1 Evaluación De La Actividad Antioxidante De Las Hojas

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LAS HOJAS DE Pentacalia corymbosa y Pentacalia nitida (ASTERALES: ASTERÁCEAE)

CAMILA URIBE-HOLGUÍN

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE BIOLOGÍA

2010

ANÁLISIS FITOQUÍMICO DE LAS HOJAS DE Pentacalia corymbosa y P.nitida (ASTERALES: ASTERÁCEAE) Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE.

CAMILA URIBE-HOLGUÍN

APROBADO

INGRID SCHULER, PhD ANDREA FORERO

Decano Académico Directora carrera de Biología

Facultad de ciencias

ANÁLISIS FITOQUÍMICO DE LAS HOJAS DE Pentacalia corymbosa y P.nitida (ASTERALES: ASTERÁCEAE) Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE.

CAMILA URIBE-HOLGUÍN

APROBADO

LUIS GONZALO SEQUEDA, MSc ALBA NOHEMI TELLEZ, PhD

Director Jurado

NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. Artículo 23 de la Resolución Número 13 de julio de 1946.

ÍNDICE DE CONTENIDO PG. Abreviaturas…………………………………………………………………………………………………………… 6 Resumen……………………………………………………………………………………………………………….. 7 Introducción…………………………………………………………………………………………………………… 7 Referentes conceptuales 1. Radicales libres y antioxidantes…………………………………………………………………………...... 8 1.1 Antioxidantes naturales y comerciales……………………………………………………………………. 9 Los flavonoides…………………………………………………………………………………………………………… 10 Las cumarinas……………………………………………………………………………………………………………… 10 los Quinoles………………………………………………………………………………………………………………… 11 1.1.2. El romero…………………………………………………………………………………………………………… 11 1.1.3. Clasificación taxonómica de Pentacalia……………………………………………………………… 12 1.1.3.1. Las Asteráceas o compuestas ………………………………………………………………………… 12 1.1.3.2. La tribu Senecioneae……………………………………………………………………………………….. 12 1.1.3.3. El género Pentacalia…………………………………………………………………………………………. 13 Pentacalia corymbosa……………………………………………………………………………………………………. 13 Pentacalia nítida…………………………………………………………………………………………………………… 13 Antecedentes 2. Métodos para la evaluación de la actividad antioxidante…………………………………………… 14 2.1 Método ABTS…………………………………………………………………………………………………………… 15 2.1. Método DPPH………………………………………………………………………………………………………… 15 3. Métodos para la identificación de metabolitos secundarios……………………………………… 16 3.1. Cromatografías………………………………………………………………………………………………………. 16 Objetivo general y específicos…………………………………………………………………………………….. 17 Materiales y métodos………………………………………………………………………………………………… 17 Identificación de metabolitos secundarios………………………………………………………………….. 17 4. El material vegetal y obtención de extractos totales……………………………………………….. 17 4.1. Pruebas químicas preliminares……………………………………………………………………………… 18 5. Técnicas de separación……………………………………………………………………………………………. 19 5.1. Cromatografía de capa fina (C.C.F) ……………………………………………………………………….. 19 5.2. Fraccionamiento líquido-líquido…………………………………………………………………………….. 20 Evaluación de la actividad antioxidante………………………………………………………………………… 21 6. Por medio del método DPPH……………………………………………………………………………………… 21 7. GC/MS a las fracciones con mayor actividad antioxidante…………………………………………. 22 Resultados y Discusión…………………………………………………………………………………………………. 22 Identificación de metabolitos secundarios………………………………………………………………….. 22 8. Material vegetal y obtención de extractos totales…………………………………………………….. 22 8.1. Pruebas químicas preliminares……………………………………………………………………………….. 23 9. Técnicas de separación……………………………………………………………………………………………… 24 9.1. Cromatografía en capa fina (C.C.F) de extractos totales………………………………………… 24 9.2. Fraccionamiento líquido-líquido……………………………………………………………………………. 26 9.3. Cromatografía en capa fina (C.C.F) de fracciones………………………………………………… 26 10. Resultados de la actividad antioxidante………………………………………………………………. 27

11. GC/MS de las fracciones con mayor actividad antioxidante…………………………………… 31 Conclusiones………………………………………………………………………………………………………………… 33 Recomendaciones………………………………………………………………………………………………………….. 33 Bibliografía …………………………………………………………………………………………………………………… 34 Anexos……………………………………………………………………………………………………………………………. 38

ABREVIATURAS

ABTS Radical ácido 2,2’azinobis-(3-etilbenzotiazolina)-6 sulfónico AcOEt Acetato de etilo AAO Actividad antioxidante AE Eficiencia antiradical BHT Butil Hidroxitolueno, un antioxidante sintético CCF Cromatografía en capa fina CHCl3 Cloroformo CG/EM Cromatografia de gases acoplada a espetrometría de masas DCM Diclorometano DPPH Radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo EC50 Concentración efectiva al 50% ET Métodos para la evaluación de AAO por transferencia de electrones EtOH Etanol FeCl3 Cloruro férrico HAT Métodos para evaluación AAO por transferencia de átomos de hidrógeno HCL Ácido clorhídrico H2SO4 Ácido sulfúrico MeOH Metanol Petrol éter de petróleo Rem. Remanente Rf Relación de frente ROS Especies reactivas del oxígeno TEAC Capacidad antioxidante equivalente TROLOX tEC Tiempo para alcanzar la concentración efectiva TROLOX Análogo de la vitamina E UV Ultravioleta

RESUMEN

Los radicales libres, debido a su electrón desapareado, son átomos inestables, que al intentar estabilizarse capturan electrones de las moléculas que tienen a su alrededor y las desestabilizan (Youngston, 2005). A pesar de que el cuerpo humano, en su metabolismo normal y al combatir infecciones produce radicales libres, el exceso de contaminación y estrés, generan un exceso de radicales libres, que al intentar estabilizarse, generan una reacción oxidativa, que genera grandes daños en nuestras células, lo que termina en enfermedades degenerativas, como cardiomiopatías y diferentes tipos de cáncer (Avello & Suwalsky, 2006). Según los estudios de Choi y colaboradores (2002), los radicales libres pueden detener su acción oxidativa por medio de antioxidantes, quienes donan electrones y/o hidrógeno logrando estabilizar los radicales libres. Estas sustancias antioxidantes se pueden encontrar de forma natural en nuestro cuerpo y en los metabolitos secundarios de diferentes plantas, con propiedades antioxidantes, como es el caso de las Asteráceas de la tribu Senecioneae, del género Pentacalia, que según los estudios de Sklenár & Balslev (2004) y de Tene y colaboradores (2007) se han registrado en los páramos de la región andina, y se han caracterizado por sus usos medicinales y por la presencia de metabolitos secundarios con estructura polifenolica, como quinoles y flavonoides, que le pueden atribuir una alta actividad antioxidante (Pedrozo et al. 2006). En este proyecto, se realizó un estudio fitoquímico y se evaluó la actividad antioxidante de las hojas de Pentacalia corymbosa y Pentacalia nítida, la cual fue comparada frente a la actividad antioxidante del romero, que según diferentes estudios (Wang et al., 2008& Mahmoud et al., 2005) ha sido aceptada como una de las especies con mayor actividad antioxidante presente en sus hojas. Y finalmente todos los resultados fueron comparados frente a la actividad antioxidante de antioxidantes sintéticos como el Trolox y el BHT.

PALABRAS CLAVE

Antioxidante, Actividad antioxidante, radicales libres, método DPPH, Pentacalia

INTRODUCCIÓN

El cuerpo humano en su metabolismo normal produce radicales libres, átomos con un electrón desapareado, que al estabilizarse, pueden ceder su electrón o capturar un electrón de alguna otra molécula (Youngston, 2005). En presencia del oxígeno, los radicales libres son denominados especies reactivas del oxígeno (ROS), como el del peróxido de hidrógeno (H2O2), el anión - superóxido (O 2) y el radical hidroxilo (HO·), entre otros (Choi et al, 2002). Según los estudios de Aruoma (1996) cuando estos radicales se producen en exceso pueden llegar a ser tóxicos o dañinos para nuestras células. La contaminación atmosférica, la falta de ejercicio, el estrés y la luz ultravioleta, generan un exceso de radicales libres que al intentar estabilizarse capturan electrones de las moléculas estables, convirtiéndolas al mismo tiempo en radicales libres (Aruoma, 1996). Lo que termina por generar una reacción oxidativa, que produce grandes daños en nuestras células. Al alterar la funcionalidad normal de las células, se desarrollan enfermedades degenerativas como caridiomiopatias, enfermedades neurológicas y diferentes tipos cáncer (Avello & Suwalsky, 2006).

