LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên Ngành: Công Nghệ Thực Phẩm

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRƯƠNG NGỌC ĐĂNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM NANO BẠC BỔ SUNG CHITOSAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN QUÝT HƯƠNG CẦN (CITRUS DELICIOSA) SAU THU HOẠCH

LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

HUẾ - 2018 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRƯƠNG NGỌC ĐĂNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. VÕ VĂN QUỐC BẢO

HUẾ - 2018 i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn này do chính tôi thực hiện. Mọi nội dung, số liệu, kết quả được đưa ra trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi thông tin trích dẫn đã chỉ rõ nguồn gốc trong mục tài liệu tham khảo. Nếu có vấn đề gì tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Huế, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận văn

Trương Ngọc Đăng

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành Luận văn tốt nghiệp này, trong thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình từ các cá nhân và tập thể. Đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô của Khoa Cơ Khí – Công Nghệ đã truyền đạt những kiến thức cho tôi trong quá trình học tập. Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy giáo hướng dẫn: TS. Võ Văn Quốc Bảo đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành Luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến giáo viên phụ trách Phòng thí nghiệm Khoa Cơ khí Công nghệ trường Đại học Nông Lâm Huế đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành tốt bài luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, anh chị, bạn bè đã giúp đỡ trong những lúc khó khăn và động viên tôi trong quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện Luận văn tốt nghiệp. Mặc dù đã có nhiều cố gắng tuy nhiên không thể tránh khỏi những sai sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý và đánh giá của quý Thầy Cô, bạn bè để Luận văn này được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cám ơn!

Tác giả luận văn

Trương Ngọc Đăng

iii

TÓM TẮT

Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nano bạc-Chi để bảo quản quả có múi nói chung và quả quýt nói riêng là hướng đi mới. Trong công trình này, chúng tôi đã nghiên cứu bổ sung chitosan vào nano bạc có nồng độ 10 ppm để khảo sát khả năng kháng nấm cũng như xử lý quả quýt Hương Cần, nhằm góp phần nâng cao hiệu quả bảo quản quả sau thu hoạch tại Thừa Thiên Huế. Để khảo sát khả năng kháng nấm của chế phẩm nano bạc-Chi, chúng tôi phân lập và định danh nấm gây bệnh Macrophoma theicola trên quả quýt Hương Cần. Kết quả cho thấy, chế phẩm nano bạc-Chi trong điều kiện in vitro nồng độ từ 0,2% đã có tác dụng ức chế đến sự phát triển của nấm và ức chế hoàn toàn từ nồng độ 0,4%. Ở điều kiện in vivo, nồng độ từ 0,2% đến 0,8%, có khả năng hạn chế sự phát triển gây bệnh của nấm từ 57,8% đến 100% tương ứng. Mặt khác, chúng tôi đã nghiên cứu ứng dụng bảo quản quýt với các chỉ tiêu theo dõi (vitamin C, acid hữu cơ, đường tổng, hao hụt khối lượng, tỷ lệ hư hỏng và đánh giá cảm quản) và từ đó đề xuất được quy trình bảo quản quýt Hương Cần sau thu hoạch bằng chế phẩm nano bạc-Chi được 60 ngày ở nồng độ 0,6% trong điều kiện lạnh 13°C và độ ẩm 80% đến 95%.

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ...... i

LỜI CÁM ƠN ...... ii

TÓM TẮT ...... iii

MỤC LỤC ...... iv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...... vii

DANH MỤC BẢNG ...... viii

DANH MỤC HÌNH ...... ix

MỞ ĐẦU ...... 1

1. Đặt vấn đề ...... 1

2. Mục đích đề tài ...... 2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ...... 2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...... 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ NANO BẠC ...... 3

1.1.1. Giới thiệu công nghệ nano ...... 3

1.1.2. Giới thiệu về nano bạc ...... 3

1.2. TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN ...... 11

1.2.1. Định nghĩa và tính chất của chitosan ...... 11

1.2.2. Phương pháp điều chế chitosan ...... 13

1.2.3. Ứng dụng của chitosan ...... 14

1.3. TỔNG QUAN VỀ QUÝT ...... 14

1.3.1. Giới thiệu tổng quan về quýt ...... 14

1.3.2. Đặc điểm hình thái ...... 16

1.3.3. Giá trị dinh dưỡng của quýt ...... 17

1.3.4. Bệnh nhiễm trên quýt ...... 20

1.3.5. Những biến đổi của quýt và yếu tố ảnh hưởng trong thời gian bảo quản ...... 20

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU MÀNG BẢO QUẢN THỰC PHẨM Ở NƯỚC TA VÀ THẾ GIỚI ...... 26

1.4.1. Tình hình nghiên cứu màng bảo quản thực phẩm ở thế giới ...... 26

1.4.2. Tình hình nghiên cứu màng bảo quản thực phẩm ở nước ta ...... 26

1.4.3. Tính mới của đề tài ...... 27

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 28

2.1. PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...... 28

2.1.1. Phạm vi nghiên cứu ...... 28

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu...... 28

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...... 28

2.2.1. Phân lập, định danh nấm từ quả quýt Hương Cần ...... 28 2.2.2. Khảo sát khả năng kháng nấm của chế phẩm nano bạc-Chi với nấm được phân lập trên quả quýt Hương Cần ...... 29 2.2.3. Ứng dụng bảo quản quýt (Citrus deliciosa) Hương Cần bằng chế phẩm nano bạc-Chi ...... 32

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 33

2.3.1. Phương pháp phân lập nấm mốc...... 33

2.3.2. Phương pháp lấy mẫu ...... 33

2.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm ...... 34

2.3.4. Phương pháp vật lý ...... 35

2.3.5. Phương pháp hóa sinh ...... 36

2.3.6. Phương pháp đánh giá cảm quan ...... 36

2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu ...... 37

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...... 38

3.1. PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH NẤM TỪ QUẢ QUÝT HƯƠNG CẦN ...... 38

3.1.1. Phân lập nấm...... 38

3.1.2. Định danh nấm ...... 39 3.2. KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM ĐÃ ĐƯỢC ĐỊNH DANH BỞI CHẾ PHẨM NANO BẠC-CHI ...... 40

3.2.1. Khảo sát khả năng kháng nấm bởi chế phẩm nano bạc-Chi ở điều kiện in vitro ..... 41

3.2.2. Khảo sát khả năng kháng nấm bởi chế phẩm nano bạc-Chi ở điều kiện in vivo ...... 43 3.3. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BẢO QUẢN QUÝT HƯƠNG CẦN BẰNG CHẾ PHẨM NANO BẠC-CHI Ở ĐIỀU KIỆN LẠNH ...... 44 3.3.1. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hàm lượng vitamin C của quýt trong quá trình bảo quản ...... 44 3.3.2. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hàm lượng acid tổng số của quýt trong quá trình bảo quản ...... 45 3.3.3. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hàm lượng đường tổng số của quýt trong quá trình bảo quản ...... 47 3.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm nano bạc-Chi đến sự hao hụt khối lượng trong quá trình bảo quản ...... 48 3.3.5. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm nano bạc-Chi đến tỷ lệ hư hỏng của quả quýt trong quá trình bảo quản ...... 49 3.3.6. Đánh giá chỉ tiêu cảm quan đối với mẫu CT3 và CT4 sau 60 ngày bảo quản lạnh ...... 50

3.4. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH BẢO QUẢN QUÝT Ở ĐIỀU KIỆN LẠNH ...... 52

o 3.4.1. Sơ đồ quy trình bảo quýt bằng chế phấm nano bạc-Chi ở điều kiện lạnh 13 C ...... 52

3.4.2. Thuyết minh quy trình ...... 52

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...... 54

Kết luận ...... 54

Đề nghị ...... 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO...... 55

PHỤ LỤC

vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ANOVA: Analysis Of Varianace CMC: Carboxymethyl cellulose CT: Công Thức DNA: Deoxyribonucleic Acid ĐC: Đối chứng ĐKTN: Đường kính tản nấm LSD: Least Significant Difference MAP: Modified Atmosphere Packaging Nano bạc-Chi: Chế phẩm nano bạc bổ sung chitosan PDA: Potato Dextrose Agar SPSS: Statistical Package for Social Sciences RDA: Recommended Dietary Allowance TCVN: Tiêu Chuẩn Việt Nam

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích ...... 4 Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng trong 100g phần ăn được của quýt ...... 18 Bảng 2.1. Nồng độ của chế phẩm nano bạc-Chi ứng với công thức bố trí thí nghiệm . 35 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nano bạc-Chi đến khả năng sinh trưởng tản nấm Macrophoma theicola QB1 sau 6 ngày theo dõi ...... 42 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm nano bạc-Chi đến tỷ lệ hư hỏng của quả quýt theo thời gian bảo quản ...... 49 Bảng 3.3. Điểm đánh giá cảm quan ...... 51

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Vi khuẩn MKY3...... 7 Hình 1.2. Tác động của ion bạc lên vi khuẩn ...... 8 Hình 1.3. Sơ đồ ion bạc vô hiệu hóa enzyme chuyển hóa oxy của vi khuẩn ...... 8 Hình 1.4. Các hạt nano bạc bám trên bề mặt tế bào vi khuẩn...... 9 Hình 1.5. Cơ chế diệt khuẩn của nano bạc ...... 10 Hình 1.6. Ion bạc liên kết với các base của DNA ...... 10 Hình 1.7. Công thức cấu tạo của chitosan (poly β-(1-4)-D-glucozamin) ...... 11 Hình 1.8. Vỏ cua ghẹ và chitosan ...... 12 Hình 1.9. Quýt hồng ...... 15 Hình 1.10. Quýt đường ...... 15 Hình 1.11. Quýt Phủ Quỳ ...... 15 Hình 1.12. Quýt Hương Cần ...... 16 Hình 2.1. Sơ đồ phân lập nấm từ quả quýt Hương Cần ...... 29 Hình 2.2. Sơ đồ khảo sát tính kháng nấm ở điều kiện in vitro ...... 30 Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát tính kháng nấm ở điều kiện in vivo ...... 31 Hình 2.4. Sơ đồ ứng dụng bảo quản quýt Hương Cần (Citrus deliciosa) bằng chế phẩm nano bạc-Chi ...... 32 Hình 2.5. Quả quýt Hương Cần sau thu hoạch ...... 33 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ...... 34 Hình 3.1. Nấm bệnh trên quả quýt Hương Cần ...... 38 Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc của nấm bệnh ở quả quýt Hương Cần trên môi trường PDA...... 39 Hình 3.3. Kết quả giải trình tự gene của chủng nấm được phân lập từ quả quýt Hương Cần ...... 39 Hình 3.4. Kết quả tra cứu bằng công cụ BLAST search (NCBI) ...... 39 Hình 3.5. Các mẫu nấm sau 6 ngày theo dõi ...... 41

Hình 3.6. Tỷ lệ quả quýt bị nhiễm nấm bệnh Macrophoma theicola QB1 sau khi nhúng nano bạc-Chi ở các nồng độ khác nhau ...... 43 Hình 3.7. Đồ thị biến đổi hàm lượng vitamin C của quýt trong thời gian bảo quản với các công thức khác nhau ...... 45 Hình 3.8. Sự biến đổi hàm lượng acid tổng số của quýt trong thời gian bảo quản...... 46 Hình 3.9. Đồ thị thể hiện biến đổi hàm lượng đường tổng số của quýt trong thời gian bảo quản với các công thức khác nhau...... 47 Hình 3.10. Đồ thị biến đổi sự hao hụt khối lượng tự nhiên của quýt trong quá trình bảo quản với các công thức khác nhau...... 48 Hình 3.11. Quy trình bảo quản quýt Hương Cần bằng chế phấm nano bạc-Chi ở điều kiện lạnh ...... 52

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề Việt Nam là một quốc gia nằm trong khu vực Đông Nam Á, là nước nhiệt đới gió mùa, khí hậu nóng ẩm mưa nhiều, rất thuận lợi cho việc trồng các cây công, nông nghiệp. Vì vậy, các sản phẩm rau quả khác nhau được trồng quanh năm, phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng trong nước và cho nhu cầu xuất khẩu. Theo số liệu thống kê của Tổng cục Hải quan, kim ngạch xuất khẩu nhóm hàng rau quả của Việt Nam trong năm 2017 đạt 3,5 tỷ USD tăng 42,5% so với năm trước [10]. Tuy nhiên, do sản xuất thủ công, manh mún, Việt Nam vẫn còn nhiều hạn chế trong việc kiểm soát chất lượng nông sản. Sử dụng lượng thuốc bảo vệ thực vật cũng như hóa chất vượt mức cho phép nên đã ảnh hưởng đến uy tín của các loại nông sản xuất khẩu [39]. Nhằm bảo quản được rau quả lâu ngày, một số người đã bất chấp sử dụng các loại chế phẩm hóa học để giữ cho rau quả được tươi, ngon và đẹp mắt hơn mà không quan tâm đến tác hại nghiêm trọng của nó như gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người. Theo chuyên gia kinh tế, Việt Nam hiện gặp nhiều khó khăn trong tiêu thụ hoa quả nói riêng và các sản phẩm nông sản khác nói chung, bởi công nghệ sau thu hoạch còn hạn chế, chưa hình thành được hệ thống sơ chế, xử lý, đóng gói và bảo quản, cũng như chưa có mối quan hệ liên hoàn giữa sản xuất, sơ chế, bảo quản và tiêu thụ rau quả trên thị trường [39]. Để tiêu thụ nông sản bền vững, bảo quản sau thu hoạch cần phải được người sản xuất, doanh nghiệp và người tiêu dùng đều quan tâm. Vì vậy, việc tìm hiểu điều kiện bảo quản trái cây nói chung và quýt Hương Cần nói riêng để hạn chế rồi tiến đến loại bỏ những hóa chất bảo quản có hại ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng và môi trường sinh thái bằng các chế phẩm có nguồn gốc sinh học là rất cần thiết. Chitosan là sản phẩm deacetyl của chitin, một polysaccharide có trong thành phần cấu trúc của các loài giáp xác và vách tế bào nấm, đặc biệt từ các phế liệu thủy sản như vỏ tôm, cua, ghẹ; là một trong những chất có tính diệt khuẩn cao, không gây độc và ô nhiễm môi trường sinh thái [16], [18]. Công nghệ nano là một lĩnh vực mới cho phép nâng cao nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt đạt hiệu quả cao trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực phẩm và nông nghiệp. Một trong số các hạt nano thân thiện với môi trường và con người được ứng dụng rộng rãi hiện nay là nano bạc. Các hạt nano bạc có diện tích bề mặt rất lớn nên gia tăng tiếp xúc của chúng với vi khuẩn hoặc nấm và nâng cao hiệu quả diệt khuẩn và diệt nấm [13], [21].

Việc nghiên cứu chế tạo chế phẩm tổng hợp từ chitosan và nano bạc nhằm ứng dụng bảo quản rau quả nói chung và loại trái cây có múi nói riêng là một hướng đi mới. Quýt Hương Cần là một loại trái cây có múi đặc sản được người tiêu dùng nhiều nơi ưa chuộng, có giá trị kinh tế cao, tồn tại và phát triển lâu đời ở Thừa Thiên Huế và đang nằm trong danh mục quy hoạch phát triển cây ăn quả chủ lực của Tỉnh. Trong quýt có nhiều thành phần dinh dưỡng bao gồm đường, protein, lipid, vitamin, acid hữu cơ, chất khoáng,… rất tốt cho sức khỏe. Từ tính cấp thiết cũng như những vấn đề đã nêu trên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc bổ sung chitosan đến khả năng kháng nấm và ứng dụng trong bảo quản quýt Hương Cần (Citrus deliciosa) sau thu hoạch”. 2. Mục đích đề tài Nâng cao hiệu quả sử dụng nguồn polyme sinh học trong việc kết hợp chitosan với công nghệ nano từ kim loại bạc nhằm góp phần tăng hiệu quả kinh tế cho các hộ trồng quýt trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1) Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu khả năng kháng nấm được phân lập từ quả quýt Hương Cần và ứng dụng bảo quản quýt Hương Cần bằng chế phẩm nano bạc bổ sung chitosan ở quy mô phòng thí nghiệm. 2) Ý nghĩa thực tiễn Ứng dụng chế phẩm này nhằm kháng và tiêu diệt nấm Macrophoma theicola gây bệnh trên quả và bảo quản quýt Hương Cần sau thu hoạch góp phần tăng hiệu quả kinh tế cho các nhà vườn cây ăn quả.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ NANO BẠC 1.1.1. Giới thiệu công nghệ nano Ý tưởng sơ khai về công nghệ nano được giới thiệu bởi nhà vật lý người Mỹ Richard Feynman vào năm 1959, ông cho rằng khoa học đã được đi vào chiều sâu của cấu trúc vật chất đến từng phân tử, nguyên tử và sâu hơn nữa. Mãi đến năm 1974, thuật ngữ công nghệ nano mới bắt đầu được sử dụng do Nario Taniguchi, một nhà nghiên cứu tại trường đại học Khoa học Tokyo đề cập khả năng chế tạo cấu trúc vi hình của mạch điện tử [13], [21]. Công nghệ nano là công nghệ xử lý vật chất ở mức nanomet (xấp xỉ từ 1 dến 100nm). Công nghệ nano tìm cách lấy phân tử đơn nguyên tử nhỏ đến to, khác với cách làm thông thường từ trên xuống dưới, từ to đến nhỏ; là một khoa học liên ngành, là sự kết tinh của nhiều thành tựu khoa học trên nhiều lĩnh vực khác nhau (bao gồm toán học, vật lý, hóa học, y - sinh học…) và là một ngành công nghệ có nhiều tiềm năng [21], [43]. Có rất nhiều cách định nghĩa công nghệ nano, tuy nhiên hiện nay được sử dụng nhiều nhất là: “Công nghệ nano bao gồm các quá trình của phân tách, làm bền và biến dạng của vật liệu bằng một nguyên tử hoặc phân tử” [30]. Hiện nay, có rất nhiều công nghệ nano từ các kim loại khác nhau như: nano bạc, nano đồng, nano chì, nano kẽm... nhưng công nghệ nano được chế tạo từ bạc được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau. 1.1.2. Giới thiệu về nano bạc 1.1.2.1. Vài nét về kim loại bạc Bạc là kim loại mềm, dẻo, dễ uốn (cứng hơn vàng một chút), có hóa trị 1, có màu trắng bóng ánh kim nếu bề mặt có độ đánh bóng cao. Ký hiệu: Ag, có nguồn gốc từ chữ Argentum trong tiếng Latinh - Cấu hình electron: 1s22s22p63s23p63d104s24p64d105s1 - Nhiệt độ nóng chảy: 1234,93oC - Bán kính nguyên tử Ag: 0,288 nm - Bán kính ion bạc: 0,23 nm

Bạc kim loại và các hợp chất của bạc có tính kháng khuẩn tốt (diệt nấm khuẩn, khử mùi hôi). Đặc biệt ở kích thước nano (5-10nm), các hạt nano bạc thể hiện mạnh mẽ khả năng diệt nấm, vi khuẩn vượt trội so với kim loại bạc nguyên khối (kích thước lớn, không phải kích thước nano) [24]. Bảng 1.1. Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích [24]

Kích thước của hạt nano Ag (nm) Số nguyên tử chứa trong đó

1 31

5 3900

20 250000

1.1.2.2. Định nghĩa và tính chất nano bạc a) Định nghĩa [22], [24], [30] Hạt nano bạc là những hạt bạc có kích thước nano khoảng từ 1-100 nanomet. Thông thường kích thước đo được khoảng 25 nanomet, gần với kích thước của phân tử bạc, có hiệu ứng bề mặt vô cùng lớn giúp gia tăng tiếp xúc của chúng với vi khuẩn hoặc nấm vì thế cho hiệu quả diệt khuẩn ngay khi tiếp xúc. Là một loại vật liệu nano có tác động diệt khuẩn, kháng khuẩn, khử mùi nhanh chóng, có hiệu quả cao, không độc, không kích thích, không dị ứng. Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt. Hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa nano bạc, với các màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano. b) Tính chất của nano bạc [22], [24], [30] + Nano bạc có khả năng tiêu diệt vi khuẩn, diệt virus, chống nấm, khử mùi hiệu quả. + Nano bạc tiêu diệt triệt để bào tử nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh và không cho vi khuẩn có cơ hội tạo ra tính kháng thuốc. Do đó nano bạc có thể sử dụng thường xuyên lâu dài mà không phải thay thế các chế phẩm (thuốc) diệt khuẩn khác. + Nano bạc không có hại cho sức khỏe con người cho dù với liều lượng tương đối cao, không có phụ gia hóa chất, không gây tồn dư các chất hóa học độc hại trên nông sản sau thu hoạch. + Có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung môi khác nhau (trong các dung môi phân cực như nước và trong các dung môi không phân cực như benzene, toluene).

+ Độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới các tác nhân oxy hóa khử thông thường của môi trường. Thời hạn sử dụng (bảo quản) của nano bạc tương đối dài từ 2 - 3 năm. + Do nano bạc có kích thước vô cùng nhỏ (từ 6 - 12nm) nên khi phun qua lá các hạt nano bạc dễ dàng bám dính trên các kẽ lá (kẽ lá và tế bào khí khổng, thủy khổng có độ lớn vài chục micromet). + Chi phí cho quá trình sản xuất thấp, ổn định ở nhiệt độ cao, không bị keo tụ ở môi trường phân tán. + Đặc biệt, ngoài khả năng diệt nấm và vi khuẩn mạnh, nano bạc còn góp phần làm tăng năng suất - sản lượng nông sản. Đồng thời nano bạc còn có tác dụng nâng cao chất lượng và mẫu mã nông sản qua đó kéo dài thời gian bảo quản nông sản sau thu hoạch (do nano bạc có khả năng chống sự xâm nhiễm của nấm và vi khuẩn gây thối trên hoa, quả sau thu hoạch). 1.1.2.3. Phương pháp chế tạo Có hai phương pháp để tạo vật liệu nano, phương pháp từ dưới lên và phương pháp từ trên xuống. Phương pháp từ dưới lên là tạo hạt nano từ các ion hoặc các nguyên tử kết hợp lại với nhau. Phương pháp từ trên xuống là phương pháp tạo vật liệu nano từ vật liệu khối ban đầu. Đối với hạt nano bạc, phương pháp từ dưới lên thường được áp dụng. Nguyên tắc là khử các ion kim loại Ag+ để tạo thành các nguyên tử Ag. Các nguyên tử sẽ liên kết với nhau tạo ra hạt nano. Các phương pháp từ trên xuống ít được dùng hơn nhưng thời gian gần đây đã có những bước tiến trong việc nghiên cứu theo phương pháp này [22], [24], [21].  Một số phương pháp chế tạo nano bạc: - Phương pháp ăn mòn laser Đây là phương pháp từ trên xuống. Vật liệu ban đầu là một tấm bạc được đặt trong một dung dịch có chứa một chất hoạt hóa bề mặt. Một chùm laser xung có bước sóng 532 nm, độ rộng xung là 10 ns, tần số 10 Hz, năng lượng mỗi xung là 90 mJ, đường kính vùng kim loại bị tác dụng từ 1 - 3 mm. Dưới tác dụng của chùm laser xung, các hạt nano có kích thước khoảng 10 nm được hình thành và được bao phủ bởi chất hoạt hóa bề mặt CnH2n + SO4Na với n = 8, 10, 12, 14 với nồng độ từ 0,001 đến 0,1M. - Phương pháp khử hóa học Phương pháp khử hóa học là dùng các tác nhân hóa học để khử ion kim loại thành kim loại. Thông thường các tác nhân hóa học ở dạng dung dịch lỏng nên còn gọi là phương pháp hóa ướt. Đây là phương pháp từ dưới lên. Dung dịch ban đầu có chứa

6 các muối của các kim loại. Tác nhân khử ion kim loại Ag+, Au+ thành Ag0, Au0 ở đây là các chất hóa học như acid citric, vitamin C, Sodium Borohydride, Ethanol (cồn), Ethylene Glycol,… (phương pháp sử dụng các nhóm rượu đa chức như thế này còn có một cái tên khác là phương pháp polyol). Để các hạt phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ thành đám, người ta sử dụng phương pháp tĩnh điện để làm cho bề mặt các hạt nano có cùng điện tích và đẩy nhau hoặc dùng phương pháp bao bọc chất hoạt hóa bề mặt. Phương pháp tĩnh điện đơn giản nhưng bị giới hạn bởi một số chất khử. Phương pháp bao phủ phức tạp nhưng vạn năng hơn, hơn nữa phương pháp này có thể làm cho bề mặt hạt nano có các tính chất cần thiết cho các ứng dụng. Các hạt nano Ag, Au, Pt, Pd, Rh với kích thước từ 10 đến 100 nm có thể được chế tạo từ phương pháp này. - Phương pháp khử vật lý Phương pháp khử vật lý dùng các tác nhân vật lý như điện tử, sóng điện từ năng lượng cao như tia gamma, tia tử ngoại, tia laser, khử ion kim loại thành kim loại. Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý, có nhiều quá trình biến đổi của dung môi và các phụ gia trong dung môi để sinh ra các gốc hóa học có tác dụng khử ion thành kim loại. Ví dụ, người ta dùng chùm laser xung có bước sóng 500 nm, độ dài xung 6ns, tần số 10

Hz, công suất 12 - 14 mJ chiếu vào dung dịch có chứa AgNO3 như là nguồn ion kim loại và Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) như là chất hoạt hóa bề mặt để thu được hạt nano bạc. - Phương pháp khử hóa lý Đây là phương pháp trung gian giữa hóa học và vật lý. Nguyên lí là dùng phương pháp điện phân kết hợp với siêu âm để tạo hạt nano. Phương pháp điện phân thông thường chỉ có thể tạo được màng mỏng kim loại. Trước khi xảy ra sự hình thành màng, các nguyên tử kim loại sau khi được điện hóa sẽ tạo các hạt nano bám lên điện cực âm. Lúc này người ta tác dụng một xung siêu âm đồng bộ với xung điện phân thì hạt nano kim loại sẽ rời khỏi điện cực và đi vào dung dịch. - Phương pháp khử sinh học Dùng vi khuẩn là tác nhân khử ion kim loại. Người ta cấy vi khuẩn MKY3 vào trong dung dịch có chứa ion bạc để thu được hạt nano bạc. Phương pháp này đơn giản, thân thiện với môi trường.

Hình 1.1. Vi khuẩn MKY3[34] 1.1.2.4. Cơ chế diệt khuẩn của nano bạc Bạc là một nguyên tố có tính kháng khuẩn tự nhiên, có khả năng tiêu diệt phổ rộng các loài vi sinh vật gây bệnh, nhưng đồng thời là một chất kháng khuẩn thân thiện môi trường, bởi vì không gây tác dụng độc hại đối với cơ thể con người và động vật nếu được sử dụng với liều lượng phù hợp cho việc khử trùng. Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion Ag+. Hiện nay, tồn tại một số quan điểm giải thích cơ chế diệt khuẩn của bạc được nhiều người ủng hộ. Các quan điểm đó chủ yếu dựa trên sự tương tác tĩnh điện giữa ion bạc mang điện tích dương và bề mặt tế bào vi khuẩn mang điện tích âm và dựa trên sự vô hiệu hóa nhóm Thiol trong enzyme vận chuyển oxy, hoặc trên sự tương tác của ion bạc với DNA dẫn đến sự đime hóa pyridin và cản trở quá trình sao chép DNA của tế bào vi khuẩn.  Cơ chế diệt vi khuẩn của nano bạc được diễn tả theo một số quan điểm sau [26], [30]: Các nhà khoa học thuộc hãng Inovation Hàn Quốc cho rằng bạc tác dụng trực tiếp lên màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn. Màng này là một cấu trúc gồm các glycoprotein được liên kết với nhau bằng cầu nối acid amin để tạo độ cứng cho màng. Các ion bạc vừa mới được giải phóng ra từ bề mặt các hạt nano bạc tương tác với các nhóm peptidoglican và ức chế khả năng vận chuyển oxy của chúng vào bên trong tế bào, dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Các tế bào động vật thuộc nhóm sinh vật bậc cao (sinh vật đa bào: động vật nói chung bao gồm cả con người là động vật bậc cao) có lớp màng bảo vệ hoàn toàn khác so với tế bào vi sinh vật đơn bào (nấm, vi khuẩn và virus). Chúng có hai lớp lipoprotein giàu liên kết đôi bền vững có khả năng cho điện tử do đó không cho phép các ion bạc xâm nhập, vì vậy chúng không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion bạc. Điều này có nghĩa nano bạc hoàn toàn không gây hại đến con người và động vật nói chung, do cấu trúc màng tế bào bền vững và dày hơn các vi sinh vật đơn bào.

Hình 1.2. Tác động của ion bạc lên vi khuẩn [36] Cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn được các nhà khoa học Trung Quốc làm việc trong hãng ANSON mô tả như sau: khi ion Ag+ tương tác với lớp màng của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó sẽ phản ứng với nhóm Sunphohydril –SH của phân tử enzyme vận chuyển oxy và vô hiệu hóa enzyme này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của tế bào vi khuẩn.

Hình 1.3. Sơ đồ ion bạc vô hiệu hóa enzyme chuyển hóa oxy của vi khuẩn [36] Ngoài ra, các ion bạc còn có khả năng ức chế quá trình phát triển của vi khuẩn bằng cách sản sinh ra oxy nguyên tử siêu hoạt tính trên bề mặt của hạt nano bạc: 2Ag+ + O-2 => 2Ag0 + O0 Theo các nhà khoa học Nga, hiện nay có nhiều lý thuyết về cơ chế tác dụng diệt vi khuẩn của nano bạc đã được đề xuất, trong đó lý thuyết hấp phụ được nhiều người chấp nhận hơn cả. Bản chất của thuyết này là tế bào vi khuẩn bị vô hiệu hóa do kết quả của quá trình tương tác tĩnh điện giữa bề mặt mang điện tích âm của tế bào vi khuẩn và ion Ag+ được hấp phụ lên đó, các ion này sau đó xâm nhập vào bên trong tế bào vi khuẩn và vô hiệu hóa chúng.

Hình 1.4. Các hạt nano bạc bám trên bề mặt tế bào vi khuẩn [34] Cho đến nay, những gì liên quan đến cơ chế tác động của nano bạc lên tế bào vi sinh vật (đơn bào), mới chỉ có một quan điểm được hầu hết các nhà khoa học thừa nhận. Đó là khả năng diệt khuẩn của hạt nano bạc, kết quả của quá trình biến đổi (giải phóng liên tục) các nguyên tử bạc kim loại trên bề mặt hạt nano bạc thành các ion Ag+ tự do và các ion tự do này sau đó tác dụng lên vi khuẩn và diệt khuẩn theo những cơ chế đã nói ở trên. Tuy nhiên, nếu dùng Ag+ thì lại không có hiệu quả cao mà phải là hạt nano bạc, tức phân tử bạc.  Các nhà khoa học đã đề xuất một số giả thiết về cơ chế diệt khuẩn của nano bạc như sau [34]: - Cơ chế thứ nhất: Ức chế quá trình vận chuyển các ion Na+ và Сa2+ qua màng tế bào, ngăn cản quá trình trao đổi chất (Hình A). - Cơ chế thứ hai: Phá vỡ màng tế bào, oxy hóa nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn, phá hủy nguyên sinh chất bởi oxi hòa tan trong nước với vai trò xúc tác của bạc (Hình B). - Cơ chế thứ ba: Tác động gián tiếp lên phân tử DNA bằng cách tăng số lượng các gốc tự do làm giảm hoạt tính của các hợp chất chứa oxy hoạt động, làm rối loạn các quá trình oxy hóa cũng như phosphoryl hóa trong tế bào vi khuẩn (Hình C). - Cơ chế thứ tư: Vô hiệu hóa enzym có chứa các nhóm –SH và –COOH, phá vỡ cân bằng áp suất thẩm thấu, hoặc tạo phức với acid nucleic dẫn đến làm thay đổi cấu trúc DNA của tế bào vi sinh vật (tác động trực tiếp đến cấu trúc DNA ( Hình D)).

Hình 1.5. Cơ chế diệt khuẩn của nano bạc [45] Nano bạc thể hiện mạnh mẽ khả năng diệt nấm: tại nồng độ 0,1mg/lít (0,1ppm), với mật độ 105 tế bào/lít, nấm Candida albicans có thể bị vô hiệu hóa hoàn toàn sau 30 phút tiếp xúc với các hạt nano bạc. Ngoài ra, còn rất nhiều thử nghiệm khoa học đã chứng minh phổ diệt khuẩn rất rộng của nano bạc.  Tóm lại, xét trên góc độ sinh học các nhà nghiên cứu đều có một quan điểm thống nhất rằng nano bạc diệt khuẩn theo một trong những cơ chế sau: - Nano bạc phá hủy chức năng hô hấp. - Nano bạc phá hủy chức năng của thành tế bào. - Nano bạc liên kết với DNA của tế bào vi sinh vật và ức chế chức năng sao chép của chúng, kìm hãm chúng, không cho chúng phát triển mạnh.

Hình 1.6. Ion bạc liên kết với các base của DNA [34] 1.1.3. Ứng dụng của công nghệ nano bạc trong thực phẩm Nano bạc rất an toàn, không gây kích ứng và có hiệu quả tác dụng cao, đồng thời có khả năng chữa trị mau lành các vết thương hở, vết bỏng hoặc các vết loét khó lành do bệnh tiểu đường hoặc do nằm bất động lâu ngày tạo ra. Chính vì lý do này mà nano bạc ngày càng sử dụng phổ biến trong cuộc sống [34].

+ Ứng dụng trong quá trình chế biến nhựa (PE, PS, APS, PP) ở dạng lỏng. Dung dịch nano bạc được pha vào lúc chế biến hoặc dạng khô dưới dạng bột chitosan đã tẩm dung dịch, giúp tạo ra tính diệt và kháng khuẩn của vật liệu nhựa [35]. Bạc là nguyên tố có cấu trúc nguyên tử thích hợp, nguyên tử bạc rất dễ nhường điện tử cho bên ngoài để trở thành ion bạc. Sau đó, ion bạc lại dễ nhận điện tử để trở thành nguyên tử bạc trung hòa. Điện tử mà nguyên tử bạc nhường cho bên ngoài dễ bị kích thích để tạo thành các phản ứng oxy hóa. Kết quả là làm tổn thương, phá hoại màng bọc của các loại vi khuẩn, tiêu diệt chúng hoặc làm cho chúng khó sinh sôi, nảy nở. Loại túi nilon có mặt trong chứa lớp hạt nano bạc khử được vi khuẩn, nhờ đó thực phẩm giữ được lâu hơn 3 – 4 lần so với loại túi ni lông thường. Các thùng chứa thực phẩm trong kho cũng được tráng lớp nano bạc để bảo quản lâu hơn. + Để phát hiện vi khuẩn E. Coli trong thực phẩm, người ta chế tạo ra loại túi có mặt trong có chứa các hạt SiO2 hình cầu có kích thước nanometer, trên bề mặt của mỗi hạt có dính kháng thể và các phân tử hình quang. Khi thực phẩm đựng trong túi nhiễm vi khuẩn E.Coli, lập tức các kháng thể bám chặt vào, các phân tử chất huỳnh quang trên hạt nano SiO2 tiếp xúc với vi khuẩn E.Coli sáng lên. Nhờ thế, khi túi đựng thực phẩm đổi màu, người ta có thể biết ngay trong thực phẩm có vi khuẩn E.Coli. + Dung dịch nano bạc được ứng dụng trong bảo quản nông sản [22] Các loại rau củ quả sau thu hoạch được ngâm, phun phủ dung dịch nano bạc sẽ được sạch vi khuẩn và nấm bám trên sản phẩm nhờ vậy mà rau củ quả được gia tăng được chất lượng và hạn sử dụng. Nồng độ khuyến cáo sử dụng: Dung dịch nano bạc với nồng độ 20-50ppm 1.2. TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN 1.2.1. Định nghĩa và tính chất của chitosan a) Định nghĩa Chitosan là một polysacarit mạch thẳng được cấu tạo từ các D-glucosamin (đơn vị đã deaxetyl hóa) và N-acetyl-D-glucosamine ( đơn vị chứa nhóm acetyl) liên kết tại vị trí β-(1-4). Nó được sản xuất từ quá trình xử lý vỏ các loài giáp xác (vỏ tôm, cua) với dung dịch kiềm NaOH [13], [28].

Hình 1.7. Công thức cấu tạo của chitosan (poly β-(1-4)-D-glucozamin)[37]

b) Tính chất Chitosan được sản xuất trong công nghiệp bằng phương pháp deacetyl hóa chitin, vốn là chất tạo nên cấu trúc của lớp vỏ của các loài giáp xác và thành tế bào của loài nấm. Độ deacetyl hóa có thể được xác định bằng phương pháp đo phổ NMR, độ tinh khiết của chitosan thương mại thường dao động trong khoảng từ 60 đến 100%. Nhìn chung, phân tử lượng của chitosan thương mại nằm trong khoảng 3800 - 20000 Daltons. Phương pháp deacetyl hóa chitosan thông dụng là sử dụng lượng dư dung dịch NaOH. Phương pháp này cho phép thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao đến 98% [13]. - Tính chất vật lý [13], [28] + Chitosan là những polymer sinh học có khối lượng phân tử lớn. + Chitosan là chất rắn vô định hình, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ thành các kích cỡ khác nhau.

Hình 1.8. Vỏ cua ghẹ và chitosan [13] + Chitosan có thể tan trong dimethylactamine (DMA) có chứa 8% lithium choloride hoặc acid hữu cơ như acetic acid, citric acid, chlohydrite acid, không tan trong nước, xút, cồn hoặc các dung môi hữu cơ khác. + Bột chitosan có dạng hơi sệt trong tự nhiên và màu sắc của nó biến đổi từ màu vàng nhạt đến trắng. + Giống như cellulose, chitosan là chất xơ, nhưng không giống chất xơ thực vật, chitosan có khả năng tạo màng, có tính chất của cấu trúc quang học… + Chitosan là chất có độ nhớt cao, phụ thuộc vào nhiều yếu tố như mức độ deacetyl hóa, khối lượng nguyên tử, nồng độ dung dịch, độ mạnh của lực ion, pH và nhiệt độ…

+ Chitosan có khả năng tích điện dương do đó nó có khả năng kết hợp với những chất tích điện âm như chất béo, lipid và acid mật… - Tính chất hóa học [13], [28]

+ Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức -OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích N-axetyl-D-glucozamin và nhóm -OH, nhóm -NH2 trong các mắt xích D-glucozamin có nghĩa chúng vừa là ancol vừa là amin, vừa là amit. Phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-, hoặc dẫn xuất thế O-, N-. + Mặt khác chitosan là những polime mà các monome được nối với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glicozit, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hóa học như: acid, bazơ, tác nhân oxy hóa và các enzyme thủy phân. 1.2.2. Phương pháp điều chế chitosan - Phương pháp điều chế chitosan bao gồm 3 giai đoạn [13], [16]: + Giai đoạn 1: những phần tử vô cơ thường bị loại do tác dụng của acid vô cơ loãng hoặc enzyme hòa tan muối vô cơ. + Giai đoạn 2: protein và các hợp chất hữu cơ khác bị loại do tác dụng của kiềm hoặc enzyme protease. + Giai đoạn 3: dùng NaOH 40-60% và các muối của nó hoặc enzyme protease để deacetyl hóa thu được chitosan. - Có rất nhiều phương pháp để tạo chitosan, dưới đây là một số phương pháp phổ biến [11]: + Phương pháp khâu mạch nhũ tương: phương pháp đầu tiên được dùng để tạo chitosan. Phương pháp này được dùng để tạo hạt chitosan có tính chất ổn định. + Phương pháp tạo giọt/kết tủa: do chitosan có tính chất không tan trong nước, kiềm hay acid đậm đặc nên phương pháp này được dùng để ứng dụng tính chất trên. + Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương: nguyên tắc thực hiện của phương pháp này dựa vào sự kết hợp của cả hai phương pháp trên. Phương pháp này cho thấy rằng khi mức độ deacetyl hóa của chitosan giảm sẽ làm tăng kích thước hạt và làm giảm khả năng tạo hạt chitosan. + Phương pháp sấy phun: nó được ứng dụng nhiều trong dược phẩm, thực phẩm để tạo bột, tạo hạt từ hỗn hợp huyền phù thuốc với tá dược, thực phẩm. + Phương pháp tạo gel ionic: phương pháp này có ưu điểm là giai đoạn chuẩn bị đơn giản, chi phí thấp, dễ thực hiện, hạt chitosan có kích thước hạt nhỏ, phân bố kích thước đồng đều và điện thế hạt cao. Chính vì vậy nó được sử dụng rất nhiều trong các nghiên cứu.

