FILOGENIA MOLECULAR Y BIOGEOGRAFÍA HISTÓRICA DE Oreobolus (CYPERACEAE)
JULIANA CHACON PINILLA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BOGOTA D. C. 2003 FILOGENIA MOLECULAR Y BIOGEOGRAFÍA HISTÓRICA DE Oreobolus (CYPERACEAE)
JULIANA CHACON PINILLA
Trabajo de Grado para optar al título de Biólogo
Director Santiago Madriñán, Ph. D. Profesor Asistente del Departamento de Ciencias Biológicas Universidad de los Andes
Codirector Favio González, Ph. D. Profesor del Departamento de Biología Universidad Nacional de Colombia
ii AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer al profesor Santiago Madriñán, director de esta tesis, por hacer posible la realización de esta investigación y por su continuo interés y dedicación hacia la misma. Gracias por transmitirme el interés por el estudio de las plantas y la evolución, y por la energía, la paciencia y el apoyo incondicional que me brindó desde la difícil etapa de laboratorio hasta la ejecución del manuscrito final. Al profesor Favio González, codirector de esta tesis, por sus valiosos comentarios y sugerencias. También quisiera agradecer a Julio Betancur por las muestras de Oreobolus que amablemente cedió para ser utilizadas en este trabajo. A Mark W. Chase y a mis compañeros en Kew Gardens, por abrirme las puertas del laboratorio Jodrell y por su constante interés y sugerencias. A mis compañeros del Laboratorio de Botánica & Sistemática de la Universidad de los Andes; Rafa, Alfredo, Jorge y Adriana, por sus sonrisas y su amistad. A Andrés por estar siempre ahí y ser un apoyo incondicional en todos los momentos. Finalmente quisiera dar las gracias por todo a mis padres, mis hermanos y a mi grandiosa familia…a ellos les dedico este trabajo.
iii TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN...... v
INTRODUCCION...... 1
Distribución geográfica de Oreobolus ...... 1
Taxonomía del género Oreobolus...... 3
Estudios sistemáticos de Oreobolus realizados por Mora-Osejo (1987) y Seberg (1988)
...... 6
Comparación de la hipótesis de Mora-Osejo (1987) y la de Seberg (1988)...... 6
MATERIALES Y MÉTODOS...... 10
Muestreo taxonómico...... 10
Secuenciación del ADN ...... 10
Análisis filogenético...... 12
Calibración del reloj molecular...... 14
RESULTADOS...... 16
DISCUSION ...... 19
Relaciones filogenéticas del género Oreobolus...... 19
Biogeografía histórica de Oreobolus...... 21
CONCLUSION...... 26
LITERATURA CITADA...... 28
FIGURAS Y TABLAS ...... 31
iv RESUMEN
Oreobolus (Cyperaceae) es un género de plantas que crecen formando cojines cerca de pantanos de las montañas de Centro y Suramérica, Islas del Pacífico Sur, Australia y el archipiélago de Hawaii. Su hábito peculiar es el resultado de las ramificaciones acrotónicas, justo por debajo de la inflorescencia, carácter compartido con el género monotípico Schoenoides y con unas pocas especies del género Costularia. Schoenoides oligocephalus y Oreobolus comparten además la presencia de un pseudopeciolo en la lámina foliar.
Previas hipótesis sobre las relaciones filogenéticas de las especies de Oreobolus han sido propuestas por Mora-Osejo en 1987 y Seberg en 1988, el primero limitándose a las especies americanas y el segundo abarcando la totalidad del género. Las incongruencias entre dichas filogenias han generado hipótesis biogeográficas diferentes que intentan explicar los patrones de distribución del género.
Mediante la secuenciación del gen nuclear ITS y de los genes plastidiales trnL y rbcL, se propone una filogenia molecular de Oreobolus, la cual se compara con las hipótesis filogenéticas propuestas previamente. Los resultados del análisis molecular generaron el siguiente árbol: (C. laxa ((O. pectinatus, O. strictus), (S. oligocephalus (O. furcatus (O. oxycarpus, O. distichus)))), (O. pumilio (O. obtusangulus (O. ecuadorensis (O. cleefii (O. goeppingeri, O. venezuelensis)))))). Este resultado demuestra que S. oligocephalus no es el grupo hermano de Oreobolus, como propone Seberg, sino que se encuentra embebido en el clado de especies de este género provenientes del Pacífico. En las diferentes filogenias obtenidas se presentan dos clados; uno conformado por las especies suramericanas (clado suramericano) y otro conformado por la especies del Pacífico Sur,
v Australia y Hawaii (clado Pacífico). Oreobolus distichus (especie australiana) hace parte del clado Pacífico, posición que conlleva a una hipótesis biogeográfica diferente a la de
Seberg, según la cual esta especie forma parte del clado suramericano. La topología del clado suramericano y la posición de O. obtusangulus como grupo hermano de las demás especies suramericanas, sugieren una progresión geográfica de algunas especies hacia el norte de Suramérica, apoyando la hipótesis biogeográfica de Mora-Osejo. La evidencia molecular indica que O. obtusangulus ssp. unispicus no es una subespecie de O. obtusangulus, validando el estatus de especie de O. cleefii sensu Mora-Osejo.
La presencia de O. furcatus en Hawaii permitió la calibración de un reloj molecular basada en la edad mínima de surgimiento de éste archipiélago hace mínimo 5,1 millones de años. La distribución de esta especie en Hawaii es el resultado de eventos de dispersión a larga distancia a partir de Australia u otras islas del Pacífico Sur.
vi INTRODUCCION
El género Oreobolus R. Br. (Familia Cyperaceae) está conformado por un conjunto de plantas que crecen formando cojines debido a la innovación basal de los brotes justo por debajo de la inflorescencia (carácter c' en Seberg 1988, figura 1). Esta característica es compartida con otras especies como Schoenoides oligocephalus (W. M. Curtis) O.
Seberg, y con las especies del género Costularia subgénero Chamaedendron de
Kükenthal, más C. brevicaulis (Seberg 1988).
Schoenoides y Oreobolus forman un grupo monofilético ya que, además del tipo de innovación mencionada, comparten otras características como la filotaxis espiro- ortodística, la presencia de pseudopecíolo (carácter e' en Seberg 1988), que puede ser una sinapomorfia para el grupo Schoenoides+Oreobolus, y la presencia de cuerpos de sílica piriformes, cónicos o en forma de domo. Además poseen un tipo de tépalos escamosos ubicados en dos verticilos alternos, los cuales están presentes en todas las especies de
Schoenoides y Oreobolus, excepto en O. ambiguus donde dichos tépalos tienen forma de cerda (Seberg 1988).
Oreobolus aparentemente es un género monofilético que se separa de Schoenoides debido a que presenta espiguillas unifloras ligeramente comprimidas (carácter f' en Seberg
1988), compuestas de tres o cuatro glumas según la especie.
Distribución geográfica de Oreobolus Oreobolus presenta un patrón de distribución complejo, que no ha podido explicarse con certeza. La distribución de este género se conoce como disyunta ya que se encuentra en dos regiones ampliamente separadas del hemisferio sur (Brown & Lomolino 1998). La primera región comprende los páramos, punas y jalcas de la cordillera de los Andes en 2
Suramérica (Colombia, Venezuela, Ecuador, Perú, Chile y Argentina), con algunas poblaciones aisladas en Brasil (Sierra de la neblina), y parte de Centroamérica (Panamá y
Costa Rica). La segunda comprende las praderas alpinas de algunas islas del Pacífico Sur
(Nueva Zelandia, Tasmania, Nueva Guinea, Borneo, Sumatra, Filipinas), Australia y
Hawaii (Seberg 1989; 1991).
