BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------
NGUYỄN CẨM HÀ
NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƢỚNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ PHẨM VÀ DƢỢC PHẨM
LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC
Hà Nội - Năm 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------
NGUYỄN CẨM HÀ
NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƢỚNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ PHẨM VÀ DƢỢC PHẨM
Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9 42 01 16
LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. TS Đặng Diễm Hồng
Hà Nội – Năm 2020 i
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Đặng Diễm Hồng, nguyên Trưởng phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người thầy đã định hướng, truyền dạy những kiến thức khoa học và giúp đỡ tôi vượt qua những trở ngại và khó khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Lãnh đạo và bộ phận đào tạo của Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu. Trong quá trình viết luận án tôi đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của TS. Hoàng Thị Lan Anh. Ngoài ra tôi cũng nhận được sự giúp đỡ của các đồng nghiệp làm việc tại phòng Công nghệ Tảo: TS. Hoàng Thị Minh Hiền, TS. Ngô Thị Hoài Thu, TS. Lưu Thị Tâm, ThS. NCS. Lê Thị Thơm. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Nguyễn Hoàng Ngân- Học viện Quân Y, đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm, phân tích độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý của squalene. Luận án được thực hiện trong khuôn khổ các đề tài Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia - Nafosted, Bộ Khoa học và Công nghệ “Nghiên cứu đánh giá và khai thác chất squalene làm dược phẩm từ vi tảo biển của Việt Nam” (2013-2016) do PGS. TS. Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm, đề tài “Cơ chế điều hòa trao đổi lipid của các hợp chất từ thực vật biển Việt Nam trong phòng và điều trị bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu” (2014-2016) và đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi trồng lượng lớn sinh khối tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 và tách chiết qualene đủ tiêu chuẩn nguyên liệu làm thực phẩm chức năng” (2014-2016) do TS. Hoàng Thị Minh Hiền làm chủ nhiệm. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả
Nguyễn Cẩm Hà ii
Lời cam đoan
Tôi xin cam Ďoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần Ďã Ďược công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự Ďồng ý và cho phép của các Ďồng tác giả;
Phần còn lại chưa Ďược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2020 Tác giả
Nguyễn Cẩm Hà
iii
MỤC LỤC
Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn……………………………………………………………………... i Lời cam Ďoan…………………………………………………………………... ii Mục lục………………………………………………………………………… iii Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt………………………………………….. viii Danh mục các bảng……………………………………………………...... xi Danh mục các hình vẽ, Ďồ thị………………………………………………….. xii MỞ ĐẦU………………………………………………………………………. 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………….... 4 1.1. Giới thiệu chung về squalene………………………………….. 4 1.1.1. Tính chất hóa lý của squalene…………………………………... 4 1.1.2. Nguồn gốc và cấu trúc của squalene……………………………. 4 1.1.3 Các con Ďường sinh tổng hợp của squalene ở Ďộng vật, thực vật và vi sinh vật…………………………………………………….. 6 1.1.4 Ứng dụng của squalene…………………………………………. 11 1.1.5. Các nguồn cung cấp squalene…………………………………... 18 1.2. Công nghệ tách chiết và tinh sạch squalene……………..…… 21 1.2.1. Công nghệ tách chiết squalene…………………………………. 21 1.2.2. Các phương pháp Ďịnh lượng và tinh sạch squalene…………..... 27 1.3. Giới thiệu công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dƣỡng……… 29 1.4. Giới thiệu về chi vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium………. 33 1.4.1 Đặc Ďiểm chung của chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium…. 33 1.4.2. Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium cho sản xuất squalene…………………………………………… 37 1.4.2.1. Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium cho sản xuất squalene trên thế giới……………………………...... 37 1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng Schizochytrium cho sản xuất squalene ở Việt Nam………………………………………………...... 39 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………... 43 iv
2.1. Vật liệu…………………………………………………………. 43 2.1.1. Mẫu vật………………………………………………………….. 43 2.1.2. Các bộ kít sinh phẩm……………………………………………. 44 2.1.3. Động vật thí nghiệm…………………………………………….. 45 2.1.4. Các dòng tế bào…………………………………………………. 46 2.1.5. Hoá chất…………………………………………………………. 46 2.1.6. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm………………………………….. 46 2.1.7. Môi trường nuôi cấy…………………………………………….. 47 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu……………………………………… 48 2.2.1. Nhóm phương pháp xác Ďịnh chủng/loài; Ďặc Ďiểm sinh học; Ďiều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng cho sản xuất squalene cao ………………...... 48 2.2.1.1. Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào và sinh khối khô………………………………………………………………… 48 2.2.1.2. Phương pháp chụp ảnh hình thái………………………………...... 49 2.2.1.3. Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số trong sinh khối tảo……………………………………………………………………….. 49 2.2.1.4. Phương pháp nhuộm lipid bằng Nile Red………………………….. 49 2.2.1.5. Phương pháp xác định đường khử bằng DNSA…………………… 49 2.2.1.6. Phương pháp xác định sơ bộ hàm lượng squalene……………….. 50 2.2.1.7. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng thuộc chi Schizochytrium cho sản xuất squalene cao …………………………………………………………... 50 2.2.2. Nhóm phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch squalene từ S. mangrovei PQ6………………………………………. 53 2.2.2.1. Phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ sinh khối S. mangrovei PQ6……………………………………………………………………… 53 2.2.2.2. Phương pháp xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch squalene ở quy mô pilot từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6……………………………………………………………………… 55 2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của squalene...... 56 v
2.2.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc của squalene...... 57 2.2.3. Nhóm phương pháp xác Ďịnh các chỉ tiêu chất lượng của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6……………………….. 57 2.2.4. Nhóm phương pháp Ďánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên Ďộng vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro)…………………... 58 2.2.4.1 Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vivo……………………………………………………………………… 58 2.2.4.2. Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro………………………………………………….. 59 2.2.5. Thống kê phân tích số liệu……………………………………… 63 2.2.6. Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu…………… 63 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN….……………. 65 3.1. Sàng lọc chủng vi tảo biển dị dƣỡng có tiềm năng sản xuất squalene………………………………………………………… 65 3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 lên sinh trƣởng và hàm lƣợng squalene………………………….. 67 3.2.1. Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 cho sản xuất squalene ở cấp Ďộ bình tam giác………………………………… 67 3.2.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác……………………………………………….. 67 3.2.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác …………………………… 69 3.2.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác……………………… 70 3.2.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ tebinafine lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác …………………………… 72 3.2.1.5. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp vitamin lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác………….…………... 73 3.2.2 Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng chủng S. mangrovei PQ6 ở bình lên men 30 lít Ďể thu sinh khối tảo giàu squalene…………………... 75 vi
3.2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong hệ thống bình lên men 30 lít…………………………………………. 75 3.2.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong hệ thống lên men 30 lít…………………………………………………………... 77 3.2.2.3 Ảnh hưởng của lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6……... 79 3.2.2.4 Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6…………………………. 81 3.3. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene từ S. mangrovei PQ6…………………………………………………. 86 3.3.1. Tối ưu Ďiều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ S. mangrovei PQ6……………………………………………….. 86 3.3.1.1. Tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S. mangrovei PQ6……….... 86 3.3.1.2 Tách chiết lipid không xà phòng hóa từ lipid tổng số……………. 90 3.3.1.3. Tinh sạch và định lượng squalene bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp…………………………………………………………. 91 3.3.1.4. Tách chiết, tinh sạch và làm giàu squalene bằng phương pháp dung môi………………………………………………………………... 92 3.3.2. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene ở quy mô pilot từ S. mangrovei PQ6………………………………………. 94 3.3.2.1. Ảnh hưởng của các tác nhân lên hiệu quả tách chiết squalene từ sinh khối khô S. mangrovei PQ6……………………………………. 95 3.3.2.2. Tách chiết squalene từ dịch tế bào chủng S. mangrovei PQ6 sau quá trình nuôi cấy lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất ………… 97 3.3.2.3. Điều kiện tinh chế squalene bằng phương pháp sắc ký cột……... 98 3.3.2.4. Xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch nguyên liệu squalene từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6……………………………… 101 3.3.3. Tách chiết và tinh chế lượng lớn squalene từ S.mangrovei PQ6... 103 3.3.4. Phân tích các chỉ tiêu về cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6………………. 105 3.4. Tính an toàn và tác dụng dƣợc lý của squalene tách chiết từ vii
S. mangrovei PQ6 trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro)……………………………… 107 3.4.1. Độc tính cấp của squalene trên mô hình Ďộng vật thực nghiệm…………………………………………………………... 107 3.4.2. Độc tính bán trường diễn của squalene trên mô hình Ďộng vật thực nghiệm……………………………………………………... 108 3.4.2.1. Ảnh hưởng của squalene lên tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng của chuột cống trắng khi dùng dài ngày……………………. 108 3.4.2.2. Ảnh hưởng của squalene đối với một số chỉ tiêu huyết học và sinh hóa của chuột…………………………………………………….. 109 3.4.2.3. Đánh giá mức độ tổn thương chức năng gan, thận chuột khi dùng squalene dài ngày………………………………………………. 112 3.4.3. Tác dụng dược lý của squalene trên chuột nhắt trắng thí nghiệm…………………………………………………………... 114 3.5. Bƣớc đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro……………………………………………………………... 117 3.5.1. Đánh giá Ďộc tính của squalene trên các dòng tế bào…………… 117 3.5.2. Tác dụng giảm lipit của squalene lên tế bào gan và tế bào Ďại thụ thể…………………………………………………………… 118 3.5.2.1. Tối ưu hóa thời gian và nồng độ ủ squalene lên sự thay đổi hàm lượng lipid trong tế bào gan HepG2……………………………….. 118 3.5.2.2. Tác dụng của squalene lên sự thay đổi hàm lượng lipid nội bào trong tế bào gan HepG2 và RAW264.7…………………………….. 119 3.5.3. Cơ chế phân tử tác dụng giảm cholesterol của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6………………………………………. 121 3.5.4. Tác dụng giảm triglyceride của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6………………………………………………….. 125 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………... 127 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ……………………………… 129 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 131 PHỤ LỤC
viii
Q111`DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng Việt
ABCA1 ATP-binding cassette protein A1 Protein A1 liên kết với ATP
ABCG1 ATP-binding cassette protein G1 Protein G1 liên kết với ATP
ALT Alanine aminotransferase Alanine aminotransferase
ApoE Apolipoprotein E Apolipoprotein E
AST Aspartate aminotransferase Aspartate aminotransferase
ATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphate
CCT Chuột cống trắng Chuột cống trắng
CNT Chuột nhắt trắng Chuột nhắt trắng
CYP7A1 Cholesterol 7a- hydroxylase Cholesterol 7a- hydroxylase
DHA Docosahexaenoic acid Axít docosahexaenoic
DMAPP Dimethylallyl diphosphate Dimethylallyl diphosphate
DMEM Dulbecco's modified eagle Môi trường DMEM medium
DNA Deoxyribonucleic acid Axít deoxyribonucleic
DO Dissolved oxygen Oxy hòa tan
DXP 1- deoxy-D-xylulose-5-phosphate 1- deoxy-D-xylulose-5-phosphate
EN Ectoplasmic net Mang lưới ngoại chất
ER Endoplasmic reticulum Màng lưới nội chất
EPA Eicosapentaenoic acid Acid eicosapentaenoic
FAS Fatty acid synthase Fatty acid synthase ix
ESFA Este steryl fatty acid Acid béo este steryl
FBS Fetal bovine serum Huyết thanh phôi bò
FPP Farnesyl diphosphate Farnesyl diphosphate
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate GAPDH dehydrogenase
GC Gas chromatography Sắc ký khí
GPP Geranyl diphosphate Geranyl diphosphate
HDL-C high density lipoprotein- cholesterol gắn với lipooprotein tỷ cholesterol trọng cao
HMG-CoA 3-hydroxy-3 methylglutaryl-CoA 3-hydroxy-3 methylglutaryl-CoA
HMGR 3 - hydroxyl - 3 - methylglutaryl 3 - hydroxyl - 3 - methylglutaryl coenzyme A reductase coenzyme A reductase
HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng cao áp chromatography
IPP Isopentenyl diphosphate Isopentenyl diphosphate
KLCT Khối lượng cơ thể Khối lượng cơ thể
KXPH Không xà phòng hóa Không xà phòng hóa
LD50 Lethal dose 50% Liều gây chết 50% số Ďộng vật thực nghiệm
LDL-C Low density liporotein-cholesterol Cholesterol gắn với lipoprotein tỷ trọng thấp
LDL-R Low density lipoprotein - receptor Thụ thể lipoprotein có tỷ trọng thấp
LXR Liver X receptor Thụ thể gan X
MĐTB Mật Ďộ tế bào Mật Ďộ tế bào x
MEP Methylerythritol phosphate Methylerythritol phosphate
MJA Methyl jasmonate Methyl jasmonate
MVA Mevalonate Mevalonat
NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân
OA Oleic acid Acid oleic
ORO Oil Red O Oil red O
PA Palmitic acid Palmitic acid
PBS Phosphate buffered salina Muối Ďệm phosphate
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp
PUFA Polyunsaturated fatty acid Axít béo không bão hòa Ďa nối Ďôi
RNA Ribonucleic acid Acid ribonucleic
SCF Super critical fluid Chất lỏng siêu tới hạn
SKK Sinh khối khô Sinh khối khô
SKT Sinh khối tươi Sinh khối tươi
TB Tế bào Tế bào
TG Triglycerid Triglycerit
TBNF Terbinafine Terbinafine
TBS Tris-buffered saline Tris-buffered saline
TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng
VLDL-C Very low density-cholesterol Cholesterol gắn với lipoprotein tỷ trọng rất thấp
VTBDD Vi tảo biển dị dưỡng Vi tảo biển dị dưỡng
xi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các thông số lý hóa của squalene…………………………………..… 4 Bảng 1.2 Một số tiêu chuẩn của squalene thương mại…………………………. 17 Bảng 1.3. Tính chất vật lý của một số chất lỏng siêu tới hạn (SCF)……………. 23 Bảng 1.4. Các phương pháp tách chiết squalene từ nguồn tự nhiên…………….. 24 Bảng 1.5. Sự phân loại của lớp Labyrinthulea Ďược Ďiều chỉnh từ các nghiên của Anderson và Cavalier-Smith (2012), Gomaa và cộng sự (2013), Beakes và cộng sự, (2014)……………...... 35 Bảng 2.1. Danh sách các chủng thuộc chi Schizochytrium và Thraustochytrium.. 44 Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi Ďược sử dụng trong phản ứng qPCR………….. 45 Bảng 2.3. Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu………………… 63 Bảng 3.1. Sinh trưởng, hàm lượng lipid tổng số và squalene của các chủng thuộc chi Schizochytrium, Thraustochytrium Ďã phân lập…………..... 65
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên hàm lượng và sản lượng squalene trong quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất của tế bào S. mangrovei PQ6………………………………………………………... 84 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform lên hàm lượng và hiệu suất tách chiết lipid KXPH từ lipid tổng số của chủng PQ6…………………………………………………………….. 91 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform lên hiệu suất tách chiết lipid KXPH và hàm lượng squalene từ lipid tổng số của chủng PQ6……………………………………………………... 91 Bảng 3.5. Các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại của squalene tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6…………………………….. 106 Bảng 3.6. Độc tính cấp theo Ďường uống của squalene trên chuột nhắt trắng…... 107 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của squalene lên thể trọng chuột cống trắng……………... 109 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của squalene lên một số chỉ tiêu huyết học và sinh hóa trong máu chuột……………………………………………………….. 109 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của squalene lên nồng Ďộ HDL-C máu chuột……………. 112 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của squalene lên cân nặng cơ thể và gan chuột nghiên cứu 115 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của squalene lên các chỉ số lipid máu chuột……………... 116 xii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene và tiền chất của nó…………………… 5 Hình 1.2. Tổng hợp squalene thông qua con Ďường MVA ở Ďộng vật có vú (A). Tổng hợp squalene ở thực vật thông qua con Ďường MVA tại phần bào tan và MEP ở lạp thể (B)…………………………………………. 7 Hình 1.3 Sinh tổng hợp squalene thông qua con Ďường MEP ở vi khuẩn E. coli (A). Sinh tổng hợp squalene ở nấm men Sacchacromyces cerevisae (B)………………………………………………………………… 8 Hình 1.4. Mối quan hệ giữa sinh tổng hợp terpenoid và DHA ở Thraustochytrids………………………………………………………. 9 Hình 1.5. Các hệ thống bình lên men 5 lít, 10 lít, 30 lít và 150 lít cho nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng S. mangrovei PQ6…..………………………………. 41 Hình 2.1. Sơ Ďồ thí nghiệm nghiên cứu squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6……………………………………………………………………. 64 Hình 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt Ďộ lên sinh trưởng (A) và hàm lượng squalene (B) ở các ngày nuôi cấy khác nhau…………………………………… 68 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng Ďộ cao nấm men lên sinh trưởng (A) và hàm lượng squalene (B) ở các ngày nuôi cấy khác nhau ...... 69 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng Ďộ glucose lên sinh trưởng (A) và hàm lượng lipit (B) của S. mangrovei PQ6……………………………………….. 70 Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng Ďộ glucose lên hàm lượng squalene (A) và hiệu suất squalene (B) của S. mangrovei PQ6...... 71 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng Ďộ terbinafine lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối khô (B), hàm lượng lipid và squalene (C) của S. mangrovei PQ6...... 73 Hình 3.6. Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối khô (B), hàm lượng squalene (C) của S. mangrovei PQ6…………………. 74 Hình 3.7. Ảnh hưởng của các nồng Ďộ glucose khác nhau lên sinh trưởng (A-B) và hàm lượng squalene (C) của S. mangrovei PQ6...... 76 Hình 3.8. Hình thái của S. mangrovei PQ6 khi nuôi trồng ở các nồng Ďộ glucose ban Ďầu khác nhau dưới kính hiển vi quang học (Ďộ phóng Ďại x400). 77 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối xiii
khô (B), sản lượng squalene (C), Ďường dư (D) của tế bào S. mangrovei PQ6 ...... 78 Hình 3.10. Ảnh hình thái của S. mangrovei PQ6 dưới kính hiển vi quang học ở các thời Ďiểm khác nhau khi nuôi lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất trong bình 30 Lít...... 80 Hình 3.11. Mật Ďộ tế bào (A), sinh khối khô (B), sản lượng squalene (C) của S. mangrovei PQ6 và hàm lượng Ďường dư (D) trong nuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất...... 81
Hình 3.12. Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin B1, B6, B12 lên sinh khối (A), hàm lượng squalene (B) và lượng Ďường dư (C) trong môi trường khi nuôi cấy theo mẻ S. mangrovei PQ6...... 82 Hình 3.13. Hình thái tế bào chủng PQ6 ở các giai Ďoạn nuôi cấy của quá trình lên men fed-batch. A- Trước thời Ďiểm bổ sung glucose; B- Sau khi bổ sung glucose lên 22%...... 85 Hình 3.14. Ảnh hưởng của các yếu tố dung môi (A), nhiệt Ďộ (B), thời gian (C), số lần chiết (D) tỷ lệ sinh khối/dung môi (E), chế Ďộ khuấy trộn (G), nhiệt Ďộ sấy sinh khối (H), Ďộ ẩm sinh khối (I) lên hiệu suất tách chiết lipid ...... 87 Hình 3.15. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipid không xà phòng hóa (A) và sắc ký Ďồ squalene tinh sạch từ sinh khối chủng PQ6 (B) ...... 92 Hình 3.16. Hàm lượng squalene qua các bước làm giàu và tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6 ...... 92 Hình 3.17. Ảnh chạy sắc ký lớp mỏng (A) và sắc ký Ďồ của squalene tinh sạch sau quá trình làm giàu thông qua quy trình 6 bước (B) ...... 93 Hình 3.18. Phổ 1H (A) và 13C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S. mangrovei PQ6...... 94 Hình 3.19. Ảnh hưởng của dung môi lên hàm lượng squalene tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6. (A) Ảnh chạy TLC mẫu squalene thô Ďược tách chiết từ sinh khối tảo với các loại dung môi khác nhau ...... 95 Hình 3.20. Ảnh hưởng của Ďộ ẩm sinh khối tảo lên hàm lượng squalene tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6. (A) Ảnh chạy TLC mẫu squalene trong mẫu squalene thô Ďược tách chiết từ sinh khối tảo có xiv
Ďộ ẩm khác nhau. (B) Hàm lượng squalene thô thu Ďược sau quá trình chiết từ sinh khối có Ďộ ẩm 20 và 100%. (C) Hàm lượng squalene có mặt trong squalene thô thu Ďược sau quá trình chiết từ sinh khối có Ďộ ẩm 20 và 100%...... 96 Hình 3.21. Ảnh hình thái tế bào S. mangrovei PQ6 sau 0 h (A), 2 h (B), 4 h (C) và 6 h (D) có bổ sung KOH 45% và duy trì pH=10...... 97 Hình 3.22. Hàm lượng squalene thô (A) và squalene có mặt trong squalene thô (B) tách chiết từ sinh khối khô và dịch lên men tế bào S. mangrovei PQ6...... 98 Hình 3.23. Sắc ký lớp mỏng xác Ďịnh squalene từ mẫu chuẩn và mẫu squalene thô của chủng PQ6 với các hệ dung môi chạy khác nhau...... 99 Hình 3.24. Sắc ký lớp mỏng TLC (A) và kết quả phân tích HPLC (B) xác Ďịnh sự có mặt của squalene trong các phân Ďoạn thu Ďược sau khi tách và tinh sạch squalene thô qua cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là n- hexan/chloroform (9:1; v/v)...... 100 Hình 3.25. Sắc ký lớp mỏng TLC (A) và kết quả phân tích HPLC (B) xác Ďịnh sự có mặt của squalene trong các phân Ďoạn thu Ďược sau khi tách và tinh sạch squalene thô qua cột silica gel với dung môi rửa giải là n- hexane...... 100 Hình 3.26. Quy trình tách chiết squalene từ S. mangrovei PQ6………………….. 102 Hình 3.27. Ảnh minh họa sản phẩm squalene thô (A), squalene tinh sạch và hỗn hợp acid béo (B) tách từ dịch lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất từ sinh khối tảo chủng PQ6……………………………………………… 103 Hình 3.28. Sắc ký Ďồ HPLC của squalene chuẩn (A) và squalene tinh sạch từ sinh khối S. mangrovei PQ6 (B)……………………………………… 104 Hình 3.29. Phổ 1H (A) và 13C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S. mangrovei PQ6………………………………………………………………. 104 Hình 3.30. Hình ảnh Ďại thể và mô bệnh học vi thể - tương ứng (HE, x 400) của gan, thận, lách chuột tương ứng sau 60 ngày uống thuốc lô Ďối chứng (a, d, g, k), lô thí nghiệm 1 (b, e, h, l) và lô thí nghiệm 2 (c, f, i, m)…. 114 Hình 3.31. Tỷ lệ sống sót của tế bào HepG2 và RAW246.7 Ďược ủ với squalene ở các nồng Ďộ khác nhau……………………………………………… 117 xv
Hình 3.32. Ảnh hưởng của thời gian ủ squalene sau 24 h (A), 48 h (B) và 72 h (C) lên khả năng tích lũy lipid trong tế bào gan HepG2 Ďược gây rối loạn chuyển hóa lipid…………………………………………………. 118 Hình 3.33. Ảnh hưởng của squalene tách chiết từ S. mangrvei PQ6 lên sự tích lũy hàm lượng cholesterol (A); triglycerid (B) và nhuộm lipid bằng Oil Red O (C) trong tế bào HepG2…………………………………… 120 Hình 3.34. Ảnh hưởng của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 lên hàm lượng cholesterol (A); triglycerid (B) và nhuộm Oil Red O (C) trong tế bào Ďại thực bào RAW264.7……………………………………….. 120 Hình 3.35. Ảnh hưởng của squalene lên mức Ďộ biểu hiện mRNA của các gen tham gia vào các quá trình trao Ďổi cholesterol trong tế bào HepG2 ..... 121 Hình 3.36. Ảnh hưởng của squalene lên mức Ďộ biểu hiện gen của LXR α (A) và LXR β (B) trong tế bào Ďại thực bào RAW264.7…………………….. 122 Hình 3.37. Squalene Ďiều hòa quá trình vận chuyển ngược cholesterol và mức Ďộ biểu hiện các gen Ďích của LXRs trong tế bào Ďại thực bào RAW264.7……………………………………………………………. 124 Hình 3.38. Ảnh hưởng của squalene trong quá trình sinh tổng hợp triglyceride trong tế bào HepG2 ...... 125 Hình 3.39. Sơ Ďồ tóm tắt bước Ďầu nghiên cứu cơ chế phân tử tác dụng giảm cholesterol và tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6………………………………………………………... 126
1
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Việt Nam có trên 3.200 km bờ biển với một nguồn sinh vật biển nhiệt Ďới rất Ďa dạng, phong phú về thành phần loài và giàu các hợp chất tự nhiên có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y dược.... Trong Ďó vi tảo với ưu Ďiểm chính là giàu dinh dưỡng, có kích thước tế bào nhỏ (< 10 µm) phù hợp với miệng của các ấu trùng thủy hải sản, dễ tiêu hóa, không Ďộc, có tốc Ďộ sinh trưởng cao và sức chống chịu cao với những Ďiều kiện khắc nghiệt của môi trường, Ďược coi là mắt xích Ďầu tiên, nguồn sinh khối sơ cấp quan trọng trong chuỗi thức ăn biển. Ngoài ra, sinh khối vi tảo cũng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng cho người và Ďộng vật nuôi như: các loại sắc tố, vitamin, khoáng chất, protein, các acid béo không bão hòa Ďa nối Ďôi (polyunsaturated fatty acid - PUFA)....Ďặc biệt là squalene. Squalene là một tripterpene tự nhiên, là tiền chất steroid của Ďộng, thực vật thường Ďược sử dụng trong các sản phẩm dinh dưỡng, chăm sóc sức khỏe, mỹ phẩm và y học. Squalene Ďược ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm, có tác dụng chống khô da và làm mềm da, có vai trò bảo vệ da khỏi các tác hại do ánh sáng, tia UV gây ra. Các nghiên cứu dịch tễ học Ďã cho thấy squalene ức chế hiệu quả các tác nhân hóa học có khả năng gây ung thư ruột kết, phổi, da ở Ďộng vật thực nghiệm. Squalene cần thiết cho cơ thể do nó là một chất chống oxy hoá tự nhiên có vai trò bảo vệ các tế bào khỏi các gốc tự do và oxy phân tử có hoạt tính cao, có khả năng tăng cường hoạt Ďộng của hệ miễn dịch. Việc cung cấp thực phẩm chức năng có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày) Ďã Ďược chứng minh là cần thiết cho sức khỏe dinh dưỡng của con người, làm giảm Ďáng kể bệnh tim mạch và ung thư vì vậy, chúng cũng Ďược dùng phổ biến trong dược phẩm. Cho Ďến nay, các nguồn sản xuất squalene Ďược biết Ďến nhiều nhất là các loại dầu Ďộng, thực vật. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức làm ảnh hưởng Ďến sự bảo tồn nguồn lợi cá biển trong tự nhiên, cũng như sự phụ thuộc vào thổ nhưỡng, mùa vụ của các loại cây trồng có dầu dẫn Ďến nguồn khai thác squalene Ďang dần cạn kiệt. Trong khi Ďó, hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, nhu cầu về squalene làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm Ďang ngày càng tăng. Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới thay thế nguồn truyền thống Ďể tách chiết squalene là rất cần thiết và Ďang Ďược các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trong Ďó, vi sinh vật nói chung và vi tảo biển nói riêng là một nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene trên quy mô 2 lớn. Gần Ďây một số các loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) như thraustochytrids Ďược xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản xuất các chất có giá trị cao trong Ďó có squalene. Tuy nhiên việc nghiên cứu squalene ở Việt Nam mới Ďược bắt Ďầu từ 2012, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng ở việc cung cấp cơ sở khoa học ban Ďầu về hàm lượng squalene từ một số chủng vi tảo, chưa có Ďược các phương pháp tối ưu cho tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene; chưa có Ďược Ďiều kiện nuôi trồng tối ưu vi tảo tiềm năng có sức sản xuất sinh khối có hàm lượng squalene cao; chưa có Ďược quy trình công nghệ tạo chế phẩm squalene có hoạt tính sinh học bảo Ďảm an toàn cho sử dụng theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm ở Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện Ďề tài “Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hƣớng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dƣợc phẩm”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Sàng lọc và xác Ďịnh Ďược Ďiều kiện nuôi trồng thích hợp của chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 của Việt Nam, tiềm năng lựa chọn Ďược cho sản xuất squalene. - Xác Ďịnh Ďiều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ sinh khối chủng S. mangrovei PQ6 lựa chọn Ďược; Ďánh giá Ďộ an toàn và tác dụng sinh học, dược lý của squalene tách chiết Ďược theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án - Sàng lọc Ďược chủng/loài vi tảo biển của Việt Nam tiềm năng cho sản xuất squalene từ một số chủng vi tảo biển Việt Nam - Tối ưu Ďiều kiện nuôi cấy Ďể thu Ďược sinh khối tảo có hàm lượng squalene cao ở chủng tiềm năng lựa chọn Ďược ở quy mô bình tam giác; bình lên men 30 Lít. - Tối ưu Ďiều kiện tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene từ sinh khối chủng vi tảo biển lựa chọn Ďược; xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene; xác Ďịnh Ďộ sạch và cấu trúc của squalene tách chiết Ďược. - Đánh giá tính an toàn của squalene bao gồm Ďộc tính cấp và bán trường diễn, tác dụng sinh dược trên mô hình in vivo (mô hình Ďộng vật thực nghiệm). - Bước Ďầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm cholesterol của squalene trên mô hình in vitro (mô hình tế bào). 4. Những đóng góp mới của luận án - Luận án là công trình Ďầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách bài bản, có hệ thống về: sàng lọc; nuôi trồng chủng tiềm năng Schizochytrium mangrovei PQ6 3 có hàm lượng squalene cao (sản lượng squalene Ďạt Ďược sau quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất là 6,9 g/L); lựa chọn Ďược Ďiều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ chủng PQ6 có Ďộ tinh sạch Ďạt 90- 95%; squalene tách chiết Ďược là an toàn, có tác dụng làm giảm cholesterol tổng số và làm tăng hàm lượng lipoptrotein có tỷ trọng cao gắn với cholesterol ở mô hình Ďộng vật thực nghiệm, Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm. - Lần Ďầu tiên ở Việt Nam Ďã chứng minh Ďược squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 có tác dụng giảm cholesterol do tăng Ďiều hòa biểu hiện của các gen tham gia vào quá trình hấp thu, vận chuyển, lưu thông cholesterol từ các mô ngoại biên Ďến tế bào gan; bước Ďầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm triglyceride của squalene. 5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án - Có Ďược những dẫn liệu khoa học về Ďiều kiện nuôi trồng thích hợp của chủng S. mangrovei PQ6 phân lập Ďược từ huyện Ďảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang vào năm 2006-2008 (lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất glucose 22% vào môi trường nuôi tại 36 h; bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin (vitamin B1- 45g/L; vitamin B6
- 45 g/L; và vitamin B12- 0,25g/L)) cho sinh trưởng Ďạt sinh khối khô (75,41±1,35) g/L, hàm lượng squalene Ďạt (91,53±2,45) mg/g sinh khối khô, sản lượng squalene Ďạt 6,9 g/L. - Có Ďược quy trình tách chiết lượng lớn squalene từ chủng S. mangrovei PQ6 có Ďộ tinh sạch cao 90- 95%, an toàn và Ďạt tiêu chuẩn Ďảm bảo chất lượng Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm. - Góp phần làm sáng tỏ squalene tách chiết từ chủng PQ6 có tác dụng giảm cholesterol và tryglycerol nội bào, tăng hàm lượng cholesterol gắn với lipoprotein có tỷ trọng cao, HDL-C và tỷ lệ HDL-C/cholesterol toàn phần trong máu; giảm cholesterol gắn với LDL-C và VLDL-C trong máu mà không gây ảnh hưởng Ďến sự phát triển cân nặng cơ thể và gan, cholesterol toàn phần và tryglyceride ở mô hình tế bào và Ďộng vật thực nghiệm; bước Ďầu Ďã cung cấp cơ sở khoa học cho việc Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm có. 6. Bố cục của luận án Luận án gồm 148 trang, trong Ďó phần mở Ďầu 3 trang; Tổng quan tài liệu 39 trang; Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 22 trang; Kết quả và thảo luận 62 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang; Danh mục các công trình Ďã công bố 2 trang; Tài liệu tham khảo 18 trang gồm 179 tài liệu. Trong luận án có 19 bảng, 45 hình và 28 trang phụ lục.
4
CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về squalene 1.1.1. Tính chất hóa lý của squalene Squalene có cấu tạo (2,6,10,15,19,23-hexanmethyltetracosa-2,6,10,14,18,22- hexane) - là một chất trao Ďổi trung gian quan trọng trong sinh tổng hợp sterol và triterpenes ở Ďộng vật và thực vật. Squalene là một chất lỏng dạng dầu, trong suốt với trọng lượng phân tử là 410,7 g/mol, tỷ trọng 0,858 g /mL, nhiệt Ďộ nóng chảy 20°C, hợp chất này có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ nhưng không hòa tan trong nước [1, 2]. Bảng 1.1 Ďưa ra một số tính chất của squalene như Ďộ nhớt, tỷ trọng, Ďộ hòa tan và những thông số này khẳng Ďịnh bản chất kị nước mạnh mẽ của phân tử này. Bảng 1.1. Các thông số lý hóa của squalene [3] Tính chất Giá trị Trọng lượng phân tử 410,7 g/mol Điểm nóng chảy -75oC Chi số khúc xạ 1,499 Độ nhớt ở 25oC 12 cP Tỷ trọng 0,858 g/mL Điểm sôi ở 25oC 285oC Điểm chớp cháy 110oC Chỉ số Iod 381 g/100g Các Ďỉnh hồng ngoại 2728, 1668, 1446, 1380, 1150, 1180, 964, 835 cm-1 Sức căng bề mặt ~ 32 mN/m Khả năng hòa tan của squalene trong nước 0,124 mg/L 1.1.2. Nguồn gốc và cấu trúc của squalene Squalene Ďược phát hiện vào năm 1096 bởi nhà nghiên cứu người Nhật, TS. Mitsumaru Tsujimoto, một chuyên gia về dầu và chất béo tại trạm kiểm Ďịnh Công nghiệp Tokyo. Ông Ďã phân tách phần không xà phòng hóa từ dầu gan cá mập “kuroko - zame” và khám phá ra sự tồn tại một lượng lớn hydrocacbon không bão hòa. Tại thời Ďiểm Ďó, TS. Mitsumaru Tsujimoto không phân tách Ďược hợp chất này. Tuy nhiên, ông Ďã thu Ďược thành phần bromine dưới dạng bột màu trắng, phân hủy ở 155oC, trong Ďó chứa 26,93% C, 3,94% H và 69,28% Br. Ông Ďưa ra 5 công thức cho hợp chất này là C10H18Br4. Mười năm sau, TS. Tsujimoto M. Ďã thành công trong việc chưng cất chân không một phân Ďoạn của dầu từ gan của hai con cá mập biển sâu, một hydrocacbon không bão hòa với công thức C30H50, Ông gọi nó là “squalene”, từ gốc Latin là “Squalus” (cá mập) [4, 5]. Năm 1934, Robinson Ďã công bố cấu trúc vòng của squalene với phân tử steroit. Năm 1936, cấu trúc sinh học của squalene Ďược mô tả lần Ďầu tiên bởi nhà nghiên cứu Paul Karrer - người cũng Ďã khám phá ra cấu trúc hóa học của vitamin A và E [6]. Theo công bố của Kohno và cộng sự (1995) thì squalene là một hydrocarbon hợp chất béo không bão hòa (C30H50), với 6 liên kết Ďôi, chứa 6 Ďơn vị isoprene Ďể cung cấp bộ khung cho tổng hợp cholesterol, acid mật và steroit. Do cấu trúc của liên kết Ďôi trong sáu nhóm CH3, các isoprenoid có tác dụng chống oxy hóa tự nhiên một cách mạnh mẽ [7].
