Fungos Endofíticos De Folhas E Caule De Lippia Sidoides Cham

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS

Virgínia Medeiros de Siqueira

Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham. e avaliação da atividade antimicrobiana

Recife-PE 2008

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS

Virgínia Medeiros de Siqueira

Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham. e avaliação da atividade antimicrobiana

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Biologia de Fungos do Departamento de Micologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco em cumprimento da exigência para obtenção do grau de Mestre em Biologia de Fungos.

Orientadora: Profa Dra Cristina Maria Souza Motta Co-orientadora: Profa Dra Janete Magali de Araújo

Recife-PE 2008

Siqueira, Virgínia Medeiros de Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham. e avaliação da atividade antimicrobiana./ Virgínia Medeiros de Siqueira. – Recife: A Autora, 2008.

94 fls. .: il.

Dissertação (Mestrado: Biologia de Fungos) – UFPE. CCB

1.Fungos endofíticos 2.Lippia sidoides 3.Atividade antimicrobiana I.Título

582.28 CDU (2ª. Ed.) UFPE 579 CDD (22ª. Ed.) CCB – 2008 – 06

O objetivo da vida não é ser feliz. É ser útil, honrado, compassivo, fazendo com que nossa vida, bem vivida, faça alguma diferença.

Dedico à Kátia, Érika e Murilo.

AGRADECIMENTOS

À minha mãe, Kátia Maria Medeiros de Siqueira, por ser amorosa, honesta, serena e compreensiva. É meu porto seguro e minha referência de vida. Obrigada pelo amor, mimos, confiança e compreensão. Ao meu pai, Raimundo Nonato, por sempre me incentivar a estudar. Aos meus irmãos, Érika e Murilo, pela amizade, pelos momentos de descontração e pelo apoio em todas as horas. Em especial para Érika, além de irmã, uma verdadeira amiga. Quando temos irmãos ao nosso lado, tudo fica mais fácil. À minha avó Gilda Medeiros de Albuquerque (in memorian) pelo acolhimento cheio de mimos e preocupações desde minha chegada em Recife e à minha tia Magnólia Medeiros (in memorian), ser humano de alma superior e de coração único. Obrigada pelos momentos de suas vidas dedicados a mim. A Bidu (in memorian) e Nzinga, pelo amor incondicional indispensável ao meu bem estar. À professora Dra. Cristina Maria Souza Motta, minha orientadora, pelos conhecimentos transmitidos e pela confiança depositada em mim. À professora Dra. Janete Magali, minha co-orientadora, pelos conhecimentos transmitidos e pelo acolhimento sem restrições no Departamento de Antibióticos. Às professoras Débora Maria Massa Lima e Maria José dos Santos Fernandes, pela colaboração na identificação de muitos dos meus fungos isolados. Ao professor Dr. Uwe Braun, da Universidade Martin Luther, Alemanha, pela co- autoria de um dos artigos que compõe esta dissertação. Obrigada pela sua colaboração e disponibilidade. Às minha amigas, Ludmila Lima, Evanilza Moura, Ana Josephina, Lucimary Araújo e Pamela Simoa, pelos grandes momentos de amizade vividos juntos, desde nossa infância até os tempos de hoje. A nossa verdadeira amizade eternizou o amor que tenho por vocês. À Judith Advíncula e Alexandra Muniz, pelos conselhos, pelos momentos de estudos e pelas muitas alegrias compartilhadas. A todos os meus colegas do X Curso de Especialização em Micologia, onde dei início aos meus estudos micológicos, pelos ótimos momentos, aulas, trabalhos e seminários. Nesta turma não havia lugar para vaidade ou competição e sim para algo precioso: a simplicidade. Como foi bom conviver com vocês. À Adriana, Ivana e Raphael, um muito obrigado pelo apoio dado em todos os momentos. A companhia de vocês foi essencial para a mim. Vocês são tão especiais que se tornaram minha segunda família, além de serem amigos extraordinários. Obrigado também a todos os meus colegas do Departamento de Antibióticos: a disposição que cada um tem de ajudar o outro é uma riqueza única. Ao CNPq, pela bolsa de estudos concedida durante os dois anos dos meus estudos e pelo apoio financeiro essencial para a realização deste trabalho através do projeto RENNEBRA. A todos que direta ou indiretamente contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

Toda a nossa ciência, comparada com a realidade, é primitiva e infantil – e, no entanto, é a coisa mais preciosa que temos.

Albert Einstein (1879-1955) RESUMO

Fungos endofíticos vivem por todo ou uma parte do seu ciclo de vida no interior de tecidos vegetais, sem causar sintomas de doença. Desde que foram devidamente estudados despertaram grande interesse biotecnológico em virtude da aplicabilidade de seus metabólitos secundários na medicina, indústria e agricultura. Lippia sidoides Cham,. planta medicinal popularmente conhecida como alecrim-pimenta, é encontrada no Nordeste brasileiro e utilizada principalmente como antisséptico. Folhas e caule foram superficialmente desinfectados e fragmentados. Os fragmentos dos tecidos vegetais foram distribuídos na superfície dos meios Batata dextrose agar e Sabouraud agar acrescidos de tetraciclina e cloranfenicol (100µL/mL) contidos em placas de Petri e cultivados a 30o C por até 30 dias. Todos os isolados foram submetidos ao ensaio antimicrobiano primário em meio sólido (bloco de gelose) e aqueles que se mostraram ativos a algum microrganismo teste foram então submetidos ao teste de atividade microbiana em meio líquido (fermentação). Os microrganismos teste utilizados foram Staphylococcus aureus (ATCC-6538), Bacillus subtilis (UFPEDA-16), Escherichia coli (ATCC-25922), Klebsiella pneumoniae (ATCC- 29665), Pseudomonas aeruginosa (ATCC-27853), Candida albicans (UFPEDA-1007), Malassezia furfur (URM-5436) e Trichophyton rubrum (URM-4350). Um total de 207 fungos endofíticos pertencentes a quatorze espécies foram isolados: 125 (52%) de folhas e 82 (34,1%) de caule. Colletotrichum gloeosporioides foi a espécie mais freqüente, seguida de Alternaria alternata, Guignardia bidwelli e Phomopsis archeri. No bloco de gelose, 8% (16) se mostraram ativos a pelo menos um dos microrganismos teste. Destes, 10 apresentaram atividade nos ensaios em meio líquido, com os melhores halos de inibição de 25mm, 18mm e 13mm contra S. aureus, B. subtillis e K. pneumonie, respectivamente.

Palavras-chave: Fungos endofíticos; Diversidade; Atividade antimicrobiana; Lippia sidoides

ABSTRACT

Endophytic fungi colonize healthy living tissue of the host plant, typically causing no apparent symptoms of disease. Since they were truly studied they called great attention to the biotechnological interesting because of the applicability of they secondary metabolites in medicine, industry and agricultural. Lippia sidoides Cham., a medicinal plant popularly known as “alecrim-pimenta”, is founded at Brazilian northeast and used mostly as antiseptic. Leaves and stem were superficially disinfected and fragmented. The fragments were placed on the surface of the media Potato dextrose agar and Sabouraud agar supplemented with tetraciclin (100µg/mL) and chloramphenicol (100µg/mL) on Petri dishes and cultivated at 30o C up to 30 days. All the strains were submitted to the agar plug screening assay (“bloco de gelose”) and those who showed antimicrobial activity were submitted to the fermentation assay. The microorganisms test were Staphylococcus aureus (ATCC-6538), Bacillus subtilis (UFPEDA-16), Escherichia coli (ATCC-25922), Klebsiella pneumoniae (ATCC-29665), Pseudomonas aeruginosa (ATCC-27853), Candida albicans (UFPEDA-1007), Malassezia furfur (URM-5436) and Trichophyton rubrum (URM-4350). A total of 207 endophytic fungi were isolated, 125 (52%) from leaves and 82 (34,1%) from stem, belonging to fourteen species. Colletotrichum gloeosporioides was the mostly frequently specie, fallowed by Alternaria alternata, Guignardia bidwelli and Phomopsis archeri. At the agar plug screening assay, 8% (16) endophytic fungi showed antimicrobial activity to at least one microorganism test. From these, ten showed antimicrobial activity during the fermentation. The bests inhibition zone were 25mm, 18mm e 13mm against S. aureus, B. subtillis e K. pneumonie, respectively.

Keywords: Endophytic fungi; diversity, antimicrobial activity; Lippia sidoides.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Equilíbrio antagônico entre virulência fúngica e defesa da planta. Adaptado de SCHULZ et al. 2002. 05

Pág.

Figura 2. Cryptocandin A e Criptocin (LI et al. 2000). 12

Figura 3. Colletotric Acid (ZOU et al. 2000). 13

Figura 4. 2,4-diidroxi-5,6-dimetil benzoato de etila e phomopsilactona (SILVA et al. 2005). 13

Figura 5. Brefeldin A (WANG et al. 2006). 14

Figura 6. Planta medicinal Lippia sidoides Cham. 16

Figura 7. Estrutura Química do Carvacrol (A) e Timol (B) (COSTA et al. 16 2001).

Primeiro Capítulo: Fungos Endofíticos de Folhas e Caule de Lippia sidoides Cham.

Figura 1. Percentagem de fungos endofíticos de diferentes grupos. 37

Figura 2 Diferenças em número e especificidade de fungos endofíticos de Lippia sidoides nos tecidos vegetais 37

Terceiro Capítulo: Corynespora subcylindrica sp. nov. – uma nova espécie de Hyphomycete do Brasil e uma discussão sobre a taxonomia de gêneros “corynespora- like” Figura 1. Corynespora subcylindrica sp. nov. – Cultura em BDA (Diâmetro da 71 placa de Petri: 90mm).

Figura 2. Corynespora subcylindrica sp. nov. Conidióforo surgindo 71 lateralmente de uma hifa em cultura em BDA, com conídio primário (conídio secundário da cadeia já formado). – Bar = 10 µm.

Figura 3. Corynespora subcylindrica sp. nov. – A. Hifa. – B. conidioforos. – 72 C. célula conidiogência com proliferação percorrente. – D. conídio. – Bar = 10 µm.

LISTA DE TABELAS

Pág.

Tabela 1. Número de espécies endofíticas isoladas de vários hospedeiros 07 mundialmente distribuídos (Adaptado de Stone et al. 2004)

Tabela 2. Fungos endofíticos freqüentes e acidentais de diferentes 08 hospedeiros.

Primeiro Capítulo: Fungos Endofíticos de Folhas e Caule de Lippia sidoides Cham.

Tabela 1. Número (N) de fungos endofíticos isolados de cada tecido de 36 Lippia sidoides e sua freqüência de colonização (%).

Segundo Capítulo: Potencial antimicrobiano de fungos endofíticos da planta medicinal Lippia sidoides Cham.

Tabela 1. Screening de atividade antimicrobiana de fungos endofíticos 56

Tabeça 2. Atividade antimicrobiana do líquido fermentativo de fungos 57 endofíticos

SUMÁRIO

Pág.

1. INTRODUÇÃO GERAL 01 1.1 Introdução 02

1.2 Fungos Endofíticos 03 1.3 Diversidade e Especificidade de Fungos Endofíticos 06 1.4 Importância dos Fungos Endofíticos 09 1.5 Antimicrobianos Produzidos por Fungos 11 1.5.1 Antibióticos Produzidos por Fungos Endofíticos 12 1.5.1.1 Cryptocandin A e Cryptocin 12 1.5.5.2 Colletotric Acid 13 1.5.5.3 2,4-diidroxi-5,6-dimetil benzoato de etila e Phomopsilactona 13 1.5.5.4 Brefeldin A 14 1.6 Lippia sidoides Cham. 15 3. REFERÊNCIAS 17 4. PRIMEIRO CAPÍTULO 27 4.1 Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham. 27 5. SEGUNDO CAPÍTULO 44 5.1 Potencial Antimicrobiano de Fungos Endofíticos da Planta Medicinal Lippia sidoides Cham. 45 6. TERCEIRO CAPÍTULO 58 6.1 Corynespora subcylindrica sp. nov. – uma nova espécie de Hyphomycete do Brasil e uma discussão sobre a taxonomia de gêneros “corynespora-like” 59 7. CONCLUSÕES 77 7.1 Conclusões gerais 78 8. ANEXOS 79

1. INTRODUÇÃO GERAL

1.1 Introdução

O estabelecimento de plantas em seus respectivos habitats envolve a sua capacidade de interagir com variadas espécies de organismos. Os microrganismos interagem de maneiras distintas em diferentes áreas do vegetal, sendo denominados de endofíticos quando colonizam intra e/ou intercelularmente tecidos sadios de plantas em algum tempo do seu ciclo de vida, sem causar danos aparentes ao seu hospedeiro (PETRINI, 1991; AZEVEDO et al., 2000). Todo vegetal estudado quanto a sua microbiota se mostrou hospedeiro de endofíticos, mas poucas das 300.000 espécies de plantas existentes no Planeta foram até então analisadas. Como resultado, a oportunidade de encontrar novos microrganismos e estes serem produtores de compostos bioativos úteis para indústria, agricultura e medicina vem aumentando a bioprospecção desta micobiota de grande importância para biotecnologia (STROBEL, 2002; STROBEL et al., 2004). A descoberta de novos antibióticos se faz necessária devido ao aparecimento de patógenos resistentes, bem como à evolução de novas doenças como a AIDS e à toxicidade de alguns produtos que já estão no mercado. Considerando-se que seis entre vinte dos medicamentos mais comumente prescritos são de origem fúngica e que, em comparação com fungos obtidos de outros substratos, relativamente poucos metabólitos têm sido isolados de endofíticos, estes oferecem um potencial para desenvolvimento de novos produtos (Schultz et al. 2002). Os microrganismos endofíticos representam uma importante fonte para a produção de metabólitos secundários com ação antibacteriana, antifúngica, antitumoral, dentre outras (TAN; ZOU, 2001; STROBEL; DAYSE, 2003; WIYAKRUTTA et al., 2004; GUNATILAKA, 2006).

Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae), popularmente conhecida como alecrim- pimenta, é um arbusto encontrado no sertão nordestino. A exemplo de outras espécies do gênero, esta é uma planta aromática, de uso medicinal popular, principalmente como anti- séptico, havendo sido introduzida há pouco tempo nos programas de fitoterapia e nas práticas caseiras como fármaco fitoterápico (COSTA et al., 2002). Esse caráter medicinal fundamenta a investigação de fungos endofíticos envolvidos na produção de compostos bioativos que apresentam atividade antagônica contra bactérias e fungos patogênicos ao homem.

