RESSALVA

Alertamos para ausência das Figuras do Vol. II, não incluídas no formato adequado pelo(a) autor(a) no arquivo original. 1

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Júlio de Mesquita Filho

LUCIANA DE ÁVILA SANTOS

Estudo químico e das atividades citotóxica, antioxidante e antifúngica de Prunus myrtifolia L. (Urban.) (ROSACEAE)

Tese apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química

Orientadora: Prof Dra Dulce Helena Siqueira Silva

(VOLUME 1)

ARARAQUARA 2005

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SÚMULA CURRICULAR

DADOS PESSOAIS

LUCIANA DE ÁVILA SANTOS Nascimento: 23/03/1970 RG: 22128674-3 Endereço Residencial: Avenida Alberto Toloi, 185- Bloco 1, Apto 11 - Quitandinha - Araraquara, São Paulo, CEP 14800-075.

Endereço Profissional: Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - UNESP NuBBE- Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais, Instituto de Química de Araraquara - Departamento de Química Orgânica. Rua Prof. Francisco Degni s/n - Quitandinha, Araraquara, SP, CEP 14800-900. Telefone: (16) 3301-6600 ramal 6785 E-mails: [email protected] [email protected]

FORMAÇÃO UNIVERSITÁRIA Graduação Bacharelado em Química com Atribuições Tecnológicas Faculdade de Ciências Exatas e Experimentais (FCEE) da Universidade Mackenzie – São Paulo. Período: 1991-1996. Trabalho de conclusão de curso: “Extração, Isolamento e identificação de alcalóides dos galhos de Porcelia macrocarpa (Annonaceae)”

Pós-Graduação Mestrado em Química Área: Química Orgânica. Realizado no Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” – UNESP/ Campus Araraquara. Título da Dissertação: “Isolamento e caracterização de ácidos graxos e acilglicerídeos acetilênicos de Porcelia macrocarpa (Warm.) R. E. Fries (ANNONACEAE), com potencial atividade inibitória de lipoxigenases”. Período: março de 1998 a novembro 2000. Menção Distinção e Louvor.

Doutorado em Química. Área: Química Orgânica. Realizado no Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” – UNESP/ Campus Araraquara. Título da tese: “Estudo químico e das atividades citóxica, antioxidante e antifúngica de Prunus myrtifolia ( L.) Urban. (ROSACEAE)” Em andamento desde abril de 2001.

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ESTÁGIOS REALIZADOS

Iniciação à Pesquisa Científica

Título do projeto: “Isolamento e identificação de alcalóides de Porcelia macrocarpa (ANNONACEAE)”. Realizado no Instituto de Química da Universidade de São Paulo - USP/SP, sob a orientação da Profa Dra Nídia Franca Roque (atualmente na Universidade Federal da Bahia-UFBa) e co-orientação da Profa Dra Mariana Helena Chaves (atualmente na Universidade Federal do Piauí – UFPI).

BOLSAS RECEBIDAS Iniciação Científica (IC), mestrado (MS) e doutorado (DR) pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo- FAPESP.

IDIOMAS Inglês: Nível avançado de leitura, escrita e conversação. Francês: Bom nível de leitura, escrita, compreensão e conversação. Espanhol: Bom nível de leitura, escrita e compreensão e conversação.

EXPERIÊNCIA PROFISSIONAL

Elaboração e co–orientação de projetos. Projeto de IC: Busca de substâncias antioxidantes em Lippia salvifolia (Verbenaceae). Daniela Cristina Bonfim (Bolsista FAPESP). Concluído. Projeto IC: Busca de substâncias bioativas em Parinari excelsa (Chrysobalanaceae). Rene Francisco Gonçalves (Bolsista CAPES). Em andamento. Projeto IC: Estudo dos extratos apolares de folhas e galhos de Prunus myrtifolia (Rosaceae). Marcelo Furlan Shoubeck (Bolsista CNPq). Concluído. Projeto IC: Re-isolamento de substâncias acetilênicas de Porcelia macrocarpa (Annonaceae). Rosilene Cristina Rossetto Burgos (Bolsista BAE). Concluído. Projeto IC: Bioprospecção em Swartzia langsdorffii (Leguminosae) visando substâncias antifúngicas, antioxidante e potencialmente citotóxicas. Renata Lemos – bolsista FAPESP. Em andamento.

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ARTIGOS CIENTÍFICOS

PUBLICADO: SANTOS, L. Á., CHAVES, M. H., ROQUE, N. F. Alkaloids from Porcelia macrocarpa (Annonaceae), Journal of Natural Products, v. 64, p.240-242, 2001.

NO PRELO: SANTOS, L.Á., CAVALHEIRO, A. J. Acetylenes from Porcelia macrocarpa seeds oil (Annonaceae). Phytochemistry.

EM ELABORAÇÃO: SANTOS, L. Á., SILVA, D. H. S. Cyanogenic glycosides and derivatives from Prunus myrtifolia (Rosaceae). SANTOS, L. Á., BOLZANI, V. S., SILVA, D. H. S. Triterpenes and flavonoids from Prunus myrtifolia (Rosaceae). SANTOS, L. Á., BONFIM, D. C., BOLZANI, V. S. Antioxidant activity in Lippia salvifolia: I- flavanones and chalcones.

ATIVIDADES EXTRA CURRICULARES

SEMINÁRIOS E PALESTRAS APRESENTADOS

Título: A química dos aromas

1a apresentação: Instituto de Química da UNESP/Campus Araraquara- São Paulo. 14 de abril de 2003. 2a apresentação: Departamento de Química da Universidade Católica de Brasília (UCB), Taguatinga- Brasília- DF. 5 de novembro de 2003.

Título: Substâncias acetilênicas de Porcelia macrocarpa (Annonaceae) com potencial atividade inibitória de lipoxigenases. Instituto de Química da UNESP/Campus Araraquara, durante o II workshop “Conservação e uso sustentável da diversidade de plantas do Cerrado e Mata Atlântica: diversidade química e prospecção de novos fármacos”. 9 de julho de 2001. Título: Cianogênese em plantas Instituto de Química da UNESP/Campus Araraquara, durante a II Reunião de 2005 do Grupo NuBBE – Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais. 30 de março de 2005.

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TRABALHOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS NACIONAIS

Luciana de Ávila Santos, Dulce Helena S. Silva e Vanderlan da S. Bolzani Constituintes químicos das folhas de Lippia salviaefolia (Verbenaceae). Evento: 28a Reunião da Sociedade Brasileira de Química (SBQ). Período e local: 30 de maio a 2 de junho de 2005 em Poços de Caldas- Minas Gerais.

Luciana de Ávila Santos, Dulce Helena S. Silva e Vanderlan da S. Bolzani Técnicas Hifenadas utilizadas na identificação de derivados do ácido cafeico em exratos de Prunus myrtifolia (Rosaceae) Evento: 28a Reunião da Sociedade Brasileira de Química (SBQ). Período e local: 30 de maio a 2 de junho de 2005 em Poços de Caldas- Minas Gerais.

Luciana de Ávila Santos, Dulce Helena S. Silva e Vanderlan da S. Bolzani Glicosídeos cianogênicos e derivados isolados de Prunus myrtifolia (Rosaceae). Evento: 27a Reunião da Sociedade Brasileira de Química (SBQ). Período e local: 30 de maio a 2 de junho de 2004 em Salvador- Bahia.

Luciana de Ávila Santos e colaboradores. Conservação e Utilização Sustentável da Biodiversidade Vegetal do Cerrado e Mata Atlântica: diversidade química de plantas nativas de mata e cerrado e seu potencial biológico Evento: IV Simpósio e IV Reunião de Avaliação do Programa BIOTA/FAPESP Período e local:08 a 13 de dezembro de 2003 em Águas de Lindóia – São Paulo.

Luciana de Ávila Santos, Dulce H.S. Silva, Daniela C. Bonfim, Maria Claudia M. Young e Vanderlan da S. Bolzani Triterpenos pentacíclicos e esteróides de Prunus myrtifolia (Rosaceae). Evento: 26a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (SBQ). Período e local: 26 a 29 de maio de 2003 em Poços de Caldas- Minas Gerais.

Luciana de Ávila Santos, Dulce Helena S. Silva, Alberto José Cavalheiro, Maria Claudia M. Young e Vanderlan da Silva Bolzani Substâncias antioxidantes e antifúngicas de Prunus myrtifolia (Rosaceae). Evento: III Simpósio do programa BIOTA/FAPESP. Período e local: 26 a 28 de novembro de 2002, na Universidade Federal de São Carlos-São Paulo.

Luciana de Ávila Santos, Dulce Helena, S. Silva, Maria Claudia M. Young e Vanderlan da S. Bolzani Substâncias antioxidantes de Prunus myrtifolia (Rosaceae). Evento: 25a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (SBQ). Período e local: 20 a 23 de maio de 2002 em Poços de Caldas- Minas Gerais.

Luciana de Ávila Santos, Luce M. I. Silva, Mariana H. Chaves e Nídia Franca Roque Estudo do óleo essencial e extrato aquoso das folhas de Guatteria aff minarum R. E. Fries (Annonaceae). Evento: 20a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (SBQ). Período e local: 24 a 27 de maio de 1997 em Poços de Caldas- Minas Gerais.

Luciana de Ávila Santos, Mariana H. Chaves e Nídia Franca Roque Alcalóides dos galhos de Porcelia macrocarpa (Annonaceae). Evento: 19a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (SBQ). Período e local: 27 a 30 de maio de 1996 em Poços de Caldas- Minas Gerais.

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Luciana de Ávila Santos, Mariana Helena Chaves e Nídia Franca Roque Alcalóides dos galhos de Porcelia macrocarpa (Warm.) R E. Fries (Annonaceae) Evento: I Jornada Científica – FCEE da Universidade Mackenzie. Período e local: 10 a 15 de junho de 1996 na Faculdade de Ciências Exatas e Experimentais da Universidade Mackenzie.

Luciana de Ávila Santos, Mariana H. Chaves e Nídia Franca Roque Amidas e lignanamidas de Porcelia macrocarpa (Annonaceae). Evento: 18a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (SBQ). Período e local: 30 de maio a 2 de junho de 1995 em Poços de Caldas- Minas Gerais.

TRABALHOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS INTERNACIONAIS

Luciana de Ávila Santos e Alberto José Cavalheiro Ácidos graxos acetilênicos de Porcelia macrocarpa (Annonaceae) com atividade contra células neoplásicas. Evento: Simpósio Latino-americano de Farmacobotânica e III Reunião Latino- americana de fitoquímica. Período e local: 13 a 17 de setembro de 1999 em Gramado- Rio Grande do Sul.

Luciana de Ávila Santos and Alberto José Cavalheiro New conjugated acetylenes: unusual compounds obtained from seed oil of Porcelia macrocarpa (Annonaceae). Evento: 22nd IUPAC International Symposium on Chemistry of Natural Products. Período e local: 3 a 8 de setembro de 2000 na Universidade Federal de São Carlos- São Paulo.

PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS

27a Reunião da Sociedade Brasileira de Química. Período e local: 30 de maio a 2 de junho de 2004 em Salvador- Bahia.

IV Simpósio e IV Reunião de Avaliação do Programa BIOTA/FAPESP Período e local: 08 a 13 de dezembro de 2003 em Águas de Lindóia – São Paulo.

IX Escola de Verão em química farmacêutica e química medicinal. Período e local: 17 a 21 de fevereiro de 2003 no Centro de Ciências da Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)- Rio de Janeiro.

26a Reunião da Sociedade Brasileira de Química. Período e local: 26 a 29 de maio de 2003 em Poços de Caldas- Minas Gerais.

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III Simpósio e IV Reunião de Avaliação do Programa BIOTA/FAPESP Período e local: 26 a 28 de novembro de 2002 na Universidade Federal de São Carlos- São Paulo.

III workshop “Conservação e uso sustentável da diversidade de plantas do Cerrado e Mata Atlântica: diversidade química e prospecção de novos fármacos”. Período e local: 15 a 17 de julho de 2002 no Instituto de Química da UNESP/Campus Araraquara.

25a Reunião da Sociedade Brasileira de Química. Período e local: 20 a 23 de maio de 2002 em Poços de Caldas- Minas Gerais. VIII Escola de Verão em química farmacêutica e química medicinal. Período e local: 22 a 26 abril de 2002 no Centro de Ciências da Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)- Rio de Janeiro.

XXII Escola de verão em química. Período e local: 18 a 22 de fevereiro de 2002, no Departamento de Química do Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia da Universidade Federal de São Carlos. 24a Reunião anual da SBQ. Período e local: 28 a 31 de maio de 2001 em Poços de Caldas- Minas Gerais.

48a Jornada Farmacêutica. Período e local: 18 a 24 agosto de 2001 na Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP/Campus Araraquara- São Paulo.

II workshop “Conservação e uso sustentável da diversidade de plantas do Cerrado e Mata Atlântica: diversidade química e prospecção de novos fármacos”. Período e local: 08 a 10 de julho de 2001 no Instituto de Química da UNESP/Campus Araraquara. IX Simpósio Latino-americano de Farmacobotânica e III Reunião Latino- americana de fitoquímica. Período e local: 13 a 17 de setembro de 1999 em Gramado- Rio Grande do Sul.

XIV Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil Período e local: 17 a 20 de setembro de 1996 em Florianópolis- Santa Catarina.

X Semana das Ciências Período e local: 26 a 30 de agosto de 1991 na Faculdade de Ciências Exatas e Experimentais da Universidade Mackenzie.

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CURSOS EXTRACURRICULARES

Desenvolvimento de Biaromas. Ministrado pela Profa Dra Gláucia Maria Pastore da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Unicamp, durante a 48a Jornada Farmacêutica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP/Campus Araraquara. Carga horária: 3 horas. Farmacoterapia da dor e da inflamação: passado, presente e futuro. Ministrado pela Profa Dra Lídia Moreira, da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, durante a 48a Jornada Farmacêutica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP/Campus Araraquara. Carga horária: 9 horas. Educação ambiental. Durante o IV Simpósio e IV Reunião de Avaliação do Programa BIOTA/FAPESP (2003) e ministrado pelos professores Dra Eliana Amabili Dancini do Departamento de Estudos Sociais Básicos e Educação da UNESP/ Campus Franca-SP e Dra Maria de Lourdes Espazianni do Instituto Moura Lacerda de Ribeirão Preto- SP. Carga horária: 12 horas. Biodiversidade: um enfoque químico-biológico. Ministrado pelos professores Dr Otto R. Gottlieb e Dra Renata M. B. Borin, no programa de pós-graduação em química da Universidade Federal de São Carlos- são Paulo. Carga horária: 8 horas. Introdução a química medicinal. Durante a VIII Escola de verão em química farmacêutica e química medicinal da Faculdade de Farmácia da UFRJ. Carga horária: 16 horas. Fármacos na natureza e a procura de novos compostos protótipos em plantas. Ministrado pelo Prof Dr Kurt Hostettmann, durante a XXII Escola de verão em química no Departamento de Química do Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia da Universidade Federal de São Carlos. Carga horária: 30 horas. Estratégias racionais de desenvolvimento de novos fármacos no tratamento de doenças tropicais. Ministrado pelos professores Dr Eliezer J. Barreiro e Dra Elizabeth I. Ferreira, durante a IX Escola de verão em química farmacêutica e química medicinal da Faculdade de Farmácia da UFRJ. Carga horária: 16 horas Química forense. Ministrado pelo perito criminal Ricardo Luis Lopes, durante a XXXII Semana da Química do Instituto de Química da UNESP/Campus Araraquara. De 20 a 25 de outubro de 2002. Carga horária: 8 horas Fisiopatologia dos radicais livres. No departamento científico da FCMSCSP- São Paulo. 10 março de 1994. Carga horária: 9 horas.

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“Pagai o mal com o bem, porque o amor é vitorioso no ataque e invulnerável na defesa” Lao Tsé

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Aos meus avós maternos Ana e Basílio e paternos Maria e Álvaro (em memória).

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À medida que envelheço, presto menos atenção ao que as pessoas dizem; simplesmente observo o que fazem.

AGRADEÇO À Deus, pela vida repleta de alma.

Aos meus pais, Gabriel e Caetana de Ávila Santos, que com fé em Deus, construíram minha alma repleta de vida.

Aos meus irmãos Gabriel, Paulo e Cristina, por tudo que compartilhamos. Agradeço por terem compreendido o distanciamento (somente físico) que foi necessário para a realização de meus trabalhos de mestrado e doutorado.

À Profa Dra Dulce Helena S. Silva, por ter me orientado durante a realização desse trabalho, e por todos os bons conselhos e sugestões, as conversas que engrandecem, as exigências, ou seja, tudo aquilo que é próprio de um grande profissional e de uma grande amiga.

Aos Profs Drs do Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química da UNESP/CAr: Alberto José Cavalheiro, Vanderlan da S. Bolzani, Márcia N. Lopes, Ângela R. Araújo, Maysa Furlan (atual diretora do Instituto), Lucia M. X. Lopes, Wagner Vilegas e Ian C-Gambôa; às Profas Dras Meire R. Santiago e Raquel P. Nogueira do Departamento de Química Analítica do Instituto de Química da UNESP/CAr, ao Prof Dr Luiz Victor Sacramento da Faculdade de Farmácia da UNESP/Campus Araraquara e à Profa Dra Anne Dockeddal da UNESP/Campus Bauru, por tudo que me ensinaram em suas aulas proveitosas.

À Dra Maria Claudia M. Young e sua colaboradora Débora Agripino do Instituto Botânico de São Paulo; à Dra Maria José Gianini e sua aluna Renata B. Lemos da Faculdade de Farmácia da UNESP/CAr e à Dra Claudia do Ó Pessoa da Universidade Federal do Ceará, pela realização dos ensaios biológicos.

Ao Prof Dr Edson Rodrigues Filho, do Instituto de Química da Universidade Federal de São Carlos, pela obtenção e auxílio nas análises de alguns espectros de massas.

Ao Denis Lazzari Skiadaressis. Não há como detalhar: agradeço por tudo, em especial o amor, a dedicação e apoio emocional (incondicionais) que me ofereceu durante muitos anos. À Dra Débora Cristina B. Bérgamo, querida amiga, por toda ajuda em situações inesperadas e difíceis mas também pela alegria divida em eventos com hora marcada e sempre divertidíssimos. Com um beijo para o Arthur: "A alma é renovada ao estarmos com crianças." Fyodor Dostoiévski Às minhas queridas amigas de sempre, a jornalista Raquel Duarte Lino e a economista Selma Guedes, por me amarem tanto, mesmo com minhas inúmeras faltas.

Ao Dr Cláudio Viegas Junior por toda ajuda emocional e, porque não recordar, pela companhia em momentos agradáveis.

Aos mestres Clenilson Martins Rodrigues, Viviane Cândida da Silva e Mariana Carrara Cafêu: nos momentos difíceis é que (re)conhecemos pessoas com grande coração.

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À MSc Andréia N. de Luca, à Adriana A. Lopes e Vânia A. F. Formenton, queridas amigas da cidade de São Carlos.

Aos amigos e colegas que conheci no Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química da UNESP/CAr: Dra Renata V. da Silva, Dra Luz Margarita C. Zuleta, Dra Lourinalda Luiza D. da Silva, Prof Dr Alex H. Jeller, Profa Dra Hosana M. D. Navickiene, MSc Waldemar B. Filho, Luis Octávio Regasini, MSc Juliana J. T. Gama, MSc Otavio Flausino, MSc Marcelo Telascrea, MSc Karin Bandeira, Dr Geraldo H. da Silva, Aristeu G. Tininis, Dr Fernando José C. Carneiro, Lidiane Gaspareto, Dra Patrícia Mendonça Paulete, Dra Carmen Lucia Cardoso, Prof Dra Lidilhone Harmerski, Dr Carlos Carbonezzi, MSc Inara C. de Pascoli, MSc Jonas da S. Mota, Dr Fábio Donizete, MSc André Gonzaga, Maísa Cristina M. Monteiro, Guilherne Julião Zocolo, MSc Geralda de F. Lemes, Murilo N. Assonuna, Sara, Amanda de Rezende, Amanda Danuello com os quais compartilhei todo esse tempo de trabalho e, com isso, aprendi muito sobre “coisas de química” e “coisas da vida” – as boas e as não tão boas...

Aos alunos de Iniciação Científica Rene F. B. Gonçalves e Rosilene C. R. Burgos (Instituto de Química, UNESP/CAr), Renata B. Lemos e Fabiana Garcia Minucelli (Faculdade de Farmácia, UNESP/CAr) e Daniela Cristina Bomfim (Ciências Biológicas, UNIARA) por terem aceitado que eu ensinasse o que aprendi.

Ao Marcelo Furlan Shoubeck (Faculdade de Farmácia, UNESP/CAr), também aluno de Iniciação Científica, pela colaboração em parte do trabalho experimental.

Aos funcionários e amigos do Instituto de Química da UNESP/Campus Araraquara: Dr Nivaldo Boralle, Dr Alberto C. Alécio, Helia R. S. Rafael, Elaine de Fátima G. Jardim, MSc Ana Lúcia M. Nasser, Marcos Antônio Alves, Mario Cilense Jr. e Márcia Lara R. Ferreira, pelo auxílio na realização de experimentos e obtenção de dados espectrométricos.

Aos funcionários da biblioteca e da seção de pós graduação do Instituto de Química da UNESP/CAr Valéria A. Novelli, Priscila C. B. Vicentini, Cátia A. Bryan, Vilma D. Coutinho, Patrícia R. de Matos, Vilma A. Pestana, Izolina A. Fachini, Sandra R. Pavanelli, Fernando C. Valderrama, Célia M. C. V. Coelho pela eficiência no cumprimento de seus compromissos com os alunos do Instituto e pela simpatia, qualidades extraordinárias nos serviços públicos.

À FAPESP, pela bolsa concedida e apoio financeiro ao projeto.

À CAPES e CNPq pelo apoio financeiro.

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ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

CC Cromatografia em coluna CCDC Cromatografia em camada delgada comparativa CCDP Cromatografia em Camada Delgada Preparativa CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência d Dubleto dd Duplo dubleto dq Duplo quadrupleto ddt Duplo duplo tripleto dt Duplo tripleto DPPH 2,2- difenil-picrilhidrazila δ Unidade de deslocamento químico J Constante de acoplamento m Multipleto MeOH Metanol nm Nanometros RMN Ressonância Magnética Nuclear Si Sílica sl Singleto largo t Tripleto

Rf Fator de retenção tR Tempo de retenção IV Infravermelho DAD Diodo Array Detector UV Ultra Violeta EM Espectrometria de Massas nBuOH Butanol AcOEt Acetato de Etila Hex Hexanos Extr. Extrato RP 18 Sílcia de fase reversa C18 CRC Cromatografia Rápida em Coluna IsopOH Isopropanol FAc Fase acetato de etila FBu Fase butanólica

FCHCl3 Fase clorofórmica

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FH Fase hexânica FAq Fase aquosa (g) Galhos (f) Folhas EM-ES Espectrometria de massas com ionização por electrospray M Multiplicidade

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SUMÁRIO

1- INTROCUÇÃO...... 27 1.1- Plantas medicinais e a importância dos produtos naturais...... 27 1.2- Produtos naturais no Brasil – breve histórico...... 32 1.3- Rosaceae...... 36 1.3.1- Aspectos botânico, químico, etnofarmacológico...... 36 1.3.2- O gênero Prunus...... 45 1.3.3- Prunus myrtifolia ...... 54 1.4- Considerações sobre a importância farmacológica e biossíntese de classes de substâncias isoladas de Prunus myrtifolia...... 58 1.4.1- Glicosídeos cianogênicos ...... 58 1.4.2- Substâncias fenólicas...... 66 1.4.3- Terpenóides ...... 71 1.5- Desreplicação- técnicas hifenadas em estudos de bioprospecção ...... 77 2- OBJETIVOS GERAIS...... 80 3- EXPERIMENTAL...... 81 3.1- Materiais e métodos...... 81 3.2- Testes químicos e biológicos realizados...... 82 3.2.1- Cultura de Saccharomyces cerevisiae - detecção de atividade citotóxica...... 82 3.2.2- Bioautografia com Cladosporium - detecção de atividade antifúngica...... 82 3.2.3- Autografia em CCD com β-caroteno - detecção de atividade antioxidante...... 83 3.2.4- Teste para detecção de atividade antimicrobiana e antifúngica ...... 84 3.2.5- Teste de viabilidade celular para detecção de atividade antitumoral...... 84 3.2.6- Teste com DPPH - detecção do potencial seqüestrador de radicais livres...... 85 3.3 - Estudo fitoquímico guiado por ensaios químicos e biológicos...... 86 3.4 - Coleta de material vegetal e obtenção de extratos...... 87

4- RESULTADOS E DISCUSSÃO...... 115 4.1- Substâncias isoladas de folhas e galhos de Prunus myrtifolia ...... 115 4.2-Determinação estrutural e identificação das substâncias isoladas ...... 119 4.2.1- Esteróides...... 120 4.2.2- Terpenóides...... 122

4.2.3- Derivados C6-C1...... 132

4.2.4- Derivados C6-C2 e C6-C3...... 136 4.2.5- Glicosídeos cianogênicos...... 146

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4.2.6- Flavonóis...... 149 4.3- Desreplicação...... 157 4.4- Resultados de ensaios químicos e biológicos...... 178 5- CONCLUSÃO...... 183 6- REFERÊNCIAS ...... 185

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1- Estruturas de algumas substâncias bioativas extraídas de plantas...... 27 Figura 2- Flavonóides tetraglicosilados com atividade antiúlcera isolados de Maitenus 28 ilicifolia...... Figura 3- Flavonóides com atividade ansiolítica isoladas de Valeriana officinalis...... 29 Figura 4- Substâncias cardiotônicas e hipotensivas isoladas de Ginko biloba...... 29 Figura 5- Estruturas moleculares complexas de substâncias bioativas de plantas...... 30 Figura 6- Substâncias com atividade antimalárica isoladas de plantas...... 31 Figura 7- Fotos de espécies do gênero Rubus utilizadas na medicina popular...... 41 Figura 8- Espécies de Rosa...... 41 Figura 9- Substâncias isoladas de Pyrus ussuriensis com atividade antibacteriana 42 frente a Erwinia amylovora...... Figura 10- Fotos de Sanguisorba officinalis e Crataegos pinnatifida...... 42 Figura 11- Triterpenóides com atividade citotóxica...... 43 Figura 12- Estruturas moleculares de substâncias antitumorais de Prunus jamasakura...... 49 Figura 13- Fotos de Prunus myrtifolia...... 55 Figura 14- Substâncias isoladas de folhas e frutos de Prunus myrtifolia em trabalho anterior. 57 Figura 15- Estruturas moleculares de glicosídeos cianogênicos encontrados em alimentos vegetais...... 60 Figura 16- Reações envolvidas na biossíntese de glicosídeos cianogênicos...... 65 Figura 17- Estruturas moleculares de algumas substâncias fenólicas derivadas dos ácidos benzóico e cinâmico...... 67 Figura 18- Flavonóides isolados de Silybum marianum, com atividade hepatoprotetora...... 70 Figura 19- Triterpenos de esqueleto lanostano isolados do fungo Fomitopsis pinicola com atividade inibitória para COx-2...... 71 Figura 20- Ácido oleanólico e derivados...... 72 Figura 21- Biossíntese de isoprenóides...... 74 Figura 22- Biossíntese de triterpenos...... 76 Figura 23- Fluxograma do fracionamento cromatográfico do extrato etanólico dos folhas de Prunus myrtifolia [(Extr. EtOH)]...... 88 Figura 24- Fluxograma do fracionamento cromatográfico do extrato etanólico dos galhos de Prunus myrtifolia [Extr. EtOH (g)]...... 89 Figura 25 - Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase hexânica de partição do extrato etanólico das folhas [FH(f)]...... 92 Figura 26 - Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase hexânica de partição do extrato etanólico das folhas [FH(g)]...... 93

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Figura 27- Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase clorofórmica de partição do extrato etanólico das folhas [FCHCl3(f)]...... 94 Figura 28- Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase clorofórmica de partição do extrato etanólico dos galhos [FCHCl3(g)]...... 95 Figura 29 - Cromatograma obtido através de CLAE-UV para a subfração FCHCl3(g)-28.2...... 97 Figura 30- Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase acetato de etila de partição do extrato etanólico das folhas [FAc(f)]...... 97 Figura 31 - Cromatogramas em CLAE fase reversa para a fração FAc(f)-6 e as subfrações FAc(f)-6.1 e FAc(f)-6.3...... 99 Figura 32 - Cromatogramas em CLAE fase reversa para a fração FAc(f)-11 e as subfrações FAc(f)-11.1, FAc(f)-11.4 e FAc(f)-11.5 (d)...... 99 Figura 33- Cromatogramas em CLAE-UV fase reversa para a subfração FAc(f)-18.2...... 100 Figura 34 - Cromatogramas em CLAE-UV fase reversa para as subfrações Fac(f)-20.1, Fac(f)-20.3, Fac(f)-20.4, Fac(f)-20.6 e Fac(f)-20.8...... 101 Figura 35 - Cromatogramas em CLAE-UV fase reversa para as subfrações Fac(f)-20.8, Fac(f)-20.14, Fac(f)-20.16, Fac(f)-20.18 e Fac(f)-20.20...... 101 Figura 36- Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase acetato de etila de partição do extrato etanólico dos galhos [Fac(g)]...... 102 Figura 37- Cromatograma obtido através de CLAE-UV fase reversa preparativo para FAc(g)- 4...... 103 Figura 38- Cromatograma em CLAE-UV fase reversa preparativo para FAc(g)-4.4...... 103 Figura 39 - Cromatograma em CLAE-UV analítico para a fração FAc(g)-8...... 104 Figura 40 - Fluxograma de fracionamento da fração FAc(g)-8...... 104 Figura 41- Cromatogramas em CLAE-UV fase reversa analítico para FAc(g)-8.2, FAc(g)-8.10 e FAc(g)-8.16...... 105 Figura 42 - Cromatogramas em CLAE fase reversa analítico para as subfrações FAc(g)- 8.10.1 e FAc(g)-8.10.2...... 106 Figura 43 - Cromatogramas obtidos através de CLAE fase reversa analítico para as subfrações FAc(g)-8.10.2a (a) e FAc(g)-8.10.2b (b)...... 106 Figura 44 - Cromatograma obtido através de CLAE-UV fase reversa preparativo para a fração FAcOEt(g)-14...... 107 Figura 45- Fluxograma de fracionamento cromatográfico da fase butanólica de partição do extrato etanólico de folhas [FBu(f)]...... 108 Figura 46 - Cromatograma obtido através de CLAE-UV analítico para FBu(f)-4...... 109

19

Figura 47 - Cromatograma analítico obtido através de CLAE-UVfase reversa para a fração FBuOH(f)-9...... 109 ...... Figura 48- Cromatogramas em CLAE-UV fase reversa para as subfrações FBu(f)-9.5, FBu(f)-9.6 (b) eFBu(f)-9.7...... 109 ...... Figura 49 - Sobreposição de cromatogramas em CLAE-UV para as subfrações FBu(f)-12.1 e FBu(f)-12.2...... 110 Figura 50- Fluxograma de fracionamento cromatográfico da fase butanólica de partição do extrato etanólico de galhos [FBu(g)]...... 111 Figura 51- Cromatograma obtido através de CLAE-UV para FBu(g)-4...... 111 Figura 52- Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase aquosa de partição do extrato etanólico das folhas [Faq(f)]...... 112 Figura 53- Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase aquosa de partição do extrato etanólico das galhos [FAq(g)]...... 113 Figura 54- Cromatogramas obtidos através de CLAE-UV para FAq(f)-1:9 e FAq(g)-1:9...... 113 Figura 55- Cromatogramas obtidos em CLAE fase reversa analítico para as subfrações obtidas a partir de Faq(f)-1:9, Faq(f)-1:9.2, Faq(f)-1:9.4 e Faq(f)-1:9.5...... 114 Figura 56- Cromatogramas em CG para as frações FH(f)-22.1 e FH(g)-23.3...... 121 Figura 57 - Correlações observadas no mapa de contorno gHMBC da substância 30...... 135 Figura 58- Algumas correlações no mapa de contorno gHMBC da substância 13...... 137 Figura 59- Espectros de massas obtidos para a substância 13...... 137 Figura 60- Correlações observadas no mapa de contorno gHMBC, da substância 15...... 140 Figura 61- Espectros de massas da substância 15...... 141 Figura 62- Fragmentações observadas no espectro de massas da substância 15...... 141 Figura 63- Espectros de massas da substância 14...... 144 Figura 64 - Espectro de massas da substância 23...... 146 Figura 65- Algumas correlações observadas no mapa de contorno gHMBC da fração FAc(g)- 4.4b...... 148 Figura 66 - Espectro de massas obtido para as substâncias 11 e 12...... 148 Figura 67 - Espectros de massas da substância 16...... 151 Figura 68 - Espectros de massas da substância 17...... 152 Figura 69- Espectros de UV das substâncias 16, 17 e 18...... 154 Figura 70- Espectros de massas da fração FBu(f)-12.1...... 158 Figura 71- Cromatogramas obtidos através de CLAE-UV para as frações FBu(f)-9 e FBu(f)- 12.1...... 159

20

Figura 72- Cromatogramas obtidos através de CLAE-UV para as frações FBu(f)-9, FAc(f)- 20.20 e FAc(f)-18.2...... 160 Figura 73- Espectros de massas obtidos para as frações FAc(f)-18.2 (a) e FAc(f)-20.20...... 161 Figura 74- Cromatogramas obtidos via CLAE fase reversa para as subfrações Fac(f)-20.1 (subst. 15), Fac(f)-20.3, Fac(f)-20.4, Fac(f)-20.6 e Fac(f)-20.8...... 162 Figura 75- Comparação dos cromatogramas obtidos através de CLAE-UV para as subfrações FAc(f)-20.4, FAc(g)-4.4 e FAc(f)-18.2 (substância 21)...... 163 Figura 76 - Comparação dos cromatogramas através de CLAE-UV obtidos para: (a) subfração FAc(f)-28...... 164 Figura 77 - (a) cromatograma obtido em CLAE-UV para a fração FAc(g)-8...... 165 Figura 78 - cromatogramas e espectros de UV obtidos em CLAE-UV para FAC(g)-8 e para as substâncias 14 e 16...... 166 Figura 79 - Cromatogramas obtidos para a fração FAc(g)-8 e as subfrações FAc(g)-8.2 e FAc(g)-8.10...... 166 Figura 80- Espectros de massas obtidos para a fração FAc(g)-8.2...... 167 Figura 81 - Íons característicos observados no espectro de massas da substância 26...... 168 Figura 82 - Íons característicos observados no espectro de massas da substância 27.... 169 Figura 83 - Cromatogramas obtidos via CLAE-UV para as subfrações FAc(g)-8.10.1, FAc(g)- 8.10.2 e FAc(g)-8.10.3...... 170 Figura 84- Espectros de massas obtidos através de CLAE-EM para a fração FAc(g)-8.10...... 171 Figura 85 - Comparação dos cromatogramas de CLAE-UV da subfração FBu(f)-9.5;FBu(f)- 9.7, Fac(g)-8.15; Fac(g)-8.16 e Fac(g)-8.17...... 172 Figura 86- Cromatogramas obtidos através de CLAE-UV para as frações FAq(f)-1:9 e FAq(g)- 1:9...... 173 Figura 87 - Cromatogramas obtidos através de CLAE-UV para as frações FAq(f)-1:9, FAq(f)- 8:2, FAq(f)-1:1, e FBu(f)-9...... 174 Figura 88- Fotografia de amostras das frações FAq(f)-4:6 e FBu(g)-19...... 174 Figura 89- Cromatogramas obtidos para FAq(f)-1:9 e FAq(g)-2:8...... 174 Figura-90 Cromatogramas obtidos para FAq(g)-2:8, FAq(g)-3:7 e FAq(g)-10:0...... 175 Figura 91- Cromatogramas obtidos para subst. 13, subst. 18, subst.14 e frações FBu(f)-4, FBu(f)-3 e FBu(f)-2...... 175 Figura 92 - Cromatogramas obtidos para FBu(g)-1, FBu(g)-4 e FBu(g)-15, FBu(g)-19 e FBu(g)-final...... 176 Figura 93 - Cromatogramas obtidos através de CLAE-UV para FAq(g)-1:9, subst. 13, FAc(g)-8 e FBu(g)-4...... 177 Figura 94- Atividade seqüestradora de radicais livres das substâncias 16- 19 (DPPH). 182