E
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene và tiền chất của nó [8] A - Cấu trúc hóa học của isoprene. Các cấ u trúc khác nhau của squalene: B - Dạng kéo dài, C - Dạng cuộn, D - Dạng giống như sterol E - Cấu trúc hóa học của squalene
Do cấu trúc hóa học của squalene, Ďặc biệt là mức Ďộ không bão hòa cao nên squalene không có tính ổn Ďịnh cao mà lại rất dễ bị oxy hóa. Hình 1.1 Ďã cho thấy các liên kết Ďôi Ďã cho phép hình thành nên cấu trúc squalene ở dạng giống sterol, dạng kéo dài hoặc cuộn. Thật thú vị khi cấu trúc squalene cũng có thể Ďược tổ chức ở cả dạng giống với sterol. Hauss và cs (2002) Ďã chỉ ra squalane - một dạng hydro 6 hóa của squalene, Ďược gắn theo chiều ngang trong màng kép phospholipid. Các tác giả nêu trên Ďã chỉ ra rằng cấu trúc liên kết như vậy có thể giúp bảo vệ việc chống lại sự mất proton và ảnh hưởng tới protein màng [9]. Lohner và cs (1993) cũng Ďã chứng minh squalene ở nồng Ďộ 6 % Ďã làm thay Ďổi cấu trúc lục giác bằng cách tăng kích thước của các ống lục giác ngược. Trong trường hợp này cấu trúc squalene Ďược cuộn lại và tích lũy trong lớp màng lipid kép (là màng hay một vùng của màng chứa các phân tử lipid) [10]. Các thí nghiệm này cho thấy squalene trong màng lưới nội chất có thể thích ứng với một dạng cấu trúc gần giống với ergosterol trong khi cấu trúc cuộn trong màng huyết tương có thể chiếm ưu thế. 1.1.3. Các con đường sinh tổng hợp của squalene ở động vật, thực vật và vi sinh vật Squalene là một hợp chất trung gian trong tổng hợp các hopanoid, phytosterol và hơn 200 triterpenes quan trọng cho màng tế bào [11]. Squalene Ďược tổng hợp từ các Ďơn vị isopentenyl, iso pentenyl di-phosphate (IPP) thông qua con Ďường mevalonate (MVA) và dimethyl-allyl-diphosphate (DMAPP) thông qua con Ďường methylerytritol phosphate (MEP) [12, 8]. Sự tổng hợp squalene thông qua con Ďường MVA bắt Ďầu với sự kết hợp của một acetyl-CoA với một acetyl-CoA khác bởi acetoacetyl-CoA synthase. Enzyme này Ďược gọi là transferyl acetyl-CoA hoạt Ďộng từ sự hình thành của acetoacetyl-CoA. Chuỗi phản ứng từ acetoacetyl CoA Ďến mevalonate tiếp tục tạo thành 3-hydroxy-3 methylglutaryl-CoA (HMG- CoA) với sự có mặt của adenosine triphosphate (ATP) Ďể tạo thành mevalonate 5- phosphate [13]. Sau Ďó, tiếp tục phosphoryl hóa bởi phosphomevalonate kinase với sự hiện diện của ATP Ďể tạo thành mevalonate 5-diphosphate. Tiếp theo, decacboxyl hóa bằng decarboxylase 5-diphosphate mevalonate Ďể tạo thành IPP, từ Ďây nó là chất cơ bản Ďể xây dựng các hợp chất polyprenyl. DMAPP sau Ďó Ďược tạo thành bằng cách Ďồng phân hóa IPP thông qua isopentanyl diphosphate isomerase. Phản ứng ngưng tụ của IPP với DMAPP khi có mặt của farnesyl diphosphate synthase Ďã tạo thành geranyl diphosphate (GPP) và sau Ďó có quá trình ngưng tụ tiếp tục với một IPP khác Ďể tạo thành farnesyl diphosphate (FPP). Cuối cùng, squalene synthase Ďược xác Ďịnh là enzyme xúc tác cho sự hình thành gián tiếp NADPH của squalene với FPP là cơ chất [14, 15, 11]. Sinh tổng hợp squalene thông qua con Ďường MEP do sự kết hợp của hai phân tử FPP. Quá trình sinh tổng hợp ở các vi sinh vật này bắt Ďầu bằng sự hình thành 1- deoxy-D-xylulose-5- 7
phosphate (DXP) trong Ďó DXP-synthase và các enzyme khác tham gia Ďể hình thành IPP và DMAPP. Các bước còn lại từ IPP Ďến FPP giống hệt với con Ďường MVA. Con đường sinh tổng hợp squalene ở động vật có vú [8] Ở các tế bào Ďộng vật, sự tổng hợp cholesterol (Hình 1.2A) xảy ra thông qua con Ďường MVA/isoprenoid. Con Ďường này bắt Ďầu với acetyl-CoA, Ďược chuyển thành HMG-CoA và sau Ďó Ďược khử bằng 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMGR) thành MVA. Sự Ďiều hòa Ďược duy trì bằng cách kích hoạt hoặc làm giảm HMGR. HMGR là một loại protein không thể tách rời của mạng lưới nội chất chứa vùng cảm ứng sterol xuyên màng, Ďóng vai trò quan trọng trong sự thoái hóa của enzyme bởi proteasome. Các nghiên cứu gần Ďây cho thấy có sự kích thích trực tiếp và gián tiếp của sự thoái hóa bởi cholesterol, lanosterol và oxapseol.
A B
Hình 1.2. Tổng hợp squalene thông qua con Ďường MVA ở Ďộng vật có vú (A) [8]. AACT - acetoacetyl-CoA thiolase; FPS - FPP synthase; HMGS - HMG-CoA synthase; HMGR - HMG-CoA reductase; IDI - isopentenyl diphosphate isomerase; SQS - squalene synthase; SQE - squalene epoxidase. Tổng hợp squalene ở thực vật thông qua con Ďường MVA ở phần bào tan (cytosol) và MEP ở lạp thể (plastid) (B). AACT-acetoacetyl-CoA thiolase; DMAPP - dimethylallyl diphosphate; DXP - 1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate; DXR - DXP reductoisomerase; DXS - DXP synthase; FPP - farnesyl diphosphate; FPS - FPP synthase; G-3-P - glycerol-3- phosphate; GPP - geranyl diphosphate; GGPP - geranylgeranyl diphosphate; HMBPP - (E)-4- hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate; HMG-CoA - 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA; HMGS - HMG-CoA synthase; HMGR-HMG-CoA reductase; IDI - isopentenyl diphosphateisomerase;IPP- isopentenyldiphosphate; MEP - 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate; MVA - mevalonate; SQS- squalene synthase; ER - endoplasmic reticulum.
8
Con đường sinh tổng hợp squalene ở thực vật [8] Ở thực vật, con Ďường sinh tổng hợp của sterol hơi khác so với tế bào Ďộng vật và nấm. Phản ứng sinh tổng hợp từ squalene Ďến phytosterol dẫn Ďến sự hình thành các sterol khác nhau, chẳng hạn như sitosterol, stigmasterol, campesterol và isofucosterol. Trong thực vật, squalene bị oxy hóa thành 2,3-oxidosqualene và sau Ďó Ďược chuyển Ďổi thành cycloartenol (9b, 19-cyclo-24-lanosten-3b-ol) thay vì lanosterol Ďược biết ở Ďộng vật và nấm. Isoprenoid của thực vật có thể Ďược tổng hợp thông qua con Ďường MVA trong phần bào tan (cytosol) dẫn Ďến sự hình thành của sterol và brassinosteroids hoặc trong ty thể - nơi chuỗi ubiquinone Ďược hình thành [16]. Ngoài ra, con Ďường MEP, trước Ďây Ďược gọi là con Ďường không mevalonate hoặc DXP, Ďược xảy ra ở lạp thể (plastid) dẫn Ďến sự tổng hợp carotenoids, chuỗi bên của chlorophyll, plastoquinone và phytohormone dạng isoprenoid (Hình 1.2B). Con đường sinh tổng hợp squalene ở vi sinh vật [8] Sự tổng hợp squalene ở vi sinh vật khác nhau là khác nhau và tùy theo loài. Các vi sinh vật nhân sơ (như E. coli) hay sinh vật nhân chuẩn (như Saccharomyces cerevisea, Torulaspora delbrueckii và Chlamydomonas reinhardtii) sản xuất squalene thông qua con Ďường MEP bởi sự kết hợp của hai phân tử FPP. Quá trình sinh tổng hợp ở các vi sinh vật này bắt Ďầu bằng sự hình thành 1- deoxy-D- xylulose-5-phosphate (DXP) trong Ďó DXP-synthase và các enzyme khác tham gia Ďể hình thành IPP và DMAPP. Các bước còn lại từ IPP Ďến FPP giống hệt với con Ďường MVA. Không giống như con Ďường MVA, con Ďường MEP thường là không tạo ra squalene, nhưng với những tiến bộ Ďạt Ďược về kỹ thuật trao Ďổi chất và sinh tổng hợp Ďã cho phép tạo ra một gen mã hóa cho squalene synthase dị hợp có thể mở rộng con Ďường MEP Ďể tạo ra squalene. Như vậy, con Ďường MEP xảy ra chủ yếu ở vi khuẩn có nhân thật (eubacteria) và vi khuẩn lam (cyanobacteria), trong khi MVA Ďược tìm thấy trong vi khuẩn cổ (archaea) và một số ít eubacteria. Nhiều nghiên cứu Ďã xác Ďịnh vai trò của sterol trong các tế bào nhân chuẩn Ďã Ďược thực hiện với nấm men như một hệ thống mô hình nhân chuẩn. Ảnh hưởng của sterol Ďến Ďộ bền màng, tính thấm của màng, sử dụng nguồn năng lượng và hoạt Ďộng của ATPase gắn màng Ďã Ďược nghiên cứu bằng cách sử dụng các nấm men Ďột biến có khiếm khuyết ở con Ďường 9
sinh tổng hợp ergosterol. Giống như trong các tế bào nhân chuẩn khác, sự hình thành các sterol trong nấm men có thể Ďược chia thành hai phần. Phần Ďầu tiên có tên là mevalonate hoặc con Ďường isoprenoid bắt Ďầu với acetyl-CoA và dẫn Ďến sự hình thành của FPP Ďược sử dụng làm chất nền cho các tuyến sinh tổng hợp tiếp theo (Hình 1.3).
A B C
Hình 1.3. Sinh tổng hợp squalene thông qua con Ďường MEP ở vi khuẩn E.coli (A) [8]. DMAPP - dimethylallyl diphosphate; DXR - DXP reductoisasease; FPP - farnesyl diphosphate; FPP - G -3-P, glycerol-3-phosphate; HMBPP - (E) -4-hydroxy-3-methyl- 2-butenyl pyrophosphate; HMG- CoA - 3hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA; IDI - isopentenyl diphosphate isomerase; IPP - isopentenyl diphosphate; MEP - 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate; SQS - synthase squalene. Sinh tổng hợp
squalene ở nấm men Saccharomyces cerevisae (B). DMAPP - dimethylallyl diphosphate; Erg1p, SQE; Erg7p, lanosterol synthase; Erg9p, SQS; Erg20p, FPP synthase; FPP, farnesyl diphosphate; GPP, geranyl diphosphate; HMG-CoA, 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA; Hmg1p, Hmg2p, HMG-CoA reductase; Idi1p, isopentenyl diphosphate isomerase; IPP, isopentenyl diphosphate; MVA, mevalonate. Sinh tổng hợp squalene thông qua con Ďường MEP ở vi tảo
lục Botrycoccus braunii (C). BS, botryococcene synthase; DMAPP, dimethylallyl diphosphate; FPP, farnesyl diphosphate; DXP, 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate; DMAPP, dimethylallyl diphosphate; IPP, isopentenyl diphosphate; MEP, 2-Cmethyl-D-erythritol 4-phosphate; NADPH, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; SQS, synthase squalene; SAM, Sadenosylmethionine
Tác giả Xie và cộng sự (2017) Ďã Ďưa ra mối liên hệ giữa sinh tổng hợp terpenoid và docosahexaenoic acid (DHA) ở loài VTBDD Schizochytrium [17] (Hình 1.4). Sự kết hợp qua lại giữa sinh tổng hợp các acid béo và terpenoid với một Ďiểm chung là chất acetyl-CoA và từ chất này Ďã cho phép tạo các sản phẩm cuối cùng khác nhau là acid béo DHA và terpenoid. Phân tích mức Ďộ biểu hiện gene trong mỗi giai Ďoạn sinh trưởng Ďã cho thấy hoạt tính xúc tác của acetyl-CoA 10 carboxylase Ďã bị giảm dần ở cuối pha log trong khi quá trình tổng hợp squalene lại là bắt Ďầu. Sự suy giảm nêu trên Ďã buộc acetyl-CoA phải Ďược phân chia thành hai con Ďường trong chu trình tổng hợp sterol của tế bào Schizochytrium. Chính vì vậy, cần phải hiểu rõ cơ chế tổng hợp terpenoid cũng như DHA ở loài vi tảo này nhằm Ďiều chỉnh các Ďiều kiện nuôi cấy thích hợp Ďể thu Ďược hàm lượng squalene cao nhất.
Hình 1.4. Mối quan hệ giữa sinh tổng hợp terpenoid và DHA ở Thraustochytrids [17]
1.1.4. Ứng dụng của squalene Squalene và hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ Các nghiên cứu về quá trình oxy hóa ở squalene là rất ít; cho Ďến thế kỷ trước, các diperoxide tuần hoàn mới Ďược thông báo là các sản phẩm oxy hóa. Sau 80 năm, với các kỹ thuật tiên tiến (1H-NMR và 13C-NMR), người ta thấy rằng cơ chế oxy hóa và cấu trúc hóa học của epoxy và rượu Ďược hình thành sau một quá trình oxy hóa kéo dài Ďến 55 - 150°C [18, 19, 20]. Naziri và cs (2014) Ďã nghiên cứu quá trình oxy hóa squalene ở nhiệt Ďộ và Ďiều kiện không khí, tăng sự hình thành epoxy với hoạt tính proxidant trong dầu ở 40°C và 62°C [18]. Từ những năm 50s nhiều công bố Ďã cho thấy sự tạo vòng của squalene với lanosterol Ďể tạo thành oxydosqualene liên quan tới sự tổng hợp cholesterol và hoạt tính chống oxy hóa. Ở một số Ďiều kiện nhất Ďịnh, squalene dạng không vòng bị mất 11
Ďi sự ổn Ďịnh của nó và trở thành dạng vòng, cùng lúc Ďó khả năng chống oxy hóa của chúng bị giảm Ďi. Để ổn Ďịnh, squalene cũng liên kết với các ion hydro (Ďược phân ly từ nước) và acid trong cơ thể Ďồng thời giải phóng oxy trong cơ thể theo phản ứng như sau:
C30H50 (squalene) + 6H2O C30H62 (squalane) + 3O2. Cũng chính nhờ phản ứng này, oxy Ďã Ďi Ďến Ďược các tế bào, nhờ vậy mà sự chuyển hóa trong tế bào Ďược tăng lên và chức năng của một số cơ quan như gan, thận Ďược tăng cường [21]. Một số nghiên cứu trên in vitro và in vivo Ďã nhấn mạnh tác dụng chống oxy hóa của squalene, có thể do Ďặc tính phân tử của nó liên kết trực tiếp với các gốc tự do. Trên thực tế, do cấu tạo mà squalene có thể dễ dàng di chuyển qua các màng tế bào và dưới tế bào, cho phép phân bố trong mọi ngăn tế bào. Ngoài ra, nó hoạt Ďộng như một chất thu dọn và chống lại một số gốc tự do. Đặc biệt, squalene phá vỡ chuỗi peroxy hóa lipid cả trong nhiều giai Ďoạn khác nhau [22]. Hoạt tính chống ung thư và bảo vệ tế bào của squalene Trong y học, phương pháp trị liệu ung thư bằng hóa học có thể gây ra các thương tổn Ďến những mô khỏe mạnh, gây Ďộc tính tới các cơ quan và do Ďó dẫn Ďến hạn chế liều lượng thuốc chống ung thư và thậm chí không có hiệu quả trong việc Ďiều trị. Một loạt các nghiên cứu Ďã chỉ ra rằng việc hấp thụ squalene thường xuyên có thể ức chế sự tăng sinh của các tế bào khối u, Ďặc biệt là các tế bào tuyến vú, tuyến tụy, Ďại tràng và khối u ác tính, sự kích hoạt phụ thuộc vào quá trình prenyl hóa protein [23]. Theo Smith (2000), squalene có tác dụng hạn chế quá trình gây ung thư bằng ba cơ chế: (1) squalene ức chế hoạt Ďộng của enzyme HMGR (HMG reductase) chuyển hóa HMG-CoA thành MVA (acid mevalonic- một tiền thân sớm của cholesterol); (2) squalene Ďiều chỉnh chặt chẽ quá trình chuyển hóa các hợp chất xenobiotic bằng cách Ďiều chỉnh quá trình sinh tổng hợp các enzyme tham gia vào quá trình này; (3) squalene có thể dọn sạch các gốc tự do và các oxy 1 phản ứng singlet (singlet reactive oxygen; oxy singlet; O2 ) có tác dụng gây tổn thương do Ďột biến trong DNA, cuối cùng dẫn Ďến ung thư [24]. Các nghiên cứu thực nghiệm Ďã cho thấy squalene có thể ức chế về mặt hóa học một cách hiệu quả các khối u trên da ở loài Ďộng vật gặm nhấm. Việc bổ sung squalene vào trong màng bụng Ďể tăng cường chức năng của hệ thống lưới nội mô, 12
Ďặc biệt là kháng thế IgM (Immunoglobulin M) Ďã cho thấy loài gặm nhấm cái có mang bướu thịt 180 có thể kéo dài Ďược sự sống của nó [25]. Nhiều công bố cũng khẳng Ďịnh squalene có vai trò là chất chống oxy hóa mạnh cũng như có hoạt tính chống ung thư thông qua con Ďường của các gen gây ung thư thuộc họ ras (ras- oncogene pathway) (ras là tên viết tắt của Rat sarcoma - Ďược sử dụng Ďể nói về họ gen mã hoá cho các protein GTPase nhỏ, tham gia vào quá trình truyền tín hiệu trong tế bào) thể hiện tiềm năng chữa bệnh của nó [6]. Nghiên cứu gần Ďây cũng cho thấy squalene có tác dụng làm giảm kích ứng da, ngăn ngừa những bức xạ bởi tia cực tím. Phương pháp Ďiều trị squalene với các loại dầu Ďể bảo vệ vết bỏng và bổ sung một lượng phù hợp lên da có thể ngăn chặn sự tấn công của vi khuẩn và nấm [1]. Squalene sử dụng làm thực phẩm hỗ trợ bảo vệ sức khỏe Nhiều loại thực phẩm hỗ trợ bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ thực vật và Ďộng vật ngày càng Ďược nghiên cứu về vai trò của chúng trong việc phòng ngừa một số bệnh mãn tính. Squalene là hợp chất có mặt trong các loại thực phẩm chức năng chủ yếu như dầu ô liu và dầu gan cá mập nhưng tập trung Ďặc biệt ở gan của một số loài cá mập vì lần Ďầu tiên nó Ďược xác Ďịnh là một chất hỗ trợ cho chữa bệnh trong dầu gan cá. Ngày nay squalene Ďược biết là chất hoạt Ďộng sinh lý ở Ďộng vật, là tiền thân của quá trình sinh tổng hợp cholesterol. Mặt khác, nó có lịch sử sử dụng lâu dài như một nguồn tài nguyên hấp dẫn cho sản xuất thực phẩm chức năng, bổ sung hoặc thậm chí dược phẩm vì nó có Ďặc tính vật lý Ďộc Ďáo và nhiều chức năng sinh lý như chống ung thư và chống tăng cholesterol máu [26]. Các Ďặc tính chống oxy hóa và khả năng mang oxy của squalene Ďã khẳng Ďịnh tiềm năng của nó trong việc hỗ trợ phòng chống bệnh tim mạch. Trong quá trình hóa trị liệu chống ung thư, squalene Ďược cho là có thể ngăn ngừa tình trạng viêm; tuy nhiên, có rất ít bằng chứng trực tiếp chứng minh Ďiều này. Tác giả Bhilwade và cộng sự (2019) Ďã kiểm tra tác dụng bổ trợ của squalene Ďối với chuột Ďược cấy ghép khối u và Ďược uống thuốc chống ung thư doxorubicin (DOX). Squalene Ďã ngăn chặn Ďáng kể sự gia tăng về nồng Ďộ prostaglandin E2 (PGE2) (P <0,05) trong huyết tương của chuột mang khối u do DOX gây ra. Squalene Ďã ức chế số lượng các cơn Ďau (P <0,05) và giảm biểu hiện COX-2 (cyclooxygenase-2) và chất P (receptor peptid) trong mô khối u so với chuột Ďối chứng và cũng tăng cường hiệu quả chống 13 ung thư của DOX ở chuột allograft (ghép khác gen cùng loài - là việc trao Ďổi ghép giữa các thành viên khác nhau về di truyền nhưng cùng trong một loài, ở chuột ghép khác gene cùng loài khi chuyển mô của một con chuột thuộc dòng này ghép sang cho một con chuột thuộc dòng khác) Do Ďó, vai trò của squalene trong Ďiều chế sản xuất PGE2 cho thấy tiềm năng của nó như một chất bổ trợ cho quá trình hóa trị ở chuột mang khối u [27]. Squalene là một tá dược cho dẫn truyền vacxin Squalene cũng thường Ďược sử dụng dưới dạng nhũ tương, là một chất Ďược xử lý cho việc dẫn truyền vacxin. Một tá dược lý tưởng sẽ làm tăng hiệu lực của phản ứng miễn dịch trong khi vẫn không Ďộc và an toàn cho vật chủ [28]. Squalene Ďược sử dụng như một tá dược trong vacxin, kích thích Ďáp ứng miễn dịch và tăng Ďáp ứng của bệnh nhân Ďối với vacxin. Nhũ tương squalene Ďược xem là hệ thống phân phối thuốc vì chúng dễ dàng kết hợp các loại thuốc có Ďộ hòa tan kém trong pha phân tán. Bằng việc sử dụng nhũ tương squalene như một chất mang thuốc có thể tránh Ďược việc tiếp xúc trực tiếp giữa chất hoạt Ďộng và chất dịch lỏng trên cơ thể người hoặc mô, từ Ďó tránh các tác dụng phụ có thể xảy ra, và giúp tạo ra phản ứng miễn dịch thuận lợi chống lại kháng nguyên ngoại sinh [29]. Nhũ tương lecithin-squalene kết hợp với Tween 80 (polysorbate 80) Ďã Ďược chứng minh là có hiệu quả trong việc kích thích sản xuất kháng thể, trong khi Ďó sử dụng nhũ tương squalene chỉ có thể hỗ trợ cho việc tiêm vắc-xin phòng bệnh cúm (10 mg squalene/liều) [30]. Một số bằng sáng chế Ďã cho thấy việc bổ sung các chất khác nhau cho công thức vacxin khiến chúng trở nên hiệu quả hơn trong việc tạo ra kháng thể. MF59 (do công ty dược Norvartis sản xuất) - một hợp chất Ďã Ďược cấp bằng sáng chế và là một chất tá dược Ďang Ďược sử dụng nhiều nhất hiện nay. Nó bao gồm squalene (4,3%) cùng với hai chất hoạt Ďộng bề mặt Tween 80 và Span85, Ďược sử dụng như tá dược trong một số vacxin phòng bệnh sốt rét [31], viêm gan B, C [32], virus herpes simplex [33], cúm H1N1 [34] và HIV [32]. Mặc dù cơ chế tác dụng sinh học của MF59 vẫn chưa rõ ràng, tuy nhiên, có thể dự Ďoán MF59 Ďã tạo ra phản ứng miễn dịch bằng cách Ďưa các tế bào thực bào vào vị trí cần Ďưa tới, thúc Ďẩy sự phát triển của bạch cầu Ďơn nhân vào các tế bào Ďuôi gai và tạo Ďiều kiện cho chúng vận chuyển Ďến các hạch bạch huyết gần Ďó Ďể kích hoạt sự thích nghi Ďáp ứng miễn 14 dịch [35]. Có thể xem Ďây là vacxin cúm Ďầu tiên Ďã Ďược thương mại hóa cho sử dụng [36]. Theo tổ chức Y tế thế giới thì từ năm 1997 Ďã có hơn 22 triệu vacxin cúm có chứa squalene Ďược phân phối cho bệnh nhân ở châu Âu do nó có thể có tác dụng tăng cường Ďáp ứng miễn dịch [3, 37]. Squalene trong công nghiệp mỹ phẩm Do bản chất kỵ nước nên squalene có thể Ďược tìm thấy ở nồng Ďộ 275 μg/g trong tế bào mỡ. Squalene chiếm khoảng 12% lipid bề mặt da của con người, có lẽ bởi vì so với các loài Ďộng vật có vú khác, da người không có nhiều lông và do Ďó nó cần một số chiến lược nhằm chống lại tác Ďộng quang oxy hóa của tia UV [22]. Các thuộc tính làm mềm, hydrat hóa cũng như khả năng tương thích sinh học với da làm cho squalene trở thành một thành phần quan trọng trong các công thức mỹ phẩm (các loại kem dưỡng ẩm, trang Ďiểm, son môi, móng tay, các sản phẩm tóc). Squalene với tính chất không màu, không mùi, có kết cấu không nhờn, thẩm thấu qua da nhanh chóng và khả năng kháng khuẩn Ďang Ďược coi là một trong những chất làm mềm tự nhiên, hấp thụ nhanh chóng và hiệu quả vào da mà không chứa dư lượng dầu nào [38]. Squalene Ďóng một vai trò thiết yếu trong việc bảo vệ da khỏi sự phá hủy các gốc oxy hóa tự do. Một nghiên cứu của Kohno và cs (1995) Ďã cho thấy hằng số tốc Ďộ của các gốc oxy tự do của squalene cao hơn nhiều so với các lipid khác trong da người và tương Ďương với 3,5-di-t-butyl-4-hydroxytoluene [7]. Các tác giả cũng Ďưa ra khẳng Ďịnh là dường như không có khả năng xuất hiện chuỗi phản ứng peroxide hóa lipid nào khi bổ sung một lượng squalene phù hợp lên da [39, 1]. Cơ chế giảm cholesterol của squalene Các kết quả nghiên cứu gần Ďây Ďã cho thấy squalene có khả năng Ďiều hòa lipid máu, ngăn ngừa và Ďiều trị các bệnh liên quan Ďến rối loại chuyển hóa lipid ở cả người và Ďộng vật [30]. Theo Chan và cộng sự (1996), chế Ďộ ăn uống chứa 850 mg squalene mỗi ngày trong vòng 20 tuần có thể giảm cholesterol toàn phần, cholesterol gắn với lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL-c), triglycerid (TG) xuống 17%, 22%, 5%, tương ứng, trên bệnh nhân tăng cholesterol máu [40]. Một số nghiên cứu trước kia cũng cho thấy Ďiều trị squalene liều cao làm giảm lượng mỡ trong cơ thể và lượng Ďường trong máu của chó và chuột. Mặc dù cơ chế này vẫn chưa rõ ràng tuy nhiên, squalene có thể tác dụng trực tiếp hoặc gian tiếp thông qua việc giảm TG, 15 từ Ďó tăng cường Ďộ nhạy cảm với leptin. Squalene Ďã Ďược Ďề xuất là một thành phần Ďược sử dụng cho Ďiều trị các bệnh tim mạch, bởi vì nó làm giảm nồng Ďộ cholesterol, TG và leptin huyết tương [41]. Mặc dù nhiều nghiên cứu Ďã chỉ ra rằng squalene có hiệu quả trong phòng chống xơ vữa Ďộng mạch và tác dụng giảm cholesterol. Tuy nhiên, cơ chế phân tử của squalene trong chuyển hóa cholesterol vẫn chưa Ďược làm sáng tỏ. Cân bằng cholesterol nội bào là Ďiều cần thiết Ďể duy trì cholesterol ở mức bình thường. Một số cơ chế có thể xảy ra Ďể duy trì mức Ďộ cân bằng cholesterol trong cơ thể là: (1) tăng hoạt Ďộng của thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp LDL-R (low density lipoprotein receptor) dẫn Ďến tăng quá trình vận chyển các cholesterol xấu từ huyết thanh tới tế bào gan Ďể chuyển hóa thành acid mật; (2) tăng hoạt tính của enzyme chuyển hóa cholesterol thành acid mật, cholesterol 7 alpha-hydroxylase (CYP7A1); (3) tăng cường quá trình lưu thông cholesterol, kích thích vận chuyển cholesterol ngược từ các mô ngoại biên và tăng cường lượng cholesterol tốt - cholesterol gắn với lipoprotein tỷ trọng cao (high density lipoprotein - cholesterol; HDL-C) thông qua việc kích hoạt các thụ thể gan X (liver X receptors - LXRs) [42]. Nhiều nghiên cứu chứng minh các gen Ďích của thụ thể LXRs Ďóng vai trò Ďặc biệt quan trọng trong việc bảo vệ chống xơ vữa Ďộng mạch bằng cách Ďiều chỉnh, tăng sự biểu hiện của các protein liên kết ATP như (ABC) proteins A1 (ATP - biding cassette (ABC) protein A1, ABCPA1); G1 (ABCG1) và apolipoprotein E (ApoE), kích thích sự vận chuyển cholesterol ngược (reverse cholesterol transpor) từ các mô ngoại biên, tăng sự hình thành HDL-C [42]. LXR cũng ảnh hưởng Ďến mức cholesterol toàn phần bằng cách giảm hấp thu cholesterol ở ruột và tăng bài tiết cholesterol qua Ďường mật thông qua sự Ďiều hòa của chất vận chuyển ABCG5 và ABCG8 [43]. Điều trị chuột bị xơ vữa Ďộng mạch bằng các phối tử LXR (LXR agonist) Ďược tổng hợp, chẳng hạn như GW3965 (a synthetic LXR agonist) và
T0901317 (phối tử có tiềm năng và Ďược lựa chọn cho cả LXRα và LXRß với EC50 vào khoảng 50 nM) có thể ức chế sự tiến triển và thúc Ďẩy hồi quy của các mảng xơ vữa Ďộng mạch. Hơn nữa, việc nuôi các Ďại thực bào thiếu LXRα và LXRβ ở vật chủ có xu hướng gây xơ vữa Ďộng mạch dẫn Ďến tăng sự biệt hóa các tế bào này và hình thành mảng bám Ďộng mạch, ngay cả sau khi Ďiều trị bằng các phối tử LXR [44]. Mặc dù các phối tử LXR có hiệu quả Ďiều trị rõ ràng tuy nhiên, chúng có thể 16 gây ra sự hình thành lipit, dẫn Ďến tăng nồng Ďộ TG trong huyết tương và gây ra gan nhiễm mỡ [45]. Do Ďó, các phối tử LXR không gây ra/thúc Ďẩy quá trình tổng hợp acid béo cần phải Ďược tập trung nghiên cứu nhiều hơn nữa. Độc tính và liều lượng sử dụng của squalene Squalene là thành phần lipid từ tự nhiên có mặt trong các loại thực phẩm bổ dưỡng cho nên nó an toàn Ďối với người sử dụng trong một thời gian dài [21]. Nghiên cứu về Ďộc tính cho thấy squalene Ďược hấp thụ tốt khi dùng Ďường uống và nó có thời gian hấp thu nhanh hơn so với cholesterol [22]. Các thí nghiệm trên Ďộng vật tiến hành trong khoảng thời gian ba tháng cho thấy không có tác dụng phụ và không có dấu hiệu gây Ďộc Ďáng kể khi xét nghiệm sinh hóa huyết thanh và thử nghiệm chức năng gan ở Ďộng vật Ďược Ďiều trị với squalene [21]. Các nghiên cứu về lâm sàng Ďã chỉ ra rằng khoảng 60 - 85 % tổng số squalene Ďược Ďưa vào cơ thể qua con Ďường thức ăn Ďã Ďược hấp thụ và phân bố tới tất cả các mô trong cơ thể. Một số Ďặc tính dinh dưỡng của squalene Ďã Ďược Ďề cập trong các nghiên cứu như hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ tim mạch. Với chế Ďộ ăn giàu squalene (khoảng 500 mg/ngày) Ďược chứng minh là có lợi Ďối với tình trạng năng lượng của ty thể, quá trình peroxy hóa lipid và sự ổn Ďịnh của màng [21, 22]. Tác dụng của squalene phụ thuộc vào liều và mục Ďích sử dụng. Khi sử dụng 500 mg/ngày, squalene có tác dụng như là thuốc giảm lipid máu, tuy nhiên, trong một số thí nghiệm khác lại cho thấy liều dùng 1g squalene/ngày không có tác dụng này. Liều dùng của squalene Ďược khuyến cáo cho giải Ďộc sau dị ứng có thể sẽ cao hơn rất nhiều. Ở Ďộng vật, squalene Ďược yêu cầu phải Ďạt tối thiểu 5% trong khẩu phần ăn. Số lượng này tương Ďương với 11g/ngày ở người. Tuy nhiên, chưa có 1 nghiên cứu nào về tính an toàn của liều dùng squalene trên người, cũng như chưa có thông tin về liều lượng squalene cần sử dụng Ďể hỗ trợ Ďiều trị ung thư. Kết quả nghiên cứu trên Ďộng vật thực nghiệm cho thấy, Ďộng vật Ďược cho uống từ 2-5 g squalene/ngày có tác dụng giảm ung thư [21]. Công bố của tác giả Gabas-Rivena và cộng sự (2014) Ďã Ďưa ra liều squalene sử dụng cao nhất là 1g/kg/ngày. Sau 11 tuần thí nghiệm, liều này Ďã làm tăng HDL- C, kèm theo sự gia tăng phosphatidylcholine và paraoxonase 1 và không làm thay Ďổi apolipoprotein A1 và A4 ở chuột hoang dại [46]. Squalene trong ứng dụng kỹ thuật di truyền 17
Gần Ďây, một số nghiên cứu về di truyền liên quan Ďến hàm lượng squalene của cây lúa rất có giá trị Ďối với việc tạo giống lúa có chứa squalene cao. Wang và cộng sự (2019) Ďã thực hiện một nghiên cứu liên kết toàn bộ bộ gen Ďối với squalene (GWAS – genome wide association study) ở cây lúa bằng cách sử dụng 1,6 triệu Ďa hình nucleotide Ďơn (SNP - single nucleotide polymorphism) chất lượng cao Ďược trích xuất từ dữ liệu giải mã của 295 bộ lúa. Vị trí gen ứng cử viên tại locus Os09g0319800 - một orthologue của chuỗi tổng hợp terpene trong cây Arabidopsis Ďã cho thấy Ďây là gen ứng cử viên có khả năng nhất trong số các locus Ďã xác Ďịnh. Các biến thể nucleotide trong promoter có liên quan Ďến các biến thể về hàm lượng squalene trong nhóm lúa Japonica. Kỹ thuật GWAS Ďã góp phần trong việc tìm hiểu cơ chế sinh tổng hợp chất dinh dưỡng và cung cấp nền tảng cho các nghiên cứu trong tương lai về giống lúa có chứa hàm lượng squalene cao [47]. Xu và cộng sự (2019) Ďã tạo ra Ďược một dòng vi khuẩn Escherichia coli tái tổ hợp Ďể sản xuất squalene bằng biểu hiện gen hSQS (human squalene synthase). Thông qua sự biểu hiện của các enzym giới hạn tốc Ďộ (IDI, DXS và FPS) trong con Ďường isoprenoid, việc sửa Ďổi mô-Ďun nạp isoprenoid cùng với việc ngăn chặn con Ďường menaquinone thì Ďây Ďược coi là phương pháp hiệu quả Ďể tăng cường hiệu suất squalene ở E. coli, tăng 21 lần về hàm lượng squalene (28,5 mg/g SKK và 52,1 mg/L). Mặc dù sản lượng squalene Ďạt Ďược từ E. coli trong nghiên cứu này và các nghiên cứu trước Ďó [48] tương Ďối thấp hơn so với sản xuất squalene tự nhiên, tuy nhiên E. coli là loài Ďã có nhiều ứng dụng công nghiệp vì có nhiều lợi thế trong sản xuất, chẳng hạn như thời gian nhân giống ngắn, quá trình sinh trưởng sử dụng môi trường rẻ tiền, lên men Ďạt mật Ďộ cao và khả năng thích nghi cao với các biến Ďổi gen…Nhìn chung, nghiên cứu này cung cấp một hướng Ďi mới nhằm cải thiện năng suất squalene và chứng minh tiềm năng sản xuất squalene ở vi khuẩn E. coli [49]. Squalene và một số sản phẩm thương mại Công bố tiêu chuẩn sản phẩm là một trong những yếu tố quan trọng nhất Ďối với một sản phẩm trước khi lưu hành ra thị trường. Bảng 1.2 chỉ ra một số tiêu chuẩn của squalene thương mại. Bảng 1.2. Một số tiêu chuẩn của squalene thương mại Các thông số tiêu chuẩn của squalene Tài liệu tham khảo Tính chất vật lý và hóa học Thông số khác 18
Trọng lượng phân tử: 410.71 Chất Ďộc hại: Popa và cộng sự, Điểm nóng chảy: 75ºC Trong dầu gan cá mập: sự (2015) [4] Độ khúc xạ: 1,499, Độ nhớt ở 25ºC: 12 cps có mặt của các chất hữu cơ Mật Ďộ: 0,858 g/mL khó phân hủy trong môi Điểm sôi ở 25ºC: 285ºC trường biển: PCB, PBDE, Điểm chớp cháy: 110ºC organochlorine pesticids, Giá trị iot: 381g/100g polycyclic aro-matic Phổ hồng ngoại: 2728, 1668, 1446, 1380, hydrocarbons, dioxin, kim 1150, 1180, 964, 835 cm-1 loại nặng. Sức căng bề mặt: 32 mN/m - Màu sắc: vàng nhạt; mùi vi: nhẹ, nhờn; Ďộ axit: < 0,5 mg KOH/kg, Olive Squalene không xà phòng hóa > 96 %; xà phòng hóa < 5 mg KOH/g; INCI: Squalene hàm lượng squalene > 85%; CAS No: 111- tỷ trọng: 0,85-0,9 g/L; 02-4 EINECS Ďộ ẩm < 2% No: 203-826-1 [50] - Squalane và squalene Ďược xác Ďịnh là thành phần tự nhiên trong bã Sage, 1982 [51] nhờn của người, Ďược sử dụng trong mỹ phẩm ở các nồng Ďộ khác nhau ≤ 0,1 tới > 50%. - Squalene màu vàng nhạt, không mùi, không tan trong nước, dễ tan trong ether, petroleum ether, carbon tetrachloride, acetone và các dung môi tan trong dầu khác, ít tan trong rượu và axit acetic. Squalene dễ bị oxy hóa, khi tiếp xúc với oxy tạo thành peroxit - Trọng lượng phân tử: 410,71; tỷ trọng ở 20°C: 0,855-0,865 g/L; Ďiểm sôi: 335°C; Ďiểm nóng chảy: 75ºC/103ºF; Ďộ khúc xạ ở 20ºC: 1,495- 1500; Ďiểm chớp cháy: 200ºC; Ďộ nhớt ở 25ºC: 12 cps; giá trị acid: 5 max; giá trị xà phòng hóa: 0-5 max; giá trị iot: 360-380.
