Revista Argentina De Microbiología (2008) 40:

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PUBLICACION DE LA ASOCIACION ARGENTINA DE MICROBIOLOGIA

Aparece en Biological Abstracts, Chemical Abstracts, Veterinary Bulletin, Index Veterinario, Embase (Excerpta Medica) Medline (Index Medicus), Tropical Diseases Bulletin, Abstracts on Hygiene and Communicable Diseases, Literatura Latino- americana en Ciencias de la Salud (LILACS), Periódica, LATINDEX, SciELO, Science Citation Index Expanded y Redalyc.

DIRECTORA Elsa C. Mercado Instituto de Patobiología - INTA

SECRETARIO DE REDACCIÓN Gerardo A. Leotta Facultad de Ciencias Veterinarias - UNLP - CONICET

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Alicia I. Arechavala Ana M. Jar Hospital Francisco J. Muñiz - GCBA Facultad de Ciencias Veterinarias - UBA José A. Di Conza Claudia I. Menghi Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA - UNL - CONICET Hospital de Clínicas - Facultad de Farmacia y Bioquímica - UBA Inés E. García de Salamone Héctor R. Morbidoni Facultad de Agronomía - UBA Facultad de Ciencias Médicas - UNR - CIUNR Silvia Carla Predari Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari - UBA

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Xxxx ISSN 0325-7541 XXX Revista Argentina de Microbiología (2008) 40: ---

Volumen 43 Nº 1  ENERO-marzo de 2011

ÍNDICE

EDITORIAL Microorganismos del suelo y sustentabilidad de los ecosistemas I. García de Salamone 1

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y DE ALIMENTOS Optimización de metodologías de cribaje para la búsqueda de Streptococcus agalactiae en embarazadas S. E. Montibello, L. I. Guelfand, M. G. Machaín, A. N. Carrión, M. D. Ferreira, J. C. Pidone, M. E. Ceregido, 4 S. C. Kaufman, R. N. Soloaga Desarrollo de una prueba de ELISA para detectar anticuerpos en carneros vacunados o infectados con Corynebacterium pseudotuberculosis J. J. Solanet, R. Malena, S. M. Estein, S. Estevao Belchior, F. A. Paolicchi 9 Etiología bacteriana de la neumonía nosocomial y resistencia a los antimicrobianos en pacientes con y sin tratamiento antimicrobiano previo B. Weyland, B. Perazzi, S. García, C. Rodríguez, C. Vay, A. Famiglietti 18 β-lactamasas AmpC plasmídicas tipo CMY-2 emergentes en Tucumán, Argentina M. A. Jure, C. Presti, N. M. Cudmani, L. M. Grellet, C. López, E. H. Musa, O. C. Aulet, C. Nieto, L. Saavedra, 24 M. C. de Castillo Descripción de un brote de intoxicación alimentaria estafilocócica ocurrido en Las Rosas, Provincia de Santa Fe, Argentina A. A. Brizzio, F. A. Tedeschi, F. E. Zalazar 28 Brote de intoxicación alimentaria asociado al consumo de leche ultrapasteurizada en la República del Paraguay N. Weiler, G. A. Leotta, M. N. Zárate, E. Manfredi, M. E. Álvarez, M. Rivas 33 Tuberculosis pediátrica en un hospital de referencia durante el período 2004-2008 M. G. Rodríguez, C. P. Patallo, V. A. Rizzotti, M. A. Moscoloni, D. S. Ballester 37 Brote de leptospirosis en terneros en recría en la provincia de Corrientes, Argentina M. G. Draghi, B. Brihuega, D. Benítez, J. M. Sala, G. M. Biotti, M. Pereyra, A. Homse, L. Guariniello 42 * Meningitis neonatal por Listeria monocytogenes en San Luis, Argentina: análisis de tres casos A. L. Laciar, M. L. Vaca Ruiz, A. Le Monnier 45 * Efectos clínicos adversos relacionados con ivermectina en pacientes tratados por infecciones con Mansonella ozzardi A. J. Krolewiecki, S. P. Cajal, C. Villalpando, J. F. Gil 48

ARTÍCULOS ESPECIALES Primer consenso argentino para el estudio de la sensibilidad in vitro a los antimicrobianos de las bacterias anaerobias de importancia clínica en humanos M. C. Legaria, H. M. Bianchini, L. Castello, G. Carloni, A. Di Martino, L. Fernández Canigia, M. Litterio, R. 51 Rollet, A. Rossetti, S. C. Predari

IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS Alicyclobacillus acidoterrestris J. M. Oteiza 67 Alteraciones ultramicroscópicas en tejido placentario de animales infectados con Leptospira interrogans serovar Pomona B. Brihuega, A. Venzano, J. Diodati, A. Boffi, D. Funes, C. Auteri, G. Romero, L. Samartino 68

Nuevas instrucciones para los autores 69

* En inglés Revista Argentina de Microbiología (2008) 40: ---

Volumen 43 Nº 1  january-MARCH 2011

INDEX

EDITORIAL Soil microorganisms and sustainability of the ecosystems I. García de Salamone 1

CLINICAL AND FOOD MICROBIOLOGY Optimization of screening methodologies for the detection of Streptococcus agalactiae in pregnant women S. E. Montibello, L. I. Guelfand, M. G. Machaín, A. N. Carrión, M. D. Ferreira, J. C. Pidone, M. E. Ceregido, 4 S. C. Kaufman, R. N. Soloaga Development of an ELISA test to detect antibodies in vaccinated or infected sheep with Corynebacterium pseudotuberculosis J. J. Solanet, R. Malena, S. M. Estein, S. Estevao Belchior, F. A. Paolicchi 9 Bacterial etiology of nosocomial pneumonia and antimicrobial resistance in patients with and without antimicrobial treatment B. Weyland, B. Perazzi, S. García, C. Rodríguez, C. Vay, A. Famiglietti 18 CMY-2-type plasmid-mediated AmpC b-lactamases emerging in Tucumán, Argentina M. A. Jure, C. Presti, N. M. Cudmani, L. M. Grellet, C. López, E. H. Musa, O. C. Aulet, C. Nieto, L. Saavedra, 24 M. C. de Castillo Description of an staphylococcal alimentary poisoning outbreak in Las Rosas, Santa Fe Province, Argentina A. A. Brizzio, F. A. Tedeschi, F. E. Zalazar 28 Foordborne outbreak associated with consumption of ultrapasteurized milk in the Republic of Paraguay N. Weiler, G. A. Leotta, M. N. Zárate, E. Manfredi, M. E. Álvarez, M. Rivas 33 Pediatric tuberculosis at a reference hospital during the 2004-2008 period M. G. Rodríguez, C. P. Patallo, V. A. Rizzotti, M. A. Moscoloni, D. S. Ballester 37 Leptospirosis outbreak in calves from Corrientes Province, Argentina M. G. Draghi , B. Brihuega, D. Benítez, J. M. Sala, G. M. Biotti, M. Pereyra, A. Homse, L. Guariniello 42 *Neonatal Listeria-meningitis in San Luis, Argentina: a three-case report A. L. Laciar, M. L. Vaca Ruiz, A. Le Monnier 45 * Ivermectin-related adverse clinical events in patients treated for Mansonella ozzardi infections A. J. Krolewiecki, S. P. Cajal, C. Villalpando, J. F. Gil 48

SPECIAL ARTICLES First Argentine consensus guidelines for in vitro antimicrobial susceptibility testing of clinically relevant anaerobic bacteria in humans M. C. Legaria, H. M. Bianchini, L. Castello, G. Carloni, A. Di Martino, L. Fernández Canigia, M. Litterio, R. 51 Rollet, A. Rossetti, S. C. Predari

MICROBIOLOGICAL IMAGES Alicyclobacillus acidoterrestris J. M. Oteiza 67 Ultramicroscopic alterations in placental tissue from infected animals with Leptospira interrogans serovar Pomona B. Brihuega, A. Venzano, J. Diodati, A. Boffi, D. Funes, C. Auteri, G. Romero, L. Samartino 68

New instructions to authors 69

* In English Editorial ISSN 0325-7541 EDITORIAL Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 1-3

Microorganismos del suelo y sustentabilidad de los agroecocistemas

El suelo es un recurso viviente y dinámico que condiciona la producción de alimentos. Su calidad tiene un papel fundamental en el mantenimiento del balance entre producción y consumo de dióxido de carbono en la biosfera. El suelo no sólo es la base para la agricultura, sino que de él depende toda la vida del planeta. La mayor parte de las etapas de los ciclos biogeoquímicos tienen lugar en él (9). La actividad microbiana del suelo (o edáfica) da cuenta de las reacciones bioquímicas que se suceden dentro de este complejo y heterogéneo sistema. Los cambios en la tasa de circulación del carbono y de los nutrientes minerales en el suelo como consecuencia de las interacciones entre las plantas y otros organismos involucran modificaciones en la estructura y el funcionamiento de sus comunidades bióticas. En un ecosistema, la pronta respuesta de los procesos microbianos y de la estructura de las comunidades a las alteraciones físicas, químicas y biológicas constituye un aspecto central de la calidad del suelo. Los cambios en la estructura de las comunidades microbianas en sistemas perturbados generalmente

están asociados a emisiones de gases con efecto invernadero (CO2, NO o N2O) y a la pérdida del N por lixiviación (8). El manejo agrícola convencional, que incluye el excesivo uso de maquinaria, ha incrementado la erosión del suelo y la concentración de dióxido de carbono atmosférico, y en consecuencia, el calenta- miento global. La aplicación de sistemas de manejo con uso reducido o nulo de maquinaria ha sido una estrategia para revertir este proceso de deterioro de los suelos (6), y los productores argentinos la han adoptado en forma generalizada, sobre todo en la región pampeana. Sin embargo, esta alternativa no es suficiente para garantizar la sustentabilidad. Desarrollar sistemas de manejo sustentable conlleva una gran dificultad, pues es preciso considerar las demandas sociales vinculadas con la eficiencia en el uso del recurso y la capacidad de mantener un balance favorable (4). Hiperdensidad e hiperdiversidad son los dos aspectos fundamentales que caracterizan a las comunidades microbianas del suelo. La cantidad de microorganismos en un gramo de suelo puede variar entre 107 y 109 células, mientras que algunas estimaciones indican la posibilidad de que haya al menos 104 especies microbianas distintas por gramo de suelo (13). La biodiversidad es una propiedad que condiciona la capacidad de recuperación del sistema edáfico ante una alteración y que le asegura su estabilidad funcional (7). Además, brinda la posibilidad de obtener microorganismos con capacidad de promover el crecimiento de los cultivos de tal manera que la sustentabilidad de los agroecosistemas se vea favorecida por diversos mecanismos (1, 2, 12). La práctica de inoculación de semillas ha sido incorporada a los sistemas de cultivos en Argentina desde hace muchos años en las asociaciones Rhizobium‑leguminosa. En nuestro país, casi el 90% de los cultivos de soja son inoculados con bacterias del género Bradyrhizobium y la especie más utilizada es B. japonicum. De esta manera se logra el establecimiento de la simbiosis bacteria‑planta. Esta brinda al cultivo la posibilidad de obtener nitrógeno del aire mediante la fijación biológica por la actividad del complejo enzimático de la nitrogenasa, sólo presente en algunos procario- tes. En la actualidad, otras bacterias del suelo con capacidad de asociarse a plantas de cultivo se están aplicando con éxito. Entre ellas se destacan las de los géneros Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter y Azospirillum. Este último género es uno de los más estudiados y sobre el cual se han publicado numerosos artículos científicos y de divulgación. Esto se debe a que Azospirillum tiene la capacidad de colonizar diversas especies vegetales de manera endofítica y promover su crecimiento, nutrición y productividad a través de mecanismos tales como fijación biológica de nitrógeno y producción de fitohormonas. La capacidad de aumentar el rendimiento biológico de los cultivos se asocia a favorecer la sustentabilidad de los agroecosistemas, dado que se incrementa la cantidad de materia orgánica aportada al suelo a Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 1-3

través de residuos de cosecha y se reduce, en ciertas ocasiones, la necesidad de fertilización química. Con el objetivo de establecer el estado de situación respecto de su uso y de la investigación en torno al tema, la Subcomisión de Microbiología Agrícola y Ambiental de la AAM organizó el Primer Taller Inter- nacional sobre Azospirillum que se realizó en la ciudad de Córdoba en octubre de 2007. Con los aportes realizados por investigadores nacionales y extranjeros de gran trayectoria en la temática se editó un libro que abarca tanto temas de fisiología bacteriana como de respuesta agronómica (3). La aplicación de microorganismos se realiza a través de la utilización de inoculantes sobre las semillas y/o sobre el suelo, con el fin de establecer una asociación benéfica entre la planta y el microorganismo. Los inoculantes pueden ser monovalentes, es decir, contener un solo tipo de microorganismo, o polivalentes, cuando dos o más microorganismos están incluidos en su formulación. Aunque existen formulaciones sólidas en el mercado, actualmente el comercio nacional de inoculantes ha seguido la tendencia mundial de utilizar inoculantes líquidos, formulados de tal manera que la supervivencia del microorganismo en el inoculante pueda ser mantenida durante períodos prolongados, que pueden variar entre 6 y 18 meses desde el momento de su fabricación. La utilización adecuada y sin riesgos de estos productos microbiológicos requiere el cumplimiento de ciertos parámetros de calidad, que deberían ser observados por las empresas fabricantes y controlados por el ente regulador. Los inoculantes no deben aportar microorganismos no deseados ni posibles contaminantes, y las cantidades del microorganismo a aplicar deben estar en los niveles necesarios para garantizar su eficiencia. En este sentido, la red de control de inoculantes REDCAI de la División de Microbiología Agrícola y Ambiental (DIMAYA) de la AAM ha desarrollado procedimientos interlaboratorio para la aplicación de protocolos de consenso, que ya han sido publicados (10,11). La rizosfera, definida como la porción del suelo influenciada por las raíces vegetales, es el sitio de máxima interacción entre microorganismos edáficos y entre éstos y los cultivos. Por ello, el conocimiento detallado de este ambiente y la caracterización de su biodiversidad constituyen pilares fundamentales para lograr agroecosistemas sustentables. En este sentido, la DIMAYA organizó en octubre de 2010 el Primer Taller Internacional sobre Rizosfera, Biodiversidad y Agricultura Sustentable (TIRBAS). Éste se realizó en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y tuvo como objetivo generar un ámbito de discusión e intercambio de ideas, las cuales estas en forma resumida han sido plasmadas en el libro de resúmenes de las presentaciones brindadas por disertantes nacionales y extranjeros, el que conforma una actuali- zación exhaustiva en la temática (5). El logro y el mantenimiento de la sustentabilidad de los agroecosistemas deben ser objetivos perma- nentes en pos de mantener el recurso suelo en niveles de máxima calidad y salud. Todos los actores intervinientes tales como productores, fabricantes de insumos, investigadores y políticos tienen ese compromiso con las generaciones venideras. En ese sentido, la microbiología del suelo brinda la posibilidad de generar nuevos conocimientos, tanto básicos como aplicados, y de hacer valiosos aportes al desarrollo económico respetando el recurso natural.

INÉS EUGENIA GARCÍA DE SALAMONE Cátedra de Microbiología Agrícola Departamento de Biología Aplicada y Alimentos Facultad de Agronomía. Universidad de Buenos Aires Avda. San Martin 4453. Ciudad Autónoma de Buenos Aires E-mail: [email protected]

1. Antoun H, Prevost D. Ecology of plant growth promoting 3. Cassan FD, García de Salamone IE. Azospirillum sp.: Cell rhizobacteria. In: Siddiqui ZA, editor. PGPR: Biocontrol and physiology, plant interactions and agronomic research in Biofertilization. Dordrecht, Springer, 2006, p. 1-38. Argentina. Buenos Aires, Argentina, Asociación Argentina 2. Bashan Y, de-Bashan LE. Bacteria/Plant growth-promotion. de Microbiología, 2008. In: Hillel D, editor. ��Encyclopedia of soils in the environment. 4. Doran JW, Zeiss MR. Soil health and sustaintability: managing the Oxford,�� UK��,�� Elsevier, 2005, V�olume�� 1, p. 103-15. biotic component of soil quality. Appl Soil Ecol 2000; 15: 3-11. Editorial

5. García de Salamone IE, Cassan FD. Taller Internacional 10. REDCAI Control de Calidad de Inoculantes en Legumino- sobre Rizosfera, Biodiversidad y Agricultura Sustentable. sas. Documento de Procedimientos Nº 1. Subcomisión Buenos Aires, Argentina , Asociación Argentina de Micro- de Microbiología Agrícola y Ambiental (SMAYA), Aso- biología, 2010. ciación Argentina de Microbiología, 2006. Buenos Aires, 6. Grandy AS, Robertson GP, Thelen KD. Do productivity and Argentina. environmental trade-offs justify periodically cultivating no-till 11. REDCAI Control de Calidad de Inoculantes que contie- cropping systems? Agron J 2006; 98: 1377-83. nen Azospirillum. Documento de Procedimientos No 2. 7. Griffiths BS, Bonkowski M, Roy J, Ritz K. Functional stability División de Microbiología Agrícola y Ambiental (DIMAYA), substrate, utilisation and biological indicators of soil following Asociación Argentina de Microbiología, 2010. Buenos environmental impacts. Appl Soil Ecol 2001; 16: 49-61. Aires, Argentina. 8. Jackson LE, Calderonb FJ, Steenwertha KL, Scow KM, 12. Reed MLE, Glick BR. Applications of free living plant Rolston DE. Responses of soil microbial processes and growth-promoting rhizobacteria. Antonie van Leeuwen- community structure to tillage events and implications for hoek 2004; 86: 1-25. soil quality. Geoderma 2003; 114: 305-17. 13. Torsvik V, Øvreås L, Thingstad TF. Prokaryotic diversity 9. Paul EA, Clark FE. Soil Microbiology and Biochemistry. - magnitude, dynamics, and controlling factors. Science San Diego, CA, Academic Press Inc., 1996. 2002; 296: 1064-6. Revista Argentina de Microbiología ISSN(2011) 0325-75 43: 44-81 ARTÍCULO ORIGINAL Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 4-8

Optimización de metodologías de cribaje para la búsqueda de Streptococcus agalactiae en embarazadas

Silvia E. Montibello1, Liliana I. Guelfand1, Mónica G. Machaín2, NATALIA A. Carrión3, María D. Ferreira2, Juan C. Pidone3, María E. Ceregido2, Sara C. Kaufman1, Rolando N. Soloaga3*

1Laboratorio de Bacteriología del Hospital “Juan A. Fernández”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires; 2Laboratorio de Bacteriología del Hospital Piñeyro, Junín, Pcia. de Buenos Aires; 3Laboratorio de Microbiología del Hospital Naval “Pedro Mallo”, Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina *Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN Streptococcus agalactiae es una causa importante de morbimortalidad en mujeres embarazadas y neonatos en todo el mundo. El objetivo del presente trabajo fue determinar la utilidad del medio cromogénico chromID Strepto B de bioMérieux para detectar S. agalactiae en embarazadas cuando la muestra es sembrada directamente en dicho medio o después del enriquecimiento en caldo de Todd Hewitt selectivo, opciones que se compararon con la metodología propuesta por el CDC. Se analizaron 1924 hisopados, 962 de introito vaginal y 962 rectales, correspondientes a 962 embarazadas entre la semana 35 y 37 de gestación, asistidas en distintos hospitales. Los hisopados se sembraron directamente en el medio chromID Strepto B (CR) y luego se colocaron en un caldo de Todd Hewitt selectivo, suplementado con 15 μg/ml de ácido nalidíxico y 10 μg/ml de colistina (CTH-sel). Luego de 24 h de incubación, se realizaron subcultivos en el medio CR y en agar con 5% de sangre de carnero (ASO). La prevalencia global de S. agalactiae fue de 17,4%. La sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivo y negativo del subcultivo en CR del material desarrollado en el CTH-sel fueron 98,8%, 100%, 100% y 99,7% respectivamente, con una incubación de 48 h. Los valores correspondientes de la siembra directa fueron 57,8%, 100%, 100% y 90%. La sensibilidad del subcultivo en ASO del material desarrollado en el CTH-sel fue del 85%. Se destaca el excelente rendimiento del subcultivo en CR luego del enriquecimiento en caldo de Todd Hewitt selectivo en comparación con el método propuesto por el CDC.

Palabras clave: Streptococcus agalactiae, embarazo, cribaje

ABSTRACT Optimization of screening methodologies for the detection of Streptococcus agalactiae in pregnant women. Streptococcus agalactiae is a significant worldwide cause of morbidity and mortality in pregnant women and their new- born infants. The objective of this work was to determine the usefulness of bioMrieux chromogenic medium chromID Strepto B (CR) for detecting S. agalactiae in pregnant women from the selective Todd-Hewitt broth (sel-THB) against the methods proposed by the CDC. A total of 1924 swabs were analyzed, 962 from vaginal introitus and 962 rectal, belonging to 962 women in weeks 35-37 of pregnancy. The swabs were directly seeded in CR. Both swabs were later placed in sel-THB with 15 μg/ml supplement of nalidixic acid and 10 μg/ml colistin. After 24 h of incubation, subcultures in CR medium and agar containing 5% sheep blood (SBA) were performed. The prevalence found was 17.4%. Sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of sel-THB subcultures with CR supplement and 48 h incubation were: 98.8, 100, 100 and 99.7%, respectively. The corresponding values of direct harvest of the sample were 57.8, 100, 100, and 90%, respectively. Sensitivity of sel-THB in SBA was 85%. Sel-THB subculture performance in CR was outstanding in comparison with the method proposed by the CDC. Key words: Streptococcus agalactiae, pregnancy, screening

INTRODUCCIÓN un patógeno humano, dado que se había convertido en una causa frecuente de infección entre las mujeres Streptococcus agalactiae fue comunicado por primera en etapa de posparto y los neonatos febriles (3-7, 11, vez como patógeno humano en 1938 por Fry (13), quien 22, 23). describió tres casos de sepsis puerperal fatal. Algunos Este microorganismo integra la flora comensal intesti- años antes, Lancefield y Hare (17) habían identificado a nal, principal reservorio, y en forma intermitente coloniza estos microorganismos en cultivos vaginales de puérperas el área perineal y el tracto genital. La prevalencia de la asintomáticas. colonización orofaríngea es baja (aproximadamente 5%), Hacia comienzos de los años 70, ya no se pudo pa- pero puede llegar al 20% en los hombres homosexuales sar más por alto la importancia de S. agalactiae como (1-8, 11, 14, 16, 18, 23, 24). S. agalactiae en embarazadas

En pacientes adultos con el sistema inmunológico alte- A las colonias sospechosas, rojas en CR y grises que pre- rado, como diabéticos, cirróticos, alcohólicos, dializados, sentaran o no b-hemólisis en ASO, se les realizó la coloración de Gram y las pruebas de catalasa, bilis esculina, CAMP, hidrólisis personas que viven con el virus de la inmunodeficiencia de hipurato y aglutinación con partículas de látex para estrepto- humana y personas con anormalidades neurológicas cocos del grupo B (12, 21). (accidente cerebrovascular, demencia, paraplejía o Siguiendo las recomendaciones del fabricante, las colonias cuadriplejía) o con úlceras por decúbito, es responsable púrpuras o blanquecinas no fueron consideradas. Se consideró como valor de referencia o “patrón de oro” al de enfermedades tales como artritis, osteomielitis, bac- resultado total de cultivos positivos obtenidos en CR y en ASO teriemia, endocarditis, neumonía, meningitis, infecciones a partir de los subcultivos provenientes del CTH-sel. urinarias, uretritis no gonocócica (en el hombre), fiebre Se realizó el cálculo de la sensibilidad, la especificidad, el va- de origen desconocido e infecciones de piel y partes lor predictivo positivo y el valor predictivo negativo sobre la base de la prueba t de Student. Para ello, se definieron las siguientes blandas. Otras formas inusuales son el absceso mamario categorías de cultivos: en mujeres que no se hallan en el período de lactancia, - Verdaderos positivos: presencia de colonias rojas/rosadas el absceso epiglótico, el aneurisma micótico de la arteria en CR subcultivado desde CTH-sel, con confirmación de la femoral, el absceso hepático, la peritonitis, la queratitis, identidad como S. agalactiae por las pruebas bioquímicas antes mencionadas y por la prueba de aglutinación con partículas de la endoftalmitis y la infección del cable de marcapasos látex para S. agalactiae. (11, 23). - Verdaderos negativos grupo B (bioMérieux): cultivo negativo Los objetivos de este trabajo fueron: a) comparar la (sin desarrollo o con colonias púrpuras o blanquecinas) en CR y prevalencia de colonización por S. agalactiae en mujeres cultivo negativo en ASO, ambos subcultivados desde CTH-sel. - Falsos positivos: presencia en CR de colonias rojas/rosa- embarazadas entre la semana 35 y 37 de gestación asis- das cuya identidad como S. agalactiae no pudo corroborarse tidas en 3 hospitales diferentes; b) determinar la utilidad mediante las pruebas bioquímicas efectuadas ni por aglutinación del medio cromogénico chromID Strepto B de bioMérieux con partículas de látex. en la detección de S. agalactiae bajo dos estrategias - Falsos negativos: cultivo negativo en CR (sin desarrollo o con colonias púrpuras o blanquecinas) y cultivo positivo en ASO, metodológicas comparadas con la metodología propuesta con confirmación de la identidad comoS . agalactiae mediante las por el CDC y establecer el tiempo óptimo de incubación; pruebas bioquímicas y la aglutinación con partículas de látex. c) comparar el rendimiento de las muestras vaginales con las rectales y de ambas combinadas en lo que hace a la Criterios de exclusión No fueron incluidas en el estudio aquellas pacientes que no posibilidad de documentar la portación de S. agalactiae. hubieran dado su consentimiento para la toma de las muestras; th Este estudio fue presentado en parte en el 20 Eu- también se excluyeron las muestras no pareadas y las que no ropean Congress of Clinical Microbiology and Infectious cumplieron con los requisitos de transporte mencionados. Diseases, Viena, Austria, abril 2010. RESULTADOS MATERIALES Y MÉTODOS I) Prevalencia Población estudiada Se aisló S. agalactiae de 168 pacientes, lo que implica En los servicios de Bacteriología del Hospital “Juan A. Fernández” y del Hospital Naval “Pedro Mallo”, ambos de la una prevalencia global de 17,4%; sin embargo, cuando Ciudad Autónoma de Buenos Aires, y del Hospital Piñeyro de la este parámetro se analizó separadamente por hospital, ciudad de Junín, Provincia de Buenos Aires, se realizó un estudio se encontraron valores dispares, con una prevalencia del prospectivo observacional para lo cual se analizaron 1924 hiso- 26,2% (47/179 pacientes) en el Hospital Naval, del 11,7% pados, 962 de introito vaginal y 962 rectales correspondientes a 962 embarazadas que se encontraban entre la semana 35 y 37 de (35/297 pacientes) en el Hospital Piñeyro y del 17,7% gestación. Las muestras fueron remitidas al laboratorio en el medio (86/486 pacientes) en el Hospital Fernández (p=0,001 y de transporte de Stuart, dentro de las 24 h de obtenidas. p=0,04, respectivamente); las diferencias en prevalencia entre las poblaciones estudiadas en el Hospital Fernández Procesamiento bacteriológico Un subgrupo de hisopados vaginales y rectales correspon- y el Hospital Piñeyro no fueron significativas (p=0,09). dientes a 665 pacientes se sembraron directamente en el medio cromogénico chromID Strepto B (bioMérieux, Marcy l’Etoile, II) Comparación de métodos Francia) (en adelante, CR); este material se incubó en aerobiosis a) Rendimiento del subcultivo en CR y en ASO del a 37 °C durante 24 h. De no observarse colonias sospechosas de S. agalactiae en ese plazo, la incubación se prolongó 24 material previamente desarrollado en el CTH-sel h más. Todos los hisopos se colocaron luego en un caldo de De las 168 pacientes en las que se detectó S. agalactiae, Todd Hewitt suplementado con 15 μg/ml de ácido nalidíxico y 166 produjeron aislamientos a partir de uno o de ambos 10 μg/ml de colistina (CTH-sel) (Laboratorios Britania, Buenos tipos de hisopado (vaginal y rectal) subcultivados en CR Aires). Luego de 24 h de incubación, se realizaron subcultivos en el medio CR y en agar tripticasa soja con 5% de sangre de luego del cultivo inicial en CTH-sel (sensibilidad: 98,8%), carnero (ASO) (bioMérieux). Nuevamente, las placas de CR se en tanto que sólo 143 los produjeron en ASO (sensibilidad: examinaron a las 24 h, y de ser negativas se incubó un día más; 85,1%) a partir del mismo caldo (p < 0,0001). las placas de ASO se observaron a las 24/48 h. Las muestras Siguiendo la indicación del fabricante de considerar del resto de las pacientes (n: 297) se colocaron directamente en el CTH-sel y luego se continuó con su procesamiento, tal como sólo las colonias rojo/rosadas, no se observaron falsos se describió para las otras muestras. positivos con el medio CR (especificidad: 100%). Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 4-8

b) Rendimiento comparativo del medio CR en siembra bacteriológico, los cuales permiten aumentar la recupe- directa y en subcultivo ración en un 50% (2-7, 14, 16, 18, 24). Otro factor que En segundo lugar, se comparó la sensibilidad de la influye en los resultados es el tipo de muestra analizada. siembra directa en CR y de los subcultivos desde el De hecho, en algunos estudios un número significativo CTH-sel a ASO y a CR. Del subgrupo de 665 pacientes de pacientes no tiene realizado ambos hisopados (vagi- cuyos hisopados se cultivaron de las dos maneras (en nal y rectal), lo que puede disminuir la sensibilidad en la siembra directa y como subcultivos) se obtuvo un total recuperación (2-7, 14). de 133 cultivos positivos para S. agalactiae. De estos, Estos niveles de prevalencia y la considerable varia- 77 fueron detectados por la siembra directa en CR y 131 bilidad ya descrita se han verificado en nuestro estudio, a partir del subcultivo en CR del material desarrollado en donde se observaron notables diferencias según el hos- CTH-sel, lo que brinda valores de sensibilidad de 57,9% pital considerado (rango: 11,7% al 26%), pese a que la para la primera estrategia y del 98,5% para la segunda metodología empleada fue uniforme. Es posible que estas (p < 0,00001). Los valores predictivos positivo y negativo obedezcan a diferencias en las poblaciones estudiadas. del subcultivo en CR desde el CTH-sel fueron 100% y La colonización de la membrana mucosa en los re- 99,7%, en tanto que para la siembra directa en CR, estos cién nacidos es el resultado de la transmisión vertical valores fueron 100% y 90%, respectivamente. del microorganismo desde la madre, ya sea en el útero c) Tiempo óptimo de incubación en CR siguiendo la vía canalicular ascendente o en el momento La incubación de las placas con CR durante 48 h, del parto. Un inóculo genital elevado en el momento del sembradas como subcultivo desde el CTH-sel permi- parto aumenta de modo significativo la posibilidad de tió detectar a 166 de las 168 pacientes portadoras de transmisión vertical (2-8, 11). S. agalactiae, pero sólo a 70 de estas en las primeras 24 Además de la exposición materna durante el parto, h de incubación. Con una incubación de 24 h, esta meto- en algunas ocasiones se puede producir la colonización dología tuvo 42% de sensibilidad, 100% de especificidad, de origen intrahospitalaria en el recién nacido, sobre 100% de valor predictivo positivo y 89% de valor predic- todo cuando las condiciones de trabajo en la enfermería tivo negativo; en tanto que los valores correspondientes promueven la transmisión horizontal (11). con una incubación de 48 h fueron 98,8%, 100%, 100% La tasa de transmisión vertical es del 50%, y de estos y 99,7%, respectivamente. Se observó una diferencia recién nacidos colonizados, el 1% a 2% desarrolla infec- significativa con la incubación de 48 h con respecto a la ción clínica (3% de los nacidos vivos). Aproximadamente de 24 h (p < 0,00001). el 25% de estas infecciones ocurre en prematuros (3, 6, 7, d) Rendimiento de los distintos tipos de muestra 11). En algunos estudios, la tasa de incidencia entre los En 82 de las 168 pacientes que resultaron ser porta- años 1998 y 2000 fue de 0,5 a 0,6 por 1000 nacimientos, doras de S. agalactiae, (49%, IC 95%: 12-31) se obtuvo nuevamente con oscilaciones vinculadas con variables desarrollo sólo a partir del hisopado rectal, en 51 (30%, IC étnicas y geográficas (4, 7, 14, 18, 19). 95%: 20-41) a partir de la muestra rectal y vaginal y en 35 Varios factores obstétricos se asocian a un mayor (21%, IC 95%: 12-31) sólo desde el hisopado vaginal, lo riesgo de infección neonatal, fundamentalmente la prema- que documenta un rendimiento del cultivo vaginal signifi- turez (< 7 semanas), la rotura prematura de membranas cativamente inferior al del cultivo rectal (p < 0,00001). (> 18 h), la presencia de fiebre intraparto (> 38 °C), el antecedente de haber tenido ya un hijo con infección por DISCUSIÓN S. agalactiae y la bacteriuria por dicho microorganismo durante el embarazo (3, 6, 7, 11). Asimismo, un bajo nivel S. agalactiae es uno de los microorganismos habitua- de anticuerpos maternos anti-S. agalactiae incrementa la les del intestino; desde allí puede colonizar el tracto genital probabilidad de enfermedad invasiva en el recién nacido. femenino y convertirse en un factor de riesgo determinante Se han observados niveles mayores de 2 μg/ml de anti- en mujeres embarazadas, dada la posibilidad de transmi- cuerpos maternos en el 15% de las mujeres colonizadas sión al recién nacido (1, 3-8, 11, 16, 22-24). y en el 4% de las mujeres no colonizadas (3, 6, 7, 11). En la embarazada, S. agalactiae puede dar origen a Las infecciones neonatales pueden ser de comienzo infección urinaria, corioamnionitis, endometritis posparto, temprano o de presentación tardía (11). infección de la herida quirúrgica poscesárea, endocarditis Los Centers for Disease Control and Prevention (CDC), y fiebre (3-8, 11, 22, 23). la American Academy of Pediatrics (APO) y el American Según la bibliografía internacional, la prevalencia de College of Obstetrician and Gynecologists (ACOG) publi- S. agalactiae en este grupo de mujeres se encuentra caron las siguientes recomendaciones para la prevención entre el 10% y el 40% (1-7,18, 23); en Argentina oscila de la infección neonatal por S. agalactiae: 1) realizar entre el 5% y el 18% (10, 14). Estas variaciones en la cultivos vagino-rectales entre las semanas 35 y 37 de prevalencia de colonización asintomática se relacionan gestación, para luego administrar profilaxis intraparto a con la población estudiada y con la utilización o no de todas las portadoras de S. agalactiae; y 2) administrar medios de enriquecimiento y selectivos para el estudio de manera empírica profilaxis a todas las gestantes que S. agalactiae en embarazadas presenten factores de riesgo. Independientemente de la modo similar a lo encontrado por Rosa-Fraile et al. (20) estrategia empleada, se recomienda profilaxis antibiótica, respecto del medio de Granada, con esta metodología sin necesidad de realizar ningún muestreo, en todas las disminuyen los tiempos de informe en al menos 24 h, mujeres que ya han tenido un hijo con infección por S. dado que no son necesarias las pruebas bioquímicas. La agalactiae y en aquellas con bacteriuria (recuentos > 103 especificidad del medio CR considerando las colonias de UFC/ml) por este microorganismo durante el embarazo color rojo ladrillo es de 100%; una observación importan- (2-8). Estas guías fueron modificadas posteriormente y te es que no se deben tener en cuenta las colonias de ahora se recomienda realizar un cribaje que comprenda color púrpura o rojo-blanquecinas, tal como indican las a todas las mujeres embarazadas (35-37 semanas de recomendaciones del fabricante. gestación), y dejar la metodología basada en los factores La menor sensibilidad del método clásico puede aso- de riesgo sólo para aquellas mujeres que llegan al parto ciarse con la existencia de muestras donde un alto inóculo sin conocer su estado de colonización (2-8). de enterococos o de bacilos gram negativos “enmascara” La profilaxis con penicilina o ampicilina comenzada el crecimiento de S. agalactiae. al menos 4 h antes del parto interrumpe la transmisión La siembra directa en CR mostró una sensibilidad muy vertical y previene la infección neonatal, con lo que la baja; no obstante ello, el valor predictivo positivo y la es- incidencia se reduce hasta el 0,6-0,8‰ (4, 6, 7-9, 21). pecificidad fueron excelentes y, al reducir en casi 48 h el En la República Argentina, la Ley nº 26369 promulga- tiempo de informe con respecto al método clásico, tendría da en 2008 establece la obligatoriedad de realizar dichos importancia en los casos de urgencia. La indicación del cultivos en todas las embarazadas dentro del período fabricante es realizar el subcultivo del CTH-sel a CR. gestacional señalado. La sensibilidad del cultivo en placas de CR con 24 h de Es importante tener en cuenta que el aislamiento de S. incubación fue significativamente menor que la correspon- agalactiae en los controles prenatales depende del sitio diente a las 48 h (42% versus 98,8%). Sin embargo, en de búsqueda, del uso de medios selectivos y de enrique- el 42% de las pacientes ya se podría haber informado en cimiento para procesar los cultivos y de las semanas de ese momento el resultado positivo para S. agalactiae; esto gestación (1, 2, 5,14-16, 18, 20, 23-24). significa una disminución de al menos 24 h con respecto Habitualmente se toma como método de referencia lo al método propuesto por el CDC (7). sugerido por el CDC, esto es, sembrar las muestras en Nuevamente es importante resaltar que no se debe un caldo selectivo, como el de Todd Hewitt suplementado dar un resultado negativo antes de las 48 h de incuba- con gentamicina (8 μg/ml) o colistina (10 μg/ml) y ácido ción, lo que concuerda con las recomendaciones del nalidíxico (15 μg/ml); estas guías también sugieren el uso fabricante. de medios comerciales como el caldo TransVag suple- Las guías del CDC (2-8) establecen la necesidad de mentado con 5% de sangre desfibrinada de carnero o el tomar tanto muestras vaginales como rectales para mejo- caldo LIM (5). Los caldos deben incubarse durante 18-24 h rar el rendimiento del cultivo. Esto también fue establecido a 35 ºC en atmósfera aeróbica o con 5% de CO2; luego se por diversos estudios como el de García et al. (14), en el deben subcultivar en placas con agar sangre de carnero que además se documentó que las muestras de introito (ej. agar tripticasa soja con 5% de sangre desfibrinada de vaginal tenían un rendimiento significativamente mayor carnero), las cuales se deben inspeccionar a las 24 h y, si que las de fondo de saco vaginal. no se observan colonias sospechosas de S. agalactiae, Los datos que se presentan aquí son coincidentes se vuelven a incubar durante 24 h adicionales (5). con lo publicado con anterioridad y demuestran que es Sin embargo, existen otras posibilidades que presentan absolutamente necesario contar con la muestra rectal y el mismo rendimiento que la metodología citada o incluso la vaginal. Sin embargo, nuestros datos discrepan del mayor. Rosa-Fraile et al. (20) demostraron que el medio trabajo de García et al. antes citado, en el aspecto de de Granada, en el que S. agalactiae presenta colonias que encontramos una diferencia importante a favor de de color naranja, tenía la misma sensibilidad en muestras la muestra rectal comparada con la vaginal; esto podría vaginales y mayor sensibilidad en muestras vagino-rec- deberse a las diferencias en las metodologías empleadas tales que la metodología propuesta por el CDC (7). Por o en las poblaciones estudiadas. otra parte, este medio disminuye el tiempo de informe en Frente a la necesidad de disminuir costos, el CDC su- al menos 24 h y también la carga de trabajo del laborato- giere que los hisopos correspondientes a ambas muestras rio, al hacer innecesario el uso de pruebas bioquímicas. se pueden colocar en el mismo tubo de transporte, el cual Otros estudios presentaron datos similares a los citados puede mantener su viabilidad hasta 4 días a temperatura (2, 15, 18, 20). Cabe aclarar que en el momento en que ambiente o a 4 °C (6, 7). Las muestras de endocérvix no fue realizada esta investigación, no se disponía en la se recomiendan, y no se debe utilizar espéculo para la Argentina del medio comercial de Granada. obtención del material (5, 7). Los resultados del presente estudio indican que el medio Este es el primer trabajo en el que se compara el ren- CR sembrado a partir del CTH-sel es significativamente dimiento del medio CR a diferentes tiempos de incubación más sensible que la metodología clásica. Además, y de con la metodología propuesta por el CDC. Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 4-8

En conclusión, la sensibilidad del medio CR sembrado intrapartum ampicillin and prevention if vertical transmission desde el caldo de Todd Hewitt selectivo fue excelente of group B Streptococcus. Obstet Gynecol 1998; 91: 112-4. 10. di Bartolomeo S, Gentile M, Priore G, Valle S, Di Bella A. en comparación con la calculada con la metodología Streptococcus agalactiae en embarazadas. Prevalencia propuesta por el CDC, de modo que dicha estrategia en el Hospital Nacional Alejandro Posadas.�� Rev Argent resulta recomendable siempre y cuando se incube hasta Microbiol 2005; 37: 142-4. 48 h antes de descartar el material como negativo y se 11. Edwards M, Baker C. Streptococcus agalactiae. En: Mandell G, Bennett J, Dolin R, editores. Enfermedades Infecciosas, siembren tanto la muestra rectal como la vaginal. Los Principios y Práctica. Buenos Aires, Editorial Médica Pana- resultados positivos a las 24 h ya pueden ser informa- mericana, 2004, p. 2615-28. dos, lo que podría ser relevante en algunos casos de 12. facklam R. What happened to the streptococci. Overview of urgencia. taxonomic and nomenclature changes. Clin Microbiol Rev 2002; 15: 613-30. 13. fry R. Fatal Infections by haemolytic Streptococcus group Los autores agradecen la colaboración Agradecimientos: B. Lancet 1938; 1: 199-201. brindada por los Servicios de Ginecología y Obstetricia del 14. García SD, Eliseth MC, Lazzo MJ, Copolillo E, Barata Hospital Naval “Cirujano Mayor Dr. Pedro Mallo” y del Hospital AD, de Torres R, Vay CA, Famiglietti AM. Portación de General de Agudos “Dr. Juan Fernández”. Rolando Soloaga estreptococos grupo B en mujeres embarazadas. Rev�� se desempeña en la actualidad como Asesor de la Empresa Argent Microbiol 2003; 35: 183-7. Biomérieux Argentina. 15. Kelly VN, Garland SM. Evaluation�� of new Granada medium (modified) for the antenatal screening of group BStreptococcus . BIBLIOGRAFÍA Pathology 1994; 26: 487-9. 16. Kubota T, Nojima M, Itoh S. Vaginal bacterial flora of preg- 1. Alsina-Manrique L, Iriondo M, Muñoz-Almagro C, Borrás M, nant women colonized with group B streptococcus. J Infect Pou J, Juncosa T, Jiménez R. Evaluación de la aplicación Chemother 2002; 8: 328-30. del cribado de estreptococos del grupo B para la preven- 17. Lancefield R, Hare R. The serological differentiation of patho- ción de la infección perinatal en un hospital de tercer nivel. genic and non-pathogenic strains of hemolytic streptococci Enferm Infecc Microbiol Clin 2006; 24: 505-8. from parturient women. J�� Exp Med 1935; 61: 335-49. 2. block T, Munson E, Culver A, Vaughan K, Hryciuk J. 18. Montague NS, Cleary TJ, Martinez OV, Procop GW. 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Recibido: 10/08/10 – Aceptado: 26/01/11 Diagnóstico de pseudotuberculosis por ELISA ISSN 0325-7541 ARTÍCULO ORIGINAL Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 9-17

D��esarrollo� �de� ��una� ��prueba� �de� �E��LI�S�A ��para� ��detectar� ��anticuerpos� en carneros vacunados o infectados con Corynebacterium pseudotuberculosis

JUAN J. SOLANET1, ROSANA MALENA2, SILVIA M. ESTEIN3, SILVIA ESTEVAO BELCHIOR4, FERNANDO A. PAOLICCHI2, 5*

1Residencia Interna en Salud Animal, Departamento de Producción Animal, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA); 2Laboratorio de Bacteriología, Departamento de Producción Animal, INTA Balcarce; 3Laboratorio de Inmunología, Departamento de Sanidad Animal y Medicina Preventiva, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires, Tandil; 4Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco, Comodoro Rivadavia, Chubut; 5Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Mar del Plata, Balcarce, Argentina *Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN El objetivo de este trabajo fue evaluar un ELISA indirecto desarrollado para medir la respuesta inmune humoral en carneros vacunados contra la linfoadenitis caseosa (LC) y/o desafiados con una cepa de Corynebacterium pseudotuberculosis homóloga. Se distribuyeron corderos de 4 meses clínicamente sanos en 4 grupos: grupo 1, corderos vacunados (G1, n = 5); grupo 2, corderos vacunados e inoculados (G2, n = 8); grupo 3, corderos inoculados (G3, n = 2); y grupo 4, control (G4, n = 2). Los animales del G1 y del G2 recibieron dos dosis de una bacterina experimental; los del G2 y del G3 fueron desafiados con una cepa de C. pseudotuberculosis cuatro semanas posvacunación. Se estudiaron por ELISA los títulos serológicos durante 7 meses y se efectuaron las necropsias en los grupos G2, G3 y G4. Se tomaron muestras de pulmón y linfonódulos para efectuar estudios bacteriológicos e histopatológicos. La cepa inoculada en los animales del G2 y del G3 reprodujo las lesiones macroscópicas y microscópicas típicas de la LC; ésta fue aislada del sitio de inoculación, de linfonódulos o de pulmón en 7/8 animales del G2 y en 2/2 animales del G3. La prueba de ELISA, con una sensibilidad del 98% y una especificidad del 100%, detectó diferencias significativas entre los serorreactores de los diferentes grupos experimentales y permitió establecer una relación con el tipo de tratamiento aplicado. Se concluye que el ELISA desarrollado puede ser una herramienta útil para identificar animales infectados y con clínica positiva a la LC. Palabras clave: linfoadenitis caseosa, Corynebacterium pseudotuberculosis, ELISA indirecto, ovinos

ABSTRACT Development of an ELISA test to detect antibodies in vaccinated sheep or infected Corynebacterium pseudotuberculosis�. The aim of this study was to evaluate an indirect specific ELISA developed for the detection of humoral immune response in vaccinated sheep and/or challenged with a Corynebacterium pseudotuberculosis strain. Healthy 4 month-old lambs were distributed into 4 groups: Group 1 immunized (G1, n = 5), Group 2 vaccinated/inoculated (G2, n = 8), Group 3 inoculated (G3, n = 2) and Group 4 control (G4, n = 2). Groups G1 and G2 received two doses of an experimental bacterin. Four weeks postvaccination, G2 and G3 groups were challenged with a C. pseudotuberculosis strain. Serological titers were studied by ELISA for 7 months and pathological studies were performed in groups G2, G3 and G4 by taking lung and lymph node samples for bacteriology and histopathology. The inoculated strain in G2 and G3 animals reproduced the macroscopic and microscopic lesions typical of caseous lymphadenitis (CL) and was isolated from the inoculation site, lymph nodes and/or lung in 7/8 animals from G2, and 2/2 animals of G3. The developed ELISA test had sensitivity and specificity of 98% and 100% respectively, detected significant differences between serological reactors of different experimental groups and allowed to establish a relationship with the type of treatment. We conclude that the developed ELISA may be a useful tool to identify infected animals with positive clinical CL.