Oreobolus presenta una interesante historia filogenética y biogeográfica similar a la de otras plantas como Nothofagus (familia Fagaceae) y algunos miembros de las familias
Proteaceae, Winteraceae y Gesneriaceae (Seberg 1988). Varios grupos de animales también presentan este tipo de distribución, como por ejemplo ciertos dípteros de las familias Chironomidae y Sciadoceridae, algunos invertebrados de las familias
Lepidoptera y Hemiptera (Seberg 1988), y algunos vertebrados como las ranas Pipinae y
Xenopinae, los peces Galaxioidea y varios grupos de marsupiales (Brown & Lomolino
1998).
La coincidencia en cuanto a la distribución de dichos grupos ha inspirado a varios investigadores para explicar la formación de los continentes del Pacífico Sur, basándose en la hipótesis biogeográfica de la vicarianza (Seberg 1988). Según esta hipótesis los patrones de distribución que hoy observamos en los diferentes taxa son el reflejo de la división (vicarianza) de áreas antiguas, y no de eventos de dispersión. Así, la principal
área de diversificación de plantas y animales probablemente se encontraba en el súper continente Gondwana (Suramérica, Africa, Madagascar, India, Nueva Zelandia, Antártica y Australia, aproximadamente 130 millones de años antes del presente (map)), donde las condiciones climáticas de latitudes tropicales y las variadas condiciones edáficas permitieron tal diversificación (Brown & Lomolino 1998; Raven & Axelrod 1974). Hace 3
100 millones de años, la biota que antes formaba parte de Gondwana, se dividió tras la separación de Australasia (Australia, Antártica, algunas islas del Pacífico Sur y Nueva
Zelandia) y de Gondwana Occidental (Suramérica y Africa). Sin embargo, por un lado se mantuvo una migración directa entre estos nuevos continentes y por el otro, entre
Australasia y Suramérica via Antártica-India. Al parecer ésta fue la principal ruta de migración para las primeras angiospermas, como Nothofagus, en cuyo caso las evidencias provienen de registros palinológicos (Raven & Axelrod 1974; Bremer 2002).
Taxonomía del género Oreobolus El género Oreobolus comprende quince especies de plantas cuya distribución geográfica se presenta a continuación; esta lista se basa en las descripciones de Seberg (1988) y
Mora-Osejo (1987). También se incluyen a Schoenoides oligocephalus y Costularia laxa, esta última como grupo externo del análisis filogenético.
Oreobolus acutifolius S. T. Blake: se encuentra en hábitats húmedos, entre 650 y 1300 metros sobre el nivel del mar (msnm), en el centro de Tasmania.
Oreobolus ambiguus G. Kükenthal & C. G. G. J. van Steenis: se encuentra en los pantanos de las praderas alpinas y subalpinas de las islas Celebes , Borneo y Nueva
Guinea; entre 2450 y 4150 msnm.
Oreobolus cleefii Mora-Osejo: en los sitios pantanosos de los páramos de la cordillera de los Andes en Colombia, Ecuador y Norte del Perú, entre 3000 y 4400 msnm. Fue descrita por O. Seberg como una subespecie de O. obtusangulus (Oreobolus obtusangulus ssp. unispicus). 4
Oreobolus distichus F. v. Mueller: en regiones húmedas de la zona alpina, en las montañas del sureste y suroeste de Australia (1300 a 2400 msnm), y en el centro de
Tasmania (1100 a 1650 msnm).
Oreobolus ecuadorensis T. Koyama: en los páramos de la Cordillera de los Andes de
Colombia, Ecuador y Perú; entre 3200 y 4100 msnm.
Oreobolus furcatus H. Mann: en pantanos y sitios húmedos de bosques, es raro encontrarlo en substratos áridos. Se encuentra en algunas islas de Hawaii (Hawaii, Maui,
Molokai, Oahu, Kauai) entre 650 y 3300 msnm. Se han reportado especimenes en Tahití
(Mt. Orehena) a 2200 msnm.
Oreobolus goeppingeri K. Suessenguth: en los páramos de la Cordillera de Talamanca en Panamá y Costa Rica, y en los Andes de Colombia y Ecuador. Hay algunos registros en Brasil (Amazonas y Sierra de la Neblina).
Oreobolus impar E. Edgar: pantanos y praderas húmedas en la Isla del Sur e Isla
Stewart en Nueva Zelandia. Se encuentra entre 200 y 1900 msnm.
Oreobolus kuekenthalii C. G. G. J. van Steenis: en sitios húmedos de bosques montanos o en montañas de ericales (heaths), principalmente en la península Malaca y el norte de Sumatra.
Oreobolus obtusangulus C. Gaudichaud-Beaupré: se encuentra a 2400 msnm, al sur de
Chile y Argentina (Patagonia y Tierra del Fuego). También en la islas Malvinas y Juan
Fernandez (Masafuera).
Oreobolus oxycarpus S.T Blake: tiene 2 subespecies:
Oreobolus oxycarpus ssp. oxycarpus: en pantanos entre 1450 y 2000 msnm, en las montañas del sureste y oeste de Australia. 5
Oreobolus oxycarpus ssp. brownii (O. Seberg): en hábitats húmedos, entre 750 y 1200 msnm, en las montañas del oeste de Tasmania.
Oreobolus pectinatus J. D. Hooker: en hábitats húmedos, desde el nivel del mar hasta
2150 msnm, en las islas de Nueva Zelandia (Islas Norte y Sur, Stewart, Campbell y
Auckland).
Oreobolus pumilio R. Brown: tiene 2 subespecies:
Oreobolus pumilio ssp. pumilio: se encuentra en zonas húmedas alpinas, a lo largo de quebradas y bordes de lagos; entre 240 y 1600 msnm. También en el sureste de las montañas de Australia, y entre 900 y 1650 msnm en el centro de Tasmania.
Oreobolus pumilio ssp. clemensiae G. Kükenthal: se encuentra en pantanos de praderas alpinas. Sólo se conocen especímenes de Nueva Guinea, por encima de 3000 msnm.
Oreobolus strictus S. Berggren: en hábitats húmedos, desde el nivel del mar hasta 1500 msnm. Está distribuida en Nueva Zelandia en las Islas del Norte y del Sur e Isla Stewart.
Oreobolus venezuelensis J. A. Steyermark: en pantanos de cojines y de Sphagnum, en la Cordillera de Talamanca en Costa Rica y Panamá. También en la Cordillera de los
Andes de Colombia, Ecuador, suroeste de Venezuela y en Perú.
Schoenoides oligocephalus (W. M. Curtis) O. Seberg = Oreobolus oligocephalus W.
M. Curtis: se encuentra distribuida en Australia y Tasmania.
Costularia laxa Cherm.: al igual que Oreobolus crece formando cojines en hábitats húmedos de las altas montañas de Nueva Caledonia, Africa, Madagascar e islas adyacentes. 6
Estudios sistemáticos de Oreobolus realizados por Mora-Osejo (1987) y Seberg (1988) Mora-Osejo (1987) realizó un estudio acerca de la biogeografía y sistemática de las especies americanas del género Oreobolus (Oreobolus cleefii, O. ecuadorensis, O. goeppingeri, O. obtusangulus y O. venezuelensis), empleando a O. pumilio como grupo externo o de comparación. En su estudio filogenético utilizó como caracteres el tipo organizacional general de los brotes y las inflorescencias de Oreobolus, importantes en la diferenciación de las especies de este género. Mora-Osejo analizó los caracteres tipológicos ordenados de mayor a menor relevancia, y estableció las series de transformaciones de los mismos por medio del algoritmo de Wagner. Mediante la comparación entre dichas transformaciones y las posibles formas en que se dispersaron las especies, dedujo la "filogénesis” o transformación del “plan organizacional” de las especies americanas de Oreobolus a través del tiempo (Mora-Osejo 1987).
