UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN FACULTAD DE BIOQUIMICA QUIMICA Y FARMACIA Ayacucho 471 - T. E. 0054 381 4107215 - FAX 0054 381 4248169 T4000CAN – San Miguel de Tucumán – República Argentina
Trabajo de Tesis Doctoral
METABOLITOS SECUNDARIOS DE PLANTAS AUTÓCTONAS DEL NOA: IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MOLÉCULAS ÚTILES EN EL CONTROL DE HONGOS TOXIGÉNICOS CAUSANTES DE PODREDUMBRES EN UVA Y CEREALES
Licenciada en Biotecnología GISSELLE RAQUEL APUD -2018-
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AUTORIDADES DEPARTAMENTO DE POSGRADO
DIRECTOR: Dr. Sergio Enrique Pasteris
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TRABAJO DE POSGRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO SUPERIOR DE DOCTORA EN BIOQUIMICA
CARRERA DE DOCTORADO EN BIOQUIMICA
Acreditado y Categorizado A ante la Comisión Nacional de Acreditación Universitaria (CONEAU) Resolución nº: 732/00
Acreditado y Categorizado A ante la Comisión Nacional de Acreditación Universitaria (CONEAU) Resolución nº: 489-CONEAU-12
DIRECTOR: Dr. Manuel Javier Aybar
COMITÉ ACADÉMICO: Dra. Aida Ben Altabef Dra. Gladis Susana Álvarez Dra. Inés del Carmen Ramos Dra. Roxana Beatriz Medina Dr. Raúl Armando Salomón
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TRABAJO DE POSGRADO TITULADO:
METABOLITOS SECUNDARIOS DE PLANTAS AUTÓCTONAS DEL NOA: IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MOLÉCULAS ÚTILES EN EL CONTROL DE HONGOS TOXIGÉNICOS CAUSANTES DE PODREDUMBRES EN UVA Y CEREALES
TESISTA: Lic. en Biotecnología GISSELLE RAQUEL APUD
DIRECTOR: Dr. DIEGO ALEJANDRO SAMPIETRO
CODIRECTOR: Dr. PEDRO ADRIÁN AREDES FERNÁNDEZ
COMISION DE SUPERVISION: Dra. NANCY ROXANA VERA Dra. LUCÍA MARGARITA MENDOZA
A mi familia
Agradecimientos
A mi Director, Dr. Diego Sampietro por sus conocimientos, sus aportes y su dedicación.
Gracias por estar pendiente de mí siempre para que pueda cumplir mi objetivo.
A mi Co-director, Dr. Pedro Aredes Fernández por acompañarme desde mis inicios y enseñarme a valorar mi esfuerzo, creer en mí y continuar a pesar de las dificultades. Gracias
Pedro por preocuparte siempre, por no dejarme bajar los brazos, por escucharme, por confiar en mí. Me siento orgullosa de poder cumplir otra meta a tu lado.
A la Dra. Marta Elena Farías porque aún tengo presente la confianza que depositó en mí para formar parte de su grupo de trabajo. Gracias por transmitirme tus valores y tus conocimientos. Te extraño! Un gran beso al cielo.
A la Dra. Nancy Vera y Dra. Lucía Mendoza, miembros de la comisión de supervisión, por brindarme sus conocimientos y los aportes necesarios para que pueda desarrollar esta Tesis.
Gracias por su bondad y su apoyo constante.
Al Dr. César Catalán por enseñarme y acompañarme en diferentes etapas experimentales de mi Tesis brindándome sus aportes y grandes conocimientos.
Al personal del Instituto de Biotecnología, Dr. Roberto Navarro, Dra. Cristina Rubio, Dra.
Cristina Maldonado, Dra. Zonnia López y Dra. María Ester Romero por permitirme realizar mi
Tesis en esta cátedra, por su amabilidad y su colaboración. A los no docentes Carlos Catania y Gustavo Álvarez por su alegría, amabilidad y respeto.
A la Dra. María Antonieta Gordillo por su excelente predisposición, cariño y amabilidad.
Gracias por resolver mis dudas y ayudarme siempre que necesité.
A Oscar Parravicini, Fernando Díaz y Luis Argañaraz de la Cátedra de Química Orgánica II, por su colaboración, su buena predisposición para ayudarme y su gran amabilidad.
Al Departamento de Posgrado de la Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, principalmente a la Lic. Marta Quinteros y Carlos Puig por su gran predisposición para despejar mis dudas y resolver mis inconvenientes.
A la Dra. María Gilda Stivala, mi amiga y compañera incondicional, por enseñarme y transmitirme su experiencia, por preocuparse siempre por mí, por entenderme, por su ayuda desinteresada, por sus consejos y palabras de aliento, por su confianza y por los hermosos momentos compartidos. Gracias Gil por estar a mi lado siempre! Sos una excelente persona y profesional y le agradezco a Dios haberte conocido.
A la Lic. Cecilia Ledesma por ayudarme siempre y darme alegría con todas sus ocurrencias, por las charlas y los momentos compartidos, por transmitirme su fortaleza. Gracias Ce por ser parte de mi vida y acompañarme en esta etapa.
Al Lic. José Martínez Chamás por brindarme su alegría con su risa incomparable, por creer siempre que lo lograría y por su ayuda constante.
A la Lic. Irina Kristof por las charlas y mates compartidos, por preocuparse, por destacar mis virtudes, por darme valor y creer en mí.
A Melina Belizán, Pamela Terán Baptista, Analía Gómez, Laura Andina y Marisol Jiménez de la Cátedra de Fitoquímica por ser excelentes personas, por su ayuda, colaboración y amabilidad de siempre.
A la Dra. Melina Sgariglia y Dr. Rodolfo Soberón por su ayuda, sus aportes y sugerencias.
Gracias por la amabilidad y el respeto de siempre.
A Baltasar, mi amor, mi amigo, mi compañero, mi confidente, porque me acompañó en toda esta etapa, desde el inicio, y nada hubiera sido igual si no hubiera estado a mi lado.
Gracias por creer en mí, por alentarme, por tu infinita paciencia, por tu inmenso amor y tu compañía inigualable…Te amo!!
A mi mamá, Raquel, la persona que más me conoce en el mundo, mi amiga fiel y mi compañera incondicional. No me alcanzan las palabras para agradecerle porque cada paso que di estuvo acompañado de sus consejos, sus enseñanzas y su fe en mí. Gracias por incentivarme cada día y enseñarme que todo es posible y se puede lograr.
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justas cuando más lo necesito y sobre todo, gracias por demostrar desde siempre sentirte orgulloso de mí.
A mi hermano Fede, por su apoyo incondicional y su cariño sincero. Gracias por enseñarme a ser fuerte y enfrentar mis obstáculos, por conocerme y ser mi sostén, por cuidarme, valorarme y aconsejarme.
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ABSTRACT
Fungi responsible of rot diseases reduce crops yields and contaminate the harvestable food products with mycotoxins noxious for human and animal health. They include the Fusarium species causing cereal rots, which are fumonisin and trichothecene producers, and Aspergillus species of the Nigri section responsible of black grape rots and ochratoxin A (OTA) production.
Chemical control of these fungi is based in the use of commercial fungicides which are expensive, generate environmental pollution and led to the development of fungal resistance. Plant extracts might provide new antifungals overcoming these problems. In this work, the inhibitory effect of extracts from aerial parts (leaves and stems) of native plants from northwest Argentina
(Amphilophium cynanchoides, Tecoma stans, Macfadyena cynanchoides and
Jacaranda mimosifolia) was investigated on Fusarium (F. graminearum and F. verticillioides) and Aspergillus (A. carbonarius and A. niger) species. Ten of a total of 24 extracts inhibited 50% of the fungal growth (IC50). Microdilution assays indicated that the extracts with the lowest IC50 values were the ethyl acetate leaf and stem extracts of A. cynanchoides against F. graminearum (IC50=1320 ppm) and F. verticillioides (IC50=1305 ppm), respectively, and the dichloromethane stem extract of M. cynanchoides against A. niger (IC50=1025 ppm) and A. carbonarius (1066 ppm). The dichloromethane stem extract of M. cynanchoides was the only one that completely suppressed fungal growth
(MIC) at 2500 ppm. It was antifungal on all the fungal strains in dot blot assays where Aspergillus strains were more sensitive than the Fusarium strains. The antifungal constituents of the dichloromethane extract were isolated and identified as 2-hydroxy-3- (3-methyl-2-butenyl)-1,4-naphthoquinone (lapachol) and 1-hydroxy-4-methyl anthraquinone. The anthraquinone was more active on the fungal strains (MIC= 78.1-625 ppm) than lapachol (MIC = 312.5-1250 ppm).
The dichloromethane extract and the antifungal constituents were tested in mixtures with propiconazole on all the fungal strains, with sodium metabisulfite against the Aspergillus strains and with potassium sorbate on the Fusarium strains. They synergized the effect of sodium metabisulfite on the Aspergillus strains and propiconazole only on Fusarium. Added at sub-MIC concentrations to grape juice, the dichloromethane extract and its antifungal quinines inhibited OTA production while sodium metabisulfite induced OTA accumulation. They suppressed OTA accumulation in mixtures with sodium metabisulfite. The dichloromethane extract of M. cynanchoides and its isolated antifungals have potential as additives of sodium metabisulfite against the
Aspergillus responsible of the black grape rots.
Keywords: Aspergillus, Fusarium, ochratoxin A
RESUMEN
Los hongos responsables de prodredumbres reducen el rendimiento de los cultivos y contaminan las cosechas con micotoxinas tóxicas para seres humanos y animales. Los mismos incluyen especies de Fusarium causantes de podredumbres de cereales que son productores de fumonisinas y tricotecenos, y especies de Aspergillus de la sección Nigri responsables de podredumbres de uvas y contaminación con ocratoxina A. El control químico de estos hongos se basa en el uso de fungicidas comerciales los cuales son costosos, contaminan el ambiente y condujeron al desarrollo de resistencia fúngica. Extractos vegetales podrían proveer nuevas moléculas que superen esos problemas. En este trabajo, se investigó el efecto inhibitorio de extractos de partes aéreas
(hojas y tallos) de plantas autóctonas del Noroeste Argentino (Amphilophium cynanchoides, Tecoma stans, Macfadyena cynanchoides y Jacarandá mimosifolia) sobre especies de Fusarium (F. graminearum y F. verticillioides) y
Aspergillus (A. carbonarius y A. niger). De los 24 extractos obtenidos, 10 alcanzaron a inhibir el 50% del crecimiento fúngico (CI50). Ensayos de microdilución indicaron que los extractos con los menores valores de CI50 fueron los de acetato de etilo de hojas y tallos de A. cynanchoides contra F. graminearum (CI50=1320 ppm) y F. verticillioides (CI50=1305 ppm), respectivamente, y el extracto diclorometano de tallos de M. cynanchoides contra A. niger (CI50=1025 ppm) y A. carbonarius (1066 ppm). El extracto diclorometano de tallos de M. cynanchoides fue el único que suprimió completamente el crecimiento fúngico (CIM=2500 ppm). El mismo fue antifúngico sobre todas las cepas fúngicas ensayadas en bioautografía por siembra puntual, donde las cepas de Aspergillus fueron más sensibles que las de Fusarium. Los constituyentes antifúngicos del extracto diclorometano se aislaron e identificaron como 2-hidroxi-3- (3-metil-2-butenil)-1,4-naftoquinona
(lapachol) y 1-hidroxi-4-metil antraquinona. La antraquinona fue más activa sobre las cepas fúngicas (CIM= 78,1-625 ppm) que el lapachol (CIM=312,5-1250 ppm). El extracto diclorometano y sus constituyentes antifúngicos se ensayaron en mezclas con propiconazol sobre todas las cepas fúngicas, con metabisulfito de sodio contra las cepas de Aspergillus y con sorbato de potasio sobre cepas de Fusarium. El extracto y sus metabolitos aislados sinergizaron el efecto del metabisulfito de sodio sobre las cepas de Aspergillus y de propiconazol sobre las cepas de Fusarium. Incorporados en jugo de uva en concentraciones sub-
CIM, el extracto diclorometano, el lapachol y la 1-hidroxi-4-metilantraquinona inhibieron la síntesis de OTA mientras que el metabisulfito de sodio estimuló la acumulación de esa micotoxina. Sin embargo, los mismos suprimieron la producción de OTA en mezclas con metabisulfito de sodio. El extracto diclorometano de tallos de M. cynanchoides y sus quinonas identificadas tienen potencial como aditivos de metabisulfito de sodio contra Aspergillus responsables de la podredumbre negra de la uva.
Palabras claves: Aspergillus, Fusarium, ocratoxina A ÍNDICE
CAPÍTULO 1 1. Introducción ...... 1 1.1 Los hongos toxigénicos ...... 2 1.2 Los géneros Fusarium y Aspergillus ...... 3 1.3 Taxonomía de Fusarium y Aspergillus ...... 3 1.4 Especies de Fusarium como agentes fitopatógenos de cereales ...... 4 1.3.1 Zearalenona ...... 6 1.3.2 Deoxinivalenol ...... 7 1.3.3 Fumonisinas ...... 8 1.5 La podredumbre de la espiga ...... 9 1.6 Especies de Aspergillus sección Nigri como agentes fitopatógenos de uvas ...... 12 1.6.1 Ocratoxina A ...... 12 1.7 La podredumbre de la uva ...... 13 1.8 El control químico de Fusarium y Aspergillus y su relación con el riesgo micotoxigénico ...... 15 1.9 Bignoniáceas autóctonas del NOA ...... 17 1.10 Referencias bibliográficas ...... 26
HIPÓTESIS ...... 37 OBJETIVOS ...... 38
CAPÍTULO 2 2. Actividad antifúngica de extractos procedentes de plantas nativas del noroeste Argentino ...... 39 2.1 Introducción ...... 40 2.1.1 Preparación de extractos vegetales ...... 41 2.1.2 Evaluación de la actividad antifúngica de extractos vegetales ...... 43 2.1.2.1 Método de difusión en agar ...... 44 2.1.2.2 Métodos de dilución ...... 45 2.1.2.3 Métodos bioautográficos ...... 46 2.2 Objetivo ...... 47 2.3 Materiales y Métodos ...... 48 2.3.1 Material vegetal ...... 48 2.3.2 Preparación de los extractos vegetales ...... 48 2.3.3 Microorganismos y condiciones de crecimiento ...... 50 2.3.4 Evaluación de la actividad antifúngica ...... 51 2.3.4.1 Microdilución en medio semilíquido ...... 51 2.3.4.2 Bioautografía directa por siembra puntual ...... 52 2.3.5 Análisis estadístico ...... 53 2.4 Resultados ...... 54 2.4.1 Preparación del material vegetal y rendimientos de extracción ....54 2.4.2 Ensayos de microdilución en medio semilíquido ...... 55 2.4.3 Ensayos de bioautografía directa por siembra puntual ...... 56 2.5 Discusión ...... 60 2.6 Conclusiones ...... 63 2.7 Referencias bibliográficas ...... 64
CAPÍTULO 3 3. Aislamiento e identificación de moléculas antifúngicas procedentes del extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides ...... 69 3.1 Introducción ...... 70
3.1.1 Metabolitos antifúngicos y su rol en el reino vegetal ...... 70 3.1.2 Separación y purificación de constituyentes antifúngicos ...... 73 3.1.2.1 Cromatografías sólido-líquido ...... 73 3.1.2.2 Cromatografías gas-líquido o gas-sólido ...... 74 3.1.3 Identificación de productos naturales ...... 75 3.1.3.1 Visualización de sustancias en cromatografía en capa fina ...... 75 3.1.3.2 Espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) ...... 76 3.1.3.3 Espectrometría de masas ...... 76 3.2 Objetivo ...... 77 3.3 Materiales y Métodos ...... 77 3.3.1 Material vegetal ...... 77 3.3.2 Microorganismos ...... 78 3.3.3 Separación de los constituyentes antifúngicos por CCF ...... 78 3.3.4 Bioautografía de cromatogramas en capa fina (CCFBio) ...... 79 3.3.5 Separación de constituyentes bioactivos mediante CC ...... 79 3.3.6 Bioautografía directa por siembra puntual ...... 81 3.3.7 Análisis de los constituyentes bioactivos mediante espectroscopia UV-Vis ...... 81 3.3.8 Identificación de los constituyentes bioactivos mediante CG-EM ...... 81 3.3.9 Actividad antifúngica de los grupos 2b y 4b ...... 82 3.4 Resultados ...... 83 3.4.1 Detección de bandas con constituyentes bioactivos mediante CCFBio ...... 83 3.4.2 Separación de constituyentes antifúngicos mediante CC ...... 84 3.4.3 Espectroscopia UV-Vis ...... 88 3.4.4 CG-EM de los grupos 2b y 4b ...... 90 3.4.5 Actividad antifúngica de los compuestos identificados ...... 94 3.5 Discusión ...... 96 3.6 Conclusiones ...... 99 3.7 Referencias bibliográficas ...... 100
CAPÍTULO 4 4. Caracterización de la actividad antifúngica de los grupos 2b y 4b recuperados del extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides ...... 109 4.1 Introducción ...... 110
4.1.1 Importancia de los agentes antifúngicos de Macfadyena cynanchoides en el control de hongos toxigénicos ...... 110 4.1.2 Compuestos fenólicos como agentes antimicotoxigénicos ...... 111 4.1.3 Riesgo micotoxigénico de especies de Aspergillus productoras de OTA en uvas y vinos ...... 113 4.1.4 Detección y cuantificación de OTA...... 114 4.2 Objetivos ...... 117 4.3 Materiales y Métodos ...... 117 4.3.1 Microorganismos ...... 117 4.3.2 Efecto conjunto entre antifúngicos vegetales y comerciales sobre el crecimiento fúngico ...... 118 4.3.3 Determinación de la actividad antiocratoxigénica ...... 121 4.3.4 Análisis estadístico ...... 122 4.4 Resultados ...... 122 4.4.1 Efecto conjunto entre antifúngicos vegetales y comerciales sobre el crecimiento fúngico ...... 122 4.4.2 Determinación de la actividad antiocratoxigénica ...... 123 4.5 Discusión ...... 127 4.6 Conclusiones ...... 130 4.7 Referencias bibliográficas ...... 131
CAPÍTULO 5 5. Conclusiones generales, consideraciones finales y proyecciones ...... 138 5.1 Conclusiones generales ...... 139 5.2 Consideraciones finales y proyecciones ...... 141
1. Introducción
1
1.1 Los hongos toxigénicos
Los hongos son un grupo heterogéneo de microorganismos eucariotas.
Se estima que existen aproximadamente 1,5 millones de especies fúngicas en la tierra, de las cuales sólo se conocen 70.000 (Agrios, 2009). La presencia de la mayor parte de las mismas es indispensable para el equilibrio de los ecosistemas, al degradar la materia orgánica y permitir el reciclaje de los elementos minerales. Ciertas especies fúngicas son utilizadas por el hombre en su beneficio en la industria farmacéutica (ej., la penicilina producida por
Penicillium chrysogenum), alimenticia (ej., Penicillum camembert en la maduración del queso que lleva ese nombre) y de biocontrol de plagas (ej., el uso de especies del género Trichoderma en el control de patógenos vegetales). Menos del 8% de las especies fúngicas conocidas son patógenas sobre plantas cultivadas. Sin embargo, ellas ocasionan el 70% de las enfermedades agrícolas en el mundo. Se invierte aproximadamente 6000 millones de dólares estadounidenses al año para controlar las mismas
(FAOSTAT, 2009). La presencia de ciertas especies fúngicas en productos cosechables utilizados en alimentación es especialmente peligrosa para el hombre, debido a que ellas no solamente reducen la calidad de las cosechas, sino que además las contaminan con metabolitos secundarios denominados micotoxinas (Bueno y col., 2011). La ingestión de alimentos con altos contenidos de micotoxinas puede provocar intoxicaciones en el hombre y/o sus ganados o animales de granja, conocidas como micotoxicosis. Los hongos capaces de producir estas últimas se suelen denominar hongos toxigénicos.
Entre estos últimos, en este trabajo de tesis son de nuestro interés especies de
2 los géneros Fusarium y Aspergillus responsables de podredumbres de granos y uva, respectivamente.
1.2 Los géneros Fusarium y Aspergillus
Los géneros Fusarium y Aspergillus comprenden especies de hongos filamentosos de distribución universal y ubicua, generalmente presentes en el aire, el suelo, el agua y material orgánico en descomposición. Muchas especies de Fusarium y Aspergillus son nocivas para el hombre al causar enfermedades en plantas cultivadas o generar infecciones oportunistas en humanos y animales (Seyedmousavi y col., 2015; Lainhart, 2018). Sin embargo, otras son benéficas para el hombre. Por ejemplo, especies de Fusarium se utilizan en agricultura en el control biológico de enfermedades o como micoherbicidas contra malezas (Magani y col., 2011; Avedi y col., 2014).
Especies de Aspergillus se utilizan durante procesos de fermentación para la producción de ácidos orgánicos, tales como los ácidos cítrico, láctico, propiónico y glucónico, como así también de enzimas hidrolíticas como amilasas y lipasas (Perrone y col., 2007; Moresi y Parente, 2014).
