Universidad De Ciencias Y Artes De Chiapas

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS Y ARTES DE CHIAPAS

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

TESIS

HERBIVORÍA Y ESTRUCTURA GENETICA DE Rhizophora mangle EN LA COSTA DE CHIAPAS.

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

PRESENTA MARTÍN HERNÁNDEZ LÓPEZ

DIRECTOR: CO-DIRECTOR: Dr. Sergio López Mendoza Dr. Alejandro Nettel Hernanz UNICACH UNICACH

ASESORES Dra. Tamara M. Rioja Paradela Dr. Cristian Tovilla Hernández UNICACH ECOSUR Dr. Rodolfo Dirzo Professor, Stanford University

Tuxtla Gutiérrez, Chiapas Junio de 2017 DEDICATORIA

A mi Padre Celestial por su inmesurable amor sobrenatural, manifestado por el derramamiento del Espiritu Santo en mi familia y a nuestro único salvador Jesús de

Nazareth. A mis padres espirituales: Carlos Cesar Burguete y Lupita Galindo, pastores de la Iglesia cristiana Ministerio Internacional el Rey de Gloria. De igual forma, esta tesis va dedicada con profundo cariño a mis padres biológicos: Profra. Zoila Beatriz

López Pivaral (q.e.p.d.) y Sr. Erolfo Hernández Santizo, quienes me han instruido en el camino de la honestidad, dedicación y perseverancia. A mi amada esposa Claudia

Marissa y mi pequeña hija Yarita Alejandra, porque son Princesas y Guerreras de Dios, declarando e intercediendo en sus oraciones por nuestras metas y própositos. A mis hermanos: Margarita, Edith, Arsenio, Graciela y Odilia, por guiarme y orientarme con sus consejos y a la nueva integrante de la familia: mi sobrinita Alexa Beatríz. A mis abuelitas: Inesita y Tashita, sobrinos, amigos, a los tíos: Rosemberg, Ruben, Martín,

Mario, Roberto, Hermain y Oscar, por exhortarme a continuar con mi preparación profesional.

Martín Hernández López

y de conocer el amor de Cristo, que excede a todo conocimiento, para que seáis llenos de toda la plenitud de Dios. Efesios 3: 19

AGRADECIMIENTOS

A mi comité tutorial integrado por el Dr. Sergio López Mendoza, Dr. Alejandro Nettel

Hernanz, Dra. Tamara Rioja Paradela, Dr. Cristian Tovilla Hernández y Dr. Rodolfo

Dirzo.

Al personal de Laboratorio de Ecología Evolutiva de la UNICACH

A los docentes que impartieron las diferentes materias en el Programa de la Maestría en Ciencias Biológicas de la UNICACH.

A los estudiantes de la Universidad de Guadalajara, Universidad Autónoma de Ciudad

Juárez y a la Universidad de Occidente por su valioso apoyo en las técnicas de extracción, amplificación y visualización de DNA.

Al Laboratorio de Ecología y Manejo Integral de Ecosistemas Costeros, Ecosur unidad

Tapachula.

A Margarita Hernández López encargada de la Biblioteca de Ecosur, SIBE, Unidad-

Tapachula.

Al Sr. Erolfo Hernández Santizo por su apoyo financiero en las salidas de campo de este proyecto.

ÍNDICE RESUMEN……………………………………………………………………………………….ix ABSTRACT………………………………………………………………………………………xi I. INTRODUCCIÓN ...... 1 II. MARCO TEÓRICO ...... 4 2.1 Historia Natural de Rhizophora mangle...... 4 2.2 Interacciones Bióticas...... 5 2.3 Depredación...... 6 2.4. Herbivoría...... 7 2.4.1 Resistencia y tolerancia...... 8 2.5. Importancia de la herbivoría dentro de la genética, ecología y evolución...... 9 2.5.1. Genético...... 9 2.5.2. Ecológico...... 10 2.5.3. Evolutivo...... 11 2.6 Herbivoría en ecosistemas de manglar...... 12 2.6.1 Insectos herbívoros de manglar...... 14 2.6.1.1 Tipos de daño foliar...... 15 2.6.2 Crustáceos herbívoros de manglar...... 17 2.7 Diversidad genética en manglares ...... 19 2.7.1 Marcadores Moleculares...... 21 III. ANTECEDENTES ...... 24 3.1 Estudios de herbivoría en mangles...... 24 3.2 Estudios de diversidad genética en mangles...... 27 IV. OBJETIVOS ...... 29 4.1 Objetivo General ...... 29 4.2 Objetivos específicos ...... 29 V. HIPÓTESIS ...... 30 VI.- MÉTODO...... 31 6.1.- Área de estudio...... 31

iii

6.2- Programas de Manejo de las Zonas Sujetas a.Conservación.Ecológica: “El Cabildo Amatal” y “Gancho Murillo”...... 31 6.3 Colecta de material foliar...... 34 6.4. Índice de herbivoría...... 36 6.5 Diversidad genética...... 37 6.5.1 Extracción y visualización de ADN...... 37 6.5.2 Amplificación de ADN...... 39 6.5.3 Análisis de geles de acrilamida...... 40 6.6 Análisis estadístico...... 42 6.6.1 Indice de herbivoría en relación a los estadíos de R. mangle...... 42 6.6.2 Diversidad genética en relación a los estadíos de R. mangle...... 42 6.6.3 La herbivoría y su relación con la diversidad genética...... 43 VII. RESULTADOS ...... 44 7.1 Herbivoría ...... 44 7.1.1 Distribución de frecuencias por categoría de daño en estadíos de R. mangle...... 44 7.1.2 Herbivoría de R. mangle en relación al estadío...... 46 7.2 Diversidad genética de R. mangle...... 48 7.2.1 Diversidad genética de R. mangle en relación al estadío...... 49 7.3 Herbivoría y Diversidad Genética ...... 51 7.3.1 Herbivoría de R. mangle en relación al número de Heterocigotos...... 51 7.3.2 Herbivoría de R. mangle en relación al % Loci polimórfico...... 51 7.3.3 Herbivoría en estadíos de R. mangle y su relación con el %loci polimórfico. 54 7.3.4 Relación Herbivoría – Heterocigosidad promedio...... 55 7.3.5 Relación Herbivoría – Heterocigosidad promedio cuadrática...... 57 7.3.6 Relación Herbivoría – Alelos Promedio...... 58 VIII. DISCUSIÓN ...... 60 8.1 Herbivoría de R. mangle en relación al estadío...... 60 8.2 Genética de R. mangle en relación al estadío...... 63 8.3 Relación Herbivoría – Diversidad genética ...... 65

IX. CONCLUSIONES ...... 67 X LITERATURA CITADA ...... 69 XI. ANEXOS ...... 101

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Familias y especies de lepidópteros capturados en Pozuelos y Cabildo,

Chiapas. (Niño, 2002)………………………………………………………………….27

Cuadro 2. Caracterización de 10 loci microsatélites de R. mangle……………………….39

Cuadro 3. Prueba x2 entre las categorías de daño y estadíos de R. mangle …………..45

Cuadro 4. Prueba de Kruskal Wallis entre la herbivoría de R. mangle y su estadío en las

dos poblaciones………………………………………………………………………...47

Cuadro 5. Diversidad genética en plántulas y árboles adultos de R. mangle …………..48

Cuadro 6. Diversidad génetica en las dos poblaciones de R. mangle…………………...49

Cuadro 7. Valores de t para la diversidad genética de R. mangle………………………..49

Cuadro 8. Valores de t para la diversidad genética de R. mangle………………………..50

Cuadro 9. Anova de la herbivoría y número de heterocigotos en plántulas y árboles

adultos de R. mangle………………………..………………………………….……..53

Cuadro 10. Anova de la herbivoría de R. mangle en relación al % de loci

polimórfico…………………………………………………………………………...... 54

Cuadro 11. Anova de la herbivoría en los estadíos de R. mangle en relación al % de loci

polimórfico………………………………………………………………………………54

Cuadro 12. Anova de la herbivoría y heterocigosidad promedio en plántulas y árboles

adultos de R. mangle………………………………...... ……………57

Cuadro 13. Anova de la herbivoría y heterocigosidad promedio cuadrática en plántulas y

árboles adultos de R. mangle…………………………………………………………57

Cuadro 14. Anova de la herbivoría y alelos promedio en plántulas y árboles adultos de

R. mangle………………………………………….……………………………….……58

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Distribución Mundial de la familia Rhizophoraceae (N.C. Duke 2002)…………..5

Figura 2. Localización de los humedales costeros El Cabildo Amatal y Gancho Murillo,

Chiapas………………………………………………………………………………….33

Figura 3. Colecta de materia foliar de plántulas y árboles adultos de R. mangle………35

Figura 4. Recipiente con hielo para depositar el materia foliar……………………………35

Figura 5. Separación aleatoria de las hojas para estimar herbivoría y diversidad

genética………………………………………………………………………………….36

Figura 6. Acetato marcado con puntos cada 0.5 cm para calcular porcentaje de

herbivoría………………………………………………………………………………..37

Figura 7. Visualización de ADN genómico de R. mangle en un gel de agarosa al 1 %..38

Figura 8. Amplificación de alelos de R. mangle en gel acrilamida al 6 % microsatelite

RM36 (rango 210 ± 30) en la población de Cabildo, Chiapas…………………….41

Figura 9. Distribución de frecuencias por categoría de daño en el manglar...…………..44

Figura 10. Distribución de frecuencias por categoría de daño en el manglar de Pozuelos

Murillo……………………………………………………………………………...…….45

Figura 11. Porcentaje de herbivoría en plántulas y árboles adultos de R. mangle …….46

Figura 12. Porcentaje de herbivoría en dos poblaciones de R. mangle…………………47

Figura 13. Tendencia lineal de herbivoría y No. heterocigotos en plántulas y árboles

adultos de R. mangle…………………………………………………………………..52

Figura 14. Tendencia lineal de herbivoría y % loci polimórfico en plántulas y árboles

adultos de R. mangle……………………………………..……………………………53

vii

Figura 15. Tendencia lineal de herbivoría y % loci polimórfico en plántulas y árboles

adultos de R. mangle…………………………………………………………………..55

Figura 16. Tendencia lineal de herbivoría y heterocigosidad promedio en plántulas y

árboles adultos…………………………………….…...... 56

Figura 17. Tendencia lineal de herbivoría y alelos promedio en plántulas y árboles

adultos…………………………………………………………………………………...59

viii

RESUMEN

En este trabajo se determinaron los niveles de herbivoría (IH), según el método propuesto por Dirzo y Domínguez (1995), y la diversidad genética, usando ocho marcadores moleculares tipo microsatélites de DNA (RM7, RM11, RM19, RM21, RM36,

RM38, RM41 y RM46) diseñados por Rosero-Galindo et al. (2002), de plántulas y

árboles adultos de Rhizophora mangle, localizados en dos complejos lagunares denominados “Cabildo” y “Pozuelos Murillo”, Chiapas; se obtuvo la relación entre el porcentaje de herbivoría y la diversidad genética en las dos poblaciones. En general, se reportaron bajos niveles de daño foliar de R. mangle en Cabildo (8.5%) y Pozuelos

Murillo (7.9%). Las plántulas resultaron más susceptibles a la herbivoría. La distribución de frecuencias de daño son más altos en categorías menores: 2 (6 a 12%) y 3 (13 a

25%); a partir de la chi cuadrada (X2), se encontraron diferencias significativas (P= 0.00) entre los valores categóricos de daño y los estadíos en ambas poblaciones. Con la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis, se demostró que la herbivoría de R. mangle mantiene una relación significativa (P < 0.00) con los estadíos. En Cabildo, la diversidad genética, referente al número de heterocigotos, porcentaje de loci polimórfico, promedio de heterocigosidad y alelos, presenta diferencias significativas (P= 0.00) con los estadíos; mientras que, en Pozuelos Murillo, las diferencias significativas (P= 0.03) se hallaron en el número de heterocigotos y promedio de heterocigosidad. La mayor diversidad genética de R. mangle se registró en la población de Pozuelos Murillo. Los

árboles adultos alcanzaron elevados niveles de diversidad genética en las dos poblaciones; aunque, los resultados demuestran bajos niveles de diversidad. En

Cabildo, la herbivoría en árboles adultos de R. mangle poseen una relación significativa

ix negativa (P= 0.04) con el número de heterocigotos, porcentaje de loci polimórfico y heterocigosidad promedio; mientras que, en plántulas guarda una relación marginalmente significativa negativa (P= 0.05) con el número de heterocigotos, promedio de heterocigosidad y alelos. En Pozuelos Murillo, la herbivoría en árboles adultos de R. mangle presenta una relación marginalmente significativa negativa (P=

0.05) con el número de heterocigotos, porcentaje de loci polimórfico, promedio de heterocigosidad y alelos; en plántulas, la herbivoría exhibe una relación significativa positiva (P= 0.00) con el número de heterocigotos, porcentaje de loci polimórfico, promedio de heterocigosidad y alelos.

Palabras clave: Índice de herbivoría, Diversidad Genética, Microsatélites, Gancho

Murillo, Cabildo Amatal, plántulas y árboles adultos de mangle rojo.

ABSTRACT

In this work, we determined the herbivory levels (IH), according to the method proposed by Dirzo and Domínguez (1995), and genetic diversity using eight DNA microsatellite markers (RM7, RM11, RM19, RM21, RM36, RM38 , RM41 and RM46) designed by

Rosero-Galindo et al. (2002), of Rhizophora mangle seedlings and adult trees, located in two lagoon complexes called "Cabildo" and "Pozuelos Murillo", Chiapas; the relationship between the percentage of herbivory and the genetic diversity in the two populations was obtained. In general, low levels of leaf damage of R. mangle were reported in Cabildo (8.5%) and Pozuelos Murillo (7.9%). Seedlings were more susceptible to herbivory. The distribution of frequencies of damage are higher in smaller categories: 1 (1 to 5%) and 2 (6 to 12%); From the chi square (X2), significant differences (P= 0.00) were found between the categorical damage values and the stages in both populations. With the nonparametric Kruskal Wallis test, it was shown that the herbivory of R. mangle maintains a significant relation (P <0.00) with the stages.

In the Cabildo, genetic diversity, referring to the number of heterozygotes, percentage of polymorphic loci, average heterozygosity and alleles, presented significant differences

(P= 0.00) with the stages; While in Pozuelos Murillo, significant differences (P= 0.03) were found in the number of heterozygotes and mean heterozygosity. The greatest genetic diversity of R. mangle was recorded in the population of Pozuelos Murillo. Adult trees reached high levels of genetic diversity in both populations; Although, the results show low levels of diversity. In Cabildo, herbivory in R. mangle adult trees have a significant negative relation (P= 0.04) with the number of heterozygotes, percentage of polymorphic loci and mean heterozygosity; While in seedlings it has a marginally

xi significant negative relation (P= 0.05) with the number of heterozygotes, mean heterozygosity and alleles. In Pozuelos Murillo, herbivory in R. mangle adult trees shows a marginally significant negative (P= 0.05) relation with the number of heterozygotes, percentage of polymorphic loci, mean heterozygosity and alleles; In herbivory, the herbivory exhibits a significant positive relation (P= 0.00) with the number of heterozygotes, percentage of polymorphic loci, mean heterozygosity and alleles.