Seberg en su análisis filogenético y biogeográfico de Oreobolus (Seberg 1988) incluyó todas las especies del género y utilizó caracteres anatómicos y morfológicos, cuya polaridad determinó previamente.
Comparación de la hipótesis de Mora-Osejo (1987) y la de Seberg (1988) Existen incongruencias entre las hipótesis de Mora-Osejo (1987) y Seberg (1988) en cuanto a las relaciones filogenéticas de las especies suramericanas de Oreobolus (figura
2). En la filogenia propuesta por Seberg (1988) O. distichus, proveniente de Australia y
Tasmania, aparece como grupo hermano de O. goeppingeri la cual se encuentra profundamente embebida en el clado de especies suramericanas. Esto no sucede en la hipótesis de Mora-Osejo (1987) en la que O. ecuadorensis es la especie hermana de O. 7 goeppingeri. Por otro lado Mora-Osejo incluyó a O. cleefii como una especie diferente mientras que Seberg la incluyó como subespecie de O. obtusangulus (O. obtusangulus ssp. unispicus), formando un clado monofilético con O. obtusangulus ssp. obtusangulus.
Si se acepta dicha circunscripción, en la hipótesis de Mora-Osejo O. obtusangulus sería parafilética ya que no estaría incluyendo a O. cleefii. Finalmente O. venezuelensis es el grupo hermano de las especies suramericanas en la hipótesis de Mora-Osejo mientras que en la hipótesis de Seberg es O. ecuadorensis.
Con estas dos hipótesis filogenéticas incongruentes se deducen entonces dos hipótesis biogeográficas distintas, una incluyendo todas las especies del género (Seberg 1988) y la otra incluyendo solamente las especies del Neotrópico (Mora-Osejo 1987). Según Mora-
Osejo la diversificación de las especies americanas de Oreobolus se inició en Suramérica meridional durante el Pleistoceno, hace aproximadamente 2.5 millones de años. La primera especie en aparecer sería O. obtusangulus en Argentina, a medida que iba surgiendo la cordillera de los Andes se iban creando condiciones similares a las del sur del continente permitiendo que otras especies se dispersaran hacia el norte. Este sería el caso de O. venezuelensis que se expandió hacia Venezuela y O. cleefii que posiblemente surgió en las montañas de Chile y luego se expandió hacia el norte. Oreobolus goeppingeri y O. ecuadorensis probablemente se diversificaron durante el Pleniglaciar, cuando en las montañas de los Andes predominaban las bajas temperaturas y la vegetación paramuna (Mora-Osejo 1987).
La hipótesis anterior se diferencia en gran medida de la que Seberg (1988) presenta en su análisis filogenético y biogeográfico de Oreobolus. Mediante el análisis de cladogramas de área este autor dedujo que la diversificación del género posiblemente se inició en un 8
área que comprendía a Australia, Tasmania y Suramérica o Nueva Zelandia. Esta conclusión se basa en el hecho que éstas cuatro regiones aparecen formando un grupo monofilético en el cladograma de área, por lo cual puede inferirse que presentan una misma historia geográfica (Brown & Lomolino 1998). Este resultado es similar al de los cladogramas de área hechos por Patterson en los años ochenta, a partir de datos de marsupiales y otros vertebrados, en los cuales Suramérica y Australia aparecen como grupos hermanos. Según la hipótesis de Seberg (1988) Oreobolus se diversificó a partir de los continentes del Pacífico Sur, cuando en el mapa aparecieron Gondwana occidental y Australasia. La dispersión hacia Suramérica pudo darse a través de puentes terrestres como la conexión entre Antártica y Asia o algunas islas del Pacífico Sur. Esto se remontaría a mediados del Cretácico, hace aproximadamente 110 millones de años
(Seberg 1989; 1991).
En vista de las incongruencias entre las filogenias propuestas por Mora-Osejo (1987) y
Seberg (1988), y de sus distintas implicaciones biogeográficas, en el presente estudio se construye una filogenia de Oreobolus basada en caracteres moleculares la cual se contrasta con las hipótesis morfológicas expuestas anteriormente. En base a los patrones de la filogenia molecular y a los tiempos de divergencia estimados a partir de las secuencias de ADN se infieren los procesos biogeográficos que pudieron llevar a la distribución actual de Oreobolus. Para este fin se realizaron extracciones de ADN de algunas especies de este género, además de Schoenoides oligocephalus y Costularia laxa
(utilizada como grupo externo), y se secuenciaron los genes ITS, trnL y rbcL. A diferencia de este último gen, ITS y trnL fueron lo suficientemente variables e 9 informativos como para inferir las relaciones filogenéticas entre las diferentes especies analizadas. 10
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestreo taxonómico Se realizaron 39 extracciones de 13 especies del género Oreobolus, 3 especies del género
Costularia y de la única especie del género Schoenoides (Schoenoides oligocephalus).
Se utilizaron especímenes preservados en sílica gel provenientes de la colección de plantas de páramo del Laboratorio de Botánica & Sistemática de la Universidad de los
Andes, y especímenes suministrados por J.J. Bruhl (Royal Botanic Gardens, Sydney).
Algunas muestras secas fueron facilitadas por Julio Betancur (Instituto de Ciencias
Naturales, Universidad Nacional de Colombia). Adicionalmente se utilizaron especímenes de herbario (COL y K); la información sobre la localidad, el voucher y la procedencia de dichos especímenes se encuentra en la Tabla 1. La secuencia de O. kuekenthalii para el gen rbcL se obtuvo de GenBank (ver número de acceso en la Tabla
1).
Secuenciación del ADN El ADN se extrajo de ~0.5 g de hojas preservadas en sílica gel y de ~0.08-0.2 g de hojas de material de herbario, usando el método CTAB modificado de Doyle & Doyle (1987).
Posteriormente el ADN fue precipitado utilizando etanol 96% para las muestras de sílica gel, e isopropanol para las muestras de herbario. Este producto fue purificado mediante el gradiente de cloruro de cesio-bromuro de etidio. El ADN extraído se visualizó en geles de agarosa al 1%. En el caso de las muestras de herbario fue necesario realizar una segunda purificación a través de las columnas QIAquick (Qiagen, Inc.), según los protocolos de los fabricantes, debido a que no se pudo visualizar el ADN en el gel. 11
El perfil térmico del PCR para ITS consistió de 28 ciclos, cada uno con 2 minutos de pre- fundición a 94°C, 1 minuto de denaturación a 94°C, 1 minuto de anillamiento a 50°C, 3 minutos de extensión a 72°C y 7 minutos de extensión final a 72°C. Para trnL y rbcL el perfil térmico consistió de 28 ciclos, cada uno con 3 minutos de pre-fundición a 94°C, 1 minuto de denaturación a 94°C, 1 minuto de anillamiento a 48°C, 1 minuto de extensión a 72°C y 7 minutos de extensión final a 72°C. Fue necesario modificar el perfil térmico del PCR para algunas muestras de herbario, aumentando la temperatura de anillamiento y el tiempo de extensión, ya que el ADN se encontraba muy degradado y en muy bajas concentraciones. Los productos de PCR fueron purificados usando las columnas
QIAquick (Qiagen, Inc., siguiendo los protocolos para productos de PCR) y posteriormente fueron reamplificados mediante ciclos de secuenciación. Estos consistieron de 26 ciclos con 10 segundos de denaturación a 96°C, 5 segundos de anillamiento a 50°C y 4 minutos de extensión a 60°C, usando dideoxi-dntp's y terminadores big-dye (Applied Byosystems, Inc.). Los productos de las reacciones de secuenciación fueron purificados mediante precipitación simple. Las muestras resuspendidas se corrieron en un secuenciador ABI 3700 automated sequencer (Applied
Byosystems, Inc.) siguiendo las instrucciones de los fabricantes.
