Autoantikörper-Induzierte Effekte Des Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 Und

Autoantikörper-induzierte Effekte des Angiotensin II-Rezeptors Typ 1 und des Endothelinrezeptors Typ A auf humane periphere mononukleäre Zellen und ihre Relevanz bei der Pathogenese der systemischen Sklerose

vorgelegt von Master of Science Jeannine Günther geb. in Berlin

von der Fakultät III – Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. -

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. Stephan Pflugmacher Lima Gutachter: Prof. Dr. Roland Lauster Gutachterin: Prof. Dr. Gabriela Riemekasten Gutachter: Prof. Dr. Jens Kurreck

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 30. Januar 2017

Berlin 2017

Für Timo

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ...... 3

Zusammenfassung ...... 8

Abstract ...... 9

Abkürzungsverzeichnis ...... 10

1 Einleitung ...... 13

1.1 Autoimmunität und Autoantikörper ...... 13

1.1.1 Immunität und Autoimmunität ...... 13

1.1.2 Autoantikörper ...... 14

1.2 Die systemische Sklerose ...... 16

1.2.1 Prävalenz, Inzidenz und Mortalität ...... 16

1.2.2 Äthiologie ...... 17

1.2.3 Klinisches Erscheinungsbild ...... 17

1.2.4 Verlauf und Komplikationen ...... 18

1.2.5 Therapiemöglichkeiten ...... 20

1.2.6 Die Rolle von Immunzellen in der SSc-Pathogenese ...... 21

1.2.7 Die Rolle von Auto-Ak in der SSc-Pathogenese ...... 23

1.3 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren ...... 25

1.3.1 Struktur und Funktionsweise von GPCRs ...... 25

1.3.2 GPCRs in der Inflammation ...... 29

1.3.3 Angiotensin II-Rezeptoren ...... 30

1.3.4 Endothelinrezeptoren ...... 35

1.3.5 AT1R- und ETAR-Auto-Ak ...... 38

2 Aufgabenstellung ...... 42

3 Ergebnisse ...... 43

3.1 Expression der Angiotensin II- und Endothelinrezeptoren in humanen PBMCs ...... 43

Inhaltsverzeichnis 3.1.1 Expression des AT1R und ETAR in PBMCs von gesunden Spendern und SSc- Patienten ...... 43

3.1.2 Expression des AT2R und ETBR in PBMCs von gesunden Spendern und SSc- Patienten, Verhältnis der Angiotensin II- und Endothelinrezeptoren ...... 44

3.1.3 Abhängigkeit der Rezeptorexpression vom Alter der Spender ...... 46

3.1.4 Abhängigkeit der Rezeptorexpression vom Geschlecht der Spender...... 47

3.1.5 Assoziationen der Rezeptorexpression mit den klinischen Parametern der SSc- Patienten ...... 50

3.2 Untersuchung des Einflusses der Auto-Ak auf die Proteinexpression der Rezeptoren in vitro 52

3.3 Wirkung von AT1R- und ETAR-Auto-Ak auf die Chemotaxis von T-Zellen ...... 56

3.3.1 Etablierung eines Migrationsassays ...... 57

3.3.2 Nachweis einer Auto-Ak-induzierten Migration ...... 59

3.4 Aktivierung von PBMCs durch AT1R- und ETAR-Auto-Ak in vitro ...... 62

3.4.1 Etablierung von geeigneten Outcome-Parametern ...... 62

3.4.2 Überprüfung ausgewählter SSc-IgG-induzierter Effekte und deren Hemmung durch selektive AT1R- und ETAR-Antagonisten ...... 65

3.4.3 Zeitlicher Verlauf der IL-8- und CCL18-Sekretion und deren Hemmung durch selektive AT1R- und ETAR-Antagonisten ...... 67

3.4.4 Screening zu SSc-IgG-induzierten IL-8- und CCL18-Konzentrationen, deren Hemmbarkeit und klinische Assoziationen ...... 68

3.4.5 Verifizierung der IL-8- und CCL18-Hemmung unter Hinzunahme eines AT2R- und eines ETBR-Antagonisten ...... 72

3.5 Auto-Ak-Konzentrationen der AT1R- und ETAR-IgG-Subklassen und ihre klinischen Assoziationen ...... 74

4 Diskussion ...... 80

4.1 Expression der Angiotensin II- und Endothelinrezeptoren in humanen PBMCs ...... 80

4.1.1 Expression des AT1R und ETAR in PBMCs von gesunden Spendern und SSc- Patienten ...... 80

Inhaltsverzeichnis 4.1.2 Expression des AT2R und ETBR in PBMCs von gesunden Spendern und SSc- Patienten, Verhältnis der Angiotensin II- und Endothelinrezeptoren ...... 81

4.1.3 Abhängigkeit der Rezeptorexpression vom Alter der Spender ...... 82

4.1.4 Abhängigkeit der Rezeptorexpression vom Geschlecht der Spender...... 83

4.1.5 Assoziationen der Rezeptorexpression mit den klinischen Parametern der SSc- Patienten ...... 84

4.2 Untersuchung des Einflusses der Auto-Ak auf die Proteinexpression der Rezeptoren in vitro 86

4.3 Wirkung von AT1R- und ETAR-Auto-Ak auf die Chemotaxis von T-Zellen ...... 87

4.4 Aktivierung von PBMCs durch AT1R- und ETAR-Auto-Ak in vitro ...... 89

4.4.1 Etablierung von geeigneten Outcome-Parametern ...... 89

4.4.2 Screening zu SSc-IgG-induzierten IL-8- und CCL18-Konzentrationen, deren Hemmbarkeit und klinische Assoziationen ...... 95

4.4.3 Verifizierung der IL-8- und CCL18-Hemmung unter Hinzunahme eines AT2R- und ETBR-Antagonisten ...... 100

4.5 Auto-Ak-Konzentrationen der AT1R- und ETAR-IgG-Subklassen und ihre klinischen Assoziationen ...... 101

4.6 Limitationen ...... 104

4.7 Schlussfolgerung und Ausblick ...... 105

5 Methoden ...... 108

5.1 IgG-Aufreinigung, Zellisolierung und Zellkultur ...... 108

5.1.1 Herkunft von IgG und PBMCs ...... 108

5.1.2 Aufreinigung von IgG mittels Affinitätschromatografie ...... 108

5.1.3 Isolierung der PBMCs mittels Dichtegradientenzentrifugation ...... 109

5.1.4 Trennung der PBMCs mit magnetisch aktivierter Zellsortierung ...... 109

5.1.5 Kultivierung und Stimulation von PBMCs ...... 110

5.1.6 Kultivierung und Stimulation von T-Zellen ...... 111

5.2 Nachweis der Proteinexpression mittels Durchflusszytometrie ...... 111

Inhaltsverzeichnis 5.2.1 Markierung der Oberflächenmarker mit direkter Immunfluoreszenzfärbung .... 111

5.2.2 Analyse der Rezeptorexpression mit indirekter Immunfluoreszenzfärbung ...... 111

5.2.3 Fixierung und Permeabilisierung der PBMCs für intrazelluläre Färbung ...... 113

5.2.4 Durchflusszytometrische Messung ...... 114

5.3 Nachweis der mRNA-Expression mittels Real-time PCR ...... 115

5.3.1 Isolierung von mRNA ...... 115

5.3.2 Reverse Transkription ...... 116

5.3.3 Real-time PCR ...... 116

5.4 Chemotaxisassay ...... 119

5.5 ELISA ...... 120

5.6 Statistische Methoden ...... 121

5.6.1 Normalitätstest ...... 121

5.6.2 Mann-Whitney-Test ...... 121

5.6.3 Varianzanalyse und Kruskal-Wallis-Test ...... 122

5.6.4 Paarvergleichstest nach Wicoxon ...... 122

5.6.5 Spearman-Korrelation ...... 122

5.6.6 Signifikanzniveau ...... 122

6 Material ...... 124

6.1 Geräte ...... 124

6.2 Verbrauchsmaterial ...... 125

6.3 Chemikalien, Proteine, Medien, Lösungen und Puffer ...... 126

6.3.1 Chemikalien, Proteine, Medien und Zusätze ...... 126

6.3.2 Lösungen und Puffer ...... 127

6.4 Kits und Enzyme ...... 127

6.5 Primer, dNTPs und Antikörper ...... 128

6.5.1 Primer ...... 128

6.5.2 mRNA-spezifischer Primer und Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP) ...... 129

Inhaltsverzeichnis 6.5.3 Antikörper ...... 129

6.6 Zellen und Immunglobuline ...... 130

6.7 Software...... 131

7 Referenzen ...... 132

8 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis ...... 148

8.1 Abbildungsverzeichnis ...... 148

8.2 Tabellenverzeichnis ...... 150

9 Danksagung ...... 151

10 Lebenslauf und relevante Veröffentlichungen ...... 152

10.1 Lebenslauf ...... 152

10.2 Publikationen in Fachzeitschriften ...... 153

10.3 Präsentationen im Rahmen von Kongressen ...... 154

11 Eidesstattliche Erklärung...... 156

Zusammenfassung/Abstract

Zusammenfassung

In Patienten mit systemischer Sklerose (SSc) sind funktionelle Autoantikörper (Auto-Ak), die gegen den Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 (AT1R) und den Endothelinrezeptor Typ A (ETAR) gerichtet sind, identifiziert worden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte dieser Auto-Ak auf humane mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) untersucht. Dazu wurde zuerst die Expression des AT1R und des ETAR in PBMCs von Gesunden und SSc- Patienten durchflusszytometrisch analysiert. Außerdem wurden aufgereinigte IgG-Fraktionen von Patienten (SSc-IgG), welche AT1R- und ETAR-Auto-Ak enthielten, für die Stimulation von PBMCs und isolierten T-Zellen in vitro verwendet. IgG von gesunden Normalspendern diente als Kontrolle. Veränderungen in der Sekretion von Zytokinen oder der chemotaktischen Motilität wurden mittels ELISA bzw. Chemotaxisassay untersucht.

Es konnte gezeigt werden, dass AT1R und ETAR in humanen PBMCs exprimiert werden, jedoch vermindert in SSc-Patienten. Die AT1R-Expression in Monozyten korrelierte mit der Krankheits- aktivität und schien im Verlauf der Erkrankung abzunehmen. Die SSc-IgG-induzierte Chemotaxis von isolierten T-Zellen ließ sich mit selektiven AT1R- und ETAR-Antagonisten inhibieren. In PBMC-Kultur führte SSc-IgG zur erhöhten HLA-DR-Expression auf inflammatorischen Monozyten sowie zur Sekretion des inflammatorischen Zytokins IL-8 und des profibrotischen Zytokines CCL18. Auch die Sekretion beider Zytokine ließ sich durch die selektiven Antagonisten inhibieren, die Zytokinkonzentrationen korrelierten mit der Schwere der klinischen Manifestationen der IgG-Spender.

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass AT1R und ETAR in humanen PBMCs exprimiert werden. Somit sind diese Zellen für eine Regulation durch die natürlichen Liganden sowie durch funktionelle AT1R- und ETAR-Auto-Ak empfänglich. Die verminderte Expression der Rezeptoren in Monozyten und T-Zellen von SSc-Patienten ist vermutlich in Desensitisierungs- mechanismen und/oder einer Abwanderung hoch rezeptor-positiver Zellen ins Gewebe begründet. SSc-IgG bzw. die darin enthaltenen AT1R- und ETAR-Auto-Ak sind in der Lage, durch Induktion einer T-Zell-Migration sowie der Sekretion von IL-8 und CCL-18 ein entzündliches und/oder profibrotisches Milieu zu schaffen. Die Resultate dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass funktionelle agonistische AT1R- und ETAR-Auto-Ak krankmachende Prozesse initiieren und aufrechterhalten, und somit zur Pathogenese der SSc beitragen. Die spezifische Entfernung dieser Auto-Ak sollte daher stärker als bisher in den Fokus der SSc-Behandlung rücken.

Zusammenfassung/Abstract

Abstract

Functional autoantibodies (aab) against the angiotensin II receptor type 1 (AT1R) and the endothelin 1 receptor type A (ETAR) have been identified in patients suffering from systemic sclerosis (SSc). Aim of this study was to investigate the effects of these aab on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). As a first approach, expression of AT1R and ETAR has been analysed in PBMCs of SSc-Patients and healthy individuals by flow cytometry. Second, purified IgG from SSc-Patients (SSc-IgG) containing AT1R- and ETAR-aab was used to stimulate PBMCs and isolated T cells in vitro. Purified IgG from healthy individuals served as normal control (N- IgG). Alterations in cytokine secretion and chemotactic motility have been investigated by ELISA and chemotaxis assay, respectively.

This study revealed that human PBMCs express both, AT1R and ETAR, and that the expression was decreased in PBMCs of SSc-patients. AT1R expression in monocytes of SSc-patients correlated with disease activity and seemed to decline in the course of the disease. SSc-IgG was able to induce the chemotaxis of isolated T cells, that was reduced by selective AT1R and ETAR antagonists. In PBMC culture, SSc-IgG led to an increased expression of the activation marker HLA-DR on inflammatory monocytes and stimulated PBMCs to secrete the inflammatory cytokine IL-8 and the profibrotic cytokine CCL18. Secretion of both cytokines was inhibited by selective antagonists too. The concentrations of the cytokines correlated with the severity of clinical manifestations of the SSc-IgG donors.

It was shown here, that both AT1R and ETAR are expressed in human PBMCs. Thus these cells are susceptive to the natural ligands as well as to functional AT1R- and ETAR-aab. The reduced receptor expression found in monocytes and T cells of SSc-patients can be assumed to be a consequence of desensitization mechanisms and/or migration of highly receptor-positive cells into the surrounding tissue. SSc-IgG containing AT1R- and ETAR-aab is able to create an inflammatory and/or profibrotic environment by inducing the chemotaxis of T cells as well as the secretion of IL-8 and CCL18. In conclusion, the results of this study suggest that functional agonistic AT1R- and ETAR-aab induce and maintain pathogenic processes, and are therefore involved in the pathogenesis of SSc. Therefore, specific removal of these aab should be more than to date in the focus of SSc treatment.

Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis

aab autoantibodies Abb. Abbildung(en) ACE Angiotensin-converting enzyme ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity AECA anti-endothelial cell autoantibodies AFA anti-Fibroblast-Auto-Ak AGTR1 AT1R-Gen Ak Antikörper Ang II Angiotensin II AP-1 Aktivatorprotein-1 APC Allophycocyanin AT1R Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 AT1R-Auto-Ak anti-AT1R-Auto-Ak AT2R Angiotensin II-Rezeptor Typ 2 ATR Angiotensin II-Rezeptor Auto-Ak Autoantikörper BAL bronchoalveoläre Lavage BV421 Brilliant Violet 421 CCL CC-Motiv-Ligand CCR CC-Motiv-Chemokin-Rezeptor cAMP cyclic adenosine monophosphate CD cluster of differentiation cDNA complementary DNA CREB cAMP response element-binding protein CXCL CXC-Motiv-Ligand CY5 Cyanin 5 Cy7 Cyanin 7 DAG Diacylglycerol dcSSc diffuse cutaneous SSc

dest. H2O destilliertes Wasser DLCO diffusing capacity of the lung for carbon monoxid DNA desoxyribonucleic acid DRFZ Deutsches Rheumaforschungszentrum ECE Endothelin-converting enzyme

Abkürzungsverzeichnis

ECL extracellular loop ECM extracellular matrix EDNRA ETAR-Gen EEF1A1 eukaryotischer Elongationsfaktor 1-alpha 1 eNOS endotheliale NO-Synthase ERK1/2 extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 ET-1 Endothelin 1 ETAR Endothelinrezeptor Typ A ETAR-Auto-Ak anti-ETAR-Auto-Ak ETBR Endothelinrezeptor Typ B ETR Endothelinrezeptor EULAR European League Against Rheumatism EUSTAR EULAR Scleroderma Trials and Research Fc fragment crystallizable FCS fetales Kälberserum FITC Fluoresceinisothiocyanat FSC forward scatter FVC forced vital capacity GPCRs G protein-coupled receptors G-Protein Guanosintriphosphat-bindendes Protein GRKs GPCR kinases HLA-DR humanes Leukozytenantigen DR HMECs human microvascular endothelial cells ICL intracellular loop IgG Immunglobulin G IL Interleukin ILD interstitial lung disease IP3 Inositoltriphosphat KC Keratinocyte-derived Chemokine lcSSc limited cutaneous SSc LPS bakterielles Lipopolysaccharid M1 klassischer Aktivierungstyp von Monozyten/Makrophagen M2 alternativer Aktivierungstyp von Monozyten/Makrophagen M3R muskarin 3 receptor MACS magnetic activated cell sort MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase

Abkürzungsverzeichnis

MCP-1 monocyte chemoattractant protein 1 MFI mediane Fluoreszenzintensität MHCs major histocompatibility complexes/molecules MMP Matrix-Metalloproteinase mRNA messenger ribonucleic acid mRSS modified Rodnan skin score NAG-2 Novel antigen 2 NF-B Nuklearfaktor B N-IgG IgG isoliert aus dem Serum von gesunden Spendern als Normalkontrollen NO Stickstoffmonoxid PAH pulmonalarterielle Hypertonie PBMCs peripheral blood mononuclear cells PCR polymerase chain reaction PDGFR platelet-derived growth factor receptor PE Phycoerythrin PerCP Peridinin-Chlorophyll PKC Proteinkinase C PLC Phospholipase C RAS Renin-Angiotensin-System ROS reactive oxigen species RT Raumtemperatur sCD14 soluble CD14 SLE Systemischer Lupus Erythematodes SSc systemic sclerosis SSC side scatter SSc-IgG IgG isoliert aus dem Serum von SSc-Patienten TGF- Transforming growth factor- Th1-Zellen T-Helferzellen Typ 1 Th2-Zellen T-Helferzellen Typ 2 TMs transmembrane domains TNF- Tumornekrosefaktor  TSHR thyroid-stimulating hormone receptor v/v volume per volume VEDOSS very early diagnosis of systemic sclerosis VSMCs vascular smooth muscle cells w/v weight per volume

Einleitung 1 Einleitung

1.1 Autoimmunität und Autoantikörper

1.1.1 Immunität und Autoimmunität

Das Immunsystem besteht aus einem Netzwerk aus Organen, Zellen und Molekülen, das den Organismus vor Angriffen jeglicher Art bewahrt und ihm damit Immunität gegenüber krankmachenden Einflüssen bietet [1]. Dabei stellt das angeborene Immunsystem die erste Abwehrlinie dar. Seine Mechanismen beinhalten physikalische, chemische und biologische Barrieren sowie zelluläre Komponenten zur raschen und unspezifischen Bekämpfung von Pathogenen. Auch akute Entzündungsreaktionen gehören zum Repertoire der angeborenen Immunität. Die adaptive Immunität umfasst die Reaktionen antigenspezifischer Lymphozyten auf Antigene und die Ausbildung eines sogenannten immunologischen Gedächtnisses, wobei das gesunde Immunsystem die Balance zwischen Toleranz und Immunität hält [1, 2].

Der Begriff der Autoimmunität beschreibt Reaktionen des Immunsystems, die gegen den eigenen Organismus gerichtet sind. Das gesunde Immunsystem toleriert Autoantigene, da autoreaktive T- und B-Zellen im Thymus bzw. im Knochenmark durch negative Selektion sowie in der Peripherie durch lokale Toleranzmechanismen eliminiert werden. Sind jedoch die Abläufe der Immuntoleranz gestört, kommt es zu einem Ungleichgewicht zwischen Effektor- und regulatorischen Zellen, welches das Überleben und die Aktivierung autoreaktiver B- und T- Zellen begünstigt [3, 4].

Der Verlust der Immuntoleranz kann intrinsische oder extrinsische Ursachen haben. Bei den intrinsischen Ursachen handelt es sich beispielsweise um individuelle Merkmale der Histokompatibilitätsmoleküle (MHCs, major histocompatibility complexes/molecules), die oft mit bestimmten Polymorphismen assoziiert sind. MHCs der Klasse II finden sich auf antigen- präsentierenden Zellen, wie zum Beispiel Monozyten und Makrophagen [3]. Neben den MHCs unterliegen weitere Komponenten des angeborenen Immunsystems, wie das Komplementsystem und Toll-like-Rezeptoren, sowie Komponenten der erworbenen Immunität, zum Beispiel regulatorische T-Zellen und Zytokine, ebenso wie hormonelle Faktoren der genetischen Steuerung und gehören ebenfalls zu den intrinsischen Einflüssen. Umweltfaktoren, wie bakterielle und virale Infektionen, der Kontakt mit physikalischen oder chemischen Agenzien wie UV-Strahlung, Pestiziden, Drogen oder Medikamenten können extrinsische Ursachen sein, die eine initiale Entzündungsreaktion oder epigenetische Modifikationen

Einleitung hervorrufen. Epidemiologische Studien lassen den Schluss zu, dass bei einer genetischen Disposition ein bestimmter Auslöser zum Verlust der Immuntoleranz führt [1, 5].

Frauen sind weit häufiger von Autoimmunerkrankungen betroffen als Männer [5]. Zunehmend werden die immunmodulatorischen Effekte von Hormonen und ihre Rolle in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen evident. So konnte gezeigt werden, dass Estradiol das Überleben und die Aktivierung von autoreaktiven Lymphozyten begünstigt [6]. Darüber hinaus ist bei Frauen die Anzahl von zytotoxischen T-Zellen genetisch bedingt geringer als bei Männern, womit die höhere Anfälligkeit von Frauen für virale Infektionen erklärt werden kann, und damit auch ein erhöhtes Auftreten von molekularer Mimikry, einem Hauptmechanismus der Induktion von Autoimmunität [7-9].

1.1.2 Autoantikörper

Autoantikörper (Auto-Ak) treten natürlicherweise auch in gesunden Menschen auf (natürliche Auto-Ak), meist jedoch in niedrigen Konzentrationen und/oder ohne pathogene Wirkung [10]. In den letzten Jahren und Jahrzehnten konnte sogar gezeigt werden, dass vielen der natürlichen Auto-Ak eine physiologische Rolle zugeschrieben werden kann, zum Beispiel in der unspezifischen Infektionsabwehr, bei der Clearance von katabolischen Produkten und löslichen Immunkomplexen sowie bei der Kontrolle autoreaktiver T- und B-Zellen [11, 12].

Ein dereguliertes Immunsystem mit einer gesteigerten Reaktivität gegenüber Autoantigenen ist das gemeinsame Merkmal diverser klinischer Ausprägungen von Autoimmunerkrankungen [13]. Diese sind durch eine erhöhte Konzentration von bestimmten Auto-Ak im Serum der Betroffenen gekennzeichnet. Diese Auto-Ak können zum Teil bereits Jahre bis Jahrzehnte vor dem Ausbruch der Erkrankung detektiert werden. So wurde in einer prospektiven Studie unter Angehörigen der US-Armee festgestellt, dass fast 90 % der an Systemischen Lupus Erythematodes (SLE) Erkrankten bereits bis zu 30 Jahre vor Ausbruch der Erkrankung Auto-Ak- positiv waren, jedoch keine der gesunden Kontrollen [14]. Für Patienten mit einem primären Raynaud-Syndrom konnte anhand des Auftretens bestimmter Auto-Ak der spätere Ausbruch einer systemischen Sklerose (SSc) prognostiziert werden [15, 16].

Die im menschlichen Blut mengenmäßig mit Abstand am häufigsten vorkommende Form von Antikörpern (Ak) ist das Immunglobulin G (IgG). Dies ist auch für Auto-Ak zutreffend. Als pathogene Auto-Ak bezeichnet man für gewöhnlich Immunglobuline, die zur Entwicklung einer Autoimmunerkrankung und ihren Organmanifestationen beitragen [17]. Diese Definition wurde

Einleitung durch Naparstek und Plotz wie folgt präzisiert: Ein pathogener Auto-Ak sollte in Kombination mit einem plausiblem Autoantigen am Ort der Gewebeschädigung gefunden werden und in einem Experiment nachvollziehbar zur assoziierten Schädigung führen [18]. Auto-Ak im klassischen Sinne sind demnach krankmachend. Durch ihre Anheftung kennzeichnen sie ihr spezifisches Autoantigen als „fremd“ (Opsonierung). Gebunden an ihre Zielstruktur präsentieren die Auto-Ak ihren fragment crystallizable (Fc)-Teil den Fc-Rezeptor-tragenden Immunzellen, zum Beispiel Monozyten/Makrophagen, dendritischen Zellen, B-Zellen und NK- Zellen. Nachfolgend kommt es zur Phagozytose der opsonierten Zelle oder zu einer Ak- abhängigen zellvermittelten Zytotoxizitätsreaktion (ADCC, antibody dependent cellular cytotoxicity) [2]. In beiden Fällen führt die Auto-Ak-Bindung zur Zerstörung der Zielstruktur. Bei stetig wiederkehrender Bindung durch die Auto-Ak kommt es zu einer andauernden Immunreaktion, die zu einer chronischen Entzündung und abnormaler Wundheilung im betroffenen Gewebe führt, wodurch diverse Krankheitsmanifestationen verursacht werden [19].

Neben den gewebezerstörenden Auto-Ak treten insbesondere bei systemischen Autoimmunerkrankungen auch Auto-Ak auf, die aufgrund der Lokalisation ihres Antigenes innerhalb der Zelle oder im Zellkern nicht automatisch zu den pathogenen Auto-Ak zu zählen sind. Die intrazellulären/intranukleären Antigene dieser Auto-Ak umfassen Peptide, die während der Apoptose oder Nekrose proteolytisch modifiziert und freigesetzt werden, und nachfolgend von antigen-präsentierenden Zellen aufgenommen und präsentiert werden können. Da Apoptose und Nekrose normalerweise im gesunden Organismus stattfinden, ohne eine übermäßige Produktion von Auto-Ak zu initiieren, wird angenommen, dass auch hier weitere Konditionen, wie zum Beispiel ein unvollständiger Abbau apoptotischer und nekrotischer Zellen, eine erhebliche Gewebezerstörung und/oder Entzündungsreaktion, sowie eine Beeinträchtigung der Toleranzmechanismen bei der Entstehung dieser Auto-Ak eine Rolle spielen [3]. Inzwischen konnten bei einigen dieser Auto-Ak immunstimulatorische Eigenschaften identifiziert werden, sodass die Zuordnung der Auto-Ak nicht starr ist, sondern vielmehr der Dynamik der Forschung unterliegt [3].

Studien der vergangenen Jahre und Jahrzehnte haben gezeigt, dass einige Auto-Ak funktionelle Eigenschaften haben. Das bedeutet, sie sind in der Lage, durch Bindung an ihr Antigen das betreffende Molekül in seiner Funktion zu beeinflussen, also einen molekularen Signalweg auszulösen oder zu inhibieren, bzw. zu verstärken oder abzuschwächen [20]. Auto-Ak, die gegen das Gewebe der Schilddrüse gerichtet sind, wurden bereits in den 50er Jahren des

Einleitung letzten Jahrhunderts beschrieben [21, 22], in den 80ern konnte der Rezeptor für das schilddrüsenstimulierende Hormon (TSHR, thyroid-stimulating hormone receptor) als ihr Zielmolekül identifiziert werden [23, 24]. Der TSHR ist ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR, G protein-coupled receptor), die TSHR-Auto-Ak können in Abhängigkeit von ihrem Bindungsort den Rezeptor sowohl stimulieren als auch inhibieren, und damit unterschiedliche klinische Manifestationen verursachen [25]. Die TSHR-Auto-Ak waren damit die ersten Auto-Ak, deren funktionelle Eigenschaften, vermittelt durch ihre Bindung an einen GPCR, beschrieben worden sind [26]. Nachfolgend konnten diverse funktionelle Auto-Ak und ihre Rolle als pathogene Faktoren im Rahmen verschiedener Erkrankungen identifiziert werden, zum Beispiel Auto-Ak gegen den Beta-Adrenorezeptor und Muskarinrezeptor Typ 2 bei Herzmuskel- erkrankungen sowie gegen den Rezeptor für den Plättchen-Wachstumsfaktor (PDGFR, platelet- derived growth factor receptor) in der SSc.

1.2 Die systemische Sklerose

1.2.1 Prävalenz, Inzidenz und Mortalität

Die SSc ist eine systemische Autoimmun- und Bindegewebserkrankung und zählt zu den rheumatischen Erkrankungen. Mit einer Prävalenz von 5-14 zu 100.000 gehört sie zu den seltenen Krankheiten. In Europa trifft sie Frauen etwa vier bis sechs Mal häufiger als Männer, mit einer maximalen Inzidenz zwischen dem 45. und 64. Lebensjahr [27, 28].

Abbildung 1: Überleben und geschlechtsspezifisches Überleben in SSc. Eine italienische Kohorte von 1012 SSc- Patienten wurde über 20 Jahre beobachtet und ihr (A) Überleben im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung sowie (B) Überleben von männlichen (M) und weiblichen (F) SSc-Patienten im Vergleich zu Männern (M) und Frauen (F) in der Allgemeinbevölkerung untersucht. Modifizierte Grafik nach Ferri et al. [27]. Unter den Bindegewebserkrankungen hat die SSc die schlechteste Prognose, die Sterberate ist bei SSc-Patienten im Vergleich zur Normalbevölkerung höchst signifikant erhöht (Abb. 1 A).

Einleitung Dabei ist die Mortalität bei erkrankten Männern signifikant höher als bei den erkrankten Frauen. In einer italienischen Kohorte haben von 1012 Patienten zehn Jahre nach der Diagnose 72% der Frauen, aber nur noch 53% der Männer gelebt (Abb. 1 B).

1.2.2 Äthiologie

Die SSc ist durch eine entzündliche Vaskulopathie, ein gestörtes Immunsystem mit erhöhter Auto-Ak-Produktion sowie durch die Deposition extrazellulärer Matrix (ECM) gekennzeichnet, welche schließlich zur Fibrose und Sklerose der Haut, der Gefäße und bestimmter innerer Organe führt [29]. Funktionelle und morphologische Abnormalitäten der Endothelzellen, Lymphozyten und Fibroblasten sowie eine gestörte Angiogenese sind für die SSc beschrieben worden [30].

Die Äthiologie der SSc ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Wie bei anderen Autoimmunerkrankungen wird eine genetische Prädisposition in Kombination mit einem auslösendem Faktor angenommen (siehe 1.1.1) [31]. Dieser führt nach der Hypothese von LeRoy zu einer initialen Störung des Gefäßendothels und nachfolgend zu einer erhöhten Gefäßpermeabilität [32-34]. Auch eine deregulierte Entzündungs- und Immunantwort wird als initiales Moment angenommen [35]. Perivaskuläre Infiltrate von mononukleären Immunzellen konnten besonders in der frühen SSc beobachtet werden und scheinen erheblich zur Entzündung und Schädigung des Gefäßendothels und zur Aktivierung von adventitialen Fibroblasten beizutragen, die nachfolgend übermäßig ECM-Proteine produzieren. Das Ungleichgewicht von ECM-Auf- und -Abbau wird oft noch zusätzlich durch die Inhibierung von Matrix-degradierenden Enzymen, zum Beispiel durch Auto-Ak, verstärkt [36-38]. Die exzessive Akkumulation der ECM-Proteine führt schließlich zur Fibrosierung des betroffenen Gewebes.

1.2.3 Klinisches Erscheinungsbild

Monate bis Jahre, mitunter sogar Jahrzehnte, vor dem ersten Auftreten einer Hautfibrose oder einer anderen Organmanifestation leiden 90-98% der Patienten am sogenannten Raynaud- Syndrom, benannt nach seinem Entdecker Maurice Raynaud [39]. Das Raynaud-Syndrom ist durch plötzlich auftretende, Sekunden bis Minuten andauernde Vasospasmen in den Fingern und/oder Zehen gekennzeichnet, die mit einem scharf abgegrenzten Erblassen und einer häufig nachfolgenden bläulichen Verfärbung (Zyanose) der betroffenen Glieder einhergehen. Beim Wiedereinsetzen der Durchblutung wird die Haut rot. Ursächlich für die zum Teil schmerzhaften Vasospasmen ist eine Fehlfunktion der Kapillaren in der betroffenen Region. Auslöser können

Einleitung Stress oder plötzliche Kälte, aber auch Drogen oder bestimmte Medikamente sein. Das Raynaud-Syndrom kann primär als alleinstehendes Krankheitsbild auftreten, oder als Begleiterscheinung einer zugrundeliegenden Erkrankung, wie der SSc [40].

Neben dem Raynaud-Syndrom ist die Hautfibrose die häufigste Manifestation der SSc. Anhand ihrer Ausbreitung werden zwei Erscheinungsformen der Erkrankung unterschieden: die limitierte kutane SSc (lcSSc, limited cutaneous SSc), bei der die Hautfibrose auf die unteren Extremitäten und das Gesicht beschränkt ist, und die diffuse kutane SSc (dcSSc, diffuse cutaneous SSc), die durch eine diffuse Ausbreitung der Hautfibrose auf die gesamten Extremitäten, Gesicht und Rumpf gekennzeichnet ist [41]. Daneben kann im Verlauf ein sogenanntes Overlap-Syndrom diagnostiziert werden, bei dem zu einer SSc-Symptomatik Merkmale anderer Bindegewebserkrankungen hinzukommen, meist entzündliche Veränderungen an den Gelenken, Muskeln und Sehnen [42]. Weitere Krankheits- manifestationen, die im Verlauf bei allen SSc-Formen auftreten können und mit einer erhöhten Morbidität und Mortalität der Patienten einhergehen, sind eine Lungenfibrose, eine pulmonalarterielle Hypertonie (PAH), Komplikationen am Herzen sowie Beeinträchtigungen der Nierenfunktion [30, 41, 43]. Darüber hinaus leiden die Patienten oft an Fingerulzera (Nekrosen an den Fingerspitzen), Mundtrockenheit, einer Störung der Peristaltik von Speiseröhre und des Magen-Darm-Traktes und einer Beeinträchtigung des Bewegungsapparates.

1.2.4 Verlauf und Komplikationen

Die SSc kann sich in ihrer Ausprägung und ihrem Verlauf von Patient zu Patient stark unterscheiden. Das klinische Erscheinungsbild der SSc ist daher sehr heterogen und hängt in erster Linie von der SSc-Form und der Organbeteiligung sowie dem Erkrankungsstadium ab.

Die SSc ist eine progressive Erkrankung, die oft in Schüben verläuft. Besonders in den ersten Jahren ist die Krankheitsaktivität oft hoch [44]. Ein Maß der Aktivität ist die Hautbeteiligung, die sich in der durch Fibrose und Sklerose bedingten Dicke und Steifigkeit der Haut widerspiegelt und mit Manifestationen bestimmter innerer Organe assoziiert sein kann [45]. Zur Bestimmung der Krankheitsaktivität hat sich die Bewertung der Haut nach dem modifizierten Rodnan-Haut- Score (mRSS, modified Rodnan skin score), durchgesetzt [46, 47]. Dabei wird die Hautbeteiligung durch Palpation definierter Körperstellen bestimmt und mit Punkten von null bis drei bewertet. Die Summe aller Punkte ergibt den aktuellen mRSS (Abb. 2).

Einleitung

Abbildung 2: Der modified Rodnan skin score (mRSS) als Maß der Krankheitsaktivität. (A) Durch Palpation wird die Schwere der Hautbeteiligung an definierten Körperstellen bestimmt und mit Punkten von 0-3 bewertet. Die Summe der Punkte ergibt den mRSS, hier bei Palpation von 17 Körperstellen (17-site mRSS) beispielhaft mit einem Ergebnis von 23/51 möglichen Punkten. (B) Die meisten Patienten haben zu Beginn der Erkrankung die höchste Krankheitsaktivität. Modifizierte Grafiken nach (A) Clements et al. [46] und (B) Denton [48].

Die Hautbeteiligung ist jedoch nicht immer ausreichend, um die Krankheitsaktivität zu bestimmen. So ist besonders in der sehr frühen Phase der dcSSc oft noch keine Verfestigung der Haut festzustellen, obwohl innere Organe bereits betroffen sein können [49, 50]. Auch bei fortgeschrittener Erkrankung kann bei einer milden Hautbeteiligung eine Organbeteiligung nicht ausgeschlossen werden, sodass außerdem andere Kriterien hinzuzuziehen sind, um eine SSc zu diagnostizieren und ihre Ausprägung und Aktivität zu beurteilen (zum Beispiel Häufigkeit von Raynaud-Syndrom-Schüben, Auftreten spezifischer Auto-Ak, Nagelfalzkapillaroskopie, Untersuchung von Organen) [49, 50].

Eine manifeste Lungenbeteiligung ist eine der Haupttodesursachen bei Patienten mit SSc [27, 45]. In der hochauflösenden Computertomografie zeigen bereits zu Beginn der Erkrankung bis zu 90% der Patienten Merkmale einer interstitiellen Lungenerkrankung (ILD, interstitial lung disease). Die ILD ist durch entzündliche Veränderungen der Lungenbläschen und -kapillaren sowie dem angrenzenden Gewebe gekennzeichnet, die sich nachfolgend zu einer Lungenfibrose entwickeln können. Sowohl im entzündeten als auch fibrotischen Lungengewebe kann nur noch ein verminderter Gasaustausch stattfinden, wodurch je nach Ausmaß die körperliche Leistungsfähigkeit und der Gesundheitszustand der Betroffenen erheblich beeinträchtigt wird. Die in der Lungenfunktionsprüfung erhobenen Parameter Forcierte Vitalkapazität der Lunge (FVC, forced vital capacity) und Diffusionskapazität der Lunge für Kohlenmonoxid (DLCO, diffusing capacity of the lung for carbon monoxid) geben Aufschluss über die Lungenfunktion und eine mögliche Beeinträchtigung. Zur Ermittlung der FVC muss der Patient so viel Volumen

Einleitung wie möglich einatmen und mit größtmöglicher Geschwindigkeit (forced) ausatmen. Das ausgeatmete Volumen wird erfasst und mit einem Normwert abgeglichen, der von Größe, Gewicht, Alter und Geschlecht des Patienten abhängt. Die Angabe der FVC erfolgt in Prozent vom Normwert. Eine restriktive Lungenfunktionsstörung (FVC < 75%) entwickelt sich in etwa bei 40% der SSc-Patienten, eine schwere restriktive Lungenfunktionsstörung (FVC < 50%) in etwa bei 10-15% der Patienten [45]. Die DLCO wird über das Ein- und Ausatmen einer der Atemluft beigefügten definierten Menge von Kohlenmonoxid ermittelt. In der Ausatemluft wird der Partialdruck des Gases bestimmt und die Differenz zum initialen Partialdruck ermittelt. Die DLCO wird im Befund prozentual zu einem Referenzwert angegeben [51].

Neben der Lungenfibrose ist die PAH die häufigste Todesursache in der SSc [52, 53]. Aufgrund der Gefäßsklerose steigt der Druck in der Lungenarterie weit über den Normwert an und führt zu einer Beeinträchtigung der Herzfunktion mit einer verminderten Herzauswurfleistung bis hin zur Rechtsherzinsuffizienz. Nachfolgend kann es bei den Patienten zu einer erheblichen Beeinträchtigung der körperlichen Leistungsfähigkeit und zu lebensbedrohlichen Komplika- tionen, wie dem Herzversagen, kommen [53].

Eine weitere lebensbedrohliche Komplikation in der SSc ist die akute renale Krise, die durch eine rasch fortschreitende Verschlechterung der Nierenfunktion bis hin zum Nierenversagen gekennzeichnet ist. Ursache ist eine proliferative obliterative Vaskulopathie, die zu einer Ischämie der Glomeruli führt [54].

1.2.5 Therapiemöglichkeiten

Die therapeutischen Strategien zur Behandlung der SSc sind so vielfältig wie die Erscheinungs- und Verlaufsformen dieser schweren rheumatischen Erkrankung, und orientieren sich in erster Linie an den Symptomen und Manifestationen und den daraus resultierenden Komplikationen beim einzelnen Patienten. So wird beispielsweise bei hoher Krankheitsaktivität mit rasch fortschreitender Hautfibrose das Zytostatikum Cyclophosphamid oder das Immunsuppressivum Mykophenolat-Mofetil verabreicht, um die abnorme Immunantwort und das entzündliche Geschehen aufzuhalten und einzudämmen. Beide Medikamente haben auch einen positiven Effekt auf eine ILD, wie Untersuchungen der Lungenfunktionsparameter FVC und DLCO zeigten [45, 55, 56].

Die Europäische Liga gegen Rheuma (EULAR, European League Against Rheumatism) und die EULAR Scleroderma Trials and Research group (EUSTAR-group) empfehlen für die frühe dcSSc

Einleitung die Behandlung mit dem Zytostatikum Methotrexat, vor allem unter der Abkürzung MTX bekannt, welches zu eine deutlichen Verringerung der Krankheitsaktivität führt [57, 58]. Die Behandlung einer PAH zielt vor allem auf eine gefäßerweiternde Wirkung, wie sie durch Endothelinrezeptorantagonisten und/oder Phosphodiesterase-5-Inhibitoren erreicht werden kann. Liegt bereits eine Beeinträchtigung der Herzfunktion vor, kann hier außerdem unterstützend mit Digitalis behandelt werden [53]. Die Therapie einer renalen Krise konnte in den letzten Jahrzehnten durch den Einsatz von Angiotensin-converting enzyme (ACE)-Hemmern erheblich verbessert werden. Überlebten früher nur 15% der betroffenen Patienten eine renale Krise im ersten Jahr, stieg die 1-Jahres-Überlebensrate bei Behandlung mit ACE-Hemmern auf über 76% an [59]. Daher haben inzwischen nicht mehr die SSc-Patienten mit renaler Krise die schlechteste Prognose, sondern die mit einer Lungen- bzw. Herzbeteiligung (Abb. 3) [27, 45].

Abbildung 3: Überleben in SSc mit und ohne Organmanifestationen. Eine italienische Kohorte von 1012 SSc- Patienten wurde über 10 Jahre beobachtet und ihr Überleben mit (+) und ohne (-) Krankheitmanifestationen der Lunge (L), des Herzens (H) und/oder der Nieren (K) untersucht. Modifizierte Grafik nach Ferri et al. [27].

Der Erfolg der Behandlung eines aktiven Schubes und/oder einer bestimmten Krankheitsmanifestation hängt in erster Linie von dem frühestmöglichen Therapiebeginn ab. Dieser kann durch eine frühzeitige Diagnose, individuelle Risikostratifizierung und engmaschige risikobezogene Untersuchungen der SSc-Patienten realisiert werden.

1.2.6 Die Rolle von Immunzellen in der SSc-Pathogenese

Bereits im Jahr 1974 konnten LeRoy und Kollegen den hohen Aktivierungsstatus von Fibroblasten aus der betroffenen Haut von SSc-Patienten aufzeigen [60]. Prescott und Kollegen haben 1992 Infiltrate von mononukleären Zellen im perivaskulären Gewebe der betroffenen Hautregionen von SSc-Patienten in der frühen Phase der Erkrankung beschrieben, die bei

Einleitung fortschreitender Fibrose wieder rückläufig sind [36], und bereits 1985 konnten Rossi und Kollegen zeigen, dass die SSc-assoziierte ILD durch perivaskuläre Makrophageninfiltrate im Lungenparenchym gekennzeichnet ist [61]. Seither wurde in zahlreichen Studien erforscht, ob und wie Immunzellen im perivaskulären Gewebe Fibroblasten aktivieren können. Dabei wurden vor allem Monozyten und T-Zellen, aber auch B-Zellen untersucht:

Monozyten sind Zellen des angeborenen Immunsystemes, die nach entsprechender Aktivierung am Endothel anhaften und in das Gewebe einwandern. In Abhängigkeit von den stimulatorischen Faktoren differenzieren die Monozyten dort zu Makrophagen mit unterschiedlichen Phänotypen. Die klassisch aktivierten Monozyten/Makrophagen (M1) produzieren inflammatorische Zytokine, zum Beispiel Interleukin (IL) 6 und IL-8, und treiben entzündliche Prozesse voran. Die alternativ aktivierten Monozyten/Makrophagen (M2) produzieren vor allem das Zytokin Transforming growth factor- (TGF- und fördern damit die Wundheilung und Vaskularisierung. Sowohl inflammatorische Prozesse als auch TGF- spielen bei chronisch-entzündlichen und fibrotischen Krankheitsgeschehen eine Rolle. Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, dass im Serum von SSc-Patienten besonders die Zytokine für die Aktivierung des alternativen Phäntoypus von Monozyten erhöht sind [62-64].

Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass die Monozyten im Blut sowie die Makrophagen in der Haut und in der Lunge von SSc-Patienten zahlenmäßig erhöht sind und sowohl einen aktivierten profibrotischen als auch entzündlichen Phänotyp zeigen. So wurden die Aktivierungsmarker Cluster of Differentiation (CD) 163 und CD204 auf Monozyten/Makrophagen vermehrt exprimiert, und die inflammatorischen bzw. profibrotischen Zytokine IL-8 und CC-Motiv-Ligand (CCL) 18 waren in der Flüssigkeit der bronchoalveolären Lavage (BAL) erhöht [62, 65-67].

Andere Studien konnten aufzeigen, dass besonders TGF- und CCL18 in vitro Fibroblasten aktivieren und diese dazu anregen, sich zu ECM-überproduzierenden Fibroblasten mit erhöhter Apoptoseresistenz zu entwickeln, wie sie auch vermehrt in den betroffenen Geweben von SSc- Patienten zu finden sind [68-70].

Neben den Monozyten/Makrophagen sind auch T-Zellen in der Lage, TGF- zu sekretieren und somit zur Entwicklung eines abnormalen Fibroblasten-Phänotypus beizutragen [70]. Wahr- scheinlich von Monozyten/Makrophagen entsprechend aktiviert, zeigen die T-Zellen in der Haut und im Serum von SSc-Patienten einen aktivierten Phänotyp mit einer erhöhten Expression von CD69 und CD154 (CD40L) sowie einen erhöhten Anteil von Th2-Zellen, welche vermehrt IL-4, IL-

Einleitung 6 und IL-13 produzieren und damit wiederum die Differenzierung von Monozyten zum profibrotischen M2-Phänotyp vorantreiben. Darüber hinaus scheint die direkte Nachbarschaft von aktivierten T-Zellen und Fibroblasten sowohl durch die Sekretion von IL-4 und IL-8 als auch über eine CD40-Ligation eine synergistische Verstärkung der Fibroblastenaktivierung und - proliferation zu bewirken [71, 72].

In SSc-Patienten zeigen B-Zellen besonders zu Beginn der Erkrankung häufig einen hyperreaktiven Phänotyp. Dagegen sind die sogenannten regulatorischen B-Zellen, die anti- entzündlich wirken und die regulatorischen T-Zellen unterstützen, in SSc-Patienten verringert. Hyperreaktive B-Zellen produzieren vermehrt Auto-Ak, die zu den entzündlichen und fibrogenen Prozessen in der SSc beitragen. Außerdem können auch aktivierte B-Zellen IL-6 und TGF- sekretieren und somit direkt zur Entzündung und Fibrose beitragen [73]. Wodurch dieser Teufelskreis aus überaktiverten Monozyten, T-Zellen, B-Zellen und Fibroblasten initiiert und aufrechterhalten wird, konnte immer noch nicht hinreichend aufgeklärt werden.