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Figura 95- Atividade seqüestradora de radicais livres das substâncias 16, 21 e 22 (DPPH). 182

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1- Teor de taninos e porcentagem de inibição de elastase em Rosaceae...... 39 Tabela 2- Nomes científico e popular de espécies de Prunus...... 46 Tabela 3- Espécies de *Prunus utilizadas em formulações patenteadas...... 51 Tabela 4- Vegetais comestíveis que contêm glicosídeos cianogênicos...... 61 Tabela 5- Classificação de substâncias fenólicas...... 67 Tabela 6- Etapas enzimáticas da biossíntese de terpenóides...... 75 Tabela 7- Resultados dos ensaios realizados com os extratos de P. myrtifolia...... 87 Tabela 8- Extratos de galhos e folhas de P. myrtifolia e fases de partição...... 87 Tabela 9- Resultados obtidos com o bioensaio para detecção de atividade antifúngica para as frações F. Hex(f), F. Hex(g), F. CHCl3(f) e F. CHCl3(g)...... 90 Tabela 10- Resultados obtidos com o bioensaio para detecção de atividade citotóxica para as fases de partição dos extratos de P. myrtifolia...... 90 Tabela 11- Resultados obtidos com teste para detecção de atividade antitumoral...... 90 Tabela 12- Frações obtidas a partir do fracionamento cromatográfico de[FH(f)]...... 92 Tabela 13- Frações obtidas a partir do fracionamento cromatográfico de [FH(g)]...... 93

Tabela 14- Frações obtidas a partir do fracionamento de [FCHCl3(f)] e atividades antioxidantes observadas...... 95

Tabela 15- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FCHCl3(g) e atividade antioxidante...... 96

Tabela 16- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FCHCl3(g)-28...... 96 Tabela 17- Frações obtidas a partir do fracionamento cromatográfico de FAc(f) e atividade antioxidante observada...... 98 Tabela 18- Frações obtidas a partir do fracionamento cromatográfico de FAc(f)-6 e atividade antioxidante observada...... 98 Tabela 19- Frações obtidas a partir do fracionamento cromatográfico de FAc(f)-11 e atividade antioxidante observada...... 98 Tabela 20- Frações obtidas a partir do fracionamento cromatográfico de FAc(f)-18 e atividade antioxidante observada...... 100 Tabela 21- Frações obtidas a partir do fracionamento cromatográfico de FAc(f)-20 e atividade antioxidante observada...... 100 Tabela 22- Frações obtidas a partir do fracionamento cromatográfico de FAc(g) e atividade antioxidante observada...... 102

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Tabela 23- Frações obtidas a partir do fracionamento cromatográfico de FAc(g)-8 e atividade antioxidante observada...... 105 Tabela 24- Frações obtidas a partir do fracionamento cromatográfico de FAc(g)-8.10 e atividade antioxidante observada...... 105 Tabela 25- Frações obtidas a partir do fracionamento cromatográfico de FAc(g)-14 e atividade antioxidante observada...... 107 Tabela 26- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FBu(f) e atividade antioxidante observada...... 109 Tabela 27- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FBu(f)-9 e atividade antioxidante observada...... 110 Tabela 28- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FBu(f)-12 e atividade antioxidante observada...... 110 Tabela 29- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FBu(g) antioxidante observada...... 111 Tabela 30- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FAq(f) e atividade antioxidante observada...... 112 Tabela 31- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FAq(g) e atividade antioxidante observada...... 113 Tabela 32- Dados de RMN de 13C das substâncias 4 e 5...... 124 Tabela 33- Dados de RMN de 13C das substâncias 6 e 7...... 126 Tabela 34- Alguns dados de RMN de 1H para a substância 8...... 128 Tabela 35- Dados de RMN de 13C para a substância 8...... 128 Tabela 36- Dados de RMN das substâncias 28 e 29...... 130 Tabela 37- Dados de RMN da substância 9...... 131 Tabela 38- Dados de RMN da substância 10...... 132 Tabela 39 - Dados de RMN obtidos e os relatados na literatura para a substância 31...... 133 Tabela 40- Dados de RMN da substância 30...... 135 Tabela 41- Dados de RMN da substância 13...... 138 Tabela 42- Dados de RMN da substância 15...... 140 Tabela 43- Dados de RMN da substância 14...... 143 Tabela 44- Dados de RMN da substância 23...... 145 Tabela 45- Dados de RMN de 1H e 13C para as substâncias 11 e 12...... 148 Tabela 46- Dados de RMN de 1H e 13C da substância 16...... 150 Tabela 47- Dados de RMN de 1H e 13C da substância 17...... 152 Tabela 48- Dados de RMN de 1H e 13C da substância 18...... 154 Tabela 49- Dados de RMN de 1H e 13C para a substância 19...... 156

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Tabela 50- Resultados obtidos com o bioensaio para detecção de atividade antifúngica para linhagens de Cladosporium...... 178 Tabela 51- Resultados obtidos com o bioensaio para detecção de atividade antifúngica para linhagens de Candida...... 179 Tabela 52- Resultados obtidos com o bioensaio para detecção de atividade citotóxica...... 180 Tabela 53 – Atividade antitumoral de substâncias e frações obtidos a partir de extratos de Prunus myrtifolia...... 181

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RESUMO

O presente trabalho descreve o estudo químico das folhas e galhos de Prunus myrtifolia (L.) Urban (Rosaceae), exemplar coletado na Fazenda Campininha em São Paulo – SP. A química do gênero Prunus é determinada pela ocorrência de glicosídeos cianogênicos , terpenóides, flavonóides e outras substâncias fenólicas. Os extratos obtidos a partir de folhas e galhos de P. myrtifolia foram fracionados através de técnicas cromatográficas diversas que forneceram 31 substâncias, sendo 3 consideradas inéditas. Suas estruturas foram determinadas através de dados espectrométricos (RMN, EM, UV, entre outros), bem como através da utilização de técnicas hifenadas tais como CLAE-UV e CLAE-EM. O fracionamento cromatográfico guiado por testes químicos demonstrou o potencial de atividade antioxidante de flavonóides e arilpropanóides isolados de folhas e galhos de P. myrtifolia. A mistura de esteróides estigmasterol e sitosterol apresentou atividade antifúngica moderada frente a fungos fitopatógenos do gênero Cladosporium enquanto que os glicosídeos cianogênicos prunasina e durrina, além do ácido prunasínico apresentaram atividade antifúngica contra Cândida krusei e C. Albicans. A atividade citotóxica para Sacharomyces cerevisea apresentada pelos extratos brutos não foi mais observada após os procedimentos de fracionamento cromatográfico. Entretanto, a mistura de triterpenos pentacíclicos triidroxilados obtida a partir do extrato etanólico de galhos, apresentou atividade antitumoral para células de câncer de cólon, de mama e do sistema nervoso central humano. Os resultados obtidos com esse estudo químico corroboram dados da literatura sobre Prunus e Rosaceae e poderão contribuir com estudos de quimiossistemática.

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ABSTRACT

This work reports the results from chemical study of leaves and branches of Prunus myrtifolia (L.) Urban. (Rosaceae), collected at Fazenda Campininha, São Paulo. The chemistry of genus Prunus is determined by occurrence of cyanogenic glicosides, terpenoids, flavonoids and other phenolic compounds. Ethanolic extracts obtained from leaves and branches of Prunus myrtifolia were fractionated through chromatographic methods that led to the isolation of 28 compounds wich were previously descibed and 3 additional new compounds. Their structures were determined by spectrscopic data (NMR, MS, UV, etc), and also by the use of hyphenated technics (HPLC_UV and HPLC-MS). The fractionation guided by chemical and biological assays demonstrated the atioxidant activity of 6 flavonoids, arilpropanoid derivatives and other isolates from leaves and branches of P. myrtifolia. The mixture of steroids stigmasterol and sitosterol obtained showed moderate activity against phytopatogenic fungus of genus Cladosporium and the cyanogenic glycosides prunasin and dhurrin, and prunasinic acid showed antifungal activity against human Candida pathogens. The cytotoxic activity against Sacharomyces cereviseae presented for crude ethanol extracts were not observed anymore after the chromatograpic frationation procedures, although the trihydroxylated triterpenoids obtained from branches ethanol extract inhibited growth of colon, breast and CNS human cancer cells. Additionally, the results obtained with this work corroborate chemical data about genus Prunus and Rosaceae and therefore contribute with chemosystematic studies.

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No mistério do sem-fim equilibra-se um planeta.

E, no planeta, um jardim, e, no jardim, um canteiro; no canteiro uma violeta, e, sobre ela, o dia inteiro, entre o planeta e o sem-fim, a asa de uma borboleta.

Cecília Meireles

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1- INTRODUÇÃO

1.1- PLANTAS MEDICINAIS E A IMPORTÂNCIA DOS PRODUTOS NATURAIS

O uso de plantas medicinais pelo Homem para o alívio ou combate a muitas doenças data de cerca de cinco milênios em documentos escritos por antigas civilizações da China e da Índia e ainda hoje, em muitas regiões do mundo, as plantas são a única fonte de obtenção de medicamentos para muitas populações [Hamburger & Hostettmann, 1991]. São xaropes, tinturas, infusões, óleos essenciais e outras formulações vegetais contendo substâncias ativas e muitas outras substâncias que, embora não apresentem atividade definida para determinada enfermidade, podem potencializar a ação das substâncias ativas, promovendo o processo de sinergismo. Depois de séculos de uso empírico de preparados de ervas, o isolamento de princípios ativos de plantas - alcalóides como a morfina, estricnina, quinina no início do século 19, marcou nova era na utilização de plantas medicinais e o início da pesquisa moderna em química de produtos naturais. O isolamento do ácido acetilsalicílico a partir das folhas do salgueiro (Salix alba) é um outro exemplo importante (Figura 1).

H N H CH 3 H N HO H N H3CO H HO NO

O N O OH quinina morfina estricnina

O

OCH3

O

ácido acetilsalicílico

Figura 1- Estruturas de algumas substâncias bioativas extraídas de plantas.

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As plantas produzem centenas de micromoléculas para a sua defesa, regulação e adaptação, sendo portanto, biologicamente ativas. Muitas substâncias produzidas por plantas, possuem atividade contra insetos, fungos, bactérias, patógenos em geral, como uma forma de defesa principalmente nos ambientes tropicais e equatoriais onde a biodiversidade de microorganismos e insetos é muito grande. São estas substâncias que o Homem aprendeu a utilizar como medicamento desde os tempos remotos e que têm despertado o interesse da indústria farmacêutica nos dias atuais [O’Neill, Lewis, 1993]. Esse interesse é movido, principalmente, pelo fato de que, nos últimos quinze anos, houve grande aumento do consumo de plantas medicinais e da procura por terapias alternativas no tratamento de doenças, inclusive em países desenvolvidos da Europa e Estados Unidos [Borman, 1999]. A atividade antiúlcera atribuída aos flavonóides tetraglicosilados encontrados em extratos de Maytenus ilicifolia e M. aquifolium (Celastraceae) é frequentemente relatada (Figura 2) [Corsino et al., 2003; Vilegas et al.,1999; Leite et al., 2001]. Cápsulas contendo extrato seco de M. ilicifolia são comercializadas e utilizadas nos dias atuais como tratamento alternativo contra úlceras no trato digestório.

R = OH R = H

Figura 2- Flavonóides tetraglicosilados com atividade antiúlcera isolados de Maitenus ilicifolia.

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Outros dois exemplos bastante interessantes do uso de extratos de plantas comercializados em cápsulas como medicamento são o de Gingko biloba e Valeriana officinalis, utilizadas como hipotensivo e ansiolítico, respectivamente [Fernandez, 2004; Jezova, 2002]. Entre os diversos estudos químicos relatados na literatura sobre essas espécies vegetais medicinais encontram-se os trabalhos de Fernandez e Koch [Fernandez et al., 2004; Koch, 2005] que mostram a presença dos flavonóides 6-metil-apigenina e hesperidina com atividade ansiolítica em Valeriana officinalis e dos flavonóis quercetina, kaempferol e isoramnetina, além do ginkgolídeo bilobalídeo com atividades cardiotônica e hipotensiva em Ginkgo biloba (Figuras 3 e 4) .

OH OH

OCH3 OH

ram glicO O HO O

CH3O

OH O OH O hesperidina 6-metil-apigenina

Figura 3- Flavonóides com atividade ansiolítica isoladas de Valeriana officinalis.

OH OH OH HO O HO O

CH OOH OH 3 OH O OH O quercetina OCH3 kaempferol OH

HO O H O O O O OH O OH O O OH iso-ramnetina OH CH3 CH . CH3 3 bilobalídeo

Figura 4- Substâncias cardiotônicas e hipotensivas isoladas de Ginko biloba

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A eficácia dos assim conhecidos fitoterápicos têm sido demonstrada em estudos que utilizam os mesmos procedimentos científicos aplicados à avaliação de drogas sintéticas. Além dos fitoterápicos, substâncias isoladas de plantas são, há muito tempo, utilizadas como medicamentos alopáticos ou como produto de partida para a síntese de análogos. Algumas drogas assim obtidas mostram-se bastante eficientes no tratamento do câncer, que ainda é uma das principais causas de morte, sendo responsável por cerca de 5 milhões de óbitos por ano em todo o mundo, segundo estimativa da Organização Mundial da Saúde (OMS) [Pisani et al., 1999]. São exemplos desses medicamentos a vinblastina (Velban®) e a vincristina (Oncovin®), utilizadas no tratamento de leucemia infantil, o derivado da podofilotoxina, etoposídeo (VP-16-213;Vepesid®); paclitaxel (Taxol®), e mais recentemente os derivados da camptotecina Irinotecan® e Topotecan®. A complexidade estrutural dessas substâncias (Figura 5) evidencia a importância dos produtos naturais como fonte de moléculas protótipos para novos fármacos, uma vez que o número de etapas envolvidas na síntese completa de algumas delas torna-se inviável para a indústria.

paclitaxel

0

R

R = CH3 vinblastina R = CHO vincristina

Figura 5- Estruturas moleculares complexas de substâncias bioativas isoladas de plantas.

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Outra doença muito comum em países subdesenvolvidos é a malária, que tem sido atualmente combatida com fármacos obtidos a partir da modificação estrutural de substâncias com esqueleto quinolínico isoladas de plantas. São exemplos a quinina, a cloroquina e a primaquina (Figura 6) [Weiss, 2000; Steele, 1999; Foley, 1998].

H

H NC2H5 H HO CH C2H5 NH 3 CH O N 3 H

N Cl N

quinina cloroquina

CH3 H NCH(CH2)NH2 N

CH O 3 primaquina

Figura 6- Substâncias com atividade antimalárica isoladas de plantas.

Conclui-se, portanto, que muitas substâncias oriundas de plantas são, ainda hoje, de grande valor social e econômico no que diz respeito à obtenção de fitoterápicos e de novas drogas alopáticas para o tratamento de inúmeras enfermidades. Muitas pessoas em todo o mundo ainda utilizam plantas medicinais em preparados caseiros (garrafadas) e, considerando-se esse fato, torna-se cada vez mais necessário o conhecimento do potencial de atividade biológica das substâncias isoladas de plantas bem como, em muitos casos, do perigo que podem oferecer à saúde quando utilizadas de maneira aleatória e inadequada. A importância de produtos naturais entretanto, vai além de sua utilização na medicina como descrito acima, e alcança vastos campos de aplicação que os torna uma vez mais, importantes fontes de comercialização, agregando valores econômicos cada vez maiores aos produtos finais que os contém

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(nutracêuticos, cosmecêuticos, agrocêuticos). As plantas fornecem milhares de substâncias que podem ser utilizadas como fragrâncias, alimentos e/ou flavorizantes, bebidas, fibras, corantes, materiais para a construção civil, biocidas e reguladores do crescimento de outras plantas, ou seja, uma infinidade de aplicações.

1.2- PRODUTOS NATURAIS NO BRASIL - BREVE HISTÓRICO

Diz se que o estudo da química de produtos naturais no Brasil teve seu início quando Portugal começou a perder suas fontes de especiarias na Índia e outras regiões da Ásia, que foram passando para as mãos dos ingleses e holandeses. Desbravadores portugueses iniciam então a corrida às especiarias do sertão do Brasil: canela, baunilha, cravo, anil, raízes aromáticas, urucum, salsa, sementes oleaginosas, madeiras e ervas medicinais. Além dos medicamentos utilizados na terapêutica vale ressaltar também extrato obtido do tronco da árvore pau-brasil (Caesalpinia echinata), constituído majoritariamente pelo flavonóide brasilina e seu derivado oxidado, a brasileína, o principal produto de exportação da colônia durante mais de dois séculos [Pinto, 1995].

HO O HO O H OH

H

HO OH HO O

Brasilina Brasileína

A vinda da Corte Real para o Brasil em 1808 e o decreto de D. João VI que abriu os portos brasileiros às nações amigas pode ser considerado como marco histórico oficial na ciência brasileira, porque foi a partir deste decreto que começaram a chegar ao país as primeiras expedições científicas, cujo principal objetivo era dar conhecimento aos europeus da exuberância de nossa fauna e flora. Pero de Magalhães Gândavo escreveu “História da Província de Santa

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Cruz” em 1576 e Gabriel Soares de Souza, em 1587, escreveu “Tratado descritivo do Brasil”, referindo-se aos produtos medicinais usados pelos índios como “árvores e ervas da virtude”. A maioria dos naturalistas destas expedições vieram com a incumbência de coletar espécies de animais e de plantas para os museus europeus. Não se pode deixar de mencionar, entretanto, que a Europa já tinha conhecimento, há muito tempo, de plantas medicinais brasileiras, através da obra “Historia Naturalis Brasiliae” [Willem, 1648]. Em uma das expedições científicas vieram o médico Carl Friederich von Martius e o zoólogo Johann Baptist Spix, dois dos inicadores do estudo sistemático da flora e da fauna brasileiras. Martius teve implicação direta com o início da fitoquímica brasileira, porque foi por sugestão dele que o farmacêutico Theodor Peckolt, em 1847, veio para o Brasil para estudar a flora. Pelo trabalho realizado, Peckolt pode ser considerado o pai da fitoquímica brasileira, além de ser o patriarca de uma família de cientistas notáveis que se dedicaram ao estudo das plantas brasileiras [Pinto et al., 2002]. Ainda no século XIX algumas instituições de ensino como a Faculdade de Medicina do Rio de Janeiro foram fundadas e tornaram-se pioneiras no estudo da química de produtos naturais no Brasil.

Já no século XX, em 1916, foi criada a Academia Brasileira de Ciências; e na década de 20, ocorreu a criação de 8 cursos de química industrial anexos a instituições técnicas já existentes, além da fundação das primeiras Sociedades Científicas, como por exemplo a Sociedade Brasileira de Química (SBQ). E ao longo das últimas décadas observa-se que a realização de estudos com plantas, insetos, fungos e organismos marinhos no Brasil vem crescendo exponencialmente [Pinto et al., 2002], graças ao aprimoramento de pesquisas com produtos naturais realizadas na interface com outras áreas da ciência como a biologia, a botânica, a ecologia, a farmacologia e a medicina.

O Brasil possui hoje cerca de 10% de todos os organismos descritos e aproximadamente 22% de todas as Angiospermae, distribuídas principalmente nas regiões Amazônica, Mata Atlântica e Cerrado, e é detentor de uma flora riquíssima, considerada uma fonte imensa de metabólitos especiais de

34 interesse [Gottlieb et al., 1996], que podem ser utilizados para diferentes aplicações.

As pesquisas atuais desenvolvidas com espécies da flora brasileira na busca por novas substâncias com atividades biológicas contam com o apoio do NCI (Instituto Nacional do Câncer - EUA), OMS (Organização Mundial da Saúde) e o Ministério da Saúde. Essa parceria torna-se importante no momento atual, quando a idéia de modificação genética de plantas para a produção de substâncias de interesse necessita de equipamentos modernos, novas técnicas e ensaios biológicos práticos, eficientes e de baixo custo. Nesse contexto, a química de produtos naturais, juntamente com a biologia molecular têm papel importante no isolamento e caracterização de enzimas, proteínas e micromoléculas relacionadas, que são a base da pesquisa proteômica, cujo objetivo final é elucidar a rede regulatória e sinalizadora da organização e da dinâmica metabólica pela qual a vida das células - inclusive as vegetais - é processada [Meinke, 1998].

Em futuro próximo, o Homem poderá ter ao seu dispor as “biofábricas vegetais” no que será conhecido como setor agrocêutico, onde cultivares de mamão e bananas geneticamente modificadas substituirão as fábricas de vacinas e um vegetal que per si não é comestível pode se tornar um alimento importante na nossa dieta. Conhecer a química dos vegetais comestíveis é igualmente importante nos dias atuais- e também no futuro, especialmente no que concerne a constituição química de órgãos como frutos e sementes que, consumidos in natura ou industrializados e comercializados sob a forma de cápsulas, purês (pastas) ou óleos, recebem a conotação de “alimento funcional” ou nutracêutico, termos freqüentes na literatura fitoquímica atual, associados a espécies vegetais comestíveis que, além do valor nutricional, apresentam propriedades quimiopreventivas. A complexa e completa constituição química da “ameixa preta” (frutos de Prunus domestica) permite conceituá-la como um nutracêutico e é um bom exemplo de alimento funcional indispensável na dieta do indivíduo que pretende, antes de tudo, a prevenção de doenças.

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Consumidos “in natura”, na forma de suco ou como pasta, os frutos de P. domestica provêm porcentagens apreciáveis de água, carboidratos, proteínas, açúcares, gorduras, fibras, ácidos aminados, sais minerais, vitaminas, carotenóides e ácidos orgânicos como os ácidos málico e quínico [Sapuntzakis et al., 2001], que desempenham papel importante no bom funcionamento do Prunus domestica organismo como um todo. Finalmente, a presença de substâncias fenólicas como os ácidos clorogênico, neo-clorogênico, cafeico e cumárico, juntamente com uma série de flavonóides glicosilados [Sapuntzakis et al., 2001], conferem a esse alimento a acentuada propriedade de proteger as membranas celulares e de organelas importantes presentes nos vários sistemas biológicos, contra a ação deletéria de radicais livres e espécies reativas de oxigênio, envolvidas nos processos que levam a doenças como arterosclerose e câncer. Esse conhecimento torna-se cada dia mais importante nas civilizações ocidentais que, ao longo dos anos, relegou a segundo plano o hábito de consumo de produtos não industrializados como os cereais integrais, frutos, etc. Nesse contexto, o estudo químico e biológico de Prunus myrtifolia, uma Rosaceae, agrega dados científicos à literatura sobre quimiossistemática e atividade biológica para essa importante família vegetal.

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The rose is a rose, And was always a rose. But the theory now goes That the apple’s a rose, And the pear’s, and so’s The plum, I suppose …. What will next prove a rose ? (Robert Frost – ‘The Rose Family’)

1.3- ROSACEAE

1.3.1- Aspectos botânico, químico, etnofarmacológico.

Rosaceae L. é constituída de árvores, arbustos e ervas organizadas em 26 tribos, 124 gêneros e cerca de 3500 espécies distribuídas em todo o globo terrestre, predominantemente em regiões temperadas [Ribeiro et al, 1999]. No hemisfério Norte ocorrem, principalmente, os gêneros Rosa, Rubus, Geum, Pontetilla e Acaena, mas são encontrados ainda os gêneros Spiraeae, Aruncus, Padus, Prunus, Amelanchier, Sorbus, Crataegus, Sanguisorba, Alchemilla e Cotoneaster. Em duas ilhas do Atlântico ocorrem dois gêneros endêmicos Bencomia, nas ilhas Canário e Da Madeira e Chamaemelles, na ilha Da Madeira. O gênero Hagenia está confinado ao Noroeste da África; Leucosidea é bastante encontrada no Sudoeste da África e Cliffortia é encontrada exclusivamente no Sul da África. O gênero Oncostylis é mais comumente encontrado na Tasmânia, Nova Zelândia e América do Sul. Lyonothamnus, Stylobasium e Grangeria estão distribuídos de maneira mais restrita e ocorrem somente nas ilhas da Costa da Califórnia, na Austrália e em Madagascar, respectivamente. Physocarpus, Duchesnea, Chamaerhodos e Photinia são comuns no Leste da Ásia e Norte da América. E os gêneros Chrysobalanus, Acioa, Hirtella e Parinari ocorrem originalmente nas regiões tropicais da África e da América [Hutchinson et al, 1967]. Gêneros em Rosaceae incluem: Kageneckia, Quillaja, Vauquelinia, Lindleya, Exochorda, Lyonothamnus, Spireae, Sibiraea, Petrophyton, Kelseya, Luetkea, Aruncus, Apopetalum, Neillia, Stephanandra, Guamatela,

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Physocarpus, Sorbaria, Chamaebatiaria, Spiraeanthus, Porteranthus, Grielum, Neuradopsis, Neurada, Osmaronia, Naddenia, Padus, Laurocerasus, Prunus, Pygeum, Prinsepia, Plagiospermum, Stylobasium, Chrysobalanus, Geobalanus, Licania, Angelesia, Couepia, Ocioa, Hirtella, Parastemon, Filipendula, rubus, Holodiscus, Rhodotypos, Kerria, Neviusia, Ivesia, Purpusia, Horkeliella, Horkelia, Comarella, Pontetilla, Stellariopsis, Sibaldiopsis, Penthaphylloides, Argentina, Comarum, Duchesnea, Fragaria, Sibbaldia, Drymocallis, Chamaerhodos, Fallugia, Cowania, Novosieversia, Sieversia, Geum, Acomastylis, Orthurus, Dryas, Coluria, Waldsteinia, Purshia, Chamaebatia, Hagenia, Leucosideae, Polylepsis, Tetraglochin, Margyricarpus, Cliffortia, Bencomia, Agrimonia, Aremonia, Spenceria, Poterium, Poteridium, Scarpoterium, Sanguisorba, Acaena, Alchemilla, Coleogyne, Potaninia, Cercocarpus, Adenostoma, Rosa, Mespilus, Dichotomanthes, Cotoneaster, Malacomeles, Chamaemeles, Pyracantha, Crataegus, Hespenomeles, Osteomeles, Stranvaesia, Sorbus, Aronia, Photinia, Eriobotrya, Chaenomeles, Pseudocydonia, Docynia, Cydonia, Paphiolepsis, Malus, Eriolobus, Pyrus, Amelanchier, Peraphyllum. No Brasil são encontrados principalmente os gêneros Prunus, Rubus e Quillaja. Existem poucas características anatômicas (morfológicas) que podem ser consideradas comuns aos diversos gêneros pertencentes a Rosaceae. De acordo com Ribeiro, “algumas espécies podem ser trepadeiras providas de acúleos ou espinhos. Em relação às folhas podem ser alternadas ou (raramente) opostas, simples ou compostas e são quase sempre cerreadas; os folíolos são coriáceos ou membranáceos com margem inteira, denteada ou lobada, muitas vezes biglandulares; 2 estípulas, às vezes ausentes. As inflorescências podem ser cimeiras, corimbosas, racemosas, espigas ou panículas, ou reduzidas a flores solitárias, terminais ou axilares. As flores apresentam 5 sépalas, 5 pétalas brancas, amarelas, rosas, púrpuras ou alaranjadas e livres (raramente ausentes ou duplicadas). O fruto pode ser folículo, aquênio, pomo, drupa ou agregados de drupas ou aquênios” [Ribeiro et al, 1999]. Rosaceae possui grande importância econômica porque é constituída de muitas espécies que são fontes de frutos comestíveis: Malus sp (maçãs),

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Prunus sp (cerejas, damascos, nectarinas, pêssegos), Pyrus sp (peras), Fragaria sp (morangos), entre outras.

Além dos frutos, as árvores de médio porte e os arbustos possuem também belíssimas folhagem e flores que podem ser utilizadas na arborização urbana (como atrativo para animais silvestres) e como plantas ornamentais e cercas vivas. A madeira de muitas espécies de Rosaceae também pode ser utilizada na construção civil.

A constituição química de Rosaceae inclui especialmente glicosídeos cianogênicos [Fikenscher et al., 1981], derivados da fenilalanina ou leucina [Lamaison et al., 1990; Lechtemberg et al., 1994], taninos [Okuda et al., 1992], flavonóides (isoflavonas e derivados de caemferol e quercetina) [Harbone, 1988; Challice et al., 1972], além de triterpenos e esteróides Wallaart, 1980]. Derivados C6-C3 são quase sempre observados enquanto que alcalóides e iridóides são ausentes [on line, http//biodiversity.uno.edu, 2001].

As atividades biológicas relacionadas à inibição de enzimas são muitas vezes devido à presença de taninos em extratos de Rosáceas submetidos a ensaios biológicos. Em trabalho relatado na literatura, o teor de taninos associado ao potencial de inibição da elastase foi avaliado para algumas espécies [Lamaison et al., 1990]. A elastase é uma protease de serina que tem a capacidade de hidrolisar as fibras de elastina, presentes no tecido conjuntivo. Nesse trabalho, observou-se uma grande variação no potencial de inibição enzimática dentro das várias sub-famílias avaliadas (Tabela 1). A subfamília Rosoideae possui espécies com os maiores potenciais de inibição de elastase. Comparativamente, a subfamília Prunoideae apresentou os menores potenciais de inibição, indicando que possui menor quantidade de taninos.

Rosaceae fornece espécies que detêm grande potencial nutricional e farmacológico sendo utilizadas na medicina popular para o tratamento de diversas enfermidades e para a manutenção de boas condições de saúde.

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Tabela 1- Teor de taninos e porcentagem de inibição de elastase em Rosaceae. Sub-família Parte da planta Taninos (%) Inibição de elastase (%) Spiraeoideae Sorbaria sorbifolia Flores/folhas 6,4 90 Spirae x vanhouttei Flores/folhas 2,7 29 Rosoideae Agrimonia eupatoria folhas 7,3 90 flores 10,9 79 A. procera folhas 12,8 91 Alchemilla alpina folhas 11,4 85 A. basaltica flores 13,0 92 folhas 18,4 92 A. mollis planta com flores 20,1 80 A. chantochlora flores 12,1 94 folhas 15,0 94 Dryas octopetala planta com flores 5,5 81 Folipendula ulmaria flores 21,8 100 folhas 12,5 92 galhos 7,0 86 Fragaria vesca folhas 11,4 85 Geum montanum planta com flores 15,5 96 G. rivale planta com flores 6,4 95 G. urbanum folhas 8,5 92 flores 6,9 91 raízes 6,9 90 Dados retirados da referência Lamaison et al., 1990.

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Tabela 1- Teor de taninos e porcentagem de inibição de elastase em Rosaceae. Sub-família Parte da planta Taninos (%) Inibição de elastase (%) Maloideae Chaenomeles japonica flores 4,8 89 Crataegos monogina flores 7,6 89 frutos 1,9 55 Cydonia oblonga flores 4,8 28 folhas 5,8 87 Mespilus germanica folhas 3,5 85 Pyracantha coccinea flores 7,3 88 Pyrus communis flores 4,0 34 Prunoideae Prunus armeniaca folhas 2,5 24 P. avium folhas 3,8 40 flores 3,2 21 pedúnculo 2,8 82 casca do tronco 4,5 81 P. cerasifera flores 3,1 28 P. cerasus flores 4,4 40 P. persica flores 2,9 13 folhas 2,3 15 P. spinosa flores 3,1 41 frutos 1,2 11 Continuação da tabela 1. Dados retirados da referência Lamaison et al., 1990.

Rubus imperialis foi reconhecida recentemente como planta medicinal [Niero et al., 2002]. Extratos obtidos a partir de raízes e galhos dessa espécie de Rosaceae apresentam atividade antinociceptiva. O decocto das folhas de Rubus idaeus possui propriedade relaxante e é também utilizado para tratar diarréias e cólicas uterinas [Rojas et al., 2002]. O mesmo processo extrativo utilizado para folhas de Rubus chingii leva a um preparado que é utilizado na medicina tradicional chinesa como tônico e apresenta atividade antioxidante [Yau et al., 2000]. Folhas de Rubus ulmifolius e Rubus brasiliensis são utilizadas contra o diabetes e como ansiolítico, respectivamente [Lemus et al.,

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1999; Nogueira et al., 1998]. A partir das folhas de Rubus ulmifolius foram isoladas antronas que apresentam atividade antimicrobiana [Flamini et al., 2002]. (Ilustrações na figura 7). Os frutos de Rosa canina são utlizados para dissolver cálculos renais e são excelente fonte de vitamina C [Pahlow, 1988; Teske & Trentini, 1995]. Rosa darvunica é utilizada como medicamento para diversas enfermidades em algumas localidades da China (Figura 8) [Kuang et al., 1989].

Rosa canina Rosa darvunica

Figura 8- Espécies de Rosa.

Outras atividades farmacológicas (biológicas) podem ser destacadas tais como a atividade citotóxica potencial de extratos aquosos obtidos a partir das folhas de Vauquelinea corymbosa [Thrumbull et al., 1976] e Cowania mexicana [Konoshima et al., 1993; Ito et al., 1999]; a atividade antiviral para herpes tipo I, atribuída à isoquercetina isolada de Waldsteinia fragorioides e para coronavírus, obtida através de bioensaios realizados com extratos metanólicos de Rosa nutkana, Amelanchier alnifolia e Pontetilla arguta [McCutcheon et al., 1995].

H O R 2 HO OH

HO OH H OH OH COOR1 Rubus chingii Rubus ulmifolius

Rubantrona A R1 = CH3 R2 = OH Rubantrona B R1 = CH3 R2 = H Rubantrona C R1 = H R2 = OH

Rubus imperialis Rubus brasiliensis

Figura 7- Fotos de espécies do gênero Rubus utilizadas na medicina popular. À esquerda, antronas com atividade antimicrobiana, isoladas de Rubus ulmifolius.

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Entre as substâncias isoladas das folhas e galhos de Pyrus ussuriensis (Figura 9) a benzoquinona é a substância responsável pela atividade antibacteriana contra Erwinia amylovora causadora do “fogo bacteriano” [Jin e Sato, 2003].

O OH OH

O OH OGlicose

Figura 9- Substâncias isoladas de Pyrus ussuriensis com atividade antibacteriana frente a Erwinia amylovora. À direita, foto de espécie de Pyrus infectada pela bactéria.

Triterpenos pentacíclicos e saponinas isolados das folhas de Crataegos pinnatifida e das raízes de Sanguisorba officinalis (Figura 10).possuem atividade citotóxica para células tumorais das linhagens A549, SK-OV-3, SK- MEL-2, XF498 eHCT15 [Min et al., 2000] e HSC-2 e HGF [Mimaki et al., 2001]. Algumas dessas substâncias são mostradas na Figura 11.

(a) (b)

Figura 10- (a) Sanguisorba officinalis e (b) Crataegos pinnatifida.

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R2

H COOR4 COOH H H H R1O H RO H R3

R1 R2 R3 R4 R Ara OH H Glic H H OH H H Ara Ara H OH Glic

H COOGlic COOH H H H

AraO H HO H R

R H OH

Figura 11- Triterpenóides com atividade citotóxica.

Os dados químicos e etnofarmacológicos resumidamente descritos acima enfatizam a importância de Rosaceae como representante de muitas espécies com atividades biológicas para aplicações medicinais e nutricionais. Em Em um pequeno povoado isolado do Canadá (Carrier), todo produto necessário para sua subsistência, da alimentação à vestimenta e remédios, é proveniente da floresta. Entre as 26 plantas medicinais identificadas por etnofarmacólogos nessa região, 3 são espécies de Rosaceae: Fragaria virginiana, cuja decocção das raízes é utilizada para problemas do coração e também contra diarréia; Rubus idaeus (decocção dos galhos finos) é utilizada para “sangue fraco” e, quando em mistura com as folhas de Prunus virginiana,

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é empregada contra a anemia [Towers et al., 1996]. Em estudo realizado com 156 espécies de plantas medicinais utilizadas pelo povoado indígena de Chacobo na Bolívia, Prunus amplifolia aparece como espécies detentora de atividades contra diversas doenças aparentemente não relacionadas com infecção por Plasmodium falciparum. Ensaios biológicos mostram entretanto, um grande potencial de atividade antimalárica para extratos obtidos a partir de P. amplifolia [Muñoz, 2000]

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1.3.2- O gênero Prunus

Prunus pertence à subfamília Prunoideae e é constituído de aproximadamente 130 espécies que ocorrem nas regiões Norte, Sul e Sudeste do Brasil.