Keywords: caseous lymphadenitis, Corynebacterium pseudotuberculosis, indirect ELISA, sheep

INTRODUCCIÓN Ovina Nacional N° 25 422 se ha incrementado el interés productivo orientado hacia los ovinos de lana fina y de En nuestro país, las existencias de ganado ovino han carne (18). Para que ese sector se expanda, es necesario disminuido en forma notable en las últimas décadas; se que las majadas presenten una salud productiva óptima estima que actualmente hay alrededor de 15,3 millones y que sean erradicadas las enfermedades que limitan el de cabezas. Sin embargo, con el advenimiento de la Ley comercio nacional e internacional. 10 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 9-17

La linfoadenitis caseosa (LC) o pseudotuberculosis ovi- estas últimas en el diagnóstico de LC en majadas, con na es una enfermedad infectocontagiosa ocasionada por resultados auspiciosos (3, 6). Para detectar la infección Corynebacterium pseudotuberculosis, una bacteria que en ovinos por C. pseudotuberculosis mediante pruebas de se caracteriza por producir lesiones caseosas-purulentas ELISA se han empleado diferentes componentes antigéni- en los linfonódulos y en otros tejidos, como el pulmón (2, cos, tales como extractos de la pared celular y exotoxina 24). Esta bacteria infecta principalmente a las especies purificada (fosfolipasa D) u obtenida de manera recom- ovina y caprina, aunque puede producir alteraciones en binante. En general, los métodos serológicos pueden los linfonódulos de otras especies animales y también en presentar la desventaja de dar resultados falsos positivos el hombre (10). La LC provoca cuantiosas pérdidas en la por producirse reacciones cruzadas con otros microorga- industria ovina mundial, ocasionadas por la reducción en nismos o cuando los animales han sido recientemente la ganancia de peso, el menor peso del vellón y la dismi- vacunados (12, 27). En Argentina no hemos registrado nución de la eficiencia reproductiva y de la producción de datos de relevamientos serológicos o de la aplicación de leche y lana, así como por el decomiso de las canales y ELISA en el diagnóstico de LC en ovinos naturalmente la depreciación de las pieles. Estos hechos impactan en infectados o desafiados con C. pseudotuberculosis. las exportaciones, pues disminuyen las posibilidades de El objetivo de este trabajo fue desarrollar y evaluar comercialización y el valor de las reses ovinas (1, 19). un ELISA indirecto utilizando un antígeno nativo para La LC es una enfermedad cosmopolita, ya que está medir los anticuerpos generados por la infección con presente en los cinco continentes y en casi todas las zonas C. pseudotuberculosis. Para ello se desarrolló un mo- geográficas definidas por la Organización Internacional delo experimental de infección controlada con la cepa de Epizootias (OIE) (24). En nuestro país se estima que homóloga, con el fin de estudiar la cinética de anticuer- existe una prevalencia cercana al 70% en áreas endémi- pos generada por el desafío o por la aplicación de una cas; asimismo, se han realizado algunos relevamientos bacterina. Además, se procesaron por el ELISA indirecto parciales de la situación de LC en estudios de frigorífico sueros de animales negativos o positivos con lesiones (12, 15, 23). La transmisión de esta enfermedad se pro- y aislamientos de C. pseudotuberculosis provenientes duce principalmente a través de las heridas provocadas de frigorífico. durante la esquila con cuchillas contaminadas con el material purulento de los abscesos (13), aunque existe MATERIALES Y MÉTODOS la posibilidad de infección a través del agua contaminada con el microorganismo en los baños antiparasitarios (25). Animales Se utilizaron 17 carneros Corriedale de 4 meses, sanos, pro- La LC ha sido reconocida como una enfermedad zoonóti- venientes de una majada clínicamente libre de LC de la reserva ca emergente y, aunque las infecciones en seres humanos ganadera N° 8 del INTA Balcarce, provincia de Buenos Aires. Los son raras, pueden presentarse casos de LC adquirida por animales fueron distribuidos al azar en 4 grupos experimentales de la siguiente manera: grupo 1, vacunado (G1; n = 5), grupo 2, exposición ocupacional o a través de lesiones cutáneas vacunado y desafiado (G2; n = 8), grupo 3, desafiado (G3; n = por contacto con animales enfermos (10, 17, 20). 2), y grupo 4, control sano (G4; n = 2). Los animales del G1 y G2 C. pseudotuberculosis es un cocobacilo gram-positivo, recibieron dos dosis de un inmunógeno experimental (bacterina). de 1-3 μm largo x 0,5-0,6 μm ancho, que desarrolla en A las 4 semanas posvacunación, los carneros del G2 y G3 fueron desafiados mediante inoculación en el rodete coronario con una agar sangre dentro de las 48 a 72 h de incubación a cepa virulenta de C. pseudotuberculosis. 37 °C formando colonias blancas, rodeadas por una tenue

ß-hemólisis (9, 12). Es un microorganismo intracelular Reactivación de la cepa y prueba de patogenicidad facultativo (11, 12) que pertenece al filo Actinobacteria, A) Reactivación de la cepa orden Actinomycetales, suborden Corynebacterineae y a La cepa indígena de C. pseudotuberculosis fue donada por el Centro Regional de Investigación y Desarrollo Tecnológico, la familia Corynebacteriaceae. Universidad Nacional Pontificia San Juan Bosco (Comodoro Riva- Posee varios factores de virulencia, entre ellos se in- davia, Argentina). Dicha cepa pertenece a la colección del banco de cluyen glucolípidos y ácidos micólicos de la pared celular cepas con denominación C. pseudotuberculosis cepa 15, tipificada y las exoenzimas fosfolipasa D y esfingomielinasa. por pruebas bioquímicas, moleculares (PCR) y secuenciación del gen 16S rDNA, con un 99% de homología con secuencias alineadas El análisis bacteriológico de la LC comprende la con las cepas de referencia C. pseudotuberculosis CIP102968T microscopía y la tinción de Gram y de Ziehl Neelsen y y C. pseudotuberculosis NCTC 3450 del GenBank. La cepa fue el cultivo de las muestras. La hemólisis sinérgica con reactivada mediante pasaje por un carnero Corriedale de 3 años, Rhodococcus equi y la inhibición de la b-hemolisina clínicamente sano, con el objetivo de reaislarla y emplearla como cepa desafío. de Staphylococcus aureus (CAMP y CAMP reversa) B) Pruebas de patogenicidad en carnero ponen en evidencia la producción de las exotoxinas de Para probar la patogenicidad de la citada cepa una vez reac- C. pseudotuberculosis. tivada e identificar el sitio más apropiado para la reproducción Además de los estudios clínicos, anatomopatológicos y experimental de la LC, se la inoculó en diferentes sitios en un carnero adulto clínicamente sano, según 3 protocolos de infec- bacteriológicos, existen otros métodos diagnósticos como ción experimental: I) en el espacio subcutáneo detrás de la oreja la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las prue- derecha (29), II) en el pliegue inguinal de la pata izquierda por bas serológicas (7, 14). Diversos autores han aplicado escarificación de la piel (29), y III) en el tejido subcutáneo de la Diagnóstico de pseudotuberculosis por ELISA 11 zona interdigital de la pata derecha (7). Como inóculo se utilizó fología de las colonias desarrolladas; aquellas blanquecinas y una suspensión bacteriana en una solución de tampón fosfato puntiformes (0,5 mm), rodeadas de un halo tenue de b-hemólisis, salino (PBS) pH 7,2; la concentración se ajustó según trabajos se seleccionaron para efectuar la tinción de Gram y las siguientes previos (7) utilizando la escala de McFarland. El inóculo se pruebas bioquímicas: ureasa; catalasa; fermentación de glucosa, transportó refrigerado y al abrigo de la luz hasta el lugar donde maltosa y ribosa; lactosa, manitol, sacarosa y xilosa; reducción se lo utilizó. Para el protocolo I se aplicó 1 ml del inóculo con de nitratos; hidrólisis de gelatina a 37 °C, movilidad; oxidasa y una concentración de 7,25 x 108 UFC/ml. Para el protocolo II se b-galactosidasa. Adicionalmente, se utilizaron las pruebas de escarificó la piel y se aplicó un hisopo que contenía alrededor hemólisis sinérgica a Rhodococcus equi (CAMP) y de inhibición de 10 colonias de la cepa tomadas directamente de la placa de la b-hemolisina de Staphylococcus aureus para detectar la de cultivo. Por último, para el protocolo III se aplicaron 3 ml del producción de fosfolipasa D (CAMP reversa) y así diferenciar inóculo con una concentración de 7,25 × 108 UFC/ml. El cálculo a C. pseudotuberculosis de otras especies de Corynebacterium final de la concentración bacteriana de los inóculos empleados (11). Para efectuar los estudios patológicos, las muestras obte- se efectuó mediante el recuento de microorganismos viables nidas de pulmón y linfonódulos se fijaron en formol tamponado sobre agar Columbia base. A las cuatro semanas de la inocu- al 10%, se incluyeron en parafina, se seccionaron (5 µm), se lación se realizó la necropsia del carnero, según el protocolo montaron en portaobjetos y se tiñeron con hematoxilina y eosina, tradicional empleado en INTA. Se revisaron los órganos y se según las técnicas histológicas de rutina. tomaron muestras de los linfonódulos poplíteo y prefemoral, de pulmón, de hígado y del material purulento formado en el Serología por ELISA espacio interdigital, para realizar estudios bacteriológicos. De El antígeno empleado para sensibilizar las placas de ELISA acuerdo con los hallazgos clínicos, patológicos macroscópicos fue elaborado con la misma cepa que se usó para el desafío. Ésta y de aislamiento bacteriano, se seleccionó el tejido subcutáneo fue cultivada en 500 ml de caldo tripticasa soya (Difco, EE.UU.) de la zona interdigital de la pata derecha como el sitio más ade- durante 72 h a 37 °C en agitador orbital a 50 rpm. El cultivo se cuado para realizar el desafío experimental, en coincidencia con centrifugó a 10 000 g durante 30 min y el pellet obtenido se re- el utilizado en otros trabajos. suspendió en 10 ml de PBS pH 7,2; este paso se repitió 2 veces más. Finalmente se resuspendió el pellet en PBS formolado Inmunización de los animales al 0,5% y se disgregó mediante un sonicador semiautomático Los animales de los grupos G1 y G2 fueron inmunizados a fin (Sonic Vibra Cell, Mod VCX130, EE.UU.) utilizando el siguiente de conocer los títulos serológicos desarrollados posvacunación, protocolo: tiempo, 15 seg; pulsos, 15/05; amplitud, 1 50%; tiempo para lo cual se aplicaron dos dosis de 3 ml de una bacterina total, 1 min 30 seg. Luego se determinó la concentración proteica no comercial, separadas por un intervalo de 4 semanas. La utilizando el kit BCA™ Protein Assay (Pierce, Reino Unido). El bacterina, compuesta por la cepa 15 de C. pseudotuberculosis antígeno se almacenó en alícuotas de 0,5 ml a -20 °C. Para el inactivada con 0,5% de formol tamponado a pH 7,2 y formulada desarrollo del ELISA, se adsorbieron placas de 96 pocillos (NUNC en hidróxido de aluminio, contenía antígeno somático de la citada Polysorp F-96; BATCH 054480) con 100 µl del antígeno por cepa en una concentración de 10 mg/ml. pocillo, a una concentración de 4 µg/ml. El antígeno se preparó en buffer carbonato/bicarbonato (15 mM de carbonato de sodio y Desafío de los animales 35 mM de bicarbonato de sodio) pH 9,6; se incubó durante toda A las 8 semanas del inicio del ensayo, los animales de la noche a 4 °C. Luego se añadió por duplicado a cada pocillo los grupos G2 y G3 fueron desafiados con la cepa 15 de 100 µl de los sueros en estudio diluidos 1:200. Se utilizaron en C. pseudotuberculosis. El inóculo para el desafío tuvo una cada placa dos sueros controles positivos de animales con le- concentración de 7,75 x 108 UFC/ml y fue aplicado en el tejido siones y con cultivo positivo de C. pseudotuberculosis, además subcutáneo de la zona interdigital de la pata derecha. A los de un suero control negativo proveniente de un carnero sano sin animales del G4 se les inyectó en el mismo sitio 3 ml de PBS inocular ni vacunar y negativo al cultivo de Corinebacterias. Se estéril pH 7,2. incubaron las placas durante toda la noche a 4 °C y se agregó el conjugado (100 µl) a cada pocillo en una dilución 1:3000 (Pro- Revisación clínica y toma de muestras teína G conjugada a peroxidasa, BioRad, USA). Las placas se Todos los animales fueron revisados desde el comienzo del incubaron luego a 37 °C durante 1 h. Posteriormente, en cada ensayo y cada 15 días por palpación externa de los linfonódulos pocillo se agregó 100 µl de una solución de trabajo de sustra- preescapulares, poplíteos y prefemorales, así como por inspec- to/cromógeno ABTS (2.2’-azino-di [3-etil-benzotiazolin sulfonato ción del sitio de inoculación, para comprobar lesiones clínicas de (6)] SIGMA), H2O2 30% y tampón citrato pH 4,5. Las placas se LC. Para la determinación de anticuerpos, en el G1 se realizaron mantuvieron en agitación constante durante 10 minutos hasta sangrías cada 15 días desde el comienzo del ensayo (día 0) el momento de lectura. La lectura de las placas se realizó en hasta los 45 días posvacunación, mientras que en los grupos un espectrofotómetro (Multiskan, Labsystem, Finlandia) con un G2, G3 y G4 se realizaron muestreos adicionales a los 90 días, filtro de 405 nm, utilizando el programa ELISA 2.20. Para una y luego en 4 oportunidades más hasta los 200 días, momento mejor interpretación de la sensibilidad (Se) y especificidad (Es) de finalización del ensayo. del ELISA, los resultados, obtenidos en densidad óptica (DO), se expresaron como porcentaje de positividad (PP) aplicando la Estudios bacteriológicos y patológicos siguiente la fórmula: Se realizó la necropsia de los animales de los grupos G2, G3 y G4 a las 28 semanas de iniciado el ensayo. Los ovinos PP = (promedio DO suero problema/promedio DO control positivo) × 100 del grupo G1 no fueron sometidos a necropsia al momento de finalizar el ensayo; sin embargo, fueron enviados a frigorífico 6 Para calcular la exactitud del ELISA se analizó la Se y la Es meses después y sus carcasas y órganos fueron inspeccionados mediante el método de la curva ROC utilizando el programa a fin de estudiar la presencia de lesiones o reacciones vacunales MedCalc (Versión 4.1, 1995). El cálculo de la sensibilidad y la adversas. Las muestras seleccionadas de los grupos G2, G3 especificidad de la prueba se obtuvo tomando sueros positivos y G4 correspondieron a los linfonódulos poplíteo, prefemoral, y negativos. El grupo positivo verdadero (A) estuvo represen- preescapular, pulmón, sitio de inoculación y contenido de los tado por los sueros de los ovinos desafiados y enfermos de LC, abscesos en los animales que presentaron estas lesiones. Las con aislamiento de la cepa de C. pseudotuberculosis (G2 y G3) muestras se cultivaron en agar sangre Columbia a 37 °C con pasados los 30 días posdesafío (A1), y por los 48 sueros de ovinos con LC y aislamiento positivo de C. pseudotuberculosis atmósfera de 10% de CO2 durante 48-72 h. Se observó la mor- 12 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 9-17 provenientes de un frigorífico localizado en un área endémica mientras que a las 4 semanas fue afectado el linfonódulo del sur del país (A2). El grupo negativo verdadero (B) estuvo poplíteo derecho. La necropsia realizada a las 10 sema- integrado por los sueros de los ovinos no inoculados (G4) y por 60 sueros de ovinos jóvenes y 40 de ovinos adultos, todos ellos nas posinculación reveló lesiones macroscópicas típicas clínicamente negativos a la LC y provenientes de la reserva nº 8 de LC en los linfonódulos poplíteo y prefemoral derechos, del INTA, libre de la enfermedad (B1), y por 244 sueros de ovinos con aumento del tamaño de hasta 5 veces comparado sanos, sin aislamiento de C. pseudotuberculosis, provenientes con el normal. En el sitio de inoculación detrás de la oreja de áreas geográficas libres de la enfermedad (B2). derecha, la lesión inicial se resolvió por encapsulación Análisis estadístico fibrosa, sin afectar los linfonódulos regionales. De los Se realizó un análisis de medidas repetidas en el tiempo linfonódulos con lesiones caseopurulentas se obtuvieron utilizando el procedimiento Mixed de SAS. Para comparar las cultivos puros de C. pseudotuberculosis. La histología diferencias medias de los tratamientos entre grupos se aplicó el test de Tuckey y Kramer. Para la expresión de las densidades reveló linfonódulos reactivos con fibroplasia, que con- ópticas del ELISA se utilizó el logaritmo del resultado expresa- tenían macrófagos, áreas de necrosis y mineralización, do en porcentaje de positividad (PP) del ELISA indirecto (SAS neutrófilos, células epitelioides y gigantes multinucleadas, Institute Inc, SAS online DOC 9.1.3, Cary, NC: SAS Institute observaciones que corroboran la patogenicidad de la Inc, 2002-2005). cepa inoculada.

RESULTADOS Hallazgos clínico-patológicos posdesafío Entre la segunda y la tercera semana posinoculación Reactivación de la cepa y pruebas de patogenicidad se detectó un incremento del tamaño en el linfonódulo La cepa 15 de C. pseudotuberculosis reaislada se cul- poplíteo derecho en los animales de los grupos G2 y tivó en agar sangre base Columbia (Oxoid). Al cabo de 72 G3, pero no en los animales de los grupos G1 y G4. Se h se obtuvieron colonias pequeñas de 1 mm de diámetro, realizaron las necropsias de los animales de los grupos de color blanco y consistencia seca, rodeadas de un halo G2, G3 y G4 a las 28 semanas de iniciado el ensayo. En 7 tenue de b-hemólisis. Las colonias correspondían a baci- de 8 animales del grupo G2 se detectó un agrandamiento los gram-positivos pequeños, agrupados en empalizadas, de 2 a 3 veces en los linfonódulos poplíteo y prefemoral lo que es característico de las corinebacterias. Para la derechos, los que contenían material caseopurulento. Am- identificación bioquímica se utilizó el sistema API®Coryne bos carneros del grupo G3 presentaron en el linfonódulo estandarizado para la identificación de bacterias corine- poplíteo derecho abscesos con áreas caseopurulentas; formes (API®Coryne, bioMérieux® S.A.). uno de ellos presentó focos caseosos en el hígado. La La cepa 15 de C. pseudotuberculosis inoculada en el histología reveló lesiones microscópicas típicas de LC carnero utilizado como preensayo produjo en los sitios similares a las descritas en otros trabajos (22). de inoculación lesiones caseopurulentas características de LC a partir de la primera semana. Tres semanas po- Hallazgos bacteriológicos sinoculación, el linfonódulo prefemoral derecho aumentó En la Tabla 1 se describen los aislamientos bacterio- su tamaño 3 veces respecto del homólogo izquierdo, lógicos obtenidos de los animales de los grupos G2 y

Tabla 1. Aislamiento de C. pseudotuberculosis a partir de tejidos afectados en los animales de los grupos experimentales G2 (vacunado / inoculado), G3 (inoculado) y G4 (control)

Animal nº Linfonódulo Linfonódulo Linfonódulo Sitio de Pulmón Abscesos (grupo) poplíteo prefemoral preescapular inoculación

1 (G2) + - - - - + 3 (G2) + - - - - - 5 (G2) + - + + + - 7 (G2) ------9 (G2) - - - - - + 11 (G2) + - - - - + 13 (G2) + - - - - + 15 (G2) - - - - + - 4 (G3) + - - - - - 8 (G3) + - + + + - 14 (G4) ------Diagnóstico de pseudotuberculosis por ELISA 13

Figura 3. Diagrama de dispersión. Porcentajes de positividad (PP) de los sueros positivos verdaderos y de los negativos utilizando el ELISA indirecto. Figura 1. Curvas de los anticuerpos desarrollados por los animales de los distintos grupos experimentales, expresados como Resultados serológicos. En la Figura 1 se muestran porcentaje de positividad (PP) del ELISA. Las flechas claras los resultados de los títulos de anticuerpos séricos de indican el momento de aplicación de la primera y la segunda dosis de la bacterina en los grupos G1 (vacunado) y G2 (vacunado / modo secuencial, cada 15 días, desde el día 0 hasta el inoculado). La flecha oscura indica el momento de la inoculación día 200 (fin del ensayo) en los diferentes grupos de ani- (G2 y G3). El grupo G4 ofició como control. Letras diferentes males. El análisis mediante el programa Medcalc para la indican diferencias significativas entre grupos (p < 0,001). elaboración de la curva ROC y el punto de corte expresado en PP ajustó un valor de 17,6%, con un 98% de Se y un 100% de Es. En la Figura 2 (área bajo la curva ROC) y en la Figura 3 (diagrama de dispersión del PP de los sueros positivos y negativos) se observa la discriminación entre los animales serorreactores al ELISA (desafiados e infectados naturalmente con C. pseudotuberculosis) y los animales negativos verdaderos (controles y sanos), teniendo en cuenta la distribución del PP para ambas poblaciones. Los valores promedio del PP en los grupos G2 y G3 mostraron diferencias cuando se los comparó con los promedios en los animales controles negativos, con una media de 46,5% (desvío estándar 12,7) versus una media de 11,1% (desvío estándar 7,1) en la población de ovinos seropositiva y seronegativa, respectivamente. Los grupos G1, G2, G3 y G4 presentaron en promedio resultados por debajo del 17% al inicio del ensayo (día 0); sin embargo, al finalizar el ensayo (día de necropsia), el promedio en el PP de los animales del G2 y del G3 presentó un aumento de al menos 4 veces como resultado de la respuesta inmune humoral generada por el desa- fío con la cepa 15 de C. pseudotuberculosis (Tabla 3 y Figura 1). Se observó que en el grupo G1, dos animales Figura 2. Área bajo la curva ROC del ELISA indirecto. El aná- presentaron un PP superior al punto de corte al finalizar lisis arroja un valor de 0,999 (error estándar 0,004) que indica la sensibilidad y especificidad de la prueba y el porcentaje de el ensayo, quizá como producto residual del estímulo positividad (PP) seleccionado como punto de corte (≥ 17,6%) antigénico de la bacterina usada. En los animales del para diferenciar entre sueros ovinos positivos y negativos. G2 se observó que 7 desarrollaron lesiones compatibles con LC y se aisló C. pseudotuberculosis de todos ellos; sin embargo, los 8 animales (100%) del grupo mos- G3 a partir de las muestras tomadas de los linfonódulos traron un PP mayor de 17,6% al final del ensayo. En afectados, del sitio de inoculación, del pulmón y de abs- los dos animales del G3 se encontraron lesiones de cesos hallados en el área posterior de la pierna y en el LC y aislamiento de C. pseudotuberculosis, y ambos hígado. Además, se detallan los resultados obtenidos presentaron un PP mayor de 17,6% que correspondió en los mismos órganos de las muestras tomadas de un al máximo título alcanzado. Uno de los animales del animal del grupo G4. grupo G4 murió durante el ensayo y fue excluido del 14 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 9-17

Tabla 2. Resumen de los hallazgos clínico-patológicos, bacteriológicos y serológicos en los distintos grupos experimentales al final del ensayo

Grupo Número (y %) de animales con Número (y %) de Número de serorreactores por (nº de animales) lesiones aislamientos obtenidos ELISA al final del ensayo tratamiento Macroscópicas Microscópicas PP < 17,6% PP > 17,6%

G1 (n = 5) ------3 2 vacunado G2 (n = 8) 7 (87,5) 7 (87,5) 7 (87,5) 0 8 vacunado / inoculado G3 (n = 2) 2 (100) 2 (100) 2 (100) 0 2 inoculado G4 (n = 1) ------1 0 control

Tabla 3. Distribución de los animales de acuerdo con los títulos de los anticuerpos (obtenidos por ELISA indirecto y expresados en PP) al inicio del ensayo y a su finalización (día de la necropsia) en los distintos grupos experimentales

Grupo Número de animales al inicio Número de animales al día (tratamiento) del ensayo con PP de la necropsia con PP < 17,6 (promedio PP) > 17,6 (promedio PP) < 17,6 (promedio PP) > 17,6 (promedio PP)

G1 5 (11,6) 0 3 (11,3) 2 (23,6) (vacunado) G2 7 (9,91) 1 (20) 0 8 (51,1) (vacunado/inoculado) G3 2 (5,75) 0 0 2 (45,95) (inoculado) G4 1 (15,6) 0 1 (16,15) 0 (control)

análisis. El PP promedio para los sueros analizados de serorreactores a C. pseudotuberculosis, con resulta- de las poblaciones negativas (244 ovinos sanos, 60 dos promisorios para su uso en majadas en el marco de sueros de ovinos jóvenes y 40 de ovinos adultos) fue programas de erradicación de la enfermedad (6, 8). de 9,73%, mientras que el de las poblaciones positivas La virulencia de la cepa indígena utilizada en este (48 sueros de ovinos de frigorífico) fue de 48%. trabajo (Cepa 15 C. pseudotuberculosis) fue confirmada En la Tabla 2 se detalla el número de animales en los por el establecimiento de las lesiones patognomónicas de diferentes grupos con lesiones macroscópicas y micros- la enfermedad y por su progresión en la cadena linfática cópicas y con aislamientos bacteriológicos. Asimismo, se de drenaje del sitio de desafío seleccionado para la repro- indican los resultados por ELISA al finalizar el estudio, ducción experimental. Los hallazgos clínico-patológicos y expresados como PP. En la Tabla 3 se detallan los pro- microscópicos en los tejidos afectados son coincidentes medios de PP en cada uno de los grupos de animales, con hallazgos presentados por otros autores en casos tanto al inicio como al finalizar el ensayo. clínicos de LC y en ensayos de desafío (4, 5, 21). Según la bibliografía consultada, en Argentina no existen registros DISCUSIÓN de ensayos de reproducción experimental de la enfermedad mediante el desafío con C. pseudotuberculosis y Los resultados obtenidos en este trabajo preliminar posterior seguimiento de la respuesta inmunitaria humoral demuestran la utilidad de un ELISA indirecto, tanto para el mediante ELISA, de modo que este es el primer reporte diagnóstico de ovinos infectados por el agente causal de la en nuestro país y podría constituir una base para futuros LC como para medir la capacidad inmunogénica de bacte- ensayos de protección vacunal y de inmunopatogenicidad rinas elaboradas con cepas de C. pseudotuberculosis. En en casos de LC. otros países con diferentes niveles de prevalencia de LC El sitio de inoculación experimental seleccionado para se han adaptado pruebas de ELISA para la identificación nuestros grupos de ovinos fue el más representativo des- Diagnóstico de pseudotuberculosis por ELISA 15 de el punto de vista del desarrollo de la infección a través tipos de antígenos para diagnóstico de LC (6). Utilizando del sistema linfático y por las lesiones microscópicas y la exotoxina purificada deC. pseudotuberculosis, nues- macroscópicas que produjo la inoculación de la cepa tro grupo obtuvo recientemente resultados de Se y Es indígena. A su vez, permitió simular la infección natural semejantes a los descritos en este trabajo cuando fue mediante inoculación de C. pseudotuberculosis y esta- utilizado antígeno crudo enfrentado a los mismos sue- blecer un grado de enfermedad subagudo/crónico, con ros ovinos estudiados (datos no mostrados). Por estos desarrollo de lesiones típicas y cultivos positivos en linfo- resultados, es probable que el antígeno crudo utilizado nódulos u otros órganos, sitios frecuentes de aislamiento en las pruebas de ELISA indirecto que describimos de C. pseudotuberculosis en casos clínicos (28). La en este trabajo tuviera un porcentaje no conocido de reproducción experimental con este modelo de infección exotoxina que haya contribuido a maximizar los resulta- con C. pseudotuberculosis en ovinos nos permitió obtener dos obtenidos con sueros de animales desafiados con sueros controles positivos verdaderos para realizar las C. pseudotuberculosis. pruebas preliminares de Se y Es del ELISA desarrolado, Dercksen et al. (8) desarrollaron un ELISA doble anticuerpo a la vez que demostró la utilidad del modelo experimental para la detección de la infección con C. pseudotuberculosis en estudios de patogenia y microbiológicos de LC. y lograron así mejorar la sensibilidad respecto de otras En este ensayo se logró cultivar exitosamente pruebas. Se alcanzó una Se de 94% y una Es de 98% C. pseudotuberculosis a partir de las muestras del sitio con sueros de caprinos infectados, mientras que en las de inoculación y de los linfonódulos de los carneros, pero pruebas con sueros de ovinos, la Se y la Es alcanzadas también de otros órganos como el pulmón, lo que ratifica fueron de 99% y 79%, respectivamente. Según los cita- la virulencia especie-específica de la cepa indígena. Una dos autores, estos ensayos sirvieron para establecer una observación de interés fue que el cultivo de órganos de los prueba adecuada para ser empleada en programas de grupos experimentales no presentó aislamientos de otros erradicación de áreas endémicas de LC. microorganismos productores de abscesos o lesiones En nuestro ensayo, luego del desafío los animales similares a las de la LC, como se ha descrito en casos vacunados con la bacterina desarrollaron mayores ni- naturales con aislamiento de Arcanobacterium pyogenes, veles de anticuerpos y más precozmente que aquellos Nocardia brasiliensis o Staphylococcus aureus, entre los animales que sólo fueron desafiados. Esto sugiere que más importantes (6). la memoria inmunológica de los vacunados permitió de- La dosis de desafío utilizada en nuestro trabajo fue ade- sarrollar una respuesta humoral secundaria más rápida y cuada para la reproducción experimental de la enfermedad potente frente a los componentes bacterianos presentes y también para generar anticuerpos detectables por ELISA, en la cepa utilizada para el desafío, en coincidencia con tempranamente y durante los 6 meses del ensayo. Otros los resultados obtenidos por otros autores (16). En otros autores han usado dosis de desafío más bajas, del orden trabajos en los que se aplicaron dosis repetidas para de 4,7 x 105 células viables de C. pseudotuberculosis, con el desafío con C. pseudotuberculosis, se incrementó refuerzos de desafío mediante dosis de 5,3 x 108 células la respuesta serológica de los animales desafiados y viables, y obtuvieron resultados similares a los nuestros mejoró así la detección de anticuerpos por los métodos en la reproducción experimental de la LC (6). Usando inmunológicos (6). dosis de desafío con 104 células viables, Fontaine y Baird Mediante el test de Tuckey y Kramer se logró identificar (13) obtuvieron un modelo experimental de LC con esta- una diferencia significativa (p < 0,001) entre los grupos blecimiento de lesiones y cultivos positivos en múltiples experimentales; esto permite concluir que los resultados linfonódulos y en el pulmón. variaron a lo largo del tiempo por efecto del tratamiento El ELISA indirecto desarrollado y probado en este y no debido al azar. Como se observa en la Figura 1, ensayo mostró una Se de 98% y una Es del 100%. Este no se detectaron diferencias en los PP entre los grupos resultado preliminar es comparable con los informados hasta el día 60 del ensayo. Sin embargo, a partir de la en pruebas de ELISA descritas en trabajos previos sobre fecha de desafío se observó una diferencia significativa diagnóstico de LC (3, 6, 26, 27). (p < 0,001) entre el grupo control (G4) y los grupos G2 Aplicando un sistema de extracción de antígeno si- y G3, aunque entre estos dos últimos no hubo diferencia milar al usado en nuestro trabajo, otros autores lograron significativa hasta el final del ensayo. La técnica de ELISA desarrollar un ELISA para la detección de anticuerpos permitió diferenciar animales positivos de negativos, ya anti-C. pseudotuberculosis que, después de validado, que los resultados promedio en PP de los infectados resultó tener una Se del 83%, valor comparable con el estuvieron al menos 4 veces por encima de los valores obtenido con otras técnicas de ELISA indirecto desarro- correspondientes a los animales negativos. lladas para el diagnóstico de la LC (3). Se ha sugerido De acuerdo con estos resultados, la técnica de ELISA que el uso de exotoxina o de antígenos secretados en indirecto desarrollada en este trabajo permitiría distinguir cultivos de C. pseudotuberculosis condujeron a los me- entre animales sanos y enfermos de LC, y sería un in- jores resultados, en los que se alcanzó una Se de 72% y dicador de infección útil para analizar majadas en áreas una Es de 67% frente a pruebas de ELISA con diferentes endémicas de LC. 16 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 9-17

Si bien esta prueba de ELISA discriminó con una DNA vaccine against Corynebacterium pseudotuberculosis buena Se y Es entre poblaciones positivas y negativas in sheep. Am Soc Microbiol 1999; 67: 6434-8. 6. Chirino-Zárraga C, Rey-Valeirón C, Scaramelli A, Carrero L. dentro de un esquema de infección experimental con Diagnosis of caseous lymphadenitis by ELISA in naturally C. pseudotuberculosis, sería necesario continuar con infected goats from Venezuela. Small Ruminant Res 2009; los estudios aplicando el ELISA en poblaciones ovinas doi:101016/j.smallrumres.2009.09.031 naturalmente infectadas con el microorganismo. 7. Çetinkaya B, Karahan M, Atil E, Kalin R, De Baere T, Vaneechoutte M. Identification of Corynebacterium Otros autores sugirieron que los animales menores pseudotuberculosis isolates from sheep and goats by PCR. de 6 meses no desarrollarían títulos serológicos su- Vet Microbiol 2002; 88: 75-83. ficientemente altos para ser detectados por pruebas 8. Dercksen D, Brinkhof J, Dekker-Nooren T, van Maanen K, diagnósticas debido a una débil respuesta inmune a la Bode C, Baird G,�� Kamp E. A comparison of four serological tests for the diagnosis of caseous lymphadenitis in sheep infección con C. pseudotuberculosis (6). Utilizando un and goats. Vet Microbiol 2000; 167-75. ELISA con exotoxina como antígeno, estos investiga- . Dorella F, Pacheco L, Olivera S, Miyoshi A, Azevedo V. dores demostraron que los animales adultos mayores Corynebacterium pseudotuberculosis: microbiology, bio- de 20 meses conformarían la categoría adecuada para chemical properties, pathogenesis and molecular studies of virulence. Vet Res 2006; 37: 201-18. analizar dentro de un programa de erradicación. Los 10. Estevao Belchior S, Gallardo, A, Abalos M, Álvarez L, Núñez resultados de nuestro trabajo experimental mostraron N, Guevara D, Jensen O. Corynebacterium pseudotuber- que una vez infectados, los animales jóvenes pueden culosis, poten��cial agente zoonótico. Revisión de casos. desarrollar una rápida respuesta inmune, adecuada para REDVET 2009; 10, Disp en URL: http://www.veterinaria. org/revistas/redvet/n101009.html ser medida por ELISA. 11. Estevao Belchior S, Gallardo A, Abalos A, Díaz Y, Álvarez Un aspecto de importancia que cabe considerar en L, Callejo R, Prieto M, Jodor N, Jesen O. Diagnóstico de majadas ovinas es la presencia de otras enfermedades, Pseudotuberculosis en ovinos patagónicos. Rev Arg Micro- como listeriosis o paratuberculosis, ya que éstas en biol 2007; 39: 44-6. 12. Estevao Belchior S, Gallardo A, Abalos A, Jodor N, Jensen circunstancias subclínicas podrían causar reacciones O. Actualización sobre Linfoadenitis Caseosa: El agente cruzadas que interferirían con el diagnóstico por ELISA etiológico y la enfermedad. Vet Arg 2006; 23: 258-78. de LC (8). 13. Fontaine M, Baird G. Caseous lymphadenitis. Small Rumi- Actualmente estamos trabajando para validar la nant Res 2008; 76: 42-8. 14. García Vázquez S, Martínez Rodríguez H, Muñoz Guzmán técnica de ELISA indirecta aquí descrita mediante la M, Mendoza Saavedra M, Sánchez Pérez M, Urquiza evaluación de un mayor número de animales prove- Pérez M. Establecimiento de una prueba de ELISA para nientes de áreas endémicas afectadas de LC enviados el diagnóstico de Linfadenitis Caseosa en Cabras. XXI a frigorífico. Dichos estudios serán completados con Congreso Panamericano de Ciencias Veterinarias, 2008, p 956. Guadalajara, México. el análisis de sueros ovinos de establecimientos con 15. González C, Jorge M, Zeballos H, West M, Mateos E, Yotti diferente prevalencia clínica de LC. Futuros estudios en C. Actualización y estudio de situación de la Linfoadenitis los que se evalúe la respuesta inmune celular podrían Caseosa de los lanares en el partido de Tandil. ��Vet Arg contribuir a completar los protocolos de diagnóstico de 1991; 8: 304-11. 16. Hodgson L, Carter K, Tachedjian M, Krywult J, Cornel L, LC en ovinos. McColl M, Cameron A. Efficacy of ovine caseous lymphadenitis vaccine formulated using a genetically inactive form Agradecimientos: Los autores agradecen a los Dres. Germán of the Corynebacterium pseudotuberculosis phospholipase Cantón y Eduardo Sánchez y a los Sres. José Llamas, Sergio D. Vaccine 1999; 17: 802-8. Dinino y Jorge Lali por la colaboración en el desarrollo del tra- 17. Mills A, Mitchell R, Lim E. Corynebacterium pseudotuberculosis bajo. A los Dres. Adolfo Casaro, Ernesto Spath y María Andrea is a cause of human necrotising granulomatous lymphad- Fiorentino y a la Sra. Adriana Cano por la colaboración en el enitis. Pathology 1997; 29: 231-3. análisis de los resultados. 18. Mueller J. Producción ovina en Argentina, situación actual y perspectivas futuras. Boletín informativo INTA, 2001, EEA Bariloche, Argentina. Disp en: http://www.inta.gob. BIBLIOGRAFÍA ar/bariloche/ssd/nqn/data/genetica/Ct-392.pdf 19. Paton M, Mercy A, Wilkinson F, Gardner J, Sutherland S, 1. 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Recibido: 13/04/10 – Aceptado: 20/01/11 18 Revista Argentina de Microbiología (2011)ISSN 43:0325-7541 18-23 ARTÍCULO ORIGINAL Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 18-23