Los radicales libres pueden detener su acción oxidativa por medio de los antioxidantes, que estabilizan su electrón desapareado (Choi et al, 2002). Según los estudios de Youngston (2005), las sustancias antioxidantes, previenen el daño o la destrucción generada por una oxidación, al ceder átomos de hidrógeno. Las sustancias naturales como la vitamina E y la vitamina C, se pueden encontrar en plantas cuyos frutos sean de color amarillo, naranja o rojo, y en frutos ácidos respectivamente; Igualmente, este tipo de sustancias provienen del metabolismo secundario de diversas plantas, ejemplo de ello son los polifenoles (Aruoma, 1996). Los estudios deWang y colaboradores (2008), junto con los de Mahmoud y compañía(2005), demuestran la alta actividad antioxidante de las hojas del romero, una de las razones por las cuales ha sido aceptada como una de las especies con mayos actividad antioxidante. Así mismo, según los estudios de Pedrozo y colaboradores (2006), junto con los estudios de Deuschle et al. (2006), las especies del género Pentacalia, se han caracterizado por la presencia de metabolitos secundarios con estructura polifenólica, como flavonoides y quinoles, a quienes se les atribuye una alta actividad antioxidante (Aruoma, 1996). El trabajo propuesto se enfocó en determinar la actividad antioxidante de los extractos y fracciones obtenidas de las hojas de Pentacalia nítida y P.corymbosa, donde previamente se realizó su estudio fitoquímico y posteriormente se identificó la composición de las fracciones con mayor actividad por medio de la cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas.

REFERENTES CONCEPTUALES

 MARCO CONCEPTUAL

1. Radicales libres y antioxidantes

Los radicales libres son compuestos que poseen un electrón desapareado, una característica que los hace realmente inestables y altamente activos químicamente. Al intentar estabilizarse, los radicales libres pueden ceder su electrón desapareado o capturar un electrón de otra molécula o de otro radical (Youngston, 2005). Según estudios de Aruoma (1996), este tipo de reacciones depende de las concentraciones de radicales libres y de sitios activos en las moléculas, como dobles enlaces, en donde los radicales libres pueden interactuar. Los Radicales libres como las especies reactivas del oxígeno (ROS), están constantemente formándose como producto del metabolismo normal del cuerpo humano, debido a que muchas ROS participan en las funciones fisiológicas del cuerpo humano, pero cuando éstas especies son generadas en exceso, pueden generar daños en nuestras células y en el ADN (Aruoma, 1996).

Las ROS causan el mayor daño oxidativo sobre el cuerpo humano son, el peróxido de hidrógeno - (H2O2), el anión superóxido (O 2) y el radical hidroxilo (HO·),quienes reaccionan con cualquier célula del cuerpo, dañando membranas celulares, enzimas y otras biomoléculas, son tan activos que en menos de un segundo atacan a otros átomos convirtiéndolos en radicales libres, lo que termina en una reacción oxidativa (Youngston, 2005). Los radicales libres pueden ser originados de diversas maneras; las radiaciones de luz ultravioleta, la toxicidad de los productos químicos, el

8 estrés, la falta de sueño y de ejercicio son las principales causas que conllevan a un exceso de radicales libres (Aruoma, 1995). Según los estudios de Youngston, 2005, las radiaciones rompen los enlaces existentes entre los átomos y liberan un exceso de radicales libres en nuestras células, asimismo, según los estudios de Huang y colaboradores (2005),cuando el peróxido de hidrógeno

(H2O2), reacciona con el hierro, se generan una alta cantidad de radicales libres altamente reactivos, como el radical hidroxilo (HO·), lo que se conoce como la reacción de Fenton.

1.1 Antioxidantes naturales y comerciales

Los radicales libres pueden neutralizar su acción oxidativa por medio de antioxidantes que estabilizan su radical desapareado. Existen antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos, en nuestro - cuerpo, la enzima superóxido dismutasa (SOD), convierte el superóxido (O 2) en peróxido de hidrógeno (H2O2), y la enzima catalasa, descompone el peróxido de hidrógeno en agua y en oxígeno (Castañeda et al., 2008). Sin embargo, según los estudios de Huang y colaboradores (2005), no se conoce reacción enzimática que estabilice al radical hidroxilo (HO·), lo que hace necesario el suministro de antioxidantes no catalíticos.Según los estudios de Youngston (2005), las sustancias antioxidantes, previenen el daño oxidativo al ceder átomos de hidrógeno al radical hidroxilo, lo que conlleva a la formación de agua, este tipo de moléculas que neutralizan la acción de los radicales libres de forma directa, no catalítica, se encuentran en la vitamina E (tocoferol), en la vitamina C, en diferentes compuestos de plantas y en microelementos escenciales como zinc, cobre y selenio (Hercberg et al., 1998). Según los estudios de Krishnaiah y colaboradores (2010), así como existen antioxidantes naturales, se han desarrollado diferentes antioxidantes sintéticos como el BHT y el Trolox, que además de ser utilizados por su acción antioxidante, también sirven para comparar la actividad antioxidante de diferentes compuestos o extractos de plantas. El BHT, butil hidroxitolueno, es un antioxidante sintético, que a pesar de ser ampliamente utilizado como antioxidante para prevenir la ranciedad de los alimentos, puede ser el causante de diferentes problemas de hígado, mientras que el Trolox, es un análogo de la vitamina E, soluble en agua, que debido a su alta actividad antioxidante muchas veces es utilizado como control de la actividad antioxidante de diferentes extractos y compuestos (Krishnaiah et al., 2010).

Según los estudios de Huang y colaboradores (2005), dependiendo del fin de los antioxidantes, existen una gran variedad de definiciones establecidas para éste término, por ejemplo, en la industria química, los antioxidantes son compuestos que retardan la auto oxidación de productos químicos; en la industria de alimentos, los antioxidantes son compuestos que previenen la ranciedad de los alimentos; pero la definición más adecuada biológicamente, es que son sustancias naturales ó sintéticas, que previenen o retrasan el deterioro causado por el oxígeno en el aire.

Según los estudios de Wei & Ho (2006), la mayoría de los antioxidantes en su estructura molecular incluyen un anillo aromático con uno o más grupos hidroxilos, lo que permite atrapar el electrón desapareado o ceder protones para estabilizar el radical. El tipo de compuesto, el grado de metoxilación y el número de grupos hidroxilo son algunos de los parámetros que determinan la actividad antioxidante de los metabolitos secundarios (Fukumoto& Mazza, 2000). La gran mayoría

9 de antioxidantes naturales son derivados de flavonoides, cumarinas, y carotenoides (Wei & Ho, 2006). Sin embargo, hay que tener en cuenta que los metabolitos secundarios se generan bajo causas de estrés, por lo cual su concentración depende de los factores medio ambientales (Aruoma, 1996).

Los Flavonoides

Según los estudios de Rice-Evans y colaboradores (1996), junto con Fukumoto& Mazza (2000), los compuestos de mayor actividad antioxdante son los de estructura flavonoidea. Según los estudio de Martínez-Flórez y colaboradores (2002) los flavonoides son pigmentos naturales, que se encuentran en los vegetales y protegen al organismo de los daños causados por la oxidación y evitan la toxicidad de los metales pesados. Esto se debe a que en su estructura química presentan buena cantidad de grupos hidroxilo fenólicos, pues su esqueleto químico de difenilpirano (C6-C3- C6) se encuentra compuesto por dos anillos de fenilo (A y B), unidos por un anillo C de pirano, lo que le confiere una alta polaridad y una gran propiedad antioxidante. Los flavonoides se han caracterizado por ser compuestos polifenólicos que estabilizan los radicales hidroxilo y superóxido (Hodek et al., 2001). En las plantas, además de que intervienen como pigmentos y de filtros solares, actúan como antioxidantes, inhibidores enzimáticos y precursores de sustancias tóxicas (Tenorio et al., 2006). Debido a que el ser humano no produce flavonoides, los debe obtener mediante diferentes alimentos o bebidas vegetales, como cítricos, vino y frutos rojos.

Figura 1. Estructura básica de los flavonoides. (Martínez-Flórez y colaboradores, 2002)

Las Cumarinas

Son compuestos fenólicos que proceden de la vía del ácido shiquímico, son 2H1-benzopiran-2- onas, por lo cual son consideradas como lactonas de los ácidos 2-hidroxi-z-cinámicos. Las cumarinas, han sido utilizadas con pacientes con cánceres avanzados, gracias a su actividad inmunoestimulante, antioxidante y citotóxica (Bruneton, 2001).

Figura 2.Estructura general de las cumarinas (Pedrozo, 2001).

Los Quinoles

O también denominados hidroquinonas, son un grupo de fenoles simples, que son poco comunes en la naturaleza y proceden de la vía del ácido shiquímico (Pedrozo, 2001). Se originan a partir de la reducción de la quinona, las altas concentraciones de quinoles pueden ser de alta actividad antioxidante, siendo que reaccionan directamente con los radicales libres volviéndolos estables (Crane, 2001).

Figura 3. Estructura general de los quinoles (Pedrozo, 2001).

El ser humano puede obtener antioxidantes, mediante diferentes medios, especialmente vegetales, mediante la obtención de extractos provenientes de las hojas de romero (Wang et al.,2008&Mahmoud et al., 2005) y muy probablemente por medio de las hojas de las Asteráceas de la tribu Senecioneae, del géneroPentacalia, que según los estudios de Pedrozo y colaboradores (2006) y de Torrenegra et al (2004), presentan flavonoides y quinoles, que le pueden atribuir una alta actividad antioxidante.