Hiện nay, các sản phẩm chứa squalene như dầu gan cá mập từ lâu Ďã Ďược nghiên cứu và Ďiều chế thành thực phẩm bảo vệ sức khỏe rất Ďược ưa chuộng trên thế giới. Dầu gan cá mập Orihiro squalene của Nhật Bản là một loại thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa 99,6% tinh chất squalene có nhiều lợi ích cho sức khỏe, Ďặc biệt tốt cho những người bị Ďau xương khớp, có sức Ďề kháng kém. Healthy Care là một trong những thương hiệu cung cấp những sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ thiên nhiên hàng Ďầu của nước Úc trong Ďó phải kể Ďến viên uống dầu gan cá mập squalene. Với mỗi viên nang chứa 1.000 mg squalene nguyên chất có khả năng giải Ďộc kim loại nặng, hỗ trợ Ďiều trị tiêu hóa ngoài ra còn hỗ trợ trong việc duy trì sức khỏe chung trong cơ thể con người. Bên cạnh Ďó, nhiều nghiên cứu còn chứng minh Ďược khả năng làm giảm nguy cơ ung thư vú, ung thư tiền liệt và ung thư kết tràng của sản phẩm dầu gan cá mập này. 1.1.5. Các nguồn cung cấp squalene Nguồn động vật 19
Squalene ban Ďầu Ďược phát hiện trong gan của một số loài cá, Ďặc biệt là cá mập sống ở biển dưới Ďộ sâu 400 m. Trong một thời gian dài, dầu gan cá mập Ďược coi là nguồn cung cấp squalene duy nhất trên quy mô công nghiệp [52, 53]. Ngay cả sau khi dầu ô liu trở thành nguồn nguyên liệu lớn thứ hai cung cấp squalene thi dầu gan cá vẫn là nguồn quan trọng cho sản xuất squalene bởi sản xuất squalene từ dầu gan cá ít phức tạp hơn và rẻ hơn so với dầu ô liu. Người ta ước tính Ďể sản xuất 1 tấn squalene cần tới khoảng 3.000 con cá mập và cần phải chưng cất chân không một lần duy nhất ở nhiệt Ďộ 200 - 230ᵒC Ďể thu hồi squalene có Ďộ tinh sạch > 98% từ dầu gan cá [54]. Mỗi năm, có khoảng 100 triệu con cá mập bị giết và Ďáp ứng Ďược một phần lớn nhu cầu toàn cầu về squalene Ďối với ngành công nghiệp [54, 55]. Tuy nhiên, squalene chiết xuất từ dầu gan cá không thể Ďược sử dụng trong mỹ phẩm hoặc dược phẩm bởi mùi khó chịu của chúng và các tạp chất không mong muốn bao gồm các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy trong môi trường biển như polyclorinated biphenyl, polybrominated diphenylether, các chất ô nhiễm hữu cơ khác nhau, các thuốc trừ sâu organochlorine, hydrocarbon thơm Ďa vòng, dioxin và các kim loại nặng [56, 57, 3]. Trong khi Ďó, ngành dược phẩm có những tiêu chuẩn sản xuất rất khắt khe và không thể dễ dàng thực hiện bằng cách thu nhận squalene có nguồn gốc từ cá mập. Ngoài ra, cho Ďến nay, việc Ďánh bắt cá thâm canh cũng Ďã gây ảnh hưởng không nhỏ tới vấn Ďề bảo tồn loài cá này do chúng có sinh trưởng chậm và chu kỳ sinh sản khá dài. Đó là lý do tại sao châu Âu giảm mạnh hạn ngạch Ďánh bắt cá Ďối với những loài cá này. Chính vì vậy, hiện nay việc tìm kiếm các nguồn tự nhiên mới cho sản xuất squalene Ďang Ďược thu hút và tập trung nghiên cứu. Nguồn thực vật Squalene có nguồn gốc từ thực vật Ďược Ďánh giá cao trong ngành mỹ phẩm và dược phẩm do Ďặc tính không nhờn, Ďộ ổn Ďịnh cao, không màu, không mùi cũng như không có các chất gây hại cho con người [3]. Squalene xuất hiện trong hầu hết các loại dầu thực vật và ở dầu ô liu chúng có hàm lượng cao nhất. Một số nguồn không Ďược thu hoạch rộng rãi hoặc sử dụng ở quy mô công nghiệp còn một số khác Ďược coi là nguồn sản xuất và thay thế tốt hơn so với nguồn Ďộng vật. 20
Theo công bố của Samaniego-Sanchez và cộng sự (2010) Ďã cho thấy hàm lượng squalene trong dầu ô liu nguyên chất thu Ďược bằng phương pháp chiết lạnh nằm trong khoảng 50 -100 µg/mL [58]. Sự khác biệt về hàm lượng squalene giữa ba vụ thu hoạch Ďã Ďược ghi nhận, trong Ďó, hàm lượng này Ďạt 5012,7 mg/kg vào năm 2001-2002 và 6502,7 mg/kg trong năm 2003-2004 Ďã Ďược công bố. Cùng thời Ďiểm này, Mlakar và cộng sự (2010) cũng Ďã công bố trong dầu hạt cây rau dền Amaranth cũng chứa hàm lượng squalene tương Ďối cao (chiếm 7 - 11 %) [59]. Tuy nhiên, các Ďiều kiện môi trường tự nhiên như Ďộ cao so với mực nước biển, số giờ có ánh sáng mặt trời trong ngày, chế Ďộ mưa có thể ảnh hưởng Ďến kích thước hạt và thông số này Ďã ảnh hưởng trực tiếp Ďến hàm lượng squalene. Mặc dù có chứa hàm lượng squalene tốt tuy nhiên, thực vật không thể Ďược coi là một nguồn lý tưởng cho sản xuất squalene vì một số thực vật Ďược trồng theo mùa nghiêm ngặt và hàm lượng squalene lại thay Ďổi rất nhiều theo vị trí Ďịa lý cũng như Ďòi hỏi phải có sự thích hợp về nhiệt Ďộ và Ďộ ẩm, Ďiều kiện khí hậu thuận lợi, kết cấu Ďất, tưới nước theo lịch trình, lượng mưa ổn Ďịnh, phân bón và quản lý dịch hại. Bên cạnh những thách thức Ďã Ďược thảo luận nêu trên, quá trình trồng trọt thực vật lại Ďòi hỏi rất nhiều lao Ďộng và hàm lượng squalene Ďược sản xuất từ các nguồn thực vật thực tế Ďã không Ďủ Ďể Ďáp ứng nhu cầu squalene ngày càng tăng. Nguồn vi sinh vật Từ nấm men Vi sinh vật là một trong những nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene tự nhiên và Ďược coi như là một nguồn thay thế tốt cho sản xuất squalene trong những năm gần Ďây. Drozdikova và cộng sự (2015) Ďã sử dụng sinh khối nấm men Kluyveromyces lactis nuôi cấy trong môi trường glucose và lactose làm nguyên liệu cho sản xuất squalene ngày một tăng cao. Hàm lượng squalene trong tế bào của loài vi sinh vật này Ďược tích lũy cao dưới Ďều kiện có bổ sung 7,5 mg/L terbinafine (TBNF) [60]. Gần Ďây, chủng Pseudozyma sp. (chủng SD301) phân lập tại vịnh Shuidong, Trung Quốc Ďược Song và cộng sự (2015) công bố là chủng tiềm năng cho sản xuất squalene thương mại. Hiệu suất sinh khối và squalene của chủng này Ďạt Ďược cao nhất khi sử dụng glucose và cao nấm men như một nguồn nito và cacbon tương ứng với tỷ lệ C/N =3. Bằng quy trình lên men fed-batch, hiệu suất squalene Ďạt Ďược tối Ďa lên tới 2,445 g/L [61]. Nghiên cứu mới Ďây của Rasool và cộng sự (2016) trên chủng Saccharomyces cereavisae hoang dại Ďã cho thấy có thể 21 tích lũy 0,62 mg/L squalene trong suốt pha cân bằng và khi nuôi cấy Ďi vào pha log thì năng suất squalene Ďạt 3,4 mg/L [62]. Trong báo cáo của Ebert và cộng sự (2018) cũng chỉ ra nồng Ďộ squalene bị ảnh hưởng Ďáng kể bởi các thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cũng như Ďiều kiện nuôi cấy. Khi nuôi cấy theo mẻ có bổ sung acetyl - CoA với nguồn cacbon là glucose thì hàm lượng squalene có thể Ďạt Ďến mức là 59 mg/g SKK [63]. Từ vi tảo Trong nhiều nghiên cứu từ trước tới nay, vi tảo Ďược khám phá là một nguồn thay thế và Ďã Ďem lại nhiều kết quả thú vị cho sản xuất squalene. Chúng Ďược sử dụng rộng rãi Ďể sản xuất các hợp chất khác nhau như polysaccharides, protein và carotenoid hoặc cho sản xuất năng lượng tái tạo bằng việc sử dụng nước thải Ďể nuôi trồng góp phần giảm giá thành sản phẩm cuối cùng. Các loài Ďại diện tiêu biểu của vi tảo cho tách chiết squalene là Scenedesmus obliquus, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella fusca và Botryococcus braunii, Ďều thuộc nhóm vi tảo quang tự dưỡng [8]. Mặc dù vi tảo Botrycoccus braunii có khả năng tổng hợp squalene cao tuy nhiên, nó là môt cơ thể quang tự dưỡng bắt buộc có tốc Ďộ sinh trưởng thấp, việc mở rộng nuôi trồng chúng trên quy mô lớn gặp rất nhiều khó khăn nên việc thương mại hóa sản phẩm này cũng cần phải Ďược xem xét một cách kỹ lưỡng khi phát triển thương mại hóa squalene từ vi tảo này. Trong khi Ďó, một số các loài VTBDD như thraustochytrids Ďược xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản xuất các chất có giá trị cao trong Ďó có squalene [64]. Tác giả Jiang và cộng sự (2004) Ďã xác Ďịnh thành phần acid béo và hàm lượng squalene ở loài Schizochytrium mangrovei mới Ďược phân lập từ loài thực vật Kandelia candel bị phân hủy ở môi trường rừng ngập mặn của Hồng Kong [65]. Trong các chủng Ďã phân lập Ďược thì S. mangrovei FB1 có hàm lượng và hiệu suất squalene Ďạt cao nhất tương ứng là 0,162 mg/g SKK và 1,313 mg/L. Theo một mô tả trong patent WO 2012/159979 thì Pora và cộng sự cũng tiến hành nuôi cấy chủng Thraustochytrium ở nhiệt Ďộ tối ưu là 28 - 32oC trong môi trường có bổ sung vitamin B1, B6, B12, hiệu suất squalene Ďạt Ďược là 2 - 12 g/100g SKK [66]. Chi vi tảo Schizochytrium Ďược Ďánh giá là có tốc Ďộ sinh trưởng cao trong Ďiều kiện nuôi cấy dị dưỡng có bổ sung nguồn cacbon hữu cơ và không cần có ánh sáng bởi vì cơ thể chúng thiếu bộ máy quang hợp cho cố Ďịnh carbon [67]. Do vậy, việc nâng cấp 22 quy mô nuôi trồng chúng bằng các hệ thống bình lên men khác nhau Ďể bảo Ďảm cung cấp Ďủ nguồn nguyên liệu cho sản xuất squalene hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thành công. 1.2. Công nghệ tách chiết và tinh sạch squalene 1.2.1. Công nghệ tách chiết squalene Ngày nay, thị trường của squalene chủ yếu nằm ở ba ngành công nghiệp, mỹ phẩm (69,2%), thực phẩm (22,8%), dược phẩm (8%) và trong năm 2014, nhu cầu tiêu thụ squalene khoảng 267.000 tấn tương Ďương với 102,4 tỷ Ďô la. Squalene Ďược tiêu thụ nhiều nhất ở khu vực châu Âu, tiếp theo là châu Á, Thái Bình Dương và Bắc Mỹ [68]. Nhiều nghiên cứu Ďược tiến hành với mục Ďích tìm kiếm các nguồn squalene mới bằng các phương pháp chiết xuất khác nhau an toàn, dễ thực hiện Ďược trong Ďiều kiện phòng thí nghiệm nhằm Ďạt Ďược năng suất cao nhất với chi phí thấp nhất có thể. Các phương pháp tách chiết squalene Ďược sử dụng phổ biến trên thế giới như: Phương pháp ép cơ học Là phương pháp liên quan Ďến việc sử dụng tác Ďộng của lực nén cơ học Ďể phá vỡ thành tế bào Ďể thu hồi squalene từ bên trong các tế bào. Mặc dù có ưu Ďiểm là giá thành rẻ tuy nhiên, squalene Ďược tạo ra theo phương pháp này có lẫn màu và mùi của nguồn nguyên liệu, không thích hợp cho các nguồn nguyên liệu khác nhau vì squalene thu Ďược Ďã không Ďảm bảo an toàn vì toàn bộ các chất hóa học tan trong dầu cũng sẽ Ďược lẫn vào squalene. Phương pháp dung môi Trên quy mô công nghiệp, tách chiết lipid bằng dung môi hữu cơ ở Ďiều kiện lạnh Ďược sử dụng Ďể tránh gây phá hủy các thành phần không bền với nhiệt bởi vì ở áp suất thấp sẽ cho năng suất chiết thấp. Chính vì vậy, kỹ thuật mới tách chiết ở áp suất cao hơn có thể giúp nâng cao hiệu suất và giảm thời gian xử lý [69]. Thông thường, tách chiết squalene bằng n-hexane Ďược sử dụng ở quy mô lớn, có chi phí thấp nhưng lại có hiệu quả tương Ďối cao [70]. Hàm lượng squalene tách từ chủng S. cerevisae SK2 bằng ethanol/KOH khi chủng này có biểu hiện mạnh tHmg1 (truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A (HMG-CoA) reductase) cao gấp 30 lần so với chủng không có tHMG1, hiệu suất tách squalene Ďược nâng cao khi sử dụng kết hợp methanol/KOH và n-hexan [71]. 23
Phức hợp ion bạc (dựa trên phản ứng tạo phức giữa Ag+ và liên kết Ďôi cacbon không bão hòa) Ďược sử dụng với dầu Camellia (thu từ hạt Camellia o oleifera) có mặt 70% methanol (v/v), 0,6 mol/L AgNO3 trong 12 giờ và ở 0 C Ďã cho phép thu Ďược squalene có Ďộ tinh sạch 37,8%. Ưu Ďiểm của phương pháp này là có chi phí thấp, tái sử dụng Ďược thuốc thử và hệ thống tách chiết chạy liên tục. Tuy nhiên, vẫn phải có quá trình xà phòng hóa và este hóa trước khi chiết xuất và thuốc thử hóa học phải Ďược loại bỏ sau quá trình phân tách nên thực tế quá trình tách chiết này trở nên phức tạp gồm nhiều bước khác nhau [72]. Phá vỡ tế bào S. cerevisae (chủng EGY48) bằng cơ học ở Ďiều kiện xà phòng hóa (60% KOH ở 45oC; 18% KOH ở 90oC) Ďã tăng hiệu quả tách squalene cao gấp 2,5 lần với dung môi chloroform so với methanol, ethanol, acetone và n - hexane, Ďạt Ďược là 0,6 mg/g SKK [73]. Squalene trong dịch chiết (Ďạt 24,08%) thu Ďược bằng cách xà phòng hóa PFAD (Palm Fatty acids Distillate) với 50% KOH trong 60 phút và cuối cùng sử dụng 100 mL nước cất cùng với 3 lần bổ sung dichlomethane cho chiết lỏng - lỏng (LLE - liquid - liquid extraction) cũng Ďã Ďược công bố [74]. Khi sử dụng phương pháp chiết bằng Soxhlet, siêu tới hạn và dung môi nhanh (ASE) với 3 kiểu gen khác nhau của cây rau dền (Amaranthus sp.) Ďã cho hiệu suất tách chiết squalene cao nhất ở phương pháp ASE và kiểu gen 16 là 4,7g/kg hạt [75]. Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn (SCF) Hiện nay công nghệ chiết suất siêu tới hạn Ďã và Ďang Ďược áp dụng phổ biến Ďể chiết tách các hoạt chất sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm… Công nghệ này Ďã Ďược biết từ năm 1879 nhưng mãi cho Ďến những năm 1980 thì mới Ďược áp dụng rộng rãi cho tách chiết các hợp chất thiên nhiên từ thực vật. Phương pháp này sử dụng dạng dung môi Ďặc biệt ở trạng thái siêu tới hạn. Trạng thái siêu tới hạn hình thành khi nhiệt Ďộ và áp suất vượt quá Ďiểm tới hạn tại Ďiểm cân bằng lỏng hơi. Khi Ďó chất ở trạng thái siêu tới hạn vừa có tính chất giống pha lỏng vừa có tính chất giống pha hơi và chúng trở thành một dung môi tuyệt vời Ďể tách chiết và tham gia các phản ứng. Các dung môi có thể sử dụng cho phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn Ďược trình bày ở Bảng 1.3 Bảng 1.3. Tính chất vật lý của một số chất lỏng siêu tới hạn (SCF) [76] SCF Trọng lượng Nhiệt Ďộ tới Áp suất tới hạn Tỷ trọng ở Ďiểm 3 phân tử g/moL hạn ᵒC bar (psi) tới hạn Kg/m Không Khí n/a - 140,6 37,7 (546,8) 319,9 24
Amoniac (NH3) 17,03 132,2 113,3 (1643,2) 225 Nito (N2) 28,01 -147 34 (493,1) 313,3 Nước (H2O) 18,02 373,9 220,6 (3166) 322 CO2 44,01 30,9 73,7 (1056) 467,6 Chlorotrifluoro 104,5 28,8 38,8 (563,3) 582,9 methane (CCIF3) Dichlorofluoro 102,9 178,3 51,8 (751,3) 526,1 methane (CHCl2F) Octafluoropropane 188 71,9 26,8 (388,7) 629 (C3F8) Aceton (C3H6O) 58,08 235,1 46,4 (672,9) 278 Benzen (C2H6) 78,11 289 49 (710,7) 30,9 Dimethyl ete 46,1 127,1 53,4 (774,5) 277 (CH3)2O Ethan (C2H6) 30,07 32,2 48,7 (697,6) 206,20 Ethanol (C2H5OH) 46,07 240,9 60,6 (878.9) 276 Ethylen (C2H4) 28,05 9,2 50,4 (720,9) 214,2 Methane (CH4) 16,04 -82,6 45,9 (658,5) 162,7 Methanol (CH3OH) 32,04 239,4 81 (1157,4) 275,5 n - Propane (C3H8) 44,1 96,7 42,5 (761,4) 220,5 Propylene (C3H6) 42,08 91,9 45,5 (658,5) 230,1 Phương pháp chiết SCF có các ưu Ďiểm so với các phương pháp khác là khả
năng khuyếch tán tốt, Ďộ nhớt thấp, áp suất hơi cao, Ďiểm siêu tới hạn của CO2 dễ Ďạt Ďược nhưng lại thân thiện với môi trường, dễ áp dụng ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, Ďây là phương pháp tách chiết squalene Ďòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng, Ďắt tiền. Do vậy, trong Ďiều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam không dễ ứng dụng Ďược phương pháp này. Sử dụng các phương pháp khác nhau Ďể tách chiết squalen từ nguồn nguyên liệu tự nhiên Ďã Ďược chỉ ra ở Bảng 1.4. Bảng 1.4. Các phương pháp tách chiết squalene từ nguồn tự nhiên [4] Nguồn Phƣơng pháp tách chiết/Điều Sản phẩm thu đƣợc squalene kiện tách chiết Dầu ô liu Chưng cất phân tử suốt quá trình Thu hồi tất cả các thành phần khử mùi công nghiệp trong qui trình tinh chế dầu ô liu Cặn khử mùi - (i) Hòa tan trong các dung môi - Thu hồi 93% squalene bằng phương phụ phẩm chủ khác nhau (tỷ lệ dung môi 3:1, pháp (i) (2 lần rửa) trong phần dịch yếu của quá w/v), như methanol và acetone. lọc trình tinh chế (ii) Kết tinh ở -20oC/24 giờ, hỗn - Thu hồi 79,5% sterol tổng số trong dầu hợp acetone và methanol (4:1) phần cặn (iii) Ly tâm, lọc, rửa lại bằng dung môi với tỷ lệ dung môi : cặn khử mùi là 3:1 Sinh khối ô liu Phương pháp chiết lỏng có hỗ (i) 575 µg squalene/g trợ áp suất (Soxhlet) (ii) 509 µg squalene/g (i) Acetone, 100oC, 3 x10 phút 25
(ii) 2 - propanol, 190oC, 3 x10 phút Hạt rau dền (i) Tách chiết dầu trong ê te dầu Hàm lượng squalene tăng từ 4,2% tới Amaranthus hỏa (40 - 60oC) sử dụng thiết bị 43,3% ở phần không xà phòng hóa Soxtec System HT6 (i) thu Ďược 94% squalene tinh sạch (ii) Loại bỏ phần không xà phòng hóa bằng hỗn hợp ethanol 95%: KOH 50% (tỷ lệ 30:5; v/v) (iii) rửa, sấy khô, lọc, loại bỏ dung môi (iv) Tách chiết squalene bằng hệ thống sắc ký cột trên cột silicagel (24 g, 70 - 230 mesh, Sigma Co.) Tách chiết các thành phần theo a) Methanol các bước sau: (c) Chưng cất ở nhiệt Ďộ (T) < 200ᵒC, (a) Este hóa dầu với rượu p < 150 mmTorr Ďã thu Ďược nồng Ďộ (b) Thu hồi pha ester từ glycerol 5% carotene, 0,5% tocols, 0,7% (c) Chưng cất pha este squalene, 0,7% sterol Dầu thực vật (d) Hòa tan sản phẩm của bước (d) n - hexan (dầu cọ) (c) trong dung môi không phân (e) cột nhồi (12 cm x 4 cm); chất hấp cực (Áp suất p là 0,2 - 50 barr) thụ 23g/kg (e) Hấp thụ sản phẩm của (d) (f) n-hexan: isopropanol - 99,5: 0,5, p trên một chất hấp thụ < 1barr (f) Tách chiết các thành phần sử (g) Phân Ďoạn Ďầu tiên thu Ďược dụng hỗn hợp dung môi squalene với hiệu suất thu hồi Ďạt 92 % Dầu ô liu Quy trình bao gồm 4 bước: xà Squalene Ďạt Ďược với Ďộ tinh sách > (cặn) phòng hóa, bẻ gãy và este hóa 90% các acid béo và tách chiết bằng khí siêu tới hạn Nguồn Ďộng Phương pháp bao gồm các bước: (a) Te (70, 100oC) vật như dầu (a) Chưng cất tinh sạch ở T1 pe [0,5 µm Hg, 5 µm H] với 95% gan cá mập (b) Chưng cất biến tính ở T2, squalene o o T1 và T2 là nhiệt Ďộ sôi của (b) Te [200 C, 300 C] o squalene; T1 < 140 C và T2 ≥ pe [0,5 mm Hg, 5 mmHg] với 200oC squalene có Ďộ tinh sạch Ďạt 99% (c) Sự xà phòng hóa của thành phần trong dầu gan cá trước hoặc sau giai Ďoạn chưng cất Cặn khử mùi Quy trình tách chiết squalene, (1) Alcohol C1 - C3: acid béo với tỷ lệ sterol, vitamin E phân tử > 5 (1) Este hóa acid béo tự do Xúc tác acid: chưng cất =1:10 (w/w) T (2) Phản ứng chuyển vị este của < 95oC acid béo với alcohol (2) Alcohol C1-C3, xúc tác cơ bản, T < (3) Chưng cất liên tiếp ba lần; 100 oC sản phẩm chưng cất chứa (3) Chưng cất lần thứ 1 trên cột 20, p squalene là 3 mbar - 10 mbar; T là 160oC - 180oC Chưng cất lần 2 trên cột 10, P là 20 26
mbar - 30 mbar, T là 220 - 225oC Chưng cất lần 3 trên cột 10; p là 1 mbar - 10 mbar, T là 220 - 260oC Hạt rau dền (i) Chiết suất CO2 siêu tới hạn có (i) Ở 55 Mpa và 5% dung môi: 0,289 Amaranthus hoặc không sử dụng ethanol (2 g squalene/100 g hạt hoặc 5% ethanol) (ii) Lên tới 17,9 g squalene/100 g dầu (ii) Chiết phân Ďoạn bằng cách (iii) Tách chiết tocopherols với quy giảm dần áp suất (ở Ďiều kiện trình tương tự môi trường xung quanh) tới nồng Ďộ squalene cao nhất Dầu cọ thô Tách chiết phytosterol, squalene, (a) MeOH/EtOH với NaOH và KOH vitamin E theo các bước: (b) Chưng cất ở (a) Chuyển Ďổi dầu cọ thô trong + T: 70 - 120oC và p: 1,33 Pa - 6,67 dầu cọ methyl este Pa (b) Chưng cất dầu cọ methyl + T: 130 - 200oC và p < 1,133 Pa ester + T < 120oC và P < 1,133 Pa (c) Xà phòng hóa phytonutrient (c) 10% NaOH/KOH thu Ďược ở bước (b) (d) phần không xà phòng hóa thu Ďược (d) Sự kết tinh của phytosterol ở bước (c) phản ứng với (e) Phân Ďoạn dung môi của hydrocacbon/C1 - C4 alcohol/H2O tỷ vitamin E và squalene lệ: 25:1:1, ở 65oC - 85oC, làm lạnh từ từ xuống 25oC - 30oC (e) Sản phẩm thu Ďược từ (d) phản ứng với hỗn hợp heptane/n-hexan/i- octane và C1 - C4 alcohol (5:3); tách chiết squalene từ lớp hydrocacbon và vitamin E từ lớp alcohol; dầu cọ ban Ďầu chứa 250 - 730 ppm squalene, tách chiết bằng quy trình này thu hồi squalene lên tới 97%. Dư lượng từ Cột Ďối lưu Ďẳng nhiệt, T= 343 K, p: quá trình khử Chiết suất CO2 siêu tới hạn 150-230 bar mùi dầu ô liu Thu Ďược squalene Ďạt 90% Cặn khử mùi (1) Ester hóa trong MeOH siêu tới hạn từ quá trình (2) Tách chiết squalene với SC -CO2 ở chưng cất khử Chiết suất lỏng siêu tới hạn 52,05oC, p = 104, 8bar, thời gian tách mùi dầu ô liu chiết là 180 phút Thu Ďược squalene Ďạt 75% Cặn khử mùi (i) Xà phòng hóa các acid béo tự do từ quá trình với glycerol và xúc tác acid (Zn) chưng cất khử (ii) Glycerol ester sản phẩm là phụ mùi dầu ô liu thuộc vào sự tách chiết SC -CO2: T = o Chiết suất CO2 siêu tới hạn 40 C, P = 150 bar, 30 k CO2/kg mẫu, cột Ďối lưu (3 m x 30 mm) với vòng thép không gỉ Sulzer làm vật liệu Ďóng gói; hiệu suất tách chiết là 83,7% (iii) Cột có gradient nhiệt Ďộ SC -CO2, tách chiết SC - CO2 50:40:30 Ďã cho hiệu suất tách chiết 91,1% (iv) Các thí nghiệm ở quy mô pilot 27
Chưng cất (i) bộ giải nén 50 mL (320 mm x 13 acid béo trong mm) cọ Chiết suất siêu tới hạn (ii) Tách chiết SC - CO2 ở 3mL/phút cho 90 phút, ở 200 bar và 50oC (iii) Thu Ďược 438,16 ppm squalene o Chưng cất khử Chiết CO2 siêu tới hạn (i) T: 50 - 90 C; p: 24,1-31,0 Mpa; mùi dầu Ďậu 200 - 1000L STP CO2; tương (ii) Nồng Ďộ squalene là 1,26 Dầu Amaranth Chưng cất ngắn (i) Đơn vị chưng cất (KDL4 Model, UIC Inc, Joliet, IL) (ii) Việc khử gum dầu thô bằng cách Ďun nóng ở 90oC, bổ sung 2% (w/w) H2O, khuấy, Ďể tĩnh 24 h, ly tâm ở 18.900g/20 phút (iii) Tinh chế dầu thô sử dụng NaOH 20 % (iv) Kết quả tốt nhất cho phân Ďoạn khi chưng cất ở T = 180oC và 3 mtorr: (v) Nồng Ďộ squalene trong chưng cất tăng gấp 7 lần với hiệu suất thu hồi Ďạt 76%. Nấm men Ďột (i) Hệ thống nuôi cấy hai giai Ďoạn Ďối biến thu Ďược với nấm men: kị khí cho sinh trưởng, bằng kỹ thuật kị khí cho sản xuất squalene di truyền Chiết CO2 siêu tới hạn (ii) Phá vỡ tế bào bằng nghiền (iii) Tách chiết squalene theo 2 bước (a) Tách chiết bằng dung môi với CHCl3: MeOH = 2:1 (v/v) (b) Sấy phun khô, sau Ďó tách chiết bằng SC - CO2 cho phép thu Ďược 95% squalene tinh khiết Torulaspora Chiết suất CO2 siêu tới hạn (i) Các tế bào sau quá trình lên men kị delbrueckii kí Ďược sấy phun khô (ii) Chiết suất siêu tới hạn ở T = 60oC, p = 250 - 255 bar, tốc Ďộ dòng chảy CO2: 0,2 L/phút (iii) Hiệu suất Ďạt Ďược 430,52 µg squalene/g sinh khối khô Sản phẩm phụ Chiết suất siêu tới hạn (i) T = 343K, p = 180 bar Ďã cho thu thu Ďược sau hồi Ďược squalene Ďạt Ďộ tinh khiết là quá trình 84% và hiệu suất thu hồi là 64,2% chưng cất, (ii) Cột chiết suất Ďối lưu với 15 tấm ester hóa và theo lý thuyết, có hồi lưu, T = 351K, p chuyển vị este = 177 bar Ďã cho thu Ďược squalene có của dầu ô liu Ďộ tinh sạch Ďạt 92% và hiệu suất hu hồi là 93%
1.2.2. Các phương pháp định lượng và tinh sạch squalene 28
Sau quá trình tách chiết, squalene có thể lẫn rất nhiều thành phần khác do vậy Ďòi hỏi cần phải có một bước tinh sạch Ďể thu hồi Ďược squalene có chất lượng cao. Các phương pháp phân tích hiện Ďại sử dụng Ďể Ďịnh lượng và tinh sạch squalene là các phương pháp sắc ký bao gồm: sắc ký khí (GC) hoặc kết hợp với khối phổ (GC-MS), sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC/MS), sắc ký cột silicagel. Bằng phương pháp GC, Sherazi và cộng sự (2016) công bố hàm lượng squalene thu Ďược từ một số loại dầu thực vật (Ďậu tương, ngô, hướng dương, hạt nho) [77]. Kết quả cho thấy squalene tách chiết từ dầu Ďậu tương Ďạt cao nhất 1,3- 2,1% so với các loại dầu còn lại. Một phương pháp khác cũng cho phép tinh sạch mẫu cặn khử mùi sau quá trình tinh chế dầu ô liu trong thông báo của Xynos và cs (2016) là phương pháp sắc ký ly tâm phân Ďoạn (Centrifugal partition chromatography). Sự phân Ďoạn Ďược thực hiện bằng cách sử dụng hệ dung môi hai pha không chứa nước, bao gồm heptan-axetonitril-butanol (1,8:1,4:0,7, v/v/v). Hàm lượng squalene trong mẫu ban Ďầu là 23,4% có Ďộ tinh sạch của squalene lên tới 95,5% và sự thu hồi squalene Ďược tính toán Ďến 76,3% [78]. Squalene là một trong những sản phẩm phụ có giá trị lẫn trong cặn chưng cất khử mùi sau quá trình chưng cất dầu thực vật. Định lượng squalene trong cặn chưng cất khử mùi rất khó khăn bởi vì ngoài squalene ra còn có nhiều thành phần khác nhau xuất hiện với nồng Ďộ rất thấp. Do Ďó, Ďể Ďịnh lượng Ďược squalene, phải tiền xử lý mẫu bao gồm: xà phòng hóa các sản phẩm chưng cất, thu nhận các sản phẩm không xà phòng hóa và sau Ďó phân tách bằng sắc ký cột. Hàm lượng squalene sau Ďó Ďược xác Ďịnh bằng GC kết hợp với HPLC. Gunawan và cộng sự (2008) công bố cặn khử mùi dầu Ďậu nành chứa khoảng 45% acid béo tự do và 20% TG trong quá trình tinh chế [79]. Các chất có hoạt tính sinh học gồm tocopherols, phytosterol tự do, este của acid béo steryl (EASEs) và squalene Ďược tách chiết và làm sạch từ cặn khử mùi bằng Soxhlet và sắc ký cột silica gel. Phân Ďoạn Ďầu tiên sau Ďó Ďược Ďưa vào sắc ký cột silicagel Ďể tách chiết squalene. Squalene (có Ďộ tinh sạch 95,90% và hiệu suất thu hồi 93,09%) thu Ďược trong phân Ďoạn thứ hai sau khi rửa cột với 10,96 lít n-hexan ở 23oC. Mặc dù phương pháp này Ďòi hỏi một lượng lớn dung môi hữu cơ và không thân thiện với môi trường nhưng dung môi có thể thu hồi dễ dàng Ďể sử dụng lại, thiết bị sử dụng ít phức tạp hơn vì hoạt Ďộng dưới áp suất khí quyển, 29 nhiệt Ďộ thấp hơn nên thực tế hiện nay, chúng vẫn Ďược sử dụng nhiều ở các phòng thí nghiệm cũng như các cơ sở sản xuất. Vi tảo Ďược công bố là một nguồn thay thế tiềm năng Ďể sản xuất squalene có hiệu quả trong Ďó Ďặc biệt phải kể Ďến các loài thuộc chi Schizochytrium. Chính vì vậy, việc nghiên cứu Ďể tách chiết squalene nhanh, có Ďộ tinh sạch cao với giá thành rẻ từ nguồn nguyên liệu này ngày càng Ďược tập trung nghiên cứu. Lu và cộng sự (2003) Ďã sử dụng thành công phương pháp sắc ký ngược dòng tốc Ďộ cao Ďể tách chiết và tinh sạch squalene từ VTBDD Thraustochytrium ATCC 26185 [80]. Sau khi tách chiết bằng dung môi hữu cơ, squalene thô tiếp tục Ďược tách ra bằng cách sử dụng một hệ thống dung môi hai pha không chứa nước gồm n-hexan: methanol (2:1, v/v). Pha trên là pha Ďộng Ďược bơm vào cột tạo lưu lượng dòng chảy 2 mL/phút và các phần phân Ďoạn Ďược tinh sạch và thu thập Ďược phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Phương pháp này cho hiệu suất squalene Ďạt 0,2 mg với Ďộ sạch Ďạt 96% từ 150 mg squalene thô (chiếm 0,14% squalene) và khả năng thu hồi là 95%. 