Uma vez que muitas espécies pertencentes a esse gênero são representantes importantes no comércio como fonte de frutos comestíveis (P. domestica – ameixa preta; P. persica – pêssego; P. armeniaca – damasco; P. avium – cereja), cerca de 70% dos estudos realizados e relatados na literatura estão relacionados à morfologia [Naotoshi et al., 1998], mapeamento genético e resistência frente a pesticidas utilizados na produção e cultivo [Vimel et al., 1997; Sosinski et al., 1998; Abbot et al., 1998; Lu et al., 1998; Bartolozzi et al., 1998; Kim et al., 1997] e frente a viroses que atacam as plantações [Kofalvi et al., 1997]. O grande número de variedades e a repetição de nomes populares atribuídos a diferentes espécies de Prunus (tabela 2) indicam a relevância de estudos químicos de plantas pertencentes a esse gênero que podem, eventualmente, levar a uma melhor classificação botânica. Vale ressaltar que os glicosídeos cianogênicos e alguns açúcares, tais como o sorbitol são considerados marcadores taxonômicos em Prunus [Sapuntzakis et al., 2001].

Tal como outros gêneros de Rosaceae, o gênero Prunus mostra-se importante no que concerne a sua utilização na medicina popular. Chás preparados a partir das folhas de Prunus persica e Prunus armeniaca são utilizados como laxativo [Gilani et al., 2000] e no tratamento da faringite [Wang, 1997], respectivamente. As folhas de Prunus amplifolia são utilizadas como emplastros para o alívio da dor causada por picada de insetos e reumatismo (http://www.euphorbia.com/,2002). Dados etnofarmacológicos encontrados na literatura destacam as espécies Prunus domestica, cujos extratos são constituídos de grandes quantidades de flavonóides com atividade antioxidante [Nakatani et al., 2000; Parmar et al., 1992; Henning & Herrmann, 1980; Nagarajan & Parmar, 1977] e Prunus davidiana para a qual relatou-se as atividades anti-hiperglicêmica e anti hiper-trigliceridêmica atribuídas à miricetina isolada a partir de suas folhas [Ong & Khoo, 2000].

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Tabela 2- Nomes científico e popular de espécies de Prunus.

Nome científico Nome popular Prunus serotina Ehrh. var. alabamensis (C. Mohr) Little - Prunus serotina Ehrh. ssp. hirsuta (Ell.) McVaugh - Prunus alleghaniensis Porter Cereja Alegani Prunus alleghaniensis Porter var. alleghaniensis Cereja Alegani Prunus alleghaniensis Porter var. davisii (W. Wight) Sarg. Cereja de Davi Prunus americana Marsh. Cereja americana Prunus andersonii Gray Pêssego do deserto Prunus angustifolia Marsh. Cereja Chicasaw Prunus angustifolia Marsh. var. angustifolia Cereja Chicasaw Prunus angustifolia Marsh. var. varians W. Wight & Hedrick - Prunus angustifolia Marsh. var. watsonii (Sarg.) Waugh Cereja de Watson Prunus armeniaca L. Damasco Prunus avium (L.) L. Cereja doce Prunus caroliniana (P. Mill.) Ait. Cereja Carolina Prunus cerasifera Ehrh. Cereja Prunus cerasus L. Cereja ácida Prunus domestica L. Cereja Européia Prunus domestica L. var. domestica Cereja Européia Prunus domestica L. var. insititia (L.) Fiori & Paoletti Cereja Européia Prunus domestica L. ssp. insititia (L.) Schneid. - Prunus domestica L. var. insititia (L.) Boivin (pro nm.) - Prunus insititia L. - Prunus dulcis (P. Mill.) D.A. Webber Amêndoa doce Prunus amygdalus Batsch - Prunus communis (L.) Arcang. - Prunus emarginata (Dougl. ex Hook.) D. Dietr. Cereja amarga Prunus emarginata (Dougl. ex Hook.) D. Dietr. var. emarginata Cereja amarga Prunus emarginata (Dougl. ex Hook.) D. Dietr. var. crenulata (Greene) - Kearney & Peebles Prunus emarginata (Dougl. ex Hook.) D. Dietr. var. mollis (Dougl. ex Cereja amarga Hook.) Brewer Prunus fasciculata (Torr.) Gray Amêndoa do deserto Prunus fasciculata (Torr.) Gray var. fasciculata Amêndoa do deserto Prunus fasciculata (Torr.) Gray var. punctata Jepson Amêndoa do deserto Prunus fremontii S. Wats. Damasco do deserto Prunus fruticosa Pallas Cereja anã européia Prunus geniculata Harper Ameixa pequena Prunus glandulosa Thunb. Amêndoa flor Prunus gracilis Engelm. & Gray Cereja Oklahoma Prunus havardii (W. Wight) S.C. Mason Cereja de Havard

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Prunus hortulana Bailey Cereja hortulana Prunus hortulana Bailey var. mineri Bailey - Prunus ilicifolia (Nutt. ex Hook. & Arn.) D. Dietr. “hollyleaf cherry” Prunus ilicifolia (Nutt. ex Hook. & Arn.) D. Dietr. ssp. ilicifolia “hollyleaf cherry”

Nome científico Nome popular Prunus ilicifolia (Nutt. ex Hook. & Arn.) D. Dietr. ssp. lyonii (Eastw.) “hollyleaf cherry” Raven Prunus lyonii (Eastw.) Sarg. - Prunus japonica Thunb. ex Murray Cereja japonesa Prunus laurocerasus L. Cereja louro Prunus lusitanica L. Cereja louro de Portugal Prunus mahaleb L. Cereja Mahaleb Prunus maritima Marsh. Cereja da praia Prunus maritima Marsh. var. gravesii (Small) G.J. Anderson Ameixa de Graves Prunus gravesii Small - Prunus maritima Marsh. var. maritima Ameixa da praia Prunus mexicana S. Wats. Ameixa mexicana Prunus americana Marsh. var. lanata Sudsworth - Prunus lanata (Sudsworth) Mackenzie & Bush - Prunus mexicana S. Wats. var. flutonensis (Sarg.) Sarg. - Prunus mexicana S. Wats. var. polyandra (Sarg.) Sarg. - Prunus pensylvanica L. f. var. mollis (Dougl.) Boivin - Prunus minutiflora Engelm. Amêndoa do Texas Prunus mume Siebold & Zucc. Damasco Japones Prunus munsoniana W. Wight & Hedrick “wild goose plum” Prunus murrayana Palmer Ameixa de Murray Prunus myrtifolia (L.) Urban “West Indian cherry” Prunus nigra Ait. Cereja canadense Prunus americana Marsh. var. nigra (Ait.) Waugh - Prunus occidentalis Sw. “western cherry laurel” Prunus orthosepala Koehne (pro sp.) [americana × angustifolia] - Prunus padus L. “European bird cherry” Prunus palmeri Sarg. (pro sp.) [hortulana × mexicana] - Prunus pensylvanica L. f. Cereja alfinete Prunus pensylvanica L. f. var. pensylvanica Cereja alfinete Prunus pensylvanica L. f. var. saximontana Rehd. Cereja alfinete Prunus pensylvanica L. f. ssp. corymbulosa (Rydb.) W. Wight - Prunus persica (L.) Batsch Pêssego Prunus persica (L.) Batsch var. nucipersica (Suckow) C. Schneider Nectarina Prunus persica (L.) Batsch var. nectarina (Aiton) Maxim. - Prunus persica (L.) Batsch var. persica Pêssego Prunus pleuradenia Griseb. -

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Prunus pumila L. “sandcherry” Prunus pumila L. Var. besseyi (Bailey) Gleason “western sandcherry” Prunus besseyi Bailey - Prunus pumila L. Ssp. besseyi (Bailey) Nizhnikev - Prunus pumila L. var. depressa (Pursh) Gleason “eastern sandcherry” Prunus depressa Pursh - Prunus pumila L. var. pumila “Great Lakes sandcherry” Prunus pumila L. var. susquehanae (hort. ex Willd.) Jaeger “Susquehana sandcherry” Prunus cuneata Raf.

Nome científico Nome popular Prunus pumila L. var. cuneata (Raf.) Bailey - Prunus susquehanae hort. ex Willd. - Prunus rivularis Scheele Ameixa do córrego Prunus reverchonii Sarg. - Prunus salicina Lindley Ameixa japonesa Prunus triflora Roxb. - Prunus serotina Ehrh. Cereja preta Prunus serotina Ehrh. var. eximia (Small) Little Cereja preta Prunus serotina Ehrh. Ssp. eximia (Small) McVaugh - Prunus serotina Ehrh. var. rufula (Woot. & Standl.) McVaugh Cereja preta Prunus virens (Woot. & Standl.) Shreve var. rufula (Woot. & Standl.) - Sarg. Prunus serotina Ehrh. var. serotina Cereja preta Prunus serotina Ehrh. var. virens (Woot. & Standl.) McVaugh Cereja preta Prunus virens (Woot. & Standl.) Shreve - Prunus serrulata Lindl. Cereja flor japonesa Prunus ×slavinii Palmer ex Rehd. [angustifolia × gracilis] - Prunus spinosa L. Chifre preto Prunus subcordata Benth. Ameixa Klamath Prunus subcordata Benth. var. kelloggii J.G. Lemmon Ameixa Klamath de Kellogg Prunus subcordata Benth. var. oregana (Greene) W. Wight ex M.E. Peck Ameixa de Oregon Klamath Prunus subcordata Benth. var. rubicunda Jepson Ameixa de Klamath Prunus subcordata Benth. var. subcordata Ameixa de Klamath Prunus subhirtella Miq. - Prunus tenella Batsch prunus Prunus texana F.G. Dietr. “peachbush” Prunus tomentosa Thunb. Cereja Nanking Prunus triloba Lindl. Ameixa flor Prunus umbellata Ell. “hog plum” Prunus umbellata Ell. var. injuncunda (Small) Sarg. “hog plum” Prunus injuncunda Small - Prunus umbellata Ell. var. umbellata “hog plum”

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Prunus mitis Beadle - Prunus umbellata Ell. var. tarda (Sarg.) W. Wight - Prunus virginiana L. “chokecherry” Prunus virginiana L. var. demissa (Nutt.) Torr. “western chokecherry” Prunus demissa (Nutt.) Walp. - Prunus virginiana L. ssp. demissa (Nutt.) Taylor & MacBryde - Prunus virginiana L. var. melanocarpa (A. Nels.) Sarg. “black chokecherry” Prunus melanocarpa (A. Nels.) Rydb. - Prunus virginiana L. ssp. melanocarpa (A. Nels.) Taylor & MacBryde - Prunus virginiana L. var. virginiana “chokecherry”

As substâncias fenólicas isoladas da casca do tronco de Prunus jamasakura (Figura 12) inibem o crescimento de tumores induzidos por ésteres de forbol em ratos [Yasukawa et al., 1998]. A atividade antioxidante (inibindo a peroxidação de lipídeos) atribuída a flavonóides isolados dos frutos de Prunus cerasus [Wang et al., 1999] e as atividades antimicrobiana e citotóxica de Prunus padus [Shin et al., 1997] e Prunus africana, que é utilizada também no tratamento da hipertofria prostática [Scarpato et al., 1998], são relatadas na literatura.

COOCH3 OH R2 HO OH HO R1 O O O O COOR HO CH CH2 OH

HO HO OH OH

R1 = OH, R2 = H R = H R1 = H, R2 = OH R = CH3

Figura 12- Estruturas moleculares de substâncias antitumorais Isoladas de Prunus jamasakura.

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Recente estudo clínico mostra que o extrato etanólico das flores de Prunus persica age como filtro solar, inibindo danos causados ao DNA de fibroblastos devido à incidência de raios UVA e UVB [Heo et al., 2001]. Prunus amplifolia também é utilizada como planta medicinal antimalárica P. pérsica [Munoz et al., 2000]. Prunus laurocerasus é utilizada como hipotensivo, sendo consumida como nutracêutico na Província de Lucca, na Itália [Pieroni, 2000] e Prunus cerasoides é utilizada para a alimentação do gado [Khanal, 2001].

A importância econômica desse gênero estende-se além da área de alimentos e fitofármacos. Encontram-se relatados na literatura mais de 100 patentes de formulações em que são utilizadas várias espécies de Prunus. As utilizações mais comuns são como cosméticos clareadores da pele [Yagi e Nagaruma, 1998]; como matéria-prima na produção de licores finos [Tsuguhiko et al., 1998]; protetores solares, nutracêuticos e como alimento na pecuária.

Também são encontradas patentes que revelam técnicas diferenciadas para produção regular e em grande escala e obtenção de frutos com polpa mais firme, sabor e odor agradávéis, com boa capacidade de armazenamento e transporte [Derwent Innovations Index]. Na tabela 3 a seguir estão resumidas algumas dessas patentes. Além dos numerosos trabalhos encontrados na literatura científica que versam sobre alguma atividade/propriedade biológica associada a extratos brutos e algumas substâncias isoladas a partir de espécies de Rosaceae, vale ressaltar neste trabalho, a importante proposta farmacológica do Laetrile®, que foi extensivamente discutida ao longo de mais de 50 anos. Os aspectos mais relevantes desse pró-fármaco serão apresentados a seguir (

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Tabela 3- Espécies de *Prunus utilizadas em formulações patenteadas.

Espécie (parte da planta) Formulação Utilização No da patente Autor

Prunus amigdalus extrato Trat. de asma bronquial BR2OOOO1777A Santana, P. E. Prunus mume extrato Antibacteriano, nutracêutico KR2001045830A Lee, O. G. Prunus persica ungüento Trat. de rachaduras na pele KR2001047265A Park, G. R. Prunus armeniaca (sementes) Extrato Hidratante para a pele KR2OO1037063A Kim, D. H. (para cosméticos) P. armeniaca, P. americana, Extrato Hidratante para a pele JP2001213750A Ichimaru Pharcos Inc P. avium, P. dulcis, P. effusa, (para cosméticos) (cremes anti envelhecimento) P. mume,P. pauciflora, P. pérsica, P. salicina, P. nucipersica P. armenmiaca e P. salicina extrato (para Hidratante e branqueador da pele KR2001000396A Lee, B. S. cosméticos) (cremes anti-idade) extrato Medicamento para hipotermia, KR2001000342A Park, J. G. P. armeniaca febre, fadiga, dores de cabeça, tosse e asma P. armeniaca extrato Trat. de gengivites, mau hálito e JP2001097875A Kobayashi Seiyaku KK cáries extrato Trat. da pele na síntese de AU2001117046A Moser, P. Prunus ssp colágeno, protetor solar P. jamasakura extrato Anti-cáries JP2001089385A Kobayashi Seiyaku KK P. persica Extrato (para Creme clareador da pele, anti- JP2000290131A Kanebo LTD cosméticos) cloasma, anti-sardas. * As espécies de Prunus podem ser utilizadas sozinhas ou com outras espécies de Rosaceae e de outras famílias.

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Espécie (parte da planta) Formulação Patente Autor Utilização Prunus ssp extrato Antioxidante, inibidor de danos da AU200018006A Hayashi, T., Higashi, Y., mucosa gástrica, inibidor da aldose Yoshikawa, M. redutase e tirosinase, antiinflamatório. Prunus ssp extrato Nutracêutico, antiinflamatório, WO200033667A2 Booren, A. M., Nair, M. citostático, cardiovascular, G., Strasburg, antiarteriosclerose, analgésico G. M., Wang, H. P. mume (frutos) extrato Tratamentos da sarna e WO200002521A2 Keller, R. H., Wen, X. hipersensibilidade, antihistamínico. Prunus ssp (frutos) extrato Tratamento de problemas da pele JP10338642A Shiseido Co LTD (vermelhidão) P. japonica (frutos) chá Tratamento da diabetes PNJP10127256A Kawazoe, M. extrato Tratamento de constipação JP2994594B2 Itek Corp, Minami Nippon P. mume Rakuno Kiodo kk, Nippon Matech KK preparado Fertilizante JP06340485A Amano, T. P. mume, P. persica, P. líquido armeniaca Prunus ssp extrato Nutracêutico, anti-hepatotóxico, , AU200057876A Green, R. S. e imunoestimulante, anticâncer. Patel, D. P. salicina preparado Tratamento da febre CN1265914A Wang, C. líquido extrato aquoso Analgésico e antiinflamatório JP58172321A Dainippon Pharm Co LTD P. persica P. cerasus extrato Tratamento da arteriosclerose RO72332A Intr Miraj Med Continuação da tabela 1. * As espécies de Prunus podem ser utilizadas sozinhas ou com outras espécies de Rosaceae e de outras famílias.

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Espécie (parte da planta) Formulação No da patente Autor Utilização P. persica, P. jamasakura, P. extrato Tônico capilar JP2962558B2 Shiseido Co LTD amygdalus, P. armeniaca, P. tomentosa, P. mume, P. zippeliana, P. nipponica P. grandulosa e P. persica (folhas) extrato Creme para tratamento de JP2810107B2 Sanko Seibutsu Kaga manchas na pele derivados de Antioxidante pra medicamentos, JP01228992A Kobe Steel LTD Prunus ssp tocoferol cosméticos e alimentos extrato Trat. de peste vermelha em peixes JP010075429A Nisshin Flour Co P. mume P. spinosa tintura Trat. de pacientes com AIDS DE3709849A Bartschi Hu P. africanus extratos de várias Trat. da isquemia e amnésia em FR2605886A Lacolle JY polaridades pacientes senis P. amigdalus, P. persica, P. extrato liofilizado Nutracêutico, antipsicossomático JP61286329A Shibuia B. davidiana (sementes) de amêndoas Prunus ssp (folhas e brotos) Voláteis Desodorante JP60126162A Matsushita Electric Works LTD P. ssp Extrato (fração Antiinflamatório, inibe a DE2753466A Sertog Soc Etud Rec insaponificável) agregação plaquetária P. wallichi , P. japonica, P. extrato Trat. de hipertrofia prostática BE860682A Sertog Soc Etud Rec arborea, P. lusitanica, P. africana. (administração via oral) P. lusitana (folhas) extrato Bactericida e fungicida BE745150A Debat, J. P. mume (frutos) extrato antinarcótico GB1096708A Wu Pun-Wah Continuação da tabela 1. * As espécies de Prunus podem ser utilizadas sozinhas ou com outras espécies de Rosaceae e de outras famílias.

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1.3.3- Prunus myrtifolia

As sinonímias Prunus sphaerocarpa Hook e Prunus sellowii Koehne são relatadas na literatura para a espécie Prunus myrtifolia que é conhecida popularmente como pessegueiro-bravo, pessegueiro-do-mato, miguel-pintado, coração-de-negro, marmelo-do-mato, coração-de-bugre, varova, varoveira.

São árvores com 10-15 metros de altura e troncos de 30-40 cm de diâmetro. As folhas possuem duas glândulas maculares na base e são simples, alternas, glabras e discolores (face abaxial verde clara, com venação escura; adaxial verde escura) de 7-12 cm de comprimento por 2- 4,5 de largura (Figura 13) [Lorenzi, 1998]. As flores são brancas com 5 sépalas, 5 pétalas, vários estames e ocorrem em racemos. Os frutos são secos. A casca do tronco, quando cortada exala forte odor de marzipan.

A madeira dessa espécie vegetal é pesada (densidade 0,92 g/cm3), dura ao corte e de textura fina, moderadamente resistente ao ataque de organismos xilófagos e é utilizada para acabamentos internos e na construção civil, confecção de móveis, artigos de esporte, cabos de ferramentas e peças torneadas [Lorenzi, 1998]

No Brasil, ocorre desde o Rio de Janeiro ao Rio Grande do Sul, na Mata Pluvial Atlântica e em Minas Gerais e Mato Grosso do Sul, nas florestas semidecíduas. No Amazonas, é a única espécie de Prunus que ocorre na Reserva Ducke [Ribeiro et al, 1999].

Seus frutos são consumidos por várias espécies de pássaros, o que a torna interessante para reflorestamentos heterogêneos destinados à recomposição de áreas degradadas de preservação permanente [Lorenzi, 1998].

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(b)

(a)

(c)

(c)

(d) (e) (f)

Figura 13- a) Prunus myrtifolia. Detalhes dos frutos (b), das folhas (c) e da madeira (d), (e) e (f).

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(g) (i)

(h)

(i)

Figura 13- (Cont.) Prunus myrtifolia. Detalhes das flores (g) e (h), e dos frutos maduros(i).

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Em trabalho relatado na literatura foram isolados o glicosídeo cianogênico prunasina (I) a partir de extrato de folhas e o ácido mandélico (II) e benzaldeído (III) a partir de extrato dos frutos de P. myrtifolia (Figura 14) [Maia, 1987]. Excetuando-se essa informação, não existem relatos de estudos químico e biológico realizados com essa espécie.

CH OH HO 2 O HO H H O HO OH CN CO2H CHO

I II III

Figura 14- Substâncias isoladas de folhas e frutos de Prunus myrtifolia em trabalho anterior. [Maia, 1987].

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1.4- Considerações sobre a importância farmacológica e biossíntese de classes de substâncias isoladas de Prunus myrtifolia

1.4.1- Glicosídeos cianogênicos

Do ponto de vista estrutural, os glicosídeos cianogênicos podem ser divididos em quatro grupos: - glicosídeos de butironitrila (i) - glicosídeos de propionitrila (ii) - glicosídeos de mandelonitrila (iii) - glicosídeos de ciclopentenocianoidrina (iv)

OH OH H CH HO O HO O 3 O CN O CN HO OH HO OH

CH3 H C CH 2 3 i ii

OH CH HO O 3 O CN HO OH OH O HO O HO OH NC iii iv

São substâncias amplamente distribuídas no reino vegetal, podendo ocorrer também em alguns insetos, bactérias e líquens [Hübel et al., 1981; Kevin, 1996]. A presença dessa classe de substâncias em plantas é devida, principalmente, à possibilidade de aumento da defesa química contra herbívoros através da cianogênese. Embora a presença de glicosídeos cianogênicos em vegetais possa ser considerada tóxica para mamíferos devido à formação de HCN no trato digestório, muitos relatos são encontrados na literatura sobre a importância dessas substâncias nos tecidos vegetais de espécies comestíveis que foram naturalmente selecionadas por nossos ancestrais através do cultivo, devido à melhor aparência que apresentavam seus frutos e folhas [Jones, 1998]. Consequentemente, um número expressivamente alto de alimentos vegetais são cianogênicos, fato que

59 culminou na necessidade de o Homem desenvolver a capacidade fisiológica de destoxificação do cianeto. Essa capacidade é especialmente melhorada quando a dieta contiver quantidades consideráveis de proteínas [Jones, 1998]. A cianogênese geralmente ocorre após a reação de hidrólise de glicosídeos cianogênicos, que leva a uma ou mais unidades de açúcar, aldeídos ou cetonas e HCN. Entre as espécies vegetais comestíveis, o potencial de formação de HCN pode variar em diferentes partes da planta e também num mesmo órgão de dois espécimens diferentes. A quantidade presente em Manihot esculenta (mandioca, Euphorbiaceae) varia de 240-890 mg/kg nos tubérculos até 1040 mg/kg nas folhas; nas duas espécies de feijão Sorghum bicolor e Phaseolus lutanus observa-se menos de 6 mg/kg para a primeira e de 100-4000 mg/kg para a segunda e, em brotos de bambu, a quantidade pode ser maior que 8000 mg/kg [Poulton, 1983]. Comparando-se essas concentrações descritas com a dose letal de HCN em mg/kg-1 de peso corporal tem-se 0,5-3,5 para humanos [Halstrom e Moller, 1945], 2,4, para carneiros [Coop e Blakely, 1949], 2,0 para o gado [Moran, 1954]; 3,7 para camundongos, 2,0 para gatos, 0,5-10 para ratos e 1,5 para gatos [Christensen, 1976], valores que explicam bem o grande número de envenenamentos por HCN em produtos alimentícios [Poulton, 1983]. Entretanto, quando vegetais cianogênicos são consumidos lentamente ou durante longo intervalo de tempo, os sintomas de envenenamento não são observados, devido ao processo de destoxificação, que pode ocorrer de diferentes maneiras. A mais efetiva é a que utiliza enzimas do tipo sulfurtransferases, que necessita, entretanto, de suprimento adequado de ácidos aminados contendo enxofre (essencialmente metionina e cisteína). Se, ao contrário, a dieta é pobre em proteínas, o envenenamento crônico por HCN pode ocorrer. Indivíduos acometidos pela doença de Leber ou fumantes com deficiência de vitamina B12 têm menor habilidade fisiológica no processo de destoxificação. O motivo pelo qual existe um número maior de relatos na literatura sobre a presença de glicosídeos cianogênicos na mandioca do que sobre a presença dessas substâncias em outros vegetais comestíveis deve-se ao fato de que a parte da planta que é consumida é cianogênica, diferente da maioria dos outros vegetais (Tabela 4). Geralmente são as folhas dos cereais que têm caráter

60 cianogênico e não os grãos. As sementes das maçãs são cianogênicas mas não a polpa. As folhas do mamão papaia e da manga são cianogênicas, mas não a parte do vegetal que costuma-se ingerir. Entretanto, não se pode descrever essa mesma observação para as amêndoas, alguns tipos de feijão, brotos de bambu, maracujá, macadâmia entre outros produtos vegetais que são consumidos em nossa dieta e que, comprovadamente, são cianogênicos. A figura 15, ilustra as estruturas de alguns glicosídeos cianogênicos encontrados em alimentos vegetais.

OH HO O O HO HO OH H O H HO O HO O CN O CN HO OH HO OH

Prunasina (R) Amigdalina (R) neo-amigdalina (S) Sambunigrina (S)

HO H HO O O CN HO OH HO CH3 HO O O CN HO OH CH3

Taxifilina (R) Lotaustralina (R) Durrina (S) OH Linamarina (S)

Figura 15- Estruturas moleculares de alguns glicosídeos cianogênicos encontrados em alimentos vegetais (Tabela 4).

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Tabela 4- Vegetais comestíveis que contêm glicosídeos cianogênicos. Vegetal (nome comum, órgão da planta) Glicosídeo cianogênico Triticum aestivum (trigo, folhas) Durrina T. monococcum (trigo, folhas) Linamarina Lotaustralina Epilotaustralina Hordeum vulgare (cevada, folhas) Epiheterodendrina Avena sativa (aveia, folhas) Linamarina Secale cereale (centeio, folhas) Dhurrina Sorghum bicolor (espécie de feijão, grãos) Dhurrina Manihot esculenta (mandioca, raiz) Linamarina Lotaustralina Phaseolus lunatus (espécie de feijão, grãos) Linamarina Lotaustralina P. vulgaris (ginjeira) Linamarina Lotaustralina Eleusine coracana (pé-de-galinha, folhas) Trigloquinina

Colocasia esculenta (inhame, raiz) Trigloquinina Eriobotrya japonica (nêspera, sementes e polpa) Amigdalina Sambucus nigra (sabugueiro) Holocalina Prunasina Sambunigrina Zierina Alocasia macrorhiza (inhame, var. selvagem, Isotrigloquinina raiz) Trigloquinina Dendrocalamus sp (bambu, folhas e caules) Taxifilina Pouteria sapota (mamey, sementes) Lucumina Carica papaya (mamão papaia, sementes) Prunasina Tetrafilina B Passiflora edulis (maracujá, sementes) Prunasina Cydonia oblonga (marmelo, polpa) Prunasina

62

Além do papel dos glicosídeos cianogênicos nos mecanismos de defesa dos vegetais que os contém, a importância farmacológica de algumas dessas substâncias tem sido relatada na literatura [Boby, 2003; Jukes, 1990]. Assim, torna-se relevante mencionar a recente publicação que descreve resultados obtidos com a administração dos glicosídeos cianogênicos linamarina e lotaustralina (Figura 15), isolados a partir de Manihot esculenta, sobre o aumento da capacidade seqüestradora de radicais livres das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase, e a diminuição de peróxidos lipídicos em fígados de ratos induzidos ao estresse oxidativo [Boby et al, 2003]. Mas o exemplo mais importante da utilização dessa classe de substâncias como fármaco é, sem dúvida, o Laetrile®, um medicamento utilizado no tratamento de vários tipos de cânceres e que teve sua eficácia e grau de toxicidade extensivamente discutidos ao longo de mais de 50 anos. Laetrile® é a contração do nome IUPAC e também o

nome comercial utilizado para o medicamento cujo componente ativo é o glicosídeo cianogênico LAEvo- mandeloniTRILE-D-glucuronila, ou amigdalina. Essa substância foi isolada pela primeira vez em 1830, a partir do

endocarpo de Prunus amigdalus (amendoeira). Em 1950 o bioquímico francês Ernst T. Krebs Jr nomeou vitamina B17 a amigdalina isolada a partir das sementes de damasco, purificada e cristalizada através de procedimentos que ele próprio patenteou, e finalmente apresentou à comunidade científica o potencial dessa substância na cura de vários tipos de cânceres sem causar os já conhecidos efeitos colaterais associados aos medicamentos utilizados em quimioterapia. Seu argumento? Células cancerosas produzem grande quantidade de β- glicosidase, a enzima responsável pela hidrólise da amigdalina no organismo humano e muitas vezes presente também no órgão vegetal de onde foi isolada. Uma vez no organismo, portanto, a formação de HCN ocorreria na região atingida pela doença, afetando somente as células cancerosas e mantendo as células saudáveis intactas, uma vez que nestas a produção de β- glicosidase é ínfima. Em seu estudo publicado em 1975 Charles Gurchot [Gurchot, 1975], divulgou os possíveis mecanismos de ação da vitamina B17. Além dos dados relatados por Krebs, Gurchot acrescentou que a enzima

63 rodanase, presente em grandes quantidades em células saudáveis, transforma HCN e benzaldeído formados após a hidrólise da amigdalina, em tiocianato e álcool benzílico. Combinadas, essas duas substâncias formam benzotiocianato, que reduzido a tioálcool, benzomercaptana e HCN, recicla o principal componente que interfere na respiração celular de tecidos constituídos por células tumorais, até o momento em que as condições intracelulares não permitam mais a continuidade das reações. A aplicação tópica da formulação em creme da amigdalina (em DMSO) tem sido utilizada também para casos de câncer de pele. Sem a comprovação da eficiência e segurança do Laetrile®, o FDA impediu a comercialização desse medicamento a partir de 1971. Entretanto, devido à pressão popular e política, a legislação de muitos Estados legalizaram a venda e uso do produto, até que, em 1978, o Instituto Nacional do Câncer (NCI) iniciou estudos clínicos com o Laetrile® em pacientes terminais [Ellison, 1978]. Os idealizadores do medicamento alertaram para a necessidade de “dieta controlada” para os pacientes tratados, esclarecendo que o tratamento somente seria eficiente em pacientes não submetidos a radioterapia anteriormente, visto que esta torna o sistema imunológico debilitado. Os resultados relatados pelo NCI foram desfavoráveis para o medicamento. Durante mais de 30 anos esse medicamento gerou controvérsias recebendo a atenção de grandes nomes como Linus Pauling entre outros [Holden,1976; Anônimo, 1977; Croft,1977; Harnes, 1978; Turczan, 1979; Young, 1981; Pauling, 1982; Jukes, 1990], e até os dias atuais são encontrados estudos na literatura, relatando especialmente os possíveis metabólitos formados a partir da amigdalina e os prováveis mecanismo de ação do Laetrile [WAGNER e GALEY, 2003]. Ainda hoje há, por um lado, instituições como o Instituto Nacional do Câncer e a American Cancer Society (ACS) tentando provar a inatividade e alta toxicidade do produto, realizando testes clínicos em humanos utilizando altas doses do medicamento, associados a dietas que incluíam a ingestão de amêndoas de Prunus amigdalus, seguramente uma fonte potencial de amigdalina (...). E, por outro lado, os pesquisadores idealizadores do Laetrile®,

64 reunindo esforços para provar a idoneidade e potencial de atividade do medicamento (...). Frases como “O câncer é uma doença provocada pela carência de uma vitamina e o Laetrile® é essa vitamina (vitamina B17)” [Martin, 1983] ou “O NCI testou Laetrile® em animais de laboratório diversas vezes e não encontrou nenhuma evidência convincente de sua ação efetiva contra o câncer” [membros do NCI], continuaram a ser publicadas em jornais e revistas científicas. Dr Dean Burk, ex-presidente do Instituto Nacional do Câncer, abriu mão de sua carreira de mais de 30 anos no Instituto, demitindo-se após tornar público que o NCI fraudou as informações sobre Laetrile® para favorecer a “indústria do câncer”, referindo-se às indústrias farmacêuticas e aos centros de pesquisas mencionados acima. Mais recentemente, a importância da substância amigdalina na medicina foi relatada uma vez mais. Trata-se de estudo demonstrando a utilização de modelagem molecular por computador com o objetivo de obter-se molécula que mimetiza o peptídeo T, responsável por impedir a entrada de vírus como o HIV nos linfócitos T [Llorens et al., 1998]. Os dados computacionais obtidos para esse propósito, levaram à estrutura molecular da amigdalina, que submetida a testes clínicos, apresentou propriedades terapêuticas reveladoras no tratamento da psoríase e, por esse motivo vem sendo utilizada como modelo (cabeça de série) para o desenvolvimento de moléculas com propriedades farmacocinéticas melhores. Torna-se evidente, portanto, que substâncias de origem natural que possuem um grupamento nitrila ainda causam impacto sobre vários aspectos nas ciências naturais. Uma vez que são facilmente detectadas a partir da liberação de HCN, essas substâncias têm atraído a atenção de fitoquímicos e, como conseqüência, muitos metabólitos especiais pertencentes a essa classe de substâncias têm sido relatados nos últimos 150 anos [Ikan, 1999]. Embora muitos taxonomistas de plantas tenham, ao longo dos anos, se interessado pela cianogênese em plantas, Hegnauer foi o primeiro a definir que a importância taxonômica dessas substâncias está na estrutura molecular da substância intacta e não na capacidade de liberar HCN [Hegnauer,1977].

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Importante observação deve ser feita ainda, em relação à facilidade de obtenção dessa substância que é proveniente principalmente de sementes, órgão vegetal que é geralmente rejeitado nas indústrias de alimentos.

Biossíntese de glicosídeos cianogênicos A biossíntese de glicosídeos cianogênicos é bastante investigada na química de produtos naturais. Os precursores biogenéticos dessas substâncias são os ácidos aminados L-valina, L-isoleucina, L-leucina, L-fenilalanina e L- tirosina. No início dos anos 60 a relação precursor - glicosídeo cianogênico foi determinada através de experimentos in vivo, utilizando L-tirosina marcada na formação da durrina em Linum usitatissimum [Conn, 1991]. A rota biossintética envolve, portanto, a formação do par de aldoximas estereoisoméricas (d e e) a partir de um ácido aminado (a), seguida da formação da nitrila (f), a cianidrina ou hidroxinitrila (g) que dá origem ao glicosídeo cianogênico (h) (Figura 16).

Figura 16- Reações envolvidas na biossíntese de glicosídeos cianogênicos.

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1.4.2- Substâncias fenólicas

Substâncias fenólicas (ou polifenólicas) possuem um ou mais anéis aromáticos contendo substituintes hidroxilados e/ou seus derivados (ésteres, metoxilas, glicosídeos e outros). Pertencem a essa classe de metabólitos especiais, substâncias com estruturas bastante variadas que vão de ácidos fenólicos a cumarinas e flavonóides, além de seus derivados. A classificação é feita segundo o tipo de esqueleto carbônico principal, conforme representado na Tabela 5, onde C6 corresponde ao anel aromático e Cx, à cadeia substituinte com x átomos de carbono.

