Review n. 25 – Italus Hortus 22 (1), 2015: 31-57

Piante da frutto transgeniche e considerazioni sulle conseguenze dei divieti imposti alla ricerca in Italia

Eddo Rugini Dipartimento di Agricoltura, Foreste, Natura e Energia, Università della Tuscia, Viterbo

Ricezione:19 dicembre 2015; Accettazione: 3 luglio 2015

Transgenic fruit trees and conse - sense at all when one consider that all the GEPs cur - quences of the prohibitions imposed rently on the market are based on plants created with on research in Italy technologies that are about 20 years old. Modern technology could placate all the criticism generated by the first generation of GEPs and be of great support Abstract. Genetic transformation allows us to get a to the problems and to traditional breeding techni - better understanding of gene function. This technique ques. In most cases, this technology will be used to could also greatly accelerate the development of improve specifically the plants’ weak traits, providing improved plants by access to the readily available an answer to farmers’ demands, while leaving untou - and enormous national germplasm gene bank which, ched all others traits – a work that is over two deca - however, still remains unappreciated today. The total des in the making. Thanks to government funding in veto imposed by the Italian government on the use of the period between 1985 and 2002, Italian scientists this technology is making Italian farmers and seed were able to produce a variety of transgenic plants companies dependent on foreign companies and una - and fruit trees using regeneration protocols based on ble to defend national gemplasm with an obvious efficient cells that were derived from mature cultivar impact on economy. In Italy, the agricultural policy is tissues. This review describes the regeneration and not influenced by the scientific community. Lobbies transformation strategies for fruit trees, for the produc - intentionally use the acronym “GMO” to scare the tion of cis- or trans-genic plants, as well as to descri - public by spreading misleading information with the bing the most important objectives and goals we goal of maintaining the status quo and limiting the obtained, and the problems we encountered. It is also evolution of the Italian agricultural market as much as described how to produce non-transgenic plants using possible. This strategy was successful in blocking not a GEP mother plant, as well as the technique used to only production and sale of new, improved Italian avoid the transmission of the transgene to other com - germplasm, but also put a dramatic halt to research, patible plants nearby. Furthemore, the possible cau - in a medieval-style attempt at stopping progress. It is ses for public opposition to GEPs, and the risks and necessary to promote a national debate with the benefits derived from the proper use of this techno - representatives of developing countries to discuss the logy are discussed. use of Genetically Engineered Plants (GEPs) in geo - graphic areas such as Africa and Asia where millions genetic transformation, new promo - of people are dying from starvation. Such debate Key words: ters, marker genes, fruit plants, plant regeneration, should focus only on facts and scientific data. Since engineered plants, resistance to biotic and abiotic politics have been proven to be unable to solve the stresses. problem of global food distribution leaving millions of people to die from starvation every year, all the legal obstacles that limit diffusion of transgenic plants, and especially the ones that block the research and deve - Introduzione lopment and approvals of the plants already built must be abolished. Especially because these plants Gli organismi geneticamente modificati (OGM) ed could save the lives of approximately one million chil - in particolare le piante geneticamente modificate dren under the age of 5 every year. Furthermore, the (PGM), pur essendo argomento di grande attualità e al ban imposed by some developed countries on the centro di grandi dibattiti, sono poco conosciuti dall’o - development and production of GEPs makes no pinione pubblica. Questi due acronimi vengono usati impropriamente per indicare le piante ottenute con la * [email protected] tecnica del DNA ricombinante, mentre più precisa -

31 Rugini mente dovrebbero essere chiamate Piante le piante per renderle adatte al “biorimedio fitoassisti - Geneticamente Ingegnerizzate (PGI). Infatti, le PGM to” o “fitorimedio biassistito”, cioè realizzare piante sono il risultato di modifiche e selezione, sulla base con estesi e densi apparati radicali che andranno a delle necessità del momento, operate dall’uomo nel costituire una enorme superficie adsorbente ed una corso dei secoli con qualsiasi tecnica di miglioramento estesa rizosfera, che insieme agli essudati radicali for - genetico. Le PGI, invece, sono ottenute con modifiche meranno un microhabitat favorevole alla comunità del genoma attraverso l’introduzione di geni isolati da microbica deputata a svolgere la biodegradazione dei qualsiasi organismo vivente ed introdotti con vettori contaminanti organici presenti nei suoli. Questa modi - biologici (batteri e virus) o fisici o chimici. Tutt’ora fica può essere realizzata in piante già note per la queste sono chiamate genericamente “transgeniche”, capacità di accumulare metalli tossici per esaltarne il perché non si distingue la provenienza dei geni impie - potenziale di accumulo. gati per le modifiche. Questa tecnologia ha dato adito La pressante richiesta di cibo, che da molti viene a forti discussioni, sin dal suo sorgere generando un interpretata come un modo per giustificare i profitti movimento culturale contrario che contesta il trasferi - delle multinazionali, al di là di sprechi e della cattiva mento di geni tra genotipi che in natura non si potreb - distribuzione, non può essere soddisfatta con la sola bero ibridare. A seguito di queste contestazioni nel messa a coltura di aree fertili vergini, che sono in 2007 vennero introdotti i concetti di cisgenico e di esaurimento, ma con il contributo di quei territori, intragenico, per distinguere le piante ingegnerizzate attualmente inospitali, per i quali non sono disponibili sulla base della provenienza dei geni introgressi o alle piante adatte perché le tecniche tradizionali di miglio - modifiche apportate ai singoli geni della pianta ogget - ramento genetico non sono state in grado di produrle. to di modifica. Vengono definite pertanto “cisgeni - Le biotecnologie, puntano a soddisfare questa esigen - che” le piante costituite con geni, incluse le regioni del za e allo stesso tempo a costituire, in tempi relativa - promotore e terminatore nativi, che derivano da piante mente brevi, varietà vegetali con requisiti di elevata della stessa specie o da una specie ad esse molto vici - produttività, qualità, sanità e sostenibilità, con l’obiet - ne, ma sessualmente compatibili. Vengono definite tivo finale di limitare le perdite pre e post-raccolta. È “intrageniche” le modificazioni apportate a singoli ben noto che la produzione media reale delle piante geni con il riarrangiamento in vitro degli elementi coltivate nel mondo è stimata intorno al 40% della genetici (Schouten et al. , 2006). Ad oggi, dal punto di potenzialità produttiva; il 60% delle perdite, dunque, vista legislativo, entrambe le tipologie di piante cis o è da ascriversi principalmente a malattie (10-20%), a trans-geniche sono considerate alla stessa stregua. Le siccità (25%), ad infestanti (5-10%), al freddo (16%), due tipologie hanno ancora in comune l’inserimento all’anossia (16%), alla salinità (5%), ai metalli pesanti della nuova sequenza in una posizione casuale del (3%) e ai terreni poveri (20%). genoma e/o il gene di selezione ed eventuali sequenze Per molte specie tuttavia persistono ancora alcuni non codificanti del vettore di origine batterica o virale ostacoli di natura metodologica, sia nel trasferimento (ad es. i T-DNA borders). Sebbene irrilevante, tuttavia genico che nella selezione, resa difficile dai protocolli alcuni ritengono importante la sostituzione del “left e poco efficienti di rigenerazione di piante da colture di right border” con sequenze di origine vegetale, cosa cellule o tessuti, soprattutto da quelli di origine soma - che oggi sarebbe possibile con l’impiego dei nuovi tica. Inoltre si può verificare la possibilità che accanto vettori del tipo P-DNA (Plant-derived transfer DNA) alla modifica voluta se ne aggiungano altre indeside - progettati appositamente per la produzione di piante rate per effetto dell’inserimento casuale del transgene cisgeniche (Rommens et al. , 2007). La presenza nella in una posizione del DNA che intralcia la funzionalità pianta modificata di uno o più di questi elementi è la dei geni contigui ed anche per effetto dell’insorgenza causa che rallentanta l’accettabilità delle cisgeniche da della variabilità somaclonale, soprattutto se la rigene - parte della legislazione. razione è preceduta da una fase di callo o se le condi - Il trasferimento genico ha successo non soltanto zioni colturali non sono idonee. Tuttavia con la sele - per i caratteri governati da geni singoli ma anche da zione, che seguirà sempre la trasformazione, si elimi - geni multipli e le PGI possono essere utili anche in neranno quei genotipi con i caratteri indesiderati. farmaceutica e nutraceutica per produrre nuovi pro - Questa tecnologia è particolarmente adatta per dotti, esaltandone l'attitudine alla sintesi e all'accumu - quelle specie vegetali caratterizzate da una lunga fase lo di metaboliti, che verranno estratti dalla pianta o giovanile, da un elevato grado di eterozigosi o da una dai suoi tessuti coltivati in vitro , usando quindi le bassa variabilità genetica. Più di ogni altra tecnologia piante come fossero “biofabbriche”. conosciuta, permette di operare con maggiore rapidità Queste tecnologie permettono di modificare anche e precisione nel correggere i difetti delle cultivar com -

32 Piante da frutto transgeniche merciali o dei portinnesti, senza modificare o modifi - quello amministrativo e a quello giudiziario (vedi cando lievemente le caratteristiche principali. Decreto Consiglio dei Ministri italiano Contrariamente a quanto si vuol far credere queste “Campolibero”, "Piano di azioni per semplificazioni, tecniche potrebbero salvare dalla estinzione vecchie lavoro, competitivita' e sicurezza nell'agroalimentare” varietà, che tutt’ora contribuiscono alla tipicità dei GU del 28 giugno 2014, che prevede sanzioni per chi nostri prodotti, previ piccoli interventi di “terapia coltiva OGM in Italia), col risultato che si è finito per genica” per correggerne i difetti più gravi, consenten - rendere le biotecnologie finanziariamente accessibili do di mantenere un’ampia biodiversità tra le varietà quasi unicamente ad una élite di imprese. coltivate. Il fatto più grave è che la ricerca in questo settore Malgrado le difficoltà di varia natura, sono stati ha subito un arresto già da oltre un decennio, nono - fatti importanti progressi, soprattutto in piante erba - stante che le indagini svolte da fonti autorevoli cee, favorite dal breve ciclo vitale e dalle dimensioni (IPSO, R. Mannheimer, dicembre 2012) dimostrino ridotte, che si prestano ad essere saggiate in vivo in che il 60% degli italiani è favorevole alla ricerca spazi limitati. Sono state costituite PGI di prima gene - scientifica sugli OGM e il 62% afferma che gli scien - razione, volte ad incrementare la produttività, attra - ziati italiani devono avere gli stessi diritti ed essere verso il miglioramento delle difese dai patogeni e messi nelle stesse condizioni di fare ricerca al pari dei dalle avversità ambientali riducendo i costi di produ - colleghi degli altri Paesi. Dalla stessa indagine si zione facilitandone le pratiche agronomiche. Si è poi evince che solo il 50% degli italiani dichiara di cono - passati a quelle di seconda generazione, realizzate per scere gli OGM e di documentarsi sull'argomento migliorare la qualità dei prodotti finali, ed infine a attraverso la radio e la televisione. Paradossalmente il quelle di terza generazione, volte a costituire prodotti tempo dedicato dalle 7 principali reti televisive e dalle con nuove proprietà come vaccini, anticorpi, vitami - 15 reti radiofoniche nei 22 mesi precedenti le intervi - ne, ormoni enzimi terapeutici di origine umana o ani - ste, è stato quasi inesistente: soltanto 61 notizie hanno male, cosmetici e bioplastiche. Sarebbe urgente acce - riguardato gli OGM su un totale di 370.000, pari allo lerare la produzione di varietà capaci di produrre cibi 0,02% e per un tempo pari allo 0,03% e soprattutto con contenuto proteico simile a quello della carne, senza alcuna trasmissione di approfondimento (fonte: con l’obiettivo di ridurne il consumo o, almeno, di G. Betto, Centro ascolto dell’informazione radiotele - non farlo aumentare. Basterebbe una piccola variazio - visiva, 2012). ne di stile di alimentazione a favore del consumo di In altri Paesi la ricerca su questa branca della carne da parte delle popolazioni africane e asiatiche scienza progredisce rapidamente, tenendo in debita (un pollo all’anno in più pro-capite) per mettere in considerazione i desideri dell’opinione pubblica, forte crisi la disponibilità di cibo e di acqua nonchè ricercando protocolli nuovi volti a sostituire quelli che per l’aumentare le emissioni di gas serra (metano e finora sono stati oggetto di critiche e preoccupazioni, ossido nitroso), causate dagli animali stessi, conside - anche se spesso prive di fondamento scientifico. rata l’enorme quantità di acqua e di vegetali necessari Le ricerche in atto, la descrizione di tecniche e per costituire una unità di proteina animale. risultati più interessanti conseguiti dal punto di vista Nonostante siano trascorsi oltre quaranta anni dalla scientifico e applicativo nelle piante da frutto, verran - scoperta di questa tecnologia e da oltre venti si no descritti di seguito. Questi saranno accompagnati da disponga di cibi da piante ingegnerizzate, in Europa la una sintetica descrizione delle strategie suggerite per legislazione non ne consente l’uso per l'alimentazione migliorare la performance delle PGI, in quanto sono umana, a causa della diffidenza di una parte della state trattate in dettaglio in precedenti lavori (Baldoni e popolazione, influenzata pesantemente da una propa - Rugini, 2002; Petri e Burgos, 2005; Bhatti e Jha, 2010; ganda indirizzata a valorizzare tutto ciò che fa ricor - Vidal et al. , 2010; Gambino e Gribaudo, 2012). dare i valori del territorio e della sua tipicità, della genuinità perduta e della lavorazione artigianale dei Tecniche e strategie per realizzare piante transge - prodotti, inducendo le imprese ad adeguare le proprie niche strategie di comunicazione e quindi di commercializ - zazione. L’informazione pubblica in materia ha con - Diversi sono i procedimenti per trasformare le cel - tribuito fortemente ad ostacolare l’accettabilità di que - lule vegetali, ma in realtà possono essere suddivisi in sti cibi, perchè spesso non corretta, confusa, di parte e metodi: indiretti (plasmidi di agrobatteri e virus) e demagogica. L’UE cerca di scaricare sugli Stati mem - diretti (bombardamento delle cellule con microproiet - bri le decisioni più importanti relativamente alle PGI, tili ricoperti di DNA, chiamato anche biolistico, inse - spostando i conflitti dal piano politico e legislativo a rimento diretto di DNA in protoplasti per mezzo di