1.3. Giới thiệu công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dƣỡng Vi tảo có hình thức sống dị dưỡng là chúng có khả năng sử dụng nguồn các bon hữu cơ Ďể tổng hợp lên các chất cần thiết cho cơ thể sống (không cần ánh sáng) [81, 82]. Dưới Ďiều kiện nuôi cấy dị dưỡng, tảo có tốc Ďộ sinh trưởng và hàm lượng lipit cao hơn Ďáng kể so với nuôi cấy quang tự dưỡng nhưng khả năng sống Ďược theo phương thức dị dưỡng lại chủ yếu phụ thuộc vào loài/chủng Ďược sử dụng. Nuôi trồng vi tảo theo phương thức sống dị dưỡng có một số thuận lợi chính như sau: có thể duy trì các Ďiều kiện nuôi trồng tối ưu và giảm tạp nhiễm; sản xuất sinh khối có thể tiến hành quanh năm, không phụ thuộc mùa vụ hay khí hậu; quá trình nuôi trồng có thể kiểm soát và Ďảm bảo Ďược chất lượng sản phẩm theo mong muốn; Ďạt mật Ďộ tế bào cao, năng suất có thể lên trên 100 g khô/l và có thể sử dụng các kĩ thuật lên men hiện Ďang Ďược sử dụng rộng rãi cho việc nuôi trồng vi sinh vật cho vi tảo dị dưỡng. Nuôi cấy dị dưỡng với thể tích 100.000 lít có thể tạo ra hàng trăm kg sinh khối/mỗi mẻ trong một khoảng thời gian ngắn Ďã cho thấy phương pháp nuôi cấy này rẻ hơn nhiều so với nuôi cấy quang tự dưỡng [83]. Tuy nhiên, nuôi cấy dị dưỡng cũng có một vài hạn chế chính: (1) Chỉ có một số lượng hạn chế các loài vi tảo có thể sinh trưởng dị dưỡng; (2) Tăng chi phí về 30 năng lượng và giá thành bởi việc sử dụng/bổ sung thêm cơ chất hữu cơ Ďắt hơn so với nguồn dinh dưỡng vô cơ; (3) Rất dễ bị nhiễm khuẩn và cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật khác vì môi trường nuôi cấy rất giàu dinh dưỡng; (4) Có thể xảy ra sự ức chế tăng trưởng của tảo Ďích cần nuôi do các chất hữu cơ dư thừa trong quá trình nuôi cấy dị dưỡng; và (5) Do nuôi cấy dị dưỡng nên không có khả năng sản xuất các chất chuyển hóa Ďược cảm ứng bởi ánh sáng [83]. Nuôi cấy dị dưỡng không phù hợp với hầu hết các vi tảo và nhiều loài có lối sống quang tự dưỡng bắt buộc hơn là dị dưỡng tùy tiện. Tuy nhiên, một số loài vi tảo sinh trưởng tốt trong tối hoàn toàn và do Ďó có thể nuôi cấy chúng ở hệ thống bình lên men. Chen và Chen (2006) Ďã Ďưa ra một số Ďặc tính ban Ďầu cần thiết Ďể một loài vi tảo phải có Ďể Ďược xem là phù hợp với kiểu/Ďiều kiện nuôi cấy dị dưỡng như sau [84]: (a) Khả năng phân chia tế bào và chuyển hóa chủ Ďộng/tích cực khi không có mặt của ánh sáng; (b) Khả năng sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy bao gồm cơ chất hữu cơ dễ khử trùng và năng lượng cần thiết cho sự sinh trưởng dị dưỡng Ďược lấy từ quá trình oxy hóa một phần các chất hữu cơ này; (c) Khả năng thích ứng nhanh chóng với những thay Ďổi của môi trường; và (d) Có khả năng chống lại/hay tồn tại tốt dưới tác dụng của áp lực thủy Ďộng học gây va Ďập mạnh ngay ở bên trong các bình lên men. Ngoài ra, các tác giả nêu trên cũng Ďã Ďưa một số vấn Ďề thực tế xảy ra khi nuôi cấy dị dưỡng vi tảo ở quy mô lớn như sau: (a) Khả năng sống sót tốt của tế bào trong quá trình nuôi cấy; (b) Tế bào ở trạng thái khỏe mạnh; (c) Chi phí nuôi cấy thấp, Ďược phản ánh qua khả năng của chủng/loài trong việc sử dụng hiệu quả các nguồn cacbon dễ kiếm, rẻ tiền, có khả năng chống chịu với những thay Ďổi của môi trường và tạo ra các chất chuyển hóa có giá trị kinh tế; và (d) Ở quy mô công nghiệp, các chủng phải Ďược xử lý dễ dàng, thành tế bào của nó phải chịu Ďược các lực thủy Ďộng lực học và lực cơ học xảy ra trong các hệ thống bể phản ứng sinh học lớn Ďể nó có thể tạo ra Ďược mật Ďộ và sinh khối cao [84]. Do vậy, số lượng các chủng vi tảo có khả năng Ďáp ứng Ďược các Ďiều kiện nêu trên lại tiếp tục bị hạn chế. Các sinh vật có khả năng nuôi dị dưỡng thiếu hoạt Ďộng của bộ máy quang hợp do Ďó không thể tạo ra Ďược năng lượng bằng quá trình oxy hóa khử các hợp chất vô cơ. Chính vì vậy, nuôi cấy dị dưỡng Ďòi hỏi cần phải sử dụng cacbon hữu cơ (glucose, fructose, sucrose, lactose, galactose, mannose, acetate, glycero…) làm 31 nguồn năng lượng và cacbon. Tuy nhiên, hầu hết các loại vi tảo ưa thích glucose vì sự Ďồng hóa dễ dàng và tạo ra các hợp chất giàu năng lượng chẳng hạn như chất béo trung tính. Ví dụ vi tảo nuôi cấy trong môi trường chứa glucose có tốc Ďộ sinh trưởng cao hơn môi trường chứa acetat và fructose. Tuy nhiên, việc nuôi cấy tảo dưới Ďiều kiện dị dưỡng có thể là một thách thức vì vấn Ďề vô trùng trong suốt quá trình nuôi cấy là rất quan trọng và Ďặc biệt là khi nuôi trồng ở các hệ thống bình lên men với thể tích môi trường tương Ďối lớn [85, 86, 87]. Các phương pháp nuôi tảo dị dưỡng thường được sử dụng bao gồm: Nuôi theo mẻ (Batch culture): Nuôi theo mẻ là kĩ thuật phổ biến Ďể tăng số lượng tế bào, Ďược Ďặc biệt áp dụng ở quy mô phòng thí nghiệm. Cách thức nuôi trồng này tương Ďối Ďơn giản, chi phí rẻ, thường Ďược sử dụng trong các nghiên cứu sơ bộ ban Ďầu Ďể tìm hiểu tác dụng của các thành phần và yếu tố môi trường lên sinh khối tảo và năng xuất sản phẩm Ďược tạo ra. Các tế bào Torulaspora delbrueckii Ďược cấy ở 1 lít môi trường có thành phần (mg/mL) gồm: Glucose - 20, cao nấm men - 10 và pepton - 20, pH 5,5, Ďiều kiện nuôi lắc quay vòng ở 44 g và (30 ± 2)oC. Sau 48 giờ sinh trưởng hiếu khí, tế bào tiếp tục lên men theo mẻ trong một hệ thống lên men chứa 2,5 lít môi trường (mg/mL) bao gồm: glucose - 40, cao nấm men - 10 và pepton - 20 (pH 5,5). Dưới Ďiều kiện nuôi cấy dị dưỡng bằng phương pháp này thì hiệu suất squalene Ďạt Ďược cao là 11,12 µg/g SKK [88]. Nuôi theo kiểu “fed-batch”: Nuôi fed - batch về bản chất là nuôi theo mẻ Ďược bổ sung các chất dinh dưỡng liên tục hay không liên tục trong quá trình nuôi. Phương pháp nuôi theo mẻ có bổ sung cơ chất là một kỹ thuật phổ biến trong ngành công nghiệp lên men. Cách thức nuôi cấy này có thể có Ďược mật Ďộ tế bào (MĐTB) cao bằng việc tránh Ďược sự ức chế hoặc sự giới hạn của cơ chất. Quy trình này Ďã Ďược phát triển Ďể nuôi cấy mật Ďộ tế bào cao cho sản xuất squalene. Kiểu nuôi cấy fed-batch cũng Ďược sử dụng thành công Ďể nuôi cấy chủng nấm men Pseudozyma sp. SD301 trên môi trường chứa glucose, cao nấm men - sử dụng như nguồn cacbon và nito có tỷ lệ C/N là 3, muối biển nhân tạo có nồng Ďộ 15 g/L, năng suất squalene tối Ďa Ďạt Ďược khi lên men theo mẻ là 0,039 g/L và khi lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed - batch) là 2,445 g/L, cao hơn nhiều so với lên men theo mẻ [61]. Phương pháp này Ďược chia thành hai giai Ďoạn. Trong giai Ďoạn Ďầu (Ďủ nito), nồng Ďộ cơ chất Ďược duy trì ở khoảng dưới 10 g/L glucose bằng cách bổ 32 sung môi trường có cùng thành phần. Lúc này, nồng Ďộ và hiệu suất của sinh khối tối Ďa Ďạt Ďược 58,8 g/L SKK và 6,6 g/L/ngày, tương ứng. Giai Ďoạn hai có giới hạn về ntio trong môi trường nuôi cấy, khi Ďó sinh khối Ďạt khoảng 50 g/L với hàm lượng lipid tăng lên 38% (tăng từ 21 tới 29%) và hiệu suất lipid tăng lên 26% (từ 1,25 tới 1,58 g/l/ngày) [89]. Mặc dù nuôi theo kiểu fed-batch có thể loại trừ Ďược sự giới hạn về cơ chất nhưng nó không thể khắc phục Ďược sự ức chế có thể xảy ra do những chất trao Ďổi Ďược tế bào tạo ra nhiều có tác Ďộng gây Ďộc hại Ďối với sinh trưởng của chính Ďối tượng cần nuôi. Khi mật Ďộ tế bào Ďạt Ďược ở mức cao, sự tích lũy các chất trao Ďổi chất gây Ďộc cho tế bào sẽ trở nên nghiêm trọng và chúng sẽ trở thành yếu tố giới hạn Ďối với sinh trưởng cao hơn nữa của tế bào Ďích cần nuôi. Vì vậy, nên cần quan tâm nghiên cứu các kỹ thuật nuôi khác có hiệu quả hơn Ďể làm sao nâng cao sản lượng squalene mong muốn. - Nuôi liên tục: Nuôi liên tục dựa trên phương pháp kéo dài pha phát triển của vi sinh vật trong nuôi theo mẻ, nhưng cần liên tục cung cấp các chất dinh dưỡng mới và Ďồng thời loại bỏ môi trường Ďã Ďược sử dụng cùng với sinh khối tế bào tảo từ hệ thống nuôi. Trong nuôi liên tục, sự phát triển của tảo cũng như các yếu tố môi trường nuôi luôn Ďược giữ ổn Ďịnh. Tác giả Coelho và cộng sự (2014) cũng sử dụng phương pháp nuôi liên tục Ďối với loài Chlorella sp. khi sinh khối tảo bắt Ďầu Ďạt 30 g/L SKK. Ở tỷ lệ pha loãng là 0,02/h thì sinh khối Ďược duy trì trong khoảng 19 g/L SKK, hàm lượng lipid là 18% SKK trong Ďiều kiện trạng thái ổn Ďịnh, dẫn Ďến hiệu suất sinh khối và lipid Ďạt Ďược tương ứng là 9,1 và 1,5 g/L/ngày [89]. - Nuôi theo kiểu “perfusion”: Nuôi cấy liên tục với sự quay vòng tế bào và loại bỏ một phần môi trường nuôi cũ (làm mới một phần môi trường nuôi) còn Ďược gọi là nuôi “perfusion”. Phương pháp này ít khi Ďược sử dụng cho nuôi cấy vi tảo [90]. Ngược lại với nuôi liên tục có trạng thái nuôi ổn Ďịnh Ďược duy trì bằng cách pha loãng liên tiếp trong quá trình nuôi, còn trong quá trình nuôi perfusion, các tế bào Ďược giữ lại theo quy luật tự nhiên trong bình nuôi. MĐTB có thể tăng liên tục cho Ďến khi Ďạt Ďược MĐTB cao. Kỹ thuật nuôi cấy này Ďược sử dụng Ďể ngăn chặn sự giới hạn về cơ chất và sự ức chế trao Ďổi chất gây hại cho sinh trưởng do các sản phẩm Ďược chính vi tảo sinh ra. Nuôi “perfusion” Ďược chứng minh là hiệu quả Ďể loại bỏ các sản phẩm này và vì vậy, sẽ làm tăng mật Ďộ tế bào cũng như sản lượng của chất Ďích cần quan tâm. Như vậy, nuôi theo kiểu “perfusion” cùng các chất dinh 33 dưỡng liên tục ổn Ďịnh có thể Ďược sử dụng Ďể tối ưu hóa Ďiều kiện nuôi cho sản xuất các chất có hoạt tính sinh học và nâng cao sản lượng sinh khối Ďối với vi tảo. Động lực chính thúc Ďẩy phát triển vi tảo theo hướng thương mại hóa chính là sản xuất các sản phẩm trao Ďổi chất từ sinh khối tảo. Để có thể thương mại hóa Ďược các sản phẩm từ tảo cần phải nuôi Ďược sinh khối tảo có giá thành Ďủ rẻ Ďược thị trường chấp nhận Ďược xem là một việc then chốt, cực kỳ quan trọng. Trong tình hình nêu trên, nuôi trồng tảo theo phương thức nuôi cấy dị dưỡng là rẻ hơn Ďáng kể so với nuôi cấy tảo quang tự dưỡng. Các sản phẩm trao đổi chất trong nuôi cấy dị dưỡng vi tảo Các Ďộng lực chính Ďể phát triển vi tảo theo hướng thương mại Ďó là thu sản phẩm trao Ďổi chất; sử dụng tảo làm thức ăn cho các Ďối tượng nuôi trồng thủy, hải sản; thức ăn trong chăn nuôi gia xúc gia cầm; làm thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung cho người; sử dụng tảo trong xử lý môi trường, làm phân bón sinh học, nhiên liệu sinh học và khai thác các chất có hoạt tính sinh học có giá trị sử dụng cao như PUFA, squalene, sắc tố, vitamin…. Để có thể thương mại hóa Ďược các sản phẩm từ tảo thì phải nuôi Ďược sinh khối tảo có giá thành Ďủ rẻ, gia hóa các sản phẩm phụ có giá trị sử dụng cao từ sinh khối tảo. Ở Việt Nam, VTBDD thuộc chi Schizochytrium là Ďối tượng tiềm năng cho việc sản xuất thương mại các acid béo không bão hóa do hàm lượng lipid tổng số của nó có thể Ďạt hiệu suất lên Ďến 70% SKK. Trong Ďó, hàm lượng acid docosahexaenoic (DHA; C22:6 ω-3) chiếm trên 32,98% so với acid béo tổng số (total fatty acid-TFA), hàm lượng DHA và acid eicosapentaenoic (EPA; C20:5 ω-3) chiếm Ďến 60,937% so với acid béo tổng số dưới dạng axít béo tự do và dạng alkyl ester [91, 92, 93]. Và gần Ďây Schizochytrium Ďược xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản xuất squalene thương mại [94]. 1.4. Giới thiệu về chi vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium 1.4.1. Đặc điểm chung của chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium Thraustochytrids Ďược Sparrow lần Ďầu tiên phát hiện vào năm 1936 và ngày càng nhận Ďược nhiều sự quan tâm nghiên cứu từ các nhà nghiên cứu hiện nay là do chúng là các Ďối tượng tiềm năng Ďể sản xuất PUFAs Ďặc biệt là DHA và EPA ở quy mô công nghiệp Ďược ứng dụng vào Ďời sống con người. Trước Ďây, chúng Ďược xếp vào giới nấm do Ďặc Ďiểm dị dưỡng thẩm thấu có khả năng phân hủy các 34 vật liệu hữu cơ như lá rụng dưới biển, tảo biển, cỏ biển …. kết hợp hình thái học giữa nấm thực và nấm noãn. Ban Ďầu, họ thraustochytrids Ďược xác Ďịnh là thuộc lớp Phycomycetes (nấm trứng), do khả năng giải phóng các Ďộng bào tử hai roi và hình thành các cấu trúc giống như sợi - gọi là rễ giả, thường Ďược gọi là mạng lưới ngoại chất (ectoplasmic net - EN). EN chính là phần mở rộng của màng sinh chất bởi một bào quan chuyên biệt có tên là sagenogenetosome. EN có tác dụng gắn các tế bào với cơ chất và tiết ra các enzyme phân giải Ďể hấp thụ dinh dưỡng. Sau Ďó, thraustochytrids Ďược sắp xếp vào lớp Oomycetes và Ďến năm 1994 thì tác giả Cavalier Smith Ďã chỉ ra rằng họ này hoàn toàn không phải là nấm bằng phân tích gen 5S và 18S rRNA của chúng. Song song với Ďó, một loạt các tác giả khác Ďã xác Ďịnh Ďặc Ďiểm chung giữa thraustochytrids, labyrinthulids và aplanochytrids [95]. Với sự ra Ďời của nhiều nghiên cứu như sinh học phần tử, siêu cấu trúc của tế bào….Ďã hỗ trợ cho mối quan hệ tương tác này thì lớp Labyrinthulomycetes (Mã quốc tế của danh pháp cho tảo, nấm và thực vật, ICN) hay lớp Labyrinthulea (Mã quốc tế của danh pháp Ďộng vật học, ICZN) Ďược tạo thành và bao gồm cả ba nhóm (thraustochytrids, labyrinthulids, aplanochytrids) của sinh vật. Honda và cộng sự (1999) Ďã xây dựng mối quan hệ của labyrinthulid và thraustochytrid là nhóm Ďơn ngành trong stramenopiles bằng cách sử dụng các kĩ thuật sinh học phân tử, chúng Ďược chia thành hai nhóm: nhóm labyrinthulids phylogeny (LPG) và nhóm thraustochytrid phylogeny (TPG) [96]. Tsui và Vrijmoed (2012) Ďã Ďưa ra sự phân loại mới về lớp Labirinthulea, phân chia thành hai bộ và bốn nhóm Ďơn ngành. Nhóm Ďầu tiên chứa hầu hết các thành viên của thraustochytrids (có tế bào trượt không dùng Ďến EN), nhóm thứ hai và thứ ba bao gồm aplanochytrids và labyrinthulids (các tế bào trượt bằng EN), trong khi Ďó nhóm thứ tư và nhóm cuối cùng chứa thraustochytrids Schizochytrium minuta LPG và Thraustochytrium multirudimentale Ďã Ďược sắp xếp lại thành một chi mới có tên là Oblongichytrium. Theo tiến trình thời gian, một số chi cũ Ďã Ďược phân loại lại, và các chi mới Ďược phát hiện, trước Ďây lớp Labyrinthulea bao gồm năm chi mới cho Ďến những năm gần Ďây các nhà nghiên cứu Ďã Ďiều chỉnh về sự phân loại như sau: sáu họ mới và một siêu họ, cùng với sự bổ sung thêm ba chi [97], một siêu họ và hai chi mới có liên quan [98] và hiện nay Ďã bổ sung thêm bốn chi 35 mới. Bảng 1.5 chỉ ra sự phân loại của lớp Labyrinthulea sau các quá trình chuyển Ďổi liên tiếp [95]. Trong hệ thống phân loại của Adl và cộng sự (2005, 2012, 2019), thraustochytrids Ďược xếp vào nhánh của Stramenopiles (Chromists) Ďược Ďặc trưng bởi không roi hình ống chia ba và ty thể có mào hình ống [99, 100, 101]. Các Stramenopila là những sinh vật Ďơn bào nhân chuẩn Ďược Ďặc trưng bởi các Ďộng bào tử có hai roi lệch, bao gồm các nhóm có lối sống dị dưỡng thẩm thấu Oomycota và Hypochytriomycota (Ďều giống như nấm và không có plastid) và Ochrophyta quang hợp. Ochrophyta là một nhóm Ďơn ngành gồm nhiều nhóm tảo có sắc tố khác nhau như tảo màu nâu, tảo vàng, như Bacillariophyceae (tảo silic), Phaeophyceae (tảo nâu), Chrysophyceae, Eustigmatophyceae và Xanthophyceae [102, 103]. Bảng 1.5. Sự phân loại của lớp Labyrinthulea Ďược Ďiều chỉnh từ các nghiên cứu của Anderson và Cavalier-Smith (2012) [97], Gomaa và cộng sự (2013) [98] và Beakes và cộng sự, (2014) [104].
Bộ 1 Labyrinthulida (Labyrinthulales) Họ 1 Labyrinthulea (Labyrinthulaceae) Labyrinthula Họ 2 Aplanochytriidae (Aplanochytridiaceae) Aplanochytrium Bộ 2 Thraustochytrida (Thraustochytridiales) Họ 1 Thraustochytriidae (Thraustochytridiacae) Thraustochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Aurantiochytrium, Ulkenia, Sicyoidochytrium, Parietichytrium, Botryochytrium, Monorhizochytrium Họ 2 Oblonggichytriidae (Oblongochytridiaceae) Oblongichytrium Họ 3 Althorniidae (Althornidiaceae) Althornia Siêu họ 1 Amphitremida Họ 1 Diplophryidae (Dioplophryidaceae) Diplophrys Họ 2 Amphitremidae (Amphitremidaceae) Amphitrema, Archella Siêu họ 2 Amphifiloidea Họ 1 Amphifilidae (Amphifilaceae) Amphifila, Fibrophrys Họ 2 Sorodiplophryidae Sorodiplophrys Siêu họ 3 Incertae sedis Stellarchytrium, Elina
36
Ghi chú Tên trong dấu ngoặc đơn là tương đương danh pháp mycological (giới Chromista, dưới giới (subkindom) Harosa, siêu ngành (superphylum) Heterokonta, ngành Bygira, dưới ngành Sagenista)
Việc thraustochytrids có Ďược gọi là tảo hay không phụ thuộc khá nhiều vào nguồn gốc tiến hóa của các thể hạt (plastid) trong Ochrophyta. Liệu rằng Ochrophyta và thraustochytrids có cùng một tổ tiên mang thể hạt chung hoặc là các thể hạt Ďược phát sinh thông qua một quá trình nội cộng sinh (hoặc một vài quá trình nội cộng sinh) hay các thể hạt chỉ có ở nhánh Ochrophyte của Stramenopiles?. Thraustochytrids không có khả năng quang hợp và thiếu plastid hoặc bất kỳ dấu tích của một bộ máy quang hợp. Tuy nhiên, theo nhiều tài liệu nghiên cứu cho Ďến nay, thraustochytrids vẫn Ďược gọi là “vi tảo”. Điều này là do Labyrinthulomycota nằm trong Stramenopiles Ďược biết Ďến nhiều nhất trong các nhánh tảo của chúng và Ďược ủng hộ bởi giả thuyết Chromalveolates (Cryptophyte, Alveolate, Stramenopile, Haptophyte). Giả thuyết này cho rằng tổ tiên của Stramenopiles có plastid và các nhánh mà hiện không có plastid là do chúng Ďã mất Ďi plastid ở một thời Ďiểm nào Ďó trong quá trình tiến hóa [105, 106]. Hiện nay, dựa trên vòng Ďời, hình thái tế bào, siêu cấu trúc của tế bào, phân tích cây phát sinh loài cũng như các marker về sinh hóa (tính chất PUFAs và carotenoid) thì họ Thrausrochytrid Ďược công nhận bao gồm 9 chi: Thraustochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Ulkenia, Aurantiochytrium, Sicyoidochytrium, Parietichytrium, Botryochytrium, và Monorhizochytrium [95]. Trong Ďó chi Schizochytrium gồm các loài là những sinh vật có kiểu sống dị dưỡng và Ďược phân lập từ nhiều vùng sinh thái khác nhau như vùng cửa sông, Ďáy biển sâu hoặc những nơi nước Ďọng; tập trung nhiều trên tảo lớn, lá cây Ďước bị chìm trôi dạt vào bờ hoặc trên xác của thực vật bản Ďịa [107]. Những Ďặc trưng của chi Schizochytrium là có tế bào hình cầu, mạng lưới ngoại chất rất phát triển, khuẩn lạc sinh dưỡng lớn, Ďộng bào tử có dạng ovan hoặc dạng trứng, sinh trưởng bằng hình thức tế bào sinh dưỡng phân Ďôi liên tiếp tạo thành 4, 8 hoặc một cụm tế bào (có thể lên tới 100 tế bào). Cũng giống như nhiều chi thuộc ngành Labyrinthulomycota, chi Schizochytrium có chu trình sống của tế bào có giai Ďoạn hình thành Ďộng bào tử có hai roi lệch [108]. 37
Năm loài thuộc chi Schizochytrium Ďã Ďược mô tả bao gồm: S. mangrovei Raghukumar (1988), S. aggregatum Goldstein & Belsky (1964), S. octosporum Raghukumar (1988), S. minutum Gaertner (1981) và S. limacinum Honda & Yokochi (1998) dựa trên các Ďặc Ďiểm hình thành lên Ďộng bào tử; kích thước túi Ďộng bào tử và Ďộng bào tử cũng như số lượng Ďộng bào tử Ďược giải phóng ra từ túi Ďộng bào tử. Dựa trên quy trình phân lập là bẫy bằng phấn thông (pine pollen) của Gaertner, 1968 với một số thay Ďổi thì tại Việt Nam nhóm nghiên cứu của Đặng Diễm Hồng và cộng sự (2008) Ďã phân lập thành công các loài thuộc chi Schizochytrium Ďược lưu giữ và bảo quản ở nhiệt Ďộ thấp có sử dụng 15% glycerol và sự hỗ trợ của isopropanol [109, 110, 111]. Nhiều chủng/loài VTBDD thuộc chi Schizochytrium Ďã Ďược lựa chọn dựa trên tốc Ďộ sinh trưởng, hàm lượng lipid và hàm lượng một số chất chuyển hóa khá cao theo Ďịnh hướng khai thác chủng tiềm năng cho thương mại hóa các sản phẩm từ vi tảo. 1.4.2. Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium cho sản xuất squalene 1.4.2.1. Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium cho sản xuất squalene trên thế giới Nhiều nghiên cứu mới Ďây Ďã chứng minh rằng khả năng sản xuất squalene từ các chủng Schizochytrium có thể Ďược sử dụng như là nguồn thay thế cho sản xuất squalene thương mại. Trong báo cáo của Fan và cộng sự (2010), tác giả Ďã bổ sung Terbinafine (TBNF) - một chất ức chế squalene monooxygenase trong con Ďường sinh tổng hợp sterol nhằm nâng cao hàm lượng và hiệu suất squalene ở loài Aurantiochytrium mangrovei FB3 (tên khoa học cũ là Schizochytrium mangrovei FB3) [112]. Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng này có năng suất sinh khối cao nhất Ďạt 21,2 g/L ở nồng Ďộ glucose 60 g/L trong khi tốc Ďộ sinh trưởng cao nhất là 0,077 h-1 và hệ số sinh trưởng là 0,44 g/g ở nồng Ďộ glucose thấp hơn là 30 g/L. Hàm lượng squalene của tế bào A. mangrovei FB3 Ďạt cao nhất là 0,53 mg/L trong Ďiều kiện nuôi cấy có bổ sung glucose với nồng Ďộ 30g/L và 100 mg TBNF/L. Giá trị này cao hơn nhiều so với công bố trước Ďây ở Sacchromyces cerevisiae (0,041 mg/g sinh khối) và Torulaspora debrueckii (0,24 mg/g SKK theo công bố của Bhattacharjee và cs.cộng sự, (2001) [113]. Nghiên cứu này không chỉ chứng minh tiềm năng sản xuất squalene 38
ở loài vi tảo này mà còn cho thấy tác dụng của TBNF trong việc tích lũy của một số chất trung gian thiết yếu trong con Ďường sinh tổng hợp liên quan Ďến con Ďường chuyển hóa sterol. Nakazawa và cộng sự (2012) Ďã có thông báo rằng chủng Aurantiochytrium sp. 18W-13a dưới Ďiều kiện nuôi cấy tối ưu (25oC; 25 - 50% nước biển nhân tạo, glucose có nồng Ďộ 2 - 6%) thì hàm lượng và sản lượng squalene Ďạt gần 171 mg/g SKK và sản lượng Ďạt 0,9 g/L, tương ứng [114]. Hàm lượng này cao hơn bất kỳ các công bố trước Ďó ở thraustochytrids, thực vật và nấm men. Ngoài ra, công trình công bố của Watanabe (2011) và Nakazawa và cộng sự (2014) cũng cho thấy một số chủng VTBDD Aurantiochytrium sp. Ďược phân lập từ vùng biển của Nhật Bản có khả năng tích lũy cao squalene với sản lượng Ďạt 1 - 2,38 g/L, cao hơn 0,9 g/L của chủng 18W-13a nêu trên [115, 116]. Gần Ďây, tác giả Otagiri và cộng sự cũng tiến hành việc sàng lọc mở rộng các chủng có khả năng sản xuất squalene tại vùng nước ngập mặn Okinawa Ďã xác Ďịnh Ďược 14/172 chủng thuộc họ Thraustochytrid có khả năng sản xuất squalene có hàm lượng từ 7,54 - 13,9 mg/g SKK [117]. Các nguồn nito - thành phần quan trọng trong môi trường, Ďã Ďược tối ưu hóa cho sản xuất squalene ở vi tảo Aurantiochytrium cũng Ďã Ďược công bố (Chen và cs, 2010). Hàm lượng và năng suất squalene Ďều bị ảnh hưởng không chỉ bởi mì chính (monosodium glutamate), trypton, cao nấm men mà còn bởi sự tương tác của các thành phần nêu trên. Ở nồng Ďộ tối ưu của mì chính, trypton và cao nấm men là 6,61 g/L, 6,13 g/L và 4,50 g/L, năng suất squalene Ďạt Ďược tương ứng là 6,94 g/L, 6,22 g/L và 4,40 g/L [112]. Ngoài ra, công trình công bố mới nhất của Martins và cộng sự (2018) cũng cho thấy loài Aurantiochytrium sp. nuôi cấy trong Ďiều kiện có Ďộ mặn 1,5%, nồng Ďộ glucose ban Ďầu 3%, ở 26°C thì sau 48 giờ nuôi cấy Ďã cho sản lượng cao nhất của squalene là 7,3 g/100 g [118]. Để nâng cao hàm lượng squalene ở loài vi tảo này, ngoài việc tối ưu các yếu tố môi trường nuôi cấy thì việc Ďiều chỉnh quá trình trao Ďổi chất dựa trên hoạt Ďộng của các enzyme chìa khóa của quá trình tổng hợp squalene cũng là một vấn Ďề quan trọng cần phải nghiên cứu. Methyl jasmonate (MJA) Ďược sử dụng thành công Ďể cảm ứng hoặc tăng cường quá trình tổng hợp nhiều chất chuyển hóa thứ cấp quan trọng trong tế bào thực vật, ví dụ như ginsenoside và paclitaxel [119]. Đây là 2 chất Ďã Ďược sử dụng rộng rãi như là thuốc và thực phẩm chức năng. Tuy nhiên, chỉ có 39 một vài báo cáo về ảnh hưởng của MJA lên hoạt hoạt Ďộng của các enzyme quan trọng ở vi tảo trong việc sản xuất các chất chuyển hóa hữu ích. Hơn nữa, các thông tin về tác dụng của MJA Ďối với quá trình sinh tổng hợp các chất trung gian thiết yếu trong tế bào của các quá trình chuyển hóa chính còn rất hạn chế. Trong quá trình tổng hợp squalene, acetoacetyl-CoA Ďược tạo ra thông qua Ďường phân Ďược sử dụng Ďể tổng hợp 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA và sau Ďó tiếp tục Ďược chuyển Ďổi Ďể farnesyl diphosphate qua một số bước. Sau Ďó, squalene Ďược tổng hợp trực tiếp từ farnesyl diphosphate. Trong quá trình tổng hợp cholesterol, squalene là chất trao Ďổi trước khi hình thành vòng sterol. Khi có mặt của MJA với nồng Ďộ 0,1 mM, hàm lượng squalene S. mangrovei Ďạt cực Ďại (1,17 ± 0,06 mg/g) SKK sau 3 giờ xử lý ở 48 giờ nuôi cấy, cao hơn 60% so với Ďối chứng [120]. Việc tăng hàm lượng squalene có thể là do hoạt tính của squalene synthase Ďược tăng cường. Như vậy, hàm lượng squalene có thể Ďược tăng cường và cải thiện bằng cách: (1) sử dụng kiểu hay cách thức lên men khác nhau kết hợp với việc tối ưu các Ďiều kiện nuôi cấy; (2) sử dụng các kỹ thuật di truyền hay sinh học phân tử Ďể Ďiều khiển biểu hiện của các các gen tham gia chính vào con Ďường sinh tổng hợp squalene và bổ sung một số chất ức chế (như TBNF, MJA) giúp ngăn chặn con Ďường cạnh tranh với tổng hợp squalene Ďể dẫn Ďến tích lũy tối Ďa squalene [121]. Trong mối liên hệ giữa sinh tổng hợp terpenoid và DHA ở loài Schizochytrium, tác giả Xie và cộng sự (2017) Ďã nhận Ďịnh rằng Ďể có thể nuôi trồng sinh khối Schizochytrium có hàm lượng squalene cao cần phải xem xét kỹ Ďiều kiện nuôi trồng Ďể có thể cân Ďối giữa hai con Ďường tổng hợp terpenoid và DHA với một chất trung gian quan trọng là Acetyl - CoA [17]. Đây là vấn Ďề nghiên cứu cần phải Ďược làm sáng tỏ ở các chủng/loài của chi Schizochytrium phân lập ở Việt Nam Ďược xem là chủng/loài tiềm năng cho sản xuất squalene theo Ďịnh hướng có thể thương mại hóa Ďược trong thời gian tới. 1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng Schizochytrium cho sản xuất squalene ở Việt Nam
Ở Việt Nam, những loài/chủng VTBDD Ďã là Ďối tượng tiềm năng cho sản xuất sinh khối giàu PUFAs Ďể làm thực phẩm chức năng cho người và Ďộng vật nuôi trong nuôi trồng thủy sản; làm nguyên liệu cho sản xuất biodiesel cũng như dầu sinh học giàu DHA, EPA (như ở chi Schizochytrium) Ďã Ďược bắt Ďầu từ năm 40
2005 [122, 109]. Tuy nhiên, ở Việt Nam cho Ďến nay lại chưa có một công trình nghiên cứu khoa học nào một cách hệ thống về squalene từ các cơ thể sống (kể cả Ďộng, thực vật và vi sinh vật). Trong khi Ďó, Việt Nam lại là một quốc gia biển, rất Ďa dạng về tảo biển, có rất nhiều loài Ďặc hữu hứa hẹn là nguồn tiềm năng sản xuất squalene cho các ngành mỹ phẩm, dược phẩm. Khả năng tổng hợp cao cũng như nghiên cứu Ďiều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh khối tảo giàu squalene là rất cần thiết. Nhiều nghiên cứu Ďã chứng minh rằng khả năng sản xuất squalene từ các chủng Schizochytrium có thể Ďược sử dụng như là nguồn thay thế cho sản xuất squalene thương mại. Trên cơ sở Ďó, bằng phương pháp so màu, Đinh Thị Ngọc Mai và cộng sự (2013) Ďã xác Ďịnh Ďược hàm lượng squalene của 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng và 2 loài VTBDD, trong Ďó S. mangrovei PQ6 là chủng vi tảo có hàm lượng squalene Ďược xác Ďịnh bằng phương pháp so màu Ďạt cao nhất là 122 mg/g SKK [94]. Tuy nhiên, hàm lượng squalene của chủng nêu trên sau khi phân tách bằng TLC và Ďịnh lượng bằng HPLC là 33,134 mg/g SKK (tốc Ďộ tạo squalene Ďạt 0,992 g/L), thấp hơn so với giá trị tính toán Ďược theo phương pháp so màu (122 mg/g SKK). Điều này Ďược giải thích là do có sự mất mát của squalene sau các bước tách chiết và tinh sạch. Ngoài ra, ở phương pháp so màu, bên cạnh squalene thì các thành phần khác của lipid như lanosterol hoặc ergosterol cũng cho phản ứng màu dương tính. Chính vì vậy, Ďã dẫn Ďến kết quả tính toán theo phương pháp so màu có thể bao gồm cả squalene và các sterol khác. Như vậy, những nghiên cứu nhằm nâng cao hàm lượng squalene trong sinh khối loài vi tảo này như tối ưu môi trường nuôi cấy, bổ sung các chất ức chế sự phân giải của squalene trong tế bào... là cần thiết. Tuy nhiên, các nghiên cứu mới chỉ Ďược tiến hành thử nghiệm ở quy mô bình tam giác 250 mL. Trong báo cáo của Thom và cộng sự (2014), tác giả Ďã bước Ďầu nghiên cứu tối ưu môi trường nuôi cấy S. mangrovei thông qua nghiên cứu ảnh hưởng của nồng Ďộ glucose khác nhau và việc bổ sung TBNF vào môi trường nuôi Ďể nâng cao hàm lượng squalene. Sau 5 ngày nuôi cấy, hàm lượng và hiệu suất squalene mới chỉ Ďạt Ďược là 61,76 mg/g SKK và 629,94 mg/L, tương ứng. Với việc tăng nồng Ďộ TBNF lên 100 mg/L vào môi trường nuôi cấy thì hàm lượng squalene Ďã Ďạt 96,71 mg/g SKK [123]. Chủng VTBDD S. mangrovei PQ6 Ďược phân lập tại huyện Ďảo Phú Quốc, Kiên Giang từ 2006 - 2008, có khả năng chịu Ďược sự dao Ďộng lớn về Ďộ mặn, 41 nhiệt Ďộ, là một chủng vi tảo tiềm năng, dễ nuôi trồng trên các hệ thống bình lên men theo mẻ có thể tích 5, 10, 30 và 150 lít ở Ďiều kiện nhiệt Ďộ 28 - 30oC, môi trường nuôi là M1, có tốc Ďộ khuấy sục là 350 - 400 vòng/phút sau 96 - 120 giờ Ďể thu sinh khối, lượng sinh khối tươi (SKT) Ďạt 70 - 100/L tương Ďương với SKK là 20 - 30 g/L, hàm lượng lipid có thể lên tới 50-70% SKK ở các hệ thống bình lên men với thể tích khác nhau cho Ďến 150 lit. Vì vậy, loài vi tảo biển này Ďược xem là tiềm năng cho sản xuất sinh khối và các chất chuyển hóa như là PUFAs và squalene trên qui mô lớn [108]. Quá trình sản xuất sinh khối loài vi tảo này trong các hệ thống lên men với các kiểu và thể tích khác nhau từ bình tam giác 1 lít Ďến hệ thống lên men 5, 10, 30 và 150 lít cũng Ďã Ďược thử nghiệm. Hình 1.5 là hình minh họa cho các hệ thống lên men này [108].
