoquer la contamination du milieu écologique s'ils étaient lessivés vers les eaux souterraines, les eaux de surfaces où consommés par les êtres vivants.

Figure II. 1: Photographie de la décharge publique où sont rejetées les boues dehydratés provenant de la station de traitement des eaux usées de la ville de Marrakech.

1.3. Stratégie d’échantillonnage

1.3.1. La STEP de Marrakech

Un échantillonnage de boue a été effectué le 24 juillet 2015 au niveau des quatre méthaniseurs en raison de deux échantillonnages par digesteur. En effet le système d’agitation au niveau des digesteurs n’est pas homogène, ce qui a potentiellement un effet sur la répartition des populations microbiennes au sein du digesteur. Pour cette raison, un prélèvement a été effectué au niveau de la partie supérieure et la partie inférieure de chaque digesteur. Le deuxième prélèvement a été effectué à partir des boues primaires épaissies (boues obtenues à partir des épaississeurs avant d’être digérées); et le troisième à partir des boues floculées (prélevées des clarificateurs obtenues par ajout de polymères pour assurer la

Chapitre II : Procédures expérimentales formation de flocs). En fin, un quatrième prélèvement a été réalisé au niveau du réacteur d’oxydation biologique dans lequel s’effectue le processus de désulfurisation biologique (Figure II. 2).

4 3

Figure II. 2: Photographie de la station de traitement des eaux usées de la ville de Marrakech. 1, Pilotage de la STEP ; 2, Décanteurs primaires ; 3, Épaississeurs ; 4, Digesteurs anaérobies ; 5, Clarificateurs ; 6, Gazomètres ; 7, Bioréacteur de désulfurisation.

Chapitre II : Procédures expérimentales Les échantillons ont été prélevés en anaérobiose comme décrit par El Houari et al., (2017) dans des flacons de 250 ml. Au laboratoire, les échantillons ont été dispatchés dans des cryotubes à raison de six répétitions par échantillon (Figure II. 3). Les flacons sont stockés à 4°C, les cryotubes sont conservés à -80 °C.

Figure II. 3: Répartition des échantillons de boue dans les cryotubes ; flacon de prélèvement de boues dans les digesteurs, les boues primaires et les boues floculées.

1.3.2. La décharge publique de Marrakech

Une fois digérées dans les digesteurs, les boues subissent un processus de déshydratation à l’aide des filtres à bandes. La déshydratation est effectuée après conditionnement des boues avec un polymère en poudre et de la chaux pour améliorer les performances de déshydratation. Ce traitement par élévation de température et de pH (à plus de 12) réduit les agents pathogènes et les mauvaises odeurs. En fin, les boues déshydratées sont transportées à la décharge. Un échantillon de ces boues a été prélevé et mis en sacs de plastiques bien fermés. Arrivés au laboratoire, les échantillons ont été stockés à 4°C.

1.4. Description des différents points d’échantillonnage

La STEP est une usine de traitement des eaux usées de la ville de Marrakech (les eaux domestiques, les eaux industrielles et les eaux pluviales) qui arrivent à la STEP par un réseau d’assainissement, avant de les rejeter dans le milieu naturel pour diminuer les risques sur l’environnement et l’homme. Le fonctionnement automatique de la STEP se fait principalement à partir de la salle de la supervision, depuis laquelle la visualisation et la modification des différentes équipements de la station est applicable, à partir d’une interface 75

Chapitre II : Procédures expérimentales de supervision. La STEP est constitué de trois composantes principales: une ligne d’eau, une ligne de boue et une ligne de biogaz. L’échantillonnage a été effectué depuis les trois différentes lignes comme décrits ci-dessous.

1.4.1. Ligne d’eau : Décantation primaire

Cette ligne est représentée un prétraitement des eaux par dégrillage, dessablage, dégraissage et décantation primaire. Une fois libérées des déchets les plus volumineux, les eaux sont envoyées vers la décantation primaire. Les particules les plus lourdes descendent vers le fond par gravité. L’eau claire est récupérée à la surface pour être envoyée vers le traitement secondaire. Les boues obtenues sont d’abord pompées vers les épaississeurs avant d’être digérées. La STEP dispose de décanteurs de type circulaire-conique au fond de pente 15°, ils sont de nombre de trois (Figure II. 4).

L’eau dessablée-dégraissée est envoyée vers un répartiteur aéré qui a pour rôle de répartir l’eau en quantité égale pour les trois décanteurs. Après deux heures de décantation, la graisse flottante raclée est envoyée vers le traitement des graisses, la matière décantée (la boue) qui a une concentration de 5 g/l est envoyé vers les épaississeurs.

1.4.2. Ligne de boue : Épaississeurs et méthaniseurs

3.2.4.3. Épaississeurs

Chapitre II : Procédures expérimentales Ce processus est appelée aussi floculation. C’est le premier stade de réduction de volume des boues sans dépenses notables d’énergies. Cette étape est caractérisée par l’augmentation de la concentration des boues de 5 g/l à 70 g/l. Elle est effectué dans des épaississeurs de type gravitaire (Figure II. 5). Les boues primaires extraites des décanteurs primaires est envoyée par une tuyauterie commune alimentant la bâche de répartition des épaississeurs gravitaires de boues primaires.

Ces boues primaires sont épaissies selon le principe de la décantation pendant une durée de 3h pour augmenter leur concentration à une moyenne de 70 g/l et elles sont dirigées vers le centre de l’épaississeur par un raclage au fond pour les extraire vers le digesteur. La surverse des eaux s’écoule à travers la sortie du surnagent.

3.2.4.4. Méthaniseurs ou digesteurs anaérobies

Après l’épaississement, les boues épaissies vont rejoindre une digestion anaérobie. La digestion anaérobie, ou méthanisation, est le processus naturel de dégradation de la matière organique en absence d'oxygène. La STEP est équipé de quatre ouvrages de digestion anaérobie de type mésophile (Figure II. 6). L’objectif de cette étape est la production du biogaz à partir des boues épaissies. Les boues épaissies (70% matière organique et 30% matière minérale) arrivant au digesteur vont subir une digestion anaérobie à une température moyenne de 35°C pendant une durée de 21j.

Chapitre II : Procédures expérimentales

1.4.3. Ligne de biogaz : Bioréacteur de désulfurisation

L’épuration du biogaz (CH4, CO2, H2S…..) produit à la sortie des digesteurs est primordiale pour tout procédé de valorisation du biogaz (chaudières, moteurs, (micro)turbines, épuration pour biométhane). Le processus de désulfurisation garantira une bonne durée de vie des équipements et sera donc source d’économie sur leur maintenance. La STEP dispose d’un procédé Thiopac de désulfurisation (Figure II. 7).

Le gaz entre dans une colonne de lavage replie de support est désulfuré à l’aide d’une solution alcaline de soude à 30%. Le biogaz est désulfuré dans la tour de lavage par contact avec une solution de soude. Le liquide de lavage est envoyé dans le bioréacteur pour les sulfures captés et régénérer la soude. Le séparateur de soufre permet de décanter et concentrer le soufre à récupérer tout en recyclant la solution de soude.

Le bioréacteur de désulfurisation biologique des sulfures traite une quantité journalière de 700 m3 de biogaz dans les conditions opérationnelles suivantes : Température : 25-40 °C : pH : 7.9-8.9 ; Conductivité (ms/cm²) : 40-60 ; MS : 168 g/l.

Chapitre II : Procédures expérimentales

Figure II. 7: Représentation schématique de principe du procédé de Thiopaq pour désulfuration du biogaz. Laveur à gauche ; Bioréacteur au milieu ; Séparateur de soufre à droite.

2. Approches culturales : culture, isolement et conservation

2.1. Composition et préparation du milieu de culture en anaérobiose

2.1.1. Techniques de l’anaérobiose

Les techniques utilisées dans cette étude sont celles décrites par Hungate (1969) modifiées par Bryant (1972) pour l’utilisation des seringues. Elles reposent sur l’utilisation des récipients divers tels que les tubes Hungate et les flacons pénicillines fermés avec des bouchons en butyl maintenus par des viroles à vis ou capsules en aluminium respectivement sous un mélange de gaz stérile N2-C02 (80-20%) (Figure II. 8). Les bouchons peuvent être transpercés par des aiguilles stériles sans risque de contamination ou d’introduction d’air. Les

Chapitre II : Procédures expérimentales prélèvements et les inoculations sont effectués stérilement à l’aide des seringues médicales stérile munies d’aiguilles hypodermiques à usage unique.

Figure II. 8: Systèmes de type (A) Hungate (écrasement d’un bouchon grâce à un pas de vis) ou (B) Balch (écrasement du bouchon par un anneau de sertissage en aluminium).

2.1.2. Préparation du milieu de culture de base pour bactéries anaérobies

La composition d’un litre de milieu de culture minéral anaérobie est la suivante : 0,5g

K2HPO4; 0,5g KH2PO4; 0,5g NH4Cl; 0,4g NaCl; 0,1g KCl; 0,05g CaCl2.9H2O ; 0,3g

MgCl2.6H2O; 2g NaHCO3 ; 0,04g Na2S.9H2O; 1 ml de la solution d’oligoéléments (Widdel and Pfennig, 1981) modifié par Imhoff-Stuckle and Pfennig (1983) Imhoff-Stuckle et Pfennig (1983) ; 1 ml de solution de rézasurine (0,1%) ; l ml de la solution vitamines (Balch et al., 1979) préparé séparément et stérilisé par filtration et ajouté au milieu de culture après autoclavage. Le pH est ajusté à 6,5. Pour la préparation des milieux solides par la méthode des roll-tubes, 2% (w/v) d’agar ont été ajouté.

Les produits entrants dans la composition du milieu de culture sont mis sous agitation dans un erlenmeyer contenant de l’eau distillée (qsp un litre), le pH est ajusté à l’aide d’une solution KOH. La solution est ensuite dégazée par ébullition, répartie après refroidissement sous azote dans des tubes Hungate ou des flacons pénicillines. La stérilisation des tubes et flacons se fait par autoclavage à 120°C pendant 30 mn (Figure II. 9).

Chapitre II : Procédures expérimentales

A) pH ajusté avec du KOH B) Milieu avec ) rézasurine

pH mètre Virage de la couleur du milieu par ébullition C) )

Entrée de flux d’azote Milieu avec rézasurine refroidi sous azote

Tubes Hungate

2.1.3. Création et maintien de l'anaérobiose des milieux de culture : Fiole de Widdel

Des procédures bien spécifiques sont requises pour créer et maintenir les milieux de culture en conditions anoxiques. La fiole de Widdel (Widdel and Bak, 1992) est utilisée pour préparer et distribuer les milieux de culture stérilement sous atmosphère contrôlée (Figure II. 10). Ce dispositif spécifique permet de dégazer le milieu autoclavé sous un flux d’azote. Cependant, une anaérobiose parfaite ne peut pas être obtenue par simple dégazage. L’efficacité réductrice des agents chimiques requis comme agent réducteurs varie selon le potentiel du couple redox correspondant. La HCl-cystéine et/ou le Na2S.9H20 sont utilisés pour réduire complètement le milieu de culture.

Dès la sortie de l'autoclave, lorsque le milieu est encore bouillant, l'atmosphère de la fiole est évacuée (sortie, 1) et remplacée (entrée l) par de l'azote stérile. Le milieu est ensuite refroidi sous cette atmosphère contrôlée et maintenu en légère surpression (0,2 bars), les sorties 1 et 2 sont alors fermées. On ajoute ensuite le Na2S.9H20, les compléments du milieu préparés dans des flacons pénicilline en anaérobiose préalablement stérilisés par autoclavage

Chapitre II : Procédures expérimentales (l20°C pendant 20 mn) ainsi que l’inoculum (entrée 2). Le milieu de culture est distribué (sortie 2) stérilement à l’aide de la cloche de verre dans des tubes ou des flacons stériles.

Entrée 1

Sortie 1 Entrée 2

Milieu de culture

Cloche en verre pour distribution du milieu de culture

Agitation Magnétique

Figure II. 10: Fiole de Widdel

2.2. Composition et préparation du milieu de culture de base pour bactéries aérobies

La composition d’un litre de milieu de culture aérobie est celle décrite dans le paragraphe précédent, sauf qu’il ne contient ni rézasurine, ni HCl-cystéine, ni sulfures

(Na2S.9H2O). La préparation du milieu de culture a été faite selon le protocole décrit ci- dessus et adapté à la culture des bactéries aérobies. Toutes les cultures sont réalisées en tubes d’Hungate ou flacons pénicillines fermés avec des bouchons en butyle maintenus par des viroles à vis ou capsules en aluminium respectivement sous air. Ce système présente plusieurs avantages par rapport à l’utilisation des boîtes de Pétri ou des cultures en Erlen bouchés avec du coton cardé (minimisation des risques de contaminations des cultures et des substrats par exemple). Les prélèvements et les inoculations sont effectués stérilement à l’aide des seringues médicales stériles munies d’aiguilles hypodermique ce qui permet

Chapitre II : Procédures expérimentales d’éviter tout risque de contamination retrouvée en utilisant des tubes à coton cardé ou les boites de Pétri.

2.3. Solutions stocks utilisées pour les milieux de culture

2.3.1. Solutions mères utilisées pour les substrats carbonés

Les solutions mères d’acides organiques (lactate, formate, acétate…), d’alcool (méthanol…) et du bicarbonate ont été préparées en aérobiose et en anaérobiose à une concentration de 1M et stérilisées à l’autoclave pendant 20 min à 120°C puis conservées en flacons pénicillines à température ambiante. La solution mère de glucose a été préparée en aérobiose et anaérobiose à une concentration de 1 M et stérilisée par filtration (filtre millipore, porosité : 0,22µm) puis conservée en flacon pénicilline à température ambiante. Les solutions mères de dérivés peptidiques ont été préparées en anaérobiose à une concentration de 10 % p/v et stérilisées par autoclavage pendant 20 min à 120°C. La liste des dérivés peptidiques est la suivante : peptone, biotrypcase (hydrolysat trypsique de caséine), extrait de levure, casamino acides (hydrolysat acide de caséine), TSB (tryptic soy broth), BHI (Broth heart infusion).

2.3.2. Solutions mères utilisées pour les substrats soufrés

Les solutions mères des composés soufrés (sulfate, sulfite, thiosulfate, soufre élémentaire, tetrathionate et thiocyanate) ont été préparées exclusivement en anaérobiose à une concentration de 1M et stérilisées à l’autoclave pendant 20 min à 120°C puis conservées en flacons pénicillines à température ambiante. Pour les sulfures, deux formes ont été utilisés : les sulfures solubles sous forme de sulfures de sodium (2%, p/v) et les sulfures sous forme de gaz préparés à partir des sulfures solubles. Toutes les solutions ont été stérilisées à l’autoclave pendant 20 min à 120°C puis conservées en flacons pénicillines à 4°C.

2.3.3. Solution d’oligo-éléments

La composition de cette solution est celle décrite par Widdel and Pfennig (1981) modifié par Imhoff-Stuckle and Pfennig (1983). La composition d'un litre est la suivante : 6,7 ml HCl (37%) ; 1500 mg FeCl2. 4H2O ; 6 mg H3BO3 ; 100 mg MnCl2. 4H2O ; 190 mg

CoCl2. 6H2O ; 70 mg ZnCl2 ; 24 mg NiCl2. 6H2O ; 2 mg CuCl2. 2H2O ; 36 mg Na2MoO4. 2H2O. Le chlorure de fer est préalablement solubilisé dans la solution d'acide chlorhydrique ;

Chapitre II : Procédures expérimentales cette solution est diluée avec de l'eau distillée avant l’addition des autres composés. La solution est stockée à 4°C.

2.3.4. Solution de rézasurine

La résazurine (7-hydroxy-3H-phénoxazin-3-one 10-oxyde) (Widdel and Bak, 1992), un indicateur d'oxydo-réduction utilisé dans les milieux de culture à raison de 1 g.l-1. Au cours de la stérilisation du milieu, ce composé est irréversiblement réduit en résofurine, de couleur rose à pH neutre. Lors de la réduction du milieu, la seconde réaction réversible, consiste en la production de hydrorésofurine. En dessous d'un potentiel rédox de - 110mV pour le couple rédox résofurine/hydrorésofurine, le milieu de culture devient transparent et redevient rose si le potentiel rédox redevient supérieur à -51mV. Cependant, un virage du milieu de culture au rose ne signifie pas forcément que le milieu s'est oxygéné. Certains microorganismes opérant la réduction du nitrate produisent des nitrites ou le dioxyde d’azote qui peuvent agir comme oxydants potentiels et augmenter le potentiel redox. De la même façon, un milieu de culture incolore ne signifie pas que les conditions réduites sont suffisantes puisque certains microorganismes requièrent un potentiel redox bien inférieur à - 110mV pour leur croissance.

2.3.5. Solution de vitamines

La solution de vitamines utilisée est celle de Balch et al., (1979). La composition par 100 ml de la solution est comme suit : 25mg acide para-aminobenzoïque ; 10mg D-biotine ; 0,5 mg cyanocobalamine ; 25mg thiamine-HCl ; 25mg riboflavine ; 50mg pyridoxal-HCl ; 25mg DL-pantothénate de calcium ; 25mg acide nicotinique (niacine) ; 10mg acide folique ; 25mg acide lipoïque. La solution est stérilisée par filtration (filtre millipore, porosité :

0,22µm) et stockée à l’abri de la lumière à 4°C.

2.4. Techniques d’isolement et de purification

2.4.1. Numération des bactéries par la méthode NPP (Nombre le Plus Probable)

Nous avons utilisé la technique du NPP (De Man, 1975) avec 3 répétitions par dilution. Cette méthode statistique est basée sur la dilution de l'échantillon. Après réalisation des dilutions, les différents milieux spécifiques des numérations sont ensemencés stérilement, en anaérobiose stricte, ou en aérobiose, selon la technique de Hungate (1960),

Chapitre II : Procédures expérimentales modifiée par Bryant (1972). Tous nos dénombrements ont été réalisés en milieu liquide, en tubes de Hungate à raison de 10 ml par tube.

Les bactéries sulfato-réductrices ont été dénombrées dans un milieu anaérobie contenant propionate (20mM) + sulfate (20mM) ; le lactate (20mM) + sulfate (20mM) et l'acétate (20mM) + sulfate (20mM) ; les bactéries sulfo-oxydantes ont été dénombrées en anaérobiose en présence du thiosulfate (40mM) + nitrate (20mM); et en aérobiose en présence de thiosulfate (40mM) + Oxygène. Ensuite, les isolements ont effectués par la technique des « roll-tubes » à partir du troisième repiquage.

2.4.2. Isolement des souches

Les isolements ont été réalisés par « la technique des roll-tubes ». En effet, une cascade de dilutions pour chaque enrichissement de facteur 10 de 10-1 à 10-10 ont été effectuée dans des tubes Hungate contenant de l’eau réduite anaérobie (9ml/tube) (Figure II. 11). L’inoculum provient des grandes dilutions positives des enrichissements préalablement décrit dans le paragraphe précédent. Des tubes Hungate contenant le milieu solide anaérobie sont chauffés pour faire fondre l’agar puis refroidis dans un bain-marie à 45°C pour maintenir la gélose en surfusion. Chaque dilution a servi pour inoculer deux exemplaires comme cela est indiqué dans la figure II. 11. Les tubes inoculés sont ensuite mis en rotation sous eau froide de façon à répartir la gélose de manière homogène sur toute la surface interne des tubes. Les « roll-tubes » sont ensuite incubés à l’envers à 35°C.

Chapitre II : Procédures expérimentales

Les grandes dilutions positives Le milieu de culture est inoculé à 10%

Le milieu de culture gélosé solidification est roulé sous l’eau froide jusqu’à Figure II. 11 : Technique d’isolement par la méthode des "roll-tubes" 2.4.3. Purification des souches

Les colonies de bactéries sulfatoréductrices sont entourées d'un halo noir à cause de la précipitation des sulfures produits avec le fer contenu dans le milieu. Les colonies (sulfato- réductrices, sulfo-oxydantes et fermentaires) sont prélevées stérilement avec une pipette Pasteur effilée, puis repiquées et diluées séparément en milieu liquide correspondant. La dernière dilution positive est de nouveau diluée dans une série de 10 tubes de milieu gélosé. Trois séries successives sont généralement nécessaires pour l'obtention d'une culture pure. La pureté des souches est vérifiée d'une part par l'ensemencement en aérobiose et en anaérobiose sur un milieu sans sulfate, avec 1% de glucose, 1% de Biotrypcase et 1% d'extrait de levure, et par examen au microscope d'autre part.

2.4.4. Conservation des souches

Une fois purifiées, les souches sont conservées en milieu liquide à 4°C et entretenues par repiquages à intervalles réguliers. Les souches sulfato-réductrices et sulfo-oxydantes d'intérêt ont été cultivées dans des volumes de culture de 5 ml. La pureté des souches a été vérifiée par observations microscopiques et repiquages successifs. Les souches en pleine phase de croissance exponentielle ont enfin été cryoprotégées avec du glycérol (20% vol/vol) et conservées à -80 °C.

3. Caractérisation morphologique et physiologique des souches pures

Chapitre II : Procédures expérimentales 3.1. Suivi de la croissance bactérienne

La croissance est suivie par mesure de la densité optique des cultures au spectrophotomètre (Camsper spectrophotometer, M107) à une longueur d'onde de 600 nm. Pour les expériences menées en tubes Hungate, les mesures sont faites directement en insérant les tubes dans le spectrophotomètre. Les spectrophotomètres ont été adaptés pour permettre le passage direct des tubes de ce diamètre, car ce transfert vers une cuve standard n'est pas possible pour des raisons de virage en rose de l'indicateur redox coloré (la résazurine) présent dans les milieux.

3.2. Caractérisation morphologique

3.2.1. Etude de la morphologie

Les caractéristiques cellulaires (forme, taille, mobilité, sporulation, coloration de Gram) et examen de flagelles ont été observées par microscopie à contraste de phase (Olympus BX 60) et microscopie électronique à transmission (HITACHI H7650; Centre de microscopie électronique de Bordeaux Imaging Center, BIC, France) après coloration négative (1%, p/v, acide phosphotungstique neutralisé), respectivement.

La prise des photographies en microscopie optique a été réalisée de la manière suivante : les cellules sont d’abord concentrées par centrifugation à 10000 tours min-1 pendant 10 mn (centrifugeuse de paillasse type Centrolit II). Le culot cellulaire ainsi obtenu est re-suspendu dans une faible quantité d’agar en fusion. Une goutte de ce mélange est immédiatement étalée sur une lame pour fixer les bactéries dans l’agar pour empêcher la mobilité et les mouvements browniens. La coloration de Gram a été réalisée en utilisant des souches de collection dont le Gram est connu, comme référence.

3.2.2. Recherche de formes de résistance à la chaleur

La recherche de formes de résistance à la chaleur a été réalisée en incubant, après croissance, deux tubes dans chacune des conditions suivantes : 10 min à 80°C, 20 min à 80°C, 5 min ou 10 min à 90°C (Figure II. 12). Chaque tube est ensuite repiqué dans un milieu de culture neuf. Une éventuelle croissance après incubation à la température optimale témoigne de la présence de spores ou autre formes de résistance à la chaleur. Les souches de collection dont on sait qu’elle ne forme pas de spores ont été utilisées comme contrôle.

Chapitre II : Procédures expérimentales

Figure II. 12: Représentation schématique des différentes étapes du test de sporulation

3.3. Étude des propriétés métaboliques

3.3.1. Donneurs d’électrons

Pour tester l’aptitude des souches isolées à utiliser les composés soufrés comme donneurs d’électrons en présence du bicarbonate et d’acétate, les substrats suivants ont été testés : thiosulfate, 20mM ; sulfite, 5 et 10 mM ; tetrathionate 10 mM, thiocyanate 10 Mm, soufre élémentaire 1% (pesé directement dans les tubes avant la répartition du milieu). Les tests ont été réalisés en condition oxiques et anoxiques et ont été confirmés par un troisième repiquage. L’utilisation des composés soufrés a été contrôlée par mesure de la densité otique à 580 nm et par la production des sulfates en fin de croissance. L’accumulation du soufre élémentaire à partir des composés soufrés testés autre que le soufre a été aussi contrôlée visuellement. Des tubes contenant les donneurs d’électrons testés mais non inoculés ont utilisés comme contrôle.

3.3.2. Accepteurs d’électrons

Pour tester l’aptitude des souches isolées à utiliser des accepteurs d’électrons autres que l’oxygène, les substrats suivants ont été testés (10mM) : nitrate, et nitrite, sulfate, sulfite, thiosulfate, tetrathionate, Diméthylsulfoxyde. Les tests ont été réalisés en présence du bicarbonate en anaérobiose et ont été confirmés par un troisième repiquage. L’utilisation des composés carbonés (acides organiques, sucres, alcools, acides aminés et dérivés peptidiques) a été contrôlée par mesure de la densité optique à 580 nm et par Le dosage des sulfures en fin de croissance. Des tubes contenant les accepteurs d’électrons testés mais non inoculés ont utilisés comme contrôle.

3.3.3. Sources de carbone

Chapitre II : Procédures expérimentales Les acides organiques, les acides aminés et les alcools ont été testés comme sources d’énergie et/ou sources de carbone à la place du bicarbonate à une concentration de 10 mM et à 1% pour les substrats complexes (tryptone, peptone, biotrypcase, extrait de levure, casamino acides, TSB, BHI, amidon, mucine). Les tests ont été réalisés en présence et en l’absence de bicarbonate et acétate et ont été confirmés par trois repiquages. L’utilisation des substrats carbonés a été contrôlée par mesure de la densité optique à 580 nm et par la production des sulfures (pour les bactéries sulfato-réductrices) en fin de croissance. Des témoins biotiques (milieu sans source de carbone et inoculé) et abiotiques contenant les sources de carbone testés mais non inoculés ont utilisés comme contrôle.

3.3.4. Besoins en facteurs de croissance

Les vitamines de Balch ainsi que l’extrait de levure (0,1 g.l-1) ont été testés comme facteurs de croissance pour les souches isolées. L’effet des facteurs de croissance a été contrôlé par mesure de la densité otique à 580 nm et par dosage des sulfures en fin de croissance.

3.3.5. Test d’anaérobiose

Afin de vérifier si les souches étudiées sont bien anaérobies, celles-ci sont inoculées dans des milieux oxygénés (exempt de réducteurs) à différentes concentration d’oxygène. Les tubes sont alors incubés horizontalement à la température optimale de croissance correspondant à chaque souche, sous agitation, de manière à faciliter la diffusion de l’oxygène dans le milieu de culture. La capacité d’une souche à croître en aérobiose est vérifiée par mesure de la densité optique, par observation au microscope et par analyse des produits finaux.

3.4. Etude des interactions métaboliques entre les bactéries sulfato-réductrices (BSR) et sulfo-oxydantes (BSO)

3.4.1. Effet de l’oxygène sur la croissance des BSR en cultures pures

Desulfobulbus oligotrophicus , D. alcoholovorans, D. fructosivorans, D. carbinolicus et D. marrakechensis ont été cultivées sur le milieu de base anaérobie sur lactate (20 mM) et sulfate (10 mM) en l’absence de la rézasurine et de la L-cystéine-HCl dans des flacons pénicillines de 120 ml de volume final contenant 40 ml de milieux de culture sous atmosphère N2 (100%) stérile. Différentes concentrations en oxygène (93µmol, 187 µmol,

Chapitre II : Procédures expérimentales 281 µmol, 375µmol, 562µmol) ont été introduites dans chaque flacon en s’assurant que les flacons sont à pression atmosphérique. Chaque milieu de culture a été ensuite inoculé (10%, v/v) à partir de cultures pures de BSR et incubé à 35°C. La croissance des BSR en culture pure a été contrôlée par le suivi de la DO à 580 nm, par la production des sulfures et le suivi du pH. Le but de ces expérimentations est la recherche de la concentration maximale d’oxygène tolérée par chaque BSR.

3.4.2. Établissement des co-cultures stables entre BSR et BSO

Dans le but d’étudier les interactions entre BSR et les BSO isolées, différentes co- cultures ont été établies en utilisant le même milieu décrit ci-dessus en présence de la concentration en oxygène permettant une croissance bactérienne et une production de sulfures par les BSR testées et en présence de nitrates ou nitrites (pour les co-cultures en anaérobiose). La croissance des co-cultures a été contrôlée par le suivi de la DO à 580 nm, par la production ou consommation des sulfures, par dosage de la consommation de l’accepteur, par analyses des produits de dégradation et par le suivi du pH. La température d’incubation était 35°C.

4. Techniques analytiques : les approches chimiques et biochimiques du dosage

4.1. Méthodes de Dosage des anions

4.1.1. Dosage des sulfures

Cette méthode a été décrite par Cord-Ruwisch (1985). 0,1 ml de la culture est injecté rapidement dans 4 ml de réactif HCl 50Mm-CuSO4 5mM sous agitation. Après cette acidification, l'intensité de la coloration du complexe CuS formé, est mesurée à 480nm au spectrophotomètre. Une courbe étalon donne la concentration en ions sulfures solubles en fonction de la densité optique mesurée (Figure II. 13). Cette technique présente l'avantage d'offrir des résultats rapides et donne des résultats productibles.

Chapitre II : Procédures expérimentales

Figure II. 13: Courbe d’étalonnage pour le dosage des sulfures 4.1.2. Dosage des sulfates (AFNOR NF T90-040)

Le principe de la méthode est le suivant : le mélange d’une solution contenant des 2- 2+ ions sulfate SO4 et d’une solution contenant des ions baryum Ba s’accompagne d’une transformation chimique modélisée par une réaction de précipitation ; l’équation associée 2+ 2- s’écrit : Ba (aq)+ SO4 (aq)→ BaSO4(s). Cette réaction, totale, unique et rapide, donne un précipité blanc le sulfate de baryum dont l’intensité de la coloration est dosée par un spectromètre. Les échantillons sont tout d’abord dilués 50 ou 100 fois afin d’éviter l’interférence de la coloration. À 39 ml de ces échantillons dilués, on ajoute 1ml d’une solution de l’acide chlorhydrique (36%) diluée au 1/10 et 5ml de d’une solution de chlorure de Baryum stabilisé (10g de BaCl2 plus 20 ml de « tween 20 », et ajuster à 100 ml). Le mélange réactionnel est agité deux ou trois fois et laissé reposer 15 minutes. On agite à nouveau et on fait une lecture en spectromètre à 650 nm. Une courbe d’étalon donne la concentration en ions sulfates en fonction de la densité optique mesurée (Figure II. 14).