1.2 Fungos Endofíticos

Microrganismos endofíticos, em sua maioria bactérias e fungos, são aqueles que passam todo ou uma parte do seu ciclo de vida colonizando inter e/ou intracelularmente os tecidos da planta hospedeira, tipicamente sem causar sintomas aparentes de doença (PETRINI, 1991; CABRAL et al., 1993; BANCON; WHITE, 2000; TAN; ZOU, 2001). A diferenciação entre endofíticos, epifíticos (aqueles microrganismos que vivem na superfície de plantas) e fitopatógenos (aqueles que causam doenças em plantas) depende do nicho ocupado em determinado estágio da interação do microrganismo com o hospedeiro (STROBEL et al., 2004), portanto, a aplicação destes termos tem puro significado didático, havendo ainda dificuldade em determinar limites entre eles (AZEVEDO et al., 2002). Os microrganismos endofíticos se relacionam com diversos tipos de vegetais como plantas herbáceas (TAECHOWISAN et al., 2003), plantas de florestas tropicais (STROBEL, 2002), plantas cultivadas (MELNROY; KLOEPPER, 1995), plantas medicinais (HUANG et al., 2001) e plantas aquáticas (CHEN et al., 2003). Comumente, de dezenas a centenas de isolados podem ser obtidos de um único vegetal e, a partir deste único hospedeiro, pelo menos uma espécie se mostra específica, confirmando o fato que os endofíticos são um componente importante da diversidade microbiana (TAN; ZOU, 2001; STROBEL; DAYSE, 2003). Os endofíticos podem ser transmitidos verticalmente quando penetram pelas sementes ou pela zona radicular, horizontalmente quando penetram através dos estômatos ou diretamente na parede celular utilizando apressórios e haustórios (SAIKKONEM et al., 2004). A colonização endofítica pode ser intracelular e limitada a poucas células, intercelular e localizada ou ainda inter e intracelular sistêmica e pode se desenvolver em qualquer tecido ou órgão do vegetal: raiz, caule, ramos, folhas, flores e frutos (PEIXOTO-NETO et al., 2002; SCHULZ; BOYLE, 2005; MARINHO et al., 2005; JOHRI, 2006). O estudo dos endofíticos pode ser realizado a partir do seu isolamento em meios de cultura e sob condições controladas, pela sua observação direta a partir de técnicas de microscopia ótica ou eletrônica ou pela sua detecção através de técnicas diretas de amplificação de DNA (SCHULZ & BOYLE, 2005). Os fungos endofíticos estão divididos em dois grupos ecológicos: balansiaceous (ou endofíticos de gramíneas) e não-balansiaceous (SCHULZ; BOYLE, 2005). O primeiro grupo composto por espécies de Epichloë e Balansia (e os anamorfos Neothyphodium e Ephelis) que são proximamente relacionadas e apresentam requerimentos ecológicos e adaptações distintas de todos os outros fungos endofíticos (PETRINI, 1996). Por conta da sua importância 4

ecológica e econômica, são os mais bem estudados quanto a interação endofítico/hospedeiro sendo encontrados de forma sistêmica e intercelular em todos os órgãos de gramíneas, resultando na transmissão vertical através de sementes (BACON; WHITE, 2000). Os endofíticos balansiaceous produzem uma ampla variedade de metabólitos secundários como alcalóides tóxicos a insetos e vertebrados (SCHARDL, 2000). Em contraste, o grupo dos fungos endofíticos não-balansiaceous é diversificado e formado principalmente por espécies de diferentes famílias de Ascomycota. Estes fungos foram isolados de todos os órgãos de praticamente todas as plantas estudadas (PETRINI, 1991; SCHULZ et al., 1993; STONE et al., 2000; STONE et al., 2004) e a colonização pode ser inter ou intracelular, sistêmica ou localizada (SCHULZ; BOYLE, 2005). Os gêneros mais comumente isolados são Acremonium, Alternaria, Cladosporium, Colletotrichum, Epicoccum, Fusarium, Guignardia, Phyllosticta, Pestalotiopsis, Phomopsis, Phoma e Pleospora (AZEVEDO et al., 2000; ARNOLD et al., 2000; PIMENTEL et al., 2006) A interação endofítico/hospedeiro é complexa e dependente de diferentes fatores como características do vegetal, do microrganismo e doB ambiente (OWEN; HUNDLEY, 2004). A relação que se estabelece tem sido bastante questionada, existindo duas hipóteses principais: a do equilíbrio antagônico e da simbiose mutualística (FAETH, 2002; SELOSSE et al., 2004; RUDGERS et al., 2004; SAIKKONEN et al., 2004; MÜLLER; KRAUSS, 2005; SCHULZ; BOYLE, 2005; KOGEL; FRANKEN, 2006; MAHESHWARI, 2006). Estudos in vitro mostraram que tanto o endofítico como a planta secretam metabólitos que são tóxicos para ambos, fato estranho numa interação assintomática (PETERS et al., 1998) já que na interação de patogenicidade o fungo produz metabólitos tóxicos e em resposta a planta produz metabólitos de defesa (AGRIOS, 1997). Schulz & Boyle (2005) levantaram uma hipótese a partir de estudos sobre estas observações e concluíram que a colonização assintomática é conseqüente da interação antagônica balanceada entre o vegetal e o fungo. Estes mesmos autores ainda relataram que os endofíticos produzem as exoenzimas necessárias para infectar o hospedeiro e a maioria é capaz de também produzir micotoxinas fitotóxicas. Além disso, o hospedeiro pode reagir com as mesmas defesas contra um patógeno, ou seja, com produção de metabólitos e repostas mecânicas. Neste caso há uma estreita harmonia entre a virulência fúngica e a defesa da planta (Figura 01). Se este equilíbrio é afetado, tanto por uma diminuição na defesa da planta como por um aumento da virulência fúngica, há o desenvolvimento de doença (SCHULZ et al., 2002). 5

Virulência fúngica Defesa do hospedeiro

Interação Endofítica

Interação Patogênica Figura 01. Equilíbrio antagônico entre virulência fúngica e defesa da planta. Adaptado de SCHULZ et al., 2002.

A interação de equilíbrio antagônico não exclui a possibilidade do endófito exercer uma função benéfica para seu hospedeiro. Nesta interação mutualística, os fungos endofíticos influenciam na produção ou inibição de metabólitos com função de defesa, conferindo ao vegetal vantagens como resistência ao ataque de insetos (AZEVEDO et al., 2000), produção de antimicrobianos contra microrganismos fitopatogênicos (ARNOLD et al., 2003; MUCCIARELLI et al., 2002; SELOSSE et al., 2004; BANDARA et al., 2006), aumento de tolerância a estresses e produção de fitohormônios enquanto que os endófitos recebem nutrientes e proteção da planta (TUDZYNSKI; SHARON, 2002). As primeiras observações mostrando que os endofíticos conferem alguma vantagem ao seu hospedeiro, por exemplo, protegendo-o de ataques de insetos e herbívoros, fizeram com que estes microrganismos começassem a ser objetivo de estudos mais aprofundados (AZEVEDO, 1999; AZEVEDO et al., 2002). Os endofíticos estão sujeitos a constantes interações metabólicas e ocupam literalmente milhões de nichos biológicos únicos presentes em diferentes ecossistemas, sendo vistos atualmente como uma ótima fonte de produtos naturais bioativos úteis para a agricultura, indústria e medicina (SCHULZ et al., 2002; STROBEL;DAYSE, 2003; STROBEL et al., 2004; BANDARA et al., 2006).

1.3 Diversidade e Especificidade de Fungos Endofíticos

Os estudos sobre fungos endofíticos são de incontestável relevância, pois estes são microrganismos ubíquos, possuem grande potencial na obtenção de substâncias bioativas e estabelecem importantes funções ecológicas. Muitos trabalhos relatam que vegetais são colonizados por dezenas de endofíticos, mostrando a sua importância na estimativa da diversidade fúngica (SAIKKONEM et al., 1998; ARNOLD et al., 2000). Investigações detalhadas da micobiota vegetal têm frequentemente descoberto novos taxa e revelado novas ocorrências de espécies já conhecidas (STONE et al., 2004). A ampla distribuição e diversidade de fungos endofíticos foram relatadas em um levantamento feito por Stone et al. (2004) no qual são relacionados os hospedeiros, tipo de tecido e o número de espécies isoladas (Tabela 1). Geralmente, os endofíticos de certo hospedeiro constituem um grupo consistente caracterizado por poucas espécies dominantes. Em adição a este grupo, surgem as denominadas espécies acidentais que são representadas por apenas um ou dois isolados entre centenas (Tabela 2). O número de espécies obtidas é proporcional à intensidade, variedade do tecido vegetal (BILLS; POLLISHOOK 1992) e menor tamanho do fragmento utilizado durante o isolamento (GAMBOA et al., 2002). As espécies mais frequentemente isoladas pertencem ao filo Ascomycota, incluindo os anamorfos (Hyphomycetes e Coelomycetes). Espécies de Basiodiomycota e Zygomycota também são isoladas como endofíticos, mas representam um número menor (SCHULZ;BOYLE, 2005). Em plantas brasileiras, espécies de Ascochyta, Cladosporium, Colletotrichum, Fusarium, Glomelera, Guignardia, Mucor, Nodulisporium, Pestalotia, Phomopsis, Phyllosticta, Rhizopus e Xylaria são as mais freqüentes (PEIXOTO-NETO et al., 2002). O habitat associado à planta é um ambiente dinâmico no qual muitos fatores afetam a freqüência e composição de espécies das comunidades microbianas. As comunidades endofíticas variam espacialmente no vegetal havendo diferença e especificidade da micobiota entre os diversos tecidos vegetais: raízes, caules, folhas, flores e frutos (NALINI et al., 2005; TEJESVI et al., 2005; GOND et al., 2007). As comunidades endofíticas também são dependentes da interação com outros microrganismos como patógenos e epifíticos (OSONO, 2007; SANTAMARÍA; BAYMAN, 2005), além de sofrerem influência do ambiente (PIMENTEL et al., 2006; UNTERSEHER et al., 2007) e da idade do tecido vegetal (PHOTITA et al., 2001; VUJANOVIC; BRISSON, 2002). 7

Tabela 1. Número de espécies endofíticas isoladas de vários hospedeiros mundialmente distribuídos (Adaptado de STONE et al., 2004). Hospedeiro Tecido ou órgão No de espécies Observações Local 17 comuns; Abies alba Ramos da base 44 Alemanha 2 endêmicas A. alba Broto 50 - Suíça A. alba Folhas 120 13 comuns Suíça Arer macrophyllum Folhas; caule 9 - Columbia Britânica 16 comuns; A. pseudoplatanus Ramos da base 28 Alemanha 5 endêmicas A. pseudoplatanus Folhas 22 - Alemanha A. spicatum Raiz 7 Hyphomycetes aquáticos Nova Escócia 17 comuns; 3 endêmicas; Alnus glutinosa Ramos da base 24 Alemanha 2 novas espécies 14 comuns; A. glutinosa Raízes aquáticas 46 Reino Unido 12 Hyphomycetes aquáticos A. rubra Folhas; caule 25 12 comuns Columbia Britânica A. rubra Broto 27 13 comuns Columbia Britânica Aretostaphylos uva-ursi Folhas 176 23 comuns Suíça A. urva-ursi Caule 35 29 comuns Suíça A. uva-ursi Raiz 14 8 comuns Suíça Betula pendula Ramos da base 23 14 comuns Alemanha 11-12 espécies por árvore; Carpinus carolintana Casca 155 EUA 5 Basidiomycetes Calocedrus decurrens Folhedo 15 - EUA Chaemacyparis lawsoniana Folhedo 18 1 Basidiomycetes EUA C. thyoides Folhas; broto 88 8-12 espécies por árvore EUA Cuscuta reflexa Caule 45 - Índia Dryas octopelata Folhas 4 - Alemanha D. octopelata Folhas 23 - Suíça Eucaluptus globulus Caule 41 9 Basidiomycetes Uruguai Euterpe oleracea Folhas 62 21 comuns Brasil Fagus sylvatica Ramos 18 - Reino Unido Gautheria shalon Folhas 13 - EUA Heisteria concinna Folhas 242 - Panamá Hordeum vulgare Folhas 14 - Nova Zelândia Juncus bufonius Folhas 14 - EUA Juniperus communis Folhas 114 - Suíça Licuala ramsayi Folhas 11 - Austrália Livistona chinensis Folhas 45 - China Manilkara bidentata Folhas 23 - Porto Rico Musa acuminata Folhas 24 - China Opuntia stricta Caule 23 - Austrália Oryza sativa Folhas; raízes 30 - Itália Ouratea lucens Folhas 259 - Panamá Picea abies Broto 85 - Suécia P. marian Raízes 97 - EUA Pinus densiflora Folhas 9 - Japão Pteridium aquilinum Folhas; raízes; caule 61 6 comuns Reino Unido Quercus ilex Brotos, folhas 149 10 espécies dominantes Espanha Salicornia perennis Folhas 31 - Reino Unido Tlia cordata Folhas 17 - Alemanha Vitis vinifera Folhas; caule 46 - África do Sul Zea mays Folhas; caule 23 - Reino Unido 8

Tabela 2. Fungos endofíticos freqüentes e acidentais de diferentes hospedeiros. Hospedeiro Tecido vegetal Endofíticos freqüentes Endofíticos acidentais Referência Aegle marmelos Correae Folhas, raiz e casca Alternaria alternata; Fusarium Trichoderma viride; Corynespora sp. GOND et al., 2007 roseum; Drechslera ellisii Azadirachta indica A. Folha, caule e casca Phomopsis oblonga; Aspergillus Drechslera sp.; Gliomastix sp. VERMA et al., 2007 Juss (Neem) flavus; Fusarium oxysporum Camptotheca acuminata Caule, casca e raiz Alternaria sp.; Phomopsis sp.; Trichoderma sp.; Cunninghamella sp. LIN et al., 2007 Decne. Centella asiática (L.) Folhas Colletotrichum higginsianum; Nodulisporium sp.; Cladosporium sp.; Physalospora sp. RAKOTONIRIANA et Urban Guignardia mangiferae; Glomerella al., 2007 cingulata Coffea Arabica L. Folhas Colletotrichum sp.; Xylaria sp.; Mucor sp.; Cladosporium sp. SANTAMARÍA; Guignardia sp.; BAYMAN, 2005 Crataeva magna (Lour.) Caule e casca Verticillium spp.; Nigrospora oryzae; Isariopsis spp.; Ascochyta rabei; NALINI et al., 2004 DC. Fusarium verticilloides Artrobotrys conoides Lycopersicon esculentum Folhas Alternaria alternata; Colletotrichum Bipolaris cynodontis; Chaetomiun globosum; LARRAN et al., 2001 Mill gloeosporioides; Cladosporium sp.; Epicoccum nigrum Melia azedarach L. Raiz, caule, folhas Penicillium sp.; Aspergillus sp.; Balansia sp.; Pestalotiopsis vesicolor SANTOS et al.,2003 Musa acuminata L. Folhas, raiz Gloesporium musae; Aspergillus sp.; Trichothecium sp.; Cladosporium sp.; Spicaria sp. CAO et al., 2001 Myxosporium sp.; Nerium oleander L Folhas e caule Torula sp.; Phoma spp. Cladosporium sp.; Chaetomium spp. HUANG et al., 2007 Pasania edulis Makino Folhas Colletotrichum sp.; Phyllosticta sp.; Apiognomonia sp. HATA et al., 2002 Phomopsis sp. Rosa hybrida L. Folhas Nigrospora oryzae; Xylaria sp.; Cladosporium sp.; Nodulisporium sp.; SALAZAR; GARCÍA, Acremonium sp. Gliocadium virens 2005 Tectonia grandis L. Folhas Phomopsis sp.; Colletotrichum sp; Schizophyllum commune; Fusarium sp.; CHAREPRASERT et Nigrospora sphaerica Daldinia eschscholzii al., 2006 Terminalia arjuna W. & Caule e casca Pestalotiopsis spp.; Chaetomium Phialophora spp.; Cladosporium elatum; TEJESVI et al., 2005 A. globosum Melasmia hypophylla Triticum aestivum L. Folhas Alternaria alternria; Rhodotorula Pleospora herbarum; Phomopsis sp. LARRAN et al., 2002 rubra; Epicoccum nigrum Vigna unguiculata (L.) Sementes Aspergillus niger; Fusarium Trichoderma longibrachiatum; Zygosporium gibbum; RODRIGUES; Walp. semitectum; Rhizopus stolonifer Helminthosporium australiensis; Drechslera sp. MENEZES, 2002 9

1.4 Importância dos Fungos Endofíticos

Os endofíticos foram descritos pela primeira vez no início do século XIX e diferenciados dos fitopatógenos por de Bary em 1866, mas apenas a partir dos anos 70 do século XX é que foram devidamente estudados, despertando grande interesse biotecnológico em decorrência da sua importância na obtenção de produtos bioativos para aplicações na indústria farmacêutica (AZEVEDO et al., 2002; ARAÚJO et al., 2002). As primeiras observações mostrando que os endofíticos conferiam alguma vantagem ao hospedeiro fizeram com que estes microrganismos começassem a ser objetivo de estudos mais aprofundados (AZEVEDO, 1999; AZEVEDO et al., 2002). Devido a seu nicho altamente específico, atenções mais recentes estão direcionadas para estudos químicos e biológicos de seus metabólitos, além de sua diversidade e funções ecológicas (TAN; ZOU, 2001; STROBEL, 2002). O taxol, substância extraída da árvore Taxus brevifolia, utilizada contra câncer de mama e de útero, é um exemplo pioneiro que ilustra o interesse pelo potencial dos microrganismos endofíticos. Taxomyces andreanea, fungo isolado de Taxus brevifolia, assim como seu hospedeiro, é capaz de sintetizar o taxol como forma de proteção do vegetal contra fungos fitopatogênicos. Esta descoberta indica grande vantagem na solução de problemas ecológicos, além de possibilitar a produção de compostos com mais rapidez e em maior quantidade (STIERLE et al., 1993). Estudos visando encontrar fungos endofíticos produtores de taxol sugerem que esta droga é mais comumente produzida pelos fungos do que pelo próprio vegetal, além de que estes microrganismos estão amplamente distribuídos em todo o mundo e não são exclusivos de espécies de Taxus (STROBEL, 2003). Pestalotiopsis microspora isolado de Taxus wallichiana (Strobel et al. 1996), P. guepini obtido de Wollemia nobilis (STROBEL et al., 1997) Seimatoantlerium tepuiense endofítico de Maguireothammus speciosus (STROBEL et al., 1999), Periconia sp. endofítico de Torreya grandifolia (LI et al., 1998) e Bartalinia robillardoides endofítico de Aegle marmelos (GANGADEVI; MUTHUMARY, 2007) são exemplos de fungos produtores de taxol. Certos endofíticos melhoram a adaptabilidade de seus hospedeiros aumentando sua tolerância a ambientes com estresse e resistência contra fitopatógenos e/ou herbívoros e insetos. Neotyphodium, por exemplo, é um endofítico de Festuca aerundinacea que beneficia seu hospedeiro aumentando a tolerância à seca (WHITE JR. et al., 2002), o crescimento da raiz, a produção de sementes, a germinação, a captação

