Oecomys (RODENTIA: SIGMODONTINAE) DA AMAZÔNIA BRASILEIRA

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA

Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

CARACTERIZAÇÃO CITOGENÔMICA E DNA BARCODING DE TRÊS ESPÉCIES DE Oecomys (RODENTIA: SIGMODONTINAE) DA AMAZÔNIA BRASILEIRA

Renan Gabriel Gomes Júnior

Manaus - AM Fevereiro, 2014

Renan Gabriel Gomes Júnior

CARACTERIZAÇÃO CITOGENÔMICA E DNA BARCODING DE TRÊS ESPÉCIES DE Oecomys (RODENTIA: SIGMODONTINAE) DA AMAZÔNIA BRASILEIRA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

Orientadora: Dra. Maria Claudia Gross - UFAM Coorientadora: Dra. Maria Nazareth Ferreira da Silva – INPA

Fonte Financiadora: Rede de pesquisa para ampliação do conhecimento sobre a biodiversidade de vertebrados da Amazônia brasileira com aplicações sobre seu uso e conservação – Rede BioPHAM (CNPq/FAPEAM)

Manaus - AM Fevereiro, 2014

G633 Gomes Júnior, Renan Gabriel Caracterização citogenômica e DNA barcoding de três espécies de Oecomys (Rodentia: Sigmodontinae) da Amazônia brasileira / Renan Gabriel Gomes Júnior. --- Manaus: [s. n.], 2014. xiv, 84 f. : il. color.

Dissertação (Mestrado) --- INPA, Manaus, 2013. Orientador: Maria Claudia Gross. Coorientador: Maria Nazareth Ferreira Da Silva. Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

1. Citogenética. 2. FISH. 3. COI. I. Título.

CDD 599.3233

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Dedico esta dissertação àqueles que me servem de exemplo todos os dias e me dão forças para buscar meus sonhos: Rosangela e Renan

“Quem tem esperança sabe que nenhuma tristeza é eterna. Sabe que, após a chuva, virá o Sol. Que amanhã será um outro dia, cheio de surpresas e de boas novidades." Hugo Schlesinger

“A fé é a força da vida. Se o homem vive é porque acredita em alguma coisa.” Léon Tolstoi

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer a todos que colaboraram e tornaram o desenvolvimento dessa tese possível, e os dias na cidade de Manaus mais prazerosos.

Primeiramente à Professora Doutora Maria Claudia Gross, pela presteza, conhecimento transmitido, confiança, e incentivo no desenvolvimento deste trabalho, às inúmeras oportunidades oferecidas, e às doses diárias de histórias e bom humor.

À Doutora Maria Nazareth Ferreira da Silva, pela coorientação, pelas leituras e sugestões na redação desta dissertação, pela paciência, calma e paixão ao me apresentar um pouco sobre os pequenos mamíferos.

À Doutora Eliana Feldberg, por me receber de portas abertas em seu laboratório, e por ser tão acessível como coordenadora do curso.

Ao professor Doutor Carlos Schneider, “vice-orientador”, pelos ensinamentos nas práticas laboratoriais, sugestões na elaboração dessa dissertação e bate-papos.

Aos meus pais, pelas palavras de apoio e incentivo que formam o motor para seguir em frente com meus objetivos.

À Ingrid, pelo apoio e companheirismo durante essa difícil temporada.

Aos amigos de laboratório, Camila, Érika, Vanessa Pinheiro, Vanessa Sales, Francy, Rafael, Jéssica, Júlia e, especialmente, a Nathália pelo auxílio nos primeiros passos no laboratório e parceria na realização da FISH, e a Thaís, pelo companheirismo, diálogos e sugestões na etapa final.

Aos amigos do laboratório de genética animal: Eduardo, Leila, Lucas, Marajó, Maelin, Masseo, Milena, KK e Ramon pelas conversas com garantia de muitos risos.

Aos demais amigos: Maysa, Roberta, Lincoln e Ramon, pelos momentos de descontração, a Iracema, pelos ensinamentos durante a coleta, pela preocupação e pelos bate-papos madrugada a dentro, e ao Mário Nunes pela ajuda com o sequenciamento.

Ao CNPq pelo bolsa fornecida. vi

RESUMO

Dentre os roedores sul-americanos, a família Cricetiadae contêm o maior número de representantes, distribuídos em uma única subfamília, Sigmodontinae. Oryzomyini é uma das sete tribos reconhecidas de Sigmodontinae, que por sua vez é composta por 27 gêneros, entre os quais o Oecomys, composto atualmente por 16 espécies. Esse táxon apresenta uma difícil classificação sistemática devido a pouca diferenciação morfológica e grande variabilidade cariotípica. Assim sendo, o presente trabalho teve como objetivo contribuir para a caracterização cromossômica e análise das relações filogenéticas entre as espécies do gênero Oecomys da Amazônia brasileira. Para isso, 30 indivíduos de quatro localidades distintas foram analisados. Três espécies foram reconhecidas: Oecomys auyantepui apresentou dois citótipos distinto, 2n=64, NFa=110 e 2n=66 NFa=114, apesar disto, as técnicas citogenéticas empregadas foram similares entre os citótipos. O bandeamento C evidenciou marcações centroméricas tênues em todos os cromossomos, a sonda de rDNA 5S evidenciou duas marcações; três marcações foram observadas pela coloração com nitrato de prata e 4 para a sonda de rDNA 18S. A FISH telomérica evidenciou uma marcação intersticial em ambos citótipos no cromossomo sexual X, indicando um possível rearranjo cromossômico. A análise molecular corrobora a similaridade citogenética, apenas um clado foi formado com distância intraespecífica de 1,41%, e com alto valor de suporte nodal. Para Oecomys bicolor não houve variação entre as técnicas citogenéticas empregadas, encontrando 2n=80 e NFa=142, a heterocromatina constitutiva se distribuiu pelos centrômeros, e se espalhou pelos braços curtos de alguns cromossomos, com marcações conspícuas. O nitrato de prata evidenciou 7 marcações, que representam as regiões organizadoras de nucléolo ativas, e a sonda de rDNA 18S 24 marcações, sugerindo uma possível duplicação e dispersão dessas sequências. A sonda de rDNA 5S apresentou 2 marcações. Pela análise molecular 3 grupos foram formados, com distância genética entre eles que varia de 7,12% a 13,44%, sugerindo representar um complexo de espécies. Oecomys rutilus apresentou 2n=54 e NFa=90, a distribuição da heterocromatina foi do tipo tênue com distribuição pelos centrômeros, porção pericentromérica e terminal. Quatro marcações foram observadas pela coloração com nitrato de prata, assim como pela sonda de rDNA 18S. O sítio ribossomal 5S apresentou apenas 2 marcações. Dois clados foram formados pela análise molecular, com alto suporte nodal, condizentes com distribuição geográfica entre os espécimes. A análise molecular sugere que Oecomys rex seja o táxon basal para o grupo.

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ABSTRACT

Among South American rodents, the Cricetiadae family contain the largest number of representatives allotted in a single subfamily, Sigmodontinae. Oryzomyini is one of the seven tribes recognized as Sigmodontinae, which is composed by 27 genera, including Oecomys genus with 16 species. This taxon presents a difficult systematic classification due to limited morphological variability and great karyotype differentiation. Therefore, this study aims to contribute to the chromosomal characterization and analysis of phylogenetic relationships among species of the Oecomys genus from Brazilian Amazon. In this study, 30 individuals were analyzed in four different regions. Four species were recognized as Oecomys auyantepui with two distinct cytotypes, 2n=64, FN=110 and 2n=66, FN=114, despite this, cytogenetic techniques employed were similar between the cytotypes. C banding revealed centromeric faint markings in all chromosomes, the 5S rDNA probe showed two marks, three marks were observed by silver-staining, and 4 for the 18S rDNA probe. The telomeric FISH showed an interstitial marking on both cytotypes of the sex chromosome X, indicating a possible chromosomal rearrangement. Molecular cytogenetic analysis supports the similarity, only one clade was formed with intraspecific distance of 1,41%, and high value of nodal support; For Oecomys bicolor no variation among cytogenetic techniques employed, with 2n=80 and FN=142 , constitutive heterochromatin was distributed by centromeres and spread by short arms of some chromosomes with conspicuous markings. Silver-staining showed 7 tags, which represent the active nucleolus organizer regions, and 24 markings with 18S rDNA probe, suggesting a possible duplication and dispersion of these sequences. The 5S rDNA probe showed 2 tags. Molecular analysis of 3 groups were performed with genetic distance between them ranging from 7, 12% to 13,44%, suggesting a species complex; Oecomys rutilus had 2n=54 and FN=90, distribution of heterochromatin was the faint type distribution with the centromeres , pericentromeric portion and terminal. Four markers were observed by silver-staining, as well as the 18S rDNA probe. The site ribosomal 5S showed only two markings. Two clades were formed by molecular analysis with high nodal support consistent with a geographical distribution among the specimens. Oecomys rex was considered basally among all Oecomys species in molecular analysis.

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ------16 1.1 Roedores do gênero Oecomys ------16 1.2 Evolução cariotípica no gênero Oecomys ------20 1.3 DNA barcoding e a identificação molecular dos táxons ------23

2. OBJETIVOS ------26 2.1 Objetivo geral ------26 2.2 Objetivos específicos ------26

3. MATERIAL E MÉTODOS ------27 3.1 Material ------27 3.1.1 Caracterização da amostra ...... 27 3.1 Métodos ------29 3.1.1 Coleta e captura ...... 29 3.1.2 Obtenção de cromossomos mitóticos ...... 30 3.1.3 Preparação das lâminas com cromossomos mitóticos ...... 30 3.1.4 Coloração com Giemsa...... 31 3.1.5 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RON) ...... 31 3.1.6 Detecção da heterocromatina constitutiva ...... 31 3.1.7 Bandeamento G ...... 32 3.1.8 Extração de DNA ...... 32 3.1.9 Hibridização in situ fluorescente (FISH) ...... 33 3.1.9.1 Obtenção e marcação das sondas ...... 33 3.1.9.2 Tratamento das lâminas ...... 34 3.1.9.3 Fixação ...... 34 3.1.9.4 Desnaturação dos cromossomos e das sondas ...... 35 3.1.9.5 Hibridização ...... 35 3.1.9.6 Lavagens ...... 35 3.1.9.7 Detecção dos sinais de hibridização ...... 35 3.1.9.8 Montagem das lâminas ...... 36 3.1.10 Microscopia e análise das imagens ...... 36 3.1.11 Isolamento, purificação e sequenciamento dos genes mitocondriais ...... 36 3.2.10.1 Edição e alinhamento das sequências ...... 38 3.2.10.2 Análises ...... 38 4. RESULTADOS ------40 5. DISCUSSÃO ------56 6. CONCLUSÕES ------65 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ------67 8. ANEXOS ------78

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Oecomys sp. Foto: Kautzmann, R. ------19

Figura 2. Hipótese de relações filogenéticas entre espécies de Oecomys proposta com base em dados moleculares. Árvore consenso de uma análise bayesiana de 104 sequências e 653 pares de base de citocromo B (Fonte: Flores 2010). O índice estatístico bayesiano de suporte nodal é mostrado acima dos ramos, e abaixo o comprimento dos mesmos. ------24

Figura 3. Mapa da região Amazônica, indicando onde os indivíduos amostrados citogeneticamente foram coletados. Foram amostradas as margens direita e esquerda dos seguintes rios do estado do Amazonas: 1) Jatapú; 2) Negro; 3) Purus; 4) Cuieiras. ------27

Figura 4. Características cariotípicas de Oecomys auyantepui macho, citótipo 2n=64: a) Coloração convencional com giemsa; b) Regiões heterocromáticas evidenciadas pelo bandeamento C; c) Bandeamento G. Barras equivalentes a 10 µm. ------43

Figura 5. Características cariotípicas de Oecomys auyantepui, macho, citótipo 2n=66: a) Coloração convencional com giemsa; b) Regiões heterocromáticas evidenciadas pelo bandeamento C; c) Bandeamento G. Barras equivalentes a 10 µm. ------44

Figura 6. Banda G comparativa para os maiores pares cromossômicos de Oecomys auyantepui. (Esquerda citótipo 2n=66 e a direita citótipo 2n=64). Em destaque os pares portadores do sítio ribossomal 5S. ------44

Figura 7. Hibridização fluorescente in situ em Oecomys auyantepui, macho, citótipo 2n=64: a) Sonda rDNA 5S (verde) e 18S (vermelho); b) Pares portadores da Região Organizadora de Nucléolo evidenciados por impregnação por nitrato de prata; c) Cariótipo indicando a presença de sítios teloméricos, bem como uma marcação telomérica intersticial no cromossomo sexual X. Barras equivalentes a 10 µm. ------45

Figura 8. Hibridização fluorescente in situ em Oecomys auyantepui, macho, citótipo 2n=66: a) Sonda rDNA 5S (verde) e 18S (vermelho); b) Pares portadores da Região Organizadora de Nucléolo evidenciados por impregnação por nitrato de prata; c) Cariótipo indicando a presença de sítios teloméricos, bem como um ITS no cromossomo sexual X. Barras equivalentes a 10 µm. ------46

Figura 9. Características cariotípicas de Oecomys bicolor. a) Coloração convencional com giemsa de um macho e em destaque na caixa os cromossomos sexuais de uma fêmea; b) Regiões heterocromáticas evidenciadas pelo bandeamento C de uma fêmea, e em destaque os cromossomos sexuais de um macho; c) Bandeamento G de uma fêmea. Barras equivalentes a 10 µm. ------48