Chapitre II : Procédures expérimentales

0,25

0,2 y = 0,6097x R² = 0,998

0,15 D0 à 650 nm 0,1

0,05

0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 Sulfate (mM)

Figure II. 14: Courbe étalon pour le dosage des sulfates.

4.1.3. Dosage des thiosulfates et des sulfites

Le thiosulfate et le sulfite ont également été vérifiés séparément avec une solution de 0,1 M I2 dans 10% d'acide acétique, et le sulfite a été séparé du thiosulfate en utilisant du formaldéhyde à 35% comme décrit par Rodier et al., (1996).

4.2. Méthodes de dosage des produits de dégradation

4.2.1. Dosages des acides organiques, sucres, alcools et acide gras volatiles par HPLC

Le suivi et la quantification de certains produits du métabolisme (acides gras volatils, sucres, alcools, composés organiques…) peuvent être effectués par Chromatographie en Phase Liquide à Haute Performance (HPLC). Les acides organiques, les sucres et les alcools ont été analysés en utilisant une colonne de phase inversée Symmetry C18 (4.66150mm, ODS2, taille de particule de 5mm), avec de l'acide sulfurique 0,005 M comme éluant (taux d'élution de 0,6 ml/min) et à une température de fonctionnement de 50 °C. Le détecteur UV (Knauer) réglé à 210 nm a été utilisé. Le tout est relié à un ordinateur permettant le traitement des résultats par un logiciel (Azur Datalys version 4.6). Les échantillons récoltés sont centrifugés pendant 5 minutes à 10000 g et 600 µl du surnageant sont récupérés pour le passeur des échantillons, lequel injecte 20 µl sur la colonne.

4.2.2. Dosage du dioxyde de carbone CO2 et de l’hydrogène H2

Chapitre II : Procédures expérimentales

L'analyse des gaz (H2 et C02) est effectuée par chromatographie en phase gazeuse (CPG) sur appareil Schimadzu GC-8A équipé d'un catharomètre et d’un injecteur, maintenus à une température de 200°C ; d’une colonne remplie avec un support de carbosphère, à 150°C. Le gaz vecteur utilisé est N2. 0,1 ml du volume de la phase gazeuse de l’échantillon est injecté. Le logiciel (Chromeleon 7 Chromatography Data System software) permet l’enregistrement et le traitement des résultats.

4.3. Méthodes de dosage biochimiques

4.3.1. Étude de la composition en base de l’ADN (% G+C)

Une culture de 10 litres ensemencée avec un inoculum de 10%, est effectuée sur milieu de culture base dans les conditions optimales d’écophysiologie. En phase exponentielle de croissance, les cellules sont collectées par centrifugation de la totalité de la culture. Une biomasse humide de 1-2g est nécessaire (culot centrifugé). La biomasse est re- suspendue dans de l'isopropanol/eau (1:1, v / v) à température ambiante puis conservé à 4°C. Les cellules lyophilisées dans une quantité correspondante sont envoyées à la DSM (collection allemande de microorganismes, Braunschweig, Germany) pour être analysé.

4.3.2. Hybridation ADN/ADN

L'hybridation ADN-ADN est nécessaire pour la description d'une nouvelle espèce dans un taxon lorsque les souches partagent plus de 97% de similarité à la séquence du gène de l'ARNr 16S (Stackebrandt and Goebel, 1994; Tindall et al., 2010). Cette limite est discutée de façon controversée (Stackebrandt, 2006). 3 g de biomasse humide de toutes les souches incluses dans l'analyse sont nécessaires. Il doit être suspendu dans l'iso-propanol / eau (1: 1, v/v) (suspendre d'abord la biomasse dans l'eau, bien mélanger et mélanger 1: 1 avec de l'isopropanol) qui peut être envoyé dans des tubes à bouchon hermétiquement scellés (par ex. 50 ml de tubes Falcon) à température ambiante. Les cellules lyophilisées en quantité correspondante sont alors envoyées à la DSM (collection allemande de microorganismes, Braunschweig, Germany) pour être analysé.

4.3.3. Analyse de la composition cellulaire en acides gras et des quinones membranaires

Pour l'analyse des acides gras cellulaires et des quinones membranaires, 250 mg de de culot lyophilisé sont également nécessaires. Cette analyse s'effectue à l'aide du système

Chapitre II : Procédures expérimentales Sherlock MIS (MIDI Inc, Newark, États-Unis). L’extraction et analyse est effectuée à la DSM (collection allemande de microorganismes, Braunschweig, Germany).

5. Approches moléculaires

5.1. Étude des souches isolées

5.1.1. Extraction des acides nucléiques des cultures pures et électrophorèse d'ADN sur gel d'agarose

Toutes les extractions d’ADNs génomiques, à partir des cultures pures, ont été réalisées à l’aide d’un kit (UltraCleanTM Soil DNA isolation kit, MoBio Laboratories) selon les recommandations du fournisseur. Les souches ont été incubées à 35°C pendant 1 semaine ; 1,8 ml de culture est centrifugé, le culot bactérien est utilisé pour l’extraction. La technique de l’électrophorèse sur gel est utilisée pour visualiser les acides nucléiques. Les ADNs sont mélangés à une solution tampon (Tris-borate ; TBE 0.5 X) appliqué sur un gel d’agarose 1% ; ensuite les molécules repoussées d’un côté par le courant électrique produit par une électrode sont attirées simultanément par le courant produit par l’autre électrode. Un marqueur de taille connue permettant de déterminer plus facilement la taille des ADN est utilisé. Les échantillons d’ADN à charger sur le gel d’agarose sont tout d’abord mélangés à un tampon de charge qui augmente la densité de l’échantillon. A la fin de la migration, les fragments d'ADN sont facilement détectés sur le gel grâce à un colorant fluorescent, le bromure d'éthidium (BET).

5.1.2. Identification des souches par Réaction de Polymérisation en chaîne (PCR)

5.1.2.1. Amplification du gène codant pour l’ARNr 16S

Les amplifications du gène codant pour l’ARNr 16S (voir Tableau II.1) ont été réalisées dans un volume final de 50 µL avec les amorces 8F/1487R (0.2 μM), 0,2 mM de dNTPs, 1.25U de Taq polymérase (Eurobio) et son tampon. Les réactions d’amplification sont menées selon le programme suivant : 1 cycle de 5 min à 94°C pour lyser les cellules et dénaturer les acides nucléiques, 35 cycles de 3 étapes : dénaturation 45 sec à 94°C, hybridation 45 sec à 55°C et élongation 1 min 30 sec à 72°C, puis un cycle d’élongation final de 10 min à 72 °C.

5.1.2.2. Amplification des gènes dsrAB par PCR

Chapitre II : Procédures expérimentales Afin de caractériser la capacité sulfato-réductrice, un couple d’amorces 1F/4R (0,4 µM) ont été utilisés en suivant les même conditions d’amplification génique précédemment décrites et à une température d’hybridation de 58 °C. Ce couple d’amorces ciblant le gène codant pour le gène de la bisulfite réductase (dsrAB) a été sélectionné dans le but de caractériser les sulfato-réducteurs.

5.1.2.3. La recherche de la nitrate réductase : Amplification des gènes nirS, nirK, nosZ et narG

- - La dénitrification est un processus où des composés azotés oxydés (NO3 et NO2 ) sont utilisés comme accepteurs d'électrons alternatifs pour la production d'énergie. Les oxydes d'azote sont réduits par étapes par rapport aux produits finaux gazeux (NO, N2O et

N2) qui sont dégagés, entraînant une perte d'azote fixe dans l'environnement. La réduction du nitrite en NO peut être catalysée par les produits de deux gènes différents de la nitrite réductase (Braker et al., 2000) un produit contient du cuivre (le produit nirK) et l'autre contient le cytochrome cd1 (le produit nirS).

Afin de caractériser la présence de ce processus chez les souches isolées, les couples d’amorces spécifiques pour les gènes nirS et nirK, nosZ et narG (Voir Tableau II. 1) (0,4 µM) ont été utilisés à leurs températures d’hybridation correspondantes. Les réactions d’amplification sont menées selon le programme suivant : 1 cycle de 5 min à 94°C pour lyser les cellules et dénaturer les acides nucléiques, 35 cycles de 3 étapes : dénaturation 30 sec à 94°C, hybridation 30 sec et élongation 30 sec à 72°C, puis un cycle d’élongation final de 5 min à 72 °C.

Chapitre II : Procédures expérimentales Tableau II. 1: Caractéristiques des différents couples d'amorces utilisés lors des PCRs. NGS ; Next-Generation Sequencing (séquençage de nouvelle génération). Gènes Gène Organisme ou Méthode Amorces Séquences (5'3') Taille Température Références impliqués métabolisme ciblé moléculaire d'amplicon (pb) d'hybridation 104F GGCGVACGGGTGAGTAA NGS 530R CCGCNGCNGCTGGCAC 426 68 Wolcott et al., (2009) 63F CAGGCCTAACACATGCAAGTC Marchesi et al., Sanger 1387R GGGCGGWGTGTACAAGGC 1300 58 (1998)

bacteria 8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1400 54 Dias et al., (2008) Marqueurs 1489R TACCTTGTTACGACTTCA globaux ARNr 16S bac1055YF ATGGYTGTCGTCAGCT qPCR bac1392R ACGGGCGGTGTGTAC 337 50 Ritalahti et al., (2006) arch349F GYGCASCAGKCGMGAAW Takai & Horikoshi, archaea NGS; qPCR arch806R GGACTACVSGGGTATCTAAT 457 58 (2000) aprA Sulfato-réduction aps1F TGGCAGATCATGATYMAYGG Meyer & Kuever, et oxydation des (2007a) dans le cycle sulfures NGS; qPCR aps4R GCGCCAACYGGRCCRTA 390 57 du soufre dsrB sulfato-réduction DSRp2060F CAACATCGTYCAYACCCAGGG Geets et al., (2006); NGS; qPCR DSR4R GTGTAGCAGTTACCGCA 376 54 Wagner et al., (1998) soxB Oxydation des soxB432F GAYGGNGGNGAYACNTGG sulfures NGS; qPCR soxB693B TANGGRAANGCYTGNCCGAT 261 58 Petri et al., (2001) Gènes nirSCd3aF GTSAACGTSAAGGARACSGG impliqués nirS PCR nirSR3cd GASTTCGGRTGSGTCTTGA 425 50 Geets et al., (2006) dans le cycle

d’azote 583F TCATGGTGCTGCCGCGKGACGG nirK Dénitrification PCR 909R GAACTTGCCGGTKGCCCAGAC 326 65 Yan et al., (2003) nosZ nosZ2F CGCRACGGCAASAAGGGTSMSSGT

nosZ2R 267 58 Henry et al., (2006) PCR CAKRTGCAKSGCRTGGCAGAA PCR nar1960m2f TAYGTSGGGCAGGARAAACTG López-Gutiérrez et al.,

narG narG2050m2r CGTAGAAGAAGCTGGTGCTGT 110 60 (2004)

Gènes mcrA méthanogénèse qPCR mlas GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA 470 57 Steinberg & Regan, impliqués (2008) dans le cycle du carbone

Chapitre II : Procédures expérimentales 5.1.3. Purification des amplicons (produits de PCR), dosage de la quantité de l’ADN et séquençage

Les produits PCR sont purifiés à l’aide du kit commercial GFXTM DNA Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech). Cette purification a pour but de séparer le fragment d’ADN amplifié du reste des composants du milieu de réaction (protéines, sels) et notamment des autres acides nucléiques (amorces non utilisées, amplification de séquences non désirées inférieures à 100 paires de bases, …). Afin d’évaluer les quantités d’ADN amplifié, une méthode d’estimation des quantités d’ADN amplifiées a été utilisée. Elle est basée sur l’utilisation d’un marqueur de taille (Smartladder Eurogentec, USA) lors de l’électrophorèse. La taille et la quantité d’amplicons ont été contrôlées par électrophorèse sur gel d’agarose à 1% puis un séquençage Sanger des amplicons obtenus est effectué par la plateforme GATC Biotech - Konstanz, German (http://www.gatc-biotech.com/fr/index.html).

5.1.4. Analyses phylogénétiques

Les séquences obtenues sont alignées à l’aide du logiciel MEGA A6 (www.megasoftware.net) avec celles de référence présentes dans les banques de données (NCBI pubmed). Les arbres phylogénétiques sont élaborés par comparaison des séquences d’ADN (ADN codant pour l’ARN 16S ou pour un gène métabolique) selon une méthode dite de distances : le neighbor joining. À la différence de l’autre méthode des distances, UPGMA, celle du neighbor joining n’est pas ultra-métrique. Elle n’implique pas que les séquences évoluent à une vitesse constante (hypothèse d’horloge moléculaire rarement confirmée). La méthode du neighbor joining permet de déterminer le nombre de nucléotides qui varient entre deux séquences. C’est une méthode agglomérative qui utilise un algorithme de «clusterisation». Les séquences sont rassemblées d’après leur similarité. Les séquences les plus similaires sont regroupées entre elles, puis comparées aux autres pour former un groupe plus vaste dans lequel le degré de similarité est moindre (Sneath and Sokal, 1973). Des méthodes statistiques permettent de vérifier la robustesse des arbres tels que le « bootstrap » (Felsenstein, 1985). Les arbres phylogénétiques sont construits à partir d’une matrice de données initiale dans laquelle des tirages aléatoires avec remise sont réalisés. Cette opération est reproduite 1000 fois. L’ensemble des topologies obtenues est comparé et un pourcentage de robustesse est attribué à chaque noeud de branche. Le pourcentage est d’autant plus élevé que le noeud de branche est retrouvé dans les différentes topologies. Plus ce pourcentage est élevé plus le noeud est robuste. Les pourcentages inférieurs à 50 % ne sont généralement pas

Chapitre II : Procédures expérimentales pris en considération. La topologie de l’arbre sera particulièrement sensible à la qualité des séquences extérieures ou «outgroup» choisies pour la reconstruction et servant à enraciner l’arbre. L’«outgroup» doit être suffisamment distant des autres séquences pour permettre la discrimination et le positionnement des unes par rapport aux autres. 5.2. Étude des communautés microbiennes

5.2.1. Extraction des ADNs génomiques des différents échantillons prélevées de la STEP Marrakech

Les ADNs génomiques issus des différents échantillons de boue prélevés in situ à partir de la STEP de Marrakech ont été extraits grâce au kit PowerSoil® DNA Isolation Kit - MO BIO Laboratories, selon les recommandations du fournisseur. Dans ce kit, deux types de lyses cellulaires sont successivement appliqués aux échantillons afin d’augmenter la récupération d’ADN provenant d’un large spectre de bactéries. La première est une lyse mécanique par broyage suivie d’une lyse enzymatique. Les deux principaux avantages d’un kit d’extraction sont la rapidité d’obtention des ADNs génomiques ainsi que la reproductibilité de cette méthode limitant ainsi les biais lors de la comparaison des échantillons, tous traités avec le même kit. L’ADN a été extrait en triplicata pour tous les échantillons.

5.2.2. Amplification de la région V4-V5 de l’ADN 16S par PCR

Les études méta-génomiques sont généralement réalisées en analysant le gène de l'ARN ribosomique 16S des procaryotes (16S rRNA gene), qui mesure environ 1,500 pb de long et contient neuf régions variables entrecoupées entre les régions conservées. Les régions variables de l'ARNr 16S sont fréquemment utilisées dans les classifications phylogénétiques. Le protocole détaillé ici est conçu pour amplifier les procaryotes (bactéries et archées) en utilisant le séquençage haut débit sur la plate-forme Illumina (Caporaso et al., 2012). La région hypervariable V4-V5 du gène 16S ARNr ciblant les bactéries et Archaea a été amplifiée en utilisant les amorces 515F, 5 '- GTG YCA GCM GCC GCG GTA - 3' et 928R, 5'- CCC CGY CAA TTC MTT TRA GT - 3'. Ces amorces sont complémentaires des amorces de séquençage avancé, inverse et multiplexé Illumina.

Les amplifications du gène codant pour l’ARNr 16S ont été réalisées dans un volume final de 50 µL avec les amorces 515F/928R (0.2 μM), 0,2 mM de dNTPs, 1.25U de Taq polymérase (Eurobio) et son tampon (Ampli Taq Gold 360). Les réactions d’amplification

Chapitre II : Procédures expérimentales sont menées selon le programme suivant : 1 cycle de 10 min à 94°C pour lyser les cellules et dénaturer les acides nucléiques, 35 cycles de 3 étapes : dénaturation 30 sec à 94°C, hybridation 30 sec à 65°C et élongation 40 sec à 72°C, puis un cycle d’élongation final de 10 min à 72 °C. L'amplification a été effectuée en utilisant un thermocycleur de PCR Modèle PTC-100 (Bio-Rad, Richmond, CA). Les amplicons ont été séquencés à l'aide d'une plate- forme Illumina MiSEQ (300 pb jumelés) à Genotoul Inc. (www.genotoul.fr, Toulouse, France).

5.2.3. Analyse de la diversité par séquençage haut débit Illumina MiSEQ

La spécificité de cette technologie repose sur une amplification en pont (bridge PCR) des fragments à séquencer. Cette dernière a lieu sur une surface de verre appelée flow cell (FC), similaire à une lame de microscope, divisé en huit lignes à raison d’une ligne par échantillon. Les fragments de la librairie possèdent des adaptateurs à leurs extrémités. Ceux- ci vont leur permettre de se fixer de façon aléatoire sur la surface en verre par une hybridation sur les amorces qui couvre la surface (Figure II. 15). Un nouveau brin est alors synthétisé par une polymérase, ce brin est fixé de façon covalente à la FC. Le brin d’origine est alors éliminé par dénaturation et l’extrémité libre du brin restant s’hybride à une amorce adjacente pour former un pont. La polymérase synthétise à nouveau le brin complémentaire pour former un pont d’ADN double brin, puis les deux copies sont libérées par dénaturation. Le cycle d’amplification en pont recommence pour former un terme de regroupent d’ADN clonal en une zone appelée cluster. Les brins anti-sens sont ensuite clivés : c’est la linéarisation.

Chapitre II : Procédures expérimentales

Figure II. 15: Principales étapes de l’approche de séquençage par la technologie de synthèse Illumina (modifié d’après Mardis, 2008).

Les brins du cluster créés par bridge d’amplification sont amorcés et les quatre nucléotides bloqués en 3’-OH marqués par fluorescence sont ajoutés à la cellule d'écoulement avec de l'ADN polymérase. Les brins du cluster sont étendus par un nucléotide. Après l'étape d'incorporation, les nucléotides inutilisés et les molécules d'ADN polymérase sont éliminés par lavage, un tampon de balayage est ajouté à la cellule d'écoulement, et le système optique (Laser) scanne chaque voie de la cellule d'écoulement par des unités d'imagerie appelées carreaux. Une fois l'imagerie terminée, des produits chimiques qui affectent le clivage des étiquettes fluorescentes et les groupes de blocage 3’-OH sont ajoutés à la cellule d'écoulement, qui prépare les brins de cluster pour une autre série d'incorporation de nucléotides fluorescents. 100

Chapitre II : Procédures expérimentales

L’extrémité 3’ libre des fragments d’ADN est bloquée et l’amorce de séquençage s’y hybride. Le séquençage s’effectue sur des centaines de millions de clusters simultanément, grâce à une chimie de terminateurs réversibles : des nucléotides réversibles marqués par fluorescences sont ajoutés, l’un d’entre eux est incorporé, la fluorescence émise est révélé puis le logophore et le bloqueur sont clivés permettant l’ajout d’un nouveau nucléotide. A chaque cycle d’incorporation, une base peut être déterminée. Cette chimie a pour avantage de séquencer correctement les homopolymères. Le Génome Analyzer a cependant pour inconvénient de lire peu de bases ; ce qui le rend approprié à l’analyses de génome dont on a une bonne annotation.

5.2.4. Traitement bio-informatique des données de séquençage illumina MiSEQ

5.2.4.1. Pipeline FROGS: Find Rapidly OTU with Galaxy Solution

Le séquençage à haut débit des amplicons d'ARN 16S a ouvert de nouveaux horizons dans l'étude des communautés microbienne. Avec le séquençage à grande profondeur, les pipelines de traitement actuels ont du mal à fonctionner rapidement et les solutions les plus efficaces sont souvent conçues pour les spécialistes. Ces outils sont conçus pour donner à la fois le tableau d'abondance des unités taxonomiques opérationnelles (OTU) et leur affiliation taxonomique. Dans ce contexte, le pipeline FROGS (Figure II. 16) a été développé pour «Trouver rapidement les OTUs avec Galaxy Solution ». Développé pour la plate-forme Galaxy (Blankenberg et al., 2010; Giardine et al., 2005; Goecks et al., 2010), FROGS a été conçu pour être exécuté dans deux modes: avec ou sans séquences démultiplexées (1). Un outil de prétraitement (2) au départ fusionne les séquences appariées dans les contigs avec flash (Magoč and Salzberg, 2011), ensuite les données sont nettoyées avec cutadapt (Martin, 2011). L’élimination des chimères (3) est effectuée avec VSEARCH (Flouri et al., 2017) et les séquences sont dé-répliquées avec un script home-made python. L'outil de clusterisation (4) fonctionne avec SWARM (Mahé et al., 2014) qui utilise un seuil de clusterisation locale, et non un seuil de clusterisation globale comme les autres logiciels. Cet outil génère le tableau d'abondance d’OTUs. L'outil d'affiliation (5) renvoie l'affiliation taxonomique pour chaque OTU en utilisant à la fois RDP Classifier (Wang et al., 2007) et NCBI Blast+ (Camacho et al., 2009) sur Silva SSU 128 (Quast et al., 2012).

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Chapitre II : Procédures expérimentales

Figure II. 16: Description des étapes utilisées pour le traitement des données de séquençage Illumina des séquences de l’ARNr16S bactérien et archéen par FROGS (modifié d’après de ric Escudie et al., (2017)). 102

Chapitre II : Procédures expérimentales

Enfin, l'outil de post-traitement (6) de la table obtenue est traitée avec des filtres spécifiés (Bokulich et al., 2013) et fournit des résultats statistiques (7) et de nombreuses illustrations graphiques de ces données. Et enfin une normalisation (8) des abondances retrouvées pour chaque OTU est effectuée. FROGS a été développé pour être très rapide, même sur de grandes quantités de données MiSEQ, et d'une conception optimisée. Il est également portable sur toutes les plates- formes Galaxy avec un minimum d'informatique et de dépendances architecturales. FROGS a été testé sur plusieurs ensembles de données simulées. L'outil est extrêmement rapide, robuste et très sensible pour la détection d'OTU avec très peu de faux positifs par rapport à d'autres pipelines largement utilisés par la communauté.

5.2.4.2. Pipeline QIIME : Quantitative Insight Into Microbial Ecology

Les traitements de données bioinformatiques ont été également effectués à l'aide du logiciel QIIME suite au pipeline QIIME (http://qiime.org/1.6.0/tutorials/index.html). Avant l'analyse des données, le nombre de séquences dans chaque échantillon a été normalisé par la raréfaction afin d'éliminer tous les effets secondaires potentiels de la taille de l'échantillon. Les lectures de chacun des échantillons d'ADN ont été fusionnées à l'aide de FLASH (V1.2.7, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/), et le filtrage de qualité des lectures a été effectué comme décrit précédemment par (Caporaso et al., 2012). Les séquences chimériques ont été supprimées en utilisant le logiciel USEARCH basé sur l'algorithme UCHIME (Edgar et al., 2011). Les séquences ont ensuite été assignées à chaque échantillon avec un code à barres de 6 pb en utilisant un script dérivé du pipeline QIIME. Les séquences restantes ont été regroupées en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) à un seuil d'identité de 97% en utilisant l'algorithme Swarm (Mahé et al., 2014). Les séquences représentatives pour chaque OTU ont été attribuées à des groupes taxonomiques utilisant l'algorithme Blast contre la base de données Silva (Silva_128_rep_set97.fna, Quast et al., (2012).

5.2.5. Études statistiques des communautés microbiennes

5.2.5.1. Analyse de la diversité alpha

Les indices de diversité Cho1, Shannon et Simpson donnent une estimation de la richesse. Ces sont mieux adaptés aux biais engendrés par les méthodes de séquençage haut débit que certains indices de richesse (Kunin et al., 2010). Ils prennent en compte le nombre d’espèces mais également la distribution des individus au sein de ces espèces. Les indices de diversité ont été calculés à l’aide du logiciel R. L’indice Chao1 permet d’estimer le nombre prévu de taxons dans un

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Chapitre II : Procédures expérimentales

échantillon en extrapolant le nombre d'organismes rares qui pourraient être manqués en raison du sous-échantillonnage. L’indice de Shannon permet d’estimer la diversité en prenant en compte le nombre d’espèce et l’abondance des individus au sein de chacune de ces espèces. Cet indice est sensible aux variations des espèces les plus rares. L’indice de Simpson mesure la probabilité que deux individus sélectionnés au hasard appartiennent à la même espèce. Il est sensible aux variations d’importance des espèces les plus abondantes. Cependant, L’indice d’Equitabilité de Piélou évalue la régularité de la distribution des espèces au sein d’une communauté. Cet indice varie de 0 à 1, il est maximal quand les espèces ont des abondances identiques dans un échantillon et il est minimal quand une seule espèce domine tout l’échantillon.

5.2.5.2. Analyse de la diversité beta et tests statistiques

Afin d'identifier les liens entre les traitements et les communautés microbiennes, la diversité bêta a été estimée sur la base des distances de dissimilarité Pondérées UniFrac et Bray-Curtis. L'analyse en composantes principales, Barplot et heatmap ont été réalisés sur le logiciel R (RDevelopment Core Team, 2013) afin de visualiser la diversité partagée au sein de plusieurs échantillons. L’influence des paramètres environnement sur nos communautés par des analyses canoniques de correspondance (CCA) parcimonieuse. Les distances de BrayCurtis ont été calculées entre les communautés avec la fonction « Vegdist » du package Vegan (Oksanen et al., 2013). La distance de Bray-Curtis permet d'évaluer la dissimilarité entre deux échantillons donnés. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées dans l'environnement R (http://www.rproject.org) en utilisant les packages Vegan (Oksanen et al., 2013) et phyloseq (McMurdie and Holmes, 2013).

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Chapitre III: Representatives and isolation of a novel member of the Synergistaceae family from a municipal anaerobic sewage sludge digester: Caenicola nitritireducens gen nov., sp. nov., an amino-acid-fermenting strain

Chapitre III

1. Préambule

La digestion anaérobie est de plus en plus appliquée au traitement des eaux usées contenant généralement des fortes concentrations de matières organiques (Goswami et al., 2016). La teneur en glucides d'un flux d'eaux usées représente souvent la majorité de la charge organique. Cependant, dans certains cas les protéines constituent également une partie importante de la charge organique (tels que les eaux usées provenant des abattoirs, du lactosérum, de l’industrie de fromage, du poisson ou certains traitements de légumes). Par exemple, la composante protéique d'un flux d'eaux usées laitières peut représenter plus de 40% de la demande chimique en oxygène totale (Barnett et al., 1994).

Les acides aminés sont des constituants communs des eaux usées et sont libérés lors de la dégradation des protéines retrouvés dans la matière organique des boues. Ces composés sont nécessaires à la croissance et au métabolisme des populations microbiennes qui, à leur tour, sont responsables de la dégradation anaérobie des matières organiques (Paster et al., 1993). Il a été démontré que les eaux usées riches en protéines traitées en anaérobiose produisent moins de biogaz que les déchets pauvres en protéines et leur dégradation abouti à la production de fortes concentrations d'ammonium (Ramsay and Pullammanappallil, 2001).

Les protéines sont hydrolysées en peptides et en acides aminés qui sont convertis à leurs tours en méthane et en CO2, par des populations bactériennes variées. Les réactions de désamination oxydative ne se déroulent que si les équivalents réducteurs produits sont éliminés par un accepteur d'électrons biologique ou chimique (Balch et al., 1979; Hungate, 1969). Ceci est possible via le transfert d'hydrogène inter-espèces en présence de méthanogènes hydrogénophiles ou de bactéries sulfato-réductrices (Stams and Hansen, 1984; Zindel et al., 1988), mais aussi lorsque les acides aminés (réaction de Strickland), l'acétate (Örlygsson et al., 1995) ou le thiosulfate (Fardeau et al., 1997; Faudon et al., 1995) agissent comme accepteurs finaux d’électrons.

La fermentation anaérobie des protéines a été évaluée par plusieurs études en utilisant des boues primaires comme substrat. La plupart de ces études ont montré que les principales bactéries protéolytiques présentes dans les boues de digestion sont des bactéries à Gram positif, principalement des Clostridia, qui jouent également un rôle dominant dans la fermentation des acides aminés (McInerney, 1988). Un grand nombre de peptides et d'acides aminés peuvent servir de sources de carbone et d'énergie pour les bactéries anaérobies saccharolytiques et non saccharolytiques (Smith and Macfarlane, 1997). La description de nouvelles espèces dégradantes des acides aminés sont isolées d'un large éventail d'écosystèmes. Des exemples de bactéries non

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Chapitre III saccharolytiques dégradant les peptides / amino-acides comprennent Clostridium aminophilum isolé du rumen (Paster et al., 1993), Eubacterium acidaminophilum provenant des eaux usées anaérobies (Zindel et al., 1988), Acidaminobacter hydrogenoformans isolée de la boue d’un estuaire (Stams and Hansen, 1984), Selenomonas aciduminidae d'une station d'épuration anaérobie (Nanninga et al., 1987) et Dethiosulfovibrio peptidovorans d'un champ pétrolifère (Fardeau et al., 1997).