10 de fósforo e a resistência a nematóides e insetos (PANACCIONE et al., 2001). Arnold et al. (2003) estudaram a resposta de plantas de cacaueiro axênicas (isentas de microrganismos) inoculadas com endofíticos do próprio hospedeiro e com o patógeno Phytophtora sp. e observaram que as plantas inoculadas com os endofíticos apresentaram menos necrose e mortalidade das folhas, quando comparadas aos controles, inoculados apenas com o patógeno. Um levantamento feito por Azevedo et al. (2000) mostra a importância de fungos endofíticos no controle de insetos que atacam plantas. Exemplos como Acremonium lolii, Balansia cyper, Cladosporium sphaerosperum e Phomopsis oblonga são citados como fungos produtores de metabólitos capazes de proteger seu hospedeiro de ataques de insetos. Este fato se deve muitas vezes a produção de toxinas pelo endofítico, correlação feita pela primeira por vez por Bacon et al. (1977) os quais estabeleceram uma ligação entre o endofítico Epichloë typhi e a toxicidade do hospedeiro, o que confere proteção ao vegetal. O crescimento do vegetal também pode ser afetado pela presença de endofíticos, este se mostrando melhor desenvolvido quando colonizados. Isto se deve em parte a produção de fitormônios e/ou ao fato dos endofíticos serem capazes de aumentar a absorção de nutrientes como nitrogênio e fósforo pela planta (TAN; ZOU, 2001; BANDARA et al., 2006). Uma das propriedades mais importantes dos fungos está associada à sua capacidade metabólica de produzir uma grande diversidade de moléculas bioativas, sendo estes fármacos importantes de uso clínico em várias patologias. Os produtos naturais de microrganismos endofíticos têm mostrado capacidade de inibir ou matar uma ampla variedade de agentes patogênicos incluindo microrganismos fitopatógenos (STROBEL, 2003; STROBEL et al., 2004; GUNATILAKA, 2006) bem como fungos, bactérias (HARRISON et al., 1991; HORN et al., 1995; STROBEL et al., 1999; BRADY; CLARDY. 2000; LI et al., 2000; LU et al., 2000;) e vírus (GUO et al., 2000), além de apresentarem atividade antiumoral (WAGENAAR et al., 2000), atuarem como agentes antidiabéticos e imunossupressivos (STIERLE et al., 1993; ZHANG et al. 1999). Schulz et al. (2002) relataram que os fungos endofíticos são realmente uma boa fonte de metabólitos secundários, visto que a proporção de novas estruturas sintetizadas por estes microrganismos (51%) é maior do que a produzida por microrganismos do solo (38%) e que 80% destes produzem compostos biologicamente ativos contra fungos e bactérias ou apresentam atividade herbicida.

1.5. Antimicrobianos Produzidos por Fungos

Produtos naturais são metabólitos derivados naturalmente de microrganismos, plantas ou animais. Há séculos estes produtos vêem sendo explorados pelo homem, sendo as plantas a principal fonte de compostos utilizados na medicina (STROBEL; DAYSE, 2003). Por conta da sua diversidade e complexidade estrutural, os produtos naturais são de grande importância na farmacologia e biotecnologia, podendo também ser utilizados como modelo para síntese e semi-síntese de moléculas bioativas de amplo espectro e baixa toxicidade (DEMAIN, 2006; GULLO et al., 2006). O exemplo mais conhecido entre os produtos naturais são os antibióticos. Na “Era dourada dos antibióticos” dos anos 40 aos anos 70 do século passado destacou-se a descoberta da Penicilina por Alexander Fleming em 1928 e por sua produção por Chain e Florey em 1940 (DEMAIN, 2000). Os microrganismos, em especial os fungos, são conhecidos pela sua capacidade metabólica de produzir uma grande diversidade de moléculas bioativas. Estas substâncias, por sua vez, podem ser altamente tóxicas, por exemplo, as micotoxinas ou ser bastante úteis por poderem ser utilizadas como fármacos de uso em várias patologias. Esta dicotomia de funções é conseqüência da grande diversidade de compostos químicos que os fungos produzem (PINTO et al.,2002). Em 1994, dos vinte medicamentos mais vendidos, representando um mercado de aproximadamente 6,7 bilhões de dólares, seis deles foram obtidos in natura ou por transformação química de metabólitos provenientes de fungos. Dentre os medicamentos de maior repercussão terapêutica para doenças infecciosas destacam-se os antibióticos penicilinas e cefalosporinas como os exemplos mais conhecidos de produtos de fungos (SINGH & BARRETT, 2006). Recentemente, a pesquisa por produtos naturais tem perdido popularidade na maioria das companhias de medicamentos e, em alguns casos, tem sido substituída pela síntese química (BILLS et al., 2002; PELÁEZ, 2006). Esta dimuição de interesse pode estar atribuída ao enorme esforço e altos custos que são requeridos na obtenção, elucidação das estruturas e no desenvolvimento de medicamentos originados de produtos naturais. O tempo estimado desde o descobrimento até o laçamento de uma nova droga no mercado é de aproximadamente 10 anos, acarretando um gasto de mais de 800 milhões de dólares (REICHERT, 2003; DICKSON; GAGNON, 2004). Como

12 solução deste problema, a bioprospecção de metabólitos bioativos deve ser melhorada com a utilização de novas tecnologias e alternativas como engenharia genética e biossíntese mutacional, além da identificação mais rápida das moléculas de uma forma economicamente viável (BUTLER, 2004; WEIST;SUSSMUTH, 2005). Os fungos endofíticos se destacam como grandes produtores de metabólitos secundários (GUNATILAKA, 2006). Schulz et al. (2002) relatam a importância da pesquisa dos metabólitos destes microganismos, pois em comparação com fungos obtidos de outros substratos, relativamente poucos metabólitos têm sido isolados de fungos endofíticos. Além disso, 51% das substâncias já estudadas se tratam de compostos inéditos, enquanto que da microbiota do solo apenas 38% eram novas. A procura por novos habitats e a diversidade fúngica são fatores importantes na busca por produtos naturais e, consequentemente, no desenvolvimento de novas drogas.

1.5.1 Antibióticos Produzidos por Fungos Endofíticos

1.5.1.1 Cryptocandin A e Cryptocin

Cryptocandin A é um antifúngico lipopetitídico isolado do fungo endofítico Cryptosporiopsis quercina endofítico de Tripterigeum wilfordii, planta medicinal pertencente à família Celastracea nativa da Eurásia. Este composto contém um número incomum de aminoácidos hidroxilados e um novo aminoácido 3-hydroxy-4 hydroxymethylproline (Figure 2). Cryptocandin A é ativo contra alguns fungos importantes por causarem patologia ao homem, incluindo Candida albicans e Trichophyton sp. Além de também agir contra fungos fitopatógenos como Sclerotinia sclerotiorum e Botrytis cinerea (STROBEL et al., 1999). Cryptocin (Figura 2), um ácido tetrâmico com atividade antifúngica também foi obtido de C. quercina. Este composto possui uma potente atividade contra Pyricularia oryzae, microrganismo causador de doenças em planta o mundo (LI et al., 2000).

Figura 2. Cryptocandin A e Criptocin (LI et al., 2000)

1.5.1.2 Acido coletótrico

Artemísia, vegetal nativo da China e que tem como característica a sua resistência contra herbívoros, fungos e bactérias que atacam plantas adjacentes com facilidade, fato que levou à caracterização de compostos bioativos de fungos endofíticos que colonizam este hospedeiro. Um novo metabólito denominado de “colletotric acid” (Figura 3), produzido pelo fungo endofítico Colletotrichum gloeosporioides isolado de caule de Artemisia anuua e A. mongolia mostrou forte atividade antimicrobiana contra as bactérias patogênicas ao homem Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis e Sarcina lutea e contra o fungo fiopatógeno Helminthosporium sativum (ZOU et al., 2000).

Figura 3. Ácido coletótrico (ZOU et al., 2000)

1.5.1.3 2,4-diidroxi-5,6-dimetil benzoato de etila e Phomopsilactona

Cassia spectabilis é uma planta medicinal tradicionalmente utilizada no Brasil para tratamento de gripes e resfriados e como laxativo. Por conta do seu caráter medicinal, foi desenvolvido um estudo dos metabólitos bioativos de culturas de fungos endofíticos que colonizam este vegetal. O fermentado de Phomopsis cassiae, fungo isolado de folhas de C. spectabilis, foi selecionado para investigações químicas. Dois novos metabólitos, 2,4-diidroxi-5,6-dimetil benzoato de etila e Phomopsilactona (Figura 4) foram elucidados e nos testes de atividade antifúngica mostraram-se fortemente ativos contra os fitopatógenos Cladosporium sphaerospermum e C. cladosporioides (SILVA et al,. 2005).

Figura 4. 2,4-diidroxi-5,6-dimetil benzoato de etila e phomopsilactona (SILVA et al., 2005).

1.5.1.4 Brefeldin A

Dentre os 67 fungos endofíticos isolados de Quercus variabilis, planta medicinal nativa da China usada conta afecções da garganta, 53,7% se mostraram inibidores do crescimento de pelo menos um microrganismo teste, tanto fungos patogênicos ao homem (Aspergillus niger, Candida albicans, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, Trichophyton rubrum,), como também bactérias (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens). O fungo que se mostrou mais ativo foi Cladosporium sp. que produz uma substancia química identificada como Brefeldin A (Figura 5) ativo contra Aspergillus niger, Candida albicans, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis e Trichophyton rubrum (WANG et al.,. 2006).

Figura 5. Brefeldin A (WANG et al., 2006)

1.6 Lippia sidoides Cham.

O gênero Lippia (Verbenaceae), de grande importância médica e econômica, é constituído de aproximadamente 200 espécies dentre ervas, árvores de pequeno porte e arbustos distribuídos principalmente ao longo da América do Sul, América Central e África Tropical (LEMOS, 1990; LACOSTE, 1996). Lippia sidoides Cham. (Figura 6), popularmente conhecida como alecrim-pimenta, é um arbusto encontrado no sertão nordestino, principalmente nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte. A exemplo de outras espécies do gênero é uma planta aromática, de uso medicinal popular, principalmente como anti-séptico, havendo sido introduzida há pouco tempo nos programas de fitoterapia científica e nas práticas caseiras como fármaco fitoterápico, com base nos elevados teores de timol de seu óleo essencial e dos resultados de vários ensaios farmacológicos que vieram validar cientificamente seu uso como planta medicinal (COSTA et al., 2001). Os principais compostos do óleo essencial de Lippia sidoides são: timol (50- 70%), carvacrol (5-8%), p-cimeno (12-27%), cis-cariofileno (1–10%), γ-terpineno (6%), mirceleno (2%) e outros terpenos (COSTA et al. 2001). O timol e o carvacrol (Figura 7) são potentes anti-sépticos de atividades bactericida e fungicida (LEMOS et al., 1990; LACOSTE et al., 1996; MATOS; OLIVEIRA, 1998). A atividade antibacteriana e antifúngica do óleo têm espectro de ação contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp, Streptococcus mutans, Salmonella typhii, Corynebacterium xerosis, Candida albicans, Trichophytom rubrum e Trichophytom interdigitale, dentre outros (GIRÃO, 2001; PASCUAL, 2001; KALEMBA; KUNICKA, 2003; KUNLE et al., 2003; DUARTE, 2005). Em virtude destas propriedades, este vegetal é cultivado em hortos de plantas medicinais e faz parte do elenco de plantas selecionadas pelo Governo do Estado de Pernambuco como fitoterápico. Dentre as investigações realizadas quanto a micobiota endofítica de plantas medicinais brasileiras, ainda não há na literatura dados de estudos realizados com Lippia sidoides quanto a este aspecto.

Figura 6. Planta medicinal Lippia sidodies Cham.

A B Figura 7. Estrutura Química do Carvacrol (A) e Timol (B) (COSTA et al., 2001)

2. REFERÊNCIAS

3. Referências

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3. PRIMEIRO CAPÍTULO

Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham.

Artigo submetido em 22/10/2007 a Wourld Journal of Microbiology and Biotechnology

Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham.

Virginia Medeiros de Siqueiraa*, Raphael Contib,

Janete Magali de Araújoc, Cristina Maria Souza-Mottaa

a Departmento de Micologia, UFPE, 50670-901 Recife - PE, Brazil. b Departmento de Ciências Farmacêuticas, UFPE, 50670-901 Recife - PE, Brazil. c Departmento de Antibióticos, UFPE, 50670-901 Recife - PE, Brazil.

*e-mails: [email protected]

[email protected]

Tel: + 55 81 21268347

Fax: + 55 81 21268346

Fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides Cham.

Resumo

Fungos endofíticos foram isolados de tecidos sadios de Lippia sidoides, planta medicinal usada principalmente como anti-séptico no Nordeste Brasileiro. A partir de 240 fragmentos de folhas e 240 de caule foi isolado um total de 207 fungos endofíticos, representando 14 espécies pertencentes aos grupos Ascomycota, Coelomycetes e Hyphomycetes. A colonização endofítica foi maior nas folhas (52%) do que no caule (34,1%). Colletotrichum gloeosporiodes foi a espécie com maior freqüência de colonização (12,3%), seguida de Alternaria alternata (7,08%), Guignardia bidwelli (6,87%) e Phomopsis archeri (5,41%). Algumas espécies se mostraram específicas para determinado tecido do hospedeiro: Corynespora subcylindrica, Curvularia pallescens, Dreschlera dematioidea, G. bidwelli, Microascus desmosporum, Peacilomyces variotti, Periconia byssoides e Ulocladium oudemansii foram isolados apenas de folhas e Fusarium lateritium e Phoma tracheiphila foram isolados apenas de caule.

Palavras chave: Fungos endofíticos, diversidade, folhas, caule, Lippia sidoides.

Introdução

O estabelecimento de plantas em seus respectivos habitats envolve sua capacidade de interagir com diferentes espécies de organismos. Os microrganismos interagem de formas distintas em diferentes áreas do vegetal, sendo denominados de endofíticos quando colonizam inter e/ou intracelularmente tecidos sadios da planta hospedeira, tipicamente sem causar sintomas de doença (Petrini, 1991; Azevedo et al. 2000). A relação entre o endofítico e seu hospedeiro é complexa e certamente muda conforme o hospedeiro e o microrganismo (Owen & Hundley 2004), sendo possível se estabelecer uma simbiose que varia desde o mutualismo até a fitopatogenia latente, passando pelo comensalismo e saprofitismo (Clay & Schardl 2002; Strobel & Dayse 2003; Kogel & Franken 2006). Os primeiros estudos mostrando que os endófitos conferiam algumas vantagens ao seu hospedeiro, por exemplo, protegendo-o de insetos, patógenos e até mesmo de herbívoros domésticos, fizeram deles objetivo de pesquisas mais aprofundadas (Azevedo 1999; Azevedo et al. 2002). Recentemente, endofíticos são vistos como uma ótima fonte de novos produtos naturais bioativos úteis na agricultura, indústria e medicina, uma vez que estes microrganismos ocupam literalmente milhões de nichos ecológicos únicos crescendo em muitos ambientes muitas vezes incomuns (Schulz et al. 2002; Strobel & Dayse 2003; Strobel et al. 2004; Bandara et al. 2006). Muitos endofíticos isolados de plantas medicinais têm se mostrado produtores de metabólitos secundários com forte atividade fungicida e bactericida (Tan & Zou 2001; Gunatilaka 2006). Investigações detalhadas da micobiota interna de plantas frequentemente descobrem novos taxa e revela novas distribuições das espécies já conhecidas. Pelo fato dos endofíticos serem incompiscuous, a diversidade de espécies da micobiota interna ser relativamente alta e uma pequena porção de potenciais hospedeiros terem sido até então examinados, endofíticos representam um número substancial de fungos ainda não descobertos (Arnold et al. 2000). Investigações de fungos endofíticos de vegetais bem caracterizados e economicamente importantes frequentemente revela novos taxa. Estudos sobre fungos endofíticos são necessários para fornecer informações fundamentais para a avaliação da diversidade e distribuição fúngica global (Stone et al. 2004).

