N° d’ordre : 11/2012-M/S.B
REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE
LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITIE DES SCIENCES ET DE LA TECHNOLOGIE
HOUARI BOUMEDIENNE
FACULTE DES SCIENCES BIOLOGIQUES
MEMOIRE Présenté pour l’obtention du diplôme de MAGISTER En : SCIENCES DE LA NATURE Spécialité : Biochimie-Immunologie
Par : Dalila KHEMILI
THEME
Etude de l’effet du venin de scorpion Androctonus australis hector sur la régulation des fonctions des polynucléaires neutrophiles
Soutenu publiquement le 31 /10 / 2012, devant le jury composé de :
Mme F. LARABA-DJEBARI, Professeur à l’USTHB Présidente
Mme D.HAMMOUDI-TRIKI, Professeur à l’USTHB Directrice de mémoire
Mme C.TOUIL-BOUKOFFA, Professeur à l’USTHB Examinatrice
Mme H.OUMEHDI-OUSSEDIK, Maitre de conférences à l’USTHB Examinatrice Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier Dieu pour la force et la patience qu’il m’a donné pour surmonter toutes les épreuves vécues au cours de ce mémoire. J'exprime mes profonds remerciements à ma directrice de thèse, le Professeur Hammoudi-Triki D, je la remercie pour m’avoir proposé ce sujet, pour sa confiance, son soutien et sa constante bonne humeur et surtout ses discussions scientifiques. Je tiens à remercier les membres de jury et particulièrement Mme Lararba-Djebari F, Professeur à la Faculté des Sciences Biologiques, qui nous a fait l’honneur de juger ce travail et de présider le jury. Je la remercie pour m’avoir donné l’opportunité de travailler au sein de son laboratoire. J’adresse mes remerciements à Mme Touil-Boukoffa C, Professeur à la Faculté des Sciences Biologiques, d’avoir aimablement accepté d’examiner ce travail. Je souhaite remercier Mme Oussedik-Oumehdi H, Maître de conférences à la Faculté des Sciences Biologiques. Pour avoir l’amabilité d’accepter d’examiner ce travail. Je tiens à remercier toutes les personnes qui sont intervenues de prêt ou de loin au cours de la réalisation de ce travail, et tout particulièrement le Professeur Kra ϊba R pour son aide. Veuillez trouver ici l’expression de ma très vive reconnaissance et de ma sincère admiration. Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à monsieur le Docteur Derrar F, chef de laboratoire Grippe et virus respiratoires à l’Institut Pasteur d'Algérie pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire, mettant à ma disposition l’ensemble des moyens disponibles. Mes sincères remerciements s’adressent également au Docteur Brahimi M et Docteur Issad M. Je voudrais également remercier les membres des deux laboratoires : Vaccins Viraux Vétérinaires et Grippe et virus respiratoires à l’Institut Pasteur d'Algérie. Je n’oublierai évidemment pas de remercier Mr Cherrouf A pour sa disponibilité, ses conseils et ses compétences scientifiques qui m’ont permis de mener à bien mes travaux et d’enrichir mes connaissances. Je remercie les membres du laboratoire de Biochimie des Biomolécules : Mode d’Action, Immunothérapie et Immunodiagnostic pour leur gentillesse.
Dédicaces A la mémoire de mes deux grands-pères A mes deux grands-mères A mes très chers parents A mes adorables frères A toute ma famille
Sommaire
Liste des abréviations Introduction…………………………………………………………..……………………….1 Chapitre I : Données bibliographiques…………………………...…………………………3 I.1. Les scorpions………………………………………………………………………………3 I.2. Les venins de scorpions……………………………………………………………………3 I.2.1. Les toxines longues……………………………………………………………………...5 I.2.1.1. Toxines α………………………………………………………………………………5 I.2.1.2. Toxines β………………………………………………………………………………5 I.2.2. Les toxines courtes………………………………………………………………………5 I.2.3. Les toxines sans ponts disulfure………………………………………………….…...…6 I.3. Les toxines du venin d’ Androctonus australis hector…………………………….……….6 I.4. Action cellulaire des toxines scorpioniques……………………………….………………6 I.4.1. Cellules excitables…………………………………………………………………….…6 I.4.2. Cellules non excitables…………………………………………………………………..7 I.5. Physiopathologie des envenimations scorpioniques……………………………………….8 I.6. Effets des venins de scorpions sur le système immunitaire………………………………..8 I.6.1. Médiateurs de l’inflammation………………………………………………...…………8 I.6.2. Cellules de l’inflammation……………………………………………………………..10 I.6.2.1. Polynucléaires neutrophiles…………………………………………….…………….13 I.6.2.1.1. Origine du neutrophile………………………………………………..…………….13 I.6.2.1.2. Fonctions du neutrophile…………………………………………………………...14 A. Fonctions de base des polynucléaires neutrophiles………………………………………..14 A.1. Chimiotactisme………………………………………………………………………….14 A.2. Phagocytose………………………………………………………………………...... 15 A.3. Dégranulation………………………………………………………………………...…16 A.4. Formation d’anions superoxydes…………………………………………………...…..16 B. Rôle des polynucléaires neutrophiles dans la régulation de l’immunité adaptative..…….17 C. Rôle des polynucléaires neutrophiles dans la résolution de l’inflammation………...…....19 I.6.2.2. Phagocytes mononucléés……………………………………………………...……..21 I.6.2.2.1. Origine du monocyte………………………………………………………...…….21 I.6.2.2.2. Sous populations de monocyte……………………………………………..……...21 I.6.2.2.3. Propriétés fonctionnelles du monocyte…………………………………...……….22 I.6.3. Réponse inflammatoire et production de dérivés réactifs de l’oxygène et du monoxyde d’azote………………………………………………………………………………………..23 I.7. Cytotoxicité induite par les venins de scorpions…………………………………………24 I.7.1. Mécanismes impliqués dans la cytotoxicité induite par les venins de scorpions………25 I.7.1.1. Génération des formes réactives de l’oxygène (ROS)…………………………...…..26 I.7.1.2. les dommages provoqués par les ROS…………………………………………...…..27 • La peroxydation des lipides…………………………………………………………...……27 • Modifications des protéines…………………………………………………………...……27 • Modification de l'ADN……………………………………………………………..……....29 I.5. Traitement des envenimations scorpioniques…………………………………...…….….29 Chapitre II : Matériel et Méthodes……………………………………………...…….…...31 II.1. Matériel……………………………………………………………………..……..…….31 II.1.1. Matériel biologique……………………………………………………..…….….……31 II.1.1.1. Le venin d’ Androctonus australis hector…………………………...…………..…...31
II.1.1.2. Les fragments F(ab)'2……………………………………………………….…...….31 II.1.1.3. Les cellules…………………………………………………………………….…….31 II.1.1.4. Le sang humain………………………………………………………………….…..31 II.1.2. Réactifs et produits chimiques…………………………………………………….…..31 II.2. Méthodes………………………………………………………………………….....….32 II.2.1. Préparation, mise en culture et induction des cellules……………………………..….32 II.2.1.1. Préparation des cellules mononuclées du sang périphérique……………….….…....32 II.2.1.2. Préparation des polymorphonucléaires neutrophiles……………………………...... 32 II.2.1.3. Contrôle de la viabilité cellulaire……………………………………………..……..32 II.2.1.4. Induction des cellules……………………………………………………..……...... 33 II.2.2. Etude de l’effet du venin d’ Androctonus australis hector sur la viabilité des PBMC et les PNs humains……………………………………………………………………..…….….33 II.2.3. Etude de l’état d’activation des PBMC et des PNs en présence de concentrations non cytotoxiques de venin d’ Aah …………………………………………………….…...……....33 II.2.3.1. Effet du venin d’ Aah sur la prolifération des PBMC humains…………...………...34 II.2.3.2. Effet du venin d’ Aah sur la dégranulation des polynucléaires neutrophiles et des monocytes……………………………………………………………………………...…...... 34 II.2.3.3. Effet du venin d’ Aah sur le volume du système lysosomal des polynucléaires neutrophiles et des monocytes……………………………………………………...……...... 35 II.2.3.4. Effet du venin d’ Aah sur la production du peroxyde d’hydrogène………………...35 II.2.3.5. Effet des fragments sur le métabolisme oxydatif des PNs et des PBMC après stimulation avec le venin d’Aah …………………………………………………………..…36 II.2.3.6. Effet du venin d’ Aah sur la production du monoxyde d’azote………………...…..36 II.2.4. Etude de l’effet cytotoxique du venin d’ Androctonus australis hector sur les PBMC et les PNs humains…………………………………………………………………………..….36 II.2.4.1. Effet du venin d’ Androctonus australis hector sur l’intégrité mitochondriale…..….37 II.2.4.2. Effet du venin d’ Androctonus australis hector sur l’intégrité membranaire……..…37 II.2.5. Effet du venin d’ Androctonus australis hector sur la balance pro/anti-oxydante….....37 II.2.5.1. Dosage du monoxyde d’azote…………………………………………………...….37 II.2.5.2. Evaluation de la peroxydation lipidique par dosage du malondialdéhyde……...….38 II.2.5.3. Evaluation de l’activité de la catalase…………………………………………...….38 II.2.6. Etude de l’effet du venin d’Androctonus australis hector sur la fragmentation de l’ADN………………………………………………………………………………………..38 II.2.7. Effet du temps d’incubation en présence du venin sur les PNs………………………39 II.2.8. Exploration statistique des résultats…………………………………………...……...40 Chapitre III : Résultats et Discussion………………………………………………..…….42 III.1. Etude de l’effet du venin d’ Androctonus australis hector sur la viabilité des PNs et des PBMC humains………………………………………………………………………...…….42 III.2. Etude de l’état d’activation des PBMC et des PNs en présence de concentrations non cytotoxiques de venin d’ Aah ……………………………………………………………...…44 III.2.1. Effet du venin d’ Aah sur la prolifération des PBMC humains………………….…...44 III.2.2. Effet du venin d’ Aah sur la dégranulation des polynucléaires neutrophiles…………46 III.2.3. Effet du venin d’ Aah sur le volume du système lysosomal des polynucléaires neutrophiles et des PBMC……………………………………………………………….…...48 III.2.4. Effet du venin d’ Aah sur la production du peroxyde d’hydrogène……………..…..50 III.3.5. Effet du venin d’ Aah sur la production du monoxyde d’azote……………………...52 III.3. Etude de l’effet cytotoxique du venin d’ Androctonus australis hector sur les PBMC et les PMNs humains……………………………………………………………………………54 III.3.1. Effet du venin d’ Androctonus australis hector sur l’intégrité mitochondriale………54 III.3.2. Effet du venin d’Androctonus australis hector sur l’intégrité membranaire…………56 III.4. Effet du venin d’ Androctonus australis hector sur la balance pro/anti-oxydante……...58 III.4.1. Dosage du monoxyde d’azote……………………………………………………….58 III.4.2. Evaluation de la peroxydation lipidique par dosage du malondialdéhyde…………..60 III.4.3. Evaluation de l’activité de la catalase………………………………………………..62 III.4. Etude de l’effet du venin d’Androctonus australis hector sur la fragmentation de l’ADN………………………………………………………………………………………....64 III.5. Effet du temps d’incubation en présence du venin sur les polynucléaires neutrophiles..66 Chapitre IV : Discussion générale………………………………………………………….68 Conclusion et perspectives…………………………………………………………………..78 Références bibliographiques………………………………………………………………..80 Annexes Résumés Liste des abréviations
Aah : Androctonus australis hector ATB : Acide Thiobarbiturique ConA : Concanavaline A DMSO : DiMéthylSulfOxyde HNE : 4-hydroxynonénal HRP : Horse-Radish Peroxidase iNOS ou NOS2 : NOsynthase inductible KTX : Kalliotoxin LDH : Lactate DesHydrogénase LPS : Lipopolysaccharide MTT : 3-(4,5-diMethylThiazol-2-yl)-2,5-diphenylTetrazolium bromide MDA : Malondialdéhyde MPO : Myéloperoxydase NADPH : Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate réduit NF-κB : Nuclear Factor kappa B PBMC : Peripheral Blood Mononuclear Cells PNs :Polynucléaires neutrophiles ROS: Reactives Oxygen species NO: Nitric Oxide PBS : Phosphate-Buffered Saline PKC: Protéine Kinase C RN : Rouge Neutre RPMI-1640 : Roswell Park Memorial Institute medium-1640 SVF : Sérum de Veau Foetal
Introduction
Introduction
Dans plusieurs régions du monde, les envenimations par piqûres de scorpions sont considérées, en raison de leur fréquence et de leur gravité, comme un problème de santé publique. En Algérie, ces envenimations sont provoquées principalement par deux espèces de scorpion, les plus dangereuses, Androctonus australis hector (Aah) et Buthus occitanus tunetanus (Bot).
La composition des venins de scorpions est très complexe, ils sont caractérisés par une grande richesse en polypeptides de faible poids moléculaire ayant une forte affinité pour les canaux ioniques (canaux sodium, potassium, calcium et chlore). A côté de ces toxines, les venins de scorpions contiennent des mucopolysaccharides, des hyaluronidases, des phospholipases, des inhibiteurs de protéases, ainsi que de petites molécules actives comme la sérotonine et l’histamine (Adam et Weiss, 1958 ; Ismail et al ., 1975 ; Chhatwal et Habermann, 1981).
La toxicité du venin de scorpion est attribuée à la présence de toxines qui sont hautement diffusibles dans l’organisme provoquant ainsi de nombreuses perturbations physiologiques et métaboliques. Ces altérations sont la conséquence d’une activation du système immunitaire qui se manifeste par l’activation et le recrutement des leucocytes au niveau périphérique ainsi que la libération de médiateurs inflammatoires notamment des cytokines, et le monoxyde d’azote.
Les polynucléaires neutrophiles sont les premières cellules à infiltrer les différents tissus après une envenimation scorpionique. Ces cellules leucocytaires jouent un rôle important dans l’engagement et la régulation des réponses immunitaires innée et adaptative de par leur marqueurs cellulaires et la production de cytokines. Cependant, stimulés de façon excessive et/ou inappropriée, ils peuvent également participer à la survenue de lésions tissulaires graves par la libération de substances toxiques notamment des dérivés réactifs de l’oxygène et des protéases.
Pour une meilleure compréhension du rôle de ces leucocytes dans les envenimations scorpioniques, l’objectif de ce travail consiste à étudier l’effet du venin d’ Aah sur les polynucléaires neutrophiles (PNs) et les cellules mononuclées circulantes (PBMC) humains in vitro par:
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‹ Une évaluation de l’état d’activation des PNs et des PBMC, après traitement avec des concentrations non cytotoxiques de venin d’ Aah .par l’étude de: • La réponse proliférative des PBMC par le test colorimétrique aux sels de tétrazolium MTT, • La dégranulation par dosage de l’activité de la myéloperoxydase libérée dans le milieu de culture, • La détermination du volume du compartiment lysosomal, marqueur de phagocytose par le test de rétention du rouge neutre. • La production du monoxyde d’azote et du peroxyde d’hydrogène par les PNs et les PBMC stimulés avec le venin.
‹ Une évaluation d’une éventuelle cytotoxicité du venin d’ Aah , sur les PNs et les PBMC, en utilisant l’accumulation d’un colorant vital, le bleu de trypan.
‹ Etude de l’effet cytotoxique du venin d’ Aah par deux autres paramètres correspondant à l’activité métabolique à l’aide du test de viabilité aux sels de tétrazolium MTT et au dosage de la lactate déhydrogénase (LDH) libérée dans le milieu extracellulaire.
‹ Etude de l’effet du venin d’ Androctonus australis hector sur quelques paramètres du système pro/anti-oxydant par l’étude: • de la production du monoxyde d’azote, • de l’activité de la catalase, • de la peroxydation lipidique et de la fragmentation de l’ADN des PNs et des PBMC après incubation en présence du venin d’ Aah .
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Chapitre I:
Données bibliographiques
Chapitre I Données bibliographiques
I.1. Les scorpions Les scorpions sont des arthropodes venimeux appartenant à la classe des Arachnides du sous-embranchement des Chélicérates. Dans le monde, environ 1500 espèces de scorpions, distribuées dans 18 familles, ont été décrites (Prendini et Wheeler, 2005). Une trentaine d'entre elles sont potentiellement dangereuses pour l'homme, elles appartiennent toutes, sauf un Scorpionidae , à la famille des Buthidae qui comprend près de 80 genres (Chippaux et Goyffon, 2008). Plusieurs espèces de scorpion sont la cause d'envenimation, dont les plus toxiques sont le genre Centruroides (Amérique du nord) et le genre Tityus (sud et centre d’Amérique) (Rezende et al ., 1998 ; Osnaya-Romero et al ., 2001 ; De Roodt et al ., 2003), Androctonus (Afrique de Nord, Est-sud d’Asie) et Buthus (la méditerranée) (Touloun et al ., 2001 ; Goyffon, 2002 ; Soulaymani-Bencheikh et al ., 2002,2003 ; Hammoudi-Triki et al ., 2004), Buthotus et Leiurus (Moyen Orient) (Sofer et al ., 1991 ; El-Amin et al ., 1994 ; Pipelzadeh et al ., 2007) et mesobuthus tamulus (Inde) (Bawaskar et Bawaskar, 1989).
I.2. Les venins de scorpions Les venins de scorpions sont des mélanges complexes de molécules qui jouent un rôle important dans la défense et la capture des proies. Ces venins contiennent une grande variété de protéines globulaires de faibles poids moléculaires, les neurotoxines (Martin-Eauclaire et Couraud, 1995; Müller, 1993; Simard et Watt, 1990). Les venins de scorpions, caractérisés généralement par une faible activité enzymatique (Gwee et al ., 2002), contiennent également un grand nombre d'autres constituants qui accompagnent la sécrétion apocrine du venin notamment le mucus (5-10 %), des sels et divers composés organiques tels que des oligopeptides, des nucléotides, et des acides aminés (Miranda et al ., 1970; McIntosh et Watt 1972 ; Watt et al ., 1978; Grishin, 1981; Possani et al ., 1981 a, b; Grégoire et Rochat, 1983; Martin et Rochat 1984). Certains venins de scorpions contiennent la sérotonine (5- hydroxytryptamine) (Adam et Weiss, 1958), des inhibiteurs de protéases (Chhatwal et Habermann, 1981) et de l’histamine (Ismail et al ., 1975). Les toxines de scorpions constituent une grande famille de protéines homologues étroitement repliées, caractérisées par la présence de similarités au niveau de leurs séquences primaires et tridimensionnelles (Simard et Watt, 1990). Ces toxines partagent une structure tridimensionnelle commune, comprenant une hélice alpha un feuillet bêta constitués de trois brins antiparallèles réticulés et stabilisés par trois ou quatre ponts disulfures (Figure 1) (Fontecilla-Camp et al ., 1982).
3 Chapitre I Données bibliographiques
A Site -4 récepteur Site -3 récepteur des toxines β des toxines α
B
A : Topologie de la sous-unité α des canaux sodiques B : Représentation de la structure cristallographique de la toxine AahII. Hélice α en rouge, les brins antiparallèles du feuillet β en vert et les ponts disulfures sont en jaune.
Figure 1 : La toxine AahII et le canal sodique (Bosmans et Tytgat, 2007 ; Gordon et al ., 2007 ; Gurevitz, 2012).
4 Chapitre I Données bibliographiques
I.2.1. Les toxines longues Les toxines qui agissent sur les canaux sodium sont des toxines à chaine longue composée de 60-70 résidus d’acides aminés réticulés par quatre ponts disulfures. Selon le site de fixation de la toxine sur le canal sodique, deux types de toxines longues ont été décrits: les toxines alpha ( α) et les toxines bêta ( β) (Figure 1) .
I.2.1.1. Toxines α : Ces toxines interagissent avec le site 3 du canal sodium, leur fixation est dépendante du potentiel membranaire. Ces toxines voltage-dépendantes provoquent une prolongation du potentiel d’action en agissant exclusivement sur la phase d’inactivation du canal sodium (Martin-Eauclaire et al ., 1999). La toxine AahII du venin de scorpion
Androctonus australis hector fait partie de cette classe de toxines.
I.2.1.2. Toxines β : Ces toxines se fixent sur le site 4 des canaux sodium, de manière indépendante du potentiel membranaire. Elles agissent sur le potentiel d’ouverture du canal sodium et induisent une série de potentiels répétitifs (Couraud et al ., 1982). Les toxines longues présentent des préférences pharmacologiques différentes pour les mammifères et les insectes et peuvent être divisées en trois principaux groupes : les toxines α ou β "classiques" hautement spécifiques pour les mammifères. Les toxines α ou β-like, actives sur les mammifères et les insectes et les toxines α ou β spécifiques pour les insectes (Abbas et al ., 2011).
I.2.2. Les toxines courtes Ce sont des toxines à chaines courtes constituées de 30-40 résidus d’acides aminés réticulés par trois ponts disulfures. Les toxines de cette famille agissent principalement sur les canaux potassium et chlore (Fontecilla-Camp et al ., 1980 ; Crest et al ., 1992 ; De Bin et al ., 1993). Plusieurs toxines appartenant à cette famille ont été identifiées à partir de différents venins, la charybdotoxine (ChTX) du venin de Leiunus quinquestriatus , la margatoxine (MgTX) du venin de Centruroides margaritatus, la maurotoxine (MTX) du venin de Scorpio maurus et les kaliotoxines KTX, KTX2 et KTX3 des venins d’ Androctonus mauretanicus mauretanicus , Androctonus australis hector et Buthus occitanus tunetanus respectivement (Miller et al ., 1986 ; Crest et al ., 1992 ; Bednarek et al ., 1994 ; Laraba-Djebari et al ., 1994 ; Kharrat et al ., 1997; Meki et al ., 2000).