À partir de ces données, il peut être déduit que la dégradation des acides aminés est un processus physiologique important dans les digesteurs anaérobies. Bien que des micro-organismes dégradants des protéines ont été isolés et caractérisés, très peu d'attention a été accordée aux bactéries dégradant les protéines et les acides aminés (Krause and Russell, 1996; Paster et al., 1993). Le phylum Synergistetes (Jumas-Bilak et al., 2009) comprend actuellement des membres des genres, Anaerobaculum, Synergistes, Dethiosulfovibrio, Aminobacterium, Aminomonas, Thermanaerovibrio , Thermovirga, Aminiphilus, Jonquetella, Cloacibacillus, Pyramidobacter, Aminivibrio, Fretibacterium et Lactivibrio (Ganesan et al., 2008; Honda et al., 2013; Qiu et al., 2014; Vartoukian et al., 2013). Un trait distinctif commun à tous les membres de ce phylum est la capacité de dégrader les acides aminés (Vartoukian et al., 2013). Dans ce chapitre, nous décrirons la caractérisation d'une nouvelle espèce Caenicola nitritireducens DZ-S4T qui représente un nouveau genre au sein de la famille des Synergistaceae impliqué dans la dégradation des acides aminés, isolée de la boue d’un digesteur anaérobie de la station de traitement des eaux usées de la ville de Marrakech. Ce chapitre se concentre également sur la diversité et l'abondance (à travers des approches moléculaires et culturales) des communautés Synergistaceae trouvées dans le processus de production de biogaz dans la STEP de Marrakech. L'analyse de séquençage à haut débit de la région V4-V5 du gène de l'ARNr 16S a été réalisée pour révéler la distribution de ce groupe de microorganismes dans l’objectif d’étudier leur diversité, leur abondance et d’évaluer leur rôle dans la dégradation de la matière organique (en particulier la dégradation des protéines) au cours du processus de production du biogaz.

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Chapitre III

2. Representatives and isolation of a novel member of the Synergistaceae family from a municipal anaerobic sewage sludge digester: Caenicola nitritireducens gen nov., sp. nov., an amino-acid-fermenting strain

Ce travail est présenté sous la forme d’un article en préparation qui sera soumis pour publication sous le titre :

Representatives and isolation of a novel member of the Synergistaceae family from a municipal anaerobic sewage sludge digester: Caenicola nitritireducens gen nov., sp. nov., an amino-acid-fermenting strain

Running title: Caenicola nitritireducens gen nov., sp. nov.

Abdelaziz El Houari1-2 and collaborators.

1Anaerobic Microbiology Team (E02B26), Sciences and Techniques Faculty, Cadi Ayyad University PO Box 549, 40 000 Marrakech, Morocco.

2Université de Pau et des Pays de l’Adour, CNRS, IPREM UMR 5254, Equipe Environnement et Microbiologie, 64013, Pau, France.

Key words: DZ-S4T, sludge digester, amino-acid-fermenting, Synergistaceae diversity.

Correspondence to: Remy Guyoneaud. Tel: + 33 5 59 40 74 89 / Fax: +33 5 59 40 74 94; e-mail: [email protected]

The GenBank/EMBL/DDBJ accession number for the 16S rRNA gene sequence of strain DZ-S4T is MF185666.

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Chapitre III

2.1. Abstract

High-throughput metagenomics sequencing of the V4-V5 region of the 16S rRNA gene was performed on municipal anaerobic sewage sludge digesters. A focus on Synergistaceae, a group of amino acid fermenters, was performed whereas isolation procedures led to novel Synergistaceae strains. Miseq sequencing generated 26 Synergistaceae OTUs. They indicated that a considerable abundance and diversity of Synergistetes (5%) was detected in the anaerobic digesters. The dominant representative of the Synergistaceae, designated DZ-S4T (T= type strain), could be isolated in pure culture. Phylogenetic analysis indicated that strain DZ-S4T represented a novel group within this phylum. The novel mesophilic isolate was obligately anaerobic and amino-acid fermenting. Cells of strain DZ-S4T were non motile, gram-negative, curved-rod shape (0.6-0.7 x 1.2-1.8 µm). Spore formation was not observed. The pH and temperature optima were 7.5 and 35°C, respectively. The optimum NaCl concentration was 0.6 %. In the presence of 0.2% yeast extract as growth enhancer, strain DZ-S4T fermented arginine, histidine, and showed growth on casamino acid, tryptone, peptone, brain-hearth infusion, tryptic soy broth, mucin, casein, starch, pyruvate, and glucose. Strain DZ-S4T could use nitrite as electron acceptor. The DNA G+C content was 49.6 %mol. The type strains of Cloacibacillus porcorum, Cloacibacillus evryensis and Synergistes jonesii, members of the family Synergistaceae, were the closest relatives of strain DZ- S4T, with low sequence similarities (91.8, 91.5 and 89.5 %, respectively). The major cellular fatty acids were iso-C15: 0 (26.95%), C16: 0 (13.27%) and C14: 0 (8.95%). Caenicola nitritireducens gen. nov., sp. nov., is proposed. The type strain of Caenicola nitritireducens is DZ-S4T (=DSM 104940T =JCM 31897T).

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Chapitre III

2.2. Introduction

Anaerobic digestion of municipal wastewater sludge has been widely practiced since the early 1900s and is always the most widely used treatment method. It is a process by which almost any organic waste can be biologically transformed (Goswami et al., 2016). The diverse microbial populations degrade organic waste, which results in the production of biogas and other energy-rich organic compounds as end products (Lastella et al., 2002; Lata et al., 2002). The hydrolysis of polymers is often considered as the rate-limiting step in methane process because it provides the monomers, such as amino acids, glycerol, soluble sugars, and long-chain fatty acids, needed for further degradation. The organic matter degradation was catalyzed by a variety of heterotrophic microorganisms bacteria (Fricke et al., 2007) including Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Selenomonas, Streptococcus. Under anaerobic digestion, in particular proteins are hydrolyzed by several microorganisms such as Synergistacae family (Allison et al., 1992). The common features shared by members of this family are anaerobic growth, rod-shaped cells, negative Gram-staining and the ability to degrade amino acids. These bacteria have been isolated from various anaerobic environments, including the human oral cavity (Vartoukian et al., 2013), the goat rumen (Allison et al., 1992) and anaerobic digesters (Ganesan et al., 2008). The Synergistetes is the common major phyla and represents a considerable relative abundance of 5% in the anaerobic digester sludges (Li et al., 2015; Whang et al., 2015; Wu et al., 2016).

To our knowledge, the phylum Synergistetes comprises 24 validated species classified into 14 recognized genera: Synergistes (Allison et al., 1992), Anaerobaculum (Rees et al., 1997), Dethiosulfovibrio (Magot et al., 1997), Aminobacterium (Baena et al., 1998), Aminomonas (Baena et al., 1999a), Thermanaerovibrio (Baena et al., 1999b), Thermovirga (Dahle and Birkeland, 2006), Aminiphilus (Díaz et al., 2007), Jonquetella (Jumas-Bilak et al., 2009), Cloacibacillus (Ganesan et al., 2008)(Ganesan et al., 2008), Pyramidobacter (Downes et al., 2009), Aminivibrio (Honda et al., 2013), Fretibacterium (Vartoukian et al., 2013) and Lactivibrio (Qiu et al., 2014). In this study, we report on the isolation and characterization of a novel representative genus of the synergistacae family, strain DZ-S4T, isolated from a municipal mesophilic anaerobic sewage sludge digester of the wastewater treatment plant (WWTP) in the Marrakech, Morocco. This paper also focuses on the diversity and abundance, through molecular approaches, of Synergistaceae communities involved in the biogas production process. The high-throughput sequencing analysis of the V4-V5 region of the 16S rRNA gene was performed to reveal the distribution of this group of microorganisms in order to study their diversity, abundance and to evaluate their role in the degradation of organic matter (especially protein) during the biogas production process.

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Chapitre III

2.3. Materials and Methods

2.3.1. Sampling strategy

The sampling was carry out on February 2014 from municipal WWTP of Marrakech (Morocco). Sludge samples were collected from each of the four-biogas digesters (DA, DB, D1 and D2), the primary sludge (PS, from primary decanters) and the flocculated sludge (FS, from thickeners). Sewage sludge were sampled using 120 ml sterile serum bottles that were filled to displace air and stored at 4°C until use for cultural methods. In Addition, six samples were stored in cryotubes at -20°C for molecular analyses.

2.3.2. Extraction of genomic DNA and high throughput sequencing

Total DNA extractions from anaerobic sludge were performed in triplicate using PowerSoil® DNA Isolation kit (MO BIO) following the manufacturer instructions. The DNA was stored at -20°C until use. The V4–V5 hypervariable region of the 16S rRNA gene targeting Bacteria and Archaea was amplified using the primers 515F, 5‘ – GTG YCA GCM GCC GCG GTA – 3‘ and 928R, 5‘ – CCC CGY CAA TTC MTT TRA GT – 3’ (Anderson et al., 2009; Liu and Whitman, 2008). The amplifications of the 16S rRNA gene were performed in a final volume of 50 μL with primers 515F/928R (0.2 μM), 0.2 mM dNTPs, 1.25U Taq polymerase (Amp Taq Gold 360) and its buffer. The amplification reactions were carried out according to the following program: 1 cycle of 10 min at 94 °C (denaturation); 35 cycles of 3 steps: denaturation for 30 sec at 94 °C, hybridization for 30 sec at 65 °C, and elongation 40 sec at 72 °C; final elongation cycle of 10 minutes at 72 °C. Amplification was conducted using a PCR thermal cycler Model PTC-100 (Bio-Rad, Richmond, CA). Forwards and reverse primers contained the adapter sequences (5’GTG YCA GCM GCC GCG GTA) and (3’ACT YAA AKG AAT TGR CGG GG) respectively, used in Illumina sequencing technology. The amplicons were sequenced using an Illumina MiSeq (250 bp paired- end reads) at the platform Genotoul Inc. (www.genotoul.fr, Toulouse, France).

2.3.3. Processing of sequencing data from Illumina Miseq and statistical analyses

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Chapitre III for each OTU was carried out by the DESeq method (Anders and Huber, 2012). The evolutionary history was inferred using the Neighbor-Joining method (Saitou and Nei, 1987). An alignment was then carried out between OTUs, the alignment was used to build a phylogenetic tree with PhyML algorithm (Guindon et al., 2010). The statistical calculations for heatmap plot building were conducted using R software package with heatmap2 libraries.

2.3.4. Cultivation and isolation

The sludge from the mesophilic anaerobic digester (DA) was inoculated (10%, v/v) into a basal medium (El Houari et al., 2017) supplemented with 5 mM HCl-Cysteine and 1% (w/v) of yeast extract and then incubated for 3-4 weeks at 35°C under N2/CO2 (80/20%) atmosphere. For solid roll-tubes, 2% (w/v) agar (Difco) was added to the medium. The isolation procedure was carried out using agar roll-tubes technique (Hungate, 1969). The purity of the strain was checked routinely by phase-contrast microscopy and by performing growth tests in basal medium containing 1% (w/v) glucose, 1% (w/v) casamino acid, 1% (w/v) peptone, 1% (w/v) yeast extract and 1% (w/v) biotrypticase under aerobic and anaerobic conditions.

2.3.5. Phylogenic identification of pure cultures

DNA was extracted from the liquid enrichment of pure culture using the UltraClean TM Soil DNA Isolation Kit (MoBio) according to the manufacturer’s protocol. The 16S rRNA gene was amplified with the 8F-1489R set of primers as described by Dias et al., (2008). DNA amplicons were purified and were sequenced by GATC Biotech - Konstanz, Germany. This 16S rRNA gene of isolated strains sequences (1365 bp) was compared with reference sequences from the NCBI of Genbank database for identification. Then, the evolutionary analyses were computed according to the Neighbor-Joining method (Saitou and Nei, 1987) using MEGA 6.06 software (Tamura et al., 2013).

2.3.6. Morphology, cellular fatty acids and G+C composition

Cellular characteristics of strain (shape, size, mobility, sporulation, Gram-staining) and flagella examination were observed by phase contrast microscopy (Olympus BX 60) and transmission electron microscopy (HITACHI H7650, Electronic microscopy center of Bordeaux Imaging Centre, BIC, France) using negatively stained (1% w/v neutralized phosphotungstic acid), respectively. The preparation of the cells for electron microscopic studies was carried out as described by Ganesan et al., (2008). For molar G+C and cell fatty acids analysis, strain DZ-S4T was grown on BHI medium supplemented with arginine and histidine (BHIAH) as described by Looft et

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Chapitre III al., (2013). The lyophilized or freeze-dried material was sent to the DSMZ (German Microorganism Collection und Zellculturen, Braunschweig, Germany) for both analysis.

2.3.7. Temperature, pH and NaCl requirements for growth

Unless otherwise indicated, all tests were performed in triplicate at 35°C (except for temperature experiments), in basal medium containing 0.2% (w/v) yeast extract, 0.2% (w/v) typtone, 0.2% (w/v) casamino acid, 20 mM arginine and 20 mM histidine using exponentially growing cells. Positive growth was determined by monitoring changes in OD600 using a spectrophotometer (Camsper spectrophotometer, M107). Temperatures were tested from 4°C to 60 °C. For pH studies, the media were adjusted with sterile anaerobic solutions of HCl (1M) or NaOH -1 (1M) to give a pH of 6-8.5 in the presence of 2 g.L NaHCO3 buffer. The extremes pH were obtained in the presence of MES (8 g.L-1) and bicine (7 g.L-1) buffers (pH of 3.6-6 and pH of 8.5- 9.5 respectively). For salt requirements, NaCl was tested from 0 to 8 % (w/v) and weighed directly into tubes and the medium was dispensed into tubes as described above.

2.3.8. Substrates utilization

Tests were determined in triplicate using exponentially growing cells resuspended in pre- reduced basal medium without L-Cysteine hydrochloride anhydrous, in presence or absence of

0.2% (w/v) yeast extract under N2 as gas phase and using MOPS as a buffer instead of NaHCO3. Substrates were tested as follows: 10 mM for amino acids, organic acids, carbohydrates, alcohols and 1 % for yeast extract, casamino acid, tryptone, peptone, brain heart infusion (BHI), tryptic soy broth (TSB), mucin, gelatin and starch. The substrates tested were L-Leucine, Isoleucine, L- arginine, DL-lysine, L-alanine, DL-valine, L-glutamate, L-histidine, L-glutamine, L-methionine, DL-tryptophan, L-Glycine, L-aspartate, L-threonine, L-aspargine, L-cysteine, DL-phenylalanine, L- tyrosine, L-serine, L-proline, L-aspartate, 2 hydroxy-pyridone, 2,4 dihydroxy-pyridone, mimosine, malate, formate, fumarate, pyruvate, lactate, succinate, acetate, propionate, butyrate, valerate, alpha- ketoglutarate, glucose, fructose, D-cellobiose, L-xylose, D-xylose, D-rhamnose, D-mannose, D- mannitol, Inositol, sorbose, D-sorbitol, maltose, melibiose, D-ribose, Lactose, galactose, rafifinose, arabinose, glycerol, ethanol, methanol, 1-propanol and 1-butanol. Biochemical characterizations were also performed using API 20E and API 20NE systems (bioMérieux) incubated under anoxic conditions. Amino-acids degradation via the Stickland reaction was determined in basal medium containing the following amino-acids couple as electron donors and acceptors, respectively (10 mM/20 mM): alanine/arginine, alanine/proline, alanine/serine, alanine/glycine, alanine/cysteine, alanine/tryptophan, leucine/glycine, isoleucine/glycine, valine/glycine and arginine/histidine.

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Chapitre III

2.3.9. Fermentation products and gas phase analysis

The monitoring and quantification of certain metabolic products (volatile fatty acids, sugars and alcohols) was carried out by high performance liquid chromatography (HPLC). Organic acids, sugars and alcohols were analyzed using a Symmetry C18 inverted phase column (4.66150 mm, ODS2, particle size of 5mm), with 0.005M sulfuric acid as eluent (elution rate of 0.6 ml / min) and at an operating temperature of 50 ° C. The UV detector (Knauer) set at 210 nm was used. Everything is connected to a computer allowing the processing of results by a software (Azur Datalys version 4.6). The collected samples are centrifuged for 5 minutes at 10000 g and 600 µl of the supernatant are recovered for the sample changer, which injects 20 µl onto the column. The analysis of the gases (H2 and CO2) is carried out by gas chromatography (GC) on a Schimadzu GC- 8A apparatus equipped with a katharometer and an injector, maintained at a temperature of 200 °C; a column filled with a carbosphere support at 150°C. The carrier gas used was N2. 0.1 ml of the volume of the gaseous phase was injected. The software (Chromeleon 7 Chromatography Data System Software) allows the recording and processing of results.

2.3.10. Electron acceptors, gas phase effect on growth and antibiotic resistance

The electron acceptors (10 mM each): sulfate, sulfite (5 mM), thiosulfate, tetrathionate, elemental sulfur (1 g.L-1), nitrate, nitrite, fumarate and oxygen (20 %, v/v, in the gas phase) were tested. The effect of different gas phases on growth of the isolate was tested in basal medium T containing substrates that supported growth of strain DZ-S4 . 100% N2, N2/CO2 (supplied as 80:20

N2/CO2) and hydrogen atmosphere (supplied as 80:20 H2/CO2) were tested. Antibiotic resistance was conducted in triplicate in basal medium containing 0.2% (w/v) yeast extract, 0.2% (w/v) typtone, 0.2% (w/v) casamino acid and supplemented with 20 mM each arginine and histidine. Tests were at pH 7.5 and 35 °C. Antibiotics were filter-sterilized and were tested at final concentration of 2 mg per 10 ml of medium: ampicillin, chloramphenicol, chlortetracycline, kanamycin, nalidixic acid, penicillin, rifampicin, streptomycin, tetracyclin, vancomycin and gentamicin.

2.3.11. Nitrate or nitrite reductase research

In order to characterize the presence of nitrate reductase in DZ-S4T, for the following genes: nirS (Geets et al., 2006), nirK (Yan et al., 2003), nosZ (López-Gutiérrez et al., 2004) and narG (Henry et al., 2006) were amplified. The specific primer pairs (0.4 μM) for each gene were used at their hybridization temperatures. The amplification reactions are carried out according to the

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Chapitre III following program: 1 cycle of 5 min at 94 °C (denaturation); 35 cycles of 3 steps: denaturation for 30 sec at 94 °C, hybridization and elongation at 72 °C for 30 sec each, then final elongation cycle of 10 minutes at 72 °C. DNA amplicons were purified and were sequenced by GATC Biotech - Konstanz, Germany

2.4. Results and discussion

2.4.1. Characterization of the Synergistaceae microbial diversity using NGS in anaerobic wastewater sludge

The high throughput sequencing analysis showed 984 OTUs (that accounted for approximately 94.72% of total sequences) that could be classified into existing genera. Among them, 29 OTUs belonging to the Synergistaceae family were represented in the Heatmap based on their abundance in each sample (Figure III. 1). Four Synergistaceae genera, i.e. Aminiphilus (OTU 425), Aminivibrio (OTU 434), Aminomonas (OTU 199) and Lactivibrio (OTU 87) were found in anaerobic digesters and primary sludge. 25 new OTU (unaffiliated at the genus level) were identified. The OTU 13, 14 and 48 were the most abundant in the different digesters D1, D2, DA and DB, with relative cumulated abundances of 1.51%, 1.50%, 1.48% and 1.47%. OTU 56, OTU 13, OTU 66, and OTU 48 were found as the most abundant OTUs in primary sludge with relative abundances of 0.46%, 0.45%, 0.44% and 0.44%, respectively. However, Synergistetes were less abundant in flocculated sludge (0.06%). This low proportion is probably related to the fact that flocculated sludge is an aerated system. Consequently, creating unfavorable conditions for growth of strictly anaerobic Synergistetes microorganisms.

It was revealed that Synergistetes phyla was among the most abundant phyla found in the primary sludge and anaerobic digesters D1, D2, and DB (5% of relative abundance). The digester A from which strains were isolated contain 6% of Synergistetes. These results were similar to those described for many municipal anaerobic digesters (Li et al., 2015; Wang et al., 2017; Wu et al., 2016) or landfill leachate lixiviate anaerobic digesters (Köchling et al., 2015; Xie et al., 2014). The phyla Synergistetes were also subdominant in anaerobic digester running on swine manure (Tuan et al., 2014). Synergistetes may affect the fermentation of proteins and sugars during anaerobic processes (Morita et al., 2011; Tang et al., 2011).

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Chapitre III

In addition of protein degradation, Synergistetes are inferred to participate in acetogenesis and fermentative processes during anaerobic digestion (Gao et al., 2016). They produce formate, acetate, butyrate, propionate and CO2 from amino acids degradation. These end fermentation products could be used in a syntrophic association with methanogenic microorganisms that use formate, acetate and CO2 for methane production (Borrel et al., 2013) or sulfate reducing bacteria that can oxidize propionate (El Houari et al., 2017), acetate and butyrate (Rabus et al., 2015)

2.4.2. Enrichment and isolation of Synergistaceae

After 3 transfers of an enrichment from digester A under the same conditions (pH and temperature) using basal medium in presence of 0.25 g.L-1 HCL-Cysteine, 0.1% (w/v) yeast extracts, 20 mM lactate and 20 mM sulfate we obtained a stable co-culture of a sulfate reducer lactate degrading identified as Desulfovibrio aminiphilus and a Synergistetes bacterium. By using repeated agar serial dilutions, in medium with 5mM HCL-Cysteine, 0.1% (w/v) yeast extracts, brown colonies, approximately 0.5-1 mm in diameter, were observed within 2 months. Two colonies were transferred from the highest dilutions (10-5) to the liquid media of the same compositions. Two pure strains, DZ-S4T and DZ-S5, very similar in their morphological characteristics, were obtained and subsequently shown to be identical by comparing their 16S rDNA sequences (100% sequence similarity). The strain designated DZ-S4T was characterized in detail.

2.4.3. Morphology and physiology

Strain DZ-S4T grew optimally on brain heart infusion (BHI) broth medium supplemented with 20 mM each arginine and histidine (BHIAH), but the best growth was obtained on basal medium with 0.2% (w/v) yeast extract, 0.2% (w/v) typtone, 0.2% (w/v) casamino acid and supplemented with 20 mM each cysteine, arginine and histidine. This last medium was used to maintain cultures. Cells of strain DZ-S4T were curved-rod shape (with rounded ends) and non- motile. No spores were seen. Cells were variable in size approximately 0.6-0.7 µm in diameter and 1.2-1.8 µm in length, usually occurring either singly or in clusters (Figure III. 2). Cells of strain DZ- S4T stained Gram-negative and ultrathin sections revealed a typical multilayered Gram-negative cell wall structure (result not showen) as found for Cloacibacillus porcorum strain CL-84T by Looft et al., (2013). The optimum temperature for growth at pH 7.5 was 35°C. No growth was observed at temperatures below 4°C or above 42°C. The temperature range of growth is corresponding to the mesophilic temperature conditions of anaerobic digesters from wich Cloacibacillus evryensis strain

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Chapitre III

158T (Ganesan et al., 2008) and Aminobacterium thunnarium strain OTA 102T (Hamdi et al., 2015) were isolated. The pH range of growth was 4.8 to 8.5, with optimum growth occurring at pH 7.5. Strain DZ-S4T did not require NaCl for growth but tolerated up to 2.5% NaCl with an optimum at 0.6% NaCl.

The characteristics that discriminate strain DZ-S4T and the most closely related type Synergistaceae strains are showed in Table III. 1. The genomic DNA G+C content of strain DZ-S4T was 49.6 %mol quite different from the five most related strains. Strain DZ-S4T is unable to grow in the absence of yeast extract, common characteristic for all described species of the synergistaceae family (Allison et al., 1992). Strain DZ-S4T fermented L-arginine and L-histidine as observed in its closely related species (Allison et al., 1992; Baena et al., 1999a; Ganesan et al., 2008; Looft et al., 2013). Poor growth was observed on glucose, pyruvate and L-Cysteine. Growth on glucose and pyruvate is a physiological feature that distinguishes strain DZ-S4T from its nearest relative. Furthermore, strain DZ-S4T could not grow on DL-tryptophan, L-threonine, L-tyrosine, L-serine and L-proline in contrast to Cloacibacillus porcorum CL-84T (Looft et al., 2013). DZ-S4T was also able to grow on complex substrates such as yeast extract, casamino acid, tryptone, peptone, BHI, TSB and starch. However, no growth of DZ-S4T was observed on 2 hydroxypyridone, 2,4 dihydroxypyridone and mucin at a final concentration of 10 mM. The non-growth on mucin distinguishes DZ-S4T from Cloacibacillus porcorum CL-84T that can grow on mucosal glycoproteins such as mucin (Looft et al., 2013).

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Chapitre III Table III. 1: Characteristics that can discriminate between strain DZ-S4T (present study) and the most-closely related type strain of Synergistaceae species. Taxa: 1, Strain DZ-S4T (present study); 2, Cloacibacillus porcorum strain CL-84T (Looft et al., 2013); 3, Cloacibacillus evryensis strain 158T (Ganesan et al., 2008); 4, Synergistes jonesii strain 78-1T (Allison et al., 1992); 5, Aminomonas paucivorans GLU-3T (Baena et al., 1999a). n.a. data not available; +, positive; -, negative; (+), weakly positive.

Characteristics 1 2 3 4 5 Habitat anaerobic sludge digester swine intestinal tract anaerobic digester rumen contents of a goat anaerobic dairy wastewater (Marrakech-Morocco) (Ames-USA) (Evry- France) (Hawaii-USA) lagoon (Colombia) Morphology curved rod shape curved rod rod shaped oval rod rod-shaped, slightly curved Cells size µm 0.6-0.7 X 1.2-1.8 0.8-1.2 X 3.5-5 0.8-1.0 X 2.0-3.0 0.6-0.8 X 1.2-1.8 µ 0.3-0.4 X 4.0-6.0 Salt range % (Optimum) 0-2.5 (0.6) 0-1.4 (0.6-0.8) 0-0.7 n.a 0-2.0 (0.05-0.5) pH range (Optimum) 6.01-8.1 (7.5) 4-8 (6.5) 6.5-10 (7) n.a 6.7-8.3 (7.5) T°C range (Optimum) 12-42 (35) 20-45 (39) 20-50 (37) (39)* 20-40 (35) Mobility - - - - - G+C mol % 49.6 55.1 55.8 58 43 Substrates utilization DL-Tryptophan - + + n.a L-Threonine - + - n.a + L-Tyrosine - + n.a n.a - L-Serine - + + n.a - L-Proline - + (+) n.a - Pyruvate (+) n.a n.a n.a - Glucose + - - - - Electron acceptors Nitrite + n.a - n.a - Antibiotics resistance Ampicillin + n.a - - n.a Penicillin + - - - n.a Vancomycin - + + + n.a Gentamicin - n.a n.a n.a n.a

*Data from Ganesan et al., (2008).

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Chapitre III

The Stickland reaction was negative. The effect of different gas phases on growth of the isolate was tested in basal medium containing substrates that supported growth of strain DZ-S4T.

An 80% hydrogen atmosphere (supplied as 80:20 H2/CO2) at 1 Bar pressure did not enhanced growth on basal medium with 1% (w/v) of TSB or 10 mM histidine. Whereas, when the strain was grown under N2/CO2 phase the growth was improved relative to the N2 phase.

The supernatant cultures and gas phases from growth of DZ-S4T were analyzed (Table III. 2). Major fermentation products were formate and acetate. These results are similar to those of Looft et al., (2013) and Ganesan et al., (2008). However, growth on glucose, yeast extract, BHI, TSB and starch produced lactate in addition to formate, acetate; yeast extract. TSB also produced

CO2. The propionate was only produced from histidine and yeast extract.

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Chapitre III

Table III. 2: Fermentation products from substrates that support growth of strain DZ-S4T in basal medium

No growth of strain DZ-S4T was occurred on L-alanine, L-glutamate, L-glutamine, DL-phenylalanine, L-serine, L-proline, L-threonine, L-aspargine, mimosine, fumarate, succinate, acetate, butyrate, alpha-ketoglutarate, fructose, D-cellobiose, D-mannose, D-mannitol, inositol, sorbose, D-sorbitol, maltose, D-ribose, galactose, 1-Propanol, 1-butanol, fumarate, succinate, acetate, butyrate, -ketoglutarate, 1-propanol and 1-butanol.

Substrate Formic acid Acetic acid Propionic acid Lactic acid *H2 *CO2 OD600 Histidine + + + - - - ++ Glucose - - - + - - +++ Pyruvate + + - - - - + Yeast extract + + + + - + +++ Tryptone + + - - - - +++ BHI + + - + - - +++ TSB + + - + - + + Starch + + - + - - +

*Measured by GC. Organic acids were measured by HPLC. All values were corrected for the small amount of short-chain fatty acids formed in the control tubes. Experiments were conducted in triplicate and mean values are given. +, detected; -, not detected.

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Chapitre III

Cellular fatty acid profiles of strain DZ-S4T are shown in Table III. 3. The major cellular fatty acids of strain DZ-S4T were iso-C15:0 (26.95%), C16 : 0 (13.27%) and C14 : 0 (8,95%), which were quite different from those of Cloacibacillus porcorum CL-84T (JQ809697) and Cloacibacillus evryensis 178T (CU463952). Additional biochemical characterizations showed that growth of strain DZ-S4T was not inhibited by ampicillin, nalidixic acid, penicillin, rifampicin and streptomycin, although it was inhibited by chloramphenicol, chlortetracycline, kanamycin, tetracyclin, vancomycin and gentamicin. Strain DZ-S4T showed positive arginine dihydrolase, ornithine decarboxylase and urease. Strain DZ-S4T tested negative for nitrate reductase, catalase and oxidase.