1.1.2. El romero

Clasificación taxonómica del romero (www.infojardin.com)

 Reino: Plantae  División: Magnoliphyta  Clase: Magnoliopsida  Orden: Lamiales  Familia: Lamiaceae  Género: Rosmarinus  Especie: R. officinalis

Se ha demostrado que el romero, tiene una gran cantidad de propiedades medicinales, como antiulcerogénico, anticancerígeno, antitumoral y con una alta actividad antioxidante (Mahmoud et al., 2005). Diferentes estudios, han reportado que el extracto del romero es muy efectivo para retardar la ranciedad de la papa, y por lo menos se han aislado 12 fenoles diterpenos de ésta misma planta, tales como carnosol, ácido carnósico, rosmanol y rosmaridifenol, lo que le atribuye su alta actividad antioxidante (Wei & Ho, 2006). Los estudios de Wang y colaboradores (2008), junto con los de Mahmoud y compañía (2005), muestran que las hojas del romero presentan una alta actividad antioxidante, por la presencia de metabolitos secundarios con alta actividad antioxidante, como quinoles y flavonoides, razón por la cual, es aceptado como una de las especias vegetales con mayor actividad antioxidante.

1.1.3. Clasificación taxonómica de Pentacalia(Díaz-Piedrahita & Cuatrecasas, 1999).

 Reino: Plantae  División: Magnoliphyta  Clase: Magnoliopsida  Orden: Asterales  Familia: Compositae – Asteraceae  Tribu: Senecioneae  Género: Pentacalia

1.1.3.1. Las Asteráceaso compuestas Según los estudios de Albrecht (2003), las asteráceas son una de las familias más grandes y diversas de angiospermas, normalmente son herbáceas, pero puede haber arbustos y árboles; se encuentra distribuida de forma cosmopolita, debido a que las especies se han adaptado a todo tipo de hábitats. Las hojas, que normalmente son alternas, pueden variar, desde simples a compuestas, hasta en roseta; ésta familia se divide en subfamilias y tribus dependiendo del tipo de inflorescencia, que suelen encontrarse en capítulo, con un receptáculo común, las flores son altamente especializadas y reducidas, de formas tubulares o en forma acicular (Albrecht, 2003).

1.1.3.2. La tribu Senecioneae

Fue propuesta por Cassini en 1819, a pesar de encontrarse distribuida de forma cosmopolita; las especies de ésta tribu se encuentran más frecuentes y más diversas en Suramérica, América central, el sur de Africa y en las zonas tropicales (Díaz-Piedrahita & Cuatrecasas, 1999). Ésta tribu se caracteriza por su hábito herbáceo, sus hojas que siempre alternas, con capítulos florales homogamos de flores hermafroditas, o heterógamos con flores terminales femeninas, y con corolas de color siempre amarilloso (Díaz-Piedrahita & Cuatrecasas, 1999).

En la tabla 1. Se pueden observar las especies pertenecientes a la tribu Senecioneae, a las cuales se les han realizado pruebas de actividad antioxidante (AAO), junto con sus metabolitos mayoritarios.

Tabla 1. Especies pertenecientes a la tribu Senecioneae a las cuales se les han realizado pruebas de actividad antioxidante (AAO), junto con sus metabolitos mayoritarios.

Especie vegetal Metabolito Pruebas de Fuente Tribu: Senecioneae mayoritario AAO Emilia sonchifolia Flavonoides DPPH Patnibul et al., 2008 Gynoxys psilophylla flavonoides DPPH Rosas-Romero & Saavedra, 2005 Lasiocephalus ovatus Cumarinas DPPH Aquino et al., 2002 Pentacalia americana Flavonoides DPPH Mosquera et al.,2007 Psacalium radulifolum Cacacol DPPH Garduño & Delgado, 2003. Senecio argunensis Flavonoides DPPH Zhou et al., 2008 Senecio squalidus polifenoles ABTS Mclnnis et al., 2006 Senecio gibbosus Flavonoides DPPH Conforti et al., 2006 Werneria poposa Cumarinas y flavonoides DPPH Lock Sing, 2004

1.1.3.3.El género Pentacalia, se ha registrado en los páramos de la región andina, las especies de éste género, suelen ser un arbusto pequeño que alcanza hasta los 4m de altura, con hojas simples y alternas; pecioladas, elípticas y coriáceas, con inflorescencia terminal o lateral, con capítulos discoideos con flores radiadas, dónde las flores se insertan sobre un receptáculo común y suelen presentar un color amarillo o blanco (Robinson & Cuatrecasas, 1993)(Ver anexo 1). Según los estudios de Pedrozo (2001), de las plantas de Pentacalia en Colombia se han aislado cumarinas y quinoles.

Pentacalia corymbosa, se distribuye entre los 2000 y 3500 metros de altitud, sin embargo, es más abundante en el páramo, que en el subpáramo, es un arbusto de 0.80 a 4m de altura, se caracteriza por sus inflorescencias terminales en racimo con aproximadamente 20 a 25 flores hermafroditas ligeramente pubescentes en el dorso, con hojas alternas espatuladas de márgenes enteros, y con ápice foliar agudo y de punta corta (Díaz-Piedrahita & Cuatrecasas, 1999). Según los estudios de Torrenegra y colaboradores (2004), del extracto de hojas de la especie Pentacalia corymbosa se ha obtenido el compuesto citotóxico jacarona, junto con otro tipo de quinoles. Asimismo, en estudios realizados sobre ésta especie, se han obtenido quinoles, cumarinas y los flavonoides quercetina y rutina (Pedrozo, et al. 2006), que se han caracterizado por sus altas propiedades antioxidantes frente a los radicales libres del oxígeno, debido a que no sólo previenen el daño oxidativo causado por el radical hidroxilo (HO·), por medio de la formación de agua, sino - que también se ha demostrado que previenen el daño causado por el superóxido (O 2) (Perez, 2003). Los quinoles o hidroquinonas, consisten en polifenoles que debido a la presencia de OH, se oxidan fácilmente y presentan actividad antioxidante; se presentan como cristales con un punto de fusión de 170°C. y al oxidarse, se va transformando a un color pardo oscuro (Yamaguchi et al., 2006)

Pentacalia nitida, se distribuye entre los 2700 y 3800 metros de altitud, y se encuentra en el páramo y en el subpáramo de Cundinamarca y de Arauca, que caracteriza por sus hojas opuestas y

13 anchas, con nervio prominente en el envés, siempre descubierto, y con un haz muy brillante; sus inflorescencias se encuentran en racimos terminales muy ramificados, con aproximadamente 33 a 58 flores tubulosas, hermafroditas, blancas o amarillas (Díaz-Piedrahita & Cuatrecasas, 1999). Según los estudios de Trillos (1992), de Pentacalia nitida, se han obtenido flavanonas, una mezcla de ácidos grasos, un hidrocarburo y un esteroide. Las flavanonas, son un tipo de flavonoides que debido a la presencia de OH en su estructura presentan una alta actividad antioxidante (Asai et al. 2008) Además los estudios de la joven investigadora del grupo de fitoquímica de la Pontificia Universidad javeriana Diana A. Varela (2010), demostraron la presencia de glicósidos de flavonoides y cumarinas en éstas plantas. En la tabla 2, se pueden observar las generalidades tanto de Pentacalia corymbosa, como de P.nitida, como el nombre común, sus usos y los metabolitos secundarios.

Tabla 2. Generlidades de P. corymbosa y P. nítida. (Díaz-Piedrahita & Cuatrecasas, 1999, Pedrozo, et al. 2006, Trillos 1992, Varela 2010).

P. corymbosa P. nitida Nombre común huashuin, panque, basguin, guasguin chitaca, romero de monte, romerillo

Usos antisifilítico para contrarrestar perturbaciones Menstruales, desinfectante

Metabolitos secundarios quinoles, cumarinas, los flavanonas, ácidos grasos flavonoides quercetina Hidrocarburo, esteroides. Glicósidos de quinoles y y rutina. cumarinas.

 ANTECEDENTES

2. Métodos para la evaluación de la actividad antioxidante Debido a las consecuencias causadas por los radicales libres, se han realizado diferentes métodos para evaluar la actividad antioxidante de diferentes componentes, a través de fuentes generadoras de radicales libres, esto es debido a que un gran porcentaje de la oxidación es inhibida por medio de la captura de los radicales libres (Mosquera et al., 2005). Según los estudios de Huang y colaboradores (2005), existen diversos métodos para monitorear la actividad antioxidante de diferentes compuestos,algunos basados en la transferencia del átomo de hidrógeno denominados (HAT) y otros basados en la transferencia de electrones, denominados (ET), donde se establece la capacidad del antioxidante, en la reducción del oxidante, el cual, cambia su color al ser reducido.

Entre los métodos (ET) existe el 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH), el ácido 2,2’azinobis-(3- etilbenzotiazolina)-6 sulfónico (ABTS) y la reacción con el óxido nitroso (test NO), entre otros. Entre los métodos más empleados se utilizan el ABTS y el DPPH, debido a que ambos métodos presentan una gran estabilidad, son simples y de rápido análisis (Fukumoto& Mazza, 2000), esto es debido, a que ambos métodos presentan una reacción simple, que sólo involucran una reacción entre el radical y el antioxidante; además ambos métodos tienen la ventaja de que pueden ser utilizados en solventes orgánicos acuosos y nos polares, como es el caso del benzeno ( Cheng et al., 2006). Sin embargo, se debe tener en cuenta que ambos métodos son artificiales, y que no representan situaciones in vivo, pero se ha comprobado que ambos métodos sirven para establecer un rango de actividad antioxidante (Villaño et al., 2007).

