Thaisa Baccarin DESENVOLVIMENTO DE
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1 Thaisa Baccarin DESENVOLVIMENTO DE NANOEMULSÕES CONTENDO CONSTITUINTES DE Punica granatum PARA APLICAÇÃO CUTÂNEA VISANDO SUA UTILIZAÇÃO NA FOTOPROTEÇÃO Tese submetida ao Programa de Pós- Graduação em Farmácia da Universidade Federal de Santa Catarina para obtenção do Grau de Doutora em Farmácia. Orientadora: Profª. Drª. Elenara Lemos Senna Florianópolis 2015 2 3 4 5 Aos meus maiores exemplos de vida, meus pais Antônio e Lenir, por todo apoio, compreensão, amor, carinho e dedicação que destinaram a mim durante toda minha vida. 6 7 AGRADECIMENTOS À Deus, por sempre iluminar meu caminho. Aos meus pais Antônio e Lenir, por estarem sempre presentes na minha vida, pelo incentivo, apoio, compreensão e amor incondicional. Ao meu irmão Marcelo e a todos meus familiares, pelo apoio e incentivo. À Profª. Drª. Elenara Lemos Senna, pela oportunidade e orientação, pela liberdade em conduzir esta tese, e pela confiança em meu trabalho. À Profª. Drª. Maria Pilar Vinardell, por ter me recebido tão bem na Universitat de Barcelona durante meu doutorado sanduíche. Obrigada por todos os ensinamentos e atenção, e principalmente por confiar em meu trabalho e contribuir não apenas com meu crescimento profissional, mas também pessoal. À Profª. Drª. Montserrat Mitjans, pelos ensinamentos e risadas compartilhadas. Aos demais funcionários, pesquisadores e professores do Departamento de Fisiologia da Falcultat de Farmàcia da Universitat de Barcelona por terem me acolhido. Aos colegas de Barcelona, Ledy, Andrèu, Roberta, Jordi, Marinela, Marta, Teresa, Carol, Gema e Itsazo, pelas risadas, conversas e aprendizado. À minha família espanhola, Paquita, Juan, Oscar e Andréia pela recepção calorosa, e por tornar minha estadia em Barcelona tão agradável e inesquecível. À Profª. Drª. Ruth Meri Lucinda Silva, do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade do Vale do Itajaí pela amizade, apoio e incentivo. À amiga Alexandra, pelo apoio e pelas conversas divertidas. À Elis, pela compreensão, apoio e assistência na utilização do UFLC. Aos colegas e amigos do Laboratório de Farmacotécnica da Universidade Federal de Santa Catarina, por estarem sempre presentes nos momentos de alegria e de dificuldades durante a realização deste 8 trabalho. Em especial, à amiga Letícia, pelos conhecimentos compartilhados, pelo incentivo, compreensão e companheirismo durante os todos esses anos de doutorado, e à amiga Janaína, por toda ajuda, coleguismo, incentivo, pelas eternas divagações sobre as dificuldades de trabalhar com plantas e principalmente, por nossas risadas nada discretas compartilhadas. Aos demais colegas e professores da Pós-Graduação em Farmácia. À CAPES, pela concessão de bolsas e apoio financeiro. 9 RESUMO O presente trabalho descreve o desenvolvimento de nanoemulsões do tipo óleo em água contendo constituintes de Punica granatum (romã) e hidrogéis termosensíveis incluindo nanoemulsões para aplicação cutânea visando sua utilização na fotoproteção. A fração acetato de etila foi obtida por partição líquido-líquido, a partir do extrato seco das cascas de P. granatum, e caracterizada pela quantificação de polifenóis totais, ácido gálico, ácido elágico e punicalagina - 638,1 mg/g, 238,6 mg/g, 84,7 mg/g e 296,7 mg/g - respectivamente. As nanoemulsões contendo óleo de semente de romã (EAF-PSO-NE) ou triglicerídeo de cadeia média (EAF-MCT-NE) como fase oleosa, encapsulando a fração acetato de etila, foram obtidas através de dois métodos: emulsificação- evaporação do solvente e emulsificação espontânea, respectivamente. As nanoemulsões apresentaram forma esférica e distribuição monodispersa das gotículas. O tamanho médio das gotículas obtido pela técnica de espalhamento de luz dinâmico (DLS) foi de aproximadamente 180 nm e 220 nm, para EAF-PSO-NE e EAF-MCT- NE, respectivamente. Estes dados foram confirmados por microscopia eletrônica de transmissão (MET). O teor médio de fenóis totais, ácido elágico, ácido gálico e punicalagina para EAF-PSO-NE foi de 2,3 mg/mL, 35,1 µg/mL, 1248,9 µg/mL, 425,6 µg/mL, respectivamente; para EAF-MCT-NE foi de 2,3 mg/mL, 89,9 µg/mL, 1320,7 µg/mL, 383,6 µg/mL, respectivamente. As nanoemulsões apresentaram valores de eficiência de encapsulação de acordo com a lipofilicidade de cada composto polifenólico e considerável ação antioxidade frente aos ensaios de DPPH e FRAP. As nanoemulsões foram caracterizadas como não irritantes/fotoirritantes em ensaio preliminar utilizando eritrócitos humanos. Ainda empregando eritrócitos humanos como modelo de biomembrana, verificou-se que as nanoemulsões foram capazes de interagir com a bicamada lipídica e proteger a mesma de danos oxidativos induzidos pelo iniciador de radical livre AAPH. O efeito fotoprotetor das nanoemulsões contra radiação UVB