Table III. 3: Cellular fatty acid profiles (%) of strain DZ-S4T, Cloacibacillus porcorum CL-84T and Cloacibacillus evryensis 178T, grown on BHIAH medium. Taxa : 1, Strain DZ-S4T ; 2, Cloacibacillus porcorum CL-84T ; 3, Cloacibacillus evryensis 178T. Proportion of total fatty acids (%) Fatty acid 1 2 3 C14 : 0 8,95 - 0,34 iso-C15 : 0 26.95 27.1 14.2 iso-C15 : 0 3-OH 0.63 15 14 iso-C17 : 0 5.47 11.7 2.4 C16 : 0 13.27 9.7 1.8 iso-C13 : 0 2.69 7.6 5.8 C17 : 0 1.32 4.2 12 iso-C17 : 1 at 10 - 3.9 2.7 C16 : 1ω7c 0.87 3.7 1.6 C18 : 0 1.37 2.8 0 C18 : 1ω11c - 2.6 0 C17 : 1ω11c - 2.3 12.4 C15 : 0 2.89 1.9 4.8 C16 : 1ω11c - 1.7 0 iso-C17 : 1 at 9 - 1.6 0 C13 : 0 0.13 0 3.4 C15 : 0 3-OH - 0 7.7 ω6c C15 : 1 0.66 0 4.3 ω5c C16 : 1 - 0 1.8 ω3c C17 : 1 - 0 1.3 ω6c C17 : 1 - 0 5.3 Summed features* C14 : 0 3-OH/iso-C16 : 1 1,5 3.2 2.2 C17 : 0 DMA/unknown 0.23 0 1.8 at 17.49† *Summed features represent two fatty acids that cannot be separated with the MIDI system †Unknown fatty acids do not have a name listed in the MIDI system library; values are equivalent chain lengths.

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For electron acceptors, the addition of sulfate, sulfite, thiosulfate, tetrathionate,Chapitre elemental III sulfur, and fumarate did not improve it. No growth was observed on oxygen. However, the presence of nitrite enhanced growth on basal medium containing 1% (w/v) of TSB or 10 mM histidine with respect to controls. Strain DZ-S4T can use nitrite as electron acceptor but not nitrate. Among the genes tested for nitrate or nitrite reductase research, only both nirS (Geets et al., 2006) and nosZ (López-Gutiérrez et al., 2004) were successfully amplified whereas narG (Henry et al., 2006) was not. The sequence analyses of these PCR products confirmed their affiliation to both nirS and nosZ genes. The closest nirS representatives in GenBank corresponded to an environmental clone (GenBank accession no. KX510506; sequence similarity of 83%) and the closest representative from cultivated strains corresponded to the Halomonas koreensis (FJ686156; sequence similarity of 76%). The closest nosZ representatives in GenBank corresponded to Pseudogulbenkiania subflava (KU175548 ; 88% sequence similarity). The reduction of nitrite was not observed in any species of Synergistaceae family, which makes a new feature that discriminate strain DZ-S4T from others Synergistaceae species.

2.4.4. Phylogenetic analysis

16S rRNA gene-sequence of strain DZ-S4T revealed that the isolate was related to representatives of the genus Cloacibacillus, belonging to the Synergistaceae family (Figure III. 3). Within this genus, strain DZ-S4T formed a separate lineage with three distantly related species, Cloacibacillus porcorum CL-84T (91.8% sequence similarity with the type strain) isolated from swine intestinal tract (Ames-USA), Cloacibacillus evryensis 158T (91.5 %) isolated from an anaerobic digester (Evry- France) and Synergistes jonesii 78-1T (89.5%) isolated from a rumen contents of a goat (Hawaii-USA).

Among the 29 Synergistaceae OTUs found in anaerobic digesters, OTU 13 is the more related to the strain DZ-S4T with 100% of similarity. OTU 13 represents a relative abundance of 0.56 % in the digester A from which strain DZ-S4T was isolated. Six OTU (13, 14, 48, 129, 875, 919), the most abundant among the Synergistaceae, were closely related to DZ-S4T and probably belonged to the same new genus. Several phenotypic properties also support the phylogenetic conclusions (see Tables 1, 2 and 3). Strain DZ-S4T is a representative of a novel species in a new genus in the family Synergistaceae.

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Chapitre III

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Chapitre III

2.4.5. Description of Caenicola gen. nov.

Caenicola [cae.ni.co′la. L. n. caenum mud, sludge; L. suff. - cola dweller; N.L. n. caenicola sludge dweller].

Cells are strictly anaerobic rods, non-motile, with no flagella. Gram-negative type cell wall. Mesophilic and non spore-forming. Neutrophilic and heterotrophic in nature. Metabolism is fermentative. Use nitrite as electron acceptor and did not perform the Stickland reaction. Saccharolytic and proteolytic. The major cellular fatty acids are iso-C15:0 (26.95%), C16 : 0 (13.27%) and C14 : 0 (8,95%). Members of this genus can be differentiated from other genera in the phylum ‘Synergistetes’ by 16S rRNA gene sequencing, cellular fatty acids profiles, DNA G+C content, metabolic end products and nitrite reduction. The genus is affiliated to the family ‘Synergistaceae’ in the phylum ‘Synergistetes’. The type species is Caenicola nitritireducens.

2.4.6. Description of Caenicola nitritireducens sp. nov.

Caenicola nitritireducens [ni.tri.ti.re.duc’ens. N.L. nitris –it is nitrite; L. part. adj. reducens leading back, bringing back and (in chemistry) converting to a different oxidation state; N.L. part. adj. nitritireducens reducing nitrite].

In addition to the properties listed in the genus description, the following properties are observed. Curved rod shaped bacterium, 0.6-0.7 X 1.2-1.8 µm in size, occurring singly or in pairs; older cells form chains. Electron microscopy reveals a cell-wall structure typical of Gram-negative bacteria. Colonies are brown, small (about 0.5–1 mm in diameter). Mesophilic, optimum temperature for growth is 35 °C and the growth range is 12–42 °C. The pH range for growth is 6.5– 8.1, with optimum at pH 7.5. Not require NaCl for growth. R growth is observed on other amino acids or carbohydrates. Formate, acetate, propionate, and CO2 are the usual end products of fermentation. Sensitive to chloramphenicol, chlorotetracycline, kanamycin, tetracyclin, vancomycin gentamicin, but resistant to ampicillin, nalidixic acid, penicillin, rifampicin, streptomycin.

The type strain, strain DZ-S4T (=DSM 104940T =JCM 31897T) was isolated from an anaerobic digester of a WWTP in Marrakech, Morocco. The DNA G+C content is 49.6 mol%.

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Chapitre III

2.5. Funding information

This work was supported by PHC Toubkal/15/19-32545NB French Moroccan project.

2.6. Acknowledgements

We are grateful to Campus France and the ‘Centre National de la Recherche Scientifique et Technique (CNRST) Rabat’, Morocco, for supporting the mobility of the researchers in this project. The authors are also grateful the Bordeaux Imaging Center, a service unit of the CNRS-INSERM and Bordeaux University, member of the national infrastructure France BioImaging. The help of Melina Petrel for microscopy is acknowledged. We also thank Mohamed Ichibane, Head of analysis laboratory of the municipal wastewater treatment plant (Marrakesh, Morocco) for his help in collecting sludge samples from sites.

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2.7. References

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Chapitre III

3. Conclusion

La souche décrite dans cette publication représente un nouveau genre appartenant à la famille des Synergistaceae. Le nouveau genre Caenicola nitritreducens DZ-S4T est le plus dominant dans les digesteurs anaérobies de la station d’épuration de la ville de Marrakech. Dans cette étude, quatre autres genres existant de Synergistaceae (Aminiphilus, Thermovigra, Aminivibrio et Lactivibrio) ont été également retrouvés dans les boues anaérobies de ces digesteurs ainsi que d’autres membres des Synergistaceae non isolés. Ces microorganismes sont souvent associés au processus de dégradation des protéines. En isolant la souche Caenicola nitritreducens DZ-S4T, nous étendons nos connaissances sur la biodiversité des microorganismes dégradant les acides aminés ainsi que sur l'écosystème à partir duquel ils peuvent être isolés. Ceci suggère le rôle important que ce nouveau genre pourrait jouer dans les écosystèmes de digestion anaérobie riches en protéines.

En plus de la dégradation des protéines, les Synergistetes participent à l'acétogenèse et aux processus de fermentation au cours de la digestion anaérobie (Gao et al., 2016). Généralement, une réaction catabolique globale de la dégradation des protéines aboutit à la formation de l’acétate, du propionate, du butyrate, de l’ammoniac et du dioxyde de carbone. Comme pour la dégradation des glucides, la minéralisation complète des protéines en méthane et en dioxyde de carbone peut se concevoir en quatre étapes majeures: dégradation enzymatique extracellulaire (hydrolyse des protéines), fermentation de grandes molécules organiques en acides organiques (fermentation des acides aminés), dégradation les intermédiaires de fermentation en acétate (acétogénèse), et la production de méthane à partir d'acétate ou d'hydrogène et de dioxyde de carbone (méthanogénèse) (Ramsay and Pullammanappallil, 2001). Ces produits finaux de fermentation pourraient être utilisés dans une association syntrophique avec des microorganismes méthanogènes utilisant du formiate, de l'acétate et du CO2 pour la production de méthane (Borrel et al., 2013) ou des bactéries sulfato-réductrices pouvant oxyder le propionate, l’acétate et le butyrate (Rabus et al., 2015). Dans le chapitre suivant (Chapitre IV) sera décrite la diversité et la structure des communautés microbiennes (dont les Synergistetes fait partie) impliqué dans le processus de digestion anaérobie. La diversité des bactéries sulfatoréductrices et des archées sera étudiée en détail au travers la combinaison des approches culturales et moléculaires.

133

Chapitre IV: Microbial communities and sulfate reducing microorganisms diversity in municipal anaerobic sewage sludge digesters from a wastewater treatment plant (Marrakech, Morocco)

Chapitre IV

1. Préambule

Les sulfures sont des composés hautement réactifs, corrosifs et très toxiques, qui causent de nombreux problèmes environnementaux liés à la production du biogaz (Gibson, 1990). Au cours de la digestion anaérobie, les sulfures sont produits essentiellement par la réduction "dissimilatrice" des composés soufrés présents dans les boues par un groupe hétérogène de bactéries sulfato-réductrices (Barton and Fauque, 2009; Muyzer and Stams, 2008). Ces microorganismes ont la capacité d'utiliser du sulfate, ainsi que d'autres composés soufrés (soufre élémentaire, thiosulfate ou sulfite) comme accepteurs terminaux d'électrons pour l'oxydation de composés organiques ou de l'hydrogène, dans un processus qui aboutissant à la production des sulfures (Castro et al., 2000; Dar et al., 2007; Rabus et al., 2015). Ce groupe de microorganismes a été étudié sur la base des méthodes moléculaire (séquençage haut débit ou PCR quantitative) ou en utilisant des approches culturales (isolement et caractérisation).

Au cours de la dernière décennie, l'application de méthodes de séquençage de nouvelle génération « Next Generation Sequencing» aux digesteurs anaérobies a permis de mieux comprendre la composition et la fonction des populations microbiennes dominantes impliquées dans l’ensemble du processus aboutissant à la production de biogaz. Ces techniques ont permis de mieux comprendre comment la configuration d’un réacteur et les conditions opérationnelles ont une influence sur la structure et la dynamique des communautés microbiennes, et comment cela est lié à l'efficacité et à la stabilité globale du digesteur (Lee et al., 2012; Nelson et al., 2011; Sundberg et al., 2013; Talbot et al., 2008; Werner et al., 2011). La compréhension des capacités métaboliques des microorganismes, leur niveau de redondance fonctionnelle au sein d'une communauté et les mécanismes fondamentaux des interactions interspécifiques est nécessaires afin d'optimiser la production du biogaz ou réagir à un disfonctionnement au cours du processus de la digestion anaérobie (Vanwonterghem et al., 2014).

Dans ce contexte, ce chapitre a pour objectif d‘apporter des éléments de réponse à la problématique des sulfures (corrosion, toxicité, coût de purification du biogaz). Pour cela nous avons entrepris d’étudier la diversité globale des communautés microbiennes et plus particulièrement celle des bactéries sulfato-réductrices (BSR) et des archées présents dans les boues des réacteurs méthanogènes traitant des eaux usées domestiques de la station

135

Chapitre IV d’épuration de la ville de Marrakech au Maroc. Ces deux groupes microbiens montrent une grande diversité, incluant à la fois la diversité phylogénétique et métabolique (Ghosh and Dam, 2009; Müller et al., 2015). Pour explorer l'abondance et la diversité environnementales des BSR et des archées, des gènes codant pour des enzymes clés dans les voies biochimiques de la sulfatoréduction (gène dsrA) et de la production du méthane (mcrA) ont été utilisés comme marqueurs moléculaires dans cette étude. Les approches moléculaires (séquençage haut débit du gène de l'ARNr 16S et PCR quantitative des deux gènes dsrB et mcrA) sont combinées à des approches culturales au travers de l’isolement de certaines souches sulfatoréductrices afin d'avoir une meilleure vision de la communauté sulfatoréductrice responsable de la production des sulfures au cours de la production du biogaz dans les réacteurs de la station de traitement et de réutilisation des eaux usées "domestique" de la ville de Marrakech (Maroc).

136

Chapitre IV

2. Microbial communities and sulfate reducing microorganisms diversity in municipal anaerobic sewage sludge digesters from a wastewater treatment plant (Marrakech, Morocco)

Ce travail est présenté sous la forme d’un article en préparation qui sera soumis pour publication sous le titre :

Microbial communities and sulfate reducing microorganisms diversity in municipal anaerobic sewage sludge digesters from a wastewater treatment plant (Marrakech, Morocco)

A El Houari1-2, M Ranchou-Peyruse2, A Ranchou-Peyruse2, R Bennisse1, R Bouterfas1, Goni MS2, A Qatibi1 and R Guyoneaud2.

1Anaerobic Microbiology Team (E02B26), Sciences and Techniques Faculty, Cadi Ayyad University PO Box 549, 40 000 Marrakech, Morocco.

2Université de Pau et des Pays de l’Adour, CNRS, IPREM UMR 5254, Equipe Environnement et Microbiologie, 64013, Pau, France.

Key words: anaerobic digestion, microbial diversity, sulfate reducing bacteria, Archaea, sulfides, biogas.

Correspondence to: Rémy Guyoneaud. Tel: + 33 5 59 40 74 89 / Fax: +33 5 59 40 74 94; e-mail: [email protected]

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2.1. Abstract

Both MiSEQ molecular analyses and cultural isolation of sulfate reducing prokaryotes have been performed on a full-scale wastewater treatment plant (Marrakech, Morocco) including four anaerobic digesters. The objective was to evaluate their diversity and their role in the production of sulfides during anaerobic digestion and thus biogas contamination. MiSEQ sequencing of the V4-V5 region of the 16S rRNA gene generated 984 OTUs. They indicated that at global scale a considerable abundance of Archaea (3.1-8.5%) was detected in the four-anaerobic digesters with abundances directly linked with temperature. Among them, the Methanomicrobiales were dominant with abundance ranging from 8.75 .106 to 1.47 .107 gene copies (mcrA) per g-1 of slugde. The most abundant bacterial populations were the Firmicutes, the Bacteroidetes, the Cloacimonetes (WWE1 candidate phylum), the Proteobacteria and the Synergistetes. The main microorganisms involved in the sulfate reduction process (mean 5% of the total sequences) in the anaerobic digesters were represented by Deltaproteobacteria belonging to the Syntrophaceae, the Desulfobulbaceae, the Desulfovibrionaceae, the Syntrophobacteraceae, the Desulfurellaceae and the Desulfobacteraceae families. The abundance of dsrB gene was highly variable depending on the digester ranging from 9.6 .105 to 9.3 .106 gene copies per g-1 of sludge. Qualitatively, the syntrophs were not detected by cultural approaches neither the Desulfurellaceae and the Desulfobacteraceae families. Among the Desulfobulbaceae and the Desulfovibrionaceae, both approaches gave distinct insight into the diversity of the sulfate reducing bacteria.

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2.2. Introduction

Anaerobic digestion is an effective way of energy production through the decomposition of wastes. This technology is applied in the treatment of not only domestic wastewater (Zeeman and Lettinga, 1999) allowing an important production of energy, recovered as biogas, composed of 50-75% methane, 25-50% carbon dioxide, 0-10% nitrogen, 0-3% hydrogen sulfide and traces of other gases (Ward et al., 2008). Because of the wide variety of starting materials, a complex set of microbial populations, with high functional redundancy, is involved in the process of anaerobic digestion (Narihiro and Sekiguchi, 2007; Weiland, 2010). This is one of the reasons for the robustness of the processes (Fernández et al., 1999; Zumstein et al., 2000). Nowadays the application of next generation sequencing technologies has provided increased resolution for the study of microbial communities in large-scale anaerobic digesters (Lee et al., 2012; Werner et al., 2011). The overlapping of both molecular and cultural approaches could be complementary to each other to give a clear vision of the microbial community present in an ecosystem (Colin et al., 2012).

The anaerobic digesters may have operational troubleshooting that resulted in increased operational costs. Among them foam and scum production, dewatering, loss of efficiency, acidification, and toxic disturbances related to the production of sulfides (Gerardi, 2003). Indeed, sulfides were essentially related to the dissimilatory reduction of sulfur compounds present in the sludge by a heterogeneous group of sulfate-reducing bacteria (SRB). They have the ability to use sulfate, as well as other oxidized sulfur compounds (elemental sulfur, thiosulfate, sulfite), as a terminal electron acceptor for the oxidation of simple organic compounds or hydrogen, in a process that ends in high sulfide production (Rabus et al., 2015). Sulfides can be an undesirable by-product in biogas reaching very high concentrations ranging from 100 ppmv to 10.000 ppmv (2-3 % v/v of the biogas). It induced the corrosion of metal and concrete (Okabe et al., 2007; Zhang et al., 2008), significantly shorten the life of gas engines in cogeneration units (Gayh et al., 2010) and the emission of strong smelly and toxic emanations (Barton and Fauque, 2009). Also, combustion of biogas with high concentrations of hydrogen sulfide causes pollution due to excess of SOx emissions. In addition, sulfide has inhibitory effect on the anaerobic digestion process (Janssen et al., 2009). Its elimination is a mandatory step before using biogas as a source of energy (Janssen et al., 2009; Pokorna and Zabranska, 2015).

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The wastewater treatment plant (WWTP) of the Marrakech city in Morocco brings an additional capacity of 33 million m3 of water reuse for the city, mainly for irrigation. The sludge is treated by anaerobic digestion and produces 18.000 m3/day of biogas for both digesters functioning (mixing and heating sludge) and the production of 30.000 KWh/day supplying 45% of energy requirements of the station. The biogas contains an average of 4000 ppm of sulfides, originating from sulfate reducing microorganisms activities that must be treated (desulfurized) before use. This study focuses on the diversity and abundance (through molecular and cultural approaches) of the microbial communities found in biogas production process in the Marrakech WWTP. The high throughput sequencing analysis of the V4-V5 region of the 16S rRNA gene has been undertaken as well as quantitative PCR (qPCR) to reveal the distribution of sulfate-reducing microorganism and Archaea in the view of the evaluation of their role in the production of sulfides and methane during anaerobic digestion. In addition some strains belonging to the sulfate reducers have been isolated and eventually described (El Houari et al., 2017) in order to gain a better view of the sulfate reducing community, a group of economic interest for the WWTP from Marrakech. In Marrakech, the elimination of sulfide from biogas is carried out through Thiopaq technology, a cost effective process.

2.3. Material and methods

2.3.1. Sampling strategy and operating condition

All anaerobic digesters were operated at variable mesophilic temperature conditions (Table IV. 1) and had each a working volume of 6400 m3. The detailed process performance of WWTP of Marrakech are summarized in Table IV. S1, whereas the data for biogas digesters are given in Table IV. 1. The sampling was carry out on July 24, 2015 from municipal WWTP of Marrakech (Morocco). Sludge samples were taken from the surface and the bottom the four-biogas digesters designated DA, DB, D1 and D2, the primary sludge (BP, from primary decanters) and the flocculated sludge (BF, from thickeners). A total of 10 different samples were collected. For sampling, bottles (120 mL sterile serum bottles) were completely filled to displace air and stored at 4°C until use for cultural methods. In Addition, six samples were stored in cryotubes at -20°C for molecular analyses.

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-1 Mass loading Temperature (°C) pH Volatile fatty acids H2S Alkalinity (g.l ) (Kg VDM/day) (mg.l-1) (ppm) Digester A 6801±931 29.7±0.5 7.0±0.1 183±24 n.a 1.8±0.3 Digester B 6193±1035 32.1±1.3 7.1±0.1 227±73 n.a 2.2±0.3 Digester 1 6802±951 41.1±2.3 7.3±0.1 620±361 219 2.5±0.4 Digester 2 5717±960 35.5±0.4 7.2±0.1 276±70 2.1 2.4±0.4 n.a: not available.

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2.3.2. Extraction of genomic DNA and high throughput sequencing

Total DNA extractions were performed in triplicate using PowerSoil® DNA Isolation kit (MO BIO) following the manufacturer instructions. The DNA was stored at -20°C until use. The V4–V5 hypervariable region of the 16S rRNA gene targeting Bacteria and Archaea was amplified using the primers 515F, 5‘ – GTG YCA GCM GCC GCG GTA – 3‘ and 928R, 5‘ – CCC CGY CAA TTC MTT TRA GT – 3’ (Anderson et al., 2009; Liu and Whitman, 2008). The amplifications of the 16S rRNA gene were performed in a final volume of 50 μL with primers 515F/928R (0.2 μM), 0.2 mM dNTPs, 1.25U Taq polymerase (Amp Taq Gold 360) and its buffer. The amplification reactions are carried out according to the following program: 1 cycle of 10 min at 94 °C (denaturation); 35 cycles of 3 steps: denaturation at 94 °C, hybridization at 65 °C, and elongation 40 sec at 72 °C; final elongation cycle of 10 minutes at 72 °C. Amplification was conducted using a PCR thermal cycler Model PTC-100 (Bio-Rad, Richmond, CA). Forward and reverse primers contained the adapter sequences (5’GTGYCAGCMGCCGCGGTA) and (3’ACTYAAAKGAATTGRCGGGG) respectively, used in Illumina sequencing technology. The amplicons were sequenced using an Illumina MiSEQ (250 bp paired-end reads) at the platform Genotoul Inc. (www.genotoul.fr, Toulouse, France).

2.3.3. Processing of sequencing data from illumina MiSEQ and statistical analyses

Bioinformatics data treatments were performed using FROGS software developed for the Galaxy platform (Blankenberg et al., 2010; Giardine et al., 2005; Goecks et al., 2010) following the FROGS pipeline as described by de ric Escudie et al., (2017). Operational taxonomic units (OTUs) were grouped at an identity threshold of 97%. From the taxonomic affiliation, a representative sequence of each OTU affiliated was extracted. Finally, a normalization of the abundances found for each OTU was carried out by the DESeq method (Anders et al., 2012). Diversity and evenness indices (Chao et al., 2014) were calculated using the bacterial OTU data after normalization using DESeq method. The evolutionary history was inferred using the Neighbor-Joining method (Saitou and Nei, 1987). An alignment was then carried out between OTUs; the alignment was used to build a phylogenetic tree with PhyML algorithm (Guindon et al., 2010).

The statistical calculations and multivariate analyses were conducted using R software package with the following libraries: phyloseq, vegan, ape, Venn diagram, heatmap2, gclus,

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Chapitre IV ggplot2, GUniFrac, grid and optparse. A one-way analysis of variance (ANOVA) was used to compare the mean values with respect to sampling sites. Duncan’s multiple range tests at p=0.05 were employed to compare the means and to group them accordingly. Pearson correlation coefficients were calculated from pairs of variables within and between process and bacterial community data. A principal component analysis (PCA) was performed to evaluate the microbial community composition of the samples.

2.3.4. Growth and isolation of sulfate reducing microorganisms, phylogenetic identification

Samples were grown in enrichment cultures using basal medium (El Houari et al., 2017) and supplemented with 10 mM sulfate as electron acceptor and 10 mM lactate for the Desulfovibrio and Desulfomicrobium genera isolation or 10 mM propionate for the Desulfobulbus genus isolation. After three transfers in enrichment, the isolation of strains was performed using repeated agar serial dilutions (Hungate, 1969). The colonies were transferred from the highest dilutions to liquid media. The purity of the strains was checked routinely by phase-contrast microscopy and by performing growth tests in basal medium containing 1% (w/v) glucose, 1% (w/v) casamino acid, 1% (w/v) peptone, 1% (w/v) yeast extract and 1% (w/v) biotrypticase under oxic and anoxic conditions.

All genomic DNAs extractions from pure cultures were performed using a kit (UltraCleanTM Soil DNA Kit insulation MOBIO Laboratories) according to manufacturer's recommendations. The amplifications of the 16S rRNA coding gene was carried out as described by Dias et al., (2008). Sequencing with the 8F primer of the amplicons obtained was performed (GATC Biotech - Konstanz, Germany). The evolutionary history was inferred using the Neighbor-Joining method (Saitou and Nei, 1987). Evolutionary analyses were conducted in MEGA6 (Tamura et al., 2013). An alignment was then carried out between OTUs sequences, sulfate reducing bacteria reference sequences obtained from the SILVA database (version 128) and the isolated strain sequences. The alignment was used to build a phylogenetic tree with MEGA software.

2.3.5. Quantitative PCR (qPCR)

Primer sets and reaction conditions were performed as described by Geets et al., (2006) and Steinberg and Regan (2008) for the dsrB and mcrA respectively. The quantifications were performed in triplicate on a Mx3005P ™ real time PCR machine

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(Stratagene) in a final volume of 20 μL containing 1 μL of template DNA, 0.4 μM of each primer and the enzyme mixture of SYBR® Green DyNAmo™ Color Flash qPCR Kit (Finnzymes). The amplifications started with an initial denaturation step (10 min at 95 °C.) and then 40 cycles of 1/denaturation (1 min, 95 °C.), 2/hybridization of the primers to the hybridization temperature (54°C for dsrB and 57°C for mcrA, 30 sec) and 3/ elongation (40 sec, 72 °C). A melting curve of the PCR products obtained was carried out at the end of each amplification.

2.4. Results and discussion

2.4.1. Global analysis of microbial communities in WWTP of Marrakech

A total of 10 samples were analyzed in triplicates from the WWTP of Marrakech, including primary sludge (PS), flocculated sludge (FS), and the four anaerobic digesters (D1, D2, DA, DB) sampled at the surface (s) and the bottom (b). A total of 1.243.519 sequences were founded in all the samples after MiSEQ sequencing, 1.095.879 among them were retained, corresponding to 88.1% of the effective sequences obtained with a mean length of 250 bp. The total number of sequences per sample varied between 27.140 (sludge) and 40.456 (anaerobic digesters), with the exception of DB-s presenting a lower value (Table IV. 2). Indeed, the number of OTUs found at 97% similarity threshold for DB-s was significantly below all other anaerobic digesters samples with values of 695 ± 13 OTU and 761 ± 32 OTU (mean value) respectively. The number of OTUs for the two sludges, PS and FS were 593 and 566 respectively. These results are in the range of those found by other studies and with the same primers (V4-V5 region) (Narihiro and Sekiguchi, 2007; Wang et al., 2017; Wu et al., 2016). The diversity indexes (Hill numbers) calculated were lower for the sample D1, whatever the selected indexes. The low values found for exponential Shannon index, and reciprocal Simpson index, compared to the chao1 numbers indicated a highly uneven distribution of the populations in the sample (Chao et al., 2014).

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Table IV. 2: Number of sequences, OTUs and diversity indexes calculated for all the samples. Results for one sample are the mean of three replicates.

Samples Sequences OTUs Chao1 exp (H-Shannon) 1/ Simpson index Floculated Sludge 30103 ± 13365 566 ± 57 628.1 118.99 35.52 Primary Sludge 24177 ± 9086 593 ± 43 669.61 110.76 36.87 D1-b 41212 ± 22030 722 ± 72 785.64 56.05 11.81 D1-s 37788 ± 15262 744 ± 37 802.61 58.11 11.41 D2-b 45925 ± 9174 771 ± 27 810.89 63.97 14.67 D2-s 40254 ± 18170 741 ± 74 812.35 58.55 12.89 DA-b 31097 ± 11116 748 ± 25 794.42 135.44 51.61 DA-s 40134 ± 18067 785 ± 36 819.27 133.28 45.44 DB-b 46781 ± 7138 816 ± 13 854.7 105.12 26.73 DB-s 18698 ± 472 695 ± 13 767.26 93.55 21.57

Abbreviations: D1= Digester 1, D2= Digester 2, DA= Digester A, DB= Digester B, s= surface, b= bottom.

The Principal Component Analysis based on the weighted UniFrac β-diversity metric (Figure IV. S1) showed that the triplicates for all samples as well as the surface and bottom samples for each digesters are closely grouped together. It is remarkable that there was no significant difference between the percentages of the most abundant families between surface and bottom samples for each digester. As a result, from now on, the surface and bottom samples will be grouped and presented together (mean of six samples). Taking into account all the samples the FS samples could be separated along axis 1 explaining, 49.68% of the difference. FS contained only limited representatives of the Euryarchaeota and Synergistes (Figure IV. 1), phyla known to contain exclusively obligate anaerobes (Bhandari and Gupta, 2012). The flocculated sludge is obtained after the activated sludge and a clarification, processes undertaken under highly aerated conditions to promote the growth of the aerobic microorganisms and our results are similar to those of Mei et al., (2016). Indeed the FS samples contained a dominance of the Bacteroidetes, aerobic carbon degraders (Zhu et al., 2013) , and the Proteobacteria, both dominant in aerated sludges (Mei et al., 2016). The PS grouped together with the anaerobic digester because it contain obligate anaerobes and Firmicutes (Figure IV. 1), but these samples contain also large proportions of Bacteroidetes (44%) since the samples were collected from both settled anoxic domestic wastes and aerobic sludge at the surface of the separating decanter.

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Another principal coordinates analysis, taking into account the four anaerobic digesters (Figure IV. S1.b) revealed a clear separation along the first axis, explaining 41.28%

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Chapitre IV of the difference. The digesters were placed along this axis corresponding to a gradient of temperature. According to the physico-chemical parameters obtained from the WWTP of Marrakech, D1 had a higher temperature, a bit higher than the mesophilic conditions (average temperature in July 2015 of 41.1°C, max value of 44.2°C), whereas DA has the lower temperature (average temperature of 29.7°C). D1 digester presented 28 OTU (1.97%) that were unique for this digester as compare with less than 0.3 % for all the others (Figure IV. 2).

