Experimentelle Untersuchungen Zur Interaktion Von Fas Mit Seinem Liganden an Normalen Und Neoplastischen Zellen Des Lympho-Hämatopoetischen Systems

Aus der Abteilung I der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg im Breisgau

Experimentelle Untersuchungen zur Interaktion von Fas mit seinem Liganden an normalen und neoplastischen Zellen des lympho-hämatopoetischen Systems

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

Vorgelegt 2000 von Manfred Richter geboren in Stuttgart

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. M. Schuhmacher

1.Gutachter: Prof. Dr. med. J. Finke

2.Gutachter: PD Dr. Hermann Eibel

Jahr der Promotion: 2002

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ...... 1

1.1 Apoptose und Nekrose...... 1 1.2 Das Fas/Fas-Ligand System...... 1 1.2.1 Das Fas-Antigen...... 1 1.2.2 Die Expression von Fas ...... 2 1.2.3 Mutation des Fas- und FasL-Gens in lpr und gld Mäusen ...... 2 1.2.4 Fas-Ligand...... 3 1.2.5 Physiologische Funktionen des Fas/FasL-Systems ...... 3 1.2.6 Homeostase peripherer T- und B-Zellen ...... 4 1.2.7 Fas-abhängige Zytotoxizität von T-Zellen ...... 5 1.2.8 FasL-Expression in immunpriviligierten Organen...... 7 1.2.9 Bedeutung der FasL-Expression in Tumoren...... 7 1.2.10 Intrazelluläre Signalkaskade des Fas-Rezeptors ...... 8 1.3 Polyklonale Antithymozytenglobuline ...... 10 1.4 Fragestellung...... 12

2 Material ...... 13

2.1 Lösungen...... 13 2.2 Chemikalien und Reagenzien ...... 14 2.3 Antikörper...... 15 2.4 Zellinien ...... 16 2.4.1 Burkitt Lymphom (BL) Zellinien...... 16 2.4.2 Myeloische Zellinien ...... 17 2.5 Patientenzellen ...... 18 2.5.1 Patienten mit CLL und Non Hodgkin Lymphomen ...... 18 2.5.2 Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie ...... 19 2.5.3 Patienten mit akuter myeloischer Leukämie ...... 19

3 Methoden...... 20

3.1 Zellkultur...... 20 3.2 Ficoll Paque Dichtezentrifugation ...... 20 3.3 Magnetische Zellsortierung (MACS) humaner Leukozyten...... 20 3.3.1 Prinzip...... 21 II

3.3.2 Isolierung unmarkierter B-Zellen...... 21 3.4 Durchflußzytometrie (FACS) ...... 22 3.5 Reverse-Transkriptase-Polymerasenkettenreaktion (RT-PCR)...... 23 3.5.1 RNA-Extraktion...... 23 3.5.2 Synthese komplementärer DNA (cDNA)...... 24 3.5.3 Fas-Ligand und PBGD-PCR ...... 25 3.6 Immunoblot (Western Blot)...... 27 3.6.1 Prinzip...... 27 3.6.2 Probenvorbereitung ...... 27 3.6.3 Gießen eines SDS-Gels ...... 27 3.6.4 Elektrophoretische Auftrennung und Transfer (Blotten) der Proteine ...... 28 3.6.5 Proteinnachweis...... 29 3.7 Apoptosenachweis ...... 29 3.7.1 Testprinzip...... 29 3.7.2 Färbung der Zellen zur zytometrischen Quantifizierung der Apoptose ...... 30

4 Ergebnisse...... 31

4.1 Restriktionsenzymanalyse der Fas Ligand PCR...... 31 4.2 Untersuchung der Fas-Ligand Expression in Zellinien und Erkrankungen der weißen Blutzellen und der blutbildenden Organe ...... 32 4.2.1 CD95L-Expression in Zellinien myeloischen Ursprungs...... 32 4.2.2 Zytometrischer Nachweis von Fas-Ligand auf CD34-positiven Stammzellen ...... 34 4.2.3 Fas-Ligand Expression bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie...... 35 4.2.4 Fas-Ligand Expression in Zellinien der B-Zellreihe ...... 36 4.2.5 Fas-Ligand Expression bei Patienten mit akuter und chronischer lymphatischer Leukämie ...... 37 4.3 Die neoplastischen B-Zellen von CLL-Patienten exprimieren keine FasL-mRNA ... 39 4.3.1 Isolierung markierter B-Zellen von Patienten mit CLL ...... 39 4.3.1 Isolierung unmarkierter B-Zellen von CLL-Patienten und gesunden Spendern ..... 39 4.4 Nachweis von FasL auf Proteinebene (Immunoblot) ...... 43 4.5 Funktioneller Nachweis von Fas-Ligand...... 44 4.5.1 Jurkatzellen als Zielzellen für die Fas-vermittelte Apoptose ...... 44 4.5.2 Kultur von Jurkatzellen mit myeloischen Zellinien ...... 45 4.5.3 Kultur von Jurkatzellen mit stimulierten K562 ...... 46 4.5.4 Kultur von Jurkatzellen mit der LCL-Zellinie Rei ...... 47 III

4.5.5 Kokultur von Jurkatzellen mit Zellen eines Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie vom T-Zelltyp (T-ALL)...... 48 4.6 Antithymozytenglobuline ...... 49 4.6.1 T-Zellen und die Fas-vermittelte Apoptose...... 49 4.6.2 Apoptoseinduktion durch ATG ...... 50 4.6.3 Die Funktion des Fas/FasL-Systems bei der ATG-vermittelten Apoptose ...... 52 4.6.4 ATG-Nachweis in Patientenplasma nach Transplantation...... 53 4.6.5 Apoptoseinduktion durch ATG-haltiges Serum nach Transplantation ...... 54

5 Diskussion...... 56

5.1 Exprimieren Tumorzellen konstitutiv Fas-Ligand?...... 56 5.2 Das Fas/FasL-System und Immunprivileg...... 60 5.3 FasL-Expression in myeloischen Zellinien...... 61 5.4 Antithymozytenglobuline ...... 64 5.4.1 Das Fas/FasL-System und Antithymozytenglobuline ...... 64 5.4.2 ATG-Nachweis in Serumproben nach Knochenmarktransplantation ...... 67 5.4.3 Zytotoxizität von Serum-ATG nach Transplantation...... 68

6 Zusammenfassung ...... 69

7 Literatur ...... 70

8 Lebenslauf ...... 86 IV

Abkürzungsverzeichnis

ALL Akute lymphatische Leukämie AML Akute myeloische Leukämie APS Ammoniumpersulfat ATG Antilymphozyten(-thymozyten)globuline ATP Adenosintriphosphat BCR B-Zellrezeptor BL Burkitt-Lymphom BSA Rinderserumalbumin CC zentrozytisch (Kiel Klassifikation) CD Cluster of Differentiation cDNA komplementäre Desoxyribonucleinsäure CLL Chronische lymphatische Leukämie CML Chronische myeloische Leukämie CTL Zytotoxische T-Lymphozyten CTP Cytidintriphosphat DEPC Diethylpyrocarbonat DNA Desoxyribonucleinsäure EDTA Ethylendiamintetraacetat EGTA Ethylenglykol-bis(β-Aminoethylether)- N,N,N‘,N‘-Tetraacetatsäure FasL Fas-Ligand FCS Foetales Kälberserum GTP Guanosintriphosphat HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N‘-2- Ethansulfonsäure]) kD Kilodalton LT Lymphotoxin MHC Major Histocompatibility Complex nd not done NEAA Non Essential Aminoacids NGF Nervenwachstumsfaktor V

NHL Non Hodgekin Lymphom NK Natürliche Killerzellen NTP Nucleosidtriphosphate PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PBGD Phorphobilinogendesaminase PBMC Peripherial Blood Mononuclear Cells PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerasenkettenreaktion PHA Phytohemagglutinin PMA Phorbol-12-Myristat-13-Acetat PS Phosphatidylserin RNA Ribonukleinsäure RT-PCR Reverse Transkriptase PCR SDS Sodiumdodecylsulfat SLE Systemischer Lupus erythematodes TEMED N,N,N‘,N‘ Tetramethylethylendiamin TNF Tumornekrosefaktor TTP Thymidintriphosphat 1.Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Apoptose und Nekrose

Die Homeostase von Säugetiergeweben wird nicht nur durch die Zellproliferation und - differenzierung gesteuert, sondern auch durch den Zelltod (Raff, M. C., 1992). Es gibt zwei verschiedene Todesmechanismen – die Nekrose und die Apoptose (Walker, N. I. et al., 1988; Wyllie, A. H. et al., 1980). Der Zelltod während der Embryogenese, der Metamorphose und des normalen Gewebeumsatzes wird programmierter Zelltod genannt. Der größte Teil des programmierten Zelltodes während der normalen Säugetierentwicklung erfolgt durch Apoptose. Die Apoptose kann morphologisch und biochemisch von der Nekrose unterschieden werden, die bei einem pathologischen Zelltod als ein Ergebnis von physikalischen oder chemischen Reizen, Kontakten zu bestimmten Toxinen oder lytischen viralen Infekten auftritt. Die Apoptose wird von einer Kondensation und Segmentation des Zellkerns, einem Verlust der Plasmamembranmikrovilli, sowie einer Degradierung chromosomaler DNA begleitet. Ein weiteres, sehr frühes Merkmal ist der Verlust der Asymmetrie der Plasmamembran mit der Exposition von Phosphatidylserin an die Zelloberfläche. Neben der Entwicklung spielt Apoptose auch in anderen Systemen eine wichtige Rolle. Die Tumorregression durch das Immunsystem wird auch durch Apoptose vermittelt. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) oder natürliche Killerzellen (NK), der TNF oder das Lymphotoxin induzieren den programmierten Zelltod ihrer Zielzellen (Nagata, S., 1994).

1.2 Das Fas/Fas-Ligand System

1.2.1 Das Fas-Antigen

Das Fas-Antigen (Fas, CD95) (Yonehara, S. et al., 1989), das auch als APO-1 bezeichnet wird (Trauth, B. C. et al., 1989), ist ein Protein an der Zelloberfläche, das zur TNF/NGF- Rezeptorfamilie gehört (Itoh, N. et al., 1991; Oehm, A. et al., 1992). Zu dieser Rezeptorfamilie gehören zwei TNF-Rezeptoren (Typ I und Typ II) (Schall, T. J. et al., 1990; Smith, C. A. et al., 1990), der NGF-Rezeptor (Johnson, D. et al., 1986), das B-Zellantigen CD40 (Stamenkovic, I. et al., 1989), das T-Zellantigen OX40 (Mallett, S. et al., 1990), CD27 (Camerini, D. et al., 1991), 4-1BB (Kwon, B. S. et al., 1989) und das Hodgkin Lymphom- 1.Einleitung 2

Oberflächenantigen CD30 (Durkop, H. et al., 1992). Die Extrazellularregionen der Mitglieder dieser Familie sind reich an der Aminosäure Cystein und teilen sich in 3 bis 6 Untereinheiten. Die Aminosäuresequenz der Extrazellularregion ist im Gegensatz zur Intrazellularregion mit 25-30% Homologie relativ konserviert (Itoh, N. et al., 1991). Fas, CD40, CD27 und CD30 sind Proteine, die durch spezifische monklonale Antikörper erkannt werden. Die molekulare Klonierung der Liganden für CD40, CD27, CD30, 4-1BB und Fas zeigte, daß diese TNF- verwandte Typ II Mebranproteine einer neuen Zytokinfamilie darstellen (Armitage, R. J. et al., 1992; Goodwin, R. G. et al., 1993; Smith, C. A. et al., 1993).

1.2.2 Die Expression von Fas

Aktivierte humane T- und B-Zellen exprimieren reichlich Fas (Trauth, B. C. et al., 1989). Lymphoblastoide Zellen, die mit dem humanen T-Zell-Leukämievirus (Debatin, K. M. et al., 1990) oder Epstein-Barr-Virus (EBV) (Falk, M. H. et al., 1992) transformiert wurden, exprimieren hoch Fas. Die Verteilung von Fas in normalem Gewebe wurde an der Maus untersucht (Watanabe-Fukunaga, R. et al., 1992a). Fas-mRNA fand sich reichlich im Thymus, Herz, Leber und Ovar, nicht dagegen im Gehirn, Knochenmark und der Milz. In Thymozyten findet man Fas in allen Populationen mit Ausnahme der doppelt negativen (CD4- und CD8-) Thymozyten (Drappa, J. et al., 1993).

1.2.3 Mutation des Fas- und FasL-Gens in lpr und gld Mäusen

Mäuse, die für die Genmutation lpr (lymphoproliferation) oder gld (generalized lymphoproliferative disease) homozygot sind, entwickeln eine Lymphadenopathie mit Ansammlung von CD4-/CD8- T-Lymphozyten und leiden an einer Autoimmunkrankheit, die dem humanen systemischen Lupus erythematodes (SLE) ähnlich ist (Cohen, P. L. et al., 1991). Lpr-Mäuse haben eine Mutation des Apoptose-vermittelnden Fas-Proteins (Watanabe- Fukunaga, R. et al., 1992b), gld-Mäuse eine Punktmutation des Fas-Liganden (Lynch, D. H. et al., 1994; Takahashi, T. et al., 1994a). Das klinische Syndrom von lpr-Mäusen, welches dem in gld-Mäusen gleicht, ist durch eine Hypergammaglobulinämie, anti-DNA-Antikörper, Rheumafaktoren und zirkulierende Immunkomplexe, eine Arthritis, sowie Glomerulonephritis gekennzeichnet, welche dem SLE beim Menschen ähnelt (Cohen, P. L. et al., 1991). Zahlreiche autoreaktive T-Lymphozyten in den peripheren Organen scheinen für die Autoimmunkrankheit in lpr-Mäusen verantwortlich zu sein. Untersuchungen von lpr-Mäusen deuten auf einen Defekt in der Negativselektion autoreaktiver T-Lymphozyten im Thymus hin 1.Einleitung 3

(Matsumoto, K. et al., 1991; Zhou, T. et al., 1991). Dies weist auf eine Beteiligung des Fas/Fas-Ligand Systems bei der Entwicklung und Selektion von T-Zellen hin. Mutationen des Fas-Genes sind auch beim Menschen beschrieben, die wie bei lpr-Mäusen, zu einen lymphoproliferativen Syndrom mit Störungen der Autoimmunität führen (Fisher, G. H. et al., 1995; Rieux-Laucat, F. et al., 1995).

1.2.4 Fas-Ligand

Fas-Ligand (FasL) ist ein Typ II Membranprotein mit 278 Aminosäuren, das zur TNF-Familie gehört. Zu dieser Familie gehören neben FasL auch der TNF, Lymphotoxin (LT) und die Liganden für CD40, CD30, CD27 und 4-1BB. Die Bindung von FasL an seinen natürlichen Fas-Rezeptor induziert den programmierten Zelltod (Apoptose) der Fas-tragenden Zielzelle. Anti-Fas-Antikörper können die Wirkung von FasL imitieren und bei Bindung an den Fas- Rezeptor Apoptose induzieren.

1.2.5 Physiologische Funktionen des Fas/FasL-Systems

Das Fas-Gen entspricht dem Gen der lpr-Mutation in Mäusen. Da lpr-Mäuse eine Lymphadenopathie und Störungen der Autoimmunität zeigen, spielt das Fas/FasL-System eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Reifung der T-Zellen. Unreife T-Zellen sterben bei mindestens zwei Schritten während ihrer Reifung im Thymus durch Apoptose ab. Diejenigen T-Zellen, die eigene MHC-Antigene nicht erkennen werden „vernachlässigt“ und sterben, während T-Zellen, die eigene MHC-Antigene erkennen, durch einen Prozeß deletiert werden, der als Negativselektion bezeichnet wird. Untersuchungen von T-Zellen des Thymus in lpr-Mäusen, die wie oben beschrieben eine Mutation des Fas-Genes besitzen, deuten darauf hin, daß die „vernachlässigten“ Thymozyten in lpr-Mäusen der Apoptose entgehen und in die Peripherie wandern.

1.Einleitung 4

1.2.6 Homeostase peripherer T- und B-Zellen

Das Fas/FasL-System spielt aber auch in der Regulation der Immunantwort und Homeostase peripherer T- und B-Zellen eine wichtige Rolle. Die Apoptose von T-Zellen kann durch die Hochregulation der FasL-Expression durch Stimulation der T-Zellen vermittelt werden; FasL bindet dann an Fas, um in diesen T-Zellen Apoptose zu induzieren. Einzelzelluntersuchungen zeigen, daß dies nicht an Zellkontakte gebunden ist, sondern autokrin geschieht, die T-Zellen also „Selbstmord“ begehen.

Fas Aktivierung TCR Target T FasL

Abbildung 1: Regulation der Immunantwort durch T-Zellen. T-Zellen exprimieren Fas und FasL nach Aktivierung. Die gesteigerte Fas-Expression erhöht die Empfindlichkeit der T- Zelle für die FasL-induzierte Apoptose und liefert einen Weg zur Regulierung der T- Zellimmunantwort, die sonst für den Organismus potentiell gefährlich wäre (Brunner, T. et al., 1995; Dhein, J. et al., 1995; Scott, D. W. et al., 1996).

Darüber hinaus können T-Zellen, die FasL exprimieren, für andere Zellen wie z. B. B-Zellen zytotoxisch sein. Das Fas/FasL-System und CD40L tragen beide zur klonalen Proliferation Fremdantigen-reaktiver B-Zellen durch CD4+ T-Zellen bei, während autoreaktive B-Zellen, die körpereigene Antigene erkennen, durch ein Zusammenspiel von FasL und CD40L selektiv durch CD4+ T-Zellen eliminiert werden. Entscheidend für das Schicksal der B-Zellen ist der B-Zell-Rezeptor (BCR). Tolerante oder selbstreaktive B-Zellen unterscheiden sich von Fremdantigen-reaktiven B-Zellen durch einen Block des BCR-Signalweges (Cooke, M. P. et al., 1994). Die adäquate Stimulation der B-Zellen durch den BCR schützt die Fremdantigen- reaktiven B-Zellen bei der Interaktion mit den CD4+ T-Zellen vor Apoptose, während selbstreaktive B-Zellen via Fas/FasL-Interaktion abgetötet werden (Rathmell, J. C. et al., 1995; Rathmell, J. C. et al., 1996).