Se secuenciaron el espaceador transcrito interno nuclear (ITS) y los genes de cloroplasto trnL y rbcL. En el primer caso se amplificó la región de ~700 pares de bases (pb) que se encuentra entre las subunidades de RNAr, 18S y 26S, incluyendo la subunidad 5.8S
(Soltis et al. 1998). Para amplificar las muestras de sílica gel se utilizaron el cebador directo AB101 y el reverso AB102, mientras que para las de herbario fue necesario llevar a cabo la amplificación por partes utilizando adicionalmente dos cebadores internos: el 12 reverso ITS2 y el directo ITS3 (Tabla 2) (Baum et al. 1998). En el caso de trnL, se amplificó el intrón que se encuentra entre los exones trnL (UAA) 5' y trnL (UAA) 3'
(~650 pb), así como el espaceador que está entre el exón trnL (UAA)3' y trnF (GAA)
(~460 pb) (Taberlet et al. 1991). Para las muestras de sílica gel se utilizaron el cebador directo c y el reverso f, mientras que para las de herbario nuevamente fue necesario amplificar el gen por partes, utilizando las parejas c-d y e-f (Tabla 2) (Taberlet et al.
1991). Se amplificó el exón rbcL en dos mitades que se sobrelapaban usando cebadores directos que comenzaban en las posiciones 1F y 636F, y cebadores reversos que comenzaban en las posiciones 724R (Monocots) y 1460R pb (Tabla 2) (Fay et al. 1997).
Análisis filogenético La edición y ensamblaje de las secuencias obtenidas se realizó con el programa
SequencherÔ, versión 4.1. Las secuencias fueron alineadas a ojo usando MacClade versión 4.0b (Maddison & Maddison 2002). El análisis filogenético se llevó a cabo en el programa PAUP* versión 4.0b10 para Macintosh (Swofford 2002). Se realizó un análisis de parsimonia para cada conjunto de datos independientemente y luego para los datos combinados, mediante una búsqueda heurística en la que se utilizaron los caracteres desordenados y con igual peso. Los espacios fueron codificados como datos ausentes y
Costularia laxa se incluyó como grupo externo de los análisis. La congruencia entre las filogenias de los genes individuales se comprobó visualmente mediante la comparación del consenso estricto obtenido para cada gen. Posteriormente se realizó el análisis de
"evidencia total" (Nixon & Carpenter 1996) a partir de la matriz combinada.
Se realizó un árbol de consenso (compromiso) Adams para los datos combinados con el fin de identificar los taxa problemáticos. De esta manera O. kuekenthalii y O. acutifolius 13 se excluyeron de la matriz, el primero debido a que solo se tenía la secuencia del gen rbcL, y el segundo debido a que su posición era muy variable en cada uno de los análisis.
Otros taxa como O. venezuelensis 2 y O. goeppingeri 2 (Tabla 1) también fueron eliminados del análisis ya que aparecían formando una politomía con O. ecuadorensis en todos los árboles obtenidos. Probablemente se trate de dos variantes genéticas de O. ecuadorensis, en lo que podría ser un evento de especiación peripátrica. Sin embargo queda abierta la pregunta para futura investigaciones.
Con la nueva matriz se realizó de nuevo el análisis de parsimonia, usando los mismos valores que se mencionaron anteriormente. Se estimó el soporte bootstrap para cada clado por medio de una búsqueda heurística con 10000 réplicas, reteniendo los grupos cuya frecuencia de aparición fuera superior al 50%. Los taxa se adicionaron secuencialmente de manera simple, uniendo las ramas mediante el algoritmo TBR.
También se determinó el soporte de Bremer de cada clado mediante adición de taxa azarosa y 20 réplicas.
Finalmente se realizó un análisis Bayesiano por particiones por locus usando el programa
MrBayes versión 2.01 (Huelsenbeck 2000). El análisis se llevó a cabo con cuatro cadenas simultáneas para 1 millón de generaciones, muestreando cada 100 generaciones.
El nivel de estabilidad en las generaciones se determinó graficando estas últimas contra el logaritmo de las verosimilitudes (LnL o Log Likelihoods), de tal forma que todos los
árboles por debajo de dicho nivel fueron descartados. En este caso la estabilidad se logró a partir de la generación 20000. Para estimar el soporte de los clados se realizó un consenso de la regla de la mayoría del 50% (50% majority-rule consensus) con 100 réplicas. 14
Calibración del reloj molecular Para determinar las edades relativas de los diferentes clados se utilizó como base el árbol más parsimonioso resultante del análisis de "evidencia total". Aunque están incluidos tres genes que pueden tener tasas de evolución distintas, actualmente existen pocos métodos que puedan combinar los datos y a la vez tener en cuenta tales diferencias
(Wikström et al. 2001). Por esta razón se calcularon las longitudes de las ramas con los datos combinados ya que así tal vez es posible compensar los patrones inusuales de evolución de cada gen (Qiu et al. 1999). De esta manera se calibró la filogenia usando como punto de calibración la fecha de surgimiento del archipiélago de Hawaii, hace mínimo 5,1 millones de años (Carson & Clague 1995). Se utilizó esta fecha debido a que el área de distribución de Oreobolus furcatus se restringe a dicho archipiélago que, por ser de origen volcánico, no pudo ser colonizado por dicha especie antes de su surgimiento.
Para la calibración del reloj molecular se utilizó TreeEdit versión 1.0-alpha 4-61
(Rambaut & Charleston 2000). La tasa de heterogeneidad entre linajes fue evaluada para la matriz combinada usando la prueba de proporción de verosimilitudes, la cual compara el logaritmo de la verosimilitud de una hipótesis en la que se forza un reloj molecular y de otra en la que no. Para esto se utilizó el modelo por defecto implementado en PAUP*
(HKY85). Se rechazó la hipótesis nula según la cual los datos se comportan como reloj molecular (5518,77050 versus 5493.17761, p < 0,05) por lo cual se realizó el emparejamiento de tasas no paramétrico (NPRS o Non Parametric Rate Smoothing), que generó un árbol ultramétrico. Se determinaron los intervalos de confianza de las fechas resultantes por medio de una prueba bootstrap con 100 réplicas, en cada una de las cuales 15 se estimó el tiempo de divergencia sobre el mismo árbol que se fijó al comienzo. Este procedimiento se realizó dos veces según el tipo de optimización de los caracteres bajo
ACCTRAN o DELTRAN. 16
RESULTADOS
Los genes ITS y trnL fueron lo suficientemente variables como para resolver las relaciones filogenéticas de las especies de Oreobolus. Por el contrario el gen rbcL no presentó la suficiente variabilidad y solo 7 caracteres de un total de 1440 fueron informativos.
El análisis de parsimonia de la partición de los datos generó tres árboles para el gen ITS
(figura 3), uno para trnL (figura 4) y tres para rbcL (figura 5). Estas filogenias son congruentes excepto por algunos elementos que no se logran resolver. En el consenso estricto de ITS (figura 3) se puede observar que la posición de O. furcatus no se encuentra resuelta y se mueve entre el clado de especies suramericanas y el clado de especies del Pacífico. Esta especie aparece como el grupo hermano de S. oligocephalus,
O. oxycarpus y O. distichus en el único árbol de trnL. En el caso de O. pumilio sucede algo similar ya que esta especie aparece como grupo hermano de las suramericanas en los
árboles de ITS y rbcL (c.f. figuras 3 y 5), mientras que en el árbol de trnL (figura 4) forma una politomía con O. pectinatus y O. strictus. Estas especies a su vez forman el grupo hermano del clado suramericano siendo en total un componente único a la filogenia de trnL.