Figure IV. 2: Venn diagram representing the OTUs richness (based on V4-V5 16S rRNA gene) shared between the four anaerobic digesters A, B, 1 and 2.

Among these 28 OTU the most dominant are Clostridia. Moreover D1 had a higher relative contents of true thermophiles such as the Firmicutes and among them Thermodesulfobacteriaceae (Figure IV. 3). Methanogenic reactors were dominated by Thermodesulfobiaceae, Rikenellaceae and bacteroidia (Mori et al., 2003; Moset et al., 2015; Sasaki et al., 2011) .

2.4.2. Microbial Communities in anaerobic digesters

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To study the abundance of communities at the OTUs level in each anaerobic digester, the 30 more abundant OTUs were presented in a heatmap based on their abundance in the four digesters (Figure IV. 3). In the present study, 984 OTUs (that accounted for approximately 94.72% of total sequences) could be classified into existing genera. The two prokaryotic domains were present in the different digesters. The 30 OTUs represented in the Heatmap (Figure IV. 3), they grouped into eight different phyla based on their relative abundance. The bacterial domain was represented by the seven following phyla: Firmicutes, Cloacimonetes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Aminicenantes, Synergistetes, Acidobacteria. It was reported that at the phylum level, the most abundant bacterial populations were found to be Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Synergistetes, and Actinobacteria (Guo et al., 2015; Li et al., 2015). Most of members belonging to the Firmicutes phylum are syntrophic bacteria that can degrade various VFAs, which were often detected in both activated sludge systems and anaerobic digesters (Li et al., 2013).

The OTU 1 corresponding to the class of Thermodesulfobiaceae (Firmicutes) was the most abundant in the different digesters D1, D2, DA and DB, with relative abundances of 0.81%, 0.75%, 0.67% and 0.75%, respectively. Firmicutes are well-known fermenters and syntrophic bacteria that can degrade various substrates (Garcia et al., 2011). On the other hand, OTU 2 (Cloacimonetes; 0.72%, 0.79%, 0.52% and 0.67%, respectively) and OTU 3 (Bacteroidetes; 0.63%, 0.68%, 0.63% 0.67%, respectively) were the most abundant into the four digesters. These results were in accordance with the characterization of microbial community structure during continuous anaerobic digestion of straw and cow manure. Firmicutes, Bacteroidetes and Cloacimonetes were identified as the three most dominant phyla within the bacterial community (Sun et al., 2015). It was reported that in the domain bacteria, the phyla of the Proteobacteria (9.52–13.50 % of the identified 16S rRNA gene fragments), Bacteroidetes (7.18–10.65 %) and Firmicutes (7.53–9.46 %) were dominant in sludge from full-scale anaerobic digesters operated in municipal wastewater treatment plants (Yang et al., 2014).

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The domain Archaea was represented by only one phylum. Among 984 OTUs, 31 OTUs were assigned the Euryarchaeota. Sequences from Euryarchaeota accounted for 0.7%, 1.3%, 4.5, 3.5%, 8.5% and 5.1% in FS, PS, D1, D2, DA and DB, respectively. The considerable abundance of Archaea (8.5% in digester A) was slightly higher than those of previous studies (Gao et al., 2016; Li et al., 2013; Yang et al., 2014). These methanogens were classified into four well-established orders: Methanobacteriales, Methanomicrobiales, Methanosarcinales, and Thermoplasmatales. At the family level, the Archeal OTUs could be classified into 7 different families that were detected present in the anaerobic digesters: Methanomicrobiaceae, Methanospirillaceae, Methanocorpusculaceae, Methanoregulaceae, Methanosaetaceae, Methanosarcinaceae, and Thermoplasmatales Incertae Sedis. The family of Methanomicrobiaceae represented by the OTU 42 (0.56%, 0.45%, 0.19%, 0.35%; D1, D2, DA and DB, respectively) and Methanospirillaceae represented by OTU 68 (0.36%, 0.41%, 0.43%, 0.43%; D1, D2, DA and DB, respectively) were more abundant into digester 1 compared to the others. In previous study on dissecting microbial community structure and methane-producing pathways, Methanobacteriales, Methanococcales, Methanomicrobiales, Methanosarcinales, and Methanopyrales were revealed present in a full-scale anaerobic reactor digesting activated sludge from wastewater treatment (Gao et al., 2016). OTU 21 and OTU 26 were the most abundant OTUs and were affiliated to the Methanomicrobia that was the most abundant class of the Archaea in the four anaerobic digester. With respect to the archaeal community residing in mesophilic anaerobic digester running on animal manure as the co-substrate, four studies have been reported and revealed the predominance of the order Methanomicrobiales (Krause et al., 2008; Kröber et al., 2009; Wirth et al., 2012; Zakrzewski et al., 2012).

The abundance of Archaea (mcrA gene quantification) ranged from 2.18.105 to 1.47.107 copies.g-1 of sludge. The number of gene copies of Archaea is much higher in the anaerobic digesters as compared to PS and FS (Figure IV. 4). However, the higher Archaeal abundances was found in digester B. It is also observed that the abundance of Archaea at the surface of the four digesters is greater than that at the bottom (vice versa for Digester B). The study of abundance of mcrA gene using a real-time qPCR method revealed that the methanogen concentration ranged from 105 to 106 copies.µl-1 during anaerobic digestion of municipal solid waste and waste-water sludge (Traversi et al., 2012).

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The abundance of sulfate reducing microorganisms (dsrB gene quantification) ranged from 4.78.103 to 9.58.104 copies. g-1 of sludge. These results were similar to the average number of dsrA gene copies in biofilm samples from full-scale municipal wastewater treatment plants using moving bed biofilm anaerobic reactor (Biswas et al., 2014). As for the Archaea, the sulfate reducing abundance was more important at the surface of each digester

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Chapitre IV compared to the bottom (Figure IV. 4). It was reported that Desulfovibrio sp. were present in anaerobic biofilm. Their development could reflect a competitive advantage due to their putatively higher affinity for sulfate compared with Desulfobulbus and Desulfobacter (Laanbroek et al., 1984) and their ability to survive under oxic conditions (Marschall et al., 1993). This may explain the large amount of dsrB gene copies (1.92.107) detected in the primary sludge compared to the other samples.

2.4.3. Diversity of sulfate reducing prokaryotes OTUs

In order to understand the role that these microorganisms play in relation to the production of sulfides in the anaerobic digesters of domestic wastewater sludge, their diversity has been studied. The OTUs that have been identified and classified are presented in a heatmap based on their abundance in the four digesters (Figure IV. 5). The analysis of the relative abundance of sulfate reducing prokaryotes into the four anaerobic digesters showed that Desulfobacteraceae, Desulfobulbaceae, Desulfovibrionaceae, Desulfurellaceae, Syntrophaceae and Syntrophobacteraceae were the different sulfate reducing families present. These results were in accordance with results from the clone libraries data of dsrAB genes that revealed that the dominant genera among the biofilms from moving bed biofilm reactor wastewater treatment plants were Desulfomonile (Syntrophaceae), Desulfomicrobium (Desulfomicrobiaceae), Desulfococcus (Desulfobacteraceae), Desulfobulbus (Desulfobulbaceae), and Desulforhopalus (Desulfobulbaceae) (Biswas et al., 2014). The global profile of the relative abundances of the different OTUs of the sulfate reducing prokaryotes shown on the heatmap indicates that the digester 1 is far different from the others digesters. The Syntrophaceae family (represented by OUT 176, OTU55, OUT 711, OTU 1051, OUT 30, OUT 103, OUT 244 and OTU688) was the most abundant in particular in digester 2, B and A. The OTU 30 was the most abundant in digester A, B (0.53% and 0.50%; respectively) followed by the OTU 55 that was the most abundant in digester 2 compared to the others digester B, A and 1 (0.50%, 0.23%, 0.39% and 0,31%; respectively). However, the digester 1 was dominated by the Syntrophobacteraceae family represented by OTU 283, followed by OTU 55 (0.34%, 0.31%; respectively). Sulfate-removal from wastewaters can be performed by means of anaerobic bioreactors, which contain Syntrophaceae and Desulfovibrionaceae (Dar et al., 2007, 2008). In contrast, a previous 16S rRNA gene pyrosequencing data of putative SRB identified Desulforhopalus (up to 6 % of the total bacterial community), Desulfomicrobium (5 %) and Desulfobacter (up to 4 %) as dominant members of the community. The family Syntrophaceae, (genera Desulfomonile, Desulfobacca

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Chapitre IV and other, non-SRB organisms) was absent from the 16S rRNA gene dataset, which reaffirms the importance of dsrAB gene-based analyses to characterize SRB communities (Biswas et al., 2014).

The family Desulfovibrionaceae (represented by OTU 349, OTU 1164, OTU 888) was not abundant in different digesters compared to the other families. However, The Desulfobulbaceae family (represented by OTU 264, OTU 226, OTU 882, OTU 330, OTU 587, OTU 107, OTU 897 and OTU 325) was the most abundant in digester A compared to the others. The OTU 107 (Desulfobulbaceae family) was the most abundant with following respective relative abundance: 0.28%, 0.28%, 0.34% and 0.32%; D1, D2, DA, DB. Studies on bacterial development in biofilms of aerated activated sludge or industrial wastewater using 16S rRNA gene analysis identified Desulfobulbus sp. as a dominant member of the SRB community in all stages of biofilm growth (Santegoeds et al., 1998; Schramm et al., 1999). These species were reported to grow on propionate and sulfate (Sass et al., 2002; Widdel and Pfennig, 1982) and were able to survive under oxic conditions (Dannenberg et al., 1992).

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Chapitre IV

2.4.4. Phylogenic relationship of sulfate reducing communities in anaerobic digesters with isolated sulfate reducing strains from anaerobic digesters sludge

As an alternative approach to identify active sulfate reducing populations in anaerobic digesters, a phylogenic relationship was carried out between the OTU sequences founded in anaerobic sludge into all samples by high throughput sequencing, the sulfate reducing bacteria reference sequences obtained from the SILVA database (version 128) and sequences of isolated sulfate reducing strains from anaerobic digester sludge. Enrichment on lactate and propionate as electron donors in the presence of sulfate as electron acceptors has made it possible to target three different genus of sulfate-reducing bacteria. Enrichment on lactate allowed to isolate 12 strains affiliated with the genus Desulfovibrio and 5 strain with the genus Desulfomicrobium (Figure IV. 6). However, in the presence of propionate 5 Desulfobulbus strain were isolated. Desulfobulbus strains (Prop1, Prop4, C3P4-2 and C3P4-3) were affiliated to Desulfobulbus oligotrophicus strain Prop6T (El Houari et al., 2017)that was the subject of a characterization publication of a new species within the genus Desulfobulbus. The Desulfobulbus strains were related to the OTU 882 (97.6 % of similarity to strain Prop6T) which represents Desulfobulbaceae family. The Desulfobulbaceae OTUs were assigned as follow: OTU 264 and OTU 226 were most related to Desulfobulbus rhabdoformis M16T (98.4 % of similarity each); OTU 587, OTU 882 & OTU 330 closely related to Desulfobulbus elongatus FPT (98.7, 98.7, and 98.9 of % similarity, respectively). OTU 897, 107 and 325 were related to Desulfobulbus propionicus 1pr3T (100, 97.8, 97 % of similarity; respectively).

The 13 Desulfovibrio strains were affiliated to Desulfovibrionaceae family. One of these strains (DZ1) was affiliated to Desulfovibrio aminophilus strain ALA-3T and was most related to the OTU 349 (99.3 % of similarity); three strains PBS3, PBS4 and PBS5 were affiliated to Desulfovibrio oxamicus strain Montecillo 2T; and the last 9 strains was affiliated to Desulfovibrio vulgaris DP4T. The isolated Desulfomicrobium strains (Halo1, Halo4, Halo6, DB4 & DB5 were affiliated to Desulfomicrobium escambiens esc1T. However, no OTUs linked to the isolated Desulfomicrobium strains or Desulfovibrio vulgaris strains could be detected.

155

Chapitre IV

Chapitre IV It was reported that the Desulfobulbus are able to grow on propionate and sulfate (El Houari et al., 2017; Isaksen and Teske, 1996; Kremer and Hansen, 1988). However, in the absence of sulfate, they can ferment other organic acids and alcohols such as lactate, ethanol and pyruvate (Biswas et al., 2014). Although the number of sequenced clones was too low to draw solid conclusions about SRB community structure, results of in situ hybridization, DGGE, and 16S rDNA clone analysis revealed that Desulfobulbus, Desulfovibrio, and Desulfomicrobium were numerically important SRB species in this wastewater biofilm community (Ito et al., 2002). Desulfobulbus and Desulfovibrio species have been found to be the numerically important SRB in wastewater biofilms grown under oxic conditions (Ariesyady et al., 2007; Santegoeds et al., 1998) and activated sludge flocs (Manz et al., 1998; Schramm et al., 1999). The reason for the higher abundance and activity of these SRB species is due to their tolerance to O2 (Cypionka et al., 1985; Marschall et al., 1993).

The four Desulfobacteraceae OTUs were divided as follow: OTU 208 was closely related to Desulfobacter postgatei 2ac9T (99.7 % of similarity); OTU 241 was related to Desulfatibacillum alkenivorans PF2803T (97 % of similarity); OTU 717 related to Desulforegula conservatrix Mb1PaT (98.7 % of similarity) and OTU 1000 affiliated to Desulfonema magnum 4be13T (93.3 % of similarity). The only OTU related to Desulfurellaceae family was closely related to Desulfurella acetivorans A63T (100 % of similarity). Members of the Desulfobacteraceae and Desulfurellaceae are considered as key players in the carbon- and sulfur-cycling in organic carbon- and sulfate rich marine sediments (Zhang et al., 2017). Their potential in treating industrial waste and drainage has been investigated under various settings (Rabus et al., 2015). In agreement with their proposed biogeochemical role, members of the completely oxidizing Desulfobacteraceae could be demonstrated by cultivation methods to dominate the SRB communities (Gittel et al., 2008; Leloup et al., 2009).

The Syntrophobacteraceae OTUs (OTU 640, 194, 283, 458) were related respectively to Desulforhabdus amnigena strain ASRB1T (98.8 % of similarity), Syntrophobacter sulfatireducens strain TB8106T (95.8 % of similarity), Syntrophobacter pfennigii strain KoPropT (96.2 % of similarity) and Syntrophobacter fumaroxidans strain MPOBT (100 % of similarity). However, The Syntrophaceae OTUs (OTU 55, 244, 711, 1051, 176, 688, 103 and OTU 30) were most related to Syntrophus gentianae strain HQgoe1T ( 92.4, 93.1, 95, 95.9, 95.3, 93.9, 95.1, 94.7 ; % of similarity, respectively). Previous study showed the involvement 157

Chapitre IV of Syntrophobacter species in the syntrophic degradation of propionate in an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) bioreactor granules (Kovacik Jr et al., 2010). Many other studies have shown that Syntrophobacter species are key organisms for the syntrophic oxidation of propionate in biogranules (Boone and Bryant, 1980; Harmsen et al., 1998; Wallrabenstein et al., 1995).

The 16S rRNA high-throughput sequencing data, the qPCR quantification of dsrB and mcrA gene combined to the cultivation approaches in the present study revealed a high diversity of microbial communities including SRB and methanogens in the anaerobic sludge from municipal wastewater treatment plant from Marrakech, Morocco. The classification of SRB and communities based on 16S rRNA gene and functional gene was analyzed and compared according to the results of a previous study (Guo et al., 2015). Overall, the present study provided more comprehensive information regarding the SRB and Archaea community characteristics and suggested the existence of an active sulfur cycle in anaerobic sludge. In the last few years, our knowledge regarding archaeal microorganisms has increased from both an ecological standpoint (Leigh et al., 2011; Liu and Whitman, 2008). The qPCR method proposed is a useful tool for studying methanogenic populations and their influence on the biogas production rate. Our results showed the important abundance of methanogens compared to the previous study (Gao et al., 2016; Li et al., 2013; Yang et al., 2014).

1.1. Conclusion

Microbial sulfate reduction is a process of great environmental and biogeochemical importance, which is associated with different environments because of their high levels of sulfate. Microbial sulfate reduction initiates and supports the sulfur cycle and is one of the main biological processes. For these reasons, sulfate-reducing bacteria play a key role in our understanding of the biogeochemical cycles of sulfur and carbon. In global aspect, the microbial communities were dominated by Firmicutes, the Bacteroidetes, the Cloacimonetes (WWE1 candidate phylum), the Proteobacteria and the Synergistetes. The molecular and cultural approaches allowed detected the Syntrophaceae, the Desulfobulbaceae, the Desulfovibrionaceae, the Syntrophobacteraceae, the Desulfurellaceae and the Desulfobacteraceae as the main families responsible for sulfide production in anaerobic digestion of WWWP of Marrakech, Morocco. Real-time quantitative PCR of dsrA and mcrA genes was used to better understand the abundance of sulfate-reducing bacteria and active methanogenic communities compared to other microorganisms in the anaerobic digesters. A

158

Chapitre IV considerable abundance of sulfate reducing bacteria and Archea were detected in anaerobic sludge.

1.2. Funding information

This work was supported by PHC Toubkal/15/19-32545NB French-Moroccan project.

1.3. Acknowledgements

We are grateful to Campus France and the ‘Centre National de la Recherche Scientifique et Technique (CNRST) Rabat’, Morocco, for supporting the mobility of the researchers in this project. We also the Head of analysis laboratory of the municipal wastewater treatment plant (Marrakesh, Morocco) for his help in collecting sludge samples from sites.

159

Chapitre IV 1.4. Supplementary data

Microbial communities and sulfate reducing microorganisms diversity in anaerobic digesters from a wastewater treatment plant (Marrakech, Morocco)

A El Houari1-2, M Ranchou-Peyruse2, A Ranchou-Peyruse2, R Bennisse1, R Bouterfas1, Goni MS2, A Qatibi1 and R Guyoneaud2. 1Anaerobic Microbiology Team (E02B26), Sciences and Techniques Faculty, Cadi Ayyad University PO Box 549, 40 000 Marrakech, Morocco. 2Université de Pau et des Pays de l’Adour, CNRS, IPREM UMR 5254, Equipe Environnement et Microbiologie, 64013, Pau, France.

Key words: anaerobic digestion, microbial diversity, sulfate reducing bacteria, Archeae, sulfides, biogas.

Correspondence to: Rémy Guyoneaud. Tel: + 33 5 59 40 74 89 / Fax: +33 5 59 40 74 94; e-mail: [email protected]

160

Chapitre IV Table IV. S1: Treatment capacity of the wastewater treatment plant (WWTP) Marrakech. The mean flow is 90720 m3.day-1. Data are from Autonomous Board of Distribution of Water and Electricity in Marrakech (RADEEMA).

Primary Secondary Tertiary Input treatment treatment treatment SM (mg.L-1) 584 200 30 5 BOD (mg.L-1) 640 430 30 10 COD (mg.L-1) 1590 nd nd nd TNK (mg.L-1) 120 120 5 5 TP (mg.L-1) 22 22 20 10 Fecal germs (L-1) 107 107 106 2.103

SM, suspended matter ; BOD, Biological oxygen demand ; TNK , Total nitrogen Kjeldahl ; TP, total phosphorus ; COD, chemical oxygen demand.

161

Chapitre IV

Figure IV. S1: a) Comparison of flocculated sludge, primary sludge and the four anaerobic digesters microbial communities (Bacteria and Archaea) by principle coordinate analysis of the weighted UniFrac β-diversity metric. The PC1 and PC2 axes accounted for 49.68 % and 20.06 % of the variability, respectively. b) The same analysis only for the four digesters 1, 2, A and B. The PC1 and PC2 axes accounted for 41.28 % and 19.78 % of the variability, respectively.

162

Chapitre IV 1.5. References

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‐

171

Chapitre IV 2. Conclusion

Les communautés microbiennes impliquées dans la digestion anaérobie sont très diverses sur le plan phylogénétique et fonctionnel parmi les environnements modifiés tels que les réacteurs méthanogènes. Tout le long de cette étude, et afin de bien comprendre ces communautés, l’ensemble de données de séquençage haut débit ont été combinés avec des méthodes culturales. Cette utilisation de techniques complémentaires permettra l'identification du plus grand nombre de microorganismes ciblés. Ces techniques combinées permettront de mieux comprendre les interactions interspécifiques et d’améliorer le fonctionnement des digesteurs anaérobies pour exploiter pleinement leur potentiel en tant que stratégie efficace de gestion des déchets.

Les résultats obtenus par combinaison des deux approches, moléculaire et culturale, ont permis d’évaluer la diversité globale des communautés microbiennes et l’abondance des microorganismes sulfatoréducteurs impliqués dans la production des sulfures lors du processus de la production du biogaz dans la station d’épuration de la ville de Marrakech. Une abondance considérable des Archées (8,5%) a été trouvée dans les boues anaérobies. L’ordre des Methanomicrobiales était le plus dominant parmi les microorganismes méthanogènes. Les populations bactériennes les plus abondantes étaient les Firmicutes, les Bacteroidetes, les Cloacimonetes, les Proteobacteria et les Synergistetes. La distribution des communautés dans les réacteurs méthanogènes est affectée par les paramètres physicochimiques tels que la température (cas du digesteur 1) ou par la présence de conditions oxiques ou anoxiques (cas des boues floculées comparées aux digesteurs anaérobies).

La production d’H2S, qui est un obstacle majeur à l’utilisation direct du biogaz, est attribuée en majorité à l'activité des bactéries sulfato-réductrices. Les principaux microorganismes impliqués dans le processus de la sulfato-réduction (en moyenne 5% des séquences totales) dans les digesteurs anaérobies étaient représentés par les Proteobacteria appartenant aux familles des Syntrophaceae, des Desulfobulbaceae, des Desulfovibrionaceae, des Syntrophobacteraceae, des Desulfurellaceae et des Desulfobacteraceae. Des souches appartenant aux genres Desullfovibrio, Desulfomicrobium et Desulfobulbus ont été isolées, identifiées et caractérisées. Dans le chapitre V sera décrite en détail la description et la caractérisation d’une nouvelle espèce, Desulfobulbus oligotrophicus Prop6T, isolée d’un digesteur anaérobie de la station d’épuration de la ville de Marrakech et qui représente un

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Chapitre IV membre du genre du genre Desulfobulbus responsable de la production des sulfures lors de la digestion anaérobie.

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Chapitre V: Desulfobulbus oligotrophicus sp. nov., a sulfate- reducing and propionate-oxidizing bacterium isolated from a municipal anaerobic sewage sludge digester

Chapitre V

1. Préambule

Le déséquilibre du processus de la digestion anaérobie abouti généralement à l'accumulation des acides gras volatiles, y compris le propionate (Pullammanappallil et al., 2001). La dégradation du propionate en acétate est considérée comme une étape limitante dans le système de digestion anaérobie (Amani et al., 2011). En outre, sa concentration élevée (> 3000 mg/1) peut perturber le processus de fermentation (Boone and Xun, 1987). Une augmentation de la concentration du propionate a été observée avant l'échec des digesteurs anaérobies traitants le fumier des porcs, des boues municipales et de l'eau de traitement des aliments (Kaspar and Wuhrmann, 1977). Plusieurs chercheurs ont montré que l'accumulation de propionate affecte la croissance, la diversité et l'activité des méthanogènes (Barredo and Evison, 1991; Dhaked et al., 2003; Hajarnis and Ranade, 1994). Il a été rapporté que la production de méthane en conditions neutrophiles diminuait de 62 à 78% lorsque le propionate atteignait 5000 mg.l-1 (Hajarnis and Ranade, 1994). L'ampleur de l'inhibition augmente considérablement lorsque le pH diminue, ce qui indique que le propionate non dissocié est le plus toxique (Dhaked et al., 2003).

La dégradation du propionate est un problème central pour améliorer les performances d'un système de digestion anaérobie, car le propionate est un produit intermédiaire, généralement accumulé dans les digesteurs anaérobies (Ghasimi et al., 2009; Kaspar and Wuhrmann, 1977; Liu et al., 2010; Shah et al., 2009; Van Lier et al., 1996). De nombreux facteurs tels que le pH, la température, la concentration des acides gras volatils et la pression partielle d'hydrogène inhiberaient la biodégradation du propionate dans des conditions anaérobies (Dhaked et al., 2003; Kim et al., 2002; Li et al., 2012; Siegert and Banks, 2005). Les bactéries oxydantes de propionate sont des microorganismes qui jouent un rôle important dans la chaîne alimentaire anaérobie et les cycles carbonés globaux anaérobies (Chen et al., 2005; De Bok et al., 2005; Ghasimi et al., 2009).

En présence de sulfate, le propionate soutient la croissance de diverses bactéries sulfatoréductrices (BSR) (Widdel and Pfennig, 1981). Ces microorganismes incluent des espèces bactériennes anaérobies phylogénétiquement diverses appartenant notamment à la classe Deltaproteobacteria et à la famille des Peptococcaceae dans le phylum Firmicutes (Castro et al., 2000). On sait que les BSR joue souvent un rôle principal dans l'oxydation du propionate dans divers environnements anoxiques (Parkes et al., 1993; Ueki et al., 1986). Les espèces des genres Desulfobacterium , Desulfonema et Desulfacinum oxydent le propionate

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Chapitre V complètement en dioxyde de carbone, tandis que les espèces des genres Desulfobulbus, Desulforhopalus et Desulfofaba oxydent partiellement le propionate en acétate (Kuever et al., 2005). Dans la publication suivante, nous décrivons une des souches oxydatrice du propionate et sulfato-réductrice. Ces souches appartenant au genre Desulfobulbus (C3P4-2, C3P4-3, Prop1, Prop4 et Prop6T), ont été isolées par culture d'enrichissement, sur propionate en tant que donneur d'électrons et sulfates comme accepteurs d’électrons. Ces souches proviennent de la boue d’un digesteur anaérobie municipal de la station d’épuration de la ville de Marrakech au Maroc. Dans le chapitre précédant nous avons vu que les Desulfobulbus trouvés aussi bien par méthode moléculaire ou culturale pouvaient représenter une part significative des sulfatoréducteurs dans ces digesteurs.

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Chapitre V

2. Desulfobulbus oligotrophicus sp. nov., a sulfate-reducing and propionate- oxidizing bacterium isolated from a municipal anaerobic sewage sludge digester

Ce travail est présenté sous la forme d’un article scientifique publié dans le journal «International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology » sous le titre :

Desulfobulbus oligotrophicus sp. nov., a sulfate-reducing and propionate-oxidizing bacterium isolated from a municipal anaerobic sewage sludge digester

Abdelaziz El Houari,1-2† Magali Ranchou-Peyruse,2† Anthony Ranchou-Peyruse,2 Adrien Dakdaki,2 Marion Guignard,2 Lahcen Idouhammou,1 Rhizlane Bennisse,1 Radia Bouterfass,1 Rémy Guyoneaud2 and Abdel-Illah Qatibi1,*

1Anaerobic Microbiology Team (E02B26), Sciences and Techniques Faculty, Cadi Ayyad University PO Box 549, 40 000 Marrakech, Morocco;

2Université de Pau et des Pays de l’Adour, CNRS, IPREM UMR 5254, Equipe Environnement et Microbiologie, 64013 Pau, France.

†These authors contributed equally to this work.

*Correspondence: Abdel-Illah Qatibi, [email protected] or [email protected]

Keywords: Desulfobulbus; sludge digester; sulfate reduction; disproportionation of sulfite.

The GenBank/EMBL/DDBJ accession number for the 16S rRNA gene sequence of Desulfobulbus oligotrophicus strain Prop6T is KU845305.

One supplementary table are available in the end of this chapter.

Modified from: El Houari, A., Ranchou-Peyruse, M., Ranchou-Peyruse, A., Dakdaki, A., Guignard, M., Idouhammou, L., Bennisse, R., Bouterfass, R., Guyoneaud, R., Qatibi, A.-I., 2017. Desulfobulbus oligotrophicus sp. nov., a sulfate-reducing and propionate-oxidizing bacterium isolated from a municipal anaerobic sewage sludge digester. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 67, 275–281.

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Chapitre V

2.1. Abstract

A novel, mesophilic, strictly anaerobic, sulfate-reducing and propionate-oxidizing bacterium, strain Prop6T, was enriched and isolated from a municipal anaerobic sewage sludge digester. Cells were Gram-stain-negative, catalase-positive, oval rods, motile by means of amphitrichous flagella, non-spore-forming and contained menaquinone MK-5(H2) as the major respiratory quinone. The genomic DNA G+C content was 51.7 mol%. The optimal NaCl concentration, temperature and pH were 2–5 g.L-1, 35 °C and pH 7.6, respectively. Strain Prop6T could only oxidize propionate, lactate and pyruvate (weakly) with sulfate, sulfite or thiosulfate, mainly to acetate. Strain Prop6T fermented pyruvate and lactate to acetate and propionate. The predominant cellular fatty acids were C14: 0, C16: 0, C16: 1ω7, C16:

1ω5, C17: 1ω6 and C18: 1ω7. Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences revealed that the newly isolated strain was a member of the genus Desulfobulbus, with Desulfobulbus elongatus DSM 2908T, Desulfobulbus propionicus DSM 2032T and Desulfobulbus rhabdoformis DSM 8777T as closest relatives among species with validly published names. On the basis of genotypic, phenotypic and chemotaxonomic characteristics, it is proposed that the isolate represents a novel species, Desulfobulbus oligotrophicus sp. nov. The type strain is Prop6T (=DSM 103420T=JCM 31535T).

