Comparación De Los Perfiles Cromatográficos De Muestras De

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA

INFORME FINAL

IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES PRODUCIDOS POR EL PINABETE ABIES GUATEMALENSIS Y CUANTIFICACIÓN DE LOS COMPONENTES MAYORITARIOS

PROYECTO FODECYT No. 87-2006

MSc. LUCÍA NITSCH VELÁSQUEZ Investigador Principal

GUATEMALA, DICIEMBRE 2010.

AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-, Universidad del Valle de Guatemala. Los análisis GC-MS fueron realizados en la Universidad Mariano Gálvez.

RESUMEN El pinabete (Abies guatemalensis) se encuentra en peligro de extinción porque el aroma de sus ramas son símbolo del tiempo de Navidad en la región de Guatemala; éstas son cortadas en diciembre, durante el tiempo de generación de la semilla dentro del ciclo fenológico de este tipo de abeto. Buscando contribuir a las estrategias de conservación de esta especie endémica, y como parte de un primer paso para diseñar un producto comercializable que en un futuro pueda generar fuentes de trabajo, en este estudio fueron identificados y cuantificados los compuestos químicos considerados como componentes mayoritarios en el aroma del pinabete. Las muestras de tres diferentes lugares (Panquix, Tejutla y San José Pinula) fueron analizados y comparados. Las emanaciones fueron extraídas con la técnica de microextracción en fase sólida (SPME por sus siglas en inglés); la identificación fue por cromatografía de gases (GC) acoplada a espectrometría de masas (MS); la cuantificación de 3 comoponentes fue con GC acoplado al detector de ionización en llma. La presencia de alfa-pineno, beta-pineno, limoneno, y cariofileno fueron confirmadas; al mismo tiempo el tricicleno –previamente detectado en el aceite esencial- no fue detectado. La composición de las emanaciones de la muestra de Panquix fue: alfa-pineno (9.33E-05 mol/g*cm3 ± 2%), beta-pineno 4.18E-04 mol/g*cm3 ± 3%, (±)-limoneno 4.89E-04 mol/g*cm3 ± 5%). Las composiciones de las muestras provenientes de diferente lugar de origin fueron differentes, a pesar del hecho que todas ellas eran de la misma especie y eran vendidas por el mismo olor característico. Sin embargo, los 4 componentes fueron detectados consistentemente en el aroma de estas ramas de pinabete, y por lo tanto es recomendable que se les incluya en el diseño del producto. Algunos de los compuestos detectados y que serán objeto de futuros estudios son: mirceno, eugenol, sesquiterpenoides, cetonas, ésteres de ácidos grasos, y fenilpropanoides (como benzaldehído, ácido benzóico, y otros). Entre las técnicas y condiciones, recomendadas para futuras investigaciones del aroma de pinabete, se encuentran: SPME en el bosque, GC-MS utilizando el “espacio de cabeza” (headspace), todas ellas aplicadas durante el tiempo de Navidad. Otras recomendacions son estudiar el perfil cromatográfico como función del lugar de origen para encontrar los compuestos que son comunes en estos pinabetes. Esto ayudará a definir cuáles son los compuestos que son los que dan el tradicional aroma a pinabete. Estos datos pueden servir también para un análisis quimiotaxonómico.

Palabras clave: pinabete, Abies guatemalensis, aroma, microextraccion de fase sólida, terpenoides.

SUMMARY Pinabete (Abies guatemalensis) is in danger to dissapear because its branchs aroma are symbol of Christmas time in the Guatemalan region; those are cut in December during the seeding time on the phenology of this fir tree. In order to contribute to conserve this endemic specie, and as part of a first step to design a commercial product that will lead to generate job sources in the future, in this study were identified and cuantified the chemical compounds considered as major components in pinabete’s aroma. Samples from 3 different places (Panquix, Tejutla and San José Pinula) were analyzed and compared. Emanations were extracted with the solid phase microextraction technique (SPME), identification were made by gas chromatography (GC) coupled to mass spectrometry (MS), cuantification of 4 componentes was by GC coupled to flame ionization detector. The presence of alpha-pinene, beta-pinene, limonene, and cariophyllene were confirmed; at the same time tricyclene -previously founded in the essential oil- was non-detected. The composition of Panquix sample emanations was: alpha-pinene (9.33E-05 mol/g*cm3 ± 2%), beta-pinene 4.18E’04 mol/g*cm3 ± 3%, (±)- limonene 4.89E04 mol/g*cm3 ± 5%). The compositions of samples from different origin were different, despite the fact that all of them are the same specie and are offered for the same smell. Nevertheless, those 3 components are consistently present in the pinabete’s aroma, and it is recommended to be included in the product design. However, since them are common to other tree firs there are still other components to identify and quantify to get the particular pinabete’s aroma composition. Some of the compounds detected and that will be in the follow up of this research are: myrcene, eugenol, sesquiterpenoids, ketones, fatty acid esters, and phenylpropanoids (such as benzaldehyde, benzoic acid and others). Between the techniques recommended for future research on pinabete’s aroma are SPME in the forest, headspace GC-MS, all of them applied during Christmas time. Other recommendations are to study the chromatographic profile as function of geographical origin to find the common compounds that will help to define what are compounds that give the traditional pinabete’s aroma. This data can be used for a chemotaxonomy analysis as well.

Keywords: pinabete, Abies guatemalensis, aroma, solid phase microextraction, terpenoids.

CONTENIDO

Página RESUMEN i LISTA DE CUADROS iii LISTA DE FIGURAS iv LISTA DE ABREVIATURAS v PARTE I 1 1.1 INTRODUCCIÓN 1 1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3 1.2.1 Antecedentes en Guatemala 3 1.2.2 Justificación 4 1.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS 6 1.3.1 Objetivos 6 1.3.1.1 Generales 6 1.3.1.2 Específicos 6 1.3.1.3 Hipótesis 6 1.4 METODOLOGÍA 7 1.4.1 Las Variables 7 1.4.2 Indicadores 8 1.4.3 Estrategia Metodológica 8 1.4.3.1 Población y Muestra 8 1.4.4 El Método 8 1.4.5 Técnica Estadística 10 1.4.6 Instrumentos Utilizados 10 PARTE II 11 2 MARCO TEÓRICO 11 PARTE III 26 3 RESULTADOS 26 3.1 Discusión de Resultados 33 PARTE IV 35 4.1 CONCLUSIONES 35 4.2 RECOMENDACIONES 36 4.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS 37 4.4 ANEXOS 42 4.4.1 Descripción Botánica del Pinabete 43 4.4.2 Resultados de Cromatografía de Gases Acoplado a Espectrometría de Masas (Panquix) 44 4.4.3. Resultados de Cromatografía de Gases Acoplado a Espectrometría de Masas (San José Pinula) 46 4.4.4. Resultados de Cromatografía de Gases Acoplado a Detector de Ionización de Llama 50 4.4.5. Cuantificación de alfa-pineno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21ºC 51 4.4.6. Cuantificación de beta-pineno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21ºC 53 4.4.7. Cuantificación de limoneno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21ºC 54

PARTE V 67 5.1 INFORME FINANCIERO 67

iii

LISTA DE CUADROS Página Cuadro No. 1, Reactivos utilizados durante el estudio...... 9 Cuadro No. 2, Especies asociadas a Abies guatemalensis en diversos bosques naturales de Guatemala ...... 17 Cuadro No.3, Breve historia del pinabete en Guatemala...... 19 Cuadro No. 4, Especies del género Abies que son o han sido investigadas en el área de fitoquímica...... 21 Cuadro No. 5, Resumen de los resultados de las investigaciones fitoquímicas sobre el pinabete...... 22 Cuadro No. 6, Resultados del tamizaje fitoquímico por reacciones químicas de extractos de diferentes polaridades de la ramilla del pinabete...... 26 Cuadro No. 7, Componentes de las emanaciones de pinabete analizados por GC-MS ...... 26 Cuadro No. 8, Tabulación de tiempos de retención de aceites esenciales comunes en coníferas ...... 27 Cuadro No. 9, Tabulación de resultados de la GC-FID de las emanaciones de pinabete a 21 C ...... 29 Cuadro No. 10, Composición de las emanaciones de pinabete de diferentes lugares de origen, a 21 C ...... 31 Cuadro No. 11, Resultados tabulados del análisis por GC-MS de emanaciones de pinabete proveniente de Panquix...... 44 Cuadro No. 12, Resultados tabulados del análisis por GC-MS de emanaciones de pinabete proveniente de San José Pinula, análisis realizado en época post-navideña ...... 46 Cuadro No. 13, Análisis estadístico de los tiempos de retención de los aceites esenciales comunes en coníferas...... 50 Cuadro No. 14, Cuantificación de alfa-pineno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21 C...... 51 Cuadro No. 15, Curva de calibración para la cuantíficacion de alfa-pineno...... 51 Cuadro No. 16, Cuantificación de beta-pineno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21 C...... 53 Cuadro No. 17, Curva de calibración para la cuantificación de b-pineno ...... 53 Cuadro No. 18, Cuantificación de limoneno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21 C ...... 53 Cuadro No. 19, Curva de calibración +/- limoneno 99% Merck en diclorometano ...... 54

LISTA DE FIGURAS

Página Figura 1, Diagrama de flujo del proceso para el diseño de un producto comercioal con aroma a pinabete ...... 7 Figura 3, Ilustración de Abies guatemalensis (Macvean, 2003)...... 17 Mapa, Distribución del género (UNEP-World Conservation Monitoring Centre, 1999)...... 20 Figura 5, Perfil cromatográfico de las emanaciones de pinabete a 21 C...... 4 1 Figura 6, Superposición de cromatogramas de las emanaciones de muestras de pinabete provenientes de diferentes lugares de origen: Panquix, Totonicapán y Tejutla...... 44

LISTA DE ABREVIATURAS

CG Cromatografía de gases GC-FID Gas Chromatography with Flame Ionization Detector GC-MS Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry GC Gas Chromatography SPME Solid Phase Micro-Extraction

PARTE I I.1 INTRODUCCIÓN

El pinabete (Abies guatemalensis R.) pertenece a la tradición navideña guatemalteca, por lo que generar información sobre esta especie representa un tipo de homenaje a la cultura chapina. Es más, el pinabete es una especie endémica de Guatemala y de acuerdo a la distribución de Abies, es la especie más austral de este género. Es decir, que otras especies relacionadas habitan en climas más fríos; lo cual implica que el pinabete es una especie que se ha adaptado a un clima más templado y por lo tanto pueden esperarse propiedades peculiares de esta especie. Por ejemplo, el efecto de un clima más cálido probablemente indujo en el pinabete el desarrollo de mecanismos para resistir infecciones a diversidad de hongos e insectos. Otro ejemplo sería la comunicación interespecifica, el particular y apreciado aroma podría ser una consecuencia de evolución adaptativa al clima. Actualmente, el pinabete se encuentra en peligro de extinción, en 1979 ingresó al listado de CITES como especie protegida. Las causas puede dividirse en dos grupos: el primero corresponde a fenómenos que afectan a la biodiversidad guatemalteca en general; mientras que el segundo esta relacionado con características particulares de la especie. La desaparición de su hábitat natural debido al pastoreo en el sotobosque, el cambio del uso de suelo y extracción de madera tanto de pinabete como de pino blanco, ha causado una significativa reducción en las poblaciones de árboles de pinabete adultos silvestres. Un factor que cabe mencionar, pero que aun no se ha estudiado, es el calentamiento global y consecuente cambio en los ecosistemas. En el caso del pinabete, hay más factores que reducen la posibilidad de regeneración de sus bosques, por ejemplo, el bajo porcentaje de germinación de la semilla, así como las dificultades para lograr transplantes del vivero al bosque. Sin embargo, el factor con mayor impacto es el uso de la ramilla de pinabete durante la época navideña. En Guatemala el olor a pinabete es un ícono de la Navidad, las ramillas son vendidas en los mercados locales únicamente durante dicha temporada, siendo su principal atractivo el característico olor. El impacto de esta tradición se origina en el ciclo fonológico del árbol, en diciembre los pinabebetes está en el proceso de generación de semillas. De esta manera, el desramado tiene un doble efecto en la regeneración de poblaciones de pinabete: primero, los árboles silvestres adultos son dañados al punto que algunas veces mueren; segundo, se reduce la producción de semilla.

El Instituto Nacional de Bosques (INAB) ha apoyado estrategias que mitiguen el desaparecimiento del pinabete. El desarrollo de bosques cultivados de pinabete a través de incentivos forestales, ha permitido el mercadeo de ramillas y árboles de pinabete de bosques cultivados, que ha resultado una exitosa alternativa. Sin embargo, un pinabete está listo para el mercado después de ocho años, lo cual representa un lento crecimiento que al mismo tiempo es afectado por la vulnerabilidad de la especie, implicando altos costos y baja producción. Aunado a esto y a pesar de los controles en el desramillado de pinabete de rodales puros, el desramillado de pinabete es todavía un hecho. Representando una desventaja para el comercio de pinabetes cultivados. Otra opción, que INAB ha desarrollado, es la introducción en el mercado navideño de otras especies del género Abies, sin embargo aunque cuentan con apariencia del Abies guatemalensis, no tienen el olor característico a pinabete. Entre otros esfuerzos para proteger la especie se encuentran diversos proyectos de investigación que buscan mejorar la propagación del árbol, ya sea por cultivo de meristemos o por diversos

tratamientos a la semilla que mejoren el porcentaje de germinación, así como estudios preliminares sobre el aroma de pinabete.

El pinabete es un ícono de la Navidad chapina por su apariencia y olor característico. Dado que el factor apariencia esta siendo resuelto con la introducción de otras especies, el olor a pinabete es un área que debe ser explorada a mayor profundidad. Es más, una posible estrategia de protección al pinabete sería la comercialización de un producto que tenga dicho olor característico. Esto contribuiría a reducir el uso de las ramas de pinabete durante la época navideña. Además, se podría combinar con otros abetos en el mercado cuya apariencia es similar al pinabete, compensando el olor con un producto sintético. Idealmente, dicho producto estaría desarrollando la generación de una industria alrededor del aroma del pinabete. Por ejemplo, el cultivo de plantas aromáticas a usarse como materia prima, ofrecería una opción más a las comunidades rurales agrícolas. El procesamiento y producción del aroma a pinabete generaría puestos de trabajo en la industria; mientras que la comercialización beneficiaría a pequeños empresarios interesados en vender dicho producto. Por lo tanto, el aroma a pinabete representa no solo enriquecimiento en el conocimiento de la biodiversidad guatemalteca que por si mismo es un objetivo importante. Sino que además, representa una potencial oportunidad para mejora de la economía nacional.

El primer paso producir aroma de pinabete sintético, es conocer la composición del aroma de pinabete. Este puede ser pensado de dos formas, la primera como una solución que lentamente se va evaporando. La segunda, como una composición gaseosa que es detectada por los receptores del olor en la nariz. Tomando la primera idea como base, se inició el proyecto de análisis del aceite esencial de pinabete en el 2003. Según estos resultados y de proyectos subsiguientes se detectaron alfa-pineno, beta-pineno y limoneno. Sin embargo, el aceite esencial extraído no contenía el mismo olor característico. Así pues, se optó por el segundo punto de vista y se determinó que era necesario analizar las emanaciones del pinabete in vivo. En proyectos posteriores se probaron diversas técnicas de aireación, detectando dichos componentes como mayoritarios, sin embargo no se llegó a la cuantificación de éstos.