Key words: Index of herbivory, Genetic Diversity, Microsatellites, Cabildo Amatal,

Pozuelos Murillo, seedlings and adult trees of red mangrove.

xii

I. INTRODUCCIÓN Los ecosistemas de manglar comprenden comunidades vegetales, arbóreas o arbustivas desarrolladas en litorales costeros de las regiones tropicales y subtropicales, consideradas como los sistemas más productivos y diversos en el mundo debido a que el 80% de la pesca marina mundial depende directa o indirectamente de estos bosques

(Ming et al., 2007). Los manglares se distinguen por presentar mecanismos de adaptación que incluyen la viviparidad, glándulas para la exclusión o excreción de sal, raíces adventicias y pneumatóforos. Dichas especializaciones morfológicas y funcionales le permiten colonizar sitios con alta concentración de sales (halofitas facultativas), suelos inundados y pobres en oxígeno (Tomlinson, 1994).

Los manglares crean entornos ecológicos únicos que son caracterizados por una notable biodiversidad. Los sedimentos de limo y arena de estos bosques son refugio de una amplia variedad de invertebrados. La importancia ecológica de esos animales en las redes tróficas, ciclo de nutrientes y sobretodo en el flujo de energía de los ecosistemas de mangle han sido materia de estudio de investigaciones ecológicas

(Kathiresan y Bingham, 2001). Para determinar el valor de los manglares y otros hábitats estuarinos es indispensable conocer su historia natural, fisiología y ecología

(Manson et al., 2005).

Por otra parte, los bosques de mangle han sido clasificados como los ecosistemas más amenazados del planeta (Valiela et al., 2001; Alongi, 2002; Duke et

1 al. 2007; FAO, 2007). A nivel mundial, se estima que, en los últimos 25 años, han desaparecido cerca del 35% de los bosques de mangle (Hogarth, 2007). De acuerdo al reporte emitido por la United Nations Environment Programme (UNEP, 2014), los manglares están siendo destruidos a una velocidad de tres a cinco veces superior a la pérdida de bosques, generando costos hasta de US$42 billones en daños económicos anuales.

En México, la situación es similar, los ecosistemas de manglar han sido severamente afectados en las últimas décadas. Especialmente, en el sureste del país debido al turismo, desarrollo de infraestructura, acuacultura, agricultura, silvicultura y a fenómenos naturales como huracanes (Sánchez e Islebe, 1999; Hirales-Cota, 2009).

Estas actividades probablemente han disminuido su diversidad genética, modificando la estructura de los bosques de mangle. Uno de estos ecosistemas que se ven afectados es el de Tajamar ubicado en Cancún (Enciso, 2016). Por lo tanto, con la sucesiva degradación y destrucción de los manglares en el mundo, existe una necesidad urgente de investigación sobre información genética básica para designar estrategias de conservación eficientes.

A nivel global, la diversidad, distribución y abundancia del manglar dependen de la latitud y longitud geográfica. Los manglares cubren menos del (1%) en la superficie del planeta (Saenger, 2002). La riqueza de especies de estos bosques disminuye a lo largo de un gradiente longitudinal: la mayor diversidad se presenta en la región del Indo-

Pacífico, donde la riqueza específica es de 60 especies y progresivamente se reduce

2 hasta llegar a 5 ó 6 especies en las costas americanas. Este gradiente en la riqueza específica (conocida como la anomalía Indo-Pacífica, y que también ocurre en corales y peces asociados a los arrecifes) se cree que se formó debido a que el centro de origen de las especies de mangle fueron las islas de los mares someros Indo-Pacífico (Ricklefs y Latham, 1990). De la misma forma, conforme se incrementa la latitud, se reduce la diversidad y complejidad estructural de los manglares, como sucede en las costas del

Golfo de México (Lot-Helgueras et al., 1975).

II. MARCO TEÓRICO

2.1 Historia Natural de Rhizophora mangle. Rhizophoraceae es reconocida como la familia de manglares de mayor riqueza, con cuatro géneros (Bruguiera, Ceriops, Kandelia y Rhizophora). El género Rhizophora, formado por cinco especies y varios híbridos interespecíficos, es vivíparo y produce largos propágulos embrionarios que permanecen adheridos a la planta madre hasta por

12 meses o más antes de ser liberados para dispersarse a través de las mareas y corrientes (Tovilla, 1998). Rhizophora, se considera el género de manglares más diverso y mejor representado a través de la región tropical (Figura 1) (Tomlinson, 1986;

Duke., et al., 1998; Duke, 2006). La historia evolutiva muestra una divergencia significativa que ha dado lugar a dos largos grupos regionales aislados genéticamente por barreras de dispersión: la masa continental Africano-euroasiático y el este del

Océano Pacífico (Duke et al., 2002). Mientras que estudios palinológicos revelan que el género Rhizophora emergió en el Indo Pacífico, después del drástico cambio floral ocurrido durante la transición Eoceno-Oligoceno (hace 33.7 millones de años) y llegaron a dominar durante el Mioceno (Rull, 1998).

Dentro del género Rhizophora, la especie Rhizophora mangle, comúnmente conocida como mangle rojo, es la de mayor distribución a lo largo de las costas americanas. De acuerdo a Tomlinson (1986), esta especie ocupa la costa occidental de

África entre Angola y Mauritania. En América se distribuye ampliamente en el Caribe

(península de Florida) hasta Brasil, y en el Pacifico está presente desde el Norte de

México hacia la costa Norte de Perú, limitada por el clima frío y las regiones áridas.

Además, esta especie sustenta algunas de las principales actividades económicas para las comunidades aledañas al litoral; no obstante, la intensa explotación de esta especie, y de los ecosistemas de mangle en general, se ha estimado una pérdida de 1% anual

(FAO, 2003) en los bosques de mangle de Sudamérica.

Figura 1. Distribución Mundial de la familia Rhizophoraceae (N.C. Duke 2002).

2.2 Interacciones Bióticas. Todas las especies son elementos incrustados en complejas redes de interacciones. A pesar de tal complejidad, diversos estudios han demostrado patrones universales en las vías de interacción de las especies a través de los diferentes tipos de hábitats (Pimm,

1991; Montoya et al., 2006; Bascompte, 2009). Como resultado de estas relaciones, los individuos pueden verse beneficiados, perjudicados o simplemente no son afectados, dependiendo del contexto en que ocurran. Por lo tanto, estos patrones determinan la

5 estabilidad de las poblaciones para recuperarse de las perturbaciones, y las probables consecuencias de la extinción de especies locales dentro de la red de interacción (Berg et al., 2010; Whalter, 2010).

Por otra parte, se presentan las interacciones biológicas (mutualismo, competencia, parasitismo y depredación) que son procesos dinámicos presentes en todos los ecosistemas (Jablonski, 2008). Cuando los efectos positivos o negativos influyen en los componentes de la adecuación de un individuo (supervivencia, crecimiento, éxito reproductivo), es probable que estas relaciones afecten procesos demográficos y ecológicos (tasa de crecimiento poblacional, abundancia o distribución de una especie) o evolutivos (selección natural, flujo génico, coevolución, entre otros).

Las relaciones dinámicas cambian, en espacio y tiempo, con la heterogeneidad del hábitat (Thompson 1994; Leathwick y Austin, 2001; Warren et al., 2010; Wiescher et al.

2011).

2.3 Depredación. La Interacción biótica de presa-depredador constituye el mayor proceso ecológico, mediante el cual afectan individuos, poblaciones y comunidades, enlazan diversos organismos dentro y a través de ecosistemas. En consecuencia, como todos los heterótrofos necesitan procurar su alimento a partir de otros organismos, y a su vez, muchos de ellos están en algún riesgo de llegar a ser un recurso alimenticio para otros, se podría argumentar que la depredación es el mecanismo fundamental de intercambio

6 de energía entre organismos. Incluso, algunos investigadores consideran la depredación como una importante fuerza evolutiva que puede contribuir notablemente a la historia de la vida sobre un amplio rango de escala temporal y espacial (Kowalewski et al. 2005, Madin et al. 2006).

2.4. Herbivoría. Por otra parte, los herbívoros necesitan alimentarse para continuar con sus funciones vitales, por lo tanto, la herbivoría puede afectar el desempeño vegetativo y/o reproductivo de las plantas, generando repercusiones ecológicas y evolutivas (Dirzo,

1984; Coley, et al. 1985; Begon, et al.1986). En las selvas tropicales se ha estimado en

10% el daño en las hojas (Dirzo, 1987) causada principalmente por larvas de mariposas

(Dirzo, 1987; Coley, 1990; Coley y Barone, 1996). La herviboría es una de las interacciones planta-animal más frecuente en la naturaleza (Weiss y Berenbaum, 1989), que no solo influye en la dinámica y estructura de ecosistemas tropicales, sino también en el desempeño individual de la planta y en procesos a nivel de población (Coley y

Barone 1996). Por consiguiente, esta interacción biológica tiene la capacidad de intervenir en la regeneración de un bosque y mantener la diversidad de la planta

(Marquis, 2005). En particular, para las interacciones planta-herbívoro se espera que en bajas latitudes (tropical), la abundancia y riqueza de insectos herbívoros sea mayor, así como también, se incremente la presencia de herbívoros especializados y las pérdidas de biomasa en las plantas sean abundantes por la acción de los herbívoros.

Es importante señalar que el reto mayor en estimación de rangos de consumo es que los herbívoros atacan la estructura completa de la planta, y más aún, no en todos los tejidos se observa con evidencia. Por ejemplo, el daño en hojas es relativamente fácil de cuantificar, mientras que la herbivoría en flores y frutos es complicada por su producción efímera, así mismo, determinar el consumo en raíces en algunas especies es prácticamente imposible (Zvereva E.L. et al. 2010; Landsberg, 1989; McCall y Irwin,

2006).

2.4.1 Resistencia y tolerancia. Las plantas pueden estar sometidas a diferentes niveles de herbivoría durante sus distintos estadíos o ciclos de vida: propágulos, plántulas juveniles y árboles árboles adultos (Tiffin 2000). Ante esta presión, las plantas muestran dos tipos de repuestas a la herbivoría: resistencia y tolerancia. La primera se refiere a la estrategia que emplean para reducir la probabilidad de un ataque por herbivoría, afectando la preferencia

(antixenosis) o el desempeño de los herbívoros (antibiosis) (Karban y Baldwin 1997;

Strauss y Agrawal 1999). La tolerancia, considerada como un mecanismo de defensa a la herbivoría, es la habilidad que tiene la planta de mantener la adecuación después de un evento de herbivoría intenso (Strauss y Agrawal 1999; Haukioja y Koricheva 2000;

Moser y Schütz 2006).

2.5. Importancia de la herbivoría dentro de la genética, ecología y evolución.

2.5.1. Genético. La diversidad genética es una característica que les permite a las especies responder y adaptarse a los cambios en su ambiente, por lo que la pérdida de diversidad se asocia con una disminución de este potencial, haciendo a las especies más susceptibles a las enfermedades y a los cambios ambientales (Luikart y Cornuet 1998; Young y Clarke

2000; Goodman et al., 2001; Landergott et al., 2001). Por lo tanto, el nivel de herbivoría depende de varios factores relacionados a la identidad genética de la planta, la estructura vegetal dañada, el porcentaje de daño previo, la edad y el estado fisiológico de la planta, así como las interacciones de la planta afectada, con el resto de la vegetación (Coley y Barone 1996; Hartley 2001). En este sentido, la variación genética referente a la característica de defensa es considerada como la principal responsable que unas plantas sean más vulnerables a la herbivoría que otras (King et al., 1997;

Mutikainen et al., 2000; O’Reilly-Wapstra et al. 2006; Donaldson y Lindroth 2007).

Diversos estudios sobre variación intraespecífica en cuanto a resistencia a la herbivoría

(Pilson, 2000, Stinchcombe y Rausher 2001, Pusenius et al. 2002, Prittinen et al.,

2003a, Laitinen et al., 2004), así como los posibles efectos ocasionados en la formación de la planta, sugieren que los herbívoros pueden afectar la diversidad de las poblaciones.

Además, los análisis geográficos de variación genética en algunas especies de plantas han revelado claras señales genéticas de adaptación local, causado por diferencias en el régimen selectivo entre localidades. Las evidencias demuestran que

9 las plantas actúan de forma diferente ante los múltiples factores de estrés. De forma individual, activan un programa específico de expresión de gene relacionado a las condiciones ambientales exactas encontradas (Rizhsky et al. 2004b).

2.5.2. Ecológico. Los herbívoros influyen directamente en el reclutamiento, establecimiento, crecimiento, asignación de recursos, reproducción y sobrevivencia de la planta. Como respuesta, las plantas han implementado numerosos mecanismos para protegerse por sí mismos

(Lubchenco y Gaines, 1981; Crawley, 1983; Coley y Barone, 1996; Bosire et al., 2005).

Esos mecanismos incluyen la evasión espacial y temporal (Lubchenco y Cubit, 1980;

Hay, 1984), defensas químicas acumuladas e inducidas (Hay y Fenical, 1988; Karban et a., 1997), y protecciones morfológicas y estructurales (Littler y Littler, 1980; Hay et al.,

1994). Las plantas se benefician de la disminución de la herbivoría cuando viven en estrecha asociación con otros organismos que le proveen protección.

En prácticamente todos los ecosistemas forestales, los insectos tienen un impacto significativo en la forma y tasa de crecimiento del árbol, sobrevivencia, rendimiento reproductivo y ecología del bosque (Schowalter, 1986; Crawley, 1989). En una consulta sobre herbivoría en sabanas tropicales, Andersen y Lonsdale (1990) afirman que los insectos folívoros son “casi universalmente más importantes que los mamíferos folívoros”. Janzen (1988) expone que solo las orugas consumen más hojas vivas en bosques tropicales que todos los otros animales combinados.

2.5.3. Evolutivo. Desde el punto de vista evolutivo, los herbívoros ejercen una fuerza selectiva sobre las plantas al modificar la tasa de mortalidad y remover la biomasa que podría ser utilizada para el crecimiento o la reproducción (Coley et al., 1985). El efecto que tiene la herbivoría sobre las plantas puede ser analizado en diferentes niveles de organización

(individual, poblacional o comunitaria). Desde el punto de vista individual, los herbívoros pueden provocar altas tasas de pérdida en los tejidos vegetales (Janzen 1970), reduciendo el área fotosintética, y con esto, modificar el balance de carbohidratos, consumo de agua y nutrimentos (Crawley 1983), debilitando la estructura física de la planta (Coley, 1985). La variación individual es ecológicamente importante, porque influyen en la formación de la estructura demográfica y dinámica de poblaciones y comunidades (Weiner et al. 2001; Herrera y Jovani 2010). A nivel poblacional o comunitario, el mantenimiento de la diversidad genética es fundamental cuando tratamos de conservar diferentes especies, debido a que la variabilidad incrementa la probabilidad de permanencia a través del tiempo (Salas-Leiva, 2008). Datos moleculares sobre parentesco de linajes y estructura poblacional son obtenidas de diferentes tipos de macromoléculas, en su mayoría constituidas por proteínas

(aloenzimas) y DNA (RFLP, RAPD y secuencia de datos) (Avise, 1994). Inferencias relativas a la historia de grupos filogenéticos y estructura geográfica de poblaciones, están basadas en la divergencia de secuencias de ADN entre linajes y en frecuencias de formas alélicas de genes dentro y entre poblaciones. El uso de marcadores

11 moleculares podría resolver cuestiones planteadas desde hace largo tiempo, tal como la causa de la diversidad anormal de manglar entre las regiones Indo-Oeste del Pacífico

(IWP) y Atlántico-Este del Pacífico (AEP). Otro tema de interés sería relacionado a la historia biogeográfica de los manglares, su centro (o centros) de origen y procesos de dispersión (e.g. Saenger, 1998; Ellison et al., 1999). Los métodos moleculares son herramientas indispensables en la identificación de fuentes de población apropiadas para la reforestación de esos hábitats únicos.