1.2.3. Ứng dụng của chitosan Chitosan an toàn, không độc hại, nó có tác dụng bảo vệ do có tác dụng kháng khuẩn (cả vi khuẩn gram (-), gram (+)), kháng nấm cho quả tươi [9]. Trong y tế, chitosan có tác dụng làm màng chữa bỏng, tá dược độn trong làm cốm, tá dược ổn định viên nén, thuốc trị viêm loét dạ dày tá tràng. Hỗn hợp chitosan-collagen làm giảm cholesterol trong máu, giảm sự hấp thụ lipid [37]. Trong công nghiệp in, chitosan làm chất keo cảm quang, trong công nghiệp nhuộm làm tăng độ màu vải nhuộm. Trong nông nghiệp, oligochitosan làm thuốc tăng trưởng thực vật và kích thích gây tạo kháng sinh thực vật, thuốc diệt nấm bệnh cho thực vật, gia tăng hệ số nhân và sinh khối tươi cho cây nuôi cấy mô [37]. Trong khoa học kỹ thuật, chitosan làm dung dịch tăng độ khuếch đại của kính hiển vi, xử lý nước thải công nghiệp và sinh hoạt: thu hồi ion kim loại, protein, phenol, thuốc trừ sâu, thuốc nhuộm [37]… Trong công nghiệp thực phẩm, chitosan làm phụ gia thực phẩm duy trì hương vị tự nhiên, ổn định màu, nhũ tương, làm dày cấu trúc, màng bảo quản rau quả tươi, làm trong nước quả ép, giữ màu sắc và hương vị tự nhiên của sản phẩm [37]. 1.3. TỔNG QUAN VỀ QUÝT 1.3.1. Giới thiệu tổng quan về quýt 1.3.1.1. Nguồn gốc Cây quýt có tên khoa học là Citrus deliciosa tenore, là một loài cây ăn quả thuộc chi Cam (Citrus), Họ Cam (Rutaceae), có nguồn gốc từ Ấn Độ và Trung Quốc, được trồng khắp nơi để lấy quả. Ở nước ta có khí hậu nóng ẩm, nhiều ánh sáng rất thích hợp để trồng quýt, do đó cây quýt có mặt hầu khắp từ Bắc chí Nam với nhiều giống và chủng loại khác nhau. Ở Việt Nam được trồng nhiều nhất tại Nghệ An, Hà Tĩnh, Huế, Hà Giang, Tuyên Quang, Hưng Yên, Bắc Giang... [36] 1.3.1.2. Giới thiệu một số loại quýt ở Việt Nam Ở nước ta, quýt có nhiều giống, chủ yếu là: - Quýt hồng: có trái tròn, dẹp 2 đầu, khi chín vỏ có màu cam vàng, thịt màu cam hay vàng cam.

Hình 1.9. Quýt hồng [40] - Quýt đường: có dạng trái tròn, vỏ mỏng, màu xanh đến xanh vàng, thịt màu cam, ngọt.

Hình 1.10. Quýt đường [41] - Quýt Phủ Quỳ: giống quýt mà trung tâm nghiên cứu cây ăn quả Phủ Quỳ dày công nghiên cứu 15 năm, giống quýt này có độ chín đồng đều cao. Chất lượng quả cũng được tăng lên theo thời gian. Quả có dạng trái tròn, vỏ xốp dễ bóc, các múi quýt dễ tách ra từng múi, cơm màu hồng nhạt, khi ăn vị ngọt và thanh.

Hình 1.11. Quýt Phủ Quỳ [42]

- Quýt Hương Cần: một loại quả ngọt trồng nhiều ở xã Hương Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam. Quýt Hương Cần tên khoa học là Citrus delicisa tenore, thuộc chi citrus, họ rutaceae, nằm trong danh mục nguồn “gien cây trồng quý cần bảo tồn của Việt Nam” Ban hành theo QĐ số 80/2005/QĐ-BNN, ngày 5/12/2005 của Bộ NN-PTNT Việt Nam [38]. Ở Việt Nam có rất nhiều nơi trồng quýt nhưng quýt Hương Cần nổi tiếng nhờ được trồng trên đất phù sa của sông Bồ, thuộc Giáp Kiền, làng Hương Cần. Người ta dùng phương pháp chiết cành để nhân giống giúp cho cây mới phát triển nhanh và không bị thoái hóa giống sau nhiều năm [38].

Hình 1.12. Quýt Hương Cần [38] Quýt Hương Cần có đặc điểm khác với các loại quýt khác là khi chín quả có màu vàng cam ở mặt quả và màu xanh lá cây ở phần cuống. Vỏ xốp mỏng như giấy rất dễ bóc, khi bóc quýt có mùi thơm đặc trưng. Các múi quýt dễ tách ra từng múi. Cơm màu hồng nhạt, khi ăn vị ngọt và thanh. Thời kì ra hoa từ tháng 3-4 âm lịch và quả chín bắt đầu thu hoạch là cuối tháng 7 nhưng để quả chín có phẩm chất tốt nhất là khoảng giữa tháng 8 âm lịch [38]. Cây quýt Hương Cần là đặc sản của Thừa Thiên Huế và đây là giống quýt ngon có tính thích nghi cao có hiệu quả kinh tế. Vì vậy, việc đầu tư phát triển có kế hoạch loại cây và quả này rất cần thiết. 1.3.2. Đặc điểm hình thái [36] Quýt là loại cây ăn trái lâu năm, được trồng chủ yếu ở các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Quả có hình cầu, vỏ nhẵn bóng. Khi chín thường có màu vàng xanh hoặc vàng da cam, có mùi thơm đặc trưng, vị biến đổi từ chua đến ngọt, tùy giống quýt. Nhìn chung, quả quýt được cấu tạo gồm 3 phần sau:

- Vỏ ngoài Gồm lớp biểu bì với lớp cutin dày và các lỗ khí. Bên dưới lớp biểu bì là lớp tế bào nhu mô vách mỏng, giàu lục lạp nên có thể quang hợp được khi trái còn xanh. Trong giai đoạn chín, diệp lục tố sẽ bị phân hủy, nhóm sắc tố màu xanthophyl và carotene trở nên chiếm ưu thế, màu sắc trái thay đổi từ xanh sang vàng hoặc da cam. Các túi tinh dầu nằm trong các mô, được giữ lại dưới sức trương của các tế bào xung quanh. - Vỏ giữa Là phần phía trong kế với vỏ ngoài, đây là một lớp gồm nhiều tầng tế bào hợp thành, có màu trắng, đôi khi có màu vàng nhạt. Các tế bào cấu tạo với những khoang gian bào rộng, chứa nhiều đường, tinh bột, vitamin C và pectin. Khi trái còn non, lượng pectin cao giữ vai trò quan trọng trong việc hút nước cung cấp cho quả. Chiều dày của phần vỏ giữa thay đổi theo loài trồng. Phần mô này cũng còn tồn tại ở giữa các màng múi nối liền vào vỏ quả, khi quả càng lớn thì trở nên xốp. - Vỏ trong Gồm các múi trái được bao quanh bởi vách mỏng trong suốt. Bên trong vách múi có các sợi đa bào, phát triển và đầy dần dịch nước chiếm đầy các múi chỉ chừa lại một số khoảng trống để phát triển. Như vậy vỏ trong cung cấp phần ăn được của trái với dịch nước chứa đường, acid và khoáng chất với tỷ lệ tùy vào điều kiện canh tác và loài trồng. 1.3.3. Giá trị dinh dưỡng của quýt Quả quýt không những là một loại trái cây thông thường mà quýt còn có nhiều công dụng bất ngờ cho sức khỏe và đời sống của mọi người vì nó chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sức khoẻ con người như: acid hữu cơ, chất đạm, chất khoáng, tinh dầu, đường, pectin và một số vitamin như B1, B2, PP và đặc biệt là vitamin C có hàm lượng rất cao [7], [38], [41]. Theo số liệu Dinh dưỡng Quốc gia của Bộ Nông nghiệp Mỹ, giá trị dinh dưỡng của quả quýt chứa trong mỗi 100g quýt tươi như bảng sau:

Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng trong 100g phần ăn được của quýt [7]

Tỷ lệ phần trăm theo Các chất chính Giá trị dinh dưỡng RDA (*) (%)

Năng lượng 53 Kcal 2,5

Đường 13,34 g 10

Protein 0,81 g 1,5

Nước 82,5 g

Tổng chất béo 0,31 g 1

Chất xơ 1,8 g 5

Vitamin

Folates 16 μg 4

Niacin 0,376 mg 2,5

Pantothenic acid 0,216 mg 4

Pyridoxine 0,078 mg 6

Riboflavin 0,036 mg 3

Thiamin 0,058 mg 5

Vitamin C 26,7 mg 44

Vitamin A 681 IU 23

Vitamin E 0,20 mg 1

Chất điện giải

Natri 2 mg < 0,5

Kali 166 mg 3,5

Tỷ lệ phần trăm theo Các chất chính Giá trị dinh dưỡng RDA (*) (%)

Chất khoáng

Canxi 37 mg 4

Đồng 42 μg 4,5

Sắt 0,15 mg 2

Magie 12 mg 3

Mangan 0,039 mg 1,5

Kẽm 0,07 mg <1

Chất màu dinh dưỡng

Carotene-β 155 μg _

Carotene-α 101 μg _

Crypto-xanthin-β 407 μg _

Lutein-zeaxanthin 138 μg _

(*): Tỷ lệ trên được đưa ra theo số liệu RDA của Viện Hàn lâm Khoa học thực phẩm và dinh dưỡng Mỹ, là lượng chất dinh dưỡng trong chế độ ăn hàng ngày được khuyến cáo để duy trì sức khỏe tốt ở người. Ví dụ trong bảng ghi 10% đường nghĩa là cứ 100g quýt cung cấp 10% lượng đường cần thiết cho một ngày của một người. Qua Bảng 1.2 cho thấy: Hàm lượng nước: chiếm tỷ lệ lớn nhất 85,2%. Đường: chiếm 10%, trong đó bao gồm hàm lượng đường glucose, sucrose và fructose, và các polysaccarit như tinh bột, cenlulose, hemicenlulose. Chủ yếu là đường đơn và đây là giá trị dinh dưỡng cao, nhờ khả năng hòa tan cao của đường đơn nên cơ quan tiêu hóa của người hấp thu tốt, tăng sự lưu thông của máu, tăng tính hoạt hóa trong quá trình oxy hóa năng lượng của các mô tế bào. Protein chiếm 1,5%, lipid 1%, còn lại là các khoáng chất, vitamin và các thành phần khác.

Carotenoid là sắc tố tự nhiên tạo ra màu vàng, da cam, cho quả quýt. Trong quýt, carotenoid tồn tại ở các dạng β-caroten, α-caroten, β-cryptoxanthin, và lutein-zeaxanthin. Khi quá trình chín bắt đầu, các chất diệp lục chlorophyll (màu xanh lá cây) bị suy giảm và chất carotenoid (có màu vàng) bắt đầu được tổng hợp. 1.3.4. Bệnh nhiễm trên quýt - Bệnh thán thư: trên trái bệnh là những đóm nhỏ, tròn, vàng nhạt, sau lớn dẫn có màu nâu đậm, vết bệnh hơi lõm vào và có thể nứt ra, trên vết bệnh có những vòng đồng tâm là những bào tử có nấm màu đen. Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum acutatum hay Colletotrichum gloeosprioides hoặc cả hai gây ra [36]. - Bệnh đốm đen: trái có những chấm tròn có kích thước khoảng 1mm, xuất hiện trên vỏ của trái còn non, sau đó phát triển rộng dần ra, màu vàng nhạt, ở giữa có màu xám, nếu nặng vết hòa lẫn nhau tạo thành mảng lớn. Bệnh đốm đen do nấm Diaporthe citri gây ra [36]. - Bệnh tàn lụi: trái đạt kích thước bằng trái bàn thì trái bị vàng từ đít trái vàng lên cuống trái làm trái rụng hàng loạt làm thất thu nặng cho nhà vườn. bệnh do loài vi rút thuộc nhóm Closterovirus. Trung gian truyền bệnh là các loại rầy mềm như rầy mềm xanh, rầy mềm nâu Toxoptera aurantii boyer, rầy mềm Mzus persicae [36]… - Bệnh thối quả màu xanh: trái có những vết đốm nhỏ nhìn như úng nước, bệnh do nấm phytophthora sp. gây ra [36]. - Bệnh sẹo: vỏ trái nổi nhiều gai sần sùi, màu nâu xám, rời rạc hoặc nối lại thành mảng lớn, bệnh do nấm Elsinoe fawcettii gây ra [36]. Hiện nay, tại Hương Cần, xã Hương Toàn, Thị xã Hương Trà có xuất hiện loại nấm bệnh gây hại làm cho quả quýt bị mốc có sợi màu trắng, chảy nước, khô cuống và rụng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phân lập và định danh để tìm ra loại nấm bệnh này. 1.3.5. Những biến đổi của quýt và yếu tố ảnh hưởng trong thời gian bảo quản 1.3.5.1. Những biến đổi của quýt sau thu hoạch [4] a) Biến đổi vật lý - Sự thoát hơi nước: hiện tượng nước từ trong cơ thể quả thoát ra ngoài thông qua lớp khí khổng và lớp vỏ ngoài. Đây là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong quá trình bảo quản đặc biệt là trong quýt có chứa rất nhiều nước (chiếm 85%). Sự thoát hơi nước làm cho quả bị mất nước từ đó dẫn đến khô héo, giảm khối lượng của quả, giảm khả năng kháng khuẩn và làm giảm giá trị cảm quan. Tốc độ mất nước của quả phụ thuộc vào một số yếu tố như là độ chín, độ chắc của vỏ, mức độ háo nước của hệ keo

21 trong tế bào, mức độ dập cơ học, độ ẩm, nhiệt độ môi trường xung quanh, thời gian và phương pháp bảo quản. - Giảm khối lượng tự nhiên do sự bay hơi nước và tổn hao các chất hữu cơ khi hô hấp. Sự tổn hao chất dinh dưỡng do quả phải sử dụng chất dinh dưỡng (chủ yếu là đường) để duy trì sự sống sau khi ngắt khỏi cây mẹ do đó quả bị giảm hàm lượng chất khô sau thời gian bảo quản. Trong bất cứ điều kiện bảo quản nào cũng không thể tránh khỏi hiện tượng hao hụt khối lượng tự nhiên mà chỉ có thể giảm hiện tượng này đến mức tối thiểu. Vậy nếu muốn hạn chế giảm khối lượng tự nhiên của quả trong quá trình bảo quản cần hạn chế được hiện tượng bay hơi nước, làm cho quá trình hô hấp diễn ra chậm. - Sự sinh nhiệt: nhiệt được sinh ra trong quá trình bảo quản tươi là do hô hấp. 2/3 lượng nhiệt đó được tải ra ngoài môi trường, 1/3 lượng nhiệt còn lại được dùng vào các quá trình trao đổi chất bên trong tế bào, quá trình bay hơi nước. Trong bảo quản cần duy trì các thông số nhiệt độ, độ ẩm tối ưu trong kho. Khi nhiệt độ tăng kích thích cường độ hô hấp mạnh lên, từ đó đẩy mạnh chu trình: nhiệt độ tăng làm quá trình hô hấp tăng, sự phát triển của vi sinh vật tăng, lượng nhiệt sinh ra lại tăng hơn nữa. Đó là điều kiện dẫn đến hư hỏng quả nhanh chóng. b) Quá trình sinh lý, hóa sinh - Sự hô hấp: Hô hấp là quá trình oxi hóa chậm các chất hữu cơ phức tạp. Dưới tác dụng của enzyme, các chất này phân giải thành các chất đơn giản hơn và giải phóng năng lượng. Hầu hết các chất này đều có thể tham gia vào quá trình hô hấp trừ protein nhưng chủ yếu là các chất đường - nhất là đường đơn. Hô hấp làm giảm khối lượng tự nhiên và tiêu hao các chất dinh dưỡng của quả. Quýt thuộc loại quả hô hấp thường hay hô hấp không đột biến, tùy theo điều kiện môi trường, quýt có thể hô hấp theo 2 phương thức: Hô hấp hiếu khí: trong điều kiện có đủ oxy, hô hấp hiếu khí sẽ xảy ra, sản phẩm tạo thành là CO2.

C6H12O6 + O2 CH3COCOOH CO2 + H2O + Q Hô hấp yếm khí: khi lượng oxy của môi trường không khí không đủ để tiến hành hô hấp hiếu khí thì sẽ xảy ra hiện tượng hô hấp yếm khí, là hô hấp không có sự tham gia của oxy và tạo ra sản phẩm cuối cùng là rượu ethanol, CO.

C6H12O6 + O2 CH3COCOOH acid lactic, acid acetic, rượu, butylic.

Khi thành phần không khí có khí O2 càng nhiều thì cường độ hô hấp càng cao và ngược lại khí O2 thấp, CO2 và N2 cao thì cường độ hô hấp bị ức chế. - Sự thay đổi thành phần hóa học

+ Glucid: thành phần thay đổi lớn và mạnh nhất trong khi bảo quản. Trong thời gian bảo quản quả đã chín, đường được sử dụng trong quá trình hô hấp chuyển hoá thành năng lượng, hàm luợng đường bị giảm theo thời gian. Các loại quả chưa chín hoặc tỷ lệ chín thấp thì tiếp tục chín trong quá trình bảo quản, tinh bột chuyển hóa thành đường, một phần đuợc sử dụng để sinh nhiệt và hô hấp, phần còn lại tích tụ trong quả làm tổng lượng đường trong quả tăng theo thời gian bảo quản. Tuy nhiên, hàm lượng đường tăng do quá trình chuyển hóa tinh bột thành đường nhiều hơn so với việc giảm đi do quá trình hô hấp. Khi lượng tinh bột chuyển hóa thành đường hết thì hàm lượng đường bắt đầu giảm. + Acid hữu cơ: trong quả chín có chứa 0,5 – 1,0 % acid hữu cơ. Acid hữu cơ thường gặp là acid citric. Trong quá trình bảo quản, lượng acid hữu cơ giảm rõ rệt cả về chất và lượng. Điều này làm cho vị chua của quả giảm đi và vị ngọt tăng lên khi quả chín. + Protopectin: trong quá trình quả chín, quả sẽ trở nên mềm do chất protopectin chuyển hóa thành pectin hoà tan làm quả trở nên mềm. Vì vậy, khi thu hoạch cần phải xác định thời điểm quả chưa chín thích hợp. Nếu quả còn quá xanh thì chất luợng quả không tốt, nếu quả chín quá thì khó bảo quản. Khi quả chín quá, pectin bị phân hủy đến acid petic và rượu metanol làm cho quả bị nhũn, cấu trúc bị phá vỡ. + Các chất màu, sắc tố: màu sắc của quả do chất chlorophyl và carotenoit quyết định. Tuỳ theo mức độ chín mà màu xanh của quả mất dần do chlorophyl giảm và màu vàng, vàng cam tăng dần do hàm lượng carotenoit tăng. Do đó tạo nên màu vàng cho quả quýt. + Vitamin C: từ giai đoạn xanh già chuyển sang chín có nhiều loại vitamin tạo thành như vitamin B9, B15, P, K, tiền vitamin A,… đặc biệt hàm lượng vitamin C có tăng lên trong đầu quá trình bảo quản do hàm lượng đường tăng làm tăng quá trình chuyển hóa đường thành vitamin C. Tuy nhiên, vitamin C lại dễ bị oxy hóa do không khí xâm nhập và quá trình khử của các mô bị phá hủy. Do đó, trong quá trình bảo quản vitamin C thường giảm mạnh. + Hương thơm: các chất thơm được tạo ra và tăng lên và tổng hợp trong quá trình chín sau thu hoạch như etse, rượu, aldehyd,… với hàm lượng rất nhỏ nhưng tạo cho quả có mùi thơm riêng. 1.3.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến thời gian bảo quản quýt [4] a. Độ chín thu hái Đối với quả thu hoạch quá sớm sẽ làm cho quả có mùi, vị kém, có thể quả sẽ không chín, trong khi thu hoạch muộn thì quá chín, thời gian lưu trữ không được lâu. Khi thu hái, vận chuyển xa chúng ta lựa chọn quả quýt đã đạt độ chín kỹ thuật, quả vẫn

23 còn xanh nhưng thuần thục về mặt sinh lý thì có thể chín tiếp tự nhiên và có thể đạt đến chất lượng tối ưu. b. Độ ẩm tương đối của không khí Độ ẩm tương đối của không khí quyết định tốc độ bay hơi nước của quýt và có ảnh hưởng đến thời hạn bảo quản của quả quýt. + Nếu độ ẩm tương đối môi trường không khí thấp thì cường độ hô hấp tăng, tốc độ bay hơi nước càng cao, khối lượng riêng của quả giảm, bề mặt bị héo làm giảm giá trị cảm quan, trong tế bào thì nguyên sinh chất co lại làm ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất, giảm khả năng đề kháng bệnh lý của quýt trong quá trình bảo quản. Tuy nhiên độ ẩm tương đối môi trường thấp thì tạo ra môi trường không thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, làm hạn chế sự xuất hiện các loại bệnh. + Nếu độ ẩm tương đối môi trường càng cao thì cường độ hô hấp, tốc độ bay hơi nước giảm nhưng đây là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, và nước có thể ngưng tụ trên bề mặt quả gây rối loạn hô hấp. c. Nhiệt độ - Nhiệt độ là yếu tố của môi trường có ảnh hưởng quyết định nhất đến quá trình sống của rau quả khi tồn trữ. Ở nhiệt độ thấp, các biến đổi sinh lý - sinh hóa trong quả bị hạn chế ở mức thấp làm cho quả chín chậm hơn, dưỡng chất trong quả được duy trì lâu hơn, sự gây hại cũng như phát triển của các loại nấm bệnh bị hạn chế ở mức thấp. Nhiệt độ thấp và ẩm độ cao làm cho sự bốc thoát hơi nước của quả giảm đáng kể từ đó giảm bớt hao hụt về trọng lượng, vỏ quả ít bị nhăn nheo và giữ được độ cảm quan và phẩm chất lâu hơn. Tuy nhiên, mỗi loại quả có thể chịu đựng được những ngưỡng nhiệt độ khác nhau, nhiệt độ cao quá hay thấp quá đều ảnh hưởng đến phẩm chất và thời gian tồn trữ. - Nhiệt độ tăng dẫn đến cường độ hô hấp tăng đến mức tối đa rồi giảm xuống. - Nhiệt độ càng thấp cường độ hô hấp càng giảm (5 – 250C) Vì vậy, để có thể bảo quản được lâu ta nên hạ thấp nhiệt độ. Vì giảm nhiệt độ sẽ dẫn đến các hoạt động sinh lý, sinh hóa trong quả giảm và thời gian bảo quản được tăng lên. Tuy nhiên khi hạ thấp nhiệt độ xuống dưới điểm đóng băng thì dịch bào của quả dễ bị đóng băng, và làm phá vỡ cấu trúc của quả. Vì thế, chỉ nên bảo quản ở nhiệt độ thấp nhưng trên điểm đóng băng.

d. Thành phần không khí trong môi trường bảo quản Thành phần khí của khí quyển tồn trữ có ảnh hưởng trực tiếp đến sự trao đổi chất của quýt.