5 lít 10 lít 30 lít 150 lít Hình 1.5. Các hệ thống bình lên men 5 lít, 10 lít, 30 lít và 150 lít cho nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng S. mangrovei PQ6
Mật Ďộ giống gốc trong bình tam giác Ďạt Ďược thông thường là (25 - 30) x 106 tế bào (TB)/ml sau 96 giờ nuôi cấy lắc sẽ Ďược chuyển vào các hệ thống lên men 30 lít với tỷ lệ giống ban Ďầu là 2 - 3% (v/v). Ở bình lên men 30 lít chứa 15 lít môi trường M12 (gồm 9% glucose, 1% cao nấm men, 17,5 g/L). Môi trường nuôi cấy Ďược bổ sung thêm 20 - 30 mL dầu ăn Ďể làm chất chống tạo bọt trong bình lên men. Chế Ďộ sục khí giữ nguyên ở 0,5 - 1 lít/lít/phút suốt thời gian lên men. Chế Ďộ khuấy Ďược duy trì ổn Ďịnh khoảng 300 - 400 vòng/phút. Thời gian lên men là 120 giờ. Sau khi quá trình lên men kết thúc, sinh khối tảo Ďược thu hoạch ngay trong ngày Ďể Ďảm bảo hàm lượng lipid và thành phần acid béo không bị thay Ďổi và Ďược bảo quản ở 4oC Ďến - 20oC cho Ďến khi sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 42
Sinh khối của loài vi tảo biển này cũng Ďã Ďược sử dụng làm nguyên liệu Ďể xây dựng nên quy trình sản xuất diesel sinh học. Trong báo cáo của Hoang và cs (2014), bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và HPLC, hàm lượng và sản lượng squalene Ďã Ďược xác Ďịnh Ďạt (33,00 ± 0,02) và (33,04 ± 0,03) mg/g SKK; và 0,992 g/L và 1,019 g/L từ bã sinh khối tảo sau quá trình sản xuất biodiesel. Ngoài ra, hàm lượng squalene trong bã sinh khối sau quy trình sản xuất biodiesel từ S. mangrovei PQ6 Ďược phân tích là khoảng (80,1 ± 0,03) mg/g SKK [124]. Kết quả này cho thấy tiềm năng to lớn trong việc khai thác squalene như một sản phẩm phụ có giá trị ngoài dầu diesel sinh học từ sinh khối S. mangrovei nhằm giảm giá thành của dầu diesel sinh học. Hiện nay có rất nhiều phương pháp tách chiết và tinh sạch squalene như: phương pháp chưng cất khử mùi (deodorization distillate), sử dụng CO2 siêu tới hạn, sử dụng các dung môi hữu cơ như n-hexan và phương pháp sắc ký cột silica gel… Tuy nhiên, trong Ďiều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam, Ďể phù hợp với Ďiều kiện kinh phí, chúng tôi nhận thấy cần phải thiết lập các phương pháp Ďơn giản, dễ làm, tương Ďối rẻ tiền nhằm tách chiết và tinh sạch squalene Ďảm bảo Ďạt tiêu chuẩn cho phép thương mại hóa sản phẩm này. Các phương pháp nghiên cứu Ďược dùng Ďể xác Ďịnh hàm lượng squalene có trong sinh khối VTBDD là TLC, sắc ký cột, HPLC. Mặc dù những nghiên cứu về chi Schizochytrium ở Việt Nam vẫn còn hạn chế nhưng có thể thấy tiềm năng ứng dụng của loại vi tảo này là rất lớn. Sau khi Ďã chọn Ďược chủng/loài tiềm năng cho sản xuất squalene cao, trong Ďiều kiện phòng thí nghiệm hiện nay, cần thiết phải có các nghiên cứu Ďể tìm ra Ďược Ďiều kiện nuôi trồng tối ưu trên các quy mô lớn khác nhau cho sinh khối tảo giàu squalene; xây dựng Ďược các phương pháp phù hợp cho tách chiết squalene từ các loài thuộc chi Schizochytrium; xác Ďịnh Ďược tính an toàn, tác dụng sinh dược trên mô hình Ďộng vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro); làm sáng rõ Ďược hoạt tính sinh dược và cơ chế tác dụng của squalene Ďể có thể khuyến cáo việc ứng dụng sản phẩm này trong Ďời sống con người. Nhằm góp phần tham gia giải quyết các vấn Ďề nêu trên, chúng tôi thực hiện Ďề tài “Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hƣớng để làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dƣợc phẩm”. 43
CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu 2.1.1. Mẫu vật 40 chủng VTBDD thuộc chi Schizochytrium, Thraustochytrium sử dụng trong nghiên cứu trong Ďó có 31 chủng Schizochytrium và 8 chủng Thraustochytrium phân lập từ các vùng bờ biển và rừng ngập mặn ở Hải Phòng, Nam Định, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An và Bình Định trong năm 2013-2014, Ďặc biệt chủng S. mangrovei PQ6 Ďược phân lập ở Huyện Ďảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang từ năm 2006-2008 (Bảng 2.1). Tất cả các chủng VTBDD sau phân lập Ďược lưu giữ trong Bộ sưu tập giống của phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Bảng 2.1. Danh sách các chủng thuộc chi Schizochytrium và Thraustochytrium STT Ký hiệu Địa Ďiểm thu mẫu Tọa Ďộ Ďiểm thu mẫu các chủng Thuộc chi Schizochytrium 1 HP1 Đồ Sơn, Hải Phòng 20°42′49″B 106°47′22″Đ 2 HP2 Đồ Sơn, Hải Phòng 20°42′49″B 106°47′22″Đ 3 HP3 Đồ Sơn, Hải Phòng 20°42′49″B 106°47′22″Đ 4 HP4 Đồ Sơn, Hải Phòng 20°42′49″B 106°47′22″Đ 5 HP5 Đồ Sơn, Hải Phòng 20°42′49″B 106°47′22″Đ 6 HP6 Đồ Sơn, Hải Phòng 20°42′49″B 106°47′22″Đ 7 QN1 Tiên Yên, Quảng Ninh 21°12' - 21°33'B 107°13' - 107°13'Đ 8 QN2 Tiên Yên, Quảng Ninh 21°12' - 21°33'B 107°13' - 107°13'Đ 9 QN3 Tiên Yên, Quảng Ninh 21°12' - 21°33'B 107°13' - 107°13'Đ 10 QN4 Tiên Yên, Quảng Ninh 21°12' - 21°33'B 107°13' - 107°13'Đ 11 QN5 Tiên Yên, Quảng Ninh 21°12' - 21°33'B 107°13' - 107°13'Đ 12 QN6 Tiên Yên, Quảng Ninh 21°12' - 21°33'B 107°13' - 107°13'Đ 13 ND1 Hải Hậu, Nam Định 21°00' - 21°15'B 106°00' - 106°21'Đ 14 ND2 Hải Hậu, Nam Định 21°00' - 21°15'B 106°00' - 106°21'Đ 15 ND3 Hải Hậu, Nam Định 21°00' - 21°15'B 44
106°00' - 106°21'Đ 16 ND4 Hải Hậu, Nam Định 21°00' - 21°15'B 106°00' - 106°21'Đ 17 ND5 Hải Hậu, Nam Định 21°00' - 21°15'B 106°00' - 106°21'Đ 18 ND6 Hải Hậu, Nam Định 21°00' - 21°15'B 106°00' - 106°21'Đ 19 TH1 Tĩnh Gia, Thanh Hóa 19°27'12"B 105°43'53"Đ 20 TH3 Tĩnh Gia, Thanh Hóa 19°27'12"B 105°43'53"Đ 21 TH6 Tĩnh Gia, Thanh Hóa 19°27'12"B 105°43'53"Đ 22 NA1 Cửa Lò, Nghệ An 180°45’ – 180°50’B 1050°42’ - 1050°45’Đ 23 NA2 Cửa Lò, Nghệ An 180°45’ – 180°50’B 1050°42’ - 1050°45’Đ 24 NA3 Cửa Lò, Nghệ An 180°45’ – 180°50’B 1050°42’ - 1050°45’Đ 25 NA4 Cửa Lò, Nghệ An 180°45’ – 180°50’B 1050°42’ - 1050°45’Đ 26 NA5 Cửa Lò, Nghệ An 180°45’ – 180°50’B 1050°42’ - 1050°45’Đ 27 BĐ6 Thị Nại, Bình Định 13°50'35"B 109°14'57"Đ 28 BĐ7 Thị Nại, Bình Định 13°50'35"B 109°14'57"Đ 29 BĐ8 Thị Nại, Bình Định 13°50'35"B 109°14'57"Đ 30 BĐ9 Thị Nại, Bình Định 13°50'35"B 109°14'57"Đ 31 BĐ10 Thị Nại, Bình Định 13°50'35"B 109°14'57"Đ 32 PQ6 Huyện Ďảo Phú Quốc, 9°53′ - 10°28′ B tỉnh Kiên Giang 103°49′ - 104°05′ Đ Thuộc chi Thraustochytrium 33 TN1 Đầm Thị Nại, tỉnh Bình Định 13°50'35"B 109°14'57"Đ 34 TN2 Đầm Thị Nại, Bình Định 13°50'35"B 109°14'57"Đ 35 TG4 Tĩnh Gia, Thanh Hóa 19°27'12"B 105°43'53"Đ 36 TG9 Tĩnh Gia, Thanh Hóa 19°27'12"B 105°43'53"Đ 37 TG10 Tĩnh Gia, Thanh Hóa 19°27'12"B 105°43'53"Đ 38 TG11 Tĩnh Gia, Thanh Hóa 19°27'12"B 105°43'53"Đ 39 TG12 Tĩnh Gia, Thanh Hóa 19°27'12"B 105°43'53"Đ 40 TG15 Tĩnh Gia, Thanh Hóa 19°27'12"B 105°43'53"Đ Ghi chú: Ký hiệu chủng: chữ cái - địa điểm phân lập, chữ số: ký hiệu chủng. Tọa độ: B- vĩ độ Bắc, Đ-kinh độ Đông 2.1.2. Các bộ k t sinh phẩm Kit tinh sạch sản phẩm PCR (Genjet Purification, Thermo ScientificTM (EU)), kit tách chiết ARN tổng số RNAiso Plus (Takara, Tokyo, Nhật Bản), kit tổng hợp cDNA (RevertAid First Strand cDNA -Thermo Fisher Scientific Inc., Singapore) Ďã Ďược sử dụng trong nghiên cứu. Trình tự mồi cho phản ứng real time PCR (Ďược thiết kể bởi TS. Hoàng Thị Minh Hiền, Phòng Công nghệ Tảo, Viện 45
Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Ďược chỉ ra trong Bảng 2.2. Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi Ďược sử dụng trong phản ứng qPCR
Kích thƣớc Gene Mồi (5´-3´) Trình tự dự đoán (bp) CYP7A1 Forward CTAAGGAGGATTTCACTTGC 459 (h) Reverse ACTGGTCCAAAGGTGGACAT Forward GAACTCCCGCCAAGATCAAGAAAG 491 LDL-R (h) Reverse GTCCGGGCAGGCGCAGGTAAA Forward AAGCACTTCCTCCGAGTCAA 462 ABCA-1 (h) Reverse TGACAGGCTTCACTCCACTG Forward CGGGCTTCCACTACAATGTT 332 LXRα (h) Reverse CTTCTCGATCATGCCCAGTT ABCA- Forward TTGATGAGAAGAGCCACCCTGGTT 122 1(m) Reverse ATTGTGGCCCAGGAAGGTAAT ABCG- Forward ACCTACCACAACCCAGCAGACTTT 160 1(m) Reverse GGTGCCAAAGAAACGGGTTCACAT Forward AGGAACAGACCCAGCAAATAC 115 ApoE(m) Reverse TTCTCCATCAGGTTTGCCC Forward CCACTCACGGCAAATTCAAC 140 GAPDH(m) Reverse CTCCACGACATACTCAGCAC Forward GGAGTGTCGACTTCGCAAATG 70 LXRα(m) Reverse GATCTGTTCTTCTGACAGCACACA Forward CCCCACAAGTTCTCTGGACACT 70 LXRβ(m) Reverse TGACGTGGCGGAGGTACTG Forward ACCACAGTCCATGCCATCAC 452 GAPDH(h) Reverse TCCACCACCCTGTTGCTGTA Ghi chú: h: người (cặp mồi dùng cho tế bào HepG2); m: chuột (cặp mồi dùng cho tế bào RAW264.7; Forward: xuôi, Reverse: ngược 2.1.3. Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng (CNT) trưởng thành, dòng Swiss, số lượng 64 con, không phân biệt giống, cân nặng 18 - 22g/1 con. Chuột cống trắng (CCT) trưởng thành, dòng Wistar, số lượng 24 con, không phân biệt giống, cân nặng 160 - 180g/1 con. Động vật do Ban Ďộng vật thí nghiệm - Học Viện Quân Y cung cấp, Ďược nuôi trong phòng nuôi Ďộng vật thí nghiệm một tuần trước khi nghiên cứu bằng thức ăn chuẩn dành cho Ďộng vật nghiên cứu, nước sạch uống tự do. Thức ăn cho chuột thí nghiệm Ďược bộ môn Dược lý - Học viện Quân y sản xuất theo công thức sau (g): Bột mỳ - 200, bột ngô - 250, Bột sữa - 100, bột Ďỗ
tương - 200, bột cá - 200, CaCl2 - 5, NaCl - 5, dầu Ďậu nành - 40 và vitamin tổng 46 hợp - 2 viên. Các nguyên liệu khô Ďược trộn Ďều, làm thành bánh, sấy khô Ďến khối lượng không Ďổi, bảo quản trong thùng chứa chuyên dụng. 2.1.4. Các dòng tế bào Các dòng tế bào gan người HepG2 và tế bào Ďại thực bào từ chuột RAW264.7 có nguồn gốc từ ngân hàng Tế bào sống, trường Đại Học Seoul, Hàn Quốc do GS. TS. Sung-Joon Lee, Trường Đại Học Korea, Hàn Quốc tặng. 2.1.5. Hóa chất Các hóa chất dùng Ďể phân lập, giữ giống và nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng gồm: glucose (Việt Nam), cao nấm men (Merk, Đức), muối biển nhân tạo (Tropic Marine, Aquarientechk, Wartenberg, Đức), polypepton (Merck, Đức), chloramphenicol (Việt Nam), agar (Việt Nam), vitamin B1, B2, B6... Hóa chất dùng Ďể tách chiết lipit và squalene: ethanol, methanol, n-hexan, , chloroform, KOH (Trung Quốc), NaCl 0,9%, Na2SO4 Silica gel (Merck, Đức). Hóa chất dùng cho nhuộm lipid trong tế bào vi tảo: Nile Red (9- (Diethylamino)-5H benzo [α] phenoxazin-5-one, Sigma), Oil Red O (ORO - 1-([4- (Xylylazo)xyly]azo)phenylazo]-2-naphthol) Hóa chất dùng cho việc Ďịnh lượng squalene bằng phương pháp so màu, phương pháp phân tích bằng TLC, HPLC: squalene chuẩn (C30H50, Sigma S3626),
H2SO4, formaldehyde, acid acetic, diethylether (Trung Quốc). Hóa chất dùng Ďể nuôi cấy tế bào: môi trường nuôi cấy Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/high glucose, Fetal bovine serum (FBS), bovine serum albumin, Hank’s buffered salt solution (HBSS), penicillin, và streptomycin
(Invitrogen, Mỹ), Fenofibrate (C20H21ClO4, Sigma F6020), T0901317
(C17H12NSO3F9, Sigma T2320), Oil Red O (C26H24N4O, Sigma O0625), acid palmitic (PA), acid oleic (OA), isopropanol (Trung Quốc). 2.1.6. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm Kính hiển vi quang học Olympus CX21 (Nhật Bản); kính hiển vi huỳnh quang NIKON eclipse 80i-Nhật Bản; kính hiển vi Ďiện tử quét (SEM) JEOL JSM - 6400 (Nhật Bản); kính hiển vi Ďiện tử truyền qua (TEM) JEM1010 (Nhật Bản); buồng Ďếm số lượng tế bào Burker - Turk (Đức); Máy Ďo mật Ďộ quang học UV- 1601 Shimazu (Nhật Bản); tủ nuôi cấy vi sinh (Binder, Đức), máy lắc IKA KS 260 basic (Đức); Máy sắc kí khí HP-6890; Cân kỹ thuật Precisa XB 1200C (max 1200 47 g; e= 0,1 g; min 0,5 g; d= 0,01 g) (Switzerland) cân phân tích (Precisa XT2200A, Thụy Điển); máy ly tâm lạnh cỡ lớn (Sorvall, Đức); Nồi khử trùng ALP (Nhật Bản); pH kế Melter Toledo (Đức); Máy cô quay chân không IKA (Đức); máy khuấy từ Kika Labortechnik (Đức), máy lắc IKA KS 260 basic (Đức); tủ sấy Cornthem (New Zealand); Máy ly tâm Sorvall Legen RT 1900W (Kendro, Germany); Tủ lạnh thường; Máy sắc ký lỏng cao áp với cột sắc ký lỏng Thermo Hypersild Gold C18 (150 x 2,1 mm, 3 µm); Bản TLC 20 x 20 cm có phủ silicagel 60 (Merck; Đức); Cột sắc ký; Các bình tam giác thuỷ tinh loại 50, 100, 250, 500 mL; bình nhựa các loại với thể tích 1,5 và 10 L; các loại ống Ďong hình trụ có chia Ďộ với thể tích khác nhau; cối-chày sứ; giấy lọc GF/C (What man); Pipetteman các loại (Gilson, France); Pipette Pasteur (USA); Pipette tự Ďộng và các dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm. Bình lên men 30 lít tự tạo: không có hệ thống Ďiều chỉnh nhiệt Ďộ, pH cũng như Ďo lượng oxy hòa tan …Quá trình lên men Ďược tiến hành ở nhiệt Ďộ phòng. Không khí Ďược cấp từ máy nén khí qua cột lọc thô và phin lọc khí vô trùng trước khi Ďược sục vào bình lên men. Tốc Ďộ cánh khuấy Ďược cố Ďịnh vào khoảng 300- 400 vòng/phút. Máy chạy PCR GeneAmp® PCR System 9700 (ABI, Mỹ); Phản ứng qPCR Ďược thực hiện trên máy LightCycler2.0 system (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany) với SYBR Green (Thermo); bộ Ďiện di DNA (Advance Tech, Nhật Bản), máy soi DNA (Bio-Rad, Mỹ); máy Ďọc trình tự tự Ďộng ABI PRISM 3100- Avant Genetic Analyzer (Mỹ); máy li tâm Eppendorf 5415 (Eppedorf, Đức); bể ổn nhiệt Memmerl (Đức); máy quang phổ UV-1650PC (Nhật Bản). Máy xét nghiệm sinh hoá Biochemical Systems International Srl, Italia, model 3000 Evolution, hóa chất của hãng; Máy phân tích huyết học Humancout 30TS, hãng Human, Đức, sử dụng phần mềm phân tích huyết học dành cho chuột thí nghiệm, hóa chất của hãng; Cân phân tích 10-4, model CP224S (Sartorius - Đức); Bộ dụng cụ mổ Ďộng vật cỡ nhỏ và các dụng cụ thí nghiệm khác. 2.1.7. Môi trường nuôi cấy Môi trường giữ giống và cấy chuyển chi Schizochytrium: ký hiệu GPY bao gồm glucose (2 g/L), polypepton (1 g/L), cao nấm men (0,5 g/L), muối biển nhân tạo (17,5 g/L), agar (15 g/L). Các chủng tảo thuộc chi Schizochytrium Ďược nuôi trong các bình tam giác 1.000 mL chứa 300 mL môi trường M1 (3% glucose, 1% cao nấm men, muối biển 48 nhân tạo 17,5 g/L - tương Ďương với hàm lượng NaCl là 1,5%), chế Ďộ lắc 200 vòng/phút ở 25-28oC [125]. Đối với Thraustochytrium Ďược nuôi trên môi trường Bajpai cải tiến với các thành phần như sau (%): NaCl - 2,5, MgSO4.7H2O - 0,5, KCl-0,01, KH2PO4 - 0,01,
CaCO3 - 0,02, (NH4)2SO4 - 0,02, sodium glutamate - 0,2, NaHCO3 - 0,01, glucose -
2, cao nấm men - 0,2, vitamin B1 1mg/L, vitamin B2 0,1 mg/L, chế Ďộ lắc 200 vòng/ phút ở 25 - 28oC [125]. Môi trường nuôi trồng Schizochytrium spp. trong bình lên men 30 lít gồm: - Môi trường sử dụng cho lên men theo mẻ là môi trường M12 (9% glucose, 1% cao nấm men, muối biển nhân tạo 17,5 g/L). - Các môi trường sử dụng Ďể nhân giống cấp 1 (CNT1), giống cấp 2 (CNT2) cho lên men theo mẻ (CNT3) có bổ sung cơ chất gồm: Môi trƣờng CNT1 (%): glucose - 3, cao nấm men - 0,4, monosodium glutamate - 6,42, NaCl - 1,25, MgSO4
- 0,4, KCl - 0,05, CaCl2 - 0,01, NaHCO3 - 0,05, KH2PO4 - 0,4, hỗn hợp vitamin -
0,14 (vitamin B1 - 45 g/L, vitamin B6 - 45 g/L và vitamin B12 - 0,25 g/L) và vi lượng - 0,8. Môi trƣờng CNT2 (%): glucose - 8,57, cao nấm men - 0,64, monosodium glutamate - 6,42, NaCl - 2, KH2PO4 - 0,64, MgSO4 - 2,29, CaCl2 -
0,03, NaHCO3 - 0,03, Na2SO4 - 0,03, hỗn hợp vitamin - 0,14 (vitamin B1 - 45 g/L, vitamin B6 - 45 g/L và vitamin B12 - 0,25 g/L) và vi lượng - 0,2. Môi trƣờng CNT3 (%): glucose- 7,5, cao nấm men - 1,2, monosodium glutamate- 6,42, NaCl - 0,25,
KH2PO4- 0,96, MgSO4- 1,2, CaCl2- 0,12, NaHCO3- 0,12, KCl-0,08, hỗn hợp vitamin - 0,4 (vitamin B1 - 45 g/L, vitamin B6 - 45 g/L và vitamin B12 - 0,25 g/L), vi lượng và dầu thực vật - 0,56. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Nhóm phương pháp xác định chủng/loài; đặc điểm sinh học; điều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng cho sản xuất squalene cao 2.2.1.1. Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào và sinh khối khô [125] Sinh trưởng của Schizochytrium spp. có thể Ďược xác Ďịnh thông qua hai thông số: - Mật Ďộ tế bào: sử dụng buồng Ďếm Burker - Turk (Đức). Số lượng tế bào Ďếm Ďược trong 5 ô vuông lớn sẽ Ďược dùng Ďể tính mật Ďộ tế bào theo công thức sau: D = A*X*104 trong Ďó: D: Mật Ďộ tế bào (tế bào/ml); A: Tổng số tế bào trong cả buồng Ďếm; X: Hệ số pha loãng 49
- Khối lượng khô: lấy 10 ml dịch tảo ly tâm thu sinh khối tế bào ở 4.000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển sinh khối tảo thu Ďược sang cốc sấy và sấy ở 105°C cho Ďến khi khối lượng không Ďổi. Khối lượng tảo Ďược tính bằng khối lượng cốc chứa mẫu (m2) trừ Ďi khối lượng cốc ban Ďầu (m1) tính trên lượng dịch nuôi Ďem phân tích theo công thức sau:
Khối lượng tảo (g/L) = m2 - m1 x 1000
10 2.2.1.2. Phương pháp chụp ảnh hình thái Hình thái tế bào Ďược chụp bằng máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY 7.0 của Nhật Bản dưới kính hiển vi quang học Olympus CX21 ở Ďộ phóng Ďại 400 lần và Ďộ phóng Ďại của máy ảnh 3 lần [108]. 2.2.1.3. Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số trong sinh khối tảo Lipid trong sinh khối tảo Ďược xác Ďịnh theo phương pháp của Bligh & Dyer (1959) có một số cải tiến cho phù hợp với Ďiều kiện của Phòng thí nghiệm Công nghệ Tảo. Quy trình ngắn gọn như sau: Cân 1 gam sinh khối tảo khô cho vào cối sứ và nghiền mịn trong cát thủy tinh. Sau Ďó bổ sung 5 mL nước cất, 6 mL cloroform và 12 mL methanol vào cối sứ. Hỗn hợp Ďược nghiền Ďều trong 2 phút và chuyển vào ống ly tâm. Sử dụng 6 mL cloroform rửa cối chày sứ, chuyển vào ống ly tâm. Hỗn hợp Ďược voltex Ďều trong 30 giây. Tiếp tục rửa cối bằng 6 mL nước cất. Sau Ďó, hỗn hợp Ďược ly tâm ở 5.500 vòng/phút trong 15 phút Ďể phân lớp. Lớp trên chứa chủ yếu là nước và methanol, lớp dưới chứa chủ yếu là lipid, cloroform và bã sinh khối. Thu lớp dưới và lọc bỏ bã sinh khối. Cất quay loại bỏ dung môi Ďể thu sản phẩm lipid và cân khối lượng lipid thu Ďược [126]. 2.2.1.4. Phương pháp nhuộm lipid bằng Nile Red [127] 50 l dung dịch Nile Red có nồng Ďộ 0,1 mg/mL pha trong aceton Ďược bổ sung vào 1 mL dịch nuôi tảo. Hỗn hợp Ďược voltex nhẹ nhàng và ủ trong tối 10 phút ở nhiệt Ďộ phòng. Các tế bào tảo sau khi nhuộm Nile Red Ďược quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang với ánh sáng kích thích có bước sóng 450-490 nm và ánh sáng phát huỳnh quang của Nile Red ở bước sóng 540-640 nm. 2.2.1.5. Phương pháp xác định đường khử bằng DNSA [128] Dựa trên phản ứng tạo màu giữa Ďường khử với thuốc thử acid dinitro- salixylic (DNSA). Chất phản ứng gồm 1% DNSA, 30% kali natri tartrat tetrahydrat
(COOKCH(OH)CH(OH)COONa.4H2O) và 0,4M NaOH. Cách tiến hành: Các phần thể tích bằng nhau của mẫu và chất phản ứng DNSA Ďược hoà trộn và Ďun sôi cách 50 thủy Ďể gia nhiệt trong 10 phút. Sau Ďó, hỗn hợp dung dịch Ďược Ďể nguội tới nhiệt Ďộ phòng và pha loãng bằng nước cất, sao cho Ďộ hấp thụ ở bước sóng 540 nm nằm trong khoảng tuyến tính. Cường Ďộ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng Ďộ Ďường khử trong phạm vi nhất Ďịnh. Từ Ďồ thị chuẩn lập Ďược Ďối với glucose tinh khiết sẽ tính Ďược hàm lượng Ďường khử quy về glucose có trong mẫu phân tích. 2.2.1.6. Phương pháp xác định sơ bộ hàm lượng squalene Squalene Ďược Ďịnh lượng bằng phương pháp so màu [129] theo công bố của Rothblat và cộng sự (1962) có một số cải tiến cho phù hợp với Ďiều kiện của phòng thí nghiệm của Việt Nam. Quy trình ngắn gọn như sau: 1 mL acid sulfuric Ďậm Ďặc Ďược bổ sung vào ống nghiệm chứa lipid và ống thí nghiệm Ďược Ďặt trong bể ổn nhiệt ở 70oC trong 5 phút. Sau giai Ďoạn giữ ấm, tiến hành bổ sung từ từ 0,5 mL dung dịch formaldehyde và lắc Ďều ống chứa mẫu. Sau Ďó, ống chứa mẫu Ďược Ďậy nắp và Ďặt trong nước sôi trong 10 phút. Ngay sau khi Ďưa mẫu khỏi bể ổn nhiệt, bổ sung 2,5 mL acid acetic lạnh Ďể Ďưa thể tích mẫu lên 4 mL, trộn Ďều hỗn hợp và tiến hành xác Ďịnh mật Ďộ quang ở bước sóng 400 nm bằng máy quang phổ (Hitachi U-1100 Spectrophotometer, Nhật Bản). Hàm lượng squalene trong mẫu Ďược xác Ďịnh dựa trên giá trị OD Ďược Ďo tại bước sóng 400 nm và Ďường chuẩn về tương quan giữa hàm lượng squalene chuẩn (C30H50, Sigma S3626) với giá trị mật Ďộ quang Ďo Ďược ở bước sóng 400 nm tương ứng. Kết quả Ďường chuẩn xây dựng Ďược về mối tương quan giữa nồng Ďộ squalene và giá trị OD400 tương ứng có trong Phụ lục 1, Hình P1. 2.2.1.7. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng thuộc chi Schizochytrium cho sản xuất squalene cao Cấp độ bình tam giác Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ cao nấm men, nồng độ glucose ban đầu, nồng độ terbinafine: S. mangrovei PQ6 Ďược nuôi trong bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường M1 ở 28oC, lắc 200 vòng/ phút trong 5 ngày Ďược sử dụng làm giống Ďể bổ sung vào các công thức thí nghiệm. Các công thức thí nghiệm Ďược tiến hành trong bình tam giác 500 mL chứa 200 mL môi trường M1. Các thông số nuôi cấy Ďược thay Ďổi bao gồm nhiệt Ďộ, nồng Ďộ cao nấm men, nồng Ďộ glucose ban Ďầu, nồng Ďộ TBNF. Nhiệt Ďộ nuôi cấy (15, 20, 25 và 30oC) Ďược kiểm soát trong ± 1ᵒC. Nồng Ďộ glucose ban Ďầu, cao nấm men và TBNF dao Ďộng trong 15, 30, 40, 60 và 90 g/L; 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4 %; 0, 0,1, 1, 10, 100, 150 và 200 µg/mL, 51 tương ứng, trong khi các thành phần khác vẫn giữ nguyên mức như trong môi trường cơ bản.