La evolución relacionada a la defensa de las plantas contra los enemigos naturales, tales como herbívoros y patógenos, ha sido motivo de discusión durante las pasadas tres décadas. Esos estudios engloban un amplio rango de enfoques, desde respuestas celulares y moleculares de daños por herbivoría, hasta patrones filogenéticas de parentesco (Agrawhal y fishbein 2006; Becerra, 1997; de Meaux y

Mitchell-Olds, 2003). En los bosques tropicales las relaciones evolutivas entre herbívoros y plantas han resultado en una impresionante variedad de adaptaciones e interacciones (Strauss y Agrawal, 1999).

2.6 Herbivoría en ecosistemas de manglar.

Las hojas de los mangles contribuyen con la alta productividad de estos bosques, debido a la materia orgánica aportada por la hojarasca. La mayor parte se queda dentro del sistema y es reciclada al interior de los bosques; mientras que la otra es exportada a la zona marina en forma de detritus (Tovilla, 1998), representando un subsidio en

12 cadenas tróficas, dentro de las cuales destacan especies de interés comercial como el camarón (Flores-Verdugo et al 1987; Wolanski, 1995; Lee, 1995).

Los manglares son propensos a la herbivoría; son afectados principalmente por folivoros, los cuales pueden influir en la producción de hojarasca y el ciclo de nutrientes dentro del sistema (Choudhury, 1988). Estudios recientes han demostrado que la herbivoría en manglares es comparable a lo que sucede en bosques tropicales y templados (Cannicci et al 2008). Los herbívoros que consumen directamente hojas

(Beever et al 1979, Camilleri, 1989, Farnsworth and Ellison 1991, Jhonstone 1981,

Newbery 1980, Onuf et al 1977, Robertson and Duke 1987, Schoener 1988), ramas

(Feller and Mathis, en manuscrito), flores (Farnsworth, unpublished data), raíces (Ellison y Farnsworth, 1990; Perry, 1988; Rehm y Humm, 1973; Simberloff et al. 1978) y propágulos (Lacerda et al, 1988, Smith 1987, Smith et al 1989) afectan el establecimiento, éxito reproductivo, capacidad fotosintética, crecimiento y arquitectura de los bosques de manglar. En ese ecosistema, las hojas de manglar son el principal recurso alimenticio para los herbívoros, mientras que la hojarasca contribuye a la alta productividad y sirve como fuente primordial de nutrientes en interacciones ecológicas

(Twilley et al., 1997; Boer, 2000; Clough et al., 2000).

La ubicación geográfica también puede influir en la herbivoría, los manglares de la región Indo-Pacífico-Oeste presentan los más altos niveles de consumo de hojarasca y hojas en comparación con los mangles localizados en el Atlántico-Este-Pacífico (Lee

2008). Los manglares del Este Africano llegan a tener elevados rangos de consumo

(Olaffson et al. 2002). Los herbívoros de esta especie son sumamente diversos, incluyen generalistas y especialistas en órganos y taxa de plantas hospederas (Ellison y

Farnsworth 2001). El consumo de hojas de manglar es realizado, en mayor proporción, por diversas especies de insectos y crustáceos, se alimentan en un rango promedio de

1 al 30 por ciento del área foliar (Onuff et al 1977, Beever et al. 1979, Lacerda et al.

1986, Farnsworth y Ellison 1991, Feller, 1995).

2.6.1 Insectos herbívoros de manglar. Durante mucho tiempo, los manglares fueron descritos como ecosistemas basados en detritus, donde los consumidores primarios jugaban un papel secundario (Tomlinson,

1986), incluso se consideraba que los aspectos estructurales de estos bosques (riqueza de especies, patrones de distribución, productividad y biomasa), dependían de procesos estrictamente abióticos (Smith, 1994). Watson (1928) reporta que los insectos ejercen bajos niveles de herbivoría foliar en los manglares, y desde un punto de vista personal, declara que ‘el daño por insectos es notable por su ausencia’. El modelo clásico de Odum y Heald (1975) establece que la mayor parte de la producción primaria en los manglares fluye dentro de las redes tróficas a través de la retención y almacén de alimento de los animales, mientras que la producción secundaria está basada en el detritus de las cadenas tróficas. De acuerdo a este modelo, menos del 10 % de la producción primaria en los bosques de mangle es consumida por herbívoros antes de la senescencia. Por su parte Tomlinson, (1986) resume que los procesos co-evolutivos que dan lugar en la relación estrecha planta-animal, no ocurren en los manglares. Más

14 tarde, Robertson y Duke (1987) mencionan que la herbivoría por insectos en los manglares es menor que la encontrada en otros ecosistemas forestales y Robertson et al. (1992) concluyen la escaza importancia ejercida por los insectos herbívoros en el manglar, aunque consideran que en plántulas los efectos pueden ser significativos.

2.6.1.1 Tipos de daño foliar. Se ha minimizado las pérdidas que pueden causar algunos insectos, sin embargo, algunos insectos herbívoros pueden causar daños considerables a la vegetación de manglar (Kathiresan and Bingham, 2001). Son abundantes en el follaje de los bosques de manglar y a menudo pueden ocasionar altos niveles de daño foliar (Robertson y

Duke, 1987). Las lesiones ocasionadas son visibles, como agujeros, agallas, minas en las hojas, manchas necróticas e inclusiones a lo largo de la periferia foliar (Kathiresan,

1992).

Los mecanismos por las cuales los insectos ocasionan daños a las hojas de manglar son diversos. En un estudio realizado por Burrows (2003), la pérdida o daño en la superficie foliar representa un tercio del área foliar atacada por insectos, ocasionando minas o excavaciones, agallas y necrosis. Orihuela et al. (2004) encontraron que en la costa de Chiapas, México, las hojas de A. germinans, los herbívoros dañan únicamente el parénquima, dejando intactos el sistema de nervaduras y la cuticula, mientras que en

L. racemosa el consumo es realizado por mordedores, ocasionando abundantes perforaciones en la materia foliar. Farnsworth y Ellison (1991) hacen referencia a diez

15 tipos de marcas en las hojas de manglar, catalogándolos como huecos, formación de agallas, manchas de varios colores, minadores, cicatrices y mordeduras. Veenakumari et al, (1997) reporta que 276 especies de insectos ocurren en los manglares de las islas de Andaman y Nicobar en la India. Ellos encontraron 197 especies de insectos herbívoros, mientras 43 y 36 eran especies parasitas y depredadoras, respectivamente.

Estudios referentes a los efectos ecológicos de insectos barrenadores en manglares se limitan a los realizados por Feller y Mathis (1997), Feller y McKee (1999) y Feller (2002).

El trabajo desarrollado por Sousa et al, (2003) examinan el impacto de los herbívoros escarabajos escolytidos, Coccotrypes rhizophorae en el reclutamiento de Rhizophora.

Al respecto encontró que Coccotrypes aparece como el huésped exclusivo de

Rhizophora en el Caribe.

A nivel mundial, el daño en el ápice las hojas de Rhizophora aparece como el tipo de ataque dominante ocasionado por insectos. Esto ha sido reportado para el caso de especies de Rhizophoraceae en Belice (Feller, 1995), Florida (Onuf et al. 1977),

Tailandia (Rau and Murphy, 1990), Islas de Andaman y Nicobar (Veenakumari et al.

1997) y Australia (Burrows, 2003). En cada caso, los mecanismos de alimentación y tipo de daño siguen el mismo esquema, pero la relación taxonómica de los agentes causales aún no ha sido determinado. En varias localidades de Australia, los herbívoros

Hypochrysops apelles y Hypolycaena phorbas se consideran entre los folívoros más dañinos del mangle Rhizhophora stylosa. Rau and Murphy (1990) encontraron la misma relación alimenticia de la larva Hypolycaena sobre R. apiculata en Tailandia. En

Pozuelos y Cabildo, Chiapas, Niño (2002) encontró que más del 78% de consumo foliar es realizado por Lepidópteros.

De acuerdo a Cannicci et al (2008) el verdadero papel ecológico que juegan los insectos herbívoros en el manglar, no se limita a cuantificar la pérdida de biomasa realizada por los herbívoros, sino también involucra efectos en el rendimiento de la planta y funcionamiento del ecosistema. Por tanto, las actividades de los insectos herbívoros llegan a tener un impacto positivo en los manglares, contribuyendo, incluso, a la transferencia de energía en el sistema.

2.6.2 Crustáceos herbívoros de manglar. La estructura de las redes tróficas dentro de las comunidades de mangle ha sido escasamente estudiada (Bouillon et al. 2008). En el caso particular de los cangrejos en manglares, los miembros dominantes pertenecen a la familia Gecarcinidae, Grapsidae y

Ocypodidae. Los cangrejos sesarmidos que consumen hojas son abundantes en áreas de manglar del Indo-Pacífico (Hartnoll, 1975; Ashton et al. 2003), África (Emmerson y

McGwynne 1992; Hartnoll et al. 2002) y para algunas extensiones de América (Abele,

1973; Sheaves y Molony, 2000), mientras el cangrejo Ocypodido, Ucides cordatus, abunda en bosques de mangle del Centro y Sur de América (Nordhaus et al., 2006).

Numerosos trabajos realizados en la región Indo-Pacifico han demostrado que los cangrejos Sesarmidos pueden llegar a trepar los árboles durante la noche para consumir las hojas desde el follaje (Fratini et al., 2005). Dentro de esos cangrejos

17 trepadores, uno de los más estudiados es el cangrejo sesarmido Aratus pisonii, capaz de remover las capas superficiales de las hojas por raspaduras de la superficie foliar, aunque el daño no penetra la hoja entera, puede remover por arriba del 30% de una hoja individual (Erickson et al., 2003).

Los cangrejos influyen en muchos aspectos relacionados a la dinámica de las comunidades de mangle, intervienen en la conversión de nitrógeno orgánico a amoniaco (Alongi, Boto y Robertson, 1992), promueven la descomposición de materia orgánica (Robertson y Daniel, 1989; Micheli, Gherardi y Vannini, 1991; Lee, 1998) y consumo de materia foliar (Onuf, Teal y Valiela, 1977; Beever, Simberloff y King, 1979).

Estos organismos también pueden alterar la distribución espacial y crecimiento potencial de los manglares, sirven como “ingenieros del ecosistema" (Jones, Lawton y

Shachak, 1994), debido al profundo efecto que producen en la microtopografía del suelo. Algunas especies de cangrejos, crean largos montículos mientras excavan sus madrigueras, elevando el suelo en un rango de 5-15 cm, o incluso más alto, en un área de 0.5 a 1.0 m2 (Minchinton, 2001), lo que permite el establecimiento de especies de mangle mejor adaptadas a bajas frecuencias de marea, reduciendo períodos de inundación y aumentando la oxigenación del suelo.

Por otra parte, numerosos estudios reportan factores que influyen en el consumo de hojas por el cangrejo grapsido de mangle relacionado con la distribución de la planta y la composición química de las hojas (Emmerson y McGwynne, 1992; Slim et al. 1997;

Sousa y Mitchell 1999; Hernes et al., 2001; Skov y Hartnoll, 2002). El cangrejo de

18 mangle Aratus piisoni H. Milne Edwards (Grapsidae), es un organismo que se alimenta de las hojas nuevas que aún permanecen adheridas a la planta (Beever et al. 1979,

Cannicci et al 1999) y desempeña un rol en el flujo de energía en los manglares y la exportación de biomasa (Beever et al. 1979). Los cangrejos muestran preferencias por la edad de las hojas (Lee, 1989; Micheli, 1993). El daño ocasionado en el interior de las hojas tiene agujeros marcados con el borde aserrado y están presentes desde las ramas más bajas hasta la parte más elevada del dosel del manglar. Nordhaus et al

(2006) encontró que Ucides cordatus consume el 81.3 % de materia foliar de

Rhizophora mangle en un bosque de mangle de Brasil.

2.7 Diversidad genética en manglares La importancia de los manglares no sólo radica en la biología de la conservación sino también en la genética poblacional. Debido, principalmente, a la historia evolutiva única en los ecosistemas de manglar, los cuales son fácilmente influenciados por los cambios de nivel de mar que podrían resultar en frecuentes procesos de extinción y recolonización de estos bosques (Minobe et al. 2010). En término de números de especies, la diversidad de manglares es relativamente baja (~ 70 especies, Duke et al

2002; Ellison 2002). Sin embargo, un extenso número de estudios demuestran una elevada diversidad genética dentro y entre poblaciones de un largo número de especies de mangle (Duke et al, 1998, 2002; Melville et al. 2004; Tan et al. 2005), los cuales han permitido profundizar conclusiones en términos de evolución y distribución de esas plantas (Dodd et al 1998; Duke et al. 2002).De manera general, se asume que en la

19 mayoría de los árboles, los rangos de dispersión genética vía polen es mayor que el flujo génico por semilla. Sin embargo, para el caso de los manglares, varias líneas de evidencia sugieren que los propágulos son capaces de dispersarse largas distancias

(LDD, por sus siglas en inglés) transportándose por varios kilómetros que pueden exceder por mucho los rangos de flujo genético a través del polen.

Actualmente, la conservación de la diversidad genética se ha convertido en uno de los principales objetivos en los planes de manejo de las especies amenazadas, debido a que la pérdida de diversidad genética puede reflejarse en una baja capacidad de adaptación y resistencia a los cambios ambientales o enfermedades (Charlesworth et al., 1993; Amos & Balmford 2001; Saura et al., 2008). Considerando el significado ecológico y económico de los ecosistemas, y que la pérdida de áreas de manglar conduce a la disminución de diversidad genética (Maguire, et al 2002), la necesidad de su conservación se hace cada vez más evidente; siendo de vital importancia atribuir el funcionamiento del ecosistema a niveles de diversidad genética altos. Mientras que bajos niveles de diversidad genética, puede hacer a las especies de mangle más vulnerables y menos resistentes a enfermedades o cambios ambientales (Bartleson, et al 2003). Esta información es crítica para el desarrollo de programas de conservación y manejo sustentable en especies vulnerables y deterioradas o para conservación de especies clave (Maguire, et al 2002).

El éxito de los programas de conservación de las especies de mangle, a través de técnicas de reforestación, depende directamente de la estructura genética dentro y

20 entre las poblaciones de mangle y los métodos por los cuales se colecta y mantiene el germoplasma (Saenger y Sidddiqi, 1993, Maguire, et al 2002). Debido a la naturaleza dinámica del hábitat del manglar mueren de manera natural durante el primer periodo de estiaje y un gran porcentaje de las plántulas perecen al ser trasplantadas a las zonas perturbadas, las cuales tienen que ser sustituidas por nuevas plantas. En este sentido, se requiere de la producción de plántulas en vivero para repoblar en el momento que sea necesario. Esta condición hace que los procesos de restauración se vuelvan lentos y laboriosos (Tovilla-Hernández y Orihuela Belmonte, 2002). La omisión de criterios genéticos puede producir efectos adversos en la población, tales como la disminución de la diversidad genética en los ecosistemas restaurados.

2.7.1 Marcadores Moleculares. La diversidad genética de una especie proporciona información valiosa acerca de su historia demográfica y estado de salud (Hamrick y Godt, 1996). En manglares, los microsatélites se han utilizado para obtener mayor información en la diversidad y estructura genética de éstas poblaciones. Siete SSR’s están disponibles para B. gymnorrhiza, desarrollados con material de origen japonés, de éstos cinco SSR’s primers son de amplificación cruzada con Bruguiera cylindrica (L.) Blume y Bruguiera parviflora (Roxb) Wright y Arnold ex Griff (Sugaya et al. 2003). Un SSR particular con seis alelos para Kandelian obovata Sheue, Liu y Yong desde Japón (Harada et al.

