УДК 595.7(571.56) Н.Г. ЛИ Льдонуклеирующая активность гемолимфы ceramboides, обитающего в Центральной Якутии

UDC 595.7(571.56) N.G. LI Ice-Nucleating Activity of Hemolymph of Upis ceremboides Inhabiting in Central Yakutia

Стратегия холодоустойчивости Upis ceramboides (Coleoptera: Tenebrionidae) основана на толерантности к замерзанию, которая позволяет данному виду обитать в экстремально холодном климате Якутии. Морозотолерантность обусловлена присутствием льдонуклеирующих белков в гемолимфе, льдонуклеирующий потенциал которых максимален в зимний период. Сезонные изменения концентрации полиолов в гемолимфе влияют на величину температуры переохлаждения, которая выше весной, чем в зимний период. Летом жуки чувствительны к температурам ниже их температур переохлаждения (–7,3°С), однако их толерантность к замерзанию возрастает в течение осени, начиная с августа; в декабре нижняя летальная температура находится в области ниже –83°С. Изменения в степени морозотолерантности тесно связаны с сезонными изменениями в активности и концентрации льдонуклеаторов, а также полиолов. Ключевые слова: Upis ceramboides, льдонуклеирующие белки, температура переохлаждения, осмоляльность гемолимфы, льдонуклеирующий потенциал. Стратегія холодостійкості Upis ceramboides (Coleoptera: Tenebrionidae) заснована на толерантності до замерзання, яка дозволяє даному виду мешкати в екстремально холодному кліматі Якутії. Морозотолерантність зумовлена наявністю льодонуклеюючих білків у гемолімфі, льодонуклюючий потенціал яких максимальний у зимовий період. Сезонні зміни концентрації поліолів у гемолімфі впливають на величину температури переохолодження, яка вища весною, ніж в зимовий період. Влітку жуки чутливі до температур нижче їхніх температур переохолодження (–7,3°С), але їх толерантність до замерзання зростає на протязі осені, починаючи з серпня; у січні нижня летальна температура знаходиться в межах нижче –83°С. Зміни в ступені морозотолерантності тісно пов'язані з сезонними змінами в активності та концентрації льодонуклеаторів, а також поліолів. Ключові слова: Upis ceramboides, льодонуклеюючі білки, температура переохолодження, осмоляльність гемолімфи, льодонуклеюючий потенціал. Strategy of cold resistance of Upis ceramboides (Coleoptera: Tenebrionidae) is based on tolerance to freezing, enabling this species to inhabit in extremely cold climate of Yakutia. Frost-tolerance is stipulated by the presence of ice-nucleating proteins in hemolymph, ice-nucleating potential of those are maximum in winter period. Seasonal changes of concentration of polyols in hemolymph affect the value of overcooling temperature, which is higher in spring than in winter. In summer the are sensitive to the temperatures lower those of their supercooling (–7.3°C), but their tolerance to freezing increases during autumn, starting from August; in December the lower level of lethal temperatures is within the range below –83°C. The changes in the level of frost-tolerance are tightly related to the seasonal changes in activity and concentration of ice nucleators, as well as polyols. Key words: Upis ceramboides, ice-nucleating proteins, supercooling temperature, hemolymph osmolality, ice-nucleating potential . Холодоустойчивые насекомые Якутии, в экстре- Cold resistant of Yakutia, an extremely cold мально холодном регионе Земли, используют как region of the Earth, use both frost-tolerance and frost- морозотолерантную, так и морозоизбегающую avoidance strategies, but the first one is likely more стратегии, но первая, вероятно, более предпочти- preferable because it allows their survival under con- тельна, поскольку позволяет им выживать в ditions of this region [1]. условиях данного региона [1]. In the major cases the adaptations forming the ba- В большинстве случаев адаптации, формирую- sis of the frost-tolerance strategy are related to the щие основу стратегии морозотолерантности, production and release of ice-nucleating compounds связаны с продукцией и выделением льдонуклеи- into extracellular liquid: proteins responsible for hete- рующих соединений во внеклеточную жидкость – rogeneic nucleation at the temperature slightly below белков, которые отвечают за гетерогенную нук- zero. It is generally accepted that the function of these леацию при температуре немного ниже 0°С. При- compounds consists in inhibiting lethal intracellular нято считать, что функция этих соединений заклю- freezing by means of the controlled transformation of

Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН, Institute of Biological Problems of Cryolitozone of the Siberian Branch г. Якутск of the Russian Academy of Sciences, Yakutsk, Russia

* Адрес для корреспонденции: пр. Ленина, 41, Якутск,Россия * Address for correspondence: 41, Lenina ave.,Yakutsk, Russia 677980; электронная почта: [email protected] 677980, e-mail: [email protected]