O gênero Lippia pertence à família Verbenaceae e é constituído de aproximadamente duzentas espécies nativas da América do Sul, América Central e África (Lemos et al. 1990; Lacoste et al. 1996). Lippia sidoides Cham., popularmente conhecida como alecrim-pimenta, é um arbusto encontrado no nordeste Brasileiro, principalmente nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte. Baseado nas altas concentrações de timol e carvacrol, componentes do seu óleo essencial, e em muitos testes farmacológicos que vieram validar seu uso como planta medicinal, Lippia sidoides é utilizada na medicina tradicional para o tratamento de doenças infecciosas (Costa et al. 2002). O chá de folhas e flores é manuseado topicamente em ferimentos e queimaduras como agente anti- séptico e antiinflamatório (Matos & Oliveira 1998; Pascual 2001). Os objetivos do presente estudo foram isolar fungos endofíticos de folhas e caule de Lippia sidoides para determinar sua freqüência de colonização e fazer um levantamento de sua distribuição nos diferentes tecidos do vegetal. Em pesquisas futuras, os resultados deste estudo poderão contribuir para a descoberta de novos compostos bioativos provavelmente derivados de fungos endofíticos desta planta medicinal.

Materiais e métodos

Material vegetal

A coleta do material vegetal foi realizada na Estação Experimental da Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA) em Carpina-PE, Brazil, em julho de 2006. O clima da região é tropical úmido com o período chuvoso de Fevereiro a Setembro. Folhas e caule de cinco indivíduos aparentemente sadios foram aleatoriamente coletados, etiquetados e colocados em sacos plásticos sob refrigeração. As amostras foram enviadas para o Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, Brasil e processadas em até 24h.

Isolamento de fungos endofíticos

Para eliminação de microrganismos epifíticos, o material vegetal foi submetido ao processo de esterilização superficial de acordo com Araújo et al. (2002a). Folhas e caules de L. sidoides foram lavados em água corrente, seguido de imersão em etanol 70% por 1 minuto, em hipoclorito de sódio (2 – 2,5% de cloro ativo) por 4 minutos, em etanol 70% por 30 segundos e lavados três vezes em água destilada e esterilizada. Após

33 esterilização superficial, as amostras foram cortadas em fragmentos de 0,5cm2 (folhas) e 0,5cm (caule) e transferidas assepticamente para placas de Petri contendo os meios de cultura Sabouraud Dextrose Agar (SAB, contendo (g/L): peptona 10, dextrose 10 e agar 15; pH 5.6) e Batata Dextrose Agar (BDA, contendo (g/L): batata 200, dextrose 20 e agar 15; pH 6.0) suplementados com tetraciclina (100µg/mL) e clorafenicol (100µg/mL) para suprimir o crescimento bacteriano. As placas de Petri foram incubadas a 30oC durante 30 dias, verificadas diariamente e qualquer colônia fúngica presente foi isolada, purificada e preservada em BDA para posterior identificação. O controle de eficiência de esterilização superficial foi confirmado pela inoculação da última água de lavagem em placas de Petri com o meio de cultura Triptona Soja Agar (TSA, contendo (g/L): peptona 5, triptona 5, sodium chlorite 15 e agar 15; pH 5.6). A freqüência de colonização (FC%) foi calculada como o número de isolados obtidos (Ni) pelo número total de fragmentos (Nf) x 100 (FC=Ni/Nf x 100) (Araújo et al. 2002a).

Identificação dos fungos endofíticos

A identificação foi realizada na Coleção de Culturas Micoteca-URM do Departamento de Micologia da UFPE, Recife, Brasil, observando-se características macroscópicas das colônias (cor, aspecto, consistência, presença de pigmento, etc.) e características microscópicas (morfologia de estruturas vegetativas e reprodutivas), utilizando literatura específica (Mason & Ellis 1953; Morton & Smith 1963; Booth 1971; Ellis 1971; Ellis 1976; Button 1980; Barnett & Hunter 1987; Hanlin 2000). Os meios de cultura BDA, SAB e Agar água foram utilizados e incubados a 28 ± 20C por até 30 dias. Após identificação os fungos foram depositados na Micoteca-URM do Departamento de Micologia (UFPE).

Resultados e discussão

De 480 fragmentos analisados (240 de folhas e 240 de caule) foram 207 fungos endofíticos, dando uma percentagem de colonização de 43,1%. Folhas e caule se diferenciaram quanto a sua colonização endofítica com 125 (52%) isolados obtidos de folhas e 82 (34,1%) obtidos de caule (Tabela 1). Estes isolados foram agrupados em 14 espécies pertencentes aos grupos Ascomycota, Coelomycetes e Hyphomycetes (Figura 1). Colletotrichum gloeosporioides foi a espécie mais isolada com freqüência de

34 colonização de 12,3%, seguida de Alternaria alternata com 7,08%, Guignardia bidwelli com 6,87% e Phomopsis archeri com 5,41%. Os isolados que não desenvolveram estruturas reprodutivas foram agrupados como Mycelia Sterilia. Estes dados estão de acordo com resultados sobre fungos endofíticos de outros hospedeiros nos quais geralmente um amplo grupo de espécies pode ser isolado de um dado vegetal, mas apenas algumas estão presentes em número significante (Petrini et al. 1992). Os gêneros Alternaria, Colletotrichum, Phomopsis e Guignardia são relatados na literatura como endofíticos com alta freqüência de colonização ocorrendo em diferentes tecidos vegetais (Larran et al. 2001; Larran et al. 2002; Hata et al. 2002; Santamaría & Bayman 2005; Chareprasert et al. 2006; Osono 2007; Verma et al. 2007; Lin et al. 2007).

Em adição a este grupo central de espécies consistentemente isoladas, investigações de fungos endofíticos invariavelmente geram longas listas de espécies acidentais. Cada espécie acidental frequentemente é representada por apenas um ou dois isolados dentre centenas (Bills & Pollishook 1992). A ocorrência de espécies acidentais também foi observada neste estudo: Alternaria tenuissima, Curvularia pallescens, Peacilomyces variotti, Periconia byssoides, Ulocladium oudemansii e foram isolados em pequeno número. Os gêneros Periconia e Drechslera segundo Verma et al. (2007) também ocorrem como endofíticos acidentais de Azadirachta indica. Periconia sp. endofítico de Torreya grandifolia é conhecido por produzir Taxol e o antibiótico periconicins (Li et al. 1998; Kim et al. 2004) enquanto que Drechslera gigantia por produzir o inseticida pestasol (Bunkes et al. 1991). Em geral, o número de espécies acidentais e raras é proporcional ao número de fragmentos utilizados (Petrini & Fisher 1986). Nossos resultados certamente indicam que o método de isolamento foi adequado e revelou espécies raras.

Os grupos de espécies se apresentam especificamente em cada tecido vegetal analisado (Figura 2). Por exemplo, Guignardia bidwellii ocorreu apenas de folhas, Phoma tracheiphila apenas de caule e Colletotrichum gloeosporioides e Alternaria alternata em ambos tecidos vegetais de Lippia sidoides. Petrini et al. (1992) concluiu que diferentes tecidos e órgãos vegetais podem de fato constituir distintos micro-habitats, sendo esta preferência um reflexo do conteúdo do tecido vegetal. Além disso, o habitat associado à planta é um ambiente dinâmico no qual muitos fatores como a espécie do hospedeiro, interação com outros endofíticos ou microrganismos patógenos (Araújo et al. 2001; Araújo et al., 2002b), características do local como elevação, exposição,

35 vegetação associada, tipo de tecido e idade do tecido (Roll & Roll 1979; Fisher et al. 1986; Fisher & Petrini 1990; Fisher et al. 1994; Rodrigues 1994) afetam a composição de espécies e a freqüência de colonização.

Em virtude do valor medicinal de Lippia sidoides, este vegetal foi selecionado para isolamento e identificação de sua micoflora endofítica. Com base na literatura, é possível que as características medicinais da planta sejam conseqüência da capacidade de seus endofíticos de produzir metabólitos secundários biologicamente ativos, como no caso do Taxol, anticancerígeno produzido por Taxus brevifolia e por seu endofíticos Taxomyces andreanea (Stierle et al. 1993). Os resultados deste trabalho mostram a importância relativa da preferência de tecido pelos endofíticos e sua diversidade, um importante passo para o entendimento das relações endofíticas com esta planta medicinal. Em trabalhos futuros, esperamos investigar a potencial produção de compostos antimicrobianos por estes fungos endofíticos.

Agradecimentos

Ao CNPq e ao Projeto Rede de Coleções de Culturas de Microrganismos do Norte e Nordeste do Brasil” (RENNEBRA).

Tabela 1. Número de fungos endofíticos isolados de cada tecido de Lippia sidoides e sua freqüência de colonização.

Folhas Caule Total Fungos endofíticos N % N % N %

Alternaria alternata (Fr.) Keissl. 07 2,91 27 11,2 34 7,08

A. tenuissima (Kunze) Wiltshire 01 0,41 01 0,41 02 0,41

Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. 42 17,5 17 7,08 59 12,3

Corynespora subcylindrica nov. sp. 06 2,5 - 06 1,25

Curvularia pallencens Boedijn 01 0,41 - 01 0,20

Dreschlera dematioidea (Bubák & Wróbl.) Scharif 03 1,25 - 03 0,62

Fusarium lateritium Nees - 05 2,08 05 1,04

Guignardia bidwellii (Ellis) Viala & Ravaz 33 13,7 - 33 6,87

Microascus desmosporum (Lechmere) Curzi 02 0,83 - 02 0,41

Peacilomyces variotti Bainier 01 0,41 - 01 0,20

Periconia byssoides Pers. 02 0,83 - 02 0,41

Phoma tracheiphila (Petri) L.A. Kantsch. & Gikaschvili - 08 3,3 08 1,66

Phomopsis archeri B. Sutton (1980) 10 4,16 16 6,6 26 5,41

Ulocladium oudemansii E.G. Simmons 01 0,41 - 01 0,20

Mycelia Sterilia 16 6,6 08 3,3 24 5,0

Total 125 52,0 82 34,1 207 43,1

N: número %: freqüência de colonização - : não isolado

30 25

15 10

5 % Isolados obtidos 0 Folha Caule FolhaCaule Folha Caule Folha Caule Coelomycetes Hyphomycetes Ascomycetes Mycelia Sterilia

Figura 1. Percentagem de fungos endofíticos de diferentes grupos.

1 Alternaria alternata 2 A. tenuissima 3 Colletotrichum gloeosporioides 4 Corynespora subcylindrica 5 Curvularia pallencens 6 Dreschlera dematioidea 7 Fusarium lateritium 8 Guignardia bidwelli 9 Microascus desmosporum 10 Peacilomyces variotti 11 Periconia byssoides 12 Phoma tracheiphila Número de fungos isolados 13 Phomopsis archeri 14 Ulocladium oudemansii 15 Mycelia Sterilia Folhas Caule Figura 2. Diferenças em número e especificidade de fungos endofíticos de Lippia sidoides nos tecidos vegetais

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4. SEGUNDO CAPÍTULO

Potencial Antimicrobiano de Fungos Endofíticos da Planta Medicinal Lippia sidoides Cham.

Artigo a ser submetido a Brazilian Journal of Microbiology

Potencial Antimicrobiano de Fungos Endofíticos da Planta Medicinal Lippia sidoides Cham.

Virginia M. de Siqueiraa*, Janete M.de Araújob, Cristina M.Souza-Mottaa

a Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de

Pernambuco, Av. Prof. Nelson Chaves s/n, 50670-420, Recife, Pernambuco, Brasil,

50670-901 Recife - PE, Brasil. b Departamento de Antibióticos, Centro de Ciências Biológicas, Rua Arthur de Sá, s/n,

50670901, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil, 50670-

901 Recife - PE, Brazil.

*e-mails: [email protected]

[email protected]

*Tel: 81 2126 8948

Potencial Antimicrobiano de Fungos Endofíticos da Planta Medicinal Lippia sidoides Cham.

Virginia M. de Siqueiraa*, Janete M.de Araújob, Cristina M.Souza-Mottaa

a Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de

Pernambuco, Av. Prof. Nelson Chaves s/n, 50670-420, Recife, Pernambuco, Brasil,

50670-901 Recife - PE, Brasil. b Departamento de Antibióticos, Centro de Ciências Biológicas, Rua Arthur de Sá, s/n,

50670901, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil, 50670-

901 Recife - PE, Brazil.

*e-mails: [email protected]

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*Telefone: 81 2126 8948

Potencial Antimicrobiano de Fungos Endofíticos da Planta Medicinal Lippia sidoides Cham.

RESUMO

Fungos endofíticos de folha e caule da planta medicinal Lippia sidoides foram isolados e investigados quanto a sua atividade antimicrobiana contra diferentes bactérias e fungos patogênicos ao homem. O potencial antimicrobiano dos fungos endofíticos foi avaliado através do ensaio em bloco de gelose. Os fungos que mostraram melhores resultados foram fermentados em diferentes meios de cultura e testados através do método de difusão em agar. Os endofíticos com atividade antimicrobiana foram: Alternaria alternata, Colletotrichum gloeosporioides, Drechslera dematioidea, Phomopsis archeri e Mycleia Sterilia. No bloco de gelose, 16 entre 207 fungos endofíticos mostraram atividade contra pelo menos um microrganismo teste com halos de inibição variando de

12 a 30mm. Durante a fermentação, os melhores halos de inibição foram de 25, 18 e

13mm contra Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Klebsiella pneumonie, respectivamente.

Palavras chave: Fungos endofíticos, atividade antimicrobiana, Lippia sidoides

INTRODUÇÃO

As plantas podem servir como reservatório de inúmeros microrganismos conhecidos como endofíticos. Por definição, estes microrganismos vivem nos espaços inter e intracelulares do tecido vegetal sem causar danos (2). Endofíticos representam uma vasta diversidade de adaptações microbianas que se desenvolveram em ambientes especiais e incomuns, e sua diversidade e habitações especializadas os tornaram uma ótima fonte de estudos e pesquisa por novas drogas (3, 15, 21). A contribuição dos endofíticos para a planta é promover proteção através de compostos antimicrobianos que os endofíticos produzem. Alguns destes compostos podem ser interessantes para a medicina desde que eles possuem atividade antifúngica e antibacteriana (19). O advento do desenvolvimento de resistência a drogas por bactérias e fungos patogênicos ao homem tem induzido uma procura por mais e melhores antibióticos. Uma busca intensiva por novos e efetivos agentes antimicrobianos é necessária (16). A busca por endofíticos específicos que possam produzir antibióticos tem sua origem na etnobotânica, a qual utiliza a medicina tradicional de povos nativos (19). Muitos endofíticos isolados de plantas medicinais têm se mostrado produtores de metabólitos secundários com forte atividade fungicida e bactericida (9, 22). Lippia sidoides Cham., popularmente conhecida como alecrim-pimenta, é um arbusto encontrado no nordeste brasileiro, principalmente nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte. Baseado nas altas concentrações de timol e carvacrol, componentes do óleo essencial, e nos muitos testes farmacológicos que vieram validar sua utilização como planta medicinal, Lippia sidoides é utilizada na medicina tradicional para o tratamento de doenças infecciosas (8). O óleo desta planta medicinal tem também sido relatado como antibacteriano e antifúngico com espectro de ação contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp, Streptococcus mutans, Salmonella typhii, Corynebacterium xerosis, Candida albicans, Trichophytom rubrum and Trichophytom interdigitale (13, 11, 6). Com base na literatura, é possível que as características de uma planta medicinal sejam conseqüência da capacidade de seus endofíticos produzirem metabólitos biologicamente ativos, como no caso do taxol, anticancerígeno produzido por Taxus brevifolia e também pelo seu fungo endofítico Taxomyces andreanea (20). O importante caráter medicinal de Lippia sidoides embasa a pesquisa da sua micoflora endofítica envolvida na produção de compostos bioativos. O objetivo do presente estudo foi investigar a potencial produção

50 de compostos antimicrobianos que apresentam atividade antagônica contra bactérias e fungos patogênicos ao homem.