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Chapitre V

2.2. Introduction

Major intermediates of anaerobic degradation of organic matter such as acetate, propionate, butyrate and H 2 serve as the most important electron donors for sulfate-reducing bacteria (SRB) in sulfate-containing anoxic environments (Bertrand et al., 2015 and references therein) . The most remarkable characteristic of the SRB belonging to the genus Desulfobulbus is their ability to oxidize propionate in the presence of sulfate to acetate and to ferment pyruvate and lactate to a mixture of acetate and propionate. This genus includes seven species with validly published names: Desulfobulbus propionicus (Widdel and Pfennig, 1981), Desulfobulbus elongates (Samain et al., 1984), Desulfobulbus rhabdoformis , Desulfobulbus mediterraneus (Sass et al., 2002), Desulfobulbus japonicus (Suzuki et al., 2007), Desulfobulbus marinus , previously Desulfobulbus 3pr10 (Oren and Garrity, 2014), and Desulfobulbus alkaliphilus (Sorokin et al., 2012). Although the genus Desulfobulbus is regularly detected by cultural and/or molecular approaches in urban, industrial wastewater and mine drainage (Colleran et al., 1995; Deng et al., 2016; Fan et al., 2016; Jordaan and Bezuidenhout, 2016; Kaksonen et al., 2004; Nanninga and Gottschal, 1987; Qatibi et al., 1990; Ramos-Padrón et al., 2010), only one species, Desulfobulbus elongatus, has been isolated and described from this kind of ecosystem (Samain et al., 1984). In this study, we report on the isolation and characterization of a novel representative of the genus Desulfobulbus, strain Prop6T, isolated from a municipal mesophilic anaerobic sewage sludge digester of the wastewater treatment plant in the city of Marrakech, Morocco.

2.3. Material, methods and results

2.3.1. Sampling strategy, Cultivation and isolation

Samples of sewage sludge were collected from a digester in February 2015, using 120ml sterile serum bottles that were filled to displace air and stored at 4°C until use. Sewage sludge was transferred (10%, v/v) into a basal medium (see below) supplemented with 20mM propionate and 20mM sulfate and then incubated for 4–5 weeks at 35°C. After several transfers, repeated agar serial dilutions were realized under the same conditions, and brown colonies, approximately 0.5–1mm in diameter, were observed within 7–8 weeks of incubation in agar roll-tubes. Well-separated colonies were transferred from the highest dilutions (10−5) to liquid medium of the same composition. The purity of the strain designated Prop6 T was checked routinely by phase-contrast microscopy and by performing growth tests

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Chapitre V in basal medium containing 1% (w/v) glucose, 1% (w/v) casamino acids, 1% (w/v) peptone, 1% (w/v) yeast extract and 1% (w/v) biotrypticase. This pure strain, designated Prop6T, was characterized in detail. The basal medium used consisted of (l−1 distilled water): 0.5 g

K2HPO4, 0.5 g KH2PO4, 0.5 g NH4Cl, 0.4 g KCl, 0.05 g CaCl2.2H 2O, 0.3 g MgCl2.6H2O, 0.4 g NaCl, 1ml trace element mineral solution (Widdel and Pfennig, 1981) modified by Imhoff- Stuckle and Pfennig (Imhoff-Stuckle and Pfennig, 1983) and 1ml resazurin 0.1% (w/v). The medium was autoclaved for 20min at 121°C and then cooled at room temperature under a −1 stream of O2-free N2/CO2 (80/20, v/v). Solutions of NaHCO3 (2 g.L ) and Na2S.9H2O (0.4 g.L−1) were autoclaved separately and added to the medium at room temperature. The medium was also supplemented with 1 ml of a filter sterilized (0.22µm) vitamin solution (Balch et al., 1979). The pH was adjusted to pH 7.3 with 10 M KOH (sterile and anoxic). Aliquots of

4.5ml of medium were dispensed into Hungate tubes under a stream of N2/CO2, sealed with butyl rubber stoppers and subsequently autoclaved. For solid agar roll-tubes (Hungate, 1969), 2% (w/v) agar (Difco) was added to the medium.

2.3.2. Morphology

Cellular characteristics of strain Prop6T (shape, size, mobility, sporulation, Gram staining) and flagella examination were observed by phase-contrast microscopy (Olympus BX 60) and transmission electron microscopy (HITACHI H7650; Electronic microscopy center of Bordeaux Imaging Centre, BIC, France) after negative staining (1%,w/v, neutralized phosphotungstic acid), respectively. Cells of strain Prop6T were motile by means of amphitrichous flagella (Figure V. 1) and oval rods (with rounded ends), approximately 0.9– 1µm in diameter and 1.6–2.2µm in length, usually occurring either singly or in pairs. Cells were Gram-stain-negative, oxidase-positive and catalase-positive. These three tests were performed as described by Smibert and Krieg (1981) using Escherichia coli CIP 54125, Pseudomonas aeruginosa CIP A22 and Enterococcus faecium CIP 5855 as references. Phase- contrast microscopy observations subsequent to heat shock did not reveal any spores (Liebgott et al., 2008).

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Chapitre V

Figure V. 1: Transmission electron micrograph of strain Prop6T grown on 20 mM propionate and 20 mM sulfate showing amphitrichous flagella.

2.3.3. Phylogenetic analysis and G+C composition

Phylogenetic analysis was carried out as follows: DNA was extracted from strain Prop6T using the UltraClean Soil DNA Isolation kit (MoBio) according to the manufacturer’s protocol. The 16S rRNA gene was amplified with the 8F–1489R set of primers according to the method of Dias et al., (2008) and purified amplicons were sequenced by Qiagen Genomic Services (Hilden, Germany). The 16S rRNA gene sequence was aligned with reference sequences from the NCBI database, and the pairwise evolutionary distances were computed according to the Jukes and Cantor method (Jukes and Cantor, 1969) using mega 6.06 software (Tamura et al., 2013). The 16S rRNA gene sequence analyses of strain Prop6T (KU845305) revealed that the isolate belonged to the class Deltaproteobacteria and was related to representatives of the genus Desulfobulbus, belonging to the family Desulfobulbaceae (Figure V. 2). Within this genus, strain Prop6T formed a separate lineage with two distantly related species, Desulfobulbus elongatus DSM 2908T (96.8% sequence similarity) isolated from an anaerobic digester and Desulfobulbus propionicus DSM 2032T (96.4% similarity) isolated from an anoxic freshwater ditch. A second lineage was formed with Desulfobulbus

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Chapitre V alkaliphilus DSM 24258T (95.0%), Desulfobulbus rhabdoformis DS8777T (94.8%), Desulfobulbus mediterraneus DSM 13871T (94.7%), Desulfobulbus japonicus DSM 18378T (93.1%) and Desulfobulbus marinus DSM 2058T (92.5%). DNA–DNA hybridization, genomic DNA G+C content, respiratory quinones and fatty acids were analysed by the DSMZ Identification Service (Braunschweig, Germany). DNA–DNA hybridization study between strains Prop6T and Desulfobulbus elongatus DSM 2908T was performed by the method of De Ley et al., (1970) as modified by (Huss et al., 1983) using a model Cary 100 Bio UV/VIS- spectrophotometer equipped with a Peltier-thermostated 6×6 multicell changer and a temperature controller with in situ temperature probe (Varian). The results showed a 20.3– 25.9%relatedness between strain Prop6T and Desulfobulbus elongatus DSM 2908T. These values are clearly below the threshold value of 70% DNA–DNA relatedness for the definition of bacterial species by the ad hoc committee (Wayne et al., 1987), indicating that strain Prop6T represents a novel species within the genus Desulfobulbus . The genomic DNA G+C content of strain Prop6T, determined using the HPLC technique (Mesbah et al., 1989), was 51.7mol%, which is within the range reported for species of the genus Desulfobulbus (50.6– 59.9mol%).

2.3.4. Cellular fatty acids and quinones

The only quinone found in strain Prop6T was menaquinone MK-5(H2), which has previously been reported to be the predominant quinone in species of the genus Desulfobulbus (Table V. 1). The following fatty acids were found to be predominant (>1%) in cells of strain T Prop6 grown on 20mM lactate and 20mM sulfate in basal medium at 35°C: C 14:0 (8.7%),

C 15:0 (2.2%), C16:0 (17.0%), C18:0 (1.2%), C16:1ω7 (7.2%), C 16:1ω5 (9.9%), C17:1ω6 (9.0%) and C18:1ω7 (41.9%). This fatty acid pattern is similar to those of the type strains Desulfobulbus elongatus DSM 2908T (grown on 20mM lactate and 20mM sulfate in the same basal medium at 35°C in this study),Desulfobulbus propionicus DSM 2032T and Desulfobulbus rhabdoformis DSM 8777T (Table V. 2), but strain Prop6T exhibited much highest percentages of C16:0 and C18:1ω7.

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Chapitre V

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Chapitre V

Table V. 1: Main characteristics of strain Prop6T and the most closely related type strains of species of the genus Desulfobulbus. Strains: 1, Desulfobulbus oligotrophicus sp. nov. Prop6T (present study); 2, Desulfobulbus elongatus DSM 2908T (Samain et al., 1984); 3, Desulfobulbus propionicus DSM 2032T (Widdel and Pfennig, 1982); 4, Desulfobulbus rhabdoformis DSM 8777T (Kuever et al., 2005; Lien et al., 1998). na, Data not available; +, positive; −, negative; (+), weakly positive. All strains have MK-5(H2) as the dominant respiratory lipoquinone.

Characteristic 1 2 3 4 Origin Anaerobic municipal sewage Anaerobic industrial Anoxic freshwater ditch Water–oil separation sludge digester system Morphology Oval rods Rod-shaped Lemon-shaped Rod-shaped Motility + + − − (amphitrichous flagella) (single polar flagellum) Cell length (µm) 1.6–2.2 1.5–2.5 1.8–2 1.7–3.5 Cell diameter (µm) 0.9–1 0.5–0.7 1–1.3 0.6–1 DNA G+C content (mol%) 51.7 59 59.9 50.6 Temperature range (°C) 20–37 20–40 10–43 10–40 (optimum) (35) (35) (39) (31) pH range 6.5–8.5 6.0–7.8 6.0–8.6 (6.8–7.2) (optimum) (7.6) (7.0) (7.2) NaCl range (g l−1) 0–18 na na 15–20 (optimum) (2–5) Electron donors H2+CO2+acetate − + + + Lactate + + + + Propionate + + + + Pyruvate (+)* + + + Fumarate − − − + Malate − − − + Ethanol − + + +

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Chapitre V

Characteristic 1 2 3 4 1-Propanol − + + + Fermentation of: Lactate + + + + Propionate − na na na Pyruvate + + + + Fumarate − − − + Malate − − − + Ethanol − − + − 1-Propanol − na + na Electron acceptors Sulfate + + + + Thiosulfate + + + + Sulfite + + + + Nitrate − − + − Iron(III) − na + na Dismutation of: Sulfite + − − na Elemental sulfur − + + na p-Aminobenzoate requirement None Yes Yes None

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Chapitre V

Table V. 2. Cellular fatty acids contents (percentages) of strain Prop6T and the most closely related type strains of species of the genus Desulfobulbus. Strains: 1, Desulfobulbus oligotrophicus sp. nov. Prop6T (this study); 2, Desulfobulbus elongatus DSM 2908T (grown on 20mM lactate and 20mM sulfate in the same basal medium at 35°C in this study); 3, Desulfobulbus propionicus DSM 2032T (Sass et al., 2002); 4, Desulfobulbus rhabdoformis DSM 8777T (Lien et al., 1998). Fatty acids amounting to less than 1% of the total fatty acids are not shown.

Fatty acid 1 2 3 4 Straight chain C14:0 8.7 4.4 10.2 9.4 C15:0 2.2 17.9 7.7 13.9 C16:0 17.0 3.3 4.9 C18:0 1.2 Unsaturated straight chain C15:1ω6 2.0 2.3 C16:1ω7 7.2 10.0 7.9 C16:1ω5 9.9 9.1 24.4 4.4 C17:1ω6 9.0 45.5 23.7 24.1 C18:1ω5 1.2 C18:1ω7 41.9 7.0 14.5 24.5

2.3.5. Physiology

All physiological and metabolic tests were performed in triplicate at 35°C (except for temperature experiments). Unless otherwise indicated, positive growth was determined by monitoring changes in OD600 using a spectrophotometer (Spectronic Instruments Spectronic 401). The dissolved sulfide that was produced was quantified photometrically as described by Cord-Ruwisch (1985). All results were compared with negative controls. Optimal growth conditions were determined in basal medium containing 10mM lactate and 20mM sulfate. Temperatures were tested from 12 to 60°C. The salinity requirement was tested from 0 to 40 −1 g.L using 5 M NaCl and 0.2 M MgCl2.6H2O solutions. The optimum growth temperature was estimated to be 35°C. No growth was observed at temperatures above 37°C or below 20°C. Strain Prop6T grew within a pH range of 6.5 to 8.5, with optimum growth occurring at pH 7.6. When tested at various added salinity concentrations in basal medium, growth was observed from 0 to 15 g NaCl L−1, with optimum growth occurring at 2–5 g.L−1. The reduction of different terminal electron acceptors (TEAs) was performed in basal medium with 10mM propionate supplied with sulfate (20mM), sulfite (10mM), thiosulfate (20mM), elemental sulfur (2%; w/v), nitrate (20mM), nitrite (5mM), fumarate (10mM), dimethyl sulfoxide 186

Chapitre V

(10mM) or iron(III) citrate (10mM). Positive growth was only observed with sulfate, sulfite and thiosulfate associated with sulfide production.

Tests of growth by disproportionation of thiosulfate (20mM), sulfite (10mM) or sulfur (2%, w/v) were performed in basal medium with 10mM acetate as a carbon source (Bak and Pfennig, 1987). The amounts of sulfate consumed and sulfide produced and changes in optical density at 600nm compared with negative controls were used to determine positive growth.

Thiosulfate and sulfite were also checked separately with 0.1 M I2 solution in 10% acetic acid, and sulfite was separated from thiosulfate using 35% formaldehyde (Rodier et al., 1996). After the addition of BaCl2 to acidified samples, sulfate was determined from the turbidity of vortexed

BaSO4 precipitations following the AFNOR NF T90-040 recommendations. Only sulfite (9.6mM) was disproportionated to sulfate (6.5mM) and sulfide (3mM) by the isolate with −1 OD600=0.12and µ max=0.01 h . These observations strongly suggest the following dismutation 2− + 2− − −1 equation: 4 SO3 +H →3 SO4 +1 SH (ΔG=−10.1 kcal sulfite mol ); calculated using data from (Thauer et al., 1977), as previously shown for Desulfovibrio sulfodismutans (Bak and Pfennig, 1987) and Desulfocapsa thiozymogenes (Janssen et al., 1996). These results suggest that Prop6T could grow by inorganic fermentation as the mode of energy conservation and that the process was not a purely chemical disproportionation even though the final pH value measured (pH=8.6) in the medium was above pH7 (Belkin et al., 1985). At this point, it is interesting to note that among the members of the genus Desulfobulbus , only Desulfobulbus propionicus DSM 2032T (Lovley and Phillips, 1994) and Desulfobulbus elongatus DSM 2908T (Janssen et al., 1996) exhibited sulfur disproportionation to small concentrations of sulfide and sulfate, even though growth under these conditions was very slow.

Substrate utilization tests were performed in triplicate using exponentially growing cells harvested and resuspended in basal medium supplemented with 20mM sulfate. Growth was obtained with addition of sterile and anoxic substrate solutions of lactate (10mM), propionate (10mM) and pyruvate (10mM). Substrates tested but not utilized are shown in the species description. The substrates were tested at 5 or 10mM, except thioacetamide (2mM), H2/CO2

(80/20, v/v; 1bar) and H2/CO2/ (80:20, v/v; 1bar) in the presence of 1mM acetate. The ability to ferment organic compounds was shown with lactate and pyruvate. The Stickland reaction was examined using pairs of amino acids at 10mM, with the first one acting as an electron donor and the second as an electron acceptor: alanine/glycine, alanine/aspartate, glycine/aspartate, glycine/serine, leucine/aspartate, leucine/glycine, valine/aspartate and valine/glycine. When necessary, lactate, pyruvate, propionate and acetate were analysed by HPLC using a Symmetry 187

Chapitre V

C18 reversed-phase column (4.66150mm, ODS2, 5mm particle size), with 0.005 M sulfuric acid as an eluent (elution rate of 0.6 ml min−1) and at an operating temperature of 50°C. A UV detector (Knauer) set at 210nm was used.

The isolate used a very limited number of carbon substrates (Table V. 1), and vitamins or yeast extract were not required for growth after three consecutive transfers in medium lacking these compounds. Only propionate, lactate and pyruvate were used as electron donors and carbon sources with sulfate, sulfite or thiosulfate as TEAs. Good growth rates, of between 0.012 and 0.024 h−1, were only obtained with propionate and lactate as electron donors and with sulfate, sulfite or thiosulfate as TEAs (Table V. S1). There was a weakly positive growth with −1 pyruvate in the presence of the three TEAs (µ max about 0.07 h ), and low levels of sulfide production were detected; it is unlikely that the growth of the isolate was influenced by the sulfide concentration in the medium, since about 11–16mM sulfide could be produced with propionate without affecting the growth (Table V. S1). In contrast to strain Prop6 T, Desulfobulbus mediterraneus DSM 13871T stopped growing when only 4mM sulfide was produced in the medium (Sass et al., 2002). Propionate and lactate were oxidized to a cetate and carbon dioxide, whereas pyruvate was oxidized to acetate and propionate. When sulfate was replaced by sulfite (10mM), which is the more energetically favourable electron acceptor, more sulfide was produced (Table V. S1). In the absence of TEA, pyruvate and lactate could be fermented to acetate and propionate.

Because several facultatively anaerobic, sulfide-oxidizing bacteria were also isolated from the same site as strain Prop6T, the oxygen (air) tolerance capacity of this isolate was assessed using the method described by Chamkh et al., (2009). Strain Prop6T cultured in basal medium containing 20mM lactate in the absence of sulfate was inoculated (10%,v/v) in Hungate tubes containing 5ml basal medium with 20mM propionate and 20mM sulfate as

TEAs under several sterile mixtures of air/N2 (v/v) atmospheres (the amount of oxygen calculated in the headspaces was approximately 10, 17, 34, 42 and 80 µmol). The tubes were incubated horizontally (to increase the exchanges between the air and the culture medium) at 35°C. After inoculation, the initial sulfide concentration was approximately 0.33mM. Positive −1 growth was only observed at 10 µmol oxygen (µ max=0.018 h ; OD 600=0.14; 10.6mM sulfide) after a second transfer under the same conditions. From these preliminary tests, it can be assumed that the isolate was at least able to survive oxygen exposure. In order to investigate more fully whether oxygen served as a direct TEA by strain Prop6T, we conducted the same experiments without the addition of sulfate under 10 µmol oxygen as TEA. While it can be 188

Chapitre V assumed that strain Prop6T was able to survive the oxygen exposure, the latter could not be used as a TEA by the isolate. In contrast to strain Prop6T, Desulfobulbus mediterraneus DSM 13871T showed an ability to grow in the presence of oxygen and could even respire it (Sass et al., 2002).

Very few organic compounds (propionate, lactate and pyruvate) were used by strain Prop6T on 94 different substrates (or substrate associations) tested as carbon sources and/or electron donors. The inability to grow on alcohol (ethanol and propanol) and under chemolithoheterotrophic conditions differentiated strain Prop6T from the other species of the genus Desulfobulbus described, in particular Desulfobulbus elongatus DSM 2908T and Desulfobulbus propionicus DSM 2032T. The isolate exhibited good growth by inorganic fermentation. In contrast to Desulfobulbus elongatus DSM 2908T and Desulfobulbus propionicus DSM 2032T, which disproportionated sulfur to sulfide and sulfate, strain Prop6T only disproportionated sulfite. It is interesting to note also that strain Prop6T was motile by means of amphitrichous flagella whereas Desulfobulbus elongatus DSM 2908T, as the closest relative among species with validly published names, uses a single polar flagellum as the mode of locomotion. Strain Prop6T is proposed as the type strain of a novel species, Desulfobulbus oligotophicus sp. nov.

2.3.6. Description of Desulfobulbus oligotrophicus sp. nov.

Desulfobulbus oligotrophicus (o.li.go.tro′phi.cus. Gr. adj. oligos little; Gr. adj. trophikos nursing, tending; N.L. masc. adj. oligotrophicus utilizing only a few growth substrates in a mineral medium).

Cells are motile by means of amphitrichous flagella and lemon-shaped oval rods (with rounded ends). Individual cells are 0.9–1µm wide and 1.6–2.2µm long, occurring either singly or in pairs. Gram-stain-negative, oxidase-positive and catalase-positive. The dominant respiratory lipoquinone is MK-5(H2). The predominant cellular fatty acids are C14:0, C15:0, C16:0,

C18:0, C16:1ω7, C16:1ω5, C17:1ω6 and C18:1ω7. Can use sulfate, sulfite and thiosulfate as terminal electron acceptors. It is strictly anaerobic, but exhibits some limited growth in the presence of sulfate under air (10 µmol oxygen) in basal medium containing propionate. Optimum growth occurs at 35°C, 2–5 g NaCl L−1 and pH 7.6. In basal medium containing acetate as a carbon source, sulfide and sulfate are formed by disproportionation of sulfite. Substrates that are oxidized by anaerobic respiration of sulfate, sulfite or thiosulfate are propionate, lactate and pyruvate (weakly). The three substrates are oxidized to mainly acetate and CO2. Lactate and pyruvate are fermented to a mixture of propionate and acetate. Unable to use cellobiose, 189

Chapitre V fructose, galactose, glucose, lactose, mannose, ribose, sucrose, acetate, benzoate, butyrate, citrate, crotonate, formate, formate/acetate, fumarate, gluconate, glycolate, malate, octanoate, palmitate, stearate, succinate, tartrate, valerate, 2,3-butanediol, 2,4-butanediol, 1-butanol, 2- butanol, ethanol, ethylene glycol, ethylene glycol/acetate, glycerol, methanol, methanol/acetate, pentanol, 1-propanol, 2-propanol, phenol, 1,2-propanediol, 1,3-propanediol, 1,4-propadiol, alanine, arginine, aspartate, glutamate, glycine, leucine, methionine, serine, thioacetamide, valine, acetone, H2/CO2, H2/CO2/acetate, yeast extract, peptone or casamino acids as a carbon source.

The type strain, Prop6T (=DSM 103420T=JCM 31535T), was isolated from a municipal mesophilic anaerobic sewage sludge digester of the wastewater treatment plant in the city of Marrakech, Morocco. The genomic DNA G+C content of strain Prop6T is 51.7mol%.

2.4. Funding information

This work was supported by PHC Toubkal/15/19-32545NB French-Moroccan project.

2.5. Acknowledgements

We are grateful to Campus France and the ‘Centre National de la Recherche Scientifique et Technique (CNRST) Rabat’, Morocco, for supporting the mobility of the researchers in this project. The authors are also grateful to the ‘Centre d’analyse et characterization (CAC)’ of Cadi Ayyad University, Marrakech, Morocco, for HPLC analysis. The microscopy was done in the Bordeaux Imaging Center, a service unit of the CNRS-INSERM and Bordeaux University, member of the national infrastructure France BioImaging. The help of Melina Petrel and Etienne Gontier is acknowledged. We also thank Mohamed Ichibane, Head of analysis laboratory of the municipal wastewater treatment plant (Marrakesh, Morocco) for his help in collecting sludge samples from sites.

190

Chapitre V

2.6. Supplementary data

Desulfobulbus oligotrophicus sp. nov., a novel sulfate-reducing and propionate-oxidizing

bacterium isolated from a municipal anaerobic sewage sludge digester

Abdelaziz El Houari, Magali Ranchou-Peyruse, Anthony Ranchou-Peyruse, Adrien Dakdaki,

Marion Guignard, Lahcen Idouhammou, Rhizlane Bennisse, Radia Bouterfas, Rémy

Guyoneaud & Abdel-Illah Qatibi.

Int J Syst Evol Microbiol

Author for correspondence: Abdel-Illah Qatibi. Anaerobic Microbiology Team (E02B26),

Sciences & Techniques Faculty, Cadi Ayyad University PO Box 549, 40 000 Marrakech,

Morocco Tel: + 212 24 43 34 04 / + 212 24 43 46 88; Fax: + 212 24 43 31 70; e-mails: [email protected] / [email protected]

191

Chapitre V

Table V. S1. Effects of electron acceptors on utilization of substrates by strain Prop6T. n.d: not detected; a: sulfide, µ: growth rate, Dt: Doubling time.

Substrates (mM)

Electron acceptor (mM) Propionate (20) Lactate (20) Pyruvate (20)

-1 -a -1 -a -1 -a  (h ) Dt (h) SH (mM) OD600  (h ) Dt (h) SH (mM) OD600  (h ) Dt (h) SH (mM) OD600

 None 0 0 n.d 0.04 0.008 86.64 n.d 0.15 0.0066 105.02 n.d 0.12 

 Sulfate (20) 0.016 43.32 15.7 0.24 0.023 30.14 13.1 0.2 0.0067 103.45 2.4 0.12 

Sulfite (10) 0.022 31.51 11.4 0.27 0.024 28.88 11.1 0.4 0.0074 93.67 3.6 0.16

 Thiosulfate (20) 0.012 57.76 15.2 0.26 0.017 40.77 9.2 0.2 0.0067 103.45 2.8 0.12 

*The inability of strain Prop6T to use pyruvate under sulfate-reducing and thiosulfate-reduction conditions more efficiently in term of biomass [G°’= -29.3 or -21.7 kcal.mol-1 pyruvate respectively; calculated using data from Thauer et al., (1977)] than under fermentative conditions (G°’= - 11.3 kcal.mol-1 pyruvate), is difficult to explain, since it has often been observed that in principle, substrates, which allow substantial free energy changes, have a tendency to promote faster and better growth than electron donors that provide less energy. It is likely that the growth of the isolate was influenced by the reaction of sulfide produced with pyruvate. In the case of D. rhabdoformis DSM 8777T, no sulfide at all was detected with pyruvate as substrate in the presence of sulfate (Lien et al., 1998); the authors put forward the assumption that the produced sulfide reacts with the 2-keto group of pyruvate.

192

Chapitre V

2.7. References

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3. Conclusion

La souche décrite dans cette publication est un membre du genre Desulfobulbus appartenant au groupe des bactéries sulfatoréductrices (BSR). Ces microorganismes produisant de l'acétate et de l’hydrogène dans des milieux anaérobies, sont souvent associés aux microorganismes méthanogènes. Trois genres sont principalement liés et retrouvés dans les digesteurs anaérobies : Desulfovibrio, Desulfotomaculum et Desulfobulbus (Ozuolmez et al., 2015). Le genre Desulfobulbus, dont Desulfobulbus oligotrophicus Prop6T fait partie, peut jouer un rôle crucial pour résoudre la problématique de dysfonctionnement lié à l’accumulation du propionate au cours du processus de la digestion anaérobie. Cependant, l’oxydation du propionate, en présence de certains composés soufrés tel que le sulfate ou le sulfite, est souvent accompagnée par une production accrue des sulfures ayant un effet inhibiteur direct dans le processus de digestion anaérobie.

Ces microorganismes sulfurogènes, qui réduisent le sulfate en sulfures, jouent un rôle important dans la digestion anaérobie des substrats complexes. McCartney and Oleszkiewicz (1991) ont constaté que les BSR : i) génèrent des sulfures qui peuvent être inhibiteurs et / ou toxiques pour les microorganismes produisant le méthane (MPM) ; ii) réduisent le taux de méthanogénèse ; et iii) diminuent la quantité de méthane produite par compétition vis-à-vis du carbone disponible et / ou de l'hydrogène disponible. Certaines études (Lovley and Klug, 1983; Oremland and Polcin, 1982; Winfrey and Zeikus, 1977) ont montré que la

197

Chapitre V méthanogénèse est inhibée si la concentration du sulfate est augmentée. En outre, Pendant le traitement anaérobie des eaux usées contenant du sulfate, la compétition entre les BSR et les MPM pour l'acétate en tant que substrat primaire commun peut affecter l’efficacité du traitement (Chen et al., 2014).

Cette inhibition s'explique de différentes façons : 1) Les bactéries sulfato-réductrices, en présence de concentrations élevées de sulfate, entrent en compétition avec les microorganismes méthanogènes pour le même substrat, l’H2, et seraient favorisées par leur taux de croissance plus élevé (Ozuolmez et al., 2015). 2) La présence de sulfate provoque la production de sulfures. Ces derniers, à des concentrations élevées, sont toxiques pour les méthanogènes ainsi que pour les autres microorganismes (Janssen et al., 2009; Pokorna and Zabranska, 2015). Bien que l'inhibition compétitive primaire puisse être surmontée dans le traitement anaérobie des eaux usées riches en sulfate, la production des sulfures permet de maintenir un faible potentiel d’oxydoréduction dans les réacteurs, ce qui rend la présence de petites quantités de sulfure avantageuse. Il a été démontré que les ions sulfures peuvent inhiber la formation de méthane, ce qui suggère une inhibition non concurrentielle de la méthanogénèse due au sulfure résultant de l'activité sulfatoréductrice, ce qui peut entraîner une rupture du processus (Paula Jr and Foresti, 2009).

Dans la station d’épuration de la ville de Marrakech sont traités les effluents des tanneries très riches en sulfate. L’activité des sulfato-réducteurs peut donc amener à une surproduction de sulfures. À des concentrations élevées de sulfures d'hydrogène dans le biogaz ; les sulfures causent de graves problèmes non seulement liées à l’inhibition du processus de la digestion anaérobie, mais corrodent aussi les installations et les équipements des usines de traitement des eaux usées (Okabe et al., 2007) et des structures en acier dans les station de biogaz (Tang et al., 2009), endommagent les tuyaux et les pompes (Burgess et al., 2001) et raccourcissent considérablement la durée de vie des moteurs à gaz des unités de cogénération.

Les méthodes chimiques et physicochimiques d’oxydation des sulfures, à savoir des méthodes de précipitation, de lavage ou d'absorption ont déjà été largement utilisées et ont été appliquées avec succès depuis longtemps. Cependant, ils sont toujours associés à des coûts d'exploitation élevés sur l'énergie et les produits chimiques et parfois avec la production de déchets qui doivent être traités. De plus, certains produits chimiques agressifs utilisés provoquent une corrosion rapide de l'équipement et des catalyseurs, des adsorbants ou des

198

Chapitre V produits chimiques épuisés doivent être périodiquement régénérés ou remplacés (Henshaw and Zhu, 2001). Les méthodes biologiques sont moins coûteuses, ne nécessitent pas de produits chimiques excédentaires et ne provoquent pas de pollution environnementale secondaire (Sublette and Sylvester, 1987). Il suffit de laver le sulfure d'hydrogène gazeux du biogaz à l'eau, le mettre en contact avec une culture de bactéries sulfooxydantes et assurer leur demande de nutriments. Les produits finaux de la biooxydation des sulfures ne sont pas dangereux ; le soufre élémentaire peut être éliminé complètement du système en raison de sa faible solubilité dans l'eau et utilisé comme engrais (Beristain Cardoso et al., 2008).