33 Rugini liposomi, di microsiringhe o dell’elettroporazione). no umano, rendendoli resistenti all’antibiotico, o ad Tuttavia nella pratica comune si usano altri microrganismi usati nella produzione di formaggi l’Agrobacterium tumefaciens o l’A. rhizogenes e il o yoghurt; per questo per cui dal 31 dicembre 2004, in metodo biolistico. Il vettore più efficiente per il trasfe - Europa, non si possono utilizzare marcatori di resi - rimento di DNA esogeno nelle piante è rappresentato stenza ad antibiotici (direttiva 2001/18/CE), contraria - dal plasmide Ti (Tumor-inducing plasmid) dell’A. mente a quanto avviene in USA o in altri paesi. tumefaciens. Il batterio viene opportunamente inge - Tuttavia per la trasformazione di specie con breve gnerizzato con uno o più geni di interesse e con un ciclo riproduttivo che si propagano per seme si può gene marcatore necessario per selezionare le cellule ricorrere alla co-trasformazione (gene di interesse su che ospiteranno i geni. Il batterio stesso provvede a un plasmide e gene marcatore su un altro), in questo trasferirli nel nucleo della cellula generalmente di modo in seguito all’incrocio e alla segregazione, la dicotiledoni, in quanto presenta scarsa capacità nei selezione sarà fatta solo tra le discendenze che non confronti delle monocotiledoni per le quali si ricorre conterranno il gene marcatore. In piante arboree si è al metodo biolistico. Questo ultimo metodo consente ricorsi, sebbene con risultati non eccellenti, a vettori di sparare a velocità di 300-600 metri/sec, proiettili multi-autotrasformazione (MAT), come nel caso degli sferici di oro o tungsteno di 0,4 – 1,2 µm, ricoperti di agrumi (Ballester et al. , 2008) e dell’albicocco costrutti genici d’interesse. Questi possono raggiunge - (Lopez-Noguera et al. , 2009). Questi vettori conten - re il nucleo ma anche i cloroplasti e/o mitocondri, nel gono un marcatore morfologico (gene ipt o geni rol) cui DNA andranno ad integrarsi anche stabilmente. associato ad un sistema di ricombinazione sito speci - fica che consente la rimozione delle sequenze indesi - Geni marcatori o di selezione derate, lasciando integrato il solo gene utile. Il gene marcatore o di selezione, a seconda del I costrutti genici di nuova generazione contengono tipo, sarà in grado di conferire alla cellula la resisten - geni marcatori che permettono il metabolismo di za a un prodotto tossico (per esempio un antibiotico) o composti che normalmente non vengono metabolizza - la capacità di metabolizzare un particolare prodotto ti dalle piante; un esempio classico è la trasformazio - specifico dal quale ricavare energia per crescere. In ne con il gene manA, che codifica per l’enzima fosfo - presenza nel terreno di coltura di questi prodotti, solo mannosio-isomerasi (PMI). Soltanto le cellule trasfor - le cellule che avranno introgresso i geni esogeni mate con questo gene sopravvivono in terreno di col - potranno metabolizzarli e quindi sopravvivere e, in tura in presenza di solo mannosio come fonte di car - opportune condizioni di coltura, queste potranno dare bonio. Con l’eccezione della vite che è in grado di origine a germogli o ad embrioni somatici. Tuttavia, metabolizzarlo, alcuni fruttiferi, quali il melo, la si può anche omettere di inserire il gene marcatore e papaia, il mandorlo sono stati trasformati con questo la selezione avverrà in campo con una attenta valuta - metodo (Petri e Burgos, 2005; Bhatti e Jha, 2010; zione fenotipica. In questo caso è indispensabile pro - Breyer et al. , 2014). Infine sono stati messi a punto durre una grande quantità di piante, perché non poten - sistemi quali quello denominato 'inducible site-speci - do fare una selezione in vitro , si è costretti ad effet - fic recombinase', che implica l’eliminazione del gene tuarla in una massa composta da piante trasformate e marcatore ad opera di una ricombinasi attivata a non. Fondamentale sarà poter disporre di un metodo seguito di trattamenti chimici o shock termici. di rigenerazione molto efficiente, purtroppo non riscontrabile nella stragrande maggioranza delle spe - Impiego di nuovi promotori cie frutticole a meno che non si utilizzi materiale Finora, la maggior parte delle piante transgeniche zigotico che però, a causa della elevata eterozigosi di sono state prodotte con promotori costitutivi, in parti - queste piante, è di poca utilità pratica. Infine, le anali - colare con il 35S proveniente dal virus del mosaico si molecolari e la selezione delle piante con l’espres - del cavolfiore, i quali sono in grado di far esprimere il sione genica desiderata, completeranno la selezione. gene in tutti i tessuti ed in modo continuativo, pertan - L’opinione pubblica non accetta l’uso di geni mar - to sono poco adatti e possono causare alterazioni nella catori per la resistenza ad antibiotici (es gene nptII) o crescita e nello sviluppo o addirittura causare il silen - erbicidi (gene bar), sebbene il loro impiego sia ben ziamento del transgene. Sono tuttavia disponibili pro - regolamentato e l’Agenzia Europea per la Sicurezza motori di piante come i promotori inducibili e promo - Alimentare (EFSA) non ritenga questa restrizione del tori situ-specifici, che fanno esprimere il transgene tutto necessaria. Infatti si teme che questi geni, nono - rispettivamente in particolari momenti (in seguito a stante siano stati presi in natura da microrganismi ubi - stimoli di vario genere, come ferite e stress abiotici di quitari, possano essere trasferiti ai batteri dell'intesti - vario genere) e in organi specifici (foglia, radice,

34 Piante da frutto transgeniche sistema vascolare, fiore, etc.). Il promotore della cal - voglia far produrre specifici prodotti o farne esaltare modulina (uidA del melo) è stato inserito in un portin - la produzione di quelli già esistenti in pianta. nesto ibrido di Prunus (Maghuly et al. , 2008) e il pro - Purtroppo nel caso in cui la cultivar target di pregio motore del cinnamoyl CoA reduttasi inserito in vite da migliorare non possegga la necessaria capacità di (Gago et al. , 2011) per aumentare l’espressione in tes - rigenerazione, si dovrà ricorrere ad una di minor pre - suti vascolari; mentre il promotore dell'espansina è gio, alimentando critiche per il risultato finale che, stato inserito in pomodoro per migliorare la shelf life sebbene migliorata per quel carattere, questa non delle bacche (Karaaslan e Hrazdina, 2010). Un pro - risulterà eccellente nel suo complesso . motore molto potente, similmente a quello virale 35S, Tra le varie spece vegetali, le piante da frutto sono ma di origine vegetale appartenente alle piante, è quelle che si avvantaggiano più di altre di questa tipo - quello del Rubisco, che viene attualmente molto stu - logia di miglioramento genetico, perché, essendo a diato. Promettente è anche il promotore DefH9, carat - propagazione vegetativa, la diffusione di un eventuale terizzato da elevata specificità di espressione nella genotipo migliorato avverrebbe in tempi brevissimi, placenta e negli ovuli; questo unito al gene iaaM, che senza dover ricorrere a incroci per selezionare il codifica per l’enzima triptofanomonossigenasi che genotipo migliore tra i discendenti. Tra l’organogene - converte il triptofano in indolacetammide, che a sua si e l’embriogenesi somatica, se venisse data la possi - volta origina l’acido indolacetico, va a costituire il bilità di scelta al ricercatore, sarebbe preferibile la gene chimerico (DefH9-iaaM), il quale sostiene lo prima, in quanto normalmente con questa si ottengo - sviluppo del frutto senza la fecondazione e quindi no genotipi stabili anche da tessuti chimerici, in quan - questo risulterà privo di semi (Spena e Rotino, 2001). to una sola cellula iniziale è coinvolta nel processo Uno dei più studiati promotori indotti da stress abioti - rigenerativo. E’ da preferire una rigenerazione diretta ci e biotici è il promotore per l’osmotina, una proteina piuttosto che mediata da callo, per evitare l’insorgen - vegetale nota per essere attiva nella difesa contro que - za di variabilità somaclonale che andrebbe a sommar - sti tipi di stress (Raghothama et al. , 1993). si alle caratteristiche del genotipo finale transgenico. Da preferire è anche l’impiego di tessuti provenienti Materiale vegetale e tecniche di rigenerazione impie - da colture in vitro , in quanto già sterili e in genere gate con capacità di rigenerazione superiore ai tessuti pre - Prerequisito indispensabile per la riuscita dell’ap - levati da piante in vivo . plicazione della tecnica è la facilità di rigenerazione a Per i genotipi che presentano una scarsa capacità meno che per il trasferimento genico non si usi la via rigenerativa si può utilizzare la tecnica della “doppia sessuale, cioè l’uso di polline transgenico, derivato rigenerazione” sperimentata per la prima volta in già da una pianta transgenica o trasformato in vitro olivo (Rugini e Caricato, 1995) e successivamente in prima del suo impiego. La rigenerazione nelle piante melo (Rugini e Muganu, 1998), pero (Abdollahi et può concretizzarsi attraverso la formazione di embrio - al. , 2006) e ciliegio (comunicazione personale) per ni somatici (embriogenesi somatica) oppure attraverso aumentare la frequenza di rigenerazione e di conse - il differenziamento di gemme (organogenesi di ger - guenza quella di trasformazione. Questa tecnica con - mogli). Nel primo caso in seguito alla germinazione e siste nell’uso di foglioline, prelevate con stereomicro - nel secondo in seguito alla radicazione del germoglio scopio, da una gemma avventizia, originata da qual - avrà origine la pianta. Teoricamente tutti i tessuti siasi tessuto in vitro , quando è appena visibile ad hanno capacità di differenziare organi, ma quelli gio - occhio nudo. Queste foglioline non solo mostrano una vanili, cioè quelli di derivazione embrionale (embrio - straordinaria capacità di rigenerare direttamente dai ni zigotici immaturi o maturi e i semenzali nel loro propri tessuti e dall’eventuale callo che da esse ne stadio iniziale di vita) hanno una spiccata potenzialità può originare, ma il callo neoformato acquisisce la rigenerativa. Per le specie arboree questi tessuti non competenza di rigenerare (embrioni somatici o ger - vengono normalmente utilizzati per l’ovvia ragione mogli) per numerose subcolture. che, non essendo le piante omozigoti, essi saranno diversi dalla pianta che si vuole migliorare. La scelta Procedure per la sperimentazione in campo e com - deve ricadere su tessuti somatici di cultivar di alto mercializzazione delle piante transgeniche in valore agronomico e commerciale, la cui diffusione è Europa limitata da uno o più specifici caratteri difettosi da migliorare (suscettibilità ad un parassita, a un patoge - Per la sperimentazione in campo è necessaria l’au - no, al freddo, breve durata di conservazione dei frutti, torizzazione dalle autorità preposte dello Stato di etc.), oppure si opereranno altre scelte, qualora si appartenenza (in Italia dal Ministero dell’Ambiente),