5 Chapitre I Données bibliographiques
I.2.3. Les toxines sans ponts disulfure Les toxines de cette famille sont douées d’une activité antimicrobienne, plusieurs peptides de scorpions sans ponts disulfures ont été isolés et caractérisés, parabutoporin du venin de Parabuthus schlechteri (Verdonck et al ., 2000), pandadinin 1 et 2 du venin de Pandinus imperator (Corzo et al ., 2001).
I.3. Les toxines du venin d’ Androctonus australis hector Quatorze neurotoxines ont été purifiées et caractérisées (Martin-Eauclaire et Rochat, 1984). Parmi ces toxines, six de type α, actives sur les canaux sodium des mammifères, AahI (Rochat et al ., 1970), AahI’ (Martin et Rochat, 1984), AahI’’ (Martin et Rochat, 1984), AahII (Rochat et al ., 1972), AahIII (Kopeyan et al ., 1979) et AahIV (Mansuelle et al ., 1992). Parmi ces toxines de type α, la toxine AahII, constituée de 64 résidus aminoacides est la plus abondante et la plus toxique, elle représente 1,13 % du poids sec du venin et sa DL50 est estimée à 0,18µg/20 g de souris (Rochat et al ., 1972 ; Martin et Rochat, 1986). Une toxine courte a été également caractérisée à partir du venin d’ Aah : la kaliotoxine (KTX2), constituée de 37 résidus d’acides aminés. Cette toxine est active sur les canaux potassium de type Kv (Laraba-Djebari et al ., 1994).
I.4. Action cellulaire des toxines scorpioniques Les venins de scorpions se composent principalement de neurotoxines qui ciblent avec une haute affinité et de manière spécifique les canaux ioniques voltage dépendants, en particulier les canaux sodium et potassium des cellules excitables et non excitables (Simard et Watt, 1990; Possani et al ., 2000).
I.4.1. Cellules excitables Les effets toxiques des venins de scorpions sont essentiellement dus à la présence de toxines longues, ayant une forte affinité pour les canaux sodiques voltage-dépendants (VDSC) des cellules excitables. Ces canaux sodiques voltage-dépendants sont une classe importante de canaux ioniques, dont l'activation est à l'origine du potentiel d'action. En effet, ces canaux ioniques en augmentant la perméabilité au sodium, jouent un rôle essentiel dans l’initiation et la propagation du potentiel d’action membranaire. Les canaux potassiques amènent le potentiel de membrane de la cellule à un niveau proche du potentiel d’équilibre de l’ion. Les canaux potassiques, responsables de la phase de repolarisation, participent à la genèse des potentiels d’action neuronaux et cardiaques. Les toxines scorpioniques qui ciblent les canaux
6 Chapitre I Données bibliographiques sodium voltage-dépendant pour les activer et les canaux potassiques pour les inhiber provoquent une prolongation du potentiel d’action des cellules neuromusculaires en exerçant un ralentissement de la phase d’inactivation du canal sodique membranaire par interaction avec le site 3 de ce canal (Zlotkin et al ., 1972 ; Couraud et al ., 1982 ; Catteral, 1988 ; Possani et al ., 1999 ). Par conséquence, un flux important de sodium extracellulaire et une décharge adrénergique de neuromédiateurs suivie par un blocage de l’excitabilité membranaire sont observés. L’augmentation de la perméabilité sodique génère un important flux intracellulaire calcique et l’activation des phospholipases responsables de l’hydrolyse des phospholipides membranaires (Corréa et al., 1997).
I.4.2. Cellules non excitables Les canaux potassium jouent un rôle vital dans le fonctionnement de différents types cellulaires. Ils régulent le potentiel membranaire, en assurant une fonction d’accélération de la repolarisation membranaire, aussi bien dans les cellules excitables (neurones, muscles...) que les cellules non excitables (cellules β du pancréas, lymphocytes, érythrocytes...) (Rudy, 1988). Ces canaux ioniques et particulièrement les canaux potassium voltage dépendant de type Kv1.3, jouent un rôle modulateur important dans l’activation des macrophages et des lymphocytes (Cahalan et al ., 2001 ; Vicente et al ., 2003). Une fonction majeure de ces canaux potassium voltage dépendant Kv1.3, avec les canaux potassium Ca2+ dépendant KCa3.1, est d’assurer le maintien du potentiel membranaire négatif, ce qui facilite le maintien d’une signalisation Ca 2+ au cours de l’activation des cellules T. Ils sont de ce fait impliqués dans les voies de signalisation cellulaire qui contrôlent la prolifération et la synthèse de l’interleukine- 2 (Cahalan et Chandy, 1997). Les cellules Th17 expriment principalement les canaux Kv1.3 nécessaires pour leur activation et la production de l’Il-17 (Di et al ., 2010). Les toxines scorpioniques qui bloquent les canaux Kv1.3 provoquent une dépolarisation membranaire et interfèrent avec l’activation des lymphocytes T par une diminution du flux de Ca 2+ limitant ainsi la synthèse de l’Il-2 et par conséquent la prolifération cellulaire (Deutsch et Price, 1982 ; Price et al ., 1989 ; Leonard et al ., 1992 ; Beeton et al ., 2001 ; Chandy et al ., 2004 ; Panyi et al ., 2004) .
I.5. Physiopathologie des envenimations scorpioniques Les perturbations physiopathologiques au cours des envenimations scorpioniques sont très complexes. A la suite d’une piqure de scorpion, le venin est rapidement distribué dans les compartiments vasculaire et tissulaires, entrainant des altérations hémodynamiques
7 Chapitre I Données bibliographiques et tissulaires, des variations métaboliques et une réaction inflammatoire . La gravité de l’envenimation scorpionique résulte essentiellement de la dysfonction cardiaque gauche avec formation d’œdème pulmonaire et une insuffisance respiratoire. L’origine de l’œdème pulmonaire n’est pas clairement élucidée, néanmoins, il semblerait qu’un dysfonctionnement du ventricule gauche résultant de la libération massive des catécholamines, secrétées par action nerveuse périphérique du venin peut contribuer à cette formation (Figure 2) (Zeghal et al ., 2000 ; Mazzei de Davila et al ., 2002). La formation de l’œdème pulmonaire est attribuée également à une infiltration de neutrophiles et de lymphocytes après une augmentation de la perméabilité capillaire provoquée par des médiateurs de l’inflammation (PAF, histamine, prostaglandines, leucotriènes, cytokines et chémokines) (Amaral et al ., 1994 ; Gueron et Ilia, 1996 ; De-Matos et al ., 1997 ; D'Suze et al ., 1999).
I.6. Effets des venins de scorpions sur le système immunitaire Les divers effets physiopathologiques observés sur tous les systèmes (nerveux, cardiovasculaire, respiratoire et endocrinien ……) lors d’une envenimation scorpionique sont la conséquence d’une action synergique de plusieurs mécanismes biologiques. Parmi ces mécanismes, le déclenchement d’une importante réaction inflammatoire. Les mécanismes impliqués dans cette réaction inflammatoire sont extrêmement complexes et font intervenir des éléments cellulaires et plusieurs médiateurs inflammatoires.
I.6.1. Médiateurs de l’inflammation La réponse inflammatoire est une réaction de défense de l'organisme face à une agression au cours de laquelle plusieurs médiateurs sont sécrétés par les cellules qui participent dans le processus inflammatoire. Parmi ces médiateurs, l'histamine, la sérotonine, les enzymes lysosomales, les eicosanoïdes tels que les prostaglandines, les leucotriènes et les thromboxanes, les facteurs d'activation plaquettaire (PAF), les espèces réactives de l'oxygène (ROS), NO, HOCL, la myéloperoxydase, diverses cytokines pro et anti-inflammatoires, les kinines, le système de la coagulation / fibrinolyse et le système du complément (Das, 1990 ; Mantovani et al ., 1997 ; Das, 1998 ; Koblish et al ., 1998 ; Binder et al ., 1999 ; Das, 2011).
8 Chapitre I Données bibliographiques
Piqûre de scorpion Neurotoxines
Canaux ioniques Na + des Canaux ioniques Na + terminaisons nerveuses du muscle cardiaque
Activation Radicaux Cytokines du complément libres pro et anti- inflammatoires
Substance P Acétylcholine Altération Catécholamines des myocytes
Mastocytes
Substances vasoactives : Dysfonction Histamine, Prostaglandines, Leucotriènes, PAF cardiaque
Réaction inflammatoire Augmentation de la perméabilité vasculaire
Activation Libération Œdème pulmonaire Induction
Figure 2 : Présentation schématique des différents mécanismes impliqués dans la physiopathologie des envenimations scorpioniques (Murthy, 2000 ; Teixeira et al ., 2001 ; Hammoudi-Triki, 2004)
9 Chapitre I Données bibliographiques
De nombreuses études ont montré que les envenimations scorpioniques accidentelles ou expérimentales sont accompagnées d’une augmentation importante des taux sériques des cytokines pro inflammatoires principalement le TNF-α, l’IL-1β et l’IL-6 (Tableau I) qui jouent un rôle important dans la stimulation de la libération d’autres facteurs pro- inflammatoires non cytokiniques, tel que les prostaglandines, les leucotriènes, le PAF et la production des protéines de la phase aigue. Ces facteurs pro-inflammatoires stimulent la production massive des radicaux libres (NO, H O ), responsables des effets toxiques pour les 2 2 cellules et de lésions tissulaires (Fukuhara et al ., 2003 ; Pessini et al ., 2003). L’IL-8, un facteur chimiotactique dont la sécrétion conduit à la chimio-attraction des neutrophiles, leur migration transendotheliale, et leur dégranulation. Ce médiateur pro- inflammatoire stimule également la production du monoxyde d’azote par les macrophages, les cellules endothéliales et les cellules du muscle lisse. La formation de radicaux libres nitrés délétère pour les cellules, augmente la perméabilité pouvant créer ainsi une dépression myocardique (Meki et al ., 2002, 2003). Des cytokines anti-inflammatoires (IL-10 et IL-4) sont également présentes en grandes quantités dans le sang des patients et des animaux envenimées (Tableau I) . Ces cytokines vont agir sur les cellules pour la régulation de la production des cytokines pro-inflammatoires (Adi-Bessalem et al ., 2008; Fukahara et al ., 2003 ; Petricevich, 2006). Après envenimation scorpionique, d’autres médiateurs non cytokiniques sont impliqués dans le processus inflammatoire. Il s’agit principalement des kinines et des prostaglandines (Teixeira et al ., 1998 ; Meki et Mohey El Dean, 1998 ; Fukahara et al ., 2004 ; Pessini et al ., 2008). Une augmentation de l’activité lytique du complément est observée dans le processus inflammatoire induit par le venin de scorpion et par conséquent dans l'œdème pulmonaire, l’augmentation de la perméabilité vasculaire, la migration des leucocytes au site inflammatoire et la dégranulation des cellules phagocytaires (Bertazzi et al ., 2003, 2005 ; Adi-Bessalem et al ., 2008).
I.6.2. Cellules de l’inflammation L'infiltration leucocytaire, par le biais de la sécrétion de médiateurs pro- inflammatoires et de cytokines, constitue une étape importante de l'amplification de la réponse inflammatoire.
10 Chapitre I Données bibliographiques
Tableau I : Médiateurs impliqués dans la réponse inflammatoire après envenimation scorpionique. Médiateurs Scorpion Etude Références inflammatoires Hammoudi-Triki et al ., 2004 • Etude clinique Adi-Bessalem et • Etudes IL-6, IL-1β, IL-4, al ., 2008 expérimentales IL-10, IL-12, IL-5 Hammoudi-Triki in vivo (Rats, et TNF-α Androctonus souris) et in et al ., 2010 NO, histamine, australis hector vitro sur des Ait-Lounis et ICAM, MPO, macrophages Laraba-Djebari, activation du système péritonéaux 2012 murins du complément Raouraoua-Boukhari
et al ., 2012
Buthus martensi Etude expérimentale NO Liu et al ., 2008 Karch (Rats) IL-1β, IL-1α, IFN-γ Centruroides Etude expérimentale IL-6, IL-10 Petricevich, 2006 noxius (Souris) et TNF-α. • Etude clinique Sofer, 1995 Leiurus • Etude IL-6, IL-8, NO Meki et al ., 2002 quinquestriatus expérimentale et TNF-α. Abdoon et Fatani, (Lapins) 2009 Magalhaes et al ., 1999 Petricevich et al ., • Etude clinique 2002 a,b • Etude IL-1β, IL-6, IL-8, Bertazzi et al ., 2003 expérimentale IL-10, NO, TNF-α, Fukuhara et al ., (Lapins, Rats). IL-1α, IL-1β, IFN- 2003 • Etude Tityus serrulatus γ, GM-CSF, les Petricevich, 2004 expérimentale kinines, activation Bertazzi et al ., 2005 in vitro sur des du système du Petricevich et al ., Macrophages complément 2007 péritonéaux Pessini et al ., 2008 murins. Petricevich et al ., 2008
11 Chapitre I Données bibliographiques
Les dommages pulmonaires engendrés par les venins de scorpion sont en partie, la conséquence de l’activation d’une réponse inflammatoire conduisant à la libération par les leucocytes activés, en particulier les polynucléaires neutrophiles, de molécules à haute potentialité toxique comme des enzymes protéolytiques, des protéines cationiques, des eicosano ϊdes, des cytokines ainsi que les espèces réactives de l’oxygène (Borges et al ., 2011) Plusieurs études cliniques et expérimentales rapportent qu’au cours d’une envenimation scorpionique, le développement de la réponse inflammatoire se caractérise par le recrutement et l’activation massive de cellules inflammatoires, ce processus se traduit par une accumulation importante de leucocytes (polynucléaires neutrophiles, monocytes et lymphocytes) au niveau des tissus altérés (cœur et poumons), dans la cavité péritonéale et au niveau du sang périphérique (Pessini et al ., 2003 ; D'Suze et al ., 2004 ; Fukuhara et al ., 2004 ; Bertazzi et al ., 2005; Coelho et al ., 2007 ; Adi-Bessalem et al ., 2008) et une infiltration des tissus adipeux par des macrophages inflammatoires de phénotype M1-like a été révélée après envenimation expérimentale avec le venin d’ Androctonus australis hector (Ait-Lounis et Laraba-Djebari, 2012). En effet, le venin de scorpion contient des molécules capables d’induire, à partir des organes lymphoïdes primaires et secondaires une libération rapide et accrue de polynucléaires neutrophiles au niveau du sang périphérique (Fialho et al ., 2011). L’infiltration leucocytaire avec une prédominance des polynucléaires neutrophiles et des cellules mononuclées, est associée à une augmentation de la perméabilité vasculaire pulmonaire, consécutive à une libération accrue des médiateurs lipidiques de l’inflammation (PAF, leucotriènes et prostaglandines), et à l’installation de l’œdème pulmonaire. (Amaral et al., 1994). Les mécanismes impliqués dans l'activation des cellules immunitaires par les venins de scorpion, constitués principalement de neurotoxines, restent encore mal élucidés. Un mécanisme possible est la libération de neuropeptides, en particulier la substance P, à partir des terminaisons nerveuses après la dépolarisation induite par la fixation de certaines toxines des venins de scorpion sur les canaux sodium, la liaison de la substance P aux récepteurs NK des cellules inflammatoires (Kalil-Gaspar, 2003) stimule le chimiotactisme des polynucléaires neutrophiles, provoque la libération de médiateurs de l'inflammation et augmente la production d'espèces réactives de l'oxygène par les macrophages, les monocytes et les polynucléaires neutrophiles (Lots et al ., 1988 ; Partsch et Matucci-Cerinic, 1992 ; Lloyds et Hallett, 1993). Par ailleurs, la libération de ce décapeptide provoque une augmentation de la perméabilité vasculaire se traduisant par une infiltration de cellules inflammatoires (Abroug et al ., 1991 ; De Matos et al ., 2001). La substance P peut d’une part activer les mastocytes qui
12 Chapitre I Données bibliographiques libèrent des substances vasoactives (PAF, leucotriènes et prostaglandines et histamine) et d’autre part peut agir directement sur l’endothélium en modifiant la perméabilité vasculaire (De Matos et al ., 1997, 2001 ; Fukuhara et al ., 2003). Un autre mécanisme plausible est la l'action directe des toxines scorpioniques sur les canaux ioniques des cellules immunitaires. En effet, d’autres travaux effectués in vitro ont permis de mettre en évidence un effet immunomodulateur direct des venins de scorpions sur les cellules immunitaires. Le venin de Tityus serrulatus est capable d’activer les macrophages murins en stimulant la production de formes réactives de l’oxygène (H 2O2), du monoxyde d’azote et de cytokines (TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-1 et IL-10) (Petricevich, 2002; Petricevich et Lebrun, 2005; Petricevich et al ., 2007). Des travaux ont également montrer que les deux toxines Ts1 et Ts6 sont responsables de l’activité pro-inflammatoire du venin de Tityus serrulatus et que son activité anti-inflammatoire est attribuée à une autre composante, la toxine Ts2 capable d’inhiber la production du monoxyde d’azote, de IL-6 et de TNF-α induite par le LPS et de stimuler la production de IL-10 par des macrophages murins de la lignée J774.1 (Zoccal et al ., 2011). Des résultats similaires ont été obtenus avec le venin d’ Androctonus australis hector sur des macrophages péritonéaux de souris BALB/c in vitro. En effet, ce venin stimule la production de cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, IL-6, TNF-α) et anti-inflammatoire (IL- 10) et il est capable d’induire le métabolisme oxydatif (peroxyde d’hydrogène) et non- oxydatif (phosphatase acide) de ces macrophages (Hammoudi-Triki et al ., 2010). Borges et al (2011) ont rapporté un effet activateur direct du venin de Tityus zulianus sur les polynucléaires neutrophiles humains in vitro . En effet, ces auteurs ont montré que le venin de scorpion est susceptible de déclencher une production de ROS intracellulaires via l’activation d’une voie de signalisation PKC -dépendante.
I.6.2.1. Polynucléaires neutrophiles I.6.2.1.1. Origine du neutrophile
Les neutrophiles, ainsi que les autres leucocytes et les érythrocytes, sont formés à partir de cellules souches hématopoïétiques pluripotentes dont la différenciation a lieu dans les tissus hématopo ϊétiques. Les lignées granulocytaires et monocytaires/macrophagiques se différencient à partir d’un précursseur myélo ϊde commun sous l’influence de facteurs de croissance, le G-CSF pour les polynucléaires neutrophiles et le M-CSF pour les monocytes/macrophages. La cellule souche multipotente donne naissance, sous l’influence de différentes cytokines, successivement à une cellule souche myéloïde, à un progéniteur mixte
13 Chapitre I Données bibliographiques des granulocytes et des monocytes-macrophages, à un progéniteur de la lignée granuleuse qui se transforme en myéloblaste, puis en promyélocyte et métamyélocyte qui se transforme en polynucléaire immature puis en polynucléaire mature. Au cours de ces étapes de maturation, apparaissent successivement des organites et des constituants cytoplasmiques et membranaires indispensables à leurs fonctions effectrices de phagocytose et de bactéricidie (Breton-Gorius, 1998) ). Les granulations azurophiles (primaires) apparaissent dans les promyélocytes, les granulations spécifiques (secondaires) qui définissent le type du polynucléaire dans les myélocytes. Les granulations contenant de la gélatinase apparaissent au stade de polynucléaires immatures.
I.6.2.1.2. Fonctions du neutrophile Les polynucléaires neutrophiles constituent la sous-population granulocytaire la plus abondante dans le sang. Ces granulocytes sont parmi les premières cellules leucocytaires à migrer dans les tissus envahis par un antigène (bactéries, des virus, des toxines…). Les neutrophiles jouent un rôle central dans l'immunité innée car elles possèdent une grande variété de fonctions effectrices antimicrobiennes ainsi que la capacité de produire des cytokines pour initier des réactions inflammatoires et des chimiokines pour induire le trafic des cellules immunitaires (Yamashiro et al ., 2001). En plus de leur rôle de cellules phagocytaire, les polynucléaires neutrophiles participent à l’engagement et à la régulation des réponses immunitaires innées et adaptatives, ainsi qu’à l’homéostasie tissulaire (Nathan, 2006 ; Mantovani et al ., 2011).
A. Fonctions de base des polynucléaires neutrophiles Les principales fonctions des polynucléaires neutrophiles se déclinent ainsi : le chimiotactisme permettant à la cellule de se rendre rapidement sur le site infectieux, la phagocytose visant à l’internalisation de l’antigène, la dégranulation d’enzymes protéolytiques et l’explosion respiratoire génératrice de dérivés microbicides de l’oxygène. A.1. Chimiotactisme Les polynucléaires neutrophiles, en réponse aux différents chimioattractants, migrent de façon orientée vers leur cible. Cette migration dirigée des neutrophiles vers le site infectieux est un processus intégré de plusieurs étapes hautement complexes. L’infiltration est déclenchée par l’apparition, sur les cellules endothéliales activées de la paroi des vaisseaux sanguins de molécules d’adhérence (P- et E-sélectines, ICAM-1, VCAM-1). Les P et E-sélectines endothéliales interagissent d’abord avec les molécules d’adhérence des
14 Chapitre I Données bibliographiques leucocytes, principalement PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1) et la L-sélectine présente de façon constitutive à la surface des polynucléaires neutrophiles (Moore et al ., 1995 ; McEver et Cummings, 1997). Ces interactions de faible affinité sont suffisantes pour ralentir les neutrophiles en les faisant rouler le long de l’endothélium. Une augmentation de l’expression des β2 intégrines à la surface des neutrophiles, assure une interaction de plus forte affinité des intégrines (CD11a, CD11b, CD11c/CD18) et des molécules ICAM- 1 exprimées par les cellules endothéliales (Fischer et al ., 1983; Anderson et al ., 1984; Sligh et al ., 1993). La migration transendothéliale du polynucléaire neutrophile, se fait ensuite par l’intermédiaire des molécules PECAM-1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 ou CD31) et CD99 (Muller et al , 1993; Vaporciyan et al , 1993 ; Martin- Padura et al, 1998), qui sont exprimées à la fois à la jonction endothéliale et sur les PNs. Le contact endothélium–PN, pendant la traversée, fait intervenir les interactions homophiles PECAM-1– PECAM-1 à la jonction des cellules endothéliales. Ce passage prépare les cellules inflammatoires à leur migration ultérieure à travers la matrice extracellulaire, en déclenchant notamment, sur les PNs, l’apparition des intégrines nécessaires, α2β1 et α6β1 et la sécrétion de métalloprotéinases, capables de dégrader la matrice extracellulaire et/ou de faire apparaître sur celle-ci des sites cryptiques reconnaissables par les intégrines.
