BS T1 V1 2009.Pdf
Total Page:16
File Type:pdf, Size:1020Kb
Науковий вісник Чернівецького університету. Біологія (Біологічні системи). – T. 1, Вип. 1 – Чернівці: Чернівецький національний університет, 2009. – 96 с. Scientific Herald of Chernivtsy University. Biology (Biological Systems). – Vol. 1, Is. 1. – Cherniv- tsy: Chernivtsy National University, 2009. – 96 p. У випуску висвітлено проблеми біохімії, біотехнології, молекулярної генетики, екології, ботаніки, грунтознавства, збереження біоти і біоресурсів, над якими працюють науковці Черні- вецького національного університету та інших наукових установ і вузів України. The articles in the journal highlight actual problems of biochemistry, biotechnology, molecular genetics, ecology, botany, soil science, preservation of biota and bioresourses, which are studied by the scientists of Chernivtsy National University and other universities and research institutes of Ukraine. Друкується за ухвалою вченої ради Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича Редакційна колегія: Editorial Board: Головний редактор М.М. Марченко Editor-in-Chief: M.M. Marchenko Заступники головного редактора: Deputy Editors: С.С. Костишин, Р.А. Волков S.S. Kostyshyn, R.A. Volkov І.П. Григорюк, Ю.М. Дмитрук, С.С. Руденко, I.P. Hryhoriuk, Y.M. Dmytruk, S.S. Rudenko, Б.К. Термена, І.І. Чорней B.K. Termena, I.I. Chorney Редакційна рада: Editorial Council: В.С. Акатов (Росія) V.S. Akatov (Russia) В.С. Бленер (США) W.S.Blaner (USA) В. Гемлебен (Німеччина) V. Hemleben (Germany) П.О. Мельник P.O.Melnik І.Ф. Мещишен I.F. Meschyshyn В.М. Решетніков (Білорусь) V.M. Reshetnikov (Bilorusia) С. Скіба (Польша) S. Skiba (Poland) Я. Собоцка (Словаччина) J. Sobocka (Slovakia) О. Б. Стрельцов (Росія) O.B. Streltsov (Russia) Л. Фартаїш (Румунія) L. Fartais (Romania) М.М. Федорончук M.M. Fedoronchuk Відповідальні секретарі: Responsible Secretaries: В.В. Буджак, І.О. Шмараков V.V. Budzhak, I.O. Shmarakov Свідоцтво про державну реєстрацію друкованого засобу масової інформації Міністерства Юстиції України серія КВ № 15752-4224Р від 12.10.2009 Журнал є правонаступником Наукового вісника Чернівецького університету:Біологія. (Свідоцтво Міністерства України у справах преси та інформації № 2158 серія КВ від 21.08.1996) Загальнодержавне видання Збірник входить до переліку наукових видань ВАК України Адреса редколегії: Adress for correspondence: Чернівецький національний університет Chernivtsy National University імені Юрія Федьковича, named after Yuriy Fed’kovych, факультет біології, екології та біотехнології, Faculty of Biology, Ecology and Biotechnology, вул. Коцюбинського, 2 Kotsyubynskyi Str., 2 м. Чернівці, Україна, 58012 Chernivtsy, Ukraine, 58012 www.bio.chnu.edu.ua/vb E-mail: [email protected] © Чернівецький національний університет, 2009 БІОХІМІЯ, БІОТЕХНОЛОГІЯ, МОЛЕКУЛЯРНА ГЕНЕТИКА УДК 616-006.6: 576.311+577.113 ФРАКЦІЙНИЙ СКЛАД ДНК ТА БІЛКІВ МІТОХОНДРІЙ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ З ТРАНСПЛАНТОВАНОЮ КАРЦИНОМОЮ ГЕРЕНА М.М. Марченко, Г.П. Копильчук, О.М. Волощук Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, вул. Лесі Українки 25, м. Чернівці, 58012 e-mail: [email protected] Досліджено ступінь фрагментації мтДНК печінки та фракційний склад мітохондріальних білків, нерозчин- них у 0,05 М Na-фосфатному буфері (рН 11,5), в динаміці росту карциноми Герена. Встановлено, що на фоні інтенсифікації генерації супероксид аніон-радикалу відбувається фрагментація мтДНК печінки щурів-пухлиноносіїв із тенденцією до накопичення молекул з вкороченою контурною довжиною та зміна фракційного складу білків, що кодуються мтДНК. На латентній і логарифмічній стадії пухлинного росту спостерігається посилення інтенсивності забарвлення смуг високомолекулярних мітохондріальних біл- ків, нерозчинних у 0,05 М Na-фосфатному буфері (рН 11,5), та поява мінорних компонентів у межах розподілу низькомолекулярних білків. На термінальних етапах експерименту різко знижується інтенсивність забарвлен- ня білкових смуг із молекулярними масами 30-66 кДа та посилюється гетерогенність на проміжку молекуляр- них мас 11-26 кДа. Ключові слова: мітохондріальна ДНК, мітохондріальні білки, нерозчинні у 0,05 М Na-фосфатному буфері ¯ (рН 11,5), генерація О2 , печінка, карцинома Герена Вступ. Одним із механізмів онкогенезу є акти- Тривалість експерименту становила 21 добу. вація в мітохондріях вільнорадикальних пероксид- Евтаназію проводили на 7 (латентна стадія пух- них процесів, які ведуть до неспецифічних змін линного росту), 14 (логарифмічна стадія пухлин- клітинного окисного метаболізму (Brandon, 2006). ного росту), 21 (термінальна стадія пухлинного Зміни, що відбуваються в печінці при розвитку в росту) добу після імплантації пухлини під лег- організмі пухлини, відображають активізацію ком- ким ефірним наркозом. пенсаторно-пристосувальних процесів, спрямова- Мітохондріальну