Hàm lượng O2 càng cao, CO2, N2 càng thấp thì quá trình hô hấp càng cao và ngược lại. Vậy muốn tăng khả năng bảo quản thì ta giảm O2 tăng CO2, N2 để hạn chế quá trình hô hấp. e. Sự thông gió và thoáng khí Thông gió là một phương pháp rất quan trọng nhằm ổn định các thông số cơ bản trong kỹ thuật bảo quản rau quả tươi. Nhằm tạo ra môi trường khí quyển xung quanh nguyên liệu cũng thoáng như không gian tự do, tức là có nhiệt độ, độ ẩm, thành phần khí quyển trong khối nguyên liệu không khác với tự nhiên. Các thông số như: nhiệt độ, độ ẩm, thành phần không khí trong kho bảo quản luôn biến động. Nguyên nhân biến động là do quá trình hô hấp, quá trình này là tất yếu và các tác hại của chúng là tất yếu. Vì vậy, quá trình thông gió và thoáng khí ảnh hưởng đến quá trình bảo quản quýt. f. Các yếu tố vi sinh vật Quýt sau thu hoạch dễ bị nhiễm các nấm, vi khuẩn gây bệnh dẫn đến hư hỏng: Bệnh thán thư, bệnh đốm đen, bệnh tàn lụi, bệnh thối quả màu xanh, bệnh sẹo [33]. 1.3.5.3. Một số phương pháp xử lý và bảo quản quýt sau thu hoạch [4] Để bảo quản và xử lý rau quả đặc biệt đối với họ quả có múi người ta sử dụng rất nhiều phương pháp chủ yếu: - Bảo quản lạnh: hạ nhiệt độ môi trường bảo quản để hạn chế cường độ hô hấp và các quá trình sinh lý, sinh hóa xảy ra trong rau quả cũng như hoạt động của vi sinh vật của rau quả ngăn ngừa sự phát triển của vi sinh vật gây hại. Nguyên lý này giúp bảo quản rau quả tươi dài ngày.

- Bảo quản bằng cát: cát có tác dụng hấp thụ nhiệt độ, ẩm, CO2 thoát ra từ nguyên liệu khi bảo quản và ngăn chặn một phần sự xâm nhập của khí O2. Cho cát (đã sàng lọc, phơi khô) vào dụng cụ chứa như lu, hũ hoặc các thùng nhựa với độ dày lớp cát ở đáy khoảng 10cm, chọn trái cây cần bảo quản (không quá chín, không bị sâu, thối, khô...) rửa sạch để ráo đặt lên lớp cát. Sau đó phủ lên một lớp cát dày 5-7cm và cứ thế làm tiếp một lớp cát, một lớp trái cây cho đến khi đầy thùng, trong đó lớp cát trên cùng cũng dày khoảng 10cm như lớp ở đáy.

- Bảo quản bằng phương pháp hóa học: + Xử lý bằng ozon + Xử lý bằng chlorine Sử dụng ở liều lượng cho phép nhằm kéo dài thời gian bảo quản. Có tác dụng ức chế sinh trưởng trong nguyên liệu rau quả cũng như tiêu diệt vi sinh vật. Để kéo dài thời gian bảo quản chủ yếu là dựa vào khả năng tiêu diệt vi sinh vật của hóa chất. Tuy nhiên khi sử dụng hóa chất để bảo quản có thể gây ra những biến đổi về màu sắc, mùi vị của rau quả, đáng lo ngại hơn là có thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. - Bảo quản bằng điều chỉnh khí quyển: + Bảo quản trong khí quyển được kiểm soát: thành phần của khí xung quanh thực phẩm hô hấp được giám sát và kiểm soát liên tục. Phòng bảo quản kín, lạnh hoặc không lạnh, có hệ thống thông gió tốt và cung cấp các khí O2, CO2, N2 với thiết bị đo nhiệt độ, độ ẩm và các khí này được đo, kiểm soát một cách chặt chẽ. + Bảo quản trong khí quyển cải biến hay vi khí quyển - Phương pháp xử lý nước nóng: ở nhiệt độ nhất định nào đó có thể ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây hại cho mô thực vật. Việc xử lý nước nóng sẽ tác động đến hoạt tính các enzyme oxy hóa tốc độ của các phản ứng sinh hóa xảy ra trong tế bào sống của quả. Làm ức chế quá trình sinh tổng hợp etylen trong quả từ đó kéo dài thời gian bảo quản. - Phương pháp tạo màng: + Bảo quản bằng bao gói khí quyển biến đổi (thường gọi tắt là MAP): Phương pháp này dựa vào khả năng bán thấm của bao bì, tạo môi trường bảo quản tốt nhất, bên trong bao bì tồn tại sự cân bằng lượng khí oxy đi vào, khí cacbonic đi ra và khuếch tán một lượng hơi nước qua màng chất dẻo. Ở một nhiệt độ nhất định hai loại khí sẽ đạt tới một trạng thái hoàn hảo. Khi tốc độ thấm khí qua màng chất dẻo cân bằng với tốc độ hô hấp thì khí CO2 tăng lên và O2 giảm là môi trường tiểu khí hậu rất tốt có tác dụng kéo dài thời hạn bảo quản, rau quả sẽ hạn chế hô hấp. Có hai dạng bao gói là bao gói chân không và bao gói trao đổi khí. + Bảo quản hoa quả bằng lớp màng phủ ăn được: một lớp vật liệu mỏng được phủ trên bề mặt sản phẩm để thay thế lớp sáp bảo vệ tự nhiên và cung cấp một lớp chắn ẩm, oxy cho thực phẩm. Các lớp phủ này được tạo trực tiếp trên bề mặt hoa quả bằng cách nhúng, phun hay quét để tạo ra một khí quyển biến đổi (MAP). Lớp màng bán thấm tạo thành trên bề mặt hoa quả sẽ giảm bớt quá trình hô hấp và kiểm soát sự mất độ ẩm cũng

26 như cung cấp các chức năng khác. 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU MÀNG BẢO QUẢN THỰC PHẨM Ở NƯỚC TA VÀ THẾ GIỚI Ngày nay, an toàn thực phẩm luôn là một vấn đề nóng và nhận được nhiều sự quan tâm của các cơ quan quản lý nhà nước lẫn người dân, việc các thực phẩm sử dụng hóa chất bảo quản, trái cây, rau quả sử dụng hóa chất bảo quản giữ tươi lâu hơn, nhưng những hóa chất bảo quản này rất có hại cho sức khỏe người tiêu dùng, vì lợi nhuận bất chấp tác hại của chúng người buôn bán vẫn sử dụng. Việc sử dụng những sản phẩm sạch, các chế phẩm sinh học để bảo quản sản phẩm đang được sự quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu khoa học. 1.4.1. Tình hình nghiên cứu màng bảo quản thực phẩm ở thế giới Ở thế giới đã ứng dụng nhiều loại màng trong bảo quản thực phẩm như màng chitosan – gelatin, màng từ tinh bột ngô và nano bạc … Năm 2005, Chien Po-Jung và cộng sự đã ứng dụng màng chitosan vào bảo quản quả vải và nhãn cho thấy quả vải và quả nhãn ít bị biến nâu hơn quả không dùng chitosan [16]. Năm 2005, Karasavses và cộng sự, đã nghiên cứu màng chitosan làm bao gói để bảo quản cá và các sản phẩm từ cá. Người ta dùng chitosan chiết rút từ tôm, ghẹ làm màng bao gói thì thấy màng chitosan chiết rút từ tôm có độ dày, độ bền kéo, độ đàn hồi cao nhất. Màng chitosan giúp cho sản phẩm giữ nước rất tốt và giữ được các đặc tính tự nhiên của sản phẩm. Trong những năm gần đây, nhóm tác giả Hadar Arnon (2014) đã nghiên cứu chế tạo thành công màng chitosan có bổ sung phụ gia thực phẩm CMC (carboxymethyl cellulose) để kéo dài thời gian bảo quản cũng như ổn định được chất lượng của các loại quả có múi. Năm 2015, Dai và cộng sự nghiên cứu tạo màng tinh bột ngô có bổ sung các hạt nano tinh bột khoai môn và ứng dụng trong kỹ thuật bảo quản thực phẩm [17]. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu màng bảo quản thực phẩm ở nước ta Từ những năm trước, Trần Thị Luyến cựu giảng viên trường Đại học Thủy Sản Nha Trang đã nghiên cứu thành công màng sinh học chitosan từ phế phẩm vỏ cua, ghẹ, tôm trong việc bảo quản nông sản. Năm 2009, Nguyễn Thị Hạnh ứng dụng bảo quản quả cam và hồng từ dung dịch chitosan [5]. Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan - nano bạc trong bảo quản nhằm nâng cao chất lượng thanh long sau thu hoạch đã được nhóm nghiên cứu Phạm Thị Hà Vân và cộng sự công bố vào năm 2017 [12]. Bên cạnh những tác dụng ưu việt được tạo ra từ chitosan, tinh bột sắn là một trong những nguồn vật liệu rẻ tiền, có khả năng phân hủy sinh học được ứng dụng để sản xuất tạo màng film bao gói thực phẩm và bảo quản trái cây. Hoàng Bình (2005) nghiên cứu chế tạo thành công vật liệu siêu hấp thụ nước từ tinh bột sắn [3]. Năm 2008, tại Đại học Bách khoa Đà nẵng, Võ

Văn Quốc Bảo và cs. nghiên cứu màng tinh bột sắn có bổ sung polyethylene glycol để tăng khả năng chịu lực của màng và đã ứng dụng bao gói một số sản phẩm bánh kẹo truyền thống [2]. Gần đây, nhóm tác giả Võ Văn Quốc Bảo và cộng sự (2018) đã nghiên cứu chế tạo màng kháng khuẩn từ nano bạc kết hợp tinh bột sắn tạo thành chế phẩm dung dịch bảo quản trái cây [31]. 1.4.3. Tính mới của đề tài Trong nghiên cứu này chúng tôi góp phần đa dạng hóa phương pháp bảo quản quýt bằng chế phẩm sinh học từ nguyên liệu tự nhiên (Chitosan) kết hợp với nano kim loại bạc nhằm kháng một số nấm gây bệnh trên quả quýt, đồng thời kéo dài thời gian lưu trữ quả.

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Phạm vi nghiên cứu 2.1.1.1. Địa điểm: Phòng thí nghiệm khoa Cơ khí – Công nghệ trường Đại học Nông Lâm Huế. 2.1.1.2. Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành vào tháng 06/2017 đến tháng 06/ 2018 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu Quýt được thu hoạch tại thôn Giáp Kiền, xã Hương Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế. 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Định danh nấm từ quả quýt Hương Cần. - Khảo sát khả năng kháng nấm của chế phẩm nano bạc-Chi. - Nghiên cứu ứng dụng bảo quản quýt Hương Cần từ chế phẩm nano bạc-Chi ở nhiệt độ 130C, độ ẩm 80% đến 95%. 2.2.1. Phân lập, định danh nấm từ quả quýt Hương Cần Quýt chứa nhiều nước, vitamin C, đường và còn nhiều thành phần dinh dưỡng khác, là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật phát triển nên đã ảnh hưởng đến công đoạn bảo quản, lưu trữ quýt. Hiện nay, trên quả quýt Hương Cần thường xuất hiện những bệnh hại và nấm gây bệnh màu trắng, xốp làm cho quả quýt bị mốc. Quả quýt nhiễm nấm bị mất nước, khô cuống và rụng. Để góp phần nghiên cứu khả năng kháng bệnh trên quả quýt Hương Cần chúng tôi tiến hành phân lập nấm gây bệnh này, chúng tôi giới thiệu tóm tắt sơ đồ phân lập nấm như Hình 2.1.

Quả quýt

Phát hiện nấm

Thu sợi nấm

Nuôi cấy trong môi trường PDA

Phân lập trong môi trường PDA

Nấm thuần

Định danh Hình 2.1. Sơ đồ phân lập nấm từ quả quýt Hương Cần 2.2.2. Khảo sát khả năng kháng nấm của chế phẩm nano bạc-Chi với nấm được phân lập trên quả quýt Hương Cần 2.2.2.1. Khảo sát ở điều kiện in vitro Để kiểm tra khả năng kháng nấm của chế phẩm nano bạc bổ sung chitosan, chúng tôi thực hiện thí nghiệm trên chủng nấm gây bệnh được phân lập từ quả quýt Hương Cần. Kết quả thu nhận dựa vào khả năng phát triển của nấm trên môi trường PDA với nồng độ nano bạc 10 ppm và bổ sung chitosan ở các nồng độ 0%; 0,2%; 0,4%; 0,6% và 0,8%. Cắt một mảnh nấm thuần Macrophoma theicola có kích thước 2 × 2 mm từ rìa của

30 tản nấm sau 3 ngày nuôi cấy ở 28°C đặt vào tâm các đĩa petri (Ф 9cm). Mỗi nồng độ khảo sát được lặp lại 3 lần. Sử dụng thước kẹp điện tử để đo đường kính tản nấm (ĐKTN) mỗi ngày một lần. Tính kháng nấm của chế phẩm được thể hiện bằng sự ức chế hoặc tiêu diệt khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật [15]. Sơ đồ khảo sát tính kháng nấm ở điều kiện in vitro được trình bày ở Hình 2.2.

Dung dịch Môi trường nano bạc-Chi PDA

Khảo sát n ồng độ (0% - 8%) Gia nhiệt

Đổ đĩa

Cấy nấm Nấm thuần

Khảo sát tính Nuôi nấm kháng khuẩn

Hình 2.2. Sơ đồ khảo sát tính kháng nấm ở điều kiện in vitro 2.2.2.2. Khảo sát ở điều kiện in vivo Quá trình thí nghiệm tiến hành tương tự như khảo sát khả năng kháng nấm được phân lập theo điều kiện in vitro. Quả quýt sau khi rửa sạch, được tạo 3 vết thương nhân tạo ở 3 vị trí khác nhau trên quả quýt và gây bệnh bằng cách cho mỗi vết thương 10µl huyền phù nấm Macrophoma theicola, nồng độ 106 tế bào/ml. Sau 2 giờ để khô ở điều kiện thường, nhúng 2 lần cách nhau 1 giờ chế phẩm nano bạc-Chi có nồng độ khác nhau (0%- mẫu đối chứng xử lý bằng nước cất; 0,2%; 0,4%; 0,6% và 0,8%) rồi tiến hành theo dõi tỷ lệ nhiễm bệnh trong 10 ngày và xác định tỷ lệ nhiễm bệnh trên các quả gây nhiễm bệnh nhân tạo. Mỗi nồng độ khảo sát được lặp lại 3 lần. Tỷ lệ nhiễm bệnh (TLN) của quả quýt được xác định như sau: TLN (%) = (Tổng số vết thương phát triển nấm bệnh/Tổng số vết thương nhân tạo của mỗi công thức) × 100. (Ghi chú: Tổng số vết thương nhân tạo của mỗi công thức = số vết thương nhân tạo/quả × số quả/mẫu = 3 × 5 =15) [15], [26].

Quýt sau thu hoạch

Rửa sạch

Tạo vết thương

Huyền phù nấm Cấy nấm Macrophoma theicola

Để khô ở điều kiện thường (2 giờ)

Nhúng chế phẩm nano bạc-Chi lần 1 (0% - 0,8%) trong 60 giây

Để khô trong 1 giờ

Nhúng chế phẩm nano bạc-Chi lần 2 (0% - 0,8%) trong 60 giây

Để khô trong 1 giờ

Bảo quản ở điều kiện thường trong 10 ngày

Khảo sát tính kháng nấm

Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát tính kháng nấm ở điều kiện in vivo

2.2.3. Ứng dụng bảo quản quýt (Citrus deliciosa) Hương Cần bằng chế phẩm nano bạc-Chi Trên cơ sở tham khảo kết quả nghiên cứu của một số tác giả [5], [7], [13], [23] kết hợp kế thừa quy trình chế tạo chế phẩm nano bạc của nhóm nghiên cứu của TS. Võ Văn Quốc Bảo chúng tôi đưa ra sơ đồ tóm tắt ở Hình 2.4 như sau:

Dung dịch Chitosan nano bạc

Phối trộn

Khuấy từ, gia nhiệt

Chế phẩm nano bạc-Chi Quýt Hương Cần (0,2%-0,8%)

Làm sạch Nhúng trong 60 giây

Để khô ở điều kiện thường 1 giờ

Khảo sát hao hụt khối Nhúng trong 60 giây lượng tự nhiên; tỷ lệ hư hỏng; Hàm lượng vitamin C; hàm Để khô trong 1 giờ lượng đường; hàm lượng acid; giá trị 0 Nhiệt độ 13 C, cảm quan. đ ộ ẩm 80%-95% Bảo quản

Hình 2.4. Sơ đồ ứng dụng bảo quản quýt Hương Cần (Citrus deliciosa) bằng chế phẩm nano bạc-Chi [31]

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp phân lập nấm mốc - Chuẩn bị mẫu cần phân lập Quýt bị nhiễm nấm bệnh được thu hái trên cây tại thôn Giáp Kiền, xã Hương Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế đem về phòng thí nghiệm để phân lập. Chế phẩm nano bạc-Chi được chuẩn bị bằng phương pháp tổng hợp các hạt nano bạc nhờ công nghệ siêu âm ở nhiệt độ phòng trong vòng 20 phút từ dung dịch bạc nitrat với dịch chiết xuất từ rau má tươi (centella asiatia) [23]. Tiếp theo cho chitosan vào dung dịch nano bạc trên máy khuấy từ với tốc độ 50 vòng/phút để chế tạo chế phẩm nano bạc-Chi với các nồng độ tương ứng. - Pha môi trường, dụng cụ phân lập và cách tiến hành được trình bày cụ thể ở phụ lục 1. 2.3.2. Phương pháp lấy mẫu 2.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu tại vườn Phương pháp lấy mẫu được thực hiện bằng phương pháp cảm quan chọn những quả quýt đồng đều về kích thước, có bề mặt quả không bị rầy, không có dấu hiệu nhiễm nấm, sâu gây bệnh và đạt độ chín thu hái thể hiện ở những đặc điểm như vỏ quả chuyển từ màu xanh non sang xanh đều, kích thước và độ cứng quả đồng đều, vỏ quả nhẵn bóng, căng mọng, đầu lún phồng, cuống quả lõm theo tiêu chuẩn Việt Nam về phương pháp thử- xuất khẩu các loại quả có múi, TCVN 1873: 2014 [14]. Quýt được cắt cuống bằng kéo, xếp vào thùng carton có đệm lót. Sau đó được vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm khoa Cơ khí - Công nghệ, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế trong thời gian ngắn nhất.

Hình 2.5. Quả quýt Hương Cần sau thu hoạch

2.3.2.2. Phương pháp lấy mẫu tại phòng thí nghiệm Quýt sau khi đưa về phòng thí nghiệm tiến hành phân loại theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 1873: 2014 [14], loại bỏ những quả không đủ tiêu chuẩn và cắt tỉa cuống. Chiều dài cuống sau khi cắt là 2 – 3 mm. Sau đó rửa sạch quả, lau khô và tiến hành dùng phương pháp chia chéo ngẫu nhiên để phân chia mẫu thành từng lô thí nghiệm. 2.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm Các mẫu bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc kết hợp chitosan đến những biến đổi sinh lý, sinh hóa của quả trong thời gian bảo quản thể hiện trong sơ đồ Hình 2.6.

Quýt Chitosan Nano bạc

Phối trộn, khuấy từ Phân loại, làm sạch

Chế phẩm nano bạc-Chi Nhúng lần 1, lần 2 (0,2%; 0,4%;0,6%; 0,8%)

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4

Để ráo 1 giờ

Vào thùng

0 Bảo quản 13 C Độ ẩm 80% -95%

Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Thuyết minh quy trình được giới thiệu ở phụ lục 2.