Uno de los componentes comunes a las particiones de los datos fue la presencia de la politomía formada por los especimenes ecuatorianos O. ecuadorensis, O. venezuelensis 2 y O. goeppingerii 2, como grupo hermano del clado (O. cleefii(O. goeppingerii, O. venezuelensis)). Sin embargo este componente no posee ningún soporte y solo aporta ruido al tratarse de duplicados de O. goeppingerii y O. venezuelensis. De esta manera 17 dichos duplicados (O. venezuelensis 2 y O. goeppingerii 2) fueron excluidos del análisis, no sin antes tratar de encontrar una posible explicación a la formación de tal politomía.
En el análisis combinado se analizaron 3260 caracteres de los cuales 70 fueron filogenéticamente informativos. La búsqueda heurística generó un árbol en el que aparecen resueltos los componentes conflictivos de la partición de los datos (L= 142, CI=
0,8592, RI= 0,8864 y RC= 0,7615, figura 6). Los valores de soporte bootstrap y Bremer de las diferentes ramas reflejan las incongruencias entre las filogenias individuales. De esta manera, el clado que incluye a O. furcatus posee un soporte bootstrap del 58% y un soporte Bremer de 1, y el que forma O. pumilio con las especies suramericanas posee un soporte boostrap del 76% y Bremer de 3.
El análisis bayesiano también permitió resolver las relaciones filogenéticas entre las especies de Oreobolus y generó una filogenia cuya topología fue idéntica a la del árbol resultante del análisis combinado de máxima parsimonia (figura 6). En este caso todos los clados poseen un soporte del 100% excepto el clado que forma S. oligocephalus como grupo hermano de (O. furcatus (O. oxycarpus, O. distichus)), cuyo soporte es del 99%.
Este árbol será la base del análisis filogenético y biogeográfico del presente estudio y en adelante se hará referencia al mismo como la filogenia molecular de Oreobolus.
Aparecen dos clados monofiléticos: un clado suramericano muy bien soportado (100% soporte bootstrap y 11 de soporte Bremer) cuya topología fue la misma en todos los análisis realizados, y un clado conformado por las especies provenientes del Pacífico Sur,
Australia y Hawaii (clado pacífico), cuyo soporte bootstrap es relativamente bajo (63%, ver figura 6). 18
Oreobolus distichus hace parte del clado pacífico y aparece como especie hermana de O. oxycarpus en todos los análisis realizados. A su vez estas dos especies conforman el grupo hermano de S. oligocephalus, la cual aparece embebida entre las especies de
Oreobolus.
Oreobolus obtusangulus, de Argentina, es la especie hermana de las demás suramericanas y se encuentra claramente diferenciada de O. cleefii, que aparece más embebida dentro de dicho clado. Esta especie conforma el grupo hermano del clado terminal (O. goeppingeri, O. venezuelensis) con un soporte muy alto (figura 6).
La calibración del reloj molecular dio como resultado dos fechas diferentes según el criterio de optimización de los caracteres. La diferencia entre las edades bajo cada criterio de optimización decreció a medida que se acercaba a las ramas más terminales.
Bajo la optimización ACCTRAN se obtuvo que la divergencia entre la especies suramericanas y O. pumilio sucedió entre 8,4 a 11,4 map. Bajo DELTRAN esta divergencia sucedió hace 6 a 8,2 map. Oreobolus obtusangulus comenzó a divergir de las demás especies suramericanas hace 4,9 a 7,2 map bajo la optimización ACCTRAN y hace 3,6 a 6,3 map bajo DELTRAN. 19
DISCUSION
Relaciones filogenéticas del género Oreobolus La presencia de un clado suramericano y un clado pacífico es un elemento común a las filogenias generadas mediante el análisis de la partición de los datos y de la evidencia total (figura 6). El clado suramericano es claramente monofilético y su topología se conserva en los diferentes análisis. El clado pacífico también es monofilético pero, a diferencia del suramericano, no posee un soporte muy alto y su topología varía dependiendo del gen analizado. Estos dos clados no se encuentran presentes en la filogenia morfológica realizada por Seberg (1988), quien incluyó todas las especies del género en su estudio. El único componente común a la filogenia morfológica de este autor y a la filogenia molecular es el clado formado por O. pectinatus y O. strictus, especies originarias de Nueva Zelandia.
Existen otros componentes incongruentes con la hipótesis filogenética de Seberg. Uno de los más importantes es la presencia de O. distichus en el clado pacífico, como especie hermana de O. oxycarpus. Las dos especies se distribuyen en Australia y Tasmania dando lugar a una relación filogenética más plausible que la propuesta por Seberg, quien ubica a O. distichus como la especie hermana de O. goeppingeri, proveniente del norte de
Suramérica.
La posición de S. oligocephalus en nuestra filogenia molecular, profundamente embebida entre las especies de Oreobolus, es otro elemento incongruente con la hipótesis filogenética de Seberg quien propone que Schoenoides es su grupo hermano. A nivel molecular no existen sinapomorfias que permitan diferenciar a Schoenoides de
Oreobolus. A simple vista la secuencia de ADN de los genes ITS y trnL es 20 prácticamente igual para ambos géneros y el filograma de la figura 6 indica que no hay suficientes cambios en sus secuencias que las diferencien sustancialmente.
A nivel morfológico la presencia de pseudopecíolo podría ser la sinapomorfia que une a los dos géneros (figura 1), como lo describe Seberg (1988) en su estudio. La presencia de cuerpos de sílica en las paredes anticlinales de las células de la epidermis (figura 7)
(carácter 4 en Seberg 1988) sería la sinapomorfia que define el clado formado por
Schoenoides y las especies de Oreobolus, específicamente las del Pacífico Sur, Australia y Hawaii (figura 8). Las inflorescencias unifloras (carácter 14 en Seberg 1988) podrían interpretarse como una convergencia entre S. oligocephalus y O. kuekenthalii y no como la característica que permita separar a Schoenoides de Oreobolus (Seberg 1988). De esta manera los argumentos anteriores podrían darle validez al estatus de la especie Oreobolus oligocephalus descrita por W. M. Curtis, evitando el nombramiento de un género monotípico difícilmente diferenciable de Oreobolus.
Oreobolus pumilio forma un clado monofilético con las especies suramericanas de las cuales O. obtusangulus es su grupo hermano. Esta especie proveniente de Argentina y
Chile se diferencia claramente de O. cleefii, que aparece embebida en el clado suramericano como hermana de O. goeppingeri y O. venezuelensis (figura 6). De esta forma se valida el estatus de la especie O. cleefii sensu Mora-Osejo y se invalida el de la subespecie O. obtusangulus ssp. unispicus sensu Seberg. Esto se debe a que en la filogenia molecular no hay sinapomorfias que apoyen un clado monofilético formado por las dos subespecies de O. obtusangulus, que sería parafilética de no ser O. cleefii una especie diferente. 21
La topología del clado suramericano en la filogenia molecular de Oreobolus (figura 6) es incongruente con la que proponen Seberg (1988) y Mora-Osejo (1987) en sus filogenias morfológicas. En la hipótesis de Mora-Osejo (1987) O. venezuelensis es el grupo hermano de las demás especies suramericanas mientras que en la de Seberg (1988) es O. ecuadorensis. Estas dos, al igual que O. goeppingeri y O. cleefii, presentan relaciones filogenéticas diferentes en la filogenia molecular, en la que la topología del clado suramericano refleja un patrón geográfico progresivo de las especies de Oreobolus hacia el norte de Suramérica (figura 6). Este patrón estaría dado por las áreas de distribución de las especies de Oreobolus en Suramérica, que en su orden son el reflejo de los clados hermanos de la filogenia molecular (Wiley 1988): las áreas hermanas de sur a norte, en orden secuencial son Argentina, Chile, Ecuador, Colombia, Venezuela y Costa Rica.