2.1. Método ABTS Según los estudios de Antolovich y colaboradores (2002), éste método, es la versión mejorada del método de capacidad antioxidante equivalente trolox (TEAC), principalmente establecido por Miller y colaboradores (1993), el cual refleja la actividad relativa de los antioxidantes de donar electrones al radical ABTS⁺ y donde los resultados son comparados frente al antioxidante sintético Trolox, el método ABTS presenta una alta solubilidad en agua y una alta estabilidad química, es un sustrato que al oxidarse con la presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2) genera el radical catión ABTS⁺. Al establecer la habilidad del antioxidante para secuestrar el radical catión en la fase acuosa, se debe monitorear por medio del espectrofotómetro a 734 nm, hasta el punto que la absorbancia se vuelva estable(Antolovich et al. ,2002). Sin embargo, según los estudios de Castañeda y colaboradores (2008), a diferencia en método DPPH, el método ABTS⁺ requiere de una reacción previa.

2.2. Método DPPH Éste método principalmente establecido por Brand-Williams y colaboradores (1995), es un método colorimétrico simple, que reacciona directamente con el compuesto, por lo cual la reacción depende de la conformación estructural del compuesto (Fukumoto& Mazza, 2000). El fundamento de ésta prueba consiste en que el radical libre presenta un electrón de nitrógeno desapareado, y se muestra de color azul-violeta, y cuando este radical libre se reduce por acción del antioxidante y se estabiliza su acción oxidativa, su color se va decolorando hasta quedar de color amarillo pálido ( Cheng et al., 2006). Según los estudios de Brand-Williams y colaboradores (1995), el DPPH es un radical estable donde la reacción es:

DPPH⁺ + AH DPPH-H + A⁺

AH hace referencia al antioxidante que va a donarle electrones al radical. Según los estudios de Rao y colaboradores (2009), el DPPH funciona a temperatura ambiente, acepta electrones de los antioxidantes para volverse estable, y hasta el momento, es el mejor método para evaluar la actividad antioxidante de los polifenoles. Los resultados se pueden observar entre 515 y 517nm, pasados unos 30 minutos aproximadamente, siendo que el cambio

15 del color del radical se puede observar en el pico de absorbancia de DPPH (Huang et al., 2005). La eficiencia del antioxidante es medida a temperatura ambiente, de tal manera que se elimina el riesgo de degradación térmica de las moléculas (Bondet et al., 1997). El método utilizado, no debería gastar mucho tiempo, pero sí debería ser lo suficientemente sensible para captar la actividad antioxidante sobre el radical (Choi et al, 2002).

3. Métodos para la identificación de los metabolitos secundarios

Según los estudios de Guzman y colaboradores (2008) todas las metodologías para la extracción e identificación de metabolitos secundarios presentan las mismas etapas. Donde principalmente por medio de la extracción continua con éter de petróleo se obtienen los compuestos de baja polaridad, mientras que con la extracción continua con etanol, se obtienen los compuestos de baja polaridad. Posteriormente, por medio de las pruebas químicas preliminares establecidas por Wall y colaboradores (1952), se identifican los tipos de metabolitos secundarios presentes tanto en los compuestos de alta polaridad, como en los compuestos de baja polaridad, y finalmente por medio de la cromatografía se identifican los metabolitos secundarios presentes.

3.1. Cromatografías

Según los estudios de Domínguez (1975), la cromatografía proviene del griego Chroma-graphos, Color-escritura, es un procedimiento físico-químico que permite separar los componentes de una mezcla en movimiento, por adsorción o depósito y retención de los mismos sobre una superficie estacionaria que puede ser un sólido o un líquido. Algunos componentes pueden ser adheridos con mayor facilidad que otros y en distintas velocidades sobre la fase estacionaria, lo que permite que estos se vayan separando. Para la separación e identificación de los metabolitos secundarios de ambas especies de Pentacalia, se va a empleoel método de cromatografía en capa delgada, donde se separan los compuestos por migración diferencial sobre una capa fina, teniendo en cuenta, que los colores observados con la ayuda del revelador o por medio de la luz UV tienden a ser morados ó amarillos cuando el extracto contiene flavonoides (Parra, 1980). Y que los quinoles al oxidarse se van transformando a un color pardo oscuro (Yamaguchi et al., 2006). Para los compuestos con mayor actividad antioxidante se empleó el método de cromatografía de gases acoplado con espectrometría de masas (GC/MS), siendo que la cromatografía de gases, para la separación junto con la espectrometría de masas para la identificación de los componentes del extracto, es un método muy favorable para identificar los metabolitos secundarios del extracto (Santos & Galceran, 2003).La mayor ventaja del método (GC/MS) consiste en separar e identificar los compuestos mediante tiempos de retención, y por comparación de los espectros de masas obtenidos, junto con los reportados en la base de datos como Wiley y Nist (McMaster, 1998).

OBJETIVO GENERAL  Evaluar la actividad antioxidante de los extractos y de las fracciones extraídas de las hojas de Pentacalia corymbosa y Pentacalia nítida.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Evaluar la actividad antioxidante de extractos y fracciones obtenidas de las hojas de Pentacalia corymbosa y Pentacalia nítida, que va a ser compararla junto con la actividad antioxidante de las hojas del rosmarinus officinalis y antioxidantes sintéticos como BHT y Trolox.

 Identificar los metabolitos secundarios mayoritarios de las hojas de Pentacalia corymbosa y Pentacalia nitida en la fracción con mayor actividad antioxidante.

MATERIALES Y MÉTODOS. (Ver anexo 2.)  IDENTIFICACIÓN METABOLITOS SECUNDARIOS.

4. El material vegetal y obtención de extractos totales

Para extraer los diferentes metabolitos secundarios de Pentacalia nítida y P. corymbosa,se realizó la metodología utilizada por Guzman y colaboradores (2008) en el laboratorio de fitoquímica de la Pontificia Universidad Javeriana (PUJ), mediante la cual, posterior a la recolección del material vegetal, éste fue secado a temperatura ambiente, y posteriormente fue deshojado y triturado en el molino de la universidad, para lograr así reducir el tamaño de las partículas de las hojas con las que se iba a trabajar .Luego, el material vegetal obtenido fue pesado y posteriormente, por medio de la extracción sólido líquido en soxhlet con éter de petróleo (petrol), se removieron las grasas sobrantes y se obtuvieron los extractos de baja polaridad. Luego, con el material vegetal sobrante en el soxhlet con etanol, se obtuvieron los extractos de alta polaridad.

En la siguiente etapa, cada extracto fue tratado independientemente, y se lleva a cabo el método de filtración mediante el rotaevaporador a 40°C. Finalmente, el compuesto concentrado se pesó en la balanza, para registrar los gramos obtenidos de cada extracto, y así obtener el % de extracción : (peso inicial/ peso final) X 100.

El romero, debido a su alta actividad antioxidante (Wang et al., 2008& Mahmoud et al., 2005), fue utilizado como control de la actividad antioxidante de las hojas de Pentacalia nítida y P. corymbosa. Para esto, el romero triturado en el molino y pesado posteriormente, fue colocado en un frasco con etanol, para así lograr una extracción discontinua (maceración) de sus compuestos al mismo tiempo que se extraían los compuestos de las hojas de ambas Pentacalias.

4.1. Pruebas químicas preliminares

Posteriormente, tanto a los extractos en etanol, como a los de petrol, y al del romero, se le realizaron pruebas químicas y físicas para determinar y comparar los metabolitos secundarios aislados. Las pruebas químicas preliminares propuestas por Wall y colaboradores (1952), tanto para los extractos de etanol, como para los extractos de petrol, para determinar los compuestos encontrados en cada extracto, se resumen en las tablas 3 y 4 dependiendo del extracto

Tabla 3. Pruebas químicas preliminares propuestas por Wall y colaboradores (1952), para el extracto en éter de petróleo.

Prueba Reacción compuestos Cambio de color a rosa (0´), Lieberman Buchard violeta (1´), azul (5´) y verde (20´) Esteroides y esteroles Salkowski Cambio de color a amarillo o rojo Terpenos Baljet Cambio de color a amarillo terpenos y esteroles Hidroxamato férrico Cambio de color café o violeta sesquiterpenolactonas

Para realizar las pruebas químicas preliminares de la tabla 3 los extractos sedisolvieron en CHCl3, hasta el punto que las reacciones químicas fueran lo suficientemente observables. El reactivo que se leagrego a la muestra para la prueba de Lieberman Buchard consiste en 1 mL de CHCl3 + 1 mL de anhídrido acético + 2 gotas de H2SO4. La prueba de Salkowski consistió en agregarle unas gotas de H2SO4 a la muestra. Para la prueba de Baljet a la muestra se le agregó ácido pícrico + NaOH, y para la prueba de hidroxamato férrico se leagregaron 2 gotas de solución MeOH 2N de clorhidrato de hidroxilamina + 2 gotas de solución MeOH 2N de KOH, la muestra posteriormente fue calentada en el baño de María y se acidulo con HCl 0.5N + 2 gotas de FeCl3 1%.