проблемы 34 problems криобиологии of cryobiology Т. 21, 2011, №1 Vol. 21, 2011, №1 чается в ингибировании летального внутриклеточ- extracellular liquid into ice [3]. There is the supposition ного замерзания путем контролируемого превра- that they contribute to the organization of aqueous mo- щения внеклеточной жидкости в лед [3]. Предпола- lecules into ice-like configuration, thereby increasing гают, что они способствуют организации водных the probability of ice crystal formation at these tempe- молекул в льдоподобную конфигурацию, что по- ratures [13]. вышает вероятность образования кристаллов льда The process of ice formation in extracellular me- при таких температурах [13]. dium is accompanied with the rise in concentration of Процесс льдообразования во внеклеточной salts up to toxic levels, the changes in cell volume due среде сопровождается повышением концентрации to the random outflow of liquid into frozen environ- солей до токсических уровней, изменением объема ment [7]. Due to this reason the insects produce sig- клеток вследствие произвольного оттока внут- nificant amount of polyols, performing the cryoprotec- риклеточной жидкости в замерзшую окружающую tion of an organism, thereby preventing the destructive среду [7]. По этой причине насекомые вырабаты- consequences of ice formation. In the majority of cases вают значительное количество полиолов, которые they produce glycerol [15]. In addition, there have been осуществляют криопротекцию организма, предот- described the insects producing sorbitol and threitol [9], вращая тем самым разрушительные последствия as well as ethylene glycol [4]. льдообразования. В большинстве случаев они про- It should be noted that the strategy of frost-toler- дуцируют глицерол [15]. Кроме того, описаны на- ance is characteristic also for the insects inhabiting in секомые, вырабатывающие сорбитол и треитол [9], warm regions of the Southern hemisphere [11]. In spite а также этиленгликоль [4]. of mild climate the temperature in this part of the Earth Следует отметить, что стратегия морозотоле- is not stable, there are observed frequent and short- рантности характерна также для насекомых, оби- term frosts after those the positive temperature is again тающих в теплых регионах Южного полушария setting. Under such non-predictable conditions the ice [11]. Несмотря на мягкий климат, температура в nucleation allows the insects to freeze and then thaw этой части Земли нестабильна, наблюдаются час- without damages in tissues and organs. In this case тые и кратковременные заморозки, после которых the site of ice nucleation is bowel, wherein nucleating вновь устанавливается положительная темпера- particles initiate crystallization in feeding insects at low- тура. При таких непредсказуемых условиях льдо- ering of the temperature a little bit below zero. Since нуклеация позволяет насекомым замерзать, а за- winter in these regions of the Southern hemisphere is тем оттаивать без повреждения тканей и органов. mild the insects do not develop an extensive seasonal В данном случае местом льдонуклеации является cold resistance. This type of tolerance to freezing is кишечник, в котором нуклеирующие частицы ини- non-specific and is stipulated with the effect of exoge- циируют кристаллизацию у питающихся насеко- neous ice nucleators of non-specific origin. мых при понижении температуры немного ниже The insects inhabiting in extremely cold regions simi- нуля. Поскольку зима в таких регионах Южного lar to Yakutia probably use more specialized strate- полушария мягкая, насекомые не развивают экс- gies. Their tolerance to freezing is likely stipulated with тенсивную сезонную холодоустойчивость. Такой biosynthesis of endogeneous nucleators being the prod- тип толерантности к замерзанию является неспе- uct of evolutional selection. In this sense ice nucleators цифическим и обусловлен действием экзогенных may be considered as the components of specific ad- льдонуклеаторов неспецифической природы. aptation to freezing [14]. Насекомые, обитающие в экстремально холод- It is known that biological activity of ice nucleators ных областях, подобных Якутии, по-видимому, significantly differs and varies depending on their ori- используют более специализированные стратегии. gin, osmolality of the medium, amount of ice nucleat- Вероятно, толерантность к замерзанию у них обус- ing agents [13]. There are recent data that the molecu- ловлена биосинтезом эндогенных нуклеаторов, les of ice nucleator proteins are dynamic structures являющихся продуктом эволюционного отбора. В with an ability to polymerization and depolymerization, этом смысле льдонуклеаторы можно рассматри- determining their ice-nucleating potential [12]. вать как компоненты специфической адаптации к Ice nucleators in insects were discovered more than замерзанию [14]. 30 years ago, however, there is a lack of information Известно, что биологическая активность льдо- on the properties and functional peculiarities of these нуклеаторов значительно отличается и изменяется compounds, produced by insects inhabiting under the в зависимости от их природы, осмоляльности сре- conditions of extremely cold climate. Probably, the ne- ды, количества нуклеирующих агентов [13]. В нас- cessity of adaptation to such severe climatic condi- тоящее время появились сведения о том, что моле- tions resulted in the production by these insects of the кулы белковых нуклеаторов являются динамич- most effective specific ice nucleators, the study of

проблемы 35 problems криобиологии of cryobiology Т. 21, 2011, №1 Vol. 21, 2011, №1 ными структурами, обладающими способностью which allows the deeper understanding of frost-toler- к полимеризации и деполимеризации, что опреде- ance in a whole. ляет их льдонуклеирующий потенциал [12]. The research aim is to investigate ice-nucleating Льдонуклеаторы у насекомых были открыты potential of hemolymph of holoarctic species Upis более 30 лет назад, однако информации о свойствах ceramboides widely spread in forests of Yakutia. и особенностях функционирования этих соединений, This paper represents the results of the study of продуцируемых насекомыми, обитающими в усло- seasonal differences in ice-nucleating activity of U. ce- виях экстремально холодного климата очень мало. ramboides hemolymph as well as some physiological Возможно, необходимость адаптации к столь суро- characteristics of their cold resistance. Since there is вым климатическим условиям привела к продук- no information in available literature on this problem, ции данными насекомыми наиболее эффективных the paper involves the data of basic studies, which could специфических льдонуклеаторов, изучение которых be the basis of more profound experiments on investi- позволит лучше понять стратегию морозотоле- gation of ice-nucleating proteins of frost-tolerant in- рантности в целом. sects. Цель работы – изучение льдонуклеирующего потенциала гемолимфы голоарктического вида Materials and methods Upis ceramboides, широко распространенного в The research object was the beetles U. ceram- березовых лесах Якутии. boides (Coleoptera: Tenebrionidae) overwintering В работе приведены результаты изучения сезон- under the bark of dead trees (birth, pine) usually higher ных различий в льдонуклеирующей активности than the snow cover is, therefore in winter they are гемолимфы U. ceramboides, а также некоторые subjected to the effect of extremely low temperatures физиологические характеристики их холодоустой- (–45...–55°C). чивости. Поскольку в литературе отсутствует ин- The insects (imago) were collected in summer as формация по этой проблеме, в работе представ- well as during early and late autumn. The insects col- лены данные базовых исследований, на основе ко- lected in the vicinity of Yakutsk city in September 2007 торых могут быть проведены последующие более were maintained during winter in the conditions similar глубокие эксперименты по изучению льдонуклеи- to natural ones.Extremely cold climate of Yakutia is рующих белков морозотолерантных насекомых. notable by the long (from October to April) dark and very cold winters. This period is spent by insects in Материалы и методы diapause state. If the insects are transferred from an Объектом исследования были жуки U. ceram- open air, the temperature of which reaches –47…–50°C, boides (Coleoptera: Tenebrionidae), зимующие под into a cold chamber with the temperature of 0°C, then корой погибших деревьев (береза, сосна) обычно their ability to coordinated movement will recover ap- выше снежного покрова, поэтому в зимнее время proximately within 24 hrs. они подвержены воздействию экстремально низких The environmental temperature in spring varies температур (–45...–55°С). from –5 to 4°C, therefore prior to the experiments to Насекомых (имаго) собирали летом, а также stabilize the organism the insects were maintained at ранней и поздней осенью. Насекомых, собранных constant temperature (4°C). Only alive individuals were в окрестности г. Якутска в сентябре 2007 г., содер- chosen. жали зиму в условиях, сходных с природными. Для Summer and autumn individuals were preliminarily экстремально холодного климата Якутии харак- incubated at 4°C for 4 hrs to clean the bowel. терны длинные (с октября по апрель), темные и In the experiments hemolymph of insects was de- очень холодные зимы. Этот период насекомые rived by capillary method on April 4th, July 10th, Au- проводят в состоянии диапаузы. Если насекомых gust 17th and December 20th 2008. перенести с открытого воздуха, температура кото- For the experiments there was used the lowest tem- рого достигает –47…–50°С, в холодную камеру с perature (–83°C), which can be obtained under our температурой 0°С, то их способность к координи- laboratory conditions. The insects were stepwise cooled рованному движению восстановится примерно в prior to their incubation at this temperature. Five indi- течение 24 ч. viduals were taken from their hibernating sites within Весной температура окружающей среды варьи- the period when air temperature reached –42°C. Un- рует от –5 до 4°С, поэтому до начала эксперимен- der these conditions the beetles were carefully placed тов для стабилизации организма насекомых со- into a plastic box, located inside thermo-insulated pack- держали в течение 8 ч при постоянной температуре ing to avoid extra-rapid cooling of the insects down to (4°С). Для эксперимента отбирали только живые –83°C. Then the insects were transfered into refriger- экземпляры. ating chamber with the temperature of –83°C for 3 hr