Figura 10. Hibridização fluorescente in situ em Oecomys bicolor: a) Sonda rDNA 5S (verde) e 18S (Vermelho) em um indivíduo fêmea; b) Pares portadores da Região Organizadora de nucléolo evidenciados por impregnação por nitrato de prata; c) Cariótipo indicando ausência de sítios teloméricos intersticiais em um indivíduo fêmea. Barras equivalentes a 10 µm. ------49

Figura 11. Características cariotípicas de Oecomys rutilus. a) Coloração convencional com giemsa de uma fêmea e em destaque os cromossomos sexuais de um macho; b) Regiões heterocromáticas evidenciadas pelo bandeamento C de um indivíduo macho; c) Bandeamento G de uma fêmea. Barras equivalentes a 10 µm. ------51

Figura 12. Hibridização fluorescente in situ em Oecomys rutilus. a) Sonda rDNA 5S (verde) e 18S (vermelho) evidenciadas em um cariótipo de um macho; b) Pares portadores da Região organizadora de nucléolo evidenciados por impregnação por nitrato de prata; c) Cariótipo de uma fêmea indicando ausência de sítios teloméricos intersticiais (sítios teloméricos em vermelho). Barras equivalentes a 10 µm. ------52

Figura 13. Banda G comparativa entre os maiores pares cromossômicos das espécies analisadas neste trabalho. Da esquerda para a direita: 2n=80 (O. bicolor), 2n=66 (O. auyantepui), 2n=64 (O. auyantepui) e 2n=54 (O. rutilus). --- 52

Figura 14. Árvore bayesiana do gene citocromo oxidase I. O suporte probabilístico é apresentado acima dos ramos. As letras (A-L) representam os grupos formados com base na análise de distância genética entre os mesmos. Os espécimes em negrito representa os indivíduos cariotipados. Ao lado dos blocos evidenciados com diferentes colorações o número diploide encontrado na literatura para o grupo. ------55

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Espécies válidas para o gênero Oecomys encontradas no Brasil e outros países latino americanos...... 18

Tabela 2. Cariótipos registrados para espécies do gênero Oecomys. Localidade indica os países ou os estados brasileiros amostrados...... 20

Tabela 3. Espécimes analisados com seus respectivos números de campo e da suspensão celular, sexo e local da coleta...... 28

Tabela 5. Espécie, local de coleta, número de campo, sexo, número diploide, número fundamental (NFa) e fórmula cariotípica, sendo m=metacêntrico, sm = submetacêntrico, st = subtelocêntrico; a = acrocêntrico...... 40

Tabela 6. Matriz de distância genética baseada no K2p expressa em porcentagem entre os grupos de Oecomys. As letras da coluna à esquerda e da linha superior representam os grupos representados na figura 14. Os valores em negrito representam a distância genética dentro dos grupos. Nos tracejados não foi possível estabelecer a distância dentro do grupo por tratar-se de um único indivíduo. GE= Grupo externo Euryoryzomys macconnelli...... 54

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LISTA DE ABREVIATURAS E TERMOS

2n Número diploide a Cromossomo acrocêntrico

Banda C Técnica de detecção da heterocromatina constitutiva

Banda G Técnica de detecção das regiões de transcrição precoce e tardia

BLASTn Ferramenta de busca e alinhamento de sequências (basic local alignment research tool)

DNA Ácido desoxirribonucleico

COI Seguimento de nucleotídeos da subunidade I do gene da citocromo c oxidase dNTP Desoxirribonucleotídeos

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

FISH Hibridização fluorescente in situ

FITC Fluoresceina isotiocianato (Fluorescein isothiocyanate)

Genbank Base de dados internacional de sequencias nucleotídicas

IB Inferência Bayesiana

K2p Modelo de Kimura-2-parâmetros m Cromossomo metacêntrico

NCBI National Center for Biotechnology Information

NTS Espaçador não transcrito (non-transcribed spacer)

xiv

PCR Reação em cadeia da polimerase (Polymerase chain reaction) rDNA DNA ribossomal pb Pares de bases

RNA Ácido ribonucleico rRNA RNA ribossomal

RON Região organizadora de nucléolo

SDS Dodecil sulfato de sódio

SSC Solução salina de citrato padrão sm Cromossomo submetacêntrico st Cromossomo subtelocêntrico

1. INTRODUÇÃO

1.1 Roedores do gênero Oecomys

O Brasil apresenta 701 espécies de mamíferos, distribuídos em 243 gêneros, 50 famílias e 12 ordens (Paglia et al. 2012), ocupando o terceiro lugar no mundo em relação ao grau de endemismo, com 183 espécies, onde destacam-se primatas e roedores (IUCN 2011). A maior parte desta diversidade de mamíferos é encontrada na Amazônia, que atualmente apresenta 399 espécies válidas, das quais 231 (57,8%) não ocorrem em nenhum outro bioma brasileiro (Paglia et al. 2012). Esta diversidade está associada aos diferentes tipos de ecossistemas encontrados na região, tais como: matas de terra firme, matas de várzea, igapós, campos, campinarana, campina e cerrados (Patterson 2000; da Silva et al. 2001).

A ordem Rodentia representa o táxon de maior diversificação e riqueza dentre os mamíferos brasileiros, abrigando cerca de 34,7% das espécies existentes (Paglia et al. 2012). Esta ordem compreende, no Brasil, nove famílias. Destas, a Cricetidae contém o maior número de membros, com destaque para a subfamília Sigmodontinae, que segundo Prado e Percequillo (2013) contem cerca de 85 gêneros e 395 espécies (sensu Reig 1980) representando cerca de 29% dos mamíferos neotropicais e o mais diverso e complexo em relação a taxonomia.

De acordo com Prado e Percequilo (2013), ao longo de sua história taxonômica, as espécies que compõem Sigmodontinae foram agrupadas em 7 a 9 tribos, que nas últimas décadas, especialmente com o advento de novos métodos e técnicas morfológicas e moleculares, foram refinadas e seus conteúdos redefinidos, estando atualmente agrupadas em nove tribos: Abrotrichini, Akodontini, Ichthyomyini, Oryzomyini, Phyllotini, Reithrodontini, Sigmodontini, Thomasomyini e Wiedomyini (Braun 1993; Voss e Carleton 1993; Smith e Patton 1993, 1999; Steppan 1995; D’Elía et al. 2003; 2005; 2006a; 2006b; 2007; Pacheco 2003; Weksler 2003, 2006; Prado e Percequillo 2013).

A tribo Oryzomyini é a mais diversa dos sigmodontineos, com 28 espécies extintas e cerca de 130 viventes (Prado e Percequillo 2013). Suas espécies são encontradas nas regiões Neotropical e Neártica (porção sudeste), da Terra do Fogo até o sul e leste dos Estados Unidos, no arquipélago de Galápagos e Trinidad e Tobago (Musser e Carleton 1993; 2005). Formas extintas da tribo também são encontradas em várias ilhas do Caribe, incluindo Jamaica, Martinica, Curaçao, Nevis e Barbuda, entre outras (Turvey et al. 2010). No Brasil, este grupo é encontrado em todos os biomas terrestres, incluindo as florestas, savanas, pântanos, cerrados e ambientes semi-áridos (Voss e Emmons 1996; Eisenberg e Redford 1999; Weksler e Percequillo 2011).

Dentre os 28 gêneros da tribo Oryzomyini, o gênero Oecomys é um dos mais diversos e de ampla distribuição, contudo, o reconhecimento de sua distinção morfológica, cariológica e de seu status genérico é relativamente recente (Andrades-Miranda et al. 2001; Carleton e Musser 1984; Gardner e Patton 1976; Reig 1984; 1986 apud Musser e Carleton 2005). Atualmente, 16 espécies são reconhecidas neste táxon (Musser e Carleton 2005; Carleton et al. 2009), mas existe uma necessidade eminente de uma revisão adequada ao grupo, e acredita- se que este número possa estar subestimado, uma vez que análises morfológicas, moleculares e cariotípicas têm demonstrado maior diversidade de espécies em Oecomys, resultando em descrições de novas espécies e revalidações de espécies anteriormente sinonimizadas (Flores 2010).

Das 16 espécies formalmente descritas, doze são encontradas no Brasil (Tabela 1), mas apenas nove estão distribuídas no bioma amazônico: O. auyantepui, O. bicolor, O. concolor; O. paricola, O. rex, O. roberti, O. rutilus, O. superans e O. trinitatis (Bonvicino et al. 2008; Flores 2010). Destas espécies, sete foram registradas para a Amazônia Ocidental: O. bicolor, O. concolor, O. rex, O. rutilus, O. roberti, O. superans e O. trinitatis (Bonvicino et al. 2008). Contudo, análises morfológicas aliadas a abordagens moleculares e citogenéticas têm revelado que várias espécies de Oecomys possuem status taxonômico questionável, sugerindo a presença de complexo de espécies no grupo decorrente da alta diversidade detectada, com prováveis novas espécies na Amazônia (Patton

e Sherwood 1983; Emmons e Feer 1997; Patton et al. 2000; Musser e Carleton 2005; Carleton et al. 2009; Flores 2010; Rosa et al. 2012).

Tabela 1. Espécies válidas para o gênero Oecomys encontradas no Brasil e outros países latino americanos.

ESPÉCIE LOCALIDADE REFERÊNCIA Brasil, Guiana Francesa, Guiana, Suriname, O. auyentepui Weksler e Bonvicino (2008) Venezuela, República Bolivariana. Bolívia, Brasil, Colômbia, Equador, Guiana O. bicolor Francesa, Guiana, Panamá, Peru, Suriname, Pino et al. (2008) Venezuela. O. catherinae Brasil. Costa et al. (2008) O. cleberi Brasil. Costa et al. (2008) O. concolor Bolívia, Brasil, Colômbia, Equador, Venezuela. Costa et al. (2008) O. flavicans Colômbia e Venezuela. Gómez-Laverde e Rivas (2008) O. mamorae Bolívia, Brasil e Paraguai. Dunnum et al. (2008) O. paricola Brasil. Percequillo et al. (2008) O. phaeotis Peru. Pacheco e Solari (2008) O. rex Brasil, Guiana Francesa, Guiana, Venezuela Catzeflis e Percequillo (2008) Bolívia, Brasil, Guiana Francesa, Guiana, O. roberti Costa et al. (2008) Venezuela. Brasil, Guiana Francesa, Guiana, Suriname, O. rutilus Catzeflis e Weksler (2008) Venezuela. O. speciosus Colômbia, Trinidade e Tobago e Venezuela. Gómez-Laverde et al. (2008) O. superans Brasil, Colômbia, Equador e Peru. Weksler e Tirira (2008) O. sydandersoni Bolívia. Carleton et al. (2009) Bolívia, Brasil, Colômbia Costa Rica, Guiana O. trinitatis Costa et al. (2008) Francesa, Guiana, Peru, Suriname, Venezuela.

As espécies do gênero Oecomys são importantes na comunidade de pequenos mamíferos em termos de riqueza de espécies e abundância de indivíduos. Seus representantes possuem tamanho variando de pequeno a médio porte, com peso entre 20 a 240g e comprimento da cabeça e corpo entre 71 e 176 mm (Figura 1). O comprimento da cauda varia entre 80 e 192 mm, sendo maior que o comprimento do corpo. A porção terminal da cauda é pilosa, podendo ou não formar um pincel caudal. A pelagem do dorso varia de castanho-escuro a castanho- 18

alaranjado, as laterais são mais claras do que o dorso, com limite bem definido com o ventre esbranquiçado com a base dos pelos cinza; em algumas espécies, os pelos do ventre podem ser inteiramente brancos. Pelagem da cabeça geralmente de cor similar à do corpo. As patas são curtas, largas e claras, com uma mancha ligeiramente escura na superfície dorsal (Bonvicino et al. 2008; Paglia et al. 2012). Ainda, estes roedores vivem aos pares ou colônias, possuem hábitos arborícolas e noturnos, sendo que normalmente forrageiam nas árvores, mas podem ir até o chão em busca de água e alimento. Fazem ninhos em copas de palmeiras, emaranhado de epífitas ou trepadeiras, buracos de árvores ou em ninhos de pássaros abandonados (Hershkovitz 1960; Hall 1981; Musser e Carleton 2005; Bonvicino et al. 2008).

Figura 1. Oecomys sp. Foto: Kautzmann, R.

De maneira geral, os roedores de pequeno porte, incluindo Oecomys, possuem grande importância quanto ao equilíbrio ecológico de diversas cadeias alimentares, especialmente naquelas onde ocorrem mamíferos de grande porte, sendo considerados animais de colonização primária de uma nova região. Além disso, servem também como predadores de insetos, disseminadores de sementes, reguladores da biodiversidade de uma determinada área e hospedeiros naturais de uma série de parasitos (Escutenaire et al. 2000; Oliveira et al. 2005).

1.2 Evolução cariotípica no gênero Oecomys

Análises citogenéticas realizadas em várias espécies de Oecomys revelaram uma grande diversidade cariotípica, com número diploide variando de 2n=54 em Oecomys sp. a 2n=86 em Oecomys bicolor.