1.3 Taxonomía de Fusarium y Aspergillus
Los miembros de Fusarium y Aspergillus pertenecen al phyllum
Ascomycota. Sin embargo, los primeros están comprendidos en el orden
Hypocreales mientras que los segundos se encuentran en el orden Eurotiales
(Tabla 1). En algunas especies de Fusarium solamente se conoce una fase asexual (anamorfo o forma imperfecta), la cual produce macroconidios curvados y pluriseptados, microconidios unicelulares o ambos tipos de esporas
3 asexuales. En otras puede presentarse además un estado teleomórfico (forma sexual o perfecta) que puede encuadrarse en uno de cuatro géneros:
Gibberella, Neocosmospora (o Haematonectria), Cosmospora y Albonectria, siendo Gibberella el que agrupa la mayor parte de los teleomorfos de Fusarium
(Seifert y Lévesque, 2004). En el caso de Aspergillus, aproximadamente un tercio de sus especies descriptas poseen forma sexual conocida (Geiser, 2009).
Los principales géneros en los que se agrupan las formas teleomórficas de
Aspergillus son Eurotium y Emericella. La sección Circumdati, a la que pertenece Aspergillus ochraceus, posee el género teleomorfo Neopetromyces
(Frisvad y Samson, 2000), mientras que la sección Flavi (Aspergillus flavus) se asocia a miembros del género teleomorfo Petromyces (Subramanian, 1972).
Aún no se conocen los teleomorfos para Aspergillus sección Nigri (Krimitzas y col., 2013).
Tabla 1. Taxonomía de los géneros Fusarium y Aspergillus Reino Fungi
Phylum Ascomycota
Clase Sordariomycetes Eurotiomycetes Orden Hypocreales Eurotiales Familia Nectriaceae Trichocomaceae Género Fusarium Aspergillus
1.4 Especies de Fusarium como agentes fitopatógenos de cereales
Argentina es un importante productor y exportador mundial de cereales, principalmente maíz y trigo. Ocupa el cuarto lugar en la producción y exportación de maíz a nivel mundial y el séptimo en la producción y exportación del trigo. La mayor parte de la producción está en la provincia de
Buenos Aires, seguida por Santa Fe y Córdoba (USDA/FAS, 2018).
4
Varias especies de Fusarium son importantes patógenos causantes de podredumbres en cereales (Logrieco y col., 2002; Desjardins y Plattner, 2003;
Sampietro y col., 2010), lo que provoca enormes pérdidas económicas no solo por la disminución en la cantidad y calidad de los granos producidos, sino también porque los contaminan con micotoxinas. Estas sustancias son metabolitos secundarios de origen fúngico que cuando son ingeridas por el hombre y los animales generan intoxicaciones conocidas como micotoxicosis.
En el caso de Fusarium, las micotoxinas pueden sintetizarse durante la infección de la planta y acumularse en los granos antes de cosecha. Estas sustancias sobreviven en los alimentos derivados de granos destinados a alimentación animal (ej. piensos) o humana. En ciertas circunstancias, pueden encontrarse en concentraciones suficientemente elevadas como para generar intoxicaciones crónicas o agudas (Rodrigues y Naehrer, 2012).
Las especies fitopatógenas del género Fusarium pueden vivir de forma saprófita en los residuos de cosecha, así como también en el grano recolectado y procesado, por ejemplo en la forma de harina o forrajes. Si las condiciones ambientales son las adecuadas, el metabolismo secundario de
Fusarium puede mantenerse activo y, por lo tanto, la acumulación de micotoxinas puede incrementarse.
Entre las especies de Fusarium comúnmente aisladas de cereales y productoras de micotoxinas se encuentran Fusarium graminearum y F. verticillioides. Fusarium graminearum es el principal productor de zearalenona y deoxinivalenol mientras que F. verticillioides produce principalmente fumonisina B1 (Rodrigues y Naehrer, 2012; Sanchez-Rangel y col., 2012).
5
1.3.1 Zearalenona
La zearalenona (ZEA) es una micotoxina producida por hongos pertenecientes al género Fusarium, principalmente F. graminearum. Se caracterizan por poseer actividad estrogénica en cerdos, bovinos y ovinos
(Zinedine y col., 2007). La ingesta de altos niveles de ZEA en humanos a través del consumo de alimentos contaminados puede producir trastornos en el sistema reproductor en desarrollo (pubertad precoz en niñas y aumento del tamaño de los órganos reproductores en niños), así como alteraciones en la fertilidad y reproducción en las mujeres. Además, puede afectar al sistema inmunológico, disminuyendo las defensas del organismo. Sin embargo, no tiende a acumularse en el organismo, por lo tanto, presenta menor toxicidad crónica a largo plazo, comparada con otras micotoxinas (Abid-Essefi y col.,
2003). Químicamente esta micotoxina es una lactona de ácido resorcicíclico
(Figura 1), cuya toxicidad es conferida por el anillo lactona y el grupo hidroxilo libre del carbono 4.
Figura 1. Estructura química de la ZEA
Si bien los cereales infectados con Fusarium pueden acumular ZEA antes de la cosecha, los altos niveles de ZEA que se presentan en los alimentos se deben a condiciones inadecuadas de transporte y almacenamiento. La ZEA se encuentra principalmente en maíz y trigo pero también puede acumularse
6 en cebada, avena, arroz, sorgo y soja. En el maíz suele estar presente junto a otras micotoxinas, generalmente tricotecenos, como el deoxinivalenol.
1.3.2 Deoxinivalenol
El deoxinivalenol (DON) es una micotoxina perteneciente al grupo de los tricotecenos producida principalmente por Fusarium graminearum (Kushiro,
2008). El mismo puede causar toxicidad aguda y crónica. En animales, altas dosis pueden producir rechazos en los alimentos, disminución del peso corporal, alteraciones inmunológicas, vómitos, irritación dérmica y gastrointestinal. A bajas concentraciones puede ocasionar anorexia y reducir el crecimiento (Rotter y col., 1996; Pestka, 2007). Químicamente, esta micotoxina es un sesquiterpeno tricíclico con un anillo epoxi entre los carbonos
12 y 13 que pertenece a los tricotecenos de tipo B (Figura 2). En su molécula contiene 3 grupos hidroxilos libres (-OH), que están asociados con su toxicidad
(Nagy y col., 2005)
Figura 2. Estructura química de DON
El DON se acumula generalmente en etapas de pre-cosecha. No obstante, también puede formarse durante la recolección, transporte y almacenamiento en condiciones inadecuadas. Se informaron altas concentraciones de DON en maíz, avena, cebada y trigo; mientras que niveles
7 más bajos están asociados generalmente a centeno, sorgo y arroz (Mendez y
Moreno, 2009).
1.3.3 Fumonisinas
Las principales toxinas producidas por Fusarium verticillioides son las fumonisinas. Ellas son responsables de leucoencefalomalacia en equinos, edema pulmonar en cerdos, cáncer de hígado en ratas y se asociaron con el cáncer de esófago en humanos (Voss y col., 2007). La Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC, 1993) las categorizó como agentes carcinogénicos del Grupo 2B. Estas sustancias son químicamente aminopolioles cuya estructura principal es una cadena lineal de 20 átomos de carbono con un grupo amino en el carbono 2 y residuos de ácido tricarboxílico esterificados en los carbonos 14 y 15. Las fumonisinas se diferencian por la presencia o la ausencia de un grupo hidroxilo en los carbonos 5 y 10. Entre ellas, las más abundantes son las del grupo B. Dentro de esta familia predominan las FB1, FB2,
FB3, pero la FB1 conforma más del 75% del total de las fumonisinas (Marín y col.,
1995; Proctor y col., 2006). En la Figura 3 se puede observar la estructura química de la FB1, la cual se caracteriza por tener dos grupos hidroxilo en los carbonos 5 y 10. Las fumonisinas se acumulan generalmente en maíz en etapas de pre-cosecha.
8
Figura 3. Estructura química de la FB1
1.5 La podredumbre de la espiga
La producción maicera del centro y norte Argentino y triguera del centro de nuestro país padece podredumbres de espiga ocasionadas por especies del género Fusarium, fundamentalmente F. verticillioides y F. graminearum (Moschini, 2014). En maíz, Fusarium graminearum genera la podredumbre rosa de la mazorca denominada de esta manera porque suele manifestarse como una masa rosa a morada de micelio que habitualmente avanza desde el extremo terminal de la espiga femenina hacia la base de la misma (Figura 4A). El micelio rosado también puede hacerse visible en las chalas y en los granos. Eventualmente pueden aparecer peritecios, los cuales se ven como estructuras oscuras (Gxasheka y col., 2015). La visualización anteriormente descripta no debe confundirse con la generada por Fusarium verticillioides donde la mazorca presenta focos de colonización (Figura 4B) o se observan granos aislados completamente colonizados o con estrías de color blanquecino, producidas por los canales de aire dejados por el micelio debajo del pericarpio (Figura 4C). En el caso del trigo, el mismo puede sufrir la
“fusariosis de la espiga” o “golpe blanco” especialmente en áreas trigueras húmedas y de clima templado. La infección ocurre mayormente en espigas en
9 floración a través de las anteras, siendo en nuestro país Fusarium graminearum, el principal agente causal. El síntoma de esta enfermedad es una decoloración prematura de las espiguillas infectadas por pérdida de clorofila, la cual puede extenderse a toda la espiga si las condiciones de humedad son elevadas (Figura 5A). Si la infección progresa puede visualizarse un micelio algodonoso, ligeramente rosado a salmón, característico de Fusarium graminearum, en el cual se forman abundantes conidios (Figura 5B).
Eventualmente pueden aparecer estructuras oscuras (peritecios) (Bai y Shaner,
1994; Díaz de Ackermann y col., 2002; Gilbert y Haber, 2013).
Las etapas más importantes del ciclo de las podredumbres generadas por Fusarium en mazorca de maíz y espiga de trigo se presentan en la Figura 6.
Una característica particular de los hongos del género Fusarium es su capacidad para sobrevivir como organismos saprófitos durante mucho tiempo, alimentándose del rastrojo, el cual está formado por los restos de las plantas de maíz que permanecen en el campo luego de la cosecha. Estos hongos también pueden encontrarse en forma de peritecios, clamidosporas, macro y microconidios, según la especie que esté presente en el material vegetal (Goswami y Kistler, 2004). La lluvia, el viento y algunos insectos favorecen el transporte de las esporas hasta la planta. Tanto las ascosporas liberadas por los peritecios como los conidios se depositan durante la floración sobre las anteras de trigo o los estigmas del maíz infectando los tejidos vegetales con posterior proliferación hacia el resto de la espiga.
10
A B C
Figura 4. Podredumbre en mazorca de maíz (A) de F. graminearum, (B) de F. verticillioides y (C) estrías generadas por F. verticillioies
A B
Figura 5. Podredumbre en espiga de trigo de F. graminearum. (A) Decoloración de las espiguillas infectadas. (B) Micelio rosado en etapa avanzada
Espiga de trigo Mazorca de maíz
Antera Estigma
Supervivencia en residuos infectados
Esporas diseminadas por viento, lluvia e insectos Macro y microconidios Ascos y ascosporas Figura 6. Ciclo de la enfermedad generada por Fusarium en trigo y maíz.
11
1.6 Especies de Aspergillus sección Nigri como agentes fitopatógenos de uvas
Argentina ocupa el séptimo lugar en el mundo en la producción de uvas y el quinto en la elaboración de vinos (INV, 2018). La mayor producción vitivinícola de nuestro país se ubica en las provincias de Mendoza (70%) y San
Juan (22%) y en menor proporción en Salta, La Rioja, Catamarca, Córdoba,
Tucumán y Río Negro (INV, 2016). En las zonas de clima húmedo y altas temperaturas se encontró una elevada incidencia de especies de Aspergillus de la sección Nigri, principalmente A. carbonarius y A. niger, causantes de podredumbres en uvas y productoras de ocratoxina A (OTA) contaminante de uvas y vino (Chiotta y col., 2013).
1.6.1 Ocratoxina A
La OTA es una micotoxina con actividades neurotóxica, inmunotóxica, genotóxica y teratogénica en animales. La Agencia Internacional de
Investigación del Cáncer la clasificó en el grupo 2B que corresponde a sustancias posiblemente carcinógenas para el ser humano (IARC, 1993;
Abouzied y col., 2002; Battilani y Camardo Leggieri, 2015). Esta micotoxina presenta una molécula formada por un anillo de 3,4- dihidro metil isocumarina, al cual se asocia su toxicidad, unido por medio de un grupo carboxilo a través de un enlace amida, a una molécula de fenilalanina (Figura 7).
Figura 7. Estructura química de la OTA
12
Si bien la OTA puede acumularse en diferentes tipos de alimentos y bebidas tales como cereales, piensos, café, cacao, carne, uvas, vino, pasas, legumbres y cerveza (Majerus y col., 1993; Blanco y col., 2007; Duarte y col.,
2009), las uvas y el vino representan las principales fuentes de contaminación e ingesta diaria de OTA (Battilani y col., 2006). La presencia de OTA en mostos y vino se debe a la contaminación fúngica de las uvas, que puede producirse en pre o post-cosecha, o durante las etapas previas a la vinificación. Las prácticas agrícolas y las condiciones medioambientales, principalmente humedad y temperatura, durante el almacenamiento y el transporte afectan de forma directa a los niveles de OTA en los alimentos (Marín y col., 2005;
Stratakou y van der Fels-Klerx, 2010).
1.7 La podredumbre de la uva
Aspergillus carbonarius y A. niger causan en la uva la “podredumbre negra”, enfermedad con mayor incidencia en climas húmedos y cálidos. Estos hongos ocratoxigénicos pueden colonizar las bayas en el período de pre- cosecha principalmente cuando la uva está madura (etapa de envero), en la cosecha o durante el transporte y/o almacenamiento (Battilani y col., 2003).
Los mismos son patógenos secundarios por lo que solo pueden establecerse una vez que la piel de la uva ha sido dañada previamente por efectos de la lluvia, otros hongos, insectos e impactos mecánicos, entre otros factores (Bellí y col., 2007).
Siguiendo su ciclo de vida (Figura 8), Aspergillus spp está presente en el suelo y la materia orgánica y coloniza a la uva a través de las esporas que migran con el viento y la lluvia (Leong y col., 2006). El estado de las bayas,
13 principalmente la presencia de lesiones como roturas por prácticas de manejo, rajaduras por exceso de agua, daños de pájaros o insectos, influye positivamente en la capacidad de colonización de estos hongos y producción de OTA (Logrieco y col., 2007; Chunmei y col., 2013a). La germinación de esporas y posterior crecimiento micelial conduce a la aparición de uvas de color blanco que se tornan posteriormente negras debido a las fructificaciones del hongo. Este puede penetrar la piel a través de las lesiones y consumir los nutrientes de la pulpa, deshidratando las bayas y otorgándole una apariencia completamente seca y arrugada.
Podredumbre negra de racimos
Supervivencia en Heridas residuos infectados
Esporas diseminadas por viento, lluvia e insectos
Microconidios
Ascos y ascosporas Figura 8. Ciclo de la enfermedad generada por Aspergillus sección Nigri en uva.
14
1.8 El control químico de Fusarium y Aspergillus y su relación con el riesgo
micotoxigénico
El ingreso de micotoxinas en la cadena alimentaria debe evitarse o minimizarse mediante la instrumentación de estrategias que permitan: 1) reducir las infecciones originadas en pre-cosecha, 2) limitar el crecimiento fúngico y la síntesis de micotoxinas durante el desarrollo de los órganos cosechables y el almacenamiento de los mismos en post-cosecha. La implementación de buenas prácticas agrícolas en cereales y uvas tales como reducir los daños mecánicos durante la cosecha, limpiar y mantener en condiciones adecuadas los contenedores empleados para el transporte, eliminar granos o uvas dañados, entre otros, es el primer paso para evitar o minimizar el daño fúngico y la contaminación con micotoxinas. En este contexto, el control químico es un componente del manejo integrado de hongos fitopatógenos en pre y post-cosecha tanto en cereales como en uvas.
En el caso de Fusarium en cereales:
1) Pre-cosecha: En trigo del centro del país, se aconseja la aplicación de fungicidas triazoles, imidazoles, benzimidazoles o sus mezclas en floración cuando las condiciones ambientales se presentan predisponentes al desarrollo de la podredumbre de la espiga. Sin embargo, el grado de control de estos productos no supera generalmente el 60%, su uso intensivo condujo a la aparición de resistencias y muchos de ellos en dosis sub-letales in vivo e in vitro demostraron inducir la acumulación de micotoxinas. En maíz del Noroeste y centro del país, el uso de fungicidas en pre-cosecha está restringido a curasemillas, no existiendo alternativas de control químico económicas y
15 ambientalmente sustentables para controlar a Fusarium en otras etapas del ciclo del cultivo (Audenaert y col., 2010, 2011; Becher y col., 2010)
2) Post-cosecha: en granos almacenados se pueden emplear preservantes de grado alimenticio tales como sorbatos, propionatos y benzoatos (Punja y
Grogan, 1982; Magan y col., 2010). Sin embargo, estas sustancias presentan actividad fungistática, siendo las mismas realmente eficaces cuando cubren totalmente las superficies de los granos. La aplicación de tales preservantes restringen el uso de los granos a alimentación animal y especies de Fusarium demostraron ser capaces de degradarlos en concentraciones sub-supresoras del crecimiento fúngico, incrementando la acumulación de micotoxinas y restringiendo la eficacia de control de esas sustancias.
En el caso de Aspergillus en uvas:
1) Pre-cosecha: Se aconseja la aplicación de fungicidas ftalimidas, triazoles, estrobirulinas, benzimidazoles, fenilpirroles, pirimidinas o sus mezclas para reducir las infecciones provocadas por los Aspergillus de la sección Nigri (Lo
Curto y col., 2004; Bellí y col., 2006; Apud y col., 2015). Se demostró que el uso de ciertos fungicidas, tales como el carbendazim, hexaconazol, pirimetanil o azoxistrobin en dosis sub-letales induce la producción de OTA (Amézqueta y col., 2009; Zouhair y col., 2014).
2) Post-cosecha: En uvas almacenadas suele aplicarse dióxido de azufre (SO2) en forma de metabisulfito de sodio o de potasio poco después de la cosecha, el cual actúa como preservante químico. Las uvas destinadas a vinificación no son almacenadas por lo que deben transportarse lo más rápidamente posible a la bodega luego de la cosecha realizando un sulfitado antes del inicio de la
16 fermentación alcohólica y antes del embotellado del vino (Considine y Foyer,
2015).
En base a los antecedentes anteriormente señalados, se puede decir que el control químico de Fusarium en trigo y maíz y el de Aspergillus en uvas requiere la incorporación al mercado de nuevos fungicidas biodegradables con capacidad nula de inducir la síntesis de micotoxinas en un amplio rango de condiciones ambientales. Plantas autóctonas del NOA podrían proveer antifúngicos útiles en el control de especies de Fusarium y Aspergillus, siendo de particular interés en este trabajo aquellas pertenecientes a la familia de las
Bignoniáceas.
1.9 Bignoniáceas autóctonas del NOA
Las Bignoniáceas son plantas Angiospermas pertenecientes al orden
Lamiales originarias predominantemente de regiones tropicales y subtropicales del mundo. Esta familia consta de 650 especies distribuidas en 110 géneros
(Rahmatullah y col., 2010). En nuestro país, las Bignoniáceas se encuentran representadas por 24 géneros que agrupan 57 especies (Arbo, 1999), incluyendo árboles, arbustos y lianas. Además existen 7 especies exóticas adventicias o cultivadas como ornamentales (Fabris, 1959; Hurrell y col., 2012).
En algunas especies de Bignoniáceas se identificaron compuestos bioactivos beneficiosos para la salud humana debido a sus propiedades antimicrobiana, antiparasitaria, antiinflamatoria, analgésica, antioxidante, antitumoral, entre otras (Barboza y col., 2009, Castillo y Rossini, 2010,
Rahmatullah y col., 2010). Sin embargo no hay muchos estudios sobre las actividades biológicas de diferentes especies Bignoniáceas nativas de la
17 región noroeste de Argentina (Barboza y col., 2009). En esta última se pueden distinguir especies arbóreas como el jacarandá o tarco (Jacarandá mimosifolia), arbustos como el guarán amarillo (Tecoma stans) y lianas como el peine de mono (Amphilophium cynanchoides) y la sacha huasca
(Macfadyena cynanchoides) ampliamente usadas en la medicina tradicional.
Amphilophium cynanchoides DC. (Figura 9):
Nombre vulgar: Peine de mono.
Descripción botánica: Liana leñosa, con hojas compuestas con zarcillos y flores blancas curvas, cigomorfas con garganta amarilla de 4 a 7 cm de longitud.
Las hojas son caducas, opuestas compuestas de 2-3 folíolos (hojas compuestas). Presenta tallos muy resistentes, grisáceos y volubles. El fruto es una cápsula elipsoide de 5 a 8 cm de longitud cubierta de pequeños dientes.
Distribución geográfica en Argentina: Buenos Aires, Catamarca, Chaco,
Córdoba, Corrientes, Entre Ríos, Formosa, Jujuy, La Rioja, Misiones, Salta,
Santiago del Estero, Santa Fe, San Juan, San Luis y Tucumán. En Tucumán crece en el Parque Chaqueño. Florece de octubre a marzo. El fruto es dehiscente, es decir se abre espontáneamente y libera sus semillas entre enero y marzo.
Propiedades y usos: Se la usa como forraje en alimentación animal y como planta ornamental. En medicina popular se le atribuyen propiedades anticonceptivas. No hay estudios reportados sobre el aislamiento e identificación de compuestos activos de la especie Amphilophium cynanchoides. Sin embargo, extractos alcohólicos demostraron ser antimicrobianos al inhibir completamente el crecimiento de bacterias antibiótico-resistentes de difícil control en humanos (Zampini y col., 2007).