проблемы 36 problems криобиологии of cryobiology Т. 21, 2011, №1 Vol. 21, 2011, №1 Летних и осенних особей также предварительно long incubation. Afterwards the box with the insects инкубировали при температуре 4°С в течение 4 ч was carefully removed for 1 hr on an open air at the для очищения кишечника. temperature of –40…–43°C. The box was placed В экспериментах гемолимфу насекомых полу- overnight into a freezing chamber at –24°C and later чали капиллярным методом 4 апреля, 10 июля, 17 the insects were put into upper chamber of the fridge августа и 20 декабря 2008 г. and maintained at 0°C for 3 days. Viability of insects Для экспериментов использовали самую низкую was assessed on their ability to active coordinated температуру (–83°С), которую можно получить в movement. наших лабораторных условиях. Инкубации насе- The samples of hemolymph were derived by means комых при данной температуре предшествовало of pinning the abdomen with thin glass capillary [17]. их поэтапное охлаждение. Пять особей были взяты Herewith hemolymph under the effect of capillary forces с их зимовочных мест в период, когда температура entered into a capillary. To prevent the evaporation and воздуха достигала –42°С. При данных условиях oxidation of hemolymph the samples were isolated in- жуки осторожно были помещены в пластиковый side the capillary by means of mineral oil drops. To бокс, находящийся внутри термоизоляционной упа- prepare the sample of diluted hemolymph 0.5 ml of na- ковки, во избежание чрезмерно быстрого охлажде- tive hemolymph was placed by specially prepared mi- ния насекомых до –83°С. Затем насекомые были cro-syringe into a thin capillary containing 4.5 ml NaCl перенесены в рефрижераторную камеру с темпе- solution of the certain osmolality. ратурой –83°С для 3-часовой инкубации. По исте- The supercooling temperature of the insects within чении данного времени бокс с насекомыми осто- the range of 0…–25°C was measured by means of рожно перенесли на 1 ч на открытый воздух при thermocouple connected to a recorder. Herewith the температуре –40…–43°С. Бокс поместили на ночь end of thermocouple was tightly pressed to a в морозильную камеру при –24°С, после чего насе- body. Supercooling temperature was examined on exo- комых переносили в верхнюю камеру холодильника thermal effect, accompanying the transition of insect's и выдерживали при 0°С в течение 3-х суток. Жизне- hemolymph from a liquid state into a solid one [6]. способность насекомых оценивали по их способ- Beetle hemolymph osmolality was found on the tem- ности к активному координированному движению. perature of melting with the osmometer (Clifton Образцы гемолимфы насекомых получали пу- Nanolitre) as described in [16]. тем прокалывания брюшка тонким стеклянным ка- Hemolymph of 5–10 nl volume prepared as above- пилляром [17]. При этом гемолимфа под действием mentioned was layered to the surface of the pores of капиллярных сил поступала в капилляр. Чтобы measuring wells, preliminarily loaded with mineral oil предотвратить испарение и окисление гемолимфы, by means of specially designed for this aim micro-sy- образцы изолировали внутри капилляра каплями ringe. The well was cooled down to the moment of the минерального масла. Для приготовления образца sample freezing in it, afterwards it was slowly thawed. разбавленной гемолимфы 0,5 мкл нативной гемо- The temperature at which the last smallest crystal dis- лимфы посредством специально изготовленного appeared was assumed as melting temperature. микрошприца вносили в тонкий капилляр, содержа- The samples of native and denaturated at 100°C щий 4,5 мкл раствора NaCl определенной осмоляль- hemolymph were used in the research. Supercooling ности. temperature of these samples was examined by capil- Температуру переохлаждения насекомых в диа- lary method. пазоне 0…–25°С измеряли с помощью термопары, Using the above described method there was meas- соединенной с самописцем. При этом конец термо- ured ice-nucleating activity in winter and spring sam- пары был плотно прижат к телу насекомого. Темпе- ples of beetle hemolymph. To obtain statistically sig- ратуру переохлаждения определяли по экзотерми- nificant results in each case 50 measurements were ческому эффекту, сопровождающему переход done. гемолимфы насекомого из жидкого состояния в To examine specific ice-nucleating activity the he- твердое [6]. molymph was stepwise diluted 10 times (factor 10) in Осмоляльность гемолимфы жуков определяли 5 µl 0.9 NaCl solution [18]. Supercooling temperature по температуре плавления с помощью осмометра of the diluted hemolymph samples as the criterion of (“Сlifton Nanolitre”), как описано в [16]. specific ice-nucleating activity was recorded by means Гемолимфу объемом 5–10 нл, приготовленную of thermocouple connected to the recording gauge. описанным выше способом, наносили на поверх- Before the measurement the capillary with hemolymph ность пор измерительных ячеек, которые предвари- was centrifuged at 3000 rpm during 2 min to remove тельно загружали минеральным маслом посред- hemocytes. Measuring was done simultaneously for 4 ством специально изготовленного для этих целей samples.