1.2.7 Die Rolle von Auto-Ak in der SSc-Pathogenese

Auto-Ak, die gegen eine Vielzahl von nukleären, zytoplasmatischen und extrazellulären Autoantigenen gerichtet sind, können bei Diagnosestellung bei über 90% der SSc-Patienten detektiert werden [4, 74]. Einige dieser Auto-Ak sind hoch spezifisch für die SSc, andere sind auch bei weiteren Autoimmunerkrankungen zu finden. Soweit man bis heute weiß, tragen die meisten Auto-Ak, die im Serum von SSc-Patienten detektiert werden können, nicht zur Pathogenese bei. Das Auftreten von bestimmten, nicht pathogenen Auto-Ak ist aber statistisch mit dem Risiko der Entwicklung gewisser Organmanifestationen assoziiert. Die routinemäßige Analyse dieser Auto-Ak ist deshalb fester Bestandteil der Diagnosestellung und Risikostratifikation [4].

Daneben wurden in den letzten Jahren zunehmend funktionelle Auto-Ak detektiert und untersucht, und somit ihre Rolle als „pathogenic drivers“ identifiziert [75]. Baroni und Kollegen fanden im Serum von SSc-Patienten Auto-Ak gegen den PDGFR und konnten deren Spezifität und agonistische Eigenschaften überzeugend demonstrieren [76]: Isoliertes IgG von SSc- Patienten (SSc-IgG) induzierte die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS, reactive oxigen species) in PDGFR-exprimierenden Zellen, nicht aber in Zellen ohne PDGFR. Die Bindung der Auto-Ak und die ROS-Produktion konnten durch die Adsorption von IgG an rekombinanten PDGFR unterbunden werden. Auch konnte PDFG die Bindung von SSc-IgG kompetitiv inhibieren [76]. Vermutlich lag der PDGFR-Aktivierung eine Dimerisation durch die Auto-Ak zugrunde [77].

Einleitung Als funktionelle Konsequenz induzierte die SSc-IgG-Bindung die Rezeptor-Tyrosinphospho- rylierung. Nachfolgende Downstream-Signale aktivierten die durch extrazelluläre Signale regulierte Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) und ROS-Kaskaden, die wiederum zur erhöhten Kollagen- und SMA-Expression in Fibroblasten führten [76].

Gegen Fibroblasten gerichtete Auto-Ak sind bei 40-69% der SSc-Patienten zu finden. Die Gruppe der anti-Fibroblast-Auto-Ak (AFA) beinhaltet verschiedene Auto-Ak, die gegen intrazelluläre oder extrazelluläre Ziele gerichtet sind oder aber funktionelle Eigenschaften besitzen [78-81]. Im Serum von SSc-Patienten konnten AFA identifiziert werden, die spezifisch an die Matrix-Metalloproteinase (MMP) 1 bzw. an die MMP-3 binden und diese in ihrer Wirkung inhibieren [37, 38]. MMPs sind Enzyme, die Kollagene und andere ECM-Moleküle degradieren, welche insbesondere von aktivierten Fibroblasten übermäßig produziert und sezerniert werden und deren Akkumulation zur Fibrose führen kann. Wo genau anti-MMP-1- und anti-MMP-3-Auto-Ak am jeweiligen MMP-Molekül binden, um ihre inhibierende Wirkung zu entfalten, konnte noch nicht aufgeklärt werden. Möglicherweise erkennen sie ein Epitop an der katalytischen Domäne oder deren Nähe, und behindern so die katalytische Aktivität oder eine aktive Konformation der MMPs.

Bei 25-85% der SSc-Patienten, aber auch bei anderen Autoimmunerkrankungen, können anti- Endothelzell-Auto-Ak (AECA, anti-endothelial cell autoantibodies) detektiert werden. Dabei sind hohe AECA-Serumspiegel in der SSc mit einer schweren vaskulären Beteiligung assoziiert. Eine erhöhte Affinität sowie nachfolgende ADCC und damit eine Schädigung des Endothels durch pathogene Auto-Ak wurde vielfach nachgewiesen [4, 77, 82, 83]. Für lange Zeit konnte aber kein Zielprotein auf Endothelzellen identifiziert werden, das einen funktionellen Effekt vermitteln könnte. Inzwischen wurden jedoch mindestens drei Moleküle gefunden, die durch AECA gebunden und aktiviert werden: Novel antigen 2, intercellular adhesion molecule 1 und der Endothelinrezeptor Typ A (ETAR). Für alle drei konnten funktionelle Eigenschaften, wie die Aktivierung von ROS, Zytokinen und vascular cell adhesion molecule 1 nachgewiesen werden [84-87].

Neben dem ETAR konnte ein weiterer GPCR als Zielprotein von funktionellen Auto-Ak in der SSc identifiziert werden, der Muskarinrezeptor Typ 3 (M3R). Der M3R gehört zu den muskarinischen Acetylcholinrezeptoren und ist vorwiegend auf den glatten Muskelzellen der Gefäße (VSMCs, vascular smooth muscle cells) und den exokrinen Drüsen des Verdauungstraktes zu finden. Auto-Ak gegen den M3R wurden vor allen in SSc-Patienten

Einleitung gefunden, die an Defekten der enteralen exzitatorischen Neurotransmission und den damit verbundenen Verdauungsstörungen leiden. SSc-IgG, aber nicht das IgG von gesunden Kontrollen, zeigte sich in der Lage, in vitro die M3R-vermittelten Kontraktionen von glatten Muskelzellen des Musculus sphincter ani internus (innerer Schließmuskel) von Ratte und Mensch signifikant und konzentrationsabhängig zu inhibieren. Anti-M3R-Auto-Ak gehören damit zu den antagonistisch wirkenden Auto-Ak [20].

Die funktionellen Effekte der GPCRs Angiotensin II-Rezeptor Typ 1 (AT1R) und ETAR sowie der gegen sie gerichteten anti-AT1R- und anti-ETAR-Auto-Ak (AT1R- und ETAR-Auto-Ak) werden in den Kapiteln 1.3.3 bis 1.3.5 ausführlich dargelegt.

1.3 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

GPCRs repräsentieren eine große Familie von integralen Membranproteinen, die im menschlichen Genom von über 800 Genen kodiert werden. Zu den GPCRs gehören Nukleotidrezeptoren, Aminrezeptoren, olfaktorische Rezeptoren und viele mehr. Die GPCRs sind in die Regulation von vielfältigen Signalwegen in nahezu allen Organsystemen involviert, von der sensorischen Wahrnehmung bis hin zur Zellaktivität, -bewegung und -tod [75].

1.3.1 Struktur und Funktionsweise von GPCRs

Allen GPCRs gemeinsam ist ihr wesentlicher struktureller Aufbau bestehend aus einem Bündel von sieben transmembranen Helices, die durch drei extrazelluläre und drei intrazelluläre Schlaufen (ECL, extracellular loop; ICL, intracellular loop) miteinander verbunden sind (Abb. 4).

Abbildung 4: Aufbau eines Modells eines G-Protein- gekoppelten Rezeptors. Die Darstellung zeigt den Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptor Typ 1 mit Agonist. Die sieben Helices (I-VII) sind in den Farben Blau, Türkis, Grün, Gelbgrün, Gelb, Orange und Rot abgebildet, wobei der extrazelluläre N-Terminus und Helix I blau und Helix VII sowie der intrazelluläre C- Terminus rot dargestellt sind. Modifizierte Abbildung nach Degano [88].

Der N-Terminus eines GPCR befindet sich außerhalb, der C-Terminus innerhalb der Zelle. N- Terminus und ECL1-3 sind für die Erkennung einer Vielzahl von Liganden zuständig und modulieren deren Zugang und Bindung. Hierbei unterscheiden sich Größe, Form und

Einleitung elektrostatische Eigenschaften erheblich zwischen verschiedenen Rezeptoren. So binden beispielsweise die Liganden von Peptidrezeptoren, wie Chemokinrezeptoren, an Vertiefungen, die flacher und offener sind als die Bindungstaschen niedermolekularer Liganden [89].

Trotz der bemerkenswerten Vielfalt der Liganden und Vielgestaltigkeit der Liganden- bindungsstellen ist der grundlegende Aktivierungsmechanismus bei allen GPCRs ähnlich: Die Bindung eines Hormones, Neurotransmitters oder Zytokins führt zu einer Konformations- änderung, die bis zu den zytoplasmatischen Bereichen des Rezeptors reicht, die daraufhin eine Schnittstelle zur Interaktion mit zytosolischen Proteinen präsentieren. Diese Proteine umfassen heterotrimere Guanosintriphosphat-bindende Proteine (G-Proteine), GPCR-Kinasen (GRKs) und Arrestine [89].

Mehrere biochemische und biophysikalische Studien deuten darauf hin, dass die Aktivierung durch relativ großräumige Rearrangements der Helices induziert wird, die zu verschiedenen Rezeptorkonformationen und damit auch zu verschiedenen Effekten auf die Downstream- Signalproteine führen [90]. Wurde der Ablauf der GPCR-Aktivierung lange Zeit als einfaches und einheitliches Konzept verstanden, wonach einzig die Erhöhung oder Verringerung der Konzentration eines sekundären Botenstoffes (second messenger) zur Weiterleitung eines Signales führt, so hat die Forschung der letzten Jahre jedoch gezeigt, dass die Signalmuster weit komplexer und vielfältiger sind und mit dem einfachen „an/aus“-Prinzip nicht länger ausreichendend beschrieben werden können [91, 92]. Vielmehr sind die GPCRs in ihren Bindungsreaktionen hochdynamisch und verfügen jeweils über ein Repertoire von funktionell unterschiedlichen Konformationen (strukturelle Plastizität), durch die unterschiedliche Signale über denselben Rezeptor vermittelt werden können [92]. Diese verschiedenen Konformationen und ihre jeweilige Energetik sind ligandenspezifisch und werden zusätzlich von zytosolischen Signalen, regulatorischen Proteinen, Lipiden, dem pH-Wert, Ionen und möglicherweise auch von transmembranen Spannungsgradienten beeinflusst [92, 93]. Darüber hinaus sind viele GPCRs in der Lage, Homo-, Hetero- oder Oligomere zu bilden. Es wird angenommen, dass diese Dimere bzw. Oligomere eine weitere Möglichkeit darstellen, die Signaltransduktion zu modulieren und einen Crosstalk zwischen GPCR-induzierten Signalwegen zu vermitteln [89].

Viele GPCRs zeigen auch ohne Bindung eines Agonisten eine sogenannte Grundaktivität. Wird bei gesättigter Ligandenkonzentration die maximale GPCR-Aktivität erreicht, so handelt es sich bei diesem Ligand um einen vollen Agonisten. Bei Liganden, die nur submaximale Aktivität induzieren, spricht man von partiellen Agonisten. Wenn sie die Aktivität unter das Niveau der

Einleitung Grundaktivität reduzieren, handelt es sich inverse Agonisten. Darüber hinaus können einige Liganden als Agonisten für den einen Signalweg fungieren, während sie für einen anderen Signalweg inverse Agonisten darstellen oder die Grundaktivität nicht verändern (biased ligands/agonists, biased agonism). Dieses Phänomen wird als funktionelle Selektivität bezeichnet [92-94]. Die funktionelle Selektivität und damit die ligandenspezifische Änderung der Konformation und damit ligandenspezifische Transduktion eines bestimmten Signalweges von vielen möglichen konnte in den letzten Jahren durch die Fortschritte in der Strukturanalyse für immer mehr GPCRs gezeigt werden [93].

Die G-Proteine fungieren in der Signaltransduktion als Vermittler zwischen GPCR und den nachgeschalteten Signalwegen. Die Untereinheiten G, G und G sind aneinander gebunden und mit dem GPCR assoziiert. In der heterotrimeren Form sind die G-Proteine inaktiv, G trägt ein GDP. Durch Bindung eines Agonisten und der nachfolgenden Konformationsänderung des GPCR kommt es zum Austausch von GDP mit GTP, und die so aktivierte G-Untereinheit dissoziiert vom Rezeptor. Alle drei Untereinheiten sind nun in der Lage, mit ihren Downstream- Effektoren zu interagieren, wobei G und G stets als Dimer erhalten bleiben [95, 96].

Vielen GPCR ist ein Repertoire verschiedener G-Proteine nachgeschaltet, die spezifisch unterschiedliche Signalwege induzieren können. Die G-Untereinheiten aktivieren intrazelluläre Effektoren, wogegen die G/-Untereinheiten in der Lage sind, transmembrane Moleküle, zum Bsp. Ionen-Kanäle, zu modulieren [96]. Darüber hinaus können G-Proteine die Phosporylierung benachbarte Tyrosinkinaserezeptoren bewirken und somit diese Rezeptoren liganden-unabhängig aktivieren, ein Effekt der als Transaktivierung oder Crosstalk bezeichnet wird [97].

Die Ligandenbindung löst auch intrazelluläre Signale aus, die zu einer meist raschen Terminierung der Rezeptoraktivierung führen. Das Phänomen der funktionellen Selektivität beschreibt nicht nur die Fähigkeit von Liganden, bestimmte aktive Konformationen eines GPCRs zu stabilisieren, sondern führt auch zu unterschiedlichen molekularen Mechanismen der Desensitisierung. In Abhängigkeit von der jeweiligen Rezeptorkonformation wird der GPCR durch eine oder mehrere GRKs phosphoryliert, worauf die multifunktionellen Adapterproteine -Arrestin 1 und 2 den GPCR von den G-Proteinen entkoppeln. Die verschiedenen GRKs bewirken unterschiedliche Phosphorylierungsmuster, die den genauen Mechanismus der Desensitisierung und den anschließenden Fortgang des GPCRs bestimmen [93, 98-101]. Gut untersucht ist der klassische Weg der GPCR-Internalisierung mit nachfolgender Resensitisierung

Einleitung oder Degradierung (Abb. 5). Hierbei wird der entkoppelte GPCR mit Hilfe von Arrestinen und dem Clathrin-Adapterprotein 2 in Clathrin-umhüllte Vesikel internalisiert und nachfolgend lysosomal degradiert oder über ein Recycling-Vesikel zurück zur Zytoplasmamembran transportiert und reinsertiert, um dort wieder als aktiver bzw. aktivierbarer GPCR zu fungieren (Resensitisierung) [100].

Abbildung 5: Mechanismen der GPCR-Desensitisierung und -Internalisierung. Nach Aktivierung des GPCR durch Ligandenbindung werden die intrazellulären Signalkaskaden ausgelöst. Hierbei kommt es auch zu Signalen, die die Desensitisierung des GPCR einleiten: Phosphorylierung durch GRKs und nachfolgende Interaktion mit Arrestinen und Cathlin-Adapterprotein 2 führen zur Entkopplung des GPCR von den G-Proteinen und zur Internalisierung. Im Endosom erfolgt die Dephosphorylierung. Anschließend wir der Rezeptor lysosomal degradiert oder in einem Recycling-Vesikel zurück an die Zelloberfläche transportiert und dort reinsertiert. Modifizierte Abbildung nach Ramachandran et al. [100].

Ob der GPCR degradiert oder recycelt wird, scheint auch von der Stimulierungsdauer eines Liganden auf die Zelle abzuhängen, wobei eine kurze Stimulation eher zum Recycling und eine längere Stimulation (mehrere Stunden) vornehmlich zur Degradierung eines GPCRs führt [99]. Bei vielen GPCRs sind die Desensitisierungsmechanismen weitaus komplexer, zum Beispiel wenn die Rezeptoren als Oligomere auftreten oder mit bestimmten Membrankompartimenten assoziiert sind [94]. Auch konnten Mechanismen aufgezeigt werden, bei denen die Phosphorylierung durch eine PKA erfolgt oder die GRKs unabhängig von einer Phosphorylierung und ohne die Mitwirkung von Arrestinen eine Desensitisierung vermitteln [99]. Diese Komplexität der GPCR-Biologie hat zu einer breitgefächerten Forschung geführt, die stetig

Einleitung vielfältige neue Erkenntnisse hervorbringt, welche zu neuen Ideen in der molekularen Pharmakologie führen [102].

1.3.2 GPCRs in der Inflammation

GPCRs spielen bei Entzündungsprozessen eine entscheidende Rolle. Inflammatorische Zellen, und hierbei besonders Granulozyten, Monozyten und Makrophagen, exprimieren eine Vielzahl von GPCRs für Chemokine und andere Zytokine [96].

Abbildung 6: Inflammatorische Signalwege von GPCRs. Der Signalweg wird durch die Ligandenbindung und nachfolgende Konformationsänderung des GPCR initiiert. Eine Liste von relevanten Liganden ist oben in der Abbildung gezeigt. Alle vier Klassen der G-Proteine sind an der Regulation inflammatorischer Zellaktivierung oder - inaktivierung beteiligt. Gezeigt sind die Haupteffektoren inklusive sekundäre Botenstoffe wie Ca2+, cAMP – cyclic adenosine monophosphate, Proteinkinasen, Lipidkinasen. Am Ende eines Signalweges führt die Anbindung von Transkriptionsfaktoren zur Regulation der Genexpression und damit zur Umsetzung des Signales in zelluläre Funktionen. Abkürzungen: AKT=PKB – protein kinase B, cAMP – cyclic adenosine monophosphate, CARMA1 – caspase recruitment domain-containig protein 11, CREB – cAMP response element-binding protein, DAG - diacylglycerol, ERKs – extracellular signal-regulated kinases, IKK – inhibitor of NF-B kinase, IP3 – inositoltriphosphate, MEKK3 – MEK kinase 3, MEKs – MAPK/ERK kinases, NFAT – nuclear factor of activated T cells, NF-B – Nuclear factor B, PLC – phospholipase C, PIP2 – phosphatidylinositol biphosphate, PIP3 – phosphatidylinositol triphosphate, PKA – protein kinase A, PKC– protein kinase C, Rho-GEF – Rho-guanine nucleotide exchange factor, SRF – serum response factor, TAK1 – TGF-activated kinase 1. Modifizierte Abbildung nach Sun et al. [96].

Die Expression dieser GPCRs ist entscheidend für die Migration und Akkumulation der Immunzellen am Entzündungsort, wo sie die Entzündung sowohl unterhalten als auch zu ihrer Beseitigung beitragen. Die GPCRs können hierbei sowohl pro-inflammatorische als auch anti-

Einleitung inflammatorische Funktionen vermitteln oder in die Regulation der Permeabilität des Gefäßendothels involviert sein [96].

Signalwege, die in der Inflammation eine Rolle spielen, sind in Abbildung 6 schematisch dargestellt. Die G-Protein-induzierten Signalkaskaden führen zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren, zum Beispiel cyclic adenosine monophosphate (cAMP) response element-binding protein, Nuklearfaktor B (NF-B) und andere. Diese Transkriptionsfaktoren, besonders NF-B, regulieren die Expression von Genen, die für inflammatorische Faktoren kodieren [96].

1.3.3 Angiotensin II-Rezeptoren

Angiotensin II-Rezeptoren sind Komponenten des Renin-Angiotensin-Systems (RAS). Das RAS reguliert den Wasser- und Elektrolythaushalt sowie den Blutdruck. Die physiologisch aktive Hauptkomponente des RAS ist Angiotensin II (Ang II), ein aus acht Aminosäuren bestehendes Peptidhormon. Seine physiologischen Effekte umfassen die Regulation des Gefäßwiderstandes und des Gefäßvolumens, der Filtrationsrate in den Nieren sowie die Induktion von Zellwachstum und Proliferation [103]. Ang II wird durch Spaltung aus dem inaktiven Angiotensin I gebildet. Diese Reaktion wird durch ACE katalysiert. Die Vorstufe des Angiotensin I wird in der Leber produziert und im Blut durch das in den Nieren synthetisierte Renin in Angiotensin I gespalten. Daneben existieren sogenannte lokale oder intrazelluläre RAS, in denen die Ang II- Synthese extrazellulär durch zum Beispiel Chymase oder durch intrazelluläre Komponenten des RAS katalysiert wird [103, 104]. So sind zum Beispiel Endothelzellen, VSMCs, Fibroblasten und Monozyten in der Lage, Ang II zu produzieren [104, 105].

Seine Wirkung vermittelt Ang II über die Angiotensin II-Rezeptoren (ATR) Typ 1 und 2 (AT1R und AT2R). AT1R und AT2R gehören zu den rhodopsinähnlichen GPCRs (Familie A) und werden über die Gene AGTR1 und AGTR2 kodiert. Funktionelle Eigenschaften sowie die Protein- und mRNA- Expression eines dritten ATR wurden für Maus-Neuroblastom-Zellen gezeigt. Der Nachweis eines Genes, das unabhängig von AGTR1 und AGTR2 für einen dritten ATR kodiert, steht jedoch noch aus, sodass über die Existenz eines dritten ATR bislang Unklarheit herrscht [104].

AT1R

Der wichtigste Effekt von Ang II, die Aufrechterhaltung des Gefäßtonus‘ durch Vasokonstriktion, wird über den AT1R vermittelt. Darüber hinaus ist der AT1R u. a. an der Regulation des Sympathikus sowie der Proliferation von Myozyten beteiligt. Er wird in den VSMCs exprimiert,

Einleitung sowie in vielen Organen, zum Beispiel Niere, Nebenniere, Herz, Gehirn und Lunge [106, 107]. Eine AT1R-Expression konnte auch für humane B- und T-Zellen sowie Monozyten des peripheren Blutes gezeigt werden [106].

Die zweidimensionale Darstellung des AT1R sowie seine dreidimensionale Struktur bei Antagonistenbindung sind in Abbildung 7 gezeigt. Die Kristallstrukturanalyse mit einer Auflösung von 2.9 Å wurde mit einem humanen AT1R durchgeführt [108]. Die Analyse bestätigt einen Aufbau ähnlich dem anderer GPCRs der Rhodopsinfamilie. Vier Cysteinreste im extrazellulären Bereich können bei Anwesenheit eines reduzierenden Agenz‘ zwei Disulfidbrücken formen und somit den Rezeptor inaktivieren. Der ECL2 weist eine Haarnadelstruktur auf. Der zytoplasmatische C-Terminus enthält die Phosphorylierungsstellen für Serin-/Threoninkinasen. Die innerhalb der GPCRs hochkonservierten Motive DRY in Helix III und NPxxY in Helix VII spielen eine Rolle bei den Mechanismen der Rezeptoraktivierung und der funktionellen Selektivität [104]. Der ECL2 ist in mehreren Studien als Bindungsstelle für agonistische Auto-Ak identifiziert worden [75, 109, 110].

Abbildung 7: Struktur des humanen AT1R. (A) Sekundärstruktur des humanen AT1R mit präziser Darstellung der Aminosäureabfolge, bestimmter Sequenzmotive sowie der helicalen Bereiche (grau unterlegt). (B) Drei- dimensionale Struktur des AT1R mit dem Antagonisten ZD7155 und bestimmten Sequenzmotiven. Die für die Aktivierung wichtige Wasserstoffbindung zwischen Asn111 und Asn295 ist angedeutet. Die konservierten GPCR- Motive DRY und NPxxY scheinen ebenfalls eine Rolle bei der Aktivierung zu spielen. Die kleine intrazelluläre Helix VIII ist vermutlich an der G-Protein-Kopplung, Aktivierung, Dimerisierung, Internalisierung und dem intrazellulären Transport des Rezeptors beteiligt. Das YIPP-Motiv ist essentiell für die Aktivierung des Jak-STAT-Signalweges und der Phospholipase C-Phosphorylierung sowie für die AngII-induzierten intrazellulären Ca2+- Impulse. Modifizierte Abbildung nach Karnik et al. [104] .

Der AT1R kann über seine G-Proteine eine Vielzahl verschiedener Signalmoleküle aktivieren, zum Beispiel verschiedene Phospholipasen, welche dann Inositoltriphosphat (IP3)/Ca2+,

Einleitung Diacylglycerol/Proteinkinase C (DAG/PKC) und Phosphatidsäure generieren. Diese wiederum können multiple Downstream-Kaskaden aktivieren, zum Beispiel über PKC, durch ERK1/2, Tyrosinkinasen, NF-B und ROS [98, 104]. Eine AT1R-Aktivierung kann aber auch zur Stimulation von G-Protein-unabhängigen Signalwegen führen, wie die ß-Arrestin-vermittelte Aktivierung von Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPK) und des Januskinase/Signal Transducer and Activator of Transcription (JAK/STAT)-Weges [98]. Die Aktivierung eines G-Protein-Signales führt zur raschen Phosphorylierung und Internalisierung des AT1R. Ein Teil der Rezeptoren wird über Recycling-Vesikel an die Membran zurückgeführt, der andere Teil wird degradiert.

Das Phänomen der funktionellen Selektivität ist auch für die Aktivierung des AT1R beschrieben worden. Der natürliche Ligand Ang II kann als voller Agonist alle nachgeschalteten Signalwege des AT1R aktivieren. Dagegen sind diverse Ang II-Analoga in der Lage, nur bestimmte Signalwege mit unterschiedlicher Effizienz anzuregen. So kann beispielsweise das synthetische Analog SII-AngII eine Rezeptorphosphorylierung und -Arrestin-vermittelte-Signalwege induzieren, ohne dabei ein G-Protein-Signalweg zu aktivieren. Die funktionelle Selektivität bestimmter Ang II-Analoga ist vor allem für deren möglichen Einsatz in der Medizin interessant, insbesondere in der Therapie von Herzinsuffizienzen und Bluthochdruck [104].

Die Aufklärung der vielfältigen Downstream-Signalwege des AT1R hat gezeigt, dass seine Aktivierung nicht nur in physiologische Vorgänge involviert ist. Die Produktion von ROS, sowie eine veränderte Vasoreaktivität, gesteigerte Wachstumsprozesse, Migration und Plättchen- aktivierung sind an pathophysiologischen Prozessen beteiligt, die zur endothelialen Dysfunktion, chronischen Entzündung, Hypertrophie, Atherosklerose und Fibrose führen können [98, 104]. Eine andauernde AT1R-Aktivierung kann daher Bluthochdruck, Herzrhythmusstörungen, Nephropathien und metabolischen Störungen verursachen.

Eine Überaktivierung des AT1R scheint auch in der SSc eine Rolle zu spielen. Ang II ist besonders im Serum von Patienten mit dcSSc signifikant erhöht und ist in allen Stadien der vaskulären Inflammation beteiligt [111]. Die AT1R-vermittelte ROS-Produktion trägt zur endothelialen Dysfunktion bei, da die resultierenden toxischen Radikale eine Erhöhung der Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle bewirken, die zu einer vermehrten Anheftung und Migration von inflammatorischen Zellen aus dem Blut in die Gefäßwand und in das Gewebe führen. Die inflammatorischen Zellen verursachen wiederum die Produktion von weiteren ROS sowie weiterem Ang II, sodass es nun zu einem wechselseitigen Verstärkereffekt kommt. Darüber hinaus induziert Ang II die Freisetzung von Zytokinen, die ebenfalls die vaskuläre Inflammation

Einleitung unterhalten, und aktiviert verschiedene Transkriptionsfaktoren, zum Beispiel NF-B, das wiederum die Transkription weiterer Zytokine induziert [104, 112-117]. Auch für die Entstehung einer Fibrose ist die Beteiligung des AT1R für verschiedene Gewebe beschrieben. Der grundlegende fibrogene Effekt scheint hierbei in einer AT1R-vermittelten Induktion von TGF- zu liegen. TGF- ist der zentrale profibrotische Faktor und wird von Lymphozyten und Monozyten produziert. Er verstärkt die Differenzierung von Fibroblasten zum profibrotischen Phänotyp der Myofibroblasten, die vermehrt ECM, insbesondere Kollagen produzieren. Kommt der Ausfall von bestimmten Regulationsmechanismen hinzu, zum Beispiel die Inhibierung von ECM-degradierenden Matrix-Metalloproteasen, führt die deregulierte, übermäßige Produktion von ECM im betroffenen Gewebe schließlich zur Fibrose [104, 118].

Viele der aus einer übermäßigen AT1R-Aktivierung resultierenden pathophysiologischen Erscheinungen, wie zum Beispiel Bluthochdruck, Herzinsuffizienz und diabetische Nephropathien, können inzwischen sehr gut mit ACE-Hemmern wie Captopril und etablierten AT1R-Antagonisten, sogenannten Blockern, behandelt werden [104]. AT1R-Blocker, die in der Klinik zur Anwendung kommen, sind Nicht-Peptid-Antagonisten, wie zum Beispiel Losartan, Candesartan, Irbesatan, Olmesartan und Valsartan. Sie weisen in ihrer chemischen Struktur zwei Phenylringe und einen Tetrazolrest auf, womit sie im Innern des Helixbündels mit den hydrophoben Transmembrandomänen (TMs, transmembrane domains) interagieren können. Die Blocker binden dabei in jeweils ähnlicher Orientierung an die drei Reste Arg167 (ECL2), Trp84 (TM2) und Tyr35 (TM1) der Ligandenbindungstasche des AT1R und verhindern somit die Bindung eines Liganden [104].

In der SSc werden die ACE-Hemmer vor allem zur Therapie einer renalen Krise eingesetzt (siehe 1.2.5). Mit dem AT1R-Blocker Losartan konnten erfolgreich schwere Schübe des Raynaud- Syndroms gelindert und reduziert werden [119].

AT2R

Der AT2R weist eine AS-Sequenzhomologie von etwa 34% mit dem AT1R auf. In seiner übrigen Proteinsequenz sowie seinen Aktivierungsmechanismen und pharmakologischen Eigenschaften unterscheidet er sich jedoch erheblich vom AT1R. Er wird im Embryonalstadium ubiquitär exprimiert, wobei ihm insbesondere bei der Entwicklung des kardiovaskulären Systemes eine wichtige Rolle zugeschrieben wird. Nach der Geburt nimmt die AT2R-Expression rapide ab, sodass er im erwachsenen Organismus nur noch auf bestimmte Gewebe begrenzt und auch dort nur in geringeren Maßen nachgewiesen werden kann. Der AT2R ist in den

Einleitung Nebennierenrinden, den neuronalen Geweben, dem Uterus, der Haut und dem kardiovaskulären System zu finden, häufig koexprimiert mit dem AT1R [103, 104, 120].

Die über den AT2R vermittelten Signalwege scheinen atypisch für einen GPCR zu sein und sind schwer zu untersuchen. Obwohl die klassischen Motive und Signaturen für die entsprechenden Wechselwirkungen vorhanden sind, konnten eine robuste G-Protein-Aktivierung, Signale sekundärer Botenstoffe sowie eine Rezeptordesensitisierung und -internalisierung weder in nativ AT2R-exprimierenden noch in AT2R-transfizierten Zellen hinreichend demonstriert werden. Verschiedene Untersuchungen scheinen jedoch darauf hinzudeuten, dass eine Kopplung des AT2R an Gi/Go-Proteine zumindest in einigen Zellen und Geweben von zum Beispiel Ratten stattfindet. Andere Studien implizieren, dass über den AT2R die Produktion von endothelialer NO-Synthase (eNOS) und Prostaglandinen erhöht wird, die eine Vasodilatation bewirken. Daneben kann die AT2R-Aktivierung verschiedene Phosphatasen induzieren, die wiederum die Aktivität von von ERK1/2 und anderen MAPK limitieren. Generell scheint der AT2R damit ein negativer Regulator der intrazellulären Kinasen zu sein und somit den durch Ang II, EGF und PDGF induzierten Signalwegen entgegenzuwirken. Darüber hinaus kann der AT2R auch verschiedene Tyrosinkinaserezeptoren negativ regulieren, zum Beispiel den EGFR, FGFR und den Insulinrezeptor. Als mögliche Mechanismen werden eine G-Protein-vermittelte Transinaktivierung oder ein direkter Kontakt des C-Terminus‘ mit der entsprechenden Rezeptortyrosinkinase angenommen [103, 104].

Die physiologischen Funktionen des AT2R sind weniger gut aufgeklärt als die des AT1R und konnten daher immer noch nicht klar definiert werden. Es ist jedoch sicher, dass er für die AT1R-vermittelte Vasokonstriktion den Gegenspieler darstellt und seine Aktivierung eine Vasodilatation bewirkt. Jedoch kann auch der AT2R eine Vasokonstriktion vermitteln, wenn der AT1R dazu nicht in der Lage ist, zum Beispiel bei Inhibierung mit einem selektiven AT1R- Antagonisten. Neben seiner Funktion als Vasodilator ist der AT2R auch an verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Vorgängen beteiligt, wobei nicht immer eindeutig zu bestimmen ist, ob seine Aktivierung zur Pathogenese beiträgt oder dieser entgegenwirkt [104]. Untersuchungen von Hautwunden, entzündeten Gefäßen, infarktbetroffenen Myokard und ischämischen Hirngewebe zeigten jedenfalls, dass die AT2R-Dichte in diesen Geweben unter pathologischen Bedingungen, die von Entzündung und Gewebsumbau gekennzeichnet sind, deutlich erhöht ist [103, 104].

Einleitung Als therapeutischer Angriffspunkt ist der AT2R wegen seiner Expression im Gehirn und anderen Nervengeweben vor allem für die Behandlung von neuropathischen Schmerzen interessant. Hierfür wurden bereits selektive AT2R-Antagonisten identifiziert, zum Beispiel EMA401 [120]. Daneben existieren selektive AT2R-Antagonisten, die bislang vor allem im Rahmen der Erforschung des AT2R zum Einsatz kommen, zum Beispiel PD123319 [121]. Ähnlich den AT1R- Blockern besitzen auch diese niedermolekularen Nicht-Peptid-Antagonisten eine Struktur mit mindestens zwei Phenylringen, mit denen sie sich an die hydrophoben TMs anlagern und somit die Bindung eines Agonisten verhindern.

1.3.4 Endothelinrezeptoren

Endotheline sind die aktiven Komponenten des Endothelinsystems. Ihre Familie besteht aus drei Peptiden, Endothelin 1 (ET-1), Endothelin 2 und Endothelin 3, die jeweils 21 AS lang sind. ET-1 ist die im Menschen am häufigsten vorkommende und am besten untersuchte Isoform. Es ist der stärkste Vasokonstriktor im humanen Organismus und wird kontinuierlich von Endothelzellen freigesetzt. ET-1 spielt eine Schlüsselrolle in der Regulation des vaskulären Tonus‘, den es im Zusammenspiel mit Ang II und Vasodilatoren reguliert, und ist auch am Erhalt eines ausgeglichenen Wasser-Elektrolyt-Haushaltes beteiligt [122-125]. Darüber hinaus ist es aber auch als pathogener Mediator bei krankhaften Veränderungen wie der Fibrose, der vaskulären Hypertrophie und der Inflammation involviert [122].

ET-1 wird durch Hydrolyse seines inaktiven Vorläufers, des Großen ET-1, gebildet, welches in den Endothelzellen synthetisiert wird. Die Hydrolyse wird durch Endothelin-converting enzyme (ECE) 1 oder 2 katalysiert, wobei ECE-2 die Reaktion am effektivsten bei einem verringertem pH-Wert, also vornehmlich unter pathophysiologischen Bedingungen, katalysiert. Beide Enzyme sind an der Zellmembran lokalisiert. [123, 124]. Neben den Endothelzellen sind noch weitere Zellen in der Lage, ET-1 zu produzieren. Dazu gehören perivaskuläre Neuronen und Astrozyten, sowie vor allem unter pathologischen Bedingungen, Monozyten und Makrophagen [125, 126].

ET-1 kann an zwei Endothelinrezeptoren (ETR) binden, den ETAR und den Endothelinrezeptor Typ B (ETBR), die verschiedene und zum Teil gegensätzliche Effekte vermitteln. Auch die ETR gehören zur Familie der rhodopsinähnlichen GPCRs, sie werden über die Gene EDNRA und EDNRB kodiert [122-124].

Einleitung ETAR

Der ETAR wird reichlich auf den VSMCs des vaskulären Systems exprimiert, sowie in der Lunge und den Nieren. Neben der Vasokonstriktion ist er auch an der Aktivierung von proliferativen, inflammatorischen, apoptotischen und fibrotischen Prozessen beteiligt [124, 127, 128]. Die Transduktion dieser Signalwege erfolgt nach Agonistenbindung hauptsächlich über Gs- und Gq- Proteine, die Phospholipase C (PLC) aktivieren. Diese hydrolysiert Phosphatidylinositol-4,5- Bisphosphat, wobei DAG und IP3 entstehen. Letzteres löst schließlich die Freisetzung von Kalziumionen aus den intrazellulären Speichern aus. Die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration führt rasch zur Kontraktion der VSMCs und damit zur Konstriktion des Gefäßes. Die Akkumulation von Kalziumionen und DAG aktiviert PKC, wodurch weitere Signalwege angeregt werden, die zur Migration und Zellproliferation oder auch Apoptose führen können [122, 129]. Unter physiologischen Bedingungen wird der ETAR nach -Arrestin- vermittelter Internalisierung recycelt und in die Plasmamembran reinsertiert [125].

Der Wirkung von ET-1 wird durch Vasodilatatoren wie NO und Prostaglandinen entgegengewirkt [125]. Hält eine Aktivierung des ETAR jedoch länger an, kann das eine dauerhafte Verengung von Gefäßen im Herzen, den Nieren und der Lunge bewirken oder zur Hypertrophie von Kardiomyozyten, Fibroblasten sowie VSMCs und damit zu einer Hypertrophie und/oder Fibrose des betroffenen Gewebes führen [129]. Pathophysiologische Bedingungen wie Hypoxie oder Inflammation, die eine ETAR-Überaktivierung bewirken, gehen mit einer erhöhten ET-1-Serumkonzentration einher. Die ET-1-Synthese kann durch verschiedene Faktoren induziert bzw. erhöht werden, zum Beispiel durch Adrenalin, Ang II, die Zytokine IL-1 und TGF-, vascular endothelial growth factor, Thrombin und durch ET-1 selbst [129]. ET-1 wiederum aktiviert Neutrophile und stimuliert die Freisetzung von Zytokinen aus Monozyten [122], und trägt so selbst zur Inflammation bei. Kann der Organismus der übermäßigen ETAR- Aktivierung nicht entsprechend entgegenwirken (ET-1-Clearance, Vasodilatatoren), verstärken sich die pathogenen Effekte wechselseitig.

Hypoxie und Inflammation liegen auch im betroffenen Gewebe der SSc-Patienten vor. In der Pulmonalarterie führen hypoxische Bedingungen und ein erhöhter Druck paradoxerweise zu einer erhöhten ET-1-Freisetzung, wodurch die Pathogenese einer PAH initiiert bzw. vorangetrieben wird [122]. Die gestörte Angiogenese und die daraus resultierende Hypoxie führen bei einem Teil der Patienten zu schweren Ulzerationen an den Fingerspitzen. Studien zeigten, dass durch die Applikation der ETAR-Blocker Sitaxsentan und Ambrisentan die

Einleitung Fingerulzerationen von SSc-Patienten erfolgreich behandelt werden konnten und zumindest ein Teil der Patienten mit PAH eine signifikante Verbesserung der körperlichen Leistungsfähigkeit erlangte [130-133].

Beide Blocker gehören zu den selektiven ETAR-Antagonisten, die als niedermolekulare Nicht- Peptid-Antagonisten in ihrer chemischen Struktur wiederum zwei Phenylringe enthalten, welche die hydrophoben Wechselwirkungen mit den TMs des Rezeptors und damit die Bindung der Antagonisten ermöglichen. Aufgrund vereinzelt aufgetretener schwerer Nebenwirkungen (Leberversagen) wurde Sitaxsentan als Medikament vom Markt genommen und wird nur noch in der Forschung in vitro verwendet [53, 129, 134].

ETBR

Der ETBR wird hauptsächlich von Endothelzellen exprimiert. Hier repräsentiert er den Gegenspieler des ETAR und bewirkt als Scavenger-Rezeptor die ET-1-Clearance aus der Zirkulation und vermittelt durch die Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) eine Vasodilatation. Die eNOS ist stets aktiv, um ETBR-vermittelt NO als Antwort auf Scherstress oder andere physiologische Stimuli sowie auf ET-1-induzierte Gefäßverengungen zu generieren. NO, auch als endothelium derived relaxing factor bezeichnet, aktiviert lösliche Guanylatzyklase, beide setzen den Gefäßtonus herab. Das Gleichgewicht zwischen ET-1 und NO scheint für eine gesunde Physiologie entscheidend zu sein und ist unter pathophysiologischen Bedingungen, wie der endothelialen Dysfunktion, gestört [125].

Auch auf den VSMCs einiger Gefäße ist der ETBR exprimiert, allerdings in wesentlich geringerem Maße als der ETAR. Hier wirkt er jedoch gemeinsam mit dem ETAR gefäßverengend [125, 129]. Die durchschnittliche prozentuale Verteilung des ETAR und ETBR in ETR- exprimierenden Organen ist in Abbildung 8 dargestellt.

Eine ETBR-vermittelte Signaltransduktion erfolgt hauptsächlich über Gi- und Gq-Proteine, wobei über Gq wie beim ETAR PLC und ihre nachfolgenden Komponenten aktiviert werden. Wird die Signalkaskade PI3K  Phosphatidyl-IP3  PKB/Akt angeregt, phosphoryliert PKB/Akt schließlich eNOS, die daraufhin die NO-Produktion verstärkt und die Freisetzung von Prosta- glandinen bewirkt. Nach Internalisierung wird der ETBR zu den Lysosomen transportiert, wo er degradiert wird [125, 135].

Die medikamentöse Inhibierung des ETBR erfolgt vor allem mit Präparaten, die auch den ETAR blockieren, sogenannten dualen ETR-Blockern wie Bosentan und Macitentan. Diese Form der

Einleitung Therapie ist dann angezeigt, wenn eine ETAR- und ETBR-vermittelte Vasokonstriktion maßgeblich an der Pathogenese beteiligt ist, wie zum Beispiel bei beeinträchtigter Nierenfunktion und PAH angenommen wird. Der Einsatz von selektiven ETBR-Blockern erscheint klinisch nicht sinnvoll und sogar gefährlich, weshalb bislang nur wenige ETBR- Antagonisten entwickelt worden sind [53, 125, 129, 134].

Abbildung 8: Verhältnis von ETAR- und ETBR-Expression in verschiedenen Geweben und Gefäßen. Die Rezeptordichten wurden im humanen Gehirn, Herz sowie der Niere, Lunge, Leber und VSMC- Schicht (VSMCs, vascular smooth muscle cells) der bezeichneten Gefäße analysiert. Hierzu wurden die Rezeptoren in einem Bindungs- assay quantifiziert. Die Querbalken repräsentieren jeweils die Gesamt- heit der ETRs. Der blaue Teil eines Balken gibt den prozentualen ETAR-Anteil wider, der pinke den prozentualen ETBR-Anteil. Modifi- zierte Grafik nach Davenport et al. [125].

Für Forschungszwecke wird häufig der selektive Peptid-ETBR-Blocker BQ788 verwendet [125]. BQ788, auch als Pseudo-Peptid bezeichnet, ist ein künstlich hergestelltes kleines Protein, das unnatürliche Aminosäuren (Norleucin, Methylleucyl, Methoxycarbonyltryptophanyl) mit ungewöhnlichen Substituenten enthält und dessen Synthese deshalb vergleichsweise kompliziert ist [136].

1.3.5 AT1R- und ETAR-Auto-Ak

Funktionelle AT1R-Auto-Ak wurden erstmals bereits 1999 von Wallukat et al. beschrieben [137]. Die AT1R-Auto-Ak sind aus den Seren von an Präeklampsie erkrankten Frauen isoliert worden. Ihre agonistische Aktivität konnte anhand des chronotropen Effektes, den sie in spontan kontraktierenden Kardiomyocyten von Ratten induzierten, demonstriert werden. Dieser Effekt konnte mit dem AT1R-Antagonisten Losartan komplett inhibiert werden. In weiteren Experimenten ist mit kurzen überlappenden Proteinen ein Epitop auf dem ECL2 identifiziert worden. Die Applikation des PKC-Inhibitors Calphostin C zeigte auf, dass der Signalweg offenbar

Einleitung über PKC verläuft [137]. Im Anschluss an diese Entdeckung wurde in zahlreichen weiteren Studien demonstriert, dass AT1R-Auto-Ak in der Lage sind, den AT1R zu stimulieren und biologische Reaktionen zu induzieren, die im Zusammenhang mit der Pathogenese von Gefäßerkrankungen stehen [138]. Folglich wurden auch AT1R-Auto-Ak in Patienten gefunden, die an malignem Bluthochdruck, renovaskulären Erkrankungen und Abstoßungsreaktionen nach Allotransplantation der Niere litten [112, 139].

ETAR-Auto-Ak wurden zuerst in Patienten mit idiopathischer PAH gefunden [75]. Sie zeigten ebenfalls einen chronotropen Effekt in spontan kontraktierenden Kardiomyocyten von Ratten, der mit einem selektiven ETAR-Antagonisten inhibiert werden konnte. Auch hier wurde der ECL2 als Epitop der Auto-Ak identifiziert. Die funktionellen ETAR-Auto-Ak induzierten eine permanente Signalkaskade ohne Desensitisierung, die schließlich zur Translokation der Transkriptionsfaktoren NF-b und Aktivatorprotein-1 (AP-1) vom Zytosol in den Zellkern führte. Da die Pathogenese der idiopathischen PAH mit einer erhöhten Aktivierung dieser Transkriptionsfaktoren einhergeht, ist anzunehmen, dass funktionelle ETAR-Auto-Ak zur Pathogenese einer PAH beitragen können [140, 141].

Abbildung 9: AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen im Serum von gesunden Spendern und Spendern mit rheumatischen Erkrankungen. (A) Die AT1R-Auto-Ak-Konzentrationen und die (B) ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen wurden mittels ELISA im Serum von 372 gesunden Spendern (N), 208 Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA), 478 Patienten mit systemischer Sklerose (SSc), 38 Patienten mit primärem Sjögren’s Syndrom (pSS), 33 Patienten mit Morphea (M) und 32 Patienten mit primärem Raynaud-Syndrom (PRP) analysiert. Gezeigt sind die Einzelwerte, die Mediane sind durch eine Linie gekennzeichnet. Die statistische Analyse erfolgte mit dem Mann-Whitney-Test, mit ***p<0.001 und n.s. = nicht signifikant. Modifizierte Grafik nach Riemekasten et al. [142].

Frau Prof. Dr. Riemekasten und Kollegen haben erstmals im Jahr 2011 deutlich erhöhte AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen im Serum von SSc-Patienten beschrieben [142]. Die

Einleitung Konzentrationen beider Auto-Ak waren dabei höchst signifikant höher als in Gesunden und Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen (Abb. 9).