18
B A
C
Figura 9. Amphilophium cynanchoides DC. (A) Planta entera. (B) Hojas, flores y fruto. (C) Rama florífera (dibujo de Watson L. y Dallwitz M.J., 1992).
19
Tecoma stans L. (Figura 10):
Nombre vulgar: Guarán amarillo
Descripción botánica: Arbusto o árbol de pequeño porte de 3 a 7 metros de altura con follaje caduco. El tronco generalmente es de forma irregular y en muchos casos presenta más de dos troncos que emergen desde la base.
Presenta hojas opuestas, imparipinnadas. Los folíolos son lanceolados puntiagudos en ambos extremos y dentados en los márgenes. Las flores son amarillas y ligeramente perfumadas. El fruto es una vaina alargada y puntiaguda que cuelga de las ramas.
Distribución geográfica en Argentina: Catamarca, Córdoba, Corrientes, Entre
Ríos, Jujuy, La Rioja, Misiones, Salta, Santiago del Estero, Santa Fe y Tucumán. En
Tucumán crece en la selva de las Yungas y florece de agosto a octubre.
Propiedades y usos: Se usa su madera de dureza media y además se lo cultiva como planta ornamental en los jardines. En la medicina popular se le atribuyen a las raíces y a las hojas diferentes propiedades curativas. Las infusiones de raíz se usan como tónico estomacal y diurético y las de hojas como estimulantes del apetito y para calmar los nervios. Se demostró que contiene los alcaloides tecomaninas y tecostatina con actividad hipoglucemiante, ácido clorogénico, ácido cumárico, ácido oleanólico y β-sitosterol. Kottai Muthu
(2012) realizo un estudio a partir de extractos de duramen de Tecoma stans, los cuales presentaron actividad antibacteriana y antifúngica. Se demostró que extractos acuosos, metanólicos y etanólicos de esta especie fueron efectivos contra bacterias y hongos del género Aspergillus y Alternaria. Las tres fracciones mostraron un alto contenido de compuestos fenólicos, principalmente ácido gálico (Govindappa y col., 2011).
20
B
A
C
D
Figura 10. Tecoma stans L. (A) Planta entera, (B) hojas y flores, (C) frutos (D) rama florífera (dibujo de Roux W., publicado por Henderson L., 1995).
21
Jacaranda mimosifolia D. Don (Figura 11):
Nombre vulgar: Jacarandá, tarco.
Descripción botánica: Árbol caducifolio, de rápido crecimiento, copa esférica de 4 a 6 m de diámetro, de porte medio con unos 10 a 12 m de altura. El tronco presenta 6 a 9 m de altura y 40 a 70 cm de diámetro. Presenta hojas opuestas, bipinnadas, con pares de folíolos pequeños de forma oval-oblonga, apiculados. Los frutos son cápsulas leñosas planas de color marrón oscuro. Las flores son grandes, de 4 a 5 cm, de forma tubular, acampanada y con lóbulos desiguales, de color azul violeta.
Distribución geográfica en Argentina: Jujuy, Salta, Tucumán y Catamarca. En
Tucumán crece en el nivel inferior de la selva de las Yungas y en la zona de transición con el Parque Chaqueño. Florece en septiembre cuando las ramas muestran los primeros brotes. Fructifica desde marzo y mantiene las cápsulas durante todo el año.
Usos y propiedades: Se cultiva en calles, plazas y parques como árbol ornamental. Proporciona una madera semidura y semipesada de múltiples aplicaciones en carpintería en general. La corteza se emplea para teñir de amarillo cuero, lana y seda ya que contiene un pigmento llamado jacarandina. En la medicina popular, a las hojas se le atribuyen propiedades antibacteriana y antiséptica y a la corteza propiedad astringente. Algunos autores demostraron que las hojas de Jacaranda mimosifolia poseen jacaranona, una quinona con propiedades antimicrobianas, antitumorales y sedantes (Gambaro y col., 1988; Xu y col., 2003; Tian y col., 2005; Lechuga y col., 2010). También se aislaron triterpenos de las hojas y los tallos (Joshi y col.,
1973; Varanda y col., 1992) y flavonoides de las flores (Scogin, 1980; Mahran y col., 1991).
22
B
A
C
a
b d
c
Figura 11. Jacaranda mimosifolia D. Don. (A) Planta entera, (B) hojas y flores, (C) caracteres botánicos: (a) rama florífera, (b) flor, (c) fruto, (d) semilla (dibujo de Sierra S., 2005)
23
Macfadyena cynanchoides Cham. (Figura 12):
Nombre vulgar: Sacha huasca.
Descripción botánica: Liana leñosa de tallo muy largo con verrugas.
Crece trepándose a los árboles a los que se adhiere por medio de zarcillos de
3 ramas en forma de gancho similares a uñas de gato. Las hojas son opuestas y bifoliadas. Las flores son de color rojo, tubulares, en forma de trompeta con una longitud de 6 cm. Los frutos son cápsulas chatas, alargadas, de color castaño, con numerosas semillas, de 8 a 10 cm de longitud.
Distribución geográfica en Argentina: Buenos Aires, Catamarca, Chaco,
Córdoba, Corrientes, Entre Ríos, Formosa, Jujuy, La Rioja, Misiones, Salta, Santa
Fe, Santiago del estero y Tucumán. En Tucumán se encuentra en la selva de las
Yungas, principalmente en el cerro San Javier. Florece durante muy pocos días con las primeras lluvias de septiembre u octubre.
Propiedades y usos: Se cultiva como planta ornamental debido a sus flores vistosas. En la medicina popular se usan sus hojas y tallos como anticonceptivos, antidiarreicos y antieméticos. Se demostró que extractos de hojas contienen los iridoides macfadienósido (Bianco y col., 1974) cinanchósido (Bonini y col., 1981) y 5, 7-bisdeoxicinanchósido (Adriani y col.,
1982). A partir de extractos etanólicos de partes aéreas de Macfadyena cynanchoides se asilaron ceras con propiedades insecticidas (Díaz Napal y col., 2016). Barneche y col. (2009) demostraron la actividad antibacteriana de extractos de hojas de Macfadyena cynanchoides frente a Staphylococcus aureus y Listeria inocua.
24
B
A
C c b
a
d
Figura 12. Macfadyena cynanchoides (A) Planta entera, (B) hojas y flores, (C) caracteres botánicos: (a) rama florífera, (b) flor, (c) semillas, (d) fruto (dibujo de Fitch W.H, 1941).
25
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36
HIPÓTESIS
1) Especies vegetales autóctonas del noroeste argentino tales como
Amphilophium cynanchocides, Macfadyena cynanchoides, Jacaranda
mimosifolia y Tecoma stans, producen metabolitos secundarios capaces
de controlar el crecimiento de especies toxigénicas de los géneros
Fusarium y Aspergillus causantes de podredumbres en granos de
cereales y uva, respectivamente.
2) Estas sustancias pueden aislarse, sus estructuras químicas pueden
elucidarse y la actividad antifúngica de las mismas puede cuantificarse.
3) Las especies autóctonas del NOA mencionadas contienen sustancias
antifúngicas con mecanismos de acción diferentes a aquellos de los
antifúngicos comerciales actualmente en uso.
37
OBJETIVOS
Objetivo general:
Aislar e identificar agentes antifúngicos utilizables en el desarrollo de fungicidas contra podredumbres de cereales y uva generadas por especies de los géneros Fusarium y Aspergillus.
Objetivos Específicos:
1) Identificar extractos de especies autóctonas del NOA con actividad
antifúngica relevante sobre especies toxigénicas de Fusarium y
Aspergillus.
2) Aislar moléculas antifúngicas del o de los extractos vegetales con mayor
bioactividad.
3) Elucidar la estructura de las moléculas antifúngicas aisladas.
4) Caracterizar la actividad antimicotoxigénica de las moléculas aisladas y
el efecto conjunto de las mismas al ser ensayadas en mezclas con
antifúngicos comerciales.
38
Capítulo 2: Actividad antifúngica de extractos procedentes de plantas nativas del noroeste Argentino
2.1 INTRODUCCIÓN
2.1.1 Preparación de extractos vegetales
La búsqueda de moléculas antifúngicas de origen vegetal requiere primeramente seleccionar aquellas plantas que se espera podrían contenerlas.
Por ello, la selección generalmente se basa en el conocimiento existente sobre el empleo tradicional o popular de las plantas (criterio etnobotánico), la composición química de determinadas familias o géneros vegetales relacionados (criterio quimiotaxonómico) y las investigaciones previas realizadas en interacciones químicas de determinadas plantas con otros organismos presentes en su entorno (criterio químico-ecológico) o de identificación de metabolitos secundarios vegetales con potenciales propiedades terapéuticas (criterio fármaco-fitoquímico) (Hosier y Mikita, 1987;
Williamson y col., 1996; Cock, 2012). Frecuentemente las plantas se eligen empleando no solo uno de estos criterios sino una combinación de de ellos, como es el caso del presente trabajo de tesis. Una vez elegidas las especies vegetales, estas deben recolectarse, lo cual requiere que el material vegetal sea reconocido como auténtico por un botánico calificado para su conservación en un herbario. Se debe tener en cuenta, entre otros, la fecha y posición geográfica de la recolección puesto que las plantas frecuentemente sufren variaciones en su composición fitoquímica según el lugar y la época del año en que crecen (Hosier y col., 1987; Smith, 2017). Puede utilizarse el material vegetal fresco o seco como fuente de metabolitos secundarios. Sin embargo, se recomienda secarlo para su almacenamiento (Eloff 1998; Smith, 2017).
Luego, se procede a extraer del mismo sus principios activos repetidas veces tras ser triturado a molido. Existen múltiples técnicas a través de las cuales
40 pueden extraerse metabolitos secundarios vegetales. Entre ellas mencionamos:
– Extracción mecánica: Se denomina también por prensada y se aplica especialmente para la obtención de aceites esenciales. Consiste en ejercer presión manual o mecánica (ej. prensa hidráulica) sobre la muestra, obteniendo el aceite crudo y la torta residual del prensado, la cual puede ser tratada posteriormente con solventes orgánicos para extraer el aceite remanente (Singh, 2008).
– Extracción por arrastre con vapor de agua: Permite la extracción de compuestos insolubles en agua y volátiles o ligeramente volátiles. El material vegetal previamente molido se coloca en un balón y se le hace pasar vapor de agua proveniente de otro balón que contiene agua en ebullición. Los componentes se mezclan con el vapor y son arrastrados hacia un refrigerante, donde el vapor se condensa. El agua y los constituyentes se separan por decantación dado que éstos últimos usualmente presentan una densidad menor que aquella (ej. aceites esenciales vegetales) (Handa, 2008).
– Extracción sólido-líquido: Consiste en poner en contacto el material vegetal con el solvente, solubilizándose los constituyentes vegetales en la fase líquida. Dado un constituyente del material vegetal, éste puede ser total o parcialmente extraído del mismo. Existen varias extracciones sólido-líquido que permiten recuperar parcialmente constituyentes, como ser:
– Maceración: Consiste en poner en contacto el material vegetal
seco y molido con un solvente a temperatura ambiente, dejando la
mezcla en reposo en un recipiente cerrado durante un tiempo
determinado. Luego se filtra para separar el residuo vegetal del
41 sobrenadante que contiene los constituyentes vegetales (Handa,
2008).
– Digestión: Se utiliza para componentes que no son solubles en frío.
Es un procedimiento similar a la maceración pero se realiza con calentamiento a una temperatura (35-50°C) que no altere los principios activos del material vegetal (Bimakr y col., 2011).
– Infusión: Se emplea para constituyentes que no se alteran con la temperatura. Consiste en colocar el material vegetal en agua hervida durante un cierto tiempo, se deja reposar hasta que se enfría y se filtra
(Bimakr y col., 2011).
– Decocción: Se utiliza para compuestos que son termoestables.
Consiste en mezclar el material vegetal con el solvente y se lleva a ebullición por un tiempo determinado, luego se enfría y se filtra (Bimakr y col., 2011).
– Percolación: Se realiza en recipientes cilíndricos o cónicos
(percoladores) donde se coloca el material vegetal previamente humedecido con el solvente de extracción. Poseen un dispositivo de carga en la parte superior por el que se añade solvente constantemente, el cual atraviesa la muestra lentamente y gotea por un sistema de descarga en la parte inferior, permitiendo una extracción exhaustiva de los constituyentes (Cowan, 1999; Handa,
2008).
– Soxhlet: Consiste en colocar el material vegetal molido en un cartucho poroso que se introduce en una cámara de extracción, conectada por un lado a un balón de destilación y por el otro a un
42
refrigerante. El solvente contenido en el balón se calienta a ebullición,
el vapor asciende por un tubo lateral y se condensa en un refrigerante,
cayendo sobre el material vegetal. Cuando se alcanza un
determinado nivel, el solvente mezclado con los constituyentes pasa
por un tubo lateral llamado sifón regresando al balón de destilación,
donde se obtiene el solvente puro por destilación y se reutiliza. Este
proceso se repite de forma continua hasta agotar el material (Handa,
2008).
2.1.2 Evaluación de la actividad antifúngica de extractos vegetales
La identificación de extractos vegetales con actividad antifúngica usualmente involucra el uso de ensayos que son adaptaciones de aquellos propuestos por el Subcomité de Sensibilidad a los Antifúngicos, el cual está incorporado en el Comité de Microbiología del Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) de Estados
Unidos (Zacchino y Gupta, 2007). Las versiones originales de esos ensayos se dirigen a establecer de manera estandarizada la sensibilidad de cepas fúngicas hacia fungicidas comerciales utilizados en la clínica humana, y son una fuente de información valiosa para definir pautas en lo referente a la selección de especies microbianas, composición de medios de cultivo, preparación y densidad de inóculos, condiciones ambientales, duración, métodos de lectura y definición de niveles de respuesta a evaluar. Sin embargo, los metabolitos involucrados en defensa vegetal, como ser los antifúngicos, suelen estar presentes en muy bajo contenido en el peso seco de los órganos vegetales y frecuentemente también de los extractos derivados de estos últimos. El uso de versiones adaptadas permite por consiguiente
43 maximizar la detección de metabolitos antifúngicos. Los métodos más conocidos y utilizados para determinar la actividad antifúngica son los ensayos de difusión en agar y los de dilución en caldo y agar (Balouiri y col., 2016).
Otros métodos útiles para detectar la actividad antifúngica de extractos vegetales son las técnicas bioautográficas, las cuales también se pueden utilizar para guiar el aislamiento de sustancias activas (Becker y col., 2005;
Choma y Grzelak, 2011).
2.1.2.1 Método de difusión en agar: Consiste en inocular con un hongo un medio de cultivo sólido y depositar sobre su superficie los extractos o los compuestos a evaluar. Pueden colocarse sobre el medio discos de papel de filtro de aproximadamente 6 mm de diámetro impregnados con cantidades conocidas de las sustancias a ensayar o realizar pocillos en los que se colocan cantidades conocidas de un extracto o metabolitos vegetales. Las sustancias se dejan en contacto con el medio sólido previamente inoculado durante un determinado periodo de incubación para que los constituyentes difundan en el agar y visualizar crecimiento fúngico. Luego se miden los diámetros de las zonas de inhibición del crecimiento alrededor del disco o pocillo (Rex y col.,
2001; Balouiri y col., 2016), siendo posible diseñar el ensayo para determinar cuál es la dosis de extracto o metabolito más baja en la que es posible detectar inhibición fúngica (dosis inhibitoria mínima o DIM). Este método es de carácter semi-cuantitativo ya que la posibilidad de detectar actividad antifúngica está subordinada a que los metabolitos activos sean capaces de difundir en medio hidrofílico. Una técnica basada en el método de difusión en agar que permite calcular una concentración inhibitoria mínima o CIM es la prueba de epsilometría, más conocida como E-test. La misma consiste en la
44 utilización de una tira de plástico rectangular que, en una de sus caras, lleva impregnado un gradiente de concentración del antimicrobiano. La tira se coloca sobre un medio de cultivo agarizado inoculado con el microorganismo.
Al finalizar el periodo de incubación, la intersección entre el crecimiento del microorganismo y la zona de inhibición en forma de elipse indican la CIM (Lass-
Flörl y col., 2010).
2.1.2.2 Métodos de dilución: Permiten la determinación cuantitativa de la actividad antifúngica (Klančnik y col., 2010). Son los métodos más apropiados para la determinación del valor de CIM, el cual se define como la menor concentración de extracto o sustancia activa capaz de inhibir completamente el crecimiento fúngico (Balouri y col., 2016). En estos ensayos se mezcla una cantidad de extracto o compuesto activo en concentraciones crecientes con medio de cultivo, el cual se inocula con la cepa fúngica.
Pueden llevarse a cabo tanto en medio sólido (agar) como en medio líquido
(caldo) o semilíquido (caldo con 0,1% agar) e incluyen las siguientes técnicas:
– Dilución en agar: Consiste en incorporar cantidades crecientes de un extracto o metabolito secundario a medio de cultivo agarizado tibio. El medio conteniendo diferentes concentraciones de extracto o metabolito se vierte en cajas de Petri, se deja enfriar y se inocula con un hongo. Luego, se incuba en condiciones óptimas de crecimiento del microorganismo. Al finalizar el periodo de incubación se determina la concentración inhibitoria mínima
(CIM) la cual se puede observar visualmente y se define como la menor concentración de extracto o sustancia activa capaz de inhibir completamente el crecimiento del hongo (Derita y col., 2007).
45
– Dilución en medio líquido: Consiste en realizar diluciones dobles seriadas del antifúngico en medio líquido, el cual se inocula con una suspensión fúngica determinada y se incuba en condiciones óptimas de crecimiento (Rodriguez-Tudela y col., 2008). Posteriormente se determina visualmente la CIM o se pueden medir niveles de respuesta inhibitoria menores a la CIM sea por estimación visual o por medición de biomasa fúngica por lectura de absorbancia usualmente a 630 nm (Aristimuño Ficoseco y col.,
2014). Los ensayos de dilución en medio líquido pueden hacerse en pequeños
(microdilución) o grandes volúmenes (macrodilución). Muchas veces se utiliza para los primeros policubetas de 96 pocillos mientras que los segundos suelen realizarse en tubos de vidrio (Rodriguez-Tudela y col., 2008).
2.1.2.3 Métodos bioautográficos: El procedimiento es similar al utilizado en los métodos de difusión en agar. La diferencia radica en que el extracto o los compuestos ensayados difunden a un medio agarizado semi-sólido a partir de la fase estacionaria de un cromatofolio (bioautografía de siembra puntual) o un cromatograma de capa fina (biotautografía en cromatograma de capa fina). En la bioautografía por siembra puntual, diferentes cantidades de materia seca del extracto vegetal se siembran puntualmente sobre la fase estacionaria (Choma y Jesionek, 2015), siendo posible establecer cuál es la mínima dosis a la cual se observa halo de inhibición o dosis inhibitoria mínima
(DIM). En la bioautografía en cromatograma de capa fina, primeramente es necesario separar los constituyentes sea de un extracto, de una fracción del mismo o de un compuesto puro mediante cromatografía planar. El cromatograma obtenido es el que se ensaya, determinándose si existe coincidencia entre la posición de los halos de inhibición del crecimiento
46 fúngico y la de los constituyentes separados sobre la fase estacionaria. Las técnicas bioautográficas pueden diferir en base a cómo se ponen en contacto el hongo investigado y los antifúngicos presentes en la fase estacionaria planar (Choma y Grzelak, 2011). En la bioautografía de contacto, el cromatofolio o el cromatograma pueden colocarse transitoriamente sobre la superficie de un medio agarizado inoculado con un hongo por algunos minutos u horas para permitir la difusión de moléculas. Alternativamente puede realizarse una bioautografía de inmersión donde el cromatograma o cromatofolio se sumergen en medio de cultivo conteniendo el hongo, o una bioautografía directa donde el medio de cultivo se aplica en la superficie de la fuente de antifúngicos. Esta última es la más empleada. Tras la puesta en contacto, se procede a incubar en condiciones ambientales óptimas para el crecimiento fúngico, evaluándose posteriormente la aparición visual de halos de inhibición.
2.2 OBJETIVO
Determinar la actividad antifúngica de extractos de partes aéreas (hojas y tallos) procedentes de las especies autóctonas Amphilophium cynanchoides,
Tecoma stans, Jacaranda mimosifolia y Macfadyena cynanchoides sobre especies de Fusarium y Aspergillus responsables de podredumbres en cereales y uvas, respectivamente.
47
2.3 MATERIALES Y MÉTODOS
2.3.1 Material vegetal
Se recolectaron partes aéreas (hojas y tallos) de las especies
Amphilophium cynanchoides, Tecoma stans, Jacaranda mimosifolia y
Macfadyena cynanchoides durante febrero-marzo de 2014 en diferentes localidades de la provincia de Tucumán. Amphilophium cynanchoides (4 kg) se recolectó en la localidad de Tapia (Departamento Trancas) (26° 38' 59" latitud sur; 65° 27' 91" longitud oeste), Tecoma stans (5 kg) y Jacaranda mimosifolia (6 kg) en El Cadillal (Departamento Tafí Viejo) (26° 38' 58" latitud sur;
65° 13' 18" longitud oeste) y Macfadyena cynanchoides (5 kg) en el camino de ascenso a Villa Nougués (Departamento Lules) (26° 51' 29" latitud sur; 65° 21' 36" longitud oeste). La identidad del material vegetal recolectado se confirmó por comparación con especímenes depositados en el Herbario (Área Botánica) de la Fundación Miguel Lillo. Especímenes de referencia recolectados se depositaron en el LABIFITO (Laboratorio de Biología de Agentes Bioactivos y
Fitopatógenos, FBQF, UNT). Las hojas y tallos se separaron, se secaron en ambiente ventilado y se almacenaron en bolsas de papel a temperatura ambiente.
