CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA INFORME FINAL IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES PRODUCIDOS POR EL PINABETE ABIES GUATEMALENSIS Y CUANTIFICACIÓN DE LOS COMPONENTES MAYORITARIOS PROYECTO FODECYT No. 87-2006 MSc. LUCÍA NITSCH VELÁSQUEZ Investigador Principal GUATEMALA, DICIEMBRE 2010. AGRADECIMIENTOS: La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-, Universidad del Valle de Guatemala. Los análisis GC-MS fueron realizados en la Universidad Mariano Gálvez. i RESUMEN El pinabete (Abies guatemalensis) se encuentra en peligro de extinción porque el aroma de sus ramas son símbolo del tiempo de Navidad en la región de Guatemala; éstas son cortadas en diciembre, durante el tiempo de generación de la semilla dentro del ciclo fenológico de este tipo de abeto. Buscando contribuir a las estrategias de conservación de esta especie endémica, y como parte de un primer paso para diseñar un producto comercializable que en un futuro pueda generar fuentes de trabajo, en este estudio fueron identificados y cuantificados los compuestos químicos considerados como componentes mayoritarios en el aroma del pinabete. Las muestras de tres diferentes lugares (Panquix, Tejutla y San José Pinula) fueron analizados y comparados. Las emanaciones fueron extraídas con la técnica de microextracción en fase sólida (SPME por sus siglas en inglés); la identificación fue por cromatografía de gases (GC) acoplada a espectrometría de masas (MS); la cuantificación de 3 comoponentes fue con GC acoplado al detector de ionización en llma. La presencia de alfa-pineno, beta-pineno, limoneno, y cariofileno fueron confirmadas; al mismo tiempo el tricicleno –previamente detectado en el aceite esencial- no fue detectado. La composición de las emanaciones de la muestra de Panquix fue: alfa-pineno (9.33E-05 mol/g*cm3 ± 2%), beta-pineno 4.18E-04 mol/g*cm3 ± 3%, (±)-limoneno 4.89E-04 mol/g*cm3 ± 5%). Las composiciones de las muestras provenientes de diferente lugar de origin fueron differentes, a pesar del hecho que todas ellas eran de la misma especie y eran vendidas por el mismo olor característico. Sin embargo, los 4 componentes fueron detectados consistentemente en el aroma de estas ramas de pinabete, y por lo tanto es recomendable que se les incluya en el diseño del producto. Algunos de los compuestos detectados y que serán objeto de futuros estudios son: mirceno, eugenol, sesquiterpenoides, cetonas, ésteres de ácidos grasos, y fenilpropanoides (como benzaldehído, ácido benzóico, y otros). Entre las técnicas y condiciones, recomendadas para futuras investigaciones del aroma de pinabete, se encuentran: SPME en el bosque, GC-MS utilizando el “espacio de cabeza” (headspace), todas ellas aplicadas durante el tiempo de Navidad. Otras recomendacions son estudiar el perfil cromatográfico como función del lugar de origen para encontrar los compuestos que son comunes en estos pinabetes. Esto ayudará a definir cuáles son los compuestos que son los que dan el tradicional aroma a pinabete. Estos datos pueden servir también para un análisis quimiotaxonómico. Palabras clave: pinabete, Abies guatemalensis, aroma, microextraccion de fase sólida, terpenoides. i SUMMARY Pinabete (Abies guatemalensis) is in danger to dissapear because its branchs aroma are symbol of Christmas time in the Guatemalan region; those are cut in December during the seeding time on the phenology of this fir tree. In order to contribute to conserve this endemic specie, and as part of a first step to design a commercial product that will lead to generate job sources in the future, in this study were identified and cuantified the chemical compounds considered as major components in pinabete’s aroma. Samples from 3 different places (Panquix, Tejutla and San José Pinula) were analyzed and compared. Emanations were extracted with the solid phase microextraction technique (SPME), identification were made by gas chromatography (GC) coupled to mass spectrometry (MS), cuantification of 4 componentes was by GC coupled to flame ionization detector. The presence of alpha-pinene, beta-pinene, limonene, and cariophyllene were confirmed; at the same time tricyclene -previously founded in the essential oil- was non-detected. The composition of Panquix sample emanations was: alpha-pinene (9.33E-05 mol/g*cm3 ± 2%), beta-pinene 4.18E’04 mol/g*cm3 ± 3%, (±)- limonene 4.89E04 mol/g*cm3 ± 5%). The compositions of samples from different origin were different, despite the fact that all of them are the same specie and are offered for the same smell. Nevertheless, those 3 components are consistently present in the pinabete’s aroma, and it is recommended to be