Bố trí các công thức thí nghiệm được trình bày ở Bảng 2.1. Bảng 2.1. Nồng độ của chế phẩm nano bạc-Chi ứng với công thức bố trí thí nghiệm

Nano bạc Công thức Chitosan Nước cất Chế phẩm nano 50 ppm thí nghiệm 2% (ml) (ml) bạc-Chi (ml) (ml)

Đối chứng 0 0 0 0 (ĐC)

Công thức 1 30 60 210 300 (0,2%; 10 ppm) (CT1)

Công thức 2 60 60 180 300 (0,4%; 10 ppm) (CT2)

Công thức 3 90 60 150 300 (0,6%; 10 ppm) (CT3)

Công thức 4 120 60 120 300 (0,8%; 10ppm) (CT4)

Các mẫu được bố trí trên cùng một diện tích và tiến hành xử lý cùng một thời điểm. Cứ sau 5 ngày theo dõi, lấy mẫu phân tích các chỉ tiêu vật lý, sinh hóa của quýt và quá trình theo dõi kết thúc cho đến khi quả có triệu chứng hư hỏng ≤ 10%. Quả quýt Hương Cần được bảo quản trong các thùng carton đục lỗ và bảo quản ở nhiệt độ 130C, độ ẩm 80% đến 95%. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và mỗi chỉ tiêu tiến hành phân tích lặp 3 lần. 2.3.4. Phương pháp vật lý 2.3.4.1. Xác định hao hụt khối lượng tự nhiên của quả Nguyên tắc: Sau khi thu hoạch các quá trình biến đổi trong quả diễn ra mạnh mẽ trong đó có quá trình bay hơi nước và tổn hao các chất hữu cơ khi hô hấp làm tổn thất khối lượng tự nhiên. Để xác định tỷ lệ hao hụt của quả dùng phương pháp cân để xác định khối lượng quýt hao hụt theo thời gian bảo quản so với khối lượng quả ban đầu. Thiết bị được sử dụng là cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01g [6], [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3, mục 3.1 2.3.4.2. Xác định tỷ lệ hư hỏng

Quả được xem bị hư hỏng là những quả có dấu hiệu bị nấm mốc, chớm thối hoặc có những vết thương đen trên thân quả đến mức không phù hợp cho sử dụng (TCVN 1873: 2014). Để xác định tỷ lệ hư hỏng quả ta dùng cách đếm số quả bị hỏng trên tổng số quả và diện tích hư hỏng của quả [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3, mục 3.2. 2.3.5. Phương pháp hóa sinh 2.3.5.1. Xác định hàm lượng đường tổng số Hàm lượng đường tổng số được xác định theo phương pháp Bertrand, nguyên tắc chung của phương pháp này là dựa vào khả năng oxy hóa khử giữa đường khử với ion kim loại trong môi trường có tính kiềm [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3, mục 3.3. 2.3.5.2. Xác định hàm lượng vitamin C Nguyên tắc: Trong quả quýt có chứa nhiều vitamin C, tham gia phản ứng oxy hóa khử. Trong phân tử acid ascorbic chứa nhóm dienol (-HOC=COH-)CO có tính khử mạnh nên có thể khử dung dịch iod. Phương trình phản ứng:

C6H8O6 + I2 C6H6O6 + HI acid ascorbic acid dehydroascorbic Hàm lượng vitamin C được xác định theo phương pháp chuẩn độ với iod 0,01N với chỉ thị hồ tinh bột [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3, mục 3.4. 2.3.5.3. Xác định hàm lượng acid tổng số Nguyên tắc: acid tổng số có trong nguyên liệu có thể định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn dựa trên phản ứng trung hòa các acid có trong mẫu. Những acid chủ yếu này là acid hữu cơ như acid acetic, acid malic, acid citric, acid lactic…Từ lượng kiềm tiêu hao ta tính được lượng acid tổng số có trong mẫu. Hàm lượng acid trong quýt được xác định theo phương pháp trung hòa bằng NaOH 0,1N với chất chỉ thị phenolphtalein [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3, mục 3.5. 2.3.6. Phương pháp đánh giá cảm quan [11] Quýt trong quá trình bảo quản, các tính chất cảm quan như màu sắc, mùi vị,...sẽ bị thay đổi. Vì vậy, phương pháp cảm quan là rất quan trọng trong việc đánh giá chất lượng sản phẩm và nhu cầu thị hiếu của người tiêu dùng. Chất lượng cảm của quả quýt được đánh giá bằng phương pháp cho điểm thị hiếu theo thang Hedonic của Hà Duyên Tư (1996) trên các chỉ tiêu: trạng thái quả, màu sắc,

37 mùi, vị. Người thử sẽ đánh giá mức độ ưa thích của mình đối với các mẫu trên thang điểm từ 1 đến 9 như sau: Cực kỳ không thích: 1 Rất không thích: 2 Không thích: 3 Tương đối không thích: 4 Không thích cũng không ghét: 5 Tương đối thích: 6 Thích: 7 Rất thích: 8 Cực kỳ thích: 9 Điểm trung bình của tất cả các người thử chính là kết quả. Mẫu phiếu đánh giá cảm quan được thể hiện ở phụ lục 4 2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả thí nghiệm được phân tích phương sai nhân tố ANOVA và kiểm định LSD (5%) để so sánh sự khác biệt trung bình giữa các nghiệm thức cũng như sự biến động giữa các lần lặp lại trong cùng nghiệm thức theo thời gian. Xử lý thống kê số liệu thực nghiệm sử dụng phần mềm tiêu chuẩn SPSS 20. Kết quả xử lý thể hiện ở phần phụ lục 5,6.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH NẤM TỪ QUẢ QUÝT HƯƠNG CẦN 3.1.1. Phân lập nấm Nấm bệnh gây hại xuất hiện bên ngoài vỏ quả quýt trên cây và trong thời gian bảo quản quýt làm cho quả quýt bị mốc, có hình thái sợ nấm màu trắng, xốp. Dùng que kẹp vô trùng lấy các mẫu nấm bên ngoài vỏ quả quýt sang môi trường PDA và nuôi ở nhiệt độ phòng.

Hình 3.1. Nấm bệnh trên quả quýt Hương Cần Sau 2 ngày, phân lập được 6 mẫu nấm (ký hiệu QB1, QB2, QB3, QB4, QB5, QB6) từ các quả quýt Hương cần bị nhiễm bệnh. Tuy nhiên, cả 6 mẫu nấm đều có màu sắc, hình thái giống nhau. Nấm sau khi phân lập, ban đầu sợi nấm mẹ thưa, có màu trắng dần dần chuyển sang màu tro, phân tán đều theo hướng thành đĩa peptri. Các sợi nấm mọc hướng lên trên, bản nấm xốp và có kích thước 1 - 3mm. Tuy chúng tôi phân lập được 6 mẫu nấm nhưng hình thái bên ngoài giống nhau và khi định danh bằng phương pháp giải trình tự ITS đều có kết quả như nhau. Vì vậy, kết quả phân lập chỉ giới thiệu một chủng nấm bệnh điển hình ở Hình 3.2.

Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc của nấm bệnh ở quả quýt Hương Cần trên môi trường PDA 3.1.2. Định danh nấm Các mẫu nấm sau khi được phân lập và định danh tại công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa 793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, Quận 7, thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự ITS, trình tự nucleotide của 6 mẫu nấm giống nhau và được trình bày ở Hình 3.3

Hình 3.3. Kết quả giải trình tự gene của chủng nấm được phân lập từ quả quýt Hương Cần Tra cứu trên BLAST search (NCBI)

Hình 3.4. Kết quả tra cứu bằng công cụ BLAST search (NCBI) Việc so sánh trình tự gene rRNA 28S của 6 mẫu nấm bằng công cụ BLAST trên NCBI cho thấy, trình tự gene tương đồng đến 100% với chủng Macrophoma theicola. Kết quả này đã cho phép kết luận rằng 6 mẫu nấm là loài Macrophoma theicola. Để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi chọn một mẫu nấm và ký hiệu Macrophoma theicola QB1.

Macrophoma theicola: nấm được phát hiện đầu tiên trên cây chè, có khả năng làm giảm sản lượng và làm ảnh hưởng rất lớn đến kinh tế sản xuất ngành chè [25]. - Phân loại khoa học [44]: + Ngành : Ascomycota. + Lớp : Dothideomycetes. + Phân lớp: Incertae sedis. + Bộ: Botryosphaeriales. + Họ: Botryosphaeriaceae. + Giống: Macrophoma. + Loài: Macrophoma theicola. - Đặc điểm sinh học của Macrophoma theicola Macrophoma theicola lây lan dễ dàng trong điều kiện mưa, ẩm ướt. Nhiệt độ tăng trưởng là 28 – 340C, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 320C. Macrophoma theicola phát triển ở trên nhánh, lá và quả. Trên lá làm héo nhanh chóng, cuối cùng lá khô, rụng lá. Trên nhánh hình thành các vết loét, vết bệnh lõm (nhiều nơi gọi là loét cành). Nếu bệnh trên quả làm cho quả bị mốc trắng và mất nước cho đến quả khô [25]. Tại các nhà vườn ở xã Hương Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế, các hộ trồng quýt cũng mô tả những hiện tượng của nấm bệnh như trên. Qua quá trình tham khảo, chưa có đề tài nào công bố liên quan đến nấm này trên đối tượng quả có múi nói chung và đối tượng quả quýt nói riêng mà chỉ ghi nhận xuất hiện và gây bệnh trên đối tượng chè. Với kết quả từ việc phân lập, định danh cho thấy có thể xảy ra sự biến thể và thích nghi với môi trường khác đối với loại nấm này, và cũng từ kết quả này có thể làm tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo đối với loại nấm Macrophoma theicola trên đối tượng cây có múi để đề ra biện pháp phòng trừ hữu hiệu. 3.2. KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM ĐÃ ĐƯỢC ĐỊNH DANH BỞI CHẾ PHẨM NANO BẠC-CHI Sau khi khảo sát hiệu quả khả năng kháng loại nấm mới gây bệnh trên quả quýt Hương Cần, Macrophoma theicola ở điều kiện in vitro và in vivo. Để tăng hiệu quả ứng dụng, chúng tôi sử dụng chế phẩm này để xử lý quả quýt sau thu hoạch với các nồng độ khác nhau nhằm kéo dài thời gian bảo quản. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung khảo sát sự ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến các thành phần hóa học như hàm lượng vitamin C, acid tổng số, đường tổng số cũng như sự hao hụt khối lượng và tỷ lệ hư hỏng, đồng thời kết hợp chỉ tiêu đánh giá cảm quan của quả quýt.

3.2.1. Khảo sát khả năng kháng nấm bởi chế phẩm nano bạc-Chi ở điều kiện in vitro Tính kháng khuẩn của chế phẩm được thể hiện bằng sự ức chế, hoặc tiêu diệt khả năng sinh trưởng của vi sinh vật. Vì vậy, dựa vào sự phát triển sợi nấm trên đĩa thạch, có thể xác định được tính kháng khuẩn của chế phẩm nano bạc bổ sung chitosan đối với nấm cần nghiên cứu. Sau 6 ngày theo dõi khả năng kháng nấm Macrophoma theicola QB1 trên môi trường PDA có sử dụng chế phẩm nano bạc bổ sung chitosan với các nồng độ khác nhau (0%- đối chứng; 0,2%; 0,4%; 0,6% và 0,8%) và các ký hiệu tương ứng: mẫu 1; mẫu 2; mẫu 3; mẫu 4 và mẫu 5; kết quả thể hiện qua Hình 3.5 và Bảng 3.1.

Mẫu 1 Mẫu 2

Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5

Hình 3.5. Các mẫu nấm sau 6 ngày theo dõi

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nano bạc-Chi đến khả năng sinh trưởng tản nấm Macrophoma theicola QB1 sau 6 ngày theo dõi

Nồng độ nano Đường kính tản nấm (cm) bạc-Chi (%) 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày

0 2,5cA 4,9cB 8,6cC 8,6cC 8,6cC 8,6cC

0,2 0,3bA 0,5bB 0,9bC 0,9bC 0,8bC 0,9bC

0,4 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA

0,6 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA

0,8 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA

Ghi chú: Các chữ cái thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95 %, trong đó a, b, c theo hàng cột và A, B, C theo hàng ngang. Số liệu ở Bảng 3.1 cho thấy tất cả các mẫu có xử lý bằng nano bạc-Chi đều có ảnh hưởng sự phát triển của đường kính tản nấm. Đường kính tản nấm giảm dần khi nồng độ chế phẩm nano bạc-Chi tăng lên. Ở mẫu 1 (ĐC), sau 1 ngày đã xuất hiện sợi nấm màu trắng, mọc tỏa theo hình tròn hướng về thành đĩa petri, ĐKTN trung bình 2,5 cm. Sau 3 ngày, lượng nấm phát triển nhiều hơn và tràn đầy mặt đĩa và sau 6 ngày sợi nấm chuyển sang giai đoạn già hóa nên chuyển sang màu tro xám. Đường kính tản nấm trung bình ở mẫu 2 là 0,3 cm; 0,5 cm và 0,9 cm tương ứng sau 1 , 2 và 3 ngày theo dõi, từ ngày thứ 4 không tăng, sợi nấm không phát triển và bắt đầu bị già hóa. Ở các mẫu còn lại tương ứng với nồng độ nano bạc-Chi 0,4; 0,6 và 0,8 %, sự sinh trưởng của nấm bị ức chế hoàn toàn ở ngày đầu tiên. Trong điều kiện in vitro, khảo sát hoạt tính kháng nấm gây bệnh Macrophoma theicola, Võ Văn Quốc Bảo và cs (2018). cho thấy các hạt nano bạc đã thể hiện tác dụng ức chế đối với nấm này đối với chế phẩm nano bạc-TBS ở nồng độ 10 ppm và có hiệu quả ức chế hoàn toàn sự phát triển nấm từ nồng độ 30 ppm [1]. Cơ chế tác dụng của nano bạc đối với nấm được đánh giá ở các nồng độ khác nhau, gây tổn thương trực tiếp đến màng tế bào, ức chế quá trình nhân đôi DNA và vô hiệu hóa các enzyme dẫn đến ức chế và tiêu diệt sự phát triển của nấm [15], [19], [27]. Như vậy, kết quả nghiên cứu khả năng kháng nấm Macrophoma theicola QB1 của chế phẩm nano bạc – Chi tương đồng với công trình đã được công bố.

3.2.2. Khảo sát khả năng kháng nấm bởi chế phẩm nano bạc-Chi ở điều kiện in vivo Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm bệnh Macrophoma theicola QB1 trên quả quýt Hương Cần trong điều kiện in vivo ở Hình 3.6 cho thấy có sự ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến khả năng hạn chế nhiễm bệnh.

Hình 3.6. Tỷ lệ quả quýt bị nhiễm nấm bệnh Macrophoma theicola QB1 sau khi nhúng nano bạc-Chi ở các nồng độ khác nhau Qua kết quả thể hiện ở Hình 3.6, tất cả các nồng độ xử lý, tỷ lệ kháng bệnh ở các nồng độ xử lý chế phẩm nano bạc-Chi vượt trội so với đối chứng. Nồng độ của chitosan bổ sung vào dung dịch nano bạc càng cao, khả năng ức chế sinh trưởng của nấm bệnh càng lớn, hiện tượng nhiễm bệnh xuất hiện tại các vết thương nhân tạo càng ít. Ở nồng độ chitosan 0,2%, tỷ lệ nhiễm bệnh là 42,2%; 0,4%, tỷ lệ nhiễm bệnh là 17,8%; và từ 0,6% không thấy xuất hiện vết bệnh. Kết quả của Võ Văn Quốc Bảo và cs. khi khảo sát sự ảnh hưởng nano bạc-TBS cùng trên loại nấm Macrophoma theicola QB1 trong điều kiện in vivo cũng cho thấy khả năng kháng nấm đối với chủng nấm gây bệnh này đạt tỷ lệ càng cao khi nồng độ chế phẩm càng lớn [1], [31]. Hơn nữa, kết quả của Kim và cs. về tác dụng kháng nấm hiệu quả của hạt nano bạc chống lại nấm gây bệnh trên thực vật và trên quả cà chua, ớt, dưa hấu, dưa chuột, lê, dâu tây,…khi nồng độ càng tăng dần [9], [22]. Như vậy, kết quả mà chúng tôi đạt được tương đồng với nhóm các tác giả đã công bố ở trên. Điều này có thể là do nano bạc tham gia hiệu quả trong hiệu ứng phối hợp chitosan tạo thành một màng bán thấm bao bọc quanh quả có tác dụng chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh. Hơn nữa nano bạc còn có tác dụng như một chất kích kháng ngoại bào, tạo sức đề kháng cho vật chủ [29], [32]. Tuy vậy, trên bề mặt của quả quýt sau thu hoạch là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của nấm Macrophoma theicola QB1 và

44 có hiệu quả tác dụng ức chế của chế phẩm nano bạc-Chi trong điều kiện in vivo sẽ kém hơn so với điều kiện in vitro. 3.3. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BẢO QUẢN QUÝT HƯƠNG CẦN BẰNG CHẾ PHẨM NANO BẠC-CHI Ở ĐIỀU KIỆN LẠNH Sau khi khảo sát khả năng kháng nấm bởi chế phẩm nano bạc-Chi ở điều kiện in vitro và in vivo, chúng tôi nhận thấy chủng Macrophoma theicola là nấm gây bệnh mới trên quả quýt Hương Cần và đã xử lý chế phẩm nano bạc-Chi rất hiệu quả. Chính vì vậy, để theo dõi quá trình bảo quản quýt Hương Cần sau thu hoạch, trong phần nghiên cứu tiếp theo này chúng tôi tập trung nghiên cứu ứng dụng bảo quản quýt Hương Cần bằng chế phẩm nano bạc có sự kết hợp chitosan trong điều kiện lạnh 130C, độ ẩm 80% đến 95%. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung khảo sát sự ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến các thành phần như hàm lượng vitamin C, acid tổng số, đường tổng số cũng như sự hao hụt khối lượng và tỷ lệ hư hỏng, đồng thời cũng đánh giá giá trị cảm quan của quýt khi sử dụng chế phẩm trong quá trình bảo quản. 3.3.1. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hàm lượng vitamin C của quýt trong quá trình bảo quản Vitamin C có vai trò hết sức quan trọng đối với con người và là một trong những thành phần quan trọng trong nhiều loại rau quả, chất chống oxy hóa ở tế bào thực vật. Tuy nhiên, hàm lượng vitamin C sẽ giảm mạnh theo thời gian bảo quản. Sự biến đổi hàm lượng vitamin C quả quýt theo thời gian bảo quản được thể hiện qua đồ thị Hình 3.7.

Hình 3.7. Đồ thị biến đổi hàm lượng vitamin C của quýt trong thời gian bảo quản với các công thức khác nhau Số liệu thể hiện trên Hình 3.7 cho thấy hàm lượng vitamin C tăng lên trong 10 và 15 ngày đầu, tương ứng nhóm mẫu ĐC, CT1 và nhóm mẫu CT2, CT3, CT4 nhưng sau đó giảm dần theo thời gian. Điều này có thể giải thích là do trong quá trình chín tới, hàm lượng đường trong quả được tổng hợp và chuyển hóa một phần thành vitamin C và sau đó các thành phần này chuyển hóa, thủy phân và phân hủy để chuyển thành các hợp chất khác như acid hữu cơ, các thành phần gây hư hỏng. Ngoài ra vitamin C lại dễ bị oxy hóa do không khí xâm nhập và quá trình khử các mô đã phá hủy vitamin C trong quá trình bảo quản. Mẫu ĐC có tốc độ giảm mạnh nhất, tại ngày bảo quản thứ 30, hàm lượng vitamin C còn 14,17 mg%, giảm 58,2% so với ban đầu. Tại thời điểm này, lô quýt ở mẫu ĐC có màu vàng héo, da quả nhăn không đảm bảo tiêu chuẩn để sử dụng theo tiêu chuẩn TCVN 1873:2014 [14]. Đối với các mẫu được xử lý chế phẩm nano bạc-Chi có thể kéo dài thời gian bảo quản đến 60 ngày (CT1) và 65 ngày ( CT2, CT3, CT4) tương ứng với tỷ lệ phần trăm khối lượng vitamin C giảm so với ban đầu là 56,8% và 53,2%, 37,5%, 35,3%. Theo kết quả đã công bố về bảo quản quýt bằng chế phẩm nano bạc có bổ sung tinh bột sắn của nhóm tác giả Võ Văn Quốc Bảo và cs. (2018) và nghiên cứu bảo quản cam bằng màng chitosan của Nguyễn Thị Hạnh (2009); kết quả nghiên cứu của chúng tôi đạt được tương đồng với quy luật biến đổi hàm lượng vitamin C trong quá trình bảo quản đối với quả có múi, tuy nhiên nhờ kết hợp bảo quản trong điều kiện lạnh nên hàm lượng vitamin C ở nghiên cứu này giảm chậm hơn và kéo dài thời gian lưu trữ hơn [5], [31]. Từ các kết quả thu nhận được cho thấy CT3 và CT4 có hàm lượng vitamin C giảm ít hơn so với các mẫu ở công thức ĐC, CT1, CT2 và giữa chúng không có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. 3.3.2. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hàm lượng acid tổng số của quýt trong quá trình bảo quản Các acid đóng vai trò quan trọng trong thành phần rau quả cũng như trong quá trình bảo quản và chế biến. Acid hữu cơ trong quả quýt tương đối cao, chủ yếu acid citric, đóng vai trò quan trọng trong thành phần dinh dưỡng của quả. Acid có trong nguyên liệu quýt tạo cho quả có vị chua nhẹ và hương thơm đặc trưng. Sự biến đổi hàm lượng acid tổng số của quả quýt theo thời gian bảo quản được thể hiện qua đồ thị Hình 3.8.