1.Einleitung 5

TCR FasL Fas B Expansion Signal TH1 CD40L CD40 Proliferation

BCR

Fremdantigen

TCR FasL Fas B Apoptose TH1 CD40L CD40

BCR

Selbstantigen kein Antigen

Abbildung 2: Rolle von Fas/FasL und CD40 bei der Interaktion von T- und B-Zellen. Die Aktivierung der T-Zelle führt zur Expression von CD40L und FasL. Die B-Zell/T-Zell- Interaktion via CD40 und CD40L führt zu einer Hochregulation von Fas und größerer Empfindlichkeit für den Fas-vermittelten Zelltod. Die B-Zellen, die vorher eine adäquate Stimulation ihres B-Zellrezeptors (BCR) durch ein Fremdantigen erfahren haben, sind vor der Apoptose geschützt. Autoreaktive B-Zellen dagegen, deren BCR desensibilisiert ist, oder B-Zellen, die kein Fremdantigen erkennen, werden über den Fas/FasL-Interaktion abgetötet. Damit wird sichergestellt, daß nur B-Zellen, die Fremdantigene erkennen, proliferieren und Antikörper produzieren (Rathmell, J. C. et al., 1996).

1.2.7 Fas-abhängige Zytotoxizität von T-Zellen

Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) stellen einen wichtigen Arm des Immunsystems bei der Elimination viral infizierter Zellen dar. Die CTL können ihre Zielzellen spezifisch erkennen und lysieren. Hierzu verfügen sie über 2 Mechanismen – einem kalziumabhängigen, der auf der Wirkung von Perforin/Granzym basiert und einem kalziumunabhängigen, der über die Interaktion von Fas mit seinem Liganden beruht (Kagi, D. et al., 1994a). In Anwesenheit von EGTA-Mg2+, das die zytotoxische Wirkung von Perforin/Granzym blockiert, konnte gezeigt werden, daß die antigenspezifische Zytotoxizität von in vitro und in vivo gezogenen CTL über den Fas-Rezeptor erfolgt (Kagi, D. et al., 1994a; Rouvier, E. et al., 1993). Neben den CTL können auch die klassischen Subpopulationen (Mosmann, T. R. et al., 1991) der CD4+ 1.Einleitung 6

T-Helferzellen FasL exprimieren und zytotoxische Wirkung zeigen, wobei TH1 Zellen dies in einem stärkeren Ausmaß tun als TH2-Zellen (Ju, S. T. et al., 1994; Ramsdell, F. et al., 1994). Keine dieser Subpopulationen zeigt eine Perforin/Granzym-vermittelte Zelllyse. Im Gegensatz hierzu zeigen CD8+ Zellen, die professionellen CTL, sowohl eine Fas- als auch eine Perforin/Granzym-vermittelte Zytotoxizität (Ju, S. T. et al., 1994; Rouvier, E. et al., 1993; Stalder, T. et al., 1994)

Effektorzelle (CTL)

FasL-Gen

Aktivierung

FasL TCR

MHC/ Selbst- oder Tumorantigen Fas

Apoptose

Targetzelle

Abbildung 3: Model für die Fas-vermittelte Zytotoxizität von CTL. Das Antigen, das durch MHC auf der Zielzelle (Targetzelle) präsentiert wird, wird von dem TCR-CD3 Komplex auf der Oberfläche der Effektorzelle erkannt. Der TCR-CD3 Komplex transduziert ein Signal in den Zellkern, das insbesondere zur Transkription von FasL-mRNA führt. Die Bindung von FasL-Protein an seinen Rezeptor (Fas) führt dann zum Zelltod der Targetzelle (Nagata, S., 1994). 1.Einleitung 7

1.2.8 FasL-Expression in immunpriviligierten Organen

Die FasL-Expression ist nicht nur auf die Zellen des Immunsystems beschränkt. Funktioneller FasL wurde auch in immunpriviligierten Organen wie der vorderen Augenkammer (Griffith, T. S. et al., 1995), den Sertoli-Zellen des Hodens (Bellgrau, D. et al., 1995), sowie in der Plazenta und im Uterus (Hunt, J. S. et al., 1997) nachgewiesen. Der Hoden ist immunpriviligiert, weil allogene und sogar xenogene Transplantate praktisch unbegrenzt in den Empfängern überleben. Hodengewebe von gld-Mäusen, das über kein funktionelles FasL- Protein verfügt, wird abgestoßen, was auf die wichtige Rolle des Fas/FasL-Systems bei der Schaffung immunpriviligierter Gewebe deutet (Hunt, J. S. et al., 1997). Ein möglicher Mechanismus stellt die Apoptoseinduktion bei infiltrierenden, Fas-positiven aktivierten T- Zellen des Empfängers dar, die als Antwort auf die Fremdantigene entstehen.

1.2.9 Bedeutung der FasL-Expression in Tumoren

Hämatologische Neoplasien waren unter den ersten malignen Erkrankungen, die auf FasL- Expression hin untersucht (Ohshima, K. et al., 1997; Perzova, R. et al., 1997; Tanaka, M. et al., 1996; Villunger, A. et al., 1997). Die häufige Positivität dieser Neoplasien stellt wahrscheinlich den konservierten Phänotyp der Ursprungszellen dar, die häufig CD95L entweder konstitutiv oder nach Stimulation exprimieren (Walker, P. R. et al., 1998).

In den letzten Jahren wurden auch bei vielen soliden Tumoren FasL nachgewiesen. Unter diesen Tumoren befanden sich Adenokarzinome des Kolons (O'Connell, J. et al., 1996), Melanome (Hahne, M. et al., 1996), Basaliome (Gutierrez-Steil, C. et al., 1998), hepatozelluläre Karzinome (Strand, S. et al., 1996), Astrozytome (Saas, P. et al., 1997), Plattenepithelkarzinome an Kopf und Hals (Gastman, B. R. et al., 1999), Adenokarzinome des Pankreas (Satoh, K. et al., 1999; Ungefroren, H. et al., 1998; von Bernstorff, W. et al., 1999), Lungentumore (Kawasaki, M. et al., 2000; Niehans, G. A. et al., 1997) und Mammakarzinome (Mullauer, L. et al., 2000) Verschiedene Untersucher konnten zeigen, daß das von den Tumorzellen produzierte FasL-Protein funktional ist, d. h. bei Fas- exprimierenden Zellen Apoptose induzieren kann. Die Verwendung von T-Zellinien durch einige Untersucher (Niehans, G. A. et al., 1997; O'Connell, J. et al., 1996; Saas, P. et al., 1997) als Targetzelle zusammen mit der Rolle von FasL in immunpriviligierten Geweben führten zu der Hypothese, daß FasL-exprimierende Tumorzellen sich dem Zugriff des Immunsystems entziehen, indem sie bei tumorinfiltrierenden T-Zellen den programmierten 1.Einleitung 8

Zelltod induzieren (O'Connell, J. et al., 1996). Diese Hypothese wurde auch als „reversed killing“ bezeichnet.

1.2.10 Intrazelluläre Signalkaskade des Fas-Rezeptors

Die intrazelluläre Signalkaskade nach der Bindung von Fas-Ligand an den Fas-Rezeptor beginnt mit der Interaktion der Todesdomäne des Fas-Rezeptors mit FADD (Fas-associating protein with death domain). FADD ist dann für die Spaltung und Aktivierung der ersten Cystein-Protease (Caspase) verantwortlich. Die Aktivierung einer Reihe von Caspasen mündet schließlich in den Prozeß des Zelltodes (Miller, D. K., 1997). Die Rolle des Fas/FasL- Systems bleibt aber nicht auf das Immunsystem beschränkt. Fas wurde in vielen Geweben, die einen ständigen Zellumsatz aufweisen, wie Kolonepithel, Hepatozyten, Milz, Thymus, Pankreas und Prostata nachgewiesen (French, L. E. et al., 1996; Strand, S. et al., 1996; von Reyher, U. et al., 1998). In diesen Geweben könnte das Fas/FasL-System am Schluß anderer zellulärer Kontrollmechanismen wie z. B. c-Myc oder p53 stehen und als allgemeiner Zelltodmechanismus in Antwort auf Mangel oder Entzug von Überlebenssignalen wie z. B. Wachstumsfaktoren in der Mikroumwelt funktionieren (French, L. E. et al., 1996; Green, D. R., 1997; Hueber, A. O. et al., 1997). Es konnte auch gezeigt werden, daß das Fas/FasL- System die Proliferation von Tumorzellen reguliert. Die Transfektion von Kolonkarzinomzellen mit dem wilden Typ von p53 resultiert in die Fas-vermittelte Apoptose (Tamura, 1995, Oncogene). Zytotoxische Medikamente und γ-Strahlung aktivieren zumindest teilweise die Fas-vermittelte Zytolyse über das p53 System (Friesen, C. et al., 1996; Muller, M. et al., 1997; Reap, E. A. et al., 1997). Das Fas/FasL-System hat daher eine wichtige Rolle bei der Homeostase als Mittler zwischen Signalen, die wie Bcl-2 den programmierten Zelltod verhindern und Signalen, die wie Bax oder p53 den Zelltod fördern oder gar induzieren (Houghton, J. A. et al., 1997)(Tamura 1995 Oncogene).

Das Zusammenspiel von Bax mit Bcl-2 und Bcl-XL bildet eine Balance, die für das Schicksal der Zelle entscheidend ist. Es wurde gezeigt, daß die Proteine Bcl-2 und Bcl-XL die Aktivierung der Caspasen blockieren und damit den Zelltod verhindern (Reed, J. C., 1997).

Bcl-2 und Bcl-XL sind an der äußern Mitochondrienmembran, im endoplasmatischen Retikulum und der Kernhülle lokalisiert (Minn, A. J. et al., 1997). Doch nicht alle Mitglieder der Bcl-2 Gruppe besitzen anti-apoptotische Wirkung; so konnte gezeigt werden, daß Bax den programmierten Zelltod fördert. 1.Einleitung 9

FasL Fas

FADD Proteasenkaskade (Caspase 8, 1, 3) Bcl-2

Bcl-XL Proteolyse und Zelltod BAX p53 c-Myc

Fas

FasL

Abbildung 4: Die Apoptosekaskade. Die Balance wird gehalten von Bcl-2 und Bcl-XL, die die Zelle vor Apoptose schützen und Bax, p53, c-Myc und FasL, die den programmierten Zelltod fördern bzw. induzieren. Beide Systeme laufen bei der Caspasenaktivierung zusammen. Die Apoptosekaskade ist in der Entwicklungsgeschichte konserviert und kommt in T-Zellen sowie vielen anderen Zellen vor (Chappell, D. B. et al., 1998). 1.Einleitung 10

1.3 Polyklonale Antithymozytenglobuline

Polyklonale Antithymozyten- bzw. Antilymphozytenglobuline (ATG) sind potente Immunsuppressiva, die seit Ende der 60er Jahre in der Transplantation verwendet werden. Sie sind effektiv in der Behandlung akuter Abstoßungsreaktionen, Graft versus Host Reaktionen (Finke, J. et al., 1997; Slavin, S. et al., 1998) oder in der prophylaktischen Behandlung von Abstoßungsreaktionen. Als Alternative zu den ATG wurde der monoklonale Antikörper OKT3 in der Organtransplantation verwendet (Ortho Multicenter Transplant Study Group, 1985; Debure, A. et al., 1988). Klinische Studien zeigten jedoch eine Überlegenheit von ATG sowohl bei der Prophylaxe als auch bei der Behandlung akuter Abstoßungsreaktionen im Vergleich zu OKT3-Antikörper (Bock, H. A. et al., 1995).

Der genaue Wirkungsmechanismus der Antilymphozytenglobuline ist noch nicht genau definiert. Die starke Lymphozytopenie dürfte jedoch hauptsächlich zu dem immunsuppressiven Effekt beitragen. Verschiedene Mechanismen wurden zur Erklärung der Lymphozytendepletion vorgeschlagen, einschließlich der komplement-vermittelten Zytolyse oder der Beseitigung der Lymphozyten durch Opsonierung und Phagozytose durch Makrophagen (Bonnefoy-Berard, N. et al., 1996).

Antithymozytenglobuline stellen eine Mischung aus Antikörpern gegen unterschiedliche Oberflächenantigene dar (Bonnefoy-Berard, N. et al., 1991; Raefsky, E. L. et al., 1986; Rebellato, L. M. et al., 1994). Neuere Untersuchungen zeigen, daß Antikörper gegen HLA Klasse I (Genestier, L. et al., 1997; Skov, S. et al., 1997; Woodle, E. S. et al., 1997), CD2 (Mollereau, B. et al., 1996; Wesselborg, S. et al., 1993), CD30 (Lee, S. Y. et al., 1996), CD45 (Klaus, S. J. et al., 1996) und CTLA-4 (Gribben, J. G. et al., 1995) bei T-Zellen in der Lage sind, den programmierten Zelltod zu induzieren. Antikörper gegen CD2, CD3, CD45 und gegen HLA-Moleküle wurden in ATG identifiziert; die ATG könnten also durch ihre Bindung an diese Moleküle in ruhenden oder aktivierten T-Zellen oder beiden ein Apoptosesignal triggern. Darüber hinaus enthalten ATG Antikörper gegen CD2 und CD3, die die mitogenen Eigenschaften erklären (Bonnefoy-Berard, N. et al., 1991). Die wiederholte Aktivierung reifer T-Zellen durch CD2 oder CD3 resultiert in der Apoptose aktivierter T-Zellen. Dieser aktivierungsinduzierte Zelltod wird vor allem durch die Interaktion von Fas mit seinem Liganden (CD95L) getriggert. Noch wenig ist derzeit bekannt, inwieweit ATG in der Lage ist, via Fas/FasL Apoptose bei T-Zellen zu induzieren. Dies veranlaßte uns, die ATG-induzierte 1.Einleitung 11

Apoptose an Jurkatzellen, einer humanen T-Zellinie, sowie aktivierten und ruhenden T-Zellen zu untersuchen. Neben diesen Analysen in vitro untersuchten wir die Wirkung von ATG in vivo. T-Zellen wurden mit Seren von Patienten nach Transplantation, die ATG erhalten hatten, inkubiert und die Apoptoserate mit einer Annexinfärbung bestimmt. Parallel wurde die Bindung der Antithymozytenglobuline auf der Zelloberfläche mit einem Sekundärantikörper nachgewiesen. 1.Einleitung 12

1.4 Fragestellung

Aus dem gesagten ergab sich folgende Zielsetzung für diese Arbeit:

I. Nachweis von Fas und FasL auf RNA- und Proteinebene mittels der reversen Transkriptase PCR und dem Western Blot Verfahren

II. Untersuchung von verschiedenen Zellinien (Burkitt-Lymphom und lymphoblastoiden Zellinien) auf die Fas/FasL-Expression

III. Screening von klinischen Proben von Patienten mit akuter und chronischer lymphatischer Leukämie sowie von Patienten mit akuter und chronischer myeloischer Leukämie auf die Expression von FasL

IV. Funktioneller Nachweis des FasL-Proteins durch Kokulturversuche (Zytotoxizitätstest) mit folgender Zielsetzung a) Nachweis der Apoptoseinduktion durch das FasL-Protein b) Untersuchung der Frage, ob FasL-exprimierende Tumorzellen in der Lage sind, in T-Zellen den programmierten Zelltod zu induzieren (reversed killing) als möglichen Immune „escape“ Mechanismus

V. Untersuchung der Beteiligung des Fas/FasL-Rezeptorsystems an der immunsuppressiven Wirkung von Antithymozytenglobulinen

2.Material 13

2 Material

2.1 Lösungen

Annexin-Bindungspuffer (1X) 10mM Hepes/NaOH, pH 7,0 140mM NaCl

2,5mM CaCl2 DEPC-Wasser 1 l dest. Wasser 1 ml DEPC (1:1000) Über Nacht bei 37°C Autoklavieren

EDTA 0,5 M (pH 8,0) 186,1g EDTA in 800 ml Wasser 20g NaOH-Plätzchen Einstellung des pH auf 8,0

Ethidiumbromidlösung 10mg/ml

Gelladepuffer 0,25% Bromphenolblau

40% Sucrose in H20 Lower-Tris (4X) 1 l 181,7g Tris (1,5 M) auf 800 ml mit Wasser auffüllen Einstellung auf pH 8,8 40 ml SDS (10%)

Running Puffer (10X) 1 l 30 g Tris (0,24 M) 144 g Glycin 10 g SDS

SDS-Puffer (Laemmli) (3X) 100ml 3 g SDS (3%) 3 ml β-Mercaptoethanol 20 ml 0,5 M EDTA pH 8 (10mM) 20 ml Glycerol (20%) 2.Material 14

0,5 g Bromphenolblau (0,5%) TBE-Puffer (20X) 216g Trisbase 110g Borsäure 80 ml 0,5 M EDTA

Transblot Puffer (1X) 1 l 5,81 g Tris (48mM) 15,02 g Glycin (200mM) 4 g SDS 200 ml Methanol (20%)

Upper-Tris (4X) 1 l 60,6g Tris (0,5 M) Einstellung pH auf 6,8 40 ml SDS (10%)

2.2 Chemikalien und Reagenzien

Agarose Gibco Paisley, Großbritannien Annexin V-FITC Kit Bender MedSystems Wien, Österreich Borsäure Merck Darmstadt, Deutschland Bovines Serum Albumin Sigma St. Louis, USA Chloroform J.T.Baker, Holland Deveter, Niederlande Desoxynucleotidtriphosphate, GeneAmp® Perkin Elmer New Jersey, USA Diethylpyrocarbonat Sigma St. Louis, USA Dimethylsulfoxid Sigma St. Louis, USA ECL® Amersham Life Sciences Buckinghamshire, England EDTA Sigma St. Louis, USA Ethanol J.T.Baker, Holland Deveter, Niederlande Ethidiumbromid Sigma St. Louis, USA Fetales Kälberserum (FCS) PAN-Systems GmbH Aidenbach, Deutschland Ficoll Paque® Pharmacia Biotech Deveter, Niederlande Glutamin Bio Whittaker Verviers, Belgien 2.Material 15