Etiología bacteriana de la neumonía nosocomial y resistencia a los antimicrobianos en pacientes con y sin tratamiento antimicrobiano previo

BEATRIZ WEYLAND*, BEATRIZ PERAZZI, SUSANA GARCIA, CARLOS RODRÍGUEZ, CARLOS VAY, ANGELA FAMIGLIETTI

Laboratorio de Bacteriología, �D�e�p��arta�m�e�n��to de Bioqu��í�m�ica�� C�lí��n�ica,�� H�o�sp��ital�� de C�lí��n�ica��s “J��o�� de�� S�a��n M�artí��n”��,� Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Córdoba 2351, CP: 1120, Capital Federal, Argentina *Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN La neumonía nosocomial (NN) se asocia a una elevada morbimortalidad y es la segunda causa de infección intrahospitalaria después de la infección urinaria. El objetivo de este trabajo fue conocer la etiología de la NN en adultos y evaluar el perfil de resistencia a los antimicrobianos de los microorganismos aislados teniendo en cuenta si los pacientes recibieron o no tratamiento antimicrobiano previo. Desde el año 2000 hasta el 2005 se analizaron 430 lavados broncoalveolares provenientes de 430 pacientes adultos con diagnóstico de neumonía internados en la unidad de cuidados intensivos del �H��ospital de Clínicas ��“J��osé de San Martín�”��. El 74% ��(1��99/�2��69��) de los pacientes con tratamiento previo tuvieron cultivos positivos, mientras que en el grupo sin tratamiento previo esta proporción fue del 83% (134/161) (p = 0,03). Los microorganismos prevalentes fueron Acinetobacter spp., Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa (37,9%; 21,3% y 20,9% vs. 36,1%; 26,6% y 17,7% en los pacientes con tratamiento previo o sin él, respectivamente; p > 0,05). La resistencia a los antimicrobianos de los citados microorganismos cuando los aislamientos provinieron de pacientes que recibieron antes tratamiento antibiótico fue superior a la encontrada en el grupo de pacientes que no recibió tratamiento previo (p < 0,05), excepto en el caso de la resistencia a la trimetoprima- sulfametoxazol por parte de S. aureus (p = 0,29). En conclusión, el tratamiento antimicrobiano previo no modificó la etiología de la NN, pero sí provocó un aumento global de la resistencia a los antimicrobianos y un menor porcentaje de cultivos positivos. Palabras clave: etiología, neumonía nosocomial, UCI, resistencia antimicrobiana

ABSTRACT Bacterial etiology of nosocomial pneumonia and antimicrobial resistance in patients with and without antimicrobial treatment. Nosocomial pneumonia (NP) is associated with high ��morbimortality, ��representing the second cause of nosocomial infection after urinary tract infection. The objective of this work was to become acquainted with the etiology of NP and to evaluate the antimicrobial resistance profile of the isolated microorganisms from adult patients with and without previous antimicrobial treatment admitted in the intensive care unit (ICU). From 2000 to 2005, 430 ��bronchoalveolar�� lavages from 430 adult patients diagnosed with pneumonia admitted in the ICU were analyzed. Seventy-four percent (199/269) of the patients with previous treatment had positive cultures, whereas in the group without previous treatment the percentage was 83% (134/161) �(p = 0,03)��. The main agents in both groups of patients were: Acinetobacter spp. (37.9% vs 36.1%), Staphylococcus aureus (21.3% vs 26.6%) and Pseudomonas aeruginosa (20.9% vs 17.7%), respectively (p > 0,05). The antimicrobial resistance in Acinetobacter spp., P.�� aeru�gi��n�o�s�a� and S. aureus from previously treated patients was higher than that from patients without previous antimicrobial treatment �(p < 0,05), except in the case of trimethoprim-sulfamethoxazole in S. aureus (p = 0,29). ��In conclusion, previous antimicrobial treatment did not modify the etiology of NP, but caused an increase in overall antimicrobial resistance and a lower percentage of positive cultures. Key words: etiology, nosocomial pneumonia, ICU, antimicrobial resistance

INTRODUCCIÓN de neumonía nosocomial ocurren durante la ventilación mecánica y la mortalidad puede alcanzar hasta un 76% La neumonía nosocomial (NN) es la principal causa (3, 10, 22). La asistencia respiratoria mecánica y la de muerte por infecciones adquiridas en el ámbito hospi- instrumentación de las vías aéreas rompen las barreras talario y la segunda en frecuencia luego de la infección naturales y favorecen la aspiración de microorganismos urinaria (7, 21). En las unidades de cuidados intensivos (9). Lo mismo ocurre frente a traumatismos y con el uso (UCI) representa la causa más frecuente de infección de sondas nasogástricas. La obstrucción de las vías aé- intrahospitalaria y se asocia con una elevada morbi- reas predispone a la infección respiratoria por la falta de mortalidad. Aproximadamente el 81% de los episodios eliminación de las secreciones orales, con el consiguiente Etiología y resistencia bacteriana de la neumonía nosocomial 19 desarrollo bacteriano. Otros factores de riesgo de adquirir ceftriaxona, ceftacidima, cefepima, imipenem, meropenem, neumonía son la edad avanzada, la enfermedad pulmonar amicacina, gentamicina, colistina, trimetoprima-sulfametoxazol (TMS) y ciprofloxacina frente a bacilos gram negativos, y ampici- crónica y la internación previa (2, 5, 18, 24, 25). lina, ampicilina-sulbactama, oxacilina, gentamicina, eritromicina, Conocer la prevalencia de microorganismos y la sensi- rifampicina, minociclina, TMS, ciprofloxacina, vancomicina y bilidad a los antimicrobianos en los centros asistenciales teicoplanina frente a cocos gram positvos. permite utilizar una terapia antimicrobiana adecuada, lo Para comparar las frecuencias relativas de microorganismos y los porcentajes de resistencia a los diferentes antimicrobianos en que se relaciona con una mayor supervivencia de los ambos grupos de pacientes se utilizó la prueba de Chi cuadrado pacientes. (c2) Yates. Se consideró significativo un valor de p < 0,05. El objetivo de este trabajo fue conocer la etiología de la NN en la UCI del H�ospital�� de Clínicas “J��osé�� de San RESULTADOS Martín”� y�� evaluar el perfil de resistencia a los antimicro�- bianos de los aislamientos obtenidos de pacientes adultos Durante el período 2000-2005 se analizaron 443 LBA, que habían recibido tratamiento antimicrobiano previo en de los cuales se excluyeron 13 que no cumplieron con comparación con aquellos que no lo habían recibido. los criterios de inclusión. De los 430 LBA analizados, el 78% (334/430) originaron cultivos positivos, el 46% PACIENTES Y MÉTODOS de ellos (154) produjeron cultivos mixtos. El total de aislamientos obtenidos fue de 435, lo que representa El presente es un análisis retrospectivo basado en el estudio de 443 lavados broncoalveolares (LBA) enviados al laboratorio una relación de 1,3 aislamientos/paciente. El 83% de de Bacteriología entre enero de 2000 y diciembre de 2005. Estos los pacientes recibían asistencia respiratoria mecánica. correspondieron a 443 pacientes adultos internados en la UCI De los 430 pacientes estudiados, 269 correspondieron del Hospital de Clínicas “José de San Martín”, con diagnóstico al grupo que recibió tratamiento antimicrobiano previo y de NN. La mediana de edad fue 72 años (intervalo: 20-96), 239 pacientes eran de sexo femenino. Se definió como neumonía 161 al grupo sin tratamiento previo. En el primer grupo, nosocomial toda infección iniciada 48 horas después del ingreso 99 sujetos (37%) habían recibido un antimicrobiano (por al ámbito hospitalario que cumpliera con los criterios especifica- lo general, una cefalosporina de tercera generación), 145 dos a continuación. Clínicos: presencia de fiebre o de hipotermia individuos (54%) habían recibido dos antimicrobianos (temperatura ≥ 38 °C o ≤ 35 °C, respectivamente), secreciones traqueobronquiales purulentas y leucocitosis o leucopenia. Radio- (en su mayoría, la combinación vancomicina/imipenem) lógicos: presencia de infiltrados pulmonares nuevos o progresivos y 25 (9%) más de dos antimicrobianos. El 74% de estos visibles en la radiografía de tórax. Microbiológicos: aislamiento pacientes (199/269) tuvieron cultivos positivos; mientras de un patógeno en una muestra de LBA representativa (13). Se que en el grupo de enfermos sin tratamiento previo el consideró como muestra de LBA representativa a aquella con menos del 1% de células epiteliales escamosas, presencia de 83% (134/161) presentaron cultivos positivos (p = 0,03) macrófagos alveolares y al menos un 10% de neutrófilos. La (Figura 1). Los cultivos fueron mixtos en el 46% y 45% presencia de células ciliadas bronquiales en elevada cantidad de los grupos, respectivamente (p = 0,92). representó un marcador de contaminación del tracto respiratorio Los microorganismos prevalentes tanto en pacientes con superior; estas muestras se excluyeron del estudio. Se consideró significativo un recuento de cada morfotipo bacteriano ≥ 103 en tratamiento antimicrobiano previo como en aquellos que el caso de pacientes con tratamiento antimicrobiano previo y ≥ no habían recibido tratamiento previo fueron Acinetobacter 104 UFC/ml en el caso de pacientes sin tratamiento previo. spp., Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa Las muestras fueron procesadas por técnicas cuantitativas. La (37,9%; 21,3% y 20,9% vs. 36,1%; 26,6% y 17,7% en los prueba de sensibilidad a antimicrobianos se realizó por el método semicuantitativo de Marcenac et al. (15), ensayando ampicilina, pacientes con tratamiento previo o sin él, respectivamente). ampicilina-sulbactama, piperacilina, piperacilina-tazobactama, No se observó una diferencia estadísticamente significativa

Figura 1. Resultados de los cultivos de lavados broncoalveolares en pacientes con tratamiento antimicrobiano previo o sin él. 20 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 18-23

Tabla 1. Frecuencia relativa de microorganismos aislados de lavados broncoalveolares de pacientes con y sin tratamiento antimicrobiano previo

Microorganismo n con ATM previo sin ATM previo n (%) n (%) p

Acinetobacter spp. 162 105 (37,9) 57 (36,1) 0,78 Staphylococcus aureus 101 59 (21,3) 42 (26,6) 0,26 Pseudomonas aeruginosa 86 58 (20,9) 28 (17,7) 0,49 Klebsiella pneumoniae 18 10 (3,6) 8 (5,1) 0,63 Tribu Proteae(1) 18 12 (4,3) � (3,8) 0,98 Otros BNF(2) 12 10 (3,6) 2 (1,3) 0,26 Serratia marcescens 11 � (3,2) 2 (1,3) 0,34 Enterobacter spp. 8 3 (1,1) 5 (3,1) ND Escherichia coli 5 4 (1,4) 1 (0,6) ND Streptococcus pneumoniae 5 1 (0,4) 4 (2,5) ND Haemophilus influenzae 4 3 (1,1) 1 (0,6) ND ECN 3 1 (0,4) 2 (1,3) ND Enterococcus faecalis 2 2 (0,8) 0 ND Totales 435 277 (100) 158 (100)

n: número de aislamientos obtenidos; ATM: antimicrobianos; ECN: estafilococos coagulasa negativos; ND: no determinado. (1) Incluye: P. mirabilis (9), Providencia spp. (5) y Morganella morganii (1) (2) Stenotrophomonas maltophilia (10) y Burkholderia cepacia (2)

Tabla 2. Resistencia a los antimicrobianos de los aislamientos de Acinetobacter spp. y P. aeruginosa recuperados de lavados broncoalveolares provenientes de pacientes con tratamiento antimicrobiano previo o sin él.

Acinetobacter spp. P. aeruginosa Antimicrobiano con ATM sin ATM con ATM sin ATM previo previo previo previo (n: 105) (n: 57) p (n: 58) (n: 28) p N (%) N (%) N (%) N (%)

Ampicilina-sulbactama (2/1) 96 (91,4) 22 (38,5) <0,0001 ND ND ND Piperacilina ND ND ND 48 (82,7) 12 (42,8) 0,0004 Piperacilina-tazobactama (7/1) 98 (93,3) 30 (52,6) <0,0001 40 (68,9) 11 (39,3) 0,02 Ceftacidima 98 (93,3) 32 (56,1) <0,0001 40 (68,9) 10 (35,7) 0,01 Cefepima 96 (91,4) 34 (59,6) <0,0001 52 (89,6) 13 (46,4) <0,0001 Imipenem 70 (66,6) 21 (36,8) 0,0005 50 (86,2) 13 (46,4) 0,0003 Meropenem 57 (54,2) 15 (26,3) 0,001 46 (79,3) 12 (42,8) 0,002 Amicacina 91 (86,6) 34 (59,6) 0,0002 52 (89,4) 13 (46,4) <0,0001 Gentamicina 83 (79,0) 28 (49,1) 0,0002 52 (89,4) 14 (49,9) 0,0001 Colistina 1 (0,9) 0 ND 1 (1,7) 0 ND Trimetoprima-sulfametoxazol (12,5/50) �2 (87,6) 31 (54,3) <0,0001 ND ND ND Ciprofloxacina 97 (92,3) 34 (59,6) <0,0001 45 (77,4) 13 (46,4) 0,01 n: número total de aislamientos evaluados; N: número de aislamientos resistentes; ATM: antimicrobianos; ND: no determinado en las prevalencias de estos microorganismos al comparar en el grupo de pacientes que recibió antes al menos un ambos grupos de pacientes (Tabla 1). antimicrobiano que en el grupo sin antimicrobiano previo Como se observa en la Tabla 2, tanto en P. aeruginosa (p < 0,05). En los citados microorganismos, la resistencia como en Acinetobacter spp. la resistencia a todos los anti- a la colistina fue menor del 2% y esta sólo se encontró en microbianos ensayados (excepto a la colistina) fue mayor el grupo de pacientes con tratamiento previo. Etiología y resistencia bacteriana de la neumonía nosocomial 21

Tabla 3. Resistencia a los antimicrobianos de los aislamientos tratamiento antimicrobiano previo como en quienes no lo de Staphylococcus aureus recuperados de lavados broncoal- recibieron. En los Estados Unidos y Europa se han infor- veolares provenientes de pacientes con y sin tratamiento mado frecuencias más bajas de Acinetobacter spp. (2,4% antimicrobiano previo. y 7%, respectivamente), mientras que en Latinoamérica se documentaron valores semejantes a los observados Staphylococcus aureus en este trabajo (25%) (13). Otros autores también comu- Antimicrobiano con ATM sin ATM nicaron cifras similares, aunque en esos análisis no se (n: 59) (n: 42) p consideró si el paciente recibió tratamiento antimicrobiano N (%) N (%) previo (11, 17, 19, 20, 24, 26). Las enterobacterias se

aislaron con una frecuencia relativa de 14%, similar a la Oxacilina 56 (94,9) 15 (35,7) <0,0001 obtenida por Ibrahim et al. (11), mientras que Chastre et Gentamicina 57 (96,6) 16 (38,1) <0,0001 al. (4) encontraron un 21%. Como era de esperar, Strepto- Eritromicina 56 (94,9) 16 (38,1) <0,0001 coccus pneumoniae y Haemophilus influenzaese aislaron Rifampicina 5 (8,5) 3 (7,1) ND con baja frecuencia (< 2%); ambos microorganismos se Minociclina 2 (3,4) 1 (2,4) ND relacionaron con NN precoz. Trimetoprima- Si bien Enterococcus faecalis y los estafilococos sulfametoxazol (12,5/50) 13 (22,0) 05 (11,9) 0,29 coagulasa negativos (ECN) son poco frecuentes en el Ciprofloxacina 55 (93,2) 14 (33,3) <0,0001 tracto respiratorio, debería evaluarse su verdadero papel Vancomicina 0 0 ND patógeno. Ambos microorganismos fueron recuperados Teicoplanina 0 0 ND de cultivos mixtos: E. faecalis se asoció con S. aureus n: número total de aislamientos evaluados; N: número de aislamientos en un paciente y con S. aureus y Acinetobacter spp. en resistentes; ATM: antimicrobianos; ND: no determinado otro; mientras que se aislaron ECN en tres pacientes: asociado con S. aureus en un caso, con P. aeruginosa El 60% de los aislamientos de Klebsiella pneumoniae en otro y con S. maltophilia y Acinetobacter spp. en el provenientes de pacientes con tratamiento previo presentó caso restante. resistencia a las cefalosporinas de espectro extendido; Si bien Stenotrophomonas maltophilia y Burkholderia esta proporción fue del 12% en los pacientes sin tra- cepacia se aislaron más frecuentemente de los pacientes tamiento antimicrobiano previo, lo cual representó una que recibieron antes terapia antimicrobiana respecto de diferencia estadísticamente significativa (p = 0,01). aquellos sin tratamiento previo, estas diferencias no fue- La resistencia a oxacilina en S. aureus (SAOR) fue del ron estadísticamente significativas p( = 0,26), quizá debido 95% en el grupo de pacientes con tratamiento antimicro- al bajo número de aislamientos de estos gérmenes. biano previo y del 36% en los que no recibieron antes Combes et al. (6) describieron la etiología mixta en el antimicrobianos. En los aislamientos de SAOR se observó 48% de los casos, valor que coincide con el obtenido en resistencia asociada a gentamicina, eritromicina y cipro- este estudio, sin observarse diferencia estadísticamente floxacina. En ambos grupos de pacientes, la resistencia significativa entre los dos grupos de pacientes considera- a minociclina y a rifampicina fue menor del 10%, mientras dos (46% en los que recibieron tratamiento antimicrobiano que a TMS fue de 22% y de 11,9% en estos grupos, en previo y 45% en los que no lo recibieron; p = 0,92). igual orden (p = 0,29). Ninguno de los aislamientos de S. Por otra parte, en este trabajo se observó que el tra- aureus presentó resistencia a glucopéptidos (Tabla 3). tamiento antimicrobiano previo no modificó la frecuencia relativa de los microorganismos, pero sí se observó DISCUSIÓN una mayor resistencia a los antimicrobianos, tal como lo describieron Souweine et al. (23). Probablemente la El diagnóstico de NN mediante el estudio microbio- similitud en el rescate de microorganismos estaría dada lógico del LBA representa el método de elección, por por el alto nivel de resistencia a los antimicrobianos que su elevada sensibilidad y especificidad. Su utilidad fue se utilizan en las UCI, los cuales no afectarían la viabilidad establecida por Chastre et al. (4), quienes describieron de aquellos en los cultivos. 91% de sensibilidad y 78% de especificidad; mientras que Tanto en Acinetobacter spp. como en P. aeruginosa, la otros autores documentaron menor sensibilidad y mayor resistencia a los antimicrobianos b-lactámicos (incluidos especificidad (1, 12). En nuestra casuística, la NN fue los carbapenemes), los aminoglucósidos y las fluoroqui- diagnosticada por el cultivo en más del 70% de los casos. nolonas se vio incrementada en el grupo de pacientes En coincidencia con lo que informa la literatura científica, que habían recibido tratamiento antimicrobiano previo. más del 80% de las NN en la UCI se asociaron con la No ocurrió lo mismo con la colistina, pero los aislados ventilación mecánica (22). resistentes a este polipéptido sólo se hallaron en los Durante el período evaluado, los microorganismos pacientes con tratamiento antimicrobiano previo. más prevalentes fueron Acinetobacter spp., S. aureus Durante varios años, los carbapenemes fueron los y P. aeruginosa, tanto en los pacientes que recibieron antimicrobianos b-lactámicos más activos frente a los 22 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 18-23 bacilos gram negativos multirresistentes, pero su amplia Los resultados obtenidos demuestran que en el tra- utilización en las UCI trajo aparejada la selección de tamiento empírico de la NN, la elección más adecuada cepas resistentes, lo que actualmente limita su uso. La sería colistina frente a P. aeruginosa y Acinetobacter spp., emergencia de estos aislados se debe a la adquisición de aun con sus limitaciones, y vancomicina o, en algunas diferentes mecanismos de resistencia: inactivación enzi- situaciones, TMS frente a SAOR. mática (b-lactamasas), hiperexpresión de ciertas bombas De acuerdo con lo informado por Luna et al. (14), el de eflujo, modificación en el sitio blanco y alteración de tratamiento inadecuado durante las primeras 48 horas, las porinas de la membrana externa que muchas veces independientemente del tratamiento dirigido con el re- se asocian. Esto ocasiona resistencia a diferentes grupos sultado del LBA, se asoció con una elevada mortalidad de antimicrobianos, tal como ocurre con P. aeruginosa y (91%), mientras que con un apropiado tratamiento la Acinetobacter spp. (16). Otra consecuencia de esta pre- mortalidad fue de 38%. sión selectiva es la emergencia de bacterias naturalmente En conclusión, el tratamiento previo con antimicrobia- multirresistentes como S. maltophilia y B. cepacia. nos derivó en una menor recuperación de cultivos positi- A causa de lo expuesto, es frecuente observar en la vos, no modificó la etiología de la NN, pero sí provocó un NN aislamientos de Acinetobacter spp. sensibles sólo a aumento de la resistencia a los antimicrobianos. Viejos colistina y minociclina. Si bien se documentaron éxitos antimicrobianos como la TMS, la minociclina y la colistina terapéuticos mediante la administración de colistina, su y otros nuevos como la tigeciclina y el linezolid, con sus utilidad se ve limitada por la nefrotoxicidad. Algo similar limitaciones, deberían ser considerados en el tratamiento ocurre con la minociclina: dada su actividad bacteriostática empírico de la NN en las UCI. y la falta de disponibilidad por vía parenteral en nuestro Por otra parte, es necesaria la vigilancia epidemiológi- medio, el uso de este agente también se ve limitado. La ca y la rotación de antimicrobianos sobre la base de los tigeciclina es un derivado semisintético de la minociclina datos epidemiológicos para tratar adecuadamente a los y constituye un nuevo antimicrobiano. Este se perfila pacientes y así evitar la diseminación de cepas multirre- como un agente promisorio por su buena actividad in sistentes, lo que restringe el uso de los antimicrobianos. vitro frente a Acinetobacter spp., con un valor de CIM entre 0,5 y 2 µg/ml (datos no mostrados). Además, este BIBLIOGRAFÍA antimicrobiano se encuentra disponible tanto por vía oral como parenteral. No obstante, son necesarios estudios 1. Carroll K. Minireview. Laboratory diagnosis of lower respi- clínicos para avalar su utilización. ratory tract infections: controversy and conundrums. J Clin En P. aeruginosa, la resistencia a carbapenemes fue Microbiol 2002; 40: 3115-20. 2. Celis R, Torres A, Gatell JH, Almela M, Rodríguez Roisin levemente superior con respecto a ceftazidima y pipera- R, Agusti Vidal A. Nosocomial pneumonia: a multivariate cilina/tazobactama. No obstante, la resistencia a estos analysis of risk and prognosis. Chest 1988; 93: 318-24. últimos antimicrobianos osciló entre 35% y 40% en el 3. Chastre J, Fagon JY. Ventilator-associated pneumonia. Am grupo de pacientes sin tratamiento previo y fue de 69% en J Respir Crit Care Med 2002; 165: 867-903. 4. Chastre J, Fagon JY, Bornet-Lecso M, Calvat S, Dombret el grupo con tratamiento previo. Con estos resultados se MC, al Khani R, Basset F, Gibert C. Evaluation of broncho- desestimaría el uso de carbapenemes en el tratamiento scopic techniques for the diagnosis of nosocomial pneumo- empírico de la NN. Para la utilización de ceftazidima de- nia. Am J Respir Crit Care Med 1995; 152: 231- 40. berá tenerse en cuenta que P. aeruginosa es capaz de 5. Chastre J, Trouillet JL, Vuagnat A, Joly-Guillou ML, Clavier H, Dombret MC, Gibert C. Nosocomial pneumonia in pa- seleccionar mutantes resistentes intratratamiento por la tients with acute respiratory distress syndrome. Am J Respir hiperproducción de b-lactamasa cromosómica inducible Crit Care Med 1998; 157: 1165-72. de tipo AmpC, la que también afectaría a la piperacilina �. Combes A, Figliolini C, Trouillet JL, Kassis N, Wolff M, Gibert y no a la cefepima. Al igual que en Acinetobacter spp., C, Chastre J. Incidence and outcome of polymicrobial ventilator-associated pneumonia. Chest 2002; 121: 1390-1. en algunas situaciones sólo queda disponible la colistina 7. Ferrer R, Loanas M, Agusti C, Torres A. Impact of BAL on como única alternativa terapéutica. the diagnosis and treatment of nosocomial pneumonia in SAOR se observó con mayor frecuencia en el grupo de ICU patients. ��Monaldi Arch Chest Dis 2001; 56�:�� 521-6�.� pacientes con tratamiento antimicrobiano previo. Fridkin�� et 8. Fridkin SK. Increasing prevalence of antimicrobial resistance in intensive care units. Crit Care Med 2001; 29 (4 suppl): al. (8) describieron la emergencia de S. aureus resistentes N64-N68. a oxacilina, aunque no establecieron grupos de pacientes �. George DL. Epidemiology of nosocomial pneumonia in in- en función de la terapéutica previa. Los bajos porcentajes tensive care unit patients. Clin Chest Med �1��99��5; 1�6��: 2�9��-44. de resistencia observados en el caso de la rifampicina, la 10. H��eyland ��DK��, Cook ��DJ�, �G��riffith L,�K ��eenan�� SP, Brun-Bruisson�� C. The attributable morbidity and mortality of ventilator-as- minociclina (< 10%) y la TMS (< 25%) permitirían la utiliza- sociated pneumonia in the critically ill patient. The Canadian ción de la minociclina y la TMS en el tratamiento empírico Critical Trials Group. Am J Respir Crit Care Med 1999; 459: de la NN; no así de la rifampicina como monodroga, ya que 1249-56. esta selecciona mutantes resistentes con alta frecuencia. 11. Ibrahim EH, Tracy L, Hill C, Fraser VJ, Kollef MH. The occurrence of ventilator-associated pneumonia in a community En ningún grupo de pacientes se detectaron cepas con hospital: risk factors and clinical outcomes. Chest 2001; 120: resistencia o sensibilidad disminuida a glucopéptidos. 555-61. Etiología y resistencia bacteriana de la neumonía nosocomial 23

12. Kirtland SH, Corley DE, Winterbauer RS, Springmeyer SC, 20. Rello J, Ollendorf DA, Oster G, Vera-Llonch M, Bellm L, Casey KR, Hampson NB, Dreis DF. The diagnosis of ven- Redman R, Kollef MH. Epidemiology�� and outcomes of tilator-associated pneumonia: a comparison of histologic, ventilator-associated pneumonia in a large US database. microbiologic and clinical criteria. Chest 1997; 112: 445-57. Chest 2002; 122: 2115-21. 13. ��Luna CM, Monteverde A, Rodriguez A, Apezteguia C, 21. Richards MJ, Edwards JR, Culver DH, Gaynes RP. Nosoco- Zabert G, Ilutovich S, Menga G, Vasen W, Diez AR, Mera mial infections in medical intensive care units in the United J. Recomendaciones de la Asociación Latinoamericana del States. National Nosocomial Infections Surveillance System. Tórax. Neumonía intrahospitalaria: guía clínica aplicable a La- Crit Care Med 1999; 27: 287-92. tinoamérica preparada en común por diferentes especialistas. 22. Richards MJ, Edwards JR, Culver DH, Gaynes RP. Nosoco- Arch Bronconeumol 2005; 41: 439-56. mial infections in combined medical-surgical intensive care 14. Luna C, Gherardi C, Famiglietti A, Vay C. Resistencia bacte- units in the United States. Infect Control Hosp Epidemiol riana y antibioticoterapia en medicina respiratoria y terapia 2000; 21: 510-5. intensiva. Medicina (Buenos Aires) 2001; 61: 603-13. 23. ��Souweine B, Veber B, Bedos J�P,�� Gachot B; Dombret M 15. Marcenac FML, Fernandez AJ, Herran IL, Civalerio TR. C; Regnier B, Wolff M. ��Diagnostic accuracy of protected Halbquantitative Resistenzbestimmung auf Agar. Arznei- specimen brush and bronchoalveolar lavage in nosocomial mittel-Forschung/Drug Research 1978; 28: 582-5. pneumonia: impact of previous antimicrobial treatments. Crit 16. Nordmann P, Poirel L. Emerging carbapenemases in gram- Care Med 1998; 26: 236-44. negative aerobes. ��Clin Microbiol Infect 2002; 8: 321-31. 24. Tejada Artigas A, Bello Dronda S, Chacón Vallés E, Muñoz 17. Pereira Gomes JC, Pedreira WL, Araújo EM, Soriano FG, Marco J, Villuendas Usón MC, Figueras P, Suárez FJ, Negri EM, Antonangelo L, Tadeu Velasco I.Impact�� of BAL Hernández A. Risk factors for nosocomial pneumonia in in the management of pneumonia with treatment failure: critically ill trauma patients. Crit Care Med 2001; 29: 304-9. positivity of BAL culture under antibiotic therapy. Chest 25. Torres A, Aznar R, Gatell JM, Jiménez R, González J, 2000; 118: 1739-46. Ferrer A, Celis R, Rodríguez-Roisin R. Incidence, risk and 18. Rello J, Díaz E, Roque M, Vallés J. Risk factors for develop- prognosis factors of nosocomial pneumonia in mechani- ing pneumonia with 48 hours of intubation. ��Am J Respir Crit cally ventilated patients. Am Rev Respir Dis 1990; 142: Care Med 1999; 155: 1742-6. 523-8. 19. Rello J, Sa Borges M, Correa H, Leal SR, Baraibar J. Varia- 26. Trouillet JL, Chastre J, Vaugnat A, Joly-Guillou ML, Com- tions in etiology of ventilator-associated pneumonia across baux D, Dombert ME. ��Ventilator-associated pneumonia four treatments sites: implications for antimicrobial prescribing caused by potentially drug-resistant bacteria. Am J Respir practices. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160: 608-13. Crit Care Med 1998; 157: 531-9.

Recibido: 02/03/10 – Aceptado: 29/12/10 24 Revista Argentina de Microbiología (2011)ISSN 43:0325-7541 24-27 INFORME BREVE Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 24-27

β-lactamasas AmpC plasmídicas tipo CMY-2 emergentes en Tucumán, Argentina

María A. Jure1*, Constanza Presti1, Norma M. Cudmani2, Lidia M. Grellet3, Carolina López4, Eduardo H. Musa4, Olga C. Aulet1, Carlos Nieto5, Lucila Saavedra6, Marta Cecilia de Castillo1

1Instituto de Microbiología “Dr. Luis C. Verna”, Cátedra de Bacteriología, Facultad de Bioquímica, Química, Farmacia y Biotecnología, Universidad Nacional de Tucumán. Ayacucho 491 2° piso, San Miguel de Tucumán; 2Laboratorio de Bacteriología, Hospital Avellaneda. San Miguel de Tucumán; 3Laboratorio de Bacteriología, Hospital de Concepción. Concepción, Pcia. de Tucumán; 4Laboratorio de Bacteriología, Centro de Microbiología Médica. San Miguel de Tucumán; 5Instituto de Microbiología “Dr. Luis C. Verna”, Cátedra de Microbiologia General, Facultad de Bioquímica, Química, Farmacia y Biotecnología, Universidad Nacional de Tucumán. San Miguel de Tucumán; 6Laboratorio de Biología Molecular, Centro de Referencia para Lactobacilos (CERELA). San Miguel de Tucumán, Argentina *Correspondencia. E-mail: [email protected], [email protected]

RESUMEN En los últimos años, algunas enterobacterias como Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis y Escherichia coli adquirieron resistencia a las cefalosporinas de tercera generación (C3G) por la adquisición de β-lactamasas de tipo AmpC plasmídicas, mecanismo que se está comunicando cada vez con mayor frecuencia en el mundo. El objetivo de esta investigación fue detectar la emergencia de b-lactamasas AmpC plasmídicas en Tucumán e identificar sus tipos predominantes. Se estudió la sensibilidad a diferentes antimicrobianos de 733 aislamientos clínicos consecutivos de enterobacterias obtenidos en el período marzo-julio de 2009 en tres centros asistenciales de nuestra provincia. Se realizaron pruebas de sensibilidad por difusión y se seleccionaron tres aislamientos de E. coli y uno de P. mirabilis resistentes a C3G y a cefoxitina. En estos aislamientos se determinó la CIM por E-test y se evaluó el mecanismo en- zimático de resistencia mediante sinergia con discos de ácido aminofenilborónico y ensayo microbiológico de Masuda. Se realizó PCR usando cebadores dirigidos al grupo CIT de las AmpC plasmídicas. Se obtuvo un amplicón de 462

pb que fue secuenciado; presentó un 100% de identidad con blaCMY-2 en los cuatro aislamientos. En conclusión, las β-lactamasas AmpC tipo CMY-2 emergieron en nuestro medio, de modo que es importante implementar una vigilancia sistemática de estas resistencias para evitar potenciales consecuencias clínicas y epidemiológicas. Palabras clave: Enterobacteriaceae, ß-lactamasa AmpC plasmídica, tipo CMY-2

ABSTRACT CMY-2-type plasmid-mediated AmpC β-Lactamases emerging in Tucumán, Argentina. In the last years, En- terobacteriaceae such as Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis and Escherichia coli, have acquired resistance to third-generation cephalosporins (C3G) because of the presence of plasmid-mediated AmpC β-lactamases. The aim of this work was to detect plasmid AmpC enzymes and to investigate the predominant types in our region. Between March and July 2009, 733 consecutive isolates of Enterobacteriaceae derived from hospitals and outpatient centers were studied. Susceptibility testing was performed by disk diffusion; one P. mirabilis and three E. coli strains showed resistance to cephamycins (cefoxitin) and C3G. An E-test to determine MIC and a synergy test by aminophenylboronic disks were performed. Enzymatic activity against cefoxitin was confirmed by a microbiological assay. A polymerase chain reaction (PCR) for the detection of plasmid-mediated ampC genes of different groups was performed and a 462-bp amplicon was obtained when using primers directed against the CIT group; the obtained sequences were

compared to blaCMY-2 sequences, showing 100% identity. The emergence of CMY-2-type plasmid-mediated AmpC β-lactamases indicated the importance of implementing systematic monitoring of these resistances to avoid potential clinical and epidemiological consequences. Key words: Enterobacteriaceae, plasmid-mediated AmpC ß-lactamases, CMY-2 type

En nuestro medio, la presencia de enterobacterias re- confiere resistencia a las C3G. En los últimos años, otras sistentes a las cefalosporinas de tercera generación (C3G) enterobacterias como Klebsiella pneumoniae y Proteus es una realidad; detectar precozmente esta resistencia en mirabilis, que naturalmente carecen de estas enzimas, el laboratorio conduce a tratamientos exitosos. o Escherichia coli que la produce en niveles basales, Géneros como Enterobacter spp., Citrobacter spp. y adquirieron también resistencia asociada a la producción Serratia spp. pueden hiperproducir β-lactamasa de tipo de AmpC codificada en plásmidos (en adelante, AmpC AmpC en forma cromosómica constitutiva, lo que les plasmídicas). AmpC plasmídica tipo CMY-2 en Tucumán 25

En Argentina se documentaron dos tipos de AmpC Con el objeto de evaluar si el fragmento obtenido se plasmídicas: tipo FOX en K. pneumoniae (1994) y tipo localizaba en un plásmido, se procedió a la extracción del CMY-2 en Citrobacter koseri, en K. pneumoniae (2007) ADN plasmídico de los aislamientos clínicos selecciona- y en Shigella flexneri (2008) (6, 10, 11). dos como probables productores de AmpC plasmídica. El objetivo de este trabajo fue detectar la emergencia Esto se realizó por dos metodologías: mediante la técnica de AmpC plasmídicas y caracterizar sus tipos predomi- de Birnboim y Dolly (2) y con un equipo comercial (Axy nantes en nuestra región. Prep Plasmid Miniprep Kit, Axygen Biosciences, Basilea, Se estudió el comportamiento antimicrobiano de 733 Suiza), luego se transformaron células competentes de aislamientos clínicos de E. coli y otras enterobacterias que E. coli DH5a. Los transformantes se seleccionaron en naturalmente no poseen el gen cromosomal ampC. Los placas que contenían agar Luria-Bertani adicionado con aislamientos correspondieron a E. coli (66%), Klebsiella 100 μg/ml de cefoxitina. spp. (21%) y Proteus spp. (13%), y se obtuvieron en De los 733 aislamientos clínicos de enterobacterias tres centros asistenciales de Tucumán (Hospital Nicolás estudiados, se seleccionaron cuatro aislamientos prove- Avellaneda, Hospital Regional de Concepción y Centro nientes de orina: tres de ellos correspondieron a E. coli de Microbiología Médica de Tucumán) en el período marzo-julio de 2009. La prueba de sensibilidad se realizó por difusión con discos siguiendo las normativas del Clinical and Labo- ratory Standards Institute (CLSI) (3). Los antibióticos ensayados fueron ampicilina, amoxicilina/clavulánico, cefalotina, cefoxitina, cefotaxima, ceftacidima, imipenem, cefotaxima/clavulánico, ceftacidima/clavulánico, piperacilina/tazobactama, trimetoprima/sulfametoxazol, ciprofloxacina, gentamicina y amicacina. Los criterios para seleccionar cepas probablemente productoras de AmpC plasmídica fueron sensibilidad disminuida o resistencia a C3G y resistencia a cefoxitina. En los aislamientos seleccionados se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) por E-test de los Figura 1. Prueba de sinergia con discos de ácido 3-aminofenil siguientes antibióticos: cefoxitina, ceftacidima, cefotaxima, borónico (AFB), ceftacidima (CAZ) y cefotaxima (CTX). ceftriaxona y cefepima. No se incluyó en este estudio ningún aislamiento productor de β-lactamasa de espectro extendido (BLEE), por su sensibilidad a cefoxitina. Las enzimas AmpC plasmídicas son inhibidas por el ácido 3-aminofenilborónico (AFB). Para investigar su presencia se llevó a cabo una prueba de sinergia colocando discos con AFB entre los de cefoxitina y/o ceftacidima/ cefotaxima (13), y luego se practicó el ensayo microbio- lógico de Masuda, que consistió en evaluar diferentes concentraciones del extracto enzimático obtenido a partir de cada aislamiento frente a la cefoxitina (8). Una vez detectada la presencia de la enzima en térmi- nos fenotípicos, se realizó la caracterización genética por PCR. Teniendo en cuenta la prevalencia de enzimas AmpC plasmídicas en nuestro país, se escogieron los cebadores descritos por Pérez-Pérez y Hanson (9), que amplifican genes codificadores de enzimas del grupo CIT (LAT-1 a LAT-4, CMY-2 a CMY-7 y BIL 1). Se utilizó como templado el ADN total; como control positivo se empleó un aislamien- to de S. flexneriproductor de AmpC tipo CMY-2 cedido por el Servicio de Antimicrobianos del Instituto Malbrán. El producto de PCR fue enviado a secuenciar con un analizador ABI3130XL (Applied Biosystems, EE.UU.) al Figura 2. Ensayo microbiológico de Masuda. Placa de agar Mueller Hinton hisopada con E. coli ATCC 25923; ee: discos de Instituto de Biotecnología, Unidad de Genómica, Centro papel de filtro impregnados con 5 μl (ee1), 10 μl (ee2) o 15 μl (ee3) de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómi- de extracto enzimático; bf: discos de papel de filtro impregnados cas (INTA Castelar). con buffer PBS (15 μl); FOX: cefoxitina (30 μg). 26 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 24-27

(aislamientos C20 y A964, de pacientes ambulatorios, En este trabajo, de los 733 aislamientos clínicos de y aislamiento C44, de un paciente hospitalizado) y uno enterobacterias obtenidos en un período de 5 meses, correspondió a P. mirabilis (aislamiento A2, de un paciente sólo 4 presentaron el perfil de resistencia enunciado en ambulatorio). Todos ellos fueron resistentes a las ami- el criterio de selección y fueron positivos en la prueba de nopenicilinas, las cefalosporinas de espectro restringido sinergia con los discos con AFB. y la cefoxitina, y presentaron sensibilidad disminuida o En un período de 6 meses y sobre un total de 25 000 resistencia a las cefalosporinas de espectro extendido, aislamientos clínicos de enterobacterias, Rapoport et al. mientras que fueron sensibles a cefepima, piperacilina/ (11) seleccionaron 15 con un perfil de resistencia inusual tazobactama, meropenem e imipenem. a β-lactámicos y que resultaron positivos en la prueba La prueba de sinergia con AFB y el ensayo de Masuda de sinergia con discos con AFB. La presencia de AmpC confirmaron el mecanismo enzimático en los 4 aislamien- plasmídica perteneciente al grupo CIT se confirmó por tos (Figuras 1 y 2). PCR en la totalidad de esos casos. Doy et al. y Rapoport Por PCR se obtuvo un amplicón de 462 pb. Las secuen- et al. sugirieron implementar el uso de discos de AFB cias de los productos de PCR de los aislamientos selec- para detectar esta enzima (5, 11); en el presente estudio, cionados presentaron un 100% de identidad con K. pneu- dicha metodología nos permitió detectar este mecanismo moniae blaCMY-2 (n° de acceso a GenBank; X 91840). inusual en cepas resistentes a cefoxitina. El ADN plasmídico obtenido a partir de los aislamientos Se han documentado valores variables de incidencia clínicos de E. coli fue transferido por transformación a de AmpC plasmídica en Enterobacteriaceae en distintas cepas receptoras de E. coli DH5a. áreas geográficas. Desde el primer informe en Corea Los transformantes presentaron valores de CIM de del Sur en 1989 (1), se ha detectado AmpC plasmídica cefoxitina > a 256 μg/ml (Tabla 1), sinergia con los discos en China y en EE.UU., con incidencias de 2,8% y 1,2%, de AFB y el ensayo microbiológico de Masuda positivos, respectivamente (7, 4). E��n Argentina, Rapoport et al. con lo cual se confirmó en términos fenotípicos que se tra- informaron en 2008 un porcentaje menor de 0,1% de en- taba de una resistencia enzimática. Además, se confirmó terobacterias productoras de enzimas del grupo CIT (11); la presencia del gen blaCMY-2 en las cepas transformantes en nuestro trabajo este porcentaje fue del 0,55%. mediante PCR de colonia con los cebadores específicos La β-lactamasa CMY-2 fue descrita por primera vez antes descritos, con los que se obtuvo un fragmento del en 1990 y se la ha detectado en E. coli, Klebsiella spp., tamaño esperado (462 pb). Proteus spp., Salmonella spp. y Shigella spp. Es la enzima En P. mirabilis no se pudieron obtener plásmidos por de mayor prevalencia y la más ampliamente distribuida los métodos empleados, por lo tanto no se confirmó su en el mundo (1). localización plasmídica. En Argentina, la β-lactamasa CMY-2 fue detectada en va- La búsqueda y detección de las enzimas AmpC en rias especies bacterianas como E. coli, P. mirabilis, C. koseri, los laboratorios se ve limitada debido a que no existen K. pneumoniae y S. flexneri(10, 11, 14, 15). En Tucumán se métodos fenotípicos estandarizados; por otra parte, la detectó por primera vez en E. coli y P. mirabilis. resistencia a cefoxitina como una herramienta de de- En conclusión, hemos demostrado que las β-lactama- tección de AmpC plasmídica es una metodología muy sas AmpC plasmídicas tipo CMY-2 emergieron en nuestro inespecífica, ya que la reducción en la permeabilidad medio. Consideramos que es muy importante implementar de la membrana externa puede originar un fenotipo de su búsqueda rutinaria en todos los centros asistenciales, resistencia similar (4, 12). para evitar su propagación a otros microorganismos.