A.2. Phagocytose La phagocytose de particules opsonisées par le neutrophile implique différentes classes de récepteurs (Gougerot-Pocidalo, 2002). Les particules opsonisées par des fragments du complément activé (C3b et iC3b) ou par des immunoglobulines (IgG1 et IgG3) facilitent leur reconnaissance, la phagocytose et leur destruction par l’intermédiaire de récepteurs exprimés à la surface du polynucléaire neutrophile (Récepteurs CR1, CR3 et CR4 pour le complément et récepteurs du Fragment Fc des IgG respectivement) (Brown, 1991). Les récepteurs PRR « Pattern recognition receptor » et en particulier les Toll Like Receptor(TLR) qui reconnaissent des motifs moléculaires associés à un pathogène ou PAMPs (Pathogen associated molecular patterns) sont impliqués dans la phagocytose indépendante des opsonines. Les polynucléaires neutrophiles expriment tous les TLR, à l’exception de TLR3 (Muzio et al ., 2000). Une fois que l’agent infectieux se trouve à l'intérieur du phagosome, des granules contenant des enzymes de dégradation viennent se fusionner à celui- ci afin de dégrader complètement son contenu (Vieira et al ., 2002 ; Lee et al ., 2003 ).
15 Chapitre I Données bibliographiques
A.3. Dégranulation La dégranulation des neutrophiles dans le phagolysosome ou dans l’espace extracellulaire représente un évènement clé de l’activité microbicide (Berton, 1999). Ce système antimicrobien indépendant de l’oxygène met en jeu les enzymes protéolytiques contenues dans des granules cytoplasmiques, qui sont libérés lors de l’activation des polynucléaires neutrophiles (Spitznagel, 1990 ; Elsbach, 1998; Lehrer et Ganz, 1999). Les granules primaires (ou granules denses azurophiles) contiennent des peptides et des protéines visant principalement à la destruction des bactéries, comme la myéloperoxydase, le lysozyme (hydrolyse des parois bactériennes), la cathepsine G et l’élastase (Fouret et al , 1989). Les granules secondaires ou granules spécifiques, se caractérisent par la présence de lysozyme, lactoferrine, gélatinase et de protéines membranaires comme le flavocytochrome b558 de la NADPH oxydase. Les granules tertiaires (ou granules gélatinase) contiennent de la gélatinase mais pas de lactoferrine. Les vésicules sécrétrices sont les vésicules les plus rapidement mobilisables, contiennent la phosphatase alcaline et le flavocytochrome b558 de la NADPH oxydase. Elles présentent également sur leur membrane une réserve de récepteurs, notamment de récepteurs de chimioattractants, pouvant être mobilisés rapidement (Sengelov et al ., 1993).
A.4. Formation d’anions superoxydes La principale fonction microbicide des neutrophiles consiste en la libération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans l’environnement du site infectieux et dans les vésicules phago-lysosomales. L’activation du métabolisme oxydatif des neutrophiles, appelé également
16 Chapitre I Données bibliographiques peroxyde d’hydrogène (H 2O2), et le radical hydroxyl (OH-) (Babior, 1984; Nathan, 1987) ainsi que des dérivés halogénés (HOCl et chloramines) générés par la myéloperoxydase à partir du peroxyde d’hydrogène (Lee et al ., 2003).
B. Rôle des polynucléaires neutrophiles dans la régulation de l’immunité adaptative Les polynucléaires neutrophiles participent de part leurs sécrétions à la régulation des fonctions de nombreux partenaires du système immunitaire, ils sont capables de synthétiser toutes les cytokines monocyto-macrophagiques et notamment l’IL-1, l’IL-1RA, le TNF-α, l’IL-6, l’IL-10, l’IL-12, ces cellules produisent des chimiokines pour la plus part des cellules immunitaires et en particulier pour les cellules dendritiques participant de ce fait à l’engagement et à la régulation des réponses immunitaires adaptatives (Figure 3). Les neutrophiles, après capture de l’antigène en périphérie, sont capables de migrer vers les ganglions lymphatiques et sont donc susceptibles d’interagir avec les cellules immunitaires qui y sont présentes (Abadie et al ., 2005 ; Chtanova et al ., 2008). Cette migration est dépendante, comme pour les cellules dendritiques, du récepteur de chémokine CCR7 (Beauvillain et al ., 2011). Au niveau des ganglions lymphatiques, les polynucléaires neutrophiles peuvent interagir avec les cellules dendritiques pour moduler la présentation de l’antigène et réguler leur maturation (Bennouna et Denkers, 2005 ; Eken al ., 2008). De plus, Il a été montré une certaine capacité de présenter l’antigène par les neutrophiles aux lymphocytes T, notamment par cross-présentation (Beauvillain et al ., 2007). Récemment il a été prouvé que les neutrophiles activés peuvent attirer les cellules Th1 et Th17 vers le site de l’inflammation par la libération de CCL2, CXCL9 et CXCL10 pour les cellules Th1 et CCL2 et CCL20 pour les cellules Th17 (Pelletier et al ., 2010). En outre, il a été démontré que les neutrophiles de souris peuvent être induits par les cellules T à exprimer les molécules de CMH de classe II et à stimuler la différenciation Th1 et Th17 avec production de grandes quantités d’IFN-γ et d’IL-17 in vitro (Abi Abdallah et al ., 2011). Les polynucléaires neutrophiles activés sont capables de stimuler directement la production de l’IFN-γ par les cellules NK, cette interaction est assurée par la molécule ICAM3 exprimée par les neutrophiles et probablement le complexe moléculaire CD11d-CD18 exprimé par les cellules NK (Costantini et al ., 2011a et b).
17 Chapitre I Données bibliographiques
Figure 3 : interaction des polynucléaires neutrophiles avec les cellules immunitaires et non immunitaires dans le site inflammatoire et les ganglions lymphatiques (Mantovani et al ., 2011).
18 Chapitre I Données bibliographiques
Un deuxième niveau d'interaction avec les cellules T est lié à la capacité de ces cellules à moduler les fonctions des polynucléaires neutrophiles (Figure 3). En effet, les cellules T CD4 + et CD8 + activées, y compris les cellules Th17, Produisent des cytokines pro- inflammatoires comme l’INF-γ, le GM-CSF et le TNF) qui modulent la survie des neutrophiles et l'expression de marqueurs d'activation en in vitro (Pelletier et al ., 2010 a et b ;
Davey et al ., 2011). En plus, les deux cytokines IL-17A et Il-17F libérées par les cellules Th17 stimulent les cellules épithéliales pour sécréter des facteurs granulopoïétiques et des facteurs chimiotactiques comme le CXCL1, CXCL2, CXCL5 et CXCL8, qui donc amplifient le recrutement et l’activation des neutrophiles (Mantovani et al ., 2011).
C. Rôle des polynucléaires neutrophiles dans la résolution de l’inflammation
Les polynucléaires neutrophiles en agissant à plusieurs niveaux, font partie du réseau cellulaire qui orchestre la résolution du processus inflammatoire, une étape fondamentale pour assurer le retour des tissus à un état d’homéostasie (Serhan et al ., 2008). Pour ces leucocytes, cela implique la diminution de leur accumulation dans le site inflammatoire, la suppression de leur activation, la production de médiateurs anti-inflammatoires, l’induction de leur apoptose et leur phagocytose par les macrophages. L’élimination des neutrophiles apoptotiques par les macrophages et la reprogrammation de ceux-ci vers un état anti-inflammatoire joue un rôle capital dans la résolution du processus inflammatoire. En effet, la reconnaissance et la phagocytose des neutrophiles apoptotiques stimule la polarisation des macrophages vers un phénotype M2-like en exprimant fortement l’IL-10 et faiblement l’IL-12 (IL-10 hi IL-12 low ) (Figure 4) (Filardy et al ., 2010) participant ainsi à la régulation négative l'inflammation et favorisant la réparation tissulaire (Bystrom et al ., 2008 ; Silva, 2010). Les neutrophiles transforment leur synthèse de médiateurs pro-inflammatoires tels les prostaglandines et leucotriènes vers d’autres classes les lipoxines. Les neutrophiles peuvent également contribuer à la synthèse de résolvines et de protectines. Ces médiateurs lipidiques avec les marésines jouent un rôle important dans l’inhibition de la migration transendotheliale et de l’activation des neutrophiles, ainsi que de leur élimination du foyer inflammatoire (Figure 4) (Schwab et al ., 2007 ; Serhan et al ., 2008 ; Serhan et al ., 2009 ; Spite et al ., 2009). La contribution des neutrophiles à la résolution de l’inflammation implique également une augmentation de l’expression de CCR5 par les neutrophiles apoptotiques qui peut agir comme scavengers pour le CCL3 et le CCL5 (Figure 4) (Ariel et al ., 2006), les neutrophiles expriment aussi le récepteur D6 ayant une spécificité pour les chimiokines inflammatoires appartenant à la sous-
19 Chapitre I Données bibliographiques
Figure 4 : Rôle des polynucléaires neutrophiles dans la résolution de l’inflammation (Mantovani et al ., 2011).
20 Chapitre I Données bibliographiques famille CC (Nibbs et al ., 1997 et 2003 ; McKimmie et al ., 2008), ainsi que le récepteur «leurre» ou «decoy receptor» de l’IL-1 (IL-1R2), Ce récepteur lie l’IL-1 et empêche son interaction avec le récepteur IL-1R1 (Bourke et al ., 2003).
I.6.2.2. Phagocytes mononucléés I.6.2.2.1. Origine du monocyte Les monocytes ainsi que les macrophages font partie du système des phagocytes mononuclées. Ce système est composé de monocytes, de macrophages, de cellules dendritiques (CD) et de cellules progénitrices dont ils sont issus. Comme toutes les cellules sanguines, les monocytes sont produits dans les tissus hématopoïétiques, à partir d’un précurseur myéloïde commun aux granulocytes et aux monocytes (Volkman et Gowans, 1965). Les étapes de différenciation des monocytes sont essentiellement dépendantes du facteur de croissance M-CSF (Macrophage-colony stimulating factor ou CSF-1), en présence de l'IL-3, GM-CSF et de M-CSF, la différenciation du progéniteur myéloïde est orientée vers les progéniteurs CFU-M puis vers les précurseurs monocytaires pour donner successivement le monoblaste, le promonocyte et le monocyte. Le monocyte médullaire réside dans la moelle osseuse puis entre dans le sang périphérique pour se localiser dans les tissus de l’organisme (Wiktor-Jedrzejczak et Gordon, 1996 ; Auffray et al ., 2009).
I.6.2.2.2. Sous populations de monocytes Tout comme les cellules T CD4 se différencient en sous populations distinctes, des cellules T helper (TH1), TH2, TH17 et T régulatrices (Treg), les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques peuvent également se différencier en sous populations fonctionnelles distinctes (Chow et al ., 2011). La population monocytaire est composée de deux sous-populations principales, les monocytes classiques et les monocytes non classiques. Ces cellules se trouvent principalement dans la moelle osseuse, la rate et au niveau de la circulation (Ingersoll et al ., 2011). Chez la souris, les monocytes classiques également connus sous le nom de monocytes inflammatoires, sont caractérisés par de haut niveau d'expression de LY6C, CCR2 et de L-sélectine (CD62L). Les monocytes de la seconde classe expriment fortement le CX3CR1, LFA1 et le CD43 et faiblement le CCR2 et LY6C (Palframan et al ., 2001 ; Geissmann et al ., 2003). Chez l’homme, deux sous-populations de monocytes sont définies en se basant sur l’expression différentielle de CD16 et CD14 (Ziegler-Heitbrock, 2007). les monocytes classiques présentent une faible expression du marqueur CD16 mais expriment fortement le marqueur CD14 (CD14 hi CD16 -) (Ziegler-Heitbrock et al ., 2010).
21 Chapitre I Données bibliographiques
Cette sous-population classique présente une forte capacité de phagocytose et de production de cytokines pro-inflammatoires (Tumor Necrosis Factor (TNF)-α et interleukine (IL)-6 et IL- 1). Cette sous-population exprime fortement le récepteur aux chémokines CCR2 mais faiblement le CX3CR (Grage-Griebenow et al ., 2001 ; Gordon et Taylor, 2005). La deuxième sous-population est caractérisée par la co-expression des deux marqueurs CD14 et CD16 (CD14 + CD16 +) (Passlick et al ., 1989). Contrairement à la population majoritaire, les monocytes CD14 + CD16 + expriment faiblement CCR2 mais fortement CX3CR1 (Grage- Griebenow et al ., 2001 ; Gordon et Taylor, 2005 ; Auffray et al ., 2009). Ces monocytes CD14 +CD16 + sont subdivisés en deux populations distinctes, les monocytes CD16 + CD32 + CD64 + qui présentent de fortes capacités de phagocytose et de production de cytokines pro- inflammatoires en réponse aux LPS. Cette population CD64 + a également une importante capacité à produire des espèces réactives de l’oxygène (Grage-Griebenow et al ., 2000). Les monocytes CD16 + CD32 - CD64 - expriment un niveau très bas de CD14 (CD14dimCD16 +). Ces monocytes sont peu phagocytaires et ne produisent pas de TNF-α ou d’IL-1 en réponse aux LPS (Skrzeczynska-Moncznik et al ., 2008).
I.6.2.2.3. Propriétés fonctionnelles du monocyte
Le monocyte présente une grande diversité fonctionnelle. C’est un élément pivot du système immunitaire, joue un rôle essentiel dans les réactions de l’immunité innée et dans la réponse adaptative. Le monocyte assure l’élimination par phagocytose des agents pathogènes, la présentation de l’antigène aux lymphocytes T et la production d’une variété de médiateurs qui régulent ou modulent la réponse inflammatoire (León et al ., 2005). De plus, les monocytes circulants ont la capacité de se différencier pour donner l’ensemble des macrophages résidents retrouvés dans les différents tissus de l’organisme, ainsi que des cellules dendritiques myéloïdes (Gordon et Taylor, 2005 ; Auffray et al ., 2009 ; Geissmann et al ., 2010). Les macrophages dégradent l’antigène qu’ils phagocytent, présentent à leurs surface cellulaire les antigènes dégradés et initient la réponse immunitaire acquise des lymphocytes T, produisent une variété de cytokines après activation cellulaire et semblent être des facteurs essentiels dans la clairance locale des cellules apoptotiques (Auffray et al ., 2009 ; Geissmann et al ., 2010). Par contre, les cellules dendritiques ayant une faible capacité protéolytique sont capables de phagocyter du matériel d’autres cellules, de transformer et retenir les peptides/antigènes
22 Chapitre I Données bibliographiques intracellulaires qui seront alors présentés via les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) aux lymphocytes T. Cette présentation antigénique conduit à une co-stimulation pour le priming des cellules T (Steinman et al ., 2003 a, b). Après maturation des cellules dendritiques, la membrane plasmatique subit un turn-over très lent permettant alors aux complexes CMH/peptides d’être présents plus longtemps à la surface cellulaire. Ce processus facilite les interactions avec les cellules T (Cella et al ., 1997). Les macrophages activés renouvellent très rapidement les protéines membranaires plasmatiques dont le CMH de type II. Les macrophages et les cellules dendritiques possèdent des propriétés migratoires différentes (Geissmann et al ., 2003 ; Randolph, 2008 ; Serbina et al ., 2008). En effet, tandis que les macrophages restent largement dans les tissus, les cellules dendritiques sont capables de migrer des tissus périphériques vers les sites d’initiation de la réponse immunitaire, c'est-à- dire les ganglions lymphatiques et les autres organes lymphoïdes afin d’interagir avec les cellules T naïves (Chorro et Geissmann, 2010).
I.6.3. Réponse inflammatoire et production de dérivés réactifs de l’oxygène et du monoxyde d’azote
La réponse inflammatoire observée au cours des envenimations scorpioniques est associée à une production accrue de radicaux libres dérivés de l’oxygène. En effet, les venins de scorpions sont capables d’induire un stress oxydant, caractérisé par un excès de production de médiateurs oxydants et/ou une défaillance du système antioxydant, responsables des dommages membranaires au niveau des organes ciblés par l'action du venin (Dousset et al ., 2005 ; Fatani et al ., 2006). Les dérivés réactifs de l’oxygène ne participent pas seulement aux dommages moléculaires, cellulaires et tissulaires dont ils sont directement responsables, mais sont également fortement impliqués dans la régulation de la production d’autres médiateurs inflammatoires et, pour certains d’entre eux, dans l’orientation de la différentiation lymphocytaire (Efron et Barbul, 1998). Les PN et les macrophages (MO) sont les principales cellules libérant des formes réactives de l’oxygène par l'intermédiaire d'une enzyme membranaire, la NADPH oxydase. Ces espèces peuvent réguler l’expression des molécules d'adhérence sur l'endothélium et sur les cellules inflammatoires, affectant ainsi le recrutement des leucocytes sur le site de l'inflammation (Niu et al ., 1994 ; Fraticelli et al ., 1996). Ils augmentent aussi l'expression de chémokines et des cytokines (Brzozowski et al ., 2003 ; Kimura et al ., 2003). Les ROS, en particulier le peroxyde d’hydrogène, possèdent la capacité de stimuler l'activité des MAP-kinases qui conduit à l'activation de plusieurs facteurs de transcription nucléaires dont le NF-κB. Ce facteur nucléaire est impliqué dans la production
23 Chapitre I Données bibliographiques de diverses molécules pro-inflammatoires telle le TNF-α qui induit la production de l’anion superoxyde dans les mitochondries (Russo-Marie et al ., 1998).Il est possible que les ROS intracellulaires puisse agir comme des seconds messagers dans la transduction du signal inflammatoire. Par ailleurs, la génération de radicaux libres dérivés de l'oxygène est également impliquée dans la régulation de la résolution de la réponse inflammatoire par la modulation de l'expression de l'IL-10 (Deng et al ., 2012). Le monoxyde d’azote joue un rôle essentiel dans la physiopathologie de l'envenimation scorpionique. La présence du monoxyde d’azote est révélée dans les sérums de patients envenimés par le scorpion Leiurus quinquestriatus et de souris exposées au venin de Tityus serrulatus , ainsi que ans les surnageants de macrophages péritonéaux traités avec le venin de Tityus serrulatus et sa toxine (Petricevich et Pena, 2002 ; Petricevich, 2004 ; Petricevich et al ., 2007 ; Petricevich et al ., 2008 ; Abdoon et Fatani, 2009).
I.7. Cytotoxicité induite par les venins de scorpions Les scorpions sont parmi les animaux terrestres qui produisent des molécules pharmacologiquement actives, capables d'interférer avec la physiologie cellulaire. Les venins de ces arthropodes présentent un grand potentiel cytotoxique. Les multiples altérations physiopathologiques, qui caractérisent une envenimation scorpionique, indiquent que les venins de scorpions sont hautement cytotoxiques. Cette activité cytotoxique se manifeste par des dommages massifs, au niveau de toutes les structures tissulaires (myocarde, foie, parenchyme pulmonaire, la rate et les reins), marqués par des hémorragies, des désorganisations et des nécroses avec des variations des activités enzymatiques, marqueurs de lésions tissulaires (Sofer et al ., 1996 ; Corréa et al ., 1997 ; Daisley et al ., 1999 ; Bessalem et al ., 2003 ; D’Suze et al ., 2004). De nombreuses études réalisées in vitro et in vivo ont démontré que le venin de scorpion possède la capacité d'induire l'apoptose et l’inhibition de la synthèse de l'ADN dans une variété de cellules (Soroceanu et al., 1998; Omran, 2003; Wang et Ji, 2005; Gupta et al ., 2007), le venin d’ Androctonus australis hector présente des effets cytotoxiques in vitro sur des splénocytes de souris et des cellules de la lignée vero, se manifestant par une libération de la lactate déshydrogénase dans le milieu de culture qui pourraient être attribuées à des altérations au niveau de la membrane cellulaire (Hammoudi-Triki et Laraba-Djebari, 2011). Le venin de scorpion Tityus zulianus , à des concentrations élevées, exerce un effet cytotoxique sur les polynucléaires neutrophiles humains (Borges et al ., 2011). Le venin de
24 Chapitre I Données bibliographiques
Heterometrus bengalensis , ainsi que sa toxine purifiée la Bengaline, possèdent des effets antiprolifératifs et apoptogènes sur des lignées de cellules leucémiques U937 et K562 (Gupta et al ., 2007 et 2010). Les venins de Buthus martensii Karsch (Wang et Ji, 2005) et Leirus quinquestriatus (Omran, 2003) inhibent la croissance de tumeurs cérébrales et gliomes primaires. Les venins d’ Androctonus crassicauda et celui d’ Odontobuthus doriae exercent également un effet cytotoxique sur une lignée du cancer du sein humain (MCF-7) et de neuroblestome humain (SH-SY5Y) (Zargan et al ., 2011a et b). Dans une étude expérimentale,il a été montré que les venins de Hemiscorpius lepturus , Androctonus crassicauda et Mesobuthus eupeus possèdent des propriétés toxiques variables. En effet, les trois venins provoquent une libération de la LDH, marqueur d’intégrité membranaire, par les cellules de la lignée leucémique K562 mais à des degrés différents, le venin de Hemiscorpius lepturus possède l’effet cytotoxique le plus important et celui de Mesobuthus eupeus le plus faible (Khodadadi et al ., 2012).