Tabela 2. Cariótipos registrados para espécies do gênero Oecomys. Localidade indica os países ou os estados brasileiros amostrados. ESPÉCIE LOCALIDADE* 2n NFa FONTE O. auyantepui PA 72 80 Lira (2012) O. bahienses** PE 60 62 Langguth et al. (2005) O. bicolor PA 54 82 Lira (2012) O. bicolor SUR 80 - Baker et al. (1983) Andrades-Miranda et al. (2000) O. bicolor RR, GO 80 124 Andrades-Miranda et al. (2001) O. bicolor PER 80 134 Gardner e Patton (1976) O. bicolor PER 80 136 Gardner e Patton (1976) O. bicolor AM 80 140 Patton et al. (2000) Andrades-Miranda et al. (2000) O. bicolor GO 82 110 Andrades-Miranda et al. (2001) O. bicolor PA 82 116 Lira (2012) O. bicolor AM 86 98 Patton et al. (2000) Andrades-Miranda et al. (2001); Andrade e Bonvicino (2003), GO, PB, PE, O. catherinae 60 62 Langguth et al. (2005) RJ, SP Pinheiro e Geise (2008) Asfora et al. (2011)

Pinheiro e Geise (2008) O. catherinae RJ, SP 60 64 Asfora et al. (2011) O. catherinae RJ, SP 86 98 Patton et al. (2000) O. concolor PAN 58 - Baker et al. (1983) O. concolor SUR 60 - Baker et al. (1983) O. concolor COL 60 62 Gardner e Patton (1976) O. concolor MEX 60 - Andrade e Bonvicino (2003) O. concolor MEX 61 - Andrade e Bonvicino (2003) O. concolor PER 80 112 Gardner e Patton (1976) Gardner e Patton (1976) Svartman (1989) DF, RJ, GO, O. concolor 60 62 Andrades-Miranda et al. (2000) SP, RO Andrades-Miranda et al. (2001) Andrade e Bonvicino (2003) O. paricola PA 68 72 Rosa et al. (2012) O. paricola PA 70 72 Rosa et al. (2012) O. paricola PA 70 76 Rosa et al. (2012) O. rex PA 62 80 Lira (2012) O. roberti AM 80 114 Patton et al. (2000) O. roberti AM, RO 82 106 Langguth et al. (2005) Gardner e Patton (1976) O. superans AM, PER 80 108 Andrade e Bonvicino (2003) Patton et al. (2000) O. trinitatis AM 58 96 Patton et al. (2000) Oecomys sp. AM 54 84 Lira (2012) Oecomys sp. AM 54 86 Lira (2012) Oecomys sp. MS 72 90 Andrade e Bonvicino (2003) *AM = Amazonas, GO = Goiás, MS = Mato Grosso do Sul, PB = Paraíba, PA = Pará, PE = Pernambuco, RO = Roraima, RJ = Rio de Janeiro, SP = São Paulo, COL= Colômbia, MEX = México, PAN = Panamá, PER = Peru, SUR = Suriname. **Sinônimo de O. catherinae.

Além disso, variações na estrutura cariotípica também são evidenciadas, mesmo quando as espécies apresentam o mesmo número diploide, o que indica a presença de rearranjos cromossômicos neste grupo (Tabela 2), sendo fundamental o emprego de bandeamentos adicionais e hibridização de sequências específicas, tais como as teloméricas, para elucidar os rearranjos. Contudo, a maior parte dos estudos se concentra em técnicas de coloração convencional, com alguns registros de bandeamento G, localização da heterocromatina constitutiva – banda C e regiões organizadoras de nucléolo - RONs (Gardner e Patton 1976; Baker et al. 1983; Svartman 1989; Patton et al. 2000; Andrades-Miranda et al. 2000; 2001; Andrade e Bonvicino 2003; Langguth et al. 2005; Pinheiro e Geise 2008; Lira 2012; Rosa et al. 2012).

O bandeamento G tem sido utilizado para auxiliar no pareamento dos homólogos, delimitação de táxons, visualização de alterações cromossômicas e também para permitir a comparação da organização genômica entre diferentes grupos, especialmente para aqueles que apresentam variabilidade de números diploides e fórmulas cariotípicas (Fagundes et al. 1997; Kasahara 2009).

Já o padrão de bandeamento C tem permitido a análise evolutiva cromossômica, bem como individualização de espécies, além de revelar polimorfismos em espécies de pequenos mamíferos (Langguth et al. 2005; Lira 2012; Eler et al. 2012; Rosa et al. 2012). Para as espécies do gênero Oecomys, marcações centroméricas são visualizadas em todos os cromossomos de O. rex, O. auyatepui, O. bicolor, O. paricola e O. catherinae (Langguth et al. 2005; Lira 2012; Rosa et al. 2012). Algumas vezes, a heterocromatina centromérica invade os braços curtos dos cromossomos, tal como evidenciado em O. bicolor e O. catherinae; marcações teloméricas de alguns pares também são encontradas em O. catherinae (Langguth et al. 2005; Lira 2012). Com relação aos cromossomos sexuais, para a maioria das espécies de Oecomys, o cromossomo Y é quase todo heterocromático, enquanto o X apresenta padrões variáveis de distribuição de heterocromatina (Langguth et al. 2005; Lira 2012; Rosa et al. 2012).

Além disso, a impregnação com nitrato de prata em diferentes espécies de Oecomys revelou RONs múltiplas, localizadas normalmente na região terminal de dois a quatro pares de cromossomos, os quais são variáveis de acordo com o 22

táxon analisado (Langguth et al. 2005; Lira 2012; Rosa et al. 2012). Contudo, parte desta varibilidade é em função do padrão de atividade destas regiões, sendo necessários estudos em citogenética molecular para evidenciar diretamente as sequências de interesse, tais como DNAs ribossomais da família 45S que evidenciam os genes ribossomais envolvidos ou não com a RON.

Assim, abordagens em citogenética clássica e molecular são de fundamental importância para Oecomys spp., uma vez que poderão auxiliar na compreensão da organização do genoma e evolução cariotípica do grupo, bem como o favorecimento na elucidação de possível diversidade críptica. Contudo, muitas vezes é difícil determinar o que seria um polimorfismo cromossômico ou uma identidade citogenética, sendo os aspectos morfológicos e moleculares fundamentais para compreender o real cenário.

1.3 DNA barcoding e a identificação molecular dos táxons

Estudos moleculares sobre a filogenia e filogeografia para a tribo Oryzomyini têm contribuído para o esclarecimento da taxonomia e relações evolutivas entre os táxons (Patton e da Silva 1995; Smith e Patton 1999; Patton et al. 2000; Andrade e Bonvicino 2003; Weksler 2003, 2006; Flores 2010). No estudo mais recente acerca da filogenia do grupo Oecomys (Figura 2) utilizando caracteres morfológicos e sequenciamento do gene mitocondrial citocromo-b, Flores (2010) reitera a monofilia do gênero Oecomys e a parafilia de O. bicolor, que mais uma vez foi visto como um complexo de espécies.

Contudo, Flores (2010) enfatiza que a diversidade intragenérica é muito maior que a reconhecida atualmente, assim como a distribuição de várias espécies, com destaque para a região amazônica. Em grande parte, a confusão filogenética e taxonômica, bem como o número subestimado de espécies, ocorre em função da submostragem e de semelhanças morfológicas entre as espécies de Oecomys (Flores 2010).

Nos últimos anos o sequenciamento de uma outra pequena região do gene mitocondrial, denominado DNA barcoding, tem sido utilizado para a avaliação da biodiversidade e identificação molecular de espécies utilizando poucos indivíduos (Hebert et al. 2003). Esta região compreende um curto seguimento de nucleotídeos da subunidade I do gene da citocromo c oxidase. Este fragmento, formado por 648 pares de base (pb), possui taxa de mutação diferente entre as espécies, ausência de recombinação gênica, herança predominantemente materna e baixo polimorfismo ancestral, o que o torna um excelente marcador genético (Hebert et al. 2003). Os dados primários obtidos a partir do sequenciamento desse pequeno fragmento são convertidos em medidas de distância, que nos permitem identificar as espécies com base na divergência nucleotídica. Contudo, para uma taxonomia integrativa o ideal é utilizar todos os marcadores, sendo fundamental averiguar se as análises morfológicas, moleculares e cariotípicas são congruentes, o que ajudaria a elucidar a biodiversidade deste grupo. Por esse motivo, além das identificações morfológicas realizadas em campo e no laboratório, e a fim de avaliar a variação cariotípica intra e interespecífica, realizamos também o sequenciamento do gene COI de todos os indivíduos aqui analisados em auxílio à delimitação dos táxons.

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Caracterizar cromossomicamente e avaliar as relações entre espécies do gênero Oecomys provenientes da Amazônia ocidental, visando contribuir para o melhor entendimento da biodiversidade do grupo, da organização genômica e sua evolução cariotípica.

2.2 Objetivos específicos

 Determinar o cariótipo das espécies de Oecomys coletados em diferentes localidades da Amazônia ocidental.

 Estabelecer os padrões de distribuição longitudinais de bandeamento (Banda G), a distribuição da heterocromatina constitutiva (Banda C), bem como as regiões organizadoras de nucléolos (RONs) em cromossomos mitóticos.

 Verificar possíveis rearranjos cromossômicos na evolução cariotípica no gênero Oecomys pela utilização da hibridização fluorescente in situ de sequências teloméricas e sondas de DNAs ribossomais 5S e 18S.

 Verificar as relações entre as espécies do gênero Oecomys por meio de sequências do gene mitocondrial citocromo oxidase I.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material 3.1.1 Caracterização da amostra

Um total de 30 espécimes foram coletados em quatro localidades distintas da Amazônia representadas na figura 3. Os indivíduos coletados estão listados na tabela 3 com seus respectivos epítetos específicos, número e local da coleta.

No laboratório de campo, os indivíduos coletados foram eutanasiados via inalação de anestésico isofluorano para a retirada da medula óssea e preparação das suspensões celulares para os estudos citogenéticos, e para a coleta de amostras de tecido muscular, que foram armazenadas em tubo de eppendorf com álcool comercial 96% para análise molecular. Os exemplares testemunhos foram identificados morfologicamente, sendo posteriormente taxidermizados ou fixados e armazenados em álcool 70%, visando sua deposição na Coleção de Mamíferos do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA). O estudo foi efetuado com permissão do ICMBio (Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, licença 10832-1 /35513-1 e licença permanente de Maria Nazareth Ferreira da Silva).

Tabela 3. Espécimes analisados com seus respectivos números de campo e da suspensão celular, sexo e local da coleta. Espécie Sexo Número de campo Local da coleta (rios) O. auyantepui M SISJAT CTGA M-16 Jatapú O. auyantepui M SISJAT CTGA M-24 Jatapú O. auyantepui M SISJAT CTGA M-27 Jatapú O. auyantepui M SISJAT CTGA M-28 Jatapú O. bicolor M SISPUR M-152 Purus O. bicolor M SISJAT CTGA M-21 Jatapú O. bicolor M SISJAT CTGA M-25 Jatapú O. bicolor F SISJAT CTGA M-42 Jatapú O. bicolor M SISJAT CTGA M-45 Jatapú O. bicolor M SIS SIS M-124 Negro O. bicolor F SISPUR M-153 Purus O. bicolor M SISJAT CTGA M-36 Jatapú O. rutilus F SISJAT CTGA M-17 Jatapú O. rutilus F SIS SIS M-59 Negro O. rutilus F SIS SIS M-90 Negro O. rutilus M SIS SIS M-115 Negro O. rutilus F EE-199 Cuieiras O. rutilus M EE-212 Cuieiras O. rutilus M SISJAT CTGA M-23 Jatapú O. rutilus M SISJAT CTGA M-29 Jatapú O. rutilus F SIS SIS M-61 Negro 28

O. rutilus F SIS SIS M-63 Negro O. rutilus F SIS SIS M-83 Negro O. rutilus F SIS SIS M-80 Negro O. rutilus F SIS SIS M-81 Negro O. rutilus F SIS SIS M-82 Negro O. rutilus M SIS SIS M-102 Negro O. rutilus F SIS SIS M-91 Negro O. rutilus F EE-195 Cuieiras O. rutilus. F SIS SIS M-56 Negro

3.1 Métodos 3.1.1 Coleta e captura

Cada ponto amostral foi constituído por 5 trilhas paralelas de 320m, distanciadas entre si por cerca de 150m, abertas em mata de terra firme, perpendicularmente a uma das trilhas de 5 km, em cada margem do rio. Em cada uma das 5 trilhas, utilizaram-se armadilhas no chão e no sub-bosque (cerca de 2 m de altura), sendo estabelecidas 16 estações de coleta, distanciadas em intervalos de 20m. Em todas as áreas foram utilizadas armadilhas dos tipos Tomahawk (14x14x40cm), Sherman (8x8x23cm) e Pitfall. As armadilhas do tipo Tomahawk e Sherman foram dispostas aos pares obedecendo ao seguinte critério: em estações ímpares, as armadilhas do tipo Sherman foram instaladas no sub-bosque, em árvores ou cipós que tinham alguma ligação com o dossel, enquanto as Tomahawks foram instaladas no chão em frente a tocas ou troncos caídos. Em estações pares a disposição das armadilhas foi invertida. As armadilhas permaneceram ativadas por um período de 8 a 10 noites para cada margem, e vistoriadas a cada dia, no período matutino. As iscas, compostas por fatias de banana com pasta de amendoim torrado e moído, foram repostas de acordo com a necessidade.

O terceiro método, armadilhas de interceptação e queda, ou Pitfall, consistiram em uma série de baldes de 62L enterrados no solo ao nível do chão e com 8m equidistantes entre si. Os baldes eram ligados por uma cerca-guia com aproximadamente 1m de altura, de forma que o animal fosse guiado para cair no

balde. Cada unidade amostral de pitfall consistiu em um conjunto de 4 baldes enterrados no chão e conectados pela cerca-guia num formato de Y. Em cada expedição foi instalado um total de 16 unidades amostrais, três em cada trilha de 2 km, e os baldes foram vistoriados uma vez ao dia por um período de até 20 noites.