SSc-Patienten mit hohen Konzentrationen beider Auto-Ak litten häufig an einer dcSSc und hatten ein erhöhtes Risiko, eine PAH, renale Krise, Lungenfibrose oder Fingerulzerationen zu entwickeln und auch daran zu versterben, als Patienten mit niedrigen AT1R- und ETAR-Auto-Ak- Konzentrationen. Anhand einer Kohorte von 298 SSc-Patienten und 327 Gesunden wurde mittels ROC-Kurvenanalyse eine optimale Trenngrenze (cut-off) der Konzentrationen der AT1R- Auto-Ak von 9,23 Einheiten und der ETAR-Auto-Ak von 10,4 Einheiten ermittelt, um zwischen Auto-Ak-positiven und -negativen Seren zu unterscheiden. Die prospektive Analyse von 186 Patienten über vier Jahre zeigte, dass die Mortalität bei den AT1R- und ETAR-Auto-Ak-positiven SSc-Patienten in diesem Zeitraum höchst bzw. hoch signifikant höher war als in Auto-Ak- negativen SSc-Patienten [142].

Abbildung 10: AT1R- und ETAR-vermittelte funktionelle Effekte von Auto-Ak in HMECs. HMECS wurden in vitro mit den natürlichen Liganden Angiotensin II (Ang II), Endothelin 1 (ET-1) sowie IgG von SSc-Patienten (SSc-IgG) stimuliert. (A) Ang II und SSc-IgG bewirkten die Aktivierung (Phosphorylierung) von extracellular signal-regulated Kinase 1/2 (p-ERK1/2) und eine erhöhte TGF1-mRNA-Expression im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle. Der selektive AT1R-Antagonist (AT1R-Ant.) Valsartan, nicht aber der selektive AT2R-Antagonist PD123319, inhibierte die SSc-IgG-induzierte Aktivierung. (B) ET-1 und SSc-IgG bewirkten die Aktivierung von ERK1/2 und eine erhöhte TGF1-mRNA-Expression im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle. Der selektive ETAR-Antagonist (ETAR-Ant.) BQ- 123, nicht aber der selektive ETBR-Antagonist BQ-788, inhibierte die SSc-IgG-induzierte Aktivierung. Modifizierte Abbildung nach Riemekasten et al. [142].

Die hohe Bindungsspezifität beider Auto-Ak wurde durch Immunpräzipitation in einem Zelllysat von humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMECs, human microvascular endothelial cells) mit anschließender Gelelektrophorese und Westernblot mittels kommerziell erhältlicher anti-

Einleitung AT1R- und anti-ETAR-Ak nachgewiesen. Für die Untersuchung der funktionellen Eigenschaften wurden ebenfalls HMECs verwendet und mit Ang II, ET-1 und SSc-IgG, mit und ohne selektive Rezeptorblocker, stimuliert. Eine weitere Kontrolle blieb ohne Stimuli. Dabei zeigte sich, dass SSc-IgG eine Aktivierung (Phosphorylierung) von ERK1/2 bewirkte, sowie eine höhere Expression von TGF- induzierte als die unstimulierte Kontrolle und die natürlichen Liganden. Diese Effekte konnten mit dem jeweils korrespondierenden Antagonisten inhibiert werden, aber nicht mit einem selektiven AT2R- oder ETBR-Antagonist (Abb. 10).

Daraus ließ sich schlussfolgern, dass die Auto-Ak spezifisch über den AT1R bzw. ETAR eine Signalkaskade auslösten, die schließlich zu einer erhöhten TGF--Expression in HMECs führte. Demnach können die AT1R- und ETAR-Auto-Ak zu den funktionellen Auto-Ak gezählt werden. Da TGF- besonders bei der Induktion einer abnormalen Fibroblastenaktivität im Rahmen der SSc-Pathogenese eine Rolle zu spielen scheint (siehe 1.2.6) und erhöhte AT1R- und ETAR-Auto- Ak-Konzentrationen mit SSc-Manifestationen und -Mortalität assoziiert sind, scheint hier ein Zusammenhang der funktionellen Effekte, die beide Auto-Ak durch Rezeptorbindung auslösen, mit der SSc-Pathogenese zu bestehen.

Aufgabenstellung 2 Aufgabenstellung

Die Arbeitsgruppe von Frau Prof. Riemekasten erforscht bzw. erforschte am Deutschen Rheumaforschungszentrum (DRFZ) und in den Rheumaforschungslaboren der Charité Berlin die Pathogenese von Autoimmunerkrankungen, insbesondere des SLE und der SSc. Die hierbei entdeckten Auto-Ak, die gegen den AT1R und den ETAR gerichtet sind, scheinen mit bestimmten Manifestationen der SSc sowie mit einer erhöhten Mortalität in Zusammenhang zu stehen [142].

Im Rahmen der Promotionsarbeit „Autoantikörper-induzierte Effekte des Angiotensin II- Rezeptors Typ 1 und des Endothelinrezeptors Typ A auf humane periphere mononukleäre Zellen und ihre Relevanz bei der Pathogenese der systemischen Sklerose“ soll die Expression dieser beiden Rezeptoren auf den Hauptpopulationen der humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs, peripheral blood mononuclear cells) validiert bzw. nachgewiesen werden. Außerdem soll geprüft werden, ob die Expression der Rezeptoren in PBMCs bei der SSc verändert ist. Darüber hinaus soll analysiert werden, ob und welche Auto-Ak-induzierten Effekte, die über diese beiden Rezeptoren vermittelt werden, in der Pathogenese der SSc eine Rolle spielen könnten.

Dazu soll zuerst die Expression des AT1R und des ETAR in humanen PBMCs von gesunden Spendern und Patienten mit SSc untersucht werden. Anschließend sollen in vitro Experimente etabliert und durchgeführt werden, mit denen die pathogenetische Relevanz von AT1R- und ETAR-Auto-Ak aus dem Serum von Patienten mit SSc überprüft werden kann. Hierbei soll untersucht werden, ob die Auto-Ak die Proteinexpression beider Rezeptoren auf PBMCs verändern, die Sekretion von Zytokinen in einer PBMC-Kultur induzieren oder die Migration von T Zellen bewirken. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sollen mit den klinischen Befunden der Patienten, von denen die PBMCs oder die Auto-Ak stammen, in einen statistischen Zusammenhang gebracht werden.

Anhand der Ergebnisse dieser Arbeit soll aufgezeigt werden, ob AT1R- und ETAR-Auto-Ak auf periphere Immunzellen wirken und dabei für die Pathogenese der SSc relevant sein könnten. Auch soll benannt werden, mit welchen Analysen die Forschungsansätze sinnvoll weitergeführt werden könnten.

Ergebnisse 3 Ergebnisse

3.1 Expression der Angiotensin II- und Endothelinrezeptoren in humanen PBMCs

3.1.1 Expression des AT1R und ETAR in PBMCs von gesunden Spendern und SSc-Patienten

Funktionelle Auto-Ak können nur dann auf eine Zelle wirken, wenn die entsprechende Zielstruktur dort exprimiert ist. Aus diesem Grund wurde die Proteinexpression des AT1R und des ETAR zunächst auf der Zelloberfläche, anschließend in der gesamten Zelle mittels Durchflusszytometrie quantitativ analysiert. Hierbei wurde die Häufigkeit (Rate) rezeptorpositiver Zellen in Prozent ermittelt, sowie die mittlere Dichte der Rezeptoren auf den Zellen anhand der medianen Fluoreszenzintensität (MFI) bestimmt, wobei eine entsprechende Isotypenkontrolle jeweils als Referenz diente (siehe 5.2.2). Untersucht wurden die drei Hauptgruppen der PBMCs, T-Zellen, B-Zellen und Monozyten – nachfolgend zusammenfassend als PBMCs bezeichnet, von 14 gesunden Spendern (Durchschnittsalter 41,1 ± 15,3 Jahre; m/w = 6/8) und 18 SSc-Patienten (Durchschnittsalter 48.4 ± 11.3 Jahre; m/w = 8/10; dcSSc/lc/SSc = 17/1).

Die ersten Immunfluoreszenzfärbungen zeigten, dass sich die Rezeptoren nicht oder kaum auf frisch isolierten PBMCs nachweisen ließen. Als Ursache hierfür wird die Internalisierung der Rezeptoren während der Isolierung aus dem Blut angenommen, wie sie zumindest für den AT1R schon beschrieben worden ist [105]. Deshalb wurde der Rezeptorfärbung ein Permeabilisierungsschritt vorangestellt und somit das Gesamtprotein des jeweiligen Rezeptors in den Zellen quantifiziert.

Die Expression des AT1R und ETAR konnte in humanen PBMCs nachgewiesen werden (Abb. 11). Die Resultate zeigen, dass die Expression beider Rezeptoren in PBMCs der SSc-Patienten dieser Kohorte im Mittel (Median) niedriger ist als die in PBMCs der gesunden Kontrollgruppe. Dies gilt sowohl für die Raten rezeptorpositiver Zellen als auch für die Rezeptor-Dichten. Die Rate AT1R- positiver Monozyten und ETAR-positive T-Zellen ist hierbei signifikant verringert (Abb. 11 A und D), ebenso die Dichte des AT1R in T-Zellen und Monozyten, sowie die Dichte des ETAR in T- Zellen (Abb. 11 B und E). Die Rate AT1R-positiver Zellen ist tendenziell auch in T-Zellen und B- Zellen der Patienten verringert (Abb. 11 A). Einzig die Rate ETAR-positiver B-Zellen ist in beiden Gruppen nahezu gleich (Abb. 11 D).

Ergebnisse

gesunde Spender SSc-Patienten A B C -2 3 ** * 4.010 * + + ] 100 ) 1.010 -3 80 2 EEF1A1 1.0 10 -4 -ct  60

40 1 AGTR1 5.010 -5 -(ct

20 [2 AT1R mRNA-Expression AT1R AT1R-positive Zellen [%] Zellen AT1R-positive AT1R-Dichte [relativeMFI] AT1R-Dichte 0 0 0 CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+

D E F 100 2.5 * 1.010 -7 ] ) 80 2.0 1.010 -8

* EEF1A1 60 1.5 - 0 9

-ct 1.010 40 1.0

EDNRA 5.010 - 1 0 20 0.5 -(ct [2 ETAR mRNA-Expression ETAR ETAR-positive Zellen [%] Zellen ETAR-positive 0 [relativeMFI] ETAR-Dichte 0.0 0 CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+

Abbildung 11: Expression des AT1R und des ETAR in humanen PBMCs. Die Quantifizierung der (A) Protein- expression des AT1R erfolgte anhand der Rate rezeptorpositiver Zellen und (B) der Rezeptor-Dichte in T-Zellen (CD3+), B-Zellen (CD19+) und Monozyten (CD14+) des peripheren Blutes von gesunden Spendern (n=14) und SSc- Patienten (n=18, n=16 für AT1R). Die Proteinexpression wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt, wobei jeweils eine Isotypenkontrolle als Referenz mitgeführt wurde. Die Quantifizierung der (C) mRNA-Expression des AT1R in den T-Zellen, B-Zellen und Monozyten von gesunden Spendern (n=6) wurde mittels Real-time polymerase chain reaction (PCR) nach vorangegangener reverser Transkription der mRNA in cDNA in Zusammenarbeit mit Angela Kill durchgeführt. Als Referenz diente das Gen des Proteins eukaryotischer Elongationsfaktor 1-alpha 1 (EEF1A1). Die Quantifizierung der (D-F) ETAR-Expression ist gleichermaßen dargestellt. Gezeigt sind die einzelnen Werte sowie der Median (A, B, D, E) bzw. der Mittelwert mit dem mittleren Standardfehler (C und F). Die statistischen Unterschiede wurden mit dem Mann-Whitney-Test ermittelt, wobei (tendenziell) signifikante Unterschiede mit +p<0.1, *p<0.05 und **p<0.01 bezeichnet sind.

Zur Verifizierung der Expression beider Rezeptoren in humanen PBMCs wurde zusätzlich die mRNA-Expression mittels quantitativer polymerase chain reaction (PCR) quantifiziert (Abb. 11 C und F). Die Daten bestätigen, dass beide Rezeptoren in humanen PBMCs exprimiert werden. Der Vergleich der Subtypen untereinander zeigt, dass die mRNA-Expression der Rezeptoren in etwa die Proportionen der Proteinexpression (Dichte) widerspiegelt. Die insgesamt relativ geringe mRNA-Expression der Rezeptoren ist in der Berechnung mit Hilfe der Delta-ct-Methode begründet, da als Referenz hierbei das house keeping-Gen EEF1A1 diente, welches in PBMCs in vergleichsweise großer Menge konstitutiv exprimiert wird.

3.1.2 Expression des AT2R und ETBR in PBMCs von gesunden Spendern und SSc-Patienten, Verhältnis der Angiotensin II- und Endothelinrezeptoren

Die Rezeptoren AT2R und ETBR können aufgrund der durch sie vermittelten Effekte als Gegenspieler zum AT1R bzw. ETAR fungieren. Eine Störung in der Balance der Expression der

Ergebnisse ATR bzw. ETR kann eine pathologische Störung bewirken oder kennzeichnen (siehe 1.3.3 und 1.3.4). Deshalb wurde auch die Proteinexpression des AT2R und des ETBR durchflusszytometrisch untersucht sowie die Resultate ins Verhältnis zu denen des AT1R und ETAR gesetzt (Abb. 12).

Die Expression des AT2R und des ETBR ist ebenfalls in PBMCs von SSc-Patienten im Mittel (Median) niedriger als in PBMCs von gesunden Spendern. Dieser Unterschied ist signifikant für die Rate AT2R-positiver T-Zellen, für die Rate ETBR-positiver T-Zellen, B-Zellen und Monozyten, sowie für die ETBR-Dichte in Monozyten, und hoch signifikant für die ETBR-Dichte in B-Zellen (Abb. 12 A-D).

gesunde Spender A SSc-Patienten B C D 120 6 + 120 * * * 7 + ** * 100 * 5 100 5

80 4 80 3

60 3 60 2 40 2 40 1 20 1 20 AT2R-positive Zellen [%] Zellen AT2R-positive ETBR-positive Zellen [%] ETBR-positiveZellen AT2R-Dichte [relative MFI] [relative AT2R-Dichte 0 0 0 MFI] [relative ETBR-Dichte CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+

E F G H 5.5 10.0 2.0 3 30 2.5 ** ** 8 2.5 6.5 5 2.0 1.5 2 4 1.5 1.0 1.0 1.0 3 1.0 2

AT1R/AT2R 1 AT1R/AT2R ETAR/ETBR ETAR/ETBR 0.5 0.5 0.5 0.5 1 [Ratio derRezeptor-Dichten] [Ratio 0.0 0.0 der Rezeptor-Dichten] [Ratio 0.0 0 0 0.0 [Ratio der rezeptorpos. Zellen] rezeptorpos. der [Ratio [Ratio der rezeptorpos. Zellen] rezeptorpos. der [Ratio CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ Abbildung 12: Proteinexpression des AT2R und des ETBR in humanen PBMCs, Verhältnis der Proteinexpression des AT1R zum AT2R sowie des ETAR zum ETBR. Die Quantifizierung der (A) Proteinexpression des AT2R erfolgte anhand der Rate rezeptorpositiver Zellen und (B) der Rezeptor-Dichte in T-Zellen (CD3+), B-Zellen (CD19+) und Monozyten (CD14+) des peripheren Blutes von gesunden Spendern (n=14) und SSc-Patienten (n=18). Die Proteinexpression wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt, wobei jeweils eine Isotypenkontrolle als Referenz mitgeführt wurde. Die Quantifizierung der (C und D) ETBR-Expression ist gleichermaßen dargestellt. Das (E-H) Verhältnis der Angiotensin II- und Endothelinrezeptoren ist jeweils als Ratio der Raten rezeptorpositiver Zellen bzw. der Rezeptor-Dichten abgebildet. Gezeigt sind die einzelnen Werte sowie der Median. Die statistischen Unterschiede wurden mit dem Mann-Whitney-Test ermittelt, wobei (tendenziell) signifikante Unterschiede mit +p<0.1, *p<0.05 und **p<0.01 bezeichnet sind.

Bildet man die Ratios der jeweiligen Gegenspieler AT1R/AT2R und ETAR/ETBR (Abb. 12 E-H), so zeigt sich eine hoch signifikant kleinere Ratio der ATR-positiven Monozyten bei SSc-Patienten im Vergleich zu gesunden Spendern (Abb. 12 E), wogegen in B-Zellen die Ratio der ETR-Dichten hoch signifikant erhöht ist (Abb. 12 H).

Ergebnisse 3.1.3 Abhängigkeit der Rezeptorexpression vom Alter der Spender

Das Durchschnittsalter und die Altersspanne der SSc-Patientenkohorte (Durchschnitt 48,0 Jahre; Standardabweichung 11,3 Jahre) stimmen nicht völlig mit denen der gesunden Spender überein (Durchschnitt 41,1 Jahre; Standardabweichung 15,3 Jahre), sodass mögliche altersbedingte Veränderungen hier nicht vollständig durch die Kontrollgruppe ausgeglichen werden können. Deshalb ist überprüft worden, ob die bei den Patienten beobachtete geringere Rezeptorexpression mit dem Alter zusammenhängt. Hierzu wurden die Expressionsdaten beider Spendergruppen mit dem Alter der Spender korreliert. Dabei zeigte sich, dass bei den gesunden Spendern häufig eine tendenzielle oder signifikante negative Korrelation der Expression mit dem Alter besteht, beispielhaft gezeigt für die Dichten des AT1R in Monozyten und des ETBR in T-Zellen sowie des AT2R und des ETAR in B-Zellen (Abb. 13 A-D). Bei den SSc- Patienten konnte dagegen für keinen der vier Rezeptoren ein solcher Zusammenhang gefunden werden, ebenfalls beispielhaft gezeigt für die Dichten des AT1R in Monozyten und des ETBR in T-Zellen sowie des AT2R und des ETAR in B-Zellen (Abb. 13 E-H).

A B C D 2.0 3.0 6.0 Spearman r = -0.61 Spearman r = -0.53 3.5 Spearman r = -0.54 + *p = 0.02 p = 0.052 *p = 0.04 5.5 2.5 3.0 3.0 1.5 2.0 2.5 2.5 1.5 2.0 2.0 1.0 ETAR in B-Zellen in ETAR ETBR in T-Zellen ETBR in AT2R in B-Zellen in AT2R 1.5 1.0 Spearman r = -0.56 1.5 AT1R in Monozyten in AT1R *p = 0.04 0.5 1.0 0.5 1.0 20 30 40 50 60 70 20 30 40 50 60 70 20 30 40 50 60 70 20 30 40 50 60 70

Alter der gesunden Spender [Jahre] E F G H 2.5 2.0 2.0 Spearman r = 0.09 3.0 Spearman r = 0.01 p = 0.73 p = 0.94 2.5 2.0

Rezeptor-Dichte [relative MFI] Rezeptor-Dichte [relative 1.5 1.5 2.0 1.5 1.5 1.0 1.0 1.0 AT2R in B-Zellen in AT2R ETAR in B-Zellen in ETAR Spearman r = 0.1 T-Zellen in ETBR 1.0 AT1R in Monozyten in AT1R Spearman r = 0.03 p = 0.72 p = 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 20 30 40 50 60 70 20 30 40 50 60 70 20 30 40 50 60 70 20 30 40 50 60 70

Alter der SSc-Patienten [Jahre] Abbildung 13: Zusammenhang zwischen Alter der Spender und Proteinexpression der Rezeptoren. Dargestellt sind (A) die Dichte des AT1R in Monozyten, (B) des AT2R in B-Zellen, (C) des ETAR in B-Zellen und (D) des ETBR in T- Zellen in Abhängigkeit vom Alter der gesunden Spender (n=14), ebenso (E) die Dichte des AT1R in Monozyten, (F) des AT2R in B-Zellen, (G) des ETAR in B-Zellen und (H) des ETBR in T-Zellen in Abhängigkeit vom Alter der SSc- Patienten (n=18, n=16 für AT1R). Die Korrelationsanalyse erfolgte nach Spearman. Gezeigt sind die Einzelwerte sowie der Korrelationskoeffizient r und der Irrtumswahrscheinlichkeitswert p, wobei (tendenziell) signifikante Korrelationen mit +p<0.1 und *p<0.05 bezeichnet sind.

Sämtliche Ergebnisse dieser Korrelationsanalyse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Hieraus wird ersichtlich, dass bei 12/24 Datensätzen (ein Datensatz = alle Werte eines Expressions- parameters eines Rezeptors einer Zellart einer Kohorte) der gesunden Spender eine signifikante

Ergebnisse (9/24) bzw. tendenziell signifikante (3/24) negative Korrelation des Alters mit der Rezeptorexpression gefunden wurde. Der entsprechende Wert des Korrelationskoeffizienten ist bei fast allen Korrelationen negativ (22/24). Dagegen gibt es bei den SSc-Patienten keinen signifikanten oder tendenziell signifikanten Zusammenhang der Rezeptorexpression mit dem Alter. Außerdem sind sämtliche Korrelationskoeffizienten positiv (24/24), sodass hier eine altersbedingte Verringerung der Expression unwahrscheinlich ist.

Tabelle 1: Statistischer Zusammenhang zwischen Alter der Spender und Proteinexpression der Rezeptoren. Das Alter der Spender wurde mit den Expressionsdaten der Rezeptoren AT1R, AT2R, ETAR und ETBR in peripheren T- Zellen (CD3+), B-Zellen (CD19+) und Monozyten (CD14+) nach Spearman korreliert. Tendenziell signifikante (p<0.1) und signifikante Korrelationen (p<0.05) sind grau unterlegt.

Datensätze der gesunden Spender Datensätze der SSc-Patienten Spearman r p signifikant? Spearman r p signifikant? Rate: AT1R CD3+ -0,34 0,24 nein 0,19 0,47 nein CD19+ -0,61 0,02 ja 0,16 0,57 nein

CD14+ -0,54 0,04 ja 0 1 nein

AT2R CD3+ 0,07 0,82 nein 0,11 0,65 nein CD19+ -0,54 0,046 ja 0,08 0,75 nein

CD14+ -0,26 0,37 nein 0,14 0,57 nein ETAR CD3+ 0,05 0,87 nein 0,37 0,13 nein CD19+ -0,76 0,002 ja -0,005 0,99 nein

CD14+ 0,32 0,26 nein 0,11 0,66 nein

ETBR CD3+ -0,53 0,06 tendenziell 0,37 0,13 nein CD19+ -0,73 0,003 ja 0,23 0,38 nein

CD14+ -0,42 0,14 nein 0,19 0,45 nein Dichte: AT1R CD3+ -0,28 0,33 nein 0,08 0,78 nein CD19+ -0,21 0,47 nein -0,21 0,46 nein

CD14+ -0,56 0,04 ja 0,1 0,72 nein

AT2R CD3+ -0,05 0,87 nein -0,05 0,84 nein CD19+ -0,61 0,02 ja 0,03 0,9 nein

CD14+ -0,34 0,24 nein 0,17 0,5 nein ETAR CD3+ -0,14 0,63 nein 0,002 0,99 nein CD19+ -0,53 0,05 tendenziell 0,09 0,73 nein

CD14+ 0,26 0,38 nein 0,15 0,54 nein

ETBR CD3+ -0,54 0,047 ja 0,02 0,94 nein CD19+ -0,66 0,01 ja 0,05 0,86 nein

CD14+ -0,47 0,09 tendenziell 0,13 0,62 nein

3.1.4 Abhängigkeit der Rezeptorexpression vom Geschlecht der Spender

Geschlechtshormone können Immunzellen direkt oder indirekt beeinflussen (siehe 1.1.1). Daher wurde hier statistisch untersucht, ob sich die Expression der Rezeptoren zwischen Männern und Frauen unterscheidet. Wie in Tabelle 2 gezeigt, ist bei fast allen Datensätzen (23/24) die Expression der Rezeptoren in den PBMC-Subtypen bei den gesunden Männern

Ergebnisse höher als bei den gesunden Frauen. Dieser Unterschied ist bei über der Hälfte der Datensätze (14/24) signifikant bzw. tendenziell signifikant. In der Gruppe der SSc-Patienten verhält es sich anders. Hier ist bei 19/24 Datensätzen die Expression der Rezeptoren bei den Frauen höher als bei den Männern. Allerdings sind hier die Unterschiede zwischen Männern und Frauen nicht signifikant.

Tabelle 2: Unterschiede in der Proteinexpression der Rezeptoren zwischen weiblichen und männlichen SSc- Patienten sowie gesunden Spenderinnen und Spendern. Die Unterschiede in der Expression des AT1R, AT2R, ETAR und ETBR in peripheren T-Zellen (CD3+), B-Zellen (CD19+) und Monozyten (CD14+) von Männern und Frauen beider Spendergruppen wurden mit dem Mann-Whitney-Test überprüft. Tendenziell signifikante (p<0.1) und signifikante Korrelationen (p<0.05), sowie „weibl.>männl.“ sind grau unterlegt.

Datensätze der gesunden Spender Datensätze der SSc-Patienten Median Mann-Whitney-Test Median Mann-Whitney-Test weibl. männl. p signifikant? weibl. männl. p signifikant? Rate: AT1R CD3+ 8,55 < 16,1 0,35 nein 6,85 > 4,5 0,72 nein CD19+ 5,9 < 18,4 0,08 tendenziell 5,5 > 3,7 0,38 nein CD14+ 29,45 < 80,7 0,12 nein 20,9 < 22 1 nein AT2R CD3+ 42,15 < 56,85 0,41 nein 13,7 < 22,7 0,63 nein CD19+ 11,7 < 52,9 0,01 ja 26,8 > 9,5 0,66 nein CD14+ 71,1 < 92 0,08 tendenziell 62,35 < 83,7 0,7 nein ETAR CD3+ 6,05 < 15,1 0,57 nein 4,3 > 2 0,28 nein CD19+ 2,7 < 12,6 0,014 ja 6,05 > 4,3 0,66 nein CD14+ 7,1 < 38,55 0,23 nein 15,45 > 11,85 0,56 nein ETBR CD3+ 17,5 < 68,4 0,006 ja 5,70 < 7,25 0,75 nein CD19+ 15,45 < 62,9 0,003 ja 12,70 > 3,4 0,46 nein CD14+ 15,05 < 70,2 0,03 ja 12,00 > 5,4 0,75 nein Dichte: AT1R CD3+ 1,65 > 1,63 0,95 nein 1,30 > 1,23 0,5 nein CD19+ 1,18 < 1,47 0,08 tendenziell 1,19 > 1,13 0,23 nein CD14+ 1,48 < 2 0,18 nein 1,43 > 1,33 0,57 nein AT2R CD3+ 1,78 < 2,28 0,18 nein 1,52 < 1,57 0,83 nein CD19+ 1,46 < 2,33 0,013 ja 1,55 > 1,39 0,47 nein CD14+ 1,66 < 2,52 0,06 tendenziell 1,91 > 1,84 0,9 nein ETAR CD3+ 1,44 < 1,68 0,06 tendenziell 1,29 > 1,19 0,24 nein CD19+ 1,1 < 1,45 0,005 ja 1,20 > 1,11 0,76 nein CD14+ 1,34 < 1,45 0,30 nein 1,32 > 1,16 0,41 nein ETBR CD3+ 1,40 < 2 0,41 nein 1,36 > 1,31 0,9 nein CD19+ 1,25 < 2,35 0,04 ja 1,41 > 0,98 0,24 nein CD14+ 1,34 < 1,74 0,08 tendenziell 1,27 > 1,08 1 nein

Um zu ermitteln, ob und wie sich geschlechtsspezifische Unterschiede vor dem Hintergrund der Erkrankung darstellen, wurden auch die Expressionsdaten der Frauen sowie die der Männer beider Gruppen miteinander verglichen (Abb. 14 und 15). Hierbei zeigt sich kein signifikanter oder tendenziell signifikanter Unterschied zwischen gesunden Frauen und SSc-Patientinnen (Abb. 14).

Ergebnisse

A gesunde Frauen B C D 3 SSc-Patientinnen 4 2.5 3

2.0 3 2 2 1.5 2 AT2R AT1R ETAR 1.0 ETBR 1 1 1 0.5

Rezeptor-Dichte[rel. MFI] 0 0 0.0 0 CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+

E F G H 100 100 70 70 60 80 80 40 50 60 60 30 AT1R AT2R ETAR 30 40 40 20 ETBR

20 20 10 10

Rezeptorpositive Zellen [%] RezeptorpositiveZellen 0 0 0 0 CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+

Abbildung 14: Vergleich der Rezeptorexpression in PBMCs zwischen gesunden Frauen und SSc-Patientinnen. Dargestellt sind die (A) Rezeptor-Dichten des AT1R, (B) AT2R, (C) ETAR und (D) ETBR in T-Zellen (CD3+), B-Zellen (CD19+) und Monozyten (CD14+) des peripheren Blutes von gesunden Frauen (n=8) und SSc-Patientinnen (n=10, n=8 für AT1R). Die (E-H) Rate der rezeptorpositiven Zellen sind gleichermaßen gezeigt. Abgebildet sind die einzelnen Werte sowie der Median. Statistische Unterschiede wurden mit dem Mann-Whitney-Test überprüft.

Vergleicht man jedoch die Expression der Rezeptoren in PBMCs gesunder Männer mit der in PBMCs männlicher SSc-Patienten, so ist sie bei den Patienten im Mittel (Median) generell deutlich geringer (Abb. 15).

gesunde Männer A B + C D * + 4 männl. SSc-Patienten 6 * 3 * + 6 ** ** ** 3 4 2 4

2 AT2R ETAR AT1R ETBR 2 1 2 1

Rezeptor-Dichte[rel. MFI] 0 0 0 0 CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+

E + * * F + + G H * * * 100 100 100 100 * 80 80 80 80

60 60 60 60 AT2R AT1R ETAR 40 40 40 ETBR 40

20 20 20 20

Rezeptorpositive Zellen [%] RezeptorpositiveZellen 0 0 0 0 CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ CD3+ CD19+ CD14+ Abbildung 15: Vergleich der Rezeptorexpression in PBMCs zwischen gesunden Männern und männlichen SSc- Patienten. Dargestellt sind die (A) Rezeptor-Dichten des AT1R, (B) AT2R, (C) ETAR und (D) ETBR in T-Zellen (CD3+), B-Zellen (CD19+) und Monozyten (CD14+) des peripheren Blutes von gesunden Männern (n=6) und männlichen SSc-Patienten (n=8). Die (E-H) Rate der rezeptorpositiven Zellen sind gleichermaßen gezeigt. Abgebildet sind die einzelnen Werte sowie der Median. Die statistischen Unterschiede wurden mit dem Mann-Whitney-Test ermittelt, wobei (tendenziell) signifikante Unterschiede mit +p<0.1, *p<0.05 und **p<0.01 bezeichnet sind.

Ergebnisse Die Dichte des AT1R ist hierbei in allen drei PBMC-Subtypen der männlichen Patienten hoch signifikant verringert (Abb. 15 A). Die Dichte des AT2R und des ETAR ist signifikant bzw. tendenziell signifikant in T- und B-Zellen der männlichen Patienten verringert (Abb. 15 B und C), ebenso die Dichte des ETBR in B-Zellen und Monozyten. Ähnliche Unterschiede zeigen sich bei der Rate rezeptorpositiver Zellen. Sie ist für den AT1R und den ETBR in allen drei Subtypen bei den männlichen Patienten signifikant bzw. tendenziell signifikant verringert im Vergleich mit gesunden Männern, ebenso die Rate AT2R-positiver T- und B-Zellen und ETAR-positiver T-Zellen.

3.1.5 Assoziationen der Rezeptorexpression mit den klinischen Parametern der SSc- Patienten

Auto-Ak gegen den AT1R und den ETAR vermitteln ihre Wirkung über diese Rezeptoren, die natürlichen Liganden Ang II und ET-1 darüber hinaus auch über den AT2R und den ETBR, wobei diese auch infolge kompensatorischer Mechanismen bei einer AT1R- und ETAR-Aktivierung in ihrer Expression verändert sein können (siehe 1.3.3 und 1.3.4). Daher können mögliche Zusammenhänge zwischen dem Ausmaß der Expression der Rezeptoren und der klinischen Ausprägung der Erkrankung infolge einer Stimulation durch Auto-Ak oder durch die natürlichen Liganden in Betracht gezogen werden. Um dies zu untersuchen, wurden die Expressionsdaten der vier Rezeptoren mit folgenden klinischen Parametern der SSc-Patienten in einen statistischen Zusammenhang gebracht: Krankheitsaktivität anhand des mRSS, Ulzerationen der Finger, Lungenfibrose, DLCO, VFC, Dauer der Erkrankung anhand der Zeit seit dem ersten Auftreten des Raynaud-Syndroms bzw. des ersten Nicht-Raynaud-Symptomes sowie AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentration. Die sich aus diesen Analysen ergebenden signifikanten bzw. tendenziell signifikanten Zusammenhänge sind nachfolgend gezeigt.

Die Krankheitsaktivität wird über den Haut-Score quantifiziert (17-site mRSS, siehe Einleitung 1.2.2). Bei der Analyse des Zusammenhanges zwischen den Expressionsdaten und dem aktuellen mRSS zeigte sich für die AT1R- und AT2R-Dichte in Monozyten eine signifikante positive Korrelation (Abb. 16 A und B). Demnach korreliert hier die Dichte der ATR in Monozyten deutlich mit der Krankheitsaktivität. Die Korrelationsanalyse der Raten rezeptorpositiver Zellen mit dem mRSS ergab keinen signifikanten Zusammenhang. Nach Aufteilung der Patienten anhand ihrer Krankheitsaktivität in zwei gleich große Stichproben (mRSS unter 10 und mRSS ab 10) ist die Rate AT1R-positiver Monozyten zumindest tendenziell signifikant höher in der Patientengruppe mit höherer Krankheitsaktivität (Abb. 16 C). Für die

Ergebnisse Expression des ETAR und ETBR konnte kein statistischer Zusammenhang mit der Krankheitsaktivität ermittelt werden.

A B C 2.00 3.0 100 +p = 0.07

1.75 2.5 80

1.50 2.0 60

1.25 1.5 40 [relativeMFI] [relativeMFI] 1.00 1.0 20 Sperman r = 0.52 Sperman r = 0.49 *p = 0.037 *p = 0.038 AT1R-Dichte in Monozyten in AT1R-Dichte Monozyten in AT2R-Dichte

0.75 0.5 [%] Monozyten AT1R-positive 0 0 10 20 30 0 10 20 30 0-9 ab 10

Krankheitsaktivität [mRSS] Abbildung 16: Zusammenhang zwischen der Krankheitsaktivität der SSc-Patienten und der Proteinexpression der Rezeptoren in ihren PBMCs. Dargestellt sind (A) die Dichte des AT1R in Monozyten, (B) des AT2R in Monozyten und (C) die Rate AT1R-positiver Monozyten in Abhängigkeit vom modifizierten Rodnan-Hautscore (modified Rodnan Skin Score = mRSS), dem Maß der Krankheitsaktivität. Die Korrelationsanalyse erfolgte nach Spearman, gezeigt sind die Einzelwerte sowie der Korrelationskoeffizient r und der Irrtumswahrscheinlichkeitswert p, wobei signifikante Korrelationen mit *p<0.05 gekennzeichnet sind (A und B). Der Unterschied (C) zwischen Patientengruppen mit niedriger Krankheitsaktivität (mRSS 0-9, n=8) und moderater bis hoher Krankheitsaktivität (mRSS ab 10, n=8) wurde mit dem Mann-Whitney-Test ermittelt, wobei die tendenzielle Signifikanz mit +p<0.1 bezeichnet ist.

Die Klassifizierung der Patienten anhand des Vorhandenseins bzw. Nichtvorhandenseins von Ulzerationen an den Fingerspitzen (Patienten mit/ohne Ulzerationen je n=9) oder einer Lungenfibrose (Patienten mit/ohne Lungenfibrose ebenfalls je n=9) ergab bezüglich der Expression der vier Rezeptoren keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen mit oder ohne diesen Krankheitsmanifestationen. Auch die Korrelationsanalysen der Expressions- daten mit den Lungenfunktionsparametern DLCO und FVC konnten keinen eindeutigen Zusammenhang aufzeigen. Entfallen mussten die Klassifizierung in Patientengruppen mit oder ohne PAH, da in dieser Kohorte nur 2 Patienten eine PAH aufwiesen, sowie die Einteilung der Patienten anhand ihrer SSc-Form, da 17/18 Patienten an einer dcSSc litten.

Das erste Symptom einer SSc ist bei fast allen Patienten das Raynaud-Syndrom (siehe 1.2.2 und 1.2.3). Da es auch isoliert als primäre Gefäßerkrankung auftreten kann, wird der eigentliche Ausbruch der SSc erst durch das Hinzukommen eines weiteren Krankheitsmerkmales, des ersten Nicht-Raynaud-Symptoms (meist die Hautfibrose), definiert. Um festzustellen, ob zwischen der Expression der Rezeptoren und der Dauer der Erkrankung ein statistischer Zusammenhang besteht, wurde für jeden Patient die Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndroms sowie des ersten Nicht-Raynaud-Symptoms mit den Expressionsdaten der Rezeptoren korreliert. Dabei zeigte sich, dass die Rate AT1R-positiver Monozyten mit der Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndroms und des ersten Nicht-Raynaud-Symptoms signifikant invers korreliert (Abb.

Ergebnisse 17 A und C). Auch die AT1R-Dichte in Monozyten wies eine zumindest deutliche bzw. tendenziell signifikante inverse Korrelation mit beiden zeitlichen Parametern auf (Abb. 17 B und D).

A 100 B 2.0 Abbildung 17: Zusammenhang zwischen der Erkrankungsdauer der 80 Spearman's r = -0.53 SSc-Patienten und der Protein- *p = 0.04 1.5 expression des AT1R in ihren PBMCs. 60 Dargestellt sind (A) die Rate AT1R- 40 positiver Monozyten und (B) die 1.0

[relative MFI] [relative Dichte des AT1R in Monozyten in 20 Spearman's r = -0.40 Abhängigkeit von der Zeit seit Beginn p = 0.12 AT1R-Dichte in Monozyten in AT1R-Dichte des Raynaud-Syndroms, sowie (C) die AT1R-positive Monozyten [%] Monozyten AT1R-positive 0 0.5 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 Rate AT1R-positiver Monozyten und

Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndroms [Jahre] (D) die Dichte des AT1R in Monozyten in Abhängigkeit von der Zeit seit C D Beginn des ersten Nicht-Raynaud- 100 2.0 Symptomes von Patienten mit dokumentierten Raynaud-Syndrom 80 Sperman's r = -0.55 *p = 0.03 1.5 und ersten Nicht-Raynaud-Symptom 60 (n=15). Die Korrelations-analyse erfolgte nach Spearman, gezeigt sind die 40 1.0 Einzelwerte sowie der Korrelations- [relative MFI] [relative

20 Spearman's r = -0.50 koeffizient r und der Irrtumswahr- +p = 0.051

AT1R-Dichte in Monozyten in AT1R-Dichte scheinlichkeitswert p, wobei (tenden-

AT1R-positive Monozyten [%] Monozyten AT1R-positive 0 0.5 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 ziell) signifikante Korrelationen mit +p<0.1 und *p<0.05 gekennzeichnet Zeit seit Beginn des ersten Nicht-Raynaud-Symptoms [Jahre] sind.

Die AT1R-positiven T- und B-Zellen wiesen ebenfalls eine negative, wenngleich eher schwache und nicht signifikante Korrelation mit der Zeit seit Beginn des ersten Nicht-Raynaud-Symptoms auf (Spearmann r = -0.29 und -0.30, nicht gezeigt). Für die Expression des AT2R, ETAR und ETBR ließ sich kein statistischer Zusammenhang mit der Krankheitsdauer feststellen.

Die Krankheitsaktivität korrelierte hierbei jedoch nicht mit der Erkrankungsdauer (mRSS vs. Zeit seit dem Auftreten des Raynaud-Raynaud-Syndromes/des ersten Nicht-Raynaud-Symptomes r = -0.13/-0.06, p = 0.22/0.82, ohne Abbildung).

Keine Korrelation zeigte sich zwischen den Auto-Ak-Konzentrationen (anti-AT1R und -ETAR) im Serum der Patienten dieser Kohorte und den Expressionsdaten der ATR und ETR.

3.2 Untersuchung des Einflusses der Auto-Ak auf die Proteinexpression der Rezeptoren in vitro

Die Fragestellung, ob die AT1R- und ETAR-Auto-Ak die Dichte der ATR und ETR modifizieren können, sollte in vitro untersucht werden. Hierzu wurde die Stimulation von isolierten PBMCs gesunder Spender (Buffy coat aus Vollblutspende, siehe 5.1.1) mit IgG von SSc-Patienten (SSc- IgG) sowie von gesunden Spendern als Normalkontrolle (N-IgG) etabliert. Dabei zeigte sich, dass

Ergebnisse die Rezeptoren wieder an der Zelloberfläche durchflusszytometrisch nachweisbar sind, nachdem die PBMCs über Nacht in Kultur waren. Daher wurden die Zellen nach der Isolierung über Nacht in Kultur gehalten und erst anschließend die Oberflächendichte der Rezeptoren zum Zeitpunkt null (t=0) analysiert und die IgG-Stimulation gestartet. Die weiteren Analysen erfolgten zu den angegebenen Zeitpunkten. Neben der Dichte des AT1R und des ETAR wurde auch die ihrer Gegenspieler AT2R und ETBR durchflusszytrometrisch auf T-Helferzellen, zytotoxischen T-Zellen und B-Zellen quantifiziert (Abb. 18). Die Analyse von Monozyten entfiel vorerst, da sie aufgrund ihrer kultivierungsbedingten starken Adherenz für diese Analyse zunächst nicht nutzbar waren.

AT1R AT2R ETAR ETBR

unstim. 2500 N-IgG 7500 5000 7000 SSc-IgG 7000 4500 2400 6000 6500 4000 2300 5000 6000 3500 CD4+ 2200 4000 5500 3000

2100 5000 2500 3000 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

1900 7000 6000 20000

6500 15000 1700 5000 6000 10000 5500

CD8+ 1500 4000 5000 5000

Rezeptordichte [MFI] auf Rezeptordichte[MFI] 1300 4500 3000 0 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

2100 10000 5000 4500

8000 4000 1900 4000 6000 3500 1700 4000 3000 3000 CD19+ 1500 2000 2500

1300 0 2000 2000 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

Inkubationszeit [Tage] Abbildung 18: Zeitlicher Verlauf der Rezeptorexpression des AT1R, AT2R, ETAR und ETBR auf PBMCs unter IgG- Stimulation in vitro, Etablierung. Nach Kultivierung über Nacht und Fc-Rezeptorblockade erfolgte die Stimulation mit 1 mg/mL SSc-IgG (Pool aus IgG von 7 Patienten mit dcSSc im Frühstadium (< 6 Jahre seit Beginn des ersten Nicht-Raynaud-Symptomes) und Organbeteiligung sowie AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen > 20 U) in Doppelansätzen. Als Kontrolle dienten Ansätze mit 1 mg/mL N-IgG (Pool aus IgG von 3 Normalspendern mit AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen < 10 U) sowie unstimulierte Kontrollen jeweils in Doppelansätzen. Die Analyse der Dichten (MFI) erfolgte durchflusszytometrisch auf T-Helferzellen (CD4+), zytotoxischen T-Zellen (CD8+) und B- Zellen (CD19+) zum Zeitpunkt t=0 (direkt vor Stimulation) sowie nach ein, zwei und drei Tagen. Gezeigt sind die Mittelwerte der Doppelansätze.

Im ersten erfolgreich etablierten Experiment stieg die Oberflächendichte des AT1R und ETAR vom Beginn der Stimulierung (t=0) zum Tag 1 in allen drei Ansätzen (SSc-IgG, N-IgG, unstimulierte Kontrolle) auf den untersuchten Subpopulationen deutlich an, wogegen die Dichte des ETBR nur auf T-Helferzellen zunahm. Die AT2R-Dichte war nach einem Tag kaum bzw.

Ergebnisse nicht angestiegen. Die Dichte des AT1R zeigte auf den mit SSc-IgG stimulierten T-Helfer- und B- Zellen über den zweiten bis zum dritten Tag dann wiederum einen deutlichen Abfall, ebenso die Dichte des AT2R auf B-Zellen und die Dichte des ETAR auf allen drei Subpopulationen der SSc- IgG-stimulierten Ansätze (Abb. 18). Auf den T-Zellen nahm die Dichte des AT2R bei SSc-IgG- Stimulation nur leicht ab und stieg dann wieder auf etwa Ausgangsniveau an, wogegen die des ETAR am zweiten Tag deutlich abfiel, aber am dritten Tag auf den T-Zellen ebenfalls wieder Ausgangsniveau erreichte bzw. dieses sogar überschritt, auf den B-Zellen jedoch deutlich niedriger blieb. Es lässt sich feststellen, dass am dritten Tag die Dichte des AT1R und des ETAR auf allen drei Subpopulationen der SSc-IgG-stimulierten Ansätzen geringer war als die der N- IgG-stimulierten Ansätze, gleiches gilt für den AT2R und den ETBR auf B-Zellen. Zusammengefasst waren die AT1R- und ETAR-Dichte nach Stimulation mit SSc-IgG auf den untersuchten Zelltypen deutlich geringer als nach Stimulation mit N-IgG, jedoch lediglich die ETAR-Dichte auf B-Zellen war auch deutlich geringer als zu Beginn der Stimulation (Abb. 18).

Dieses Experiment wurde anschließend ein zweites und drittes Mal durchgeführt. Die Monozyten wurden dabei mittels Accutase von den Zellkulturplatten gelöst, um sie ebenfalls analysieren zu können. Alle drei Experimente wurden statistisch zusammengefasst und ausgewertet. Wie aus Abbildung 19 ersichtlich, ähneln sich die Verläufe der Rezeptordichten auf T-Helferzellen und zytotoxischen T-Zellen, weshalb beide nachfolgend als T-Zellen zusammengefasst werden.

Auf den T- und B-Zellen konnte keine signifikante Änderung der Oberflächenexpression der Rezeptoren über die Zeit festgestellt werden. Verglichen wurde hierbei jeweils die Rezeptordichte direkt vor Beginn der Stimulation mit der nach einem Tag, zwei und drei Tagen, sowie die Rezeptordichte zwischen dem ersten und zweiten sowie ersten und dritten Tag, und zwischen dem zweiten und dritten Tag (Abb. 19).

Auch der Vergleich der Rezeptordichten zwischen den Stimulationsansätzen ergab zu keinem Zeitpunkt einen signifikanten Unterschied, wenngleich zumindest auf den B-Zellen die Dichte aller 4 Rezeptoren an Tag eins und drei bei SSc-IgG-Stimulation deutlich geringer war als bei N- IgG-Stimulation. Für Monozyten konnte aufgrund des Stichprobenumfanges (n=2) keine statistische Bewertung vorgenommen werden. Augenscheinlich ist jedoch, dass hier die Dichte der Rezeptoren im Laufe der drei Tage deutlich über Ausgangsniveau ansteigt, wogegen sie auf den Lymphozyten eher abnimmt (Abb. 19). Hier muss angemerkt werden, dass es sich bei den CD14-exprimierenden Zellen der Definition nach nicht mehr um Monozyten handelt, da diese

Ergebnisse bereit nach einem Tag in Kultur durch Adherenz und Aktivierung in Makrophagen oder andere monozytäre Zellen differenziert sein dürften.