2005). Ocho SSRs usados en Pelliciera rhizophorae Triana y Planchon en Colombia

(Castillo-Cárdenas y Toro-Perea, 2007). Ocho y nueve SSR´s para Aegiceras

21 corniculatum y Sonneratia caseolaris, respectivamente, en China (Chen et al. 2007 a, b).

Debido a la importancia económica y biológica de las especies del género

Rhizophora, investigadores a nivel mundial han usado marcadores moleculares tales como isoenzimas, RAPD, RFLP y AFLP para elucidar aspectos relacionados a su evolución (Duke et al., 2002), origen de híbridos interespecíficos (Parani et al., 1997), relaciones filogenéticas con otros géneros de la familia Rhizophoraceae (Schwarzbach y Rickleffs, 2000) y diversidad filogenia molecular y genética en especies de la familia

Rhizophoraceae (Lakshmi et al., 2002). El uso de isoenzimas es una técnica que representa dificultades en el análisis del polimorfismo enzimático en manglares, debido a la extrema precaución empleada en la colecta y transportación de las muestras al laboratorio para mantener la actividad de las enzimas, y sobre todo a la presencia de metabolitos secundarios en sus hojas, cuyos componentes desnaturalizan las enzimas durante la maceración en una extracción buffer. Marcadores dominantes como RAPD

(Polimorfismos de ADN amplificados al azar) y AFLP (Polimorfismos de longitud de los fragmentos amplificados) tiene sus ventajas en el procedimiento de laboratorio, por la rapidez en la extracción del completo ADN genómico, aunque tiene una mayor desventaja en mostrar los resultados para la estimación de heterocigotos, así como los niveles de endogamia (Triest, 2008).

Los microsatélites (SSR; también conocida como repetición de secuencia simple por sus siglas en inglés) han demostrado ser muy útiles en estudios de la estructura

22 genética de distintas especies (Innan et al. 1997, López et al. 1999, Beachman et al.

2000, Maguire et al. 2002, Rosero-Galindo et al 2002, Schrey y Heist 2003, Carlsson et al. 2004, Nettel et al. 2005, Woodhead et al. 2005, Shubina et al. 2005, Szczys et al.

2005, Robertson y Gemmell 2005, Terrab et al 2006). Los marcadores microsatélites son secuencias cortas en tandém de repeticiones de mono a tetra nucleótidos, se caracterizan por presentar altos niveles de polimorfismo, tópicos de herencia

Mendeliana, evolución rápida, co-dominante, amplifican fácilmente usando PCR y tienen amplia cobertura en el genoma nuclear, donde se encuentran distribuidos aleatoriamente. Tales SSR´s son relativamente abundantes y poseen elevados rangos de mutación en comparación a otros marcadores, aplicados en el estudio de varios tipos de población (Lowe et al. 2004).

III. ANTECEDENTES

3.1 Estudios de herbivoría en mangles. Para el caso de manglares, la herbivoría fue un fenómeno considerado de menor importancia comparado con otro tipo de bosques (Macnae, 1968). Sin embargo, un incremento enfocado al estudio de herbivoría en manglares ha demostrado que la situación no es diferente, debido a que los efectos son similares a lo que sucede en ecosistemas terrestres, sobre todo con la fauna de dosel, representada en su mayoría por lepidópteros. Burrows (2003) registró altos niveles de herbivoría en bosques de manglar, midiendo la cantidad de pérdida o daño de área foliar en muestras colectadas directamente del árbol. Farnsworth y Ellison (1997) encontraron que los cangrejos

Grapsidos, Coleópteros y Lepidópteros fueron los herbívoros más dañinos en propágulos y plántulas. Onuf et al., (1977), Rabinowitz (1977), Robertson et al., (1990),

Clarke (1992), Elster et al., (1999), Brook (2001), Minchinton y Dalby-Ball (2001) y

Sousa et al., (2003) han demostrado altas frecuencias y niveles de consumo en manglares, ocasionado principalmente por cangrejos, escarabajos y orugas. Elster et al., (1999), observaron que los lepidópteros causan una mortalidad substancial (hasta el

100% en algunos sitios) en propágulos y plántulas de Avicennia germinans en

Colombia. Lepidópteros y Coleópteros son los más importantes insectos fitófagos que ocurren en los bosques de manglar. Otros grupos herbívoros presentes son Ortópteros,

Hemípteros, Dípteros y Homópteros (Murphy, 1990). En un estudio de insectos herbívoros en manglares en Singapore, Murphy (1990) encontró 102 especies de herbívoros alimentándose en 21 especies de manglar. Robertson et al (1992) encuentran que la pérdida de área foliar por insectos masticadores es sumamente

24 variable, incluso entre individuos de la misma especie. Esta pérdida de área fotosintética altera el balance de carbohidratos, interfiere con el consumo de agua y nutrientes y debilita la estructura de la planta, reduciendo su potencial reproductivo y afectando el crecimiento y la supervivencia al incrementar la probabilidad de muerte de las plantas consumidas por herbívoros (Pinter y Kalman 1979, Reyes de la Cruz y

Gaspar 2002). Tovilla (1998), describe un caso de herbivoría masiva en R. mangle en la zona costera de Guerrero, México, por la presencia de la mariposa nocturna: Dalcerides ingenita (Edwards), éste lepidóptero causo daños en 19.7% del peso de las hojas y hasta 23.3% de área superficial de las mismas, provocando que , en mayo de 1995,

160 hectareas del rodal de mangle rojo quedaran desprovistas de hojas. En Australia, las larvas de dos especies de insectos son frugívoros de A. marina en bosques de mangle templados: la mosca de la fruta Euphranta marina y la mariposa nocturna plumosa Cenoloba obliteralis (McAlpine, 1965; Hutchings y Recher, 1974, 1982;

Common, 1990; Hockey y De Baar, 1991; Clarke 1992; Permkam 1993; Permkam y

Hancock 1995). Minchinton T. E. y Dalby Dall (2001) estimaron que el 53% de la fruta,

69% de abscisión de propágulos y 80% de cotiledones en plántulas han sido atacados por la larva de estos insectos.

En los manglares de Singapore, Murphy (1980, 1990), Murphy y Than (1980) fueron los primeros en demostrar la extensión y diversidad de insectos folívoros presentes en los bosques de mangle, contabilizaron arriba de 300 especies de insectos, pero no proveen un listado o indicios sobre el rol que desempeñan. Destacan que la mayoría de los elementos faunísticos tienen la capacidad de vivir y adaptarse a las

25 condiciones prevalecientes en este ecosistema. Desde entonces, varios autores han publicado información acerca de la abundancia de insectos en los manglares, aunque son escasos los estudios relacionados al papel ecológico que desempeñan. En manglares de Tailandia, Rau y Murphy (1990) reportan 37 especies, de los cuales 33 son folívoros. En Belice, Farnsworth y Ellison (1991) reconocieron 66 diferentes especies de folívoros, pero no los enlista.

En la región del sureste de México, destacan los siguientes estudios: Tovilla

(1998), encontró que en la zona costera de Barra de Tecoanapa, Guerrero, las hojas de

A. germinans son las más consumidas, con un promedio anual de 9.17%, seguidas por

L. racemosa (7.03%) y C. erectus (4.73%), mientras que R. mangle fue la especie menos dañada con 1.97 % de herbivoría. Niño (2002) identifico y enlisto las especies y familias de lepidópteros (Cuadro 1) capturados en R. mangle y L. racemosa de

Pozuelos y Cabildo, Chiapas, los resultados indican un mayor consumo de herbívoros en plántulas y árboles adultos de Laguncularia racemosa (7.4 - 6.20 %) y el menor consumo foliar en los dos estadíos de A. germinans (1.46 - 2.4%). Orihuela et al.

(2004), reportan al mangle negro Avicennia germinans como la especie preferida por los herbívoros, registró un consumo promedio de 13.5% y Conocarpus erectus obtuvó el nivel más bajo de consumo con una estimación de 5.7%, en el Sistema Lagunar

Pampa Murillo Pozuelos, Tapachula, Chiapas.

Cuadro 1. Familias y especies de lepidópteros capturados en Pozuelos y Cabildo, Chiapas.

(Niño, 2002).

No. de Lepidopteros Lugar Planta Hospedera Individuos Phyciodes vesta vesta 1 Pozuelos R. mangle

Ascia momuste monuste 2 Pozuelos y Cabildo R. mangle y L. racemosa

Rothschildia labeau 1 Pozuelos R. mangle Hylesia acuta 1 Pozuelos R. mangle Pozuelos (2) y Cabildo Familia Hesperiidae 4 R. mangle (2) Familia Aidae 2 Pozuelos L. racemosa Cincinus sp. 1 Pozuelos L. racemosa

3.2 Estudios de diversidad genética en mangles. Los marcadores moleculares han sido utilizados para evaluar la diversidad genética y estructural de diferentes plantas de mangle (e.g. Maguire et al. 2000; Giang et al. 2003;

Giang et al. 2006; Arnaud-Haond et al. 2006). Rosero-Galindo et al (2002), aisló y caracterizó 26 microsatélites loci para detectar el polimorfismo en dos poblaciones naturales de R. mangle en la Costa Pacífica Colombiana. Por su parte, Koji-Takajama et al (2007) desarrollo 14 marcadores microsatélites aislados y caracterizados a partir de R. mangle, las plantas fueron colectadas en Oaxaca, México, y también en ambas costas de Costa Rica. Todos pueden ser amplificados en Rhizophora saomensis, 13 en

Rhizophora racemosa y seis marcadores en las demás especies de Rhizophora. El estudio más reciente, empleando microsatélites, lo realizaron Sandoval Castro et al

(2012) a lo largo de la costa noroeste de México, donde evaluó la estructura genética poblacional y los patrones de flujo génico del mangle rojo (R. mangle).

Dentro del género Rhizophora, Rhizophora mangle es el de mayor distribución a lo largo de las costas americanas, donde existen pocos estudios moleculares que ayuden a evaluar la diversidad genética y estructural del mangle rojo en su hábitat natural

(Nuñez-Farfan et al 2001; Pérez 2001; Rosero- Galindo et al., 2002). Un grupo de investigadores ha venido trabajando en el uso de marcadores moleculares, tales como

AFLPs, para evaluar la diversidad genética de diferentes especies de mangle en

Colombia, empleados en Rhizophora mangle (Perez, 2001), Avicennia germinans

(Cerón-Souza et al., 2005) y Pelliciera rhizophorae (Castillo-Cárdenas et al., 2005).

Arbeláez-Cortis et al., (2007) emplearon secuencias de microsatélite para evaluar la diversidad en la composición genética del mangle rojo en cinco poblaciones del Pacífico

Colombiano. Para el caso particular de R. mangle han desarrollado una colección enriquecida con secuencias de microsatélites nucleares (Rosero-Galindo et al., 2002).

Nettel et al. (2008) desarrollaron nueve marcadores microsatélites para mangle blanco

(Laguncularia racemosa C.F. Gaertn; Combretaceae). El trabajo más reciente lo realizaron Sandoval-Castro et al, (2012), quienes utilizaron seis microsatélites, designados para R. mangle por Rosero.Galindo et al., (2002), para evaluar la estructura genética poblacional y patrones de flujo genético del mangle rojo a lo largo del noroeste de las costas mexicanas.

IV. OBJETIVOS

4.1 Objetivo General Determinar el porcentaje de daño foliar en plántulas y árboles adultos de Rhizophora mangle y relacionarla con la estructura genética de tales estadíos en las poblaciones de

Cabildo y Pozuelos-Murillo de la costa de Chiapas.

4.2 Objetivos específicos

 Cuantificar el grado de herbivoría por categoría de daño (Dirzo y Dominguez,

1995), en plántulas y árboles adultos de R. mangle en Cabildo y Pozuelos

Murillo, Chiapas.

 Determinar y comparar el porcentaje de herbivoría en plántulas y árboles adultos

de R. mangle en los dos sitios de la costa de Chiapas.

 Evaluar la diversidad genética poblacional de R. mangle, a través de marcadores

moleculares, en Cabildo y Pozuelos Murillo, Chiapas.

 Relacionar la herbivoría y diversidad genética que existe en los estadíos

plántulas y árboles adultos de R. mangle en Cabildo y Pozuelos Murillo, Chiapas.

V. HIPÓTESIS Se espera que las plántulas de R. mangle sean más susceptibles al daño foliar que los

árboles adultos; y también, que la frecuencia de los índices de herbivoría sean más altas en las categorías de daños menores en ambos estadíos. De igual forma, se espera que las plántulas, exhiban mayores niveles de diversidad genética que los

árboles adultos. La hipótesis de vigor hibrido considera que a mayor diversidad genética, menor nivel de daño por herbivoría, por lo tanto, se espera una relación significativa entre la diversidad genética y el porcentaje de daño foliar en plántulas y

árboles adultos.

VI.- MÉTODO.

6.1.- Área de estudio. La costa de Chiapas comprende un amplio litoral de aproximadamente 270 kilómetros sobre el Océano Pacífico. En el sur del Estado, el Soconusco está constituido por la región fisiográfica denominada Llanura costera del Pacífico, abarca una franja en un intervalo de 15 y 40 km entre la sierra y el litoral. En los humedales costeros alberga los bosques de mangle con mayor desarrollo estructural en la costa del Pacífico (Flores-

Verdugo et al., 2001).

El área de estudio incluye a los sistemas de humedales costeros Cabildo y

Pozuelos-Murillo, Municipio de Tapachula, Chiapas. Las lagunas están incluidas en el interior de las Zonas Sujetas a Conservación Ecológica (ZSCE) y sitios Ramsar

“Cabildo Amatal” y “Gancho-Murillo”, respectivamente. Estas zonas se localizan dentro de la Región Marina Prioritaria No. 40 “Corredor Puerto Madero” y designadas en la

Región Hidrológica Prioritaria No. 32 “Soconusco”. Según la CONABIO, se consideran sitios de manglar con relevancia biológica y con necesidades imperantes de rehabilitación ecológica (Arriaga et al., 1998, 2002; Ovalle-Estrada y Vazquez-Lule

2009).

6.2- Programas de Manejo de las Zonas Sujetas a.Conservación.Ecológica: “El Cabildo Amatal” y “Gancho Murillo”.

El área natural protegida denominada “El Cabildo Amatal” posee una extensión de

3,610.87 ha, se encuentra en la porción sur-oriente y sur-poniente de los Municipios de

Mazatán y Tapachula, Chiapas (Figura 2.). Limita en un extremo con el ejido Barra San

Simón y en el otro con el Puerto Madero de la ranchería el Cabildo. La reserva natural se ubica geográficamente entre las coordenadas 14° 43’ 24.347’’ y 14° 47’ 30.48’’ latitud

Norte y 92° 25’ 01.308’’ y 92° 29’ 45.240’’ longitud Oeste. Esta reserva presenta humedales costeros de vital importancia, debido a que sirven de refugio a unas 277 especies de fauna y 67 de flora. De las cuales, 62 especies se encuentran bajo alguna categoría de conservación según la NOM-059-SEMARNAT-2001 (Gordillo et al., 2007;

SEMAVI, 2009). Además, sirve como corredor biológico entre la Reserva de la Biosfera

“La Encrucijada” y la zona natural protegida “El Gancho Murillo”.

Por otra lado, la reserva natural “El Gancho Murillo” cuenta con una superficie de

6,633.31 ha, ubicada en la porción suroeste de Tapachula y la parte sur de Suchiate, en

Chiapas. Su localización geográfica comprende las coordenadas 14° 31’ 29.455’’ y 14°

41’ 39.068’’ latitud norte y 92° 25’ 01.308’’ y 92° 29’ 45.240’’ longitud oeste. En la actualidad, en la reserva se tienen registrados 107 especies de fauna y 19 de flora

(SEMAVI, 2009a). Siendo 20 las especies que se encuentran en algún status de la

NOM-059-SEMARNAT-2001 (SEMARNAT, 2002).