2.3.2 Preparación de los extractos vegetales
El esquema general de obtención de los extractos de las especies vegetales seleccionadas se indica en la Figura 13. Las hojas y tallos secos de cada especie vegetal se molieron en molino de cuchillas. Una cantidad conocida de cada material molido (45g) se extrajo por maceración secuencial con 200 mL de solventes de polaridad creciente (diclorometano,
48 acetato de etilo y metanol). El material vegetal se expuso a cada solvente orgánico durante 24h a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizó una filtración a través de papel de filtro Whatman N°1 y el material vegetal retenido se secó a 50°C antes de la maceración con el siguiente solvente orgánico. Los extractos filtrados se evaporaron hasta sequedad en evaporador rotatorio Buchi R-124 a 40°C. Los extractos secos obtenidos se referenciaron como fCH2Cl2, fAcet y fMeOH para el caso de diclorometano, acetato de etilo y metanol, respectivamente y se almacenaron a 4°C hasta su uso en los ensayos de actividad antifúngica. Se calcularon los rendimientos de extracción
(R) expresados en porcentaje, como:
R (%) = (Pes/Pmv) x 100
Pes: peso de extracto seco obtenido
Pmv: peso de material vegetal molido.
49
Hojas/Tallos molidos (45 g)
Maceración
Diclorometano (200 mL)
24h Filtrado Filtración Residuo vegetal seco Evaporación Presión reducida (40°C)
Maceración Extracto fCH2Cl2
Acetato de Etilo (200 mL) 24h Residuo vegetal Filtrado Filtración seco Evaporación Presión reducida (40°C) Maceración Extracto fAcet Metanol (200 mL)
24h Filtración
Filtrado Evaporación Presión reducida (40°C)
Extracto fMeOH
Figura 13. Protocolo para la extracción de los constituyentes con actividad antifúngica.
2.3.3 Microorganismos y condiciones de crecimiento
Se utilizaron los microorganismos Aspergillus carbonarius (cepa FRR 5690 aislada de uva en Australia), A. niger (cepa FRR 5695 aislada de suelo de viñedos en Australia), Fusarium verticillioides (cepa P364, aislada de maíz en
Pergamino, Argentina) y F. graminearum (cepa VI-II-3, aislada de trigo en La
50
Plata, Argentina). Todas las cepas fúngicas se conservaron por transferencia periódica cada 3-6 meses a través de sub-cultivos en medio SNA agar
(Spezieller Nährstoffarmer Agar: sacarosa 0,2 g; glucosa 0,2 g; KNO3 1 g; KH2PO4
1 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; KCl 0,5 g; agar 20 g en 1 L de agua destilada). Para favorecer el crecimiento y la esporulación, Aspergillus carbonarius y A. niger se incubaron durante 7 días a 30°C, Fusarium verticillioides durante 7 días a 25°C en oscuridad permanente y F. graminearum durante 14 días a 25°C con intervalos de 12h luz oscura (365 nm)/12h oscuridad.
2.3.4 Evaluación de la actividad antifúngica
2.3.4.1 Microdilución en medio semilíquido
Se determinó la actividad antifúngica de cada extracto mediante el método de microdilución empleando policubetas estériles de 96 celdas con fondo plano, de acuerdo al protocolo descripto en los documentos M38-A y M38-P con ligeras modificaciones (NCCLS, 2002;
Aristimuño Ficoseco y col., 2014). Se disolvió 5 mg de residuo seco de cada extracto en 20 µL de etanol (2%) y 980 µL de medio YES semilíquido
(composición en g/L: extracto de levadura 20; sacarosa 150; MgSO4 0,5, agar
1,3). A partir de esta solución se realizaron diluciones sucesivas a la mitad a fin de establecer un rango de concentraciones de 5000-4,8 µg/mL en medio YES con 2% de etanol. Se prepararon suspensiones de esporas (microconidios y macroconidios) mediante adición de agua destilada estéril a los cultivos fúngicos crecidos en medio SNA. Se contaron las esporas en cámara de
Neubauer y se diluyó con medio de cultivo YES semilíquido hasta obtener una suspensión con una concentración de 1x104 esporas/mL. Se adicionó a cada
51 pocillo 100 µL de la dilución de un extracto (fCH2Cl2, fAcet o fMeOH) y se inoculó con 100 µL de suspensión de esporas alcanzando un volumen final de
200 µL conteniendo 1% de etanol y concentraciones a la mitad de los extractos (2500-2,4 µg/mL) y de la suspensión de esporas (5x103 esporas/mL). Se realizaron controles de crecimiento con y sin la adición de etanol y controles de esterilidad de los extractos y del medio de cultivo. Se usaron como controles positivos los fungicidas comerciales propiconazol y ketoconazol en concentraciones comprendidas entre 50-1,56 µg/mL y los preservantes alimenticios metabisulfito de sodio contra las cepas de Aspergillus y sorbato de potasio sobre las cepas de Fusarium en concentraciones comprendidas entre
2500-39,1 µg/mL. Cada tratamiento se repitió 3 veces y los experimentos se realizaron por duplicado. Las policubetas se incubaron durante 48 y 72h a 30°C y a 25°C en los ensayos realizados con Aspergillus y Fusarium, respectivamente.
Al término de este período de incubación se realizaron lecturas de absorbancia a 630 nm en lector de microplacas ELX800 (BioTek). El promedio de las lecturas de absorbancia obtenidas para las diferentes concentraciones de extractos se corrigió utilizando las lecturas de los correspondientes controles. La concentración de extracto requerida para inhibir el 50% del crecimiento fúngico (CI50) se calculó junto con sus correspondientes intervalos de confianza (p=0,05) por análisis probit (Finney, 1971) mediante el uso del programa estadístico XLSTAT 2009.
2.3.4.2 Bioautografía directa por siembra puntual
Se sembraron puntualmente cantidades conocidas (2500; 1250;
625; y 312,5 g) de fCH2Cl2, fAcet y fMeOH obtenidos de hojas y tallos, un control
52 de solvente y un control positivo con ketoconazol de 25 g para Aspergillus niger y de 50 μg para A. carbonarius en placas de silica gel previamente tratadas con etanol para eliminar cualquier contaminación microbiana.
Posteriormente las placas se cubrieron con 3 mL de un medio de cultivo conteniendo 5x103 esporas/mL de Aspergillus niger, A. carbonarius, Fusarium verticillioides o F. graminearum. La difusión de compuestos antifúngicos desde la fase estacionaria se visualizó como halos de ausencia de crecimiento microbiano luego de 48h y 72h de incubación en el caso de Aspergillus y
Fusarium, respectivamente. Se definió la dosis inhibitoria mínima (DIM) como aquella más baja requerida por una sustancia para generar halo de inhibición de crecimiento fúngico. En la DIM se calculó el diámetro de inhibición (DI), el cual corresponde al promedio de dos diámetros de halo de inhibición perpendiculares entre sí.
2.3.5 Análisis estadístico
Los datos de actividad antifúngica (CI50) obtenidos en ensayos de microdilución se sometieron a un análisis probit mediante el uso de XLSTAT 2009 y se calcularon con un intervalo de confianza del 95%. Los datos de actividad antifúngica (DIM) obtenidos en ensayos de bioautografía por siembra puntual se sometieron a análisis de la varianza (ANOVA) y la diferencia entre medias de halos de inhibición se determinó a través de la prueba post-hoc T3 de
Dunnett. Los análisis estadísticos se condujeron a un nivel de significación de p=0,05.
53
2.4 RESULTADOS
2.4.1 Preparación del material vegetal y rendimientos de extracción
La cantidad de materia seca extraída y los rendimientos obtenidos para hojas y tallos de los extractos diclorometano (fCH2Cl2), acetato de etilo (fAcet) y metanol (fMeOH) de cada especie vegetal se indican en la Tabla 2.
Considerando un solvente de extracción (sea diclorometano, acetato de etilo o metanol), se observó para cada especie vegetal mayor rendimiento en materia seca para extractos de hojas que de tallos. A su vez, las cantidades de materia seca recuperadas de hojas y tallos con metanol fueron en general mayores respecto a las obtenidas con acetato de etilo y diclorometano
Tabla 2. Rendimientos de extracción obtenidos por maceración de partes aéreas (hojas y tallos) de Amphilophium cynanchoides, Tecoma stans, Jacaranda mimosifolia y Macfadyena cynanchoides con diclorometano, acetato de etilo y metanol.
Especie Parte Extracto seco Rendimiento vegetal vegetal obtenido (mg) (%) Hoja 482,6 1,07 A. cynanchoides Tallo 148,8 0,33 Hoja 1124,4 2,50 T. stans Tallo 183,8 0,41 Hoja 519,7 1,15 J. mimosifolia Tallo 230,2 0,51
Diclorometano Hoja 323,9 0,72 M. cynanchoides Tallo 146,6 0,33 Hoja 307,1 0,68 A. cynanchoides Tallo 112,0 0,25 Hoja 555,9 1,23 T. stans Tallo 80,4 0,18 Hoja 1440,9 3,20 J. mimosifolia Tallo 188,2 0,42
Acetatode etilo Hoja 177,6 0,39 M. cynanchoides Tallo 101,0 0,22 Hoja 2043,1 4,54 A. cynanchoides Tallo 1644,0 3,65 Hoja 4228,6 9,40 T. stans Tallo 951,5 2,11 Hoja 3896,4 8,66 J. mimosifolia Metanol Tallo 2769,1 6,15 Hoja 2121,4 4,71 M. cynanchoides Tallo 1238,1 2,75
54
2.4.2 Ensayos de microdilución en medio semilíquido
Los resultados de los ensayos de microdilución efectuados con los 24 extractos vegetales sobre las cuatro cepas fúngicas se presentan en la Tabla 3.
En el rango de concentraciones ensayado se obtuvieron nueve valores de CI50 de los cuales solo uno corresponde a un extracto de hoja. De ellos, 3 se alcanzaron sobre Fusarium graminearum (fCH2Cl2 de tallos de Amphilophium cynanchoides y Tecoma stans; fAcet de hojas de A. cynanchoides) y
Aspergillus niger (fCH2Cl2 y fAcet de tallos de A. cynanchoides; fCH2Cl2 de tallos de Macfadyena cynanchoides), 2 sobre F. verticillioides (fCH2Cl2 y fAcet de tallos de A. cynanchoides) y 1 sobre A. carbonarius (fCH2Cl2 de tallos de M. cynanchoides). Los extractos diclorometano de tallos presentaron valores de
CI50=1025-1066 µg/mL, significativamente más bajos que los restantes registrados (CI50 =1305-2032 µg/mL), siendo además los únicos que fueron capaces de suprimir el crecimiento fúngico (CIM=2500 µg/mL) sobre Aspergillus niger y A. carbonarius (Figura 14).
Los fungicidas propiconazol y ketoconazol fueron más efectivos que los extractos y los preservantes alimenticios ensayados. La actividad antifúngica del propiconazol (CI50=0,4-2 µg/mL) fue mayor que la del ketoconazol (CI50 =2-6
µg/mL). El metabisulfito de sodio presentó valores de CI50 (1250 µg/mL) y CIM
(2500 µg/mL) similares a los obtenidos con el extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides frente a las cepas de Aspergillus.
55
2500 1250 625 312,5 156,2 78,1 2500 1250 625 312,5 156,2 78,1 Concentración ensayada [µg/mL] A B
Controles de crecimiento de Control de esterilidad del medio A. niger y A. carbonarius de cultivo y del extracto
Figura 14. Ensayo de microdilución del extracto fCH2Cl2 de tallos de Macfadyena cynanchoides sobre (A) Aspergillus niger y (B) A. carbonarius.
2.4.3 Ensayos de bioautografía directa por siembra puntual
En la Tabla 4 se presentan los resultados de los ensayos bioautográficos realizados con los 24 extractos vegetales sobre las cuatro cepas fúngicas. Se observaron halos de inhibición en siete de los nueve casos en los cuales anteriormente se registraron CI50 en ensayos de microdilución. Las excepciones se visualizaron en el extracto diclorometano de tallos de Amphilophium cynanchoides ensayado sobre Aspergillus niger y Fusarium verticillioides.
También se obtuvieron valores de DIM para extractos ensayados sobre determinadas especies fúngicas que no demostraron contra estas últimas actividad inhibitoria en ensayos de microdilución. Situaciones de este tipo se observaron para los extractos fCH2Cl2 de hojas de Amphilophium cynanchoides sobre Fusarium graminearum y de tallos de Macfadyena cynanchoides contra ambas cepas de Fusarium. El último extracto mencionado fue el único capaz de generar valores de DIM sobre las cuatro
56 cepas fúngicas investigadas (DIM=625 µg para Aspergillus niger y DIM=1250 µg para A. carbonarius y ambas especies de Fusarium). Los halos de inhibición correspondientes fueron mayores en los hongos del género Aspergillus (DI=5,0-
6,8 mm) (Figura 15) que en aquellos de Fusarium (DI=1,8-2,5 mm).
2500 µg 1250 µg
Ketoconazol
625 µg 312,5 µg
Figura 15. Ejemplo de bioautografía por siembra puntual. Se observa DIM del
extracto fCH2Cl2 de tallos de Macfadyena cynanchoides. La cepa fúngica ensayada es Aspergillus niger. Diámetro de halo ( ).
57
Tabla 3. Concentraciones de fCH2Cl2, fAcEt y fMeOH de hojas y tallos de las especies Bignoniáceas y de los antifúngicos comerciales investigados necesarias para inhibir el 50% (CI50) del crecimiento fúngico. Aspergillus carbonarius Aspergillus niger Fusarium graminearum Fusarium verticillioides Parte Extracciones 1 2 vegetal CI50 LC (95%) CI50 LC (95%) CI50 LC (95%) CI50 LC (95%) (µg/mL) LI LS (µg/mL) LI LS (µg/mL) LI LS (µg/mL) LI LS
Hoja >2500 - - >2500 - - >2500 - - >2500 - - Diclorometano Tallo >2500 - - 1738 1305 2476 1978 1530 2826 2032 1507 2790 Hoja >2500 - - >2500 - - 1320 1119 1607 >2500 - - Acetato de etilo Tallo >2500 - - 1569 1191 2195 >2500 - - 1305 1104 1591 Hoja >2500 - - >2500 - - >2500 - - >2500 - - Amphilophium cynanchoides Metanol Tallo >2500 - - >2500 - - >2500 - - >2500 - - Hoja >2500 - - >2500 - - >2500 - - >2500 - - Diclorometano Tallo >2500 - - >2500 - - 1392 1138 1781 >2500 - - Hoja >2500 - - >2500 - - >2500 - - >2500 - - Acetato de etilo Tallo >2500 - - >2500 - - >2500 - - >2500 - - Hoja >2500 - - >2500 - - >2500 - - >2500 - - Tecoma stans Metanol Tallo >2500 - - >2500 - - >2500 - - >2500 - -
Diclorometano Hoja >2500 - - >2500 - - >2500 - - >2500 - - Tallo 1066 929 1127 1025 960 1178 >2500 - - >2500 - - Hoja >2500 - - >2500 - - >2500 - - >2500 - - Acetato de etilo Tallo >2500 - - >2500 - - >2500 - - >2500 - -
Macfadyena Hoja >2500 - - >2500 - - >2500 - - >2500 - - cynanchoides Metanol Tallo >2500 - - >2500 - - >2500 - - >2500 - - Ketoconazol 6 5 6 4 4 4 4 3 4 2 2 2 Propiconazol 2 1 2 0,5 0,4 0,6 0,4 0,4 0,5 0,4 0,3 0,5 Metabisulfito de sodio 1250 1143 1312 1250 1170 1295 NE - - NE - - Antifúngicos comerciales Sorbato de potasio NE - - NE - - 625 530 710 625 600 740 1Concentración Inhibitoria del 50%, 2Limites de confianza del 95% (LI, límite inferior; LS, límite superior), NE: No ensayado 58
Tabla 4. Dosis inhibitoria mínima (DIM) y sus correspondientes halos de inhibición observados para extractos fCH2Cl2, fAcet y fMeOH provenientes de hojas y tallos de las especies Bignoniáceas nativas investigadas.
Aspergillus carbonarius Aspergillus niger Fusarium graminearum Fusarium verticillioides Parte Halo de Halo de Halo de Halo de Extracciones DIM1 DIM DIM DIM vegetal inhibición2 inhibición inhibición inhibición (µg ms/disco) (µg ms/disco) (µg ms/disco) (µg ms/disco) (mm) (mm) (mm) (mm)
3 Diclorometano Hoja - - - - 312,5 5,0±1a - - Tallo - - - - 1250 4,0±1a - - Hoja - - - - 312,5 5,7±2a - - Acetato de etilo Tallo - - 2500 3,0±0,5a - - 1250 5,5±2a Hoja ------cynanchoides Amphilophium Metanol Tallo ------Hoja ------Diclorometano Tallo - - - - 312,5 5,3±1a - - Hoja ------Acetato de etilo Tallo ------Hoja ------Tecoma stans Metanol Tallo ------
Diclorometano Hoja ------Tallo 625 5,0±1a 1250 6,8±1b 1250 2,5±0,5b 1250 1,8±0,1b
Acetato de etilo Hoja ------Tallo ------Hoja ------Macfadyena
cynanchoides Metanol Tallo ------1DIM=dosis inhibitoria mínima expresada en µg de materia seca por disco. 2Datos de diámetros de inhibición se informan como valores de media ± desviación estándar, basado en dos experimentos donde cada tratamiento presentó tres repeticiones. Medias en la misma columna con la misma letra no difieren significativamente (test T3 de Dunnet, p=0,05). 3 (-) No se detectó halo de inhibición.
59
2.5 DISCUSIÓN
La búsqueda de agentes antifúngicos en plantas requiere primero la identificación de extractos vegetales que los contengan. Cuando los extractos bioactivos poseen una composición muy compleja, la actividad suele derivar de la interacción de los múltiples constituyentes presentes, perdiéndose la misma rápidamente durante el aislamiento y purificación de moléculas. Es por consiguiente deseable trabajar con extractos de composición lo menos compleja posible. En este capítulo, se intentó disminuir la complejidad de la muestra al separar las partes aéreas de cada especie vegetal en tallos y hojas, y al extraer los constituyentes de esos órganos en base a sus polaridades. En las especies vegetales en las cuales se detectó actividad antifúngica, los criterios de preparación de extractos mencionados permitieron eliminar grandes paquetes de metabolitos que evidentemente no aportaban bioactividad, como ser por ejemplo los compuestos más polares o, en la mayoría de los casos, los constituyentes inactivos presentes en hojas. Es importante notar que tanto los ensayos de microdilución como los bioautográficos emplearon esporas asexuales, las cuales son uno de los inóculos frecuentemente involucrados en el primer contacto planta-hongo tanto en las especies de
Fusarium como en las de Aspergillus (Jones y Epstein, 1990; Osherov y May,
2001; Deising y col., 2012).
Sin embargo, el 77% de los valores de CI50 (7/9) obtenidos en los ensayos de microdilución estuvieron asociados a valores de DIM registrados en bioautografía, o inversamente podría decirse que el 70% de los valores de DIM
(7/10) estuvieron representados por valores de CI50. Estas diferencias probablemente se deben a la diferente naturaleza de los ensayos empleados.
60
Los ensayos de microdilución evalúan el efecto antifúngico de la totalidad de los constituyentes de un extracto vegetal sea que estén disueltos o suspendidos homogéneamente en el medio de cultivo (Medina y col., 2012), mientras que los bioautográficos permiten establecer si esos compuestos son solubles en medio hidrofílico, propiedad importante que puede definir la efectividad de control de hongos fitopatógenos en condiciones naturales. En los primeros, las concentraciones de ensayo se establecen previamente a la ejecución del mismo mientras que en los segundos se generan gradientes que muchas veces determinan la exposición fúngica a concentraciones más elevadas que aquellas evaluadas en microdilución (Hadacek y Greger, 2000).
Independientemente de estas consideraciones, los resultados de actividad biológica indican por primera vez la presencia de metabolitos antifúngicos en extractos de Amphilophium cynanchoides y Macfadyena cynanchoides.