AT1R AT2R ETAR ETBR 100 180 100 n.s. n.s. n.s. n.s. 100 140 80 80 80 100 60 unstim. CD4+ 60 N-IgG SSc-IgG 60 40 60 40 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

100 180 n.s. n.s. n.s. 100 120 n.s.

140 80 80 100

100 60 CD8+ 60 80

40 60 40 60 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

100 100 100 100 n.s. n.s. n.s. n.s. 80 80 80 80 60 60 60 60 Rezeptordichte [%] auf Rezeptordichte[%] CD19+ 40 40 40 20 40 20 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

200 180 200 300

150 140 150 200

100 100

100 100 CD14+ 50 60

0 20 50 0 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

Inkubationszeit [Tage] Abbildung 19: Zeitlicher Verlauf der Rezeptorexpression des AT1R, AT2R, ETAR und ETBR auf PBMCs unter IgG- Stimulation in vitro. Nach Kultivierung über Nacht und Fc-Rezeptorblockade erfolgte die Stimulation mit 1 mg/mL SSc-IgG (Pool aus IgG von 7 Patienten mit dcSSc im Frühstadium (< 6 Jahre seit Beginn des ersten Nicht-Raynaud- Symptomes) und Organbeteiligung sowie AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen > 20 U) in Doppelansätzen. Als Kontrolle dienten Ansätze mit 1 mg/mL N-IgG (Pool aus IgG von 3 Normalspendern mit AT1R- und ETAR-Auto- Ak-Konzentrationen < 10 U) sowie unstimulierte Kontrollen jeweils in Doppelansätzen. Die Analyse der Dichten (MFI) erfolgte durchflusszytometrisch auf T-Helferzellen (CD4+), zytotoxischen T-Zellen (CD8+), B-Zellen (CD19+) und Monozyten (CD14+) zum Zeitpunkt t=0 (direkt vor Stimulation) sowie nach ein, zwei und drei Tagen. Gezeigt sind die Mittelwerte der gemittelten Doppelansätze mit mittlerem Standardfehler aus drei unabhängigen Experimenten (T- und B-Zellen n=3; Monozyten n=2). Jeder Ansatz wurde auf Unterschiede im zeitlichen Verlauf mit dem Paarvergleichstest nach Wilkoxon überprüft, Unterschiede zwischen den Ansätzen zu jedem Zeitpunkt wurden mit dem Mann-Whitney-Test überprüft, wobei n.s. „nicht signifikant“ bedeutet.

Eine signifikante oder zumindest tendenziell signifikante bzw. deutliche Veränderung der Dichte der Rezeptoren durch die Stimulation mit SSc-IgG über die Zeit hat zu keinem Zeitpunkt vorgelegen, ebenso wenig ein signifikanter oder auch nur tendenziell signifikanter Unterschied zwischen der Dichte der Rezeptoren bei Stimulation mit SSc-IgG im Vergleich zur Stimulation mit N-IgG oder zur unstimulierten Kontrolle.

Ergebnisse Setzt man die Dichte des AT1R und des ETAR jeweils ins Verhältnis zum entsprechenden Gegenspieler, so zeigt sich auch hier kein signifikanter oder tendenziell signifikanter Unterschied zwischen den Zeitpunkten oder den Ansätzen (Abb. 20). Eine Änderung der Rezeptorbalance im Zusammenhang mit einer in vitro Stimulation durch SSc-IgG lässt sich hier nicht darstellen.

0.8 0.8 0.8 0.8 n.s. n.s. n.s.

0.6 0.6 0.6 0.6

0.4 0.4 0.4 0.4

unstim. 0.2 SSc-IgG 0.2 0.2 0.2 AT1R/AT2R auf CD4+ auf AT1R/AT2R CD8+ auf AT1R/AT2R N-IgG CD19+ auf AT1R/AT2R CD14+ auf AT1R/AT2R 0.0 0.0 0.0 0.0 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

1.0 1.5 1.5 1.2 n.s. n.s. n.s. 0.8 1.0 1.0 0.8 0.6 Ratios derRezeptordichten Ratios

0.4 0.5 0.5 0.4 0.2 ETAR/ETBR auf CD4+ auf ETAR/ETBR CD8+ auf ETAR/ETBR ETAR/ETBR auf CD19+ auf ETAR/ETBR CD14+ auf ETAR/ETBR 0.0 0.0 0.0 0.0 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

Inkubationszeit [Tage]

Abbildung 20: Veränderung des Verhältnisses der Rezeptordichten des AT1R zum AT2R sowie des ETAR zum ETBR unter IgG-Stimulation. Nach Kultivierung über Nacht und Fc-Rezeptorblockade erfolgte die Stimulation mit 1 mg/mL SSc-IgG (Pool aus IgG von 7 Patienten mit dcSSc im Frühstadium (< 6 Jahre seit Beginn des ersten Nicht- Raynaud-Symptomes) und Organbeteiligung sowie AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen > 20 U) in Doppel- ansätzen. Als Kontrolle dienten Ansätze mit 1 mg/mL N-IgG (Pool aus IgG von 3 Normalspendern mit AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen < 10 U) sowie unstimulierte Kontrollen jeweils in Doppelansätzen. Die Analyse der Dichten (MFI) erfolgte durchflusszytometrisch auf T-Helferzellen (CD4+), zytotoxischen T-Zellen (CD8+), B-Zellen (CD19+) und Monozyten (CD14+) zum Zeitpunkt t=0 (direkt vor Stimulation) sowie nach ein, zwei und drei Tagen. Gezeigt sind jeweils die Ratios der Mittelwerte der gemittelten Doppelansätze mit mittlerem Standardfehler aus drei unabhängigen Experimenten (T- und B-Zellen n=3; Monozyten n=2). Die Ratio jeden Ansatzes wurde auf Unterschiede im zeitlichen Verlauf mit dem Paarvergleichstest nach Wilkoxon überprüft, Unterschiede der Ratios zwischen den Ansätzen zu jedem Zeitpunkt wurden mit dem Mann-Whitney-Test überprüft, wobei n.s. „nicht signifikant“ bedeutet.

Von der Wiederholung der Experimente unter Hinzunahme von selektiven Rezeptorantagonisten zur Überprüfung von rezeptorselektiven Effekten wurde abgesehen, da keine zu überprüfenden Effekte ermittelt werden konnten.

3.3 Wirkung von AT1R- und ETAR-Auto-Ak auf die Chemotaxis von T-Zellen

Chemotaxis ist die Eigenschaft von Zellen, auf Botenstoffe bzw. deren Konzentrations- unterschiede mit einer gerichteten Bewegung zu reagieren. Diese Bewegung führt bei Immunzellen zu deren Migration ins betroffene Gewebe.

Die im Abschnitt 3.1.5 beschriebene negative Korrelation der Rate AT1R-positiver Monozyten und Lymphozyten mit der Dauer der Erkrankung kann in einer im Krankheitsverlauf

Ergebnisse zunehmenden Migration der AT1R-positiven Zellen begründet sein. Deshalb wurde hier in vitro überprüft, ob AT1R- und ETAR-Auto-Ak die Chemotaxis bzw. Migration beeinflussen können.

3.3.1 Etablierung eines Migrationsassays

Primäre Monozyten weisen nach ihrer Isolierung aus dem Blut eine hohe Grundaktivierung auf und adherieren bereits kurz nach Inkulturnahme. Daher wurde hier ein Chemotaxisassay mit T- Zellen etabliert. Dazu wurde zuerst ermittelt, unter welchen Bedingungen die T-Zellen nach der Isolierung am besten regenerieren und dabei in einen gut aktivierbaren Zustand geraten und bleiben. In einem ersten Schritt wurden deshalb die T-Zellen in Anwesenheit verschiedener Faktoren allein und in Kombination kultiviert. Die höchste Viabilität konnte bei Kultivierung mit IL-2 allein sowie mit IL-2 in Kombination mit anti-CD3- und anti-CD28-Ak festgestellt werden (Abb. 11 A). Anschließend wurde in mehreren Versuchen ermittelt, bei welcher dieser Vorbedingungen die T-Zellen am besten gegen spezifische (CXC-Motiv-Ligand (CXCL)10, CXCL11 und CXCL12) und unspezifische (Fetales Kälberserum) chemotaktisch wirkende Faktoren migrieren. Dabei zeigte sich, dass die T-Zellen am besten gegen chemotaktisch wirkende Faktoren migrierten, wenn sie zuvor in Anwesenheit von IL-2 in Kombination mit anti-CD3- und anti-CD28-Ak kultiviert worden sind (Abb. 21 B).

A 100 B 1.510 5 IL-2 80 CD3/CD28 + IL-2

1.010 5 60

40 lebend 5.0 10 4

Zellzahl [%] Zellzahl  tot 20

0 [Zellzahl] T-Zellen migrierte 0

IL-2 PHA FCS CD3/28  CXCL10 CXCL11 CXCL12 PHA + IL2 PMA/Iono. unstimuliert CD3/28 + IL2 kein Ligand  PMA/Iono. + IL2 Abbildung 21: Etablierung eines T-Zell-Migrationsassays. T-Zellen wurden mittels Depletion aus PBMCs eines gesunden Spenders isoliert und in Kultur gebracht. (A) Die Kultivierung erfolgte über drei Tage nach Inkubation mit PMA/Iono bzw. in Anwesenheit der angegebenen Faktoren. Anschließend wurde die Viabilität mittels Trypanblaufärbung und einer Neubauer-Zählkammer am Lichtmikroskop ermittelt, die lebenden/toten Zellen sind prozentual angegeben. (B) Migration von IL-2- bzw. anti-CD3/28/IL-2-aktivierten T-Zellen gegen verschiedene Liganden sowie ohne Ligand und fetales Kälberserum (FCS) als Kontrolle. Die Migration erfolgte durch Platteneinsätze mit einer Porengröße von 5µm im Inkubator über 2 Stunden. Gezeigt sind der Mittelwert und der mittlere Standardfehler der Resultate aus drei unabhängigen Experimenten.

Nachfolgend wurde mit unter diesen Bedingungen kultivierten T-Zellen untersucht, ob und bei welchen Konzentrationen die natürlichen Liganden des AT1R und des ETAR sowie SSc-IgG eine Migration induzieren (Abb. 22).

Ergebnisse

40000 Abbildung 22: Etablierung der T-Zell- Migration mit natürlichen Liganden und 35000 * SSc-IgG. Zusammenfassung von sechs 30000 * * unabhängigen Experimenten mit den 25000 * natürlichen Liganden Angiotensin II und Endothelin-1 sowie von drei unabhän- 20000 gigen Experimenten mit je zwei SSc-IgG in 15000 verschiedenen Konzentrationen. Gezeigt sind Mittelwert und mittlerer Standard- 10000 fehler, der Vergleich zum Ansatz ohne migrierte T-Zellen [Zellzahl] T-Zellen migrierte 5000 Ligand erfolgte mit Mann-Whitney-Test, da ein Paarvergleichstest nicht durch- 0 ohne 10-7 10-6 10-5 10-4 10-9 10-8 10-7 10-6 0.125 0.25 0.5 1 gehend möglich war. Signifikante Unter- Ligand Angiotensin II [M] Endothelin-1 [M] SSc IgG [mg/mL] schiede sind mit *p<0.05 bezeichnet.

Dabei zeigte sich, dass eine T-Zellmigration sowohl durch Ang II und ET-1, als auch durch SSc- IgG in konzentrationsabhängiger Weise induziert werden kann. Die besten Resultate konnten bei einer Ang II-Konzentration von 10-6 M, einer ET-1-Konzentration von 10-9 M und einer SSc- IgG-Konzentration von 0.5 g/mL erzielt werden (Abb. 22).

Liganden und SSc-IgG wurden anschließend mit diesen Konzentrationen eingesetzt, um eine geeignete Konzentration des selektiven AT1R-Antagonisten Valsartan und des selektiven ETAR- Antagonisten Sitaxsentan zu ermitteln (Abb. 23).

A 35000 Abbildung 23: Etablierung von geeigneten 30000 ** Konzentrationen des selektiven AT1R- 25000 ** Antagonisten Valsartan und des selektiven 20000 ETAR-Antagonisten Sitaxsentan bei der 15000 Migration von T-Zellen induziert durch 10000 Angiotensin II, Endothelin-1 und SSc-IgG. 5000 (A) Zusammenfassung von sechs unab-

migrierte T-Zellen [Zellzahl] T-Zellen migrierte 0 hängigen Experimenten mit konstanter -5 -5 -6 -7 -4 -4 -5 -6 Ang II 10 10 10 10 ET-1 10 10 10 10 Konzentration von Angiotensin II und Endo- Valsartan [M] Sitaxsentan [M] thelin-1, ohne und mit den Antagonisten + Ang II 10 -6 M + ET-1 10 -9 M Valsartan und Sitaxsentan in verschiedenen B 35000 Konzentrationen. (B) Zusammenfassung 30000 von drei Experimenten mit je zwei SSc-IgG

25000 in konstanter Konzentration, allein sowie

20000 mit den Rezeptorantagonisten Valsartan

15000 und Sitaxsentan in verschiedenen Konzen-

10000 trationen. Mittelwert und der mittlere Standardfehler sind gezeigt, der Vergleich 5000

migrierte T-Zellen [Zellzahl] T-Zellen migrierte zum jeweiligen Ansatz ohne Antagonist 0 SSc- 10-5 10-5 10-6 10-7 10-4 10-4 10-5 10-6 erfolgte mit dem Paarvergleichstest nach IgG Valsartan [M] Sitaxsentan [M] Wilcoxon, wobei ein signifikanter Unter- + SSc-IgG 0.5 mg/mL + SSc-IgG 0.5 mg/mL schied mit **p<0.01 bezeichnet ist.

Eine effektive Blockierung der Migration gegen die natürlichen Liganden wurde mit einer Valsartankonzentration von 10-5 M und einer Sitaxsentankonzentration von 10-4 M erzielt (Abb. 23 A). In diesen Konzentrationen erreichten die Antagonisten auch die beste Hemmung der

Ergebnisse durch SSc-IgG induzierten Migration, wenngleich hier weniger effektiv (Abb. 23 B). Die Vitalität war bei diesen bzw. ähnlichen Konzentrationen (Valsartan 10-5 M, Sitaxsentan 0,6x10-4 M) auch nach 20 Stunden nicht beeinträchtigt (siehe 3.4.2 Abb. 32).

3.3.2 Nachweis einer Auto-Ak-induzierten Migration

Nachfolgend wurden für jedes Experiment Zellen eines anderen gesunden Spenders verwendet. Nach Isolierung und Kultivierung der T-Zellen wurde jeweils ein Assay zur Überprüfung mehrerer SSc-IgG sowie N-IgG als Kontrollen durchgeführt. Die IgG sowie die Rezeptorblocker wurden in den etablierten Konzentrationen eingesetzt. Dabei war die durch SSc-IgG induzierte Migration insgesamt stärker ausgeprägt als die durch N-IgG induzierte, dieser Unterschied ist jedoch nicht signifikant (Abb. 24). Die durch SSc-IgG induzierte Migration, bzw. die Anzahl der migrierten Zellen, konnte jedoch mit den selektiven Rezeptorantagonisten Valsartan und Sitaxsentan signifikant reduziert werden, nicht aber die durch N-IgG induzierte Migration.

* Abbildung 24: IgG-induzierte Migration von T- * n.s. Zellen und ihre Hemmung durch selektive n.s. * Rezeptorantagonisten. Zusammenfassung von 30000 n.s. sechs unabhängigen Experimenten mit insge- * samt 23 SSc-IgG und 20 N-IgG mit und ohne die 25000 Rezeptorantagonisten Valsartan (Val) und Sitax- 20000 sentan (Sit) sowie mit jeweils einer Kontrolle ohne IgG (Kontr.). Die Resultate sind als Box- 15000 Whisker-Plots nach Tukey zusammen-gefasst, 10000 der Vergleich mit der Kontrolle (Kontr.) erfolgte mit dem Mann-Whitney-Test, der Vergleich 5000 zwischen den IgG-Ansätzen mit und ohne Anta-

migrierte T-Zellen [Zellzahl] T-Zellen migrierte 0 gonist erfolgte mit dem Paarvergleichstest nach Kontr. +Val +Sit +Val +Sit Wilcoxon, wobei *p<0.05 und n.s. „nicht N-IgG SSc-IgG signifikant“ bedeuten.

Die Mitführung eines SSc-IgG als Referenz bei allen sechs Experimenten (in jeder Statistik jedoch nur einmalig eingeschlossen) sowie die großen Schwankungen unterliegende Kontrolle (ohne Ligand oder IgG) zeigten, dass die T-Zellen in Abhängigkeit vom jeweiligen Spender der Zellen eine unterschiedlich starke chemotaktische Ansprechbarkeit auf das Referenz-IgG aufwiesen, die sich auch durch Normalisierung anhand der Kontrolle nicht ausgleichen ließen. Um spenderspezifische Unterschiede auszuschließen, wurden im sechsten Assay, also bei der induzierten Migration von Zellen des sechsten Spenders, im Vergleich zu den vorherigen deutlich mehr IgG-Proben getestet, und zwar 11 SSc-IgG und 10 N-IgG. Dies ermöglichte sowohl die Analyse der IgG-induzierten Migration als auch eine statistische Assoziation der klinischen Daten der SSc-IgG-Spender mit der Anzahl der migrierten Zellen, ohne dass dabei eine

Ergebnisse Verzerrung durch zellspenderbedingte Abweichungen auftrat. Hierbei zeigt sich erneut, dass die SSc-IgG im Vergleich zu den N-IgG insgesamt eine stärkere Migration induzierten, wenngleich der Unterschied auch hier nicht signifikant ist (Abb. 25 A). Auch die unzureichende Hemmung der N-IgG-induzierten Migration durch die Antagonisten Valsartan und Sitaxsentan, sowie die signifikante Hemmung durch die Antagonisten bei der SSc-IgG-induzierten Migration konnte hierbei bestätigt werden (Abb. 25 B-E).

In Abbildung 25 B-E ist jeweils die gepaarte Darstellung der Ansätze mit und ohne Rezeptorantagonist gezeigt. Hieraus wird ersichtlich, in welchem Maße die Wirkung der einzelnen IgG durch die Antagonisten inhibiert wurde. Lediglich der Effekt eines einzigen N-IgG konnte durch Valsartan verringert werden (Abb. 25 B). Hierbei handelt es sich um das N-IgG, welches mit 8,9 U die höchste AT1R-Auto-Ak-Konzentration in dieser Gruppe aufweist. Davon abgesehen konnte Valsartan die durch die N-IgG induzierte Migration nicht reduzieren, sondern hat sie bei 7/10 N-IgG-Ansätzen erhöht, wodurch Valsartan die N-IgG-induzierte Migration insgesamt signifikant erhöht hat. Auch Sitaxsentan konnte die N-IgG-induzierte Migration im Einzelnen nur wenig reduzieren (4/10 N-IgG-Ansätze, Abb. 25 C). Die durch SSc-IgG-induzierte Migration wurde dagegen durch Valsartan bei 7/11 und durch Sitaxsentan bei 8/11 der eingesetzten SSc-IgG verringert (Abb. 25 D und E). Beide Antagonisten haben dabei insgesamt eine signifikante Hemmung der SSc-IgG-induzierten Migration bewirkt. Bei 3/11 SSc-IgG führte Valsartan zu einem leichten Anstieg der Anzahl migrierter Zellen, wogegen bei einem SSc-IgG die ohnehin relativ geringe Anzahl migrierter Zellen sowohl unter Valsartan als auch Sitaxsentan nahezu gleich blieb. Insgesamt blieb unter Sitaxsentan die Zellzahl in den SSc-IgG-Ansätzen zweimal unverändert, einmal erhöhte sie sich.

Die Resultate zeigen, dass sich die durch einzelne IgG-Proben induzierte Migration nicht immer durch beide Antagonisten gleichermaßen beeinflussen lässt. Beispielsweise wurde die N-IgG- induzierte Migration von 12500 T-Zellen durch Valsartan noch gesteigert, wogegen Sitaxsentan hier zu einer deutlichen Reduzierung geführt hat (Abb. 25 B und C, graue Pfeile). Ähnliches lässt sich bei der SSc-IgG-induzierten Migration von knapp 23000 T-Zellen sagen, die durch Valsartan ebenfalls erhöht, durch Sitaxsentan aber reduziert wurde. Ein anderes SSc-IgG induzierte die Migration von 8400 T-Zellen, die sehr gut durch Valsartan unterdrückt werden konnte, nicht jedoch durch Sitaxsentan (Abb. 25 D und E, graue Pfeile). Da die Resultate zeitgleich in einem einzigen Experiment erzielt wurden und alle Zellen vom selben Spender stammten, können die

Ergebnisse Unterschiede in der Effektivität der Rezeptorblocker hier einzig von den Eigenschaften der eingesetzten IgG-Proben abhängen.

A 30000 n.s. B 30000 * C 30000 n.s. D 30000 * E 30000 ** 25000 25000 25000 25000 25000

20000 20000 20000 20000 20000

15000 15000 15000 15000 15000

10000 10000 10000 10000 10000

5000 5000 5000 5000 5000

migrierte T-Zellen [Zellzahl] T-Zellen migrierte 0 0 0 0 0 N-IgG SSc-IgG N-IgG N-IgG N-IgG N-IgG SSc-IgG SSc-IgG SSc-IgG SSc-IgG +Val +Sit +Val +Sit

Abbildung 25: IgG-induzierte Migration von T-Zellen und ihre Hemmung durch selektive Rezeptorantagonisten. Darstellung eines einzelnen Experimentes mit den Zellen eines einzigen Spenders. Induktion der Migration mit 11 SSc-IgG und 10 N-IgG, jeweils mit und ohne die Rezeptorantagonisten Valsartan (Val) und Sitaxsentan (Sit). (A) Der Vergleich von N-IgG- und SSc-IgG-induzierter Migration erfolgte mit dem Mann-Whitney-Test, (B-E) der Vergleich zwischen den jeweiligen Ansätzen mit und ohne Antagonist erfolgte mit dem Paarvergleichstest nach Wilcoxon, wobei *p<0.05, **p<0.01 und n.s. „nicht signifikant“ bedeuten. Die grauen Pfeile kennzeichnen beispielhaft zusammengehörige Datenpaare.

Die Resultate dieses Assays wurden mit den klinischen Parametern der 11 SSc-IgG-Spender korreliert. Obwohl auch hier keine Korrelation des Alters der IgG-Spender mit der jeweils durch ihr IgG induzierten Anzahl der migrierten Zellen vorlag (nicht gezeigt), ergab sich hier ebenfalls, trotz der geringen Stichprobenzahl, eine deutliche, wenn auch nicht signifikante, inverse Korrelation der Zellzahl mit der Zeit seit dem ersten Auftreten des Raynaud-Syndroms sowie, etwas schwächer, mit der Zeit seit Beginn des ersten Nicht-Raynaud-Symptomes (Abb. 26).

30000 Pearson r = -0.48 30000 Pearson r = -0.39 A p = 0.13 B p = 0.23 25000 25000

20000 20000

15000 15000

10000 10000

5000 5000 migrierte T-Zellen [Zellzahl] T-Zellen migrierte 0 [Zellzahl] T-Zellen migrierte 0 0 5 10 20 40 60 0 5 10 20 30 40 50 Zeit seit Beginn des Zeit seit Beginn des ersten Raynaud-Syndroms [Jahre] Nicht-Raynaud-Symptoms [Jahre] Abbildung 26: Zusammenhang zwischen der Erkrankungsdauer der SSc-Patienten und der durch ihr IgG induzierten T-Zellmigration. Dargestellt sind (A) die Anzahl migrierter T-Zellen in Abhängigkeit von der Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndroms und (B) die Anzahl migrierter T-Zellen in Abhängigkeit von der Zeit seit Beginn des ersten Nicht-Raynaud-Symptomes des jeweiligen SSc-IgG-Spenders (n=11). Die Korrelationsanalyse erfolgte nach Spearman, gezeigt sind die Einzelwerte sowie der Korrelationskoeffizient r und der Irrtumswahrscheinlichkeitswert p.

Die Assoziation der Anzahl migrierter Zellen mit klinischen Parametern der SSc-IgG-Spender zeigte, dass das IgG von männlichen Patienten, Patienten mit dcSSc sowie Patienten mit Ulzerationen mehr T-Zellen zur Migration anregte als das IgG von weiblichen Patienten oder Gesunden, bzw. Patienten mit lcSSc oder Patienten ohne Ulzerationen (Abb. 27). 61

Ergebnisse

n.s. 30000 30000 n.s. 30000 n.s. A n.s. B C n.s. 25000 25000 25000

20000 20000 20000

15000 15000 15000

10000 10000 10000

5000 5000 5000 migrierte T-Zellen [Zellzahl] T-Zellen migrierte

0 0 0 weibl. weibl. männl. lcSSc dcSSc nein ja Gesunde SSc-Patienten SSc-Form Ulzerationen aktuell

Abbildung 27: Vergleich der IgG-induzierten T-Zellmigration von gesunden IgG-Spendern und SSc-Patienten, sowie von SSc-Patienten mit limitierter oder diffuser Hautfibrose und mit oder ohne Ulzerationen. Gezeigt sind (A) die Anzahl migrierter T-Zellen induziert durch IgG von gesunden Frauen, weiblichen und männlichen SSc- Patienten, (B) die Anzahl migrierter T-Zellen induziert durch IgG von Patienten mit lcSSc (n=3) oder dcSSc (n=8) sowie (C) durch IgG von Patienten mit oder ohne aktuellen Ulzerationen an den Fingerspitzen. Mit dem Mann- Whitney-Test wurde überprüft, ob die Unterschiede zwischen den Gruppen signifikant sind, n.s. bedeutet „nicht signifikant“.

Diese Unterschiede sind jedoch nicht signifikant. Dies mag hier in der relativ kleinen Stichprobenzahl der einzelnen Gruppen begründet sein. Kein Hinweis auf einen statistischen Zusammenhang ergab sich bei der Korrelationsanalyse der Anzahl migrierter Zellen mit der Krankheitsaktivität (mRSS) der Spender und den AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen der IgG.

3.4 Aktivierung von PBMCs durch AT1R- und ETAR-Auto-Ak in vitro

Die Expressionsdaten zeigen, dass PBMCs den AT1R und den ETAR exprimieren, so dass funktionelle AT1R- und ETAR-Auto-Ak theoretisch einen pathogenen Effekt über diese Rezeptoren vermitteln können. Um eine aktivierende Wirkung der Auto-Ak zu überprüfen, wurden PBMCs in Anwesenheit von SSc-IgG kultiviert und anschließend eine Auswahl von Aktivierungsmarkern untersucht. Der Fokus lag hierbei auf der Analyse der monozytären Zellen sowie den hauptsächlich von ihnen sekretierten Zytokinen.

3.4.1 Etablierung von geeigneten Outcome-Parametern

In einer ersten Testreihe wurden isolierte PBMCs gesunder Spender mit je 1mg/mL SSc-IgG oder N-IgG kultiviert (geeignete IgG-Konzentration war bereits zuvor innerhalb der Arbeitsgruppe etabliert worden). Nach acht Stunden wurden Zellen und Kulturüberstand den weiteren Analysen entsprechend präpariert. Die Darstellung der Resultate erfolgte hier jeweils in Relation zur unstimulierten Kontrolle, um Interassay-Unterschiede, die hauptsächlich in den

Ergebnisse verschiedenen PBMC-Spendern (ein Spender pro Experiment) begründet sein dürften, zu relativieren (Abb. 28 und 29).

Abbildung 28: Analyse von Oberflächenmarkern und phänotypische Charakterisierung von Monozyten und monozytären Subpopulationen nach Stimulation mit SSc-IgG. PBMCs gesunder Spender wurden in vitro mit IgG von SSc-Patienten (SSc-IgG) stimuliert. Als Kontrollen dienten Ansätze mit IgG von gesunden Spendern (N-IgG) sowie unstimulierte Ansätze. (A) Die Proteinexpression (MFI) der Oberflächenmarker HLA-DR, CD14 und CD16 wurde nach 8 Stunden durchflusszytometrisch auf Monozyten (SSC/FSC-identifiziert) analysiert. Dargestellt ist die MFI relativ zur unstimulierten Kontrolle als Box-Whisker-Plots nach Tukey. (B) Die Monozyten wurden gemäß ihrer CD14/CD16-Expression unterschieden, gezeigt ist beispielhaft der Dot-Plot einer CD14/CD16-Messung und seine Einteilung in die klassische (CD14++/CD16-), intermediäre (CD14++/CD16+), inflammatorische (CD14+/CD16+) und eine nicht näher definierte Population (CD14+/CD16-). (C) Anteile der monozytären Subpopulationen an den Gesamtmonozyten sowie (D) die HLA-DR-Expression (MFI) dieser Subpopulationen. Die Daten (C und D) sind als Säulen mit Mittelwert und dem mittleren Standardfehler relativ zur unstimulierten Kontrolle dargestellt (unstimulierte Kontrolle = 1; gestrichelte Linie). Für die Resultate (A, C und D) wurden die Daten aus drei unabhängigen Experimenten (ein PBMC-Spender pro Experiment) mit insgesamt 10 SSc-IgG und 5 N-IgG, sowie je einer unstimulierten Kontrolle, zusammengefasst (je 1Mio PBMCs/mL). Die Überprüfung auf Unterschiede zwischen N-IgG- und SSc-IgG-stimulierten Ansätzen erfolgte mit dem Mann-Whitney Test, wobei***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05 und +p<0.1 bezeichnen.

Die Proteinexpression der Oberflächenmarker humanes Leukozytenantigen DR (HLA-DR), CD14 und CD16 wurde durchflusszytometrisch auf Monozyten untersucht (Abb. 28). Hierbei zeigte sich, dass der Aktivierungsmarker HLA-DR in Anwesenheit von SSc-IgG im Mittel (Median) etwas weniger auf der Oberfläche exprimiert worden ist als in den N-IgG-Kontrollen bzw. der unstimulierten Kontrolle, jedoch mit einer größeren Streuung (28 A). Die Dichte von CD14 auf der Zelloberfläche hatte sich durch SSc-IgG erheblich reduziert, wogegen die N-IgG-stimulierten Kontrollen etwa den unstimulierten entsprachen. Der Unterschied zwischen beiden IgG-

Ergebnisse stimulierten Gruppen ist hierbei hoch signifikant. CD16 zeigte eine leichte Expressionserhöhung unter SSc-IgG, der Unterschied zwischen den IgG-Ansätzen ist hier zumindest tendenziell signifikant.

Da CD16 leicht zunahm, wurden die Durchflusszytometriedaten hinsichtlich einer möglichen Verschiebung der Monozytenpopulation hinzu einem aktivierten/inflammatorischen Phänotyp analysiert (Abb. 28 B-D). Hierbei zeigte sich, dass SSc-IgG im Vergleich zum N-IgG zu einer signifikanten Zunahme der CD14+/CD16- Subpopulation und zu einer höchst signifikanten Abnahme der klassischen Monozyten (CD14++/CD16-) führte (Abb. 28 C). Der Anteil an intermediären (CD14++/CD16+) sowie der inflammatorischen Monozyten (CD14+/CD16+) unterschied sich nicht zwischen den beiden IgG-stimulierten Gruppen.

Zur weiteren Charakterisierung wurden die Monozyten-Subpopulationen hinsichtlich ihrer HLA- DR-Expression differenziert (Abb. 28 D). Dabei konnte die höchste HLA-DR-Dichte (MFI) auf den durch SSc-IgG-stimulierten inflammatorischen Monozyten gemessen werden.

In den Kulturüberständen wurden das lösliche Protein soluble CD14 (sCD14) sowie die Zytokine TGF-β1, IL-8 und CCL18 analysiert (Abb. 29).

A 1.5 B 1.5 C 6 D 120 * * 5 60 1.0 1.0 4 30 -1  3

IL-8 20 sCD14 CCL18 TGF 0.5 0.5 2 10 1

0.0 0.0 0 0

Proteinkonz. im Überstand Proteinkonz. im N-IgG SSc-IgG N-IgG SSc-IgG N-IgG SSc-IgG HD IgG SSc IgG [relativ zurKontrolle] [relativ unstim. Abbildung 29: Analyse von löslichen Markern nach Stimulation mit SSc-IgG. PBMCs gesunder Spender wurden in vitro mit IgG von SSc-Patienten (SSc-IgG) stimuliert. Als Kontrollen dienten Ansätze mit IgG von gesunden Spendern (N-IgG) sowie unstimulierte Ansätze. (A) Das lösliche Protein sCD14 sowie die Zytokine (B) TGF-β1, (C) IL-8 und (D) CCL18 wurden jeweils mittels ELISA in den Kulturüberständen quantifiziert. Die Ergebnisse sind relativ zur entsprechenden unstimulierten Kontrolle dargstellt (unstimulierte Kontrolle = 1; gestrichelte Linie). Für die Resultate wurden die Daten aus drei unabhängigen Experimenten (ein PBMC-Spender pro Experiment) mit insgesamt 10 SSc-IgG und 5 N-IgG sowie je einer unstimulierten Kontrolle zusammengefasst (je 1Mio PBMCs/mL). Die Daten sind als Box-Whisker-Plots nach Tukey gezeigt. Die Überprüfung auf Unterschiede zwischen N-IgG- und SSc-IgG-stimulierten Ansätzen erfolgte mit dem Mann-Whitney Test, wobei *p<0.05 bezeichnet.

Die Konzentration von sCD14 war im Überstand der mit SSc-IgG stimulierten Ansätze signifikant niedriger als in den N-IgG-stimulierten Ansätzen (Abb. 29 A). Die TGF-1-Konzentration betrug in den IgG-Ansätzen etwa nur die Hälfter der Kontrolle ohne IgG (Abb. 29 B). Anders die IL-8- Konzentration, sie war bei Stimulation mit SSc-IgG etwa dreimal höher als in den Kontrollen ohne IgG, bei Stimulation mit N-IgG etwa zweimal höher, der Unterschied zwischen beiden IgG- Gruppen ist signifikant (Abb. 29 C). Auch die Konzentration von CCL18 war in den IgG-Ansätzen

Ergebnisse im Mittel (Median) um das Sieben- bis Achtfache der Kontrolle ohne IgG erhöht. Die Streuung war in den Ansätzen mit SSc-IgG jedoch deutlich größer und reichte bis zu einer hundertfachen Konzentration (Abb. 29 D).

3.4.2 Überprüfung ausgewählter SSc-IgG-induzierter Effekte und deren Hemmung durch selektive AT1R- und ETAR-Antagonisten

Aufgrund dieser Resultate wurden die Zytokine IL-8 und CCL18 als Parameter für weitere Analysen ausgewählt. Zunächst sollte überprüft werden, ob sich eine durch die natürlichen Liganden induzierte Zytokinsekretion von PBMCs mit den selektiven Rezeptorantagonisten hemmen lässt. Dazu wurden erneut PBMCs kultiviert und Ang II gegen Valsartan sowie ET-1 gegen Sitaxsentan titriert. In Anlehnung an die Literatur wurden die Liganden in physiologischer, pathologischer und hoch pathologischer Konzentration eingesetzt, wie sie auch bei Gesunden bzw. SSc-Patienten im Serum auftreten [111, 143].

Nach 20 Stunden erfolgte die Abnahme der Überstände. Bei der anschließenden Analyse lag die CCL18-Konzentration in allen Ansätzen unter dem Detektionslimit von ca. 5 pg/mL. Hier sind deshalb nur die IL-8 ELISA-Daten dargestellt (Abb. 30).

A 35 B 8 25 15 0 pg/mL ET-1 6 0,5 pg/mL ET-1 0 pg/mL Ang II 2 pg/mL ET-1 10 8 pg/mL Ang II 4 10 pg/mL ET-1 40 pg/mL Ang II 200 pg/mL Ang II 5 2 IL-8 im Überstand [ng/mL] Überstand im IL-8 IL-8 im Überstand [ng/mL] Überstand im IL-8 0 0 0 2.5 5 10 20 0 1.5 3 6 12 Valsartan [10-6 M] Sitaxsentan [10-5 M]

Abbildung 30: Testexperiment zur dosisabhängigen Hemmbarkeit einer ligandeninduzierten IL-8-Sekretion mit selektiven Rezeptorantagonisten. PBMCs eines gesunden Spenders wurden in vitro jeweils mit Angiotensin II oder Endothelin-1 in stimuliert, sowie mit dem selektiven Rezeptorantagonisten Valsartan bzw. Sitaxsentan behandelt. Hierbei wurde in jeweils 1Mio PBMCs/mL (A) Angiotensin II in den angegebenen Konzentrationen gegen die angegebenen Konzentrationen des AT1R-Antagonisten Valsartan titriert, sowie (B) Endothelin-1 in den angegebenen Konzentrationen gegen die angegebenen Konzentrationen des ETAR-Antagonisten Sitaxsentan. Als Kontrollen dienten Ansätze ohne Ligand und ohne Antagonist. Nach 20 Stunden wurden die Überstände abgenommen und ihre IL-8-Konzentration mittels ELISA bestimmt.

Die Verwendung von Valsartan zeigt hier keine eindeutig dosisabhängige inhibierende Wirkung auf eine Ang II-induzierte IL-8-Sekretion (Abb. 30 A). Sitaxsentan scheint jedoch eine ET-1- induzierte IL-8-Sekretion dosisabhängig zu inhibieren (Abb. 30 B).

In den unter Abbildung 29 dargestellten Experimenten wurden jedoch in den Ansätzen mit SSc- IgG IL-8-Konzentrationen von über 300ng/mL gemessen, hier nur bis maximal 35ng/mL. Die Induktion einer IL-8-Sekretion durch die natürlichen Liganden war damit wesentlich schwächer 65

Ergebnisse und hat quasi kaum stattgefunden, wie auch der Vergleich mit den IL-8-Konzentrationen der Kontrollansätze ohne die natürlichen Liganden zeigt.

Die Induktion von CCL18 blieb in allen Ansätzen unter dem Detektionslimit und ist deshalb hier nicht abgebildet. Um eine allein in den verwendeten PBMCs liegende Ursache ausschließen zu können, wurden in den nachfolgenden Experimenten immer wieder Ansätze mit den natürlichen Liganden mitgeführt, mit jeweils ähnlichen Ergebnissen (siehe dazu beispielhaft Abb. 31), wonach die natürlichen Ligande in vitro vergleichsweise wenig CCL18 oder IL-8 induzierten.

A 800 B 4000

600 3000

400 2000

200 1000 IL-8 im Überstand [ng/mL] Überstand im IL-8

0 [pg/mL] Überstand im CCL18 0

LPS LPS N-IgG N-IgG unstim. SSc-IgG unstim. SSc-IgG

ET-1 2 pg/mL Ang II 8 pg/mL AngII 8 pg/mL ET-1 2 pg/mL Ang II 40 pg/mLET-1 0.5 pg/mL AngII 40 pg/mLET-1 0.5 pg/mL

Abbildung 31: Testexperiment zur Stimulation von PBMCs mit IgG von Gesunden und SSc-Patienten sowie Lipopolysaccharid, Angiotensin II und Endothelin-1. Je 1 Mio. PBMCs/mL wurden 20 Stunden in der Anwesenheit von SSc-IgG kultiviert (2 Ansätze mit je einem IgG 1mg/mL). Als Kontrolle dienten 2 Ansätze mit je einem N-IgG (1mg/mL), sowie je ein Ansatz mit Lipopolysaccharid (LPS, 1mg/mL), Angiotensin II in physiologischer und pathologischer Konzentration (AngII 8 bzw. 40 pg/mL) sowie Endothelin-1 in physiologischer und pathologischer Konzentration (ET-1 0.5 bzw. 2 pg/mL). Im Anschluss wurde (A) die IL-8-Konzentration sowie (B) die CCL18- Konzentration in den Überständen mittels ELISA analysiert.

Abbildung 32: Überprüfung auf eine mögliche Beeinträchtigung der Viabilität der PBMCs durch die selektiven Rezeptorantagonisten Valsartan und 100 Sitaxsentan. Je 1Mio PBMCs/mL wurden ohne Antagonist oder mit Valsartan 10-5M bzw. Sitaxsentan 6x10-5 M kultiviert. Zu 95 ohne Antagonist den angegebenen Zeitpunkten wurde die mit Valsartan Viabilität mit Trypanblaufärbung und mit Sitaxsentan einem Hämacytometer am Licht- 90 mikroskop ermittelt. Die Daten aus drei unabhängigen Experimenten wurden zusammengefasst, gezeigt sind der Mittel- Viabilität [% lebende Zellen] [% Viabilität 0 15 min 8 Std 20 Std wert und der mittlere Standardfehler.

In Anlehnung an die für die Migrationsassays gewählte Konzentration wurde in allen nachfolgenden Experimenten Valsartan mit 10-5 M eingesetzt. Die Sitaxsentankonzentration wurde dabei mit Hinblick auf o.g. Ergebnis und eine längere Kultivierungsdauer (acht bzw. 20 Stunden gegenüber zwei Stunden im Migrationsassay) etwas reduziert (von 10-4 auf 6x10-5 M). 66

Ergebnisse In einem dreifach durchgeführten Viabilitätstest wurde überprüft, ob die Blocker in diesen Konzentrationen das Überleben der Zellen in Kultur beeinträchtigen. Wie die Abbildung 32 zeigt, haben beide Rezeptorblocker keinen negativen Einfluss auf die Viabilität der PBMCs.

3.4.3 Zeitlicher Verlauf der IL-8- und CCL18-Sekretion und deren Hemmung durch selektive AT1R- und ETAR-Antagonisten

Nachfolgend wurden die isolierten PBMCs eines Spenders (Buffy coat aus Vollblutspende) mit verschiedenen SSc-IgG mit und ohne Rezeptorantagonisten über einen Zeitraum von einer, zwei, vier und acht Stunden inkubiert und anschließend die IL-8- und CCL18-Konzentrationen in den Überständen analysiert (Abb. 33 und 34).

300 A 300 B 300 unstim. SSc-IgG 160 SSc-IgG 176 unstim. + Val SSc-IgG 160 + Val SSc-IgG 176 + Val unstim. + Sit SSc-IgG 160 + Sit SSc-IgG 176 + Sit 200 200 200

100 100 100

0 0 0 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8

300 300 300 N-IgG SSc-IgG 347 SSc-IgG 389 N-IgG + Val SSc-IgG 347 + Val SSc-IgG 389 + Val N-IgG + Sit SSc-IgG 347 + Sit SSc-IgG 389 + Sit 200 200 200 IL-8 im Überstand (ng/mL) Überstand im IL-8

100 100 100

0 0 0 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8

Inkubationszeit [Stunden] Abbildung 33: Testexperiment zum zeitlichen Verlauf der IL-8-Konzentration und der Wirkung der selektiven Rezeptorantagonisten bei der Stimulation von PBMCs mit IgG von SSc-Patienten. Je 1Mio PBMCs/ml eines gesunden Spenders wurden in vitro mit 1mg/mL N-IgG oder SSc-IgG aktiviert, oder blieben unstimuliert (unstim.). Parallel wurden die PBMCs mit dem selektiven Rezeptorantagonisten Valsartan (Val) mit einer Konzentration von 10-5M bzw. Sitaxsentan (Sit) mit einer Konzentration von 6x10-5M behandelt. In den Überständen der (A) Kontrollansätze ohne IgG bzw. mit N-IgG sowie der (B) Ansätze mit vier verschiedenen SSc-IgG wurde direkt vor der Stimulation (null Stunden) sowie nach ein, zwei, vier und acht Stunden die IL-8-Konzentration mittels ELISA analysiert.

Hierbei ist bei den vier Ansätzen mit SSc-IgG eine deutliche zeitabhängige Zunahme der IL-8- Konzentration im Vergleich zur Kontrolle ohne IgG zu erkennen (Abb. 33), wobei in drei der vier Ansätzen mit SSc-IgG die IL-8-Konzentration nach acht Stunden über der in den Kontrollen lag. In den IgG-Ansätzen mit Valsartan bzw. Sitaxsentan sind im zeitlichen Verlauf deutlich geringere IL-8-Konzentrationen zu erkennen.

Die CCL18-Konzentrationen der IgG-Ansätze zeigen keinen steten Anstieg im zeitlichen Verlauf (Abb. 34). In drei von vier SSc-IgG-Ansätzen ist jedoch zumindest ein Anstieg zwischen der

Ergebnisse vierten und achten Stunde zu erkennen (Abb. 34 B). Die Hemmeffekte beider Antagonisten bei Stunde acht sind nur in zwei von vier SSc-IgG-Ansätzen deutlich wahrzunehmen.

Die Peaks im Verlauf der Konzentrationen beider Zytokine nach ein bzw. zwei Stunden treten auch bei den unstimulierten Kontrollen auf und sind demnach nicht der Stimulation mit IgG zuzuschreiben, sondern einer allgemeinen Aktivierung aufgrund der im Rahmen des Experimentes notwendigen Hantierungsschritte zu Stunde null, die augenscheinlich zu einer Sezernierung besonders von CCL18, auch unter N-IgG, bei Stunde eins und zwei führte.

50 400 2500 A B SSc-IgG 160 unstim. SSc-IgG 176 SSc-IgG 160 + Val unstim. + Val SSc-IgG 176 + Val 40 300 2000 unstim. + Sit SSc-IgG 160 + Sit SSc-IgG 176 + Sit 30 1500 200 20 1000

100 10 500

0 0 0 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8

400 400 400 N-IgG SSc-IgG 347 SSc-IgG 389 N-IgG + Val SSc-IgG 347 + Val SSc-IgG 389 + Val 300 N-IgG + Sit 300 SSc-IgG 347 + Sit 300 SSc-IgG 389 + Sit

200 200 200 CCL18 im Überstand (ng/mL) Überstand im CCL18

100 100 100

0 0 0 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8

Inkubationszeit [Stunden] Abbildung 34: Testexperiment zum zeitlichen Verlauf der IL-8-Konzentration und der Wirkung der selektiven Rezeptorantagonisten bei der Stimulation von PBMCs mit IgG von SSc-Patienten. Je 1Mio PBMCs/ml eines gesunden Spenders wurden in vitro mit 1mg/mL N-IgG oder SSc-IgG aktiviert, oder blieben unstimuliert (unstim.). Parallel wurden die PBMCs mit dem selektiven Rezeptorantagonisten Valsartan (Val) mit einer Konzentration von 10-5M bzw. Sitaxsentan (Sit) mit einer Konzentration von 6x10-5M behandelt. In den Überständen der (A) Kontrollansätze ohne IgG bzw. mit N-IgG sowie (B) der Ansätze mit vier verschiedenen SSc-IgG wurde direkt vor der Stimulation (null Stunden) sowie nach ein, zwei, vier und acht Stunden die CCL18-Konzentration mittels ELISA analysiert.

3.4.4 Screening zu SSc-IgG-induzierten IL-8- und CCL18-Konzentrationen, deren Hemmbarkeit und klinische Assoziationen

Die oben beschriebenen uneinheitlichen zeitlichen Verläufe der Zytokinkonzentrationen und die Unterschiede in der Wirkung der selektiven Rezeptorantagonisten in den Ansätzen mit SSc- IgG zeigte erneut, wie sehr sich das Aktivierungspotential und dessen Hemmbarkeit einzelner SSc-IgG voneinander unterscheidet. Daraus ergab sich die Notwendigkeit, das Potential möglichst vieler einzelner SSc-IgG zu untersuchen, um die Wirkung der selektiven Rezeptorblocker sowie die statistischen Zusammenhänge der IgG-induzierten Zytokin- konzentrationen mit den klinischen Parametern der SSc-IgG-Spender analysieren und bewerten zu können.