Nghiên cứu ảnh hưởng của hỗn hợp vitamin (B1, B6, B12): S. mangrovei PQ6 Ďược nuôi trong bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường M1 ở 28oC, lắc 200 vòng/ phút trong 5 ngày Ďược sử dụng làm giống Ďể bổ sung vào các công thức thí nghiệm. Các công thức thí nghiệm Ďược tiến hành trong bình tam giác 500 mL chứa 200 mL môi trường CNT3 có bổ sung 0,2; 0,4; 0,6% hỗn hợp vitamin (vitamin
B1 - 45 g/L, vitamin B6 - 45 g/L và vitamin B12 - 0,25 g/L), Ďối chứng là môi trường CNT3 không bổ sung hỗn hợp vitamin. Sau các khoảng thời gian 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 giờ nuôi, tiến hành thu, Ďếm mật Ďộ tế bào (MĐTB), xác Ďịnh sinh khối tươi (SKT), SKK, và squalene có trong sinh khối tảo. Cấp độ bình lên men 30 lít Nghiên cứu ảnh hưởng của glucose Giống cấp 1: S. mangrovei PQ6 Ďược nuôi cấy trên môi trường thạch GPY với Ďiều kiện 28C. Sau khi kiểm tra giống sơ cấp ban Ďầu tốt, khuẩn lạc có hình thái Ďiển hình, có màu sắc Ďặc trưng của chủng PQ6, tiến hành lấy một cụm khuẩn lạc cấy chuyển sang các bình nuôi 1 Lít có chứa 300 mL môi trường M1, lắc ở 200 v/p, nhiệt Ďộ nuôi 28C trong thời gian 96 h. 2% giống cấp 1 sau Ďó sẽ Ďược bổ sung vào bình lên men 30 Lít có chứa 15 Lít môi trường M12 và 15 mL dầu thực vật với nồng Ďộ glucose thay Ďổi từ 3, 6, 9, 12 và 22% Ďể bảo Ďảm mật Ďộ giống ban Ďầu trong bình lên men khoảng 1-2 x106 tế bào/mL. Chế Ďộ sục khí giữ nguyên ở 0,5 Lít/Lít/phút trong suốt thời gian lên men. Tốc Ďộ khuấy Ďược duy trì trong suốt quá trình lên men là 300 v/p. pH của môi trường Ďược giữ nguyên 6-7, nhiệt Ďộ lên men tùy thuộc vào nhiệt Ďộ phòng (25- 35oC). Sau khoảng thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 giờ lên men, tiến hành thu mẫu, chụp ảnh hình thái tế bào, Ďếm MĐTB, xác Ďịnh sinh khối tươi, SKK, phân tích hàm lượng lipid và squalene có trong sinh khối tảo. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ: Giống cấp 1 Ďược bổ sung 2% vào bình lên men 30 Lít có chứa 15 Lít môi trường M12 và 15 mL dầu thực vật với nguồn nitơ là 1% cao nấm men hoặc kết hợp 1,2% cao nấm men (Y) và 6,42% monosodium glutamate (YM). Mật Ďộ giống ban Ďầu trong bình lên men Ďạt khoảng 1-2 x 106 tế bào/mL. Chế Ďộ sục khí giữ nguyên 52
ở 0,5 Lít/Lít/phút trong suốt thời gian lên men. Tốc Ďộ khuấy Ďược duy trì trong suốt quá trình lên men khoảng 300 v/p. pH của môi trường Ďược giữ nguyên 6-7, nhiệt Ďộ lên men tùy thuộc vào nhiệt Ďộ phòng (25-35oC). Sau khoảng thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 giờ lên men, tiến hành thu, chụp ảnh hình thái tế bào, Ďếm MĐTB, xác Ďịnh SKT, SKK, phân tích hàm lượng Ďường dư và squalene có trong sinh khối tảo. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch): Giống cấp 1: S. mangrovei PQ6 Ďược nuôi cấy trên môi trường thạch GPY ở Ďiều kiện 28C. Sau khi kiểm tra giống sơ cấp ban Ďầu tốt, khuẩn lạc có hình thái Ďiển hình, có màu sắc Ďặc trưng của chủng PQ6, tiến hành lấy một cụm khuẩn lạc cấy chuyển sang các bình nuôi 500 mL có chứa 200 mL môi trường CNT1, lắc ở 200 v/p, nhiệt Ďộ nuôi 28C trong thời gian 24 h. Giống cấp 2: 1% giống cấp 1 Ďược bổ sung vào bình tam giác 2 Lít có chứa 1 Lít môi trường CNT2, lắc ở 200 v/p, nhiệt Ďộ nuôi 28C trong thời gian 24 h. Giống cấp 2 Ďược bổ sung 2% vào bình lên men 30 Lít có chứa 15 Lít môi trường CNT3 Ďể bảo Ďảm mật Ďộ giống nuôi ban Ďầu là 1-2 x 106 tế bào/mL. Tại 48 giờ lên men theo mẻ tiến hành bổ sung Ďường Ďến 22%. Sau khoảng thời gian 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 và 108 giờ, tiến hành thu mẫu tảo, Ďếm mật Ďộ tế bào, xác Ďịnh SKT, SKK, phân tích hàm lượng Ďường dư và squalene có trong sinh khối tảo. Chế Ďộ sục khí giữ nguyên ở 0,5 Lít/Lít/phút trong suốt thời gian lên men. Tốc Ďộ khuấy Ďược duy trì trong suốt quá trình lên men khoảng 300 v/p. pH của môi trường Ďược giữ nguyên 6-7, nhiệt Ďộ lên men tùy thuộc vào nhiệt Ďộ phòng (25-35oC). Nghiên cứu ảnh hưởng của vitamin trong lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất Giống cấp 1: S. mangrovei PQ6 Ďược nuôi cấy trên môi trường thạch GPY với Ďiều kiện 28C. Sau khi kiểm tra giống sơ cấp ban Ďầu tốt, khuẩn lạc có hình thái Ďiển hình, có màu sắc Ďặc trưng của chủng PQ6, tiến hành lấy một cụm khuẩn lạc cấy chuyển sang các bình nuôi 500 mL có chứa 200 mL môi trường CNT1, lắc ở 200 v/p, nhiệt Ďộ nuôi 28C trong thời gian 24 h. Giống cấp 2: 1% giống cấp 1 Ďược bổ sung vào bình tam giác 2 Lít có chứa 1 Lít môi trường CNT2 có hoặc không có bổ sung 0,14% hỗn hợp vitamin (vitamin
B1 -45 g/L, vitamin B6 - 45 g/L và vitamin B12 - 0,25 g/L), lắc ở 200 v/p, nhiệt Ďộ nuôi 28C trong thời gian 24 h. 53
Giống cấp 2 Ďược bổ sung 2% vào bình lên men 30 Lít có chứa 15 Lít môi trường CNT3 có hoặc không có bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin (vitamin B1 - 45 g/L, vitamin B6 - 45 g/L và vitamin B12 - 0,25 g/L). Mật Ďộ tế bào ban Ďầu trong bình lên men 30 Lít Ďạt khoảng (1 - 2 x 106) tế bào/mL. Sau khoảng thời 12, 24, 36, 48 giờ tiến hành thu mẫu xác Ďịnh hàm lượng Ďường dư. Khi Ďường dư giảm xuống dưới 2% thì tiến hành bổ sung Ďường lên 22%. Sau khoảng thời gian 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, và 108 h tiến hành thu mẫu, Ďếm mật Ďộ tế bào, xác Ďịnh SKT, SKK, phân tích hàm lượng Ďường dư và squalene có trong sinh khối tảo. Chế Ďộ sục khí giữ nguyên ở 0,5 Lít/Lít/phút trong suốt thời gian lên men. Tốc Ďộ khuấy Ďược duy trì trong suốt quá trình lên men khoảng 300 v/p. pH của môi trường Ďược giữ nguyên 6-7, nhiệt Ďộ lên men tùy thuộc vào nhiệt Ďộ phòng (25-35oC). 2.2.2. Nhóm phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch squalene từ S. mangrovei PQ6 2.2.2.1. Phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ sinh khối S. mangrovei PQ6 Phương pháp tách chiết squalene từ lipid tổng số [130] - Phân tách lipid không xà phòng hóa (KXPH) từ lipid tổng số [130] Tách chiết lipid KXPH Ďược thực hiện theo mô tả của Lewis và cộng sự (2001) có một số cải tiến cho phù hợp với Ďiều kiện của Việt Nam. Lipid tổng số Ďược cho phản ứng với dung dịch KOH 5% (khối lượng/thể tích) trong metanol- nước (4:1, thể tích/thể tích) ở 60oC trong 3 giờ. Sau phản ứng, hỗn hợp Ďược làm nguội Ďến nhiệt Ďộ phòng và bổ sung thêm 4 mL nước cất. Các lipid không xà phòng hóa Ďược thu nhận bằng cách sử dụng hỗn hợp dung môi n-hexane-cloroform (4:1, thể tích/thể tích). Dung dịch chứa lipid KXPH Ďược làm khô trên Ďĩa kính Ďồng hồ và hòa tan lại trong cloroform. Mẫu này Ďược sử dụng Ďể chạy sắc ký lớp mỏng. - Chạy sắc ký lớp mỏng: Lipid KXPH Ďược phân tách trên bản TLC kích thước 20 x 20 cm có phủ silicagel 60 (Merck) với pha Ďộng là hệ dung môi n- hexan/diethyleter/acid acetic (70:30:4, thể tích/thể tích/thể tích). Các băng trên bản sắc ký Ďược phát hiện bằng cách phun dung dịch H2SO4 20% và sấy khô ở 100ᵒC trong 5 phút [124]. - Bố trí thí nghiệm tối ưu điều kiện tách chiết lượng nhỏ squalene từ sinh khối S. mangrovei PQ6 Tiến hành tách chiết lượng nhỏ squalene theo phương pháp của Lewis và cộng sự (2001) [130] Tối ưu điều kiện tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S. mangrovei PQ6: Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi khác nhau như n-hexan, chloroform hoặc 54 petroleum ether; nhiệt Ďộ và thời gian phản ứng; Ďiều kiện khuấy trộn; số lần chiết; tỷ lệ sinh khối/dung môi, nhiệt Ďộ sấy sinh khối và Ďộ ẩm sinh khối lên hiệu suất tách lipit tổng số từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6. Dải nhiệt Ďộ phản ứng Ďược khảo sát là 0, 30, 50 và 80C; thời gian phản ứng thay Ďổi từ 1, 3, 4 và 5 giờ; các Ďiều kiện khuấy trộn hỗn hợp phản ứng gồm: không khuấy trộn, khuấy trộn liên tục và gián Ďoạn; sinh khối Ďược tách chiết 1, 2 hoặc 3 lần; tỷ lệ sinh khối/ dung môi Ďược lựa chọn cho thí nghiệm là 1:8, 1:10 và 1:12; nhiệt Ďộ sấy sinh khối Ďược khảo sát là 60, 70, 80 và 90C; Ďộ ẩm sinh khối là 0, 30, 50, 80%. Hỗn hợp phản ứng Ďược thực hiện với 100 g sinh khối khô và theo nguyên tắc khi nghiên cứu ảnh hưởng của một yếu tố nào Ďó thì thí nghiệm Ďều Ďược tiến hành với tất cả các thông số còn lại Ďược giữ nguyên. Sau khi Ďã lựa chọn Ďược giá trị thích hợp của yếu tố Ďã Ďược nghiên cứu thì giá trị Ďó Ďược cố Ďịnh trong các thí nghiệm tiếp theo Ďể khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố còn lại. Tối ưu điều kiện tách chiết lipid KXPH từ lipid tổng số: Lipid KXPH Ďược tách chiết theo phương pháp của Lewis và cs., (2001) [130]. Nghiên cứu ảnh hưởng của các tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform là 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 và 5:1 trong khi các bước còn lại của quy trình vẫn Ďược giữ nguyên. Tách chiết, tinh sạch và làm giàu squalene bằng phương pháp dung môi Tách chiết, tinh sạch và làm giàu hàm lượng squalene như mô tả trong báo cáo của Choo và cộng sự (2005) [131] thu Ďược sau quá trình tách chiết squalene bằng phương pháp của Lewis và cộng sự (2001) [130]. - Bước 1: Lipid tổng số Ďược este hóa với methanol (2:1, w/w) và NaOH (1:100, w/) trong chai Pyrex. Hỗn hợp phản ứng liên tục trong 3h ở 60ᵒC và sau Ďó Ďược làm nguội ở nhiệt Ďộ phòng. Bổ sung nước cất theo tỷ lệ hỗn hợp: nước = 2:1 (v/v) Ďể loại bỏ glycerol và thu lớp dưới. Cất quay loại bỏ dung môi Ďể thu sản phẩm. - Bước 2: Lượng dầu thô thu Ďược ở bước 1 Ďược xà phòng hóa trong 10% KOH (1,65:1, w/v - khối lương: thể tích) và ethanol (6,64 :1, w/v). Hỗn hợp Ďược khuấy trộn liên tục trong 3 giờ ở 60ᵒC. Sau khi phản ứng kết thúc bổ sung hỗn hợp ethanol: nước cất nóng: n-hexane (ở tỷ lệ hỗn hợp: dung môi = 1: 3: 6: 10, w/v/v/v, tương ứng. Hỗn hợp phân thành 2 lớp với lớp trên là n- hexane chứa lipid KXPH, lớp dưới chứa phần xà phòng hóa. Phần lớp dưới Ďược rửa 4 lần với hỗn hợp n- hexane: nước cất (tỷ lệ 9:1, v/v). Cất quay loại bỏ n-hexane thu hồi lipid KXPH. - Bước 3: Lipid KXPH thu Ďược từ bước 2 Ďược bổ sung hỗn hợp ethanol: n- hexane : nước cất (tỷ lệ 1: 12: 12: 1, w/v/v/v), tương ứng. Hỗn hợp Ďược lắc Ďều, 55 sau Ďó phân thành 2 lớp, lớp n-hexane phía trên chứa squalene và lớp ethanol phía dưới chứa sterol. Tiến hành thu lớp n-hexane phía trên Ďồng thời rửa nhiều lần lớp dưới bằng n-hexane (20 mL cho mỗi lần rửa). Sau Ďó, toàn bộ lớp trên Ďược loại bỏ n-hexane bằng cất quay. - Bước 4: Phần lipid KPXH thu Ďược ở bước 3 tiếp tục Ďược bổ sung hỗn hợp n-hexan: methanol: nước cất (tỷ lệ mẫu : dung môi = 1: 10: 0,5: 0,5, w/v/v/v, tương ứng). Sau Ďó lắc Ďều hỗn hợp và Ďun nóng từ từ hỗn hợp lên Ďến 70ᵒC. Hỗn hợp sau phản ứng Ďược làm nguội từ từ tới nhiệt Ďộ phòng. Hỗn hợp phân thành 2 lớp, các tinh thể rắn kết tinh ở pha n - hexane phía trên và lớp dưới là methanol, nước. Pha n-hexane Ďược lọc qua giấy lọc Ө11 và rửa với một lượng dư hexane (khoảng 10 mL). Sau Ďó làm bay hơi pha trên thu lipit KXPH. - Bước 5: Lặp lại bước 4 với hỗn hợp dung môi n-hexane : n-methanol: nước cất ở tỷ lệ mẫu: dung môi = 1: 19: 0,5: 0,5. (w/v/v/v), tương ứng. - Bước 6: Phần lipid KXPH thu Ďược ở bước 5 Ďược bổ sung hỗn hợp dung môi n-hexane : methanol (tỷ lệ mẫu : dung môi = 1: 70: 28, w/v/v, tương ứng). Lắc Ďều hỗn hợp, Ďể lắng tự nhiên thấy hỗn hợp phân thành 2 lớp, lớp n - hexane phía trên và lớp methanol phía dưới, cả 2 lớp Ďều có màu vàng sáng. Sau Ďó tiến hành tách các lớp riêng biệt ra 2 ống khác nhau. Lớp dưới Ďược rửa nhiều lần bằng n - hexane cho Ďến khi thu Ďược n - hexane có màu trắng trong và lớp dưới nhạt màu nhằm thu triệt Ďể lớp chứa squalene (10 mL n - hexane cho mỗi lần rửa). Làm bay hơi n - hexane ở phần pha trên thu lipid KXPH. 2.2.2.2. Phương pháp xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch squalene ở quy mô pilot từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6 Phương pháp tách chiết squalene thô từ sinh khối tế bào Tách chiết squalene thô từ sinh khối tảo theo phương pháp của Lu và cộng sự (2003) [80]: SKK chủng PQ6 Ďược phản ứng với dung dịch KOH 10% (w/v) pha trong cồn 75% (v/v) hoặc trong MeOH 75% với tỉ lệ 1:40 (w/v) ở 50C trong thời gian 15 phút. Sau phản ứng hỗn hợp Ďược làm nguội Ďến nhiệt Ďộ phòng và bổ sung thêm 1V n-hexane tương Ďương với thể tích dung dịch KOH/cồn hoặc KOH/MeOH, lắc Ďều, và thu lớp n-hexane có chứa squalene thô. Bước bổ sung n- hexane Ďược lặp lại 3 lần. Loại bỏ hoàn toàn dung môi ở 70C - 80C và hàm lượng squalene sau Ďó Ďược phân tích bằng phương pháp HPLC. Ảnh hưởng của các tác nhân lên hiệu quả tách chiết squalene - Ảnh hưởng của dung môi: Nghiên cứu ảnh hưởng của hai dung môi ethanol và methanol Ďược lựa chọn Ďể tách chiết squalene trong sinh khối tảo sau 84 giờ lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất. 56
- Ảnh hưởng của Ďộ ẩm sinh khối tảo: Nghiên cứu ảnh hưởng của Ďộ ẩm 20% Ďến 100% lên hàm lượng squalene trong sinh khối tảo sau 84 giờ lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất. Phương pháp tách chiết squalene thô từ dịch tế bào S. mangrovei PQ6 [66] Sinh khối tế bào sau 48h lên men fed-back (150-200 g tế bào/L) Ďược phá vỡ màng tế bào bằng khuấy gia nhiệt 60C ở 150 vòng/phút, pH=10 với 45% KOH và duy trì trong suốt toàn bộ thời gian từ 2, 4, và 6 giờ. Sau khi kết thúc quá trình phá vỡ màng tế bào, bổ sung 1V cồn (tương Ďương với thể tích dịch tế bào ban Ďầu) và duy trì khuấy gia nhiệt ở 45C trong thời gian 10 phút. Tiếp tục bổ sung 1V n-hexan và khuấy trong thời gian 30 phút. Hỗn hợp phản ứng Ďược ly tâm 3.000 v/p trong thời gian 10 phút Ďể loại bỏ cặn, lớp dưới và thu phần dung môi chứa squalene thô phía trên. Sau Ďó loại bỏ dung môi khỏi squalene thô bằng cách sử dụng máy cô quay chân không ở nhiệt Ďộ 70 - 80C. Phương pháp tinh sạch squalene thô bằng sắc ký cột [124] Squalene thô sẽ Ďược tinh sạch bằng cột Silicagel 60, 0,06 - 0,2 mm cho sắc ký cột (70 - 230 mesh ASTM). 5 g dung dịch KXPH giàu squalene hòa tan trong 5mL n-hexane Ďược Ďưa lên cột, rửa cột và thu phân Ďoạn với 100% n-hexane ở tốc Ďộ dòng chảy 1,0 mL/min. Thu các phân Ďoạn trong ống facol 15 mL. Sử dụng sắc ký TLC Ďể xác Ďịnh sự có mặt của squalene ở các phân Ďoạn thu Ďược. Bố trí thí nghiệm lựa chọn hệ dung môi cho chạy sắc ký cột Kiểm tra hệ dung môi Ďịnh sử dụng trước khi Ďưa lên cột sắc ký. Squalene thô Ďược phân tách trên bản TLC kích thước 20 x 20 cm có phủ silicagel 60 (Merck) với pha Ďộng là các hệ dung môi khác nhau: n- hexane/diethylether/acid acetic (7:3:0,4; v/v/v), n-hexane/ ethyl acetate (6:1; v/v), n-hexane/ ethyl acetate (6: 0,5; v/v), n-hexane, n-hexane/chloroform (9:1; v/v), n-hexane/chloroform (4:1; v/v), n-hexane/chloroform (2:1; v/v), n-hexane/chloroform (1:1; v/v). Các băng trên bản sắc ký Ďược phát hiện bằng cách phun dung dịch H2SO4 20% và sấy khô trên Ďèn cồn. Ðại lượng Ďặc trưng cho mức Ďộ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf Ďược tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf = a/b. Trong Ďó: a là khoảng cách từ Ďiểm xuất phát Ďến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm; b là khoảng cách từ Ďiểm xuất phát Ďến mức dung môi Ďo trên cùng Ďường Ďi của vết, tính bằng cm; Rf: Chỉ có giá trị từ 0 Ďến l. 2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của squalene Squalene Ďược phân tích bằng HPLC tại Viện Công nghệ Môi trường (Viện Hàn lâm KH và CNVN) với cột sắc ký lỏng Thermo Hypersild Gold C18 (150 x 2,1 mm, 3 m), pha Ďộng là dung dịch acetonitrile : nước (9:1, v/v), tốc Ďộ dòng 250 57
µL/min. Sự nhận dạng squalene Ďược thực hiện bằng cách sử dụng Ďầu dò PDA Accella với khoảng quét 190-400 nm, bước sóng UV Ďặt ở 198 nm và thời gian lưu của mẫu có chứa squalene Ďược so sánh với thời gian lưu của squalene chuẩn. Hàm lượng squalene trong mẫu Ďược xác Ďịnh dựa trên Ďường chuẩn về mối tương quan giữa nồng Ďộ của squalene chuẩn với diện tích peak tương ứng. Độ tinh sạch của squalene Ďược tính dựa trên phần trăm diện tích peak so với squalene chuẩn có Ďộ tinh sạch Ďã Ďược biết [94]. 2.2.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc của squalene Cấu trúc squalene Ďược xác Ďịnh bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) sử dụng máy Bruker Avance - 500 MHz spectrometer (Bruker, Karlsruhe, Đức) ở tần số hoạt Ďộng 500 MHz (1H) và 125 MHz (13C) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong tất cả các thí nghiệm, CDCl3 Ďược sử dụng làm dung môi và chất chuẩn nội. Cấu trúc của squalene Ďược xác Ďịnh bằng việc so sánh dữ liệu phổ NMR với chất squalene Ďã Ďược công bố [132]. 2.2.3. Nhóm phương pháp xác định các chỉ tiêu chất lượng của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Phương pháp xác định chỉ tiêu cảm quan Trạng thái cảm quan của squalene như mầu sắc, mùi vị Ďược xác Ďịnh theo tiêu chuẩn bằng cách quan sát như TCVN (Technical Commit of Vietnam - Tiêu chuẩn quốc gia của Việt Nam) 2627-1993 [133]. Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý Độ ẩm và chất bay hơi của squalene Ďược xác Ďịnh theo TCVN 6120:2007, trị số acid, xà phòng hóa, peroxyt, Iod Ďược xác Ďịnh theo TCVN 6127:2010, TCVN 6126:2007, TCVN 6121:2010 và TCVN 6122:2010, tương ứng [134, 135, 136, 137, 138]. Phương pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật Các chỉ tiêu vi sinh vật như vi sinh vật hiếu khí, tổng số men mốc, E. coli, Coliforms, Salmonella, Staphylococcus aureus Ďược xác Ďịnh theo TCVN 4884:2005, TCVN 8275-2:2010, TCVN 7924-2:2008, TCVN 6848:2007, TCVN 4829:2005 và TCVN 4830-1:1999, tương ứng tại Phòng thử nghiệm Hóa sinh, Trung tâm chứng nhận phù hợp (Quacert), thuộc Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng, Bộ Khoa học và Công nghệ [139, 140, 141, 141, 143, 144]. Phương pháp xác định chỉ tiêu kim loại Các chỉ tiêu kim loại như sắt, Ďồng, asen, chì, ure Ďược xác Ďịnh theo AOAC (Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội các nhà hóa phân 58 tích chính thống 999.10.2012, AOAC 999.10.2012, AOAC 986.15.2012 và TCVN 7602:2007, tương ứng tạị Phòng thử nghiệm Hóa sinh, Trung tâm chứng nhận phù hợp (Quacert), thuộc Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng, Bộ Khoa học và Công nghệ [145, 146]. 2.2.4. Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên động vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro) 2.2.4.1. Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vivo Phương pháp đánh giá độc tính cấp của squalene
Nghiên cứu Ďộc tính cấp và xác Ďịnh LD50 (Lethal dose 50%) bằng Ďường uống theo phương pháp của Litchfield - Wincoxon [147], theo qui Ďịnh của Bộ Y tế Việt Nam (2018) [148], hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) (2002) và của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) (2000) [149, 150]. Chuột nhắt trắng (CNT) chủng Swiss gồm 40 con chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 08 con. Trước khi thí nghiệm chuột nhịn ăn 16 giờ, cho uống nước bình thường. Sau 16 giờ nhịn ăn, cho chuột uống squalene không pha loãng với các mức liều tăng dần 10, 20, 30, 40, 50 mL/kg khối lượng cơ thể (KLCT) tương ứng với các mức liều 11,65; 23,30; 34,95; 46,60; 58,25 g/kg KLCT. Chuột Ďược uống squalene cưỡng bức bằng cách dùng kim cong Ďầu tù Ďưa thẳng vào dạ dày chuột. Trong vòng 72 giờ và 168 giờ sau khi uống squalene, chuột Ďược theo dõi tình trạng chung (vận Ďộng, ăn uống, bài tiết...), xác Ďịnh số lượng chuột chết ở mỗi lô và xác Ďịnh liều cao nhất không gây chết chuột, liều thấp nhất gây chết 100% số chuột và các liều trung gian. Tiến hành phẫu tích quan sát tình trạng các mô gan, lách và tạng ngay sau khi có chuột chết (nếu có) Ďể xác Ďịnh nguyên nhân gây Ďộc [21, 46]. Phương pháp đánh giá độc t nh bán trường diễn Độc tính bán trường diễn Ďược Ďánh giá theo qui Ďịnh của Bộ Y tế Việt Nam (2018) hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) (2000) và của Tổ chức Y tế thế giới (2000) [149, 150]. Chuột cống trắng (CCT) 24 con, Ďược chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 08 con. Công thức thí nghiệm gồm: Lô Ďối chứng: uống dầu oliver liều 1,00 mL/kg KLCT/24 giờ; Lô thí nghiệm 1: uống squalene (pha trong dầu oliver), liều 400 59 mg/kg KLCT/ngày; Lô thí nghiệm 2: uống squalene (pha trong dầu oliver) liều 1.200 mg/kg/ngày. Chuột Ďược uống như trên với cùng thể tích 1,00 mL/kg KLCT/ngày trong 60 ngày liền, mỗi ngày một lần vào buổi sáng. Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu gồm: Tình trạng chung, thể trọng của chuột; Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu và số lượng tiểu cầu; Đánh giá chức năng gan, thận, chuyển hóa thông qua Ďịnh lượng một số chỉ số sinh hóa trong máu: Aspartat - aminotransferase (ALT); Alanin - aminotransferase (AST); bilirubin toàn phần, albumin huyết tương và cholesterol toàn phần; HDL-C; creatinin huyết thanh.
Các thông số theo dõi Ďược kiểm tra vào trước lúc uống squalene (D0), ngày thứ 30 (D30) ngày thứ 60 (D60) của nghiên cứu. Mô bệnh học: Sau 60 ngày uống squalene, chuột Ďược mổ Ďể quan sát Ďại thể toàn bộ các cơ quan. Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, lách, thận của ít nhất 30% số chuột ở mỗi lô. Các xét nghiệm vi thể Ďược thực hiện tại Bộ môn khoa Giải phẫu bệnh - Pháp y, Bệnh viện Quân y 103. Phương pháp đánh giá tác dụng làm tăng HDL-C của squalene Tác dụng làm tăng HDL-C của squalene trên CNT Ďược tiến hành Ďánh giá theo phương pháp Ďược mô tả bởi Clara Gaba´s-Rivera và cộng sự [46]. CNT có 24 con, chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 8 con bao gồm: Lô 1 (Ďối chứng): uống dầu oliver; Lô 2 (thí nghiệm 1): uống squalene (pha trong dầu oliver) liều 600 mg/kg KLCT/ngày; Lô 3 (thí nghiệm 2): uống squalene (pha trong dầu oliver) liều 1.200 mg/kg KLCT/ngày. Chuột Ďược uống như trên với cùng thể tích 1,00 mL/kg/ngày trong 60 ngày, cuối thí nghiệm giết chuột, Ďánh giá các chỉ tiêu: Cân nặng cơ thể (thể trọng), cân nặng gan; Cholesterol toàn phần, HDL-C; LDL-C; VLDL-C (very low density lipoprotein - cholesterol, cholesterol gắn với lipoprotein có tỷ trọng rất thấp), tỷ lệ HDL-C/cholesterol toàn phần; TG máu. 2.2.4.2. Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipit của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro Phương pháp nuôi cấy và thử nghiệm tác dụng sinh học của squalene Tế bào HepG2 và RAW264.7 Ďược nuôi cấy trên môi trường DMEM/high glucose có chứa 10% FBS, 100 U/mL penicillin, và 0,1 mg/mL streptomycin trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 37C, 5% CO2. 60
Đối với các thí nghiệm có sử dụng squalene, ban Ďầu các tế bào HepG2 Ďược nuôi cấy 24 h trong môi trường DMEM trong Ďĩa nuôi cấy loại 6 giếng với mật Ďộ 1 x 106 tế bào/ giếng. Sau 24 h nuôi cấy, tế bào HepG2 Ďược gây rối loạn chuyển hóa lipid bằng cách ủ với môi trường DMEM có chứa 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 0,1 mg/mL streptomycin và 600 M acid palmitic pha trong 0,16% fatty acid-free BSA trong thời gian 4 h. Tế bào HepG2 bị rối loạn chuyển hóa lipid sau Ďó Ďược ủ với dải nồng Ďộ của squalene (từ 10 Ďến 100 μM), hoặc 1 μM chất chuẩn kích hoạt thụ thể gan LXR/β (T0901317) trong 24 h - 72h. 0,1% DMSO Ďược sử dụng như là Ďối chứng. Sau thời gian ủ với squalene và thuốc, thu tế bào và sử dụng cho các thí nghiệm về phân tích hàm lượng lipit, Ďịnh lượng qPCR. Đối với tế bào RAW264.7, ban Ďầu các tế bào Ďược nuôi cấy 24 h trong môi trường DMEM trong Ďĩa nuôi cấy loại 6 giếng với mật Ďộ 1 x 106 tế bào/giếng. Sau 24 h nuôi cấy, tế bào RAW264.7 Ďược ủ với nhiều dải nồng Ďộ của nồng Ďộ của squalene (từ 10 Ďến 100 μM) và 1 μM chất chuẩn kích hoạt thụ thể LXR/β (T0901317) trong 48h. 0,1% DMSO Ďược sử dụng như là Ďối chứng. Sau thời gian ủ với squalene và thuốc, thu tế bào và sử dụng cho các thí nghiệm về phân tích hàm lượng lipit, Ďịnh lượng qPCR. Phương pháp đánh giá độc t nh của squalene đối với tế bào HepG2 Độc tính của squalene tách chiết từ chủng PQ6 lên tế bào HepG2 Ďược phân tích theo phương pháp MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H- tetrazolium bromide) [151]. Các dòng tế bào có mật Ďộ 0,5 x 104 tế bào/mL Ďược nuôi cấy trong Ďĩa 96 giếng với môi trường DMEM có chứa 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 0,1 mg/mL streptomycin, ủ ở nhiệt Ďộ 37°C, 5% CO2. Sau 24 giờ nuôi cấy, Ďĩa 96 giếng Ďược chuyển Ďổi sang môi trường DMEM không có FBS. Tế bào Ďược xử lý với squalene Ďược pha loãng bằng dung môi DMSO ở các nồng Ďộ khác nhau và Ďảm bảo nồng Ďộ cuối của DMSO trong môi trường nuôi cấy không vượt quá 0,1% (v/v) Ďể tránh gây Ďộc tế bào do dung môi. Sau 24-72 giờ, 20 μL dung dịch MTT có nồng Ďộ 2 mg/mL Ďược cho vào mỗi giếng và tiếp tục ủ trong 4 giờ; sau Ďó, tiến hành loại bỏ môi trường, thêm 100 mL DMSO lắc Ďều Ďọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometer Genios TECAN (Đức). Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (GI (%)) Ďược tính theo công thức sau:
OD 540nm mẫu Ďối chứng - OD 540 nm mẫu thử GI (%) = ------x 100 OD 540 nm mẫu Ďối chứng
61
Mỗi thí nghiệm Ďược lặp lại từ 3-5 lần. Phương pháp nhuộm lipid bằng Oil Red O [152] Các dòng tế bào sau khi Ďược ủ với squalene ở các nồng Ďộ khác nhau Ďược rửa 2 lần bằng dung dịch Ďệm phosphate buffered saline (PBS) và cố Ďịnh với 10% (v/v) formalin ở nhiệt Ďộ phòng trong thời gian 1 h. Các tế bào sau Ďó Ďược nhuộm với dung dịch ORO (Sigma-Aldrich, Biologycal Stain Commision) trong 15 phút. Rửa các dung dịch nhuộm thừa bằng nước cất. Chụp ảnh tế bào sau khi nhuộm lipid bằng máy ảnh Canon IXY digital 70 (Canon, Tokyo, Nhật Bản). Định lượng lipid nội bào bằng cách hòa tan các tế bào Ďược nhuộm ORO trong isopropanol và Ďo mật Ďộ quang ở bước sóng 500 nm trên máy quang phổ Hitachi U-1100 (Hitachi Ltd., Tokyo, Nhật Bản). Phương pháp tách chiết lipid nội bào Tế bào sau khi Ďược ủ với squalene, sẽ Ďược rửa 2 lần với PBS. Sau Ďó, tế bào Ďược ủ với hỗn hợp dung môi n-hexane: isopropanol (2:1, v:v) trong thời gian 30 phút. Dung dịch chứa lipid Ďược làm bay hơi bằng máy speed-vac và hòa tan trở lại trong 100 l ethanol. Phương pháp xác định hàm lượng lipid (cholesterol và triglycerit) nội bào Hàm lượng lipid nội bào sẽ Ďươc xác Ďịnh bằng phương pháp enzym. Để Ďịnh lượng cholesterol toàn phần, trước hết phải dùng phản ứng thuỷ phân cắt Ďứt liên kết este (sử dụng enzyme cholestrol esterase), sau Ďó biến cholesterol este thành cholesterol tự do (sử dụng enzyme cholesterol oxydase). Độ Ďậm màu của phức hồng cánh sen tỷ lệ thuận với nồng Ďộ cholesterol toàn phần trong huyết thanh và Ďược xác Ďịnh bằng Ďộ hấp thụ ở bước sóng 546 nm bằng phép Ďo Ďiểm cuối. Giá trị này Ďược Ďo trên máy phân tích tự Ďộng Olympus AU400 (Olympus Analyzers, Tokyo, Nhật Bản) tại Phòng khám Ďa khoa 125 Thái Thịnh, Hà Nội. Protein tổng số Ďược xác Ďịnh với kít Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Hàm lượng lipid trong tế bào sau Ďó sẽ Ďược chuẩn hóa với nồng Ďộ của protein tổng số theo công thức sau: Hàm lượng lipid tổng số Hàm lượng lipid trong tế bào (mg/mg protein) = ------Hàm lượng protein tổng số
Phương pháp tách chiết RNA, tổng hợp cDNA, phân t ch qPCR (real time PCR) 62
RNA tổng số Ďược tách chiết theo kit RNAiso Plus (Takara, Tokyo, Nhật Bản) và thực hiện theo quy trình như hãng Ďã khuyến cáo (Phụ lục 2, Hình P2). Tổng hợp cDNA theo kit RevertAid First Strand cDNA (Thermo Fisher, Scientific Ins., Singapore) và thực hiện theo quy trình của hãng Ďã khuyến cáo cho người sử dụng (Phụ lục 2, 2.2). Kết quả thu Ďược là 20 L cDNA. Các cDNA sau Ďó Ďược sử dụng như khuôn mẫu cho phản qPCR với các cặp mồi như Ďược trình bày trong Bảng 2.1. Phản ứng qPCR Ďược thực hiện ở Ďiều kiện phản ứng là: 95oC trong 10 phút tiếp theo là 45 chu kỳ |”của 95oC trong 20 giây, 58oC trong 10 giây và 72oC trong 20 giây. Tính Ďặc hiệu của mồi Ďược xác Ďịnh ở 65-95oC với tốc Ďộ làm nóng 0,1oC/giây và kết thúc bằng cách hạ nhiệt Ďộ xuống 40oC trong 30 giây. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) Ďược sử dụng Ďể chuẩn hóa số liệu. Bước đầu nghiên cứu cơ chế phân tử về tác dụng giảm cholesterol và triglycerid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Xác Ďịnh mức Ďộ biểu hiện của các gen mã hóa như thụ thể LDL- R là protein bề mặt tế bào, Ďóng một vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển cholesterol, bằng cách vận chuyển LDL- cholesterol từ huyết thanh Ďến các tế bào gan; CYP7A1 có vai trò là ở tại tế bào gan, khi cholesterol dư thừa sẽ Ďược chuyển hóa thành acid mật dưới tác dụng của CYP7A1 [153]; Thụ thể gan X (liver X receptor; LXR) thuộc nhóm các thụ thể hormone nội bào, Ďóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống xơ vữa Ďộng mạch bằng cách Ďiều hòa mức Ďộ biểu hiện của gen Ďích là các gen mã hóa cho các protein vận chuyển như ATP-binding cassette (ABC) proteins A1 (ABCA1), G1, và apolipoprotein E (ApoE), dẫn Ďến tăng cường quá trình lưu thông cholesterol, kích thích vận chuyển cholesterol ngược từ các mô ngoại biên và tăng cường lượng cholesterol tốt (HDL-C) trong cơ thể [42]. Xác Ďịnh mức Ďộ biểu hiện gen bằng phương pháp qPCR Ďịnh lượng. Sau khi tách chiết ARN tổng số và tổng hợp cDNA tiến hành chạy phản ứng real time PCR ở Ďiều kiện phản ứng là: 95oC trong 10 phút tiếp theo là 45 chu kỳ của 95oC trong 20 giây, 58oC trong 10 giây và 72oC trong 20 giây. Tính Ďặc hiệu của mồi Ďược xác Ďịnh ở 65-95oC với tốc Ďộ làm nóng 0,1oC/giây và kết thúc bằng cách hạ nhiệt Ďộ 63
xuống 40oC trong 30 giây. Gen GAPDH Ďược dùng Ďể chuẩn hóa (gen giữ nhà - house keeping- luôn biểu hiện trong bất kì Ďiều kiện thí nghiệm nào). 2.2.5. Thống kê phân t ch số liệu Số liệu Ďươc trình bày bằng số trung bình ± sai số chuẩn. Sự sai khác Ďược coi là có ý nghĩa thống kê ở mức P <0,05, số liệu Ďược xử lý thống kê theo phương pháp Student’s t-test, so sánh bằng anova test sử dụng phần mềm SPSS 16.0. 2.2.6. Địa điểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm và phân tích các kết quả trong nghiên cứu Ďược trình bày trong Bảng 2.3. Bảng 2.3. Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu STT Nội dung nghiên cứu Địa Ďiểm tiến hành thí nghiệm 1 Sàng lọc chủng/loài vi tảo biển tiềm Phòng công nghệ Tảo, Viện Công nghệ năng của Việt Nam cho sản xuất cao sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công squalene nghệ Việt Nam. 2 Tối ưu Ďiều kiện nuôi cấy Ďể thu Ďược Phòng công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh khổi tảo có hàm lượng squalene sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công cao nghệ Việt Nam. Tối ưu Ďiều kiện tách chiết, làm giàu Phòng công nghệ Tảo, Viện Công nghệ và tinh sạch squalene từ sinh khối tảo; sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công xây dựng quy trình tách chiết và tinh nghệ Việt Nam. 3 sạch squalene Xác Ďịnh Ďộ sạch và cấu trúc của Phòng Công nghệ Tảo, Viện CNSH và Ďo squalene tách chiết Ďược tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phân tích các chỉ tiêu về cảm quan, Phòng Công nghệ Tảo, Viện CNSH và hóa lý, vi sinh vật và kim loại của kiểm tra tại Trung tâm chứng nhận phù squalene tách chiết từ S. mangrovei hợp (Quacert), Tổng cục Tiêu chuẩn Đo PQ6 lường Chất lượng, Bộ Khoa học và Công nghệ. 4 Đánh giá tính an toàn và tác dụng Phòng Công nghệ Tảo, Viện CNSH và Bộ dược lý của squalene trên mô hình in môn Dược lý, Học viện Quân y vivo
5 Bước Ďầu Nuôi cấy tế bào Phòng Công nghệ Tảo và Phòng Công nghiên cứu cơ nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học, Viện chế tác dụng Hàn lâm KH và CNVN giảm Thí nghiệm tách chiết Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ cholesterol lipid nội bào, Oil Red sinh học, Viện Hàn lâm KH và CNVN của squalene O, tách chiết RNA trên mô hình tổng số, tổng hợp in vitro cDNA Phân tích qPCR Phòng Công nghệ Tảo và Phòng thí nghiệm trọng Ďiểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH và CNVN 64
Để thực hiện các nội dung nghiên cứu Ďã Ďược Ďề ra, sơ Ďồ thí nghiệm Ďã Ďược chỉ ra trên Hình 2.1.