Zampini y col. (2007) demostraron la actividad antibacteriana del extracto hidroalcohólico de la planta entera de Amphilophium cynanchoides frente a bacterias patógenas humanas (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Morganella morganii, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y
Stenotrophomonas maltophilia) mediante ensayos de difusión en agar, macrodilución en medio sólido y microdilución en medio líquido. Por otro lado,
Torres y col. (2013) demostraron que los extractos hidroalcohólicos de partes aéreas de otra especie de Amphilophium (A. vauthieri) suprimieron el crecimiento de otras bacterias patógenas humanas (Staphylococcus aureus,
S. epidermidis y Enterococcus faecalis), mediante ensayos de difusión en agar, microdilución en medio líquido y bioautografía por siembra puntual. Binutu y
61
Lajubutu (1994) estudiaron la actividad antimicrobiana de hojas y tallos de cuatro especies Bignoniáceas, entre ellas Tecoma stans, y demostraron que los extractos metanólicos de tallos presentaron mayor actividad antimicrobiana que los de hojas. Si bien no existen investigaciones más recientes sobre la actividad antifúngica de tallos de Tecoma stans, Kottai Muthu y col. (2012) demostraron que sus extractos etanólicos y metanólicos del duramen fueron antifúngicos frente a diferentes hongos filamentosos, incluyendo a Aspergillus niger, mediante ensayos de difusión en agar. Javid y col. (2015) evaluaron la actividad antifúngica de la planta entera de Tecoma stans mediante el método de dilución en agar y demostraron que los extractos obtenidos con n- hexano, cloroformo y butanol inhibieron el crecimiento de Aspergillus niger, no así el extracto obtenido con acetato de etilo. La actividad antifúngica de tallos de Jacaranda mimosifolia no fue reportada aún sobre hongos filamentosos. Sidjui y col. (2014) demostraron la actividad antifúngica de metabolitos secundarios de extractos de tallos de Jacaranda mimosifolia obtenidos por maceración con diclorometano y metanol en una relación 1:1
(v/v) sobre Candida albicans mediante la técnica de difusión en agar. A su vez, Sidjui y col. (2016) demostraron la actividad antibacteriana de los extractos de corteza de Jacaranda mimosifolia obtenidos por maceración con diclorometano y metanol en una relación 1:1 (v/v) mediante los métodos de microdilución y difusión con discos en agar. Respecto a la especie
Macfadyena cynanchoides, aún no existen reportes sobre su actividad antifúngica. En este trabajo se demostró que su extracto diclorometano de tallos presentó la mayor actividad inhibitoria sobre las cepas fúngicas investigadas.
62
2.6 CONCLUSIONES
1) Los ensayos de microdilución y bioautográficos indicaron actividad
antifúngica en los extractos obtenidos con solventes de mediana y baja
polaridad. Fueron bioactivos en ambos ensayos el extracto acetato de
etilo de tallos de Amphilophium cynanchoides sobre Aspergillus niger y
Fusarium verticillioides; el de hojas de la misma planta sobre F.
graminearum; los extractos diclorometano de tallos de A. cynanchoides
y Tecoma stans sobre F. graminearum y de Macfadyena cynanchoides
sobre ambas cepas de Aspergillus. Algunos solamente fueron activos en
microdilución (el extracto diclorometano de tallos de Amphilophium
cynanchoides sobre Aspergillus niger y Fusarium verticillioides) y otros
solo en ensayo bioautográfico (el extracto diclorometano de hojas de
A. cynanchoides sobre F. graminearum y el extracto diclorometano de
tallos de Macfadyena cynanchoides sobre ambas cepas de Fusarium).
2) El extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides fue
el que presentó los más bajos valores de CI50 (1025-1066 µg/mL) y el
único que suprimió completamente el crecimiento fúngico en ensayos
de microdilución (CIM=2500 µg/mL), con una CIM similar a la del
metabisulfito de sodio. En bioautografía por siembra puntual, el mismo
inhibió el crecimiento de todas las cepas fúngicas ensayadas, siendo las
de Aspergillus más sensibles que las de Fusarium.
63
2.7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Capítulo 3: Aislamiento e identificación de moléculas antifúngicas procedentes del extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides
69
3.1 INTRODUCCIÓN
3.1.1 Metabolitos antifúngicos y su rol en el reino vegetal
Las plantas sintetizan y liberan o acumulan moléculas orgánicas con estructuras químicas muy diversas, las cuales constituyen prácticamente la
única vía que tienen para interaccionar con su entorno (Bieto y Cubillo, 2008).
De las 250.000 a 750.000 especies de plantas superiores existentes en el mundo, sólo entre el 5% y el 15% se investigaron por sus compuestos biológicamente activos. Se estima que existen alrededor de 400.000 metabolitos secundarios, de los que actualmente se conocen aproximadamente 10.000 (2,5% del total), los cuales se obtuvieron de 2.121 especies vegetales distribuidas dentro de 30 familias (Balandrin y col., 1985). En el caso de los antifúngicos vegetales, y de acuerdo a cómo se sintetizan, podemos distinguirlos en:
1) Fitoanticipinas: son aquellas moléculas antimicrobianas que se sintetizan constitutivamente y por consiguiente están presentes en los tejidos vegetales antes del ataque de hongos fitopatógenos (VanEtten y col., 1995).
Estas sustancias suelen presentarse en altas concentraciones en tejidos jóvenes de las plantas que los producen, disminuyendo su contenido relativo en los
órganos a medida que éstos alcanzan su estado adulto. Las fitoanticipinas pueden ser compuestos fenólicos, glucosinolatos, glucósidos cianogénicos, saponinas, alcaloides, dienos, y agentes antinutricionales (ej. aminoácidos no proteicos como la canavanina). Muchas fitoanticipinas son precursores de moléculas antifúngicas, siendo necesario la acción de una o más enzimas específicas que provoquen la liberación de estas últimas (Leicach y col., 2009).
Son ejemplos de este tipo de liberación los glicósidos cianogénicos en gramíneas y frutales de carozo (hueso) y pepita, y los glucosinolatos en
70 brasicáceas como el rábano o el repollo. Existen fitoanticipinas que se encuentran en forma activa en determinados compartimentos celulares o sectores definidos en los órganos vegetales, como los 5-n-alquilresorcinoles ubicados entre el pericarpio y la testa seminal en granos de cereales invernales (Sampietro y col., 2013), y las saponinas almacenadas en vacuolas
(Mert-Türk, 2006). Las fitoanticipinas pueden ser sintetizadas y/o almacenadas en determinadas células (ej, la benzoquinona sorgoleona exclusivamente sintetizada en pelos radiculares de sorgo, el dímero sesquiterpénico gosipol sintetizado en estructuras glandulares ubicadas en las plantas de algodón). Las anticipinas se transportan frecuentemente al interior de las vacuolas como conjugados de carbohidratos o aminoácidos. Otras veces están unidas a estructuras apoplásticas, es el caso de los fenilpropanoides presentes en elevados contenidos en paredes celulares de pericarpio de granos de cereales, involucrados en la resistencia de los mismos a Fusarium (Sampietro y col., 2012). También pueden estar incrustados en la matriz de cubiertas exteriores de los órganos que los contienen, como la cutícula epidérmica. Tal es el caso de los alquilresorcinoles en ceras foliares de varias especies de cereales (Sampietro y col., 2013). La probabilidad de detectar fitoanticipinas en extractos vegetales es relativamente elevada, si consideramos el carácter constitutivo que presenta la expresión de las mismas en las plantas que las producen.
2) Fitoalexinas: son aquellos metabolitos antimicrobianos cuya síntesis es inducida en la planta en presencia de un agente promotor o elicitor (Leicach y col., 2009). Este último puede ser una molécula orgánica proveniente del cuerpo de la planta o el patógeno (muchas veces son poli u oligosacáridos
71 derivados de la pared celular, péptidos o glicoproteínas), o un estrés abiótico químico (ej., sales de cobre) o físico (ej., radiaciones ultravioleta). Usualmente estas moléculas se acumulan rápidamente en el sitio de infección del patógeno. Al igual que las fitoanticipinas, pueden presentar estructuras químicas muy diversas, procedentes de una o más vías metabólicas. Especies de una misma familia vegetal usualmente producen fitoalexinas de igual naturaleza química. Lo mismo puede decirse para muchas fitoanticipinas, razón por la cual tanto unas como otras suelen poseer importancia en estudios quimiotaxonómicos de familias vegetales (Sampietro y col., 2009). Por ejemplo, en especies de las Fabáceas como la soja y el poroto suelen detectarse fitoalexinas tipo flavonoide o isoflavonoide, mientras que Solanáceas como la papa y el tomate comúnmente producen fitoalexinas con estructura tipo sesquiterpenoide.
Muchos metabolitos vegetales no siempre responden funcionalmente al rol fitoanticipina o fitoalexina descriptos con anterioridad. Por ejemplo, algunas moléculas preexistentes antes del ataque de patógenos, incrementan sus niveles en presencia de un estrés biótico o abiótico (ej. los ácidos hidroxámicos en gramíneas). Existen algunas sustancias que en ciertas plantas presentan el papel de fitoanticipina y en otras el de fitoalexina. También se conoce que muchas veces un mismo metabolito secundario confiere simultáneamente protección a la planta contra especies pertenecientes a varios reinos de los seres vivos y a la vez provee a la especie productora propiedades farmacológicas útiles para el hombre (Gutzeit y Ludwig-Müller, 2014).
72
3.1.2 Separación y purificación de constituyentes antifúngicos
La identificación y cuantificación de constituyentes antifúngicos requiere primeramente separarlos de los extractos vegetales de los cuales proceden con la finalidad de obtenerlos total o parcialmente puros. Para ello existen varios métodos de separación de sustancias, los cuales se denominan genéricamente como métodos cromatográficos. Estos últimos permiten separar componentes de una mezcla por distribución de los mismos entre dos fases, una estacionaria que puede ser sólida o líquida y una móvil, líquida o gaseosa que pasa a través de la primera (IUPAC, 1993). El proceso de separación de cada sustancia es el resultado de un equilibrio entre dos conjuntos de fuerzas opuestas, las de propulsión, promovidas por el flujo de la fase móvil y las de retención, originadas por la fase estacionaria. De este modo, cada sustancia migra de forma diferencial, conforme a sus propias características físicas y al tipo de fuerzas intermoleculares que pueda establecer con ambas fases. En este trabajo se emplearon procedimientos cromatográficos sólido-líquido y gas-líquido o gas-sólido.
3.1.2.1 Cromatografías sólido-líquido
- Cromatografía en capa fina (CCF): Consiste en el uso de una placa de vidrio o aluminio recubierta con una capa delgada de una fase estacionaria, usualmente silica gel o celulosa. Las muestras se siembran en la parte inferior de la placa cromatográfica o cromatofolio a una determinada distancia del borde. El extremo inferior de la placa se sumerge en una fase móvil, la cual asciende por capilaridad. Cuando la fase estacionaria es silica gel, permite la separación de los constituyentes de acuerdo a su polaridad
73 dado que los componentes más polares son más retenidos por la fase estacionaria que los menos polares, resultando así el cromatograma respectivo
(Harvey, 2000). Un compuesto será menos retenido por la silica gel al aumentar la polaridad del solvente utilizado como fase móvil. La CCF es una técnica muy empleada para el análisis preliminar de los constituyentes de extractos de plantas ya que es un procedimiento simple, rápido y de bajo costo que permite analizar y comparar los componentes de varias muestras en un mismo cromatograma (Kovač-Bešović y Durić, 2003; Santiago y Strobel, 2013).
- Cromatografía en columna (CC): Involucra el empaquetamiento de una columna con un sólido que actúa como fase estacionaria (ej. adsorbentes como la alúmina o la silica gel), a través del cual se hace pasar una fase móvil líquida. La mayor o menor adsorción a la fase estacionaria determinará cómo se distribuyen los componentes entre ésta y la fase móvil, produciéndose la separación de acuerdo a la polaridad de los mismos. Es una técnica muy utilizada en la separación de constituyentes naturales (Kenkel, 2003; Chakravarti y col., 2016).
3.1.2.2 Cromatografías gas-líquido o gas-sólido
- Cromatografía gaseosa (CG): Consiste en inyectar una pequeña cantidad de la muestra cuyos constituyentes se desea separar en una corriente de gas inerte (helio o argón) a elevada temperatura. La corriente de gas atraviesa una columna cromatográfica que separará los componentes de la muestra por un mecanismo de partición (cromatografía gas-líquido), de adsorción (cromatografía gas-sólido) o por una mezcla de ambos. La cromatografía gas-líquido es la más empleada y consiste en un líquido no volátil inmovilizado en la superficie de un sólido inerte. La CG es muy
74 utilizada en el análisis y purificación de compuestos naturales debido a su elevada resolución, sensibilidad y precisión (Harborne, 1998; Ismail y Nielsen,
2010).
3.1.3 Identificación de productos naturales
3.1.3.1 Visualización de sustancias en cromatografía en capa fina
Una vez separados los constituyentes de un extracto, sus fracciones o constituyentes total o parcialmente purificados mediante CCF, es necesario visualizar la presencia y la posible naturaleza química de los mismos. Para ello se pueden emplear:
- Métodos físicos: Son no destructivos y consisten en irradiar el cromatograma con luz UV de onda corta (254 nm) o larga (365 nm). Muchos cromatofolios contienen agentes capaces de fluorescer a 254 nm, lo cual muchas veces permite estimar preliminarmente la cantidad relativa en que se encuentran determinados constituyentes. Esta propiedad le confiere al método universalidad en su capacidad para revelar la presencia de sustancias
(Touchstone y Dobbins, 1977; Sasidharan y col., 2011).
- Métodos químicos: Consisten en asperjar el cromatograma de capa fina con una solución que contiene un reactivo capaz de desarrollar color al reaccionar con metabolitos que contienen determinados grupos funcionales
(Sasidharan y col., 2011). Existe una gran variedad de reactivos cromogénicos, los cuales varían según la naturaleza química de las sustancias que se desean visualizar. En este trabajo se utilizó p-anisaldehído, empleado en el revelado de terpenos y esteroides (Touchstone y Dobbins, 1977), y ácido 2-aminoetil difenil
75 bórico/polietilenglicol (NP-PEG) usado en la detección de flavonoides (Wagner y Bladt, 1996).
3.1.3.2 Espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis)
La espectroscopia UV-Vis se basa en la diferente capacidad que poseen los metabolitos secundarios vegetales de absorber radiación electromagnética en longitudes de onda correspondientes a la luz visible y al ultravioleta cercano (Harborne, 1998; Anouar y col., 2014). El análisis espectrofotométrico de extractos, o más frecuentemente, de sus fracciones o constituyentes total o parcialmente purificados suelen proveer evidencias de la posible presencia de tipos estructurales básicos característicos de determinados metabolitos secundarios. La espectroscopia UV-Vis es uno de los métodos más utilizados para el análisis de constituyentes vegetales debido a su simplicidad y bajo costo, siendo especialmente utilizada durante el aislamiento y elucidación estructural de compuestos fenólicos y sus derivados (Lombard y col., 2002; Dhivya y Kalaichelvi, 2017).
3.1.3.3 Espectrometría de masas
La espectrometría de masas (EM) es una técnica analítica que proporciona información cualitativa (estructura y masa molecular) y cuantitativa, al relacionar la intensidad iónica con la cantidad de sustancia presente en la muestra. Las moléculas se vaporizan y se someten dentro de un sistema de baja presión a una fuente de electrones que provoca la ruptura de las mismas, generándose iones de diferente masa/carga (m/z). Estos últimos posteriormente se aceleran en un campo magnético que los dispersa
76 permitiendo obtener sus abundancias relativas en función de m/z (El-Aneed y col., 2009).
Figura 16. Diagrama de un espectrómetro de masas
3.2 OBJETIVO
Identificar los metabolitos secundarios procedentes del extracto diclorometano (fCH2Cl2) de tallos de Macfadyena cynanchoides con actividad antifúngica sobre especies toxigénicas de los géneros Fusarium y
Aspergillus.
3.3 MATERIALES Y MÉTODOS
3.3.1 Material vegetal
El extracto diclorometano (fCH2Cl2) de tallos de la especie Macfadyena cynanchoides se obtuvo de acuerdo al protocolo detallado en el punto 2.3.2 del capítulo 2, y se seleccionó para la identificación de constituyentes bioactivos ya que presentó la mayor actividad antifúngica sobre las cepas estudiadas (sección 2.5).
77
3.3.2 Microorganismos
Se utilizaron los hongos filamentosos Aspergillus carbonarius (cepa FRR
5690 aislada de uva en Australia), A. niger (cepa FRR 5695 aislada de suelo de viñedos en Australia), Fusarium verticillioides (cepa P364, aislada de maíz en
Pergamino, Argentina) y F. graminearum (cepa VI-II-3, aislada de trigo en La
Plata, Argentina) cuyas condiciones de crecimiento fueron establecidas en el punto 2.3.3 del capítulo 2.
3.3.3 Separación de los constituyentes antifúngicos por CCF
Los constituyentes del extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides se separaron mediante CCF en placas de silica gel G60 F254
(Merck), empleando como fase móvil diclorometano: n-hexano : acetato de etilo : ácido fórmico (8,5:1:0,4:0,1; v/v). Los cromatogramas se observaron bajo luz visible y luz UV de onda corta (254 nm) y larga (365 nm) y posteriormente se revelaron con reactivos específicos para flavonoides (NP-PEG bajo luz UV365 nm) y para terpenos (p-anisaldehído con posterior exposición a 105°C). La posición relativa de las bandas visualizadas en los cromatogramas se estableció mediante el cálculo de la relación de frente (Rf):
Rf=Db/Df
Donde:
Db=Distancia recorrida por la banda desde el punto de siembra.
Df=Distancia recorrida por la fase móvil desde el punto de siembra
(frente de corrida).
78
3.3.4 Bioautografía de cromatogramas en capa fina (CCFBio)
Los cromatogramas obtenidos mediante CCF para el extracto fCH2Cl2 de Macfadyena cynanchoides se sometieron a CCFBio frente a Aspergillus carbonarius y A. niger. Se sembraron 2500 µg de extracto en cromatofolios de silica gel G60 F254 (Merck) previamente tratados con etanol para eliminar la posible contaminación microbiana y se realizó una corrida cromatográfica empleando como fase móvil diclorometano : n-hexano : acetato de etilo :
ácido fórmico (8,5:1:0,4:0,1; v/v). Se dejó evaporar el solvente en condiciones asépticas bajo corriente de flujo laminar. Luego, los cromatogramas se colocaron en placas de Petri estériles y se cubrieron con 3 mL de medio malta- peptona (extracto de malta 15 g/L, peptona 5 g/L, sacarosa 20 g/L) con 0,8% de agar conteniendo una suspensión de 5x103 esporas/mL de las cepas de
Aspergillus o Fusarium. Las placas se incubaron durante 48h a 30°C para
Aspergillus y 72 h a 25°C para Fusarium. Zonas sobre la placa con ausencia de crecimiento micelial indicaron la presencia de compuestos antifúngicos.
3.3.5 Separación de constituyentes bioactivos mediante CC
Las bandas activas identificadas previamente en CCFBio se separaron mediante CC de silica gel (0,040-0,063 mm). Para ello, 120 g de silica gel suspendidos en n-hexano se empaquetaron en una columna de vidrio de 2,8 cm de diámetro, la cual se equilibró con n-hexano. Luego, un peso conocido del extracto (4 g) se disolvió en 20 mL de n-hexano: acetato de etilo: diclorometano (17:1:2, v/v). La separación de los constituyentes se realizó mediante una elución en gradiente, comenzando con una fase móvil constituida por n-hexano : diclorometano : acetato de etilo (8,5:1:0,5; v/v). La
79 polaridad se incrementó gradualmente disminuyendo la proporción de n- hexano a partir de la fracción 33. Se colectaron en total 125 fracciones de 20 mL cada una. La composición de las mismas se monitoreó mediante CCF, utilizando como referencias el extracto diclorometano y colesterol. Los cromatogramas se observaron directamente y luego de visualizarlos bajo luz
UV de onda corta (254 nm) y larga (365 nm) y de revelarlos químicamente con p-anisaldehído y calentamiento a 105°C. En base al análisis de las CCF obtenidas, las fracciones se combinaron en 12 grupos (G1 a G12) y se evaporaron a sequedad en rotavapor Buchi R-124 bajo presión reducida. La actividad antifúngica de los grupos de fracciones se determinó mediante bioautografía por siembra puntual y CCFBio utilizando para ambos métodos
500 µg de muestra y 3 mL de un inóculo fúngico de cada cepa de Aspergillus o
Fusarium a una concentración de 5x103 esporas/mL de medio malta-peptona agar. Posteriormente, se realizó una segunda CC del grupo con mayor actividad antifúngica empleando 5 g de silica gel suspendidos en n-hexano para empaquetar la columna, la cual se equilibró empleando el mismo solvente. La elución se realizó en gradiente, partiendo de una fase móvil constituida por n-hexano: acetato de etilo (15:1, v/v) y aumentando gradualmente la polaridad disminuyendo la proporción de n-hexano a 12:1 a partir de la fracción 10 y luego a 9:1 desde la fracción 14. Se obtuvieron en total 32 fracciones, las cuales fueron combinadas de acuerdo al seguimiento realizado mediante CCF en 8 grupos (1b a 8b). Se evaporaron a sequedad en rotavapor a 50°C y los residuos recuperados se ensayaron nuevamente mediante bioautografía por siembra puntual y CCFBio.
80
3.3.6 Bioautografía directa por siembra puntual
Se sembró puntualmente una cantidad conocida (500 μg) de cada uno de los grupos procedentes de las fracciones recuperadas de la CC de silica gel del extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides en placas de silica gel previamente tratadas con etanol y se cubrieron con medio de cultivo que contenía individualmente una suspensión de esporas de
Aspergillus carbonarius, A. niger, Fusarium verticillioides o F. graminearum de acuerdo al protocolo establecido en el punto 2.3.4.2 del capítulo 2. Al finalizar el período de incubación se visualizaron los halos de ausencia de crecimiento microbiano y se calculó el diámetro de inhibición (DI), el cual corresponde al promedio de dos diámetros de halo de inhibición perpendiculares entre sí.