3.1.2 Obtenção de cromossomos mitóticos

Para obtenção das preparações cromossômicas mitóticas utilizou-se o protocolo descrito por Ford e Harmerton (1956), com modificações relacionadas à colchicinização. Os animais foram mortos via inalação de anestésico isofluorano conforme instruções da Sociedade Norte-America de Mastozoologia, Animal Care and Use Committee, The American Society of Mammalogists (1998). A seguir os fêmures foram retirados e suas epífises cortadas para a obtenção da medula óssea.

A medula foi transferida do interior da diáfise femural para cubetas de vidro, com o auxílio de seringas de 10 mL contendo solução hipotônica de KCl a 0,075M e 0,2 mL de colchicina diluída a 0,0125%. O material foi divulsionado, homogeneizado e mantido em banho-maria a 37 °C por 30 minutos para que ocorresse a hipotonização das células a interrupção das divisões celulares em metáfase. Após este tempo, a solução foi transferida para tubos Falcon de 15 ml, e adicionado 1 mL de fixador Carnoy recém-preparado na proporção 3:1 (metanol: ácido acético), realizando-se uma nova homogeneização. Essa solução foi centrifugada e teve seu sobrenadante desprezado. O pellet contendo a suspensão celular foi ressuspendido em fixador. As fixações foram repetidas por mais duas vezes. Após a última centrifugação, o sobrenadante foi descartado e adicionado fixador na proporção de 3:1 em relação à quantidade de sedimento, com nova homogeneização. Por fim o material foi transferido para um tubo de 1,5 ml devidamente identificado com o número do espécime e armazenado em freezer (- 10 °C) para posterior análise.

3.1.3 Preparação das lâminas com cromossomos mitóticos

Para a preparação das lâminas com cromossomos mitóticos, as mesmas foram lavadas, secas ao ar e posteriormente imersas em água destilada a 60 ºC,

em banho-maria. Após cinco minutos, as lâminas foram retiradas da água de forma a manter uma película de água sobre a sua superfície, na qual foi gotejada a suspensão celular.

3.1.4 Coloração com Giemsa

Para a coloração com Giemsa, as lâminas preparadas conforme item 3.1.3 foram coradas com Giemsa 10%, por 10 minutos. Decorrido este tempo, as lâminas foram lavadas com água destilada e mantidas em temperatura ambiente para secarem. Em seguida, foram analisadas em microscópio óptico.

3.1.5 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RON)

Para a caracterização das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) foi utilizada a técnica descrita por Howell e Black (1980). As lâminas foram submetidas a duas soluções, a primeira composta por 0,02 g/ml de gelatina e 0,01 ml de ácido fórmico diluído em água, e a segunda composta por nitrato de prata (AgNO3) a 50%. Essas soluções foram gotejadas sequencialmente sobre as lâminas preparadas conforme item 3.1.3 na proporção de 1:2, respectivamente. As lâminas foram cobertas com lamínulas 24 X 60 mm e incubadas em câmara úmida na estufa a 60°C, por 5 a 8 minutos. Após a incubação, as lâminas foram lavadas com água destilada e deixadas em temperatura ambiente para secar. Depois de secas foram analisadas em microscopia óptica.

3.1.6 Detecção da heterocromatina constitutiva

Para a caracterização da heterocromatina constitutiva foi utilizada à técnica de banda C descrita por Sumner (1972). As lâminas contendo as preparações cromossômicas foram envelhecidas por uma semana, em estufa a 37 ºC. Após envelhecimento foram mergulhadas durante 2 minutos em solução de HCl 0,2N a temperatura ambiente e posteriormente lavadas em água destilada à temperatura ambiente, sendo secas ao ar. As lâminas foram imersas em solução de hidróxido de bário a 5%, filtrada e recém preparada, por 30 segundos, a 42 ºC. Para promover a interrupção da ação do hidróxido de bário, as lâminas foram imersas rapidamente em solução de HCl 0,2N (temperatura ambiente), sendo posteriormente lavadas em água destilada. Após a secagem das lâminas em 31

temperatura ambiente, estas foram incubadas em solução 2xSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trisódico 0,03M, pH 6,8), em banho-maria a 60 ºC, por um período de 15 minutos, sendo em seguida lavadas em água destilada, secas ao ar e coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato 0,06M e pH 6,8, por 10 minutos.

3.1.7 Bandeamento G

Para obtenção do padrão de bandas G foi utilizada a técnica descrita por Seabright (1971), na qual as lâminas com envelhecimento de quatro dias a uma semana foram imersas em uma solução de tripsina (0,25g de tripsina em 50 ml de tampão fosfato pH 6,8), por cerca de 3 segundos. Em seguida as lâminas foram lavadas com tampão fosfato e coradas com uma solução de Giemsa a 5%, diluída em tampão fosfato pH 6,8 durante 6 minutos.

3.1.8 Extração de DNA

Para extração de DNA foi utilizado tecido muscular de Oecomys seguindo o protocolo de Sambrook e Russell (2001), com algumas modificações. Para tanto, utilizou-se tampão de lise (Tris HCl 10 mM em pH 8,0, NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, SDS1%) de Estoup et al. (1993). Em seguida acrescentou-se 15 μL de proteinase K (10 mg/mL) e as amostras foram incubadas a 60 °C por aproximadamente 1 hora para que o tecido fosse totalmente digerido. Posteriormente, 6 μL de RNAse (10mg/mL) foram acrescentados, e as amostras incubadas a 37 ºC por aproximadamente 1 hora. Decorrido esse tempo foram adicionados 100 µL de acetato de amônio 3M, 1 volume (600 µL) de fenol-clorofórmio (1:1) e agitado por inversão, por alguns minutos. Após isso, as amostras foram centrifugadas por 30 minutos a 14.000 rpm em temperatura ambiente. A fase aquosa (sobrenadante) que contém o DNA foi separada em um novo tubo, e acrescentados 100 µL de acetato de amônio 3M, 1 volume (600 µL) de isopropanol gelado e misturado gentilmente por inversão. O precipitado foi deixado a -20 °C por cerca de 16 horas (overnight). O material foi retirado do freezer e centrifugado por 30 minutos a 14.000 rpm, descartando-se o sobrenadante. O pellet foi lavado com 1 mL de etanol 70% e centrifugado por 20 minutos a 14.000 rpm. Novamente, o sobrenadante foi descartado, o pellet seco em estufa a 55 °C, ressuspendido em 100 μl de água milli-Q e deixado eluindo por 14 horas. Para possibilitar a análise da

quantidade e integridade do material, o DNA extraído foi quantificado em espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).

3.1.9 Hibridização in situ fluorescente (FISH)

Para a hibridização fluorescente in situ foi utilizada a técnica descrita por Pinkel et al. (1986), com algumas modificações. Foram utilizadas como sondas sequências teloméricas e de DNA ribossomais, e uma estringência de 77%.

3.1.9.1 Obtenção e marcação das sondas

Sequências ribossomais da família 45S (rDNA 18S) e 5S, bem como sequências teloméricas foram isoladas por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), conforme Saiki et al. (1988), utilizando os seguintes primers: DNAr 5S (A 5’ CAGGGTCGGGCCTGGTTAGTA 3’ e B 5’ CTTCYGAGATCAGACGAGATC 3’); DNAr 18S (IpF 5’ CCGCTTTGGTGACTCTTGAT 3’ e IpR 5’ CCGAGGACCTCACTAAACCA 3’) (Gross et al. 2010). Para sequências teloméricas as amplificações foram feitas sem DNA com os seguintes primers: (TTAGGG)5 e

(CCCTAA)5 (Ijdo et al. 1991).

Os ciclos de amplificação seguiram as seguintes etapas: a) rDNA 5S: 1 minuto a 94 ºC (desnaturação inicial); 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C (desnaturação), 1 minuto a 59 °C (ligação dos primers), 1 minuto e 30 segundos a 72 °C (extensão), e 5 minutos a 72 °C (extensão final). b) rDNA 18S: 2 minutos a 94 ºC (desnaturação inicial); 35 ciclos de 1 minuto a 95 ºC (desnaturação), 1 minuto a 55 ºC (ligação dos primers), 1 minuto e 40 segundos a 72 ºC (extensão); 5 minutos a 72 ºC (extensão final); c) Telomérica: a primeira parte da amplificação foi feita em baixa estringência: 4 minutos a 94 °C (desnaturação inicial), 12 ciclos de 1 min a 94 °C (desnaturação), 45 segundos a 52 °C (ligação dos primers) e 1 minuto e 30 segundos a 72 °C (extensão); seguida por 35 ciclos de alta estringência: 1 minuto a 94 °C (desnaturação), 1 minuto e 30 segundos a 60 °C (ligação dos primers) e 1 minuto e 30 segundos a 72 °C(extensão); 7 minutos a 72 ºC (extensão final).

As reações de PCR foram feitas em um termociclador BIORAD T100, para volume final de 15 μL (1 μL de DNA genômico [100 ng]; 1,5 μL de Tampão 10X com cloreto de magnésio (1,5 mM); 0,15 μL de Taq DNA polimerase [5U/µl]; 3,0 μL de dNTP [1 mM]; 0,6 μL de cada primer [5 mM]; água milli-Q para completar o volume).

As sequências isoladas por PCR foram marcadas pelo método de Nick translation utilizando biotina 14-dATP (Bionick labeling system-Invitrogen) e/ou digoxigenina-11-dUTP (Dig-Nick Translation mix Roche) e utilizadas como sondas para hibridização em cromossomos metafásicos. Cada lâmina a ser hibridizada necessitou de 200 a 300ng de DNA para cada sonda. Para o mix (para oito lâminas), utilizou-se o Kit BioNickTM Labeling System (Invitrogen), com volume variável de produto da PCR visando atingir concentração final de 1500 ng de DNA por 45l; 5 l de dNTP mix; - 5 l de enzima mix e completa para 45 l com água milli-Q. Para o mix (para oito lâminas) utilizando o Kit DIG-NickTM Translation Mix (Roche) utilizou-se volume variável de produto da PCR visando atinguir concentração final de 1500 ng de DNA por 20 l; 4 l de mix do Kit e completado para 20 l com água milli-Q.

3.1.9.2 Tratamento das lâminas

As lâminas foram lavadas por 5 minutos em tampão PBS 1x em temperatura ambiente, desidratadas em série alcoólica gelada (70%, 85% e 100%) durante 5 minutos cada, e em seguida tratadas com 90 µl de RNAse 10 µg/mL (5 µL de RNAse 10 mg/mL e 975 µL de 2XSSC) por 1 hora em câmara úmida a 37 ºC. Posteriormente, foram lavadas três vezes em 2xSSC durante 5 minutos cada, e consecutivamente lavadas em PBS 1x durante 5 minutos.

3.1.9.3 Fixação

As lâminas foram fixadas em formaldeído 1% em PBS 1X/50mM e MgCl2 durante 10 minutos à temperatura ambiente, e posteriormente lavadas em PBS 1x por 5 minutos. Em seguida, as lâminas foram desidratadas em série alcoólica gelada (70%, 85% e 100%) durante 5 minutos cada.

3.1.9.4 Desnaturação dos cromossomos e das sondas

As lâminas contendo o DNA cromossômico foram desnaturadas em uma solução de 2xSSC contendo 70% de formamida a 70 ºC por 5 minutos e novamente desidratadas em álcool etílico 70%, 85% e 100% a 15°C por 5 minutos cada.

Simultaneamente, em um tubo eppendorf, foram adicionados 4 µl da sonda A, 4 µl da sonda B, 20 µl de formamida, 8 µl de sulfato de dextrano 50% e 4 µl de 20xSSC. A sonda foi desnaturada a 99 °C por 10 minutos e passada imediatamente ao gelo.

3.1.9.5 Hibridização

Sobre uma lamínula foram colocados 40 µl de solução de hibridização e a lâmina com o DNA cromossômico invertida sobre a lamínula. As lâminas foram mantidas com o material voltado para baixo em câmara úmida (2x SSC) a 37 °C por aproximadamente 16 horas (overnight).

3.1.9.6 Lavagens

Após a hibridização as lamínulas foram removidas das lâminas e foram lavadas em formamida 15% a 42 °C durante 15 minutos. Em seguida, lavada novamente em solução Tween 0,5% durante 5 minutos a temperatura ambiente.

3.1.9.7 Detecção dos sinais de hibridização

As lâminas foram incubadas em tampão NFDM (non fat dry milk) por 15 minutos, e em seguida lavadas duas vezes com solução Tween 5% por 5 minutos a temperatura ambiente. Foram colocadas sobre cada lâmina 50 µL de anti digoxigenina-rodamina e 30 µL de avidina-FITC 0,07% em tampão C (0,1 M de bicarbonato de sódio, pH 8,5 e 0,15 M de NaCl). Logo após, foram cobertas com lamínula e deixadas por 60 minutos em câmara úmida com água destilada. Posteriormente as lamínulas foram removidas e as lâminas lavadas três vezes em solução Tween 5% por 2 minutos a temperatura ambiente, e então desidratadas em série alcoólica 70, 85 e 100% durante 5 min cada.

3.1.9.8 Montagem das lâminas

Depois de secas, foi adicionada a cada lâmina solução de DAPI diluída em antifade VectaShield Vector (20 µL de antifade e 1 µL de DAPI).