Hình 3.8. Sự biến đổi hàm lượng acid tổng số của quýt trong thời gian bảo quản Đồ thị ở Hình 3.8 ta thấy hàm lượng acid tổng số của tất cả các công thức có xu hướng tăng dần trong giai đoạn đầu và sau đó giảm dần. Mẫu ĐC tăng nhanh hơn so với các mẫu có xử lý chế phẩm nano bạc-Chi và hàm lượng acid tổng số tăng nhanh nhất vào ngày bảo quản thứ 15 với giá trị xác định được 0,78% tăng 47,2% so với ban đầu, sau đó giảm dần và kết thúc quá trình bảo quản vào ngày bảo quản thứ 30 tương ứng với giá trị là 0,68%. Hàm lượng acid của mẫu CT1 và CT2 đạt giá trị cao nhất lần lượt là 0,80% và 0,76% tại ngày bảo quản thứ 30 và ngày bảo quản thứ 35, tăng tương ứng 51% và 43,4% so với ban đầu. Sau thời gian đó, hàm lượng này giảm dần đến khi kết thúc bảo quản tại ngày bảo quản thứ 60 và 65 với giá trị tương ứng là 0,64% và 0,63%. Hàm lượng acid của mẫu CT3 và CT4 đạt cực đại vào ngày bảo quản thứ 35 và giảm đều đến ngày thứ 65 còn 0,69% và 0,68% tương ứng với các mẫu. Kết quả cho thấy hiệu quả bảo quản quả quýt có xử lý nano bạc-Chi kết hợp với điều kiện lạnh kìm hãm sự chuyển hóa các hợp chất thành acid hữu cơ. Ở các nồng độ chế phẩm được xử lý khác nhau, mức độ tổng hợp cũng như phân giải các acid cũng khác nhau. Kết quả đạt được này tương đồng với các nghiên cứu đã được công bố trước đây. Cùng đối tượng quả quýt Hương Cần, nhóm tác giả Võ Văn Quốc Bảo và cs. (2018) đã nghiên cứu và bảo quản trong điều kiện thường cho hiệu quả thời gian bảo quản được 35 ngày, nồng độ nano bạc càng tăng (10 – 50 ppm) tỷ lệ hàm lượng acid hữu cơ giảm càng thấp, chất lượng quả càng đảm bảo [31]. Hơn nữa, kết quả đạt được từ công trình nghiên cứu của nhóm tác giả Chien Po-Jung và cs. (2007) về bảo quản nhóm trái cây họ có múi bằng chitosan có nồng độ (0,05; 0,1 và 0,2), hàm lượng acid hữu cơ cũng giảm chậm và thời gian bảo quả tăng theo chiều tăng của nồng độ [16].

Qua đồ thị Hình 3.8 cho thấy CT3 và CT4 có hàm lượng acid tổng số giảm chậm nhất và đều theo thời gian theo dõi và giữa chúng không có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Kết quả thực nghiệm trên cho thấy, xử lý chế phẩm nano bạc-Chi đối với quả quýt sau thu hoạch ở công thức CT3 và CT4 có tác dụng hạn chế biến đổi hàm lượng acid tổng số thất nhất. 3.3.3. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hàm lượng đường tổng số của quýt trong quá trình bảo quản Hàm lượng đường tổng số là một chỉ tiêu và là thông số có ý nghĩa rất quan trọng để tạo mùi vị cũng như để đánh giá chất lượng của quýt tươi trong quá trình bảo quản sau thu hoạch. Sự biến đổi hàm lượng đường tổng số quả quýt theo thời gian bảo quản được thể hiện qua đồ thị Hình 3.9.

Hình 3.9. Đồ thị thể hiện biến đổi hàm lượng đường tổng số của quýt trong thời gian bảo quản với các công thức khác nhau Quan sát kết quả trên đồ thị ở Hình 3.9, ta nhận thấy hàm lượng đường ban đầu trong quá trình bảo quản tăng đến mức cực đại rồi giảm dần cuối quá trình bảo quản. Điều này đúng với quy luật sự biến đổi hàm lượng đường của quả sau thu hoạch. Hàm lượng đường tổng số của mẫu ĐC biến đổi nhanh nhất và đạt cực đại tại giá trị 10,82% sau 15 ngày bảo quản. Sau đó, hàm lượng đường giảm dần, đến ngày thứ 30 giá trị này chỉ còn 7,21%. Sự biến đổi hàm lượng đường ở các mẫu có xử lý nano bạc-Chi cũng tương tự nhưng để đạt giá trị cực đại cần giai đoạn đầu dài hơn (khoảng 35 ngày) và giai đoạn sau giảm chậm và đều hơn mẫu ĐC. Sau 65 ngày theo dõi, tổn thất hàm lượng

đường ở mẫu CT3, CT4 thất nhất, còn 8,75%; 8,24%, tương ứng và giữa chúng không có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Kết quả này tương đồng với công trình được nhóm tác giả Hadar Arnon công bố vào năm 2013 về ứng dụng kết hợp CMC (carboxymethyl cellulose) và chitosan để tạo màng bao gói bảo quản trái cây có múi (cam, bưởi), đã có tác dụng tích cực, hạn chế sự tổn thất hàm lượng đường của quả trong thời gian bảo quản [18]. 3.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm nano bạc-Chi đến sự hao hụt khối lượng trong quá trình bảo quản Hao hụt khối lượng tự nhiên là một hiện tượng vật lý không thể tránh khỏi trong suốt quá trình bảo quản rau quả, nông sản nói chung cũng như quýt nói riêng. Nguyên nhân dẫn đến sự hao hụt này là do quá trình thoát hơi nước từ quả ra môi trường xung quanh, gọi là sự hao hụt lý học và quá trình hao hụt do giảm chất khô dự trữ trong quả gọi là sự hao hụt sinh học. Hàm lượng nước trong quả quýt lớn 83,2±1,5 % [31]. Nước làm cho quả căng mọng và hòa tan các chất dinh dưỡng chủ yếu của quýt. Nhưng trong quá trình bảo quản, quả chín có xảy ra quá trình hô hấp, là quá trình oxy hóa phân giải các vật chất trong tế bào (tinh bột, đường, acid hữu cơ) thành các chất đơn giản hơn, đồng thời giải phóng năng lượng. Bên cạnh đó, quá trình bay hơi nước của quả quýt cũng làm cho quả hao hụt khối lương. Hơn nữa, do đặc điểm cấu tạo của quả quýt Hương Cần vỏ mỏng nên việc tiến hành khảo sát hao hụt khối lượng tự nhiên của quýt ở các nồng độ chế phẩm nano bạc-Chi bảo quản khác nhau là rất cần thiết. Kết quả mức độ hao hụt khối lượng của quả quýt khi xử lý chế phẩm ở các nồng độ nano bạc-Chi khác nhau được thể hiện ở đồ thị Hình 3.10.

Hình 3.10. Đồ thị biến đổi sự hao hụt khối lượng tự nhiên của quýt trong quá trình bảo quản với các công thức khác nhau

Qua đồ thị ở Hình 3.10 chúng tôi nhận thấy rằng hao hụt khối lượng tự nhiên của quýt tăng dần theo thời gian bảo quản ở tất cả 5 mẫu tuy nhiên ở các mẫu có xử lý nano bạc-Chi với nồng độ tăng dần thì tỷ lệ hao hụt khối lượng thấp hơn. Mẫu ĐC hao hụt khối lượng tự nhiên là 13,34% (sau 30 ngày), phần trăm hao hụt khối lượng của quýt ở CT1, CT2, CT3 và CT4 cũng lần lượt tăng nhưng thấp hơn so với phần trăm hao hụt khối lượng ở mẫu ĐC cùng khoảng thời gian theo dõi trong cùng một điều kiện bảo quản lạnh. Cụ thể, ở ngày thứ 30 mẫu CT1, CT2, CT3 và CT4 tổn thất lần lượt là 7,88%; 5,32%; 3,61% và 2,65%. Ngày bảo quản thứ 60, CT1 tổn thất 12,08 % khối lượng, trong khi đó CT2, CT3 và CT4 lần lượt là 9,52%; 9,22% và 6,60% ở ngày thứ 65. Tỷ lệ hao hụt khối lượng thấp nhất khi xử lý chế phẩm nano bạc-Chi có nồng độ chitosan là 0,8% ứng với mẫu CT4. Như vậy, khi xử lý quýt ở các nồng độ nano bạc-Chi khác nhau, việc tạo các màng bao xung quanh quả với các nồng độ khác nhau đã ảnh hưởng đến tốc độ thoát hơi nước và hô hấp của quả dẫn đến các kết quả đạt được có sự sai khác ý nghĩa về sự hao hụt khối lượng tự nhiên của quýt trong cùng thời kỳ của quá trình bảo quản. 3.3.5. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm nano bạc-Chi đến tỷ lệ hư hỏng của quả quýt trong quá trình bảo quản Quả quýt được theo dõi mức độ hư hỏng trong suốt thời gian bảo quản. Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 1873-2014, kết quả đánh giá được thể hiện ở Bảng 3.2. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm nano bạc-Chi đến tỷ lệ hư hỏng của quả quýt theo thời gian bảo quản Mẫu bảo quản Thời gian bảo quản (ngày) Tỷ lệ hư hỏng (%) 20 6,67 ĐC 25 14,48 30 17,45 50 4,44 CT1 55 11,11 60 16,56 50 4,57 CT2 55 11,00 60 15,37 55 4,12 CT3 60 7,33 65 12,33 55 3,53 CT4 60 6,67 65 11,67

Kết quả thể hiện ở Bảng 3.2 cho thấy trong tất cả các mẫu có xử lý chế phẩm nano bạc-Chi, tỷ lệ hư hỏng thấp hơn so với mẫu ĐC, các vết hư hỏng thâm đen, nhũn, nấm trắng ở cuống và hiện tượng rụng cuống xuất hiện ít, thời gian theo dõi dài hơn. Điều này chứng tỏ rằng chế phẩm nano bạc-Chi có ảnh hưởng trong việc giảm tỷ lệ hư hỏng của quả. Có thể giải thích do nano bạc-Chi tạo màng film bao quanh quả nên có khả năng ức chế cường độ hô hấp, dẫn đến hạn chế sự tích tụ hơi nhiệt và hơi nước, ngoài ra nano bạc và chitosan là hai tác nhân có khả năng kháng và ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh trên quả quýt sau thu hoạch. Qua số liệu cho thấy mẫu CT3 và CT4 đã duy trì được sự biến đổi sinh lý, sinh hóa tốt nhất, kéo dài thời gian bảo quản quýt được 65 ngày với tỷ lệ hư hỏng tương ứng 12,33% và 11,67%. 3.3.6. Đánh giá chỉ tiêu cảm quan đối với mẫu CT3 và CT4 sau 60 ngày bảo quản lạnh Đánh giá cảm quan là yếu tố đầu tiên ảnh hưởng trực tiếp đến người tiêu dùng và quyết định chất lượng sản phẩm. So sánh, phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 20 từ các chỉ tiêu đã được khảo sát, chúng tôi nhận thấy rằng quả quýt Hương Cần được xử lý bằng chế phẩm nano bạc bổ sung chitosan ở các mẫu CT3 (10 ppm - 0,6%) và CT4 (10 ppm - 0,8%) cho kết quả tương đồng và hiệu quả nhất so với các mẫu còn lại. Từ lập luận này, chúng tôi tiến hành lập Hội đồng đánh giá cho điểm thị hiếu theo thang Hedonic (9 điểm), như được trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu, mục 2.3.6 đối với các mẫu CT3 và CT4 sau 60 ngày bảo quản lạnh so với mẫu quýt Hương Cần đối chứng có các thời điểm chín khác nhau, được ký hiệu như sau: - ĐC1: quả quýt Hương Cần chín tự nhiên trên cây, không xử lý chế phẩm nano bạc-Chi - ĐC2: quả quýt Hương Cần không xử lý chế phẩm nano bạc-Chi, bảo quản ở nhiệt độ thường sau 7 ngày - ĐC3: quả quýt Hương Cần không xử lý chế phẩm nano bạc-Chi, bảo quản ở nhiệt độ 13°C sau 15 ngày - ĐC4: quả quýt Hương Cần không xử lý chế phẩm nano bạc-Chi, bảo quản ở nhiệt độ 13°C sau 25 ngày Hội đồng đánh giá cho điểm dựa theo tiêu chuẩn xuất khẩu trái cây họ có múi của Việt Nam (TCVN 1873-2014) với các chỉ tiêu: trạng thái (độ cứng mềm, độ căng mọng), màu sắc (xanh vàng đặc trưng), mùi (thơm), vị (ngọt chua thanh), kết quả đánh giá được thể hiện ở Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Điểm đánh giá cảm quan

Điểm đánh giá Mẫu Trạng thái Màu sắc Mùi Vị

CT3 7,57ab 8,29a 7,86b 7,43a

CT4 7,29b 8,14a 7,86b 7,43a

ĐC1 8,14a 8,43a 8,57a 6,29b

ĐC2 6,86c 7,29b 8,0b 7,71a

ĐC3 7,86ab 7,57b 7,86b 7,86a

ĐC4 5,29d 4,14c 6,0c 5,43c

Ghi chú: Các chữ cái thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95 %, trong đó a, b, c, d theo hàng cột. Kết quả thể hiện trên Bảng 3.3 cho thấy rằng: Ở mẫu ĐC1, các chỉ tiêu trạng thái, màu sắc và mùi vị được hội đồng đánh giá cao. Tuy nhiên do quả quýt Hương cần mới thu hoạch có vị chua gắt nên kết quả về vị không được đánh giá cao. Đối với mẫu ĐC2 và ĐC3 được đánh giá tương đồng, nhưng riêng chỉ tiêu về trạng thái thì mẫu ĐC3 bảo quản trong điều kiện lạnh sau 15 ngày được đánh giá tốt hơn mẫu ĐC2 được bảo quản thường sau 7 ngày. Mẫu ĐC4 được hội đồng đánh giá cho điểm thấp nhất, do ở thời điểm này các chỉ tiêu về màu sắc, mùi vị cũng như trạng thái của quả giảm một cách rõ rệ. Từ các mẫu đối chứng được đánh giá như trên làm căn cứ để so sánh các mẫu có xử lý chế phẩm nano bạc-Chi. Cụ thể đối với mẫu CT3 và CT4 được đánh giá cao và tương đồng về màu sắc và mùi vị. Số liệu chỉ tiêu trạng thái không thể hiện sự sai khác có ý nghĩa, tuy nhiên ở mức điểm 7,57 và 7,29 tương ứng với mẫu CT3 và CT4 nói lên điều ở nồng độ chitosan 0,8% việc tạo màng trên quả khó khăn hơn, dễ gây hiện tượng vón cục do nồng độ chitosan cao. Với kết quả đánh giá mẫu CT3 và CT4 đều được hội đồng đánh giá cho điểm cao ở mức “thích” và “rất thích”. Điều này cho thấy mẫu có xử lý chế phẩm không làm ảnh hưởng nhiều đến chất lượng cũng như giá trị cảm quan. Các chỉ tiêu được khảo sát có số điểm đánh giá tương đồng với mẫu quýt chín tự nhiên.

Từ những luận chứng đó, chúng tôi quyết định chọn nồng độ chitosan bổ sung vào nano bạc 10ppm là 0,6% để đề xuất quy trình bảo quản quýt Hương Cần ở điều kiện lạnh được giới thiệu ở phần tiếp theo. 3.4. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH BẢO QUẢN QUÝT Ở ĐIỀU KIỆN LẠNH 3.4.1. Sơ đồ quy trình bảo quýt bằng chế phấm nano bạc-Chi ở điều kiện lạnh 13oC Qua các kết quả nghiên cứu đã cho thấy các mẫu quýt Hương Cần được bảo quản ở CT3 và CT4 cho kết quả tốt nhất. Xuất phát từ thực tế chúng tôi chọn nồng độ nano bạc 10ppm và chitosan 0,6% để đề xuất quy trình bảo quản quýt Hương Cần như sau:

Dung dịch Chitosan, 2% nano bạc, 50ppm

Phối trộn

Khuấy từ 50 vòng/phút (30 phút)

Chế phẩm nano bạc-Chi Quýt (0,6%)

Phân loại, làm Nhúng lần 1 sạch (trong 60 giây)

Để khô điều kiện thường (trong 60 phút)

Nhúng lần 2 (trong 60 giây)

gia nhiệt

Để khô điều kiện thường (trong 60 phút)

0 Bảo quản lạnh 13 C Độ ẩm 80% - 95%

Hình3.4.2. 3.11.Thuy Quyết minh trình quy bảo tr quìnhản quýt Hương Cần bằng chế phấm nano bạc-Chi ở điều kiện lạnh

1. Chuẩn bị quả: Quả quýt Hương Cần được lựa chọn, đạt độ chín kỹ thuật được tiến hành xử lý sơ bộ theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 1873-2014: phân loại, cắt cuống, rửa và để ráo ở nhiệt độ phòng. 2. Chuẩn bị chế phẩm nano bạc-Chi Chuẩn bị 300 ml chế phẩm nano bac-Chi (10ppm, 0,6%) bằng cách hòa trộn dung dịch nano bạc (60ml, 50ppm), chitosan (90ml, 2%) với nước cất (150ml tương ứng) rồi tiến hành phối trộn bằng máy khuấy từ (50 vòng/phút) trong 30 phút, thu được hỗn hợp dung dịch đồng nhất nano bạc (10 ppm)- chitosan (0,6%). 3. Xử lý quả quýt bằng chế phẩm nano bạc-Chi Quả quýt sau khi đã lựa chọn, rửa sạch được nhúng lần thứ 1 trong chế phẩm nano bạc-Chi (0,6%) rồi tiến hành để khô trong 60 phút ở điều kiện thường. Nhúng quả lần 2 được tiến hành tương tự như trên. Quả sau khi để khô được cho vào thùng carton có đục lỗ và đệm lót sau đó chuyển vào kho lạnh ở 130C, độ ẩm 80% đến 95% để bảo quản.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Kết luận Qua những kết quả đạt được sau một thời gian triển khai đề tài nghiên cứu làm luận văn tốt nghiệp chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau: - Đã phân lập và định danh được nấm gây bệnh Macrophoma theicola. - Đã khảo sát khả năng kháng nấm Macrophoma theicola bằng chế phẩm nano bạc-Chi có hiệu lực ức chế từ 0,2% và ức chế hoàn toàn từ nồng độ 0,4% ở điều kiện in vitro và ở điều kiện in vivo hạn chế được sự phát triển gây bệnh của nấm này từ 57,8% đến 100%, tương ứng nồng độ chitosan 0,2% - 0,6%. - Xác định được nồng độ thích hợp để bảo quản quýt Hương Cần sau thu hoạch ở điều kiện lạnh là chitosan 0,6% - 0,8% bổ sung vào dung dịch nano bạc 10 ppm. Chế phẩm ở nồng độ này có hiệu quả bảo quản quả quýt ở 13°C đến 60 ngày với các chỉ tiêu theo dõi như là hàm lượng đường tổng số, acid hữu cơ tổng số, hàm lượng vitamin C, sự hao hụt khối lượng, tỷ lệ hư hỏng đảm bảo. - Đề xuất được quy trình bảo quýt Hương Cần bằng chế phấm nano bạc–Chi ở điều kiện lạnh 13oC, độ ẩm 80% đến 95% Đề nghị 1. Cần nghiên cứu xác định độ chín thu hoạch của quýt. 2. Tiếp tục khẳng định tính khả thi quy trình bảo quản quýt đã đề xuất và triển khai nghiên cứu ứng dụng bảo quản quýt Hương Cần ở quy mô Hợp tác xã. 3. Cần nghiên cứu ứng dụng chế phẩm tạo màng nano bạc-Chi trên nhóm quả có múi nói riêng và các loại quả nói chung.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt: [1]. Võ Văn Quốc Bảo, Trương Ngọc Đăng (2018), Khả năng kháng nấm của chế phẩm nano bạc-TBS đối với Macrophoma theicola gây hại trên quả quýt Hương Cần (Citrus deliciosa T.), Tạp chí Khoa học tự nhiên, Đại học Huế, 127(1), 131-139. [2]. Võ Văn Quốc Bảo, Trương Thị Minh Hạnh (2008), Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chịu lực của màng bao gói thực phẩm được chế tạo từ tinh bột sắn có bổ sung polyethylene glycol (PEG), Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đà Nẵng 3(2), 49-57 [3]. Hoàng Bình (2005), “Nghiên cứu chế tạo thành công vật liệu siêu hấp thụ nước từ tinh bột sắn”, Tạp chí khoa học, TP Hồ Chí Minh, 21 (3) [4]. Quách Đĩnh, Nguyễn Văn Tiếp, Nguyễn Văn Thoa (2008), Bảo quản và chế biến rau quả, NXB Khoa học và Kỹ thuật. [5]. Nguyễn Thị Hạnh (2009), Bảo quản cam và hồng bằng màng chitosan, Luận văn thạc sỹ khoa học, ngành Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội. [6]. Nguyễn Thị Hiền, Từ Việt Phúc, Trần Thanh Đại (2010), Phân tích thực phẩm, NXB Lao động. [7]. Nguyễn Thị Tuyết Mai, Nguyễn Thị Mỹ An và Nguyễn Bảo Vệ (2012), Ảnh hưởng của xử lý calci đến chất lượng và khả năng bảo quản trái quýt đường (Citrus reticulata blanco) sau thu hoạch, Tạp chí Khoa học, Đọc học Cần Thơ, 23(a), 193-202 [8]. Phạm Quang Thu, Trần Thanh Trăng (2009), Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng với nấm gây bệnh vùng rễ cây thông, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. [9]. Nguyễn Thị Bích Thủy, Nguyễn Thị Thu Nga, Đỗ Thị Thu Thủy (2008), Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến chất lượng và thời gian bảo quản chanh. Tạp chí Khoa học và Phát triển, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, 4 (1), 70-75. [10]. Thống kê Hải quan (2018), Tình hình xuất khẩu, nhập khẩu hàng hóa của Việt Nam tháng 12 và 12 tháng năm 2017, Hải quan Việt Nam