3.3.7 Análisis de los constituyentes bioactivos mediante espectroscopia UV-Vis
Los grupos 2b y 4b obtenidos en la segunda CC y un estándar de lapachol (Sigma) fueron disueltos en etanol absoluto y analizados en un espectrofotómetro Beckman DU650 en un rango de longitudes de onda de
200-800 nm. Los espectros de absorbancia obtenidos se compararon con el espectro del estándar y con espectros previamente publicados (Thomson,
1971; Medeleanu y col., 1998; Harborne y col., 1998; Marković y col., 2013;
Segoloni y Di María, 2018).
3.3.8 Identificación de los constituyentes bioactivos mediante CG-EM
Los residuos secos de los grupos 2b y 4b recuperados en la segunda CC se disolvieron en 1 mL de diclorometano y se inyectó 1 µL de cada uno en un cromatógrafo gaseoso ThermoElectron modelo Trace GC Ultra (Thermo
Electron Corp, Madison, WI) equipado con una columna DB-5 (5%-fenil-
81 metilpolisiloxano, 30 m x 0,25 mm DI y una película polimérica de 0,25 µm de espesor como fase estacionaria) acoplado a un detector de espectrometría de masas ThermoElectron modelo Polaris Q (Thermo Electron Corp, Madison,
WI). Se empleó Helio como fase móvil a un flujo de 1 mL/min con modo split en una relación10:1. El programa de temperatura aplicado fue: 60°C (4 min), 60–
300°C (rampa 10°C/min), 300°C (12 min). Se utilizó un analizador de trampa de iones, la ionización se realizó por impacto electrónico a 70 eV durante 0,25 min y el método de adquisición empleado fue de barrido completo (modo full scan) de 50 a 500 a.m.u. Los constituyentes de los grupos 2b y 4b se identificaron mediante la comparación de sus espectros de masas con los almacenados en la base de datos Wiley/NIST. Los índices de retención de cada compuesto identificado se calcularon en relación a n-alcanos
(Aristimuño Ficoseco y col., 2014).
3.3.9 Actividad antifúngica de los grupos 2b y 4b
La actividad antifúngica de los grupos 2b y 4b se evaluó mediante la técnica de microdilución descripta en el punto 2.3.4.1 del capítulo 2 frente a
Aspergillus carbonarius, A. niger, Fusarium verticillioides y F. graminearum. El rango de concentraciones ensayado para ambos compuestos fue de 1250-9,8
µg/mL. Se preparó una suspensión fúngica con una concentración final de
5x103 esporas/mL. Se usó como control positivo de actividad antifúngica propiconazol para las 4 especies fúngicas, metabisulfito de sodio para
Aspergillus y sorbato de potasio para Fusarium. Se incluyeron controles de crecimiento y de esterilidad del medio de cultivo y de los grupos. Cada tratamiento se repitió 3 veces y los experimentos se realizaron por duplicado.
82
Las microplacas se incubaron durante 48h a 30°C para las cepas de Aspergillus y durante 72h a 25°C para las cepas de Fusarium. Al finalizar el tiempo de incubación se determinó visualmente la concentración inhibitoria mínima
(CIM) necesaria para inhibir el 100% del crecimiento fúngico.
3.4 RESULTADOS
3.4.1. Detección de bandas con constituyentes bioactivos mediante CCFBio
La actividad antifúngica detectada en las CCFBio del extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides frente a las cepas de
Aspergillus y Fusarium estuvo asociada a 5 bandas visibles bajo UV254nm con Rfs comprendidos entre 0,79 y 0,53. La inhibición del crecimiento fúngico fue más notable y evidente sobre ambas cepas de Aspergillus. La Figura 17 muestra el patrón de bandas del extracto fCH2Cl2 obtenido mediante CCF con diclorometano : n-hexano : acetato de etilo : ácido fórmico (8,5:1:0,4:0,1; v/v) observado con luz visible, bajo luz ultravioleta de onda corta y larga y revelado con NP-PEG y p-anisaldehído. También presenta en su lado derecho los CCFBio frente a Aspergillus niger y A. carbonarius correspondientes a esos patrones de bandas. De las 5 bandas mencionadas, las 1 y 2 presentaron Rfs muy cercanos entre sí (Rfs 0,79 y 0,76, respectivamente) y se observaron visiblemente de color amarillo-anaranjado. Bajo luz UV de onda larga (365 nm) la banda 1 se observó de color pardo oscuro, mientras que la banda 2 presentó un color rosado. La banda 3 (Rf=0,70) no presentó color a simple vista y tampoco fluorescencia bajo luz UV365nm. La banda 4 (Rf=0,63) se detectó a simple vista de color verde y de color rojo bajo luz UV254nm. La banda 5 no se detectó a simple vista ni con luz UV365nm. No obstante, fue la única banda asociada a la
83 actividad antifúngica que fue revelada con p-anisaldehído, lo cual indica la posible presencia de terpenos. Al revelar con NP-PEG, no se observó ningún cambio lo cual es un indicativo de que el extracto no presenta flavonoides.
A B C D E F G
1 2 3 4 5
Figura 17. CCF del extracto fCH2Cl2 de tallos de Macfadyena cynanchoides observada con (A) luz visible, (B) luz UV254 nm, (C) luz UV365 nm y revelada con (D) p-anisaldehído y (E) NP-PEG. También se observan bioautografías asociadas a CCF frente a (F) Aspergillus niger y (G) A. carbonarius. Los números arábigos 1, 2, 3, 4 y 5 indican las bandas con Rf=0,79, 0,76, 0,70, 0,63 y 0,56, respectivamente, cuya posición se superpone con los halos de inhibición observados en las bioautografías.
3.4.2 Separación de constituyentes antifúngicos mediante CC
La bioautografía por siembra puntual de los grupos G1 a G6 procedentes de las fracciones recuperadas de la CC de silica gel del extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides indicó halos de inhibición fúngica en los grupos G4 (DI=0,4 cm), G5 (DI=0,5 cm) y G6 (DI=1,2 cm). El grupo G7 también generó un halo de inhibición de diámetro similar al observado para el grupo G4. La Figura 18 muestra la imagen representativa de las bioautografías por siembra puntual efectuadas sobre las especies de
Aspergillus. Los grupos que combinaron fracciones posteriores a las reunidas por el grupo G7 no inhibieron el crecimiento fúngico. La Figura 19 muestra las
CCF de los 12 grupos obtenidos de la primera columna empaquetada con
84 silica gel, observados bajo luz visible, luz UV de onda corta (254 nm) y larga
(365 nm) y revelados con p-anisaldehído. Bajo luz UV254nm se detectó que en los grupos G5, G6 y G7 se concentraron los constituyentes correspondientes a las 5 bandas coincidentes con los halos de inhibición observados en la Figura 16. Las bandas de mayor intensidad bajo luz UV de 254 nm fueron las 1 y 2 (Rfs 0,79 y
0,76, respectivamente) y se visualizaron de color amarillo-anaranjado a simple vista bajo luz visible y de color pardo oscuro bajo luz UV de 365 nm. La actividad inhibitoria de grupo G6 condujo a realizar una CCF en silica gel y
CCFBio del mismo sobre las cepas de Aspergillus (Figura 20). Se observó que el halo de inhibición se centralizó en las bandas de color amarillo-anaranjado anteriormente mencionadas. En los ensayos de bioautografía por siembra puntual y CCFBio de los grupos obtenidos en la segunda CC de silica gel de los constituyentes que presentaron mayor actividad (grupo G6 obtenido de la primera CC), se detectó actividad antifúngica en los grupos 2b, 3b y 4b. Las
CCFBio de los mismos indicaron halos de inhibición en Rfs correspondientes a las bandas amarillo-anaranjado sobre ambas cepas de Aspergillus (Figura 21).
G1 G2 G3
G6 G5 G4
Figura 18. Bioautografía por siembra puntual de los grupos G1-G6 obtenidos mediante CC frente a Aspergillus niger. Se marca límites del halo de inhibición del grupo G6 ( ).
85
A B
EC C 1 2 3 4 EC C 5 6 7 8 EC C 9 10 11 12 EC C 1 2 3 4 EC C 5 6 7 8 EC C 9 10 11 12
C D
EC C 1 2 3 4 EC C 5 6 7 8 EC C 9 10 11 12 EC C 1 2 3 4 EC C 5 6 7 8 EC C 9 10 11 12 Figura 19. Cromatogramas en capa fina de silica gel desarrollados con diclorometano:n-hexano:acetato de etilo:ácido fórmico (8,5:1:0,4:0,1 v/v) de los 12 grupos obtenidos en la separación por cromatografía en columna del extracto fCH2Cl2 de tallos de Macfadyena cynanchoides, visualizados (A) con luz visible, (B) bajo luz UV de 365 nm, (C) bajo luz UV de 254 nm y (D) con p-anisaldehído. Los números arábigos del 1-12 indican los grupos G1-G12 de fracciones obtenidos. Se incluyó como referencia el extracto crudo (EC) y colesterol (C).
86
AB CD
Rf1 Rf2
Figura 20. CCF del grupo 6 visualizado (A) con luz visible, (B) bajo luz UV de 365 nm y (C) bajo luz UV de 254 nm. Rf1= 0,79; Rf2=0,76. (D) CCFBio del grupo G6 frente a Aspergillus niger.
A B
Figura 21. (A) CCF del grupo 2b observado con luz visible y (B) CCFBio frente a Aspergillus niger, representativa de lo observado para grupos 2b, 3b y 4b frente a ambas cepas de Aspergillus.
87
3.4.3 Espectroscopia UV-Vis
Los grupos 2b y 4b en sus respectivas CCF, visualmente se observaron como una única banda (Rf= 0,79 y Rf=0,76, respectivamente). Estos grupos de fracciones al ser disueltos en etanol eran coloreados, por lo que se procedió a obtener los espectros de absorbancia UV-Vis de los mismos (Figura 22 y 23, respectivamente) con el fin de determinar evidencias de la posible naturaleza química de los constituyentes presentes. Los picos del espectro superior con máximos en 276 nm y 486 nm se ubicaron dentro de los rangos de longitudes de onda de 240-290 nm y 400-510 nm anteriormente informados para compuestos con estructuras tipo naftoquinona (Thomson, 1971; Medeleanu y col., 1998; Segoloni y Di María, 2018). Un espectro UV-Vis de un estándar de lapachol generó picos con máximos de absorbancia coincidentes a aquellos observados en Figura 22, lo cual era también conducente a considerar que efectivamente el grupo 2b contenía elevada concentración de una o más naftoquinonas. En la Figura 23, se observan cuatro picos con máximas absorbancias en 217, 257, 329 y 505 nm. La presencia de estos picos, tres en rango de ultravioleta cercano al visible y uno a longitud de onda mayor a 430 nm es compatible con la posible presencia en grupo 4b de elevados contenidos de una o más antraquinonas (Harborne y col., 1998; Marković y col., 2013).
88
1,0 276
0,5 Absorbancia
486
0 200 800 Longitud de onda [nm]
Figura 22. Espectro de absorbancia UV-Vis del grupo 2b.
2,0 257
217 1,5
1,0 Absorbancia 0,5 329 505
200 800 Longitud de onda [nm]
Figura 23. Espectro de absorbancia UV-Vis del grupo 4b.
89
3.4.4 CG-EM de los grupos 2b y 4b
Los grupos 2b y 4b se sometieron a CG-EM. Los cromatogramas de las
Figuras 24 y 25 muestran que ambos grupos presentaron picos con tiempos de retención (Tr) de 21,66 min (compuesto 1) y 23,05 min (compuesto 2). El compuesto 1 domina la composición del grupo 2b (89,84 %), con pequeña presencia de compuesto 2 (6,73 %). Lo opuesto se observó en el grupo 4b
(9.81%, compuesto 1; 79,80 % compuesto 2). El remanente de constituyentes detectados en los grupos 2b y 4b (3,43% y 10,39%, respectivamente) no fueron identificables, con porcentajes de participación individual comprendidas entre
1 y 3%. Los espectros de masas del compuesto 1 (Figura 26) y 2 (Figura 27) presentaron una coincidencia mayor al 90% con aquellos existentes en la base de datos Wiley/NIST para lapachol (2-hidroxi-3-(3-metil-2-butenil)-1,4- naftoquinona) y 1-hidroxi-4-metil antraquinona (1H4MA).
90
Abundancia relativa (%) relativa Abundancia
Tiempo (min) Figura 24. Cromatograma obtenido por CG-EM de grupo 2b
Abundancia relativa (%) relativa Abundancia
Tiempo (min) Figura 25. Cromatograma obtenido por CG-EM de grupo 4b
91
Abundancia relativa (%) relativa Abundancia
m/z Figura 26. Comparación de espectros de masas del compuesto 1 con el de lapachol existente en base de datos Wiley/NIST, representativa de lo observado para el pico de Tr=21,66 min para los grupos 2b y 4b.
Abundancia relativa (%) relativa Abundancia
m/z Figura 27. Comparación de espectros de masas del compuesto 2 con el de 1-hydroxy- 4-metil antraquinona existente en la base de datos Wiley/NIST, representativa de lo observado en el pico de Tr=23,05 min para los grupos 2b y 4b.
92
La Figura 28 permite comprender el patrón de fragmentación observado en el espectro de masa para lapachol (Elwood y col., 1970). El fragmento correspondiente al pico base (m/z=227) se genera por pérdida de un grupo metilo (-CH3) de la cadena lateral. La pérdida de una molécula de agua da lugar a la formación del fragmento m/z 209. La pérdida de –CO de este fragmento conduce a la liberación de los fragmentos m/z 181 y m/z 153. La pérdida de la cadena carbonada (-C3H7) de la molécula de iso-lapachol, genera el fragmento m/z 199, a partir del cual se forman los fragmentos m/z
171, m/z 143 y m/z 115 por pérdidas secuenciales de –CO.
+
+ + + -H2O C14H9O2 -CO C13H9O -CO C12H9 m/z 209 m/z 181 m/z 153
m/z 242 m/z 227
Lapachol -CH3· +
-C3H7· -CO
m/z 171 m/z 242 m/z 199 Iso-lapachol -CO
+ C9H7 -CO m/z 115
m/z 143 Figura 28. Ruta de fragmentación de lapachol (Elwood y col., 1970).
A la fecha no se ha reportado la ruta de fragmentación de iones del compuesto 1H4MA. En este trabajo de tesis se evidenciaron por primera vez algunos de los fragmentos iónicos (m/z 220 y m/z 210) correspondientes al patrón de fragmentación observado en el espectro de masas de la 1H4MA
(Figura 29)
93
-CO
m/z 238 m/z 210
-H2O
m/z 220
Figura 29. Algunos iones liberados durante la fragmentación de la 1H4MA
3.4.5 Actividad antifúngica de los compuestos identificados
La Tabla 7 muestra las mínimas concentraciones necesarias para alcanzar
100% de inhibición del crecimiento fúngico (CIM) obtenidas para los grupos 2b y 4b al ser ensayados sobre Aspergillus carbonarius, A. niger, Fusarium verticillioides y F. graminearum. También se representan los valores de CIM del extracto diclorometano, de propiconazol, metabisulfito de sodio y sorbato de potasio. Los antifúngicos comerciales fueron incluidos en los ensayos como controles positivos de actividad. Ambos grupos inhibieron completamente el crecimiento de Aspergillus, siendo el grupo 4b, 4 y 8 veces más activo que el grupo 2b frente a A. niger y A. carbonarius, respectivamente. El propiconazol fue 4 veces más activo frente a Aspergillus niger, alcanzando valores de CIM de 4 µg/ml para A. carbonarius y 1 µg/mL para A. niger. Al ensayar la actividad antifúngica del metabisulfito de sodio se observó igual inhibición para ambas
94 cepas (CIM=2500 µg/mL), siendo el valor de CIM alcanzado similar al registrado para el extracto. No obstante, la actividad antifúngica del preservante alimentario fue 2 y 16 veces menor que la actividad de los grupos 2b y 4b, respectivamente, frente a Aspergillus carbonarius y 8 y 32 veces menor frente a
A. niger. Respecto a las cepas de Fusarium, la especie más sensible a la actividad antifúngica fue F. graminearum. También se puede observar que la actividad del grupo 4b fue 2 veces mayor que la del grupo 2b. Las cepas de
Fusarium no difieren entre sí en sus valores de CIM enfrentadas a propiconazol
(CIM=1,6 µg/mL) y a sorbato de potasio (CIM=1250 µg/mL). De acuerdo a los resultados obtenidos, la actividad inhibitoria del sorbato de potasio frente a
Fusarium graminearum resultó ser 2 y 4 veces menor que la de los grupos 2b y
4b, respectivamente. Respecto a Fusarium verticillioides, los valores de CIM del sorbato de potasio y del grupo 2b fueron similares; no obstante, el grupo 4b resultó ser 2 veces más activo que el preservante alimentario.
Tabla 7. Mínima concentración del grupo 2b y grupo 4b necesarias para inhibir el 100% (CIM) del crecimiento fúngico de Aspergillus carbonarius, A. niger, Fusarium verticillioides y F. graminearum CIM (µg materia seca/mL) Compuesto ensayado A. carbonarius A.niger F. verticillioides F. graminearum Grupo 2b 1250 312,5 1250 625
Grupo 4b 156,2 78,1 625 312,5
Extracto diclorometano 2500 2500 >2500 >2500
Propiconazol 4 1 1,6 1,6
Metabisulfito de sodio 2500 2500 NE NE
Sorbato de potasio NE NE 1250 1250 NE: no ensayado
95
3.5 DISCUSIÓN
La búsqueda de constituyentes antifúngicos procedentes del extracto diclorometano (fCH2Cl2) condujo a la separación de dos grupos de fracciones ricas en compuestos fenólicos pertenecientes al grupo de las quinonas, los cuales se informan por primera vez como constituyentes de tallos de
Macfadyena cynanchoides. Los compuestos identificados son los pigmentos lapachol (una naftoquinona) y 1-hidroxi-4-metil antraquinona (1H4MA). El lapachol se aisló por primera vez en 1882 de la corteza del lapacho
(Handroanthus impetiginosus). También se aisló de la corteza de tallo y raíz de otras especies Bignoniáceas tales como Paratecoma peroba (Sanderman y col., 1968), Phyllarthron comorense (Joshi y col., 1973), Stereospermum tetragonum (Purushothaman y Natarajan, 1974), Stereospermum suaveolens
(Joshi y col., 1977), Radermachera sinica (Inoue y col., 1981), Millingtonia hortensis (Prakash y Garg, 1981), Catalpa longíssima (Chauhan y col., 1988),
Macfadyena unguis-cati (Duarte y col., 2000), Melloa quadrivalvis (De Andrade
Lima y col., 2005), Newbouldia laevis (Eyong y col., 2005) y Kigelia pinnata
(Singh y col., 2010) y de otras especies pertenecientes a las familias
Scrophulariaceae, Verbenaceae, Malvaceae, Leguminosae, Proteaceae, y
Sapotaceae (Hussain y col, 2007). En relación a la 1H4MA, este metabolito se aisló previamente de la raíz de Ceratotheca triloba, una especie vegetal perteneciente a la familia de las Pedaliáceas (Mohanlall y col., 2011). Sin embargo, no existen informes previos de su presencia en especies
Bignoniáceas.
Existe una importante cantidad de trabajos que informan sobre actividad biológica de naftoquinonas y antraquinonas vegetales (López y col., 2011;
96
2014; Qiu y col., 2017). En el caso particular del lapachol, anteriormente se informó para esta sustancia efectos biológicos que le confieren potencial terapéutico en medicina como ser las actividades antimicrobiana sobre organismos patógenos humanos, tanto hongos filamentosos y levaduriformes
(de Souza y col., 2008) como bacterias (Eyong y col., 2012); antioxidante
(Wenceslau y col., 2006), antiinflamatoria (Landa y col., 2013), antimalárica
(Kapadia y col., 2001), antidepresiva (Eyong y col., 2013a), gastroprotectora
(Theoduloz y col., 2013), e incluso antineoplásica (Fiorito y col., 2014; Xu y col.,
2016). Sin embargo, pocos informes se ocupan de su posible uso en el control de enfermedades agrícolas. En alta concentración (100 mg/mL) el lapachol inhibió 74% la absorción de oxígeno de un parásito causante de la malaria,
Plasmodium knowlesi, afectando el ciclo de Krebs y la cadena de transporte de electrones al inhibir la actividad del complejo succinato oxidasa (Hussain y col., 2007). Otros autores demostraron que el lapachol presentó actividad antibacteriana frente a Helicobacter pylori, Staphylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Bacillus y Clostridium y actividad antifúngica frente a Cándida y
Cryptococcus en ensayos de microdilución (Portillo y col., 2001; Breger y col.,
2007). Existen solo dos informes sobre el efecto de lapachol sobre hongos toxigénicos. Ensayos de microdilución indicaron que el mismo alcanzó la CIM en 200 µg/mL sobre A. niger, un valor muy cercano al informado en esta tesis doctoral (Binnutu y col., 1996). El lapachol fue capaz de inhibir 92% el crecimiento de Fusarium oxysporum al ser administrado en macrodilución a concentración de 500 µg/mL. En igual concentración, no provocó fitotoxicidad en semillas germinantes de lechuga (de Souza y col., 2008). No existen informes
97 previos sobre actividad de lapachol sobre Aspergillus carbonarius, Fusarium verticillioides y F. graminearum.