Vi tảo biển dị dưỡng 32 chủng Schizochytrium và 8 chủng Thraustochytrium
Schizochitryum mangrovei PQ6
Tối ưu Ďiều kiện Tách chi ết và tinh Tính an toàn và tác dụng kiện nuôi trồng sạch squalene sinh dược của squalene
Bình tam giác Bình lên Quy mô phòng Quy mô pilot Mô hình Mô hình -Nhiệt Ďộ (15, men 30L thí nghiệm o invivo invitro 20, 25, 30 C) -Lên men - Glucose (15, theo mẻ: 30, 40, 60, 90 glucose (3, -Tách chiết squalene g/L) 6, 9, 12, -Tách chiết - Độc tính -Nuôi cấy tế -Cao nấm từ lipid tổng số cấp trên bào Hep G2 và 22%), nito + Điều kiện tách squalene từ men (0,5, 1, (cao nấm sinh khối khô CNT RAW264.7 1,5, 2, 3, 4%) chiết lipid tổng số: - Độc tính -Đánh giá Ďộc men và cao ảnh hưởng của dung (ảnh hưởng -Terbinafine nấm men + dung môi, Ďộ bán tính của (0, 0,1, 1, 10, môi, nhiệt Ďộ, thời mì chính) ẩm) trường squalene trên 2 100, 150, 200 gian phản ứng, Ďiề u -Tách chiết diễn trên dòng tế bào µg/mL) -Lên men kiện khuấy trộn, số squalene từ CCT -Tác dụng - Vitamin theo mẻ có lần chiết, tỷ lệ sinh bổ sung cơ khối/dung môi, nhiệt dịch tế bào -Tác dụng giảm lipid của (0, 0,2, 0,4, tăng squalene 0,6%) chất (ảnh Ďộ sấy sinh khôi, Ď ộ -Tinh sạch hưởng của ẩm sinh khối squalene thô HDL-C -Cơ chế phân vitamin) + Điều kiện tách bằng sắc kí của tử tác dụng chiết lipid KXPH từ cột (lựa chọn squalene giảm lipid tổng số: ảnh hệ dung môi chlesterol của hưởng tỷ lệ n- rửa giải cho squalene hexane/chloroform chạy sắc kí) -Tinh sạch và làm giàu squalene bằng dung môi
Xác Ďịnh hàm lượng và Ďộ tinh sạch bằng HPLC HPLCHPLC Xác Ďịnh cấu trúc squalene
Xác Ďịnh các chỉ tiêu chất lượng của squalene (Cảm quan, hóa lý, vi sinh vật, kim loại)
Hình 2.1. Sơ Ďồ thí nghiệm nghiên cứu squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6
65
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sàng lọc chủng vi tảo biển dị dƣỡng có tiềm năng sản xuất squalene Tiêu chí tuyển chọn các chủng/loài vi tảo biển dị dưỡng tiềm năng cho việc sản xuất squalene trong Ďiều kiện phòng thí nghiệm trước tiên Ďược dựa trên khả năng sinh trưởng (tạo sinh khối), tích lũy lipid và squalene. Chúng tôi tiến hành sàng lọc 31 chủng thuộc chi Schizochytrium và 8 chủng thuộc chi Thraustochytrium phân lập từ các vùng bờ biển và rừng ngập mặn ở Hải Phòng, Nam Định, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An và Bình Định trong năm 2013-2014 và chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 Ďược lưu giữ trong tập Ďoàn giống của phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học. Các chủng sau khi phân lập, làm sạch Ďược nuôi riêng rẽ trên môi trường lỏng M1 (Ďối với các chủng thuộc chi Schizochytrium) hoặc Bajpai cải tiến (Ďối với các chủng thuộc chi Thraustochytrium) Ďể xác Ďịnh các thông số như MĐTB, SKK, hàm lượng lipid và squalene sau 5 ngày nuôi cấy. Đây là thời Ďiểm mà hầu hết các chủng sinh trưởng Ďạt cực Ďại. Kết quả Ďược trình bày trên Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Sinh trưởng, hàm lượng lipid tổng số và squalene của các chủng thuộc chi Schizochytrium, Thraustochytrium Ďã phân lập
Hàm lượng Hàm lượng Số thứ Mật Ďộ tế bào Sinh khối Chủng lipid (% squalene tự (x106 TB/mL) khô (g/L) SKK) (mg/g SKK) Thuộc chi Schizochytrium Hải Phòng 1 HP1 38,45 ± 0,09 10,05 ± 0,15 17,95 ± 0,13 35,77 ± 0,78 2 HP2 42,83 ± 0,20 8,19 ± 0,13 20,03 ± 0,05 28,59 ± 0,46 3 HP3 45,95 ± 1,04 7,72 ± 0,24 14,12 ± 0,14 31,34 ± 1,25 4 HP4 44,96 ± 0,12 10,17 ± 0,84 12,61 ± 0,05 35,98 ± 2,78 5 HP5 45,20 ± 0,12 11,12 ± 0,32 36,21 ± 0,31 47,05 ± 1,53 6 HP6 31,16 ± 0,14 10,02 ± 0,55 15,36 ± 0,01 20,31 ± 0,25 Nam Định 7 ND1 38,48 ± 0,09 10,07 ± 0,03 17,98 ± 0,15 15,09 ± 0,08 8 ND2 44,85 ± 0,21 8,04 ± 0,02 21,07 ± 0,02 17,04 ± 0,07 9 ND3 46,95 ± 1,04 10,92 ± 0,17 13,93 ± 0,14 9,37 ± 0,05 10 ND4 45,96 ± 0,15 10,02 ± 0,64 10,67 ± 0,25 15,08 ± 2,03 11 ND5 47,20 ± 0,13 11,09 ± 0,02 30,04 ± 0,31 32,98 ± 0,54 66
12 ND6 32,16 ± 0,19 9,03 ± 0,07 14,87 ± 0,01 22,16 ± 1,25 Quảng Ninh 13 QN1 33,82 ± 0,14 9,04 ± 0,01 16,05 ± 0,05 57,14 ± 3,07 14 QN2 38,05 ± 1,05 9,07 ± 0,04 16,94 ± 0,46 36,74 ± 1,78 15 QN3 33,40 ± 0,02 11,12 ± 0,03 20,84 ± 0,56 18,26 ± 0,74 16 QN4 31,90 ± 0,03 11,09 ± 0,01 34,34 ± 0,74 45,98 ± 1,73 17 QN5 28,63 ± 0,24 10,15 ± 0,02 18,64 ± 0,61 19,08 ± 0,74 18 QN6 47,34 ± 0,27 12,11 ± 0,01 25,70 ± 0,32 7,13 ± 0,25 Thanh Hóa 19 TH1 40,08 ± 3,06 9,98 ± 0,26 25,89 ± 1,46 45,70 ± 1,56 20 TH3 41,27 ± 2,39 10,06 ± 0,56 30,56 ± 1,74 78,50 ± 1,78 21 TH6 47,56 ± 3,04 11,39 ± 1,07 35,46 ± 1,05 41,30 ± 1,05 Nghệ An 22 NA1 33,82 ± 0,14 9,04 ± 0,01 16,05 ± 0,05 67,56 ± 1,97 23 NA2 38,05 ± 1,05 9,07 ± 0,04 16,94 ± 0,46 25,93 ± 0,72 24 NA3 33,40 ± 0,02 11,12 ± 0,03 30,84 ± 0,56 60,21 ± 1,89 25 NA4 31,90 ± 0,03 11,09 ± 0,01 24,34 ± 0,74 45,07 ± 0,83 26 NA5 28,63 ± 0,24 10,15 ± 0,02 18,64 ± 0,61 45,33 ± 1,85 Bình Định 27 BĐ6 38,48 ± 0,09 10,07 ± 0,63 17,98 ± 0,15 8,15 ± 0,09 28 BĐ7 44,85 ± 0,21 10,04 ± 0,12 21,07 ± 0,02 11,25 ± 0,16 29 BĐ8 46,95 ± 1,04 11,02 ± 0,34 13,93 ± 0,14 22,38 ± 1,85 30 BĐ9 45,96 ± 0,15 10,15 ± 0,44 11,61 ± 0,05 36,48 ± 1,42 31 BĐ10 47,20 ± 0,13 11,09 ± 0,92 28,04 ± 0,31 30,01 ± 0,82 32 PQ6* 40,62 ± 0,96 12,38 ± 0,72 39,61 ± 0,12 102,01 ± 1,04 Thuộc chi Thraustochytrium 33 TN1 32,15 ± 0,17 9,97 ± 0,07 14,85 ± 0,03 13,76 ± 0,56 34 TN2 33,80 ± 0,15 9,04 ± 0,01 16,07 ± 0,02 15,25 ± 0,31 35 TG4 46,82 ± 1,78 9,07 ± 1,13 20,45 ± 1,16 43,85 ± 0,56 36 TG9 84,48 ± 1,76 8,98 ± 0,23 16,87 ± 1,78 35,70 ± 2,47 37 TG10 108,03 ± 1,96 10,05 ± 0,45 20,36 ± 1,69 40,32 ± 1,89 38 TG11 98,72 ± 1,24 11,04 ± 1,07 20,01 ± 1,32 28,90 ± 0,07 39 TG12 82,88 ± 1,38 10,65 ± 1,16 18,95 ± 1,14 10,40 ± 1,78 40 TG15 114,56 ± 1,27 11,86 ± 1,63 28,79 ± 1,09 12,20 ± 0,05 Ghi chú: PQ6* - chủng PQ6 được phân lập ở Huyện đảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang năm 2006-2008; hàm lượng squalene được xác định sơ bộ theo phương pháp quang phổ; Ký hiệu chủng: chữ cái - địa điểm phân lập, chữ số: ký hiệu chủng.
Do kích thước tế bào sau 5 ngày nuôi ở các chủng phân lập là hoàn toàn khác nhau nên trong Bảng 3.1 Ďã không có sự tuyến tính giữa SKK và MĐTB giữa các chủng trong một chi. Kết quả thu Ďược Ďã cho thấy, trong số các chủng Schizochytrium và Thraustochytrium Ďã phân lập thì các chủng Schizochytrium spp. bao gồm HP5, ND5, QN4, TH6 và NA3 là chủng có khả năng tạo sinh khối lớn (>11 g SKK/Lit), hàm lượng lipit tổng số tích lũy cao (> 30% SKK), cũng như hàm 67 lượng squalene cao (> 40 mg/g SKK). Tuy nhiên, khi so sánh hàm lượng squalene và khả năng tạo sinh khối thì tất cả các chủng này Ďều thấp hơn chủng PQ6 (102,01 mg/g SKK); sinh khối Ďạt > 12 g SKK/Lit; hàm lượng lipit Ďạt > 40 % SKK- chủng Ďược sử dụng Ďể tham chiếu. Chủng PQ6 Ďã Ďược chứng minh là chủng tiềm năng Ďể sản xuất squalene trong số các chủng vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng trong tập Ďoàn giống của phòng Công nghệ tảo trước Ďây [90, 120]. Dựa trên những Ďặc Ďiểm hình thái, Ďọc và so sánh trình tự nucleotide Ďoạn gen 18S rRNA, tên khoa học của chủng PQ6 Ďược xác Ďịnh thuộc về loài Schizochytrium mangrovei Raghukumar với mã số Ďăng ký trên Genbank là EU72865 [125]. Các công bố trước Ďây của chúng tôi cũng Ďã chứng minh Ďược chủng S. mangrovei PQ6 là một chủng tiềm năng cho sản xuất PUFAs trong Ďó có DHA, Ďặc Ďiểm sinh học và khả năng nuôi trồng chúng trên quy mô lớn cũng Ďã Ďược nghiên cứu tương Ďối kỹ [125, 154]. Do vậy, chúng tôi Ďã lựa chọn chủng PQ6 cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 lên sinh trƣởng và hàm lƣợng squalene Sau khi Ďã lựa chọn Ďược chủng S. mangrovei PQ6 là tiềm năng cho sản xuất squalene chúng tôi tiến hành tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng chủng này ở quy mô bình tam giác và bình lên men với mục Ďích là nuôi Ďủ sinh khối tảo có hàm lượng squalene cao Ďể phục vụ cho các thử nghiệm về Ďộc tính cấp, bán trường diễn và tác dụng sinh dược sau này. 3.2.1. Tối ưu điều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 cho sản xuất squalene ở cấp độ bình tam giác 3.2.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác Nhiệt Ďộ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng Ďến quá trình sinh trưởng và tích lũy các hợp chất thứ cấp của các loài vi tảo nói chung trong Ďó có squalene ở vi tảo Schizochytrium. Ảnh hưởng của nhiệt Ďộ lên sinh trưởng của S. mangrovei PQ6 Ďã Ďược nghiên cứu trong khoảng từ 15, 20, 25, 28, 30 và 35ᵒC. Kết quả nghiên cứu Ďã Ďược trình bày ở Hình 3.1. Sau 6 ngày nuôi cấy chủng PQ6 ở nhiệt Ďộ khác nhau từ 15, 20 25, 28, 30 và 35oC Ďã cho thấy sinh trưởng và hàm lượng squalene Ďạt cao nhất khi nuôi ở 28oC là (13,47 ± 0,53) g/L và (61,42 ± 1,24) mg/g SKK sau 4 và 5 ngày nuôi cấy, tương ứng. Ở nhiệt Ďộ này, lượng sinh khối khô khác biệt không Ďáng kể giữa 4 và 5 ngày nuôi (13,47 ± 0,53) g/L và (13,11 ± 0,34) g/L, tương ứng; trong khi Ďó hàm lượng 68
squalene lại khác biệt rất rõ (61,42 ± 1,24) mg/g SKK và (54,14 ± 1,63) mg/g SKK, tương ứng, (p < 0,05). B A
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt Ďộ lên sinh trưởng (A) và hàm lượng squalene (B) ở các ngày nuôi cấy khác nhau
Theo công bố của Nakazawa và cộng sự (2012), nhiệt Ďộ tối ưu Ďể chủng Aurantiochytrium 18W-13a sản xuất squalene là 25oC, thấp hơn so với chủng PQ6 [114]. Lewis và cộng sự (2001) chỉ ra rằng hàm lượng squalene ở chủng thraustochytrid ACEM 6063 thay Ďổi theo nhiệt Ďộ và lượng oxy hòa tan (DO) cũng như tuổi tế bào. Khi nuôi ở 20oC và 25oC, sinh khối Ďạt 21-23 g/L sau 7-8 ngày nuôi trong khi ở 15oC sinh khối chỉ Ďạt 17 và 10 g/L (tương ứng với DO cao và thấp) sau 9 ngày. Ở 20oC và 25oC, hàm lượng squalene cao nhất ở 5-6 ngày nuôi và ở 15oC hàm lượng squalene cao nhất Ďạt 1,8 mg/g SKK sau 5 ngày nuôi cấy. Ảnh hưởng tuổi tế bào lên hàm lượng squalene và sterol của chủng ACEM 6063 khi nhiệt Ďộ khác nhau là khác nhau. Khi chủng ACEM 6063 sinh trưởng ở 15oC, hàm lượng
squalene không khác nhau Ďáng kể giữa T-4 và T-2 (mẫu thu ở ngày thứ 4 và thứ 2), trong khi ở 20 và 25oC, hàm lượng squalene thay Ďổi theo tuổi tế bào với xu hướng
chung: tăng hàm lượng squalene giữa T- 4 và T-2, giảm giữa T-2 và Tp (mẫu 0 ngày) [130]. Như vậy, có sự khác biệt về ảnh hưởng của nhiệt Ďộ lên sinh trưởng và hàm lượng squalene của chủng PQ6 so với công bố của Lewis và cộng sự (2001) và Nakazawa và cộng sự (2012). Ở chủng PQ6, sinh trưởng và hàm lượng squalene Ďạt cực Ďại ở ngày thứ 4 và thứ 5, tương ứng. Sự khác biệt này có thể là do các Ďặc Ďiểm khác nhau của các chủng nghiên cứu. Điều kiện khí hậu và nơi phân lập chủng có thể Ďóng một vai trò quyết Ďịnh trong sự khác nhau về nhiệt Ďộ tối ưu lên sinh trưởng, hàm lượng và sản lượng squalene của các chủng nghiên cứu. 69
3.2.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác Trong những nghiên cứu trước Ďây về ảnh hưởng của nguồn nitơ Ďến sinh trưởng và tích lũy DHA của chủng PQ6, Dang và cộng sự (2011) thấy rằng chủng này có thể sử dụng nhiều nguồn nitơ khác nhau như cao nấm men, CH3COONH4,
(NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO3 và phân N-P-K [125]. Tương tự với các chủng Schizochytrium khác như SR21 và S31, chủng PQ6 có thể sử dụng cả hai nguồn + - nitơ là NH4 và NO3 [155, 156]. Trong số Ďó, cao nấm men cho sản lượng sinh khối và DHA cao nhất (11,91 và 1,41 g/L, tương ứng) sau Ďó là các nguồn nitơ khác như phân N-P-K, CH3COONH4, NaNO3. Việc tăng nồng Ďộ cao nấm men từ 0,4% Ďến 1% sẽ làm tăng sản lượng sinh khối và DHA của chủng PQ6. Trong môi trường có chứa cao nấm men 1%, sản lượng sinh khối và DHA tương ứng Ďạt 12,15 và 1,45 g/L [125]. Trên cơ sở Ďó, ảnh hưởng của nồng Ďộ cao nấm men trong khoảng 0,5- 4% lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng PQ6 Ďược lựa chọn Ďể nghiên cứu tiếp tục. Kết quả Ďược trình bày trên Hình 3.2.
A B
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng Ďộ cao nấm men lên sinh trưởng (A) và hàm
lượng squalene (B) ở các ngày nuôi cấy khác nhau
Kết quả cho thấy, SKK và hàm lượng squalene của chủng PQ6 khi nuôi trong môi trường có nồng Ďộ cao nấm men 1 và 1,5% Ďạt tương ứng là (13,56 ± 0,28) mg/g SKK; (12,02 ± 0,39) mg/g SKK và (61,02 ± 1,36) mg/g SKK; (59,98 ± 2,29) mg/g SKK sau 5 ngày nuôi cấy, tương ứng. Tuy nhiên, sự khác biệt về SKK và hàm lượng squalene ở nồng Ďộ cao nấm men là 1 và 1,5% sau 5 ngày nuôi không có ý nghĩa thống kê sinh học (P > 0,05). Do Ďó, Ďể tiết kiệm chi phí cho môi trường nuôi cấy, chúng tôi chọn nồng Ďộ cao nấm men 1% cho các nghiên cứu tiếp theo. 70
Trong nghiên cứu của Chen và cộng sự (2010), nồng Ďộ tối ưu của monosodium glutamate, cao nấm men và trypton ở Aurantiochytrium sp. Ďược dự Ďoán tương ứng là 6,61, 6,13 và 4,50 g/L Ďể thu Ďược hàm lượng squalene cao nhất (6,94, 6,22 và 4,40 g/L, tương ứng) [112]. Trong khi Ďó, ở thí nghiệm kiểm chứng, hàm lượng và sản lượng squalene Ďã Ďạt Ďược 0,72 mg/g SKK và 5,9 mg/L, tương ứng, Ďược xem là cao hơn các nghiên cứu Ďã Ďược công bố trước Ďó. Sinh khối khô của Aurantiochytrium sp. tăng khi nồng Ďộ cao nấm men tăng từ 0,5 g/L Ďến 3 g/L. Hàm lượng và sản lượng squalene cao nhất Ďạt 0,21 mg/g và 1,62 mg/L khi môi trường nuôi Ďược bổ sung cao nấm men 6 g/L (tỷ lệ C/N: 5:1) [112]. Như vậy, ở cấp Ďộ bình tam giác, hàm lượng squalene của chủng PQ6 Ďạt Ďược cao hơn so với công bố của tác giả trên ((61,02 ± 1,36) mg/g SKK) sau 5 ngày nuôi của chủng PQ6 so với giá trị 0,21 mg/g SKK sau 36 h nuôi ở Aurantiochytrium sp). 3.2.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng Ďộ glucose lên sinh trưởng, hàm lượng lipit và squalene của chủng PQ6, glucose Ďược bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ 1,5% Ďến 9% trong khi các thành phần khác Ďược giữ nguyên.
A B
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng Ďộ glucose lên sinh trưởng (A) và hàm lượng lipit (B) của S. mangrovei PQ6
Kết quả chỉ ra trên Hình 3.3 cho thấy sự khác biệt về SKK và hàm lượng lipid của S. mangrovei PQ6. Sinh trưởng của chủng này Ďạt cực Ďại ở nồng Ďộ glucose 4 % sau 5 ngày nuôi cấy là (13,06 ± 0,39) g/L. Hàm lượng lipid tích lũy trong tế bào cao hơn Ďáng kể khi môi trường nuôi cấy có nồng Ďộ glucose ban Ďầu 3, 4 và 6% là (40,23 ± 0,39), (39,07 ± 1,62) và (49,17 ± 0,48)% SKK, tương ứng so với nồng Ďộ 1,5% Ďạt (22,75 ± 0,53)% SKK ở ngày thứ 5. Tuy nhiên, hàm lượng lipid 71 cao nhất Ďạt Ďược là ở ngày nuôi thứ 6 trong môi trường chứa 9% glucose (51,02 ± 1,54% SKK). Mặc dù sinh trưởng và hàm lượng lipid không Ďạt giá trị cao nhất khi nuôi ở 3% glucose nhưng hàm lượng và sản lượng squalene lại Ďạt cao nhất sau 5 ngày nuôi ở nồng Ďộ này ((62,89 ± 2,59) mg/g SKK và (640,94 ± 10,04) mg/L, tương ứng) (Hình 3.4). Như vậy, giá trị hàm lượng và sản lượng squalene Ďạt cao nhất vào khoảng (62,89 ± 2,59) mg/g SKK và (640,94 ± 10,04) mg/L, tương ứng ở Ďiều kiện tối ưu chứa 1% cao nấm men, 3% glucose ở 28oC sau 5 ngày nuôi cấy. Khi chủng này Ďược nuôi trồng trong bình tam giác ở Ďiều kiện tối ưu, hàm lượng squalene chiếm 6,3% SKK Ďã Ďược xác Ďịnh bằng phương pháp TLC và HPLC cao hơn hàng trăm lần so với các chủng thraustochytrids Ďã Ďược thông báo trước Ďây (0,002-0,150 % SKK) [65, 67, 112, 130, 157].
A B
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng Ďộ glucose lên hàm lượng squalene (A) và
hiệu suất squalene (B) của S. mangrovei PQ6
Một số chủng thraustochytrids Ďã Ďược thông báo có hàm lượng squalene cao như chủng Thraustochytrid ACEM 6063 (0,1 mg/g SKK) và Aurantiochytrium mangrovei FB1 (0,162 mg/g SKK) [65, 130]. Một nghiên cứu khác của Fan và cộng sự (2010) cũng Ďã cho thấy tiềm năng sản xuất squalene ở A. mangrovei FB3. Hàm lượng squalene cao nhất Ďạt 0,53 mg/g SKK khi nuôi trong môi trường có bổ sung 3% glucose và 100 mg/L TBNF ở ngày nuôi cấy Ďầu tiên [157]. Tuy nhiên, khi tăng nồng Ďộ glucose lên 40-80 g/L thì hàm lượng squalene lại giảm dần. Như vậy, có thể thấy hàm lượng squalene của chủng PQ6 trong nghiên cứu này cao hơn rất nhiều so với các chủng nói trên. Khi so sánh với các kết quả mà Nakazawa và cộng sự (2012) Ďã Ďạt Ďược Ďối 72 với chủng Aurantiochytrium sp. 18W-13a nuôi trồng ở Ďiều kiện tối ưu (25C, Ďộ mặn 25-50% và 2-6% glucose) thì hàm lượng và sản lượng squalene ở chủng PQ6 thấp hơn (61,76 mg/g SKK so với 171 mg/g SKK; 0,63 g/L so với 0,9 g/L) nhưng xét về khả năng tạo sinh khối thì chủng PQ6 lại cao hơn 2,51 lần so với chủng 18W-13a (5,0 g SKK/L so với 12,56 g SKK/L) [114]. Kết quả này một lần nữa chứng minh chủng PQ6 là chủng tiềm năng Ďể sản xuất squalene. 3.2.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ tebinafine lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác Dựa trên kết quả của các thí nghiệm trên với nồng Ďộ glucose và cao nấm men ban Ďầu lần lượt là 3% và 1% ở Ďiều kiện nhiệt Ďộ 28ᵒC, chúng tôi tiếp tục Ďánh giá ảnh hưởng của các nồng Ďộ TBNF lên sinh trưởng tế bào và hàm lượng squalene của chủng PQ6. TBNF là một chất ức chế enzyme squalene monooxygenase trong con Ďường sinh tổng hợp sterol. Enzyme này có vai trò xúc tác quá trình oxy hóa squalene thành 2,3 oxidosqualene trong sự có mặt của phân tử ôxy và NADH [158, 159]. Ở sinh vật nhân chuẩn, sterol là lipid màng quan trọng. Bước quan trọng Ďầu tiên trong quá trình tổng hợp sterol là ôxy hóa squalene Ďể tạo thành (3S) squalene epoxide (3S-squalene- 2,3-oxide) sau Ďó Ďược tuần hoàn Ďể tạo thành lanosterol hoặc cycloartenol. Nếu bước ôxy hóa squalene Ďược xúc tác bởi squalene monooxygenase bị ảnh hưởng, quá trình tổng hợp sterol và màng tế bào hoặc thậm chí sự phát triển của tế bào sau Ďó cũng bị ảnh hưởng [130, 159, 160]. Ảnh hưởng của việc bổ sung nồng Ďộ TBNF vào môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng tảo và hàm lượng squalene Ďược thể hiện trên Hình 3.5. Kết quả chỉ ra trên Hình 3.5 Ďã cho thấy việc bổ sung TBNF từ 0,1 lên 200 g/mL vào môi trường nuôi Ďã làm giảm Ďáng kể MĐTB và lượng SKK sau 5 ngày nuôi (từ 104,16 xuống 37,65) x 106 tế bào/mL; (từ 12,73 xuống 4,6) g/L SKK) so với công thức Ďối chứng (106,98 x 106) tế bào/mL và 13,06 g/L, tương ứng) (Hình 3.5 A-B). Mặc dù sinh trưởng giảm nhưng hàm lượng lipid và squalene lại tăng lên Ďáng kể. Lipid tăng từ (28,09 ± 2,15)% SKK ở công thức Ďối chứng lên (30,02 ± 2,36) - (40,42 ± 1,09)% SKK khi chủng PQ6 Ďược nuôi trong môi trường có bổ sung TBNF từ 0,1-200 g/mL, sau 5 ngày nuôi (Hình 3.5C). Hàm lượng squalene của chủng PQ6 tăng từ (62,05 ± 0,96) mg/g SKK lên (97,34 ± 1,97) mg/g SKK, 73 tương ứng khi tăng nồng Ďộ TBNF tới 100 g/mL và hầu như không thay Ďổi khi nồng Ďộ TBNF Ďược bổ sung 150-200 g/mL vào môi trường nuôi cấy. Hàm lượng squalene thay Ďổi không Ďáng kể khi tăng nồng Ďộ TBNF lên 10 lần (0,1-1 µg/mL). Khi nồng Ďộ TBNF trong môi trường tăng lên 1000 lần (100 g/L) thì hàm lượng squalene Ďạt cực Ďại (97,34 ± 1,97) mg/g SKK sau 5 ngày nuôi cấy.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng Ďộ terbinafine lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối khô (B), hàm lượng lipid và squalene (C) của S. mangrovei PQ6
Như vậy việc bổ sung TBNF vào môi trường nuôi có thể tăng tích lũy squalene nhưng làm giảm sinh trưởng tảo ở nồng Ďộ cao tuy nhiên việc nghiên cứu ảnh hưởng của chất này trên quy mô bình tam giác là cần thiết bởi Ďây là cơ sở khoa học gián tiếp khẳng Ďịnh con Ďường sinh tổng hợp squalene ở PQ6 là theo con Ďường MVA. 3.2.1.5. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp vitamin lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác Nghiên cứu của Pora và cộng sự (2014) gần Ďây Ďã cho thấy một trong các thông số quan trọng cho việc tăng sản xuất squalene trong nuôi cấy tảo
Schizochytrium là vitamin, Ďặc biệt là vitamin B1, B6 và B12 [66]. Trong Ďó, vitamin
B12 Ďóng vai trò như là cofactor của một số enzyme quan trọng tham gia vào quá trình sinh tổng hợp squalene; vitamin B1 kích thích con Ďường phân hủy leucine, 74 dẫn Ďến tăng số lượng tiền chất của squalene; và vitamin B6 có tác dụng thay Ďổi tác Ďộng của cytochrome, kết quả là ngăn chặn sự phân hủy của squalene. Vì vậy, chúng tôi Ďã nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp 0%, 0,2%, 0,4% và 0,6% của vitamin B1, B6 và B12 lên quá trình sinh tổng hợp squalene của chủng PQ6. Trước tiên cần tiến hành khảo sát sơ bộ nồng Ďộ hỗn hợp vitamin bao gồm B1 (45 g/L), B6 (45 g/L), B12 (0,25 g/L) tối ưu bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở quy mô bình tam giác.
A B
C
Hình 3.6. Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối khô (B),
hàm lượng squalene (C) của S. mangrovei PQ6
Kết quả trên Hình 3.6 A và B Ďã cho thấy MĐTB và SKK của chủng PQ6 nồng Ďộ Ďạt cực Ďại sau 5 và 6 ngày nuôi cấy khi bổ sung Ďộ 0,4% và 0,6% tổ hợp vitamin vào môi trường nuôi cấy tương ứng với (104,82 ± 2,14) x 106 TB/mL và (96,27 ± 1,6) x 106 TB/mL; (39,98 ± 0,35) x 106 TB/mL, (35,76 ± 0,14) g/L, tương ứng. Hàm lượng squalene Ďạt cao nhất ở công thức có bổ sung 0,4% và 0,6% trong ngày nuôi thứ 6 là (76,16 ± 2,34) mg/g SKK và (79,43 ± 4,72) mg/g SKK, tương ứng tăng 34,43% và 36,61% so với công thức Ďối chứng (không bổ sung vitamin). Tuy nhiên, sự khác biệt về hàm lượng squalene ở 2 công thức nêu trên là không có ý nghĩa thống kê sinh học (P > 0,05). Như vậy, khi bổ sung tổ hợp vitamin có tác dụng tăng sinh trưởng và hàm lượng squalene của tảo. Do vậy, Ďể tiết kiệm chi phí 75 chúng tôi lựa chọn bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo ở quy mô lớn hơn nhằm tăng sinh trưởng và hàm lượng squalene của chủng PQ6.
3.2.2. Tối ưu điều kiện nuôi trồng chủng S. mangrovei PQ6 ở bình lên men 30 lít để thu sinh khối tảo giàu squalene Để có thể thu Ďược lượng sinh khối S. mangrovei PQ6 Ďủ Ďể tiến hành các thí nghiệm tách chiết squalene cũng như thử hoạt tính sinh học của chất này, chủng PQ6 cần Ďược nuôi trồng ở cấp Ďộ lớn hơn. Việc nuôi trồng trong các hệ thống bioreactor có hệ thống Ďiều chỉnh tự Ďộng các thông số nhiệt Ďộ, pH, sục khí...như BioFlo-110 ferementor/ Bioreactor (New Brunswick Scientific, USA) có thể Ďảm bảo tối ưu các Ďiều kiện cho sinh trưởng của chủng nghiên cứu. Tuy nhiên, khi nuôi cấy Ďể thu một lượng lớn sinh khối Ďể tiến hành các thí nghiệm ứng dụng sau này gặp phải nhiều khó khăn do giá thành vận hành hệ thống lên men 5, 10 L chuẩn như trên là khá cao (chi phí khoảng 4-5 triệu Ďồng/1 bình/1 Ďợt lên men). Do vậy, Ďể có thể chủ Ďộng trong các thí nghiệm, tiết kiệm chi phí, hệ thống các bình lên men 30 lít tự tạo Ďã Ďược sử dụng Ďể nghiên cứu khả năng sinh trưởng và tích lũy squalene của S. mangrovei PQ6. Trong Ďó, các yếu tố Ďược quan tâm khi nuôi trồng chủng PQ6 ở cấp Ďộ này sẽ bao gồm ảnh hưởng của nguồn cacbon (glucose), nguồn nitơ (cao nấm men) và các kiểu lên men khác nhau Ďến sinh trưởng và khả năng tích lũy squalene của chủng này. Với các hệ thống bình lên men 30 L tự tạo Ďã cho phép chúng tôi có thể chủ Ďộng thí nghiệm nhằm hạn chế tối Ďa yếu tố giới hạn về sinh khối, cho phép giảm giá thành sinh khối tảo cũng như sản phẩm squalene và dễ dàng cho phép chuyển giao Ďược công nghệ nuôi trồng sinh khối chủng PQ6 cho các cơ sở sản xuất squalene sau này. 3.2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong hệ thống bình lên men 30 lít Theo các tác giả Fan và cộng sự (2010) và Nakazawa và cộng sự (2012), nồng Ďộ glucose ban Ďầu có ảnh hưởng lớn Ďến sinh trưởng và khả năng tích lũy squalene của loài A. mangrovei (tên khoa học cũ là S. mangrovei) [116, 157]. Điều này cũng Ďã Ďược chứng minh khi nuôi trồng chủng PQ6 trong bình tam giác. Tương tự, khi nuôi trồng ở bình lên men 30 lít với nồng Ďộ glucose khác nhau là 3, 76
6, 9, 12 và 22%, MĐTB, SKK, hàm lượng squalene của chủng S. mangrovei PQ6 Ďược chỉ ra trong Hình 3.7. Kết quả chỉ ra trên Hình 3.7 cho thấy, MĐTB, SKK và sản lượng squalene của chủng PQ6 tăng mạnh khi nồng Ďộ glucose tăng từ 3 Ďến 9%. Tuy nhiên, các giá trị này lại giảm ở nồng Ďộ Ďường 12 và 22%, ngoại trừ MĐTB. Theo Qu và cộng sự (2013), tác dụng ức chế khi nồng Ďộ glucose cao Ďối với việc sản xuất squalene có thể là do sự ức chế dị hóa. Glucose là một nguồn cacbon - năng lượng chuyển hóa nhanh, nó làm tăng nồng Ďộ ATP nội bào, gây ra sự ức chế sinh tổng hợp enzyme và dẫn Ďến quá trình chuyển hóa năng lượng chậm hơn [161]. Khi nuôi trồng chủng PQ6 ở nồng Ďộ glucose ban Ďầu 9% cho lượng SKK và lượng squalene Ďạt giá trị cao nhất. Lượng SKK và squalene Ďạt giá trị cực Ďại tương ứng là (35,5 ± 0,1) g/L và (1,1 ± 0,1) g/L. Vì vậy, nồng Ďộ glucose thích hợp cho nuôi cấy chủng PQ6 theo mẻ là 9%. Hình 3.8 là ảnh chụp hình thái của chủng PQ6 khi nuôi trồng trong hệ thống lên men có các nồng Ďộ glucose khác nhau.
Hình 3.7. Ảnh hưởng của các nồng Ďộ glucose khác nhau lên sinh trưởng (A-B)
và hàm lượng squalene (C) của S. mangrovei PQ6
77
Hình 3.8. Hình thái của S. mangrovei PQ6 khi nuôi trồng ở các nồng Ďộ glucose
ban Ďầu khác nhau dưới kính hiển vi quang học (Ďộ phóng Ďại x400).