3.1.10 Microscopia e análise das imagens

Todas as preparações citogenéticas clássicas foram analisadas em um microscópio ótico, sendo pelo menos 30 metáfases utilizadas para determinação do número diploide. As melhores metáfases obtidas com as técnicas clássicas (Giemsa, RON, banda C e banda G) foram fotografadas com câmera digital AxioCam ESc, com objetiva de imersão. As metáfases submetidas à FISH foram analisadas e capturadas em microscópio de epifluorescência Olympus BX-51 em objetiva de imersão, através de um sistema de análise de imagens computadorizado e com o software DP Manager (Olympus America).

Para a montagem dos cariótipos foi utilizado o programa Adobe Photoshop 7.0, versão CS4, a partir de cromossomos metafásicos mitóticos, os quais foram recortados e tentativamente emparelhados. Os cromossomos foram medidos, utilizando o programa livre Image J e organizados em ordem decrescente de tamanho. A morfologia cromossômica foi determinada de acordo com os critérios de relação de braços segundo Levan et al. (1964). O número fundamental (NFa) foi determinado de acordo com o número de braços cromossômicos autossômicos, considerando-se os metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos como tendo dois braços e acrocêntricos como tendo apenas um braço. Uma análise comparativa entre os sexos e entre as localidades foi realizada, afim de estabelecer o padrão cariotípico das espécies. A porcentagem de sucesso na obtenção dos cromossomos mitóticos em campo pela técnica de colchicina in vitro também foi avaliada, efetuando-se a comparação entre as localidades e espécies.

3.1.11 Isolamento, purificação e sequenciamento dos genes mitocondriais

O DNA extraído conforme o Item 3.1.8. foi submetido à reação de polimerase em cadeia (PCR) para a obtenção de sequências do gene Citocromo Oxidase subunidade I (COI) das espécies estudadas, utilizando para esse fim um coquetel

de primers (tabela 4) descrito por Ivanova et al. (2007). As amplificações foram feitas em volume total de 25 µL (~100 ng de DNA genômico), contendo tampão de reação 10x (concentração final de 10 mM Tris-HCl; 1,5 mM MgCl; 50 mM KCl; pH 8,3); 0,3 unidade de Taq DNA polimerase; 0,2 mM de cada dNTP; 0,2 µL de cada primer e água mili-Q para completar o volume. As reações foram processadas em termociclador BIORAD T100 nas seguintes condições:

- 1 minuto a 94 ºC (desnaturação inicial); 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C (desnaturação), 1 minuto a 50 °C (ligação dos primers), 1 minuto e 30 segundos a 72 °C (extensão), e 5 minutos a 72 °C (extensão final).

Tabela 4. Coquetel de primers utilizados na obtenção da sequência COI segundo Ivanova et al. (2007). As letras minúsculas representam a cauda M-13, em negrito na coluna à esquerda representa o código dos primers utilizados. LepF1 5’ gtaaaacgacggccagtTTCAACCAATCATAAAGATATTGG 3’ VF1 5’ gtaaaacgacggccagtCTCAACCAACCACAAAGACATTGG 3’ VF1d 5’ gtaaaacgacggcca gtCTCAACCAACCACAARGAYATYGG 3’ VF1i 5’ gtaaaacgacggccagtCTCAACCAACCAIAAIGAIATIGG 3’ VF1it 5’ gtaaaacgacggccagtCTCAACCAAYCAIAARGAIATYGG 3’ Lep R1 5’ caggaaacagctatgacTAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA 3’ VR1d 5’ caggaaacagctatgacTAGACTTCTGGGTGGCCRAARAAYCA 3’ VR1 5’ caggaaacagctatgacTAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA 3’ VR1i 5’ caggaaacagctatgacTAGACTTCTGGGTGICCIAAIAAICA 3’ VR1it 5’ caggaaacagctatgacTAGACTTCTGGGTGICCIAARAAYCA 3’

Após a amplificação, os produtos da PCR foram verificados em gel de agarose 1%, corado com GelRed Acid Gel Stain (Biotium 1:500) e as bandas de DNA foram visualizadas e fotografadas em transluminador de luz ultravioleta (UV) (Labnet international, Inc.). A purificação dos fragmentos resultantes da amplificação foi realizada utilizando o kit ExoSAP-IT® (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA).

Os fragmentos isolados foram sequenciados pelo método de Sanger et al. (1977), com terminadores marcados com fluorescência. Para a realização do sequenciamento foram utilizados 5 pmol de cada primer em reações separadas; 4 μL do premix (kit) e água mili-Q para completar o volume de 10 μL. Essas reações foram processadas em um termociclador sendo:

- 1 minuto a 96 ºC (desnaturação inicial); 15 ciclos de 10 segundo a 96 °C (desnaturação), 15 segundos a 55 °C (ligação dos primers), 75 segundos a 60 °C (extensão); 5 ciclos de 10 segundo a 96 °C (desnaturação), 15 segundos a 55 °C (ligação dos primers), 90 segundos a 60 °C (extensão); 5 ciclos de 10 segundo a 96 °C (desnaturação), 15 segundos a 55 °C (ligação dos primers), 120 segundos a 60 °C (extensão). O primer utilizado no sequenciamento foi o M13F (Messing 1983).

Depois de sequenciado, os fragmentos foram submetidos a um tratamento de precipitação para a eliminação do produto não incorporado durante a reação de sequenciamento e logo após foi realizada a leitura automática do fragmento no sequenciador automático ABI 3130 XL (Applied Biosystem) nas condições de injeção e corrida recomendadas pelo fabricante.

As sequências foram geradas na forma de cromatogramas, por um computador conectado ao aparelho sequenciador. Estes cromatrogramas foram interpretados pelo software Sequencing Analysis 3.4.1 e convertido em sequências de DNA.

3.2.10.1 Edição e alinhamento das sequências

Os dados resultantes do sequenciamento foram salvos na extensão abd. As sequências foram conferidas com auxílio do programa Chromas Pro 134. Depois de editadas foram alinhadas utilizando o programa de alinhamento múltiplo Clustal W (Thompson et al. 1994) incluído no software BioEdit v7.2.2 (Hall 2001). As sequências alinhadas apresentaram tamanho final de 514pb. Estas foram comparadas com as depositadas no GenBank utilizando a ferramenta BLASTn (Basic Local Alignement Search Tool).

3.2.10.2 Análises

Para gerar a árvore de relacionamento, uma análise Bayesiana foi realizada utilizando o programa MrBayes 3.2 (Ronquist et al. 2003). Para esta análise, foi utilizado o método de MCMC (Markov Chain Monte-Carlo) o qual realiza amostragens a cada 20.000 gerações até que uma significância de <0,01 seja alcançada. Um período de burn-in igual a 25% do total de gerações foi necessária para sintetizar os parâmetros das árvores.

A partir das sequências, foi calculada a distância genética interespecífica e intraespecífica pelo modelo de Kimura-2-Parâmtros (K2p) (Kimura 1980), utilizando o programa Molecular Evolution Genetics Analysis (MEGA, Tamura et al. 2011). Os clados formados foram subdivididos em diferentes grupos quando os ramos eram subdivididos com elevados valores de suporte dos ramos e distância genética superior a encontrada dentro do grupo.

DNA de outros indivíduos de Oecomys spp. de diferentes localidades amazônicas depositadas na Coleção de Mamíferos do INPA (Anexo 1) e sequências disponíveis no Genbank (anexo 3) também foram analisados a fim de aumentar a robustez da análise e auxiliarem na definição e alocação taxonômica dos indivíduos cariotipados. Assim, os resultados da análise molecular foram comparados aos resultados citogenéticos, a fim de averiguar a congruência entre eles e a variação cariotípica intra e interespecífica em Oecomys.

4. RESULTADOS

4.1 Análises citogenômicas

No presente estudo, 30 espécimes foram coletados e analisados, dos quais 16 deram resultado satisfatório quanto às análises citogenéticas pormenorizadas. Houve diferença no sucesso de obtenção dos cromossomos em campo entre as espécies. Para Oecomys rutilus 50 % dos indivíduos apresentaram cromossomos de boa qualidade; O. auyantepui 50% dos indivíduos e O. bicolor 62,5 % dos indivíduos. Porém, não existiu nenhuma relação estatística significativa entre a qualidade de obtenção de cromossomos entre machos e fêmeas (p>0,05), tampouco entre as localidades (p>0,05).

Quatro números diploides distintos foram encontrados para Oecomys (2n=54, 2n=80, 2n=64 e 2n=66), sendo os dois últimos relatados pela primeira vez na literatura. Na tabela 5 é mostrado o número total de indivíduos coletados, bem como as espécies, local de coleta (margem dos rios), número de campo, sexo, número diploide, fórmula cariotípica e o número fundamental (NFa) dos indivíduos analisados.

Local de Número de Número Espécie Sexo NFa Formula cariotípica coleta campo diploide

O. auyantepui Jatapú SISJAT M-24 M 2n=66 114 12m+8sm+30st+14a, XY

O. auyantepui Jatapú SISJAT M-27 M - - -

O. auyantepui Jatapú SISJAT M-28 M 2n=64 110 12m+8sm+28st+14a, XY

O. auyantepui Jatapú SISJAT M-16 M - - -

O. bicolor Jatapú SISJAT M-21 M 2n=80 142 16m+10sm+38st+14a, XY

O. bicolor Jatapú SISJAT M-25 M - - -

O. bicolor Jatapú SISJAT M-36 M 2n=80 142 16m+10sm+38st+14a, XY

O. bicolor Jatapú SISJAT M-42 F 2n=80 142 16m+10sm+38st+14a, XX

O. bicolor Jatapú SISJAT M-45 M 2n=80 142 16m+10sm+38st+14a, XY

O. bicolor Rio Negro SISSIS M-124 M - - -

O. bicolor Purus SISPUR M-152 F 2n= 80 142 16m+10sm+38st+14a, XY

O. bicolor Purus SISPUR M-153 F - - -

O. rutilus Cuieiras EE 195 M 2n=54 90 24m+6sm+8st+14a, XY

O. rutilus Jatapú SISJAT M-23 M 2n=54 90 24m+6sm+8st+14a, XY

O. rutilus Jatapú SISJAT M-29 M 2n=54 90 24m+6sm+8st+14a, XY

O. rutilus Rio Negro SISSISM-61 F 2n=54 90 24m+6sm+8st+14a, XX

O. rutilus Rio Negro SISSIS M-63 F 2n=54 90 24m+6sm+8st+14a, XX

O. rutilus Rio Negro SISSIS M-83 F - - -

O. rutilus Rio Negro SISSIS M-80 F 2n=54 90 24m+6sm+8st+14a, XY

O. rutilus Rio Negro SISSIS M-81 F - - -

O. rutilus Rio Negro SISSIS M-82 F - - -

O. rutilus Rio Negro SISSIS M-102 M 2n=54 90 24m+6sm+8st+14a, XY

O. rutilus Rio Negro SISSIS M-91 F - - -

O. rutilus Cuieiras EE 195 F 2n=54 90 24m+6sm+8st+14a, XX

O. rutilus Rio Negro SISSIS M-56 F 2n=54 90 24m+6sm+8st+14a, XY

O. rutilus Cuieiras EE 212 M - - -

O. rutilus Jatapú SISJAT M-17 F - - -

O. rutilus Rio Negro SISSIS M-59 F - - -

O. rutilus Rio Negro SISISI M-90 F - - -

O. rutilus Rio Negro SISSIS M-115 M - - -

4.1.1 Oecomys auyantepui

Dois espécimes machos provenientes de um único ponto de coleta (rio Jatapú), foram analisados detalhadamente e cada um apresentou um número diploide distinto: a) 2n=64 cromossomos, com número fundamental igual a 110 e fórmula cariotípica 12 metacêntricos (m) + 8 submetacêntricos (sm) + 28 subtelocêntricos (st) + 14 acrocêntricos (a) (Figura 4a); b) 2n=66 cromossomos, com número fundamental 114 e fórmula cariotípica de 12 metacêntricos (m) + 8 submetacêntricos (sm) + 30 subtelocêntricos (st) + 14 acrocêntricos (a) (Figura 5a). O sistema de determinação sexual é do tipo XX/XY, porém o indivíduo com 2n=64 apresentou o cromossomo X e Y do tipo submetacêntricos, enquanto o 2n=66 apresentou o cromossomo X metacêntrico e o Y submetacêntrico, com metade do tamanho do X.

Em ambos, a heterocromatina evidenciada pelo bandeamento C foi predominantemente centromérica, variando de tênue a conspícua (Figura 4b e 5b). O cromossomo sexual Y dos dois indivíduos apresentaram o braço longo heterocromático, enquanto os cromossomos X apresentam um bloco centromérico e marcações biteloméricas. O padrão de bandas G possibilitou a identificação dos pares homólogos para cada citótipo (Figura 4c e 5c) e a detecção de homeologia entre os maiores pares do complemento, sendo os pares 1, 2, 7, 8, 12, 13, 14, 15 e 29 do citótipo com 2n=66 cromossomos homeólogos aos pares 1, 2, 8, 7, 11, 12, 14, 16 e 26 do citótipo com 2n=64 cromossomos, respectivamente (Figura 6). Ainda, não houve diferença quanto à impregnação por nitrato de prata entre os dois indivíduos, sendo que três marcações terminais foram observadas - ambos os homólogos do par 25 e em um dos cromossomos do par 16 (Figura 7b e 8b).

