EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LAS HOJAS DE Pentacalia corymbosa y Pentacalia nitida (ASTERALES: ASTERÁCEAE) CAMILA URIBE-HOLGUÍN PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGÍA 2010 1 ANÁLISIS FITOQUÍMICO DE LAS HOJAS DE Pentacalia corymbosa y P.nitida (ASTERALES: ASTERÁCEAE) Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE. CAMILA URIBE-HOLGUÍN APROBADO INGRID SCHULER, PhD ANDREA FORERO Decano Académico Directora carrera de Biología Facultad de ciencias 2 ANÁLISIS FITOQUÍMICO DE LAS HOJAS DE Pentacalia corymbosa y P.nitida (ASTERALES: ASTERÁCEAE) Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE. CAMILA URIBE-HOLGUÍN APROBADO LUIS GONZALO SEQUEDA, MSc ALBA NOHEMI TELLEZ, PhD Director Jurado 3 NOTA DE ADVERTENCIA “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. Artículo 23 de la Resolución Número 13 de julio de 1946. 4 ÍNDICE DE CONTENIDO PG. Abreviaturas…………………………………………………………………………………………………………… 6 Resumen……………………………………………………………………………………………………………….. 7 Introducción…………………………………………………………………………………………………………… 7 Referentes conceptuales 1. Radicales libres y antioxidantes…………………………………………………………………………....... 8 1.1 Antioxidantes naturales y comerciales……………………………………………………………………. 9 Los flavonoides…………………………………………………………………………………………………………… 10 Las cumarinas……………………………………………………………………………………………………………… 10 los Quinoles………………………………………………………………………………………………………………… 11 1.1.2. El romero…………………………………………………………………………………………………………… 11 1.1.3. Clasificación taxonómica de Pentacalia……………………………………………………………… 12 1.1.3.1. Las Asteráceas o compuestas ………………………………………………………………………… 12 1.1.3.2. La tribu Senecioneae……………………………………………………………………………………….. 12 1.1.3.3. El género Pentacalia…………………………………………………………………………………………. 13 Pentacalia corymbosa……………………………………………………………………………………………………. 13 Pentacalia nítida…………………………………………………………………………………………………………… 13 Antecedentes 2. Métodos para la evaluación de la actividad antioxidante…………………………………………… 14 2.1 Método ABTS…………………………………………………………………………………………………………… 15 2.1. Método DPPH………………………………………………………………………………………………………… 15 3. Métodos para la identificación de metabolitos secundarios……………………………………… 16 3.1. Cromatografías………………………………………………………………………………………………………. 16 Objetivo general y específicos…………………………………………………………………………………….. 17 Materiales y métodos………………………………………………………………………………………………… 17 Identificación de metabolitos secundarios………………………………………………………………….. 17 4. El material vegetal y obtención de extractos totales……………………………………………….. 17 4.1. Pruebas químicas preliminares……………………………………………………………………………… 18 5. Técnicas de separación……………………………………………………………………………………………. 19 5.1. Cromatografía de capa fina (C.C.F) ……………………………………………………………………….. 19 5.2. Fraccionamiento líquido-líquido…………………………………………………………………………….. 20 Evaluación de la actividad antioxidante………………………………………………………………………… 21 6. Por medio del método DPPH……………………………………………………………………………………… 21 7. GC/MS a las fracciones con mayor actividad antioxidante…………………………………………. 22 Resultados y Discusión…………………………………………………………………………………………………. 22 Identificación de metabolitos secundarios………………………………………………………………….. 22 8. Material vegetal y obtención de extractos totales…………………………………………………….. 22 8.1. Pruebas químicas preliminares……………………………………………………………………………….. 23 9. Técnicas de separación……………………………………………………………………………………………… 24 9.1. Cromatografía en capa fina (C.C.F) de extractos totales………………………………………… 24 9.2. Fraccionamiento líquido-líquido……………………………………………………………………………. 26 9.3. Cromatografía en capa fina (C.C.F) de fracciones………………………………………………… 26 10. Resultados de la actividad antioxidante………………………………………………………………. 27 5 11. GC/MS de las fracciones con mayor actividad antioxidante…………………………………… 31 Conclusiones………………………………………………………………………………………………………………… 33 Recomendaciones………………………………………………………………………………………………………….. 33 Bibliografía …………………………………………………………………………………………………………………… 34 Anexos……………………………………………………………………………………………………………………………. 38 ABREVIATURAS ABTS Radical ácido 2,2’azinobis-(3-etilbenzotiazolina)-6 sulfónico AcOEt Acetato de etilo AAO Actividad antioxidante AE Eficiencia antiradical BHT Butil Hidroxitolueno, un antioxidante sintético CCF Cromatografía en capa fina CHCl3 Cloroformo CG/EM Cromatografia de gases acoplada a espetrometría de masas DCM Diclorometano DPPH Radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo EC50 Concentración efectiva al 50% ET Métodos para la evaluación de AAO por transferencia de electrones EtOH Etanol FeCl3 Cloruro férrico HAT Métodos para evaluación AAO por transferencia de átomos de hidrógeno HCL Ácido clorhídrico H2SO4 Ácido sulfúrico MeOH Metanol Petrol éter de petróleo Rem. Remanente