Tabla 4.Pruebas químicas preliminares propuestas por Wall y colaboradores (1952), para el extracto en etanol.

Flavonoides y Shinoda Cambio de color a naranja o rojizo fenoles Flavonoides y

Cloruro férrico FeCl3 Cambio de color a verde intenso fenoles Formación de anillo verde en la Glicósidos de Antrona interfase flavonoides Dragendorff Formación de un precipitado naranja Alcaloides Espuma Formación de espuma por más de (15´) Saponinas

Para realizar las pruebas químicas preliminares de la tabla 4, los extractos deben se disolvieron en etanol. Para la prueba de Shinoda, se le agrego 1 cm. de Mg. + 2 gotas de HCl 2N. Para la prueba del cloruro férrico, se le agregaron unas gotas de FeCl3. La prueba de Antrona, consistió en agregarle Antrona disuelta en H2SO4 concentrado por pared. Para la prueba de Dragendorff, a la muestra se le agregaron unas gotas del reactivo de Dragendorff + HCl. Y finalmente para la prueba de espuma, a la muestra se leagrego agua, y posteriormente se agitó fuertemente. Lasreacciones químicas que dieron como resultado el cambio de color, la formación de un precipitado o de espuma, indicaron la presencia de los compuestos anteriormente nombrados.

5.Técnicas de separación

Las pruebas que se realizaron para determinar los metabolitos secundarios, consistieron en la cromatografía de capa fina y de gases acoplada a espectrometría de masas, que permitieron separar los componentes del extracto. La CG/MS únicamente se le realizó a las fracciones que demostraron mayor actividad antioxidante.

5.1.Cromatografía de capa fina (C.C.F)

También denominada TLC por sus iniciales en inglés (Thin layer chromatography), consiste en la separación de sustancias de una mezcla por migración diferencial sobre una capa delgada; es un método rápido para separar de forma bien definida, compuestos estructuralmente muy parecidos (Domínguez, 1975). La fase estacionaria de este tipo de cromatografía consistió en una placa homogénea de algún aglutinante, que permita la separación de los componentes; fue utilizada la sílica gel impregnada con fluoresceína, que retiene los componentes sobre la placa de vidrio (www.depa.pquim.unam.mx). La fase móvil es líquida y consiste en un eluyente que asciende por la placa arrastrando los componentes de manera ascendente, de tal manera que estos van dejando marcas a medida que estos son separados. Los compuestos fluorescentes se localizaron bajo la luz ultravioleta tanto corta (254nm.) como larga (360nm.), mientras quelas manchas incoloras, se revelaron bajo agentes cromógenos, físicos ó químicos, que actúan sobre las sustancias separadas por la cromatografía dándole coloraciones perceptibles a simple vista, donde se utilizó vainillina al 1%, luego de rociar el reactivo, este se debe calentó a 110°C. por unos segundos para observar los compuestos carbonizados (Domínguez, 1975).

Al extracto de etanol y al de éterse les realizó una cromatografía de capa fina, para observar los posibles compuestos presentes. Para esto, 500mg. del extracto pétrol se solubilizaron en éter y la muestra se agregó con la ayuda de capilares sobre la placa que contiene sílica gel, con la precaución de que la mancha no sobrepasara los 3mm y a 1 cm. del extremo del borde inferior de la placa, siendo que cada mancha estuviera separada de la otra por 1 ó 2 cm (Domínguez, 1975). La placa con el extracto de éter, solubilizado en éter se ingresó en la cámara cromatográfica, dónde la fase móvil consistía en hexano: acetato de etilo (7:3). Luego que el disolvente corriera por la placa, ésta se sacó de la cámara, y se guardó el registro de las manchas a simple vista, bajo luz UV corta, bajo luz UV larga, al agregarle vainillina al 1 % y luego de haber calentado por unos segundos, cuando las manchas estuvieran carbonizadas, se estableció el RF (Retención en frente):

RF: Distancia recorrida por la muestra / Distancia recorrida por el disolvente.

Posteriormente, 500 mg. del extracto etanólico, se solubilizaron en pétrol, seguido por dicloro y finalmente en acetato de etilo, donde a cada fracción se le realizó el mismo procedimiento de la cromatografía en capa fina establecida anteriormente para el extracto pétrol. Teniendo en cuenta que la fase móvil de la cámara cromatográfica es de hexano: acetato de etilo (7:3) para la fracción EtOH-petrol, es de cloroformo: metanol (9:1) para la fracción EtOH-DCM, y para la fracción acetato de etilo es cloroformo: metanol (8:2), que según los estudios de Domínguez (1975), son excelentes mezclas de los disolventes para tener una buena resolución de los compuestos. Finalmente, cuando las placas pasaron por la cámara cromatográfica, seregistraron los colores de las manchas a simple vista, con luz UV corta, luz UV larga, al rociarle vainillina y cuando las manchas estaban carbonizadas, lo que permitió establecer el RF de las manchas. Por medio de los colores de las manchas y de sus cambios con el calentamiento, se pudo hacer un aproximamiento de los posibles compuestos presentes en las diferentes fracciones.

El extracto de pétrol, primero se solubilizó en pétrol y posteriormente se le agregó acetona en doble proporción de volumen, de tal manera, que pasadas 24 horas las grasas formaron un flóculo por el cambio de polaridad

5.2. Fraccionamiento líquido-líquido.

El extracto etanólico se solubilizó en etanol y se le agregó un poco más del doble volumen de agua destilada, para que por medio del cambio de polaridad se removieran las grasas sobrantes, de tal manera que pasadas 24 horas, se formó un flóculo y se pudo filtrar el extracto de EtOH, el cual por medio del fraccionamiento líquido-líquido con DCM y de su concentración por medio del rotaevaporador a 40°C. permitió obtener la fracción de DCM, la cual antes de concentrar se filtró con sulfato de sodio para remover el agua. Posteriormente el extracto sobrante fue sometido a fraccionamiento líquido-líquido con acetato de etilo, y la fracción obtenida se concentró en el rotaevaporador a 40°C. de tal manera que se obtuvo la fracción de acetato de etilo y finalmente el extracto sobrante en EtOH posteriormente fue liofilizado, para remover el agua, se concentró en el rotaevaporador a 40°C. y se obtuvo la fracción de etanol.

Posteriormente, tanto a la fracción de DCM, como a la de acetato de etilo, también se les realizó una cromatografía en capa delgada, donde la cámara cromatográfica para ambas placas de sílica gel era de cloroformo: metanol (8:2), registrando igualmente, los colores de las manchas a simple vista, luz UV corta, luz UV larga, con vainillina y con calor.

 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

6. Por medio del método DPPH

Posterior a la identificación de los posibles metabolitos secundarios que presentan propiedades antioxidantes como quinoles, flavonoides y cumarinas, (Aruoma, 1996. Wei & Ho, 2006). Se evaluó la actividad antioxidante tanto de todas las fracciones obtenidas, como del romero y delos antioxidantes comerciales que se caracterizan por su alta actividad antioxidante (Krishnaiah et al., 2010) y que fueron utilizados como control de la evaluación de la actividad antioxidante de las diferentes fracciones. Para evaluar la actividad antioxidante, se utilizó el método desarrollado por Brand-Williams y colaboradores (1995), donde se utiliza la prueba del radical libre 1,1-difenil-2- picril-hidrazilo (DPPH).Principalmente se realizó una solución de DPPH con metanol por medio de prueba y error, hasta que la absorbancia en el espectrofotómetro de luz UV Cary 100 a 515nm, estuviera entre 0,7 y 0,8. Posteriormente se realizaron diluciones de 250, 500, 750, 1000 y 2500 ppm. de cada fracción y del romero de 250, 500, 750 y 1000 ppm., además de que se realizaron diluciones de 50, 100, 150, 200, 250 y 300 ppm. del análogo de la vitamina E Trolox, y diluciones de 150, 200, 250 y 300 ppm. del antioxidante sintético BHT, de éstos antioxidantes comerciales, se utilizaron bajas concentraciones debido a que su concentración según la literatura debe ser de 250 ppm. (Krishnaiah et al., 2010). La solución de DPPH (975µ)+ se mezcló con la dilución de cada muestra (25µ) y se monitoreo en el espectrofotómetro de luz UV a 515nm, durante 20 minutos, hasta que la absorbancia se volviera estable (Huang et al., 2005&Sharififar et al. 2009). Según los estudios de Sharififar y colaboradores (2009), junto con los de Wang y colaboradores (2008), se debe obtener el porcentaje de inhibición del antioxidante y el % de DPPH remanente, hasta el punto donde la absorbancia a 515 nm. se vuelva estable.

% inhibición: [(A. inicial – A. final) / (A. inicial)] X 100

% de DPPH rem: ( A.Final/A.inicial)X 100. A. inicial, hace referencia a la absorbancia en tiempo 0 y A. final, hace referencia a la absorbancia, pasados 20 min. ó 30 min. Cuando se llega a un estado estacionario, es decir, que ya la absorbancia no cambia.

La actividad antioxidante se estableció por medio la eficiencia antiradical (AE), método propuesto por Sánchez-Moreno y colaboradores (1998), donde se tiene en cuenta el método propuesto en un principio por Brand-Williams et. al (1995) quienes definen la actividad del antiradical por medio de la concentración necesaria del antioxidante para reducir la concentración inicial de DPPH a un 50 %, además de que se tiene en cuenta, el tiempo necesario para alcanzar ésta concentración definido como tEC

AE: 1/(EC50 X tEC50) EC50 hace referencia a la concentración necesaria del antioxidante para reducir la concentración inicial de DPPH al 50% y tEC50 hace referencia al tiempo necesario para alcanzar ésta concentración.

Entre mayor sea la eficiencia del antiradical, mayor será su actividad antioxidante (Sánchez- Moreno et al. 1998)

7. CG/MS a las fracciones con mayor actividad antioxidante

Finalmente para la identificación de los metabolitos secundarios de las fracciones con mayor actividad antioxidante, se realizó la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC/MS), por medio de un equipo de GC/MS (HP agilent 6850 acoplado a un detector de espectrometría de masas HP Agilent 5975), con columna de HP5MS de 30M. X 0,25mm X 0,25 µm. Donde la separación de los componentes por medio de la cromatografía de gases, es seguida por la espectrometría de masas que establece el % de las posibles identidades de cada componente (McMaster, 1998).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN  IDENTIFICACIÓN METABOLITOS SECUNDARIOS

8. Material vegetal y obtención de extractos totales

El material vegetal de Pentacalia nítida fue traído del páramo de Sumapaz, mientras que el material vegetal de Pentacalia corymbosa, fue traído del páramo de Guascas, ambos en Cundinamarca, Colombia y con una altitud entre 3600 y 4000 m.s.n.m.Los gramos del peso seco inicial, junto con los gramos de la fracción de pétrol y de DCM de P. corymbosa, fueron suministrados gracias a la colaboración de la joven investigadora del grupo de fitoquímica de la Pontificia Universidad Javeriana, Ana Paola Romero, quien se encontraba trabajando con ésta misma planta. Mientras que los gramos de la P.nitida, fueron obtenidos por medio de la trituración de las hojas, seguido por la extracción sólido-líquido en soxhlet y por su concentración en el rotaevaporador a 40°C. Siendo que ambas plantas fueron traídas de páramo, que es donde se suelen encontrar las Pentacalias (Robinson & Cuatrecasas, 1993), son plantas que tienen gran cantidad de grasas, por lo cual, estas fueron desengrasadas previamente, las hojas deP. corymbosa fueron desengrasada por medio de su inmersión en cloroformo durante 5 min. El romero, que va a ser utilizado como control de la actividad antioxidante, debido a su alta actividad (Wang et al., 2008& Mahmoud et al., 2005), es tratado independientemente y fue traído de la plaza de mercado Codabas de la 170 en Bogotá. En la tabla 5, se puede observar el peso seco inicial de cada planta, seguido por el peso del extracto de pétrol y de etanol posterior a su concentración, el peso seco final del material vegetal seco y la eficiencia de la concentración.

Tabla 5.Resultados iniciales de las hojas de Pentacala nítida, P. corymbosa y R. officinalis.

Especie Peso seco peso extracto Eficiencia peso extracto Eficiencia vegetal inicial petrol extracción etanol extracción P. corymbosa 359.4 10.2 278,00% 128.7 35,8 % P. nitida 500.3 14.3 2,79% 190.4 38 % R. officinalis 253.8 89.7 35,3 %

La eficiencia de la extracción, mostrada en la tabla 5, demuestra que todas las plantas tuvieron una eficiencia de extracción mayor al 30% con el extracto de etanol y una eficiencia menor al 20% con el extracto de petrol, sin embargo, el romero es el que tiene una menor eficiencia, esto probablemente se debe al modo en el que se realizó la extracción, siendo que a ambas Pentacalias se les realizo la extracción por medio del soxhlet, que puede tener una mayor eficiencia de extracción.

8.1. Pruebas químicas preliminares Las pruebas químicas preliminares establecidas por Wall y colaboradores (1952), se lerealizaron tanto a los extractos de petrol, como a los extractos de etanol de ambas Pentacalias, como al romero. Se debe tener en cuenta que las pruebas de Lieberman-Buchard, de Salkowski, de Baljet y de Hidroxamato férrico, están establecidas especialmente para los extractos de baja polaridad, por lo cual, los extractos que pasaron por éstas pruebas fueron diluidos en CHCl3. Mientras que las pruebas de Shinoda, Cloruro férrico, Antrona, Dragendorff y de espuma, están establecidas especialmente para los extractos de alta polaridad, por lo cual, los extractos que fueron sometidos a estas pruebas fueron disueltos en etanol. La tabla 5, demuestra los resultados obtenidos después de realizar las pruebas químicas preliminares a los diferentes extractos con su respectivo solvente, y al romero que se encontraba en etanol. Tabla 6. Resultados de las pruebas químicas preliminares, de las Pentacalias y del romero. P. nitida P. corymbosa Romero Extracto Extracto Extracto Extracto Extracto Prueba Compuesto Petrol Etanol Petrol Etanol Etanol Lieberman Buchard Esteroides y esteroles x --- x --- x Salkowski Terpenos x x x x x Baljet Terpenos y esteroles x x x x x Hidroxamato férrico Sesquiterpenolactonas --- x x ------Shinoda Flavonoides y fenoles ------x x Cloruro férrico Flavonoides y fenoles --- x --- x x Glicósidos de Antrona flavonides --- x --- x x Dragendorff Alcaloides ------Espuma Saponinas ------

Por medio de los resultados registrados en la tabla 6 de las pruebas establecidas para los extractos de baja polaridad, se demuestra una reacción química de un cambio de color de los extractos disueltos en CHCl3 tanto para la prueba de Lieberman Buchard, como para la prueba de Salkowski y de Baljet. Lo que permite establecer la presencia de terpenos (Ordoñez et al.,2006) , tanto para los extractos de Pentacalia nítida, como para los de P. corymbosa. Además de la presencia de

23 terpenos en el extracto de romero. Sin embargo, la prueba de Hidroxamato férrico, para observar la presencia de sesquiterpenolactonas, únicamente demostró un cambio de color positivo en el extracto etéreo de P. corymbosa. Los resultados de las pruebas establecidas para los extractos de alta polaridad, demuestran la presencia de flavonoides y fenoles, tanto para el extracto en etanol de P. corymbosa, como para el de P. nítida y de romero, esto debido a un cambio de color en la prueba de Shinoda para el extracto de P. corymbosay de romero. Además la prueba de cloruro férrico para observar la presencia de flavonoides y fenoles (Ordoñez et al.,2006), y la prueba de Antrona para verificar la presencia de glicósidos de flavonoides, dieron positivas para los extractos en etanol de ambas Pentacalias y del romero, lo que permite establecer la presencia de estos compuestos tanto en lo extractos etanólicos de las Pentacalias, como en los del romero. Sin embargo, las últimas pruebas para verificar la presencia de saponinas y alcaloides, no demostraron ninguna reacción química, lo que permite establecer la ausencia de estos compuestos en los extractos.

9. Técnicas de separación. Debido a que en ya se tienen los resultados de los compuestos de Pentacalia corymbosa, gracias a la Joven investigadora del grupo de fitoquímica Ana Paola Romero. Las técnicas de separación únicamente se le realizaron a los extractos de Pentacalia nítida.

9.1. Cromatografía en capa fina (C.C.F.) de extractos totales. De la tabla 7 a la 10, se pueden observar los resultados obtenidos por medio de la cromatografía en capa delgada de los extractos totales, donde se registraron los colores observados mediante la luz visible, la lus UV corta, Uv larga, vainillina y con el efecto del calor, además de los valores de Rf obtenidos

Tabla 7. Resultados de cromatografía en capa fina del extracto pétrol con fraccionamiento sólido líquido con pétrol. Con fase móvil hexano: acetato de etilo (7:3). Fase estacionaria: sílica gel. Ver anexo 3A. REVELADORES Valores de Rf Luz visible UV corta UV larga Vainillina Calor 0,69 amarillos mancha mancha amarillos amarillo 0,61 oscura oscura verde verde 0,53 verdes rosado 0,46 verde rosado 0,3 amarillo claro claro amarillo

Tabla 8. Resultados de cromatografía en capa fina del extracto etanólico con fraccionamiento sólido líquido con petrol. Con fase móvil hexano: acetato de etilo (7:3). Con fase estacionaria: sílica gel. Ver anexo 3B. REVELADORES

Valores de Rf Luz visible UV corta UV larga Vainillina Calor

0,68 verde verde 0,59 amarillo claro mancha mancha verde amarillo

0,3 9 amarillo oscura oscura intenso morado 0,31 amarillo mancha mancha amarillo morado oscura oscura

Tabla 9. Resultados de cromatografía en capa fina del extracto etanólico con fraccionamiento sólido líquido con DCM. Con fase móvil cloroformo: metanol (9:1). Fase estacionaria: sílica gel. Ver anexo 3C. REVELADORES Valores de Rf Luz visible UV corta UV larga Vainillina Calor 0,84 verde- verde verde verde verde amarillo 0,69 morado 0,61 morado morado 0,46 morado 0,23 morado 0,15 morado 0,1 morado 0,07 naranja azul

Tabla 10. Resultados de cromatografía en capa fina del extracto etanólico con fraccionamiento sólido líquido con acetato de etilo. Con fase móvil cloroformo: metanol (8:2). Fase estacionaria: sílica gel. Ver anexo 3D. REVELADORES Valores de Rf Luz visible UV corta UV larga Vainillina Calor 0,92 verde verde mancha verde verde oscura 0,61 amarillo morado amarillo amarillo

0,46 morado 0,38 azul 0,23 amarillo mancha amarillo rosado

0,07 oscura naranja amarillo

Las cromatografías de capa fina, que se muestran de la tabla 7 a la 10, fueron realizadas sobre una fase estacionaria de sílica gel, lo que permite la buena separación de aldehídos, cetonas, alcaloides, azúcares, fenoles, esteroides, terpenoides, ácidos grasos y aminoácidos (Domínguez, 1975). La presencia de flavonoides se pueden observar de colores morados y amarillos con un Rf de 0,3. Diversos estudios realizados sobre Pentacalia, han demostrado la presencia de flavonoides (Pedrozo, et al. 2006. Trillos, 1992). Las manchas de los quinoles, en la cromatografía, se muestran desde un amarillo ocre hasta colores azulosos o oscuros, con un Rf cercano a 0.4 (Santana, 2010. Pedrozo, 2001) como se demuestra en los resultados de la tabla 10, la mancha azul, con un Rf de 0.38.Además, según los estudios de Pedrozo (2001), las cumarinas bajo la luz UV de onda larga, muestran una mancha intensa, como se muestra en la tabla 10, al presentar un color morado bajo la luz UV de onda larga.

9.2. Fraccionamiento líquido-líquido. Tabla 11. Resultados de las fracciones de P.nitida obtenidas por medio del fraccionamiento líquido-líquido Fracciones del extracto Extractos Peso inicial Peso flóculo etanólico Peso de fracciones % de extracción Pétrol 12,3 6,8 gr = 55% Pétrol 2,8 gr. 23% EtOH 185,4 25,66 gr. = DCM 46,5 gr. 25% 14% AcOEt 39,4 gr. 21% EtOH 1 gr. 0,5%

La tabla 11, nos permite observar los % de la extracción por medio de la extracción líquido-líquido para obtener las diferentes fracciones, además del % del peso del flóculo, que es una porción amorfa de las grasas sobrantes de los extractos, lo que demuestra que a pesar de que al comienzo ambas plantas fueron desengrasadas, éstas todavía conservaban grasas. A pesar de que se puede observar de que por medio del fraccionamiento líquido-líquido, todas las fracciones superan el 20% de su extracción, la fracción de EtOH se demoró demasiado liofilizándose, lo que no hizo posible tener los gramos finales de la fracción.

9.3.Cromatografía en capa fina (C.C.F.) de fracciones.

Tabla 12. Resultados de cromatografía en capa fina de la fracción DCM. Con fase móvil cloroformo: metanol (8:2). Fase estacionaria: sílica gel. Ver anexo 4A.

REVELADORES Valores de Rf Luz visible UV corta UV larga Vainillina Calor

0,91 mancha café- larga morado

0,83 azul azul- morado 0,16 amarillo amarillo claro claro

Tabla 13. Resultados de cromatografía en capa fina de la fracción Acetato de etilo. Con fase móvil cloroformo: metanol (8:2). Fase estacionaria: sílica gel Ver anexo 4B. REVELADORES Valores de Rf Luz visible UV corta UV larga Vainillina Calor Morado 0,78 mancha claro oscura Morado 0,58 mancha claro oscura

0,05 amarillo mancha amarillo amarillo claro oscura ocre

Según los estudios de Pedrozo 2001, las cumarinas pueden apagar la fluorescencia, al verse como unas manchas largas bajo la luz UV, como se puede observar en la tabla 12 de la C.C.F. de la fracción de DCM bajo la luz UV de onda larga. Las cumarinas con la vainillina se pueden apreciar de color azul (Pedrozo, 2001), como se puede observar en la tabla 12 en la macha de color azul con vainillina, que se pasa al color morado bajo el efecto del calor. La tabla 13, nos demuestra la posbile presencia de quinoles siendo, que según los estudios de Pedrozo 2001 y de Santana 2010, con el calor posterior a agregada la vainillina, los quinoles se pueden observar de un color amarillo ocre, como se puede observar en la C.C.F. de la fracción de acetato de etilo bajo el efecto del calor.Ambas cromatografías en capa fina nos demuestran la posible presencia de quinoles y de cumarinas, y muy probablemente de glicósidos de quinoles y cumarinas.

10. Resultados de la actividad antioxidante. Uno de los métodos más utilizados para evaluar la actividad antioxidante de diferentes compuestos por medio del radical DPPH, reportan los resultados por medio de la eficiencia Antiradical (AE), un parámetro propuesto por Sánchez-Moreno y colaboradores (1998), donde se tiene en cuenta el método propuesto en un principio por Brand-Williams et. al (1995) que consiste

27 en la concentración necesaria del antioxidante para disminuir la concentración inicial de DPPH al 50% (EC50), además del tiempo necesario para alcanzar ésta concentración (tEC50). Para evaluar la actividad antioxidante de los extractos se utilizó la eficiencia antiradical, la cual fue planteada desde la gráfica de % de DPPH remanente, como desde la gráfica del % de inhibición del radical DPPH, como se puede observar en la tabla 14 y de la gráfica 1 a la 6. En el anexo 5, se pueden observar dichas gráficas de las fracciones con mayor actividad antioxidante y de los extractos totales de Pentacalia nítida y de P. corymbosa.

Tabla 14. Resultados de la Actividad antiradical de ambas Pentacalias, del romero, del antioxidante sintético BHT y del análogo de la vitamina E (Trolox).

% DPPH rem. % de inhibición t EC (min.) EC50 AE X 10E6 EC50 AE X 10E10 P.nitida Extracto total 9 5453 20,3 3638 30,5 Fracción pétrol 12 11171 7,4 5669 1,4 fracción DCM 10 2363 42,2 2363 42,23 Fracción AcOEt 18 2116 26,3 2116 26,3 Fracción EtOH 15 3309 20,1 3669 18,1

P. corymbosa Extracto total 18 1478 37,5 1347 41,12 Fracción pétrol 15 44677 1,4 10578 6,3 Fracción DCM 9 24538 4,5 12383 9

Romero 12 685,37 121,0 720,34 115

BHT 18 2479 22,4 2503 22,1

Trolox 6 234,14 718,0 231,3 720

AE % DPPH rem. 800 700 600 500 400 300 200 100

00 Eficiencia Eficiencia antiradicalX10E6

Gráfica de 1. Eficiencia antiradical según el % de DPPH remanente, para ambas Pentacalias, el romero, el BHT y el Trolox

800 700 AE % inhibición 600 500 400 300 200 100

Eficiencia Eficiencia antiradicalX10E6 0

Gráfica 2. Eficiencia antiradical según el % de inhibición del DPPH, para ambas Pentacalias, el romero, el BHT y el Trolox.

Como se puede observar en la gráfica 1 y 2, el trolox es el que mayor eficiencia antiradical presenta, por lo cual es muchas veces es utilizado como control de la actividad antioxidante de diferentes extractos (Krishnaiah et al., 2010). Sin embargo, el BHT, mostro una eficiencia antiradical muy baja para ser un antioxidante sintético, lo que corrobora la búsqueda de antioxidantes naturales (Antolovich, et. al, 2002)

AE % DPPH rem. 140 120 100 80 60 40 20

00 Eficiencia Eficiencia antiradicalX10E6

Gráfica 3. Eficiencia antiradical del antiradical según el % de DPPH remanente para ambas Pentacalias comparadas con el romero.

AE % inhibición 150 100 50 0

Eficiencia Eficiencia antiradicalX 10E6 Gráfica 4. Eficiencia antiradical según el % de inhibición de DPPH para ambas Pentacalias, comparadas con el romero.

En las gráficas 3 y 4, se puede observar con mayor claridad la eficiencia antiradical de ambas Pentacalias, además de que se observa claramente la alta actividad que presenta el romero, esto muy probablemente se debe a los compuestos fenólicos que se encuentran en la parte foliar de ésta planta tales como flavonoides y quinoles, además de carnosol, ácido carnósico, rosmanol y rosmaridifenol, que le atribuyen una alta actividad antioxidante (Wei & Ho, 2006). Además se puede observar que los extractos totales de ambas Pentacalias presentan una actividad antioxidante relativamente baja frente a las hojas del romero.

AE Pentacalias por % DPPH rem. 45 40 35 30 25 20 15 10 05

00 Series1 Eficiencia Eficiencia antiradical X 10E6 l

Gráfica 5. Eficiencia antiradical de Pentacalia nítiday P. corymbosa según el % de DPPH remanente.