I.7.1. Mécanismes impliqués dans la cytotoxicité induite par les venins de scorpions
Toutes les données suggèrent que les venins de scorpions peuvent être considérés comme de puissants agents cytotoxiques. Un agent cytotoxique est capable d’induire la mort cellulaire selon différents mécanismes. La mort cellulaire par apoptose implique l’activation de protéases, les caspases, dont l'effet est révélé soit par des messagers moléculaires en provenance de la mitochondrie (cytochrome c) ou d'origine extracellulaire, par activation de récepteurs de mort membranaires. L’apoptose se caractérise par une condensation du cytoplasme et de la chromatine nucléaire, la membrane plasmique bourgeonne transitoirement, puis la cellule se fragmente en corps apoptotiques. Ces modifications morphologiques s’accompagnent d’une fragmentation de l’ADN et du clivage limité de protéines intracellulaires, cytoplasmiques ou nucléaires par les caspases (Hughes et Mehmet,
2003). En plus de la perte de l'intégrité de la membrane plasmique et de la formation de la mPTP, la nécrose est caractérisée par la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), l’appauvrissement en ATP, un déséquilibre de l'homéostasie du Ca 2+ , l'activation de protéases tels que calpaïnes c et cathepsines, la rupture des lysosomes et la libération des hydrolases (Hedrick et al ., 2010). Le mécanisme moléculaire responsable de l’effet anticancéreux de la Bengaline sur les cellules leucémiques humaines, implique l’activation de la voie mitochondriale de l'apoptose. L'inhibition des HSP par cette toxine pourrait également jouer un rôle crucial dans l'induction de l'apoptose (Gupta et al ., 2010). Le venin d’ Androctonus crassicauda et d’ Odontobuthus
25 Chapitre I Données bibliographiques doriae provoquent l'apoptose par un arrêt du cycle cellulaire en phase S et une augmentation de la production du monoxyde d’azote et de l’activité de la caspase-3 et la dépolarisation de la membrane mitochondriale (Zargan et al ., 2011a et b) (Figure 5) . La cytométrie en flux en utilisant l’iodure de propidium, a permis de montrer que le venin de scorpion Tityus zulianus , pour des concentrations supérieures à 5 µg/ml, induit la mort des polynucléaires neutrophiles humains par un processus nécrotique (Borges et al ., 2011). Les mécanismes moléculaires impliqués dans la cytotoxicité induite par les venins de scorpion, notamment celui d’ Androctonus australis hector demeurent méconnus. Cependant, il semblerait que l’effet cytotoxique du venin d’ Androctonus australis hector , sur des splénocytes de souris et des cellules de la lignée vero, résulterait de l’instauration d’un stress oxydant via une surproduction d’espèces réactives de l’oxygène (H 2O2) pouvant être impliqués dans la peroxydation des lipides membranaire, la perte de l’intégrité membranaire et dans l’attaque de l’ADN et/ou des protéines enzymatiques cellulaire (Hammoudi-Triki et Laraba-Djebari 2011). En effet, il a été rapporté que les venins de scorpions sont capables d’induire un stress oxydant in vivo , caractérisé par une surproduction de formes réactives de l’oxygène et une défaillance du système antioxydant, responsables des dommages membranaires au niveau des organes cibles (Dousset et al ., 2005 ; Fatani et al ., 2006).
I.7.1.1. Génération des formes réactives de l’oxygène (ROS)
Les ROS sont produits de façon endogène à partir de l’oxygène moléculaire, au niveau de plusieurs organelles, tout particulièrement la mitochondrie qui est le lieu privilégié d’utilisation de l’oxygène. Ils sont représentés principalement par trois espèces chimiques, le − • • radical superoxyde O 2 , le radical hydroxyle OH et la molécule de peroxyde d’hydrogène
H2O2 (Robert, 2010). L’ion superoxyde est formé par réduction mono-électronique de l’oxygène moléculaire lors d’une réaction catalysée par des enzymes au premier rang les oxydoréductases de la chaîne de transport d’électrons mitochondriale et les NADPH oxydases − • + membranaires (NOX) : NADPH + O2 O2 + NADP
L’ion superoxyde est détoxiqué par les superoxyde dismutases (SOD), la Cu2+- Zn2+-SOD, localisée dans l’espace intermembranaire de la mitochondrie et la Mn2+- SOD, localisée dans la matrice mitochondriale. Cette dismutation génère le peroxyde d’hydrogène selon la − • + réaction : 2 O 2 + 2H H2O2 + O 2
26 Chapitre I Données bibliographiques
Le peroxyde d’hydrogène est lui-même détoxiqué par l’action de diverses enzymes : catalases (CAT) et peroxyrédoxines (PRDX). Toutefois, en présence de certains ions métalliques, comme le fer ferreux, mais aussi le cuivre, le chrome ou le cobalt, le peroxyde d’hydrogène peut entrer dans une réaction générant le radical hydroxyle OH −, la réaction de Fenton :
2+ − • 3+ H2O2 + Fe OH + OH + Fe
La réaction d’Haber-Weiss est également susceptible de générer le radical OH − :
− • − • H2O2 + O 2 O2 + OH + OH
I.7.1.2. les dommages provoqués par les ROS
Lorsque la production excède l'élimination, l'accumulation des ROS conduit à l'apparition d'un stress oxydatif. Les ROS sont considérés comme un des modes majeurs de la cytotoxicité de part leur capacité à oxyder et endommager toutes les molécules biologiques majeures notamment les protéines, les acides nucléiques et les lipides (Chandra et Orrenius, 2002 ; Korsloot et al., 2004).
• La peroxydation des lipides : Les lipides membranaires, principalement leurs acides gras polyinsaturés sont la cible privilégiée des attaques par les ROS, ils peuvent subir, lors de ces attaques, une dégradation en chaîne dont les conséquences sont nombreuses. Les membranes deviennent rigides, perdent leur perméabilité sélective, et sous conditions extrêmes, peuvent perdre leur intégrité. Les produits de la peroxydation lipidique, particulièrement les aldéhydes peuvent diffuser à travers les membranes et atteindre d’autres compartiments (Rémita, 2001 ; Korsloot et al., 2004 ; Dancygier et Schirmacher, 2010).
• Modifications des protéines : La réaction des radicaux libres de l’oxygène avec les protéines conduit à des modifications de leurs activités biologiques. Les dommages oxydatifs des acides aminés mènent à des modifications de la structure secondaire et tertiaire des protéines : dénaturation, fragmentation et formation d’agrégats entrainant une perte de l’activité enzymatique. Les protéines endommagées peuvent être dégradées par le protéasome. Cependant, les agrégats sont résistants à la dégradation protéolytique, entraînant une accumulation d’agrégats de protéines qui inhibe graduellement le protéasome (Favier, 2003 ; Dancygier et Schirmacher, 2010).
27 Chapitre I Données bibliographiques
Venin de scorpion
Génération de RNI Génération de ROS
Réduction de la catalase et du GSH
ADN Dépolarisation Membrane plasmique mitochondriale
Activation de
la caspase-3
Lésions de la membrane Peroxydation des lipides Perte du potentiel membranaire Réticulation des protéines Altération de la perméabilité Altération de la perméabilité Rupture de l'homéostasie énergétique Fragmentation
de l’ADN Rupture des brins et fragmentation de l’ADN
Apoptose Nécrose
Figure 5 : Mécanismes de cytotoxicité induites par les venins de scorpion (Dancygier et Schirmacher , 2010 ; Hammoudi-Triki et Laraba-Djebari, 2011 ; Zargan et al., 2011a et b)
28 Chapitre I Données bibliographiques
• Modification de l'ADN : Lors d’un stress oxydatif, les radicaux libres peuvent également endommager l'ADN. Les bases et le désoxyribose de l’ADN nucléaire et mitochondrial peuvent être altérés. Cinq classes principales de dommages oxydatifs médiés par OH• peuvent être générées. Parmi elles, les bases oxydées, les sites abasiques, des adduits intra-caténaires, des cassures de brins et des pontages ADN-protéines (Cadet et al ., 2002). L'attaque radicalaire directe entraine l’oxydation des bases purines et pyrimidines engendrant des bases oxydées, la plus abondante est la 8 oxo guanine. En effet la guanine est la cible privilégiée de nombreux oxydants tels que le OH• et le peroxynitrite (Cadet, 1999). Des dommages indirects peuvent résulter de l'attaque des lipides dont la peroxydation génère des aldéhydes réactifs, le MDA et le 4-HNE, pouvant s’ajouter au groupe amine des bases de l’ADN et constituer une autre classe de dégâts oxydatifs de l’ADN (Marnett, 1999 ; Nair, 1999 ; Favier, 2003).
I.5. Traitement des envenimations scorpioniques
L’immunothérapie constitue, à l’heure actuel, le seul traitement susceptible de neutraliser spécifiquement les toxines présentes dans les venins de scorpions (Pepin-Covatta et al ., 1996 ; Rezende et al ., 1998 ; Krifi et al ., 1999 ; Hammoudi-Triki et al ., 2004). Cependant, à raison des diverses complications engendrées par les venins de scorpions, l’immunothérapie seule est incapable d’abolir tous les effets systémiques déclenchés par ces venins (Bawaskar et al ., 1991 ; Sofer et al ., 1994 ; Tarasiuck et al ., 1998). L’utilisation de médicaments symptomatiques permet de potentialiser l’effet du le sérum antivenimeux.
Les anti-venins sont préparés par hyperimmunisation d’animaux, ils peuvent être monovalent, lorsque l’animal est immunisé contre un seul venin, ou polyvalents contre un mélange de venin provenant des principales espèces venimeuses connues dans une région . En Algérie, la préparation des sérums thérapeutiques est obtenue à partir de chevaux hyper- immunisés avec le venin d’ Aah . Il s’agit d’une préparation de fragments F(ab') 2 résultant de la digestion d’immunoglobulines par la pepsine, A raison de leur faible poids moléculaire, ces fragments sont plus diffusibles dans les compartiments tissulaires et plus efficaces que les immunoglobulines entières (Morais et Massaldi, 2005). L’efficacité de l’immunothérapie est conditionnée par les propriétés pharmacologiques et pharmacocinétiques du venin et de ses toxines mais aussi de celles du sérum antivenimeux et des conditions de son application. L’injection de l’anti-venin dans un délai court et par voie appropriée est nécessaire pour une neutralisation complète et permanente du venin circulant. En effet, la rapidité de diffusion des
29 Chapitre I Données bibliographiques toxines, rends la voie intra-veineuse la voie la plus recommandée pour l’injection de l’anti- venin (Hammoudi-Triki et al., 2007 ; Sami-Merah et al., 2008). Dans le but d’améliorer l’effet neutralisant de l’anti-venin, différentes approches ont été abordées. Le développement de nouveaux formats d’anticorps par ingénierie moléculaire a permis de concevoir des anticorps sous forme de scFv (Single Chain Variable Fragment) de petite taille et peu immunogènes constitué des domaines variables des chaines lourdes et légères de l’anticorps monoclonal (Muzard et al ., 2005). L’utilisation d’un mélange de fragments d’anticorps sous forme de diabody serait également prometteur pour la neutralisation des toxines scorpioniques (di Tommaso et al ., 2012). Les antigènes purifiés et détoxifiés par irradiation gamma sont utilisés dans l’immunisation des animaux et dans le développement d’une approche immunoprotective. En effet cette immunisation a permis d’obtenir des immun-sérums avec une meilleure capacité neutralisante des toxines du venin. Par ailleurs, l’utilisation de ces antigènes irradiés dans une approche immunoprotective a montré son efficacité à moyen et à long terme (Abib et Laraba-Djebari, 2003 ; Boussag-Abib et Laraba-Djebari, 2011).
30
Chapitre II:
Matériel et Méthodes
Chapitre II Matériel et Méthodes
II.1. Matériel II.1.1. Matériel biologique II.1.1.1. Le venin d’ Androctonus australis hector
Le venin de scorpion Androctonus australis hector (Aah ) obtenu par stimulation électrique a été fourni, sous forme lyophilisée, par le Laboratoire de Recherche et de Développement sur les Venins de l’Institut Pasteur d’Algérie.
II.1.1.2. Les fragments F(ab)' 2
Les fragments F(ab)' 2 sont purifiés à partir de sérum de chevaux hyperimmunisés avec le venin d’Androctonus australis hector (Aah ). Après une double précipitation au sulfate d’ammonium, les immunoglobulines G récupérées subissent un clivage enzymatique par la pepsine. Ces fragments F(ab)' 2 sont fournis par le Laboratoire de Recherche et de Développement sur les Venins de l’Institut Pasteur d’Algérie.
II.1.1.3. Les cellules
Les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) et les polynucléaires neutrophiles (PNs) sont isolées à partir de sang humain de sujets sains (hommes et femmes âgés entre 20 et 35 ans).
II.1.1.4. Le sang humain
Les échantillons de sang périphérique ont été prélevés chez des sujets volontaires sains, n’ayant pas reçu de traitement antibiotique ou anti-inflammatoire dans les quinze jours précédant le prélèvement. Le prélèvement sanguin est réalisé dans des tubes contenant le citrate de sodium comme anticoagulant.
II.1.2. Réactifs et produits chimiques
Les produits chimiques, de bonne qualité analytique sont fournis par les firmes suivantes :
Milieu de séparation des lymphocytes (Eurobio), Milieu de culture : RPMI-1640 (Sigma), Sérum de veau fétal (Sigma), Antibiotiques : pénicilline, streptomycine (Sigma), Dextran
(Sigma), Chlorure d’ammonium : NH 4Cl (Prolabo), Chlorure de Sodium (Merck), PBS sous forme de pastilles (Gibco), Bleu de trypan (Gibco), MTT (Sigma), DMSO (Sigma), O- dianizidine (Sigma Aldrich), Peroxyde d’hydrogène (Sigma), Dextrose (Difco), rouge de phénol (Difco), Horse-radish peroxidase : HRP (Sigma), Soude caustique (Merck), Nitrates de
31 Chapitre II Matériel et Méthodes
Sodium (Merck), Nitrites de Sodium (Panreac), Trichlorure de Vanadium (Gibco), Sulfanilamide (Sigma), N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride (Sigma), Acide orthophosphorique :H3PO 4 (Merck), HCl (Merck), Acétonitrile (Sigma), Sodium Dodécylsulfate : SDS (Sigma), Acide acétique glacial (Merck), acide thiobarbiturique (Sigma), Tris-HCl (Sigma), Triton-X100 (Sigma), Ethylène diamine tétra-acétate : EDTA (Prolabo), Diphenylamine (Sigma), acide sulfurique (Merck), glutaraldehyde (Sigma), rouge neutre (Reactifs RAL), Kit de dosage de la lactate déshydrogénase (Spinreact).
II.2. Méthodes II.2.1. Préparation, mise en culture et induction des cellules II.2.1.1. Préparation des cellules mononuclées du sang périphérique
Les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) sont isolées par sédimentation des érythrocytes sur dextran à 7% dans du NaCl isotonique. Le sang total est mélangé avec une solution de dextran (5 :1) puis mis à sédimenter pendant 60 minutes à 37°C. Le surnageant riche en leucocytes est ensuite prélevé et déposé délicatement dans un tube conique de 15 ml contenant 3 ml de ficoll 1077 puis centrifugé à 400 g pendant 30 minutes. Après centrifugation, les PBMC qui forment un anneau à l’interface plasma-ficoll sont récupérés. Les cellules sont ensuite lavées en ajoutant 10 ml de tampon PBS 0,1M ; pH 7,4 suivie d’une centrifugation pendant 10 min à 160 g. Le dernier culot est resuspendu dans un volume minimal de RPMI-1640 contenant 10% de sérum de veau fétal (SVF).
II.2.1.2. Préparation des polymorphonucléaires neutrophiles
Les polynucléaires neutrophiles (PNs) sont isolés à partir du même échantillon sanguin que les PBMC. Après centrifugation sur un gradient de ficoll 1077, le culot cellulaire correspondant aux PNs est récupéré, les cellules sont lavées en ajoutant 10 ml de tampon PBS
1M ; pH 7,4 suivie d’une centrifugation pendant 10 min à 160 g. Une solution de NH 4Cl à 0,87% est ajoutée aux culots cellulaires afin de lyser les globules rouges contaminants.
II.2.1.3. Contrôle de la viabilité cellulaire
Un dénombrement des cellules avant mise en culture est réalisé par la méthode d’exclusion au bleu de Trypan (0,4%) sur cellule de Malassez, Une suspension cellulaire (PBMC ou PNs) diluée est mélangée avec un volume égal de bleu de trypan. Ce mélange est déposé sur une cellule de Malassez, et observé au microscope optique à un grossissement de X 40 pour une numération cellulaire. La viabilité cellulaire estimée est supérieure à 98%. La
32 Chapitre II Matériel et Méthodes densité de la suspension cellulaire est ajustée et les cellules sont ensuite mises en culture dans des microplaques de 96 puits à fond plat à raison de 10 6cellules/puits.
II.2.1.4. Induction des cellules
Les PNs et les PBMC sont mises en culture dans du RPMI-1640 contenant 10% de SVF. Ces cellules sont stimulées avec des concentrations croissantes de venin d’ Androctonus australis hector : 2,5 µg/ml, 5 µg/ml, 12,5 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml, 125 µg/ml, 250 µg/ml et 500 µg/ml et incubées pendant 24 heures à 37°C en atmosphère humide et en présence de 5
% CO 2.
Un agent mitogène a été utilisé : la concanavaline A (conA). Les concentrations de cet activateur sont choisies après une incubation des cellules avec des concentrations croissantes de ConA.
II.2.2. Etude de l’effet du venin d’ Androctonus australis hector sur la viabilité des PNs et des PBMC humains
L’effet du venin d’ Aah sur la viabilité des PNs et les PBMC est évalué par le test d’exclusion au bleu de trypan. Après incubation pendant 24 heures en présence de concentrations croissantes de venin d’ Aah (2,5 ; 5 ; 12,5 ; 25 ; 50 ; 125 ; 250 et 500 µg/ml), les suspensions cellulaires récupérées de chaque puits sont centrifugées à 160 g pendant 10 minutes, les surnageants obtenus sont conservés à -80°C pour le dosage de la lactate déshydrogénase, la myéloperoxydase et le monoxyde d’azote. Le dénombrement cellulaire sur cellule de Malassez est réalisé en différenciant cellules vivantes des cellules mortes et le pourcentage de viabilité cellulaire est calculé en utilisant la formule suivante :
Le pourcentage de viabilité cellulaire = [(Nombre de cellules vivantes/ Nombre total de cellules) x 100]
II.2.3. Etude de l’état d’activation des PNs et des PBMC en présence de concentrations croissantes de venin d’ Aah
Les polynucléaires neutrophiles et les PBMC, incubés dans du RPMI-1640 contenant 10% de SVF, sont stimulés avec des concentrations non-cytotoxiques croissantes de venin
33 Chapitre II Matériel et Méthodes d’ Aah (2,5 ; 5 ; 12,5 ; 25 µg/ml). Ces concentrations sont sélectionnées en se basant sur les résultats du test de viabilité au bleu de trypan.
II.2.3.1. Effet du venin d’ Aah sur la prolifération des PBMC humains
L’effet de concentrations non cytotoxiques de venin d’ Aah (2,5 ; 5 ; 12,5 ; 25 µg/ml) sur la prolifération des PBMC est évalué par le test colorimétrique en utilisant un sel de tétrazolium, le MTT (Mosmann, 1983), qui permet une quantification rapide et sensible de la prolifération et de la viabilité cellulaire. Ce test est basé sur la réduction du MTT (3-(4,5- diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromide) en cristaux insolubles de formazan par une enzyme mitochondriale, la succinate déshydrogénase. La quantité de sel formazan produite par les cellules à partir du MTT est mesurée après solubilisation par spectrophotométrie à 540 nm.
Après 24 heures d’incubation à 37°C, en atmosphère contenant 5% de CO 2, Les cellules sont ensuite incubées en présence d’une solution de MTT (5 mg/ml) diluée au 1/10 dans du milieu RPMI-1640 complet à raison de 200 µl/puits pendant 4 h à 37 °C. La solution de MTT est éliminée et les cristaux de formazan insolubles formés sont dissous dans une solution de lyse (DMSO) à raison de 200 µl/puits. Après incubation, l’absorbance est mesurée à 540 nm. Le pourcentage des cellules vivantes en présence du venin (cellules traitées) par rapport aux cellules non traitées (cellules témoins) est calculé par la formule suivante :
Le % de viabilité = [(DO des cellules traitées avec le venin/DO des cellules témoin) x 100]
II.2.3.2. Effet du venin d’ Aah sur la dégranulation des polynucléaires neutrophiles et des monocytes
La myéloperoxydase (MPO), une hémoprotéine fortement exprimée par les neutrophiles (environ 5% des protéines totales des neutrophiles) est également exprimée par les monocytes (environ 1 % des protéines totales) (Lau et Baldus, 2006). L’activité de la myéloperoxydase, indice de dégranulation, est quantifiée dans les surnageants de culture des PNs stimulés avec des concentrations non cytotoxiques de venin d’ Aah (2,5 ; 5 ; 12,5 ; 25 µg/ml), pendant 24 heures, en absence et en présence de fragments F(ab)’2. Le même dosage est réalisé sur des surnageants de PBMC incubés avec les mêmes concentrations de venin.