Entretanto, a definição que leva em conta somente a estrutura química não é muito apropriada, uma vez que existem substâncias contendo hidroxilas fenólicas que fazem parte de outras classes de substâncias. Dessa forma, é conveniente empregar-se uma definição que leva em conta também a origem biogenética.

As rotas biossintéticas que dão origem às substâncias fenólicas em plantas são a via chiquimato, responsável pela formação de unidades C6-C1, C6-C2 e C6-C3 e a via acetato/malonato (via policetídeo), responsável pela formação de unidades C6-C3-C6;

As estruturas moleculares de derivados do ácido benzóico (C6-C1): ácido p-hidroxibenzóico, ácido protocatecuico e ácido vanílico são mostradas na Figura 17 como exemplos de substâncias fenólicas, bem como as estruturas dos ácidos p-cumárico, cafeico e ferúlico, derivados do ácido cinâmico (C6-C3).

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Tabela 5- Classificação de substâncias fenólicas de acordo com seu esqueleto principal. Esqueleto principal Classe de substâncias fenólicas C-6 Fenóis simples C6-C1 Ácidos fenólicos C6-C2 Acetofenonas e ácidos fenilacéticos C6-C3 Fenilpropanóides: ácidos cinâmicos e substâncias análogas, fenilpropenos, cumarinas, isocumarinas e cromonas C6-C4 Naftoquinonas C6-C1-C6 Xantonas C6-C2-C6 Estilbenos, antraquinonas C6-C3-C6 Flavonóides

(C6-C3)2 Lignanas

(C6-C3-C6)2 Biflavonóides (C6-C3)n Ligninas (C6-C1)n Taninos hidrolisáveis (C6-C3-C6)n Taninos condensados

O O O

OH OH OH

HO HO HO OH OCH3 Ácido p-hidroxi-benzóico Ácido protocatecuico Ácido vanílico

O O O HO H H CO OH OH 3 OH

HO HO HO H H H

Ácido cafeico Ácido p-cumárico Ácido ferúlico

Figura 17- Estruturas moleculares de algumas substâncias fenólicas derivadas dos ácidos benzóico e cinâmico.

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Os flavonóides representam um dos grupos de substâncias fenólicas mais importantes e diversificados entre os produtos de origem natural.

Inicialmente eram reconhecidos apenas como os pigmentos hidrossolúveis das flores e frutos de diversos vegetais, muitos deles comestíveis. Essas substâncias também ocorrem em grande quantidade nas folhas e em sementes de muitas espécies vegetais. São mais de 6000 substâncias fenólicas diferentes [Harbone et al., 199] distribuídas em subclasses: chalconas, flavonas, flavonóis, flavandióis, antocianidinas e taninos condensados, auronas entre outros [Harbone, 1994]. Excetuando-se as catequinas e proantocianidinas, esses flavonóides são encontrados na natureza frequentemente como glicosídeos e as principais diferenças observadas estão relacionadas aos padrões de hidroxilação, metoxilação, glicosilação e acilação descritos na literatura [Rice-Evans, 1998].

Apesar dessas variedades estruturais, a maioria dos representantes dessa classe de substâncias possui 15 átomos de carbono em seu esqueleto principal, constituídos de duas fenilas ligadas entre si por uma cadeia de 3 átomos de carbono. Quando o esqueleto é do tipo 1,3-difenilpropano, as substâncias são chamadas de chalconas. A formação de um terceiro anel (de 5 ou 6 membros) a partir da cadeia de 3 átomos de carbono e de um átomo de oxigênio pertencente à um dos anéis aromáticos, dá origem ao sistema tricíclico característico dos flavonóides (anéis A, B e C). As auronas são formadas a partir da ciclização a anel furano e os flavonóides e seus derivados são formados após ciclização a anel pirano.

B B OH O B O A A C A C

Chalcona Aurona Flav

Devido à presença dessas substâncias em muitos vegetais comestíveis, alimentos e bebidas obtidos a partir de plantas, os flavonóides são considerados constituintes não energéticos muito importantes na dieta humana.

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Espécies de plantas contendo altos teores de flavonóides são há muito tempo utilizadas na medicina popular, levando consequentemente à necessidade de validação desses fitoterápicos no tratamento de doenças crônicas e agudas ou como quimiopreventivos.

Substâncias fenólicas não flavonoídicas contendo núcleo catecol, tais como o ácido clorogênico, seus precursores ou seus derivados, também são encontrados em produtos que consumimos diariamente tais como os chás e as várias espécies de uva. Sendo detentoras de propriedades farmacológicas potenciais como antiinflamatória, antimutagênica, anticarcinogênica [Moridani et al., 2001], essas substâncias têm grande importância na dieta do Homem e despertam interesse científico. Entre os vários exemplos de fitofármacos contendo substâncias fenólicas como constituintes ativos, pode-se citar o Silimarina (Sylimarin®). Esse medicamento foi concebido a partir da informação etnológica sobre a capacidade hepatoprotetora das flores de Sylibum marianum. Estudos químicos realizados com extratos obtidos a partir das flores e frutos dessa espécie de Asteraceae mostram que esses órgãos da planta sintetizam um grande número de flavonolignanas (silibinas A e B, isosilibinas A e B, silicristina, isosilicristina, silidianina) além do flavonol taxifolina, presentes majoritariamente no medicamento (Figura 18) [Kim, 2003].

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Silibina A Silibina B Isosilibina A

Isosilibina B Silicristina Isosilicristina

Silidianina Taxifolina

Figura 18- Flavonóides isolados de Silybum marianum, com atividade hepatoprotetora.

Flor de Silybum marianum (Asteraceae).

71

1.4.3- Terpenóides

Terpenóídes, de modo geral, apresentem diversidade estrutural muito grande, embora sejam biossinteticamente derivados de uma mesma unidade precursora. São metabólitos especiais amplamente distribuídosem plantas e organismos marinhos, e podem ocorrer na forma livre ou como derivados éteres, ésteres ou ainda como glicosídeos (saponinas). Estudos recentes têm demonstrado a importância farmacológica dessa classe de substâncias. Os triterpenos de esqueleto lanostano (Figura 19), isolados de Fomitopsis pinicola possuem ação antiinflamatória e são de grande interesse farmacológico, uma vez que apresentam atividade inibitória seletiva para a enzima COX-2 [Yoshikawa et al., 2005]. Já os triterpenos de núcleo oleaneno ácidos uncárico A e B (Figura 20), isolados a partir das folhas de Uncaria rhynchophylla apresentam atividade citotóxica para diversas cepas de células tumorais (A-549, HCT-15, MCF-7) [Lee et al., 2000],

a =

b =

X: R1=R2= OH Y : R1 = Ac R = a 2

Z : R1 = Ac R2 = b Xy = xilose

Figura 19- Triterpenos de esqueleto lanostano isolados do fungo Fomitopsis pinicola com atividade inibitória para COx-2.

72

Ácido uncárico A R= E-feruloila Ácido oleanólico Ácido uncárico B R= Z-feruloila

Figura 20- Ácido oleanólico e derivados.

Muitos derivados do ácido oleanólico (Figura 20) têm sido relatados na literatura desde 1978 [Heitzman et al., 2005; Mahato e Kundu, 1994] e apenas um deles revela dados sobre o direcionamento e potencial de atividade dessas substâncias [Lee et al, 2000]. Em estudos mais recentes, entretanto, são relatadas as atividades antiúlcera, antiinflamatória, antihipertriglicirêmica, antihiperglicêmica, anti-HIV e um grande potencial de atividade nos tratamentos da artrite e reumatismo apresentados para essa substância na sua forma livre [Heitzman et al., 2005; Safayhi e Sailer, 1997]. Para algumas substâncias pertencentes a essa classe de metabólitos especiais, estudos de relação estrutura-atividade mostram requisitos estruturais imprescindíveis para a obtenção da atividade antiinflamatória, tais como a presença de grupos carboxila em C-28 e C-30 [Recio, 1995; Recio, 1995a].

Biossíntese de terpenóides

A figura 21 ilustra a rota biossintética de terpenóides em plantas e a tabela 5 mostra as enzimas presentes em etapas determinantes dessa rota. Embora a via do mevalonato tenha sido considerada por muitos anos como a única rota biossintética de isoprenóides, uma rota alternativa foi descrita mais recentemente [Rohner, 1993; Knöss, 1994]. Essa rota alternativa, via triose-piruvato, inicia-se com a condensação do gliceraldeído-3-fosfato com o piruvato, dando origem ao 1-desoxi xilulose-5-fosfato. Etapas subsequentes,

73 incluindo um rearranjo intramolecular, conduzem ao difosfato de isopentenila (IPP), que é o precursor dos terpenóides em plantas. Estudos demonstram que essa via não-mevalonoídica ocorre especificamente nos plastídeos e é responsável pela formação de mono-, di- e triterpenos enquanto sesquiterpenos e esteróides são formados no citoplasma, via mevalonato [McKaskill, 1998; Adam, 1998]. A subclasse dos triterpenos é a de maior ocorrência em Rosaceae. Essas substâncias são biossintetisadas a partir do esqualeno 2,3-epóxido após a abertura do anel epóxido seguida de ciclização concertada (Figura 22). Os triterpenos pentacíclicos são divididos em subclasses baseadas nos esqueletos principais que apresentam. Três dessas subclasses são abastante conhecias; β-amirina, α-amirina e lupeol.

HO HO HO

Lupeol α-amirina β-amirina

Atualmente é possível consultar bancos de dados de genes constituintes das enzimas que participam das etapas biossintéticas de muitas classes de substâncias oriundas de plantas. As informações obtidas nesses bancos de dados são de suma importância em trabalhos de melhoramentos genéticos de plantas em que se pretende interferir ou controlar a produção de um metabólito especial de interesse.

74

HMG-CoA Piruvato + Gliceraldeído-3-fosfato 1 Ácido mevalônico 2 Ácido mevalônico-5-fosfato

Pirofosfato de isopentenila (IPP) 8 tRNA 7 Isopreno

3 Dimetilalilpirofosfato Ergolina

9,10 Pirofosfato de geranila Monoterpenos 4, 5 IPP 11, 12, 13 Pirofosfato de farnesila Sesquiterpenos 14 → IPP Esqualeno Triterpenos 4, 5

17 Fitol Tocoferóis Pirofosfato de geranilgeranila Diterpenos 18, 19, 20, 21, 22 23

Fitoeno Luteína 24 28 26, 27 ς-Caroteno α-caroteno 25 6? 5 IPP Licopeno

26

β-caroteno

Solanesilpirofosfato 28 Violaxantina Zeaxantina 29, 30 Neoxantina

6? IPP Ácido abcísico

Solanesil-50-pirofosfato Ubiquinona-45 Plastoquinona

(várias unidades) IPP Ubiquinona-50 Borracha

Figura 21- Biossíntese de isoprenóides. As etapas enzimáticas estão numeradas de acordo com a tabela 6.

75

Tabela 6- Etapas enzimáticas mostradas na figura 21. Etapa Enzima 1 3-hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A redutase 2 Ácido mevalônico quinase 3 Mevalonato-5-pirofosfato descarboxilase 4 Farnesilpirofosfato sintase 5 Geranilgeranilpirofosfato sintase 6 Hexaprenilpirofosfato sintase 7 Isopentenilpirofosfato isomerase 8 Crisantemilpirofosfato sintase 9 Linalol sintase 10 Limoneno sintase 11 5-epi-Aristoloqueno sintase 12 Vetispiradieno sintase 13 (+)-δ-Cadineno sintase 14 Esqualeno sintase 15 Esqualeno epoxidase 16 Oxidoesqualeno ciclase (cicloartenol sintase) 17 Geranilgeranilpirofosfato hidrogenase 18 Abietadieno sintase 19 Casbeno sintase 20 ent-Copalilpirofosfato sintase A 21 ent-Caureno sintase 22 Taxadieno sintase 23 Fitoeno sintase 24 Fitoeno dessaturase 25 ξ-Caroteno dessaturase 26 Licopeno ciclase (β) 27 Licopeno ciclase (ε) 28 β-caroteno hidrolase 29 Zeaxantina epoxidase 30 Violaxantina epoxidase

76

+ + O

H+ HO HO Esqualeno-2,3-epóxido

+ +

HO HO HO Cátion lupenílico

Figura 22- Biossíntese de triterpenos.

77

1.5- Desreplicação- uso de técnicas hifenadas em estudos de bioprospecção.

Existem mais de 150.000 substâncias de origem natural conhecidas [Chapmam, 1999] e novas estruturas estão sendo publicadas numa proporção de cerca de 10.000/ano. A utilização de dados espectrométricos de RMN e EM obtidos na literatura para substâncias conhecidas e a utilização de bibliotecas especializadas, auxiliam na identificação de substâncias isoladas. O reconhecimento de substâncias conhecidas em matrizes complexas naturais e extratos brutos sem a necessidade de fracionamento cromatográfico preparativo é um importante procedimento para pesquisadores envolvidos na busca de substâncias bioativas naturais. O procedimento, conhecido como desreplicação [Bradshaw, 2001], utiliza várias técnicas de análise tais como a CLAE-UV, CLAE-RMN e CLAE-EM ou uma combinação dessas e, para que esses procedimentos sejam válidos, torna-se necessário inicialmente, obter-se os dados espectrométricos e de tempos de retenção para as substâncias que serão utilizadas como padrão.

Flavonóides como padrões CLAE-UV (DAD) pode ser considerado um método rotineiro para a localização e identificação de flavonóides em plantas. Os espectros de UV obtidos durante a análise sugerem a subclasse de flavonóides analisados e o tipo específico de aglicona. A combinação dos dados de UV com os dados cromatográficos fornecem importantes informações sobre a estrutura do flavonóide investigado. As diferentes classes de flavonóides podem ser distinguidas através da análise dos espectros de UV baseados na região de absorção de 300-400 nm (Banda I, unidade cinamoíla). Saturações entre os carbonos C2 e C3 (flavanonas e flavanonóis) assim como a ausência de conjugação entre os anéis A e B (isoflavonas) causam o desaparecimento da banda de absorção máxima próxima de 350 nm. Por outro lado, a presença da ligação dupla causa um máximo de absorção que é maior em flavonas que em flavonóis. Os espectros obtidos para chalconas são caracterizados por uma forte absorção no intervalo de 350-380 nm, com pequena inflexão próximo de 240 nm e

78 mínimo em 270 nm. Adicionalmente, as razões entre as absorções máximas M1 (264 nm) e M2 (340 nm) são diferentes e típicas para cada subclasse. Agliconas diferentes pertencentes a uma mesma subclasse de flavonóides podem ser diferenciadas por comparação dos dados de UV na região 250-290 nm (Banda II, unidade benzoila), onde a forma da banda de absorção máxima está estritamente relacionada com o padrão de substituição. Considerando-se os flavonóis, o perfil das absorções máximas de derivados do kaempferol são diferentes daquelas observadas para derivados da quercetina e isoramnetina. Com relação a influência do açúcar, a intensidade de absorção em 350 nm está relacionada com a natureza do carboidrato e sua posição de ligação à aglicona. Uma possível acilação do açúcar por resíduos cinamoíla, por exemplo, resulta no deslocamento da banda de absorção máxima para comprimentos de onda mais baixos. O mesmo pode ser aplicado para outras classes de substâncias cujos dados espectroscópicos sejam conhecidos na literatura ou possam ser obtidos experimentalmente. Essa metodologia foi utilizada durante os procedimentos de separação, purificação e identificação de algumas substâncias descritas nesse trabalho, para as quais foram utilizados métodos cromatográficos usuais.

Fracionamento cromatográfico guiado por ensaios químicos e biológicos.

A utilização de fracionamento cromatográfico guiado por ensaios químicos e biológicos tem frequentemente levado ao isolamento de substâncias potencialmente ativas, presentes em extratos provenientes de material de origem vegetal, organismos marinhos e microrganismos como fungos e bactérias. O isolamento de metabólitos biativos em quantidades insuficientes para a elucidação estrutural é uma limitação encontrada quando a técnica de fracionamento cromatográfico guiado por ensaios é utilizada. Isto ocorre quando o metabólito secundário é muito ativo e o bioensaio muito sensível [Hamburger e Hostettmann, 1991]. Assim, durante os procedimentos de fracionamento guiado por ensaios biológicos, um dos fatores que merece

79 grande atenção é a escolha do bioensaio a ser empregado desde a prospecção preliminar até a avaliação de frações mais purificadas. Nos últimos anos, alguns ensaios biológicos simples e de baixo custo vêm sendo desenvolvidos para que possam ser utilizados em laboratórios fitoquímicos, por exemplo. Dentre essa nova geração de bioensaios, alguns são indicativos de atividades específicas, como por exemplo a bioautografia para a detecção de atividade antifúngica e o bioensaio com linhagens da levedura Saccharomyces cerevisiae deficientes nas vias de reparo e/ou combinação do DNA, que fornece indício de atividade antineoplásica e/ou antifúngica. Dois outros ensaios bastante utilizados em laboratório são os que utilizam soluções de β-caroteno e/ou DPPH para detecção de atividade antioxidante. Neste trabalho, foram utilizados também os ensaios de viabilidade celular utilizando método colorimétrico para detecção de atividade antitumoral.

80

2- OBJETIVOS GERAIS O trabalho desenvolvido pelo Núcleo de Bioensaios Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE), utiliza critério de seleção de espécies vegetais, baseado no uso em medicina popular, endemicidade e conhecimento do perfil fitoquímico da família ou gênero que a contém.

Os testes preliminares de bioprospecção realizados pelo NuBBE incluem ensaios biológicos de rotina como o teste com linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae, para a detecção de substâncias citotóxicas e potencialemte antitumorais [Gunatilaka et al., 1992]; a bioautografia com fungos fitopatogênicos Cladosporium, para a detecção de substâncias com atividade antifúngica e avaliação da atividade antioxidante com autografia em placas cromatográficas nebulizadas com solução metanólica de β-caroteno.

Através do projeto temático “Conservation and sustainable use of the plant diversity from Cerrado and Atlantic forest: chemical diversity and prospection for potential drugs” Biota FAPESP, foram obtidos extratos cerca de 700 espécies vegetais de Cerrado e Mata Atlântica, que foram submetidos aos testes biológicos mencionados acima e aproximadamente 8% apresentaram alguma atividade frente aos ensaios.

Dentre as espécies selecionadas Prunus myrtifolia mostrou-se bastante promissora, fato que culminou na proposta desse trabalho cujos objetivos são:

∠ Estudo químico biomonitorado da espécie Prunus myrtifolia, visando o isolamento e determinação estrutural de substâncias com atividade citotóxica, antioxidante e antifúngica. ∠ Análise do perfil químico procedendo também o fracionamento das frações inativas, objetivando o isolamento e determinação estrutural de substâncias inéditas ou de ocorrência inédita no gênero e família em estudo. ∠ Avaliação da atividade biológica das substâncias isoladas, submetendo-as a ensaios mais específicos para avaliação das atividades detectadas.

81

3- EXPERIMENTAL

3.1- Materiais e métodos 3.1.1- Solventes Os solventes utilizados para obtenção de extratos, fracionamentos e purificações são das marcas Merck (p.a) e Mallinckrodt (p.a. e HPLC). Os solventes deuterados são das marcas Aldrich, Fluka e Merck.

3.1.2- Suportes e reagentes

Para cromatografia gasosa utilizou-se coluna capilar Supelco™ SPB-5

(30m x 0,25mm x 0,10 µm). Gás de arraste (H2): 60 kPa. Gás de chama (H2):

40 kPa. Ar: 35 kpa. Gás auxiliar (N2): 35 kPa. Para cromatografia em coluna (CC) foram utilizadas sílica-gel 60H (230- 400µm- Merck), sílica de fase reversa e Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech) como fases fixas Para cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) utilizou-se colunas analítica “Luna” Phenomenex (250mm x 4.60mm) e preparativa Phenomenex (250mm x 21.20mm).

Solução de β-caroteno 0,02% em CH3OHM para o teste de detecção preliminar de atividade antioxidante (Merck). Solução de difenil-picrilhidrazila (DPPH, Aldrich) 0,004% em MeOH.

3.1.3- Equipamentos utilizados para cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e cromatografia gasosa (CG)

Cromatógrafo líquido analítico Varian Pro Star 9080 HPLC-ECD com detector eletroquímico amperométrico bomba modelo 210. Cromatógrafo preparativo binário, Varian Star Dynamax modelo SD-1, com detector UV-VIS Varian modelo 320. Cromatógrafo analítico sistema ternário Varian Pro Star modelo 240 , com auto injetor Varian Pro Star modelo 410, detector UV-Diodo Array modelo 330. Cromatógrafo gasoso Varian Chrompack modelo CP-3800, com injetor automático Varian modelo 8200..

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3.1.4- Espectrometria

Espectrômetros de ressonância magnética nuclear (RMN) Brucker AC 200, operando a 200 MHz pra 1H e 50 MHz para 13C; Varian INOVA 500, operando a 500 MHz para 1H e 125 MHz para 13C.

3.2- Testes químicos e biológicos realizados

3.2.1- Cultura de Saccharomyces cerevisiae – detecção de atividade citotóxica [Gunatilaka et al., 1994]. O ensaio biológico realizado para a detecção de atividade antitumoral utiliza um meio de cultura preparado com o extrato de levedura (1%), peptona (2%), dextrose (2%) e ágar (2%), que são pesados e solubilizados em água destilada. O meio é então esterilizado em autoclave entre 12 e 15 psi por 15 minutos. A temperatura de 40-50 °C o meio é vertido em placa de Petri e armazenado a 4° por cerca de 2 a 3 semanas. Uma solução preparada de levedura (2mL) é acrescentada à placa homogeneamente. Após 15 minutos retira-se o excesso e a placa é deixada secando. Foram feitas as cavidades nestas placas (0,5mm de diâmetro) onde as amostras testes e os padrões foram adicionados (100µL). As concentrações utilizadas dos padrões em cada linhagem são: Rad+ camptotecina (200µL. mL-1), 321 estreptonigrina (4µL.mL-1) e 52Y camptotecina (5µL. mL-1). As amostras testadas foram preparadas pesando-se 2,0 mg para fases de partição e 0,5 mg para substâncias puras em 1,0 mL de uma solução MeOH/DMSO (1:1). Os resultados destes ensaios são registrados em forma , -1 IC12 que representam a concentração em µg. mL necessária para formar um halo de inibição de 12 mm de diâmetro ao redor do ponto de aplicação da amostra [Gunatilaka et al., 1994]. Amostras são consideradas ativas quando mostraram seletividade contra uma ou mais leveduras deficientes, apresentando IC12 com valores de pelo menos um terço em relação ao tipo selvagem (RAD+) e sendo menor que 2.000.

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3.2.2- Bioautografia com fungos do gênero Cladosporium - detecção de atividade antifúngica [Homans & Fuchs, 1970]. Os ensaios são realizados no laboratório do Instituto Botânico de São Paulo, utilizando como reveladores, soluções de esporos das espécies Cladosporium cladosporoides e Cladosporium sphaerospermum. Em cromatoplacas (Merck), as amostras foram aplicadas e eluídas em solventes adequados. Após a secagem destas cromatoplacas, uma solução de glicose e sais contendo esporos do fungo foi nebulizada sobre as placas que foram incubadas à temperatura de 25°C em câmara úmida e escura por 2-3 dias. O halo de inibição aparece na placa sobre áreas onde existam substâncias fungitóxicas e este halo pode ser relacionado com a concentração da amostra aplicada, comparando-se o limite de detecção com os padrões utilizados, os antibióticos nistatina e gentamicina.

3.2.3- Autografia em CCD com β-caroteno-detecção preliminar de atividade antioxidante. [Pratt & Miller, 1984] Entre os testes preliminares mais utilizados para a detecção de substâncias com potencial atividade antioxidante encontra-se o que utiliza solução de β-caroteno (0,02% em CH3OH). O teste está fundamentado na capacidade de uma ou mais substâncias em um extrato vegetal impedir a oxidação do β-caroteno quando em contato com o ar. As substâncias (ou misturas de substâncias) são aplicadas em placas cromatográficas e eluídas em sistema de solventes apropriado de maneira a obter-se boa separação dos constituintes. Após a secagem, as placas foram nebulizadas com a solução de β-caroteno. O resultado positivo é verificado pela permanência da coloração alaranjada do β-caroteno sobre as áreas, na placa cromatográfica, onde existam substância antioxidantes que o tenham protegido contra a oxidação causada pela sua exposição à luz.

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3.2.4- Teste para detecção de atividade antimicrobiana e antifúngica [National Commitee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS, 1997]. O meio de cultura RPMI 1640, 25 de glicose em ágar é preparado dissolvendo-se o pó do meio RPMI e o tampão MOPS (pH 7,2) em duas vezes a concentração em água milli-Q e 2% de glicose (a concentração de MOPS é de 0,165 M). Esteriliza-se por filtração em membrana 0,22 µm a vácuo. Reserva-se. Prepara-se o ágar duas vezes concentrado: 30 g/L. Autoclava-se e mantém-se a 650C. Mistura-se as duas soluções em ambiente estéril e preparam-se placas deixando altura de 9 mm ou uma razão de 20 mL por placa. O preparo do inóculo é feito através de repiques de 24 a 48hs a 300C. Ressuspende-se uma alçada da amostra em 5 m\L de solução salina a 85 % e realiza-se contagem em câmara de Neubauer. Prepara-se a suspensão equivalente a 1x106 – 5x106 UFC/mL. O volume final da solução a ser inoculada na placa é de 1 mL. Incuba-se a 350C, durante 24 a 48 hs. Anfotericina B é utilizada como controle a 16 µg/mL. O resultado é avaliado medindo-se o tamanho dos halos de inibição através da medida total do diâmetro pelo verso da placa. Microorganismos utilizados: Candida albicans, C. parapsilosis, C.krusei, Cryptococcus neoformans, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis. 3.2.5- Teste de viabilidade celular utilizando método colorimétrico para detecção de atividade antitumoral [Skehan et al., 1990]. A citotoxicidade das amostras é avaliada pelo método da sulforodamina B. São plaqueadas cinco placas de 96 cavidades por experimento, uma para cada linhagem celular testada (MDA/MB-435, SF-295 e HCT-8) e uma placa em tempo-zero com as três linhagens. As células são plaqueadas nas seguintes concentrações: MDA/MB-435 e SF-295, 0,1 x 106 cél/mL e HCT-8, 0,7 x 105 cél/mL. Após 24 horas de incubação, é fixada a placa de tempo zero em ácido tricloroacético 50% gelado e, as demais placas são incubadas com as drogas na concentração de 100 ug/mL. As amostras são testadas em duplicata. Estas placas são fixadas após 48 horas de incubação com as drogas. Todas as placas são coradas com sulforodamina B e lidas em espectrofotômetro de placa no comprimento de onda de 540nm.

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O percentual de crescimento celular (%G) é calculado comparando a absorbância do teste com o controle (100%), tempo-zero (0%) e padrões doxorubicina e taxol (100% de inibição). As amostras são classificadas em sem atividade (SA), com pouca atividade (aquelas que provocaram inibição de até 50% do crescimento, PA), com moderada atividade (aquelas que provocaram inibição entre 50% e 75% do crescimento, MO), e com muita atividade (aquelas que provocaram inibição maior que 75% do crescimento, MA). As linhagens utilizadas, MDA/MB- 435 (mama - humano), SF - 295 (Sistema Nervoso Central - humano) e HCT-8 (cólon - humano), foram cedidas pelo Mercy Children´s Hospital, tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640, suplementados com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos, mantidas em estufa a 37 C e atmosfera contendo 5% de CO2.

3.2.6- Ensaio colorimétrico com 2,2- difenil-picrilhidrazila (DPPH) – detecção do potencial seqüestrador de radicais livres [Ribeiro, 2005]. Em solução, o radical DPPH apresenta cor violeta intensa que é conseqüência do elétron desemparelhado. Esse radical absorve a 517 nm e um decréscimo nesse comprimento de onda ocorre pela estabilização do radical através do recebimento de um hidrogêncio radicalar da espécie antioxidante, que é indicada pela mudança de cor.

N + RH HN O N NO 2 2 O2N NO2

NO2 NO2

(máxima absorção a 517 nm) (Diminuição na absorção a 517 nm)

Redução do radical difenil-picrilhidrazila (DPPH)

86

A solução a 0,004% (2 mL) de DPPH é utilizada como fonte de radicais livres e e adicionada à soluções de diferentes concentrações (5, 10, 20, 40, 80 e 100 µmol.mL-1) das amostras a serem testadas. Após 30 minutos de reação, realiza-se a leitura da absortividade molar destas soluções a 517 nm. O decréscimo na absortividade molar expressa o potencial antioxidante da amostra teste que é representada por uma curva da concentração pela porcentagem da ariação da absortividade molar (∆A).

3.3 – Estudo fitoquímico guiado por ensaios químicos e biológicos

Em experimento preliminar, pequenas quantidades de extratos etanólico, diclorometânico e hexânico foram obtidas a partir das folhas de Prunus myrtifolia que em seguida foram submetidos aos ensaios descritos nos itens 5.2.1.1, 5.2.1.2 e 5.2.1.3. O Extrato etanólico (Extr. EtOH) apresentou atividade frente às leveduras de S. cerevisiae RAD+ (IC12 = 12 mm) e 52Y (IC12 = 18 mm) e atividade antioxidante sobre β-caroteno e os extratos diclorometânico e hexânico apresentaram atividade moderada frente ao fungo fitopatogênico Cladosporium sphaerospermum (Tabela 7).

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Tabela 7- Resultados dos ensaios realizados com os extratos de Prunus myrtifolia.

Parte Extrato S. cerevisaea Bioautografiab c/ Autografia c/ β-carotenoc da planta C. sphaerospermum Rad+ 52Y 321 Folhas EtOH 12 18 i +++ (0,52) 2 - 4,5 Folhas DCM - - ++ (0,69) - Folhas Hex - - ++ (0,62) - aA dose resposta é dada em mm (diâmetro do halo de inibição), b alíquota de 500 mg de extrato foi aplicada nas cromatoplacas. (i) inativo, + baixa atividade, ++ atividade moderada, +++ atividade forte. Os valores entre parênteses equivalem aos Rf(s) das manchas apresentadas pelos extratos no sistema c Hex/CH2Cl2/IsopropOH (60:36:4). Representado pelos Rf(s), das manchas onde persistiu a cor amarela do β-caroteno. Sistema de eluição: CHCl3/MeOH/H2O/HOAc (65:30:3:2).

3.4- Coleta de material vegetal e obtenção de extratos e fases de partição

O material vegetal [folhas (1400 g) e galhos finos (600 g)] foi coletado em maio de 2001 na Fazenda Campininha em São Paulo, secado em estufa a 40oC, triturado em moinho de facas e extraído com etanol. Os extratos obtidos [Extr. EtOH(folhas) = 120 g e Extr. EtOH(galhos) = 42,g ] foram submetidos a partições líquido-líquido com diferentes solventes (Figuras 23 e 24), que deram origem às fases de partição mostradas na Tabela 8.

Tabela 8- Quantidades obtidas para extratos de galhos e folhas de Prunus myrtifolia e as respectivas fases de partição. Massa (g) Extrato F. Hex F. CHCl3 F. AcOEt F. n-BuOH F. Aquosa Extr. EtOH (folhas) 16,0 7,9 7,2 12,0 2,4 (alíquota de 50,0 g) Extr. EtOH (galhos) 7,8 6,3 3,2 16 1,9 (42,0 g)

88 Extr. EtOH (folhas) 50,0 g

1- Susp. MeOH/H2O (9:1) 2- Partição c/ hexano

F. Hidroalcoólica F. Hex(f) (16,0 g)

Partição c/ CHCl3

F. CHCl3(f) F. Hidroalcoólica (7,9 g)

Partição c/ AcOEt

F. Hidroalcoólica F. Ac(f)

(7,2 g) 1- Adição de H2O 2- Partição c/ n-BuOH

F.Aq(f) F. n-BuOH(f) (~9,0 g) (12,0 g)

Figura 23- Fluxograma do fracionamento cromatográfico do extrato etanólico dos folhas de Prunus myrtifolia (Extr. EtOH).

89 Extr. EtOH (galhos) 42,0 g

3- Susp. MeOH/H2O (9:1) 4- Partição c/ hexano

F. Hidroalcoólica F. Hex(g) (7,8 g)

Partição c/ CHCl3

F. CHCl (g) 3 F. Hidroalcoólica (6,3 g)

Partição c/ AcOEt

F. Hidroalcoólica F. Ac(g) (550 mg) 3- Adição de H2O 4- Partição c/ n-BuOH

F.Aq(g) F. n-BuOH(g) (~1,9 g) (16,0 g)

Figura 24- Fluxograma do fracionamento cromatográfico do extrato etanólico dos galhos de Prunus myrtifolia (Extr. EtOH).

Dando continuidade, as fases hexânica e clorofórmica das partições dos extratos de galhos e folhas [(F.Hex(g), F.Hex(f), F.CHCl3(g) e F.CHCl3(f)] foram submetidas a ensaio para detecção de atividade antifúngica (ver 3.2.1.2) e as fases Ac(g), Ac(f), n-BuOH(g) e n-BuOH(f) foram submetidas a testes para detecção de atividade citotóxica (ver 3.2.1.1), utilizando cepas selvagens e transgênicas de Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos com esses ensaios são descritos nas tabelas 9 e 10.

90

Tabela 9- Resultados obtidos com o bioensaio para detecção de atividade antifúngica (item 3.2.1.2) para as fases F. Hex(f), F. Hex(g), F. CHCl3(f) e F. CHCl3(g) de partição dos extratos etanólicos de galhos e folhas de Prunus myrtifolia. Amostra C. sphaerospermum C. cladosporioides F. Hex(f) Rastro (*) i F. Hex(g) Rastro (*) i F. CHCl3(f) 0.6/0.76 (***/*) 0.6/0.76 (*/*) F. CHCl3(g) Rastro/0.61/0.71 0.61/0.71 (*/*) i = inativo.

Tabela 10- Resultados obtidos com o bioensaio para detecção de atividade citotóxica (item 3.2.1.1) para as fases de partição dos extratos etanólicos de galhos e folhas de P. myrtifolia. Amostra Cepas de S. cerevisaea Rad+ 52Y 321 F.Ac(f) i i 8 F.Ac(g) i i i F.BuOH(f) 8 i i F.BuOH(g) i i i A dose resposta é dada em mm (diâmetro do halo de inibição).

As fases de partição foram submetidas também ao ensaio para detecção de atividade antitumoral (ver 3.2.1.5). Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 11.

Tabela 11- Resultados obtidos com o teste para detecção de atividade antitumoral. Amostra MDA/MB-435 SF - 295 HCT-8 FAc(f) SA -76,72526 SA -76,077701 SA -103,85844 FAc(g) SA -65,78776 SA -52,128792 SA -62,346993 FAq(f) SA -64,795409 SA -62,591623 SA -65,104712 FAq(g) SA -68,388224 SA -85,209424 SA -78,612565 FBu(f) SA -52,897135 SA -81,50612 SA -84,699308 FBu(g) SA -80,240885 SA -43,187866 SA -46,381054 FCHCl3(f) MO 67,321089 MA 81,776765 PA 26,1959 FCHCl3(g) SA -57,584635 SA -54,364023 SA -62,666312 FHex(f) SA -15,00651 SA -41,910591 SA -64,262906 FHex(g) SA -44,303385 SA -39,675359 SA -66,178819 MDA/MB- 435 (mama - humano), SF - 295 (Sistema Nervoso Central - humano) e HCT-8 (tumor de cólon humano). SA – sem atividade, PA – pouca atividade (inibição até 50%), MO – moderada (inibição entre 50 E 75%), MA – muito ativo (inibição maior que 75%).

91

Todas as fases de partição obtidas foram testadas para detecção de atividade antioxidante (ver 3.2.1.3), utilizando placas cromatográficas nebulizadas com solução de β-caroteno. F.Hex(g), F.Hex(f), FCHCl3(g) e

FCHCl3(f) foram eluídas em CHCl3/MeOH (99,8/0,2). Após 24h a placa não apresentou a permanência da coloração alaranjada da solução de β-caroteno, indicando que nessas fases não ocorrem substâncias com atividade antioxidante. As fases AcOEt(g), AcOEt(f), n-BuOH(g) e n-BuOH(f) foram eluídas em CHCl3/MeOH/H2O (65:30:5) e após 24h observou-se que, em manchas correspondentes à substâncias presentes nas fases AcOEt(g), AcOEt(f), n-BuOH(f) e n-BuOH(g), a coloração alaranjada do β-caroteno foi mantida. Todas as fases de partição descritas acima foram submetidas a análise por cromatografia em placa utilizando os mesmos procedimentos descritos e nebulizadas com o reagente de Dragendorf, utilizado para detecção da presença de alcalóides. Nenhuma das fases analisadas apresentou resultado representativo para a presença dessas substâncias. Em seguida as fases de partição foram submetidas a fracionamentos cromatográficos diversos (CC em gel de sílica, CC em gel Sephadex LH-20™, CLAE-UV preparativo), e as frações obtidas foram analisadas através de CCDC ou CLAE analítico (figuras 25-55; tabelas 11-32) que resultaram no isolamento e identificação de 31 substâncias. Nos fluxogramas são descritos os trabalhos de fracionamento realizados apenas com as frações mais importantes. As demais não foram trabalhadas porque mostraram-se constituídas de misturas complexas com pequena quantidade de massa, ou por conterem grande quantidade de material graxo e/ou de pigmentos.

92

3.4.1- Fracionamento da fase hexânica da partição do extrato etanólico das folhas [F.Hex(f)].

FH(f) (2,0 g)

CC com gel de sílica Hex→AcOEt→CH3OH // //

FH(f)-1 FH(f)-18 FH(f)-38 (39 mg) (238,9 mg) FH(f)-20 CCDP CC sílica gel (60-200 µm) Mistura de DCM/AcOEt (59,6 mg) FH(f)-22 CHCl3//CH3OH (95:5). hidrocarbonetos (99:1) (62,0 mg) // // CCDP // // (550 mg) DCM/CH OHt 3 CC c/ gel de sílica FH(f)-43 (99,5:0,5) → → Hex AcOEt CH3OH (25,5 mg) // // FH(f)-38.10 FH(f)-18.5 // //

FH(f)-20.5 9 FH(f)-22.5 6 + 7 10 ( 10,5 mg) (9 mg) 8 FH(f)-38.7 ( 19 mg) 1 + 2 + 3 ( 22 mg) 6 (6 mg)

Figura 25 - Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase hexânica de partição do extrato etanólico das folhas [FH(f)].

Tabela 12- Frações obtidas a partir do fracionamento cromatográfico de[FH(f)]. Frações reunidas Massa em mg Atividade Código antifúngicaa 1→ 13 FH(f)-1 550 - 18 → 19 FH(f)-18 39,0 - 20 FH(f)-20 59,6 - 22→24 FH(f)-22 62,0 ** 25 → 29 FH(f)-25 103,1 - 30 → 35 FH(f)-30 148,5 - 36 → 37 FH(f)-36 94,5 - 38 → 40 FH(f)-38 238,9 - 41 → 42 FH(f)-42 55,1 - 43 → 45 FH(f)-43 25,5 - 46→ 51 FH(f)-46 120,8 - 52→53 FH(f)-52 138,2 - 60 FH(f)-60 105,2 - a – resultados obtidos através do teste descrito no item 5.2.1.2. ** = atividade moderada.

93

3.4.2- Fracionamento da fase hexânica da partição do extrato etanólico dos galhos [FHex(g)].

FH(g) (1,8 g) CC com gel de sílica → → Hex AcOEt CH3OH // //

FH(g) -1 FH(g) -7 FH(g) -33 (66mg) (75 mg)

FH(g)-23 CCDP CCDP ( 215 mg) Hex/AcOEt (6:4) CHCl3 / /CH3 OH hidrocarbonetos (93:7). // // CCDP (590 mg) CHCl //CH OH 3 3 // // (95:5). // // FH(g) -7.3 FH(g) -33.5

FH(g)-23.3 4 + 5 6 + 7 (15 mg) (29 mg) 1 + 2+ 3 (19 mg)

Figura 26- Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase hexânica de partição do extrato etanólico das galhos [ FH(g) ].

Tabela 13- Frações obtidas a partir do fracionamento cromatográfico de [FH(g)]. Frações reunidas Quantidades Atividade Código obtidas (mg) antifúngica 1→ 6 FH(g)-1 590 - 7 → 10 FH(g)-7 66 - 11 → 18 FH(g)-11 140 - 19 → 21 FH(g)-19 88,5 - 22 FH(g)-22 25,0 - 23 → 27 FH(g)-23 215 * 28 → 36 FH(g)-28 26 - 37 → 40 FH(g)-37 12,7 - 41 → 61 FH(g)-41 280 - 62 → 64 FH(g)-62 25 - 65 → final FH(g)-65 144 - a – resultados obtidos através do teste descrito no item 5.2.1.2. * = atividade fraca.

94

3.4.3- Fracionamento da fase clorofórmica de partição do extrato etanólico das

folhas [FCHCl3(f)].

FCHCl (f) 3 (2,0 g) CC com gel de sílica

Hex→AcOEt→CH3OH // //

FCHCl (f)-41 FCHCl3(f)-7 FCHCl3(f)-9 FCHCl3(f)-36 3 FCHCl3(f)-45 ( 13,8 mg) (119 mg) CC sílica gel (60-200 µm) CC sílica gel (60-200 µm) 8 1+2+3 Hex/AcOEt (1:9). CHCl3//CH3OH (9:1). 11+12 // // // //

FCHCl (f)-36.2 FCHCl (f)-36.5 FCHCl3(f)- FCHCl3(f)- 3 3 41.6 ( 2,8 mg) (2,0 mg) 41.10 (18,3 mg) (7,4 mg)

Misturas binárias Misturas binárias de triterpenos de triterpenos urseno/oleaneno urseno/oleaneno

FCHCl3(f)-46 CLAE H2O→CH3OH Com padrão FCHCl3(f)-47 // // CLAE-UV H2O→CH3O 15 (16 mg) 15 + impurezas

Figura 27- Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase clorofórmica de partição do extrato etanólico das folhas [FCHCl3(f)].

95

Tabela 14- Frações obtidas a partir do fracionamento de [FCHCl3(f)] e atividades antioxidantes observadas. Fração Massa Atividade Fração Massa Atividade (mg) antioxidante (mg) Antioxidantea FCHCl3(f)-3 4,1 - FCHCl3(f)-36 13,8 - FCHCl3(f)-6 3,7 - FCHCl3(f)-37 3,5 - FCHCl3(f)-7 3,0 - FCHCl3(f)-38 105,4 - FCHCl3(f)-8 7,2 - FCHCl3(f)-41 119,6 - FCHCl3(f)-9 29,9 - FCHCl3(f)-44 42,1 - FCHCl3(f)-10 7,8 - FCHCl3(f)-45 93,9 - FCHCl3(f)-12 26,5 - FCHCl3(f)-46 216,7 - FCHCl3(f)-14 58,4 - FCHCl3(f)-47 191,7 ** FCHCl3(f)-15 13,6 - FCHCl3(f)-48 135,4 - FCHCl3(f)-16 4,3 - FCHCl3(f)-49 122,0 - FCHCl3(f)- 17 69,0 - FCHCl3(f)-50 135,7 - FCHCl3(f)-25 77,5 - FCHCl3(f)-51 51,4 - FCHCl3(f)-30 80,9 - FCHCl3(f)-52 117,2 - FCHCl3(f)-33 175,9 - FCHCl3(f)-52 117,2 -

a – resultados obtidos através do teste descrito no item 5.2.1.3. Eluente: CHCl3/CH3OH (93:7). ** = atividade moderada.

3.4.4- Fracionamento da fase clorofórmica de partição do extrato etanólico das galhos [FCHCl3(g)].

FCHCl3(g) (2,3 g)

CC sílica gel

Hex→AcOEt→CH3OH // //

FCHCl3(g)-28 FCHCl3(g)-36 (119,1 mg) (60,3 mg) FCHCl3(g)-44

CC RP 18 CC CC → H2O CH3OH Hex→AcOEt→CH3OH Hex→AcOEt→CH3OH // // // // // //

FCHCl3(g)- 44.c FCHCl3(g)- 28.2 FCHCl (g)- 36.25 3 (12 mg) (8,8 mg) (7 mg)

→ CLAE-UV, H2O CH3OH 254 nm, 1mL/min. 15 30 28 + 29

Figura 28- Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase clorofórmica de partição do extrato etanólico dos galhos [FCHCl3(g)].

96

Tabela 15- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FCHCl3(g) e atividade antioxidante observada. Fração Quantidade Atividade (mg) antioxidante FCHCl3(g)-1 4,8 - FCHCl3(g)-3 9,9 - FCHCl3(g)-6 10,8 - FCHCl3(g)-10 26,1 - FCHCl3(g)-13 155,5 ** FCHCl3(g)-23 42,8 - FCHCl3(g)-28 119,1 ** FCHCl3(g)-32 77 - FCHCl3(g)-36 60,3 - FCHCl3(g)-37 59,9 * FCHCl3(g)-38 838,8 * FCHCl3(g)-44 266 ** a – resultados obtidos através do teste descrito no item 5.2.1.3. Eluente: CHCl3/CH3OH (93:7). * = atividade fraca. ** = atividade moderada.

√ Fracionamento de FCHCl3(g)-28 – CRC de fase reversa [2,0 x 10 cm,

(CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH

Tabela 16- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FCHCl3(g)-28. Eluente Volume Fração obtida Atividade (mL) (massa em mg) antioxidantea 1:9 (40 mL) (40 mL) FCHCl3(g)-28.1 (0,1) -

4:6 (30mL) (30mL) FCHCl3(g)-28.2 (8,8) ** 1:1 (50 mL) (50 mL) FCHCl3(g)-28 (14,7) * 6:4 (30 mL) (30 mL) FCHCl3(g)-28.4 (11) * 10:0 (50 mL) (50 mL) FCHCl3(g)-28.5 (45,3) * a – resultados obtidos através do teste descrito no item 5.2.1.3. Eluente: CHCl3/CH3OH (9:1). * = atividade fraca ** = atividade moderada.

97

Absorbance 240.00 nm mAU

30

20

10

0

-10

-20

-30

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 minutes B a se lin e C o rre c tio n

Figura 29 - Cromatograma obtido através de CLAE-UV para a

subfração FCHCl3(g)-28.2, CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH, 1mL/min., 240 nm.

3.4.5- Fracionamento da fase acetato de etila de partição do extrato etanólico das folhas [F.AcOEt(f)].

FAc(f)

(1,0 g) * CRC com gel de sílica AcOEt/CH3OH (9:1) // //

Fac(f)-6 Fac(f)-11 Fac(f)-18 Fac(f)-20 Fac(f)-28 (36 mg) (65 mg) CLAE-UV CLAE-UV analítico CC fase reversa CC fase reversa H2O/CH3OH (47:53) → H O→CH OH H O→CH OH 254 nm, 10 mL/min. H2O CH3OH. 2 3 2 3 c/ padrões // // CRC com gel de sílica* CHcl3/CH3OH (75:25) 18 CLAE analítico ( mg) → Fac(f)-18.2 H2O CH3OH Fac(f)-20.1 Frações Fac(f)-20.20 intermediárias 21 Figuras 31 e 32 (12,0 mg) CLAE-UV → 15 H2O CH3OH. 22 ( 102,7 mg) ( 4 mg) Figuras 34 e 35

* Parcialmente desativada com 10% de H2O

Figura 30- Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase acetato de etila de partição do extrato etanólico das folhas [FAc(f)].

98

Tabela 17- Frações obtidas a partir do fracionamento de FAcOEt(f) e atividade antioxidante observada. Frações reunidas Massa (mg) Atividade antioxidante FAcOEt(f)-1 12,0 - FAcOEt(f)-6 36,5 ** FAcOEt(f)-11 58,2 ** FAcOEt(f)-17 23,4 - FAcOEt(f)-18 90,4 * FAcOEt(f)-20 359,0 ** FAcOEt(f)-26 108,3 - FAcOEt(f)-28 159,5 ** a – resultados obtidos através do teste descrito no item 5.2.1.3. Eluente:CHCl3/CH3OH (9:1). ** = atividade moderada.

√ Fracionamento de FAc(f)-6 e FAc(f)-11 – CRC de fase reversa [1,5 x 10 cm, (H2O → CH3OH].

Tabela 18- Frações obtidas a partir do fracionamento de FAcOEt(f)-6 e atividade antioxidante observada. Eluente Frações Massa (mg) Atividade a H2O/CH3OH reunidas antioxidante 95:5 FAc(f)-6.1 5 ** 8:2 FAc(f)-6.2 19 - 0:10 FAc(f)-6.3 1,6 - a – resultados obtidos através do teste descrito no item 5.2.1.3. Eluente: CHCl3/CH3OH (9:1). * = atividade fraca. ** = atividade moderada.

Tabela 19- Frações obtidas a partir do fracionamento de FAcOEt(f)-11 e atividade antioxidante observada.

Eluente Frações Massa (mg) Atividade a H2O/CH3OH reunidas Antioxidante 95:5 FAc(f)-11.1 7,3 ** 8:2 FAc(f)-11.2 1,2 - 8:2 FAc(f)-11.3 2,0 - 1:1 FAc(f)-11.4 9,8 - 0:10 FAc(f)-11.5 20,1 - 100% DCM FAc(f)-11.6 1,0 - a – resultados obtidos através do teste descrito no item 5.2.1.3. Eluente: CHCl3/CH3OH (9:1). * = atividade fraca. ** = atividade moderada.

99

mAU 20 (a) 10 0 -10

-20 (b) mAU

5.0 2.5 0.0 -2.5 -5.0 (c) mAU 7.5 5.0 2.5 0.0

-2.5 -5.0 5101520 Minutes

Figura 31 - Cromatogramas obtidos através de CLAE fase reversa para a fração FAc(f)-6 (a) e as subfrações FAc(f)-6.1(b) e FAc(f)-6.3 (c).

CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH, 1mL/min., 254 nm.

mAU 75 50 (a) 25 0 -25 mAU

20 (b) 10 0 mAU 75 (c) 50 25 0 mAU 20 (d) 10 0 5101520 Minutes

Figura 32 - Cromatogramas obtidos através de CLAE fase reversa para a fração FAc(f)-11(a) e as subfrações FAc(f)-11.1 (b), FAc(f)-11.4 (c)

e FAc(f)-11.5 (d). CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH, 1mL/min., 254 nm.

100

√ Fracionamento de FAc(f)-18 – CRC de fase reversa [2,0 x 60 cm,

CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH

Tabela 20- Subfrações obtidas a partir do fracionamento da fração FAcOEt(f)-18 e atividade antioxidante observada.

MeOH:H2O (mL) Fração obtida Atividade (massa em mg) antioxidante 1:9 (40 mL) FAcOEt(f)-18.1 (0,1) - 2:8 (30mL) FAcOEt(f)-18.2 (8,8) ** 1:1 (50 mL) FAcOEt(f)-18.3 (14,7) * 6:4 (30 mL) FAcOEt(f)-18.4 (11) * 10:0 (50 mL) FAcOEt(f)-18.5 (45,3) - a – resultados obtidos através do teste descrito no item 5.2.1.3. Eluente: CHCl3/CH3OH (9:1). * = atividade fraca. ** = atividade moderada.

Absorbance 254.00 nm Absorbance 237.00 nm mAU mAU

(a) 250 (b) 250

200 200

150 150

100 100

50 50

0 0

-50 -50 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 minutes Baseline Correction minutes Baseline C orrection Figura 33 - Cromatogramas obtidos através de CLAE-UV fase reversa para a subfração

FAc(f)-18.2. (a) 254 nm, (b) 237 nm. CH OH/H O (5% → 100%) CH OH, 1mL/min., 3 2 3

√ Fracionamento de FAc(f)-20– CC de sílica [1,5 x 60 cm, CHcl3/CH3OH (75:25)].

Tabela 21- Subfrações obtidas a partir do fracionamento da fração FAcOEt(f)-20 e atividade antioxidantes observada. Fração Massa em mg Atividade antioxidante FAcOEt(f)-20.1 102,7 ** FAcOEt(f)-20.3 34,5 * FAcOEt(f)-20.4 56,0 * FAcOEt(f)-20.6 22,3 * FAcOEt(f)-20.8 25,0 ** FAcOEt(f)-20.14 33,4 - FAcOEt(f)-20.16 17,2 - FAcOEt(f)-20.18 7,0 - FAcOEt(f)-20.20 3,1 *

101

A figuras 34 e 35 mostram o grau de pureza obtido para as subfrações Fac(f)-20.1 e Fac(f)-20.20, bem como as frações intermediárias obtidas durante o fracionamento através de cromatografia em coluna.

II+ mAU Fac(f)-20.1 300 (a) 100

II+ mAU 50 (b)

II+ mAU 150 50 (c)

II+ mAU (d) 0

II+ mAU FAc(f)-20.8 200 100 (e) 0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

Minutes Figura 34 - Cromatogramas obtidos via CLAE-UV fase reversa para as subfrações: (a) Fac(f)-20.1, b) Fac(f)-20.3, c) Fac(f)-20.4 e d) Fac(f)-20.6

e (e) Fac(f)-20.8. CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH, 1mL/min., 254 nm.

II+ mAU 200 (a) 100 0

II+ mAU 200 (b) 100 0

II+ mAU (c) 0

II+ mAU 50 (d) 0

II+ mAU 50 (e) FAc(f)-20.20 0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Figura 35 - Cromatogramas obtidos via CLAE-UV fase reversa para as subfrações Fac(f)-20.8, b) Fac(f)-20.14, c) Fac(f)-20.16 e d) Fac(f)-20.18

e (e) Fac(f)-20.20. CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH, 1mL/min., 254 nm.

102

3.4.6- Fracionamento da fase acetato de etila de partição do extrato etanólico dos galhos [F.Ac(g)]

FAc(g) (550 mg) CC Sephadex LH-20 CH3OH // //

Fac(g)-4 Fac(g)-8 Fac(g)-14 (47mg) (121,2 mg) (72 mg) CLAE-UV CC fase reversa. CLAE-UV H2O/CH3OH (1:1) → H2O CH3OH 254 nm,1 mL/min. H2O/CH3OH (7:3) 254 nm, 12 mL/min. Figuras 39 e 40 // // // //

Fac(g)-4.4 Fac(g)-14.2

11 + 12 19 (22,0 mg) (13 mg) CLAE-UV H2O/CH3OH. (85:15) 237 nm, 1 mL/min.

Fac(g)-4.4a Fac(g)-4.4b (12 mg) (6 mg)

11+12 31

Figura 36- Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase acetato de etila de partição do extrato etanólico dos galhos [Fac(g)].

Tabela 22- Frações obtidas a partir do fracionamento de FAc(g) e atividades antioxidantes observadas. Fração Massa em mg Atividade antioxidante FAc(g)-1 5 - FAc(g)-2 52 - FAc(g)-3 9,9 - FAc(g)-4 47,6 - FAc(g)-6 60 ** FAc(g)-7 50 - FAc(g)-8 121,2 * FAc(g)-12 87 ** FAc(g)-14 72,0 - FAc(g)-16 26,7 - FAc(g)-21→final 23,5 -

103

√ Fracionamento de FAc(g)-4. CLAE-UV H2O/CH3OH (1:1) e CLAE-UV

H2O/CH3OH (85:15)

11 + 12 + 31

mAU 4.035 200

150

100

2. 917

50

8.880 6.027 6.907 8.277 12.307 10. 000 20. 563 13.773 14.147 0

-19 5101520 Mi nu te s Figura 37- Cromatograma obtido em CLAE-UV fase reversa preparativo para FAc(g)-4. H2O/CH3OH (1:1), 10 mL/min, 236 nm.

mAU 75 31

50

25

0 mAU 11 + 12

30

20

10

0

-10

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

Minutes Figura 38- Cromatograma obtido em CLAE-UV fase reversa preparativo para FAc(g)-4.4. H2O/CH3OH (85:15), 12 mL/min, 236 nm.

104

√ Fracionamento de FAc(g)-8.

mA U d:\luciana\fac(g)-8.run

100

50

0 Figura 39 – Cromatograma obtido através de CLAE-UV analítico

-50 para a fração FAc(g)-8. -61 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 CH OH/H O (5% → 100%) Minutes 3 2 CH3OH, 254 nm.

FAc(g)-8 (261,2 mg) CC fase reversa.

H2O→CH3OH // //

FAc(g)-8.2 Fac(g)-8.10 FAc(g)-8.16 (42,0 mg) (33 mg) (64,8 mg)

CLAE-UV DAD e CLAE-UV CLAE-UV DAD CLAE-EM H2O/CH3OH. (65:35) H O→CH OH. → 2 3 H2O CH3OH. 254 nm. 12 mL/min. (1 mL/min; 20 min.) (1 mL/min; 20 min.) // // 16 + 18 14 + 26 + 27 Fac(g)-8.10-1 Fac(g)-8.10-2 Fac(g)-8.10-3

23

24 + 25

CLAE-UV H2O/CH3OH. (73/27; 1 mL/min.)

Fac(g)-8.10-2a Fac(g)-8.10-2b CLAE-UV DAD CLAE-EM H2O→CH3OH. (1 mL/min; 20 min.) 24 e 25

Figura 40 - Fluxograma de fracionamento da fração FAc(g)-8.

105

Tabela 23- Subfrações obtidas a partir do fracionamento da fração FAc(g)-8 e atividade antioxidantes observada.

MeOH/H2O (mL) Fração obtida Atividade (massa em mg) antioxidante 5:95 FAc(g)-8.2 (45,2) ** 1:9 FAc(g)-8.7 (2,5) * 2:8 FAc(g)-8.9 (3,0 * 3:7 FAc(g)-8.10 (21,9) ** 4:6 FAc(g)-8.15 (0,1) - 1:1 FAc(g)-8.16 (76,5) ** 10:0 FAc(g)-8.19 (68,2) ** a – resultados obtidos através do teste descrito no item 5.2.1.3. Eluente: CHCl3/CH3OH (9:1). * = atividade fraca. ** = atividade moderada.

mAU 40 (a) 30 20 10 0 mAU (b) 75

50

25 0 mAU 100 (c)

75 50 25 0 5101520 Minutes Figura 41- Cromatogramas obtidos através de CLAE-UV fase reversa analítico para: (a) FAc(g)-8.2, (b) FAc(g)-8.10 e (c) FAc(g)-8.16. CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH, 254 nm, 1mL/min.

√ Fracionamento de FAc(g)-8.10. CLAE-UV CH3OH/H2O (65:35).

Tabela 24- Subfrações obtidas a partir do fracionamento da fração FAc(g)- 8.10 e atividade antioxidantes observada. Fração obtida Atividade antioxidante FAc(g)-8.10.1 ** FAc(g)-8.10.2 ** FAc(g)-8.10.3 ** a – resultados obtidos através do teste descrito no item 5.2.1.3. Eluente: CHCl3/CH3OH (9:1). * = atividade fraca. ** = atividade moderada.

106

mA U 15 (a) 10

5 0

-5 (b) mA U 70 60 50 40 30 20

10 0

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Minutes Figura 42 - Cromatogramas obtidos através de CLAE fase reversa analítico para as subfrações FAc(g)-8.10.1 (a) e FAc(g)-

8.10.2 (b). CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH, 254 nm, 1mL /min.

mA U

40 (a) 30

20

10

0

mA U 70 (b) 60

50

40

30

20

10

0

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

Minutes Figura 43 - Cromatogramas obtidos através de CLAE fase reversa analítico para as subfrações FAc(g)-8.10.2a (a) e

FAc(g)-8.10.2b (b). CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH, 254 nm, 1mL/min

107

√ Fracionamento de FAc(g)-14. CLAE fase reversa H2O/CH3OH (7:3).

mAU

40

30 19

20 7. 360 9. 760 13.235

10 5.656 2.864 3.752 0

-8 5101520 Mi n ut e s

Figura 44 - Cromatograma obtido através de CLAE-UV fase reversa preparativo para a fração FAcOEt(g)-14, MeOH/H2O (1:1), 10 mL/min., 237 nm.

Tabela 25- Subfrações obtidas a partir do fracionamento da fração FAct(g)- 14 e atividade antioxidantes observada. Fração Massa em mg Atividade antioxidante FAcOEt(g)-14.1 - - FAcOEt(g)-14.2 3 * FAcOEt(g)-14.3 3,8 - FAcOEt(g)-14.4 2,5 - FAcOEt(g)-14.5 - - FAcOEt(g)-14.6 - - a – resultados obtidos através do teste descrito no item 5.2.1.3. Eluente: CHCl3/CH3OH (9:1). * = atividade fraca.

108

3.4.7- Fracionamento da fase butanólica de partição do extrato etanólico das folhas [FBuOH(f)]

Uma alíquota de 3,0 g da fase n-BuOH(f) foi submetida a fracionamento cromatográfico em coluna de Sephadex LH-20™ eluída com metanol. Foram coletadas 99 frações de 10 mL cada, que após análise por CCDC, foram reunidas de acordo com as semelhanças apresentadas. A fração n-BuOH(f)-9 foi submetida a fracionamento cromatográfico através de CLAE-UV fase reversa preparativo, que levou ao isolamento das substâncias 16, 17 e 18 (Figuras 45, 47 e 48).

FBu(f) (3,0 g)

CC Sephadex LH-20 CH3OH // //

FBu(f)-1 FBu(f)-4 FBu(f)-6 FBu(f)-9 FBu(f)-10 FBu(f)-12 (50,0 mg) (2,3 g) (31 mg) (139,0 mg) (103,2 mg) (10 mg)

CLAE-UV analítico CLAE-UV prep. RMN CLAE analítico → CH3OH/H2O (25:75) H2O CH3OH H2O→CH3OH CLAE-UV analítico 254 nm, 10 mL/min. Açúcares C/ padrões CLAE-UV prep. 16+17+18+20 H2O→CH3OH CH3OH/H2O (3:7) C/ padrões 18 + 254 nm, 12 mL/min. impurezas FBu(f)-12.1 FBu(f)-12.2 (2,5 mg) (5,0 mg) 13 + 14 + 18 FBu(f)-9.5 FBu(f)-9.6 FBu(f)-9.7

CLAE-UV analítico H2O→CH3OH 16 17 18 c/ padrões

16 + 20

Figura 45- Fluxograma de fracionamento cromatográfico da fase butanólica de partição do extrato etanólico de folhas [FBu(f)].

109

Tabela 26- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FBu(f) e atividade antioxidante observada. Fração Atividade Fração Atividade obtida Massa em mg antioxidante obtida Massa em mg antioxidante [frações reunidas] [frações reunidas] FBu(f)-1 50 [23-31] i FBu(f)-10 60 [73-75] ** FBu(f)-2 139 [32-36] i FBu(f)-11 14 [76] * FBu(f)-3 420 [37-39] * FBu(f)-12 10 [77] ** FBu(f)-4 2300 [40-48] ** FBu(f)-13 19,2 [78-80] * FBu(f)-9 139 [66-72] *** FBu(f)-14 48 [81-final] *

√ Fracionamento de Bu(f)-4. CRC de fase reversa [2,5 x 30 cm, (H2O

→ CH3OH].

mA U

70 60

50

40

30

20 10 Figura 46 - Cromatograma obtido 0 através de CLAE-UV analítico para

-10 FBu(f)-4. CH3OH/H2O (5% → 100%) 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

Minutes CH3OH, 1mL/min., 254 nm.

√ Fracionamento de Bu(f)-9. CLAE-UV.

mAU 18 700 16

600

500

400

300 17 200 100

0

-90 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

Minutes

Figura 47- Cromatograma analítico obtido através de CLAE-UV fase reversa para a fração FBuOH(f)-9. H2O/CH3OH (7:3), 1 mL/min., 254 nm.

110

mAU 20 (a) 16 15 10

5 0 -5

mAU (b) 20 17 15

10

5 0 -5

mAU 40 18 30 (c)

20 10 0

5101520

Figura 48- Cromatogramas obtidos através de CLAE-UV fasereversa para as subfrações FBu(f)-9.5 (a), FBu(f)-9.6 (b) e FBu(f)-9.7 ©. CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH, 1mL/min., 254 nm.

Tabela 27- Subfrações obtidas a partir do fracionamento da fração FBu(f)-9 e atividade antioxidantes observada. Fração obtida Atividade (Massa em mg) antioxidante FBu(f)-9.5 (27 ) ** FBu(f)-9.6 (5,8) ** FBu(f)-9.7 (8,0) **

√ Fracionamento de Bu(f)-12. CLAE-UV.

mAU e:\luciana\fbu(f)-12.2.run e:\luciana\fbu(f)-12.1.run 16

300

200

100 20

0

X: 1.9552 Minutes Y: -0.0678 mAU -83 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Minutes Figura 49 - Sobreposição de cromatogramas obtidos através de CLAE-UV para as subfrações FBu(f)-12.1 (em preto) e FBu(f)-12.2 (em rosa).

CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH, 1mL/min., 254 nm.

Tabela 28- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FBu(f)-12. Fração obtida Massa em mg Atividade antioxidante FBu(f)-12.picos iniciais 2,0 * FBu(f)-12.1 2,5 ** FBu(f)-12.2 5,0 ** FBu(f)-12.3 0,5 - FBu(f)-12.4 0,8 -

111

3.4.8- Fracionamento da fase butanólica de partição do extrato etanólico dos galhos [FBuOH(g)]

FBu(g) (3,0 g)

CC Sephadex LH-20 CH3OH

FBu(g)-1 FBu(g)-4 FBu(g)-15 FBu(g)-19 FBu(g)-final (1,63 g) (1841 mg) (85,2 mg) (679,2 mg) (184,2 mg) CRC de fase reversa H2O→CH3OH Material não 15 subfrações fracionado CLAE-UV analítico

H2O→CH3OH c/ padrões

13 + 14 + 18 + 23 + 24 + 25

Figura 50- Fluxograma de fracionamento cromatográfico da fase butanólica de partição do extrato etanólico de galhos [FBu(g)].

Tabela 29- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FBu(g). Fração obtida Massa em mg Atividade antioxidante FBu(g)-1 1630 * FBu(g)-4 1841 *** FBu(g)-15 85,2 - FBu(g)-19 1583 - FBu(g)-final 200 -

√ Análise cromatográfica de FBu(g)-4, obtida através de CRC de fase reversa [2,5 x 30 cm, CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH.

mA U d :\luciana\fb u(g )-4 .run

250

200

150 100

50

0

-50 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Minutes

Figura 51- Cromatograma obtido através de CLAE-UV para FBu(g)-4, CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH, 1mL/min., 254 nm.

112

3.4.9- Fracionamentos das fases aquosas de partição dos extratos etanólicos das folhas [FAq(f)] e dos galhos [FAq(g)]

Alíquotas de ~ 2,5g das fases aquosas obtidas foram submetidas a fracionamento cromatográfico em coluna a pressão reduzida utilizando-se como fase estacionária sílica de fase reversa (RP-18) e como fase móvel

CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH. Foram obtidas 6 frações a partir da fase aquosa das folhas e 4 frações a partir da fase aquosa dos galhos (Figuras 52 e 53 ). As tabelas 31 e 32 mostram as massas obtidas para cada fracionamento cromatográfico e atividade antioxidante apresentada por algumas frações.

FAq(f)

CC c/ sílica de fase reversa (C18) H2O→CH3OH

Faq(f)-1:9 Faq(f)-2:8 (175,6 mg) Faq(f)-3:7 Faq(f)-4:6 Faq(f)-1:1 Faq(f)-8:2 CLAE-UV analítico CLAE-UV analítico () → H O→CH OH H2O CH3OH 2 3 CLAE-UV prep. CLAE-UV analítico c/ padrões c/ padrões ACN/H2O (1:9) 254 nm, 10 mL/min. 16+17+18+20 18 Material não fracioando Faq(f)-1:9.2 Faq(f)-1:9.4 Faq(f)-1:9.5

CLAE-UV CH3OH/H2O (3:6) 13 235 nm, 10 mL/min. 14 ? ( mg)

Figura 52- Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase aquosa de partição do extrato etanólico das folhas [Faq(f)].

Tabela 30- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FAq(f) e atividade antioxidante observada. Fração Eluente Quantidade Atividade antioxidante CH3OH/H2O (mg) Faq(f)-1:9 1:9 ** Faq(f)-2:8 2:8 176,0 - Faq(f)-3:7 3:7 238,6 - Faq(f)-4:6 4:6 120,9 - Faq(f)-1:1 1:1 158,8 *** Faq(f)-8:2 m/a 19,2 *

113 FAq(g)

CC sílica gel C18 → H2O CH3OH // //

Faq(g)-1:9 Faq(g)-2:8 ( ) ()CLAE-UV analítico CC sílica gel C18 H2O→CH3OH c/ padrão H2O→CH3OH

// // 14

Faq(g)-1:9.2 Faq(g)-1:9.5 CLAE-UV H2O/CH3OH (9:1) Faq(g)-1:9.2.8

30

Figura 53- Fluxograma do fracionamento cromatográfico da fase aquosa de partição do extrato etanólico das galhos [FAq(g)].

Tabela 31- Frações obtidas a partir de fracionamento cromatográfico de FAq(g) e atividade antioxidante observada. Fração Eluente Massa (mg) Atividade CH3OH/H2O antioxidante Faq(g)-1:9 m/a 1:9 1800 * Faq(g)-2:8 m/a 2:8 14,4 - Faq(g)-3:7 m/a 3:7 632,9 -

mA U 200 (a) 150

100

50

0 mA U 30 30 (b)

20 13 10

0

-10

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Minutes Figura 54- Cromatogramas obtidos através de CLAE-UV para:

(a) FAq(f)-1:9 e (b) FAq(g)-1:9, CH3OH/H2O (5% → 100%) CH3OH, 20 min., 254 nm.

114

O fracionamento cromatográfico da fração Faq(f)-1:9 levou a obtenção de três subfrações (Figura 55). As subfrações Faq(f)-1:9.2 e Faq(f)-1:9.5 representam as substâncias 13 e 14.

13 mA U 150 (a) 100 50 0

mA U 40 (b) 30 20 10 0 -10 mA U (c) 14 250 Figura 55- Cromatogramas obtidos em CLAE 200 150 fase reversa analítico para as subfrações 100 50 obtidas a partir de Faq(f)-1:9. a) Faq(f)-1:9.2, b) 0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Faq(f)-1:9.4 e c) Faq(f)-1:9.5. CH3OH/H2O (5% Minut es → 100%) CH3OH, 1 mL/min, 254 nm.

115

4- RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1- Substâncias isoladas de folhas e galhos de Prunus myrtifolia O estudo químico das folhas e galhos de Prunus myrtifolia permitiu o isolamento e caracterização de 31 substâncias que serão ilustradas e descritas a seguir, tendo sido agrupadas por classes de metabólitos especiais.