Este patrón se tratará con más profundidad a continuación.
Biogeografía histórica de Oreobolus La distribución de las especies de Oreobolus demuestra que se trata de un género típicamente gondwánico que tal vez se originó en Australasia después de que esta región se separara de Gondwana occidental, hace más de 100 map (Raven & Axelrod 1974;
Bremer 2002). Los ancestros del género tal vez habitaron un área que comprendía lo que actualmente es Australia, Tasmania, Nueva Zelandia y otras islas del Pacífico Sur. Años más tarde pudo iniciarse la dispersión de especies hacia el archipiélago de Hawaii y hacia
Suramérica, como se explicará más adelante.
Oreobolus furcatus es la única especie del género cuya distribución se limita a algunas islas del archipiélago de Hawaii (Hawaii, Maui, Molokai, Oahu y Kauai), habiendo reportes de especímenes colectados en Tahití (Seberg 1988). Este archipiélago de origen 22 volcánico se formó sobre un punto caliente (hot spot) del manto de la Tierra hace más de
80 millones de años. Algunas de las islas más antiguas son Nihoa, que se originó hace aproximadamente 7,2 map, y Kauai, hace 5,1 map (Carson & Clague 1995). La calibración del reloj molecular de nuestra filogenia se basó en la fecha de surgimiento de
Kauai, en la que actualmente se encuentra O. furcatus. Sin embargo es posible que algunos especimenes de Oreobolus se encontraran presentes en el archipiélago mucho antes de que dicha isla surgiera y se podría pensar en la extinción de especimenes más antiguos, tal vez como resultado de la intensa actividad volcánica de la zona (Carson &
Clague, 1995). De esta manera las fechas que se reportan en este estudio son edades mínimas de divergencia si se tiene en cuenta que estamos asumiendo que O. furcatus colonizó el archipiélago en el momento en que surgió Kauai y no antes.
En vista del tipo de origen del archipiélago de Hawaii, la presencia de Oreobolus en ese lugar solo puede explicarse como el resultado de eventos de dispersión a la larga distancia, tal vez a partir de Australia y Tasmania (figura 6). El transporte probablemente fue facilitado por aves que migraban a través del Océano Pacífico, llevando entre su plumaje algunas espiguillas que por accidente se quedaron adheridas a su cuerpo (Mora-
Osejo com. pers.).
Algo similar pudo haber ocurrido con la llegada de Oreobolus a Suramérica. La posición que ocupa O. pumilio como especie hermana del clado suramericano indica una relación de áreas hermanas entre Suramérica, Australia y Tasmania, en lo que sería claramente un componente Gondwánico. De antemano la explicación más plausible de la distribución de Oreobolus en esas dos áreas sería como el resultado de eventos de vicarianza de dos
áreas vecinas dentro de Gondwana, en donde tal vez se encontraban los ancestros de las 23 especies suramericanas y australianas (Wiley 1988, Craw 1982). Sin embargo según la calibración del reloj molecular la llegada de Oreobolus a Suramérica fue relativamente reciente (hace aproximadamente 6 a 11 map) si se compara con la fecha de separación de
Australia y Suramérica, hace por lo menos 45 map, cuando se rompió la conexión con el puente de la Antártica (Raven & Axelrod 1974). De esta manera se descarta la hipótesis de una posible migración directa de especies hacia Suramérica ya que solo hubiera sido posible a través de dicha conexión. La hipótesis alternativa es entonces un evento de dispersión a larga distancia a partir de Australia y Tasmania, como el descrito para O. furcatus.
Tras la llegada de especimenes de O. pumilio a Suramérica se iniciaría la diversificación de las especies hacia el norte del continente, comenzando con el surgimiento de O. obtusangulus en Argentina y Chile (figura 6). La divergencia de esta especie de sus ancestros australianos tal vez ocurrió hace 4 a 8 map en el Pleistoceno. En estos momentos el continente suramericano presentaba condiciones climáticas y edáficas similares a las de las altas montañas australianas y en la cordillera de los Andes apenas comenzaban a surgir los primeros elementos de páramo, a alturas que no sobrepasaba los
3000 metros (van der Hammen & Cleef 1986).
Durante el Pleistoceno, hace 2 a 4 map, la flora de páramo comenzaba a enriquecerse con nuevas especies que iban surgiendo a medida que la cordillera de los Andes se comenzaba a elevar, siendo testigo de continuos procesos de adaptación de especies que inmigraban continuamente desde regiones pacífico-australes, como Gunnera
(Gunneraceae) (Wanntorp et al. 2001; 2002). Los continuos cambios glaciares e interglaciares también pudieron impulsar eventos de extinción y reemplazo de especies 24 que intentaban adaptarse al medio cambiante (van der Hammen 1974). Hacía 4 map había finalizado la formación de las tres cordilleras en Colombia y la cordillera de Mérida en Venezuela (Kroonenber et al. 1990) y tal vez en esta panorámica fueron surgiendo las nuevas especies de Oreobolus, en un patrón geográfico progresivo de nacimiento de especies cada vez más hacia el norte de Suramérica. Este sería el caso de O. ecuadorensis y O. cleefii que probablemente surgieron en la región que hoy es Ecuador, hace 5 a 1 map aproximadamente (figura 6).
En este contexto, la politomía que formaban O. ecuadorensis con los especimenes ecuatorianos que supuestamente corresponden a O. venezuelensis y O. goeppingerii (O. venezuelensis 2 y O. goeppingerii 2, c. f. Tabla 1), puede relacionarse con los procesos de especiación que tal vez se presentaban en los Andes. Es posible que algunos individuos de la especie O. ecuadorensis hubieran comenzado a migrar hacia el norte, dándose un flujo genético entre las poblaciones periféricas ( tal vez de O. goeppingerii, O. venezuelensis u O. cleefii) y las centrales. Sin embargo aunque el flujo genético permite mantener la cohesión genética de la especie, es posible que el intercambio con representantes periféricos haya sido lo suficientemente fuerte como para fijar nuevos fenotipos (Brooks & McLennan 1991). En este caso una posible convergencia con el fenotipo de O. goeppingerii o de O. venezuelensis podría ser la causa de una identificación errada de los especimenes de herbario. Una evidencia podrían ser las secuencias de ADN de O. venezuelensis 2, O. goeppingerii 2 y O. ecuadorensis, para los genes trnL e ITS, que solo difieren entre sí por tres o cuatro bases.
En esta época (hace 5 map aproximadamente) el páramo propiamente dicho dominaba la vegetación de las altas montañas de los Andes y se comenzaban a dar procesos de 25 enfriamiento de los océanos en lo que sería una de las glaciaciones de comienzos del
Pleistoceno (van der Hammen & Cleef 1986). Estas condiciones tal vez permitieron que
O. cleefii continuara su migración a través del páramo hasta llegar a Colombia.
Columnas estratigráficas de polen de algunas localidades en la cordillera de los Andes
(van der Hammen 1974) demuestran que hace 1 millón de años se comenzó a presentar una continua alternancia entre vegetación de bosque y de páramo, reflejando continuos periodos glaciares e interglaciares que gradualmente permitían el enriquecimiento de la flora. En estos momentos tal vez surgieron O. venezuelensis y O. goeppingeri (hace aproximadamente 1 map a 20000 años) (figura 6), especies que posteriormente migrarían a través del puente de Panamá (cuyo levantamiento finalizó hace aproximadamente 5,7 map) hacia Costa Rica.