Tabla 1. Perfiles de sensibilidad a los antimicrobianos en los aislamientos clínicos de E. coli y P. mirabilis seleccionados y en sus respectivos transformantes

Antimicrobianos CIM por E-test (μg/ml) C20 dH5a A964 dH5a C44 dH5a A2 dH5a (TC20) (TA964) (TC44)

FOX ≥256 ≥ 256 ≥256 ≥ 256 ≥256 ≥ 256 ≥256 - CAZ 16 32 16 16 16 16 32 - FEP 0,25 0,25 0,25 0,125 0,25 0,25 3 - CTX 16 16 16 16 16 16 32 - CRO 16 16 16 16 16 16 24 -

FOX: cefoxitina; CAZ: ceftacidima; FEP: cefepima; CTX: cefotaxima; CRO: ceftriaxona. C20: E. coli, Hospital de Concepción; A964: E. coli, Hospital Avellaneda; C44: E. coli, Hospital de Concepción; A2: P. mirabilis, Hospital Avellaneda; DH5a (TC20): E. coli transformante C20; DH5a (TA964): E. coli transformante A964; DH5a (TC44): E. coli transformante C44. AmpC plasmídica tipo CMY-2 en Tucumán 27

Agradecimientos: los autores agradecen a las Dras. Clara of CMY-2 -type AmpC β-lactamase resistance in China. J Ruiz y Cristina Allori y a las Bioqcas. Rosa Cangemi y Norma Clin Microbiol 2008; 46: 1317-21. Porcel por su colaboración en la recepción y conservación 8. Masuda G, Tomioka S, Hasegawa M. Detection of β-lac- de las cepas estudiadas, y al Dr. Fernando Pasterán por tamase production by gram-negative bacteria. J Antibiot- proveer la cepa de S. flexneri utilizada como control positivo. ics1976; 29: 662-4. Este trabajo fue financiado por la Secretaría de Ciencia y 9. Pérez-Pérez FJ, Hanson ND. Detection of plasmid-medi- Técnica de la Universidad Nacional de Tucumán. Programa ated AmpC β-lactamase genes in clinical isolates by using CIUNT 26/D417. multiplex PCR. J Clin Microbiol 2002; 40: 2153-62. 10. Radice M, Cittadini R, Stortz M, Ruggiero M, Gutkind G, Vay C. Emergence of plasmid-mediated AmpC β-lactamases in BIBLIOGRAFÍA ESBL producing enterobacteria in Buenos Aires, Argentina. 47th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and 1. Bauernfeind A, Stemplinger I, Junwirth R, Giamarellou H. Chemotherapy (ICAAC), 2007. Resumen C-2 1512, Chi- Characterization of the plasmidic β-lactamase CMY-2, wich cago, EE.UU. is responsible for cephamycin resistance. ��Antimicrob Agents 11. Rapoport M, Monzani V, Pasteran F, Morvay L, Faccone D, Chemother 1996; 40: 221-4. Petroni A, Galas M. CMY-2-type plasmid-mediated AmpC 2. Birnboim H, Dolly J. A rapid alkaline extraction procedure β-lactamase finally emerging in Argentina. Int J Antimicrob for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res Agents 2008; 31: 385-7. 1979; 7: 1513-23. 12. tan T, Yong L, He J, Koh T, Yang Hsu L. Evaluation of 3. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance screening methods to detect plasmid-mediated AmpC Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 17th in Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Proteus Informational Supplement, 2007; M100-S17. Wayne, PA�, mirabilis. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53: 146-9. EE.UU. 13. Yagi T, Wachino J, Kurokawa H, Suzuki S, Yamane K, Doi 4. Coudron P, Moland E, Thomson K. Occurrence and detection Y, Shibata N, Uato H, Shibayama K, Arakawa Y. Practical of AmpC β-lactamases among Escherichia coli, Klebsiella methods using boronic acid compounds for identification of pneumoniae, and Proteus mirabilis isolates at a Veterans class C β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae and Medical Center. J Clin Microbiol 2000; 38: 1791-6. Escherichia coli. J Clin Microbiol 2005; 43: 2551-8. 5. doi Y, Paterson DL. Detection of plasmid-mediated class 14. Cejas D, Radice M, Almuzara M, Quinteros M, Famiglietti A, C β-lactamases. Int J Infect Dis 2007;11: 191-7. Vay C, Gutkind G. Detección y caracterización de enzimas 6. González M, Pérez-Díaz J, Ayala J, Casellas JM, Mar- de tipo AmpC de localización plasmídica en Escherichia coli. tínez-Beltrán J, Bush K, Baquero F. Gene sequence and XIII Jornadas Argentinas de Microbiología, 2008. Resumen biochemical characterization of FOX-1 from Klebsiella pneu- p. 389, Rosario, Santa Fe, Argentina. moniae, a new AmpC type plasmid mediated β-lactamase 15. Cejas D, Almuzara M, Giovanakis M, Fernández Canigia L, Vay with two molecular variants. Antimicrob Agents Chemother C, Quinteros M, Pagnila G, Lascialandare S, Mutti D, Gutkind 1994; 38: 2150-7. G, Radice M. Análisis de prevalencia de enzimas de tipo AmpC 7. Li Y, Li Q, Du Y, Juang X, Tang J, Wang J, Guilan L, Jiang de codificación plasmídica (PAMPC) en Enterobacteriaceae. Y. ��Prevalence of plasmid-mediated AmpC β-lactamases in X Congreso de la Sociedad Argentina de Infectología, 2010. a Chinese University Hospital from 2003-2005: first report Resumen 26906, p. 75, Mar del Plata, Argentina.

Recibido: 29/12/09 – Aceptado: 15/12/10 28 Revista Argentina de Microbiología (2011)ISSN 43:0325-7541 28-32 INFORME BREVE Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 28-32

Descripción de un brote de intoxicación alimentaria estafilocócica ocurrido en Las Rosas, Provincia de Santa Fe, Argentina

ANÍBAL A. BRIZZIO1*, FABIÁN A. TEDESCHI2, FABIÁN E. ZALAZAR2

1Servicio de Laboratorio, Agencia Santafesina de Seguridad Alimentaria (ASSAL). Francia 2690, 3000 Santa Fe; 2Laboratorio de Práctica Profesional, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral. Avda. Freyre 2150, (3000) Santa Fe, Provincia de Santa Fe, Argentina *Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN En febrero de 2008 se denunció en la localidad santafecina de Las Rosas un presunto brote de una enfermedad transmitida por alimentos. En los procedimientos oficiales no fue posible determinar la cantidad de personas afectadas luego de consumir canelones de verdura adquiridos en un local comercial. Se auditó el establecimiento elaborador y se tomaron muestras del citado producto, muestras ambientales e hisopados de los manipuladores de alimentos. Se entrevistó a los afectados y se recuperaron restos del alimento ingerido. Mediante análisis microbiológicos de rutina se determinó la presencia de S. aureus subespecie aureus coagulasa positivo en muestras del producto consumido, del producto crudo y de los manipuladores del alimento. Los microorganismos indicadores no mostraron niveles significativos y no se aisló otro patógeno de transmisión alimentaria. Se investigó la presencia de genes productores de enterotoxinas estafilocócicas, con resultado positivo para la enterotoxina B en las cepas aisladas de un manipulador y en el alimento vinculado con el brote. Al analizar los aislamientos por SmaI-PFGE se demostró un 100% de similitud entre ellos. La notificación oportuna, las acciones sanitarias coordinadas y la disponibilidad de las herramientas de laboratorio apropiadas permitieron identificar los factores de protección y de riesgo, y cortar la cadena de transmisión de la enfermedad.

Palabras clave: Staphylococcus aureus, enterotoxinas, PCR múltiple, toxiinfección alimentaria

ABSTRACT On February 2008, a suspected foodborne outbreak was reported in Las Rosas (Santa Fe Province, Argentina). The formal procedures indicated that an undetermined number of individuals had experienced food poisoning following consumption of vegetable cannelloni bought at a local shop. The manufacturer establishment was audited. Samples from the suspected food, as well as environmental samples and swabs from food handlers were obtained and involved subjects were interviewed. Remnants of ingested food were also obtained. Routine microbiological procedures of the foodborne outbreak revealed the presence of coagulase positive S. aureus subspecies aureus in samples from ingested and raw food, and from manipulators. Indicator microorganisms did not show significant levels and no other foodborne pathogen was isolated. Presence of staphylococcal enterotoxin-producing genes was subsequently investigated, and a positive result for enterotoxin B was shown in S. aureus strains isolated from a food handler as well as from food linked to the outbreak Moreover, these isolates showed 100% similarity by SmaI-PFGE. Timely notification together with coordinated sanitary measures and the availability of appropriate laboratory tools allowed to interrupt the chain of disease transmission by identifying risk and protective factors.

Key words: Staphylococcus aureus, enterotoxins, multiplex PCR, food poisoning

Alrededor de 1500 millones de casos de diarrea aso- Entre las bacterias que originan estas enfermedades, ciados a 3 millones de muertes ocurren anualmente en Staphylococcus aureus ocupa un papel destacado como el mundo en menores de 5 años. Entre el 15% y el 70% agente etiológico de una de las gastroenteritis más de estas diarreas son el resultado directo de la contami- frecuentes por consumo de alimentos contaminados. nación química o biológica que presentan algunos de los Esta afección se conoce como intoxicación alimentaria alimentos que se comercializan en los diferentes países. estafilocócica (IAE) y está identificada en la Clasificación Se estima que, solo en EE.UU., cada año se presentan Internacional de Enfermedades como CIE 005.0 (14). S. entre 3,3 y 12,3 millones de casos de enfermedades trans- aureus es la especie más característica del género. Entre mitidas por los alimentos (ETA), con un costo asociado sus numerosos factores de virulencia se encuentran las de 6,5 a 34,9 millones de dólares anuales (5). enterotoxinas estafilocócicas (SE). Estas toxinas son pro- Intoxicación alimentaria 29 teínas simples de bajo peso molecular y termotolerantes. en la Guía de Sistemas de Vigilancia de las Enfermedades Hasta hace unos años se reconocían 5 enterotoxinas dife- Transmitidas por Alimentos y la Investigación de Brotes rentes por inmunodifusión (SEA, SEB, SEC, SED, SEE), (GuíaVETA) elaborada por el Instituto Panamericano de posteriormente se describieron 13 nuevos tipos mediante Protección de Alimentos y Zoonosis (INPPAZ), depen- técnicas genotípicas. En la actualidad se reconocen 18 diente de la OPS/OMS (11). Asimismo, se entrevistó a los tipos diferentes de enterotoxinas (SEA-SEU), además de afectados y se recuperaron muestras de los canelones de las variaciones de SEC (SEC1, SEC2, SEC3) (3, 7). verdura tal como fueron consumidos, esto es, con salsa Las SE se producen principalmente en la fase posexpo- y crema. Además, se consultó al centro de salud donde nencial del crecimiento bacteriano y su expresión genética fueron atendidos los afectados, quienes recibieron trata- está controlada por al menos tres sistemas de regulación: miento ambulatorio, sin medicación específica y con re- agr, sar y un sistema de represión catabólica (6). La de- sultados negativos en los análisis bioquímicos realizados terminación del tipo de SE producida por una cepa dada sobre muestras clínicas. Se completaron las planillas y los aporta datos importantes para el estudio bacteriológico, formularios de relevamiento de brote de ETA correspon- epidemiológico, clínico, alimentario y medioambiental de dientes al Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica un evento epidemiológico (7). (SINAVE) y al Sistema de Vigilancia Laboratorial (SIVILA) Existe alta correlación entre la producción de coagu- (11, 14). La documentación, junto con las muestras, fue lasa y la producción de SE en las cepas de S. aureus. De remitida al laboratorio de la Agencia Santafesina de Se- hecho, la mayoría de las cepas de S. aureus vinculadas guridad Alimentaria para su evaluación. con IAE son productoras de coagulasa, por lo cual es esta Según el relevamiento epidemiológico realizado se la principal característica fenotípica que se debe determi- identificaron 5 personas expuestas al consumo de los nar en los aislamientos provenientes de alimentos (7, 10). canelones, 4 adultos y un niño, de los cuales resultaron Sin embargo, también se informaron cepas enterotoxigé- afectados 3 adultos y el niño. Los síntomas que presen- nicas de estafilococos coagulasa negativos S.( cohnii, S. taron estas personas fueron diarrea, náuseas y vómitos, xilosus, S. haemoliticus y S. epidermidis) (12). Además, y se iniciaron 3 h luego de consumido el alimento sospe- se demostró la transferencia a la comunidad de cepas de choso, esto es, los canelones de verdura (masa tipo crêpe S. aureus resistentes a antibióticos o enterotoxigénicos y relleno de picadillo de verdura sazonado) elaborados en desde animales domésticos, granjas u hospitales (1). el establecimiento y listos para consumir. Este alimento Considerando la dificultad para individualizar este fue adicionado con salsa de tomate y crema de leche, y microorganismo como agente etiológico en un brote de calentado en un horno de cocina familiar antes de ser ETA con las herramientas usuales en el laboratorio de consumido. microbiología de alimentos, la reacción en cadena de la El análisis de la información que constaba en la do- polimerasa (PCR) es una alternativa rápida y sencilla para cumentación sugería la presentación de una intoxicación establecer un nexo epidemiológico entre un aislamiento alimentaria. En consecuencia, se realizaron los análisis de de S. aureus y un evento de descripción compatible con rutina de un brote de intoxicación alimentaria: recuento de una IAE (7). Se han descrito numerosas técnicas de PCR microorganismos indicadores por gramo (coliformes tota- para la detección de los genes codificantes de las SE les, coliformes fecales, presencia de Escherichia coli spp. clásicas (sea, seb, sec, sed, see) (1, 9, 12). El objetivo de y de clostridios reductores de sulfito) e investigación de este trabajo fue investigar un brote de IAE y caracterizar patógenos frecuentes, en 25 gramos de muestra (Salmo- el fenotipo y el genotipo de los aislamientos de S. aureus nella spp., E. coli enteropatógena, Clostridium prefringens, relacionados con dicho brote. Bacillus cereus y Staphylococcus aureus). Durante febrero de 2008 se comunicó un presunto Los valores de indicadores microbiológicos no mostra- brote de IAE en la oficina de Seguridad Alimentaria del ron niveles significativos y no se detectó la presencia de Municipio de Las Rosas, provincia de Santa Fe. El res- ninguno de los otros patógenos analizados. Sin embargo, ponsable del establecimiento elaborador de los alimentos en 3 de las muestras analizadas, una de los canelones vinculados con el brote denunció que un número no de- sin cocinar tomada en la rotisería, otra de los canelones terminado de personas habrían padecido una intoxicación ya listos para su consumo (con la salsa y la crema) y la alimentaria luego del consumo de canelones de verdura tercera proveniente del relleno de verdura, los recuentos adquiridos en su local. Como consecuencia del cuadro de S. aureus coagulasa positivo fueron superiores a105 presentado, estas personas habrían sido atendidas en el UFC/g de alimento. Las muestras de la masa para canelón hospital local (Samco Las Rosas). y las de la salsa con crema fueron negativas. Durante la Se realizaron distintos procedimientos oficiales ten- auditoría realizada en el local se concretaron diversas dientes a obtener la información necesaria para la ela- acciones, entre las que cabe destacar el relevamiento boración del informe pertinente del brote (14). Se auditó integral de la información, la toma de muestras medio- el establecimiento elaborador y se tomaron muestras del ambientales en el lugar donde fue elaborado el alimento alimento implicado (canelones con relleno de verdura, sin (hisopados de superficie) y de muestras provenientes de cocinar). A tal fin se aplicaron los procedimientos previstos los manipuladores de los alimentos (hisopados de ma- 30 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 28-32 nos, fauces y narinas), y acciones sanitarias correctivas de cada cebador (SA-U, SA-A, SA-B, SA-C, SA-D y SA- y preventivas. E) (Integrated DNA Technologies, Florida, EE.UU.), 5 Se demostró que los hisopados nasofaríngeos de dos μl de la muestra de ADN y agua destilada estéril, en un manipuladores fueron positivos para S. aureus coagula- volumen suficiente para 25 μl. Se usó un termociclador sa positivo. Las muestras de superficies de mesadas y marca Eppendorf Mastercycler® Personal (Hamburgo, utensilios fueron negativas. Se realizó la identificación Alemania) con las siguientes condiciones de ciclado: bioquímica de los aislamientos a partir de un cultivo en incubación inicial a 95 °C durante 5 min, seguida por 30 agar infusión cerebro corazón (Merck, Alemania) incubado ciclos de15 seg a 95 °C, apareamiento a 50 °C durante a 37 ºC durante 24 h en aerobiosis. En los aislamientos 30 seg y extensión final a 72 °C por 30 seg. El último obtenidos se verificó la presencia de catalasa, DNAsa ciclo consistió en una incubación a 72 °C durante 2 min. (Merck) y coagulasa (Merck), además se realizó la colo- Como controles positivos se utilizaron 5 cepas salvajes ración de Gram. Cuatro aislamientos fueron identificados productoras de enterotoxinas SE y como controles ne- como S. aureus subespecie aureus. Estos fueron hallados gativos repiques provenientes de cepas de S. aureus no en el alimento adquirido, en el alimento consumido y en enterotoxigénicas (ATCC 25923 y ATCC 6538) cedidas dos de los manipuladores. por centros de salud (Figura 1A). La detección cualitativa de genes productores de SE Para la confirmación de los productos de amplificación se realizó con una técnica de PCR múltiple previamente se utilizó una digestión con enzimas de restricción. La validada (7). La extracción de ADN genómico se realizó a selección de la enzima apropiada se realizó mediante partir de 5-10 colonias, que fueron resuspendidas en 150 el análisis de las secuencias asistido por programas µl de agua bidestilada y calentadas durante 15 minutos bioinformáticos disponibles en línea. Los tamaños de a 100 °C. Posteriormente, el resultado de la extracción los fragmentos generados en la digestión se describen se centrifugó a 10 000 g durante 10 min para eliminar en la Tabla 1. La digestión se realizó adicionando 10 U restos celulares. El sobrenadante fue trasvasado a un (1 μl) de la enzima Rsa I Promega® a un volumen de 20 tubo nuevo y almacenado a -20 °C hasta su utilización μl de la reacción de amplificación, esa mezcla se incubó en la reacción de amplificación. Los oligonucleótidos luego a temperatura óptima durante 1 h. El análisis de los cebadores empleados fueron los propuestos por Sharma productos de amplificación se realizó por electroforesis en et al. (13); dicho protocolo permite la detección de genes un gel de agarosa a una concentración adecuada en pre- que codifican estas enterotoxinas utilizando un cebador sencia de 0,5 μg/ml de bromuro de etidio. Se analizaron delantero universal que se aparea a una región 5´conser- alícuotas de 10 μl de la reacción de PCR en un campo de vada y 5 oligonucleótidos cebadores reversos específicos, 10 V/cm por espacio de 1 h o hasta la resolución deseada. para cada uno de los 5 genes individuales que codifican Finalizada la electroforesis, los geles fueron visualizados cada una de las enterotoxinas que se investigan (sea, en un transiluminador UV. Las imágenes resultantes seb, sec, sed, see) en una sola reacción de amplificación se registraron en una cámara digital utilizando un (Tabla 1). La reacción de amplificación se preparó con filtro naranja. Cada corrida se realizó en presencia 12,5 μl del 2X GoTaq Green MasterMix Buffer (pH 8,5) de un marcador de tamaño molecular (Cien Marker Promega® (Biodynamics SRL, Buenos Aires, Argentina), Promega®). Se empleó el ARNr 16S como control in- que contenía Taq polimerasa, dNTPS y MgCl2, 0,4 μM terno de amplificación no competitivo. Utilizando este

Tabla 1. Secuencia de los cebadores utilizados en la PCR, tamaño de los productos de amplificación, N° de acceso de las cepas patrón en Gene Bank y análisis teórico de los sitios de corte de la enzima de restricción Rsa I. SA-Uf: forward primer universal; SA-Ar, SA-Br, SA-Cr, SA-Dr, SA-Er: reverse primer específico para cada gen.

Molécula Secuencia de Oligonucleótidos Producto de Acceso en Sitio de Tamaños de PCR (pb) Gene Bank N° corte Fragmentos (pb)

sea SA-Uf: 5’-TGTATGTATGGAGGTGTAAC-3’ 270 FJ495182 98 172-98

SA-Ar: 5’-ATTAACCGAACGTTCTGT-’3 seb SA-Uf: 5’-TGTATGTATGGAGGTGTAAC-3’ 165 AB462490 107 107-58

SA-Br: 5’-ATAGTGACGAGTTAGGTA-3’ sec SA-Uf: 5’-TGTATGATATGGAGGTGTAAC-3’ 102 AM778682 65 65-37

SA-Cr: 5’-AATTGTGTTTCTTTTATTTTCATAA-3’ sed SA-Uf: 5’-TGTATGTATGGAGGTGTAAC-3’ 303 DQ630751 83-107 166-83-54

SA-Dr: 5’-TTCGGGAAAATCACCCTTAA-3’ see SA-Uf: 5’-TGTATGTATGGAGGTGTAAC-3’ 213 AY518387 7-59-98 115-52-39-7

SA-Er: 5’GCCAAAGCTGTCTGAG-3’ Intoxicación alimentaria 31

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa al 2%. A- Productos de amplificación por PCR múltiple de los genes de enterotoxinas de S. aureus. Calles A, B, C, D y E; enterotoxinas A, B, C, D y E, respectivamente. Calle M: marcador de tamaño molecular (BenchTop 100bp DNA Ladder, Promega®, EE.UU.). B- Calle 1: control de reactivos; calles 2 y 3: ADN extraído de S. aureus aislados de manipuladores; calles 4 y 5: ADN extraído de S. aureus aislados de canelones crudos y cocidos, respectivamente.

Figura 2. Patrones de SmaI-PFGE y dendrograma de los aislamientos de S. aureus recuperados de los canelones y de los manipuladores Calle 1: aislamiento recuperado de manipulador 1; calle 2: aislamiento recuperado de canelones cocidos; calle 3: aislamiento recuperado de canelones crudos; calle 4: aislamiento recuperado de manipulador 3. protocolo se investigó la presencia de las secuencias y establecer su relación genética por electroforesis en correspondientes a los genes que codifican SE en los campo pulsado (PFGE). Por SmaI-PFGE se demostró que aislamientos provenientes de los canelones adquiridos, los aislamientos 1, 2 y 3, correspondientes al manipula- como así también en los aislamientos recuperados de dor 1, a los canelones cocidos y a los canelones crudos, los canelones consumidos y de los manipuladores de respectivamente, presentaron un 100% de similitud entre ese alimento. Tanto los aislamientos provenientes de sí, y se diferenciaron del aislamiento proveniente del otro los alimentos analizados como los recuperados de los manipulador en un 69% (Figura 2). En consecuencia, al manipuladores demostraron ser productores de ente- comparar los distintos patrones de restricción, se despren- rotoxina B (Figura 1B). de que las muestras de ADN provenientes de las cepas Los cuatro aislamientos de S. aureus coagulasa posi- de S. aureus aisladas de los canelones, tanto crudos tivo obtenidos (el de los canelones crudos, aislamiento 3; (muestra 3) como cocidos (muestra 2), son indistinguibles el de los canelones cocidos, aislamiento 2; y los obtenidos de la cepa obtenida a partir del hisopado nasofaríngeo del de los dos manipuladores, aislamientos 1 y 4) fueron primer manipulador (muestra 1). A partir de estos perfiles remitidos al Laboratorio Nacional de Referencia (ANLIS se podría inferir que el origen de la contaminación podría “Dr. Carlos G. Malbrán”) para confirmar los resultados estar relacionado con el manipulador 1 (15). 32 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 28-32

Cabe mencionar que las cepas aisladas podrían ser 2. Becker K, Roth R, Peters G. Rapid and specific detection of portadoras de otros genes productores de enterotoxinas, toxigenic staphylococcus aureus: use of two multiplex PCR enzyme immunoassays for amplification and hybridization que en el presente trabajo no se investigaron (3, 8). El of staphylococcal enterotoxin genes, exfoliative toxin genes, análisis microbiológico del alimento no evidenció la pre- and toxic shock syndrome toxin 1 gene. J Clin. Microbiol sencia de otros patógenos de transmisión alimentaria 1998; 36: 2548-53. y el conteo de microorganismos indicadores no arrojó 3. ��Bhatia A, Zahoor S. Staphylococcus aureus enterotoxins: A review. J Clin Diag Res 2007; 3: 188-97. niveles significativos, lo que indicaría condiciones ade- 4. Brizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identifi- cuadas de procesamiento, con fallas en la manipulación cación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis del alimento (7). de Maestría en Microbiología Molecular 2009. ANLIS “Dr. La notificación oportuna de un brote de ETA es im- Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín. 5. Buzby JC, Roberts T. Economic costs and trade impacts of portante para obtener un diagnóstico correcto y cortar microbial foodborne illness. World Health Stat Q 1997; 50: la cadena de transmisión de la enfermedad. También es 57-66. fundamental la toma de acciones sanitarias coordinadas 6. Fueyo Mendoza, JM. Frecuencia y tipos de toxinas superan- y la disponibilidad de herramientas de laboratorio apropia- tígenos en Staphylococcus aureus de diferentes orígenes: tipos y relaciones. 2008. Editorial�� Univ Oviedo [�Online��] das. En este trabajo se pudo poner de manifiesto el valor http://www.ebrary.com/lib/unsam. de realizar una vigilancia basada en el laboratorio (14) 7. International Comission on Microbiological Specifications como parte de una vigilancia integrada de las enferme- for Foods-ICMSF. Microorganisms in Foods 1. Their sig- dades transmitidas por los alimentos. El relevamiento de nificance and methods of enumeration. 1982. 8. Le Loir Y, Baron F, Gautier M. Staphylococcus aureus and la información, la recolección de muestras y el análisis de food poisoning. Genet Mol Res 2003; 2: 63-76. los resultados permitió vincular al patógeno con la fuente 9. López C, Feltri A, Leotta G, González G, Manfredi E, Gottardi e inferir las asociaciones espacio-tiempo de este brote. G, Elder M, de las Contreras S, Patri C, Guajardo F, San Además, esta investigación corrobora la importancia de Martín A, Rivas M. Brote de enfermedad alimentaria en la localidad de El Huecú, provincia de Neuquén. Rev Argent caracterizar los aislamientos por PCR, una alternativa Microbiol 2008; 40: 198-203. rápida y económica para la evaluación de eventos epide- 10. Mac Faddin J. Pruebas bioquímicas para la identificación miológicos. Finalmente, cabe mencionar la importancia de bacterias de importancia clínica. Editorial Médica Pana- de aplicar y verificar las medidas sanitarias de control mericana, 2003. 11. OPS / OMS / Instituto Panamericano de Protección de Ali- y fiscalización de los alimentos, como su manipulación mentos y Zoonosis, INPPAZ. Guía para el establecimiento higiénica y las buenas prácticas de manufactura. de Sistemas de Vigilancia Epidemiológicas de Enferme- dades Transmitidas por Alimentos y la Investigación de Agradecimientos: Marta Rivas y Servicio Fisiopatogenia, Brotes de Toxi-infecciones Alimentarias. ��“Guia VETA”. Departamento Bacteriología, INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, INPPAZ/OPS/OMS, HPV/FOS/103/93. Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Gerardo Ardusso: Facultad 12. Rapini L S, Cerqueira M, Carmo L, Veras J, Souza M. Pre- de Cs. Veterinarias Universidad Nacional de Rosario. Cátedra sence of Staphylococcus strains producer of enterotoxins de Parasitología. ASSAL, Ministerio de Salud, Santa Fe; por su and toxic shock toxin syndrome isolated from goat’s cheese colaboración en relevar la información vinculada al brote de in- handlers. Arq ��Bras Med Vet Zootec 2005; 57: 825-9. toxicación alimentaria. Juan M. Fernández: Servicio Laboratorio, 13. Sharma N, Rees C, Dodd C. Development of a single-reac- ASSAL, Ministerio de Salud, Santa Fe; por su colaboración en el tion multiplex PCR toxin typing assay for Staphylococcus análisis de las muestras colectadas en el brote de intoxicación aureus strains. Appl Environ Microbiol 2000; 66: 1347-53. alimentaria. 14. SINAVE SIVILA. Ministerio de Salud, Argentina. Dirección de Epidemiología, Programa de Vigilancia de la Salud y Control de Enfermedades. Manual de Normas y Proced- BIBLIOGRAFÍA imientos del Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica. 1999, Revisión Internacional 2000. 1. Atanassova V, Meindl A, Ring C. Prevalence of Staphylococ- 15. Tenover F, Arbeit R, Goering R, Mickelsen P, Murray B, cus aureus and staphylococcal enterotoxins in raw pork and Persing DH, Swaminathan B. Interpreting chromosomal uncooked smoked ham-a comparison of classical culturing DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel elec- detection and RFLP-PCR. Inter J Food Microbiol 2001; 68: trophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 105-13. 1995; 33: 2233-9.

Recibido: 08/06/10 – Aceptado: 20/10/10 Brote de ETA en Paraguay ISSN 0325-754133 INFORME BREVE Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 33-36

Brote de intoxicación alimentaria asociado al consumo de leche ultrapasteurizada en la República del Paraguay

NATALIE WEILER1*, GERARDO A. LEOTTA2, 3, MIRIAN N. ZARATE1, EDUARDO MANFREDI2, MERCEDES E. ALVAREZ 1, MARTA RIVAS2

1Departamento de Bacteriología y Micología, Laboratorio Central de Salud Pública, Ministerio de Salud Pública y Bienestar Social de la República del Paraguay. Av. Venezuela y Florida, (1429) Asunción, Paraguay; 2Servicio Fisiopatogenia, Departamento Bacteriología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”. Av. Vélez Sarsfield 563, (1281) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina; 3Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). *Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN Durante marzo de 2007 ocurrió un brote epidémico asociado al consumo de leche ultrapasteurizada que afectó a las ciudades de San Lorenzo, Ciudad del Este y Asunción, de la República del Paraguay. Las personas afectadas fueron 400, de las cuales 60 requirieron hospitalización. Se aisló S. aureus subespecie aureus de 5 pacientes, 3 operarios y 3 muestras de leche. Todas las cepas fueron productoras de enterotoxinas. Las aislamientos de 3 pacientes, de un operario y de las muestras de leche portaron los genes que codifican las enterotoxinas C (sec) y D (sed), y presentaron un patrón único de macrorrestricción (SmaI-PFGE). Se identificó a la leche como fuente de intoxicación y a un operario de la línea de producción como origen de la contaminación. Este es el primer brote de ETA denunciado en Paraguay en el cual se pudo aislar, caracterizar y subtipificar el agente etiológico en la planta de elaboración, en el alimento y en las personas afectadas. Palabras clave: Staphylococcus aureus; Paraguay; gastroenteritis; enfermedad alimentaria; leche ultrapasteurizada

ABSTRACT Foodborne outbreak associated with consumption of ultrapasteurized milk in the Republic of Paraguay. During March 2007 there was an epidemic outbreak associated with the consumption of ultrapasteurized milk. Four hundred people were affected and 60 required hospitalization. S. aureus subspecies aureus was isolated from 5 patients, 3 operators and 3 milk samples. All strains produced enterotoxins. Strains isolated from 3 patients, one operator and all the milk samples carried the genes encoding enterotoxins C (sec) and D (sed), and showed an indistinguishable macrorestriction pattern (SmaI-PFGE). Milk was identified as the source of intoxication and a production line operator as the source of contamination. This is the first foodborne outbreak reported in Paraguay whose agent was isolated, characterized and subtypified in the production plant, the food and the affected people. Key words: Staphylococcus aureus, Paraguay, gastroenteritis, foodborne disease; ultrapasteurized milk

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) frente a determinadas condiciones como, por ejemplo, constituyen uno de los problemas de salud más relevan- temperatura de almacenamiento >10 °C, actividad acuosa tes. Las ETA de origen infeccioso pueden estar asociadas > 0,86 y pH >5 (15). Los principales factores de virulencia a agentes virales, parasitarios y bacterianos. Entre las de S. aureus son las enterotoxinas (SE), proteínas simples bacterias se incluye Staphylococcus aureus, un microor- de bajo peso molecular (26 000 - 34 000) y termotolerantes ganismo que coloniza la piel, la mucosa y la nasofaringe (4). Se considera que las SE asociadas a brotes de ETA del hombre y de los animales (8). Su presencia en los son SEA, SEB, SEC, SED y SEE (5, 14). Sin embargo, en alimentos procesados se debe a la contaminación in- la actualidad se reconocen 13 nuevos tipos de toxinas y su troducida por los manipuladores, debido a inadecuadas implicancia en la salud pública todavía no está totalmente prácticas de manufactura, o por la utilización de materia dilucidada. Los signos clínicos aparecen en forma brusca prima contaminada (3). después de 1 a 6 h de haber ingerido los alimentos con Entre los alimentos implicados en brotes de ETA aso- SE y comprenden vómitos, náuseas, dolor abdominal, ciados a S. aureus se encuentran la leche y sus derivados. malestar general, debilidad, postración, calambres y La multiplicación de S. aureus en el alimento se favorece diarrea moderada. La mayoría de los enfermos se recu-

Filiación actual de Gerardo A. Leotta: Laboratorio de Microbiología de los Alimentos CCT-La Plata, Instituto de Genética Veterinaria “Ing. Fernando Noel Dulout” CONICET. Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata. Calle 60 y 118 S/N. CC: 296. (1900) La Plata,Buenos Aires, Argentina 34 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 33-36 peran en 24-48 h sin necesidad de tratamiento, aunque caracterizados por pruebas bioquímicas, ELISA y PCR. las personas debilitadas, los niños y los ancianos pueden Se realizaron las siguientes pruebas bioquímicas (9): requerir atención hospitalaria (5, 10, 11). catalasa, coagulasa en tubo, DNAsa (Laboratorios Brita- En el presente trabajo se describe la investigación mi- nia), producción de acetoína (caldo RM/VP, Laboratorios crobiológica de un brote de ETA asociado al consumo de Britania) y reducción de nitrato (caldo cerebro corazón leche ultrapasteurizada en la República del Paraguay. 2,5% KNO3 0,1% Standard, EE.UU.). Luego se determinó Las ciudades de San Lorenzo y Asunción pertenecen al la fermentación de azúcares al 1% en caldo base de rojo Departamento Central; Asunción es la capital de la Repú- fenol (Becton Dickinson). Los azúcares probados fueron blica; Ciudad del Este pertenece al Departamento de Alto trehalosa, lactosa y manosa (ICN Biomedials Inc., Ohio, Paraná. Estas ciudades cuentan con una población de EE.UU.). Simultáneamente se utilizó el equipo de inmu- 450 000, 519 000 y 250 000 habitantes, respectivamente. noensayo TECRA (International Pty Ltd, Australia) para Entre los días 6 y 11 de marzo de 2007 ocurrió un brote determinar la capacidad de los aislamientos de producir de ETA que afectó a las tres ciudades. Se registraron el pool de enterotoxinas SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, aproximadamente 400 denuncias sobre personas con SED y SEE. Para la detección de los genes sea, seb, signos y síntomas de enfermedad gastrointestinal luego sec, sed, see y 16S ARNr, se utilizaron los protocolos de del consumo de leche ultrapasteurizada. De estas perso- reacción en cadena de la polimerasa (PCR) estandariza- nas, 279 fueron atendidas en servicios de salud, donde dos por Manfredi et al. (11). Las cepas de S. aureus que se realizaron las encuestas epidemiológicas pertinentes se obtuvieron fueron subtipificadas mediante la técnica para el estudio de brotes de enfermedades transmitidas de electroforesis en campo pulsado con la enzima SmaI por alimentos. La edad promedio de los afectados fue (SmaI-PFGE), según el protocolo utilizado por López de 10,3 ± 13,7 años (rango: 0,25 - 78 años). La mayoría et al. (10). El análisis de los patrones de restricción se de ellos presentó un cuadro emético a las 3 h de haber realizó con el programa informático BioNumerics versión consumido la leche, y posteriormente un cuadro de diarrea 3.5 (Applied Maths, Kortrijk, Bélgica). La relación entre asociada. En dos casos se observó un cuadro de shock, los perfiles fue estimada por la proporción de bandas uno de los cuales afectó a un niño menor de un año que compartidas aplicando el coeficiente de Dice y generando falleció. Los pacientes refirieron en común el consumo de dendrogramas basados en el método UPGMA. leche ultrapasteurizada adquirida en bocas de expendio. Se aisló S. aureus coagulasa positivo de 5 muestras de Se definió como “caso clínico” a toda persona que informó materia fecal de las personas afectadas, de 3 muestras de la presencia de dolor cólico abdominal o de diarrea a partir secreción nasal de operarios de la planta elaboradora y de del 6 de marzo y que había consumido leche ultrapasteu- las 3 muestras de leche ultrapasteurizada. Las 11 cepas rizada del mismo lote y marca comercial. fueron identificadas comoS. aureus subespecie aureus. Ante la presunción de un brote de ETA por una fuente Mediante la técnica de ELISA se demostró que todas las común con origen en el consumo de leche ultrapasteu- cepas eran productoras de una o más enterotoxinas del rizada, se tomaron tres tipos de muestras: 1) de casos pool SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED y SEE. Por clínicos (n = 12); 2) de operarios de la planta elaboradora PCR múltiple fue posible diferenciar los genes que codi- (n = 5); y 3) de leche ultrapasteurizada (n = 3). El 11 de fican la expresión de cada una de estas enterotoxinas. marzo se recibieron en el laboratorio tres envases ce- Se demostró que las cepas aisladas de 3 casos clínicos, rrados de leche ultrapasteurizada adquiridos en bocas de un operario y de la leche ultrapasteurizada fueron de expendio, de la misma marca y lote que las unidades portadoras de los genes sec y sed. Las cepas aisladas consumidas por las personas afectadas. Entre los días 8 de los otros dos casos clínicos sólo portaron el gen sed. y 11 de marzo se recibieron 12 muestras de materia fecal Respecto de los otros operarios, la cepa aislada de la de casos clínicos. El día 23 de marzo se tomaron muestras secreción nasal de uno de ellos fue positiva para el gen de secreción nasal a 5 operarios de la planta elaborado- seb, en tanto que la cepa aislada del otro operario fue ra de leche ultrapasteurizada mediante la utilización de negativa para todos los genes. Sobre un total de 11 cepas hisopos estériles, las que fueron colocadas en medio de de S. aureus analizadas, se establecieron 4 patrones de transporte Stuart (Laboratorios Britania, Argentina) hasta SmaI-PFGE (Figura 1), los cuales presentaron entre 12 su procesamiento. y 14 bandas bien definidas de 45 a 630 kb. Las 3 cepas Las tres muestras de leche fueron procesadas según aisladas de las muestras de leche ultrapasteurizada, las la norma ISO 6888-1 para la detección y el aislamiento 3 cepas aisladas de las muestras de materia fecal de de S. aureus (13). Las muestras de materia fecal y de casos clínicos y la cepa aislada de la muestras de secre- secreción nasal fueron sembradas en agar sangre de ción nasal de uno de los operarios (patrón SmaI-PFGE carnero al 5% (agar base tripticasa soja, Laboratorios #3) presentaron un 100% de similitud entre sí, un 93,7% Britania) y agar manitol salado (Becton Dickinson, Le de similitud con las cepas aisladas de otros dos casos Pont de Claix, EE.UU.), y se incubaron durante 24 h a clínicos (patrón SmaI-PFGE #4) y un 44% de similitud con 35 ºC. Las colonias compatibles con Staphylococcus las cepas aisladas de los otros dos operarios (patrones spp. fueron reaisladas en agar sangre y los aislamientos SmaI-PFGE #1 y #2, respectivamente). Brote de ETA en Paraguay 35

Figura 1. Dendrograma de la relación genética de cuatro patrones Smal-PFGE, origen y perfil feno-genotípico de los aislamientos.