проблемы 37 problems криобиологии of cryobiology Т. 21, 2011, №1 Vol. 21, 2011, №1 микрошприца. Ячейку охлаждали до момента за- Using multi-purpose lackmus paper there was found мерзания образца в ней, после чего его медленно an approximate pH value of U. ceramboides hemo- отогревали. Температуру, при которой исчезал по- lymph, which made 7.0. Therefore the optimum of pH следний самый маленький кристалл, принимали за for hemolymph ice-nucleating activity was studied in температуру плавления. 0.1 M Na-phosphate buffer with pH 6.0–8.0. In the В работе использовали образцы нативной и де- work there was applied capillary method of examining натурированной при 100°С гемолимфы. Темпера- the ice-nucleating activity. туру переохлаждения данных образцов определяли Capillary with 5 µl of corresponding buffer served капиллярным методом. as the control sample. The supercooling temperature По описанному выше методу измеряли льдонук- of this sample was found in the same way as the su- леирующую активность в зимних и весенних об- percooling temperature of the insects. разцах гемолимфы жуков. Для получения статис- The experimental sample contained 0,5 µl hemo- тически достоверных результатов в каждом слу- lymph of U. ceramboides in 4.5 µl of corresponding чае было проведено по 50 измерений. buffer. The maximum ice-nucleating activity was the Для определения специфической льдонуклеи- difference between the experimental value of super- рующей активности гемолимфу поэтапно разво- cooling temperature and the the control one. дили в 10 раз (фактор 10) в 5 мкл 0,9%-го раствора Protein concentration was found by Lowry method NaCl [18]. Температуру переохлаждения разбав- as described in [5]. Prior to measurements the sam- ленных образцов гемолимфы как критерий специ- ples of winter and spring hemolymph were diluted with фической льдонуклеирующей активности регистри- physiological solution 20 times, 10 times for autumn, ровали с помощью термопары, соединенной с and 5 times for summer one. регистрационным счетчиком. Перед измерением In the research the ANOVA method with statisti- капилляр с гемолимфой центрифугировали при cal software SAS was used. 3000 об/мин в течение 2 мин для удаления гемоци- тов. Измерение проводили одновременно для 4-х Results and discussion образцов. U. ceramboides (Coleopetra: Tenebrionidae) are С помощью универсальной лакмусовой бумаги large beetles of 373 mg mass referred to frost-tolerant определяли приблизительное значение рН гемо- species [2]. The winter in Central Yakutia is charac- лимфы U. ceramboides, которое составляло 7,0. terized by extremely low temperature. Snowline is usu- Поэтому оптимум рН для льдонуклеирующей ак- ally thin so the beetles in such conditions are less pro- тивности гемолимфы исследовали в 0,1 М Na-фос- tected from extremely low temperatures [10] which фатном буфере с рН 6,0–8,0. В работе также при- during a recent decade have been registered within меняли капиллярный метод определения льдонук- the temperature range –45…–49°C (rarely down to леирующей активности. –55°C) during two and more weeks. В качестве контрольного образца использовали According to the Miller's data U. ceramboides in- капилляр, содержащий 5 мкл соответствующего habitant in Alaska is highly cold resistant species due буфера. Температуру переохлаждения данного об- to its producing of two cryoprotectants: sorbitol and разца измеряли так же, как и температуру переох- threitol [9]. This species is frost-tolerant with an aver- лаждения насекомых. age supercooling temperature of –6°C during the whole Опытный образец содержал 0,5 мкл гемолимфы year and as the author notes there were not revealed U. ceramboides в 4,5 мкл соответствующего буфе- any seasonal changes of cooling temperature in spite ра. Максимальная льдонуклеирующая активность of occurring changes in hemolymph. The beetles sho- определяли как разность между опытным и конт- wed the sensitivity to cooling rate and survived at рольным значениями температуры переохлажде- –60°C, the lowest temperature that may be obtained ния. in laboratory [9]. Концентрацию белка определяли по методу In these investigations U. ceramboides beetles were Лоури, как описано в [5]. Перед измерениями образ- resistant to 3-hour exposure at –83°C and then were цы зимней и весенней гемолимфы разводили фи- successfully reactivated during 3 days. Thus lethal tem- зиологическим раствором в 20, осенней – 10 и лет- perature for Yakutian population of U. ceramboides ней – 5 раз. is the one below –83°C. В работе использовали метод ANOVA со ста- As it was mentioned one of the principles of insect тистическим пакетом SAS. freezing tolerance is the production of endogenous ice nucleators. According to the Lundheim's classification Результаты и обсуждение there are distinguished 2 types of ice nucleators, adap- U. cerаmboides (Coleoptera: Tenebrionidae) – tive and random [8]. крупные жуки массой до 373 мг, относящиеся к It has been established that adaptive ice nucleators морозотолерантным видам [2]. Зима в Централь- produced by frost-tolerant insects are of protein natu-

проблемы 38 problems криобиологии of cryobiology Т. 21, 2011, №1 Vol. 21, 2011, №1 ной Якутии характеризуется очень низкой темпера- re. They appear in hemolymph when insects are pre- турой. Снежный покров обычно тонкий, поэтому paring to diapause. It is suggested, that in summer the жуки в таких условиях менее защищены от экстре- ice nucleation proteins either disappear or are "masked" мально низких температур [10], которые в послед- in membrane structures [15]. Random ice nucleators нее десятилетие регистрируются в области –45… initiate a spontaneous ice formation and do not protect –49°С (в редких случаях до –50…–55°С) в течение from a cold damage the insects inhabitant in extremely двух и более недель. cold regions. В соответствии с данными L.K. Miller U. ceram- Nowadays the criterion of nucleator activity is the boides, обитающий на Аляске, является высоко- temperature at which crystallization of liquids occurs, холодоустойчивым видом благодаря продуциро- it is called as the system supercooling temperature. ванию им двух криопротекторов: сорбитола и тре- As Zachariassen showed, the rise in concentration of итола [9]. Данный вид является морозотолерант- os-motically active solutions lowered the temperature ным со средней температурой переохлаждения в at which biological ice nucleators caused the freezing течение всего года –6°С и, как отмечает автор, in a system. Coefficient of active depression is usually не было выявлено каких-либо сезонных изменений approximately equal to colligative depression of melt- температуры переохлаждения, несмотря на проис- ing temperature, the value of which makes 1.86°C/Osmol. ходящие изменения в гемолимфе. Жуки проявляли It is known, that accumulation of polyols moderately чувствительность к скорости охлаждения и выжи- affects the ice nucleation activity [13]. So polyols will вали при температуре –60°С – самой низкой темпе- affect the supercooling point and in this sense it is not ратуре, которую можно получить в лаборатории [9]. an exact measure of nucleating activity in a whole. В данных исследованиях жуки U. ceramboides It has been shown that supercooling temperature были устойчивы к 3-часовой экспозиции при –83°С of U. ceramboides is exposed to seasonal fluctuations и затем проходили успешную реактивацию в тече- [2]. Statistically significant data confirm that in winter ние 3-х суток. Таким образом, летальной для якут- the ice-nucleating activity of beetle hemolymph is sig- ской популяции U. ceramboides является темпера- nificantly lower than in spring (p < 0.001). Fig. 1 shows тура ниже –83°С. the distribution of nucleating temperatures during dilu- Как было отмечено выше, одним из принципов tion of 0.5 µl hemolymph in 4.5 µl of 0.9% NaCl solu- стратегии морозотолерантности насекомых яв- tion. The most ice nucleators with activity at –8.5°C ляется продукция эндогенных льдонуклеирующих are present in spring samples. Significant number of агентов. В соответствии с классификацией R. Lund- ice nucleators with supercooling point of –10.5°C was heim, различают два типа льдонуклеаторов: адап- noted in hemolymph of winter beetles U. ceramboides. тивные и случайные [8]. In winter period the hemolymph osmolality is higher Установлено, что адаптивные льдонуклеаторы, (Table). Polyols probably stipulate the depression of продуцируемые морозотолерантными насекомы- insect supercooling temperature, so during this period ми, имеют белковую природу. Они появляются в the hemolymph is characterized by a moderate nucle- гемолимфе в период подготовки насекомых к диа- ating activity. Generally, there is an obvious correlation паузе. Предполагают, что летом льдонуклеирую- between supercooling temperature and value of hemo- щие белки либо исчезают, либо “маскируются” в lymph osmolality, varying depending on the season of мембранных структурах [15]. Случайные льдонук- a year (Fig. 2). леаторы инициируют спонтанное льдообразование Ice-nucleating activity is the function of quantita- и не защищают от холодового повреждения насеко- tive content of ice-nucleating agents. The samples, con- мых, обитающих в экстремально холодных регио- taining the same number of ice nucleators, have the нах. same supercooling temperature [19]. The present in- В настоящее время критерием активности нук- vestigation shows that an ice-nucleating activity is as- леаторов является температура, при которой про- sociated with certain protein fraction. If hemolymph исходит кристаллизация жидкости, ее принято на- fraction will be boiled or treated by protease, the su- зывать температурой переохлаждения системы. percooling point lowers from –8 to –11°C testifying to Как было показано K.E. Zachariassen, повышение the loss of ice-nucleating activity. концентрации осмотически активных растворов As there is no method for studying the single mo- понижает температуру, при которой биологические lecules of ice-nucleating proteins, the information about льдонуклеаторы вызывают замерзание в системе. its amount in hemolymph was obtained during assess- Коэффициент депрессии активности обычно при- ment of total protein content, that is only an indirect мерно эквивалентен коллигативной депрессии тем- indication of quantitative content of these compounds. пературы плавления, величина которой составляет Nevertheless, this information allows the obtaining of 1,86°С/Осмоль. Известно, что накопление полиолов initial notion about the dependence between protein con- оказывает умеренное влияние на льдонуклеирую- centration in hemolymph and supercooling tempera- щую активность [13]. Поэтому на температуру пере- ture.