фракцію з гомогенату печін- них на відновлення гомеостазу та супроводжують- ки отримували методом диференційного центри- ся стадійними змінами вільнорадикального окис- фугування (Шабалина и др., 1995). Всі операції лення (Carew, Huang, 2002; Шабалкин и др., 2002). проводили при 0-30С. Чистоту мітохондріальної Чутливою мішенню для дії активних форм кисню фракції контролювали за співвідношенням (АФК) є мітохондріальна ДНК (мтДНК) та протеї- ДНК/білок та шляхом порівняльного визначення ни, що нею кодуються (Jerónimo et al., 2001, Wei, глюкозо-6-фосфатазної активності у фракціях мі- Lee, 2002). Вразливість мтДНК зумовлена тим, що кросом та мітохондрій (Kagan et al., 2005). Вміст вона не захищена білками, не містить некодуючих білка визначали за Лоурі (Lowri et al., 1951). ділянок і механізми її репарації менш ефективні у Виділення мтДНК здійснювали фенольним порівнянні з ядерною ДНК (Wilding et al., 2006; методом. мтДНК розділяли методом електрофо- Чанакчи и др., 2005). резу в 0,8 % агарозному гелі. Електрофорез про- Метою нашої роботи стало вивчення інтенси- водили в трис-боратному буфері (рН 8,0), при вності генерації супероксид аніон-радикалу, сту- напрузі електричного поля 5 В/см, з використан- пеня деградації мтДНК та фракційного складу ням горизонтальних пластин (12,5 × 8,5 см), то- нерозчинних у 0,05 М Na-фосфатному буфері вщина гелю 5 мм. У ролі маркерів використову- (рН 11,5) мітохондріальних білків печінки в про- вали препарати ДНК фага λ, отримані при роз- цесі росту карциноми Герена. щепленні рестриктазами ЕсоRI та HindIII. Гелі Об’єкт і методи. Дослідження проводили на зафарбовували розчином бромистого етидію з білих безпородних щурах масою 110-130 г. Тва- концентрацією 0,5 мкг/мл. рин поділили на групи: І – інтактні щурі (К), ІІ – Мітохондріальні білки виділяли за методом щурі з трансплантованою карциномою Герена (Kitagawa, Sugimoto, 1980), який базується на не- (Пх). Трансплантацію карциноми Герена прово- розчинності продуктів мітохондріальної транс- дили шляхом підшкірного введення 0,5 мл 30% ляції у 0,05 М Na-фосфатному буфері рН 11,5. суспензії ракових клітин в ізотонічному розчині Електрофорез в 10 % поліакриламідному гелі натрію хлориду. проводили в системі Леммлі (Laemmli, 1970) в Біологічні системи. T. 1, Вип. 1. 2009 3 пластинах (13×12×0,1 см). Як маркери молекуля- ченко та ін., 2007), що за даними літератури, бу- рної маси використовували білки: овоальбумін де призводити до падіння мембранного потенці- (Mr 45 кДа) та бичачий сироватковий альбумін алу (Брайловская и др., 2001). В свою чергу, зі (Mr 66 кДа). зниженням мембранного потенціалу зменшуєть- ¯ Після електрофорезу гелі фіксували в 15 % ся генерація О2 (Трубицын, 2006). ТХО протягом години, забарвлення поліпептидів Не дивлячись на те, що на термінальних етапах проводили Coomassie blue R-250. Відмивку фону пухлинного росту спостерігається тенденція до ¯ здійснювали сумішшю для фіксації без барвника: зниження продукції О2 порівняно зі стадією акти- 25 % ізопропанолом та 10 % оцтовою кислотою. вного росту пухлини, досліджуваний показник все Сканування електрофореграм проводили на ж перевищує контрольні значення на 34 %. апараті “GelDoc 2000” та аналізували з викорис- Посилена генерація супероксид аніон- танням програми “Quantity One”(“Bio-Rad”, США). радикалу в мітохондріальній фракції печінки в Продукцію супероксидного аніон-радикалу організмі пухлиноносія супроводжується інтен- мітохонд-ріальним електронотранспортним лан- сифікацією фрагментації мтДНК в динаміці рос- цюгом оцінювали в тесті з нітросинім тетразолі- ту карциноми Герена. єм (НСТ) (Metcalf et al., 1986). Так, електрофоретичні профілі мтДНК, отри- Статистичну обробку даних проводили з ви- маної з мітохондріальної фракції печінки в лате- користанням критерію Стьюдента. нтний період росту пухлини характеризуються Результати та їх обговорення. В результаті наявністю гетерогенних фрагментів довжиною проведених досліджень встановлено, що процесі від 16,5 до 12 т.п.н (рис.2). росту карциноми Герена в мітохондріальній фра- кції печінки пухлиноносіїв відбувається посиле- на генерація супероксид аніон-радикалу порів- М К 1 2 3 няно з контролем впродовж усього експеримен- тального періоду (рис.1). Максимальна інтенсив- ність генерації супероксид аніон-радикалу спо- 21226 п.н. → стерігається на стадії активного росту карциноми Герена. В цей період продукування О2¯ на 75 % перевищує показники, встановлені для інтактних 5148 п.н. → тварин. 4973 п.н. → 2,5 ** К хв / 2 * мг / * 4268 п.н. → 2- О Пх ь 1,5 3530 п.н. → л нмо 2027 п.н. → 1 1904 п.н. → 0,5 0 Доба, тер м ін 71421 після трансплантації Рис.2. Електрофореграми мітохондріальної ДНК печінки щурів з трансплантованою карциномою - Рис. 1. Генерація О2 в мітохондріях печінки щурів у Герена у динаміці росту новоутворення динаміці росту карциноми Герена Примітка: Примітка: M