Ergebnisse Für die Untersuchung von 27 SSc-IgG wurden PBMCs eines einzigen gesunden Spenders (buffy coat aus Vollblutspende) mit den einzelnen SSc-IgG jeweils mit und ohne Valsartan bzw. Sitaxsentan stimuliert. Mit Hinblick auf den nach acht Stunden noch vorliegenden Anstieg der IL-8- bzw- CCL18-Konzentration bei vier bzw. drei von vier SSc-IgG-Ansätzen in der vorangegangenen Untersuchung (Abb. 22 und 23) wurden die Überstände nach acht und 20 Stunden gewonnen, per ELISA analysiert und ausgewertet. Dabei zeigte sich, dass nach 20 Stunden in allen Ansätzen die IL-8-Konzentration höher war als nach 8 Stunden, die Wirkung der Antagonisten jedoch nicht mehr so effektiv. Die CCL18-Konzentration war nach 20 Stunden zum Teil niedriger als nach acht Stunden. Aus diesen Gründen wurden die Resultate der nach acht Stunden gewonnenen Überstände statistisch ausgewertet (Abb. 35) und für die Korrelationsanalysen verwendet (Abb. 36-38).

A 225 *** 225 *** B 3000 *** 3000 *** 200 210, 200 2500 2500 175 175 462, 150 150 2000 2000 12,205,5, 428, 125 176, 125 435,33, 1500 1500 35,50, 100 393, 100

208, 75 411, 75 1000 1000 453, 421, 50 332,25, 50 IL-8 im Überstand [ng/mL] Überstand im IL-8 163, 13,19,263, 500 500 268,170,106, [pg/mL] Überstand im CCL18 25 357, 25

0 0 0 0 SSc-IgG SSc-IgG SSc-IgG SSc-IgG SSc-IgG SSc-IgG SSc-IgG SSc-IgG + Valsartan + Sitaxsentan + Valsartan + Sitaxsentan Abbildung 35: IL-8- und CCL18-Konzentrationen im Überstand nach Stimulation von PBMCs mit SSc-IgG mit und ohne Rezeptorantagonisten. Je 1Mio PBMCs/ml eines gesunden Spenders wurden in vitro mit 27 SSc-IgG aktiviert (1mg/mL), jeweils mit und ohne die selektiven Rezeptorantagonisten Valsartan (Val) mit einer Konzentration von 10-5M bzw. Sitaxsentan (Sit) mit einer Konzentration von 6x10-5M. Nach acht Stunden wurden die Überstände abgenommen und (A) die IL-8 und (B) CCL18-Konzentration mittels ELISA analysiert. Dargestellt sind die einzelnen Wertepaare mit und ohne den selektiven Rezeptorantagonisten Valsartan bzw. Sitaxsentan. Die Überprüfung auf Unterschiede zwischen den Ansätzen mit und ohne Antagonist erfolgte mit dem Paarvergleichstest nach Wilcoxon, wobei ***p<0.001 bedeutet.

Die Konzentrationen von IL-8 und von CCL18 konnten durch beide Rezeptorantagonisten höchst signifikant reduziert werden (Abb. 35 A und B). Dabei war der hemmende Effekt von Sitaxsentan auf beide Zytokine insgesamt stärker als der von Valsartan.

Die ermittelten SSc-IgG-induzierten Zytokinkonzentrationen wurden mit folgenden klinischen Parametern der SSc-IgG-Spender in einen statistischen Zusammenhang gebracht: Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndroms, des ersten Nicht-Raynaud-Symptoms, einer PAH und einer Lungenfibrose; aktuelles Vorhandensein/Nichtvorhandensein einer PAH, Lungenfibrose und digitaler Ulzerationen; zeitnahe DLCO, FVC und mRSS, limitierte oder diffuse Hautfibrose. Die daraus resultierenden statistisch (tendenziell) signifikanten Assoziationen sind nachfolgend in

Ergebnisse den Abbildungen 36 und 37 dargestellt. Darüber hinaus wurden die IL-8 und CCL-18- Konzentrationen miteinander korreliert, um zu überprüfen, ob ein Zusammenhang zwischen beiden besteht (Abb. 37 A).

A 250 Spearman r = -0.41 B 250 C 200 Spearman r = -0.69 D 250 Spearman r = -0.41 *p = 0.04 * **p = 0.009 +p = 0.053 200 200 200 150

150 150 150 100 100 100 100

50 50 50 50

0 0 0 0 IL-8 im Überstand [ng/mL] Überstand im IL-8 0 10 20 30 40 0-6 > 6 0 2 4 6 8 10 0 20 40 60 80 100 Zeit seit Beginn des Zeit seit Beginn des ersten Zeit seit Beginn einer PAH DLCO [%] Raynaud-Syndroms [Jahre] Nicht-Raynaud-Symptoms [Jahre] [Jahre] Abbildung 36: Zusammenhang der SSc-IgG-induzierten IL-8-Konzentrationen mit klinischen Parametern der SSc- IgG-Spender. Die IL-8-Konzentrationen wurden mit (A) der Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndroms, (B) der Zeit seit Beginn des ersten Nicht-Raynaud-Symptomes, (C) der Zeit seit Beginn einer PAH sowie (D) der Diffusionskapazität der Lunge für Kohlenmonoxid (diffusing capacity of the lung for carbon monoxide = DLCO) der SSc-IgG-Spender assoziiert. Dabei war die Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndroms für n=26 SSc-Patienten und die des ersten Nicht- Raynaud-Symptomes für n=25 SSc-Patienten dokumentiert, sowie der Beginn einer PAH für n=13 SSc-Patienten. Eine zeitnahe DLCO-Bestimmung lag für n=23 SSc-Patienten vor. Gezeigt sind die Einzelwerte. Die Korrelations- analysen erfolgten nach Spearman (A, C und D), der Korrelationskoeffizient r und der Irrtumswahrscheinlich- keitswert p sind angegeben. Der Gruppenvergleich (B) wurde mit dem Mann-Whitney-Test durchgeführt. Es gilt **p<0.01, *p<0.05 und +p<0.1.

Auch hier, bei den durch SSc-IgG induzierten Konzentrationen von IL-8, zeigt sich erneut eine signifikante, inverse Korrelation mit der Zeit seit dem ersten Auftreten des Raynaud-Syndroms (Abb. 36 A). Die Korrelationsanalyse der IL-8-Daten und der Zeit seit Beginn des ersten Nicht- Raynaud-Symptomes ergab keinen signifikanten Zusammenhang. Betrachtet man jedoch die Patienten mit kürzerer Erkrankungsdauer (0-6 Jahre) getrennt von denen mit längerer Erkrankungsdauer, so induziert das IgG von Patienten in der früheren Phase der Erkrankung signifikant mehr IL-8 in PBMCs (Abb. 36 B). Darüber hinaus findet sich eine tendenziell signifikante, inverse Korrelation mit der Zeit seit Beginn einer PAH, trotz der relativ geringen Stichprobenzahl von SSc-Patienten mit PAH (Abb. 36 C). Ebenfalls signifikant ist die inverse Korrelation der IL-8-Konzentrationen mit dem Lungenfunktionsparameter DLCO, eine hohe IL-8- Konzentration ist hier mit einer schlechten Diffusionskapazität der Lunge des SSc-Patienten assoziiert (Abb. 36 D).

Die Überprüfung eines möglichen Zusammenhanges zwischen der CCL18- und IL-8- Konzentration, die durch das jeweilige SSc-IgG induziert worden sind, ergab hier keine signifikante Korrelation (Abb. 37 A). Es zeigt sich jedoch eine tendenziell signifikante, inverse Korrelation mit der Zeit seit Beginn einer Lungenfibrose, trotz der auch hier geringen Stichprobenzahl (Abb. 37 B). Das IgG von Patienten mit einer vaskulären Komplikation, wie eine beeinträchtigte Nierenfunktion, Ulzerationen an den Fingern oder PAH, induzierte signifikant

Ergebnisse höhere CCL18-Konzentrationen als das IgG von SSc-Patienten ohne diese Manifestationen (Abb. 37 C).

A 3000 Spearman r = -0.26 B 2000 Spearman r = -0.49 C 3000 p = 0.19 +p = 0.09 * 2500 2500 1500 2000 2000

1500 1000 1500

1000 1000 500 500 500

0 0 0 CCL18 im Überstand [pg/mL] Überstand im CCL18 0 50 100 150 200 250 0 5 10 15 20 nein ja IL-8 im Überstand [ng/mL] Zeit seit Beginn einer Vaskuläre Komplikationen Lungenfibrose [Jahre] aktuell

Abbildung 37: Zusammenhang der SSc-IgG-induzierten CCL18-Konzentration mit der IL-8-Konzentration sowie mit klinischen Parametern der SSc-IgG-Spender. Die CCL18-Konzentrationen wurden mit (A) der IL-8- Konzentration, (B) der Zeit seit Beginn einer Lungenfibrose und (C) dem Vorhandensein vaskulärer Komplikationen der SSc-IgG-Spender assoziiert. Dabei war die Zeit seit Beginn einer Lungenfibrose für n=13 SSc-Patienten und die für das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein vaskulärer Komplikationen für n=25 SSc-Patienten dokumentiert. Gezeigt sind die Einzelwerte. Die Korrelationsanalysen erfolgten nach Spearman (A und B), der Korrelations- koeffizient r und der Irrtumswahrscheinlichkeitswert p sind angegeben. Der Gruppenvergleich (C) wurde mit dem Mann-Whitney-Test durchgeführt. Es gilt *p<0.05 und +p<0.1.

Anders als die IL-8-Konzentrationen zeigten die CCL18-Konzentrationen keinen linearen Zusammenhang mit der Erkrankungsdauer. Dieser konnte nur partiell für die Lungenfibrose und auch hier nur tendenziell signifikant festgestellt werden. Ein zeitlicher Zusammenhang des Aktivierungspotentiales der SSc-IgG mit der Erkrankungsdauer wurde dennoch angenommen. Deshalb erfolgte die Darstellung beider Zytokinkonzentrationen in Abhängigkeit von der Zeit seit Beginn des ersten Nicht-Raynaud-Symptoms nach Klassifizierung in Gruppen von je vier Patienten (Abb. 38).

A 200 B 2500

2000 150

1500 100 1000

50 500 IL-8 Überstandim [ng/mL]

0 Überstand im CCL18 [pg/mL] 0 0-1 2-5 6-7 8-11 12-15 16-38 0-1 2-5 6-7 8-11 12-15 16-38 Zeit seit Beginn des ersten Zeit seit Beginn des ersten Nicht-Raynaud-Symptoms [Jahre] Nicht-Raynaud-Symptoms [Jahre]

Abbildung 38: Verlauf der SSc-IgG-induzierten Zytokin-Konzentrationen im Überstand in Abhängigkeit von der Erkrankungsdauer der SSc-IgG-Spender. Gezeigt sind (A) die IL-8-Konzentrationen und (B) die CCL18- Konzentrationen gegen die Zeit seit Beginn des ersten Nicht-Raynaud-Symptomes. Die Klassifizierung erfolgte in sechs Zeitabschnitte mit je vier Patienten. Dargestellt sind der Mittelwert und der mittlere Standardfehler.

Die Mediane beider Zytokinkonzentrationen bilden einen kurvenförmigen Verlauf über die Zeit seit Beginn der Erkrankung. IL-8 weist sein Maximum bei 2-5 Jahren nach Beginn des ersten

Ergebnisse Nicht-Raynaud-Symptomes auf, fällt dann ab, mit einem Minimum bei 8-11 Jahren, um im späteren Stadium wieder leicht anzusteigen (Abb. 38 A). Die CCL18-Konzentration zeigt nach Beginn der Erkrankung einen Abfall, mit einem Minimum bei 6-7 Jahren, und ab dem Zeitraum von 8-11 Jahren einen Anstieg. Das Maximum wird erst bei 16-38 Jahren, also zum Ende der dokumentierten Erkrankungsdauer, erreicht (Abb. 38B).

Die Konzentrationen beider Zytokine korrelierten nicht mit den AT1R- oder ETAR-Auto-Ak- Konzentrationen, die in den aufgereinigten SSc-IgG gemessen worden sind. Ebenfalls wurde überprüft, ob zumindest der hemmende Effekt der Rezeptorantagonisten (prozentuale Reduktion der Zytokinkonzentration) mit den Auto-Ak-Konzentrationen korrelierte, doch auch dies war nicht der Fall.

3.4.5 Verifizierung der IL-8- und CCL18-Hemmung unter Hinzunahme eines AT2R- und eines ETBR-Antagonisten

Um spender- oder tagesbedingte Abweichungen zu vermeiden, wurde das oben beschriebene Screening der SSc-IgG zeitgleich mit den Zellen eines einzigen Spenders durchgeführt. Zur Verifizierung der inhibierenden Wirkung der Antagonisten wurde die Stimulation mit Zellen von drei weiteren Spendern an drei verschiedenen Tagen wiederholt. Hierzu wurde gepooltes SSc- IgG verwendet, das aus 13 IgG-Proben von Patienten mit dcSSc und AT1R- und ETAR-Auto-Ak- Konzentrationen über 20 U vereint worden war. Dabei sollte nicht nur die Einzelwirkung von Valsartan und Sitaxsentan reproduziert werden, sondern auch ihre Wirkung in Kombination überprüft werden. Außerdem wurden der AT2R-Antagonist PD123319 und der ETBR-Antagonist BQ-788 ebenfalls einzeln und in Kombination mit Valsartan und Sitaxsentan eingesetzt. In einem Testexperiment wurden verschiedenen Konzentrationen der Einzel- und Kombinationsansätze überprüft.

Abbildung 39 zeigt, dass die SSc-IgG-induzierte CCL18-Konzentration sowohl in den Ansätzen mit den einzelnen Rezeptorantagonisten als auch in den Kombinationsansätzen dosisabhängig inhibiert wurde, wobei der beste inhibitorische Effekt jeweils bei einer Antagonisten- konzentration von 10-5 M erreicht werden konnte. Weniger eindeutig waren die IL-8-Resultate. Dennoch zeigte sich auch hier zumindest in den Kombinationsansätzen die effektivste Reduktion einer SSc-IgG-induzierten IL-8-Konzentration bei einer Antagonistenkonzentration von 10-5 M.

Ergebnisse A B 80 10-5 M 10-6 M 10-7 M 1750 10-5 M 1500 10-6 M 60 1250 10-7 M 1000 40 750 500 20 [pg/mL] Überstand im im Überstand [ng/mL] Überstand im 250 IL-8

0 CCL18 0 Val PD Sit BQ Val+Sit Val+Sit Val+Sit Val PD Sit BQ Val+Sit Val+Sit Val+Sit +PD +BQ +PD +BQ Abbildung 39: IL-8- und CCL18-Konzentration im Überstand nach Stimulation von PBMCs mit gepooltem SSc-IgG mit und ohne Rezeptorantagonisten in verschiedenen Konzentrationen und Kombinationen. Je 1Mio PBMCs/ml eines gesunden Spenders wurden in vitro mit 1mg/mL gepooltem SSc-IgG aktiviert, jeweils mit und ohne den selektiven AT1R-Antagonisten Valsartan (Val), AT2R-Antagonisten PD123319 (PD), ETAR-Antagonisten Sitaxsentan (Sit) und ETBR-Antagonisten BQ-788 (BQ) in verschiedenen Konzentrationen und Kombinationen wie angegeben. Nach acht Stunden wurden die Überstände abgenommen und (A) die IL-8 und (B) CCL18-Konzentration mittels ELISA analysiert. Die gestrichelte Linie kennzeichnet die Zytokinkonzentration des Ansatzes ohne Antagonist.

Dieses Experiment wurde deshalb mit einer Antagonistenkonzentration von jeweils 10-5 M einzeln und in Kombination zwei weitere Male wiederholt, um zu überprüfen, ob die kombinierte Gabe der Antagonisten eine additive Hemmung bewirkt (Abb. 40).

A 140 B 120 120 100 100 80 80 60 60 40 40 IL-8 im Überstand im IL-8

20 Überstand im CCL18 20 [% vom unblock. Ansatz] unblock. vom [% [% vom unblock. Ansatz] unblock. vom [% 0 0 Val PD Sit BQ Val+Sit Val PD Sit BQ Val+Sit +PD +BQ +PD +BQ Abbildung 40: IL-8- und CCL18-Konzentration im Überstand nach Stimulation von PBMCs mit gepooltem SSc-IgG mit und ohne Rezeptorantagonisten einzeln und in verschiedenen Kombinationen. Je 1Mio PBMCs/ml eines gesunden Spenders wurden in vitro mit 1mg/mL gepooltem SSc-IgG aktiviert, ohne oder mit 10-5 M des selektiven AT1R-Antagonisten Valsartan (Val), AT2R-Antagonisten PD123319 (PD), ETAR-Antagonisten Sitaxsentan (Sit) und ETBR-Antagonisten BQ-788 (BQ) allein und in verschiedenen Kombinationen wie angegeben. Nach acht Stunden wurden die Überstände abgenommen und (A) die IL-8 und (B) CCL18-Konzentration mittels ELISA analysiert. Die Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten, die Zytokinkonzentrationen sind prozentual zum Ansatz ohne Antagonist dargestellt (Ansatz ohne Antagonist = 100% = gestrichelte Linie). Gezeigt sind der Mittelwert und der mittlere Standardfehler. Die Überprüfung eines Unterschiedes zwischen den Ansätzen erfolgte mit dem Paarvergleichstest nach Wilcoxon sowie mit dem Kruskal-Wallis-Test und blieb bei n=3 ohne signifikantes Ergebnis.

Die durch SSc-IgG induzierten IL-8- und CCL18-Konzentrationen ließen sich dabei durch Einzelgaben von Valsartan und Sitaxsentan erneut deutlich hemmen, jedoch nur kaum durch den AT2R-Antagonisten PD123319 (Abb. 40). Der ETBR-Antagonist BQ-788 verursachte sogar eine höhere IL-8-Konzentration als in den Kontrollen ohne Antagonist gemessen wurde (Abb. 40 A). Dagegen konnte die CCL18-Sekretion auch durch BQ-788 deutlich inhibiert werden (Abb. 40 B).

Ergebnisse Eine additive Hemmung durch die Kombination der Antagonisten Valsartan und Sitaxsentan oder Valsarten, Sitaxsentan und PD123319 bzw. BQ-788 lässt sich für IL-8 nicht feststellen. Vielmehr entsprechen die IL-8-Konzentrationen in den Kombinationsansätzen in etwa der Konzentration der Einzelgabe von Sitaxsentan.

Die CCL18-Sekretion wird durch Sitaxsentan nahezu ebenso gut gehemmt wie durch Sitaxsentan in Kombination mit Valsartan. Auch hier ist demnach die Wirkung nicht additiv. In Kombination mit dem AT2R-Antagonisten PD123319, der allein die CCL18-Konzentration um etwa 6 % reduzierte (Mittelwert 94.3%), ergibt sich tatsächlich ein additiver Effekt. Denn die Kombination Sitaxsentan und Valsartan verringerte die CCL18-Sekretion auf im Mittel 47.5% des Ansatzes ohne Antagonisten, zusätzlich mit PD123319 verringerte sie sich noch weiter auf 37.4%. Der ETBR-Antagonist BQ-788 hat mit 55.5% des Ansatzes ohne Antagonisten eine deutlich inhibierende Wirkung auf die CCL18-Sekretion, in Kombination mit Valsartan und Sitaxsentan beträgt sie 26.6%.

3.5 Auto-Ak-Konzentrationen der AT1R- und ETAR-IgG-Subklassen und ihre klinischen Assoziationen

Es gibt Autoimmunerkrankungen, bei denen insbesondere das IgG der Klasse 4 (IgG4) eine pathogene Rolle zu spielen scheint. Diese IgG4-assoziierten Erkrankungen (IgG4-related diseases) sind durch entzündliche Veränderungen bis hin zu Gewebsfibrosen in den betroffenen Organen oder Organsystemen charakterisiert, wie man sie auch bei der SSc findet [144, 145]. Um festzustellen, ob die SSc zur Gruppe dieser Erkrankungen gehört, sollten die IgG-Subklassen der AT1R- und ETAR-Auto-Ak spezifiziert werden. In Kooperation mit der Firma CellTrend® GmbH wurde ein ELISA entwickelt, mit dem die Auto-Ak auch auf ihre Zugehörigkeit zur IgG- Subklasse 1 bis 4 analysiert werden können.

Es wurden 91 Seren von SSc-Patienten sowie 199 Seren von Normalspendern untersucht und die AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen spezifisch für jede IgG-Subklasse analysiert. Dabei zeigte sich, dass die Auto-Ak-Konzentrationen des IgG3 sowohl bei den Gesunden als auch bei den SSc-Patienten hoch signifikant höher sind als die Auto-Ak-Konzentrationen des IgG1, IgG2 und IgG4 (Abb. 41 A und B). AT1R-spezifisches IgG4 ist dagegen bei den SSc- Patienten signifikant niedriger als AT1R-spezifisches IgG1, IgG2 und IgG3, und ETAR-spezifisches IgG4 ist signifikant niedriger als ETAR-spezifisches IgG1 und IgG3. Bei den gesunden Spendern ist AT1R- und ETAR-spezifisches IgG4 signifikant niedriger als AT1R-spezifisches IgG2 und IgG3.

Ergebnisse

A n. s. ** B n. s. ** *** *** *** *** 50 *** *** *** n. s. *** *** 50 *** *** *** ** *** *** *** * ** n. s. 40 40

30 30

20 20

10 10 IgG-subklassenspezifische IgG-subklassenspezifische anti-AT1R-Konz. im Serum [U] Serum im anti-AT1R-Konz. 0 [U] Serum im anti-ETAR-Konz. 0 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 gesunde Spender SSc-Patienten gesunde Spender SSc-Patienten

Abbildung 41: Vergleich der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen zwischen den Subklassen IgG1, 2, 3 und 4 im Serum von gesunden Spendern und SSc-Patienten. In den Seren von 91 SSc-Patienten und 199 Normalspendern wurden die IgG-Subklassen-Konzentrationen der (A) AT1R-Auto-Ak und (B) ETAR-Auto-Ak mittels ELISA analysiert. Gezeigt sind die einzelnen Messwerte und der Median. Die statistischen Unterschiede wurden mit dem Paarvergleichst nach Wilcoxon ermittelt, wobei n.s. „nicht signifikant“, *p<0.05, **p<0.01 und ***p<0.001 bedeuten.

Vergleicht man die Auto-Ak-Konzentrationen der einzelnen Subklassen zwischen SSc-Patienten und gesunden Spendern, so zeigt sich, dass sowohl die AT1R- als auch die ETAR-Auto-Ak- Konzentrationen der Subklassen IgG1 und IgG3 im Serum der SSc-Patienten höchst signifkant erhöht sind. Die Auto-Ak-Konzentrationen der IgG2 und 4 unterscheiden sich dagegen nicht zwischen Gesunden und Patienten (Abb. 42).

50 50 A *** n. s. *** n. s. B *** n. s. *** n. s. 40 40

30 gesunder 30 Spender SSc-Patient 20 20

10 10 IgG-subklassenspezifische IgG-subklassenspezifische anti-AT1R-Konz. im Serum [U] Serum im anti-AT1R-Konz. 0 [U] Serum im anti-ETAR-Konz. 0 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4

Abbildung 42: Vergleich der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen von IgG1, 2, 3 und 4 im Serum zwischen gesunden Spendern und SSc-Patienten. In den Seren von 91 SSc-Patienten und 199 Normalspendern wurden die IgG-Subklassen-Konzentrationen der (A) AT1R-Auto-Ak und (B) ETAR-Auto-Ak mittels ELISA analysiert. Gezeigt sind die einzelnen Messwerte und der Median. Die statistischen Unterschiede wurden mit dem Mann-Whitney-Test ermittelt, wobei n.s. „nicht signifikant“ und ***p<0.001 bedeuten.

In den Seren der SSc-Patienten wurde auch die AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentration des Gesamt-IgG ermittelt. Der Vergleich mit den Auto-Ak-Konzentrationen der IgG-Subklassen zeigt, dass sich die Gesamt-Auto-Ak-Konzentration offensichtlich hauptsächlich in der Subklasse IgG3 widerspiegelt, die sehr hohen Auto-Ak-Konzentrationen aber in allen vier Subklassen zu finden sind.

Ergebnisse

50 Abbildung 43: Vergleich der AT1R- und ETAR- *** *** n. s. *** *** *** * *** Auto-Ak-Konzentrationen von IgG1, 2, 3 und 4 40 mit den Auto-Ak-Konzentrationen des Gesamt-IgG im Serum von SSc-Patienten. In 30 den Seren von 91 SSc-Patienten und 199 Normalspendern wurden die IgG-Subklassen- 20 Konzentrationen der AT1R-Auto-Ak und ETAR- Auto-Ak mittels ELISA analysiert. Gezeigt sind 10 die einzelnen Messwerte und der Median. Die statistischen Unterschiede wurden mit dem IgG-subklassenspezifische Auto-Ak-Konz. im Serum [U] Serum im Auto-Ak-Konz. 0 IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Paarvergleichstest nach Wilcoxon ermittelt, ges. ges. wobei n.s. „nicht signifikant“, *p<0.05 und anti-AT1R-Titer anti-ETAR-Titer ***p<0.001 bedeuten.

Die Auto-Ak-Konzentrationen der IgG-Subklassen wurden mit den klinischen Parametern der SSc-Patienten assoziiert. Dabei ergaben sich nur für die IgG1- und IgG3-Auto-Ak- Konzentrationen deutliche bzw. signifikante Zusammenhänge. Diese sind nachfolgend gezeigt:

A 50 n. s. B 50 n. s. C 50 n. s. + * * n. s. ** * 40 40 40

30 30 30

20 20 20 IgG1-spezifische 10 IgG3-spezifische 10 10 anti-AT1R-Konz. im Serum [U] Serum im anti-AT1R-Konz. anti-AT1R-Konz. im Serum [U] Serum im anti-AT1R-Konz. 0 0 [U] Serum im Anti-AT1R-Konz. 0 lcSSc dcSSc andere lcSSc dcSSc andere lcSSc dcSSc andere

D 50 + E 50 n. s. F 50 n. s. + ** *** + ** ** 40 40 40

30 30 30

20 20 20 IgG1-spezifische 10 IgG3-spezifischer 10 10 Anti-ETAR-Konz im Serum [U] Serum im Anti-ETAR-Konz anti-ETAR-Konz. im Serum [U] Serum im anti-ETAR-Konz. 0 [U] Serum im anti-ETAR-Konz. 0 0 lcSSc dcSSc andere lcSSc dcSSc andere lcSSc dcSSc andere

Abbildung 44: Vergleich der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen von IgG1, IgG3 und Gesamt-IgG im Serum von SSc-Patienten mit lcSSc und dcSSc sowie anderen SSc-Formen. Dargestellt sind (A) die IgG1-spezifische und (B) die IgG3-spezifische AT1R-Auto-Ak-Konzentration sowie (C) die Gesamt-AT1R-Auto-Ak-Konzentration im Serum von 33 Patienten mit lcSSc, 40 Patienten mit dcSSc und 18 Patienten mit anderen SSc-Formen, zumeist Overlap-Syndrom. (D) Die IgG1-spezifische und (E) die IgG3-spezifische ETAR-Auto-Ak-Konzentration sowie (F) die Gesamt-ETAR-Auto-Ak-Konzentration sind gleichermaßen dargestellt. Gezeigt sind die einzelnen Messwerte und der Median. Die statistischen Unterschiede wurden mit dem Mann-Whitney-Test ermittelt, wobei n.s. „nicht signifikant“, +p<0.1, *p<0.05, **p<0.01 und ***p<0.001 bedeuten.

Die Klassifizierung der SSc-Patienten anhand ihrer Erkrankungsform sollte zeigen, ob eine bestimmte SSc-Form mit einer IgG-spezifischen AT1R- oder ETAR-Auto-Ak-Konzentration assoziiert ist (Abb. 44). Beide IgG1-spezifischen Auto-Ak-Konzentrationen unterscheiden sich

Ergebnisse signifikant bzw. hoch signifikant zwischen dcSSc und anderen SSc-Formen (hauptsächlich Overlap-Syndrom), wobei die Auto-Ak-Konzentrationen in dcSSc höher sind (Abb. 44 A und D). Die IgG3-spezifischen Auto-Ak-Konzentrationen sind im Serum von Patienten mit dcSSc signifikant bzw. höchst signifikant höher als im Serum von Patienten mit lcSSc (Abb. 44 B und E). Die Gesamt-Auto-Ak-Konzentrationen sind ebenfalls signifikant höher in Patienten mit dcSSc, sowohl im Vergleich zu Patienten mit lcSSc als auch im Vergleich zu Patienten mit anderen SSc- Formen (Abb. 44 C und F).

A 50 Spearman r = -0.19 B 50 Spearman r = -0.19 C 50 Spearman r = -0.09 p = 0.10 p = 0.09 p = 0.45 40 40 40

30 30 30

20 20 20 IgG3-spezifische IgG1-spezifische 10 10 10 anti-AT1R-Konz. im Serum [U] Serum im anti-AT1R-Konz. 0 [U] Serum im anti-AT1R-Konz. 0

Anti-AT1R-Konz. im Serum [U] Serum im Anti-AT1R-Konz. 0 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40

D 50 Spearman r = -0.23 E 50 Spearman r = -0.27 F 50 Spearman r = -0.09 *p = 0.04 *p = 0.01 p = 0.44 40 40 40

30 30 30

20 20 20 IgG3-spezifische IgG1-spezifische 10 10 10 Anti-ETAR-Konz. im Serum [U] Serum im Anti-ETAR-Konz. anti-ETAR-Konz. im Serum [U] Serum im anti-ETAR-Konz. anti-ETAR-Konz. im Serum [U] Serum im anti-ETAR-Konz. 0 0 0 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40

Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndroms [Jahre] Abbildung 45: Zusammenhang der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen von IgG1, IgG3 und Gesamt-IgG im Serum von SSc-Patienten mit der Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndroms. Dargestellt sind (A) die IgG1-spezifische und (B) die IgG3-spezifische AT1R-Auto-Ak-Konzentration sowie (C) die Gesamt-AT1R-Auto-Ak-Konzentration im Serum in Abhängigkeit von der Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndroms (Patienten mit dokumentierten Beginn des Raynaud-Syndroms n=78). (D) Die IgG1-spezifische und (E) die IgG3-spezifische ETAR-Auto-Ak-Konzentration sowie (F) die Gesamt-ETAR-Auto-Ak-Konzentration sind gleichermaßen dargestellt. Die Korrelationsanalysen erfolgten nach Spearman, der Korrelationskoeffizient r und der Irrtumswahrscheinlichkeitswert p sind angegeben, wobei (tendenziell) signifikante Korrelationen mit +p<0.1 und *p<0.05 bezeichnet sind.

Die IgG1- und IgG3-spezifischen Auto-Ak-Konzentrationen korrelieren invers mit der Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndroms (Abb. 45). Diese Korrelation ist relativ schwach für die IgG-1- spezifischen AT1R-Auto-Ak-Konzentrationen, jedoch tendenziell signifikant für die IgG3- spezifischen AT1R-Auto-Ak-Konzentrationen, und signifikant für die IgG1- und IgG3-spezifischen ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen (Abb. 45 A, B, D und E). Keinen statistischen Zusammenhang ergaben dagegen die Gesamt-AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen mit der Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndromes (Abb. 45 C und F).

Ergebnisse

A 50 Spearman r = -0.11 B 50 Spearman r = -0.28 C 50 Spearman r = -0.27 p = -0.36 *p = 0.01 *p = 0.02 40 40 40

30 30 30

20 20 20 IgG1-spezifische 10 IgG3-spezifische 10 10 anti-AT1R-Konz. im Serum [U] Serum im anti-AT1R-Konz. 0 [U] Serum im anti-AT1R-Konz. 0 [U] Serum im Anti-AT1R-Konz. 0 40 60 80 100 120 140 40 60 80 100 120 140 40 60 80 100 120 140

D 50 Spearman r = 0.1 E 50 Spearman r = -0.24 F 50 Spearman r = -0.27 p = 0.41 *p = 0.03 *p = 0.02 40 40 40

30 30 30

20 20 20

IgG1-spezifische 10 IgG3-spezifische 10 10 anti-ETAR-Konz. im Serum [U] Serum im anti-ETAR-Konz. [U] Serum im anti-ETAR-Konz. 0 0 [U] Serum im Anti-ETAR-Konz. 0 40 60 80 100 120 140 40 60 80 100 120 140 40 60 80 100 120 140

FVC [%] Abbildung 46: Zusammenhang der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen von IgG1, IgG3 und Gesamt-IgG im Serum von SSc-Patienten mit der forcierten Vitalkapazität der Lunge (FVC). Dargestellt sind (A) die IgG1- spezifische und (B) die IgG3-spezifische AT1R-Auto-Ak-Konzentration sowie (C) die Gesamt-AT1R-Auto-Ak- Konzentration im Serum in Abhängigkeit von der FVC (Patienten mit einem zeitnahen dokumentierten FVC-Wert n=77). (D) Die IgG1-spezifische und (E) die IgG3-spezifische ETAR-Auto-Ak-Konzentration sowie (F) die Gesamt- ETAR-Auto-Ak-Konzentration sind gleichermaßen dargestellt. Die Korrelationsanalysen erfolgten nach Spearman, der Korrelationskoeffizient r und der Irrtumswahrscheinlichkeitswert p sind angegeben, wobei (tendenziell) signifikante Korrelationen mit +p<0.1 und *p<0.05 bezeichnet sind.

Trotz des Zusammenhangs zwischen Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndromes und den IgG1- /IgG3-spezifischen Auto-Ak-Konzentrationen korrelierte die Krankheitsaktivität der SSc- Patienten dabei jedoch nicht mit deren Erkrankungsdauer (mRSS vs. Zeit seit dem Auftreten des Raynaud-Syndromes Spearman r = -0.04, p = 0.75, und des ersten Nicht-Raynaud-Symptomes Spearman r = -0.05, p = 0.69, ohne Abb.).

Es findet sich in dieser Patientenkohorte aber eine signifikante inverse Korrelation der IgG3- spezifischen sowie der Gesamt-AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentration mit der forcierten Vitalkapazität (FVC) der Lunge (Abb. 46). Die Korrelationsanalyse mit der Diffusionskapazität der Lunge (DLCO) ergibt ein ähnliches Bild (Abb. 47). Beide Lungenfunktionsparameter korrelieren stark miteinander (Spearman r = 0.61, p<0.0001, ohne Abb.), da beide mit zunehmender Beeinträchtigung der Lungenfunktion abnehmen.

Ohne signifikante Ergebnisse blieb die Überprüfung eines statistischen Zusammenhangs zwischen den IgG1- und IgG3-spezifischen AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen sowie den Gesamt-IgG-Auto-Ak-Konzentrationen mit Alter, Geschlecht, sowie dem Zeitraum seit Beginn des ersten Nicht-Raynaud-Symptoms und dem Zeitraum seit Beginn bzw. dem Vorhandensein von einer Lungenfibrose, PAH und akralen Ulzerationen. Die Korrelationsanalysen der

Ergebnisse klinischen Parameter mit den IgG2- und IgG4-spezifischen AT1R- und ETAR-Auto-Ak- Konzentrationen ergaben keinerlei statistischen Zusammenhang.

A 50 Spearman r = -0.08 B 50 Spearman r = -0.26 C 50 Spearman r = -0.2 p = 0.51 *p = 0.02 +p = 0.08 40 40 40

30 30 30

20 20 20 IgG1-spezifische 10 IgG3-spezifische 10 10 anti-AT1R-Konz. im Serum [U] Serum im anti-AT1R-Konz. 0 [U] Serum im anti-AT1R-Konz. 0 [U] Serum im Anti-AT1R-Konz. 0 20 40 60 80 100 20 40 60 80 100 20 40 60 80 100

D 50 Spearman r = -0.002 E 50 Spearman r = -0.21 F 50 Spearman r = -0.16 p = 0.99 +p = 0.07 p = 0.16 40 40 40

30 30 30

20 20 20

IgG1-spezifische 10 IgG3-spezifische 10 10 Anti-ETAR-Konz. im Serum [U] Serum im Anti-ETAR-Konz. anti-ETAR-Konz. im Serum [U] Serum im anti-ETAR-Konz. 0 [U] Serum im anti-ETAR-Konz. 0 0 20 40 60 80 100 20 40 60 80 100 20 40 60 80 100

DLCO [%] Abbildung 47: Zusammenhang der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen von IgG1, IgG3 und Gesamt-IgG im Serum von SSc-Patienten mit der Diffusionskapazität der Lunge für Kohlenmonoxid (DLCO). Dargestellt sind (A) die IgG1-spezifische und (B) die IgG3-spezifische AT1R-Auto-Ak-Konzentration sowie (C) die Gesamt-AT1R-Auto-Ak- Konzentration im Serum in Abhängigkeit von der DLCO (Patienten mit einem zeitnahen dokumentierten DLCO- Wert n=76). (D) Die IgG1-spezifische und (E) die IgG3-spezifische ETAR-Auto-Ak-Konzentration sowie (F) die Gesamt-ETAR-Auto-Ak-Konzentration sind gleichermaßen dargestellt. Die Korrelationsanalysen erfolgten nach Spearman, der Korrelationskoeffizient r und der Irrtumswahrscheinlichkeitswert p sind angegeben, wobei (tendenziell) signifikante Korrelationen mit +p<0.1 und *p<0.05 bezeichnet sind.

Jedoch zeigten vier der SSc-Patienten sehr hohe IgG4-spezifische AT1R-Auto-Ak- Konzentrationen (40 U), obwohl die AT1R-Auto-Ak-Konzentrationen der anderen Patienten in dieser Subklasse sonst unter 20 U blieben (Abb. 41 A, 42 A und nachfolgende). Diese vier Patienten waren alle weiblich, zwischen 43-51 Jahre alt und befanden sich in einer relativ frühen Phase der Erkrankung (Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndroms 3-8 Jahre, Zeit seit Beginn des ersten Nicht-Raynaud-Symptomes 3-6 Jahre). Bei drei von ihnen wurde eine dcSSc diagnositiziert, eine Patientin litt bereits an einer LF, drei an Ulzerationen der Finger.

Diskussion 4 Diskussion

4.1 Expression der Angiotensin II- und Endothelinrezeptoren in humanen PBMCs

4.1.1 Expression des AT1R und ETAR in PBMCs von gesunden Spendern und SSc-Patienten

In der vorliegenden Arbeit ist die Expression des AT1R und des ETAR, den Zielmolekülen von AT1R- und ETAR-Auto-Ak, in PBMCs von Gesunden und SSc-Patienten untersucht worden. Dabei konnte mittels Durchflusszytometrie und quantitativer Real-time PCR gezeigt werden, dass beide Rezeptoren in humanen peripheren T-Zellen, B-Zellen und Monozyten exprimiert werden (Abb. 11). Für den AT1R sind sowohl die Protein- als auch die mRNA-Expression in diesen Zellen bereits zuvor nachgewiesen worden [105, 106], bis zur Veröffentlichung dieser Resultate jedoch nicht die des ETAR [146]. Die Expression beider Rezeptoren in humanen PBMCs ermöglicht ihre Aktivierung durch die natürlichen Liganden und durch funktionelle agonistische Auto-Ak, und damit die Transduktion entsprechender Signalwege und der nachfolgenden biologischen Effekte.

Aufgrund der raschen Internalisierung der Rezeptoren während der Isolierung der PBMCs aus dem Blut, die für den AT1R sowie für andere Rezeptoren auch schon zuvor beschrieben worden ist [105, 147], erfolgte die Detektion der Rezeptorproteine nach einem Permeabilisierungs- schritt, sodass nicht nur die Moleküle erfasst werden konnten, die sich an der Oberfläche präsentierten, sondern auch die, die internalisiert und noch nicht wieder reinseriert bzw. noch nicht degradiert worden waren.

In PBMCs von SSc-Patienten, besonders in T-Zellen und Monozyten, war die Proteinexpression des AT1R und des ETAR deutlich geringer als in PBMCs von Gesunden (Abb. 11). Es konnte bereits umfänglich gezeigt werden, dass Ang II und ET-1, sowie andere Hormone und Wachstumsfaktoren, die ebenfalls im Serum von SSc-Patienten erhöht sind, die Expression des AT1R bzw. des ETAR herabregulieren [122, 148-152]. Verantwortlich hierfür sind die Feedback- Mechanismen der Desensitisierung, mit denen die Zelle der Rezeptoraktivierung begegnet [153, 154]. Eine verringerte AT1R-Expression ist auch für die VSMCs von geschädigten Gefäßen bei Patienten mit granulomatöser Polyangiitis beschrieben worden, einer Gefäßerkrankung, die gleichfalls durch eine endotheliale Dysfunktion und Inflammation sowie erhöhte AECA- Serumkonzentrationen gekennzeichnet ist [155]. Ebenfalls verringert war die ETAR-Expression im fibrotischen Lungengewebe sowie in den Fibroblasten der Haut von SSc-Patienten [122, 149].

Diskussion Möglicherweise bewirken nicht nur die natürlichen Liganden und Wachstumsfaktoren eine Herabregulation der AT1R- und ETAR-Expression, sondern auch rezeptoraktivierende Auto-Ak. Für funktionelle Auto-Ak, die an den Beta-Adrenorezeptor oder den Muskarin-2-Rezeptor binden, konnte gezeigt werden, dass sie ihre aktivierende Wirkung durch eine Dimerisation von benachbarten Rezeptoren erzielen, die durch die bivalente Struktur der Ak ermöglicht wird [75]. Normalerweise führt die Rezeptoraktivierung durch Bindung eines klassischen Agonisten rasch zu einer Desensitisierung des Rezeptors und zur Termination des Signales, der GPCR ist dann vorerst nicht mehr aktivierbar. Im Gegensatz dazu verhindern funktionelle agonistische Auto-Ak die Desensitisierung des Rezeptors, wodurch ein permanentes Signal verursacht wird. Dieser Effekt konnte bei allen bislang untersuchten agonistischen Auto-Ak beobachtet werden und scheint ein genereller Schlüsselmechanismus in der Pathogenese GPCR-Auto-Ak-assoziierter Erkrankungen zu sein. Offenbar verhindert die Dimerisation durch die funktionellen Auto-Ak eine Internalisierung der Rezeptoren [75]. Jedoch konnten Podlowski und Kollegen zeigen, dass die langanhaltende in vitro Stimulation durch Auto-Ak nach 72 Stunden schließlich zu einer Herabregulation von Beta-Adrenorezeptoren auf mRNA- und Proteinebene führte [156].

Die bei den SSc-Patienten im Mittel geringere AT1R- und ETAR-Dichte kann demnach auch in einer anhaltenden Stimulation der Rezeptoren durch AT1R- und ETAR-Auto-Ak und einer daraus resultierenden Herabregulation der Rezeptoren begründet sein. Der geringere Anteil rezeptorpositiver Zellen kann als sekundärer Effekt auf die geringeren Rezeptordichten oder auf eine Abwanderung der hoch rezeptorexprimierenden und damit besser aktivierbaren Zellen ins Gewebe zurückzuführen sein.

4.1.2 Expression des AT2R und ETBR in PBMCs von gesunden Spendern und SSc-Patienten, Verhältnis der Angiotensin II- und Endothelinrezeptoren

Signalwege, die über den AT2R und ETBR aktiviert werden, wirken häufig denen des AT1R bzw. ETAR entgegen und können somit die rezeptorvermittelten Effekte in einem physiologischen Gleichgewicht halten (siehe 1.3.3 und 1.3.4). Daher wurde hier die Hypothese untersucht, ob insbesondere die Dichte des AT2R und des ETBR in PBMCs von SSc-Patienten höher ist als in Gesunden oder zumindest eine verringerte Ratio der AT1R/AT2R- und der ETAR/ETBR-Dichten vorliegt.

In den hier analysierten T- und B-Zellen von SSc-Patienten waren jedoch sowohl die Raten AT2R-positiver Zellen als auch die AT2R-Dichte geringer als in den PBMCs der Gesunden (Abb. 12). Der Anteil AT2R-positiver Monozyten entsprach dagegen dem von Gesunden. Da jedoch

Diskussion der Anteil AT1R-positiver Monozyten in den SSc-Patienten signifikant verringert war, ergab sich hier eine hoch signifikant verringerte AT1R/AT2R-Ratio. Die AT1R/AT2R-Ratio der Rezeptor- dichten unterschied sich jedoch kaum von denen der Gesunden, sodass zumindest auf Subtypenebene eine Störung des Gleichgewichtes der Rezeptoren nicht abgeleitet werden kann. Die ETBR-Expression war in PBMCs von SSc-Patienten ebenfalls geringer. Die hoch signifikant verminderte Dichte des ETBR in B-Zellen führte zu einer hoch signifikant erhöhten ETAR/ETBR- Ratio.

Auch das fibrotische Lungengewebe von SSc-Patienten und Patienten mit idiopathischer PAH zeigte einer verringerte Expression von ETAR und ETBR in Endothelzellen, sowie eine erhöhte Expression des ETBR in VSMCs [149, 157, 158]. Die verringerte Dichte beider ATR und beider ETR in den PBMCs von SSc-Patienten kann als kompensatorischer Mechanismus der Zellen angesehen werden [157]. Eine Überexpression der Gegenspieler zum Ausgleich einer AT1R- und/oder ETAR-vermittelten Überaktivierung lag in den hier untersuchten PBMCs der SSc- Patienten nicht oder nicht mehr vor. Möglicherweise war sie aufgrund der offenkundig erfolgten Herabregulation des AT1R und ETAR auch nicht mehr notwendig.

Die Analyse der Korrelationen von Ratios mit der Erkrankungsdauer (Zeit seit Auftreten des Raynaud-Syndromes bzw. ersten Nicht-Raynaud-Symptomes) ergab jedoch keinen Hinweis auf eine Änderung von AT1R/AT2R und ETAR/ETBR im Krankheitsverlauf (Daten nicht gezeigt). Hier könnten wiederholte durchflusszytometrische Analysen von PBMCs aus SSc-Patienten über einen längeren Zeitraum, möglichst zeitnah dem Krankheitsausbruch beginnend, aufschluss- reichere Daten liefern. Dabei sollten zumindest AT1R und AT2R sowie ETAR und ETBR jeweils gemeinsam angefärbt werden, um eine Veränderung der Ratios auch auf Einzelzellniveau analysieren zu können.

4.1.3 Abhängigkeit der Rezeptorexpression vom Alter der Spender

Auch das Immunsystem unterliegt wie der gesamte menschliche Organismus physiologischen und pathophysiologischen Alterungsprozessen. Sowohl die angeborene als auch die adaptierte Immunabwehr verändern sich insbesondere ab einem Alter von 50 Jahren. Die Anzahl von B- und T-Zellen nimmt ab, wogegen die Serumkonzentration von proinflammatorischen Zytokinen wie IL-6 und Tumornekrosefaktor  (TNF- zunimmt und es mit fortschreitendem Alter zu einer andauernden unterschwelligen Entzündungsantwort kommt, dem sogenannten „inflamm-aging“ [159, 160].

Diskussion Die deutlichen Korrelationen der Expressionsdaten mit dem Alter der gesunden Spender weisen darauf hin, dass die Expression des AT1R, AT2R, ETAR und ETBR in PBMCs von Gesunden mit zunehmendem Alter abzunehmen scheint (Abb. 13). Wenngleich eine Korrelation zwischen dem Alter und der ATR- und ETR-Expression in der Literatur bislang noch nicht beschrieben worden ist, so kann in diesem Kontext angenommen werden, dass auch die Konzentrationen von Ang II und ET-1 im Rahmen dieser inflammatorischen Prozesse erhöht sind und die Expression der Rezeptoren infolgedessen abnimmt. Diese Hypothese wird durch die Tatsache unterstützt, dass viele der im Alter auftretenden Leiden, wie Bluthochdruck, Atherosklerose, Schlaganfall, Herzinfarkt, Diabetis Typ 2, chronische Niereninsuffizienz, Demenz, Osteoporose, Krebs, usw., mit einer Aktivierung des Angiotensin- und/oder Endothelinsystems assoziiert sind [161, 162]. Erhöhte ET-1-Plasmakonzentrationen sind in vielen dieser alterungsbedingten Erkrankungen beobachtet worden, wobei bislang unklar ist, ob eine erhöhte ET-1- Konzentration tatsächlich für die Progression der Erkrankungen ursächlich ist oder sekundär auftritt [162]. Daneben konnte gezeigt werden, dass es infolge einer altersbedingten RAS- Überaktivierung zu einer unkontrollierten Ang-II-abhängigen ROS-Generierung kommt und besonders AT1R-vermittelte Signale in die pathophysiologischen Prozesse der o.g. Erkrankungen involviert sind [161, 163].

Die hier gezeigte altersabhängige Abnahme der Expression der Rezeptoren in den PBMCs von Gesunden könnte demnach in einer Herabregulierung als kompensatorische Antwort auf ein mit dem Alter zunehmend überaktiviertes bzw. dereguliertes Endothelin- und Angiotensin- system begründet sein.

Bei den SSc-Patienten konnte kein Zusammenhang von Alter und Rezeptorexpression aufgezeigt werden (Abb. 13). Vielmehr als von altersabhängigen Veränderungen scheint die Expression der Rezeptoren in den PBMCs von SSc-Patienten von den individuellen bzw. pathophysiologischen Konditionen beeinflusst zu sein, wie zum Beispiel Geschlecht sowie Krankheitsdauer und -aktivität (siehe 4.1.4 und 4.1.5).

4.1.4 Abhängigkeit der Rezeptorexpression vom Geschlecht der Spender

Die PBMCs der gesunden Frauen wiesen insgesamt eine geringere Expression der vier untersuchten Rezeptoren auf als die der gesunden Männer (Tabelle 2). Dieser Unterschied scheint hormonell bedingt zu sein. Es ist bekannt, dass Estrogen die AT1R-Expression supprimiert, wie beispielsweise mit in vitro Untersuchungen von VSMCs nachgewiesen werden konnte [104]. 83

Diskussion Der Vergleich der gesunden Frauen mit den SSc-Patientinnen zeigte, dass sich die Expression der Rezeptoren zwischen diesen beiden Gruppen nicht unterscheidet (Abb. 14). Bei den männlichen SSc-Patienten waren die Rezeptoren dagegen deutlich geringer exprimiert als bei den männlichen Gesunden, die Dichte des AT1R war dabei auf allen drei untersuchten Zellzypen hoch signifikant verringert (Abb. 15).

Statistische Analysen belegen, dass erkrankte Männer häufiger als erkrankte Frauen an der einer dcSSc leiden, insgesamt eine höhere Krankheitsaktivität aufweisen sowie schneller und öfter schwere Manifestationen und Komplikationen wie eine Lungenfibrose, PAH, Herzinsuffizienz oder eine renale Krise entwickeln, und auch früher versterben [27, 28, 164- 166]. In einer großen europäischen Multicenter-Studie mit mehr als 4000 SSc-Patienten wurde bei den männlichen Patienten eine insgesamt deutlich schwerere Vaskulopathie festgestellt [28]. Vor diesem Hintergrund lässt sich die signifikant geringere Rezeptorexpression in den PBMCs von männlichen SSc-Patienten möglicherweise mit einem hochgradig überaktivierten Angiotensin-/Endothelinsystem erklären, das nicht nur eine schwere Vaskulopathie bewirken kann (siehe 1.3.3 und 1.3.4), sondern auch die hier gezeigte drastische Herabregulation der Expression von ATR und ETR.

Die Ursachen für eine häufig schwerere Ausprägung der SSc bei den erkrankten Männern sind noch nicht hinreichend erforscht und werden sowohl in geschlechtsspezifischen genetischen Prädispositionen als auch in unterschiedlichen Expositionen von Umwelteinflüssen und ungleichem Gesundheitsverhalten vermutet [28, 164, 165].

4.1.5 Assoziationen der Rezeptorexpression mit den klinischen Parametern der SSc- Patienten

Die Analyse der statistischen Zusammenhänge zwischen der Expression der Rezeptoren und den klinischen Daten der SSc-Patienten ergab eine signifikante positive Korrelation der AT1R- und AT2R-Dichte in Monozyten mit der Krankheitsaktivität (Abb. 16). Demnach geht eine höhere Dichte der ATR mit einer erhöhten Krankheitsaktivität einher. Auch die Rate AT1R- positiver Monozyten war in Patienten mit höherer Krankheitsaktivität deutlich größer (Abb. 16).

Die Krankheitsaktivität ist besonders zu Beginn der Erkrankung häufig hoch und nimmt dann insgesamt ab, von Phasen erhöhter Aktivität abgesehen (siehe 1.2.4 und [167]). Daher wurden die Expressionsdaten hier auch mit der Dauer der Erkrankung assoziiert. Dabei zeigte sich eine signifikante negative Korrelation der AT1R-Dichte in Monozyten sowie der Rate AT1R-positiver

Diskussion Monozyten mit der Krankheitsdauer, also eine scheinbare Abnahme der Expression im Verlauf der Erkrankung (Abb. 17).

In einer weiteren Kohorte von SSc-Patienten, deren Monozyten und T-Zellen von unserer Arbeitsgruppe unter einem anderen Gesichtspunkt untersucht worden sind, konnte ebenfalls diese Abhängigkeit der AT1R-Expression in Monozyten von der Dauer der SSc-Erkrankung festgestellt werden [20, 168]. In der betreffenden Patientenkohorte waren jedoch sowohl beide ATR als auch beide ETR in Monozyten und T-Zellen im Mittel höher exprimiert als bei der gesunden Kontrollgruppe. Bei der genauen Betrachtung dieser scheinbar zu den o.g. Ergebnissen im Widerspruch stehenden Resultate zeigten die klinischen Daten, dass diese Patienten eine höhere Krankheitsaktivität aufwiesen und häufiger an einer Lungenfibrose litten als die der hier untersuchten Kohorte [20, 168].

Die AT1R-Expression in Monozyten scheint demnach zu Beginn der Erkrankung und/oder bei hoher Krankheitsaktivität besonders hoch zu sein, und zwar u. U. auch höher als die in Monozyten von Gesunden. Im weiteren Verlauf wird einer andauernden Rezeptoraktivierung offenbar mit einer Herabregulation der AT1R-Expression entgegengesteuert, woraus die in beiden Studien beobachtete krankheitsdauerabhängige Verringerung der AT1R-Expression resultieren könnte. Um diese These zu bestätigen, müsste die AT1R-Expression in Monozyten von SSc-Patienten über einen längeren Zeitraum analysiert werden, insbesondere zu Beginn der Erkrankung, und regelmäßig im weiteren Verlauf, sowie bei Änderungen der Krankheitsaktivität und während des Auftretens bzw. der Manifestation von Komplikationen wie der Lungenfibrose. Sollte sich dabei zeigen, dass tatsächlich im einzelnen Patienten die Dichte der Rezeptoren, besonders des AT1R, zu Beginn der Erkrankung hoch ist, möglicherweise sogar höher als in Gesunden, im weiteren Verlauf jedoch abnimmt, so lässt sich dies jedoch allein mit einem Feedback-Mechanismus auf Zellebene nicht erklären, da die Monozyten nur ca. 24-72 Stunden im Blut verweilen, bevor sie sterben oder aktiviert werden und ins Gewebe migrieren [169].

Hoch AT1R-exprimierende Monozyten und deren rasche Aktivierung und nachfolgende Migration könnten jedoch Teil des Phänomenes sein: Infiltrate von mononukleären Zellen sind besonders in der frühen Phase, also der Phase hoher Krankheitsaktivität, im perivaskulären Gewebe zu finden (siehe 1.2.6). Monozyten von SSc-Patienten generieren mehr ROS als die von gesunden Kontrollindividuen, und zwar ebenfalls vor allem in der frühen Phase der Erkrankung [170]. Sie zeigen dann einen aktivierten Phänotyp, gekennzeichnet durch erhöhte Expression von CD163 und verstärkte Sekretion von CCL18, sowie ein größeres Potential zu ECM-

Diskussion produzierenden Zellen zu differenzieren, die dann wiederum zur Fibrose beitragen [65, 171]. Eine erhöhte ROS-Produktion kann aus einer andauernden AT1R-Aktivierung resultieren (siehe 1.3.1). Darüber hinaus induziert Ang II über eine NF-B-Aktivierung die Synthese von monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1/CCL2) und anderen inflammatorischen Zytokinen [172-174]. MCP-1 wird von Monozyten/Makrophagen, Fibroblasten und Endothelzellen sezerniert. Seine Konzentration ist im Serum von SSc-Patienten signifikant erhöht und korreliert mit der Krankheitsaktivität. Neben seiner Eigenschaft, als Chemoattraktant für Monozyten zu wirken, ist MCP-1 auch in der Lage, die Kollagenproduktion in Fibroblasten zu stimulieren [175]. Es zeichnet sich also ab, dass in der frühen Phase der Erkrankung eine hohe AT1R-Expression in Monozyten mit einer erhöhten Aktivierung und Migration von Immunzellen, insbesondere Monozyten/Makrophagen, einer Stimulation von Fibroblasten und einer hohen Krankheits- aktivität zusammenfällt. Ob hoch-AT1R-exprimierende Monozyten von SSc-Patienten mit AT1R- Auto-Ak so stimuliert werden können, dass sie in erhöhtem Maße ROS und MCP-1 produzieren, müssen weitere Untersuchungen zeigen. Die AT1R-Expression in Monozyten könnte damit möglicherweise einen Biomarker darstellen, der die Krankheitsaktivität sensibler abbildet als der mRSS, der lediglich das Ausmaß der Hautfibrose erfasst (siehe 1.2.4).

4.2 Untersuchung des Einflusses der Auto-Ak auf die Proteinexpression der Rezeptoren in vitro

Die Inkubation von PBMCs mit SSc-IgG sollte aufzeigen, ob SSc-IgG in der Lage ist, in vitro die Dichte der Rezeptoren auf der Zelloberfläche zu regulieren. Hierbei konnte jedoch im Untersuchungszeitraum von drei Tagen kein signifikanter Unterschied der Rezeptorexpression im Vergleich zu den Kontrollen festgestellt werden (Abb. 18-20). Demnach konnte in diesem experimentellen Ansatz nicht gezeigt werden, dass die in dem verwendeten SSc-IgG enthaltenen AT1R- und ETAR-Auto-Ak die Expression des AT1R und ETAR signifikant modulieren und dabei ggf. auch einen, zumindest indirekten, Effekt auf die Expression des AT2R und ETBR haben. Möglicherweise kann SSc-IgG die Expression der Rezeptoren nicht modulieren oder es ist ein gewisses Entzündungsszenario erforderlich, um einen Effekt der Auto-Ak auf die Rezeptorexpression nachzuweisen. Dieses könnte in vitro durch die Beigabe von einem bestimmten Zytokin, zum Beispiel MCP-1, oder mehreren Zytokinen in Kombination nachgestellt werden. Hieraus ließe sich eine experimentelle Studie ableiten, in deren Rahmen die optimalen Bedingungen für eine reproduzierbare Modulation der ATR und ETR durch SSc- IgG erprobt werden könnten.

Diskussion 4.3 Wirkung von AT1R- und ETAR-Auto-Ak auf die Chemotaxis von T-Zellen

Die übermäßige Aktivierung von Immunzellen, insbesondere von Monozyten und T-Zellen und deren Migration in das perivaskuläre Gewebe, scheint vor allem zu Beginn der SSc eine Rolle zu spielen und stellt vielleicht sogar das initiierende Moment in der Pathogenese der SSc dar (siehe 1.2.6). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist untersucht worden, ob SSc-IgG die Migration von T-Zellen in vitro bewirken oder verstärken kann. Dabei konnte gezeigt werden, dass T-Zellen sowohl gegen die natürlichen Liganden Ang II und ET-1 als auch gegen SSc-IgG konzentrationsabhängig migrieren (Abb. 22). Ang II wirkt für Monozyten und T-Zellen als Chemoattraktant [176-179], und ET-1 ist an der Migration von PBMCs beteiligt, in dem es die Expression von Adhesionsmolekülen verstärkt und die Sezernierung von MCP-1 und IL-8 induziert, die wiederum chemotaktisch auf Monozyten, T-Zellen und andere Immunzellen wirken [122, 180-182].

Dass IgG für T-Zellen als Chemoattraktant wirkt, ist bislang nicht beschrieben worden. Es ist daher wahrscheinlich, dass in den Ansätzen mit (SSc-)IgG die Migration nicht entlang eines IgG- Konzentrationsgradienten erfolgte. Wie die Daten zeigen (Abb. 22 und 24), migrierte ein Teil der Zellen auch ohne Stimuli, da sie in Folge der erforderlichen Kultivierungsbedingungen eine gewisse Präaktivierung aufwiesen. Es ist anzunehmen, dass die so migrierten Zellen dann in den Ansätzen mit SSc-IgG durch die Bindung der Auto-Ak dazu angeregt wurden, chemotaktische Stoffe zu sezernieren, zum Beispiel IL-8, welches auch von T-Zellen exprimiert wird und auf diese chemotaktisch wirkt [183, 184]. Dieser sekundär entstandene Chemokingradient führte dann vermutlich zur gerichteten Migration weiterer Zellen.

Die Anzahl der T-Zellen, die IgG-induziert migrierten, war sowohl in den Ansätzen mit SSc-IgG als auch in denen mit Kontroll-IgG signifikant höher als in den Kontrollansätzen ohne Stimuli (Abb. 24). Die durch SSc-IgG induzierte Migration war dabei im Mittel stärker als die durch die Kontroll-IgG induzierte, der Unterschied war allerdings nicht signifikant, sodass hier offenbar allein durch den Einsatz von IgG bereits die Chemotaxis der T-Zellen ausgelöst worden ist. Die Migration in den SSc-IgG-Ansätzen konnte jedoch durch den AT1R-Antagonisten Valsartan und den ETAR-Antagonisten Sitaxsentan signifikant gehemmt werden, nicht jedoch die Migration in den N-IgG-Ansätzen (Abb. 24). Es ist daher anzunehmen, dass die vermutete Sezernierung von Chemokinen in den SSc-IgG-Ansätzen zu einem signifikanten Teil über die Aktivierung des AT1R und des ETAR durch spezifische Auto-Ak ausgelöst worden ist, wie auch die natürlichen Liganden Ang II und ET-1 ihre chemotaktischen Eigenschaften bzw. die Ausschüttung von

Diskussion Chemokinen über den AT1R bzw. den ETAR vermitteln (siehe 1.3.3 und 1.3.4). In einer weiteren Studie unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die SSc-IgG, ebenfalls AT1R- und ETAR-vermittelt, in vitro auch die Migration von Neutrophilen induzieren [185]. Dieser Effekt ließ sich durch lösliche anti-IL8-Ak sowie durch einen NF-B-Inhibitor signifikant hemmen, woraus geschlussfolgert werden kann, dass die Migration durch eine Auto-Ak-induzierte, NF- B-vermittelte IL-8-Sekretion ausgelöst wurde. Eine durch AT1R- und ETAR-Auto-Ak induzierte Migration ins umliegende Gewebe könnte auch die verringerte Rate AT1R- und ETAR-positiver T-Zellen und Monozyten in SSc-Patienten erklären. Zur Bestätigung dieser Hypothese sollte nach einem Chemotaxisassay der Anteil AT1R- und ETAR-positiver Zellen bei den migrierten Zellen deutlich höher sein als bei den im Einsatz verbliebenen Zellen. Dies könnte durchflusszytometrisch untersucht werden.

Die Darstellung der einzelnen IgG-Ansätze eines Migrationsassays mit und ohne den jeweiligen spezifischen Rezeptorantagonisten (Abb. 25 B-E) verdeutlicht, dass sich das Potential, Chemotaxis zu induzieren, sowie dessen Hemmbarkeit zwischen den einzelnen SSc-IgG deutlich unterscheidet. Zwar konnte die Migration größtenteils durch den AT1R- und ETAR-Antagonist unterdrückt werden, jedoch jeweils in unterschiedlichem Maße. Bei 4/10 SSc-IgG ließ sich die Migration durch den einen Blocker sehr gut inhibieren, nicht aber durch den jeweils anderen Blocker. In vorangegangenen Studien korrelierten die Serumkonzentrationen von AT1R- und ETAR-Auto-Ak stark miteinander [142], ebenso die Konzentrationen in den aufgereinigten IgG (nicht gezeigt), sodass große Differenzen zwischen der jeweiligen AT1R- und ETAR-Auto-Ak- Konzentration einer IgG-Probe nicht als Ursache für die unterschiedliche Hemmbarkeit durch den jeweiligen Antagonisten angenommen werden können. Denkbar ist jedoch, dass in den SSc-IgG weitere funktionelle Auto-Ak enthalten sind [20], die ebenfalls zur Sezernierung eines chemotaktisch wirkenden Stoffes führen, und damit die hemmende Wirkung eines AT1R- oder ETAR-Antagonisten umgehen. Unsere Arbeitsgruppe konnte gemeinsam mit ihren Kooperationspartnern auch Auto-Ak gegen den CXCR3 und CXCR4 im Serum von SSc-Patienten detektieren [186]. CXCR3 und CXCR4 werden u.a. in T-Zellen exprimiert. Die Bindung der Chemokine CXCL9, CXCL10 und CXCL11 an den CXCR3 sowie CXCL12 an den CXCR4 führt zu deren Aktivierung und resultiert rasch in einer Migration der aktivierten T-Zellen entlang des Chemokingradienten [187, 188]. In den Ansätzen, in denen die SSc-IgG-induzierte Migration nicht mit einem AT1R- oder ETAR-Antagonisten gehemmt bzw. reduziert werden konnte, ist sie möglicherweise über eine Aktivierung des CXCR3 oder CXCR4 durch spezifische Auto-Ak ausgelöst worden. 88

Diskussion Die Korrelationsanalyse der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentration in den verwendeten SSc- IgG mit der Anzahl der migrierten Zellen ergab in der Zusammenfassung der ersten fünf Experimente eine signifikante bzw. deutliche positive Korrelation der Ak-Konzentrationen mit der Anzahl der migrierten T-Zellen [146]. Dieser Zusammenhang zeigte sich nicht bei den Kontroll-IgG. Entgegen den Erwartungen konnte die signifikante positive Korrelation der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentration der SSc-IgG mit der Anzahl migrierter Zellen mit dem sechsten Experiment nicht bestätigt werden. Auch durch die Zusammenfassung der Daten aller sechs Experimente konnte entgegen den Erwartungen diese Korrelation nicht dargestellt werden. Ähnlich wie für die teilweise unzureichende Hemmung durch die Rezeptor- antagonisten vermutet, könnte auch hierfür der Einfluss anderer Auto-Ak ursächlich sein. Damit ließe sich auch erklären, warum die Migration zwar in Abhängigkeit von der SSc-IgG- Konzentration erfolgte (Abb. 22), nicht aber in Abhängigkeit von der Konzentration der AT1R- und ETAR-Auto-Ak.

Die Anzahl migrierter Zellen zeigte deutliche, wenn auch nicht signifikante Assoziationen mit den klinischen Parametern der SSc-IgG-Spender. So war besonders IgG von Patienten in der früheren Erkrankungsphase eher in der Lage, die Migration einer hohen Anzahl von T-Zellen zu bewirken (Abb. 26), ebenso IgG von männlichen SSc-Patienten, sowie von Patienten mit dcSSc und Ulzerationen an den Fingern (Abb. 27). Trotz der geringen Stichprobenzahl von 11 SSc-IgG im sechsten Experiment, zeigt sich hier eine Assoziation zwischen den Merkmalen frühe Erkrankung, männlich, dcSSc, Ulzerationen und dem erhöhten Potenzial des IgG der betreffenden Patienten, eine T-Zellmigration zu induzieren.

4.4 Aktivierung von PBMCs durch AT1R- und ETAR-Auto-Ak in vitro

4.4.1 Etablierung von geeigneten Outcome-Parametern

Monozytäre Oberflächenmarker

Monozyten und Makrophagen sowie deren Aktivierung und Zytokinsekretion scheinen bei der Pathogenese der SSc eine Schlüsselrolle zu spielen (siehe 1.2.6 und 4.1.5). Daher wurde hier in ersten Testexperimenten untersucht, ob eine Aktivierung von Monozyten durch SSc-IgG in einer PBMC-Kultur erfolgt und die Sekretion von inflammatorischen und/oder profibrotischen Zytokinen ausgelöst wird. Dazu wurden PBMCs mit SSc-IgG stimuliert und anschließend die Expression der Aktivierungsmarker CD14, CD16 und des MHC Klasse II HLA-DR, sowie die Konzentration des löslichen Proteins sCD14 und der Zytokine TFG-, IL-8 und CCL18 analysiert.

Diskussion Der Oberflächenrezeptor CD14 wird hauptsächlich auf Monozyten und Makrophagen exprimiert, sehr viel schwächer auch auf Neutrophilen. Er fungiert mit dem Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) und einem weiteren Protein, dem Lymphocyte antigen 96 (Ly96), als Ko-Rezeptor und erkennt bakterielles LPS sowie bakterielle Lipoteichonsäure [2]. Die LPS-Bindung bewirkt die Aktivierung von CD14-positiven Zellen. Durch Abtrennung des CD14-Moleküls von der Zellmembran oder durch Sezernierung von ungebundenem CD14 aus Vesikeln wird sCD14 freigesetzt, das als negativer Regulator einer T-Zellaktivierung fungiert. Es bindet an aktivierte

T-Zellen, von denen es internalisiert und abgebaut wird [189].

Der Oberflächenrezeptor CD16 (Fc-Rezeptor III) wird auf Monozyten/Makrophagen und anderen Immunzellen exprimiert. Er ist ein Low-affinity-Rezeptor für Fc, und bindet in Immunkomplexen gebundenes IgG.

CD14 und CD16 werden auf den Subpopulationen von Monozyten in Abhängigkeit vom Subtyp und dem Grad der Aktivierung exprimiert. Eine starke CD14-Expression und geringe bis keine CD16-Expression (CD14++/CD16-) kennzeichnet den klassischen Monozyten, wogegen aufgrund erhöhter TNF-Produktion die CD14+/CD16+ Monozyten inflammatorische bzw. nicht-klassische Monozyten genannt werden [190]. In der Übergangsphase zwischen den klassischen und den nicht-klassischen befinden sich die intermediären Monozyten (CD14++/CD16+). Durch die Analyse weiterer Oberflächenmarker können die entsprechenden Subtypen noch genauer charakterisiert werden. So sind die inflammatorischen Monozyten außerdem durch eine erhöhte Expression des Aktivierungsmarkers HLA-DR gekennzeichnet [190].

In den hier durchgeführten Testexperimenten konnte durch Kultivierung mit SSc-IgG im Vergleich zum Kontroll-IgG eine signifikante Verringerung der CD14-Dichte auf Monozyten festgestellt werden, die Dichte von CD16 war tendenziell erhöht (Abb. 28). Eine Änderung des Phänotypus vom klassischen zum inflammatorischen Monozyten wurde durch die differenzierte Quantifizierung der monozytären Subpopulationen überprüft. Dabei zeigte sich, dass sich der Anteil klassischer Monozyten (CD14++/CD16-) unter SSc-IgG höchst signifikant verringert hat, jedoch nicht zugunsten einer Zunahme der intermediären oder inflammatorischen Monozyten (CD14++/CD16+ bzw. CD14+/CD16+). Signifikant erhöht war der Anteil der Subpopulation CD14+/CD16-, die bislang in der Literatur nicht näher definiert worden ist. Beschrieben ist jedoch eine von Monozyten abstammende Population inflammatorischer CD14+/CD16- dendritischer Zellen [191]. Da dendritische Zellen in hohem Maße HLA-DR exprimieren [191], wurde auch die HLA-DR-Expression der monozytären Subpopulationen dargestellt. Diese zeigte

Diskussion sich leicht erhöht bei den intermediären und deutlich erhöht bei den inflammatorischen Monozyten, die mit SSc-IgG stimuliert worden waren (Abb. 28). Die CD14+/CD16- Population wies jedoch keine erhöhte HLA-DR-Expression auf, sodass ohne weitere Analysen eine Aussage über einen differenzierteren Phänotyp dieses unter SSc-IgG angestiegenen Subtypes nicht möglich ist.

Über die Ursache der höchst signifikanten Abnahme der klassischen Monozyten kann hier ebenfalls nur spekuliert werden. Auch sCD14 war signifikant verringert (Abb. 29), wodurch ein Shedding-Effekt per se nicht nachgewiesen werden konnte. Dennoch könnte dieser stattgefunden haben und das sCD14 rasch von hochgradig aktivierten T-Zellen aufgenommen worden sein [189]. Ebenfalls denkbar wäre eine CD14-Abnahme als Zeichen einer Desensitisierung aufgrund einer übermäßigen Aktivierung der Monozyten in diesem artifiziellen System. Hier könnten weitere Experimente Aufschluss geben, die eine Kinetik des sCD14 im Überstand und der Expression der Oberflächenmarker sowie die Analyse der Aktivierungs- marker von T-Zellen beinhalten (zum Beispiel CD25, CD69).

TGF-1

Bei der Pathogenese fibrosierender Erkrankungen stellt TGF- einen Schlüsselfaktor dar [192- 194]. Die in Immunzellen prädominante Form ist TGF-1. Es wird vor allem von Lymphozyten und Monozyten produziert und reguliert die Proliferation, das Überleben und die Differenzierung von Lymphozyten sowie die Polarisation von Makrophagen [193]. Bis zu seiner Aktivierung ist TGF- in einem Proteinkomplex gebunden, der oft mit der Zelloberfläche von Monozyten/Makrophagen assoziiert ist oder von diesen aufgenommen wird und bei deren Aktivierung bzw. durch extrazelluläre Enzyme oder pH-Wert-Änderungen freigesetzt wird. Anschließend bindet TGF- an seine Rezeptoren Typ I und II, wodurch ein Signalweg induziert wird, der über verschiedenen Smad-Proteine u. a. zur Transkription von sogenannten „myofibroblast related genes“ führt [193]. Der pathophysiologische Aspekt von TGF- zeigt sich in der Induktion und Aufrechterhaltung von fibrotischen Prozessen. Es moduliert die Differenzierung von Fibroblasten hin zu dem fibrotischen Phänotyp der sogenannten Myofibroblasten [192, 193, 195].

Aufgrund der erhöhten TGF--Produktion, die SSc-IgG, ähnlich wie Ang II und ET-1, in Endothelzellen induziert hat [142], wurde diese auch für PBMCs erwartet. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch nach achtstündiger IgG-Stimulation in den Überständen der PBMCs nur ca.

Diskussion halb so viel TGF-1 gemessen werden, wie in den unstimulierten Kontrollen. Der Unterschied zwischen den Ansätzen mit SSc-IgG und denen mit Kontroll-IgG war dabei nicht signifikant (Abb. 29). Möglicherweise wurde von den IgG-stimulierten Zellen ebenso viel oder sogar mehr TFG- 1 freigesetzt wie von den unstimulierten, dabei jedoch von den IgG-stimulierten Zellen auch mehr TGF-1 aufgenommen. Für verschiedene humane Zelllinien, welche TGF--Rezeptoren des Typs I und II exprimieren, konnte gezeigt werden, dass an die Zelloberfläche gebundenes 125I-TGF-1 nach Aktivierung innerhalb kurzer Zeit, mit einem Maximum bei 40 min, von den Zellen internalisiert und anschließend offenbar degradiert wird [195]. Daher ist es denkbar, dass von den PBMCs zwar TGF-1 freigesetzt worden ist, aber anschließend von den entsprechend aktivierten Zellen, zum Beispiel von regulatorischen T-Zellen [196], rascher gebunden und internalisiert wurde. Um die SSc-IgG-induzierte Freisetzung von TGF-1 genauer zu analysieren, wären deshalb weitere Experimente erforderlich, die vor allem die Untersuchung des zeitlichen Verlaufes der Konzentration von TGF-1 im Überstand sowie der Tgfb1-mRNA in den Zellen beinhalten. Möglicherweise würde sich dann auch ein signifikanter Unterschied zur Stimulation mit Kontroll-IgG zeigen. Eine andere Erklärung für die vergleichsweise geringe TGF-1-Konzentration im Überstand könnte sein, dass SSc-IgG die Freisetzung von TGF-1 in PBMCs nicht hinreichend induzieren kann, und der vermutete profibrotische Effekt über eine andere Signalkaskade ausgelöst wird. Sowohl für Ang II als auch für CCL18 konnte gezeigt werden, dass sie in der Lage sind, profibrotische Effekte über einen TGF-- unabhängigen Signalweg zu induzieren [68, 197-199].

IL-8

Statt einer erhöhten TGF-1-Konzentration konnte hier eine signifikant erhöhte IL-8- Konzentration in den Überständen der mit SSc-IgG stimulierten PBMCs festgestellt werden (Abb. 29).

Das Chemokin IL-8 spielt eine Schlüsselrolle bei der Induktion von Entzündungsantworten. Es wird hauptsächlich von Endothelzellen und Monozyten/Makrophagen sezerniert und bewirkt in erster Linie die Chemotaxis und Aktivierung von Neutrophilen, aber auch von T-Lymphozyten und Monozyten/Makrophagen [200]. In einer anderen Studie unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass SSc-IgG in vitro auch in HMECs eine IL-8-Expression induziert, die regenerative Kapazität von HMECs erheblich beeinträchtigt und Fibroblasten zur erhöhten Kollagenproduktion anregt [185]. Diese Effekte konnten ebenfalls mit den selektiven AT1R- und ETAR-Antagonisten Valsartan und Sitaxsentan signifikant inhibiert werden. Folglich könnten 92

Diskussion Auto-Ak, die eine IL-8-Sekretion induzieren, zu der perivaskulären Infiltration von Immunzellen beitragen, die besonders zu Beginn der SSc beobachtet werden kann [72, 148]. Hierfür spricht auch, dass IL-8 im Serum von SSc-Patienten detektiert werden konnte, nicht aber im Serum von Gesunden oder Patienten mit SLE oder Dermatomyositis [200]. Eine erhöhte IL-8-Expression wurde ebenfalls in Hautbiopsien von SSc-Patienten, und zwar vor allem in der sehr frühen Phase der Erkrankung, gefunden [201]. Auch konnte gezeigt werden, dass IL-8 in der Lage ist, Fibroblasten direkt zu aktivieren und damit fibrosierende Prozesse zu unterstützen [72, 200]. Es kann daher sowohl als inflammatorisches als auch profibrotisches Zytokin bezeichnet werden. Auto-Ak, die eine IL-8-Sekretion induzieren, können daher für die SSc-Pathogenese relevant sein.

CCL18

Neben den erhöhten IL-8-Konzentrationen wurden in den Überständen der mit SSc-IgG stimulierten PBMCs auch erhöhte CCL18-Konzentrationen nachgewiesen, die bis zum Hundertfachen der unstimulierten Kontrollen reichten (Abb. 29).

Das Chemokin CCL18, zuvor als “pulmonary and activation-regulated chemokine” bezeichnet, wird konstitutiv von Monozyten/Makrophagen und dendritischen Zellen produziert und ist an der Induktion einer primären Immunantwort beteiligt. Es wirkt als Chemoattraktant für Lymphozyten und wird durch inflammatorische Stimuli in hohem Maße in alternativ aktivierten Makrophagen (M2-Makrophagen) induziert, die an der Heilungsphase nach akuten Entzündungsreaktionen sowie am Gewebeumbau und an fibrosierenden Prozessen beteiligt sind [197, 202].

Obwohl die physiologische Rolle von CCL18 bislang noch nicht hinreichend aufgeklärt werden konnte, haben Untersuchungen der letzten Jahre gezeigt, dass es bei pathophysiologischen Prozessen, die zu einer Fibrose, insbesondere zu einer Lungenfibrose, führen, maßgeblich involviert zu sein scheint. So konnte im Serum von SSc-Patienten sowie von Patienten mit einer idiopathischen Lungenfibrose eine im Vergleich zu Gesunden und SLE-Patienten signifikant höhere Konzentration von CCL18 detektiert werden [197, 202-205]. Differenzierte Analysen der CCL18-Serumkonzentrationen zeigten, dass sie in Patienten mit dcSSc signifikant höher waren als in Patienten mit lcSSc. Darüber hinaus wiesen sie eine signifikante inverse Korrelation mit den Lungenfunktionsparametern FVC und DLCO auf, also hohe CCL18-Konzentrationen gingen mit einer beeinträchtigten Lungenfunktion einher [197, 203]. Auch in der BAL-Flüssigkeit von SSc-Patienten mit Lungenmanifestationen sowie von Patienten mit einer idiopathischen 93

Diskussion Lungenfibrose war die Konzentration von CCL18 signifikant höher als in der von Gesunden. Die Makrophagen aus der BAL-Flüssigkeit dieser Patienten zeigten außerdem eine signifikant höhere CCL18-Protein- und mRNA-Expression. Darüber hinaus korrelierte die Änderung der CCL18-Serumkonzentration in SSc-Patienten signifikant mit der Änderung der Lungenfunktions- parameter, wobei eine sinkende CCL18-Konzentration eine verbesserte Lungenfunktion anzeigte, eine ansteigende CCL18-Konzentration eine Verschlechterung [68, 197]. In einer Verlaufsstudie über zwei Jahre zeigte sich, dass SSc-Patienten mit hohen CCL18-Serum- konzentrationen ein höchst signifikant größeres Risiko aufwiesen, eine Verschlechterung ihrer Lungenfunktion zu erleiden oder daran zu versterben [205]. Die CCL18-Serumkonzentration ist daher ein geeigneter Parameter, um eine Lungenmanifestation anzuzeigen bzw. zu prognostizieren.

Die Signalwege, die zu diesen Assoziationen führen, sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Es ist jedoch gezeigt worden, dass CCL18 über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Sp1 die Kollagenproduktion in humanen Fibroblasten erhöht, und daher als prototypisches fibrotisches Zytokin zu bezeichnen ist [68, 206]. Erst vor wenigen Jahren konnte CCL18 durch Islam et al. als Agonist für den CC-Motiv-Chemokin-Rezeptor (CCR) 8 identifiziert werden: CCL18 bewirkte ähnlich wie der bereits zuvor bekannte CCR8-Ligand CCL1 die Chemotaxis von in CCR8- transfizierten Zellen und löste einen Kalziumflux in diesen Zellen aus [207]. CCR8 wird von T- Zellen, und hier hauptsächlich von Th2-Zellen, sowie von Monozyten/Makrophagen exprimiert [208]. Interessant hierbei ist, dass die von Th2-Zellen sezernierten Zytokine IL-4 und IL-13 die Differenzierung von M2-Makrophagen bewirken, und die Sezernierung von CCL18 durch M2- Makrophagen ebenfalls durch diese beiden Zytokine induziert wird [207], sodass es hier unter chronisch-entzündlichen Bedingungen zu einem positiven Feedback-Mechanismus kommen kann, der die profibrotischen Prozesse fortwährend unterhält.

Ob auch Fibroblasten CCR8 exprimieren, ist bislang nicht beschrieben worden. Es ist jedoch möglich, dass CCL18 in Fibroblasten über einen anderen Rezeptor eine Signaltransduktion auslösen kann. Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeiten können viele Chemokine an zwei oder mehr Rezeptoren mit unterschiedlicher Affinität binden [208, 209]. Daher ist es möglich, dass CCL18 auch für einen anderen Rezeptor als Agonist fungiert, über den es die Kollagenproduktion in Fibroblasten hochreguliert.

Diskussion 4.4.2 Screening zu SSc-IgG-induzierten IL-8- und CCL18-Konzentrationen, deren Hemmbarkeit und klinische Assoziationen

In der vorliegenden Arbeit konnten IL-8 und CCL18 als geeignete Parameter zur Überprüfung einer pathophysiologischen Wirkung von SSc-IgG identifiziert werden. Daher wurden in einem Screening-Experiment gleichzeitig 27 SSc-IgG hinsichtlich ihrer Fähigkeit, diese Zytokine in PBMCs zu induzieren, überprüft. Für jedes IgG wurden dabei PBMC-Ansätze mit und ohne AT1R- bzw. ETAR-Antagonist kultiviert. Die Resultate der ELISA-Analysen zeigten, dass die durch SSc-IgG induzierte IL-8- und CCL18-Sekretion mit beiden Antagonisten signifikant gehemmt werden konnte (Abb. 35). Folglich wurde die Sekretion beider Zytokine hauptsächlich über den AT1R und den ETAR vermittelt, also vermutlich durch AT1R- und ETAR-Auto-Ak ausgelöst.

Anders als SSc-IgG waren die natürlichen Liganden Ang II und ET-1 in diesem experimentellen System nicht in der Lage, eine ähnlich hohe IL-8- oder CCL18-Sekretion zu induzieren (Abb. 30 und 31). Ursächlich für diesen Unterschied könnte die bivalente molekulare Struktur der AT1R- und ETAR-Auto-Ak und die möglicherweise daraus resultierende lang andauernde Aktivierung der Rezeptoren sein (siehe 4.1.1), die dann zu einer desensitisierungs-resistenten Sezernierung der Zytokine führte, und damit zu Zytokinkonzentrationen, die weit über denen lagen, die durch die natürlichen Liganden ausgelöst worden waren.

Die Signalwege, die über eine Aktivierung des AT1R und des ETAR durch Auto-Ak zur Sezernierung von IL-8 und CCL18 durch monozytäre Zellen führen, sind bislang nicht untersucht worden. Beschrieben ist dagegen eine Vielzahl von Signalwegen, deren Transduktion durch Ang II über den AT1R und durch ET-1 über den ETAR vermittelt wird (siehe 1.3.3 und 1.3.4). So konnte u. a. gezeigt werden, dass Ang II über den AT1R die Genexpression von IL-8 in Monozyten, VSMCs und Adipozyten aktiviert [178, 210, 211]. Auch ET-1 induziert die Sekretion von IL-8 durch Monozyten und Endothelzellen [182, 212]. Für Endothelzellen wurde beschrieben, dass die durch ET-1 induzierte IL-8-Expression über den ETAR vermittelt wird [213]. Sowohl Ang II als auch ET-1 sind in der Lage, ein Repertoire an gemeinsamen Transkriptions- faktoren zu aktivieren. Dazu gehören neben NF-B auch AP-1 und STAT [114, 115, 172, 211, 214]. Die Aktivierung von NF-B und AP-1 ist bereits für ETAR-Auto-AK aus Patienten mit idiopathischer PAH beschrieben worden (siehe 1.3.3). Daher ist es denkbar, dass aufgrund der funktionellen Selektivität von GPCR-Liganden und der strukturellen Plastizität des AT1R und des ETAR durch die Auto-Ak andere Signalwege transduziert werden als die durch die natürlichen Liganden, dabei dennoch der gleiche bzw. die gleichen Transkriptionsfaktoren aktiviert werden.

Diskussion Beide Zytokine ließen sich ähnlich stark durch den AT1R-Antagonisten Valsartan hemmen, wie auch durch den ETAR-Antagonisten Sitaxsentan (Abb. 25 und [146]). Dies spricht für einen Kreuzungspunkt der Signalkaskaden, die zur Expression von IL-8 und CCL18 führen. Dieser Kreuzungspunkt könnte beispielsweise bei der Aktivierung eines Transkriptionsfaktors oder einer vorgeschalteten Kinase liegen. Welche Signalkaskaden tatsächlich durch AT1R- und ETAR- Auto-AK in Monozyten bzw. PBMCs ausgelöst werden und ob diese direkt oder indirekt zur Expression von IL-8 und CCL18 führen, muss in weiteren Untersuchungen analysiert werden. Dazu könnte man beispielsweise die Phosphorylierungsaktivitäten der verschiedenen Kinasen mittels sogenannter Kinase-Arrays analysieren und die möglichen Signalwege und ihre Kreuzungspunkte mit Hilfe einer entsprechenden Datenbank identifizieren (z. B. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway mapping).

SSc-IgG-induzierte IL-8-Konzentrationen und deren Assoziationen mit klinischen Parametern

Um zu überprüfen, ob die durch SSc-IgG in vitro erzeugten Effekte mit bestimmten Krankheits- manifestationen der jeweiligen IgG-Spender assoziiert sein könnten, wurden die Zytokin- konzentrationen mit den klinischen Daten in einen statistischen Zusammenhang gebracht. Dabei zeigte sich, dass IgG von Patienten mit einer kürzeren Krankheitsdauer von bis zu 6 Jahren eine signifikant höhere IL-8-Konzentration hervorrief als IgG von Patienten mit einer längeren Krankheitsdauer (Abb. 36). Demnach scheint nicht nur bei der ATR1-Expression von Monozyten sondern auch bei der IL-8-Induktion durch Auto-Ak ein Zusammenhang mit der Krankheitsdauer zu bestehen. Daneben ergab sich eine signifikante inverse Korrelation der IL-8- Konzentrationen im Überstand mit der Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndroms und einer PAH (Abb. 36). IgG, das zu Beginn der SSc-Erkrankung, eines Raynaud-Syndroms oder einer PAH gewonnen wurde, hat offenbar ein besonders großes Potential, das inflammatorische Zytokin IL-8 in PBMCs zu induzieren.

Bemerkenswert ist außerdem die signifikante inverse Korrelation der IL-8-Konzentration mit der DLCO (Abb. 36). Bei den meisten Patienten verschlechtert sich die DLCO im Laufe der Erkrankung, weshalb man hier eine positive Korrelation mit der ebenfalls zeitabhängig abnehmenden IL-8-Konzentration erwarten würde. Die Assoziation von SSc-IgG-induzierter IL-8- Konzentration und DLCO stellt sich hier aber unabhängig von der Krankheitsdauer als negative Korrelation dar und scheint damit auf einen direkten Zusammenhang von DLCO und IL-8- Konzentration hinzudeuten: je höher die IL-8-Konzentration, desto geringer die DLCO, also desto beeinträchtigter die Lungenfunktion. Das erscheint plausibel, da eine verminderte DLCO

Diskussion nicht nur durch eine Lungenfibrose verursacht wird, sondern auch schon durch die entzündlichen Veränderungen, die zu einer ILD führen (siehe 1.2.4).

Ein ähnlicher Zusammenhang wurde bereits in einer früheren Studie unserer Arbeitsgruppe gefunden, in der die Konzentration von Zytokinen in der BAL-Flüssigkeit von SSc-Patienten analysiert worden ist. Auch dabei zeigte sich eine signifikante inverse Korrelation der IL-8- Konzentration mit der DLCO [67]. Außerdem waren hierbei die IL-8-Konzentrationen in der BAL- Flüssigkeit von Patienten mit einer SSc-assoziierten Alveolitis oder ILD im Vergleich zu Patienten mit anderen Formen der Alveolitis oder ILD signifikant erhöht. Dabei wiesen SSc-Patienten mit einer neutrophilen Alveolitis die höchsten IL-8-Konzentrationen in der BAL-Flüssigkeit auf. Es scheint also SSc-spezifisch zu sein, dass IL-8 mit einer Alveolitis und ILD assoziiert ist. Dass hierfür auch in vivo Auto-Ak aus SSc-IgG verantwortlich sein können, konnte unsere Arbeitsgruppe mit weiteren Studien zeigen [185, 215]: Der einmalige Transfer von SSc-IgG in gesunde C57BL-6-Mäuse führte bereits nach sieben Tagen zu einer Neutrophilie in der Lunge und zu einer erhöhten Serumkonzentration des IL-8-Analogs Keratinocyte-derived Chemokine (KC). Das SSc-IgG konnte in den Lungen der Mäuse detektiert werden. Der wiederholte Transfer von SSc-IgG verursachte deutliche Veränderungen in der Lungenstruktur in Form einer erhöhten Zelldichte im Interstitium. Keiner dieser Effekte war in den Kontrollmäusen zu sehen, in die IgG von gesunden Spendern transferiert worden war [185, 215].

Der Zusammenhang von IL-8 und Lungenneutrophilie mit einer fibrosierenden Alveolitis und daraus resultierender Lungenfibrose ist für die SSc bereits beschrieben worden [200]. Es erscheint daher plausibel, dass AT1R- und ETAR-Auto-Ak, die eine IL-8-Sekretion induzieren, sowohl die Infiltration von Immunzellen in das perivaskuläre Gewebe der Haut, als auch in das der Lunge verursachen und damit eine Alveolitis auslösen, die nachfolgend zu strukturellen Veränderungen der Lunge bis hin zu einer ILD und Lungenfibrose führen kann.

SSc-IgG-induzierte CCL18-Konzentrationen und deren Assoziationen mit klinischen Parametern

Für die durch SSc-IgG induzierten CCL18-Konzentrationen zeigte sich eine tendenziell signifikante inverse Korrelation mit der Zeit seit dem Beginn einer Lungenfibrose, also eine hohe CCL18-Konzentration wurde durch IgG von Patienten induziert, die sich im frühen Stadium einer Lungenfibrose befanden (Abb. 37). Dies ist bemerkenswert, da CCL18, wie oben beschrieben, maßgeblich an der Entwicklung von Lungenmanifestationen, die im Rahmen einer SSc auftreten können, beteiligt zu sein scheint. Dass hierbei möglicherweise die durch AT1R- und ETAR-Auto-Ak ausgelöste Sezernierung von CCL18 eine Rolle spielt, zeigen auch die 97

Diskussion signifikant höheren CCL18-Konzentrationen, die durch die IgG von SSc-Patienten mit vaskulären Komplikationen, wie PAH, Fingerulzerationen oder renale Krise, induziert worden sind (Abb. 37). All diese Manifestationen resultieren aus fibrotischen Veränderungen der Gefäße, bei deren Entwicklung CCL18 beteiligt ist [203, 216].