AE Pentacalias por % de inhibición 45 40 35 30 25 20 15 10 5

0 Eficiencia Eficiencia antiradicalX 10E6

Gráfica 6. Eficiencia antiradical de Pentacalia nítida y P. corymbosa por % de inhibición del radical DPPH.

En la gráfica 5 y 6, podemos observar la eficiencia antiradical de ambas Pentacalias, tanto de sus extractos totales, como de las diferentes fracciones. Se puede establecer que Pentacalia nítida, presenta la mayor eficiencia antiradical, muy probablemente por la presencia polifenoles como flavonoides (Trillos 1992), además de la presencia de glicósidos de quinoles y cumarinas (Varela, 2010) que le pueden atribuir su alta actividad antioxidante, que se puede apreciar especialmente en la fracción de DCM, Acetato de etilo y en la fracción etanólica, que presentan los compuestos más polares. Mientras que la fracción de pétrol de ambas Pentacalias mostraron una eficiencia antiradical muy baja, probablemente debido a que presenta compuestos con una eficiencia antiradical muy baja o nula. Aunque P.nitida presento una mayor actividad antioxidante en sus

fracciones, P.corymbosa, demostró una mayor actividad antioxidante en su extracto total, lo que muy probablemente se deba a la presencia de quinoles, cumarinas y flavonoides (Pedrozo, et al. 2006). Sin embargo las fracciones de ésta planta demostraron una actividad antioxidante relativamente baja. Hay que tener en cuenta que los métodos para medir la actividad antioxidante de diferentes compuestos son extremadamente sensibles y dependientes de las condiciones utilizadas y de los productos monitoreados (Fukumoto& Mazza, 2000). La acción antioxidante de los extractos también se puede observar cuando el radical DPPH se reduce por la acción del antioxidante y su color púrpura se va decolorando hasta alcanzar un color amarillo pálido (Cheng et al., 2006).(Ver anexo 6)

11. GC/MS de las fracciones con mayor actividad antioxidante

En la tabla 15 y 16 se puede observar la normalización de la GC/MS de las fracciones con mayor actividad antioxidante, donde se tienen en cuenta los compuestos con mayor % de área superior a 0,91 y con un % de similitud mayor al 80%. (ver anexo 7 y 8)

Tabla 15. Normalización de los compuestos mayoritarios se la GC/MS de la fracción de DCM del extracto etanólico de Pentacalia nítida. N.Pico t retención Área compuesto % de similitud 1 4,172 1,17 Eucaliptol 64 2 5,612 0,71 tri-(metil)-biciclo(2.2.1) Heptano 96 3 10,346 0,75 2-Amino-4-metilpiridina fenol, 3-amino- 35 4 10,637 1,06 Bencenoacetico acido, 2,5-dihydroxy- 90 5 10,68 1,84 Bencenoacetico acido, 2,5-dihydroxy- 86 6 11,130 3,13 Bencenoacetico acido, 2,5-dihydroxy- 83 7 11,908 4,16 1H-Imidazol-2-metanol 41 8 11,993 2,23 Benzaldehido 4-hidroxy-3,5-dimetoxy- 91 9 12,766 1,07 1,3,2-Dioxaborolano, 2-etilo 43 10 15,371 0,91 3,5-Dimethoxy-4-hydroxy cinamaldehido 94 11 15,446 11,92 2-Penteno, 1-(2,4,6-tri hidroxifenil) 53 12 15,657 21,3 2,6-Aminoantraquinona 55 13 18,993 3,01 acido Hexanodioico, bis 2-ethylhexyl ester 95 ácido 1,2-Bencenodicarboxílico , mono (2-ethylhexyl) 14 20,227 2,02 ester 91

Tabla 16. Normalización de los compuestos mayoritarios de la GC/MS de la fracción de Acetato de etilo del extracto etanólico de Pentacalila nitida

Picos t retención Área compuesto % de similitud 1 9,859 14,46 D-Alosa 90 2 10,632 25,84 acido Bencenoacetico , 4-hydroxy- 58 3 11,130 10,34 fenol 45

4 11,490 19,65 beta.-D-Glucopiranosa, metil 43 5 11, 9114 11,14 3-(2-Hidroxi Ciclopentil)-tiofeno 43 6 15,440 7,62 Tiofeno, 2-isobutil-5-isopentil- 53

A pesar de la posible presencia de quinoles, de cumarinas y de glicósidos de glicósidos y cumarinas, estos fueron compuestos muy difíciles de verificar por medio de la cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas. Sin embargo, cuando los compuestos presentan más de un grupo hidroxilo presentan una alta actividad antioxidante (Fukumoto& Mazza, 2000).

CONCLUSIONES

 Se identificó la posible presencia de flavonoides y cumarinas en la fracción de DCM del extracto etanólico de Pentacalia nítida.  Se identificó la posible presencia de quinoles en la fracción de acetato de etilo del extracto etanólico de Pentacalia nítida  Los extractos totales de Pentacalia nítida y de Pentacalia corymbosa, presentaron actividad antioxidante frente al radical DPPH.  Las fracciones de diclorometano y de acetato de etilo del extracto etanólico de Pentacalia nítida, fueron las que presentaron la mayor actividad antioxidante, en especial la fracción de diclorometano.  Frente a el extracto total del romero, los extractos totales de Pentacalia nítida y Pentacalia corymbosa presentaron una eficiencia antiradical relativamente baja.

RECOMIENDACIONES

 En lo posible, evaluar la actividad antioxidante todas las muestras el mismo día, siendo que el método DPPH es altamente dependiente de las condiciones utilizadas(Fukumoto& Mazza, 2000).  Realizar también el método ABTS sobre los extractos, siendo que generalmente los compuestos con alta actividad antioxidante demostrada por el método DPPH también lo demuestran por el método ABTS (Fukumoto& Mazza, 2000).

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ANEXOS

Anexo 1. Pentacalia corymbosa y p.nitida.

Anexo 2. Diagrama de flujo de la metodología.

Anexo 3. Resultado de cromatografías de capa fina del extracto de petrol de Pentacalila nitida posterior a su extracción sólido líquido con petrol. Y el resultado de la TLC del extracto etanólico de Pentacalia nítida, posterior a su extracción por sólido líquido con petrol, seguido con DCM y finalmente con acetato de etilo

Anexo 4. Resultados de la cromatografía en capa fina de la fracción de DCM y de AcOEt.

Anexo 5. Gráficas de % de DPPH remanente y de % de inhibición del radical DPPH con las fracciones de mayor actividad antioxidante y con los extractos totales de Pentacalia nitida y P. corymbosa

A1) Gráficas de % de DPPH remanente con la fracción de DCM de pentacalia nitida

y = -0,0224x + 102,93 % DPPH rem. R² = 0,9889 120 100 080 060 % DPPH rem. 040 020 Lineal (% DPPH 000 rem. )

0 1000 2000 3000 % de DPPH DPPH de% remanente ppm

A2) Gráfica de % de inhibición del radical DPPH con la fracción DCM de Pentaclia nitida

% Inhibición y = 0,0224x - 2,926 060 R² = 0,9889

040 % Inhibición

020 Lineal (% Inhibición) 000 0 1000 2000 3000

B1) Gráfica de % de DPPH remanente con la fracción de acetato de etilo de Pentacalia nitida.

% DPPH rem. 100 y = -0,0208x + 94,021 R² = 0,9307 080 060 % DPPH rem. 040 Lineal (% DPPH 020 rem.) 000 0 1000 2000 3000

B2) Gráfica de % de inhibición del radical DPPH con la fracción de acetato de etilo de Pentacalia nitida

% de inhibición 080 y = 0,0208x + 5,979 060 R² = 0,9307 040 020 Lineal (% de inhibición % de inhibición) 000 0 1000 2000 3000 ppm

C1) Gráfica de % de DPPH remanente con el extracto total de Pentacalia nítida

% DPPH rem y = -0,01x + 104,53 R² = 0,9826 150 100 % DPPH rem 050

000 Lineal (% DPPH 0 1000 2000 3000 rem) ppm

C2) Gráfica del % de inhibición del extracto total de Pentacalia nítida

% Inhibición y = 0,0162x - 8,9417 040 R² = 0,9483 020 % Inhibición

000 Lineal (% 0 1000 2000 3000 -020 Inhibición) ppm

D1) Gráfica del % de DPPH remanente con el extracto total de Pentacalia corymbosa

y = -0,028x + 91,376 % DPPH rem. R² = 0,9792 100 80 60 % DPPH rem. 40 20 Lineal (% DPPH 0 rem. ) 0 1000 2000 3000

D2) Gráfica del % de inhibición del radical DPPH con el extracto total de Pentacalia corymbosa

% Inhibición y = 0,0363x + 1,095 40 R² = 0,9886 30 % Inhibición 20

10 Lineal (% Inhibición) 0 0 500 1000 1500

Anexo 6. Decoloración del radical DPPH de púrpura a amarillo pálido debido a que este se reduce.

Anexo 7. Cromatograma de la fracción DCM del extracto etanólico de Pentacalia nítida

Anexo 8. Cromatograma de la fracción acetato de etilo del extracto etanólico de Pentacalia nítida