En este proyecto se analizaron las emanaciones de la planta in vivo y se cuantificaron los compuestos antes mencionados, así también se encontraron nuevos componentes en el aroma como ésteres de ácidos grasos y cetonas. Entre las perspectivas del proyecto queda al análisis del aroma durante la época de producción de semilla, así como pruebas preliminares de mezclas de los monoterpenoides cuantificados.

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1. Antecedentes en Guatemala

Desde mediados del siglo XX hasta la actualidad, se ha dado una disminución continua de los bosques de Abies guatemalensis Rheder, llevando a la desaparición de los ecosistemas asociados en algunas regiones de Guatemala. Entre los factores que influyen en la desaparición o disminución de los ecosistemas con pinabete, figuran: pastoreo en el sotobosque, desramado, cambio de uso del suelo, extracción de madera, e incendios, principalmente (CONAP-INAB-USAID, 1999). Así pues, dado que el A. guatemalensis es una especie endémica de Guatemala (Steinle, 2001) y por las amenazas anteriormente expuestas, el CITES lo agregó a su lista de especies amenazadas en peligro de extinción en 1979 (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991).

El corte de ramas para árboles de Navidad figura como la segunda amenaza para los bosques de pinabete y supone un doble problema para el árbol en sí. En primer lugar, el árbol desramado se debilita y en ocasiones termina muriendo. Por otro lado, debido a que la actividad se realiza en la época en la que los árboles están produciendo semillas, se reduce la capacidad de regeneración natural de la especie (CONAP-INAB- USAID, 1999). El uso principal de las ramas es ornamental, especialmente para la decoración en iglesias y de gran demanda en época navideña (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991).

La ramilla es valorada tanto por su apariencia como por su aroma. Dado que existen árboles de apariencia similar (por ejemplo A. alba, que es utilizado como árbol de navidad en Europa), el principal problema es que estos árboles no liberan el mismo aroma que A. guatemalensis. Por ello, si saliera al comercio un producto con las mismas propiedades organolépticas que el aroma del pinabete, se estaría dando una alternativa al consumidor para obtener dicho aroma sin que él tuviera que obtener la ramilla de pinabete. Lo cual, implicaría una disminución en el interés comercial de la ramilla de pinabete, que al mismo tiempo forzaría al vendedor a desramar menos árboles. De esta forma se estaría protegiendo a dicho árbol del desramado (que como ya se mencionó, figura como la segunda causa de desaparición de los bosques de pinabete). Además de proteger al pinabete de la deforestación, se estarían generando fuentes de empleo para la producción a nivel industrial del aroma.

Dado el potencial aprovechamiento del aroma sintético a A. guatemalensis (no extraído del árbol) y la necesidad de proteger al pinabete por estar en peligro de extinción, el diseño de un producto con este aroma característico contribuiría tanto a la generación de fuentes de trabajo como a la protección del mismo. Como primera parte de este proceso, es necesario conocer la composición cualitativa y cuantitativa del aroma de pinabete (Ver fig. No. 1: Proceso para el diseño de un producto comercializable con aroma a pinabete).

I.2.2. Justificación del trabajo de investigación

En la fase anterior a esta propuesta, (Análisis del aceite esencial de Abies guatemalensis: Identificación y cuantificación de los componentes químicos de su aroma, Nitsch, 2002), se determinó la presencia de alfa pineno, beta pineno, limoneno y cariofileno. Se especuló sobre la presencia de felandreno. También, se halló que el aroma del aceite esencial, obtenido por destilación con arrastre de vapor, era diferente al del árbol in vivo. Por ello, se hace necesario determinar los compuestos de una forma tal que no se degraden en el proceso de extracción. Por eso en esta investigación se trabajó con el aroma obtenida in vivo, utilizando la técnica de extracción en fase sólida (SPME por sus siglas en inglés).

El proyecto global, lograr la industria del aroma del pinabete, llegaría a durar alrededor de 10 años. El proceso requiere de profesionales de diversas áreas como: química, ingeniería química, ingeniería forestal, agricultores, mercadeo, técnicos para la planta industrial. Además, la inversión requeriría de diversas asociaciones a empresas para lograr la cantidad de fondos requerida (en especial, para el establecimiento de la planta industrial tanto a pequeña como a gran escala). También, se ha de considerar el elaborar mezclas con éstos, para determinar la composición real que dará el aroma a pinabete. En esta fase, se inician estas pruebas, aunque no se completan y será necesario validar las concentraciones utilizadas en una fase posterior.

En esta investigación, se analizaron las emanaciones de la planta obtenidas de la ramilla sin aplicación de calor y se cuantificaron los compuestos químicos ya identificados en la fase anterior. Con lo cual se definen fases posteriores para llegar a la fabricación de un producto comercializable con aroma a A. guatemalensis pero que su materia prima provenga de otras especies.

Fig. No. 1. Diagrama de flujo del proceso para el diseño de un producto comercial con aroma a pinabete.

El aroma del pinabete tiene potencial comercial.

Análisis químico del aceite esencial de pinabete

Se conoce la identidad y concentración de todos los compuestos NO

SI Adquisición de los compuestos

Verificación de las concentraciones encontradas previamente

Determinar la composición de las emanaciones de la planta

NO Se conoce la composición del aroma.

Pruebas de mezclas para obtener la Estudios de mercado Investigar plantas idóneas composición exacta del producto a para materia prima del comercializar aceite esencial, tal que: Contengan los compuestos de interés; sean de fácil siembra y cosecha; endémicas de Guatemala.

Diseño del producto comercializable Pruebas en Planta de Fabricación a pequeña escala. el mercado. extracción, Siembra de Diseño y elaboración de planta piloto. Pruebas en plantas que el mercado. servirán de

materia prima Industria del aroma del pinabete

I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 General

Identificar y cuantificar los componentes del aroma de pinabete A. guatemalensis.

I.3.1.2 Específicos

1. Extraer el aroma de pinabete de ramillas de árboles cultivados. 2. Determinar la cantidad de componentes presentes en el aroma de pinabete. 3. Identificar y cuantificar los componentes mayoritarios del aroma de pinabete. 4. Determinar si los compuestos: alfa-pineno, beta-pineno, limoneno, cariofileno y felandreno están presentes en el aroma. 5. Generar información acerca de la composición del aroma de dicha especie para investigaciones relacionadas con cultivo de meristemos a través de la divulgación de los resultados en publicaciones periódicas.

I.3.1.3 Hipótesis

Las emanaciones de pinabete in vivo contienen otros compuestos volátiles además de los compuestos mayoritarios: alfa-pineno, beta-pineno y limoneno.

I.4 METODOLOGIA

I.4.1. Localización Lugar de colecta: Compra Mercado Navideño al Sr. Dimas López. Calzada Roosevelt. Las muestras procedían de bosques de pinabete cultivados en Panquix, Tejutla y San José Pinula.

Las áreas de Panquix (Totonicapán) y Tejutla (San Marcos) corresponden al bosque muy húmedo montano subtropical. Se estima que la precipitación total anual puede ser de 2,500 mm con una biotemperatura de 11ºC. (De la Cruz).

Lugar de origen de la muestra: Bosque cultivado en la comunidad de Panquix Coordenadas geográficas: Localización de Panquix: altura: 2930 mts SNM, lat. 14º52’56”, long 91º19’48” (Diccionario Geográfico de Guatemala) Altura: 2,400 a 3,300 msn Temperatura mínima: -7ºC en las partes más altas Temperatura promedio: 9ºC Precipitación anual: 1,000 a 1,500 mm. Humedad relativa: hasta el 80%

Localización de Tejutla: lat. 15º07’21”, long. 91º48’19”. (Diccionario Geográfico de Guatemala) Lugar de colecta: Mercado Navideño. Calzada Roosevelt. Lugar de origen de la muestra: Tejutla Altura: a más de 3,300 msnm

En San José Pinula (Guatemala), la región asociada a bosques de pinabete corresponde con la del bosque húmedo montano bajo subtropical. Se estima que la precipitación anual va de 2,065 a 3,900 mm, con un promedio de 2,730 mm. Biotemperaturas de 12.5 a 18.6ºC (De la Cruz). Localización de San José Pinula: 1,752 mts SNM, lat. 14º32’44”, long. 90º24’46” (Diccionario Geográfico de Guatemala).

I.4.2 Las Variables

1.4.2.1. Variables dependientes

Composición de las emanaciones de pinabete adsorbidas a una fibra específica.

1.4.2.2. Variables Independientes

En esta investigación se consideraron las siguientes variables como estudio preliminar para determinar en un futuro la composición real del aroma del pinabete:  Temperatura: se analizaron las emanaciones a 6ºC, 21ºC y 23ºC (temperatura ambiente).  Intervalo de tiempo de emanación, el cual se dejó constante a 24 horas aproximadamente.

 Duración del muestreo por SPME, que está asociado al tiempo requerido para llegar al equilibrio entre la fase gaseosa y la fase líquida. Sin embargo, por la naturaleza de la muestra, este equilibrio no se da de manera idéntica a una muestra no viva, porque el proceso de emanación está regulado fisiológicamente, y no regida únicamente por factores abióticos.  Lugar de origen del material vegetal utilizado: Panquix, Tejutla, Totonicapán.

I.4.3 Indicadores

 Perfiles cromatográficos de las emanaciones de pinabete.  Espectros de masas de los compuestos mayoritarios.

I.4.4 Estrategia Metodológica

I.4.4.1 Población y Muestra

La población de árboles de pinabete silvestre, las muestras fueron tomadas de ramilla de pinabete comercializada en el mercado navideño.

I.4.5. El Método Materiales

 Material Vegetal: Se colectó el material vegetal el 9/12/2007 en el “Mercado Navideño de los Campos del Roosevelt”, en la venta del Sr. Dimas propietario de bosques de pinabete en Panquix, Huehuetenango, Totonicapán, Totonicapán y Tejutla, San Marcos. Se almacenó a temperatura ambiente hasta el día del análisis.

 Terpenoides para curva de calibración  a-pineno: () -a-pineno, Aldrich (99%)  b-pineno: ()-b-pineno, Aldrich (99%)  limoneno: (+/-)- limoneno, Merck (98%)

 Diclorometano, Merck, 99%, grado HPLC.

 Viales ámbar para HPLC (2 mL +/- 0.05 mL)

 Pinzas para sellar y abrir viales

 Micropipetas de 100 microL y 1000 microL

 Cristalería volumétrica y diversos matraces.

 Balanza analítica (+/- 0.000001g)

Cuadro No.1 Reactivos utilizados durante el estudio. punto de índice de densidad No. Nombre Marca Pureza Masa molar ebullición refracción (g/mL) (ºC) (nD20) 1 (±)--pinene Aldrich 98% 136,24 155-156 1,465 0,858 2 (1S)-(-)-b-pinene Aldrich 99% 136,24 165-167 1,4782 0,859 3 ®-(+)-limonene Merck >97% 136,24 xxx 0,84 4 diclorometano Merck xxx

Métodos:

Preparación de la muestra: Se cortaron pedazos de ramilla. Se pesaron. Se anotó si eran solamente hojas o bien, hojas y tronco. El material vegetal fue cortado con tijeras de acero inoxidable en regiones que representaban crecimiento de años previos y no de crecimiento reciente. Se pesó la muestra. Se colocó en viales ámbar (HPLC vials, Hewlett Packard) de 2 mL, sellados herméticamente. Se colocaron en un sitio donde recibieran luz natural, en un espacio a temperatura controlada, dejándoles emanar por 24 horas, permitiendo las sustancias volátiles (desde monoterpenos como el pineno hasta sesquiterpenos como el cariofileno) equilibrarse en el espacio superior del vial (o “headspace”). .

Microextracción en fase sólida (SPME) Se utilizó una fibra de 100 m PDMS (Supelco) sin sistema de sostén para todos los muestreos por SPME. Se expuso la fibra de SPME al espacio superior del vial por 30 minutos bajo condiciones estáticas, a 4º y 21ºC. Para la determinación de estas condiciones, se tomaron como referencia los estudios de Lagalante y Montgomery (2003) y Steffen & Pawliszyn, (1996).

GC-MS Se utilizó un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas Hewlett Packard modelo, en colaboración con el Instituto de Investigaciones Químicas, Biológicas y Biomédicas de la Universidad Mariano Gálvez. Se analizaron adsorbidas a la fibra de SPME, con desorción por 5 min. Se analizaron muestras de pinabete por Headspace, sin embargo se deberá optimizar el método para obtener resultados adecuados.

GC-FID: Perfil cromatográfico de las emanaciones de pinabete Las muestras fueron analizadas en un Cromatógrafo de gases acoplado al detector de ionización en llama. El programa utilizado fue el diseñado por el Programa de Análisis Químico, de la Universidad del Valle de Guatemala para el análisis de aceites esenciales o fragancias, con modificación en la inyección de muestra. Después de adsorbidos los volátiles en la fibra, se colocó ésta por 5 min en el puerto de inyección A para resorberlos a 250ºC en el inyector. Las condiciones del método son: Nitrógeno a (40ps), columna SPB-5 30m*0.53mm diámetro, 0.5 micrómetros de film, nitrógeno splitless, acarreador inicial en la columna: 2psi, inyector 250ºC, Detector FID 300ºC, Horno a 70ºC por 3 min, 10ºC/min hasta 255ºC por 5 min.

Comparación de tiempos de retención de estándares vs la muestra Se colocaron 5 mL de estándar en el mismo tipo de vial usado para SPME. Se dejaron vaporizar a 21ºC durante 24 hrs. Se procedió al muestreo por SPME y se inyectó al GC/FID según procedimientos indicados previamente. Se obtuvieron los tiempos de retención de los estándares y se compararon con las muestras.

Curva de calibración Se prepararon soluciones de de al menos cinco diferentes concentraciones, usando diclorometano como solvente según David et al (1995). Se inyectaron alrededor de 0.5 L y se determinó el área correspondiente en cuentas*s. Los estándares utilizados fueron los terpenoides: -pineno, -pineno, D-limoneno. Se graficó el área de pico en cuentas*s en función de la cantidad de analito (L) inyectado. Se consideró un rango lineal aquél cuyo coeficiente de correlación múltiple fuera de 0.99. Se obtuvieron las ecuaciones de cada uno, utilizando la fórmula con intercepto (y=mx+b, donde y= área (cuentas*s), y x = L de terpenoide.

Procesamiento de resultados Se interpolaron las cantidades de -pineno, -pineno, D-limoneno. Se obtuvo la cantidad de moles y la fracción molar de cada uno en la fase gaseosa. Aplicando la ley de se calculó la fracción molar en la fase líquida en el equilibrio.

I.4.6. Técnica Estadística Para el análisis de estadística descriptiva y regresión lineal se utilizó el análisis toolpack de Excell 2004.

I.4.7. Instrumentos utilizados Cromatógrafo de gases con detector de ionización en llama Cromatógrafo de gases acoplado a espectrometría de masas Jeringa para la microextracción en fase sólida Balanza analítica

PARTE II MARCO TEÓRICO

Información de la planta

Nombre científico Abies guatemalensis Rehder

Sinónimos Según Farjon (1998), son:  Abies tacanensis Lundell 1940  Abies guatemalensis Rehder var. tacanensis (Lundell) Martínez 1963.  Abies guatemalensis Rehder var. longibracteata Debreczy et Rácz 1995.  Abies guatemalensis Rehder var. tamaulipensis Silba 1997.

Nombres comunes Pinabete Pashaque (Standley y Steyermark, 1958) Abeto Guatemalan fir Guayami Hallarin Plumajatzinç Plumajillo de montaña, Oyamel (Vales et al, 2000) Romerillo (UNEP-World Conservation Monitoring Centre, 1999), Guayamé.