Hexanucleotide Boehringer Mannheim Mannheim, Deutschland Ionomycin Sigma St. Louis, USA Isopropanol J.T. Baker, Holland Deveter, Niederlande Kaleidoscope Prestained SDS-PAGE Bio-Rad Hercules, CA, USA Standards Mineralöl Sigma St. Louis, USA Na-Bikarbonat Bio-Whittaker Verviers, Belgien Non Essential Amino Acids (NEAA) Bio-Whittaker Verviers, Belgien PCR-Master Boehringer Mannheim Mannheim, Deutschland Penicillin/Streptomycin Bio-Whittaker Verviers, Belgien Phorbol 12-Myristat 13-Acetat Sigma St. Louis, USA Phosphate Buffered Saline (PBS) Bio-Whittaker Verviers, Belgien Phytohemagglutinin (PHA-P) Sigma St. Louis, USA Primer Biologisches Institut, Freiburg, Deutschland Freiburg, Dr. Igloi Reverse Transkriptase (M-MuLV) Gibco Paisley, Großbritannien RNAse Inhibitor Boehringer Mannheim Mannheim, Deutschland RNAzolTM Biozol Cincinnati, Ohio, USA RPMI 1640 Bio Whittaker Verviers, Belgien Streptavidin-PE Pharmingen San Diego, CA, USA

2.3 Antikörper

Firma Antikörper Becton Dickinson, San Diego, CA, USA CD5-PE, CD3-PE, CD19-PE, CD13-PE,

CD20-PE, CD25-PE, IgG1-PE (Klon X40),

Simultest Control γ1/γ2a, CD3/HLA-DR, Simultest CD3/CD19 Alexis, Columbia, Maryland, USA FITC-Anti-FasL (Klon H11) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, CD19 MicroBeads Deutschland

Pharmingen, San Diego, USA FITC- u. Biotin-IgG1 (Klon MOPC-21) Biotin-Anti-FasL (NOK-1) FITC-CD95 (Klon DX2) 2.Material 16

FITC-Rat IgG2a (Klon R35-95) Anti-Human Fas Ligand (Klon G247-4) Immunotech, Marseille, Frankreich CD95 (Klon CH-11) Transduction Laboratories, Lexington, Fas-Ligand (Klon 33) Kenntucky, USA CD95 (Klon 13) Dianova, Hamburg, Deutschland FITC-Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Peroxidase-conjugated Rabbit Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) Cilag, Sulzbach, Deutschland Orthoclone® OKT 3 (Muriner monoklonaler Antikörper gegen CD3-Rezeptor) Fresenius AG, Bad Homburg, Deutschland ATG-Fresenius S (Anti-Human-T-Lympho- zyten-Immunserum vom Kaninchen)

2.4 Zellinien

2.4.1 Burkitt Lymphom (BL) Zellinien

Die folgende Tabelle zeigt die untersuchten Burkittlinien und, soweit bekannt, die Gruppeneinteilung und Oberflächenmarker. Die Burkitt Lymphomzellinien wurden freundlicherweise von Prof. George Klein, Karolinska Institut, Stockholm, Schweden zur Verfügung gestellt. Die Gruppeneinteilung (Gruppe I bis III) erfolgte nach Rowe. BL- Zellinien der Gruppe I (Keimzentrumsphänotyp) wachsen in Einzelzellsuspension, während BL-Zellinien der Gruppen II und III (aktivierter Phänotyp) in kleinen (Gruppe II) bzw. großen Klumpen (Gruppe III) wachsen (Rowe, M. et al., 1987).

Name Gruppe Fas CD EBV Akata I - + BL16 II-III +++ 19, 10, 40 Typ B Virus BL2 II-III + 19, 10, 40, w70 Neg BL28 Neg BL29 I-II - 19, 10, 77, 40 Typ A Virus BL60 I-II Neg BL72 III - Typ B Virus CHEP I 40 + 2.Material 17

Elija I 19, 10, 77, 40 Typ B Virus Ly67 Namalwa III ++ 40, 54, w70 Typ A Virus RAJI III + Typ A Virus Seraphin ++ Silfere ++ Solube - WW1-BL II Typ B Virus WW2-BL III Typ B Virus

2.4.2 Myeloische Zellinien

Die Zellinien HL 60 (Collins, S. J. et al., 1977) und K562 (Lozzio, C. B. et al., 1973) wurden von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DMSZ), Braunschweig, Deutschland bezogen. Die Zellinien HEL und KG1 (Koeffler, H. P. et al., 1978) wurden freundlicherweise von PD Dr. M. Lübbert, Medizinische Universitätsklinik, Freiburg zur Verfügung gestellt. Die Zellinie Mai wurde in unserem Labor aus den peripheren Zellen einer Patientin mit AML (M4) etabliert.

Name Gruppe CD Translokation Sonstiges HEL AML M6 Erythroleukämie HL 60 AML M3 13, 15, 33 Promyelozyten AML-Zellinie K562 CML 13 t(9;22) Erythroleukämie KG1 AML 13, 15, 33 Erythroleukämie Mai M4 13, 33, 7, 56, 34 Patient mit AML

2.Material 18

2.5 Patientenzellen

2.5.1 Patienten mit CLL und Non Hodgkin Lymphomen

Alle Patientenproben standen im Rahmen der Routinediagnostik zur Verfügung. Probe Geschlecht Alter WBC Lymphozyten Rai Stadium Therapie (in %) CLL1 w 59 150000 87 II keine CLL3 m 74 80500 84 III Immunglobuline CLL5 w 74 79300 87 0 keine CLL6 w 72 42400 68 0 keine CLL7 w 57 12600 77 IV Immunglobuline CLL8 m 70 84200 94 II keine CLL9 w 81 120000 97 III keine CLL10 w 45 78000 95 I keine CLL11 m 74 20300 69 I keine CLL13 m 83 19300 83 IV keine CLL14 m 71 35000 100 III 3) CLL16 w 75 34800 77 I keine CLL17 m 58 38900 74 0 keine CLL21 m 56 25900 75 0 keine CLL22 w 77 52000 89 III 1) CLL24 m 51 17900 77 II 1) CLL25 w 67 6400 31 II keine CLL54 m 54 121600 87 II 2) CLL55 w 81 134400 - II keine CLL56 m 58 83000 - IV 2) CLL57 m 73 62900 89 III keine CLL58 w 82 134000 89 II keine CLL59 w 77 35200 69 I keine CLL60 w 60 84800 91 0 keine CLL61 m 58 44000 92 0 keine CLL62 m 52 46500 85 II 2) 2.Material 19

CLL63 m 61 40700 84 I 1) CLL64 w 69 71700 86 II keine ccNHL m 65 n.b. n.b. - n.b.

1) Chlorambucil (Leukeran®) und Prednison 2) Chlorambucil (Leukeran®) 3) COP: Cyclophosphamid, Vincristin, Prednison

2.5.2 Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie

Probe Alter Geschlecht WBC Lymphozyten Blasten (%) Therapie (in %) B-ALL2 47 w 9400 8 50 ja B-ALL15 21 w 30000 10 50 ja B-ALL19 26 w 100000 - 97 keine T-ALL53 27 m 30800 n. b. n. b. n. b.

2.5.3 Patienten mit akuter myeloischer Leukämie

Probe FAB Alter Geschlecht WBC LC (%) Blasten (%) Therapie AML4 M1 23 M 18200 - 98 keine AML12 M4 30 W 12700 16 67 keine AML23 M2 16 W 17600 17 66 keine AML26 M5a 21 W 13200 5 94 keine AML31 M0 30 W 17000 - 84 ICE/HAM

3. Methoden 20

3 Methoden

3.1 Zellkultur

Alle Zellinien sowie Patientenzellen wurden in RPMI 1640 Medium (Dulbecco) mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), 1% Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin (500 U/ml), 1% nicht essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1% Natriumpyruvat und 0,5% Natriumbicarbonat kultiviert. Soweit nicht anders erwähnt wird das RPMI 1640 Medium mit den genannten Zusätzen nur noch als Medium bezeichnet. Alle Kulturen wurden in einer feuchten Atmosphäre mit 5% Kohlendioxyd bei 37°C in einem Brutschrank von Hereus gehalten. Zur Stimulation der Zellen in Kultur wurde dem Medium Phorbol-12-Myristat 13-Acetat (PMA, 10 ng/ml) sowie Ionomycin (500 ng/ml) zugefügt.

3.2 Ficoll Paque Dichtezentrifugation

Heparin-Blut oder EDTA-Blut wurden mit Verhältnis 1 : 2 mit PBS verdünnt und 15 ml vorgelegte Ficoll-Paque-Lösung (Pharmacia) mit dem Blut/PBS-Gemisch in einem 50 ml Falcon-Röhrchen vorsichtig überschichtet. Anschließend wurden die Röhrchen bei 800g 15 Minuten lang bei ausgeschalteter Bremse zentrifugiert. Die Interphase, ein weißlicher Ring, der die peripheren mononukleären Zellen enthielt, wurde abgenommen und die Zellen zweimal in PBS mit 0,1% BSA gewaschen. Das Pellet, das die Granulozyten sowie die Erythrozyten enthielt, wie auch der Überstand wurde verworfen. Die PBMC-Zellen wurden bis zur weiteren Bearbeitung (MACS-Säule) lebend in Einfriermedium in flüssigem Stickstoff, oder für die PCR pelletiert und bei –80°C gelagert.

3.3 Magnetische Zellsortierung (MACS) humaner Leukozyten

Zur Isolierung von B-Zellen wurden CD19 Microbeads (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach) verwendet. Das CD19 (Leu-12) Antigen wird bereits in einem sehr frühen Stadium der B-Lymphozytendifferenzierung exprimiert und bleibt bis zur Umwandlung des B-Lymphozyten zur Plasmazelle exprimiert. Es findet sich nicht auf T-Zellen oder normalen Granulozyten. 3. Methoden 21

3.3.1 Prinzip

Zur MACS-Trennung wurden die Zellen magnetisch mit CD19 Microbeads markiert und in einer Säule, die sich in einem magnetischen Feld befand, getrennt. Die magnetisch markierten, CD19-positiven Zellen wurden in der Säule zurückgehalten, während die nicht markierten, CD19-negativen Zellen durchliefen. Nach dem Entfernen der Säule aus dem Magnetfeld konnten die CD19-positiven Zellen aus der Säule eluiert werden. Im einzelnen wurden folgende Arbeitsschritte durchgeführt: Ficollisierte PBMC-Zellen aus antikoaguliertem Blut wurden in 80µl MACS-Puffer pro 1x107 Gesamtzellzahl resuspendiert. Dann wurden 20µl der MACS CD19 Microbeads hinzugefügt und die Zellen für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Für weniger Zellen wurden dieselben Volumina an Puffer bzw. Antikörper verwendet. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde das Antikörper/Zell-Gemisch in 20X MACS Puffer verdünnt, mit 300g für 10 min sedimentiert und in 500µl Puffer pro 1x108 Zellen resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen auf eine Säule (Typ LS+/VS+, Miltenyi Biotech), die vorher mit 3ml MACS-Puffer gespült worden war, aufgetragen. Nach der Trennung wurde die Säule aus dem Magnetfeld entfernt und die positiv selektionierten Zellen 2 mal mit je 3 ml MACS-Puffer ausgewaschen. Die Reinheit der so gewonnenen Zellfraktion wurde zytometrisch anhand der CD20 (Leu-16) Expression bestimmt. Das CD20 Antigen findet sich auf aktivierten und ruhenden B-Lymphozyten mit Ausnahme von Progenitor-B- Zellen und Plasmazellen synchron mit der Expression von Oberflächenimmunoglobulin vom Typ IgM. Eine geringe Expression von CD20 ist auf einer kleinen Untergruppe von T-Zellen beschrieben worden.

3.3.2 Isolierung unmarkierter B-Zellen

Die Isolierung unmarkierter B-Zellen erfolgte mit einem B-Zellisolationskit von Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach. Das Prinzip beruht auf einer magnetischen Depletion humaner T-Zellen, NK-Zellen, myeloiden Zellen, basophilen Granulozyten, Monozyten, dentritischen Zellen, Thrombozyten und früher Erythrozyten. Ein Cocktail hapten-konjugierter Antikörper gegen CD2, CD4, CD11b, CD16, CD36 und IgE wurde für die Entfernung der Nicht-B-Zellen verwendet. In einem zweiten Schritt wurden diese Zellen mit einem monoklonalem, magnetisch markiertem, anti-hapten Antikörper markiert. Die magnetisch markierten Zellen wurden dann entfernt, indem sie im magnetischen Feld einer MACS-Säule zurückgehalten wurden, während die B-Zell-Fraktion diese ungehindert passierte. Im einzelnen wurden die folgenden Schritte durchgeführt. Die wie oben beschrieben isolierten mononukleären Zellen 3. Methoden 22 aus peripheren Blut wurden in 60 µl MACS Puffer mit 10% gepoolten Humanserum/ 1 x 107 Zellen vermischt. Anschließend wurden je 20 µl des FcR Blocking Reagents und Hapten- Antikörper Cocktails hinzugegeben und für 10 min. bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit dem 20fachen Volumen MACS-Puffer gewaschen und nach dem letzten Waschschritt in 80 µl Puffer/ 1 x 107 Zellen resuspendiert. Darauf wurden 20 µl der MACS anti-hapten MicroBeads pro 1 x 107 Zellen hinzugegeben und für 15 min bei 4°C im Kühlschrank inkubiert. Die weitere Vorgehensweise entsprach nun der für die Positivselektion mit CD19 MicroBeads, wie sie weiter oben bereits beschrieben ist. Die Effektivität der magnetischen Separation wurde zytometrisch überprüft, indem der Anteil der CD19-positiven Zellen bestimmt wurde.

3.4 Durchflußzytometrie (FACS)

Alle untersuchten Zellen wurden nach einmaligen Waschen in PBS resuspendiert und in Konzentrationen von 1x105 bis 5x105/100µl in Eppendorfröhrchen verteilt. Anschließend wurden je 10µl des entsprechenden Antikörpers hinzugegeben und die Zellen 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Im Falle des Biotin-gelabelten Antikörperklon NOK-1 (Anti-CD95-Ligand) wurde nach 15 Minuten Inkubationzeit 5 µl Streptavidin-PE (Pharmingen) hinzugegeben und die Inkubation 15 weitere Minuten fortgesetzt. Nach erfolgter Inkubation wurden die Zellen in 1ml PBS gewaschen und bei 2100 rpm 3 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Pellets in 500 bis 1000µl PBS resuspendiert und innerhalb einer Stunde mit dem Durchflußzytometer (Becton Dickinson) untersucht.

3. Methoden 23

3.5 Reverse-Transkriptase-Polymerasenkettenreaktion (RT-PCR)

3.5.1 RNA-Extraktion

Die Isolierung von RNA wurde mit der RNAzolTM B-RNA Isolierungsmethode (Biozol) durchgeführt, die auf der Guanidinthiozyanat/Phenol-Methode basiert (Chomczynski, P. et al., 1987). Sie umfaßt insgesamt fünf Schritte: Homogenisieren, Phasenseperation, RNA- Präzipitation, Waschen und Lösen der präzipitierten RNA.

Die kultivierten Zellen wurden bei 300g in der Zentrifuge in einem 1,5 ml-Eppendorfröhrchen pelletiert und bis zum Beginn der Extraktion bei –80 °C gelagert. Das Pellet wurde in 1 ml RNAzolTM durch wiederholtes Pipettieren lysiert. Nach Zugabe von 100 µl Chloroform wurden die Proben 5 Minuten bei 4 °C auf Eis gelagert und anschließend mit 12000g bei 4 °C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation bildeten sich 2 Phasen: Die untere, blaue Phenol/Chloroform Phase und die obere, wäßrige Phase. Die RNA befand sich in der oberen Phase, wohingegen die DNA und die Proteine die Interphase und die organischen Phase bildeten. Die wäßrige Phase, welche ca. 50% des Volumens bildete, wurde vorsichtig mit 200µl-Pipettenspitzen abgenommen und in ein sauberes, autoklaviertes 1,5ml- Eppendorfröhrchen überführt. Die Präzipitation erfolgte durch die Zugabe von Isopropanol im Volumenverhältnis 1 : 1 und anschließende Lagerung der Proben bei –20 °C für mindestens 2 Stunden oder über Nacht. Nach der Fällung wurden die Proben 15 Minuten mit 12000g bei 4°C sedimentiert, der Überstand verworfen und mit 200µl 75%igen Ethanol in DEPC- behandeltem Wasser resuspendiert und erneut mit den o. g. Einstellungen zentrifugiert. Der Alkohol wurde abgenommen und das gelblich weiße RNA-Pellet 15 Minuten auf Eis getrocknet und danach in 20 µl DEPC-behandeltem Wasser aufgelöst. Zur Lösung wurden die Proben für 5 Minuten in einen auf 65°C vorgeheizten Heizblock gestellt. 2 µl der isolierten RNA wurden 1 : 200 in DEPC-behandeltem Wasser verdünnt und die Konzentration und Reinheit der RNA mit dem Photometer (Pharmacia) bestimmt, indem die Absorption bei 260 und 280 nm bestimmt wurde. 3. Methoden 24

3.5.2 Synthese komplementärer DNA (cDNA)

Soll die PCR zum Nachweis von RNA verwendet werden, muß diese zuerst in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben werden. Hierzu bedient man sich eines Enzyms, der reversen Transkriptase. Diese RNA-abhängige DNA-Polymerase kann aus Retroviren, wie z. B. dem Avian-Myeloblastose Virus und dem Moloney-Murine-Leukämie Virus (M-MLV) isoliert werden. Die RT benötigt wie die Taq-DNA-Polymerase zum Start der Synthese ein kurzes zum 3‘-Ende des Ursprungstranges komplementäres Nukleinsäurefragment. Neben der reversen Transkription weisen die AMV-RT und die M- MLV-RT eine RNAse-H-Aktivität auf, wodurch der RNA-Strang eines DNA : RNA-Hybrids degradiert und damit die Effektivität der cDNA-Synthese vermindert werden kann. Die verwendete M-MLV-RT, ein gentechnisch hergestelltes Derivat, besitzt keine RNAse-H- Aktivität mehr. Als Primer fanden Hexanucleotide Anwendung, welche sich unspezifisch an weiten Bereichen der RNA anlagern können. Das Endvolumen zur cDNA-Synthese betrug 20 µl und setzte sich wie folgt zusammen:

• 3 µg RNA

• 2 µl Hexanucleotide (in 0,5 mM Tris-HCl, 0,1 mM MgCl2, 0,001 mM Dithioerythrit (DET), Rinderserumalbumin 2 µg/ml, Hexanucleotide 0,062 A260U/µl, pH 7,2) • 8 µl dNTP (dGTP, dCTP, dATP, dTTP jeweils 200 mM) • 1 µl RNAse-Inhibitor (25 U/µl) • 5 µl DEPC-behandeltes Wasser • 1 µl M-MLV-RT

Die genannten Reagenzien wurden mit Ausnahme der reversen Transkriptase gemischt und bei 70 °C 10 min inkubiert. Danach wurden die Röhrchen auf Eis abgekühlt und die M-MLV- RT hinzugegeben und die Synthese bei den folgenden Bedingungen in dem Thermocycler durchgeführt:

23 °C 10 min 45 °C 60 min 95 °C 5 min 3. Methoden 25

3.5.3 Fas-Ligand und PBGD-PCR

Die RT PCR wurde mit komplementärer DNA (cDNA) geschrieben, wobei die folgenden Primer verwendet wurden:

Fas Ligand (FasL) Sense 5‘-GGA TTG GGC CTG GGG ATG TTT CA-3‘ Antisense 3‘-TTG TGG CTC AGG GGC AGG TTG TTG-5´

Phorphobilinogendeaminase (PBGD) Sense 5‘-TGT CTG GTA ACG GCA ATG CGG CTG CAA C-3´ Antisense 3‘-TCA ATG TTG CCA CCA CAC TGT CCG TCT-5´

Die Primer wurden so gewählt, daß sie Introns in der Genomsequenz umspannen, um eine mRNA-spezifische Amplifikation zu gewährleisten (Finke, J. et al., 1992; O'Connell, J. et al., 1996).

2 µl des cDNA-Pools wurden durch die PCR amplifiziert, wobei die oben genannten Primer verwendet wurden. Die cDNA wurde in 50 µl Volumen amplifiziert, welches 2,5 U Taq- Polymerase, je 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl und je 25 pmol der PBGD- bzw. Fas-Ligand-spezifischen Primer enthielt.

Die Zyklen zur Amplifikation umfaßten folgende Schritte: Denaturierung bei 96° C für 15 s, Annealing bei 55° C für 30 s und Extension bei 72° C für 3 Minuten für die FasL-PCR. Insgesamt wurden 40 Zyklen geschrieben. Die PBGD-PCR beinhaltete die folgenden Schritte: Einmalige Denaturierung bei 94°C für 7 Minuten, je 35 Zyklen mit 2 Minuten bei 94°C, 1 Minute bei 72° C. Die Extensionsdauer wurde um 8 Sekunden/Zyklus verlängert, um die sinkende Aktivität der Taq-Polymerase auszugleichen. Die Reaktion wurde mit zwei Folgen von 10 und 7 Minuten bei 72°C bzw. 94°C beendet.

Je 15 µl der Reaktionsprodukte wurden auf einem 2%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. 3. Methoden 26

ATGCAGCAGC CCTTCAATTA CCCATATCCC CAGATCTACT GGGTGGACAG

CAGTGCCAGC TCTCCCTGGG CCCCTCCAGG CACAGTTCTT CCCTGTCCAA

CCTCTGTGCC CAGAAGGCCT GGTCAAAGGA GGCCACCACC ACCACCGCCA

CCGCCACCAC TACCACCTCC GCCGCCGCCG CCACCACTGC CTCCACTACC

GCTGCCACCC CTGAAGAAGA GAGGGAACCA CAGCACAGGC CTGTGTCTCC

TTGTGATGTT TTTCATGGTT CTGGTTGCCT TGGTAGGATT GGGCCTGGGG

ATGTTTCAGC TCTTCCACCT ACAGAAGGAG CTGGCAGAAC

TCCGAGAG...Intron1...TC TACCAGCCAG ATGCACACAG CATCATCTTT

GGAGAAGCAA ATAG...Intron2...GCCACC CCAGTCCACC CCCTGAAAAA

AAGGAGCTGA GGAAAGTGGC CCATTTAACA G... Intron3...GCAAGTCCA

ACTCAAGGTC CATGCCTCTG GAATGGGAAG ACACCTATGG AATTGTCCTG

CTTTCTGGAG TGAAGTATAA GAAGGGTGGC CTTGTGATCA ATGAAACTGG

GCTGTACTTT GTATATTCCA AAGTATACTT CCGGGGTCAA TCTTGCAACA

ACCTGCCCCT GAGCCACAAG GTCTACATGA GGAACTCTAA GTATCCCCAG

GATCTGGTGA TGATGGAGGG GAAGATGATG AGCTACTGCA CTACTGGGCA

GATGTGGGCC CGCAGCAGCT ACCTGGGGGC AGTGTTCAAT CTTACCAGTG

CTGATCATTT ATATGTCAAC GTATCTGAGC TCTCTCTGGT CAATTTTGAG

GAATCTCAGA CGTTTTTCGG CTTATATAAG CTCTAA

Abbildung 5: Das humane FasL-Gen (Takahashi, T. et al., 1994b). Die Abbildung zeigt das humane FasL-Gen von der Base 65 bis 910. Die Lage der Primer (O'Connell, J. et al., 1996) ist durch Pfeile gekennzeichnet. Die Primer umspannen die Introns 1 bis 3. 3. Methoden 27

3.6 Immunoblot (Western Blot)

3.6.1 Prinzip

Mit einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) werden Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Durch die Anwesenheit von SDS erhalten alle Proteine eine negative Ladung (SDS-Bindung), und der Zusatz von 2-Mercaptoethanol verringert die internen Disulfidbrücken. Indem die Charakteristika „Ladung“ und „Form“ also ihren Einfluß bei der elektrophoretischen Auftrennung verlieren, ist das Molekulargewicht die Eigenschaft, nach der die Proteine hier aufgetrennt werden.

Anschließend werden die Proteine aus dem Gel auf eine immobilisierende Membran (Nitrozellulose) transferiert („blotting“) und können hier von spezifischen Antikörper im Untersuchungsmaterial erkannt werden. Der Vorteil des Verfahrens liegt im Spezifitätsnachweis durch die vorangegangene Proteinauftrennung.

3.6.2 Probenvorbereitung

1 x 107 Zellen wurden in einem 1,5 ml Eppendorfröhrchen sedimentiert und in 1 ml 1X SDS Ladepuffer gelöst. Danach wurde das Zell/Puffergemisch für 10 Minuten bei 95°C gekocht, um die Proteine zu denaturieren und in Lösung zu bringen. DNA-Stränge, welche das Auftragen auf das SDS-Gel erschweren, wurden durch 5minutige Beschallung im Ultraschallbad gebrochen.

3.6.3 Gießen eines SDS-Gels

Die SDS-Gele bestanden aus einem Separationsgel und einem Sammelgel, die sich in ihrer Polyacrylamidkonzentration unterschieden. Diese betrugen soweit nicht anders erwähnt 4 bzw. 12%. Das Sammelgel diente zum „Sammeln“ des aufgetragenen Proteingemisches, um gleiche Ausgansbedingungen für die elektrophoretische Auftrennung zu schaffen. Die Tabelle zeigt die Zusammensetzung der Gele im einzelnen. 3. Methoden 28

Sammelgel (4%) Separationsgel (12%) Polyacrylamid (PAA) 30% 0,8 ml 8 ml VE-Wasser 3,7 ml 6,8 ml Lower-Puffer 4X - 5,0 ml Upper-Puffer 4X 1,5 ml - APS 60 µl 135 µl TEMED 10 µl 33 µl

Zuerst wurden alle Komponenten in einen Erlenmeyerkolben pipettiert, wobei TEMED zur Polymerisation des PAA als letztes hinzugegeben wurde. Dann wurde das Gel sofort zwischen die Glasplatten der Miniblotkammer (Bio-Rad) gegossen, welche durch 0,75 mm Spacer getrennt waren. Das Separationsgel wurde anschließend mit 200 µl Wasser überschichtet, um ein Austrocknen zu vermeiden. Nach 30 Minuten wurde das Wasser vorsichtig entfernt und das Sammelgel über das Separationsgel gegossen. Nach weiteren 30 Minuten wurde das Gel im Gelständer entsprechend der Gebrauchsanweisung in die Miniblotkammer gestellt und die Kammer mit Laufpuffer (Running-Puffer) gefüllt, der Kamm gezogen und die Proben in die Taschen des Sammelgels gefüllt.

3.6.4 Elektrophoretische Auftrennung und Transfer (Blotten) der Proteine

Die aufgetragenen Proteine wurden mit einer Spannung von 180 V aufgetrennt, welche bei Erreichen des Separationsgels auf 150 V gesenkt wurde. Nach der Auftrennung wurde das Gel vorsichtig aus den Glasplatten entnommen, das Sammelgel verworfen und das Separationsgel 10 Minuten in Tansblot-Puffer inkubiert. Zum Transfer der Proteine wurde das Gel zusammen mit der Nitrozellulosemembran zwischen Whatman-Filterpapieren in die Lochkammer eingespannt, die Blotkammer mit Transferpuffer gefüllt und der Blot bei 4°C, 400 mA für 45 Minuten durchgeführt. Der erfolgreiche Proteintransfer wurde mit Hilfe von gefärbten Proteinstandards (Bio-Rad) kontrolliert. 3. Methoden 29

3.6.5 Proteinnachweis

Zum spezifischen Proteinnachweis wurden die folgenden Schritte ausgeführt: 1. Blocken unspezifischer Bindungen in NET-Gelatine für 1 Stunde, wobei die NET- Gelatine einmal gewechselt wurde 2. Inkubation der Nitrozellulosemembran mit dem entsprechenden spezifischen Antikörper, 1:100 in NET-Gelatine verdünnt, für 1 Stunde bei RT oder bei 4°C über Nacht 3. Waschen für 30 Minuten, NET-Gelatine alle 3 Minuten wechseln 4. Inkubation der Nitrozellulosemembran mit dem peroxidase-markierten rabbit anti-mouse IgG + IgM (H+L) Sekundärantikörper, 1:5000 in NET-Gelatine verdünnt, für 30 Minuten 5. Waschen wie unter Schritt 3 6. Detektion des markierten Proteins mit dem ECLTM System (Amersham Life Science)

3.7 Apoptosenachweis

3.7.1 Testprinzip

Annexin V ist eine sensitive Methode, um Zellen zu identifizieren, die in Apoptose gehen. Annexin V ist ein 35-36 kDa großes Protein, welches sich kalziumabhängig an Phospholipide bindet. Es bindet an die Plasmamembran in einem frühen Apoptosestadium. Veränderungen der Plasmamembran an der Zelloberfläche gehören zu den frühesten Merkmalen von Zellen, die in den programmierten Zelltod gegen. In apoptotischen Zellen wird das Membranphospholipid Phosphatidylserin (PS) von der Innenseite an die Außenseite der Plasmamembran transloziert und exponiert somit das PS der extrazellulären Umwelt. Annexin V hat eine hohe Affinität für PS und bindet an Zellen mit nach außen exponiertem PS (Boersma, A. W. et al., 1996; Koopman, G. et al., 1994; Martin, S. J. et al., 1995; Vermes, I. et al., 1995). 3. Methoden 30

Annexin V-FITC

Apoptose

Externalisation von Plasmamembran Phosphatidylserin

Zytoplasma

Abbildung 6: Schematische Darstellung des Annexin V Testprinzips. In der frühen Apoptose wird PS von der Innenseite an die Außenseite der Plasmamembran transloziert. In der Anwesenheit von Kalziumionen besitzt Annexin V eine hohe Affinität für PS. Die Konjugation mit FITC dient zur Detektion apoptotischer Zellen mit Hilfe der Durchflußzytometrie.

3.7.2 Färbung der Zellen zur zytometrischen Quantifizierung der Apoptose

Die zu analysierenden Zellen wurden in PBS gewaschen und in 200 µl Annexin-V- Bindungspuffer resuspendiert. Dann wurden 5µl des FITC-konjugierten Annexin V hinzugefügt und die Zellsuspension kurz gevortext und 10 Minuten inkubiert. Nach erfolgter Inkubation wurden die Zellen gewaschen und in 200µl Annexinpuffer resuspendiert. Kurz vor der FACS-Analyse wurde 20 µl Propidiumjodid hinzugfügt, um apoptotische von nekrotischen Zellen zu unterscheiden. 4. Ergebnisse 31

4 Ergebnisse

4.1 Restriktionsenzymanalyse der Fas Ligand PCR

Zur Überprüfung, ob das durch die Fas Ligand PCR amplifizierte Produkt dem erwarteten DNA-Abschnitt entspricht, wurde eine Restriktionsenzymanalyse durchgeführt. Restriktionsendonucleasen sind DNA-schneidende Enzyme. Jedes Enzym erkennt eine spezifische Sequenz von 4-8 Nucleotiden (Schnittstelle). Es spaltet DNA in Fragmente, deren Größe vom Vorkommen der Schnittstelle abhängt. Hier wurde das Enzym SauIII verwendet, welches das 344 bp große PCR-Produkt an der Stelle 261 schneidet, sofern die DNA spezifisch amplifiziert wurde. Nur stimulierte Jurkatzellen exprimierten FasL-mRNA, wohingegen sowohl bei stimulierten als auch nicht stimulierten PBMC-Zellen (siehe unten) FasL-mRNA nachgewiesen werden konnte. Marker 4h Jurkat Jurkat 4h +Sau3A PBMC Exn PHA +Sau3A PHA Exn PBMC PBMC Exn OKT3 OKT3 +Sau3A PBMC Exn

344 bp

261 bp

Abbildung 7: FasL-Expression in stimulierten Jurkatzellen (PMA/Ionomycin) und stimulierten peripheren mononukleären Zellen (PHA bzw. OKT3). Links befindet sich jeweils das 344bp große PCR-Produkt. Rechts davon wurde das aus der gleichen Reaktion stammende, durch das Enzym SauIII verdaute Produkt aufgetragen. 4. Ergebnisse 32

4.2 Untersuchung der Fas-Ligand Expression in Zellinien und Erkrankungen der weißen Blutzellen und der blutbildenden Organe

4.2.1 CD95L-Expression in Zellinien myeloischen Ursprungs

Alle untersuchten Zellinien, die sich von verschiedenen Reifungsstufen der Myelopoese ableiten, exprimieren konstitutiv keine FasL-mRNA. Die Zellinien HL60, K562, HEL und Mai exprimieren FasL-mRNA nach Stimulation mit PMA und Ionomycin. Obgleich die RT- PCR keine exakten quantitative Rückschlüsse erlaubt, scheint bei allen positiven Zellinien nach 4 Stunden ein Maximum der mRNA-Expression vorzuliegen. Parallel zur FasL-PCR wurde auch die PBGD-PCR geschrieben, um amplifizierbare cDNA nachzuweisen und falsch negative Resultate zu vermeiden. Zur Kontrolle einer erfolgreichen Stimulation wurden jeweils Jurkatzellen unter gleichen Bedingungen parallel stimuliert und dienten bei der Amplifikation als Positivkontrolle. A PBGD B FASL Oh 2h 4h 6h Oh 2h 4h 6h HL60

K562 HEL

KG1 Oh 2h 3h 4h Oh 2h 3h 4h Mai

Abbildung 8: A zeigt die Banden der PBGD-PCR. PBGD wird in allen Zellen humanen Ursprungs exprimiert und diente zum Nachweis von cDNA. B zeigt die Ergebnisse der FasL- PCR. Alle getesteten Zellinien mit Ausnahme von KG1 exprimieren 4h nach Stimulation mit PMA und Ionomycin FasL-mRNA. 4. Ergebnisse 33

Um Fas-Ligand auch auf Proteinebene nachzuweisen wurden von allen Zellen zu jedem Zeitpunkt der Stimulation auch FACS-Analysen durchgeführt. Keine der untersuchten Zellen (HL 60, K562, HEL, KG1 und Mai) exprimierte Fas-Ligand auf der Zelloberfläche. Nach Zugabe des Metalloproteinaseinhibitors EDTA konnte Fas-Ligand auf der Zelloberfläche von K562 nachgewiesen werden. Keinen Einfluß hatte EDTA auf die CD95L-Expression bei den Zellinien HL60, HEL, KG1 und Mai. Hier lies sich auch nach Zugabe von EDTA kein Fas- Ligand auf der Zelloberfläche nachweisen. EDTA, ein Komplexbildner, soll die enzymatische Abspaltung des Fas-Liganden von der Zelloberfläche (shedding) inhibieren (Mariani, S. M. et al., 1995). Ein solcher Effekt lies sich in unseren Versuchen jedoch nur bei stimulierten K562- Zellen nachweisen.

0h 4h

Abbildung 9: FasL-Expression auf der Oberfläche PMA/Ionomycin-stimulierter K562-Zellen. Das linke Histogramm zeigt die FACS-Analyse vor Stimulation (0h), das rechte die Analyse nach Stimulation mit PMA und Ionomycin (4h). Als Antikörper fand der Klon NOK-1 Verwendung. Der Nachweis gelang erst nach Zusatz von EDTA zum Medium (2mM).

4. Ergebnisse 34

4.2.2 Zytometrischer Nachweis von Fas-Ligand auf CD34-positiven Stammzellen

Die Stammzellen wurden mit SCF (10ng/ml), IL-3 (10ng/ml) und GM-SCF (0,001ng/ml) unter Standardbedingungen inkubiert und die Fas-Ligand-Expression an den Tagen 0, 4 und 6 mit dem Durchflußzytometer bestimmt. 97,95 % der Zellen exprimierten vor Versuchsbeginn den Stammzellmarker CD34. Beide verwendeten Klone, die spezifisch für Fas-Ligand sein sollen, detektierten diesen, allerdings an unterschiedlichen Zeitpunkten. Auf nativen Stammzellen (Tag 0) konnte durch beide Klone kein CD95-Ligand nachgewiesen werden. Am Tag 4 zeigt der Klon NOK-1 ein deutlich positives Signal, wohingegen bei Messung mit dem Klon H11kein Fas-L nachgewiesen werden konnte. Am Tag 6 des Versuchs zeigt sich erstaunlicherweise ein umgekehrtes Bild. Hier zeigt der Klon H11 ein deutliches CD95L- Signal während der Klon NOK-1 den FasL nicht detektiert.

A NOK-1 B H11

Tag 0 Tag 0

Tag 4 Tag 4

Tag 6 Tag 6

Tag 8 Tag 8

Abbildung 10: FasL-Expression auf stimulierten Stammzellen. Der Nachweis erfolgte in einem einzelnen Experiment mit den Antikörperklonen NOK-1 (Abb. A) und H11 (Abb. B). Die leere Kurve zeigt die Negativkontrolle, die gefüllte Kurve die FasL-Expression. Auffällig ist der inkongruente Nachweis von Fas-Ligand durch die verwendeten Klone, der besonders am Tag 4 und 6 deutlich wird. 4. Ergebnisse 35

4.2.3 Fas-Ligand Expression bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie

Insgesamt wurden Zellen von 6 Patienten untersucht, bei denen die Diagnose akute myeloische Leukämie gestellt wurde. Keine Probe der jeweils untersuchten PBMC-Zellen exprimierte konstitutiv FasL-mRNA. Die Proben standen im Rahmen der Routinediagnostik zur Verfügung und wurden bis zur Analyse bei –80 °C gelagert. AML 4 12 AML 18 AML 23 AML 26 AML 31 AML PBGD

FasL

Abbildung 11: Alle 6 untersuchten AML Patienten (PBMC-Zellen) exprimierten konstitutiv keine FasL-mRNA. Die Anwesenheit amplifizierbaren Materials wurde durch die PBGD-PCR nachgewiesen. 4. Ergebnisse 36

4.2.4 Fas-Ligand Expression in Zellinien der B-Zellreihe

Die nachfolgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der RT-PCR für verschiedene Zellinien der B- Zellreihe. Es wurden Burkittzellinien verschiedener Gruppen, lymphoblastoide Zellinien (LCL), sowie die Prä-B-Zelleukämielinie BV 173 untersucht. Die Zellen wurden unstimuliert (0h) und nach Stimulation mit PMA/Ionomycin (4h) analysiert. Die Zahl der Kreuze gibt die Intensität der Bande des PCR-Produkts nach Färbung mit Ethidiumbromid wieder (+++ starke Bande, ++ deutliche Bande, + schwache Bande, - keine Bande). Der Eintrag nd. bedeutet, daß die Zellen unter diesen Bedingungen nicht untersucht worden sind. Jede Zellinie wurde je einmal in stimulierten und unstimulierten Zustand untersucht.

Zellinie Gruppe PBGD Fas-Ligand 0h 4h 0h 4h BL16 Burkitt +++ +++ - - BL28 Burkitt + + - - BL60 Burkitt ++ ++ - - BL72 Burkitt ++ +++ - - CHEP Burkitt ++ + - - Elija Burkitt +++ - - - LY67 Burkitt +++ +++ - - Namalwa Burkitt +++ + - - RAJI Burkitt +++ ++ - - WW1-BL Burkitt +++ + - - WW2-BL Burkitt ++ - - - BL2 Burkitt +++ +++ - - BL29 Burkitt +++ +++ - - Akata Burkitt +++ +++ - - RAJI Burkitt +++ - - - Seraphin Burkitt +++ +++ - - Solube Burkitt +++ +++ - - Rael Burkitt +++ nd. - nd. Fin LCL +++ +++ - - Rei LCL +++ +++ - - 4. Ergebnisse 37

Pis LCL +++ nd. - nd. CB-RAL-STO LCL +++ nd. - BJAB NHL +++ + - - BV 173 Prä-B-Zelleukämie +++ +++ - -

4.2.5 Fas-Ligand Expression bei Patienten mit akuter und chronischer lymphatischer Leukämie

Es wurden 25 Proben ficollisierter PBMC-Zellen von Patienten mit der Diagnose einer chronischen (n=21) bzw. akuten (n=4) lymphatischen Leukämie (CLL bzw. ALL) in unterschiedlichen Stadien untersucht. Die Ergebnisse von 17 der insgessamt 21 untersuchten Patienten mit CLL sind hier gezeigt. Daneben wurden die Proben der 4 Patienten mit der Diagnose ALL analysiert. Bei 3 dieser Patienten wurde eine B-ALL diagnostiziert, bei einem Patienten eine T-ALL. Alle 21 Patienten mit CLL, sowie 2 von den untersuchten ALL- Patienten exprimierten konstiutiv FasL-mRNA. Um die Bedeutung dieser Ergebnisse zu evaluieren, wurden als Vergleich die PBMC-Zellen von 4 gesunden Spendern untersucht. Diese erwiesen sich ebenfalls als positiv in der RT-PCR. Es konnte kein Unterschied hinsichtlich der FasL-Expression festgestellt werden, obwohl große Unterschiede zwischen den Proben bestanden bezüglich des Anteils der B- und T-Zellen. So betrug der mit Hilfe der Durchflußzytometrie bestimmte B-Zellanteil bei den Proben CLL1 und CLL17 82% bzw. 83%, der T-Zellanteil 2,5% bzw. 8,6%. In der Probe des gesunden Spenders Gra befanden sich dagegen 66% T-Zellen und nur 6,6% B-Zellen.

A Gla B CLL17

6,6% 83%

66% 8,6%

Abbildung 12: FACS-Analyse zur Bestimmung des T- und B-Zellanteils. Aufgetragen ist die CD3-Expression (Abszisse) versus die CD19-Expression (Ordinate). A Probe des gesunden Spender Gla B Probe CLL17 4. Ergebnisse 38

A CLL Kontrolle CLL1 9 CLL CLL11 CLL14 CLL16 CLL17 CLL21 CLL22 CLL24 CLL25 3 CLL 5 CLL 6 CLL 7 CLL 8 CLL CLL10 CLL13

PBGD 127 bp

FASL 344 bp

B ALL B-ALL 2 B-ALL B-ALL 15 B-ALL 19 53 T-ALL

PBGD 127 bp

FASL 344 bp

C Gesunde Spender Kontrolle Den Sch Ric Gla

PBGD 127 bp

FASL 344 bp

Abbildung 13: FasL-Expression in PBMC-Zellen von CLL- und ALL-Patienten (A und B) , sowie von gesunden Spendern (C) detektiert durch RT-PCR. PBGD diente zum Nachweis amplizierbarer cDNA. Die Negativkontrolle entsprach einem Ansatz ohne cDNA (H20). Alle CLL-Proben und alle Proben der gesunden Spender zeigten FasL-mRNA. 2 von 4 Patientenproben mit ALL exprimierten FasL-mRNA 4. Ergebnisse 39

4.3 Die neoplastischen B-Zellen von CLL-Patienten exprimieren keine FasL-mRNA

4.3.1 Isolierung markierter B-Zellen von Patienten mit CLL

Um die Fas-Ligand Expression der einzelnen Zellpopulationen genauer zu untersuchen, entschlossen wir uns, die Zellen mittels magnetischer Zellsortierung (MACS) zu separieren und die einzelnen Fraktionen getrennt mit der RT-PCR zu analysieren. Zunächst wurden 4 Patientenproben (CLL) positiv selektioniert, d. h. direkt mit einem magnetisch markierten Antikörper markiert. Die Reinheit und somit die Effektivität der Separation wurde durch die zytometrische Bestimmung der CD20 Expression gemessen. Diese war bei allen 4 Proben größer 99%. Die Abbildung 14 zeigt die Ergebnisse von 3 Proben. CLL 54 CLL 55 CLL 56

PBGD

FasL

Abbildung 14: Ergebnis der RT-PCR nach Separation der B-Zellfraktion von CLL-Patienten. Die Proben 55 und 56 waren vor der Auftrennung positiv für FasL (Daten nicht gezeigt). Die Probe 54 wurde vor der Trennung nicht auf FasL-Expression hin analysiert.

4.3.1 Isolierung unmarkierter B-Zellen von CLL-Patienten und gesunden Spendern

Um einen eventuellen Einfluß der Bindung des CD19 Antikörpers hinsichtlich der Fas-Ligand Expression auszuschalten, isolierten wir Zellen von 7 weiteren CLL-Patienten mittels der Negativselektion wie unter 3.3.2. beschrieben. Darüber hinaus versprachen wir uns durch diese Vorgehensweise eine zuverlässigere Analyse der Fas-Ligand Expression mit der Durchflußzytometrie. Die Reinheit der gewonnenen B-Zellfraktion wurde bei der Negativselektion durch die Messung der CD19 Expression bestimmt. Die Tabellen A und C zeigen den Anteil der B-Zellen nach Separation. Bei den CLL-Patienten wurde zusätzlich noch die CD5-Expression untersucht, um Rückschlüsse auf den Anteil neoplastischer Zellen ziehen zu können. Der Median für die Reinheit der aufgereinigten CLL-Proben betrug 98,4% bei der CD19-Expression und 96,1% bei der CD5-Expression. Bei den gesunden Spendern betrug der Anteil der CD19-positiven Zellen im Durchschnitt 90,6%. 4. Ergebnisse 40

A Patientenproben C Gesunde Spender

Probe Reinheit CD5-Expression Probe Reinheit (in %) (in %) Ric 84,68 CLL 1 99,56 99,63 CLL 3 97,79 97,20 Ber 76,51 CLL61 99,71 99,63 Man 99,52 CLL62 99,67 99,31 Wit 97,43 CLL63 99,88 94,06 Wäs 96,15 CLL64 99,74 99,57 CLL64* 98,57 99,68 CLL65 92,62 83,14

Tabelle 1: Ergebnisse der magnetischen Separation. Die Reinheit gibt den Anteil der CD19- positiven Zellen (in %) an, wie sie zytometrisch bestimmt wurde. Die Probe CLL64 wurde mittels Negativselektion und Positivselektion (mit * markiert) aufgereinigt. AB

99,74% 99,57% M1 M1

Abbildung 15: FACS-Analyse nach magnetischer Separation. Die Probe CLL64 ist hier beispielhaft gezeigt. Die relative Zellzahl (Ordinate) ist gegen die Fluoreszenz des PE- markierten Antikörper (CD19 bzw. CD5) aufgetragen. A Expression von CD19. 99,74% der Zellen exprimieren CD19 auf der Oberfläche (gefüllte Kurve). Die leere Kurve entspricht der Isotypkontrolle. B Expression von CD5. Analoges Histogramm für den Marker CD5, den 99,57% der Zellen auf der Oberfläche tragen.

4. Ergebnisse 41

Abbildung 16: A PBGD-PCR der unberührten B-Zellen sowie der Non-B-Zellfraktionen. Die B-Zellen der Probe 64 wurden sowohl positiv (durch + markiert) als auch negativ selektioniert. B FasL-PCR der negativ selektionierten B-Zellen (oben) sowie der Non-B- Zellen (unten). C PBGD-PCR (oben) und FasL-PCR (unten) von gesunden B-Zellspendern

4. Ergebnisse 42

Zytometrische Analyse der CD95L-Expression. Die Proben CLL1 bis CLL65 wurden vor und nach Seperation zytometrisch auf die CD95L-Expression hin untersucht. Nach Seperation wurden die isolierten, unberührten B-Zellen untersucht. Bei keiner Probe konnte Fas-Ligand auf der Oberfläche nachgewiesen werden. Auch die Verwendung von EDTA-Röhrchen zur Blutabnahme und die Zugabe von EDTA zu dem Waschpuffer (PBS) zeigte keinen Einfluß im Hinblick auf den FasL-Nachweis. Die Abbildung zeigt exemplarisch ein Histogramm einer FACS-Analyse nach magnetischer Separation.

CLL64

Abbildung 17: FACS-Analyse der B-Zellfraktion nach magnetischer Separation. Die gefüllte Kurve entspricht der Fluoreszenz des FasL-Antikörper (Klon H11), die offene Kurve der Isotypkontrolle. Auf der Abszisse ist die relative Zellzahl aufgetragen. Die Analyse ist exemplarisch auch für die Proben vor der magnetischen Trennung. Als Positivkontrolle dienten stimulierte CD34-positive Stammzellen (siehe 4.2.2) 4. Ergebnisse 43

4.4 Nachweis von FasL auf Proteinebene (Immunoblot)

Zum Proteinnachweis wurde ein Western Blot mit verschiedenen Zellen durchgeführt. Es wurden eine T-ALL-Zellinie (Jurkat), zwei Burkitt-Linien (Sou-LCL, BL60), eine lymphoblastoide Zellinie (KR4), OKT3- und PHA-stimulierte PBMC-Zellen eines gesunden Spenders (Exn), sowie eine Probe ficollisierter Zellen eines CLL-Patienten (Haf). Die Probe Human endothelial entsprach der Positivkontrolle, die vom Hersteller des Klones 33 mitgeliefert wurde.

Alle Proben, die mit dem Klon 33 (Transduction Laboratories) inkubiert wurden zeigten ein Signal, das der erwarteten Größe des FasL-Proteins entsprach. Zur Überprüfung dieser Ergebnisse färbten wir die gleichen Proben mit dem Klon G247-4 (Pharmingen). Dieser Klon detektierte entweder kein FasL-Protein oder die Bande der entsprechenden Größe zeigte die gleiche Intensität wie die unspezifischen, so daß keine sichere Aussage möglich war. Interessant ist noch, daß die Positivkontrolle des Klones 33 nicht von dem Klon G247-4 erkannt wurde.

kDa Jurkat Sou-LCl BL60 KR4 (LCL) (PHA) PBMC (OKT3) PBMC Ha CLL Endothelial Human Marker

Klon 33 45 32,8

45 Klon G247-4 32,8

Abbildung 18: Immunoblot zur Detektion von Fas-Ligand. Der obere Immunoblot wurde mit dem Klon 33 durchgeführt, der untere mit dem Klon G247-4. Es wurden jeweils die gleichen Proben, sowie die gleiche Proteinmengen aufgetragen.

4. Ergebnisse 44

4.5 Funktioneller Nachweis von Fas-Ligand

4.5.1 Jurkatzellen als Zielzellen für die Fas-vermittelte Apoptose

Zum funktionellen Nachweis von Fas-Ligand wurden Jurkatzellen als Target zusammen mit anderen Zellen bzw. Zellinien inkubiert. Die Jurkatzellinie wurde gewählt, da diese CD95 (Fas), den Rezeptor von Fas-Ligand exprimiert, und nach dessen Stimulation durch einen monoklonalen Antikörper (Klon CH11) leicht in Apoptose geht. Diese Apoptoseinduktion läßt sich durch den Klon ZB4 blockieren. Der Klon ZB4 bindet an Fas ohne jedoch Apoptose zu induzieren. AB

kDa

45 32,8

Abbildung 19: CD95 (Fas)-Nachweis in Jurkatzellen. A FACS-Analyse. Die gefüllte Kurve entspricht der Fluoreszenz des FITC-markierten Fas Antikörpers (Klon DX2), die offene Kurve zeigt die Isotypkontrolle. B Immunoblot. Der Immunoblot von Jurkat zeigte ein Signal bei 40-42 kDa, welches dem Molekulargewicht von CD95 (Fas) entspricht. Zur Detektion im Blot wurde der Klon CH11 verwendet.

) 30 25 20 15 10

Apoptoserate (in % 5 0 spontan 0 50 100 200 400 ZB4 (ng/ml) Abbildung 20: Apoptoseinduktion durch den monoklonalen Anti-Fas-Antikörper (Klon CH11) in Jurkatzellen. Die spontane Apoptoserate liegt bei unter 5% und steigt bei Zugabe von 50ng/ml CH11 nach Inkubation über Nacht auf mehr als 30%. Die Zugabe des Klones ZB4 blockiert die Apoptose dosisabhängig. Bei der Konzentration von 400ng/ml entspricht die Apoptoserate in etwa wieder der spontanen. 4. Ergebnisse 45

4.5.2 Kultur von Jurkatzellen mit myeloischen Zellinien

Um eine eventuelle Fas-Ligand Expression auf funktioneller Ebene nachzuweisen wurden Zellen der HL60 und K562 Zellinie als Effektorzellen zusammen mit Jurkatzellen als Target in einem Verhältnis von 10:1 über mehrere Tage in einer Microwellplatte inkubiert. An den Tagen 1 bis 4 wurde der Anteil der apoptotischen Jurkatzellen zytometrisch bestimmt. A B

100 Kontrolle 100 Kontrolle

80 Jurkart 80 K562

60 60

40 40

Apoptose in % 20 Apoptose in % 20

0 0 1234 1234 Tage Tage C D

100 Kontrolle 100 Kontrolle

80 Jukart 80 HL60

60 60

40 40

Apoptose inApoptose % 20 inApoptose % 20

0 0 1234 1234 Tage Tage

Abbildung 21: Anteil apoptotischer Jurkatzellen nach Kokultur mit K562 (A) und HL60 (C) im Verhältnis !0:1 (Jurkart/K562 bzw. HL60). Als Negativkontrolle wurde der Anteil apoptotischer Zellen in einer reinen Jurkatzellkultur bestimmt. Parallel zur Apoptose der Jurkatzellen wurde auch die Vitalität der K562-Zellen (B) und HL60-Zellen (D) analysiert. Als Negativkontrollen dienten K562 bzw. HL60-Zellen ohne Jurkatzellen.

4. Ergebnisse 46

4.5.3 Kultur von Jurkatzellen mit stimulierten K562

Zur Beurteilung der Funktionalität des Fas-Liganden, der in PMA/Ionomycin-stimulierten K562-Zellen mittels RT-PCR nachgewiesen wurde, wurden Jurkatzellen zusammen mit aktivierten K562 inkubiert. Die K562 Zellen wurden vor der Inkulturnahme mit Jurkatzellen 4 Stunden lang mit PMA und Ionomycin nach dem im Abschnitt Material und Methoden aufgeführten Protokoll stimuliert. Als Kontrolle dienten Jurkatzellen, die für 1 Stunde mit dem Anti-Fas Antikörper ZB4 inkubiert wurden. Der Klon ZB4 bindet an den Fas-Rezeptor, ohne jedoch den programmierten Zelltod auszulösen. Die so behandelten Jurkatzellen sind daher unempfindlich für den Zelltod via Fas/FasL-Interaktion und dienten als Negativkontrolle. Die Jurkatzellen mit und ohne Vorbehandlung durch den Antikörperklon ZB4 wurden 14 Stunden zusammen mit stimulierten K562 inkubiert. A

50 mit ZB4

40 ohne ZB4

Apoptose in % 10

0 Kontrolle 1:16 1:8 1:4 1:2 1:1 2:1

E/T-Ratio Abbildung 22: Apoptoseinduktion durch stimulierte K562 Zellen. Zur Kontrolle diente eine reine Jurkartzellkultur ohne K562 Zellen. Die E/T-Ratio entspricht dem Verhältnis K562/Jurkart.

Die Kokultur von unstimulierten HL60 (Abbildung 21 C) und K562 (Abbildung 21 A) mit einer E/T-Ratio rsultiert in einer erhöhten Apoptoserate der Jurkartzellen. Eine Beteiligung des Fas/Fas-Ligand an der beobachteten erhöhten Apoptoserate ist jedoch fraglich, da dieses Ergebnis im Widerspruch zu den Ergebnissen der RT-PCR steht. Sowohl bei HL60 als auch bei K562 konnte in unstimulierten Zustand keine Fas-Ligand Messenger RNA nachgewiesen werden. Eine Funktionalität des in PMA/Ionomycin-stimulierten K562 Zellen exprimierten Fas-Liganden konnte mit dem durchgeführten Versuch nicht bewiesen werden. Es fand sich kein Unterschied bezüglich der Apoptoserate zwischen den vorbehandelten und nicht vorbehandelten Jurkatzellpopulationen. Die Apoptoseraten entsprachen, unabhängig von der E/T-Ratio, der gemessenen spontanen Apoptoserate der reinen Jurkatzellkultur. 4. Ergebnisse 47

4.5.4 Kultur von Jurkatzellen mit der LCL-Zellinie Rei

Analog zu den myeloischen Zellinien wurde auch die zytotoxische Wirkung von LCL-Rei Zellen gegenüber Jurkatzellen als Target untersucht. Zu diesem Zweck wurden LCL-Rei zusammen mit Jurkart im E/T-Verhältnis 1:1 und 10:1 in Kultur genommen und nach 4 und 16 bzw. 24 Stunden Inkubation der Anteil apoptotischer Zellen zytometrisch bestimmt. ABJurkart LCL-Rei

E/T-Ratio E/T-Ratio 50 50 1:10 1:10

40 1:1 40 1:1 30 30

20 20

Apoptose in % 10 Apoptose in % 10

0 0 04240424 Stunden Stunden C

50 E/T-Ratio 1:1

40 Rei

30 Jurkart

Apoptose in% 10

0 0416 Stunden

Abbildung 23: A Anteil der apoptotischen Jurkatzellen nach 4 und 24 Stunden. Jurkatzellen wurden im Verhältnis 1:1 (unterer Graph) und 1:10 (oberer Graph) mit LCL-Rei in Kultur genommen B Anteil der apoptotischen LCL-Rei Zellen. C zeigt die Ergebnisse eines zweiten unabhängig durchgeführten Experimentes, wobei der obere Graph die Apoptose der Jurkatzellen, der untere Graph die Apoptose der LCL-Rei Zellen wiedergibt.

Die gewonnenen Ergebnisse zeigen bei beiden untersuchten E/T-Ratios (1:1 und 1:10) keine zytotoxische Wirkung von LCL-Rei gegenüber Jurkatzellen. Der Anteil apoptotischer Jurkatzellen nahm sogar tendenziell eher ab; eine Tatsache, die für eher ungestörtes Wachstum der Jurkatzellen in Gegenwart von LCL-Rei spricht. Auch die LCL-Rei zeigen keine erhöhte Apoptoserate infolge der Kokultur mit Jurkatzellen (Abbildung 23 B). Diese Ergebnisse wurden durch ein zweites unabhängiges Experiment bestätigt, dessen Resultate in Abbildung 23 C dargestellt sind. 4. Ergebnisse 48

4.5.5 Kokultur von Jurkatzellen mit Zellen eines Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie vom T-Zelltyp (T-ALL)

Das EDTA-Blut eines Patienten mit T-ALL wurde wie im Teil Material und Methoden beschrieben ficollisiert. Die gewonnenen PBMC-Zellen wurden zusammen mit Jurkatzellen im Verhältnis 10:1 inkubiert. Die Apoptoserate der zwei Zellpopulationen wurde an den Tagen 1, 2 und 3 bestimmt. Die nachfolgende Abbildung zeigt die Ergebnisse der zytometrischen Bestimmung des Todanteils der verschiedenen Zellpopulationen. A

50 E/T-Ratio 10:1

40 Kontrolle Jurkart 30

Apoptose in % in Apoptose 10

0 123 Tage

Abbildung 24: Apoptoserate von Jurkatzellen. Der obere Graph gibt die Apoptoserate von Jurkartzellen wieder, die zusammen mit den T-ALL 53 Zellen inkubiert wurden. Der untere Graph zeigt die spontane Apoptose einer reinen Jurkatzellkultur, die parallel zur gemischten Kultur Jurkart/T-ALL 53 angesetzt wurde.

Die zytometrischen Analysen des Todzellanteils ergaben einen über Tag 1 bis Tag 3 leicht ansteigenden Anteil apoptotischer Jurkatzellen (oberer Graph) im Vergleich zur Negativkontrolle (unterer Graph). Obgleich die gemessenen Apoptoserate oberhalb der Kontrollpopulation liegt, ist eine Beteiligung des Fas-Liganden nicht wahrscheinlich, weil sich in den ficollisierten PBMC-Zellen des Patienten keine Fas-Ligand Messenger RNA durch die RT-PCR nachwiesen lies.

4. Ergebnisse 49

4.6 Antithymozytenglobuline

4.6.1 T-Zellen und die Fas-vermittelte Apoptose

Der monoklonale Anti-Fas-Antikörper (Klon CH11) induziert Apoptose in ruhenden und aktivierten T-Zellen. Bei PHA und OKT3/IL-2 aktivierten T-Zellen ist die Apoptoseinduktion durch den Anti-Fas-Antikörper wesentlich effizienter als bei nicht stimulierten. Der Klon CH11 induziert vorzugsweise bei aktivierten T-Zellen den programmierten Zelltod.

Zur Messung der Fas-vermittelten Apoptose wurden PBMC-Zellen eines gesunden Spenders 3 Tage mit PHA (10µg/ml) oder OKT3/IL-2 stimuliert. Danach wurden die Zellen über Nacht mit verschiedenen Konzentrationen des Klones CH11 inkubiert und der Todanteil zytometrisch bestimmt. Bei Zugabe von 250 bzw. 500 ng/ml des Klones CH11 betrug der Todanteil bei den PHA und OKT3/IL-2 stimulierten Zellen 20%, etwa doppelt so hoch wie der Todanteil bei den unstimulierten T-Zellen. Dieser Unterschied verringert sich bei noch höheren Dosen des Klones CH11 (1000ng/ml). Dennoch liegt der Todanteil sowohl bei den PHA- als auch bei den OKT3/IL-2-stimulierten Zellen höher als bei den ruhenden.

25 )

20 unstimuliert

15 PHA OKT3/IL-2 10 Spez. Apoptose (in % Apoptose Spez. 5

0 250 500 1000 CH11 (ng/ml)

Abbildung 25: Fas-vermittelte Apoptose bei aktivierten und ruhenden T-Zellen. Aktivierte T- Zellen sind bei den Konzentrationen 250ng/ml und 500 ng/ml deutlich empfindlicher bei die Fas-vermittelten Apoptose als ruhende T-Zellen. Auf der Ordinate ist die spez. Apoptose aufgetragen, die sich aus dem Anteil der toten Zellen abzüglich der spontanen Apoptoserate der Zellen (Negativkontrolle) berechnet. 4. Ergebnisse 50

4.6.2 Apoptoseinduktion durch ATG

Zur Untersuchung, ob und in welchem Umfang ATG in der Lage ist, den programmierten Zelltod zu induzieren wurden Jurkatzellen, ruhende und aktivierte PBMC-Zellen mit steigenden ATG-Dosen über Nacht inkubiert und der Anteil toter Zellen anschließend zytometrisch mit FITC-markiertem Annexin bestimmt. Es wurden aktivierte und ruhende T- Zellen untersucht, um zu analysieren, ob ATG präferentiell bei aktivierten T-Zellen den programmierten Zelltod induziert. Die Diagramme geben die zytometrischen Bestimmungen wieder.

Jurkat

100

60 Jurkat 40

20 Phosphatidylserinexpression 0 01,252,55 1020 ATG (µg/ml)

Abbildung 26: Apoptoseinduktion durch ATG bei Jurkatzellen nach 24stündiger Inkubation. Auf der Ordinate sind die Anteile (in %) der Phosphatidylserin-positiven, d. h. der Anteil der apoptotischen Zellen aufgetragen, auf der Abszisse die ATG-Konzentrationen in µg/ml

ATG induziert den programmierten Zelltod bei Jurkatzellen. Eine zytotoxische Wirkung ist nach 24 Stunden Inkubationszeit bei einer Konzentration ab 5µg/ml nachweisbar. Bei geringeren Konzentrationen (1,25µg/ml und 2,5µg/ml) entspricht der Anteil der toten Zellen dem der Negativkontrolle ohne ATG-Zusatz. Die Dosis-Wirkungsbeziehung ist bei den gemessenen Konzentrationen (5, 10 und 20µg/ml) annähernd linear. Ganz ähnlich verhält sich dieser Sachverhalt bei ruhenden und aktivierten PBMC-Zellen eines gesunden Spenders. ATG induziert bei beiden den programmierten Zelltod mit annähernd linearer Dosis- Wirkungsbeziehung. Aktivierte PBMC-Zellen scheinen insbesondere bei höheren ATG- Dosen (80 bzw. 160µg/ml) etwas empfindlicher auf ATG zu reagieren als ruhende. 4. Ergebnisse 51

PBMC-Zellen

100

40 PS-Expression 20

0 10 20 40 80 160 ATG (µg/ml)

Abbildung 27: Apoptoseinduktion durch ATG bei ruhenden (links) und aktivierten (rechts) PBMC-Zellen. Dargestellt ist hier die spezifische Apoptoserate, die sich aus der folgenden Formel berechnet: Aspez. = AATG – Aspontan ohne ATG. Der Wert der Negativkontrolle ohne ATG wurde von der gemessenen Apoptoserate also abgezogen. Die Ordinate gibt den Anteil der apoptotischen Zellen in % an. 4. Ergebnisse 52

4.6.3 Die Funktion des Fas/FasL-Systems bei der ATG-vermittelten Apoptose

Zur Klärung der Frage, ob ATG den programmierten Zelltod via der Fas/Fas-Ligand Interaktion induziert, wurden Jurkatzellen, die Fas (CD95) exprimieren und nach Stimulation des Fas-Rezeptors mit einem monoklonalen Antikörper in Apoptose gehen, mit steigenden ATG-Konzentrationen inkubiert. Parallel wurden Jurkatzellen angesetzt, die zuvor mit 1µg/ml bzw. 10µg/ml Anti-Fas Antikörper (Klon ZB4) inkubiert worden waren. Dieser Klon bindet an den Fas-Rezeptor, ohne Apoptose zu induzieren und blockiert somit die Induktion des Fas- vermittelten Zelltodes.

100

60 0µg ZB4 1µg ZB4 40 10µg ZB4

Phosphatidylserinexpression (in%) 0 0204080160 ATG (µg/ml)

Abbildung 28: Apoptoseinduktion von ATG bei Jurkatzellen. Auf der Abszisse sind die ATG- Konzentrationen aufgetragen. Auf der Ordinate ist der Anteil der apoptotischen Zellen aufgetragen, welche Phosphatidylserin auf ihrer Oberfläche exprimieren. ATG induziert Apoptose in Jurkatzellen. Der Anteil der apoptotischen Zellen zeigt bei geringen Konzentrationen eine lineare Beziehung zur ATG-Konzentration.

Die spontane Apoptoserate von etwas mehr als 20% bei Zugabe von 10µg/ml des blockierenden Antikörpers (Klon ZB4) spricht für eine gewisse intrinsische Aktivität des Klones ZB4 bei sehr hohen Konzentrationen. Um auszuschließen, daß die gewählten ATG- Konzentrationen zu hoch gewählt wurden, wurde das gleiche Experiment mit einer Verdünnungsreihe durchgeführt, deren Konzentrationen von 1,25µg/ml – 40µg/ml ATG reichten. Bei der Zugabe von 1µg/ml des apoptose-blockierenden Klons ZB4 fand sich auch hier kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Apoptoseinduktion. Die zytoxische Wirkung von ATG scheint demnach nicht Fas/(CD95)-vermittelt. 4. Ergebnisse 53

4.6.4 ATG-Nachweis in Patientenplasma nach Transplantation

Zum Nachweis von ATG in Patientenplasma wurden Jurkatzellen über Nacht mit Plasmaproben eines Patienten, die im Verhältnis 1 : 1 mit Medium verdünnt wurden, inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit einem FITC-markierten Goat-anti- rabbit Antikörper markiert und mit dem Durchflußzytometer analysiert. Als Negativkontrolle diente eine Plasmaprobe desselben Patienten, die vor der ersten ATG-Applikation gewonnen wurde. Zur Positivkontrolle wurden Jurkatzellen in reinem Medium inkubiert, das 10µg/ml ATG enthielt.

Die Intensität der gemessenen Fluoreszenz nimmt von Tag 7 bis nach Tag 134 ab. ATG ist auch am Tag 134 nach Transplantation (längster Beobachtungszeitraum) noch im Plasma nachweisbar.

+Kontrolle Pre-TX

+7 +30 +134

Abbildung 29: Nachweis von ATG in Patientenplasma im zeitlichen Verlauf nach Transplantation. Aufgetragen ist die relative Zellzahl (Ordinate) gegen die Fluoreszenz des Goat-anti-rabbit Antikörpers (Abszisse). Die oberen Histogramme zeigen die Positivkontrolle (links) und die Negativkontrolle (rechts). Die offene Kurve entspricht der Patientenprobe vor der ersten ATG-Gabe. Die gefüllten Kurven zeigen die Proben an den Tagen 7, 30 und 134 nach Transplantation.

4. Ergebnisse 54

4.6.5 Apoptoseinduktion durch ATG-haltiges Serum nach Transplantation

ATG war auch am Tag 134 nach Transplantation noch in einer Plasmaprobe eines Patienten nachweisbar. Um die Frage zu klären, ob dieses ATG noch in der Lage ist, in T-Zellen Apoptose zu induzieren, wurden OKT3/IL-2 stimulierte und unstimulierte PBMC-Zellen eines gesunden Spenders in ATG-haltigem Serum über Nacht inkubiert. Das Seren, die zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach ATG-Gabe abgenommen wurden, wurden wie im vorangegangenen Versuch im Verhältnis 1:1 mit Medium verdünnt. Zur Überprüfung und Quantifizierung der Stimulation wurden die Aktivierungsmarker CD25 und HL2-DR mittels der Durchflußzytometrie bestimmt. 94% der stimulierten Zellen exprimierten CD25, 46 % waren positiv für HL2-DR. Von den unstimulierten Zellen hingegen waren nur 8% positiv für CD25 und 16% exprimierten HL2-DR.

Das ATG in den untersuchten Proben zeigt am Tag 1 vor Transplantation eine apoptose- induzierende Wirkung sowohl auf aktivierte wie auch auf unstimulierte PBMC-Zellen. So betrug der Anteil der apoptotischen Zellen 13% (aktivierte Zellen) bzw. 24% (unstimulierte) Zellen. Die spontane Apoptoserate, die mit der Serumprobe vom Tag 2 vor Transplantation und ATG-Gabe ermittelt wurde (Negativkontrolle) betrug hingegen für beide nur 8%. Der Anteil der toten Zellen in der Positivkontrolle (40µg ATG/ml) erreichte 36% bei den aktivierten und 46% bei den nicht aktivierten Zellen. Bei allen Zellen war der ATG- Nachweis mit dem gegen die Kaninchen-Immunoglobuline des ATG gerichteten Antikörper positiv. Anders sah die Situation schon am Tag 8 nach Transplantation aus. Obgleich der ATG-Nachweis mit einem Shift um ca. eine Zehnerpotenz deutlich positiv ausfiel, zeigte sich bei Messung der Phospatidylserinexpression mit FITC-markiertem Annexin kaum noch ein Unterschied im Vergleich zur Negativkontrolle (Tag –2). Der Totanteil der stimulierten Zellen erreichte mit 8% den Wert der Kontrolle; eine ATG-induzierte Apoptose konnte also nicht mehr nachgewiesen werden. Lediglich bei den nicht aktivierten PBMC-Zellen konnte am Tag 8 noch ein gering erhöhter Totanteil von 10% gemessen werden, dessen Signifikanz allerdings nicht eingeschätzt werden kann.

Die nachfolgende Graphik zeigt die zytometrischen Messungen für den ATG- und Apoptosenachweis für die OKT3/IL-2-stimulierten PBMC-Zellen. Diese sind in analoger Weise auch für die nicht aktivierten PBMC-Zellen durchgeführt worden, die hier nicht gezeigt werden. 4. Ergebnisse 55

+Kon M2 36% M1

-2 M2 8% M1

-1 M2 13% M1

+8 M2 8% M1

Abbildung 30: Apoptoseinduktion bei OKT3-stimulierten PBMC-Zellen durch ATG-haltiges Serum. A ATG-Nachweis mit einem FITC-markierten Goat-anti-rabbit Antikörper. Als Positivkontrolle dienten Zellen, die in Medium über Nacht inkubiert wurden, das 40µg/ml ATG enthielt. Zur Negativkontrolle wurden Zellen mit Serum inkubiert, welches vor der ersten ATG-Applikation, 2 Tage vor Transplantation (-2), abgenommen wurde. B Annexin-FACS- Analysen zur Bestimmung der apoptotischen Zellen 5. Diskussion 56

5 Diskussion

Der Fas-Rezeptor wird von vielen Zellen des Immunsystems wie T-Zellen, B-Zellen und Monozyten exprimiert (Nagata, S. et al., 1995)(Depraetere). Fas-Ligand ist ein Typ II Transmembranprotein, das zur Familie der Tumornekrosefaktoren gehört. Fas-Ligand findet sich bei aktivierten T-Zellen, aktivierten NK-Zellen, einigen Makrophagen/Monozyten und an immunpriviligierten Orten wie den Sertoli-Zellen des Hodens und der vorderen Augenkammer (French, L. E. et al., 1996; Griffith, T. S. et al., 1995). Gefäßendothel exprimiert FasL, wo er eine wichtige Rolle bei der Extravasation von Lymphozyten spielen soll (Sata, M. et al., 1998). FasL ist auch auf Vorläuferzellen der Granulo- und Erythropoese beschrieben worden, an deren Regulierung er beteiligt sein soll. Membrangebundener FasL wird durch Metalloproteinasen von der Zelloberfläche gespalten, was zur Bildung von löslichem FasL (sFasL) führt. Löslicher FasL ist im Vergleich zur membrangebundenen Form weniger effizient bei der Apoptoseinduktion (Tanaka, M. et al., 1998). Die Bindung der transmembranösen Form von FasL führt zur Trimerisation des Fas-Rezeptors und zu einem Apoptosesignal bei empfindlichen Zellen (Nagata, S. et al., 1995).

5.1 Exprimieren Tumorzellen konstitutiv Fas-Ligand?

Eine Reihe von Autoren behaupten, daß Tumorzellen FasL exprimieren und diese sich so dem Zugriff des Immunsystems entziehen, was auch als „reversed killing“ bezeichnet wurde. Unter den Tumoren, die als FasL-positiv beschrieben worden sind, befanden sich Melanome (Hahne, M. et al., 1996), Kolonkarzinome (O'Connell, J. et al., 1996), hepatozelluläre Karzinome (Strand, S. et al., 1996), Astrozytome (Saas, P. et al., 1997), Myelome (Villunger, A. et al., 1997) und Lungenkarzinome (Niehans, G. A. et al., 1997). Nach diesen Modellen infiltrieren Lymphozyten das Tumorbett, wo sie mit FasL-positiven Tumorzellen in Kontakt kommen und via den Fas-Rezeptor in Apoptose gehen. Das Ergebnis wäre eine sich kontinuierlich erneuernde Lymphozytenpopulation im Tumor mit ausbleibender Wirkung auf das Tumorwachstum, das unweigerlich überhandnehmen würde. Ein Problem mit diesem Modell ist allerdings, daß T-Zellen nicht alle gleich empfindlich auf FasL reagieren. Es konnte gezeigt werden, daß die Stimulation des TCR die T-Zellen sowohl empfindlicher für die FasL-vermittelte Apoptose macht als auch die Bildung von FasL durch die T-Zelle selbst induziert (Abbildung 1 und Abbildung 31). T-Zellen, die am empfindlichsten auf die FasL- vermittelte Apoptose reagieren, produzieren daher autokrin selbst Fas-Ligand. In vielen funktionellen Untersuchungsmodellen wird es daher sehr schwierig oder unmöglich sein zu 5. Diskussion 57 entscheiden, ob T-Zellen absterben, weil sie mit FasL-positiven Tumorzellen in Kontakt gekommen sind oder weil sie autokrin FasL produzieren.

A. Fas FasL+

Fas

Caspasenaktivierung Zelltod B. FasL Induktion - FasL * FasL Induktion MHC I TCR

Abbildung 31: Zwei Modelle (A und B) der T-Zellapoptose nach dem Zusammentreffen mit Tumorzellen. A Tumorzellen exprimieren FasL und induzieren in Fas-positiven T-Zellen Apoptose, wenn diese in Tumorgewebe wandern. B T-Zellen erkennen Tumorantigene, die durch die Tumorzellen präsentiert werden, und werden aktiviert. Die aktivierten T-Zellen gehen autokrin (Pfeil) oder parakrin (Stern) in Apoptose.

Weitere Variablen, die für Verwirrung sorgen können, müssen bei der Literaturdurchsicht bezüglich der FasL-Expression von Tumoren berücksichtigt werden. Jedes frisch entnommene Tumorgewebe ist unweigerlich mit Lymphozyten kontaminiert und eine Positivität für Fas-Ligand kann nicht ohne weiteres den Tumorzellen zugeschrieben werden, wenn nicht Maßnahmen getroffen werden, um kontaminiernde Lymphozyten und nicht maligne entartete Zellen zu entfernen, die wie z. B. Endothelzellen ebenfalls FasL exprimieren können (Sata, M. et al., 1998). Das die Kontamination mit T-Zellen eine wichtige Rolle bei den Versuchsergebnissen spielt, wurde durch eigene Experimente gezeigt. Die Analyse von 21 ficollisierten Proben von 21 CLL-Patienten mittels RT-PCR schien eine im Vergleich zu gesunden Spendern erhöhte Fas-Ligand Expression zu zeigen (Abbildung 13). Nach Entfernung der T-Zellen bot sich jedoch ein gänzlich anderes Bild. Weder in B-Zellen gesunder Spender noch in malignen B-Zellen von CLL-Patienten fand sich konstitutiv FasL- mRNA (Abbildung 16). Diese Resultate stehen in Widerspruch zu den Ergebnissen von 5. Diskussion 58

Tinhofer et al. Dieser Unterschied beruht wahrscheinlich auf technischen Schwierigkeiten beim Nachweis von Fas-Ligand. FasL wurde durch die Arbeitsgruppe als Protein mittels FACS-Analyse nachgewiesen, wobei ein Antikörperklon verwendet wurde, der nicht spezifisch für FasL sein soll. Funktionell wurde FasL in dieser Arbeit mittels JAM-Test nachgewiesen, wobei eine T-Zellinie als Zielzelle Verwendung fand. T-Zellen können jedoch selbst FasL exprimieren und auf autorkrinem oder parakrinem Weg in Apoptose gehen. Im Einzelfall ist funktionellen Versuchen nicht festzustellen, ob die Tumorzellen (in diesem Fall B-CLL-Zellen) oder die Zielzellen FasL exprimieren. Darüber hinaus bestehen bei diesem Zytotoxizitätstest die Möglichkeit falsch positiver Reaktionen (Bohm, C. et al., 1998).

Eine weitere Variable, die für Konfusion sorgen kann, ist die Regulation des autokrinen Zelltodes durch c-Myc und p53. Ein Überwachsungseffekt oder Mangel an Wachstumsfaktoren in der Zellkultur könnte ein Apoptosesignal via c-Myc an die apoptosesensitive Zielzelle geben, die unabhängig vom FasL-Status der Effektorzelle über das Fas/FasL-System in Apoptose gehen könnte (French, L. E. et al., 1996; Green, D. R., 1997; Hueber, A. O. et al., 1997). Es ist deshalb nicht leicht, funktionelle Versuche, die solche Überwachsungseffekte nicht durch Zugabe von FasL-negativen Effektorzellen kontrollieren, zu interpretieren. Hahne et al. fanden zum Beispiel eine hohe Apoptoserate durch Melanomzellen von A20-Zellen (apoptosesensibel) verglichen mit A20R (apoptoseresistent). In diesem Versuchsaufbau wurden die Melanomzellen (Effektorzellen) 48 Stunden vor den Zielzellen (A20 bzw. A20R) angesetzt und keine FasL-negative Zellinie zur Kontrolle eines Überwachsungseffektes mituntersucht. Im Gegensatz dazu fand Arei et al. keine Apoptose von Jurkat-Zellen durch insgesamt 6 untersuchte Melanomzellinien. In diesem Versuchsaufbau wurden die Melanomzellen zusammen mit den Targetzellen (Jurkat) ausgesät. Die Ergebnisse von Arei et al. stimmen mit denen anderer Untersucher überein (Chappell, D. B. et al., 1999). Diese unterschiedlichen Ergebnisse deuten darauf hin, daß Mechanismen, die unabhängig von der FasL-Expression von Melanomzellen sind, eine Rolle spielen.

Trotz aller Schwierigkeiten bei den funktionellen Versuchen scheinen einige Zellinien doch mit immunhistochemischen Färbungen oder auf RNA-Ebene positiv für FasL zu sein. Auch hier ist jedoch Vorsicht bei der Interpretation der Ergebnisse angebracht, da das Fas/FasL- System als Suizidmechanismus in Antwort auf eine Vielzahl unterschiedlicher Bedingungen dienen kann. Kolonkarzinomzellinien mit Thymidylatsynthesedefekt regulieren die FasL- 5. Diskussion 59

Expression bei Thyminmangel hoch (Houghton, J. A. et al., 1997). Fibroblastenzellinien gehen nach Serumentzug c-myc abhängig in Apoptose, die über Fas/FasL vermittelt wird (Green, D. R., 1997; Hueber, A. O. et al., 1997). Der Nachweis von FasL auf Tumorzellen nach einer längeren Kulturperiode in vitro bedeutet daher nicht unbedingt, daß diese auch in vivo FasL exprimieren.

Tabelle 2: Bei verschiedenenTumorarten wurde die FasL-Expression beschrieben. Die unten gezeigte Tabelle enthält eine kleine Übersicht über einige Arbeiten.

Tumor mRNA Proteinnachweis Funktioneller Nachweis Lebermetastasen von RT-PCR Immunfluoreszenz (C20) Kokultur mit Jurkatzellen Kolonkarzinomen (Shiraki et al.)

Lungenkarzinom RT-PCR Westernblot (Klon 33) Kokultur mit Jurkatzellen (Niehans et al.) Immunhistochemie (Klon 33 u. polyklonaler AK)

Melanom Nicht nachgewiesen Nicht nachgewiesen durch Keine Zytotoxizität an (Chappell et al.) FACS Jurkat, A20 nachweisbar

Melanom RT-PCR Westernblot (Klon 33) Kokultur mit A20 und A20R (Hahne et al.) Monozyten Keine Daten FACS (C20 und N20) Kokultur mit Jurkatzellen (Villunger et al.) Westernblot (N20)

Myelom RT-PCR Westernblot (Klon 33) Kultur mit CEM-C7H2 T- (Villunger et al.) Northern-Blot FACS (NOK-1) Zellen

Pankreaskarzinom RT-PCR Westernblot (Klon 33 und Kokultur mit Jurkatzellen (Ungefroren et al.) G247-4) FACS (A11)

Prostatakarzinom RT-PCR FACS (C20, Santa Cruz) Keine Daten (Liu et al.) Immunhistochemie (C20) Westernblot (C20)

CLL Keine Daten FACS (Klon 33) Kokultur von B-CLL Zellen (Tinhofer et al.) mit CEM-C7H2 (T-ALL) JAM-Test

5. Diskussion 60

Die Verbreitung falscher Hypothesen und Rückschlüsse wurde auch durch erhebliche technische Probleme gefördert, die die frühe Forschung an Fas-Ligand behinderte. Ein Hauptproblem waren die Antikörper, die in vielen Veröffentlichungen Verwendung fanden. Der polyklonale Antikörper C-20 gegen Fas-Ligand, der von Santa Cruz Biotechnologies produziert wurde, erwies sich als wenig spezifisch (Smith, D. et al., 1998), was zur Veröffentlichung von vielen falsch-positiven Resultaten führte bis und auch noch nachdem seine Kreuzreaktivität 1998 entdeckt wurde (Gastman, B. R. et al., 1999). Hinzu kommt noch der Umstand, daß viele polyklonale Antiseren auf ähnliche Weise hergestellt wurden, die aber nicht in der Arbeit von 1998 getestet wurden. Der Gebrauch von polyklonalen Antiseren, die nach Peptidinjektion von Tieren gewonnen werden stellt generell ein Problem dar. Obschon die Erzeugung polyklonaler Antikörper ein einfaches Verfahren darstellt, ist eine komplette Charakterisierung der Spezifitäten kompliziert und voller Fallstricke. Ein anderer, monoklonaler Antikörper (Klon 33), der von Transduction Laboratories vertrieben wird, und häufig Verwendung fand, wurde ebenfalls als nicht spezifisch für FasL beschrieben (Stokes, T. A. et al., 1998). Eigene Untersuchungen mit dem Westernblot Verfahren zeigten sehr deutliche Differenzen im Färbeverhalten der zwei von uns verwendeten Antikörperklone (33 und G247-4). Alle untersuchten Zellysate zeigten bei Verwendung des Klones 33 ein deutliches Signal in der erwarteten Größenordnung (40 kDa) im Immunoblot, welches sich jedoch bei Verwendung des Klones G247-4 nicht mehr nachwiesen lies (Abbildung 18).

5.2 Das Fas/FasL-System und Immunprivileg

Die Beobachtung, daß FasL-exprimierende Sertoli-Zellen nach Transplantation in allogene Mäuse nicht abgestoßen werden, führte zu der Hypothese, daß das Fas/FasL-System im Zentrum dieses Immunprivilegs steht (Bellgrau, D. et al., 1995). Eine andere Arbeitsgruppe berichtete darauf, daß transplantiertes Gewebe (in diesem Fall Insulin produzierende Inselzellen des Pankreas) durch umgebende FasL-positive Myoblasten vor einer Abstoßungsreaktion geschützt werden können (Lau, H. T. et al., 1996). Fas/FasL-Interaktion wurde auch als wesentlich bei dem Immunprivileg des Auges angesehen (Griffith, T. S. et al., 1995). Die Auswirkungen waren enorm: Die Abstoßungsreaktionen würden durch Transfektion der Zellen mit FasL vor der Transplantation verhindert. Das Gegenteil ist jedoch der Fall. Tumorzellen, die mit FasL transfiziert worden sind, wurden eliminiert während native oder mit Neomycin transfizierte Kontrollen ungehindert weiter wuchsen. Dies wurde von B16, CT26 und RENCA berichtet (Arai, H. et al., 1997; Seino, K. et al., 1997). Die 5. Diskussion 61

Injektion eines FasL-exprimierenden Adenovirus in einen subkutanen Tumorknoten führte darüber hinaus zur Elimination des Tumors, wohingegen der Adenovirus alleine keinen Einfluß auf das Tumorwachstum zeigte (Arai, H. et al., 1997). Die Histologie legt nahe, daß neutrophile Granulozyten in das Tumorgebiet wandern und wahrscheinlich eine Rolle bei der Tumorabwehr spielen (Allison, J. et al., 1997; Kang, S. M. et al., 1997). Die Theorie, daß Fas- Ligand Geweben ein Immunprivileg verleiht oder maßgeblich daran beteiligt ist, gilt heute deshalb als widerlegt.

5.3 FasL-Expression in myeloischen Zellinien

Die myeloischen Zellinien HL60, K562, HEL und Mai exprimierten konstitutiv keine FasL- mRNA. Die Expression von FasL-mRNA in diesen Zellinien konnte jedoch durch die Stimulation mit PMA und Ionomycin induziert werden (Abbildung 8). Zur Überprüfung der Funktionalität des in der RT-PCR nachgewiesenen FasL-mRNA wurden aktivierte K562 Zellen zusammen mit Jurkatzellen inkubiert. Jurkatzellen exprimieren den Fas-Rezeptor und sind empfindlich für die Fas-vermittelte Apoptose (Abbildung 19). Sie fanden daher als Targetzellen Verwendung, um die Funktionalität des Fas-Liganden zu testen. Der Fas-Ligand, der nach Stimulation von K562 exprimiert wurde, war in diesem Versuch nicht in der Lage, bei Jurkatzellen den programmierten Zelltod zu triggern. Fas-Ligand kann wie auch der TNF- α und CD40-Ligand, beides Mitglieder der TNF-Familie, in löslicher Form in Kulturmedien nachgewiesen werden (Perez, C. et al., 1990; Pietravalle, F. et al., 1996; Tanaka, M. et al., 1995). Die lösliche Form des Fas-Liganden (sFasL) ist funktional, allerdings nur bei transformierten WR19L Zellen, die den Fas-Rezeptor überexprimieren (Pietravalle, F. et al., 1996). Der sFasL triggert dagegen bei humanen Jurkat T-Zellen, die bei unseren Experimenten als Targetzelle Verwendung fanden, keine Apoptose, während die membrangebundene Form des Fas-Liganden in diesen Zellen effektiv den programmierten Zelltod induziert (Tanaka, M. et al., 1998). Hohlbaum et al. zeigten in ihrer Arbeit ebenfalls, daß Lymphomzellen, die löslichen Fas-Liganden exprimieren, nicht in der Lage sind, Apoptose zu triggern (Hohlbaum, A. M. et al., 2000). Diese Befunde können den scheinbaren Widerspruch zwischen dem Nachweis des Fas-Liganden bei den stimulierten K562 Zellen in der RT-PCR einerseits, dem fehlenden zytometrischen Nachweis des FasL auf der Zelloberfläche und die nicht vorhandene Zytotoxizität gegenüber Jurkatzellen andererseits erklären.

5. Diskussion 62

Mögliche Funktionen des Fas-Liganden. Es stellt sich die Frage, welche Funktion der FasL- Expression in diesen Zellen zukommt. In der Diskussion stehen im Moment zwei Erklärungsansätze im Vordergrund. Fas-Ligand wurde zuerst auf aktivierten T-Zellen beschrieben. Aktivierte T-Zellen benützen das Fas/Fas-Ligand System als zytotoxischen Mechanismus, um bei Fas-exprimierenden Zellen Apoptose zu induzieren (Kagi, D. et al., 1994b; Kagi, D. et al., 1994a; Lowin, B. et al., 1994). Das Fas/Fas-Ligand System spielt somit eine wichtige Rolle bei der Elimination von virusinfizierten und transformierten Tumorzellen. Die Demonstration von Fas-Ligand in immunpriviligierten Geweben, wie dem Auge (Griffith, T. S. et al., 1995), dem Uterus und der Plazenta (Hunt, J. S. et al., 1997) und den Sertoli- Zellen des Hodens (Bellgrau, D. et al., 1995) führte zu der Hypothese, daß Fas-Ligand zu diesem Privileg beiträgt, indem er Fas-positive, infiltrierende T-Zellen in diesen Geweben eliminiert. Die Beschreibung einer funktionellen FasL-Expression in einer steigenden Anzahl von soliden Tumoren führte dann zur These, daß diese Tumorzellen sich durch das Fas/Fas- Ligand Systems der Elimination durch das Immunsystem entziehen. Diese Theorie wurde vor allem durch Untersuchungen gestützt, wonach diese Tumorzellen in der Lage sind bei Fas- positiven T-Zellen wie z. B. Jurkatzellen in vitro, Apoptose zu induzieren. Kokulturversuche von nicht stimulierten HL60, K562, LCL-Rei und T-ALL-Zellen mit Jurkatzellen zeigten jedoch keine erhöhten Apoptoseraten.