34 Chapitre II Matériel et Méthodes
Ce dosage est effectué selon la méthode de Bradely et al (1982), en mélangeant 100 µl de surnageant avec 2,9 ml de tampon phosphate (pH 6,0) contenant 0,167 mg/ml d’O-dianizidine chlorhydrate et 0,0005 % de peroxyde d’hydrogène. L’activité enzymatique est évaluée par mesure de l’absorbance pendant 5 minutes. Les résultats obtenus sont exprimés en ∆DO/min.
II.2.3.3. Effet du venin d’ Aah sur le volume du système lysosomal des polynucléaires neutrophiles et des monocytes
Le volume du système lysosomal est évalué par l’étude de la rétention du rouge neutre (3-amino-7-dimethylamino2-methylphenazine-hydrochloride). Ce colorant cationique se concentre dans les lysosomes ayant une activité hydrolase. Cette propriété est utilisée comme marqueur de phagocytose pour les polynucléaires neutrophiles et les monocytes (Bonatto et al ,. 2004).
Les polynucléaires neutrophiles et les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) (PNs) sont incubées en présence de concentrations non cytotoxiques du venin d’ Aah (2,5 ; 5 ; 12,5 ; 25 µg/ml) pendant 24 heures. Après récupération des surnageants, les cellules sont incubées pendant 30 minutes à 37°C en présence d’une solution de rouge neutre (3%) diluée dans du RPMI-1640. Les cellules sont ensuite lavées deux fois avec du PBS par centrifugation à 453 g pendant 5 minutes et le rouge neutre retenu est solubilisé en ajoutant 100 µl d’une solution contenant un mélange éthanol-acide acétique (40:10%, v:v). Après 30 minutes d’incubation, l’absorbance est mesurée à 540 nm.
II.2.3.4. Effet du venin d’ Aah sur la production du peroxyde d’hydrogène
Le dosage du peroxyde d’hydrogène (H 2O2), un des produits dérivés de l’oxygène sous l’action de la NADPH oxydase lors de l’explosion respiratoire, est réalisé sur des cultures de PBMC et de PNs après 24 heures d’incubation en présence de concentrations non cytotoxiques de venin d’ Aah (2,5 ; 5 ; 12,5 ; 25 µg/ml).
Une solution de rouge de phénol (140 mM NaCl, 5 mM dextrose, 0,28 mM rouge de phénol et 8,5 U/ml HRP dans du tampon phosphate 0,01 M et pH 7,0) est ajoutée aux cellules. Après une heure d’incubation à 37°C. La réaction est arrêtée par ajout de 10 µl/puits de NaOH 1 N et la densité optique est mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques à la longueur d'onde de 620 nm. Les résultats sont exprimés en nM/10 6 cellules à l’aide d’une courbe étalon préparée à partir de concentrations croissantes de peroxyde d’hydrogène sur un intervalle de 5 nM-50 µM (Pick et Mizel, 1981).
35 Chapitre II Matériel et Méthodes
II.2.3.5. Effet des fragments sur le métabolisme oxydatif des PNs et des PBMC après stimulation avec le venin d’ Aah
Les PNs et les PBMC sont stimulés avec des concentrations non cytotoxiques de venin d’ Aah (2,5 ; 5 ; 12,5 ; 25 µg/ml), après 30 min d’incubation, une solution de fragments F(ab’)2 est rajoutée au milieu de culture à raison de 0,8 mg/ml. L’effet de ce traitement spécifique sur le métabolisme oxydatif des cellules est étudié par dosage de la production du peroxyde d’hydrogène (H 2O2), après 24 heures d’incubation.
II.2.3.6. Effet du venin d’ Aah sur la production du monoxyde d’azote
La production du monoxyde d’azote, dans les surnageants de cultures des PNs et des PBMC stimulés par des concentrations croissantes de venin d’ Aah (2,5 ; 5 ; 12,5 ; 25 µg/ml) pendant 24 heures est estimée par le dosage des nitrites et des nitrates, produits de dégradation oxydative du monoxyde d’azote les plus stables.
La concentration des espèces NOx (nitrates + nitrites) est déterminée, après réduction des nitrates en nitrites, par le test colorimétrique de Griess. Les nitrites en milieu acide forment avec le sulfanilamide (SA) un sel diazonium, qui donne par couplage avec le N-1- naphthylethylene diamine (NED) un composé diazo stable avec un maximum d’absorbance à 540 nm (Miranda et al ., 2001). Les surnageants de culture préalablement déprotéinisés sont déposés sur microplaque de 96 puits à fond plat. Une solution de trichlorure de vanadium (8 mg/ml) est ajoutée dans chaque puits pour la réduction des nitrates en nitrites suivi de l’ajout du réactif de Griess (2% SA et 0,1% NED dans l’acide orthophosphorique). L’absorbance est mesurée à 540 nm avec un lecteur de microplaques après 30 min d’incubation,. La concentration des nitrates est déterminée par extrapolation des valeurs de l’absorbance sur une courbe étalon DO = f
(NaNO 2) établie pour une gamme de NaNO 2 allant de 0 à 100 µM.
II.2.4. Etude de l’effet cytotoxique du venin d’ Androctonus australis hector sur les PBMC et les PMNs humains
Les polynucléaires neutrophiles et les PBMC, incubés dans du RPMI-1640 contenant 10% de SVF, sont stimulés avec des concentrations cytotoxiques croissantes de venin d’ Aah (50, 125, 250 et 500 µg/ml).
36 Chapitre II Matériel et Méthodes
Après une durée d’incubation de 24 heures à 37°C en atmosphère humide et à 5% de CO 2, l’effet cytotoxique du venin d’ Aah est étudié par deux tests : le test de viabilité aux sels de tétrazolium MTT pour évaluer l’intégrité mitochondriale et le dosage de la lactate déshydrogénase comme marqueur d’intégrité membranaire.
II.2.4.1. Effet du venin d’ Androctonus australis hector sur l’intégrité mitochondriale
L’effet du venin d’ Aah sur l’activité et l’intégrité mitochondriale des polynucléaires neutrophiles et les PBMC donc sur le métabolisme cellulaire est évalué par le test de viabilité utilisant un sel de tétrazolium, le MTT.
Les PNs et les PBMC isolés sont incubés en présence de concentrations croissantes de venin d’ Aah (50, 125, 250 et 500 µg/ml). Après 24 heures, le test MTT est réalisé.
II.2.4.2. Effet du venin d’ Androctonus australis hector sur l’intégrité membranaire
Le dosage de la lactate déshydrogénase, un des marqueurs d’intégrité membranaire, est basé sur la propriété que possède le coenzyme à nicotinamide, sous sa forme réduite (NADH, H+) à absorber la lumière à une longueur d’onde de 340 nm.
La lactate déshydrogénase, en présence de NADH, H + , catalyse la réduction du pyruvate en lactate et la vitesse de diminution ou d’augmentation de l’absorbance à 340 nm est proportionnelle à la quantité d’enzyme présente. Le dosage de la lactate déshydrogénase dans les surnageants de culture des PNs et des PBMC, est réalisé selon les instructions du fournisseur du kit (SPINREACT). Un volume de 33 µl de surnageant de culture est mélangé avec 1ml de milieu réactionnel contenant 0,18 mM de NADH et 0,6 mM de pyruvate dans du tampon imidazol à 65 mM. Après une minute d’incubation, l’absorbance est mesurée à chaque minute pendant 3 minutes à 340 nm. L’activité enzymatique de la LDH, exprimée en UI/l, est calculée en multipliant la variation moyenne de l’absorbance ( ∆ DO/min) par un coefficient de 4925.
II.2.5. Effet du venin d’ Androctonus australis hector sur la balance pro/anti-oxydante
II.2.5.1. Dosage du monoxyde d’azote
La production du monoxyde d’azote dans les surnageants de cultures des PNs et des PBMC stimulés avec des concentrations croissantes de venin d’ Aah (50, 125, 250 et 500 µg/ml) pendant 24 heures, est estimée par le test colorimétrique de Griess permettant le
37 Chapitre II Matériel et Méthodes dosage des nitrites totaux, après réduction des nitrates en nitrites en utilisant le trichlorure de vanadium.
II.2.5.2. Evaluation de la peroxydation lipidique par dosage du malondialdéhyde
L’évaluation de la peroxydation lipidique est réalisée par la détermination de la concentration de malondialdéhyde (MDA) sur la base de sa dérivatisation avec l’acide thiobarbiturique (ATB). La condensation de ces deux molécules donne naissance à un produit facilement quantifiable par spectrophotométrie en raison de sa forte absorbance à 532 nm. La concentration du malondialdéhyde est évaluée dans les surnageants de culture des PNs et des PBMC après 24 heures d’incubation en présence de concentrations croissantes de venin d’ Aah (50, 125, 250 et 500 µg/ml). Les surnageants de culture déprotéinisés (150 µl) sont mélangés avec 50 µl sulfate dodecylsulfate à 8,1%, 375 µl d’acide acétique à 20% et 375 µl d’acide thiobarbiturique à 0,8 %. Après incubation pendant une heure à 100°C, la réaction est arrêtée dans un bain de glace et l’absorbance est lue à 532 nm. Les résultats sont exprimés en nM de MDA/10 6 cellules en utilisant un coefficient d’extinction molaire ε = 156 x 10 2 cm -1 M-1.
II.2.5.3. Evaluation de l’activité de la catalase
L’activité enzymatique de la catalase, une enzyme du système antioxydant est évaluée en mesurant le taux de consommation de son substrat, le peroxyde d’hydrogène (H 2O2), à une longueur d’onde de 240 nm.
Le dosage de cette enzyme est réalisé après une stimulation de 24 heures des PNs et des PBMC avec des concentrations croissantes de venin d’ Aah (50, 125, 250 et 500 µg/ml). L’activité de la catalase est déterminée par la méthode de Claiborne (1985), décrite par Iqbal et al (1995) et Ansar et al (1999). Les cellules sont incubées avec 200 µl de tampon de lyse (tampon Tris-HCl 20 mM, pH 7,5 contenant 150 mM NaCl, 1 mM EDTA et 0,1 % TritonX- 100). Le mélange réactionnel est constitué de 1 ml de tampon phosphate (0,05 M, pH 7,0), 0,975 ml de peroxyde d'hydrogène (0,019 M) et 0,025 ml de surnageant. La diminution de l’absorbance est mesurée pendant 2 minutes à une longueur d’onde de 240 nm.
38 Chapitre II Matériel et Méthodes
II.2.6. Etude de l’effet du venin d’Androctonus australis hector sur la fragmentation de l’ADN Une quantification de la fragmentation de l’ADN est réalisée par un dosage colorimétrique en utilisant la diphénylamine (Liles et al ., 1995; Squier et Cohen, 1997). Les suspensions cellulaires sont centrifugées et les culots cellulaires sont lysés avec une solution hypotonique contenant 10 mM Tris-HCl pH 7,4, EDTA 1 mM, et le Triton X-100 à 0,2%. Les lysats cellulaires sont centrifugés à 13000 g pendant 10 minutes pour séparer la chromatine intacte, de poids moléculaire élevé (culot). Le surnageant, correspondant à la chromatine fragmentée de faible poids moléculaire et le culot subissent une précipitation par incubation avec de l’acide trichloroacétique à 25 % pendant une nuit suivie d’une centrifugation à 13000 g pendant 10 minutes. Toutes les fractions ont été incubées avec 160 ml de diphénylamine à 37°C pendant 4 h, dans laquelle 150 mg de diphénylamine était dissous dans 10 ml d'acide glacial, puis 150 ml d'acide sulfurique concentré et 50 ml de solution d'acétaldéhyde ont été ajoutés. La quantité d'ADN dans chaque échantillon a été estimée après lecture de l’absorbance à 570 nm. Les résultats ont été calculés par l'équation suivante:
Le pourcentage de l’ADN fragmenté = [DO du surnageant/ (DO du surnageant + DO
du culot)] x 100
II.2.7. Effet du temps d’incubation en présence du venin sur les polynucléaires neutrophiles Les polynucléaires neutrophiles, incubées dans du RPMI-1640 additionné de 10% de SVF, sont incubés en absence ou en présence de 250 µg/ml de venin d’ Aah pendant une heure, 16 heures, 20 heures, 22 heures et 24 heures. A chaque temps d'incubation, le pourcentage de viabilité cellulaire est déterminé par le test d’exclusion au bleu de trypan. Cette cinétique de viabilité des polynucléaires neutrophiles est réalisée en absence et en présence d’un prétraitement avec un inhibiteur spécifique des neutrophiles : Le propofol, qui en plus de ses propriétés pharmacologiques, il présente également des effets immunomodulateurs en diminuant la production de cytokines pro-inflammatoires et la production du monoxyde d’azote et confère une activité antioxydante en piégeant les radicaux libres et peroxynitrite pour diminuer la peroxydation lipidique induite par le stress oxydant.
39 Chapitre II Matériel et Méthodes
II.2.8. Exploration statistique des résultats
Les résultats sont exprimés par la moyenne ± l’écart-type. Les comparaisons de moyenne ont été effectuées à l’aide d’une analyse ANOVA et du test de différence significative honnête de Tukey, en utilisant le logiciel STATISTICA.
Degré de signification : P < 0,05 significative ( *) P < 0,01 très significative ( ** ) P < 0,001 hautement significative ( *** )
40 Chapitre II Matériel et Méthodes
Activité de la catalase
Fragmentation de l’ADNFragmentation de venin d’Aah Peroxydation des lipidesPeroxydation des Production du NO Concentrations cytotoxiquesConcentrations du
e e
(Test au MTT) au (Test Intégrité mitochondriale mitochondriale Intégrité ytotoxicité ytotoxicité vec des concentrationsvec de venin croissantes d’Aah partir de sang partir périphérique humain sainssujets de Etude de la c
Schéma récapitulatifSchéma expérimentale. démarche la de Intégrité membranaire membranaire Intégrité (Libération de la la de LDH)(Libération Détermination du pourcentage de viabilitéDétermination du cellulair pourcentage Figure 6 : 6 : Figure
2 O 2
Production du NO Stimulation des PBMC et des PMNs des PMNs Stimulation enet culturemises a des PBMC Isolement et et en cultureIsolement mise et des PBMC des PMNs à Production du H
Volume Volume lysosomal Dégranulation (MPO)Dégranulation venin d’Aah Prolifération des PBMC des Prolifération
nonConcentrations cytotoxiques du 41
Chapitre III:
Résultats et Discussion
Chapitre III Résultats et Discussion
III.1. Etude de l’effet du venin d’ Androctonus australis hector sur la viabilité des PNs et des PBMC humains Afin d’étudier l’effet du venin d’ Aah sur la viabilité des PNs et des PBMC humains, ces cellules ont été incubées pendant 24 heures en présence de concentrations croissantes de venin d’ Aah (2,5 ; 5 ; 12,5 ; 25 ; 50 ; 125 ; 250 et 500 µg/ml).
Les résultats du test d’exclusion au bleu de trypan indiquent qu’en présence de 2,5 µg/ml, 5 µg/ml, 12,5 µg/ml et 25 µg/ml de venin d’ Aah , les pourcentages de viabilité pour les polynucléaires neutrophiles et les PBMC sont similaires aux témoins. Ceci suggère que pour ces faibles concentrations, le venin d’ Aah ne présente aucun effet cytotoxique pour ces cellules. A partir de 50 µg/ml, une diminution dose dépendante, du pourcentage de viabilité des PNs (Figure 7A) et des PBMC (Figure 7B) est observée. Ce qui indique que pour des concentrations supérieures à 50 µg/ml, le venin d’ Aah exerce un effet cytotoxique sur les polynucléaires neutrophiles, les lymphocytes et les monocytes humains.
Comparativement aux témoins, le venin d’ Aah à une concentration de 50 µg/ml et de 125 µg/ml induit un effet cytotoxique, qui se traduit par une diminution très significative (p<0,01) de la viabilité des PNs respectivement à 87,63 ± 2,09 % et 68,57 ± 5,84 %. En présence de concentrations plus élevées 250 µg/ml et 500 µg/ml, cet effet cytotoxique augmente progressivement et se révèle hautement significative (p<0,001) pour atteindre respectivement 62,37 ± 1,32 % et 43,85 ± 6,22 % de viabilité cellulaire.
De même, les concentrations 2,5 ; 5 ; 12,5 et 25 µg/ml de venin d’ Aah ne provoquent aucune cytotoxicité pour les PBMC. En revanche, à partir de 50 µg/ml une cytotoxicité dose dépendante est révélée. En effet, les concentrations 50 µg/ml, 125 µg/ml et 250 µg/ml provoquent des taux très significatifs de cytotoxicité (p<0,01) se traduisant par une réduction du pourcentage de viabilité cellulaire respectivement à 80,89 ± 3,28 %, 61,66 ± 7,76% et 61,89 ± 6,4%. Une concentration de 500 µg/ml provoque une cytotoxicité plus significative (p<0,001) avec 49,47 ±5,55% de viabilité cellulaire.
Ces résultats concordent avec ceux des études réalisées sur différentes espèces de scorpions. En effet, le venin de scorpion Tityus zulianus à des concentrations faibles, inférieures à 5 µg/ml, il n’exerce aucun effet cytotoxique sur les polynucléaires neutrophiles humains (Borges et al ., 2011). De même, la toxine purifiée du venin de scorpion Heterometrus bengalensis Koch , la bengaline à de faibles concentrations, ne présente aucun effet cytotoxique vis-à-vis des lymphocytes humains.
42 Chapitre III Résultats et Discussion
A 120
NS NS 100 NS NS ** 80 ** *** 60 *** 40 Pourcentagede viabilité 20
0 Témoin 2,5 5 12,5 25 50 125 250 500 Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
B 120
NS 100 NS NS NS ** 80 ** ** 60 ***
40 Pourcentage de viabilité de Pourcentage 20
0 Témoin 2,5 5 12,5 25 50 125 250 500 Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
Figure 7 : Evaluation de la cytotoxicité du venin d’ Aah sur les polynucléaires
neutrophiles (A) et les PBMC (B) par le test d’exclusion au bleu de trypan .
43 Chapitre III Résultats et Discussion
III.2. Etude de l’état d’activation des PBMC et des PNs en présence de concentrations non cytotoxiques de venin d’ Aah III.2.1. Effet du venin d’ Aah sur la prolifération des PBMC humains L’effet de concentrations non cytotoxiques du venin d’ Aah sur la prolifération des PBMC est évalué par le test colorimétrique au MTT (Mosmann, 1983). Les PBMC sont stimulés pendant 24 heures avec des concentrations non cytotoxiques de venin d’ Aah (2,5 ; 5 ; 12,5 ; 25 µg/ml). Ces concentrations ont été choisies en se basant sur les résultats obtenus par le test d’exclusion au bleu de trypan.
Les PBMC incubés en présence de ConA (2,5 µg/ml) ont une réponse proliférative plus élevée (p<0,01) que les cellules non traitées. La stimulation des PBMC avec une concentration de 2,5 µg/ml de venin d’ Aah pendant 24 heures entraine une augmentation de 11,19 ± 9,03 % de viabilité cellulaire par rapport au témoin. Ce taux augmente progressivement de manière dose dépendante. En effet, des concentrations de 5 µg/ml et 12,5 µg/ml de venin entraine une augmentation de 18, 58 ± 3,57 % et de 21,24 ± 3,48 % (très significative avec un p<0,01) de la viabilité cellulaire respectivement. Une concentration de 25 µg/ml induit une augmentation significative de la viabilité cellulaire de 9,20 ± 3,02 %. En revanche, une diminution très significative (p<0,001) de la viabilité ellulaire est obtenue en présence de 50 µg/ml (Figure 8).
Ces résultats montrent qu’en accord avec les résultats du test d’exclusion au bleu de trypan, aucun effet cytotoxique de venin d’Aah à des concentrations de 2,5 µg/ml, 5 µg/ml, 12,5 µg/ml et 25 µg/ml sur les PBMC n'a été observé. Ces résultats témoignent également d’un effet activateur exercé par les constituants du venin d’ Aah sur les PBMC humains se manifestant par une prolifération cellulaire en réponse à des faibles concentrations de venin.
44 Chapitre III Résultats et Discussion
180 ** * 160
140 NS ** ** 120 *
100 **
80
60
40
Pourcentagede viabilité cellulaire 20
0 Témoin Con A (2,5 2,5 5 12,5 25 50 µg/ml) Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
Figure 8 : Evaluation de la prolifération cellulaire des PBMC en présence de concentrations croissantes de venin d’ Aah
45 Chapitre III Résultats et Discussion
III.2.2. Effet du venin d’ Aah sur la dégranulation des polynucléaires neutrophiles
La myéloperoxydase est une enzyme hémique présente en concentration importante dans les granules primaires des polynucléaires neutrophiles, elle est également présente dans les monocytes mais en concentrations plus faibles.
Le dosage de l’activité de la MPO dans les surnageants de culture révèle une activation dose dépendante des polynucléaire neutrophiles par le venin d’ Aah (Figure 9A). Cette activation se manifeste par une augmentation du taux de sécrétion de la myéloperoxydase. Les neutrophiles en présence de 5 µg/ml et 12,5 µg/ml ont une activité myéloperoxydase significativement élevée (p<0,5), par rapport au témoin, avec des taux d’augmentation respectives de 46,28 % et 109 %. Cette activité augmente très significativement (p<0,01) de 165,69 %, par rapport au témoin, en présence de 25 µg/ml de venin.
En présence de fragments F(ab)’2, le venin d’ Aah induit des taux de libération de la myéloperoxydase similaires au témoin (Figure 9A) . des quantités de myéloperoxydase significativement réduites (p<0,5) sont obtenues en présence de fragments F(ab)’2 par rapport à celles libérées en présence de venin seul.