Clasificación según Wiersema (2004): Reino: Plantae Subreino: Plantas vasculares División: Gimnosperma Clase: Pinópsida Orden: Pinales Familia: Pinaceae Subfamilia: Abietoideae Género: Abies Especie: Abies guatemalensis

En la Fig. No. 1, se presenta una ilustración de las ramas, conos y semilla de la especie.

Fig. No. 1 Ilustración de Abies guatemalensis (Macvean, 2003). Se observa la ramilla, la disposición de hojas, semillas y yemas en ésta. Además el cono y la semilla alada. También la plántula que se forma durante el proceso de germinación.

Descripción de la especie:

El pinabete es un árbol siempre verde, llega a medir hasta 25 m de alto, con el tronco hasta 1 m de diámetro, con crecimiento simétrico (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991). Llega a su madurez entre los 30 y 40 años de edad (MAGA- ICTA-UNEPROCH, 2000). La copa tiene forma piramidal o cónico-oblonga (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991). Cabe mencionar que usualmente la ramilla es obtenida en rodales puros, y particularmente proviene de árboles maduros. Muchas veces los árboles son desramillados al punto que mueren, por lo que la regeneración de dichos especímenes requeriría 30 a 40 años. Las hojas son lineares, en la parte superior son verde oscuro brillante; en la parte inferior, plateadas. Las hojas poseen canales resiníferos (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991), presentando dos canales resiníferos subepidérmicos (Ponciano et al, 1988). Los conos cilíndricos subsésiles, de 8.5 a 11.5 cm de largo, anchamente truncados en forma cilíndrica, con un diámetro que fluctúa entre 4.5 y 5 cm (López, 1997). Son resinosos, de color café claro y con escamas planas transversales. Las semillas aladas son de color café pálido y tienen forma de cuñas ovoidales (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991). La madera es de hilo recto, fácil de hendir, flexible, medianamente dura, fuerte, de limitada resistencia a la intemperie (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991), no es resinosa, ni presenta olor. Tiene la zona la zona de la albura blanca; la medular, color rojizo y con olor fuerte (López, 1997). Los anillos de crecimiento son poco diferenciados a simple vista, con anchura bastante heterogénea. La madera de primavera es más ancha que la de verano. Su peso específico es de 0,35 g/cm3, por lo que puede decirse que es muy ligera (Vales et al, 2000) Su madera es utilizada por sus cualidades para la industria del papel (Ponciano et al, 1988). La corteza varía en color y textura según la edad del árbol. En los jóvenes es gris blanquecina y lisa; en los adultos, moreno grisácea, surcada y partida en placas no muy profundas (López, 1997)). Las especies del género Abies, producen óleoresina por incisión, la cual se usa por sus propiedades balsámicas (Ponciano et al, 1988). Las semillas son cuneabovadas de 8 a 10mm de largo, color castaño claro y alas ovaladas que llegan a alcanzar 15 mm de diámetro (López, 1997). La época de colecta de las semillas es de enero a diciembre (MAGA-ICTA-UNEPROCH, 2000). En diversos estudios realizados sobre las características fisiológicas y anatómico- morfológicas de la semilla del pinabete se ha encontrado que:

 La viabilidad es de 2% en el campo y 10% en el vivero (sin aplicar tratamiento alguno a la semilla) (Macz et al, 2000a).

 No todas las semillas de pinabete contienen un embrión viable. Pero, entre las que sí lo contienen, no presentan embriones deformes o carentes de cotiledones (Macz et al, 2000a).

 Las semillas presentan cinco sacos resiníferos, que están turgentes y llenos de resina bajo condiciones normales. Durante el proceso de germinación, los

sacos pierden turgencia y disminuyen en tamaño y volumen. Sin embargo, no se observó que tuvieran algún efecto sobre la germinación (Macz et al, 2000a).

 La cubierta seminal tiene alta cantidad de compuestos fenólicos (determinados por la actividad catecol oxidasa) (Valdéz, 1999).

Distribución y Hábitat El género cuenta con unas 39 especies –también se reportan 55 especies en Ponciano et al (1988)- de zonas templadas del hemisferio Norte, en América del Norte, Central y Europa, ver figura 2 (UNEP-World Conservation Monitoring Centre, 1999). La localización de los dos biomas de coníferas diferentes en América, los cuales están separados por alrededor de 20° latitudinales (Earle ed., 2004). El bioma más ecuatorial se extiende del sur de México (Estado de Chiapas), al norte de Nicaragua. En dicha región, el género tiene un número máximo de especies entre la zona de Guatemala (altiplano occidental) y México, y se reduce hacia el sur en Honduras (Ponciano et al, 1988). Se ha reportado que Abies religiosa corresponde al lado norte de México; mientras que Abies guatemalensis se encuentra en el sur de México, Guatemala y algunos bosques aislados en Honduras (Ponciano et al, 1988).

Mapa No. 1

A) Distribución del género (UNEP-World Conservation Monitoring Centre, 1999). Puede observarse que crece en la parte Norte del globo terrestre. A excepción de México y América Central (Sur de México, Guatemala y Norte de Honduras y el Salvador) y otras regiones de Asia.

Fuente: Nitsch (2005)

b) Distribución de Abies guatemalensis (Vales et al, 2000). De esta especie se encuentran bosques naturales en el Sur de México, Guatemala y el Norte de Honduras y El Salvador.

Fuente: Nitsch (2005)

El A. guatemalensis se encuentra desde el Sur de México hasta Honduras y El Salvador. En Guatemala, se le encuentra en los bosques del altiplano occidental, en la siguiente distribución:  Las partes altas de Totonicapán: Rancho de Teja, Pachoc, Volcán Zunil (Ponciano et al, 1988), San Francisco El Alto, Santa maría Chiquimula, Santa Lucía la Reforma, Chinente (Macz et al, 2000a);

 Huehuetenango: Todos Santos Cuchumatán, Chiantla, San Mateo Ixtatán (López, 1997), Puerta del Cielo, Cumbres del Aire, camino a San Juan Ixcoy, Chex, Certix, Las Majadas, Cerro Canana, Chee, Tuculta, Tzuján, Anlaj, partes altas cerca de San Juan Atitán, Cerro Grande y arriba de 2,500 msnm (Ponciano et al, 1988), Santa Cruz Barillas, San Rafael Petzal, San Pedro Soloma, Santa Eulalia, Aguacatán (Macz et al, 2000a);

 El Quiché: Sierra de los Cuchumatanes, Nebaj, Xesibanchitz, Asichimansana, Calauté, Macalajau Zunil (Ponciano et al, 1988);

 Quetzaltenango: San Francisco la Unión, San Carlos Sija, San Andrés Xecul, San Miguel Siguilá, San Martín Sacatepéquez (Ponciano et al, 1988), Palestina delos Altos, San Juan Ostuncalco, Sibilia, Cabricán, Cantel (Macz et al, 2000a);

 San Marcos: Tejutla (López, 1997), Ixchigüán, San Andrés, Volcán Tajumulco, San Sebastián, San Lorenzo, Sierra Madre (Ponciano et al, 1988), Comitancillo, Astillero Municipal de San Marcos y de San Pedro Sacatepéquez (Macz et al, 2000a);

 Jalapa: Cerro Miramundo, Mataquescuintla (Macz et al, 2000);

 Chimaltenango: Del camino viejo de Tecpán a Los Encuentros (Ponciano et al, 1988);

 Chiquimula: Volcán de Ipala (López, 1997);

 Zacapa: Sierra de las Minas (López, 1997).

El A. guatemalensis, se caracteriza por su endemismo (INAB, 1997). Ésta es la especie más austral del género, aunque se encuentran otros géneros de la familia más al sur; se le halla entre las latitudes 14º y 15º Norte (MAGA-ICTA-UNEPROCH, 2000), y en altitudes que van de los 2700 a 3600 msn (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991). Estas áreas corresponden a las montañas de Guatemala y México, y las partes altas de Honduras y el Salvador. Por lo que puede decirse que crece en poblaciones aisladas (MAGA-ICTA-UNEPROCH, 2000).

Condiciones de crecimiento (adaptado de Nitsch (2005)): o Precipitación pluvial anual: 1500-3000 mm, con época notoria de lluvia de abril a octubre y el resto del año lluvias aisladas (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991).

o Temperatura media: 9-10°C. aunque puede soportar temperaturas bajo cero. En algunos casos, se encuentra en áreas donde la temperatura llega hasta los 17ºC (Mataquescuintla, por ejemplo), pero éstas no son los ecosistemas característicos de la especie (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991).

o Suelo: suelos de altura desarrollados sobre ceniza volcánica, texturas diversas: franco turboso, franco arcilloso o franco arenoso, con suficiente materia orgánica (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991).

o Zonas biogeográficas: se distribuye en tres de las ocho zonas de vida donde crecen las coníferas en Guatemala, las cuales según INAB (1997) son: o Bosque muy húmedo montano subtropical o Bosque muy húmedo bajo subtropical o Bosque montano bajo subtropical.

Se ha encontrado que, generalmente, su dirección de exposición foliar es hacia el noroeste, raramente se observa otra exposición. Lo que podría indicar que es una especie con bajos requerimientos de horas luz (López, 1997).

Asociaciones en el bosque: En general se halla asociado con Pinus ayacahuite (pino blanco), Pinus rudis y Cupresus sp o ciprés. En el cuadro No.1, se presentan otras especies agrupadas según la localización de bosques de pinabete (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991).

Cuadro No. 2 Especies asociadas a Abies guatemalensis en diversos bosques naturales de Guatemala. Localización No. del bosque de Especies asociadas pinabete 1 Cuchumatantes Pinus hartweegii Lindl María Tecún; Pinus ayacahuite 2 San Marcos; Eherenberg Quetzaltenango Áreas tal que las Cupressus lusitánica temperaturas Miller, Pinus 3 suben de 12 a pseudostrobus Lindl, 17 °C Pinus rudis Endl Fuente: Nitsch (2005)

Propagación Se reproduce por semilla. La colecta se realiza entre lo meses de octubre a enero (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991); se ha observado que la producción de mejor calidad de semillas cada tres años (Macz et al, 2000a). El INAB, como parte de la estrategia de protección al pinabete, ha financiado diversos proyectos de caracterización ecológica (González (1979), USAC-DIGI (1998), López (1997)) y estudios que buscan facilitar la propagación de la especie, como el cultivo de meristemos (Saquimux et al, 1998 y Macz et al, 2000), tratamientos pre-germinativos con ácido giberélico y diversas temperaturas (García (1989), Valdéz (1999)), y, en general, el crecimiento de Abies (Guzmán, (1986) y Peñalonzo y Zanotti (1989).

Plantación Actualmente el INAB, a través del programa de Incentivos Forestales, está apoyando a las plantaciones de pinabete con fines comerciales. Las principales son: Palestina de los Altos, Quetzaltenango; Tecpán, Chimaltenango. Según estadísticas (Vales et al, 2000) hay datos de exportación de semillas desde Guatemala a EE.UU.

Respecto al manejo de los bosques y ecosistemas cabe decir que la tasa promedio de crecimiento varia entre 0.36 y 0.46m/año y viven entre 49 y 71 años. El incremento anual en diámetro varía entre 0.59 y 0.69cm (crecimiento lento) (UNEP- World Conservation Monitoring Centre, 1999).

Producción El pinabete plantado puede venderse para navidad a los 7 u 8 años de sembrado (Asociación Becaria Guatemalteca, 1991).

Plagas y enfermedades Los hongos que atacan al pinabete, causando la muerte cuando éste es joven: Fusarioum sp, Verticillium sp, Rhizoctonia sp (Saquimux et al, 1999). También, se ha encontrado que insectos de la familia Torymidae atacan la semilla del pinabete (Macz et al, 2000).

Usos principales La Asociación Becaria Guatemalteca indica los siguientes usos: Fabricación de telares Forros interiores Techos para construcciones rurales Leña Carbón La pulpa es apreciada por la industria papelera Las ramas, para tapeexcos (refugios temporales) Etnobotánico: oleorresina, obtenida por incisión, con propiedades balsámicas, se usa para: Fabricación de medicinas Pinturas. Ornamental: decoración en iglesias arbolito de navidad

Causas del peligro en extinción Actualmente, el A. guatemalensis es una especie considerada en peligro de extinción, figura en el listado del CITES desde 1979 (ver cuadro No. 2), debido a la reducción de los rodales de pinabete (INAB, 1997). En Honduras fue común hasta 1940 y es probable que aún existan poblaciones aisladas. En México es difícil de definir su estado, debido a una confusión con otras especies del mismo género, muchas de las cuales son morfológicamente muy similares y presentan distribuciones muy restringidas (UNEP-World Conservation Monitoring Centre, 1999).

Se han realizado estudios donde se determinó que la mayoría de áreas donde crece A. guatemalensis, son zonas que presentan alteración ecológica – en algunas, el pinabete está siendo desplazado por otras especies forestales o arbustivas (López, 1997). Entre las causas de este deterioro que se Nitsch (2005) incluye como de mayor impacto se encuentran:  Incendios forestales, que causan la muerte en pie de los árboles, y son frecuentes en la zona.

 Fuertes vientos, que provocan quebraduras de ramas y fustes.

 Pastoreo a gran escala de ganado bovino que impide la regeneración natural de la especie.

 Dificultad para reproducción por medio de la semilla (bajo porcentaje de germinación entre otros) (INAB, 1997).

 Deforestación y avance de la frontera agrícola.

 Sobrepastoreo.

 Plagas y enfermedades (López, 1997)

 Aprovechamiento de la especie a una tasa superior a la de su regeneración natural (Saquimux et al, 1999).

 Tala de árboles para consumo local (leña) y comercial (madera de aserrío y arbolitos de navidad).

 Corte de ramilla en época navideña, las ramillas y los árboles son utilizados para comercializarse en centros urbanos, principalmente en la ciudad capital en la época navideña. En esta temporada es cuando aun se están produciendo los conos (Macz et al, 2000) y se inicia la liberación de semillas. Por lo cual, las posibilidades de regeneración natural son casi nulas (López, 1997), y las de almacenamiento y establecimiento de nuevas plantaciones se ven reducidas (Macz et al, 2000). Actualmente, este corte y comercialización es considerado ilegal. Sin embargo, éstas se deben a razones culturales y socioeconómicas: su demanda se incrementa como árbol ornamental por sus características morfológicas y de aroma (Saquimux et al, 1999).