проблемы 39 problems криобиологии of cryobiology Т. 21, 2011, №1 Vol. 21, 2011, №1 охлаждения будут влиять полиолы и в этом смысле 60 температура переохлаждения является не совсем точной мерой нуклеирующей активности в целом. 50 Показано, что температура переохлаждения U. ceramboides подвержена сезонным колебаниям [2]. На статистически достоверном материале под- 40 тверждено, что в зимний период льдонуклеирую- измерений щая активность гемолимфы жука действительно 30 ниже, чем весной (р < 0,001). На рис. 1 показано распределение нуклеационных температур при разведении 0,5 мкл гемолимфы в 4,5 мкл раствора Number of events 20 0,9% NaCl. Большинство льдонуклеаторов с актив- Количество ностью –8,5°С присутствует в весенних образцах. 10 Значительное количество льдонуклеаторов с тем- пературой переохлаждения –10,5°С было обнару- 0 жено в гемолимфе зимних жуков U. ceramboides. В зимний период осмоляльность гемолимфы -6,5-7,5-8,5-9,5-10,5 более высокая (таблица). Полиолы, вероятно, обус- Температура переохлаждения, °С лавливают некоторую депрессию температуры Supercooling temperature, °C переохлаждения насекомого, поэтому в этот период Рис. 1. Сезонное изменение в льдонуклеирующей актив- гемолимфа характеризуется умеренной нуклеа- ности (выражена как температура переохлаждения) ционной активностью. В целом существует оче- гемолимфы U. ceramboides: – весна; – зима; разли- видная корреляция между температурой переох- чия между зимним и весенним максимумами темпера- тур переохлаждения статистически значимы, p < 0,001. лаждения и величиной осмоляльности гемолимфы, Fig. 1. Seasonal changes in ice-nucleating activity (expres- которая варьирует в зависимости от сезона года sed as supercooling temperature) in U. ceramboides hemo- (рис. 2). lymph: – spring; – winter; changes between supercool- Льдонуклеирующая активность является функ- ing temperature maxima are statistically significant, p < 0.001. цией количественного содержания льдонуклеирую- щих агентов. Образцы, содержащие одинаковое ко- личество льдонуклеаторов, имеют одинаковую As Fig. 3 shows there is a positive correlation be- температуру переохлаждения [19]. В настоящем tween supercooling temperature and concentration of исследовании показано, что льдонуклеирующая protein in the samples of winter and spring hemolymph активность связана с определенной белковой фрак- (R2 = 0.317). Basing on these data a specific ice-nu- цией. Если образец гемолимфы прокипятить или cleating activity was estimated (Fig. 4), herewith the обработать протеазой, то температура переохлаж- dependence between specific ice-nucleating activity дения понижается от –8 до –11°С, что свидетель- and concentration of protein had a significant charac- ствует о потере льдонуклеирующей активности. ter with correlation coefficient R2 = 0.928. Поскольку методика работы с индивидуальны- In spring the correlation coefficient is higher than ми молекулами льдонуклеирующих белков не in winter. In spring a photoperiod "triggers" the proc- ess of polyol utilization, and on the background of their concentration Изменение физиологических параметров гемолимфы lowering the ice-nucleating activ- U. ceramboides в течение года ity rises, probably affecting the de- Changes in U. ceramboides hemolymph physiological parameters during a year gree of evidence of correlative de- pendence between these param- Температура Kонцентрация белка, Осмоляльность, Сезон переохлаждения,°С мг/мл eters. It was established from ex- мОсмоль Season Supercooling Protein concentration, Osmolarity,mOsmol perimental data that correlation co- temperature,°С mg/ml efficient of spring beetles is higher Зима -510,5 ± 1,2 5950 ± 2 117 ± 1 than of the winter ones (see Fig. 3, a) Winter while summer beetles U. ceram-

Весна boides had a negative coefficient -88,5 ± 0,8 3110 ± 1 106 ± 1 Spring (Fig. 3, b). The content of protein in summer hemolymph is signifi- Лето -47,7 ± 0,2 1650 ± 1 45 ± 2 Summer cantly lower than in other seasons (Table). Obviously the concentra- Осень -07,8 ± 0,15 4532 ± 1 56,8 ± 1 tion of ice-nucleating proteins is not Autumn significant and major part of ice-

проблемы 40 problems криобиологии of cryobiology Т. 21, 2011, №1 Vol. 21, 2011, №1 разработана, то информация об их количестве в 0

гемолимфе была получена при оценке общего С ° , содержания белка, что является только косвенным C -2 указанием на количественное содержание данных ° соединений. Тем не менее эта информация позво- -4 ляет получить первоначальное представление о зависимости между концентрацией белка в гемо- лимфе и температурой переохлаждения. -6