5. Diskussion 63

Die gezeigte FasL-Expression könnte auch den konservierten Phänotypus der normalen Ursprungszellen darstellen. Diese These wird durch neuere Untersuchungen unterstützt, wonach das Fas/Fas-Ligand System eine wichtige Rolle bei der Regulation der Hämatopoese spielt. Erythropoetin (EPO), ein Glykoproteinhormon, das von der Niere als Antwort auf Gewebehypoxie gebildet wird (Krantz, S. B., 1991), bestimmt das Schicksal unreifer Erythroblasten (Kelley, L. L. et al., 1993). Unreife Erythroblasten zeigen ein hohes Proliferationspotential und sind deshalb ein wichtiger Angriffspunkt bei der Regulation der Erythropoese. Diese Zellen exprimieren den Fas-Rezeptor (CD95) und gehen in Gegenwart reifer, Fas-Ligand exprimierender Erythroblasten in Apoptose, es sei denn sie werden hohen Spiegeln von EPO ausgesetzt. Das Fas/Fas-Ligand System könnte also zusammen mit niedrigen EPO-Konzentrationen zu einer negativen Regulation der physiologischen Blutbildung beitragen (De Maria, R. et al., 1999).

Die Rolle des Fas/Fas-Ligand Systems für die Blutbildung wird auch durch Untersuchungen über die Wirkung von γ-Interferon unterstrichen. γ-Interferon induziert die Bildung und steigert die Intensität von funktionellem Fas auf erythoiden Progenitorzellen (ECFC). Die Steigerung dieser Fas-Expression geht mit einer Verminderung der Proliferation einher. Fas/FasL-Interaktionen vermitteln demnach die inhibitorischen und proapoptotischen Effekte von γ-Interferon auf die ECFC (Dai, C. H. et al., 1998).

Die Zellinie HEL wurde von einem Patienten mit Erythroleukämie etabliert und kann spontan oder nach Induktion Globin synthetisieren (Martin, P. et al., 1982). K562-Zellen leiten sich von einer CML in Blastenkrise ab und produzieren Hämoglobin (Lozzio, C. B. et al., 1973). Die Zellinien HL60 (Collins, S. J. et al., 1977) und Mai stammen von Patienten mit einer akuten myeloischen Leukämie (FAB 2 bzw. FAB 4). Dies deutet auf die nahe Verwandtschaft hin und könnte die gefundene Fas-Ligand-Expression der malignen Zellen im Sinne einer konservierten Eigenschaft der nicht malignen Ursprungszellen erklären. 5. Diskussion 64

5.4 Antithymozytenglobuline

5.4.1 Das Fas/FasL-System und Antithymozytenglobuline

Ein gemeinsames Hauptmerkmal der Behandlung mit Antithymozytenglobulinen (ATG) ist die nicht unerhebliche Depletion peripherer Lymphozyten, die gewöhnlich über den eigentlichen Gabezeitraum hinaus reicht und erst langsam wieder zurückgeht (Lamb, L. S., Jr. et al., 1998). Diese Depletion ist, obgleich nicht formell in klinischen Studien nachgewiesen, wahrscheinlich für die immunsuppressive Wirkung der ATG verantwortlich. ATG werden in der Behandlung von schweren aplastischen Anämien, der GVHD und Fremdorganabstoßung eingesetzt (Champlin, R. et al., 1983; Deeg, H. J. et al., 1985; Najarian, J. S. et al., 1976), aber ihr genauer Wirkungsmechanismus ist noch weitgehend unbekannt.

Der wichtigste Mechanismus, der für die Homeostase des lymphatischen Gewebes sorgt, und eine Hyperplasie, trotz wiederholter Antigenstimulation und klonaler B- und T-Zellexpansion, verhindert, ist der aktivierungsinduzierte programmierte Zelltod (AICD). Der AICD wird durch die Interaktion des Fas-Rezeptors mit seinem Liganden (Fas-Ligand, CD95L) vermittelt (Lynch, D. H. et al., 1995). Dies veranlaßte uns, eine mögliche Beteiligung der Fas/FasL- Interaktion an der ATG-induzierten Depletion peripherer Lymphozyten näher zu untersuchen. Für alle Versuche wurde ATG-Fresenius verwendet, das von Kaninchen stammt, die gegen Jurkatzellen, einer humanen T-Zellinie, immunisiert worden sind (Grosse-Wilde, H. et al., 1981).

ATG induzierte dosisabhängig Apoptose in ruhenden und aktivierten PBMC, sowie in Jurkatzellen. Aktivierte T-Zellen zeigen eine Hochregulation ihres Fas-Rezeptors (Lynch, D. H. et al., 1995). Es war daher nicht überraschend, daß die aktivierten T-Zellen entsprechend empfindlicher auf die Fas-vermittelte Apoptose durch den murinen Anti-Fas-Antikörper (Klon CH11)(Abbildung 25). Es fanden sich hierbei keine nennenswerten Unterschiede zwischen PHA- und OKT3/IL2-stimulierten PBMC-Zellen (Abbildung 25).

Dieses änderte sich jedoch, als zur Apoptoseinduktion ATG eingesetzt wurden. Hier fand sich zwischen ruhenden und aktivierten PBMC kein Unterschied, unabhängig von den ATG- Konzentrationen, die von 10µg bis 160 µg/ml reichten (Abbildung 27). Solche Konzentrationen finden sich auch im Serum von Patienten nach Knochenmarktransplantation 5. Diskussion 65

(Eiermann, T. H. et al., 1999). Das gleiche Bild bot sich, als Jurkatzellen als Target für die Antithymozytenglobuline verwendet wurden. Trotz Zugabe des blockierenden Anti-Fas- Antikörpers ZB4, der die FasL-induzierte Apoptose schon bei einer Konzentration von 50ng/ml effektiv blockierte (Abbildung 20), fand sich hinsichtlich der Apoptoserate kein signifikanter Unterschied bei den getesteten ATG-Konzentrationen, die von 20 µg bis 160 µg/ml reichten (Abbildung 28). Selbst bei Zugabe von exzessiv hohen Dosen (1µg/ml und 10µg/ml) des blockierenden Antikörpers ZB4 fand sich kein Unterschied bei der durch die ATG induzierten Apoptose (Abbildung 28). Es ist deshalb davon auszugehen, daß die Apoptoseinduktion der ATG unabhängig von dem Fas/FasL-Rezeptorsystem ist, zumindest bei dem hier getesteten ATG-Fresenius.

Die Ergebnisse von der Arbeitsgruppe Genestier et al., wonach nur PHA-aktivierte PBMC, nicht aber ruhende PBMC empfindlich für den ATG-getriggerten programmierten Zelltod sind konnten nicht bestätigt werden (Genestier, L. et al., 1997). Nach den Untersuchungen dieser Arbeitsgruppe wurde die ATG-getriggerte Apoptose bei den PHA-Blasten durch den antagonistischen Anti-Fas-Antikörper (Klon ZB4) nahezu vollständig verhindert, was auf eine entscheidende Rolle des Fas-Rezeptors bei der ATG-vermittelten Apoptose deutet.

Antithymozytenglobuline enthalten eine Vielzahl von unterschiedlichen spezifischen Antikörpern, die mit unterschiedlichen Zellen (Thymozyten, T-Zellinien, B-Zellinien) und nach differenten Immunisierungsprotokollen hergestellt werden (Bonnefoy-Berard, N. et al., 1991; Raefsky, E. L. et al., 1986; Rebellato, L. M. et al., 1994). Es ist daher nicht ausgeschlossen, daß die unterschiedlichen Antithymozytenglobuline sich in ihrer Zusammensetzung und Wirkung unterscheiden. Dies könnte helfen, die gefundenen Unterschiede zu erklären. Dennoch ist es fraglich, ob die ATG-Wirkung zum überwiegenden Teil auf die Fas/FasL-Interaktion zurückgeführt werden kann, wie durch Genestier et al. vorgeschlagen. Untersuchungen zu den ATG-Wirkungen an B-Zellen zeigen, daß die Entfernung Fas-positiver B-Zellen die Zytotoxizität nur teilweise verringert. Darüber hinaus sind Burkitt Lymphomzellinien der Gruppe III, die den Fas-Rezeptor exprimieren, jedoch resistent gegen die Fas-vermittelte Apoptose sind, empfindlich gegen ATG. Bei manchen Fas- negativen B-Zellinien sind ATG dennoch in der Lage, Apoptose zu induzieren (Bonnefoy- Berard, N. et al., 1994; Bonnefoy-Berard, N. et al., 1996).

5. Diskussion 66

Untersuchungen zur Funktion verschiedener Oberflächenmoleküle auf Lymphozyten ergaben, daß Antikörper gegen HLA der Klasse I (Woodle, E. S. et al., 1997), gegen CD2 (Mollereau, B. et al., 1996) und gegen CD45 (Klaus, S. J. et al., 1996) in der Lage sind, den programmierten Zelltod zu induzieren. Antikörper gegen diese Oberflächenmoleküle wurden in Kaninchen-Antilymphozytenglobulinen, die gegen humane Thymozyten immunisiert worden sind, nachgewiesen (Bonnefoy-Berard, N. et al., 1991; Rebellato, L. M. et al., 1994).

Eine alleinige oder wesentliche Beteiligung des Fas/FasL-Systems bei der zytotoxischen Wirkung von ATG erscheint jedoch auch aus anderen Gründen nicht plausibel. Die Verabreichung eines spezifischen Anti-Fas-Antikörpers führt im Tierexperiment zu einer fulminanten Hepatitis, die den Tod der Versuchstiere innerhalb weniger Stunden nach sich zieht (Feldmann, G. et al., 1998; Ogasawara, J. et al., 1993). Hepatozyten exprimieren den Fas-Rezeptor und gehen bei dessen adäquater Reizung in Apoptose. Diese gravierenden Nebenwirkungen sind jedoch bei der Administration von ATG beim Menschen nicht beobachtet worden (Preussner, S. et al., 1979).

5. Diskussion 67

5.4.2 ATG-Nachweis in Serumproben nach Knochenmarktransplantation

Antilymphozytenglobuline werden prophylaktisch gegeben, um eine Graft versus Host Reaktion (GVHD) nach Transplantation von Knochenmark zu verhindern (Finke, J. et al., 1997; Slavin, S. et al., 1998). Weitere Indikationen für Antilymphozytenglobuline sind die schwere aplastische Anämie und die allogene Organtransplantation. Der Wirkungsmechanismus der ATG ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Die Patienten, die hier untersucht wurden, erhielten am Tag2 und Tag1 vor Transplantation 20mg/kg/KG ATG als Infusion über 6 Stunden. Dieser Hintergrund veranlaßte uns, den Verbleib von ATG in Plasma- und Serumproben von transplantierten Patienten, sowie deren zytotoxische Wirkung in vivo näher zu untersuchen. Der ATG-Nachweis erfolgte durch Inkubation über Nacht von Jurkatzellen mit Patientenproben (Plasma oder Serum), die zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Transplantation entnommen wurden. Die ATG-Bindung wurde anschließend mit einem Zweitantikörper nachgewiesen. Die ATG konnten bis zum Tag 134 (längster Beobachtungszeitraum) nach Transplantation auf den Jurkatzellen nachgewiesen werden (Abbildung 29). Diese lange andauernde Nachweisbarkeit von ATG könnte eine mögliche Erklärung für die über den Gabezeitraum hinaus beobachtete Lymphozytendepletion sein. Unsere Untersuchungen zur ATG-Nachweisbarkeit nach Transplantation stimmen mit den Ergebnissen anderer Untersucher überein (Bunn, D. et al., 1996). Bunn et al. berichten über eine durchschnittliche Halbwertzeit von 29 Tagen (mit einer Spanne von 14 bis 45 Tagen) von Kaninchen-IgG beim Menschen. Im Tierversuch zeigten sich interessanterweise bei der Elimination von ATG-Antikörpern Unterschiede bei den einzelnen spezifischen Antithymozytenantikörpern (Rebellato, L. M. et al., 1994). 5. Diskussion 68

5.4.3 Zytotoxizität von Serum-ATG nach Transplantation

Nun stellte sich die Frage, inwiefern die nachgewiesenen Antithymozytenglobuline in Serum- und Plasmaproben transplantierter Patienten in der Lage sind, bei T-Zellen Apoptose zu induzieren. Bei der Untersuchung der zytotoxischen Wirkung der ergab sich dagegen ein anderes Bild. Eine direkt zytotoxische Wirkung der ATG konnte bei stimulierten und ruhenden T-Zellen nur bis kurz nach der zweiten ATG-Gabe am Tag 1 vor Transplantation nachgewiesen werden (Abbildung 30), trotz nachgewiesener Bindung an der Zelloberfläche über diesen Zeitpunkt hinaus (Abbildung 30 A). Hier liegt eine interessante Parallele zu den Ergebnissen einer anderen Arbeitsgruppe. Eiermann et al. untersuchten den inhibitorischen Effekt von Antithymozytenglobulinen auf die Phythämagglutinin-induzierte Blastogenese. Bei ATG-Konzentrationen von 10 mg/ml zeigte sich eine effektive Blockierung des ³H- Thymidineinbaus, die erst bei einer Konzentration von 10 ng/ml ATG nicht mehr nachweisbar war. Dieser Effekt konnte bei ATG in Serumproben nach Transplantation dagegen nur bis maximal 4 Tage post transplantationem nachgewiesen werden, während ATG über diesesn Zeitraum hinaus nachweisbar blieb (Eiermann, T. H. et al., 1999). 6.Zusammenfassung 69

6 Zusammenfassung

Fas-Ligand (FasL) stellt einen der 2 Effektormechanismen dar, mit dem T-Zellen den programmierten Zelltod induzieren. Die FasL-Expression auf Tumorzellen wurde in letzter Zeit als ein möglicher Mechanismus angesehen, mit dem sich Tumorzellen der Immunantwort des Körpers entziehen. Die Datenlage bezüglich der FasL-Expression in normalen und neoplastischen B-Lymphozyten ist im Moment kontrovers. Wir untersuchten die FasL- Expression mit Hilfe der RT-PCR und FACS-Analyse in einem leukämisch verlaufenden zentrozytischen Non-Hodgkin-Lymphom (cc-NHL), in hoch aggressiven Burkitt Lymphomen (BL), und in der indolenten NHL chronischen lymphozytischen Leukämie (CLL). Die FasL- Expression war in allen BL-Zellinien, sowie in gereinigten CLL-Proben und in B-Zellen gesunder Spender stets negativ. Wir folgern aus diesen Ergebnissen, daß Fas-Ligand weder auf normalen peripheren B-Zellen noch auf neoplastischen B-CLL-Zellen exprimiert wird. Eine Beteiligung von FasL bei Umgehung des Immunsystems, wie dies beim Adenokarzinom des Kolons beschrieben wurde, erscheint daher bei den untersuchten Entitäten unwahrscheinlich.

Antithymozytenglobuline werden bei der Knochenmarktransplantation zur Vermeidung einer Graft-versus-Host-Reaktion eingesetzt und induzieren eine Depletion peripherer Lymphozyten. Verschiedene Mechanismen zur zytotoxischen Wirkung der ATG werden diskutiert. Der aktivierungsinduzierte programmierte Zelltod (AICD), der durch Fas vermittelt wird, trägt wesentlich zur Homeostase des lymphatischen Gewebes bei. Wir untersuchten eine mögliche Beteiligung des Fas/FasL-Rezeptorsystems an der Lymphozytendepletion durch ATG an Jurkatzellen, ruhenden und aktivierten peripheren Lymphozyten (PBMC). Aktivierte PBMC zeigen eine Hochregulation des Fas-Rezeptors und reagierten dementsprechend empfindlicher auf die Fas-getriggerte Apoptose. Als zur Apoptoseinduktion ATG-Fresenius eingesetzt wurde, fand sich kein Unterschied mehr zwischen ruhenden und aktivierten PBMC. Bei Jurkatzellen induzierte ATG den programmierten Zelltod trotz Blockade des Fas- Rezeptors mit hohen Konzentrationen eines Anti-Fas-Antikörpers. Diese Ergebnisse machen eine Beteiligung der Fas-Mechanismus bei der ATG-induzierten Apoptose unwahrscheinlich.

7.Literatur 70

7 Literatur

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8 Lebenslauf

Name: Manfred Richter Geburtsdatum: 30. April 1971 in Stuttgart

Ausbildung: 06/87 Realschulabschluß

09/87 - 09/89 Ausbildung im mittleren Dienst der Allgemeinen Finanzverwaltung beim Statistischen Landesamt Baden- Württemberg

09/89 - 09/90 Tätigkeit beim Landesamt für Besoldung und Versorgung Baden-Württemberg

09/90 - 06/92 Wirtschaftsoberschule Stuttgart 06/92 Erwerb der allgemeinen Hochschulreife

08/92 - 10/93 Zivildienst

10/93 Beginn des Studiums der Medizin an der Universität Tübingen 08/95 Physikum 08/96 1. Staatsexamen 10/96 - 07/97 Studium der Medizin an der Universität Victor Segalen Bordeaux seit 10/97 Studium an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg 03/98 Beginn der Dissertation in der Abteilung Hämatologie/Onkologie der Medizinischen Klinik 03/00 2. Staatsexamen seit 04/00 Praktisches Jahr