Un intérêt croissant pour une l'application de procédés‐ biologiques d'élimination des sulfures a entraîné une augmentation de la recherche de bactéries sulfooxydantes et de leur application technologique. Le prochain chapitre évaluera l'écologie des microorganismes sulfo-oxydants présent dans les boues anaérobies, floculées et primaires de la station d’épuration de la ville de Marrakech, et la possibilité d'une utilisation technologique de leurs propriétés prometteuses pour l’oxydation in situ ou ex situ des sulfures.

199

Chapitre VI: Microbial diversity of Sulfur-Oxidizing Prokaryotes in anaerobic digesters and Thiopaq bioreactor from a wastewater treatment plant (Marrakech, Morocco)

Chapitre VI

1. Préambule

La sulfato-réduction est considérée comme un inconvénient dans le traitement des eaux usées par voie anaérobie pour différentes raisons ; (1) à faibles concentrations, l’H2S cause des problèmes d'odeurs nauséabondes, (2) à des concentrations élevées, l’H2S peut être toxique pour les microorganismes anaérobies et notamment les méthanogènes, (3) les sulfures produits peuvent entraîner des problèmes de corrosion au niveau du stockage et de l’utilisation du biogaz. Selon la charge en sulfate et le pH dans un réacteur anaérobie, les concentrations d’H2S dans le biogaz peuvent atteindre les 2 à 3% (v / v) (Janssen et al., 2009). À des concentrations supérieures à 500 ppmv, la plupart des moteurs de cogénération d’électricité à partir du biogaz sont confrontés à de graves problèmes de corrosion, d'acidification de l'huile du moteur, tandis que le dioxyde de soufre (SO2) produit par combustion de l’H2S est responsable de la formation de pluies acides.

Au cours des deux dernières décennies, un certain nombre de technologies environnementales nouvelles et innovantes ont été mises au point, reposant sur l’utilisation des connaissances du cycle biologique du soufre. L'application industrielle du cycle biologique du soufre pour l'élimination d’H2S du biogaz a été précédemment décrite (Janssen et al., 1999, 2009). Dans la plupart des pays, une étape d'élimination du H2S est nécessaire avant toute combustion ou incinération du biogaz. Cette élimination est possible à la station de traitement des eaux usées de Marrakech par l’application de la technologie Thiopaq® Process (Paques, Pays-bas) pour la désulfuration du biogaz. Toutefois, des coûts d'exploitation élevés sont cependant associés à cette technologie, liés à la grande consommation d’énergie et au lavage caustique (solubilisation du H2S) car la majorité de la soude caustique réagit avec le CO2 présent dans le biogaz (Pokorna and Zabranska, 2015).

Récemment, un intérêt croissant pour l'application de méthodes biologiques d'élimination des sulfures a conduit à une augmentation des recherches sur les bactéries sulfo- oxydantes et leur application technologique. Dans ce contexte, ce chapitre se concentrera sur l'écologie de ce groupe de microorganismes à travers de l’étude de la diversité et l'abondance (en utilisant des approches moléculaires et des approches à base de culture) des communautés microbiennes sulfooxydantes trouvées dans le processus de production de biogaz dans la STEP de Marrakech. Les perspectives d'utilisation technologique de leurs propriétés prometteuses, et de leur exploitation pour la désulfurisation du biogaz seront également discutées.

201

Chapitre VI

2. Microbial diversity and community structure of Sulfur-Oxidizing Microorganisms in anaerobic digesters and Thiopaq bioreactor from a wastewater treatment plant (Marrakech, Morocco)

Ce travail est présenté sous la forme d’un article en préparation qui sera soumis pour publication sous le titre :

Microbial diversity and community structure of Sulfur-Oxidizing Microorganisms in anaerobic digesters and Thiopaq bioreactor from a wastewater treatment plant (Marrakech, Morocco)

A El Houari1-2, A Qatibi1 and R Guyoneaud2.

1Anaerobic Microbiology Team (E02B26), Sciences and Techniques Faculty, Cadi Ayyad University PO Box 549, 40 000 Marrakech, Morocco.

2Université de Pau et des Pays de l’Adour, CNRS, IPREM UMR 5254, Equipe Environnement et Microbiologie, 64013, Pau, France.

Key words: anaerobic digestion, microbial diversity, sulfur-oxidizing microorganisms, sulfides, biogas.

Correspondence to: Rémy Guyoneaud. Tel: + 33 5 59 40 74 89 / Fax: +33 5 59 40 74 94; e-mail : [email protected]

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Chapitre VI

2.1. Abstract

High-throughput metagenomics sequencing and cultural isolation of sulfur-oxidizing microorganisms have been performed on a full-scale wastewater treatment plant (Marrakech, Morocco) including anaerobic digesters and Thiopaq bioreactor. The objective was to evaluate their role in the oxidation of sulfides during anaerobic digestion and biogas desulfurization. Miseq sequencing of the V4-V5 region of the 16S rRNA gene generated 984 OTUs. They indicated that at global scale a considerable abundance of sulfur-oxidizing microorganisms was detected in the four-anaerobic digesters (5.5%), the primary sludge (9.7%), the flocculated sludge (8%) and of courses the BioOx reactor (64.5%). Proteobacteria (Alpha, Beta, Gamma and Epsilon) and Spirochaetes represented the main microorganisms involved in the sulfide biooxydation. The most abundant bacterial populations were the Comamonadaceae, Spirochaetaceae, Rhodobacteraceae, Hydrogenophilaceae and Halothiobacillaceae. Both molecular and cultural approaches gave distinct insight into the diversity of the sulfur-oxidizing bacteria in anaerobic sludge and Thiopaq bioreactor of wastewater treatment Marrakech, Morocco. The potential for sufide oxidation among the bacterial communities of WWTP of Marrakech is discussed.

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2.2. Introduction

Sulfide (H2S) is an undesirable byproduct during anaerobic digestion. It essentially originated from sulfate-reducing microorganisms that have the capacity to reduce the sulfur compounds (Barton and Fauque, 2009). Once excreted into the surroundings, liquid-phase sulfide has several effect such as inhibition of other bacterial groups, particularly syntrophic acetogenic bacteria and methanogenic microorganisms (Wiemann et al., 1998). Sulfides can also react with heavy metals, which are important components of functional enzymes, such as iron, and affect the native proteins structure through the formation of disulfide crosslinks between the polypeptide chains (Chen et al., 2010). Once in the biogas (i.e., gas-phase), it not only causes severe sensory and toxic problems, but also corrodes the concrete (Okabe et al., 2007) and steel structures in biogas plants (Zhang et al., 2008), pipes and pumps (Okabe et al., 2007). In addition, it significantly shortens the life of gas engines in cogeneration units, where it degrades the lubricating oil (Gayh et al., 2010). Finally, combustion of biogas with high concentrations of hydrogen sulfide causes problems due to excessive SOx emissions. It is thus necessary to remove hydrogen sulfide from biogas before its use for energy production (Pokorna and Zabranska, 2015).

There are many different methods to remove hydrogen sulfide from biogas. Biological, chemical and/or physico-chemical methods of precipitation, washing or absorption have been widely used and successfully applied for a long time (Nemati et al., 2001; Zhang et al., 2008). However, they are still associated with high operating costs for energy and chemicals. In addition, some aggressive chemicals (catalysts or adsorbents) cause rapid equipment corrosion that need to be periodically replaced (Henshaw and Zhu, 2001). Biological methods of sulfides oxidation using Sulfur Oxidizing Bacteria (SOB) are less expensive and do not cause secondary environmental pollution (Sublette and Sylvester, 1987). The potential for biological oxidation of sulfides is widespread in a group of diverse sulfur oxidizing microorganisms, particularly, in the Proteobacteria class. These bacteria are able to use H2S as an electron donor coupled to CO2 reduction in a chemolithoautotrophic metabolism (Janssen et al., 1999). It is evident that the adaptability of SOBs to high concentrations of hydrogen sulfide provides the potential for broad application of biological desulfurization of biogas or other gases containing hydrogen sulfide. The biological methods, alternatives to chemical processes, and their application in situ or ex situ (reactor) has been a

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Chapitre VI proof of concept or has be used on an industrial scale, respectively (Thiopaq® or Sulfothane TM) (Janssen et al., 2009; Tang et al., 2009).

Thiopaq's technology, a cost effective process of biological sulfide oxidation is applied at the wastewater treatment plant (WWTP) in Marrakech, Morocco. The process is designed with a pure strain as sulfide oxidizer but is sometimes amended with floculated sludge or sulfur produced during the biooxidation to overcome problems. The WWTP from Marrakech produces 18.000 m3/day of biogas by anaerobic digestion equivalent to a production of 30.000 KWh/day supplying 45% of energy requirements of the station. The biogas contain an average of 4000 ppm of sulfides, originating from sulfate reducing microorganisms. This study focuses on the diversity and abundance (through molecular and cultural approaches) of the sulfur oxidizing microbial communities found in anaerobic digestion and sludges in the Marrakech WWTP. The final objective is to use autochtonous populations (adapted to temperature variations for example) in the Thiopaq’s reactor instead of a commercial strain. The high throughput sequencing analysis of the V4-V5 region of the 16S rRNA gene revealed the distribution of SOB in the view of the evaluation of their role in the oxidation of sulfides. In addition, some strains belonging to the sulfur oxidizing microorganisms have been isolated and characterized in order to to evaluate their sulfo-oxidation potential.

2.3. Material and methods

3.1.1. Sampling strategy and operating conditions

All anaerobic digesters were operated at variable mesophilic temperature conditions and had each a working volume of 6400 m3. For the Thiopaq bioreactor of WWTP Marrakech, the physicochemical data are given in Table VI. 1. Sludge samples were taken from the four-biogas digesters (DA, DB, D1 and D2), the primary sludge (PS, from primary decanters), the flocculated sludge (FS, from thickeners) on July 2015. The sampling was carry out in February 2017 for the Thiopaq’s reactor (BioOx). A total, 11 different samples were collected. For sampling, bottles (120 mL sterile serum bottles) were completely filled to displace air and stored at 4°C until use for cultural methods. In Addition, six replicates were stored for each samples in cryotubes at -20°C for molecular analyses.

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Table VI. 1: Biogas quality (mean values calculated during February 2017, n= 28) and physicochemical conditions of Thiopaq bioreactor functionning in WWTP Marrakech.

Biogas quality Operating conditions of Thiopaq bioreactor

Biogas non treated Biogas treated pH Conductivity Temperature Soluble matter (g.L-1) (ms/cm²) (°C) [H2S] ppm % CH4 % O2 % CO2 [H2S] ppm % CH4 % O2 % CO2 Bioreactor Decanter

3898 70.76 0.23 31.8 249 71.31 0.21 31.11 8.60 77 25-40 148 233

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3.1.2. Extraction of genomic DNA and high throughput sequencing

Total DNA extractions were performed in triplicate using PowerSoil® DNA Isolation kit (MO BIO) following the manufacturer instructions. The DNA was stored at -20°C until use. The V4–V5 hypervariable region of the 16S rRNA gene targeting Bacteria and Archaea was amplified using the primers 515F, 5‘ – GTG YCA GCM GCC GCG GTA – 3‘ and 928R, 5‘ – CCC CGY CAA TTC MTT TRA GT – 3’ (Anderson et al., 2009; Liu and Whitman, 2008). The amplifications of the 16S rRNA gene were performed in a final volume of 50 μL with primers 515F/928R (0.2 μM), 0.2 mM dNTPs, 1.25U Taq polymerase (Amp Taq Gold 360) and its buffer. The amplification reactions are carried out according to the following program: 1 cycle of 10 min at 94 °C (denaturation); 35 cycles of 3 steps: denaturation at 94 °C, hybridization at 65 °C, and elongation 40 sec at 72 °C; final elongation cycle of 10 minutes at 72 °C. Amplification was conducted using a PCR thermal cycler Model PTC-100 (Bio-Rad, Richmond, CA). Forwards and reverse primers contained the adapter sequences (5’GTGYCAGCMGCCGCGGTA) and (3’ACTYAAAKGAATTGRCGGGG) respectively, used in Illumina sequencing technology. The amplicons were sequenced using an Illumina MiSeq (250 bp paired-end reads) at the platform Genotoul Inc. (www.genotoul.fr, Toulouse, France).

3.1.3. Processing of sequencing data from illumina Miseq and statistical analyses

Bioinformatics data treatments were performed using FROGS software developed for the Galaxy platform (Blankenberg et al., 2010; Giardine et al., 2005; Goecks et al., 2010) following the FROGS pipeline as described by de ric Escudie et al., (2017). Operational taxonomic units (OTUs) were grouped at an identity threshold of 97%. From the taxonomic affiliation, a representative sequence of each OTU affiliated was extracted. Finally, a normalization of the abundances found for each OTU was carried out by the DESeq method (Anders et al., 2012). Diversity and evenness indices were calculated using the bacterial OTU data after normalization using DESeq method. The evolutionary history was inferred using the Neighbor-Joining method (Saitou and Nei, 1987). An alignment was then carried out between OTUs, the alignment was used to build a phylogenetic tree with PhyML algorithm (Guindon et al., 2010).

The statistical calculations and multivariate analyses were conducted using R software package with the following libraries: phyloseq, vegan, heatmap2, gclus, ggplot2 and GUniFrac. A one-way analysis of variance (ANOVA) was used to compare the mean values 207

Chapitre VI with respect to sampling sites. Duncan’s multiple range tests at p = 0.05 were employed to compare the means and to group them accordingly. Pearson correlation coefficients were calculated from pairs of variables within and between process and bacterial community data. A principal component analysis (PCA) was performed to evaluate the microbial community composition of the samples.

3.1.4. Growth and isolation of Sulfur-oxidizing bacteria, phylogenetic identification

Samples were grown in enrichment cultures using basal medium (El Houari et al., 2017) supplemented with thiosulfate (20 mM) as electron donor. The enrichment was performed in anoxic and oxic conditions in presence of nitrate (10 mM) or oxygen as electron acceptors, respectively. After three transfers in enrichment, the isolation of strains was performed using repeated agar serial dilutions (Hungate, 1969). The colonies were transferred from the highest dilutions to liquid medium. The purity of the strains was checked routinely by phase-contrast microscopy and by performing growth tests in basal medium containing 1% (w/v) glucose, 1% (w/v) casamino acid, 1% (w/v) peptone, 1% (w/v) yeast extract and 1% (w/v) biotrypticase under oxic and anoxic conditions.

All genomic DNAs extraction from pure cultures were performed using a kit (UltraCleanTM Soil DNA Kit insulation MOBIO Laboratories) according to manufacturer's recommendations. The amplifications of the 16S rRNA coding gene was carried out as explained by Dias et al., (2008). Sequencing with the 8F primer of the amplicons obtained was performed (GATC Biotech - Konstanz, Germany). The evolutionary history was inferred using the Neighbor-Joining method (Saitou and Nei, 1987). Evolutionary analyses were conducted in MEGA A6 (Tamura et al., 2013). An alignment was then carried out between OTUs sequences, sulfur-oxidizing bacteria reference sequences obtained from the NCBI database and the isolated strain sequences. The alignment was used to build a phylogenetic tree with MEGA A6 software.

2.4. Results and discussion

2.4.1. Global analysis of microbial diversity in WWTP of Marrakech

A total of 1.095.879 high-quality 16S rRNA gene sequences were obtained from an Illumina MiSEQ sequencing analysis. The high-quality sequences were clustered into OTUs with 97% sequence similarity. Accordingly, bacterial richness (Chao 1 estimator) and diversity (Shannon index) estimates were calculated for each sample. A total of 984 OTUs 208

Chapitre VI with 97% similarity were identified in the 11 sludge samples. These results are in the range of those found by other studies and with the same primers (V4-V5 region) (Wu et al., 2016). Among them, 73 OTUs were affiliated to sulfur oxidizing prokaryotes. The diversity indices (Shannon indices) and species richness indices (Chao 1) indicated that the samples from digester B displayed greater richness and diversity than those from Thiopaq bioreactor (Chao et al., 2014).

The Principal Component Analysis based on the weighted UniFrac β-diversity metric (Figure VI. 1) showed that the samples are organized in three different clusters. Primary sludge and the four anaerobic digesters (closely grouped together) composed the first cluster; the BioOx reactor represents the second cluster and finally a cluster represented by the flocculated sludge. Taking into account of all the samples, the flocculated sludge samples and BioOx reactor could be separated along axis 1 explaining 35% and 65% of the difference, respectively. The different samples were placed along this axis corresponding to the anaerobiosis gradient. According to the operating conditions obtained from the WWTP of Marrakech, The anaerobic digesters are operating in anaerobic conditions. However, the BioOx reactor operate in strict aerobic and halophilic conditions. The flocculated sludge is an intermediate in which primary sludge was aerated, agitated and treated to form flocculated sludge.

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2.4.2. Microbial taxonomic analysis of sulfur oxidizing prokaryotes at the OTU level

The relative abundances of sulfide oxidizing bacterial groups in different sludge samples were analyzed at the family level (Figure VI. 2). They revealed a considerable abundance of sulfur-oxidizing microorganisms in the four-anaerobic digesters (5.5%), the primary sludge (9.7%), the flocculated sludge (8%) and the BioOx reactor (64.5%). In total, 15 different bacterial sulfur-oxidizing families were detected across all samples. Among them, the Comamonadaceae, Spirochaetaceae, Rhodobacteraceae and Hydrogenophilaceae were the most dominant families in anaerobic digesters (DA, DB, D1 and D2), FS and PS. It was reported that the soxB gene was detected in all investigated photo and chemotrophic species belonging to these families (Meyer et al., 2007).

The relative occurrence (average percentages) of the Comamonadaceae, as most abundant family, was higher in FS than PS (56.4 vs. 47.2 %), and similar for D1, D2 (39 %) and DA, DB (48 %). The Halothiobacillaceae and the Rhodobacteraceae with percentages of abundance of 88.7 and 10.9 %, respectively, were the most abundant families in the BioOx reactor; the rest of families are less abundant and had different percentages of across the samples. A comparison of the bacterial communities in the anaerobic digester showed that these results are in accordance with previous results. In general, Rhodobacteraceae, Comamonadaceae, Rhodocyclaceae, Burkholderiaceae, Xanthomonadaceae and Rhizobiaceae were detected among the most abundant families in the microbial community of the anaerobic digestion sludge from a full-scale municipal wastewater treatment plant (Gao et al., 2016; Guo et al., 2015).

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The clustering of the 30 most abundant sulfur-oxidizing OTUS is shown in a Heatmap based on their abundance in each sample (Figure VI. 3). The anaerobic digesters and primary sludge were most related and formed an only cluster next to flocculated sludge and BioOx reactor. The OTU 29 and OTU 32 affiliated to the Comamonadaceae family were most abundant in primary sludge and anaerobic digesters with average relative abundance of 0.54 % (of the total bacterial community). OTU 138, OTU 32, OTU 438, OTU 29 and OTU 397 that belonging to the Comamonadaceae family dominated the flocculated sludge (0.46, 0.34, 0.40, 0.33 and 0.28 % of relative abundance, respectively). In addition, OTU 78 that belong to the Hydrogenophillaceae were more abundant in the flocculated sludge (0.39 %) and less abundant in primary sludge and anaerobic digesters (with 0.11 and 0.29 % of relative

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Chapitre VI abundance, respectively). This findings are consistent with the results of a previous study, in sediments, that found that numerous sequences were affiliated with potential SOB (Ye et al., 2016). Overall, these results confirm the high abundance of potential SOB groups and suggest the existence of an active sulfur cycle in this area, and these sulfur cycle-related bacterial communities have considerable potential for further exploration (Sorokin, 2011; Zhang et al., 2017).

OTU 4 affiliated to Thioalkalibacter (Halothiobacillaceae) dominated the BioOx reactor with relative abundance of 17.85 % of the total community. The OTU 4 was not detected across the other samples. The genus Thioalkalibacter includes a species, Thioalkalibacter halophilus which is a sulfur oxidizing facultative alkaliphilic halophilic bacteria (Banciu et al., 2008) according to the operating conditions of BioOx reactor (Table VI. 1). OTU 19 belonging to the Rhodocyclaceae and affiliated to the Thauera genus was more dominant in primary sludge and anaerobic digesters with average relative abundance of 0.52% and 0.51%. The Rhodobacteraceae was also dominant in Thiopaq bioreactor and represented by OTU 126 (affiliated to Roseinatronobacter genus belonging to the Rhodobacteraceae), OTU 105 and OTU 491 with respective relative abundance of 12.9 %, 12.5% and 2.5%. Rhodospirillaceae (OTU 920 at relative abundance of 7.5%) and Halothiobacillaceae (OTU 1325 at relative abundance of 7.3%) were found out dominant in BioOx reactor. The Roseinatronobacter was described as heterotrophic alkaliphilic aerobic phosynthetic bacteria capable of oxidizing sulfur compounds to sulfate (Sorokin et al., 2000).

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The Rhodocyclaceae, Halothiobacillaceae and Hydrogenophilaceae which may contribute to the sulfide oxidation in wastewater treatment process (Luo et al., 2011). Concentration of hydrogen sulfide in biogas can reach very significant values ranging from 500 ppmv to 20,000 ppmv (2%) (Pokorna and Zabranska, 2015). At these concentrations, sulfides causes serious sensoric toxic problems and corrodes the structures and equipment in biogas plants (Zhang et al., 2008). The OTU 4 next to the OTU 105 and OTU 126 represent the main sulfooxydants microorganisms involved in sulfides removal (3898 to 249 [H2S] ppm in Thiopaq bioreactor) from biogas of WWTP Marrakech in Morocco.

2.4.3. Distribution of sulfur oxidizing prokaryotes OTUs and isolated strains from anaerobic digester

The microbial sulfur cycle is among the most active in several environment such as anaerobic digesters. One of the explanations for that is high-energy efficiency of dissimilatory conversions of inorganic sulfur compounds, both oxidative and reductive, sufficient to cope with costly life at double extreme conditions. Sulfate reducing bacteria drive the reductive part. The chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria (SOB) drive the oxidative part of the sulfur cycle (Barton and Fauque, 2009; Muyzer and Stams, 2008; Pokorna and Zabranska, 2015; Rabus et al., 2015). To identify active sulfur oxidizing microorganisms in anaerobic digesters, an alternative approach was investigated thought combination of molecular and cultural approaches. The phylogenic relationship was carried out between the 73 OTUs sequences of sulfur oxidizing bacteria founded into all samples by high throughput sequencing, the sequences of isolated sulfur oxidizing strains from anaerobic digester sludge and their reference sequences from Genbank database (Figure VI. 4).

The first pure strains of potential SOB, belonging to the Rhodocyclaceae, able to grow anaerobically in presence of thiosulfate as energy source and nitrate as electron acceptor were isolated from the anaerobic sludge. Strains BSO2, BSO3, BSO4, BSO5, BSO6, BSO7 and BSO12 were closely related to the type strain of type species for the Dechloromonas genera (99.3 % of similitude to Dechloromonas hortensis strain MA-1T). The only member of Rhodocyclaceae family in soxB clone library, Dechloromonas aromatica, can use acetate, Fe2+, and sulfide as electron donors (Ju et al., 2007; Sahu et al., 2009). It was reported that D. aromatica, had a probable sulfur oxidation enzyme cluster containing homologs of SoxFRCDYZAXB in which was predicted to support thiosulfate oxidation to sulfate (Salinero et al., 2009, 2011). Strains C1 and C9 isolated from anaerobic sludge (Figure VI. 4) were

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Chapitre VI represented by OUT 19 and affiliated to the Thauera genera (with 99.3 % of similitude to Thauera phenylacetica). This genera is well documented in anaerobic degradation of phenylalanine in the denitrifying bacterium Thauera phenylacetica and Thauera aromatica (Heider and Fuchs, 2015; Mechichi et al., 2002; Qiao et al., 2017) but not for their sulfide oxidation properties.

None strain belonging to the order Neisseriaceae, Comamonadaceae and Burkholderiaceae were detected by enrichment and isolation on thiosulfate as energy source. However, 19 OTUs were detected belonging to the Comamonadaceae by investigation using high throughput sequencing of 16S rRNA gene. OTU 32 and OTU 306 were affiliated to the Comamonas genera. It was reported that SoxB gene was detected in Comamonas testosteroni (Meyer et al., 2007) belonging to the Comamonadaceae family the most abundant family in anaerobic digesters, primary sludge and flocculated sludge (Figure VI. 2). Some researchers also revealed that besides common SOB, Comamonadaceae may also play a specialized role in sulfur compounds cycling (Kumar et al., 2018; Schmalenberger et al., 2008). Comamonas testosteroni is involved in thiosulfate oxidation (Pandey et al., 2009).The order of Burkholdeiales was described as involved in sulfur cycle, Burkholderia sp. strain ATSB13T, a thiosulfate-oxidizing facultative chemolithoautotrophic, was isolated from tobacco rhizosphere and has ability to serve as a potential inoculant along with elemental sulfur fertilizers (Anandham et al., 2009). An effort must be placed on this bacterial group in order to isolate representant of this well adapted sufur oxidizers. Among the Burkholderiacea (represented OTU 507, OTU 267) and Neisseriaceae (OTU 397) previous research revealed that this families possess the soxB gene (Jung et al., 2005; Masuda et al., 2010; Meyer et al., 2007; Zhang et al., 2017). It was reported that Aquaspirillum autotrophicum belonging to the 2- Neisseriaceae was capable of oxidizing S2O3 (Friedrich and Mitrenga, 1981). The Herminiimonas arsenicoxydans strain KF-1T affiliated to the Oxalobacteraceae (represented by OTU 891 and OTU 852) could be a sulfooxydant candidate (Meyer et al., 2007).

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Figure VI. 4: Evolutionary dendrogram constructed by the neighbour-joining method showing the affiliation of isolates of sulfur- oxidizing bacteria and OTUs found in the samples with their closest relatives reference sequences obtained from the NCBI database. 216 Methanosarcina spelaei MC-15T was used as outgroup to root the tree. Bootstrap values are represented at nodes. Bar, 0.05 substitutions per site. The red lozenge corresponds to the OTU sequences; the isolated strains are represented by green circles Chapitre VI

Two obligately chemolithotrophic pure strains TPI2 and TPI3 were isolated from anaerobic sludge (Figure IV. 4). TPI2 and TPI3 were affiliated to Thiobacillus genus (with 99% of similitude to Thiobacillus thioparus starkeyT), and have the ability to couple denitrification to the sulfur-compound oxidation. This characteristic is in accordance to Thiobacillus denitrificans and Thiobacillus thioparus that have the ability to couple denitrification to sulfur-compound oxidation (Beller, 2005; Beller et al., 2006; Sievert et al., 2000, 2008; Vlasceanu et al., 1997). Several studies were reported that most species of Hydrogenophilaceae and Halothiobacillaceae family are obligately chemolithoautorrophic, aerobic or facultative anaerobic SOB (Kelly and Wood, 2000; Vlasceanu et al., 1997), which are often found in wastewater treatment systems and with a high richness (Ji et al., 2009; Luo et al., 2011; Silva et al., 2010). Thioalkalibacter (represented by OTU 4), Halothiobacillus (OTU 567, OTU 728 and OTU 1325) and Thiofaba (OTU 828) were the main genera detected in Halothiobacillaceae family and present in anaerobic sludge and bioOx reactor. Thioprofondum (OTU 1013) belonging to the Thioalkalispiraceae was detected present in anaerobic sludge. OTU 567 present in the primary sludge (Figure IV. 3) could be a good candidate to replace the Thioalkalibacter in the Bioox reactor. Thioalkalispira and Thioalkalivibrio were described as lithoautotrophic and sulfur-oxidizing bacterium isolated from a soda lake (Sorokin, 2011; Sorokin et al., 2002).

The BSO13, TPI5 and TPS9 (affiliated to the Pseudomonas genus (99.2 % of similitude to Pseudomonas stutzeri) were isolated by enrichment using thiosulfate as energy source. The thiosulfate degradation process appears to be common in chemotrophic SOB such as Acidithiobacillus, Thermothiobacillus and Halothiobacillus (Kelly et al., 1997; McInerney et al., 2008; Meulenberg et al., 1993; Meyer et al., 2007; Pronk et al., 1990). In addition, some Pseudomonas, Halomonas and Thiofaba species use the formation of tetrathionate from thiosulfate as supplemental energy source (Mori et al., 2003; Sorokin, 2003). These genera were qualified as autotrophic denitrifying sulfur oxidizing that generally use various reduced sulfur compounds and produce nitrogen gas by the reduction of nitrate or nitrites. Among them, the common genera are Thiobacillus denitrificans, Thiobacillus versutus, Thiosphaera pantotropha and Pseudomonas denitrificans (Kumar et al., 2018).

Three strains TI-OX1, TI-OX4 and TI-OX5 (most related to Ancylobacter polyporphus) were isolated using thiosulfate as energy source in aerobic conditions. Ancylobacter polyporphus was described as strict aerobic strain and involved in thiosulfate

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Chapitre VI degradation. Several isolates of thiosulfate oxidizing soil bacteria were identiﬁed as Ancylobacter sp. (Stubner et al., 1998) and a recent description of a new Ancylobacter species, A. dichloromethanicus mentions growth as a facultative thiosulfate oxidizer as a trait of the species (Firsova et al., 2009).The Acetobacteraceae (OUT 660) and Rhodospirillaceae (OTU 859 and OTU 920) were detected present in anaerobic sludge. Rhodospirillum photometricum was reported as genus possessing the soxB gene. However, the Rhizobiaceae (represented by OTU 1060), the Hyphomicrobiaceae (OTU 452), Bradyrhizobiaceae (OTU 966 and OTU 723) might have acquired the soxB gene (Meyer et al., 2007).