MATERIAIS E MÉTODOS

Microrganismos Teste

Os microrganismos teste utilizados para os testes antimicrobianos foram duas bactérias Gram-positivas (Staphylococcus aureus ATCC-6538 e Bacillus subtilis UFPEDA-16), três bactérias gram-negativas (Escherichia coli ATCC-25922, Klebsiella pneumoniae ATCC-29665 and Pseudomonas aeruginosa ATCC-27853), obtidas da Coleção de Culturas UFPEDA, Departamento de Antibióticos, UFPE, Recife, Brasil, e três fungos patogênicos ao homem (Candida albicans UFPEDA-1007, Malassezia furfur URM- 4849 e Trichophyton rubrum URM-4350) obtidos da Micoteca – URM, Departamento de Micologia, UFPE, Recife, Brasil.

Screening de Atividade Antimicrobiana

Os fungos endofíticos foram submetidos ao ensaio antimicrobiano em meio sólido baseado na metodologia descrita por Ichicawa et al. (10) a qual permite uma seleção rápida e qualitativa de microrganismos bioativos. Cada fungo foi cultivado na superfície de BDA em placas de Petri a 30oC por sete dias. Após este período, discos foram cortados da colônia com um furados (6mm de diâmetro) e transferidos para a superficial do meio Muller-Hinton, SAB e SAB suplementado com 0,5% de azeite de oliva, previamente semeados com as bactérias, Candida albicans ou Trichophyton rubrum e com Malassezia furfur, respectivamente. As placas de Petri foram incubadas a 37oC por 24h quando os microrganismos teste eram bactérias e a 30oC por 48h quando os microrganismos teste eram fungos. Os halos de inibição foram medidos após estes períodos.

Ensaio fermentativo

O teste de difusão foi realizado com os isolados que mostraram melhores resultados no screening. Este ensaio tem como finalidade selecionar o melhor meio e tempo de produção do metabólito bioativo. Os pré-inóculos foram preparados em frascos

Erlenmeyers de 250mL com cinco discos (6mm de diâmetro) da colônia fúngica e com 50mL de Batata Dextrose Caldo (BDC, contendo (g/L): batata 200 e dextrose 20; pH 6.0). Todas as culturas foram incubadas a 28 ± 2oC em mesa rotatória a 180rpm. Alíquotas (10mL) de cada pré-inóculo foram transferidas para fracos Erlenmeyer de 500mL contendo 90mL dos meios BDC, Extrato de Malte (EM, contendo (g/L): extrato de malte 20) e Meio para a produção de Eurimicina (MPE, contendo (g/L): farinha de soja 20, glicose 20, CaCO3 2 e NaCl 5) e submetido as mesmas condições durante 96h. A cada 24h, 1mL do líquido fermentado foi centrifugado a 225g por 15min e 30 µl do sobrenadante foram utilizados para os testes de atividade antimicrobiana pelo método de difusão em disco segundo Bauer et al. (4).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir de 480 fragmentos (240 de folhas e 240 de caule) foram isolados 207 fungos endofíticos. Todos os isolados foram submetidos ao ensaio antimicrobiano em meio sólido. No total, 16 de 207 fungos endofíticos mostraram atividade contra pelo menos um microrganismo teste com halos de inibição variando de 12 a 30mm (Tabela 1). Os isolados obtidos de folhas, apesar de em menor número, se mostraram capazes de inibir bactérias Gram-negativas, Gram-positivas e fungos, significando um amplo espectro de ação. Na medicina popular, o chá de folhas de Lippia sidoides é utilizado para o tratamento de doenças infecciosas causadas por bactérias e fungos (5). Este caráter medicinal pode estar intimamente ligado aos metabólitos secundários dos fungos endofíticos que habitam as folhas.

Os fungos endofíticos com atividade antimicrobiana estão distribuídos em quatro espécies: Alternaria alternata (9), Colletotrichum gloeosporioides (1), Drechslera dematioidea (2) e Phomopsis archeri (2). Outros isolados que não produziram estruturas reprodutivas foram classificados como Mycelia Sterilia (2). Em outros rastreamentos, espécies destes gêneros foram também detectados como produtores de produtos naturais com atividade antimicrobiana. Resultados similares foram observados com Alternaria alternata, Alternaria sp., Colletotrichum sp., e Phomopsis sp. isolados de plantas medicinais. Estes fungos mostraram atividade contra Staphylococcus aureus, S. aureus meticilina-resistente, Escherichia coli e Bacillus subtilis (7, 14, 16, 17, 18). C. gloeosporioides, endofítico isolado de caule de Artemísia mongólica também é conhecido por produzir um novo metabólito antimicrobiano denominado “ácido

52 coletotrico” o qual é capaz de inibir o crescimento de Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus bem como atuar contra o fungo fitopatógeno Helminthosporium sativum (23). Espécies de Phomopsis isoladas como endofíticos da planta medicinal Erythrina crista- galli é produtor de um novo antibiótico chamado “phomol” o qual apresenta atividade antifúngica, antibacteriana e baixa atividade citotóxica (24). Lin et al. (14) relataram que os fungos que não esporulavam foi o grupo maior e mais amplamente distribuído entre os fungos isolados da planta medicinal Camptotheca acuminate e que estes fungos foram também a maior fonte de produtos bioativos apresentando atividade contra as bactérias S. aureus, B. subtilis, E. coli e contra o fungo Candida albicans. Mycelia Sterilia é também citado como produtor de agentes antimicrobianos por Krohn et al. (12).

Strobel et al. (21) enfatizam que os endofíticos comumente produzem metabólitos secundários quando cultivados e que a temperatura, a composição do meio e o grau de aeração afetam a quantia e os tipos de compostos que são produzidos pelos fungos endofíticos. Produtos naturais de fungos endofíticos têm sido observados inibindo e matando uma ampla variedade de microrganismos prejudiciais incluindo, mas não limitado a, fitopatógenos, bem como bactérias, fungos, vírus e protozoários que afetam homens e animais (9, 25).

Dos 16 fungos endofíticos submetidos ao ensaio fermentativo, 10 exibiram atividade antimicrobiana. Noventa por cento deles contra Staphylococcus aureus, 30% contra Bacillus subtilis e 10% contra Klebsiella pneumoniae (Tabela 2). Os halos de inibição variaram de 13 a 25mm. Nenhum dos fungos endofíticos repetiram os resultados mostrados no ensaio em meio sólido contra Malassezia furfur e Thichophyton rubrum.

Durante a fermentação, parâmetros como pH, tempo de produção e meio de cultura foram analisados. Entre estes, Extrato de Malte, 72-96h e pH 5-7, foram considerados os melhores meio de cultura, tempo e pH, respectivamente (Tabela 2). As condições de cultura como as propriedades do meio, agitação, aeração e temperatura podem interferir na produção do composto pelo fungo. Por esta razão, seria necessário testar outros meios de cultura para avaliar a atividade dos isolados que não produziram compostos bioativos durante a fermentação. Além disso, a produção de compostos bioativos por fungos endofíticos sem dúvidas é estimulada pela planta ou pelos efeitos causados pelo ambiente. Quando in vitro um endofítico pode continuar a produzir o composto ou, em certas circunstancias, após certo período de tempo, pode parar o processo químico.

Mais pesquisas são necessárias para descobrir que fatores podem ajudar a induzir o fungo a continuar a síntese (15).

Nossas observações sugerem que fungos endofíticos de Lippia sidoides possuem potencial farmacêutico. Desde que estes fungos caracterizados quanto a isto mostraram atividade contra patógenos humanos, estes isolados podem ser considerados como alvos atrativos para estudos posteriores visando identificar os compostos através de análises químicas.

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Tabela 1. Screening de atividade antimicrobiana de fungos endofíticos. Identificação S. aureus B. subtillis E. coli K. pneumonie P. aeruginosa C. albicans M. furfur T. rubrum Fungos endofíticos de caule URM

5641 Alternatia alternata +++ ++ ------5646 A. alternata ++ ------5642 A. alternata ++ ------5552 A. alternata ++ ------5647 A. alternata +++ ++ ------5648 A. alternata ++ ------5649 A. alternata ++ ------5639 A. alternata ++ ------

5469 Phomopsis archeri ++ ++ ------Fungos endofíticos de folhas

5548 A. alternata +++ ++ ------5471 Dreschlera dematiodea +++ ++ - - - - ++ +++ 5775 Dreschlera dematiodea ++ ------+++

5640 Mycelia sterilia +++ +++ - ++ - - - +++

5645 Mycelia sterilia - - - ++ - - +++ - 5551 Colletotrichum gloeosporioides ------++

5644 Phomopsis archeri ++ ++ ------

–: sem atividade; ++: halo de inibição menor que 20mm; +++: halo de inibição maior que 20mm

Tabela 2. Atividade antimicrobiana do líquido fermentativo de fungos endofíticos.

No do Meio de Halos de inibição (mm) Endofítico Tempo (h) pH isolado cultura S. aureus B. subtillis K. pneumonie M. furfur T. rubrum

5648 A. alternata MPE 96 7,28 17 nt nt nt nt

5552 A. alternata EM 72 6,34 17 nt nt nt nt 5641 72 5,98 18 A. alternata EM 96 5,62 25 nt nt nt

5548 A. alternata 72 6,02 18 EM 96 6,19 25 nt nt nt

5646 A. alternata EM 72 6,65 15 nt nt nt nt

5639 A. alternata EM 72 6,22 17 nt nt nt nt

5775 D. dematiodea EM 72 5,13 17 nt nt nt -

5471 D. dematiodea BDC 96 7,32 15 - nt - -

5469 P. archeri BDC 72 5,2 18 - nt nt nt

5645 Mycelia Sterilia EM 96 6,36 nt nt 13 - nt

15 96 4,71 5640 Mycelia Sterilia BDC 13 - nt - 48 6,02 nt: não testado - : sem atividade EM: Extrato de Malte; BDC: Batata Dextrose Caldo; MPE: Meio para Produção de Eurimicina

5. TERCEIRO CAPÍTULO

Corynespora subcylindrica sp. nov. – uma nova espécie de Hyphomycete do Brasil e

uma discussão sobre a taxonomia de gêneros “corynespora-like”

Artigo submetido em 03/12/2007 a SYDOWIA

Corynespora subcylindrica sp. nov. – uma nova espécie de Hyphomycete do Brasil e

uma discussão sobre a taxonomia de gêneros “corynespora-like”

Virginia Medeiros de Siqueira1, Uwe Braun2 & Cristina M. Souza-Motta1

1Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Micologia, Avenida Professor

Nelson Chaves s/n, 50670-420, Recife, Pernambuco, Brasil,

E-mail: [email protected]

2Martin-Luther-Universität, Institut für Biologie, Geobotanik und Botanischer Garten,

Herbarium, Neuwerk 21, D-06099 Halle (Saale), Germany,

E-mail: [email protected]

Siqueira M. V., Braun U. & Souza-Motta C. M. (2008) Corynespora subcylindrica sp. nov. - uma nova espécies de Hyphomycete do Brasil e uma discussão sobre a taxonomia de gêneros “corynespora-like” – Sydowia xx (x): xx-xx

A nova espécie de Hyphomycete Corynespora subcylindrica, isolada como endofítico vivendo em folhas de Lippia sidoides em Pernambuco, Brasil, está descrita e ilustrada. A afinidade geral intricada à nova espécie está discutida em detalhe e são fornecidos um levantamento da taxonomia atual de gêneros “corynespora-like” bem como uma chave para o gênero em questão.

Palavras chave: fungos anamórficos, Hyphomycetes corinesporioides, nova espécie, América do Sul, chave.

Um hyphomyceto endofítico foi recentemente isolado de folhas sem lesões de

Lippia sidoides cultivada na Estação Experimental de Pesquisa Agropecuária de

Pernambuco no Brasil. Pelo fato da proliferação das células conidiogênicas ser monotretica, determinada ou ocasionalmente percorrente, este fungo pertence ao complexo Corynespora Güssow (Güssow 1906; Wei 1950; Ellis 1957, 1971, 1976;

Mercado Sierra et al. 1997). Uma comparação do hifomiceto isolado de Lippia sidoides com as numerosas espécies designadas para Corynespora e gêneros aliados sugeriu uma nova espécie não descrita. Os caracteres dos conídios com poucos distoseptos os quais são, entretanto, formados regularmente em cadeias tornou difícil encontrar um gênero apropriado para esta espécie. A inclusão em Corynespora s. lat. (sensu Ellis 1971) é aparentemente a melhor solução.

Materiais e Métodos

Endofíticos foram isolados colonizando folhas de Lippia sidoides utilizando o método descrito por Araújo et al. (2002) e cultivado em Batata Dextrose Agar (BDA) a

20%. Para descrição das características da colônia, foi feito cultivo em BDA contido em em placas de Petri de 90mm a 30oC. Material desidratado foi depositado no herbário

HLA e URM (Holgren et al. 1990) e culturas na URM. O estudo dos caracteres microscópicos e medidas foram feitos utilizando microscopia de luz (Olympus BX40) em água destilada sem coloração.

Taxonomia

Corynespora subcylindrica V. M. Siqueira, U. Braun & C.M. Souza-Motta, sp. nov. –

Figs 1–3.

Mycobank, MB 511295

Etym.: referido ao formato do conidio.

Corynesporae laevistipitatae similis, sed endophyticis, conidiophoris brevioribus, 10–85 µm longis, conidiis semper catenatis, saepe subcylindraceis.

Holotypus. – BRAZIL: Pernambuco, Carpina, Estação Experimental de Pesquisa

Agropecuária (IPA), isolado como endofíticos de folahs de Lippia sidoides Cham.

(Verbenaceae), 20 Jul. 2006, V. M. Siqueira (URM), cultura desidratada.

Isotypus. – HAL 2102 F, cultura desidratada..

Ex type culture: URM 5550 (sob óleo meineral e liofilização).

In vitro (BDA) – colônia efusa, lisa, aveludada, cinza claro, cinza-rato a cinza amarronzado, reverso marrom, margens quase totalmente irregulares, levemente plumosa, chegando a 30mm de diâmetro em sete dias, 60mm de diâmetro após dez dias.

– Hifas ramificadas, 1.5-8 µm de largura, às vezes células hifais dilatadas, até 15µm de diâmetro, septada, subhialina a oliváceo claro (hifas mais estreitadas) a marrom- olíváceo ou marrom (hifas regulares), ocasionalmente gutuladas, parede fina, até 1µm, lisas. – Conidióforos surgindo das hifas, laterais, usualmente macronematosos, ocasionalmente curtos e semimacronematosos, eretos, retos a delicadamente curvos, subcilindricos, não ramificados, 10–85 × 5–7 µm, 0–4 septos, claro a marrom ou marrom-oliváceo, paredes finas, ≤ 1 µm, lisa ou quase lisa. – Células conidiogênicas integradas, terminais, 10-30 µm de comprimento, monotreticas, determinadas, proliferação ocasionalmente percorrente (visível por ter células conidiogênicas terminais e subterminais as quais são levemente constrictas no septo), monotreticas, i.e. com um único poro terminal, 1-3µm diâmetro, nenhuma espessura significante ou escurecimento ao redor do poro. – Conídios catenulados (com até oito conídios por cadeia), elipsóide, subcilíndrico, ocasionalmente obvoide ou abclavado curto, reto a

63 levemente curvado, 18–60(–90) × 5–13 µm, 0–3(–6)-distoseptado (com lumina constricta), raramente com uma constricção delgada, marrom claro, parede fina, < 1 µm, porém usualmente parecendo ter parede dupla, conseqüente de uma camada interna clara, até 1.5 µm de largura, lisa ou quase lisa, ambos extremos obtusos, arredondados, com poros conspicuous, 1-3 µm de diâmetro, nenhuma espessura significante ou escurecimento ao redor dos poros.

Discussão

O gênero Corynespora foi introduzido por Güssow (1906). Wei (1950) redescreveu a espécie tipo deste gênero, C. mazei Güssow [= C. cassiicola (Berk. &

M.A. Curtis) C.T. Wei], a qual é caracterizada por apresentar células conidiogênicas monotreticas, com proliferação frequentemente percorrente e conídios pluridistoseptados formados isoladamente ou ocasionalmente em cadeias curtas. Mais tarde, o conceito de Corynespora foi ampliado pela adição de espécies com poucos a numerosos euseptos, solitários ou em cadeias curtas (Ellis 1971, 1976).

Corynesporella Munjal & Gill (Munjal & Gill 1961) foi proposto para um hifomiceto corinesporioide Indiano também com células conidiogênicas monotreticas e conídios distoseptados, porém diferindo de Corynespora por possuir várias células conidiogênicas terminais formdas como ramificações laterais. Castañeda (1985) alterou o conceito de Corynesporella pela adição de C. pinarensis R.F. Castañeda caracterizada por possuir conidióforos não ramificados com células conidiogênicas monotreticas, terminais e intercalares. A diferenciação entre Corynespora e Corynesporella é bastante sutil. Ambos os gêneros possuem células conidiogênicas monotreticas e conídios distoseptados. A ocorrência das células conidiogênicas terminais e intercalares bem

64 como conidióforos ramificados e não ramificados não são incomuns e são conhecidos em numerosos outros gêneros de hifomicetos, e.g., Alternaria Nees (Ellis 1971, 1976),

Cladosporium Link (Heuchert et al. 2005, Schubert 2005), Drechslera S. Ito (Ellis

1971, 1976), etc.

Hemicorynespora M.B. Ellis (Ellis 1972) constitui um hifomyceto

“corynespora-like” com conídios asseptados [H. deightonii M.B. Ellis, a espécie tipo;

H. aseptata Hol.-Jech. (Hobubová-Jechová 1987)] ou conídios com 1-eusepto [H. mitratae (Penz. & Sacc.) M.B. Ellis (Ellis 1972)].

Corynesporopsis P.M. Kirk (Kirk 1981a,b; Mercado Sierra et al. 1997) foi introduzido para acomodar espécies com células conidiogênicas monotretica e terminais, mas com conídios catenulados e euseptados, usualmente didimo- a fragmosporos. C. indica P.M. Kirk (Kirk 1983) é uma espécie incomum com um septo simples, mais ou menos mediano, escuro, e com septo “bandlik”. Morgan-Jones (1988a) recolocou Corynespora biseptata M.B. Ellis para Corynesporopsis, discutiu a taxonomia do último gênero e gêneros morfologicamente similares, e enfatizou que

“além do septo, a forma dos conídios e o fato de serem catenulados, existe uma pequena diferença entre Corynesporopsis e Hemicorynespora”. Monotretomyces Morgan-Jones,

Sinclair & Eicker (Morgan-Jones et al. 1987), caracterizado por apresentar conidióforos clavados com células conidiogênicas integradas, terminais e monotreticas e didimosporos catenulados, conídios euseptados, é pouco diferenciada de

Corynesporopsis e deve ser reduzido a sinônimo com o último gênero. Estromata e caespitoso, paredes finas, conidióforos mais claros não são suficientes para manter

Monotretomyces.

Castañeda & Kendrick (1990) introduziu o novo gênero Scolicorynespora R. F.

Castañeda & W.B. Kendr. consistindo de espécies de Corynespora com conídios

65 euseptados e formados isoladamente. Castañeda et al. (2004) descreveu uma nova espécie de Solicorynespora, propuseram uma combinação mais nova, e forneceram uma chave para espécies deste gênero. Estretanto, há uma continuidade morfológica de

Hymicorirespora com conídios com 0-1-septo para Solicorynespora caracterizados por possuir conídios bi a pluriseptados. Corynesporopsis apenas difere pela presença de conídios em cadeia. Baseado em estudos de outros gêneros de hifomicetos, e.g.

Cladosporium (David 1997, Schubert 2006, Crous et al. 2007), Passalora Fr. e outro anamórfico cercosporoide Mycosphaerella Johanson (Crous & Braun 2003), características como forma conidial e tipo de formação (solitários ou em cadeias) são de pouca importância a nível genérico. Por esta razão, a separação de Corynesporopsis,

Hemicorynespora e Solicorynespora é também duvidosa. Além disso, este gênero, caracterizado por ter conídios euseptados, são proximamente conectados com

Corynespora (s. str.) no qual os conídios são distoseptados, por numerosas espécies intermediárias. C. obclavata Dyko & P. Sutton (Dyko & Sutton 1979) foi descrita por contendo conídios 4-6-euseptados, mas ocasionalmente também distoseptados. C. rhapidis-humilis X.G. Zhang & M. Ji (Zhang & Ji 2005) é caracterizadas por apresentar conídios 12-15-distoseptsdos ou 1-4-euseptados, e C. toonae X.G. Zhang & Ch.K. Shi

(Zhang & Shi 2005) possui conídios 0-4-distoseptados ou 4-14-euseptados. Wulandari

(2006) descreveu C. hamata Wulandari com conídios 14-19-distoseptados, interespaçados com 3-8-euseptos, C. acalyphae Wulandari com 8–16-distoseptos e 3–8- eusepta, e C. gracilis Wulandari tendo conídios com 10-22 distoseptos com 1-2-eusepto interespaçados. Siboe et al. (1999) introduziu C. kenyensis Siboe, P.M. Kirk & P.F.

Cannon caracterizada pelos conídios 3-8-distoseptados misturados com 3-4-euseptados.

Espécies de Corynespora com disto e euseptação são sem dúvidas não incomuns e

66 representam a diferenciação entre Corynespora e Solicorynespora e gêneros similares difíceis e duvidosos.

Devido aos esporos catenulados e distoseptados a nova espécie Corynespora subcilíndrica é próxima de Corynesporina elegans Subram., a espécie tipo no gênero monotipo Corynesporina Subram. (Subramanian 1994), porém não pode ser atribuída ao ultimo gênero desde que este foi descrito produzindo conídios em cadeias basipetais.

Os conídios em espécies de Corynespora e gêneros aliados, se totalmente catenulados, são formados em cadeias acropetais. A nova espécie descrita do Brasil, caracterizada por possuir células conidiogências integradas e monotreticas terminais e conídios distoseptados formados em cadeias acropetais, se encaixa bem dentro do atual conceito de Corynespora, embora os conídios sejam formados em cadeias com até oito conídios

(versus a formação solitária ou na maioria das vezes em cadeias curtas pela espécie tipo de Corynespora e muitas outras espécies atribuídas ao gênero). Algumas espécies com conídios catenulados regularmente também têm sido descritas em Corynespora, e.g. . C. matuszakii Morgan-Jones (Morgan-Jones 1988b), a qual é, entretanto, completamente distinta de C. subcylindrica pelos conídios muito longos, pluriseptados, com até 260µm de comprimento, com forte célula lumina reduzida. O conídio de C. catenulade N.

Sharma et al. (Sharma et al. 2002), descrito na India como Clerodendrum indicum, são formados solitariamente, mas podendo formar algums conídios secundários formando cadeias conidiais curtas. Esta espécie é, entretanto, caracterizada por possuir conídios longos e largos, 1-24-distoseptados , 27.5–225.5 × 11–19 µm.

A maioria das espécies de Corynespora possui conídios largos, pluriseptados, formados isoladamente ou a maioria ocasionalmente em cadeias curtas, e assemelha-se com relação a este aspecto foliícola e sapróbio assim como C. cassiicola, a espécie tipo.

Muitos destas espécies se assemelham as ultimas espécies e são morfologicamente

67 distintas, e.g. C. erianthemi J.M. Yen & Lim, C. hemigraphidis J.M. Yen & Lim, C. heterospora J.M. Yen, C. ruelliae J.M. Yen & Lim (Yen 1980), C. ligustri Y.L. Guo, C. merremiae Y.L. Guo, C. millettiae Y.L. Guo e C. viticis Y.L. Guo (Guo 1984), C. morindae-tinctoriae Meenu & Kamal, C. nana Meenu & Kamal e C. rosacearum

Meenu & Kamal (Meenu & Kamal 1998).

A maioria das espécies de Corynespora (s. lat.) com conídios menores e poucos septos têm sido excluídas deste gênero devido aos conídios euseptados ou catenulados.

O conídio do liquenícola C. laevistipitata (M.S. Cole & D. Hawsksw.) Heuchert & U.

Braun (Heuchert & Braun 2006) assemelha-se a aqueles de C. subcylindrica, porém difere por ter conidióforos mais longos, até 228µm, e conídios formados isoladamente ou apenas ocasionalmente em cadeias curtas. Além disso, a parede ao redor do “lócus” conidiogêneo (poro) é frequentemente levemente escura. Corynespora pauciseptata Bat.

& Bezerra (Batista et al. 1965), descrita no Brasil sobre uma planta viva desconhecida, tem também conídios menores, 19–37 × 5.5–7.5 µm, com apenas 1-3-septos (não descrito se eu- ou distosepto), porém os conidióforos são muito longos, 300-510µm.

Com respeito ao tamanho e septação do conídio, C. gymnocladi Jian Ma & X.G. Zhang

(Ma & Zhang 2007) está próximo a C. subcylindrica (conídio 15–40 × 7–10.5 µm, 2–6- distoseptos), porém os conídios são mais obclavados e formados solitariamente. A

Norte Americana C. arctespora (Cooke & Ellis) Carries (Carries 1987) é outra espécie similar a C. subcylindrica por apresentar conídios pequenos, cilíndricos a obclavados,

13-63µm de comprimento, formados isoladamente ou em cadeias, mas os conídios são estreitados, 4-7µm de espessura, e possuem até 20 distoseptos.

Chave para gêneros “corynespora-like” (hifomiceteos com células conidiogências monotreticas).

Nesta discussão, foi mostrado que a diferenciação entre Corynespora e aliados, separar gêneros é sutil, i.e., há uma continuidade com respeito aos caracteres morfológicos, e os gêneros particulares estão conectados por numerosas espécies intermediárias.

Entretanto, no presente não faz sentido propor formalmente mudanças taxonômicas e novos sinônimos. Uma revisão taxonômica de gêneros corinesporoides é necessariamente urgente, porém pode ser baseada em afinidades filogenéticas derivadas de análises de seqüências moleculares. Há uma forte tendência para definir gêneros anamórficos pela combinação de dados morfológicos e filogenéticos (Crous et al. 2007).

Gêneros segregdos podem ser mantidos apenas quando filogeneticamente distintos de

Corynespora (s. str.), baseado na espécie tipo, porém tais dados ainda não estão disponíveis. Por esta razão, o gênero em questão pode ser mantido apenas como uma entidade morfológica, o qual pode ser “keyed” como se segue. Alguns gêneros adicionais com células conidiogênicas monotreticas também estão inclusos na chave, e.g. Briansuttonia R.F. Castañeda, Minter & Saikawa (Castañeda et al. 2004),

Dendryphiopsis S. Hughes, Didymobotryum Sacc. e Podosporium Schwein. (Ellis 1971,

Kiffer & Morelet 2000), e Paradendryphiopsis M.B. Ellis (Ellis 1976).

1. Conídios dictiosporos (com vários distoseptos tranversais, longitudinais e

oblíquos)...... Briansuttonia

1. Conídios asseptados ou com eu- ou distoseptos

transversais...... 2

2. Conidióforos mononematosos, não ramificados...... 3

2. Conidióforos mononematosos, porém frequentemente ramificados ou sinematosos...... 8

3. Conídios distoseptados ou com disto e euseptos misturados...... 4

3. Conídios asseptados ou euseptados (sem distosepto) ...... 6

4. Células conidiogências integradas, terminais e

intercalares...... Corynesporella pinarensis

4. Células conidiogênicas integradas, porém estritamente terminais

...... 5

5. Conídios formados isoladamente em cadeias acropetais curtas a

longas...... Corynespora

5. Conídios solitários ou em cadeias basipetais curtas ...... Corynesporina

6. Conídios catenulados...... Corynesporopsis

6. Conídios solitários...... 7

7. Conídios asseptados ou com um septo simples (obvoide-elipsoide, “mitre-

shaped”, “limoniform” e navicular) ...... Hemycorinespora

7. Conídios bi ou pluriseptado ...... Solicorynespora

8. Conidióforos em sinemata ...... 9

8. Conidióforos mononematosos, frequentemente ramificados ...... 10

9. Conídios solitários ...... Podosporium

9. Conídios catenulados...... Didymobotryum

10. Conídios distoseptados ...... Corynesporella

10. Conídios euseptados ...... 11

11. Conídios solitários, parede espessa ...... Dendryphyopsis

11. Conídios catenados, paredes delgada...... Paradendryphiopsis

Fig. 1. – Corynespora subcylindrica sp. nov. – Cultura em BDA (Diâmetro da placa

de Petri: 90mm).

Fig. 2. – Corynespora subcylindrica sp. nov. Conidióforo surgindo lateralmente de uma hifa em cultura em BDA, com conídio primário (conídio secundário da cadeia já solto). – Bar = 10 µm.

Figure 3. Corynespora subcylindrica sp. nov. – A. Hifa. – B. conidioforos. – C. célula conidiogência com proliferação percorrente. – D. conídio. – Bar = 10 µm.

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6. CONCLUSÕES GERAIS

8. Conclusões gerais

A comunidade de fungos endofíticos associada à planta medicinal Lippia sidoides, composta por quatorze espécies pertencentes aos grupos Ascomycota, Coelomycetes e Hyphomycetes, representa uma importante diversidade fúngica. A comunidade endofítica é diferente quanto ao tipo de tecido vegetal estudado, sendo aquela isolada de folha em maior número e mais diversificada quando comparada com a obtida de caule. Certas espécies fúngicas são freqüentes e isoladas de ambos tecidos vegetais, como Colletotrichum gloeosporioides, Alternaria alternata e Phomopsis archeri. Outras espécies são pouco frequentes e demonstram especificidade quanto ao tecido vegetal, como Curvularia pallencens e Ulocladium oudemansii isoladas apenas de folhas e Fusarium lateritium e Phoma tracheiphila isoladas apenas de caule. O estudo da diversidade de fungos endofíticos de plantas ainda não exploradas quanto a este aspecto, pode auxiliar na descoberta de novas espécies de fungos. Fungos endofíticos de Lippia sidoides são produtores de metabólitos bioativos de potencial uso terapêutico contra bactérias e fungos patogênicos ao homem. Esta atividade antimicrobiana pode estar intimamente ligada ao caráter medicinal do hospedeiro. Parâmetros como meio de cultura, pH e tempo de fermentação interferem na produção do metobólito bioativo.

7. ANEXOS

ANEXO I

Submission Confirmation

De: [email protected] em nome de Carolien van der Gaag ([email protected]) Enviada: segunda-feira, 22 de outubro de 2007 17:55:59 Para: [email protected] Dear Virginia,

Thank you for submitting your manuscript, "Endophytic Fungi from Leaves and Stem of Lippia sidoides Cham.", to World Journal of Microbiology and Biotechnology

During the review process, you can keep track of the status of your manuscript by accessing the following web site:

http://wibi.edmgr.com/

Your username is: virginiamedeiros Your password is: siqueira

If your manuscript is accepted for publication in World Journal of Microbiology and Biotechnology, you may elect to submit it to the Open Choice program. For information about the Open Choice program, please access the following URL: http://www.springer.com/openchoice

With kind regards, Editorial Office World Journal of Microbiology and Biotechnology Springer P.O. Box 990 3300 AZ DORDRECHT The Netherlands

ANEXO II

ANEXO III

World Journal of Microbiology & Biotechnology

Springer Open Choice In addition to the normal publication process (whereby an article is submitted to the journal and access to that article is granted to customers who have purchased a subscription), Springer now provides an alternative publishing option: Springer Open Choice. A Springer Open Choice article receives all the benefits of a regular subscription-based article, but in addition is made available publicly through Springer’s online platform SpringerLink. To publish via Springer Open Choice, upon acceptance please visit www.springer.com/openchoice to complete the relevant order form and provide the required payment information. Payment must be received in full before publication or articles will publish as regular subscription-model articles.