Luego del brote se inspeccionó la planta elaboradora. de S. aureus se encontraba en la leche ultrapasteurizada, Se identificaron inconvenientes durante el proceso de en la materia fecal de 3 casos clínicos y en la secreción producción de los 50 000 litros de leche ultrapasteuriza- nasal de un operario. Este hallazgo demuestra que el ope- da. Los operarios involucrados repararon un desperfecto rario tuvo contacto con el alimento en una etapa posterior técnico en la línea de producción, pero no se realizó la al tratamiento térmico. Esta hipótesis fue confirmada en recirculación de la leche hacia la etapa de ultrapasteu- una entrevista posterior realizada a los operarios de la rización. planta elaboradora. Además, estos resultados permitieron La notificación de un brote de ETA como el descrito confirmar que luego de la intervención del operario, los causa un gran impacto en la sociedad y pone en evidencia 50 000 litros de leche afectados no fueron reprocesados. la fragilidad de los sistemas de control de los alimentos, y Debemos considerar que la leche ultrapasteurizada se en menor medida, de los sistemas preventivos de salud. conserva a temperatura ambiente debido al tratamiento En la mayoría de los brotes de ETA es difícil relacionar la térmico que recibe, y que esta temperatura favorece la fuente de intoxicación con los pacientes afectados, y más multiplicación de S. aureus, que puede alcanzar o incluso difícil aún es establecer el origen de la contaminación de superar niveles de 105 UFC/ml de alimento, concentración los alimentos involucrados, sobre todo si consideramos en la que este microorganismo produce las enterotoxinas que, en general, el lote del alimento involucrado en un causantes de la intoxicación alimentaria (7). brote de ETA no se encuentra en las bocas de expendio En la última década se describieron varios brotes de cuando las personas afectadas manifiestan los síntomas intoxicación alimentaria por la presencia de enterotoxinas de la intoxicación alimentaria. Es por ello que muchos de S. aureus en los alimentos (2, 12) y se caracterizaron brotes de ETA pasan inadvertidos, lo que genera un im- aislamientos de S. aureus enterotoxigénico a partir de portante subregistro de casos. En otras oportunidades, alimentos (1, 6). En este trabajo se demostró el valor de particularmente en brotes masivos, se toman medidas recolectar rápidamente los alimentos en las bocas de de intervención sin identificar las causas que originaron expendio, investigar la planta elaboradora del alimento y el brote. En tales casos son escasas las posibilidades analizar muestras del alimento, de los casos clínicos y de de cortar la cadena de transmisión, y muchas veces la los operarios de las plantas elaboradoras mediante técnicas investigación queda reducida a una descripción de los bacteriológicas y de subtipificación molecular. Este es el hechos, sin recuperación de muestras biológicas ni de primer brote de ETA denunciado en Paraguay en el cual alimentos (10). se pudo identificar al patógeno implicado en el alimento y Si bien en este trabajo se identificó el alimento invo- en muestras de pacientes; además, se pudo establecer el lucrado en el brote y se analizaron muestras de dicho origen de la contaminación. Los resultados de este trabajo alimento y de materiales clínicos obtenidos de los pa- permitieron proponer recomendaciones de prevención en cientes afectados así como de los operarios de la planta la planta elaboradora de leche ultrapasteurizada. elaboradora, no se realizó un estudio epidemiológico de tipo caso-control. Agradecimientos: Se agradece al Instituto Nacional de Alimentación y Nutrición de la República del Paraguay (INAN), El agente etiológico de la intoxicación alimentaria fue al Instituto Nacional de Tecnología y Normalización de la Re- identificado comoS. aureus subespecie aureus enterotoxi- pública del Paraguay (INTN) y al Laboratorio Tesai de Ciudad génico. Por SmaI-PFGE se demostró que el mismo clon del Este.

36 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 33-36

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Recibido: 10/08/10 – Aceptado: 23/11/10 Tuberculosis pediátrica durante 2004-2008 ISSN 0325-754137 INFORME BREVE Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 37-41

Tuberculosis pediátrica en un hospital de referencia durante el período 2004-2008

MÓNICA G. RODRÍGUEZ*, CLAUDIA P. PATALLO, VIVIANA A. RIZZOTTI, MARÍA A. MOSCOLONI, DANIELA S. BALLESTER Hospital General de Agudos “Parmenio Piñero”, Varela 1037 (1406) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. *Correspondencia. E-mail: ��monicared��55@y�a�h��oo.com.ar

RESUMEN Se realizó un estudio retrospectivo y descriptivo de las muestras de pacientes pediátricos remitidas al laboratorio del Hospital Piñero durante el período 2004-2008 para el cultivo de micobacterias por sospecha de tuberculosis. Durante dicho período ingresaron un total de 8409 muestras, de las cuales 1542 (18%) fueron pediátricas; de ellas 1407 (91%) pulmonares y 135 extrapulmonares (9%). El procesamiento de las muestras incluyó baciloscopía, cultivo, identificación y prueba de sensibilidad. La nacionalidad de los pacientes pediátricos se distribuyó del siguiente modo: argentinos, 1218 (79%); extranjeros, 247 (16%), representados estos últimos por paraguayos, peruanos y sobre todo bolivianos. Para un 5% de los pacientes no fue informada la nacionalidad. La distribución por sexo fue: femenino, 787 pacientes (51%); masculino, 755 pacientes (49%). De acuerdo con la edad de los pacientes se obtuvo la siguiente distribución: 0 a 4 años, 674 niños (grupo A, 45%), 5 a 9 años, 354 niños (grupo B, 24%); y 10 a 15 años, 464 pacientes (grupo C, 31%). Las principales asociaciones mórbidas fueron desnutrición e infección por el virus de la inmunodeficiencia humana. La baciloscopía fue positiva en 41 muestras (2,6%), en tanto que la recuperación mediante cultivo alcanzó las 84 muestras (5,4%), 78 de ellas pulmonares y 6 extrapulmonares. Todas las cepas fueron identificadas como complejo Mycobacterium tuberculosis. Los aislamientos fueron sensibles a estreptomicina, isoniazida, rifampicina y etambutol, excepto una cepa resistente a etambutol y estreptomicina y otra resistente a isoniazida. La confirmación bacteriológica de la tuberculosis pediátrica es difícil de alcanzar debido a la presentación paucibacilar de las muestras, pero juega un papel fundamental en el diagnóstico de certeza, ya que permite la identificación y la realización de las pruebas de sensibilidad del aislamiento. Palabras clave: tuberculosis, pediatría, diagnóstico, confirmación bacteriológica

ABSTRACT Pediatric tuberculosis at a reference hospital during the 2004-2008 period. Samples of pediatric patients suspected of tuberculosis and cared for at Hospital Piñero during the 2004-2008 period were analyzed according to epidemiological and clinical criteria. The bacteriological contribution was evaluated to confirm the disease diagnosis. A descriptive retrospective analysis of the cases was done. A total of 8409 samples were received for mycobacterial culture: 1542 (18%) of which were pediatric and distributed as follows: 1407 (91%), pulmonary and 135 (9%), extra-pulmonary. The sample examination included staining for acid-fast bacilli, culture, identification and drug susceptibility testing. The following are the results of analized demographic variables: Nationality: 1218 Argentinean (79%), 247 foreigners (16%) and 77, not disclosed (5%); Gender: 787 female (51%) and 755 male (49%). Patients were grouped according to age into: Group A, 0 to 4 years 674 (45%); Group B, 5-9 years 354 (24%) and Group C, 10-15 years 464 (31%). Morbidity causes associated with the disease were mainly malnutrition and infection by Human Immunodeficiency Virus. Stain- ing for acid-fast bacilli was positive in 41 samples (2.6%) and 84 cultures resulted positive (5.4%), 78 (93%) of which were pulmonary and 6 (7%) extra-pulmonary samples. All the strains were identified as Mycobacterium tuberculosis. Isolates were susceptible to streptomycin, isoniazid, rifampicin, and ethambutol, except for one strain that was resistant both to ethambutol and streptomycin, and another one which was resistant to isoniazid. Bacteriological confirmation of pediatric tuberculosisis is rarely achieved due to the predominantly paucibacillary nature of the disease in children (5% in our study), but plays a fundamental role in diagnosis accuracy, allowing the identification and susceptibility testing of the strain.

Key words: tuberculosis, pediatric, diagnosis, bacteriological contribution

La tuberculosis (TBC) constituye en el mundo un nes de casos, aunque debe considerarse que esa cifra grave problema de salud pública aún no resuelto, puede estar sesgada por notificaciones deficientes y, especialmente en los países pobres. Un tercio de la en muchos casos, prácticamente nulas. La prevalencia población mundial está infectada por Mycobacterium suma más de 30 millones de casos y la letalidad oscila tuberculosis, con una incidencia anual de 8 a 10 millo- entre 2 y 3 millones por año (15). 38 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 37-41

En el 2008 se comunicaron en Argentina 10 452 casos y etambutol (E) (5 µg/ml) se realizó por los métodos sede TBC, lo que representó una tasa de 26,3 casos por cada miautomatizado BACTEC 460 SIRE (Becton Dickinson) 100 000 habitantes (4). Según datos recogidos por la Red y automatizado BACTEC MGIT 960 SIRE kit (Becton para la Atención de la Tuberculosis, en el 2009 hubo en Dickinson). la Ciudad de Buenos Aires 36,9 casos por 100 000 habi- El análisis de las variables demográficas reveló los tantes, con grandes diferencias entre las distintas áreas siguientes resultados. En lo referente a la nacionalidad programáticas. Así, el área del Hospital Pirovano registró de los pacientes de los que provenían las muestras, hubo una tasa de 5,6 por 100 000 habitantes, en comparación 1218 argentinos (79%) y 247 extranjeros (16%), represen- con los informes de áreas como la del Hospital Piñero, tados estos últimos por paraguayos (20), peruanos (25) que fue de 133,7 por 100 000 habitantes. y bolivianos (202); para los 77 pacientes restantes (5%) La TBC en la edad pediátrica presenta características este dato no fue informado. peculiares en cuanto a su abordaje, su patogenia, su La distribución por sexo no reveló diferencias significa- presentación clínico-radiológica y la posibilidad de con- tivas: 787 eran mujeres (51%) y 755 varones (49%). firmación microbiológica e implicancias epidemiológicas, De acuerdo con la edad, los pacientes se clasificaron que la distingue de las formas del adulto (1). en 3 grupos: 0 a 4 años (grupo A), 5 a 9 años (grupo B) El rédito bacteriológico en la infancia es escaso dada la y 10 a 15 años (grupo C). Los resultados obtenidos se naturaleza paucibacilar de las lesiones, a lo que se agrega muestran en la Figura 1, donde se observa la cantidad la problemática de la recolección de las muestras para total de muestras recibidas para el cultivo en los diferen- su estudio microbiológico. Por lo tanto, la epidemiología de la TBC primaria en el niño no tiene injerencia en la cadena de transmisión, sino que constituye una adver- tencia para la búsqueda activa y exhaustiva de un caso bacilífero cercano. Los objetivos de este informe fueron analizar las ca- racterísticas epidemiológicas y clínicas de las muestras de pacientes pediátricos con sospecha de tuberculosis atendidos en el Hospital General de Agudos “Parmenio Piñero”, en su área programática y en los hospitales derivantes ingresadas al laboratorio durante el período 2004-2008, así como evaluar el aporte bacteriológico al diagnóstico de certeza. Se realizó un estudio retrospectivo y descriptivo donde se analizaron las variables demográficas (sexo, nacionalidad, edad), las formas de presentación clínica y las variables microbiológicas. Un total de 8409 muestras ingresaron en dicho período para el cultivo de micobacterias, de las cuales 1542 (18%) fueron pediátricas, con un promedio de 3 muestras para cada uno de los pacientes, distribuidas en: l Muestras pulmonares, 1407 (91%), representadas Figura 1. Clasificación de las muestras totales recibidas según por esputos, lavados gástricos, aspirados traqueales, grupos etarios y casos positivos por cultivo. lavados bronquiales y broncoalveolares. l Muestras extrapulmonares, 135 (9%), entre ellas orina, sangre, líquido pleural, líquido cefalorraquídeo, ganglios cervicales y material de abscesos. El procesamiento de las muestras incluyó baciloscopía mediante coloración de Ziehl Neelsen (ZN), cultivo en medios sólidos (Lowenstein-Jensen y Stonebrink) y en medio líquido (MGIT 960, Becton Dickinson, EE.UU.), previa descontaminación por el método de Petroff modificado. La identificación bacteriana se realizó mediante la prueba de NAP (p-nitro-a-acetilamino-b-hidroxi-propiofe- nona) utilizando el sistema semiautomatizado Bactec 460 (Becton Dickinson). Figura 2. Rendimiento diagnóstico mediante tinción de Ziehl La prueba de sensibilidad a estreptomicina (S) (1 µg/ Neelsen (ZN) y cultivo de las principales muestras pulmonares, ml), isoniazida (H) (0,1 µg/ml), rifampicina (R) (1µg/ml) esputo (E) y lavado gástrico (LG). Tuberculosis pediátrica durante 2004-2008 39 tes grupos etarios y la cantidad de resultados positivos son, además, factores de riesgo muy importantes para la obtenidos en dichos grupos. adquisición de la enfermedad. Con respecto a las formas de presentación clínica, 78 Muchos inmigrantes que acarrean consigo la tuber- (93%) correspondieron a formas pulmonares y 6 (7%) a culosis son la fuente de contacto de los niños, ya que a formas extrapulmonares. menudo coincide el lugar de trabajo con el lugar reducido Las asociaciones mórbidas más frecuentes fueron la de vivienda precaria. La inmigración ilegal aumenta la desnutrición y, en proporción mucho menor, la infección gravedad de la situación, debido a la falta de controles por el virus de la inmunodeficiencia humana (n = 2). Sin sanitarios, las consultas tardías y la dificultad en el acceso embargo, en muchos casos no se consignó el dato de a los sistemas de salud. El incumplimiento de las indica- esta condición. ciones médicas y la falta de adherencia al tratamiento El análisis de la observación microscópica resultó por cuestiones culturales o sociales también son factores positivo en 41 baciloscopías (2,6% del total). Hubo recu- agravantes. peración mediante cultivo a partir de 84 muestras (5,4% Respecto de la distribución etaria de la TBC, podemos del total). El aporte de este último a la baciloscopía fue observar que la afección alcanzó en mayor porcentaje de 2,8%. a los niños de 10 a 15 años. Esto se contrapone a lo Todos los aislamientos provenientes de los cultivos informado en el registro de notificación a nivel nacional positivos fueron identificados como complejo Mycobac- por el Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias terium tuberculosis (CMT); 82 de ellos (98%) fueron “Dr. Emilio Coni”, que informa en nuestro país una mayor sensibles a las cuatro drogas de primera línea ensayadas. prevalencia de TBC infantil en el grupo de menores de De las restantes cepas, una fue resistente a H y había 5 años, lo cual coincide con el alto riesgo de contraer la sido aislada de un paciente proveniente de Perú; otra enfermedad que caracteriza a ese grupo etario (1, 10). presentó resistencia conjunta a E y S; no se registraron Una probable explicación que daría cuenta de nuestros los antecedentes epidemiológicos en este caso. hallazgos es que los niños del grupo C son más bacilíferos La Figura 2 ilustra el número de muestras ingresadas y y permiten obtener muestras de mejor calidad y, por lo compara el rendimiento obtenido mediante baciloscopías tanto, de mayor rendimiento en los cultivos, a diferencia y cultivos en las muestras de lavado gástrico y esputo, que de las presentaciones clínicas que se dan en los menores representan los materiales más frecuentemente remitidos de 5 años. Por otra parte, los primeros están más ex- para el diagnóstico de TBC pediátrica. De los 84 cultivos puestos a la problemática social con impacto en la salud positivos obtenidos, 73 (87%) comprendieron el estudio (trabajo ilegal o insalubre, maltrato, abuso o negligencia, de estos materiales. Nótese que el aporte de los esputos situaciones de calle por falta de continencia familiar, al diagnóstico positivo fue de 40% por baciloscopía y de drogadependencia, alcoholismo, VIH, etc.). 67% por cultivo; mientras que en el caso de los lavados Como era esperable, se observó una alta prevalencia gástricos, la superioridad de rendimiento del cultivo por de las formas de presentación clínica pulmonares (91%). sobre la baciloscopía fue más marcada (contribución al Durante el 2008, las localizaciones extrapulmonares de diagnóstico positivo: 20% y 2%, respectivamente). TBC alcanzaron en nuestro país el 15,5%, y las más fre- Si bien la mayoría de los pacientes de los que provi- cuentes fueron las formas pleural, ganglionar y meníngea, nieron las muestras analizadas eran argentinos, es impor- la que ocupó el tercer lugar. Una distribución similar se tante señalar que las zonas aledañas a nuestro hospital obtuvo en este estudio (9% de TBC extrapulmonares), cuentan con un importante asentamiento de extranjeros, entre las que predominó el compromiso pleural (n = 3) con hijos nacidos en nuestro país y afectados por TBC, seguido de adenitis (n = 2). por lo cual es necesario consignar la nacionalidad de Es notable la ausencia de formas graves como la TBC los padres como dato epidemiológico. Asimismo, cabe meníngea o miliar en nuestros pacientes, lo que se puede destacar que el hospital se encuentra en una de las atribuir a la protección conferida por la vacunación BCG. zonas de mayor pobreza y marginalidad de la Ciudad de Es sabido que esta vacuna brinda una alta y continuada Buenos Aires, lo cual se ve reflejado en la elevada tasa cobertura en el caso de las formas graves de TBC, no así de incidencia. La TBC es una enfermedad marcadora de para formas pulmonares. Algunas publicaciones naciona- pobreza: el 95% de los casos se registra en países en les informan que en la Argentina la meningitis tuberculosa vías de desarrollo y un 98% de las muertes se observa en tuvo en los últimos 20 años una disminución significativa- esos países (15). Según el censo realizado por la Sindi- mente mayor en los menores de 5 años que la observada catura General de la Ciudad, en el año 2001 la población para la TBC meníngea en los adultos (5, 8, 12). del área atendida por el Hospital Piñero era de 303 764 El diagnóstico de certeza de TBC implica la identi- personas, de las cuales el 41,5% tenían sus necesidades ficación del agente causal en las muestras clínicas y básicas insatisfechas (NBI); con una importante propor- mediante el cultivo de secreciones orgánicas o muestras ción de trabajadores en talleres de costura, cartoneros, de tejidos. La baciloscopía en muestras pediátricas pre- etc. El hacinamiento y la mala alimentación de los niños senta bajos rendimientos: solamente entre 1% y 10% de 40 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 37-41 ellas son positivas, esto se relaciona con la presentación de Medicina Respiratoria, en consenso con el Programa paucibacilar de la TBC en los niños. Es preciso tener Nacional de Control de la Tuberculosis (9). en cuenta que para que una muestra sea positiva se En definitiva, el criterio diagnóstico de mayor valor requiere la presencia de entre 5000 y 10 000 bacilos por predictivo, en ausencia de posibilidades de cultivo o con mililitro; es decir, se trata de una prueba poco sensible resultado pendiente, sería el examen directo positivo de pero altamente específica, por lo que una baciloscopía los esputos o del líquido de aspiración gástrica, o por lo negativa no descarta la enfermedad (3, 4). El cultivo es menos dos de los siguientes elementos: un método diagnóstico de mayor complejidad y costo l Antecedentes de contacto con un paciente tubercu- que el anterior, y sus resultados recién se obtienen entre loso. 20 y 60 días después de procesada la muestra. Sus l Síntomas compatibles: tos persistente de más de 2 ventajas son la alta sensibilidad (detecta hasta 10 bacilos semanas, hemoptisis, pérdida de peso, fiebre prolongada por mililitro en la muestra) y la especificidad absoluta, al y/o anemia. permitir el estudio de los bacilos vivos por técnicas de l Reacción cutánea a la tuberculina. identificación y la realización de pruebas de sensibilidad l Imágenes radiológicas compatibles con el diag- a los antibióticos. nóstico: opacidades hiliomediastinales, patrón miliar o Los perfiles de resistencia de las cepas del CMT ais- cavitario. ladas de los pacientes pediátricos se correlacionan con l Respuesta favorable al tratamiento antituberculoso los de la población general atendida en nuestro hospital, empírico (disminución de los síntomas, aumento de peso donde se observa un elevado porcentaje de sensibilidad de más del 10% en 2 meses). a drogas antituberculosas de primera línea (7). Sin embargo y a pesar de lo expuesto, es la intención Según el último informe de la OMS en Latinoamérica, del presente estudio realzar el valor del cultivo, ya que la proporción de nuevos casos de tuberculosis multirre- proporciona el diagnóstico de certeza de la TBC infantil y sistente a drogas (TBMDR) en nuestro país en 2008 fue genera datos estadísticos confiables. Además, cuando se de 2,2%, mientras que en países vecinos como Perú fue sospecha que hay resistencia bacteriana primaria permite de 5,4%, la mayor en la región (13). que ésta sea confirmada o descartada. Solo así es posi- Es de destacar la marcada recuperación del CMT ble adecuar el tratamiento y estimar la real importancia en los cultivos de muestras de esputo al comparar con epidemiológica de estos casos. las de lavado gástrico. Es posible que en estos últimos hayan incidido cuestiones de índole técnica: recolección BIBLIOGRAFÍA inadecuada, largos períodos o temperaturas inapropiadas 1. Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias (INER) de conservación hasta su procesamiento, falta de neutra- “Dr. Emilio Coni”. Programa Nacional de Control de la Tu- lización; todo esto podría llevar a la pérdida de viabilidad berculosis: Normas Técnicas 2009, 3ra. edición, Santa Fe, de M. tuberculosis (14). Argentina.

También es preocupante el número elevado de indivi- 2. González N, Pawluk V. Tuberculosis cavitaria en niños menores de 5 años. Arch Argent Pediatr 2007; 105: 143-53 duos bacilíferos que se detectaron en el grupo de los pa- 3. Giuffre A, Zabala A, Loreto E, Pisera Z. Tuberculosis cientes de 10 a 15 años, lo cual refleja que muchos niños pediátrica. En: Sancineto, J. et al. editores. Tuberculosis, llegan tardíamente a la consulta, con un estado avanzado diagnóstico y tratamiento. Ed. Lajouane. Argentina. 2009; de la enfermedad. Esto deja al descubierto fallas en el p. 157-69. 4. Kantor I. Falcone R, Hernández T, Pontino M. Epidemio- estudio del foco contagiante de la tuberculosis. logía de la tuberculosis. En: Sancineto et al. Tuberculosis, La TBC infantil continúa siendo una patología vigente diagnóstico y tratamiento. Ed. Lajouane. Argentina. 2009; y de suma importancia, debido a la gravedad que puede p. 55-80. llegar a alcanzar y a las consecuencias derivadas de la 5. Miceli I, Sequeira M, Kantor I. La tuberculosis infantil y su diagnóstico en la Argentina. Medicina (Buenos Aires) 2002; falta de tratamiento oportuno. Los casos de tuberculosis 62: 585-92. en Argentina disminuyeron en los últimos 10 años; sin 6. Ministerio de Salud y Acción Social. ANLIS “Dr. Carlos G. embargo, el número de niños que padecen la enfermedad Malbrán” INER “E. Coni”. La Situación de la Tuberculosis continúa siendo alto (5, 6). En el presente estudio, los en Argentina. PRO TB Doc. Tec. 07/07, 2006. Santa Fe, Argentina. cultivos positivos en pacientes pediátricos representaron 7. Rodríguez M, Rizzotti V, Patallo C, Moscoloni M, Ballester un 5% del total de los casos estudiados. D. Tuberculosis en el área programática de un hospital re- Los escasos rendimientos del examen baciloscópico ferencial de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Período directo y la demora en la obtención de los resultados 2007-2008, IX Congreso Argentino de la Sociedad Argentina de Infectología - SADI 2009. Resumen 24861, Mar del Plata, mediante la recuperación por cultivo, obligan a tener en Argentina. cuenta para el diagnóstico de la TBC infantil consideracio- 8. Sequeira M, Imaz S, Barrera L, Poggio G., Latini O. Diagnós- nes epidemiológicas y a recurrir a un sistema de criterios tico de la Tuberculosis infantil en provincias de la Argentina. para diagnosticar la mayoría de los casos. En nuestro Medicina (Buenos Aires) 2000; 60: 170-8. 9. Sociedad Argentina de Pediatría. Comité Nacional de Neu Neu-- país se siguen las recomendaciones establecidas por la monología y Comité Nacional de Infectología. Tuberculosis Sociedad Argentina de Pediatría y la Sociedad Argentina infantil. Modificaciones a los criterios de diagnóstico y Tuberculosis pediátrica durante 2004-2008 41

tratamiento de la tuberculosis infantil. Arch Argent Pediatr sistance in the world. Fourth global report. Disponible 2007; 105: 54-5. en: http://whqlibdoc.who.int/hq/2008/WHO_HTM_TB_ 10. Starke JR, Jacobs RF, Jereb J. Resurgence of tuberculosis 2008.394_eng.pdf. in children. J Pediatr 1992; 120: 839-55. 14. WHO/PAHO. Manual para el diagnóstico bacteriológico 11. Starke JR. Tuberculosis in children. Semin Respir Crit Care de la tuberculosis. Parte II Cultivo, 2008.Disponible en: 2004; 25: 353-64. http://www.paho.org/spanish/ad/dpc/cd/tb-labs-cultivo. 12. World Health Organization. The immunological basis for pdf. immunization. Disponible en: http://www.who.int/vaccines- 15. World Health Organization Report 2009, Global tuberculosis documents/DocsPDF-IBI e/mod5_e.pdf control: surveillance, planning and financing. Disponible en: 13. World Health Organization. Anti-tuberculosis drug re- http://www.who.int/tb/publications/global_report/2009/en/.

Recibido: 13/04/10 – Aceptado: 04/11/10 42 Revista Argentina de Microbiología (2011)ISSN 43:0325-7541 42-44 INFORME BREVE Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 42-44

Brote de leptospirosis en terneros en recría en la provincia de Corrientes, Argentina

MARÍA G. DRAGHI1*, BIBIANA BRIHUEGA2, DANIEL BENÍTEZ1, JUAN M. SALA1, GRACIELA M. BIOTTI1, MATILDE PEREYRA1, ALBERTO HOMSE1, LUCIANO GUARINIELLO3

1Grupo Sanidad Animal, Estación Experimental Agropecuaria Mercedes, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Juan Pujol al Este s/n (3470) Mercedes, Corrientes, Argentina; 2Laboratorio de Referencia en Leptospirosis de la Organización Internacional de Epizootias, Instituto de Patobiología, Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Las Cabañas y Los Reseros s/n (1712) Castelar, Buenos Aires, Argentina; 3Veterinario de actividad privada. *Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN La leptospirosis es una enfermedad infecciosa que produce importantes pérdidas económicas en la producción ganadera. Los signos característicos de la enfermedad son aborto, muerte embrionaria, muerte de terneros de pocos días de vida y mastitis. Se describe un brote de leptospirosis en terneros en actividad de recría. Se realizaron estudios histopatológicos, de hemoparásitos, inmunofluorescencia y cultivos bacterianos. Se aislóLeptospira interrogans serovar Pomona a partir de muestras de los terneros muertos. Palabras clave: leptospirosis, terneros, brote, Pomona

ABSTRACT Leptospirosis outbreak in calves from Corrientes Province, Argentina. Leptospirosis is an infectious disease resulting in significant economic losses in livestock production. This disease causes abortion, embryo death, death of calves within the first few days of life and mastitis. We report a leptospirosis outbreak in calf growing and fattening. Histopathological and hemoparasite studies, immunofluorescence, and bacterial cultures were performed. A strain of Leptospira interrogans serovar Pomona was isolated from samples collected from dead calves. Key words: leptospirosis, calves, outbreak, Pomona

La leptospirosis es una enfermedad bacteriana zoo- Hasta el año 2008 la presentación más frecuente nótica distribuida mundialmente, que afecta a la mayoría de leptospirosis en la zona fue la llamada “tormenta de de los mamíferos domésticos. También se ha documen- abortos” en el último tercio de gestación o la muerte de tado en reptiles, aves, anfibios y artrópodos (1, 8). En terneros de menos de 14 días de vida. El objetivo de los bovinos la enfermedad causa pérdidas económicas nuestro trabajo es describir por primera vez un brote de debido a abortos, infertilidad, terneros que nacen débiles leptospirosis ocurrido en un lote de terneros en recría, y mueren en los primeros días de vida y disminución de una presentación no informada hasta el presente en la la producción láctea (6). provincia de Corrientes, Argentina. Existen antecedentes de la presencia de la enfermedad En el mes de abril de 2009, en un período de intensa en rodeos y majadas de la provincia de Corrientes en los sequía en la región, se registró la muerte de 10 terneros últimos 20 años. En 1986, Draghi de Benítez et al. (3) en el transcurso de una semana en un campo ubicado en detectaron 8,85% de sueros positivos a L. interrogans el departamento de Mercedes, provincia de Corrientes. serovar Wolffi, 2,08% aL. interrogans serovar Pomona y Los signos observados en los animales fueron: emisión 1,73% a L. interrogans serovar Tarassovi sobre un total de de orina con sangre, decaimiento, anorexia y muerte en 2294 sueros provenientes de vacas que sufrieron aborto. pocas horas. Estos terneros formaban parte de un lote de Los mismos autores aislaron cepas de L. interrogans 1400 animales raza Bradford que pastoreaban un potrero serovar Pomona en bovinos y ovinos (4). Encontraron, de campo natural y eran suplementados con trigo, maíz además, que la leptospirosis fue la causa infecciosa de y girasol. Los animales no habían sido vacunados para aborto o muerte perinatal más importante en el nordeste la prevención de la leptospirosis puesto que no existían argentino (5). Sobre un total de 3557 sueros pertenecien- en ese establecimiento antecedentes de la enfermedad. tes a terneros y fetos abortados, el 11,4% de los animales Se remitieron para el diagnóstico tres terneros muertos y resultó serológicamente positivo a L. interrogans. dos agónicos. A cada uno de los dos terneros agónicos se Brote de leptospirosis en bovinos en recría 43 les aplicó 40 mg/kg de pentobarbital sódico (Euthanyle, ad libitum. El sacrificio de los terneros y los ensayos Brouwer S.A., Argentina) por vía endovenosa rápida y en cobayos fueron realizados de acuerdo con las reco- luego se realizaron las necropsias. Las muestras de riñón, mendaciones internacionales (2, 7). La determinación hígado, bazo y linfonódulos obtenidas en la necropsia del serovar de los aislamientos de Leptospira spp. se se colocaron en formol tamponado al 10% para realizar realizó mediante la técnica de microaglutinación cruzada estudios histopatológicos. A partir de sangre periférica empleando los 23 antisueros de referencia del Royal se realizaron extendidos finos y gruesos. Se confeccio- Tropical Institute, Holanda. Los aislamientos también naron improntas de cerebro, hígado, bazo, riñón y punta se caracterizaron genéticamente empleando la técnica de corazón, las que fueron fijadas en alcohol metílico conocida como MLVA (Multiple-locus variable-number y teñidas según la técnica de Giemsa para identificar tandem repeat analysis), usando los cebadores VNTR4, Babesia spp. o Anaplasma marginale. Se aplicó la técni- VNTR7, VNTR9, VNTR10, VNTR19, VNTR23 y VNTR31 ca de inmunofluorescencia directa para la detección de (9, 10). Leptospira spp. en improntas de humor acuoso, bazo, En los terneros sacrificados se pudo observar hepato- riñón e hígado de los 5 terneros. Estas muestras fueron megalia, esplenomegalia e ictericia en mucosas y tejido fijadas 10 minutos en acetona y posteriormente procesa- subcutáneo. En todos los animales se presentaron dife- das para inmunofluorescencia directa con un conjugado rentes lesiones histopatológicas. En riñón se detectaron de conejo multivalente anti-Leptospira (USDA, EE.UU.), importantes áreas de necrosis cortical con glomerulitis que contiene anticuerpos contra las serovariedades Icte- (con afectación y atrofia de glomérulos) y reacción infla- rohaemorrhagiae, Pomona y Canicola. Los cultivos para matoria del intersticio con infiltración de mononucleares y el aislamiento de Brucella spp., Campylobacter fetus y polimorfonucleares neutrófilos y depósitos de fibroblastos. Leptospira spp. se realizaron por métodos estándares. En algunos cortes se observaron áreas de infarto. En Brevemente, se sembraron muestras de cerebro, pulmón, hígado se vieron focos de necrosis diseminados por todo líquido de abomaso, humor acuoso, hígado, bazo y riñón el órgano en el área centrolobulillar, con ligera infiltración en agar Skirrow (Becton, Dickinson and Co, Reino Unido) de mononucleares y polimorfonucleares neutrófilos. En suplementado con 10% de sangre ovina bajo atmósfera bazo se observó hiperplasia de pulpa roja, hemorragias microaerófila (90% de N2, 5% de CO2 y 5% de O2) para intensas por todo el órgano y escaso desarrollo de núcleos Brucella spp. y Campylobacter fetus; en agar Columbia germinativos. Los linfonódulos presentaron hemorragias (Oxoid, Reino Unido) con sangre bovina al 7% para bac- en toda su estructura. Todos los animales fueron nega- terias aerobias, y en medio EMJH (Difco, KS, EE.UU.) tivos a Babesia bovis, Babesia bigemina y A. marginale. con el agregado de albúmina bovina y medio de Fletcher Todas las muestras procesadas según la técnica de (Difco) con suero de conejo al 10% para el aislamiento inmunofluorescencia directa dieron resultado positivo a de L. interrogans. Todos los cultivos se incubaron a 37 Leptospira spp. en riñón. Se logró aislar leptospiras en °C durante 96 h, salvo en el caso del aislamiento de los medios de Fletcher y EMJH a partir del macerado de Leptospira, los que fueron incubados a 28 °C y observa- órganos en 3 de los 5 terneros estudiados, y de riñón e dos semanalmente con un microscopio de campo oscuro; hígado de los cobayos inoculados con los macerados de los cultivos negativos no fueron descartados hasta las órganos de dichos terneros. Las cepas fueron caracteriza- 24 semanas. Con el objetivo de aumentar la posibilidad das como L. interrogans serovar Pomona sensu stricto por de aislamiento de Leptospira spp., se inoculó 1 ml de ambos métodos (microaglutinación cruzada y MLVA). Los macerado de órganos de cada uno de los terneros en cultivos para Brucella spp., C. fetus y gérmenes aerobios cobayos de 150 g por vía intraperitoneal. Los animales de fueron negativos. experimentación fueron anestesiados con acepromazina El brote tuvo un costo total para el propietario de 0,5 mg/kg y ketamina 20 mg/kg por vía intramuscular $ 150 000 considerando la muerte de 100 terneros y el y sangrados por vía intracardíaca entre los días 5 y 8 tratamiento de los sobrevivientes. Los costos de vacu- posinoculación; las muestras de sangre se sembraron nación de los 1400 animales del establecimiento para en los medios EMJH y de Fletcher. Los cobayos fueron la prevención de leptospirosis hubieran sido de $ 4480. luego sacrificados con 40 mg/kg de pentobarbital sódico El esquema de vacunación recomendado consiste en y sus órganos se sembraron en los mismos medios que aplicar una primera vacunación a los 4 meses de vida, la sangre. Los animales utilizados en esta experiencia repetir a los 20 días y luego revacunar anualmente. Surge estaban clínicamente sanos y fueron evaluados previa- de este informe que la muerte de terneros de recría se mente mediante la técnica de microaglutinación (MAT), debió a un brote de leptospirosis, una enfermedad poco frente a leptospiras de las serovariedades de referencia frecuente en animales de esta edad. Como conclusión se Pomona, Icterohaemorrhagiae, Canicola, Wolffi, Hardjo, recomienda considerar la presencia de esta enfermedad Ballum, Grippotyphosa, Pyrogenes y Tarassovi, con no solamente cuando se presentan abortos y muertes resultados negativos. Los animales fueron alojados en en terneros de pocos días, y vacunar como forma de jaulas individuales con pisos de alambre galvanizado y prevención para evitar grandes pérdidas económicas en con acceso al alimento comercial balanceado y al agua los establecimientos ganaderos. 44 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 42-44

Bibliografía bovinos en el Nordeste Argentino. ��Rev Med Vet. 2006; 4: 140-3. 1. Adler B, de la Peña Moctezuma A. Leptospira and leptos- 6. Faine S, Adler B, Bolin C, Perolat P. Leptospira and leptospirosis. Vet Microbiol 2010; 27: 287-96. pirosis. Melbourne, Australia, MediSci, 1999, p. 272. 2. European Convention for the Protection of Vertebrate Ani- 7. Apéndice A. En: Grossblatt N, editor. Guide�� for the Care mals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. and Use of Laboratory Animals. Washington D.C., National Council of Europe Treaty Series, Strasbourg, France 1986; Research Council, National Academy Press, 1978, p. 92. 123: 21-5. 8. Levett PN. Leptospirosis. Clin Microbiol Rev 2001; 14: 296- 3. Draghi de Benítez MG, Zurbriggen M, Rochinotti D, Vanzini 326. V, Homse A, Soni C. Estudio serológico de leptospirosis 9. Majed Z, Bellenger E, Postic D, Pourcel C, Baranton G, Pi- bovina en la provincia de Corrientes. Vet Argent 1986; 24: cardeau M. Identification of variable-number tandem-repeat 357-63. loci in Leptospira interrogans sensu stricto. J Clin Microbiol 4. Draghi de Benítez MG, Biotti de Cáceres G. Aislamiento 2005; 43: 539-45. de Leptospira interrogans en un cordero de la provincia de 10. Pavan ME, Cairó F, Brihuega B, Samartino L. Multiple-locus Corrientes (República Argentina). Rev Med Vet 1998; 3: variable-number tandem repeat analysis (MLVA) of Leptos- 224-5. pira interrogans serovar Pomona from Argentina reveals four 5. Draghi MG, Soni C, Beckwith B, Zurbriggen MA, Homse AC, new genotypes. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2008; Rochinotti D. Principales causas de mortalidad perinatal en 31: 37-45.

Recibido: 04/05/10 – Aceptado: 28/10/10 Listeriosis in San Luis, Argentina ISSN 0325-754145 INFORME BREVE Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 45-47

Neonatal Listeria-meningitis in San Luis, Argentina: a three-case report

ANALÍA L. LACIAR1*, MARÍA L. VACA RUIZ1, ALBAN LE MONNIER2

1Área Microbiología, Universidad Nacional de San Luis. Chacabuco y Pedernera (5700) San Luis, Argentina; 2Laboratoire des Listeria, Centre National de Reference des Listeria and World Health Organization Collaborating Centre for Foodborne Listeriosis, Institut Pasteur. 75724 Paris Cedex 15, Paris, France. *Correspondence. E-mail: [email protected]

ABSTRACT Between November 1996 and December 2006, two cases of early-onset and one case of late-onset neonatal listeriosis were reported in San Luis, Argentina. This article describes clinical and laboratory findings as well as treatment and outcome for newborns treated for Listeria monocytogenes meningitis or septicaemia. In one of the newborns with early-onset listeriosis, meningitis led to important complications including hydrocephalus. The two other newborns showed complete recovery following adequate treatment. The L. monocytogenes isolates from two patients belonged to PCR group IVb (including serovar 4b strains) and to PCR group IIb (including serovar 1/2b strains) in the third patient. Listeriosis, especially the maternal-fetal presentation, is still rare in Argentina for unknown reasons. Our data can be used in the future as an epidemiological survey. Key words: Listeria monocytogenes, neonatal meningitis, Argentina

RESUMEN Meningitis neonatal por Listeria monocytogenes en San Luis, Argentina: análisis de tres casos. En el presente estudio se describen tres casos de infección neonatal por Listeria monocytogenes, dos de inicio temprano y uno tar- dío, diagnosticados en San Luis, Argentina, entre noviembre de 1996 y diciembre de 2006. En uno de los pacientes afectados por listeriosis temprana, la meningitis condujo a la hidrocefalia secundaria. En los otros recién nacidos, la evolución clínica fue favorable después de la administración de un rápido y adecuado tratamiento. Los aislamientos de L. monocytogenes de dos pacientes pertenecieron al grupo IVb (serovar 4b) y el del tercer paciente al grupo IIB (serovar 1/2b) según la técnica de PCR. La listeriosis es, por razones que se desconocen, una enfermedad rara en Argentina, especialmente la presentación materno-fetal. Los resultados presentados aquí podrán ser utilizados en un futuro con fines epidemiológicos. Palabras clave: Listeria monocytogenes, meningitis neonatal, Argentina

Listeriosis during pregnancy leads to abortion, stillbirth Care Unit of the San Luis Hospital in incubator with res- or premature delivery of newborns (NB) with neonatal piratory assistance and presenting symptoms compatible sepsis and meningitis. These presentations are associated with precocious neonatal sepsis and petechial lesions on with a high fatality rate especially related to the term of her face, trunk and abdomen, which disappeared after pregnancy. Neonatal listeriosis may present either early or 24 h. Blood and cerebrospinal fluid (CSF) cultures were late (4). In San Luis province, between 1996 and 2006, a taken and she was immediately treated with cephalothin. total of 33 cases of suspected neonatal Listeria meningitis After 72 h, all the cultures were positive for L. monocyto- were registered. Out of a total of 103 samples analyzed, genes. Initially prescribed antibiotic therapy was changed Listeria monocytogenes was identified in 5 samples to ampicillin i.v. (100 mg/kg/day) plus gentamicin i.v. (3 (4.85%) occurring in the three mentioned patients from mg/kg/day). The NB showed evidence of hydrocephalus two adjacent district general hospitals. We describe here and she was shunt-operated. their clinical and epidemiological findings to highlight their In case 2, the NB, a male, was born by vaginal route variable presentation. at term gestation. He was discharged 48 h after delivery In case 1, the mother related an influenza-like syndro- and readmitted to San Luis Hospital on day 15 because me 15 days prior to the onset. The NB, a girl, was born by of fever, reticulated skin, weeping, diminished suction and vaginal route after a 37-week gestation. The Apgar scores high heart rate. Lumbar puncture yielded cloudy CSF with were 0/6 (one and five minutes after birth, respectively). a leukocyte count of 1300 cells/mm3, a glucose concen- She showed respiratory distress and required type IV re- tration of 1.9 g/l, and a protein concentration of 3 g/l. CSF animation. She was transferred to the Neonatal Intensive culture yielded L. monocytogenes after 48h of incubation, 46 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 45-47

Table 1. Characteristics of the L. monocytogenes isolates obtained in this study

Serotyping Isolates Origin Patient Date MIC(μg/ml) Serovar(1) PCR group

L. monocytogenes 1 CSF(2) 1 1996/06/15 1.75 4b IVb L. monocytogenes 2 Blood 1 1996/06/07 1.75 4b IVb L. monocytogenes 3 Blood 1 1996/06/10 1.75 4b IVb L. monocytogenes 4 CSF 2 2001/11/11 1.25 1/2b IIb L. monocytogenes 5 CSF 3 2006/04/26 1.50 4b IVb

(1)Determined by the slide agglutination test; (2)cerebro-spinal fluid.

Figure 1 A. PFGE separation of AscI (left) and ApaI (right) macrorestriction fragments of L. monocytogenes genomic DNA from three clinical cases. Lanes 1, 2 and 3: case 1, lane 4: case 3, lane 5: case 2, lanes l: control corresponding to Salmonella serotype Braenderup (H9812) after DNA macrorestriction by XbaI, according to the internationally standardized protocol from PulseNet. B. PFGE of L. monocytogenes strains analyzed in this study. Schematic patterns and total dendrogram. The dendrograms were produced by the UPGMA algorithm based on a Dice similarity coefficient with a 1.5% band position tolerance. Listeriosis in San Luis, Argentina 47 and ceftriaxone initially prescribed was changed to ampi- both AscI and ApaI macrorestriction fragments, differen- cillin (100 mg/kg/day) plus gentamicin (5 mg/kg/day). The tiated the 5 isolates into 3 different patterns. The same NB was discharged 16 days later. DI value was obtained with ApaI (0.70) and AscI (0.70). Finally, case 3 was a male preterm NB. He was born The combination of patterns produced by both enzymes by vaginal route in his home (Justo Daract town). He was yielded 3 combined ApaI and AscI PFGE types but did not immediately transferred to Villa Mercedes Hospital becau- increased the discriminatory power. se of important signs of prematurity. On admittance, he In the present study, the differences observed in the cli- showed respiratory distress and was therefore intubated nical presentation of cases 1 and 3 of early-onset listeriosis for mechanical ventilation. He was febrile and presented may be related to the developmental stage of the neonates signs of meningitis. The CSF analysis showed a mildly (7). Late-onset listeriosis is much rarer and linked to another opalescent liquor with pleocytosis of 546 leucocytes/mm3 situation: healthy full-term NB with no clinical signs for the and polymorphonuclear cell predominance (> 70%), and mother and late onset of more than 7 days. Meningitis is increased protein concentration. The CSF culture yielded more likely in late-onset infection as in the patient in case 2 L. monocytogenes after 48h of incubation. Initial therapy (4). In case 1, delay in L. monocytogenes identification led consisted in ceftriaxone, and was rapidly switched to to severe hydrocephalus because empirical treatment had ampicillin (100 mg/kg/day) plus gentamicin (5 mg/kg/day). only included a cephalosporin (8). The two other NB showed The patient was discharged 15 days later. complete recovery following adequate treatment. All evocative gram-positive bacilli isolated were iden- In Argentina, listeriosis is not a national notifiable disease tified by the API Listeria strip (bioMérieux Marcy l’Etoile, but physicians should always consider L. monocytogenes France) and haemolysin production in 5% horse-blood as a possible etiologic agent of neonatal meningitis. (Columbia agar base, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) (6). L. monocytogenes CLIP 22762 was obtained from Acknowledgements: We thank UNSL (Project 8802) and Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas the Listeria Collection of the Pasteur Institute, Paris, and (CONICET) for financial support of this study. was included as reference strain. MIC values of ampicillin (≤ 2 μg/ml) were determined by the broth microdilution REFERENCES method (2) (Table 1). The isolates were stored at −80 °C in brain-heart infusion broth (BHI) containing 15% glycerol 1. Centers for Disease Control and Prevention 2009. PulseNet. for further characterization. [Online] http://www.cdc.gov/od/oc/media/pressrel/r021121.htm 2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Serotyping of all isolates was performed by the classical Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Test. 9th method (9) and a multiplex PCR (3). The isolates from ca- Edition. 2006; M2-A9. 26. Wayne, PA, USA. ses 1 and 3 belonged to PCR-group IVb/serovar 4b. The 3. Doumith M, Buchrieser C, Glaser P, Jacquet C, Martin P. isolate from case 2 belonged to PCR-group IIb/serovar 1/2b Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR. J Clin Microbiol 2004; 42: 3819-22. (Table 1). All the isolates were characterized by pulsed-field 4. Fayol L, Beizig S, Le Monnier A, Lacroze V, Simeoni U. gel electrophoresis (PFGE) using the Pulse Net protocol Neonatal meningitis due to Listeria monocytogenes after 3 involving the restriction enzymes AscI and ApaI (1). PFGE weeks of maternal treatment during pregnancy. Arch Pediatr of the DNAs of the 5 isolates digested with AscI showed 2009; 16: 353-6. 5. Hunter P, Gaston M. Numerical index of discriminatory ability 7-8 fragments ranging from approximately 30 to 1130 kb systems: an application of Simpson’s index. J Clin Microbiol in size, while 14 fragments of 30-510 kb were obtained fo- 1988; 26: 2465-6. llowing digestion using ApaI (Figure 1A). The relationships 6. Laciar AL, de Centobi ONP. Listeria species in seafood: among L. monocytogenes strains based on their combined isolation and characterization of Listeria spp. from seafood in San Luis, Argentina. Food Microbiol 2002; 19: 645-51. ApaI and AscI PFGE profiles are shown in the dendrogram 7. Pattarino G, Arrigoni S, Grazioli R, De Palma A, di Natale displayed in Figure 1B. The three isolates from case 1 B. A case of Listeria monocytogenes meningitis in an im- showed indistinguishable PFGE types. Although the strains munocompetent infant. Minerva Pediatr 2006; 58: 391-4. from cases 1 and 3 belonged to the same PCR-group, they 8. Sarlangue J, Castella C, Lehours P. First and second line antibiotic therapy for bacterial meningitis in infants and were not similar according to the analysis of PFGE profiles children. Med Mal Infect 2009; 39: 521-30. (Figure 1A). The discrimination index (DI) value of PFGE 9. Seeliger H, Hölme K. Serotyping of Listeria monocytogenes was calculated by Simpson’s diversity index (5). PFGE of and related species. Methods Microbiol 1979; 13: 31-49.

Recibido: 10/11/09 – Aceptado: 07/12/10 48 Revista Argentina de Microbiología (2011)ISSN 43:0325-7541 48-50 INFORME BREVE Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 48-50

Ivermectin-related adverse clinical events in patients treated for Mansonella ozzardi infections

ALEJANDRO J. KROLEWIECKI1, 2*, SILVANA P. CAJAL1, 3, CARLOS VILLALPANDO1, 4, JOSÉ. F. GIL1, 5

1Instituto de Investigaciones en Enfermedades Tropicales, Universidad Nacional de Salta, Sede regional Orán. San Ramón de la Nueva Orán, Argentina; 2Fundación Huésped, Área de Investigaciones Clínicas. Buenos Aires, Argentina; 3Laboratorio de Enfermedades Tropicales, Hospital San Vicente de Paul, San Ramón de la Nueva Orán, Argentina; 4Gerencia sanitaria, Hospital San Vicente de Paul, San Ramón de la Nueva Orán, Argentina; 5Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Argentina. *Correspondence. E-mail: [email protected]

Abstract We report the occurrence of serious reactions after treatment with oral ivermectin in two patients with Mansonella ozzardi infections. Both had systemic and respiratory symptoms and recovered without sequelae. Follow-up revealed clearance of microfilaremia in both cases, with relapse in one of them. These reactions are well described in the treatment of other filarial infections, but have not yet been reported in the treatment of M. ozzardi. We are now reporting the first such known reactions with this helminthiasis. Keywords: Mansonella ozzardi, filariasis, ivermectin, safety

Resumen Efectos clínicos adversos relacionados con ivermectina en pacientes tratados por infecciones con Manso- nella ozzarddi. Se informa la aparición de reacciones adversas graves con el tratamiento con ivermectina oral en dos pacientes con infección por Mansonella ozzardi. Ambos presentaron síntomas respiratorios y sistémicos y se recuperaron sin secuelas. El seguimiento mostró ausencia de microfilaremia en ambos casos, con recidiva en uno de ellos. Estas reacciones, bien conocidas durante el tratamiento de otras filariosis, se describen por primera vez con esta helmintiasis. Palabras clave: Mansonella ozzardi, filariosis, ivermectina, seguridad

The filarial parasite Mansonella ozzardi causes infec- due to M. ozzardi, which appears to be susceptible to tions in the tropical regions of Central and South America ivermectin but resistant to diethylcarbamazine (7). and the Caribbean. In Argentina, Biglieri and Araoz de- This report comments on two cases of serious adverse scribed the first cases in the Province of Tucumán in events related to ivermectin in the treatment of infections 1914 (1), at a time when no other human filarial infections due to M. ozzardi in the department of Oran, Province of were identified in this area. The Yungas, an ecological Salta, Argentina. area characterized by tropical rainforest spreading from In the area of El Oculto in Salta (Figure 1), 10 symp- northwestern Argentina to southern Bolivia is endemic for tomatic patients over a 15 year period agreed to the M. ozzardi. Culicoides lahillei has been postulated as the off-label use of a single dose of ivermectin (12 mg orally) principal vector in the area, with transmission occurring for the treatment of M. ozzardi infection. All the patients primarily during the wet season (9). A prevalence of M. were permanent residents of the community suffering ozzardi infection of 20.7% was reported (10) in El Oculto, from musculoskeletal symptoms. Diagnosis was made a village with 80 inhabitants in the Yungas, in the Province by the Knott’s concentration test in blood obtained from of Salta (altitude 700 meters), Argentina. venopuncture (5). Two patients developed serious adverse Currently, ivermectin is the first-line drug for the treat- events following ivermectin (Securo, Valeant Argentina, 6 ment of filarial infections due to its efficacy and safety; over mg tablets) administration. 400 million doses have been prescribed with excellent Case 1 was a 70 -year-old female with no remarkable results and only a few cases with severe complications medical history who presented with bilateral non-inflam- have been reported in the treatment of loiasis and oncho- matory edema of her knees and shoulder pain. She had cerciasis (2, 3). The side effects associated with treating lived her entire life in the Yungas and settled in El Oculto patients infected with Loa loa are believed to be due to an in 1970. Her peripheral blood smear stained with the exaggerated inflammatory response to the dying parasites Knott´s technique (Figure 2) revealed microfilaremia (3). There is little experience in the treatment of infections caused by M. ozzardi, with mild to moderate micro- Adverse reactions to ivermectin for Mansonella ozzardi infection 49

Figure 1. Geographic location of El Oculto in the Province of Salta, Argentina.

Figure 2. Mansonella ozzardi microfilaria seen in a Giemsa stained blood smear of patient case 1 prepared with the Knott’s technique. 1,000 x magnification under immersion oil.

filaremia density. She was treated with 190 μg/kg of was assisted by his neighbors and recovered without se- ivermectin. Within 12 hours of ivermectin administration, quelae after 2 days. He was not taking any concomitant she started complaining of severe malaise, chills, fever therapy, but used local herbal infusions during his recov- and moderate dyspnea, which kept her bedridden. Her ery. A follow-up examination revealed no microfilaremia symptoms improved after 3 days and recovered without in a blood smear 3 weeks after treatment. sequelae. The patient used non-concomitant medi- Both cases were informed to the medical team in a cal or herbal therapies and recovered without further follow-up visit to the village; three other patients who had treatment. Blood smear examination with the Knott’s lived in the endemic area for 25, 20 and 10 years, who technique revealed no microfilaremia 2 weeks after were treated with ivermectin for M. ozzardi infections dur- treatment, but a relapse was confirmed in a follow-up ing the same period did not report any adverse events; evaluation 5 years later. The patient was admitted to they were of similar age and also had mild-moderate the local hospital and treated under medical supervision infection density in peripheral blood. Follow-up testing with ivermectin 200 μg/kg without any side effects. A for microfilaremia performed between 30 and 60 days follow-up evaluation 3 months after treatment revealed after therapy was negative in 2 of the 3 patients without no microfilaremia. adverse events; no follow-up smears were performed in Case 2 was a 68-year-old male without remarkable the remaining patient. medical history, who presented with bilateral knee pain We report the occurrence of serious adverse events in and generalized myalgias, and was found to have mild patients with infections due to M. ozzardi that resemble to moderate density of M. ozzardi microfilaria using the excessive forms of the expected Mazzotti’s reaction Knott’s technique in his peripheral blood smear. He had seen upon treatment of other filarial infections; the lack lived in El Oculto since 1972. Six hours after receiving 158 of dermatologic findings in these cases might be related μg/kg of ivermectin he began to have chills and malaise, to the absence of the dermal localization that has been followed by an episode of acute shortness of breath. He described for M. ozzardi (8). Due to the remoteness of 50 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 48-50 the patient’s village, their reactions resolved without any References medical attention or intervention. In a bibliographic review of the published literature, the 1. Araoz R, Biglieri JM. Casos de microfilaria observados por primera vez en Tucumán. An Dept Nac Higiene 1915; 22: only report of events similar to our observations appears 151-9. in the first report on the use of ivermectin against M. oz- 2. Boatin BA, Richards FO, Jr. Control of onchocerciasis. Adv zardi, where a traveler with asthma and childhood allergies Parasitol 2006; 61: 349-94. developed urticaria, fever and wheezing 12 hours after 3. Boussinesq M, Gardon J, Gardon-Wendel N, Chippaux JP. Clinical picture, epidemiology and outcome of Loa-associ- taking ivermectin. Her symptoms were rapidly controlled ated serious adverse events related to mass ivermectin with epinephrine (7). In a clinical trial of ivermectin against treatment of onchocerciasis in Cameroon. Filaria Journal M. ozzardi infections in Trinidad, 15% of the patients had 2003; 2 Suppl 1: S4. severe reactions mostly consisting of fever, arthralgias 4. Chadee DD, Tilluckdharry CG, Doon R, Rawlins SC, Narayans- ingh V, Ariyanayagam DC, Teelvcksingh S, Gaxotte P. Ivermec- and headache (4). Infection intensity, which is positively tin treatment of mansonellosis in Blanchisseuse, Trinidad, West correlated with the severity of Mazzotti’s reaction and other Indies. Ann Trop Med Parasitol 1996; 90: 645-9. adverse events related to the treatment of filarial infec- 5. Garcia L. Procedures for detecting blood parasites. In: tions (6), could not be verified in our cases. In our group Diagnostic Medical Parasitology. Washington, DC., ASM Press, 2001, p. 829-47. of patients, despite no statistically significant differences, 6. Mackenzie CD, Geary TG, Gerlach JA. Possible pathogenic patients with symptoms were those who had lived longer pathways in the adverse clinical events seen following iver- in the endemic area, which could be a surrogate marker mectin administration to onchocerciasis patients. Filaria for intensity of infection. Journal 2003; 2 Suppl 1: S5. 7. Nutman TB, Nash TE, Ottesen EA. Ivermectin in the suc- In summary, serious adverse events previously ob- cessful treatment of a patient with Mansonella ozzardi served in the treatment of filarial infections could pos- infection. J Infect Dis 1987; 156: 662-5. sibly be expected with M. ozzardi infections. Based on 8. Raccurt C, Lowrie RC, Jr., Boncy J, Katz SP. Mansonella this report, and until further studies can be conducted, ozzardi in Haiti. III. A comparison of the sensitivity of four sampling methods in detecting infections. Am J Trop Med acute adverse events could be expected in patients with Hyg 1982; 31: 275-9. M. ozzardi and the convenience of its treatment weighed 9. Shelley AJ, Coscaron S. Simuliid blackflies (Diptera: Simulii- against the risk of adverse events. The availability of dae) and ceratopogonid midges (Diptera: Ceratopogonidae) medical resources to treat adverse events (corticosteroids as vectors of Mansonella ozzardi (Nematoda: Onchocerci- dae) in northern Argentina. Mem Inst Oswaldo Cruz 2001; and epinephrine) and the case-by-case decision on the 96: 451-8. convenience of treatment appear to be required issues in 10. Taranto NJ, Castelli E. Detección de un foco de filariasis en el the management of these patients. noroeste argentino. Rev Argent Microbiol 1988; 20: 49-51.

Recibido: 05/10/10 – Aceptado: 13/12/10 Bacterias anaerobias y pruebas de sensibilidad ISSN 0325-754151 ARTÍCULO ESPECIAL Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 51-66

Primer consenso argentino para el estudio de la sensibilidad in vitro a los antimicrobianos de las bacterias anaerobias de importancia clínica en humanos

MARÍA C. LEGARIA1, 2*, HEBE M. BIANCHINI2, LILIANA CASTELLO2, GRACIELA CARLONI2, ANA DI MARTINO2, LILIANA FERNÁNDEZ CANIGIA2, MIRTA LITTERIO2, RAQUEL ROLLET2, ADELAIDA ROSSETTI2, SILVIA C. PREDARI2

1Coordinador, 2Integrantes de la Subcomisión de Bacterias Anaerobias. Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínicas (SADEBAC), Asociación Argentina de Microbiología (AAM). Deán Funes 472, (1214) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. *Correspondencia. E-mail: [email protected]

RESUMEN Históricamente, las bacterias anaerobias se han caracterizado por presentar buena respuesta a los agentes antia- naeróbicos de utilidad clínica. Sin embargo, los patrones de resistencia de muchas de las especies asociadas a infecciones graves en humanos se han modificado significativamente en los últimos años, y en la actualidad se advierte resistencia a los antimicrobianos primariamente activos, lo que hace poco predecible su efectividad. En respuesta a estos eventos, la Subcomisión de Bacterias Anaerobias de la Asociación Argentina de Microbiología decidió elaborar el primer consenso argentino para el estudio de la sensibilidad in vitro a los antimicrobianos de las bacterias anaerobias de importancia clínica en humanos. Este consenso se elaboró sobre la base de las pautas establecidas por el Clinical and Laboratory Standards Institute, los trabajos publicados y la experiencia de la subcomisión. El documento incluye una breve actualización taxonómica y explicita cuándo y por qué se deben realizar las pruebas de sensibilidad, qué antimicrobianos se deben probar según el microorganismo en estudio y cuáles son las recomendaciones para realizar el ensayo, la lectura y la interpretación de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos. Además, se muestran los perfiles de sensibilidad, la categorización de los antibióticos según su actividadin vitro, las resistencias naturales y adquiridas, las resistencias emergentes y los patrones de resistencia locales de las especies clínicamente más relevantes. Palabras clave: bacterias anaerobias, pruebas de sensibilidad, antimicrobianos, consenso

ABSTRACT First Argentine consensus guidelines for in vitro antimicrobial susceptibility testing of clinically relevant anaerobic bacteria in humans. Through time, anaerobic bacteria have shown good susceptibility to clinically useful antianaerobic agents. Nevertheless, the antimicrobial resistance profile of most of the anaerobic species related to severe infections in humans has been modified in the last years and different kinds of resistance to the most active agents have emerged, making their effectiveness less predictable. With the aim of finding an answer and for the purpose of facilitating the detection of anaerobic antimicrobial resistance, the Anaerobic Subcommittee of the Asociación Argentina de Microbiología developed the First Argentine consensus guidelines for in vitro antimicrobial susceptibility testing of clinically relevant anaerobic bacteria in humans. This document resulted from the compatibilization of the Clinical and Laboratory Standards Institute recommendations, the international literature and the work and experience of the Subcommittee. The Consensus document provides a brief taxonomy review, and exposes why and when anaerobic antimicrobial susceptibility tests should be conducted, and which antimicrobial agents can be used according to the species involved. The recommendations on how to perform, read and interpret in vitro anaerobic antimicrobial susceptibility tests with each method are exposed. Finally, the antibiotic susceptibility profile, the classification of antibiotics according to their in vitro activities, the natural and acquired mechanisms of resistance, the emerging resistance and the regional antibiotic resistance profile of clinically relevant anaerobic species are shown. Key words: anaerobic bacteria, antimicrobial susceptibility testing, consensus guidelines

ÍNDICE 2.2. Resistencias naturales. Consideraciones generales 1. Introducción y taxonomía 2.3. Resistencias adquiridas. Consideraciones gene- 2. Perfiles de sensibilidad de las bacterias anaerobias a rales los antimicrobianos 2.4. Patrones de resistencia en nuestro medio 2.1. Categorización de los antibióticos según su ac- 3. Cuándo y por qué realizar las pruebas de sensibili- tividad in vitro. dad 52 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 51-66

4. Cómo realizar las pruebas de sensibilidad El objetivo de este documento es dar a conocer las 4.1. Consideraciones generales recomendaciones consensuadas por la Subcomisión 4.2. Preparación del inóculo de Bacterias Anaerobias (SBA) para la realización de 4.3. Atmósfera y tiempo de incubación las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos de las 4.4. Métodos para evaluar la sensibilidad de las bac- bacterias anaerobias aisladas con mayor frecuencia en terias anaerobias a los antimicrobianos infecciones en humanos. 4.4.1. Dilución en agar Para elaborar este consenso se adoptaron las re- 4.4.2. Microdilución en caldo comendaciones del Clinical and Laboratory Standards 4.4.3. Epsilométrico Institute (CLSI) (12), de los Manuales de Bacteriología 4.4.4. Elución en caldo con discos Clínica (11, 16, 31) y de los documentos de la SBA- SA- 4.4.5. Detección de b-lactamasas DEBAC- AAM (5, 6). 4.4.6. D-test: prueba de difusión con doble disco Las primeras revisiones de la taxonomía de las / tableta bacterias anaerobias se realizaron a fines de los años 5. Qué antibióticos probar en las pruebas de sensibilidad 70. Desde 1980, el advenimiento de los métodos de la 6. Cepas patrones biología molecular produjo cambios muy relevantes que 7. Consideraciones finales ayudaron a resolver múltiples problemas taxonómicos; no obstante, todavía quedan otros por dilucidar. Sin 1. INTRODUCCIÓN Y TAXONOMÍA duda, surgirán nuevas especies y modificaciones en la nomenclatura de estas bacterias. Es por ello que en la Los patrones de resistencia de la mayoría de las bacte- actualidad continuamos realizando la identificación de rias anaerobias han cambiado en estas últimas décadas, rutina de los aislamientos clínicos por medio del estudio en especial en el grupo Bacteroides fragilis. Además, se de las características microscópicas, macroscópicas y ha detectado emergencia de resistencia a los antibióticos fenotípicas, y utilizamos las pruebas moleculares como tradicionalmente activos como los β-lactámicos con inhi- una herramienta válida para una categorización taxonó- bidores de β-lactamasas, los carbapenemes y el metro- mica más minuciosa. nidazol, así como una mayor resistencia a la clindamicina En la Tabla 1 se muestran los nombres de las bac- y a la cefoxitina, lo cual hace poco predecible el esquema terias anaerobias aisladas con mayor frecuencia de los terapéutico empírico y demuestra la necesidad de efectuar materiales clínicos, las modificaciones taxonómicas y los estudios de sensibilidad (18, 24, 29, 30, 32, 39). los nuevos hallazgos informados en los últimos 10 años Si bien las pruebas de sensibilidad in vitro de las bac- (11, 17, 31). terias anaerobias a los antimicrobianos no se realizan en forma rutinaria, en ciertas situaciones clínicas se ha 2. PERFILES DE SENSIBILIDAD DE LAS demostrado que son necesarias (4, 11, 20, 22, 24, 30, BACTERIAS ANAEROBIAS 33, 49). La decisión de realizar el estudio de sensibilidad requiere de un material proveniente de un sitio estéril, 2.1. Categorización de los antibióticos según su clínicamente significativo, en el marco de una patología actividad in vitro que requiera un tratamiento prolongado, el que por lo En la Tabla 2 se muestra la categorización de la activi- tanto deberá ser efectivo. Asimismo, se necesita un dad in vitro de los antibióticos frente a los distintos grupos estrecho contacto con el médico tratante. En cuanto a de bacterias anaerobias, según los resultados obtenidos a los microorganismos a evaluar, deberán seleccionarse través de los estudios de vigilancia realizados por la SBA aquellos anaerobios que presenten mayor virulencia y en Argentina (18, 21, 23, 33, 35) y la información de otros cuya sensibilidad a los antimicrobianos de uso habitual países (4, 27, 28, 42, 48, 49). no pueda ser predicha, tales como las especies de Bac- En líneas generales, los antimicrobianos más teroides, Clostridium, Prevotella, Fusobacterium, Bilophila activos son la combinación de b-lactámicos con y Sutterella (4, 12). En los casos donde se aíslan varios inhibidores de b-lactamasas, los carbapenemes, el anaerobios potencialmente patógenos, es conveniente cloranfenicol y el metronidazol. Cabe señalar la excep- seleccionar como mínimo a los miembros del grupo ción del último frente a los bacilos gram positivos no Bacteroides fragilis, por ser los más resistentes a los esporulados (32). antibióticos (4, 18, 20-22). Las quinolonas fluoradas de cuarta generación como Los centros que habitualmente realizan el cultivo y la moxifloxacina presentan mejor actividad frente a los la identificación de las bacterias anaerobias deberían anaerobios que sus predecesoras (por ej., la ciprofloxa- evaluar periódicamente los patrones de resistencia de cina), las cuales tienen actividad marginal frente a este los microorganismos aislados con mayor frecuencia, tipo de bacterias. Sin embargo, a pesar de haber sido con el fin de detectar sus variaciones y la emergencia de recientemente incorporadas en el mercado, ya se han resistencia, y de poder orientar la selección del esquema detectado cepas del grupo Bacteroides fragilis resistentes de tratamiento más adecuado (12). a estos antibióticos (4, 20, 27). Bacterias anaerobias y pruebas de sensibilidad 53

Tabla 1. Nomenclatura de las bacterias anaerobias aisladas con mayor frecuencia de materiales clínicos

Nomenclatura Nuevas especies y Nomenclatura Nuevas especies y actual modificaciones actual modificaciones desde el año 2000 desde el año 2000

Bacilos gram negativos Alistipes finegoldii Nueva especie Porphyromonas asaccharolytica Alistipes putredinis Bacteroides putredinis Porphyromonas catoniae Anaerohabdus furcosa Bacteroides furcosus Porphyromonas endodontalis Bacteroides caccae Porphyromonas gingivalis Bacteroides coagulans Porphyromonas levii Bacteroides coprocola Bacteroides vulgatus-like Porphyromonas somerae Porphyromonas levii-like Bacteroides dorei Bacteroides vulgatus-like Prevotella nigrescens Bacteroides finegoldii Prevotella baroniae Nueva especie Bacteroides fragilis Prevotella bivia Bacteroides nordii Bacteroides uniformis-like Prevotella buccae Bacteroides ovatus Prevotella buccalis Bacteroides stercoris Prevotella corporis Bacteroides tectus Prevotella dentalis Bacteroides thetaiotaomicron Prevotella denticola Bacteroides uniformis Prevotella disiens Bacteroides vulgatus Prevotella enteca Bilophila wadsworthia Prevotella heparinolytica Campylobacter gracilis Bacteroides gracilis Prevotella intermedia Campylobacter ureolyticus Bacteroides ureolyticus Prevotella loescheii Centipeda periodontii Prevotella marshii Nueva especie Dialister spp.(1) Prevotella melaninogenica Faecalibacterium prausnitzii Fusobacterium prausnitzii Prevotella multiformis Prevotella denticola-like Fusobacterium gonidiaformans Prevotella multisaccharivorax Nueva especie Fusobacterium mortiferum Prevotella nigrescens Fusobacterium naviforme Prevotella oralis Fusobacterium necrophorum Prevotella oris Fusobacterium nucleatum Prevotella oulorum Fusobacterium periodonticum Prevotella pallens Fusobacterium ulcerans Prevotella salivae Prevotella oris- like Fusobacterium varium Prevotella shahii Prevotella loeschii- like Fusobacterium russii Prevotella tannerae Leptotrichia buccalis Prevotella timonensis Nueva especie Mitsuokella multiacida Prevotella veroralis Odoribacter splanchnicus Bacteroides splanchnicus Pseudoflavonifractor capillosus Bacteroides capillosus Parabacteroides distasonis Bacteroides distasonis Snathia sanguinegens Leptotrichia sanguinegens Parabacteroides goldsteinii Bacteroides distasonis-like Sutterella wadsworthensis Parabacteroides merdae Bacteroides merdae Tannerella forsythia Bacteroides forsythus Tissierella praeacuta Bacilos gram positivos no esporulados Actinobaculum spp.(2) Anaerofustis stercorihominis Nueva especie Actinomyces cardiffensis Nueva especie Anaerostipes caccae Nueva especie Actinomyces dentales Nueva especie Anaerotruncus colihominis Actinomyces europaeus Atopobium spp.(3) Actinomyces funkei Bifidobacterium spp.(4) Actinomyces georgiae Collinsella spp.(5) Actinomyces gerencseriae Dorea spp.(6) Actinomyces graevenitzii Eggerthella lenta Eubacterium lentum Actinomyces hongkongensis Nueva especie Eggerthella spp. Actinomyces israelí Eubacterium spp. Actinomyces johnsonii Actinomyces Fusobacterium prausnitzii Faecalibacterium prausnitzii naeslundii genoespecie WVA 963 Actinomyces meyeri Filifactor alocis Actinomyces naeslundii Lactobacillus spp.(7) Actinomyces nasicola Nueva especie Mobiluncus curtisii Actinomyces neuii Mobiluncus mulieris Actinomyces odontolyticus Mogibacterium spp.(8) 54 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 51-66

Tabla 1. Continuación

Nomenclatura Nuevas especies y Nomenclatura Nuevas especies y actual modificaciones actual modificaciones desde el año 2000 desde el año 2000

Actinomyces oricola Nueva especie Olsenella spp.(9) Actinomyces radicidentis Propionibacterium spp.(10) Actinomyces radingae Scardovia inopinata Bifidobacterium inopinatum Actinomyces turicensis Slackia spp.(11) Actinomyces urogenitalis Turicibacter sanguinis Nueva especie Actinomyces viscosus Varibaculum cambriensis Nueva especie

Bacilos gram positivos esporulados Clostridium argentinense Clostridium paraputrificum Clostridium baratii Clostridium perfringens Clostridium bartlettii Nueva especie Clostridium putrificum Clostridium bifermentans Clostridium ramosum Clostridium botulinun Clostridium septicum Clostridium butyricum Clostridium sordelli Clostridium cadaveris Clostridium sphenoides Clostridium carnis Clostridium sporogenes Clostridium clostridioforme Clostridium subterminale Clostridium difficile Clostridium symbiosum Clostridium glycolicum Clostridium tertium Clostridium hastiforme Tissierella preacuta Clostridium tetani Clostridium histolyticum Clostridium aldenense Nueva especie Clostridium indolis Clostridium asparagiforme Nueva especie Clostridium innocuum Clostridium chauvoei Clostridium limosum Clostridium citroniae Nueva especie Clostridium neonatali Nueva especie Clostridium hiranonis Nueva especie Clostridium novyi A Clostridium hylemonae Nueva especie Clostridium orbiscindens Filifactor villosus

Cocos gram negativos Acidaminococcus spp.(12) Megasphaera micronuciformis Nueva especie Megasphaera elsdenii Veillonella aypica Veillonella denticariosi Nueva especie Veillonella dispar Veillonella montpellierensis Nueva especie Veillonella parvula Veillonella rogosae Nueva especie

Cocos gram positivos Anaerococcus hydrogenalis Peptostreptococcus hydrogenalis Peptococcus niger Anaerococcus lactolyticus Peptostreptococcus lactolyticus Peptoniphilus asacharolyticus Peptostreptococcus asacharolyticus Anaerococcus murdochii Nueva especie Peptoniphilus harei Peptostreptococcus harei Anaerococcus octavius Peptostreptococcus octavius Peptoniphilus indolicus Peptostreptococcus indolicus Anaerococcus prevotii Peptostreptococcus prevotii Peptoniphilus ivorii Peptostreptococcus ivorii Anaerococcus tetradius Peptostreptococcus tetradius Peptoniphilus lacrimales Peptostreptococcus lacrimalis Anaerococcus vaginalis Peptostreptococcus vaginalis Peptoniphilus gorbachii Nueva especie Atopobium spp.(13) Peptostreptococcus spp.(14) Finegoldia magna Peptostreptococcus magnus Ruminococcus productus Peptostreptococcus productus Gallicola barnesae Peptostreptococcus barnesae Staphylococcus sacharolyticus Peptococcus sacharolyticus

(1)3 especies, (2)3 especies, (3)4 especies, (4)9 especies, (5)4 especies, (6)2 especies, (7)22 especies, (8)5 especies, (9)2 especies, (10)2 especies, (11)3 especies, (12)2 especies, (13)3 especies, (14)2 especies. Bacterias anaerobias y pruebas de sensibilidad 55

Tabla 2. Categorización de los antibióticos según su actividad in vitro frente a las bacterias anaerobias

Microorganismos Muy buena actividad Mediana actividad Regular a mala (> 90% S) ( 70 - 90% S) actividad (< 70% S)

Bacteroides fragilis Ampicilina-sulbactama Cefoxitina Ampicilina Amoxicilina-clavulánico Piperacilina Cefalosporinas de 1.ª, 2.ª, Piperacilina-tazobactama Clindamicina (excepto cefoxitina), 3.ª y 4.ª generación Imipenem Moxifloxacina Meropenem Azitromicina Ertapenem Telitromicina Metronidazol Cloranfenicol Tigeciclina

Grupo Bacteroides fragilis Piperacilina-tazobactama Ampicilina-sulbactama Ampicilina (no B. fragilis) Imipenem Amoxicilina-clavulánico Cefalosporinas de 1.ª, 2.ª, 3.ª Meropenem Piperacilina y 4.ª generación Ertapenem Moxifloxacina Clindamicina Metronidazol Azitromicina Cloranfenicol Telitromicina Tigeciclina

Prevotella spp. y Ampicilina-sulbactama Clindamicina Ampicilina(1) Porphyromonas spp. Amoxicilina-clavulánico Azitromicina Piperacilina-tazobactama Telitromicina Cefoxitina Moxifloxacina Ceftriaxona Imipenem Meropenem Ertapenem Metronidazol Cloranfenicol Tigeciclina

Fusobacterium spp. Ampicilina Azitromicina Ampicilina-sulbactama Telitromicina Amoxicilina-clavulánico Piperacilina-tazobactama Cefoxitina Ceftriaxona Imipenem Meropenem Ertapenem Clindamicina Metronidazol Cloranfenicol Tigeciclina Moxifloxacina Veillonella spp. Ampicilina Penicilina Ampicilina-sulbactama Piperacilina Amoxicilina-clavulánico Piperacilina-tazobactama Cefoxitina Ceftriaxona Imipenem Meropenem Ertapenem Metronidazol Cloranfenicol 56 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 51-66

Tabla 2. Continuación

Microorganismos Muy buena actividad Mediana actividad Regular a mala (> 90% S) ( 70 - 90% S) actividad (< 70% S)

Moxifloxacina Tigeciclina Azitromicina Telitromicina

Clostridium spp. Ampicilina-sulbactama Penicilina(2) Azitromicina (no C. difficile) Amoxicilina-clavulánico Ampicilina Telitromicin Piperacilina-tazobactama Cefoxitina Imipenem Ceftriaxona Meropenem Clindamicina Ertapenem Moxifloxacina Metronidazol Cloranfenicol Tigeciclina Vancomicina

Clostridium difficile Piperacilina-tazobactama Imipenem Ampicilina Metronidazol Meropenem Ampicilina-sulbactama Cloranfenicol Ertapenem Amoxicilina-clavulánico Tigeciclina Cefoxitina Vancomicina Ceftriaxona Clindamicina Azitromicina Telitromicina Moxifloxacina

Bacilos gram positivos Penicilina Cefoxitina Metronidazol no esporulados Ampicilina-sulbactama Ceftriaxona Amoxicilina-clavulánico Azitromicina Piperacilina-tazobactama Telitromicina Imipenem Moxifloxacina Meropenem Ertapenem Clindamicina Cloranfenicol Vancomicina(3)

Cocos gram positivos Penicilina Telitromicina Azitromicina Ampicilina(4) Moxifloxacina Ampicilina-sulbactama(4) Amoxicilina-clavulánico Piperacilina-tazobactama Cefoxitina Ceftriaxona Imipenem Meropenem Ertapenem Clindamicina Metronidazol Cloranfenicol Vancomicina

S: sensibilidad; (1)Porphyromonas gingivalis y Fusobacterium nucleatum en nuestro medio aún son sensibles a la ampicilina, ya que no se ha comunicado el aislamiento de cepas productoras de b-lactamasa; (2)Clostridium perfringens permanece sensible a la penicilina; (3)excepto Lactobacillus spp., que usualmente son resistentes a la vancomicina. (4)excepto Peptostreptococcus anaerobius, sobre el cual la ampicilina presenta mediana actividad.

Bacterias anaerobias y pruebas de sensibilidad 57

Los azálidos y los cetólidos muestran actividad varia- los del relevamiento realizado en el año 2002 se observa ble y son más activos frente a los géneros Prevotella y que su actividad se mantuvo a través del tiempo (92% y Porphyromonas (19, 36). 86% de sensibilidad, respectivamente) (18). Dentro de los antibióticos no β-lactámicos, el metro- 2.2. Resistencias naturales. nidazol y la tigeciclina son los que mostraron la mejor Consideraciones generales actividad. Es importante destacar que el metronidazol, un Todas las bacterias anaerobias son naturalmente antibiótico tradicionalmente utilizado para el tratamiento resistentes a los monobactames, a los aminoglucósidos, de infecciones por anaerobios, continúa mostrando una a las sulfonamidas y a la trimetroprima (55). excelente actividad frente a estas bacterias. Las especies de Lactobacillus, en su mayoría, son La moxifloxacina, utilizada para el tratamiento de las resistentes a la vancomicina, y los bacilos gram positivos infecciones abdominales, presentó una actividad va- no esporulados son resistentes al metronidazol (9, 14, riable según la especie. Es un antibiótico que debe ser 26, 28, 42, 48). monitoreado, debido a que si bien en nuestro medio la sensibilidad global fue del 91%, se observó un corrimiento 2.3. Resistencias adquiridas. de las CIM hacia los valores de resistencia. Consideraciones generales Los niveles de resistencia a la clindamicina fueron Los mecanismos de resistencia adquirida se muestran inaceptablemente altos como para utilizar dicho antibiótico en la Tabla 3. en forma empírica frente a este grupo bacteriano. Con respecto al relevamiento anterior, se observó un aumento del 2.4. Patrones de resistencia en nuestro medio porcentaje de resistencia durante el último período (25% El principal mecanismo de resistencia observado en de resistencia en B. fragilis y 48% en las otras especies los bacilos gram negativos anaerobios es la producción del grupo Bacteroides fragilis) (18). de β-lactamasas, cuyos genes codificantes pueden estar presentes en plásmidos o en otros elementos móviles, lo Prevotella spp., Porphyromonas spp. y cual permite su transferencia horizontal y muy eficiente Fusobacterium spp. a otras células bacterianas. Como estas β-lactamasas Las especies de los géneros Prevotella, Porphyromo- son muy frecuentes en el grupo Bacteroides fragilis, se nas y Fusobacterium fueron muy sensibles a la mayoría puede considerar que todos los miembros de este grupo de los antibióticos probados, excepto a la ampicilina, son resistentes a la penicilina y más del 95% son resis- especialmente Prevotella spp., y a los macrólidos en el tentes a la ampicilina. Los otros bacilos gram negativos caso de Fusobacterium spp. (35) Tabla 5. no pertenecientes a este grupo también pueden producir β-lactamasas, por lo tanto, la resistencia a la penicilina Clostridium spp., Clostridium difficiley cocos y a la ampicilina resultan no predictibles, especialmente gram positivos en el género Prevotella (18, 20, 22, 33, 35). Los clostridios estudiados, con la excepción de C. difficile, mostraron buena sensibilidad a los antibióticos Grupo Bacteroides fragilis ensayados. La ampicilina y la clindamicina fueron los Las especies del grupo Bacteroides fragilis son las que antibióticos que presentaron menor actividad. Los 7 aisla- más han variado en cuanto a sus patrones de resistencia. mientos de C. perfringens que se evaluaron no mostraron En la Tabla 4 se muestran los datos del último releva- resistencia a los β-lactámicos (35). Tabla 5. miento de la sensibilidad de estos microorganismos frente C. difficilemostró un perfil característico de mayor re- a 10 antibióticos. El método utilizado fue la dilución en sistencia a los antibióticos. Sin embargo, el metronidazol y agar o método de Wadsworth, recomendado por el CLSI la vancomicina demostraron una buena actividad in vitro. (12). En ese relevamiento participaron 17 centros de la En un relevamiento realizado en el 2006 (Tabla 6), sobre Ciudad Autónoma de Buenos Aires y de otras ciudades 52 aislamientos no se detectó resistencia al metronidazol del país y fue realizado por la SBA-SADEBAC-AAM como ni a la vancomicina, antibióticos de elección en el trata- parte de su tarea de vigilancia de la resistencia en estas miento de las infecciones causadas por C. difficile (23). bacterias (21). Los cocos gram positivos presentaron bajos niveles de Los datos sobresalientes de ese estudio fueron la detec- resistencia a la ampicilina y a la clindamicina. Este último ción –por primera vez– de aislamientos resistentes y con antibiótico conservó más del 95% de actividad frente a sensibilidad disminuida a los carbapenemes (imipenem, estas bacterias (35). Tabla 5. ertapenem y doripenem) y con resistencia a la piperacilina- tazobactama (21, 22). A pesar de ello, dichos antibióticos 3. CUÁNDO Y POR QUÉ REALIZAR LAS continúan siendo los β-lactámicos más activos frente a PRUEBAS DE SENSIBILIDAD estos microorganismos. La ampicilina-sulbactama mostró actividad variable de acuerdo a la especie analizada, aun- La realización de las pruebas de sensibilidad en la que si se comparan los resultados del citado estudio con bacteriología anaerobia no es un evento rutinario, sino 58 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 51-66

Tabla 3. Mecanismos de resistencia adquirida

Antibiótico Mecanismo de resistencia Gen Especie anaerobia Características

β-lactámicos

Enzimas inactivantes(1) Cefalosporinasa Grupo Bacteroides fragilis En cromosoma clase 2e Bacteroides spp No transferible Prevotella spp Confiere resistencia a ampicilina y penicilina Bilophila wadsworthia Inh. por inhibidores de β-lactamasas Cefoxitinasa cepA Grupo Bacteroides fragilis Transferible por plásmidos cfxA Prevotella spp. o Tansposones Porphyromonas spp. Confiere resistencia a cefoxitina y cefotaxima Penicilinasa Fusobacterium spp. Inh. por inhibidores de β-lactamasas Clostridium spp. (no C. perfringens) Carabapenemasa ccrA cfiA Bacteroides fragilis Metaloenzima En cromosoma Transferi- clase B grupo 3 rible No inh. por inhibidores de β-lactamasas. Confiere resistencia a todos los β lactámicos y carbapenemes Baja afinidad de PLP(2) Alteraciones en PLP1 Bacteroides fragilis Confiere resistencia a las cefalosporinas o PLP2 Veillonella spp. Cocos gram positivos Alteraciones en la permeabilidad Alteraciones en Bacteroides spp. Confiere resistencia a ampicilina-sulbactama ≥ 1 porina Porphyromonas spp. Fusobacterium spp. Clindamicina Alteraciones en el sitio blanco(3) Metilasa de la subunidad erm F, G, S, Grupo Bacteroides fragilis En cromosoma, plásmidos y Transposones 23S del ARN Q, P, Z, B Porphyromonas spp. Transferible Prevotella spp. Clostridium perfringens Confiere resistencia de alto nivel Clostridium difficile Cocos gram positivos Quinolonas Alteraciones en el sitio blanco(4) Mutaciones en la gyr A Bacteroides fragilis Transferible ADN girasa gyr A, B Clostridium perfringens Confiere resistencia de alto nivel Clostridium difficile Bombas de eflujo Bacteroides spp. ≥1 bomba de eflujo Bacteroides fragilis Confiere resistencia a todas las quinolonas Metronidazol Enzimas inactivantes(5) Nitroimidazol reductasa nim A-G Grupo Bacteroides fragilis En cromosoma y plásmidos Bacteroides spp. Transferible Finegoldia magna Inducible por exposición prolongada a metronidazol en mutantes de laboratorio Tetraciclinas Alteraciones en el sitio blanco y Bombas de eflujo(6) Proteínas protectoras tet A, B, M, Grupo Bacteroides fragilis En transposones conjugativos ribosomales �O�, �Q��, S, W, Porphyromonas spp. Transferible Proteínas de eflujo ��otros Prevotella spp. energía dependiente Fusobacterium nucleatum Veillonella spp. Clostridium perfringens Clostridium difficile Bifidobacterium spp. Tigeciclina Desconocido (7) Desconocido Bacteroides spp. Rara Cloranfenicol Enzimas inactivantes Cloranfenicol acetil transferasa cat P, Q, D Clostridium perfringens Constitutiva Clostridium difficile En cromosomas y transposones

(1)Appelbaum et al. (2)Giraud-Morin et al. (25), Mättö et al. (38), Podglajen et al. (43); (2)Theron et al. (51), Wexler et al. (54); (3)Ackermann et al. (1), Cooper et al. (13); (4)Bachoual et al. (3), Dridi et al. (15); (5)Theron et al. (50), Trinh et al. (52); (6)Scott et al. (47), Villedieu et al. (53); (7)Hecht DW (30). Bacterias anaerobias y pruebas de sensibilidad 59

Tabla 4. Actividad in vitro de 10 antibióticos frente a 363 aislamientos del grupo Bacteroides fragilis

Microorganismos/ Categoría (%) Antibióticos Sensible Intermedio Resistente

Bacteroides fragilis (N = 198) Ampicilina-sulbactama 97 1,5 1,5 Piperacilina-tazobactama 99 0 1 Cefoxitina 82,8 11,1 6,1 Ertapenem (n = 126) 96 1,6 2,4 Imipenem 98,5 0 1,5 Doripenem (n = 159) 97,5 0,6 1,9 Clindamicina 74,7 2,5 22,7 Metronidazol 100 0 0 Moxifloxacina 89,9 2,0 8,1 Tigeciclina 99,5 0,5 0

Bacteroides thetaiotaomicron / ovatus (N = 69) Ampicilina-sulbactama 87 8,7 4,3 Piperacilina-tazobactama 98,6 1,4 0 Cefoxitina 49,3 27,5 23,2 Ertapenem (n = 49) 89,8 4,1 4,1 Imipenem 98,6 0 1,4 Doripenem (n = 58) 96,6 0 3,4 Clindamicina 42 18,8 39,1 Metronidazol 100 0 0 Moxifloxacina 89,9 2,9 7,2 Tigeciclina 100 0 0

Bacteroides caccae (N = 30) Ampicilina-sulbactama 90 10 0 Piperacilina-tazobactama 100 0 0 Cefoxitina 63,3 16,7 20 Ertapenem (n = 19) 94,7 5,3 0 Imipenem 100 0 0 Doripenem (n = 25) 96 4 0 Clindamicina 63,3 10 26,7 Metronidazol 100 0 0 Moxifloxacina 86,7 6,7 6,7 Tigeciclina 96,7 3,3 0

Bacteroides vulgatus (N=27) Ampicilina-sulbactama 74,1 18,5 7,4 Piperacilina-tazobactama 96,3 0 3,7 Cefoxitina 81,5 7,4 11,1 Ertapenem (n = 24) 100 0 0 Imipenem 100 0 0 Doripenem 100 0 0 Clindamicina 66,7 3,7 29,6 Metronidazol 100 0 0 Moxifloxacina 81,5 3,7 14,8 Tigeciclina 100 0 0

Otras especies del grupo Bacteroides fragilis (N = 39)(1) Ampicilina-sulbactama 87,2 10,3 2,6 Piperacilina-tazobactama 97,4 2,6 0 Cefoxitina 61,5 20,5 17,9 Ertapenem (n = 34) 97,1 0 2,9 Imipenem 100 0 0 Doripenem (n = 37) 100 0 0 Clindamicina 51,3 7,7 41 Metronidazol 100 0 0 Moxifloxacina 79,5 5,1 15,4 Tigeciclina 94,9 5,1 0

N: número total de aislamientos evaluados; n: número de aislamientos evaluados frente a dicho antibiótico. (1)Parabacteroides (Bacteroides) distasonis, 7; Bacteroides uniformis, 7; Bacteroides stercoris, 7; Bacteroides merdae, 2; Bacteroides spp., 16. Para la tigeciclina se utilizaron los puntos de corte propuestos por la Food and Drug Administration (μg/ml), sensible ≤ 2, intermedio = 4, resistente ≥ 8. 60 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 51-66

Tabla 5. Actividad in vitro de 10 antibióticos frente a bacterias anaerobias diferentes de las incluidas en el grupo B. fragilis

Microorganismos / CIM (µg /ml) Categoría (%)(6) Antibióticos Rango CIM50 CIM90 Sensible Intermedio Resistente

Fusobacterium nucleatum (N=14) Ampicilina ≤ 0,25 ≤ 0,25 ≤ 0,25 100 0 0 Ampicilina-sulbactama ≤ 0,25-0,25 ≤ 0,25 ≤ 0,25 100 0 0 Cefoxitina ≤ 0,125-0,5 ≤ 0,125 0,5 100 0 0 Ceftriaxona ≤ 4 ≤ 4 ≤ 4 100 0 0 Imipenem ≤ 0,015-0,25 0,03 0,125 100 0 0 Piperacilina ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1 100 0 0 Piperacilina-tazobactama ≤ 0,06-0,5 ≤0,06 ≤ 0,06 100 0 0 Clindamicina ≤ 0,03-0,125 ≤ 0,03 0,125 100 0 0 Metronidazol ≤ 0,125-4 ≤ 0,125 0,5 100 0 0 Azitromicina ≤ 0,06-8 0,125 2 57 7 36 Otros Fusobacterium spp. (N=12)(1) Ampicilina ≤ 0,25-1 ≤ 0,25 1 75 25 0 Ampicilina-sulbactama ≤ 0,25-2 ≤ 0,25 2 100 0 0 Cefoxitina ≤ 0,125->128 ≤ 0,125 4 91,6 0 8,3 Ceftriaxona ≤ 4-16 ≤ 4 4 100 0 0 Imipenem ≤ 0,015-1 0,03 1 100 0 0 Piperacilina ≤ 1-16 ≤ 1 4 100 0 0 Piperacilina-tazobactama ≤ 0,06-8 ≤ 0,06 4 100 0 0 Clindamicina ≤ 0,03->16 ≤ 0,03 2 91,6 0 8,3 Metronidazol ≤ 0,125-2 0,25 1 100 0 0 Azitromicina 0,25->16 1 16 38,5 15,4 46 Prevotella spp. (N=21)(2) Ampicilina ≤ 0,25->64 0,5 16 47,6 9,5 42,8 Ampicilina-sulbactama ≤ 0,25-4 0,5 2 100 0 0 Cefoxitina ≤ 0,125-16 0,5 4 100 0 0 Ceftriaxona ≤ 4-16 ≤ 4 8 100 0 0 Imipenem ≤ 0,015-0,25 0,125 0,125 100 0 0 Piperacilina ≤ 1-32 2 16 100 0 0 Piperacilina-tazobactama ≤ 0,06 ≤ 0,06 ≤ 0,06 100 0 0 Clindamicina ≤ 0,03->8 ≤ 0,03 ≤ 0,03 95,2 0 4,7 Metronidazol ≤ 0,125-2 1 1 100 0 0 Azitromicina ≤ 0,06-16 ≤ 0,06 2 82 0 18 Porphyromonas spp. (N=10)(3) Ampicilina ≤ 0,25-0,25 ≤ 0,25 ≤ 0,25 100 0 0 Ampicilina-sulbactama ≤ 0,25 ≤ 0,25 ≤ 0,25 100 0 0 Cefoxitina ≤ 0,125-2 ≤ 0,125 0,5 100 0 0 Ceftriaxona ≤ 4 ≤ 4 ≤ 4 100 0 0 Imipenem 0,03-0,25 0,125 0,25 100 0 0 Piperacilina ≤ 1 ≤ 1 ≤ 1 100 0 0 Piperacilina-tazobactama ≤ 0,06 ≤ 0,06 ≤ 0,06 100 0 0 Clindamicina ≤ 0,03-8 ≤ 0,03 ≤ 0,03 90 0 10 Metronidazol ≤ 0,125-0,5 0,25 0,25 100 0 0 Azitromicina ≤ 0,06-0,125 ≤ 0,06 0,125 100 0 0 Clostridium difficile (N=10) Ampicilina 2--4 2 4 0 0 100 Cefoxitina 4->16 >16 >16 10 0 90 Ceftriaxona 16-128 64 128 10 10 80 Imipenem 0,25-16 4 8 50 40 10 Piperacilina ≤ 1-8 4 8 100 0 0 Piperacilina-tazobactama 1-8 4 8 100 0 0 Clindamicina 0,5-16 16 16 30 10 60 Metronidazol 0,25-2 0,5 1 100 0 0 Otros Clostridium spp. (N=12)(4) Ampicilina ≤ 0,25-2 0,5 1 75 16,6 8,3 Ampicilina-sulbactama ≤ 0,125-0,5 ≤ 0,125 0,25 100 0 0 Cefoxitina ≤ 0,25-2 0,5 1 100 0 0 Ceftriaxona ≤ 0,125-64 0,5 4 91,6 0 8,3 Imipenem 0,03-0,25 0,06 0,25 100 0 0 Piperacilina ≤ 1-16 ≤ 1 ≤ 1 100 0 0 Piperacilina-tazobactama ≤ 0,06-4 ≤ 0,06 0,5 100 0 0 Clindamicina ≤ 0,125->32 0,5 8 75 8,3 16,6 Metronidazol 0,125-4 1 2 100 0 0 Cocos gram positivos (N=22)(5) Ampicilina ≤ 0,25-8 ≤ 0,125 1 86,3 4,5 9 Ampicilina-sulbactama ≤ 0,125-32 ≤ 0,125 4 95,4 0 4,5 Cefoxitina ≤ 0,125-16 ≤ 0,125 4 100 0 0 Ceftriaxona ≤ 0,125-8 ≤ 0,125 2 100 0 0 Imipenem ≤ 0,004-0,5 0,015 0,5 100 0 0 Piperacilina ≤ 0,5-16 ≤ 0,5 2 100 0 0 Piperacilina-tazobactama ≤ 0,06-16 ≤ 0,06 2 100 0 0 Clindamicina ≤ 0,03->32 0,5 2 95,4 0 4,5 Metronidazol ≤ 0,125-2 0,5 1 100 0 0 Azitromicina ≤ 0,125->32 1 >32 41 9 50

N: número total de aislamientos evaluados (1)F. necrophorum (n=6), F. mortiferum (n=4), F. varium (n=2), (2)P. intermedia/nigrescens (n=11), Prevotella spp. (n=4), P. denticola (n=2), P. melaninogenica (n=2), P. oralis (n=1), P. oris (n=1), (3)P. asaccharolytica (n=8), P. gingivalis (n=1), Porphyromonas sp. (n=1), (4)C. perfringens (n=7), C. sordellii (n=2), C. cadaveris (n=1), C. paraputrificum (n=1), C. tertium (n=1), (5)Peptostreptococcus spp. (n=14), P. anaerobius (n=8), (6)Para la azitromicina se utilizaron los puntos de corte de Streptococcus pneumoniae (CLSI 2006, en µg/ml): sensible ≤ 0,5, intermedio = 1, resistente ≥ 2.

Bacterias anaerobias y pruebas de sensibilidad 61

Tabla 6. Actividad in vitro de 12 antimicrobianos frente a 52 aislamientos de Clostridium difficile

Antibióticos Rango CIM (µg/ml) Categoría (%)(1) (µg/ml) MIC50 MIC90 Modo Resistente Intermedio Sensible b-lactámicos Ampicilina ≤ 0,06 - 4 0,5 2 0,5 13 23 64 Piperacilina 4 - >64 32 >64 32 15 13 72 Piperacilina-tazobactama 0,5 - >64 16 64 32 10 15 75 Ceftriaxona 1 - >128 16 64 16 21 17 62 Imipenem ≤ 0,06 - 16 4 8 4 2 12 86 No b-lactámicos Vancomicina 0,125 - 2 0,5 1 0,5 0 0 100 Teicoplanina ≤ 0,03 - 2 0,125 0,125 0,125 0 0 100 Metronidazol ≤ 0,125 - 2 0,5 1 1 0 0 100 Clindamicina 0,25 - >64 64 >64 >64 58 11 31 Moxifloxacina 0,25 - 16 4 16 16 52 13 35 Azitromicina 0,25 - >64 32 >64 >64 56 10 35 Tigeciclina ≤ 0,016- 0,03 ≤ 0,016 0,03 ≤ 0,016 0 0 100

(1) Se utilizaron los puntos de corte de Staphylococcus spp. (CLSI 2006, en µg/ml) para la vancomicina (sensible ≤ 2, intermedio 4 - 8, resistente ≥ 16) y para la teicoplanina (sensible ≤ 8, intermedio = 16, resistente ≥ 32); para la tigeciclina se emplearon los puntos de corte propuestos por la Food and Drug Administration (sensible ≤ 2, intermedio = 4, resistente ≥ 8). que responde a objetivos epidemiológicos y clínicos es- 3.2.3. Ante el aislamiento de microorganismos pecíficos (4-6, 11, 21, 29, 30, 39, 49). infrecuentes, con perfiles de sensibilidad 3.1. Fines epidemiológicos desconocidos o impredecibles. 3.1.1. Realizar la vigilancia en forma periódica, institucional y multicéntrica, con alcance local y regional, a fin de conocer los patrones de 4. CÓMO REALIZAR LAS PRUEBAS DE sensibilidad y detectar las resistencias emer- SENSIBILIDAD gentes con el objeto de orientar y eventualmente modificar los esquemas terapéuticos 4.1. Consideraciones generales empíricos. El método de referencia recomendado por el CLSI 3.1.2. Evaluar nuevos agentes antimicrobianos. documento M11-A7 2007 (12) es la dilución en agar o 3.2. Fines clínicos método de Wadsworth. Otros métodos aprobados por 3.2.1. La mayoría de las infecciones por anaerobios este organismo son la microdilución en caldo y la detec- son polimicrobianas y el éxito del tratamiento ción de b-lactamasa. La prueba por medio de tiras con involucra la combinación de intervenciones gradiente de concentración de antibióticos está sugerida quirúrgicas (drenaje y desbridamiento) con el como una alternativa más simple y rápida para el uso de uso de terapia empírica de amplio espectro. rutina en el laboratorio clínico. La elución con discos es Se justifica la realización de la prueba de el método recomendado por la SBA como tamizaje para sensibilidad ante el aislamiento de bacterias los organismos de crecimiento rápido (6). El D-test es anaerobias en forma monomicrobiana o de utilidad en cocos gram positivos para la detección del polimicrobiana de infecciones con focos en- fenotipo de resistencia iMLS (44). dovasculares y/o que requieren tratamiento El medio de cultivo utilizado debe asegurar el adecuado médico prolongado, y en las que la asistencia desarrollo del microorganismo en estudio. Las CIM de quirúrgica no siempre es posible. Tal es el los microorganismos utilizados como control de calidad caso de los abscesos hepáticos pequeños deben estar dentro del rango de aceptación para cada y múltiples, los abscesos en el SNC, en el antimicrobiano. pulmón u otros, las endocarditis, las os- Con el fin de lograr la reproducibilidad y confiabilidad de teomielitis y las bacteriemias refractarias al los resultados, la SBA recomienda seguir cuidadosamente tratamiento. las normas descritas en este documento. 3.2.2. Ante el aislamiento de bacterias anaerobias 4.2. Preparación del inóculo con probada resistencia a los antibióticos de 4.2.1. Suspensión directa de colonias: se prepara elección y/o reconocida patogenicidad. una suspensión equivalente al patrón 0,5 de 62 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 51-66

la escala de Mc Farland y al patrón 1 para el Inóculo final: aproximadamente 1x105 UFC/spot. Se�� método epsilométrico a partir de colonias en emplea una suspensión de turbidez equivalente al 0,5 agar Brucella suplementado, o en cualquier de la escala de Mc Farland. otro agar que permita el crecimiento del Incubación: en atmósfera anaerobia, a 35 °C durante microorganismo a las 24 a 48 horas de incu- 48 horas. bación. Las placas no deben exponerse más Todo el procesamiento puede realizarse en atmósfera de 30 minutos a la atmósfera aeróbica para ambiental, teniendo la precaución de no exponer a los evitar células no viables en la suspensión. microorganismos al oxígeno durante un período superior 4.2.2. Método de crecimiento en medio líquido: con a 1 hora. microorganismos de crecimiento rápido como Lectura e interpretación de los resultados: la lectura los del grupo Bacteroides fragilis o Clostri- del punto final es una de las etapas más delicadas. En dium spp., el inóculo se puede preparar a algunos casos puede llevar a interpretaciones ambiguas. partir de un caldo Brucella incubado durante La CIM es la concentración más baja de cada antimicro- 6 a 24 horas en atmósfera anaeróbica o biano que inhibe el crecimiento del organismo o donde se con una suspensión del microorganismo a observa una marcada reducción del desarrollo (pátina, < partir de placas de 48 horas de incubación. 10 colonias pequeñas o 1-3 colonias medianas) compa- Luego se ajusta la turbidez a una densidad rado con la placa de control de desarrollo (sin antibiótico) equivalente al patrón 0,5 de la escala de Mc y la de control de gota. Farland. Controles. Control de desarrollo: incluirlo al comienzo y 4.3. Atmósfera y tiempo de incubación al final de cada serie; son placas inoculadas, sin antibiótico Para las pruebas de sensibilidad, las muestras se e incubadas en atmósfera anaerobia.

incuban en atmósfera anaerobia (< 1% de O2 y 4-7% Control aerobio: inocular placas de agar chocolate sin

de CO2) durante 48 horas. La atmósfera anaerobia antibiótico al comienzo y al final de cada serie e incubarlas

puede lograrse en la cámara anaerobia (10% H2 - 5% en atmósfera de CO2 al 5-7%.

CO2 - 85% N2) o en jarras utilizando generadores Microorganismos utilizados como control: Bacteroides comerciales. Se debe incluir un indicador de óxido- fragilis ATCC 25285, Bacteroides thetaiotaomicron ATCC reducción como control de calidad de la anaerobio- 29741, Clostridium difficile ATCC 700057 y Eubacterium sis, la cual es indispensable para el desarrollo de lentum ATCC 43055. los microorganismos y fundamental para que actúe el metronidazol. 4.4.2. Microdilución en caldo 4.4. Métodos para evaluar la sensibilidad de las Utiliza pequeños volúmenes (100 µl) de caldo distri- bacterias anaerobias a los antimicrobianos buidos en bandejas plásticas con pocillos (policubetas 4.4.1. Dilución en agar tipo ELISA). Es un método comercial, menos complejo y 4.4.2. Microdilución en caldo laborioso que el de referencia, que permite probar varios 4.4.3. Epsilométrico antibióticos simultáneamente. En la actualidad, está 4.4.4. Elución en caldo con discos validado sólo para estudiar especies del grupo B. fragilis 4.4.5. Detección de b-lactamasas frente a agentes seleccionados, como la ampicilina-sul- 4.4.6. D-test: prueba de difusión con doble disco bactama, la cefoxitina, la clindamicina, el ertapenem, el metronidazol y la piperacilina. 4.4.1. Dilución en agar Medio de cultivo: caldo Brucella suplementado con 5 Es el método de referencia. Permite evaluar prácti- µg/ml de hemina, 1 µg/ml de vitamina K1 y 5% de san- camente a todas las especies de anaerobios, aunque gre lacada de caballo. El volumen mínimo que se debe se debe tener presente que aquellas que invaden el utilizar es 0,1 ml de caldo por pocillo. Las bandejas con medio pueden generar interferencias en la lectura de los las diluciones del antibiótico pueden ser almacenadas resultados. a -70 °C. Es un método laborioso que permite probar simultánea- Inóculo final: aproximadamente 1x106 UFC/ml. mente un gran número de aislamientos, dependiendo de Incubación: en atmósfera anaerobia a 35 °C durante la capacidad del multiinoculador empleado. Es el método 48 horas, en jarras o bolsas aptas para este tipo de utilizado para validar otros métodos y para probar nuevas placas o en cámara de anaerobiosis. Para evitar la drogas. Es útil para realizar los estudios de vigilancia. evaporación, las placas deben ser cubiertas con una Medio de cultivo: agar Brucella suplementado con 5 tapa plástica, semiabierta, que permita el intercambio µg/ml de hemina, 1 µg/ml de vitamina K1 y 5% de sangre gaseoso. lacada de carnero. Lectura: la CIM es la mínima concentración donde no Las placas con antibióticos deben prepararse prefe- se observa desarrollo o donde se observa una disminu- rentemente en el día de uso, si bien pueden conservarse ción significativa del desarrollo con respecto al pocillo a 2 - 8 °C hasta 72 horas. sin antibiótico. Bacterias anaerobias y pruebas de sensibilidad 63

Controles. Control de desarrollo: incluir un pocillo sin a que se han observado discrepancias en lo que respecta antibiótico con el inóculo, en la misma placa de la CIM, al comportamiento de algunos microorganismos frente a para evaluar si desarrolla el microorganismo en las con- ciertos antibióticos cuando se lo comparó con el método diciones de la prueba. de microdilución (que no es el método de referencia). El Control de esterilidad del caldo: incluir un pocillo con método ha sido reevaluado por la SBA por ser una prueba el medio sin inocular para verificar su esterilidad. accesible para nuestros laboratorios (6). La validación se Microorganismos utilizados como control: Bacteroides realizó mediante: a) la estandarización de las condiciones fragilis ATCC 25285, Bacteroides thetaiotaomicron ATCC de la prueba (medio de cultivo, inóculo, incubación), b) 29741, Clostridium difficile ATCC 700057 y Eubacterium la comparación con el método de referencia (dilución en lentum ATCC 43055. agar), y c) el estudio de la reproducibilidad del método. Las condiciones utilizadas fueron las siguientes: 4.4.3. Epsilométrico Medio de cultivo: infusión cerebro corazón Este método está actualmente muy difundido para Suplementos: hemina, 5 µg/ml microorganismos exigentes, inclusive los anaerobios, ya vitamina K1, 1 µg/ml que es muy fácil de realizar y permite tener rápidamente extracto de levadura, 50 mg/ml la CIM de un único microorganismo (10, 26, 34). Volumen: 5 ml por tubo Medio de cultivo: agar Brucella suplementado con 5 µg/ Inóculo: 0,1 ml de una suspensión del patrón ml de hemina, 1 µg/ml de vitamina K1 y 5% de sangre la- 0,5 Mc Farland cada de carnero. Este medio permite un mejor crecimiento Incubación: anaerobiosis, a 35 °C durante 48 h bacteriano y es el que mostró mayor reproducibilidad en los valores de las CIM. Cada ensayo debe constar de: Inóculo: hisopar una placa con una suspensión equi- - Un tubo con el antibiótico a probar y el inóculo, TUBO valente al patrón 1 de la escala de Mc Farland. Luego de DE LA PRUEBA aproximadamente 10-15 minutos, aplicar la tira plástica - Un tubo sin antibiótico con el inóculo, CONTROL con el gradiente de concentración del antimicrobiano. Se DEL DESARROLLO pueden colocar hasta 2 tiras en las placas de 100 mm - Un tubo sólo con caldo, CONTROL DE ESTERILIDAD de diámetro. DEL MEDIO Incubación: incubar las placas dentro de los 30 minutos En la Tabla 7 se detallan el número de discos y la de inoculación en atmósfera anaerobia, a 35 ºC durante concentración de cada antimicrobiano. 48 horas. La manera en que se debe efectuar la lectura e inter- Lectura: la CIM es el valor donde la elipse de la zona pretación de los resultados se indica en la Tabla 8. de inhibición intercepta la tira. Algunas combinaciones El porcentaje de concordancia con el método patrón microorganismo-droga pueden presentar dificultades en fue 98,5%. Sólo el 0,5% de las discrepancias fueron con- la lectura de la CIM. sideradas errores muy mayores, porcentaje que está por debajo de lo que es exigido en la literatura para que un 4.4.4. Elución en caldo con discos método sea aceptable (1,5%). La SBA lo recomienda como Es un método sencillo, accesible, económico y al al- método de tamizaje en aislamientos clínicos individuales. cance de todos los laboratorios clínicos, aunque poco co- Los resultados de resistencia o sensibilidad no habituales nocido. Este método no está aprobado por el CLSI debido deberán ser confirmados por el método de referencia (6).

Tabla 7. Esquema de trabajo para el método de elución con discos

Antibiótico Potencia del Nº de discos Concentración disco (µg) en 5 ml de BHI(1) final (µg/ml)(2)

Ampicilina 10 1/10 ml 1 Ampicilina-sulbactama 10/10 8 16/16 Imipenem 10 3 6 Penicilina 2 U 5 2 U Cefoxitina 30 5 30 Clindamicina 5 4 4 Metronidazol 50 1 10

(1) Excepto para ampicilina, que se prepara con 10 ml; (2)excepto penicilina, que se expresa en unidades. 64 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 51-66

Tabla 8. Lectura e interpretación de los resultados del mé- 5. QUÉ ANTIBIÓTICOS PROBAR EN LAS todo de elución con discos PRUEBAS DE SENSIBILIDAD

Tubo con ATB Control de desarrollo Interpretación Ante el aislamiento de un anaerobio clínicamente significativo según las pautas ya expuestas, los antibióticos Turbio(1) turbio resistente que se deben ensayar en el laboratorio clínico dependen Límpido turbio sensible del tipo de microorganismo, del sitio de la infección y de Límpido límpido no desarrolla: los patrones de resistencia nacionales, regionales y lo- prueba no válida cales ya conocidos para ese microorganismo, los cuales Turbio límpido incoherente: orientan el esquema terapéutico empírico hasta contar prueba no válida con los resultados del caso en estudio (30, 55).

(1)Cualquier grado de turbidez comparado con el control (caldo sin Teniendo en cuenta estas premisas y de acuerdo con el inocular). microorganismo en estudio, se sugiere seguir el siguiente protocolo de trabajo: - Grupo Bacteroides fragilis. Determinar la sensibilidad a ampicilina-sulbactama, piperacilina-tazobactama 4.4.5. Detección de b-lactamasas y clindamicina. Para detectar la presencia de β-lactamasas en bacte- - Fusobacterium spp., Porphyromonas spp., Prevotella rias anaerobias se recomienda el método de la cefalos- spp. Detección de β-lactamasa con nitrocefín. porina cromogénica (nitrocefín). Las cepas productoras - Veillonella spp. Determinar la sensibilidad a penicilina, de β-lactamasas pueden ser consideradas resistentes a a ampicilina y a clindamicina. la penicilina y a la ampicilina independientemente de los - Cocos gram positivos. Determinar la sensibilidad a resultados de otras pruebas adicionales de sensibilidad penicilina y a ampicilina-sulbactama. in vitro. El CLSI la recomienda para todos los organismos - Bacilos gram positivos esporulados. En Clostridium anaerobios con excepción del grupo B. fragilis, dado que no C. perfringens, detección de β-lactamasa con nitrocefín la mayoría de los miembros de este grupo producen β-lac- y determinación de la sensibilidad a clindamicina. tamasas y, por lo tanto, se deben considerar resistentes - Bacilos gram positivos no esporulados. Determinar a la penicilina y a la ampicilina. la sensibilidad a penicilina y a clindamicina. Cabe aclarar que algunos anaerobios pueden requerir hasta 30 minutos para producir una prueba positiva, y 6. CEPAS CONTROL algunas cepas de Parabacteroides (Bacteroides) distasonis y de B. fragilis son resistentes a los b-lactámicos Con el fin de monitorear los procedimientos de las por otros mecanismos, que no son detectados por esta pruebas de sensibilidad, deben utilizarse al menos dos de prueba (11, 12, 54). las siguientes cepas control para el método de dilución en agar y al menos una para el resto de los métodos (12). 4.4.6. D-test: prueba de difusión con Bacteroides fragilis ATCC 25285 doble disco / tableta Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741 La mayoría de las publicaciones muestran que la clin- Clostridium difficile ATCC 700057 damicina presenta buena actividad frente a los cocos gram Eubacterium lentum ATCC 430557 positivos; sin embargo, se ha comunicado resistencia a este antibiótico (8, 35, 40, 44). Si bien el fenotipo consti- 7. CONSIDERACIONES FINALES tutivo fue el más frecuentemente observado, también fue detectado el fenotipo inducible (41). Con el fin de evaluar Las decisiones del cuerpo médico para el tratamiento el mecanismo inducible, se ha propuesto una prueba de de los pacientes gravemente enfermos dependen, en gran difusión con doble disco / tableta similar a la utilizada para medida, de la información que emana del Servicio de Mi- cocos gram positivos aerobios. Esta se realiza hisopando crobiología. Es por ello que las pruebas de sensibilidad a un agar Brucella suplementado con 5 µg/ml de hemina, los antimicrobianos para los diferentes microorganismos y 1 µg/ml de vitamina K1 y 5% de sangre con un inóculo por los distintos métodos deben realizarse en condiciones de turbidez similar al patrón 0,5 de Mc Farland. Luego óptimas y estandarizadas, para que sean reproducibles, se aplican los discos / tabletas de eritromicina (15 μg) y confiables y permitan la detección de las variaciones en de clindamicina (2 μg) a una distancia de 10 a 15 mm de los patrones habituales de sensibilidad que alerten acerca centro a centro. El achatamiento de la zona de inhibición de probables resistencias emergentes. Este documento alrededor del disco/tableta de clindamicina se interpreta pretende contribuir al crecimiento de la bacteriología como prueba positiva. clínica anaerobia en nuestro medio. Bacterias anaerobias y pruebas de sensibilidad 65

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Recibido: 25/01/11 – Aceptado: 22/02/11 Imágenes microbiológicas ISSN 0325-754167 IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 67

Alicyclobacillus acidoterrestris

Pertenece a un grupo de bacterias aerobias estrictas, acidófilas, termófilas y esporoformadoras, a las que se conoce con la sigla TAB. Son organismos de morfología bacilar (de 0,3 a 0,8 µm x 2 a 4,5 µm), gram positivos o gram variables (Figura 1). Requieren elevadas temperaturas (40 a 70 °C) y condiciones de pH bajo (2 a 6) para su desarrollo (1). Han sido aislados de frutas, vegetales, jugos, purés, jarabes, bebidas y otros alimentos de bajo pH, así como de suelo y aguas de proceso (2). Sus esporos (Figuras 2 y 3) poseen la capacidad de tolerar temperaturas cercanas a los 120 °C. Se los considera microorganismos alteradores debido a la producción de 2-6 dibromofenol y 2-metoxifenol (guayacol), entre otros, los cuales modifican eloff-flavor y el off-odour (3). De todas las especies del género, A. acidoterrestris es la que mayor impacto tiene en la industria productora de Figura 2. Tinción de esporos (verde de malaquita al 5% y safrani- na al 0,5%). Las flechas indican la presencia de esporos (verdes) jugos. La presencia de 1 a 10 esporos por ml de jugo es en el interior de las células vegetativas (rojas) (100x). suficiente para causar su deterioro. Argentina es el segundo país en el mundo exportador de jugo concentrado de manzana y pera, con volúmenes cercanos a las 100 000 toneladas al año. Uno de los principales destinos es EE. UU., donde el valor pagado por tonelada es aproximadamente de 1200 dólares. De este modo, se estima que el negocio de los jugos concen- trados de fruta generaría unos 120 millones de dólares anuales. La exigencia a nivel mundial con respecto a la presencia de Alicyclobacillus es variable; sin embargo, aproximadamente el 62% de los importadores exige su ausencia (c=0). La detección de A. acidoterrestris en un lote de jugo de fruta repercute en importantes daños económicos, sumado a la desconfianza que esto genera por parte de los compradores hacia los proveedores, de ahí la importancia de su monitoreo. Figura 3. Tinción de esporos. Las flechas indican la presencia de esporos (verdes) sueltos. En rojo, las células vegetativas. (100x).

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Juan M. Oteiza Centro de Investigación y Asistencia Técnica a la Industria Agroalimentaria (CIATI), Calle Chile y Primeros Pobladores, (8309) Centenario, Neuquén, Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Figura 1. Coloración de Gram (100x). E-mail: [email protected] 68 Revista Argentina de MicrobiologíaISSN (2010) 0325-7541 42: --- IMÁGENES MICROBIOLÓGICAS Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 68

Alteraciones ultramicroscópicas en tejido placentario de animales infectados con Leptospira interrogans serovar Pomona

En las infecciones por Leptospira interrogans de animales preñados se producen alteraciones en los tejidos placen- tarios, lo que provoca aborto y muerte embrionaria. El microscopio electrónico nos permite observar las alteraciones celulares que se producen en procesos como la apoptosis y la necrosis. En la apoptosis se destacan las alteraciones morfológicas del núcleo frente a las del citoplasma, a la inversa de lo que ocurre en la necrosis en general. En este ensayo se buscaron las alteraciones morfológicas ultraestructurales producidas en células endoteliales placentarias de cobayos experimentalmente inoculados con una cepa de Leptospira patógena (1). Se observaron capilares pla- centarios congestionados y células endoteliales con vacuolas citoplasmáticas. Se visualizaron células en necrobiosis e indicios de apoptosis, donde la cromatina condensada formaba acúmulos. La presencia de grumos de cromatina indica la existencia de un proceso de apoptosis en su fase inicial (Figura 1). Se evidenció pérdida de integridad de las uniones intercelulares endoteliales, alteración de la estructura celular y ruptura de la membrana celular (Figura 2). Las alteraciones celulares se presentaron en todos los animales inoculados, no se observaron leptospiras intactas y la estructura celular en los animales controles estaba conservada. Existe un gran número de patologías que se pensaba estaban relacionadas con la necrosis y que actualmente se relacionan también con la apoptosis, como el daño isquémico (2). El daño placentario producido por L. interrogans serovar Pomona observado en este ensayo es un ejemplo de la concurrencia de ambos procesos, necrosis y apoptosis.

Figura 1. Microfotografía electrónica de células Figura 2. Microfotografía electrónica de células endoteliales placentarias. Las flechas indican endoteliales placentarias. La flecha indica la pér- los grumos de cromatina característicos de la dida de integridad de las uniones intercelulares apoptosis. endoteliales.

Bibliografía

1. Macedo S. Ultrastructural study of Leptospira biflexa serovar Andamana, strain JNS using transmission and scanning electron microscope. Rev Peru Med Exp Salud Pública 2005; 22: 281-9. 2. Nicodemo A, Duarte M, Alves V, Takakura C, Santos R, Nicodemo E. Lung lesions in human leptospirosis: microscopic, im- munohistochemical and ultrastructural features related to thrombocytopenia. Am J Trop Med Hyg 1997; 56: 181-7.

Bibiana Brihuega1, Agustín Venzano1, Julián Diodati 2, Alberto Boffi 3, Daniel Funes1, Carmelo Auteri 1, Graciela Romero1, Luis Samartino1 1Instituto de Patobiología y 2Laboratorio de Microscopía Electrónica, Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Buenos Aires, Argentina; 3Consultor Servicio Anatomía Patológica, Hospital Prof. Dr. A Posadas, Buenos Aires, Argentina. Xxxx ISSN 0325-754173 Revista Argentina de Microbiología (2011) 43: 73

Guía para la preparación de los manuscritos

La siguiente lista está destinada a servir de guía para la preparación y revisión de su manuscrito de acuerdo con el estilo y formato de la revista. Para más detalles consultar las Instrucciones a los Autores (http://www.aam.org.ar). Los manuscritos que no cumplan con el formato especificado serán devueltos a los autores, retrasándose el proceso de evaluación y publicación.

Título Sí No No corresponde

Incluye título en español    Incluye título en inglés    Incluye título abreviado   

Autores Identifica al autor responsable    Incluye dirección, teléfono y correo electrónico del autor responsable    Incluye a todos los autores    Incluye el lugar de trabajo de cada autor Incluye nota de presentación del manuscrito por el autor responsable   

Resúmenes No supera el máximo de palabras permitidas    Incluye resumen en español    Incluye palabras clave en español    Incluye resumen en inglés    Incluye palabras clave en inglés   

Texto No supera el máximo de palabras permitidas    No supera el máximo de tablas y/o figuras permitidas    Contiene las secciones correspondientes    Hace uso correcto de las abreviaciones    Cita la marca y procedencia de los reactivos, de los medios de cultivo y de los equipos    Cita el número de acceso de las nuevas secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos   

Tablas y Figuras Incluye cada una en hoja aparte    Los títulos son claros y concisos    Incluye las leyendas    Las citas en el texto se corresponden con el número de cada tabla y figura    Explica las abreviaciones no convencionales al pie de las tablas    Envía las figuras y fotografías en archivos adjuntos   

Bibliografía Respeta estrictamente el formato requerido por la revista    Ordena las citas bibliográficas en forma alfabética    Incluye las referencias en el texto en correspondencia con el número con el que aparecen en esta sección   

Agradecimientos Cita las fuentes de financiamiento    78 Revista Argentina de MicrobiologíaISSN (2010) 0325-7541 42: --- Revista Argentina de Microbiología (2010) 42: 78

Manuscript Preparation Checklist

The following checklist is designed to help you prepare and revise your manuscript according to journal style and format. For additional details, consult the Instructions to Authors (http://www.aam.org.ar). Manuscripts not following the specified format shall be returned to their authors, delaying the evaluation and publication process.