[11]. Hà Duyên Tư (2009), Phân tích hóa học thực phẩm, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. [12]. Phạm Thị Hà Vân, Nguyễn Thị Thúy Liễu, Lê Sĩ Ngọc, Nguyễn HoàngThảo Ly (2017), Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan - nano bạc trong bảo quản nhằm nâng cao chất lượng thanh long sau thu hoạch, Tạp chí Khoa học tự nhiên và công nghệ, Đại học Sư phạm Hồ Chí Minh, 14(3), 47-56 [13]. Viện Hóa học (2014), Nghiên cứu chế tạo vật liệu dùng bảo quản rau quả tươi, Nghiên cứu khoa học, Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. [14]. Ủy ban Khoa học và Kỹ thuật Nhà nước (2014), Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 1873:2014 về các loại quả có múi, Tiêu chuẩn TCVN/TC/F10 Rau quả và sản phẩm rau quả Tài liệu nước ngoài: [15]. Ales Panacek, M. Kolar, R. Vecerova, R. Prucek, J. Soukupova, V. Krystof, P. Hamal, R. Zboril, L. Kvitek, (2009), Antifungal activity of silver nanoparticles against C and ida spp., Biomaterials, 30(31), 6333-6340 [16]. Chien Po-Jung Sheu, Fuu, Lin Hung-Ren (2005), Coating citrus (Murcott tangor) fruit with low molecular weight chitosan increases postharvest quality and shelf life, Food Chemistry, 100( 3), 1160-1164 [17]. Dai, L.; Qiu, C.; Xiong, L.; Sun, Q. Characterisation of corn starch-based films reinforced with taro starch nanoparticles, Food Chemistry, 2015, 174, 82–88. [18]. Hadar Arnon, Y. Zaitsev, R. Porat, E. Poverenov, (2014), Effects of carboxymethyl cellulose and chitosan bilayer edible coating on postharvest quality of citrus fruit, Postharvest Biology and Technology, 87, 21-26 https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2013.08.007 [19]. Keuk-Jun Kim, Woo Sang Sung, Bo Kyoung Suh, Seok-Ki Moon, Jong-Soo Choi, Jong Guk Kim, Dong Gun Lee, (2008), Antifungal Effect of Silver Nanoparticles on Dermatophytes, Microbiology and Biotechnology. 18(8), 1482–1484 [20]. Keuk-Jun Kim, Woo Sang Sung, Bo Kyoung Suh, Seok-Ki Moon, Jong-Soo Choi, Jong Guk Kim, Dong Gun Lee, (2009), Antifungal activity and mode of action of silver nano-particles on Candida albicans, BioMetals, 22(2), 235–242 [21]. Klabunde K. J. (2001), Nanoscale Materials in Chemistry, Wiley, 1-13.

[22]. Kim D., , Jeong S, Moon J. (2006), Synthesis of silver nanoparticles using the polyol process and the influence of precursor injection, Nanotechnology 17(16), 4019-4014. doi: 10.1088/0957-4484/17/16/004 [23]. Le Dai Vuong, N. D. T. Luan, D. D. H. Ngoc, P. T. Anh and V. V. Q. Bao (2016), Green Synthesis of Silver Nanoparticles from Fresh Leaf Extract of Centella asiatica and Their Applications, International Journal of Nanoscience, 15(3) 1650018. [24]. Mafune, F.; Kohno, J.-Y.; Takeda, Y.; Kondow, T.; Sawabe, H. (2000), Structure and Stability of Silver Nanoparticles in Aqueous Solution Produced by Laser Ablation, The journal of Physical Chemistry 104 (35), 8333-8337. [25]. Mareesw wran J, Nepolean P, Jayanthi R, Premkumar samuel asir R and radhakrishnan B (2015), In vitro Studies on Branch Canker Pathogen (Macrophoma sp.) Infecting Tea, Plant Pathology & Microbiology.6:284. doi:10.4172/2157-7471.1000284 [26]. Nasrollahi A., Pourshamsian Kh, Mansourkiaee P., (2011), Antifungal activity of silver nanoparticles on some of fungi, International Journal of Nano Dimension, 1(3), 233-239 [27]. Rabab M. Elamawi, Raida E. Al-Harbi, and Awatif A. Hendi, (2018), Biosynthesis and characterization of silver nanoparticles using Trichoderma longibrachiatum and their effect on phytopathogenic fungi, Agriculture and Agricultural Science Procedia,28(1) 296-303 [28]. Ravikumar M. N. V., Dutta P. K. & Nakamura S. (2000), Chitosan-amine oxide: a new gelling system, characterization and in vitro evaluations, Indian Journal of pharmaceutical Science, 62 55-58. [29]. Sang Woo Kim, J. H. Jung, K. Lamsal, Y. S. Kim, J. S. Min, Y. S. Lee (2018), Antifungal Effects of Silver Nanoparticles (AgNPs) against Various Plant Pathogenic Fungi, Mycobiology, 42(1), 53-58 [30]. Taniguchi, N. (1974). On the basic concept of nanotechnology. Proceedings of the international conference on Production Engineering, Japan society of precision Engineering. 18-23 [31]. Vo Van Quoc Bao, L. D. Vuong and L. V. Luan (2018), Biomimetic Synthesis of Sliver Nanoparticles for Preparing Preservative Solutions for Mandarins (Citrus Deliciosa Tenore), Nano LIFE, 8(1) 1850003.

[32]. Young-Ki Jo, Byung H. Kim, Geunhwa Jung, (2009), Antifungal Activity of Silver Ions and Nanoparticles on Phytopathogenic Fungi, APS journals, 93(10), 1037-1043, https://doi.org/10.1094/PDIS-93-10-1037 Trang Web [33]. https://giongcayanqua.edu.vn/cach-benh-hai-cam-quyt-va-cach- phong-tranh-tot-nhat.html; cập nhật ngày 10/1/2018. [34]. https://nanobacdietkhuan.com/2016/10/co-che-diet-khuan-nano-bac-va-un g-dung-cua-nano-bac-trong-nong-nghiep.html; cập nhật ngày 16/1/2018. [35]. https://ahtc.com.vn/ưng-dung-nanobac-trong-mot-so-linh-vuc-khac/; cập nhật ngày 16/1/2018. [36]. https://www.2lua.vn/article/cay-quyt-cong-dung-va-ki-thuat-trong-2466.html; cập nhật ngày 11/1/2018. [37]. https://www.academia.edu/31479301/Chitosan; cập nhật ngày 17/1/2018. [38].Ghttp://langhuongcan.blogspot.com/2013/01/nang-len-cho-quyt-ngot-huong-can. html; cập nhật ngày 10/1/2018. [39].Fhttp://vov.vn/kinh-te/bao-quan-nong-san-sau-thu-hoach-dang-la-bai-toan-kho-40 8149.vov; cập nhật ngày 20/1/2018 [40]. https://nghenong.vn/chiet/ky-thuat-chiet-cay-quyt-trong-215.html; cập nhật ngày 20/1/2018. [41]. https://caygiong.com/products/quyt-duong; cập nhật ngày 21/1/2018. [42]. https://baonghean.vn/nghe-an-quyt-ngot-pq-tai-vuon-duoi-10000-dong-k g-181879.html; cập nhật ngày 12/1/2018. [43]. https://www.zbook.vn/ebook/nghien-cuu-dieu-che-dung-dich-ag-nan o-mat-do-cao-va-khao-sat-kha-nang-diet-khuan-cua-chung-32225/; cập nhật ngày 21/1/2018. [44]. https://en.wikipedia.org/wiki/Macrophoma_theicola; cập nhật ngày 12/1/2018 [45]. https://www.nanobacsuper.com/nano-bac-va-ung-dung-cua-nano-bac-trong-nong -nghiep; cập nhật ngày 16/1/2018 [45].Rhttps://www.nanobacsuper.com/nano-bac-va-ung-dung-cua-nano-bac-trong- nong-nghiep; cập nhật ngày 19/1/2018.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Pha môi trường, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu Phụ lục 2. Phương pháp bố trí thí nghiệm Phụ lục 3. Phương pháp tiến hành phân tích các chỉ tiêu về sinh lý, hóa sinh Phụ lục 4. Mẫu phiếu đánh giá cảm quan Phụ lục 5. Bảng số liệu xử lý thống kê trong quá trình nghiên cứu Phụ lục 6. Kết quả xử lý thống kê ANOVA Phụ lục 7. Một số hình ảnh trong quá trình thực hiện đề tài

PHỤ LỤC 1 PHA MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU

a. Môi trường phân lập: Môi trường PDA là môi trường giàu cacbon hydrate chứa: D – glucose: 20g Agar: 20g Khoai tây: 200g Nước: 1 lít Khoai tây bao vỏ, rửa sạch, thái nhỏ nấu khoảng 1 giờ, lọc lấy dịch trong. Cho lượng agar, nước và đường khuấy đều và định mức đủ 1 lít nước. sau đó đem đi hấp tiệt trùng ở 1210C, 1atm trong vòng 15 phút. - Các dụng cụ, giấy báo, bao nilong cần thiết trong quá trình phân lập được rửa sạch, sấy khô, bao gói bằng giấy báo, nilong và đem đi tiệt trùng. Mục đích tiệt trùng nhằm tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật ngoại lai hiện diện trong môi trường, tạo điều kiện vô trùng cho môi trường để kết quả phân lập, nuôi cấy chính xác. Nguyên tắc tiệt trùng: không làm biến tính môi trường, không làm bến tính một số chất trong môi trường. Sau khi khử trùng không sinh sản ra các chất độc gây chết vi sinh vật nuôi cấy, phải đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối sau khi khử trùng. Khi phân lập cho các dụng cụ cần thiết đã tiệt trùng như: đĩa petri, môi trường, dao cắt thạch, giấy báo, nilong … vào tủ cấy để khử trùng bằng tia UV. Các dụng cụ như: đèn cồn, bật lửa … có thể khử trùng bằng cồn. b. Phân lập nấm [3] Nấm sau khi được nuôi trong môi trường ẩm thì được tách sợi mà nuôi trong môi trường PDA để nấm phát triển. Quá trình tách sợi nuôi cấy trong môi trường PDA được thực hiện vô trùng trong tủ cấy. - Cách dụng cụ sau khi khử trùng bằng tia UV thì ta bắt đầu khử trùng bàn tay, cánh tay, đèn cồn và bật lửa cho vào tủ cấy để bắt đầu tiến hành tách nấm. - Để tiến hành cấy ban đầu ta phải thắp đèn cồn lên. Rồi mới mở giấy báo, đĩa, môi trường ra. - Đĩa được hơ trên đèn cồn sau đó đổ môi trường PDA vào đĩa và ta chỉ đổ 1/3 đĩa. Nếu nhiều quá tốn môi trường, và không quan sát được sự phát triển của nấm, nếu ít quá thì không đủ môi trường cho nấm phát triển. Sau đó, để cho môi trường PDA đông lại. - Tiếp theo, nấm ở ngoài được khử trùng và đem vào tủ cấy. Ta dùng que cấy tách nấm từ môi trường ẩm qua môi trường PDA. Lưu ý, trong quá trình cấy lúc nào cũng cấy gần đèn còn và ta cấy nấm ở chính giữa để cho sợi nấm được phát triển tốt nhất. Sau đó,

ta cho đĩa vào bao bì đã hấp và đưa đĩa và tất cả dụng cụ ra khỏi tủ cấy và tiến hành về sinh tủ. - Sau 2 ngày nấm phát triển ta dùng dao cắt từng miếng thạch kích thước dài và rộng 2 mm và cấy vào đĩa PDA cho đến khi trên đĩa chỉ còn một mẫu nấm thuần. Quá trình phân lập thực hiện trong tủ cấy giống trên để quá trình phân lập có kết quả chính xác nhất. a) Hóa chất - Chitosan tiến hành khảo sát ở các nồng độ từ 0,2 đến 0,8%. - Dung dịch nano bạc: Được kế thừa quy trình công nghệ chế tạo dung dịch nano bạc từ nhóm nghiên cứu của TS. Võ Văn Quốc Bảo và TS. Lê Đại Vương [23], [31]. Dung dịch nano bạc này có chứa các hợp chất chứa fitonxit, đặc biệt có hoạt chất asiaticosid tác dụng đến sự phân chia tế bào làm lành nhanh vết thương ngoài da, tác dụng chống loét dạ dày, kháng virus, kháng nấm. Nồng độ nano bạc thích hợp là 10 ppm. b) Dụng cụ Kho lạnh, tủ lạnh, tủ sấy, bếp điện,thiết bị lọc hút chân không, cân phân tích,bình tam giác, bình định mức, ống đong, cối sứ, buret, pipet,… Bảng 1.1. Danh mục các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

STT Hóa chất STT Hóa chất

1 Nước cất 9 Iod 0,01 N

2 Felling A 10 HCl 5%

3 Felling B 11 Chì acetate 30%

4 Fe2(SO4)3 12 Phenolphtalein 0,1%

5 H2SO4 đ (d = 1,84) 13 H2SO4 180g/l

6 KMnO4 0,1 N 14 NaOH 1 N; 0,1 N

7 Na2SO4

8 Hồ tinh bột 5g/l

Bảng 1.2. Danh mục các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

STT Dụng cụ STT Dụng cụ

1 Bình định mức 100ml, 500ml 6 Máy xay

2 Bình tam giác 100ml, 250ml 7 Cốc sấy

3 Cốc đong 25ml, 100ml, 250ml 8 Phễu thủy tinh

4 Pipet 9 Đũa thủy tinh

5 Buret 10 Giấy lọc

Bảng 1.3. Các loại thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị Hiệu Nước sản xuất

1 Cân kỹ thuật SARTORIUS Đức

2 Hệ thống kho lạnh bảo quản mẫu Kho lạnh Việt Nam

3 Tủ sấy UNB – 500 Đức

4 Bể ổn định nhiệt LWB-106D Hàn Quốc

5 Phễu BUCNE

6 Thiết bị đo nồng độ khí CO2 ICA 15 Nhật Bản

7 Thiết bị lọc hút chân không

PHỤ LỤC 2 PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM Nguyên liệu: nano bạc (50 ppm), chitosan (2%), acid acetic 1%, nước cất và các dụng cụ cần thiết. - Pha dung dịch chitosan 2%: Cho 20g bột chitosan trong 1lít dung dịch acid acetic 1%. Thời gian khuấy: 24h. - Hòa trộn dung dịch chitosan đã pha với nano bạc sau đó khuấy bằng máy khuấy từ, đến khi chế phẩm này đồng nhất. Thời gian khuấy từ 30 phút để nguyên liệu hòa lẫn, đồng nhất mà không bị phân lớp. Khi chế phẩm được đồng nhất thì ta tiến hành xử lý, rửa cắt bỏ cuống quả còn 2 - 3mm sau đó để ráo. Sau khi chuẩn bị xong chế phẩm nano bạc - Chi, ta cho quýt nguyên liệu nhúng qua chế phẩm này, thời gian nhúng là 1 phút sau đó để khô ráo hoặc có thể sử dụng quạt để thông thoáng khí làm lớp màng nhanh khô hơn. Sau khi chế phẩm khô ta cho quýt vào thùng carton có đục lỗ và đệm mút lót bảo quản ở nhiệt độ lạnh 13oC.

Quýt Chitosan Nano bạc

Phối trộn, khuấy từ Phân loại, làm sạch

Chế phẩm nano bạc-Chi Nhúng lần 1, lần 2 (0,2%; 0,4%;0,6%; 0,8%)

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4

Để ráo 1 giờ

Vào thùng

Bảo quản 130C Độ ẩm 80% -95%

Trong đó: ĐC: mẫu không xử lý chế phẩm dung dịch nano bạc - chitosan CT1: mẫu được xử lý với nồng độ nano bạc 10 ppm và nồng độ chitosan 0,2%. CT2: mẫu được xử lý với nồng độ nano bạc 10 ppm và nồng độ chitosan 0,4%. CT3: mẫu được xử lý với nồng độ nano bạc 10 ppm và nồng độ chitosan 0,6%. CT4: mẫu được xử lý với nồng độ nano bạc 10 ppm và nồng độ chitosan 0,8%. Các mẫu được bảo quản ở cùng điều kiện. Nhiệt độ từ 130C, độ ẩm 90 – 95%.

PHỤ LỤC 3 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VỀ SINH LÝ, SINH HÓA

3.1. Xác định hao hụt khối lượng Nguyên tắc: Tổn thất khối lượng được xác định bằng cách cân. Cách tiến hành: dùng cân kỹ thuật để xác định khối lượng mẫu tại các lần đo, từ đó tính ra tỷ lệ hao hụt khối lượng so với ban đầu.

m =

Trong đó: m là tỷ lệ hao hụt khối lượng rau theo thời hạn bảo quản (%). a khối lượng mẫu ngày phân tích trước tính theo lần lặp. b là khối lượng mẫu tại ngày phân tích. 3.2. Xác định tỷ lệ hư hỏng Cách tiến hành: tỷ lệ hư hỏng được xác định bằng cách đo diện tích phần bị hỏng trên bề mặt quả. Mức hư hỏng được đánh giá theo các mức sau: - Mức 0: quả không bị hư hỏng gì. - Mức 1: có 1/4 diện tích bề mặt quả bị hư hỏng. - Mức 2: có 1/4 – 1/3 diện tích bề mặt quả bị hư hỏng. - Mức 3: có 1/3 – 1/2 diện tích bề mặt quả bị hư hỏng. Tỷ lệ hư hỏng được tính theo công thức:

T =

Trong đó: T: tỷ lệ hư hỏng của quả sau các ngày bảo quản. N: tổng số quả được dùng để xác định tỷ lệ hư hỏng.

N1, N2, N3: lần lượt là số quả hư hỏng ở các mức 1,2,3.

3.3.Xác định hàm lượng đường tổng số Xác định hàm lượng đường tổng số bằng phương pháp Bertrand. Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm các đường khử có khả năng khử ion Cu2+ thành Cu+ kết tủa dưới dạng oxit đồng màu đỏ.

Dùng dung dịch Fehling A và B (bao gồm CuSO4 và tactrat kép trong môi trường kiềm) khử đường khử có trong dung dịch phân tích để tạo thành đồng oxit kết tủa màu đỏ.

CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4

O-CH-COONa Cu (OH)2 + OH-CH-COONa 2Cu + H2O

OH-CH-COONa O-CH-COONa

O-CH-COONa OH-CH-COONa 2Cu 2 O-CH-COONa OH-CH-COONa +

CH2OH(CHOH)4CHO + H2O CH2OH(CHOH)4COOH + Cu2O

Kết tủa đồng màu đỏ sẽ bị sunfat sắt III hòa tan theo phản ứng sau:

Fe2(SO4)3 + Cu2O 2 CuSO4 +2 FeSO4 + H2O

Tiếp theo, ta định phân lượng FeSO4 mới hình thành bằng dung dịch KMnO4:

2KMnSO4 + 10FeSO4 + 8H2SO4 K2SO4 + 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3 + 8H2O

Căn cứ vào lượng KMnO4 tiêu hao ta nhân 6,36 sẽ nhận được số mg Cu. Sau đó, tra phụ lục quan hệ giữa lượng Cu và lượng glucose hoặc maltose khi xác định đường khử theo phương pháp Bertrand ta sẽ biết được lượng đường chứa trong mẫu. Dụng cụ: - Bình tam giác - Ống đong - Bếp điện (hoặc bếp ga)

- Dung dịch Fehling A: cân 40 g CuSO4.5H2O hòa tan và định mức tới 1 lít sau đó đem lọc rồi cho vào lọ rồi đậy kín. - Dung dịch Fehling B: cân 200 g muối tactrat kép và 150 g NaOH vào 2 cốc khác nhau, sau đó đem hòa lẫn và để nguội rồi định mức tới 1 lít. Đem lọc rồi bảo quản trong bình nâu, đậy nút kín.