Esteróides e terpenóides

H H H H H H H H H H H H HO HO HO 1 3 2

OH OH O O O O

O O

4 5

OH OH

O O

HO HO

6 7

116

OH OH HO O HO O

HO HO HO HO 28 29

O OH O

HO 8 9

Glicosídeos cianogênicos

H OH OH O H O NC O OH NC O OH OH OH HO HO

11 12

117 Derivados C6-C1, C6-C2 e C6-C3

O O OH O O O OH OH HO OH HO OH HO O

HO OH 14 10 13

HO O OH O OH OH O O O HO OH O OH HO OH O HO O 23 15

HO O OH HO OH HO HO OH OH O O O OH HO HO HO O O

24 25

HO COOH HO COOH O O HO O OH O OH OH OH HO HO

26 27

O OH O OH OH O O OH HO OH O HO OH HO OH O

30 31

118

Flavonóides

OH OH OH O OH HO O O OH HO OH HO O OH HO O O O O OH O OH O OH OH OH O HO OH O HO

16 17

OH OH OH O OH HO O OH HO HO O O O O OH OH OH OH O HO OH O 18 19

OH OH O OH HO O HO OH O O O OH OH OH O HO

20

OH OH OH

HO O HO O

OH OH O OH O O O OH OH OH OH O HO OH O HO

21 22

119

4.2-Determinação estrutural e/ou identificação das substâncias isoladas

A determinação estrutural e/ou identificação das substâncias isoladas de Prunus myrtifolia foi feita utilizando-se técnicas espectrométricas uni e bi dimensionais (gHMBC, gHMQC, COSY 1H-1H e NOESY), UV e EM. As mesmas foram agrupadas por classes de metabólitos especiais, independente da fase de partição e órgão da planta a partir das quais foram obtidas. As substâncias 1-13, 14, 16, e 18-31 já foram isoladas anteriormente a partir de outras fontes vegetais e, portanto, encontram-se relatadas na literatura. Nesse trabalho, a identificação dessas substâncias foi feita através da comparação dos dados espectrais obtidos com os descritos na literatura. Para as substâncias 15, 17 e 20 não foram encontrados relatos na literatura quanto ao isolamento e determinação estrutural, sendo portanto consideradas inéditas. E, finalizando esta capítulo, encontra-se ainda nesse item o trabalho de identificação de algumas substâncias em diferentes frações através da utilização conjunta de técnicas hifenadas (CLAE-UV e CLAE-EM), metodologia que evitou a replicação de resultados. Os espectros obtidos para as substâncias descritas a seguir estão ilustrados a partir da figura 1 do volume 2.

120

4.2.1- Esteróides

Substâncias 1, 2 e 3 [frações FH(g)-23.3 e FH(f)-22.1]

29 28 28 21 22 26 20 24 22 19 25 21 26 20 24 19 25 11 27 18 11 27 1 18 9 14 1 2 10 15 9 14 2 10 15 3 5 3 5 HO 4 6 HO HO 4 6 1 2 3

Através da análise do espectro de RMN de 1H de FH(g)-23.3 (Figura 1, p. 1, v. ) foi possível observar sinais em δ 5,33, atribuído a um hidrogênio olefínico, δ 3,53, atribuído a hidrogênio carbinólico e sinais entre δ 2,27 e δ 0,66, correspondentes a hidrogênios metilênicos, metínicos e metílicos característicos de hidrocarboneto. No espectro de RMN de 13C (Figura 2, p. 2, v.2) foi possível observar a presença de sinais em δ 140,6 e δ 121,6 relativos a carbonos olefínicos e um sinal para carbono carbinólico em δ 71,6. Os dados obtidos, comparados com os dados relatados na literatura [Nes et al., 1992] permitiram concluir que a substância 1 é o β-sitosterol. Sinais com menor intensidade no espectro de 13C na região de 129 ppm foram atribuídos a carbonos olefínicos do estigmasterol (2) que, assim como campesterol (3), geralmente co-ocorrem com a substância 1 na maioria dos vegetais. A análise dos espectros de RMN realizada para essa fração é válida igualmente para a fração FH(f)-22.1, proveniente da fase hexânica de partição do extrato obtido a partir de folhas. Os cromatogramas obtidos através de cromatografia gasosa confirmaram a presença dessas substâncias, sendo que a substância 1 é majoritária na fração FH(f)-22.1 (Figura 56). A identificação foi concluída comparando-se os cromatogramas das frações em análise, com padrão constituído de β-sitosterol, estigmasterol e campesterol obtidos em laboratório.

121

mV ol t s 40 (a) 30 () 20

10 mV ol t s pico2 25 20 Pico3 (b) 15 Pico 1 (b) 10 5 0 mV ol t s 5 (c) 4 () Figura 56- Cromatogramas obtidos através de 3 2 CG para as frações: a) FH(f)-22.1, b) padrão 1 0 contendo campesterol (pico 1), estigmasterol 10 20 30 40 (pico 2) e β-sitosterol (pico 3) e c) fração FH(g)- Mi n ut es 23.3.

122

4.2.2- Terpenóides Quando misturas de substâncias terpenoídicas são fracionadas através de técnicas cromatográficas usuais, frequentemente há dificuldades na purificação dessas substâncias, sendo quase sempre obtidas em mistura de difícil resolução. Isto traz geralmente problemas adicionais na sua identificação.

A identificação dos triterpenos, entretanto, pode ser auxiliada com base nos dados de RMN de 13C. A caracterização inicia-se através da comparação dos deslocamentos químicos dos carbonos olefínicos da mistura com os já existentes na literatura. Triterpenos pentacíclicos e tetracíclicos têm, em gerl, uma ou duas ligações duplas respectivamente. Os espectros de substâncias com esqueleto fridelano e cicloartano, que não contém ligações duplas, possuem outros sinais característicos.

O espectro de RMN de 13C totalmente desacoplado de uma mistura de triterpenos apresenta, geralmente, um número bem maior do que 30 carbonos. A atribuição para alguns dos carbonos no esqueleto lupano pode ser feita facilmente, uma vez que os sinais são característicos, tanto para a ligação dupla do grupo isopropenila, quanto para os carbonos do anel E (pentagonal). Já, para diferenciar os carbonos dos esqueletos ursano e oleanano, onde vários sinais são muito próximos ou coincidentes entre si, encontram-se algumas dificuldades.

30

19 21 29 12 22 19 21 13 12 22 25 17 28 26 13 14 25 17 28 26 1 14 2 10 29 27 1 35 7 2 10 HO 35 7 27 20 HO 30 19 21 23 24 22 oleanano 23 24 12 ursano 25 17 26 28 14 1 10 35 7 27 HO 23 24 lupano

123

As diferenças somente podem ser observadas nos deslocamentos químicos dos carbonos do anel E do esqueleto ursano, que assume conformação torcida (twist), para melhor acomodar espacialmente o grupo metílico em C-19. Esta conformação torcida tem um efeito anisotrópico de proteção para os carbonos C-11, C-13, C-19, C-21 e C-27 e desproteção anisotrópica para os carbonos C-12, C-18, C-20 e C-22, quando comparados aos mesmos carbonos no esqueleto oleanano.

Substâncias 4 e 5 [fração FH(g)-7.3].

OH OH

O O O O O O 4 5

A análise do espectro de RMN de 1H da fração FH(g)-7.3 (Figura 3, p.3, v.2) mostrou vários sinais na região diamagnética, referentes a grupos metílicos, tripletos em 5,24 δ e δ 5,27 característicos de hidrogênios olefínicos e um duplo dubleto em δ 4,49, atribuído a um hidrogênio oximetínico. Os sinais em δ 2,83 (dl, J= 4,5 Hz) e 2,20 (dl, J= 10 Hz) foram atribuídos aos hidrogênios H-18 de triterpenos com esqueleto ursano e oleano. A análise dos espectros de RMN de 13C (Tabela 33), DEPT 1350 e DEPT 900 dessa fração (Figuras 4-6, p. 4- 6, v.2) mostraram sinais em δ 122,4, δ 143,5, δ 125, 6 e δ 138,0 que caracterizam os carbonos C-12 e C-13 de triterpenos com esqueleto oleaneno e urseno, sugerindo uma mistura binária de triperpenos para essa fração. Os sinais observados em δ 80,8 e δ 170,9 foram atribuídos ao C-3 e ao carbono carbonílico de um grupo acetato em C-3, enquanto o sinal em δ 183,8 foi atribuído a uma função ácido carboxílico em C-28. A comparação dos dados espectrométricos encontrados para essa fração com os descritos na literatura [Mahato e Kundu, 1994], confirmaram a

124 presença dos isômeros constitucionais ácido 3β-O-acetil-urs-12-en-28-óico e ácido 3β-O-acetil-olean-12-en-28-óico.

Tabela 32- Dados de RMN de 13C das substâncias 4 e 5. C δ 13C M C δ 13C M 4 5 4 5 1 38,0 t 38,0 t 16 # # 2 27,6 t 27,6 t 17 32,8 s 32,8 s 3 80,9 d 80,9 d 18 63,2 d 55,3 d 4 a37,6 s a36,9 s 19 40,9 d 40,9 d 5 55,2 d 55,2 d 20 40,9 d 40,9 d 6 18,2 t 18,2 t 21 31,8 t 31,8 t 7 32,4 t 32,4 t 22 # # 8 39,3 s 39,3 s 23 29,3 q 29,3 q 9 47,5 d 47,5 d 24 15,3 q 15,3 q 10 36,95 s 36,95 s 25 15,5 q 15,3 q 11 23,3 t 23,3 s 26 b16,6 q b17,0 q 12 122,4 d 125,6 d 27 23,5 q 23,5 q 13 143,6 s 138,9 s 28 183,6 q 183,6 q 14 41,5 s 41,5 s 29 17,1 q 17,1 q 15 27,6 t 27,6 t 30 21,1 q 21,2 q a, b - valores podem ser permutados. # não observado. δ (ppm), CDCl3, 125 MHz)

125

Substâncias 6 e 7 [fração FH(g)-33.5 e FH(f)-38-7]

OH OH

O O HO HO 6 7

A análise do espectro de RMN de 1H da fração FH(g)-33.5 (Figura 7, p 7, v.2) apresentou sinais em δ 0,79, δ 0,80, δ 0,92, δ 0,94, δ 1,00 e δ1,10 referentes aos grupos metílicos, em δ 5,23 (t, J= 3,0 Hz) e δ 5,28 (t, J= 3,0 Hz), atribuídos aos hidrogênios olefínicos H-12 e em δ 3,22 (dd, J= 10 e 3 Hz) atribuído a hidrogênio oximetínico em H-3. O dubleto em δ 2,20 (J= 12 Hz) foi atribuído ao hidrogênio alílico H-18, sugerindo esqueleto ursano. Os sinais de RMN de 13C em δ 125, 8 e δ137,9 e em δ122,6 e δ138,0 evidenciaram novamente uma mistura binária de triterpenos com esqueleto ursano e oleanano, sendo atribuídos aos carbonos C-12 e C-13 das substâncias 6 e 7 (Figura 8, p. 8). A partir de experimento DEPT 135o (Figura 9, p. 9) foi possível evidenciar também a presença de função ácido carboxílico através dos sinais observados em δ 79,0 e δ 180,0 atribuídos aos carbonos C- 3 e C-28, respectivamente. A comparação dos dados de RMN de 13C dessa mistura com dados descritos na literatura [Mahato e Kundu, 1994; Kagawa et al., 1998], conduziram à identificação dessas substâncias como sendo os isômeros constitucionais 3β-hidroxi-urs-12-en-28-óico (ácido ursólico) (6) e ácido 3β- hidroxi-olean-12-en-28-óico (ácido oleanólico) (7). A substância (6) foi, adicionalemnte, obtida na forma pura a partir da fração FH(f)-38 [FH(f)-38.10]. Os espectros obtidos para essa substância pura, inclusive experimentos bidimensionais (Figuras 10-17, p. 10-17, v.2) confirmaram as observações descritas acima.

126

Tabela 33- Dados de RMN de 13C observados para as substâncias 6 e 7. C δ 13C M C δ 13C M 6 7 6 7 1 38,6 t 38,6 t 16 23,2 t 23,2 t 2 26,9 t 26,9 t 17 40,1 s 40,1 s 3 79,0 d 79,0 d 18 52,4 d 47,4 d 4 # # 19 38,4 d 38,4 d 5 54,9 d 54,9 d 20 38,3 d 38,3 d 6 18,0 t 18,0 t 21 30,4 t 30,4 t 7 32,7 t 32,7 t 22 36,5 t 36,5 t 8 39,7 s 39,7 s 23 27,8 q 27,8 q 9 47,2 d 47,2 d 24 16,8 q 16,8 q 10 38,8 s 38,8 s 25 16,8 q 16,8 q 11 22,5 t 22,5 t 26 15,2 q 15,2 q 12 125,8 d 122,6 d 27 23,0 q 23,0 q 13 137,9 s 143,5 s 28 180,0 s 180,0 s 14 37,7 s 37,7 s 29 15,4 q 19,0 q

15 30,4 t 30,4 t 30 21,0 q 21,0 q a, b - valores podem ser permutados. # não observado. δ (ppm), CDCl3, 125 MHz)

127

Substância 8 [fração FH(f)-21.5]

HO

A análise do espectro de RMN de 1H da fração FH(f)-21.5 (Figura 18, p. 18, v.2) mostrou a predominância de sinais na região diamagnética e presença de singletos largos na região relativa aos hidrogênios olefínicos. Na primeira região, observou-se, entre outros, os singletos em δ 0,85 δ 0,87, δ 1,00, δ1,01 e δ1,67, atribuídos aos diversos grupos metílicos, sendo que o último encontra- se desblindado devido a sua natureza alílica. Observou-se também um duplo dubleto largo em δ 3,14, característico de hidrogênio oximetínico. Na região dos hidrogênios olefínicos, observou-se um singleto largo em δ 4,68 e outro em δ 4,70, referentes a dois hidrogênios não equivalentes de um grupo metilênico em isopropenila. Os espectros de RMN de 13C e DEPT 1350 (Figuras 19 e 20, p. 19 e 20, v.2) apresentaram sinais em δ14,3, δ15,3, δ 20,4, δ 20,7, δ 21,1 e δ 21,5, relativos a seis grupos metílicos. Os sinais em δ110,3 e δ148,5 relativos aos carbonos olefínicos corroboram a proposta apresentada de um grupo isopropenila na molécula. Esses dados, em conjunto com os dados de RMN de 1H, caracterizaram uma estrutura triterpênica da série lup-20(29)-eno. O espectro de RMN de 13C mostrou também um sinal em δ 76,4 característico de carbono carbinólico. O sinal em δ3,14 (ddl, J=10 e 5 Hz) foi atribuído ao hidrogênio H-3 e o valor das suas constantes de acoplamento indica sua posição axial. A comparação destes dados com os descritos na literatura permitiu identificar o 3-β-hidroxi-lup-20(29)-eno (lupeol) [Mahato e Kundu, 1994; Nick et al., 1995] na fração FH(f)-21.5.

128

A presença dos pares de sinais observados para carbonos olefínicos em 129,1 δ; δ 139,2 , e δ 117,7 e δ 137,8 podem indicar a presença de duas outras substâncias nessa fração, de esqueleto triterpênico, porém de substâncias pertencentes à série olean-18-eno e urs-20-eno [Roque e Olea, 1990].

Tabela 34- Alguns dados de RMN de 1H para a substância 8 e os encontrados na literatura para o lupeol. H 8 Lupeol δ ppm (M, J em Hz) δ ppm (M, J em Hz) 3 3,14 (ddl, J= 10,0 e 5,0) 3,13 (m) 23 1,01 (s) 0,67 (s) 24 0,87 (s) 0,46 (s) 25 1,00 (s) 0,61 (s) 26 0,85 (s) 0,44 (s) 27 # 0,63 (s) 29 4,70 (sl) 4,70 (d, J= 2,0) 4,68 (sl) 4,58 (d, J= 2,0) 30 1,67 (s) 1,34 (s) # não observado. δ (ppm), CDCl3, 500 MHz)

Tabela 35- Dados de RMN de 13C para a substância 8 e os encontrados na literatura para o lupeol. Posição Subst. 8 Lupeol Posição Subst. 8 Lupeol 1 37,2 t 38,7 16 32,1 t 32,1 2 26,8 t 27,4 17 56,0 s 56,3 3 76,4 d 78,9 18 46,9 d 46,8 4 39,6 d (?) 38,8 19 49,8 d 49,2 5 55,2 d 55,3 20 148,5 s 150,3 6 20,7 t 18,3 21 31,2 t 29,7 7 32,1 t 34,3 22 37,2 t 37,0 8 39,6 s 40,7 23 27,9 9 49,8 d 50,5 24 14,3 qa 15,3 10 37,3 s 37,2 25 15,3 qa 16,0 11 21,6 t 20,8 26 15,3 qa 16,1 12 26,8 t 25,5 27 12,2 qa 14,7 13 # 38,4 28 180,5 14 # 42,4 29 110,3 t 109,6 15 29,8 t 30,5 30 20,4 t 19,4 a - valores podem ser permutados. # não observado. δ (ppm), CDCl3, 125 MHz)

129

Substâncias 28 e 29 [FCHCl3(g)-36.25]

OH OH HO O HO O

HO HO HO 28 HO 29

13 No espectro de RMN de C da fração FCHCl3(g)-36.25 (Figura 21, p. 21 v. 2) evidenciou a presença de mistura binária de triterpenos de núcleo urseno e oleaneno, conforme os dados descritos anteriormente para as substâncias 4- 7 e os que são mostrados na Tabela 37 para essa fração. Nos espectros de RMN de 1H e HMQC (Figuras 22, p. 22 e 23-27, p. 23-25, v.2), os dois dubletos em δ 3,38 e δ 3,34, o dubleto em δ 3,75 e o multipleto em δ 3,91, correlacionados, respectivamente com os sinais em δ 65,8, δ 74,6 e δ 67,0 foram atribuídos a um grupo hidroximetilênico e dois grupos hidroximetínicos. A comparação dos dados obtidos experimentalmente, inclusive correlações a longa distância (Figura 28, p. 26, v.2), com os descritos na literatura para o ácido 2α,3α,24-triidroxiolean-12-en-28-óico (28), isolado de Prunella vulgaris (Labiatae) [Kojima, 1987], permitiram identificar essa substância como sendo um dos constituintes da mistura e a segunda substância identificada é o ácido 2α,3α,24-triidroxiurs-12-en-28-óico (29).

O recente relato na literatura sobre a atividade inibitória da colesterol aciltransferase apresentada pelo ácido 2α,3β,24-triidroxiolean-12-en-28-óico, isolado de Campsis grandiflora (Bignoneaceae) [Kim, 2005] é exemplo da grande variedade de atividades biológicas atribuída à essa subclasse de substâncias.

130

Tabela 36- Dados de RMN das substâncias 28 e 29. C/H 29 28 δ 13C δ 1H (M, J em Hz) δ 13C δ 1H (M, J em Hz) 1 40,9 40,9 2 67,0 3,91 (m) 67,0 3,91 (m) 3 74,6 3,75 (d, 2) 74,6 3,75 (d, 2) 4 40,9 43,8 5 49,9 49,9 6 18,2 18,2 7 32,7 33,0 8 39,3 39,5 9 47,3 47,2 10 38,0 37,9 11 23,4 23,3 12 123,4 5,25 (m) 126,7 5,25 (m) 13 143,7 138,1 14 40,7 42,7 15 26,4 28,8 16 21,5 23,0 17 45,4 45,4 18 39,2 2,85 (m) 54,4 2,23 (d, 10) 19 45,4 40,45 20 29,2 38,1 21 33,8 31,6 22 32,2 36,5 23 21,5 0,97 (s) 21,5 0,97 (s) 24 65,8 3,38 (d, 11,2) 65,8 3,38 (d, 11,2) 3,64 (d, 11,2) 3,64 (d, 11,2) 25 17,4 0,79 (s) 17,7 0,83 (s) 26 17,6 0,89 (s) 17,4 0,90 (s) 27 26,4 1,14 (s) 23,8 1,09 (s) 28 181,7 - 181,7 - 29 33,5 0,95 (s) 17,6 0,89 (d) 30 24,0 0,91 (s) 21,5 0,97 (d)

131

Substância 9 [fração FH(f)-18.5]

16 12 8 2 OH 5 1 17 19 20 9

A análise do espectro de RMN de 1H da fração FH(f)-18.5 (Figura 29, p. 27, v.2), mostrou sinais característicos da presença de substância terpenoídica, evidenciada pelos sinais atribuíveis a metilas: δ 0,80, δ 0,79, δ 0,78 e δ 1,60, sendo esse último característico de metila ligada a carbono sp2. Além desses sinais, foram observados um tripleto em δ 5,34 e um dubleto em δ 4,15 (J=7 Hz), com integração para um e dois hidrogênios, respectivamente, e um tripleto em δ 1,99 (J=7,4 Hz), característico de grupo metilênico em α a ligação dupla. Essas informações associadas à análise e comparação dos dados de RMN de 13C obtidos para essa fração (Figura 30, p. 28, v.2; Tabela 38) com os disponíveis na literatura [Rhaman e Ahmad, 1992] permitiram identificar a substância 9 como sendo o diterpeno (E)-fitol.

Tabela 37- Dados de RMN da substância 9. C/H δ 13C δ 1H (M, J em Hz) C/H δ 13C δ 1H (M, J em Hz) 1 59,4 5,40 (t, 7,0) 11 32,7 2 123,1 4,15 (d, 7,0) 12 37,4 3 140,3 1,99 (t, 7,4) 13 24,8 4 39,9 14 39,4 5 25,1 15 28,0 6 36,7 16 22,7 7 32,8 17 22,6 8 37,3 18 19,7 9 24,5 19 19,7 10 37,4 20 16,2 1,60 (s)

132

4.2.3- Derivados C6-C1

Substância 10 [fração FH(f)- 43]

O

OH

O espetro de RMN de 1H obtido para a fração FH(f)-43 (Figura 31, p. 29, v. 2) mostrou três conjuntos de sinais na região de hidrogênios aromáticos: dubleto em δ 8,06 (J= 7,5 Hz) e multipletos em δ 7,56 e δ 7,42, que caracterizaram a presença de anel aromático monossubstituído (Tabela 39). Nos espectros de RMN de 13C e DEPT 1350 (Figuras 32 e 33, p. 30 e 31, v.2), além do sinal em 29,6 δ, que foi atribuído a carbonos metilênicos de substância graxa alifática (impureza), foram observados sinais em δ128, 4 (d), δ129,2 (s), δ130,1 (d), 133,7 (d) e 171,3 (s), atribuídos aos carbonos aromáticos e carboxílico, respectivamente, do ácido benzóico (10), presente nessa fração.

Tabela 38- Dados de RMN da substância 10 C/H δ 13C δ 1H (M, J em Hz) 1 129,2 - 2 130,1 8,06 (d, 7,5) 3 128,4 7,53 (t, 5,0) 4 133,7 7,42 (t, 5,0) 5 128,4 7,53 (t, 5,0) 6 130,1 8,06 (d, 7,5) 7 171,3 -

133

Substância 31 [fração FAc(g)-4.4a]

OH O O OH OH HO O

Os dados relacionados no conjunto de espectros de RMN obtidos para a fração FAc(g)-4.4a (Figuras 34-37, p. 32-35, v.2), foram atribuídos de maneira consistente ao esqueleto carbônico delineado acima. Os sinais característicos de RMN de 13C, já descritos como parte da determinação estrutural da substância 10, bem como os deslocamentos químicos dos hidrogênios da molécula são mostrados na Tabela 40. Os dados obtidos, comparados com os descritos na literatura [Horsley, 1981] permitiram identificar o benzoato de glicosila na fração FAc(g)-4.4a.

Tabela 39 - Dados de RMN obtidos e os relatados na literaturaa para 31. 31 Benzoato de Glicosila C/H δ 13C (ppm) δ 1H (M, J em Hz) δ 13C δ 1H

1 129,1 - 129,1 2 129,5 8,02 (dd; 8, 1,25) 129,8 8,09 (dd) 3 128,7 7,56 (m) 129,4 7,64 (m) 4 133,7 7,67 (m) 134,1 7,64 (m) 5 128,7 7,56 (m) 129,4 7,64 (m) 6 129,5 8,02 (dd; 8, 1,25) 129,8 8,09 (dd) 7 164,6 - 165,0 - 1’ 95,0 5,58 (d, 8) 95,3 4,64 2’ 72,5 72,8 4,05-3,45 3’ 77,9 78,1 4,05-3,45 4’ 69,5 69,8 4,05-3,45 5’ 76,3 76,6 4,05-3,45 6’ 60,5 60,9 4,05-3,45 a [Horsley, 1981].

134

Substância 30 [fração FAq(g)-1:9.2.8]

O OH O O OH OH HO HO OH

No espectro de RMN de 1H da fração FAq(g)-1:9.2.8 (Figura 38, p. 36, v. 2) os sinais observados em δ 7,35 (d, J= 3,0 Hz), δ 6,87 (dd, J= 3,0 e 9,0 Hz) e δ 6,50 (d, J= 9,0 Hz) foram atribuídos a um sitema aromático trissubstituído e o dubleto em 4,59 (J= 8 Hz) é característico de hidrogênio anomérico de uma unidade de açúcar, cuja presença está relacionada também com os sinais entre δ 3,65 e 3,14 (Tabela 41). A análise dos dados de RMN de 13C, DEPT 135O e do mapa de contorno gHMQC (Figuras 39-41, p. 37-39, v.2), permitiu delinear uma estrutura molecular com sitema aromático característico do ácido catecuico através dos sinais em δ 120, 8, δ 115,6 e δ118,1 que foram atribuídos aos carbonos metínicos C-3, C-4 e C-7, respectivamente. Os sinais em δ 158,0 e δ 148,6 referen-se aos carbonos C-5 e C-6 e o sinal em 171,0 foi atribuído ao carbono carbonílico. As correlações observadas na mapa de contorno gHMBC (Figura 42, p. 40, v. 2) entre os hidrogênios H-1’ e C-4, H-6 e C-5 e entre H-2 e o carbono da carbonila, permitiram posicionar a unidade glicosídida em posição para em relação a carbonila. A partir dos dados descritos acima, a substância presente na fração FAq(g)-1:9.2.8 foi identificada como sendo o ácido 3-hidroxi-4-glicosil-benzóico. O ácido 3,4-diidroxi-benzoico (ácido protocatecuico), isolado a partir do extrato aquoso de Coffea arabica, é a substância responsável pela atividade antimicrobiana para Legionella pneumophila, bactéria causadora de um tipo de pneumonia [Dogasaki, 2002].

135

HO HO HO O O H HO 1’ H 1 OH HO 2 H O

Figura 57 - Correlações observadas no mapa de contorno gHMBC da substância 30.

Tabela 40- Dados de RMN da substância 30. Posição δ 13C δ 1H (M; J em Hz) Correlação gHMBC COOH 171,4 - 7,35 1 n.o. - - 2 118,1 7,35 (d, 3) - 3 158,0 - 6,88; 7,35; 6,51 4 148,5 - 6,88; 4,59; 6,51 5 115,6 6,51 (d; 9,0) - 6 120,8 6,88 (dd, 3,0 e 9,0) 6,51 1’ 102,4 4,59 (d; 8,0) 3,15 2’ 76,9 3,18 (m) 3,16 3’ 76,6 3,16 (m) 3,18 4’ 73,4 3,16 (m) 3,18 5’ 69,7 3,16 (m) - 6’ 60,7 3,62 e 3 ,65 (m) -

136

4.2.4- Derivados C6-C2 e C6-C3

Substância 13 [fração FAq(f)-1:9.2]

O OH O O OH HO OH 7 1’ HO 1 2

Os espectros de RMN de 1H e gHMQC da substância 13 (Figura 43 e 46-47, p.41, e p.44-45, v. 2) mostraram a presença de multipleto em δ 7,41 que foi atribuído a um sistema aromático monossubstituído. Adicionalmente, o singleto em δ 5,32 foi atribuído a um hidrogênio metínico sobre carbono carbinólico e os sinais entre δ 4,21 e δ 3,21 foram atribuídos a uma unidade de açúcar, sendo que o dubleto em δ 4,21 (J= 7,5 Hz), sugere que esta unidade está em ligação β, em relação à aglicona. Os dados obtidos através dos espectros de RMN de 13C e experimento DEPT 1350 (Figuras 44 e 45, p. 42 e 43, v.2) confirmaram a presença de sistema aromático monossubstituído através da observação dos sinais em δ 135,3, δ 129,8, δ 129,3 (2C) e δ 128,4 (2C); de carbonos carbinólicos de uma unidade de glicose com os sinais em δ 99,1, δ 76,2, δ 75,7, δ 73,2, δ 69,8 e δ 60,9, além de um carbono hidroximetínico adicional em δ 78,7 atribuído a C-7 e de carbono carbonílico em δ 175,9 (Tabela 42).

As correlações observadas no espectro de gHMBC entre o hidrogênio metínico H-7 e os carbonos carboxílico (δ 175,9), C-1 (δ 135,3), C-2 e C-6 (δ 129,3) (Figura 58 e Figura 48, p. 46, v. 2), confirmaram a determinação estrutural apresentada para a substância 13. Essa substância, já isolada anteriormente a partir das sementes de Prunus persica, apresentou atividade antitumoral para câncer de pele, em experimento realizado com camundongos [Toshyuki, 2003]

137

O

H HO OH O O HO OH HO

Figura 58- Algumas correlações observadas no mapa de contorno gHMBC da substância 13.

Os espectros de massas obtidos em electrospray nos modos negativo e positivo para a fração FAq(f)-1:9.2 (Figura 59) evidenciaram a presença do pico em m/z 312, atribuído ao íon quasi molecular e do pico em m/z 336, [M + Na]+, que confirmaram a estrutura proposta para a substância 13.

Figura 59- Espectros de massas obtidos para a substância 13. (a) ES, - 25 eV, (b) ES +45 eV.

138

Tabela 41- Dados de RMN obtidos para a substância 13.

13 C/H δ C ( mult.) δH, (M, J em Hz) gHMBC

1 135,3 (s) - 5,32; 7,41 2 129,3 (d) 7,41 (m) 5,32; 7,41 3 128,4 (d) 7,41 (m) 5,32; 7,41 4 129,8 (d) 7,41 (m) 5 128,4 (d) 7,41 (m) 5,32; 7,41 6 129,3 (d) 7,41 (m) 5,32; 7,41 7 78,7 (d) 5,32 (s) COO 175,9 (s) - 5,32 1’ 99,1 (d) 4,21 (d, 7,5) 3,38; 5,32 2’ 75,7 (d) 3,38 (dd, 9 e 8) 3’ 76,2 (d) 3,36 (dd; 9,2 e 9,2) 4’ 69,8 (d) 3,29 (dd; 9,2 e 9,2) 5’ 78,7 (d) 3,23 (ddd; 2,4; 5,8 e 10) 6’ 60,9 (t) a 3,83 (dd, 12,5 e 2) b 3,68 (dd; 12,5 e 2)

139

Substância 15 [fração FAc(f)-20.1]

O

7 OH O 1 B O OH 8’ O 7’ OH A 1’ 1’’ HO O

A análise do espectro de RMN de 1H da fração FAc(f)-20.1 (Figuras 49, e 52-53 p. 47, 50 e 51, v. 2) mostrou um conjunto de sinais característicos da presença de duas unidades aromáticas monossubstituídas: dubleto largo em δ 7,96 (2H, J= 8,0 Hz), tripleto em δ 7,52 (1H, J= 7,5) e tripleto em δ 7,41 (2H, J =7,7 Hz), atribuídos ao anel B; dubleto largo em δ 7,25 (2H, J=7,7 Hz) e multipleto em δ 7,16 (3H) atribuídos ao anel A. Além desses sinais, foram observados um singleto em δ 5,08, característico de hidrogênio hidroximetínico, e sinais característicos de uma unidade glicosídica entre δ 3,61 e δ 4,33 (Tabela 43). Nos espectros de RMN de 13C e DEPT 1350 (Figuras 50 e 51, p. 48 e 49, v. 2), os sinais em δ 168,3; δ 134,9; δ 131,7; δ 130,2 e δ 129,8, foram atribuídos aos carbonos de uma unidade benzoíla, e os sinais observados em δ 100,4; δ 77,8; δ 76,1; δ 75,6; δ 72,3 e δ 65,7 foram atribuídos a carbonos de uma unidade glicosídica, baseando-se em dados encontrados na literatura para benzoato de 1-glicosila, isolado de Prunus serotina [Horsley e Meinwald, 1981], sendo que o sinal em δ 65,7, atribuído ao carbono C-6 da unidade glicosídica, indica a presença de substituinte nessa posição. Ainda através da análise do espectro de RMN de 13C, foi possível propor a presença de outro sistema aromático através dos sinais em δ 176,2; δ 137,3; δ 131,1; δ 130,5; δ 130,1 e δ 79,9, atribuídos de maneira consistente ao esqueleto carbônico do ácido mandélico. Esses dados, em conjunto com as correlações observadas no mapa de contorno gHMBC (Tabela 43 e figuras 54 e 55, p. 52 e 53, v. 2), permitiram propor a estrutura apresentada para a substância 15, cujo relato não foi encontrado na literatura.

140

Tabela 42- Dados de RMN da substância 15. C/H δ 13C δ 1H Sinais correlacionados (gHMBC) 8’ 176,2 (s) - 5,08 7 168,3 (s) - 7,96/ 4,57 (f) / 4,32 1’ 137,3 (s) - 5,08/ 7,13 4, 4’ 134,9 (d) 7,52 (t, J= 7,5 Hz) 1 131,7 (s) - 2, 6 131,1 (d) 7,96 (d, J=8 Hz) 5, 3 130,5 (d) 7,41 (t, J= 7,7 Hz) 5,08/ 7,52/ 7,41 2’, 6’ 130,2 (d) 7,17 (m) 7,17/ 7,13/5,08 5’ 130,1 (d) 7,25 (d, 7) 3’ 129,8 (d) 7,13 (m) 1’’ 100,4 (d) 3,96 (d, J= 7,5 Hz) 3,20/ 5,08 7’ 79,9 (d) 5,08 (s) 7,17/ 3,96 3’’ 77,8 (d) 3,29 (m) 3,96 5’’ 76,1 (d) 3,17 (m) 4,32 2’’ 75,6 (d) 3,20 (m) 4’’ 72,3 (d) 3,17 (m) 3,2 6’’ 65,7 (t) 4,32 (dd, J= 11,7 e 6 Hz) 4,57 (dl, J= 11,7 Hz)

O HH HHO OO O HH O HOHO OH

Figura 60- Correlações observadas no mapa de contorno gHMBC, da substância 15.

141

No espectro de massas obtido para essa substância (Figura 61) foram observados, entre outros, os íons m/z 105 e m/z 135 que podem ser atribuídos às fragmentações ilustradas na Figura 62. O sinal em 440 foi atribuído ao aduto [M+ Na]+.

Figura 61- Espectros de massas da substância 15. (a) ES, +25 eV, (b) ES,

O OH OO O

O HO OH OH OH + O

+ O

C7H5O C8H7O2 105 (20%) 135 (50%)

Figura 62- Fragmentações observadas no espectro de massas da substância 15. ES, +25 eV.

142

Substância 14 [fração FAq(f)-1:9.5]

O 3’ 6 7 OH HO O 1’ 2’ 1 8 OH HO

O espectro de RMN de 1H da subfração FAq(f)-1:9.5 (Figura 56, 58 e 59, p. 54, 56 e 57, v. 2) apresentou dois dubletos em δ 7,58 e δ 6,29 (J= 15,8 e 15,8 Hz, respectivamente), característicos de hidrogênios olefínicos com orientação trans, que juntamente com os dubletos em δ 6,79 (J=8,0 Hz) e δ 6,96 (J= 7,5 Hz) e o singleto largo em δ 7,05 atribuídos a hidrogênios aromáticos caracterizaram uma unidade 3,4-diidroxicinamoíla (cafeoíla). Os sinais em δ 3,72 (dl; J=7,5 Hz), δ 5,35 (sl) e δ 4,16 (sl), foram atribuídos a três hidrogênios hidroximetínicos, sendo um (δ 5,35) esterificado; e os multipletos em δ 2,03 e δ 2,20, foram atribuídos a dois grupos metilenos. No espectro de RMN de 13C (Figura 57, p. 55, v.2) foram observados um carbono carbonílico, oito carbonos metínicos e dois carbonos metilênicos. Três dos carbonos metínicos (δ 74,0, δ 72,2 e δ 72,0) são oxigenados e apresentam correlação com três hidrogênios metínicos em δ 3,72, δ 5,35 e δ 4,16, respectivamente, como evidenciado pelos dados obtidos a partir do espectro de gHMQC (Figuras 58 e 59,p. 56 e 57. Tabela 44). Os demais carbonos metínicos em δ 115,2, δ 116,5, δ 122,9, δ 146,9 e δ 115,4 mostraram correlação com os três hidrogênios aromáticos em δ 7,05, δ 6,79 e δ 6, 96 e dois hidrogênios olefínicos em δ 7,58 e δ 6,29. Os dados de RMN observados permitem considerar que a unidade cafeoil descrita está ligada a uma unidade ciclopentano-2,3-diol. A constante de acoplamento observada para o sinal atribuído a H-2 (δ 3,72, J = 7,5 Hz), permitiu propor a configuração relativa apresentada. Não foram observadas correlações entre os sinais relativos ao anel ciclopentano e a unidade cafeoila no mapa de contorno gHMBC dificultando a conclusão da estrutura apresentada (Figuras 60 e 61, p. 58 e 59, v. 2).