Title Yes No Does not apply

Includes title in Spanish    Includes title in English    Includes abbreviated title   

Authors Identifies corresponding author    Includes corresponding author’s address, telephone number and e-mail adress    Includes all the authors    Includes authors’ affiliations    Includes cover letter for manuscript submission signed by corresponding author   

Abstracts Each abstract does not exceed the maximum number of words allowed    Includes an abstract in Spanish    Includes key words in Spanish    Includes an abstract in English    Includes key words in English   

Text Does not exceed the maximum number of words allowed    Does not exceed the maximum number of tables and/or figures allowed    Has the corresponding sections    Makes correct use of abbreviations    Mentions trademarks and origin of reagents, culture media and equipment    Mentions accession number of new amino acids and nucleic acids sequences   

Tables and Figures Each of them is included on a separate page    Titles are clear and concise    Legends are included    Citations in the text correspond with the numbers of each table and figure    Abbreviations are explained as a table footnote    Figures and photographs are sent in attached files   

References Strictly adheres to the format required by the journal    Items in this section are listed in alphabetical order    Citations in the text correspond with the numbers appearing in this section   

Acknowledgements Funding sources are mentioned    69

NUEVAS INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES (VIGENTES A PARTIR DE 2011)

La Revista Argentina de Microbiología (RAM) es una publicación trimestral editada por la Asociación Argentina de Microbiología y destinada a la difusión de trabajos científicos en las distintas áreas de la Microbiología. La Asociación Argentina de Microbiología se reserva los derechos de propiedad y reproducción del material aceptado y publicado.

REQUISITOS GENERALES Los manuscritos enviados a esta revista deben constituir informes de investigación original. El envío de un manuscrito implica que los autores tienen las autorizaciones institucionales para proceder a la publicación de los datos y que el mismo manuscrito (u otro de contenido similar) no ha sido previamente publicado (salvo presentaciones parciales en reuniones científicas) ni se encuentra en consideración por otra revista. Los datos originales deberán ser presentados al Comité Editor en caso de ser necesario. Se debe explicitar que los resultados que se muestran provienen de proyectos aprobados por los Comités de Bioseguridad y/o Bioética de las instituciones participantes, así como que respetan la Ley de Hábeas Data en caso de incluir datos de pacientes.

PRESENTACIÓN DE LOS ORIGINALES Y DERECHOS DE AUTOR Los manuscritos deben dirigirse al Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología acompañados de una nota de acuerdo con el siguiente modelo:

“Sres. Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología: en mi carácter de autor responsable declaro que el resto de los autores han acordado que los represente frente a la RAM con respecto al envío del manuscrito …[Título]… y son responsables junto a mí de su contenido. Este trabajo (u otro de contenido similar) no ha sido publicado previamente ni está siendo considerado en otra revista para su publicación. Asimismo, manifiesto mi conformidad de otorgar los derechos de copia (copyright) a la Revista Argentina de Microbiología, una vez concretada la publicación”.

Todos los autores de un manuscrito deberán acceder explícitamente a su publicación, serán responsables de la veracidad de los contenidos y deberán explicitar su conformidad para que uno de ellos, que es quien suscribirá la nota arriba citada, actúe como autor para la correspondencia a los fines del manejo editorial. Asimismo, los autores manifestarán su conformidad con la posición de cada uno en la lista de autores, en la que se indicará su filiación académica. Un cambio de autor o de orden de autores sólo será considerado si se solicita mediante una nota firmada por todos los autores a tal efecto. En una carta adjunta, los autores deberán especificar la existencia de conflictos de interés que puedan afectar la evaluación del manuscrito. Estos serán confidenciales y mantenidos en reserva por el Comité Editor. Deben especificarse en la sección agradecimientos las fuentes de financiación para la tarea experimental descrita en el manuscrito, ya sean éstas institucionales, oficiales o privadas. También se deberán especificar en esta sección las afiliaciones comerciales o los vínculos tales como consultorías, así como la copropiedad de licencias con fines comerciales por parte de uno o más autores. El material será analizado por el Comité Editor y sometido a la consideración de dos árbitros científicos designados para cada caso. El Comité Editor se reserva el derecho de rechazar aquellos manuscritos cuyos contenidos se superponen total o parcialmente con trabajos ya publicados, o cuyas temáticas no se correspondan con las de la RAM. Asimismo, son motivos de rechazo la falta de cumplimiento de las reglas editoriales, violaciones éticas, baja calidad científica y un uso pobre del idioma, sea éste inglés o español. El Comité Editor se reserva el derecho de efectuar las modificaciones gramaticales o de estilo que considere necesarias.

ORGANIZACIÓN Y FORMATO La RAM acepta artículos originales, informes breves, artículos especiales, imágenes microbiológicas, editoriales y también edita suplementos. Se solicita leer cuidadosamente las especificaciones de cada formato a los efectos de elegir el más apropiado y de esta manera agilizar el proceso de evaluación. Los manuscritos podrán redactarse indistintamente en español o en inglés, aunque el Comité Editor estimula a los autores a escribir los trabajos en inglés para favorecer su difusión y lectura a nivel internacional. Artículos originales. Son trabajos de investigación completos y deben redactarse respetando las siguientes secciones: Título (en español y en inglés) y Título abreviado, Resumen y Palabras clave (en español y en inglés), Introducción, Materiales y métodos, Resultados, Discusión, Agradecimientos y Bibliografía. El manuscrito no deberá exceder las 8000 palabras incluyendo a todas las secciones, con hasta 6 tablas o figuras. Informes breves. Son trabajos de menor extensión, entre los que se incluyen casuísticas, casos clínicos y descripciones de técnicas o dispositivos nuevos, avalados por trabajos experimentales concluyentes. Se debe omitir la división del texto en secciones y todo el manuscrito no podrá exceder las 3000 palabras, con un máximo de quince citas bibliográficas y de tres tablas o figuras. Es necesario un análisis cuidadoso de la presentación de los datos para evitar su reiteración en el texto, en las tablas y en las figuras, a fin de mantener la característica de brevedad de este tipo de artículos. Artículos especiales. Son actualizaciones o consensos de grupos de trabajo acerca de temas de gran interés en el ámbito regional o internacional. Sus autores deben ser especialistas en la materia y el texto debe incluir una revisión bibliográfica amplia y actualizada. Los artículos especiales admiten hasta 10 000 palabras, 8 tablas o figuras y no más de 100 citas bibliográficas. Imágenes microbiológicas. Pueden corresponder a fotos de bacterias, hongos, parásitos o virus, tomadas de exámenes en fresco o con coloraciones, y observadas bajo microscopía óptica, electrónica o de fluorescencia. También se admiten otras imágenes fotográficas, por ejemplo, microorganismos en medios de cultivo, lesiones ilustrativas en pacientes o en animales de experimentación, imágenes radiográficas y ecográficas, de tomografías computarizadas, de resonancia magnética nuclear, etc. Estas imágenes, de gran valor didáctico y no necesariamente excepcionales, deben estar acompañadas de un texto explicativo y de flechas indicadoras, cuando corresponda. El conjunto no debe exceder una página impresa. Los requisitos de calidad para el envío de las imágenes se describen bajo el ítem “Figuras”. 70 Revista Argentina de Microbiología (2006) 38: 49-52

Editoriales. Abordan tópicos científicos de gran actualidad y particular relevancia para la comunidad científica especializada en la Microbiología, o trabajos de opinión sobre política científica. La oportunidad y autoría de los editoriales, así como sus lineamientos generales, quedan exclusivamente a criterio del Comité Editor. Suplementos. Corresponden a revisiones extensas de un tema específico realizadas por una o varias sociedades científicas o universidades, o a los resúmenes de las contribuciones efectuadas en el marco de eventos científicos organizados por la Asociación Argentina de Microbiología o alguna de sus Divisiones o Filiales (comunicaciones orales, paneles, conferencias, mesas redondas, etc.). Los suplementos estarán a cargo de editores invitados; sus propuestas temáticas y lineamientos generales deberán ser aceptados por el Comité Editor. La revisión de los manuscritos correspondientes a los suplementos estará a cargo de revisores elegidos por el Comité Editor (revisiones extensas) y de los editores invitados (resúmenes de eventos). El suplemento deberá ser financiado en su totalidad por la entidad que ha organizado la reunión científica, la que tendrá en cuenta que el suplemento deberá ser accesible a todos los participantes del evento o a todos los socios de la Asociación Argentina de Microbiología (por suscripción y on line). Con respecto a la edición, el suplemento deberá respetar exactamente el formato y el estilo de la Revista Argentina de Microbiología en todos sus aspectos (tapa, tipo de papel, impresión, tablas, figuras, fotos, etc.), tal como se describe en este instructivo. Los suplementos correspondientes a los resúmenes de los eventos deben incluir en este orden: nómina de los miembros del Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología, datos de presentación del evento (título completo, lugar y fecha), índice en español y en inglés, agradecimientos, nómina de las autoridades del evento y mensaje/s del/de los presidente/s. A continuación se presentarán los resúmenes numerados desde el uno con números arábigos. Al final del suplemento debe incluirse el índice alfabético de autores y las “Instrucciones para los autores” de la Revista Argentina de Microbiología, en español y en inglés. El programa esquemático del evento sólo se podrá incluir en forma de tríptico, suelto en el interior del suplemento.

ELABORACIÓN DE LOS MANUSCRITOS Los manuscritos se deben escribir en hoja A4 con márgenes de 3 cm de lado. Se deberá utilizar formato de fuente Times New Roman, estilo regular, tamaño 12 puntos, a doble espacio. Las letras en negrita o itálica se usarán sólo cuando corresponda. A partir del resumen, se deberán numerar consecutivamente las páginas (en el ángulo inferior derecho) y las líneas del manuscrito. Esto se aplicará tanto para el texto como para las tablas, figuras y leyendas, y también para la bibliografía. Las páginas correspondientes a las tablas, figuras y leyendas se incluirán después de la sección de bibliografía. Carátula. En la primera página se debe indicar el título del trabajo (sólo la primera letra en mayúscula, el resto en minúscula); los autores (primer nombre completo, iniciales de los nombres restantes y apellidos completos de todos los autores); lugar de trabajo (nombre de la institución y dirección postal) y título abreviado del trabajo, de hasta 50 caracteres, para cabeza de página. Si el trabajo incluye autores con distintos lugares de trabajo, se colocarán superíndices numéricos (no encerrados entre paréntesis) junto a los nombres, de manera de identificar a cada autor con su respectivo lugar de trabajo. El autor responsable de la correspondencia se indicará con un asterisco en posición de superíndice ubicado junto al nombre; se detallará su dirección de correo electrónico. En aquellos casos en que uno o varios de los autores hayan cambiado de filiación, se debe consignar la filiación donde se realizó el trabajo y al pie de página, su lugar de trabajo actual. Resúmenes. Se incluirán sólo en los artículos originales, informes breves y artículos especiales y podrán tener una extensión máxima de 250 palabras para los artículos originales y de 150 palabras para los informes breves. El primero de ellos estará redactado en el idioma empleado en el trabajo; el segundo, en el otro idioma y estará encabezado por el título completo del trabajo. Cada uno de ellos estará seguido de una lista de tres a seis palabras clave en el idioma correspondiente. Se debe evitar en los resúmenes el uso de abreviaturas y de citas bibliográficas. Dado que el resumen puede ser publicado separadamente por servicios bibliográficos, se deberá asegurar que resulte comprensible aun en ausencia del texto completo. Introducción. Debe suministrar suficiente y adecuada información sobre el tema en cuestión, como para permitir su comprensión al lector no especializado. Asimismo debe incluir la hipótesis o la base científica que guió el diseño experimental y los objetivos del trabajo definidos con claridad. Las referencias citadas en esta sección deberán ser elegidas muy cuidadosamente y ser las más importantes del tema. Materiales y métodos. Debe contener una adecuada descripción de los métodos, aparatos, reactivos y procedimientos utilizados, con el detalle suficiente como para permitir la reproducción de los experimentos. Los procedimientos o técnicas comunes y de utilización de rutina pueden citarse por medio de una referencia (ej., determinación de la CIM según el CLSI, 2010). Los métodos nuevos o desarrollados especialmente para el trabajo deben ser descritos con detalle, como así también la fuente de drogas poco comunes o materiales biológicos (cepas bacterianas, virales, fúngicas, plásmidos, etc.). La marca y la procedencia de los reactivos, de los medios de cultivo y de los equipos deben consignarse en el texto la primera vez que se los cita identificando marca, ciudad/ estado (si correspondiera) y país de origen. Resultados. Debe incluir el diseño experimental y su base científica, así como los resultados obtenidos presentados en forma concisa como texto (preferentemente) o como tabla(s) o figura(s). Evite el uso innecesario de tablas y figuras para mencionar datos que podrían ser presentados en el texto. No duplique la misma información incluyéndola en el texto y en las tablas o figuras. Limite el número de fotografías a las mínimas necesarias para mostrar los resultados experimentales. Numere las tablas y figuras en el orden en el que se citan en el texto. Se deben evitar las repeticiones y destacar sólo los datos importantes. Se debe dejar para la sección Discusión la interpretación más extensa. Discusión. Debe hacer énfasis sobre los aspectos más importantes y novedosos del estudio, e interpretar los datos experimentales obtenidos en relación con los ya publicados. Indique las conclusiones a las que se arribó y evite la reiteración de datos y conceptos ya vertidos en secciones anteriores. Se admite la presentación de Resultados y Discusión como una sección conjunta. Agradecimientos. Esta sección se debe presentar en un solo párrafo, en un tamaño de letra menor al usado en el texto del manuscrito (Times New Roman, tamaño 11 puntos). Se mencionarán en esta sección las fuentes de financiación y los individuos o instituciones que hayan contribuido con reactivos, materiales biológicos o discusión de resultados. Bibliografía. En todos los manuscritos es conveniente que el 70% de las citas bibliográficas corresponda a los últimos 10 años y el 30% restante se distribuya entre los trabajos clave publicados durante los años anteriores. Las citas bibliográficas se deben escribir en hoja aparte y presentarse en orden alfabético de autores, numeradas correlativamente empleando números arábigos. En el texto, las citas deben aparecer con números entre paréntesis, en correspondencia con el número con que aparecen en la bibliografía. Las referencias a comentarios personales y a trabajos inéditos deberán mencionarse en el texto como comunicación personal, escrito entre paréntesis. Para las referencias, se deberán citar la totalidad de los autores y seguir los siguientes modelos: a. Publicaciones periódicas Héritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 3198-202. 71

Los títulos de las revistas serán abreviados según el Index Medicus (el listado puede obtenerse en http://www.ncbi.nlm.nih. gov/sites/entrez?db=journals). b. Capítulos de libros/módulos Martins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam RR. Enterococcus. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA, editors. ��Manual of Clinical Microbiology, 9th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42. c. Presentaciones en congresos u otros eventos científicos Aguilar M, Punschke K, Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora Desulfoar- culus baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Resumen J2, p. 102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. d. Presentaciones en congresos u otros eventos científicos reproducidas dentro de un suplemento publicado por una revista de publicación periódica. Fellner MD, Correa RM, Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV) en pacientes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de Virología, Resumen 10416. Rev Argent Microbiol 2005; 37 Supl 1: 95. e. Institucionales Clinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th Informational Supplement, 2005; M100-S15. Wayne, PA, EE.UU. f. Tesis Brizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas deStaphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría en Microbiología Molecular 2009. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín. g. Referencias on line 1. Para libros on line Sullivan CJ, editor. 1999-2001.�� Fungi: an evolving electronic resource for the microbiological community. ASM Press. ��[O��nline] http://link.asmusa.de/link/service/books/91090. Consultado el 7 de setiembre de�� 2001. 2. Para versiones on line de revistas disponibles en forma impresa. van der Zeiss L, Danziger VB. ��History of clinical microbiology. Clin Microbiol ��1999;�� 100: 123�–��234. [O��nline��] 3. Para revistas únicamente disponibles on line Zellnitz F, Foley PM. October 1998, posting {or revision} date. History of virology. Am Virol J 1998; 1: 30-50. [Online] http://www. avj.html. 4. Para trabajos publicados on line como manuscritos de publicación adelantada Zheng Z, Zou J. 5 September 2001. ��The initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol-3-phosphate/dihydroxy- acetone phosphate dual substrate acyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 10. 1074/jbc.M104749200. h. Los ítems, referencias a trabajos o a resúmenes de congresos no publicados, en proceso de publicación o bajo revisión; comunicaciones personales; patentes en aplicación o en trámite; bases de datos y páginas web deben ser citadas en el texto entre paréntesis como se muestra: … resultados similares (Gómez H, resultados no publicados) … nuevo protocolo de detección empleado (González JL, enviado para su publicación). … concentraciones de droga (López GO, 34th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother; abstr. 114, 1994). … nueva especie de bacteria celulolítica (Márquez W, comunicación personal) … comentados previamente por diversas fuentes (http://fcen.uba.edu.ar) Tablas. Se presentarán en hoja aparte, numeradas consecutivamente con números arábigos, encabezadas con un breve título explicativo (que en lo posible no reitere los títulos de las filas y las columnas), con las leyendas y/o aclaraciones que correspondan al pie. Las llamadas para las aclaraciones al pie se harán empleando números arábigos entre paréntesis y superíndice. Sólo los bordes externos de la primera y la última fila y la separación entre los títulos de las columnas y los datos se marcarán con línea continua. No se marcarán las filas ni los bordes de las columnas. Figuras. Se presentarán en hoja aparte, con el número de figura en el margen superior izquierdo y en el orden que aparecen en el texto. Los dibujos deberán estar en condiciones que aseguren una adecuada reproducción. Los números, letras y signos tendrán dimensiones adecuadas para ser legibles cuando se hagan las reducciones necesarias. Las referencias de los símbolos utilizados en las figuras deberán incluirse dentro de la misma figura y no en el texto de la leyenda. Las fotografías podrán ser realizadas en color o en blanco y negro, en el formato JPEG o TIFF. Las resoluciones mínimas requeridas son 300 dpi para las imágenes y fotografías en color y escala de grises, 600 dpi para las imágenes de arte de combinación (letras e imágenes) y 1200 dpi para las imágenes de arte de línea (gráficos y dibujos). Nota: es muy importante que se use una adecuada resolución de archivo. Todas las imágenes individuales que se importan en un archivo gráfico deben estar en la resolución correcta antes de su carga. Tenga en cuenta, sin embargo, que cuanto mayor sea la resolución más grande será el archivo y más tiempo demandará su envío por medios electrónicos. Las leyendas de las figuras se presentarán reunidas en una hoja aparte, ordenadas consecutivamente con números arábigos. Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos. Las secuencias nuevas comunicadas a través de la publicación en esta revista deberán ser depositadas en una base de datos y sus números de acceso incluidos en el manuscrito, no más tarde de la etapa de revisión. Los números de acceso deberán ser incorporados en un párrafo separado al final de la sección “Materiales y métodos” en el caso de trabajos originales, o luego del texto en el caso de informes breves. La información sobre bases de datos actualmente disponibles es la siguiente: DDBJ: Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan National Institute of Genetics; e-mail: [email protected]; URL, http://www.ddbj.nig.ac.jp EMBL: EMBL Nucleotide Sequence Submissions, European Bioinformatics Institute; e-mail: [email protected]; URL, http:// www.ebi.ac.uk GenBank: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine; e-mail: [email protected]; URL, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov En lo que respecta a la presentación de nuevas secuencias de ácidos nucleicos, aquellas de hasta 50 nucleótidos pueden ser presentadas en cualquier estilo. Las secuencias de longitud importante deben ser presentadas como Figuras para reducir espacio, indicando 80 a 120 nucleótidos por línea, en un tipo de letra que lo haga fácilmente legible en las condiciones de publicación (16 cm, ancho de dos columnas de la RAM). De ser posible, se dividirán las líneas de la secuencia en bloques de 10 o 20 nucleótidos separados por un espacio o por números indicativos encima de la secuencia. Las líneas deberán estar numeradas, indicando el número correspondiente a la izquierda de la primera base de cada línea. Las anotaciones necesarias se marcarán en negrita, subrayadas o entre paréntesis. Si se requiriere presentar la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica, 72 Revista Argentina de Microbiología (2006) 38: 49-52 se indicará mediante el uso de símbolos de una letra aceptados como indicativos de aminoácidos, los que se localizarán debajo del primer nucleótido del codón codificante. Siglas. Las siglas y demás abreviaciones (cuando esto corresponda) deberán ser explicitadas después de su primera mención en el texto. Las unidades de medida se expresarán siguiendo las normas del Système International d´Unités.

ENVÍO DE LOS MANUSCRITOS Los manuscritos podrán ser enviados por correo electrónico ([email protected]) o por correo postal (Deán Funes 472, C1214AAD, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina), incluyendo una versión electrónica en CD-ROM, el que deberá estar identificado con una etiqueta o rótulo que indique el nombre del trabajo y los programas (y versiones) usados para confeccionar el texto, las figuras y las fotografías, así como el nombre de los archivos que contiene. Se recomienda incluir todo el texto del artículo en un solo archivo; en caso de haber imágenes, éstas deben enviarse en archivos separados. Se recomienda además tipear las mayúsculas, los espacios entre palabras, las itálicas y las negritas tal como se desea se muestren luego en el impreso; no dejar espacios antes y después de los subtítulos; justificar el texto y usar la tecla de tabulación y no la barra espaciadora para encolumnar las tablas. Se recomienda a los autores revisar la lista de chequeo que figura a continuación de estas instrucciones y verificar que se ha cumplido con todos los requisitos allí señalados. Antes de enviar un manuscrito, es también recomendable consultar algún ejem- plar reciente de la RAM para verificar si se han seguido las pautas requeridas de formato y estilo y, eventualmente, efectuar las modificaciones necesarias. Se aconseja a los autores eliminar de las propiedades de los archivos que envíen todo tipo de información que identifique su autoría.

PROCESO EDITORIAL Una vez que el manuscrito ha cumplido el proceso editorial y se encuentra listo para su publicación, se enviará por correo electrónico al autor responsable el archivo en formato pdf de la prueba de galera, para que realice las correcciones tipográficas que correspondieran. No podrá cambiar conceptos ni modificar párrafos que alteren el formato de la impresión. Se deberá imprimir el documento, realizar las correcciones sobre el texto y devolverlo por fax o como archivo escaneado por correo electrónico. Las correcciones también pueden ser enviadas por correo electrónico, especificando claramente la página, el párrafo y la línea que se desea corregir. La corrección deberá ser devuelta en un plazo no superior a los siete días corridos de remitida la prueba de galera, caso contrario se considerará como declinada su publicación. En ese momento se le enviará al autor el monto que deberá abonar para que el artículo pueda ser publicado.

La Revista Argentina de Microbiología apoya las políticas para el registro de ensayos clínicos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y del International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), reconociendo la importancia de estas iniciativas para el registro y la divulgación internacional de información sobre estudios clínicos, en acceso abierto. En consecuencia, solamente se aceptarán para publicación los artículos de investigaciones clínicas que hayan recibido un número de identificación en uno de los Registros de Ensayos Clínicos validados por los criterios establecidos por la OMS y el ICMJE, cuyas direcciones están disponibles en el sitio del ICMJE. El número de identificación se deberá registrar al final del resumen.

Costo de la página. Por cada página publicada se cobrarán $ 75 o $ 200 si ésta incluye fotografías en color (Argentina, socios de la AAM), $ 200 o $ 600 (Argentina, no socios de la AAM) y USD 70 o USD 180 (otros países).

Separatas. Se suministrarán 25 separatas sin cargo.

Secretaria: Deán Funes 472, (C1214AAD) Ciudad Autónoma de Buenos Aires - Argentina; Tel.: (54-11) 4932-8858 y (54-11) 4932-8948; e-mail: [email protected]; http://www.aam.org.ar SUSCRIPCIÓN ANUAL (4 números) Socios AAM $ 120 Argentina no socios $ 240 América Latina USD 100 Otros países USD 200

Formas de pago Si es socio y abona sus cuotas por débito, puede suscribirse abonando con débito con solo solicitarlo por mail a [email protected] con copia a [email protected]

Por depósito en Banco Galicia, (cualquier sucursal),cta. cte. Nº 10980/6 007/1, CBU 0070007820000010980619, enviándonos la fotocopia de la boleta de depósito por fax, aclarando nombre, domicilio y concepto del pago, a los TE/FAX: 011 4 932-8858 y 8948 -CUIT: 30-60746436-3 o escaneada por mail a [email protected] Banco Nación, (cualquier sucursal), cta. cte. Nº 000969700035/74 suc. Bulnes, CBU: 0110697420069700035747, CUIT: 30-60746436-3 enviándonos la fotocopia, idem instrucciones para Bco. Galicia. 74 Revista Argentina de Microbiología (2006) 38: 49-52

NEW INSTRUCTIONS TO AUTHORS (VALID AS OF 2011)

Revista Argentina de Microbiología (RAM) is published by the Asociación Argentina de Microbiología on a quarterly basis. The aim of this journal is to publish current scientific works in the different areas of Microbiology. TheAsociación �� Argentina�� de Microbiología�� reserves the right to use, reproduce and publish the accepted material.

GENERAL REQUIREMENTS Manuscripts submitted for publication in RAM should be original research articles. Submitting a manuscript for publication implies that the authors have been authorized by the corresponding institutions to publish relevant data and that neither the manuscript nor one with substantially similar content has been previously published, except in the case of partial presentations at scientific meetings, or is being considered for publication by another journal. If necessary, original data should be submitted to the Editorial Board. It should also be made clear that results come from projects approved by the Biosafety and Bioethics Committees of the participating institutions, and that when those results include patient information they conform to the Habeas Data Act.

SUBMISSION OF ORIGINALS AND COPYRIGHT Manuscripts should be addressed to the Editorial Board of Revista Argentina de Microbiología accompanied by a cover letter according to the following model:

“Dear Editors Revista Argentina de Microbiología, �A��s corresponding author �(��to whom correspondence should be addressed�)��, hereby declare that the coauthors have accepted to be represented by myself before RAM with regard to the submission of the manuscript “…Title…”, and they are jointly responsible with me for the contents of this work. Neither this manuscript (nor any other with similar contents) has been previously published or is being considered for publication by another journal. I also agree to transfer copyright to Revista Argentina de Microbiología once published.”

All the authors of a manuscript should explicitly authorize its publication and will be responsible for the truthfulness of its contents. They should also express their agreement regarding the choice of one of them to become the corresponding author for editorial purposes. Furthermore, they should express their agreement with respect to their position in the list of authors, indicating their academic affiliation.A change of the corresponding author or in the order of the list of authors shall only be considered by a note signed by all the authors to that effect. The authors shall also disclose any existing conflict of interests that might affect the manuscript assess- ment on an attached letter. The Editorial Board shall treat all received manuscripts in strict confidence. Funding sources for research work described in the manuscript, either from public or private institutions, commercial affiliations or consultancies, as well as co-ownership of patents for business purposes by one or more authors shall be indicated under the Acknowledgements Section. Contributions will be assessed by the Editorial Board and submitted to the consideration of two scientific referees appointed for each case. The Editorial Board reserves the right to reject those manuscripts whose contents partially or totally overlap with works already published or whose topics are irrelevant to those of RAM. Furthermore, reasons for rejection are non-compliance of editorial requirements, ethical violations, low scientific quality and poor use of language, either English or Spanish. The Editorial Board reserves the right to make all necessary grammatical and style modifications.

ORGANIZATION AND FORMAT RAM accepts original articles, brief reports, special articles, microbiological images, editorials and supplements. ��Careful reading of the specifications for each special format is recommended in order to choose the most adequate one and therefore, to expedite the evaluation proceedings. Manuscripts shall be written in Spanish or English. The Editorial Board encourages authors to use English as their language of choice so that their work reaches wider international scope and readership. Original Articles. They�� are full research papers which must be submitted in accordance to the following sections: Title (�in�� Span- ish and English) and Short Title, Abstract and Key words (in Spanish and English), Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowledgements and References. Manuscripts shall not exceed 8,000 words including all the sections and shall include a maximum of 6 tables or figures. Brief reports. They are less extensive works. They include case reports, descriptions of new tecniques or equipment based on conclusive experimental work. Manuscripts should not be divided into sections and shall not exceed 3,000 words. References should be limited to fifteen citations and tables and figures to a maximum of three. Careful analysis of data presented should be observed so as to avoid their repetition in the text, tables and figures, in order to maintain the typical concision in style that characterizes this type of articles. Special Articles. ��They are updates or workshop results on topics of regional and international weight. Their authors must be specialists in their field of study. Texts must include updated and comprehensive bibliography. Updates may include up to 10,000 words, 8 tables or figures. ��References should be limited to 100 bibliographic citations. Microbiological Images. They may include high-quality pictures of bacteria, fungi, parasites and viruses, from direct observation or staining under optical, electronic or fluorescent microscopy. They may also include other photographic images of microorganisms in culture media, lesions in humans or laboratory animals, x-ray and ultrasound images, computed tomography scans, nuclear magnetic resonance, etc. These images having great instructional value though not necessarily ground-breaking, should be accompanied by an explanatory text and indicating arrows when necessary. The set of images should fit one printed page at most. Quality requirements for images are described under the “Figures” section below. Editorials. They�� focus on current scientific topics of special relevance to the scientific community specialized in Microbiology, or are opinion works on scientific policies.�� This�� section is the sole domain of the Editoral Board, who will determine editorial policy and authorship, as well as the general guidelines. Supplements. ��They will consist of detailed reviews of a specific subject conducted by one or several scientific organizations or universities, as well as abstracts of contributions presented at scientific meetings or universities organized by theA sociación Argentina 75 de Microbiología or any of its divisions or branches (oral communications, boards, lectures, round tables,etc.), and chaired by guest editors. Topics to be considered in the supplements and general outlines should be approved by the Editorial Board. Revision of manuscripts under the Supplements section will be in charge of reviewers appointed by the Editorial Board in the case of extensive reviewing, and of guest editors in the case of abstracts of meetings. Supplements will be wholly financed by the body organizing the scientific meeting, which will bear in mind that supplements should be distributed among participants to the meetings and all members of the Asociación Argentina de Microbiología either by subscription or on line. As regards style and format, supplements shall strictly conform to the standards of Revista Argentina de Microbiología in all respects (cover, paper quality, printing, tables and figures, illustrations, etc.), as described in the “Instructions to Authors” section. Supplements corresponding to abstracts of meetings shall include the following information in this order: names of members of the Editorial Board of Revista Argentina de Microbiología, data about the event (complete title, venue and date), content list of meetings (in Spanish and English), acknowledgements, names of organizing officers and message delivered by the Chair/s. Abstracts�� consecutively numbered in Arabic�� numerals as from 1 (one) should subsequently follow. A�n�� alphabetical index of authors and the English and Spanish versions of the instructions to authors of Revista Argentina de Microbiología should be printed next. The meeting schedule will only be included in the Supplement as a separate leaflet in the form of a triptych.

PREPARATION OF MANUSCRIPTS Manuscripts should be written in A4 paper format with 3 cm margins on each side, using Times New Roman font, regular, 12, and double-spaced. Bold and italics printing types should be used when necessary. Counting from the abstract section of the manuscript onwards, all pages should be consecutively numbered in the lower right margin, as well as the manuscript lines. This shall also apply to text, tables, figures, legends and references. Pages including tables, figures and legends shall be included after the References section. Front or Title Page. The first page shall include the manuscript title using capitals only for the first letter and lowercase for the rest, the author’s names (complete first name, initials of other names and surname of all authors); place of work (institution name and mailing address), and a short title of the work with a maximum of 50 characters as running head. If authors have different working places, the institutional affiliation of each autor shall be indicated by numerical superinscriptions added to their names( not between parenthesis) to identify each author with his/her affiliation. The name of the corresponding author shall be marked by an asterisk in superscript position next to his/her name. The corresponding author’s e-mail shall also be included. If one or several authors have changed his/her/their affiliation, the current affiliation where work was performed should be indicated and the current place of work in a footer. Abstracts. They�� will only be included in original articles, brief reports and special articles and shall have a maximum of 250 words for original and special articles, and 150 words for brief reports. The first abstract will be written in the language used in the work and the second in the other language. It shall be headed by the complete title of the work. Abstracts shall be followed by a list of three to six key words in the corresponding language. Abbreviations and bibliographic citations should be avoided. A clear understanding of abstracts should be ensured since they may be separately published by bibliographic services. Introduction. ��It should provide sufficient and relevant information on the topic to be analyzed to allow the understanding of non-specialized readers. It should also include the hypothesis or scientific background that guided the experimental layout of the work as well as its clearly defined objectives. References mentioned in this section should be the most relevant ones with respect to the topic and must be carefully chosen. Materials and Methods. This section should include an accurate and detailed description of the methods, equipment, reagents and procedures used, so that the experiments could be replicated. Frequently used or routine procedures and techniques may be mentioned by specific reference( eg., MIC determination by the CLSI methods, 2010). New methods or those especially developed for the study should be described in detail, as well as infrequent drug sources or biological materials (bacterial, viral, fungal strains and plasmids, etc.). Trademarks and origin of reagents, culture means and equipment should be indicated in the text the first time they are mentioned, identifying the commercial brand name, state and country of origin. Results. It should include the experimental layout and its scientific background as well as the results obtained presented in a concise way preferably as text, or as table/s or figure/s). Unnecessary use of tables and figures to mention data should be avoided when they could be included in the text. Do not repeat the same information in the text and in the tables or figures. Limit the number of photographs to the minimum necessary to support experimental results. Number the tables and figures in the order they are mentioned in the text. Avoid repetitions and include only most relevant data. In-depth interpretation will be included in the Discus- sion section. Discussion. Emphasis should be placed on important cutting-edge findings; experimental data should be examined in the light of previously published works. Conclusions should be presented avoiding unnecessary repetition of data and concepts already included in preceding sections. Results and Discussion can be presented as a joint section. Acknowledgements. This�� section shall be typed in smaller printing characters than those used in the manuscript (�Times�� New Roman, 11). Financing sources and names of individuals and/or institutions contributing with reagents, biological material or result discussions should be briefly mentioned. References. It is convenient that 70% whenever possible of bibliographic citations in all manuscripts correspond to the last 10 years and the remaining 30% be distributed in key works from previous years. Names of authors cited shall be listed in alphabetical order and numbered in sequence with Arabic numerals on a separate page. Citations in the text should appear in numbers placed between parenthesis, to coincide with the number they have in the References section. Reference to personal comments and unpublished works should be presented as personal communication, written between parenthesis. References should include the name of all the authors and conform to the following models: a. Periodical publications Héritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii. A�ntimicrob�� A�gents�� Chemother 2005; 49�:�� 319�8-202.�� Names of journal titles shall be abbreviated according to Index Medicus, a list of which can be obtained at http://www.ncbi.nlm. nih.gov/sites/entrez?db=journals. b. Chapters of books/modules Martins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam RR. Enterococcus. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA, editors. ��Manual of Clinical Microbiology, 9�th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42. c. Presentations in scientific meetings or other events Aguilar M, Punschke K, Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora Desulfoar- 76 Revista Argentina de Microbiología (2006) 38: 49-52 culus baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Abstract J2, p. 102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. d. Presentations in congresses or other scientific meetings in a supplement published by a periodic academic journal Fellner MD, Correa RM, Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV) en pacientes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de Virología, Abstract 10416. Rev Argent Microbiol 2005; 37 Supl 1: 95. e. Institutional Publications Clinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th Informational Supplement, 2005; M100-S15. Wayne, PA, USA. f. Theses Brizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas de Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría en Microbiología Molecular 2009. INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín. g. On line Refe��rences 1. For on line Books Sullivan CJ, editor. 1�999��-2001.�� Fungi: an evolving electronic resource for the microbiological community. A�SM�� Press. (�On line) http://link.asmusa.de/link/service/books/91090. �A��ccessed 7 September 2001. 2. For on line versions of printed journals van der Zeiss L, Danziger VB. ��History of clinical microbiology. Clin Microbiol �1��999;�� 100: 123�–��234. (�On line) 3. For journals only available on line Zellnitz F, Foley PM. October 1998, posting {or revision} date. History of virology. Am Virol J 1998; 1: 30-50. (�On line) http://www. avj.html. 4. For manuscripts published on line in advance of their publication Zheng Z, Zou J. 5 September 2001. The�� initial step of the glycerolipid pathway: identification of glycerol-3-phosphate/dihydroxy- acetone phosphate dual substrate acyltransferases in Saccharomyces cerevisiae. J�� Biol Chem. 10. 1074/jbc.M10474�9��200. g. Items, references to works or congress abstracts not yet published, about to be published or under revision, personal communications, existing or pending patents, databases and web pages shall be mentioned in the text between parenthesis as shown: … similar�� results (�G�ó�mez�� H, unpublished results)� … new�� detection protocol used (�González�� JL, Submitted for publication)�.� … drug�� concentrations (�L�ó�pez�� GO, 34th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother, abstr. 114, 1994). … new�� type of cellulolytic species (�Márquez�� W, personal communication)� previously commented by different sources (http://fcen.uba.edu.ar) Tables. They�� should be included on separate pages, consecutively numbered with A�rabic�� numerals, preceded by an explanatory title, with captions and/or the corresponding explanations below. Reference marks for explanations in the form of footnotes shall use superscripted Arabic numbers betweeen parenthesis. Lines shall only be used in the external borders of the first and last row, and to separate the headings of the columns from the data. Rows and column borders shall not be inserted. Figures. They will be included on separate pages with the figure number in the upper left margin and in the order they are mentioned in the text. Drawings should be clear enough to ensure suitable reproduction. Numbers, letters and signs shall have the adequate size to be readable once reduced as needed. References to symbols used in the figures shall be included within the same figure and not in the text legend. Photographs may be in colour or black and white, in JPEG or TIFF formats. Minimum photo resolution requirements are 300 dpi for color and grayscale images and photo prints, 600 dpi for combined art images (letters and images) and 1200 dpi for images composed of lines (graphs and drawings). Note: It is very important to use the adequate file resolution.A ll individual images imported in a graphic file should be in the correct resolution before uploading them. Bear in mind that the higher the resolution, the larger the file and the longer it will take to send it electronically. Captions to the illustrations should be included on a separate page, in consecutive order using Arabic numerals. Aminoacid and nucleic acid sequences. New�� sequences informed by publication in this journal should be deposited in a database and their accession number included in the manuscript, no later than revision stage. ��The mentioned accession numbers should be included in a separate paragraph at the end of the Materials and Methods section in the case of original works or at the end of the text in the case of brief reports. The information about currently available databases is the following: DDBJ: Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan, National Institute of Genetics; e-mail: [email protected]; URL, http://www.ddbj.nig.ac.jp EMBL: EMBL Nucleotide Sequence Submissions, European Bioinformatics Institute; e-mail:�� datasubs@�ebi.ac.uk;�� URL, http:// www.ebi.ac.uk GenBank: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine; e-mail: [email protected]; URL, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov Nucleic acid sequences of up to 50 nucleotides included in the work developed in the manuscript may be presented in any style whatsoever. Significantly long sequences should be presented as Figures so as to reduce space, printing those having 80 to 120 nucleotides per line in a readable font according to publishing guidelines (16 cm, width of two RAM columns). If possible, the sequence should be divided into blocks of 10 to 20 nucleotides separated by a space or by indicative numbers placed above the sequence. Lines should be numbered, indicating the corresponding number to the left of the first pair on each line. Any necessary comments shall be bold-typed, underlined or written between parentheses. If it is necessary to include the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence, it shall be indicated by the use of one-letter symbols accepted as amino acid indicators placed under the first nucleotide of the encoding codon. Abbreviatons. They�� must be made explicit when mentioned for the first in the text. Units of measurements will be expressed according to the standards of Système International d´Unités.

SUBMITTANCE OF MANUSCRIPTS Manuscripts may be submitted by e-mail ([email protected]) or ordinary mail to Deán Funes 472, C1214AAD, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina, including a CD-ROM electronic version, with a label or inscription indicating: title of work, the program and program version used for the text, figures, photographs and the title of all the files it contains. The complete text of the article should be included in only one file. If there are images, they should be sent on separate files. Besides, it is advisable that capital letters, spaces between words, italics and bold letters are typed in the same way they appear in the printed version. There should be no spaces before and after subheadings, the text should be justified and tab-setting should be used instead of the spacing bar for columns in tables. 77

Authors should revise the check list shown after these instructions and see that all the requirements therein have been fulfilled. Before submitting the manuscripts, authors should also examine one of the latest RAM issues in order to verify if all guidelines have been followed as regards format and style and to make all necessary modifications if neccessary. Authors should delete from file properties all kind of information that could identify their authorship.

EDITORIAL PROCESS Once the manuscript has completed the editorial process and is ready for publication, a file in pdf format with the galley proof shall be sent by e-mail to the corresponding editor for making the corresponding typing corrections. He/she should not change concepts nor modify paragraphs which could alter the print format.. The document should be printed after making the corrections on the text and sent by fax or as a scanned file by e-mail. Corrections may also be sent by e-mail, clearly specifying the page, paragraph and line to be corrected and should be returned within seven running days of reception, otherwise it shall be assumed that its publication has been declined. At that moment, the amount to be paid for the publication of the article will be sent to the author. Revista Argentina de Microbiología follows the policies for clinical trial registration of the World Health Organization (WHO) and of the International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE), acknowledging the importance of those initiatives for the international dissemination of information on clinical research in open access format. Therefore, only articles referring to trials previously registered with an identifying number in one of the Clinical Trial Registers that meet WHO and ICMJE requirements will be accepted for publication. Their addresses are available in the ICMJE site. The identifying registration number shall be published at the end of the abstract. Publishing charges. Each�� published page will cost $ 75 or $ 200 (�pesos��) when the page includes color photographs (AA��M� members in Argentina,), $ 200 o $ 600 (pesos) (AAM non-members in Argentina) and U$S 70 o U$S 180 (in other countries).

Reprints. Twenty five off prints will be provided free of charge.

The Secretary: Deán Funes 472, (C1214AAD) Ciudad Autónoma de Buenos Aires - Argentina; Tel.: (54-11) 4932-8858 and (54-11) 4932-8948; e-mail: [email protected]; http://www.aam.org.ar ANNUAL SUBSCRIPTION (4 issues) AAM members $ 120 Argentina non members $ 240 Latin America U$S 100 Other countries U$S 200

Payment: By check or money order, to the order of Asociación Argentina de Microbiología. Price includes mail postage.

Edición realizada por Estudio Sigma S.R.L. - J. E. Uriburu 1252 - 8º F - Buenos Aires - Tel.: 4824-9431 / 4821-2702 E-mail: [email protected] - www.estudiosigma.com.ar Impreso en el mes de marzo de 2011