35 Rugini regolamentata dalla Direttiva (2001/18/CE) del torio a cielo aperto” che avrebbe fornito numerose e Parlamento Europeo e del Consiglio del 12 marzo importanti informazioni scientifiche. 2001 sull'emissione deliberata nell'ambiente di orga - Dei 250 progetti che l’Italia aveva in atto negli nismi geneticamente modificati, che abroga la anni ’90 anche con relative sperimentazioni di campo, Direttiva 90/220/CEE. E’obbligatorio compilare una attualmente non ne è rimasto nemmeno uno. In serie di schede prestampate per ciascun genotipo tran - Europa, invece, si continua a sperimentare in campo sgenico (Notifica). Il fascicolo tecnico deve contenere anche con qualche sporadica minaccia da parte dei in modo molto dettagliato: a) Informazioni generali, “Verdi”, come accaduto in Inghilterra nel 2012. Nello comprese quelle relative al personale ed alla sua for - stesso periodo, mentre in Inghilterra la distruzione del mazione; b) Informazioni relative alla PGI; c) materiale della prova sperimentale veniva bloccata Informazioni relative alle condizioni di emissione ed dalle autorità statali, a Viterbo le stesse intimavano la al potenziale ambiente ospite; d) informazioni sulle distruzione e istruivano tre separate ispezioni con la interazioni tra PGI ed ambiente. e) un piano di moni - polizia forestale, i carabinieri e una commissione toraggio diretto a valutare gli effetti sulla salute regionale, controlli che ovviamente non hanno trovato umana, animale e sull’ambiente; f) Informazioni su nulla di irregolare (Meldolesi, 2012). Si continua a piani di controllo, trattamento rifiuti, interventi di sperimentare regolarmente sia in serra che in campo bonifica in caso di emergenza. Inoltre, deve contenere anche in quei Paesi in cui le contestazioni nei con - la valutazione del rischio ambientale e la valutazione fronti della coltivazione di PGI sono vigorose, e la del rischio per l’agrobiodiversità, i sistemi agrari e la ricerca viene sempre salvaguardata, tranne che in filiera agroalimentare. Infine, la notifica deve essere Italia! Per quanto concerne le specie arboree, nella comunicata alla UE con le caratteristiche delle PGI. UE sono attivi attualmente solo tre progetti specifici In Italia tuttavia dal 2002 il Ministero che riguardano però il pioppo; per le piante da frutto dell’Ambiente non rilascia alcun permesso a causa non risulta esserci alcun progetto attivo. Riguardo alla delle inadempienze dello Stato italiano nei confronti sperimentazione di campo, invece, come si può delle direttive europee (direttiva europea 2001/1), che dedurre dal registro GMO della Commissione euro - obbligava gli stati membri della UE ad adempiere ad pea, tra il 2005 al 2010 sono state rilasciate diverse alcuni obblighi entro l’anno 2007. In particolare le autorizzazioni: cinque alla Spagna (arancio per preco - Regioni, entro tale data, avrebbero dovuto individuare ce fioritura, portinnesti agrumi per resistenza a fun - i siti di sperimentazione e il MiPAAF approvare i pro - ghi, architettura di portinnesti di agrumi, aroma aran - tocolli di sperimentazione, ma nulla è stato ancora cia); due alla Svezia (portinnesti pero e melo per fatto a causa dell’ostruzionismo praticato dalle modificarne l’architettura del nesto); una all’Olanda Regioni. Le Regioni avrebbero dovuto approvare i (resistenza a ticchiolatura in melo); due alla Romania piani di coesistenza delle colture PGI con quelle tradi - (susino per resistenza a virus) e una alla Francia (por - zionali, e in caso di inadempienza da parte regionale tinnesti vite per resistenza a virus). Non risultano altre tale obbligo lo avrebbero dovuto svolgere gli Uffici autorizzazioni dopo il 2010. delegati ai Poteri Sostitutivi dello Stato. Proprio a Le procedure per la commercializzazione, molto causa di queste inadempienze che il Ministero lunghe e costose, prevedono una valutazione del dell’Ambiente, nel 2012, non ha concesso una proro - rischio per la salute umana e per l’ambiente. In genere ga alla sperimentazione regolarmente in atto da oltre sono richiesti più di 10 anni, cioè un periodo pari a 10 anni all’Università della Tuscia intimando la quello per valutare un prodotto chimico per la difesa distruzione di tutte le piante (360 appartenenti a ben 9 delle piante e di un farmaco, mentre per approvare un notifiche), incluse quelle per le quali era stata chiesta prodotto cosmetico sono necessari 1-2 anni e 7-8 anni una deroga, perché secondo la nuova legislazione per un prodotto biologico per la difesa delle piante. europea (anno 2001), le piante modificate con Per produrre una pianta transgenica sono necessari l’ Agrobacterium rhizogenes wt non rientravano in mediamente 50 mila € mentre per l’immissione sul questa legge in quanto il batterio non era stato sotto - mercato ci vogliono alcune decine di milioni di euro. posto ad alcuna modifica. La sperimentazione era E’ da notare che per le piante derivate da qualsiasi stata concepita non solo per studiare le piante e la altra tecnica di miglioramento genetico non è richie - salubrità dei loro frutti, ma i movimenti del polline, le sto alcun controllo prima dell’immissione in commer - influenze sui microrganismi del suolo, insetti, funghi cio. E’ noto che con l’incrocio il rimescolamento di e batteri; i geni usati, sebbene di altre specie, sono tut - geni che si verifica nella progenie può creare nuove tavia presenti naturalmente nelle piante (sono stati combinazioni di geni deputati alla produzione di pro - solo sovra-espressi). Di fatto il campo era un “labora - teine e altri composti, quali gli allergeni, che potreb -

36 Piante da frutto transgeniche bero arrecare danno a chi se ne alimenta. Non bisogna Dagli studi pubblicati relativi alla sicurezza delle dimenticare che nel recente passato in USA alcune PGI (ca. 3.500) e dai dati ottenuti da una serie di studi varietà di patate sono state ritirate dal commercio finanziati dalla Comunità Europea, durati 15 anni e dalle autorità deputate al controllo quando si erano già costati 70 milioni di euro con il coinvolgimento di verificati alcuni decessi a causa della loro tossicità. 400 Centri di ricerca pubblici, emerge che le PGI non Per le PGI ciò non potrà accadere in quanto i control - manifestano un comportamento diverso da quello li, molto complessi ed accurati, sono fatti sia sugli delle colture tradizionali. Dei circa 1783 lavori analiz - animali che sull’uomo prima che i prodotti vengano zati (articoli di ricerca originali, reviews, opinioni immessi in commercio. rilevanti e repporti), pubblicati nel periodo 2002- 2012, molti dei quali scaturiti da progetti europei volti Organi scientifici e amministrativi preposti ai con - ad analizzare i rischi delle PGI per l’ambiente, per la trolli delle PGI e dei loro prodotti salute dell’uomo e degli animali non ce ne è nemme - no uno che testimoni un rischio reale connesso con A causa di una carenza di informazione, pochissi - l’uso di piante geneticamente ingegnerizzate (Nicolia mi conoscono la mole di lavoro e la scrupolosità con et al. , 2014). I test sui rischi esaminati da accademie cui varie Agenzie pubbliche internazionali e nazionali scientifiche indipendenti e da numerosi altri organi - controllano i prodotti derivati dalle PGI prima di arri - smi sono giunti alla conclusione che le colture GM vare al consumatore. Questa cattiva informazione rap - commercializzate sono sicure per il consumo umano e presenta una delle principali cause che determina dif - per l'ambiente. La recente meta-analisi di Klümper e fidenza e paura nei confronti delle PGI da parte del - Qaim (2014) ha consolidato tali affermazioni e con - l’opinione pubblica. Il controllo inizia dall’isolamento fermato i significativi elevati benefici medi agronomi - del gene fino alla trasformazione e alla valutazione ci ed economici delle colture GM con riduzioni altret - della pianta in serra e in campo fino al mercato. Negli tanto significative dell’uso di pesticidi. Inoltre i USA la NIH (National Institute of Health) emana le numerosi lavori di studio dell'espressione genica dif - linee guida, l’USDA (U.S. Department of ferenziale tra linee derivate da incrocio e linee tran - Agriculture) esercita i controlli dal punto di vista sgeniche, ed in particolare uno di questi svolto in fru - agronomico; l’EPA (U.S. Environmental Protection mento (Baudo et al. , 2006), suggeriscono che la pre - Agency) controlla la sicurezza per l’ambiente e infine senza di transgeni non altera significativamente l'e - l’FDA (U.S. Food and Drug Administration), esercita spressione genica, per cui le piante transgeniche i controlli sulla sicurezza alimentare. Nella UE le PGI potrebbero essere considerate sostanzialmente equiva - sono sotto il controllo dell’EEA (Environmental lenti alle linee parentali non trasformate. European Agency) e dell’EFSA (European Food Safety Authority) che è l’ente preposto al controllo La ricerca sulle PGI delle specie da frutto e nuovi delle PGI e dei prodotti da essi derivati nell’Unione strumenti di “editing genetico” Europea, e decide quali sementi geneticamente modi - ficate possono essere importate e quali possono essere La trasformazione genetica oggi è una tecnologia coltivate sul territorio europeo. L’autorizzazione pre - da preferire alle altre conosciute, perché rappresenta vede una serie di analisi chimiche, genetiche e biolo - l’avanguardia tecnologica dell’agricoltura. Comparare giche effettuate in più di 40 laboratori in Europa. In le tecniche di trasformazione genetica a quelle della Europa il principio di precauzione è diventato norma ibridazione classica è come confrontare uno smart- di controllo per l’immissione delle PGI nell’ambiente. phone di ultima generazione con un telegrafo a fili. Con tale principio si intende una politica di condotta Così come nel campo della comunicazione lo smart- cautelativa per quanto riguarda le decisioni politiche phone rappresenta la logica scientifica e necessaria ed economiche sulla gestione delle questioni scientifi - evoluzione del telegrafo, così anche nel campo biolo - camente controverse. gico, e quindi farmacologico e soprattutto agricolo, Relativamente all’etichettatura degli alimenti con - questa tecnica biotecnologicaa è la normale e logica tenenti PGI, negli USA se equivalenti ai convenziona - evoluzione delle tecniche di ibridazione classiche. li non c’è necessità di etichettatura, mentre in Europa Infatti, essa permette un miglioramento genetico più gli alimenti con contenuto superiore allo 0,9% sull’in - mirato, è svincolata dalla compatibilità sessuale, per - grediente per gli OGM autorizzati e superiore allo mette di aumentare la variabilità genetica (la biodi - 0,5% per gli OGM con il solo giudizio positivo versità) e permette di realizzare gli obiettivi in tempi dell’EFSA (49/2000) vanno etichettati al fine di favo - relativamente brevi, difficilmente raggiungibili con le rire la libera scelta del consumatore. tecniche classiche di incrocio, che trasferiscono interi