143

Tabela 43- Dados de RMN da substância 14. C/H δ 13C (m) gHMQC gHMBC δ 1H (m, J em Hz) 1 127,8 (s) - 6,29/ 6,58 2 115,2 (d) 7,05 (sl) - 3 a149,5 (q) - 6,79/6,96/7,05 4 a146,9 (q) - 6,79/6,96/7,05 5 116,5 (d) 6,79 (d, 8) - 6 122,9 (d) 6,96 (dl; 7,5) 7,05/7,58 7 115,4 (d) 6,29 (d, 15,8) 7,58/6,79 8 146,7 (d) 7,58 (d, 15,8) 6,79/6,96/7,05 9 168,8 (s) - 1’ 72,2 (d) 5,35 (m) - 2’ 74,0 (d) 3,72 (m) - 3’ 72,0 (d) 4,16 (m) - 4’ 38,4 (t) 2,20 (m) - 5’ 39,4 (t) 2,03 (m) - a Valores podem ser permutados.

O espectro de massas obtido para essa fração (Figura 63, EMES, modo positivo) apresentou picos de m/z 135 e m/z 179 que confirmam a presença da unidade cafeoíla descrita. O pico referente ao íon quasi molecular [M+H] 281 não foi evidenciado nesse espectro. Após análise do íon de m/z 179 em equipamento com triplo quadrupuolo (EM/EM) para obtenção do íon precursor, o íon quasi molecular foi obtido. Considerando-se especialmente os dados de 1H e 13C obtidos experimentalmente e aqui descritos com os relatados na literatura [Cardoso, 2003; Wang, 1999] foi possível identificar a substância 14 como sendo 1S*- (3’,4’-diidroxicinamoil)-ciclopentano-2S*,3S*-diol.

144

(a)

(b)

Figura 63- Espectros de massas da substância 14. ES, + 40 eV. (a) “Full scan”, (b) íons precursori de m/z 179.

145

Substância 23 [fração FAc(g)-8.10.1]

HO OH O O OH OH HO HO O

A análise do espectro de RMN de 1H da fração FAc(g)-8.10.1(Figura 62, p. 60, v.2) revelou sinais consistentes com a presença de uma unidade cafeoíla, coforme descrito anteriormente para a substância 14 e de acordo com os dados representados na Tabela 45. Adicionalmente, foram observados sinais correspondentes a uma unidade de açúcar em δ 3,20- 3,65 (m), e em δ 5,45 (d, 8,0 Hz), que apresentaram correlação com os sinais em δ 60,5; 69,5; 72,4; 76,4; 77,7 e 94,2, observados nos espectros de RMN de gHMQC e de 13C (Figura 63 e 64, p. 61 e 62, v.2), caracterizando uma unidade de glicose ligada à aglicona através de ligação β. A correlação entre o hidrogênio anomérico e o carbono carboxílico observada no espectro de gHMBC dessa fração (Figura 65, p. 63, v. 2), indicou finalmente, que a unidade o açúcar está ligado à aglicona pelo carbono C-1. A substância presente na fração FAc(g)-8.10.1 foi identificada como sendo o cafeoato de glicosila (23).

Tabela 44- Dados de RMN da substância 23. C/H δ 13C (m) gHMQC gHMBC δ 1H (m, J em Hz) 1 125,0 - 6,27 2 121,7 7,02 (dd, 8,0 e 2,0) 7,54/ 7,02 3 115,7 6,76 (d, 8,0) 4 - - 5 - - 6 114,6 7,06 (d, 2,0) 7,02/ 7,54 7 146,4 7,54 (d, 16,0) 6,76 8 113,0 6,27 (d, 16,0) 9 165,3 - 5,45/ 6,27/ 7,54 1’ 94,2 5,45 (d, 8,0) 3,20/ 5,45 2’ 3,20 (m) 3,20 3’ 3,20 (m) 4’ 3,20 (m) 5’ 3,20 (m) 6’ 60,58 3,65 (m)

146

O espectro de massas EM/ES (Figura 64) obtido no modo negativo para essa fração apresentou pico em m/z 241, confirmando a proposta estrutural apresentada.

Figura 64 - Espectro de massas da substância 23. ES, -25 eV.

4.2.5- Glicosídeos cianogênicos

Substâncias 11 e 12 [frações FAc(g)-4.4b e FCHCl3(f)-45]

OH OH H O H O NC O OH NC O OH OH OH HO HO

11 12

A análise do espectro de RMN de 1H da fração FAc(g)-4.4b (Figura 66, p. 64, v. 2) mostrou sinais entre δ 7,45 e δ 7,54 que, integrados para 12 H, foram atribuídos a dois sistemas aromáticos monossubstituídos. Os singletos em δ 6,08 e 6,00 indicaram a presença de hidrogênios metínicos isolados e, além dos dubletos observados para os hidrogênios anoméricos H-1’ e H-1a’ (δ

147

4,28, d e δ 4,55, d), o espectro apresentou sinais para hidrogênios hidroximetínicos característicos de unidades de açúcar. Os espectros de RMN de 13C, DEPT 135O (Figuras 67 e 68, p. 65 e 66, v. 2) e experimento gHMQC (Figura 69, p. 67, v. 2) corroboraram a presença de duas unidades mandelonitrila e os sinais em δ 66,6 e δ 66,7 foram atribuídos aos carbonos C-7 e C-7a [Chassagne e Crouzet, 1998], e apresentaram correlação com os hidrogênios anoméricos descritos. A presença de duas unidades de glicose foi confirmada a partir dos seguintes sinais no espectro de RMN de 13C: δ 77,5; δ 77,3; δ 76,6; δ 76,5; δ 73,2; δ 73,1; δ 70,0; δ 69,9; δ 61,2 e δ 61,1. Os dados de RMN de 13C, especialmente os sinais em δ 61,2 e δ 61,1, indicaram aos carbonos C-6’ e C-6a’ indicam que essas duas unidades de glicose não estão ligadas entre si (Tabela 46). Os sinais em δ 118,8 (q) e δ 119,7 (q) foram atribuídos aos carbonos de duas nitrilas. Finalmente, as correlações observadas no mapa de contorno gHMBC (Figuras 70 e 71, p. 68 e 69, v. 2) entre os hidrogênios anoméricos de cada uma das unidades de glicose e os carbonos que comportam as nitrilas (C-7 e C-7a) permitiram concluir que FAc(g)-4.4b é constituída da mistura binária dos glicosídeos cianogênicos diastereoméricos (R)-mandelonitrila-β-glicopiranosídeo (prunasina) e (S)-mandelonitrila-β-glicopiranosídeo (sambunigrina). A literatura relata a possibilidade de identificação de glicosídeos cianogênicos diastereisoméricos em mistura a partir de dados de RMN de 13C [Hübel et. al. 1981]. Os dados experimentais obtidos comparados com os descritos na literatura, confirmaram a presença dessas duas substâncias na mistura. As correlações mais evidentes observadas no espectro de gHMBC, válidas para os dois isômeros, estão ilustradas na Figura 65. O espectro de massas obtido através de CLAE-EM (Figura 66) ilustra o pico do íon quasi molecular de m/z 294. Essas substâncias foram detectadas também na fração

FCHCl3(f)-45, após análise da mesma por CLAE-UV.

148

Tabela 45- Dados de RMN de 1H e 13C para as substâncias 11 e 12.

C/H δC δH, (mult.; J em Hz) Correlações gHMBC 1/1a 133,8/133,7 - 2/2a 129,0/128,9 7,45 (m) 3/3a 127,4/127,3 7,54 (m) 4/4a 129,6/129,5 7,45 (m) 5/5a 127,4/127,3 7,54 (m) 6/6a 129,0/128,9 7,45 (m) 7 66,7 6,08 (s) 133,8/133,7 7a 66,6 6,00 (s) 133,8/133,7 8 118,8 - 8a 117,9 - 1’ 101,2 4,20 (d; 7,0) 1’a 100,8 4,51 (d; 7,5) 2’/2’a 73,2/73,1 3,09 (m) 3’/3’a 77,5/77,3 a3,11/ a3,25 (m) 4’/4’a 70,0/69,9 3,09 (m) 5’/5’a 76,6/76,5 3,02 (m) 6’/6’a 61,2/61,1 b3,52/ b3,70 (m) 1 13 a, b CD3OD, 500 e 125 MHz para RMN de H e C, respectivamente. - valores podem ser permutados.

OH CN H OH O O H HO HO

Figura 65- Algumas correlações observadas no mapa de contorno gHMBC da fração FAc(g)-4.4b.

Figura 66 - Espectro de massas obtido para as substâncias 11 e 12. ES, -45 eV.

149

4.2.6- Flavonóis

Substâncias 16, 17 e 18 [frações FBu(f)-9.5, FBu(f)-9.6 e FBu(f)-9.7]

OH OH OH O OH O OH HO O OH HO O HO HO OH O O O OH O O O OH OH OH OH O HO OH O HO

16 17

OH

O OH HO O OH HO O O O OH OH OH O HO

18

As substâncias 16, 17 e 18 foram obtidas a partir da fração FBu(f)-9, através de CLAE fase reversa. A análise do espectro de RMN de 1H e o mapa de contorno gHMQC da substância 16 (Figuras 72 e 75, p. 70 e 73, v. 2) apresentou sinais na região de hidrogênios aromáticos com padrão de substituição característico do flavonóide quercetina: dois dubletos em δ 6,92 (2 Hz) e δ 6,0 (2 Hz) atribuídos aos hidrogênios do anel A; dois dubletos em 6,88 (8Hz) e δ 7,66 (2Hz) e um duplo dubleto em δ 7,64 ( 8 e 2 Hz) atribuídos ao anel B 3,4-dioxigenado.

Observou-se ainda nesse espectro, sinais na região de δ 3,80 relativos a hidrogênios carbinólicos e dois dubletos em δ 5,09 (8 Hz) e δ 4,52 (1,5 Hz), característicos de hidrogênios anoméricos de duas unidades de açúcar. A presença de dubleto em δ 1,13 sugere que um dos açúcares é a ramnose.

150

O espectro de RMN de 13C e DEPT 135 0 (Figuras 73, p.71, v. 2) apresentou 27 sinais sendo 15, atribuídos à aglicona e 12, aos açúcares. As multiplicidades desses carbonos forma atribuídas com base nos sinais do espectro de RMN de DEPT 1350 (Figura 74, p. 72, v.2). Assim, além da ramnose, a outra unidade de açúcar foi identificada com base nos dados encontrados na literatura [Markhan & Ternai, 1978 e 1976] como sendo a glicose. A ligação interglicosídica ramnosil-(1→6)-glicopiranosídeo foi evidenciada em função dos efeitos observados, ou seja, deslocamento de C-6’’ para região diamagnética e de C-5’’ para região paramagnética (Tabela 47). A configuração dos açúcares foi definida com base na constante de acoplamento dos hidrogênios anoméricos. H-1’’e H-1’’’ apareceram como dubletos com constantes de acoplamento 8,0 e 1,5 Hz, respectivamente, indicando que os carbonos anoméricos da ramnose e glicose têm configuração α e β, respectivamente. A confirmação do posicionamento da cadeia glicosídica no carbono C-3 foi evidenciada pela correlação observada no espectro de gHMBC entre δ 5,09 (H-1’’) e δ 136 (C-3) (Figuras 76-78, p. 74-76, v.2). A estrutura da substância 16 foi finalmente confirmada após análise dos espectros de massas, onde observou-se, entre outros, o pico com m/z 609, atribuído ao íon quasi molecular [M-H] (Figura 67). A substância foi identificada, portanto, como sendo o flavonol 3-O-β-ramnopiranosil-α-(1→6)-glicopiranosil-quercetina (rutina).

Tabela 46- Dados de RMN de 1H e 13C da substância 16. Posição δC, mult. δH, mult, J (Hz) Posição δC, mult. δH, mult, J (Hz) 2 159,6 s - 1'' 104,7 d 5.09 d (8,0) 3 136,1 s - 2'' 72,7 d 4 180,0 s - 3'' 76,2 d 5 160,1 s - 4'' 70,2 d 6 100,2 d 6,20 d (2,0) 5'' 78,7 d 7 167,2 s - 6'' 69,1 t 8 95,5 d 6,39 d (2,0) 1''' 102,4 d 4,52 d (1,5) 9 150,4 s - 2''' 71,8 d 10 105,3 s - 3''' 72,5 d 1' 122,7 s - 4''' 74,4 d 2' 117,6 d 7.66 d (2,0) 5''' 77,6 d 3' 158,1 s - 6''' 18,4 q 1,12 d (6.0) 4' 146,3 s - 5' 116,7 d 6.88 d (8,0) 6' 123,5 d 7.64 dd (2,0 e 8,5) 1 13 CD3OD, 500 e 125 MHz para RMN de H e C, respectivamente.

151

(a)

(b)

(c)

Figura 67 - Espectros de massas da substância 16. ES, -25 eV em (a); ES, +25 eV em (b) e em (c) ES, +25 eV “íon derivado” de m/z 610.

A análise dos espectros de RMN de 1H da substância 17 (Figura 79 e 82 p. 77 e 80, v. 2) mostrou sinais na região de hidrogênios aromáticos com padrão de substituição característico do flavonóide kaempferol: dois singletos em δ 6,42 e δ 6,22 e dois dubletos em δ 8,11 (9Hz) e 6,91 (9Hz) atribuídos aos hidrogênios dos anéis A e B, respectivamente. O conjunto de sinais entre δ 3,17 e δ 5,18 foi atribuído a hidrogênios de açúcar, sendo que os sinais em δ 5,18 (d, 7,5 Hz) e δ 4,07 (d, 7,0 Hz) são característicos de hidrogênios anoméricos com configuração β. Nos espectros de RMN de 13C e DEPT 1350 (Figuras 80 e 81, p. 78 e 79, v. 2), observou-se a presença de 24 sinais sendo 13, atribuídos à aglicona e 11, a duas unidades glicosídicas. Através da comparação dos dados, espectrais obtidos (Tabela 48) e dados da literatura [Agrawall, 1989] foi possível propor a presença de uma unidade de glicose e uma unidade de arabinose ligadas entre si

152

[glicopiranosídeo-(1→6)-arabinopiranosídeo]. As correlações observadas no espectro de gHMBC (H-1’’→ C-3; H-1’’’→ C-6’’) confirmaram essa proposta e tornou possível posicionar a função glicosídica em C-3 (Figuras 83 e 84, p. 81 e 82, v. 2) Para a substância 17, foi proposta a estrutura do 3-O-β- arabnopiranosil-(1→6)-β-glicopiranosil- kaempferol.

Tabela 47 - Dados de RMN de 1H e 13C da substância 17. Posição δC, mult. δH, mult., J (Hz) Posição δC, mult. δH, mult., J (Hz) 2 158,6 s - 1'' 104,2 d 5,17 d (7,5 Hz) 3 135,5 s - 2'' 72,3 d 4 179,3 s - 3'' 77,9 d 5 162,5 s - 4'' 69,4 d 6 101,0 d 6,42 s 5'' 77,9 d 7 167,8 s - 6'' 68,8 t 8 95,2 d 6,22 s 1''' 104,7 d 9 158,6 s - 2''' 73,9 d 10 105,3 s - 3''' 75,7 d 1' 122,7 s - 4''' 71,4 d 2', 6' 132,3 d 8,11 d (9 Hz) 5''' 66,5 t 3', 5' 116,2 d 6,91 d (9 Hz) 4' 161,6 s - 1 13 CD3OD, 500 e 125 MHz para RMN de H e C, respectivamente .

Os espectros de massas obtidos para a substância 17 (Figura 68) mostraram a presença dos íons de m/z 579 (íon quasi molecular) e de m/z 603 correspondente ao aduto [M + Na]+, que corroboraram a estrutura molecular proposta.

Figura 68 - Espectros de massas da substância 17. ES, +25 eV em (a) e ES, -30 eV em (b).

153

Para a substância 18, os espectros de RMN de 1H, 13C e DEPT 1350 (Figuras 85-87, p. 83-85, v. 2) mostraram perfil de sinais semelhante ao observado para a substância 17. No espectro de RMN de 13C foram observados 25 sinais sendo 12, atribuídos a duas unidades de açúcar e 13, atribuídos à aglicona. A presença de dubleto em δ 1,12 no espectro de RMN de 1H e do sinal em δ 17,8 no espectro de RMN de 13C evidenciaram a presença de uma unidade de ramnose e a outra unidade de açúcar foi identificada como sendo a glicose através da comparação com dados da literatura [Agrawall, 1989] (Tabela 49). As correlações observadas no espectro de gHMBC (H-1’’→ C-3 e H-1’’’→ C-6’’) caracterizaram ligação interglicosídica 1’’’→ 6’’ e permitiram posicionar a função glicosídica em C-3 (Figura 88, p. 86, v.2). A configuração desses açúcares foi definida pelas constantes de acoplamento observadas para os hidrogênios anoméricos em δ 5,09 (8,5 Hz) e δ 4,51 (1,5 Hz). Assim, a substância 18 foi identificada como sendo o 3-O-α-ramnosil-(1→6)-β- glicopiranosil- kaempferol.

154

Tabela 48 - Dados de RMN de 1H e 13C da substância 18. Posição δC, mult. δH, mult., J (Hz) P0sição δC, mult. δH, mult., J (Hz) 2 159,8 s - 1’’ 102,4 d 5,09 d (7,5) 3 132,35 s - 2’’ 73,8 d 4 179,1 s - 3’’ 75,7 d 5 161,9 s - 4’’ 71,4 d 6 100,2 d 6,38 d (1,7) 5’’ 77,2 d 7 161,9 s - 6’’ 68,6 t 8 95,1 d 6,19 d (1,7) 1’’’ 104,6 d 4,51 d (1,5) 9 164,9 s - 2’’’ 72,0 d 10 105,3 s - 3’’’ 72,3 d 1’ 122,9 s - 4’’’ 78,1 d 2’, 6’ 132,3 d 8,06 d (9,0) 5’’’ 69,7 d 3’, 5’ 116,1 d 6,89 d (9,0) 6’’’ 17,8 t 1,12, d, (1,5 ) 4’ 166,2 s - 1 13 CD3OD, 500 e 125 MHz para RMN de H e C, respectivamente.

Os espectros de UV obtidos para as substâncias 16, 17 e 18 durante a análise em CLAE-UV (Figura 69), mostraram bandas características de derivados da quercetina (255 e 354 nm) para 16 e de derivados do kaempferol (263 e 354 nm) para as substâncias 17 e 18, cujos espectros se sobrepõem. Esses dados espectrométricos foram utilizados para a identificação das substâncias 20, 21 e 22, descritas a seguir.

p () AU 219.02 481.07 100% - 16 - 17 75% - 18

50%

25%

0% 250 300 350 400 450 nm

Figura 69- Espectros de UV das substâncias 16, 17 e 18.

155

Substância 19 [fração FAcOEt(g)-14.2]

OH OH

HO O

OH OH

A substância 19 foi obtida através do fracionamento cromatográfico da fração F.Ac(g)-14, através de CLAE fase reversa. A análise dos dados de RMN de 1H dessa substância (Tabela 50) mostrou sinais característicos de uma catequina: 2 dubletos em δ 5,82 (J =2,5 Hz) e δ 5,85 (J =2,5 Hz) atribuídos aos hidrogênios do anel A 5,7-dioxigenado; dubletos em δ 6,98 (J =1,5 Hz) e em δ 6,82 (8,0 Hz)Hz, e duplo dubleto em δ 6,77 (J =1,5 e 8,0 Hz), atribuídos ao anel B 3,4-dioxigenado. Os sinais em δ 2,89 e δ 2,76, dois duplos dubletos (J =4,7 e 16,7Hz; 2,7 e 16,7), foram atribuídos aos hidrogênios do grupo metilênico (C-4) e os sinais em δ 4,82 e δ 4,19 foram atribuídos aos hidrogênios H-2 e H-3. Os sinais em δ 79,9 e δ 67,5, atribuídos aos carbonos C-2 e C-3 são característicos de catequina com configuração cis [Agrawal, 1989], devendo tratar-se, portanto da epi-catequina, na fração FAc(g)-14.2. Os espectros de RMN obtidos para essa substância estão ilustrados nas Figuras 89-94, p. 87-92, v.2). Em recente publicação foi demonstrado que, dentre os diversos flavonóis isolados das folhas de Eclea crispa (Ebenaceae), a epicatequina descrita acima é a substânia com maior potencial antibacteriano para Moraxella catarrhalis, causadora de um tipo de

Eclea crispa pneumonia [Pretorius, 2003].

156

Tabela 49- Dados de RMN de 1H e 13C para a substância 19.

δC, mult. δH, (mult., J em Hz) δC, mult. δH, (mult., J em Hz) Posição Posição 2 79,8 d 4,82 (sl) 9 157,8 s - 3 67,5 d 4,19 (m) 10 100,0 s - 4 29,2 t a 2,76 (dd, 16,7 e 2,7) 1’ 132,9 s - b 2,89 (dd, 16,7 e 4,5) 2’ 119,4 d 6,82 (d, 8) 5 157,6 s - 3’ 115,9 d 6,77 (dd; 8 e 1,5) 6 95,9 d 5,82 (d, 2,5) 4’ 145,9 s - 7 158 s - 5’ 145,8 s - 8 96,4 d 5,85 (d, 2,5) 6’ 115,3 6,98 (d, 1,5)

157

4.3- Desreplicação

Algumas frações provenientes dos diferentes fracionamentos cromatográficos parciais realizados com os extratos etanólicos de folhas e galhos de Prunus myrtifolia foram analisadas através de cromatografia líquida de alta eficiência acoplados a espectrômetros de massas e de luz ultravioleta, que foram utilizados como detectores. A análise conjunta de frações contendo misturas de substâncias e de substâncias purificadas durante esse trabalho, permitiu a localização de substâncias já isoladas em frações contendo misturas de substâncias que não foram submetidas a métodos cromatográficos para sua purificação, evitando assim a replicação de resultados. Adicionalmente, foi possível localizar frações contendo substâncias diferentes daquelas já isolados tais como os flavonóis 20, 21 e 22, e os derivados arilpropanóides 23 - 27. Para algumas dessas frações foram realizados experimentos de RMN de 1H e/ou 13C, que auxiliaram na identificação dessas substâncias.

Substância 20 [fração Fbu(f)-12.1]

OH OH

HO O OH O O O O OH HO OH OH O HO OH

A análise dos espectros de RMN de 1H e gHMQC da subfração FBu(f)- 12.1 (Figuras 95 e 96, p. 93 e 94, v.2), indicou a presença de sinais característicos de flavonol derivado da quercetina: dubleto em δ 6,21 (J=3 Hz) e δ 6,41 (J=3,0 Hz) característico de anel A 5,7-dioxigenado; dois dubletos em δ 6,89 e em δ 7,69 (J= 8,5 Hz, em ambos) e dubleto em δ 7,71 (J=2 Hz) caracterizando o anel B 3,4-dioxigenado. Os dois dubletos em δ 5,20 (J= 7,5 Hz) e em δ 4,05 (J= 7 Hz) e sinais em ca 3-4ppm, sugerem a presença de duas

158 unidades de açúcar, ambas em ligação β à aglicona. Essa subfração foi analisada através de CLAE fase reversa, utilizando como padrões de comparação, as substâncias 16, 17 e 18, descritas. Essa análise mostrou que a subfração FBu(f)-12.1 é constituída de duas substâncias sendo que uma delas é a substância 16 (em menor quantidade). A outra substância presente na mistura é diferente daquelas já descritas, devendo tratar-se, no entanto, de substância com esqueleto flavonoídico do tipo quercetina, como pôde ser evidenciado pelos dados de RMN de 1H obtidos e também pela comparação dos espectros de UV obtidos para a substância em análise e para a substância 16 (Figura 70). No espectro de massas obtido para a fração FBu(f)-12.1 observou-se sinais em m/z 609 [M-H]+ e m/z 596 [M-H]+, que foram atribuídos aos íons quasi moleculares das duas substâncias presentes nessa fração, confirmando-se que uma delas é a rutina (Figura 69a). A obtenção do íon derivado a partir do íon de massa 596, confirmou a presença da mesma unidade flavonoídica para as duas substâncias (Figura 69b). Assim, inferiu-se a estrutura acima para a substância referente ao pico 1 do cromatograma (Figura 71), o flavonol quercetina-3-O-arabinopiranosil-(1→6)-glicopiranosila, tal como foi proposto também para a substância 17 e de acordo com dados encontrados na literatura [Agrawal, 1989].

(a)

(b)

Figura 70- Espectros de massas da fração FBu(f)-12.1. ES, - 25 eV. Em (a) “full screen” e em (b) obtenção de íon derivado de m/z 596.

159

mAU AU 196.44 400.26 400 16 100% (a) 300 - 16 200 18 - 21 75% 100

0

mAU 50% 75 (b) Pico1 50 16 25

25%

0 -25 -50 0% 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 200 250 300 350 nm Minut es

Figura 71– Cromatogramas obtidos através de CLAE-UV para as frações FBu(f)-9 (a) e FBu(f)-12.1 (b). Ao lado espectros de UV obtidos.

Substâncias 21 [fração FAc(f)-18.2] e 22 [fração FAc(f)-20.20].

OH OH OH H O O HO O OH O OH O OH O OH O OH HO OH OH O HO OH O 21 22

Avaliação semelhante à descrita para a subfração FBu(f)-12.1 foi realizada com as subfrações FAc(f)-18.2 e FAc(f)-20.20, uma vez que a análise de seus espectros de RMN de 1H, embora ainda em mistura, evidenciaram sinais característicos da presença de substâncias glicosiladas com esqueleto flavonoídico, sendo FAc(f)-18.2 (Figuras 97-99, p. 95 e 96, v.2), um derivado do kaempferol e FAc(f)-20.20 (Figura 100, p. 97, v.2), um derivado da quercetina. A análise através de CLAE fase reversa confirmou essas informações através da comparação de espectros de UV e dos tempos de retenção obtidos para essas duas frações e para a fração padrão FBu(f)-9 (Figura 71). A presença de substância flavonoídica com esqueleto do tipo kaempferol em FAc(f)-18.2 foi confirmada após comparação dos espectros de UV obtidos para essa fração e para a fração FBu(f)-9, a partir da qual foram isolados os

160 flavonóis 16, 17 e 18. O perfil do espectro de UV obtido para FAc(f)-18.2 é idêntico ao observado para a substância 18. Os outros sinais observados no espectro de RMN de 1H da fração dessa fração são relativos à substância 15, descrita anteriormente. Quanto à fração FAc(f)-20.20, após comparação dos cromatogramas obtidos foi possível observar um mesmo tempo de retenção para essa substância e para a substância 18, um derivado do kaempferol. Entretanto, o espectro de UV obtido para essa substância é idêntico ao observado para a substância 16 (Figura 72), e corrobora os dados obtidos através de RMN de 1H para essa fração.

AU 196.44 400.26 16 100% mAU - 18 400 (a) - FAc(f)-18.2 300

200 18 - 16

75% 100 - FAc(f)-20.20

0

mAU (b) 22 100

75 50% 50 25

0 -25 -50 25% mAU (c) 21 250 200 150

100 0% 50 200 250 300 350 0 nm

-50 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Minutes Figura 72 – Cromatogramas obtidos através de CLAE-UV para as frações FBu(f)-9 (a) e FAc(f)-20.20 (b) e FAc(f)-18.2. Ao lado espectros de UV obtidos. Uma interessante comparação dos tempos de retenção observados para as substâncias purificadas e utilizadas como padrões e para as substâncias 21 e 22 suportam essa avaliação: em uma mesma condição cromatográfica, as substâncias 18 (tR = 10,7) e 21 (tR = 11,2 min.) possuem entre si uma diferença de 0,5 minutos e, estruturalmente, diferem entre si na porção glicosídica da molécula, sendo que 18 possui uma unidade rutinosila e 21 apenas uma unidade de glicose. Concluindo a observação, as substâncias 16 (tR = 10,2 min.) e 22 (tR = 10,7 min.) possuem igualmente entre si 0,5 minutos de diferença em termos de tempo de retenção e também diferem somente na porção glicosídica da molécula. Todas essas observações, associadas aos dados obtidos através de CLAE-EM para FAc(f)-18.2 e FAc(f)-20.20 (Figura 73), permitiram construir as

161 estruturas a acima para as substâncias 21 e 22. Os espectros ilustram os picos referentes aos íons quasi moleculares (m/z 447 e m/z 463) que caracterizam essas substâncias.

D

Figura 73 – Espectros de massas obtidos para as frações FAc(f)-18.2 (a) e FAc(f)-20.20 (b). ES, -30 eV

162

As frações intermediárias provenientes do fracionamento de Fac(f)-20 seriam reunidas para a tentativa de purificação da substância referente ao pico 3 do cromatograma (c) (Figura 74). Entretanto, após análise conjunta dos cromatogramas obtidos para as substâncias já descritas e baseando-se nos tempos de retenção observados para cada uma delas, bem como dos espectros de UV obtidos, foi possível constatar que o pico 3 do cromatograma [Fac(f)-20.8], que está presente também nos cromatogramas das frações Fac(f)-20.3, Fac(f)-20.6 e Fac(f)-20.8, é relativo à substância 14. Ainda através da comparação dos espectros de UV obtidos durante essas análises, foi possível confirmar a presença dos glicosídeos cianogênicos 11 e 12 (picos 1 e 2) em FAc(f)-20.3 e do flavonol 21 em FAc(f)-20.4 (pico 4) (Figura 75). A substância presente em FAc(f)-28 foi identificada como sendo o flavonol 18 conforme dados apresentados no espectro de UV obtido para a substância, durante a análise via CLAE (Figura 76).

II+ mAU 15 300 (a) 100

II+ Picos 1 e 2 mAU

50 (b)

Pico 4 II+ mAU 150 50 (c)

II+ mAU (d) 0

II+ Pico 3 mAU 200 100 (e) 0

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

Minutes

Figura 74-Cromatogramas obtidos via CLAE fase reversa para as subfrações: (a) Fac(f)-20.1 (substância 15), b) Fac(f)-20.3, c) Fac(f)-20.4 e d)

Fac(f)-20.6 e (e) Fac(f)-20.8. Detector UV, 254 nm. H2O/CH3OH (5:95)→ CH3OH (100%).

163

mA U Pico 4 200 (a) Pico 2 150 Pico 1 100

50

0

-50 11 mA U (b) 10 12 0 -10 -20 -30 (c) -40 21 mA U 250 200 150 100 50 0 -50

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

Minutes

AU 19 6.44 4 00.26 1 00% - 21 - 11 - 12 75% - Pico 1 (FAc(f)-20.4) - Pico 2 (FAc(f)-20.4) - Pico 4 (FAc(f)-20.4) 50%

25%

0% 200 250 30 0 35 0 nm

Figura 75 – Comparação dos cromatogramas obtidos através de CLAE-UV para as subfrações (a) FAc(f)-20.4, (b) FAc(g)-4.4 e (c) FAc(f)-18.2 (substância 21). Abaixo, espectros de UV obtidos durante as análises.

164

AU 10.696 18 (a) 1.5

1.0

0.5 12.280 12.709 9.333 10.219 8.501 13.304 3.723 9.765 11.272 13.739 17.059 3.280 4.275 5.987 8.752 11.573 11.792 12.037 14.072 14.565 14.883 16.331 7.259 7.667 7.888 8.075 15.168 15.653 16.720 17.427 17.853 18.525 19.339 19.752

0.0

mAU 16 10.213 500 (b)

400 18

300 10.699

200

100 9.885 3.245 3.781 4.373 8.829 9.176 9.507 7.379 8.528 11.208 12.712 13.341 16.752 17.317 0

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

Minutes

AU 218.55 400.26 100% (c) - FAc(f)-28 - 18

75%

50%

25%

0%

225 250 275 300 325 350 375 nm

Figura 76 - Comparação dos cromatogramas através de CLAE-UV obtidos para: (a) subfração FAc(f)-28, 254 nm; (b) FBu(f)-9, 254 nm. (c) espectros de UV obtidos durante a análise.

165

Arilpropanóides da fração FAc(g)-8.

Uma interessante análise da fração FAc(g)-8 e de suas subfrações pôde ser realizada com a utilização da CLAE-UV e CLAE-EM. A Figura 77 ilustra em (a) o cromatograma obtido em sistema gradiente de eluição (H2O→CH3OH, 254 nm) para FAc(g)-8 e em (b) os diversos espectros de UV obtidos para cada um dos picos desse cromatograma. Em todos os espectros verificou-se a presença de bandas de absorção características de unidade cafeoíla já identificada anteriormente através de RMN de 1H e dados de UV para a substância 14, sugerindo a presença de outras substâncias possuindo esse mesmo cromóforo em FAc(g)-8. Exceção foi observada para o espectro relativo ao pico 8, que mostrou padrão característico de flavonol derivado da quercetina (espectro em rosa). A comparação dos cromatogramas e espectros de UV obtidos em CLAE-UV para FAC(g)-8 e para as substâncias 14 e 16 isoladas (Figura 78), indicou a presença dessas duas substâncias na fração FAc(g)-8 (Picos 4 e 8 e espectros de UV em preto e rosa, respectivamente).

mAU 5 8 150

100 9 3 50 2 6 7 1 4

0

-35 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

Minutes

AU 218.55 400.26 100%

75%

50%

Figura 77 - (a) cromatograma 25% obtido em CLAE-UV para a fração FAc(g)-8. H2O→CH3OH, 254 nm. (b) espectros de UV obtidos para 0% 225 250 275 300 325 350 375 nm as substâncias representadas pelos picos 1-9.

166

mAU

150 14 (a) 100

50

0

mAU 700 (b) 16 600

500 400 300

200

100

0

mAU 150 (c) 100

50

0

5101520

AU 218.55 400.26 100% - 14 - Pico 4 - 16 75% - Pico 5

50%

25%

0% 225 250 275 300 325 350 375 nm

Figura 78 - cromatogramas e espectros de UV obtidos em CLAE-UV para FAC(g)-8 e para as substâncias 14 e 16.

FAc(g)-8 foi fracionada através de cromatografia de fase reversa em coluna de média pressão e, dentre as subfrações obtidas, FAc(g)-8.2, FAc(g)- 8.10 e FAc(g)-8.15 foram selecionadas como subfrações representativas da fração original. A figura.79 ilustra os cromatogramas obtidos para as subfrações FAc(g)-8.3, FAc(g)-8.10.

mAU FAc(g)-8.2 FAc(g)-8.15 150 125 (a) 100 75 FAc(g)-8.10 50

25

0

mAU 40 (b) 30

20

10

0

mAU

70 60 (c) 50

40

30

20

10

0

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

Minutes

Figura 79 - Cromatogramas obtidos para a fração FAc(g)-8 (a)

e as subfrações FAc(g)-8.2 (b) e FAc(g)-8.10 (c). H2O→CH3OH, 254 nm.

167

De acordo com o descrito acima foi possível observar, portanto a presença da substância 14 na subfração FAc(g)-8.2, além de outras duas substâncias. A análise dos espectros de massas obtidos através de EM/ES para essa fração permitiu identificar adicionalmente, as substâncias 26 e 27 nessa fração, através da presença dos íons quasi moleculares de m/z 353 e de m/z 337 (Figura 80c). A obtenção de íons precursores de m/z 179, revelaram com maior intensidade os íons quasi moleculares derivados, e característicos para as substâncias 26 e 27 (Figura 80a e b). As fragmentações esperadas para cada uma dessas substâncias estão ilustradas nas Figuras 81 e 82.