El patrón geográfico que se ha descrito es muy similar al que propuso Mora-Osejo (1987) en su análisis. Este autor propuso que la diversificación se inició en Argentina a partir de
O. obtusangulus durante el Pleistoceno seguida por O. venezuelensis, que continuaría su expansión hacia el norte de Suramérica. Aunque la sucesión de especies es diferente en la filogenia de Mora-Osejo (1987) la hipótesis sobre una migración hacia el norte del continente suramericano se encuentra respaldada totalmente por los resultados de este estudio. Lo contrario sucede con la hipótesis biogeográfica de Seberg (1988) donde la posición de O. distichus en el clado suramericano conlleva a hipótesis biogeográfica difícil de explicar. 26
CONCLUSION
El análisis de varios conjuntos de genes simultáneamente aporta un mayor número de caracteres que pueden resultar informativos para la resolver las relaciones filogenéticas de un grupo de organismos. En este caso el análisis de evidencia total permitió dilucidar las relaciones de las especies de Oreobolus, aclarando algunos componentes conflictivos de las particiones de los datos.
La filogenia molecular de Oreobolus demuestra que se trata de un género monofilético de origen gondwánico (figura 6). La topología del árbol demuestra que existe una clara separación entre las especies suramericanas y las provenientes del Pacifico Sur, Australia y Hawaii, formando dos clados monofiléticos ausentes en las filogenias morfológicas.
Existen algunas incongruencias con la filogenia propuesta por Seberg (1988), como la posición de O. distichus y S. oligocephalus en el clado pacífico. En cuanto al clado suramericano O. cleefii aparece como una especie diferente y no como una subespecie de
O. obtusangulus, como propone dicho autor.
La calibración del reloj molecular indica que Oreobolus comenzó a diversificarse en
Suramérica hace aproximadamente 6 a 11 map, tal vez a partir de especimenes de O. pumilio provenientes de Australia y Tasmania por eventos de dispersión a larga distancia por parte de aves. Este tipo de dispersión también fue la responsable de la presencia de
O. furcatus en Hawaii.
La topología del clado suramericano demuestra una progresión geográfica de las especies hacia el norte de Suramérica, como lo propuso Mora-Osejo en 1987, iniciando en
Argentina con O. obtusangulus hace 4 a 7 map. A medida que iba surgiendo la cordillera de los Andes y se iban creando condiciones climáticas y edáficas características de los 27 páramos, el género se iba diversificando hacia el norte a través de procesos de especiación impulsados por los periodos glaciales e interglaciales, característicos de los finales del Plioceno y principios del Pleistoceno (hace 2 a 3,5 map), y por la migración de especies desde zonas Pacífico-australes. Probablemente en Ecuador se estaban dando procesos de especiación peripátrica a partir de individuos de O. ecuadorensis que migraban e intercambiaban genes con otras poblaciones periféricas. Esto pudo resultar en una convergencia fenotípica con O. venezuelensis u O. goeppingerii, causando posiblemente problemas con la identificación de los especimenes en el herbario. Se sugiere una revisión de la distribución del género en la región del Ecuador para comprobar si realmente O. goeppingerii y O. venezuelensis se encuentran en esta zona, o si se trata de variantes genéticas de O. ecuadorensis. La diversificación de Oreobolus finalizaría con la llegada de O. goeppingeri y O. venezuelensis a Costa Rica, hace aproximadamente 1 millón de años. 28
LITERATURA CITADA
Baum, D. A., Small, R. L. & Wendel, J. F. 1998. Biogeography and floral evolution of
Baobabs (Adansonia, Bombacaceae) inferred from multiple data sets. Systematic
Biology 47: 181--207.
Bremer, K. 2002. Gondwanan evolution of the grass alliance of families (Poales).
Evolution 57 (7): 1374--1387.
Brooks, D. R. & McLennan, D. A. 1991. Phylogeny, Ecology, and Behavior. A
Research Program in Comparative Biology. The University of Chicago Press.
Chicago and London.
Brown, J. & Lomolino, M. 1998, Biogeography, 2° edition, Sinauer Associates Inc.
USA.
Carson, H. L. & Clague, D. 1995. Pp. 14--29 in: Wagner, W. & Funk, V. A. (eds.),
Hawaiian Biogeography. Smithsonian Institution Press, Washington and London.
Craw, R. 1982. Phylogenetics, areas, geology and the biogeography of Croizat: a radical
view. Systematic Zoology 23: 265--287.
Doyle, J. J. & Doyle, J. L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities
of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19:11--15.
Fay, M. F., Swensen, S. M. & Chase, M. W. 1997. Taxonomic affinities of Medusagyne
oppositifolia (Medusaginaceae). Kew Bull. 52: 111--120.
Huelsenbeck, J. P. 2000. Mr Bayes: A program for the Bayesian inference of phylogeny.
Distributed by the author, Univ. Rochester, Rochester, New York. 29
Kroonenberg, S. B., Bakker, J. G. M. & van der Wiel, A. M. 1990. Late Cenozoic
uplift and paleogeography of the Colombian Andes: constraints on the development
of high-andean biota. Geologie in Mijnbouw 69: 279--290.
Mora-Osejo, L. E. 1987. Estudios Morfológicos, Autoecológicos y Sistemáticos en
Angiospermas. Academia Colombiana de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Serie
Jorge Alvarez Lleras, N°1: 147--190.
Maddison, W. P. & Maddison, D. R. 1992. MacClade: Analysis of Phylogeny and
Character Evolution. Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massachusetts.
Nixon, K. C. & Carpenter, J. M. 1996. On simultaneous analysis. Cladistics 12 (3):
221--241.
Qiu, Y. L., Lee, J., Bernasconi-Quadroni, F., Soltis, D. E., Soltis, P. S., Zanis, M.,
Chen, Z., Savolainen, V. & Chase, M. W. 1999. The earliest angiosperms: evidence
from mitochondrial, plastid and nuclear genomes. Nature 402: 404--407.
Rambaut, A. & Charleston, M. 2000. TreeEdit version 1. 0 alpha 4-61
(http://evolve.zoo.ox.ac.uk/software/TreeEdit/TreeEdit.html).
Raven, P. & Axelrod, D. 1974. Angiosperm biogeography and past continental
movements. Ann. Missouri Bot. Gard. 61: 539--673.
Seberg, O. 1988. Taxonomy, phylogeny and biogeography of the genus Oreobolus R. Br
(Cyperaceae), with comments on the biogeography of the South Pacific continents.
Botanical Journal of the Linnean Society 96: 119--195.
Seberg, O. 1991. Biogeographic congruence in the South Pacific. Aust. Syst. Bot. 4: 127-
-136. 30
Soltis, D. E. & Soltis, P. S. 1998. Pp: 1--42 in Soltis, D. E., Soltis, P. S. & Doyle, J. J.
(eds.), Molecular Systematics of Plants. Second edition, Kluwer.
Swofford, D., Olsen, G. J., Waddel, P. J. & Hillis, D. 2002. PAUP *: Phylogenetic
analysis using parsimony. Version 4.0b10. Sinauer Associates, Sunderland,
Massachusetts.
Taberlet, P., Gielly, L., Pautou, G. & Bouvet, J. 1991. Universal primers for
amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Molecular Plant
Biology 17: 1105--1109. van der Hammen, T. 1974. The Pleistocene changes of vegetation and climate in
tropical South America. Journal of Biogeography 1: 3--26. van der Hammen, T. & Cleef, A. M. 1986. Development of the High Andean Páramo
Flora and Vegetation. In: F. Vuilleumier & M. Monasterio (eds). Tropical High-
altitude Biogeography. Oxford University Press: 153--200.