37 Rugini

Tab. 1 - Alcuni risultati principali in piante da frutto ottenuti con la tecnologia di trasferimento genico via agrobatterio. Tab. 1 - Main results obtained in fruit trees using gene tranfers technlogy by Agrobactrium . ; 7 ; 0 9 4 0 0 9 . 2 0 9 )

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38 Piante da frutto transgeniche

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39 Rugini cromosomi o comunque grossi segmenti di DNA. Se La ricerca è orientata a correggere i difetti, poten - non fossero così osteggiate, potrebbero fornire dei ziando o riducendo l’espressione di geni esistenti, di progressi inimmaginabili in brevissimo tempo sia nel cultivar già di per sé molto importanti commercial - campo dell’agricoltura sia in quello della farmaceuti - mente, sfidando la difficoltà che spesso oppongono ca, creando innumerevoli posti di lavoro ad alto reddi - alla rigenerazione in vitro . Il sequenziamento dei to e attirando investimenti. Ricordiamo che recente - genomi delle piante, peraltro in progresso anche in mente alcuni farmaci anti-ebola sono stati prodotti in piante da frutto (Dondini e Tartarini, 2014), consente piante di Nicotiana benthamiana ricombinanti, svilup - di individuare nella pianta stessa i geni da modificare pate negli USA, quando, paradossalmente, i primi e di modificarli secondo le nostre esigenze senza biso - passi nello sviluppo delle piante come bioreattori per gno di doverli importare da altre specie. Si tende ad farmaci e per la produzione di anticorpi monoclonali utilizzare sempre più le tecniche del Gene ‘stacking’ o sono stati fatti in Italia (Franconi et al. , 1998) pyramiding’ e la tecnica dell'RNA antisenso. La tec - L’abbinamento di questa tecnica con quelle tradi - nica del Gene ‘stacking’ o ‘pyramiding’, cioè la com - zionali di incrocio è una via da perseguire, non fos - binazione di tratti desiderati in un’unica linea, è già s’altro che per costituire piante madri con giovanilità utilizzata nel breeding tradizionale. Questa strategia brevissima, da mantenere solamente in serra con la sta rapidamente guadagnando popolarità in colture funzione di produrre rapidamente discendenze in biotech attraverso la co-espressione di geni multipli, seguito ad incroci con varietà compatibili. La selezio - che sono necessari per alcuni pathway biochimici ne di piante migliorate da destinare alla coltivazione (enzimi multimerici, proteine che controllano diversi verrà fatta esclusivamente tra le discendenze che non ‘choke points’, miglioramento della tolleranza a stress conterranno i transgeni, per cui queste non saranno abiotici quali: alte e basse temperature, carenza idrica, soggette ai vigenti regolamenti relativi agli OGM, asfissia, calcare e acidità dei suoli, deficit ed eccessi perché non sono transgeniche. Le discendenze che di luce, inquinanti, etc.). Con questo metodo erano conterranno i transgeni verranno di nuovo utilizzate state costituite all’Universita della Tuscia fragole per essere sottoposte a nuovi incroci in serre protette. transgeniche con tre geni (Osmotina, PR1, chitinasi) In questo modo in pochissimi anni si potranno produr - distrutte dai “No Global” nel 2002 durante la speri - re piante arboree migliorate non transgeniche invece mentazione di campo. Fino a quel momento, nè in di dover aspettare le decine di anni necessarie a causa serra né in campo, avevano manifestato alcun sintomo della lunga giovanilità delle piante arboree (Cressey, di malattie fungine contrariamente ai controlli. Uno di 2013) (tab. 1). questi geni, l’osmotina si è rivelata essere un omologo I nuovi strumenti di “editing genetico” nominati, dell’ormone umano adipinectina, coinvolto nel meta - ZSFNs, TALENs e CRISPRs (Bogdanove et al. , bolismo del glucosio. E’ promettente per essere alla 2010), possono sostituirsi ai tradizionali metodi di tra - base di nuove terapie per la cura di diverse patologie sformazione genetica e superarne le regole ristrettive e tra cui il diabete, il cancro e alcune patologie del gli ostacoli di natura sociale associati alle piante tran - sistema nervoso centrale (Naseer et al. , 2014). sgeniche. Questi mezzi innovativi consentono di inse - La tendenza è di utilizzare geni appartenenti alla rire un nuovo gene in posizioni ben precise della cate - specie inseriti in senso o antisenso per capire meglio na del DNA, di farlo funzionare quando è necessario e anche la loro funzione. La tecnica dell'“RNA antisen - di evitare di arrecare eventuale disturbo a geni conti - so” viene utilizzata normalmente nelle piante per gui, oltre a fornire la possibilità di cambiare, base per bloccare l’espressione di geni endogeni, utilizzando base, il DNA della pianta, migliorando gli stessi geni frammenti di geni clonati in orientamento inverso senza lasciare traccia, in quanto usano come sito di vicino ad un promotore che riduce in modo più o inserzione lo stesso segmento di DNA che deve essere meno marcato la produzione della proteina endogena. modificato o, ancora, trasferiscono sequenze di RNA Utile per bloccare l’attività di alcuni geni considerati senza inserimenti nel genoma, qualora si voglia gene - dannosi (allergeni) o per rallentare la maturazione dei rare un semplice knock-out (silenziamento gene-speci - frutti (es. silenziando geni come quelli per la poliga - fico). Sono già disponibili inoltre tecniche biomoleco - latturonasi (PG) e per la biosintesi dell’etilene). La lari che consentono di vedere subito, prima che la tecnica più evoluta è quella dell’RNAi (RNA interfe - pianta diventi adulta, se la modificazione genetica è rence), basata su un processo di inattivazione genica stata soddisfacente (Kanchiswamy et al. , 2015). post-trascrizionale, altamente specifico, presente in Queste metodologie, non ancora applicate alle piante piante e animali, innescato da RNA a doppia elica da frutto, sono da qualche tempo usate in campo onco - (dsRNA) omologo alla sequenza del gene dannoso da logico per la terapia genica (Lu-Xiao, et al. , 2015). sopprimere. Tutte queste tecniche sono originate dallo

40 Piante da frutto transgeniche studio dei risultati ottenuti con l’utilizzo delle prime e pianta con due o più geni che codificano per la stessa più rudimentali tecniche di transfezione genetica che proteina con un differente modo di azione, operando causando un inserimento del transgene random gene - cioè una co-trasformazione con più costrutti genici o rava ogni sorta di risultato: duplicazioni, doppie, triple una co-trasformazione con un singolo costrutto recan - inserzioni, inserzioni antisenso e soprattutto l’indesi - te più transgeni. Attualmente questa strategia funzio - derato gene silencing causato dall’interferenza tra na bene per difendere le piante dai lepidotteri (pirali - l’RNA esogeno e quello endogeno. de del mais) e alcuni coleotteri (diabrotica del mais), Di seguito vengono riportate brevemente le strate - mentre qualche difficoltà è stata incontrata con altri gie di miglioramento genetico e i geni più promettenti fitofagi. Esperienze di trasformazione con questi geni che potrebbero essere impiegati per le piante da frutto, vengono riportate in letteratura anche su melo e kaki nonchè i risultati ritenuti più interessanti riuniti in (tab 1). Sebbene la tossina Bt venga degradata in tabella 1. Particolare enfasi sarà data agli stress biotici ambiente acido, tipico dello stomaco dei mammiferi, e abiotici che rappresentano le principali cause delle tuttavia per rassicurare l’opinione pubblica è auspica - perdite di produzioni, nonostante l’impiego massiccio bile far produrre la tossina solo in tessuti di organi dei di agrofarmaci. vegetali non usati per l’alimentazione, ricorrendo all’impiego di promotori sito-specifici o inducibili Trasformazione per proteggere la pianta da stress (es: promotori da ferita). biotici: insetti, funghi, virus, batteri e nematodi Nuove strategie si stanno studiando, per ora in Gli insetti e i funghi sono molto più distruttivi dei piante erbacee, per costituire piante transgeniche virus e dei batteri. In alcuni casi, con il breeding tradi - capaci di imitare l'avvertimento chimico 'feromone di zionale si è potuto introdurre geni di resistenza da allarme' prodotto per esempio dagli afidi quando sono specie selvatiche a specie coltivate con i tempi e con sotto attacco dei loro predatori. In questo modo gli le problematiche che questo comporta, per altre inve - insetti avvertendo il pericolo provenire dalle piante e ce non sono stati trovati ancora geni di resistenza effi - credendo che siano i loro simili ad esserlo, non si caci e durevoli. Particolarmente penalizzate sono le avvicinano alle piante geneticamente modificate piante arboree da frutto a causa dei tempi lunghi di (Cressey, 2013). realizzazione. Protezione delle piante dai funghi. Con la compar - Protezione delle piante dagli insetti . La resistenza sa di nuovi ceppi di patogeni virulenti, anche le culti - agli insetti è stato il carattere maggiormente conside - var resistenti tendono a diventare sensibili nel tempo rato dai laboratori privati per produrre le colture tran - e i patogeni a diffondersi rapidamente, sebbene venga sgeniche oggi in commercio, dopo la resistenza agli messo in atto il controllo con diverse tecniche tra cui erbicidi, sfruttando le particolarità di una tossina (pro - la quarantena, l’igiene, l'allevamento e la selezione teina Bt) prodotta dal Bacillus thuringiensis, batterio clonale di varietà e l'applicazione di fungicidi. L’uso usato da molto tempo nella lotta biologica come inset - incontrollato di questi non solo determina un aumento ticida organico naturale. Quando è spruzzato sulla dei costi di produzione e il degrado ambientale, ma chioma delle piante da difendere gli insetti fitofagi induce nuove forme di resistenza ai patogeni, costrin - che lo ingeriscono insieme ai tessuti della pianta gendo lo sviluppo di altri nuovi fitofarmaci. Questi muoiono in seguito alla rottura della parete intestinale problemi hanno incoraggiato la ricerca a trovare solu - dovuta alla tossina del batterio. I geni responsabili zioni biotecnologiche per la lotta contro le malattie della produzione (geni Cry), integrati nel genoma fungine, puntando in particolare all'identificazione dei delle piante inducono i loro tessuti a produrre le stesse geni coinvolti nella resistenza, sia quelli che codifica - tossine mortali per gli insetti. Per limitare l’insorgen - no per enzimi coinvolti nella biosintesi di composti za di resistenze alla tossina Bt da parte degli insetti, tossici per i funghi che quelli che codificano per pro - che si può verificare sia con l’intenso uso del batterio teine tossiche che inibiscono direttamente la crescita distribuito sulla pianta con finalità di lotta biologica fungina (Terras et al. , 1998) con lo scopo di introdurli sia con la diffusione di piante transgeniche, è consi - in piante sensibili o sostituire i promotori dei geni gliato coltivare un 20% di piante non transgeniche antifungini con altri più efficienti. Diverse proteine, accanto a quelle transgeniche. Inoltre, per evitare rapi - denominate proteine correlate alla patogenesi (PR), damente l’insorgenza di resistenze sembra sia neces - sono state riportate avere attività antifungina e sono sario produrre piante con alti livelli di tossina Bt nei state classificate in almeno 11 classi. Alcune di queste tessuti usando metodi multipli o geni piramidati hanno mostrato anche attività antivirali e antibatteri - (Gassmann et al. , 2011); in sintesi si trasforma una che. I geni legati alla difesa sono stati ampiamente

