Isolement Et Caractérisation De Bactéries Cadmium-Résistantes De Sols Des Sites Pollués : Etude De L’Accumulation Des Ions Métalliques

N° d’ordre 05/2019-D/S.B

UNIVERSITE DES SCIENCES ET DE LA TECHNOLOGIE HOUARI BOUMEDIENE USTHB/ALGER FACULTE DES SCIENCES BIOLOGIQUES

THESE de Doctorat en Sciences Présentée pour l’obtention du grade de

Docteur en Sciences Biologiques

Spécialité : Ecologie Microbienne de la Rhizosphère

Par Yakoubi Lila

SUJET

Isolement et caractérisation de bactéries cadmium-résistantes de sols des sites pollués : Etude de l’accumulation des ions métalliques

Soutenue publiquement le 07 / 02 /2019 devant le jury composé de :

Mr Hacene H. Professeur à l‘ USTHB /FSB Président

Mme Benmalek Y. Professeur à l’ USTHB /FSB Directrice de thèse

Mme Abrous O. Professeur à l’ USTHB /FSB Examinatrice

Mme Gana-Kebbouche S . Professeur à l’ UMBB Examinatrice

Mr Jaouadi B. Maître de Conférences A au CBS /Tunisie Examinateur

Mme Bouanane A. Professeur à l’ USTHB/FSB Examinatrice

Mme Zermane N. Professeur à l’ Université d’Alger Invité d’honneur

Résumé

Au cours de cette étude, 103 bactéries cadmium -résistantes, ont été isolées de 9 sols provenant de différentes régions d'Algérie et pollués par les métaux lourds. 94% des isolats se sont révélés à Gram négatif, appartenant principalement aux genres Pseudomonas, Burkholderia, Aeromonas et à la famille des Enterobacteriaceae. . Les Gram positifs (4%), appartiennent principalement aux genres Bacillus. Toutes les souches cadmium-résistantes ont affiché des CMIs très importantes, qui oscillent entre 400 et 2000 µg mL-1, et une multirésistance vis-à-vis de 12 antibiotiques testés. Quatre souches hautement résistantes au cadmium, ont été caractérisées au niveau moléculaire, par séquençage de l'ARNr 16S, étaient affiliées aux espèces Raoultella ornithinolytica (souche YL-ML1), Klebsiella pneumoniae (souche YL-SS2) ,Pseudomonas fluorescens (souche YL-SS3) et Bacillus infantis (souche YL-SS8). Ces souches ont accumulé de très grandes quantités de cadmium au cours des 24 premières heures d’incubation, malgré l’effet toxique du Cd, exprimé par une inhibition de leur croissance. L’accumulation du cadmium est légèrement meilleure lorsque les cellules sont immobilisées dans des billes d’alginate que lorsqu’elles sont libres en suspension. Le cadmium provoque une chute du contenu en protéines totale, mais induit en revanche, une surproduction d’Exopolysaccharides (EPS). Par ailleurs, le cadmium stimule les activités enzymatiques, de la catalase, de la superoxyde dismutase et du glutathion chez les trois Protéobactéries YL-ML1, YL-SS2 et YL-SS3. Cependant, la souche YL-SS8 (Gram-Positif) a affiché une réduction de ces trois paramètres. Nous avons noté une différence dans le profil protéique des souches testées en l'absence et en présence de cadmium. Ce changement s’est matérialisé par une surexpression, induction et/ou répression de protéines de différentes masses moléculaires. Une PCR nous a permis de détecter le gène cadA dans les souches sélectionnées, ce gène confère une résistance au cadmium en codant une protéine d'efflux. Ce gène a été confirmé par séquençage après clonage, au niveau de la souche YL-ML1. Ce résultat original, révèle le rôle du transfert latéral des gènes dans l’acquisition de la résistance de cette entérobactérie dans un sol pollué par le cadmium. Les résultats de la présente étude montrent que les souches répondent au stress généré par le cadmium, par une surproduction d’EPS, activation du système antioxydant et induction de certaines protéines de stress, ainsi qu’une possible extrusion des ions métalliques par des pompes d’efflux codées par le gène cadA. Mots clés : Pollution des sols, cadmium, toxicité, mécanismes de résistance , bactéries. Remerciements

La présente étude a été réalisée au laboratoire de Microbiologie de la FSB/USTHB, sous la direction de Madame Benmalek Y. Au terme de ce travail, je tiens à exprimer ma reconnaissance et ma gratitude à ma directrice de thèse Mme Benmalek Y. professeur à l’ISN/USTHB, d’avoir accepté de diriger ce travail , je la remercie vivement pour ses conseils et ses orientations précieuses, qu’elle trouve ici l’expression de mon profond respect. J’adresse mes plus grands remerciements à Monsieur Hacène H. de m’avoir accueilli dans son laboratoire et de m’offrir une paillasse de travail et aussi pour l’honneur qu’il m’accorde en présidant ce jury ,et ce, en dépit de ses charges. Mes remerciements les plus profonds à mon enseignante Mme Abrous O., professeur à la FSB/USTHB de m’avoir accordé de son temps si précieux, j’imagine, pour évaluer mon travail .Je tiens très sincèrement à lui exprimer mon profond respect. Mon immense reconnaissance va à Monsieur Jaouadi B. pour avoir accepté de faire partie du jury ,mais aussi pour ses conseils et ses orientations. Il m’est spécialement agréable que mon travail soit évalué par Madame Gana S., laquelle j’ai eu l’honneur d’apprécier sa compétence et son sérieux . Madame Zermane , a qui j’exprime toute ma gratitude et mon respect pour le modèle de l’enseignant très soucieux de l’intérêt des étudiants ,qu’elle représente .Je tiens à la remercier vivement pour sa présence . Et en fin Madame Bouanane, que je ne remercierai jamais assez, pour l’âme qu’elle a insufflée à mon travail, c’est un grand plaisir pour moi de vous compter parmi le jury de ma soutenance.Merci pour votre soutien et votre agréable moralité ! Je remercie très chaleureusement l’ensemble des membres du laboratoire de Microbiologie, de la FSB spécialement Lydia,Khelifa, Fawzi,Nawel ,Okba ,et tout le reste. Afin de n’’oublier personne, je tiens à remercier tous ceux qui ont participé, à titre professionnel ou personnel, à la réalisation de cette thèse. Je pense particulièrement à Mme Rahmania F. ,Professeur à l’USTHB/FSB , Mr Benayad T.,directeur du laboratoire de la police scientifique. , Mme Berka S . Mme Djebari K . , enseignante à l’ENSA , Monsieur Djili ,chef de département de Biologie des sols à l’ENSA (El-Harrach). Et en fin, j’adresse mes plus grands remerciements à mon mari, qui a non seulement soutenu tant financièrement que moralement une éternelle étudiante !, mais qui, en plus a été présent et patient depuis déjà 10 ans. J’adresse une tendresse toute particulière à mes enfants, mes parents et toute ma famille et ma belle famille, pour leurs encouragements tout au long de mes études et vis à vis de mes choix. Je leur dédie ce travail.

Liste des abréviations

ADN acide désoxyrionucléique

AFNOR association française de normalisation

ATB antibiotique

ARN acide ribonucléique

ARN 16S Sous unité 16S de l’ARN ribosomal

BSA bovine serum albumine

BN Bouillon nutritif

CAT Catalase

CMI : concentration minimale inhibitrice

Ca Calcium

Cd Cadmium

CaCl2 Calcium chloride

Cr Chrome

CMI Concentration minimale inhibitrice

Cu cuivre

DO : densité optique

EPS Exopolysaccharides

ERO espèces réactives d’oxygéne

ETM Eléments Trace Métallique

GN gélose Nutritive

GSH glutathion réduit h heure

K Potassium

KDa kilo dalton

mg milligramme

mL Millilitre

Mm Masse molaire

PAGE Protein Analysis Gel Electrophoresis

Pb plomb pb paire de base

PCR abréviation anglaise de réaction en chaîne par polymérase ppm particule par million

rpm r otation par minute

SAA spectrophotométrie à absorption atomique

SDS sodium dodecyl Sulfate

T témoin

Zn zinc

Liste des tableaux

Tableau I. Propriétés physico-chimiques du cadmium ………………………………………………………………………………….. ………….7

Tableau II. Protéines de transport des éléments métalliques chez les microorganismes ……………………………………………………………………………………………….19

Tableau III : Principaux groupements fonctionnels et constituants membranaires chez les bactéries…………………………………………………………………… ………………21

Tableau IV : Nomenclature des ATPases-P selon la classification d’Alxelsen et al., (1998) et correspondance entre les classes d’ATPases-P avec la classifcation de Lutsenko et al . , (1995)…………………………………………………………………………………………29 Tableau V. Classification et structure des protéines RND…………………………………..37

Tableau VI. Sites et souches isolées pour chaque prélèvement…………….. 44

Tableau VII .Les antibiotiques testés (Molécules, codes et charge des disques) …… 53

Tableau VIII. Résultats des analyses physico-chimiques des sols étudiés………… 63

Tableau IX .Classification des sols selon leur conductivité électrique……………….. 64

Tableau X .Distribution des genres bactériens cadmium-résistants en fonction de leur origine et les valeurs des CMI ………………………………………………………………. 70

Tableau XI. Profil de résistance des bactéries cadmium-résistantes vis-à-vis des antibiotiques testés…………………………………………………………………………………………..73

Tableau XII. Résultats de l’identification moléculaire des souches cadmium-résistantes…77

Tableau XIII. Effet de différentes concentrations de Cd sur les teneurs en protéines totales chez la souche test YL-ML...... 92

Tableau XIV. Effet de différentes concentrations de Cd sur les teneurs en protéines totales chez la souche test YL-SS8………………………………………………………………….96

Tableau XV. Effet de différentes concentrations de Cd sur les teneurs en protéines totales chez la souche YL-SS3……………………………………………………………………..93

Tableau XVI. Effet de différentes concentrations de Cd sur les teneurs en protéines totales chez la souche test YL-SS2…………………………………………………………………94 Tableau XVII. Effet de différentes concentrations de Cd sur la production d’EPS chez la souche test YL-ML1.. …………………………………………………………….96

Tableau XVIII. Effet de différentes concentrations de Cd sur la production d’EPS chez la souche test YL-SS8………………………………………………………………………….97

Tableau XIX. Effet de différentes concentrations de Cd sur la production d’EPS chez la souche test YL-SS3…………………………………………………………………………97

Tableau XX. Effet de différentes concentrations de Cd sur la production d’EPS chez la souche test YL-SS2…………………………………………………………………………98

Tableau XXI. Bandes protéiques induites, sur-exprimées et réprimées, révélées par SDS- PAGE ,chez la souche YL-ML1……………………………………………………………110 Tableau XXII. Bandes protéiques induites, sur-exprimées et réprimées, révélées par SDS- PAGE ,chez la souche YL- SS2…………………………………………………………………………………………111 Tableau XXIII. Bandes protéiques induites, sur-exprimées et réprimées révélées par SDS- PAGE ,chez la souche YL- SS8…………………………………………………………………………………………112 Tableau XXIV. Bandes protéiques induites ,surexprimées et réprimées ,révélées par SDS- PAGE ,chez la souche YL- SS3…………………………………………………………………………………………112

Liste des figures

Figure 1. Tableau périodique de Mendeleïev situant les métaux lourds par rapport à l’ensemble des éléments chimiques…………………………………………………………...5 Figure 2. Sources et distribution des métaux lourds dans le sol …………………………….6

Figure 3. Différentes activités responsables de la pollution de l’envinnement par le cadmium et autres éléments minéraux ………………………………………………………………….8 Figure 4. Divers états d’éléments métalliques et le phénomène de mobilité (Juste, 1995)………………………………………………………………………………………….9 Figure 5. Effets toxiques du cadmium et autres métaux sur les microorganismes ……………………………………………………………………………………………….13 Figure 6: Principales espèces réactives d’oxygène générées par réduction monovalente de l’oxygène ……………..…………………………………………………………………….14 Figure 7. Réactions de Fenton et de Haber-Weiss) ,source de génération des radicaux hydroxyls………………………………………………………………………… .………15

Figure 8 .Cibles biologique des ERO et mode d’action des systémes enzymatiques antioxydants et de leurs cofacterurs métalliques …………………………………………..l6 Figure 9 : Schéma des réponses antioxydantes de la cellule face aux ROS ………………………………………………………………………. ………………17 Figure 10 .Principaux mécanismes de résistance bactérienne aux métaux lourds ………………….…………………………………………………………… ………………20

Figure 11. Schémas des structures moléculaires des ligands des surfaces bactériennes impliqués dans la biosorption du Cd2+en fonction de la concentration ……………………………………………………………………………………………...22

Figure 12 . Représentation schématique des exopolysaccharides de surface bactérienne…………………………………………………………………………………..23

Figure 13 . Structure RMN de la métallothionéine bactérienne Zn4SmtA, ……………………………………………………………………………………………..26

Figure 14. Représentation schématique de l’unité structurale commune des ATPases-P. .…………………………………………...... 28 Figure 15. Schéma de la topologie d’une ATPase-PIB . ……………………………………31

Figure 16. Extrusion et resistance aux ions Cd2+ et Zn2+ chez Staphylococcus aureus Silver, ………………………………………………………………………………………………32

Figure 17. Sous famile P1B-type ATPases…………………………………………………..33. Figure 18. Schéma du plasmide pMOL30 codant pour la resistance aux Co2+/ Zn2+/Cd2+ chez Alcaligenes eutrophus ……………………………………………………………….35 Figure 19. Modèle de la topologie et le mode de fonction du système CzcCBA chez les bactéries à Gram-négatif ………………………………...... 36 Figure 20. Schéma de co-régulation entre la résistance aux métaux lourds et l’imipenème Chez Pseudomonas aeuriginosa……………………………………………………………..40

Figure 21. Localisation géographique des sites de prélèvements des échantillons de sols…………………………………………………………………………...... 42

Figure 22 . Carte de restriction du plasmide pGEM-T Easy…………………...... 50

Figure 23 . Les plasmides obtenus après transformation…………………………………….51

Figure 24. Carte de restriction du plasmide pYL cadA (4066 pb) portant le gène d’ATPase « cadA », 1051 pb , de Raoultella ornthinolytica souche YL-ML1...... 58

Figure25. Répartition globale des bactéries cadmium-résistantes isolées et caractérisées de l’ensemble des sols étudiés ………………………………………………………………….67

Figure 26 .Arbres phylogénétiques basés sur le gène codant l’ARNr 16S mettant en évidence les résultats de l’identification phylogénétique des 7 souches hautement résistantes au Cd . ……………………………………………………………………………………………….78

Figure 27. Effet du cadmium sur la croissance des cellules bactériennes ……………… 80

Figure 28. Bioaccumulation des ions cadmium par les cellules bactériennes libres et immobilisées………………………………………………………………………………….85

Figure 29. Effet de la concentration et de la durée d’exposition au cadmium sur les teneurs en protéines totales des souches YL-ML1 (a),YL-SS8 (b),YL-SS3(c) et YL SS2(d)……………………………………………………………………………………….91 Figure 30. Effet de la concentration et de la durée d’exposition au Cd sur la production d’EPS chez les souches YL-ML1 (a),YL-SS8 (b),YL-SS3(c) et YL-SS2(d). ……………………………………………………………………………………………..96

Figure 31. Profil électrophorétique des produits PCR des souches YL-ML1,YL-SS2,YL-SS3 et YL-SS8 , avec les amorces universelles du gène cadA (cad1-F/cad1-R et cad2 –F/cad2R …………………………………………………………………………………………….100

Figure 32. Effet du Cd sur l’activité CAT des souches Test…………………………………………...... 104

Figure 33.Effet du Cd sur l’activité SOD chez les souches Test……………………………………………………………………………………...... 106

Figure 34.Effet du Cd sur le GSH chez les souches Test……………………………………………...... 107

Figure 35. Profile électrophorétique, dans les conditions dénaturantes sur SDS-PAGE à 15%, des extraits protéiques des souches YL-ML1, YL-SS2, YLSS3 et YL-SS8 avec (+) ou sans (-) cadmium………………………………………………………………. ……………………109

Figures des Annexes

Figure 1 . Principe du four à graphite en SAA .

Figure 2.Courbe de corrélation, absorbance en fonction de la concentration en Sérum albumine bovine (BSA), utilisée pour la détermination des protéines cellulaires totales par la méthode de Bradford.

Figure 3.Courbe de corrélation, absorbance 630nm en fonction de la concentration en glucose, utilisée pour le dosage des pentoses et des hexoses obtenus dans les EPS par la méthode à l’anthrone sulfurique.

Figure 4.Courbe de corrélation, absorbance en fonction de la concentration en Sérum albumine bovine (BSA), utilisée pour la détermination des protéines cellulaires solubles par la méthode de Bradford.

Figure 5. Courbe de corrélation « log (masse molaire) en fonction de la mobilité relative

Figure 6 .Résultats de l’etude physiologique des souches Cd-résstantes isolées de l’ensemble des sols étudiés ;(a) Résultats du Gram,(b) Résultats de l’oxydase ,(c) Résultats de la catalase et (d) Résultats de la nitrate réductase. Figure 7 : Distribution détaillée des genres bactériens caractérisés selon leur différentes origines

Figure 8 . Répartition des bactéries cadmium résistantes selon leur valeurs de CMI et le sol d’origine

Figure 9.Gel d’agarose des produits PCR du gène de l’ARNr 16S , des souches YL-SS2, YL- BS2,YL- CS2 et YL-IS2. En haut ,les souches YL-SS2 et YL-SS8 en bas , obtenus avec les amorces 27F et 1525R

. Introduction 1 Chapitre I .Etude bibliographique 4 1. Métaux lourds 4 1.1. Définition et classification 4 1.2. Sources et distribution des métaux lourds 6 2. Généralités sur le cadmium 7 3. Le cadmium : Problématique environnementale 10 3.1. Toxicité et Ecotoxicité 11 3.2. Cadmium et stress oxydant 12 3.2.1. Les dommages liés au stress oxydant 13 3.3. Système antioxydant 14 3.3.1. Système enzymatique 15 17 3.3.2. Système non enzymatique 4. Interactions Bactéries –éléments métalliques et mécanismes de résistance 18 4.1. Interactions Bactéries –éléments métalliques 18 4.2. Mécanisme de résistance bactérienne aux métaux lourds 19 4.2.1. La Biosorption 20 4.2.2. La Biominéralisation 23 4.2.3. précipitation 24 4.2.4. La chélation 24 4.2.5. L’imperméabilité membranaire 24 4.2.6. La bioaccumulation 25 4.2.7. La complexation 25 4.2.8. Les systèmes d’efflux 26 4.2.8.1. La famille des ATPases de type P 27 4.2.8.2. Les transporteurs ABC(ATP-bindng-cassette) 34 4.2.8.3. La famille des transporteurs RND 34 4.2.8.4. La famille CDF 37 5. Protéines de stress 37 6. Co-sélection de la résistance aux antibiotiques et aux métaux lourds 39 Chapitre II. Matériel et méthodes 41 1. Matériel 41 2. Méthodes 41 2.1. Echantillonnage et conditions de transport des sols 41 2.2. Analyses physicochimiques des sols… 42 a.Mesure du pH 42 b.Mesure de la conductivité électrique 42 c.Détermination du taux de carbone organique total 42 d. Analyse des éléments métalliques par spectrophotométrie à absorption atomique 43 d1. Minéralisation des échantillons 43 2. 3. Criblage, isolement et caractérisation des bactéries cadmium-résistantes 44 2. 3.1. Criblage et isolement des bactéries 44 2. 3.2. Caractérisation et identification des isolats 45 2.3.3. Identification moléculaire des isolats 47 2.4 .Etude de la résistance aux agents antimicrobiens chez les isolats 52 2.4.1. Détermination de la concentration minimale inhibitrice du cadmium 52 2.4.2. Etude de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries cadmium-résistantes 52 2.5. Etude de la Bioaccumulation des ions cadmium 53 2.5.1. Accumulation des ions cadmium par des cellules vivantes libres 54 a. Préparation de l’inoculum 54 b. Inoculation 54 2.5.2. Accumulation des ions cadmium par des cellules vivantes immobilisées 55 2.6. Etude de l’effet du cadmium sur la teneur en protéines totales et la production 55 d’EPS chez les bactéries étudiées 2.6.1. Effet du cadmium sur la teneur en protéines totales…………………………….. 56 2.6.2. Effets du cadmium sur la cinétique de production des EPS ……………………. 56 2.7. Recherche du gène CadA chez les bactéries sélectionnées………………………. 57 2.7.1. Séquençage du gène cadA de Raoultella ornthinolytica souche YL-ML1……... 58 2.8. Effets du cadmium sur l’activité enzymatique et non enzymatique du système 59 antioxydant. 2.8.1. Extraction des protéines ……………………………………………………. 59 2.8.2. Dosage de l’activité superoxyde dismutase (SOD)…………………… 59 2.8.3. Dosage de l’activité catalase (CAT)…………………. ……………………… 59 2.8.4. Dosage du glutathion réduit (GSH)……………………………………………. 60 2.8.5. Dosage des protéines solubles totales………………………………………….. 60 2.9. Effet du cadmium sur le profil protéique des bactéries étudiées……………….. 61 2. 9.6. Détermination de la masse molaire des protéines………………………….. 62 Chapitre III. Résultats et discussions……………………………………………….. 63 1.Analyses physico-chimique des sols 63 2. Caractérisation des bactéries cadmium-résistantes 66 3. Etude de la résistance aux agents antimicrobiens chez les bactéries cadmium- 69 résistantes 3.1. Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) de cadmium 69 3.2. Etude de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries cadmium-résistantes 72 3.3. Sélection et caractérisation moléculaire des bactéries cadmium-résistantes 76 4. Etude de l’accumulation des ions cadmium par les cellules bactériennes 78 4.1. Effet du cadmium sur la croissance des bactéries Test 79 4.2. Accumulation des ions cadmium par des cellules libres en suspension 84 4. 3. Accumulation des ions cadmium par des cellules immobilisées 87 5 .Effet de la concentration du cadmium et la durée d’exposition sur le taux des 90 protéines totales et la production d’EPS 5.5.1. Effets de la concentration du cadmium et la durée d’exposition sur la teneur 95 e en protéines totales

5.2. Effets de la concentration du Cd et la durée d’exposition sur la production des 95 EPS 6. Détection du gène cadA chez les souches étudiées 100 7 .Effet du cadmium sur l’activité de certaines enzymes du système antioxydant et le 103 taux du glutathion 8. Effet du Cd sur le profil protéique des souches test ……………………………… 109 Conclusion et perspectives …………………………………………………………. 117

Références bibliographiques………………………………………………………………………………………… 120

INTRODUCTION

Introduction

La pollution des écosystèmes par les métaux lourds est actuellement, un défi environnemental mondial, en raison de leur toxicité et de leur menace pour la vie humaine et l'environnement (Cerebasi et Yetis 2001) .Ces éléments font partie des polluants à risque prioritaire, car ils sont très toxiques et non dégradables. Leur persistance dans l’environnement, implique, qu’ils s'accumulent dans les organismes et qu'il est difficile de réduire leur concentration, causant des effets toxiques sur les êtres vivants et perturbant le bon fonctionnement des écosystèmes. Les métaux lourds présents dans le sol, proviennent du contexte géochimique et anthropique. Cependant, l’activité anthropique n'a ni créé ni éliminé les métaux, elle a essentiellement modifié leur distribution, leur spéciation et leur concentration dans les différents compartiments de la biosphère.

Si certains métaux lourds pénètrent directement dans le sol et dans l'eau, la plus grande partie est rejetée dans l'atmosphère avant d'atteindre les deux autres compartiments (Sigg et al., 2001). La contamination des sols est un problème fondamental, non seulement parce que cela affecte notre environnement immédiat, mais aussi et surtout, parce que la pollution des sols est directement liée à l'approvisionnement en eau potable (Desauney, 2011). D'autre part, les sols sont des écosystèmes complexes qui supportent de nombreux organismes biologiques exposés à la pollution. Les microorganismes et les plantes sont les premiers touchés et sont les premiers maillons de la chaîne alimentaire, qui peuvent être contaminés. L'importance de la disponibilité des métaux tels que K, Na, Mg, Ca, Zn ... pour les microorganismes est bien connue, beaucoup de ces oligo-éléments sont essentiels et associés aux protéines nécessaires à leur croissance et au métabolisme cellulaire (Gelabert et al., 2006), cependant d'autres éléments métalliques tels que le plomb, le mercure ou le cadmium ,n'ont aucune fonction biologique connue ,et sont très toxiques même à de faibles niveaux. Parmi les métaux lourds, le Cd (II), le Cr (VI), le Cu (II), le Pb (II) et le Zn (II), ont attiré l'attention des chercheurs, car ils sont largement répandus dans l'environnement (Zhang et al., 2015) .

L'un des métaux lourds les plus dangereux rencontrés dans le sol, est le cadmium. Il a été suggéré que le cadmium, serait l'élément le plus mobile dans les sols cultivés (Singh, 2015)

La nécessité de réduire ces risques, a suscité l’utilisation de techniques pour redresser la pollution de l’environnement. Après avoir été longtemps dépendante des méthodes physico- chimique, coûteuses et lourdes d’application (Guzman et al., 2016), la dépollution est aujourd’hui orientée ,vers la maitrise et le développement de techniques de bioremédiation combinant la performance à un moindre coût écologique, la bioremédiation est orientée vers

Introduction l’exploitation et la rentabilisation des ressources naturelles. Au cours des dernières décennies, on a assisté à une augmentation spectaculaire de l'intérêt pour les techniques de bioremédiation, parmi les nombreux faits qui expliquent cet intérêt, la prise de conscience de l'importance de l'accumulation de pollutions domestiques, industrielles et agricoles ainsi que les accidents écologiques spectaculaires et médiatisés. La bioremédiation s’impose comme une alternative de choix pour restaurer les sites pollués par les métaux lourds (Changli et al., 2010; Salem, 2013; Zhou & Guo, 2015) .Basée sur l’utilisation des microorganismes, la bioremédiation exploite les capacités accumulatrices de ces organismes pour extraire les métaux des sites contaminés. Les bactéries omniprésentes dans les milieux pollués, sont actuellement utilisées pour développer la biotechnologie de l’environnement, en recrutant leur résistance, qui leur confère de hautes capacités d’accumulation et de concentration des ions métalliques (Liu et al., 2012; Singh et Prasad, 2015).La résistance aux métaux est le résultat du développement de mécanismes de tolérance permettant à la bactérie, de détoxifier les métaux présents en trop grandes quantités dans le milieu (Soussou ,2013).

L’isolement de bactéries résistantes aux métaux lourds de milieux pollués, constitue de ce fait, la première étape vers la création d’outils de bioremédiation (Watanabe, 2001).

C’est dans ce contexte que s’inscrit notre travail qui porte sur l’exploitation du potentiel de résistance au cadmium, des bactéries autochtones de sols pollués, dans le processus de la bioremédiation du cadmium. Le choix du cadmium est basé sur sa forte toxicité et la large propagation de ce métal dans l’environnement. Nous avons entrepris notre étude par une démarche qui s’articule autour de deux axes principaux .Le premier est consacré à l’isolement et la caractérisation des bactéries cadmium -résistantes à partir d’ échantillons prélevés de sols et sites des zones exposées à la pollution par des rejets industriels, urbains, domestiques et agricoles d’Algérie.

Nous avons procédé à l’évaluation du taux de pollution métallique des échantillons de sols, par dosage de six métaux lourds, et l’étude de quelques caractères physico--chimiques de chaque sol. Cette étape a été suivie par le criblage, l’isolement et la caractérisation des bactéries cadmium-résistantes. Par la suite, l’ensemble des isolats a été testé vis-à-vis de concentrations croissantes du cadmium, en vue de déterminer leur concentration minimale inhibitrice (CMI). Comme la résistance aux métaux lourds est très souvent liée à celle aux antibiotiques, nous avons aussi étudié la résistance des isolats vis-à-vis de 12 antibiotiques appartenant à sept familles différentes.

Introduction

Le deuxième axe, vise à appréhender chez les bactéries fortement cadmium-résistantes, la capacité d’accumuler le cadmium, puis de déterminer son effet sur certaines activités cellulaires. Ainsi, les souches les plus performantes ont été sélectionnées et identifiées par le séquençage de l’ARNr 16S .Les essais de l’accumulation des ions cadmium ont été réalisés en utilisant des cellules bactériennes vivantes en état libre et fixé (immobilisé). Les activités cellulaires supposées intervenir pour répondre à un stress métallique, ont été quantifiées et mesurées, telles que l’activité des enzymes anti-oxydantes (catalase et superoxyde dismutase), la biosynthèse du glutathion, les protéines cellulaires totales et le profil protéique, ainsi que la production des Exopolysaccharides (EPS).

Vu que, les mécanismes de résistance aux agents antimicrobiens (antibiotiques et métaux lourds) développés par les bactéries, sont codés par des gènes de résistance inductibles, le gène cadA, codant pour une protéine d’efflux du cadmium, a été recherché chez les bactéries sélectionnées.

Revue bibliographique

Etude bibliographique

Depuis plus de 100 ans, la plupart des écosystèmes subissent des modifications importantes liées aux activités anthropiques (agriculture, industrialisation, déforestation, urbanisation…) à cause de l’augmentation constante de la croissance démographique et économique. Ces activités, ont toujours devancé les mesures de contrôle de la pollution et de la maîtrise de la dégradation de l’environnement. Actuellement, la pollution des écosystèmes par les métaux lourds, est considérée comme un fléau environnemental majeur qui expose la société humaine à de sérieux problèmes sanitaires.

1. Métaux lourds

1. 1.Définition et classification

Les métaux sont des éléments chimiques, issus le plus souvent, d’un minerai et caractérisés par, une forte conductivité thermique et électrique, des caractéristiques de dureté et de malléabilité, une capacité à se combiner avec d’autres éléments pour former des alliages. Les métaux portent, un à trois électrons sur leur couche périphérique. Ils perdent facilement leurs électrons de valence, pour former des cations en milieu aqueux, ils ont une faible électronégativité et sont de bons agents réducteurs.

Le terme « métaux lourds » reste aujourd’hui mal défini par la communauté scientifique. Une des définitions proposées pour ce terme, englobe tous les éléments métalliques ayant une masse volumique supérieure à 5g/cm3 (Nies, 1999). Cependant il s’agit d’une appellation courante, qui n’a ni fondement scientifique ni application discutable, car certains métaux toxiques ne sont pas particulièrement lourds , comme le Zinc et l’Aluminium , qui ont une masse volumique inferieure à 5g/cm3 ) et d’autres éléments non métalliques ,appartenant au groupe des métalloïdes comme le Sélénium (Se) et l’Arsenic (As) ,sont considérés comme métaux lourds ,alors que les métalloïdes sont des éléments chimiques, dont les propriétés sont intermédiaires entre les métaux et les non métaux.

Dans la classification périodique des éléments, les métaux lourds ou de transition, regroupent tous les éléments présents dans le bloc « d » du tableau périodique, qui s’étend de la colonne 3 à la colonne 12 (périodes 4 à 7), mais qui n’inclut pas les lanthanides ni les actinides (Fig. 1). Les éléments de transition, ont tous leur orbitale « s » saturée mais, diffèrent par leur orbitale « d » incomplète. C’est précisément cette orbitale qui n’est pas totalement remplie, qui permet aux métaux de transition de former des complexes avec des ligands non métalliques comme les chaînes latérales des protéines (Housecroft et Constable, 2006). La formation de ces

Etude bibliographique complexes et les réactions qu’ils catalysent font de certains métaux de transition des constituants essentiels pour les organismes vivants (Nies, 2007).

Figure 1. Tableau périodique de Mendeleïev situant les métaux lourds par rapport à L’ensemble des éléments chimiques

D’un point de vue biologique, on distingue deux groupes de métaux lourds, en fonction de leurs impacts physiologiques, métaux lourds essentiels ou physiologiques et métaux lourds toxiques. Les métaux physiologiques , sont essentiels à la vie sous forme d’oligoéléments, mais peuvent s’avérer toxiques à de fortes concentrations.

Les métaux les plus importants dans cette catégorie, sont le manganèse, le fer, le cobalt, le nickel et le cuivre. Divers métaux, sont indispensables aux organismes vivants, comme cofacteurs (catalyseurs enzymatique). Par exemple, le couple Cu+/Cu2+ , est utilisé dans divers réactions d’oxydoréduction, par de nombreuses enzymes (Linder et al., 1999), le nickel est un cofacteur des uréases (Dosanjh et al., 2007) ,le zinc intervient dans les grandes voies métaboliques, soit comme cofacteur, soit comme constituant de la structure des enzymes phosphatase alcaline, glutamate déshydrogénase, protéinase, peptidase (Vallee et Auld,1990;Kabata-Pendias et Pendias, 2001). Le cobalt est un cofacteur chez certaines

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enzymes du métabolisme de la vitamine B12 (Wang et al., 2003) et le fer est un cofacteur chez les dioxygénases et mono-oxygénases (Jakoncic et al., 2007 ).

Une deuxième catégorie, comporte les métaux lourds toxiques même en faibles quantités, car ils n’ont aucun rôle biologique connu, c’est le cas du mercure (Hg),le plomb (Pb), le cadmium (Cd).

1.2. Sources et distribution

Les métaux sont présents dans tous les compartiments de l’environnement, mais généralement, en quantités très faibles, « en traces », pour cette raison, l’on préfère l’appellation d’ « Eléments Traces Métalliques » ou ETM (Didier et al., 1993).

Les ETM sont présents naturellement dans les roches (Fig.2), ils sont libérés lors de l’altération de celles-ci pour constituer le fond géochimique ou Pool endogène (Bourrelier et Berthelin, 1998) . Les sources naturelles atmosphériques consistent en une émission de particules due, aux activités volcaniques, aux feux de forêts ou aux particules du sol emportées par le vent (Nriagu, 1989). Tandis que les principales sources de pollution anthropique ,sont les activités industrielles, minières et agricoles, mais aussi des quantités croissantes de déchets domestiques issues des activités urbaines (Nriagu & Pacyna, 1988).Les boues résiduaires d’origine urbaine ,constituent une autre source de contamination des zones agricoles par les métaux lourds (Terslov, 1997).

Figure 2. Sources et distribution des métaux lourds dans le sol (Soes ,2009)

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2. Généralités sur le cadmium 2.1. Propriétés et caractéristiques physico-chimiques générales

Abrégé en Cd, le cadmium est un métal d’aspect blanchâtre, argenté et malléable. Il appartient au groupe IIB du tableau périodique. Il se retrouve ainsi souvent associé aux éléments du même groupe ,dans les roches, c’est à dire avec le zinc ou le mercure. Le Cd se trouve, la plupart du temps sous forme de cation divalent et il possède une affinité forte pour les soufre et différents composés organiques (Kabata-Pendias 2001). Il se distingue par un rayon ionique effectif (0,97 Å) très proche de celui du calcium (0,99 Å), ce qui explique pourquoi il peut facilement se substituer à ce dernier dans les sites de fixation du Ca, sur les roches phosphatées ou au sein des molécules d’origine biologique. Les principales caractéristiques du Cd sont regroupées dans le Tableau I.

Tableau I. Propriétés physico-chimiques du cadmium (Lenntech, 2007) ,A droite aspect du cadmium pur

Symbole chimique Cd

Numéro atomique 48

Masse volumique 8.65g.cm-3 à 20°C

Masse atomique 112.41g.mol-1

Etat d'oxydation +2

Température de fusion 321°C

Température d'ébullition 767°C

2.2. Sources de Cadmium

2.2.1. Origine naturelle

Le Cd (stable), est un élément assez rare dans la croûte terrestre (0.3ppm). Son rejet lié aux activités anthropiques est environ 10 fois plus important que celui provenant des sources naturelles. La source de dispersion naturelle du cadmium dans l’ atmosphère est principalement liée à l’ activité volcanique et à l’ altération des matériaux de la croûte terrestre .

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2.2.2. Origine anthropique

Les principales sources de pollution de l’environnement par le Cd, sont les activités industrielles, les activités agricoles et l’exploitation des minerais (Fig.3). Sachant que ce métal est largement utilisé dans des applications diffuses pour protéger l’acier contre la corrosion (cadmiage), dans les accumulateurs électriques (piles) sous forme de Ni-Cd et aussi comme stabilisant pour les plastiques et les pigments. Ainsi, les rejets domestiques et urbains, peuvent être considérés comme des sources importantes de pollution des différents écosystèmes par le Cd. Par ailleurs, l’épandage des boues provenant des stations d’épuration sur le sol peuvent constituer également une source de pollution (GisSol ,2011). Avec 65 % de la production mondiale réalisée lors de ces quelques dernières années, le Cd est considéré comme le métal du XXème siècle (Sammut, 2007).

Figure 3. Différentes activités responsables de la pollution de l’environnement par le cadmium et autres éléments minéraux (Malik et Ahemad , 1995).

2.3. Le cadmium dans le sol

Dans le sol le Cd est relativement mobile (Bourrelier et Berthelin, 1998), Cependant, en présence d’éléments ou de substances de forte oxydation dans le sol, le cadmium forme des 3+ oxydes, des carbonates ou des sulfates tels que le CdO, le CdCO3, le CdHCO et le CdSO (Sposito, 1989 ; Kabata-Pendias et Pendias, 1992). Le Cd peut aussi s’associer aux composés organiques présents et former des complexes plus stables, c’est pour cette raison qu’il a tendance à s’accumuler dans les horizons supérieurs, riches en matière organique. Par ailleurs, dans les sols riches en calcaire, la faible solubilité des carbonates de cadmium limite

Etude bibliographique considérablement la mobilité des ions cadmium. Ainsi, les complexes de type carbonate, constituent une phase de sorption dominante, contrôlant ainsi la distribution et la biodisponibilité du cadmium (McBride, 1980). Cependant La teneur en élément métallique dans un sol ne peut être une indication suffisante pour évaluer sa mobilité, sa biodisponibilité et conséquemment sa toxicité pour les organismes vivants (microorganismes, plantes, animaux) (He et al., 2009). Plus que sa teneur, c’est la forme sous laquelle se trouve l’élément c’est à dire la spéciation, qui est déterminante. La spéciation peut être définie comme la distribution d’un élément donné ou d’un composé au sein de différentes formes (ou espèces) chimiques, qui dans l’ensemble, représentent la teneur totale de l’élément (Cai et al., 2007). Ces espèces sont différenciées selon leur composition isotopique, leur structure électronique, leur état d’oxydation, et/ou leur structure moléculaire (Fig.4). La forme chimique des métaux affecte leur biodisponibilité et leur capacité de transfert vers les écosystèmes, par exemple les métaux dissous (solubles) sont plus disponibles pour les plantes et les organismes que les métaux fortement liés à des structures cristallines ,hormis dans le cas d'une altération du minéral (Monterroso et al., 2013). Dans le cas du Cd, la forme 2+ hydratée (Cd(H2O) 6) , est la forme la plus disponible, c’est-à-dire la plus apte à être prélevée par les microorganismes et à agir sur leur métabolisme. Ainsi, plus l'élément métallique est libre et mobile, plus il est biodisponible, et plus le risque de toxicité sur les organismes vivants augmente (Roane et Peper, 2000).

Figure 4. Divers états d’éléments métalliques et le phénomène de mobilité (Juste, 1995)

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2.4.Paramètres influençant la spéciation Les formes chimiques des éléments traces (spéciation), leurs interactions et associations avec les différents constituants du sol (argiles, oxy-hydroxydes, carbonates, capacité d’échange cationique et matières organiques les teneurs en argile, en anions et cations, en oxydes de Fe, d’Al et de Mn, le potentiel rédox, la présence d’agents complexants),et le pH, conditionnent leur biodisponibilité pour les végétaux et les microorganismes par le biais de leur mobilité (Antoniadis et al., 2008; Usman et al., 2008).

2. 4.1. Effet du pH

L’acidification du sol favorise la mobilité des métaux lourds notamment par la mise en solution de sels métalliques ou la destruction de la phase de rétention (Kirkham, 2006). Inversement, l'augmentation du pH provoque l'immobilisation par la formation de composés insolubles ou des cristaux (Du Laing et al., 2007). Le Cd est beaucoup plus mobile que le Zn , particulièrement autour de pH 4,5-5,5 et il ne l’est plus au dessus de pH 7,5.(Maynaud,2012). De manière générale, un milieu acide rend les métaux plus disponibles pour les organismes qu'un milieu alcalin.

24.2. Effet de la matière organique

La biodisponibilité du cadmium dépend non seulement du pH , mais aussi de la richesse du sol en matière organique. En effet, les matières organiques présentent à leurs surfaces de nombreux groupements fonctionnels, permettant ainsi la complexation des éléments métalliques avec des substances humiques insolubles intégrées à la matrice du sol (Kretzchmar and Schäfer, 2005 ; Madejón et al., 2010). Les groupements hydroxyles (‐OH) ou carboxyles (‐COOH) sont les plus abondants dans le sol, alors que les groupements thiols (‐SH) ou amines (‐NH2) le sont moins, mais peuvent jouer un rôle très important dans la complexation des éléments chimiques (Cheng et al., 2010).Des études ont signalé que l’enrichissement du sol par de la matière organique comme les acides humiques , entraîne une diminution de biodisponibilité du Cd (Almas et al., 2000 ; Zhou et Wong, 2003). 2.4. 3. Les argiles Les minéraux secondaires, comme les argiles issus directement ou indirectement des minéraux primaires de la roche mère sont considérés comme les principaux constituants

Etude bibliographique minéralogiques des sols qui contribuent au piégeage des polluants métalliques comme le Cd ,Zn, Cu et Pb (Kabata-Pendias et Pendias, 1992 ; Alloway, 1995).

3 .Le cadmium : Problématique environnementale 3.1 Toxicité et Ecotoxicité 3.1.1. Vis- à -vis de l’Homme

Contrairement aux contaminants organiques, les métaux lourds, ne peuvent pas être dégradés biologiquement et persistent indéfiniment dans l’environnement. Sans fonction biologique connue, en dehors d’une implication dans une enzyme de diatomée (Lane et al., 2005), le cadmium est un polluant extrêmement toxique pour la plupart des organismes. (Godt et al., 2006). Chez l’Homme, les deux principales voies d’exposition sont l’inhalation et l’ingestion. Ce métal est transporté dans le sang via l’hémoglobine et est efficacement retenu dans les reins et le foie, avec une demi-vie allant de 20 à 30 ans. Il peut causer une déminéralisation des os, par dommage direct ou comme conséquence d’un dysfonctionnement rénal. Il a ainsi été à l’origine d’une intoxication aigüe au Japon ,dans la première moitié du 20e siècle, engendrée par l’exploitation minière : la maladie d’Itai -Itai (littéralement maladie aïe-aïe) ,dont le nom vient du fait, que le métal absorbé en fortes concentrations, dans le riz cultivé dans des parcelles contaminées, entraînait la rupture très douloureuse des os, des personnes touchées. Le Cd est classé dans la catégorie « 1»cancérogènes pour l’Homme, par l’Agence internationale de recherche sur le cancer« (IARC) (Leblanc et al. 2004). L’alimentation est la première source d’exposition au Cd, notamment par les légumes comme les pommes de terre, suivis par les crustacés et mollusques (6,41 %), le pain et les biscottes (5,78 %) et les eaux (4,51 %) (Leblanc et al. 2004).

3.1.2. Vis- à -vis des plantes

Le cadmium est également connu pour sa phytotoxicité. Celle-ci se manifeste tout d’abord par une réduction de croissance, des chloroses, qui peuvent être suivies de nécroses puis de la mort de la plante. Dans le cas d’une intoxication aigüe, la concentration critique, à partir de laquelle le Cd perturbe le fonctionnement des plantes non adaptées au métal, varie de 8 à 12 mg kg-1 (Balsberg 1989). Ses effets dépendent de la dose et de l’espèce considérée. L’origine de la phytotoxicité n’est pas complètement éclaircie et serait attribuée à une perturbation, soit de la photosynthèse, soit de la nutrition minérale (Fe, Ca, Mg, K et P) (DalCorso et al. 2008). Cependant, dans beaucoup de situations de contaminations de sols par le Cd, les teneurs en ce

Etude bibliographique dernier sont plus préoccupantes du fait des risques de transfert du métal dans les parties consommées, que pour la toxicité vis-à- vis de la plante elle même.

3.1.3. Vis- à -vis des microorganismes

L’impact du Cd sur les microorganismes est encore plus marqué en raison de leur petite taille, qui est en contact intime avec le vaste milieu environnant. Le Cd affecte les bactéries sur le plan structurel de la population, en augmentant la tolérance de base de certains microorganismes, diminuant ainsi la biodiversité des microorganismes retrouvés dans ces sols, en comparaison avec des sols non pollués (Pier-Anne, 2009).

Sur un plan cellulaire, le cadmium affecte négativement la croissance, la division cellulaire, en s’accumulant sur la paroi cellulaire, ce qui provoque une diminution de la plasticité de celle –ci d’une part ,d’une autre part le cadmium inhibe la croissance suite aux dommages oxydatifs qui sont à l’origine d’une réduction de l’activité cellulaire et du taux de croissance (Sihamim et Rehman,2012).Le cadmium affecte négativement les activités enzymatiques et respiratoires, à l’origine de la diminution du nombre et du changement dans la structure et la diversité des populations microbiennes (Roane et Pepper, 2000) (Fig. 5). Le Cd peut, altérer les membranes cellulaires par le biais de la peroxydation lipidique, et provoquer des changements dans la composition des lipides .La peroxydation concerne essentiellement les acides gras polyinsaturés, il en résulte une modification de la perméabilité membranaire, entrainant souvent un efflux d’ions de potassium (K+) (Valko et al., 2007 ; Rodriguez- Serrano et al., 2009). De même, le Cd peut affecter la structure des acides nucléiques, des protéines par fixation aux groupements thiols et interaction avec le métabolisme du calcium et du zinc (Gadd et Griffiths, 1980, Nies, 1999).

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Figure 5. Effets toxiques du cadmium et autres métaux sur les microorganismes (Giller et al., 1998)

Le Cd peut inhiber la réparation des lésions de l’ADN formées spontanément ou suite à des réactions oxydatives, en interférant avec des enzymes antioxydantes, par exemple en se substituant au zinc de certaines protéines impliquées dans la réparation de l’ADN, comme il peut influencer le niveau d’expression des gènes en interférant dans des voies de transduction du signal (Hartwig, 2002). En outre, le cadmium peut également entraîner l’augmentation d’un messager secondaire autre que les ROS : le calcium intracellulaire (Misra et al., 2002). Cette augmentation en Ca2+ peut provoquer une dérégulation de l’expression des gènes de façon directe (Hardingham et al., 1997) ou indirecte (Livneh et Fishman, 1997).

3. 2.Cadmium et stress oxydant

Le stress oxydant ou oxydatif, peut être défini comme un excès d’espèces oxydantes ou d’espèces réactives d’oxygène (ERO) (ou ROS pour Reactive Oxygen Species dans la terminologie anglophone), au sein de la cellule, suite à une surproduction de celles-ci (ERO) ou une carence au niveau des systèmes de défense antioxydants (Chow et al. , 2007). Le métabolisme normal de la cellule produit, sans cesse des espèces réactives d’oxygène (Storz et Imlay, 1999). En effet, les systèmes utilisant un transfert d’électrons, sont le lieu de « fuites électroniques ». Imlay et Fridovich (1991) ont montré, que la plus importante source .- de O2 in vivo , était très probablement la chaîne de transport des électrons présente chez les

Etude bibliographique cellules aérobies . Les principales espèces réactives de l’oxygène, formées au cours de réductions successives de I ‘oxygène moléculaire (Fig.6), sont le peroxyde d'hydrogène H2O2, 2 .- . I'anion superoxyde O2 , le radical hydroxyle OH .( Byczkowski et Gessner, 1988).

Figure 6.Principales espèces réactives de l’oxygène (ERO) générées par réduction monovalente de l’oxygène (Soughir,2012) Les ions métalliques peuvent être toxiques en activant les formes réduites de l’oxygène pour aboutir à la formation d’espèces radicalaires qui en réagissant avec les molécules essentielles de l’architecture cellulaire tels que les acides nucléiques, les protéines ou les lipides, engendrent des dégâts cellulaires, des dysfonctionnements enzymatiques ou la peroxydation des lipides.

Néanmoins, et en présence de Cd, il se crée un déséquilibre entre la génération des ERO et la production d’antioxydants (Ikediobi et al., 2004) .Le Cd peut inhiber la chaîne de transport des électrons et de ce fait induire la production des ERO (Wang et al., 2004). Le Cd génère indirectement un stress oxydant suite à sa capacité à déplacer des éléments métalliques essentiels tels que le Fe2+ et le Cu2+ des métalloprotéines,ce qui permet d’augmenter la concentration de ces oligoéléments dans la cellule (Tamas et al, 2006).Or le Fe2+ et le Cu2+,sont directement impliqués par la génération directe des ERO (Fig.7).

Ainsi,Gonzalez-Flecha et Demple (1995) ont montré que 87% du peroxyde d’hydrogène .- intracellulaire est formé au niveau de la chaîne respiratoire. Parallèlement, O2 et H2O2 participent à la production du radical hydroxyle OH., via les réactions d’Haber- Weiss(Goldstein & Czapski, 1983) et de Fenton (Rush & Bielski, 1985).

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Figure 7. Réactions de Fenton et de Haber-Weiss ,source de génération des radicaux hydroxyls. (https://www.researchgate.net )

3.2.1. Les dommages liés au stress oxydant

Toutes les macromolécules biologiques sont des cibles potentielles des ERO (Valko et al., 2007) , Ces dernières réagissent avec les lipides, les protéines et les acides nucléiques. Les ERO altèrent la composition lipidique des membranes cellulaires ce qui est à l'origine d'une peroxydation membranaire, provoquent l’oxydation des groupements soufrés (sulfonyls, sulfhydriles) des protéines. Ils sont à l'origine d'une activation ou une désactivation de plusieurs enzymes tels que les enzymes intervenant dans le métabolisme oxydant. et l’oxydation des acides nucléiques (Fig.8).Ces altérations peuvent conduire à des pertes de fonction et d’intégrité et une altération des fonctions vitales de la cellule, conduisant parfois à sa mort (Briat et Lebrun, 1999)

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Figure 8. Cibles biologiques des ERO et mode d’action des systèmes enzymatiques antioxydants et de leurs cofacteurs métalliques (Matés, 1999)

3.3. Systèmes antioxydants : les antioxydants agissent soit en réduisant ou en dismutant les espèces réactives de l’oxygène, soit en les piégeant pour former un composé stable. Ils peuvent aussi chélater le fer libre ou le cuivre pour empêcher la réaction de Fenton (Favier, 2003). Ces systèmes peuvent être de type enzymatique ou non (Wassmann et al., 2004).

3.3.1. Système enzymatique Les enzymes antioxydantes (Fig.9) ont une signification négligeable dans l’espace extracellulaire alors qu’elles jouent un rôle très significatif dans l’espace intracellulaire (Durackova, 2008). On note principalement: ✓ Les enzymes responsables de la dismutation de l’ion superoxyde sont les superoxydes dismutases, ✓ Les enzymes agissant sur les peroxydes comme la catalase et la glutathion peroxydase, et l’ascorbate peroxydase ✓ Les enzymes intervenant dans la réparation aussi bien des lipides endommagés que les

Etude bibliographique protéines oxydées à fonction thiol ,ce sont les thiorédoxines (Goudable et Favier, 1997)

Figure 9 .Schéma des réponses antioxydantes de la cellule face aux ROS : GRd - Glutathion Réductase, GPx - Glutathion Peroxydase, CAT - Catalase, SOD - Superoxide Dismutase, en vert - Réaction de Fenton, GSSG - Glutathion oxydé, GSH - Glutathion réduit( InPerhirin,2009)

3.3.1.1.Superoxyde dismutase (SOD): c’est l'enzyme antioxydante la plus importante dans la défense contre le stress oxydatif (Anderson et al, 1997). C’est une métallo-enzyme qui dismute l'anion superoxyde en oxygène moléculaire et peroxyde d'hydrogène (Fridovich,1995 ; Frank et al., 2004). Trois isoformes de SOD ont été distinguées à savoir : (Cu/Zn-SOD), (Mn-SOD), (Fe-SOD). Récemment, une nouvelle SOD contenant du nickel (Ni-SOD), a été purifié à partir de plusieurs espèces de Streptomyces (Wuerges et al., 2004 ; Schafer et Kardinah, 2003). Les types Cu/Zn-SOD sont très répandues dans le cytosol et le périplasme des procaryotes (Steinman, 1985 ; Steinman, 1992).

3.3.1.2.Catalase (CAT): c’est une enzyme endogène antioxydante, catalyse la dismutation du peroxyde d’hydrogène en dioxygène et en eau (Chelikani et al., 2004). Elle existe chez tous

Etude bibliographique les organismes aérobies et participe comme la peroxydase à la défense contre les dérivés toxiques de l’oxygène (Goudable et Favier, 1997). La catalase assure l’élimination du peroxyde d'hydrogène produit dans les conditions physiologiques (Ye-Shih et al., 2004).

3.3.2. Système non enzymatique

Certaines substances ont la propriété de piéger et d’anéantir les espèces réactives de l’oxygène. Il s’agit de composés facilement oxydables présents dans le cytoplasme comme l’acide ascorbique ou le glutathion ou dans les membranes cellulaires comme la vitamine E (Vertuani et al., 2004).

3.3.2.1. Le Glutathion (GSH)

C’est un tripeptide composé de glutamate, cystéine et glycine (Vivancos et al., 2010). Il est présent chez plusieurs procaryotes (Fahey, 2001; Allocati et al., 2009). Le GSH agit comme un antioxydant en interagissant directementavec les espèces réactives de l'oxygène ou de l’azote et les électrophiles pour prévenir les effets néfastes de différents stress cellulaires, incluant le stress métallique (Cobbett, 2000 ; Ahner et al., 2002 ; Kawakami et al., 2006). Il peut aussi agir indirectement en tant que cofacteur de plusieurs enzymes telles que la glutathion peroxydase « GPx » (Lushchak, 2012). Le GSH peut également agir comme réserve de cystéine, pour prévenir directement Le GSH ; cependant n’est pas synthétisé par tous les microorganismes et est donc absents chez plusieurs groupes procaryotiques. Le glutathion intervient également dans la détoxification du cytoplasme des ions métalliques, en se complexant à ces derniers, modifiant ainsi leur spéciation et conséquemment leur toxicité.

Comme les métallothionéines, le glutathion réduit (GSH) peut lier le cadmium et empêcher son interaction néfaste avec des cibles cellulaires (Singhaet al., 1987).

4. Interactions Bactéries éléments traces métalliques et mécanismes de résistance

4.1. Interactions Bactéries éléments métalliques L’interaction microorganismes-éléments métalliques se produit sur une gamme de concentrations allant du nanomolaire pour l’homéostasie (éléments minéraux essentiels), au millimolaire pour la résistance (éléments toxiques) et jusqu’au molaire pour certains microorganismes chimiolithotrophes acidophiles (Monchy, 2007). Du fait des similitudes entre les métaux, les non essentiels peuvent suivre accidentellement la même voie que les métaux essentiels, ce qui explique en

Etude bibliographique partie la toxicité des métaux. L’internalisation est l’étape clé du mécanisme d’assimilation des métaux .Les ions métalliques lourds, entrent dans la cellule par deux types de voies. Une voie passive et une autre voie active (Tableau II). ➢ Voie passive Est un système passif exprimé constitutivement, qui incorpore rapidement les ions au travers des membranes plasmiques bactériennes de façon non-spécifique en fonction du gradient chimio-osmotique. Il est constitué par des protéines de la famille des MIT (Metal Inorganic Transport), comme CorA pour le transport du nickel, du cobalt, du zinc ou du manganèse. Cette "porte ouverte" est la raison principale pour laquelle les métaux lourds sont toxiques. L’expression des gènes de la famille MIT peut être diminuée par mutation et ces mutants deviennent tolérants aux métaux. Par exemple, les mutants corA ont été décrits comme tolérants au cobalt (Nelson et Kennedy, 1971). ➢ Voie active Est un système de transport lent d’import (Tableau II), qui possède une forte affinité pour son substrat et utilise l’hydrolyse de l’ATP comme source d’énergie. Sa production est induite en fonction du gradient chimio-osmotique et des besoins de la cellule (Nies and Silver, 1995).

Tableau II. Protéines de transport des éléments métalliques chez les microorganismes (Nies, 2003)

Familles de protéines Type de Transport Source d’énergie Ions métalliques ABC Import, Efflux ATP Mn2+, Zn2+, Fe2+, Ni2+

P- ty pe Import, Efflux ATP Mg 2+, Mn2+, Ca2+, K+, Cu2+, Zn2+, Cd2+, Pb2+, Ag+ A-ty pe Efflux ATP Arsenic RND Efflux Gradient de protons Co2+, Zn2+, Cd2+, Ni2+, Cu2+, Ag+ Hox N Import Chimiosmotique Co2+, Ni2+ CDF Efflux Chimiosmotique Zn2+, Cd2+, Co2+, Fe2+ MIT Import Chimiosmotique Un grand nombre d’ions Les ATPases de type P assurent l’import du manganèse, du magnésium, du calcium, du potassium, du cuivre, du zinc, du cadmium, du plomb et de l’argent (Fagan ,1994).Les ATPases de type P ,assurent dans l’autre sens du transport, l’efflux de Mg 2+, Mn2+, Ca2+, K+, Cu2+, Zn2+, Cd2+, Pb2+, Ag+

4.2. La résistance bactérienne aux métaux lourds

Le principal défi des micro-organismes, en présence d’un excès d’ions métalliques dans leur milieu environnant, consiste à leur capacité à maintenir une concentration intracellulaire, appropriée en métaux essentiels et à exclure en même temps les métaux 19

Etude bibliographique toxiques. Ce défi environnemental ancien, était probablement un moteur qui a permis l'évolution des mécanismes d'homéostasie et de détoxification des métaux lourds (Gatti et al., 2000). Ainsi, les microorganismes, ont développé des systèmes de résistance, pour faire face aux stress générés par les métaux toxiques. Ces systèmes, qui sont basés sur des gènes chromosomiques, plasmidiques ou encore sur des transposons, confèrent des résistances à la quasi-totalité des éléments du tableau périodique (Misra, 1998; Silver 1998). Chez les microorganismes, les principaux mécanismes de détoxication des métaux (Fig.10) concernent, les mécanismes qui permettent de maintenir les ions hors de la cellule tels que, la biosorption, la biominéralisation, la précipitation, la chélation et l‘imperméabilité membranaire, ainsi que d’autres mécanismes activés, après pénétration des ions métalliques dans le cytoplasme et concernent principalement la complexation et l’efflux (Monchy,2007).

Figure 10 .Principaux mécanismes de résistance bactérienne aux métaux lourds (Desauney,2011)

4.2.1. La biosorption

Un premier processus passif dit « Passive uptake » (Malik, 2004), consiste en la fixation des métaux par la surface bactérienne .Ce mécanisme met en jeu particulièrement la voie périphérique cellulaire, qui est la paroi. Cette dernière, représente la première ligne de

Etude bibliographique défense, contre la toxicité des ions métalliques et constitue de ce fait un compartiment cellulaire très réactif avec les métaux lourds .La structure de la paroi est d’une importance capitale, puisqu’elle conditionne la charge et la capacité à échanger les protons et retenir les cations comme les métaux lourds à sa surface externe. C'est plus particulièrement la charge nette négative de l’enveloppe cellulaire, qui fait que ces microorganismes soient capables de fixer et d’accumuler les cations métalliques de l'environnement. La paroi des cellules bactériennes présente de nombreux composants, encore appelés groupements fonctionnels, susceptibles de réagir avec les constituants extérieurs. En effet étant en contact avec le milieu extérieur, les différents composants présents sur la couche externe des cellules ,sont des lieux d’interactions privilégiés avec l’environnement (ions, métaux, pesticides, composants du sol…). Les groupes fonctionnels présentent des fonctions anioniques au niveau de la surface bactérienne, qui vont être les principaux responsables de la capacité des bactéries à fixer les cations métalliques. Différentes techniques ont été utilisées afin de caractériser les groupements fonctionnels des cellules bactériennes (titrations acide-base, spectroscopie EXAFS, ATRFTIR…) (Guiné et al., 2006, 2007; Mishra et al., 2009). Ainsi ,Cox et al., (1999), ont établi une liste des principaux sites réactifs et leur localisation au niveau des parois bactériennes, présentées et décrites dans le Tableau III ci-dessous

Tableau III : Principaux groupements fonctionnels et constituants membranaires chez les bactéries (Cox et al.,1999)

Groupements fonctionnels Constituants membranaires Carboxyles R-COOH Acides lipoteichoiques,LPS,EPS

Phophomonoesters R-OPO3H2 Acides teichoiques,EPS,LPS

Phosphodiesters (RO)2-P (OH)2 Peptidoglycanes ,Phopholipides Amines R-NH3+ Peptidoglycanes ,Phopholipides Hydroxyles R-OH Peptidoglycanes Ces groupements fonctionnels membranaires, forment des ligands avec les cations métalliques. Ces groupements fonctionnels font partie de la structure de la membrane cellulaire des Gram –négatif et Gram-positif. Ce processus est indépendant de l’état physiologique de la bactérie (morte ou vivante). Par ailleurs, de nombreux travaux récents ont pu mettre en évidence l’intervention des sites réactifs impliquant le soufre dans la rétention du zinc et du cadmium, et également la participation de groupements sulfhydriles (Fig . 11) dans la fixation du cadmium par des consortiums bactériens (Guiné et al., 2006 ; Mishra et al., 2009).

Etude bibliographique

Faible [Cd] Forte [Cd]

Ligands sulfhydrile Ligands phosphoryle, et carboxyle sulfhydrile et carboxyle

Figure 11. Schémas des structures moléculaires des ligands des surfacesbactériennesimpliqués dans la biosorption du Cd2+en fonction de la concentration (Guiné, 2006)

Un deuxième processus de biosorption fait intervenir des constituants anionique (ligands) contenus dans les substances polymériques extracellulaires ou EPS.

4.2.1.1. Les substances polymériques extracellulaires ou EPS Les EPS sont majoritairement composées d’une grande variété de macromolécules de haut poids moléculaire tels que des polysaccharides (75 à 90 % de la masse) et dans une moindre proportion, de protéines, des acides nucléiques et quelques molécules de faible poids moléculaire non-polymériques. Les EPS présentent de très bonnes propriétés de rétention des métaux avec des variations de spécificité et d’affinité. La fixation des cations aux bio- polymères bactériens se fait généralement par l'interaction électrostatique avec des groupes fonctionnels négativement chargés portés par les polysaccharides comme les acides uroniques ,le pyruvate ,succinate et acétate . La partie protéique des EPS joue aussi un rôle majeur dans la complexation d'ions métalliques. Les protéines riches en acides aminés acides (notamment l'acide glutamique et aspartique) contribuent aussi aux propriétés anioniques des EPS. Les acides nucléiques sont poly-anioniques en raison de la présence des résidus phosphates sont suspectés d’être impliqués dans des liaisons électrostatiques avec les cations (Pal et Paul, 2008). Sur le plan immunologique, les lipopolysaccharides constituent l'antigène O des bactéries à Gram négatif. Le LPS est un lipide complexe auquel est attaché un polysaccharide qui est responsable de la spécificité antigénique de l'antigène O. Parmi les polysaccharides de surface (Fig.12), on peut distinguer les lipopolysaccharides, la capsule et les couches muqueuses ou slime. Les lipopolysacchrides (ou LPS) sont des

Etude bibliographique composants essentiels de la paroi bactérienne des bactéries à Gram négatif. La capsule est l'enveloppe qui entoure la paroi de certaines bactéries. Elle est généralement de nature polysaccharidique.La capsule est une structure bien organisée, alors que le slime correspond à des constituants polysaccharidiques plus ou moins libérés dans le milieu et ne constituant plus une véritable entité morphologique (structure lâche). En général, les polymères qui se trouvent à l’extérieur de la paroi cellulaire et qui ne sont pas directement ancrés dans la membrane sont considérés comme des EPS solubles. Ces EPS sont des polymères synthétisés par la bactérie puis, excrétés dans le milieu ou ils constituent une barrière protectrice hautement hydratée qui joue un rôle dans la survie des bactéries puisqu’elle permet de tamponner les variations physicochimiques du milieu naturel (Harrah et al., 2006). Elles assurent des fonctions variées comme la lutte contre la dessiccation, les substances hydrophobes toxiques, la résistance aux antibiotiques, la capture des minéraux essentiels et des nutriments et la biosorption des métaux (Comte et al., 2008; De Philippis et al.,2011) .

Figure 12.Représentation schématique des exopolysaccharides de surface bactérienne .

EPS :Exopolysaccharides ;KPS :Exopolysaccharides capsulaires ;LPS :Lipopolysaccharides ; IM :;membrane interne (internal membrane) ;OM :membrane externe (Outer membrane)

Source :Lepek et D’Antuono(2005)

Source :Lepek et D’Antuono (2005) Dans une récente étude, Kenney et Fein (2011) , avaient montré que les EPS présentent des groupements fonctionnels similaires à ceux que l’on retrouve à la surface des cellules bactériennes. 4.2.2. La biominéralisation

La biominéralisation est définie comme étant la synthèse de matières minérales cristallines ou amorphes, par des organismes vivants (Yoshida et al,.2010).De nombreux travaux témoignent de la capacité des bactéries à catalyser la formation de précipités minéraux

Etude bibliographique insolubles emprisonnant un métal, ce qui peut représenter un procédé intéressant pour immobiliser et confiner un métal toxique à la surface bactérienne. La biominéralisation requiert des conditions de milieu spécifique tel qu’une forte alcalinisation. Ainsi, la formation 2− de carbonate de calcium se fait à partir d'une solution sursaturée en CO3 qui réagissent avec les ions (Ca2 +) dans le milieu .Ces ions proviennent des activités métaboliques des bactéries et provoquent l’alcalinisation du milieu (Bosak ,2011).Les cristaux formés peuvent s’adsorber de façon non spécifique sur la paroi extracellulaire (Podda et al., 2000). Selon des études récentes réalisées in vitro, la biominéralisation peut assurer l’élimination d’un taux très important (99,95%) de Cd2+après seulement deux jours de contact (Kang et al . , 2014).

4.2.3. La précipitation

La précipitation extracellulaire intervient quand les microorganismes produisent ou sécrètent des substances qui réagissent avec les métaux solubles pour produire un composé métallique insoluble. Les métabolites inorganiques tels que des ions sulfate, carbonate ou phosphate issus principalement du métabolisme respiratoire, peuvent précipiter des ions métalliques toxiques. La formation de sulfures métalliques par les bactéries sulfato-réductrices (sédiments anoxiques, sols faiblement aérés) est par exemple l’un des processus d’immobilisation microbiologique les plus connus (Ledin, 2000). Ainsi, Cupriavidus sp. et Klebsiella aerogenes sont capables de détoxifier le Cd, en excrétant des sulfures pour limiter l’influx de Cd dans la cellule (Aiking et al., 1982; McEntee et al., 1986). Des souches de Citrobacter utilisent les phosphates pour précipiter le Cd à l’extérieur de la cellule pour éviter son entrée (Macaskie et al., 2000). Il a été signalé chez C. metallidurans souche CH34 , un processus de bioprécipitation des métaux sous forme de bicarbonates ou d’hydroxydes pour empêcher la ré-entrée des cations exportés (Diels et al., 1995) . D’autres mécanismes interviennent pour prévenir l’entrée du métal dans le cytosol, à l’instar de la chélation et l’imperméabilité membranaire.

4.2.4. La chélation

Les sidérophores, dont certains, ont une forte affinité pour les métaux lourds, même si elle reste inférieure à celle observée pour le Fer, les agents complexant tel que les acides organiques (oxalate, citrate…) ou encore les polyphosphates, il a été démontré une production de sidérophores, induite par le cadmium (Sinha et al.,2008).

Etude bibliographique

4.2.5. L’imperméabilité membranaire

La réduction de la pénétration du Cd dans les cellules constitue un mécanisme très important dans l’atténuation des effets toxiques des métaux lourds sur les molécules biologiques. Ainsi certaines bactéries limitent l’entrée des métaux en modifiant la production des porines (Lutkenhaus, 1977). Il a été montré par des études protéomiques portant sur E. coli, qu’un stress par les ions cadmium provoquait, chez cette bactérie, une diminution de la synthèse de la porine OmpF (Faber et al., 1993). Cette protéine étant supposée jouer un rôle dans l’entrée des métaux, la baisse de sa production aura, de ce fait, un impact sur l’accumulation intracellulairedes ions métalliques. Plusieurs études ont montré une corrélation entre une absorption réduite de Cu et la tolérance au Cu. Des souches de levure, résistantes aux métaux lourds montrent une réduction de l’absorption du Cu et du Cd.

Après internalisation des ions métalliques ou Bioaccumulation, d’autres mécanismes interviennent dans la résistance et concernent principalement la complexation et l’efflux.

4.2.6. La bioaccumulation

C’est un mécanisme par lequel des éléments métalliques sont transportés dans la cellule au travers des membranes biologiques. Chez les bactéries à Gram-négatif, le transport est réalisé en deux phases distinctes : une phase initiale de biosorption très rapide, suivi d’une autre active dépendante du métabolisme cellulaire, du métal considéré, de sa concentration et de son état (internalisation). D’après certaines études, le métabolisme des métaux ne peut s’expliquer seulement par la rétention des métaux sur les membranes, mais plutôt par l’intervention de composants, de structures et de compartiments cellulaires variés (Nies et Silver, 1995 ; Guiné et al., 2006 ; Ha et al., 2010). En effet, la pénétration, le stockage et l’éxtrusion des ions métalliques seront sous la dépendance des facteurs abiotiques du milieu tel que le pH (Binet et al., 1997). Chez les bactéries à Gram-négatif, après internalisation des ions métalliques la détoxification s’effectue souvent en combinaison avec des systèmes d’efflux, des protéines à hautes affinités telles que les métallothionéines le glutathion et autres agents complexant (Bruins et al., 2000 ; Blindauer et al., 2002).

4.2.7. La complexation La complexation se fait par l’association des métaux comme le mercure, le cadmium, le plomb, le zinc, l’argent et le cuivre avec des protéines de haute affinité pour les ions

Etude bibliographique métalliques de type métallothionéines (Fig . 8) (Bruins et al., 2000; Blindauer et al., 2002) ,ou encore le glutathion ,qui par leur propriétés chimiques, lient le cadmium pour réduire sa réactivité chimique .

➢ Les métallothionéines

Ce sont des molécules de faible poids moléculaire (6-7 kDa) riches en cystéines (Fig.13) que l’on retrouve principalement chez les eucaryotes ainsi que chez quelques procaryotes (Hamer, 1986). Bien que de nombreux génomes bactériens aient été séquencés, peu de métallothionéines ont été identifiées à ce jour. Elles ont principalement été trouvées chez des Cyanobacteria et des bactéries du genre Pseudomonas (Blindauer et al., 2002).Les métallothionéines sont divisées en trois classes sur la base de leur structure et de leur contenu en cystéines. Les motifs caractéristiques et invariables des métallothionéines sont Cys-Cys, Cys-X-Cys et Cys-X-X-Cys où X correspond à n’importe quel acide aminé à l’exception des acides aminés aromatiques et de l’histidine. La biosynthèse des métallothionéines est régulée au niveau transcriptionel et peut être induite par des métaux.

Figure 13. Structure (résonnance magnétique nucléaire ou RMN) de la métallothionéine bactérienne Zn4SmtA (Blindauer, 2001).

4.2.8. Les système d’efflux

La résistance au Cd est principalement basée sur des systèmes d’efflux (Silver et Phung, 2005) .Le système d’efflux sert à porter le métal introduit dans la cellule, hors du cytoplasme vers le périplasme (transporteurs ABC, ATPases de type P, transporteurs CDF) mais aussi du périplasme vers l’extérieur de la cellule (protéines RND) .Ainsi, l’accumulation des cations métalliques, peut être diminuée, par l’intermédiaire de systèmes d’efflux des ions, au travers 26

Etude bibliographique des membranes cellulaires.

Deux systèmes de transport actif ont été décrits chez les bactéries à Gram-négatif, les transporteurs couplés à l’hydrolyse de l’ATP (transporteurs ABC, ATPases de type P) et des transporteurs soumis au gradient chimio-osmotique (protéines RND, CDF) (Nies and Silver, 1995) . Ces types de transporteurs se caractérisent par une forte affinité au substrat et permettent de maintenir de faibles concentrations métalliques dans le cytosol (Mergeay et al., 2003; Nies et Silver, 1995; Nies, 2003).

4.2.8.1.La famille des «ATPases type P» La famille des «ATPases P-type» forment une grande famille de transporteurs actifs dont l’énergie provient de l’hydrolyse de l’ATP. Le « P » fait référence à la formation d’un intermédiaire aspartate phosphorylé lors du fonctionnement de ces pompes. Les pompes ATPase de type P assurent aussi bien l’import que l’export des éléments inorganiques et jouent un rôle important dans l’homéostasie ionique intracellulaire par le processus de détoxification. Une ATPase-P est composée de quatre domaines distincts : les trois domaines, nommés A, P et N sont cytosoliques, le quatrième est le domaine transmembranaire. Le fonctionnement d’une ATPase-P consiste en un couplage entre l’hydrolyse de l’ATP et le transport de l’ion considéré .

Les ATPases-P présentent des caractéristiques enzymatiques et structurales communes (Fig.14). Ce couplage apparaît comme une alternance ordonnée d’évènements structuraux (changements de conformation), et d’évènements chimiques de phosphorylation et de déphosphorylation. Au cours de son fonctionnement, l’ATPase-P forme un intermédiaire phosphorylé (d’où son nom) qui résulte du transfert du phosphate γ de l’ATP sur un acide aspartique complètement conservé au sein de cette famille de protéines (Pederson et Carafoli,1987).

Etude bibliographique

Figure 14.Représentation schématique de l’unité structurale commune des ATPases-P. (Gardarin ,2007).

• Caractéristiques Structurales

Le cœur d’une ATPase-P est constitué d’un petit domaine et d’un grand domaine cytoplasmiques ancrés à la membrane par quatre hélices (Fig .14). Ces domaines portent les séquences les plus conservées au cours de l’évolution chez les ATPases-P, séquences qui servent à identifier sans ambiguïté une ATPase-P (Fagan,1994).

➢ Le domaine A (Actuateur) est le plus petit des trois domaines cytosoliques constituant une ATPase-P. Il est constitué d’environ une centaine d’acides aminés. Il est connecté au domaine membranaire par l’intermédiaire de deux boucles longues et flexible .Le rôle primordial du domaine A au cours du transport est suggéré par la présence du motif TGES très conservé parmi les ATPases-P. L’importance de ce motif est incontestable car lorsque des acides aminés de cette séquence sont mutés, il s’ensuit une inhibition complète de l’activité ATPase et de la phosphorylation Pi chez l’ATPase modèle SERCA(Clark et al.,1990 ;Anthonisen et al., ,2006). ➢ Le domaine de phosphorylation (domaine P),d’une taille comprise entre 40 et 80 acides aminés, le domaine de phosphorylation ou domaine P est ancré par les hélices qui constituent les sites de transport des ATPases-P. Il contient l’acide aspartique phosphorylé dans la séquence DKTGT, signature de toutes les ATPases-P .La séquence consensus TG703DGxNDxP ,représente une région très flexible du domaine P critique pour l’étape de phosphorylation par l’ATP notamment pour le transfert du phosphate γ de l’ATP sur l’acide aspartique phosphorylé mais aussi pour la coordination du Mg2+ nécessaire à la stabilisation de la liaison aspartyl-phosphate . Les différentes structures de l’ATPase-Ca2+ ont montré

Etude bibliographique

que le domaine P change sa structure interne ainsi que son orientation lors de l’étape de phosphorylation de la protéine. Ces changements dans la structure en feuillets β permet au domaine N de se déplacer au plus près du domaine P favorisant ainsi l’interaction entre le phosphate γ de l’ATP et l’acide aspartique du motif DKTGT .

➢ Le domaine de fixation du nucléotide (domaine N) Le domaine N est formé par les acides aminés insérés entre les deux régions constituant le domaine P. Les différentes structures cristallographiques disponibles pour les principales sous familles d’ATPases-P montrent qu’il est composé d’un feuillet β antiparallèle à 7 brins entouré par deux faisceaux d’hélices α. Le domaine N de l’ATPase-K+ KdpB est le plus petit de tous et est supposé représenter la structure minimale de ce domaine. Les domaines transmembranaires sontformés par des hélices transmembranaires ancrées dans la membrane plasmique .

• Classification des ATPases-P Si elles partagent le même mode de fonctionnement et la même unité structurale, les ATPases-P présentent cependant des différences notables (Tableau IV) comme le laissent supposer les différences de sélectivité ionique relevées dans cette famille de transporteurs. Comme le montrent les classifications de Lutsenko et al., 1995 et d’Axelsen et al., 1998 .Ces différences de sélectivité ionique sont corrélées à des différences d’organisation du domaine membranaire et de séquences primaires . Tableau IV : Nomenclature des ATPases-P selon la classification d’Alxelsen et al., (1998)et correspondance entre les classes d’ATPases-P avec la classifcation de Lutsenko et al . , (1995) Classe Sous- classe Substrat transporté Correspondance avec Lutsenko

PI PI A K+ P3

PI B Métaux lourds P1

PII PII A Ca2+ P2 PII B Ca2+ PII C Na+/K+ ;H+/K+ PII D Na+

PIII PIII A H+

Etude bibliographique

PIII B Mg2+

PIV Aminophospholipides

PV Inconnu

• Les ATPases-PIB : transport des métaux lourds

Ces protéines assurent le transport des métaux lourds physiologiques tels que le cuivre ou le zinc ou des métaux lourds toxiques comme le cadmium et le plomb. La protéine CADA fait partie de cette sous famille et est spécialisée dans le transport des ions Cd2+, Pb2+ et Zn2+. Encore appelées CPx- ATPases du fait de la présence du motif conservé Cys-Pro-x au sein de leur sixième hélice transmembranaire (Solioz ,1996) les ATPases-PIB sont des protéines ubiquitaires présentes dans tous les règnes vivants, de la bactérie à l’Homme en passant par les plantes. Initialement, elles ont été identifiées chez des organismes procaryotes tels que Staphylococcusaureus (Nucifora etal.,1989) ; Rhizobium meliloti (Kahn et al.,1989) ou encore Enterococcus hirae (Odermatt et al.,1993) chez lesquels elles participent au maintien de l’homéostasie du cuivre et du zinc.

• Topologie

Initialement, la présence de huit segments transmembranaires au lieu de dix comme c’est le cas chez les ATPases-PII et -PIII, a été établie à l’aide d’analyses de profils d’hydrophobicité et de logiciels de prédiction de structures secondaires puis a été expérimentalement démontrée chez certains procaryotes (Tsai et al.,2002). Leur topologie est nettement différente de celle des autres ATPases-P puisqu’elles possèdent trois segments transmembranaires situés en amont et un segment situé en aval de l’unité structurale commune. De plus, une des particularités de cette classe repose sur la présence à leurs extrémités N- et C-terminales d’un ou plusieurs domaines capables de fixer les métaux, par les motifs MBD (Metal Binding Domain) (Fig.15).

➢ Les domaines cytoplasmiques situés aux extrémités N- et C-terminales (Les N- MBD et Les C-MBD)

Le nombre de N-MBD varie d’une ATPase à l’autre : on en compte un ou deux chez les ATPases- PIB-2 . Les domaines N-MBD des ATPases-PIB transportant des cations divalents possèdent sans exception un groupement acide à proximité du site de liaison du métal. Ceci suggère que le groupement carboxylate fournirait une sphère de coordination appropriée à la liaison de cations divalents. Cependant ,peu de données probantes sont disponibles sur le rôle de ces différents motifs. Les N- et C-MBD ne sont pas essentiels au fonctionnement des ATPases-PIB puisque leur délétion

Etude bibliographique ou leur mutation n’inactive pas complètement la protéine mais diminue son efficacité. Ces domaines sembleraient avoir un rôle régulateur sur l’activité de la pompe. Des études réalisées sur les ATPases-Cu+ CopA et CopB d’Archeoglobus fulgidus sembleraient indiquer que les N-MBD seraient nécessaires aux étapes de relargage du métal et de déphosphorylation de l’ATPase puisque ces étapes sont ralenties par la délétion ou la mutation de ces domaines .

Figure 15. Schéma de la topologie d’une ATPase-PIB caractérisée par 8 segments transmembranaires (H1-H8).Les acides aminés conservés des hélices H6, H7 et H8 impliqués dans les sites de transport membranaires (TM-MBS) sont symbolisés par les points bleus. La présence de domaines de liaison des métaux (MBD) aux extrémités N- et C-terminales pouvant avoir des structures différentes sont symbolisés par les rectangles jaune et rouge. Les domaines cytoplasmiques A, N et P sont aussi indiqués (Arguello etal.,2007) . • Rôles des ATPases-Cd2+/Zn2+/Pb2+ Une équipe polonaise (Tynecka et al.,1981) , constate que la résistance au cadmium des souches de Staphylococcus aureus est associée à un plasmide. Par ailleurs, cette résistance implique un transport de cadmium nécessitant un apport d’énergie. Une première hypothèse impliquait un antiport qui aurait éjecté un ion cadmium, entré par le système de transport actif du manganèse, en accumulant deux proton .En 1989, Nucifora et al., clonent le gène CadA et en déterminent sa séquence. Ce gène code pour l’ATPase-P CadA (Fig.16en haut) constituée de 727 acides aminés. Ce fut la première ATPase-PIB-2 découverte

Etude bibliographique

Figure 16. Extrusion et résistance aux ions Cd2+ et Zn2+ chez Staphylococcus aureus (Nies et Silver, 1995)

La régulation de l’expression du gène cadA a été étudiée principalement pour l’ATPase CadA de Staphylococcus aureus. L’opéron cadmium localisé sur le plasmide pI258 de la bactérie possède deux gènes : CadA et CadC. CadC, localisé en 5’ du gène CadA, code pour une petite protéine de 122 acides aminés indispensable à la résistance au cadmium. En effet, la concentration en métal induisant un arrêt de la croissance pour les cellules n’exprimant pas CAD C est de 40µM alors qu’elle est de 2,5mM pour celle l’exprimant (Yoon et al., ,1991). CAD C appartient à la famille des protéines métallorégulatrices de la transcription dont ArsR est le modèle (Silver, 1996). Elle régule la transcription de l’opéron cadmium de la façon suivante. En absence d’ions métalliques, CAD C est liée sur la région promotrice/régulatrice de l’opéron et réprime la transcription du gène CadA (Endo,1995). En présence d’ions métalliques, la fixation stœchiométrique de Cd2+ ou de Pb2+ sur les cystéines de CAD C (Busenlehner etal.,2001 ;Sun et al.,2001) ,résulte en une diminution de son affinité pour l’ADN. CAD C se dissocie et CadA peut alors être transcrite. Il s’agit donc d’un mécanisme de régulation négative. • Classification des ATPases –PIB Une classification, basée sur une analyse de 234 séquences d’ATPases-PIB, a été développée dans le but d’identifier les acides aminés des hélices transmembranaires qui pourraient participer à la coordination du métal durant le transport. Des acides aminés conservés ont été

Etude bibliographique identifiés au sein des hélices transmembranaires 6, 7 et 8 formant des séquences signatures. Ces séquences ont alors servi à classer les ATPases-PIB en sous-groupes de sélectivité ionique distincte. Selon Arguello (2011), les ATPaese-PIB, se subdivisent en 5 sous groupes (Fig. 17).

Figure 17. Sous famile P1B-type ATPases. Les séquences bactériennes utilisées pour effectuer l’arbre sont: Symbiobacterium thermophilum Q67KE0, Mycobacterium tuberculosis A5U970, Synechocystis sp PCC 6803 Q59997, Bacillus subtilis O31688, Corynebacterium glutamicum Q8NT32, Streptomyces coelicolor Q9RJ01, Sinorhizobium meliloti Q92Z60, Mesorhizobium loti Q988U4, B. subtilis O32220, M. tuberculosis P77894, Brucella melitensis Q8YE27, Erwinina carotovora Q6D7Y2, P. aeruginosa Q9HX93, K. pneumonia A6T5P4, Lactococcus lactis Q9CH87, Enterococcus hirae P05435, Archaeoglobus fulgidus O30085, Aquifex aeolicus O67203, P. aeruginosa Q9I3G8, Gramella forsetii A0M1B0, B. melitensis Q8YFF3, Sinorhizobium meliloti P18398, Helicobacter pylori Q59465, Synechocystis sp. PCC 6803 Q59998, E. coli P37617, salmonella enterica Q8Z255 (Argüello et al., 2011).

Sous groupe P1B-1 : il comprend les P1B-type ATPases spécialisées dans le transport des ions Cu+/Ag+ telles que le cas de la CopA et CopB d’Enterococcus hirae.

Sous groupe P1B-2 : il comporte les P1B-type ATPases spécialisées dans le transport des ions Zn2+/Cd2+/Pb2+, exemple la CadA de Staphylococcus aureus (Zn2+/Cd2+) et la ZntA d’E.coli (Cd2+, Zn2+, Pb2+).

Etude bibliographique

Sous groupe P1B-3 : il regroupe les P1B -type ATPases assurant le transport du cuivre sous forme de Cu2+/Ag+. Donc, il s’agit de Cu2+- type ATPases tel que le cas de CopA2-like de Sinorhizobium meliloti.

Sous groupe P1B-4 : il comporte les P1B-type ATPases assurant le transport des ions Zn2+/Cu2+/Co2+ (CoaT de Synechocystis sp), Cd2+, Zn2+, Co2+ (CzcP de Cupriavidus metallidurans CH34).

Sous groupe P1B-5: il regroupe unnombre deP1B-type ATPases rares. LesP1B-5-ATPases ont été déterminés chez des bactéries pathogènes telles que Mycobacterium tuberculosis.

4.2.8.2. Les transporteurs ABC (ATP-binding-cassette)

Utilisant l’hydrolyse de l’ATP comme source d’énergie, les transporteurs ABC constituent la plus vaste famille de protéines (Lage, 2003). Ils sont surtout connus pour leur implication dans la résistance multiple des cellules cancéreuses. Chez les bactéries, ces transporteurs sont généralement organisés en homodimères (Li et Nikaido, 2004). Chaque monomère est constitué d’un domaine transmembranaire de 6 hélices α impliqué dans la reconnaissance du substrat et d’un domaine ABC, très conservé, impliqué dans la liaison à l’ATP. La première structure cristallographique d’un transporteur ABC entier a été obtenue pour BtuCD d’E. coli (Hvorup et al., 2007) .

4.2.8.3. Les protéines de la famille « Resistance-Nodulation-cell Division » RND C’est le premier groupe de protéines décrites comme impliquées dans le transport des ions métalliques (R. metallidurans), la nodulation (Mesorhizobium meliloti) et la division cellulaire (E. coli) chez les bactéries à Gram-négatif (Saier et al., 1994).Ces transporteurs ont également été décrits chez les bactéries à Gram positif, les Archées et les Eucaryotes. Le premier membre identifié des protéines RND est CzcA, suivi par CnrA chez les bactéries à Gram-négatif (Alcaligenes eutrophus). Le principal rôle de la pompe efflux CzcCBA est de détoxifier le Co2+/Zn2+/Cd2+ (Fig.18). Ce système est inductible et codé par un méga plasmide pMOL30 (Nies, 1992 ; Saier et al., 1994 ; Rensing etal., 1999 ; GroBe etal., 1999). Ces protéines se situent au niveau de la membrane cytoplasmique, et transportent activement les substrats sous un gradient chimiosmotique. Le système RND intervient dans le maintien de l'homéostasie de la cellule, l'élimination des composés toxiques et comporte de nombreuses protéines assurant le transport de divers composés organiques et inorganiques (Tseng etal., 1999) comme les xénobiotiques , les médicaments et les ions métalliques.

Etude bibliographique

Figure 18. Schéma du plasmide pMOL30 codant pour la résistance auxCo2+/ Zn2+/Cd2+ chez Alcaligenes eutrophus (Nies, 1992) CzcD : protéine impliquée dans la régulation de czc K= site KpnI H= site Hind

L’efficacité de ce système serait due au fait que non seulement il permet de diminuer la concentration cytoplasmique mais également la concentration périplasmique. Dans ce cas les cations peuvent être excrétés avant même leur entrée dans la cellule (Nies, 2003).Cette fonction est directement liée à la structure de ces protéines. En effet les protéines RND de la membrane interne cytoplasmique (CzcA) , interagissent avec celles de fusion membranaires (MFP) de l’espace périplasmique CzcB , et les facteurs membranaires (OMF ) externes CzcC, pour former des pores et des canaux transmembranaires permettant ainsi la sortie d’un flux du cytoplasme vers le périplasme, la membrane externe, puis vers l’extérieur (Johnson et Church, 1999). • Composition et structure de la pompe efflux CzcCBA

La pompe d’efflux CzcCBA est composée de trois protéines ,de structure et de localisation différentes (Dong et Mergeay, 1994 ; Saier et al., 1994) (Fig.19)

➢ Protéine CzcA : composée de 1064 acides aminés et se localise dans la membrane cytoplasmique. Elle est constituée d’un canon à proton et l’autre à cations. Certains auteurs, suggèrent qu’elle possède douze hélices transmembranaires avec deux grandes boucles périplasmiques. Elle est pauvre en cystéine et en histidine. L’ultra structure de cette protéine montre qu’elle est composée de 4 domaines dont deux hydrophobes et deux autres hydrophiles.

Etude bibliographique

➢ Protéine CzcB : composée de 521 acides aminés avec environ 8 résidus d’histidine. Cette protéine est périplasmique, mais avec une partie dans le cytoplasme et l’autre extra-membranaire. Elle possède au niveau de son extrémité N- terminale un petit segment hydrophobe qui pourrait permettre son ancrage à la membrane externe. Elle est sous forme de dimère. ➢ Protéine CzcC : composée de 346 acides aminés sans résidus d’histidine et son fonctionnement dépend de la protéine CzcB. Elle est probablement en contact avec une protéine intégrante dans la membrane externe. Elle est localisée dans la membrane externe, mais son extrémité C- terminale dans le périplasme.

Extérieur 6 CzcC

CzcB

Peptidoglycan e 2 5 2 Périplasme

MCP Respiration CzcA

a 1 b

1 Mg2+ + H 3 4

Figure 19. Modèle de la topologie et le mode de fonction du système CzcCBA chez les bactéries à Gram-négatif (Nies, 2003). Prtéine CzcA : Est composée d’un canal à protons (a) et un autre à cations (b). Le gradient de protons entre le cytoplasme et le périplasme est en partie du aux transporteurs de la chaîne respiratoire (1). L’affinité des protons pour le site (2) situé dans une des boucles de CzcA induit une translocation des protons dans le cytoplasme créant ainsi un déficit de charge à ce niveau. Ce déficit de charge (4) crée une attraction électrostatique des cations métalliques qui peuvent alors diffuser dans CzcC et sortir de la cellule (6). Les cations métalliques situés dans le périplasme (5) peuvent également accéder au site (2). MCP : Membrane Cytoplasmisque,ME : membrane externe.

Les bactéries à Gram positif contiennent peu de protéines RND , ceci est étroitement lié à la structure trans- enveloppe de ces molécule .Seule la protéine CzcA intervient dans quelques résistances. Ainsi, chez les Gram- positif, les protéines RND fonctionnent avec une seule sous unité. En outre, chez les bactéries à Gram-positif l’ensemble des protéines RND sont regroupées dans la grappe HAE2. Supposant que le mécanisme d’action de ces protéines serait différent de celui des bactéries à Gram-négatif (Tseng et al., 1999). Chez ces dernières,

Etude bibliographique elles sont fréquentes et forment des pompes efflux trans-membranaires, alors que chez les bactéries à Gram-positif leur nombre est très faible, en raison de la structure de l’enveloppe externe. Ainsi le complexe efflux CBA ne pourra pas fonctionner au niveau de la paroi des bactéries à Gram-positif. En cas de présence, elles fonctionnent en tant que système d’efflux avec une seule sous unité, la protéine CzcA qui peut intervenir dans quelques résistances (Rensing et al., 1997).

• Classification des protéines RND

La spécificité du substrat permet de distinguer deux sous familles (Tableau V) , la sous famille HAE-RND regroupe les protéines RND effectuant le transport des composés hydrophobes et amphiphiles. Alors que les protéines RND de la sous famille HME-RND assurent l’efflux de métaux lourds. Tableau V. Classification et structure des protéines RND (Nies, 2003)

Noms des protéines Séquences protéiniques Substrats Exemples Protéines HME

HME1- (M1) DFG-DGA-Ven Zn2+,Co2+, Cd2+ CzcA, CztA, HelA HME2- (M2) DFG-DGA-Ven Ni2+, Co2+ CnrA, NccA HME3a- (M3a) GFD-D(G,S,A)(S,A)-(V,M)EN Ions divalents RSA 1040 HME3b- (M3b) (A,g)(I.L)G-D(G-A,s)-VEN Ions monovalents HPO 969 HME4- (M4) A(I,V)G-DA(A,s)-V,I)(E,d)N Cu+, Ag+ SilA, CusA HME5- (M5 AIG-DDX-(M,V)EN Ni 2+ AII 7631 Protéines HAE

HAE1- (A1) X(V,L)G-D(N,G)A-X(D,E)N Inconnu AlrI 1656 HAE2- (A2) XXG-D(D,X)(S,a)-X(D,E)(N,S) Inconnu YerP HAE3- (A3) XXG-DDA-XEN Inconu NolG HAE4- (A4) XXG-D(D,S,N)(S,A)-XE(N,1) Inconnu Al5294 HAE5- (A5) AIG-DDA-XEN Composés organiques AcrB

G, D, E, N: Résidus d’acides aminés de la protéine CzcA correpondant à G404, D408 , E415 et N416 ( ) : indique une alternance des acides aminés pour la même position X : indique n’importe quel acide aminé

4.2.8.4. La famille « Cation Diffusion Facilitators » (CDF) ce type de protéines assurent le transport des cations de manière passive ou par simple diffusion (Saier, 2000). Les principaux substrats des CDF sont le Zn2+ ,Mn2+, Mg2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, et le Cd2+. Le transport est réalisé par un gradient chimiosmotique (Wong et al., 2000 ; Bloss et al., 2002 ; Lee et al., 2002). Chez les procaryotes, les protéines CDF identifiées sont classées dans trois groupes différents (Nies, 2003). La détoxification intracellulaire du Cd fait intervenir d’autres mécanismes qui ne sont pas spécifiques aux métaux lourds, mais représentent des réponses généralisées aux stress.

Etude bibliographique

5.Protéines de stress

Les protéines accomplissent les fonctions essentielles à la survie cellulaire (récepteur, enzyme, transporteur, mouvement). Ces fonctions dépendent de la structure tridimensionnelle des protéines et toute anomalie à ce niveau est responsable de la perte totale ou partielle de la fonction en question. Les protéines de choc thermique, constituent une réponse universelle et représente le système génétique le plus hautement conservé dans des organismes aussi divers que les bactéries, les animaux et les plantes (Lindquist, 1986).Les bactéries répondent au stress métallique par expression des gènes codant pour des protéines de stress. L’induction ou la synthèse de plusieurs protéines lors du stress est considérée comme un mécanisme ubiquitaire de défense impliqué dans la réponse des organismes aux agressions biotiques et abiotiques imposées par leur environnement. Ces protéines pourraient être regroupées en fonction des rôles qu’elles accomplissent à l’intérieur de la cellule pendant les stress. Parmi ces protéines, certaines sont impliquées dans le métabolisme antioxydant, d’autres interviennent dans les processus d’adaptation des bactéries à leur nouvel environnement et le maintien du métabolisme de base.Les métallothionéines sont induites lors d'une intoxication par les métaux lourds.

➢ Les protéines de choc thermique (HSP) ,sont des molécules «chaperonnes". Elles protègent les protéines d'une dégradation enzymatique, réparent les protéines endommagées, empêchent ou stimulent l'expression de certains gènes. Certaines de ces protéines sont exprimées de manière stable, mais d’autres sont induites sous l’effet de différents stress physiques, métaboliques ou chimiques telle que la présence de Cd (Fenik et al., 1995; Sanita di Toppi et Gabbrielli, 1999).

➢ Les proteines du système antioxydant : l’expression des gènes codant pour des enzymes antioxydantes a été peu étudiée en présence du Cd. Les métaux lourds dont le Cd, semblent exercer une régulation transcriptionnelle sur les gènes codant pour la CAT (catalase), la GR(glutathion reductase), l’APX(ascorbate perroxydase) la GPX(glutathion perroxydase) et la SOD (superoxyde dismutase) (Tamás et al., 2008). Une induction de la synthèse du ɣ Lglutamyl-Lcysteine précurseurs du glutathion, a été signalée chez Rhizobium alamii (Schue et al.,2011) .

Etude bibliographique

D’autre protéines de résistance aux métaux ,comme les protéines de transport telles que les pompes d’efflux comme les ATpases et les ABC transporteurs(Schue etal.,2011) et celles intervenant dans le métabolisme basal comme des acides aminés et des pyrimidines (Zhai et al .,2017).

6. Co-sélection de la résistance aux antibiotiques et aux métaux lourds Il a été démontré qu’il existe une corrélation positive entre la présence de métaux dans l’écosystème et la résistance simultanée à ces éléments et aux antibiotiques chez les bactéries indigènes. De telles observations ont été faites chez des bactéries provenant de milieux aquatiques, de sédiments et de sol (Stepanauskas et al., 2005). Cette co-sélection peut se faire selon trois mécanismes,la co-résistance, la résistance croisée et la co-régulation (Baker- Austin et al., 2006).

✓ La co-résistance : elle est observée lorsque les gènes de résistances aux métaux et aux antibiotiques sont positionnés sur les mêmes éléments génétiques mobiles (plasmide, transposon, ilot génomique). Ainsi, la présence d’un métal pourra sélectionner les deux résistances. ✓La résistance croisée : elle est observée lorsque le même mécanisme de résistance permet à la fois la résistance à un métal et à un antibiotique. C’est notamment le cas de certaines pompes à efflux (Aendekerk et al., 2002) ✓ La co-régulation : elle s’observe lorsque la régulation d’un mécanisme, induite par la présence d’un métal ou d’un antibiotique, régule également un autre mécanisme, permettant ainsi les deux résistances .Ainsi Perron et al .( 2004) ,ont pu mettre en évidence une co-régulation entre la résistance de Pseudomonas aeruginosa aux métaux lourds (Cd,Zn et Co) (Fig.20 ).En effet, en présence de ces éléments métalliques, la bactérie développe des pompes d'efflux destinées à l’extrusion des métaux, et entraîne en même temps la fermeture des porines OprD membranaires, empêchant ainsi la pénétration de l'imipenème. Si les doses de ces métaux lourds deviennent plus importantes, les bactéries subissent une sélection sévère qui ne laisse survivre que celles ayant un système d'efflux continuellement enclenché et leurs porines OprD définitivement closes.

Etude bibliographique

Figure 20. Schéma de co-régulation entre la résistance aux métaux lourds et l’imipénème Chez Pseudomonas aeuriginosa

Le régulateur CzcR active sa propre transcription ainsi que celle des gènes d’ efflux CzcCBA. Le mécanisme exact par lequel CzcR réprime l’expression de OprD reste à déterminerME :membrane externe ;MC :membrane cytoplasmique.

Matériel et Méthodes

Matériel et méthodes

1. Matériel

Des échantillons de sols ont été prélevés de différentes zones et régions nationales. Le critère primordial pour le choix des stations est la pollution. En général, des environnements ayant subi une influence anthropique excessive, constituent une niche écologique idéale pour la recherche de bactéries résistantes aux métaux lourds. Pour cet objectif, neuf (09) échantillons de sols au total ont été collectés des localités suivantes :

- Région d’Alger centre : Trois échantillons de sol ont été prélevés ,dont un sol en provenance de la cimenterie de Bologhine, un sol en provenance de Bordj El Kiffane (sol cultivé) et un troisième sol de la gare ferroviaire de Bab Ezzouar ;

- Wilaya de Boumerdès : deux échantillons de sols ont été prélevés de Dellys, le premier provient d’un sol cultivé et le deuxième de Statir, qui est une décharge hospithalo-ménagère ;

- Wilaya de Ghardaïa : deux échantillons de sols ont fait l’objet de prélèvement de la nouvelle et de l’ancienne décharge de Guerara ;

- Wilaya de Batna : un échantillon de sol a été collecté d’une décharge municipale ;

- Wilaya de Sétif : un échantillon de sol a été prélevé d’une zone industrielle.

La localisation géographique des sites d’échantillonnages est indiquée sur la figure 21.

2. Méthodes

2.1. Echantillonnage et conditions de transport des sols

Les échantillons de sol ont été collectés pendant le mois de février de l’année 2014. A l’aide d’une spatule stérile, et à environ 5 cm de profondeur des quantités représentatives de sol ont été prélevés de manière aseptique et introduites immédiatement dans des flacons stériles de 250 mL de capacité. Par la suite, les échantillons destinés aux analyses microbiologiques ont été placés dans une glacière réglée à 4 °C, tandis que ceux destinés aux analyses physico- chimiques transportés à température ambiante.

Matériel et méthodes

Figure 21. Localisation géographique des sites de prélèvements des échantillons de sols

2.2. Analyses physicochimiques des sols Cette partie de travail a été réalisée au département de Biologie des sols de l’ENSA (El Harrach). L’ensemble des sols prélevés, ont été soumis à des analyses physicochimiques, dans le but de déterminer les paramètres suivants : le pH, la conductivité électrique, le taux du carbone total et le dosage de quelques éléments trace métalliques. Ainsi, les sols prélevés ont été dispersés pour être séchés, et ensuite passés à travers un tamis de deux millimètres de diamètre, avant de procéder aux diverses mesures. a. Mesure du pH

Les pH des sols ont été déterminés selon les recommandations d’AFNOR NFX3-10 en trempant l’électrode d’un pH-mètre dans des solutions de sols diluées avec un rapport « sol- eau » de 1/5. b.Mesure de la conductivité électrique

Ce paramètre a été déterminé par un conductimètre de référence HI 2316, HANNA Instruments (Roane et Kellogg, 1995).

Matériel et méthodes

c.Détermination du taux de carbone organique total

Les teneurs en carbone organique total des échantillons de sols, ont été déterminées selon la méthode d’oxydation du bichromate de potassium-acide sulfurique

(K2Cr2O7·H2SO4) d’Anne (1945), décrite dans le standard NF X31-109.Pour passer de la teneur en carbone organique d'un échantillon de sol à celle en matières organiques, très couramment le facteur de conversion de 1,724 est utilisé (Waksman et Stevens, 1930), selon la formule suivante: m.o = carbone organique total x 1.72

m.o % = matière organique 1,72 = facteur de conversion d. Analyse des éléments métalliques La teneur de six métaux lourds (cadmium, plomb, zinc, chrome, cuivre, nickel) a été déterminée dans chaque sol, après dosage par le biais d’un spectrophotomètre à absorption atomique (SAA) avec flamme à graphite AA 800 Perkin Elmer, à une longueur d’onde adéquate pour chaque élément métallique. Cette technique consiste à détecter de très faibles concentrations (de l'ordre du ppm) ,de nombreux éléments métalliques, suite à l’utilisation de différentes sources de rayonnement pour chaque élément à mesurer, tout en se référant à des solutions témoins dont la concentration de l’élément à doser ,est connue. Cette analyse suscite une étape antérieure permettant l’élimination totale de la matière organique contenue dans l’échantillon à analyser : C’est la minéralisation de l’échantillon.

d1. Minéralisation des échantillons les sols préalablement préparés (séchés et passés à travers un tamis de deux millimètres de diamètre) ont subi une digestion acide à l'aide d'un mélange d’acide chloridrique (HCl ) pur et d’acide nitrique (HNO3) concentré Supra Pure à raison de (3:1 v/v, Sigma-Aldrich), avec l'ajout de trois (03) gouttes d'eau oxygénée (H2O2), effectuée sur une plaque chauffante à 300 ° C jusqu'à digestion complète (USEPA, 1996). Après minéralisation, les échantillons ont été transférés dans des flacons volumétriques et dilués aux concentrations désirées. Une gamme de solutions d'étalonnage du métal recherché

Matériel et méthodes permet de tracer une courbe d’étalonnage, en respectant son domaine de linéarité, ainsi la concentration du métal dans l’échantillon de sol peut être calculée. d2.Principe et fonctionnement de la spectrophotométrie à absorption atomique (SAA)

Le principe de la SAA est détaillé en Annexes I.

2. 3. Criblage, isolement et caractérisation des bactéries cadmium-résistantes

2. 3.1. Criblage et isolement des bactéries : l’isolement des bactéries a été réalisé à partir des suspensions des sols, en utilisant comme milieu de base la gélose nutritive supplémentée de cadmium. 5g de chaque échantillon de sol ont été mis en suspension dans 45mL de bouillon nutritif stérile, puis incubés à 30°C pendant 24h sous agitation (100 rpm). A partir des solutions mères obtenues, des dilutions décimales ont été préparées. Par la suite, 1mL de chaque dilution est incorporé en surfusion dans de la gélose nutritive stérile à pH6,8 amendée de Chlorures de cadmium CdCl2·2H2O (BIOCHEM, Chemopharma) à une concentration finale de 50 μg.mL-1.

Après une période d’incubation de 7 jours à 30°C, les différentes colonies bactériennes obtenues ont été repiquées sur le même milieu, puis purifiées par des repiquages successifs sur la gélose nutritive exempte de cadmium. Des codes ont été attribués aux bactéries cadmium -résistantes isolées des différents sols (Tableau VI).

Tableau VI. Sites et souches isolées pour chaque prélèvement.

Site de Codes attribués aux bactéries Coordonnées GPS prélèvement cadmium-résistantes isolées AS1, BS1, CS1, DS1, ES1,FS1, Cimenterie de GS1, HS1, IS1, JS1, KS1, LS1, Bologhine (W. 36°48’53.426’’N3°0’57.627E MS1, NS1, OS1, PS1, YL-ML1, Alger) SS1, TS1, US1, VS1 ,WS1et XS1 Décharge hospitalo- YL-BS2, YL-CS2, YL-IS2, YL- ménagére Statir de SS2, DS2, ES2 ,FS2, GS2 ,HS2 36°52’42.096’’N3°56’12.638’’E Dellys (W. JS2, KS2, NS2, OS2, PS2, QS2, Boumerdes) RS2, MS2, US2, SS2 et TS2 YLS3A, YLS3B, YLS3C, Sol décharge YLS3D, YLS3E, YLS3F, municipale (W. 35°33’39.687’’N6°10’26.081’’E YLS3G YLS3H, YLS3I, Batna) YLS3J, YLS3K, YLS3B’ et YLS3J’ Sol ancienne 32°29’24.809’’N3°40’25.828’’E YLS4A, YLS4B, YLS4C,

Matériel et méthodes décharge municipale YLS4D, YLS4E, YLS4F, Guerara (W. YLS4G, YLS4H et YLS4I Ghardaia) Sol nouvelle YLS5A, YLS5B, YLS5C, décharge municipale 32°29’24.809’’N3°40’25.828’’E YLS5D, YLS5E, YLS5F et Guerara (W. YLS5G Ghardaia) YLS6A, YLS6B, YLS6C, Sol cultivé (BEK, W. 36°44’49.873’’N3°11’25.555’’E YLSA, YLSB, YLS2A, YLS2B d’Alger) et YL6D Sol gare routière S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8 et Bab Ezzouar (W. 36°42’25.409N3°11’10.332E S9 d’Alger) Sol cultivé à Dellys YL- SS8, YL-SS3, S10, S11, 36° 38’56739’’N2°55’39.3’’E (W. Boumerdes) S12, S13, S14, S15, S16 et S17 Sol zone industrielle 36°9’35.232’’N5°25’ 3.068’’E S21, S22, S23 et S24 de W. Sétif

2. 3.2. Caractérisation et identification des isolats

La caractérisation préliminaire des souches a été réalisée sur la base des critères morphologiques, physiologiques et biochimiques, en utilisant des galeries d’identification de type Api « analytical profile index » appropriés pour chaque groupe bactérien. a .Etude morphologique

Cette étude est réalisée pour des colonies des isolats cultivés à la surface du milieu d’isolement gélosé ou bien pour des cellules en état vivant ou mort de chaque souche jeune. a1.Etude morphologique macroscopique : cette étude consiste à décrire les bactéries cadmium-résistantes isolées sur milieu gélosé standard (gélose nutritive), après une période d’incubation de 24-48 h à 30 °C. Puis, les colonies de chaque souche ont été observées à l’œil nu dans le but de décrire la forme, la taille, l’opacité, l’aspect, la surface, le contour, la chromogénèse, la consistance et l’odeur. a2. Etude morphologique microscopique

Cette partie de l’étude consiste à observer au microscope les bactéries à l’état frais et après coloration de Gram.

 L’Observation à l’état frais consiste à réaliser des observations au microscope photonique (grossissement ×40), des cellules bactériennes jeunes de chaque isolat. Elle

Matériel et méthodes permet alors d’apprécier la mobilité des cellules vivantes, d’examiner la forme et le mode d’arrangement des cellules.  Observation après coloration de Gram : basée sur leur propriétés tinctoriales, cette coloration double, permet de distinguer deux groupes bactériens selon la composition chimique de leur paroi, à savoir : les bactéries à Gram-positif et celles dites à Gram-négatif. La paroi du premier type est riche en peptidoglycane et peu perméable, alors que pour le second riche en lipides et perméable. b .Etude physiologique

Cette étude a pour but la détermination du type respiratoire, la recherche des enzymes de la chaine respiratoire (catalase, oxydase, nitrate réductase). Ces tests sont considérés comme une première approche d’orientation pour la classification des bactéries dans des taxons précis. b1. Recherche de la catalase Ce test standardisé pour l’identification en bactériologie, est réalisé sur des colonies jeunes et purifiées. Il s’agit d’une enzyme Ferro-protéique qui catalyse l’hydrolyse du peroxyde d’oxygène (H2O2), produit toxique issu du métabolisme aérobie et dont l’accumulation serait létale pour les cellules bactériennes. La mise en évidence d’une bactérie catalase positive se manifeste par une effervescence visible à l’œil nu, après émulsion d’une colonie à étudier dans une goutte d’eau oxygénée. b2. Recherche de l’oxydase

La recherche de l’oxydase permet la détection de la phényle–diamine–oxydase ou cytochrome oxydase, enzyme intervenant dans divers couples d’oxydoréduction. Agissant sur un substrat incolore, cette enzyme entraine la formation d’une semi quinone rouge. Cette dernière s’oxyde rapidement pour donner un composé noirâtre. Le test d’oxydase permet donc la distinction entre les bacilles à Gram- négatif avec un métabolisme fermentaire, tels que les Entérobactéries (Oxydase négative), et les bacilles à Gram- négatif avec un métabolisme oxydatif comme Pseudomonas (Oxydase positive). b3. Recherche de la nitrate réductase La nitrate réductase est une enzyme qui catalyse la réduction des nitrates (NO3-) en nitrites

(NO2-).Certaines bactéries peuvent poursuivre cette réduction jusqu’au stade azote gazeux

(N2). c. Etude des caractères biochimiques : les critères d’identification de chaque isolat ont été

Matériel et méthodes

déterminés par application d’une galerie biochimique classique, et également les galeries api spécifiques. c1. Galerie classique

La galerie classique se compose d’un ensemble de tests biochimiques en tubes, dont l’objectif principal est la mise en évidence de certaines enzymes et de métabolites importants. Ces tests nécessitent des milieux prêts à l’emploi fournis par l’Institut Pasteur d’Alger ou préparés par nos soins à partir des milieux déshydratés. c2. Galeries api

le système api (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) repose sur différentes galeries miniaturisées, standardisées et automatisées contenant des tests biochimiques conventionnels pour l’identification. Les galeries sont constituées de différentes séries de tubes-cupules, prêts à l’emploi, contenant des substrats lyophilisés nécessaires à l’étude des caractères biochimiques. En se basant sur les tests d’orientation précédents, les souches ont été soumises à l’identification biochimique par galeries api 20E (bacilles à Gram -négatif à métabolisme fermentaire), api 20NE (bacilles à Gram- négatif à métabolisme oxydatif), api 50CH (bacilles Gram- positif) et api 20Staph (cocci à Gram- positif, catalase positive). Les galeries ont été inoculées suivant les recommandations du fabriquant et incubées selon le temps et la température nécessaires à la croissance des souches.

2.3.3. Identification moléculaire des isolats

Sept bactéries fortement résistantes au Cd ont été sélectionnées et identifiées par séquençage

du gène de l’ARNr 16S. Cinq souches d’entre elles ont été séquencées par la méthode de clonage du gène ARNr 16S, décrite par Sambrook et al. 1989 dans le manuel de « Molecular Cloning » ,au niveau du Centre de Biotechnologies de Sfax (CBS) en Tunisie, dans le cadre du projet de Doctorat de Mr Khelifa Bouacem (Equipe MI-LBMC-FSB/USTHB) .Il s’agit des souches, YL-SS2 ,YL-BS2,YL-CS2 ,YL-IS2 et YL-SS8. Deux autres souches YL-SS3 et YL- ML1 ont été séquencées au niveau des laboratoires GATC-biotech AG (Constance en Allemagne) selon la méthode de Sanger et al. 1977.

Le séquençage des souches réalisé au CBS a suivi les étapes suivantes :

Matériel et méthodes

2.3.3.1. Lyse cellulaire et extraction d’ADN

Une colonie bien isolée sur boîte a été mise en culture pendant une nuit dans 400 mL de milieu approprié. Le lendemain, une centrifugation a été réalisée à 9000 rpm pendant 10 min, et le culot lavé avec 10 mL de tampon I (50 mM glucose anhydre ; 25 mM Tris-base et 10 mM EDTA à pH 8).

La lyse des cellules a été réalisée dans 20 mL de tampon I contenant 5 mg.ml-1 de lysozyme après une heure d’incubation à 37°C. Cette opération a été suivie par une centrifugation à 9000 rpm pendant 15 min à 4 °C, et le culot cellulaire resuspendu dans 30 mL de tampon II (10 mM Tris-base ; 100 mM NaCl ; 5 mM EDTA et 1 % SDS à pH 8). Par la suite, 30 mL de phénol/chloroforme (v/v) ont été ajoutés au surnageant et après centrifugation à 9000 rpm pendant 20 min 2,5 V d’éthanol absolu et 1/10 de volume d’acétate de sodium 3 M à pH 5,2 ont été ajoutés.

A l’aide d’une pipette Pasteur effilée, les filaments d’ADN apparus, ont été récupérés et mis en solution dans 2 mL de TE 1× (100 mM Tris-base et 10 mM EDTA à pH 8). La solution restante a été centrifugée à 10000 rpm pendant 15 min, le précipité resuspendu dans 6 mL de TE 1× contenant 10 mg.mL-1 de RNase A et incubé à 37 °C pendant 1heure. Ensuite, la protéinase K a été ajoutée à une concentration finale de 5 mg.mL-1 , suivie d’une incubation à 50 °C pendant 2 à 3h.

Après une première extraction avec un volume de phénol, une autre avec un volume égal de phénol/chloroforme et une dernière avec un volume de chloroforme, la solution a été précipitée avec 2 volumes d’éthanol 100 % et 1/10 v de chlorure de sodium 5 M ou d’acétate de sodium 3 M à pH 5.2, puis laissée au moins 2 h à -20 °C ou gardée 15 min à -80 °C.

La solution a été alors centrifugée à 12000 rpm pendant 15 min, le précipité lavé avec une solution d’éthanol 70 %, séché à température ambiante pendant environ 15 min, puis resuspendu dans 50 L d’eau MilliQ ou de TE 1×et conservé à -20 °C.

2.3.3.2. Amplification de l’ARNr 16S par PCR

Le gène d’ARNr 16S a été amplifié en utilisant des amorces (oligonucléotides) universelles (Gurtler et Stanisich, 1996). Les séquences appartiennent aux régions conservées flanquant ce gène, respectivement de 8 à 27 et de 1541 à 1525 de l’opéron d’ARNr d’E. coli comme suit: - Oligonucléotide directe 27F :5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ - Oligonucléotide reverse 1525R: 5’-AAGGAGGTGATCCAAGCC-3’

Matériel et méthodes

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique qui permet l’amplification spécifique d’une séquence d’ADN grâce à deux amorces nucléotidiques synthétiques, en s’hybridant avec des séquences complémentaires encadrant la séquence à amplifier. Le volume du milieu réactionnel de la PCR est généralement de 50 µL contenant 2 unités d’ADN polymérase, 300 ng d’ADN matrice, 10 picomol de chacun des deux amorces, 10 mM de chacune des bases dNTP sans mettre les sels adéquats à l’enzyme, selon les instructions du fabricant.

Au cours de ce travail il a été adopté les conditions ci-dessous en utilisant l’appareil PCR: Applied Biosystems 2720Prime Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific, USA).

1 µL ADNg ( 300 ng) 5 µL Tampon d’ADN polymérase Taq commercial 2 µL dNTP (10 mM) 5 µL Amorce directe 27F (10 pmol) 5 µL Amorce reverse 1525R (10 pmol) 1 µL ADN polymérase Taq (2 U)

1 µL MgCl2 25 mM (facultatif) 5 µL DMSO 50% (facultatif)

q.s.p. 50 µL H2O Ultra pure Dans nos conditions, une étape de dénaturation de la matrice à 94 °C pendant 5 min a été suivie de 40 cycles de polymérisation dont chacun comprend :

- Une étape de dénaturation de la matrice (30 s à 94 °C).

- Une étape d’hybridation des nucléotides amorces à la matrice (60 s à 60 °C).

- Une étape de polymérisation par une ADN polymérase (120 s à 72 °C).

2.3.3.3. Electrophorèse sur gel d’agarose et purification des produits de la PCR Afin de s’assurer de la spécificité de l’amplification, une électrophorèse des amplicons est réalisée sur gel d’agarose–TAE (Tris-HCL 1.6 mM ; acétate de sodium 1.6 mM ; EDTA 0.04 mM pH 8 ; agarose 1%(p/v) ; bromure d’éthydium (0.5µg/µL). Les produits de la PCR ainsi obtenus ont été additionnés de 0.1% d’une solution de dépôt (bleu de bromophénol 0.25% (p/v) ; xylène cyanol 0.25% (p/v) ; EDTA 25 mM ; glycerol 50% (v/v), et la migration faite sur un tampon TAE sous une tension de 100 volts. L’électrophorèse a été suivie grâce au dépôt d’un marqueur « DNA ladder ». Les fragments d’ADN sont visibles aux UV à 300 nm

Matériel et méthodes grâce au BET contenu dans le gel et qui s’insère entre les plateaux de bases d’ADN. Le gel a été ensuite photographié sur une table UV assistée par un appareil photo numérique de type Gel Doc™ XR+Gel Documentation System (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.3.3.4. Ligation et clonage du gène ARNr 16S Les fragments d’ADN issus de l’amplification par PCR ont été clonés dans le vecteur pGEM- T Easy (Promega Corp., USA) de 3018 paires de bases (Fig. 22). Ce plasmide porte un gène de résistance à l’ampicilline et le gène lacZα codant pour la β-galactosidase, permettant l’α- complémentation et donc la sélection des clones par criblage bleu-blanc.

2.3.3.5. Transformation et sélection des colonies La transformation consiste à transférer le vecteur d’intérêt dans une cellule compétente E. coli JM109 acquise commercialement (Promega Corp., USA). La transformation a été effectuée par choc thermique dans le milieu SOC [composé de : 10 g de bactotryptone (Difco) ; 5 g d’extrait de levure (Difco) ; 10 g de NaCl ; 10 mM de MgSO4 ; 10 mM de MgCl2 ; 20 mM de glucose et H2O q.s.p. 1 litre] selon les recommandations du fournisseur. Une partie de l’aliquote d’environ 200 µL de la suspension contenant 1µL du produit de ligation a été étalée sur le milieu LB solide complémenté de 100 µ.L-1 d’ampicilline de 5-bromo-4-chloro-3- indolyl--D-galactoside (X-Gal) et de l’isopropyl--D-thiogalactopyranoside (IPTG), ajoutés stérilement après une filtration sur membrane de 0,45 µm.

Figure 22 . Carte de restriction du plasmide pGEM-T Easy

Matériel et méthodes

La sélection des transformants a été effectuée selon le test bleu-blanc. Le X-Gal (360 µg/mL) et l’IPTG (160 µg/mL) permettent de détecter les bactéries contenant le vecteur avec l’insert suite à une réaction entre le X-Gal et le gène de la β-galactosidase présent dans le vecteur et induit par l’IPTG.

Substrat incolore chromogène X-Gal Galactose + X (produit coloré bleu) Pour les colonies possédant le vecteur avec l’insert, le gène de la β-galactosidase serait rendu inactif suite à l’insertion du fragment d’ADN, ce qui conduira à des colonies blanches. Les colonies bleues auront une β-galactosidase fonctionnelle et ne possèderont pas d’insert.

Le clonage dans le vecteur pGEM-T Easy aboutit à la construction des plasmides, contenant le gène de l’ARNr 16S de chaque souche. Ces plasmides sont baptisés pYL-SS2, pY-BS2, pYCS2, pYIS2 et pYL-SS8 (Fig. 23).

Ap aI (14 ) Ap aI (14 ) Ap aI (14 ) AatII (20 ) AatII (20 ) AatII (20 ) Sph I (26 ) Sph I (26 ) Sph I (26 ) BstZI (31 ) BstZI (31 ) BstZI (31 ) No cI (37 ) No cI (37 ) No cI (37 ) No tI/BstZI (43 ) No tI/BstZI (43 ) No tI/BstZI (43 ) SacII (49 ) SacII (49 ) NaeI (3995) SacII (49 ) NaeI (4008) NaeI (3937) 1 1 T7 1T7 T7 (pGEM-T 3015 pb) (pGEM-T 3015 pb) (pGEM-T 3015 pb) Ori f1 Ori f1 gène 16S Ori f1 gène 16S gène 16S XmnI (3297) (1508 pb) XmnI (3310) (1521 pb) XmnI (3239) (1447 pb) pYBS2 pYCS2 pYL-SS2 16S R 4523 pb SacI (3178) Amp AmpR 4536 pb R SacI (3191) SacI (3120) Amp 4465 pb SP6 SP6 lac Z HindIII (1595) lac Z HindIII (1608) Ori pUC SpeI (1605) SP6 Ori pUC SpeI (1618) NotI/BstZI (1618) lac Z HindIII (1545) Ori pUC SpeI (1539) NotI/BstZI (1636) PstI (1629) NotI/BstZI (1560) PstI (1642) NdeI (1638) PstI (1571) NdeI (1651) SacI (1650) SacI (1663) BstXI (1659) NdeI (1580) NsilI (1668) SacI (1590) BstXI (1672) NsilI (1681) BstXI (1601) SalI (1671) NsilI (1610) SalI (1684) SalI (1613) Ap aI (14 ) AatII (20 ) Sph I (26 ) Ap aI (14 ) BstZI (31 ) AatII (20 ) No cI (37 ) Sph I (26 ) No tI/BstZI (43 ) BstZI (31 ) SacII (49 ) No cI (37 ) NaeI (3945) No tI/BstZI (43 ) 1 SacII (49 ) T7 NaeI (3934) (pGEM-T 3015 pb) 1 T7 Ori f1 gène 16S (pGEM-T 3015 bp) XmnI (3247) (1455 pb) Ori f1 16S rRNA gene XmnI (3236) (1471 bp) pYL-SS8 16S R pYIS2 SacI (3128) Amp 4473 pb R Amp 4486 bp SacI (3117) SP6 lac Z HindIII (1545) Ori pUC SpeI (1555) SP6 NotI/BstZI (1568) lac Z HindIII (1535) PstI (1579) Ori pUC SpeI (1545) NdeI (1588) NotI/BstZI (1557) SacI (1598) PstI (1568) BstXI (1609) NdeI (1577) NsilI (1618) SacI (1589) SalI (1621) BstXI (1604) NsilI (1607) SalI (1608) Figure 23 . Les plasmides obtenus après transformation.

2.3.3.6. Extraction des plasmides L’ADN des plasmides ont été extraits des cellules transformées d’E. coli à l’aide de IA spin Miniprep Kit Protocol (Qiagen, Allemagne) après culture d’une nuit dans le milieu LB complémenté en ampicilline (100 µg.mL-1).

Matériel et méthodes

2.3.3.7. Séquençage automatique de l’ADN Les réactions de séquences ont été réalisées en utilisant le séquenceur automatique ABI Prism® 3100-Avant Genetic Analyser (Applied Biosystems) du CBS. Ces séquences ont été faites dans des plaques PCR de 96 puits en utilisant le kit de séquençage (« BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit »). Le volume de réaction de 10 µL contenait : 2 µL de produit PCR ; 1.5 µL de tampon (ABI 5×) ; 1 µL d’un mélange d’enzyme/dNTP/ddNTP marqués (Rrmix 2.5×) ; 0.25 µL de différentes amorces à (200 ng/µL = 30 µM), complété avec de l’eau ultra pure à 10 µL. Le programme de la réaction comporte 25 cycles : 10 s de dénaturation à 96 °C, 5 s d’hybridation à 50 °C et 4 min d’élongation à 60 °C. Les produits de séquences ont été alors purifiés en utilisant le kit (« Montage SEQ 96 cleanup ») de millipore. Cette étape de purification permet de faire de l’économie du kit de séquençage au moins 3 fois et d’avoir des réactions de séquence de bonne qualité.

2.3.3.8. Analyse des séquences

Les séquences ont été récupérées sous format FASTA. L’analyse phylogénétique a été réalisée par comparaison des séquences d’ADN codant pour l’ARNr 16S des bactéries phylogénétiquement proches dont la séquence a été déposée dans les banques de données : GenBank (USA), ENA (Europe) et DDBJ (Japon) utilisant les programmes Basi Local Alignement Research Tool (BLAST) disponibles sur le site du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) et RDP II (« Ribosomal Databank Project ») (http://rdp.cme.msu.edu/html). Par la suite, ces séquences ont été analysées par le programme ARB (http:// www.arb-home.de) pour visualiser l’arbre phylogénétique et déterminer l’apparenté des souches étudiées. Les analyses phylogénétiques ont été également réalisées moyennant la version 6 du logiciel Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) (http://www.megasoftware.net).

2.4. Etude de la résistance aux agents antimicrobiens chez les isolats

2.4.1. Détermination de la concentration minimale inhibitrice vis-à-vis du cadmium La CMI est désignée comme la plus faible concentration de cadmium ne permettant pas l’apparition de colonies sur le milieu (Nies, 1999). Elle a été déterminée sur milieu gélosé standard (gélose nutritive) par augmentation progressive de la concentration du métal de 100 μg.mL-1 à chaque fois jusqu’à arrêt total de la croissance après dix jours à 30 °C. La solution mère du métal a été préparée suite à la dissolution d’une quantité adéquate des chlorures de cadmium (CdCl2·2H2O) dans un volume bien défini d’eau distillée. La

Matériel et méthodes stérilisation est effectuée à 120°C pendant 20 min. La méthode de travail appliquée est celle de l’incorporation du métal dans la masse gélosée, et la gamme de concentration testée était de 100 à 2000 μg.mL-1.

De chaque souche pure et jeune, un ensemencement en stries a été effectué sur gélose nutritive additionnée de concentrations croissantes de cadmium. Par la suite, les boites ont été mises en incubation à 30°C pendant 10 jours. La croissance des souches est régulièrement contrôlée chaque 24h.

2.4.2. Etude de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries cadmium-résistantes Comme la résistance aux métaux lourds est souvent liée à celle aux antibiotiques, l’ensemble des isolats a été testé vis-à-vis de douze antibiotiques du panel hospitalier (Tableau VII). La méthode utilisée est celle des disques ou de diffusion en milieu gélosé.

Tableau VII. Les antibiotiques testés (Molécules, codes et charge des disques)

Familles d’ATBs Molécules Code Charge en µg et/ou en UI Β- lactamines AmpicillineAztreonam AMP 10 Imipenème ATM 30 Ceftazidine IPM 10 Cefotaxime CAZ 30 CTX 10

Phénicoles Chloramphénicole C 30 Rifamycines Rifampicine RIF 5 Tetracyclines Tetracycline TE 30 Polymyxines Colistine sulfate CS 10 Aminosides Gentamycine GN 10 Tobramycine TOB 10 Non classés Novobiocine NV 30

Cette méthode est basée sur l’observation de la croissance bactérienne, en présence d’un gradient de concentration de l’antibiotique, obtenu après sa diffusion en milieu gélosé. Celle ci s’arrête lorsque les bactéries sont en contact avec la concentration minimale inhibitrice, autour du disque d’antibiotique (Courvalin et al., 1985).

A partir de chaque souche pure et jeune, une suspension bactérienne est préparée dans de l’eau physiologique stérile. La densité de cette dernière est ajustée à 0,5 Mc Farland . La suspension bactérienne préalablement ajustée, est ensemencée par écouvillonnage à la surface de la gélose Muller Hinton antérieurement séchée. Par la suite, les disques d’ATBs sont déposés à la surface de ce milieu à l’aide d’une pince stérile. Après diffusion d’ATBs, les

Matériel et méthodes boites sont incubées à 30°C pendant 24 h. La lecture est faite par la mesure du diamètre de la zone d’inhibition à l’aide d’une règle graduée, et les bactéries seront classées dans les catégories: Sensibles (S), Intermédiaires (I) ou Résistantes (R) selon les recommandations du CA-SFM (2010). 2.5. Etude de l’accumulation des ions cadmium

En ce qui concerne cette étude et le reste du travail, quatre souches très résistantes au cadmium ont été sélectionnées à savoir: YL-ML1etYL-SS2 ,YL-SS3 et YL-SS8.

Les essais de bioaccumulation ont été réalisés en utilisant des cellules bactériennes vivantes, libres en suspension d’une part, et en état immobilisé dans des billes d’alginates d’une autre.

Cette étude a été menée parallèlement avec le suivi de la croissance des bactéries Test en fonction du temps. Son objectif était de situer l’accumulation des ions métalliques au cours du cycle cellulaire de croissance des souches sélectionnées.

2.5.1. Accumulation des ions cadmium par des cellules vivantes libres a. Préparation de l’inoculum De chaque culture jeune sur gélose nutritive des bactéries sélectionnées, une à deux colonies de taille moyenne ont été prélevées et ensemencées dans des Erlenmeyer de 250 mL de capacité, contenant chacun 100 mL de bouillon nutritif. L’incubation a été réalisée à 30°C pendant 18 h sous agitation (100 rpm). Par la suite, les cellules ont été recueillies par centrifugation (4000 rpm pendant 30 min), lavées trois fois avec de l’eau physiologique stérile, puis remises en suspension dans de l’eau physiologique stérile, homogénéisées et étalonnées avec un spectrophotomètre UV-visible à 0,6 à λ = 600 nm. b.Inoculation Des Erlenmeyer contenant 100 mL de bouillon nutritif additionné de cadmium à une concentration finale de 100 μg.mL-1, ont été inoculés au 1/10 ème (10% v/v), des suspensions précédemment préparées et ajustées, puis incubés sous agitation (100 tr/min) à 30 °C pendant 72 h (Sujitha et Jayanthi 2014, Benmalek et Fardeau, 2016). Deux contrôles ont été préparés simultanément avec les cultures expérimentales pour chaque isolat. Le premier a été préparé sans ajout de cadmium pour mesurer la croissance bactérienne, alors que le second sans biomasse bactérienne pour déterminer les artefacts qui pourraient survenir en raison de la sorption du métal sur la surface du verre des Erlenmeyer. La croissance a été déterminée en mesurant la DO à 600 nm, par contre la concentration

Matériel et méthodes résiduelle de cadmium évaluée après centrifugation de 5 mL de chaque culture bactérienne à 4000 tr/min pendant 30 min. La concentration des ions cadmium dans le surnageant a été déterminée avec un spectrophotomètre d’absorption atomique Perkin-Elmer 2380 nm avec une lampe à cadmium à λ = 228,8. Les valeurs obtenues par analyse SAA, représentent les concentrations résiduelles de Cd ([Cd]r) dans le milieu, la concentration accumulée par les bactéries est calculée en ôtant la concentration résiduelle déterminée, de la concentration initiale utilisée (100 µg/mL).

2.5.2. Accumulation des ions cadmium par des cellules vivantes immobilisées

Les cellules bactériennes sélectionnées ont été immobilisées dans des billes d’alginate selon la procédure de Leung et al. (2000). Ainsi, une solution d’alginate de sodium à 2% (Biochem, Chemopharma) a été préparée et stérilisée (Tao et al., 2009). Par la suite, 100 mL de la solution préparée, ont été refroidis à température ambiante, et inoculés par 10 mL de chaque culture bactérienne (10% v/v). L’alginate de sodium avec les bactéries ont été agités pour obtenir des mélanges homogénéisés, puis 100 mL de solution de chlorures de calcium (CaCl2) 0.1M (Riedel-de-Haen) ont été préparés séparément dans des béchers, et stérilisés. Chaque suspension cellulaire contenant de l’alginate de sodium, a été extrudée goutte à goutte à travers une seringue, et laissée tomber, dans un bêcher contenant la solution de chlorures de calcium stérilisée. Les billes de gel d’alginate de sodium formées, ont été laissées dans des flacons pendant une nuit pour durcir. Par la suite, elles ont été lavées avec de l’eau distillée stérile, introduites dans des Erlenmeyer contenant chacun 100 mL de bouillon nutritif additionné de cadmium à une concentration finale de 100 µg.mL-1, et incubées sous agitation (100 tr/min) à 30 °C pendant 72 h.

Des contrôles contenant uniquement du bouillon nutritif et des billes ont été préparés dans les mêmes conditions expérimentales. Ensuite, 5 mL d’échantillons ont été prélevés à différents temps, centrifugés à 4000 tr/min pendant 30 min, et retirés pour l’analyse du cadmium dans le surnageant, en utilisant le spectrophotomètre à absorption atomique (SAA).

2.6. Etude de l’effet du cadmium sur la teneur en protéines totales et la production d’Exopolysaccharides chez les bactéries étudiées

Durant cette étude, cinq concentrations de cadmium (25, 50, 75, 100, 150 µg.mL-1) ont été utilisées, afin d’évaluer l’effet de la sévérité du stress généré par ce métal, sur le contenu en protéines totales des bactéries étudiées d’une part, et leur capacité de production des

Matériel et méthodes

Exopolysaccharides (EPS) d’autre part. Un témoin sans cadmium est préparé pour chaque souche.

Des Erlenmeyer contenant chacun 100 mL de bouillon nutritif, ont été inoculés au 1/10 avec les suspensions bactériennes ajustées et calibrées au spectrophotomètre à 0 ,6 à λ = 600 nm, puis mises sous agitation (100 rpm) à 30°C. Une fois la phase exponentielle de croissance a

été atteinte (DO de 0,4 à 0,6 à λ = 600 nm), différents volumes de la solution mère de cadmium ont été ajoutés, pour obtenir les concentrations de cadmium précitées. Un témoin sans cadmium a été préparé simultanément avec les cultures expérimentales pour chaque souche.

2.6.1. Effet du cadmium sur la teneur en protéines totales

Des aliquotes de cultures sont prélevés après 1h, 3h, 24h et 72h de rajout du Cd dans le milieu, puis centrifugés à 4000 rpm pendant 30 min. Les surnageants serviront au dosage des EPS et les culots sont récupérés pour servir au dosage des protéines totales selon la méthode de Bradford (1976).

Cette méthode est basée sur l’utilisation du bleu de Coomassie G250 qui renferme les deux formes de ce colorant: la forme bleue et la forme rouge. Cette dernière est convertie en forme bleue lorsqu’elle se fixe aux protéines, et s’accompagne par une augmentation de la densité optique (absorbance) du mélange réactionnel dans le jaune (couleur complémentaire du bleu) à λ=595 nm.

Ainsi , à 0.2 mL de chaque culot cellulaire, un volume égal de NaOH à 2N a été ajouté. Par la suite, les culots ont été remis en suspensions par agitation énergique (vortex), puis portées au bain marie à 100 °C pendant 30 min. Pour 0,1 mL de chaque échantillon, 1 mL de réactif au bleu de Coomassie G250 a été ajouté, le mélange réactionnel a été homogénéisé (vortexé), puis laissé reposer pendant 3 min. La lecture de la DO a été effectuée à λ = 595 nm. La teneur des culots cellulaires en protéines a été déterminée à l’aide d’une droite de corrélation, et les résultats exprimés en milligrammes de protéines par millilitre de culture. La gamme étalon a été réalisée à partir d’une solution mère de sérum albumine bovine (SAB) à 1 g.L-1. Une gamme de concentrations décroissantes a été réalisée : 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 mg.mL-1(AnnexeII ).

2.6.2. Effets du cadmium sur la cinétique de production des EPS

Les surnageants des aliquotes ayant servi au dosage des protéines totales, ont été utilisés pour

Matériel et méthodes le dosage des EPS totaux des souches étudiées. Ainsi, la quantité des EPS de chaque souche libérée dans le milieu, a été évaluée selon la méthode de dosage des sucres totaux à l’anthrone sulfurique (Hansen et Phillips, 1984). Cette méthode consiste à mesurer la concentration en oses neutres des fractions polysaccharidiques des EPS.

Cette réaction n’est pas spécifique et permet d’effectuer un dosage global des oses (aldoses cétoses et acides uroniques). Les EPS sont généralement composées essentiellement par des pentoses et des hexoses. Il suffit de doser les pentoses et les hexoses qu’ils libèrent après hydrolyse pour évaluer de manière fidèle leur abondance. L’acide sulfurique présent dans le réactif à l’anthrone provoque à chaud l’hydrolyse des EPS en déshydratant les monosaccharides. Les pentoses sont transformés en furfurals et les hexoses en hydroxy- méthyle furfurals. Ces derniers réagissent avec l’anthranol, forme tautomère de l’anthrone, en donnant une coloration verdâtre d’autant plus intense que le milieu est riche en sucres (pentoses et hexoses).

Après centrifugation, les EPS totaux se détachent des cellules, et se retrouvent dans le surnageant. 1 mL de surnageant de chaque échantillon a été introduit dans un tube à essai, et placé dans de la glace, auquel 2 mL de réactif à l’anthrone sulfurique ont été rajoutés. Aprés agitation, les tubes sont placés dans un bain marie bouillant (100 °C) pendant 7 min, puis refroidis. Les densités optiques (DO) ont été mesurées à une longueur d’ondes λ = 630 nm. Le spectrophotomètre a été préalablement étalonné grâce à un « blanc » préparé à partir de 1 ml d’eau distillée et 2 mL de réactif.

La teneur des surnageants en sucres totaux a été déterminée par comparaison avec une droite de corrélation (courbe étalon) [DO (630 nm) = f (Glucose)] (AnnexesIII).La concentration en glucose de la solution mère est de 100µg /mL. Les résultats obtenus ont été exprimés en microgramme d’équivalent glucose par mL de milieu.

2.7. Recherche du gène cad A chez les bactéries sélectionnées

Le criblage du gène cadA chez les bactéries cadmium-résistantes sélectionnées, a été réalisé au CBS ,par PCR en utilisant un couple d’ amorces cadA1/F et reverse cadA1/R (Mullapidi et al .,2010). cad1-F CAGAGCACTTTACTGACCATCAATCGTT cad1-R CTTCTTCATTTAACGTTCCAGCAAAAA

Avec le programme PCR Applied Biosystems 2720 Prime Thermal Cycler (Thermo Fisher 57

Matériel et méthodes

Scientific, USA) comme suit :

1 µL ADNg ( 200 ng) 5 µL Tampon d’ADN polymérase Taq commercial 1 µL dNTP (10 mM) 5 µL Amorce directe cad1-F (10 pmol) 5 µL Amorce reverse cad1-R (10 pmol) 1 µL ADN polymérase Taq (2 U)

q.s.p. 50 µL H2O Ultra pure

Les conditions de la PCR: Une étape de dénaturation de la matrice pendant 3 min à 94 °C, suivie de 40 cycles de polymérisation dont chacun comprend :

- Une étape de dénaturation de la matrice (30s à 94 °C). - Une étape d’hybridation des nucléotides amorces à la matrice (45s à 53 °C). - Une étape de polymérisation par une ADN polymérase (60s à 72 °C).

2.7.1.Séquençage du géne cadA de Raoultella ornthinolytica soucheYL-ML1

Pour une éventuelle confirmation, le gène cadA de taille ~1 kb détecté par PCR chez Raoultella ornthinolytica souche YL-ML1, a été séquencé au niveau du CBS , par clonage dans un plasmide pGEM-T de 3015 pb (Fig .24).

Les étapes de clonage du gène cad, sont décrites comme mentionnés ci-dessus pour le clonage des gènes de l’ARNr 16S. Le plasmide ayant incorporé l’insert (gène cadA) est baptisé pYL cad A.

Ap aI (14 ) AatII (20 ) Sph I (26 ) BstZI (31 ) No cI (37 ) No tI/BstZI (43 ) SacII (49 ) NaeI (3538) 1T7 (pGEM-T 3015 pb) Ori f1 gène cadA XmnI (2840) (1051 pb) pYL cadA R 4066 pb SacI (2721) Amp

SP6 lac Z HindIII (1138) Ori pUC SpeI (1348) NotI/BstZI (1166) PstI (1172) NdeI (1181) SacI (1193) BstXI (1202) NsilI (1211) SalI (1214) Figure 24.Carte de restriction du plasmide pYL cadA (4066 pb) portant le gène d’ATPase

« cadA »,1051 pb , de Raoultella ornthinolytica souche YL-ML1

Matériel et méthodes

2.8. Effets du cadmium sur l’activité enzymatique et non enzymatique du système antioxydant

L’évaluation de l’activité de certaines enzymes impliquées dans le stress oxydant ainsi que le dosage du glutathion ont été réalisés à partir de l’extrait protéique préparé .Cette partie du travail a été réalisée au niveau du CBS.

2.8.1. Extraction des protéines Après récupération des biomasses bactériennes, les protéines intracellulaires (solubles) ont été extraites par sonication dans un tampon d’extraction, Tris-HCl 100 mM à pH 8. La suspension bactérienne récupérée par centrifugation à 4°C et suspendue dans le tampon Tris- HCl 10mM, PH8, ajouter 500µl de lysozyme (10mg/mL) et incuber sur de la glace pendant 15 min.Puis on procède à la sonication des échantillons pendant 3 x 30 secondes avec un intervalle de 2min entre chaque sonication . Suite à une centrifugation à 14000 ×g pendant 30 min à 4°C, les surnageants supposés contenir les différentes protéines bactériennes solubles, ont été récupérés. 2.8.2. Mesure de l’activité superoxyde dismutase (SOD)

La superoxyde dismutase catalyse la dismutation des anions superoxydes en peroxyde d’hydrogène et oxygène, selon la réaction suivante :

.- O2 H2O2+O2

Le dosage de l’activité enzymatique de la SOD a été réalisé selon la méthode de Marklund and Marklund, (1974). Le principe de la méthode repose sur la capacité d’inhibition de l’autooxydation du pyrogallol par la SOD à 420 nm. Ainsi 2.85 mL de Tris HCl ont été mélangés avec 0,1 mL d’extrait enzymatique déjà préparé et 25 µL de pyrogallol. L’incubation a été réalisée à température ambiante pendant 30s. Le blanc « contrôle » a été préparé selon la même méthode, mais en remplaçant l’extrait enzymatique par 0,1 mL d’eau distillée. La lecture de l’absorbance a été faite à λ = 420 nm, et l’activité de la SOD mesurée comme suite:

SOD (U/mL) = (% d inhibitions × 1000)/volume de prise × 50)

Sachant que: % d’inhibition = (Abs Blanc –Abs test)/Abs Blanc

testttest)/Abs test

Matériel et méthodes

2.8.3. Mesure de l’activité catalase (CAT)

La catalase est une enzyme de la chaine respiratoire bactérienne, qui joue un rôle important dans la protection des cellules contre les effets toxiques du peroxyde d’hydrogène (H2O2) issue du métabolisme. Cette enzyme catalyse la conversion du peroxyde d’hydrogène en eau et oxygène, selon la réaction suivante :

H2O2 2H2O+O2

Pour la mesure de l’activité de cette enzyme, une homogénéisation des concentrations des protéines solubles totales a été réalisée au spectrophotométre, puis 0.1 mL de chaque extrait enzymatique, a été mélangé avec 2.9 mL du tampon phosphate 50 mM à pH 7 et en présence de H2O2. La diminution de la concentration de H2O2 a été mesurée chaque minute à λ = 420 nm pendant les deux premières minutes.

Calcul de l’activité CAT :UI/g=(2,3033/T) x (LogA1/A2)/g de protéines

Avec A1 : Absorbance à la première minute

A2 : Absorbance à la deuxième minute

T : intervalle de temps en minutes

2.8.4. Dosage du glutathion réduit (GSH)

Le dosage du glutathion réduit a été réalisé selon la méthode de Weckbeker et Cory, (1988). Le principe de cette méthode repose sur la mesure de la densité optique de l’acide 2-nitro-5- mercapturique. Ce dernier résulte de la réduction de l’acide 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoїque (réactif d’Ellman, DTNB) par les groupements (-SH) du glutathion. Pour cela, une déprotéinisation de l’homogénat est indispensable afin de garder uniquement les groupements thiol spécifiques du glutathion. Mode opératoire (Annexes IV).

2.8.5. Dosage des protéines solubles totales

Les protéines solubles extraites après 24 h de culture des bactéries étudiées en absence et en -1 présence du CdCl2 (100 µg.mL ) ont été dosées par la méthode de Bradford (1976).

Il a été utilisé le kit (« Bio-Rad Protein Assay ») Bio-Rad, France, en mélangeant à chaque fois 200 µL de colorant (le bleu de Coomassie G250), à 800 µL d’une solution diluée de

Matériel et méthodes protéine de chaque culture bactérienne. L’absorbance a été mesurée à λ = 595 nm contre un blanc sans extrait enzymatique. Cette méthode nécessite une courbe de référence (étalon) établie en utilisant la BSA comme protéine standard, ce qui permet d’estimer la quantité de protéine de chaque culture de souches (Annexes V)

2.9. Effet du cadmium sur le profil protéique des bactéries étudiées

Dans le but de mettre en évidence les variations du profil protéique, sous l’effet du stress au cadmium, une électrophorèse a été réalisée à partir des extraits protéiques des souches étudiées en absence et en présence de 100 µg.mL-1 de ce métal, après 6 heures d’incubation. Le protocole expérimental appliqué est celui décrit par Laemmli (1970). L’électrophorèse des protéines a été effectuée au niveau du CBS.

2.9.1. Etude électrophorétique

Les extraits protéiques ont été analysés par SDS-PAGE (15%) selon la technique de Laemmli (1970).

2.9. 2.Préparation des échantillons protéiques

Les extraits protéiques des quatre souches étudiées, ont été dilués dans un tampon de charge de façon à avoir la même concentration de protéines solubles totales pour l’ensemble des échantillons, en présence et en absence du cadmium. Les extraits dilués ont été dénaturés à 100 °C pendant 3 min.

2.9.3. Migration des protéines

Après ajustement des concentrations protéiques des échantillons, 50 µg de protéines ont été déposés dans les puits d’électrophorèse en présence de protéines standards à masses moléculaires connus (LMW Amersham, Pharmacia Biotech). L’électrophorèse a été menée à 100 mV.

2.9.4. Séparation des protéines sur gel d’acrylamide SDS-PAGE

Les protéines obtenues des échantillons ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dans des conditions dénaturantes en présence de SDS. Dans notre étude, un gel de polyacrylamide SDS-PAGE à 15% a été utilisé.

Matériel et méthodes

2.9.5. Coloration au bleu de Coomassie

Cette méthode consiste à colorer les protéines de chaque culture bactérienne, de façon à peu près indépendante de la séquence. Après migration électrophorétique, le gel a été plongé dans une solution de coloration composée de (3 g de bleu de Coomassie (Bio-Rad) dans 100 mL d’acide acétique, 400 mL d’éthanol et H2O q.s.p. 1 litre) pendant une nuit. Par la suite, le gel a été transféré dans une solution de décoloration (acide acétique 100 mL ; éthanol 350 mL et

H2O q.s.p. 1 litre) pendant 30 min, suivi par un séchage et enfin scanné.

2. 9.6.Détermination de la masse molaire des protéines

La masse molaire des protéines a été déterminée à l’aide du marqueur de taille LMW qui contient des protéines standards de masses molaires connues.

La mobilité relative = distance de migration d’une bande / distance de migration du front de migration

La droite: log (masse molaire) = f (mobilité relative) permet de déterminer la masse molaire d’une protéine inconnue (Annexes VI)

Résultats et discussion

Résultats et discussions

1. Analyses physico-chimique des sols

L’ensemble des sols étudiés, affichent des valeurs de pH entre 6,9 et 8, 04, et seront donc considérés, comme neutres à légèrement alcalins (Tableau VIII). Les teneurs en matière organique des échantillons varient entre 4,66% et 6,60%. Les échantillons (6 et 8), respectivement, sols cultivés de Dellys et de Bordj El Kiffan présentent des taux élevés de matière organique par rapport aux sols agricoles d’Algérie qui en sont généralement pauvres, il a été signalé une teneur fluctuant entre 1,6 % et 4,87 % pour des sols agricoles de la Mitidja

( Aouamer-Ali ,2010).

Les fortes teneurs en m.o dans les sols en provenance des décharges, seraient dues au fait que les déchets municipaux, contiennent des composés organiques difficilement minéralisables, ce qui ne stimulerait pas la microflore et mènerait à une condensation de la m.o, renforcée par un manque d’aération qui retarde la minéralisation.

Concernant les sols des zones industrielles, les fortes teneurs en m.o serait conséquentes aux déversements des huiles de vidange, ces dernières contiennent jusqu’à 80% d’hydrocarbures, qui constituent une source importante de m.o.

Tableau VIII. Résultats des analyses physico-chimiques des sols étudiés

Paramètres Sol 1 Sol 2 Sol 3 Sol 4 Sol 5 Sol 6 Sol 7 Sol 8 Sol 9 Normes

recherchés AFNOR

Cd (mg.Kg -1) 03,355 03,788 04,634 01,798 0,805 05,650 0,854 01,024 01,612 02

Cr (mg.Kg -1) 77,90 46,79 70,46 24,74 18,52 71,84 52,44 60,610 58,49 150

Zn (mg.Kg -1) 87,50 586,4 73,52 50,53 08,578 293,80 55,26 70,010 124,00 150-300 Pb (mg.Kg -1) 51,46 61,64 38,24 22,47 08,983 142,20 12,850 24,130 21,980 100

Ni (mg.Kg -1) 44,68 29,03 34,69 23,20 03,111 53,38 49,890 30,140 20,46 50

Cu (mg.Kg -1) 29,70 74,76 11,31 06,344 0,847 132,00 27,650 26,990 24,830 100

PH 8,04 7,65 7,74 7,17 6,9 7,45 7,74 7,83 7,49 -

C.E (ds/m) 0,575 0,582 0,210 2,93 2,31 0,219 0,205 0,120 0,355 -

M.O (%) 4,828 6,60 5 ,93 6,02 4,66 5,38 5,38 5,31 5,12

Sol 1: cimenterie (Bologhne),Sol 2:décharge hospitalo-ménagère (Dellys),Sol 3: décharge ménagère(Batna), Sol 4: ancienne décharge ménagère (Guerara), Sol 5: nouvelle décharge ménagère (Guerara), Sol 6: cultivé (Bordj El Kiffane), Sol 7:gare ferroviaire (Bab Ezzouar), Sol 8: cultivé (Dellys), Sol 9: zone industrielle (Setif). Cd: cadmium, Cr: chrome, Zn: zinc, Pb: plomb, Ni: nickel, Cu: cuivre, CE: conductivité électrique, M.O: matière organique.

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Les valeurs des conductivités électriques des sols fluctuent entre 0,12 et 2,93dS.m-1 .Les sols 4 et 5 des deux décharges de Guerara, affichent les valeurs de conductivité les plus élevées 2,93 et 2,31ds/m respectivement, traduisant leur forte salinité. Selon la classification de Mathieu et al (2003), Tableau IX, ces deux sols sont considérés comme trés salés puisqu’ils affichent des valeurs de conductivités electriques comprises entre 2dS/m et 4dS/m. Ces valeurs sont determinées à partir d’un extrait acqeux dilué au 1/5.

Tableau IX :Classification des sols selon la conductivité éléctrique ( Mathieu et al.,2003).

Connaissant la localisation géographique des sols 4 et 5 (zone steppique algérienne),ces résultats sont attendus. D’après Halitim (1973), les sols salés se rencontrent dans les zones steppiques ou désertiques dans les quelles des nappes salées contiennent à l'instar des sels solubles, une quantité importante de calcium qui alimente le profil.

Le restant des sols (1, 2, 3, 6, 7,8 et 9) sont considérés comme non salés à faiblement salés car les conductivités électriques des extraits dilués au 1/5, varient entre 0.12 et 0.582 dS/m selon le même auteur.

Le dosage des métaux par spectrométrie à absorption atomique (SAA) a permis d’appréhender la pollution des échantillons de sols par six métaux lourds analysés.

Les concentrations des métaux lourds, varient d’un sol à un autre (Tableau VIII). Ainsi, la teneur en Cd est plus faible dans les sols 4, 5, 7, 8 et 9 correspondant respectivement aux sols de l’ancienne décharge ménagère de Guerara, nouvelle décharge ménagère de Guerara, gare ferroviaire de Bab E-zzouar, cultivé de Dellys et zone industrielle de Sétif , avec des valeurs allant de 0.805 mg.Kg-1 à 1.798 mg.Kg-1, alors que celle des sols 1, 2, 3, 6 ,respectivement ,cimenterie de

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Bologhine, décharge hospitalo-ménagère de Dellys, décharge ménagère de Batna et cultivé de Bordj El Kiffan (Alger) ,va de 3.355 mg.Kg-1 à 5.650 mg.Kg-1, ces valeurs dépassent largement la norme fixée à 2 mg.Kg-1, et par conséquent les teneurs naturelles des sols (Bourrelier et Berthelin, 1998; Alloway, 1990). Le sol cultivé de Bordj El Kiffan (sol 6), présente la plus forte pollution par le Cd (5 ,625 mg.kg-1), cette valeur représente environ le triple de la concentration normale conçue par AFNOR, suivie du plomb, le cuivre et le nickel, dont les teneurs sont toutes supérieures aux normes. Cette forte pollution d’un sol cultivé est fort surprenante et pourrait être expliquée par l’historique du terrain. Ce sol communal était exploité par les habitants, comme surface de mécanique et maintenance de véhicules, ainsi, de grandes quantités d’huiles de moteurs étaient déversées avant qu’il ne soit utilisé par la suite pour la culture de certaines maraichères. Ces huiles contiennent des métaux lourds soit à l’état de particules en suspension (usures de pièces mobiles des moteurs) soit en solution (complexes organométallique ou sels) ; la forte contamination de ce sol pourrait aussi s’expliquer par les apports de fertilisants et des produits phytosanitaires riches en métaux lourds lors de l’exploitation agricole. Le sol de la décharge de Batna (sol 3), présente également une forte contamination par le Cd avec une teneur équivalente au double de la norme AFNOR, soit de 4.634 mg/kg. La teneur en Zn est très importante au niveau du sol de la décharge hospithalo-ménagère de Dellys (sol 2) et affiche une valeur de 586.4 mg.Kg-1 dépassant largement la norme supérieure AFNOR fixée à 300 mg.Kg-1. le sol cultivé de Bordj El Kiffan présente également une forte teneur en Zinc (293,8mg.Kg-1).Ceci reviendrait au fait que le Zn est très largement utilisé dans l’industrie et dans les fertilisants organiques (Allam,2012). D’une façon générale, la présence de telles concentrations de métaux lourds dans les sols étudiés, serait directement attribuée à la nature des polluants au niveau des rejets, issus des diverses activités humaines, que reçoivent ces sols. Certains déchets sont considérés comme source de métaux lourds tels que les piles, les batteries de véhicules, les produits de la métallurgie, les rejets provenant des établissements de santé, de l’industrie pharmaceutique et autres. La pollution du sol de la cimenterie de Bologhine (Sol 1), résulterait de l’industrie du ciment qui dégage des poussières fines chargées d’éléments minéraux sur lesquelles des polluants inorganiques comme les métaux lourds, peuvent s’adsorber. En revanche les sols 4, 5 ,8 et 9 en provenance de l’ancienne, de la nouvelle décharge municipale de Guerara,le sol cultivé de Dellys et le sol de la zone industrielle de Sétif ,respectivement ,ne sont pas pollués par aucun des métaux testés puisqu’ils affichent des teneurs plus faibles que les valeurs seuil fixées par AFNOR. L’absence de pollution par les métaux testés n’exclut pas la

Résultats et discussions présence d’autres polluants organiques et inorganiques non évalués lors de notre étude, serait probablement due à la nature des déchets déversés au niveau des deux décharges de Guerara mais aussi à la texture sableuse de ces deux sols, qui faciliterait la lixiviation des métaux dans les horizons sou jacents. Cependant, les concentrations des métaux déterminées au niveau des différents sols, ne renseignent pas sur leur spéciation et donc leur biodisponibilité aux microorganismes. La toxicité du Cd dépend de sa spéciation .Les résultats de l’étude physicochimique des sols ne sont pas en faveur d’une bonne biodisponibilité du cadmium.

2. Caractérisation des bactéries cadmium-résistantes

103 bactéries cadmium-résistantes ont été isolées de l’ensemble des sols étudiés puis caractérisées. La répartition des bactéries Cd-résistantes selon leur origine et les codes attribués

pour chaque souche sont reportés en Annexes VI .Sur la base des résultats de l’étude morphologique macroscopique et microscopique ainsi que la caractérisation biochimique par le biais des galeries api, appropriées pour chaque souche (api 20E, api NE, api 50CH), 23 genres appartenant à 16 familles bactériennes ont pu être déterminés (Fig.25).Les résultats de l’étude physiologique sont reportés en Annexes VII.

La résistance au Cd est distribuée entre de nombreux genres bactériens à Gram-négatif et à Gram-positif, mais semble être surtout la tâche des bactéries à Gram-négatif (Protéobactéries), puisque elles sont majoritairement représentées, avec un taux de 94%, contre seulement (6%) pour celles à Gram-positif. Ces résultats sont en accord avec ceux rapportés dans la bibliographie précisant que les bactéries à Gram-négatif sont le groupe le plus répandu et le plus retrouvé dans les sols pollués par les métaux (Pennanen et al., 1996 ;Kunito et al., 1997). Cette prédominance pourrait être étroitement liée à la structure de la paroi cellulaire, conférant à cette catégorie de bactéries, la résistance à un grand nombre de molécules et de composés toxiques tels que les métaux lourds (Khafilzadeh, 2013). Par ailleurs, la résistance au Cd a été aussi observée chez certaines bactéries à Gram-positif (Foster, 1983). Les résultats de la figure 25 montre une nette prédominance des bacilles à Gram négatifs non fermentaires (BGNnf) (6 6%), largement représentés par les genres Pseudomonas (28souches) soit un taux de 27% suivi par Burkholderia 25 souches (24%). Les représentants des genres Sphingomonas, Empedobacter, Vibrio Photobacterium ,Pasteurella, Brevundimonas,Ochrobactrum, Chromobacterium , sont présents avec des taux relativement faibles de l’ordre de 3%, 1%, 1%,1%,2% , 1% ,2% et 1% respectivement. La répartition

Résultats et discussions détaillée des espèces bactériennes Cd-résistantes isolées selon chaque sol est reportée en AnnexesVIII.

Certaines études rapportent que les espèces appartenant aux genres Pseudomonas, Bacillus, Burkholderia et Aeromonas sont fréquemment isolées à partir de sites pollués par les ions métalliques en raison de leur grandes résistances au stress métallique (Joonu et al., 2012; Marzan, 2017).

Bacilles Gram-négatif non fermentaires Bacilles Gram-négatifs fermentaires Bactéries Gram-positif 30 25 20 15 10 5

Fréquences des genres caractérisés 0

Genres bactériens caractérisés

Figure 25.Répartition globale des bactéries cadmium-résistantes isolées et caractérisées de l’ensemble des sols étudiés.

Singh et al ( 2011), rapportent que les genres Pseudomonas, Pasteurella, Salmonella, Bacillus et Burkholderia ,exhibent de grandes potentialités de résistance au Cd et que la plus grande capacité de ces genres à se développer dans un sol contaminé par de nombreux métaux lourds, peut être liée aux différents mécanismes de résistance tels que la séquestration intra et extracellulaire et les systèmes d'efflux (Gupta, 2012; Bushra , 2016). Les Pseudomonas sont connus pour jouer un rôle important dans la détoxification de divers métaux lourds comme le cadmium (Halder et Basu, 2016); ce genre a été largement étudié pour ses propriétés de résistance aux métaux (Deb et al., 2013). Les Pseudomonas sont capables de produire des sidérophores qui sont couramment utilisés pour le transport du Fe et ont la capacité de chélateur des métaux lourds tels que Cd2 +, et peuvent être responsables du maintien de l'homéostasie des métaux essentiels (Złoch et al., 2016).

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A l’instar des Pseudomonas, les espèces du genre Burkholderia sont présentes avec une fréquence assez importante dans les sols étudiés .Les représentants de ce genre s’adaptent facilement aux milieux pollués grâce à la plasticité de leurs génomes (Burkholder, 1950, Mahialiralingam et al. ., 2011).

Les bactéries à Gram négatif fermentaires, sont majoritairement représentées par le genre Aeromonas et différents genres de la famille des Enterobacteriaceae ,à égale proportion soit de 15%.

Les espèces du genre Aeromonas isolées de l’ensemble des sols présentent une abondance relative de 15%. Cette prépondérance est justifiée, connaissant les capacités de ces bactéries ubiquistes à coloniser des niches écologiques très contaminées (Miranda et Castillo, 1998).

Par ailleurs, 15 représentants de la famille des Enterobacteriaceae sont isolés avec une prédominance du genre Klebsiella ( 33% ) ,suivi du genre Serratia (20%) , Shigella ( 13%) et Enterobacter (13%)p puis des genres Raoultella ,Salmonella et Pantoe présents à égales proportions soient de 6,66% . Avec une nette prévalence de l’espèce Klebsiella pneumoniae, ces résultats renseignent sur la capacité des espèces appartenant à cette famille à coloniser les sols pollués (Khafilzadeh et al , 2010). .

Quatres (4) souches parmi sept (7) souches cadmium-résistantes à Gram-positif isolées, appartiennent au genre Bacillus . Les capacités des Gram-positives à coloniser les niches écologiques polluées sont démontrées. Les membres du genre Bacillus montrent une tolérance élevée aux métaux lourds et possèdent une forte capacité de sorption des métaux (Yelmaz et al., 2003). Il est important de signaler que l’ensemble des tests de caractérisation phénotypiques et biochimiques en utilisant les galeries api, ne permettent pas à eux seuls une identification fiable des bactéries .Il peuvent cependant constituer une première approche pour un regroupement de bactéries (genres) en vue d’une identification poussée par des techniques moléculaires. Cependant, la diversité de ces microorganismes « in situ » demeure imprécise. Car d’une part, seule une faible fraction du microbiote édaphique est cultivable au laboratoire, et d’une autre part nous n’avons considéré que la microflore aérobie mésophile. Une exploration de la diversité des bactéries Cd-résistantes serait beaucoup mieux appréhendée par le biais d’approches moléculaires telles que la métagénomique, la DGGE ou Denaturing gradient gel electrophoresis, etc. L’apport des techniques moléculaires a enrichi les connaissances en écologie microbienne à tel point qu’aujourd’hui, certains groupes phylogénétiques entiers n'ont

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aucun représentant cultivable (Rappé et Giovannoni 2003). Ces groupes bactériens qualifiés de « Candidate Division » posent problème car, sans représentant cultivable, leur rôle dans les écosystèmes est difficile à établir. Ainsi, malgré l’essor des techniques moléculaires d’étude de la diversité qui contribuent grandement à l’apport de nouvelles séquences d’ARNr 16S, il est indispensable de maintenir les techniques traditionnelles de culture. La culture des microorganismes est très importante, car elle permet d’étudier ces microorganismes et de valoriser leurs potentialités. Par ailleurs, la diversité microbienne contribue au fonctionnement des sols et peut être utilisée comme un indicateur biologique de la qualité des sols et de leur fertilité. Les bactéries les plus résistantes souvent isolées et caractérisées des milieux pollués, appartiennent aux genres tels que Bacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Burkholderia, Serratia, Alcaligenes, Klebsiella et autres (Ajaz et al., 2010; Elsilk et al., 2014).

3. Etude de la résistance aux agents antimicrobiens chez les bactéries cadmium-résistantes

3.1. Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) de cadmium

Le comportement des bactéries caractérisées vis-à-vis des différentes concentrations de cadmium varie en fonction de leur origine et de l’espèce ̋bactériennȅ étudiée. Globalement, les CMI déterminées oscillent entre 400µg.mL-1et 2000µg.mL-1 .Une bactérie est considérée comme tolérante au Cd si la valeur de la CMI vis à vis de ce métal, excède 100 mg/L (Matyar 2008).Se basant sur cette définition, nos souches peuvent être considérées comme hautement résistantes au Cd.

Ces valeurs importantes des CMIs (Tableau X), traduisent la grande adaptabilité de ces genres bactériens aux environnements pollués, et serait conséquente, aux effets à long terme, de leur contact avec les métaux lourds. Des résultats antérieurs ont montré que les sols contaminés par les métaux lourds, hébergent des bactéries très tolérantes aux éléments trace métalliques et que cette tolérance était corrélée avec le niveau de pollution (Diaz-Ravina et al., 1994, Diaz-Ravina et Baath, 1996a; Pennanen et al, 1996; Baath et al, 1998) . Les microorganismes indigènes survivent et se multiplient en présence de substances toxiques (Perry, 2001). La présence de phylotypes bactériens hautement résistants au Cd, pourrait refléter l’accumulation des métaux dans ces sols et donc leur contamination. Ces souches bactériennes seraient de bons indicateurs biologiques de contamination métallique et permettraient ainsi de caractériser l’état de ces sols. Par ailleurs, les souches bactériennes sont capables de se développer dans des milieux hautement contaminés en métaux et pourraient

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devenir des outils intéressants pour la bioremédiation des environnements contaminés (Santos Gandelman et al., 2014).

La distribution des fréquences des CMI pour chaque sol est détaillée en Annexes IX

Tableau X: Distribution des genres bactériens cadmium-résistants en fonction de leur origine et les intervalles des valeurs des CMIs

Sols Genres rencontrés Nombre Intervalle de valeurs D’isolats de CMI (µg.mL-1)

1.Cimenterie de Aeromonas(7), Pseudomonas(4), Burkholderia (2) 2 3 400-2000 Bologhine ,Vibrio (1), Bacillus(1) , Paenibacillus(1), Pasteurella (1) ,Salmonella(1),Raoultella(1),Shigella(1),Enterobacte r(2) ,Serratia(1)

2 .Décharge Klebsiella (5),Shigella (1),Pantoea (1), Burkholderia (4), 20 400-1900 hospithalo-ménagére de Dellys Pseudomonas(3) ), Empedobacter (1),Bacillus(2), Ochrobactrum(1), Pasteurella (1), Brevundimonas(1)

3.Décharge ménagére Pseudomonas(8), Burkholderia (2), 13 500-700 de Batna Aeromonas(1), Sphingomonas (1), Weissella(1)

4.Ancienne décharge Burkholderia (5), Pseudomonas(1), Serratia(1), 9 600-1700 (Guerara) Ochrobactrum (1)

5.Nouvelle décharge Pseudomonas(3), Aeromonas(3), Burkholderia (2) 7 1100-1700 de Guerara

6.Sol cultivé de Bordj Burkholderia (6), Pseudomonas(2) 8 600-1500 El Kiffane

7.Sol de la gare Pseudomonas(2), Burkholderia (2), Aeromonas(2), 9 500-800 ferroviaire de Bab Ezzouar Sphingomonas(1), Serratia(1), Photoacterium (1)

8.Sol cultivé de Dellys Pseudomonas(5), Burkholderia (2), Bacillus(1), 10 500-1100 Staphylococcus (1), Delftia(1)

9.Zone industrielle de Aeromonas(2), Sphingomonas(1),Chromobacterium(1) 4 600-700 Sétif

Ainsi, ces bactéries natives de sites pollués, se seraient adaptées à ces conditions hostiles par le développement de mécanismes qui leur permettent de contrecarrer l’effet toxique des métaux

Résultats et discussions lourds .Leur survie serait favorisée par les pressions sélectives provoquées par les rejets de polluants chimiques, inhérents aux activités anthropiques. Les pressions sélectives exercées par les environnements chargés de métaux, ont entraîné le développement de systèmes de résistance bactérienne pour la plupart des métaux. Ces systèmes sont surtout de type plasmidique, très spécifiques et sont présents virtuellement chez tous les groupes d’Eubactéries (Habi, 2005). La prédominance des genres tels que Pseudomonas , Burkholderia et les Aeromonas ,retrouvée au niveau de nos sols , n’est donc pas aléatoire.

Dans ces sols contaminés, les bactéries peuvent être impliquées dans l'altération de la mobilité des métaux à travers leur réduction, leur accumulation et leur immobilisation ou transformation in situ (Congeevaramet et al., 2007) ainsi que d’autres mécanismes comme le transport membranaire, la séquestration intra- ou extracellulaire ou des systèmes de détoxification enzymatiques (Nies, 1999; Bruins et al., 2000). Cette haute résistance au Cd serait conséquente au contact des isolats avec d’autres polluants organiques ou minéraux présents dans ces sols et qui n’ont pas fait objet d’analyses au cours de notre étude. Nos résultats révèlent que les entérobactéries sont les plus résistantes au Cd. Deux espèces appartenant à cette famille, ont affiché les CMIs les plus importantes de la totalité des souches Cd-résistantes isolées de l’ensemble des sols étudiés, ce sont les espèces Raoultella ornitinolytica(souche YL-ML1) et Klebsiella pneumoniae (souche YL-SS2). L'espèce Raoultella ornithinolytica(souche YL-ML1), isolée du sol de la cimenterie de Bologhine, s’est montrée la plus résistante au Cd ,avec une valeur de CMI de 2000μg.mL-1. Raoultella est un nouveau genre de la famille des Enterobacteriaceae.Ce genre renferme trois espèces rattachées auparavant, au genre Klebsiella : R. ornithinolytica, R. planticola et R. terrigena. Chez l'Homme, ces espèces ont un pouvoir pathogène opportuniste. Le réservoir du genre Raoultella est le tractus gastro-intestinal et les voies respiratoires supérieures, mais peut fréquenter des environnements tels que l'eau, le sol et les plantes (Henriques et al, 2006). Raoultella ornithinolytica et Raoultella planticola sont les pathogènes humains les plus fréquemment rencontrés .Certaines études ont rapporté que l'espèce Raoultella planticola isolée de l'eau de surface était à la fois multirésistante aux antibiotiques et aux métaux lourds. Cette bactérie a montré une résistance à onze métaux lourds (Serkan et al., -1 2013). Klebsiella pneumoniae (souche YL-SS2) a affiché une CMI de 1900 µg.mg . Les espèces du genre Klebsiella, montrent une résistance accrue à une variété de métaux lourds toxiques et antibiotiques. Ils ont donc suscité un grand intérêt dans le domaine de la

Résultats et discussions bioremédiation environnementale (Bruins et al., 2003).Une forte CMI vis à vis du Cd de 1500µg.mL-1 a été signalée chez une souche de Klebsiella pneumoniae (Shamim et Rehman, 2015 ).

L’espèce Empedobacter brevis isolée de la décharge hospithalo-ménagère de Dellys, a montré une forte résistance au Cd (CMI de 1700µg.mL-1). Kanazawa et Mori (1996) avaient isolé une Flavobacteriaceae très fortement résistante au cadmium (CMI = 2mM). Une Flavobacteriacea. résistante au Cd a été isolée des terres agricoles en Chine .Sa résistance au Cd était liée à la présence du gène cadA codant pour les pompes d’efflux du métal (Zhang et al., 2008). Selon Benmalek (2008), la résistance aux Cd, Zn et Pb, chez une nouvelle espèce de la famille des Flavobacteriacea (Chyseobacterium solincola), était naturelle, portée par le chromosome. Deux espèces appartenant au genre Burkholderia, isolées du sol de la décharge hospithalo- ménagére de Dellys , se sont montrées très résistantes au Cd avec des CMI équivalentes de 1600µg.mL -1 .Les espèces de Burkholderia sont très résistantes aux métaux lourds, mais leurs mécanismes de résistance sont largement inconnus (Schwager et al., 2012) . Singh et collaborateurs (2011), rapportent que les genres Pseudomonas, Pasteurella, Salmonella, Bacillus et Burkholderia exhibent de grandes potentialités de résistance au Cd et que la plus grande capacité de ces genres à se développer dans un sol qui contient de nombreux métaux lourds, peut être liée au fait qu'ils possèdent différents mécanismes de résistance tels que la séquestration intra et extracellulaire et les systèmes d'efflux (Gupta, 2012; Bushra , 2016) .

3.2. Etude de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries cadmium-résistantes

L’étude des antibiogrammes des 103 isolats, a révélé que 100% des souches sont résistantes à ,au moins, 3 familles différentes d’antibiotiques, et de ce fait ces bactéries sont considérées comme multirésistantes. Sur cinq antibiotiques testés de la famille des β lactamines (Tableau XI), une forte résistance est observée chez les isolats vis-à-vis de l’ampicilline (75,72 %), le céfotaxime ( 73,78%), l’aztréonam ( 65 %), la céftazidime( 58,25%). Cependant, l’imipenème (29 %) est considéré comme le plus actif, avec 58,25 % de souches sensibles et 12,62% à profil intermediaire. D’importantes fréquences de résistance sont signalées pour la colistine sulfate (Polymixines) 68% ; la Rifamycine (Rifamycines) 68% suivie par la novobiocine 64% ; le Chloramphénicol (Phénicoles) 52,42% ; la Tétracycline 42,7% (Tétracyclines) ; la Tobramycine et la Gentamycine (aminosides) 41,7% et 35% respectivement.

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Cette insensibilité envers les antibiotiques testés pourrait être naturelle (chromosomique) ou acquise extra-chromosomique portée par les plasmides, les transposons, les intégrons et les cassettes. Les mécanismes de résistance impliqués pourraient être de type altération ou modification de la cible, inactivation de l’antibiotique par production d’enzymes, imperméabilité ou diminution de la perméabilité de la membrane et expulsion de l’antibiotique vers le milieu externe par les systèmes d’efflux (Poole, 2002 ; Poole, 2012). ). L’inactivation enzymatique est très fréquemment empruntée, par ce mécanisme, la bactérie acquiert la capacité d’inactiver l’action des antibiotiques par la sécrétion d’enzymes avant même qu’ils n’aient pénétrés au sein du microorganisme.

Tableau XI. Profil de résistance des bactéries cadmium-résistantes vis-à-vis des antibiotiques testés. AMP: ampicilline;; IMP: imipenème; CAZ: ceftazidime ; CTX: cefotaxime ; TE: tetracycline; GENT: Gentamycine ; CS: colistine; NV: novobiocine ; C: chloramphenicole; TOB: tobramycine ; ATM: aztreonam ; RIF: rifampycine ;R :resistante,I :intermediaire ;S :sensible.

Sols et Profil AMP IM CTX CAZ ATM TE RIF C TOB GEN CS NV Total nombre P des souches de souches

1. R 15 11 14 14 8 8 8 6 9 8 18 12 23

Cimenterie I 0 1 1 1 1 1 3 6 2 2 0 3

Bologhine S 8 11 8 8 14 14 12 11 12 13 5 8

2 . R 12 10 9 8 12 13 15 9 10 10 7 11 20

Décharge I 2 0 1 1 2 3 0 2 1 0 0 0

Hospithalo- S 6 10 10 11 6 4 5 9 9 10 13 9

Ménagère

Dellys

3.Décharge R 13 1 13 13 13 11 12 11 1 1 10 11 13 ménagère de Batna I 0 7 0 0 0 0 1 1 2 0 3 0

S 0 5 0 0 0 2 0 1 10 12 0 2

4.Ancienne R 5 4 8 7 9 6 6 3 2 0 4 7 09 décharge ménagère I 0 4 0 0 0 1 1 3 3 0 0 0 (Guerara) S 4 1 1 2 0 2 2 3 4 9 5 2

5.Nouvelle R 5 2 7 3 6 3 6 4 0 0 5 7 07 décharge de I 0 0 0 0 0 0 1 0 3 0 0 0

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Guerara S 2 5 0 4 1 4 0 3 4 7 2 0

6.Sol cultivé R 8 1 7 1 6 3 6 5 6 2 6 5 08 BEK I 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0

S 0 7 1 7 2 5 1 2 2 6 2 3

7.Sol R 9 0 4 3 3 0 9 6 6 6 9 5 09

I 0 0 0 1 1 1 0 2 0 0 0 0

S 0 9 5 5 5 8 0 1 3 3 0 4

8.Sol cultivé R 9 1 5 8 6 0 7 8 5 4 6 6 10 de Dellys I 0 2 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0

S 1 7 4 2 3 9 2 2 4 6 4 4

9.Zone R 2 0 0 3 4 0 1 2 4 4 4 2 04 industrielle de Sétif I 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

S 2 4 3 1 0 4 3 2 0 0 0 2

R 78 30 76 60 67 44 70 54 43 36 70 66 103

Total I 2 13 4 3 5 7 8 15 12 2 2 3

S 23 60 23 40 31 52 25 34 48 65 31 34

Les classes d’antibiotiques visées par ces enzymes sont les ß- lactamines, les macrolides- lincosamimides-streptogramines (MLS), les aminosides et les phénicoles. La production de bétalactamases est un mécanisme que l’on retrouve aussi bien chez les bactéries à Gram-positif que celles à Gram- négatif, il s’agit du mode de résistance aux antibiotiques, le plus courant .

La multirésistance des isolats pourrait s’expliquer par le fait qu’un même gène peut coder pour plusieurs résistances à la fois, notamment aux antibiotiques de la même famille (Reijer et al., 2016).

L’étude de l’antibiorésistance des isolats Cd -résistants a permis de dévoiler leur multirésistance vis-à-vis des douze antibiotiques testés étudiés et ce, indépendamment de leurs niveau de résistance (CMI) au cadmium, et permet de présenter ces sols, dont la majorité sont situés en milieux urbains ,comme des réservoirs de gènes de résistance aux antibiotiques . L’isolement de bactéries multirésistantes aux antibiotiques à partir d'écosystèmes où la pression sélective est quasiment absente ,comme en Antarctique (Gonzalez-Avena, 2016) suppose que les mécanismes impliqués dans cette résistance existent naturellement ,depuis longtemps

Résultats et discussions

,d’autres parts , les bactéries sont soumises à la présence de métaux depuis leur existence sur Terre, par conséquent, les mécanismes impliqués dans la résistance existaient bien avant la perturbation des écosystèmes par les humains. Cependant, suite à la pollution anthropique, le rejet des métaux lourds dans les sols et les écosystèmes aquatiques peut favoriser la sélection de bactéries résistantes (Baker-Austin et al., 2006).

Les études réalisées par Calomiris et al. (1984), sur des souches bactériennes à Gram négatif et à Gram positif, révèlent l’association entre la résistance aux métaux (Hg2+, Cd2+, Zn2+, Cu2+, Pb2+,Sn2+ ,Al3+) et la résistance aux antibiotiques. Les résultats de l’étude ont révélé que la multi-tolérance au Cu2+, au Pb2+, et au Zn2+ est associée de manière significative aux germes multi-résistants aux antibiotiques mais pas aux germes sensibles. De même, la résistance à la kanamycine est liée à la tolérance au Cu2+, au Pb2+, et au Zn2+.Des souches de Staphylococcus pasteuri isolées du système de distribution d’eau se sont révélées simultanément résistantes au Hg et aux β-lactamines (Faria et al., 2009). Karbasizaed et al. (2003) ont étudié des souches d’entérobactéries impliquées dans des infections nosocomiales et ont pu isoler un plasmide conjugatif (>56.4 kb) qui véhicule la résistance à la triméthoprime-sulphaméthoxazole, à l’ampicilline, et à la tétracycline. Le transfert de ce plasmide aux cellules réceptrices s’est traduit par une augmentation des valeurs des CMI de 5, 4, et 2 fois respectivement pour le mercure, le plomb, et le cadmium.

L’émergence de la résistance aux antibiotiques est très souvent relatée à l’utilisation immodérée de ces molécules en médecine humaine, en médecine vétérinaire, en élevage agricole et en agriculture. Un autre risque, peu exploré à ce jour, est le risque environnemental .Il a été démontré que la pollution métallique peut avoir un rôle important dans le maintien et la prolifération de la résistance aux antibiotiques (Baker-Austin et al., 2006) par le bais de ,

La résistance croisée : Des études suggèrent que les mécanismes impliqués dans la résistance aux antibiotiques le sont également dans la résistance aux métaux (Mata et al., 2000) et que les gènes codant pour ces résistances sont souvent portés par les même éléments génétiques et transférés en même temps chez les bactéries (McArthur & Tuckfield, 2000).

La co-résistance : Les gènes de résistance au mercure (opéron merRTPA) sont fréquemment portés par des éléments génétiques mobiles et associés à ceux de la résistance aux antibiotiques. Notamment, le transposon Tn21 est connu pour porter à la fois l’opéron merRTPA et le gène aad1 à l’origine de la résistance à la streptomycine et à la spectinomycine. Des études récentes

Résultats et discussions ont montré la présence de ce transposon à la fois chez des bactéries du sol, aquatiques et cliniques (Liebert, et al., 1999).

La co-régulation : comme déjà mentionné chez Pseudomonas aeruginosa (Perron et al., 2004).

Ponctuelle à l'origine, la résistance aux antibiotiques est devenue massive et inquiétante et constitue aujourd'hui l'une des menaces les plus graves pour la santé mondiale, la sécurité alimentaire et le développement. Il semble indispensable d’approfondir les connaissances sur l’impact des pressions anthropiques, en particulier des pollutions métalliques sur la sélection de résistance aux antibiotiques chez Les bactéries. L’accent est mis sur l’ubiquité de ces bactéries, présentes à la fois dans des environnements variés (milieux aquatiques, sol, environnements extrêmes ou pollués) et dans le milieu clinique (infections nosocomiales, pouvoir pathogène, virulence). La résistance importante des bactéries au cadmium est bénéfique pour leur adaptation et leur survie en environnement pollué, mais la prolifération de bactéries résistantes aux antibiotiques, indirectement par le biais d'une sélection de pollution métallique, pourrait poser un risque potentiel pour la santé publique en raison d'échecs thérapeutiques.

3.3. Sélection et caractérisation moléculaire des bactéries cadmium-résistantes

L’étude des CMI des bactéries Cd-résistantes a révélée la présence d’un grand nombre d’isolats manifestant de hautes résistance au Cd .Nous avons sélectionnée sept (7) d’entre eux pour la caractérisation moléculaire par séquençage de l’ARN r 16S .

Les résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose, visualisant le gène ARNr 16S des souches identifiées au CBS, ainsi que les séquences des souches identifiées sont reportés dans les Annexes X .

Aujourd’hui, l’identification des bactéries s’effectue souvent sur la base des séquences du gène de l’ARNr 16S. Cette identification permet de définir une catégorie proche du rang taxonomique de l’espèce si le degré d’identité est au moins de 97%. L’utilisation de ce gène comme biomarqueur en taxonomie a permis de révéler la biodiversité d’Eucaryotes et de Procaryotes dans de nombreux environnements et de pallier les limites de l’approche culturale.

Le Tableau XII,rapporte les résultats de l’identification des souches sélectionnées et montre l’affiliation de YL-ML1 à l’espèces Raoultella ornithnolytica ( souche YL-ML1) ,Klebsiella pneumoniae(souche YL-SS2),Empedobacter brevis (souche YL-IS2) ,Burkholderia cepacia

Résultats et discussions

(soucheYL-BS2),Burkholderia ambifaria(souche YL-CS2) ,Bacillus infantis (souche YL-SS8) et Pseudomonas fluorescens (souche YL-SS3).

Tableau XII. Résultats de l’identification moléculaire des souches cadmium-résistantes

Les isolats CMI Longueur de l % de similitude Résultats du N° d’accès à

séquence (pb) NCBI-BlastN GenBank

YL-ML1 2000 1311 98 Raoultellaornithinolytica MF419186

YL-SS2 1900 1447 99 Klebsiella pneumoniae MG758500

YL-SS3 900 1457 99 Pseudomonas fluorescens MF419185

YL-SS8 1100 1455 99 Bacillus infantis MG758499

YL-CS2 1600 1508 99 Burkholderia ambifaria MF419183

YL-BS2 1600 1521 99 Burkholderia cepacia MF419182

YL-IS2 1700 1471 98 Empedobacter brevis MF419184

La construction de l’arbre phylogénétique (Fig .26) a permis de positionner les souches séquencées , par rapport aux souches voisines, en se basant sur le séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S.

Résultats et discussions

42 YL-ML1 (MF419186) 57 Raoultella planticola strain NBRC 14939 (NR 113701.1) 98 Raoultella ornithinolytica strain CIP 103364 (NR 044799.1) 96 YL-SS2 (MG758500) 95 Citrobacter freundii strain LMG 3246 (NR 117752.1) 100 Klebsiella pneumoniae strain DSM 30104 (NR 114715.1)

98 E.coli ATCC 11775T (X80725.1) Pseudomonas aeruginosa strain DSM 50071 (NR 026078.1) Pseudomonas putida strain ATCC 12633 (NR 114479.1) 100 Pseudomonas entomophila strain L48 (NR 102854.1) 100 88 YL- SS3 (MF419185) 94 Pseudomonas mosselii strain CFML 90-83 (NR 024924.1)

44 YL-CS2 (MF419183) Burkholderia ambifaria strain AMMD (NR 074687.1)

100 Burkholderia cepacia strain ATCC 25416 (NR 114491.1)

25 YL-BS2 (MF419182) 99 Burkholderia stagnalis strain LMG 28156 (NR 136495.1) Flavobacterium xanthum strain NBRC 14972 (NR 113714.1) Elizabethkingia meningoseptica strain ATCC 13253 (NR 042267.1) 100 Chishuiella changwenlii strain BY4 (NR 133996.1) 99 100 YL-IS2 (MF419184) 100 Algoriella xinjiangensis strain XJ109 (NR 145933.1)

0.05

Figure 26.Arbre phylogénétique basé sur le gène codant l’ARNr 16S, mettant en évidence les résultats de l’identification phylogénétique des 7 souches hautement résistantes au Cd sélectionnées .Les arbres sont obtenus en utilisant le logiciel MEGA 6 et la méthode Neighboor joining avec 1000 réplications.

4. Etude de l’accumulation des ions cadmium par les cellules bactériennes

Parmi les sept bactéries les plus résistantes au Cd, quatre isolats seulement ont été retenus pour cette partie d’étude. Deux ont été sélectionnés tout au début de notre travail à savoir : Pseudomonas fluorescens (souche YL-SS3) et Bacillus infantis (souche YL-SS8) avec des CMI de l’ordre de 900µg. mL-1et1100µg. mL-1 respectivement. Le choix des deux autres souches a été fait à la fin de notre travail, soit Raoultella ornithinolytica (souche YL-ML1) et

Résultats et discussions

Klebsiella pneumoniae (souche YL-SS2) avec des CMI respectives de2000µg. mL-1 et 1900 µg. mL-1.

L’étude de la bioaccumulation du Cd par les bactéries sélectionnées serait mieux appréhendée en situant l’accumulation au cours du cycle cellulaire des souches bactériennes, pour cela nous avons étudié l’effet du Cd sur la croissance bactérienne parallèlement à l’accumulation du Cd.

4.1. Effet du cadmium sur la croissance des bactéries Test

Le suivi de la croissance bactérienne et l’évaluation de la quantité des ions cadmium accumulés, ont été réalisés sur des cultures cellulaires en bouillon nutritif en présence de 100µg.mL-1 de métal. La croissance est évaluée par des mesures périodiques de l’absorbance à 600nm, alors que la capacité d’accumulation est évaluée par le dosage du Cd résiduel par SAA, durant les mêmes périodes d’incubation (Fig.27).

En absence du métal (Témoin), les courbes de croissance des souches YL-ML1 ,YL-SS2 ,YL- SS3 et YL-SS8 se distinguent par une phase de croissance exponentielle de durées variables, selon les souches et est respectivement de 72h ,24h ,24h et 24h respectivement pour les souches YL-ML1,YL-SS8 ,YL-SS3 et YL-SS2 , cette phase est suivie par une phase stationnaire. En présence du Cd, nos résultats montrent clairement l’effet cytotoxique qu’exerce le cadmium sur la croissance de toutes les souches testées par rapport aux témoins non traités. L’apparition de phénomènes toxiques chez les bactéries Test, exposées au Cd, traduis par une inhibition de la croissance, présente le Cd comme, un facteur de stress. La notion de stress intervient dès que les conditions optimales de croissance d’un microorganisme ne sont pas réunies. Par conséquent, quelle que soit sa nature, toute modification environnementale conduisant à des conditions de croissance non favorables, va perturber la physiologie cellulaire et sera donc perçue comme un stress (Dressaire,2009) .Ainsi ,Bauda (1989) ,rapporte que la toxicité du Cd peut s’exprimer aux niveaux périphériques membranaires et intracellulaires, la toxicité du Cd est envisageable sur les protéines transporteurs et les enzymes de l’espace péri- plasmique ainsi que sur les molécules biologiques à l’intérieur de la cellule. La capacité d’adaptation des souches Test à ces conditions, va être déterminante pour leur survie .Il est important de noter que les stress, quelles que soient leurs natures, s’accompagnent d’une réduction plus ou moins importante de la vitesse de croissance (Dressaire, 2009).

A l’exception de la souche YL-SS3, la croissance des souches Test suit un modèle général, dans lequel, une réduction de la croissance très importante ,survient en début

Résultats et discussions d’expérimentation : c’est la phase de latence, inexistante en absence de Cd .Cette phase est de durées variables d’une souche à une autre, suivie d’une phase durant laquelle, les bactéries se trouvent capables de redémarrer leur croissance (phase exponentielle) mais à des taux toujours inférieurs par rapport aux témoins respectifs des souches Test.. Les résultats montrent que l’effet négatif du Cd sur la croissance des souches, est très marqué au début d’incubation, ce qui suggère que l’impact de la toxicité de ce métal est immédiat. Ainsi la souche YL-ML1 montre une phase de croissance très réduite située entre 0h et 8h d’incubation, tout comme la souche YL-SS2. Ces deux entérobactéries sont capables d’améliorer leur prolifération au-delà de cette période, puisqu’une production de biomasse est notée après 8h de latence.

1,6 a 1,6 b 1,4 1,4 1,2 1,2 1 1 0,8 0,8 0,6 0,6

0,4 0,4 DO DO mesurée à600nm

0,2 DO mesuréeà600nm 0,2 0 0 Temps (heure) temps (heure) 2h 8h 24h 48h 72h 2h 8h 24h 48h 72h

YL-ML1-Cd YL-ML1+Cd YL-SS8-Cd YL-SS8+Cd

1,6 c 1,6 1,4 1,4 d 1,2 1,2 1 1 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4

DO DO mesurée à600nm 0,2 0,2 0 DO mesuréeà600nm 0 Temps (heure) Temps (heure) 2h 8h 24h 48h 72h 2h 8h 24h 48h 72h

YL-SS3-Cd YL-SS3+Cd YL-SS2-Cd YL-SS2+Cd

Figure 27. Effet du cadmium sur la croissance des cellules bactériennes. Le Cd étant rajouté en début d’expérimentation à une concentration finale de 100µg/mL .

A l’instar des souches YL-ML1 et YL-SS2, la souche YL-SS8 exhibe une réduction drastique depuis le début de l’expérimentation, mais cette période de latence est plus prolongée par

Résultats et discussions rapport aux autres souches, puisque la reprise de croissance n’est notée qu’après 48h d’incubation. La croissance de la souche YL-SS3 progresse très lentement en fonction du temps d’incubation et ne présente pas de phase de latence. La durée de la phase de latence renseigne sur le degré de toxicité du Cd pour les souches Test .En conditions de stress, cette phase représente une période cruciale pour la bactérie afin de s’adapter aux changements environnementaux. Cette phase est influencée par la concentration du métal dans le milieu. Ainsi chez Rhizobium alamii la durée de la phase de latence a doublé en passant d’une concentration de 1 mg.L-1 à 2 mg.L-1 de Cd. De ce fait la souche YL-SS8 semble être la plus affectée par le Cd, car cette souche (YL-SS8) n’a pu redémarrer sa croissance qu’après 48h d’incubation, avec un taux toujours inférieur par rapport aux autres souches Test. En revanche la souche YL-SS3 serait considérée comme la plus tolérante. La phase de latence est une phase de maintenance et d’accommodation et constituerait un passage obligé pour les bactéries afin de s’adapter à cette perturbation chimique dans leur milieu. Cette période de maintenance semble impliquer la réparation des lésions et l’ajustement de la physiologie cellulaire pour limiter la distribution des ions toxiques dans la cellule (Fahmy ,2013). L’adaptation au stress entraîne une vaste réorganisation de la physiologie cellulaire. Cette réponse concerne les niveaux d’ARN messagers et de protéines mais aussi les processus cellulaires majeurs que sont la transcription, la traduction et la dégradation des protéines. (Dressaire, 2009), et c’est ce qui a permis à nos souches par la suite ,de s’accommoder et de redémarrer leur croissance . Cette adaptation plus ou moins lente, selon les souches ,suggère que la souche YL-SS8 a reçu le plus de dommages . Plusieurs travaux antérieurs, avaient signalé une prolongation de la phase de latence des souches bactériennes soumises au Cd. Ainsi Les cellules de la souche B d'Escherichia coli développent de grandes vacuoles intracellulaires et présentent une phase de latence anormalement longue lorsqu'elles sont inoculées dans un milieu défini au glucose et à des sels contenant 3 fois 10-6 M de Cd2 +. Au début de ce retard, environ 95% des cellules ne parviennent pas à former des colonies lorsqu'elles sont étalées sur bouillon nutritif- agar (Mitra et al., 1975 ) . Des résultats similaires ont été rapportés chez Bacillus cereus ou, une réduction drastique a été notée pendant 8h depuis l’ajout d’une concentration de Cd de 15µg.mL-1 .Notre souche YL- SS8 qui appartient au même genre (Bacillus) a affiché une prolongation beaucoup plus

Résultats et discussions importante de 48h, cependant la concentration utilisée durant notre étude est nettement plus importante (100µg.mL-1)( Ganguly et Ray,2011). De même, Enshaei et al , (2010), avaient montré qu’une période d’adaptation de 12h était requise pour l’accommodation de P. aeruginosa en présence de 0,7mM/L de Cd.

Cependant Higham et al (1985) , rapportent chez une souche de P. putida l’ absence de la phase d’adaptation en présence de Cd, la bactérie a directement entamé la phase logarithmique mais à un niveau de prolifération assez faible comparé au témoin non traité, ce qui concorde avec les résultats de notre étude obtenus chez YL-SS3 ( P. fluorescens).

Le Cd est considéré comme l’élément le plus toxique parmi les métaux lourds, de ce fait l’impact négatif sur la croissance est perçu par un large éventail d’espèces bactériennes.

Dans le cas de nos souches Test, l’effet inhibiteur du Cd s’est clairement manifesté. Ainsi, les taux de réduction de croissance par rapport aux témoins, sont maximaux durant la période d’adaptation (jusqu’à 8 h d’incubation pour les souches YL-ML1 YL-SS2 et YL-SS3 et jusqu’à 48h d’incubation pour la souche YL-SS8) , et sont de 87,96 % ,70% ,60%, et 56,94% respectivement pour YL-SS8 ,YL-SS2 ,YL-ML1 et YL-SS3. Au delà de la phase de latence, et au bout de 72h d’incubation, ces taux s’améliorent, parallèlement à la reprise de la croissance et passeront à 72,58%, 50,71% 51,42% et 50% respectivement pour YL-SS8, YL-SS2, YL-ML1 et YL-SS3. Ces résultats montrent qu’en dépit des fortes CMI vis-à-vis du Cd, retrouvées chez nos souches Test, il s’avère que ce métal affecte drastiquement leur croissance. Il est important de rappeler que les CMIs des souches cadmium-résistantes, ont été évaluées sur milieu solide (gélose nutritive). Il a été rapporté qu’une CMI plus élevée, est signalée dans les milieux solides comparativement aux milieux liquides, en raison de la différence de disponibilité des métaux, de la capacité de diffusion et de la capacité de liaison des métaux dans les deux milieux (Kumar et al., 2013). L’inhibition de la croissance, provoquée par la présence du Cd dans le milieu de culture, est due essentiellement à la forte toxicité de ce métal. Le cadmium est connu comme l'un des plus puissants inhibiteurs biologiques, même à faible concentration. Le contact avec le cadmium provoque des dommages au niveau cellulaire tels qu’une inhibition de la réplication de l'ADN (Mitra et al., 1975; Nystrom& Kjelleberg, 1987) qui rendrait l'ADN plus sensible aux attaques nucléolytiques. L’effet inhibiteur des métaux lourds ,et particulièrement le Cd sur les microorganismes ,est largement décrit dans la littérature scientifique. Le Cd exerce ses effets toxiques sur une large

Résultats et discussions gamme de concentrations. Dans la plupart des cas, les algues et les cyanobactéries sont les organismes les plus sensibles, tandis que les bactéries et les champignons semblent plus résistants. Le cadmium est toxique pour ces organismes, provoquant une inhibition sévère des processus physiologiques à des concentrations de moins de 2 ppm et souvent dans la gamme des ppb (Trevors et al ., 1986). Le Cadmium provoque également des aberrations morphologiques marquées chez ces organismes, probablement liées à des effets délétères sur la division cellulaire. Cela peut être direct ou indirect, en raison des effets du Cd sur la synthèse des protéines (Fahmy, 2008). D’une façon générale, La toxicité intracellulaire des cations métalliques lourds a trois origines : la modification de la structure des acides nucléiques, l’inhibition des activités enzymatiques et l’interaction avec des dérivés réactifs de l’oxygène (Hengstler et al., 2003). La toxicité du Cd se manifeste même avant la pénétration des ions dans la cellule. Les bactéries ont la capacité de résister aux métaux lourds, car elles sont dotées de gènes de résistance aux métaux lourds portés par des plasmides, transposons ou bien les chromosomes. Ces gènes codent les protéines structurelles et enzymatiques intervenant dans les processus de bioaccumulation du métal.

Chez Bacillus subtilis le gène chromosomique copZ code pour une protéine chaperonne CopZ qui transfère le cuivre au transporteur de cuivre copA .Les gènes copZ et copA sont regroupés en un opéron et son promoteur est régulé par des ions Cu. Les ions cadmium activent l'expression de copZA aussi fort que le cuivre (Irina, 2004).

De même que la résistance d’une souche de P.aeruginosa EP-Cd1 ,au cadmium est relatée à la présence du gène czcA qui code pour des pompes d'efflux (Raja and Selvam,2009).

Le profil « hautement résistantes » des souches Test , suppose le recrutement de mécanismes permettant à ces isolats de redémarrer leur croissance, après une période d’adaptation d’une durée variable entre les souches. Ce qui suggère que la capacité d’adaptation des souches est liée à leur capacité de mettre en œuvre des mécanismes de résistance activés durant phase d’adaptation. La réaction des souches au Cd, semble distinguer les Protéobactéries de la souche à Gram-Positif, du moins au cours de notre étude, puisque Bacillus infantis a été la plus affectée par la toxicité du Cd.

La réversibilité de l’inhibition de la croissance par le Cd ,observée chez nos souches Test suppose que les conditions du milieu ne présentent plus la même sévérité de la toxicité installée au début de l’expérimentation et seraient donc devenues moins toxiques . Le but de

Résultats et discussions l’adaptation est de ramener le Cd à une concentration assez faible, qui permettrait les fonctions physiologiques de la prolifération cellulaire. Une diminution de la toxicité du cadmium pourrait être attribuée à une amélioration du statut antioxydant des bactéries et /ou à une surproduction d’EPS (Song, 2016) .Ces substances jouent un rôle très important dans la biosorption des métaux lourds permettant ainsi leur immobilisation à l’extérieur de la cellule.

Cette restauration, aurait recruté des mécanismes passifs, car les bactéries épargnent leur énergie en présence d’un stress, en vue de la dépenser ultérieurement durant les mécanismes actifs inductibles.

Les phénomènes passifs de la biosorption recrutent les structures constitutives des membranes cellulaires telles que les groupements fonctionnels carboxyles, hydroxyles et sulfhydriles anioniques qui complexent les cations divalents du Cd. D’autres mécanismes actifs sont induits par le Cd ,comme l’induction de la biosynthèse des EPS ,des activités de certaines enzymes du système antioxydant ainsi que l’induction de certaines protéines qui permettent la séquestration intracellulaire du Cd comme les métallothionéines et certains peptides comme le glutathion ainsi que les protéines des pompes d’efflux qui permettent l’extrusion du Cd hors de la cellule. La réduction de la prolifération cellulaire dévoile l’effet toxique du Cd sur le métabolisme des souches Test .Cependant, la concentration utilisée dans notre étude (100µg.mL-1) est loin d’être rencontrée dans les sols. Ces résultats permettent de valoriser la grande adaptabilité de ces souches Cd-résistantes in situ.

4.2. Accumulation des ions cadmium par des cellules libres en suspension

Si l’analyse des cinétiques de croissance des souches Test en présence du Cd, a montré un effet inhibiteur de ce métal en début d’incubation, l’accumulation, en revanche est fortement favorisée pendant cette période (au bout de 24h de contact avec le Cd). Comme le montrent les courbes de la figure 28, une quantité importante des ions cadmium est éliminée du milieu pendant les premières 24h de culture.

Résultats et discussions

120 120 a b 100 100 80 80

60 60 résiduel(µg/mL)

résiduel( µg/mL) 40 40

ConcentrationdeCd ConcentrationdeCd

20 20

0 0 0h 24h 48h 72h 0h 24h 48h 72h Temps(heure) Temps(heure) YL-ML1 Lib. YL-ML1 Imm. YL-SS8 Lib. YL-SS8 Imm.

120 120 c d 100 100

80 80

60 60

résiduel(µg/mL) 40

résiduel(µg/mL)

ConcentrationdeCd ConcentrationdeCd 20 20

0 0 0h 24h 48h 72h 0h 24h 48h 72h Temps(heure) Temps(heure) YL-SS3 Lib YL-SS3 Imm. YL-SS2 Lib. YL-SS2 Imm

Figure 28.Bioaccumulation des ions cadmium par les cellules bactériennes libres et immobilisées.

Le Cd est rajouté en début d’expérimentation à une concentration finale de 100µg.mL-1 .

Ainsi, les concentrations de Cd accumulées sont de l’ordre de 89µg. mL-1(souche YL-ML1), 90µg. mL-1(souche YL-SS8), 83µg. mL-1(souche YL-SS3) et 87,8µg. mL-1(souche YL-SS2). Le taux d’accumulation du cadmium chez les souches YL-SS2 et YL-ML1 au-delà de 24h , semble stabilisé en un plateau traduisant un ralentissement voir un arrêt de l’accumulation. Cependant dans la même période (au-delà de 24h d’incubation), les souches YL-SS8 et YL- SS3 ,se comportent différemment vis à vis du Cd.

Durant ce temps, ces souches ont ralenti l’accumulation et les quantités des ions cadmium accumulée par la souche YL-SS8 sont passées de 90µg.mL-1 (après 24h d’incubation) à 73µg. mL-1 après 48h et 68 µg. mL-1 au bout de 72h .

De même que pour la souche YL-SS3 le taux d’accumulation a régressé en fonction du temps, ainsi au bout de 48h la concentration du cadmium résiduelle est de 44µg. mL-1 et est de 53 85

Résultats et discussions

µg. mL-1 après 72h de contact avec le métal. Cette augmentation du Cd dans le milieu laisse supposer une extrusion du métal par les souches YL-SS3 et YL-SS8.

Ces résultats montrent la relation entre la résistance au Cd et la capacité d’accumulation du Cd. Ainsi les souches YL-SS3 et YL-SS8 hautement résistantes au Cd ne sont pas autant performantes quand à la bioremédiation du Cd au-delà de 24 heures que les souches YL-ML1 et YL- SS2, suggérant l’activation de système d’efflux du Cd.

Dans la présente étude il a été observé, que la capacité d’accumulation des souches est maximale durant les premières 24h d’incubation. Selon Bauda (1986), la bioaccumulation du Cd est un phénomène rapide. Chez Pseudomonas fluorescens 72 à 86% de Cd est fixé durant la première heure de contact avec le métal (Bauda et BLocK, 1985). Selon Simon et al. (1985), la fixation du Cd par Alcaligenes eutrophus est maximale après 15 minutes de contact avec le métal.Chez Bacillus cereus ,par contre ,la reprise de la croissance était accompagnée d’une augmentation de remediaton du Cd (Shamim et rehman ,2012).

Nos résultats montrent que le maximum du Cd est accumulé en début d’incubation (après 24h). Concernant les souches YL-ML1 ,YL-SS2 et YL-SS3 ,cette période correspond à la phase exponentielle de croissance ,supposant que la bioaccumulation pourrait dépendre de la biomasse cellulaire vivante .Cependant ,dans le cas de la souche YL-SS8,cette période correspond à une très faible biomasse vivante suggérant que beaucoup de cellules seraient mortes .En effet le cadmium cause des dommages oxydatifs aux microorganismes, conduisant à diminution de l'activité cellulaire, réduction du taux de croissance et de la densité cellulaire, inhibition de la prolifération et conséquemment la diminution du nombre de bactéries vivantes du à la mort de certaines d’entre elles (Shamim et Rehman, 2012) Ce qui suggère que l’accumulation chez cette souche ,en cette période n’est pas complètement dépendante de la biomasse vivante. Ceci nous mène à penser que les bactéries mortes auraient également participé à l’accumulation du Cd à travers la biosorption passive.

La part de la biosorption passive est mieux relativisée en effectuant des mesures de la cinétique d’accumulation du métal dans des conditions non proliférantes, c’est-à-dire dans un milieu totalement dépourvu d’éléments nutritifs, ce qui permet d’une part d’éliminer de l’étude, le paramètre croissance, et de limiter les phénomènes de complexation entre métaux et molécules nutritives et d’une autre part de relativiser la marge de l’accumulation passive. La majorité des auteurs supposent que la première partie de la cinétique d’accumulation du Cd, correspondrait à un processus passif d’adsorption du métal à la périphérie cellulaire. En ce qui

Résultats et discussions concerne la seconde, deux hypothèses sont plausibles : soit une saturation de sites d'adsorption, en cas d’obtention d’une phase plateau, soit l’intervention d’un mécanisme d’accumulation autre que l’adsorption. Cependant, en aucun cas les études cinétiques ne sauraient préciser la nature des mécanismes impliqués dans cette accumulation du Cd (Bauda,1986). Dans une même optique, Trévors (1986) signale, que le cadmium s'accumule à l'intérieur des algues, à la suite d'un processus d'absorption en deux phases : La première phase implique une adsorption physico-chimique rapide du Cd sur les sites de liaison de la paroi cellulaire, qui sont probablement des protéines et (ou) des polysaccharides. Ceci est suivi d'une période de latence, puis d'une absorption intracellulaire lente et régulière. Cette dernière phase dépend de l'énergie et peut impliquer des systèmes de transport utilisés pour accumuler d'autres cations divalents.

L’accumulation des métaux par les bactéries a été souvent rapportée dans la littérature scientifique. Toutefois la diversité des résultats obtenus relate la diversité des paramètres intervenant dans la bioaccumulation des métaux et la difficulté à bien les controler.Ces paramètres peuvent être répartis d’une manière simple en trois groupes qui ne sont pas indépendants les uns des autres : paramètres liés au microorganisme, paramètres liés au métal et paramètres liés au milieu (Bauda, 1986).

4. 3. Accumulation des ions cadmium par des cellules immobilisées

Les courbes illustrées dans la figure 28 ,montrent que l’essentiel du Cd est accumulé pendant les premières 24h d’incubation ,comme dans le cas des cellules libres .Ainsi les quantités accumulées par les cellules immobilisées pendant 24h d’incubation sont légèrement meilleures comparées avec leur état libre et sont de 94%, 93%, 85% et 91,5% respectivement pour YL- ML1 ,YL-SS8 ,YL-SS3 et YL-SS2 contre 89% , 90% , 81% et 87,98% en état libre .

Au delà de cette période (48h à72h), les quantités de Cd accumulées par les cellules immobilisées, ont diminué, notamment chez les souches YL-SS3 et YL-SS8.

Durant la même période (48h à72h), les cellules immobilisées de la souche YL-ML1 ont montré une stabilisation de l’accumulation du Cd , alors que l’immobilisation des cellules d’YL-SS2 après 48h d’exposition au Cd a affiché une très légère augmentation de celle ci.

Ainsi les quantités d’ions métalliques accumulés au bout de72 heures par les cellules immobilisées sont de 92,44% ,86% ,74% et 92,44% respectivement pour YL-ML1,YL-

Résultats et discussions

SS2 ,YL-SS3 et YL-SS2 contre 88,5%,68%,47% et 92,44% respectivement pour YL- ML1,YL-SS2 ,YL-SS3 et YL-SS2 libres. Globalement, nos résultats montrent une amélioration de l’accumulation du Cd en mode « immobilisé » par rapport au mode « planctonique » en suspension. De nombreux auteurs ont démontré une meilleure bioremédiation des métaux lourds par les Organismes immobilisés, par rapport aux cellules libres (Tsekova et Ilieva, 2001;Wuana et Okieimen, 2010; Sujitha et Jayanthi, 2014; Wasi et al., 2011 ).La technologie de l’immobilisation des micro-organismes offre une multitude d'avantages, tels que la biomasse élevée, grande activité métabolique et une forte résistance aux produits chimiques toxiques (Cai et al., 2011, Liu et al., 2012). La technique des cellules immobilisées est une technique ancienne, pour illustration, elle est utilisée traditionnellement par les allemands dans la fabrication du vinaigre où des bactéries acétiques sont immobilisées sur des copeaux de hêtre. Récemment, diverses techniques d'immobilisation cellulaire sont utiles dans la production d'enzymes telles que l'ᾁ-amylase, la β-amylase, la xylanase, la glucoamylase, la pullulanase ou la phosphatase alcaline (Ramakrishna et al .,1990 ; Sivaramakrishnan et al.,2006 ; Abdelwahed et al.,2014) .Des cellules d'Escherichia coli immobilisées viables, mais non en croissance, dans des films biocatalytiques développés par Lyngberg et al .(1999), ont produit une β-galactosidase ayant une activité spécifique supérieure à celle des cellules en suspension. Des observations similaires ont été faites par Klingeberg et al. (1999) .Les α-amylases et les pullulanases produites par des bactéries piégées dans un gel étaient caractérisées par des activités spécifiques supérieures à celles obtenues à partir de cellules libres. Un autre domaine dans la microbiologie appliquée utilisant des cellules immobilisées (CI) est la production d'antibiotiques et de chimiothérapies (Ramakrishna et al .,1990 ; Zhu et al.,2015). La synthèse d'antibiotiques par les systèmes à CI comprend, par exemple, le Ca-alginate, le Polyacrylamide, le k-carraghénane, le coton ou la Celite. Les antibiotiques produits par les cellules bactériennes immobilisées comprennent l'actinomycine D, la bacitracine, les céphalosporines, la chlortétracycline, l'érythromycine et la néomycine (Ramakrishna et al .,1990) . Dans le secteur environnemental, l’immobilisation cellulaire est utilisée dans la protection de l’environnement depuis presque un siècle, bien avant l’invention du terme biotechnologie. On a mis au point des installations municipales d’épuration des eaux usées au tournant du siècle. Ils se sont montrés très efficaces, alors qu’on en savait peu à cette époque sur les principes biologiques expliquant leur fonctionnement. Depuis ce temps-là, la science et le savoir ont beaucoup évolué. 88

Résultats et discussions

Au cours des vingt dernières années, de nombreuses bactéries bénéfiques pour l'environnement ont été isolées et étudiées. Ces bactéries sont utilisées généralement dans la bioremédiation sous forme immobilisée sur un support préparé par des polymères. Les cellules immobilisées exhibent une plus grande stabilité catalytique ainsi qu’une plus importante tolérance aux concentrations plus élevée de composés toxiques comparés avec leurs homologues non immobilisés (Ignatov et al. 2002; Wasi et al. 2011).L'immobilisation fournit une résistance accrue aux substrats et aux produits à la diffusion. Quelques études ont signalé l'utilisation de cellules immobilisées pour dégrader les composés toxiques (Cho et al., 2000, Prieto et al., 2002; Wasi et al. 2011 ) . Souvent, le procédé imite ce qui se produit dans la nature où les bactéries sont rarement sous forme planctonique mais immobilisées dans des biofilms.Dans les communautés naturelles bactériennes , il a été démontré que les microorganismes attachés sont plus actifs que leurs homologues vivant librement et présentent des différences dans l'expression des gènes (Mitra et al.,2016 ;Toyofuku et al.,2016). En outre, il est bien connu que l'interaction entre les bactéries et la phase solide entraîne une variété de modifications physiologiques du comportement microbien (Costerton et al.,1985 ; Van Loosdrecht et al,1990 ; Costeron et al.,1995 ; Davey et al.,2000 ; Abee et al.,2011 ;Smet et al.,2015). En 1943, ZoBell, avait démontré que l'activité bactérienne augmentait en présence d'un support en verre, même lorsque les concentrations de nutriments dans l'environnement étaient faibles (Van Loosdrecht et al.,1990 ;Zobell,1943). Karel et al. (1985) ont déjà constaté que la voie métabolique des cellules attachées à des surfaces, peut être différente de celle des cellules libres. Entre-temps, plusieurs travaux ont rapporté de tels changements lors des fermentations avec des cellules immobilisées, notamment une tolérance accrue envers l'inhibition par le produit (Fortin et Vuillemard 1989; Krisch et Szajani 1997; Teixeira de Mattos et al. 1994) ou même envers d'autres facteurs de stress environnementaux (Doleyres et al. 2002a; Trauth et al. 2001) .Ces dernières années, des systèmes de cellules immobilisées (CI) sont couramment utilisés à des fins biotechnologiques, par exemple dans la bioremédiation et la biodégradation, la lutte biologique, l'application de pesticides et la production de divers composés tels que des acides aminés, des antibiotiques, des stéroïdes ou des enzymes. La biodégradation et /ou biotransformation de polluants toxiques et de xénobiotiques est l’une des principales applications des systèmes de cellules immobilisées.des effets toxiques des composés xénobiotiques ou de leurs métabolites. Dans les eaux usées, les composés organiques s’absorbent d’abord sur la surface des supports, puis pénètrent progressivement au travers de leurs pores. Cela permet aux micro-organismes de libérer des enzymes extracellulaires pour la pré-hydrolyse des xénobiotiques organiques, puis de transporter les fragments de polluants à

Résultats et discussions travers la membrane cellulaire en vue de leur oxydation ( Sekaran et al.,2013 ; Antizar- Ladislao et al.,2003 ;Del Castillo et al.,2012) Dans le cas des polluants inorganiques comme les métaux lourds, les techniques d'immobilisation conviennent non seulement aux bactéries de type sauvage, mais elles peuvent être utilisées avec succès pour des souches mutantes. Branco et al., 2016, ont utilisé Ochrobactrum tritici As5 avec des pompes d'efflux d'arsénite inactivées immobilisées dans du poly (tétrafluoroéthylène) pour la biofiltration de l'arsénite. Deux mécanismes d’accumulation des métaux peuvent être distingués, la biosorption et la précipitation (Ahalaya et al.,2003).La biosorption représenterait une large marge dans l’accumulation des métaux chez les cellules immobilisées à travers leur complexation avec les EPS ;il a été suggéré que l’immobilisation stimule la production des EPS ; cette propriété est d’ailleurs exploitée dans le secteur de l’agroalimentaire pour produire augmenter leur production des EPS en vue d’être utilisés comme bioingrédients ,grâce à leur propriétés texturantes et émulsifiantes (Bergmaier, 2002). Cependant, les données sur les effets exercés par l'immobilisation sur la physiologie microbienne restent limitées et largement dispersées (Cassidy et al., 1996 ;Junter et al.,2002 ; Junter et al.,2004 ; Ramakrishna,1999).

5 .Effet de la concentration du cadmium et la durée d’exposition sur le taux des protéines totales et la production d’EPS

5.1. Effets de la concentration du cadmium et la durée d’exposition sur la teneur en protéines totales des souches Test

Les résultats de la figure 29 , montrent une réduction de la quantité des protéines totales de toutes les souches étudiées et à toutes les concentrations de Cd testées, par rapport aux témoins . La diminution des teneurs en protéines totales reflète l’effet cytotoxique du Cd sur le métabolisme cellulaire.

Résultats et discussions

a b

) ) 1

1 1500 800

- - 0h 600 0h 1000 1h 400 1h 500 3h 3h 200

24h 24h Proteines(µg.mL Proteiens(µg.mL 0 0 T 25 50 75 100 150 72h T 25 50 75 100 150 72h Concentrations de cadmium Concentrations de cadmium

c d

800 1200

700 ) 1

- 1000

) ) 600 1

- 0h 0h 500 800 400 1h 600 1h 300 3h 400 3h 200 24h 24h Proteines(µg.mL 200 100 72h 72h Proteines(µg.mL 0 0 T 25 50 75 100 150 T 25 50 75 100 150 Concentrations de cadmium Concentrations de cadmium

Figure 29.Effet de la concentration et de la durée d’exposition au cadmium sur les teneurs en protéines totales des souches YL-ML1 (a),YL-SS8 (b),YL-SS3(c) et YL-SS2(d).

Le Cd est rajouté en phase exponentielle de la croissance. 0h : correspond au moment qui précède le rajout du Cd dans le milieu de culture.1h, 3h ,24h et 72h : correspondent aux différent temps après rajout du Cd dans le milieu de culture.

Cette réduction est d’autant plus importante que la concentration de Cd augmente, et varie en fonction du temps d’incubation pour une même concentration. Ainsi, après 3heures de contact avec le Cd, la réduction des teneurs en protéines totales est maximale.

La chute des teneurs en protéines totales, traduit l’inhibition de la croissance des souches Test par le Cd, En effet, la croissance peut être évaluée en mesurant la densité optique ou bien à travers la quantification des protéines totales.

Résultats et discussions

Les quantités des protéines totales dosées après 3h d’incubation en présence des différentes concentrations de Cd , sont de 616 µg. mL-1,540 µg. mL-1 , 380 µg. mL-1,340 µg. mL-1 et 300 µg. mL-1 correspondant à des taux de réduction de 10,21% ; 21,29%, ; 44,61% ; 50,44% et 56,27% respectivement en présence de 25 µg. mL-1 ; 50 µg. mL-1 ; 75 µg. mL-1 ;100 µg. mL-1 et 150 µg. mL-1 par rapport au témoin ,chez la souche YL-ML1 (Tableau XIII).

Tableau XIII .Effet de différentes concentrations de Cd sur les teneurs en protéines totales chez la souche test YL-ML1

YL-ML1 Temps d’incubation

Concentratio 1h 3h 24h 72h ns Protéines % de Protéines % de Protéines % de Protéines % de variation (µg.ml-1) variation (µg.ml-1) variation de Cd (µg.ml-1) (µg.ml-1) varia (µg.mL-1) tion

T(0) 550 / 686 / 956 / 1205 /

25 613 -11,45 616 10,20 1025 7,21 942 21,82

50 517 6 540 21,28 589 38 616 46

75 526 4 ,36 380 44,6 485 49,26 512 57,5

100 82,72 17,27 340 50,43 422 55,85 450 62,65

150 346 37,09 300 56,26 332 65,27 346 71,28

Chez la souche YL-SS8 les teneurs en protéines totales affichent des valeurs de 415 µg. mL- 1,373 µg. mL-1,291 µg. mL-1,277 µg. mL-1 et 242 µg. mL-1 ce qui correspond à des taux de réduction enregistrés durant la même période (3h) de 19,73% ; 27,86% ; 43,72% ; 46,43% et 49,13%. respectivement en présence de 25 µg. mL-1 ; 50 µg. mL-1,75µg. mL-1 ; 100µg. mL-1et 150µg. mL-1 par rapport au témoin (Tableau XIV).

Résultats et discussions

Tableau XIV. Effet de différentes concentrations de Cd sur les teneurs en protéines totales chez la souche test YL-SS8

YL-SS8 Temps d’incubation

Concentratio 1h 3h 24h 72h ns Protéines % de Protéines % de Protéines % de Protéines % de variation (µg.ml-1) variation (µg.ml-1) variation variati de Cd (µg.ml-1) (µg.ml-1) on (µg.mL-1)

T (0) 429 / 517 / 762 / 741 /

25 419 2,33 415 19,73 547 28,22 589 20,52

50 395 7,93 373 27,86 415 45,54 435 41,3

75 360 16,09 291 43,72 318 58,27 346 53,35

100 291 32,17 277 46,43 277 63,65 318 57,09

150 277 35,44 263 49,13 242 68,25 235 68,29

Quant à la souche YL-SS3 après 3h d’incubation les valeurs des protéines totales sont de 415 µg. mL-1,415 µg. mL-1,277 µg. mL-1,325 µg. mL-1 et de 221 µg. mL-1 correspondant a des taux de réduction de 11,89% ; 12 % ; 41,19% ; 31% et 53,08% respectivement en présence du cadmium aux concentrations 25µg. mL-1 ; 50 µg. mL-1 ; 75µg. mL-1 100µg. mL-1 et 150 µg. mL-1(Tableau XV).

Tableau XV. Effet de différentes concentrations de Cd sur les teneurs en protéines totales : chez la souche test YL-SS3

YL-SS3 Temps d’incubation

Concentratio 1h 3h 24h 72h ns Protéines % de Protéines % de Protéines % de Protéines % de variation (µg.ml-1) variation (µg.ml-1) variation variati de Cd (µg.ml-1) (µg.ml-1) on (µg.mL-1)

T(0) 388 / 471 / 699 / 727 /

25 360 7,22 415 11,89 547 21,75 623 14,31

50 346 10,83 415 11,89 438 37,44 554 23,8

Résultats et discussions

75 322 14,44 277 41,19 360 48,5 415 42,92

100 311 19,5 325 31 346 50,51 388 46,63

150 277 28,61 221 53,08 268 61,66 300 58,74

A l’instar des autres souches test, la souche YL-SS2 affiche des teneurs en protéines totales de 700 µg. mL-1,598 µg. mL-1,336 µg. mL-1,281 µg. mL-1 et 305 µg. mL-1 ce qui correspond à des taux de réduction de 11,4% ; 24,31% ; 49,63% ; 64,44 et 61,4% respectivement en présence des concentrations de cadmium de 25 µg. mL-1 ; 50 µg. mL-1,75µg. mL-1 ; 100µg. mL-1et 150µg. mL-1 .Ces taux s’améliorent en fonction du temps d’incubation (au-delà de 3h d’incubation) quand les bactéries reprennent leurs croissance, mais restent toujours inferieurs aux témoins (Tableau XVI).

Tableau XVI. Effet de différentes concentrations de Cd sur les teneurs en protéines totales chez la souche test YL-SS2

YL-SS2 Temps d’incubation

Concentratio 1h 3h 24h 72h ns Protéines % de Protéines % de Protéines % de Protéines % de variation (µg.ml-1) variation (µg.ml-1) variation varia de Cd (µg.ml-1) (µg.ml-1) tion (µg.mL-1)

T(0) 547 / 790 / 1004 / 1164 /

25 582 6,39 700 11,4 838 16,54 900 22,69

50 485 11,34 598 24,31 831 17,24 852 26,81

75 342 37,48 336 57,47 623 37,95 713 38,75

100 310 43,33 281 64,44 554 44,83 680 41,59

150 312 42,97 305 61,4 388 61,36 415 64,35

Nos résultats concordent avec ceux de Shurty et al,(2013 ) et qui signalent une réduction du contenu en protéines totales chez des souches bactériennes exposées au stress au Cd ,en revanche ,une prolongation du temps de génération et notée quand la concentration du métal

Résultats et discussions augmente. De même que les travaux de Figueira et al (2005) appuient nos résultats, en signalant une chute des protéines totales chez des souches de Rhizobium leguminosarum bv. viciae résistantes au Cd stressées par le Cd. Brahmi et al (2013) avaient également montré une chute de protéines totales chez Pseudomonas aeruginosa résistante aux métaux lourds en présence de métaux. Les quantités de protéines totales synthétisées étaient variables et inversement proportionnelles à la sévérité du stress ce qui est en accord avec nos résultats. L’augmentation de la concentration en métal s'accompagne d'une inhibition plus importante de la synthèse protéique. Cependant les travaux de Desauney (2011) corroborent nos résultats en suggérant une augmentation des protéines totales indépendantes de la division cellulaire, due à une hyper expression de protéines de stress.

5.2. Effets de la concentration du Cd et la durée d’exposition sur la production des EPS

Les courbes représentant la cinétique de production des EPS (Fig.30), montrent que cette dernière est stimulée par le Cd, puisque Les quantités d’EPS produits en présence de toutes les concentrations de Cd testées sont supérieures à celles produites chez les témoins non traités et ce chez toutes les souches Test.

a b 30 25 30 25 20 0h 0h 20 15 1h 15 1h 10

EPS EPS (µg/mL) 3h 10 3h 5 EPS (µg/mL) 24h 5 24h 0 0 72h 72h T 25 50 75 100 150 T 25 50 75 100 150 Concentrations de Cd (µg/mL) Concentrations de Cd(µg/mL) d c 30 25 40 20 0h 30 0h 15 1h 20 1h

10 3h EPS(µg/mL) 10 3h 5 EPS EPS (µg/mL) 24h 24h 0 0 72h T 25 50 75 100 150 72h T 25 50 75 100 150 Concentrations de Cd (µg/mL) Concentrations de Cd(µg/mL)

Figure 30. Effet de la concentration et de la durée d’exposition au Cd sur la production d’EPS chez les souches YL-ML1 (a),YL-SS8 (b),YL-SS3(c) et YL-SS2(d).Le Cd est rajouté en phase

Résultats et discussions exponentielle de croissance. 0h correspond au moment avant le rajout du Cd.1h, 3h, 24h et 72h correspondent aux différents temps après rajout du Cd dans le milieu.

Les résultats de la figure 34, montre que Le Cd stimule la biosynthèse des EPS .Celle ci est variable en fonction du temps d’incubation, de la concentration de Cd et de la souche considérée. Les plus importantes quantités d’EPS induites par le Cd sont produites en présence des plus fortes concentrations du Cd (100 et 150µg .mL-1).

Ainsi , après 3heures d’incubation et de contact avec le Cd ,les quantités d’EPS produites par la souche YL-ML1 sont de 11,2µg.mL-1,12,4 µg.mL-1,24 µg.mL-1,23,3 µg.mL-1 et 16,9 µg.mL-1 correspondant à des taux d’augmentation ,par rapport au témoin ,de l’ordre de - 2,63% ; 7,82%; 108,5%; 101,38% et 46,82% respectivement aux concentrations 25 µg. mL-1 ; 50 µg. mL-1,75µg. mL-1 ; 100µg. mL-1et 150µg. mL-1 de Cd (Tableau XVII).

Tableau XVII. Effet de différentes concentrations de Cd sur la production d’EPS chez la souche test YL-ML1

YL-ML1 Temps d’incubation

Concentrations 1h 3h 24h 72h

de Cd (µg.mL- EPS % de EPS % de EPS % de EPS % de variation variation variation varia 1) (µg.ml-1) (µg.ml-1) (µg.ml-1) (µg.ml-1) tion

25 19,2 25,49 11,2 -2,61 8,5 8,97 6,8 36

50 18 17,64 12,4 7,82 7,6 -2,57 5,8 16

75 12,71 -16,93 24 108,69 22 189,47 7,8 56

100 12,6 -17,65 23,3 102,69 16,3 108,97 10 100

150 17,5 14,37 16,9 46,5 21,2 171,79 16 220

Le même constat est fait pour la souche YL-SS8 , ou la production d’EPS a été stimulée affichant des valeurs de 24,8 µg.mL-1 ,25 µg.mL-1,25,4 µg.mL-1,25,9 µg.mL-1 et 28,3 µg.mL-1 ce qui correspond à des taux d’augmentation, par rapport au témoin non traité ,de 24% ; 25%; 27%; 29,5% et 41,5% respectivement aux concentrations 25 µg. mL-1 ; 50 µg. mL-1,75µg. mL-1 ; 100µg. mL-1et 150µg. mL-1(Tableau XVIII ).

Tableau XVIII. Effet de différentes concentrations de Cd sur la production d’EPS chez la souche test YL-SS8

Résultats et discussions

YL-SS8 Temps d’incubation

Concentrations 1h 3h 24h 72h

de Cd (µg.mL-1) EPS % de EPS % de EPS % de EPS % de variation variation variation variati (µg.ml-1) (µg.ml-1) (µg.ml-1) (µg.ml-1) on

25 17,68 86,89 24,8 24 15,2 -12,6 10,1 -2,89

50 16,97 79,38 25 25 24,7 41,95 18,2 75

75 21,1 123,04 25,4 27 24,7 41,95 18,4 76,92

100 16 69,13 25,9 29,5 24,6 41,37 17,7 70,19

150 20,8 119,8 28,3 41,5 28,1 61,49 21,5 106,7

Une surproduction d’ EPS également enregistrée chez YL-SS 3, au bout de la même période de contact avec le Cd(3h) ,les quantités d’EPS étaient à 21,8 µg.mL-1 ;24,5 µg.mL-1 ;25,82 µg.mL-1,25,5 µg.mL-1 et 29 µg.mL-1 avec des taux d’augmentation par rapport au témoin de 10,1% ; 23,73%; 30,4%; 30,4% et 49,48% respectivement aux concentrations 25 µg. mL-1 ; 50 µg. mL-1,75µg. mL-1 ; 100µg. mL-1et 150µg. mL-1 de Cd (Tableau XIX).

Tableau XIX. Effet de différentes concentrations de Cd sur la production d’EPS chez la souche test YL-SS3

YL-SS 3 Temps d’incubation

Concentratio 1h 3h 24h 72h ns EPS % de EPS % de EPS % de EPS % de variation variation variatio variati de Cd -1 -1 -1 (µg.ml-1) (µg.ml ) (µg.ml ) n (µg.ml ) on (µg.mL-1)

25 19,41 22,07 21,8 10,10 26,5 15,72 19,2 30,61

50 19,11 20,18 24,5 23,73 26 13,53 18,4 25,17

75 18,9 18,86 25,82 30,4 27,3 19,4 19,3 31,2

100 22 38,36 25,82 30,4 29,3 27,94 21,4 45,57

150 22,8 43,39 29 49,48 32 39,73 22,1 50,34

Résultats et discussions

De la même manière, le Cd provoque une surproduction d’EPS chez la souche YL-SS2 affichant des valeurs de 15 µg.mL-1,13 µg.mL-1,13 µg.mL-1,20 µg.mL-1et 22 µg.mL- 1correspondant à des taux d’augmentation de 50% ; 30%; 30 % ; 100% et 150 % respectivement en présence de 25 µg. mL-1 ;50 µg.mL-1,75µg. mL-1 ; 100µg. mL-1et 150µg. mL- 1 du métal (Tableau XX)

Tableau XX. Effet de différentes concentrations de Cd sur la production d’EPS chez la souche test YL-SS2

YL-SS2 Temps d’incubation

Concentrations 1h 3h 24h 72h

de Cd (µg.mL-1) EPS(µg.ml- % de EPS(µg. % de EPS(µg. % de EPS(µg.m % de 1) variation ml-1) variation ml-1) variation l-1) variation

25 17 112,5 15 50 13 8,33 8,2 141,17

50 20 150 13 30 10 -17,67 9,1 164

75 10 25 13 30 22 83,33 9 164

100 17,2 118,75 20 100 24 100 11,6 241,17

150 16 100 22 120 23 91,66 13 282,35

La souche YL-SS2, présente les taux de stimulation de production d’EPS, le plus important parmi les quatre souches Test, notamment en présence des plus fortes concentrations du Cd. Les espèces du genre Klebsiella sont connues réputées pour produire des quantités remarquables d’EPS .Ces EPS, sont d’ailleurs liés à la virulence de ces espèces bactériennes.

Si le Cd exerce un effet négatif sur la croissance en réduisant les teneurs en protéines totales ,il permet en outre une meilleure biosynthèse d’EPS .Il semblerait que l’énergie dédiée à la prolifération cellulaire , serait réorientée en présence du Cd ,vers la production d’EPS. En présence du Cd ,les bactéries optent plutôt pour leur survie .En Effet , la stimulation de la biosynthèse des EPS en présence du Cd, suggère que cette induction surviendrait comme une réponse palliant la toxicité du Cd et constituerait un mécanisme parmi d’autres, justifiant la résistance des souches Test au Cd. Les EPS jouent un rôle défensif qui prévient les cellules microbiennes des ions métalliques toxiques. Leurs charges anioniques nettes permettent au

Résultats et discussions biopolymère de séquestrer efficacement les ions de métaux lourds chargés positivement (Gupta et Diwan, 2017).

Il a été rapporté dans la littérature scientifique que les conditions de culture stressantes induisent une surproduction d’EPS (Arudhanti et Paul, 2008). Ainsi une souche de Pseudomonas stutzeri soumise à un stress au cadmium produisait des quantités très importantes d’EPS (Debarati et Basu, 2016).

Nos résultats montrent que la production est plus importante en présence des fortes concentrations de Cd (75,100 et150) et que cette biosynthèse est rapidement induite (après 1 heure de contact avec le Cd) Chez les souches Test.

L’importance des EPS pour la cellule ne semble pas être très grande si on considère les bactéries in vitro. Cependant sous des conditions naturelles, ce qui signifie des conditions fortement concurrentielles, les EPS semblent donner aux bactéries un avantage compétitif et leur permettre de se maintenir (Cerning, 1994).

Les EPS jouent un rôle défensif qui prévient les cellules microbiennes de la toxicité des ions métalliques toxiques. Leurs charges anioniques nettes permettent au biopolymère de séquestrer efficacement les ions de métaux lourds chargés positivement (Gupta et Diwan, 2017). Ces bio-polymères jouent un rôle crucial dans la biosorption des métaux lourds. Étant de nature poly-anionique, l'EPS forme des complexes avec des cations métalliques entraînant l'immobilisation des métaux dans l'exo-polymère. Ces complexes résultent généralement d'interactions électrostatiques entre les ligands métalliques et les composants chargés négativement de bio-polymères De plus, les activités enzymatiques des EPS aident également la détoxification des métaux lourds par la transformation et la précipitation. Des études récentes ont mis en valeur l’implication des EPS dans la bioremédiation des métaux lourds Les EPS dans un Biofilm jouent un rôle important dans la biosorption et la biominéralisation. des ions métalliques (Pal et Paul,2008).

Dans cette parte de l’étude, il est important de noter que les plus grandes quantités d’EPS sont produites en présence des plus fortes concentrations de Cd ,or comme mentionné plus haut ,les teneurs en protéines totales étaient négativement corrélées à la sévérité du stress ,les plus fortes concentrations de Cd étaient fortement inhibitrices. Ce qui implique de fortes productions d’EPS par une faible biomasse bactérienne, ceci pourrait être expliqué par le fait que , le niveau de production des EPS d’une culture ,ne dépend pas seulement de la biomasse qu’elle

Résultats et discussions

renferme, mais aussi du potentiel de synthèse en EPS ou productivité des cellules qu’elle renferme. Ce potentiel de synthèse en tant qu’entité individuelle, peut être apprécié en rapportant le niveau de production de la culture en EPS à sa teneur en protéines cellulaires. Ainsi , chez Burkholderia fungorum souche Bf01 , les indices de productivité des EPS ,ont augmenté en présence de deux herbicides le norflurazon et la prométryne ,comparés aux témoins(Yakoubi,2013).

6. Détection du gène cadA chez les souches étudiées

Les résultats de la PCR montrent que les souches YL-ML1, YL-SS2, YL-SS3, et YL-SS8 possèdent toutes le gène de résistance au Cd, le gène cadA (Fig. 31). Le gène cadA code pour des ATPases de type P ; la présence de ce gène chez les souches Test, suppose que ces ATPases seraient indispensables à la survie de ces souches en milieux pollués par les métaux lourds.

2Kb

1Kb Taille attendue ~ 1058 pb

du gène cadA avec les

amorces cadA1-F/cadA1-R

2 kb 1 kb Figure 31.Profil électrophorétique des produits PCR des souches YL-ML1,YL-SS2,YL-SS3 et YL-SS8 , avec les amorces universelles du gène cadA (cad1-F/cad1-R et cad2 –F/cad2R)

Piste 1 : Marqueur de taille (1 kb Plus DNA ladder): figure en haut à gauche), piste 2 : témoin négatif, piste 3 : produit PCR de la l’ADNg issu de la souche YL-ML1, piste 4 : produit PCR de la l’ADNg issu de la souche YL-SS2, piste 5 : produit PCR de la l’ADNg issu de la souche YL-SS3 et piste 6 : produit PCR de la l’ADNg issu de la souche YL-SS8

La présence du gène cadA a été tout d’abord décrite chez les bactéries Gram-positives comme ,Staphylocoocus aureus,Listeria monocytogenes,et plusieurs espèces du genre Bacillus (Poelarends et al,2000) . Le séquençage du plasmide pLm74 d’une souche de Listeria

100

Résultats et discussions monocytogenes ,révèle une phase ouverte de lecture (ORF: open reading frame) de 2136 paires de bases encodant un polypeptide de 711 acides aminés qui présente 65.8% de similarité de séquence avec la protéine CadA de Staphylococcus aureus (Chen-Chou,2006). Le gène du plasmide pLm74, qui est similaire au gène cad A de S. aureus , permet non seulement à L. monocytogenes mais aussi à B. subtilis (transformée par le même plasmide pLm74) de résister à des concentrations en cadmium de 512 et 256 µM au lieu des 16 et 8 µM observés lorsque ce plasmide est absent (Lebrun et coll., 1994) Chez les bactéries à Gram négatif L’opéron zntA d' E. coli (Rensing et al., 1997) code pour une ATPase de type P ,qui partage une forte identité avec la protéine CadA (35%). ZntA est capable d'extruder le Zn(II), le Pb(II) et le Cd(II) , lorsque leurs concentrations intracellulaires deviennent trop élevées (Rensing et al., 1998) ,plus tard Lee et al (2001)ont signalé la présence du gène cadA chez une souche de Pseudomonas putida . l'analyse de la séquence d’un fragment chromosomique codant pour la résistance au Cd, a été cloné à partir de Pseudomonas putida 06909, une bactérie rhizosphérique, a révélé la présence de deux gènes transcrits de manière divergente, cadA et cadR. Le géne cadA était semblable aux gènes codant les ATPases transportant le Cd, connues principalement des bactéries Gram-positives, et à ZntA chez Escherichia coli. Le gène CadR était lié à la famille de régulateurs de réponse MerR qui contrôlent normalement la détoxification du mercure dans d’autres systèmes bactériens. Pour la plupart des Pseudomonas, la base de la résistance au cadmium n’a pas été caractérisée, mais la récente découverte d'homologues du gène cadA, dans le génome de la bactérie suggère que la cadA pourrait jouer un rôle plus important dans la résistance au cadmium chez les bactéries à Gram négatif. Le gène cadA, a ensuite été détecté sur le chromosome de Cupriavidus metallidurans CH34 (Monchy,2007), puis chez Flavobacterium sp (Zhang et al., 2008).) .

Cependant aucune étude antérieure, à notre connaissance, n’a évoqué la présence du gène cadA chez K.pneumoniae et Raoultella ornithinolytica, comme obtenus dans nos résultats, qui mettent en évidence la présence de ce gène chez ces deux entérobactéries (YL-ML1 et YL- SS2), Ces observations supposent que l’acquisition du gène cadA chez ces bactéries, serait due à un transfert latéral des génes. La présence du gène cadA pourrait être liée à la résistance des souches Test au Cd . Cependant pour une éventuelle confirmation, ces gènes devraient être séquencés. En effet le séquençage du gène cadA cloné dans un vecteur (plasmide), a révélé 94% de similitude, après comparaison des séquences obtenues (Annexes XI ) ,avec celles

101

Résultats et discussions déposées dans GenBank , avec le gène cadA détecté chez Flavobacterium sp. native de site pollué en chine en 2008 .(Zhang et al , 2008) .

La présence du gène cadA chez cette entérobactérie, serait du à un transfert latéral des gènes Ce résultat montrent d’une part, l’importance du transfert latéral des gènes dans le remaniement et le mosaïsme des génomes et par la suite la diversité phénotypique ,comme l’acquisition de nouvelles performances adaptatives et d’une autre ,l’influence de l’environnement sur le génome, ainsi la présence du gène cadA chez cette entérobactérie, serait liée à l’écologie de cette souche et non pas forcément un caractère de l’espèce .L’origine pollué de la souche YL- ML1 (sol de la cimenterie de Bologhine) ,augmente les fréquences de rencontrer et d’acquérir un tel gène. Oger (2001) a rapporté que la pollution de l’estuaire de la seine a provoqué l’augmentation des copies du gène cadA dans la population bactériennes autochtone. Ce résultat montre que le Cd , non seulement favorise la dispersion du gène cadA mais surtout parce que ce gène est induit par le Cd ,à l’instar des autres métaux lourds..Il a été rapporté par le même auteur , que les bactéries qui portent le gène cadA pourraient être un indicateur moléculaire de pollution par les métaux lourds lorsque des seuils toxiques pour le métabolisme bactérien sont atteints (Oger ,2001) .Ce résultat pourrait constituer un scenario évolutif indiquant que le nouveau phénotype qui résulte de l’acquisition du gène étranger est susceptible de présenter un avantage sélectif dans un nouveau contexte. Ceci étant acquis, la pression de sélection fera alors effectivement évoluer ce trait vers une optimisation croissante de sa faculté, réalisant l'avantage à travers un nouveau phénotype.Certaines recherches (Diene et al, 2012), se sont intéressées au rôle du transfert latéral des gènes dans l’acquisition de la virulence chez une entérobactérie Enterobacter aerogenes.Chez cette bactérie ,Les analyses génomiques et phylogénétiques montrent que son génome principal provient d'un autre genre, Klebsiella. Les caractéristiques atypiques de cette bactérie (motilité, présence d'ornithine décarboxylase et absence d'activité uréase) sont attribuées au mosaïcisme génomique, par l'acquisition de gènes supplémentaires, tels que l'opéron de l'assemblage flagellaire complet de 60 582 pb acquis «en bloc» du genre Serratia. L'arbre généalogique du plasmide conjugatif multirésistante de 162,202 pb montre qu'il s'agit d'une chimère de transposons et d'éléments conjugatifs, intégratifs provenant de diverses origines bactériennes, ressemblant à un rhizome.La récente épidémie du syndrome hémolytique-urémique en Allemagne en raison d'un transfert par transduction du gène codant pour une toxine (Shiga), chez Escherichia coli O104: H4 ,est un exemple dramatique de l'acquisition de gènes par le transfert de séquence latérale et la création d'un nouveau répertoire génomique (Rasko et al., 2011).

102

Résultats et discussions

Des études récentes ont démontré que le nombre de séquences transférées latéralement entre les organismes est positivement corrélé à la similarité entre leurs pools d'ARNt, ce qui suggère que les organismes partageant une niche écologique commune tendent à avoir des pools d'ARNt similaires (Tuller et al. , 2011 ).

7.Effet du cadmium sur l’activité de certaines enzymes du système antioxydant et le taux du glutathion

Durant cette étude nous nous sommes intéressés à l’étude de la réponse des souches Test ,à la présence du Cd dans le milieu en évaluant l’activité de certaines enzymes impliquées dans la réponse au stress oxydant généré par le Cd ,telles que, la catalase (CAT) et la superoxyde dismutase (SOD), nous avons également déterminé l’effet du Cd sur la production d’un peptide non enzymatique, le glutathion (GSH). Le dosage de ces biomarqueurs a été effectué après 24h de contact des cellules Test avec 100µg/mL de Cd. Les résultats obtenus, montrent que l'activité des différentes enzymes étudiées varie ,selon la souche considérée .Ainsi le Cd stimule l’activité enzymatique de la SOD et la CAT ainsi que la production du GSH total chez les souches (YL-ML1,YL-SS2 et YL-SS3) en revanche , une réduction de tous ces paramètres étudiés, est révélée chez la souche (YL-SS8), après une même période (24h) d’exposition au Cd.En absence de Cd ,la catalase est présente chez toutes les souches Test avec un pool cellulaire basal de 8 .52 Ug/mg protéines ; 5.22 Ug/mg protéines ; 6.11 Ug/mg protéines et 4.78 Ug/mg protéines ,respectivement chez YL-ML1,YL-SS8 ,YL-SS3 et YL- SS2 Ce résultat est attendu puisqu’au cours de l’identification préliminaire des bactéries cadmium-résistantes , la recherche de la catalase , constitue un test d’orientation dans la caractérisation bactérienne , le test présomptif de la catalase a permis de mettre en évidence la présence de cette enzyme chez les souches Test, par le dégagement de bulles effervescentes indiquant un résultat positif. La présence de cette enzyme chez les souches Test, renseigne sur le caractère « aérobie »des souches étudiées.

En présence de Cd, les résultats obtenus (Fig. 32) révèlent une stimulation de l’activité CAT d’environ 79%, 81% et 25 % par rapport au témoin, chez les souches YL-ML1, YL-SS3 et YL-SS2 respectivement. L’augmentation de la CAT suggère que le traitement par le Cd induit une réponse antioxydante chez lez 3 Protéobactéries et dévoile l'implication de cette enzyme dans la conversion du peroxyde d’hydrogène ( H2O2) intracellulaire généré indirectement par le

103

Résultats et discussions

Cd. Ce qui suppose une réaction de la part de ces bactéries pour neutraliser les effets délétères des peroxydes d’hydrogène.

Une étude réalisée par Chakraborty et al. (2014), avait montré une augmentation de l’activité CAT chez Aspergillus niger en présence du Cd, à une concentration initiale de 5mM, cependant une concentration plus importante de 20mM avait provoqué une chute de l’activité CAT.

Le même résultat a été signalé chez Aspergillus niger en présence de l’arséniate (Buckovam et al.,2007) .

Une augmentation de la concentration de l’antimoine a conduit à une diminution de l’activité CAT chez des souches de Fusarium sp,Rhizopus sp,Aspergillyus sp et Glomus sp (Aouam et Boukebous ,2012) .

20 Sans Cd

Avec Cd 15

5 ActvtéCAT(U/mg Proteines) 0 YL-ML1 YL-SS2 YL-SS3 YL-SS8 Souches Test

Figure 32. Effet du Cd sur l’activité CAT des souches Test.

Le Cd est rajouté en début d’expérimentation à une concentration finale de 100µg.mL-1

Cependant et en présence de la même concentration de Cd (100µg.mL-1) , la soucheYL-SS8 a affiché une réduction de l’activité CAT de 27,8% par rapport au témoin.

Ce résultat suggère que la réponse antioxydante de l’activité CAT, varie pour une même concentration de Cd suivant la souche considérée.

La réduction de l’activité CAT chez YL-SS8, pourrait être causée par une hyperproduction de

H2O2 intracellulaire, ce qui inhiberait l'activité de la catalase et favoriserait encore

104

Résultats et discussions

l’accumulation de H2O2. Polidoros et Scandalios (1966) ont signalé que l'activité CAT, est directement régulée par la concentration de H2O2 ; ainsi, les fortes concentrations en peroxyde d’hydrogene, pouvaient réduire cette activité. La réduction des activités CAT, serait probablement due à un influx massif d’ions Cd conduisant à l’inhibition de ces paramètres.

Un phénomène similaire a été observé chez une souche de Staphylococcus aureus, sensible au cadmium, via le potentiel membranaire Mn2 + (delta psi) qui était rapide en raison de l'énergie produite par deux pompes à protons, la chaîne respiratoire et le complexe ATP synthétase dans la direction hydrolytique. Une telle fuite d'énergie inhabituelle pour un afflux initial rapide de Cd2+ serait due à une série d'événements toxiques provoqués par l'accumulation de Cd2 + (Tynecka et Malm, 1995).

La pénétration du Cd dans les cellules bactériennes accentue les dégâts générés par ce métal et mène à une forte implication production de peroxyde d’hydrogène dans par la réaction de Fenton.

Cependant l’apparition de phénomènes toxiques chez les bactéries exposées au Cd ne permet pas de savoir si ,chez la souche YL-SS8, il y’a eu une pénétration massive des ions de Cd puisque la toxicité de ce métal peut s’exprimer aussi bien aux niveaux périphériques membranaire qu’au niveau intracellulaire.

Un premier constat a été fait en étudiant l’effet de cette même concentration sur la croissance de la souche YL-SS8 ou elle a présenté une phase de latence trés prolongée (48h), traduisant un effet toxique plus prononcé par rapport aux autres souches, suggérant probablement une forte pénétration du Cd.

Il est important de remarquer que l’activité CAT a été mesurée au bout de 24h d’incubation, période d’adaptation durant laquelle la souche YL-SS8 ,n’était pas encore capable de redémarrer sa croissance, contrairement aux 3 autres souches qui avaient déjà réussi à surmonter la toxicité du Cd et s’accommoder avec la perturbation chimique causée par le Cd..

Comme la souche YL-SS8 a été capable par la suite de s’acclimater avec la contrainte chimique et reprendre sa prolifération ,ceci suppose que d’autres mécanismes impliqués dans la détoxification antioxydantes ont été activés ,comme la synthèse des métallothioneines.Ces protéines sont capables de complexer le Cd .Ainsi la transformation de certaines bactéries marines avec un vecteur portant le gène bmtA codant pour une métallothionéine a conduit à une importante accumulation des métaux lourds après surexpression de cette protéine (Chen et al., 1999; Satyanarayana et al., 2012) . 105

Résultats et discussions

Les autres souches auraient probablement limité la pénétration du Cd, chez lesquelles les faibles concentrations du métal internalisées auraient agit comme stimulateur de l’activité CAT . Les faibles concentrations de Cd agissent comme un signal mettant la cellule sur ses gardes ,afin de mettre en place la machinerie enzymatique adéquate pour prévenir l’attaque par les ERO . Une hypothèse a été avancée dans des cellules eucaryotes stressées à faible niveau de peroxyde d'hydrogène (H2O2), ca dernier agit comme un «signal de vie» continu pour soutenir la prolifération cellulaire et protéger les cellules de l’apoptose, par l'influence sur les voies de signalisation régulatrices sensibles aux ERO ( Paolicchi et al, 2002) .

En ce qui concernent l’effet du Cd sur l’activité de la SOD , les résultats obtenus (Fig.33 ) montrent que l’activité de la SOD chez les souches Test YL-ML1, YL-SS2 et YL-SS3, a été stimulée par le Cd. Ainsi des taux d’augmentations de l’activité SOD, estimées à 81,28%,70,8% et 45,79% ,s’affichent respectivement chez les trois souches YL-ML1, YL-SS2 et YL- par rapport à leur témoins respectifs.

18 Sans Cd 16 Avec Cd 14 12 10 8 6 4

Activité Activité SOD(U/mg Proteines) 2 0 YL-ML1 YL-SS2 YL-SS3 YL-SS8 Souches Test

Figure 33.Effet du Cd sur l’activité SOD chez les souches Test.

Le Cd est rajouté en début d’expérimentation à une concentration finale de 100µg.mL-1

A l’instar de la CAT, l’activité SOD chez la souche YL-SS8 a été inhibée, affichant un taux de réduction de 24,61% % par rapport au témoin non traité. Ce qui renseigne sur le caractère fortement pro-oxydant du Cd chez cette souche, à la concentration de 100µg.mL-1 .

Les variations des taux de glutathion réduit (Fig.34) montrent, que la biosynthèse de ce tripeptide est favorisée en présence du Cd, chez les souches YL-ML1, YL-SS3 et YL-SS2,ou des taux de stimulation estimés à 54,93%,68,85% et 31,35% sont signalés respectivement .

106

Résultats et discussions

Sans Cd Avec Cd

3 GSH(µg/mL) 2

0 YL-ML1 YL-SS2 YL-SS3 SouchesYL-SS8 Test

Figure 34.Effet du Cd sur le GSH chez les souches Test. Le Cd est rajouté en début d’expérimentation à une concentration finale de 100µg.mL-1

Chez YL-SS8, une chute de production du GSH estimée à 49,42% est également notée, en présence de Cd par rapport au témoin.

La stimulation des activités enzymatiques de la CAT et de la SOD ainsi que la biosynthèse du GSH chez les souches YL-ML1, YL-SS3 et YL-SS2, surviendraient comme des réponses au stress oxydant généré par le Cd.Il a été démontré que certains ETM comme le cadmium, le fer, le cuivre, le zinc, le chrome, le cobalt ou le vanadium vont pouvoir générer, , la formation ●- des ERO tels que le peroxyde d’hydrogène (H2O2), les ions Superoxydes (O2 ) et les radicaux hydroxyles (●OH) (Galanis et al., 2009).

Chez les microorganismes, les thiols ,plus particulièrement le GSH, jouent essentiellement des rôles de protection cellulaire contre les stress oxydatifs (Polle et Rennenberg, 1992) et participent à la régulation des concentrations d’ions métalliques (Satoh et al., 2002) en plus de réduire les effets toxiques de certains métaux (Cobbett 2000). Il a été montré chez Rhizobium sp une stimulation de la biosynthèse de glutathion sous stress au Cd, chez des souches de Rhizobium résistantes au Cd (Figueira ,2005) .Un résultat similaire a été enregistré chez une souche de Klebsiella pneumoniae ,en présence du Cd (Khan et 107

Résultats et discussions al.,2015). Plusieurs études en laboratoire , ont pu démontrer une augmentation de la production de différentes espèces de thiols suite à l’exposition d’algues à des stress métalliques (Ahner et al ., 2002 ; Kawakami et a.,l ,2006). La biosynthèse de ces thiols ,est une réponse rapide des microorganismes qui produisent la cystéine, le GSH et les phytochélatines, respectivement substrats les uns des autres. La réponse aux stress métalliques peut varier d’un organisme à l’autre et les concentrations de thiols produits dépendent de la nature du métal présent. Par exemple, chez Thalassiosira weisflogii, une diatomée marine, le cadmium est l’ion induisant la biosynthèse la plus rapide et la plus grande de phytochélatines (Ahner and Morel 1995), alors que chez Chlamydomonas reinhardtii, une chlorophyte d’eau douce, l’exposition au mercure inorganique sous sa forme divalente mène principalement à la production de GSH (Howe and Merchant 1992).

L’augmentation de la synthèse de GSH permet de protéger la cellule de la toxicité du cadmium (Eneman et al., 2000). En général l’activité des enzymes antioxydantes, telles que la superoxyde-dismutase (SOD) et la catalase reste basale (Ikediobi et al., 2004). Cependant, une augmentation de ces activité e est observée lors d’une contamination par le cadmium de cellules en culture ou d’animaux (Kostic et al., 1993 ; Salovsky et al., 1992)

L'inhibition de l'activité SOD pourrait s'expliquer par l'accumulation des ERO particulièrement le H2O2 connu comme inhibiteur des SOD (Sandalio et al., 2001)

Ces résultats montrent que le stress au Cd n’est pas perçu de la même façon par les quatre souches Test . Les conséquences du stress oxydatif sont extrêmement variables selon la dose et le type cellulaire touché (Favier, 2003).

Behera et al (2014), ont montré que le contenu en H2O2 et l’activité SOD augmentent en présence du Cd, parallèlement à une inhibition de l’activité CAT.

Shamim et Rehman (2015) avaient signalé que les souches Cupriavidus metallidurans et Pseudomonas putida répondaient différemment au stress par le Cd, quant à la biosynthèse du GSH, l’activité SOD et l’activité CAT. La biosynthèse du GSH et l’activité CAT ont été fortement stimulées chez C.metallidurans, alors que P. putida mt2, recrute préférentiellement la superoxyde dismutase (SOD) et l’ascorbate peroxydase pour combattre le stress occasionné par le Cd.

L’absence de l’implication des activités enzymatique de la CAT et la SOD chez YL-SS8 en présence du Cd, serait probablement compensée par le recrutement d’autres voies

108

Résultats et discussions enzymatiques, ou non, empruntée par cette souche pour vaincre la toxicité du Cd. Ainsi selon Fang et Dos Santoz (2015), de nombreuses bactéries à Gram-positives ne synthétisent pas de

GSH, mais produisent à la place, d’autres thiols structurellement non liés mais fonctionnellement équivalents. Parmi ceux-ci, le bacillithiol (BSH) qui a été récemment identifié chez plusieurs bactéries Gram-positives à faible teneur en G + C.

D’autres parts, si nos résultats montrent une absence de l’implication du système antioxydant chez YL-SS8 au bout de 24 h de contact avec le Cd, ceci ne permet pas d’écarter son intervention dans une période ultérieure (au-delà de 24h) par le biais d’une régulation transcriptionelle plus tardive, car l’induction de ces paramètres enzymatiques et non enzymatiques sont, temps et dose dépendants.

8. Effet du Cd sur le profil protéique des souches test

.Les résultats de l’électrophorèse des protéines solubles réalisée par SDS-PAGE (5%-15%) (Fig .35), montrent des différences de profil protéique entre les souches Test traitées au Cd et leur témoins .Ainsi nous notons l’induction, la surexpression ou la répression de certaines protéines, de différentes masses moléculaires (Mm), sous l’effet du Cd

Figure 35. Profile électrophorétique, dans les conditions dénaturantes sur SDS-PAGE à 15%, des extraits protéiques des souches YL-ML1, YL-SS2, YLSS3 et YL-SS8 avec (+) ou sans (-) cadmium. Le Cd est rajouté au milieu de culture en début d’expérimentation pour les échantillons, les témoins n’ayant rien reçu. Piste à gauche: Marqueur de taille LMW (Amersham).

109

Résultats et discussions

Les résultats de la figure 35 permettent de distinguer trois zones de migration élèctrophorétique, La zone 1 comprenant les protéines à migration lente >60 kDa, de moyen contenu protéique. La zone 2 à fort contenu protéique et de mobilité moyenne (Mm compris entre 60 et 20 kDa), et troisième zone de migration rapide concernant les protéines à faible Mm (<20kDa), ce profile protéique est obtenu après 6h d’incubation des souches Test avec le Cd, à une concentration finale de 100µg.mL-1.

Nous avons présenté pour chaque souche les résultats du profil protéique obtenu par électrophorèse, détaillant : l’apparition de nouvelles bandes chez l’échantillon traité au Cd et qui n’étaient pas apparentes chez le témoin (protéines induites ) ,la disparition de certaines bandes, qui étaient apparentes chez le témoin mais non apparentes chez l’échantillon traité au Cd ,ce sont les protéines réprimées, et enfin ,les bandes protéiques présentes chez le témoin mais dont l’épaisseur a augmenté en présence du Cd ,ce sont les protéines surexprimées.

Ainsi , chez YL-ML1 ,quatre protéines de 27,54 kDa , 66 kDa , 79,44 kDa et 97,72 kDa sont surexprimées, deux protéine de 77 kDa et 21, 87 kDa ont été réprimées sous l’effet du Cd ;,tandis que deux protéines de 23 ,98 kDa , 53,7 kDa ont été induites par de Cd(Tableau XXI).

Tableau XXI. Bandes protéiques induites, surexprimées et réprimées, révélées par SDS- PAGE, chez la souche YL-ML1

Souche YL-ML1

Mm Protéines induites Protéines Protéines réprimées surexprimées

77,62 +

27,54 +

97,72 +

53 +

66 +

23,98 +

72,44 +

21,87 +

110

Résultats et discussions

Chez YL-SS2 trois protéines de 56,23 kDa ,43 kDa et 27 ,54 kDa, sont surexprimées en présence de Cd. Trois protéines de 25,11, kDa,35,48 kDa et 39,81 kDa ont été induites par le Cd ,une protéine de 4 7,86 kDa a été réprimée dans le profil de l’échantillon traité au Cd(Tableau XXII ).

Tableau XXII. Bandes protéiques induites, surexprimées et réprimées, révélées par SDS- PAGE, chez la souche YL-SS2

Souche YL-SS2

Mm Protéines induites Protéines Protéines réprimées surexprimées

56,23 +

27,54 +

47,86 +

43 +

39,81 +

35,48 +

25,11 +

111

Résultats et discussions

Chez YL-SS8 , deux protéine de 27,54 kDa et 58,88 kDa sont surexprimées, quatre protéines de 72,8 , 70 kDa ,43,65 kDa et 41,68 kDa sont induites , quatre protéines de 45 kDa ,58,88 kDa ,77,62 kDa et 85,11 kDa ont été réprimées (TableauXXIII)

Tableau XXIII. Bandes protéiques induites, surexprimées et réprimées révélées par SDS- PAGE ,chez la souche YL-SS8

Souche YL-SS8

Mm Protéines induites Protéines Protéines réprimées sur-exprimées

72,85 +

64 +

70 +

27,54 +

45 +

77,62 +

85,11 +

58,88 +

43,65 +

41,68 +

112

Résultats et discussions

Chez YL-SS3 ,le profil protéique montre une surexpression de trois protéines de 70,97 kDa ,67,60 kDa et 27,54 kDa ,trois protéines ont été induites par le Cd de Mm,35 kDa,

46kDa et 100 kDa, tandis que trois protéines de 37,65 kDa ,47,54 kDa et 90 kDa ont été réprimées sous l’effet du Cd (Tableau XXIV).

Tableau XXIV. Bandes protéiques induites, surexprimées et réprimées, révélées par SDS- PAGE, chez la souche YL-SS3

Souche YL-SS3

Mm Protéines induites Protéines Protéines réprimées surexprimées

67,60 +

35 +

90 +

100 +

48,97 +

46 +

37,65 +

27,54 +

47,54 +

Plusieurs protéines de différentes masses moléculaires sont surexprimées, d’autres induites et d’autres carrément réprimées, sont notées dans le profil électrophorétique des souches Test en absence et en présence du Cd. Des résultats similaires ont été signalés par Urban-Chemiel (2013), chez E.coli soumise à un stress thermique. L ‘induction, la surexpression et même la répression de certaines protéines, chez nos souches Test ,en présence du Cd ,est de toute évidence nécessaire, pour assurer l’adaptation des bactéries au stress métallique.

113

Résultats et discussions

Ces résultats montrent que la survie des bactéries dans un environnement stressant est associée à des réponses physiologiques aux niveaux transcriptomique et protéomique.ces réponses tendent à amener la cellule vers nouvel état homéostatique similaire aux cellules normales même sous conditions de stress ( Lopez-Maury et al., 2008).

Dans notre étude, l’induction de protéines de fortes masses moléculaires et de masses moléculaires moyennes, survient pendant que les souches n’ont pas encore redémarré leur croissance ( au bout de 6h d’incubation), suggérant que ces protéines interviennent (par leur induction, surexpression et répression) pour réparer les dommages et permettre l’adaptation des souches au Cd. Les changements (tant qualitatifs que quantitatifs) au niveau des protéines en réponse aux stress, permettent une modulation des voies métaboliques (Dressaire,2009) et donc une meilleure protection des souches Cd-résistantes.

A première vue, chaque souche semble présenter un profil propre à elle et peu de similitudes sont notées .La seule bande qui représente un dénominateur commun entre les souches Test est celle correspondant à un PM de 27,54 kDa. Cette protéine, s’est fortement sur -exprimée en présence du Cd chez les quatre souches, Cette protéine fait partie du profil normal des souches Test, car bien exprimées chez les témoins, suppose son intervention même en dehors du stress causé par le Cd.

Les protéines induites sont toutes de la zone 1 (Mm supérieure à 60kDa) et la zone 2 (Mm entre 60kDa et 20kDa) . Aucune protéine de la zone 3 (Mm inférieure à 20 kDa) n’a été induite, ni même surexprimée ou bien réprimée. Nos résultats ne concordent pas avec ceux obtenus dans d’autres études, qui rapportent que le Cd, provoque l’induction de protéines de fortes Mm comme de faible Mm de l’ordre de 14 et 10 kDa ( Bushra et al .,2016 ; Soltan et al .,2008). Cependant, en absence d’une standardisation des conditions de cultures et de période d’analyses, les résultats sont difficiles à comparer.

En absence d’une identification de ces protéines, aucune information ne nous est disponible pour reconnaitre ces protéines, cependant, la littérature rapporte une large implication de protéines chaperonnes ou Hsp (Heat Shoc Proteins ), dans la réponse bactérienne à une large gamme de stress environnementaux. Les protéines sur exprimées ou induites par le Cd chez les souches Test , seraient probablement des protéines chaperonnes ou protéines Hsp.Ces protéines sont rapportées jouer un rôle dans la réponse généralisée au stress. Il a été rapporté que la synthèse des Hsp est induite non seulement par l'hyperthermie mais aussi par une large variété

114

Résultats et discussions de conditions toxiques qui vont de l'exposition aux métaux lourds à l'infection virale, leur point commun étant de mener à l'accumulation de protéines anormales (Santoro, 2000).

Il a été rapporté que des protéines intervenant dans la régulation du choc thermique sont aussi induites par le cadmium (Ferianc et al ., 1998 ; Beyersmann,1997) .Le rôle, crucial des différentes Hsp pour toutes les cellules procaryotes et eucaryotes, est la protection, le maintien et la régulation des fonctions des protéines auxquelles elles sont associées. Les procaryotes expriment trois protéines Hsp70: DnaK, HscA (Hsc66), et HscC (Hsc62) (Yoshimune ,2002). Des phénomènes d’agrégation protéique sont observés dans toute cellule en conditions normales et sont fortement augmentés par le stress .Les chaperonnes peuvent intervenir dans la désagrégation des protéines. Ils peuvent aussi défaire des agrégats « physiologiques » (Morange,2000). Généralement, les protéines de faibles Mm (6 à 14 kDa) le plus souvent induites par le Cd, sont les métallothionéines. D’autres protéines sont fréquemment induites sous stress au Cd, comme les ATPases, les oxydoréductases, et des protéines de transport (Waldron et Robinson, 2009).

Pour éviter les dégâts intracellulaires induits par le cadmium, les cellules répondent à une contamination métallique par l’induction de la transcription de gènes qui codent des protéines de « défense » ou de « réparation ». Ces protéines peuvent séquestrer les métaux afin de neutraliser leurs effets toxiques, lutter contre la formation d’espèces réactives de l’oxygène, réparer (dans le cas où elles ne sont pas inhibées par le cadmium) les atteintes au niveau de l’ADN, renaturer ou dégrader des protéines mal repliées. Une contamination par le cadmium peut entraîner l’induction de plusieurs gènes de réponse au stress tels que les gènes codant pour les métallothionéines (MTs) (Hamer, 1986), les protéines de choc thermique (Hsp, Heat Shock Proteins) (Wiegant et al., 1994), des gènes impliqués dans la réponse au stress oxydant ou encore la synthèse de glutathion (Eneman et al., 2000)

Une approche fondée sur la protéomique, a été empruntée, pour caractériser l’expression protéique chez Cupriavdus taiwanensis KKU2500-3 résistante au Cd, durant sa croissance sous stress au Cd. La protéine qui s’est montrée la plus fortement stimulée, s’est avérée être la chaperonne GroEL, ce qui indique que cette protéine contribue probablement à la survie et à la croissance de la bactérie en réponse à la toxicité au Cd (Siripornadulsil et al ., 2014) . Les protéines de choc thermique sont particulièrement conservées dans les êtres vivants, puisqu'elles existent aussi bien chez les bactéries, les plantes et les animaux. Par exemple, il

115

Résultats et discussions existe environ 50 % d'homologie entre le gène hsp70 humain et l'équivalent chez Escherichia coli (DnaK), et plus de 70 % avec le gène de la drosophile. De même, l'équivalent de HSP60 chez E. coli est GroEL (Growth E Coli large protein). Les protéines HSP70 sont les plus conservées et les plus nombreuses.

Une étude protéomique similaire réalisée par Zhai et al, (2017), sur des souches de Lactobacillus plantarum résistantes et sensibles au Cd, a révélé une différence intra-spécifique des profils protéomiques entre les souches résistantes et sensibles au Cd .Selon cette étude, 206 protéines, pourraient être impliquées dans le processus de réponse au stress du Cd. Ces protéines ont été classées en trois catégories: réponse globale au stress, métabolisme des glucides et des lipides, transporteurs, et protéines membranaires et extracellulaires. Chez les souches sensibles au Cd , il a été noté des concentrations plus faibles de protéines appartenant à la réponse globale au stress, au métabolisme des glucides, au système phosphotransférase (PTS), au système à deux composants, aux protéines membranaires et aux protéines de surface cellulaire et hydrolase par rapport à celles observées chez les souches résistantes . D'autre part, les protéines impliquées dans le métabolisme des acides aminés, le métabolisme des acides nucléiques et les protéines extracellulaires présentaient des abondances plus élevées chez les souches résistantes

La répression de protéines traduit une régulation à la baisse de certaines fonctions non essentielle à la survie de la bactérie. Ainsi, il est probable que les cellules stressées au Cd régulent à la baisse des voies comportant une utilisation de l’ATP en faveur d’autres mécanismes intervenants dans la réponse à la toxicité au Cd .Ainsi, une perte flagellaire des cellules a été observée Cupriavidus taiwansis traitées au Cd, confirmée par une analyse par microscopie électronique à balayage (Siripornadulsil et al ., 2014)

D’une façon générale, la réponse d’un organisme à un stress environnemental est particulièrement complexe et peut entraîner la surexpression de gènes « de défense » directe, mais aussi par des modifications en cascade de l’expression de gènes impliqués de façon indirecte. Il est ainsi fréquent d’observer une surexpression de gènes codant pour des protéines qui a priori ne sont pas impliquées dans un mécanisme de résistance ou de détoxification, mais qui constituent cependant, une réponse de l’organisme à « l’attaque » d’un polluant. Elucider les mécanismes cellulaires et les régulations permettant de résister aux stress, reste depuis de nombreuses années, le cheval de bataille de nombreux microbiologistes.

116

Conclusion

Conclusion et perspectives

L’objectif principal de notre travail, était de rechercher des bactéries résistantes au cadmium, d’évaluer leur capacités accumulatrice du métal , en vue de les utiliser dans la bioremédiation du cadmium, puis d’appréhender l’effet du cadmium sur certaines activités cellulaires impliquées dans la réponse au stress dans le but de justifier la résistance de quatre isolats hautement résistants au cadmium.

Le matériel biologique le mieux conçu pour la bioremédiation du cadmium, est celui qui provient des environnements pollués par les métaux lourds. C’est pour cela qu’au cours de notre étude, nous nous sommes intéressés à l’isolement de souches cadmium-résistantes natives de sites et sols pollués par les métaux toxiques. Nous avons considéré 9 sols en provenance de décharges municipales, des sols cultivés et de sites industriels et de cimenterie. L’évaluation du taux de contamination des échantillons de sols par les métaux lourds analysés (Cd,Cu ,Pb,Cr,Zn et le Ni ) a révélé des variations des teneurs de ces éléments traces métalliques entre les sols étudiés. Le sol cultivé de Bordj El Kiffan s’est avéré le plus pollué, en revanche les sols de l’ancienne et de la nouvelle décharge de Guerara,le sol cultivé de Dellys et le sol de la zone industrielle de Sétif , n’ont affiché aucune pollution par aucun des métaux testés.

L’exploration de ces niches écologiques ,nous a permis d’isoler 103 souches cadmium- résistantes .La caractérisation préliminaire a permis de les classer dans 2 3 genres appartenant à 16 familles bactériennes .L’identification a révélé une prévalence des bacilles à Gram négatif (94%), avec une prédominance des Gram-négatif non fermentaires principalement représentés par les genres Pseudomonas et Burkholderia ,et des bacilles Gram négatifs fermentaires tels que le genre Aeromonas et plusieurs représentants de la famille des Enterobacteriaceae ,notamment le genre Klebsiella.Ces genres bactériens sont très connus pour leur capacités adaptatrices aux milieux pollués .Les bactéries à Gram-positif sont minoritaires (4%) représentés majoritairement par le genre Bacillus.

L’étude de la résistance des bactéries cadmium-résistantes ,aux agents antimicrobiens, a révélé que l’ensemble des isolats ,affiche de fortes CMIs qui fluctuent entre 400 et 2000 µg/Ml. Parallèlement, ces isolats se sont avérés tous résistants à au moins 3 familles d’antibiotiques différentes, testées, de ce fait ils sont considérés comme multirésistants.

7 souches fortement résistantes au cadmium, ont été identifiées par l’approche moléculaire ,par le biais du séquençage du gène ARN r 16s . La caractérisation moléculaire a permis de les affilier aux espèces Raoultella ornithinolytica souche YL-ML1 ,Klebsiella pneumoniae

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Conclusion et perspectives souche YL-SS2 ,Empedobacter brevis souche YL-IS2,Burkholderia cenocepacia souche YL- BS2,Burkholderia ambifaria souche YL-CS2 ,Bacillus infantis souche YL-SS8 et Pseudomonas fluorescens souche YL-SS3 , ces souches ont affiché des valeurs de CMI très importantes de l’ordre de 2000,1900,1700 ,1600 ,1600 ,1100 et 900 µg/mL respectivement.

Cette étude nous a permis également, de mettre en exergue les potentialités d’accumulation du cadmium chez quatre souches sélectionnées ,selon deux modes de vie ,libre et immobilisé ,ces souches sont YL-ML1 ,YL-SS2 ,YL-SS8 et YL-SS3.Nos résultats ont montré que les souches immobilisées accumulent une quantité de cadmium légèrement meilleure que lorsqu’elles sont libres en suspension. Cette accumulation est maximale en phase exponentielle dans le cas des souches YL-ML1,YL-SS2 et YL-SS3, cependant l’essentiel du cadmium est accumulé pendant la phase de latence ou d’adaptation chez la souche YL-SS8. Les résultats de la bioaccumulation , présentent les deux entérobactéries (Klebsiella Pneumoniae souche YL-SS2 et Raoultella ornithinolytica souche YL-ML1, comme des candidates très intéressantes pour la bioremédiation du cadmium .Cependant Pseudomonas fluorescens souche YL-SS3et Bacillus infantis souche YL-SS8 , semblent perdre leurs capacités d’élimination du cadmium en fonction du temps, probablement par extrusion des ions métalliques Le cadmium exerce une forte cytotoxicité menant à une réduction de la prolifération cellulaire dans le même sens que la chute des protéines totales. En revanche la production des EPS a été fortement stimulée par le cadmium, par rapport aux témoins respectifs de chaque souche Test.

Le cadmium influe sur les activités de la catalase et de la superoxyde dismutase, en stimulant ces paramètres chez les souches YL-ML1,YL-SS2 et YL- SS3.En revanche une inhibition de ces même activités enzymatique, est affichée chez la souche YL-SS8 .Le même constat est fait pour le glutathion. La biosynthèse du glutathion est stimulée chez YL-ML1, YL-SS2 et YL-SS3 , alors que chez YL-SS8 cette biosynthèse est inhibée. Le gène cadA codant pour une ATPase de type P ,assurant l’efflux du cadmium et conférant la résistance au cadmium ,a été détecté chez les quatre souches Test .Le gène cadA de la souche YL-ML1 a été cloné et séquencé .La comparaison des séquences de ce gène avec celles déposées dans la base de données universelle (Genbank), a révélé une similitude de 94% avec le gène cadA de Flavobacterium sp.Durant cette étude nous avons appréhendé l’effet du cadmium sur le Pattern protéique des souches sélectionnées .Ainsi le cadmium provoque la surexpression ,l’induction et /ou la répression de protéines de différentes masses moléculaires dans le profil des souches soumises au traitement par le cadmium comparées à leur témoins respectifs.

118

Conclusion et perspectives

La résistance chez les souches étudiées, fortement tolérantes au cadmium serait relatée à la résultante de différents mécanismes œuvrant simultanément avec, probablement, des parts d’implication variables .Ainsi, ces souches auraient recruté plusieurs mécanismes dont la biosorption par le biais des EPS, l’efflux codé par le gène cadA détecté chez l’ensemble des souches et l’intervention du système antioxydant enzymatique et non enzymatique pour la détoxification intracellulaire. Ces mécanismes permettent aux bactéries résistantes de survire et d’accumuler de grandes quantités de cadmium du milieu, cette capacité accumulatrice semble meilleure lorsqu’elle est combinée à une technique adéquate comme l’immobilisation.

En perspectives, il serait très intéressant d’évaluer les capacités de bioremédiation des souches sélectionnées in situ, afin d’évaluer l’impact de la complexité des facteurs édaphiques sur la bioremédiation. Dans la présente étude, les potentiels de bioremédiation du cadmium ont été évalués sur milieu liquide, l’utilisation des souches Klebsiella Pneumoniae et Raoultella ornithinolytica pour la dépollution des eaux usées, est aussi envisageable.

Il serait également très intéressant, d’identifier les protéines impliquées dans la réponse au stress généré par le cadmium.

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Annexes I

Le spectrophotomètre d’absorption atomique équipé d’un four en graphite doit constituer un ensemble compatible (Thibaud, 1983). Il comprend:

• un spectrophotomètre d’absorption atomique équipé d’une correction d’absorption non spécifique d’origine moléculaire et particulaire qui constitue une interférence très courante avec les fours en graphite. Cette absorption non spécifique introduirait des erreurs de mesure. De ce fait, elle exige une correction du bruit de fond. L’avènement de l’effet Zeeman qui veut que les atomes et eux seuls et non pas les molécules, modifient leurs caractéristiques d’absorption sous l’effet d’un champ magnétique, permet une correction optimale du bruit de fond (Caron, 2000).

• un atomiseur four à graphite (Fig. 1) est un cylindre creux en graphite de quelques centimètres. Il est le siège de l’analyse. Une goutte d’échantillon y est déposée (quelques µl). Il est porté à très haute température (3000 °C) par effet joule. A ces températures, les combinaisons chimiques du soluté sont détruites et les atomes se retrouvent à l’état libre : atomisation. Le passage d’un rayon lumineux au travers du four excite les atomes qui absorbent à la longueur d’onde (lampe à cathode creuse spécifique à l’élément à doser) qui leur est propre: absorbance.

• un ensemble d’injection automatique qui commande les opérations successives d’une mesure (ouverture de la cellule d’atomisation, injection dans le four, fermeture de la cellule d’atomisation, montée en température du four en graphite, refroidissement...). L’échantillon est introduit grâce à un injecteur automatique.

Figure 1: Principe du four à graphite en SAA (In Chaib,2010).

 Etalonnage et gamme étalon

Une gamme étalon relative au métal à analyser est préparée. Des solutions filles de concentrations croissantes obtenues à partir d’une solution mère de concentration connue (1 g/L) sont injectées au SAA pour le calibrer. Les concentrations des échantillons doivent être comprises entre la plus faible et la plus grande concentration des solutions filles.

Parfois, le dosage des échantillons au SAA montre des densités optiques (DO) ou absorbances supérieures à celles de la solution fille la plus concentrée. Cette situation impose des dilutions de l’échantillon qui lui permettent d’intégrer la fourchette de la gamme étalon. Chaque DO de la gamme étalon correspond à une concentration connue. A partir de ces données, le tracé d’une courbe d’étalonnage d’un même élément permet par interpolation de déterminer la concentration de cet élément dans l’échantillon analysé.

Annexes II

1,4 y = 0,6935x R² = 0,9634 1,2

0,8

0,6 DO DO nm) (590 0,4

0,2

0 0 0,5 1 1,5 2 Concentrations en BSA mg/ml Figure 2.Courbe de corrélation, absorbance en fonction de la concentration en Sérum albumine bovine (BSA), utilisée pour la détermination des protéines cellulaires totales par la méthode de Bradford.

Annexes III

1,2 y = 0,0109x R² = 0,9936 1

0,8

0,6

DO DO (630nm) 0,4

0,2

0 0 20 40 60 80 100 120 Concentrations en glucose µg/ml Figure 3.Courbe de corrélation, absorbance 630nm en fonction de la concentration en glucose, utilisée pour le dosage des pentoses et des hexoses obtenus dans les EPS par la méthode à l’anthrone sulfurique

Annexes IV

Protocole du dosage du glutathion réduit (GSH) par la méthode de Weckbeker et Cory (1988).

Le protocole consiste à prélever 0,8 mL de l’extrait protéique précédemment préparé. Puis déprotéiniser l’extrat protéique , en ajoutant 0,2 mL d’une solution d’acide sulfosalicylique (SSA) 0,25 %. Agiter ensuite le mélange, et laisser pendant 15 min dans un bain de glace. Centrifuger à 1000 tr/min pendant 5 min. Prélever 0,5 mL du surnagent. Ajouter 1 mL du tampon Tris + EDTA (0,02 M d’EDTA), pH 9,6. Mélanger et ajouter 0,025 mL de DTNB à 0,01 M (dissous dans le méthanol absolu). Laisser pendant 5 min à température ambiante pour la stabilisation de la couleur qui se développé instantanément. Lire les densités optiques à 412 nm contre le blanc. La concentration du glutathion est obtenue par la formule suivante:

[GSH] (nM GSH/mg protéines) = DO × 1×1,525/ 13100 × 0,8 × 0,5 × mg protéines

Avec:

DO: Densité optique. 1: Volume total des solutions utilisées dans la déprotéinisation (0,8 mL homogénat + 0,2 mL de l’acide salicylique).

1.525: Volume total des solutions utilisées dans le dosage du GSH au niveau du surnageant (0,5 mL surnageant + 1 mL Tris + 0,025 mL DTNB).

13100: Coefficient d’absorbance du groupement –SH à 412 nm.

0.8: Volume de l’homogénat. 0.5: Volume du surnageant.

Annexes V Courbe d'étalonnage du BSA (BioRad Commercial)

14-11-2005 14 y = 18,237x 12 R2 = 0,9939

(µg/ml) 6

Qtés Protéines Qtés 4

0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Absorbance à 595 nm

Annexes VI

y = -0,1531x + 2,1127

2,5 Log PM Log 2

1,5

0,5

0 14 27 35 52 70 102 Distance rf (mm)

Figure 5. Courbe de corrélation « log (masse moléculaire) en fonction de la mobilité relative

Annexes VII a b

6% 24,28 % Gram- Gram+ 94% 75,72 %

c d

1% 23,30 %

70,87 % 99%

Annexes VIII

Sol 1 Sol 2

Pseudomonas Pseudomona Burkholderia s Aeromonas Burkholderia Serratia Enterobacter Klebsiella Shigella Ochrobactru Salmonella m Raoultella

sol 3 Sol 4

Pseudomonas Pseudomonas Burkholderia Burkholderia Aeromonas Ochrobactru Sphingomonas m Weissella Serratia

Sol 5 Sol 6

Pseudomonas Pseudomonas Burkholderia Burkholderia Aeromonas

Sol 7 Sol 8 Pseudomona s Pseudomonas Burkholderia Burkholderia

Aeromonas Bacillus Sphingomonas Serratia Staphylococc us Photobacterium Delftia

Sol 9

Aeromonas Sphingomonas Chromobacterium

Figure 7 : Distribution détaillée des genres bactériens caractérisés selon leur différentes origines

Annexes IX

SOL 1 Sol 2 400 400 700 500 2000 600 1900 800 800

900 1100 1800 1600 1000 1600 1100 1200 1700

Sol 3 Sol4

600 1700 500 700

700

1100

1500

600 1300

Sol 5 Sol 6

700

1100 600 1500 700

1100 1400 800 1300

900

Sol 7 500 Sol 8

800 500 1100 600

700 900 700 800

Sol 9

700

600

Figure 8 . Répartition des bactéries cadmium résistantes selon leur valeurs de CMI et le sol d’origine

Annexes X

1 2 3 4 5 6

2 kb 1,5 kb 1,5 Kb Taille attendue du gène de l’ARN 16s avec les amorces universelles( 27F/1525R)

1 2 3 4

2 kb 1,5 kb ~ 1,5 kb 1 kb (Taille attendu du gène de l’ARNr 16S avec les amorces universelles des bactéries 27F/1525R)

En haut Piste 1: taille du marqueur 1 kb (marqueurs d'ADN Marqueur: en haut à gauche), piste 2: contrôle négatif, piste 3: produit PCR de l'ADNc de la souche YL-SS2 , piste 4: Produits PCR de la soucheYL- BS2 ,piste 5: produit PCR de l'ADNc de la soucheYL- CS2 , piste 4: Produits PCR de l’ADNc de la souche YL-IS2 .

En bas Piste 1: taille du marqueur 1 kb (marqueur d'ADN Marqueur: figure en haut à gauche), piste 2: contrôle négatif, piste 3: produit PCR de l'ADNc de la souche YL-SS2 , piste 4: Produits PCR de la souche YL-SS8

YL-ML1 Numéro d’accés à Genbak MF419186

AAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAG GCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAAT CCGGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGC CCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCC GAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCA TGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTC GCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACT CCCCAGGCGGTCGACTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACTCCTCAAGGGAACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTACAGCGT GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCA CCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCAAGCCTGCCAGTTTC AAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTAACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCG ATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCAATCACCA AGGTTATTAACCTTAATGCCTTCCTCCTCGCTGAAAGTACTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGCTGCAT CAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAATCTGGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGGGGCTGG GCATCCTCCCAAACCAGCTAGGGATCNNCCCCCTAGGTGAACCATTACCCCCCCTACTAGCTAATCCCATCTGGGGCCATTCT GATGGCTTNGGGNCCCAAAGGTCCCCCACTTTTGGTCTTGGCANCTTTANGGGNNATTAAGC

YL- SS3 Numéro d’accés à Genbak MF419185

CACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACG

GGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATA

CGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAG

TAGGTGAGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAG GAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGC GTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGA GCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGAT ACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGAT TTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAG GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCAC TCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGG TACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTA GTAATCGCAAATCAGAATGTTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAA CCTTCGGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGTAACCCCG

YL-SS2 Numéro d’accés à Genbak MG758500

GCATAGGGGGCGGACTACACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGAAGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAA ACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCAT CAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTG GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAA GAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGAGGAGGAAGGCATTAAGGTTAATAACCTTAGTGATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGG CTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCA GATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTTTTGGTGTAGCGGTGA AATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGAT TAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGC CTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAG AACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACATTGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCT CGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAG TGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGACTTG CGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATC GTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTA ACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTGGATCCGGGGCC

YL-BS2 Numéro d’accés à Genbak MF419182

CTTACCCTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAG TGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACATGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATTTGATCCACGGATGAA AGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGAAATATAGGGTTGGCCGATGGCTGATTAGCCCCTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGC TGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAG CCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAACCGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGGTCCTAATATGGCCGGGGGA TGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAA AGCGTGCGCAGGCGGTTTGCTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGCCCGGCAGGCTAGAGTATGGCAGAGG GGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATG CACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAA CGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGAT GTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAATCCTGCCGAGAGGCGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGATA CACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAG AGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATA CAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAACCCGTGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCAT GAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACATTTCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGT TTTACCAGAAGTGGCTAGTCTAACCGCAAGGAGGACGGTCACCACGGTAGGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGA AGGTGCGGCAAAATCAC

YL-CS2 Numéro d’accés à Genbak MF419183

CGAGTGGGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAAAAGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGG CGAACGGGTGAGTAATACATCCCAACATGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCCCCTACGATCTATGGATGAAAGC GGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTATAGGGTTGGCCGATGGCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTTTCCAAGGCGACGATCAGTAGCTGG TCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTTTGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCT GATAAAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTAAACGGAAAGAAATCCTTGGTTCTAATATAGCCGGGGGATG ACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAG CGTGCGCAGGCGGTTTGCTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTAGAGTATGGCAGAGGGG GGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCA CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACG TAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGT GGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAATCCTGCTGAGAGGCGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCA CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAG CACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACA ATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGA AGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTT TACCAGAAGTGGCTAGTCTAACCGTAAGGAGGACGGTCACCACGGTAGGATTCGGGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAG GTGC

YL-IS2 Numéro d’accés à Genbak MF419184

TGCGCGTGGGGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATNAACGCTAGCGGGAGGCTTAACACATGGGAGGGGAGGGGTAGAATTAGCTTGCTAATTTGAG ACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATGCAACTTGCCCTACTGAAAAGGATAGCCCAGAGAAATTTGGATTGGGACTTTATAATAGACTGAATG GCATCATTTAGTTTTGAAAGATTTATCGCAGTAGGATAGGCATGCGTAAGATTAGATAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGTCGACGATCTT TAGGGGGCCTGAGAGGGTGAACCCGGATACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGTG GAAGCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTAGGATGACGGCCTTATGGGTTGTAAACTACTTTTATCTGGGGATAAACCTACTTACGTGTAAGTAGC TGAAGGTACCAGAAGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAA AGGGTCCGTAGGCGGACTGATCCGTCAGTGGTGAAATCCTATCGCTTAACGATGGGACTGCCATTGATACTGTTAGTCTTGAATTAGTTTGAAG TGGCTGGAATGTGTAGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATTACGCAGAACACCAATTGCGAAGGCAGGTCACTAAGTCTATATTGACGCTGATG GACGAAAGCGTCGGGAGCGAACAGGATTACCCACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTTGCTGTTGGGACTTCGGTTTCAGTGGCT AAGCGAAAGTTATAAGTATCCGGGGTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT GGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAAGGCTTAAATGCATAATGACGTATTTGGAAACAGATATTTCTTCGGACAGAATGCAAGGT GCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTAGGTTAAGTCCTCCAACGAGCGCAACCCCTATCATTAGTTGCCAGCGTTTAAAGACG GGGACTCTAATGAGACTGCCAATGAAAGTTGAGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCACGGCCCTTACGTCTTGGGCTACACACGTGCTA CAATGGTAAGTACAGAGGGCAGCTACTGGGTGACCAGATGCGAATCTCGAAAACTTATCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCTATG AAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCATATCAGCCATGATGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCTGGG GGTACCTGAAGTCGGTGACCGTAAAAGGAGCTGCCTAGGGTAAAACTGGTAACGAGGGCGC

YL-SS8 Numéro d’accés à Genbak MG758499 GGCGATCGTAACTGCCTATACTGCAGTCGAGCGGACGGATGGGAGCTTGCTCCCTGAAGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAAC ACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATGCACAGCCTCTCATGAGGC TATGCTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAG GCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA GTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGAATTCGGATCGTAAAACTCTG TTGTCAGGGAAGAACAAGTGCCGGAGTAACTGCCGGCACCTTGACGGTACCTGACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCA GCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCTCTTAAGTCTGA TGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCACG TGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGC CCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGG GCCCGCACAAGCAGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTCCTGACAACCC TAGAGATAGGGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGGATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCG GAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGC TGCAAGACCGCGAGGTTAAGCGAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCTGG ACCCGCTAGTAATCGCGGATCCCCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTT TGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTGGAGCCAGCCGCTATAGAGAGTCAAACGCC

Annexes XI

Raoultella ornithinolytica strain YL-ML1 cadmium resistance ATPase (cadA) gene, partial cds 1051pb

>Seq1 [organism= Raoultella ornithinolytica] [strain=YL-ML1] cadmium resistance ATPase (cadA) gene, partial cds

CTTATTGTGAAAGATAGTTTGAGAATAACGTAAAACAGCTTCCAGGAGTTAAAAATGCAAAAGTAAATTCTGGTGCATC TAAGATATCTGTTTACGGTGATGCAACAATTGCCGAACTAGAAAAAGCCGGTGCATTCGAAAATCTTAAAGTGACTCCT GAAAAATCGGGGCGCCGAGTTTCACAAGAGGTAAAAGAAGATACGAAAGAAGCCAACCCCCCGTTGGGTAAAAAGCATA GTACTCTACTTTATGCTTCCTTATTGATTGCATTTGGTTACCTTTCCTCGTCTGTGAACGGAGAAGAGAACATTGTTAC TACCTTATTGTTTTTAGCATCCATGCCCATTGGTTTGTTGTCACTTTTTAAAGTCGGTTTGAAAAATTTACTACGCTTT GAATTTGACATGAAAACCCTTATGACAGTAGCTGTTATAGGTGGTGCTAAAATTGGAGAATGGAAAGAAGTTGCCATTG TTGTTCCGCTCTTTGCAATCAGTGAAGCACTTGAGCGATTCTCTATGGACAGAGCAAGACAATCGATTCGTTCATTAAT GGATATCGCTCCTAAAGAGGCACTCGTTAGACGAAATGGACAAGAAACAATGATTCATGTCGATGATATTGCTGTTGGG GATATTACCCTTGTATTTCCTGGTCAAAACCTTGCGATGGATGGTGTAGTCGTAAATGGCTACTCTGCAGTCAACCAAG CAGCTCCCACCGGTGAATCAGTCCCTTTTGAGAAAACAGTTGATGATGAGGTATTTGCAGGTACCTTAAATGAAGAAGG CCCACTTGAAGTAAAAATAACGAAACTTGTAGAAGATACAACGATTTCTGGGATTATTCATCTTGTAGAGGTTTCACAG GGACCACGGGCTCCTTCTCAAGCATTTGTCGATAAATTTGCAAAATATTACACACCGAGGATTATGATCATTGCAGCTT TAGTGGGTATAGTCCCTCCTTTATTCGGGGATGGTAGTTGGGAAACATGGGTTTATCAAGGATTAGCTGTGGTTGTTGT TGGTTGTCCTTCACCATTAGACGC

Revue d’Ecologie (Terre et Vie), Vol. 73 (3), 2018 : 254-267

CHARACTERIZATION OF CADMIUM-RESISTANT BACTERIA ISOLATED FROM POLLUTED SOILS IN ALGERIA, AND EVALUATION OF CADMIUM REMOVAL, USING LIVING FREE AND IMMOBILIZED CELLS

Lila YAKOUBI1*, Yamina BENMALEK1, Tahar BENAYAD1 & Marie-Laure FARDEAU2

1 Laboratoire de Microbiologie, Département de BCM, Faculté des sciences biologiques, Université des Sciences et de Technologie Houari Boumediene, Alger, Algérie 2 Laboratoire de Microbiologie IRD, Aix-Marseille Université, Université du Sud Toulon-Var, CNRS/INSU, IRD, Marseille, France * Corresponding author: [email protected]

RÉSUMÉ.— Caractérisation des bactéries cadmium-résistantes isolées de sols pollués en Algérie et évaluation de l’élimination du cadmium en utilisant des cellules libres ou immobilisées.— La pollution des sols par les métaux lourds est un problème particulièrement préoccupant du fait de leur toxicité et de leur non biodégradabilité. Dans ces environnements, les bactéries développent divers mécanismes de résistance qui leurs confèrent la capacité à accumuler ces métaux. Dans cette étude, vingt-trois bactéries cadmium-résistantes ont été isolées de trois sols algériens et ont été caractérisées. Deux isolats (YL-SS8, YL-SS3), hautement résistants au cadmium, ont été sélectionnés et identifiés par séquençage du gène de l’ARNr 16S, puis testés pour leur capacité à capturer les ions cadmium. Les résultats ont révélé que les bactéries caractérisées appartenaient à neuf familles et dix genres, tandis que les deux souches les plus résistantes sélectionnées, ont été identifiées comme Bacillus infantis et Pseudomonas fluorescens. Les concentrations minimales inhibitrices ou CMI oscillaient entre 500 μg.mL-1 et 1100 μg.mL-1. Les souches YL-SS8 etYL-SS3 ont montré les CMI les plus importantes, de l’ordre de 1100 μg.mL-1 et 900 μg.mL-1 respectivement. Les cellules libres vivantes de B. infantis ont prélevé environ 90 μg.mL-1 de cadmium, alors que celles de P. fluorescens ont capturé 81 μg.mL-1 après 24 heures de contact. Dans le même temps, les cellules immobilisées ont accumulé des concentrations en cadmium légèrement plus importantes avec des valeurs respectives de 93 μg.mL- 1 et 85 μg.mL-1. En raison de leur forte résistance et de leur importante capacité d’accumulation du cadmium, les deux isolats bactériens pourraient être exploités pour l’assainissement biotechnologique du cadmium dans les sols contaminés par les métaux lourds.

SUMMARY.— Soil pollution by heavy metals is one of the most important problems around the world. Microorganisms in these environments develop various mechanisms of resistance and become able to accumulate these metals. In this study, twenty-three cadmium-resistant bacteria were isolated from three soils and characterized. Two of them (YL-SS8, YL-SS3), highly cadmium-resistant, were selected and identified by the sequencing of the 16S rRNA gene, then tested for their ability to remove cadmium ions. The results revealed that the characterized bacteria belonged to nine families and ten genera, while the most resistant are authentically identified as Bacillus infantis and Pseudomonas fluorescens. The MIC of bacteria ranged from 500 µg.mL-1 to 1100 μg.mL-1, Bacillus infantis and Pseudomonas fluorescens showed MIC of the order of 1100 μg.mL-1 and 900 μg.mL-1respectively. The free living cells of B. infantis accumulated about 90 μg.mL-1 of cadmium, whereas those of P. fluorescens 81 μg.mL-1 after 24 hours of contact. During the same time, the immobilized cells accumulated quantities slightly better with respective values of 93 μg.mL-1and 85 μg.mL-1. Due to their strong resistance and high cadmium removal capacity, the two bacterial isolates could be exploited for biotechnological remediation of cadmium and other heavy metals from contaminated soils.

______Soil pollution by heavy metals is a serious environmental and social problem, on account of the dangers that can cause these elements, not only for human health but also for biodiversity and structure of soil organisms and microbial populations (Tran & Popova, 2013). Some of heavy metals are essential and required by the organisms as micro-nutrients, while others have no biological role and are detrimental even at very low concentration (Bruins et al., 2000). One of the most dangerous heavy metals encountered in soil is cadmium. These metal ions enter agricultural soils with others from pesticides, industrial effluents, phosphate fertilizers and atmospheric deposition, which finally lead to transport to the food chain (Jain et al., 2007). Cadmium has a

254 higher tendency to accumulate in the tissues of plants and affects their growth (Lux et al., 2010). This metal affects many physiological processes such as membrane functions by changing the fatty acid composition of the lipids, nitrogen metabolism, oxidative stress through increased proteolysis and lipid peroxidation (Chaffei et al., 2003; Djebali et al., 2005). In human, it affects cell proliferation and differentiation, chromosomal aberrations, modification of transcription factors, skin cancer, prostatic proliferative lesions, pulmonary adenocarcinomas, peripheral neuropathy and peripheral arterial disease (Gunaseelan & Ruban, 2011; Chakravarthi et al., 2012). Because of its higher solubility in water, and highest toxicity, the pollutant gains more significance (Katoch & Singh, 2014). The pollution of the ecosystem by heavy metals is quite special because although these trace elements are mobilized by various organisms, they cannot be degraded into less toxic products and persist indefinitely in the environment, posing a major problem in ecology but also for public health. Their toxicity and persistence in the environment require the development of different methods to reduce the number of contaminated sites. If physico-chemical methods such as excavation and storage or stabilization and containment are used in soil decontamination, most of them tend to be very expensive and many countries encounter difficulties in its implementation (Guzman et al., 2016). In recent years, an important attention has been paid to the problems of soil contamination by heavy metals (Changli et al., 2010; Salam, 2013; Zhou & Guo, 2015; Liu et al., 2015; Singh & Prasad, 2015) with interest in a remediation strategy depending on microorganisms and plants: it is bioremediation. Bioremediation is a branch of biotechnology which uses natural biological mechanisms to address environmental problems; it is being explored as an effective and technological solution to the problem of heavy metal pollution (Basha & Rajaganesh, 2014). Bioremediation has been regarded as an environment-friendly, inexpensive and efficient means of environmental restoration (Hrynkiewicz & Baum, 2014) and, in some cases, has been successfully applied in remediating contaminated sites in the developed world (Owolabi & Hekeu, 2015). A vast array of biological materials, especially bacteria, algae, yeasts and fungi have received increasing attention for heavy metal removal (Wang & Chen, 2008). Heavy metal-resistant bacteria have been demonstrated to exhibit high metal ion removal capacity. Biosorption, bioaccumulation, biotransformation, and biomineralization are the techniques employed by microorganisms for their continued existence in metal polluted environment. These strategies have been exploited for remediation procedures (Gadd, 2000; Lin & Lin, 2005). Heavy metal removal can be carried out by living organisms or dead biological materials. Large scale feasibility applications of biosorptive processes have shown that dead biomass is more applicable than the bioaccumulation approach, which involves the use of living organisms and thus requires nutrient supply and a complicated bioreactor system. Also, the toxicity of pollutants, as well as other unfavourable environmental conditions, can contribute to the inability to maintain a healthy microbial population. However, many characteristic attributes of living microorganisms have not been exploited in large scale applications (Park et al., 2010). The choice organism must develop resistance towards metal ions as it comes into contact with the heavy metal pollutant to achieve the goal of remediation. The organism of choice may be native to the polluted environment or isolated from another environment and brought to the contaminated site (Sharma et al., 2000). Micro-organisms can also act indirectly as they support the growth of phytoaccumulator plants thus they help in the remediation of heavy metals (Yan-De et al., 2007; Zhuang et al., 2007; Heshmatpure & Rad, 2012). However, studies demonstrate that living systems may be inconsistent in heavy metal removal if used as free suspended biomass. Free suspended biomass can promote higher contact with the contaminants during the removal process; often, however, it is not practical as a clean-up method. To obtain a more reliable and reproducible system, bacteria should be immobilized on a solid matrix (Vijayaraghavan & Yun, 2008; Wang & Chen, 2009), some materials employed for this

255 were clay (Quintelas et al., 2009) or synthetic polymers such as alginates and pectates (Pires et al., 2011). The principal aim of the present work was to isolate and characterize cadmium-resistant bacteria from some polluted soils in Algeria, to determine the minimum inhibitory concentration of cadmium and eventually to study the ability of two highly resistant isolates to remove cadmium ions, free or immobilized.

MATERIALS AND METHODS

STUDY AREAS AND COLLECTION OF SOIL SAMPLES Soil samples were taken from three areas located in the east of Algiers (Algeria). The first is a cultivated soil (Dellys), the second from an industrial zone (Setif) and the third from deposit metal tools next to the railway (Bab-Ezzouar). The samples were collected in sterilized and non-sterilized flasks during the month of February 2014 to a depth of four centimetres from the surface. The samples for microbiological analyses were placed in a cooler (4°C), while those for physic-chemical analyses were transported at ambient temperature.

PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES OF SOIL SAMPLES The soil samples were dispersed to be dried and then passed through a two millimetres sieve before measuring the various parameters. The pH of each soil was measured according to the AFNOR standard NFX31-10 using a pHmeter electrode in a solution of soil diluted to 1/5 in water. Available nitrogen (N) content in soils was measured by an alkali N- proliferation method, whereas organic material was determined by the K2CrO72H2SO4 oxidation method of "Anne" described in the standard NF X31-109. The determination of heavy metal concentration tested (cadmium, lead, zinc, chrome, copper and nickel) was carried out using Atomic Absorption Spectrometry (AAS) with flame and graphite furnace AA 800 Perkin Elmer. It is based on the detection of very low levels of concentration (of the order of ppb), of numerous mineral elements by using different radiation sources for each mineral element to be measured, compared to solutions the concentrations of which are known, from the element to be assayed. This step comes after mineralization of soil samples undergoes acid digestion using a pure HCl mixture and Supra Pure-concentrated HNO3 (3:1 v/v; Sigma-Aldrich) with the addition of 3 drops of H2O2. Then heating is carried out on a heating plate at 300°C until complete digestion (USEPA, 1996). Soil samples after mineralization, are transferred to volumetric flasks and diluted to desired concentrations. A range of calibration solutions of the sought-after metal makes it possible to plot a calibration curve while respecting its linearity domain. The concentration of metals in the soil samples can be calculated. Soils texture was determined by the hygrometry method, whereas the electrical conductance was by conductivity meter (HI 2316, HANNA Instruments) (Roane & Kellogg, 1995).

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF CADMIUM-RESISTANT BACTERIA From each sample, 5 g of soil were suspended in 45 mL of nutrient broth [Grams per litre: 5 g peptic digest of animal tissue; 5 g sodium chloride; 1.5 g beef extract; 1.5 g yeast extract (HiMedia laboratories)], then flasks were incubated at 30°C for 48 hours with shaking at 90 rpm. Thereafter, ten-fold serial dilutions of the cultures were prepared. An aliquot (1 mL) of the diluted samples was spread in mass of sterile nutrient agar plates amended with 50 μg.mL-1of cadmium chloride (CdCl2,2H2O; Biochem, Chemopharma). After an incubation period (48 h at 30°C), isolated and distinct colonies were sub- cultured on the same media for purification. The purified isolates were identified on the basis of cells morphology, Gram- stain, catalase, oxidase, nitrate reductase enzymes and some biochemical characteristics following Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994). Commercial biochemical identification systems Api 20E, Api 20NE and Api 50CH used, are provided by Biomerieux. The most resistant isolates were identified by sequencing of the 16S rRNA gene by GATC laboratories (GATC – biotech laboratories, Germany).

DETERMINATION OF MINIMUM INHIBITORY CONCENTRATION (MIC) MIC of the cadmium-resistant isolates was determined by gradually increasing the concentration of cadmium 100 µg.mL-1 each time on nutrient-agar plate until the strains failed to grow on plates even after five days of incubation at 30°C. Cadmium solution used was prepared by dissolving cadmium chloride (CdCl2, 2H2O) in ultrapure water (MILLI-Q plus, USA), then sterilized. The MIC was designated as the lowest concentration that inhibited growth of colonies on the medium (Nies, 1999). The range of concentrations tested was from 100 to 1300 µg.mL-1

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CADMIUM REMOVAL BY LIVING BACTERIAL FREE CELLS Two isolates (YL-SS3 strain and YL-SS8 strain), highly cadmium-resistant were selected and used in this study. Foremost, the evolution of growth was measured in the presence of cadmium ions at pH 7.2. Thereafter, the cadmium removal capacity of living free cells was evaluated by measuring concentrations of cadmium in the medium (residual cadmium) as a function of contact time (incubation time). So, the isolates were cultivated in 100 ml of nutrient broth with 100 μg.mL-1 of metal at final concentration. The inoculated flasks were incubated in shaking conditions (100 rpm) at 30°C for 72 h (Sujitha & Jayanthi, 2014; Benmalek & Fardeau, 2016). Two controls were prepared simultaneously with the experiment cultures for each isolate. The first one was prepared without cadmium to measure bacterial growth and the second without bacterial biomass to determine the artefacts that might arise due to the metal sorption on the glass surface of the culture container. The growth was determined by measuring the optical density at 600 nm. However, the residual concentration of cadmium was evaluated after centrifugation of 10 mL of each bacterial culture at 4000 rpm for 30 minutes and analysis of the supernatant from each sample using AAS. The values so obtained by AAS analysis represent the residual concentration of cadmium in the medium. The cadmium concentration in the supernatant was determined with a Perkin-Elmer 2380 atomic absorption spectrometer at 228.8 nm with a cadmium lamp.

CADMIUM REMOVAL BY IMMOBILIZED BACTERIAL CELLS The bacterial cells of the isolates YL-SS3 and YL-SS8 were immobilized as beads of alginate according to the procedure of Leung et al. (2000). So, 2 % sodium alginate solution (Biochem, Chemopharma) is prepared in distilled water and sterilized (Tao et al., 2009). Thereafter, 100 mL of the solution prepared were cooled to room temperature, then 10 mL of the bacterial cultures were added (10 % v/v). The sodium alginate with cell culture was stirred by shaking to get homogenized mixtures. In a separate beaker, 100 ml of 0.1 M sterilized calcium chloride solution (Riedel-de-Haen) was taken. The sodium alginate containing cell culture suspension was extruded dropwise through a syringe and allowed to fall in the beaker containing sterilized calcium chloride solution. The beads of sodium alginate gel formed were left in the flasks overnight for hardening. Afterwards, beads were washed with sterile distilled water and introduced into flasks containing 100 mL of nutrient broth with 100 μg.mL-1 of cadmium and incubated with shaking (100 rpm) at 30°C for 72 hours. Controls containing only nutrient broth and beads were prepared in the same experimental conditions. Then, 5 mL of samples were taken at different times, centrifuged at 4000 rpm for 30 minutes and withdrawn for cadmium analysis in the supernatant using AAS.

RESULTS

As shown in Table I, the amount of heavy metals varies according to the soil studied. Thus, the concentration of zinc was important in all samples with values ranging from 55.26 mg.kg-1 to 124 mg.kg-1. However, the content of cadmium was low relative to AFNOR norms values (2 mg.kg-1). The highest amount of zinc was obtained in the industrial zone (124 mg.kg-1), while that of nickel (49.89 mg.kg-1) was in soil taken from Bab-Ezzouar. Furthermore, the soil pH was slightly higher with values of the order of 7.83 (cultivated soil), 7.49 (industrial zone) and 7.74 (deposit metal tools). The organic matter content of samples ranged between 5.12 % and 5.38 %. Though, the amount of nitrogen fluctuates between 0.01 and 0.11 mg.kg-1, while the conductivity ranged from 0.12 to 0.35 dS.m-1. Results of the soil structure showed that the clay and coarse sand were the dominant elements.

TABLE I The basic physicochemical properties and heavy metal concentrations in the soil samples

Parameters studied Cultivated Soil (Dellys) Industrial zone (Setif) Deposit metal tools (Bab-Ezzouar) Cadmium (mg.kg-1) 1.024 1.612 0.854 Chrome (mg.kg-1) 60.61 58.49 52,44 Zinc (mg.kg-1) 70.01 124.00 55.26 Copper (mg.kg-1) 26.99 24.83 27.65 Lead (mg.kg-1) 24.13 21.98 12.85 Nickel (mg.kg-1) 30.14 20.46 49.89 pH 7.83 7.49 7.74 Organic matter (%) 5.31 5.12 5.38 Conductivity (dS.m-1) 0.12 0.35 0.20 Nitrogen (N) (mg.kg-1) 0.11 0.056 0.01 Clay (Cl%) 23 10 20 Silts (S%) 14 12 10 Coarse silt (CS%) 8 4 6 Coarse sand (Cs%) 37 21 28

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IDENTIFICATION AND MIC DETERMINATION OF THE CADMIUM-RESISTANT BACTERIA A total of twenty-three cadmium-resistant bacteria were isolated with ten strains from cultivated soil, nine others from the deposit metal tools and only four from industrial zone. According to the results of the biochemical identification, these bacteria belonged to nine families and ten genera: Chromobacterium, Burkholderia, Pseudomonas, Photobacterium, Aeromonas, Sphingomonas, Staphylococcus, Delftia, Serratia and Bacillus as shown in Table II. The most resistant bacteria YL-SS3 strain and YL-SS8 strain were selected, 16S rRNA gene sequencing and phylogeny analysis revealed that the strain YL-SS3 was authentically identified as Pseudomonas fluorescens with maximum sequence similarity of 99 % and the strain YL-SS8 was identified as Bacillus infantis with 98% maximum sequence similarity. Length of sequenced gene was 1492 bases pairs for either YL-SS3 or YL-SS8 strain.

TABLE II Cadmium-resistant bacteria identified using API system and MIC values

Cadmium-resistant bacteria Origin of isolates Similarity rate (%) MIC (µgmL-1) Burkholderia cepacia Dellys 99 800 Pseudomonas fluorescens Dellys 95 700 Pseudomonas fluorescens (YL-SS3 Dellys 99 900 Staphylococcus sp Dellys 100 500 Delftia acidovoran Dellys 98 600 Pseudomonas fluorescens Dellys 90 700 Pseudomonas aeruginosa Dellys 100 800 Burkholderia cepacia Dellys 98 800 Bacillus infantis (YL-SS8) Dellys 99 1100 Pseudomonas fluorescens Dellys 90 800 Pseudomonas fluorescens Bab-Ezzouar 90 800 Photobacterium damselae Bab-Ezzouar 90 800 Aeromonas hydrophila G1 Bab-Ezzouar 95 500 Burkholderia cepacia Bab-Ezzouar 98 800 Serratia macerans Bab-Ezzouar 98 800 Burkholderia cepacia Bab-Ezzouar 90 700 Sphingomona paucimobilis Bab-Ezzouar 95 700 Pseudomonas aeruginosa Bab-Ezzouar 96 700 Aeromonas hydrophila Bab-Ezzouar 90 800 Chromobacterium violacerum Setif 95 600 Aeromonas hydrophila G1 Setif 90 700 Sphingomonas paucimobilis Setif 98 600 Aeromonas hydrophila G2 Setif 92 600

Neighbour-joining tree was constructed using both the sequences YL-SS3 (Fig. 1) and YL-SS8 (Fig. 2), and representative sequences from databases.

Figure 1.— Neighbour-joining phylogenetic tree based on 1492 bp of 16S rRNA gene sequences of isolate YL-SS3 depicting the phylogenetic relationships of YL-SS3 and its closest relatives in the genera Pseudomonas. Staphylococcus aureus strain ACC 14458 was taken as the out-group organism and the scale bar corresponds to the expected number of changes per nucleotide position.

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Figure 2.— Neighbour-joining phylogenetic tree based on 1492 bp of 16S rRNA gene sequences of isolate YL-SS8 depicting the phylogenetic relationships of YL-SS8 and its closest relatives in the genera Bacillus. Aeromonas hydrophila strain ACC 7966 was taken as the out-group organism and the scale bar corresponds to the expected number of changes per nucleotide position.

Cadmium resistance studies showed that the MIC were in interval of 500-1100 μg.mL-1 for the isolates of Dellys, 600-700 μg.mL-1 for the isolates of Setif and 500-800 μg.mL-1 for the isolates of Bab-Ezzouar. Overall, the majority of isolates reached a MIC of 800 μg.mL-1 (8 isolates) and 700 μg mL-1 (7 isolates). The maximum resistance to Cd was observed in YL-SS8 strain with MIC 1100µg.mL-1 and next to it, the resistant bacteria YL-SS3 was reported as the most resistant with MIC 900µg.mL-1.

EFFECT OF CADMIUM ON BACTERIAL GROWTH OF THE STRAINS YL-SS8 AND YL-SS3 To study the effect of cadmium on growth of YL-SS3 strain and YL-SS8 strain, the cells were cultivated in the metal stress. For both strains, the concentration of 100 µgm.L-1 inhibited cell proliferation compared to untreated controls, as shown in Fig. 3.

1,6

) 1,4 1,2 1 0,8 YL-SS3 0,6 YL-SS3+Cd 0,4 YL-SS8

Optical density (600nm density Optical 0,2 YL-SS8+Cd 0 2 8 24 30 48 72 Incubation times(hours)

Figure 3.— Growth curves of free living cells of YL-SS3 or YL-SS8 strains in the presence and absence of cadmium. In treated samples cadmium was added at the beginning of experimentation with final concentration of 100 µgmL-1.

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The growth of the strain YL-SS8 (Bacillus infantis) was low, between the beginning of experimentation until 48 hours of incubation. But after this period, strain YL-SS8 cells were able to adapt and resume growth, translated by an increase in optical density. However, growth of YL-SS3 strain (P. fluorescens) stressed evolved positively as a function of incubation time, but at lower level than the control (Fig. 3).

CADMIUM REMOVAL BY LIVING FREE CELLS As shown in Figure 4, YL-SS8 strain (B. infantis) captured considerable concentrations of cadmium than the strain YL-SS3 (P. fluorescens). The cadmium removal level was 90 μg.mL-1 after 24 hours of incubation, and then decreased to 83 μg.mL-1 after 48 hours. During this same period, YL-SS3 strain (P.fluorescens) removed quantities of the order of 81 μg.mL-1 then 56 μg.mL-1.

120 100 YL-SS3 free

80 YL-SS3 imm

) ) 60 1 - YL-SS8 free 40

(µgmL YL-SS8 immo 20 0 0 24 48 72

Cadmium concentration in the supernatant the in concentration Cadmium Incubation times(hours)

Figure 4.— Cadmium removal by living cells of YL-SS3 and YL-SS8 strains free, or immobilized in alginate beads. Cadmium was added at the beginning of experimentation at final concentration of 100 µgmL-1.

CADMIUM REMOVAL BY LIVING IMMOBILIZED CELLS The immobilized cells showed better uptake capacity than free cells (Fig. 4). On the first and second day, the removed amounts were 93 μg.mL-1 , 88 μg.mL-1 for YL-SS8 strain (B. infantis) and 85 μg.mL-1 ,76 μg.mL-1 for YL-SS3 strain (P. fluorescens). According to these results, B. infantis immobilized cells captured higher amounts of cadmium ions.

DISCUSSION

In this study we adopted the AFNOR regulatory standards as a reference for assessing the pollution of soil samples. There is a lack in Africa in terms of regulating the maximum allowable levels of potentially toxic metals in soils. It was observed that the determined quantities of heavy metals were lower than standards compared to AFNOR norms, except for nickel that displays an important value in the soil from Bab-Ezzouar. According to Baize (2000), most clayey and iron-rich soils approach or exceed the value of 50 mg Ni per kg. However, the zinc content of the three soils could be related to that the

260 soils samples are the support of many industrial (Setif soil), agricultural (Dellys soil) and urban activities (Bab-Ezzouar soil). The development of these activities leads to a marked increase in the contents of metallic trace elements (MTE) since the high use of zinc in industry and organic fertilizers (Allam, 2012). The cadmium concentrations determined in the three soils are all lower than the AFNOR standards (2 mg.kg-1). However, these soils are not free from contamination because these levels greatly exceed the natural concentrations of cadmium in the upper soil horizons which are between 0.2 and 0.4 mg.kg-1 (Bourrelier & Berthelin, 1998; Alloway, 1990), showing the share of anthropological contamination resulting from human activities. However, bacteria isolated from these soils were highly resistant to Cd. Previous results of several laboratory and field experiments concerning the long term heavy metal effects, showed an increased bacterial community tolerance to metals present in soil, with the tolerance increase being correlated with the pollution level (Diaz-Ravina et al, 1994; Diaz-Ravina & Baath, 1996a; Pennanen et al, 1996; Baath et al, 1998).The soil isolates identified belonged to the genera Bacillus, Pseudomonas, Burkholderia, Staphylococcus, Chromobacterium, Photobacterium, Aeromonas, Sphingomonas, Delftia and Serratia. These bacterial genera are often encountered in contaminated areas (Ajaz et al., 2010; Elsilk et al., 2014). 91 % of isolates are gram-negative. It is widely accepted in the scientific literature that gram-negative bacteria are very common at contaminated sites (Khafilzadeh et al., 2013), indicating that gram-negative bacteria have an outer membrane and a negative surface charge of lipopolysaccharides (LPS). However, resistance to Cd has been reported for both gram-positive and gram-negative bacteria (Foster, 1983). In agreement with our results gram-positive bacteria like firmicutes were found to tolerate high concentration of heavy metals (Gupta, 2012). All the isolates have a MIC above 500 µg.mL-1. The MIC high value translates the great adaptability of these bacterial genera to hostile environments, which is related to their varied energy metabolisms and a wide range of biochemical and molecular processes. Certain bacteria like Pseudomonas are able to produce siderophores which are commonly used for Fe transportation and have the capability to chelate heavy metals such as Cd2+, and may be responsible for maintaining metal homeostasis (Złoch et al., 2016). Besides, metallothionein (MT), a thiol-containing, cysteine-rich protein, induced by heavy metals and used to transport and reduce toxic metals, is of great help in the sequestration of metal ions. Thiol groups of cysteine residues in metallothionein can bind Cd2+ to form metal-thiolate complexes, thus rendering Cd unavailable to exert toxicity (Khan et al., 2015). Microbes still have other detoxification methods such as glutathione (GSH) system (Wang & Wang, 2010; Barmo et al., 2011; Won et al., 2011; Cirillo et al., 2012). When cells of strain YL-SS3 and strain YL-SS8 were cultivated in presence of 100 µg.mL-1 of cadmium, results showed that the metal has an inhibitory effect on growth of both strains YL- SS3 and strain YL-SS8. Furthermore, growth was not completely inhibited at this concentration. It should be noted that a concentration of 10 mM of cadmium was lethal for E. coli (Ferianc, 1998), which shows the large capacity of these isolates to adapt to hostile conditions of growth, such as metallic stress and develop various resistance mechanisms towards heavy metals. It is very important to mention that cadmium causes oxidative damage to microorganisms, leading to a decrease of cell activity, a reduction of growth rate and cell density, an inhibition of cell proliferation and therefore a decrease of the bacterial number due to the death of some bacteria (Sihamim and Rehman, 2012). Although the Cd2+ concentration used in this work was much higher than those generally observed in contaminated environments (Wagner, 1993), the inhibition of cell proliferation in presence of cadmium could be linked to an inhibited DNA replication (Mitra et al., 1975; Nystrom & Kjelleberg, 1987) which makes the DNA more susceptible to nucleolytic attack, resulting in single-strand DNA breaks. Therefore, cadmium causes serious damage during the growth of bacteria present in polluted environments (Fahmy, 2013). Strain YL-SS8, growth was low at the beginning of incubation, but after 48 hours of contact with the metal ions, bacterial cells became

261 able to adapt and resume growth. This period appears to involve repair of cadmium-mediated cellular damage and adjustment of the cell physiology to limit the distribution of toxic ions in the cell. Wiatrovska (2015) reported that Cd was more toxic to Bacillus sp than Pb. YL-SS3 strain growth, was not stopped by Cd; the cells were able to maintain their growth at a low rate and then restart. Gram-negative bacteria like (Pseudomonas) are well reported to play a significant role in detoxification of various heavy metals like cadmium (Halder & Basu, 2016); this genus has widely been studied for its well-adapted metal resistance properties (Deb et al., 2013). However, the negative effect of cadmium on bacterial growth did not prevent the capture of cadmium ions, since YL-SS3 strain and YL-SS8 strain were capable of taking up the metal ions. Large amounts of cadmium ions were removed by living free cells of the two species. The results showed that the maximum of cadmium uptake occurred during the first period of incubation (24 h). This period corresponds to low cell biomass level, resulting from the toxic effect of cadmium on the cells of the two strains; cells would probably involve passive mechanisms, as bacteria during this period need to save energy to ensure their adaptation and then their proliferation. Interactions between bacterial cells and metals are governed by passive or active mechanisms (Chang, 1997; Haferburg & Kothe, 2007). The passive mechanisms of uptake are independent of the metabolism and therefore the physiological state of the cells (living or dead), they are fast and reversible. They take place at the cell / solution interface and involve mechanisms such as ion exchange, surface complexation onto the cell wall and other outer layers (Fomina & Gadd, 2014) or precipitation. These processes are grouped in the term of Biosorption. An analysis of the cell wall components, which vary among the different microorganisms, helps in assessing metal uptake by different microorganisms. The peptidoglycan layer in gram- positive bacteria, which contains alanine, glutamic acid, meso-di-aminopimelic acid, polymer of glycerol and teichoic acid, and that of the gram-negative bacteria, which contains enzymes, glycoproteins, lipopolysaccharides, lipoproteins, and phospholipids, are the active sites involved in metal binding processes (Lesmana et al., 2009; Gupta et al., 2015). Changli et al. (2010) reported that Pseudomonas fluorescens biomass includes different functional groups and these functional groups are able to react with metal ions in aqueous solution. When bacterial growth increased (48-72 h), cadmium remediation could be attributed to active mechanisms. Active mechanisms depend on the metabolism of the cells and are therefore specific to each bacterial strain. They are slower and generally inducible such as efflux pumps. Removal cadmium capacity decreased when incubation time increased, showing that the contact time between bacterial cells and cadmium ions and also the age of the cells could be considered as an important factor affecting metal uptake. The lack of remediation could be also explained by metal exclusion or by detoxification mechanisms similar to those described for antibiotic resistance, which represent the main defence of bacteria in the presence of external toxicants (Saier, 2003; Pana, 2012). Two well-studied genetic mechanisms of metal resistance in bacteria include heavy metal efflux systems (Nies & Silver, 1995) and the presence of metal binding proteins (Robinson et al., 1990). Many operons of efflux system are known. In the gram-positive bacteria, the plasmid- encoded Cd efflux system, called the CadA resistance system, utilizes the CadA protein, which is a P-type ATPase (Tsai & Linet, 1993). An analysis of the cadmium tolerance genes of B. cereus S5, identified ATPase genes that were associated with cadmium tolerance and involved in the ATP pumping mechanism (Huiqing et al, 2016). However, Cd resistance in gram-negative organisms is due to a multi-protein chemiosmotic antiport system (Silver, 1996). Our results showed that during this period (48-72 h), growth of the two strains improved, proving that the medium became less toxic to bacterial cells than at the beginning of incubation. A decrease in the toxicity of copper at a longer feast famine period was attributed to the presence of higher amounts of extracellular polymeric substances (EPS) (Song, 2016). EPS play a defensive action that prevents microbial cell

262 from toxic heavy metal ions. Its net anionic makeup allows the biopolymer to effectively sequester positively charged heavy metal ions (Gupta & Batul, 2017). Enhanced production of EPS was induced by the so-called stressful culture conditions (Arudhanti & Paul, 2008). Pseudomonas stutzeri produced large quantities of EPS under cadmium stress (Debarati & Basu, 2016). Gram-negative and gram-positive bacteria are able to accumulate the metal ions inside the cell, in the cytoplasm and/or the periplasm, and outside on the outer membrane (Voloudakis et al., 1993). The immobilized cells of strain YL-SS3 and YL-SS8 strain showed high cadmium uptake capacity. Several researches demonstrated a better remediation of heavy metals by the immobilized organisms as compared to free cells. Numerous authors (Tsekova & Ilieva, 2001; Wuana & Okieimen, 2010; Sujitha & Jayanthi, 2014; Wasi et al., 2011) have reported better efficiency bioremediation potential of immobilized P. fluorescens SM1 strain compared to free cells. This could be directly linked to the advantage of this process, based on the immobilized biomass which leads to the improvement of the stability of microbial cells, thus allowing a continuous operation of the process and avoiding the need to separate the biomass from the medium. Cellular immobilization leads to the confinement or localization of the viable microbial cells to a certain defined region of the space, so as to limit their free migration and increase their contact surface with the metal and consequently their capacity for biosorption. Immobilized microorganism technology offers a multitude of advantages, such as high biomass, high metabolic activity and strong resistance to toxic chemicals (Cai et al., 2011; Liu et al., 2012). In other hands, numerous reports verify that attachment of bacterial cells to solid surfaces stimulates the exopolysaccharides production without altering the specific growth rate (Vandevivere & Kirchman, 1993). A combination of bacterial EPS immobilized in calcium alginate resulted in maximum cadmium and cobalt ion sequestration from aqueous solutions (Ozdemir et al., 2005). Microbial cells in communities display a variety of metabolic differences as compared to their free-living counterparts. The majority of changes observed in immobilized cells result from protection provided by the supports ( Zur et al., 2016).

CONCLUSION

The present study showed that contaminated areas offer good ecological niches for cadmium resistant bacteria. In terms of bioremediation, immobilized cells removed more cadmium than free cells in both YL-SS3 and YL-SS8. Better remediation of cadmium requires both bacterial strains cadmium-resistant but also a technique that better values their performance. In our study, immobilization in alginate beads proved better than the cells in suspension. However, knowledge about the main physiological responses occurring in immobilized cells may contribute to improving the efficiency of immobilization techniques.

ACKNOWLEDGEMENTS

We are thankful to the Scientific Police Laboratory of Algiers. We also like to thank Microbiology Laboratory Staff of the FSB/USTHB, Algiers-Algeria. Special thanks are due to Pr Christian Erard for his precious collaboration and to two anonymous referees for their constructive comments on a first version of this paper.

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Abstract

In this study, 103 cadmium-resistant bacteria were isolated from 9 soils from different regions of Algeria and polluted by heavy metals. 94% of the isolates were Gram-negative, mainly Pseudomonas, Burkholderia, Aeromonas and the family Enterobacteriaceae. . Gram positive (4%) belong mainly to the genera Bacillus. All cadmium-resistant strains showed very high MICs, ranging from 400 to 2000 μg mL-1, and a multi-resistance against 12 antibiotics tested. Four highly cadmium-resistant strains were characterized at the molecular level, by 16S rRNA sequencing, were affiliated with Raoultella ornithinolytica (strain YL-ML1), Klebsiella pneumoniae (strain YL-SS2), Pseudomonas fluorescens (strain YL- SS3) and Bacillus infantis (strain YL-SS8). These strains accumulated very large amounts of cadmium during the first 24 hours of incubation, despite the toxic effect of Cd, expressed by inhibition of their growth. The accumulation of cadmium is slightly better when the cells are immobilized in alginate beads than when they are free in suspension. Cadmium causes a drop in the total protein content, but on the other hand induces an overproduction of Exopolysaccharides (EPS). In addition, cadmium stimulates enzymatic activities, catalase, superoxide dismutase and glutathione in the three YL-ML1, YL-SS2 and YL-SS3 Proteobacteria. However, strain YL-SS8 (Gram-Positive) showed a reduction of these three parameters. We noted a difference in the protein profile of the strains tested in the absence and presence of cadmium. This change has materialized by overexpression, induction and / or repression of proteins of different molecular masses A PCR allowed us to detect the cadA gene in the selected strains, this gene confers a cadmium resistance by coding an efflux protein. This gene was confirmed by sequencing after cloning, at the level of strain YL-ML1. This original result reveals the role of lateral transfer of genes in the acquisition of resistance of this enterobacterium in a soil polluted by cadmium. The results of the present study show that the strains respond to the stress generated by cadmium, overproduction of EPS, activation of the antioxidant system and induction of certain stress proteins, as well as possible extrusion of metal ions by ATPases pumps. efflux coded by the cadA gene

يف هذه ادلراسة ، مت عزل 301 بكترياي مقاومة اكدميوم من 9 تربة ملوثة ابملعادن الثقيةل من مناطق خمتلفة من اجلزائر. 99٪ من السالالت وجد أهنا سلبية الغرام ويه يف ا ألساس تنمتي اىل جنس Pseudomonas و Burkholderia و Aeromonas والعائةل Enterobacteriaceae . تنمتي الغرام ا الجيابية )9 ٪( يف الغالب اىل أجناس الع صيات. مجيع السالالت لها MICs هممة جدا ، واليت تت أرحج ما بني 900 و 0000 ميكروغرام / مل ، ومقاومة متعددة ضد 30 مضادا حيواي مت اختبارها. أربع سالالت عالية املقاومة دل Cd مت حتديدها عىل املس توى اجلزييئ بواسطة تسلسل rRNA 16S اكنت اتبعة لـ Raoultella ornithinolytica )سالةل -YL (Klebsiella pneumoniae ،ML1 )سالةل (Pseudomonas fluorescens ،YL-SS2 )سالةل ( .(Bacillus ،YL-SS3 Infantis )سالةل YL-SS8(. ترامكت هذه السالالت مكيات كبرية جدا من Cd خالل 09 ساعة ا ألوىل من احلضانة ، عىل الرمغ من الت أثري السام لل Cd ، وأعرب عن تثبيط هلم المنو. ترامك ، هو أفضل قليال عندما يمت خلع اخلالاي يف حبات اجلينات. يسبب Cd اخنفاض يف الربوتني اللكي ، لكنه يؤدي اىل فرط انتاج EPS حيفز النشاط ا ألنزميي ، مثل الاكتالز ، ديسمواتز superoxide و glutathione احليوي يف YL-ML1 YL-SS2 و YL-SS3 ، ولكن سالةل YL-SS8 أظهرت اخنفاضا يف هذه املعايري الثالثة ا ألخرية. الحظنا وجود اختالف يف بروفيل الربوتني يف سالالت الاختبار يف غياب ووجود الاكدميوم. يسمح PCR للكشف عن جني cadA يف سالالت اختبار ، وهذا اجلني مينح املقاومة ل Cd بتشفري بروتني افراز ، مت ت أكيد هذا اجلني بواسطة التسلسل يف سالةل YL-ML1. أظهرت نتاجئ ادلراسة احلالية أن السالالت تس تجيب للضغط الناجت عن الاكدميوم ، اب الفراط يف انتاج الـ EPS ، وتفعيل نظام مضاد الت أكسد وحتريض بعض بروتينات ا الهجاد ، اب الضافة اىل احامتل خروج أيوانت Cd عن طريق مضخات التدفق.