Cuadro No. 3 Breve historia del pinabete en Guatemala. Ubicación temporal Estado de los bosques del pinabete Época Maya Deforestación parcial por el cultivo migratorio de los Mayas. Colonia Aumenta la deforestación, por la necesidad de madera para construcción. XIX Aún hay abundancia en los altiplanos del occidente de Guatemala. 1941 El pinabete entra al listado de especies arbóreas en protección. 1950 Fuerte explotación de los rodales. 1979 El CITES lo agregó a su lista internacional de especies amenazadas en peligro de extinción Fuente: Nitsch (2005)

Investigación fitoquímica del género y la especie Actualmente, se están investigando varias especies del género Abies (ver Anexo 8). Se han encontrado diversos principios activos además de los aceites esenciales (que en algunos casos es comercializado como el del Abies alba). Además, los taninos y triterpenos son compuestos comunes del género. En el estudio realizado por Nitsch (2005), se identificaron a las familias de metabolitos secundarios estaban presentes en los extractos hexánico, etérico, etanólico y acuoso de cinco partes del árbol (semilla, ramilla, corteza, madera y raíz); además de determinar si éstos eran bioactivos. Para lo cual se hicieron baterías de pruebas químicas según el extracto y luego se analizaron por cromatografía de capa fina (CCF). Se encontró que la composición general es predominantemente de terpenoides y esteroles; también contiene flavonoides, carotenoides, y glicósidos de los tres; saponinas, taninos catéquicos, osas y/o poliosas. Se observó que los extractos de raíz y corteza presentan patrones de CCF. En el extracto etérico se detectó un terpenoide mayoritario. Se cree que la madera puede contener alta concentración de saponinas. Los extractos etanólicos presentan una parte apolar (terpenoides y esteroles) y una polar según el análisis por CCF y cromatografía en columna. Se determinó lo mismo para los acuosos, por CCF. Se encontró que la bioactividad de todos los extractos está en el intervalo de 400 ppm a menos de 100 ppm (Nitsch, 2005). Los resultados obtenidos indicaron que la especie tiene interés para fines de la humanidad (uso terapéutico, insecticida, etc) y que debe continuarse con la investigación de los metabolitos secundarios encontrados. Los patrones de CCF de los extractos hexánicos o etéricos que presenta el árbol pueden ser utilizados en quimiotaxonomía del árbol (en especial para las diferentes regiones de Guatemala en las que crece esta especie) (Nitsch, 2005).

Las investigaciones sobre A. guatemalensis, en su mayoría, analizan procesos que mejoren el porcentaje de germinación, ecología y genética de poblaciones. Las que se refieren a su fitoquímica que hayan sido realizadas en Guatemala, son:  Análisis del aceite esencial de semilla y ramilla de pinabete (Nitsch, 2002).  Extracción del aceite esencial de pinabete (Abies guatemalensis Rheder) por medio de arrastre de vapor, para la extracción y caracterización del aceite esencial a nivel de planta piloto y su escalonamiento a nivel industrial, para la elaboración de un producto de limpieza y su esencia (Castañeda, 2005).  Análisis fitoquímico de los extractos de pinabete (Nitsch, 2005). Ver cuadros Nos. 3, 4 y 5 donde se resumen propiedades del genero Abies. Se ha encontrado que la ramilla de pinabete es rica en diversas familias de productos naturales y tiene una alta bioactividad (ver cuadro 5).

Cuadro No. 4. Especies del género Abies que son o han sido investigadas en el área de fitoquímica.

Información fitoquímica No. Especie sobre la especie Triterpenoide con capacidad de gelificarse 1 Abies alba Miller (desmetilabietoespirano) de la corteza (O’neill et al, 2005). El extracto etanólico de Abies cilicia Ant y resinas de las raíces y madera tiene 2 Kotschy Carr. una alta actividad antimicrobiana (Kizil , 2002). Un triterpenoide tipo lanostano, de la corteza de la raíz, 3 Abies coreana presenta actividad antitumoral (Kim et al, 2004). Las hojas contienen fenoles derivados de la catequina, incluyendo el Abies 4 epigalocatequingalato, los cuales nephrolenpsis presentan un potencial efecto quimioprotectivo contra la carcinogénesis (Lee et al, 2004). Planta utilizada en el Ayurveda. Los extractos de diferente polaridad mostraron

actividades: antiinflamatoria,

analgésica, potenciación de la 5 Abies pindrow hipnosis por barbitúricos y

antiulcerogénica. Contiene

glicósidos, esteroides, terpenoides y flavonoides. No tienen efecto antibacteriano (Singh et al, 1998). El extracto acuoso de semillas es coadyuvante del efecto 6 Abies sibirica radioprotectivo del quitosano (en Radiats Biol Radioecol, 2004). Usado en medicina tradicional hindú. Se ha encontrado que el extracto metanólico de las hojas tiene: actividad antitusiva Abies webbiana contra el reflejo de tos inducida por 7 Lindl dióxido de azufre en ratones, por dosis oral. Efecto sedativo, además, presenta sinergia en el tiempo de sueño provocado por sedantes patrón (Nayak et al, 2004).

Fuente: Nitsch (2005)

Continuación Cuadro No. 4. Especies del género Abies que son o han sido investigadas en el área de fitoquímica.

Información fitoquímica No. Especie sobre la especie Se determinó que contienen cuatro antocianidinas: 3- Conos de la familia glucósido cianidina, 3-glucósido 8 Pinaceae (Abies, Picea, delfinidina, 3-glucósido peonidina, Pinus, Pseudotsuga, Tsuga) 3-glucósido petunidina (Griesbach y Santamour, 2003). La semilla contiene taninos condensados (Behrens et al, 2003). El duramen contiene al lignano 9 Picea abies hidroximatairesinol, el cual tiene efectos quimiopreventivos de carcinogenesis en ratas (Katsuda et al, 2004).

Fuente: Nitsch (2005)

Cuadro No. 5 Resumen de los resultados de las investigaciones fitoquímicas sobre el pinabete. Se presenta la composición del aceite esencial de ramilla y semilla obtenida por destilación por arrastre con vapor. Según Castañeda (2005) el aceite esencial de ramilla tiene una densidad de 0.768 g/mL y nD=1.38.

Parte del árbol Ramilla1 Ramilla2 Semilla2 analizada Componente % (v/v) % (v/v) % (v/v) Alfa-pineno 5 3 7 3.65 9.38 1 Beta-pinento - 1 8 - .34 .5 Limoneno 2 3 1 8.86 4.42 6 Mirceno 5 - - .10 - - Canfeno 1 5 0 .07 .67 .46 Tricicleno - 0 0 - .60 .21 No identificado 1 - 1.32 - Rendimiento 0.8 % 0.6 % 6 % (v/p) (v/p) (v/p)

1: Según Castañeda (2005). La destilación fue a nivel industrial por 1 hr 30 min. 22

2: Según Nitsch (2002). La destilación fue a nivel de laboratorio por 3 hrs. Entre las observaciones de este experimento figuraba que hubo un compuesto que era muy volátil y se perdió durante el proceso.

Cuadro No. 6. Resultados del tamizaje fitoquímico por reacciones químicas de extractos de diferentes polaridades de la ramilla del pinabete. Solvente de extracción Categoría Hexano Éter Etanol Agua Betún verde oscuro. Betún verde oscuro. Sólido café, Apariencia Bioactividad Bioactividad Líquido café inmediata inmediata esponjoso Concentración final (g/mL +/- ) 0.02468 0.014 0.01775 0.01

Bioactividad (DE50 para Artemia salina, ppm) <100 <100 <1000 <1000 Metabolito secundario Solvente de extracción Tratamiento detectado Hexano Éter Etanol Agua Alcaloides - - Agliconas de flavonoides +1 +1 Extracto Emodoles - - apolar no Cumarinas - - hidrolizado +, esteroles y +, terpenoides Esteroles y triterpenos terpenoides + Carotenoides ++ sln verde. Se formó gota grasosa, apariencia naranha. Se filtro. sln verde CCF (Cuadro No.) Extracto +++, apolar Esteroles y triterpenos + terpenos hidrolizado Carotenoides +++ + +, color Ácidos grasos + verde Glucósidos de antraceno - - Cumarinas - - Extracto Glicósidos +, terpenoides el +, terpenoides polar esteroidales/terpenoides menos abundante hidrolizado Glicósidos de flavonoides +, flavonas +, flavonoides 5 +, cambios de color Glicósidos de antocianidinas. - de rojo a verde 4. Poliurònidos ? Compuestos reductores + + Osas y poliosas Extracto +, triterpénicas polar no Saponinas probablemente hidrolizado Taninos +, catéquicos +, catéquicos Glicósidos cardiotónicos - Alcaloides - - Fuente: Nitsch (2005)

Extracción en fase sólida (SPME) El método de Microextracción en fase sólida (SPME por sus siglas en inglés) usa una fina barra de sílica cubierta con una fina capa de un sólido o líquido para extraer compuestos orgánicos directamente de muestras acuosas para análisis instrumental por GC o GC/MS (Zhang & Pawliszyn, 1993).

El tiempo de eficiencia, portabilidad, precisión, y límite de detección así como el bajo costo de la técnica SPME ha sido mejorara significativamente en comparación a la extracción en fase sólida tradicional (Zhang & Pawliszyn, 1993).

Si bien el muestreo por SPME puede hacerse en matrices líquidas, también puede hacerse del espacio libre arriba de la muestra. Este muestreo reduce el tiempo de obtención de analito porque la difusión de los analitos en la fase gaseosa es De cuatro órdenes de magnitud mayor que en la fase acuosa. Se puede alcanzar el equilibrio rápidamente entre las fases acuosas y de vapor a través de la agitación constate de la muestra gaseosa para generar una superficie “fresca” continuamente. Al muestrear de esta manera, la técnica de SPME puede ser extendida a muestras más complejas que contengan sólidos o materiales de alta masa molecular como tierra y lodos (Zhang & Pawliszyn, 1993).

Esta técnica, acoplada con GC, ha sido usada para analizar compuestos orgánicos volátiles en áreas como alimentos, bebidas, bioquímica clínica, biología vegetal y monitoreos ambientales. Entre las ventajas que presenta la SPME se encentran la reducción de los tiempos de muestreo, reducción de costos en equipo, presenta selectividad para los compuestos presentes en la fase gaseosa. Además, puede extenderse a compuestos menos volátiles por el efecto de concentración en el recubrimiento de la fibra (Zhang & Pawliszyn, 1993).

El principio de la SPME es el proceso de equilibrio de partición del analito entre el recubrimiento de la fibra y la solución acuosa. Para un recubrimiento líquido, la cantidad absorbida por éste puede ser calculada a partir de la ecuación n = CoV1V2K/(KV1+V2) (Ecuación No.1) Donde: n = masa absorbida por el recubrimiento V1 = Volumen del recubrimiento V2 = Volumen de la solución acuosa K = es el coeficiente de partición del analito entre el recubrimiento y el agua Co = es la concentración inicial del analito en la solución acuosa. (Zhang & Pawliszyn, 1993)

Según Zhang & Pawliszyn (1993), el sistema SPME puede considerarse como un sistema de tres fases: el recubrimiento polimérico de la fibra, el espacio libre y la solución acuosa involucrada. La cantidad de analitos absorbidos por el recubrimiento polimérico está relacionado con el equilibrio total de los analitos en las tres fases del sistema. La técnica de SPME del espacio libre sobre la solución está basada en el equilibrio de los analitos entre las fases involucradas. La ecuación No. 1, da la masa de

los analitos absorbidos por el recubrimiento polimérico cuando se ha llegado al equilibrio.

La cinética del transporte de masas, en el cual los analitos se mueven de la fase acuosa hacia el espacio libre sobre la muestra y, finalmente, hacia el recubrimiento, debe ser tomada en cuenta. Porque, precisamente, es este proceso el que determina el tiempo de muestreo en la técnica de SPME del espacio libre sobre la solución (Zhang & Pawliszyn, 1993). Si la muestra fuera un ser no vivo, entonces se podría aplicar el análisis fisicoquímico sugerido por dichos autores. Sin embargo, la muestra y los resultados esperados tenían las siguientes características:

 Se buscaba analizar las emanaciones de la planta, pues son éstas las que percibe el órgano del olfato.

 El origen de las emanaciones es un material vivo, estando reguladas por condiciones ecofisiológicas particulares. Por lo cual se debe considerar la posibilidad de daño celular por calor y agitación de la muestra, con la consecuente alteración del ritmo metabólico de la planta y sus emanaciones.

 Aparentemente existen compuestos termolábiles.

Por lo cual, no se consideró necesario aplicar dicho análisis, pues en este estudio no se buscaba la concentración de los analitos en el pinabete sino en los compuestos volatilizados. Las concentraciones determinadas por GC/FID, con la curva de calibración respectiva, fueron tomadas como las concentraciones de los analitos en la fase gaseosa. Esto, suponiendo que los terpenoides cuantificados tenían un igual coeficiente de absorción al recubrimiento.

Presión de vapor Un líquido colocado en contenedor cerrado que tiene un volumen mayor que el ocupado por el líquido, llenará el espacio libre con su vapor, y eventualmente el líquido llega al equilibrio con su vapor. Esto no implica que la transferencia de moléculas a partir de la superficie líquida del espacio del vapor haya cesado, pero la concentración molecular en el vapor se vuelve lo suficientemente grande para que la velocidad de condensación de las moléculas de vapor es igual a la velocidad de volatilización de las moléculas líquidas. Se dice que la presión de vapor en el equilibrio es una función de la sustancia líquida y de su temperatura y es llamada presión de vapor del líquido (Brey, 1978).

Suponiendo que la concentración de los analitos en el recubrimiento de la fibra es igual a su concentración en la fase gaseosa, y que los analitos se comportan idealmente, puede predecirse la concentración de estos tres componentes en la fase líquida en el equilibrio.

Debe hacerse notar que el análisis GC-MS reveló la presencia de otros terpenoides, diferentes ésteres de ácidos grasos, aldehídos y algunos fenilpropanoides, que deberán ser cuantificados para incluirlos en el cálculo de la mezcla para la elaboración de aroma a pinabete.

PARTE III

III. RESULTADOS

Los resultados obtenidos consisten en el análisis de las emanaciones de pinabete en GC-MS, los tiempos de retención de aceites esenciales en GC-FID, y la cuantificación de los -pineno, -pineno y limoneno en emanaciones de pinabete de tres lugares de origen. Los datos originales, así como las curvas de calibración se encuentran en la sección de Anexos.

Cuadro No. 7. Componentes de las emanaciones de pinabete analizados por GC-MS. Se presentan los compuestos con >90% de coincidencia con los de patrones de la librería NIST. Para ver resultados de varias corridas, consultar Anexo 8. tR Compuesto CAS 5,13 Tolueno 108-88-3 7785-70-8 ó 11,59 alpha-pinene 7785-26-4 15,39 3-carene 13466-78-9 15,95 Limoneno 5989-27-5 16,14 1-metil-3-(1-metiletil)-benceno 535-77-3 16,6 alcohol bencílico 100-51-6 19,65 1-metil-4-(1-metiletenil)-benceno 1195-32-0 20 Undecano 1120-21-4 20,21 Nonanal 124-19-6 20,6 Alcohol feniletílico 60-12-8 23,42 ácido benzóico 65-85-0 25,19 Decanal 112-31-2 28,93 acetato de bornilo 76-49-3 31,76 (+)-4-careno 29050-33-7 32,1 Eugenol 97-53-0 32,94 alpha-cubebene 17699-14-8 34,84 Caryophyllene 87-44-5 36,24 alpha-caryophyllene 67653-98-6 37,74 Ciclodecano 294-62-2 39,67 alpha-calacorene 1000293-02-3 42,69 heptadecil éster del ácido 3-cloropropiónico 1000283-05-1 42,78 1,6-dimetil-4-(1metiletil)-naftaleno 483-78-3

43,1 Eicosano 112-95-8 44,08 ácido tetradecanoico 544-63-8 45,45 ácido pentadecanoico 1002-84-9

Fuente: FODECYT 87-2006. Obsérvese en el cuadro 2 la presencia de diversos fenilpropanoides presentes en las emanaciones de pinabete, por ejemplo el alcohol bencílico, metilbencenos y ácido benzoico; los cuales no habían sido detectados en estudios preliminares. Así también se encuentran diversos aldehídos, como el nonanal y el decanal, y ésteres de ácidos grasos. Se hace resaltar la presencia del careno, eugenol, calacoreno y cubebeno cuya naturaleza es terpenoidal. Es recomendable que en estudios posteriores se cuantifique la presencia de éstos. En especial, la del careno quien es común en los aceites esenciales de coníferas por lo que sería de esperar su presencia en las emanaciones de pinabete. Respecto a los dos últimos, son sesquiterpenoides que podrían estar asociados al aroma remanente en los pinabetes cortados y almacenados hasta después de la época navideña.