Instructions to Authors

The World journal of Microbiology & Biotechnology welcomes research papers, short communications, short notes, technical communications and review papers. Full-length Research Papers: These should describe new and carefully confirmed findings. Experimental procedures should be given in sufficient detail for others to verify the work. The length of a full paper should be the minimum required to describe and interpret the work clearly. Short Communications: A Short Communication is suitable for recording the results of complete but small investigations or giving details of new methods, techniques or apparatus. Short communications are two printed pages in length. Progress reports are not acceptable. Short Notes: Short Notes are one printed page in length. They are suitable for reports of simple findings such as the properties of an already well described enzyme or of observations not requiring elaboration. They should be written with a short (40−word) summary, no main subdivisions, they may contain one table or figure, or two if the text is brief, and no more than three references. Technical Communications: These are reports of processes or procedures which may be published as an annex to a full- length paper or on their own provided that the work described is of sufficient interest to other workers in the field. Review Papers: These should be submitted only after consultation with the Editor. They will be limited to no more than 8 printed pages.

World Journal of Microbiology & Biotechnology

Manuscript Presentation Manuscripts not conforming to the instructions below will be returned for reformatting without review. You should refer to a previously published article in the journal which can be downloaded for free from the journal website at http://www.springeronline.com. The journal's language is English. British English or American English spelling and terminology may be used, but either one should be followed consistently throughout the article. If English is not your first language please ensure that the language is corrected by a fluent English speaker or via www.manuscript-improvement.com before submission. Manuscripts submitted in poor English may be returned for revision without review. Text should be formatted to fit A4 or US Letter

83 paper size, leaving 2.5 cm margins on all sides of the text. Please double-space all material, including notes and references. Quotations of more than 40 words should be set off clearly, either by indenting the left-hand margin or by using a smaller typeface. Use double quotation marks for direct quotations and single quotation marks for quotations within quotations and for words or phrases used in a special sense.

Number the pages consecutively with the first page containing: • running head (shortened title) • title • author(s) • affiliation(s) • full address for correspondence, including telephone and fax number and e-mail address

Summary Please provide a short abstract of 100 to 250 words. The summary should not contain any undefined abbreviations or unspecified references. It should be page 2 of the manuscript with the title repeated on that sheet. Key Words Please provide 5 to 10 key words or short phrases in alphabetical order. Abbreviations Abbreviations should be explained at first occurrence in the text though extensive mathematical symbols should be defined collectively before the introduction begins on page 3. A list of abbreviations which need not be defined is given in Table 1 at the end of this document. Main text Presentation of the main text depends on the type of article. For guidance on this respect you should refer to a previously published article in the journal which can be downloaded for free from the journals’ website at www.springer.com. Sections headings should be clearly distinguishable but not numbered. If you decide to use notes, please use endnotes rather than footnotes. Notes should be indicated by consecutive superscript numbers in the text and listed at the end of the article before the references. Please consult a current issue for the styles. References in the text are cited as follows: One author: (Rosso 1973) Two authors: (Ross & Bianco 1978) Three or more authors: (Rosso et al. 1980) In the event that a cited author has two or more works published during the same year, the reference, both in the text and in the reference list, should be identified by a, b etc. after the date to distinguish the works.

Full-length Research papers should be presented under the following headers: Introduction (including a consideration of the current literature and the objectives of the study), Materials & Methods (with sufficient detail to allow the work to be repeated), Results & Discussion (focus the reader’s attention on your key results and put your key results into the context of current information).

The style of main sections of Short Communications need not conform to that of full-length papers. However, we encourage authors to present the main text under the following headers: Introduction, Materials & Methods, Results & Discussion.

Acknowledgements Acknowledgements (including funding agencies and help from other colleagues) should follow the main text and precede the references.

References References should be given at the end of the manuscript arranged alphabetically in order by de last name of the first author and in the form and style indicated below.

1. Journal article: Smith J, Jones M Jr, Houghton L et al (1999) Future of health insurance. N Engl J Med 965:325–329 2. Journal issue with issue editor: Smith J (ed) (1998) Rodent genes. Mod Genomics J 14:126–233 3. Journal issue with no issue editor: Mod Genomics J (1998) Rodent genes. Mod Genomics J 14:126–233 4. Book chapter: Brown B, Aaron M (2001) The politics of nature. In: Smith J (ed) The rise of modern genomics, 3rd edn. Wiley, New York 5. Book, authored: South J, Blass B (2001) The future of modern genomics. Blackwell, London 6. Book, edited: Smith J, Brown B (eds) (2001) The demise of modern genomics. Blackwell, London 7. Chapter in a book in a series without volume titles: Schmidt H (1989) Testing results. In: Hutzinger O (ed) Handbook of environmental chemistry, vol 2E. Springer, Berlin Heidelberg New York, p 111 8. Chapter in a book in a series with volume title: Smith SE (1976) Neuromuscular blocking drugs in man. In: Zaimis E (ed) Neuromuscular junction. Handbook of experimental pharmacology, vol 42. Springer, Berlin Heidelberg New York, pp593–660 9. Proceedings as a book (in a series and subseries): Zowghi D et al (1996) A framework for reasoning about requirements in evolution. In: Foo N, Goebel R (eds) PRICAI'96: topics in artificial intelligence. 4th Pacific Rim conference on artificial intelligence, Cairns, August 1996. Lecture notes in computer science (Lecture notes in artificial intelligence), vol 1114. Springer, Berlin Heidelberg New York, p 157 10. Proceedings with an editor (without a publisher): Aaron M (1999) The future of genomics. In: Williams H (ed) Proceedings of the genomic researchers, Boston, 1999 11. Proceedings without an editor (without a publisher): Chung S-T, Morris RL (1978) Isolation and characterization of plasmid deoxyribonucleic acid from Streptomyces fradiae. In: Abstracts of the 3rd international symposium on the genetics of industrial microorganisms, University of Wisconsin, Madison, 4–9 June 1978 12. Paper presented at a conference: Chung S-T, Morris RL (1978) Isolation and characterization of plasmid deoxyribonucleic acid from Streptomyces fradiae. Paper presented at the 3rd international symposium on the genetics of industrial microorganisms, University of Wisconsin, Madison, 4–9 June 1978 13. Patent: Norman LO (1998) Lightning rods. US Patent 4,379,752, 9 Sept 1998 14. Institutional author (book): International Anatomical Nomenclature Committee (1966) Nomina anatomica. Excerpta Medica, Amsterdam 15. Non-English publication cited in an English publication: Wolf GH, Lehman P-F (1976) Atlas der Anatomie, vol 4/3, 4th edn. Fischer, Berlin. [NB: Use the language of the primary document, not that of the reference for "vol" etc.!] 16. Non-Latin alphabet publication: The English translation is optional. Marikhin VY, Myasnikova LP (1977) Nadmolekulyarnaya struktura polimerov (The supramolecular structure of polymers). Khimiya, Leningrad 17. Published and In press articles with or without DOI: 17.1 In press Wilson M et al (2006) References. In: Wilson M (ed) Style manual. Springer, Berlin Heidelberg New York (in press) 17.2. Article by DOI (with page numbers) Slifka MK, Whitton JL (2000) Clinical implications of dysregulated cytokine production. J Mol Med 78:74–80. DOI 10.1007/s001090000086 17.3. Article by DOI (before issue publication with page numbers)

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Figure Legends Figure legends should follow the references on a separate page and precede the tables. Each figure should be mentioned in the text.

Tables Each table should be numbered consecutively (1, 2, etc.). Please provide a short explanatory caption (without abbreviations) to each table, refer to the table in the text and note its approximate location in the margin. Finally, please place the tables after the figure legends in the manuscript. In tables, footnotes are preferable to long explanatory material in either the heading or body of the table. Such explanatory footnotes, identified by superscript letters, a, b, c etc., should be placed immediately below the table.

Figures All photographs, graphs and diagrams should be referred to as a 'Figure' and they should be numbered consecutively (1, 2, etc.). Multipart figures ought to be labelled with lower case letters (a, b, etc.). Please insert keys and scale bars directly in the figures. Relatively small text and great variation in text sizes within figures should be avoided as figures are often reduced in size. Figures may be sized to fit approximately within the column(s) of the journal. Provide a detailed legend (without abbreviations) to each figure, refer to the figure in the text and note its approximate location in the margin. Please place the legends in the manuscript after the references.

Policy on Colour Figures: Springer treats the inclusion of color figures on a per article basis and offers two options 1) Free Online Color, the color figures will only appear in color on the journals’ website and b/w in the printed version of the journal 2) Online and Printed Color which comes at a charge of Euro 950/ USD 1150 per article. The color figures will appear in color on the website and in the printed version of the journal.

Symbols and Units Only recommended SI units should be used. Authors may use either superscript presentations (mg ml−1) or the solidus (/) presentation (mg/ml). When giving the concentration of a solution in a solvent the correct description is, for example, l0 g glucose/100 ml, not 10 g/100 ml glucose. The term % used to express a concentration must be used correctly, i.e. g per 100 g

86 solution; otherwise % (v/v) or % (w/v) should be used for solutions of concentration greater than 1%. For solvent mixtures use, for example, butan−1−ol/acetic acid/water (4:1:1, by vol.) or chloroform/methanol (2:1, v/v).

Nomenclature Chemical and biochemical nomenclature should follow the IUPAC−IUB Commission guidelines; appropriate guidelines are given in, for example, Policy of the Journal and Instructions to Authors, The Biochemical Society, 59 Portland Place, London W1N 3AJ, UK and references therein. This document is available online at http://www.biochemj.org/bj/bji2a.htm. The Enzyme Commission (EC) number for enzymes should be given at the first time of mention; see Enzyme Nomenclature (1992), Academic Press; London & New York, or visit http:/www.expasy.org/enzyme/. Microorganisms must be correctly named using the current codes for bacteria, yeasts, fungi, algae and protozoa; (see Microbiology 1999, 145 (January), p. viii). Guidelines for genetic nomenclature are quoted in the same publication. For further information on quantities and units, see Table 2 at the end of this document.

Proofs Proofs will be sent to the corresponding author by e-mail. Your response, with or without corrections, should be sent within 72 hours!

Offprints Fifty (50) offprints of each article will be provided free of charge. Additional offprints (both hard copies and PDF files) can be ordered by means of an offprint order form supplied with the proofs.

Page Charge No page charges are levied on authors or their institutions.

Copyright Authors will be asked, upon acceptance of an article, to transfer copyright of the article to the Publisher (see section Manuscript Submission). This will ensure the widest possible dissemination of information under copyright laws. Permissions It is the responsibility of the author to obtain written permission for a quotation from unpublished material, or for all quotations in excess of 250 words in one extract or words in total from any work still in copyright, and for the reprinting of figures, tables or poems from unpublished or copyrighted material.

ANEXO IV

INSTRUÇÕES AOS AUTORES

Objetivo e política editorial

A Brazilian Journal of Microbiology destina-se à publicação de trabalhos de pesquisa originais, notas breves e, ocasionalmente, revisões, envolvendo todos os aspectos da microbiologia. Os textos submetidos à publicação devem ser redigidos em inglês, e conter Título, Resumo e Palavras-chave também em português. A Brazilian Journal of Microbiology tem uma política muito severa de avaliação dos trabalhos submetidos à publicação, sendo cada manuscrito avaliado por pelo menos dois revisores criteriosamente selecionados. Enviando originais para publicação Ser membro da Sociedade Brasileira de Microbiologia não é um pré-requisito para a aceitação de um manuscrito para publicação. Trabalhos de pesquisadores do Brasil e de outros países, não membros da SBM, são igualmente considerados para publicação. Quando um manuscrito é submetido à publicação, entende-se que todos os autores e suas instituições estão de acordo com a publicação. Manuscritos submetidos à publicação na Brazilian Journal of Microbiology não podem ter sido publicados anteriormente (exceto na forma de resumo), nem ter sido sumbetidos à publicação em outro periódico. Brazilian Journal of Microbiology não assume qualquer responsabilidade por erros cometidos pelos autores. Além disso, a Brazilian Journal of Microbiology não assume qualquer responsabilidade pelas conclusões dos autores. Todos os manuscritos devem ser submetidos em triplicata aos Editores, e enviados ao endereço abaixo (por e-mail ou por fax não são aceitos).

Publicação de um manuscrito

Manuscritos são aceitos para publicação somente após criticamente revisados. Os trabalhos são avaliados por revisores indicados pelo Editores. Após a revisão, os manuscritos são devolvidos para o autor indicado, para as correções sugeridas pelos revisores, quando necessárias. Os autores devem retornar o novo texto para os Editores. O autor indicado recebe uma notificação sobre o recebimento, a aceitação ou a recusa de um trabalho submetido à publicação. Quando um manuscrito é aceito, o autor indicado é avisado sobre a necessidade de envio de um disquete de computador contendo o texto. O autor indicado receberá provas tipográficas para correção, que deverão ser cuidadosamente revisadas de acordo com as instruções enviadas e devolvidas no prazo de 5 dias.

Tipos de trabalhos

Os seguintes tipos de trabalho podem ser publicados na Brazilian Journal of Microbiology: Trabalho de pesquisa relata os resultados de pesquisa original ainda não publicada. O texto deve ter de 12 a 15 páginas impressas, em espaço duplo, além das referências bibliográficas, tabelas e

88 figuras pertinentes. Um Resumo com Título e Palavras-chave em português também devem ser incluídos. Nota breve é um relato conciso de novas e importantes descobertas. A Nota Breve deve ser redigida de acordo com as instruções para a preparação de Trabalho de Pesquisa, mas sem as divisões em tópicos. Os Resumos em português e em inglês devem conter no máximo 50 palavras. Tabelas e Figuras devem limitar-se a duas tabelas ou duas figuras, ou uma tabela e uma figura. A designação short communication aparecerá no topo do trabalho. O autor deve indicar que o manuscrito é uma nota breve, permitindo que o texto seja avaliado de maneira apropriada. Mini-revisão - Artigos de revisão serão sobre temas de interesse geral na área de microbiologia, escritos por especialistas convidados. Além dos resumos em inglês e em português, o texto poderá ter também um índice.

Preparação do texto

Geral 1. Todos os manuscritos devem ser datilografados em espaço duplo, com amplas margens, com as páginas numeradas em seqüência. Trabalhos de pesquisa devem ter no máximo 15 páginas impressas, incluindo figuras e tabelas. Notas breves devem ter no máximo 6 páginas.

2. Todos os manuscritos devem ser redigidos em inglês. Os Editores recomendam que, antes de ser submetido, o texto seja cuidadosamente revisado por alguém fluente em inglês. Manuscritos em inglês precário não serão aceitos.

3. O texto deve ser organizado em tópicos, conforme descrito no próximo parágrafo. O nome dos tópicos deve ser digitado em letras maiúsculas (ABSTRACT, INTRODUCTION etc.). A citação de tabelas e de figuras deve iniciar com maiúsculas (as shown in Table 1..., as presented in Fig. 2..., etc.).

4. A abreviação de palavras e de símbolos deve seguir as recomendações da IUPAC-IUB Commission. O Sistema Métrico deve ser adotado em todo o texto.

5. Como regra, as referências devem ser citadas por seus números. Excepcionalmente, quando autores são mencionados no texto, a menção deve ser feita de acordo com os seguintes exemplos: Bergdoll (número) reported that..., Bailey and Cox (número) observed that..., ou Smith et al. (número) mentioned that... Não utilizar letras maiúsculas.

6. Aos autores dos trabalhos aceitos para publicação será solicitado o envio de um disquete de 3 1/2" contendo o trabalho digitado em um processador de texto adequado para PC. Esse material pode ser enviado também por correio eletrônico.