Keine Korrelation fand sich zwischen den durch SSc-IgG induzierten Konzentrationen von CCL18 und IL-8 (Abb. 37). Daher lässt sich nicht ableiten, dass hier das eine Zytokin die Sekretion des anderen ausgelöst haben könnte. Die Darstellung der Einzelwerte und das negative Vorzeichen des Korrelationskoeffizienten zeigten vielmehr, dass die einzelnen SSc-IgG entweder IL-8 oder CCL18 in hohem Maße induziert haben, nicht jedoch beides. Dies erscheint auch schlüssig und stimmt mit der Literatur überein, wonach IL-8 als entzündungsförderndes Zytokin von klassisch aktivierten Monozyten und M1-Makrophagen sezerniert wird [217-219], CCL18 dagegen von M2-Makrophagen [219, 220].

Da alle 27 SSc-IgG gleichzeitig zur Stimulation von Zellen desselben Spenders eingesetzt wurden, sind die Unterschiede in der Zytokinsekretion hauptsächlich auf die einzelnen SSc-IgG zurückzuführen, die sich offensichtlich in ihrem Aktivierungspotenzial erheblich unterscheiden. Humane Monozyten und Makrophagen weisen eine hohe Plastizität auf und können in Abhängigkeit von den entsprechenden Stimuli und vom umgebenden Milieu in zwei große Hauptgruppen differenzieren: M1-Makrophagen, die eine Inflammation auslösen und unterhalten, und M2-Makrophagen, die der Inflammation entgegenwirken und die Proliferation und Heilung des zuvor entzündeten Gewebes einleiten und modulieren [218, 219]. Es ist beschrieben, dass die Polarisation von M1-Makrophagen durch die Zytokine von Th1-Zellen ausgelöst wird und umgekehrt, gleiches gilt für M2-Makrophagen und Th2-Zellen [217, 221]. Da, wie hier gezeigt, sowohl Monozyten als auch T-Zellen den AT1R und den ETAR exprimieren, kann nicht ohne weiteres rückgeschlossen werden, welche der beiden Zelltypen hier durch Stimulation mit den im SSc-IgG enthaltenen AT1R- und ETAR-Auto-Ak als erstes die eine oder andere Differenzierungsrichtung eingeschlagen hat, die schließlich in der Sezernierung von IL-8 oder CCL18 resultierte. Im Hinblick auf die vergleichsweise kurze Verweildauer der Zellen in Kultur (über Nacht in Ruhe plus 8h IgG-Stimulation ergeben ca. 24h) erscheint eine direkte Polarisationswirkung der Auto-Ak auf die Monozyten/Makrophagen wahrscheinlicher.

Ob die AT1R- und ETAR-Auto-Ak direkt oder indirekt die Differenzierung von Monozyten und T- Zellen modulieren können, muss in weiteren Experimenten analysiert werden. Dies scheint besonders vor dem Hintergrund, dass in der Pathogenese der SSc chronisch-entzündliche

Diskussion Prozesse eine andauernde Gegenregulation durch anti-entzündliche Mechanismen hervorrufen, die schließlich zu einem hoch-pathologischen fibrosierenden Geschehen führen, von hoher Relevanz zu sein. In einem weiteren Stimulationsexperiment könnte eine AT1R-/ETAR-Auto-Ak- abhängige Polarisation der Monozyten/Makrophagen zum Beispiel durch die Analyse der M1- Zytokine IP-10, IFN-, IL-8, TNF-, IL-1 und CCL5 sowie der M2-Zytokine IL-13 und CCL17 aufgeklärt werden [218].

Die Korrelationsanalyse der CCL18-Konzentrationen mit der Erkrankungsdauer ergab keinen linearen Zusammenhang. Nach Klassifizierung der Zytokinkonzentrationen in Gruppen von je vier Patienten pro Zeitintervall zeichnete sich jedoch sowohl für CCL18 als auch für IL-8 einen kurvenförmigen Verlauf in Abhängigkeit von der Erkrankungsdauer der IgG-Spender ab (Abb. 38). Dabei zeigte sich, dass die höchsten IL-8-Konzentrationen durch SSc-IgG von Patienten mit einer relativ kurzen Erkrankungsdauer von 2-5 Jahren induziert worden sind, die höchsten CCL18-Konzentrationen durch SSc-IgG von Patienten mit der längsten Erkrankungsdauer (16-38 Jahre). Angesichts der Tatsache, dass beide Zytokine in vitro nur durch die verschiedenen SSc- IgG in einer PBMC-Kultur induziert worden sind, erstaunt es umso mehr, dass die zeit- abhängigen Konzentrationsverläufe den biphasischen Verlauf der SSc mit einer frühen inflammatorischen Phase und einer späten fibrotischen Phase widerspiegeln, der auch beschrieben ist [201]. Im Hinblick auf eine möglicherweise Auto-Ak-abhängige AT1R/ETAR- vermittelte Differenzierung von Monozyten/Makrophagen in den M1- oder M2-Phänotyp könnte sich hiermit andeuten, dass AT1R-und ETAR-Auto-Ak bei der Modulation des Krankheitsverlaufes eine Rolle spielen. Doch welche Mechanismen könnten die Reaktivität der Auto-Ak im Laufe der Erkrankung verändern?

Für die rheumatoide Arthritis konnte gezeigt werden, dass die Avidität von Auto-Ak, die gegen citrullinierte Proteine gerichtet sind, bis zum Ausbruch der Erkrankung ansteigt, dann aber gleichbleibt [222]. Die Gründe für diese Aviditätsänderung sind unerforscht und mögliche Erklärungen hoch spekulativ. So gibt es beispielsweise die These, dass die Avidität zunimmt, wenn B-Zellen um ein limitiertes Angebot des Antigens konkurrieren [222].

Neuere Untersuchungen weisen darauf hin, dass eine Änderung des Glykosilierungsmusters von Immunglobulinen mit einer Änderung der Funktionalität einhergeht. Die in den letzten Jahren zunehmenden massenspektrometrischen Analysen von biologischen Proben haben gezeigt, dass sich das Glykosilierungsmuster von Immunglobulinen in Abhängigkeit von Alter und Geschlecht sowie bei Krankheit ändern kann [223, 224]. Diese Änderung mag durch

Diskussion epigenetische Einflüsse auf die Expression der Glycosyltransferasen verursacht sein, die durch verschiedenene Faktoren einschließlich Alter, Schwangerschaft, Hormone, Zytokine und Lebensmittelmetabolite beeinflusst wird [224].

Diesen Einflüssen könnten auch AT1R- und ETAR-Auto-Ak von SSc-Patienten unterliegen. Die Funktionen der Oligosacharide sind noch nicht hinreichend aufgeklärt, aber erste Studien zeigten auf, dass die Fab-ständigen Zucker nahe den variablen Regionen die Antigenbindung positiv oder negativ beeinflussen können [225]. Vor dem Hintergrund der strukturellen Plastizität von GPCRs und der ligandenabhängigen funktionellen Selektivität von GPCR- vermittelten Signaltransduktionen (siehe 1.3.1) wäre ein solcher Zusammenhang denkbar. Ob und wie bestimmte Glykosylierungen die Pathogenität von AT1R-und ETAR-Auto-Ak im Laufe der Erkrankung beeinflussen, müssen zukünftige Untersuchungen zeigen. Hierbei erscheint vor allem die Analyse der Glykosylierungsmuster von AT1R- und ETAR-Auto-Ak über die Zeit und der Abgleich mit dem klinischen Verlauf sinnvoll, um mögliche Zusammenhänge tatsächlich aufdecken zu können.

Die Konzentrationen beider Zytokine korrelierten nicht mit den Konzentrationen der AT1R- und ETAR-Auto-Ak der verwendeten IgG. Daher ergab sich die Frage, ob die IL-8- oder CCL18- Konzentrationen mit der Expression und damit mit der Aktivierbarkeit der Zelle über den AT1R und den ETAR zusammenhängen. Dieser Fragestellung ist mit einer anderen Studie unserer Arbeitsgruppe nachgegangen worden [168]. Dazu wurden die ATR- und ETR-Expression von Monozyten vor der Stimulation mit IgG analysiert. Nach der Stimulation wurden IL-8 und CCL18 im Überstand mittels ELISA bestimmt. Es ergab sich hierbei jedoch keine Korrelation zwischen der Expression eines der vier Rezeptoren und den gemessenen Zytokinkonzentrationen, aber zumindest für CCL18 konnte eine positive Korrelation mit den AT1R/AT2R-Ratios der Raten rezeptorpositiver Monozyten sowie eine negative Korrelation mit den ETAR/ETBR-Ratios der Raten rezeptorpositiver Monozyten dargestellt werden, die auf eine CCL18-abhängige Modulation der Rezeptorbalance hinweist [168].

4.4.3 Verifizierung der IL-8- und CCL18-Hemmung unter Hinzunahme eines AT2R- und ETBR- Antagonisten

Die Inhibierung der IL-8- und CCL18-Sekretion durch den selektiven AT1R-Antagonisten Valsartan und den selektiven ETAR-Antagonisten Sitaxsentan konnte in drei weiteren Experimenten reproduziert werden (Abb. 40). Dabei wurden auch der AT2R und der ETBR mit den selektiven Antagonisten PD123319 bzw. BQ-788 blockiert. Die Sekretion von IL-8 konnte

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Diskussion nur mit Valsartan und Sitaxsentan inhibiert werden. Daraus lässt sich ableiten, dass in PBMC- Kultur die SSc-IgG-induzierte Sekretion von IL-8 über den AT1R und ETAR vermittelt wird, nicht aber über den AT2R und den ETBR. Die Kombination der Antagonisten zeigte hierbei keinen additiven Effekt.

Anders die CCL18-Sekretion. Sie konnte nicht nur durch Valsartan und Sitaxsentan inhibiert werden, sondern auch geringfügig durch den AT2R-Antagonisten PD123319 und deutlich durch den ETBR-Antagonisten BQ-788 (Abb. 40). Die Kombination der Antagonisten Valsartan, Sitaxsentan und PD123319 bzw. BQ-788 zeigte erkennbar einen additiven Effekt. Scheinbar wird die Sekretion von CCL18 hier nicht nur über den AT1R und ETAR vermittelt, sondern auch über den ETBR. Dieser Umstand unterstützt die o.g. Vermutung, dass die Auto-Ak-induzierte Produktion/Sekretion beider Zytokine zwar über den AT1R und ETAR vermittelt wird, IL-8 und CCL18 dabei jedoch das Endprodukt unterschiedlicher Signalwege sind und/oder in unterschiedlich differenzierten Monozyten/Makrophagen exprimiert werden. Besonders der ETBR-Antagonist BQ-788 zeigt eine deutlich inhibierende Wirkung und kann neben dem ETAR- Antagonisten die CCL18-Sekretion am besten unterdrücken. Daher ist es naheliegend, dass CCL18 vorrangig ETR-vermittelt induziert wird. Dabei könnten ETAR-Auto-Ak auch an den ETBR binden und diesen aktivieren, da beide Rezeptoren eine große Ähnlichkeit ihrer Aminosäure- sequenzen aufweisen [226], die sich teilweise auch über die ECLs, insbesondere den ECL2, erstreckt. Denkbar wäre außerdem, dass die ETAR-Auto-Ak aufgrund ihrer Struktur ETAR-ETBR- Heterodimere bilden und somit über beide Rezeptoren eine Aktivierung ermöglichen. Auf einen ähnlichen Mechanismus weisen Bindungsstudien mit ET-1 hin [227].

Eine andere Erklärung für die Hemmbarkeit der CCL18-Sekretion über beide ETR wäre die indirekte Induktion von CCL18. Vorstellbar ist beispielsweise, dass ETAR-Auto-Ak über den ETAR die Sekretion von ET-1 induzieren, und ET-1 dann aber ETAR- und ETBR-vermittelt die Sekretion von CCL18 auslöst (siehe 1.3.4). Ein ähnlicher über ET-1 führender Mechanismus ist für die Aktivierung alveolarer Makrophagen beschrieben worden, bei dem die LPS-induzierte Sekretion von MCP-1/CCL2 und IL-6 durch die Blockierung beider ETR gehemmt werden konnte [126].

4.5 Auto-Ak-Konzentrationen der AT1R- und ETAR-IgG-Subklassen und ihre klinischen Assoziationen

IgG ist das im humanen Plasma am häufigsten vertretene Immunglobulin, sein Anteil am Gesamtplasmaprotein beträgt 10-20%. Das humane IgG lässt sich in die Subklassen IgG1-4 unterteilen. Obwohl sich die Subklassen in ihrer Aminosäurensequenz zu über 90 % gleichen,

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Diskussion unterscheiden sie sich in Struktur und Funktion hinsichtlich ihrer Antigenbindung, Immunkomplexbildung sowie Komplement- und Effektorzellaktivierung. Der IgG- Klassenwechsel (class switch) vollzieht sich in Abhängigkeit vom Antigen. So werden lösliche Proteinantigene vor allem von IgG1 erkannt, wogegen IgG2 auf die Bindung an bakterielle Kapselpolysaccharide beschränkt ist. Virale Infekte führen meist zur Synthese von Ak der IgG1- und IgG3-Subklasse, wogegen IgG4 oft nach wiederholter und/oder lang anhaltender Exposition von Antigenen auftritt, auch im Rahmen von nicht-entzündlichen Geschehen [224].

Mit erhöhten IgG4-Serumkonzentrationen geht eine Gruppe von pathologischen Manifestationen einher, die unter dem Begriff IgG4-related disease(s) zusammengefasst werden. Das Spektrum dieser Krankheitsbilder reicht von autoimmuner Pankreatitis, Entzündungen des Interstitiums der Lunge und Niere bis hin zur Retroperitonealfibrose und entzündlichen Pseudotumoren. Allen gemeinsam ist ein inflammatorisches und fibrosierendes Geschehen, dass einzelne Organe betrifft oder systemisch auftritt und durch Infiltrate von Immunzellen, entzündlichen und fibrotischen Veränderungen der Gefäße und des umliegenden Gewebes sowie Hautläsionen gekennzeichnet ist [144, 224]. Es erscheint daher naheliegend, dass auch bei der Pathogenese der SSc erhöhte IgG4-Serumkonzentrationen eine Rolle spielen könnten. Deshalb untersuchten Reddi et al. Serum und Hautbiopsien von 16 SSc-Patienten. In drei Patienten fanden sie eine erhöhte IgG4-Serumkonzentration und einen erhöhten Anteil von IgG4-positiven Plasmazellen in der Haut [144].

Da die Literatur sowie das klinische Bild auf eine übergeordnete Rolle von IgG4 in der SSc- Pathogenese hindeuten, sind hier die AT1R- und ETAR-Auto-Ak auch hinsichtlich ihrer Subklassenzugehörigkeit untersucht worden. Die Resultate zeigten, dass die AT1R- und ETAR- Auto-Ak sowohl von SSc-Patienten als auch von Gesunden hauptsächlich der Subklasse IgG3 angehören. In beiden Kohorten waren die Serumkonzentrationen von AT1R- und ETAR-Auto-Ak der Subklasse IgG3 gegenüber den anderen IgG-Klassen höchst signifikant erhöht (Abb. 41).

Der Vergleich zwischen den Subklassen von Gesunden und SSc-Patienten zeigte, dass die Serumkonzentrationen von AT1R- und ETAR-Auto-Ak sowohl der IgG1- als auch der IgG3-Klasse in Patienten höchst signifikant erhöht sind (Abb. 42). Virale Infekte führen oft zur Synthese von Ak der IgG1- und IgG3-Subklasse [224]. So könnten die erhöhten Konzentrationen der AT1R- und ETAR-Auto-Ak dieser IgG-Klassen darauf hinweisen, dass molekulare Mimikry aufgrund infektiöser Agenzien zur Entstehung dieser Auto-Ak beigetragen hat, da dieser Mechanismus als

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Diskussion eine mögliche Ursache von Autoimmunreaktionen in prädisponierten Individuen gilt [8, 224, 228].

Bei den hier untersuchten Serumproben bildeten die Auto-Ak der IgG-Subklasse 3 die Mehrheit der AT1R- und ETAR-Auto-Ak (Abb. 43), ihre Konzentration war, wie auch die des Gesamt-IgGs, signifikant erhöht in Patienten mit dcSSc im Vergleich zu Patienten mit lcSSc (Abb. 44). Die AT1R- und ETAR-Auto-Ak der IgG-Subklasse 3 sowie die ETAR-Auto-Ak der IgG-Subklasse 1 scheinen im Verlauf der Erkrankung abzunehmen (Abb. 45). Darüber hinaus gibt es einen statistischen Zusammenhang der IgG3-AT1R/ETAR-Auto-Ak mit den Lungenfunktions- parametern FVC und DLCO, wobei eine beeinträchtigte Lungenfunktion mit hohen IgG3-Auto- Ak-Konzentrationen assoziiert ist (Abb. 46 und 47). Dieser Zusammenhang findet sich auch bei den Gesamt-IgG-Konzentrationen der AT1R- und ETAR-Auto-Ak, hier jedoch weniger deutlich.

Wenngleich eine Ähnlichkeit zwischen bestimmten Manifestationen der SSc und den IgG4- related diseases besteht, so deuten die hier erhobenen Daten darauf hin, dass bei den AT1R- und ETAR-Auto-Ak die IgG-Subklasse 3 von besonderer Relevanz ist. Dies erscheint auch vor dem Hintergrund der funktionellen Eigenschaften von IgG3 schlüssig zu sein: IgG3-Ak sind bei der Aktivierung von Effektorfunktionen besonders wirkungsvoll und stellen per se potente inflammatorische Ak dar: IgG3-Moleküle haben eine besonders lange Hinge-Region und können vermutlich aufgrund dieses Strukturmerkmales wesentlich effizienter als die IgG der anderen Subklassen durch Bindung an das Komplementprotein C1q eine Komplementaktivierung auslösen [224]. Die Komplementaktivierung führt zu einer akuten Entzündungsantwort mit erhöhter Gefäßpermeabilität und Anlockung von Immunzellen. Darüber hinaus sind IgG3- Moleküle auch besser als andere IgG in der Lage, an FcRs zu binden und somit FcR- exprimierende Immunzellen zu aktivieren oder zu inhibieren. Auch hierbei scheinen wieder Glykosylierungen, und zwar die des Fc-Teiles, eine Rolle zu spielen, die aufgrund der Struktur von IgG3 dessen Bindung an FcRs besonders effektiv unterstützen [224]. Dabei interagiert IgG3 hauptsächlich mit dem FcRI (CD64), der konstitutiv auf Monozyten und Makrophagen exprimiert wird. Die Aktivierung über FcRI durch IgG3 löst besonders bei geringer IgG- Konzentration die Freisetzung von Zytokinen aus [224, 225].

Da in den in vitro Studien der vorliegenden Arbeit die spezifischen anti-AT1R- und -ETAR- vermittelten Effekte untersucht worden sind, erfolgte dabei vor jeder Stimulation von PBMCs mit IgG eine Blockierung der FcRs, um eine unspezifische FcR-vermittelte Aktivierung zu verhindern. Davon unberührt bleiben jedoch die Zusammenhänge, die hinsichtlich der Serum-

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Diskussion Konzentrationen von AT1R- und ETAR-Auto-Ak der IgG-Klasse 3 mit der Erkrankungsdauer, der beeinträchtigten Lungenfunktion und der SSc-Form aufgezeigt werden konnten. Die Serum- Konzentrationen von AT1R- und ETAR-Auto-Ak der IgG-Klasse 3 scheinen hier im Laufe der Erkrankung abzunehmen, gleichzeitig gehen hohe Konzentrationen dieser IgG3-Auto-Ak mit einer beeinträchtigten Lungenfunktion einher. Es ist daher denkbar, dass vor allem die Auto-Ak der IgG-Subklasse 3 das zu Beginn der Erkrankung überwiegend entzündliche Geschehen, das im weiteren Verlauf einem fibrotischen Geschehen weicht, hervorrufen oder verstärken. Möglicherweise kann die scheinbare Abnahme der IgG3-Serumkonzentration der AT1R-und ETAR-Auto-Ak auch in einer erhöhten Abwanderung von IgG3 ins Gewebe begründet sein.

Es zeigte sich jedoch auch bei den AT1R-Auto-Ak der IgG-Klasse 4 eine Gruppe von vier Patientinnen, die höchste Ak-Konzentrationen aufwiesen, obwohl die Serumkonzentrationen der anderen Patienten nicht einmal 20 U betrug (Abb. 41 und 42). Alle vier Patientinnen befanden sich in einer früheren Phase der Erkrankung, und drei von ihnen litten an der rascher voranschreitenden dcSSc. Möglicherweise spielt bei diesen Patientinnen auch die Wirkung von IgG4-Auto-Ak eine Rolle. Aufgrund der geringen Fallzahl kann zu diesen hoch-positiven IgG4- Auto-Ak keine statistische Auswertung erfolgen. Die Analyse der Serumkonzentration der IgG- Subklassen von funktionellen AT1R- und ETAR-Auto-Ak könnte aber, in der Routinediagnostik praktiziert, dabei helfen, bestimmte Krankheitsverläufe noch besser zu prognostizieren und ihnen frühzeitig mit der entsprechenden Behandlung entgegenzuwirken.

4.6 Limitationen

Die Aussagekraft der Resultate der Rezeptorexpressionsanalysen von PBMCs und ihrer Assoziationen mit den klinischen Parametern müssen vor allem im Hinblick auf die geringe Stichprobenzahl mit Vorsicht bewertet werden. Die SSc gehört zu den seltenen Erkrankungen und ist in ihrem klinischen Erscheinungsbild von großer Heterogenität gekennzeichnet, so dass die einzelnen Patienten oft unterschiedliche Krankheitsverläufe zeigen. Deshalb werden sie im Rahmen einer klinischen Beurteilung hinsichtlich der Form ihrer Hautbeteiligung sowie dem Auftreten bestimmter Auto-Ak und Krankheitsmanifestationen in Gruppen unterteilt (siehe 1.2.3). Für eine statistisch sinnvolle Auswertung kann jedoch nur bei einer entsprechend großen Stichprobe die Einteilung der SSc-Patienten gemäß ihrem klinischen Subtyp erfolgen. Dies war in der vorliegenden Studie nicht immer gegeben, so dass die Expressionsdaten der ATR und ETR in PBMCs von SSc-Patienten durch nachfolgende Untersuchungen verifiziert und entsprechend dem klinischen Bild differenziert bewertet werden sollten.

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Diskussion Zum Nachweis von Effekten, die von Auto-Ak über den AT1R und ETAR vermittelt werden, ist IgG von verschiedenen SSc-Patienten verwendet worden. Durch die Blockierung des AT1R bzw. ETAR mit selektiven Antagonisten konnte gezeigt werden, dass die funktionellen Effekte größtenteils über diese beiden Rezeptoren vermittelt wurden. Eine Verifizierung mit aufgereinigten AT1R- und ETAR-Auto-Ak erfolgte bislang nicht. Diese ist jedoch notwendig, um die spezifische Wirkung der AT1R- und ETAR-Auto-Ak direkt zu demonstrieren. Alternativ könnte auch die Negativfraktion nach Entfernung der AT1R- und ETAR-Auto-Ak als Negativkontrolle verwendet werden. Sowohl für Aufreinigung als auch Entfernung beider Auto- Ak käme eine mit Membranextrakt beschichtete Matrix in Frage, wie sie auch von der CellTrend GmbH für die Entwicklung der kommerziellen Assays zur Detektion von AT1R- und ETAR-Auto- Ak verwendet wurde.

4.7 Schlussfolgerung und Ausblick

Die vorliegende Arbeit zeigt eine verringerte Expression der ATR und ETR in PBMCs von Patienten mit SSc auf. Dabei scheint die Dichte des AT1R im Laufe der Erkrankung abzunehmen und bei Patienten mit hoher Krankheitsaktivität besonders hoch zu sein. Eine Aktivierung des AT1R und des ETAR durch AT1R- und ETAR-Auto-Ak könnte einerseits zu einer Herabregulation der Rezeptoren durch Desensitisierungsmechanismen führen, andererseits eine Migration hoch rezeptorpositiver Zellen in das umliegende Gewebe induzieren.

Es konnte hier gezeigt werden, dass SSc-IgG nicht nur die Chemotaxis isolierter T-Zellen auslöst, sondern auch die Sekretion von IL-8 und CCL18 in einer PBMC-Kultur bewirkt. Diese Effekte konnten mit selektiven Rezeptorantagonisten gehemmt werden, scheinen also vorwiegend durch AT1R- und ETAR-Auto-Ak vermittelt worden zu sein. Dabei hat IgG von Patienten in der frühen Erkrankungsphase hohe IL-8-Konzentrationen induziert, und IgG von Patienten in der späten Phase hohe CCL18-Konzentrationen. Die einzelnen SSc-IgG-Proben scheinen also in der Lage zu sein, die phänotypische Ausrichtung der Monozyten/Makrophagen und damit deren Zytokinsekretion in Abhängigkeit von der Erkrankungsdauer zu modulieren.

Besonders in der frühen Phase der SSc infiltrieren Monozyten und T-Zellen die Haut und das perivaskulare Gewebe, und zeigen dort einen aktivierten Phänotyp, der vor allem die Kollagenproduktion durch Fibroblasten induziert. Ein Zusammenhang zwischen einer hohen AT1R-Dichte in Monozyten zu Beginn der Erkrankung und einer durch AT1R- und ETAR-Auto-Ak induzierten Chemotaxis sowie der Sekretion von IL-8 scheint daher plausibel zu sein. Ebenso schlüssig scheint, dass die im weiteren Krankheitsverlauf andauernden fibrosierenden Prozesse 105

Diskussion durch die hier gezeigte AT1R- und ETAR-Auto-Ak-vermittelte CCL18-Sekretion und eine daraus resultierende Fibroblastenaktivierung initiiert und/oder aufrechterhalten werden.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen die Vermutung zu, dass AT1R- und ETAR-Auto-Ak für die Pathogenese der SSc von hoher Relevanz sind. Insbesondere der Nachweis einer Induktion von inflammatorischen und profibrotischen Bedingungen, ausgelöst durch die Freisetzung von IL-8 und CCL18, die Migration von T-Zellen sowie durch eine mögliche Modulation des Monozyten-/Makrophagen-Phänotypus, könnte und sollte die Eliminierung von AT1R- und ETAR-Auto-Ak in den Fokus der SSc-Behandlung rücken.

Konventionelle immunsupressive Behandlungen haben oft keine oder nur kurzzeitige und schwache Wirkung auf die Serumkonzentrationen von AT1R- und ETAR-Auto-Ak, vor allem bei Patienten, bei denen diese hoch sind [20]. Um den pathophysiologischen Effekten von funktionellen AT1R- und ETAR-Auto-Ak entgegenzuwirken, sind daher vor allem zur Behandlung dieser Patienten alternative Therapiekonzepte erforderlich.

Der Einsatz von selektiven AT1R- und/oder ETAR-/ETBR-Antagonisten ist seit vielen Jahren eine wichtige therapeutische Komponente bei der Behandlung von SSc-Patienten. Die Prävention oder Reduktion von AT1R- und ETR-vermittelten pathophysiologischen Effekten durch den Einsatz der Blocker soll dabei vor allem einem überaktivierten Angiotensin- bzw. Endothelin- system entgegenwirken (siehe 1.3.3 und 1.3.4). Daher ist der Einsatz diese Blocker bislang auf bestimmte Manifestationen und Komplikationen beschränkt, wie zum Beispiel Ulzerationen der Finger oder PAH, die vor allem in einem fortgeschrittenen Krankheitsstadium auftreten [20]. Im Hinblick auf die pathophysiologische Wirkung, die funktionelle AT1R- und ETAR-Auto-Ak vor allem in der frühen Phase der SSc zu haben scheinen, sollte ein Einsatz von AT1R- und/oder ETAR-/ETBR-Antagonisten vor allem für die frühe und sehr frühe Phase der Erkrankung dringend in Betracht gezogen werden. Eine sehr frühe Erkennung, Risikostratifizierung und entsprechende Behandlung der SSc ist generell von immenser Bedeutung, um den krankheits- bedingten Einschränkungen und lebensbedrohlichen Manifestationen, die bei vollem Ausbruch oder in der späteren Phase der Erkrankung auftreten, vor ihrem Entstehen entgegenzuwirken oder ihr Entstehen hinauszuzögern. Rheumatologen der EUSTAR-Gruppe haben sich daher zusammengeschlossen, um auf die Bedeutung der Diagnose und Behandlung der sehr frühen SSc (VEDOSS, very early diagnosis of systemic sclerosis) aufmerksam zu machen und diagnostische Konzepte zu entwickeln und bereitzustellen [49].

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Diskussion Das zunehmende Wissen über funktionelle Auto-Ak und ihre mangelnde Ansprechbarkeit gegenüber herkömmlichen Therapien führte zur Entwicklung von Behandlungsmethoden, mit denen Auto-Ak eleminiert werden können. Erste Daten zeigen, dass die Depletion von B-Zellen mit Rituximab, einem chimären anti-CD20-Ak, die Progression von Hautverdickung und Lungenfibrose aufzuhalten vermag, besonders in der frühen dcSSc [229]. Noch spezifischer ist die direkte Entfernung von Immunglobulinen mittels Immunadsorption. Die Immunadsorption wird schon erfolgreich bei anderen Autoimmunerkrankungen eingesetzt, zum Beispiel bei einer bestimmten Form der dilatativen Kardiomyopathie und der pulmonalen Hypertonie. Bei der SSc hat sich der klinische Einsatz dieser Therapieform bislang jedoch noch nicht durchgesetzt [75, 230-232].

Zur Entfernung spezifischer Auto-Ak stellt die Applikation von sogenannten Aptameren eine neue Behandlungsmöglichkeit dar. Aptamere sind synthetische einzel- oder doppelsträngige Oligonukleotide oder Peptide, die mit hoher Spezifität an ihr entsprechendes Zielmolekül binden. So konnte bereits ein Aptamer identifiziert und in vitro sowie in Ratten erprobt werden, das spezifisch anti-beta1-Adrenorezeptor-Auto-Ak bindet und erfolgreich neutralisiert [75, 233- 235]. Erst kürzlich wurde ein weiteres Aptamer, das Aptamer BC 007, und sein Einfluss auf den chronotropen Effekt von Auto-Ak in einem Bioassay mit neonatalen Rattencardiomyocyten in vitro untersucht [236]. Dabei konnte gezeigt werden, dass dieses Aptamer in der Lage ist, neben anderen GPCR-Auto-Ak auch AT1R- und ETAR-Auto-Ak zu neutralisieren. Möglicherweise stellt BC 007 eine neue Behandlungsmöglichkeit der SSc dar, um bei Patienten mit hohen Serum- konzentrationen von AT1R- und ETAR-Auto-Ak das Fortschreiten der Erkrankung und die Ausbildung von schweren Manifestationen zu verhindern oder zumindest zu verzögern, ohne dabei maßgeblich in das Immunsystem und seine Funktionen eingreifen zu müssen.

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Methoden 5 Methoden

5.1 IgG-Aufreinigung, Zellisolierung und Zellkultur

5.1.1 Herkunft von IgG und PBMCs

IgG und PBMCs wurden aus dem Vollblut von gesunden Spendern und SSc-Patienten isoliert. PBMCs wurden auch aus sogenannten „Buffy Coats“ gewonnen. Bei einem Buffy Coat handelt es sich um die Leukozytenfraktion, die von einer Blutspende nach Abtrennung von Plasma, Erythrozyten und Thrombozyten übrig bleibt und vom DRK bezogen werden kann [237].

Die Patienten hatten eine fundierte SSc-Diagnose gemäß der Kriterien des American College of Rheumatology [238]. Sämtliche Eingriffe, Untersuchungen und experimentelle Arbeiten wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki vorgenommen. Für die Blutentnahmen und die Untersuchungen der Immunzellen und Immunglobuline lagen zwei Ethikvota der Ethikkommission der Charité Universitätsklinik Berlin vor (EA1/042/09, EA1/013/05 und EA1/160/10). Patienten und gesunde Spender gaben ihre informierte Einwilligung, ihre Proben und klinischen Daten wurden pseudonymisiert (SKL-Nummer der SSc-Datenbank der rheumatotogischen Fachambulanz, NG-Nummer der Normalspenderdatei der AG Riemekasten, beide Charité Universitätsklinik Berlin).

5.1.2 Aufreinigung von IgG mittels Affinitätschromatografie

Für die Die Isolierung von IgG aus dem Serum wurden SSc-Patienten und gesunden Spendern von einem Arzt 2-6 mL Blut aus der Unterarmvene in Vacutainer mit Trenngel abgenommen. Direkt im Anschluss erfolgte die Zentrifugation des Blutes für 10 min bei 300xg und Raumtemperatur (RT). Das nun über dem Trenngel befindliche Serum wurde abgenommen und für maximal 12 Stunden bei 4°C bis zur Aufreinigung gelagert. Die affinitätschromatografische IgG-Aufreinigung wurde routinemäßig durch das Zentrallabor des DRFZ mit Protein G Sepharose Fast Flow Säulen von Sigma nach Herstellerangaben durchgeführt. Hierzu wurde das Serum 1:2 in 20 mM Natriumphosphat-Puffer pH 7 verdünnt. Mit diesem Puffer wurde auch die Chromatografiesäule äqulibriert und anschließend das verdünnte Serum aufgebracht. Das an dem Protein G gebundene IgG wurde anschließend mit 0,1 M Glycin/HCl pH 2,7 eluiert. Das Eluat wurde mit 1 M Tris-HCl pH 9 neutralisiert und für einige Stunden oder über Nacht gegen PBS dialysiert. Die Proteinkonzentration wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm im EMax Reader bestimmt. Die Analyse der AT1R- und ETAR-Auto-AK-Konzentrationen erfolgte wie unter 5.5 beschrieben. 108

Methoden 5.1.3 Isolierung der PBMCs mittels Dichtegradientenzentrifugation

Für die Isolierung von PBMCs aus dem Vollblut wurden SSc-Patienten und gesunden Spendern von einem Arzt bis zu 10 mL Blut aus der Unterarmvene in heparinisierte Blutröhrchen (Vacutainer) entnommen. Die weiteren Isolierungsschritte erfolgten in der Sterilbank. Die Blutproben wurden zeitnah 1:1 mit PBS/BSA (RT) verdünnt und in 50mL-Falcons auf 15mL Ficoll vorsichtig aufgeschichtet. Die Dichtegradientenzentrifugation wurde direkt im Anschluss für 30 min bei 320xg und RT ohne Bremse durchgeführt. Danach befanden sich die PBMCs inklusive Thrombozyten in der Interphase, Erythrozyten und Granulozyten im Pellet. Die Interphase wurde mit der Pipette entnommen und in kalten PBS/BSA (4°C) überführt und gewaschen (10 min, 320xg, 4°C), der Überstand wurde anschließend abgesaugt.

Um die restlichen Erythrozyten zu entfernen, wurden die Pellets in ca. 10 mL Erythrozyten-Lyse- Puffer (4°C) resuspendiert und für 6 min auf Eis inkubiert, anschließend mit kaltem PBS/BSA auf 50 mL aufgefüllt und wie o. g. gewaschen, jedoch bei 200xg, wobei die Thrombozyten im Überstand verbleiben. Der Überstand wurde abgesaugt und die PBMCs entsprechend ihrer weiteren Verwendung in Medium oder Puffer resuspendiert. Die Zellzahl wurde mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt.

Da auch Buffy Coats von Blutspenden noch Erythrozyten und Thrombozyten enthalten, wurden die PBMCs aus Buffy Coats nach dem gleichen Protokoll isoliert.

5.1.4 Trennung der PBMCs mit magnetisch aktivierter Zellsortierung

Für die Analyse der mRNA-Expression wurden die PBMCs mit magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS, magnetic activated cell sort) anhand ihrer subgruppentypischen Oberflächenantigene aufgetrennt. Hierzu wurden die Microbeads der Firma Miltenyi verwendet und CD3-, CD19- und CD14-positive Zellen nach dem Protokoll des Herstellers mittels positiver Selektion gewonnen.

Bei den Microbeads handelt es sich um ca. 50 nm große, superparamagnetische Partikel, die an einen Ak gekoppelt sind, der gegen das entsprechende Antigen der Zielzelle gerichtet ist. Werden die damit markierten Zellen in die in einem Magnetfeld befindliche Säule überführt, binden die Microbeads mit den Zellen an die mit Eisenpartikeln befüllte Säule und können nach Entfernung der Säule aus dem Magnetfeld in einem Waschschritt eluiert werden.

Für die Isolierung von T-Zellen zur Kultivierung vor einem Migrationsexperiment wurden die T- Zellen nach dem Prinzip der negativen Selektion (Depletion) mit dem Pan T cell Kit von Miltenyi

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Methoden nach Herstellerangabe aufgereinigt. Hierbei wurden die unerwünschten Zellen zuerst mit einem biotin-gekoppelten zelltyp-spezifischen Ak markiert, in einem zweiten Schritt wurde ein Mirobead-gekoppelter anti-Biotin-Ak verwendet, so dass hier die unerwünschten Zellen in der Säule blieben, die gewünschten T-Zellen jedoch gleich nach dem Auftrag eluierten. Der Vorteil der Depletion ist der Ausschluss einer möglichen Aktivierung der Zellen durch die Microbeads sowie eine höhere Reinheit.

Die Reinheit der zu isolierenden Zellpopulationen wurde nach jeder MACS im Durchflusszytometer kontrolliert. Sie betrug in der Regel über 95%.

5.1.5 Kultivierung und Stimulation von PBMCs

Für die Untersuchungen von IgG-vermittelten Effekten wurden die isolierten PBMCs zunächst für einige Stunden oder über Nacht in Kultur ruhen gelassen. Sofern nicht abweichend beschrieben, fanden Kultivierung und Stimulation von PBMCs wie folgt statt: 1-2 Mio. Zellen/mL in RPMI 1640 mit Glutamax, 1%(v/v) IgG-freiem FCS, 100 U/mL Penicillin und 100

µg/mL Streptomycin im Inkubator bei gesättigter Luftfeuchte, 37°C und 5% CO2.

Die Stimulation mit IgG erfolgte nach der Ruhephase. Dazu wurden zuerst die Fc-Rezeptoren durch Zugabe von Flebogamma oder Octagam blockiert (Flebogamma 1:10, Octagam 1:20). Nach einer 30-minütigen Inkubationszeit wurde 1mg/mL IgG wie angegeben dazu pipettiert. Die Konzentration war im Rahmen der Vorarbeiten von der Arbeitsgruppe etabliert worden. Die Zugabe der selektiven Antagonisten erfolgte, wenn angegeben, etwa eine Stunde vor der Stimulation einzeln oder in Kombination in den jeweils genannten Konzentrationen.

Nach Ablauf der Stimulation wurden die Zellkulturplatten aus dem Inkubator genommen und auf Eis gelegt. Für die Analyse der Überstände wurden die Ansätze in geeignete Reaktions- gefäße (auf Eis) pipettiert, bei 320xg und 4°C für 10 min zentrifugiert, die Überstände in neue Reaktionsgefäße überführt und bis zur Analyse bei -20°C gelagert.

Für die Analyse der Zellen wurden die Ansätze in 15mL-Falcons (auf Eis) überführt, die im Well verbliebenen adhärenten Zellen wurden mit Accutase bedeckt (ca 2mm Schichthöhe) und für 10-15 min bei 37°C inkubiert. Nach mikroskopischer Kontrolle wurden die abgelösten Zellen in das entsprechende Falcon überführt, das Well mit eiskaltem PBS gespült und die darin ggf. noch enthaltenen Zellen ebenfalls in das entsprechende Falcon überführt. Nach erneuter mikroskopischer Kontrolle erfolgte ggf. nochmals eine Accutase-Inkubation für ca. 5 min. (anschließend wie beschrieben).

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Methoden Die Zellen wurden abschließend in eiskaltem PBS/BSA gewaschen (auffüllen, zentrifugieren bei 200xg für 10 min bei 4°C) und anschließend der Immunfluoreszenzfärbung unterzogen.

5.1.6 Kultivierung und Stimulation von T-Zellen

Die T-Zellen wurden nach ihrer Isolierung über Nacht in RPMI 1640 mit Glutamax, 1%(v/v) IgG- freiem FCS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin in einem Inkubator bei gesättigter

Luftfeuchte, 37°C und 5% CO2 mit einer Zellzahl von 1-2 Mio./mL kultiviert. Für eine anti- CD3/CD28-Aktivierung wurden 6-Well-Zellkulturplatten mit je 2mL/well einer Lösung von 10µg/mL anti-CD3-Ak und 5µg/mL anti-CD28-Ak in PBS über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Lösung wurde am nächsten Tag entfernt und die T-Zellen in die nun beschichtete Platte mit einer Zellzahl von 1-1,3 Mio Zellen/mL ausgesät und drei Tage in Anwesenheit von 10ng/mL IL-2 kultiviert (Mediumzusammensetzung sonst wie oben beschrieben).

5.2 Nachweis der Proteinexpression mittels Durchflusszytometrie

5.2.1 Markierung der Oberflächenmarker mit direkter Immunfluoreszenzfärbung

Die Färbung der Oberflächenmarker erlaubt die subtyp-spezifische Analyse der im Durchflusszytometer gewonnenen Proteinexpressionsdaten (Abb. 48).

Hierzu wurden die isolierten PBMCs nach dem letzten Waschschritt mit Flebogamma 1:10 in PBS/BSA resuspendiert und entsprechend den für die Analyse erforderlichen Aliquots in mehrere Wells einer 96-Well-Platte a 0,2-1 Mio Zellen/Well aufgeteilt. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei 4°C wurden die Fluorochrom-konjugierten Ak bzw. ein Mastermix aus diesen zur direkten Immunfluoreszenzfärbung der Oberflächenmarker CD3, CD4, CD8, CD14 und CD19 der jeweils erforderlichen Verdünnung entsprechend dazu pipettiert und die Zellen erneut für 20 min auf Eis inkubiert. Es folgte ein Waschschritt durch Auffüllen mit PBS/BSA und Abzentrifugieren bei 320xg für 10 min bei 4°C, der Überstand wurde anschließend verworfen.

5.2.2 Analyse der Rezeptorexpression mit indirekter Immunfluoreszenzfärbung

Die Expression der Rezeptoren AT1R, AT2R, ETAR und ETBR wurde in separaten Aliquots mittels indirekter Immunfluoreszenzfärbung detektiert. Die unkonjugierten primären Ak wurden dabei in ihrer entsprechend austitrierten Verdünnung verwendet und die dazugehörenden Isotypen- kontroll-Ak in der jeweils gleichen Menge eingesetzt. Ein gegen diese Ak gerichteter konjugierter sekundärer Ak wurde zur Detektion verwendet. Die Zellen wurden mit den primären Ak bzw. den Isotypenkontroll-Ak 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte ein

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Methoden Waschschritt wie oben beschrieben und die Inkubation mit dem sekundären Ak ebenfalls in PBS/BSA, die ebenfalls durch einen Waschschritt wie oben beschrieben beendet wurde.

Abbildung 48: Unterscheidung der PBMC-Subtypen im Durchflusszytometer. (A) Darstellung der Monozyten- und Lymphozytenpopulation im Seitwärtsstreulicht- (side scatter = SSC) und Vorwärtsstreulichtkanal (forward scatter = FSC). (B) Darstellung der ungefärbten und CD14-gefärbten Monozyten zur Abgrenzung der (C) CD14-positiven Monozytenpopulation. (D) Innerhalb der Lymphozyten lassen sich die B-Zellen (CD19+) und T-Zellen (CD3+) unterscheiden. (E) Die T-Zellen lassen sich in T-Helferzellen (CD4+) und zytotoxische T-Zellen (CD8+) einteilen. Folgende Ak wurden zur Unterscheidung der PBMC-Subtypen verwendet (Kanal jeweils in Klammern): anti-CD14 PerCP-Cy5.5 (FL4), anti-CD3 APC (FL6), anti-CD19-FITC (FL2), anti-CD8 Alexa 405 (FL1), anti-CD4 APC-Cy7 (FL7). Die Messung fand am LSR II im DRFZ statt.

Die Zellen wurden final in PBS/BSA/Azid resuspendiert und zeitnah im Durchflusszytometer LSR II von BD analysiert. Die Färbung der Rezeptoren zeigte nur selten zwei getrennte Populationen von rezeptorpositiven und -negativen Zellen. Vielmehr verschoben sich die untersuchten Populationen in den positiven Bereich, weshalb für die Auswertung der Expressionsdaten die Isotypenkontrollen als Referenz verwendet wurden: Die Rate der rezeptorpositiven Zellen entsprach dem prozentualen Anteil einer Zellpopulation im positiven Bereich, welcher anhand der jeweiligen Isotypenkontrolle definiert wurde (Abb. 49). Die Rezeptordichte wurde anhand der Ratio der medianen Fluoreszenzintensität (MFI) von Rezeptorfärbung und Isotypenkontrolle bestimmt (MFIRezeptor/MFIIsotypenkontrolle).

112

Methoden

Abbildung 49: Ermittlung der Rezeptorexpression anhand der Durchflusszytometriedaten. (A) Der Bereich rezeptorpositiver Zellen, hier T-Helferzellen, wird anhand der Isotypenkontrolle ermittelt, die mit demselben sekundären Ak angefärbt worden ist. (B) Der definierte Bereich wird auf die Rezeptorfärbung, hier AT2R, übertragen. Die Differenz aus beiden Prozentangaben ergibt die Rate AT2R-positiver Zellen, hier 35,9% - 0,73% = 39,17%. (C) Die Zelldichte wird anhand der medianen Fluoreszenzintensität (MFI) ermittelt. Die MFI der Isotypenkontrolle (im Histogramm hellgrau gefüllt) dient hierbei als Referenzwert. Die gegen die Isotypenkontrolle normalisierte Zelldichte ergibt sich aus der Ratio beider MFI-Werte und beträgt demnach hier 309,97/187,44 = 1,65. Der AT2R wurde mit einem Cy5-konjugierten sekundären Ak detektiert. Cy5 emittiert im APC-Kanal. Die Messung fand am LSR II im DRFZ statt.

5.2.3 Fixierung und Permeabilisierung der PBMCs für intrazelluläre Färbung

Für die intrazelluläre Färbung zur Detektion der Gesamtproteinexpression der einzelnen Rezeptoren wurden die Zellen vor der indirekten Immunfluoreszenzfärbung fixiert und permeabilisiert. Vor der Fixierung wurden die Zellen in PBS resuspendiert, die Fixierung erfolgte durch Inkubation in Fixierlösung für 20 min bei RT und anschließendem zweimaligen Waschen in PBS/BSA. Formaldehyd bewirkt eine Vernetzung der Zellproteine, wodurch eine hohe Zellstabilität und -haltbarkeit erreicht wird. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Pellet in Saponinpuffer resuspendiert. Das Detergenz Saponin reagiert mit dem Cholesterol der Zellmembran und macht diese durchlässig [239], sodass die Ak ins Zellinnere diffundieren können.