foi evidenciado pela proteção a danos no DNA celular. O fator de proteção solar (FPS) determinado in vitro foi de até 25 para EAF-PSO-NE. Estudos in vitro demonstraram que nas concentrações testadas as nanoemulsões e fração livre não foram citotóxicas ou fototóxicas. O comportamento das nanoemulsões na presença do meio de cultura foi verificado pela técnica de DLS e crio-microscopia eletrônica de transmissão (Crio-MET). Nos estudos de internalização celular as nanoemulsões demonstraram 10 habilidade de se acumularem ao redor da célula e também internalizar. A estabilidade físico-química (exceto teor de punicalagina) das nanoemulsões foi evidenciada por 60 dias. A fotoestabilidade das formulações foi verificada pela exposição a doses mínimas preconizadas de radiação UVA e UV-visível; as nanoemulsões foram consideradas fotoestáveis. A baixa viscosidade das nanoemulsões inviabiliza sua aplicação na pele, deste modo um copolímero termosensível foi incorporado nas mesmas. A presença das nanoemulsões nos hidrogéis foi confirmada pela técnica de DLS e por microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (SEM-FEG). Os hidrogéis foram caracterizados físicamente e quimicamente e foi verificado que na concentração mais baixa de copolímero um hidrogel de textura agradável e de fácil aplicação em spray foi obtido. Estudos de permeação e retenção dos compostos fenólicos através de pele de orelha suína também foram conduzidos. A fração nanoemulsionada aumentou substancialmente a liberação tópica dos compostos polifenólicos quando comparada com a fração livre. A permeação e retenção dos compostos polifenólicos dependeram de suas características físico-químicas, do veículo e de possíveis interações com a pele. As concentrações dos compostos polifenólicos retidos no stratum corneum, e permeados até a epiderme viável e derme evidenciaram a possibilidade de aplicação das formulações como fotoprotetor atuando na absorção de fótons e complementando a ação antioxidante na pele. Com o intuito de visualizar a permeação e retenção a partir da aplicação tópica de nanoemulsões ou de hidrogéis contendo as nanoemulsões, um agente fluoróforo (vermelho de nilo) foi juntamente nanoemulsionado com a fração acetato de etila. As imagens obtidas por microscopia confocal de varredura laser (MCVL) corroboraram os resultados obtidos nos estudos de permeação e retenção cutânea. Assim, os resultados obtidos indicam que as nanoemulsões e hidrogéis contendo constituintes de P. granatum (óleo da semente e fração), oferecem uma estratégia promissora para liberação tópica de compostos polifenólicos (ácido gálico, ácido elágico e punicalagina) com potencial aplicação na fotoproteção. Palavras-chave: Punica granatum; Romã; Nanoemulsão; Óleo de semente de romã; Fração acetato de etila; Ácido gálico; Ácido elágico; Punicalagina; Polifenóis; Aplicação tópica; Validação analítica; Atividade antioxidante; Potencial irritante e fotoirritante; Fotoproteção; Radiação UVB; Citotoxicidade in vitro; Dano ao DNA; Internalização celular; Fototoxicidade; Hidrogel termosensível; Liberação tópica. 11 ABSTRACT This work describes the development of oil in water nanoemulsions containing Punica granatum (pomegranate) constituents and thermosensitive hydrogels thickened nanoemulsions for topical application aiming its use in photoprotection. The polyphenol-rich ethyl acetate fraction (EAF) was obtained by liquid-liquid partition from the dry peel extract of P. granatum and characterized by quantification of total polyphenols, gallic acid, ellagic acid, and punicalagin - 638.1 mg/g, 238.6 mg/g, 84.7 mg/g and 296.7 mg/g - respectively. The nanoemulsions containing pomegranate seed oil (EAF-PSO-NE), or medium chain triglyceride (EAF-MCT-NE) as oil phase entrapping the EAF was obtained by two methods: emulsification-evaporation of the solvent and spontaneous emulsification, respectively. Nanoemulsions presented spherical shape and monodisperse distribution of droplets. The average droplet size obtained through dynamic light scattering (DLS) was around 180 nm and 220 nm for EAF-PSO-NE and EAF- MCT-NE, respectively. These data were confirmed by transmission electron microscopy (TEM). The average of total phenolic content, ellagic acid, gallic acid and punicalagin for EAF-PSO-NE were 2.3 mg/mL, 35.1 µg/mL, 1248.9 µg/mL and 425.6 µg/mL, respectively; for EAF-MCT-NE were 2.3 mg/mL, 89.9 µg/mL, 1320.7 µg/mL and 383.6 µg/mL, respectively. The encapsulation efficiency values were according to the lipophilicity of each polyphenol compound and considerable antioxidant activity was observed for nanoemulsions through DPPH and FRAP assays. In preliminary testing using human erythrocytes the nanoemulsions were characterized as non- irritant/photoirritant. Also employing human erythrocytes as a biomembrane model, it was found that the