переохлаждения 2 Как видно на рис. 3, существует положительная R = 0,7514 корреляция между температурой переохлаждения -8 и концентрацией белка в образцах зимней и весен- ней гемолимфы (R2 = 0,317). На основе этих данных Supercooling temperature, была вычислена удельная льдонуклеирующая -10 Температура активность (рис. 4), при этом зависимость между удельной льдонуклеирующей активностью и кон- -12 центрацией белка имела достоверный характер с 0 200 400 600 коэффициентом корреляции R2 = 0,928 . Осмоляльность гемолимфы, мОсмоль/мл Весной коэффициент корреляции выше, чем зи- Hemolymph osmolality, mOsm/ml мой. Весной фотопериод “запускает” процесс ути- Рис. 2. Зависимость температуры переохлаждения от лизации полиолов, на фоне их понижающейся кон- осмоляльности гемолимфы U. ceramboides (каждая центрации льдонуклеирующая активность растет, точка представлена как среднее значение 4 параллельных что, вероятно, влияет на степень выраженности измерений). коррелятивной зависимости между этими парамет- Fig. 2. Supercooling temperature dependence on U. ceram- рами. Из экспериментальных данных установлено, boides hemolymph osmolality (each point is an average of 4 simultaneous measurements). что коэффициент корреляции у весенних жуков вы- ше, чем у зимних (см. рис. 3, a), в то время как у летних жуков U. ceramboides он был отрицатель- nucleating activity is stipulated by random ice nuclea- ный (рис. 3, б). Содержание белка в летней гемо- tors. In such an amount the nucleator proteins are not лимфе значительно ниже, чем в остальные сезоны able to perform a cryoprotective function and as this (таблица). По-видимому, концентрация льдонуклеи- investigation showed the insects died if they were fro- рующих белков незначительна и существенная zen, i. e. in summer they were not frost-tolerant. In доля льдонуклеирующей активности обусловлена addition, a supercooling temperature of summer hemo-

0 0 С С ° ° , , C -2 C -2 ° °

-4 R 2 = 0,4152 -4

-6 -6 R 2 = 0,0049 переохлаждения переохлаждения

-8 -8

Supercooling temperature, -10 Supercooling temperature, -10 R 2 = 0,1513 Температура R 2 = 0,3172 Температура -12 -12 50 100 150 200 050100150 а Концентрация белка, мг/мл aб Концентрация белка, мг/мл b Protein concentration, mg/ml Protein concentration, mg/ml Рис. 3. Взаимосвязь между температурой переохлаждения и концентрацией белка в гемолимфе U. ceramboides: a – зима ( ) и весна ( ); б) лето () и осень (). Fig. 3. Relation between supercooling temperature and protein concentration in U. ceramboides hemolymph: a – winter ( ) and spring ( ); b – summer () and autumn ().

проблемы 41 problems криобиологии of cryobiology Т. 21, 2011, №1 Vol. 21, 2011, №1 случайными льдонуклеаторами. В таких количест- 0 мг /

вах белки-нуклеаторы не способны выполнять С °

криопротекторную функцию и, как показали дан- , -0,02 C/mg

ные исследования, насекомые погибают, если ° замерзают, т. е. в летний период они не являются -0,04 морозотолерантными. Кроме того, температура активность переохлаждения летней гемолимфы в среднем -0,06 составляет –7,7°С, после ее обработки при 100°С температура нуклеации понижается всего лишь до -0,08 ° –8,3 С (для сравнения см. данные, относящиеся к 2 зимней гемолимфе). При этом температура плав- -0,1 R = 0,928 ления, а значит и осмоляльность гемолимфы, не изменяются. -0,12 льдонуклеирующая При изучении рН-оптимума льдонуклеирующей активности in vitro (рис. 5) определена область рН -0,14 6,5–7,5, в пределах которой льдонуклеирующая Normalised ice nucleating activity, 50 100 150 200

активность гемолимфы U. ceramboides макси- Удельная Концентрация белка, мг/мл мальна в течение всего года. Возможно, что в те- Protein concentration, mg/ml чение года в гемолимфе U. ceramboides присутст- Рис. 4. Взаимосвязь между температурой переохлаж- вуют льдонуклеаторы одного типа, при этом их дения и удельной льдонуклеирующей активностью содержание и активность значительно изменяются зимней гемолимфы U. ceramboides. в зависимости от сезона (рис. 5). Эти данные, по- Fig. 4. Relation between supercooling temperature and видимому, указывают на то, что в летний период normalised ice nucleating activity of U. ceramboides winter льдонуклеирующие белки адаптивного типа все же hemolymph. присутствуют в гемолимфе, однако из-за следовых количеств они не выполняют криопротекторной функции. lymph in average is –7.7°C; after its treatment at 100°C В конце лета концентрация белка в гемолимфе the temperature of nucleation lowers only to –8.3°C повышается, вместе с ней повышается и концент- (for comparing see the data referred to winter hemo- рация адаптивных льдонуклеаторов, так как в этот lymph). Furthermore, the melting temperature and con- период жуки становятся морозотолерантными. sequently the hemolymph osmolality remain the same. Вероятно, содержание льдонуклеирующих белков During in vitro investigation of pH optimum of ice- все еще небольшое, и хотя его достаточно для раз- nucleating activity (Fig. 5) the range of pH was deter- вития морозотолерантности, корреляции между их количественным содержанием и льдонуклерующей активностью не выявлено (рис. 3, б). 6,5 На рис. 6, a представлена специфическая льдо- С

° 6 осень

нуклеирующая активность зимних и осенних образ- , autumn 5,5

цов гемолимфы, которая выражена как темпера- C тура переохлаждения, являющаяся функцией лога- ° весна 5 spring рифма фактора разведения. Впервые такое пред- активность

ставление специфической активности льдонук- 4,5 лето леатора было предложено K.E. Zachariassen [15]. summer Как видно, изменение специфической нуклеи- 4 рующей активности зимнего образца гемолимфы 3,5 якутского жука в зависимости от разведения име- зима ет достаточно умеренный характер, существует Ice nucleating activity, 3 winter область (“концентрационное плато”), в пределах 2,5 которой активность льдонуклеторов практически Льдонуклеирующая не изменяется. Из графика видно, что скорость по- 2 нижения специфической льдонуклеирующей актив- 56789 ности осенних образцов гемолимфы U. ceramboi- pH des в зависимости от ее разведения значительно Рис. 5. Льдонуклеирующая активность гемолимфы выше, чем для зимних образцов гемолимфы (см. U. ceramboides в зависимости от сезона и pH. коэффициент в уравнении). Аналогичные исследо- Fig. 5. Ice nucleating activity of U. ceramboides hemolymph вания весенних образцов показали, что разбавление depending on the season and pH.

проблемы 42 problems криобиологии of cryobiology Т. 21, 2011, №1 Vol. 21, 2011, №1 0 0

-2 С С ° ° , , C C -4 ° -5 ° y = -0,1964x2 + 0,175x - 8,6857 -6

-8 y = 0,022x2 - 0,9375x - 7,8738 -10 -10 переохлаждения переохлаждения -12

-15 -14 2

Supercooling temperature, Supercooling temperature, -16 y = -0,05 + 0,942x - 7,892 y = -0,1583x2 + 0,6893x - 8,3167 Температура Температура -20 -18 02468 02468 а Log фактора разведения aб Log фактора разведения b Log of dilution factor Log of dilution factor Рис. 6. Специфическая льдонуклеирующая активность 0,5 мкл образцов гемолимфы U. ceramboides, разбавленной повторно фактором 10 в 4,5 мкл 0,9% раствора NaCl, представленная как функция фактора разбавления: a – осень () и зима ( ); б – весна ( ) и лето (). Fig. 6. Specific ice nucleating activity of 0.5 µl samples of hemolymph, diluted additionally by factor 10 in 4.5 µl of 0,9% NaCl solution, and expressed as dilution factor function: a – autumn () and winter ( ); b – spring ( ) and summer ().