Figura 2. Localización de los humedales costeros El Cabildo Amatal y Gancho Murillo,

Chiapas.

6.3 Colecta de material foliar. En marzo y abril de 2013, se colectó el material foliar de 160 individuos de R. mangle en dos poblaciones de la costa de Chiapas: Cabildo y Pozuelos Murillo. En cada población se muestrearon 80 individuos (la mitad plántulas y el resto adultos). En un área determinada se seleccionaron dos individuos, estadío plántula y adulto, respectivamente; lo anterior, considerando el estudio desarrollado por Erickson et al., (2012).

En cada punto de muestreo se realizó, de manera aleatoria, la colecta de 5 hojas por espécimen (Figura 3), separados a una distancia mínima de 80 metros, esto con la finalidad de reducir la probabilidad de muestrear individuos con cierto grado de consanguineidad de acuerdo con el trabajo de Sandoval Castro (2012). Las hojas sustraídas se trasladaron al laboratorio en bolsas de plástico cerradas herméticamente y etiquetadas. Con la finalidad de evitar su descomposición, el material se depositó en hieleras de plástico (Figura 4), para luego conservarlas en el congelador a -20 ⁰C en el laboratorio, hasta usarlas en la extracción de ADN (Cullings, 1992).

Se hizo la separación aleatoria, del material foliar colectado (Figura 5), según la técnica de Erickson, et al. (2012), por individuo se escogieron tres hojas para medir el

índice de herbivoría y dos en la determinación de la diversidad genética.

Figura 3. Colecta de material foliar de plántulas y árboles árboles adultos de R. mangle

Figura 4. Recipiente con hielo para depositar el material foliar.

Figura 5. Separación aleatoria de las hojas para estimar herbivoría y diversidad genética.

6.4. Índice de herbivoría. Una vez en laboratorio, se midió el índice de herbivoría (IH), de las 3 hojas elegidas por individuo de R. mangle, usando el método propuesto por Dirzo y Domínguez (1995) para estimar los patrones de herbivoría. Empleando un acetato marcado con puntos cada 0.5 cm, colocamos la hoja debajo de este material y procedimos a efectuar el conteo de puntos totales y el número de puntos en el área dañada (Figura 6).

Calculamos el porcentaje de daño por herbivoría, y evaluamos diferenciando el grado de herbivoría en seis rangos (Categoría 0 =hojas sin herbivoría; categoría 1 =1 a 5% de daño; categoría 2 = 6 a 12% de daño; categoría 3 = 13 a 25% de daño; categoría 4 = 26 a 50% de daño; y categoría 5 = más 50% de daño). Se dividió el número de puntos del

área dañada entre el total de puntos de cada hoja.

Donde, Xini = número de puntos con daño en la categoría i

N= número toral de puntos.

Figura 6. Acetato marcado con puntos cada 0.5 cm para calcular el porcentaje de herbivoría.

6.5 Diversidad genética.

6.5.1 Extracción y visualización de ADN. A partir de las dos hojas seleccionadas por espécimen (plántula y árbol adulto), llevamos a cabo las pruebas moleculares en el Laboratorio de Ecología Evolutiva de la

UNICACH. Para la extracción de ADN, previamente las hojas se lavaron con alcohol isopropílico y agua destilada, con la finalidad de eliminar las impurezas de la materia

37 foliar. El ADN de las muestras se obtuvieron usando el método CTAB cloroformo para plantas descrito por Cullings (1992, anexo 1).

Para visualizar el ADN extraído se utilizó la técnica de electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) (anexo 2). Con base a la metodología, en cada pozo se cargó la mezcla de 5 µl de ADN con 3 µl de Azul de bromofenol. El corrimiento de gel fue realizado a un voltaje de 100 voltios por aproximadamente 40 minutos en la cámara de electroforesis. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio (bromuro de 3,8 diamino-

6-etil-5-fenilfenantridio) (10 mg/ml) por 15 minutos. La visualización se llevó a cabo en un transiluminador de luz ultravioleta para evidenciar las bandas características del

ADN (Figura 7).

Pozos de carga

Bandas de ADN genómico

Figura 7. Visualización de ADN genómico de R. mangle en un gel de agarosa al 1%

6.5.2 Amplificación de ADN. Se realizó mediante la preparación de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) (anexo 3), con 10 microsatélites diseñados por Rosero-Galindo et al (2002) (Cuadro 1). La amplificación se llevó a cabo en un termociclador marca

Mygene modelo MG96. El programa de amplificación de microsatélites consistió en la desnaturalización inicial a 95°C por 2 minutos, seguido por 30 ciclos de 45 segundos a

94°C, temperatura de alineación por 45 segundos, 72°C por 45 segundos y una extensión final de 72°C por 5 minutos. Se utilizó la temperatura de alineación reportada por Rosero-Galindo et al (2002). Las reacciones se realizaron con el kit comercial Go

Taq Flexi Green de Promega y agua destilada esterilizada. Cada reacción incluyo 1.5 µl de ADN, 4 µl de Green Go Taq Flexi Buffer, 2.5 µl de Cloruro de Magnesio (MgCl2),

0.40 µl de DNTP’s, 1 µl de cada primer (forward y reverse), 0.25 µl de BSA, 9.75 µl de agua destilada esterilizada y 0.10 µl de GoTaq DNA polymerase, con un volumen final de 20 µl.

Cuadro 2. Caracterización de 10 loci microsatélites de R. mangle.

Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% (p/v) (anexo 4), mezclando 3 µl de ADN con 1 µl de Azul de bromofenol en cada pozo del gel. En uno de los pozos se incluyó un marcador de peso molecular (ladder) de 50 pares de bases (pb). Los corrimientos de los geles fueron sometidos a la cámara de electroforesis conectado a la fuente de poder a un voltaje de 100 voltios por aproximadamente hora y media. Luego se tiñeron, durante 15 minutos, con Bromuro de etidio disueltos en 500 ml de agua destilada.

6.5.3 Análisis de geles de acrilamida. Las lecturas de geles acrilamida, obtenidas a través de la técnica de electroforesis de poliacrilamida al 6% para amplificación de ADN (anexo 5), se realizaron a través de las bandas (alelos) observadas en cada locus de microsatélite en R. mangle, referenciados al intervalo de pares de bases (pb) caracterizados por Rosero.Galindo et al., (2002)

(Cuadro 1). Los patrones de bandeo fueron determinados usando el marcador de control denominado ladder o escalera, constituido en nuestro caso por 50 pb por banda.

Para tal efecto, se ordenaron alfabéticamente, asignando la letra A, aquellas bandas de menor peso molecular cercanas al sitio de carga y finalizando en bandas con mayor peso molecular, nominados secuencialmente de acuerdo al número total de bandas detectadas en cada individuo.

Las amplificaciones obtenidas del PCR, visualizados en geles de acrilamida, representan patrones de bandeo para cada individuo, cuyo tamaño depende del

40 número de bases de la región amplificada por cada par de cebadores. Para observar el patrón de bandeo, fue usado el marcador control denominado ladder, constituido por 50 pares de bases (pb) por banda (Figura 8). La lectura de los geles se llevó a cabo mediante la localización de los alelos (bandas observadas) cercanos al tamaño aproximado reportado en la literatura (Cuadro 1). Se inicia en orden ascendente y alfabéticamente, a partir de la primer banda se le designa la letra A y se continúa sucesivamente hacia arriba con las subsecuentes bandas (B,C,D….), dependiendo de los alelos encontrados en cada microsatélite.

Ladder 50 pb

Heterocigoto

Figura 8. Amplificación de alelos de R. mangle en gel acrilamida al 6 % microsatélite RM36

(rango 210 ± 30) en la población de Cabildo, Chiapas.

6.6 Análisis estadístico.

6.6.1 Indice de herbivoría en relación a los estadíos de R. mangle. Cada hoja fue asignada a una de las categorías antes mencionadas, se graficaron las frecuencias por categoría de daño en plántulas y árboles adultos de R. mangle, para observar si existe un patrón de distribución. De igual forma, mediante un análisis de

Prueba G, se obtuvieron las diferencias estadísticas de los valores categóricos en los estadíos de R. mangle en Cabildo y Pozuelos Murillo.

G = 2∑O¡ ·ln (O¡/E¡), Donde, ln = logaritmo natural

Oi= observada

Ei= esperada

Así también, se aplico la prueba Chi cuadrada, con el programa SPSS 23, para evaluar la relación entre la distribución de frecuencias por categoría de daño en plántulas y árboles adultos de R. mangle en Cabildo y Pozuelos Murillo. Con la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis, se determinó si el daño foliar presenta diferencias significativas con los estadíos, de acuerdo al estudio realizado por Erickon, et al. (2003).

6.6.2 Diversidad genética en relación a los estadíos de R. mangle. Con el programa InfoStat y SPSS 23, mediante la prueba t para la igualdad de medias, se evaluó la relación que existe entre la diversidad genética (número de heterocigotos,

% loci polimórficos, promedio de heterocigosidad y alelos) y la herbivoría de plántulas y

árboles adultos de R. mangle en Cabildo y Pozuelos-Murillo.

6.6.3 La herbivoría y su relación con la diversidad genética.

A través de un Análisis de Varianza Molecular (ANOVA), evaluamos la relación entre la variación genética (número de heterocigotos, % loci polimórficos, promedio de heterocigosidad y alelos) y herbivoría, en los dos estadíos de R. mangle dentro y entre las poblaciones.

VII. RESULTADOS

7.1 Herbivoría

7.1.1 Distribución de frecuencias por categoría de daño en estadíos de R. mangle. Los patrones de distribución de herbivoría en plántulas y árboles adultos de R. mangle

(Anexo 5), evaluados mediante el método propuesto por Dirzo y Dominguez (1995), indican que los árboles adultos exhiben los niveles más altos en la categoría de daño 1

(1 al 5%); mientras que en plántulas, la mayor distribución de frecuencias se presento en las categorías de daño 2 (6 a 12%), 3 (13 a 25%) y 4 (26 a 50%) en las dos poblaciones (Figura 9 y 10). Usando la prueba G, se obtuvieron diferencias significativas en las frecuencias por categoría de daño de plántulas y árboles adultos en

Pozuelos Murillo (12.93) y Cabildo (32.07), resultados mayores a la tabla (chi cuadrada

2 x 0.05,5= 11.070).

Población de R. mangle Cabildo 35

25 Adulto

20 Plántula

Frecuencia daño de 10

0 Cat 0 Cat 1 Cat 2 Cat 3 Cat 4 Cat 5 Categorías

Figura 9. Distribución de frecuencias por categoría de daño en el manglar.

Población de R. mangle Pozuelos Murillo 30

Adulto 20 Plántula 15

10 Frecuencia Frecuencia daño de

0 Cat 0 Cat 1 Cat 2 Cat 3 Cat 4 Cat 5 Categorías

Figura 10. Distribución de frecuencia por categoría de daño en el manglar de Pozuelos Murillo.

Con el programa estadístico SPSS 23, mediante la prueba Chi cuadrada(X2), determinamos que los valores categóricos están relacionados con los estadíos (plántula y árbol adulto) de R. mangle, en Cabildo (P-valor 0.00)y Pozuelos Murillo (P-valor 0.00), respectivamente (Cuadro 3).

Cuadro 3. Prueba x2 entre las categorías de daño y estadíos de R. mangle.

Categorías Cabildo Cat 1 Cat 2 Cat 3 Cat 4 Total Estadío Plántulas 9 17 10 4 40 Adultos 32 7 1 0 40

Valor gl Significación asintótica (bilateral) Chi-cuadrado de Pearson 28.43a 3 0.00 Categorías Pozuelos Murillo Cat 0 Cat 1 Cat 2 Cat 3 Cat 4 Total Estadío Plántulas 1 8 20 9 1 39 Adultos 0 26 11 3 0 40 Valor gl Significación asintótica (bilateral) Chi-cuadrado de Pearson 17.13a 4 0.00

7.1.2 Herbivoría de R. mangle en relación al estadío. De forma general, las plántulas de R. mangle son más vulnerable a los herbívoros en las dos poblaciones (Figura 11), con niveles de consumo foliar que oscilan en un porcentaje de 10 a 12. En árboles adultos, el promedio de herbivoría es menor a 6%. A nivel poblacional, Cabildo presento el mayor promedio de herbivoría (Figura 12).

Empleando la prueba no paramétrica de Kruskall Wallis, se determinó que existen diferencias significativas (P < 0.0001) entre la herbivoría y los estadíos (plántulas y

árboles adultos) en las dos poblaciones. (Cuadro 4).

Figura 11. Porcentaje de herbivoría en plántulas y árboles adultos de R. mangle.

Cuadro 4. Prueba de Kruskal Wallis entre la herbivoría de R. mangle y su estadío en las dos poblaciones.

Variable Población Estadío N Medias D.E. Medianas H P Herbivoría Cabildo Árboles 40 4.82 2.90 4.47 36.15 Adultos <0,0001 Herbivoría Cabildo Plántulas 40 12.23 8.79 9.90 Herbivoría Pozuelos Árboles 40 5.96 4.56 5.05 Adultos Herbivoría Pozuelos Plántulas 40 10.02 7.27 8.39

Figura 12. Porcentaje de herbivoría en dos poblaciones de R. mangle.

7.2 Diversidad genética de R. mangle. El estudio de diversidad genética se realizó con 8 loci microsatélites (RM7, RM11,

RM19, RM21, RM36, RM38, RM41 y RM46), caracterizados para esta especie de mangle, en Cabildo y Pozuelos Murillo, Chiapas. A partir de la lectura de geles acrilamida, generamos una base de datos con las siguientes medidas de diversidad genética: número de heterocigotos, porcentaje de loci polimórfico, promedio de heterocigosidad y alelos. En cada población, se observó que los árboles adultos de R. mangle presentan una mayor diversidad genética que las plántulas (Cuadro 5). Según los resultado obtenidos, Pozuelos Murillo es más diverso que Cabildo (Cuadro 6).

Cuadro 5. Diversidad genética en plántulas y árboles adultos de R. mangle.

Desviación Media de error Población Diversidad génetica Estadío N Media estándar estándar

Cabildo Número Heterocigotos Adulto 40 2.27 1.28 0.20 Cabildo Número Heterocigotos Plántula 40 1.47 1.06 0.16 Cabildo % Loci Polimórfico Adulto 40 0.30 0.15 0.02 Cabildo % Loci Polimórfico Plántula 40 0.21 0.18 0.02 Cabildo Heterocigosidad Promedio Adulto 40 0.14 0.08 0.01 Cabildo Heterocigosidad Promedio Plántula 40 0.09 0.06 0.01 Cabildo Alelos Promedio Adulto 40 1.44 0.20 0.03 Cabildo Alelos Promedio Plántula 40 1.24 0.21 0.03 Pozuelos Número Heterocigotos Adulto 40 2.35 1.92 0.30 Pozuelos Número Heterocigotos Plántula 40 1.57 1.31 0.20 Pozuelos % Loci Polimórfico Adulto 40 0.29 0.23 0.03 Pozuelos % Loci Polimórfico Plántula 40 0.22 0.20 0.03 Pozuelos Heterocigosidad Promedio Adulto 40 0.14 0.12 0.01 Pozuelos Heterocigosidad Promedio Plántula 40 0.09 0.08 0.01 Pozuelos Alelos Promedio Adulto 40 1.35 0.31 0.05 Pozuelos Alelos Promedio Plántula 40 1.34 0.36 0.05

Cuadro 6. Diversidad genética en las dos poblaciones de R. mangle. Media de error Diversidad genética Localidad N Media D.E. estándar Cabildo 80 1.87 1.23 0.13 Heterocigotos Pozuelos 80 1.96 1.68 0.18 Cabildo 80 0.25 0.17 0.01 Loci Polimórfico Pozuelos 80 0.26 0.22 0.02 Heterocigosidad Cabildo 80 0.11 0.07 0.00 Promedio Pozuelos 80 0.12 0.10 0.01 Cabildo 80 1.34 0.22 0.02 Alelos Promedio Pozuelos 80 1.34 0.33 0.03

7.2.1 Diversidad genética de R. mangle en relación al estadío. En Cabildo, la diversidad genética de R. mangle, relativa al numero de heterocigotos, porcentaje de loci polimórfico, promedio de heterocigosidad y alelos presenta diferencias significativas (P= 0.00) con los estadíos plántula y árbol adulto (Cuadro 7); mientras que en Pozuelos Murillo se hallaron diferencias significativas (P= 0.03) entre la diversidad genética (número de heterocigotos y heterocigosidad promedio) y los estadíos (Cuadro 8).