Análisis de estándares de aceites esenciales Las muestras analizadas fueron aceites esenciales comunes en coníferas con los que contaba internamente la Universidad del Valle par determinar tiempos de retención para comparar más adelante con las muestras de pinabete. Se analizaron 5 microlitros de cada aceite utilizando las condiciones antes mencionadas. En el cuadro No. 3. se presenta la tabulación de estos resultados.

Cuadro No. 8 Tabulación de tiempos de retención de aceites esenciales comunes en coníferas. Ver análisis estadístico en Anexos. Tiempo Aceite esencial de Datos del No. (Nombre común y Estructura retención reactivo UIPAC) (min.)

Aldrich, alfa pineno 98%, grado

1 13.577 técnico. (Bicyclo[3.1.1]hept-2- CAS: 80- ene, 2,6,6-trimethyl-) 56-8

®-+-limoneno Merck,

2 17.844 97%, CAS: (1-methyl-4-(1- 5989-27-5 methylethenyl)-)

beta pineno Aldrich, 99%, grado 3 (Bicyclo[3.1.1]heptane, 16.305 técnico, 6,6-dimethyl-2- CAS: 127- methylene-) 91-3

+/- linalool Aldrich,

4 19.560 CAS: 78- (1,6-Octadien-3-ol, 70-6 3,7-dimethyl-)

Fuente: FODECYT 87-2006.

Continuación Cuadro No. 8 Tabulación de tiempos de retención de aceites esenciales comunes en coníferas. Ver análisis estadístico en Anexos. Tiempo Aceite esencial de Datos del No. (Nombre común y Estructura retención reactivo UIPAC) (min.)

Mirceno Aldrich,

5 16.144 CAS: 123- (1,6-Octadiene, 7- 35-3 methyl-3-methylene-)

[(1S)-endo]-(-)-borneol Aldrich,

6 20.525 CAS: 507- (Bicyclo[2.2.1]heptan- 70-0 2-ol, 1,7,7-trimethyl-)

Canfeno Aldrich, 7 15.583 CAS:

alfa terpineol

Aldrich, (2-(4-Methyl-3- 8 26.837 CAS: cyclohexen-1-yl)-2- 10482-56-1 propanol)

Fuente: FODECYT 87-2006.

Estos datos se compararon con los cromatogramas GC-FID de las emanaciones de pinabete.

El 2/12/2007 se colectó ramilla de pinabete del mercado local (Mercado Navideño de la Calzada Roosevelt, zona 12). Se obtuvieron muestras de Panquix, Huehuetenango y de Tejutla, San Marcos, del bosque cultivado del Sr. Dimas Pérez. También se colectó pinabete de San José Pinula. Se obtuvieron las emanaciones de pinabete de 10 hojas de pinabete de cada una de las muestras, según el método desarrollado previamente. Se analizaron por GC/FID (Fig. No. 1), observando que hay diferencias en el perfil cromatográfico de las emanaciones según el lugar de origen de la muestra. El análisis por GC/masas confirma la presencia de alfa-pineno, limoneno y cariofileno (Ver cuadro No. 2). Estos componentes también habían sido detectados previamente en el aceite esencial de pinabete, difiriendo en la presencia de beta-pineno y canfeno, aunque se recomienda realizar estudios utilizando la técnica de headspace-GC/MS Además de haberse detectado otros componentes como aldehídos y ésteres de ácidos grasos, los cuales debieran ser estudiados en futuras investigaciones. Con estos resultados y los de estudios anteriores, se asignaron identidades a los picos mayoritarios (ver cuadro No. 3). Entre las dificultades que se presentaron durante este periodo, cabe mencionar la disponibilidad del equipo durante las fechas navideñas. Por lo que se realizaron análisis en fechas próximas a antes y después de la Navidad. Sin embargo, puede esperarse diferencias del aroma entre unas fechas y otras debido a la fenología de la planta.

Cuadro No. 9. Tabulación de resultados de la GC- FID de las emanaciones de pinabete a 21ºC. Tiempo No. de Área Compuesto Origen Código Cromatograma retención (counts*s) (SIG00) (min.) Tejutla Ag6A 6 13,640 2,00E+07 Tejutla Ag6B 7 13,327 9,66E+06 alfa-pineno Panquix Ag5J 5 13,419 7,03E+06 San José Ag19A 17 13,567 5,18E+05 Pinula Tejutla Ag6A 6 16,757 1,41E+07 Tejutla Ag6B 7 16,746 2,12E+07 beta pineno Panquix Ag5J 5 16,905 2,57E+07 San José Ag19A 17 16,496 2,38E+05 Pinula Tejutla Ag6A 6 18,372 3,41E+06 Tejutla Ag6B 7 18,248 1,77E+06 Limoneno Panquix Ag5J 5 18,294 1,74E+06 San José Ag19A 17 18,155 6,51E+04 Pinula

Tejutla Ag6A 6 25,281 9,70E+00 Tejutla Ag6B 7 25,263 9,74E+05 Cariofileno Panquix Ag5J 5 25,418 1,11E+06 San José Ag19A 17 25,427 3,94E+05 Pinula Fuente: FODECYT 87-2006.

Fuente: FODECYT 87-2006.

2006. -

origen. de lugar el según

Perfil Perfil cromatográfico de las emanaciones de pinabete a 21ºC. Obsérvense las diferencias. Fuente: 87 FODECYT Figura No. 2 No. Figura

Cuadro No. 10 Composición de las emanaciones de pinabete de diferentes lugares de origen, a 21ºC.

(+/-)- No. a-pineno b-pineno limoneno Origen Código Cromatograma (moles (moles (moles (SIG00) mL*g) mL*g) mL*g) Tejutla Ag6A 6 1,41E-03 1,24E-03 5,13E+05 Tejutla Ag6B 7 6,43E-05 1,74E-04 2,50E+04 Panquix Ag5J 5 9,33E-05 4,18E-04 4,89E+04 San José Pinula Ag19A 17 4,26E-05 1,21E-06 5,69E+02

Fuente: FODECYT 87-2006.

Fig No. 3 Superposición de cromatogramas de las emanaciones de muestras de pinabete provenientes de diferentes lugares de origen: Panquix, Totonicapán y Tejutla. Los tiempos de retención fueron normalizados utilizando el programa de ChemStation. A) compuestos cuantificados. B) Posibles compuestos detectados.

Felandreno

Mirceno Región de los sesquiterpenoides

Fuente: FODECYT 87-2006.

III.1 Discusión de Resultados

Si bien, los tiempos de retención son reproducibles (ver cuadro No. Anexos), lo cual implica que la desorción y el método cromatográfico son reproducibles no puede decirse lo mismo de las concentraciones de los diversos analitos, pues varían significativamente de una muestra a otra, indicando falta de reproducibilidad (Ver Figura No. 2 ). Esto se puede atribuir, según Lagalante y Montgomery (2003), a que la concentración de alfa pineno sea diferente entre muestra y muestra. También se ha de considerar el proceso de partición de los terpenoides entre la matriz vegetal y el espacio libre durante el muestreo, el cual puede ser reducir la reproducibilidad por depender de la fisiología de la planta. Se recomienda trabajar con mayor cantidad de muestras provenientes de la misma región geográfica y en lo posible de la misma región de la ramilla; siempre se deberá incluir una prueba de olor de cada muestra para poder correlacionar los perfiles cromatográficos y el aroma. Esto permite utilizar la información obtenida, aún si no hay reproducibilidad en la emanación de aceites esenciales por la planta.

Respecto a la metodología SPME utilizada cabe decir que aunque Beaulieu & Lea (2006) sugieren calentamiento a 40ºC y agitación durante la exposición a la fibra, el experimento se realizó a 21ºC y sin movimiento por la naturaleza de la muestra. Respecto a la agitación, porque se buscaba analizar la emanación de la planta viva cuando no está movimiento (pues es la forma en que se comercializa). Y, el calentamiento, afectaría de los resultados de dos formas principales: a) El calor, mataría a sus células perdiendo la regulación fisiológica y liberando más sustancias volátiles que las que normalmente emanaría la planta. Por lo cual se corría el riesgo de extraer más tipos y mayor concentración de los metabolitos de los necesarios para el aroma a pinabete. Pues en estudios anteriores (Nitsch, ), se ha determinado que el aroma del aceite esencial obtenido por destilación por arrastre con vapor de agua es diferente al del aroma a pinabete b) Posiblemente existen compuestos termolábiles. Sin embargo, podrían considerarse modificaciones metodológicas de la incubación como utilizar una temperatura aún menor, similar a la del bosque nuboso; además de considerar la cantidad y tipo de luz que recibe la planta durante la SPME.

En esta investigación se realizaron pruebas preliminares para las siguientes variables con el fin de tener parámetros para la siguiente fase del estudio:  Temperatura: se analizaron las emanaciones a 6ºC, 21ºC y 23ºC (temperatura ambiente). Encontrando diferencias en los perfiles cromatográficos, por lo cual se recomienda analizar las emanaciones de la planta a diferentes temperaturas que estén dentro del intervalo de las condiciones climáticas de la época navideña (de 19 a 24 ºC).  Intervalo de tiempo de emanación, el cual se dejó constante a 24 horas aproximadamente. Sin embargo se pueden explorar intervalos menores.  Duración del muestreo por SPME, que está asociado al tiempo requerido para llegar al equilibrio entre la fase gaseosa y la fase líquida. Sin embargo, por la

naturaleza de la muestra, este equilibrio no se da porque la planta está en un proceso de emanación regulada fisiológicamente, y no regida únicamente por factores no biológicos como en el caso de muestras inertes.  Material vegetal utilizado

Según los resultados obtenidos es recomendable considerar las siguientes variables en futuros estudios:  Hora en que se hace el muestreo. Dado que se está trabajando con material vegetal vivo, debe considerarse la fenología de la planta pues puede presentar patrones de emanación diferentes según la cantidad de luz, calor , humedad, etc. Es recomendable hacer un estudio de correlación entre las propiedades organolépticas del aroma y la composición de las emanaciones de la planta durante el período de producción de semilla del pinabete (que va de octubre a enero).

 Humedad presente en la muestra y el medio ambiente. Además de la producida por la planta durante el tiempo de extracción.  Presión atmosférica.  Época del año

El agua y el dióxido de carbono detectada por GC/MS se atribuyen a productos del metabolismo de la planta, pues el vial estaba guardado en un lugar seco y el porcentaje de humedad del GC/MS reportaba menos del 8% (ver anexo).

Aunque la cantidad de repeticiones no es óptima, puede decirse que hay compuestos que aparecen en los perfiles cromatográficos de ejemplares de pinabete provenientes de diferentes lugares (Fig. No.3). Estos compuestos son: alfa-pineno, beta-pineno, limoneno y cariofileno. Los primeros tres fueron cuantificados en este proyecto (ver cuadro No. 5). Estos compuestos podrían ser esenciales para obtener un aroma característico a pinabete, puesto que los tres ejemplares fueron recolectados por su aroma en bosques cultivados por personas que venden pinabete durante las épocas navideñas. Sin embargo, aun quedan compuestos por identificar y cuantificar (Fig No. 3). Por ejemplo, los compuestos que representan los picos alrededor de 15.3 min, 20.2 y la región de los sesquiterpenoides. Al cruzar esta información con la obtenida por GC-MS (Anexos ) y la composición de plantas de la familia pinaceae (Nitsch, 2005 ), puede asignarse al canfeno, mirceno, en los tiempos de retención mencionados. Y se puede esperar la presencia de alfa-copaeno y cubebeno en la región de los sesquiterpenoides.

Entre otros compuestos detectados en las emanaciones del pinabete, cabe resaltar los fenilpropanoides (Anexos) tales como el benzaldehído, salicilato de metilo, alcohol bencílico y ácido benzoico. Aunque éstos se encuentran a bajas concentraciones, Dada la alta concentración de beta-pineno, el cálculo de fracción molar en la fase gaseosa se ve afectado, pues se obtiene un valor de 0.999, reduciendo los valores de los otros compuestos a una cantidad de 0.001 o menos. Aunque podría predecirse una mezcla basada en esta información (Anexos), es recomendable determinar la composición de las emanaciones de pinabete bajo diferentes condiciones (Fig No.3 ) para observar si hay variaciones de liberación de aroma durante el transcurso del día que puedan orientar de mejor manera el diseño de la composición de la mezcla de aceites esenciales para obtener el aroma a pinabete.

PARTE IV.

IV.1 CONCLUSIONES

1. Se identificaron y cuantificaron los componentes mayoritarios del aroma del pinabete.

2. Se extrajeron las emanaciones/aroma de ramilla de pinabete cultivados provenientes de tres diferentes lugares: Panquix, Tejutla y San José Pinula, utilizando la técnica de microextracción en fase sólida.

3. Se determino que existen 7 compuestos en común en las emanaciones de ramilla de pinabete cultivado de tres diferentes lugares de origen. Además se detectaron alrededor de 80 compuestos presentes en las emanaciones de pinabete, los cuales pertenecen a diferentes familias de compuestos: terpenoides, fenilpropanoides, aldehídos y ésteres de ácidos grasos.

4. Se identificaron alfa-pineno, beta-pineno, (±)-limoneno como componentes mayoritarios en el aroma de ramilla de pinabete cultivado, de acuerdo a previos estudios sobre su aceite esencial. En las emanaciones de ramilla de pinabete cultivado proveniente de Panquix, se cuantificaron: -pineno (9,33E-05 moles/g*cm3 ± 2%), -pineno (4,18E-04 moles/g*cm3 ± 3%), (±)-limoneno (4,89E+04 moles/g*cm3 ± 5%).

5. Se confirmo la presencia de -pineno, -pineno, (±)-limoneno.

6. La fibra utilizada en SPME presentó un comportamiento lineal en la adsorción de los compuestos cuantificados, ver cuadros 10, 12 Y 14.

7. Se detectaron nuevos componentes de las emanaciones de pinabete: terpenoides (D-3-careno, cubebeno, eugenol), aldehídos (decanal), y fenilpropanoides (benzaldehído, ácido benzóico).

8. Se cuantificaron los componentes mayoritarios alfa-pineno, beta-pineno y limoneno en las emanaciones de pinabete utilizando la microextracción en fase sólida encontrando variaciones en las emanaciones según temperatura y otros factores que no eran parte de este estudio.

9. Al comparar la composición de emanaciones de ramilla de pinabete cultivado de tres diferentes lugares de origen, se detectaron diferentes perfiles cromatográficos (ver figuras 2 y 3). Sin embargo, todas las ramillas eran Abies guatemalensis y en el mercado se ofrecían por su característico olor. Por lo tanto puede decirse que estas muestras contenían los compuestos necesarios para el aroma de pinabete, además de otros compuestos.

10. Se generó información acerca de la composición del aroma de pinabete.

11. Se acepta la hipótesis planteada

IV.2 RECOMENDACIONES

1. Ya que se determinaron los compuestos mayoritarios del aroma de pinabete, el siguiente paso sería determinar los componentes necesarios para el aroma de pinabete. Esto se recomienda debido a que se detectaron diferencias de composición en ramillas de pinabete de diferente lugar de origen, pero que todas fueron adquiridas por su aroma característico. Para ello se deberán estudiar más muestras de al menos los lugares de origen incluidos en esta investigación. Al mismo tiempo se sugiere hacer una revisión bibliográfica de plantas que sean potenciales fuentes de limoneno, y los pinenos, compuestos detectados como parte del aroma de pinabete.