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Methoden Die Immunfärbung von fixierten Zellen wurde mit folgenden Abweichungen gegenüber der o. g. Vorgehensweise durchgeführt: Die Färbung der CD-Oberflächenmarker mit Ak, die mit einfachen Fluorochromen konjugiert sind, erfolgte vor der Fixierung, um eine optimale Detektion der Antigene zu erreichen. Die Färbung der CD-Oberflächenmarker mit Ak, die mit Tandem-Fluorochromen konjugiert sind, erfolgte nach der Fixierung, da der Energietransfer zwischen den Fluorochromen eines Tandems durch vernetzte Proteine gestört wird. Vor Färbung nach Fixierung erfolge eine weitere Inkubation mit Flebogamma 1:10 für 30 min bei 4°C, um auch intrazelluläre unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Inkubationszeit mit den primären sowie dem sekundären Ak zur Detektion der Rezeptorexpression wurde auf jeweils 45 min verlängert, da die Diffusion der Ak ins Zellinnere mehr Zeit beansprucht. Nach Fixierung/Permeabilisierung erfolgen sämtliche Zentrifugationsschritte mit 350-380xg, da die Zellen in ihrer Struktur nun weniger kompakt sind. Der Waschschritt erfolgte wie oben beschrieben, jedoch zweimal und mit Saponinpuffer. Fixierte Zellen wurden bis zur durchflusszytometrischen Analyse einige Tage bei 4°C und vor Licht geschützt gelagert. Die Färbung der Rezeptoren erfolgte jeweils erst am Tag der Analyse.

5.2.4 Durchflusszytometrische Messung

Die durchflusszytometrische Messung erlaubt die Analyse großer Zellmengen auf Einzelzellebene in relativ kurzer Zeit (mehrere tausend bis zehntausend Zellen pro Sekunde). Die Zellen fließen an einem Messpunkt vorbei und werden einzeln erfasst. Dabei können die Streulichtparameter (Zellgröße und Granularität) der Zelle sowie die Emissionsintensität verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe detektiert werden.

Für die Analyse im Durchflusszytometer müssen die Zellen als Suspension vorliegen. Für die Messung sind wenige hundert Mikroliter Probe ausreichend. Die Exzitationsleistung der verwendeten Laser wird über die Spannung so reguliert, dass die dargestellte Fluoreszenz- intensität der ungefärbten Kontrolle einen bestimmten Bereich nicht überschreitet, eine gefärbte positive Probe oder Kontrolle aber auch noch innerhalb der Darstellung sichtbar ist. Vor jeder Messreihe werden die optimalen Einstellungen mit Einzelfärbungen ermittelt und die Proben mit diesen Einstellungen analysiert. Beim Nachweis von zwei oder mehr Antigenen in einer Probe müssen die Fluorochrome und die Filter so gewählt werden, dass sich die Wellenlängenbereiche ihrer Emissionsstrahlung nicht oder nur wenig überschneiden. Kommt es dennoch zu Überschneidungen der Emissionsbereiche, müssen diese Einstrahlungen kompensiert werden, um falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden.

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Methoden Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde für die Expressionsanalysen verschiedener Proteine in PBMCs das Durchflusszytometer LSR II am DRFZ verwendet. Die vier Laser und die dazugehörigen Filtersysteme erlaubten die Detektion aller gängigen Fluorochrome inklusive derer, die im UV-Bereich angeregt werden. Durch die geeignete Kombination verschiedener Fluorochrome und der entsprechenden Filter gemäß den Herstellerangaben konnten bis zu sieben verschiedene Parameter in einer Messprobe untersucht werden. Die Markierung der Antigene und die Verwendung der Messdaten erfolgten wie unter 5.2.1 und 5.2.2 angegeben. Zum Ausschluss toter Zellen wurden bei den nichtfixierten Zellen aus den Zellkultur- experimenten direkt vor der Messung 50-100ng Propidiumiodid zugefügt (1-2µL einer 50µg/mL-Stocklösung). Die Messeinstellungen wurden mit einer ungefärbten Kontrolle sowie den Einzelfärbungen aller verwendeten Ak für jede Messreihe neu adjustiert.

5.3 Nachweis der mRNA-Expression mittels Real-time PCR

Die mRNA-Menge eines Genes gibt Aufschluss über die gegenwärtige Häufigkeit und/oder Effizienz der Transkription dieses Genes in einer Zelle. Die quantitative Bestimmung der reifen mRNA, die sich bereits im Zytoplasma befindet, erlaubt eine Aussage über den Expressionslevel dieses Genes und ermöglicht zum Beispiel den Vergleich von normalen und pathologisch veränderten Zellen oder von Genexpressionsmustern vor und nach medikamentöser Behandlung.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression des AT1R und ETAR (Gene AGTR1 und EDNRA) in den T-Zellen, B-Zellen und Monozyten gesunder Probanden mittels Real-time PCR untersucht, um die Resultate der Proteinexpressionsanalysen zu stützen, da die Expression beider Rezeptoren bis dato [146] noch nicht vollständig für alle dieser Subpopulationen beschrieben worden war. Die mRNA-Analyse erfolgte in drei Schritten: Erstens mRNA-Isolierung, zweitens cDNA-Synthese durch reverse Transkription, drittens Real-time PCR.

5.3.1 Isolierung von mRNA

Die Isolierung von RNA aus den einzelnen PBMC-Subpopulationen wurde mit dem NucleoSpin RNA II Kit von Macherey Nagel nach Herstellerangaben durchgeführt. Gemäß der Hersteller- empfehlung wurden bis zu 5x106 Zellen pro Säule verwendet, der Zellaufschluss erfolgte chemisch-mechanisch durch Resuspension der Zellen in RLT-Puffer (im Kit enthalten) und Homogenisieren des Lysates durch mehrmaliges Aufziehen mit einer Spritze (Durchmesser der Nadel <0,9 mm). Bei der Verwendung des NucleoSpin RNA II Kits wird durch ein spezielles stark

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Methoden salzhaltiges Puffersystem die Bindung von langen RNA-Fragmenten (mRNA) an eine Silica-Gel- Membran unterstützt. Im Anschluss an die Elution wurde die Konzentration und Reinheit der RNA-Proben im Photometer Nanodrop ND-1000 bestimmt, wobei eine Absorption von eins bei einer Wellenlänge von 260nm (A260nm) 40µg RNA/mL entspricht und eine A260nm/A280nm- Ratio < 1,8 eine Verunreinigung mit Proteinen anzeigt. Proben mit einer A260/A280-Ratio > 2 wurden für die reverse Transkription verwendet. Die RNA-Proben wurden für maximal drei Tage bei -20°C gelagert und so zeitnah wie möglich in cDNA umgeschrieben.

5.3.2 Reverse Transkription

RNA ist relativ unstabil, daher erfolgt vor der Quantifizierung ihre Umschreibung in komplementäre DNA (cDNA, complementary DNA) mit Hilfe des Enzyms reverse Transkriptase. Dieses Enzym stammt ursprünglich aus Retroviren und ist eine DNA-Polymerase zur Transkription der Virus-RNA in DNA. Da die Transkription dabei in umgekehrter Richtung abläuft, wird sie als reverse Transkription bezeichnet.

Für die vorliegende Arbeit wurde die cDNA mit der reversen Transkriptase des Moloney murine Leukämie-Virus (M-MLV) von Promega generiert. Die M-MLV reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase mit schwacher RNase H-Funktion, die bevorzugt längere mRNA-Abschnitte (> 5kb) transkribiert [240]. Die M-MLV reverse Transkriptase wurde gemäß den Herstellerangaben unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers zur cDNA-Synthese eingesetzt. Die Inkubationsschritte erfolgten in einem Thermocycler. Abschließend wurde eine Behandlung mit RNAse H für 20 min bei 37°C durchgeführt, ebenfalls im Thermocycler. Bis zur weiteren Verwendung wurden die cDNA-Proben bei -20°C gelagert.

5.3.3 Real-time PCR

Die Real-time PCR ist eine quantitative PCR-Methode. Sie dient der sequenzspezifischen Analyse von DNA-Fragmenten und deren relativer Häufigkeit. Die reverse Transkription von RNA in cDNA ermöglicht ihre Nutzung zur Analyse der Expression von Genen. Dabei wird die Zunahme der Amplifikate in jedem Zyklus der PCR bestimmt.

In der vorliegenden Arbeit wurde SYBR Green zur Detektion der amplifizierten DNA verwendet. Wenn SYBR Green in doppelsträngige DNA-Moleküle interkaliert, emittiert es bei 520nm. Da sich dieser Farbstoff sequenzunabhängig in DNA-Moleküle einlagert, wurde nach jeder abgeschlossenen PCR-Reaktion eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, um die Reinheit des gewünschten Amplifikates zu überprüfen. Unspezifische Amplifikate verfälschen die Real-time

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Methoden PCR-Analyse. Sie weisen eine andere Schmelztemperatur als das gewünschte Produkt auf und lassen sich somit in der Schmelzkurvenanalyse erkennen bzw. ausschließen.

Die Sequenzen der Primerpaare zur Amplifikation von AGTR1 und EDNRA sowie des Houskeeping-Gens eukaryotischer Elongationsfaktor 1A1 (EEF1A1) wurden mit Hilfe von Primer Express ermittelt. Die Primer wurden so gewählt, dass sie ggf. in einem Exon liegen, das in allen Splice-Varianten vorkommt. Unter http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/exonview wurden die Exons und Splice-Varianten überprüft. Die PCR-Reaktion wurde für beide Gene hinsichtlich der Primer- und Magnesiumchloridkonzentration sowie der Annelingtemperatur optimiert. Der optimierte Real-time PCR-Ansatz setze sich wie folgt zusammen:

Vorwärtsprimer 0,25 nM

Rückwärtsprimer 0,25 nM

dNTP-Mix 0,25 mM

MgCl2 4 bzw. 6 mM*

DNA Polymerase Immolase 1 U

SYBR Green I 1fach

Tris pH 8,8 500 mM

BSA 12 µg/mL

cDNA 5 µL (entsprach 2 ng RNA)

*4 mM für EDNRA, 6 mM für AGTR1

Die PCR-Reaktion wurde wie folgt im Stratagene Thermocycler programmiert und durchgeführt:

Schritt Anzahl der Zyklen Dauer [min:sec] Temperatur [°C]

primäre Denaturierung 1 10:00 95

Annealing 40 00:10 66

Elongation 40 00:14 72

Denaturierung 40 00:12 95

Schmelzkurvenanalyse 1 01:00 und 00:30 95 und 60

Alle Proben wurden für die Real-time PCR-Analysen als Triplikate angesetzt, für jede Probe wurden eine Wasserkontrolle und eine Referenzprobe (Houskeeping-Gen EEF1A1) ebenfalls als Triplikat mitgeführt. Die Zykluszahl c, bei der die Fluoreszenzintensität in einem Ansatz einen

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Methoden bestimmten Schwellenwert überschreitet (Treshold = T), wurde für die Quantifizierung zugrunde gelegt (cT-Wert).

Die Berechnung der Resultate beruht auf der Annahme, dass mit jedem Zyklus eine n Verdopplung der DNA-Moleküle gemäß folgender Formel stattfindet: N0 x 2 = N

Dabei ist N0 die Ausgangsmenge der eingesetzten DNA-Moleküle, n die Anzahl der Zyklen und N die Menge der DNA-Moleküle nach n Zyklen. Da die Amplifikation jedoch nur theoretisch mit dem Faktor 2n stattfindet, ist es normalerweise erforderlich, den Faktor 2n durch En zu ersetzen. E beschreibt die Amplifikationseffizienz und ist in der Praxis kleiner als zwei. Die Bestimmung der Effizienz erfolgt mit einem Validierungsexperiment für jedes Gen, Primerpaar und jede Probenart (Zelltyp, Spezies) sowie im Fall einer Änderung der Isolierungs- oder PCR- Bedingungen. Zur Effizienzbestimmung wird eine vier- bis sechsstufige Verdünnungsreihe der cDNA-Probe mit den dazugehörenden Primern als Triplikate angesetzt und in einer Real-time PCR-Reaktion unter den gewünschten Bedingungen durchgeführt. Die aus den Triplikaten gemittelten cT-Werte werden gegen den Logarithmus der eingesetzten Konzentrationen aufgetragen, wobei die Standardkurve einen linearen Verlauf zeigt bzw. einen linearen Bereich aufweist. Mit Hilfe einer Software, zum Beispiel der des verwendeten Thermoyclers, wird der Anstieg im linearen Bereich bestimmt und in folgende Formel eingesetzt:

Effizienz E = 10 (-1/Anstieg)

Im Idealfall beträgt der Anstieg -3,3. Danach wäre E = 10 (-1/-3,3) = 2. In der Praxis sollte eine Effizienz von über 1,95 angestrebt werden, um die Resultate vergleichen zu können.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Effizienz der PCR-Reaktion nicht ermittelt, da die Analyse der mRNA-Expression hier lediglich zur Verifizierung der Expression beider Rezeptoren in den untersuchten Zellen benötigt wurde, die zuvor mitttels Durchflusszytometrie festgestellt worden war. Die Quantifizierung erfolgte relativ zum Houskeeping-Gen mit der cT-Methode mit einer angenommenen Effizienz von 2 nach der Formel:

cT 2 mit cT = cT (Housekeeping-Gen) - cT (Ziel-Gen)

Es wurde die mRNA-Expression von AGTR1 und EDNRA in T-Zellen, B-Zellen und Monozyten von sechs gesunden Spendern analysiert.

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Methoden 5.4 Chemotaxisassay

Ein Chemotaxisassay soll zeigen, ob eine bestimmte Substanz die zielgerichtete Chemotaxis von Zellen induzieren kann. Dabei migrieren Zellen durch eine Membran und/oder eine Schicht von ECM-Proteinen und können anschließend quantifiziert werden.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Chemotaxisassays in Transwell-Platten unter sterilen Bedingungen mit Assaymedium durchgeführt (RPMI 1640 mit 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 0,5% w/v BSA, sterilfiltriert). Für Ansätze mit Rezeptorantagonisten wurden diese in den angegebenen Konzentrationen dem Assaymedium beigemengt (steril, Vortex) und zu je 600µL nach Schema in die Wells pipettiert. Die chemotaktisch wirksamen Faktoren (Ang II, ET-1, CXC-Liganden, IgG) wurden nach Schema in die entsprechenden Wells pipettiert.

Die T-Zellen wurden nach einer Kultivierungsdauer von drei Tagen (siehe 5.1.6) mikroskopisch kontrolliert, in ein Falcon pipettiert und die Zellzahl mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Zellen wurden 2x mit PBS/BSA gewaschen (auffüllen, zentrifugieren mit 200xg für 10 min bei 4°C), im dem Ansatz entsprechenden Assaymedium (mit/ohne Antagonist) resuspendiert und auf 600.000 Zellen pro 100µL eingestellt. Die Einsätze mit Polykarbonatmembran (Porengröße 5µm) wurden in die Wells gelegt. Anschließend wurden je 100µL der T- Zellsuspension in die Einsätze pipettiert und die Assayplatten für zwei Stunden im Brutschrank inkubiert. In ersten Testexperimenten wurde nach dem Assay die Vitalität der Zellen in den Einsätzen sowie den Wells durch Trypanblaufärbung am Mikroskop ermittelt. Die Antagonisten hatten in den verwendeten Konzentrationen keinen Einfluss auf die Vitalität (siehe 3.4.2 Abb. 32).

Wichtig: Die Zusammensetzung des Assaymediums inklusive der Konzentration der Rezeptorantagonisten war bei jedem Ansatz im Well (unten) und im Einsatz (oben) identisch. Lediglich der Chemotaxis-induzierende Faktor (Ligand/Chemokin oder IgG) befand sich jeweils nur unten im Well (Abb. 50).

Zur Beendigung der zielgerichteten Zellwanderung wurden die Platten aus dem Inkubator genommen und auf Eis gelegt. Die Unterseite der Membranen wurden mit je 200µL eiskaltem PBS abgespült, um migrierte aber noch mit dem Flüssigkeitsfilm anhaftende Zellen ins Well zu spülen. Die Zellen wurden aus den Wells in Reaktionsgefäße überführt, die Wells wurden anschließend ebenfalls mit eiskaltem PBS gespült, um alle migrierten Zellen zu gewinnen. Anschließend wurden die Zellen mit 200xg für 10 min bei 4°C zentrifugiert und in 30µL PBS resuspendiert. 119

Methoden

Abbildung 50: Schematische Darstellung der Präparation eines Chemotaxisassays. Das Assaymedium wird für jeden Ansatz (mit/ohne Antagonist) vorbereitet und sowohl im Well als auch zur Resuspension und Auftragung der T-Zellen verwendet. Somit ist das Medium im Well und im Einsatz bei jedem Ansatz identisch, lediglich der Ligand (natürlicher Ligand, Chemokin, IgG) befindet sich nur im Well, so dass eine gerichtete Chemotaxis stattfinden kann.

Vor der Ermittlung der Zellzahl wurde für die spätere Berechnung das genaue Volumen der Zellsuspension (30µL plus Pellet) durch Aufziehen in eine 100µL-Pipette ermittelt. Die Zellen wurden mit einer Neubauer-Zählkammer ausgezählt. Bei Ansätzen mit hohen Zellzahlen erfolgte eine Verdünnung der Zellsuspension und erneute Auszählung. Es wurden jeweils mindestens drei Großquadrate gezählt und der Mittelwert (MW) für die weitere Berechnung zugrunde gelegt. Die absoluten Zellzahlen wurden wie folgt mit einem Kammerfaktor von 10.000/mL errechnet:

Zellzahl = MW Zellzahl x Verdünnungsfaktor x Kammerfaktor x Volumen der Zellsuspension [mL]

Die so ermittelten Zellzahlen wurden für die statistische Auswertung verwendet.

5.5 ELISA

Nach der Stimulation von PBMCs mit IgG wurde die Konzentration des löslichen Protein sCD14 sowie der Zytokine TGF-β1, IL-8 und CCL18 mit Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs) nach dem Sandwich-Prinzip in den Überständen bestimmt. Die Analyse von sCD14, TGF-β1 und CCL18 erfolgte dabei jeweils mit einem Duoset ELISA-Kit von R&D gemäß den Herstellerangaben. Für die Bestimmung von IL-8 wurde das Ak-Paar („matched pair“) anti- human IL-8 Beschichtungs-Ak H8A5 und der Biotin-gekoppelte Detektions-Ak E8N1 von Biolegend verwendet. Gemäß dem Hersteller wurden beide Ak in einem Testexperiment gegeneinander titriert und anschließend in optimaler Verdünnung eingesetzt (Beschichtungs-Ak 1:250, Detektions-Ak 1:2000). Die Durchführung des IL-8-ELISA erfolgte ebenfalls nach Herstellerangabe. Die geeigneten Verdünnungen der Überstände wurden für jeden Analyten in einem Testexperiment ermittelt. Die Messungen erfolgten in einem EMax Reader.

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Methoden AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen wurden sowohl im Serum der SSc-Patienten als auch in den affinitätschromatografisch aufgereinigten IgG-Proben mit den Kits von One Lambda nach dem Prinzip eines indirekten ELISAs analysiert. Hierbei sind die Platten mit dem Antigen beschichtet, gegen welches die zu detektierenden Auto-Ak gerichtet sind. Die Messungen wurden von unserem Kooperationspartner, der CellTrend GmbH, nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Messungen der Subklassen-spezifischen AT1R- und ETAR-Auto-Ak- Konzentrationen im Serum wurden von der Firmal Celltrend GmbH entwickelt und ebenfalls von ihren Mitarbeitern durchgeführt. Dabei wurden in einem indirekten ELISA subklassenspezifische Detektions-Ak verwendet.

5.6 Statistische Methoden

5.6.1 Normalitätstest

In der vorliegenden Arbeit wurden experimentelle und klinische Daten unabhängiger oder verbundene Stichproben miteinander verglichen oder korreliert. Zur Auswahl des geeigneten statistischen Verfahrens wurde zuerst jede Stichprobe hinsichtlich der Normalverteilung ihrer einzelnen Werte mit dem D’Agostino und Pearson Omnibus Normalitätstest analysiert. Da hierbei jeweils immer mindestens eine Gruppe keine Normalverteilung zeigte, kamen bei den hier gezeigten Daten nur statistische Methoden zur Anwendung, die keine Normalverteilung voraussetzen (nichtparametrische Tests).

5.6.2 Mann-Whitney-Test

Mit dem Mann-Whitney-Test, auch Mann-Whitney-U-Test oder Wilcoxon-Rangsummentest genannt, werden Unterschiede der zentralen Tendenz einer mindestens ordinalskalierten Variablen zwischen zwei unabhängigen Stichproben analysiert. Dabei werden die Rangsummen der Stichproben verglichen, wozu eine Normalverteilung der Daten nicht erforderlich ist [241]. Hier wurden mit dem Mann-Whitney-Test Gruppen wie Gesunde und Patienten, Männer und Frauen, Patienten mit dcSSc und solche mit lcSSc hinsichtlich eines bestimmten Merkmales miteinander verglichen. Bei Stichproben von n=3 ist die Feststellung eines signifikanten Unterschiedes mit diesem Test rechnerisch kaum möglich. Daher wurde bei der Datenaufbereitung von einigen Testexperimenten auf eine statistische Analyse verzichtet.

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Methoden 5.6.3 Varianzanalyse und Kruskal-Wallis-Test

Mit der Varianzanalyse (ANOVA, analysis of variance) wird untersucht, ob sich eine oder mehrere Variablen (einfaktorielle oder mehrfaktorielle ANOVA) zwischen mehreren unabhängigen Stichproben im Mittel unterscheiden. Kann eine Normalverteilung nicht belegt oder angenommen werden, zum Beispiel bei kleinem Stichprobenumfang, kann die Varianzanalyse mit dem nicht-parametrischen Kruskal-Wallis-Test erfolgen. Wie beim Mann- Whitney-Test werden Unterschiede der zentralen Tendenz einer mindestens ordinalskalierten Variablen, hier zwischen mehreren statt nur zwischen zwei unabhängigen Stichproben analysiert, wobei wiederum die Rangsummen der Stichproben verglichen werden [241].

5.6.4 Paarvergleichstest nach Wicoxon

Mit dem Paarvergleichstest nach Wilcoxon werden Unterschiede der zentralen Tendenz einer mindestens ordinalskalierten Variablen zwischen zwei verbundenen Stichproben analysiert. Dabei wird der Unterschied für jedes einzelne Datenpaar analysiert und die Unterschiede gemäß ihres Ranges und ihrer Richtung summiert [241]. Da es sich auch hier um einen Rangsummenvergleich handelt, ist eine Normalverteilung der Daten nicht erforderlich. In der vorliegenden Arbeit wurden mit dem Paarvergleichstest nach Wilcoxon zum Beispiel Unterschiede zwischen Versuchsansätzen mit und ohne Antagonist untersucht.

5.6.5 Spearman-Korrelation

Zur Untersuchung eines statistischen Zusammenhanges zwischen zwei Merkmalen wurde die Spearman-Korrelation verwendet. Auch bei dieser Methode werden die Daten nach Rängen geordnet, so dass eine Normalverteilung der Daten nicht erforderlich ist und auch nicht-lineare Zusammenhänge aufgezeigt werden können. Der Korrelationskoeffizient r rangiert von minus eins bis plus eins und zeigt Stärke und Richtung des statistischen Zusammenhanges an [241]. Auto-Ak-Konzentrationen, die unter der Nachweisgrenze von 2,5 U lagen, wurden für die Korrelationsanalysen mit 1,25 U beziffert.

5.6.6 Signifikanzniveau

In der vorliegenden Arbeit wurden Unterschiede und Korrelationen, die mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von unter 5% (p<0.05) ermittelt worden sind, als signifikant erachtet. Bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von unter 1% und unter 0.1% (p<0.01 und p<0.001) sind statistische Unterschiede und Korrelationen als hoch bzw. höchst signifikant bezeichnet worden.

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Methoden Für Irrtumswahrscheinlichkeiten von 5% und größer aber kleiner 10% wurde eine statistische Tendenz angenommen (0.1>p≥0.05).

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Material 6 Material

6.1 Geräte

Gerätebezeichnung Hersteller

Brutschrank CB 150 Binder GmbH, Tuttlingen, Deutschland

Durchflusszytometer FACS BD LSR II BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland

ELISA reader EMax Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA

Gefrierschrank – 20°C MediLine Liebherr, Bulle, Schweiz

Gefrierschrank – 80°C Herafreeze Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA

Kühlschrank + 4°C Premium Liebherr, Bulle, Schweiz

MACS Magneten midi und mini Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland

MACS Magnethalter Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland

Mikroskop H 600 BS Fa. Helmut Hund, Wetzlar, Deutschland

Multikanalpipette Finnpipette, 300 µL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA

PCR Thermocycler DNA Engine Biorad, Hercules, CA, USA

Photometer Nanodrop ND-1000 Preqlab/VWR, Erlangen, Deutschland

Pipettboy Accu-Jet pro Hirschmann, Eberstadt, Deutschland

Pipetten 10/20/100/200/1000 µL Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Pipetten 10/100/200/1000 µL Abimed/Kinesis, Langenfeld, Deutschland

Real-time PCR Cycler MX3000P Stratagene, La Jolla, CA, USA

Sterilbank HeraSafe Heraeus, Hanau, Deutschland

Vortex Genie 2 Scientific Industries, New York, NY, USA

Wasserbad RO 03003 ROWA, Heimsheim, Deutschland

Neubauer-Zählkammer improved brightline Marienfeld, Lauda-Königshofen, Deutschland

Zentrifuge Biofuge Fresco Heraeus, Hanau, Deutschland

Zentrifuge Laborfuge 400R Heraeus, Hanau, Deutschland

Zentrifuge Megafuge 1.0R Heraeus, Hanau, Deutschland

Zentrifuge Megafuge 3SR+ Heraeus, Hanau, Deutschland

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Material 6.2 Verbrauchsmaterial

Materialbezeichnung Hersteller

Adhesive Seal Microfilm Biorad, Hercules, CA, USA

Blutentnahmeröhrchen Vacutainer, BD Vacutainer Systems, Plymouth, UK heparinisiert, 10 mL

Blutentnahmeröhrchen Vacutainer mit BD Vacutainer Systems, Plymouth, UK Trenngel, 6 mL

FACS Röhrchen BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland

Falcon Röhrchen 15 und 50 mL Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Kanülen Sterican 0,9 x 44 mm Braun, Melsungen, Deutschland

MACS Cell-Separation Column LS und MS Miltenyi, B. Gladbach, Deutschland

MACS Pre-Separation Filter Miltenyi, B. Gladbach, Deutschland

Pasteurpipetten DRFZ, Berlin, Deutschland

PCR 96-well-Platten Biozym, Hessisch Oldendorf, Deutschland

Pipettenspitzen 10/200/2000 µL Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Pipettenspitzen mit Filter 10/100/2000 µL Biozym, Hessisch Oldendorf, Deutschland

Protein G Sepharose Fast Flow Säulen Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

Reaktionsgefäße 1,5 und 2,0 mL Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Reaktionsgefäße für PCR 0,5 mL Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Serologische Pipetten 5, 10 und 25 mL Greiner, Kremsmünster, Österreich

Spritzen 1 und 10 mL Braun, Melsungen, Deutschland

24-transwell-Platte, Inserts mit 5 µm Costar Corning, New York, NY, USA Porengröße

Zellkulturflaschen T75 Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

96-Well-Platte Flachboden Costar Corning, New York, NY, USA

96-Well-Platte Rundboden Greiner, Kremsmünster, Österreich

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Material 6.3 Chemikalien, Proteine, Medien, Lösungen und Puffer

6.3.1 Chemikalien, Proteine, Medien und Zusätze

Name/Kürzel Produktbezeichnung Hersteller

Accutase Accutase solution ready-to-use Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

Ang II humanes Angiotensin II Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

BSA bovines Serumalbumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

BQ-788 BQ-788 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

CXCL10 rekombinantes humanes CXCL10 Immunotools, Friesoythe, Deutschl.

CXCL11 rekombinantes humanes CXCL11 Immunotools, Friesoythe, Deutschl.

CXCL12 rekombinantes humanes CXCL12 Immunotools, Friesoythe, Deutschl.

DMSO Dimethylsulfoxid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

ET-1 humanes Endothelin 1 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

EtOH Ethanol, 100% Merck, Darmstadt, Deutschland

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

FA Formaldehyd-Lösung, 37%ig Roth, Karlsruhe, Deutschland

FCS fetales Kälberserum PAA, Pasching, Österreich

Ficoll LSM 1077 Lymphocyte Separation PAA, Pasching, Österreich Medium

Flebogamma humanes IgG 50 mg/mL Instituto Grifols, Barcelona, Spanien Infusionslösung

IL-2 Proleukin (rekombinantes humanes Novartis, Basel, Schweiz IL-2)

Iono Ionomycin calcium salt Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

Octagam humanes IgG 100 mg/mL Octapharma, Langenfeld, Deutschl. Infusionslösung

PD123319 PD123,319 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

Pen/Strep Penicillin/Streptomycin GE Healthcare, Wien, Österreich

PHA Phytohaemagglutinin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

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Material

PMA Phorbol-12-Myristat-13-Acetat Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

PI Propidiumiodid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

RNasin Rekombinantes RNasin, Promega, Mannheim, Deutschland Ribonuklease-Inhibitor

RPMI 1640 Gibco RPMI 1640 mit GlutaMAX Thermo Fisher, Waltham, MA, USA

Saponin Saponin aus Quillaja-Borke Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

Sit Sitaxsentan Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA

Trypanblau Trypan Blau Färbelösung 0,4% Biochrom, Berlin, Deutschland

Val Valsartan Pfizer, New York, NY, USA

6.3.2 Lösungen und Puffer

Carbonat-Puffer: 50 mM Karbonat/Hydrogenkarbonat; destilliertes Wasser (dest. H2O); pH 9,6

Erythrozyten-Lyse-Puffer: 10 mM KHCO3; 155 mM NH4Cl; 0,1 mM EDTA; dest. H2O; pH 7,5

Fixierlösung 4%ig (v/v): 5,4 mL 37%ige (v/v) Formaldehydlösung mit PBS auf 50 mL auffüllen

Glycinpuffer: 100 mM Glycin; 100 mM HCl; dest. H2O; pH 2,7

PBS: 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 1,4 mM KH2PO4; 4,3 mM Na2HPO4; dest. H2O

PBS/BSA: 0,5 % BSA (w/v) in PBS

PBS/BSA/Azid: 0,05% (v/v) NaN3 in PBS/BSA

PBS/BSA/EDTA: 2 mM EDTA in PBS/BSA

Phosphatpuffer: 20 mM NaH2PO4; dest. H2O; pH 7

Phosphat-Citrat-Puffer: 200 mM Na2HPO4; 100 mM Zitronensäure; dest. H2O; pH 5

Saponinpuffer: 0,5 % (w/v) Saponin in PBS/BSA

Trispuffer: 1 M Tris-HCl; dest. H2O; pH 9

Sämtliche Chemikalien wurden von den Firmen Roth und Sigma-Aldrich bezogen.

6.4 Kits und Enzyme

Produktbezeichnung Hersteller

CCL18 DuoSet ELISA DY394 R&D Systems, Minneapolis, MN, USA

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Material

CC14 DuoSet ELISA DY383 R&D Systems, Minneapolis, MN, USA

CD3 MicroBeads, human Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland

CD14 MicroBeads, human Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland

CD19 MicroBeads, human Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland

DNase Qiagen, Hilden, Deutschland

Enzyme immunoassay AT1R One Lambda, Canoga Park, CA, USA

Enzyme immunoassay ETAR One Lambda, Canoga Park, CA, USA

Immolase DNA Polymerase 5 U/µL Bioline, Luckenwalde, Deutschland

M-MLV reverse Transkriptase Promega, Mannheim, Deutschland

NucleoSpin RNA II Kit Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

Pan T Cell Isolation Kit II human Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland

RNase H Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA

RNAse-freies Wasser Promega, Mannheim, Deutschland

SYBR Green I Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA

TGF-beta 1 DuoSet ELISA DY240 R&D Systems, Minneapolis, MN, USA

6.5 Primer, dNTPs und Antikörper

6.5.1 Primer von TIB Molbiol, Berlin, Deutschland Gen-Name Richtung Primer-Sequenz

AGTR1 forward 5′-TTC AGC CAG CGT CAG TTT CA-3′

AGTR1 reverse 5′-GGC GGG ACT TCA TTG GGT-3′

EDNRA forward 5′-CAC AGA GCT CAG CTT CCT GGT TA-3′

EDNRA reverse 5′-GTA ATT TTA GTC TGC TGT GGG CAA TAG-3’

EEF1A1 forward 5′-GTT GAT ATG GTT CCT GGC AAG C3′-3’

EEF1A1 reverse 5′-GCC AGC TCC AGC AGC CTT C-3’

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Material 6.5.2 mRNA-spezifischer Primer und Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP)

Produktbezeichnung Hersteller

Oligo(dT)15 Primer Promega, Mannheim, Deutschland

Desoxyadenosintriphosphat Promega, Mannheim, Deutschland

Desoxycytosintriphosphat Promega, Mannheim, Deutschland

Desoxyguanosintriphosphat Promega, Mannheim, Deutschland

Desoxythymidintriphosphat Promega, Mannheim, Deutschland dNTP-Mix Bioline, Luckenwalde, Deutschland

6.5.3 Antikörper

Bezeichnung (Klon/Produktnr.) Hersteller mouse anti-human (anti-hu.) CD3 (UCHT1) DRFZ, Berlin, Deutschland mouse anti-hu. CD3 PE* (UCHT1) DRFZ, Berlin, Deutschland mouse anti-hu. CD3 APC (UCHT1) DRFZ, Berlin, Deutschland mouse anti-hu. CD4 APC-Cy7 (RPA-T4) BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland mouse anti-hu. CD8 Alexa 405 (GN11/134D7) DRFZ, Berlin, Deutschland mouse anti-hu. CD14 Cy5 (TM1) DRFZ, Berlin, Deutschland mouse anti-hu. CD14 Alexa 700 (TM1) DRFZ, Berlin, Deutschland mouse anti-hu. CD14 PerCP-Cy5.5 (HCD14) BioLegend, San Diego, CA, USA mouse anti-hu. CD16 FITC (3G8/555406) BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland mouse anti-hu. CD19 Cy5 (BU12) DRFZ, Berlin, Deutschland mouse anti-hu. CD19 FITC (BU12) DRFZ, Berlin, Deutschland mouse anti-hu. CD28 Ultra-LEAF (CD28.2) BioLegend, San Diego, CA, USA mouse anti-hu. HLA-DR BV421 (G46- BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland 6/562804) mouse anti-hu. IL-8 capture antibody (E8N1) BioLegend, San Diego, CA, USA mouse anti-hu. IL-8 detection antibody BioLegend, San Diego, CA, USA (H8A8)

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Material rabbit polyclonal IgG anti-human-AT1R (sc- Santa Cruz Biotechnology, USA 1173) rabbit polyclonal IgG anti-human ETAR (sc- Santa Cruz Biotechnology, USA 33535) rabbit polyclonal IgG isotype control (sc- Santa Cruz Biotechnology, USA 3888) rabbit polyclonal IgG anti-human-AT2R Abcam, Cambridge, UK (ab19134) rabbit polyclonal IgG anti-human ETBR Abcam, Cambridge, UK (ab39960) rabbit polyclonal IgG isotype control Abcam, Cambridge, UK (ab175652) goat anti-rabbit-IgG H&L Cy5 (ab6564) Abcam, Cambridge, UK goat anti-rabbit-IgG H&L Alexa 430 (A-11064) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA *Die ausgeschriebenen Bezeichnungen der Fluorochrome erscheinen aus Gründen der Übersichtlichkeit nur im Abkürzungsverzeichnis

6.6 Zellen und Immunglobuline

Die untersuchten Immunzellen stammen aus Blutspenden von gesunden Probanden (Nichtraucher, keine Medikation, nicht alkoholisiert) und SSc-Patienten (zum Zeitpunkt der Blutentnahme keine immunsupressive und/oder zytotoxische Medikation) sowie aus buffy coats unbefundeter Blutspender vom DRK Blutspendedienst. Die verwendeteten Immunglobulin-G-Proben wurden aus dem Serum von gesunden Probanden (wie oben) und SSc-Patienten (zum Zeitpunkt der Blutentnahme keine immunsupressive und/oder zytotoxische Medikation) aufgereingt.

Alle Patienten hatten eine fundierte SSc-Diagnose gemäß der Kriterien des American College of Rheumatology [242]. Sämtliche Eingriffe, Untersuchungen und experimentellen Arbeiten wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki vorgenommen. Für die Blutentnahmen und die Untersuchungen der Immunzellen und Immunglobuline lagen zwei Ethikvota der Ethikkommission der Charité Universitätsklinik Berlin vor (EA1/042/09, EA1/013/05 und EA1/160/10). Die Patienten und gesunden Spender gaben ihre informierte Einwilligung, ihre Proben und Daten wurden in pseudonymisierter Form verwendet.

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Material 6.7 Software

Bezeichnung Hersteller

Adobe Acrobat 9.0 Adobe Systems, San José, CA, USA

FlowJo 7.6.5 TreeStar, Ashland, OR, USA

GraphPad Prism 4 GraphPad Software, La Jolla, CA, USA

GraphPad Prism 5 GraphPad Software, La Jolla, CA, USA

MxPro-Mx3005P Stratagene, La Jolla, CA, USA

Office 2010 Microsoft, Redmond, WA, USA

Primer Express 2.0 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA

SoftMax Pro V5 Bucher Biotech AG, Basel, Schweiz

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Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 8 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

8.1 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Überleben und geschlechtsspezifisches Überleben in SSc 16 Abbildung 2: Der modified Rodnan skin score (mRSS) als Maß der Krankheitsaktivität 19 Abbildung 3: Überleben in SSc mit und ohne Organmanifestationen 21 Abbildung 4: Aufbau eines Modells eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors 25 Abbildung 5: Mechanismen der GPCR-Desensitisierung und -Internalisierung 28 Abbildung 6: Inflammatorische Signalwege von GPCRs 29 Abbildung 7: Struktur des humanen AT1R 31 Abbildung 8: Verhältnis von ETAR- und ETBR-Expression in verschiedenen Geweben und Gefäßen 38 Abbildung 9: AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen im Serum von gesunden Spendern und Spendern mit rheumatischen Erkrankungen 39 Abbildung 10: AT1R- und ETAR-vermittelte funktionelle Effekte von Auto-Ak in HMECs 40 Abbildung 11: Expression des AT1R und des ETAR in humanen PBMCs 44 Abbildung 12: Proteinexpression des AT2R und des ETBR in humanen PBMCs, Verhältnis der Proteinexpression des AT1R zum AT2R sowie des ETAR zum ETBR 45 Abbildung 13: Zusammenhang zwischen Alter der Spender und Proteinexpression der Rezeptoren 46 Abbildung 14: Vergleich der Rezeptorexpression in PBMCs zwischen gesunden Frauen und SSc-Patientinnen 49 Abbildung 15: Vergleich der Rezeptorexpression in PBMCs zwischen gesunden Männern und männlichen SSc-Patienten 49 Abbildung 16: Zusammenhang zwischen der Krankheitsaktivität der SSc-Patienten und der Proteinexpression der Rezeptoren in ihren PBMCs 51 Abbildung 17: Zusammenhang zwischen der Erkrankungsdauer der SSc-Patienten und der Protein-expression des AT1R in ihren PBMCs 52 Abbildung 18: Zeitlicher Verlauf der Rezeptorexpression des AT1R, AT2R, ETAR und ETBR auf PBMCs unter IgG-Stimulation in vitro, Etablierung 53 Abbildung 19: Zeitlicher Verlauf der Rezeptorexpression des AT1R, AT2R, ETAR und ETBR auf PBMCs unter IgG-Stimulation in vitro 55 Abbildung 20: Veränderung des Verhältnisses der Rezeptordichten des AT1R zum AT2R sowie des ETAR zum ETBR unter IgG-Stimulation 56 Abbildung 21: Etablierung eines T-Zell-Migrationsassays 57

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Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abbildung 22: Etablierung der T-Zell-Migration mit natürlichen Liganden und SSc- IgG 58 Abbildung 23: Etablierung von geeigneten Konzentrationen des selektiven AT1R- Antagonisten Valsartan und des selektiven ETAR-Antagonisten Sitaxsentan bei der Migration von T-Zellen 58 Abbildung 24: IgG-induzierte Migration von T-Zellen und ihre Hemmung durch selektive Rezeptorantagonisten 59 Abbildung 25: IgG-induzierte Migration von T-Zellen und ihre Hemmung durch selektive Rezeptorantagonisten 61 Abbildung 26: Zusammenhang zwischen der Erkrankungsdauer der SSc-Patienten und der durch ihr IgG induzierten T-Zellmigration 61 Abbildung 27: Vergleich der IgG-induzierten T-Zellmigration von gesunden IgG- Spendern und SSc-Patienten, sowie von SSc-Patienten mit limitierter oder diffuser Hautfibrose und mit oder ohne Ulzerationen 62 Abbildung 28: Analyse von Oberflächenmarkern und phänotypische Charakteri- sierung von Monozyten und monozytären Subpopulationen nach Stimulation mit SSc-IgG 63 Abbildung 29: Analyse von löslichen Markern nach Stimulation mit SSc-IgG 64 Abbildung 30: Testexperiment zur dosisabhängigen Hemmbarkeit einer ligandeninduzierten IL-8-Sekretion mit selektiven Rezeptorantagonisten 65 Abbildung 31: Testexperiment zur Stimulation von PBMCs mit IgG von Gesunden und SSc Patienten sowie Lipopolysaccharid, Angiotensin II und Endothelin-1 66 Abbildung 32: Überprüfung auf eine mögliche Beeinträchtigung der Viabilität der PBMCs durch die selektiven Rezeptorantagonisten Valsartan und Sitaxsentan 66 Abbildung 33: Testexperiment zum zeitlichen Verlauf der IL-8-Konzentration und der Wirkung der selektiven Rezeptorantagonisten bei der Stimulation von PBMCs mit IgG von SSc-Patienten 67 Abbildung 34: Testexperiment zum zeitlichen Verlauf der IL-8-Konzentration und der Wirkung der selektiven Rezeptorantagonisten bei der Stimulation von PBMCs mit IgG von SSc-Patienten 68 Abbildung 35: IL-8- und CCL18-Konzentrationen im Überstand nach Stimulation von PBMCs mit SSc-IgG mit und ohne Rezeptorantagonisten 69 Abbildung 36: Zusammenhang der SSc-IgG-induzierten IL-8-Konzentrationen mit klinischen Parametern der SSc-IgG-Spender 70 Abbildung 37: Zusammenhang der SSc-IgG-induzierten CCL18-Konzentration mit der IL-8-Konzentration sowie mit klinischen Parametern der SSc- IgG-Spender 71 Abbildung 38: Verlauf der SSc-IgG-induzierten Zytokin-Konzentrationen im Überstand in Abhängigkeit von der Erkrankungsdauer der SSc-IgG- Spender 71

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Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abbildung 39: IL-8- und CCL18-Konzentration im Überstand nach Stimulation von PBMCs mit gepooltem SSc-IgG mit und ohne Rezeptorantagonisten in verschiedenen Konzentrationen und Kombinationen 73 Abbildung 40: IL-8- und CCL18-Konzentration im Überstand nach Stimulation von PBMCs mit gepooltem SSc-IgG mit und ohne Rezeptorantagonisten einzeln und in verschiedenen Kombinationen 73 Abbildung 41: Vergleich der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen zwischen den Subklassen IgG1, 2, 3 und 4 im Serum von gesunden Spendern und SSc-Patienten 75 Abbildung 42: Vergleich der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen von IgG1, 2, 3 und 4 im Serum zwischen gesunden Spendern und SSc- 75 Patienten Abbildung 43: Vergleich der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen von IgG1, 2, 3 und 4 mit den Auto-Ak-Konzentrationen des Gesamt-IgG im Serum von SSc-Patienten 76 Abbildung 44: Vergleich der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen von IgG1, IgG3 und Gesamt-IgG im Serum von SSc-Patienten mit lcSSc und dcSSc sowie anderen SSc-Formen 76 Abbildung 45: Zusammenhang der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen von IgG1, IgG3 und Gesamt-IgG im Serum von SSc-Patienten mit der Zeit seit Beginn des Raynaud-Syndroms 77 Abbildung 46: Zusammenhang der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen von IgG1, IgG3 und Gesamt-IgG im Serum von SSc-Patienten mit der forcierten Vitalkapazität der Lunge 78 Abbildung 47: Zusammenhang der AT1R- und ETAR-Auto-Ak-Konzentrationen von IgG1, IgG3 und Gesamt-IgG im Serum von SSc-Patienten mit der forcierten Vitalkapazität der Lunge 79 Abbildung 48: Unterscheidung der PBMC-Subtypen im Durchflusszytometer 112 Abbildung 49: Ermittlung der Rezeptorexpression anhand der Durchflusszytometriedaten 113 Abbildung 50: Schematische Darstellung der Präparation eines Chemotaxisassays 120

8.2 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Statistischer Zusammenhang zwischen Alter der Spender und Proteinexpression der Rezeptoren 47 Tabelle 2 Unterschiede in der Proteinexpression der Rezeptoren zwischen weiblichen und männlichen SSc-Patienten sowie gesunden Spenderinnen und Spendern 48

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Danksagung 9 Danksagung

Ich danke Frau Prof. Riemekasten ganz herzlich für ihr Vertrauen und ihre Unterstützung, für ihre Ideen und die stets anregenden Diskussionen, und nicht zuletzt für die Bereitstellung der finanziellen Mittel, durch die diese Arbeit erst möglich geworden ist.

Herrn Prof. Lauster danke ich herzlich für seine Bereitschaft, diese Arbeit zu betreuen und in allen Fragen zu unterstützen.

Ich danke all meinen Kollegen der Arbeitsgruppe AG Riemekasten, die jahrelang meine Gefährten in guten und in schlechten Zeiten des Wissenschaftlerdaseins waren, und die mir stets hilfsbereit und diskussionsfreudig zur Seite standen. Besonders erwähnen möchte ich hier Reinmar Undeutsch, Angela Kill, Mike Becker, Elise Siegert, Philipp Enghard, Jens Humrich, Caroline Spee-Mayer, Dimas Abdirama, Judith Rademacher, Anika Klaus und Kathrin Mattat. Danke für die wunderbare Zeit!

Den lieben Kollegen im DRFZ, besonders denen der AG Buttgereit, danke ich für die stets freundliche und fröhliche Atmosphäre sowie die immer offenen Ohren bei Problemen aller Art, besonders hervorheben möchte ich hierbei Martin Hahne, Monique Fangradt, Paula Hoff, Cindy Strehl und Manuela Jackstadt. Ohne Euch hätte es nur nur halb so viel Spaß gemacht!

Darüber hinaus danke ich all den freundlichen Menschen im DRFZ und in der Rheumatologie der Charité, denen ich im Laufe der Jahre begegnet bin und die auf die eine oder andere Weise zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, wenngleich ich hier nicht alle namentlich erwähnen kann.

Meinem zukünftigen Ehemann Timo danke ich für die unermüdliche, immerwährende und geduldige Unterstützung – ohne Dich wäre diese Arbeit nicht zum Ende gekommen, Dir gilt mein innigster Dank!

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Lebenslauf und relevante Veröffentlichungen 10 Lebenslauf und relevante Veröffentlichungen

10.1 Lebenslauf

Persönliche Angaben