41 Rugini descritti da Baldoni e Rugini (2002), alcuni di questi dal M. floribunda (Belfanti et al. , 2004) e al suo suc - vengono riportati di seguito. cessivo trasferimento via agrobatterio alle cvs Gala ed Il gene dell’osmotina (Osm) che codifica per una Elstar. Il risultato di questo trasferimento è stato il proteina PR si esprime in tutte le piante in condizioni conferimento di resistenza al fungo mantenendone le di stress biotici ed abiotici (Liu et al. , 1994;. Zhu et caratteristiche morfofisiologiche originarie (fig. 2a). al. , 1996; Yun et al. , 1998). Le proteine di questa Fragole transgeniche con il gene rolC risultano più grande famiglia vengono oggi studiate nelle piante per tolleranti a Phytophthora cactorum e più produttive e indurre tolleranza al freddo invernale e stress idrici. i frutti di migliore qualità; stessi risultati si sono avuti Il gene di osmotina di tabacco, sotto il controllo con il trasferimento di geni rol piramidati (rolABC) del promotore costitutivo 35S, è stato introdotto in (tab. 1, fig. 3). actinidia cv Hayward e olivo cv Canino. Nel primo caso, in seguito ad infezioni artificiali post-raccolta, i Protezione delle piante dai virus. frutti hanno mostrato una chiara tolleranza a Botritis Dall’osservazione sulle proprietà della nota “protezio - cinerea (botrite) e a Cadophora luteo-olivacea (cadofora) (fig. 1) (Rugini et al. , 2011); lo studio pro - grammato sulle proprietà salutistiche non è stato pos - sibile farlo a causa dell’intimazione alla distruzione delle piante da parte del Ministero dell’Ambiente. Nel secondo caso, uno dei 3 cloni esaminati in vaso e in campo per 10 anni ha mostrato una migliore tolleran - za all’occhio di pavone ( Spilocea oleagina ) (Rugini et al. , 2000) correlabile ad un maggior contenuto della proteina intercellulare nelle foglie (tab. 1). Riguardo all’uso delle endochitinasi, delle proteine inibenti la poligalatturonasi (PGIP) e della famiglia dello stilbene sintasi per la difesa, si ricorda la trasfor - mazione del limone con la chit42, una chitinasi del fungo Tricoderma harsianum con effetti protettivi nei confronti della botrite, e la trasformazione del melo con i geni dello stilbene sintasi di vite e della PGIP dell’actinidia (tab. 1). Per superare le difficoltà incontrate con il breeding classico di trasferire il gene Vf di resistenza alla tic - chiolatura ( Venturia inequalis ) dal Malus floribunda , con frutti molto piccoli, al melo coltivato al fine di ottenere discendenze con frutti di pezzatura commer - ciabile, si è fatto ricorso all’isolamento del gene Vf

Fig 2 - Meli transgenici: il gene Vf, isolato dal Malus floribunda che controlla la ticchiolatura, è stato trasferito in due cultivar di melo Gala e Elstar rendendole resistenti al patogeno (Szankowski et al. , 2009; Paris et al. , 2009). Meli autosterili sono diventati autofertili con il silenziamento del gene S-Rnase (Broothaerts et al. , 2004 ). Meli divenuti ipoallergenici in seguito alla riduzione dell’espressione dell’allergene Mal d 1 con il metodo dell’ RNA interference (Gilissen et al. , 2005). Fig. 2 - Transgenic apples: The Vf gene, isolated from Malus flo - ribunda controlling scab, was transferred in two apple cultivars, Fig. 1 - Kiwi, della cv Hayward trasformata con osmotina , sono Gala and Elstar, making them resistant to the pathogen (Belfanti più tolleranti a botrite e cadofora in seguito ad inoculi artificiali et al., 2004; Szankowski et al. , 2009; Paris et al. , 2009). Self-ste - (Rugini et al. , 2011). rile apples become self-fertile with the S-RNase gene silencing Fig. 1 - Kiwi, cv Hayward, transformed with osmotin gene: the (Broothaerts et al. , 2004). Apples became hypoallergenic fol - fruits resulted more tolerant to botrytis and cadofora following lowing the reduction of the expression of the allergen Mal d 1 by artificial inoculation (Rugini et al ., 2011) . the method of RNA interference (Gilissen et al. , 2005).

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Fig. 3 - Fragole trasformate con rolC in alto a destra (Costantini et al. , 2009). Le restanti foto mostrano le fragole in un test di campo all’Università della Tuscia con rolABC e Osmotina (Rugini, non pubbl.). Tutte risultano più tolleranti a funghi patogeni. Fig. 3 - Strawberries transformed with rolC (top right) (Costantini et al ., 2009). The other photos show a field trial at the University of Tuscia of transgenic strawberries with rolABC and osmotin genes (Rugini, unpubl. data). All plants were more tolerant to pathogenic fungi. ne crociata” (un virus che produce soltanto lievi effet - patogeni si è dimostrato anche l'uso di anticorpi ti è in grado di proteggere la pianta stessa da virus più ricombinanti scFv (Cervera et al. , 2010). dannosi), è nata l’intuizione che sarebbe stato suffi - ciente attivare la protezione con la sola presenza nella Protezione delle piante dai batteri e nematodi. Il pianta di una proteina del capside esterno (CP-Coat fuoco batterico delle Rosaceae (melo, pero, cotogno e Protein) del virus fatta produrre dalla pianta stessa. altre specie ornamentali), causato da Erwinia amylo - Infatti piante transgeniche capaci di produrre la CP, vora e il cancro batterico delle drupacee (da manifestano una resistenza all'infezione ai virus. Ciò è Pseudomonas syringae ), le macchie nere del noce (da stato osservato in diverse piante ortive, incluse quelle Xanthomonas campestris pv Juglandis ) ed il cancro varietà a rischio di estinzione, come il pomodoro San degli agrumi (da Xanthomonas citri ) sono tra le Marzano, oltre a piante da frutto quali albicocco, susi - malattie che di recente hanno provocato problemi alla ni, agrumi (tab 1). Questa tecnologia ha contribuito a frutticoltura nel mondo. La ricerca si è concentrata sui salvaguardare la coltivazione e l'indotto industriale geni che producono proteine anti-microbiche, come della papaia nelle Hawaii grazie alle realizzazione peptidi litici (cecropine, manganine, attacine, arpine, della papaia PRV, resistente a “papaia ringspot e analoghi sintetici) (Petri e Burgos, 2005; Batti e Jha, virus”,, che risulta la prima pianta da frutto autorizza - 2010; Mendes et al. , 2009). Altre strategie, i cui risul - ta alla coltivazione per la commercializzazione dei tati sono riportati in tabella 1, sono risultate efficaci frutti. Sono ormai oltre 10 anni che si coltiva e che ha nel controllo dei batteri in piante da frutto come: l’e - dimostrato l'integrità e stabilità del gene anche nei spressione in pianta di lattoferrina bovina che riduce discendenti (Kohli e Criostou, 2008) e nessun proble - la disponibilità del ferro; la sovraespressione di pig - ma è stato causato in animali alimentati con i frutti. menti colorati, con il gene Lc (Leaf Color); la sovrae - Una certa efficacia nel proteggere le piante dai virus spressione di spermidina sintasi, via quest’ultima

43 Rugini interessante per difendere le piante da stress sia di olivo cv Canino transgenico sovraesprimenti il gene natura abiotica che biotica; la trasformazione con il dell’osmotina (D’Angeli et al. , 2001), contrariamente gene glucosio ossidasi (Gox ) di Aspergillus niger , alle piante di controllo, mostravano una evidente sof - che induce la produzione di H 2O2 che innesca la morte ferenza alle normali condizioni di coltivazione con cellulare. Sembrano anche efficaci modifiche a livello irrigazione, con la morte di alcune foglie (Rugini et di sintesi di alcuni terpeni nel controllo dei nematodi, al. , 2000). In esperimenti condotti in vaso nel periodo considerando gli elevati quantitativi di questi compo - estivo di massima traspirazione, con piante di oltre 2 sti trovati in radici di piante erbacee resistenti. anni di età sottoposte a una somministrazione minima di acqua, è stato osservata dopo 4 settimane la morte Trasformazione per proteggere la pianta da stress dei controlli e delle combinazioni d’innesto abiotici rolABC/su “Canino controllo”, contrariamente ai 3 Tolleranza a siccità/salinità e pH elevato. Circa un cloni, derivati da differenti eventi di trasformazine con quarto delle terre emerse coltivate nel mondo è sog - l’osmotina (fig. 4). In vitro , i germogli hanno mostrato getto a danni da sali, soprattutto da cloruro di sodio un tasso di crescita normale in presenza di 2 e 4% di (NaCl), ma anche da solfati di Ca, Na e Mg, cloruro di PEG (polietilenglicole) accompagnata da un maggiore

K e carbonato di sodio (Na 2CO 3) anch’essi molto accumulo di prolina nei tessuti, mentre i controlli a comuni. Lo stress salino provoca vari tipi di danni tra quelle concentrazioni osmotiche presentavano eviden - cui riduzione della crescita, inibizione della fotosinte - ti segni di danni fogliari con crescita ridottissima. Un si, attenuato assorbimento dei nutrienti, disorganizza - ulteriore passo avanti è stato fatto con la scoperta del zione della membrana e produzione di metaboliti tos - gene NCED-3 (Ruggiero et al. , 2004), responsabile sici. La via seguita per rendere le piante tolleranti o della produzione di uno degli enzimi chiave della bio - resistenti a stress di natura abiotica è quella legata sintesi dell’acido abscissico (ABA), un ormone all’incremento della capacità dei geni coinvolti nella responsabile per la risposta delle piante agli stress detossificazione dai radicali liberi (reactive oxygen ambientali. Questo svolge un’azione di promotore species -ROS-). Sostanze osmoprotettive prodotte da degli inibitori delle ciclinchinasi 2alfa (ICK1), enzimi alcune piante in risposta a stress osmotici come siccità responsabili della crescita cellulare e, in seguito al e salinità (heat-shock proteins -HSPs-) vengono accu - messaggio ormonale, attivo solo sotto stress, inibisce mulate dalla pianta in seguito a stress da calore. la crescita della pianta esposta a stress salino prima Inoltre, molti geni sono coinvolti nel controllo dello che l’accumulo dello ione nelle cellule raggiunga stress da sale, ma quelli per il trasporto di ioni e osmo - livelli tossici. Modifiche dei livelli di espressione di liti organici sembrano essere bersagli particolarmente NCED-3 e degli elementi a valle di questo nuovo promettenti, soprattutto se combinati in un approccio pathway, come ICK1 e 6, sono state apportate a culti - di tipo piramidale (Jain e Selvaraj, 1997). Piante di var di riso con risultati molto promettenti. actinidia sono state prodotte con il gene antiporto AtNHX1 (Tian et al. , 2011) migliorandone la resisten - Tolleranza a stress da freddo. I diversi tessuti za al sale. Il trealosio, è un disaccaride che in alcuni delle piante dei climi temperati rispondono in modo microrganismi consente la sopravvivenza in assenza diverso quando esposte a temperature di congelamen - di acqua e di alte temperature, è un osmoprotettivo to. Le loro strategie per la difesa e quelle biotecnolo - contro gli stress ambientali, in modo particolare la giche adottate dall’uomo per selezionare piante tolle - salinità, ma anche il congelamento, le alte temperature ranti a questo stress sono state descritte in dettaglio da e lo stress idrico. Piante transgeniche di patata sono Baldoni e Rugini (2002). In sintesi le modifiche di state prodotte con successo. Uno degli osmoregolatori acclimatamento coinvolgono il metabolismo dei car - più conosciuti è la prolina, la quale si accumula nei boidrati, la composizione delle membrane plasmati - tessuti in seguito a stress osmotico, conferendo una che e l’accumulo di classi di proteine con funzione maggior tolleranza allo stress idrico. Piante transgeni - crioprotettiva (Chen et al. , 1995). Le piante adottano che di carrizo esprimenti un gene che codifica per l'en - due strategie principali per difendersi da stress da zima limitante la velocità del pathway della prolina freddo: tollerando o evitando il congelamento. Nel erano in grado di accumulare molta prolina nelle primo caso si forma ghiaccio extracellulare con con - foglie e di resistere a lunghi periodi di siccità seguente abbassamento del punto di congelamento (Molinari et al. , 2004), similmente alle piante di melo delle cellule; nel secondo caso la cellula super-raf - transgeniche con Osmyb4 di riso che migliorava la fredda i fluidi interni prevenendo la formazione di risposta adattativa allo stress idrico e a quello al fred - ghiaccio (Wisniewski e Arora, 2000). Normalmente do (Pasquali et al. , 2008). Piante in campo e in serra di in alberi da frutto il super-raffreddamento è di -2 a -4

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Fig. 4 - Olivo cv Canino trasformato con osmotina a confronto con il controllo (a sinistra) risulta resistente a stress idrico e al freddo. Fig. 4 - Olive plants (cv Canino) transformed with the osmotin gene (right). The transgenic plants resulted more resistant to water stress and cold than the control (left).