2. Respecto al proceso de extracción:  Explorar el potencial uso de técnicas de espacio de cabeza (headspace) para el análisis de las emanaciones de la planta, pues representa una medición directa de la fase gaseosa sin la fibra intermediaria como en SPME.  Utilizar una ramilla de pinabete completa, lo cual implica utilizar una cámara cerrada más grande. Esto debido a que el pinabete se comercializa por ramilla, la cual lleva tanto hojas como tronco del árbol, y los resultados de este estudio sugieren que puede existir diferencias entre analizar solamente hojas y ramilla.  Utilizar mayor cantidad de material vegetal en un contenedor hermético. El volumen de este contenedor debe ser tal que el volumen del material vegetal sea insignificante.

3. Respecto a la detección y cuantificación de los componentes del aroma de pinabete:  Optimizar un método de detección y cuantificación de volátiles utilizando GC- MS.  Determinar la isomería de los compuestos detectados, para lo cual se deberá considerar una columna cromatográfica quiral.  Cuantificar al cariofileno, careno, eugenol, aldehídos y fenilpropanoides detectados.  Se puede considerar el uso de agentes secantes para reducir la cantidad de agua, que es producida por la planta inyectada al cromatógrafo y podría alterar los resultados obtenidos.

4. Entre otras recomendaciones se encuentran:  Al estudiar la composición de las emanaciones de pinabete en función de diferentes lugares de origen, los datos generados pueden servir para el estudio quimiotaxonómico. Un modelo de estudios en quimotaxonomía de coníferas utilizando SPME puede hallarse en Lagalante & Montgomery (2003).

 Monitoreo de las variaciones en la composición de las emanaciones del pinabete según la época del año, para determinar otros componentes importantes para el aroma característicos.

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Aguilar, J. 1961. Pinos de Guatemala. Ministerio de Agricultura. Guatemala. 32pp. Allingen, N., et al. 1971. Organic Chemistry. Worth Publishers. New York. 1007 pp.

Asociación Becaria Guatemalteca. Guauhitemala: lugar de bosques. 1991. Asociación Becaria Guatemalteca. Ed. Piedra Santa. Guatemala. vol 1. 65pp.

Bagci, E. & M. Digrak. 1996. Antimicrobial Activity Of Essential Oils Of Some Abies Species From Turkey. J. Flavour. Fragr. (11) 251-256 Bauer, J. Ed. 1982. Especies con potencial para la reforestación en Honduras. Corporación Hondureña de desarrollo forestal. CATIE. Honduras. Beaulieu, J. & J. M. Lea. Characterization and semiquantitative analysis of volatiles in seedless watermelon varieties using solid-phase microextraction. JAgricFoodChem (54): 7789-7793. 2006. Beneítez Flores, Rocío. Terpenos, esteroles y aceites esenciales. Química de productos vegetales. Universidad del Valle de Guatemala. 1999.

Bennaton, E. 2001. Estrategia Nacional para la protección y conservación del pinabete. Revista Guatemala Forestal. INAB. Número 9, Año IV. Pagina 2. Guatemala

Brey. W. Physical Chemistry And Its Biological Applications. Academic Press. New York. 1978. 589pp.

Castañeda, Juan Carlos. 2005. Extracción del aceite esencial de pinabete (Abies guatemalensis Rheder) por medio de arrastre de vapor, para la extracción y caracterización del aceite esencial a nivel de planta piloto y su escalonamiento a nivel industrial, para la elaboración de un producto de limpieza y su esencia. Castañeda González, J. C. 1979. Las comunidades de pinabete en Guatemala. Tesis de Ing. Agrónomo. USAC. Tesis. Universidad de San Carlos de Guatemala.

Chalchat, J., R.Garry, & M. Gorunovic. 1995. Chemotaxonomy Of Pines Native To The Balkans (IV): Variations In The Composition Of Essential Oils Of Pinus Omorika Paneic According To Plant Part And Age Of Specimens. Pharmazie (50) 640-641. Chivílícková, I. Y V. Kubán. 2004. Headspace solid-phase micro-extraction (HS- SPME): a micro-scale sampling technique for determination of monoterpene hydrocarbons in coniferous needles by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) . Anal bioanal Chem. 378 (Enero): 150-8. CONAP. 2001. Listado de especies de flora silvestre amenazadas de extinción (Lista Roja de Flora). Resolución ALC 028-2001 del Consejo Nacional de Áreas Protegidas. Guatemala. CONAP-INAB-USAID. 1999. Diagnóstico de las poblaciones naturales de pinabete (Abies guatemalensis R.) en Guatemala y estrategia para su conservación. Coediciones técnicas. No. 11. INAB. 60pp.

UNEP-World Conservation Monitoring Centre. Contribution to an evaluation of tree species using the new CITES Listing Criteria Annex 2. Profiles of Tree

Species: The Americas. 1999. UNEP-World Conservation Monitoring Centre . Inglaterra. http://www.unep-wcmc.org/species/tree_study/2_esp.pdf. De la Cruz, J. 1982. Clasificación de zonas de vida de Guatemala a nivel de reconocimiento. INAFOR. Guatemala. 42pp.

De Macvean, L. 2003. Species Descriptions: Abies guatemalensis. En Tropical Tree Seed Manual de RNGR (Team Reforestation, Nurseries and Genetic. Resources). http://www.rngr.net/Publications/ttsm/Folder.2003-07- 11.4726/Abies%20guatemalensis.pdf/file

Diccionario Geográfico de Guatemala. Tomos I al IV. Ed. F. Gall. 1983. Instituto Geográfico Nacional. Guatemala.

Domínguez, X. A. 1973. Métodos de investigación Fitoquímica. Limusa. México. 281 pp. Donahue, J. K., et al. 1985. Abies guatemalensis: informe sobre el estado en que se encuentra el estudio a los dos años. CAMCORE. Boletín No. 3 sobre asuntos forestales tropicales. North Carolina Sate University. Carolina del Norte. 19p. Escobar, María del Rosario. Aislamiento del aceite esencial de la planta Jasminum grandiflorum. Proyecto final Química orgánica 3. Universidad del Valle de Guatemala. 1998.

Farjon, Aljos. 1998. World Checklist and Bibliography of Conifers. Richmond, U.K.: Royal Botanical Gardens at Kew.

Fengel, D. 1984. Wood: chemistry, ultrastructure, reactions. Berlim Walter de Gruyter. 613pp. González, J. 1979. Caracterización ecológica de las comunidades de pinabete (Abies guatemalensis Rehder). Tesis Universidad de San Carlos de Guatemala. 79pp. Güenther, E. 1948. The Essential Oils. D. Van Nostrand Co. New York. 426pp. Vol. 1. Herrera, Z. y A. Morales. 1993. Propiedades y usos potenciales de 100 maderas nicaragüenses. Ed. Hispamer. Nicaragüa. 178pp. Holdridge, L. R. 1975. Las coníferas de Guatemala. FAO. Roma. 45pp. http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco- Home/Datanodes.html?cat_paht=970367&supelco_name=SPME&id=970367

INAB-CONAP-SEPRONA. Estrategia nacional de protección y conservación del pinabete Abies guatemalensis R. 2000. INAB-CONAP-SEPRONA. Guatemala. 30pp.

Kirk, R. & P. Othmer. 1983. Enciclopedia de tecnología química. Tomo I. Unión Tipográfica. Ed. Hispanoamericana. México. 1061pp.

Lagalante, A. F. & M.E. Montgomery. Analysis Of Terpenoids From Hemlock (Tsuga) Species By Solid-Phase Microextration/Gas Chromatography/Ion-Trap Mass Spectrometry. JAgricFoodChem (51): 2115-2120. 2003.

Legault, J.; W. Dahl, E. Debiton, A. Pichette y J.C. Madelmont. 2003. Antitumor activity of balsam fir oil: production of reactive oxygen species induced by alpha-humulene as possible mechanism of action. Planta Med 69(May): 402-7.

INAB. Ley forestal: Decreto legislativo 101-96. 1998. INAB. Asociación Centroamericana de comunicación para el desarrollo Humano “Hombres de maíz”. Guatemala. 27pp. INAB. Ley Forestal: Decreto legislativo No. 101-96. 1997. INAB. Guatemala. 27pp. CONAP. Lista Roja de Flora Silvestre para Guatemala. 1996. CONAP. Diario de Centro América. Guatemala. No. 1. pp. 4-19. Macz, O.; D. Landaverde y L. Gonzalez. 2000. Estudio del comportamiento del pinabete (Abies guatemalensis Redher) a la reproducción meristemática in vitro. Universidad Rafael Landívar-INAB. Guatemala. 19pp. Macz, O.; B. Gómez y J. González. 2000. Estudio anatómico-morfológico de las semillas de pinabete (Abies guatemalensis Redher) de cuatro procedencias. Universidad Rafael Landívar de Guatemala-INAB. 26pp. MAGA-ICTA-UNEPROCH. Adaptación de un método de embriogénesis somática para la regeneración de embriones asexuales de pinabete (Abies guatemalensis Redher). 2000. MAGA-ICTA-UNEPROCH. 17pp.

Mejicano, Mariano. El atractivo cultivo del Pinabete. Región I. INAFOR. INAB. CINFOR – 00196. Miall, S. y M. Miall. 1956. Diccionario de Química. 2ed. Atlante. México. 1084pp. Mirov, N. T. Composición de las trementinas de los pinos mexicanos. www.fao.org/docrep/x5373S/x5373sOO.htm#Contents.

Moore, H. E. 1994. Especies para reforestación. MARENO-SFN-ASDI. Nicaragua. Nota técnica No. 31. Nakanishi, K, T. Yoto, S. Ito, S. Naton, S. Nozoe. 1975.Natural Products. Kodansha. Japón. Vol I. Nimitz, J. 1991. Techniques in Organic Chemistry. Prentice Hall. EEUU. Nitsch, Jacobo. 1999. Situación actual y uso potencial del Abies guatemalensis. Bosques de Guatemala. Universidad del Valle de Guatemala. 3pp. Nitsch, Jacobo. Apuntes de Gira al altiplano y clases del curso bosques de Guatemala. Universidad del Valle de Guatemala. 2001.

Nitsch, Lucía. 2001. Extracción del aceite esencial de Abies guatemalensis. Química Orgánica 3. Universidad del Valle de Guatemala. 50pp. Nitsch, Lucia. 2002. Análisis del aceite esencial de Abies guatemalensis: Identificación y cuantificación de los componentes químicos de su aroma. Instituto Nacional de Bosques. Guatemala. 48 + 79 pp. Nitsch, Lucia. 2005. Análisis fitoquímico de los extractos de pinabete (Abies guatemalensis Rehder). Tesis de Bioquímica. UVG Tesis. Universidad del Valle de Guatemala. Peñalonzo, R. y R. Zanotti. 1989. El pinabete (Abies guatemalensis): Su producción para árbol de navidad. DIGEBOS. Guatemala. 21pp. Phillips, Michael A., y Rodney B. Croteau. 1999. Resin-based defenses in conifers. Trends in Plant Science. 4 (5): 184-190

Plan de Acción de la Estrategia para la Conservación de Pinabete (Abies guatemalensis R.) en los Bosques Naturales y Plantaciones de la Región Altiplano de Guatemala. 2004. CBD- Secretariat of the Convention on Biological Diversity. United Nations Environment Programme. http://www.biodiv.org/programmes/outreach/cepa/projects/project.shtml?type=P RJ&group=PRJ-CEPA&id=9019 Pokrovsky, L. & A. Tkachev. Study of Composition of Volatile Compounds of Siberian and Far East Conifers by Gas Chromatography - Mass-Spectrometry. Abstracts of Posters Novosibirsk Institute of Organic Chemistry. All Contents Copyright © 1998. No 136. http://www.nioch.nsc.ru/icnpas98/pdf/posters1/136.pdf

Pöll, E. PhD en Botánica. Directora herbario Universidad del Valle de Guatemala. Entrevista en Universidad del Valle de Guatemala. 2004.

Poll, Elfriede de. 2005. Entrevista: el pinabete. Dra. En Fisiología Vegetal, graduada con honores de la Universidad de Viena. Universidad del Valle de Guatemala. Ponciano, I.; J. Dary y Aguilar, J. 1988. Las coníferas de Guatemala. Universidad de San Carlos de Guatemala. Colección Cuadernos de Investigación. No. 12-87. 80pp. PUIRNA. Zonificación Geográfica y determinación de fuentes semilleras de pinabete (Abies guatemalensis Rehder), en la sierra de los Cuchumantanes, Huehuetenango. 1999. PUIRNA. Universidad de San Carlos de Guatemala- Dirección general de Investigación. 24pp.

Robinson, T. 1980. The organic constituents of higher plants. Cordus Press. Massachusets. 351pp Rodas Zamora, J. xxxx. Producción de Arbolitos de Navidad. Dirección de Recursos Renovables (DIGESA)-Ministerio de agricultura. Temas agrícolas. Guatemala. Fascículo 49. Ruiz, J.; J. Ventanas & R. Cava. New Device For Direct Extraction Of Volatiles In Solid Samples Using SPME. JAgricFoodChem (49): 5115-5121. 2001.

Saquimux, F.; J. Castiglione y J. Salazar. 1999. Generación de tecnología en el desarrollo inicial del cultivo del pinabete(Abies guatemalensis Redehr). MAGA-ICTA-UNEPROCH. Guatemala. 33pp. Singh R.K.; S. K. Bhattacharya y S. B. Acharya . 2000. Pharmacological activity of Abies pindrow. J Ethnopharmacol 73(Nov): 47-51

Singh, R. K., et al. 1998. Pharmacological actions of Abies pindrow Royle leaf. Indian j Exp Biol. 36(Feb): 187-91. Skoog, D. & J. Leary. 1994. Análisis Instrumental. 4a ed. McGraw-Hill. España. 935 pp. Standley, P. y J. Steyermark. 1958. Flora of Guatemala. Fiel Museum of Natural History of Chicago, Fieldana: Botany. Chicago. Vol. 24. Steffen, A. & J. Pawliszyn. Analysis Of Flavour Volatiles Using Headspace Solid- Phase Microextraction. JAgricFoodChem (44): 2187-2193.1996.

Tairu, A, Hofmann, T. & Schieberle, P. 1999. Identification of the key aroma compounds in dried fruits of Xylopia aethiopica. En: Perspectives on new crops and new uses. ASHS Presss, Alexandria, VA. Págs. 474-478.

UNEP-World Conservation Monitoring Centre. Contribution to an evaluation of tree species using the new CITES Listing Criteria Annex 2. Profiles of Tree Species: The Americas. 1999. UNEP-World Conservation Monitoring Centre . Inglaterra. http://www.unep-wcmc.org/species/tree_study/2_esp.pdf.

Urrutia, Salvador. 1977. Recopilación de documentos oficiales, decretos legislativos, acuerdos gubernativos, oficios, circulares y telegramas, relacionados con la cuarentena vegetal y animal del país. MAGA. Guatemala. 85pp. Urzúa, A. 2002. Monoterpenes and sesquiterpenes in the headspace volatiles from intact plants of Pseudognaphalium vira vira, P. heterotrichium, P. chiranthifolium y P. robustum: their insect repellent function. Sociedad Chilena de Química. Chile. http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_attex&pid=S0366- 16442002200005&Ing=es&nrm=iso.

US Forest Service. 1948. Woody Plant Seed Manual. US Government printing office. Washington. 416 pp. Miscellaneus publication. No . 654 Valdéz Orellana, Silvia Patricia. 1999. Efecto de la temperatura, radiación, sustratos y reguladores del crecimiento en la germinación de la semilla de pinabete (Abies guatemalensis Rehder). Tesis. Universidad de San Carlos de Guatemala. 93 pp.