Cuadro 7. Valores de t para la diversidad genética de R. mangle.

Sig. Diferencia de Cabildo F Sig. T Gl (bilateral) error estándar Asumen varianzas 1.10 0.29 3.04 78.00 0.00 0.26 Número iguales Heterocigotos No asumen varianzas 3.04 75.41 0.00 0.26 iguales Asumen varianzas 0.20 0.65 2.39 78.00 0.01 0.03 % Loci iguales Polimórfico No asumen varianzas 2.39 75.69 0.01 0.03 iguales

Asumen varianzas 1.10 0.29 3.04 78.00 0.00 0.01 Heterocigosidad iguales Promedio No asumen varianzas 3.04 75.41 0.00 0.01 iguales Asumen varianzas 0.00 0.99 4.40 78.00 0.00 0.04 iguales Alelos Promedio No asumen varianzas 4.40 77.82 0.00 0.04 iguales

Cuadro 8. Valores de t para la diversidad genética en la población de R. mangle.

Sig. Diferencia de Pozuelos Murillo F Sig. T Gl (bilateral) error estándar Asumen varianzas 10.62 0.00 2.09 78.00 0.03 0.36 Número iguales Heterocigotos No asumen varianzas 2.09 68.90 0.04 0.36 iguales Asumen varianzas 3.70 0.05 1.43 78.00 0.15 0.05 % Loci iguales Polimórfico No asumen varianzas 1.43 76.43 0.15 0.05 iguales Asumen varianzas 10.62 0.00 2.09 78.00 0.03 0.02 Heterocigosidad iguales Promedio No asumen varianzas 2.09 68.90 0.04 0.02 iguales Asumen varianzas 0.16 0.68 0.17 78.00 0.86 0.07 iguales Alelos Promedio No asumen varianzas 0.17 76.85 0.86 0.07 iguales

7.3 Herbivoría y Diversidad Genética

7.3.1 Herbivoría de R. mangle en relación al número de Heterocigotos. En Cabildo, la herbivoría en plántulas y árboles adultos de R. mangle presenta una tendencia lineal negativa con el número de heterocigotos (Figura 13a). Aplicando la prueba de análisis de varianza (ANOVA), observamos que en adultos, el daño foliar demuestra una relación significativa con respecto al número de heterocigotos (F= 4.40,

R2= 0.14, P-valor= 0.04). En el estadío plántulas, no presenta una relación significativa entre la herbivoría y el número de heterocigotos (F= 3.34, R2= 0.11, P-valor= 0.07)

(cuadro 9).

En Pozuelos, la herbivoría de R. mangle manifiesta una tendencia lineal positiva en plántulas y negativa en árboles adultos con respecto al número de heterocigotos

(Figura 13b). El ANOVA demuestra que en adultos, el daño foliar y el número de heterocigotos presenta una relación significativa (F= 4.21, R2= 0.13, P=0.04). En el cuadro 9 observamos que la herbivoría en plántulas exhibe una relación significativa con el número de heterocigotos (F= 8.08, R2= 0.22, P=0.00).

7.3.2 Herbivoría de R. mangle en relación al % Loci polimórfico. La herbivoría de plántulas y árboles adultos de R. mangle en Cabildo, poseen una tendencia lineal negativa con % de loci polimórfico (Figura 14a). En el análisis de varianza se observó que la herbivoría en árboles adultos presenta una relación significativa con el porcentaje de loci polimórfico (F= 4.84, R2= 0.15, P= 0.03). Para el

51 caso de plántulas, se encontró una relación no significativa del consumo foliar y la diversidad genética (F= 2.62, R2= 0.09, P= 0.11) (Cuadro 10).

Por otro lado, en Pozuelos, la herbivoría y el porcentaje de loci polimórfico presenta una tendencia lineal positiva en plántulas y negativa en árboles adultos de R. mangle (Figura 14b). La herbivoría en árboles adultos exhiben una relación marginalmente significativa con respecto al porcentaje de loci polimórfico (F= 3.93, R2=

0.12, P=0.05); mientras que en el cuadro 10, se aprecia que en plántulas la relación del daño foliar y diversidad genética es altamente significativa (F= 8.03, R2= 0.22, P=0.00).

Bivariate Fit of Herbivoría By Número Heterocigotos a) Cabildo b) Pozuelos Murillo

Figura 13. Tendencia lineal de herbivoría y No. heterocigotos en plántulas y árboles adultos de R. mangle.

Cuadro 9. Anova de la herbivoría y número de heterocigotos en plántulas y árboles adultos de R. mangle.

Población Estadío Variable N R2 R2 Aj Cabildo Adultos Herviboría 30 0.14 0.11 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor No. de Heterocigotos 4.40 0.04 Cabildo Plántulas Herviboría 30 0.11 0.07 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor No. de Heterocigotos 3.34 0.07 Población Estadío Variable N R2 R2 Aj Pozuelos Adultos Herviboría 30 0.13 0.10 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor No. de Heterocigotos 4.21 0.04 Pozuelos Plántulas Herviboría 30 0.22 0.20 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor No. de Heterocigotos 8.08 0.00

Bivariate Fit of Herbivoría By % Loci Polimórfico a) Cabildo b) Pozuelos Murillo

Figura 14. Tendencia lineal de herbivoría y % loci polimórfico en plántulas y árboles adultos de R. mangle.

Cuadro 10. Anova de la herbivoría de R mangle en relación al % de loci polimórfico.

Población Estadío Variable N R2 R2 Aj Cabildo Adultos Herviboría 30 0.15 0.12 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor % de loci polimórfico 4.84 0.03 Cabildo Plántulas Herviboría 30 0.09 0.05 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor % de loci polimórfico 2.62 0.11 Población Estadío Variable N R2 R2 Aj Pozuelos Adultos Herviboría 30 0.12 0.09 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor % de loci polimórfico 3.93 0.05 Pozuelos Plántulas Herviboría 30 0.22 0.20 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor % de loci polimórfico 8.03 0.00

7.3.3 Herbivoría en estadíos de R. mangle y su relación con el %loci polimórfico. Se obtuvó la relación que guarda la herbivoría y % loci polimórfico de las plántulas y

árboles adultos. Al respecto, los árboles adultos presentan una tendencia lineal negativa y en plántulas es ligeramente positiva (Figura 15). A través de un análisis de varianza (Anova), se determinó que el daño foliar en árboles adultos presento una relación altamente significativa con el porcentaje de loci polimórfico (F= 8.17, R2= 0.12,

P= 0.00). Así mismo, la relación obtenida entre el consumo foliar y diversidad genética en plántulas no es significativa (F= 0.44, R2= 0.01, P= 0.51) (Cuadro 11).

Cuadro 11. Anova de la herbivoría en los estadíos de R. mangle en relación al % de loci polimórfico.

Estadío Variable N R2 R2 Aj Adultos Herviboría 60 0.12 0.11 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor % de loci polimórfico 8.17 0.00 Plántulas Herviboría 60 0.01 0.00 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor % de loci polimórfico 0.44 0.51

Bivariate Fit of Herbivoría By % Loci Polimórfico

Figura 15. Tendencia lineal de herbivoría y % loci polimórfico en plántulas y árboles adultos de R. mangle.

7.3.4 Relación Herbivoría – Heterocigosidad promedio. Para Cabildo, la herbivoría demuestra una tendencia lineal negativa con la heterocigosidad promedio en plántulas y árboles adultos de R. mangle. El mayor consumo de hojas por herbívoros corresponde a plántulas (Figura 16a). De acuerdo al análisis de varianza (ANOVA), la herbivoría en árboles adultos presentan una relación significativa con respecto a su heterocigosidad promedio (F= 4.40, R2= 0.14, P= 0.04).

Las plántulas guardan una relación no significativa entre el consumo foliar y la heterocigosidad promedio (F= 3.34, R2= 0.11, P= 0.07).

La herbivoría de R. mangle en plántulas de Pozuelos tiene una tendencia lineal positiva y en árboles adultos es negativa, siendo las plántulas las más consumidas por herbívoros (Figura 16b). El ANOVA demuestra que la hervivoria en árboles adultos posee una relación significativa con la heterocigosidad promedio calculada (F= 4.21,

R2= 0.13, P= 0.04). De igual manera, en plántulas existe una relación significativa elevada entre el daño foliar y su diversidad genética (F= 8.08, R2= 0.22, P= 0.00)

(Cuadro 12).

Bivariate Fit of Herbivoría By Heterocigosidad Promedio.

a) Cabildo b) Pozuelos Murillo

Figura 16. Tendencia lineal de herbivoría y heterocigosidad promedio en plántulas y árboles adultos.

Cuadro 12. Anova de la herbivoría y heterocigosidad promedio en plántulas y árboles adultos de R. mangle. Población Estadío Variable N R2 R2 Aj Cabildo Adultos Herviboría 30 0.14 0.11 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor Heterocigosidad promedio 4.40 0.04 Cabildo Plántulas Herviboría 30 0.11 0.07 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor Heterocigosidad promedio 3.34 0.07 Población Estadío Variable N R2 R2 Aj Pozuelos Adultos Herviboría 30 0.13 0.10 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor Heterocigosidad promedio 4.21 0.04 Pozuelos Plántulas Herviboría 30 0.22 0.20 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor Heterocigosidad promedio 8.08 0.00

7.3.5 Relación Herbivoría – Heterocigosidad promedio cuadrática. De manera conjunta, se obtuvieron los resultados del ANOVA en plántulas y árboles adultos de R. mangle en las dos poblaciones. Al respecto, observamos que el daño foliar en árboles adultos tiene una relación significativa con la heterocigosidad cuadrática promedio (F= 9.06, R2= 0.24, P=0.00). De igual forma, las plántulas presentan una relación significativa entre la herbivoria y su heterocigosidad cuadrática

(F= 8.06, R2= 0.14, P=0.00) (Cuadro 13).

Cuadro 13. Anova de la herbivoría y heterocigosidad promedio cuadrática en plántulas y árboles adultos de R. mangle. Estadío Variable N R2 R2 Aj Adultos Herviboría 60 0.24 0.22 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor Heterocigosidad promedio cuadrática 9.06 0.00 Plántulas Herviboría 60 0.14 0.11 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor Heterocigosidad promedio cuadrática 8.06 0.00

7.3.6 Relación Herbivoría – Alelos Promedio. En Cabildo, la herbivoría en plántulas y árboles adultos de R. mangle manifiesta una tendencia lineal negativa con el promedio de alelos (Figura 17a). Con base a los resultados obtenidos a través del ANOVA, el daño foliar (herbivoría) en árboles adultos no tiene una relación significativa con el promedio de alelos (F= 2.05, R2= 0.07, P- valor= 0.16). La herbivoría en plántulas de la misma población, presenta una relación significativa marginal con su diversidad genética obtenida en alelos promedio (F= 4.04,

R2= 0.13, P-valor= 0.05).

En la población de R. mangle de Pozuelos Murillo, el consumo foliar y el promedio de alelos presenta una tendencia lineal negativa en árboles adultos y positiva en plántulas (Figura 17b). En cuanto a los adultos, el análisis de varianza (ANOVA) indica que la herbivoría y el promedio de alelos exhibe una relación no significativa (F=

3.80, R2= 0.12, P= 0.06). En plántulas se observa una elevada relación significativa entre el daño foliar y el promedio de alelos (F= 7.55, R2= 0.21, P= 0.01) (Cuadro 14).

Cuadro 14. Anova de la herbivoría y alelos promedio en plántulas y árboles adultos de R. mangle. Población Estadío Variable N R2 R2 Aj Cabildo Adultos Herviboría 30 0.07 0.04 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor Alelos promedio 2.05 0.16 Cabildo Plántulas Herviboría 30 0.13 0.09 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor Alelos promedio 4.04 0.05 Población Estadío Variable N R2 R2 Aj Pozuelos Adultos Herviboría 30 0.12 0.09 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor Alelos promedio 3.80 0.06 Pozuelos Plántulas Herviboría 30 0.21 0.18 Analisis de la Varianza (SC tipo III) F P-valor Alelos promedio 7.55 0.01

Bivariate Fit of Herbivoría By Alelos Promedio a) Cabildo b) Pozuelos Murillo

Figura 17. Tendencia lineal de herbivoría y alelos promedio en plántulas y árboles adultos.

VIII. DISCUSIÓN

8.1 Herbivoría de R. mangle en relación al estadío. El promedio de herbivoría observada en estadíos de R. mangle en Cabildo y Pozuelos

Murillo, demuestra que las plántulas son más susceptibles a las lesiones ocasionadas por herbívoros, que los árboles adultos. A nivel Poblacional el mayor porcentaje de lesiones foliares se registró en Cabildo. En la distribución de frecuencias por categoría de daño, observamos que son más altos en categorías de daño menores. La herbivoría puede influir negativamente en cualquiera de los estadíos del mangle; sin embargo, estos efectos son acentuados en plántulas, debido a que una porción de hoja consumida representa una sustracción significativa de la energía fotosíntetica usada para las funciones vitales, como el crecimiento de la planta (Dirzo, 1987); además, de los incipientes mecanismos de defensa que presentan contra el ataque de los herbívoros. La selección natural debería favorecer la generación de rasgos defensivos durante las etapas de mayor vulnerabilidad al ataque de herbívoros (Stowe et al. 2000), sin embargo, la asignación de recursos, también es dirigida para otras funciones vitales de la planta. La alta depredación en plántulas ha sido reportado bajo ciertas circunstancias, como el severo ataque de la larva Junonia evarete en plántulas de A. germinans en un bosque de mangle perturbado en Colombia (Elster et al., 1999). En

Brasil, Souza (2011) encontró que las plántulas de R. mangle fueron más consumidas

(cerca de 14%), en comparación con Languncularia racemosa y Avicennia schaueriana.