°C circa (Ashworth e Kieft, 1995). I geni responsabili mente coinvolta nella induzione della programmazio - del fenotipo dell’enucleazione del ghiaccio “ice+”, ne della morte cellulare, che viene prodotta durante il clonati da diverse specie (Warren, 1995 ) e al di là periodo di acclimatamento al freddo e la sovraespres - delle specifiche proteine (antigelo), come le deidrine sione migliora il suo ruolo di crioprotettore (tab.1). (un sottogruppo di proteine LEA), direttamente coin - volte nella acclimatazione al freddo, anche altre pro - Trasformazione per produrre molecole bioattive e teine, come quelle di riserva della corteccia (BSP), fattori di trascrizione per il controllo di caratteri alcuni sistemi enzimatici (membrana plasmatica multipli ATPasi; glutatione reduttasi) e fitocromo, sono state Sono in corso studi per verificare la possibilità di associate all’adattamento a stress da freddo. Proteine trasformare le cellule al fine di indurle a differenziare. antigelo isolate in piante hanno una struttura diversa I geni VvWOX, in vite, sembrano avere un ruolo e, probabilmente, diverse modalità di azione; alcune nella regolazione dell’embriogenesi somatica di queste sono simili alle PR (Hon et al. , 1995). E’ (Gambino et al. , 2011), per cui se si dimostrassero stato clonato il gene della deidrina di pesco (ppdhn1), efficienti potrebbero sostituire i geni marcatori in uso mentre nel ribes nero è stato isolato un gene deidrina- attualmente, quando usati con cellule non in grado di simile (dhns) (Lanham et al. , 2001). Diverse proteine, rigenerare. Le piante da frutto potrebbero essere usate identificate come sovraespresse in risposta a freddo, anche per produrre molecole bioattive; l’actinidia e il sono anche sovraespresse in risposta ad altri tipi di citrange sono stati trasformati con l’hEGF umano stress, inclusi quelli biotici. Una di queste è l’osmoti - (fattore di crescita dell’epidermide umana), meli tran - na che è stata identificata in risposta allo stress da sale sgenici sono in grado di produrre l’antigene contro e, successivamente, a stress da freddo e altri ancora l’infezione virale delle vie respiratorie (Lau e Korban, (Zhu et al. , 1996). Proteine 1,3 endoglucanasi like, 2010); infine la banana e la papaia sono state trasfor - chitinasi-simile, come la taumatina, hanno proprietà mate rispettivamente per produzione di vaccini contro antigelo e anche funzioni antimicrobiche in vivo l’epatite B (Kumar et al. , 2005) e contro la Taenia (Pearce, 1999). Geni corrispondenti sono stati isolati e solium (Hernandez et al. , 2007). successivamente inseriti in piante, incluse quelle da Alcune classi di fattori di trascrizione sembrano frutto. In piante di olivo cv Canino transgeniche per essere promettenti per la difesa delle piante da stress l’osmotina, allevate in campo dall’Università della biotici e abiotici. Due geni codificanti per VpWRKY 1 Tuscia, si è dimostrato che questa proteina è positiva - e 2, isolati da vite selvatica cinese espressi in

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Arabidopsis hanno migliorato la resistenza a funghi e la tolleranza a stress di natura osmotica (Li et al. , 2010); il gene VvWRKY11 ha contribuito ad aumenta - re la tolleranza allo stress osmotico (Liu et al. , 2011); mentre il gene VvWRKY2 ha influenzato il pathway della lignina in tabacco (Guillaumie et al. , 2010); il gene MbDREB1 di melo nano ( Malus baccata ) ha incrementato la tolleranza a basse temperature, sale e siccità (Yang et al. , 2011) (tab. 1). Questi studi aprono la via per costituire piante da frutto possibilmente cis- geniche da destinare a colonizzare aree della terra oggi inospitali e per produrre frutti che possono controllare certe malattie umane in paesi sottosviluppati.

Trasformazione per modificare l’architettura della chioma e ridurre il periodo di giovanilità La crescita e lo sviluppo delle piante possono esse - re modificati variando l’espressione dei fitocromi (Phy) che regolano la percezione della luce con riper - cussioni sulla dominanza apicale. Le modifiche a cari - co della percezione della luce possono mutare la distribuzione dei fotosintetati negli organi vegetativi e quindi la forma della chioma a vantaggio degli impianti ad alta densità. La modifica del fenotipo può essere realizzata anche con la sovraespressione di geni che alterano la percezione ormonale, che potrebbe causare uno scarso accumulo di carboidrati nei rami dovuto ad una debole crescita (Zerche e Druege, 2009) o uno squilibrio ormonale nei tessuti (auxine/citochinine). I geni singoli o piramidati di Agrobacterium rhizogenes, (rolABC, rolB, rolC) o tutto il T-DNA di questo agrobatterio (riT-DNA) sono noti per determinare queste caratteristiche (tab. 1) (fig. 5). Questa strategia può essere impiegata per pro - durre portinnesti transgenici per ridurre la mole della cultivar innestata. L’ A. rhizogenes wt potrebbe essere invece impiegato per indurre rizogesi in microtalee di genotipi recalcitranti, avendo però l’accortezza di verificare se le radici contengano realmente il suo riT- DNA, nel qual caso l’habitus vegeto/produttivo risul - terà variato (Rugini et al., com. pers.) (figg. 6, 7, 8). Fig. 5 - Actinidia cv Hayward rolB mantiene la stessa morfologia Le piante derivate da infezione con A. rhizogenes wt del controllo, ma più resistente a siccità e produce frutti più grandi. non dovrebbero essere considerate trangeniche, per - Notare i frutti raggrinziti del controllo in confronto a quelli turgidi chè non vi è alcuna manipolazione genetica. e più grandi del rolB in condizione di non irrigazione. Mentre l’Hayward rolABC presenta una mole più piccola e una elevata Infine, è possibile raccorciare o quasi eliminare il resistenza a stress idrico ma con frutti più piccoli e di forma roton - periodo giovanile facendo sovraesprimere in piante i deggiante, riscontrabile anche nella progenie F1. (Rugini, 2012). geni deputati alla fioritura. I risultati, peraltro molto Fig. 5 - Kiwiplant cv Hayward transgenic for rolB retains the same morphology of the control plant, but it is more resistant to interessanti sono riportati in tabella 1 e figura 9. drought and produces larger fruits than control. Note the shrivel - led fruits of the control in comparison to those of the rolB line Trasformazione per la qualità, maturazione, sapore e which are turgid and larger under not irrigated condition. The pezzatura dei frutti, autocompatibilità e partenocarpia rolABC Hayward plant instead shows a smaller size, high resi - stance to water stress but produces smaller fruits with round shape, similarly to derived F1 (Hyward x GTH rolABC) progeny I target per migliorare la qualità dei frutti sono in than the respective controls (Rugini, 2012).

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Fig. 6 - Frutteto sperimentale dell’Università della Tuscia nella prima decade di questo secolo: portinnesti di Ciliegio e Susino, indotti a radicare con A. rhizogenes wt (di mole più piccola e con foglie ) a confronto con quelli indotti a radicare con l’auxina (di mole più grande). Da notare che non sempre la induzione di radici con il batterio corrisponde la presenza di radici trasformate (in questo caso la morfologia e fenologia della pianta non risultano modificate). Fig. 6 - Field trials at University of Tuscia in the first decade of this century: cherry and plum (right) rootstocks, induced to root with A. rhizogenes wt infection. These plants resulted smaller and with crinkled leaves than the respective ones which were induced to root with auxin treatment. It should be stressed that the roots, differentiated following bacterium infection, not always result transformed (in this case the morphology and phenology of the plant do not change).

Fig. 7 - Rigenerazione del portinnesto Colt in vitro (sinistra) e in vivo (destra) da radici trasformate con geni rol piramidati ( rol ABC o con tutto il riT-DNA di Agrobacterium rhizogenes ). Se non è possibile rigenerare i germogli in vitro, si può ricorrere alla strategia in vivo , seb - bene in alcuni casi i polloni transgenici possano risultare paradossalmente recalcitranti ad emettere radici. Fig. 7 - In vitro (left) and in vivo (right) regeneration of Colt rootstock. In both cases the roots originated in vitro from the explants infec - ted with Agrobacterium rhizogenes wt. In vivo regeneration may be used when it is difficult to regenerate in vitro , but in some cases the riT-DNA suckers, paradoxically may be recalcitrant to produce roots.

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genere i carboidrati, i metaboliti secondari, la durata di conservazione, l’ammorbidimento della polpa, la maturazione e la soppressione di allergeni. Attualmente la fragola viene presa a modello per il suo ciclo di sviluppo breve, per studiare vie per migliorare la qualità dei frutti delle Rosaceae. Le strategie seguite per specie erbacee potrebbero essere applicate a quelle arboree. Frutti più dolci, ma con poche calorie, posso - no essere prodotti esprimendo la proteina taumatina super-dolce, già sperimentata con successo in patate e cetrioli (Witty e Harvey, 1990). Proteine simili sono stati trovate in ciliegio (Fils-Lycaon et al. , 1996) e in pompelmi (Tattersall et al. , 1997) durante la matura - zione che conferiscono un sapore dolce, oltre a svolge - re un ruolo antimicotico. Altro target è la produzione di banane, quasi unico alimento per alcune popolazio - ni, con elevato contenuto di β- carotene e micronu - trienti, tra cui il ferro (Cressey, 2013).

Fig. 8 - Azienda sperimentale dell’Università della Tuscia. In alto uno scorcio del ciliegeto con cv Lapins: le piante più piccole sono innestate sul portinnesto Colt r i-TDNA provenienti da diversi eventi di trasformazione,a confronto con quelle innestate su Colt wt, al momento del trattamento con disseccante prima dell’espian - to coatto ordinato dallo Stato. Sotto: incenerimento dei ciliegi assieme ad altre specie arboree transgeniche (360 piante in totale) in data 29 ottobre 2012. Fig. 8 - Field trials at experimental farm of the University of Tuscia. Top with a view of the cherry grove with cv Lapins: the Fig. 9 - Citrus spp overesprimenti i geni LEAFY (LFY) e A PE - small plants are grafted on ri-TDNA rootstock Colt derived from TALA1 (AP1) (Pena et al ., 2001) e il gene CiFT , fioriscono dopo different infection events, in comparison with those grafted on un anno dall’acclimatamento in serra (Endo et al. , 2005). Colt wt. The plants were sprayed with a chemical before extirpa - Fig 9 - Citrus spp overexpressing LEAFY (LFY) genes and APE - tion, ordered by the Italian Ministry of Environment. Below: a TALA1 (AP1) (Pena et al. , 2001) and the gene CiFT are able to view of incineration of cherry trees and several other transgenic differentiate flowers after one year hardening in greenhouse fruit tree species (360 plants in total) on 29 October 2012. (Endo et al ., 2005).