L’activité de la myéloperoxydase dans les surnageants des PBMC augmente significativement (p<0,5) par rapport au témoin avec des taux de 87 % et 102,5 % pour des concentrations respectives de 5 µg/ml et 12,5 µg/ml. En réponse à une concentration de 25 µg/ml, une augmentation très significative (p<0,01) de 148,7 % est enregistrée (Figure 9B) .
La présence de concentrations élevées de myéloperoxydase dans le milieu extracellulaire suggère une activation excessive des polynucléaires neutrophiles et des monocytes par les constituants du venin d’ Aah , aboutissant à une dégranulation massive de ces cellules.
46 Chapitre III Résultats et Discussion
A * Venin Venin + F(ab)'2 0,016 ** * 0,014 * 0,012 DO/min)
∆ 0,01 * 0,008
0,006
0,004
Activité de ActivitéMPOla ( 0,002
0 Témoin 2,5 5 12,5 25 Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
B 0,012 ** 0,01 *
*
DO/min) 0,008 ∆
0,006
0,004
Activité de ActivitéMPOla ( 0,002
0 Témoin 2,5 5 12,5 25 Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
Figure 9 : Dosage de l’activité de la myéloperoxydase dans les surnageants de
culture des polynucléaires neutrophiles (A) et des PBMC (B) incubés avec des
concentrations croissantes de venin d’ Aah .
47 Chapitre III Résultats et Discussion
III.2.3. Effet du venin d’ Aah sur le volume du système lysosomal des polynucléaires neutrophiles et des PBMC
L'absorption du rouge neutre, qui se concentre dans les lysosomes de la cellule, a été utilisée pour évaluer le volume du système lysosomal des neutrophiles et des PBMC après 24 heures d’incubation en présence de faibles concentrations de venin d’ Aah (2,5 ; 5 ; 12,5 ; 25 µg/ml).
Les résultats obtenus montrent qu’en présence de venin d’ Aah , une augmentation significative du taux de rétention du rouge neutre est observée pour les polynucléaires neutrophiles et les PBMC.
Une rétention du rouge neutre dose-dépendante, par les polynucléaires neutrophiles, a été observée en présence du venin d’Aah (Figure 10A), cette augmentation, hautement significative (p<0,001), est de 116,13%, 105,13% et de 144, 22%, par rapport au témoin, pour des concentrations respectives de venin 2,5 µg/ml, 5 µg/ml et de 12,5µg/ml. Par contre, une concentration de 25 µg/ml entraine une diminution du taux de rétention du rouge neutre de manière hautement significative (p<0,001) par rapport à celui provoqué par une concentration de 12,5 µg/ml, toutefois ce taux de rétention demeure très significativement élevé (p<0,01) par rapport au témoin.
Par ailleurs, la mise en culture des PBMC avec de faibles concentrations de venin, révèle une augmentation, très significative (p<0,01), de 17,27%, 30,74%, 36,42% et de 38,26% du taux de rétention du rouge neutre, par rapport au témoin, pour des concentrations respectives de venin de 2,5 µg/ml, 5 µg/ml, 12,5 µg/ml et de 25 µg/ml (figure 10B) .
Ces résultats renforcent l'absence d'une perméabilisation membranaire en présence de faibles concentrations de venin. De plus, l’augmentation du volume lysosomal des neutrophiles et des PBMC reflète une activation de ces leucocytes par les constituants du venin d’ Aah .
48 Chapitre III Résultats et Discussion
A 300 *** *** 250 *** *** 200 ** 150
100
% de rétention% du rougeneutre 50
0 Témoin 2,5 5 12,5 25 Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
B 160 *** *** 140 ** *** 120
100
80
60
40 % de rétention% du rougeneutre 20
0 Témoin 2,5 5 12,5 25 Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
Figure 10 : Effet du venin d’ Aah sur le volume du système lysosomal des polynucléaires neutrophiles (A) et des PBMC (B) par le test de rétention du rouge neutre.
49 Chapitre III Résultats et Discussion
III.2.4. Effet du venin d’ Aah sur la production du peroxyde d’hydrogène
Le dosage du peroxyde d’hydrogène (H 2O2), un des métabolites réactifs de l’oxygène, est réalisé sur des cultures de polynucléaires neutrophiles et de PBMC après 24 heures d’incubation en présence de concentrations croissantes de venin d’ Aah (2,5 µg/ml, 5 µg/ml, 12,5 µg/ml et 25 µg/ml), cette mise en culture cellulaire a été faite en présence et en absence de fragment F(ab)’ 2 spécifiques au venin d’ Aah .
Les résultats obtenus montrent que le venin d’ Aah induit une augmentation dose dépendante de la production du peroxyde d’hydrogène par les polynucléaires neutrophiles (Figure 11A). En effet, la concentration de ce métabolite augmente très significativement (p<0,01) de 9,91 ± 4 nM/10 6 cellules, pour le témoin, à 28,79 ± 0,66 nM/10 6 cellules en présence de 2,5 µg/ml de venin. Une concentration de 12,5 µg/ml entraine une production significativement élevée (p<0,1) par rapport au témoin, estimée à 36,4 ± 7,41 nM/10 6 cellules. Cependant, une élévation du taux du peroxyde d’hydrogène jusqu’à 71,76 ± 3,33 nM/10 6 cellules est obtenue avec une concentration de 25 µg/ml, soit une différence hautement significative (p<0,001) par rapport au témoin.
Un profil similaire est obtenu avec les PBMC (Figure 11B). En effet, après 24 heures d’incubation, une augmentation significative (p<0,1) de la concentration du peroxyde d’hydrogène jusqu’à 26,44 ± 9,34 nM/10 6 cellules, par rapport au témoin (4,71 ± 1,33 nM/106 cellules) est enregistrée, en présence de 2,5 µg/ml de venin. Cette augmentation devient très significative (p<0,01) avec 5 µg/ml et atteint une valeur de 36,35 ± 9,34 nM/10 6 cellules. Les concentrations 25 et 50 µg/ml de venin stimule également une production de peroxyde d’hydrogène avec des concentrations respectives de 41,99 ± 1,99 nM/10 6 cellules et 145,41 ± 19,36 nM/10 6 cellules confirmant ainsi une augmentation hautement significative (p<0,001) par rapport au témoin.
Les fragments F(ab)’ 2, spécifiques au venin, ajoutés dans le milieu de culture semblent affecter la production du peroxyde d’hydrogène provoquée par le venin d’ Aah . Par rapport aux cellules stimulées avec le venin seul, les PBMC en présence de venin et de fragments
F(ab)’ 2 présentent une production réduite de peroxyde d’hydrogène, mais ces taux réduits demeurent significativement (p<0,1) élevés par rapport au témoin. La formation du complexe
F(ab)’ 2-venin d’ Aah serrait responsables d’une réduction partielle du métabolisme oxydatif des PBMC stimulés avec le venin d’ Aah .
50 Chapitre III Résultats et Discussion
A Venin Venin + F(ab)'2 ** * ** * 80 ** * 70 ** *
60
cellules 50 6 * 40 ** * ** 30
20 [H2O2] (nM/10 [H2O2] 10
0 Témoin 2,5 5 12,5 25 Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
B * 180 Venin Venin + F(ab)'2 ** * 160
140
120 cellules 6 100 * ** 80 ** 60 ** ** * [H2O2] (nM/10 [H2O2] 40 * * 20 *
0 Témoin 2,5 5 12,5 25 Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
Figure 11 : Dosage du peroxyde d’hydrogène dans les surnageants de culture des polynucléaires neutrophiles (A) et des PBMC (B) incubés avec des concentrations faibles de venin d’ Aah , en absence et en présence de fragments F(ab)’2.
51 Chapitre III Résultats et Discussion
Pour les polynucléaires neutrophiles, en présence de fragments F(ab)’2, une faible concentration de venin (2,5 µg/ml) semble induire une augmentation hautement significative (p<0,001) de la production du peroxyde d’hydrogène. Pour des concentrations plus élevées (5 et 12,5 µg/ml) de venin cet effet s’annule et les fragments ne semblent avoir aucun effet car des taux similaires de peroxyde d’hydrogène sont obtenus en présence et en absence de fragments F(ab)’2. Pour une concentration de 25 µg/ml de venin, les fragments diminuent de manière hautement significative (p<0,001) la production du peroxyde d’hydrogène, néanmoins la quantité de H2O2 produite demeure, pour cette concentration de 25 µg/ml, très significativement élevée (p<0,01) par rapport au témoin.
III.3.5. Effet du venin d’ Aah sur la production du monoxyde d’azote
L’évaluation de la production du monoxyde d’azote dans les surnageants de cultures a été réalisée par la mesure des nitrites totaux après 24 heures d’incubation des polynucléaires neutrophiles et des PBMC en présence de concentrations non cytotoxiques croissantes de venin d’ Aah (2,5 µg/ml, 5 µg/ml, 12,5 µg/ml et 25 µg/ml).
L’étude de la production du NO a permis de révéler une augmentation dose dépendante de ses taux pour les deux types de culture.
La stimulation des cultures de polynucléaires neutrophiles avec des concentrations de 5 µg/ml, 12,5 µg/ml et 25 µg/ml de venin a induit une augmentation très significative (p<0,01) de la concentration des nitrites totaux, par rapport au témoin (6,99 ± 3,06 µM), jusqu’à 22 ± 2,82 µM, 21 ± 2,82 µM et 19,33 ± 1,88 µM (Figure 12A). De même, les PBMC ont montré une production plus élevée de NO par rapport au témoin (5,83 ± 0,94 µM). Cette augmentation est hautement significative (p<0,001) avec des concentrations de venin de 2,5 µg/ml, 5 µg/ml et 25 µg/ml. La différence se révèle très significative en présence de 12,5 µg/ml avec une concentration de 20 ± 2,82 µM (Figure 12B).
52 Chapitre III Résultats et Discussion
A 30
25 ** ** NS ** 20
15 [NOx] (µM) [NOx] 10
5
0 Témoin 2,5 5 12,5 25 Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
B 30 *** 25 *** ** *** 20
15 [NOx] (µM) [NOx] 10
5
0 Témoin 2,5 5 12,5 25 Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
Figure 12 : Dosage des nitrites totaux dans les surnageants de culture des polynucléaires neutrophiles (A) et des PBMC (B) incubés avec des concentrations faibles de venin d’ Aah .
53 Chapitre III Résultats et Discussion
III.3. Etude de l’effet cytotoxique du venin d’ Androctonus australis hector sur les PBMC et les PMNs humains III.3.1. Effet du venin d’ Androctonus australis hector sur l’intégrité mitochondriale Pour évaluer l'effet du venin d’ Aah sur le métabolisme cellulaire, un test de viabilité cellulaire au sel de tétrazolium a été réalisé après traitement des PNs et des PBMC avec des concentrations cytotoxiques, comparativement aux résultats du test d’exclusion au bleu de trypan, de venin d’ Aah (50, 125, 250 et 500 µg/ml) pendant 24 heures. Ce test est basé sur la transformation du sel de tétrazolium MTT en cristaux de formazan par les cellules métaboliquement actives, grâce à l'activité enzymatique de la succinate déshydrogénase présente dans les mitochondries .
Les résultats de ce test montrent pour les deux types de cultures, une activité métabolique réduite est observée par rapport aux témoins, conséquence probable d’une altération de l’intégrité mitochondriale induite par le venin d’ Aah . Toutes les concentrations de venin utilisées induisent une diminution dose dépendante de la viabilité cellulaire des PNs et des PBMC. Une réduction hautement significative de la viabilité des PNs jusqu’à 64,55 ± 2,11 % ; 62,04 ± 0,14 % ; 51,81 ± 4,07 % et 46,58 ± 2,20 % en présence des concentrations respectives de venin d’ Aah 50 µg/ml, 125 µg/ml, 250 µg/ml et 500 µg/ml (Figure 13A).
Comparativement aux témoins, les concentrations 50 µg/ml, 125 µg/ml, 250 µg/ml et 500 µg/ml provoquent une toxicité cellulaire (Figure 13B), qui se manifeste par une diminution hautement significative de la viabilité des PBMC de 65,17 ± 0,04 % ; 66,35 ± 1,46 % ; 63, 91 ± 1,68 % et 53,35 ± 0,62 % respectivement.
Ces résultats permettent d’une part de suggérer que les altérations de l’intégrité mitochondriale sont impliquées dans la cytotoxicité induite par le venin d’ Aah . D’autre part, cette affirmation conforte les résultats obtenus avec le test d’exclusion au bleu de trypan révélant que des concentrations supérieures à 50 µg/ml de venin d’ Aah sont douées d’un effet cytotoxique sur les polynucléaires neutrophiles et les PBMC humains.
54 Chapitre III Résultats et Discussion
A 120
100
80 *** *** 60 *** ***
40 % de viabilité% cellulaire 20
0 Témoin 50 µg/ml 125 µg/ml 250 µg/ml 500 µg/ml Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
B 120
100
80 *** *** *** 60 ***
40 % de viabilité% cellulaire
20
0 Témoin 50 µg/ml 125 µg/ml 250 µg/ml 500 µg/ml Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
Figure 13 : Evaluation de la cytotoxicité du venin d’ Aah sur les polynucléaires neutrophiles (A) et les PBMC (B) par le test MTT.
55 Chapitre III Résultats et Discussion
III.3.2. Effet du venin d’ Androctonus australis hector sur l’intégrité membranaire L’intégrité membranaire des PNs et des PBMC en présence de concentrations cytotoxiques de venin d’ Aah (50, 125, 250 et 500 µg/ml) a été évaluée par la mesure de l’activité enzymatique de la lactate déshydrogénase libérée dans les surnageants de culture cellulaire.
En réponse à ces concentrations de venin d’ Aah , une augmentation du taux de la LDH libérée par les PNs ainsi que les PBMC, a été révélée. Cette libération reflète une altération de l’intégrité membranaire suite au traitement des cellules avec le venin d’ Aah .
Dans les surnageants des PNs, la libération de la LDH révèle une altération significative de la membrane plasmique en présence de 125 µg/ml de venin. L’activité de la LDH augmente progressivement jusqu’à devenir très significativement plus élevée, de 18,05 ± 4,64 UI/l pour le témoin à 41,04 ± 4,64 UI/l et 52,53 ± 9,28 UI/l pour des concentrations respectives de venin de 250 µg/ml et de 500 µg/ml (Figure 14A).
Par ailleurs, une augmentation, dose dépendante, de l’activité enzymatique de la LDH dans les surnageants des PBMC a été révélée. Une concentration de 50 µg/ml provoque une augmentation significative de l’activité de cet enzyme, les concentrations 125 µg/ml et 250 µg/ml entraine une libération très significativement élevée de la LDH, de 44,32 ± 6,96 UI/l et 49,25 ± 6,96 UI/l respectivement et atteint 57,45 ± 3,32 UI/l pour 500 µg/ml, une différence hautement significative (p<0,001) par rapport au témoin (18,05 ± 2,32 UI/l) (Figure 14B).
L’augmentation de l’activité enzymatique de la LDH corroborent et renforcent la cytotoxicité et la perte de l’intégrité membranaire, déterminées par l’absorption du colorant vital (bleu de trypan). Ces résultats indiquent que des altérations au niveau de la membrane plasmique serraient également impliquées dans la cytotoxicité du venin d’ Aah .
56 Chapitre III Résultats et Discussion
A 70 ** 60
50 ** 40 NS * 30
20 Activité de ActivitéLDH la (UI/l)
10
0 Témoin 50 µg/ml 125 µg/ml 250 µg/ml 500 µg/ml Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
B 70
60 *** ** 50 **
40
30 *
20 Activité de ActivitéLDH la (UI/l)
10
0 Témoin 50 µg/ml 125 µg/ml 250 µg/ml 500 µg/ml concentration de venin d'Aah
Figure 14 : Mesure de l’activité de la lactate déshydrogénase dans les surnageants de culture des polynucléaires neutrophiles (A) et des PBMC (B).
57 Chapitre III Résultats et Discussion
III.4. Effet du venin d’ Androctonus australis hector sur la balance pro/anti-oxydante Dans le cas d’une surproduction d’espèces réactives de l’oxygène, excédant la capacité de la machinerie antioxydante cellulaire, des dommages oxydatifs peuvent survenir, engendrant un stress oxydant, et affecter considérablement le fonctionnement de la cellules. Lors d’un stress oxydant, les espèces réactives de l’oxygène non détoxifiés par le système antioxydant vont oxyder des macromolécules, telles les lipides, protéines, sucres et acides nucléiques, désorganisant leurs structures chimiques et altérant leurs fonctions biologiques.
III.4.1. Dosage du monoxyde d’azote
La production du monoxyde d’azote par les polynucléaires neutrophiles et les PBMC a été évaluée après une durée d’incubation de 24 heures avec des concentrations cytotoxiques croissantes de venin d’ Aah (50, 125, 250 et 500 µg/ml).
La mise en culture des polynucléaires neutrophiles et des PBMC en présence de 50, 125, 250 et 500 µg/ml de venin d’ Aah entraine une augmentation du taux des nitrites de manière dose dépendante.
Le taux de nitrites dans les surnageants de culture des polynucléaires neutrophiles marque une augmentation hautement significative (p<0,001) de 6,99 ± 3,06 µM, pour le témoin jusqu’à 30,39 ± 1,72 µM en présence de 50 µg/ml de venin, des taux de 32,27 ± 6,04 µM et 35,11 ± 7,22 µM sont atteint par stimulation des PNs avec des concentrations respectives de venin de 125 µg/ml et 250 µg/ml, soit une élévation très significative (p<0,01) par rapport au témoin. Une concentration de 500 µg/ml entraine une augmentation hautement significative (p<0,001) (Figure 15A).
De manière similaire, le venin d’ Aah provoque une augmentation dose dépendante du taux des nitrites dans les surnageants de culture des PBMC (Figure 15B), pour des concentrations de venin de 50, 125, 250 et 500 µg/ml. La concentration des nitrites augmente de manière hautement significative (p<0,001) de 5,16 ± 0,94 µM, pour le témoin, jusqu’à 29,5 ± 2,59 µM, 30,33 ± 3,06 µM, 44 ± 2,82 µM et 56,22 ± 7,22 µM respectivement.
Ces valeurs sont nettement supérieures à celles retrouvées dans les surnageants de cultures des polynucléaires neutrophiles et des PBMC stimulés avec des concentrations non cytotoxiques de venin d’ Aah .
58 Chapitre III Résultats et Discussion
A 60
50 *** ** 40 ** *** 30 [NOx] (µM) [NOx] 20
10
0 Témoin 50 µg/ml 125 µg/ml 250 µg/ml 500 µg/ml Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
B 70 *** 60
50 ***
40 *** *** 30 [NOx] (µM) [NOx]
20
10
0 Témoin 50 µg/ml 125 µg/ml 250 µg/ml 500 µg/ml Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
Figure 15 : Dosage des nitrites totaux dans les surnageants de culture des polynucléaires neutrophiles (A) et des PBMC (B ) incubés avec des concentrations croissantes de venin d’ Aah .
59 Chapitre III Résultats et Discussion
III.4.2. Evaluation de la peroxydation lipidique par dosage du malondialdéhyde
La peroxydation des lipides de la membrane plasmique survient lors de stress oxydatifs intenses. Ce phénomène peut conduire à une perméabilisation de la membrane plasmique et à la mort de la cellule. Pour le présent travail, il a été choisi d'évaluer la peroxydation lipidique après incubation des polynucléaires neutrophiles et des PBMC avec des concentrations cytotoxiques de venin d’Aah (50, 125, 250 et 500 µg/ml).
Les polynucléaires neutrophiles ont une concentration initiale de MDA de 40,57 ± 2,98 nM/10 6 cellules, en présence de 50 µg/ml cette concentration est de 46,96 ± 3,05 nM/10 6 cellules. Une augmente hautement significative de la concentration en MDA est obtenus lorsque ces cellules sont exposées à 125 µg/ml (100,39 ± 6,06 nM de MDA/ 10 6 cellules), 250 µg/ml (105,38 ± 6,52 nM de MDA/ 10 6 cellules) et 500 µg/ml (104,64 ± 6,11 nM de MDA/ 10 6 cellules) (Figure 16A) .
Les résultats de la figure 16B montrent une augmentation, concentration dépendante, de la quantité de MDA présente dans les surnageants des PBMC par rapport au témoin (55,55 ± 12,08 nM de MDA/ 10 6 cellules). La concentration en MDA est de 53,39 ± 8,01 nM de MDA/ 10 6 cellules, 74,73 ± 15,03 nM de MDA/ 10 6 cellules et 76,92 ± 18,13 nM de MDA/ 10 6 cellules en présence de concentrations respectives de venin de 50 µg/ml, 125 µg/ml et 250 µg/ml. Une augmentation très significative de cette concentration (98,16 ± 3,06 nM de MDA/ 10 6 cellules) est observée lors de l’exposition des cellules à une concentration de 500 µg/ml de venin.
Les résultats indiquent que le venin d’Aah peut engendrer des dommages oxydatifs lipidiques. Ces dommages sont corrélés avec l’apparition d’un état de stress oxydant et avec l’apparition d’effets cytotoxiques lors de l’exposition des PNs et des PBMC à des concentrations cytotoxiques de venin.
60 Chapitre III Résultats et Discussion
A 120 *** *** *** 100
80 cellules) 6 60
40 [MDA] (nM/10 [MDA] 20
0 Témoin 50 125 250 500 Concentrations de venin d'Aah (µg/ml)
B 120 ** 100
80 cellules) 6 60
40 [MDA] (nM/10 [MDA] 20
0 Témoin 50 µg/ml 125 µg/ml 250 µg/ml 500 µg/ml Concentrations de venin d'Aah (µg/ml)
Figure 16 : Evaluation de la concentration du malondialdéhyde dans les
surnageants des polynucléaires neutrophiles (A) et des PBMC B) incubés avec des concentrations croissantes de venin d’ Aah .