гемолимфы приводит к еще более заметному пони- mined 6.5–7.5 within which ice nucleating activity of жению активности весенних льдонуклеаторов по U. ceramboides hemolymph is maximal during a whole сравнению с зимними. На рис. 6, б видно, что харак- year. It is possible that during the whole year the тер кривой нуклеирующей активности летней гемо- hemolymph of U. ceramboides contains ice nucleators лимфы не подчиняется общей закономерности, что of the same type, thereat their content and activity sig- указывает на преобладание неспецифического nificantly vary depending on the season (Fig. 5). These нуклеационного механизма. Основным отличием data probably point to the fact that in summer period кривой весенней льдонуклеирующей активности по the ice nucleating proteins of adaptive type are still сравнению с зимней является отсутствие “плато” present in hemolymph, but because of their trace amount (рис. 6). Причина этого отличия пока не установ- they do not perform the cryoprotective function. лена. Физиологические изменения в гемолимфе в In the end of summer the concentration of protein период подготовки насекомых к диапаузе, по- in hemolymph as well as the concentration of adaptive видимому, способствуют формированию нуклеи- ice nucleators rises and in this period the beetles be- рующего потенциала “зимнего” типа (рис. 6, а). come frost-tolerant. Probably the content of ice-nu- Несмотря на наблюдаемые изменения физико- cleating activity is still not large and although it is suffi- химических свойств весенней и осенней гемолим- cient for the development of freezing-tolerance, cor- фы U. ceramboides по сравнению с зимней, жуки relation between their quantitative content and ice-nu- являются морозотолерантными в этот период. cleating activity was not revealed (Fig. 3, b). Только летом они становятся морозочувствитель- Fig. 6, a presents a specific ice-nucleating activity ными. of winter and autumn samples of hemolymph which is expressed as supercooling temperature vs. the loga- Выводы rithm of dilution factor. For the first time such a pres- Проведенные исследования впервые выявили entation of ice nucleator specific activity data was sug- наличие эндогенных белковых льдонуклеаторов у gested by Zachariassen [15]. As is seen, the changes представителя семейства Tenebrionidae и опреде- in specific nucleating activity in winter sample of лили характер сезонных изменений физико-хими- Yakutian beetle's hemolymph depending on the dilu- ческих свойств его гемолимфы. Будучи морозото- tion has rather a mild character, there is the area ("con- лерантным видом, U. ceramboides продуцирует centration plateau") within which the ice nucleator ac- высокоэффективные льдонуклеаторы, которые в tivity practically does not vary. The diagram shows that оптимальной концентрации аккумулируются в ге- rate of specific ice-nucleating activity lowering in au- молимфе в зимний период и обеспечивают контро- tumn hemolymph samples of U. ceramboides depend-

проблемы 43 problems криобиологии of cryobiology Т. 21, 2011, №1 Vol. 21, 2011, №1 лируемое льдообразование с высокой вероятнос- ing on its dilution is significantly higher than for winter тью. Наряду с синтезом таких криопротекторов, hemolymph samples (see the coefficient in equation). как сорбитол и треитол, льдонуклеирующие агенты, The same investigations of spring samples showed that по-видимому, обуславливают толерантность dilution of hemolymph led to the more significant ac- U. ceramboides к низким температурам вплоть до tivity decrease of spring nucleators unlike the winter –83°С. Очевидно, что такая высокая холодоустой- ones. Fig. 6, b shows that the character of the curve of чивость якутской популяции U. ceramboides яв- summer hemolymph nucleating activity does not fol- ляется результатом эволюционной адаптации к low the general regularity that denotes the predomi- суровым климатическим условиям этого региона, nance of non-specific nucleation mechanism. The main которые предъявляют высокие требования к холо- difference of the curve of spring ice-nucleating activ- доадаптивным стратегиям, развивающимся в на- ity comparing to the winter one is the absence of "pla- правлении их более высокой специализации. teau" (Fig. 6). The reason of this difference has not been established yet. Physiological changes in hemo- Исследования поддержаны грантом РФФИ “Арк- lymph during the period of preparation to diapauses, тика”, проект 06-04-96048 probably contribute to the formation of nucleating po- tential of "winter" type (Fig. 6, a). In spite of observed changes of physical and chemical properties of U. ce- Литература ramboides spring and autumn hemolymph in contrast 1. Ли Н.Г., Аверенский А.И. Стратегия холодовой адаптации to the winter one the beetles are freezing-tolerant in у насекомых, обитающих в Центральной Якутии // this period. Only in summer they become freezing-sen- Биофизика.– 2007.– Т. 52, №4.– C. 747–752. sitive. 2. Ли Н.Г. Экофизиологические особенности адаптации жуков Upis ceramboides, обитающих в Центральной Якутии // Проблемы криобиологии.– 2006.– Т. 16, №3.– Conclusions С. 310–317. The carried-out investigations firstly revealed the 3. Duman J.G., Wu Ding Wen, Xu Lei et al. Adaptations of insects to subzero temperature // Quart. Rev. Biol.– 1991.– presence of endogenous protein ice nucleators in the Vol. 66, N4.– P. 387–407. representative of Tenebrionadae family and deter- 4. Gehrken U. Winter survival of an adult bark beetle Upis mined the character of seasonal changes in its hemo- acuminatus // J. Insect Physiol.– 1984.– Vol. 30, N4.– P. 421– lymph physico-chemical properties. Being a frost-tol- 429. 5. Jones A., Reed R., Weyers J. Practical Skills in Biology.– erant species, the U. ceramboides produces highly ef- Pearson Education Limited, 2003.– P. 321. fective ice nucleators which are accumulated in opti- 6. Laak van der S. Physiological adaptations to low temperature mal concentration in hemolymph during winter and pro- in freeze-tolerant Phyllodecta laticollis beetles // Comp. Biochem. Physiol.– 1982.– Vol. 73A, N4.– P. 613–621. vide controlled ice nucleation with a high probability. 7. Lovelock J.E. The mechanism of the protective action of Along with the synthesis of such cryoprotectants as glycerol against haemolysis by freezing and thawing // sorbitol and threitol, ice nucleators obviously stipulate Biochem. Biophys. Acta.– 1953.– N11.– P. 28–36. the tolerance of U. ceramboides to the low tempera- 8. Lundheim R. Adaptive and incidental biological ice nucleator: Dr. Scient. Thesis.– Trondheim: Norwegian University of tures down to –83°C. Evidently, such a high freezing Science and Technology, 1996.–P. 11. tolerance of Yakutian population of U. ceramboides 9. Miller L.K. Production of threitol and sorbitol by an adult insect: is the result of evolutional adaptation to severe climatic association with freezing tolerance // Nature.– 1975.– N258.– P. 519–520. conditions of this region, that make the high demands 10. Osokin N.I., Samoilov R.S., Sosnovskiy A.V., Nikolaev V.N. to the strategies of cold adaptation, becoming more The variability of a thermo-physical regime of the ground at specialized. change of air temperature and snow parameters // Influence of climatic and ecological changes on permafrost ecosys- tems.– Yakutsk: Publishing House of the Yakutian Branch of The investigations are supported by grant of Russian SD RAS, 2003.– 165 p. Foundation of Fundamental Investigations, “Arctics” 11. Sinclair B.J., Addo-Bediako A., Chown S.L. Climatic variability project 06-04-96048. and the evolution of insect freeze tolerance // Biol. Rev.– 2003.– Vol. 78.– P. 181–195. 12. Yeung K.L., Wolf E.E., Duman G.A. A scanning tunneling microscopy study of an insect lipoprotein ice nucleator // J. Vac. Sci. Technol.– 1991.– N9.– P. 1197–1201. References 13. Zachariassen K.E. Ice nucleating agents in cold hardy in- 1. Li N.G., Averenskiy A.I. Cold adaptation strategy of insects sects // Water and Life.– Berlin: Springer Verlag, 1992.– habitant in Central Yakutia // Biofizika.– 2007.– Vol. 52, N4.– P. 261–281. P. 747–752. 14. Zachariassen K.E. Nucleating agents in cold-hardy insects // 2. Li N.G. Ecophysiological peculiarities of cold adaptation of Comp. Biochem. Physiol.– 1982.– Vol. 73A, N4.– P. 557–562. Upis ceramboides beetles habitant in Central Yakutia // 15. Zachariassen K.E. Physiology of cold tolerance in insects // Problems of Cryobiology.– 2006.– Vol. 16, N3.– P. 310–317 Physiol. Rev.– 1985.– Vol. 65, N4.– P. 799–831. 3. Duman J.G., Wu Ding Wen, Xu Lei et al. Adaptations of 16. Zachariassen K.E. Seasonal variation in hemolymph osmolality insects to subzero temperature // Quart. Rev. Biol.– 1991.– and osmotic сontribution of glycerol in adult Rhagium inquisi- Vol. 66, N4.– P. 387–407.