Rf Relación de frente ROS Especies reactivas del oxígeno TEAC Capacidad antioxidante equivalente TROLOX tEC Tiempo para alcanzar la concentración efectiva TROLOX Análogo de la vitamina E UV Ultravioleta 6 RESUMEN Los radicales libres, debido a su electrón desapareado, son átomos inestables, que al intentar estabilizarse capturan electrones de las moléculas que tienen a su alrededor y las desestabilizan (Youngston, 2005). A pesar de que el cuerpo humano, en su metabolismo normal y al combatir infecciones produce radicales libres, el exceso de contaminación y estrés, generan un exceso de radicales libres, que al intentar estabilizarse, generan una reacción oxidativa, que genera grandes daños en nuestras células, lo que termina en enfermedades degenerativas, como cardiomiopatías y diferentes tipos de cáncer (Avello & Suwalsky, 2006). Según los estudios de Choi y colaboradores (2002), los radicales libres pueden detener su acción oxidativa por medio de antioxidantes, quienes donan electrones y/o hidrógeno logrando estabilizar los radicales libres. Estas sustancias antioxidantes se pueden encontrar de forma natural en nuestro cuerpo y en los metabolitos secundarios de diferentes plantas, con propiedades antioxidantes, como es el caso de las Asteráceas de la tribu Senecioneae, del género Pentacalia, que según los estudios de Sklenár & Balslev (2004) y de Tene y colaboradores (2007) se han registrado en los páramos de la región andina, y se han caracterizado por sus usos medicinales y por la presencia de metabolitos secundarios con estructura polifenolica, como quinoles y flavonoides, que le pueden atribuir una alta actividad antioxidante (Pedrozo et al. 2006). En este proyecto, se realizó un estudio fitoquímico y se evaluó la actividad antioxidante de las hojas de Pentacalia corymbosa y Pentacalia nítida, la cual fue comparada frente a la actividad antioxidante del romero, que según diferentes estudios (Wang et al., 2008& Mahmoud et al., 2005) ha sido aceptada como una de las especies con mayor actividad antioxidante presente en sus hojas. Y finalmente todos los resultados fueron comparados frente a la actividad antioxidante de antioxidantes sintéticos como el Trolox y el BHT. PALABRAS CLAVE Antioxidante, Actividad antioxidante, radicales libres, método DPPH, Pentacalia INTRODUCCIÓN El cuerpo humano en su metabolismo normal produce radicales libres, átomos con un electrón desapareado, que al estabilizarse, pueden ceder su electrón o capturar un electrón de alguna otra molécula (Youngston, 2005). En presencia del oxígeno, los radicales libres son denominados especies reactivas del oxígeno (ROS), como el del peróxido de hidrógeno (H2O2), el anión - superóxido (O 2) y el radical hidroxilo (HO·), entre otros (Choi et al, 2002). Según los estudios de Aruoma (1996) cuando estos radicales se producen en exceso pueden llegar a ser tóxicos o dañinos para nuestras células. La contaminación atmosférica, la falta de ejercicio, el estrés y la luz ultravioleta, generan un exceso de radicales libres que al intentar estabilizarse capturan electrones de las moléculas estables, convirtiéndolas al mismo tiempo en radicales libres (Aruoma, 1996). Lo que termina por generar una reacción oxidativa, que produce grandes daños en nuestras células. Al alterar la funcionalidad normal de las células, se desarrollan enfermedades degenerativas como caridiomiopatias, enfermedades neurológicas y diferentes tipos cáncer (Avello & Suwalsky, 2006). 7 Los radicales libres pueden detener su acción oxidativa por medio de los antioxidantes, que estabilizan su electrón desapareado (Choi et al, 2002). Según los estudios de Youngston (2005), las sustancias antioxidantes, previenen el daño o la destrucción generada por una oxidación, al ceder átomos de hidrógeno. Las sustancias naturales como la vitamina E y la vitamina C, se pueden encontrar en plantas cuyos frutos sean de color amarillo, naranja o rojo, y en frutos ácidos respectivamente; Igualmente, este tipo de sustancias provienen del metabolismo secundario de diversas plantas, ejemplo de ello son los polifenoles (Aruoma, 1996). Los estudios deWang y colaboradores (2008), junto con los de Mahmoud y compañía(2005), demuestran la alta actividad antioxidante de las hojas del romero, una de las razones por las cuales ha sido aceptada como una de las especies con mayos actividad antioxidante. Así mismo, según los estudios de Pedrozo y colaboradores (2006), junto con los estudios de Deuschle et al. (2006), las especies del género Pentacalia, se han caracterizado por la presencia de metabolitos secundarios con estructura polifenólica, como flavonoides y quinoles, a quienes se les atribuye una