Plný Text Práce
Total Page：16
File Type：pdf, Size：1020Kb
MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení funkční genomiky a proteomiky Klasické a moderní metody molekulární biologie při studiu repetitivních oblastí eukaryotického genomu Brno 2011 Roman Gogela PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych rád poděkoval své školitelce Mgr. Miloslavě Fojtové, CSc. a konzultantovi Mgr. Vratislavu Peškovi za čas, který mi ochotně věnovali a za cenné rady a připomínky, kterými přispěli k úspěšnému dokončení této práce. 2 OBSAH 1 ÚVOD ......................................................................................................................................... 5 2 REPETITIVNÍ SEKVENCE .................................................................................................... 6 2.1 OBECNÁ CHARAKTERISTIKA REPETITIVNÍCH SEKVENCÍ .................................. 6 2.2 VÝZNAM REPETITIVNÍCH SEKVENCÍ ........................................................................ 7 2.3 KLASIFIKACE REPETITIVNÍCH SEKVENCÍ ............................................................... 9 2.3.1 TANDEMOVÉ REPETICE ............................................................................................. 9 2.3.2 ROZPTÝLENÉ REPETICE ........................................................................................... 10 3 KLASICKÉ BIOFYZIKÁLNÍ METODY NA POČÁTKU POZNÁVÁNÍ REPETITIVNÍ DNA.......................................................................................................................................... 13 3.1 CENTRIFUGACE V HUSTOTNÍM GRADIENTU ........................................................ 13 3.1.1 PRINCIP A POSTUP ...................................................................................................... 13 3.1.2 VYUŢITÍ CENTRIUGACE V HUSTOTNÍM GRADIENTU PŘI OBJEVOVÁNÍ A STUDIU TANDEMOVÝCH REPETIC .................................................................. 14 3.2 ANALÝZA C0t FRAKCÍ .................................................................................................. 16 3.2.1 STRUKTURNÍ A FYZIKÁLNÍ PODSTATA RENATURACE DNA .................... 16 3.2.2 STANOVENÍ TEPLOTY TÁNÍ – HYPERCHROMNÍ EFEKT .............................. 17 3.2.3 APLIKACE RENATURAČNÍ KINETIKY PŘI STUDIU REPETIC ...................... 18 3.3 KLASICKÉ METODY VYUŢÍVAJÍCÍ NUKLEÁZY .................................................... 20 3.3.1 IZOLACE SATELITŮ ŠTĚPENÍM GENOMOVÉ DNA RESTRIKČNÍMI ENDONUKLEÁZAMI ................................................................................................... 20 3.3.2 ANALÝZA TERMINÁLNÍCH RESTRIKČNÍCH FRAGMENTŮ (TRF) ............. 20 3.3.3 EXONUKLEÁZOVÁ ANALÝZA TERMINÁLNÍCH SEKVENCÍ ENZYMEM BAL31 ........................................................................................................................... 21 4 METODY POUŢÍVANÉ OD 70. LET 20. STOLETÍ DODNES ........................................ 23 4.1 HYBRIDIZAČNÍ TECHNIKY ......................................................................................... 23 4.1.1 POČÁTKY HYBRIDIZAČNÍCH METOD ................................................................. 23 4.1.2 PRINCIP HYBRIDIZAČNÍCH METOD ..................................................................... 23 4.1.3 HYBRIDIZAČNÍ SONDY ............................................................................................. 24 4.1.4 PŘÍKLADY VYUŢITÍ HYBRIDIZAČNÍCH METOD PRO ANALÝZU REPETITIVNÍCH SEKVENCÍ ..................................................................................... 27 4.2 PCR – POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE ....................................................... 34 4.2.1 HISTORIE PCR ............................................................................................................... 34 4.2.2 PRINCIP PCR .................................................................................................................. 34 3 4.2.3 VARIANTY PCR PRO ANALÝZU REPETITIVNÍCH SEKVENCÍ ..................... 36 4.3 SEKVENOVÁNÍ............................................................................................................... 39 4.3.1 POČÁTKY SEKVENOVÁNÍ ....................................................................................... 39 4.3.2 SEKVENAČNÍ METODY NOVÉ GENERACE A JEJICH APLIKACE PŘI VÝZKUMU REPETITIVNÍCH SEKVENCÍ .............................................................. 40 5 ZÁVĚR ..................................................................................................................................... 47 6 LITERATURA......................................................................................................................... 