Para o espécime com 2n=64, a FISH com sonda rDNA 18S resultou na marcação de 2 pares de cromossomos, 16 e 25, e para o sítio ribossomal 5S apenas o par 11 foi marcado (Figura 7a). Para o espécime com 2n=66 os pares marcados para o rDNA 18S foram os mesmos, 16 e 25, enquanto para o rDNA 5S o par marcado foi o de número 13 (Figura 8a). Quanto à sonda telomérica, todos os telômeros foram marcados, e uma região telomérica intersticial (ITS) na região centromérica do cromossomo X foi observada para ambos os cariótipos (Figura 7c e 8c). 42

4.1.2 Oecomys bicolor

Para Oecomys bicolor o número diploide encontrado foi igual a 80 cromossomos e número fundamental (FN) igual a 142, com fórmula cariotípica de 16 metacêntricos (m) + 10 submetacêntricos (sm) + 38 subtelocêntricos (st) +14 acrocêntricos (a). O sistema de determinação sexual é do tipo XX/XY, sendo o cromossomo sexual X o maior submetacêntrico do conjunto, e o cromossomo sexual Y um subtelocêntrico médio (Figura 9a).

O bandeamento C evidenciou que a heterocromatina se concentra em blocos conspícuos na região centromérica de todos os cromossomos, e para a maioria dos cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e no cromossomo sexual X há um espalhamento da heterocromatina para o braço curto (Figura 9b). Na hibridização in situ fluorescente utilizando sondas teloméricas, nenhuma marcação telomérica intersticial foi observada (Figura 10c). A impregnação por nitrato de prata evidenciou marcações múltiplas do tipo terminal em ambos os homólogos dos pares 20 e 27, assim como em um dos homólogos dos pares 19, 24 e 25 (Figura 10b). A utilização de sondas para o DNA ribossomal 18S evidenciou marcações em ambos os homólogos dos pares 13, 15, 19, 20, 22, 24, 25, 27, 28, 33, 36 e 37. A aplicação da sonda de DNA ribossomal 5S resultou em apenas uma marcação no cromossomo 16 (Figura 10a). O bandeamento G revelou homeologia entre o par 16 de Oecomys bicolor (Figura 9c; Figura 13) e os pares 13 e 11 de Oecomys auyantepui. Além disso, o cromossomo 15 desta espécie corresponde ao braço curto e parte do seu braço longo do par 1 de Oecomys auyantepui, enquanto que o cromossomo 33 corresponde ao restante do cromossomo 1 (Figura 13).

4.1.3 Oecomys rutilus

Para Oecomys rutilus o número diploide encontrado foi igual a 54 cromossomos e número fundamental 90 para todos os indivíduos analisados, não havendo diferenças entre as localidades. O complemento autossômico consiste em 19 pares com dois braços cada, e 7 pares de cromossomos acrocêntricos, tendo fórmula cariotípica de 24 metacêntricos (m) + 6 submetacêntricos (sm) + 8 subtelocêntricos (st) + 14 acrocêntricos (a). O sistema de determinação sexual do tipo XX/XY, tendo um cromossomo X submetacêntrico grande e um Y submetacêntrico de aproximadamente 2/3 do tamanho do X (Figura 11a).

As regiões heterocromáticas são constituídas de marcações centroméricas tênues em alguns pares de cromossomos e conspícuas em outros, tais como os pares 5, 7, 8, 9, 16, 17, 20, 21, 22, 26 e o cromossomo sexual Y (Figura 11b). O padrão de bandeamento G permitiu o correto pareamento dos homólogos, no entanto, não foi possível identificar qualquer tipo de rearranjo cromossômico intraespecífico, mesmo porque as fórmulas cariotípicas foram similares entre os indivíduos (Figura 11c). Contudo, foi possível verificar homeologia entre os cromossomos 16 desta espécie e os cromossomos 11, 13 de O. auyantepui e 16 de O. bicolor (Figura 13). Além disso, o cromossomo 15 desta espécie corresponde ao cromossomo 1 de O. auyantepui, bem como o cromossomo 1 corresponde ao 7 ou 8. As demais homeologias estão demonstradas na figura 13.

As regiões organizadoras de nucléolo evidenciadas pela coloração com nitrato de prata apresentaram 4 marcações localizadas nas regiões terminais de ambos os homólogos do par 1, o maior do complemento, e do par 25 (Figura 12b). Nenhuma variação quanto à distribuição das RONs foi observada entre os indivíduos.

A hibridização fluorescente in situ com sondas de rDNA 18S foram coincidentes com as RONs, apresentando marcações nos pares 1 e 25 (Figura 12a). Para a sonda rDNA 5S um único par marcado foi observado (par 16), próximo a região centromérica. Com FISH telomérica, todos os telômeros apresentaram-se marcados (Figura 12c) e nenhuma marcação telomérica intersticial (ITS) foi observada.

4.2. Análises moleculares

Um total de 87 sequências de COI foram analisadas (30 Oecomys do presente estudo, 3 espécimes de outras localidades do Amazonas [Anexo1], 53 do GenBank e um Euryoryzomys macconnelli como grupo externo). A árvore de relacionamento (Figura 14) agrupou em um ramo os Oecomys bicolor provenientes das Guianas, Suriname e do Brasil, sendo estes últimos procedentes das margens do rio Jari e rio Jatapu (Figura 14, A). A distância genética dentro do agrupamento foi de 1,23% (Tabela 6). Porém, outros Oecomys bicolor e Oecomys sp. do Brasil (rio Negro) e do Equador foram agrupados no ramo B, estando no ramo C os O. bicolor do rio Purus (Brasil). A distância genética entre A e B foi de 8,4%; de A e C foi de 9,89% e entre B e C de 7,12% (Tabela 6).

Todos os O. roberti provenientes das Guianas foram agrupados no ramo D, com 0,39% de distância dentro deste agrupamento. No ramo E ficou um indivíduo do Equador não identificado em nível de espécie, sendo este grupo irmão do ramo formado por Oecomys concolor e Oecomys sp. (ramo F), com uma distância de 12,35% entre os dois ramos. Porém, outro indivíduo de O. concolor, também do Equador, aparece no ramo G, existindo uma distância genética de 12,88% entre os ramos F e G (Tabela 6).

Todos os O. auyantepui foram agrupados no ramo H, que compreende indivíduos do Brasil, Guiana e Suriname, com distância genética intraespecífica de 1,41% (Tabela 6).

Já os O. rutilus foram separados em dois ramos, um que compreende os indivíduos do Brasil, Suriname e Guiana (I) e outro com um indivíduo do Equador (Figura 14, J). A distância genética entre estes dois ramos foi de 7,33% (Tabela 6), enquanto que a distância genética dentro do ramo I foi de 1,62%.

Oecomys rex também formou dois ramos monofiléticos (K e L). No entanto, a distância genética entre eles foi de 11,92%. Além disso, estes aparecem como grupo irmão dos demais ramos.

A B C D E F G H I J K L A 1,23 B 8,40 2,43 C 9,89 7,12 ------D 10,78 11,05 13,44 0,39 E 10,30 11,04 13,98 8,52 ------F 13,98 14,67 16,54 12,41 12,35 0,79 G 11,47 12,58 15,16 10,97 10,53 12,88 ------H 15,51 15,45 18,06 14,81 13,73 14,23 14,24 1,41 I 11,28 12,11 13,27 11,95 10,83 13,36 11,33 11,35 1,62 J 12,57 12,58 14,40 12,44 11,44 14,43 10,51 11,70 7,33 ------K 12,23 13,64 16,26 14,31 13,14 14,07 11,81 15,24 12,65 12,34 0,79 L 14,31 14,36 16,87 12,62 11,96 14,03 13,10 13,82 12,97 11,62 11,92 0,00 GE 14,77 15,76 18,15 16,69 15,28 16,95 16,82 15,80 15,33 17,29 15,97 13,53

5. DISCUSSÃO

As espécies do gênero Oecomys apresentam uma grande variabilidade cariotípica, no entanto, poucos estudos citogenéticos foram feitos utilizando métodos mais detalhados e modernos. Os primeiros trabalhos para esse gênero foram realizados por Gardner e Patton em 1976, seguido pelo trabalho de Baker e colaboradores em 1983. Após quase duas décadas, estudos citogenéticos para este táxon voltaram a ser realizados (Svartman 1989; Patton et al. 2000; Andrades- Miranda et al. 2000, 2001; Andrade e Bonvicino 2003; Langguth et al. 2005; Pinheiro e Geise 2008; Asfora et al. 2011; Lira 2012; Rosa et al. 2012). No entanto, os dados cromossômicos desses estudos são restritos em grande parte a descrição do número diploide e número fundamental, o que restringe a comparação dos dados obtidos no presente trabalho.

A obtenção de cromossomos mitóticos in vitro em campo possui vantagens em relação a in vivo pelo fato de ser mais econômica, demandando um menor volume de colchicina e por ter a possibilidade de ser utilizada em animais recém- mortos, panorama comumente encontrado em coletas utilizando armadilhas de queda e em regiões de alto índice pluviométrico. O aproveitamento obtido com a presente técnica foi em torno de 55%, e a maior parte dos indivíduos que não apresentou resultados citogenéticos estavam mortos antes de ter sido iniciado o procedimento de obtenção de cromossomos. A comparação da eficiência deste protocolo com a técnica de obtenção de cromossomos mitóticos in vivo em campo para pequenos mamíferos é dificultada pelo fato dos autores indicarem apenas o número de indivíduos analisados, não revelando o número de indivíduos coletados e o coeficiente de aproveitamento (Eler et al. 2007; Silva et al. 2012). Contudo, dados disponíveis para a família Cricetidae, na qual está inserido o gênero Oecomys, revelam que cerca de 60% dos indivíduos analisados apresentaram metáfases de qualidade suficiente para determinação de suas características cariotípicas (Lira 2012). Considerando que Lira (2012) analisou as espécies Euryoryzomys macconnelli, Hylaeamys megacephalus, Oecomys rex, Oecomys auyantepui, Oecomys bicolor e Oecomys sp., o valor de aproveitamento pode ser considerado similar ao encontrado no presente estudo. Constatamos diferenças no

aproveitamento intragenérico, com Oecomys rutilus e O. auyantepui apresentando o menor sucesso na obtenção dos cromossomos em campo utilizando técnica in vitro (50%), seguido de O. bicolor (62,5%), o que possivelmente está relacionado à biologia das espécies, que podem apresentam índices mitóticos diferenciados.

Em relação aos cromossomos sexuais, observa-se que o cromossomo X varia de metacêntrico a submetacêntricos grandes (2n = 80 e 2n = 54, respectivamente) até pequenos subtelocêntricos (2n=64 e 2n=66). Resultados encontrados por Lira (2012), tanto para o gênero Oecomys, quanto para outros Oryzomyini, atestam uma tendência do cromossomo sexual X em ser o maior do complemento, com algumas exceções. Contudo, este cromossomo parece ser um dos que mais sofreram alterações ao longo da evolução das espécies de Oecomys, uma vez que não existe homeologia entre os X das diferentes espécies, conforme evidenciado em banda G. Além disso, o padrão de heterocromatinização do X é diferente entre as espécies. As diferenças na quantidade de heterocromatina entre as espécies de roedores congêneres, segundo Graphodatsky et al. (2011), podem variar de 36% do DNA nuclear em cricetídeos das espécies Peromyscus (Deaven 1977), até 60% em roedores das espécies Thomomys (Sherwood e Patton 1982). Em 1983 Patton e Sherwood sugeriram que a variação na quantidade de heterocromatina pode ser significativa em termos da relação entre o tamanho do genoma e as pequenas mudanças cariotípicas, e que ambos podem estar envolvidos nos processos de especiação. Possivelmente, isso pode ter ocorrido em Oecomys.

Por sua vez, o cromossomo Y manteve sua morfologia subtelocêntrico pequeno em todas as espécies. Esse fato é inerente à sua história evolutiva que ressalta que após o cromossomo adquirir o gene determinante do sexo (SRY) e outros alelos relacionados, houve um período de seleção, que levou à supressão da recombinação (Charlesworth 1991).

Em Oecomys auyantepui foi observado uma única marcação telomérica intersticial no cromossomo sexual X, tais como os observados em roedores do gênero Acomys e em Drymoreomys albimaculatus (Castiglia et al. 2007; Rovatsos et al. 2011; Suárez-Villota et al. 2013). Uma variedade de mecanismos que poderiam produzir sinais teloméricos intersticiais foi proposta por diferentes

autores, e esses mecanismos podem ser explicados de várias maneiras.

Primeiramente, a ocorrência de sequências teloméricas curtas (TTAGGG)n foi classificada como um componente do DNA satélite (Adegoke et al. 1993) podendo ser localizado em posições subteloméricas e intersticiais dos cromossomos (Garrido-Ramos et al. 1998), estando sujeitas, inclusive, à amplificação (Arnason et al. 1998; Castiglia et al. 2006) ou podem surgir também durante o mecanismo de reparo das quebras da dupla fita de DNA (Nergadze et al. 2004; 2007). Todavia, o mais comumente aceito é que eles indicam possíveis rearranjos recentes desses cromossomos, tais como a transposição de sequências teloméricas funcionais em uma posição intersticial (Dobigny et al. 2003; Zhdanova et al. 2005). Apesar da possibilidade de não se tratar de uma fusão cromossômica, este mecanismo parece ser a principal fonte de ITS em muitos organismos (Lee et al. 1993; Slijepcevic 1998).