The molecular approach by high throughput sequencing revealed 24 OTUs belonging to the Rhodobacteraceae family. Paracoccus genus was reported as the most efficient genus (genus belonging to the Rhodobacteraceae) for hydrogen sulfide removal from the biogas. Paracoccus pantotrophus isolated from a full-scale leather industry wastewater treatment plant is able to use sulfide and thiosulfate as energy sources for growth under aerobic conditions (Vikromvarasiri et al., 2015). In this study, two pure strain BSO16 and TPS10 (affiliated to Paracoccus solventivorans) were isolated and supposed as potential sulfur oxidizing bacteria that could be involved in sulfide oxidation in anaerobic sludge. The Tisserellaceae family was represented by strains C5, C6 and BSO14. These strains affiliated to Soehngenia saccharolytica were implicated in sulfur compounds degradation by using sulfite and thiosulfate as electron acceptors (Parshina et al., 2003). Finally among the Rhodobacteraceae comprises photrophic purple non sulfur bacteria (Rhodobacter, Rhodovulum, Rhodopseudomonas, Rhodocyclus) which are involved in sulfur oxidation. The majority of them can use carbon dioxide as their primary carbon source and sulfur as an electron donor (Brune, 1989; Friedrich et al., 2005). In this study we reported also that the Spirochaetaceae in anaerobic sludge, represented by OTU 356, OTU 1039, OTU 579 and OTU 847 could be sulfide oxidizers. Spirochaeta sp. strain M-6 (Dubinina et al., 2004) present a high sequence identity values of the partial SoxB sequences to those of their putative donor strains, Sulfitobacter, are indicative for recent lateral transfers (Meyer et al., 2007).

Biological removal of sulfides is based on the activities of photoautotrophic or chemolithotrophic sulfur-oxidizing bacteria. Oxygen (aerobic microbial species) or nitrates or nitrites (anoxic microbial species) can serve as acceptor of electrons during the oxidation of sulfides (Tang et al., 2009). From a technological point of view, for the biological removal of sulfides, the most appropriate are chemolithotrophic sulfur-oxidizing bacteria (Thiobacillus,

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Sulfolobus, Thermothrix, Paracoccus, Beggiatoa and Thiothrix), also known as colorless sulfur-oxidizing bacteria. They are particularly suitable for their highest rate of sulfide oxidation, modest nutritional requirements and extremely high affinity for sulfides and oxygen. These properties allow them to successfully compete with chemical oxidation of sulfides in both the natural environment and bioreactors with a limited supply of oxygen (Janssen et al., 1999, 2009). Finally, it is possible to utilize favorable properties of sulfur- oxidizing bacteria described and isolated in this paper and found out present into anaerobic sludge for external desulfurization. The final products of the biooxidation of sulfides (elementary sulfur, sulfate) are not further dangerous; elemental sulfur can be removed from the system completely due to its low solubility in water and used in industry or as a fertilizer (Beristain Cardoso et al., 2008). Sulfates can be discharged directly into surface water.

Biological‐ methods are less expensive, do not require expensive chemicals and do not cause secondary environmental pollution (Janssen et al., 2009; Pokorna and Zabranska, 2015; Tang et al., 2009). It is only necessary to wash gaseous hydrogen sulfide from the biogas to water, bring it into contact with SOB culture and assure nutrient demand (Sublette and Sylvester, 1987).

2.5. Conclusion

Sulfur oxidizing bacteria is an eco-physiological group, which possess the ability to oxidize various reduced sulfur compounds. Considering sulfur pollution, serious problems are caused mainly by sulfur in reduced form as sulfides due to their odor and toxic characteristics. Recently a growing interest in the application of biological methods of sulfide removal has led to increase in research of sulfur oxidizing bacteria and their technological application. This study has evaluated the diversity of the sulfur oxidizing bacteria found out in anaerobic sludge and in Thiopaq bioreactor of WWTP Marrakech (Morocco). The goal is to evaluate the possibility of technological utilization (data not shown) of their promising properties. The perspectives of successful exploitation of biotechnology with sulfur oxidizing bacteria are especially in environment protection. This perspective is possible through the study of the sludge from the biogas process from Marrakech WWTP. To know the organisms that are responsible for the production of sulfides (Sulfate reducing bacteria), which are troublesome in the context of biogas production (by production of sulfides), and those potentially involved in the elimination of these sulfides by oxidation (Sulfur-Oxidizing bacteria). A perspective, is to find out the operating conditions in which the sulfides produced by SRB are re-oxidized by SOB, in situ. So that the net production of sulfides into digesters was zero, and the biogas can

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Chapitre VI be used directly without any post-treatment. This way is promising but risky. It is necessary to supply oxygen (depending on the concentration it could decrease the methanogenic activity) or nitrate (it could lead to nitros oxide production). Another perspective of these microorganisms application is possible through the improvement of the performances of the Thiopaq reactor with indigenous strains (in particular chemolithotrophic sulfur-oxidizing bacteria) isolated from anaerobic sludge, which comes from the same environment and are adapted to environmental flutuating conditions. In addition this allows the minimization of the expenses related to the purchase of commercial strains used in Thiopaq biodesulfurization reactor.

2.6. Funding information

This work was supported by PHC Toubkal/15/19-32545NB French-Moroccan project.

2.7. Acknowledgements

We are grateful to Campus France and the ‘Centre National de la Recherche Scientifique et Technique (CNRST) Rabat’, Morocco, for supporting the mobility of the researchers in this project. We also thank Hicham Bensaleh and Mohamed Ichibane, Head of analysis laboratory of the municipal wastewater treatment plant (Marrakesh, Morocco) for his help in collecting sludge samples from sites.

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Chapitre VI

2.8. References

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Chapitre VI

3. Conclusion

La combinaison des approches moléculaires (séquençage haut débit) a permis d’évaluer la diversité des bactéries sulfooxydantes dans les boues anaérobies et dans le bioréacteur Thiopaq de la station d'épuration de la ville de Marrakech. Une abondance considérable de ces microorganismes a été détectée dans les digesteurs anaérobies (5,5%), les boues primaires (9,7%), les boues floculées (8%) et le réacteur Thiopaq (64,5%). Les Proteobacteria (alpha, bêta et gamma) et les spirochètes représentent les principaux microorganismes impliqués dans la biooxydation des sulfures. Les populations bactériennes les plus abondantes étaient les Comamonadaceae, les Spirochaetaceae, les Rhodobacteraceae, les Hydrogenophilaceae et les Halothiobacillaceae.

Des souches sulfooxydantes ont été isolées, identifiées et caractérisés. L’évaluation de la possibilité d'une utilisation technologique de leurs propriétés prometteuses et de leur exploitation pour une oxydation des sulfures a été explorée. Cette perspective est possible à travers l'étude des boues issues du processus de biogaz de la station d'épuration de Marrakech. Connaître les organismes responsables de la production de sulfures (bactéries sulfatoréductrices), qui sont gênants dans le contexte de la production de biogaz (par la production de sulfures ; Chapitre IV), et ceux potentiellement impliqués dans l'élimination de ces sulfures par oxydation (bactéries sulfooxydantes).

Le but final sera de déterminer les conditions opératoires pour tous les sulfures produits par les bactéries sulfatoréductrices sont ré-oxydées par les bactéries sulfooxydante, in situ, au sein même du digesteur anaérobie de tel sorte que la production nette de sulfures en digesteur est nulle, et le biogaz peut être utilisé directement sans aucun post-traitement. Une autre perspective de l'application de ces microorganismes est possible grâce à l'amélioration des performances du réacteur Thiopaq avec des souches indigènes, en particulier des bactéries chimiolithotrophes, isolées des boues anaérobies (souche appartenant au genre Thiobacillus et Paracoccus). Permettant ainsi la minimisation des dépenses liées à l'achat de souches commerciales utilisées dans le réacteur de biosulfuration Thiopaq.

229

Chapitre VII: Synthèse générale et perspectives

Les études menées durant ce doctorat visait à étudier les boues issues du procédé de méthanisation de la station d'épuration de la ville de Marrakech (Maroc). L'étude avait pour objectif de connaître les organismes à l'origine de la production des sulfures (sulfato- réducteurs), gênant dans le cadre de la production de biogaz, et ceux potentiellement impliqués dans l'élimination de ces sulfures par oxydation (sulfo-oxydants). En effet, cette production des sulfures, essentiellement liée à la réduction dissimilatrice des composés soufrés présents dans les boues par un groupe hétérogène de microorganismes procaryotes appelé bactéries sulfato-réductrices(Barton and Fauque, 2009; Muyzer and Stams, 2008; Rabus et al., 2015), est considérée comme un problème majeur empêchant toute utilisation directe du biogaz produit par digestion anaérobie, l’utilisation du biogaz générant des oxydes de soufre libérés dans l’atmosphère (Pokorna and Zabranska, 2015; Tang et al., 2009). De plus, les sulfures sont responsables de phénomènes de corrosion pour les installations des stations d’épurations tels que les unités de cogénération d’électricité. Cela implique des coûts d'exploitation élevés liés à la purification du biogaz visant à éliminer ces sulfures (Janssen et al., 2009).

La station d’épuration de la ville de Marrakech a été choisie comme site d’étude. Des échantillons de boues ont été prélevés, au niveau des quatre bioréacteurs de méthanisation (en surface et en profondeur) ainsi que au niveau des boues floculées et primaires qui alimentent ces réacteurs (Chapitre II). Des échantillons du bioréacteur Thiopaq, traitant le biogaz riche en hydrogène sulfuré par bio-désulfurisation, ont également été prélevés (Chapitre VI. Les études des échantillons ont été menées à la fois sur la base d'approches moléculaires (MiSEQ et qPCR) (Chapitre IV et Chapitre VI) et sur la base de mise en culture (isolement et caractérisation) (Chapitre III et Chapitre V). Trois principaux objectifs ont été fixés qui correspondaient au projet SULFOX (PHC Toubkal) :

(1) Caractérisation moléculaire de la diversité des organismes intervenant dans la bio- méthanisation, en particulier des sulfato-réducteurs gênant dans le cadre de la production de biogaz et sulfo-oxydants colonisant les boues de station d’épuration de la ville de Marrakech et potentiellement impliqués dans l'élimination de ces sulfures par oxydation.

(2) Isolement et caractérisation des organismes sulfato-réducteurs, sulfo-oxydants et fermentaires colonisant des boues de méthanisation.

231

(3) Évaluation des conditions optimales de la mise en place d’un biotraitement des sulfures. Cette étape se réalise à travers des études préalables en microcosmes, fermenteurs pour définir les meilleures conditions pour la mise en œuvre de ce type de traitements.

Les résultats lors des différentes études présentées dans ce manuscrit seront discutés dans ce chapitre. Nous déterminerons dans quelle mesure ces résultats ont répondu aux objectifs fixés ci-dessus. Comme tout travail de recherche, les études présentées dans ce mémoire soulèvent de nouvelles questions et la fin de ce chapitre sera consacrée aux différentes perspectives envisagées pour donner suite à ce travail.

En réponse au premier objectif, la caractérisation moléculaire de la diversité taxonomique des communautés microbiennes (Chapitre IV et VI partiellement) en utilisant des marqueurs taxonomiques (région V4-V5 de l'ADN 16S et quantification des gènes dsrA et mcrA) a permis, étant donné la quantité d'informations générée, de caractériser les communautés microbiennes de façon globale (bactéries et archées méthanogènes) et d'obtenir une image suffisamment précise sur les organismes sulfato-réducteurs et sulfo-oxydants. D’une façon globale, Le séquençage MiSEQ de la région V4-V5 du gène de l'ARNr 16S a généré 984 OTU. Les Firmicutes, les Bacteroidetes, les Cloacimonetes, les Proteobacteria et les Synergistetes étaient les populations les plus abondantes retrouvées dans les boues anaérobies. Une abondance considérable des Archées (8,5%) a été observée parmi les échantillons analysés (Digesteur A). L'abondance considérable d'Archaea était légèrement supérieure à celle des études précédentes (Gao et al., 2016; Li et al., 2013; Yang et al., 2014). Les archées sont dominées par l’ordre des Methanomicrobiales. Ces résultats sont similaire à ceux trouvés par d'autres études et avec les mêmes amorces (région V4-V5) (Narihiro and Sekiguchi, 2007; Wang et al., 2017; Wu et al., 2016). Les microorganismes méthanogènes ont été classés en sept familles différentes : les Methanomicrobiaceae, les Methanospirillaceae, les Methanocorpusculaceae, les Methanoregulaceae, les Methanosaetaceae, les Methanosarcinaceae et les Thermoplasmatales Incertae Sedis. Dans une étude précédente sur l’étude de la structure de la communauté microbienne et des voies productrices de méthane, les Methanobacteriales, les Methanococcales, les Methanomicrobiales, les Methanosarcinales et les Methanopyrales ont été révélés dans un réacteur anaérobie à grande échelle digérant les boues activées du traitement des eaux usées (Gao et al., 2016).

232

L’étude de la diversité des microorganismes sulfatoréducteurs, responsables de la production des sulfures, a montré que les principaux microorganismes impliqués dans le processus de la sulfato-réduction (en moyenne 5% des séquences totales) dans les digesteurs anaérobies étaient représentés par les Deltaproteobacteria appartenant aux familles des Syntrophaceae, des Desulfobulbaceae, des Desulfovibrionaceae, des Syntrophobacteraceae, des Desulfurellaceae et des Desulfobacteraceae. La fonction de sulfatoréduction spécifique à ces micro-organismes a été évaluée par quantification du gène dsrB. L'abondance du gène dsrB était très variable selon le digesteur, allant de 9,6.105 à 9,3.106 copies de gène par gramme de boue. Ces résultats en accordance avec des résultats obtenus par étude de l’abondance du gene dsrAB dans des biofilms des réacteurs méthanogènes d’une station de traitement des eaux usées. Cette étude a révélé que les genres dominants étaient Desulfomonile (Syntrophaceae), Desulfomicrobium (Desulfomicrobiaceae), Desulfococcus (Desulfobacteraceae), Desulfobulbus (Desulfobulbaceae) et Desulforhopalus (Desulfobulbaceae) (Biswas et al., 2014).

L’étude de la diversité des microorganismes sulfo-oxydants a été également effectué par séquençage haut débit. En ce qui concernait les sulfo-oxydants, les (alpha, bêta et gamma) et les spirochètes représentaient les principaux micro-organismes potentiellement impliqués dans la biooxydation des sulfures. Parmi les 984 OTUs trouvés par MiSEQ, 73 OTUs étaient affiliées à des procaryotes sulfooxydants. Les populations bactériennes les plus abondantes étaient les Comamonadaceae, les Spirochaetaceae, les Rhodobacteraceae, les Hydrogenophilaceae et les Halothiobacillaceae. Il a été rapporté que le gène soxB était détecté dans toutes les espèces photographiques et chimiotropes étudiées appartenant à ces familles (Meyer et al., 2007). Leur abondance était considérable dans les digesteurs anaérobies (4%, c’est à dire une abondance comparable à celle des sulfatoréducteurs), les boues primaires (4,9%), les boues floculées (6,9%). Elles représentaient 41,5% dans le réacteur Thiopaq, dominé principalement par les Halothiobacillaceae. La comparaison des communautés sulfooxydantes trouvées dans les digesteurs anaérobies a montré que ces résultats sont en accord avec des résultats des études précédentes (Gao et al., 2016; Guo et al., 2015). En général, Rhodobacteraceae, Comamonadaceae, Rhodocyclaceae, Burkholderiaceae, Xanthomonadaceae et Rhizobiaceae ont été détectés parmi les familles les plus abondantes dans la communauté microbienne des boues de digestion anaérobie d'une station d'épuration municipale à grande échelle (Gao et al., 2016; Guo et al., 2015). La distribution des communautés dans les réacteurs méthanogènes est affectée par les paramètres

233

physicochimiques tels que la température (cas du digesteur 1) ou par la présence de conditions oxiques ou anoxiques (cas des boues floculées comparées aux digesteurs anaérobies). Ces résultats ont permis d’évaluer la diversité et l’abondance des microorganismes sulfatoréducteurs et sulfooxydants impliqués dans la production des sulfures lors du processus de la production du biogaz dans la station d’épuration de la ville de Marrakech.

La tâche de mise en culture a permis de caractériser en détail certains microorganismes cultivables responsables du bon fonctionnement des méthaniseurs (fermentaires, Chapitre III), les microorganismes responsables des effets indésirables due à la production d’hydrogène sulfuré (sulfato-réducteurs, (El Houari et al., 2017)) et les microorganismes qui pourront être potentiellement les « outils biologiques » utilisés dans le cadre d'un biotraitement. Plus de 40 souches de bactéries sulfato réductrices (Desulfovibrio, Desulfomicrobium, et Desulfobulbus), sulfo-oxydantes (Thiobacillus, Pseudomonas, Paracoccus, Thaura, Ancylobacter) et fermentaires (Synergistes) ont pu être isolées. Au final, ce sont deux publications de caractérisation ont été produites à partir des résultats de ce travail de culture.

La première publication (Chapitre III) décrit une souche, Caenicola nitritreducens DZ- S4T, qui représente un nouveau genre appartenant à la famille des Synergistaceae. Ceci a permis d’étendre nos connaissances sur la biodiversité des microorganismes impliqués dans la dégradation des acides aminés dans les digesteurs anaérobie. Des nouvelles propriétés métaboliques ont été trouvées chez cette souche. Ceci suggère le rôle important que ce nouveau genre, au même titre que les autres Synergistetes, pourrait jouer dans les écosystèmes de digestion anaérobie riches en protéines. Le nouveau genre « Caenicola » était le plus dominant dans les digesteurs anaérobies de la station d’épuration de la ville de Marrakech (Analyse MiSEQ). D’autres genres faisant partie des Synergistaceae ont été également retrouvés dans les boues anaérobies de ces digesteurs (Aminiphilus, Thermovigra, Aminivibrio et Lactivibrio). En plus de la dégradation des protéines, les Synergistetes participent à l'acétogenèse et aux processus de fermentation au cours de la digestion anaérobie (Gao et al., 2016). Les produits finaux de fermentation par ce groupe de microorganismes pourraient être utilisés dans une association syntrophique avec des microorganismes méthanogènes utilisant du formiate, de l'acétate et du CO2 pour la production de méthane (Borrel et al., 2013) ou des bactéries sulfato-réductrices pouvant oxyder le propionate, l’acétate et le butyrate (Rabus et al., 2015).

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La deuxième publication (Chapitre V) décrit une souche, Desulfobulbus oligotrophicus Prop6T, qui représente un membre du genre Desulfobulbus appartenant au groupe des bactéries sulfatoréductrices. Desulfobulbus est un genre principalement lié et retrouvé dans les digesteurs anaérobies (Ozuolmez et al., 2015). Ce genre, peut jouer un rôle crucial pour résoudre la problématique de dysfonctionnement lié à l’accumulation du propionate au cours du processus de la digestion anaérobie. Cependant, l’oxydation du propionate, en présence de certains composés soufrés tel que le sulfate ou le sulfite, est souvent accompagnée par une production accrue des sulfures ayant un effet inhibiteur direct dans le processus de digestion anaérobie (McCartney and Oleszkiewicz, 1991; Pokorna and Zabranska, 2015) et gênant dans le cadre de production du biogaz (Janssen et al., 2009; Tang et al., 2009) (coûts de désulfurisation). Plusieurs chercheurs ont montré que l'accumulation de propionate affecte la croissance, la diversité et l'activité des méthanogènes (Barredo and Evison, 1991; Dhaked et al., 2003; Hajarnis and Ranade, 1994).

Des souches sulfooxydantes ont été également isolées, identifiées et caractérisés (Chapitre VI, et données non présentées). L’évaluation de la possibilité d'une utilisation technologique de leurs propriétés prometteuses et de leur exploitation pour une oxydation des sulfures a été explorée (Janssen et al., 1999). Des études préliminaires de co-culture entre des souches sulfatoréductricess (Genre Desulfobulbus et de Desulfovibrio) et des souches sulfo- oxydantes (Genre Thiobacillus) ont été réalisées en batch et en fermenteurs. Ces résultats constituent des résultats préliminaires en réponse au troisième objectif de l’évaluation des conditions optimales de la mise en place d’un biotraitement. Ceci a montré des résultats prometteurs pour une possibilité d’oxydation biologique des sulfures in situ. Ces travaux ont été menés sur la base des souches sulfatoréducteurs et sulfo-oxydantes isolées à partir des boues anaérobies (souches indigènes). Il est possible d'utiliser les propriétés favorables des bactéries sulfooxydantes décrites et isolées dans cette étude à partir dans les boues anaérobies pour la désulfuration externe. Des études ont montré que leurs propriétés permettent de concurrencer avec succès l'oxydation chimique des sulfures dans l'environnement naturel et les bioréacteurs avec un apport limité d'oxygène (Janssen et al., 1999, 2009). Les produits finaux de la biooxydation des sulfures (soufre élémentaire, sulfate) ne sont pas plus dangereux; Le soufre élémentaire peut être complètement éliminé du système en raison de sa faible solubilité dans l'eau et utilisé dans l'industrie ou comme engrais (Beristain Cardoso et al., 2008). ‐

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L'objectif in fine est de trouver les conditions opératoires (oxygène, nitrates, pH, ...) pour lesquelles tous les sulfures produits par les sulfato-réducteurs sont ré-oxydés par les sulfo-oxydants afin que la production nette de sulfures soit nulle. Dans un premiers temps, nous pourrions alors envisager de comparer les rendements de sulfo-oxydation du bioréacteur ensemencé par une souche modèle, avec un réacteur ensemencé par des sulfo-oxydants autochtones. L’utilisation de souches modèles a un coup certain. Enfin l’utilisation de sulfo- oxydants dans les méthaniseurs directement, est une solution à envisager car cela permettrait de ré-oxyder immédiatement les sulfures produits par sulfatoréduction. Ceci est possible après la détermination des conditions opératoires optimales pour que tous les sulfures produits par les bactéries sulfatoréductrices soient ré-oxydées par les bactéries sulfooxydantes, in situ, au sein même du digesteur anaérobie de tel sorte que la production nette de sulfures en digesteur soit nulle, et le biogaz puisse être utilisé directement sans aucun post-traitement. Il faudra veiller à ce que ces conditions soient viables pour la production du biogaz (méthanogénèse). Une autre perspective d'application de ces microorganismes est possible grâce à l'amélioration des performances du réacteur Thiopaq avec des souches indigènes, adaptées aux variations des conditions environnementales dans la station de Marrakech (température notamment). L’utilisation de bactéries chimiolithotrophes, isolées des boues anaérobies (souches appartenant au genre Thiobacillus et Paracoccus), permettant ainsi la minimisation des dépenses liées à l'achat de souches commerciales utilisées dans le réacteur de bio- désulfurisation Thiopaq serait envisageable

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Formations suivies (proposées par l’école doctorale)

 Cross-border UPPA/UPV-EHU doctorials : Séminaire des Doctoriales organisé à Bielle, France, du 19 au 23 octobre 2015; Compétences et aptitudes nécessaires à la réussite sur le marché actuel. Développement de compétences transversales telles que le travail d'équipe, la coopération, la gestion de projet et le leadership.

 La valorisation de la recherche : enjeux, bases et pratiques ; pourquoi et comment déposer un brevet, faites avancer votre recherche, explorez de nouvelles voies.

 Insertion professionnelle : Préparation aux entretiens d'embauche - Volet 3.

 Introduction to scientific research.

 Module logiciel R.

 Formation Zotero (I et II).

 Habilitation à la mise en service d‘autoclave.

Publication

El Houari, A., Ranchou-Peyruse, M., Ranchou-Peyruse, A., Dakdaki, A., Guignard, M., Idouhammou, L., Bennisse, R., Bouterfass, R., Guyoneaud, R. and Qatibi, A.I., (2017). Desulfobulbus oligotrophicus sp. nov., a sulfate-reducing and propionate-oxidizing bacterium isolated from a municipal anaerobic sewage sludge digester. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 67(2), pp.275-281.

Communication orales et congrès

A. El Houari, L. Idouhammou, R. Bennisse, E. Carlier, R. Guyoneaud, R. Bouterfas, M. ranchou-peyruse, A. ranchou-peyruse, M. Guignard, C. Gassie, A.I. Qatibi (2015) Elimination du sulfure d'hydrogène par des bactéries chimiolithotrophiques sulfooxydantes isolées à partir d'un digesteur de méthanisation. VIIème colloques de l'AFEM, 3-6 novembre 2015, Anglet, France.

A. El Houari, R. Guyoneaud, A.I. Qatibi (2016) Production et élimination des sulfures produits lors de la bio-méthanisation de boues de station de traitement des eaux domestiques:

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procédés biologiques de sulfo-oxydation par des bactéries sulfo-oxydantes (Projet SULFOX). 1st edition of the Scientific Days of PhD Students of the FSTG, 21-21 April 2016, Marrakech, Morocco.

A. El Houari, R. Guyoneaud, A.I. Qatibi (2016). Production and elimination of sulfides produced during bio-methanation of domestic sewage treatment plant sludge: biological processes of sulfooxidation by sulfur oxidizing bacteria. Journées de l’École Doctorale ED 211. 21-22 juin 2017. Pau, France.

A. El Houari, L. Idouhammou, R. Bennisse, E. Carlier, R. Guyoneaud, R. Bouterfas, M. ranchou-peyruse, A. ranchou-peyruse, M. Guignard, C. Gassie, A.I. Qatibi (2016) : Production and removal of the sulfides produced during the bio-Methanization of domestic wastewater treatment plant sludge: biological processes of sulfo-oxidation by sulfur oxyding bacteria (SULFOX). Doctoral School Days, 23-24 juin 2016, Pau-France. (Poster).

Valorisation

Présentation des programmes de coopération scientifique franco-marocaine : (Appel à projets de recherche, PHC Toubkal & Maghreb, UNIVERS); 1ère édition de la rencontre entre doctorants de la coopération scientifique franco-marocaine: 16 février 2016, Rabat, Maroc.

Expérience d’enseignement

 Encadrement des travaux pratiques en biologie à la faculté des sciences et techniques Marrakech.

 Enseignant des cours de soutiens en Sciences de la vie et de la terre (SVT) au coin des brillants affilié au lycée Victor Hugo Marrakech.

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Résumé : Production et élimination des sulfures produits lors de la biométhanisation de boues de station de traitement des eaux usées domestiques : procédés biologiques de sulfooxydation par des thiobacilles anaérobies facultatifs (projet SULFOX)

2- - Reconnu pour leur effet toxique, inhibiteur et corrosif, les sulfures (S , SH , SH2) sont un sous-produit indésirable de la digestion anaérobie des boues de station de traitement des eaux domestiques de la ville de Marrakech, Maroc (STEP). Ils proviennent essentiellement de la 2- 2- 2- réduction "dissimilatrice" des composés soufrés (SO4 , SO3 , S2O4 ..) contenus dans ces boues. Ce processus est réalisé par un groupe bactérien anaérobie appelé bactéries sulfato- réductrices (BSR). Une fois dans le biogaz, les sulfures sous forme gazeuse réduisent en plus la durée de vie des installations et des équipements de la STEP. Elle est ainsi dotée d’installations biologiques et physico-chimiques lui permettant d’éliminer ces sulfures avant la transformation du biogaz en énergie électrique. Cependant, ces procédés sont onéreux et grands consommateurs d’énergie. D’où l’idée de minimiser la production des sulfures au sein même des digesteurs anaérobies. Pour cela, il était nécessaire d’abord de connaître les microorganismes à l'origine de la production des sulfures (BSR), ceux potentiellement impliqués dans leur élimination (bactéries sulfo-oxydantes), et d’un groupe de microorganismes fermentaires (Synergistetes) intervenant dans le bon fonctionnement de la digestion anaérobie. Ces études ont été menées à la fois sur la base d’approches moléculaires et culturales. Les résultats obtenus, ont permis de comprendre comment ces groupes bactériens, d’intérêt écologique et économique important, interviennent dans la digestion anaérobie des boues de la STEP permettant à la fois d’accélérer les processus d’oxydation de la matière organique combinée à la réduction des composés soufrés et de minimiser la concentration des sulfures dans le biogaz. Mots clés : Sulfures, digestion anaérobie, biogaz, bactéries sulfatoréductrices, bactéries sulfooxydantes, Archées, Synergistetes, MiSEQ, isolement et caractérisation.

Abstract: Production and removal of sulfides produced during biomethanation of from domestic wastewater treatment plant sludge: biological sulfooxidation processes using facultative anaerobic thiobacilli (SULFOX project)

2- - Recognized for their toxic, inhibitory and corrosive effect, sulfides (S , SH , H2S) are an undesirable by-product of the anaerobic digestion of domestic wastewater treatment plants sludge in the city of Marrakech, Morocco (WWTP). They are produced mainly by the 2- 2- 2- dissimilatory reduction of sulfur compounds (SO4 , SO3 , S2O4 ) contained in these sludges. This process is performed by an anaerobic bacterial group called sulfate reducing bacteria (SRB). Once in the biogas, the sulfides in gaseous form shorten in addition the lifetime of the installations and equipment of the WWTP. It is thus equiped with biological and physicochemical installations allowing to eliminate these sulfides before the transformation of biogas into electrical energy. However, these processes are expensive and consume large amounts of energy. Hence the idea of minimizing the production of sulfides within anaerobic digesters. For this, it was first necessary to know the microorganisms at the origin of the production of sulfides (SRB), those potentially involved in their elimination (sulfur oxidizing bacteria), and a group of fermentative microorganisms (Synergistetes) involved in the good functioning of the anaerobic digestion. These studies were conducted by both molecular and cultural approaches. The results obtained allowed to understand how these bacterial groups, of great ecological and economic interest, are involved in the anaerobic digestion of sludge from the WWTP, which both accelerates the oxidation processes of the organic matter combined with the reduction of sulfur compounds and to minimize the concentration of sulfide in the biogas.

Key words: Sulfides, anaerobic digestion, biogas, sulfate reducing bacteria, sulfur oxidizing bacteria, Archea, Synergistetes, MiSEQ, isolation and characterisation.