Vales, Miguel; M. Muñoz y L. García. 2000. Especies Maderables CITES. http://www.uco.es/organiza/servicios/jardin/cd1/Maderas%20CITES/Abies.htm.

Wagner, H, S. Bladt y Z. M. Againski. 1984. Plant Drug Analysis: A thin layer chromatograpy Atlas. Springer-Veslag. Berlín Heindeberg. 320 pp.

Woody Plant Seed Manual, prepared by the forest service US Depto. Of agriculture. Miscellaneus publication. No . 654. 1948. US. Government printing office. Washington. 416 pp.

Zhang, Z. & J. Pawliszyn. Headspace Solid-Phase Microextraction. AnalChem (65): 1843-1852. 1993.

Zhang, Z.; M.Yang; & J. Pawliszyn. Solid-Phase Microextraction, a Solvent-free Alternative For Sample Preparation. AnalChem (66): 844A-853A. 1994.

IV.4. ANEXOS

IV.4.1. ANEXO 1

IV.4.1.A. Descripción botánica del Pinabete Descripción del árbol: el pinabete es una conífera proveniente del hemisferio norte, con tronco alto y fuerte, hojas aciculares perennes color verde, la copa con forma piramidal, sus conos son dehiscentes de forma ovalada. El olor de su resina en el tronco y ramas es muy agradable. Sus semillas son de forma ovalada que presentan datos de germinación muy bajos (7-15%).

Distribución: el pinabete crece en regiones con una altitud mínima aprox. de 2400 msnm hasta los 3500, con precipitaciones mínimas de 1000mm anuales, con exposición solar de norte y noroeste. Estos datos corresponden según Holdrige a las zonas de vida Bosque húmedo y muy húmedo montano. En Guatemala, se encuentra principalmente en las zonas montañosas como el altiplano y Sierra de las Minas. Los bosques más representativos de pinabete se encuentran en los departamentos de Totonicapán, Quetzaltenango y Huehuetenango.

Ecología: los bosques de pinabete suelen estar asociados con diferentes especies de coníferas y latifoliadas. Los principales rodales se encuentran asociados con las coníferas Pinus ayacahuite y Cupressus lusitanica, y en menor proporción con latifoliadas como Quercus spp. Ocupa un “grado avanzado” en la sucesión ecológica de los lugares en donde habita, ya que para su buen desarrollo, necesita de sombra que es proporcionada por grandes árboles de especies descritas anteriormente y micorrizas características de estos bosques.

Las semillas y el aceite esencial: Las semillas tienen localizadas glándulas de almacenamiento de las oleorresinas donde se encuentra el aceite esencial. El aroma en del género Abies es una mezcla de varios compuestos (terpenos, a-b pineno, a-b- felandreno, limoneno, mentona, entre otros comunes del género Abies del Este de Rusia). Las propiedades de estos compuestos son utilizadas como defensa natural de las plantas contra depredadores. Estas mezclas complejas pueden ser determinadas en su mayoría por el método que implica la separación de estos componentes por sus interacciones químicas (polares y apolares) y la determinación de la fórmula molecular de éstos: espectrometría de masas/cromatografía de gases.

La determinación de los componentes del aceite esencial servirían de información importante para investigaciones relacionadas con la especie tales como:

 Procesos de germinación  Cultivo de meristemos  Síntesis del aceite esencial

Componentes del aceite esencial que han sido identificados: Alfa pineno, beta pineno, limoneno, cariofileno. Probablemente, también felandreno.

ANEXO 2 Resultados de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas Cuadro No. 11 Resultados tabulados del análisis por GC-MS de emanaciones de pinabete proveniente de Panquix. La fibra fue almacenada a 4ºC durante cuatro semanas. Pico Area Coincidencia tR Nombre Ref· CAS No. No. (%) (%) 11 2,46 0,61 2,4-Heptadiene, (E,E)- 86 2818 002384-94-3 2,4-Hexadiene, 2-methyl- 64 2849 028823-41-8 12 6,74 3,76 2-Hexenal 96 3073 000505-57-7 2-Hexenal, (E)- 91 3111 006728-26-3 2-Hexenal, (E)- 91 3113 006728-26-3 13 6,93 4,49 2-Hexenal 96 3073 000505-57-7 2-Hexenal, (E)- 94 3112 006728-26-3 2-Hexenal, (E)- 94 3113 006728-26-3 14 12,27 4,91 Benzaldehyde 96 4942 000100-52-7 Benzaldehyde 96 4944 000100-52-7 Benzaldehyde 96 4941 000100-52-7 15 12,46 0,76 Benzaldehyde 74 4941 000100-52-7 Benzaldehyde 72 4944 000100-52-7 Benzene, 1-methyl-2-(1- 17 15,74 1,33 97 14404 000527-84-4 methylethyl) Benzene, 1-methyl-2-(1- 95 14406 000527-84-4 methylethyl) Benzene, 1-methyl-3-(1- 91 14402 000535-77-3 methylethyl) 18 15,95 5,68 D-Limonene 93 15136 005989-27-5 D-Limonene 93 15128 005989-27-5 Limonene 91 15138 000138-86-3 Cyclohexene, 1-methyl-4-(1- 19 16,08 1,16 70 15340 005989-54-8 methylethenyl)-, (S)- 1,4-Cyclohexadiene, 1-methyl-4- 20 17,54 0,64 91 15330 000099-85-4 (1-methylethyl)- 1,4-Cyclohexadiene, 1-methyl-4- 86 15322 000099-85-4 (1-methylethyl)- 1,4-Cyclohexadiene, 1-methyl-4- 78 15328 000099-85-4 (1-methylethyl)- 21 20,39 1,89 Phenylethyl Alcohol 91 9609 000060-12-8 Phenylethyl Alcohol 91 9608 000060-12-8 Phenylethyl Alcohol 87 9607 000060-12-8 22 24,49 2,06 Methyl Salicylate 91 24654 000119-36-8 Methyl Salicylate 91 24651 000119-36-8 Methyl Salicylate 90 24653 000119-36-8 Acetic acid, 1,7,7-trimethyl- 23 28,87 1,14 98 53424 092618-89-8 bicyclo[2.2.1]hept-2-yl ester Bicyclo[2.2.1]heptan-2-ol, 1,7,7- 96 53444 005655-61-8 trimethyl-, acetate, (1S-endo)- Pico Área Coincidencia tR Nombre Ref· CAS No. No. (%) (%) 45

Acetic acid, 1,7,7-trimethyl- 89 53426 092618-89-8 bicyclo[2.2.1]hept-2-yl ester 24 34,79 14,24 Caryophyllene 99 58633 000087-44-5 Caryophyllene 98 58637 000087-44-5 Bicyclo[5.2.0]nonane, 2- 93 58752 242794-76-9 methylene4,8,8-trimethyl-4-vinyl- 25 36,22 1,99 .alpha.-Caryophyllene 95 58682 006753-98-6 1,4,7,-Cycloundecatriene, 1,5,9,9- 94 58735 1000062-61-9 tetramethyl-, Z,Z,Z- .alpha.-Caryophyllene 93 58681 006753-98-6 26 40,13 0,51 Dodecanoic acid 94 56048 000143-07-7 Dodecanoic acid 93 56046 000143-07-7 Dodecanoic acid 93 56043 000143-07-7 Naphthalene, 1,6-dimethyl-4-(1- 28 42,77 2,94 98 55045 000483-78-3 methylethyl)- Naphthalene, 1,6-dimethyl-4-(1- 96 55044 000483-78-3 methylethyl)- Azulene, 1,4-dimethyl-7-(1- 94 55040 000489-84-9 methylethyl) - 29 44,07 0,96 Tetradecanoic acid 98 75070 000544-63-8 Tetradecanoic acid 96 75069 000544-63-8 Tetradecanoic acid 95 75071 000544-63-8 1,2-Benzenedicarboxylic acid, 30 45,64 1,41 83 105074 000084-69-5 bis(2-methylpropyl) ester 1,2-Benzenedicarboxylic acid, 78 145664 000089-18-9 butyl 8-methylnonyl ester 1,2-Benzenedicarboxylic acid, 74 134724 000084-78-6 butyl octyl ester 31 46,43 0,82 Hexadecenoic acid, Z-11 98 90865 002416-20-8 z-7-Hexadecenoic acid 92 90861 1000130-90-8 Cyclopentadecane 86 63051 000295-48-7 32 46,66 3 n-Hexadecanoic acid 99 92228 000057-10-3 n-Hexadecanoic acid 98 92226 000057-10-3 n-Hexadecanoic acid 96 92227 000057-10-3 Hexanedioic acid, bis(2- 33 51,65 4,84 95 148385 000103-23-1 ethylhexyl) ester Hexanedioic acid, bis(2- 91 148381 000103-23-1 ethylhexyl) ester Hexanedioic acid, bis(2- 91 148384 000103-23-1 ethylhexyl) ester

Fuente: FODECYT 87-2006.

ANEXO 3 Cuadro No. 12 Resultados tabulados del análisis por GC-MS de emanaciones de pinabete proveniente de San José Pinula, análisis realizado en época post-navideña. Pico Área Coincidencia tR Nombre Ref· CAS No. No. (%) (%) 6 5,13 0,15 Toluene 91 2403 000108-88-3 Toluene 87 2400 000108-88-3 Toluene 87 2404 000108-88-3 10 11,59 0,24 1R-.alpha.-Pinene 96 15161 007785-70-8 1S-.alpha.-Pinene 96 15160 007785-26-4 Bicyclo [3.1.1] hept-2-ene, 2,6,6- trimethyl-, (.+/-.)- 95 15351 002437-95-8 13 12,93 5,47 Benzaldehyde 96 4942 000100-52-7 Benzaldehyde 96 4944 000100-52-7 Benzaldehyde 95 4943 000100-52-7 Bicyclo[3.1.1]hept-2-ene, 3,6,6- 16 14,52 0,03 trimethyl- 74 15289 004889-83-2 Tricyclo[2.2.1.0(2,6)]heptane, 1,7,7-trimethyl- 72 15325 000508-32-7 Cyclohexane, 1-methylene-4-(1- methylethenyl)- 72 15307 000499-97-8 17 14,95 0,08 cis-3-Hexenoic acid 64 7000 1000132-06-8 18 15,05 0,15 Cyclotetrasiloxane, octamethyl- 72 115616 000556-67-2 Bicyclo[4.1.0]hept-3-ene, 3,7,7- 22 15,39 0,44 trimethyl-, (1S)- 97 15344 000498-15-7 3-carene 95 15133 013466-78-9 3-carene 94 15130 013466-78-9 Benzene, 1-methyl-3-(1- 24 16,14 0,46 methylethyl)- 97 14402 000535-77-3 Benzene, 1-methyl-2-(1- methylethyl)- 95 14406 000527-84-4 Benzene, 1-methyl-3-(1- methylethyl)- 95 14403 000535-77-3 27 16,36 6,18 D-Limonene 94 15138 005989-27-5 Limonene 91 15127 000138-86-3 Limonene 91 15128 000138-86-3 28 16,6 5,12 Benzyl Alcohol 94 5229 000100-51-6 Benzyl Alcohol 94 5228 000100-51-6 Benzyl Alcohol 91 5227 000100-51-6 29 19,46 Benzene,5229 1 -000100methyl-4--(151- -6 94 522896 00010013628- 51-6001195 94 -522732-0 000100-51-6 0,9 91methylethenyl) -

o-Isopropenyltoluene 95 13581 007399-49-7 Benzene, (2-methyl-1-propenyl)- 90 13598 000768-49-0 33 20 0,75 Undecane 89 27119 001120-21-4 34 20,21 0,43 Nonanal 90 19126 000124-19-6 Nonanal 64 19124 000124-19-6 35 20,6 3,64 Phenylethyl Alcohol 91 9608 000060-12-8

Fuente: FODECYT 87-2006. 47

Pico Área Coincidencia tR Nombre Ref· CAS No. No. (%) (%) Phenylethyl Alcohol 91 9607 000060-12-8 Phenylethyl Alcohol 91 9609 000060-12-8 41 23,42 0,17 Benzoic Acid 72 9574 000065-85-0 42 23,79 3,36 Benzoic Acid 70 9572 000065-85-0 Benzoic Acid 64 9574 000065-85-0 Benzoic Acid 64 9573 000065-85-0 43 24,05 1,3 Benzoic Acid 76 9574 000065-85-0 Benzoic Acid 64 9573 000065-85-0 Cyclobutane-1,1-dicarboxamide, N,N' -di-benzoyloxy- 64 151867 1000253-25-3 56 25,19 0,11 Decanal 91 26906 000112-31-2 Decanal 86 26907 000112-31-2 57 27,37 0,28 Benzeneacetic acid 90 15708 000103-82-2 Benzeneacetic acid 83 15709 000103-82-2 Benzoic acid, 3-methyl 72 15718 000099-04-7 Bicyclo[2.2.1]heptan-2-ol, 1,7,7- 60 28,93 1,82 trimethyl-, acetate, (1S-endo)- 98 53444 005655-61-8 Acetic acid, 1,7,7-trimethyl- bicyclo[2.2.1]hept-2-y1 ester 98 53424 092618-89-8 Bornyl acetate 96 53333 000076-49-3 61 31,76 0,09 (+)-4-Carene 93 15144 029050-33-7 Bicyclo[3.1.0]hexane, 6- isopropylidene-1-methyl- 90 15339 024524-57-0 Bicyclo[2.2.1]heptane, 2,2- dimethyl-3-methylene-, (1S)- 87 15363 005794-04-7 62 32,1 0,22 Eugenol 97 31517 000097-53-0 Eugenol 96 31519 000097-53-0 Phenol, 2-methoxy-3-(2- propenyl)- 96 31637 001941-12-4 63 32,94 0,23 .alpha.-Cubebene 95 58657 017699-14-8 Copaene 93 58614 003856-25-5 .alpha.-Cubebene 93 58655 017699-14-8 65 34,3 0,17 Caryophyllene 70 58633 000087-44-5 Naphthalene, 1,2,3,5,6,7,8,8a- octahydro-1,8a-dimethy1-7-(1- methyleth enyl)-, [1R- (1.alpha.,7.beta.,8a.a1pha.)]- 62 58890 004630-07-3 66 34,84 8,57 Caryophyllene 99 58633 000087-44-5 Caryophyllene 95 58637 000087-44-5 Bicyclo[5.2.0]nonane, 2- methylene-4,8,8-trimethyl-4- vinyl- 95 58752 242794-76-9 1,4,7,-Cycloundecatriene, 1,5,9,9- 69 36,24 1,24 tetramethyl-, Z,Z,Z- 98 58735 1000062-61-9 .alpha.-Caryophyllene 98 58683 006753-98-6 .alpha.-Caryophyllene 97 58682 006753-98-6 Fuente: FODECYT 87-2006. 48