Apenas uma ITS foi encontrada nos cariótipos de Oecomys auyantepui e esta está relacionada ao cromossomo sexual X em ambos os casos, porém dois citótipos foram evidenciados (2n = 64, NFa = 110 e 2n = 66, NFa = 114), os quais até o presente momento não haviam sido descritos na literatura. A presença de dois números diploides distintos sugere a ocorrência de rearranjos robertsonianos, contudo não foi possível estabelecer se ocorreu um aumento do número diploide a partir do 2n=64, por meio de fissões, ou uma diminuição a partir do 2n=66 por meio de fusões. As marcações evidenciadas pelo bandeamento C são similares entre os dois cariótipos, predominantemente centroméricas e tênues. O mesmo acontece para as regiões organizadoras de nucléolo, onde três marcações foram localizadas em ambos os citótipos. A resolução obtida com o bandeamento G permitiu inferir que há homeologia entre os maiores cromossomos dos dois citótipos (Figura 13), em especial dos portadores do sítio ribossomal 5S (Figura 6), indicando que, assim como os pares portadores das RONs, estes não estiveram envolvidos em processos de alterações cromossômicas que levaram à presença de dois números diploides em Oecomys auyantepui.

No caso destes dois citótipos em questão, os dois indivíduos (SISJAT CTGA M- 24 e 28) foram capturados na mesma margem (direita) do rio Jatapu, a cerca de 1 km de distância um do outro. Contudo, considerando que em termos do DNA mitocondrial todos os Oecomys auyantepui foram agrupados em um único ramo 58

(Figura 14; H), com altos valores de suporte e baixa distância genética intraespecífica (1,41%), é possível tratar-se de um polimorfismo cromossômico. Ou seja, não seriam duas unidades evolutivas diferenciadas, uma vez que o valor de distância genética intraespecífica obtida é compatível com os dados disponíveis para outros Sigmodontinae e para a família Cricetidae em geral (Smith e Patton 1993; Patton 1999; Ventura 2009). Assim, apesar do número limitado de indivíduos analisados cariotipicamente para a espécie em questão, os diferentes números diploides encontrados poderiam ser interpretados como variantes cariotípicas pertencentes a uma mesma espécie, que apresenta polimorfismo tanto no número de cromossomos com no número fundamental autossômico. Neste caso, não existe uma congruência entre os marcadores citogenéticos e os dados obtidos por sequenciamento do COI, sendo que o número diploide é mais variável que o marcador molecular utilizado, o que acaba sendo um problema se considerado que ambos os dados são utilizados como ferramentas acessórias para a delimitação de espécies de pequenos mamíferos. Ou seja, estes dados reforçam a complexidade taxonômica de Oecomys e demonstram que cada espécie válida não necessariamente tem apenas um cariótipo padrão.

O mesmo ocorre com o complexo Oecomys bicolor, onde apesar de não haver total congruência com relação a ramos filogenéticos e dados cariotípicos, todos os dados sugerem a presença de complexo de espécie (Smith e Patton 1999; Flores 2010; Andrade e Bonvincino 2003; tabela 1 e presente trabalho). Quatro números diploides distintos foram evidenciados para Oecomys bicolor na Amazônia brasileira, variando de 54 a 86 cromossomos e predominância de 2n=80 (Gardner e Patton 1976; Patton et al. 2000; Andrades-Miranda et al. 2000; Andrades-Miranda et al. 2001; Lira 2012). Já os dados moleculares revelaram no presente estudo dois grandes ramos bem suportados, os quais correspondem a duas linhagens geograficamente distintas (Anexo 4): o ramo A, que engloba as espécies do nordeste amazônico e clado B+C, que engloba as espécies do oeste amazônico. Esta observação pode estar diretamente relacionada ao hábito de vida não migratório das espécies em questão, levando à uma grande estruturação geográfica, combinado ou não com os aspectos geográficos das áreas, caracterizados, a priori, por uma grande distância geográfica, e por apresentar heterogeneidade de relevo em sua extensão. Assim, a variação cariotípica parece

ser maior que a variação relacionada à análise de DNA barcoding. A distância genética observada entre os ramos A e B é de 8,4%, entre A e C é de 9,89% e entre B e C é de 7,12%. Porém, a ausência de dados cariotípicos correspondentes às sequências provenientes do GenBank dificulta outras deduções.

Comparando os padrões cariotípicos das populações analisadas no presente trabalho (rio Jatapú e rio Purus), observa-se um padrão de organização cariotípica similar entre os indivíduos das diferentes localidades, com 2n=80 cromossomos. Apesar de divergência no número diploide, a distribuição da heterocromatina foi similar ao encontrado para indivíduos coletados no rio Jari, na Amazônia oriental, com 2n=82 e FN=116, sendo evidenciados blocos centroméricos que se estendem pelos braços curtos da maioria dos cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e dos cromossomos sexuais. Em contrapartida, as regiões organizadores de nucléolo evidenciadas neste trabalho (7 marcações) são mais numerosas que as já descritas para a espécie (1 a 4 marcações) (Andrades-Miranda 2001; Lira 2012). Estas RONs observadas não se referem a marcações de regiões heterocromáticas ácidas, pois a hibridização fluorescente in situ utilizando sondas de rDNA 18S mostraram a existência de 12 pares cromossômicos portadores destas sequências. Assim, a diferença no número de sítios impregnados pela prata entre as diferentes populações poderia ser em decorrência da atividade das regiões organizadoras de nucléolo, mas como a hibridização das sequências ribossomais não foi efetuada nos indivíduos das outras populações, não é possível comprovar esta suposição.

Nenhuma variação na estrutura cariotípica foi encontrada para a espécie O. rutilus no presente trabalho, independente da localidade de coleta. O número diploide encontrado (2n=54) foi primeiramente descrito por Lira (2012) a partir de três exemplares de amostras populacionais do Amazonas. No entanto, nos três espécimes descritos por Lira (2012), observa-se uma variação quanto ao número fundamental autossômico (82, 84 e 86), sendo que o indivíduo com 2n=54 e NFa=84 compartilha a mesma localização geográfica que o espécime analisado neste trabalho, o rio Cuieiras. Divergências entre os autores na interpretação do cariótipo podem estar diretamente relacionadas à qualidade da preparação cromossômica analisada, ao padrão de compactação do DNA, ao tamanho e número dos cromossomos e erros na medida dos braços cromossômicos.

O padrão de bandeamento C de O. rutilus consistiu de marcações muito sutis na maioria dos cromossomos, incluindo os sexuais, com exceção dos três primeiros pares de cromossomos subtelocêntricos que apresentaram marcações mais conspícuas nas regiões centroméricas e pericentromérica. A localização da banda C segue o padrão de localização já descrito para o gênero Oecomys e para a tribo Oryzomyini (Yonenaga-Yassuda et al. 1987; Svartman e Almeida 1992; Silva e Yonenaga-Yassuda 1998; Aniskin e Volobouev 1999; Volobouev e Aniskin 2000; Andrades-Miranda et al. 2002; Bonvicino et al. 2005; Lira 2012).

As análise moleculares agruparam os espécimes denominados de O. rutilus em dois ramos, I e J (Figura 14), sendo o ramo J formado por um único indivíduo proveniente do Equador. Apesar do ramo I agrupar todas as sequências provenientes do Brasil, Suriname e Guiana com elevado suporte, é possível observar que os espécimes do Brasil estão mais próximos entre si do que dos demais. Ainda, a distância genética deste ramo em relação ao J foi de 7,33%, o que sugere a existência de um complexo de espécies, tal como evidenciado em O. bicolor. A divergência encontrada relacionada à distribuição conhecida até então para a espécie sugere linhagens estejam isoladas geograficamente, contudo se ampliar as áreas de amostragem este padrão pode ser alterado (Anexo 5).

Com relação a sequências de COI das demais amostras disponíveis no Genebank e dos indivíduos que não foram utilizadas na análise cariotípica, as sequências de Oecomys concolor, assim como as de Oecomys sp. que formam o clado F, compartilham a mesma localização geográfica e apresentam baixa distância genética entre eles (0,79%). Assim, os indivíduos não identificados que compõem esse clado poderiam se tratar de O. concolor. Em contrapartida, o indivíduo O. concolor proveniente do Equador que forma o clado G apresentou alto suporte de ramo e alta distância genética, se comparado ao ramo F (12,88%), que agrupa os demais espécimes de O. concolor. Assim, esse haplótipo deve representar uma outra espécie, distinta de O. concolor correspondente ao ramo F.

O ramo E, formado por um único indivíduo não identificado, nesta análise é grupo irmão de O. roberti (ramo D) e apresentou elevado suporte do ramo, e distância genética entre os clados D e E de 8,52%. Apesar de não termos encontrado dados publicados quanto à distância intraespecífica e interespecífica

para o COI, os valores encontrados para os ramos supracitados são representativos e estão próximos à distância entre espécies encontradas por Patton et al. (2000) (7,2 a 9,8%) para outro gene mitocondrial, o citocromo b. Desta forma, o ramo E deve corresponder a uma espécie distinta. O ramo D, representado por exemplares de O. roberti, apresentou distância genética intraespecífica de 0,39%.

Langguth et al. (2005), baseado na amplitude de distribuição do gênero propõem que os táxons com menor número diploide (2n=60) seriam os basais para o gênero, enquanto os de maior número diploide seriam derivados. A análise filogenética realizada por Weksler (2006) baseada no gene IRBP e dados morfológicos que incluiu as espécies O. bicolor, O. catherinae, O. concolor, O. mamorae e O. trinitatis revelou O. catherinae como o táxon basal. Embora a presente análise de relacionamento utilizando COI seja limitada (inferência Bayesiana de um fragmento de cerca de 500pb de um gene mitocondrial) e não contemple vários dos táxons analisados por Flores (2010), nossos resultados são similares aos seus e evidenciam, com elevados valores de suporte, o monofiletismo do gênero Oecomys, assim como encontrado em outros estudos moleculares com outros marcadores (Smith e Patton 1999, Weksler 2006). Porém, se considerado que Oecomys rex é grupo irmão de Oecomys catherinae os quais seriam basais, o número diploide basal seria em torno de 60/62 cromossomos. Desta forma, nota-se que não existe uma tendência de aumento ou diminuição de números diploides entre os ramos obtidos pelas análises moleculares, o que sugere a existência de uma complexa estruturação cariotípica, fato que é revelado por diferentes números diploides em uma mesma espécie morfológica e cujos indivíduos apresentam-se em um único agrupamento na análise de relacionamento.

Com relação à localização das regiões organizadoras de nucléolo, quatro marcações foram observadas para a espécie Oecomys rutilus e três para O. auyantepui, sendo o par 25 uma constante entre elas. Para O. rex Lira (2012) também encontrou 4 marcações, sugerindo um estado ancestral para a característica. Em Oecomys bicolor o par 25 também se apresentou impregnado com nitrato de prata, porém quatro pares adicionais apresentaram sinais, totalizando 5 pares de cromossomos, nem todos com ambos os homólogos marcados. No presente estudo, observa-se que as regiões organizadoras de 62

nucléolo distribuem-se preferencialmente nas regiões terminais dos cromossomos, e são crescentes em número simultaneamente ao aumento do número diploide, em padrão similar a outros membros da família Cricetidae (Lira 2012; Romanova 2006; Ventura 2009; Fagundes et al. 1997). Esses dados são corroborados pelos resultados obtidos pela FISH com sonda de DNA ribossomal 18S, confirmando a presença de dois pares marcados para os cariótipos basais, e em O. bicolor há um salto no número de DNAr 18S, totalizando 12 pares portadores destas sequências.

O maior número de sítios identificados pela hibridização in situ pela sonda de DNA ribossomal 18S se comparado aos sítios identificados pela técnica de impregnação por nitrato de prata é comum em diversos outros grupos (Lira 2012; Santos 2010), uma vez que esta última técnica marca as proteínas associadas à estrutura nucleolar, e não as regiões de DNA ribossomal, limitando-se a identificar somente RONs que estiveram ativas na interfase precedente (Miller et al. 1976).

Esses múltiplos sítios de DNAr 18S de O. bicolor foram, provavelmente, derivados de duplicação e dispersão, todavia, vale ressaltar que apenas os sítios marcados com nitrato de prata apresentam atividade transcricional, havendo a possibilidade dos demais serem pseudogenes. Di Meo et al. (1993) relatam que diferença na distribuição das RONs em espécies correlatas é atribuída a rearranjos acumulados desde a divergência do ancestral em comum, principalmente por inversões e translocações Robertsonianas. Já Grozdanov et al. (2003) e Britton- Davidian et al. (2012) dizem que essa diversidade de RON observada em roedores indica uma alta taxa de transposição intracromossomal em ausência de rearranjos visíveis, desta forma, este caráter sugere mais uma vez representar o estado derivado para o táxon em questão.

A análise comparativa do bandeamento G foi possível apenas entre os maiores cromossomos dos complementos, os quais apresentaram um padrão de faixas melhor delimitados (Figura 13). Observa-se a homeologia entre os pares 11 e 13 (Figura 7) em Oecomys auyantepui e entre as outras espécies (Figura 13), sendo esses os portadores dos genes de rDNA 5S. Desta forma eles compartilham semelhança quanto à localização destas sequências nos cromossomos (cromossomos subtelocêntricos), quanto à posição (região próxima ao centrômero), e quanto ao número de marcações, totalizando um par em todos os exemplares.

Martins e Galetti Jr. (1999) afirmam que a localização do DNA ribossomal 5S em posição intersticial estaria diretamente relacionada ao grau de proteção destas sequências, evitando possíveis eventos de crossing-over ou transposição, mais frequentes nas regiões terminais. Este fato pode ser observado se compararmos o grau de conservação da posição e localização desta sequência em relação ao RNAr 45S. Situação semelhante foi encontrada por Ventura et al. (2012) em Akondotineos, onde, apesar da grande variabilidade cromossômica já descrita para o grupo, os sítios cromossômicos de DNAr 5S mantiveram-se conservados.