61 Chapitre III Résultats et Discussion
III.4.3. Evaluation de l’activité de la catalase La catalase est une enzyme du système antioxydant, elle catalyse la décomposition du peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène. Le dosage de l’activité catalytique de cette enzyme a été effectué après 24 heures d’incubation des polynucléaires neutrophiles et des PBMC en présence de concentrations cytotoxiques de venin d’ Aah (50, 125, 250 et 500 µg/ml).
Les polynucléaires neutrophiles, pour toutes les concentrations de venin utilisées, présentent une activité catalasique réduite. En effet, une diminution hautement significative (p<0,001) de cette activité est enregistrée, de 0,03 ± 0,001 pour le témoin à 0,0059 ± 0,0011 ; 0,0024 ± 0,0004 ; 0,002 ± 0,0003 et 0,0037 ± 0,0003 ∆DO/min pour les concentrations respectives de venin 50, 125, 250 et 500 µg/ml (Figure 17A) . En revanche, les PBMC en présence de 50 µg/ml de venin possèdent une activité catalasique similaire au témoin (p), à partir de 125 µg/ml. Cette activité diminue de manière hautement significative (p<0,001) par rapport au témoin (0,016 ± 0,0003) et atteint 0,0081 ± 0,0012 ; 0,0053 ± 0,0015 et 0,0036 ± 0,0001 en présence de 125 µg/ml, 250 µg/ml et 500 µg/ml respectivement (Figure 17B) .
La diminution de l’activité de la catalase corrèle avec l’augmentation du taux de peroxyde d’hydrogène et des nitrites totaux indiquant une probable implication de ces deux métabolites dans la réduction de l’activité catalasique.
62 Chapitre III Résultats et Discussion
A 0,035
0,03
0,025
0,02
0,015 DO (240nm)/min
∆ 0,01 *** 0,005 *** *** *** 0 Témoin 50 125 250 500 Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
B 0,018
0,016 NS
0,014
0,012
0,01 ***
0,008 ***
DO (240nm)/min 0,006 ∆ 0,004 ***
0,002
0 Témoin 50 125 250 500 Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
Figure 17 : Mesure de l’activité de la catalase dans les surnageants des polynucléaires neutrophiles (A) et des PBMC (C) incubés avec des concentrations croissantes de venin d’ Aah .
63 Chapitre III Résultats et Discussion
III.4. Etude de l’effet du venin d’Androctonus australis hector sur la fragmentation de l’ADN La fragmentation de l'ADN est une caractéristique des dommages oxydatifs de l'ADN et de lésions cellulaires. La cytotoxicité du venin d’ Aah a été examinée en déterminant le taux de fragmentation de l'ADN 24 heures après le traitement des polynucléaires neutrophiles et des PBMC avec 50 µg/ml, 125 µg/ml, 250 µg/ml et 500 µg/ml de venin.
La quantification de la fragmentation de l’ADN des PNs indique qu’une concentration de 50 µg/ml entraine une augmentation significative (p<0,05) jusqu’à 48,49 ± 3,12 % par rapport au témoin (42,88 ± 0,71 %). Cette augmentation devient très significative (p<0,01) et atteint 54,42 ± 1,59 %, 55,71 ± 0,97 % et 60,12 ± 0,52 % pour des concentrations respectives de venin de 125 µg/ml, 250 µg/ml et 500 µg/ml, soit une augmentation de 11,63 % ; 13,22 % et de 17,63 % par rapport au témoin (Figure 18A) .
Une fragmentation très significative (p<0,01) de l’ADN des PBMC est révélée pour toutes les concentrations cytotoxiques de venin, le pourcentage de fragmentation de l’ADN augmente de 34,68 ± 3,95 % à 58,38 ± 1,40 %; 56,49 ± 1,69 %; 60,21 ± 0,11 % et 54,99 ± 1,98 % respectivement pour des concentrations de venin de 50 µg/ml, 125 µg/ml, 250 µg/ml et 500 µg/ml, soit une augmentation de 23,7 %; 21,81 %; 25,53 % et de 20,31% comparativement au témoin (Figure 18B) .
64 Chapitre III Résultats et Discussion
A 70 ** 60 ** **
50 *
40
30
20 % de fragmentation% de l'ADN 10
0 Témoin 50 125 250 500 Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
B 70 ** ** 60 ** **
50
40
30
20
% de fragmentation% de l'ADN 10
0 Témoin 50 µg/ml 125 µg/ml 250 µg/ml 500 µg/ml Concentration de venin d'Aah (µg/ml)
Figure 18 : Evaluation de la fragmentation de l’ADN des polynucléaires neutrophiles (A) et des PBMC (B) incubés avec des concentrations croissantes de venin d’ Aah .
65 Chapitre III Résultats et Discussion
III.5. Effet du temps d’incubation en présence du venin sur les polynucléaires neutrophiles
Les polynucléaires neutrophiles, incubées dans du RPMI-1640 additionné de 10% de SVF, sont incubés en absence ou en présence de 250 µg/ml de venin d’ Aah pendant une heure, 16 heures, 20 heures, 22 heures et 24 heures.
A chaque temps d'incubation, le pourcentage de viabilité cellulaire est déterminé par le test d’exclusion au bleu de trypan.
Afin de comprendre le mécanisme d’action du venin d’ Aah sur les neutrophiles et de mettre en évidence les voies impliquées dans leurs activation, un prétraitement avec un inhibiteur spécifique des neutrophiles et des cellules mononuclées est utilisé. Il s’agit du propofol, initialement décrit comme un anesthésique, En plus de ses propriétés pharmacologiques, le propofol présente également des effets immunomodulateurs en diminuant la production de cytokines pro-inflammatoires et la production du monoxyde d’azote. En outre, le propofol inhibe les fonctions des neutrophiles, y compris la chimiotaxie, l'adhésion, la migration, la phagocytose, et la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). Le propofol confère une activité antioxydante en piégeant les radicaux libres et peroxynitrite pour diminuer la peroxydation lipidique induite par le stress oxydant.
La cinétique de viabilité des PNs en présence d’une concentration 250 µg/ml de venin d’ Aah montre une diminution très significative (p<0,01) de la viabilité cellulaire à 72,86 ± 4,62 % après une heure d’incubation. Ce pourcentage diminue pour atteindre 63,23 ± 2,08 % après 16 heures d’incubation. La cytotoxicité demeure constante après 20 heures d’incubation, à partir de ce temps la viabilité cellulaire est hautement inférieure (p<0,001) à celle du témoin (Figure 19).
En présence du propofol, la cinétique de cytotoxicité du venin d’ Aah est similaire à celle du venin seul (Figure 19), néanmoins cet effet cytotoxique du venin d’ Aah est significativement réduit de 11,23% ; 12,13 % ; 16,47 % ; 14,33 % et 18,28 % après une heure, 16, 20, 22 et 24 heures respectivement.
66 Chapitre III Résultats et Discussion
120 Venin Venin + Propofol
100
80
60
40
20 Pourcentagede viabilité cellulaire
0 0 h 1 h 16 h 20 h 22 h 24 h Temps d'incubation
Figure 19 : cinétique de l’effet cytotoxique du venin d’ Aah sur les polynucléaires neutrophiles en présence et en absence de pré-traitement.
67
Chapitre IV:
Discussion générale
Chapitre IV Discussion générale
Le venin d’ Androctonus australis hector est, comme les venins des autres espèces de scorpion capable d’induire une réponse inflammatoire systémique caractérisée par une libération accrue de médiateurs pro-inflammatoires notamment des cytokines ainsi qu’une activation et une importante accumulation de lymphocytes, macrophages et neutrophiles au niveau de différents tissus, cardiaque, pulmonaire et adipeux, au niveau de la cavité péritonéale ainsi qu’une libération rapide de ces leucocytes dans la circulation sanguine.
Afin de mieux comprendre l’effet du venin de scorpion d’ Aah sur les polynucléaires neutrophiles (PNs) et les cellules mononuclées circulantes (PBMC) ainsi que l’implication de ces leucocytes dans la réponse inflammatoire au cours des envenimations scorpioniques. Cette étude a été réalisée in vitro sur des PNs et des PBMC isolées à partir de sang humain de sujets sains.
Pour répondre à cet objectif, nous nous sommes intéressés dans une première étape de ce travail, à étudier l’effet du venin d’ Aah sur la viabilité cellulaire in vitro . Cette étude a été abordée par la mise en culture des polynucléaires neutrophiles et des cellules mononuclées du sang périphérique en présence de concentrations croissantes de venin d’ Aah (2,5 ; 5 ; 12,5 ; 25 ; 50 ; 125 ; 250 et 500 µg/ml). Le test d’exclusion au bleu de trypan a été réalisé pour vérifier la viabilité cellulaire. Contrairement aux cellules vivantes et en apoptose précoce, les cellules en apoptose tardive ou en nécrose se caractérisent par une perte de l’intégrité membranaire. Ces cellules, devenues capables d’incorporer le bleu de trypan, apparaissent bleues à l’observation microscopique. Les résultats de ce test ont révélé que l’incubation des polynucléaires neutrophiles et des PBMC pendant 24 heures en présence de faibles concentrations de venin (2,5 ; 5 ; 12,5 et 25 µg/ml) n’a aucun effet sur la viabilité cellulaire. En revanche, une cytotoxicité apparait à des concentrations plus élevées (50 ; 125 ; 250 et 500 µg/ml). Le venin semble induire un effet cytotoxique dose dépendant pour les deux types de cultures.
Le but de la seconde étape de ce travail est d’analyser l’effet de concentrations non cytotoxiques de venin d’ Aah sur l’état d’activation des lymphocytes, monocytes et des polynucléaires neutrophiles, par l’évaluation de la réponse proliférative des lymphocytes, la libération de la myéloperoxydase, du peroxyde d’hydrogène et du monoxyde d’azote, ainsi que le volume du système lysosomal. Les concentrations non cytotoxiques utilisées sont les mêmes faibles concentrations fixées d’après les résultats de l’étude de la viabilité cellulaire au bleu de trypan.
68 Chapitre IV Discussion générale
La réponse proliférative des lymphocytes en réponse au venin a été utilisée comme un marqueur des fonctions de ces cellules immunitaires. La composition des venins de scorpion est variée et complexe, il s’agit des neurotoxines, des polypeptidiques qui présentent à leur surface des déterminants antigéniques différents. Ces neurotoxines sont immunogènes avec au moins quatre sites antigéniques. Le faible taux de prolifération des lymphocytes en réponse au venin d’ Aah , par rapport à celui obtenu avec l’agent mitogène (ConA), pourrait être attribué à la présence de toxines courtes actives sur les canaux Kv1.3, notamment la KTX qui, par l'inhibition de l’augmentation de Ca 2+ dans le cytosol ([Ca 2+ ] i) entraine l’inhibition de la production de l’IL-2 et de TNF et la diminution du taux de prolifération des cellules T (Beeton et al ., 2001). La présence de ces toxines serait donc à l’origine de la perturbation de l’activation des lymphocytes induite par les autres constituants du venin. Les canaux K + jouent un rôle essentiel dans le maintien du potentiel membranaire de nombreuses cellules, incluant les lymphocytes, cellules effectrices principales de la réponse immunitaire adaptative (Chandy et al ., 1984). Deux de ces canaux ioniques, les canaux K+ voltage dépendants et les canaux K + calcium dépendants, sont indispensables à l'activation des lymphocytes T et B, et particulièrement impliqués dans la réponse proliférative à un antigène ou à des mitogènes, dans la régulation du volume cellulaire et l'apoptose (De Coursey et al ., 1984; Matteson and Deutsch, 1984 ; Rader et al ., 1996 ; Koo et al ., 1997 ; Fanger et al ., 2001). Des études in vitro ont clairement démontré que les canaux de Kv1.3 sont essentiels pour la synthèse (activation génique) et la sécrétion de l’Il-2 suite à l’activation des cellules T par des toxines (Price et al ., 1989). L’activation des cellules T via le TCR permet le recrutement de molécules adaptatrices et le couplage à des enzymes, dont la phospholipase C γ, qui produit de l’inositol 1,4,5 tri- phosphate (IP3) et du diacylglycerol. L’IP3 en se fixant à ses récepteurs du réticulum endoplasmique libère les stocks de Ca 2+ dans le cytosol. L’entrée de Ca 2+ à partir du milieu extracellulaire reconstitue ces stocks et maintient une signalisation soutenue (Lewis, 2001) entraînant l'activation génique puis la sécrétion de l’Il-2 et son récepteur, la prolifération des lymphocytes et leur différenciation en cellules T effectrices (Matko, 2003). Outre les molécules « classiques » impliquées dans les voies de signalisation des lymphocytes T activés, les canaux Kv1.3 participent à la formation de la synapse immune et l'activation des lymphocytes T grâce à une répartition non aléatoire de ces canaux de Kv1.3, ainsi que leur colocalisation avec le complexe TCR–CD3 dans la membrane de cellules T (Panyi et al ., 2003, 2004).
69 Chapitre IV Discussion générale
La myéloperoxydase (MPO), une hémoprotéine fortement exprimée par les neutrophiles (environ 5% des protéines totales des neutrophiles) est également exprimée par les monocytes (environ 1 % des protéines totales) et les macrophages tissulaires (Lau et Baldus, 2006). Lors de l’activation des neutrophiles, la myéloperoxydase est libérée dans le phagosome et dans le milieu extracellulaire, où elle utilise le peroxyde d’hydrogène (H 2O2), pour catalyser la formation d’acide hypochloreux (HOCl), une espèce ayant un potentiel microbicide et cytotoxique beaucoup plus puissant que son précurseur (Harrison et Schultz, 1976 ; Witko-Sarsat et al ., 2000).
La libération de concentrations élevées de myéloperoxydase dans le milieu extracellulaire pourrait être expliquée par une activation excessive des neutrophiles et des monocytes par les constituants du venin d’ Aah , aboutissant à une dégranulation massive de ces cellules. Au cours d'une activation normale, l'activité de la MPO s'exerce dans les vacuoles intracellulaires et seules des quantités limitées de MPO sont libérées dans le milieu extracellulaire (estimées aux environs de 10 à 15%). Mais lorsque la réaction inflammatoire devient incontrôlée, la dégranulation massive et la mort des neutrophiles relâchent la MPO et les enzymes protéolytiques dans le milieu extracellulaire (Eiserich et al. , 1998).
Toute particule ingérée par les cellules phagocytaires est internalisée au sein d’une vacuole dérivée de la membrane plasmique, le phagosome, qui procède à l’acquisition de propriétés de dégradation par un processus de maturation, en se transformant en phagolysosome après fusion avec des granules ou des lysosomes des cellules phagocytaires. Le volume du système lysosomal des neutrophiles et des monocytes a été étudié par la méthode de rétention du rouge neutre, ce colorant vital, faiblement cationique, s’accumule intra-cellulairement dans les lysosomes, essentiellement des neutrophiles et des monocytes/macrophages. Sa rétention est en corrélation avec l’augmentation du volume lysosomal subséquente à l’activation de ces phagocytes (Antal et al ., 1995 ; Sipka et al ., 2000). En plus du volume lysosomal, ce colorant d’inclusion spécifique des lysosomes permet d’étudier l’intégrité de la membrane lysosomale assimilable à une estimation de la viabilité cellulaire. En effet, une diminution du volume du compartiment lysosomal détectée par une altération de l’absorption du rouge neutre reflète des dommages au niveau de la membrane lysosomale (Kull et Cuatrecasas, 1983 ; Harbell et al ., 1997 ; Repetto et al ., 2008). Comparativement avec les résultats du test de viabilité au bleu de trypan, les faibles concentrations de venin d’ Aah (2,5 ; 5 ; 12,5 et 25 µg/ml) n’entraine pas une diminution de la
70 Chapitre IV Discussion générale rétention du rouge neutre, indice de stabilité lysosomale et de viabilité cellulaire. De plus, l’augmentation du volume du système lysosomal indique une activation des polynucléaires neutrophiles, des monocytes et des lymphocytes par les constituants du venin. En effet, il a été montré que l'augmentation du nombre de vacuoles lors d’une stimulation antigénique par le LPS est probablement due à une mobilisation des lysosomes et une augmentation de l'exocytose de protéines inflammatoires, notamment des cytokines, qui pourraient être détectés dans les surnageants de culture (Nacife et al ., 2004). Le venin de scorpion d’ Aah comme le venin de Tityus serrulatus, stimule la production de cytokines pro-inflammatoires par les macrophages murins. Ces cytokines agissent comme de puissants modulateurs de la production de dérivés réactifs de l’oxygène (ROS) et de monoxyde d’azote (Petricevich, 2002; Petricevich et Lebrun, 2005; Petricevich et al ., 2007 ; Hammoudi-Triki et al ., 2010). La capacité de défense des polynucléaires neutrophiles et des monocytes-macrophages ne se limite pas à la phagocytose. En effet, en plus de la dégranulation, ces deux types de phagocytes partagent d’autres fonctions, en particulier l'activation métabolique oxydative. La première étape de ce processus implique une enzyme appelée la NADPH oxydase. Ce complexe enzymatique activé peut produire l'anion superoxyde à partir de l'oxygène. Le peroxyde d’hydrogène formé au cours de la dismutation de radicaux superoxydes se propage par diffusion dans les différents compartiments cellulaires et le milieu extracellulaire et peut réguler le fonctionnement cellulaire par des mécanismes paracrine et autocrine (Knaapen et al ., 2006; Nathan, 2006). Lors de la stimulation des neutrophiles avec le venin de scorpion, l’activation directe de la protéine kinase C est responsable de la production de ROS intracellulaire par la NADPH oxydase (Borge et al ., 2011). Les PKCs participent aussi bien à la transduction du signal d’activation qu’à la phosphorylation finale des facteurs cytosoliques aboutissant à l’activation du complexe NADPH oxydase (Karlsson et al ., 2000). Un autre mécanisme implique une augmentation de la concentration de Ca 2+ intracellulaire en induisant la formation de pores, ayant des propriétés de transport anionique sélectif aux ions calcium. En effet, certains venins de scorpion, comme Parabuthus et Opistophthalmus contiennent des toxines formant des pores entrainant un afflux de calcium (Moerman et al ., 2002). En plus de leur rôle dans la défense de l’hôte, les neutrophiles participent également à l’induction de dysfonctionnement d’organes au cours des processus inflammatoires aigus où leur capacité à libérer des ROS semble contribuer à des dommages cellulaires et tissulaires
71 Chapitre IV Discussion générale
(Abraham, 2003; Moraes et al ., 2006). Mitra et Abraham (2006) ont montré que l'augmentation des concentrations intracellulaires d’anions superoxydes induit la production de cytokines pro-inflammatoires par les neutrophiles après l’activation de la MAP kinase p38 et l’augmentation de la translocation nucléaire de NF-κB.
L’étude de l’effet de l’antivenin, sous forme de fragments F(ab)’ 2, indique que la neutralisation des constituants du venin, par la formation de complexes F(ab)’2-venin, semble inhiber la dégranulation des polynucléaires neutrophiles. Cet effet est partiel sur le métabolisme oxydatif des PNs et des PBMC. Ce résultat est probablement du à la capacité des fragments F(ab)’ 2 spécifiques au venin d’ Aah , complexés ou non à leur antigène, à activer le métabolisme oxydatif des PNs et des PBMC. La production de monoxyde d'azote (NO) est le reflet de l'induction de la NO synthase inductible (iNOS ou NOS2) en réponse aux cytokines inflammatoires comme l'IFN γ, l'IL-1, le TNF et le MIF ou en réponse aux endotoxines. Cette enzyme transforme la L-arginine en NO et citrulline. Le NO, gaz instable, est ensuite rapidement oxydé en nitrite (NO2 -) ou en nitrate (NO3 -). Les résultats obtenus corroborent avec des travaux antérieurs réalisés sur le venin Tityus serrulatus (Petricevich, 2002 ; Petricevich et Lebrun, 2004 ; Petricevich et al ., 2007). Cette augmentation de la production du monoxyde d’azote serait due à une activation de l’iNOS, exprimée au niveau des monocytes et des polynucléaires neutrophiles suite à leur activation par le venin d’ Aah . Le monoxyde d’azote régule plusieurs fonctions importantes des polynucléaires neutrophiles notamment la migration transendothéliale, le chimiotactisme, l’explosion oxydative et la dégranulation (Sethi et Dikshit, 2000).
Dans toutes les cellules vivantes, l'intégrité de la membrane plasmique est fondamentalement importante pour le maintien du milieu intracellulaire et le soutien des diverses fonctions de la cellule. La perturbation de la fonction de cette barrière est couramment utilisée comme un critère simple et fiable pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. La lactate déshydrogénase (LDH) est une enzyme cytosolique, sa libération dans le milieu de culture révèle une perte de l'intégrité membranaire des polynucléaires neutrophiles et des PBMC. L’augmentation du taux de cette enzyme cytosolique confirme les résultats du test de viabilité au bleu de trypan, montrant ainsi que le venin d’ Aah, pour des concentrations supérieures à 50 µg/ml présente une cytotoxicité dose dépendante vis-à-vis des polynucléaires neutrophiles et des PBMC en induisant des altérations au niveau de la membrane cellulaire.