48 Piante da frutto transgeniche

Sono state prodotti meli transgenici con l’aldoso 6- fosfato riduttasi (A6PR) (Cheng et al. , 2005) per aumentare il saccarosio e ridurre il sorbitolo nelle foglie. Nella vite è stata operata la trasformazione con costrutti sotto il controllo del promotore costitutivo 35S per modificare l’attività dell’alcool deidrogenasi (Adh); quando il gene veniva sovra-espresso si osser - vava un contenuto più basso di saccarosio e una migliore polimerizzazione delle proantocianidine (Tesniere et al. , 2006). Riguardo agli olii, con la soppressione antisenso o la co-soppressione della oleato desaturasi è possibile aumentare l'acido oleico (C18:1) dal 24% al 80% nel - l'olio di soia transgenica. Per rilanciare il consumo di mele di IV gamma sono stati prodotti meli modificati, i cui frutti (Arctic Apple) non imbruniscono rapidamente a seguito di taglio o morsicatura grazie al silenziamento della poli- fenolo-ossidasi (PPO), un enzima chiave nella catena di eventi biochimici che causa l’imbrunimento. Se il consumatore le accoglierà con favore, altri fruttiferi potrebbero essere sottoposti a questa modifica come l’avocado, il pero e anche alcuni ortaggi. Il 13 feb - braio 2015 U.S. Department of Agriculture’s Animal and Plant Health Inspection Service, ha deciso di deregolamentare le prime due varietà di mele che non imbruniscono, l’Arctic Golden e l’Arctic Granny. Fig. 10 - Vite cv Silcora e lampone trasformati con il gene per la partenocarpia DefH9-IAAM producono un maggior numero di In, Fragaria vesca, Fragaria x ananassa e Rubus fiori e frutti più grandi (Mezzetti et al. , 2004). idaeus , piante DefH9-IAAM presentavano un mag - Fig. 10 - Grape, cv Silcora, and raspberry, transformed with gior numero di fiori per infiorescenza e un aumento DefH9-IAAM gene. The plants produced great number of flowers and fruits resulted larger than the respective controls (Mezzetti et del numero di infiorescenze per pianta, traducendosi al ., 2004). in un aumento del numero di frutti, oltre al peso e le dimensioni dei frutti transgenici (Mezzetti et al. , po del frutto anche in condizioni ambientali proibitive 2004). Nella vite, cloni di 'Silcora' e ‘Sultanina' tran - per l'impollinazione e potrebbe aumentare la pezzatu - sgenici per DefH9-IAAM, coltivati in campo aperto ra dei frutti. Broothaerts et al. , (2004) dimostrarono hanno mostrato una produzione più elevata di uva che attraverso il silenziamento del gene SI, che pre - dovuta ad un aumento del numero delle infiorescenze viene l’autofertilizzazione in molte specie arboree, e del contenuto di IAA, con una sostanziale equiva - era possibile produrre frutti in linee di melo capaci di lenza delle caratteristiche nutrizionali della bacche autofecondarsi (fig. 2). Il carattere partenocarpia è (Costantini et al. , 2007) (fig. 10). Sono in atto ricer - spesso poligenico e quindi più difficile da introdurre che per produrre prugne per uso industriale senza con tecniche tradizionali per cui si ricorre alla muta - endocarpo legnoso, per evitare che residui legnosi, zione genetica e all'alterazione del livello di ploidia dovuti allo sgretolamento del nocciolo durante il pro - come recentemente osservato in olivo. Frutti di tabac - cesso di trasformazione, possano finire negli alimenti co, melanzana e pomodoro partenocarpici transgenici trasformati (Cressey, 2013). sono stati ottenuti con successo (Rotino et al. , 1999). Il controllo della maturazione dei frutti è possibile Queste piante contengono nel loro genoma la regione regolando l'attività degli enzimi in essa coinvolti, codificante del gene IAAM (gene della triptofano come la poligalatturonasi e l’etilene (tab 1). Tuttavia monossigenasi), enzima che converte il triptofano in la possibilità di ritardare il rammollimento e la matu - indolacetamide, un precursore dell’IAA, sotto il con - razione sono spesso associate ad una riduzione di trollo della sequenza di un gene regolatore defh9 pla - aromi tipici della maturazione. centare-ovulo specifico. L'espressione di defh9- In specie auto-sterili l'introduzione del carattere IAAM inizia durante lo sviluppo del fiore imitando partenocarpia può consentire il controllo dello svilup - gli effetti ormonali dell’impollinazione e dello svilup -

49 Rugini po embrionale aumentando il contenuto e/o l'attività te ne è stata osservata la perdita di funzionalità nel di auxina nell'ovulo. Piante di actinidia cv ‘Hayward’, tempo. Le osservazioni in piante arboree sono state esprimenti questi geni, prodotte 15 anni or sono, sono fatte sia con i soli geni marcatori, come il gene per la attualmente mantenute in vitro in attesa di poter esse - resistenza alla Kanamicina, sia con i geni inseriti per re sperimentate in campo (Rugini e Spena, dati non migliorare vari aspetti agronomici (Rugini et al. , pubblicati). 1997; 1999; 2008). Nel primo caso la stabilità e la ereditarietà sono state osservate nel melo e nel secon - Trasformazione per produzione di metaboliti secon - do in actinidia transgenica per rolABC, sia per la dari linea maschile (cv GTH) che per quella femminile Molta attenzione oggi è rivolta agli effetti dei (cv Hayward) che hanno conservato il tipico fenotipo metaboliti secondari, in particolare flavonoidi (ad hairy root per tutto il periodo di osservazione di circa esempio, quercitina e kaempferolo) e antociani, che 24 anni, compresi il periodo in serra e quello in posseggono proprietà antiossidanti ed azione vasodi - campo. Inoltre, la progenie derivante da “maschi tran - latatrice, con conseguente protezione da malattie car - sgenici x femmine normali” è risultata stabile nell’e - diovascolari. Il gene del calchone isomerase di spressione per oltre 16 anni di osservazione. Stessa Petunia, enzima coinvolto nella biosintesi dei flavono - considerazione vale per l’olivo transgenico per li potrebbe essere usato per trasformare molte piante rolABC e osmotina (Rugini et al. , 2008) e per il por - da frutto, come susino, vite, fragola, arancio e pom - tinnesto del ciliegio Colt, contenente il riTDNA di A. pelmo, rafforzando il naturale colore dei frutti. rhizogenses mantenendo la capacità nel tempo di (Baldoni e Rugini , 2002; Petri et al. , 2008; 2011). ridurre il vigore della cv Lapins innestata (Rugini e Numerosi lavori sono stati fatti nei recenti anni su Gutierrez-Pesce, 1999; Rugini et al. , com. pers.), per piante da frutto (fragola, agrumi, vite, melo, susino, la fragola transgenica per rolABC e Osmotina, per actinidia) per studiare la funzione dei vari geni coin - l’albicocco transgenico per la proteina di rivestimento volti nella produzione di questi pigmenti sia usando la del virus (Laimer, comunicazione personale). Molto via della sovraespressione sia quella del blocco di lavoro è stato fatto in USA da Scorza e collaboratori alcuni geni. Poiché l’espressione delle antocianine su piante di Prunus domestica transgeniche per la (appartenenti alla famiglia dei flavonoidi) è regolato proteina di rivestimento del “Plum pox virus” (PPV- da un fattore di trascrizione MYB, la trasformazione CP), Gus e geni nptII. L'espressione è rimasta stabile con FaMYB10 (Lin-Wang et al. , 2010) e MdMYB10 per oltre 5 anni sia nelle piante originarie sia nella (Espley et al. , 2007) rispettivamente in fragola e progenie da esse derivata per incrocio (Ravelonandro melo, ha prodotto elevati livelli di antocianine sia et al. , 1997). nella pianta che nei frutti. In fragola, diminuendo il livello di flavonoidi con calcone sintasi antisenso Prospettive e conclusioni (chs), si è aumentata la sensibilità alla Botritis cinerea (Hanhineva et al. , 2009). L’actinidia trasformata con La frutticoltura ha bisogno di rinnovi varietali geni per la biosintesi dei carotenoidi (Kim et al. , sempre più frequenti, necessità accentuata anche dai 2010) si è aumentato il contenuto in β- carotene nei cambiamenti climatici in atto. Le rare vecchie varietà frutti. Gilissen et al. , (2005) ottennero una drastica locali rimaste in coltivazione sono in progressiva riduzione della espressione dell’allergene Mal d 1 nel sostituzione a causa del naturale invecchiamento. melo (tab. 1 e fig. 2). Mentre le centinaia di varietà locali salvate dall’estin - zione ad opera dei ricercatori, anche con lodevoli ini - Stabilità genetica ziative regionali, aspettano di essere migliorate perché così come sono non potranno essere coltivate, se non Quando un gene viene trasferito o modificato da per una agricoltura di nicchia, si continua ad impiega - agenti fisici o chimici nel genoma di una pianta, è re cultivar costituite in ambienti diversi dal nostro essenziale che la sua espressione rimanga stabile nel (vedi liste varietali consigliate, AAVV, 2013) i cui tempo e possa essere ereditato dalla progenie. Tale frutti spesso presentano caratteristiche diverse da requisito è essenziale per le piante a propagazione quelli che si potrebbero ottenere da varietà derivate da gamica, ma lo è altrettanto per quelle a propagazione breeding di genotipi locali o dalla “terapia genica”, vegetativa per eventuali successivi miglioramenti migliorate cioè con tecnologie del DNA ricombinan - della specie avvalendosi anche della via sessuale. Sia te. E’ ormai fuori discussione che le biotecnologie, in in piante arboree che erbacee sono stati condotti molti stretta unione con il miglioramento genetico classico, studi su stabilità genica ed ereditarietà. Solo raramen - sono in grado di migliorare le varietà anche locali ren -