0 LuAv_MA2_DI353b 38 (0.723) Daughters of 353ES- 191.1 7.38e3 100 (a)

179.1 %

173.2 353.4 135.2 107.7 123.4 161.1 202.7206.4 0 LuAv_MA2_DI337a 22 (0.430) Daughters of 337ES- 337.3 100 8.53e3

(b)

191.1 % 163.2 173.1 160.9 176.3 265.3 141.9 212.9 244.4 248.1 361.8 380.8 392.0 0 LuAv_MA2_FSb 40 (1.048) Scan ES- 353.3 100 1.55e6 179.1 176.2 (c) 191.2 % 103.2

243 .3 265.2 216.2 295.3 337.3

0 m/z 1001101201301401501601701801902002102202302402 50260270280290300310320330340350360370380390

Figura 80- Espectros de massas obtidos para a fração FAc(g)-8.2. ES, -30 eV. Em (a) íons derivados de m/z 353; (b) íon pai de m/z 179 e (c) “full scan”.

168

HO COOH O HO O OH OH -O C16H17O9 353 (22 %)

O HO COOH HO OH -O OH -O OH C9H7O4 179 (50 %) C7H11O6 191 (100 %)

HO

HO COOH -O

C8H7O2 135 (15 %) HO OH C7H9O5 173 (100 %)

Figura 81 - Íons característicos observados no espectro de Massas da substância 26.

169

HO COOH O

O OH OH -O C16H18O8 337 (100 %)

O HO COOH OH

-O -O OH OH C H O 9 7 3 163 (30 %) C7H11O6 191 (100 %)

HO HO COOH

-O

C8H7O2 HO OH 179 (15 %)

C7H9O5 173 (100 %)

Figura 82 - Íons característicos observados no espectro de massas da substância 27.

170

FAc(g)-8.10 foi submetida a fracionamento que deu origem às subfrações FAc(g)-8.10.1, FAc(g)-8.10.2 e FAc(g)-8.10.3, sendo as duas últimas constituídas ainda da mistura de duas substâncias. A análise dos espectros de RMN obtidos para FAc(g)-8.10.1, e, especialmente os dados de RMN de 13C, foram conclusivos para a determinação da estrutura molecular da substância 23. FAc(g)-8.10.2 e FAc(g)-8.10.3 foram reunidas e, embora a fração resultante [FAc(g)-8.10.2a] tenha sido submetida a separação cromatográfica preparativa, as substâncias permaneceram em mistura (Figura 83).

mAU 15 10 (a) 5 0

-5 mAU 70 (b) 60

50 40 30

20

10 0

mAU 40 (c) 30

20

10

0

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

Minutes

Figura 83 - Cromatogramas obtidos via CLAE-UV para as subfrações FAc(g)-8.10.1 (a), FAc(g)-8.10.2 (b) e FAc(g)-8.10.3 (c).

Uma pequena amostra da fração FAc(g)-8.10 inicial foi então analizada através de CLAE-EM, tendo sido obtidos os espectros de massas para cada uma das substâncias representadas pelos picos 1, 2 e 3 do cromatograma da Figura 84. Uma vez que o espectro de massas do pico 1 (compatível com FAc(g)-8.10.1) tem perfil semelhante aos dos picos 2 e 3 (compatíveis com FAc(g)-8.10.2 e FAc(g)-8.10 3), evidenciando a perda de uma unidade

C6H11O6, considerou-se a existência de isômeros constitucionais. Os dados obtidos a partir dos espectros de RMN de 1H, gHMBC e gHMQC de FAc(g)- 8.10.2a (Figuras 101-103, p. 98-100, v. 2), evidenciaram a correlação entre os hidrogênios anoméricos em δ 4,33 e δ 4,92 com o carbono carboxílico em δ 168,0.

171

Pico 2 (a) (b) Pico 3

Pico 1

(c) (d)

Figura 84 - (a) Cromatograma em CLAE fase reversa da fração FAc(g)-8.10. Espectros de massas em ES, -45 eV, referentes aos picos 1 (b), 2 (c) e 3 (d). 172

Os sinais observados no espectro de RMN de 13C em δ 96,9, 92,3, 76,4, 74,7, 73,6, 72,9, 72,23, 70,7, 70,3, 69,3 e 63,8 (2C), foram atribuídos à duas unidades de galactose, sendo uma em ligação α à aglicona e a outra em β, confirmando os dados de RMN de 1H. Através desses dados as substâncias presentes na fração FAc(g)-8.10.2a foram identificadas como sendo o cafeoato de β-galactosila e o cafeoato de α-galactosila. Nas frações FAc(g)-8.10.15, FAc(g)-8.10.16 E FAc(g)-8.10.17, também obtidas a partir do fracionamento de FAc(g)-8, foram identificadas as substâncias 16 e 18 a partir da comparação dos dados obtidos em análise através de CLAE-UV (Figura 85 ).

16 mAU

15 10 (a) 5 0 -5

mAU 18 30 (b) 20

10

0

mAU

75

50 (c)

25

0

mAU

75 50 (d) 25

0

mAU

40 30 (e) 20 10 0

5101520

Minutes

287.248 19.733 Within B a se lin e fac(g)-8.17.run

AU 218.55 400.26 100%

75%

50%

- 16 25% - 18 - Fac(g)-8.15 - Fac(g)-8.17

0% 225 250 275 300 325 350 375 nm

Figura 85 - Comparação dos cromatogramas através de CLAE-UV obtidos para: (a) subfração FBu(f)-9.5; (b) FBu(f)-9.7; (c) Fac(g)-8.15; (d) Fac(g)-8.16; (e) Fac(g)-8.17. Condição, 254 nm. (c) espectros de UV obtidos durante a análise. Gradiente de eluição CH OH/H O). 3 2 173

Frações provenientes das fases hidroalcoólicas de partição dos extratos etanólicos de galhos e folhas A análise comparativa das frações FAq(f)-1:9 e FAq(g)-1:9 provenientes das fases hidroalcoólicas de partição dos extratos de galhos e folhas mostrou perfil cromatográfico diferenciado para os dois órgãos da planta em relação aos metabólitos de maior polaridade (Figura 86). Conforme descrito, as substâncias 13 e 14 foram obtidas a partir de FAq(f)-1:9.

mA U 14 13 (a) 200 150 100

50

0

mA U 30 30 (b) 20 13 10 Figura 86- Cromatogramas obtidos 0 através de CLAE-UV para as frações -10 → 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 FAq(f)-1:9 (a) e FAq(g)-1:9 (b). H2O Minutes CH3OH, 254 nm.

Além de FAq(f)-1:9, as demais frações provenientes do fracionamento cromatográfico de FAq(f), foram igualmente analisadas através de CLAE fase reversa. A análise dos cromatogramas evidenciou os seguintes dados: as frações FAq(f)-8:2 e FAq(f)-1:1 são constituídas majoritariamente pelas substâncias 16 e 18, respectivamente (Figura 87). As frações FAq(f)-4:6, FAq(f)-3:7 e FAq(f)-2:8 são constituídas de material sólido de coloração castanho avermelhado e de difícil dissolução em solventes orgânicos (Figura 88). Essas frações não foram analisadas nesse trabalho.

174

mA U 13 14 200 (a) 150 100 50 0 mA U 16 (b) 50 25 0

mA U 18 (c) 100 50 0 mA U 16 (d) 300 Figura 87 - Cromatogramas obtidos 200 18 100 através de CLAE-UV para as frações 0 FAq(f)-1:9 (a), FAq(f)-8:2 (b), FAq(f)-1:1 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 → Minutes (c) e FBu(f)-9 (d). H2O CH3OH, 254 nm.

Figura 88 – Fotografia de amostras das frações FAq(f)- 4:6 e FBu(g)-19.

As frações provenientes do fracionamento cromatográfico de FAq(g) foram analisadas através de CLAE. A partir de FAq(g)-1:9 a substâncias 30 foi isolada. FAq(g)-2:8 contém a substância 14 (Figura 89).

mA U

200 (a)

150

100

50

0

mA U 14 (b) 100

75 ? 50 25

0 Figura 89 - Cromatogramas obtidos

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 para FAq(f)-1:9 (a) e FAq(g)-2:8 (b). Minut es H O→CH OH, 254 nm. 2 3 As frações FAq(g)-3:7 e FAq(g)-10:0 apresentaram perfil semelhante ao da fração FAq(g)-2:8, que é constituída da substância 14 (Figura 90).

175

mA U 100 75 (a) 50 25 0 mA U 20 (b) 10 0 -10 mA U 0.0 (c) Figura-90 Cromatogramas obtidos -2.5 -5.0 para FAq(g)-2:8 (a), FAq(g)-3:7 (b) e -7.5 → FAq(g)-10:0 (c). H2O CH3OH, 254 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 nm. Minutes

Frações provenientes das fases butanólica de partição dos extratos etanólicos de galhos e folhas Conforme descrito, a partir de FBu(f)-9 foram isolados os flavonóis 16, 17 e 18. As demais frações provenientes de FBu(f) foram analisadas através de CL e RMN de 1H, de modo que a fração FBu(f)-1 mostrou ser constituída majoritariamente por açúcares (Figura 104, p. 101, v. 2). As frações FBu(f)-2, FBu(f)-3 e FBu(f)-4 possuem perfil cromatográfico semelhante, conforme ilustrado na Figura 91. As substâncias presentes nessas frações foram identificadas de acordo com a mesma metodologia descrita anteriormente para frações provenientes da FAc(g)-8. Estão presentes nessas frações as substâncias 13, 14 e 18.

faq(f)1.9-2 224.911 7.387 PeakApex Baseline faq(f)1.9-2.run

AU 218.55 400.26 100% mA U 13 (a) 100 75% 0 mA U 18 100 (b) 50 50% 0 mA U 14 50 (c) 25% 0

mA U 75 (d) 25 0% 225 250 275 300 325 350 375 nm

mA U 50 (e) 30 10 Figura 91- Cromatogramas obtidos para mA U subst. 13 (a), subst. 18 (b), subst.14 (c) e 5 (f) 0 -5 frações FBu(f)-4 (d), FBu(f)-3 (e) e

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 FBu(f)-2 (f). H2O→CH3OH, 254 nm. Em Minutes destaque, espectros de UV obtidos.

176

As frações provenientes do fracionamento de FBu(g) foram analisadas através de CLAE-UV. Os cromatogramas obtidos estão ilustrados na Figura 92. A partir dessa análise foi possível observar grande semelhança no perfil cromatográfico de todas as frações obtidas, com exceção de FBu(g)-19 e FBu(g)-final, que são constituídas do mesmo material sólido apresentado na Figura 88.

mA U 10 (a) 0

mA U 150 (b) 100 50 0

mA U 20 (c) 10 0

mA U 0.0 -2.5 (d) -5.0 -7.5

mA U

-2.5 (e) -5.0 -7.5

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

Minutes

Figura 92 - Cromatogramas obtidos para FBu(g)-1 (a), FBu(g)-4 (b) e

FBu(g)-15 (c), FBu(g)-19 (d) e FBu(g)-final (e). H2O→CH3OH, 254 nm.

A fração FBu(g)-4 foi selecionada para representar a fase butanólica de partição do extrato etanólico dos galhos e a constituição química dessa fração foi inteiramente determinada através da comparação dos tR(s) e dos dados de UV obtidos durante as análises, tendo sido possível identificar as substâncias 13, 16, 18, os arilpropanóides 14 e 23 – 27, além da substância 30 (Figura 93).

177

30 mA U

20 13 10

0

mA U 150 13 100

50

0 14 mA U 16 100 24 50 25 18 23 26 0

14 mA U 16 150 24 30 25 26 100 13 23 18 50

0

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5

Minutes Figura 93 - Cromatogramas obtidos através de CLAE-UV para: (a) FAq(g)-1:9, (b) Subst. 13, (c) FAc(g)-8 e (d) FBu(g)-4. Gradiente de eluiçãoH2O→ CH3OH

178

4.4- Resultados de ensaios químicos e biológicos

De acordo com os testes preliminares descritos no projeto, os extratos hexânico e diclorometânico das folhas e dos galhos apresentaram atividade frente aos fungos patogênicos Cladosporium sphaerospermum e C. cladosporioides e o extrato etanólico das folhas e galhos mostrou atividade citotóxica e antioxidante (Tabelas 8-10, p. 82 e 85).

Atividade antifúngica As fases hexânica e clorofórmica das partições dos extratos de galhos e folhas [(FHex(g), FHex(f), F.CHCl3(g) e F.CHCl3(f)] foram submetidas a bioensaio para detecção de atividade antifúngica. Os resultados obtidos com os ensaios são mostrados na Tabela 51. Esses resultados sugerem que a substância proveniente das fases hexânicas de partição dos extratos de galhos e folhas, que detêm a atividade antifúngica apresentada nos ensaios preliminares com cepas de Cladosporium, é a substância 1 (majoritária na fração FH(g)-7.3), ou mesmo a mistura de 1, 2 e 3. Já a atividade apresentada pelas fases clorofórmicas de partição não foi mais observada para as frações obtidas após fracionamento cromatográfico.

Tabela 50- Resultados obtidos com o bioensaio para detecção de atividade antifúngica para linhagens de Cladosporium. Amostra C. sphaerospermum C. cladosporoides F. Hex(f) Rastro (*) i F. Hex(g) Rastro (*) i F. CHCl3(f) 0.6/0.76 (**/*) 0.6/0.76 (*/*) F. CHCl3(g) Rastro/0.61/0.71 0.61/0.71 (*/*) subst. 1 + 2 + 3 ** * i = inativo.

Para ensaio realizado com linhagens de Candida, dentre as várias fases de partição, frações e substâncias isoladas submetidas ao ensaio, a mistura de glicosídeos cianogênicos 11 e 12 apresentou atividade fraca frente à C. krusei, enquanto a substância 13 apresentou atividade moderada para C. albicans (Tabela 52).

179

Tabela 51- Resultados obtidos com o bioensaio para detecção de atividade antifúngica para linhagens de Candida. Fração/microrganismo C. albicans C. parapsilosis C. krusei

FAc(g)-8 - - - FAc(g)-4.4b (11 + 12) - - * FAc(g)-6 - - - FAc(g)-16 - - - FAc(g)-21 - - - FAc(g)-12 - - - FAc(f)-6 - - - FAc(f)-11 - - - FBr(f)-12.2 - - - FAc(g)-4.4 - - - FBr(g)-15 - - - FBr(g)-4 - - - FBr(g)-19 - - - FBr(g)-final - - - FBr(g)-1 - - - FAc(f)-20:1 - - - Faq(g)-1:9 - - - Faq(g)-3:7 - - - Faq(f)-1:9 - - - Faq(f)-1:9 - - - Faq(f)-1:9:2 (13) ** - - Faq(f)-4:6 - - - Faq(f)-1:9 HPLC-4 - - - Faq(f)-3:7 - - - Faq(f)-1:9 HPLC-1 - - - FH(f)-2:8 - - - FH(f)- 46-53 - - - FH(f)-36.6+36.7 - - - FH(f)-43.2 - - - FH(f)-42.3 e 43.2 - - - FBr(f)-4 - - - FBr(f)-4 - - - FBr(f)-9 - - - FCHCl3(f)-44i - - - FCHCl3(f)-36 - - - FCHCl3(f)-47i - - - FCHCl3(f)-30 - - - FCHCl3(f)-17 - - -

180

Atividade citotóxica e antitumoral As fases FAcOEt(g), FAcOEt(f), FBuOH(g) e FBuOH(f) foram submetidas a ensaio para detecção de atividade citotóxica, conforme protocolo descrito no itemOs resultados obtidos com esse ensaio são mostrados na Tabela 53. Esses resultados mostram que a atividade citotóxica apresentada pelos extratos brutos como resultados dos ensaios anteriores ao início dos trabalhos de fracionamento cromatográfico (Tabelas 8-10, p. 82 e 85), não foram mais observadas após o fracionamento dos extratos obtidos em larga escala.

Tabela 52- Resultados obtidos com o bioensaio para detecção de atividade citotóxica. Amostra Cepas de S. cerevisae Rad+ 52Y 321 F.AcOEt(f) i i 8 F.AcOEt(g) i i i F.BuOH(f) 8 i i F.BuOH(g) i i i i = inativo.

Entretanto, para o ensaio utilizado na detecção de atividade antitumoral, um interessante resultado pôde ser observado para as amostras submetidas ao teste (Tabela 54). As linhas da tabela destacadas em verde, representam resultados com potencial fraco obtidos para frações ou substâncias purificadas. O destaque em azul refere-se a resultados com potencial moderado e, em vermelho, o resultado refere-se à amostras muito ativas. Assim, além de

FCHCl3(f)-44, que contém a substância 15, e de FBu(g)-19, que apresentaram atividade fraca, destaca-se a fase de partição FCHCl3(g) que apresentou atividade moderada e, a partir da qual foi obtida a mistura de triterpenos triidroxilados 28 e 29, que apresentaram atividade potencial na inibição de crescimento de células de câncer de mama, de cólon e do sistema nervoso central humano.

181

Tabela 53 – Atividade antitumoral de substâncias e frações obtidos a partir de extratos de Prunus myrtifolia. Amostra MDA/MB-435 SF - 295 HCT-8 FAq(f)-1:9 SA -21,981038 SA -32,748691 SA -79,240838 13 SA -64,795409 SA -76,727749 SA -81,439791 14 SA -70,484032 SA -49,397906 SA -63,848168 FAq(g)-1:9 SA -68,388224 SA -85,209424 SA -78,612565 FAq(g)-3:7 SA -38,448104 SA -9,5026178 PA 38,041002 FAq(f)-2:8 SA -61,801397 SA -62,905759 SA -89,293194 FAq(f)-3:7 SA -61,501996 SA -66,04712 SA -84,895288 15 SA -42,639721 SA -57,879581 SA -76,099476 FCHCl3(f)-44 PA 15,470704 SA -5,4188482 PA 4,3280182 FCHCl3(f)-47 SA -8,2085828 SA -45,942408 SA -45,314136 FAq(f)-4:6 SA -64,795409 SA -62,591623 SA -65,104712 16, 17,18 SA -70,484032 SA -75,157068 SA -76,099476 FBu(f)-1 SA -62,999002 SA -79,554974 SA -63,848168

FBu(f)-2 SA -60,603792 SA -76,413613 SA -66,675393 FBu(f)-3 SA -58,507984 SA -76,099476 SA -63,848168 FBu(f)-4 SA -41,741517 SA -46,256545 SA -63,219895 FBu(g)-1 SA 2,8308097 SA -79,554974 SA -71,073298 FBu(g)-4 SA -81,861277 SA -87,722513 SA -78,612565 FBu(g)-19 SA -34,855289 PA 7,0615034 SA -2,591623 FAc(g)-4 SA -78,567864 SA -76,727749 SA -83,324607

28 + 29 MA 97,63002 MA 98,177677 MA 95,444191 FCHCl3(g)-38 SA -67,190619 SA -68,246073 SA -64,162304 FCHCl3(g)- SA -46,232535 SA -80,811518 SA -65,732984 36.2 FAc(f)-28 SA -48,328343 SA -50,026178 SA -85,52356

FCHCl3(f)-30 MA 128,11906 MA 136,44647 SA -28,179883 FCHCl3(f)-17 SA -90,00651 SA 17,995444 SA 42,596811 FCHCl3(f)- SA -45,084635 SA -88,531134 SA -88,211815 46.1 FH(f)-38.7 PA 24,762508 SA -20,835551 PA 31,66287 FCHCl3(g) MO 67,321089 MA 81,776765 PA 26,1959 FHex(f) SA -15,00651 SA -41,910591 SA -64,262906 FAc(f) SA -76,72526 SA -76,077701 SA -103,85844 FBu(f) SA -52,897135 SA -81,50612 SA -84,699308 Extr bruto (g) SA -59,147135 SA -57,557211 SA -39,675359 FHex(g) SA -44,303385 SA -39,675359 SA -66,178819 FCHCl3(g) SA -57,584635 SA -54,364023 SA -62,666312 FAc(g) SA -65,78776 SA -52,128792 SA -62,346993 FBu(g) SA -80,240885 SA -43,187866 SA -46,381054 MDA/MB- 435 (mama - humano), SF - 295 (Sistema Nervoso Central - humano) e HCT-8 (tumor de cólon humano). SA – sem atividade, PA - POUCA ATIVIDADE (inibição até 50%), MO - MODERADA (inibição entre 50 E 75%), MA – muito ativo (inibição maior que 75%).

182

- Atividade antioxidante Todas as fases de partição obtidas foram submetidas a teste para detecção de atividade antioxidante, utilizando placas cromatográficas nebulizadas com solução de β-caroteno. FHex(g), FHex(f) foram submetidas a

CCD analíticas eluídas com CHCl3/MeOH (99,8/0,2). Após 4h a placa não apresentou a permanência da coloração alaranjada da solução de β-caroteno, indicando que nessas fases não ocorrem substâncias com atividade antioxidante. FCHCl3(g) e FCHCl3(f), analisadas no mesmo sistema de eluição, mostraram atividade antioxidante de moderada a fraca, sendo que após fracionamento dessas fases partição não foi possível relacionar a atividade à alguma substância isolada. As fases FAc(g), FAc(f), FBu(g) e FBu(f) foram submetidas a CCD analíticas eluídas com CHCl3/MeOH/H2O (65:30:5) e, após 4h, observou-se que, em manchas correspondentes à substâncias presentes nas fases FAc(g), FAc(f) e FBu(f) a coloração alaranjada do β-caroteno foi mantida enquanto que na fase FBu(g) o resultado foi considerado fraco. As substâncias 16, 17, 18 isoladas a partir de FBu(f), e a substância 19 foram submetidas ao teste químico para detecção de atividade seqüestradora de radicais livres, utilizando o radical livre estável DPPH. Os resultados são mostrados no gráfico da Figura 94.

110 padrão BHT 100 padrão rutina 16 90 1 19 80 4 18 70 3 17 60 2 50 40 30 20 10 % de decrescimo de DPPH 0 -10 0 20406080100 Figura 94- Gráfico da atividade Concentração em mM seqüestradora de radicais livres das substâncias 16- 19, frente ao DPPH.

183

5- CONCLUSÃO

O estudo químico de Prunus myrtifolia demonstra estar de acordo com relatos encontrados na literatura no que concerne a química do gênero Prunus. Foram isolados flavonóis, terpenóides, glicosídeos cianogênicos e derivados arilpropanóides entre outros metabólitos especiais. A ausência de alcalóides em folhas e galhos de Prunus myrtifolia corrobora os dados de quimiossistemática, inclusive para Rosaceae. Entre os metabólitos isolados de P. myrtifolia foi possível observar a ocorrência, em grande quantidade, dos flavonóis glicosilados de núcleo kaempferol e quercetina e do ácido 2-glicosil- mandélico. Plantas com elevado teor de flavonóis em seu metaboloma são de grande valor terapêutico e são utilizadas como fitoterápicos e/ou fitofármacos para o tratamento de enfermidades relacionadas com as principais propriedades farmacológicas apresentadas por essas substâncias, tais como antiespasmódica, antialérgica, antiviral, antiinflamatória e protetor solar, além de outras decorrentes do desequilíbrio entre fatores pró e anti oxidantes dos sistemas biológicos. Em alguns casos, entretanto, o valor terapêutico de tais plantas não está na fração flavonídica isolada e sim na mistura complexa constituída também de outras classes de substâncias que contribuem direta ou indiretamente para o potencial de ação do extrato. Essa conclusão, relatada na literatura para algumas espécies [Maitar et al., 1995; Safayhi et al., 1994], pode ser considerada também para P. myrtifolia, com relação aos resultados de testes biológicos utilizados para o monitoramento das atividdes citotóxica e antifúngica, uma vez que o extrato apresentou atividade potencial, enquanto as substâncias isoladas foram pouco ativas ou inativas. Já em ensaio mais específico realizado para detecção de atividade antitumoral, a mistura de dois triterpenos triidroxliados obtidos a partir do extrato etanólico dos galhos, apresentou potencial inibição do crescimento de células isoladas de câncer de mama, de cólon e do sistema nervoso central humano. Os testes químicos utilizados para a detecção de atividade antioxidante e da capacidade seqüestradora de radicais livres tiveram maior destaque entre os ensaios descritos, tendo sido possível avaliar essa propriedade em substâncias isoladas de galhos e folhas. Embora algumas substâncias

184 antioxidantes tenham sido identificadas em mistura e, portanto, não tenham sido avaliadas quanto ao seu potencial seqüestrador de radicais livres, a atividade antioxidante proposta é conhecida na literatura e a presença dessas substâncias na matriz, deve certamente ter colaborado para a potente atividade antioxidante observada para o extrato bruto.

Para esse trabalho, tal como foi realizado, a utilização das técnicas hifenadas CLAE-UV e CLAE-EM foi imprescindível não somente para obter dados espectrométricos de flavonóis, substâncias fenólicas e outros metabólitos aromáticos, mas também para localizar análogos das substâncias isoladas em frações obtidas durante os procedimentos cromatográficos, evitando-se a replicação de resultados.

Fica evidente o grande potencial dessas técnicas na localização e identificação de substâncias de interesse em matrizes complexas, como extratos vegetais, que são fundamentais para atender à crescente demanda decorrente da intensificação das atividades de bioprospecção, que se configuram como um dos principais focos das pesquisas realizadas pelo NuBBE.

185

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LUCIANA DE ÁVILA SANTOS

Estudo químico e das atividades citotóxica, antioxidante e antifúngica de Prunus myrtifolia L. (Urban.) (ROSACEAE)

Tese apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química

Orientadora: Prof. Dra Dulce Helena Siqueira Silva

(VOLUME 2)

ARARAQUARA 2005

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Espectro de RMN de H de FH(g)-23.3 (subst. 1+2+3). CDCl3, 200 MHz. 1 13 Figura 2 - Espectro de RMN de C da fração FH(g)-23.3 (subst. 1+2+3). CDCl3, 200MHz. 2 1 Figura 3 - Espectro de RMN de H da fração FH(g)-7.3 (subst. 4+5). CDCl3, 200 MHz. 3 13 Figura 4 - Espectro de RMN de C da fração FH(g)-7.3 (subst. 4+5). CDCl3, 50 MHz. 4 0 Figura 5 - Espectro de DEPT 135 da fração FH(g)-7.3 (subst. 4+5). CDCl3, 125 MHz. 5 0 Figura 6 - DEPT 90 da fração FH(g)-7.3 (subst. 4+5). CDCl3, 200 MHz. 6 1 Figura 7 - Espectro de RMN de H da fração FH(g)-33.5 (subst. 6+7). CDCl3, 500 MHz. 7 13 Figura 8 - Espectro de RMN de C da fração FH(g)-33.5 (subst. 6+7). CDCl3, 125 MHz. 8 0 Figura 9 - DEPT 135 da fração FH(g)-33.5 (subst. 6+7). CDCl3 125 MHz. 9 1 Figura 10 - Espectro de RMN de H da substância 6. CD3OD, 500 MHz. 10 13 Figura 11 - Espectro de RMN de C da substância 6. CD3OD, 125 MHz. 11 0 Figura 12 - DEPT 135 da substância 6. CD3OD, 125 MHz 12 Figura 13 - Espectro de gHMQC da substância 6. CD3OD, 500 MHz. 13 Figura 14 - Expansões do espectro de gHMQC da substância 6. CD3OD, 500 MHz. 14 Figura 15 - Espectro de gHMBC da substância 6. CD3OD, 500 MHz. 15 Figura 16 - Expansões do espectro de gHMBC da substância 6. CD3OD, 500 MHz. 16 Figura 17 - Expansões do espectro de gHMBC da substância 6. CD3OD, 500 MHz. 17 1 Figura 18 - Espectro de RMN de H da substância 8. CDCl3, 500 MHz. 18 13 Figura 19 - Espectro de RMN de C da substância 8. CDCl3, 125 MHz. 19 0 Figura 20 - Espectro de DEPT 135 da substância 8. CDCl3, 125 MHz. 20 1 Figura 21 - Espectro de RMN de H da fração FCHCl(g)-36.25 (subst. 28+29). CD3OD, 500 MHz 21 13 Figura 22 - Espectro de RMN de C da fração FCHCl3(g)-36.25 (subst. 28+29). CD3OD, 125 MHz. 22 Figura 23 - Espectro de gHMQC, da fração FCHCl3(g)-36.25 (subst. 28+29). CD3OD, 500 MHz. 23 Figura 24 - Expansão do espectro de gHMQC da fração FCHCl3(g)-36.25. CD3OD, 500 MHz. 24 Figura 25 - Expansão do espectro de gHMQC da fração FCHCl3(g)-36.25. CD3OD, 500 MHz. 24 Figura 26 - Expansão do espectro de gHMQC da fração FCHCl3(g)-36.25. CD3OD, 500 MHz. 25 Figura 27 - Expansão do espectro de gHMQC da fração FCHCl3(g)-36.25. CD3OD, 500 MHz. 25 Figura 28 - Espectro de gHMBC da fração FCHCl3(g)-36.25 (subst. 28+29). CD3OD, 500 MHz 26 1 Figura 29 - Espectro de RMN de H da substância 9. CDCl3, 500 MHz. 27 13 Figura 30 - Espectro de RMN de C da substância 9. CDCl3, 500 M125 28 Figura 31 - Espectro de RMN de 1H da substância 10. CDCl3, 500 MHz. 29 13 Figura 32 - Espectro de C da substância 10. CDCl3, 500 MHz. 30 0 Figura 33 - Espectro de DEPT 135 da substância 10. DCCl3, 500 MHz 31 1 Figura 34 - Espectro de RMN de H da substância 31. DMSO-d6, 500 MHz. 32 13 Figura 35 - Espectro de RMN de C da substância 31. DMSO-d6, 125 MHz. 33 Figura 36 - Espectro de gHMQC da substância 31. DMSO-d6, 500 MHz. 34 Figura 37 - Espectro de gHMBC da substância 31. DMSO-d6, 500 MHz. 35 1 Figura 38 - Espectro de RMN de H da substância 30. DMSO-d6, 500 MHz. 36 13 Figura 39- Espectro de RMN de C da substância 30. DMSO-d6, 125 MHz. 37 0 Figura 40- Espectro de DEPT 135 da substância 30. DMSO-d6, 125 MHz 38 Figura 41 - Mapa de contorno gHMQC da substância 30, DMSO-d6, 500 MHz. 39 Figura 42 - Mapa de contorno gHMBC da substância 30. DMSO-d6, 500 MHz. 40 1 Figura 43 - Espectro de RMN de H da substância 13. D2O, 500 MHz. 41 13 Figura 44 - Espectro de RMN de C obtido para a substância 13. D2O, 125 MHz. 42 O Figura 45 - Experimento DEPT 135 obtido para a substância 13. D2O, 125 MHz. 43 Figura 46 - Espectro de g HMQC da substância 13. D2O, 500 MHz. 44 Figura 47 - Expansões do espectro de g HMQC da substância 13. D2O, 500 MHz. 45 Figura 48 - Espectro de g HMBC da substância 13. D2O, 500 MHz. 46 1 Figura 49 - Espectro de RMN de H da substância 15. CDCl3, 500 MHz. 47 13 Figura 50 - Espectro de RMN de C da substância 15. CDCl3, 125 MHz. 48 O Figura 51 - Espectro de DEPT 135 obtido para a substância 15 CDCl3, 500 MHz 49 Figura 52 - Mapa de contorno gHMQC da substância 15. CD3OD, 500 MHz. 50 Figura 53 - Expansões do mapa de contorno gHMQC da substância 15. CD3OD, 500 MHz. 51 Figura 54 - Mapa de contorno gHMBC da substância 15. CD3OD, 500 MHz. 52 Figura 55 - Expansões do mapa de contorno gHMBC da substância 15. CD3OD, 500 MHz. 53 1 Figura 56 - Espectro de RMN de H da substância 14. CD3OD, 500 MHz. 54 13 Figura 57 - Espectro de RMN de C da substância 14. CD3OD, 125 MHz. 55 Figura 58 - Espectro de RMN de gHMQC da substância 14. CD3OD, 500 MHz. 56 Figura 59 - Expansões do espectro de RMN de gHMQC da substância 14. CD3OD, 500 MHz. 57 Figura 60 - Espectro de gHMBC da substância 14. CD3OD, 500 MHz. 58 Figura 61 - Expansão do espectro de gHMBC da substância 14. CD3OD, 500 MHz. 59 1 Figura 62 - Espectro de RMN de H da substância 23. DMSO-d6, 500 MHz. 60 13 Figura 63 - Espectro de RMN de C da substância 23. DMSO-d6, 500 MHz. 61 Figura 64 - Espectro de gHMQC da substância 23. DMSO-d6, 500MHz 62 Figura 65 - Espectro de gHMBC da substância 23. DMSO-d6, 500MHz. 63 1 Figura 66 - Espectro de RMN de H da fração FAc(g)-4.4b (subst. 11+ 12). DMSO-d6, 500 MHz. 64 13 Figura 67 - Espectro de RMN de C da fração FAc(g)-4.4b (subst. 11+ 12). DMSO-d6, 125 MHz. 65 0 Figura 68 - Espectro de DEPT 135 da fração FAc(g)-4.4b (subst. 11+ 12). DMSO-d6, 125 MHz. 66 Figura 69 - Espectro de gHMQC da fração FAc(g)-4.4b (subst. 11+ 12). DMSO-d6, 500 MHz. 67 Figura 70 - Espectro de gHMBC da fração FAc(g)-4.4b (subst. 11+ 12). DMSO-d6, 500 MHz. 68 Figura 71 - Expansões do espectro de gHMBC da fração FAc(g)-4.4b. DMSO-d6, 500 MHz. 69 1 Figura 72 - Espectro de RMN de H da substância 16, CD3OD, 500 MHz. 70 13 Figura 73 - Espectro de RMN de C da substância 16, CD3OD, 125 MHz. 71 0 Figura 74 - Espectro de DEPT 135 da substância 16, CD3OD, 125 MHz. CD3OD, 125 MHz. 72 Figura 75 - Espectro de gHMQC da substância 16, CD3OD, 500 MHz. 73 Figura 76 - Espectro de gHMBC da substância 16, CD3OD, 500 MHz. 74 Figura 77 - Expansão do espectro de gHMBC da substância 16, CD3OD, 500 MHz. 75 Figura 78 - Expansões do espectro de gHMBC da substância 16, CD3OD, 500 MHz. 76 1 Figura 79 - Espectro de RMN de H da substância 17. CD3OD, 500 MHz. 77 13 Figura 80 - Espectro de C da substância 17. CD3OD, 125 MHz. 78 13 Figura 81 - Espectro de C da substância 17. CD3OD, 125 MHz. 79 Figura 82 - Espectros de gHMQC da substância 17 e expansões. CD3OD, 500 MHz. 80 Figura 83 - Espectro de gHMBC da substância 17. CD3OD, 500 MHz. 81 Figura 84 - Expansões do espectro de gHMBC da substância 17. CD3OD, 500 MHz 82 1 Figura 85 - Espectro de RMN de H da substância 18, CD3OD, 500 MHz. 83 13 Figura 86 - Espectro de RMN de C da substância 18, CD3OD, 125 MHz. 84 Figura 87 - Espectro de DEPT 1350 da substância 18, CD3OD, 125 MHz. 85 Figura 88 - Espectro de gHMBC da substância 18, CD3OD, 500 MHz. 86 1 Figura 89 - Espectro de RMN de H da substância 19, CD3OD, 500 MHz. 87 13 Figura 90 - Espectro de RMN de C da substância 19, CD3OD, 125 MHz. 88 Figura 91 - Espectro de gHMQC da substância 19, CD3OD, 500 MHz. 89 Figura 92 - Espectro de RMN de gHMBC da substância 19, CD3OD, 500 MHz. 90 Figura 93 - Expansões do espectro de RMN de gHMBC da substância 19, CD3OD, 500 MHz. 91 Figura 94 - Expansões do espectro de gHMBC da substância 19, CD3OD, 500 MHz. 92 1 Figura 95 - Espectro de H da fração FBu(f)-12.1, CD3OD, 500 MHz. 93 Figura 96 - Espectro de g HMQC da fração FBu(f)-12.1, CD3OD, 500 MHz. 94 1 Figura 97 - Espectro de RMN de H da substância 21. CD3OD, 500MHz. 95 1 Figura 98 - Expansão do espectro de RMN de H substância 21. CD3OD, 500MHz. 96 1 Figura 99 - Expansão do espectro de RMN de H substância 21. CD3OD, 500MHz. 97 1 Figura 100 - Espectro de RMN de H da substância 22. CD3OD, 500MHz. 98