проблемы 44 problems криобиологии of cryobiology Т. 21, 2011, №1 Vol. 21, 2011, №1 tor L. (Coleaptera Cerambycidae) // Norw. J. Entomol.– 1973.– 4. Gehrken U. Winter survival of an adult bark beetle Upis acumi- Vol. 20, N20.– P. 259–262. natus // J. Insect Physiol.– 1984.– Vol. 30, N4.– P. 421–429. 17. Zachariassen K.E., Baust J.G., Lee R.E. A method for 5. Jones A., Reed R., Weyers J. Practical Skills in Biology.– quantitative determination of ice nucleating agents in insect Pearson Education Limited, 2003.– P. 321. hemolymph // Cryobiology.– 1982.– Vol. 19, N2.– P. 180–184. 6. Laak van der S. Physiological adaptations to low temperature 18. Zachariassen K.E., Hammel H.T. Nucleating agents in the in freeze-tolerant Phyllodecta laticollis beetles // Comp. hemolymph of insects tolerant to freezing // Nature.– 1976.– Biochem. Physiol.– 1982.– Vol. 73A, N4.– P. 613–621. Vol. 262, N5566.– P. 285–287. 7. Lovelock J.E. The mechanism of the protective action of 19. Zachariassen K.E., Hammel H.T. The effect of ice-nucleating glycerol against haemolysis by freezing and thawing // agents on ice-nucleating activity // Cryobiology.– 1988.– Biochem. Biophys. Acta.– 1953.– N11.– P. 28–36. Vol. 25, N2.– P. 143–147. 8. Lundheim R. Adaptive and incidental biological ice nucleator: Dr. Scient. Thesis.– Trondheim: Norwegian University of Science and Technology, 1996.–P. 11. Поступила 20.11.2010 9. Miller L.K. Production of threitol and sorbitol by an adult insect: Рецензент Л.И. Релина association with freezing tolerance // Nature.– 1975.– N258.– P. 519–520. 10. Osokin N.I., Samoilov R.S., Sosnovskiy A.V., Nikolaev V.N. The variability of a thermo-physical regime of the ground at change of air temperature and snow parameters // Influence of climatic and ecological changes on permafrost ecosys- tems.– Yakutsk: Publishing House of the Yakutian Branch of SD RAS, 2003.– 165 p. 11. Sinclair B.J., Addo-Bediako A., Chown S.L. Climatic variability and the evolution of insect freeze tolerance // Biol. Rev.– 2003.– Vol. 78.– P. 181–195. 12. Yeung K.L., Wolf E.E., Duman G.A. A scanning tunneling microscopy study of an insect lipoprotein ice nucleator // J. Vac. Sci. Technol.– 1991.– N9.– P. 1197–1201. 13. Zachariassen K.E. Ice nucleating agents in cold hardy in- sects // Water and Life.– Berlin: Springer Verlag, 1992.– P. 261–281. 14. Zachariassen K.E. Nucleating agents in cold-hardy insects // Comp. Biochem. Physiol.– 1982.– Vol. 73A, N4.– P. 557–562. 15. Zachariassen K.E. Physiology of cold tolerance in insects // Physiol. Rev.– 1985.– Vol. 65, N4.– P. 799–831. 16. Zachariassen K.E. Seasonal variation in hemolymph osmolality and osmotic сontribution of glycerol in adult Rhagium inquisi- tor L. (Coleaptera Cerambycidae) // Norw. J. Entomol.– 1973.– Vol. 20, N20.– P. 259–262. 17. Zachariassen K.E., Baust J.G., Lee R.E. A method for quantitative determination of ice nucleating agents in insect hemolymph // Cryobiology.– 1982.– Vol. 19, N2.– P. 180–184. 18. Zachariassen K.E., Hammel H.T. Nucleating agents in the hemolymph of insects tolerant to freezing // Nature.– 1976.– Vol. 262, N5566.– P. 285–287. 19. Zachariassen K.E., Hammel H.T. The effect of ice-nucleating agents on ice-nucleating activity // Cryobiology.– 1988.– Vol. 25, N2.– P. 143–147.

Accepted in 20.11.2010

проблемы 45 problems криобиологии of cryobiology Т. 21, 2011, №1 Vol. 21, 2011, №1