included in the product design. However, since them are common to other tree firs there are still other components to identify and quantify to get the particular pinabete’s aroma composition. Some of the compounds detected and that will be in the follow up of this research are: myrcene, eugenol, sesquiterpenoids, ketones, fatty acid esters, and phenylpropanoids (such as benzaldehyde, benzoic acid and others). Between the techniques recommended for future research on pinabete’s aroma are SPME in the forest, headspace GC-MS, all of them applied during Christmas time. Other recommendations are to study the chromatographic profile as function of geographical origin to find the common compounds that will help to define what are compounds that give the traditional pinabete’s aroma. This data can be used for a chemotaxonomy analysis as well. Keywords: pinabete, Abies guatemalensis, aroma, solid phase microextraction, terpenoids. ii CONTENIDO Página RESUMEN i LISTA DE CUADROS iii LISTA DE FIGURAS iv LISTA DE ABREVIATURAS v PARTE I 1 1.1 INTRODUCCIÓN 1 1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3 1.2.1 Antecedentes en Guatemala 3 1.2.2 Justificación 4 1.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS 6 1.3.1 Objetivos 6 1.3.1.1 Generales 6 1.3.1.2 Específicos 6 1.3.1.3 Hipótesis 6 1.4 METODOLOGÍA 7 1.4.1 Las Variables 7 1.4.2 Indicadores 8 1.4.3 Estrategia Metodológica 8 1.4.3.1 Población y Muestra 8 1.4.4 El Método 8 1.4.5 Técnica Estadística 10 1.4.6 Instrumentos Utilizados 10 PARTE II 11 2 MARCO TEÓRICO 11 PARTE III 26 3 RESULTADOS 26 3.1 Discusión de Resultados 33 PARTE IV 35 4.1 CONCLUSIONES 35 4.2 RECOMENDACIONES 36 4.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS 37 4.4 ANEXOS 42 4.4.1 Descripción Botánica del Pinabete 43 4.4.2 Resultados de Cromatografía de Gases Acoplado a Espectrometría de Masas (Panquix) 44 4.4.3. Resultados de Cromatografía de Gases Acoplado a Espectrometría de Masas (San José Pinula) 46 4.4.4. Resultados de Cromatografía de Gases Acoplado a Detector de Ionización de Llama 50 4.4.5. Cuantificación de alfa-pineno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21ºC 51 4.4.6. Cuantificación de beta-pineno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21ºC 53 4.4.7. Cuantificación de limoneno en emanaciones de ramilla de pinabete obtenidas a 21ºC 54 PARTE V 67 5.1 INFORME FINANCIERO 67 iii LISTA DE CUADROS Página Cuadro No. 1, Reactivos utilizados durante el estudio. .......................................................................................... 9 Cuadro No. 2, Especies asociadas a Abies guatemalensis en diversos bosques naturales de Guatemala .............................................................................................................................................................................. 17 Cuadro No.3, Breve historia del pinabete en Guatemala. .............................................................................................................................................................................. 19 Cuadro No. 4, Especies del género Abies que son o han sido investigadas en el área de fitoquímica. .............................................................................................................................................................................. 21 Cuadro No. 5, Resumen de los resultados de las investigaciones fitoquímicas sobre el pinabete. .............................................................................................................................................................................. 22 Cuadro No. 6, Resultados del tamizaje fitoquímico por reacciones químicas de extractos de diferentes polaridades de la ramilla del pinabete. .............................................................................................................................................................................. 26 Cuadro No. 7, Componentes de las emanaciones de pinabete analizados por GC-MS ........................................ 26 Cuadro No. 8, Tabulación de tiempos de retención de aceites esenciales comunes en coníferas ......................... 27 Cuadro No. 9, Tabulación de resultados de la GC-FID de las emanaciones de pinabete a 21 C .......................... 29 Cuadro No. 10, Composición de las emanaciones de pinabete de diferentes lugares de origen, a 21 C ........................................................................................................................................................................... 31 Cuadro No. 11, Resultados tabulados del análisis por GC-MS de emanaciones de pinabete proveniente de Panquix.