48 4 1 ÚVOD Repetitivní sekvence jsou nedílnou součástí genomové výbavy prokaryot i eukaryot a můţeme je nalézt jak v jaderné tak i v mimojaderné DNA. Přestoţe byly dříve tyto úseky povaţovány pouze za jakousi „vycpávkovou“ či „odpadní“ a genetického hlediska nezajímavou oblast genomu, dnes jiţ víme, ţe jejich role je nenahraditelná nejen pro genom, ale v konečném důsledku i pro celou buňku a vyšší organismus. Proto je jim v současnosti vědeckou obcí věnována široká pozornost. Jiţ od konce 30. let 20. století byly (bez znalosti bliţších informací o jejich stavbě) popisovány některé typy repetitivních sekvencí a chromozomové struktury jimi tvořené. V roce 1938 byla poprvé popsána telomerová oblast na chromozomech Drosophila melanogaster (Muller, 1938) a o dva roky později také u Zea mays (McClintock, 1941). Na přelomu 40. a 50. let byl poloţen první, i kdyţ pouze teoretický, předpoklad existence transponovatelných elementů vycházející z pozorování na úrovni fenotypu (McClintock, 1951). K podrobnějšímu zkoumání repetitivních sekvencí mohlo dojít aţ s objevem struktury DNA (Watson a Crick, 1953) a rozvojem technik umoţňujících jejich detekci, cílenou izolaci, popis a srovnávání. Cílem této práce je shrnout vybrané metody vyuţívané při studiu repetitivních sekvencí. Do své práce jsem chronologicky zařadil nejdéle vyuţívané metody – klasické biofyzikální postupy centrifugace a denaturace DNA, dále pak techniky molekulární biologie zaloţené na vyuţití restrikčních enzymů a hybridizačních postupů a nakonec sekvenační protokoly, které v masivním, paralelním provedení otevírají novou dimezi genomových studií. Kromě popisu principu fungování jednotlivých technik, případně variant některých obecných postupů (PCR, hybridizace) spojených s repeticemi, budou uváděny i příklady jejich vyuţití v praxi. 5 2 REPETITIVNÍ SEKVENCE 2.1 OBECNÁ CHARAKTERISTIKA REPETITIVNÍCH SEKVENCÍ Repetitivní sekvence DNA představují významnou strukturní i funkční součást genomu všech ţivých organismů. Jsou to úseky DNA tvořené opakováním sekvenčního motivu, který se nazývá jednotka repetice. Podle toho, zda jsou jednotky dané repetice všechny stejné nebo se liší, rozeznáváme repetice dokonalé nebo degenerované. V případě potřeby se degenerované repetice zapisují pomocí konsenzuální sekvence. Například telomery Lycopersicon esculentum jsou tvořeny degenerovanou verzí typické rostlinné telomerové sekvence, od které se liší tím, ţe v G-bohatém vlakně je adenin na čtvrté pozici střídán tyminem - 5´-(TTT(A/T)GGG)-3´ (Ganal et al., 1991). Velikosti jednotek repetic se pohybují od jednotek nukleotidů (mono-, di-, tri-, a vícenukleotidové repetitivní jednotky) aţ po stovky párů bazí nebo dokonce několik kilobází, jako je tomu v případě retrotranspozonů. Repetice mohou být uspořádány v řadě za sebou (tzv. tandemové repetice), nebo se můţe jednat o sekvence, u kterých se jejich jednotky vyskytují na různých místech v genomu samostatně (tzv. rozptýlené repetice). Kromě jednosměrného uspořádání u přímých repetic, označovaného téţ jako „hlava k patě“ z anglického označení „head-to-tail“, můţeme v genomu nalézt i sekvence, které mají shodnou nukleotidovou stavbu, ale na řetězci jsou orientovány v opačném směru. Jedná se obrácené repetice a tomuto postavení se někdy také říká „hlava k hlavě“, z anglického „head to head“. Nejméně časté, ale o to zajímavější, jsou palindromatické repetice. Ty jsou tvořeny sekvencí, která má na obou řetězcích ve směru od 5´-konce ke 3´-konci stejné pořadí nukleotidů a zároveň je sama se sebou komplementární. Příkladem mohou být cílová místa některých restrikčních endonukleáz, jako je EcoRI pocházející z bakterie Escherichia coli, která štěpí sekvenci 5´-GAATTC-3´ mezi bázemi GA (Woodhead a Malcolm, 1980). Neobvykle vysoký počet palindromů se nalézá v mitochondriální DNA Lubomirskia baicalensis, zástupce skupiny Porifera. Mitochondriální genom tohoto druhu je tvořen necelými dvaceti devíti tisíci páry bazí (28 958 bp). Mezigenové oblasti představují asi 34 % a obsahují 160 různých palindromů, z nichţ 55 je unikátních a zbývajících 105 jsou repetice patřící do 8 rodin H1 aţ H8 (Lavrov, 2010). Kromě skupiny Porifera byly palindromatické repetice prokázány i v mitochondriích rostlin (Nakazono et al., 1994), kvasinek (Weiller et al., 1989) nebo řas (Boer a Gray, 1991). Obsah repetic v genomu je velmi rozdílný. U Z. mays tvoří repetitivní sekvence 77 % genetické výbavy buňky (Meyers et al., 2001), zatímco u Fugu rubripes je to jen 15 % (Aparicio et al., 2002). Zastoupení repetic v genomu se můţe značně lišit nejen mezidruhově, ale i uvnitř 6 jednoho druhu. Například u Oryza sativa tvoří repetitivní sekvence 42 % genomu poddruhu O. sativa indica a 45 % genomu poddruhu O. sativa japonica. Tento poměr nemá přímou souvislost s celkovou velikostí jejich genomů, neboť poddruh O. sativa indica má genom o přibliţně 44 Mb větší (Goff et al., 2002; Yu et al., 2002). V lidském genomu jsou