72 Chapitre IV Discussion générale
Cette perte de l’intégrité membranaire serait probablement due à une apoptose ou une nécrose induite par les constituants du venin d’ Aah . La membrane plasmique devient perméable relativement tôt après le déclenchement du processus de la mort cellulaire (Chen et al, 2001; Liu et Schnellmann 2003) alors que la fuite de protéines cytoplasmiques, tels que la lactate déshydrogénase (LDH), indique la phase terminale de perméabilisation dans toutes les modalités de mort cellulaire avec un phénotype nécrotique (Nishimura et Lemasters, 2001). La cinétique de ce phénomène permet de distinguer les cellules apoptotiques des cellules nécrotiques. En effet, au stade d’apoptose précoce, la membrane cellulaire est encore intacte, permettant ainsi l’exclusion de colorants vitaux. La nécrose et l’apoptose tardive sont au contraire caractérisées par une perte de l’intégrité membranaire (Edinger et Thompson, 2004). Les mitochondries jouent un rôle central dans l’initiation de la mort cellulaire. En plus de leur implication dans la synthèse de l’Adénosine triphosphate (ATP), la modulation de l’état redox de la cellule, la régulation osmotique et l’homéostasie du calcium cytoplasmique ainsi que la signalisation cellulaire. Ces organites jouent un rôle crucial dans l’apoptose, car un dysfonctionnement ou une altération structurale des mitochondries peut conduire à une mort cellulaire (Green et Reed, 1998 ; Hughes et Mehmet, 2003). Le test au MTT qui dépend de la capacité des cellules à réduire le sel de tétrazolium (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) par les déshydrogénases mitochondriales a permis d’évaluer l'activité de ces réductases et donc le métabolisme cellulaire, marqueur de la fonction mitochondriale considérée comme une condition préalable à la viabilité cellulaire (Liu et al ., 2008). Le pouvoir cytotoxique du venin d’ Aah semble plus élevé avec le test MTT par rapport à la libération de la LDH et la pénétration du bleu de trypan. Ce résultat est probablement dû à des modifications précoces de l’activité enzymatique des mitochondries (activité métabolique) par rapport aux perturbations de la membrane cellulaire. Les résultats de l’effet cytotoxique induit par le venin d’ Aah sur les PNs corroborent avec des travaux réalisés avec le venin de scorpion Tityus zulianus. Une augmentation de la production du peroxyde d’hydrogène par les polynucléaires neutrophiles humains pourrait être responsable de la mort de ces cellules par nécrose en réponse à des concentrations supérieures à 5 µg/ml (Borges et al ., 2011).
73 Chapitre IV Discussion générale
La production du monoxyde d’azote in vitro par les PNs et les PBMC est corrélée avec la cytotoxicité induite par des concentrations supérieures à 50 µg/ml de venin d’ Aah . Ce métabolite serait probablement impliqué dans le mécanisme de cytotoxicité du venin d’ Aah .
L’augmentation de la production du monoxyde d’azote suite à la libération de cytokines inflammatoires peut induire une cytotoxicité par de multiples mécanismes. L’un des principaux mécanismes d'action cytotoxique de l'oxyde nitrique semble être l'inhibition du métabolisme énergétique par le biais des effets néfastes sur la respiration mitochondriale, la glycolyse et le cycle de Krebs (Battinelli et Loscalzo, 2000). En effet, les nitrites peuvent endommager les biomembranes et affecter le fonctionnement des mitochondries (Vieira et Kroemer, 2003 ; Finocchietto et al ., 2009). De plus, l’exposition prolongée d’une cellule cible à de fortes concentrations en NO peut conduire à l’inhibition de plusieurs enzymes de son cycle respiratoire tels que le cytochrome c oxydase des mitochondries pour les eucaryotes ou le cytochrome bd pour les procaryotes (Borisov et al ., 2006 ; Brunori et al ., 2006). Le monoxyde d’azote peut également stimuler la production mitochondriale de superoxyde, peroxyde d'hydrogène et peroxynitrite, qui ont tous un potentiel pro-apoptotique et de perméabilisation de la membrane mitochondriale (Yuyama et al ., 2003).
A de fortes concentrations, le peroxyde d’hydrogène est délétère pour la cellule, son accumulation entraine l’oxydation des macromolécules, la désorganisation de leurs structures chimiques et l’altération de leurs fonctions biologiques (Babior, 2000). Le H2O2, produit de dismutation de l’anion superoxyde, est capable d’activer la NADPH oxydase par activation du facteur de transcription NF-κB conduisant à une production excessive de ROS (Cai, 2005).
L’activation du NF-κB par le H 2O2 peut également augmenter l’expression de l’iNOS (MacMicking et al ., 1997 ; Nathan et Shiloh, 2000 ; Forman et Torres, 2002 ; Fang, 2004), et l’ augmentation de la production du monoxyde d’azote. La présence de NO et d'anion superoxyde, forment le peroxynitrite, un puissant agent oxydant responsable des dommages tissulaires et la nécrose des cellules hépatiques (Beckman et al ., 1990 ; Diehl, 2000 ; Kaplowitz, 2000 ; Liaudet et al ., 2009).
En plus de la production du peroxyde d’hydrogène et du monoxyde d’azote, le venin d’ Aah , à des concentrations supérieures à 50 µg/ml, est capable d’induire une perturbation du système antioxydant des PNs et des PBMC in vitro , se traduisant par une inactivation de la catalase. Cette inactivation pourrait être expliquée d’une part, par la saturation de cette
74 Chapitre IV Discussion générale enzyme en présence d’un excès de substrat (H 2O2) et d’autre part par une perte de la fonction catalytique de cette enzyme résultant de l’attaque radicalaire des protéines. Par ailleurs, le monoxyde d’azote peut inhiber la catalase en réagissant avec le fer (ferrique, Fe3+) de l’hème de cette enzyme. La catalase est responsable du métabolisme du peroxyde d’hydrogène. Son inhibition par le NO entraine une augmentation de la concentration intracellulaire du peroxyde d’hydrogène pouvant contribuer à la cytotoxicité (Brown, 1995 ; Brunelli et al ., 2000). L’ensemble de ces résultats indique que le venin d’Aah , comme pour les splénocytes de souris BALB/c et les cellules Vero, présente des effets cytotoxiques sur les polynucléaires neutrophiles et les PBMC humains avec des perturbations au niveau de la balance pro/antioxydante par une augmentation de production et une accumulation d’espèces réactives de l’oxygène, le peroxyde d’hydrogène et de l’azote, menant ainsi à l’installation d’un stress oxydant résultant de l’inhibition de quelques activités enzymatiques et d’une attaque radicalaire de l’ADN et sa fragmentation (Hammoudi-Triki et Laraba-Djebari, 2011). Le stress oxydatif est défini comme une oxydation intracellulaire excessive due à un déséquilibre entre la production d'espèces oxydantes ou formes réactives de l'oxygène (FRO) et celle des systèmes antioxydants. Les FRO sont responsables de la dénaturation et de dégradation de molécules biologiques et sont impliquées dans les lésions tissulaires observées au cours des processus inflammatoires. Elles sont produites au cours de divers processus biologiques par un grand nombre de cellules et en particulier par la NADPH oxydase des cellules phagocytaires. L’effet cytotoxique du venin d’ Aah sur les polynucléaires neutrophiles et les PBMC semble résulter d’une détérioration de l’intégrité membranaire, révélée par une perméabilité au bleu de trypan et confirmée par la libération de la lactate déshydrogénase dans le milieu extracellulaire. Cette cytotoxicité pourrait être due à une action directe des constituants du venin d’ Aah sur les PNs et les PBMC, ou à l’activation incontrôlée de ces leucocytes et la production de substances cytotoxiques (monoxyde d’azote et peroxyde d’hydrogène) qui peuvent mener à l’inhibition de quelques activités enzymatiques, comme les succinates déshydrogénases mitochondriales révélée par le test MTT et la diminution de l’activité de la catalase. Les résultats obtenus après le dosage du malondialdéhyde permettent de suggérer que la production intense d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote (peroxyde d’hydrogène et nitrites/nitrates) observée en présence du venin d’Aah est à l’origine d’une peroxydation des
75 Chapitre IV Discussion générale lipides membranaires pouvant affecter la perméabilité de la membrane plasmique des PNs et des PBMC. La peroxydation lipidique peut altérer les propriétés biologiques de la membrane cellulaire telles que la modification de sa fluidité, mais aussi l’inactivation de récepteurs ou d’enzymes. Les produits de peroxydation lipidique, en particulier les produits terminaux stables, tels que des aldéhydes α,β-insaturés (malondialdéhyde ou MDA, 4-hydroxynonénal ou HNE) ou les isoprostanes, constituent des produits stables comparativement aux espèces radicalaires, susceptibles de diffuser hors de la cellule et d’attaquer des cibles relativement éloignées de leur lieu de formation primaire; ils peuvent ainsi représenter des seconds messagers cytotoxiques (Dalle-Donne et al., 2006). La fragmentation de l’ADN observée in vitro , suite à l’activation des PNs et des PBMC avec le venin d’ Aah , indique que la peroxydation des lipides est impliquée dans la restauration d’un état pro-oxydant des PNs et des PBMC par l'inactivation des enzymes antioxydantes (catalase), ce qui conduit par conséquent à une diminution de la survie et des dommages oxydatifs au niveau de l'ADN. Dans les membranes biologiques, la peroxydation des acides gras insaturés résultant de l’attaque par des radicaux libres, génère des radicaux libres, des hydroperoxydes et des composés carbonyles, qui peuvent causer des dommages au niveau des protéines et de l’ADN (Cerutti, 1985 ; Park et al ., 2003). Dans une étude réalisée sur des lymphocytes humains, Gupta et ses collaborateurs (2010) rapportent que la bengaline, une toxine purifiée du venin de scorpion Heterometrus bengalensis Koch est douée d’un effet pro-apoptotique sur les deux lignées de cellules leucémiques U937 et K562. Pour les mêmes concentrations, la bengaline ne présente aucun effet cytotoxique sur les lymphocytes humains de sujets normaux. Cette différence de sensibilité peut être expliquée par le changement de l’expression des canaux ioniques au cours de la transformation maligne des cellules tumorales. L’utilisation du propofol confirme l’implication d’un stress oxydant, résultant de l’activation excessive des neutrophiles, dans la cytotoxicité du venin. En effet, de nombreuses études ont montré que le propofol peut : (1) inhiber l'adhésion des neutrophiles aux cellules endothéliales vasculaires (Takemoto, 2003); (2) piéger les radicaux libres de l’oxygène et empêcher les dommages oxydatifs (Tsao et al., 2003); (3) et inhiber la libération de facteurs inflammatoires tels que le TNF-α, l’IL-6 et l’IL-1β (Tsao et al., 2003 ; Chen et al., 2005 ; Hsing et al., 2011). Le propofol en piégeant les radicaux libres et peroxynitrite, confère
76 Chapitre IV Discussion générale
également une activité antioxydante pour diminuer la peroxydation lipidique induite par le stress oxydant. En plus, de cette inhibition partielle de l’effet cytotoxique du venin, le propofol révèle l’existence d’un autre mécanisme.
77
Conclusion
ChapitreV Conclusion et perspectives
Conclusion
L’étude entreprise dans ce travail a eu comme objectif d’étudier l’effet du venin d’ Androctonus australis hector sur la régulation des fonctions des polynucléaires neutrophiles et des cellules mononuclées du sang périphérique.
Dans une première étape, la mise en culture de ces deux types de leucocytes avec des concentrations croissantes de venin a montré une cytotoxicité dose et temps dépendants pour des concentrations supérieures à 50 µg/ml, des concentrations plus faibles de venin n’ont pas d’effet sur la viabilité cellulaire.
Dans une seconde étape, l’étude de l’effet de concentrations non cytotoxiques sur l’état d’activation des ces leucocytes a montré que le venin d’ Aah exerce un effet immunomodulateur. En effet, des concentrations faibles sont capables d’induire une prolifération des PBMC, une dégranulation des neutrophiles et des monocytes, une augmentation du volume du compartiment lysosomal, une production du monoxyde d’azote et l’activation du métabolisme oxydative (H 2O2).
L’effet cytotoxique du venin d’ Aah a été montré avec des concentrations supérieures à 50 µg/ml de venin. Une modification de l’activité métabolique mitochondriale et de l’intégrité membranaire a été observée. Une production de peroxyde d’hydrogène et de monoxyde d’azote par les PNs et les PBMC seraient probablement à l’origine, au moins en partie, de l’effet cytotoxique du venin d’ Aah , par la mise en place d’un stress oxydatif avec une altération du système anti-oxydant, révélée par une réduction de l’activité de la catalase. Une attaque des lipides membranaires par les espèces réactives de l’oxygène a été également mise en évidence par une augmentation dose dépendante du taux de malondialdéhyde, marqueur de la peroxydation lipidique.
L’ADN est également une cible majeure des espèces réactives de l’oxygène, des altérations structurales de l’ADN ont été mises en évidence par une augmentation dose dépendante du taux de fragmentation de l’ADN pour les deux types de leucocytes étudiés.
Les résultats de cette étude impliquent le stress oxydant dans l’origine de la cytotoxicité du venin d’ Aah sur les PNs et les PBMC et montrent l’apparition de dégâts oxydatifs suite à une production incontrôlée de radicaux libres, pouvant avoir un effet sur les protéines et leurs acides aminés, en altérant leurs fonctions biologiques, comme les succinates déshydrogénases
78 ChapitreV Conclusion et perspectives mitochondriales et la catalase ainsi que la formation de résidus de la peroxydation lipidique (MDA) et des dommages au niveau de l’ADN.
L’implication des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans la cytotoxicité du venin d’ Aah est confirmée par l’utilisation du propofol. Cette substance a inhibé partiellement la cytotoxicité du venin, ce qui suggère que les ROS seraient en partie impliqués dans le mécanisme de cytotoxicité du venin.
L’ensemble de ces résultats suggèrent que le venin d’ Aah agit sur les leucocytes de diverses façons, à des concentrations élevées, le venin exerce des effets cytotoxiques alors qu’à des concentrations plus faibles, il a un effet activateur. En effet, avec des concentrations élevées, le venin pourrait être à l’origine de dommages cellulaires par l’action d’espèces réactives de l’oxygène, peroxynitrites et autres produits sécrétés par les polynucléaires neutrophiles, les monocytes et les lymphocytes activés.
Les faibles doses de venins induisent la mise en place de l'activité phagocytaire et la production de divers médiateurs comme le peroxyde d’hydrogène et le monoxyde d’azote.
En perspective, il serait intéressant de réaliser une étude dans des conditions de sang total de sujets sains et envenimés et de confronter ces résultats avec ceux obtenus in vitro afin d’établir une corrélation entre le degré d’activation de ces leucocytes et la gravité de l’envenimation scorpionique. Une étude plus approfondie de l’état d’activation des polynucléaires neutrophiles et des PBMC par le dosage de médiateurs inflammatoires notamment des cytokines pro et anti-inflammatoires et des médiateurs lipidiques de l’inflammation serait importante.
Il serait également intéressant d’étudier l’effet du venin d’ Aah et de ses toxines purifiées sur d’autres fonctions notamment le chimiotactisme, l’apoptose des neutrophiles, ainsi que l’expression des phénotypes cellulaires en présence du venin.
D’autres études seront nécessaires pour élucider le mécanisme exact de cytotoxicité induite par le venin d’ Aah notamment l’implication d’autres marqueurs du stress oxydant.
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Bibliographie
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98 Annexes
Annexe 1 : Courbes étalon DO = f([H 2O2])
0,6 y = 0,001x + 0,008 R² = 0,998 0,5
0,4
0,3
DO à 620àDO nm 0,2
0,1
0 0 100 200 300 400 500 600
[H 2O2] (nM)
Annexe 2 : Courbes étalon DO = f([NaNO 2])
0,8 y = 0,006x + 0,054 0,7 R² = 0,999 0,6
0,5 0,4 0,3
540àDO nm 0,2 0,1 0 0 20 40 60 80 100 120
NaNO 2 (µM) dans du RPMI Résumé
Les envenimations scorpioniques sont associées à diverses manifestations physiopathologiques, qui résultent de l'induction d'une réponse immunitaire systémique caractérisée par l’activation et le recrutement des leucocytes dans le sang périphérique. L'immunothérapie est le seul traitement préconisé pour la prise en charges des victimes envenimées. Le but de la présente étude est d'évaluer les effets du venin d’ Androctonus australis hector (Aah) sur les polynucléaires neutrophiles (PNs) et les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) isolés à partir de sang veineux chez de volontaires sains. L’étude de l’effet du venin sur la viabilité cellulaire in vitro par le test d’exclusion au bleu de trypan révèle un effet cytotoxique dose dépendant pour des concentrations élevées de venin. La stimulation des PNs et des PBMC par des faibles concentrations de venin (inférieures à 50 µg/ml) a permis de révéler une activation de la prolifération des lymphocytes, une dégranulation par libération de la myéloperoxydase, une augmentation du volume lysosomal et une production du monoxyde d’azote et du peroxyde d’hydrogène résultant d’une activation du métabolisme oxydatif. La neutralisation des constituants du venin par des fragments F(ab)’2 a empêché la dégranulation des neutrophiles, alors qu’elle diminue la production du peroxyde d’hydrogène par les PNs et les PBMC. L’étude de l’effet cytotoxique a été abordé par une étude des intégrités mitochondriale et membranaire, respectivement par le test de viabilité cellulaire aux sels de tétrazolium (MTT) et par le dosage de la LDH libérée par les cellules. Une perte de l’intégrité mitochondriale et une augmentation dose-dépendantes de la lactate déshydrogénase (LDH) libérée dans le milieu extracellulaire ont été provoquées par des concentrations élevées de venin, supérieures à 50 µg/ml. Cet effet cytotoxique du venin d’ Androctonus australis hector est accompagné d’une augmentation dose dépendante des taux de production du monoxyde d’azote (NO) et de génération du malondialdéhyde avec inhibition de l’activité enzymatique de la catalase et une fragmentation de l’ADN des PNs et des PBMC. Par ailleurs, l’utilisation du propofol a permis de réduire significativement la cytotoxicité provoquée par le venin confirmant l’implication d’un stress oxydant dans le mécanisme de cytotoxicité. Cet état délétère résulterait probablement d’une activation excessive des PNs par les constituants du venin.
Mots clés : Venin, Androctonus australis hector , PN, PBMC, Cytotoxicité, Activation, MTT, Marqueurs de stress oxydant. Abstract
Scorpion envenomations are associated with complex pathophysiological manifestations, which result from the induction of a systemic immune response characterized by important leukocyte recruitment in peripheral blood. Immunotherapy is the only effective treatment for envenomation. However the efficiency of the guidelines of this treatment remains empirical. The aim of the present study is to evaluate the effects of Androctonus australis hector (Aah) venom on human polymorphonuclear neutrophils (PMNs) and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from venous blood of healthy volunteers. Trypan blue exclusion showed that viability of both human PMNs and PBMC was significantly reduced by Aah venom at concentrations higher than 50 µg/ml. Stimulation of PMNs and PBMC with low concentrations of Aah venom (less than 50 mcg / ml) revealed activation of PBMC proliferation, degranulation with release of myeloperoxidase, an increase in lysosomal volume and production nitric oxide and hydrogen peroxide resulting from activation of oxidative metabolism. The use of F(ab) '2 fragments for the neutralization venom components prevented neutrophils degranulation, while it decreases the production of hydrogen peroxide by PMNs and PBMC. The study of the cytotoxic effect reveals loss of mitochondrial integrity and a dose-dependent release of lactate dehydrogenase (LDH) into the extracellular medium caused by venom concentrations higher than 50 µg / ml. This cytotoxic effect of Androctonus australis hector venom is accompanied by a dose-dependent increase of the rate of production of nitric oxide (NO) and malondialdehyde (MDA) generation with inhibition of the enzymatic activity of catalase and DNA fragmentation in both PMNs and PBMC. In addition, the use of propofol significantly reduced the cytotoxicity induced by the venom confirming the involvement of oxidative stress in the mechanism of cytotoxicity. This oxidative stress would probably result from excessive activation of PMNs by venom components.
Keywords: Venom, Androctonus australis hector , neutrophils, PBMC, cytotoxicity, activation, MTT, NO, hydrogen peroxide, MDA, oxidative stress.
إن ا رب ن ة و ظ ر ا ا ت ا م ا ا ن. ھ ه ا ا ت ا ا ت ا م ا ء . ا ج ا ھ ا ج ا ا ل ت ا رب . ا ف ھ ه ا را ھ آ ر ا ب Androctonus australis hector ا م ا دة ا ى ( PNs ) و و ات ا ى ( PBMC ) ا و ا م ا ر ي ا ا ء . . أظ ت ا أن ا ب Androctonus australis hector ت ا اظ ه Bleu de trypan ات أ 50 و ام / . ا دة ا ى ( PNs ) و و ات ا ى ( PBMC ) ات ا ب ( أ 50 و ام / ) و ات ا ى ، ا دة و و ات ا ى دة رة ھ ه ا myéloperoxydase ا ا ر ، ز دة ا وزو وإ ج أ ا ( NO) وH2O2 ا ا ا ة . ا رب أظ ت أ أن ا م ا دة، myéloperoxydase ، F(ab') 2 ا ا ر ط ف ا دة ا ى أ إ ج H2O2 ا دة ا ى ( PNs ) و و ات ا ى (. (. PBMC ) درا ا م ان ا ر . ھ ا ا ه د la lactate déshydrogénase (LDH) ا ا ر ا ات أ 50 و ام / ل إ اث أ ار ء ا . . و ا ھ ا ا ا م ز دة أ ا ( NO ) و ا و ا ھ ( MDA ) ا ط ا ز و PMNs DNA و PBMCs . و إ ذ ، و إ ذ ، ن ا ام ا و ل ا ا ا ي ا ا ل رط ا د ا ي آ ا ا ، ھ ا ا د ا ر ا ا ط ا دة ا ى ط ف ت ا . .
ت ا : ، Androctonus australis hector ، دة ا ى ، و ات ا ى ا ، ا ي ، ا ، MTT ، NO ، و ا رو ، MDA ، ا د ا ي . .