Filogeografía De Systrophia Helicycloides: El Reflejo De La Dinámica Del Bosque Lluvioso Tropical En Los Genes 16S Rrna Y COI De Moluscos Terrestres
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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS UNIDAD DE POSTGRADO Filogeografía de Systrophia helicycloides: el reflejo de la dinámica del bosque lluvioso tropical en los genes 16S rRNA y COI de moluscos terrestres TESIS para optar el grado académico de Magíster en Biología Molecular AUTOR Pedro Eduardo Romero Condori ASESORA Rina L. Ramírez Mesias Lima – Perú 2010 "In the end, we will conserve only what we love; we will love only what we understand; and we will understand only what we are taught." (Baba Dioum, 1968) ii Para Katherine ¡buenas salenas! iii AGRADECIMIENTOS A Emma, por continuar apoyándome en esta aventura, día tras día, y a Pedro por acompañarme ahora desde un buen lugar, para toda la vida. A la Dra. Rina Ramírez, por enseñarme a buscar las preguntas, y encontrar las respuestas a este “misterio de los misterios”, tal como llamaba Charles Darwin al origen de las especies. Es una suerte tenerla como referente académico, y más aún como ejemplo de vida. Este trabajo pudo ser realizado gracias al apoyo de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos a través del Vicerrectorado de Investigación y el Instituto de Ciencias Biológicas Antonio Raimondi que aprobaron los proyectos: “Evaluación de la biodiversidad de moluscos en la región del río Bajo Madre de Dios”, “Diversidad genética en la Amazonia: Polimorfismo del genoma mitocondrial de moluscos terrestres de la familia Systrophiidae” y “Biodiversidad de la Familia Systrophiidae (Mollusca, Gastropoda) en la cuenca del Río Los Amigos (Dpto. Madre de Dios). Al Concejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONCYTEC), por la beca para finalizar mis estudios de maestría, fue un honor ser elegido en este grupo de jóvenes profesionales peruanos ganadores de una beca de posgrado en 2008, esta tesis es un sincero esfuerzo para retribuir la confianza y el apoyo prestado. A la Asociación para la Conservación de la Cuenca Amazónica / Amazon Conservation Association (ACCA/ACA), y en especial a Nigel Pitman (ex-Director Científico de ACCA), por el seed grant otorgado a los investigadores argentinos Dr. Cristián Ituarte y Dra. Gabriela Cuezzo así como a la Dra. Rina Ramírez, en el marco del proyecto “Inventory of Molluscs assemblages in the Los Amigos watershed – Peru” que se convirtió en mi primera oportunidad de conocer el bosque amazónico y a mi especie de estudio. Además, el research grant que se me concedió fue fundamental para la realización de esta tesis, principalmente por el apoyo moral y logístico prestado en la Concesión de Conservación del Río Los iv Amigos (CICRA). También debo agradecer a la Inkaterra Asociación (ITA), en particular al Blgo. José Purisaca, por la gran ayuda prestada en las localidades del Bajo Madre de Dios, y a la Dirección Forestal y de Fauna Silvestre del Ministerio de Agricultura por las autorizaciones de colecta. El estatus de estudiante de posgrado me permitió también participar en congresos y cursos nacionales e internacionales. En particular, debo agradecer a la Red de Macrouniversidades de Latinoamérica y el Caribe (RedMacro) por el apoyo para realizar una estancia de investigación en el Laboratorio de Genética y Evolución Molecular de Aves de la Universidade de São Paulo (USP) – Brasil, a la Red de Genética de la Conservación (REGENEC) por elegirme para asistir al “IV Taller Latinoamericano de Genética para la Conservación” en la Universidad de Chile, y a la European Molecular Biology Organizartion (EMBO) por el curso “Advanced methods for phylogenetic analyses of molecular sequences” en Rio de Janeiro - Brasil. A mis amigos del Laboratorio de Sistemática Molecular y Filogeografía – Facultad de Ciencias Biológicas y del Departamento de Malacología y Carcinología del Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos: Jenny Chirinos, Carlos Congrains, y en especial a Víctor Borda por su invalorable ayuda en las salidas de campo y el manejo de muestras. Al Dr. Pablo Ramírez y los amigos del Laboratorio de Microbiología Molecular de la Facultad de Ciencias Biológicas – UNMSM por su importante colaboración. Son muchas más las personas e instituciones a agradecer, lo cual sólo corrobora el enorme e invalorable apoyo otorgado para esta investigación. Obtener el grado de Magíster no sólo implicó incrementar mis conocimientos sino también tener un mayor y mejor panorama de mundo académico. Por ello, para todos ustedes: ¡Muchas Gracias! v CONTENIDO Pág. 1. Introducción 1 2. Antecedentes 3 2.1 Posición taxonómica de Systrophia helicycloides (d´Orbigny, 1835) 3 en el del Phylum Mollusca 2.2 Aspectos generales de la especie 3 2.3 El DNA mitocondrial y su uso en el estudio de las poblaciones 4 3. Hipótesis y Objetivos 7 3.1 Hipótesis 7 3.2 Objetivos 7 3.2.1 Objetivo General 7 3.2.2 Objetivos Específicos 7 4. Materiales y Métodos 8 4.1 Área de estudio y colecta 8 4.2 Conservación y preparación del tejido 12 4.3 Extracción de DNA 14 4.4 Amplificación de DNA 14 4.5 Electroforesis de DNA 16 4.6 Secuenciamiento de DNA 16 4.7 Edición y alineamiento múltiple de secuencias 16 4.8 Caracterización de las secuencias 17 4.9 Diversidad genética 17 4.10 Análisis Filogenéticos 18 4.11 Redes de haplotipos (Networks) 19 4.12 Análisis de estructura poblacional 20 4.13 Patrones Demográficos 20 4.14 Tiempos de Divergencia 20 4.15 Barcoding 22 vi 5. Resultados 23 5.1 Análisis del marcador mitocondrial 16S rRNA 23 5.1.1 Descripción de las secuencias obtenidas 23 5.1.2 Alineamiento múltiple de secuencias 26 5.1.3 Diversidad Genética 29 5.1.4 Análisis Filogenético 31 5.1.5 Redes de haplotipos (Networks) 35 5.1.6 Estructura y diferenciación poblacional 37 5.1.7 Patrones Demográficos 39 5.1.8 Tiempos de Divergencia 45 5.2 Análisis del marcador mitocondrial citocromo oxidasa subunidad I 47 5.2.1 Descripción de las secuencias obtenidas 47 5.2.2 Alineamiento múltiple de secuencias 49 5.2.3 Diversidad Genética 51 5.2.4 Análisis Filogenético 53 5.2.5 Barcoding 55 5.3 Análisis filogenético de los marcadores concatenados 59 6. Discusión 63 6.1 El primer paso: Comparación de Secuencias 63 6.2 Causas de la divergencia intraespecífica 64 6.3 El “misterio de los misterios” 65 6.4 Poca vagilidad: Una espada de doble filo 68 6.5 Estructuración geográfica de la diversidad genética 69 6.6 Demografía Histórica 71 6.7 Los cambios históricos y su efecto en la estructura genética 74 6.8 La dinámica actual del bosque tropical 76 6.9 El reflejo de la dinámica del bosque tropical en los genes 78 mitocondriales de los moluscos terrestres 6.10 Barcoding 81 6.10 Conservación 82 7. Conclusiones 84 8. Referencias Bibliográficas 85 vii LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1. Ubicación de los lugares de colecta. Cuenca del Río Los 10 Amigos y Bajo Madre de Dios. Departamento de Madre de Dios, Perú. Figura 2. Localidades de muestreo. Cuenca del Río Los Amigos. 10 Figura 3. Mapa fisiográfico de la concesión de conservación Los 11 Amigos. Figura 4. Localidades de muestreo. Cuenca del Bajo Madre de Dios. 11 Figura 5. Individuos de Systrophia helicycloides de los diferentes 13 lugares de colecta. Figura 6. Transiciones y tranversiones comparadas contra las 25 distancias a pares entre las secuencias 16S rRNA de S. helicycloides. Figura 7. Primera porción del alineamiento múltiple (16S rRNA). 26 Figura 8. Porción central del alineamiento múltiple (16S rRNA). 27 Figura 9. Porción final del alineamiento múltiple (16S rRNA). 27 Figura 10. Filogenia NJ de los haplotipos 16S rRNA. 31 Figura 11. Filogenia MP de los haplotipos 16S rRNA. 32 viii Figura 12. Filogenia ML de los haplotipos 16S rRNA. 33 Figura 13. Filogenia IB de los haplotipos 16S rRNA. 34 Figura 14. Red de haplotipos para el marcador mitocondrial 16S 36 rRNA. Figura 15. Distribución de diferencias a pares (mismatch distribution) 42 utilizando todas las secuencias. Figura 16. Distribución de diferencias a pares (mismatch distribution) 43 sin considerar a los haplotipos divergentes S10 y S11. Figura 17. Distribución de diferencias a pares (mismatch distribution) 44 de los linajes encontrados. Figura 18. Tiempos de divergencia entre los linajes de S. 46 helicycloides. Figura 19. Transiciones y tranversiones comparadas contra las 48 distancias a pares entre las secuencias COI de S. helicycloides. Figura 20. Porción del alineamiento múltiple de secuencias COI. 49 Figura 21. Filogenia NJ para los haplotipos COI. 53 Figura 22. Filogenia MP de los haplotipos COI. 54 Figura 23. Filogenia ML de los haplotipos COI. 54 Figura 24. Filogenia IB de los haplotipos COI. 55 Figura 25. Códigos de barras observados en la base de datos BOLD. 55 ix Figura 26. Distancias intraespecíficas considerando todas las 56 secuencias COI (a) y sin considerar a los haplotipos C5 y C6 (b). Figura 27. Resultados al comparar las secuencias con las bases de 57 datos del BOLD. Figura 28. Resultados al comparar el haplotipo C4 con la COI FULL 58 DATABASE del BOLD. Figura 29. Resultados al comparar el haplotipo C5 con la COI FULL 58 DATABASE del BOLD. Figura 30. Filogenia NJ de los marcadores concatenados. 60 Figura 31. Filogenia MP de los marcadores concatenados. 60 Figura 32. Filogenia ML de los marcadores concatenados. 61 Figura 33. Filogenia IB de los marcadores concatenados. 61 Figura 34. Individuos de Systrophia helicycloides de los diferentes 67 haplotipos encontrados. Figura 35. Comparación del posible evento de expansión poblacional 73 con las condiciones climáticas presentes hace 200 mil años. Figura 36. Divergencia entre los linajes de S. helicycloides 80 comparada con los cambios geológicos y climáticos ocurridos durante los últimos 10 millones de años. x LISTA DE TABLAS Pág. Tabla 1. Ubicación geográfica de los lugares de colecta.