Las antraquinonas se caracterizan por su gran variedad estructural y su amplio rango de actividades biológicas (Fouillaud y col., 2016). Presentan actividades antibacteriana (Ayo y col., 2007), antifúngica (Barros y col., 2011;
Singh, 2014), antineoplásica (Singh, 2014), antidiabética (Lee y Sohn, 2008), antioxidante (Mellado y col., 2013), antiinflamatoria (Park y col., 2016) y antiviral
(Mohammed y col., 2013), como así también propiedades hepato, neuro y cardioprotectoras, entre otras (Izhaki, 2002; Singh, 2014). En el caso particular de 1H4MA, en este capítulo se la informa por primera vez con actividad antifúngica sobre especies toxigénicas de Fusarium y Aspergillus. Mohanlall y
Odhav (2013) demostraron la actividad antibacteriana de este compuesto frente a Bacillus sp, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Micrococcus sp,
Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Salmonella typhimurium y
Staphylococcus sp en ensayos de microdilución en un rango de concentraciones entre 40-1000 µg/mL. No obstante, hay estudios reportados sobre la actividad antifúngica de otras antraquinonas. En ese sentido, Mishra y col. (2010) demostraron que la 1-metil-2-(3-metil-but-2-eniloxi)-antraquinona aislada de semillas de Aegle marmelos Correa presentó actividad antifúngica frente a Aspergillus fumigatus, A. flavus, A niger y Cándida albicans en ensayos de difusión en agar con valores de DIM de 6,25 µg/disco y en ensayos de microdilución con valores de CIM comprendidos entre 31,25 y 62,5 µg/mL.
La potencia antifúngica de los grupos 2b y 4b demostró ser mayor a la de los preservantes alimentarios y menor a la del fungicida azol ensayado, lo cual es una situación frecuentemente observada para antifúngicos de naturaleza
98 fenólica ensayados sobre hongos toxigénicos (Quiroga y col., 2009; Jiménez y col., 2014). Los valores de CIM obtenidos para los grupos 2b y 4b indica que ellos fueron moderadamente antifúngicos (0,10 mg/mL < CIM ≤ 1,00 mg/mL) sobre Aspergillus niger y Fusarium graminearum y demostraron baja actividad
(CIM > 1,00 mg/mL) sobre A. carbonarius y F. verticillioides (Pandini y col., 2015).
El grupo 4b manifestó fuerte actividad antifúngica (CIM ≤ 0,10 mg/mL) sobre
Aspergillus niger y moderada sobre las restantes especies.
3.6 CONCLUSIONES
1) Se identificaron dos grupos de fracciones (2b y 4b) procedentes del
extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides capaces
de suprimir el crecimiento de las cuatro cepas fúngicas investigadas. Los
constituyentes de las mismas son una naftoquinona (lapachol) y una
antraquinona (1-hidroxi-4-metil antraquinona).
2) En microdilución, las especies de Aspergillus y Fusarium fueron más sensibles
al grupo 4b, rica en 1-hidroxi-4-metil antraquinona, que al grupo 2b
constituido mayoritariamente por lapachol.
3) La bioactividad observada sobre los hongos toxigénicos indicó efectos
antifúngicos moderados a débiles (grupo 2b) y fuertes a moderados
(grupo 4b) de acuerdo a los rangos de actividad establecidos como
parámetros de referencia internacionales.
99
3.7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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108
Capítulo 4: Caracterización de la actividad antifúngica de los grupos 2b y 4b recuperados del extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides
109
4.1 INTRODUCCIÓN
4.1.1 Importancia de los agentes antifúngicos de Macfadyena cynanchoides en el control de hongos toxigénicos
En el capítulo anterior se determinó la composición de dos grupos de fracciones antifúngicas del extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides denominadas 2b y 4b. La actividad biológica de estos últimos es consecuencia de la presencia de compuestos fenólicos pertenecientes al grupo de las quinonas. Como se indicó precedentemente en el capítulo 3, el grupo 2b demostró una actividad antifúngica moderada sobre Aspergillus niger y Fusarium graminearum y débil frente a A. carbonarius y F. verticillioides, mientras que el grupo 4b demostró un efecto inhibitorio fuerte sobre A. niger y moderado frente a las restantes especies fúngicas. Investigaciones dirigidas a productos naturales vegetales, y en particular a compuestos fenólicos, indican que moléculas o mezclas de ellas con moderada o débil actividad antifúngica debilitan mecanismos de respuesta de los hongos al estrés, incrementando la sensibilidad de estos últimos hacia biocidas o biostáticos comerciales (Kim y col., 2010; Campbell y col., 2012). Algunos ejemplos referidos al control de especies de Fusarium involucradas en este trabajo de tesis son la fracción etérea del follaje de Zuccagnia punctata rica en 2',4'-dihidroxichalcona y 2',4'- dihidroxi-3'-metoxichalcona sinergista de fungicidas azoles y preservantes de grado alimentario (Jimenez y col., 2014), o la fracción de alquilcatecoles procedente de follaje de especies del género Schinopsis, las cuales sinergizan el efecto de azoles (Aristimuño Ficoseco y col., 2017). En este trabajo de tesis, el efecto conjunto entre los extractos, fracciones o moléculas mencionados y los antifúngicos comerciales se efectuó mediante diseños en tablero de ajedrez
110 en ensayos de microdilución (Vitale y col., 2005), lo cual permite establecer a un determinado nivel de respuesta inhibitoria del crecimiento fúngico la concentración inhibitoria fraccional (CIF) y el índice de concentración inhibitoria fraccional (ICIF), con el fin de comprender si las interacciones son sinérgicas, aditivas o antagónicas.
4.1.2 Compuestos fenólicos como agentes antimicotoxigénicos
La búsqueda de antifúngicos naturales frecuentemente se centra más en los efectos letales de las sustancias investigadas que en aquellos que pueden presentar en concentraciones sub-letales o sub-supresoras del crecimiento fúngico (Nazzaro, 2017). En el caso de los compuestos fenólicos, algunos de ellos en dosis sub-letales demostraron quebrar la dominancia apical en la germinación de macroconidios de Fusarium graminearum y manifestaron actividad antimicotoxigénica al inhibir la cantidad de fumonisinas y tricotecenos producida por unidad de biomasa fúngica. Estas respuestas estuvieron asociadas a un desbalance de la homeostasis redox fúngica en favor de la desaparición de formas reactivas de oxígeno
(Aristimuño Ficoseco y col., 2014; 2017). Anteriormente se propuso la teoría de la existencia de cambios en el desarrollo fúngico mediados por el estrés oxidativo. Esta teoría plantea que la producción de micotoxinas y otras modificaciones en el desarrollo fúngico, como ser la esporulación y la inducción de germinación de esporas y dominancia apical en la germinación de macroconidios, son consecuencias de estallidos oxidativos sub-letales
(Reverberi y col., 2010). Los compuestos fenólicos en concentraciones sub- letales afectarían la homeostasis redox fúngica en sentido inverso a la
111 generación de esos estallidos, lo cual explicaría los efectos anteriormente descriptos. En base a evidencias previas, no se puede sugerir la universalidad de esta teoría, ya que los factores ambientales (ej. actividad agua, temperatura y composición de sustrato) podrían influir en la homeostasis redox, siendo la interacción de éstos con las moléculas fenólicas las que determinarían globalmente la respuesta fúngica (Aristimuño Ficoseco y col.,
2017). Por este motivo, la actividad antimicotoxigénica de compuestos fenólicos debería siempre evaluarse bajo condiciones ambientales lo más parecidas posible a aquellas en las cuales los hongos toxigénicos usualmente generan sus podredumbres (Sampietro y col., 2018).
En el capítulo anterior se determinó que los compuestos fenólicos de los grupos 2b y 4b ejercieron el mayor efecto inhibitorio sobre Aspergillus niger, respecto a las otras especies fúngicas estudiadas. Tanto Aspergillus niger como
A. carbonarius son los principales contaminantes de uvas en climas cálidos y húmedos y los mayores productores de OTA en uvas y vinos (Terra y col., 2014), principalmente a 15°C (Leong y col., 2006b; Passamani y col., 2014). Teniendo en cuenta que el metabisulfito de sodio es el principal preservante alimenticio utilizado en uvas y vinos, se decidió evaluar el efecto antiocratoxigénico de los grupos 2b, 4b y metabisulfito de sodio, solos y en combinación, sobre ambas especies de Aspergillus estudiadas. Se eligió como sustrato jugo de uva natural ya que presenta una composición similar a la uva (Battilani y col., 2001). Los resultados obtenidos permitirán realizar una estimación de lo que ocurriría en uvas dañadas contaminadas con estas especies de Aspergillus durante su almacenamiento en post-cosecha en concentraciones sub-letales o sub- supresoras de crecimiento, ya que cuando el producto antifúngico aplicado a
112 las uvas en contenedores no se distribuye de forma uniforme, se crean gradientes de concentración que estimulan en ciertas zonas el crecimiento fúngico y por lo tanto, la producción de micotoxinas.
4.1.3 Riesgo micotoxigénico de especies de Aspergillus productoras de OTA en uvas y vinos
La presencia de OTA representa un riesgo para la salud humana y animal. Es por este motivo que la Unión Europea estableció límites de 2 µg/L de
OTA para jugos de uvas, mostos y vinos y 10 µg/L para uvas (European
Commission, 2006). La mejor estrategia para evitar la contaminación con OTA en uvas y productos derivados es prevenir el crecimiento de hongos micotoxigénicos antes de la cosecha y luego, en post-cosecha, durante el almacenamiento o la elaboración de vinos, mediante buenas prácticas agrícolas y la aplicación de fungicidas (Magan y Aldred, 2007; Ponsone y col.,
2012). Las elevadas temperaturas y la humedad provocada por continuas lluvias durante el periodo de madurez de la uva pueden provocar daños en la piel del fruto favoreciendo la penetración de hongos productores de OTA
(Stratakou y van der Fels-Klerx, 2010). A su vez, se debe tener cuidado con el uso de fungicidas ya que algunos de ellos, tales como el carbendazim en dosis sub-letales reduce el crecimiento fúngico pero estimula la producción de OTA
(Amézqueta y col., 2009). Estudios realizados por Zouhair y col. (2014) demostraron que la aplicación de dosis sub-letales de hexaconazol, pirimetanil o azoxistrobin disminuyen el crecimiento de A. niger y A. carbonarius pero incrementan la producción de OTA. Las condiciones de almacenamiento para uvas de mesa también representan un riesgo de contaminación con OTA. Por
113 ello se realizan a temperaturas lo más bajas posibles que eviten el desarrollo de hongos pero que no provoquen daños en las uvas. En uvas destinadas a vinificación los riesgos de contaminación con OTA se minimizan con un transporte rápido hacia las bodegas y condiciones de sanidad (Visconti y col.,
2008). Ciertos autores demostraron que las mayores concentraciones de OTA se encuentran en vinos dulces y frecuentemente son más altas en vinos tintos que en blancos y rosados (Burdaspal y col., 2007; Brera y col., 2008). Esto se debe principalmente a las diferencias en el proceso de vinificación durante la etapa de maceración la cual favorece el desplazamiento de OTA desde los hollejos hacia el mosto (Welke y col., 2009). Además durante el transcurso de la fermentación alcohólica la producción de etanol incrementa la solubilidad de la OTA, contribuyendo a aumentar su concentración en el vino (Fernandes y col., 2007). No obstante, el nivel de OTA disminuye durante el trasiego y la clarificación del vino debido a la adsorción de la micotoxina a las levaduras y sólidos suspendidos que serán removidos (Leong y col. 2006a).
4.1.4 Detección y cuantificación de OTA
Existen diferentes métodos para la detección y cuantificación de OTA:
– Cromatografía en capa fina (CCF): es ampliamente usada para su detección rutinaria ya que es un método rápido. Acoplada a densitometría, la misma permite realizar un análisis cuantitativo (Braicu y col., 2008).
– Cromatografía líquida de alta presión acoplada a detector de fluorescencia (HPLC-FL): es uno de los métodos más utilizados para la cuantificación de OTA ya que es una técnica sensible, precisa y reproducible.
114
La detección de la micotoxina es posible gracias a que fluoresce bajo luz UV
(Tessini y col., 2010).
– Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (CL-EM/EM): Es una técnica muy empleada en la detección de OTA ya que presenta una gran sensibilidad y especificidad (Bandeira y col., 2013).
– Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas: Más conocido por su acrónimo inglés ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), es uno de los métodos más elegidos debido a su sensibilidad, especificidad y simplicidad
(Zhang y col., 2011; Meulenberg, 2012). En este trabajo de tesis se utilizará la técnica de ELISA competitivo en la cual la OTA presente en la muestra
(antígeno) compite con un conjugado enzima-OTA (marcador) por un número limitado de sitios específicos de unión a anticuerpos (Figura 30). Cuanto mayor sea la cantidad de micotoxina presente en la muestra, menor será la unión de la micotoxina marcada. La detección de OTA se realiza mediante el agregado de un sustrato cromogénico incoloro que será trasformado por la enzima del conjugado en una sustancia coloreada. La cantidad de OTA presente en la muestra se determinará por absorbancia. Esta cuantificación es indirecta y competitiva puesto que los valores de absorción registrados son inversamente proporcionales a las concentraciones de OTA libre presente. Por consiguiente, una mayor intensidad de color implica una concentración más baja de la micotoxina en la muestra (Maragos y Plattner, 2002).
115
Superficie del pocillo cubierta con anticuerpo OTA libre Conjugado enzima-OTA de captura
Adición de OTA libre y conjugado enzima-OTA
Captura de OTA libre y conjugada
Generación de color por oxidación de un sustrato cromogénico (TMB), catalizada por la enzima del conjugado enzima-OTA
Figura 30. Immunoensayo enzimático competitivo.
El antígeno mencionado en la imagen es ocratoxina A (OTA). Los pocillos están cubiertos con anticuerpos específicos contra OTA (anticuerpos de captura). La OTA en muestras o estándares se agrega en solución junto con un conjugado OTA-enzima. Las OTA y OTA-conjugada compiten por los sitios de unión de anticuerpo de captura. La fracción de OTA-conjugada que permanece libre se elimina por lavados sucesivos. Un sustrato enzimático (ej. peróxido de hidrógeno o peróxido de urea) y un agente cromogénico (ej. tetrametilbenzidina o TMB) se adicionan en los pocillos, dejándose incubar un lapso de tiempo, en el cual la enzima conjugada con OTA transforma el TMB de su estado original incoloro a color azul. La adición de un reactivo de detención de la reacción (ácido sulfúrico) causa que el color pase de azul a amarillo. El desarrollo de color puede medirse a 450 nm, siendo los valores de
116 absorbancia obtenidos inversamente proporcionales a la concentración de
OTA en una muestra.
4.2 OBJETIVOS
1) Evaluar el efecto conjunto entre los antifúngicos vegetales (grupo 2b, grupo 4b y extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides) y comerciales (metabisulfito de sodio y sorbato de portasio) sobre el crecimiento de Fusarium y Aspergillus.
2) Determinar la actividad antiocratoxigénica del grupo 2b, del grupo
4b y del extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides solos y en combinación con metabisulfito de sodio.
4.3 MATERIALES Y MÉTODOS
4.3.1 Microorganismos
Se utilizaron los hongos filamentosos Aspergillus carbonarius (cepa FRR
5690 aislada de uva en Australia), A. niger (cepa FRR 5695 aislada de suelo de viñedos en Australia), Fusarium verticillioides (cepa P364, aislada de maíz en
Pergamino, Argentina) y F. graminearum (cepa VI-II-3, aislada de trigo en La
Plata, Argentina) cuyas condiciones de crecimiento fueron establecidas en el punto 2.3.3 del capítulo 2.
117
4.3.2 Efecto conjunto entre antifúngicos vegetales y comerciales sobre el crecimiento fúngico
Se evaluó el efecto de los grupos 2b y 4b y del extracto diclorometano en mezclas con propiconazol frente a Aspergillus y Fusarium y en combinación con sorbato de potasio y metabisulfito de sodio sobre Fusarium y Aspergillus, respectivamente. El efecto conjunto se determinó mediante ensayos de microdilución empleando la técnica de tablero de ajedrez (Vitale y col., 2005).
Los rangos de concentraciones ensayados fueron de 1250-2,4 µg/mL (grupos
2b y 4b), 2500-4,8 µg/mL (extracto), 4,0-0,6 µg/mL (propiconazol) y 2500-39
µg/mL (metabisulfito de sodio y sorbato de potasio). Por otro lado, se preparó una suspensión fúngica con una concentración final de 5 x 103 esporas/mL. Se incluyeron controles de crecimiento y de esterilidad del medio de cultivo y de las sustancias naturales. En la Figura 31 se representa una microplaca de 96 pocillos mostrando el diseño en tablero de ajedrez para droga A (antifúngico comercial, sea propiconazol, metabisulfito de sodio o sorbato de potasio) y B
(grupo 2b, el grupo 4b o el extracto). Se indican las concentraciones finales en pocillo ensayadas para las drogas A y B por separado, y en mezclas (A+B). En los pocillos donde se agregaron mezclas, se adicionaron alícuotas de 50 µL de una dilución de droga B más 50 µL de una dilución droga A. Posteriormente los pocillos se inocularon con 100 µL de suspensión fúngica. Las microplacas se incubaron a 30°C durante 48h y a 25°C durante 72h para las cepas de
Aspergillus y Fusarium, respectivamente. Los valores de concentración inhibitoria mínima (CIM) se determinaron visualmente. En base a ellas, se calculó la concentración inhibitoria fraccional de A (CIFA) y de B (CIFB), y posteriormente el índice de concentración inhibitoria fraccional:
118
CIFA= Concentración de A en CIMA+B/Concentración de A en CIMA
CIFB= Concentración de B en CIMA+B/Concentración de B en CIMB
ICIF= CIFA + CIFB
Si este valor de ICIF es ≤ 0,5 se considera que A+B actuaron sinérgicamente, si se encuentra entre >0,5 y ≤4,0, que lo hicieron aditivamente y si es >4,0 que presentaron efecto conjunto antagónico (Johnson y col., 2004).
119
Droga B
1250 625 312 156 78 39 19,5 9,8 4,9 2,4 0 Grupo 2b
1250 625 312 156 78 39 19,5 9,8 4,9 2,4 0 Grupo 4b
2500 1250 625 312 156 79 39 19,5 9,8 4,9 0 Extracto crudo Propiconazol Sorbatode K Metabisulfito
Combinaciones A+B A+BA+BA+BA+B A+B A+B A+B A+B A+B A CC 2500 2500 Metabisulfito Metabisulfito Metabisulfito 4 A+B A+B A+B A+BA+B A+B A+B A+B A+B A+B A CC Extracto crudo Grupo 2b Grupo 4b A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A CC Sorbato de K Sorbato de K Sorbato de K A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+BA+B A+B A+B A CC
Droga A Extracto crudo Grupo 2b Grupo 4b A+BA+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A CE
A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A CE Propiconazol Propiconazol Propiconazol Extracto crudo Grupo 2b Grupo 4b A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A+B A CE
0 0,6 0 0,12 0,25 0,5 1 2 39 0 78 156 312 625 1250 0 39 78 156 312 625 1250 B B B B B B B B B B CE
Figura 31. Diseño en tablero de ajedrez. Se indica la droga A (metabifulfito de sodio, propiconazol o sorbato de potasio), droga B (grupo 2b, grupo 4b o extracto) y mezclas (A+B). Se realizaron controles (CE) de esterilidad y (CC) de crecimiento. A la derecha de la imagen se presentan las combinaciones de drogas A y B ensayadas.
120
4.3.3 Determinación de la actividad antiocratoxigénica
Se evaluó el efecto antiocratoxigénico del extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides, de los grupos 2b y 4b y de mezclas de estas sustancias con metabisulfito de sodio frente a Aspergillus niger y A. carbonarius. Se ensayaron rangos de concentraciones sub-letales, de 1250-
156,3 µg/mL (extracto diclorometano) y 625-156,3 µg/mL (grupo 2b, grupo 4b y metabisulfito de sodio). El metabisulfito de sodio (actuante como droga A) se ensayó en mezcla con grupo 2b o grupo 4b o extracto diclorometano
(actuantes como droga B), en el rango A:B de 625-156,2 µg/mL:39,1-9,8
µg/mL). Un volumen de 4 mL de medio jugo de uva previamente filtrado con membrana de 0,22 µm y suplementados con las sustancias antifúngicas se inocularon con 5x103 esporas/mL de Aspergillus carbonarius o A. niger y se incubaron durante 6 días a 15°C. Al finalizar el periodo de incubación, los micelios se separaron, se secaron, se pesaron y se determinó la cantidad de
OTA producida en el jugo sobrenadante. También se evaluó la acumulación de OTA en jugo de uva inoculado pero sin agregado de agentes antifúngicos, y en jugo de uva sin inocular. La cuantificación de OTA se realizó mediante el método de ELISA competitivo usando el kit Ridascreen-Fast ochratoxin A provisto por R-Biopharm, Alemania (Ghafari y col., 2011). Se realizaron lecturas a 450 nm en lector de absorbancia en microplacas Biotek elx800. Los contenidos de OTA se calcularon usando el programa Ridasoftwin
(Ridascreen). Los resultados se expresaron en ng de OTA producidos por mg de biomasa fúngica.