Aunque, a nivel mundial, Aratus pisonii es uno de los pocos crustáceos capaces de trepar sobre el follaje de árboles adultos de R. mangle para consumir sus hojas

(Erickson et al., 2003). Tovilla (1998) considera que la herbivoría en plántulas es menos visible que en los demás estadíos, por la marcada diferencia de biomasa que presentan a nivel foliar. Con la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis, encontramos que existen diferencias significativas entre la herbivoría y los estadíos de R. mangle en las dos poblaciones. Con la misma prueba no paramétrica, Erickson, et al. (2003), realizaron un estudio de hábitos alimenticios del cangrejo de manglar (Aratus pisonnii), demostraron que existen mayores diferencias significativas en el porcentaje de hojas dañadas de R. mangle, en comparación que Avicennia germinans y Laguncularia racemosa, en la

Bahía de Tampa, cuyos resultados coinciden con los estudios obtenidos por Beever, et al. (1979) y Wilson (1981), en Florida. Más adelante, Erickson, et al. (2012), encontraron que el porcentaje de daño foliar por individuo es mayor para R. mangle, en los estadíos: plántulas, juveniles y adultos, en comparación con A. germinans y L. racemosa. En este úlitmo estudio, encontraron diferencias significativas en el porcentaje de daño foliar en los estadíos (plántulas, juveniles y adultos) de R. mangle, aunque en contraste con los resultados reportados en este trabajo, los árboles adultos obtuvieron el mayor promedio de herbivoría.

De acuerdo a los resultados alcanzados en este trabajo,la herbivoría estimada para ambos estadíos es muy baja en las dos poblaciones, con un valor aproximado de

10%. En general, la herbivoría en los mangles es baja y en su mayoría lo realizan determinados grupos de coleópteros, lepidópteros y crustáceos (Tovilla, 1998). Los bosques de manglar representan un buen modelo biológico para el estudio de selección alimenticia, debido a que estos ecosistemas presentan baja diversidad de especies y

61 escasos enlaces en la cadena trófica. Las hojas de mangle son consideradas como una dieta pobre, debido a su bajo contenido de nitrógeno y elevado radio de Carbono a

Nitrógeno (C/N); además, la dureza de su carbono estructural, a base de celulosa y hemicelulosa, y metabolitos secundarios (taninos), disminuyen la absorción y digestión de nutrientes (Linton y Greenaway 2007). El 10% de consumo anual de hojas no parece representar un valor extremo; sin embargo, es suficiente para reducir el estado físico de las plantas (Dirzo, 1984). Por ejemplo, Marquis (1984, 1992) encontró que el 10% de la defoliación experimental de un arbusto de sotobosque, Piper arieianum, redujo el crecimiento y producción de semilla, retraso la floración y disminuyó la viabilidad. En plántulas de Dipterix panamensis se encontró que la sobrevivencia anual es de 85% cuando no presentan daños foliares y 0% en aquellas con pérdida de área foliar de 8%

(Clark y Clark, 1985). Además, la mayoría de las plantas asignan solo el 10% de sus recursos a la reproducción, una inversión que afecta su estado físico (Bazzaz et al.,

1987). Las plantas pueden compensar la pérdida de hojas incrementando la tasa fotosintética en el remanente foliar. Sin embargo, se ven afectadas negativamente por la pérdida de nutrientes según la edad y los tejidos que hayan sido extraídos. Diversos estudios han demostrado que, cuando la disponibilidad de nutrientes es elevada, las plántulas de mangle invierten más en la biomasa aérea (el cual maximiza la captura de carbono) que en raíces, mientras que cuando la disponibilidad es escaza, las plántulas redirigen los recursos para mejorar la biomasa de sus raíces (McKee, 1995; Naido,

2009).

8.2 Genética de R. mangle en relación al estadío. La disponibilidad de un amplio número de marcadores moleculares polimórficos e informativos, como microsatélites y AFLP, han abierto novedosas posibilidades para el análisis de la estructura genética poblacional de especies de mangle, y a su vez, permite conocer los procesos evolutivos e históricos que forman el patrón filogeográfico actual (Sahu y Kathiresan, 2012). En el presente estudio, se determinó la estructura genética en dos estadíos de R. mangle, usando ocho microsatelites diseñados por

Rosero Galindo et al. (2002). Según los resultados obtenidos, los árboles adultos exhiben mayores niveles de diversidad genética que las plántulas, aunque de acuerdo a la hipótesis planteada, se esperaba más diversidad en plántulas, debido a que constituyen la base principal de material genético que ha permitido la perpetuación de la especie y el mejoramiento de las características para sobrevivir y reproducirse; atributos que se van eliminando por selección natural directa, hasta llegar al estadío adulto. La diversidad genética de R. mangle presentó diferencias significativas con los estadíos, plántulas y adultos, en Cabildo y Pozuelos Murillo. A nivel poblacional, la diversidad genética de R. mangle de Pozuelos Murillo es mayor que en Cabildo. Las diferencias en la diversidad genética obtenidas en las dos poblaciones, pueden ser atribuidos a la escaza producción de hipocotilos, o bien, a las obras y actividades antropogénicas como: la construcción del complejo portuario (Puerto Chiapas), tala indiscriminada de madera, contaminación de los cuerpos de agua por la presencia de agroquímicos, y principalmente por el dragado de canales para el desasolve de los sistemas lagunares

(Conapesca, 2004); cuyos factores han contribuido a la reducción del tamaño de la población. Diversos trabajos se han elaborado con la finalidad de conocer la diversidad

63 genética en diferentes poblaciones de R. mangle. Piero Bruschi et al (2014), evaluaron la diversidad genética de R. mangle usando tres microsatélites loci (RM19, RM41 y

RM46) en cuatro poblaciones ubicados a lo largo de la costa norte del Pacífico de

Nicaragua, los análisis demostraron niveles más altos de diversidad alélica de R. mangle (30 alelos y un promedio de numero de alelos por locus por población = 6.42), que los reportados para la misma especie en otros sitios de America tropical; incluso, estos valores de diversidad son mayores, comparado con los resultados obtenidos en las poblaciones de R. mangle en la costa de Chiapas. Usando marcadores microsatélites, Arbeláez-Corte et al., (2007), estudiaron la estructura genética de R. mangle en la Costa Pacífica Colombiana, encontraron el 100% de loci polimórfico y un promedio de heterocigosidad de 0.493; aplicando un AMOVA, obtuvieron datos significativos en cuanto a la variancia genética ocurrida entre poblaciones (5.58%) y dentro de la población (94.62%). Por su parte, Nuñez-Farfán et al. (2002), también hallaron alta diversidad genética, mediante un análisis de isoenzimas, estimaron un nivel de polimorfismo de 38% y heterocigosidad de 0.069 en poblaciones de R. mangle en las costas del Atlántico y Pacífico de México. En un estudio realizado a lo largo de la costa Pacífica de Baja California y costa Noroeste de México, Sandoval-Castro et al.

(2012) observaron una reducción significativa de la diversidad genética de R. mangle, mostrando una disminución hacia el norte, donde los bosques de manglar se encuentran estresados por disturbios naturales y antropogénicos. Con la técnica AFLP

(Amplified Fragment Length Polymorphism), M. Albrecht et al., (2013) estimaron bajos niveles de polimorfismo y heterocigosidad en poblaciones pequeñas de R. mangle ubicadas en Florida y el Caribe. El conocimiento de la estructura genética permite que

64 los esfuerzos de conservación sostengan la diversidad genética prevaleciente, previene la depresión endogámica, evitando la mezcla involuntaria de poblaciones genéticamente diferentes, logrando la permanencia exitosa de estos bosques (Salas-

Leiva et al., 2009a). La cantidad y estructura de la variación genética observada en poblaciones naturales depende de la sensibilidad de la técnica utilizada y los marcadores genéticos aplicados, así como, las características biológicas de la población en estudio (Douglas et al. 2001).

8.3 Relación Herbivoría – Diversidad genética La presencia constante de insectos herbívoros en el consumo de plantas, representa una de las interacciones dominantes del planeta y juegan un papel preponderante en la diversificación de las plantas y sus características (Ehrlich y Raven 1964 y Futuyma y

Agrawal 2009). Los insectos herbívoros son considerados como los mayores factores que afectan la ecología y evolución de las plantas. En Cabildo, la herbivoría en árboles adultos de R. mangle poseen una relación significativa negativa con la diversidad genética; mientras que, en plántulas no es significativa. En Pozuelos Murilllo, la herbivoría de R. mangle tiene una relación significativa, positiva en plántulas y negativa en árboles adultos, con la diversidad genética. En general, los arboles adultos presentan mayores niveles de diversidad genética y son los menos consumidos por herbívoros; en contraste, con las plántulas que son menos diversas y más susceptibles a la herbivoría. Lo anterior, se atribuye a que los individuos más variables, tienden a desarrollar eficaces mecanismos de defensa contra el ataque inminente de los

65 herbívoros, cuyas características permiten ser más resistentes y tolerantes a estas interacciones biológicas. Cuando los insectos herbívoros atacan a la planta, en la superficie de la hoja dañada se genera una señalización que producen transciptos de mRNA, los cuales son traducidos por la maquinaria celular para sintetizar compuestos usados para la defensa (Schmelz et al., 2007). En este sentido, la variación genética de las plantas relacionada a las defensas, determina el grado de vulnerabilidad a la herbivoría (King et al., 1997; Mutikainen et al., 2000). Luke et al. (2012), refieren que los diferentes niveles de diversidad genética en una planta pueden ser evolutivamente importantes para los diversos herbívoros. Según Strauss et al.(2002), los niveles de herbivoría varian a través de la población, genotipos de defensa podrian dominar en poblaciones fuertemente atacadas, mientras que, genotipos no defensivos deberían prevalecer cuando los enemigos están ausentes o son raros. Cuando las plantas son atacadas por diversas colección de especies de herbívoros, que difieren en el estilo de consumo y especialización, podría conducir a mayores niveles de polimorfismo en los genes de defensa, debido a la selección específica de perfiles defensivos para el herbívoro local o comunidad herbívora predominante (Johnson y Agrawal, 2005); sin embargo, no existe una evidencia directa que la variación en comunidades locales herbívoras represente una fuerte presión selectiva suficiente para favorecer características defensivas específicas y mantener polimorfismos en genes relacionados con la defensa.

IX. CONCLUSIONES

 Las poblaciones de R. mangle presentaron bajos niveles de herbivoría en

Cabildo y Pozuelos Murillo, con valores estimados alrededor de 10%.

 La distribución de frecuencias por índice de herbivoría son más altas en

categorías de daños menores.

 El daño foliar, ocasionado por el ataque de herbívoros, es mayor en plántulas

que en árboles adultos de R. mangle en Cabildo y Pozuelos Murillo.

 La herbivoría exhibida en las poblaciones de R. mangle poseen relaciones

significativas con los dos estadíos: árbol adulto y plántula. Por lo tanto, el nivel de

herbivoría depende del estadío que presente esta especie de mangle.

 Los árboles adultos de R. mangle presentaron mayor diversidad genética:

número de heterocigotos, porcentaje de loci polimórfico, promedio de

heterocigosidad y alelos, que las plántulas, en Cabildo y Pozuelos Murillo.

 La diversidad genética de R. mangle presenta diferencias significativas con los

estadíos: árbol adulto y plántula.

 La información relacionada a la diversidad genética de la población de R. mangle

de Cabildo y Pozuelos Murillo, contribuye a desarrollar estrategias para la

conservación in situ, así como implementar directrices apropiadas en el manejo

ecológico de los manglares en las Costa de Chiapas.

 Los niveles de herbivoría de R. mangle presentan una relación significativa con la

diversidad genética.

 De acuerdo a la hipótesis planteada, se cumplieron los resultados esperados en

cuanto a los mayores índices de herbivoría en plántulas de R. mangle en las dos

poblaciones; sin embargo, no fue así, en la diversidad genética, toda vez que, se

esperaban mayores niveles en plántulas.

 Con respecto a la hipótesis del vigor hibrido, se cumplió con lo esperado en los

estadíos de R. mangle, debido a que a mayor diversidad genética, los niveles de

daño por herbivoría fueron menores.

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100

XI. ANEXOS Anexo 1. Protocolo de extracción de ADN por el método CTAB Cloroformo para plantas. Día 1. Maceración de la muestra. 1.- Se toma un trozo de hoja de mangle de aproximadamente 1.5 cm x 1.5 cm y se corta en pedazos pequeños, previamente se lava con agua destilada para la eliminación de impurezas, e introduce en un tubo para microcentrífuga de 1.5 ml de capacidad. 2.- Para la eliminación de metabolitos secundarios (taninos en las hojas de mangle) se agregan 50 µl de Buffer CTAB. 3.- Las muestras se maceran hasta obtener una pasta consistente y nuevamente se agregan 650 µl de Buffer CTAB para cada tubo. 4.- Se agitan en vortex hasta que las muestras quedan en total resuspensión en el CTAB, luego se centrifugan por uno segundos a 16 000 revoluciones por minuto (rpm) para bajar la muestra y el líquido. 5.- Enseguida se incuban a 65˚C toda la noche en baño maría o en baño seco. Día 2. Lavados con cloroformo y precipitación. 6.- Para esto se agrega 1µl de RNAsa (10 mg/ml) y nuevamente dejamos reposar en baño maría o en baño seco por hora y media a 37˚C, se someten a centrifuga durante 5 minutos a 16 000 rpm. 7.- Tomamos la mayor cantidad de sobrenadante y lo pasamos a un set de tubos nuevos etiquetados. 8.- Añadimos 500 µl de cloroformo a cada tubo y se pasan los tubos a vortex por 20 segundos antes de centrifugarlos por 5 minutos a 16 000 rpm. 9.- Extraemos 400 µl de solución de la capa superior del tubo y agregamos este sobrenadante a la segunda serie de tubos etiquetados con 400 µl de cloroformo a cada tubo. 10.- Antes de centrifugar los tubos durante 10 minutos a 16 000 rpm se agitan en vortex por unos segundos. 11.- En el tercer set de tubos etiquetados se colocan 250 µl de la solución extraída de la capa superior del tubo.

101

12.- A esta última serie de tubos se le añade 148.7 µl de Isopropanol y 20.4 µl de Acetato de Amonio a 7.5 M, respectivamente, se agita en el vortex por 20 segundos y dejamos reposar los tubos durante 10 minutos. 13.- Lavado y secado de botón. El set de tubos se centrifuga durante 10 minutos a 16 000 rpm. 14.- Posteriormente se tiene que verter la solución en un vaso de precipitado con residuos y luego identificar el botón blanco de ADN en la parte inferior del tubo. 15.- Es necesario secar el borde del tubo para obtener la última gota del líquido fuera del recipiente. 16.- Se agregan 1000 µl de etanol al 70% y cuidadosamente invertimos los tubos de 2 a 3 veces y dejamos reposar por 20 minutos. 17.- Centrifugamos 2 minutos a 16 000 rpm, volvemos a derramar la solución y secamos el borde del tubo hasta obtener la última gota del líquido fuera del tubo con cuidado de mantener el botón. 18.- Colocamos los tubos en una gradilla con las tapas abiertas y cubrimos completamente con servilletas. 19.- Dejamos secar las muestras a temperatura ambiente por dos horas o durante toda la noche. Día 3. Reconstitución del botón. 20.- Agregamos 50 µl de agua estéril a cada tubo, para luego incubarlo o baño seco a 65˚C por 20 minutos. 21.- Se mezcla la muestra golpeando con el dedo a en la parte inferior de los tubos y se centrifuga a 16 000 rpm por unos segundos. La visualización de ADN se realiza por electroforesis en gel de agarosa al 1%.