Organização

Página de título: Uma página separada deve conter o título do trabalho, o nome completo (inclusive o primeiro nome e as iniciais intermediárias) e a afiliação de cada autor. Um asterisco deve indicar o autor para correspondência. Os números de telefone e fax e o endereço eletrônico, quando disponível, devem ser assinalados no pé da página. A página de título não deve ter nenhum texto. O título deve ser o mais conciso possível e indicar claramente o objetivo do trabalho, não devendo conter abreviações. Expressões do tipo "Effects of...", "Influence of...", "Study on..." etc. devem ser evitadas. O título deve ser preparado com muito cuidado pois ele é utilizado nos sistemas de busca. Abstract: Deve ser apresentado em uma página separada, limitando-se a no máximo 250 palavras. Ele deve resumir o conteúdo básico do trabalho, devendo ser compreensível mesmo sem a consulta do texto completo. Um abstract não deve conter referências, tabelas ou abreviações incomuns. Abstracts devem ser preparados com muito cuidado pois são publicados

89 em textos de referência e lidos por pessoas que não têm acesso ao trabalho completo. Três a cinco keywords também devem ser apresentados. Resumo: Resumo é o abstract redigido em português. Sua preparação deve seguir as recomendações para a preparação do abstract em inglês. O resumo deve ter também um título em português. As regras para o título em português são as mesmas para o título em inglês (ver acima). Três a cinco palavras-chave também devem ser apresentadas. O resumo e o título em português também devem ser apresentados em página separada. Introdução: Deve iniciar em página nova e fornecer ao leitor informações suficientes para que os resultados relatados no trabalho possam ser avaliados sem consulta à literatura. Entretanto, a introduction não deve ser uma extensa revisão de literatura. Deve também dar subsídios para a compreensão dos objetivos do trabalho que está sendo apresentado. Materiais e Métodos: Esse tópico deve fornecer informações suficientes para a repetição do trabalho. Descrição repetida de detalhes de técnicas anteriormente publicadas deve ser evitada. Quando um método publicado é modificado pelos autores, essas modificações devem constar do texto. A origem de reagentes, meios de cultura e equipamentos (companhia, cidade, estado, país) deve ser mencionada. Nomes comerciais e marcas registradas também devem ser indicados. A utilização de subtópicos geralmente facilita a leitura e a compreensão desse item. Resultados: Esse tópico deve, através de texto, tabelas ou figuras, fornecer os resultados experimentais. Caso um tópico relativo à Discussion seja incluído, evitar a excessiva interpretação dos resultados, que deverá ser feita na Discussion. Caso Results e Discussion sejam combinados em um único tópico, os resultados devem ser discutidos no texto quando adequado. Tabelas devem ser numeradas independentemente das figuras, devendo-se utilizar números arábicos. Todas as tabelas e figuras devem ser mencionadas no texto. A localização mais adequada das tabelas e figuras deve ser assinalada. Discussão: Deve fornecer a interpretação dos resultados em função das informações disponíveis. Agradecimentos: Esse tópico é opcional e deve vir após a discussão. Destina-se a agradecimentos por apoio financeiro e pessoal. Referências: A lista de referências bibliográficas deve ser apresentada em ordem alfabética, de acordo com o sobrenome do primeiro autor. Todos os autores devem ser mencionados. As referências devem ser numeradas em ordem crescente. Cada referência deve ser citada no texto por seu número. Os nomes das revistas devem ser abreviados de acordo com o sistema utilizado pelo Biological Abstracts ou Chemical Abstracts. Todas as referências mencionadas na lista devem ser citadas no texto, assim como todas as referências citadas no texto devem constar da lista. Seguir os seguintes exemplos: a. Artigo em revista Campos, L.C.; Whittam, T.S.; Gomes, T.A.T.; Andrade, J.R.C.; Trabulsi, L.R. Escherichia coli serogroup 0111 includes several clones of diarrhaegenic strains with different virulence properties. Infect. Immun. , 62:3282-3288, 1994. b. Trabalho ou capítulo em livro Nelson, E.B. Current limits to biological control of fungal phytopathogens. In: Arora, D.K.; Rai, B.; Mukerji, K.G.; Knudsen, G. (eds). Handbook of applied mycology: soils and plants. Marcel Dekker, New York, 1991, p.327-355. c. Livro pelos autores Salyers, A.A.; Whitt, D.D. Bacterial pathogenesis. A molecular approach. ASM, Washington, 1994, 418p. d. Patente Hussong, R.V.; Marth, E.H.; Vakaleris, D.G. Manufacture of cottage cheese. U.S. Pat. 3,117,870. Jan.14, 1964.

90 e. Tese Calzada, C.T. Campylobacter jejuni e Campylobacter coli – caracterização em sorogrupos e biotipos das cepas isoladas no município de São Paulo no período de 1983-1989. São Paulo, 1991, 131p. (Ph.D. Thesis. Instituto de Ciências Biomédicas. USP). f. Publicação com autor ou editor desconhecido Anonymous. The economy of by-products. Álcool Alcoolquim., 2: 33-40, 1985. g. Communicações em eventos (Simpósios, Conferências etc.) Simões, G.S.; Silva, J.; Toledo, A.S.; Gontijo Filho, P.P. Micobactérias não tuberculosas isoladas de pacientes com sindrome da imunodeficiência adquirida. XVII Congresso Brasileiro de Microbiologia, Santos, 1993, p.41.

Referências como personal communication ou unpublished data devem ser evitadas, embora algumas vezes elas sejam necessárias. Nesses casos, elas devem ser citadas no texto e não na lista de referências bibliográficas. Referências a respeito de trabalhos accepted for publication ou in press podem ser utilizadas. No entanto, referências de trabalhos submitted ou in preparation não devem ser utilizadas.

Tabelas As tabelas não devem estar no meio do texto. Cada tabela deve ser apresentada em uma página separada e numerada em seqüência empregando números arábicos. O título da tabela deve aparecer no topo, e descrever de maneira clara as informações apresentadas. Títulos e subtítulos devem ser concisos, apresentando os dados em colunas e linhas, cuidadosamente arranjadas.

Figuras As figuras devem ser identificadas com números arábicos. Dados apresentados em tabelas não devem ser repetidos nas figuras. A legenda deve vir no pé da figura.

Fotografias e desenhos Apenas fotografias extremamente necessárias para a compreensão do trabalho devem ser apresentadas. Sua qualidade deve ser suficiente para garantir boa reprodução. As fotografias devem ser numeradas no verso e identificadas com o nome do autor. No caso de desenhos, os detalhes devem ter qualidade suficiente para permitir redução. Desenhos e figuras devem ser desenhados ou impressos em preto e devem ser preparados como indicado para as fotografias. Ilustrações coloridas não são aceitas.

Cópias O autor indicado receberá gratuitamente quinze cópias do trabalho. Cópias adicionais, pagas, devem ser requisitadas no retorno da prova gráfica corrigida.

Departamento de Microbiologia - ICB II - USP Av. Prof. Lineu Prestes, 1374 - Sala 214 Cidade Universitária 05508-900 São Paulo SP - Brasil Tel./Fax: +55 11 3813-9647 [email protected]

ANEXO V

Author's guidelines Editorial Board of Sydowia General policy Sydowia publishes contributions (reports of original research and reviews) relevant to fungal taxonomy, systematics, evolution, structure, development, ecology, pathology (plants, animals, humans), and biotechnological applications. The official journal language is English. An abstract of no more than 200 words is mandatory for each paper. Submission of a manuscript to the Executive Editor implies that the results have not been published or submitted for publication elsewhere, except as an abstract. When the authors are in doubt as to the suitability of their papers for Sydowia, the editor of the journal should be consulted before submission of the manuscript. Manuscript preparation A proper and quick processing of your manuscript requires a clean manuscript regarding both its scientific content and its formal presentation. Detailed information on the layout/style conventions recommended for Sydowia is given in the attached file ‘Sydowia_Manuscript_Template.DOC’. When in doubt as for the presentation of special items, please refer to papers recently published in Sydowia. Responsibility The author(s) alone bear full responsibility for the form and contents of their contributions. Submission of a manuscript for publication implies that all authors have agreed to publication of the work. The authors must ensure that the manuscript does not infringe copyrights or property rights. The editors of Sydowia will not bear any responsibility in issues of copyright infringement. Review of the papers All manuscripts are reviewed by two referees and an Associate Editor. In case of doubt, the right to consult additional experts is reserved to the editor. Sydowia will accept only manuscripts that fit the editorial regulations of the journal. Submission of manuscripts Please submit your manuscript electronically as e-mail attachments, or, if the files are too large, on a IBM PC-DOS compatible disk/CD by mail. Submission of hard copies will only be accepted in exceptional cases, when authors have no appropriate electronic facilities. In the latter case, contact the editor before submission ([email protected] or see address below). Manuscripts, which are not prepared according to our editorial requirements (see SYDOWIA_Manuscript_Template.doc) or containing tables and/or figures/plates not fitting the page format (18.5 cm x 11 cm) will be rejected. Electronic Submission Guidelines First submission: Send all files as e-mail attachments to [email protected], [email protected] or [email protected]. If the files are too large, send a PC-DOS compatible disk/CD to: Dr. Reinhold Pöder Leopold-Franzens-University Innsbruck Institute of Microbiology Technikerstrasse 25 6020 Innsbruck

AUSTRIA FAX: +43-512-507-2938 The following files are required: 1. Name_letter.pdf (covering letter) 2. Name _manuscript.pdf (full manuscript; not larger than 1.5 MB) 3. Name _text.doc (or Smith_text.rtf) (text without illustrations) NOTES: Each file name starts with the name of the corresponding author. 1. A covering letter must be submitted as part of the online submission process, stating on behalf of all authors that the work has not been published and is not being considered for publication elsewhere. Please, suggest potential reviewers (full names and e-mail addresses) who have not seen the manuscript before submission Do not include the covering letter in the body of the manuscript. 2. A PDF file containing the full, properly structured/formatted manuscript (text incl. tables and figures on separate pages; see SYDOWIA_Manuscript_Template.doc). 3. A MS-Word file with the extension ‘DOC’ or ‘RTF’ with the text of your manuscript only. This allows electronic remarks/corrections by reviewers and/or editors. Submission of revised manuscripts: After a careful revision of your paper, you are required to resubmit the following, separate files: 1. Name_letter.pdf (your comments on the revision) 2. Name_revised_text.doc (or *.rtf) (text without illustrations) 3. Name_figure1.tif (each figure as separate TIF-File) Name_figure2.tif NOTES: In order to avoid unnecessary delays, authors should verify the completeness and correct display of text and figures on their PC prior to submission. The collective size of all files may not exceed 10 MB, otherwise the authors are asked to send the files on CD. Figures/plates: Line drawings in black and white (TIFF-Format) must have a resolution of 1200 dpi, colour or grey-scale figures/plates (TIFF-Format) must have a resolution of 300 dpi. Page charges - Reprints No charge is made by Sydowia for publication, except for colour plates. But authors will be asked to pay for an excessive number of figures, or for excessive alterations to agreed scripts at the proof stage. Colour pages (4- colored) cost Euro 735 (+ 10 % VAT) per single page, and Euro 1085 (+10 % VAT) per double page. If you have additional questions regarding printing and price of coloured illustrations, please contact the publisher directly ([email protected]). Twenty-five reprints are free of charge. The manuscript – General requirements Manuscripts should be concise and consistent in style, spelling, and use of abbreviations. Generally, the main text in the manuscript, including legends to illustrations, should be written in Times New Roman, 12 pt, double-spaced throughout. Latin names of genera and species must be italicised. Hyphenation must be avoided throughout (switch off automatic hyphenation). No special formatting other than bold face or italic should be used. All pages should be numbered in the upper right corner of each page, including tables and legends. In addition to the page number, state the name of the first author on each page. For the benefit of reviewers, manuscripts should also include line numbers: restart line numbering on every page. (Use the line numbering option in MS Word). Layout and headings The required layout is demonstrated in the file ‘Sydowia_Manuscript_Template.DOC’. The title should be short but accurate: avoid generic titles such as "Notes on Cortinarius IV". The text should commence with an

93 abstract (max. 200 words) followed by up to five keywords (do not repeat words from the title). Do not use any heading for the introduction. Usually a paper will have following headings: ‘Materials and Methods’, ‘Results’, ‘Discussion’, ‘Acknowledgments’, and ‘References’. Other headings, however, can be used depending on the kind of manuscript presented (e.g. ‘Taxonomy’ instead of ‘Results’). Subheadings (second and higher order headings) are flush left in plain text (no bold, italics, or underline). Footnotes in the text should be avoided whenever possible. D a t e s .– The currently accepted format for the citation of dates in Sydowia is (examples): 1 Jan 2005, 9 May 2005 (no period after number of day, first three letters of month, year). U n i t s .– Measurement results should be given in metric system units according to the SI unit rules and style conventions: http://physics.nist.gov/cuu/Units/checklist.html). S p e l l i n g .– Both American and British spelling are accepted. The authors, however, are urged to be consistent in their use. Q u o t a t i o n m a r k s . - Double quotes (" ") are used in general for quotations (e.g. The authors reported that “Pigmentation of apothecia varies with environmental parameters.”). Single quotes (' ') should be used to signify (technical) terms or character strings (e.g. “…the term ‘medulla’ is used …”) when it improves the understanding of the text. S c i e n t i f i c n a m e s . – Only names of genera or species will be italicised. Names of authorities should be abbreviated (see http://www.indexfungorum.org/Names/AuthorsOfFungalNames.asp). Names of two collaborating authors should be linked by ampersand (&). The authorities of scientific names are given in the title or the abstract of the paper only if absolutely necessary (e.g. “On Rosellinia abscondita Rehm non Tassi”). But authors of scientific names must be given the first time a name appears in the main text. Tables and legends Prepare tables with the table format feature of your word processor and ensure that each data entry is in its own cell ; do not use tabs, spaces, or graphics boxes. Tables and figures should be arranged to fit the format of Sydowia (18.5 cm x 11 cm) or the width of the page (11 cm). Tables (cited in the text with 'Tab.') should be typed on separate pages following the text and numbered according to their appearance in the text. Footnotes in tables should be indicated by letters or asterisks. Distinguish between the value zero (0.00) and missing results (n. d. = no data). Legends for illustrations (cited in the text with 'Fig.' or 'Figs.') must be typed on separate pages. Tables (and illustrations) must be referred to in the text. Figures and photographs Only high-quality illustrations are accepted. Photographs (scanned with 300 dpi) and black and white drawings (1200 dpi) should be prepared with good contrast. Whenever possible, compose a plate of figures with no space between them, and number the figures consecutively in Arabic numbers. Single figures or plates must fit the printing block size of 18.5 x 11 cm. The insertion of a scale bar on each illustration to indicate magnification is required. Please use the same magnification as far as possible. Put each plate or single figure on a separate page (without legend). Descriptions of taxa Strict adherence to the International Code of Botanical Nomenclature is required. A Latin diagnosis must be provided. The new taxon must be adequately illustrated and clearly delimited from similar taxa. The type specimen of a new taxon must be deposited in a public mycological collection (herbarium). DNA sequences must be deposited in GenBank or EMBL, and accession numbers must be provided. For the presentation of the descriptions, please refer to recent issues of Sydowia. Citation of Herbaria

The acronyms given in Index Herbariorum, not preceded by 'Herb.', must be used. (http://sciweb.nybg.org/science2/IndexHerbariorum.asp) References All citations should be listed alphabetically in the ‘References’. In the text authors should be cited chronologically (Name 1948, Name & Name 1966, Name et al. 2005). Capitalisation of author's names should be avoided Full citations are listed at the end of the paper (for examples see SYDOWIA_Manuscript_Template.doc). If references are quoted as 'In press', the relevant manuscript(s) should also be attached. Galley proofs and reprints Galley proofs will be sent to the corresponding author. They of must be checked and returned within five working days. Faxing only the relevant pages of corrected proofs will help to accelerate the process. The proof stage is not the time to make extensive corrections, additions, or deletions. The costs of excessive changes will be charged to the authors. The proofs will be checked for typographical errors and deviations from the manuscript by two members of the Editorial Board. In the case that the corrected proofs are not returned within three weeks after they have been sent off to the authors, only the corrections made by the Editorial Board members will be sent to the printer. The Editorial Board cannot be held responsible for errors not pointed out timely by the authors. Twenty-five reprints are offered to the author free of charge. Additional reprints may be ordered at the time of receipt of the galley proofs. The reprint order form must be sent to the Executive Editor (not the Publisher). Correspondence All correspondence on commercial matters (subscriptions, orders, backorders, changes of address, payments, etc.) should be addressed directly to the Publisher. Manuscripts, books to be reviewed and questions in editorial matters should be directed to the Executive Editor. Publisher Ferdinand Berger & Söhne Ges.mbH E-mail: [email protected] Wiener Strasse 21-23 http://www.berger.at 3580 Horn AUSTRIA Editors Dr. Reinhold Pöder FAX: +43-512-507-2938 Leopold-Franzens-University Innsbruck E-mail: [email protected] Institute of Microbiology [email protected] Technikerstrasse 25 [email protected] 6020 Innsbruck AUSTRIA