Wanntorp, L., Wanntorp, H-E. & Källersjö, M. 2001.Phylogeny of Gunnera. Plant.
Syst. Evol. 226: 85--107.
Wanntorp, L., Wanntorp, H-E. & Källersjö, M. 2002. Phylogenetic Relationships of
Gunnera based on Nuclear Ribosomal ITS Region, rbcL and rps16 Intron Sequences.
Systematic Botany. 27 (3): 512--521.
Wikström, N., Savolainen, V. & Chase, M. W. 2001. Evolution of the angiosperms:
calibrating the family tree. Proc. R. Soc. Lond. 268: 2211—2220
Wiley, E. O. 1988. Vicariance Biogeography. Ann. Rev. Ecol. Syst. 19: 513—542. FIGURAS Y TABLAS Figura 1. Posición de Oreobolus en la familia Cyperaceae (modificado de Seberg 1988). O. goeppingerii
O. distichus
O. ecuadorensis
O. cleefii
O. obtusangulus
O. venezuelensis
O. strictus
O. pectinatus
O. acutifolius
O. oxycarpus
O. impar
O. furcatus
O. kuekenthalii
O. ambiguus
O. pumilio
Schoenoides oligocephalus
Figura 2. Comparación de la hipótesis de Mora-Osejo (1987) (izquierda) y la de Seberg (1988) (derecha). C. laxa
O. pectinatus
O. strictus
O. oxicarpus
O. distichus
S. oligocephalus
O. furcatus
O. pumilio
O. obtusangulus
O. ecuadorensis
O. cleefii
O. goeppingerii
O. venezuelensis
Figura 3. Consenso estricto de los 3 árboles generados mediante el análisis de parsimonia del gen ITS (para cada árbol, L=68, CI= 0,867, RI= 0,913, RC= 0,793). C. laxa
O. pectinatus
3 O. strictus
O. pumilio 1 6 5 O. obtusangulus
8 1 O. ecuadorensis
1 O. cleefii
5 O. goeppingerii
O. venezuelensis
5 O. furcatus
9
O. oxicarpus 7 2 O. distichus
4 S. oligocephalus 1 cambio
Figura 4. Filograma del árbol más parsimoniosos obtenido para el gen trnL (L= 57, CI= 0.912, RI= 0.928, RC= 0.847). Sobre cada rama aparece el número de cambios, la escala correspondiente aparece en la parte inferior de la figura. O. pectinatus
O. pumilio
O. cleefii
O. goeppingerii
O. venezuelensis
Figura 5. Consenso estricto de los 3 árboles más parsimoniosos obtenidos para el gen rbcL (para cada árbol L= 11). C. laxa O. pectinatus
100/100 0.84--5.46 MA 6 4.49 MA O. strictus
8.70-11.12 MA 63/100 6.23-8.94 MA O. furcatus 2 80/100 5.1 MA 4 O. oxicarpus
1.03-2.21MA 58/99 7.36-9.36 MA 100/100 0.088 MA 1 5.68-8.03 MA 7
10.46-13.13 MA O. distichus 7-10.26 MA
S. oligocephalus O. pumilio
76/100 8.36-11.44 MA 6.01-8.21 MA O. obtusangulus 3 4.9-7.16 MA 100/100 3.65-6.35 MA O. ecuadorensis 11
3.29-4.57 MA 100/100 2.03-3.75 MA 7 O. cleefii
1.56-2.6 MA 99/100 0.74-2.02 MA 6 O. goeppingerii
100/100 0.02-0.45 MA
5 0-0.38 MA O. venezuelensis 5 cambios Figura 6. Arbol obtenido mediante el análisis de parsimonia de la evidencia total (L= 142, CI= 0,859, RI= 0,886 y RC= 0,761) y mediante el análisis bayesiano de la partición de los datos por locus. Sobre cada rama aparecen los soportes bootstrap/bayesiano, debajo el soporte de Bremer. A la derecha de cada nodo aparecen las fechas de divergencia estimadas bajo optimización ACCTRAN (arriba) y DELTRAN (abajo) en millones de años (MA). La escala que se muestra en la parte inferior corresponde al número de cambios y es equivalente a millones de años. Figura 7. Fotografía de los cuerpos de sílica en las paredes periclinales de la epidermis de O. pectinatus, especie de Nueva Zelandia (fotografía tomada de la colección de micropreparados del Laboratorio Jodrell, Sección de Anatomía, Kew Gardens, Inglaterra). Figura 8. Filogenia molecular de Oreobolus donde se muestra la distribución de los cuerpos de sílica en las paredes periclinales de la epidermis. Genes secuenciados ITS trnL rbcL AB101 AB101 ITS3 1F 627F Especimen Localidad Voucher AB102 ITS2 AB102 c-f c-d e-f 724R (M) 1460R C. laxa Madagascar L. Gautier & C. Chatelain LG 2706 (K) x x x x O. acutifolius Tasmania S. Ockenden sn (K) x x x x O. cleefii Colombia C. García 122 (COL) x x x x O. distichus 1 Australia R. Coveny 5373 (K) x x x O. distichus 2 Australia J. J. Bruhl 1870 x x x O. distichus 3 Aus-Tas* K. L. Wilson 8304 (K) x x x x O. ecuadorensis Colombia H. Sturn & A. Abouchar 103 (COL) x x x x O. furcatus Hawaii S. Carlquist 21111 (K) x x x x O. goeppingerii 1 Colombia C. García 093 (COL) x x x x O. goeppingerii 2 Ecuador S. Laegaard 70382 (COL) x x x x O. kuekenthalii Borneo GenBank Y12972** O. obtusangulus Argentina D. M. Moore 2817 (K) x x x O. oxicarpus Tasmania S. T. Blake 18320 (K) x x x O. pectinatus Nueva Zelandia R. & E. F. Melville & H. E. Connor 6528 (K) x x x x x x O. pumilio 1 Nueva Guinea W. R. Barker LAE-66981 (K) x x O. pumilio 2 Australia J. J. Bruhl 1879C x x x O. strictus Nueva Zelandia B. H. Mc. Millan 143395 (K) x x x O. venezuelensis 1 Colombia D. Jiménez 02 (COL) x x x x O. venezuelensis 2 Ecuador Ollgaard et. al. 58308 (COL) x x S. oligocephalus Australia J. J. Bruhl 1889A x x
Tabla 1. Especímenes utilizados en este estudio con su distribución geográfica y voucher (herbario). Los especímenes incluidos en el análisis filogenético de Oreobolus y los genes secuenciados para cada uno de ellos aparecen en negrilla. *Australia-Tasmania. **Número de acceso a GenBank para la secuencia del gen rbcL. Gen Secuencia Cebador (5'--->3') AB 101 ACG AAT TCA TGG TCC GGT GAA GTG TTC ITS ITS 2 GCT GCG TTC TTC ATC GAT ITS 3 GCA TCG ATG AAG AAC GCA AB 102 TAG AAT TCC CCG GTT CGC TCG CCG TTA c CGA AAT CGG TAG ACG CTA trnL d GGG GAT AGA GGG ACT TGA e GGT TCA AGT CCC TCT ATC f ATT TGA ACT GGT GAC ACG 1 F ATG TCA CCA CAA ACA GAA rbcL 724 R(M) TCG CAT GTA CCY GCA GTT 636 F GCG TTG GAG AGA TCG TTT CT 1460 R TCC TTT TAG TAA AAG ATT GGG CCG
Tabla 2. Secuencia nucleotídica de cada uno de los cebadores utilizados en la amplificación del ADN de los especímenes de Oreobolus. En la parte superior de la tabla se muestra la dirección de las secuencias entre paréntesis.