121
4.3.4 Análisis estadístico
Las medias de datos de cantidad de OTA que se presentan en las
Tablas de actividad antiocratoxigénica se sometieron a análisis de la varianza
(ANOVA) y la diferencia entre medias se determinó mediante el test post-hoc
T3 de Dunnett con un nivel de significación de p=0,05.
4.4 RESULTADOS
4.4.1 Efecto conjunto entre antifúngicos vegetales y comerciales sobre el crecimiento fúngico
La Tabla 8 muestra el efecto de las mezclas entre antifúngicos comerciales (metabisulfito de sodio o propiconazol) y grupo 2b o grupo 4b o el extracto diclorometano sobre las cepas de Aspergillus. Los ICIF se ubicaron entre 0,26 y 0,50 en las mezclas que contienen metabisulfito de sodio y entre
0,63 y 1,25 en aquellas que contienen propiconazol. En las mezclas con los productos naturales, la concentración de metabisulfito de sodio requerida para alcanzar la CIM fue 4 a 8 veces más baja que cuando se ensayó solo. En la Tabla 9 se indica el efecto de las mezclas entre antifúngicos comerciales
(sorbato de potasio o propiconazol) y grupo 2b o 4b sobre las cepas de
Fusarium. El extracto diclorometano de Macfadyena cynanchoides no alcanzó valores de CIM sobre Fusarium, razón por la cual no fue posible evaluar su efecto conjunto con los antifúngicos comerciales. En este caso, se observaron valores de ICIF entre 0,25 a 0,50 para las mezclas que contuvieron propiconazol y entre 0,75 y 1,00 para las mezclas que presentaron sorbato de potasio. En las mezclas, la concentración necesaria de propiconazol para
122 alcanzar la CIM fueron 2 y 4 veces más bajas que cuando se ensayó individualmente.
4.4.2 Determinación de la actividad antiocratoxigénica
La Tabla 10 indica la actividad antiocratoxigénica del extracto, los grupos 2b y 4b y las mezclas con metabisulfito de sodio sobre las cepas de
Aspergillus. El extracto provocó inhibición significativa de OTA en concentraciones de 1250 µg/mL (Aspergillus carbonarius) y ≥625 µg/mL (A. niger). En las concentraciones mencionadas y sobre ambas cepas fúngicas, la producción de biomasa cayó un 90% respecto de la observada en los controles de crecimiento, mientras que la reducción en la producción de OTA alcanzó un 30% (Aspergillus carbonarius) y ≥60% (A. niger). Los grupos 2b y 4b también mostraron inhibición significativa en la biosíntesis de OTA (30% sobre ambas cepas) a una concentración de 625 µg/mL. En el caso del metabisulfito de sodio, se observó un incremento en la producción en el rango de concentraciones ensayado, alcanzándose los niveles más altos a 625 µg/mL
(60%, A. carbonarius; 100%, A. niger). La OTA no se produjo en concentraciones detectables en el jugo de uva cuando se le incorporó al mismo las mezclas de metabisulfito de sodio con el grupo 2b o 4b o extracto diclorometano en el rango de concentraciones ensayado (metabisulfito de sodio:antifúngico vegetal; 625-156,2 µg/mL:39,1-9,8 µg/mL).
123
Tabla 8. Efecto conjunto de grupo 2b, grupo 4b y extracto fCH2Cl2 de tallos de Macfadyena cynanchoides con propiconazol y metabisulfito de sodio sobre el crecimiento de Aspergillus carbonarius y A. niger
A. carbonarius A. niger Compuestos CIM (µg/mL) CIM (µg/mL) ensayados CIF ICIF Interacción CIF ICIF Interacción Individual Combinado1 Individual Combinado
Propiconazol 4 2 0,50 1 0,5 0,5 0,75 Aditiva 1,00 Aditiva Grupo 2b 1250 312,5 0,25 312,5 156,2 0,5
Propiconazol 4 2 0,50 1 1 1,0 0,75 Aditiva 1,25 Aditiva Grupo 4b 156,2 39,1 0,25 78,1 19,5 0,25
Propiconazol 4 2 0,50 1 1 1,0 0,63 Aditiva 1,25 Aditiva Extracto diclorometano 2500 312,5 0,13 2500 625 0,25
Metabisulfito de sodio 2500 625 0,25 2500 625 0,25 0,31 Sinérgica 0,50 Sinérgica Grupo 2b 1250 156,2 0,06 312,5 78,1 0,25
Metabisulfito de sodio 2500 312,5 0,13 2500 312,5 0,13 0,38 Sinérgica 0,26 Sinérgica Grupo 4b 156,2 39,1 0,25 78,1 9,77 0,13
Metabisulfito de sodio 2500 312,5 0,13 2500 312,5 0,13 0,38 Sinérgica 0,38 Sinérgica Extracto diclorometano 2500 625 0,25 2500 625 0,25
1Valor de CIM obtenido al ensayar la mezcla binaria entre el antifúngico comercial y el compuesto natural referenciados en el margen izquierdo
124
Tabla 9. Efecto conjunto de grupo 2b, grupo 4b y extracto fCH2Cl2 de tallos de Macfadyena cynanchoides con propiconazol y sorbato de potasio sobre el crecimiento de Fusarium verticillioides y F. graminearum.
F. verticillioides F. graminearum Compuestos CIM (µg/mL) CIM (µg/mL) ensayados CIF ICIF Interacción CIF ICIF Interacción Individual Combinado1 Individual Combinado
Propiconazol 1,6 0,4 0,25 1,6 0,4 0,13 0,50 Sinérgica 0,38 Sinérgica Grupo 2b 1250 312,5 0,25 625 156,2 0,25
Propiconazol 1,6 0,2 0,13 1,6 0,2 0,13 0,26 Sinérgica 0,25 Sinérgica Grupo 4b 625 78,1 0,13 312,5 39,1 0,12
Sorbato de potasio 1250 625,0 0,50 1250 625,0 0,50 0,75 Aditiva 1,00 Aditiva Grupo 2b 1250 312,5 0,25 625 312,5 0,50
Sorbato de potasio 1250 312,5 0,25 1250 312,5 0,25 0,75 Aditiva 0,75 Aditiva Grupo 4b 625 312,5 0,50 312,5 156,2 0,50
1Valor de CIM obtenido al ensayar la mezcla binaria entre el antifúngico comercial y el compuesto natural referenciados en el margen izquierdo
125
Tabla 10. Efecto antiocratoxigénico frente a Aspergillus carbonarius y A. niger. Los antifúngicos vegetales (extracto diclorometano de Macfadyena cynanchoides, grupo 2b y grupo 4b) se ensayaron separadamente y en mezclas con metabisulfito de sodio Aspergillus carbonarius Aspergillus niger Concentración Compuesto ensayado Biomasa Biomasa (µg/mL) ng OTA/mg biomasa ng OTA/mg biomasa (ref. a control) mg (ref. a control) mg Control de crecimiento 0 1,00±0,01 100,74±6,8a 1,00±0,01 62,71±2,8a 156,3 1,00±0,03 95,0±6,7a 1,00±0,04 58,4±2,5a 312,5 0,88±0,02 90,0±3,7a 0,58±0,02 49,2±2,8a Extracto diclorometano 625 0,32±0,02 81,0±3,2a 0,25±0,01 35,0±1,2b 1250 0,08±0,01 73,3±5,3b 0,11±0,01 24,7±1,9c 156,3 1,00±0,02 100,2±7,6a 0,71±0,04 61,9±5,7a Grupo 2b 312,5 0,89±0,01 103,5±9,2a 0,36±0,01 63,1±4,3a 625 0,20±0,01 74,5±5,6b 0,18±0,01 50,1±2,4a 156,3 0,98±0,03 102,3±7,9a 1,00±0,05 61,2±6,1a Grupo 4b 312,5 0,95±0,02 105,1±8,3a 0,75±0,03 60,1±5,2a 625 0,73±0,05 72,2±6,3b 0,58±0,02 42,3±4,1b 156,3 0,78±0,04 140,4±7,2c 0,81±0,06 114,4±7,3d Metabisulfito de sodio 312,5 0,25±0,02 152,1±8,9c 0,24±0,01 120,1±7,9d 625 0,15±0,01 156,4±9,4c 0,10±0,01 127,7±8,2d 156,2 + 9,80 0,81±0,01 ND 0,91±0,01 ND Metabisulfito de sodio + Extracto 312,5 + 19,50 0,31±0,01 ND 0,41±0,01 ND 625 + 39,06 0,15±0,01 ND 0,18±0,01 ND 156,2 + 9,80 0,51±0,01 ND 0,91±0,01 ND Metabisulfito de sodio + Grupo 2b 312,5 + 19,50 0,35±0,03 ND 0,48±0,01 ND 625 + 39,06 0,21±0,02 ND 0,22±0,03 ND 156,2 + 9,80 0,58±0,02 ND 1,00±0,01 ND Metabisulfito de sodio + Grupo 4b 312,5 + 19,50 0,35±0,01 ND 0,51±0,02 ND 625 + 39,06 0,15±0,01 ND 0,23±0,02 ND Los datos de la concentración específica de micotoxina (ng OTA/mg biomasa) se informan como valores de media ± desviación estándar, basado en 2 experimentos donde cada tratamiento presentó 3 repeticiones; Medias en la misma columna con la misma letra no difieren significativamente (test T3 de Dunnet, p=0,05); ND: No detectado 126
4.5 DISCUSIÓN
Los grupos 2b y 4b procedentes del extracto diclorometano de tallos de
Macfadyena cynanchoides sinergizaron la actividad antifúngica del metabisulfito de sodio sobre las cepas de Aspergillus y del propiconazol sobre las de Fusarium, permitiendo reducir sustancialmente la concentración de antifúngicos comerciales requeridos para alcanzar la CIM. Los grupos 2b y 4b manifestaron un efecto aditivo en mezclas con propiconazol frente a
Aspergillus y en mezclas con sorbato potasio frente a Fusarium. Dado que los constituyentes mayoritarios de los grupos 2b y 4b son quinonas, estos resultados sugieren que las mismas ejercen su efecto antifúngico por mecanismos diferentes a los de los antifúngicos comerciales ensayados. Ya que ambos grupos procedentes del extracto diclorometano de tallos de Macfadyena cynanchoides presentaron el mismo tipo de interacción con los antifúngicos comerciales ensayados, se puede inferir que los constituyentes de los mismos presentan similares mecanismos de acción. El extracto diclorometano ensayado sobre las cepas de Aspergillus en mezclas con metabisulfito de sodio y con propiconazol presentó similar comportamiento antifúngico (sinergismo y aditivismo) que el observado para los grupos 2b y 4b en las mismas condiciones. Estos resultados sugieren que las quinonas, principales constituyentes de los grupos 2b y 4b, contribuirían sustancialmente al mencionado comportamiento antifúngico. El fundamento de estos comportamientos sinérgicos o aditivos, resulta difícil de elucidar ya que se informaron en la literatura científica múltiples mecanismos de acción tanto para las quinonas como para sorbato de potasio y metabisulfito de sodio. El metabisulfito de sodio, bajo determinadas condiciones libera dióxido de azufre
127
(SO2) en solución, el cual inhibe el crecimiento microbiano al romper enlaces bisulfuro de enzimas de membranas e intracelulares lo cual puede conducir a un cambio en la estructura conformacional de esas proteínas, una modificación en los sitios activos o a la destrucción de sus coenzimas (Davidson y Juneja, 1990). Además, se demostró que el metabisulfito de sodio puede inducir peroxidación de lípidos en hongos en condiciones de agitación enérgica, como se informó para Fusarium sambucinum, Rhizoctonia solani,
Sclerotinia sclerotiorum, S. rolfsii y S. minor, lo cual derivó en una pérdida de constituyentes celulares por alteración de la integridad de la membrana celular (Avis, 2007; Patsoukis y Georgiou, 2007). En Saccharomyces cerevisiae se informó que la entrada de SO2 a la célula inhibe inmediatamente la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, una enzima crítica en la vía de la glucólisis (Hinze y Holzer, 1986). En el caso de las quinonas, se cree que éstas pueden ejercer su actividad antifúngica por mecanismos que involucran ciclos redox, arilación de grupos tioles de las proteínas, e intercalación e inducción de rotura de la cadena de ADN, generación de radicales libres y formas reactivas de oxígeno, y la alquilación bioreductiva a través de la formación de metidos de quinona (Futuro y col., 2018). En el caso del propiconazol, esta sustancia es un inhibidor de la síntesis de ergosterol a nivel de la enzima lanosterol 14-α demetilasa que cataliza la conversión de lanosterol a ergosterol, alterando la fluidez e integridad de las membranas (Köller, 1992;
Warrilow y col., 2010). El sorbato de potasio provoca cambios en la composición de fosfolípidos de la membrana y una disminución en el contenido de esteroles y triacilglicerol provocando una alteración en la permeabilidad selectiva de la membrana (Sergeeva y col., 2009). Al
128 acumularse en el citosol de las células fúngicas genera un desbalance en la homeostasis celular con inactivación de varias enzimas endógenas (Plumridge y col., 2004).
El elevado poder sinergizante de los grupos 2b y 4b, y del extracto diclorometano sobre el metabisulfito de sodio condujo a evaluar la actividad antiocratoxigénica tanto de los mismos solos como en mezclas con ese preservante alimentario. En las condiciones ensayadas, el extracto y los grupos
2b y 4b inhibieron la síntesis de OTA. Existen diversos reportes sobre el efecto inhibitorio de extractos de plantas sobre el crecimiento fúngico y la producción de OTA. Murthy y col. (2009) demostraron que el extracto etanólico de la especie vegetal Trachyspermum ammi inhibió tanto el crecimiento de
Aspergillus ochraceus como la producción de OTA. Gacem y col. (2013) también demostraron la actividad antifúngica y antiocratoxigénica al estudiar los extractos acuosos y metanólicos de semillas de Citrullus colocynthis. Por otro lado, diversos autores estudiaron el efecto inhibitorio de compuestos naturales derivados de plantas sobre la producción de OTA. En ese sentido, Hua y col.,
(2014) demostraron la efectividad de aceites esenciales sobre el crecimiento de Aspergillus ochraceus y la producción de OTA. Romero y col. (2010) demostraron la capacidad del ácido gálico para inhibir completamente el crecimiento de Aspergillus carbonarius y la producción de OTA. Además,
Ferrara y col. (2014) estudiaron el efecto inhibitorio de los ácidos cafeico, p- cumárico y ferúlico sobre el crecimiento de Aspergillus carbonarius y la producción de OTA demostrando que el ácido ferúlico fue el más efectivo, alcanzando a reducir un 90% la producción de OTA. Coincidente con investigaciones previas (Ioannidis y col., 2015), Aspergillus carbonarius
129 incrementó significativamente (aproximadamente un 50%) la producción de
OTA a 15°C al estar expuesto a concentraciones sub-supresoras de metabisulfito de sodio, lo cual sugiere que este preservante alimentario posee modos de acción diferentes a los del extracto diclorometano de Macfadyena cynanchoides y sus quinonas. Cuando el metabisulfito de sodio se combinó con los antifúngicos naturales ensayados, se produjo la supresión de la producción de OTA en todas las concentraciones testeadas. Al ensayar el metabisulfito de sodio solo y en combinación, la biomasa fúngica de ambas cepas de Aspergillus disminuyó entre un 20 y un 80%. Sin embargo, la producción de OTA se inhibió totalmente en presencia de las mezclas entre el preservante químico y los antifúngicos naturales aún con las menores concentraciones ensayadas. Es importante destacar que en el caso de
Aspergillus niger, donde no se detectó inhibición del crecimiento significativa en la menor concentración testeada de las mezclas, la producción de OTA se inhibió totalmente. Se observó además que en presencia de metabisulfito de sodio, si bien disminuye la biomasa fúngica incrementó la producción de la micotoxina aproximadamente en un 50% en todas las concentraciones ensayadas. Estos resultados sugieren un efecto sinérgico en la inhibición de la producción de la OTA en presencia del metabisulfito de sodio y los antifúngicos naturales.
4.6 CONCLUSIONES
1) El extracto y los grupos 2b y 4b sinergizaron el efecto antifúngico del
metabisulfito de sodio sobre Aspergillus y el del propiconazol sobre
Fusarium.
130
2) En concentraciones sub-supresoras de crecimiento fúngico, las mezclas
de metabisulfito de sodio con los grupos 2b, 4b o extracto diclorometano
inhibieron completamente la biosíntesis de OTA.
3) El extracto y los grupos 2b y 4b podrían ser utilizados como aditivos de
antifúngicos comerciales, reduciendo las dosis utilizadas de los mismos. En
concentraciones sub-supresoras del crecimiento fúngico los mismos no
incrementarían el riesgo de contaminación con OTA.
4.7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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137
Capítulo 5: Conclusiones generales, consideraciones finales y proyecciones
138
5.1 CONCLUSIONES GENERALES
En nuestro país, especies del género Fusarium, fundamentalmente F. verticillioides y F. graminearum generan podredumbres de espiga de trigo y maíz y contaminan los granos con micotoxinas, especialmente fumonisinas y tricotecenos. Especies del género Aspergillus, principalmente A. carbonarius y
A. niger, son causantes de podredumbres en uvas y potencialmente productoras de ocratoxina A (OTA) en uvas y vinos. El control químico es una de las estrategias empleadas para combatir estos hongos. Las limitaciones que poseen los xenobióticos actualmente utilizados, impulsa la búsqueda de antifúngicos biodegradables con nuevos mecanismos y modos de acción. Las plantas autóctonas del NOA pueden podrían proveer estas sustancias. Este trabajo de tesis aporta conocimiento útil en esa dirección, lo cual queda expresado por las conclusiones que se detallan a continuación:
1. Actividad antifúngica de los extractos de especies Bignoniáceas
Se evaluó la actividad antifúngica de cuatro especies Bignoniáceas autóctonas del NOA, Amphilophium cynanchoides, Tecoma stans, Jacarandá mimosifolia y Macfadyena cynanchoides. Los ensayos de microdilución y bioautografía por siembra puntual demostraron que el extracto diclorometano de tallos de M. cynanchoides presentó la mayor actividad inhibitoria contra A. niger (CI50=1025 ppm) y A. carbonarius (CI50=1066 ppm) y fue el único extracto que suprimió completamente el crecimiento fúngico (CIM=2500 ppm) con una actividad similar a la del metabisulfito de sodio.
139
2. Aislamiento e identificación de moléculas antifúngicas
La separación y purificación del extracto diclorometano de tallos de
Macfadyena cynanchoides condujeron a la obtención de dos grupos de fracciones, 2b y 4b, constituidas principalmente por lapachol y 1-hidroxi-4-metil antraquinona, respectivamente. El grupo 4b presentó mayor efecto inhibitorio que el grupo 2b sobre las especies de Fusarium y Aspergillus. El extracto y el grupo 2b ejercieron un moderado a débil efecto antifúngico, mientras que el grupo 4b ejerció un efecto inhibitorio fuerte a moderado sobre los hongos toxigénicos investigados.
3. Caracterización de la actividad antifúngica de los grupos 2b y 4b
El extracto diclorometano y los grupos 2b y 4b sinergizaron el efecto antifúngico del metabisulfito de sodio sobre Aspergillus y el del propiconazol sobre Fusarium, reduciendo las dosis efectivas de los antifúngicos comerciales utilizados, mientras que se observó un efecto aditivo en mezclas con propiconazol frente a Aspergillus y en mezclas con sorbato potasio frente a
Fusarium. Estos resultados sugieren que los metabolitos naturales identificados actúan por mecanismos de acción diferentes a aquellos de los antifúngicos comerciales. Las mezclas de los grupos 2b y 4b con metabisulfito de sodio inhibieron completamente la biosíntesis de OTA en concentraciones sub- supresoras de crecimiento fúngico, lo cual evidencia que los primeros poseen modos de acción diferentes a los del preservante alimentario mencionado.
140
5.2 CONSIDERACIONES FINALES Y PROYECCIONES
El extracto y los constituyentes lapachol y 1H4MA de los grupos 2b y 4b, respectivamente demostraron una eficiente actividad inhibitoria en combinación con los antifúngicos comerciales investigados sobre el crecimiento de Fusarium verticillioides, F. graminearum, A. carbonarius y A. niger. Los efectos sinérgicos registrados al combinar los antifúngicos naturales con metabisulfito de sodio frente a Aspergillus y con propiconazol frente a
Fusarium, indican que el extracto y sus constituyentes activos podrían utilizarse como aditivos de fungicidas azoles (ej. propiconazol) o de preservantes alimentarios comerciales (ej. metabisulfito de sodio) con el fin de reducir las concentraciones de antifúngicos comerciales. La actividad supresora de la síntesis de OTA provocada por las mezclas del extracto, el grupo 2b o el 4b con metabisulfito de sodio indica que las mismas no significan un mayor riesgo toxigénico si sus concentraciones no alcanzan aquellas requeridas para supresión total del crecimiento fúngico, lo cual comúnmente ocurre en parte de los sustratos expuestos a agentes antifúngicos. Sin embargo se debe investigar el impacto de otros factores determinantes del efecto antimicrobiano y antimicotoxigénico sobre la actividad antifúngica de los metabolitos bioactivos como ser la actividad de agua y la temperatura.
Además debe evaluarse la estabilidad de los metabolitos de interés y la capacidad protectora contra Aspergillus y Fusarium en mezclas con antifúngicos comerciales al ser aplicados directamente sobre racimos de uva y granos de cereales e investigar si las mismas son tóxicas para el consumidor o fitotóxicas para los materiales vegetales.
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