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Anexo 2. Procedimiento electroforesis en gel de agarosa al 1% para visualización de ADN. 1.- Se prepara una solución de agarosa al 1% en TAE al 1X. Se disuelven 0.30 mg de Agarosa en 37.5 ml de amortiguador TAE 1X en un matraz de 125 ml con una agitación leve. 2.- El matraz se mete al horno de microondas por 1.05 minutos. Cuando el microondas marque 40 segundos, se detiene y saca con cuidado el matraz para agitarlo levemente. Se repite la operación a los 20 segundos. 3.- La mezcla se deja enfriar en un recipiente con agua hasta que la parte interior de la mano soporte el calor, antes de que el gel haya solidificado. 4.- Se prepara el molde de la cámara de electroforesis y el peine para los pozos que sean necesarios (10, 14 o 15) en un lugar que se encuentre plano. 5.- La mezcla se vierte en el molde y se dejan pasar de 15 a 20 minutos a temperatura ambiente para que el gel solidifique por completo. 6.- Una vez que el gel está sólido, procedemos a retirar con cuidado el peine y se pasa el molde a la cámara de electroforesis. 7.- En la cámara de electroforesis, el nivel de TAE al 1X debe cubrir el gel en su totalidad. 8.- En un parafilm se colocan 3 µl de Azul de bromofenol por cada muestra. Se toman 5 µl de ADN y se resuspenden con el azul con la micropipeta para colocar esta mezcla en cada uno de los pozos del gel. 9.- La cámara de electroforesis se conecta a la fuente de poder a un voltaje de 100 voltios por aproximadamente 40 minutos. 10.- Una vez que el gel haya corrido, se saca el molde de la cámara y se tiñe por 15 minutos en una charola que debe contener 80 µl de Bromuro de etidio disueltos en 500 ml de agua corriente. 11.- Con ayuda de la espátula destinada al uso de Bromuro de etidio, se saca el gel del contenedor de bromuro y se pasa a la charola del transiluminador de luz ultravioleta. El fotodocumentador debe cubrir por completo la luz ultravioleta para evitar daños en los ojos.

103

12.- Se fotografía el gel directamente con ayuda del fotodocumentador. 13.- Se apaga el transiluminador, se retira la tapa del mismo y con ayuda de la espátula, se retira el gel para ser depositado en el recipiente para geles teñidos. Con una servilleta, se retira el exceso de bromuro del transiluminador. La servilleta y los guantes utilizados son desechados en el recipiente rotulado como “Basura contaminada”.

104

Anexo 3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) Preparación de la Reacción de PCR.  En un tubo para microcentrífuga de .2 ml de capacidad nuevo y estéril se debe colocar la siguiente mezcla de reacción cuando se trabaja con cada uno de los reactivos (la cual puede variar de acuerdo a la especie con la que se trabaja):

Reactivos Cantidad final Buffer 2.5 µl

MgCl2 1.25 µl DNTP’s 2.5 µl Primer 1 1 µl Primer 2 1 µl Agua libre de endonucleasas µl Taq polimerasa 0.125 µl ADN* µl Volumen total 25 µl  El ADN se coloca al final en cada tubo con la mezcla de reacción.  Cuando se cuenta con los reactivos en una mezcla de fábrica como Master Mix o Green Master Mix, la mezcla de reacción debe contener lo siguiente:

Reactivos Cantidad final Master Mix o Green Master Mix 12 µl Agua libre de endonucleasas 10 µl Primer 1 1 µl Primer 2 1 µl ADN* µl Volumen total 25 µl  El ADN se coloca al final en cada tubo con la mezcla de reacción.  Después de cerrar bien las tapas de los tubos, estos se colocan en el termociclador y se someten a condiciones específicas de amplificación programadas para el ADN de cada especie a estudiar, basándose en bibliografías consultadas con anterioridad.

Programa de amplificación en el termociclador:

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Los programas varían de acuerdo al gen que se quiere amplificar. El siguiente cuadro es un ejemplo de programa de amplificación de microsatélites en la liebre Lepus plavigularis. Temperatura Tiempo Número de ciclos 94 °C 4 minutos 1 ciclo 94 °C 30 segundos 30 ciclos 60 °C 30 segundos 30 ciclos 72 °C 30 segundos 30 ciclos 72 °C 10 minutos 10 ciclos 4 °C ∞ --

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Anexo 4. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% para amplificación de ADN. 1.- Se destinan dos vasos de precipitados y dos jeringas, rotulados con la leyenda “Exclusivo Acrilamida”, para la preparación de los geles. 2.- Antes de utilizar los cristales para geles de acrilamida, deben limpiarse con alcohol y agua destilada, luego se secan por completo. 3.- Los cristales se usan por par (un espaciador y el otro delgado) y se colocan con cuidado en el marco de fundición (soportes verdes) a manera de “sándwich” para asegurar que la solución de acrilamida no se derrame. Después, se colocan los marcos en el soporte de fundición, el cual asegura los marcos con pequeñas palancas de presión, y a su vez brinda mayor estabilidad a los cristales 4.- En la mesa de trabajo se debe tener los siguientes reactivos y materiales: - Acrilamida al 30% - Servilletas - Buffer TBE al 10X - Peines para geles de acrilamida - Agua destilada estéril - Puntas para micropipeta - APS - Micropipetas - TEMED 5.- El reactivo APS debe prepararse cada 5 días como máximo, para evitar problemas de polimerización. El tubo que lo contenga debe estar rotulado con nombre y fecha para llevar un control de preparación. 6.- Se toma un vaso de precipitados y dependiendo el número de geles a preparar, se agregan los reactivos mostrados en la siguiente tabla, en el orden en que se presentan.

Preparación del gel de poliacrilamida al 6% para ADN 6 geles 5 geles 4 geles 3 geles 2 geles 1 gel Agua destilada 5034 ml 20.530 ml ml 2517 ml 13.620 ml ml 10.215 ml ml 6.810 mlml TBE 10X 5 ml 3 ml 2.5 ml 2 ml 1.5 ml 1 ml Acrilamida 30% 10 ml 6 ml 5 ml 4 ml 3 ml 2 ml  APS 10% 500 µl 500 µl 450 µl 400 µl 300 µl 200 µl  TEMED 50 µl 30 µl 25 µl 20 µl 15 µl 10 µl  Estos dos reactivos se agregan siempre al final y al mismo tiempo

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7.- Cuando se agregue la Acrilamida, el frasco que la contenga no debe abrirse en su totalidad, y la punta utilizada, se envuelve en una servilleta y se desecha directamente en el recipiente de “Basura contaminada”. 8.- Una vez agregados todos los reactivos, con ayuda de la jeringa, se mezclan rápidamente con mucho cuidado para evitar derrames y se vierten en los cristales. 9.- Se verte la mezcla en uno de los extremos superiores de los cristales, de manera lenta para evitar burbujas en el gel, hasta que la solución alcance el borde de los cristales. Después de llenar el espacio entre los cristales, se coloca con cuidado el peine y se deja polimerizar por 20 o 30 minutos a temperatura ambiente. 10.- Una vez que los geles han polimerizado, se sacan de los soportes y del marco. Los peines son retirados con precaución y los cristales se colocan en las bases de soporte de la cámara de electroforesis. 11.- La cámara de electroforesis vertical tiene marcados los niveles de Buffer dependiendo de los geles que vayan a correrse. El llenado de la cámara debe hacerse con Buffer TBE 0.5X o 1X y este debe remplazarse después de 4 corrimientos. 12.- Los geles se colocan por pares en cada uno de los soportes de la cámara, el espacio entre ellos se llena con Buffer TBE 0.5X o 1X hasta el borde de los mismos. Con una jeringa se “limpian” los pozos de los geles agregando poco a poco buffer para eliminar residuos de gel que eviten que las muestras se deslicen de manera correcta durante el corrimiento. 13.- Enseguida se procede a un “pre-corrimiento” por espacio de 25 a 30 minutos a un voltaje de 50 V. 14.- Transcurrido el pre-corrimiento, las muestras son cargadas, mezclando en un parafilm 3 µl de Azul de bromofenol más 6 µl de ADN. Una vez re-suspendida la mezcla, se vacía con cuidado en cada uno de los pozos. Si la mezcla de PCR se realizó con Green Master Mix, el azul de bromofenol NO es necesario y el tampón de carga será de 6 µl de ADN. 15.- En uno de los pozos se coloca el marcador de peso molecular (ladder) de 50 pb (los pares de bases del marcador molecular varían de acuerdo al número de pares de

108 bases a observar en el fragmento amplificado de ADN). El tampón de carga para el marcador molecular es de 2 µl de ladder más 2 µl de Azul de bromofenol. 16.- El ladder se coloca en un pozo diferente en cada gel, para identificar bien el orden de las muestras, al cargarse dos geles puede haber confusiones en muestras amplificadas, debido que al teñirse el gel puede voltearse. 17.- Una vez cargados todos los pozos, la cámara de electroforesis vertical es conectada a la fuente de poder a un voltaje de 50 voltios durante 3 horas. 18.- Las muestras van dejando una línea amarilla, indicando los residuos del colorante presente en el azul de bromofenol; cuando la línea llega al borde inferior de los cristales, el voltaje es detenido y los cristales se retiran de la cámara. 19.- En el lavabo se coloca la charola destinada a geles de acrilamida. Con precaución se llevan los cristales a esa zona y se retiran con ayuda de un separador de cristales que se inserta en uno de los bordes inferiores entre los cristales. 20.- El cristal en donde el gel quedó adherido, se coloca bajo el chorro leve de agua para que el gel se separe sin romperse y caiga en la charola que también contiene agua. 21.- Con precaución, la charola se traslada a la mesa de área de bromuro, con el apoyo de una espátula plana, el gel se coloca en la solución de bromuro de etidio para ser teñido por 10 minutos. 22.-Con ayuda de la espátula, se saca el gel de su recipiente y se pasa a la charola del transiluminador de luz ultravioleta. El fotodocumentador debe cubrir por completo la luz ultravioleta para evitar daño en los ojos. 23.- Por ser un gel muy delgado, muchas veces tiende a “enrollarse”. Con ayuda de la espátula el gel se expande por completo y se fotografía directamente con ayuda del fotodocumentador. 24.- Se apaga el transiluminador, se retira la tapa del mismo y con servilletas, se cubre el gel y se retira del transiluminador para ser desechado directamente en el recipiente rotulado como “Basura contaminada”. 25.- Con una servilleta, se retira el exceso de bromuro del transiluminador.

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26.- Una vez que se hayan terminado de secar hay que pasarlos a la mesa de área de acrilamida. Los cristales deben ser limpiados con alcohol y agua destilada. Secarlos y guardarlos en su lugar correspondiente.

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Anexo 5. Distribución de frecuencia por categoría de daño foliar en plántulas y árboles adultos de Cabildo y Pozuelos Murillo.

Localidad Estadío Id_Planta % daño Cat_0 Cat_1 Cat_2 Cat_3 Cat_4 Cat_5 Cabildo Árbol Adulto CA1 4,201 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA2 17,213 0 0 0 1 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA3 1,605 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA4 2,114 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA5 1,775 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA6 6,519 0 0 1 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA7 4,587 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA8 6,372 0 0 1 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA9 3,932 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA10 2,472 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA11 8,060 0 0 1 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA12 4,842 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA13 3,805 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA14 5,576 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA15 4,746 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA16 3,910 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA17 4,931 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA18 2,699 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA19 2,503 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA20 5,368 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA21 4,359 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA22 3,156 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA23 8,803 0 0 1 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA24 3,259 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA25 4,903 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA26 4,008 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA27 5,282 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA28 2,967 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA29 1,563 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA30 5,382 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA31 5,016 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA32 4,136 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA33 6,120 0 0 1 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA34 5,963 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA35 3,531 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA36 11,991 0 0 1 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA37 1,240 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA38 2,784 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA39 5,060 0 1 0 0 0 0 Cabildo Árbol Adulto CA40 6,200 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP1 37,343 0 0 0 0 1 0 Cabildo Plántula CP2 1,449 0 1 0 0 0 0 Cabildo Plántula CP3 11,731 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP4 9,679 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP5 10,116 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP6 8,105 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP7 9,222 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP8 5,740 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP9 39,142 0 0 0 0 1 0 Cabildo Plántula CP10 15,265 0 0 0 1 0 0

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Localidad Estadío Id_Planta % daño Cat_0 Cat_1 Cat_2 Cat_3 Cat_4 Cat_5 Cabildo Plántula CP11 16,221 0 0 0 1 0 0 Cabildo Plántula CP12 9,256 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP13 4,789 0 1 0 0 0 0 Cabildo Plántula CP14 15,256 0 0 0 1 0 0 Cabildo Plántula CP15 0,529 0 1 0 0 0 0 Cabildo Plántula CP16 6,985 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP17 11,035 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP18 14,387 0 0 0 1 0 0 Cabildo Plántula CP19 5,445 0 1 0 0 0 0 Cabildo Plántula CP20 18,655 0 0 0 1 0 0 Cabildo Plántula CP21 21,840 0 0 0 1 0 0 Cabildo Plántula CP22 8,255 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP23 3,642 0 1 0 0 0 0 Cabildo Plántula CP24 5,071 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP25 8,749 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP26 19,753 0 0 0 1 0 0 Cabildo Plántula CP27 5,618 0 1 0 0 0 0 Cabildo Plántula CP28 10,822 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP29 21,900 0 0 0 0 1 0 Cabildo Plántula CP30 11,819 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP31 3,210 0 1 0 0 0 0 Cabildo Plántula CP32 5,714 0 1 0 0 0 0 Cabildo Plántula CP33 8,014 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP34 13,867 0 0 0 1 0 0 Cabildo Plántula CP35 2,937 0 1 0 0 0 0 Cabildo Plántula CP36 7,426 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP37 18,727 0 0 0 1 0 0 Cabildo Plántula CP38 17,126 0 0 0 1 0 0 Cabildo Plántula CP39 13,608 0 0 1 0 0 0 Cabildo Plántula CP40 30,776 0 0 0 0 1 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA1 2,915 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA2 4,386 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA3 3,875 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA4 1,352 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA5 4,851 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA6 6,735 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA7 17,654 0 0 0 1 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA8 10,298 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA9 5,263 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA10 11,576 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA11 4,765 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA12 1,465 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA13 2,355 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA14 5,968 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA15 15,941 0 0 0 1 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA16 22,836 0 0 0 1 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA17 7,096 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA18 4,050 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA19 7,369 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA20 2,248 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA21 1,295 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA22 1,513 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA23 5,764 0 1 0 0 0 0

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Localidad Estadío Id_Planta % daño Cat_0 Cat_1 Cat_2 Cat_3 Cat_4 Cat_5 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA24 2,622 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA25 5,424 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA26 3,496 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA27 5,211 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA28 2,803 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA29 5,253 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA30 9,659 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA31 2,187 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA32 2,964 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA33 7,738 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA34 1,971 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA35 8,134 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA36 4,895 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA37 8,922 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA38 5,650 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA39 4,043 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Árbol Adulto PA40 5,867 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP1 8,643 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP2 2,110 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP3 3,620 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP4 0,300 1 0 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP5 10,634 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP6 0,000 1 0 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP7 22,079 0 0 0 1 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP8 6,353 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP9 3,415 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP10 7,945 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP11 3,739 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP12 7,029 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP13 11,486 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP14 2,488 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP15 13,952 0 0 0 1 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP16 8,462 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP17 7,208 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP18 8,934 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP19 5,206 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP20 14,683 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP21 5,710 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP22 6,008 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP23 19,414 0 0 0 1 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP24 4,953 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP25 8,869 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP26 23,866 0 0 0 1 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP27 10,055 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP28 18,068 0 0 0 1 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP29 25,953 0 0 0 1 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP30 13,716 0 0 0 1 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP31 8,315 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP32 7,730 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP33 5,738 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP34 8,571 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP35 34,253 0 0 0 0 1 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP36 15,328 0 0 0 1 0 0

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Localidad Estadío Id_Planta % daño Cat_0 Cat_1 Cat_2 Cat_3 Cat_4 Cat_5 Pozuelos-Murillo Plántula PP37 10,628 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP38 4,209 0 1 0 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP39 7,189 0 0 1 0 0 0 Pozuelos-Murillo Plántula PP40 14,024 0 0 0 1 0 0

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