Pico Área Coincidencia tR Nombre Ref· CAS No. No. (%) (%) Spiro[5.5]undec-2-ene, 3,7,7- 71 37,21 0,08 trimethyl-11-methylene-, (-)- 86 58754 018431-82-8 Azulene, 1,2,3,4,5,6,7,8- octahydro-1,4-dimethyl-7-(1- methylethylidene)-,(1S-cis)- 78 58831 000088-84-6 Thujopsene-13 76 58634 1000162-77-8 3-Buten-2-one, 4-(2,6,6-trimethyl- 72 37,53 0,07 1-cyclohexen-l-y1)- 86 50517 014901-07-6 3-Buten-2-one, 4-(2,6,6-trimethyl- 1-cyclohexen-l-y1)-, (E)- 62 50539 000079-77-6 3-Buten-2-one, 4-(2,6,6-trimethyl- 1-cyclohexen-l-y1)-, (E)- 62 50532 000079-77-6 73 37,74 0,07 Cyclododecane 94 34706 000294-62-2 1-Tetradecanol 91 65757 000112-72-1 1-Tetradecanol 90 65761 000112-72-1 Benzene, 1-methyl-4-(1,2,2- 75 38,38 0,07 trimethylcyclopentyl) -, (R) - 98 57459 016982-00-6 Benzene, 1-methyl-4-(1,2,2- trimethylcyclopentyl) -, (R) - 98 57458 016982-00-6 Benzene, 1-methyl-4-(1,2,2- trimethylcyclopentyl) -, (R) - 97 57457 016982-00-6 Naphthalene, 1,2,3,4-tetrahydro-1, 6-dimethyl-4-(1-methylethyl)-, 76 39,02 0,11 (1S -cis) - 91 57467 000483-77-2 Naphthalene, 1,2,3,4-tetrahydro- 1, 1,6-trimethyl- 64 38744 000475-03-6 Naphthalene, 1,2,3,4-tetrahydro-1, 5,7-trimethyl- 64 38737 021693-55-0 77 39,67 0,07 .alpha.-Calacorene 90 56313 1000293-02-3 Naphthalene, 1,2-dihydro-3,5,8- trimethyl- 81 37582 030316-18-8 78 40,14 0,13 Dodecanoic acid 94 56043 000143-07-7 Dodecanoic acid 91 56047 000143-07-7 Dodecanoic acid 83 56046 000143-07-7 81 41,03 0,03 Diethyl Phthalate 80 70484 000084-66-2 Diethyl Phthalate 78 70483 000084-66-2 Diethyl Phthalate 60 70482 000084-66-2 Propanoic acid, 2-methyl-, 1-(1,1- dimethylethyl)-2-methyl-1,3- 82 41,1 0,15 propanediyl ester 78 109845 074381-40-1 Pentanoic acid, 2,2,4-trimethyl-3- carboxyisopropyl, isobutyl ester 64 109844 1000140-77-5 Naphthalene, decahydro-4a- methyl-1-methylene-7-(1- 86 42,44 0,09 methylethylidene)-, (4aR-trans) - 66 58833 000515-17-3 .beta.-Panasinsene 76 58675 1000159-39-0 3-Chloropropionic acid, 88 42,69 0,09 heptadecyl ester 93 139663 1000283-05-1

Fuente: FODECYT 87-2006. 49

Pico Área Coincidencia tR Nombre Ref· CAS No. No. (%) (%) Trichloroacetic acid, pentadecyl ester 82 148859 074339-53-0 Naphthalene, 1,6-dimethyl-4-(1- 89 42,78 0,54 methylethyl)- 99 55045 000483-78-3 Naphthalene, 1,6-dimethyl-4-(1- methylethyl)- 96 55044 000483-78-3 6-Isopropyl-1,4- dimethylnaphthalen 94 55037 000489-77-0 90 42,99 0,08 8-Heptadecene 86 81252 054290-12-9 8-Heptadecene 86 81251 002579-04-5 2-Tetradecene, (E)- 63 53627 035953-53-8 91 43,1 0,08 Eicosane 98 107653 000112-95-8 Hexadecane 95 73963 000544-76-3 Hexadecane 94 73968 000544-76-3 94 44,08 0,35 Tetradecanoic acid 99 75070 000544-63-8 Tetradecanoic acid 99 75072 000544-63-8 Tetradecanoic acid 95 75069 000544-63-8 95 44,83 0,14 2-Ethylhexyl salicylate 87 88400 000118-60-5 97 45,45 0,1 Pentadecanoic acid 99 83686 001002-84-2 Pentadecanoic acid 93 83683 001002-84-2 1,2-Benzenedicarboxylic acid, bis( 98 45,64 0,26 2-methylpropyl) ester 86 105074 000084-69-5 Dibutyl phthalate 78 105065 000084-74-2 Dibutyl phthalate 64 105063 000084-74-2 Pentadecanoic acid, 14-methyl-, 104 46,27 0,13 methyl ester 87 100727 005129-60-2 Pentadecanoic acid, 14-methyl-, methyl ester 83 100726 005129-60-2 Hexadecanoic acid, methyl ester 83 100708 000112-39-0 105 46,43 0,17 5-Octadecene, (E)- 89 89785 007206-21-5 cis-9-Hexadecenal 89 81204 056219-04-6 Cyclopentadecane 86 63051 000295-48-7 107 46,66 0,7 n-Hexadecanoic acid 98 92228 000057-10-3 Tridecanoic acid 95 65562 000638-53-9 Tridecanoic acid 90 65565 000638-53-9 1,2-Benzenedicarboxylic acid, 108 46,76 0,1 butyl cyclohexyl ester 72 119727 000084-64-0 1,2-Benzenedicarboxylic acid, 72 145664 000089-18-9 butyl 8-methylnonyl ester Dibutyl phthalate 72 105065 000084-74-2 Piperidine, 1-(5-trifluoromethyl-2 111 47,58 0,18 -pyridyl)-4-(1H-pyrrol-1-y1)- 64 114656 1000268-74-7 2-Allylpent-4-enoic acid, methyl 113 47,96 0,17 ester 60 26429 054385-33-0 121 Hexanedioic acid, bis(2- ethylhexyl 148385 000103-23-1 51,66 1,41 95 ) ester 95 148385 000103-23-1 Fuente: FODECYT 87-2006. 50

Pico Área Coincidencia tR Nombre Ref· CAS No. No. (%) (%) Diisooctyl adipate 91 148373 001330-86-5 Hexanedioic acid, bis(2- ethylhexyl 148385 000103-23-1 95 ) ester 91 148385 000103-23-1 123 Piperidine, 1-(5-trifluoromethyl-2- 51,99 0,26 60 114656 1000268-74-7 pyridyl)-4-(1H-pyrrol-1-y1)- Fuente: FODECYT 87-2006.

ANEXO 4 Resultados de cromatografía de gases acoplado a detector de ionización en llama

Se analizó la repetibilidad de los tiempos de retención de diversos aceites esenciales con potencial interés para el aroma de pinabete. Se puede observar que existe reproducibilidad del tiempo de retención, pero al analizar la repetibilidad en la composición del las muestras (Cuadro No. 8) se encontró que variaron significativamente. Las muestras analizadas fueron aceites esenciales comunes en coníferas con los que contaba internamente la Universidad del Valle par determinar tiempos de retención para comparar más adelante con las muestras de pinabete. Se analizaron 5 microlitros de cada aceite utilizando las condiciones antes mencionadas. En el cuadro No. 3. se presenta la tabulación de estos resultados.

Cuadro No. 13 Análisis estadístico de los tiempos de retención de los aceites esenciales comunes en coníferas. Categoría -pineno canfeno  pineno limoneno cariofileno Media 13,48825 15,185 16,726 18,26725 25,34725 Error típico 0,0707264 0,04691837 0,08480468 0,045330959 0,04363938 Mediana 13,493 15,207 16,7515 18,271 25,3495 Moda #N/A #N/A #N/A #N/A #N/A Desviación estándar 0,1414529 0,081265 0,16960936 0,090661918 0,08727877 Varianza de la muestra 0,0200089 0,006604 0,02876733 0,008219583 0,00761758 - - Curtosis 2,9441668 #¡DIV/0! 1,91125584 0,305093201 5,73631122 Coeficiente de - - - asimetría 0,1276566 -1,1289534 0,87362114 -0,226312438 0,02750344 Rango 0,313 0,158 0,409 0,217 0,164 Mínimo 13,327 15,095 16,496 18,155 25,263 Máximo 13,64 15,253 16,905 18,372 25,427 Suma 53,953 45,555 66,904 73,069 101,389 Cuenta 4 3 4 4 4 Nivel de confianza (95,0%) 0,2250833 0,20187359 0,26988659 0,144263478 0,13888013 Fuente: FODECYT 87-2006.

En esta sección se presentan los datos de áreas de los picos cromatográficos, datos para curva de calibración, regresiones lineales respectivas y análisis estadístico de los tiempos de retención. ANEXO 5 Cuadro No. 14 Cuantificación de alfa-pineno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21ºC.

Tiempo Cantidad No. de Área de g de - moles de Origen Código Cromatograma (SIG00) retención (counts*s) pineno pineno -pineno (min) (uL) Tejutla Ag6A 6 13,640 2,00E+07 9,57E-03 8,21E-03 6,03E-05 Tejutla Ag6B 7 13,327 9,66E+06 4,65E-03 3,99E-03 2,93E-05 Panquix Ag5J 5 13,419 7,03E+06 3,39E-03 2,91E-03 2,14E-05 San José Pinula Ag19A 17 13,567 5,18E+05 2,89E-04 2,48E-04 1,82E-06 Totonicapán Ag4B 2 12,842 2241401 1,11E-03 9,53E-04 7,00E-06 Fuente: FODECYT 87-2006.

Cuadro No.15 Curva de calibración para la cuantificación de alfa-pineno. Tiempo de a-pineno Volumen Cantidad de No. Área Volumen (uL/500uL de dicloro- a-pineno Dilución Código Cromat retención ograma (counts*s) inyectado diclorometano inyectada (min) metano) (uL) (uL) 1/10 Ag43A 43 15,488 8,27E+07 0,4 50 500 0,04 1/20 Ag43B 44 15,183 3,56E+07 0,6 25 500 0,03 1/40 Ag43C 45 15,113 2,79E+07 0,5 12,5 500 0,0125 48: 1000000 Ag48A 62 14,918 4,22E+04 0,5 6 125000 0,000024 6:50000 Ag48B 63 14,87 5,22E+04 0,4 6 50000 0,000048 1/1000 Ag48C 64 14,916 6,13E+05 0,6 4,4 5000 0,000528 5/1000 Ag48D 65 14,955 6,06E+06 0,5 5,4 1000 0,0027 "10/1000" Ag48E 66 14,998 1,10E+07 1 5,4 1000 0,0054 "1/80" Ag43D 46 0,5 6 500 0,006 Curva de calibración: Área=2097382082(uL a-pineno)- 89098,2825 uL a- pineno= (área+89098,2825)/2097382082

Fuente: FODECYT 87-2006.

Estadísticas de la regresión de la curva de calibración para la cuantificación de a-pineno Coeficiente de correlación múltiple 0,99762233 Coeficiente de determinación R^2 0,99525031 R^2 ajustado 0,99366708 Error típico 388728,753 Observaciones 5 Fuente: FODECYT 87-2006.

Cantidad de a-pineno inyectada (uL) Curva de regresión ajustada

1,20E+07 y = 2E+09x - 89098

1,00E+07

8,00E+06

6,00E+06

4,00E+06 Área (counts*s) Área

2,00E+06

0,00E+00 0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006

-2,00E+06 Cantidad de a-pineno inyectada (uL) Fuente: FODECYT 87-2006.

ANEXO 6 Cuadro No. 16 Cuantificación de beta-pineno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21ºC.

Cantidad Tiempo de de - No. Área g de- moles de - Origen Código Cromat retención pineno (counts*s) pineno pineno ograma (min) inyectada (uL) Tejutla Ag6A 6 16,757 1,41E+07 8,39E-03 7,21E-03 5,29E-05 Tejutla Ag6B 7 16,746 2,12E+07 1,26E-02 1,08E-02 7,94E-05 Panquix Ag5J 5 16,905 2,57E+07 1,52E-02 1,31E-02 9,61E-05 San José Pinula Ag19A 17 16,496 2,38E+05 1,42E-04 1,22E-04 8,92E-07 Fuente: FODECYT 87-2006.

Cuadro No.17 Curva de calibración para la cuantificación de b-pineno. (1S)-(-)-beta-pineno 99% Aldrich en diclorometano. Cantidad Tiempo -pineno de - No. de Área Volumen (uL/500uL Dilución Código Cromat pineno retención (counts*s) inyectado dicloro- ograma inyectada (min) metano) (uL) 1/10 Ag41A 38 16,7 1,02E+08 0,6 50 0,06 1/20 Ag41B 39 16,395 3,75E+07 0,5 25 0,025 1/40 Ag41C 40 16,285 2,43E+07 0,5 12,5 0,0125 1/50 regresión lineal: área counts*s = (1685054493,5806)(uL B pineno)

entonces uL B pineno = área counts*s/1685054493,5806

Fuente: FODECYT 87-2006.

Estadísticas de la regresión para la curva de calibración para la cuantificación de -pineno Coeficiente de correlación múltiple 0,99517797 Coeficiente de determinación R^2 0,99037919 R^2 ajustado 0,98075839 Error típico 5795737,9 Observaciones 3

Fuente: FODECYT 87-2006.

ANEXO 7 Cuadro No. 18 Cuantificación de limoneno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21ºC.

Tiempo Área No. de g de (+/-)- moles de (+/- Origen Código Cromat (counts*s retención limoneno )-limoneno ograma ) (min) Tejutla Ag6A 6 18,372 3,41E+06 2,42E-03 1,77E-05 Tejutla Ag6B 7 18,248 1,77E+06 1,23E-03 9,04E-06 Panquix Ag5J 5 18,294 1,74E+06 1,21E-03 8,88E-06 San José Pinula Ag19A 17 18,155 6,51E+04 -6,89E-06 -5,06E-08

Fuente: FODECYT 87-2006.

Cuadro No. 19 Curva de calibración +/- limoneno 99% Merck en diclorometano. Volu Cantidad Tiempo men (+/-)- Dicloro de (+/-)- No. de Área Dilución Código Cromatog inyec limoneno metano limoneno retención (counts*s) rama Tado (uL) (uL) inyectada (min) (uL) (uL) 6/1000 Ag45B 56 17,439 6,06E+06 0,4 6 1000 0,0024 4/1000 Ag45A 55 17,45 3,40E+06 0,5 6 1500 0,002 2/1000 Ag46C 58 17,32 1,65E+06 0,6 6 3000 0,0012 1/1000 Ag46B 59 17,3 9,47E+05 0,5 6 6000 0,0005 6/100000 Ag47A 60 17,313 8,44E+04 0,6 6 100000 0,000036 48/1000000 Ag47B 61 17.304 4,43E+04 0,6 6 125000 0,0000288 y= 1378074731,43168 x + 74555,5034923425 entonces: x= (y- 74555,5034923425)/1378074731,43168

Fuente: FODECYT 87-2006.

Estadísticas de la regresión para la cuantificación de (+/-)-limoneno Coeficiente de correlación múltiple 0,98716563 Coeficiente de determinación R^2 0,97449598 R^2 ajustado 0,96174398 Error típico 150669,477 Observaciones 4 Fuente: FODECYT 87-2006.

Gráfica de la curva de regresión y datos experimentales para el análisis de limoneno.

Cantidad de limoneno inyectada (uL) Curva de regresión ajustada

2,00E+06

1,80E+06 y = 1E+09x + 74556 1,60E+06

1,40E+06

1,20E+06

1,00E+06

8,00E+05 Área (counts*s) Área 6,00E+05

4,00E+05

2,00E+05

0,00E+00 0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014 Cantidad de limoneno inyectada (uL)

Fuente: FODECYT 87-2006.

ANEXO 8 Perfiles cromatográficos de las emanaciones de pinabete

ANEXO 9 Espectros de masas de los componentes mayoritarios de las emanaciones de pinabete.

ANEXO 8 PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO