Πτυχιακή Εργασία

Συγκριτική μελέτη πρωτεϊνών του ακραιόφιλου αρχαίου Metallosphaera sedula με ομόλογες πρωτεΐνες άλλων οργανισμών

Σαμαράς Δημήτριος

ΑΕΜ 1664

Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: Δρ. Φαδούλογλου Βασιλική

Αλεξανδρούπολη 2021 Περιεχόμενα

Περιεχόμενα 1 Ευχαριστίες 2 Περίληψη 3 Abstract 4 1. Εισαγωγή 5 1.1. Οι ακραιόφιλοι οργανισμοί 5 Θερμόφιλα 7 Ψυχρόφιλα 8 Οξεόφιλα 9 Αλκαλόφιλα 9 Αλόφιλα 9 1.2. Εφαρμογές στη βιοτεχνολογία 10 1.3. Το αρχαίο Metallosphaera sedula 12 1.4. Σκοπός 13 2. Υλικά και μέθοδοι 14 3. Αποτελέσματα 17 3.1 Αναγωγάση του υδραργύρου 18 3.2 Μηλική αφυδρογονάση 23 3.3 Κιτρική συνθάση 29 3.4 Αποκαρβοξυλάση της 5’-μονοφωσφορικής οροτιδίνης 35 3.5 Δεϋδρατάση του 3-υδροξυπροπιονυλο-CoA 39 3.6 Vacuolar protein sorting 4 AAA-ATPase 44 4. Συμπεράσματα – Συζήτηση 50 5. Βιβλιογραφικές αναφορές 55 6. Παράρτημα 59

1 Ευχαριστίες

Σε αυτό το σημείο θα ήθελα να ευχαριστήσω ειλικρινά την επιβλέπουσα καθηγήτριά μου Δρ. Βασιλική Φαδούλογλου που με δέχθηκε στο εργαστήριό της και μου έδωσε την ευκαιρία να εκπονήσω την πτυχιακή μου εργασία υπό την επίβλεψή της. Ήταν διαθέσιμη και πρόθυμη να μου παρέχει οποιαδήποτε βοήθεια και καθοδήγηση κάθε φορά που τη χρειάστηκα. Με την υπομονή και επιμονή που έδειξε με βοήθησε να αποκτήσω θεωρητικές γνώσεις πάνω στο αντικείμενο της εργασίας, μου έδωσε σημαντικά εφόδια για τη μετέπειτα σταδιοδρομία μου, ενώ συνέβαλε και στη γενικότερη βελτίωσή μου ως άνθρωπο και εκκολαπτόμενο επιστήμονα. Φυσικά δε θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω την οικογένεια μου που στήριξε και συνεχίζει να στηρίζει την κάθε μου επιλογή και το κάθε μου βήμα.

2 Περίληψη

Οι ακραιόφιλοι οργανισμοί (extremophiles) έχουν αναπτύξει πληθώρα μηχανισμών με τους οποίους καθίσταται δυνατή η επιβίωση τους σε περιβάλλοντα όπου επικρατούν ακραίες συνθήκες. Συνθήκες όπως ακραίες τιμές θερμοκρασίας, pH, αλατότητας, πίεσης ή και συνδυασμός αυτών μπορεί να οδηγήσουν στην αποδιάταξη και απώλεια ενεργότητας των πρωτεϊνών με φυσικό επακόλουθο το θάνατο του οργανισμού. Ένας τρόπος με τον οποίο πολλοί οργανισμοί επιβιώνουν σε ακραίες συνθήκες είναι η απομόνωση του εξωτερικού τους περιβάλλοντος από το εσωτερικό τους. Παραδείγματος χάριν, ορισμένοι οξεόφιλοι οργανισμοί διαθέτουν αντλίες με τις οποίες αποβάλουν ιόντα υδρογόνου με αποτέλεσμα να διατηρούν σχέδον ουδέτερο pH στο εσωτερικό τους, ανεξάρτητα με το όξινο pH που επικρατεί στο εξωτερικό τους περιβάλλον. Ωστόσο, πολλές φορές κάτι τέτοιο δεν είναι δυνατόν. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελούν οι οργανισμοί που ζουν σε περιβάλλοντα όπου επικρατούν ακραίες θερμοκρασίες. Οι οργανισμοί αυτοί δεν μπορούν να απομονώσουν το εσωτερικό τους από τις ακραίες θερμοκρασίες και επομένως αναγκάστηκαν να αναπτύξουν άλλους μηχανισμούς για να επιβιώσουν. Στους μηχανισμούς αυτούς μπορεί να ενέχονται προσαρμογές της πρωτεϊνικής δομής και αμινοξικής αλληλουχίας, οι οποίες αποσκοπούν στη διατήρηση της σταθερότητας και ενεργότητας των πρωτεϊνών τους κάτω από τις ακραίες συνθήκες στις οποίες ζουν. Στην παρούσα εργασία μελετήσαμε πρωτεΐνες του θερμόφιλου και οξεόφιλου αρχαίου Metallosphaera sedula και τις συγκρίναμε με ομόλογες πρωτεΐνες τους απο μεσόφιλους ή ακραιόφιλους οργανισμούς. Σκοπός μας ήταν ο πιθανός εντοπισμός χαρακτηριστικών που έχουν την τάση να εμφανίζονται ή να απουσιάζουν από πρωτεΐνες που έχουν εξελιχθεί έτσι ώστε να παραμένουν λειτουργικές σε ακραίες συνθήκες.

3 Abstract

Extremophilic organisms have developed a wide variety of mechanisms which enable them to survive in environments where the conditions seem incompatible with life to humans. Conditions like extreme temperature, pH, salinity, pressure or a combination of those can lead to the denaturation of proteins and loss of their activity, which naturally leads to the death of the organism. One way which enables organisms to survive extreme conditions is by isolating their external from their internal environment. For example, some acidophiles have proton pumps that allow them to keep their cytoplasm at pH values near neutral, regardless of their extremely acidic external environment. However, this is not always possible. Organisms that live in extremely hot or cold environments is one such example. These organisms cannot shut out heat or cold, so they had to develop different mechanisms to survive. In the mechanisms developed by extremophilic organisms there could be adaptations to the protein structure and amino acid sequence, which aim to the retention of the proteins’ stability and activity under the extreme conditions in which they live. In the present study, we studied proteins of the thermoacidophilic archaeon Metallosphaera sedula and we compared them with homologous proteins from mesophilic or extremophilic organisms. Our goal was to identify protein traits that tend to appear or be absent from specific proteins and could possibly be associated with their ability to remain functional under extreme conditions.

4 1. Εισαγωγή

1.1 Οι ακραιόφιλοι οργανισμοί

Η Διεθνής Ένωση Θεωρητικής και Εφαρμοσμένης Χημείας (IUPAC) ορίζει ως κανονικές συνθήκες θερμοκρασίας και πίεσης περιβάλλοντος τους 25oC και 1 atm αντίστοιχα. Ως προς το pH και την αλατότητα, pH 5-9 και αλατότητα που δεν ξεπερνά το 1.2% NaCl (w/v) αποτελούν τιμές ευρέως αποδεκτές ως “φυσιολογικές” (Merino et al. 2019; Schröder et al. 2020). Στον πλανήτη μας υπάρχει πληθώρα περιβαλλόντων όπου τουλάχιστον ένας από τους παραπάνω παράγοντες μπορεί να παίρνει τιμές εκτός αυτών των ορίων. Τέτοιου είδους περιβάλλοντα περιλαμβάνουν ιαματικές πηγές, υδροθερμικές αναβλύσεις και τα ηφαίστεια όπου επικρατεί θερμοκρασία που πλησιάζει ή και ξεπερνά τους 100oC, την Αρκτική και την Ανταρκτική που χαρακτηρίζονται από πολύ χαμηλές θερμοκρασίες, ενώ υπάρχουν και περιβάλλοντα όπως οι έρημοι όπου παρατηρούνται μεγάλες θερμοκρασιακές διακυμάνσεις στη διάρκεια ενός εικοσιτετραώρου. Παράδειγμα αποτελεί η έρημος Σαχάρα όπου η θερμοκρασία μπορεί να κυμαίνεται από τους 50oC την ημέρα στους -4oC κατά τη διάρκεια της νύχτας. Ακραία περιβάλλοντα αποτελούν επίσης τα βάθη των ωκεανών που χαρακτηρίζονται από έλλειψη φωτός και υψηλή πίεση που μπορεί να ξεπερνά τα 110 MPa, όξινες λίμνες όπως η λίμνη Kawah Ijen όπου επικρατεί pH<0.3, καθώς και αλκαλικές λίμνες όπως η λίμνη Bogoria η οποία χαρακτηρίζεται από αλατότητα >40% και pH>10.3 (Peoples et al. 2019; Löhr et al. 2004; Jirsa et al. 2013; Rothschild and Mancinelli 2001;). Ορισμένα από τα περιβάλλοντα αυτά καθώς και η τοποθεσία τους φαίνονται στην Εικόνα 1.

5 Εικόνα 1: Πάνω αριστερά: Η έρημος Σαχάρα, μια έρημος στη νότια Αφρική όπου η θερμοκρασιακή διακύμανση μπορεί να ξεπερνά τους 40oC κατά τη διάρκεια ενός εικοσιτετραώρου. Η τοποθεσία της φαίνεται στο χάρτη της εικόνας με την κόκκινη πινέζα. Πάνω δεξιά: Φωτογραφία από το βυθό της τάφρου των Μαριανών, το βαθύτερο σημείο των Ωκεανών του πλανήτη όπου επικρατεί πολύ υψηλή πίεση και έλλειψη φωτός. Η τοποθεσία της φαίνεται στο χάρτη της εικόνας με την μπλε πινέζα. Κάτω αριστερά: H πιο όξινη λίμνη στον πλανήτη. Η λίμνη Kawah Ijen σχηματίστηκε στον κρατήρα του ηφαιστείου Ijen στην Ινδονησία και η θέση της φαίνεται στο χάρτη με την πράσινη πινέζα. Κάτω δεξιά: Η λίμνη Bogoria, μια λίμνη στην Κένυα στην οποία επικρατεί πολύ υψηλό pH και αλατότητα. Η τοποθεσία της φαίνεται στο χάρτη της εικόνας με την πορτοκαλί πινέζα.

6 Οι άνθρωποι όπως και τα περισσότερα ζώα κατατάσσονται στους μεσόφιλους οργανισμούς, δηλαδή προτιμούν θερμοκρασίες στο εύρος 20-45oC (βέλτιστη ανάπτυξη σε θερμοκρασία 30-39oC) και pH κοντά στο 7 (Schiraldi and De Rosa 2014). Ως εκ τούτου η επιβίωση του ανθρώπου σε ακραία περιβάλλοντα όπως αυτά που αναφέρθηκαν πιο πάνω είναι από πολύ δύσκολη έως αδύνατη. Γνωρίζουμε όμως πως υπάρχει ένας τεράστιος αριθμός οργανισμών που ευδοκιμούν σε περιβάλλοντα όπου επικρατούν ακραίες συνθήκες (Madigan and Marrs 1997). Πέρα από την ικανότητα τους να επιβιώνουν, κάποιοι από τους οργανισμούς αυτούς έχουν εξελιχθεί σε αυτές τις συνθήκες με τρόπο που αδυνατούν να επιβιώσουν σε άλλες συνθήκες. Παραδείγματα τέτοιων οργανισμών αποτελούν το βακτήριο Anaerobranca gottschalkii που αναπτύσσεται μόνο απουσία οξυγόνου (Prowe and Antranikian 2001), το αρχαίο Pyrococcus furiosus που αδυνατεί να αναπτυχθεί σε θερμοκρασία χαμηλότερη των 65oC (Fiala and Stetter 1986) κ.ά. Περισσότεροι ακραιόφιλοι οργανισμοί και λεπτομέρειες για αυτούς μπορούν να βρεθούν στον πίνακα του παραρτήματος τον οποίο κατασκευάσαμε στα πλαίσια της παρούσας εργασίας. Στον πίνακα αυτό υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός ακραιόφιλων οργανισμών καθώς και στοιχεία για αυτούς, όπως η επικράτεια στην οποία ανήκουν, οι ακραίες συνθήκες στις οποίες επιβιώνουν, τα μέρη στα οποία εντοπίζονται και η μοριακή βάση της ανθεκτικότητά τους όπου αυτή είναι γνωστή. Οι οργανισμοί που μπορούν να αναπτύσσονται σε ακραίες συνθήκες χωρίζονται σε 2 κατηγορίες. Μια κατηγορία αποτελούν οι οργανισμοί που μπορούν μεν να επιβιώνουν σε ακραίες συνθήκες, αναπτύσσονται όμως βέλτιστα σε φυσιολογικές συνθήκες (extremotolerant). Η δεύτερη κατηγορία αποτελείται από τους ακραιόφιλους οργανισμούς, δηλαδή οργανισμούς που αναπτύσσονται βέλτιστα σε ακραίες συνθήκες (Merino et al. 2019). Οι ακραιόφιλοι οργανισμοί χωρίζονται με τη σειρά τους σε κατηγορίες με βάση τις ιδιαίτερες συνθήκες στις οποίες αναπτύσσονται. Οργανισμοί που αναπτύσσονται σε ακραία χαμηλή ή υψηλή θερμοκρασία ονομάζονται ψυχρόφιλοι και θερμόφιλοι αντίστοιχα. Με την ίδια λογική οργανισμοί που αναπτύσσονται σε πολύ όξινο ή βασικό pH ονομάζονται οξεόφιλοι και αλκαλόφιλοι αντίστοιχα. Οργανισμοί που για την ανάπτυξή τους απαιτούν υψηλή συγκέντρωση άλατος κατατάσσονται στους αλόφιλους οργανισμούς. Άλλες κατηγορίες ακραιόφιλων οργανισμών αποτελούν οι πιεζόφιλοι και οι αναερόβιοι οργανισμοί, οι οποίοι για την ανάπτυξή τους απαιτούν υψηλή πίεση και απουσία οξυγόνου αντίστοιχα (Reed et al. 2013). Τέλος, πολλοί οργανισμοί απαιτούν περισσότερες από μία ακραίες συνθήκες για να αναπτυχθούν, γεγονός που τους κατατάσσει στην κατηγορία των πολυακραιόφιλων (Rampelotto 2013). Ένα παράδειγμα πολυακραιόφιλου οργανισμού αποτελεί και το αρχαίο με το οποίο ασχοληθήκαμε, το Metallosphaera sedula, που για την ανάπτυξή του απαιτεί τόσο υψηλή θερμοκρασία όσο και χαμηλό pH (Huber et al. 1989).

7 Οι υδροθερμικές και ηφαιστειακές αναβλύσεις καθώς και οι ιαματικές πηγές αποτελούν παραδείγματα αφιλόξενων περιβαλλόντων, με την υψηλή θερμοκρασία που επικρατεί σε αυτά να μπορεί να προκαλέσει το θάνατο των περισσότερων οργανισμών. Στο πρωτεϊνικό επίπεδο, η υψηλή θερμοκρασία διαταράσσει τις μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις που ευθύνονται για τη διατήρηση της τρισδιάστατης δομής των πρωτεϊνών, με αποτέλεσμα τη μετουσίωση τους (Tomazic and Klibanov 1988). Η μετουσίωση των πρωτεϊνών σε κύτταρα θηλαστικών ξεκινά ήδη μετά από έκθεσή τους σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες των 40°C (Lepock 1997), ενώ θερμοκρασίες που πλησιάζουν τους 100°C φυσιολογικά προκαλούν τη μη αντιστρεπτή μετουσίωση των πρωτεϊνών και των νουκλεϊκών οξέων, και αυξάνουν τη ρευστότητα των μεμβρανών σε θανατηφόρα επίπεδα. Επίσης, η χλωροφύλλη αποδομείται σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες των 75°C, με αποτέλεσμα να αποκλείεται και η φωτοσύνθεση (Rothschild and Mancinelli 2001). Υπάρχουν ωστόσο, όπως ήδη αναφέραμε στην προηγούμενη παράγραφο, οργανισμοί οι οποίοι ευδοκιμούν σε περιβάλλοντα όπου επικρατούν υψηλές θερμοκρασίες (Brock TD 1985). Οι οργανισμοί αυτοί χωρίζονται σε 2 υποκατηγορίες, ανάλογα με το εύρος θερμοκρασίας στο οποίο αναπτύσσονται. Ως θερμόφιλοι χαρακτηρίζονται οι οργανισμοί οι οποίοι αναπτύσσονται βέλτιστα σε θερμοκρασία μεγαλύτερη των 45°C, ενώ οι οργανισμοί που προτιμούν θερμοκρασία μεγαλύτερη των 80°C ονομάζονται υπερθερμόφιλοι (Madigan and Marrs 1997). Το κρύο είναι αδιαμφισβήτητα η πιο συχνά εμφανιζόμενη ακραία συνθήκη στον πλανήτη, καθώς στην πλειοψηφία του επικρατούν θερμοκρασίες μικρότερες των 5°C. Περισσότερο από το 70% του πλανήτη καλύπτεται από ωκεανούς, στα 2/3 των οποίων επικρατεί θερμοκρασία περίπου 2°C. Εάν συμπεριλάβουμε και τους πόλους, τότε καταλήγουμε στο ότι περισσότερο από το 80% της βιόσφαιρας της Γης είναι μονίμως κρύα (Russell 1990). Η χαμηλή θερμοκρασία μπορεί να επιδράσει αρνητικά στην ανάπτυξη ενός οργανισμού με ποικίλους τρόπους. Για παράδειγμα οι πρωτεΐνες έχουν συνήθως πολύ χαμηλή ενεργότητα σε αυτές τις συνθήκες, διότι σε συνθήκες χαμηλής θερμοκρασίας η ταχύτητα αλλαγής διαμόρφωσης των πρωτεϊνών μειώνεται λόγω της χαμηλής κινητικής ενέργειας (Cavicchioli et al. 2000). Ένα ακόμα πολύ σημαντικό πρόβλημα που εμφανίζεται με την μείωση της θερμοκρασίας πέραν των 0°C έχει να κάνει με τη φάση του νερού. Σε αυτή τη θερμοκρασία το νερό παγώνει και οι κρύσταλλοι που σχηματίζονται μπορούν να προκαλέσουν ρήξη των κυτταρικών μεμβρανών, ενώ σταματούν και οι χημικές αντιδράσεις που απαιτούν νερό σε υγρή μορφή για να πραγματοποιηθούν. Έτσι, το πάγωμα του ενδοκυτταρικού νερού είναι σχεδόν πάντα θανατηφόρο (Rothschild and Mancinelli 2001). Μοναδική γνωστή εξαίρεση σε αυτόν τον κανόνα αποτελεί ο νηματώδης Panagrolaimus davidi που επιβιώνει ακόμα και αν παγώσει όλο το νερό στο σώμα του (Wharton and Ferns 1995). Επίσης, η ενέργεια ενεργοποίησης των ενζύμων αυξάνεται δραματικά, και έτσι η ενεργότητά τους μειώνεται ακόμα περισσότερο (Feller, 2010). Παρά τις προκλήσεις που συνοδεύουν ένα κρύο περιβάλλον,

8 υπάρχουν πολυάριθμοι οργανισμοί που ευδοκιμούν στις συνθήκες αυτές (D’Amico et al. 2006). Οι οργανισμοί αυτοί ονομάζονται ψυχρόφιλοι και ορίζονται ως οι οργανισμοί που εμφανίζουν βέλτιστη ανάπτυξη σε θερμοκρασία 15°C ή χαμηλότερη, μέγιστη θερμοκρασία ανάπτυξης τους 20°C και ελάχιστη θερμοκρασία ανάπτυξης ≤ 0°C (Morita 1975). Τα όξινα περιβάλλοντα που εντοπίζονται στη βιόσφαιρα ποικίλουν τόσο ως προς την τιμή του pH που επικρατεί σε αυτά, όσο και από το εαν είναι φυσικής ή ανθρωπογενούς προέλευσης (Johnson and Quatrini 2016). Το χαμηλό pH που χαρακτηρίζει τέτοια περιβάλλοντα έχει ως αποτέλεσμα την πρωτονίωση ορισμένων αμινοξέων και συνεπώς την αλλαγή του φορτίου τους. Η μεταβολή αυτή του φορτίου μπορεί να διαταράξει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αμινοξέων που σταθεροποιούν την τρισδιάστατη δομή των πρωτεϊνών, με συνέπεια το ξεδίπλωμα τους (Reed et al. 2013). Παρά το γεγονός ότι τα περιβάλλοντα αυτά είναι τοξικά για την πλειοψηφία των προκαρυωτών και ευκαρυωτών, οργανισμοί που ζουν σε συνθήκες χαμηλού pH έχουν βρεθεί σε όλες τις επικράτειες της ζωής και ονομάζονται οξεόφιλοι (Johnson and Quatrini, 2016). Οι οργανισμοί αυτοί ανήκουν κυρίως στις επικράτειες των βακτηρίων και των αρχαίων (Johnson and Hallberg 2003). Ένας ευρέως αποδεκτός ορισμός κατατάσσει στους οξεόφιλους τους οργανισμούς που είναι μεταβολικά ενεργοί και αναπτύσσονται σε τιμές pH μικρότερες του 3 (Baker-Austin and Dopson 2007). Παρόμοια με τα όξινα περιβάλλοντα, υπάρχει μια μεγάλη ποικιλία περιβαλλόντων που χαρακτηρίζονται από βασικό pH (Preiss et al. 2015), με τις αλκαλικές λίμνες να αποτελούν τα πλέον αλκαλικά περιβάλλοντα με τιμές pH που συχνά ξεπερνούν το 11.5 (Jones et al. 1994). Η υψηλές τιμές pH προκαλούν την αποπρωτονίωση των αμινοξέων με αποτέλεσμα να διαταράσσονται οι ιοντικές αλληλεπιδράσεις που διατηρούν τη δομή των πρωτεϊνών και τελικά το ξεδίπλωμά τους, ενώ η αλλαγή αυτή του φορτίου μπορεί να επηρεάσει και τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και ενζύμου-υποστρώματος. Πληθώρα οργανισμών, όπως βακτήρια που ανήκουν στα γένη Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas και Streptomyces καθώς και ευκαρυώτες όπως διάφοροι μύκητες έχουν βρεθεί σε πολύ αλκαλικές αλμυρές λίμνες όπως η Λίμνη Νάτρον στην Τανζανία ή η Λίμνη Mono στην Καλιφόρνια (Duckworth et al. 1996; Groth et al. 1997; Horikoshi 1999; Yakimov et al. 2001). Οργανισμοί τέτοιου είδους ονομάζονται αλκαλόφιλοι και αναπτύσσονται σε pH>9 (βέλτιστη ανάπτυξη σε pH 10-12), ενώ αδυνατούν να αναπτυχθούν ή αναπτύσσονται πολύ αργά σε pH ~7 (Horikoshi 1999).

Οργανισμοί από όλες τις επικράτειες της ζωής έχουν βρεθεί σε περιβάλλοντα όπου επικρατούν συνθήκες υψηλής αλατότητας (Oren 1999) όπως είναι οι αλυκές, τα αλατωρυχεία, ο ωκεανός, ο πολικός πάγος και άλλες παράκτιες περιοχές (Edbeib et al. 2016). Η υψηλή συγκέντρωση άλατος που επικρατεί σε τέτοια περιβάλλοντα αποτελεί εμπόδιο για την επιβίωση πολλών οργανισμών καθώς τυπικά οι πρωτεΐνες απογυμνώνονται από τα μόρια νερού, με

9 συνέπεια τη συσσωμάτωση και κατακρήμνισή τους, ενώ το άλας διαταράσσει και τις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ φορτισμένων αμινοξέων (Reed et al. 2013; Karan et al. 2012). Οι οργανισμοί που ευδοκιμούν σε συνθήκες υψηλής αλατότητας ονομάζονται αλόφιλοι και πιο συγκεκριμένα, ανάλογα με τη συγκέντρωση άλατος που επικρατεί στο περιβάλλον τους χαρακτηρίζονται περεταίρω ως ελαφρώς αλόφιλοι (0.2Μ), μέτρια αλόφιλοι (0.5-2.5Μ), οριακά ακραίοι αλόφιλοι (borderline extreme halophiles) (>2.5-4.0Μ) και ακραία αλόφιλοι (>4.0-5.9Μ) (Edbeib et al. 2016). Τέλος, υπάρχουν και οργανισμοί που μπορούν να αναπτύσσονται τόσο απουσία άλατος, όσο και παρουσία του σε συγκεντρώσεις >2.5Μ (Margesin and Schinner 2001).

1.2 Εφαρμογές των ακραιόφιλων στη βιοτεχνολογία

Εφαρμογές της βιοτεχνολογίας είναι γνωστές από την αρχαιότητα (Farag et al. 2019). Ένα από τα πρώτα παραδείγματα αποτελεί η χρηση ζυμομυκήτων από τους Σουμέριους και τους Βαβυλώνιους το 6000 π.Χ. για την παραγωγή μπύρας καθώς και από τους Αιγύπτιους το 4000 π.Χ. για την παραγωγή ψωμιού (Oliver 1991). Η χρήση μικροοργανισμών για την παραγωγή προϊόντων με εμπορική αξία έχει ένα τεράστιο εύρος εφαρμογών που κυμαίνεται από την παραγωγή μπύρας και κρασιού (Bokulich and Bamforth 2013), την παραγωγή φαρμακευτικών προϊόντων όπως τα αντιβιοτικά (Rehman et al. 2020) και πολλά άλλα. Στις μέρες μας η βιοτεχνολογία έχει ευρύτατες εφαρμογές στην παραγωγή προϊόντων. Πολλές από τις χημικές αντιδράσεις που παίρνουν μέρος στην παραγωγή τέτοιων προϊόντων απαιτούν ακραίες συνθήκες θερμοκρασίας, πίεσης, αλατότητας και pH. Συχνά χρησιμοποιούνται ένζυμα από μεσόφιλους οργανισμούς (Herbert 1992). Τα ένζυμα αυτά συνήθως υφίστανται γενετικές ή χημικές τροποποιήσεις ώστε να προσαρμόζονται στις ακραίες αυτές συνθήκες, μια χρονοβόρα και συχνά ακριβή διαδικασία. Παράδειγμα αποτελεί η χημική τροποποίηση της πρωτεάσης σαβινάση με φικόλη ή δεξτράνη, προκειμένου να αυξηθεί η υδρόλυση αζω-καζεΐνης έως και 5 φορές σε χαμηλή θερμοκρασία σε σχέση με το μη τροποποιημένο ένζυμο (Siddiqui et al. 2009). Η διαδικασία αυτή μπορεί να αποφευχθεί, καθώς η φύση παρέχει την εναλλακτική των ενζύμων από ακραιόφιλους οργανισμούς που δεν απαιτούν τέτοιου είδους τροποποιήσεις (Elleuche et al. 2014). Η χρήση τέτοιων ενζύμων είναι πλέον ευρέως διαδεδομένη και έχει βοηθήσει στην αντιμετώπιση προβλημάτων που παλαιότερα αποτελούσαν σημαντικά εμπόδια στο χώρο της βιοτεχνολογίας. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αποτελεί βασικό εργαλείο σε κάθε εργαστήριο. Ένα πολύ γνωστό και επίκαιρο παράδειγμα εφαρμογής αυτής της τεχνικής αποτελεί το μοριακό τεστ ανίχνευσης του κορονοϊού SARS-CoV-2 που προκαλεί τη νόσο COVID-19, ενώ έχει ωφελήσει

10 και τομείς που δεν είναι στενά συνυφασμένοι με την επιστήμη, με χαρακτηριστικό παράδειγμα τη χρήση της τεχνικής για την ταυτοποίηση ή τον αποκλεισμό υπόπτων σε εγκλήματα με βάση το γενετικό τους υλικό (Gurvitz et al. 1994). H τεχνική αυτή αποτελεί αδιαμφισβήτητα ένα από τα πιο γνωστά παραδείγματα χρήσης ακραιόφιλων οργανισμών στη βιοτεχνολογία, με τις DNA πολυμεράσες θερμόφιλων οργανισμών όπως ο Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus και Thermococcus litoralis, γνωστές και ως Taq (Tindal and Kunkel 1988), Pfu (Lundberg et al. 1991) και Vent (Mattila et al. 1991) αντίστοιχα να αποτελούν βασικα αντιδραστήριά της. Η αυτοματοποίηση της PCR δε θα ήταν δυνατή χωρίς τη χρήση τέτοιων ενζύμων καθώς η υψηλή θερμοκρασία που χρησιμοποιείται κατά τη διαδικασία αυτή απαγορεύει τη χρήση μεσόφιλων πολυμερασών. Τα ένζυμα των απορρυπαντικών αποτελούν περίπου 32% της παγκόσμιας παραγωγής εμπορικών ενζύμων (Lomax et al. 1996). Οι πρωτεάσες και οι λιπάσες αποτελούν παραδείγματα τέτοιων ενζύμων καθώς αποτελούν συστατικά των απορρυπαντικών και χρησιμοποιούνται για την καταπολέμηση λεκέδων με βάση πρωτεΐνες και λίπη αντίστοιχα (Kumar et al. 2008; Fariha et al. 2010). Πρωτεάσες από ψυχρόφιλους οργανισμούς δοκιμάστηκαν στην πλύση σε κρύο νερό, ωστόσο αποδείχθηκαν ασταθείς λόγω της χαμηλής σταθερότητάς τους σε θερμοκρασία δωματίου. Παρ’όλα αυτά η προσθήκη μιας ιδιαίτερα ευέλικτης περιοχής μια ψυχρόφιλης πρωτεάσης σε μεσόφιλη πρωτεάση είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή μιας χειμερικής πρωτεΐνης που αύξησε την απόδοση κατά το πλύσιμο σε κρύο νερό (Tindbaek et al. 2004). Παρομοίως, βρέθηκε πως η χρήση λιπάσης από το ανθεκτικό σε υψηλή συγκέντρωση άλατος βακτήριο Staphylococcus arlettae βελτίωσε την αφαίρεση λιπαρών λεκέδων κατά 21% όταν χρησιμοποιήθηκε ως πρόσθετο σε εμπορικό απορρυπαντικό (Chauhan et al. 2013). Περισσότερο από το 70% του πληθυσμού παγκοσμίως αδυνατεί να καταναλώσει προϊόντα που περιέχουν λακτόζη λόγω δυσανεξίας στο συγκεκριμένο δισακχαρίτη που οφείλεται σε απώλεια ενεργότητας της β-γαλακτοσιδάσης (Messia et al. 2007). Ο καλύτερος τρόπος για την αποφυγή των συμπτωμάτων που συνοδεύουν την κατανάλωση προϊόντων με λακτόζη σε τέτοια άτομα είναι η χρήση προϊόντων χωρίς λακτόζη που παράγονται με τη χρήση β-γαλακτοσιδάσης από οργανισμούς όπως ο Kluyveromyces lactis (Messia et al. 2007). Η διαδικασία αυτή προϋποθέτει την αύξηση της θερμοκρασίας του προϊόντος από τους 5°C στους 25°C ώστε να είναι ενεργό το ένζυμο. Η αύξηση αυτή της θερμοκρασίας εγκυμονεί τον κίνδυνο ανάπτυξης παθογόνων οργανισμών, ενώ επηρεάζει και τη γεύση των προϊόντων. Μια απλή λύση σε αυτό το πρόβλημα είναι η χρήση ενζύμων που προέρχονται από ψυχρόφιλους οργανισμούς (Coker and Brenchley 2006). Επί του παρόντος έχουν χαρακτηριστεί αρκετά ένζυμα τέτοιου είδους που εμφανίζουν παρόμοια απόδοση με τα συχνά χρησιμοποιούμενα μεσόφιλα ένζυμα, χωρίς όμως την ανάγκη αύξησης της θερμοκρασίας (Coker and Brenchley 2006; Coker et al. 2003).

11 Μία ακόμα εφαρμογή των ακραιόφιλων οργανισμών στη βιοτεχνολογία είναι η βιολογική έκπλυση μετάλλων (Podar and Reysenbach 2006), δηλαδή η χρήση της μεταβολικής δραστηριότητας μικροοργανισμών για την ανάκτηση μετάλλων από ορυκτά χαμηλής περιεκτικότητας σε μέταλλα (Vera et al. 2013). Το 1992, στη βιολογική έκπλυση μετάλλων βασιζόταν το 10% της παγκόσμιας παραγωγής χαλκού, ενώ πιο πρόσφατα δεδομένα εκτιμούν πως το ποσοστό αυτό φτάνει το 15% για το χαλκό και 5% για το χρυσό (Everts 2012). Η διαδικασία αυτή χρησιμοποιείται και για την εξόρυξη μετάλλων όπως το ασήμι, ο ψευδάργυρος, το νικέλιο και το ουράνιο. Για τη βιολογική έκπλυση μετάλλων χρησιμοποιούνται οξεόφιλοι οργανισμοί συχνά από τα γένη Acidithiobacillus και Ferroplasma, ενώ ανάλογα με τις συνθήκες μπορεί να χρησιμοποιούνται και πιο θερμόφιλα στελέχη από τα γένη Sulfolobus και Metallosphaera (Podar and Reysenbach 2006; Vera et al. 2013). Μάλιστα, έχει βρεθεί πως η χρήση θερμόφιλων οργανισμών μειώνει την πιθανότητα ρύπανσης του περιβάλλοντος, ενώ ταυτόχρονα μειώνεται και το κόστος ψύξης των δεξαμενών, μια διαδικασία απαραίτητη κατά τη χρήση μη θερμόφιλων οργανισμών.

1.3 Το αρχαίο Metallosphaera sedula

Ο Metallosphaera sedula εντοπίστηκε για πρώτη φορά σε ένα ηφαίστειο στην Ιταλία από τον Hubert et al. (1989) και ανήκει στην επικράτεια των αρχαίων. Έχει σφαιρικό σχήμα με διάμετρο 0.8-1.2 μm, είναι υποχρεωτικά αερόβιος και αναπτύσσεται σε θερμοκρασιακό εύρος 50-80°C (βέλτιστα σε θερμοκρασία 75°C) και pH 1.0-4.5 (βελτιστα σε pH 2.0), συνθήκες που τον κατατάσσουν στους πολυακραιόφιλους οργανισμούς. Μπορεί να αναπτύσσεται αυτότροφα σε περιβάλλον με πυρίτη, χαλκοπυρίτη, σφαλερίτη ή και συνδυασμό αυτών. Παρατηρήθηκε επίσης ανάπτυξη και στα συνθετικά σουλφίδια CdS, SnS, ZnS καθώς και στο στοιχειακό θείο. Η ανάπτυξη σε στοιχειακό θείο συνοδεύτηκε από παραγωγή θειικού οξέος. Αναπτύσσεται επίσης και ετερότροφα σε σύμπλεγμα οργανικών υποστρωμάτων όπως εκχύλισμα βοδινού, πεπτόνη, τρυπτόνη και εκχύλισμα μαγιάς, ενώ δεν παρατηρείται ανάπτυξη σε σάκχαρα (Huber et al. 1989). Μεταγραφική ανάλυση φανέρωσε χρήση διαφορετικών ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης (ORFs) και αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση κατά την ανάπτυξη κάτω από διαφορετικά υποστρώματα. Για παράδειγμα, κατά την ετερότροφη ανάπτυξη παρατηρείται αύξηση στην έκφραση της συνθετάσης του ηλεκτρυλο-CoA, ενός ενζύμου που παίρνει μέρος στον κύκλο των τρικαρβοξυλικών οξέων, ενώ το αυτοτροφικό μεταγράφωμα χαρακτηρίζεται από αυξημένη έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη βιοσύνθεση αμινοξέων, ριβοφλαβίνης και θειαμίνης (Auernik and Kelly 2009).

12 1.4 Σκοπός

Στην παρούσα πτυχιακή εργασία μελετήσαμε πρωτεΐνες του θερμο-οξεόφιλου αρχαίου Metallosphaera sedula και αναζητήσαμε χαρακτηριστικά που ενδεχομένως να σχετίζονται με την προσαρμογή τους στο περιβάλλον που εντοπίζεται ο οργανισμός αυτός. Αναλυτικότερα, πρωτεΐνες του M. sedula με γνωστή τρισδιάστατη δομή συγκρίθηκαν με ομόλογές τους επίσης γνωστής δομής πρωτεΐνες από ψυχρόφιλους, μεσόφιλους, θερμο-οξεόφιλους, υπερθερμόφιλους και αλόφιλους οργανισμούς. Η σύγκριση των πρωτεϊνών έγινε στη βάση μιας σειράς ιδιοτήτων, που αναφέρονται αναλυτικά παρακάτω, με σκοπό τον εντοπισμό χαρακτηριστικών που ενδεχομένως να σχετίζονται με την ικανότητά τους να παραμένουν λειτουργικές σε ακραίες συνθήκες.

13 2. Υλικά και μέθοδοι

Η RCSB PDB (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank, rcsb.org) είναι η βάση δεδομένων όπου καταχωρούνται οι πειραματικά προσδιορισμένες τρισδιάστατες δομές βιολογικών μακρομορίων και συμπλόκων τους (Kouranov 2006). Οι περισσότερες από αυτές τις δομές έχουν προκύψει μέσω πειραμάτων κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ, ενώ υπάρχουν και δομές που είναι αποτέλεσμα πειραμάτων πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας. Κάθε καταχώρηση στην PDB παρέχει μια πληθώρα πληροφοριών για την πρωτεΐνη στην οποία αναφέρεται. Δίνονται πληροφορίες όπως ο κωδικός PDB της πρωτεΐνης που είναι μοναδικός για κάθε καταχώρηση, το όνομα της πρωτεΐνης, ο οργανισμός από τον οποίο προέρχεται καθώς και το σύστημα στο οποίο εκφράστηκε. Παρέχονται επίσης πληροφορίες για τις συνθήκες του πειράματος προσδιορισμού της δομής της πρωτεΐνης, ενώ η καταχώρηση παραπέμπει τους αναγνώστες και στο άρθρο στο οποίο αναγράφεται αναλυτικά η μεθοδολογία που ακολούθησαν οι συγγραφείς του. Δίνονται επίσης πληροφορίες για την αμινοξική αλληλουχία της πρωτεΐνης, την ολιγομερική της κατάσταση, προσδέτες προσδεδεμένους στο μόριο της πρωτεΐνης καθώς και για την τυχόν ύπαρξη μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων. Τέλος, είναι δυνατή η απεικόνιση της τρισδιάστατης δομής των πρωτεϊνών στο εργαλείο απεικόνισης της PDB, ωστόσο δίνεται και η δυνατότητα λήψης αρχείου PDB ώστε να γίνει απεικόνιση της δομής της πρωτεΐνης σε κάποιο άλλο πρόγραμμα γραφικών που θα επιλέξει ο χρήστης. Μέσω της βάσης δεδομένων PDB βρήκαμε ποιές πρωτεΐνες του ακραιόφιλου αρχαίου Metallosphaera sedula έχουν μελετηθεί σε επίπεδο τρισδιάστατης δομής. Για κάθε μια από τις 6 αυτές πρωτεΐνες καθώς και για τις ομόλογές τους από άλλους οργανισμούς με τις οποίες έγινε η σύγκριση, πήραμε από την PDB πληροφορίες για την ολιγομερική τους κατάσταση, την ύπαρξη ή απουσία μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, ενώ μέσω της βιβλιογραφίας που συνοδεύει την κάθε καταχώρηση λάβαμε και πληροφορίες για τη βέλτιστη θερμοκρασία ενζυμικής ενεργότητας, όπου αυτή η πληροφορία ήταν διαθέσιμη. Επίσης, από την PDB πήραμε την αμινοξική αλληλουχία των πρωτεϊνών, καθώς και το αρχείο ατομικών συντεταγμένων για χρήση σε άλλα εργαλεία πρωτεϊνικής ανάλυσης και προγράμματα γραφικών. Το BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), είναι ένα εργαλείο που παρέχει τη δυνατότητα εύρεσης περιοχών μεταξύ αλληλουχιών που εμφανίζουν ομοιότητα. Το πρόγραμμα αυτό μπορεί να συγκρίνει νουκλεοτιδικές ή αμινοξικές αλληλουχίες με βάσεις δεδομένων αλληλουχιών, υπολογίζει τη στατιστική σημασία των αποτελεσμάτων και τα κατατάσει με σειρά σημαντικότητας. Στα αποτελέσματα υπάρχουν επίσης

14 πληροφορίες όπως εξελικτικές και λειτουργικές σχέσεις μεταξύ αλληλουχιών, ενώ ταυτοποιεί και μέλη οικογενειών γονιδίων (Altschul et al. 1990). Το BLAST αποτέλεσε βασικό εργαλείο στη μελέτη μας, καθώς μέσω αυτού βρήκαμε πρωτεΐνες ομόλογες με αυτές του οργανισμού επιλογής, δηλαδή του M. sedula, προκειμένου να τις συγκρίνουμε. Αυτό πραγματοποιήθηκε με την εισαγωγή της αλληλουχίας της εκάστοτε πρωτεΐνης του M. sedula στο BLAST και χρήση του αλγόριθμου blastp (Protein-Protein BLAST). Επιλέξαμε επίσης η αναζήτηση ομόλογων πρωτεϊνών να γίνει στη βάση δεδομένων PDB ώστε στα αποτελέσματα να εμφανίζονται μόνο ομόλογες πρωτεΐνες με διαθέσιμη τρισδιάστατη δομή. Το Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) είναι ένα πρόγραμμα που πραγματοποιεί πολλαπλή στοίχιση αλληλουχιών (Multiple Sequence Alignment, MSA) με βάση τη μέθοδο της προοδευτικής στοίχισης (Feng and Doolittle 1987). Το πρόγραμμα αυτό μας δίνει τη δυνατότητα στοίχισης τόσο νουκλεοτιδικών όσο και αμινοξικών αλληλουχιών, ενώ εκτός από τη στοίχιση μας δίνει και πληροφορίες όπως το ποσοστό ταυτότητας των αλληλουχιών και το φυλογενετικό δέντρο που φανερώνει τις εξελικτικές σχέσεις των μακρομορίων που στοιχήθηκαν. Το εργαλείο Clustal Omega ήταν το εργαλείο που επιλέξαμε για να πραγματοποιήσουμε τις αμινοξικές στοιχίσεις ανάμεσα στις αλληλουχίες του M. sedula και τις ομόλογές τους που πήραμε από το πρόγραμμα BLAST. Το ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) είναι ένα εργαλείο που υπολογίζει διάφορες ιδιότητες από μια πρωτεϊνική αλληλουχία (Gasteiger et al. 2005). Τέτοιες ιδιότητες αποτελούν το ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης, το σύνολο των θετικά και αρνητικά φορτισμένων αμινοξέων, το μοριακό της βάρος, ενώ δίνει επίσης πληροφορίες για το συνολικό μήκος της αλληλουχίας καθώς και της αμινοξικής της σύστασής. Το εργαλείο ProtParam χρησιμοποιήθηκε στις συγκρίσεις των πρωτεϊνών μας προκειμένου να διαπιστωθεί τυχόν επικράτηση ή έλλειψη ενός ή περισσοτέρων αμινοξέων. Το VADAR (Volume, Area, Dihedral Angle Reporter, http://vadar.wishartlab.com) είναι μια συλλογή περισσότερων από 15 διαφορετικών αλγορίθμων και προγραμμάτων που αναλύει πρωτεϊνικές δομές διαθέσιμες στην PDB. Δέχεται είτε αρχεία PDB είτε κωδικούς PDB και υπολογίζει ένα μεγάλο αριθμό δομικών παραμέτρων. Τέτοιες παράμετροι είναι στοιχεία δευτεροταγούς δομής, αμινοξέα που συμμετέχουν σε δεσμούς υδρογόνου, ο όγκος της πρωτεΐνης καθώς και πολλά στοιχεία για την επιφάνειά τους (Willard et al. 2003). Μέσω του εργαλείου VADAR συγκρίναμε ακριβώς αυτές τις παραμέτρους. Το ποσοστό εμφάνισης α-ελίκων, β-πτυχωτών, περιοχών βρόχων καθώς και των αμινοξέων που συμμετέχουν σε δεσμούς υδρογόνου. Επίσης συγκρίναμε το συνολικό όγκο των πρωτεϊνών και στοιχεία για την

15 επιφάνειά τους. Ως προς την επιφάνεια, συγκρίναμε τόσο το εμβαδόν της, όσο και το αντίστοιχο εμβαδόν και ποσοστό της φορτισμένης, πολικής και μη πολικής επιφάνειας. To FirstGlance in Jmol (https://www.bioinformatics.org/firstglance/fgij/index.htm) είναι ένας εύκολος τρόπος απεικόνισης τρισδιάστατων δομών πρωτεϊνών, DNA, RNA και συμπλόκων τους. Το πλεονέκτημά του εργαλείου αυτού έναντι άλλων προγραμμάτων γραφικών έγκειται στο γεγονός ότι λειτουργεί στον browser χωρίς να απαιτείται εγκατάστασή του. Προσφέρει πολλές δυνατότητες όπως είναι ο υπολογισμός του ποσοστού των αμινοξέων που συμμετέχουν σε γέφυρες άλατος και η απεικόνισή τους, η απεικόνιση των δισουλφιδικών δεσμών, των φορτισμένων, υδρόφοβων και πολικών αμινοξέων καθώς και των στοιχείων δευτεροταγούς δομής. Μέσω του εργαλείου αυτού ελέγχθηκε τόσο το ποσοστό των αμινοξέων που συμμετέχουν σε γέφυρες άλατος, όσο και η θέση τους επάνω στην τρισδιάστατη δομή των πρωτεϊνών. Πήραμε επίσης πληροφορίες για τον αριθμό και τη θέση των δισουλφιδικών δεσμών, εφόσον εμφανίζονταν στις πρωτεΐνες. To UCSF Chimera (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) είναι ένα δωρεάν πρόγραμμα απεικόνισης τρισδιάστατων δομών μακρομορίων όπως είναι το DNA, το RNA και οι πρωτεΐνες. Το πρόγραμμα αυτό παρέχει τη δυνατότητα εμφάνισης του μορίου με διαφορετικές μορφες όπως είναι το χωροπληρωτικό μοντέλο, η μορφή σφαίρες και ράβδοι, το σκελετικό μοντέλο κ.ά. Δίνεται επίσης η δυνατότητα να χρωματίσουμε τα μόριά μας με ποικιλία τρόπων, όπως με βάση τα στοιχεία δευτεροταγούς δομής, τον αριθμό των αλυσίδων, συγκεκριμένα αμινοξέα κ.ά, ενώ παρέχει και εικόνες υψηλής ευκρίνειας για χρήση σε μελέτες όπως η δική μας. Το UCSF Chimera χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνουμε τις τρισδιάστατες δομές των πρωτεϊνών μας, καθώς και για να εξετάσουμε τη θέση ορισμένων αμινοξέων επάνω τους. Το Protein-Sol patches αποτελεί ένα από τα 4 εργαλεία του Protein-Sol (https://protein-sol.manchester.ac.uk/patches) που αναπτύχθηκε στο πανεπιστήμιο του Manchester το 2019. Το εργαλείο αυτό δέχεται ως είσοδο αρχεία PDB και μας δίνει την τρισδιάστατη δομή πρωτεϊνών με χρωματισμένη την επιφάνειά τους ανάλογα με το φορτίο και την υδροφοβικότητά τους (Hebditch and Warwicker 2019). Με τη βοήθεια του εργαλείου αυτού μπορέσαμε να οπτικοποιήσουμε την έκταση και τη θέση των φορτίων όπως αυτά κατανέμονται στην επιφάνεια των πρωτεϊνών που μελετήσαμε και να δημιουργήσουμε τις αντίστοιχες εικόνες.

16 3. Αποτελέσματα

Στα πλαίσια της παρούσας πτυχιακής εργασίας συγκρίθηκαν έξι πρωτεΐνες του θερμο-οξεόφιλου αρχαίου M. sedula με ομόλογές τους πρωτεΐνες από μεσόφιλους ή άλλους ακραιόφιλους οργανισμούς. Περισσότερες πληροφορίες για την προέλευση των ομόλογων αυτών πρωτεϊνών αναγράφονται στις επιμέρους ενότητες κάθε πρωτεΐνης. Αναγράφονται επίσης πληροφορίες για τη βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης των οργανισμών από τους οποίους προέρχονται οι πρωτεΐνες, καθώς και η βέλτιστη θερμοκρασία ενεργότητάς τους, όπου αυτή είναι γνωστή. Μια από τις ιδιότητες που ελέγχθηκε κατά τη σύγκριση των πρωτεϊνών είναι η αμινοξική τους σύσταση. Η συχνότητα εμφάνισης κάθε καταλοίπου καθώς και το ποσοστό που του αναλογεί στην κάθε πρωτεΐνη αναγράφεται στους αντίστοιχους πίνακες αμινοξικής σύστασης. Με αυτόν τον τρόπο ελέγξαμε εαν υπάρχει κάποια τάση επικράτησης ή απουσίας ορισμένων καταλοίπων ή ομάδας αμινοξέων ανάλογα με τον οργανισμό προέλευσης που ενδεχομένως να σχετίζεται με την ικανότητα των πρωτεϊνών αυτών να παραμένουν ενεργές σε ακραίες συνθήκες Να σημειώσουμε πως τα στοιχεία των πινάκων αυτών αφορούν μία πολυπεπτιδική αλυσίδα ανεξάρτητα από την τεταρτοταγή δομή της κάθε πρωτεΐνης. Στο παράρτημα υπάρχουν πίνακες στους οποίους εκτός από το ποσοστό εμφάνισης αναγράφεται και ο αριθμός κάθε αμινοξέος και το συνολικό μήκος των αλληλουχιών. Οι πρωτεΐνες συγκρίθηκαν επίσης και ως προς τη σύστασή τους σε στοιχεία δευτεροταγούς δομής καθώς και αμινοξικών αλληλεπιδράσεων όπως οι δεσμοί υδρογόνου, οι γέφυρες άλατος και οι δισουλφιδικοί δεσμοί. Στα πλαίσια της σύγκρισης αυτής κατασκευάστηκαν πίνακες που παρουσιάζουν το ποσοστό των α-ελίκων, των β-πτυχωτων επιφανειών και των βρόχων της κάθε πρωτεΐνης. Αναγράφεται επίσης, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, το ποσοστό των αμινοξέων που συμμετέχουν στο σχηματισμό γεφυρών άλατος και δεσμών υδρογόνου, καθώς και ο αριθμός των δισουλφιδικών δεσμών. Συστηματική τάση παρουσίας τέτοιων στοιχείων θα μπορούσε να σημαίνει αυξημένη σταθερότητα των πρωτεϊνών και να αποτελέσει τη βάση για τη συσχέτιση της αυξημένης σταθερότητας ή ευελιξίας των πρωτεϊνών με την ανθεκτικότητά τους σε ακραίες συνθήκες. Οι πίνακες αυτού του είδους περιέχουν στοιχεία που αναφέρονται σε ολόκληρο το μόριο των πρωτεϊνών. Τέλος, η σύγκριση των πρωτεϊνών περιλαμβάνει και πληροφορίες για την επιφάνεια, τον όγκο και τη συμπαγότητα των πρωτεϊνών. Πιο αναλυτικά, στους πίνακες αυτού του είδους αναγράφεται το εμβαδόν της συνολικής επιφάνειας που είναι εκτεθειμένη στο διαλύτη, καθώς και το εμβαδόν της εκτεθειμένης στο διαλύτη φορτισμένης και μη πολικής επιφάνειας. Επίσης, όπως αναφέρθηκε, αναγράφεται ο όγκος και η συμπαγότητα της πρωτεΐνης. Πιο συγκεκριμένα, με τον

17 όρο συμπαγότητα αναφερόμαστε στο λόγο της εκτεθειμένης στο διαλύτη επιφάνειας μιας πρωτεΐνης προς την αντίστοιχη επιφάνεια μιας σφαίρας ίδιου όγκου με αυτόν της πρωτεΐνης. Οι πίνακες αυτοί αναφέρονται επίσης στην τεταρτοταγή δομή των πρωτεϊνών.

3.1 Αναγωγάση του υδραργύρου

Συγκρίθηκε η αναγωγάση του υδραργύρου (MerA) του θερμο-οξεόφιλου αρχαίου M. sedula με τις ομόλογες της απο τα μεσόφιλα βακτήρια Lysinibacillus sphaericus και Pseudomonas aeruginosa (Πίνακας 1).

Βέλτιστη Βέλτιστη PDB ID - θερμοκρασία θερμοκρασία Ολιγομερική ανάπτυξης (°C) ενζυμικής κατάσταση ενεργότητας (°C) Lysinibacillus 14-37 25-50 5X1Y sphaericus Ομοδιμερές Pseudomonas 25-42 55-65 1ZK7 aeruginosa Ομοδιμερές Metallosphaera 75 >70 4YWO sedula Ομοδιμερές Πίνακας 1: Πίνακας με τη βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης των οργανισμών από τους οποίους προέρχονται οι πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκαν, βέλτιστη θερμοκρασία ενεργότητας, κωδικός PDB και λειτουργική ολιγομερική κατάσταση των πρωτεϊνών αυτών.

Το ένζυμο αυτό καταλύει την αναγωγή της τοξικης μορφής του υδραργύρου Hg2+ που εντοπίζεται σε μεγάλες συγκεντρώσεις σε υδροθερμικές αναβλύσεις και ιαματικές πηγές, στη μορφή Hg0. Σε αυτή τη μορφή ο υδράργυρος είναι πολύ λιγότερο τοξικός και απομακρύνεται παθητικά από τα κύτταρα μέσω διάχυσης.

18 Η λειτουργική μορφή της αναγωγάσης του υδραργύρου και στους τρεις οργανισμούς είναι το ομοδιμερές. Οι αμινοξικές αλληλουχίες για τις οποίες υπάρχουν προσδιορισμένες πρωτεϊνικές δομές στοιχήθηκαν με το προγραμμα Clustal Omega και οι στοιχίσεις παρουσιάζονται στην εικόνα 2. ‘Οπως φαίνεται στην εικόνα 2 μεγαλύτερο μέρος δομής προσδιορίστηκε για την πρωτεΐνη του Lysinibacillus sphaericus ενώ στη συνέχεια ακολουθούν οι πρωτεΐνες του Metallosphaera sedula και Pseudomonas aeruginosa (Εικονα 2).

Εικόνα 2: Αμινοξική στοίχιση των μονομερών των ενζύμων όπως αυτά εμφανίζονται στις καταχωρήσεις της PDB και πιθανώς σε κάποιες περιπτώσεις να μην αντιστοιχούν στην πλήρους μήκους πρωτεΐνη. Metallosphaera sedula (κωδικός PDB 4YWO), Lysinibacillus sphaericus (κωδικός PDB 5X1Y), Pseudomonas aeruginosa (κωδικός PDB 1ZK7).

19 Η σύσταση των αμινοξέων των τριών ενζύμων παρουσιάζεται στον Πίνακα 2. Σύγκριση της ποσοστιαίας σύστασης δείχνει ότι είναι ως επί το πλείστον παρόμοια και στις τρεις ομόλογες πρωτεΐνες. Το ποσοστό αργινίνης (Arg, R) και βαλίνης (Val, V) αυξάνει καθώς αυξάνει η βέλτιστη θερμοκρασία ενεργότητας των ενζύμων και το ποσοστό θρεονίνης (Thr, T) παρουσιάζει μείωση σχεδόν στο μισό στη θερμο-οξεόφιλη πρωτεΐνη σε σχέση με τις ομόλογές της από τους μεσόφιλους οργανισμούς (Πίνακας 2).

Αμινοξύ Lysinibacillus Pseudomonas Metallosphaera sedula sphaericus aeruginosa Ala (A) 8.8% 15.0% 10.4% Arg (R) 2.7% 5.8% 6.3 % Asn (N) 4.5% 2.8% 3.5% Asp (D) 4.9% 4.9% 4.3% Cys (C) 1.1% 1.3% 0.9% Gln (Q) 2.3% 4.5% 2.2% Glu (E) 9.2% 6.2% 8.4% Gly (G) 8.5% 8.6% 9.3% His (H) 2.0% 2.1% 2.8% Ile (I) 7.6% 5.4% 6.9% Leu (L) 10.3% 8.6% 7.8% Lys (K) 7.0% 2.6% 5.4% Met (M) 1.4% 2.1% 3.0% Phe (F) 2.7% 3.0% 2.6% Pro (P) 2.5% 4.5% 4.1% Ser (S) 6.7% 4.1% 5.4% Thr (T) 6.5% 7.9% 3.7% Trp (W) 0.2% 0.2% 0.4% Tyr (Y) 2.9% 1.3% 1.9% Val (V) 8.1% 9.2% 10.6%

Πίνακας 2: Αμινοξική σύσταση των αλληλουχιών της Εικόνας 2.

Όσον αφορά τα στοιχεία δευτεροταγούς δομής, η αναγωγάση του υδραργύρου του M. sedula δεν εμφανίζει κάποια αξιοσημείωτη διαφορά σε σχέση με τις ομόλογές της πρωτεΐνες από τους μεσόφιλους οργανισμούς (Πίνακας 3 - Εικόνα 3). Παρατηρείται όμως αύξηση των αμινοξέων που συμμετέχουν στο σχηματισμό γεφυρών άλατος και δεσμών υδρογόνου ανάλογη της αύξησης της βέλτιστης θερμοκρασίας ενζυμικής ενεργότητας δηλαδή παρατηρούμε ότι το ποσοστό των αμινοξέων αυτών είναι μεγαλύτερο στο ένζυμο του M. sedula και ακολουθούν με φθίνουσα σειρά αυτό του P. aeruginosa και L. sphaericus (Εικόνα 4). Παρόλα αυτά ως προς τους δισουλφιδικούς δεσμούς, η πρωτεΐνη του θερμο-οξεόφιλου M. sedula δεν περιέχει κανένα δισουλφιδικό δεσμό, σε αντίθεση με τις ομόλογές της από μεσόφιλους οργανισμούς οι οποίες περιέχουν 2 και 4 δισουλφιδικούς δεσμούς για τον L. sphaericus και P. aeruginosa αντίστοιχα (Πίνακας 3).

20 α-έλικες β-πτυχωτές Turns & Γέφυρες Δεσμοί Δισουλφιδικοί Coils άλατος υδρογόνου δεσμοί

L.sphaericus 31% 32% 36% 6.40% των αα 76% των αα 2 5X1Y

P. aeruginosa 32% 32% 35% 9.42% των αα 79% των αα 4 1ZK7

M. sedula 34% 30% 34% 11.7% των αα 80% των αα 0 4YWO

Πίνακας 3: Ποσοστό στοιχείων δευτεροταγούς δομής, αμινοξέων που συμμετέχουν σε γέφυρες άλατος και δεσμούς υδρογόνου και αριθμός δισουλφιδικών δεσμών.

Εικόνα 3: Τρισδιάστατη δομή του διμερούς της αναγωγάσης του υδραργύρου των α) Metallosphaera sedula β) Lysinibacillus sphaericus γ) Pseudomonas aeruginosa. Κάθε αλυσίδα απεικονίζεται με διαφορετικό χρώμα.

Εικόνα 4: Γέφυρες άλατος της αναγωγάσης του υδραργύρου του α) Metallosphaera sedula β) Lysinibacillus sphaericus γ) Pseudomonas aeruginosa

Όσον αφορά το εμβαδόν της εκτεθειμένης στο διαλύτη επιφάνειας (Accessible Surface Area), δεν παρατηρείται κάποια αξιοσημείωτη διαφορά στην έκτασή της μεταξύ των 3 πρωτεϊνών, ωστόσο μεγαλύτερη έκταση έχει η πρωτεΐνη του P. aeruginosa και μικρότερη αυτή του L.

21 sphaericus, παρόλο που η τελευταία έχει το μεγαλύτερο μήκος (Πίνακας 4). Παρατηρούμε ότι το εμβαδόν της φορτισμένης επιφάνειας των πρωτεϊνών που συγκρίνονται αυξάνει καθώς αυξάνει η θερμοκρασία δράσης του οργανισμού από όπου προέρχονται (Πίνακας 4 - Εικόνα 5) και αναμενόμενα η σχέση αυτή αντιστρέφεται όταν συγκρίνεται η εκτεθειμένη μη πολική επιφάνεια. Έτσι φαίνεται ότι η MerA του M. sedula παρουσιάζει αύξηση στην έκταση της εκτεθειμένης φορτισμένης επιφάνειας συγκριτικά με τις μεσόφιλες πρωτεΐνες και μείωση στην έκταση της μη πολικής επιφάνειας. Ο όγκος και η συμπαγότητα των πρωτεϊνών δεν παρουσιάζει κάποια σημαντική διακύμανση (Πίνακας 4 - Εικόνα 5).

Εικόνα 5: Εκτεθειμένη στο διαλύτη επιφάνεια χρωματισμένη με βάση το φορτίο. α) Metallosphaera sedula β) Lysinibacillus sphaericus γ) Pseudomonas aeruginosa.

22 Compactness - Συνολική ASA Φορτισμένη ASA Μη πολική ASA Όγκος Συμπαγότητα L. sphaericus 34036.9 Ų 6286.8 Ų 20499 Ų 124073.1 ų 2.83 5X1Y 18% 60% P. aeruginosa 35253.2 Ų 8058 Ų 19912.3 Ų 132113.8 ų 2.81 1ZK7 23% 56% M. sedula 34852.8 Ų 9130 Ų 18868.2 Ų 130579.1 ų 2.80 4YWO 26% 54% Πίνακας 4: Εκτεθειμένη στο διαλύτη συνολική, φορτισμένη και μη πολική επιφάνεια. Αναγράφονται επίσης ο όγκος και η συμπαγότητα των πρωτεϊνών.

3.2 Μηλική αφυδρογονάση

Η μηλική αφυδρογονάση (MDH) του M. sedula συγκρίθηκε με την αντίστοιχη πρωτεΐνη του ψυχρόφιλου βακτηρίου Aquaspirillum arcticum, του αλόφιλου αρχαίου Haloarcula marismortui και του μεσόφιλου βακτηρίου Escherichia coli (Πίνακας 5).

Βέλτιστη θερμοκρασία PDB ID - Ολιγομερική ανάπτυξης (°C) κατάσταση Aquaspirillum 4 1B8P Ομοδιμερές arcticum

Escherichia coli 37 1EMD Ομοδιμερές Haloarcula 40-50 4JCO Ομοτετραμερές marismortui

Metallosphaera 75 6IHD sedula Ομοτετραμερές Πίνακας 5: Πίνακας με τη βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης των οργανισμών από τους οποίους προέρχονται οι πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκαν, βέλτιστη θερμοκρασία ενεργότητας, κωδικός PDB και λειτουργική ολιγομερική κατάσταση των πρωτεϊνών αυτών. Δεν υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα για τις βέλτιστες συνθήκες ενεργότητας των παραπάνω ενζύμων.

Η μηλική αφυδρογονάση είναι ένα από τα ένζυμα που συμμετέχουν στον κύκλο του Krebs. Ο ρόλος του είναι η οξείδωση του μηλικού σε οξαλοξικό με ταυτόχρονη αναγωγή του NAD+ σε NADH, αναγεννώντας με αυτόν τον τρόπο το οξαλοξικό που χρησιμοποιείται κατά το πρώτο βήμα του κύκλου.

23 Η λειτουργική μορφή της μηλικής αφυδρογονάσης στο θερμο-οξεόφιλο και τον αλόφιλο οργανισμό είναι το ομοτετραμερές, ενώ στον ψυχρόφιλο και το μεσόφιλο το ομοδιμερές. Οι αμινοξικές αλληλουχίες για τις οποίες υπάρχουν προσδιορισμένες πρωτεϊνικές δομές στοιχήθηκαν με το προγραμμα Clustal Omega και οι στοιχίσεις παρουσιάζονται στην εικόνα 6. Και στις 4 περιπτώσεις φαίνεται πως προσδιορίστηκε το ίδιο μέρος δομής, το οποίο ακολουθεί φθίνουσα σειρά πηγαίνοντας από την πρωτεΐνη του του ψυχρόφιλου Aquaspirillum arcticum σε αυτή του μεσόφιλου Escherichia coli ενώ στη συνέχεια ακολουθούν οι πρωτεΐνες του Metallosphaera sedula και Haloarcula marismortui (Εικόνα 6).

Εικόνα 6: Αμινοξική στοίχιση των μονομερών των ενζύμων όπως αυτά εμφανίζονται στις καταχωρήσεις της PDB και πιθανώς σε κάποιες περιπτώσεις να μην αντιστοιχούν στην πλήρους μήκους πρωτεΐνη. Metallosphaera sedula (κωδικός PDB 6IHD), Aquaspirillum arcticum (κωδικός PDB 1B8P), Haloarcula marismortui (κωδικός PDB 4JCO), Escherichia coli (κωδικός PDB 1EMD).

24 Ως προς την αμινοξική σύσταση των πρωτεϊνών, παρατηρούμε μια γενική αύξηση στην περιεκτικότητα ισολευκίνης (Ile, I) και λυσίνης (Lys, K) και μείωση γλουταμίνης (Gln, Q) και γλυκίνης (Gly, G) στη μηλική αφυδρογονάση του M. sedula σε σύγκριση με τις υπόλοιπες πρωτεΐνες. Η μεθειονίνη (Met, M) εμφανίζεται αυξημένη στο ένζυμο του M. sedula σε σχέση με τα αντίστοιχα ένζυμα του μεσόφιλου και του αλόφιλου οργανισμού. Διαφορές παρατηρούνται και ως προς τα όξινα αμινοξέα. Η πρωτεΐνη του M. sedula παρουσιάζει αυξημένο ποσοστό ασπαραγινικού οξέος (Asp, D) σε σχέση με τη μεσόφιλη πρωτεΐνη και αυξημένο ποσοστό γλουταμινικού οξέος (Glu, E) σε σχέση με την ψυχρόφιλη, ενώ και τα δύο αυτά αμινοξέα φαίνεται να είναι ιδιαίτερα αυξημένα στη μηλική αφυδρογονάση του αλόφιλου οργανισμού. Αξιοσημείωτο είναι επίσης το γεγονός πως η περιεκτικότητα των πρωτεϊνών σε αλανίνη (Ala, A) φαίνεται να μειώνεται καθώς αυξάνει η θερμοκρασία δράσης του οργανισμού από τον οποίο προέρχονται, ενώ το αντίθετο ισχύει για την περιεκτικότητα σε σερίνη (Ser, S) (Πίνακας 6).

Αμινοξύ Aquaspirillum Escherichia Haloarcula Metallosphaera arcticum coli marismortui sedula 1B8P 1EMD 4JCO 6IHD Ala (A) 13.4% 10.9% 9.2% 8.5% Arg (R) 4.0% 2.9% 4.9% 3.0% Asn (N) 5.2% 3.5% 3.0% 3.3% Asp (D) 6.4% 3.8% 11.5% 6.6% Cys (C) 0.6% 1.0% 0.0% 0.0% Gln (Q) 4.0% 4.8% 3.9% 2.0% Glu (E) 4.0% 6.1% 8.9% 6.2% Gly (G) 8.5% 11.5% 10.2% 7.9% His (H) 1.8% 0.6% 2.3% 1.6% Ile (I) 7.0% 5.4% 5.3% 9.8% Leu (L) 8.2% 10.6% 6.6% 5.6% Lys (K) 5.2% 6.7% 2.6% 9.5% Met (M) 4.0% 1.3% 1.6% 3.6% Phe (F) 3.0% 3.2% 2.6% 3.6% Pro (P) 4.9% 4.2% 3.6% 4.6% Ser (S) 4.9% 5.4% 5.6% 7.5% Thr (T) 5.2% 5.8% 4.9% 4.3% Trp (W) 1.2% 0.0% 0.7% 1.0% Tyr (Y) 2.1% 1.3% 2.6% 2.6% Val (V) 6.7% 10.9% 9.9% 8.9% Πίνακας 6: Αμινοξική σύσταση των αλληλουχιών της Εικόνας 6.

Όσον αφορά τα στοιχεία δευτεροταγούς δομής δεν παρατηρούμε κάποια αξιοσημειωτη διαφορά ανάμεσα στα τέσσερα ένζυμα (Πίνακας 7 - Εικόνα 7). Παρατηρούμε ωστόσο αύξηση των αμινοξέων που σχηματίζουν γέφυρες άλατος και δεσμούς υδρογόνου στη μηλική αφυδρογονάση του M. sedula, με τη μεγαλύτερη διαφορά να παρατηρείται σε σχέση με τη μεσόφιλη πρωτεΐνη και τη μικρότερη διαφορά σε σχέση με την πρωτεΐνη που προέρχεται από τον

25 αλόφιλο οργανισμό. Τέλος, δεν εντοπίζονται δισουλφιδικοί δεσμοί σε κανένα ένζυμο (Πίνακας 7 - Εικόνα 8).

α-έλικες β-πτυχωτές Turns & Γέφυρες Δεσμοί Δισουλφιδικοί Coils άλατος υδρογόνου δεσμοί A. arcticum 45% 23% 31% 8.56% των 81% των αα 0 1B8P αα E. coli 45% 21% 32% 7.05% των 80% των αα 0 1EMD αα H. 43% 24% 31% 9.98% των 82% των αα 0 marismortui αα 4JCO M. sedula 43% 23% 32% 10.8% των 84% των αα 0 6IHD αα Πίνακας 7: Ποσοστό στοιχείων δευτεροταγούς δομής, αμινοξέων που συμμετέχουν σε γέφυρες άλατος και δεσμούς υδρογόνου και αριθμός δισουλφιδικών δεσμών.

Εικόνα 7: Τρισδιάστατη δομή της μηλικής αφυδρογονάσης των α) Metallosphaera sedula β) Aquaspirillum arcticum γ) Haloarcula marismortui δ) Escherichia coli. Κάθε αλυσίδα απεικονίζεται με διαφορετικό χρώμα.

26 Εικόνα 8: Γέφυρες άλατος της μηλικής αφυδρογονάσης του α) Metallosphaera sedula β) Aquaspirillum arcticum γ) Haloarcula marismortui δ) Escherichia coli. Για τις ανάγκες της παραπάνω σύγκρισης χρησιμοποιήθηκε το ένα από τα δύο διμερή των πρωτεϊνών του Metallosphaera sedula και Haloarcula marismortui.

Αναφορικά με την εκτεθειμένη στο διαλύτη επιφάνεια των πρωτεϊνών, παρατηρείται μια αύξηση του εμβαδού της στη μηλική αφυδρογονάση του M. sedula σε σχέση με τις ομόλογές της από το μεσόφιλο και τον αλόφιλο οργανισμό (Πίνακας 8). Επίσης, το εμβαδόν της φορτισμένης επιφάνειας του M. sedula είναι αυξημένο σε σχέση με τις πρωτεΐνες του μεσόφιλου και του ψυχρόφιλου οργανισμού, αλλά σημαντικά μειωμένο όταν συγκρίνεται με την πρωτεΐνη του αλόφιλου H. marismortui, του οποίου η επιφάνεια χαρακτηρίζεται από πολύ υψηλή συγκέντρωση αρνητικά φορτισμένων αμινοξέων (Πίνακας 8 - Εικόνα 9). Η έκταση της μη πολικής επιφάνειας κυμαίνεται σε παρόμοια επίπεδα ανάμεσα στην πρωτεΐνη του θερμο-οξεόφιλου οργανισμού και των ομόλογών της από το μεσόφιλο και τον ψυχρόφιλο οργανισμό. Εμφανίζεται όμως μειωμένη

27 στην περίπτωση της αλόφιλης πρωτεΐνης, στην οποία το αυξημένο ποσοστό των φορτισμένων αμινοξέων συνοδεύεται από μείωση των εκτεθειμένων στο διαλύτη υδρόφοβων καταλοίπων. Όσον αφορά τον όγκο των πρωτεϊνών, αυτός φαίνεται να είναι αυξημένος στην μηλική αφυδρογονάση του M. sedula σε σχέση με την πρωτεΐνη του αλόφιλου οργανισμού και μειωμένος συγκριτικά με αυτή του ψυχρόφιλου. Τέλος, η συμπαγότητα του ενζύμου του M. sedula εμφανίζεται αυξημένη όταν τη συγκρίνουμε με την αντίστοιχη από τις ομόλογές πρωτεΐνες της (Πίνακας 8 - Εικόνα 9).

Εικόνα 9: Εκτεθειμένη στο διαλύτη επιφάνεια χρωματισμένη με βάση το φορτίο. α) Metallosphaera sedula β) Aquaspirillum arcticum γ) Haloarcula marismortui δ) Escherichia coli. Για τις ανάγκες της παραπάνω σύγκρισης, χρησιμοποιήθηκε το ένα από τα δύο διμερή των πρωτεϊνών του Metallosphaera sedula και Haloarcula marismortui

28 Compactness - Συνολική ASA Φορτισμένη ASA Μη πολική ASA Όγκος Συμπαγότητα A. arcticum 24824.3 Ų 4746.0 Ų 14835.1 Ų 89902.7 ų 2.56 1B8P 19% 60% E. coli 22695.6 Ų 3656.0 Ų 13460.3 Ų 82656.2 ų 2.47 1EMD 17% 59% H. marismortui 22632.6 Ų 7488.2 Ų 10695.2 Ų 78453.7 ų 2.55 4JCO 33% 47% M. sedula 24625.8 Ų 5519.6 Ų 14550.9 Ų 82243.7 ų 2.69 6IHD 22% 59% Πίνακας 8: Εκτεθειμένη στο διαλύτη συνολική, φορτισμένη και μη πολική επιφάνεια. Αναγράφονται επίσης ο όγκος και η συμπαγότητα των πρωτεϊνών.

3.3 Κιτρική συνθάση

Συγκρίθηκε η κιτρική συνθάση (CS) του θερμόφιλου αρχαίου Metallosphaera sedula με τις ομόλογές της από το μεσόφιλο βακτήριο Mycobacterium tuberculosis και το υπερθερμόφιλο αρχαίο Pyrococcus furiosus (Πίνακας 9).

Βέλτιστη Βέλτιστη PDB ID - θερμοκρασία θερμοκρασία Ολιγομερική ανάπτυξης (°C) ενζυμικής κατάσταση ενεργότητας (°C) Mycobacterium 37 * 4TVM tuberculosis Ομοδιμερές Metallosphaera 75 * 6ABV sedula Ομοδιμερές Pyrococcus furiosus 100 95-100 1AJ8 Ομοδιμερές Πίνακας 9: Πίνακας με τη βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης των οργανισμών από τους οποίους προέρχονται οι πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκαν, βέλτιστη θερμοκρασία ενεργότητας, κωδικός PDB και λειτουργική ολιγομερική κατάσταση των πρωτεϊνών αυτών. * Δεν υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα για τις βέλτιστες συνθήκες ενεργότητας των παραπάνω ενζύμων.

Η κιτρική συνθάση είναι το ένζυμο που πραγματοποιεί το πρώτο βήμα στον κύκλο του τρικαρβοξυλικού οξέος. Στο στάδιο αυτό, η CS καταλύει τη μη αντιστρεπτή μετατροπή του οξαλοξικού και του ακέτυλο-CoA σε κιτρικό οξύ και CoA.

29 Η λειτουργική μορφή της κιτρικής συνθάσης και στους τρεις οργανισμούς είναι το ομοδιμερές. Συγκρίνοντας τις αμινοξικές αλληλουχίες για τις οποίες υπάρχουν προσδιορισμένες δομές παρατηρούμε πως μεγαλύτερο μέρος δομής προσδιορίστηκε για την πρωτεΐνη του Mycobacterium tuberculosis. Στη συνέχεια ακολουθεί η πρωτεΐνη του Metallosphaera sedula και τέλος η πρωτεΐνη του Pyrococcus furiosus. (Εικόνα 10).

Εικόνα 10: Αμινοξική στοίχιση των μονομερών των ενζύμων όπως αυτά εμφανίζονται στις καταχωρήσεις της PDB και πιθανώς σε κάποιες περιπτώσεις να μην αντιστοιχούν στην πλήρους μήκους πρωτεΐνη. Metallosphaera sedula (κωδικός PDB 6ABV), Mycobacterium tuberculosis (κωδικός PDB 4TVM), Pyrococcus furiosus (κωδικός PDB 1AJ8).

30 Όσον αφορά την αμινοξική σύσταση των τριών πρωτεϊνών, παρατηρούμε πως η πρωτεΐνη του θερμο-οξεόφιλου οργανισμού περιέχει το μεγαλύτερο ποσοστό σερίνης (Ser, S). Παρατηρούμε επίσης πως η περιεκτικότητα σε αλανίνη (Ala, A) εμφανίζεται αυξημένη και η αντίστοιχη περιεκτικότητα σε ισολευκίνη (Ile, I) μειωμένη στην κιτρική συνθάση του M. sedula σε σχέση με αυτή του υπερθερμόφιλου P. furiosus. Επίσης, το ένζυμο του θερμο-οξεόφιλου οργανισμού παρουσιάζει μειωμένο ποσοστό γλυκίνης (Gly, G) και λευκίνης (Leu, L) σε σχέση με το ομόλογό του από το μεσόφιλο M. tuberculosis. Αξίζει επίσης να σημειωθεί πως η περιεκτικότητα των πρωτεϊνών σε γλουταμινικό οξύ (Glu, E) και λυσίνη (Lys, K) αυξάνει με την αύξηση της βέλτιστης θερμοκρασίας ανάπτυξης των οργανισμών από όπου προέρχονται, ενώ το αντίθετο φαίνεται να ισχύει για την περιεκτικότητά τους σε ασπαραγινικό οξύ (Asp, D) (Πίνακας 10).

Αμινοξύ Mycobacterium Metallosphaera Pyrococcus tuberculosis sedula furiosus Ala (A) 9.3% 9.5% 7.5% Arg (R) 6.3% 5.4% 4.6% Asn (N) 3.0% 2.1% 2.7% Asp (D) 7.9% 4.6% 3.0% Cys (C) 0.5% 0.3% 0.3% Gln (Q) 3.0% 2.1% 1.3% Glu (E) 5.3% 7.7% 10.2% Gly (G) 8.6% 6.4% 7.8% His (H) 2.6% 3.6% 2.2% Ile (I) 5.8% 5.4% 9.2% Leu (L) 10.9% 8.7% 10.0% Lys (K) 3.9% 6.4% 8.6% Met (M) 1.9% 2.6% 2.4% Phe (F) 4.6% 4.6% 2.7% Pro (P) 4.6% 4.4% 4.6% Ser (S) 4.4% 7.7% 5.1% Thr (T) 6.3% 5.4% 3.8% Trp (W) 0.7% 0.8% 1.9% Tyr (Y) 4.9% 4.9% 6.5% Val (V) 5.6% 7.5% 5.7% Πίνακας 10: Αμινοξική σύσταση των αλληλουχιών της Εικόνας 10.

Παρατηρώντας τον πίνακα 11 διαπιστώνουμε πως η πρωτεΐνη του θερμο-οξεόφιλου και του υπερθερμόφιλου οργανισμού εμφανίζουν παρόμοια σύσταση στοιχείων δευτεροταγούς δομής. Ωστόσο, κατά τη σύγκριση των πρωτεϊνών αυτών με την κιτρική συνθάση του μεσόφιλου οργανισμού παρατηρούμε πως οι πρώτες εμφανίζουν αύξηση στις α-έλικες και μείωση στις περιοχές των βρόχων. Παρατηρείται επίσης και αύξηση στις β-πτυχωτές επιφάνειες του μεσόφιλου ενζύμου που οφείλεται σε μια περιοχή πλούσια σε β-κλώνους σε αυτή την πρωτεΐνη. Όπως φαίνεται τόσο στην εικόνα 10 όσο και στην εικόνα 11, τα Ν-τελικά κατάλοιπα κάθε μονομερούς σχηματίζουν δύο αντιπαράλληλα β-φύλλα στην περίπτωση του M. tuberculosis.

31 Ωστόσο η πληροφορία αυτή δεν υπάρχει στις αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της δομής των πρωτεϊνών των άλλων δύο οργανισμών, και έτσι το ποσοστό αυτό των β-φύλλων του πίνακα 11 μπορεί να είναι ανακριβές (Πίνακας 11 – Εικόνα 11). Αξιοσημείωτο είναι επίσης το γεγονός ότι το ποσοστό των αμινοξέων που παίρνουν μέρος στο σχηματισμό γεφυρών άλατος και δεσμών υδρογόνου αυξάνει καθώς αυξάνει η θερμοκρασία δράσης των οργανισμών από τον οποίο προέρχονται οι πρωτεΐνες, ενώ οι δισουλφιδικοί δεσμοί απουσιάζουν και από τα τρία ένζυμα (Πίνακας 11 - Εικόνα 12).

α-έλικες β-πτυχωτές Turns & Γέφυρες Δεσμοί Δισουλφιδικοί Coils άλατος υδρογόνου δεσμοί

M. tuberculosis 51% 12% 36% 5.0% των αα 75% των αα 0 4TVM

M. sedula 60% 6% 32% 7.9% των αα 82% των αα 0 6ABV

P. furiosus 60% 8% 31% 9.58% των αα 85% των αα 0 1AJ8

Πίνακας 11: Ποσοστό στοιχείων δευτεροταγούς δομής, αμινοξέων που συμμετέχουν σε γέφυρες άλατος και δεσμούς υδρογόνου και αριθμός δισουλφιδικών δεσμών.

Εικόνα 11: Τρισδιάστατη δομή του διμερούς της κιτρικής συνθάσης των α) Metallosphaera sedula β) Mycobacterium tuberculosis γ) Pyrococcus furiosus. Κάθε αλυσίδα απεικονίζεται με διαφορετικό χρώμα.

Εικόνα 12: Γέφυρες άλατος της κιτρικής συνθάσης του α) Metallosphaera sedula β) Mycobacterium tuberculosis γ) Pyrococcus furiosus.

32 Το εμβαδόν της εκτεθειμένης στο διαλύτη επιφάνειας καθώς και η συμπαγότητα των πρωτεϊνών μειώνεται καθώς αυξάνει η βέλτιστη θερμοκρασία στην οποία αναπτύσσονται οι οργανισμοί από τους οποίους προέρχονται, ενώ το αντίθετο φαίνεται να ισχύει όσον αφορά τα υδρόφοβα αμινοξέα που εκτίθενται στο διαλύτη (Πίνακας 12). Επίσης, ο όγκος της κιτρικής συνθάσης του θερμο-οξεόφιλου οργανισμού εμφανίζεται μειωμένος σε σχέση με τις ομόλογές της από το μεσόφιλο και τον υπερθερμόφιλο οργανισμό, ενώ δεν παρατηρείται κάποια διαφορά ως προς την έκταση της φορτισμένης επιφάνειας των τριών πρωτεϊνών (Πίνακας 12 – Εικόνα 13).

Εικόνα 13: Εκτεθειμένη στο διαλύτη επιφάνεια χρωματισμένη με βάση το φορτίο. α) Metallosphaera sedula β) Mycobacterium tuberculosis γ) Pyrococcus furiosus.

33 Compactness - Συνολική ASA Φορτισμένη ASA Μη πολική ASA Όγκος Συμπαγότητα M. tuberculosis 31446.0 Ų 7761.1 Ų 17445.0 Ų 112834.3 ų 2.78 4TVM 25% 55% M. sedula 27875.5 Ų 7458.7 Ų 15835.8 Ų 103013.9 ų 2.62 6ABV 27% 57% P. furiosus 26309.6 Ų 6562.5 Ų 15421.2 Ų 110853.7 ų 2.35 1AJ8 25% 59% Πίνακας 12: Εκτεθειμένη στο διαλύτη συνολική, φορτισμένη και μη πολική επιφάνεια. Αναγράφονται επίσης ο όγκος και η συμπαγότητα των πρωτεϊνών.

3.4 Αποκαρβοξυλάση της 5’-μονοφωσφορικής οροτιδίνης

Η αποκαρβοξυλάση της 5’-μονοφωσφορικής οροτιδίνης (αποκαρβοξυλάση OMP) του Metallosphaera sedula συγκρίθηκε με αυτή του θερμο-οξεόφιλου αρχαίου Sulfolobus solfataricus και του υπερθερμόφιλου αρχαίου Pyrococcus horikoshii (Πίνακας 13).

Βέλτιστη θερμοκρασία PDB ID - Ολιγομερική ανάπτυξης (°C) κατάσταση Metallosphaera sedula 75 3VE9 Ομοδιμερές Sulfolobus solfataricus 80 4DBD Ομοδιμερές Pyrococcus horikoshii 100 2CZ5 Ομοδιμερές Πίνακας 13: Πίνακας με τη βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης των οργανισμών από τους οποίους προέρχονται οι πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκαν, βέλτιστη θερμοκρασία ενεργότητας, κωδικός PDB και λειτουργική ολιγομερική κατάσταση των πρωτεϊνών αυτών. Δεν υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα για τις βέλτιστες συνθήκες ενεργότητας των παραπάνω ενζύμων.

Η αποκαρβοξυλάση της 5’-μονοφωσφορικής οροτιδίνης συμμετέχει στη βιοσύνθεση των νουκλεοτιδίων και ειδικότερα των πυριμιδινών. Το ένζυμο αυτό καταλύει τη μετατροπή του OMP σε UMP μέσω αποκαρβοξυλίωσης του πρώτου.

34 Η λειτουργική μορφή της αποκαρβοξυλάσης OMP και στους τρεις οργανισμούς είναι το ομοδιμερές Έχει προσδιοριστεί παρόμοιο μέρος δομής για τις 3 πρωτεΐνες και η στοίχιση των αλληλουχιών αυτών φαίνεται στην εικόνα 14. Εκεί φαίνεται πως μεγαλύτερο μέρος έχει προσδιοριστεί για την πρωτεΐνη του Sulfolobus solfataricus ενώ ακολουθεί η πρωτεΐνη του Metallosphaera sedula και τέλος του Pyrococcus horikoshii (Εικόνα 14).

Εικόνα 14: Αμινοξική στοίχιση των μονομερών των ενζύμων όπως αυτά εμφανίζονται στις καταχωρήσεις της PDB και πιθανώς σε κάποιες περιπτώσεις να μην αντιστοιχούν στην πλήρους μήκους πρωτεΐνη. Metallosphaera sedula (κωδικός PDB 3VE9), Sulfolobus solfataricus (κωδικός PDB 4DBD), Pyrococcus horikoshii (κωδικός PDB 2CZ5).

35 Συγκρίνοντας την αμινοξική σύσταση των τριών ενζύμων παρατηρούμε ορισμένες διαφορές. Αρχικά, η περιεκτικότητα της πρωτεΐνης του M. sedula σε αλανίνη (Ala, A) είναι μειωμένη σε σχέση με την αντίστοιχη της ομόλογής της πρωτεΐνης από τον υπερθερμόφιλο P. horikoshii, ενώ το αντίθετο παρατηρείται για το ποσοστό λευκίνης (Leu, L) και σερίνης (Ser, S). Διαφορές εντοπίζονται επίσης και κατά τη σύγκριση της αποκαρβοξυλάσης OMP του M. sedula με την ομόλογή της από τον επίσης θερμο-οξεόφιλο S. solfataricus. Σε αυτή την περίπτωση η πρωτεΐνη του M. sedula εμφανίζει αύξηση του ποσοστού προλίνης (Pro, P) και βαλίνης (Val, V) και μείωση στο ποσοστό λυσίνης (Lys, K) και τυροσίνης (Tyr, Y). Επίσης, αξίζει να αναφερθεί πως η περιεκτικότητα των πρωτεϊνών σε ισολευκίνη (Ile, I) αυξάνει καθώς αυξάνει η θερμοκρασία δράσης των οργανισμών από τον οποίο προέρχονται (Πίνακας 14).

Αμινοξύ Metallosphaera Sulfolobus Pyrococcus sedula solfataricus horikoshii Ala (A) 6.5% 5.9% 11.1% Arg (R) 5.6% 4.5% 6.7% Asn (N) 3.3% 3.6% 3.4% Asp (D) 6.5% 6.3% 5.8% Cys (C) 0.9% 0.9% 0.0% Gln (Q) 1.9% 1.4% 0.5% Glu (E) 6.0% 5.9% 7.7% Gly (G) 8.8% 9.0% 9.6% His (H) 1.4% 1.4% 1.0% Ile (I) 7.0% 10.4% 13.9% Leu (L) 11.6% 10.4% 6.2% Lys (K) 7.0% 9.0% 6.7% Met (M) 1.9% 3.6% 2.4% Phe (F) 2.8% 3.2% 2.4% Pro (P) 5.6% 2.3% 4.8% Ser (S) 7.9% 6.8% 2.4% Thr (T) 2.3% 3.2% 2.4% Trp (W) 0.9% 0.5% 0.5% Tyr (Y) 1.9% 4.5% 3.4% Val (V) 10.2% 7.7% 9.1% Πίνακας 14: Αμινοξική σύσταση των αλληλουχιών της Εικόνας 14.

Η αποκαρβοξυλάση OMP του M. sedula εμφανίζει παρόμοια σύσταση όσον αφορά τα στοιχεία δευτεροταγούς δομής σε σχέση με την πρωτεΐνη του επίσης θερμο-οξεόφιλου S. solfataricus. Ωστόσο, όταν συγκρίνεται με το ένζυμο του υπερθερμόφιλου P. horikoshii παρατηρούμε μια αύξηση α-ελίκων και μείωση περιοχών βρόχων στο τελευταίο (Πίνακας 15 – Εικόνα 15). Παρατηρούμε επίσης πως το ποσοστό των αμινοξέων που σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου είναι αυξημένο στην υπερθερμόφιλη πρωτεΐνη σε σχέση με τις αντίστοιχες από τους θερμο-οξεόφιλους οργανισμούς. Το αντίστοιχο ποσοστό των αμινοξέων που παίρνουν μέρος στο

36 σχηματισμό γεφυρών άλατος δεν εμφανίζει κάποια σημαντική διακύμανση. Το ίδιο ισχύει και για τους δισουλφιδικούς δεσμούς, οι οποίοι απουσιάζουν και από τα τρία ένζυμα (Πίνακας 15 – Εικόνα 16).

α-έλικες β-πτυχωτές Turns & Γέφυρες Δεσμοί Δισουλφιδικοί Coils άλατος υδρογόνου δεσμοί

M. sedula 44% 23% 32% 12.5% των αα 87% των αα 0 3VE9 S. solfataricus 42% 25% 31% 13.3% των αα 86% των αα 0 4DBD P. horikoshii 49% 24% 25% 11.3% των αα 90% των αα 0 2CZ5 Πίνακας 15: Ποσοστό στοιχείων δευτεροταγούς δομής, αμινοξέων που συμμετέχουν σε γέφυρες άλατος και δεσμούς υδρογόνου και αριθμός δισουλφιδικών δεσμών.

Εικόνα 15: Τρισδιάστατη δομή του διμερούς της αποκαρβοξυλάσης OMP των α) Metallosphaera sedula β) Sulfolobus solfataricus γ) Pyrococcus horikoshii. Κάθε αλυσίδα απεικονίζεται με διαφορετικό χρώμα.

Εικόνα 16: Γέφυρες άλατος της αποκαρβοξυλάσης OMP του α) Metallosphaera sedula β) Sulfolobus solfataricus γ) Pyrococcus horikoshii.

Η αποκαρβοξυλάση OMP του M. sedula έχει ελαφρώς μικρότερο όγκο και εμβαδόν επιφάνειας που εκτίθεται στο διαλύτη σε σχέση με τις ομόλογές της (Πίνακας 16). Επίσης, όσον αφορά την παρουσία φορτισμένων αμινοξέων στην επιφάνεια των πρωτεϊνών, η πρωτεΐνη του M. sedula εμφανίζει αυξημένη συγκέντρωσή τους σε σχέση με την πρωτεΐνη του επίσης θερμο-οξεόφιλου S. solfataricus (Πίνακας 16 - Εικόνα 17). Ωστόσο τη μεγαλύτερη έκταση φορτισμένης επιφάνειας έχει το υπερθερμόφιλο ένζυμο, το οποίο όπως φαίνεται και στην εικόνα

37 17 περιέχει μια αύλακα που αποτελείται εξ ολοκλήρου από θετικά φορτισμένα αμινοξέα. Ως προς τη μη πολική επιφάνεια και τη συμπαγότητα των πρωτεϊνών δεν παρατηρείται κάποια σημαντική διακύμανση ανάμεσα στις τρεις πρωτεΐνες (Πίνακας 16).

Εικόνα 17: Εκτεθειμένη στο διαλύτη επιφάνεια χρωματισμένη με βάση το φορτίο. α) Metallosphaera sedula β) Sulfolobus solfataricus γ) Pyrococcus horikoshii.

Compactness - Συνολική ASA Φορτισμένη ASA Μη πολική ASA Όγκος Συμπαγότητα M. sedula 15537.0 Ų 3934.0 Ų 8458.9 Ų 56110.9 ų 2.19 3VE9 26% 54% S. solfataricus 15890.4 Ų 3715.3 Ų 8817.2 Ų 58277.9 ų 2.19 23% 55% 4DBD P. horikoshii 16080.6 Ų 4598.9 Ų 9081.2 Ų 58939.3 ų 2.20 29% 56% 2CZ5 Πίνακας 16: Εκτεθειμένη στο διαλύτη συνολική, φορτισμένη και μη πολική επιφάνεια. Αναγράφονται επίσης ο όγκος και η συμπαγότητα των πρωτεϊνών.

38 3.5 Δεϋδρατάση του 3-υδροξυπροπιονυλο-CoA

Συγκρίθηκε η δεϋδρατάση του 3-υδροξυπροπιονυλο-CoA (3-Hydroxyropionyl-CoA Dehydratase) του Metallosphaera sedula με άλλες ECH από το μεσόφιλο βακτήριο Clostridium acetobutylicum και το Roseovarius nubinhibens, ένα μέτρια αλόφιλο βακτήριο (Πίνακας 17).

Βέλτιστη θερμοκρασία PDB ID - Ολιγομερική ανάπτυξης (°C) κατάσταση Roseovarius nubinhibens 30 5XZD Ομοεξαμερές Clostridium acetobutylicum 35-37 5Z7R Ομοεξαμερές Metallosphaera sedula 75 5ZAI Ομοεξαμερές Πίνακας 17: Πίνακας με τη βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης των οργανισμών από τους οποίους προέρχονται οι πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκαν, βέλτιστη θερμοκρασία ενεργότητας, κωδικός PDB και λειτουργική ολιγομερική κατάσταση των πρωτεϊνών αυτών. Δεν υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα για τις βέλτιστες συνθήκες ενεργότητας των παραπάνω ενζύμων.

H 3HPCD ανήκει στην οικογένεια των ενοϋλο-CoA υδατασών (ECH). Παίρνει μέρος στον κύκλο 3-Υδροξυπροπιονικού/4-Υδροξυβουτυρικού (3HP/4HB cycle) που χρησιμοποιούν οργανισμοί του φύλου Crenarchaeota, στο οποίο και ανήκει ο M. sedula. Το ένζυμο αυτό μετατρέπει το 3-υδροξυπροπιονυλο-CoA σε ακρυλοϋλο-CoA μέσω αφυδάτωσης του πρώτου.

39 Η λειτουργική μορφή και στους τρεις οργανισμούς είναι το ομοεξαμερές. Η στοίχιση των αμινοξικών αλληλουχιών για τις οποίες υπάρχει προσδιορισμένη πρωτεϊνική δομή φαίνεται στην εικόνα 18. Παρατηρούμε πως το μέρος δομής που έχει προσδιοριστεί είναι παρόμοιο για τα 3 ένζυμα και ακολουθεί φθίνουσα πορεία από την πρωτεΐνη του Clostridium acetobutylicum σε αυτή του Metallosphaera sedula και Roseovarius nubinhibens (Εικόνα 18).

Εικόνα 18: Αμινοξική στοίχιση των μονομερών των ενζύμων όπως αυτά εμφανίζονται στις καταχωρήσεις της PDB και πιθανώς σε κάποιες περιπτώσεις να μην αντιστοιχούν στην πλήρους μήκους πρωτεΐνη. Metallosphaera sedula (κωδικός PDB 5ZAI), Clostridium acetobutylicum (κωδικός PDB 5Z7R), Roseovarius nubinhibens (κωδικός PDB 5XZD).

40 Συγκρίνοντας την αμινοξική σύσταση των τριών πρωτεϊνών παρατηρούμε πως η δεϋδρατάση του 3-υδροξυπροπιονυλο-CoA που προέρχεται από τον M. sedula εμφανίζει αυξημένο ποσοστό λευκίνης (Leu, L), λυσίνης (Lys, K) και προλίνης (Pro, P) καθώς και μειωμένο ποσοστό βαλίνης (Val, V) σε σχέση με τις υπόλοιπες πρωτεΐνες. Επίσης, η περιεκτικότητά της σε αλανίνη (Ala, A) και μεθειονίνη (Met, M) είναι μειωμένη, ενώ αυτή της γλυκίνης (Gly, G) αυξημένη σε σχέση με το ένζυμο του μέτρια αλόφιλου βακτηρίου. Τέλος, συγκριτικά με τη πρωτεΐνη του μεσόφιλου C. acetobutylicum, το ένζυμο του M. sedula εμφανίζει μικρότερη περιεκτικότητα σε ασπαραγίνη (Asn, N) (Πίνακας 18).

Αμινοξύ Roseovarius Clostridium Metallosphaera nubinhibens acetobutylicum sedula Ala (A) 12.0% 10.1% 9.7% Arg (R) 5.8% 4.5% 5.0% Asn (N) 3.1% 6.4% 3.9% Asp (D) 5.4% 3.7% 3.9% Cys (C) 1.6% 1.5% 0.8% Gln (Q) 3.1% 2.6% 2.3% Glu (E) 9.7% 9.4% 10.0% Gly (G) 7.4% 9.0% 9.7% His (H) 0.4% 2.2% 0.0% Ile (I) 6.6% 8.2% 7.7% Leu (L) 7.8% 7.9% 11.6% Lys (K) 6.6% 7.5% 9.3% Met (M) 5.8% 3.7% 2.3% Phe (F) 5.0% 4.5% 3.1% Pro (P) 2.3% 2.2% 4.2% Ser (S) 5.8% 4.9% 4.2% Thr (T) 3.5% 4.1% 5.0% Trp (W) 0.0% 0.0% 1.2% Tyr (Y) 1.2% 0.4% 1.5% Val (V) 7.0% 7.1% 4.6% Πίνακας 18: Αμινοξική σύσταση των αλληλουχιών της Εικόνας 18.

Η σύσταση των στοιχείων δευτεροταγούς δομής είναι ως επί το πλείστον όμοια ανάμεσα στα τρια ένζυμα, με εξαίρεση μια μικρή μείωση στις α-έλικες και αύξηση β-πτυχωτών επιφανειών στην πρωτεΐνη του μέτρια αλόφιλου R. nubinhibens (Πίνακας 19 – Εικόνα 19). Όσον αφορά το ποσοστό των αμινοξέων που συμμετέχουν σε γέφυρες άλατος παρατηρούμε μια σταδιακή αύξηση πηγαίνοντας από το ένζυμο του μεσόφιλου οργανισμού σε αυτό του μέτρια αλόφιλου και τέλος στου θερμο-οξεόφιλου M. sedula. Επίσης, η πρωτεΐνη του M. sedula εμφανίζει μειωμένο ποσοστό αμινοξέων που συμμετέχουν σε δεσμούς υδρογόνου σε σχέση με τις άλλες πρωτεΐνες, ενώ δεν παρατηρούνται δισουλφιδικοί δεσμοί σε καμία περίπτωση (Πίνακας 19 - Εικόνα 20).

41 α-έλικες β-πτυχωτές Turns & Γέφυρες Δεσμοί Δισουλφιδικοί Coils άλατος υδρογόνου δεσμοί

R. 47% 25% 26% 11.5% των αα 88% των αα 0 nubinhibens 5XZD C. 49% 23% 26% 9.06% των αα 88% των αα 0 acetobutylicum 5Z7R M. sedula 50% 22% 26% 13.7% των αα 85% των αα 0 5ZAI Πίνακας 19: Ποσοστό στοιχείων δευτεροταγούς δομής, αμινοξέων που συμμετέχουν σε γέφυρες άλατος και δεσμούς υδρογόνου και αριθμός δισουλφιδικών δεσμών.

Εικόνα 19: Τρισδιάστατη δομή του εξαμερούς των ECH των α) Metallosphaera sedula β) Clostridium acetobutylicum γ) Roseovarius nubinhibens. Κάθε αλυσίδα απεικονίζεται με διαφορετικό χρώμα.

Εικόνα 20: Γέφυρες άλατος των ECH του α) Metallosphaera sedula β) Clostridium acetobutylicum γ) Roseovarius nubinhibens.

Το εμβαδόν της εκτεθειμένης στο διαλύτη επιφάνειας καθώς και ο όγκος της πρωτεΐνης του M. sedula είναι αυξημένα σε σχέση με τις πρωτεΐνες των C. acetobutylicum και R.

42 nubinhibens (Πίνακας 20). Η διαφορά είναι μικρότερη όταν συγκρίνουμε το ένζυμο του M. sedula με αυτό του μεσόφιλου οργανισμού, ενώ γίνεται ιδιαίτερα αισθητή σε σχέση με την πρωτεΐνη που προέρχεται από το μέτρια αλόφιλο βακτήριο. Η έκταση της φορτισμένης και μη πολικής επιφάνειας είναι παρόμοια στα τρια ένζυμα και τέλος, η συμπαγότητα εμφανίζεται αυξημένη στην περίπτωση του ενζύμου του αλόφιλου R. nubinhibens (Πίνακας 20 – Εικόνα 21).

Εικόνα 21: Εκτεθειμένη στο διαλύτη επιφάνεια χρωματισμένη με βάση το φορτίο. α) Metallosphaera sedula β) Clostridium acetobutylicum γ) Roseovarius nubinhibens.

43 Compactness - Συνολική ASA Φορτισμένη ASA Μη πολική ASA Όγκος Συμπαγότητα R. nubinhibens 42238.2 Ų 10337.8 Ų 24395.7 Ų 205755 ų 2.96 24% 58% 5XZD C. 49876.9 Ų 11578.8 Ų 29579.2 Ų 221184.1 ų 2.82 acetobutylicum 23% 59% 5Z7R M. sedula 52148.5 Ų 12438.2 Ų 30673.9 Ų 234821.1 ų 2.83 24% 59% 5ZAI Πίνακας 20: Εκτεθειμένη στο διαλύτη συνολική, φορτισμένη και μη πολική επιφάνεια. Αναγράφονται επίσης ο όγκος και η συμπαγότητα των πρωτεϊνών.

3.6 Vacuolar protein sorting 4 AAA-ATPase

Η Vps4 του Metallosphaera sedula συγκρίθηκε με τις Vps4 των Sulfolobus solfataricus και Saccharomyces cerevisiae, ενός υπερθερμόφιλου και οξεόφιλου αρχαίου και ενός μεσόφιλου μύκητα αντίστοιχα (Πίνακας 21).

Βέλτιστη θερμοκρασία PDB ID - Ολιγομερική ανάπτυξης (°C) κατάσταση Saccharomyces cerevisiae 30-35 2QP9 Μονομερές Metallosphaera sedula 75 4D82 Μονομερές Sulfolobus solfataricus 80 4LGM Μονομερές Πίνακας 21: Πίνακας με τη βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης των οργανισμών από τους οποίους προέρχονται οι πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκαν, βέλτιστη θερμοκρασία ενεργότητας, κωδικός PDB και λειτουργική ολιγομερική κατάσταση των πρωτεϊνών αυτών. Δεν υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα για τις βέλτιστες συνθήκες ενεργότητας των παραπάνω ενζύμων.

Η πρωτεΐνη Vps4 είναι μία AAA-ATPase η οποία παίρνει μέρος στο μονοπάτι MVB (Multi-Vesicular Body). Ρόλος της είναι η αποσυναρμολόγηση των συμπλόκων ESCRT, αφού αυτά επιτελέσουν τη λειτουργία τους.

44 Η πρωτεΐνη Vps4 εντοπίζεται ως μονομερές. Στην εικόνα 22 παρατηρούμε μια περιοχή στην πρωτεΐνη του Saccharomyces cerevisiae που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 278-314 αλλά απουσιάζει από τις πρωτεΐνες των ακραιόφιλων οργανισμών. Αυτό οφείλεται στην παρουσία μιας επιπλέον περιοχής (β domain) που είναι παρούσα μόνο στην Vps4 του μύκητα S. cerevisiae, καθώς απουσιάζει από τις Vps4 οργανισμών του φύλου Crenarchaeota στο οποίο ανήκει ο M. sedula και ο S. solfataricus (Εικόνα 22).

Εικόνα 22: Αμινοξική στοίχιση των μονομερών των ενζύμων όπως αυτά εμφανίζονται στις καταχωρήσεις της PDB και πιθανώς σε κάποιες περιπτώσεις να μην αντιστοιχούν στην πλήρους μήκους πρωτεΐνη. Metallosphaera sedula (κωδικός PDB 4D82), Sulfolobus solfataricus (κωδικός PDB 4LGM), Saccharomyces cerevisiae (κωδικός PDB 2QP9).

45 Η πρωτεΐνη του M. sedula έχει αυξημένο ποσοστό γλουταμινικού οξέος (Glu, E) σε σχέση με τις ομόλογες πρωτεΐνες της. Το κατάλοιπο αυτό είναι και το μόνο για το οποίο παρατηρούμε κάποια διαφορά ανάμεσα στις πρωτεΐνες των δυο θερμο-οξεόφιλων οργανισμών. Όσον αφορά τη σύγκριση της αμινοξικής σύστασης με την πρωτεΐνη του μεσόφιλου οργανισμού, παρατηρούμε πως το ένζυμο του M. sedula έχει μειωμένη περιεκτικότητα σε γλυκίνη (Gly, G), σερίνη (Ser, S) και θρεονίνη (Thr, T) και αυξημένη περιεκτικότητα σε λυσίνη (Lys, L) (Πίνακας 22).

Αμινοξύ Saccharomyces Metallosphaera Sulfolobus cerevisiae sedula solfataricus Ala (A) 7.3% 9.1% 7.8% Arg (R) 4.8% 5.1% 4.7% Asn (N) 3.9% 4.1% 3.7% Asp (D) 7.0% 6.1% 6.1% Cys (C) 0.0% 0.3% 0.3% Gln (Q) 3.1% 1.7% 2.7% Glu (E) 8.5% 10.8% 8.5% Gly (G) 8.7% 5.1% 5.1% His (H) 0.6% 1.7% 0.3% Ile (I) 5.6% 5.7% 7.1% Leu (L) 8.5% 9.8% 9.5% Lys (K) 8.5% 10.5% 9.8% Met (M) 2.0% 2.7% 2.4% Phe (F) 3.4% 3.4% 4.4% Pro (P) 4.8% 5.1% 6.1% Ser (S) 8.7% 4.4% 4.4% Thr (T) 6.5% 3.0% 4.7% Trp (W) 1.1% 1.4% 1.4% Tyr (Y) 1.4% 2.7% 3.7% Val (V) 5.6% 7.4% 7.1% Πίνακας 22: Αμινοξική σύσταση των αλληλουχιών της Εικόνας 22.

Όσον αφορά τα στοιχεία δευτεροταγούς δομής, οι πρωτεΐνες των θερμο-οξεόφιλων οργανισμών M. sedula και S. solfataricus εμφανίζουν παρόμοια σύσταση, ενώ η πρωτεΐνη του μεσόφιλου S. cerevisiae έχει μικρότερη περιεκτικότητα σε α-έλικες και μεγαλύτερη σε β-πτυχωτές επιφάνειες, ενώ δεν παρατηρείται κάποια διαφορά ως προς τις περιοχές βρόχους των τριών ενζύμων. (Πίνακας 23 – Εικόνα 23). Τα τρια ένζυμα παρουσιάζουν παρόμοιο ποσοστό αμινοξέων που παίρνουν μέρος στο σχηματισμό δεσμών υδρογόνου και δεν παρατηρούνται δισουλφιδικοί δεσμοί σε κανένα από αυτά. Επίσης, οι πρωτεΐνες των θερμο-οξεόφιλων οργανισμών περιέχουν σχεδόν ίδιο ποσοστό αμινοξέων που σχηματίζουν γέφυρες άλατος, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό για την πρωτεΐνη του μεσόφιλου S. cerevisiae παραλήφθηκε τόσο από τον πίνακα 23 όσο και από την εικόνα 24 λόγω υψηλού ποσοστού ημιτελών πλευρικών αλυσίδων, γεγονός που καθιστά τους συγκεκριμένους υπολογισμούς ανακριβείς (Πίνακας 23 – Εικόνα 24).

46 α-έλικες β-πτυχωτές Turns & Γέφυρες Δεσμοί Δισουλφιδικοί Coils άλατος υδρογόνου δεσμοί

S. cerevisiae 47% 20% 31% * 82% των αα 0 2QP9 M. sedula 52% 16% 31% 12% των αα 84% των αα 0 4D82 S. 50% 15% 33% 12.7% των αα 84% των αα 0 solfataricus 4LGM Πίνακας 23: Ποσοστό στοιχείων δευτεροταγούς δομής, αμινοξέων που συμμετέχουν σε γέφυρες άλατος και δεσμούς υδρογόνου και αριθμός δισουλφιδικών δεσμών. *Λόγω υψηλού ποσοστού ημιτελών πλευρικών αλυσίδων στην Vps4 του S. cerevisiae, το ποσοστό των αα που συμμετέχουν σε γέφυρες άλατος είναι ανακριβές και γι’αυτό παραλήφθηκε.

Εικόνα 23: Τρισδιάστατη δομή του μονομερούς της Vps4 των α) Metallosphaera sedula β) Sulfolobus solfataricus γ) Saccharomyces cerevisiae.

Εικόνα 24: Γέφυρες άλατος της Vps4 και ECH του α) Metallosphaera sedula β) Sulfolobus solfataricus.

Το εμβαδόν της εκτεθειμένης στο διαλύτη επιφάνειας και ο όγκος της πρωτεΐνης του M. sedula είναι μεγαλύτερο από αυτό της πρωτεΐνης του επίσης θερμο-οξεόφιλου S. solfataricus αλλά είναι μικρότερο από το ένζυμο του μεσόφιλου S. cerevisiae (Πίνακας 24). Οι πρωτεΐνες των θερμο-οξεόφιλων οργανισμών έχουν επίσης παρόμοια συμπαγότητα και έκταση φορτισμένης και

47 μη πολικής επιφάνειας (Πίνακας 24 - Εικόνα 25). Ωστόσο, η πρωτεΐνη του μεσόφιλου οργανισμού παρουσιάζει μείωση ως προς το εμβαδόν της φορτισμένης επιφάνειας και αύξηση της μη πολικής επιφάνειας και της συμπαγότητας σε σχέση με τις θερμο-οξεόφιλες πρωτεΐνες. Παρατηρούμε επίσης όπως φαίνεται και στην εικόνα 25 πως ο λεπτός βραχίονας κάτω από το β domain του μεσόφιλου ενζύμου αποτελείται κυρίως από αρνητικά φορτισμένα αμινοξέα στην επιφάνειά του. Στην περίπτωση των ενζύμων των θερμο-οξεόφιλων οργανισμών η περιοχή αυτή είτε έχει ομοιόμορφη κατανομή θετικών και αρνητικών αμινοξέων, όπως στην περίπτωση του M. sedula, είτε καλύπτεται κυρίως από θετικά φορτισμένα κατάλοιπα, όπως στην περίπτωση του S. solfataricus (Πίνακας 24 – Εικόνα 25).

Εικόνα 25: Εκτεθειμένη στο διαλύτη επιφάνεια χρωματισμένη με βάση το φορτίο. α) Metallosphaera sedula β) Sulfolobus solfataricus γ) Saccharomyces cerevisiae.

48 Compactness - Συνολική ASA Φορτισμένη ASA Μη πολική ASA Όγκος Συμπαγότητα S. cerevisiae 14976.4 Ų 2588.6 Ų 9587.3 Ų 37500.5 ų 2.76 17% 64% 2QP9 M. sedula 14082.9 Ų 3323.3 Ų 8291.8 Ų 37084.5 ų 2.62 5ZAI 24% 59% S. solfataricus 13522.5 Ų 2975.4 Ų 8123.6 Ų 35251.2 ų 2.60 22% 60% 4LGM Πίνακας 24: Εκτεθειμένη στο διαλύτη συνολική, φορτισμένη και μη πολική επιφάνεια. Αναγράφονται επίσης ο όγκος και η συμπαγότητα των πρωτεϊνών.

49 4. Συμπεράσματα – Συζήτηση

Στην εν λόγω εργασία συγκρίναμε 6 πρωτεΐνες του θερμο-οξεόφιλου αρχαίου Metallosphaera sedula με ομόλογές τους πρωτεΐνες από μεσόφιλους ή άλλους ακραιόφιλους οργανισμούς. Πιο συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες του θερμο-οξεόφιλου M. sedula συγκρίθηκαν με ομόλογές τους πρωτεΐνες από ψυχρόφιλους, μεσόφιλους, θερμο-οξεόφιλους, υπερθερμόφιλους και αλόφιλους οργανισμούς. Η σύγκριση των πρωτεϊνών έγινε για μια σειρά ιδιοτήτων που έχουν ήδη αναφερθεί παραπάνω, με σκοπό τον πιθανό εντοπισμό χαρακτηριστικών που έχουν την τάση να εμφανίζονται ή να απουσιάζουν από συγκεκριμένες πρωτεΐνες και ενδεχομένως να σχετίζονται με την ικανότητά τους να παραμένουν ενεργές σε ακραίες συνθήκες.

Οι ψυχρόφιλοι οργανισμοί αποτέλεσαν το μικρότερο μέρος του δείγματός μας, καθώς έγινε μόνο μια σύγκριση ανάμεσα σε μια από τις έξι πρωτεΐνες του θερμο-οξεόφιλου M. sedula και μια ομόλογή της από τον ψυχρόφιλο A. arcticum. Όσον αφορά τη σύγκριση αυτή και πιο συγκεκριμένα την αμινοξική σύσταση των πρωτεϊνών, παρατηρήσαμε συγκριτικά μειωμένη συχνότητα εμφάνισης αλανίνης και γλουταμίνης στην πρωτεΐνη του M. sedula. Επίσης παρατηρήσαμε αυξημένη συχνότητα εμφάνισης γλουταμινικού οξέος, ισολευκίνης, λυσίνης και σερίνης σε σχέση με το ψυχρόφιλο ένζυμο. Οι δύο πρωτεΐνες δε φάνηκε να διαφέρουν ως προς τη σύστασή τους σε στοιχεία δευτεροταγούς δομής, ωστόσο η θερμόφιλη πρωτεΐνη του M. sedula σχηματίζει περισσότερες γέφυρες άλατος και δεσμούς υδρογόνου σε σχέση με την ομόλογη ψυχρόφιλη πρωτεΐνη. Επίσης, η εκτεθειμένη στο διαλύτη φορτισμένη επιφάνεια της πρωτεΐνης του θερμο-οξεόφιλου οργανισμού καθώς και η συμπαγότητά της ήταν αυξημένη, ενώ μειωμένος ήταν ο όγκος της σε σχέση με τα αντίστοιχα μεγέθη της ψυχρόφιλης πρωτεΐνης. Οι δύο πρωτεΐνες δεν παρουσίασαν κάποια αξιοσημείωτη διαφορά ως προς τη συνολική και μη πολική επιφάνεια που εκθέτουν στο διαλύτη.

Οι μεσόφιλοι οργανισμοί αποτέλεσαν την πιο συχνή κατηγορία οργανισμών των οποίων οι πρωτεΐνες συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες του θερμο-οξεόφιλου M. sedula. Από τις 6 πρωτεΐνες του M. sedula οι 5 συγκρίθηκαν με τουλάχιστον μια ομόλογή τους από μεσόφιλο οργανισμό. Όσον αφορά τη σύγκριση της αμινοξικής σύστασης των πρωτεϊνών αυτών παρατηρήσαμε πως σε 3 από τις 5 περιπτώσεις οι πρωτεΐνες του M. sedula εμφάνισαν μείωση στην περιεκτικότητα σε γλυκίνη, ενώ 4 στις 5 παρουσίασαν αύξηση λυσίνης. Τουλάχιστον σε ότι αφορά τις λυσίνες η παρατήρηση αυτή είναι σύμφωνη με την αύξηση που παρατηρείται στην πρωτεΐνη του M. sedula σε σχέση με την ομόλογή της από τον ψυχρόφιλο οργανισμό. Ως προς τα στοιχεία δευτεροταγούς δομής δε βρήκαμε κάποια συστηματική διαφορά. Εντοπίσαμε ωστόσο μια τάση αύξησης των αμινοξέων που συμμετέχουν σε γέφυρες άλατος και δεσμούς υδρογόνου στις πρωτεΐνες του

50 θερμο-οξεόφιλου οργανισμού σε σχέση με τις αντίστοιχες από τους μεσόφιλους σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της σύγκρισης με την πρωτεΐνη του ψυχρόφιλου οργανισμού. Πιο συγκεκριμένα, σε 4 από τις 5 περιπτώσεις οι πρωτεΐνες του M. sedula εμφάνισαν αύξηση στο ποσοστό των αμινοξέων που σχηματίζουν γέφυρες άλατος, ενώ για την τελευταία περίπτωση τα δεδομένα ήταν ανεπαρκή λόγω υψηλού ποσοστού ημιτελών πλευρικών αλυσίδων στο αρχείο συντεταγμένων της πρωτεΐνης του μεσόφιλου οργανισμού. Στο ίδιο μοτίβο με τις γέφυρες άλατος, σε 4 στις 5 περιπτώσεις παρατηρήθηκε αύξηση των αμινοξέων που σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου στις πρωτεΐνες του Μ. sedula, ωστόσο σε αυτή την περίπτωση παρατηρήσαμε μείωση τους σε 1 εκ των 5 συγκρίσεων. Τέλος, στις 3 από τις 5 περιπτώσεις παρατηρήσαμε πως οι πρωτεΐνες του θερμο-οξεόφιλου οργανισμού εμφάνισαν αύξηση της εκτεθειμένης στο διαλύτη φορτισμένης επιφάνειας, ενώ δεν παρατηρήθηκε κάποια συστηματική διαφορά ως προς τον όγκο, τη συμπαγότητα και το εμβαδόν της συνολικής και μη πολικής επιφάνειας που εκθέτουν στο διαλύτη οι πρωτεΐνες.

Η σύγκριση δυο εκ των πρωτεϊνών του θερμο-οξεόφιλου M. sedula έγινε και με ομόλογες τους πρωτεΐνες από τον επίσης θερμο-οξεόφιλο S. solfataricus. Κατά τις συγκρίσεις αυτές δεν εντοπίσαμε διαφορές σε καμία από τις ιδιότητες που ελέγχθηκαν ανάμεσα στις πρωτεΐνες των δύο οργανισμών.

Δύο από τις 6 πρωτεΐνες του M. sedula συγκρίθηκαν με ομόλογές τους πρωτεΐνες από υπερθερμόφιλους οργανισμούς. Κατά τις συγκρίσεις αυτές και όσον αφορά την αμινοξική σύστασή τους παρατηρήθηκε μείωση της περιεκτικότητας των πρωτεϊνών του θερμο-οξεόφιλου οργανισμού σε ισολευκίνη και αύξηση σε σερίνη σε σχέση με τις αντίστοιχες των υπερθερμόφιλων οργανισμών. Επίσης ως προς τα στοιχεία δευτεροταγούς δομής οι πρωτεΐνες του M. sedula εμφάνισαν αυξημένο ποσοστό περιοχών βρόχων σε σχέση με τις υπερθερμόφιλες ομόλογές τους. Οι πρωτεΐνες του M. sedula εμφάνισαν μείωση των αμινοξέων που παίρνουν μέρος στο σχηματισμό δεσμών υδρογόνου, ενώ δεν παρατηρήθηκε κάποια διαφορά ως προς τα αμινοξέα που σχηματίζουν γέφυρες άλατος. Μείωση παρατηρήθηκε επίσης και στον όγκο των πρωτεϊνών του θερμο-οξεόφιλου οργανισμού, ενώ παρόμοια ηταν τα εμβαδά της συνολικής, φορτισμένης και μη πολικής επιφάνειας καθώς και η συμπαγότητα των πρωτεϊνών.

Τέλος, σε δύο περιπτώσεις οι ομόλογες πρωτεΐνες που συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες του M. sedula περιλάμβαναν πρωτεΐνες αλόφιλων οργανισμών. Κατά τις συγκρίσεις των αμινοξικών συστάσεων των πρωτεϊνών αυτών παρατηρήσαμε μείωση του ποσοστού αλανίνης και αύξηση λυσίνης στις πρωτεΐνες του M. sedula. Παρατηρήσαμε επίσης μια αξιοσημείωτη αύξηση των αρνητικά φορτισμένων αμινοξέων σε μια εκ των αλόφιλων πρωτεϊνών, η οποία παρόλο που δεν εμφανίστηκε και στις δύο περιπτώσεις σύγκρισης αναφέρεται λόγω του μεγέθους της. Οι

51 πρωτεΐνες του θερμο-οξεόφιλου και του αλόφιλου οργανισμού εμφάνισαν παρόμοια σύσταση στοιχείων δευτεροταγούς δομής, γεφυρών άλατος και δεσμών υδρογόνου. Στις πρωτεΐνες του M. sedula παρατηρήθηκε αυξημένος όγκος και εμβαδόν της εκτεθειμένης στο διαλύτη επιφάνειας. Επίσης, στη μία από τις δύο περιπτώσεις σύγκρισης πρωτεϊνών του M. sedula και αλόφιλων οργανισμών, εντοπίσαμε μια πολύ μεγάλη μείωση αρνητικά φορτισμένων και αύξηση υδρόφοβων καταλοίπων που είναι εκτεθειμένα στο διαλύτη στη θερμο-οξεόφιλη πρωτεΐνη σε σχέση με την αλόφιλη.

Συνολικά, δεν βρήκαμε κάποια συστηματική αύξηση ή μείωση κάποιου αμινοξέος ή ομάδας αμινοξέων. Υπάρχουν διακυμάνσεις στις διάφορες συγκρίσεις, ωστόσο αυτές είναι μεμονωμένες και δεν ακολουθούν κάποιο μοτίβο που θα μπορούσε να φανερώνει κάποια σύνδεση με την προσαρμογή των πρωτεϊνών σε ακραίες συνθήκες. Το ίδιο ισχύει και για τα στοιχεία δευτεροταγούς δομής. Ωστόσο, το ποσοστό των αμινοξέων που συμμετέχουν σε γέφυρες άλατος και δεσμούς υδρογόνου φαίνεται να ακολουθεί αυξητική πορεία ανάλογη της αύξησης της βέλτιστης θερμοκρασίας ενζυμικής ενεργότητας. Πιο συγκεκριμένα, παρατηρήσαμε πως τα αμινοξέα αυτά είναι αυξημένα στις πρωτεΐνες του θερμο-οξεόφιλου M. sedula σε σχέση με τις πρωτεΐνες του ψυχρόφιλου και των μεσόφιλων οργανισμών. Η διαφορά αυτή δεν υπάρχει όταν συγκρίνουμε τις πρωτεΐνες του M. sedula με τις ομόλογές τους από τον επίσης θερμο-οξεόφιλο S. solfataricus, ενώ τέλος παρατηρείται μείωση στους δεσμούς υδρογόνου των πρωτεϊνών του M. sedula σε σχέση με ομόλογές τους από οργανισμούς που ζουν σε ακόμα μεγαλύτερες θερμοκρασίες από αυτόν. Όσον αφορά την εκτεθειμένη στο διαλύτη συνολική και μη πολική επιφάνεια των πρωτεϊνών, τον όγκο και τη συμπαγότητά τους, δε βρήκαμε κάποια συστηματική αύξηση ή μείωση. Ωστόσο παρατηρήσαμε πως οι πρωτεΐνες του M. sedula παρουσίασαν αύξηση της εκτεθειμένης στο διαλύτη φορτισμένης επιφάνειας σε σχέση με τις πρωτεΐνες των οργανισμών που αναπτύσσονται σε χαμηλότερη θερμοκρασία, δηλαδή του ψυχρόφιλου και των μεσόφιλων οργανισμών. Για το χαρακτηριστικό αυτό των πρωτεϊνών δεν παρατηρείται κάποια συστηματική διαφορά ανάμεσα στις πρωτεΐνες του M. sedula και του επίσης θερμο-οξεόφιλου S. solfataricus ή των υπερθερμόφιλων P. furiosus και P. horikoshii, ενώ αξίζει να αναφερθεί η περίπτωση της μηλικής αφυδρογονάσης του αλόφιλου H. marismortui η οποία εμφανίζει εξαιρετικά μεγάλη συγκέντρωση αρνητικά φορτισμένων αμινοξέων και ταυτόχρονη μείωση υδρόφοβων καταλοίπων στην επιφάνειά της που εκτίθεται στο διαλύτη. Τα παραπάνω ευρήματα φαίνονται στο διάγραμμα παρακάτω.

52 Διάγραμμα 1: Διάγραμμα συγκεντρωτικών αποτελεσμάτων.

Ο λόγος του ποσοστού των αμινοξέων που συμμετέχουν στο σχηματισμό γεφυρών άλατος μιας πρωτεΐνης προς το ποσοστό των αντίστοιχων αμινοξέων της πρωτεΐνης του M. sedula.

Ο λόγος του ποσοστού των αμινοξέων που συμμετέχουν στο σχηματισμό γεφυρών άλατος μιας πρωτεΐνης προς το ποσοστό των αντίστοιχων αμινοξέων της πρωτεΐνης του M. sedula.

Ο λόγος του ποσοστού της εκτεθειμένης στο διαλύτη φορτισμένης επιφάνειας μιας πρωτεΐνης προς το αντίστοιχο ποσοστό της πρωτεΐνης του M. sedula.

Στον άξονα x έχουν τοποθετηθεί οι οργανισμοί από τους οποίους προέρχονται οι πρωτεΐνες με βάση τη θερμοκρασία ανάπτυξής τους. Στα αριστερά του άξονα βρίσκεται ο ψυχρόφιλος οργανισμός ενώ στα δεξιά του άξονα οι υπερθερμόφιλοι. Ο άξονας x είναι χρωματισμένος με βάση την κατηγορία στην οποία ανήκει κάθε οργανισμός. Στο γαλάζιο χρώμα αντιστοιχεί ο ψυχρόφιλος οργανισμός. Στο μαύρο χρώμα αντιστοιχούν οι μεσόφιλοι οργανισμοί. Στο πράσινο χρώμα αντιστοιχούν οι αλόφιλοι οργανισμοί (εύρος βέλτιστης θερμοκρασίας ανάπτυξης ίδιο με των μεσόφιλων οργανισμών). Στο πορτοκαλί χρώμα αντιστοιχούν οι θερμο-οξεόφιλοι οργανισμοί (εύρος βέλτιστης θερμοκρασίας ανάπτυξης ίδιο με των θερμόφιλων οργανισμών) και τέλος στο κόκκινο χρώμα αντιστοιχούν οι υπερθερμόφιλοι οργανισμοί.

Η έρευνα που πραγματοποιήθηκε στην εν λόγω πτυχιακή εργασία πραγματοποιήθηκε για ένα πολύ μικρό δείγμα και τα ευρήματά της είναι μόνο ενδείξεις ενός πιθανού τρόπου με τον οποίο οι πρωτεΐνες των ακραιόφιλων οργανισμών παραμένουν ενεργές σε ακραίες συνθήκες. Ωστόσο, η μελέτη αυτή μπορεί να σταθεί αφορμή για περαιτέρω έρευνα. Στην παρούσα εργασία επικεντρωθήκαμε στις πρωτεΐνες του θερμο-οξεόφιλου αρχαίου Metallosphaera sedula. Οι ίδιες

53 ιδιότητες θα μπορούσαν να ελεγχθούν και για πρωτεΐνες περισσοτέρων οργανισμών διαφόρων κατηγοριών ακραιόφιλων οργανισμών.

Η αύξηση των δεσμών υδρογόνου και γεφυρών άλατος με τη βέλτιστη θερμοκρασία ενζυμικής ενεργότητας αποτελεί μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση. Η επιβεβαίωση της τάσης αυτής μετά από έλεγχο μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών από ψυχρόφιλους, μεσόφιλους, θερμόφιλους και υπερθερμόφιλους οργανισμούς θα μπορούσε να συσχετίσει την αυξημένη σταθερότητα ή ευελιξία των πρωτεϊνών με τη ικανότητά τους να επιβιώνουν σε υψηλή ή χαμηλή θερμοκρασία αντίστοιχα. Επίσης, υψηλή παρουσία περιοχών βρόχων σε πρωτεΐνες ψυχρόφιλων οργανισμών που μειώνεται στις αντίστοιχες πρωτεΐνες των οργανισμών που ζουν σε υψηλές θερμοκρασίες, καθώς και το αντίθετο για τις α-έλικες και τις β-πτυχωτές επιφάνειες θα μπορούσε επίσης να ενισχύσει την παραπάνω ιδέα.

Αυξητική τάση παρατηρήθηκε και για την εκτεθειμένη στο διαλύτη φορτισμένη επιφάνεια πηγαίνοντας προς τις πρωτεΐνες των οργανισμών που ζουν σε υψηλή θερμοκρασία. Η ιδιότητα αυτή θα μπορούσε να ελεγχθεί για μεγαλύτερο αριθμό πρωτεϊνών που προέρχονται από μια μεγαλύτερη γκαμα οργανισμών. Επίσης, η αξιοσημείωτα υψηλή συγκέντρωση αρνητικά φορτισμένων αμινοξέων στην επιφάνεια που εκθέτει η μηλική αφυδρογονάση του Haloarcula marismortui θα μπορούσε να αποτελέσει τη βάση ώστε μελλοντικές μελέτες να εστιάσουν στην ιδιότητα αυτή σε πρωτεΐνες αλόφιλων οργανισμών.

Τέλος, οι μελλοντικές μελέτες δε θα πρέπει να περιοριστούν μόνο στις ιδιότητες που ελέγχθηκαν στην παρούσα εργασία. Θα μπορούσαν να πραγματοποιηθούν για μεγαλύτερη ποικιλία ιδιοτήτων, όπως η επικράτηση ή απουσία συγκεκριμένων αμινοξέων σε συγκεκριμένες θέσεις των πρωτεϊνών, διαφορές στα τοπολογικά διαγράμματα κ.ά. Η μελέτη του τρόπου με τον οποίο οι πρωτεΐνες των ακραιόφιλων οργανισμών παραμένουν ενεργές σε ακραίες συνθήκες έχει εκτός από το θεωρητικό ενδιαφέρον και πρακτικά οφέλη. Η κατανόηση των ιδιοτήτων που συμβάλλουν στην ανθεκτικότητα αυτή των πρωτεϊνών θα μπορούσε να αποτελέσει τη βάση για μελέτες πρωτεϊνικής μηχανικής ώστε η τροποποίηση πρωτεϊνών ως προς τις ιδιότητες αυτές να οδηγήσει στην παραγωγή ακόμα πιο αποδοτικών ενζύμων και πρωτεϊνών με βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον. Τέλος, η μελέτη των ακραιόφιλων πρωτεϊνών και γενικότερα των ακραιόφιλων οργανισμών μπορεί να επεκτείνει τις γνώσεις μας ως προς τα θεωρητικά όρια των συνθηκών στις οποίες μπορεί να υπάρξει ζωή, και να υποστηρίξει την αναζήτηση ζωντανών οργανισμών σε περιβάλλοντα και πλανήτες όπου επικρατούν συνθήκες που ως τώρα θεωρούνται ασύμβατες με τη ζωή.

54 5. Βιβλιογραφικές αναφορές

1. Merino N, Aronson H, Bojanova D, Feyhl-Buska J, Wong M, Zhang S, Giovannelli D. 2019. Living at the extremes: Extremophiles and the limits of life in a planetary context. Frontiers in Microbiology 10:780 2. Schröder C, Burkhardt C, Antranikian G. 2020. What we learn from extremophiles. ChemTexts 6(1). 3. Peoples L, Norenberg M, Price D, McGoldrick M, Novotny M, Bochdansky A, Bartlett D. 2019. A full-ocean-depth rated modular lander and pressure-retaining sampler capable of collecting hadal-endemic microbes under in situ conditions. Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers 143:50-57. 4. Löhr A, Bogaard T, Heikens A, Hendriks M, Sumarti S, Bergen M, Gestel K, Straalen N, Vroon P, Widianarko B. 2004. Natural Pollution Caused by the Extremely Acid Crater Lake Kawah Ijen, East Java, Indonesia. Environmental Science and Pollution Research - International 12(2):89-95. 5. Jirsa F, Gruber M, Stojanovic A, Omondi S, Mader D, Körner W, Schagerl M. 2013. Major and trace element geochemistry of Lake Bogoria and Lake Nakuru, Kenya, during extreme draught. Geochemistry 73(3):275-282. 6. Rothschild LJ, Mancinelli RL. 2001. Life in extreme environments. Nature, 409(6823):1092-1101. 7. Schiraldi C, De Rosa M. 2014. Mesophilic Organisms. Encyclopedia of Membranes. p. 1-2. 8. Madigan MT, Marrs BL. 1997. Extremophiles. Scientific American, 276(4):82-87. 9. Prowe S, Antranikian G. 2001. Anaerobranca gottschalkii sp. nov., a novel thermoalkaliphilic bacterium that grows anaerobically at high pH and temperature. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51(2):457-465. 10. Fiala G, Stetter K. 1986. Pyrococcus furiosus sp. nov. represents a novel genus of marine heterotrophic archaebacteria growing optimally at 100oC. Archives of Microbiology 145(1):56-61. 11. Reed, C., Lewis, H., Trejo, E., Winston, V. and Evilia, C. 2013. Protein Adaptations in Archaeal Extremophiles. Archaea. 2013:1-14. 12. Rampelotto P. 2013. Extremophiles and extreme environments. Life 3(3):482-485. 13. Huber G, Spinnler C, Gambacorta A, Stetter K. 1989. Metallosphaera sedula gen, and sp. nov. represents a new genus of aerobic, metal-mobilizing, thermoacidophilic archaebacteria. Systematic and Applied Microbiology 12(1):38-47. 14. Tomazic SJ, Klibanov AM. 1998. Mechanisms of irreversible thermal inactivation of Βacillus alpha-amylases. J Biol Chem. 263(7):3086-91. 15. Lepock J. 1997. Protein denaturation during heat shock. Thermobiology 19:223-259. 16. Brock, T. D. 1985. Life at high temperatures. Science, 230(4722):132–138. 17. Russell NJ. 1990. Cold adaptation of microorganisms. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences 326(1237):595-611. 18. Cavicchioli R, Thomas T, Curmi PMG. 2000. Cold stress response in Archaea. Extremophiles. 4(6):321–331.

55 19. Wharton, DA, Ferns, DJ. 1995. Survival of intracellular freezing by the Antarctic nematode Panagrolaimus davidi. J. Exp. Biol. 198(6):1381–1387. 20. Feller G. 2010. Protein stability and enzyme activity at extreme biological temperatures. J Phys Condens Matter. 22(32):323101. 21. D’Amico S, Collins T, Marx JC, Feller G, Gerday C. 2006. Psychrophilic microorganisms: Challenges for life. EMBO Rep. 7(4):385–389. 22. Morita RY. 1975. Psychrophilic bacteria. Bacteriol Rev. 39(2):144–167. 23. Quatrini R, Johnson D.B. 2016. Acidophile microbiology in space and time. Acidophiles: Life in Extremely Acidic Environments, Caister Academic Press. p. 3-16 24. Johnson D, Hallberg K. 2003. The microbiology of acidic mine waters. Research in Microbiology 154(7):466-473. 25. Baker-Austin C, Dopson M. 2007. Life in acid: pH homeostasis in acidophiles. Trends in Microbiology 15(4):165-171. 26. Preiss L, Hicks D, Suzuki S, Meier T, Krulwich T. 2015. Alkaliphilic bacteria with impact on industrial applications, concepts of early life forms, and bioenergetics of ATP Synthesis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 3:3-4. 27. Jones B, Grant W, Collins N, Mwatha W. 1994. Alkaliphiles: diversity and identification. Bacterial Diversity and Systematics 75:195-230. 28. Duckworth A, Grant W, Jones B, Steenbergen R. 1996. Phylogenetic diversity of soda lake alkaliphiles. FEMS Microbiology Ecology 19(3):181-191. 29. Groth I, Schumann P, Rainey F, Martin K, Schuetze B, Augsten K. 1997. Bogoriella caseilytica gen. nov., sp. nov., a New Alkaliphilic Actinomycete from a Soda Lake in Africa. International Journal of Systematic Bacteriology 47(3):788-794. 30. Horikoshi K. 1999. Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology. Microbiology and Molecular Biology Reviews 63(4):735-750. 31. Yakimov M, Giuliano L, Chernikova T, Gentile G, Abraham W, Lünsdorf H, Timmis K, Golyshin P. 2001. Alcalilimnicola halodurans gen. nov., sp. nov., an alkaliphilic, moderately halophilic and extremely halotolerant bacterium, isolated from sediments of soda-depositing Lake Natron, East Africa Rift Valley. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51(6):2133-2143. 32. Oren A. 1999. Bioenergetic aspects of halophilism. Microbiology and Molecular Biology Reviews 63(2):334-348. 33. Edbeib M, Wahab R, Huyop F. 2016. Halophiles: biology, adaptation, and their role in decontamination of hypersaline environments. World Journal of Microbiology and Biotechnology 32(8):135. 34. Karan R, Capes M, DasSarma S. 2012. Function and biotechnology of extremophilic enzymes in low water activity. Aquatic Biosystems 8(1):4. 35. Margesin R, Schinner F. 2001. Bioremediation (natural attenuation and biostimulation) of diesel-oil-contaminated soil in an alpine glacier skiing area. Applied and Environmental Microbiology 67(7):3127-3133. 36. Farag M, Elmassry M, Baba M, Friedman R. 2019. Revealing the constituents of Egypt’s oldest beer using infrared and mass spectrometry. Scientific Reports 9(1). 37. Oliver S. 1991. “Classical” Yeast Biotechnology. Saccharomyces p. 213-248. 38. Bokulich N, Bamforth C. 2013. The Microbiology of Malting and Brewing. Microbiology and Molecular Biology Reviews 77(2):157-172.

56 39. Rehman K, Niaz S, Tahir A, Akash M. 2020. Microorganisms and antibiotic production. Antibiotics and Antimicrobial Resistance Genes in the Environment. p. 1-6. 40. Herbert RA. 1992. A perspective on the biotechnological potential of extremophiles. Trends Biotechnol. 10(11): 395–402. 41. Siddiqui K, Parkin D, Curmi P, Francisci D, Poljak A, Barrow K, Noble M, Trewhella J, Cavicchioli R. 2009. A novel approach for enhancing the catalytic efficiency of a protease at low temperature: Reduction in substrate inhibition by chemical modification. Biotechnology and Bioengineering 103(4):676-686. 42. Elleuche S, Schröder C, Sahm K, Antranikian G. 2014. Extremozymes—biocatalysts with unique properties from extremophilic microorganisms. Current Opinion in Biotechnology 29:116-123. 43. Tindall KR, Kunkel TA. 1988. Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. Biochemistry. 27(16): 6008–13. 44. Lundberg K, Shoemaker D, Adams M, Short J, Sorge J, Mathur E. 1991. High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus. Gene 108(1):1-6. 45. Mattila P, Korpela J, Tenkanen T, Pitkämem K. 1991. Fidelity of DNA synthesis by the Thermococcus litoralis DNA polymerase—an extremely heat stable enzyme with proofreading activity. Nucleic Acids Research 19(18):4967-4973. 46. Gurvitz A, Lai LY, Neilan BA. 1994. Exploiting biological materials in forensic science. Australas Biotechnol. 4(2): 88–91 47. Lomax W, Hammond K, Clemente M, East R. 1996. New entrants in a mature market: An empirical study of the detergent market. Journal of Marketing Management 12(4):281-295. 48. Kumar D, Savitri, Thakur N, Verma R, Bhalla T. 2008. Microbial proteases and application as laundry detergent additive. Research Journal of Microbiology 3(12):661-672. 49. Fariha H, Aamer AS, Sundus J, Abdul H. 2010. Enzymes used in detergents: lipases. African Journal of Biotechnology 9(31):4836-4844. 50. Tindbaek N, Svendsen A, Oestergaard P, Draborg H. 2004. Engineering a substrate‐specific cold‐adapted subtilisin. Protein Engineering, Design and Selection 17(2):149-156. 51. Chauhan M, Chauhan R, Garlapati V. 2013. Evaluation of a new lipase from staphylococcus sp. for detergent additive capability. BioMed Research International 2013:1-6. 52. Messia M, Candigliota T, Marconi E. 2007. Assessment of quality and technological characterization of lactose-hydrolyzed milk. Food Chemistry 104(3):910-917. 53. Coker J, Brenchley J. 2006. Protein engineering of a cold-active β-galactosidase from Arthrobacter sp. SB to increase lactose hydrolysis reveals new sites affecting low temperature activity. Extremophiles 10(6):515-524. 54. Coker J, Sheridan P, Loveland-Curtze J, Gutshall K, Auman A, Brenchley J. 2003. biochemical characterization of a β-galactosidase with a low temperature optimum obtained from an Antarctic arthrobacter isolate. Journal of Bacteriology 185(18):5473-5482. 55. Podar M, Reysenbach A. 2006. New opportunities revealed by biotechnological explorations of extremophiles. Current Opinion in Biotechnology 17(3):250-255.

57 56. Vera M, Schippers A, Sand W. 2013. Progress in bioleaching: fundamentals and mechanisms of bacterial metal sulfide oxidation—part A. Applied Microbiology and Biotechnology 97(17):7529-7541. 57. Everts S. 2012. Mining with microbes. Chem Eng News. 90(42):34-35. 58. Auernik K, Kelly R. 2009. Physiological versatility of the extremely thermoacidophilic archaeon Metallosphaera sedula supported by transcriptomic analysis of heterotrophic, autotrophic, and mixotrophic growth. Applied and Environmental Microbiology 76(3):931-935. 59. Kouranov A. 2006. The RCSB PDB information portal for structural genomics. Nucleic Acids Research 34:D302-D305. 60. Altschul S, Gish W, Miller W, Myers E, Lipman D. 1990. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215(3):403-410. 61. Feng D, Doolittle R. 1987. Progressive sequence alignment as a prerequisitetto correct phylogenetic trees. Journal of Molecular Evolution 25(4):351-360. 62. Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, Duvaud S, Wilkins M, Appel R, Bairoch A. 2005. Protein identification and analysis tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook p. 571-607. 63. Willard L, Ranjan A, Zhang H, Monzavi H, Boyko RF, Sykes BD, Wishart DS. 2003. VADAR: a web server for quantitative evaluation of protein structure quality. Nucleic Acids Research 31(13):3316-3319. 64. Hebditch M, Warwicker J. 2019. Web-based display of protein surface and pH-dependent properties for assessing the developability of biotherapeutics. Scientific Reports 9(1).

58 6. Παράρτημα

​

Organism Domain Properties Location Base of the resistance References Thermotoga maritima Bacterium 55-90 °C (opt. 80°C), anaerobic Geothermally Robert Huber et al. heated sea floors (1986) Thermoplasma Archaea 59°C/pH 2 Self-heating coal Edward F DeLong acidophilum refuse piles and (2000) solfatara fields Thermus aquaticus Archaea ~40-79°C (opt. 70-72°C) Hot springs, hot tap TD Brock et al. water (1969) Archaea 80-110°C/high salt concentration Deep sea high content of negatively Alexei I. Slesarev hydrothermal vents charged amino acids, high et al. (2002) Methanopyrus kandleri ​ intracellular concentration of trianionic cDPG Pyrococcus furiosus Archaea 70-103°C (opt. 100°) Geothermally heated Hydrogen inhibition is G Fiala et al. (1986)

marine sediments abolished by So, where hydrogen appears to be "detoxified" within the cells

due to the formation of H2S ​Geogemma barossii 121 Archaea 85-121°C Hydrothermal vents K Kashefi, DR Lovley (2003) ​Geothermobacterium Bacterium 65-100oC (opt. 85-90oC) Hot sediment samples K Kashefi et al. ​ferrireducens FW-1a from Obsidian Pool, (2002) Yellowstone National Park Sulfolobus solfataricus Archaea 80oC/pH 2-4 Solfatara volcano Maintains its cytoplasmic pH Q She et al. (2001) P2 at about 6.5 by generating a large pH gradient across the cytoplasmic membrane Sulfolobus Archaea 75-80°C/pH 2-3 Terrestrial solfataric L Chen et al. (2005) acidocaldarius springs Acidianus infernus Archaea pH 1-5.5 (opt. pH 2)/65-96oC Hot water, mud, and A Segerer et al. (opt. 90oC) marine sediments at (1986) geothermal springs Picrophilus torridus Archaea pH 0.7/ 60°C Dry solfatarric fields Highly acid stable, very low O Fütterer et al. proton permeability membrane (2004) Cyanidium caldarium Eukarya pH 2/up to 80oC Acid hot springs Perhaps the high protein RW Bailey, LA content (50 to 55%) of the Staehelin (1968) walls is related to the heat and acid tolerance Picrophilus oshimae Archaea pH ~0 (opt. pH 0.7)/47-65oC(opt. Solfataric Potentially through increased C Schleper et al. 60oC) hydrothermal areas cyclization of their (1996) N Merino et al. tetraether membrane lipids as a (2019) generalized response to pH, temperature, and nutrient stress ​Acidianus brierleyi Archaea pH 1-6 (opt. 1.5-2)/45-75°C (opt. Acidic sofataric spring A Segerer et al. 70°C) (1986) ​Acidithiobacillus Bacterium pH 2/30°C Mineral rich, acid J Valdés (2008) ferrooxidans environments

​Dunaliella acidophila Eukarya Neutral cytoplasmic pH while Highly acidic Low membrane proton H Gimmler et al. medium pH 1 environments conductivity, very positive (1989) membrane potential minimizes the influx of protons from the medium, high H+ exporting capacity ​Acidithiobacillus Bacterium pH 1-3 (opt. 2.0-3.0) Composts of soil, J Valdes et al. thiooxidans ATCC 19377 sulfur and rock (2011) 17, phosphate SA Waksman, JS Joffe (1922) ​Euglena mutabilis Eukarya Acid-tolerant Mine-polluted streams Maintainance of a lower AE. Lane, JE. internal pH in the low external Burris (1981) pH range (2.0 to 6.0) Chlamydomonas Eukarya pH 3.5-4.5/ resistant to heavy Acidic mining lakes, E Spijkerman et al. acidophila metals acidic volcanic lakes (‎2007)

Chlamydomonas Eukarya pH 3.4-8.4 Acid mine streams Thickened cell wall that limits I Visviki, D applanata the passive uptake of hydrogen Santikul (1999) ions, expulsion of hydrogen ions ​Thermococcus Archaea pH 5.0-9.5 (opt. pH 9.0)/56-93oC Shallow marine R Dirmeier et al. acidaminovorans (opt. 85oC)/anaerobic hydrothermal system (1998) AEDII10

Thermococcus Archaea pH 6.5-10.5 (opt. pH Shallow marine M Keller et al. alcaliphilus AEDII12 9.0)/56-90oC (opt. 85oC) hydrothermal system (1995) ​Anoxybacillus Bacterium pH 8-10.5 (opt. pH Manure E Pikuta et al. ​pushchinensis K1 9.5-9.7)/37–66oC (opt. (2000)

59 62oC)/tolerant to 3% NaCl (opt. 1% NaCl)/anaerobic ​Clostridium paradoxum Bacterium pH 8.0-10.3 (opt. pH Sewage sludge GM Cook et al. 9.3)/55oC/anaerobic (1996) Bacterium pH 7.5-10 (opt. pH 9) Water/sediment AD Milford et al. Rhodobaca bogoriensis samples from soda (2000) lakes Bacillus pseudofirmus Bacterium pH>9.5 Soil, naturally alkaline Cytoplasmic pH homeostasis B Janto et al. (2011) OF4 ecological niches based on proton efflux/proton uptake and sodium ion efflux and uptake ​Bacillus halodurans Bacterium pH >9.5 Soil Active uptake of H+ mediated H Takami et al. C-125 by Na+ /H+ antiporters (2000) 28, TA Krulwich et al. (2011) ​Roseinatronobacter Bacterium pH 8.5-10.0 (opt. pH ​Hypersaline soda lakes EN Boldareva et al. monicus 9.1-9.5)/moderately halophilic (2007) Alkalimonas amylolytica Bacterium pH 7.5-11 (opt. pH 10)/opt. NaCl Soda lakes Y Ma et al. (2004) N10 2-3% Alkalimonas Bacterium pH 8-11 (opt. pH 10-10.5)/opt. Soda lakes Y Ma et al. (2004) delamerensis 1E1 NaCl 3% Halomonas campisalis Bacterium 0.2-4.5M NaCl (opt. 1.5M)/pH Saline, alkaline lakes MR Mormile et al. 4A 6-12 (opt. pH 9.5) (1999) ​Spirochaeta americana Bacterium 3% (w/v) NaCl/pH 9.5 Alkaline, hypersaline Richard B. Hoover lakes (2003) Halorubrum yunnanense Archaea 1.7-5.1M NaCl (opt. 3.4M) Subterranean salt S Chen et al. (2015) mines Eukarya Absence of salt up to saturated Hypersaline water in Differences on the level of U Petrovic et al. ​Hortaea werneckii NaCl (opt. 0.8-1.7M NaCl) the evaporate ponds of cell-wall pigmentation and (2002), solar eutrophic structure, membrane fluidity, NG Cimerman, A salterns Plemenitas, (2006) compatible solutes, existence of double sets of genes which are expressed differentially at different salinities Archaea 20-25% salt concentrations Salt evaporation ponds High concentrations of K+ ions J Antón et al. Salinibacter ruber in their cytoplasm, use of KCl (2002) to osmotically balance the high NaCl concentration in its surrounding medium ​Halorhodospira halophila Bacterium 15-35% (w/v) NaCl Hypersaline lakes JF Challacombe et SL1 al. (2013) Chromohalobacter Bacterium 6-10% (w/v) NaCl Salted food DM Beutling et al. beijerinckii (2009) ​Spirulina subsalsa Bacterium 0.3-2.5M NaCl Hypersaline lagoons Efflux of Na+ by Na+ /H+ R Gabbay-Azaria et antiporter driven by a proton al. (1992) gradient generated by high activity of cytochrome oxidase under high NaCl concentration Eukarya Optimal salinity range 15-20% Hypersaline waters of Accumulation of glycerol as J Zajc et al. (2014) ​Wallemia ichthyophaga NaCl/xerophile solar salterns the main compatible solute, levels of sodium and potassium change with changing salinity, cell wall thickening at high salinities Halomonas titanicae Bacterium 2–8 % (w/v) NaCl, metallophile Titanic wreck site C Sánchez-Porro et al. (2010) Synechocystis DUN52 Bacterium 15-120% salinity Calcareous Quaternary ammonium FAA Mohammad et stromatolites compounds (especially al. (1983) glycinebetaine) as major osmoticum ​Spirulina platensis Bacterium Resistance in salinity stress MT Zeng et al. (1998) ​Haloferax mediterranei Archaea 170 g L−1 salt Saltern crystallizer A Oren et al. (2014) concentration/47-54oC ponds ​Psychrobacter maritimus Bacterium 4–37°C (opt. 25-28°C)/0-10% Coastal sea ice LA Romanenko et NaCl al. (2004) Psychrobacter Bacterium 4-35 °C (opt. 30oC)/0–12 % (w/v) Squid jeotgal JH Yoon et al. alimentarius NaCl (opt. 2-3%) (2005) ​Psychrobacter arenosus Bacterium 4–37°C (opt. 25-28°C)/0-10% Marine sediment sand LA Romanenko et NaCl al. (2004) ​Planococcus Bacterium -15 to 37oC (opt. 25oC)/19% Permafrost Several chaperones, shock NCS Mykytczuk et halocryophilus Or1 NaCl proteins, regulation and repair al. (2013) mechanism ​Methanococcoides Archaea 1-2°C Permanently cold, De novo synthesis that DS Nichols et al. burtonii methane-saturated incorporates unsaturated lipids (2004) water directly into the membrane Arthrobacter globiformis Bacterium -5 to 32°C (opt. 25°C) Four groups of Csps and Caps, F Berger et al. SI55 each for different levels of (1996) temperature downshift Arthrobacter agilis Bacterium 5-40°C (opt. 30-35°C)/0-10% Antarctic sea ice Production of C-50 carotenoid N Fong et al. (2001) MB813 NaCl bacterioruberin may be involved in rigidifying the cell membrane in low temperature

60 ​Bacillus subtilis Bacterium Adaptation to rapid temperature Upper layer of the soil Heat- and cold-shock proteins, I Budde et al. changes de novo synthesis of (2006) branched-chain fatty acids or desaturation of pre-existing fatty acids ​Psychrobacter arcticus Bacterium −10 to 28°C Fatty acid unsaturation, HL Ayala-del-Río et 273-4 al. (2010) ​Permafrost synthesis of cold shock proteins, use of acetate as an energy source, reduced use of proline and arginine ​Methanogenium Archaea 17oC to the freezing point of the Perennially cold, PD Franzmann et al. frigidum culture medium (opt. 15oC) sulfate-depleted saline (1997) waters Bacterium Psychrophilic Antarctic coastal sea Copes with the increased C Médigue et al. ​Pseudoalteromonas water solubility of oxygen at low (2005) haloplanktis TAC125 temperature by multiplying ​ dioxygen scavenging while deleting whole pathways producing ROS. Dioxygen-consuming lipid desaturases ​Psychromonas Bacterium -12 to 10oC (opt. 5oC) Sea ice Depression of water’s freezing J Breezee et al. ingrahamii point by utilization of glycerol (2004) as a carbon source, high PUFA % Galdieria sulphuraria Eukarya High salt and metal Volcanic hot sulfur Reduced H+ permeability, G Schönknecht tolerance/heat tolerance springs, solfatara soils monovalent cation-proton et al. (2013) antiporters acquired through HGT, variety of metal transporters Thermococcus Archaea 60-90oC (opt. 75oC)/0.1-125MPa Deep-sea C Dalmasso et al. piezophilus (opt. 50MPa)/anaerobic hydrothermal vents (2016) Pyrococcus yayanosii Archaea 20-120MPa (opt 52MPa)/ Deep sea JL Birrien (2011) CH1 80-180oC (opt. 98oC)/anaerobic hydrothermal vents Shewanella benthica Bacterium 70MPa Deep sea High PUFA % (EPA) C Kato et al. DB21MT-2 (1998) ​Moritella yayanosii Bacterium 80MPa Deep sea High PUFA % (DHA) C Kato et al. DB21MT-5 (1998) Bacterium 20MPa/15°C Deep sea Occurance of mono and Y Nogi et al. polyunsaturated fatty acids (1998) ​Photobacterium profundum SS9

Moritella abyssi Bacterium 4oC/19-20MPa Atlantic sediments High PUFA % (DHA) Y Xu et al. (2003) Moritella Japonica Bacterium 50MPa/15oC Deep sea sediments High PUFA % (DHA) Y Nogi et al. (1998) DSK1 Colwellia piezophila Bacterium 60MPa/10oC Deep cold-seep Y Nogi et al. (2004) environments Moritella profunda Bacterium 2oC/20-24MPa Upper layer of deep High PUFA % (DHA) Y Xu et al. (2003) Atlantic sediments Psychromonas profunda Bacterium 2-13oC (opt. 3-4oC)/up to ~50 Upper layer of deep Y Xu et al. (2003) 2825 MPa/moderately halophilic Atlantic sediments ​Shewanella piezotolerans Bacterium 0.1–50 MPa (opt. Deep sea X Xiao et al. (2007) WP3 20MPa)/0–28oC (opt. 15-20oC)/1–7.2 % NaCl (opt. 3-4%) Thermococcus Archaea 88°C/Resistance in radiation Hydrothermal Cellular detoxification systems Y Zivanovic et al. gammatolerans chimneys to cope with ROS produced by (2009) gamma rays Rubrobacter Bacterium Resistance in Hot spring runoff AC Ferreira et al. radiotolerans radiation/moderately thermophile (1999) RSPS-4 Hymenobacter tibetensis Bacterium Resistance in radiation/4-30oC Soil from the Qinghai J Dai et al. (2009) XTM003 (opt. 25oC) - Tibet plateau Deinococcus radiodurans Bacterium Resistance in radiation Radiation-sterilized Radiation resistant proteome, A Krisko et al. corned beef cans robust DNA repair (2013)

Bacillus horneckiae Bacterium Resistance in radiation (up to Surfaces of the PHSF P Vaishampayan et 1000 J/m2 located at the Kennedy al. (2010) Space Center

Kineococcus Bacterium Resistance in radiation/ High-level radioactive ESDSA repair, base excision CE Bagwell et al. radiotolerans SRS30216 metallotolerant waste and nucleotide excision repair (2008)

61 pathway genes are overrepresented, carotenoids as one level of protection against ROS, impressive suite of genes involved in ROS detoxification ​Acinetobacter Bacterium Resistance in radiation Samples of cotton and Y Nishimura et al. radioresistens soil (1988) Deinococcus Bacterium Desiccation resistance/ radiation Arid soil FA Rainey et al. hohokamensis resistance (2005) ​Deinococcus Bacterium Radiation- and Hot springs J Frösler et al. geothermalis desiccation-tolerant (2017)

​Halobacterium salinarum Archaea Xerotolerant, Bore core from a salt Active removal of ROS, M Kottemann et al. NRC-1 radiation-tolerant mine bacteriorubrin and intracellular (2005) salts such as KCl restrict DNA DSB formation resulting from exposure to desiccation and high doses of gamma irradiation, efficient DNA repair systems (likely HR) ​Pontibacter Bacterium Resistance in desiccation and Surface layer of a An increased Mn(II)/Fe ratio J Dai et al. (2015) korlensis X14-1 radiation desert has been demonstrated to play an important role in detoxification from oxidative damage, elevated expression of transposase during gamma radiation

Xeromyces bisporus Eukarya Growth at water activity (aw) 0.62 Liquorice, dried fruits, SL Leong et al. (opt. 0.84) sugary foods, bakery (2011) goods, animal feed ​Wallemia sebi Eukarya Resistant to low water activity On food as a Decreased hyphal M Padamsee et al. contaminant, compartment length and (2012) hypersaline increased cell wall thickness, environments relatively high number of transporters, absence of orthodox aquaporin genes Eukarya Able to grow at Spoiled home-made AD Hocking, water activities at least as low as jam JI Pitt (1981) Trichosporonoides ​ 0.75 nigrescens

​Cupriavidus Bacterium Multiple metal resistance Rapid ion efflux, metal PJ Janssen metallidurans complexation and reduction (2010)

Metallosphaera sedula Archaea Resistant to several metals, Solfataric fields Two putative Y Maezato (2012) mainly copper copper-translocating ATP-dependent exporters Eukarya Multiple metal resistance and Lakes, rivers, ponds VJ Odjegba, IO hyperaccumulation and ditches in tropical Fasidi (2004) Pistia stratiotes ​ and subtropical countries ​Arthrobacter ramosus G2 Bacterium Multiple metal resistance Mercuric Reduction of toxic Hg(II) to A Bafana et al. salt-contaminated soil relatively non-toxic volatile (2010) Hg(0), reduction of highly toxic Cr(VI) to relatively non-toxic Cr(III) Ferroplasma Archaea Multiple metal resistance, Copper-contaminated Increased respiration rate, C Baker-Austin et acidarmanus Fer1 acidophile mine solutions increased mRNA transcripts al. (2005) encoding a putative metal chaperone and a P-type ATPase transporter, increased expression of DNA-repair and stress proteins Thlaspi caerulescens Eukarya Zn, Cd, Ni resistance and Metalliferous soils Storage of high concentrations MJ Milner, LV hyperaccumulation of Zn and Cd in leaf epidermal Kochian (2008) cells may be associated with avoidance of damage to photosynthesis due to lack of chloroplasts, metal chelation with organic ligands

Πίνακας ακραιόφιλων οργανισμών. Αναγράφεται το όνομα του οργανισμού, η επικράτεια στην οποία ανήκει, οι ακραίες συνθήκες στις οποίες μπορεί να αναπτύσσεται και τον καθιστούν ακραιόφιλο, η τοποθεσία στην οποία εντοπίζεται, και η βάση της ανθεκτικότητάς του σε ακραίες συνθήκες όπου αυτή είναι γνωστή.

62 Αμινοξύ L. P. M. sedula Αμινοξύ A. arcticum E. coli H. M. sedula sphaericus aeruginosa marismortui Ala (A) 49, 8.8% 70, 15.0% 48, 10.4% Ala (A) 44, 13.4% 34, 10.9% 28, 9.2% 26, 8.5% Arg (R) 15, 2.7% 27, 5.8% 29, 6.3 % Arg (R) 13, 4.0% 9, 2.9% 15, 4.9% 9, 3.0% Asn (N) 25, 4.5% 13, 2.8% 16, 3.5% Asn (N) 17, 5.2% 11, 3.5% 9, 3.0% 10, 3.3% Asp (D) 27, 4.9% 23, 4.9% 20, 4.3% Asp (D) 21, 6.4% 12, 3.8% 15, 11.5% 20, 6.6% Cys (C) 6, 1.1% 6, 1.3% 4, 0.9% Cys (C) 2, 0.6% 3, 1.0% 0, 0.0% 0, 0.0% Gln (Q) 13, 2.3% 21, 4.5% 10, 2.2% Gln (Q) 13, 4.0% 15, 4.8% 12, 3.9% 6, 2.0% Glu (E) 51, 9.2% 29, 6.2% 39, 8.4% Glu (E) 13, 4.0% 19, 6.1% 27, 8.9% 19, 6.2% Gly (G) 47, 8.5% 40, 8.6% 43, 9.3% Gly (G) 28, 8.5% 36, 11.5% 31, 10.2% 24, 7.9% His (H) 11, 2.0% 10, 2.1% 13, 2.8% His (H) 6, 1.8% 2, 0.6% 7, 2.3% 5, 1.6% Ile (I) 42, 7.6% 25, 5.4% 32, 6.9% Ile (I) 23, 7.0% 17, 5.4% 16, 5.3% 30, 9.8% Leu (L) 57, 10.3% 40, 8.6% 36, 7.8% Leu (L) 27, 8.2% 33, 10.6% 20, 6.6% 17, 5.6% Lys (K) 39, 7.0% 12, 2.6% 25, 5.4% Lys (K) 17, 5.2% 21, 6.7% 8, 2.6% 29, 9.5% Met (M) 8, 1.4% 10, 2.1% 14, 3.0% Met (M) 13, 4.0% 4, 1.3% 5, 1.6% 11, 3.6% Phe (F) 15, 2.7% 14, 3.0% 12, 2.6% Phe (F) 10, 3.0% 10, 3.2% 8, 2.6% 11, 3.6% Pro (P) 14, 2.5% 21, 4.5% 19, 4.1% Pro (P) 16, 4.9% 13, 4.2% 11, 3.6% 14, 4.6% Ser (S) 37, 6.7% 19, 4.1% 25, 5.4% Ser (S) 16,4.9% 17, 5.4% 17, 5.6% 23, 7.5% Thr (T) 36, 6.5% 37, 7.9% 17, 3.7% Thr (T) 17, 5.2% 18, 5.8% 15, 4.9% 13, 4.3% Trp (W) 1, 0.2% 1, 0.2% 2, 0.4% Trp (W) 4, 1.2% 0, 0.0% 2, 0.7% 3, 1.0% Tyr (Y) 16, 2.9% 6, 1.3% 9, 1.9% Tyr (Y) 7, 2.1% 4, 1.3% 8, 2.6% 8, 2.6% Val (V) 45, 8.1% 43, 9.2% 49, 10.6% Val (V) 22, 6.7% 34, 10.9% 30, 9.9% 27, 8.9%

Σύνολο 554 467 462 Σύνολο 329 312 304 305

α) β)

Αμινοξύ M. M. sedula P. furiosus Αμινοξύ M. sedula S. solfataricus P. horikoshii tuberculosis Ala (A) 40, 9.3% 37, 9.5% 28, 7.5% Ala (A) 14, 6.5% 13, 5.9% 23, 11.1% Arg (R) 27, 6.3% 21, 5.4% 17, 4.6% Arg (R) 12, 5.6% 10, 4.5% 14, 6.7% Asn (N) 13, 3.0% 8, 2.1% 10, 2.7% Asn (N) 7, 3.3% 8, 3.6% 7, 3.4% Asp (D) 34, 7.9% 18, 4.6% 11, 3.0% Asp (D) 14, 6.5% 14, 6.3% 12, 5.8% Cys (C) 2, 0.5% 1, 0.3% 1, 0.3% Cys (C) 2, 0.9% 2, 0.9% 0, 0.0% Gln (Q) 13, 3.0% 8, 2.1% 5, 1.3% Gln (Q) 4, 1.9% 3, 1.4% 1, 0.5% Glu (E) 23, 5.3% 30, 7.7% 38, 10.2% Glu (E) 13, 6.0% 13, 5.9% 16, 7.7% Gly (G) 37, 8.6% 25, 6.4% 29, 7.8% Gly (G) 19, 8.8% 20, 9.0% 20, 9.6% His (H) 11, 2.6% 14, 3.6% 8, 2.2% His (H) 3, 1.4% 3, 1.4% 2, 1.0% Ile (I) 25, 5.8% 21, 5.4% 34, 9.2% Ile (I) 15, 7.0% 23, 10.4% 29, 13.9% Leu (L) 47, 10.9% 34, 8.7% 37, 10.0% Leu (L) 25, 11.6% 23, 10.4% 13, 6.2% Lys (K) 17, 3.9% 25, 6.4% 32, 8.6% Lys (K) 15, 7.0% 20, 9.0% 14, 6.7% Met (M) 8, 1.9% 10, 2.6% 9, 2.4% Met (M) 4, 1.9% 8, 3.6% 5, 2.4% Phe (F) 20, 4.6% 18, 4.6% 10, 2.7% Phe (F) 6, 2.8% 7, 3.2% 5, 2.4% Pro (P) 20, 4.6% 17, 4.4% 17, 4.6% Pro (P) 12, 5.6% 5, 2.3% 10, 4.8% Ser (S) 19, 4.4% 30, 7.7% 19, 5.1% Ser (S) 17, 7.9% 15, 6.8% 5, 2.4% Thr (T) 27, 6.3% 21, 5.4% 14, 3.8% Thr (T) 5, 2.3% 7, 3.2% 5, 2.4% Trp (W) 3, 0.7% 3, 0.8% 7, 1.9% Trp (W) 2, 0.9% 1, 0.5% 1, 0.5% Tyr (Y) 21, 4.9% 19, 4.9% 24, 6.5% Tyr (Y) 4, 1.9% 10, 4.5% 7, 3.4% Val (V) 24, 5.6% 29, 7.5% 21, 5.7% Val (V) 22, 10.2% 17, 7.7% 19, 9.1%

Σύνολο 431 389 371 Σύνολο 215 222 208

γ) δ)

63 Αμινοξύ R. C. M. sedula Αμινοξύ S. cerevisiae M. sedula S. solfataricus nubinhibe acetobutylicum ns Ala (A) 31, 12.0% 27, 10.1% 25, 9.7% Ala (A) 26, 7.3% 27, 9.1% 23, 7.8% Arg (R) 15, 5.8% 12, 4.5% 13, 5.0% Arg (R) 17, 4.8% 15, 5.1% 14, 4.7% Asn (N) 8, 3.1% 17, 6.4% 10, 3.9% Asn (N) 14, 3.9% 12, 4.1% 11, 3.7% Asp (D) 14, 5.4% 10, 3.7% 10, 3.9% Asp (D) 25, 7.0% 18, 6.1% 18, 6.1% Cys (C) 4, 1.6% 4, 1.5% 2, 0.8% Cys (C) 0, 0.0% 1, 0.3% 1, 0.3% Gln (Q) 8, 3.1% 7, 2.6% 6, 2.3% Gln (Q) 11, 3.1% 5, 1.7% 8, 2.7% Glu (E) 25, 9.7% 25, 9.4% 26, 10.0% Glu (E) 30, 8.5% 32, 10.8% 25, 8.5% Gly (G) 19, 7.4% 24, 9.0% 25, 9.7% Gly (G) 31, 8.7% 15, 5.1% 15, 5.1% His (H) 1, 0.4% 6, 2.2% 0, 0.0% His (H) 2, 0.6% 5, 1.7% 1, 0.3% Ile (I) 17, 6.6% 22, 8.2% 20, 7.7% Ile (I) 20, 5.6% 17, 5.7% 21, 7.1% Leu (L) 20, 7.8% 21, 7.9% 30, 11.6% Leu (L) 30, 8.5% 29, 9.8% 28, 9.5% Lys (K) 17, 6.6% 20, 7.5% 24, 9.3% Lys (K) 30, 8.5% 31, 10.5% 29, 9.8% Met (M) 15, 5.8% 10, 3.7% 6, 2.3% Met (M) 7, 2.0% 8, 2.7% 7, 2.4% Phe (F) 13, 5.0% 12, 4.5% 8, 3.1% Phe (F) 12, 3.4% 10, 3.4% 13, 4.4% Pro (P) 6, 2.3% 6, 2.2% 11, 4.2% Pro (P) 17, 4.8% 15, 5.1% 18, 6.1% Ser (S) 15, 5.8% 13, 4.9% 11, 4.2% Ser (S) 31, 8.7% 13, 4.4% 13, 4.4% Thr (T) 9, 3.5% 11, 4.1% 13, 5.0% Thr (T) 23, 6.5% 9, 3.0% 14, 4.7% Trp (W) 0, 0.0% 0, 0.0% 3, 1.2% Trp (W) 4, 1.1% 4, 1.4% 4, 1.4% Tyr (Y) 3, 1.2% 1, 0.4% 4, 1.5% Tyr (Y) 5, 1.4% 8, 2.7% 11, 3.7% Val (V) 18, 7.0% 19, 7.1% 12, 4.6% Val (V) 20, 5.6% 22, 7.4% 21, 7.1%

Σύνολο 258 267 259 Σύνολο 355 296 295 ε) στ)

Πίνακες στους οποίους αναγράφεται εκτός από το ποσοστό εμφάνισης και ο αριθμός του κάθε αμινοξέος και το συνολικό μήκος των αλληλουχιών. α) Αναγωγάση του υδραργύρου β) Μηλική αφυδρογονάση γ) Κιτρική συνθάση δ) Αποκαρβοξυλάση της 5’-μονοφωσφορικής οροτιδίνης ε) Δεϋδρατάση του 3-υδροξυπροπιονυλο-CoA στ) Vacuolar protein sorting 4 AAA-ATPase.

64