As variações intraespecíficas e interespecíficas encontradas na macroestrutura cariotípica das espécies do gênero Oecomys indicam que rearranjos cromossômicos tais como fusões/fissões, translocações e duplicações promoveram a existência dos diferentes números diploides bem como diferentes fórmulas cariotípicas. Porém, a hibridização de sequências teloméricas não foi bom indicador de rearranjos em cromossomos autossômicos nas espécies de Oecomys analisadas, uma vez que nenhuma marcação telomérica intersticial (ITS) nos autossomos foi observada. Todavia, isso não significa que as regiões terminais dos cromossomos não estiveram envolvidas em rearranjos durante a evolução dos cariótipos, uma vez que: a) estes sítios teloméricos residuais podem ser pequenos, não sendo detectados pela FISH; b) os ITS podem ter sofrido processos de erosão molecular de sequências de DNA repetitivo (Mandrioli et al. 1999); c) Sequências teloméricas podem ter sido perdidas antes da fusão, sendo este um evento facilitador do rearranjo. Porém, O. bicolor, considerado táxon derivado para o gênero (Flores 2011), apresenta o maior número diploide, ou seja, é provável que durante a história evolutiva fissões tenham acontecido.

6. CONCLUSÕES

Os dados obtidos no presente estudo das características cromossômicas de diferentes espécies do gênero Oecomys provenientes de diferentes localidades do estado do Amazonas, tendo por base os aspectos estruturais e moleculares, permitem concluir que:

 Os padrões cariotípicos encontrados indicaram alta diversidade local e ampla distribuição para os táxons em questão.

 As duas variantes cariotípicas encontradas em simpatria para Oecomys auyantepui (2n=64, NFa 110; 2n= 66, NFa= 114), relatadas pela primeira vez na literatura, possivelmente trata-se de um polimorfismo cromossômico, considerando que ambos estão em um mesmo ramo filogenético.

 As variações cariotípicas expressivas evidenciadas no presente trabalho, confirmam a atuação de intensos processos de modificação cromossômica em espécies de Oecomys.

 A amostragem limitada quanto ao número de representantes de Oecomys e os dados moleculares ainda limitados neste estudo, torna difícil a determinação dos processos evolutivos que levaram à variabilidade morfológica cariotípica, podendo ser atribuída a diferentes fatores, entre os quais, translocações Robertsonianas, inversões pericêntricas, fusões, mobilização de elementos transponíveis e alteração na quantidade de heterocromatina.

 Oecomys bicolor e Oecomys rutilus podem ser considerados complexo de espécies.

 Não existe total congruência entre os dados citogenéticos e os moleculares, sendo que os primeiros aparentemente tendem a apresentar maior variação.

 Para delimitação dos táxons de Oecomys há necessidade de uma taxonomia integrativa, sendo que as ferramentas genéticas podem ser utilizadas juntamente com as análises morfológicas.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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8. ANEXOS

Anexo 1. Lista total de espécimes sequenciados para o gene COI neste estudo. As referências indicadas são para o número diploide. Local de Código da Espécie Sexo 2n Referência coleta coleção O. auyantepui Jatapú SIS JAT M-16 M O. auyantepui Jatapú SIS JAT M-27 M O. auyantepui Jari INPA 5225 F 2n=72 Lira 2012 O. auyantepui Trombetas SIS TROM M-517 M O. bicolor Jatapú SIS JAT M-25 M O. bicolor Rio Negro SIS SIS M-124 M O. bicolor Jari INPA 5042 F 2n=80 Lira 2012 O. bicolor Jari INPA 5226 F 2n=80 Lira 2012 O. bicolor Purus SIS PUR M-153 F O. bicolor Purus SIS PUR M-152 F 2n=80 Neste estudo O. bicolor Tapajós SIS TAP M-253 M 2n=80 O. rex Jari INPA 5049 F 2n=62 Lira 2012 O. rutilus Rio Negro SIS SIS M-90 F O. rutilus Jatapú SIS JAT M-17 F O. rutilus Jatapú SIS JAT M-23 M 2n=54 Lira 2012 O. rutilus Jatapú SIS JAT M-29 M 2n=54 Lira 2012 O. rutilus Rio Negro SIS SIS M-56 F 2n=54 Lira 2012 O. rutilus Rio Negro SIS SIS M-59 F O. rutilus Rio Negro SIS SIS M-83 M O. rutilus Rio Negro SIS SIS M-80 F O. rutilus Rio Negro SIS SIS M-81 F O. rutilus Rio Negro SIS SIS M-82 F O. rutilus Rio Negro SIS SIS M-91 F O. rutilus Rio Negro SIS SIS M-115 M O. rutilus Jari INPA 5236 F O. rutilus Cuieiras EE-195 F 2n=54 Neste estudo O. rutilus Cuieiras EE-199 M 2n=54 Neste estudo O. rutilus Cuieiras EE-212 M

Anexo 2. Mapa da região Amazônica com as localidades de coleta dos espécimes cariotipados e/ou sequenciados neste estudo. Foram amostradas as margens direita e esquerda dos seguintes localidades: 1) Rio Jatapú; 2) Rio Negro; 3) Rio Purus; 4) Rio Cuieiras; 5) Rio Tapajós; 6) Rio Jari; 7) Rio Trombetas.

Anexo 3. Sequências de COI de várias espécies de Oecomys provenientes do GenBank, utilizadas para fins comparativos com este trabalho. ESPÉCIE VOUCHER LOCALIZAÇÃO GEOGRÁFICA COLETOR O. auyantepui JQ601277.1 Suriname – Sipaliwini river camp Lim, B.K., Joemratie, S.A. O. auyantepui JQ601224.1 Suriname – Sipaliwini river camp Lim, B.K., Joemratie, S.A. O. auyantepui JQ601188.1 Suriname – kutari river camp Lim, B.K., Joemratie, S.A. O. auyantepui JQ601163.1 Suriname – kutari river camp Lim, B.K., Joemratie, S.A. O. auyantepui JQ601162.1 Suriname – kutari river camp Lim, B.K., Joemratie, S.A. O. auyantepui JQ601061.1 Suriname: Brownsberg Nature Park Fitzgerald, K., Mitro, S. O. auyantepui JQ601060.1 Suriname: Brownsberg Nature Park Fitzgerald, K., Mitro, S. O. auyantepui JQ601049.1 Suriname: Brownsberg Nature Park Fitzgerald, K., Mitro, S. Suriname: Sipaliwini, Kushere Landing, O. auyantepui HQ545642.1 Lim, B.K., Engstrom, M.D., Arcila, L. Sipaliwini River O. auyantepui HQ545608.1 Suriname Lim, B.K., Engstrom, M.D., Arcila, L. O. auyantepui HQ545608.1 Suriname Lim, B.K.: Engstrom, M.D., Arcila, L. Guyana: Upper Demerara-Berbice, West O. auyantepui JF491641.1 Lim, B.K., Rap C.I., Norman, Z. Pibiri, Mabura Engstrom, M.D., Lim, B.K., Dowler, R.C., O. auyantepui JF491640.1 Guyana: Upper Takutu-Upper Essequibo Boyd, A., Maxwell, T.C. Engstrom, M.D., Lim, B.K., Dowler, R.C., O. auyantepui JF491639.1 Guyana: Upper Takutu-Upper Essequibo Boyd, A., Maxwell, T.C. O. auyantepui JF491638.1 Guyana: Potaro-Siparuni Lim, B.K. O. auyantepui JF491637.1 Guyana: Potaro-Siparuni Lim, B.K., King, W.R.

O. auyantepui JF491635.1 Guyana: Cuyuni-Mazaruni Lim, B.K., Scully, W.M.R. O. auyantepui JF491634.1 Guyana: Cuyuni-Mazaruni Lim, B.K., Jafferally, D.M. O. rutilus JQ601181.1 Suriname: Kutari River Camp Lim, B.K., Joemratie, S.A. O. rutilus JF491682.1 Guyana: Potaro-Siparuni Lim, B.K., Kilburn, W.P. Timm, R.M., Lim, B.K., Anderson, R.P., O. rutilus JF491681.1 Guyana: Potaro-Siparuni Watson, L.C. Guyana: Potaro-Siparuni Kabukalli Landing, Lim, B.K., King, W.R. O. rutilus JF491673.1 Iwokrama Forest" Guyana: Potaro-Siparuni, 'S' Falls, Lim, B.K., Scully, W.M.R., Arjoon, J.D., O. rutilus JF491671.1 SiparuniRiver, 50 Km Wsw Of Kurupukari, Jafferally, D.M. Iwokrama Reserve O. rutilus JF491670.1 Guyana: Barima-Waini, Baramita, Old World Lim, B.K., Robertson, C.J. O. rutilus JF491667.1 Guyana: Barima-Waini, Baramita, Old World Lim, B.K., Robertson, C.J. O. rutilus JF491665.1 Guyana: Upper Takutu-Upper Essequibo Lim, B.K., O'Toole, E., Robertson, C.J. Engstrom, M.D., Lim, B.K., Dowler, R.C., O. rutilus EU095454.1 Guyana: Upper Demerara-Berbice Boyd, A., Parris, R. O. rutilus EU095453.1 Ecuador: Napo Engstrom, M.D., Reid, F.A., Sornoza, F. O. bicolor JQ601078.1 Ecuador: Parque Nacional Yasuni Engstrom, M.D., Reid, F.A., Sornoza, F. O. bicolor JF491655.1 Ecuador: Napo, Parque Nacional Yasuni Engstrom, M.D., Lim, B.K., Sornoza, F. O. bicolor JF491652.1 Ecuador: Orellana, Onkone Gare Engstrom, M.D., Peters, S.L., Reid, F.A. O. bicolor JF491649.1 Guyana: Demerara-Mahaic Lim, B.K., Jafferally, D.M., Norman, Z. O. bicolor JF491648.1 Guyana: Barima-Waini Lim, B.K., Robertson, C.J.

Engstrom,M.D., Lim,B.K., Eger,J.L., O. bicolor JF491647.1 Guyana: Barima-Waini Borisenko, A.V. Engstrom, M.D., Lim, B.K., Dowler, R.C., O. bicolor JF491644.1 Guyana: Upper Takutu-Upper Essequibo Boyd, A., Maxwell, T.C. O. bicolor JF491643.1 Guyana: Potaro-Siparuni Lim, B.K., Lee, T.E., Armitano, S. O. bicolor JF491642.1 Guyana: Potaro-Siparuni Lim, B.K., Lee, T.E., Armitano, S. O. bicolor JF444363.1 Ecuador: Orellana Reid, F.A., Peters, S.L., Engstrom, M.D. O. bicolor EU096822.1 Suriname: Sipaliwini Burton, K., Lim, Alex V. Borisenko. O. bicolor EU096821.1 Suriname: Sipaliwini Burton, K., Lim, Alex V. Borisenko. O. concolor JF491662.1 Ecuador: Napo, Parque Nacional Yasuni Engstrom, M.D., Sornoza, F., Lim, B.K. O. concolor JF491661.1 Ecuador: Orellana, Onkone Gare Engstrom, M.D., Peters, S.L., Reid, F.A. O. concolor JF444368.1 Ecuador: Orellana Reid, F.A., Peters, S.L., Engstrom, M.D. Engstrom,M.D., Lim, B.K., Eger, J.L., O. rex JF491660.1 Guyana: Potaro-Siparuni Borisenko, A.V. Engstrom, M.D., Lim, B.K., Eger, J.L. O. rex JF491659.1 Guyana: Potaro-Siparuni Borisenko, A.V. O. rex JQ601068.1 Guyana: 40 Km NE of Surama Engstrom, M.D., Lim, B.K., Reid, F.A. O. rex HQ919650.1 Suriname Engstrom, M.D., Lim, B.K., Eger, J.L. O. roberti JF491663.1 Guyana: Potaro-Siparuni Borisenko, A.V. Borisenko, A.V., Lim, B.K., Ivanova, N.V., O. roberti EU095451.1 Guyana: Upper Takutu-Upper Essequibo Hanner, R.H., Hebert, P.D.N.

Borisenko, A.V., Lim, B.K., Ivanova, N.V., O. roberti EU095450.1 Guyana: Upper Takutu-Upper Essequibo Hanner, R.H., Hebert, P.D. Engstrom, M.D., Lim, B.K., Sand, A.S., Oecomys sp. JF491618.1 Ecuador: Napo, Parque Nacional Yasuni Sornoza, F. Engstrom, M.D., Lim, B.K., Eger, J.L., Oecomys sp. JF491620.1 Ecuador: Napo, Parque Nacional Yasuni Borisenko, A.V. Eger, J.L., Lim, B.K., Engstrom, M.D. Oecomys sp. JF444362.1 Ecuador: Orellana Borisenko, A.V. Eger, J.L., Lim, B.K., Engstrom, M.D. Oecomys sp. JF444361.1 Ecuador: Orellana Borisenko, A.V. Engstrom, M.D., Lim, B.K., Sand, A.S., Oecomys sp. JF491619.1 Ecuador: Napo, Parque Nacional Yasuni Sornoza, F., Allard, M.W.

Anexo 4. Distribuição das amostras de Oecomys bicolor coletadas e sequenciadas neste estudo, com a indicação geográfica dos clados obtidos na análise Bayesiana: Em verde os espécimes do nordeste amazônico formados pelo clado A, e em rosa o clado B+C representando o leste amazônico. Localidades numeradas de acordo com a Figura 1.

Anexo 5. Distribuição das amostras de Oecomys rutilus coletadas e sequenciadas neste estudo, com a indicação geográfica dos clados obtidos na análise Bayesiana: Em roxo o espécime do oeste amazônico (Clado J) e em amarelo os espécimes do leste (Clado I). Localidades numeradas de acordo com a Figura 1.