50 Piante da frutto transgeniche dendole più adatte alle mutevoli condizioni ambientali si approfondita, che non è saggio ignorare le colture e alle mutevoli richieste di mercato. transgeniche come uno degli strumenti che possono Non si può disconoscere lo straordinario successo contribuire a soddisfare le aspirazioni di uno sviluppo ottenuto con la coltivazione della papaia nelle Hawaii globale sostenibile mentre la popolazione mondiale e del susino in USA, entrambi salvati con l’ingegneria continua ad aumentare. genetica dai temibili virus che devastavano i frutteti. Ci si preoccupa giustamente tanto del “cibo spre - Dei vantaggi portati da questa tecnologia potrebbero cato” nei paesi sviluppati per motivi legati alla sicu - usufruire altre specie da frutto coltivate in Italia, quali rezza alimentare o alle abitudini radicate, ma troppo actinidia, melo, fragola, vite, pero, portinnesti per poco del “cibo perso”, soprattutto vicino ai luoghi di melo Citrus spp e ciliegio, migliorabili per alcune produzione a causa di varietà non adeguate o per eco - caratteristiche agronomiche, se la realizzazone di PGI nomie arretrate in una agricoltura di sussistenza tanto non fosse stata ostacolata da feroci resistenze che cara a certe lobbie dell’agro-alimentare o della risto - hanno portato l’Italia addirittura all’assurdo divieto di razione dei paesi ricchi. sperimentazione in campo, minando il potenziale Le recenti tecnologie biotecnologiche possono della tecnologia in via di sviluppo. Le critiche tuttavia permettere in breve tempo di superare molte delle prendono spunto e si concentrano sulle PGI progettate controversie in atto, come quelle inerenti la diffusione e realizzate con vecchie metodologie, quindi anche del polline a colture vicine. Questo problema potreb - con possibili difetti, ma non per questo pericolose be essere risolto con la trasformazione del DNA degli come si vuol far credere. organelli cellulari con il metodo del “particle gun”. E’ necessario far capire che la biodiversità, a causa Tuttavia per i fruttiferi è un problema molto limitato e della coltivazione di una o poche varietà ingegnerizza - strettamente legato a pochissime specie e di queste te per ciascuna specie, come attualmente avviene per non a tutte le cultivar. Di certo non è un problema che quelle 7-8 specie autorizzate alla commercializzazione riguarda i portinnesti. L’assenza di specie autoctone e come d’altro canto con gli ibridi da diversi decenni, compatibili negli ambienti circostanti determina un non correrebbe alcun pericolo se si permettesse di pro - rischio non superiore a quello che può derivarne dal - durre numerose varietà migliorate in tempi relativa - l’introduzione di nuove specie esotiche. Inoltre il mente brevi, applicando tutte le tecniche a disposizio - sistema di propagazione vegetativa, rispetto a quello ne, partendo dal germoplasma locale raccolto. di propagazione per seme, riduce drasticamente il E’ altrettanto necessario far capire alla gente che rischio di diffusione dei transgeni nell’ambiente. l’agricoltura occupa spazi relativamente limitati sul Per ridurre l’impatto e per tranquillizzare ulterior - pianeta terra e se questi fossero sfruttati più efficiente - mente l’opinione pubblica, si potrebbe far ricorso mente con le adeguate rotazioni, come le buone prati - all’impiego di nuovi marcatori per la selezione, come che agricole insegnano, ma soprattutto con l’impiego il gene ipt da A. tumefaciens , che induce la rigenera - di varietà efficienti, maggiori sarebbero le estensioni zione di cellule trasformate, permettendo la selezione di superfici “verdi” disponibili. Mentre in Italia la visivamente, al fine di sostituire quelli finora impiegati ricerca su questa branca delle biotecnologie è stata (resistenza ad antibiotici o erbicidi). Per i genotipi quasi completamente bloccata, le compagnie private e dotati di alta capacità di rigenerare, si potrebbe elimi - le istituzioni pubbliche di molti Paesi stanno rapida - nare qualsiasi gene marcatore, operando la selezione in mente perseguendo obiettivi e risultati straordinari. vitro , in serra o in campo utilizzando parametri fisiolo - Il dr. Scorza ed i suoi colleghi in USA stanno uti - gici (risposta a tossine, a filtrato colturale di patogeni, lizzando il virus Plum pox per aumentare il tenore di resistenza a salinità/siccità, ecc.) o morfologici, come è zuccheri nei frutti di varie specie frutticole, oltre a stato già riportato in melo (Malnoy et al. , 2010). tentare di produrre susini da industria più adatti ai Il "potere reale" di queste tecniche consiste nella processi industriali. Anche la varietà di banano capacità di conferire nuovi tratti modificando, o Cavendish, varietà commerciale predominante nel meglio potenziando, i geni già posseduti dalle piante mondo, che è estremamente sensibile ai patogeni fun - autoctone agendo su più di uno se necessario. Ciò gini Mycosphaerella fijiensis e Fusarium oxysporum , presuppone la conoscenza del genoma della pianta e è sottoposta a miglioramenti con le strategie transge - della funzionedei geni, che via via si stanno scopren - niche anti-apoptosici, già sperimentate con successo do, grazie anche al contributo delle piante transgeni - in tabacco. La Cina, attualmente il sesto più grande che. Per esempio, invece di inserire il gene EPSPS utilizzatore di colture GM, dichiara di essere una batterico nelle piante, per creare una simile resistenza grande “serra sperimentale” per queste tecnologie. agli erbicidi, si potrebbe modificare l’analogo gene Park et al. , (2010) arriva ad affermare, dopo un’anali - che si trova naturalmente nelle piante; stessa procedu -

51 Rugini ra potrebbe essere seguita per rendere le piante resi - tivare, oltre a dover tollerare le stesse lobbies che si stenti alla siccità piuttosto che inserire geni batterici. oppongono alla coltivazione ma che sono protagoniste Nel immediato futuro la ricerca avrà sostanzial - nel venderli. mente come obiettivi principali: 1) l'identificazione e La politica della UE di lasciare liberi gli Stati la valutazione dei geni per i tratti utili con i loro pro - membri di gestire la coltivazione e la ricerca non sem - motori specifici e l'identificazione di marcatori asso - bra una buona scelta, non è altro che la dimostrazione ciati a importanti caratteristiche agronomiche e di di una certa ignavia politica. La UE lascia indifesi qualità per accelerare i programmi d’incrocio, in alter - alcuni Paesi membri, favorendo una situazione ancora nativa all’approccio del trasferimento genico e 2) la più confusa di quella attuale, senza considerare le regolazione dell'espressione genica del transgene in ritorsioni commerciali nel caso si decidesse di non pianta e 3) lo sviluppo di tecnologie sempre più mira - coltivare o di non usare derrate delle PGI (ammesso te e meno invasive delle attuali, come i nuovi editing che si trovino quelle non PGI) senza solide motivazio - genetici, rispetto alla trasformazione genetica classica ni scientifiche. È facile immaginare cosa potrebbe di trasferimento genico tra cui TALENs e CRISPRs. accadere in un Paese come l’Italia, prefigurando le Sotto la spinta pressante di milioni di persone in discussioni nelle sedi amministrative decentrate, dai Africa e Asia che lottano per la sopravvivenza, sareb - Consigli regionali fino a quelli di quartiere, con per - be necessario un dibattito razionale sulle colture gene - sone che si dichiarano contrarie al biotech sebbene si ticamente modificate e i responsabili delle politiche mostrino del tutto ignoranti in materia. Queste saran - nei paesi in via di sviluppo non dovrebbero essere no chiamate a prendere decisioni non suffragate influenzati dagli argomenti politici dominanti in ovviamente da conoscenze e motivazioni scientifiche, Europa che hanno generato una montatura e tanta ignorando il contributo della scienza e degli scienzia - avversione. In primo luogo dovrebbero affrontare i ti, come spesso si è soliti fare. problemi che limitano la diffusione di alcune piante Lo Stato deve diffidare da coloro che oggi demo - transgeniche che potrebbero già sin da subito salvare nizzano le PGI e la relativa ricerca. La lista di prodotti dalla morte o dalla cecità permanente oltre un milione venduti con lo stesso nome di varietà non più coltiva - di bambini all’anno di età inferiore a 5 anni come il te, tenderà sempre più ad allungarsi, fino a quando “golden rice”, il riso arricchito di provitamina A (400 perdurerà l’attuale considerazione che lo Stato ha nei milioni sono le persone al mondo che mangiano solo confronti della scienza e fino a quando questo non riso), e del mais resistente a siccità che potrebbe sarà in grado di trarre qualche insegnamento dagli aumentare le rese attuali del 20-30% (gli africani che errori del proprio passato. dipendono da mais sono 300 milioni) (Whitty, 2013). Sarebbe necessario istituire un “gruppo” di esperti Si dovrebbe accelerare inoltre la produzione di piante interdisciplinari che interagiscano strettamente tra da frutto che contengono vaccini o bioparticelle con - loro, di comunicare apertamente con le rilevanti agen - tro malattie diffuse in Paesi in via di sviluppo. zie governative, con i consulenti in brevetti, con i rap - L’Italia purtroppo è tagliata ormai fuori da questa presentanti dell'industria e dell’agricoltura, con com - tecnologia che avrebbe contribuito a produrre innova - pagnie di distribuzione e con i consumatori. zioni a vantaggio di tutti, inclusi i tanti giovani scien - In Italia un razionale dibattito sulle biotecnologie ziati che sono costretti ad emigrare andando a raffor - non è mai nato, né sul metodo, né sul merito. Si è dato zare anche quella ricerca privata che le lobbies com - spazio solo alle voci più sconvenienti, ovvero quelle merciali e alcune organizzazioni dei produttori. contrarie alle PGI, quando gli attuali oppositori, inclu - Sarebbe auspicabile che la politica intervenisse a si i sostenitori del “biologico” dovrebbero essere i superare paradossi esistenti in Italia attorno alle PGI e primi a sostenere le biotecnologie per gli sforzi che ai loro prodotti e soprattutto sulla indifferenza che stanno facendo per ridurre l’impatto delle pratiche mostrano nei confronti di coloro che usano la “furbi - agricole sull’ambiente e l’utilizzo di prodotti chimici. zia” per divulgare il made in Italy alimentare, con È stata perfino lanciata l’idea di “Orgenic plants”, prodotti derivati da varietà vegetali prodotte altrove o piante per la coltivazione in biologico, in altre parole da animali alimentati con farine e semi di PGI d’im - sarebbero le piante cis-geniche. portazione, usando l’acronimo OGM per fare pubbli - Lasciare tutto nelle mani delle multinazionali è un cità a loro favore, con il rischio certo di screditare grave errore, come un errore sarebbe estrometterle, prima o poi il nostro Paese. In primo luogo dovrebbe - ma è necessario piuttosto trovare un giusto equilibrio ro spiegare con onestà agli agricoltori italiani il moti - se non fosse altro che per esercitare un reciproco con - vo per cui essi sono costretti ad importare i semi per trollo. Impedire la sperimentazione di campo crea alimentare il proprio bestiame ma non li possono col - confusione nella valutazione delle piante transgeni -

52 Piante da frutto transgeniche che; spesso ciò che si verifica in condizioni protette impossibile l’impego dell’enorme quantità di germo - non è un indicatore affidabile per ciò che accade all'e - plasma nazionale in attesa di essere migliorato e valo - sterno. rizzato. In questa “review” vengono descritte le stra - Non c’è una verità assoluta, è vero, e riuscire a far tegie di rigenerazione e di trasformazione genetica coesistere tre realtà (agricoltura integrata, biologico e per produrre piante da frutto cis o trans-geniche, gli biotech) o meglio far “convivere con chi coesistere obiettivi più importanti da perseguire, i risultati più non vuole” sarebbe un segnale di civiltà e di lungimi - interessanti ottenuti e le tecniche per evitare la tra - ranza! smissione dei transgeni ad altre piante compatibili L’accettazione di genotipi modificati che non con - qualora fossero presenti nello stesso ambiente. tengono DNA di altre specie (cis-genici) e che potreb - Vengono altresì discusse le possibili cause dell’oppo - bero essere trattati in modo diverso dalle tradizionali sizione alla coltivazione e alla ricerca da parte degli PGI, come già hanno preannunciato di fare gli USA organi statali nazionali e dell’opinione pubblica, non - per alleviare le preoccupazioni dell’opinione pubbli - ché gli eventuali rischi e benefici che queste tecnolo - ca, oltre ad accordare il permesso di sperimentare a gie, sistematicamente migliorate, potrebbero apporta - cielo aperto, potrebbe essere un primo segnale di fidu - re all’uomo e all’ambiente. cia verso la scienza oltre ad un atto di rispetto dovuto alle direttive europee. Tali decisioni potrebbero salva - Parole chiave: trasformazione genetica, nuovi pro - re da figure poco onorevoli che i politici fanno quan - motori, marcatori genici, piante da frutto, rigenerazio - do pronunciano l’abusata parola “Innovazioni”, dimo - ne da cellule, piante ingegnerizzate, resistenza a stress strando chiaramente di non conoscere che “ senza la biotici e abiotici. ricerca non ci potranno essere innovazioni”. Purtroppo quelle poche discussioni che sporadicamen - Bibliografia te hanno luogo, avvengono in un clima politicizzato ed ideologico e in un oscurantismo mediatico, igno - ABDOLLAHI H., M ULEO R., R UGINI E., 2006. Optimisation of rege - neration and maintenance of morphogenic callus in pear rando le verità complesse e soprattutto in assenza di (Pyrus communis L.) by simple and double regeneration tech - scienziati. niques . Scientia Horticulturae, 108: 352-358. In una discussione aperta, se voluta, si troverà una ASHWORTH E.N., K IEFT T. L., 1995. 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Plant Cell Rep 27: 1005-1015. legge alla scienza, senza discuterne prima approfondi - BAUDO M.M., L YONS R., P OWERS S., P ASTORI G., K EITH J., tamente. E’ dalla discussione tra scienza e politica che HOLDSWORTH E.J.. S HEWRY P.R., 2006. T ransgenesis has less scaturisce la elaborazione di buone leggi! impact on the transcriptome of wheat grain than conventional breeding. Plant Biotechnology Journal, 4: 369-380. BELFANTI E., S ILFVERBERG -D ILWORTH E., T ARTARINI S., P ATOCCHI Riassunto A., B ARBIERI M., Z HU J., V INATZER B., G IANFRANCESCHI , L., GESSLER C., S ANSAVINI S., 2004. The HcrVf2 gene frm a wild La trasformazione genetica è una tecnologia inno - apple confers scab resistance to a transgenic cultivated variety. 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