- Dung dịch Fe2(SO4)3: cân 50g Fe2(SO4)3 hòa tan trong 500 – 600 ml nước.

Sau đó, ta cho thêm 110 ml H2SO4 đậm đặc (d = 1,84) rồi định mức đến 1 lít. Tiến

hành lọc và cho thêm vài giọt KMnO4 0,1N đến xuất hiện màu hồng nhạt rồi bảo quản trong bình kín.

- Dung dịch KMnO4 0,1N Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu: Lấy 5g mẫu cho vào cối sứ, nghiền nhỏ, rồi chuyển vào bình tam giác 250ml, thêm 25ml HCl 5% rồi thực hiện thủy phân trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 700C, 5 phút. Làm nguội rồi trung hòa bằng dung dịch NaOH 1N, sau đó NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch có màu hồng với thuốc thử phenolphatalein. Khử tạp chất bằng chì acetate: Dung dịch sau khi thủy phân và trung hòa cho vào bình định mức dung tích 100ml, cùng với nước rửa, thêm 7ml chì acetate 30% lắc đều và để lắng trong 5 phút. Nếu thấy xuất hiện lớp chất lỏng trong suốt ở trên lớp cặn thì việc

khử tạp chất đã hoàn thành. Cho 18 - 20ml Na2SO4 bão hòa vào để loại bỏ chì acetate dư, lắc đều và để tủa lắng xuống. Thêm nước cất vừa đủ 100ml, lắc đều và lọc qua giấy lọc. Tiến hành thí nghiệm:

B1: dùng ống đong lấy 20 ml Fehling A và 20 ml Fehling B cho vào bình tam giác rồi dùng pipet hút 5 ml dung dịch mẫu đã xử lý vào.

B2: lắc đều rồi đặt bình tam giác lên bếp điện (hoặc bếp ga), đun sao cho 3 – 4 phút thì sôi và cho sôi tiếp đúng 3 phút nữa.

B3: lấy bình ra khỏi bếp và để nghiêng cho cặn Cu2O lắng xuống. Lúc này dung

dịch bên trên lớp cặn phải có màu xanh của Cu(OH)2 dư, trong trường hợp dung dịch bên trên có màu lục, vàng hoặc nâu nghĩa là không đủ lượng đồng cần thiết, tiến hành làm lại và lấy một dịch lọc ít hơn. Chú ý: khi lọc phải luôn giữ nước trong phễu để tránh hiện tượng oxit đồng bị oxy hóa do tiếp xúc với không khí.

B4: khi kết tủa Cu2O lắng xuống thì thực hiện quá trình rửa tủa trên phễu Bucne có gắng với máy lọc hút chân không. Chiết từ từ dung dịch Feling qua phễu Bucne, giữ

tủa Cu2O ở trong bình luôn ngập trong dung dịch để Cu2O không bị tiếp xúc với oxy

không khí tạo thành CuO. Bật máy lọc chân không để dung dịch Fehling được hút nhanh. Sau đó cho từ từ khoảng 20 ml nước cất vào bình nón, lắc nhẹ và chiết nước rửa tủa tương tự như trên. Quá trình rửa tủa lặp lại 3 lần bằng nước cất.

B5: rửa xong ta dùng 30 – 50 ml dung dịch Fe2(SO4)3 để hòa tan hết đồng oxit, rồi cũng rửa bằng nước nóng. Dung dịch nhận được sau khi hòa tan và rửa đem chuẩn độ

bằng dung dịch KMnO4 1/30N đến xuất hiện màu hồng và không mất đi sau 2 – 3 giây.

Số ml KMnO4 1/30N tiêu hao đem nhân với 6,36 ta sẽ được lượng mg đồng, sau đó, tra bảng Bertrand ta sẽ biết lượng đường chứa trong 20 ml dung dịch mẫu. Tính toán: Hàm lượng đường X % (m/m) được tính theo công thức:

X = × (độ pha loãng), (%)

Trong đó

G1 : khối lượng đường nghịch chuyển tương ứng với số ml KMnO4 1/30 N đọc được ở bảng.

G2 : khối lượng thực phẩm cân lúc đầu 1000 : hệ số chuyển từ gam thành mg 3.4. Xác định hàm lượng vitaminC Vitamin C chiếm một thành phần tạo nên giá trị dinh dưỡng cho quýt. Trong phân tử ascobic chứa nhóm dienol (-OH=CHO-) có tính khử mạnh. Vitamin C dễ bị oxy hóa thành acid dehydroascobic, phản ứng có tính thuận nghịch. Acid ascobic và acid dehydroascobic là chất hoạt động sinh học mạnh và chống xuất huyết. Nguyên tắc:

Acid L-ascobic có tính khử mạnh được oxy hóa bằng dung dịch I2 với chỉ thị là dung dịch hồ tinh bột. Điểm kết thúc của phản ứng thuận nghịch được nhận biết nhờ chỉ thị của dung dịch hồ tinh bột. Đây là phương pháp xác định nhanh và cho kết quả gần đúng. Dụng cụ và hóa chất: - Bình tam giác

- Dung dịch H2SO4 180g/l

- Dung dịch I2 0,01N - Dung dịch tinh bột 5g/l

Cách tiến hành:

B1: cân 25 – 30g quả, nghiền nhỏ, cho 5 ml dịch H2SO4 vào hỗn hợp, chuyển vào bình định mức 250 ml.

B2: lấy 10 ml dịch quả cho vào bình tam giác 100ml, cho thêm vài giọt hồ tinh bột.

B3: lắc nhẹ rồi chuẩn độ bằng I2 0,01N tới khi bắt đầu xuất hiện màu xanh. Tính toán kết quả: Lượng acid ascobic hay vitaminC được tính theo công thức sau:

mC = (mg%)

Trong đó:

n – số ml dung dịch I2 0,01N dùng để chuẩn độ

0,88 – số mg acid ascobic tương ứng với 1ml I2 0,01N V – số ml dịch quả đã lấy để phân tích m – khối lượng mẫu, g 3.5. Xác định hàm lượng acid tổng số Độ acid tổng số bao gồm các acid có thể định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn dựa trên phản ứng trung hòa các acid có trong mẫu. Những acid chủ yếu này là các acid hữu cơ như acid citric, acid patothenic. Từ lượng dịch kiềm tiêu hao, ta tính được lượng acid tổng số có trong mẫu. Dụng cụ và hóa chất: - Bình tam giác - Cốc, pipet - Dung dịch NaOH 0,1N Cách tiến hành:

B1: cân 25 – 30 g quả, nghiền nhỏ và chuyển vào bình định mức 250 ml, thêm nước cất đến 3/4 thể tích bình và đun cách thủy ở 70 – 800C trong vòng 30 – 45 phút, thỉnh thoảng lắc đều để hòa tan tốt hơn.

0 B2: làm nguội đến 20 C, dùng nước cất định mức đến ngấn bình và đem lọc.

B3: thu dịch lọc vào cốc, hút 25 ml dịch lọc vào bình tam giác dung tích 100 ml và thêm 3 giọt phenolphtalein 0,1%. Sau đó chuẩn độ bằng Natri hydroxide 0,1N đến màu hồng nhạt bền vững trong 30 giây.

Tính toán kết quả: Hàm lượng acid tổng số trong dịch quả tính theo mg đương lượng trên 1 lít dịch quả gam acid trên lít (g/l). Có thể tính theo công thức: V.K.V .100 X  2 V1.m Trong đó: V - thể tích natri hydroxide 0,1N, ml

V1 - thể tích dung dịch đã hút để chuẩn, ml (V = 25 ml)

V2 - dung tích bình định mức, ml (V = 250 ml) K - hệ số acid tương ứng (K = 0,0075) m - lượng cân mẫu, g

PHỤ LỤC 4 MẪU PHIẾU ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN PHIẾU TRẢ LỜI Phép thử cho điểm thị hiếu Họ và tên: Ngày thử: Mã số người thử: Bạn nhận được … mẫu quýt, ký hiệu là…………………………………… Bạn hãy quan sát, ngửi, nếm và sau đó cho điểm mức độ yêu thích của bạn về trạng thái vỏ quả, màu sắc, mùi, vị của mỗi mẫu theo thang điểm sau: Cực kỳ không thích: 1 Rất không thích: 2 Không thích: 3 Tương đối không thích: 4 Không thích cũng không ghét: 5 Tương đối thích: 6 Thích: 7 Rất thích: 8 Cực kỳ thích: 9 Chú ý: dùng nước thanh vị trước khi thử và sau mỗi lần thử. Trả lời:

Điểm Mẫu Trạng thái Màu sắc Mùi Vị

Nhận xét: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………….

PHỤ LỤC 5 BẢNG SỐ LIỆU XỬ LÝ THỐNG KÊ TRONG QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU Các kết quả nghiên cứu được xử lý thống kê bằng chương trình ANOVA trên phần mềm thống kê xử lý số liệu SPSS 20 với mức ý nghĩa α = 0,05. Các chữ cái a, b, c, d là kết quả xử lý số liệu thống kê trên phần mềm SPSS 20. Ghi chú: (-) mẫu dừng theo dõi, các ký tự giống nhau trong một hàng ở mỗi ngày khác biệt không có ý nghĩa 5%. 5.1. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hàm lượng vitamin C của quýt trong quá trình bảo quản Bảng 5.1. Biến đổi hàm lượng vitamin C của quýt trong thời gian bảo quản

Ngày Đối chứng CT1 CT2 CT3 CT4

0 33,95 33,95 33,95 33,95 33,95

5 36,88b 35.18a 35.16a 35.67a 35.65a

10 37,86a 38.07a 37.34a 37.60a 37.13a

15 33,97c 37.11b 38.32a 38.55a 38.34a

20 28,10b 36.15a 36.88a 37.58a 37.35a

25 21,75b 33.92b 35.89a 36.15a 36.60a

30 14,17c 32.21b 33.97a 35.16a 35.15a

35 - 30.02c 31.97b 34.18a 33.46ab

40 - 27.82c 29.31b 32.93a 32.24a

45 - 26.13b 27.36b 30.75a 29.81a

50 - 21.74c 25.13b 28.80a 28.34a

55 - 19.30b 21.02b 26.84a 26.13a

60 - 14.66c 18.08b 24.41a 24.40a

65 - - 15.88b 21.23a 21.96a

5.2. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hàm lượng acid tổng số của quýt trong quá trình bảo quản Bảng 5.2. Biến đổi hàm lượng acid tổng số của quýt trong thời gian bảo quản

Ngày Đối chứng CT1 CT2 CT3 CT4

0 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53

5 0.62a 0.60a 0.56b 0.63a 0.57b

10 0.71a 0.64b 0.64b 0.65b 0.62b

15 0.78a 0.73b 0.69c 0.66d 0.61e

20 0.76a 0.79a 0.80a 0.68b 0.65b

25 0.70c 0.76b 0.80a 0.71c 0.71c

30 0.68b 0.80a 0.77a 0.75a 0.77a

35 - 0.77a 0.78a 0.75b 0.74b

40 - 0.75a 0.73a 0.73a 0.73a

45 - 0.69b 0.67b 0.70b 0.74a

50 - 0.66c 0.69bc 0.73a 0.72ab

55 - 0.66b 0.66b 0.68b 0.73a

60 - 0.64b 0.62b 0.69a 0.71a

65 - - 0.63b 0.69a 0.68a

5.3. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hàm lượng đường tổng số của quýt trong quá trình bảo quản Bảng 5.3. Biến đổi hàm lượng đường tổng số của quýt trong thời gian bảo quản

Ngày Đối chứng CT1 CT2 CT3 CT4

0 7.56 7.56 7.56 7.56 7.56

5 8.73a 7.95b 7.87bc 7.84bc 7.67c

10 10.66a 8.88b 8.28c 8.11c 8.09c

15 10.82a 9.14b 8.65c 8.54c 8.26d

20 9.96a 9.76a 9.18b 8.99b 8.55c

25 8.79c 10.30a 10.13a 9.67b 9.66b

30 7.21b 10.55a 10.60a 10.32a 10.27a

35 - 10.72b 11.01a 10.72b 10.93a

40 - 10.33c 10.57b 10.97a 11.08a

45 - 9.73c 10.20b 10.72a 10.82a

50 - 8.97c 9.68b 10.37a 10.45a

55 - 8.39c 8.92b 9.64a 9.71a

60 - 7.74c 7.39b 9.06a 9.34a

65 - - 6.88b 8.75a 8.24a

5.4. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm nano bạc-Chi đến sự hao hụt khối lượng của quả quýt trong quá trình bảo quản Bảng 5.4. Ảnh hưởng của nồng độ phẩm nano bạc-Chi đến sự hao hụt khối lượng của quýt theo thời gian bảo quản (%)

Ngày ĐC CT1 CT2 CT3 CT4

0 0 0 0 0 0

5 3.21a 2.25b 0.70c 0.63c 0.40c

10 4.56a 4.04a 1.77b 1.22bc 0.72c

15 5.77a 4.95a 2.57b 1.43bc 1.30c

20 8.52a 6.32b 3.14c 1.98c 1.64c

25 11.13a 7.05b 4.69c 2.48d 2.42d

30 13.34a 7.88b 5.32c 3.61cd 2.65d

35 8.62a 6.44b 4.23c 3.28c

40 9.17a 6.84ab 4.72bc 3.55c

45 9.93a 7.57ab 6.02b 4.84b

50 11.32a 8.86a 7.82ab 5.26b

55 12.08a 9.52ab 9.22ab 6.60b

60 13.12a 11.93a 10.36ab 7.42b

65 12.46a 11.47b 8.68c

5.5. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm nano bạc-Chi đến tỷ lệ hư hỏng của quả quýt trong quá trình bảo quản Bảng 5.5. Ảnh hưởng của nồng độ phẩm nano bạc-Chi đến tỷ lệ hư hỏng của quýt theo thời gian bảo quản

Mẫu bảo quản Thời gian bảo quản (ngày) Tỷ lệ hư hỏng (%)

20 6,67

ĐC 25 14,48

30 17,45

50 4,44

CT1 55 11,11

60 16,56

50 4,57

CT2 55 11,00

60 15,37

55 4,12

CT3 60 7,33

65 12,33

55 3,53

CT4 60 6,67

65 11,67

PHỤ LỤC 6 KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ ANOVA 6.1. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hàm lượng vitamin C của quýt trong quá trình bảo quản

ngay35

Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05

1 2 3 .20 3 30.0233 .40 3 31.9700 .80 3 33.4633 33.4633 .60 3 34.1833 Sig. 1.000 .079 .359

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay40 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 .20 3 27.8233 .40 3 29.3067 .80 3 32.2433 .60 3 32.9333 Sig. 1.000 1.000 .284 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. ngay45

Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05

1 2

.20 3 26.1333 .40 3 27.3600 .80 3 29.8033 .60 3 30.7500 Sig. .227 .342

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay50 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05

1 2 3

.20 3 21.7400 .40 3 25.1300 .80 3 28.3400 .60 3 28.8000 Sig. 1.000 1.000 .522

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay55 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 .20 3 19.3000 .40 3 21.0200 .80 3 26.1333 .60 3 26.8433 Sig. .110 .479 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay60 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 .20 3 14.6600 .40 3 18.0767 .80 3 24.3967 .60 3 24.4067 Sig. 1.000 1.000 .987 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

6.2. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hàm lượng acid tổng số của quýt trong quá trình bảo quản

ngay35 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 .80 3 .7400 .60 3 .7500 .20 3 .7633 .7633 .40 3 .7800 Sig. .077 .170 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay40 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 .40 3 .7300 .60 3 .7300 .80 3 .7300 .20 3 .7467 Sig. .354 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay45 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 .40 3 .6733 .20 3 .6900 .60 3 .6967 .80 3 .7400 Sig. .240 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay50 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 .20 3 .6600 .40 3 .6900 .6900 .80 3 .7133 .7133 .60 3 .7300 Sig. .052 .113 .240 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay55 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 .40 3 .6533 .20 3 .6567 .60 3 .6800 .80 3 .7300 Sig. .152 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay60 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 .40 3 .6133 .20 3 .6400 .60 3 .6900 .80 3 .7067 Sig. .057 .203 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay65 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 .40 3 .6300 .80 3 .6800 .60 3 .6900 Sig. 1.000 .506 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

6.3. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hàm lượng đường tổng số của quýt trong quá trình bảo quản

ngay35 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 .20 3 10.7167 .60 3 10.7167 .80 3 10.9333 .40 3 11.0067 Sig. 1.000 .402 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay40 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 .20 3 10.3300 .40 3 10.5700 .60 3 10.9767 .80 3 11.0767 Sig. 1.000 1.000 .180 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay45 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 .20 3 9.7300 .40 3 10.2067 .60 3 10.7167 .80 3 10.8200 Sig. 1.000 1.000 .352 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay55 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 .20 3 8.3833 .40 3 8.9167 .60 3 9.6367 .80 3 9.7067 Sig. 1.000 1.000 .611 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay60 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 .40 3 7.3900 .20 3 7.7467 .60 3 9.0567 .80 3 9.3433 Sig. 1.000 1.000 .053 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay65 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 .40 3 6.8767 .80 3 8.2433 .60 3 8.7567 Sig. 1.000 .060 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

6.4. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hao hụt khối lượng của quýt trong quá trình bảo quản

ngay35 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 .80 3 3.3533 .60 3 4.2433 .40 3 6.5600 .20 3 8.6667 Sig. .351 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay40 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 .80 3 3.6267 .60 3 4.7333 4.7333 .40 3 6.9867 6.9867 .20 3 9.2167 Sig. .309 .058 .060 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay45 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 .80 3 4.9333 .60 3 6.0300 .40 3 7.7333 7.7333 .20 3 10.0000 Sig. .053 .091 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay50 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 .80 3 5.3833 .60 3 7.8367 7.8367 .40 3 9.0633 .20 3 11.4233 Sig. .145 .053 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay55 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 .80 3 6.7867 .60 3 9.2367 9.2367 .40 3 9.7400 9.7400 .20 3 12.2033 Sig. .133 .132 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

ngay60 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05 1 2 .80 3 7.5967 .60 3 10.3733 10.3733 .40 3 12.1600 .20 3 13.2567 Sig. .162 .164 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

Ngay65 Duncan nongdo N Subset for alpha = 0.05

1 2 3

.80 3 8.8200 .60 3 11.5000 .40 3 12.6867 Sig. 1.000 1.000 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

6.5. Đánh giá chỉ tiêu cảm quan đối với mẫu CT3 và CT4 sau 60 ngày bảo quản lạnh trangthai Duncan Mau N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 4 4.00 7 5.2857 2.00 7 6.8571 6.00 7 7.4286 5.00 7 7.7143 7.7143 3.00 7 7.8571 7.8571 1.00 7 8.1429 Sig. 1.000 1.000 .097 .097 Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 7.000. mausac Duncan Mau N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 4.00 7 4.1429 2.00 7 7.2857 3.00 7 7.5714 6.00 7 8.1429 5.00 7 8.2857 1.00 7 8.4286 Sig. 1.000 .264 .293 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 7.000. mui Duncan Mau N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 4.00 7 6.0000 3.00 7 7.8571 5.00 7 7.8571 6.00 7 7.8571 2.00 7 8.0000 1.00 7 8.5714 Sig. 1.000 .566 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 7.000.

vi Duncan Mau N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 4.00 7 5.4286 1.00 7 6.2857 5.00 7 7.4286 6.00 7 7.4286 2.00 7 7.7143 3.00 7 7.8571 Sig. 1.000 1.000 .148 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 7.000.

PHỤ LỤC 7 HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU

7.1. Hình ảnh mẫu quýt trong thời gian bảo quản ở điều kiện lạnh

Hình 7.1.Mẫu quýt sau 5 ngày bảo quản

Hình 7.2. Mẫu quýt sau 15 ngày bảo quản

Hình 7.3. Mẫu quýt sau 25 ngày bảo quản

Hình 7.4. Mẫu quýt sau 35 ngày bảo quản

Hình 7.5. Mẫu quýt sau 45 ngày bảo quản

Hình 7.6. Mẫu quýt sau 55 ngày bảo quản

Hình 7.7. Một số mẫu quýt bị hư hỏng trong bảo quản

7.2. Hình ảnh một số dụng cụ, thiết bị trong quá trình thực hiện đề tài

Hình 7.8. Cân điện tử Hình 7.9.Thiết bị khuấy từ

Hình 7.10. Thiết bị lọc hút chân không Hình 7.11. Tủ sấy

Hình 7.12.Kho lạnh

P1S2-P6S3,11,13,14,17-24,26-32,34-37,40,42,45,49-86

MAU P7S3-P10S3,12,15,16,25,33,38,39,41,43,44,46-48,87-93