Ghi chú: G-glucose
Quan sát trên Hình 3.8 có thể thấy kích thước tế bào Ďồng Ďều ở nồng Ďộ 6% - 9% glucose và lớn hơn so với nồng Ďộ cao là 12% và 22% glucose. Chính vì vậy, ở nồng Ďộ 22% glucose, mặc dù MĐTB cao nhưng SKK của chủng PQ6 lại Ďạt giá trị thấp hơn so với nồng Ďộ 9%. 3.2.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong hệ thống lên men 30 lít Nitơ là yếu tố cần thiết cho tổng hợp các hợp chất có chứa nitơ như acid amin và protein trong tế bào vi sinh vật. Nguồn nitơ Ďóng vai trò quan trọng trong sinh trưởng và tích lũy lượng lớn các chất thứ cấp của vi sinh vật trong quá trình lên men. Các nguồn nitơ Ďược sử dụng là nguồn nitơ vô cơ như ammonia, nitrate, nguồn nitơ hữu cơ Ďơn giản như urê và monosodium glutamate (mì chính), hay nguồn nitơ hữu cơ phức tạp như cao nấm men, pepton, cao thịt. Đối với một số loài thuộc họ thraustochytrids, cao nấm men kết hợp với monosodium glutamate Ďược xem là nguồn nitơ thích hợp cho tích lũy squalene khi nuôi cấy Aurantiochytrium sp. [112]. Do Ďó, khả năng sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng PQ6 trên các nguồn nitơ là cao nấm men (Y) hoặc cao nấm men và monosodium glutamate (YM) khi nuôi trồng ở bình lên men 30 lít Ďã Ďược nghiên cứu. Kết quả Ďược trình bày ở Hình 3.9. 78
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối
khô (B), sản lượng squalene (C), Ďường dư (D) của tế bào S. mangrovei PQ6 Ghi chú: Y - cao nấm men; YM - cao nấm men và monosodium glutamate
Kết quả chỉ ra trên Hình 3.9 (A-C) cho thấy, MĐTB, SKK và sản lượng squalene của chủng PQ6 bị ảnh hưởng Ďáng kể bởi nguồn nitơ. MĐTB, SKK và sản lượng squalene thấp khi chỉ sử dụng nguồn nitơ là cao nấm men. Ngược lại, khi kết hợp cả hai nguồn nitơ là cao nấm men và monosodium glutamate, mật Ďộ tế bào, SKK và sản lượng squalene Ďạt cao hơn với giá trị cực Ďại tương ứng là (3,3 x 108) TB/mL, 46,7 g/L và 1,6 g/L sau 72 h nuôi cấy. Sau thời Ďiểm này, SKK và sản lượng squalene giảm nhẹ và không có sự khác biệt Ďáng kể giữa môi trường chỉ có cao nấm men hoặc kết hợp cả hai nguồn nitơ là cao nấm men và monosodium glutamate. Theo Fan và cộng sự (2010) tốc Ďộ sinh trưởng của tảo có mối liên quan chặt chẽ Ďến khả năng tiêu thụ glucose trong môi trường [157]. Tốc Ďộ sinh trưởng của tảo giảm khi môi trường nuôi cấy thiếu hụt glucose và ngược lại. Khi phân tích hàm lượng Ďường dư trong môi trường chứa cao nấm men và monosodium glutamate, nồng Ďộ glucose giảm Ďáng kể trong khoảng thời gian 0-72 h. Hàm lượng Ďường dư trong môi trường nuôi cấy Ďạt 71 g/L trong 24 h Ďầu tiên, sau Ďó giảm xuống 39 g/L ở thời Ďiểm 48 h và còn 7,1 g/L sau 72 h (Hình 3.9D). Sau 72 h lên men, nồng Ďộ 79 glucose trong môi trường nuôi cấy bắt Ďầu bị thiếu hụt dẫn Ďến sinh trưởng cũng như sản lượng squalene bị giảm. Ngược lại, nồng Ďộ glucose trong môi trường chứa cao nấm men chỉ giảm nhẹ. Sau 120 h lên men, nồng Ďộ glucose còn 61,4 g/L và sinh trưởng Ďạt cực Ďại với giá trị SKK Ďạt 35,5 mg/L. Kết quả này cho thấy khi sử dụng kết hợp cả hai nguồn nitơ là cao nấm men và monosodium glutamate Ďã thúc Ďẩy quá trình tiêu thụ Ďường mạnh hơn dẫn Ďến sinh trưởng của tảo Ďạt Ďược cao hơn. Hàm lượng squalene không thay Ďổi Ďáng kể khi sử dụng nguồn nitơ là cao nấm men hoặc kết hợp cả cao nấm men và monosodium glutamate. Tuy nhiên, sản lượng squalene khi sử dụng kết hợp cả hai nguồn nitơ nói trên Ďạt giá trị cao nhất sau 72 h lên men (1605,5 mg/L), trong khi Ďó cũng tại thời Ďiểm này sản lượng squalene trong môi trường có cao nấm men chỉ Ďạt 1195,2 mg/L. Điều này có thể Ďược giải thích là do tăng lượng sinh khối trong môi trường khi kết hợp cả hai nguồn nitơ. Vì vậy, nguồn nitơ trong thí nghiệm của chúng tôi chỉ có tác dụng làm tăng tốc sinh trưởng của tảo dẫn Ďến tăng sản lượng squalene chứ không có tác dụng tăng khả năng tích lũy squalene trong tảo phù hợp như mô tả của Chen và cộng sự (2010) [112]. Trong công nghệ lên men thu các hợp chất thứ cấp, muốn thu lượng sản phẩm cao Ďòi hỏi lượng cơ chất Ďầu vào phải cao. Tuy nhiên, nếu nồng Ďộ cơ chất trong dịch nuôi cấy ban Ďầu cao cũng sẽ ức chế quá trình sinh trưởng của vi sinh vật hoặc làm giảm lượng sản phẩm. Do vậy, nếu bắt Ďầu quá trình nuôi cấy với hàm lượng glucose thấp và bổ sung vào thời Ďiểm sau Ďó thì pha lag có thể Ďược rút ngắn, giúp tăng sinh trưởng và sản xuất các hợp chất thứ cấp [162]. Bên cạnh Ďó, kết quả nghiên cứu của chúng tôi về ảnh hưởng của nồng Ďộ glucose ở trên cũng cho thấy nếu nồng Ďộ glucose ban Ďầu trên 9% sẽ làm ức chế sinh trưởng và giảm tích lũy squalene của chủng PQ6. Chính vì vậy, bước tiếp theo trong nghiên cứu tối ưu Ďiều kiện lên men Ďể tăng khả năng sinh trưởng và hàm lượng squalene của chủng PQ6 với môi trường có nguồn nitơ là cao nấm men và monosodium glutamate, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất là glucose. 3.2.2.3. Ảnh hưởng của lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 Nuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch) về bản chất Ďây là phương pháp nuôi theo mẻ có bổ sung các chất dinh dưỡng (liên tục hoặc không liên tục) 80
trong quá trình nuôi. Vì vậy, nuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất thường cho năng suất cao hơn lên men theo mẻ trong cùng thời gian và Ďiều kiện lên men. Nuôi cấy fed-batch có bổ sung glucose không liên tục và không cần loại bỏ dịch lên men là một trong những phương pháp phổ biến nhất Ďể sản xuất các hợp chất thứ cấp ở quy mô công nghiệp như ethanol, squalene… [66, 163]. Pora và cộng sự (2014) Ďã thông báo rằng hàm lượng squalene của một số loài thraustochytrid có thể tăng từ 5-10 lần so với nuôi theo mẻ khi sử dụng phương pháp nuôi cấy fed-batch có bổ sung glucose lên tới 22% [66]. Vì vậy, ảnh hưởng của lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất là Ďường Ďến 22% lên sự thay Ďổi sinh trưởng và sản lượng squalene của chủng PQ6 Ďã Ďược nghiên cứu. Kết quả Ďã trình bày ở Hình 3.9D cho thấy nồng Ďộ glucose giảm rất nhanh sau 24 h và cạn kiệt vào thời Ďiểm 72 h. Trước Ďó, tại thời Ďiểm 48 h nồng Ďộ glucose trong môi trường Ďã ở mức khá thấp. Do Ďó, bổ sung thêm glucose vào thời Ďiểm 48 h Ďể nồng Ďộ glucose trong môi trường Ďạt 22% Ďã Ďược lựa chọn. Sự thay Ďổi hình thái tế bào của chủng PQ6 ở các thời Ďiểm khác nhau trong quá trình lên men fed-batch có bổ sung cơ chất Ďược trình bày ở Hình 3.10. Hình 3.11 chỉ ra ảnh hưởng của nuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất glucose lên sự thay Ďổi mật Ďộ tế bào, sinh khối khô, sản lượng squalene của chủng PQ6 và hàm lượng Ďường dư trong nuôi cấy ở Ďều kiện nêu trên.
Hình 3.10. Ảnh hình thái của S. mangrovei PQ6 dưới kính hiển vi quang học ở các thời Ďiểm khác nhau khi nuôi lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất trong bình 30 Lít. (Độ phóng Ďại x 40 X)
81
A B
C D
Hình 3.11. Mật Ďộ tế bào (A), sinh khối khô (B), sản lượng squalene (C) của S. mangrovei PQ6 và hàm lượng Ďường dư (D) trong nuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất ở bình lên men 30 Lít
MĐTB và lượng SKK tăng mạnh và Ďạt cực tại thời Ďiểm 108 h lên men (392,53 ± 1,91) × 106 TB/mL và (100,41 ± 1,43) g/L, tương ứng) (Hình 3.11 A và B). Sau 132 h nuôi cấy, MĐTB và SKK giảm, kết quả này cũng phù hợp với kết quả phân tích nồng Ďộ glucose thấp còn lại trong môi trường nuôi (6,9 g/L) Ďã dẫn Ďến giảm tốc Ďộ sinh trưởng của tế bào (Hình 3.11 D). Sản lượng squalene giảm sau 84 h, mặc dù MĐTB và SKK vẫn tiếp tục tăng. Sản lượng squalene cao nhất Ďạt Ďược là (4592,53 ± 0,3) mg/L ở 84 h (Hình 3.11 C). So với nuôi cấy theo mẻ, sản lượng squalene Ďã tăng 2-3 lần khi sử dụng phương pháp nuôi fed-batch có bổ sung cơ chất là glucose. Như vậy lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất có tác dụng tăng tốc Ďộ sinh trưởng và tích lũy squalene trong tế bào S. mangrovei PQ6. 3.2.2.4. Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 Phù hợp với công bố của tác giả Pora và cộng sự (2014) [66], trong Ďiều kiện thí nghiệm của chúng tôi thì vitamin (Ďặc biệt là tổ hợp vitamin B1, B6, B12) có thể tăng sản xuất squalene ở chủng PQ6 Ďã Ďược chứng minh ở quy mô bình tam giác 82 và Ďược trình bày ở mục 3.2.1.5 ở trên. Dựa trên kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tổ hợp vitamin bao gồm B1 (45 g/L), B6 (45 g/L), B12 (0,25 g/L) ở quy mô bình tam giác, ảnh hưởng của tổ hợp này với nồng Ďộ tối ưu là 0,4% lên quá trình sinh tổng hợp squalene của chủng PQ6 trong quá trình nuôi lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất ở bình lên men 30 L Ďược tiếp tục nghiên cứu. Trước hết Ďể xác Ďịnh Ďược thời gian tối ưu cho bổ sung Ďường trong quá trình lên men theo mẻ khi có mặt tổ hợp vitamin, xu thế tăng trưởng của tế bào, hàm lượng Ďường tiêu thụ và tổng hợp squalene trong lên men mẻ có tổ hợp vitamin Ďã Ďược nghiên cứu (Hình 3.12).
A B
C
Hình 3.12. Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin B1, B6, B12 lên sinh khối (A), hàm
lượng squalene (B) và lượng Ďường dư (C) trong môi trường khi nuôi cấy theo
mẻ S. mangrovei PQ6. Ghi chú: 0,4% hỗn hợp vitamin gồm: Vitamin B1- 45 g/L;
Vitamin B6: 45 g/L; Vitamin B12 - 0, 25 g/L
Sinh khối của chủng PQ6 trong môi trường chứa hỗn hợp vitamin tăng nhanh trong 48 h trong khi việc sản xuất squalene gần như không Ďổi trong 36 h (Hình 3.12 A-B). Nồng Ďộ glucose sau Ďó Ďã giảm và cạn kiệt sau 48 h trong quá trình lên men, trùng với sự tăng về sinh trưởng và tích lũy squalene (Hình 3.12 C). Khi nuôi cấy chủng PQ6 trong môi trường không có vitamin, sản lượng sinh khối và squalene 83 cũng như việc tiêu thụ glucose là cao hơn khi so với bổ sung vitamin vào môi trường nuôi. Do Ďó, thời gian tối ưu Ďể bổ sung Ďường trong quá trình lên men là 36 h. Sự thay Ďổi về MĐTB, SKT, SKK, hàm lượng squalene ở các giai Ďoạn nuôi khác nhau khi lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất khi có hoặc không có tổ hợp vitamin Ďược chỉ ra trong Bảng 3.2. Kết quả cho thấy MĐTB và lượng sinh khối trong lên men có bổ sung tổ hợp vitamin tăng cao hơn so với khi không bổ sung vitamin. Sau 96 h lên men có bổ sung vitamin, lượng SKK Ďạt giá trị cao nhất là (105,25 ± 0,75) g/L và tại thời Ďiểm này lượng glucose còn lại trong môi trường không Ďáng kể (11,65 g/L). Cùng với việc tăng sinh trưởng, tổ hợp vitamin cũng cho thấy có khả năng kích thích sinh tổng hợp squalene của chủng PQ6. Sau khi bổ sung Ďường Ďến nồng Ďộ 22%, hàm lượng squalene tăng mạnh từ 0 Ďến 48 h và sau Ďó giảm dần. Tại thời Ďiểm 48h, hàm lượng và sản lượng squalene Ďạt cực Ďại tương ứng là (91,53 ± 2,45) mg/g SKK và (6928,6 ± 14,6) mg/L. Các giá trị này cao gấp 2-3 lần khi so sánh với các giá trị về hàm lượng và sản lượng của chủng PQ6 Ďược lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất nhưng không có bổ sung vitamin và cao gấp 4-6 lần khi nuôi lên men theo mẻ. Như vậy, Ďể thu Ďược sinh khối giàu squalene, phương pháp nuôi theo mẻ có bổ sung glucose 22% và thu hoạch tảo sau 48 h bổ sung glucose Ďã Ďược lựa chọn. Khi so sánh với công bố của Pora và cộng sự (2014), chúng tôi thấy rằng sản lượng squalene của S. mangrovei PQ6 cao hơn rất nhiều. Sản lượng squalene của chủng PQ6 Ďạt Ďược là 6,9 g/L trong khi giá trị này ở Schizochytrium sp., Schizochytrium sp. ATCC 20888 và Aurantiochytrium sp. ATCC PRA 276 tương ứng Ďạt Ďược là 6,7, 3,7, và 1,7 g/L [66].
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên hàm lượng và sản lượng squalene trong quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất của tế bào S. mangrovei PQ6 Thời Mật Ďộ tế bào Sinh khối khô (g/L) Glucose dư Sản lượng squalene gian (h) (106 tb/mL) (mg/mL) (mg/L)
Có VTM Không VTM Có VTM Không VTM Có VTM Không VTM Có VTM Không VTM
0 0,90 ± 0,07 0,90 ± 0,21 - - 75,00 ± 2,79 75,00 ± 1,63 - -
24 222,35 ± 13,71 45,44 ± 2,63 24,43 ± 0,41 12,25 ± 1,36 42,48 ± 0,54 58,50 ± 1,66 953 ± 20,63 1079,7 ± 21,57 36 271,00 ± 12,53 203,52 ± 9,66 39,33 ± 1,59 27,95 ± 0,77 10,11 ± 1,53 35,13 ± 2,60 1332 ± 89,52 757,35 ± 20,23 Bổ sung glucose
12 262,03 ± 17,70 226, 52 ± 6,12 44,10 ± 2,09 42,69 ± 3,19 217,82 ± 1,91 209,00 ± 1,18 2938,15 ± 50,5 1206,24 ± 46,45 24 309,17 ± 7,42 278,18 ± 8,03 60,56 ± 1,95 42,63 ± 1,72 190,45 ± 1,77 205,80 ± 3,82 4346,36 ± 11,74 1567,54 ± 45,82 48 369,35 ± 7,94 300,9 ± 5,14 75,41 ± 1,35 59,36 ± 2,42 164,78 ± 1,85 170,17 ± 1,30 6928,83 ± 14,60 2384,24 ± 12,58 72 381,97 ± 5,63 345,4 ± 3,18 99,28 ± 1,48 79,85 ± 0,82 72,59 ± 0,34 102,21± 2,19 5505,91 ± 45,57 4759,44 ± 10,63 96 374,93 ± 9,45 359,6 ± 5,56 105,25 ± 0,75 92,93 ±1,59 11,65 ± 2,47 37,64 ± 1,42 4007,65 ± 22,25 3549,11 ± 50,28
120 298,81 ± 8,23 202,53 ± 9,58 100,10 ± 0,18 90,37 ±1,06 3,84 ± 0,54 6,94 ± 0,53 3410,64 ± 40,41 2678,84 ± 34,35
Ghi chú: VTM- vitamin;0,4% hỗn hợp vitamin gồm vitamin B1 - 45 g/L; vitamin B6 -45 g/L; vitamin B12 - 0,25 g/L
84
85
Nile Red là thuốc nhuộm huỳnh quang Ďược sử dụng Ďể phát hiện các hạt lipit trung tính trong tế bào nhân sơ và tế bào nhân chuẩn [164]. Vì squalene nằm trong phần lipid KXPH nên có thể quan sát Ďịnh tính sự tích lũy squalene thông qua nhuộm Nile Red. Hình 3.13 là ảnh chụp tế bào chủng PQ6 ở các giai Ďoạn nuôi cấy khác nhau trong thí nghiệm lên men fed-batch có bổ sung hỗn hợp vitamin.
Hình 3.13. Hình thái tế bào chủng PQ6 ở các giai Ďoạn nuôi cấy của quá trình lên men fed-batch. A- Trước thời Ďiểm bổ sung glucose; B- Sau khi bổ sung glucose lên
22%. (a) Kính hiển vi quang học; (b) Nile red; (c) Kính hiển vi Ďiện tử truyền qua.
L- thể lipit; Mi- ty thể; N- nhân; V- không bào. Thanh kích thước a-b = 10 µm; c = 2 µm.
Có thể thấy, trong 36 h Ďầu nuôi cấy theo mẻ, trước khi bổ sung cơ chất, các hạt lipid nằm rải rác trong phần tế bào chất của tế bào (Hình 3.13 A). Sau khi bổ sung glucose tại thời Ďiểm 36 h, các thể lipid Ďược hình thành nhiều hơn sau 48 h lên men (Hình 3.13B). Ảnh chụp siêu cấu trúc tế bào của chủng PQ6 cũng Ďã cho thấy các thể lipid với kích thước nhỏ chiếm ưu thế trong 36 h Ďầu lên men (0,12- 1,18 µm) (Hình 3.13A-C). Sau khi bổ sung glucose, mặc dù số lượng thể lipid giảm nhưng kích thước tăng dần tới 2,06 µm (Hình 3.13B-C).
86
Tóm lại, chúng tôi đã xác định được điều kiện cho sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 là lên men theo mẻ, có bổ sung cơ chất là
đường glucose đến 22% và 0,4% hỗn hợp vitamin (vitamin B1-45 g/L, vitamin B6-45 g/L và vitamin B12-0,25 g/L) với nguồn nitơ là 1,2% cao nấm men và 6,42% monosodium glutamate. Trong đó, thời gian tối ưu để bổ sung glucose trong quá trình lên men là tại thời điểm 36 giờ và tiến hành thu sinh khối tảo sau 48 giờ bổ sung glucose. Sinh khối có mật độ tế bào đạt (369,35 ± 7,94) x 106 TB/mL, sinh khối khô đạt (75,41 ± 1,35) g/L, hàm lượng squalene đạt (91,53 2,45) mg/g SKK và sản lượng squalene đạt (6928,6 14,6) mg/L. 3.3. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene từ S. mangrovei PQ6 Hiện nay, trên thế giới có nhiều phương pháp tách chiết và tinh sạch squalene như: sử dụng các dung môi hữu cơ như n-hexan và phương pháp sắc ký cột silica gel, phương pháp chưng cất khử mùi (deodorization distillate), sử dụng
CO2 siêu tới hạn….[4, 68]. Với mục tiêu tách chiết và tinh sạch Ďược một lượng lớn squalene Ďủ cho các thử nghiệm về Ďộc tính cấp, bán trường diễn và tác dụng sinh dược sau này, chúng tôi Ďã nghiên cứu, tối ưu Ďiều kiện tách chiết lượng nhỏ, sau Ďó là một lượng lớn squalene từ sinh khối chủng S. mangrovei PQ6. 3.3.1. Tối ưu điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ S. mangrovei PQ6 Quá trình tách chiết squalene tinh sạch từ sinh khối chủng PQ6 Ďược tiến hành theo các bước: tách chiết lipid tổng số từ sinh khối chủng PQ6; tách chiết lipid KXPH; tách chiết squalene thô từ lipid tổng số; tinh sạch squalene từ squalene thô. Sau Ďó, squalene Ďã tách chiết Ďược xác Ďịnh hàm lượng bằng HPLC cũng như xác Ďịnh cấu trúc bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân. 3.3.1.1. Tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S. mangrovei PQ6 Trong quy trình tách chiết squalene thì tách chiết lipid tổng số là một bước quan trọng, ảnh hưởng Ďến lượng sản phẩm cuối cùng là squalene. Do vậy, trước tiên, chúng tôi Ďã xác Ďịnh các Ďiều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết lipid tổng số như loại dung môi, nhiệt Ďộ, thời gian, Ďiều kiện khuấy trộn, số lần tách chiết, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, nhiệt Ďộ sấy sinh khối, Ďộ ẩm sinh khối. Kết quả Ďược trình bày trên Hình 3.14.
87
Hình 3.14. Ảnh hưởng của các yếu tố dung môi (A), nhiệt Ďộ (B), thời gian (C), số lần chiết (D) tỷ lệ sinh khối/dung môi (E), chế Ďộ khuấy trộn (G), nhiệt Ďộ sấy sinh khối (H), Ďộ ẩm sinh khối (I) lên hiệu suất tách chiết lipid.
88
Ảnh hưởng của các loại dung môi Kết quả Hình 3.14A cho thấy trong cùng Ďiều kiện tách chiết thì hiệu suất tách chiết lipid tổng số với các dung môi n-hexane, chloroform và petroleum ete tương ứng là (62,1 ± 2,11)% SKK, (63,5 ± 1,78)% SKK và (52,8 ± 1,95)% SKK. Mặc dù sử dụng dung môi chloroform cho hiệu suất Ďạt cao nhất, tuy nhiên, trong sản xuất công nghiệp khả năng thu hồi triệt Ďể chloroform khó hơn so với n-hexane. Bên cạnh Ďó, phân tích ANOVA ở mức ý nghĩa α = 0,05 Ďã cho thấy không có sự khác biệt giữa hàm lượng lipid tách bằng chloroform và n-hexan (P > 0,05). Do Ďó n- hexane Ďược coi là dung môi thích hợp cho tách chiết lipit tổng số từ sinh khối tảo. Ảnh hưởng của nhiệt độ tách chiết Khi xét Ďến yếu tố nhiệt Ďộ Ďã cho thấy hiệu suất tách chiết lipit tăng khi nhiệt Ďộ của quá trình phản ứng tăng và Ďạt cao nhất ở ngưỡng nhiệt Ďộ 70-75oC với (69,7 ± 2,24)% SKK (Hình 3.14B). Tuy nhiên, không có sự sai khác về hiệu suất tách chiết lipid ở hai khoảng nhệt Ďộ 50-55 và 60-65oC (P > 0,05). Do vậy, 70- 75 oC là ngưỡng nhiệt Ďộ thích hợp cho tách chiết lipid Ďã Ďược lựa chọn. Ảnh hưởng của thời gian tách chiết Kết quả Hình 3.14C Ďã cho thấy hàm lượng lipid tổng số tăng khi tăng thời gian tách chiết. Khi khuấy trong thời gian 1 và 3 giờ thì khả năng thu triệt Ďể hàm lượng lipid trong sinh khối tảo là không cao, chỉ Ďạt (36,7 ± 1,27)% SKK và (59,2 ± 1,78)% SKK, tương ứng. Khi tăng thời gian lên 4 và 5 giờ tách chiết thì hàm lượng lipid tổng số tăng lên 13-15% so với hàm lượng lipid tổng số thu Ďược ở thời Ďiểm 3 giờ. Tuy nhiên, sự sai khác về hiệu suất không có ý nghĩa thống kê sinh học ở hai khoảng thời gian này (P > 0,05). Do Ďó, Ďể tiết kiệm chi phí thì thời gian tách chiết 4 giờ Ďược lựa chọn Ďể tách dầu ở qui mô lớn. Ảnh hưởng của số lần tách chiết Sinh khối chủng PQ6 Ďược chiết từ 1, 2 và 3 lần trong dung môi n-hexane, khuấy trộn liên tục trong vòng 4 giờ ở nhiệt Ďộ 70-75oC. Kết quả nghiên cứu thu Ďược trên Hình 3.14D cho thấy tăng số lần chiết thì hàm lượng lipid tổng số có xu hướng tăng, tuy nhiên, tăng không Ďáng kể, từ (68,7 ± 1,17)% SKK lên (73,5 ± 1,69)% SKK. Bên cạnh Ďó, khi so sánh với lượng hóa chất sử dụng cho các lần tách chiết (tăng gấp 2 và 3 lần so với công thức tách chiết 1 lần) thì lượng lipid tăng
89 không Ďáng kể. Bởi vậy, khi xét Ďến hiệu quả kinh tế, chúng tôi lựa chọn tách chiết 1 lần là tối ưu Ďể vừa Ďạt hiệu suất lipid cao, vừa tiết kiệm Ďược hóa chất sử dụng. Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối: dung môi Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi có ảnh hưởng không nhỏ lên quá trình tách chiết lipid tổng số [165]. Kết quả trên Hình 3.14E cho thấy với tỉ lệ 1:8, hiệu suất tách chiết lipid Ďạt Ďược (60,4 ± 1,87)% SKK và khi tăng tỷ lệ này lên 1:10 và 1:12 thì hiệu suất tách chiết lipid tăng lên không Ďáng kể là (69,7 ± 2,54)% SKK và (71,2 ± 2,71)% SKK, tương ứng. Do Ďó, Ďể tiết kiệm dung môi cũng như tiết kiệm chi phí, việc lựa chọn tỷ lệ sinh khối: dung môi là 1:8 sẽ Ďem lại hiệu quả kinh tế cao nhất. Ảnh hưởng của chế độ khuấy trộn Mối tương quan giữa chế Ďộ khuấy (khuấy liên tục, Ďể tĩnh và khuấy gián Ďoạn với chế Ďộ khuấy 1 giờ và Ďể tĩnh trong 1 giờ) và hiệu suất tách lipid từ sinh khối PQ6 Ďược thể hiện ở Hình 3.14G. Hiệu quả tách lipid tăng lên Ďáng kể khi tảo Ďược tách chiết trong dung môi dưới Ďiều kiện khuấy trộn liên tục (tăng từ (33,4 ± 1,21)% SKK khi không khuấy trộn lên (65,8 ± 2,14)% SKK khi khuấy trộn liên tục). Mục Ďích của việc khuấy trộn này là Ďể ngăn chặn sự ngưng kết cục bộ và giúp sinh khối tảo Ďược tiếp xúc một cách Ďầy Ďủ với dung môi chiết. Khi Ďể tĩnh hoặc khuấy gián Ďoạn, sinh khối có thể bị lắng xuống Ďáy bình, sự tiếp xúc giữa sinh khối và dung môi giảm, dẫn Ďến hiệu suất lipid không Ďạt Ďược hiệu quả cao. Như vậy, sự khuấy trộn là cần thiết Ďể tăng cường hàm lượng lipid trong quá trình phản ứng. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy sinh khối Sinh khối tảo trước khi Ďược tách lipid tổng số cần qua công Ďoạn sơ chế như sấy khô nhằm nâng cao hiệu suất tách chiết [166]. Chính vì vậy, nhiệt Ďộ sấy cũng có ảnh hưởng Ďáng kể tới chất lượng sản phẩm sau này. Để tránh gây tổn thất cũng như làm biến Ďổi các thành phần trong nguyên liệu, sinh khối tảo S. mangrovei PQ6 sau khi thu hoạch sẽ Ďược sấy ở các nhiệt Ďộ 60, 70, 80 và 90oC. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt Ďộ sấy Ďến hiệu suất tách lipid Ďược trình bày ở Hình 3.14H. Kết quả cho thấy nhiệt Ďộ sấy thích hợp cho tách chiết lipid từ tảo là 80C bởi ở nhiệt Ďộ này hiệu suất tách lipid Ďạt cao nhất (71,2 ± 2,71)% SKK. Khi nhiệt Ďộ sấy cao hơn, nguyên liệu quá khô làm giảm hiệu suất tách chiết và chất lượng lipid thu Ďược. Vì
90 vậy, Ďể thu Ďược hàm lượng dầu tách chiết Ďược cao nhất, Ďồng thời tiết kiệm Ďược năng lượng sử dụng trong quá trình sấy nên chọn nhiệt Ďộ sấy sinh khối là 80oC. Ảnh hưởng của độ ẩm sinh khối Sinh khối tảo ở các Ďộ ẩm 3, 30, 50, 80% Ďược sử dụng Ďể tách chiết lipid tổng số theo Ďiều kiện tối ưu với các thông số như: dung môi n - hexane, tỷ lệ sinh khối:dung môi là 1: 8, nhiệt Ďộ 70-75oC, khuấy liên tục trong thời gian chiết 4 giờ. Kết quả về ảnh hưởng của Ďộ ẩm sinh khối lên hiệu suất tách chiết lipid Ďược thể hiện ở Hình 3.14I. Kết quả cho thấy khi Ďộ ẩm sinh khối càng cao, hiệu suất tách lipid càng giảm. Cụ thể, hàm lượng lipid thu Ďược giảm từ (68,7 ± 2,52)% SKK xuống (26,6 ± 1,38)% SKK khi Ďộ ẩm sinh khối tăng từ 3-80%. Điều này cho thấy, trong thí nghiệm tách chiết lipid thì hàm lượng lipid thu Ďược phụ thuộc vào khối lượng thực sinh khối Ďem tách chiết. Do Ďó, Ďể nâng cao hiệu suất tách chiết lipit cần sấy sinh khối tảo Ďến khối lượng không Ďổi (Ďộ ẩm 3%). Như vậy, điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết lipid tổng số của S. mangrovei PQ6 là sinh khối ban đầu sấy ở 80oC đến độ ẩm 3%, sử dụng dung môi n-hexane, nhiệt độ tách chiết 70-75oC, khuấy liên tục trong thời gian 4 giờ, chiết 1 lần với tỷ lệ sinh khối: dung môi là 1:8 (w/v), 3.3.1.2. Tách chiết lipid không xà phòng hóa từ lipid tổng số Squalene là một thành phần nằm trong lipid KXPH của vi tảo. Việc phân tách lipid KXPH từ lipid tổng số nhằm mục Ďích nâng cao hàm lượng squalene và giảm sự phức tạp trong thành phần của mẫu lipid dùng cho phân tích TLC và HPLC. Do vậy, các Ďiều kiện thích hợp cho việc tách chiết lipid KXPH từ lipid tổng số Ďã Ďược nghiên cứu. Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform khác nhau (1:1, 2:1, 3:1, 4:1 và 5:1) lên hiệu suất tách lipid KXPH Ďược trình bày trên Bảng 3.3. Kết quả trên Bảng 3.3 cho thấy, hiệu suất tách lipid KXPH thay Ďổi khi tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane:chloroform thay Ďổi. Cụ thể hiệu suất tách chiết lipid KXPH Ďạt (7,3 ± 0,28)% lipid tổng số với tỷ lệ n-hexane:chloroform là 1:1. Tăng tỷ lệ n-hexane lên 2:1, hiệu suất tách chiết lipid KXPH tăng lên (8,1 ± 0,14)% lipid tổng số. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng tỷ lệ này lên 3:1, 4: 1 và 5:1 thì hàm lượng lipid KXPH lại giảm dần. Hơn nữa, khi so sánh hàm lượng squalene có mặt trong phần lipid KXPH Ďược tách từ hỗn hợn dung môi n-hexane: chloroform với tỷ lệ
91
2:1 và 4:1 (Bảng 3.4) Ďã cho thấy hàm lượng squalene có mặt ở phần lipid KXPH Ďược tách bằng hỗn hợp dung môi có tỷ lệ 2:1 lại cao hơn khoảng 18% so với khi sử dụng hỗn hợp dung môi có tỷ lệ 4:1. Do vậy, tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform cho tách chiết lipid KXPH là 2:1 Ďã Ďược lựa chọn. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform lên hàm lượng và hiệu suất tách chiết lipid KXPH từ lipid tổng số của chủng PQ6 Tỷ lệ Lượng lipid KXPH Hiệu suất lipid KXPH n-hexane: chloroform (g) (% lipid tổng số) 1:1 0,73 ± 0,02 7,3 ± 0,28 2:1 0,81 ± 0,01 8,1 ± 0,14 3:1 0,54 ± 0,01 5,36 ± 0,15 4:1 0,38 ± 0,00 3,8 ± 0,00 5:1 0,38 ± 0,005 3,75 ± 0,07
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform lên hiệu suất tách chiết lipid KXPH và hàm lượng squalene từ lipid tổng số của chủng PQ6
Tỷ lệ n-hexane: chloroform 2:1 4:1 Hiệu suất lipid KXPH (% lipid tổng số) 8,1 3,8 Hiệu suất lipid KXPH (% SKK) 4,97 2,48
3.3.1.3. Tinh sạch và định lượng squalene bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp Sau khi tách chiết lipid KXPH (squalene thô) từ lipid tổng số của chủng PQ6 chúng tôi tiếp tục làm sạch bằng phương pháp TLC. Kết quả chỉ ra trên Hình 3.15 A cho thấy mẫu lipid KXPH tách chiết từ sinh khối chủng PQ6 có xuất hiện băng tương Ďồng với băng squalene chuẩn. Đồng thời, phần silicagel có chứa các băng này tiếp tục Ďược sử dụng Ďể phân tích bằng HPLC. Định lượng bằng HPLC, hàm lượng chất này Ďạt khoảng (50,10 ± 0,03) mg/g SKK. Kết quả thu Ďược trên Hình 3.15 B cho thấy squalene tách chiết Ďược có Ďộ tinh sạch cao (98,6%) và không bị tạp nhiễm. Nakazawa và cộng sự (2012) cũng Ďã xác Ďịnh hàm lượng squalene trong một số chủng tảo bằng phương pháp TLC kết hợp GC [116]. Kết quả Ďã cho thấy, hàm lượng squalene của 3 chủng Aurantiochytrium limacinum 9F-4a, 4W-1b, 18W- 13a và chủng Schizochytrium limacinum SR21 Ďạt 0,6 mg/g SKK; 0,5 mg/g SKK; 171,1 và 0,2 mg/g SKK, tương ứng. Như vậy, so với chủng 18w-13a (171,1 mg/g
92
SKK) thì hàm lượng squalene của chủng PQ6 trong nghiên cứu này thấp hơn nhiều. Do Ďó, phương pháp tách chiết và làm giàu squalene bằng dung môi Ďể nâng cao và làm giàu hàm lượng squalene ở chủng PQ6 Ďã Ďược sử dụng. A B
Hình 3.15. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipid không xà phòng hóa (A) và sắc ký Ďồ squalene tinh sạch từ sinh khối chủng PQ6 (B). (A: giếng 1: squalene chuẩn - 2 mg; giếng 2, 3, 4, 5, 6, 7: lipid KXPH tách từ sinh khối chủng PQ6) 3.3.1.4. Tách chiết, tinh sạch và làm giàu squalene bằng phương pháp dung môi Quá trình làm giàu squalene theo Choo và cộng sự (2005) Ďược tiến hành như mô tả ở phần Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu [131]. Kết quả thu Ďược của hàm lượng squalene sau quá trình làm giàu Ďược thể hiện ở Hình 3.16 và Hình 3.17.
Hình 3.16. Hàm lượng squalene qua các bước làm giàu và tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6.
Ghi chú: Bước 1: Lipid tổng số được este hóa với methanol (2:1, w/w) và NaOH (1:100, w/v), phản ứng liên tục ở 60oC/3h. Sau đó, làm nguội ở nhiệt độ phòng. Bổ sung nước cất theo tỷ lệ hỗn hợp: nước là 2:1 (v/v) để thu lớp dưới. Tiếp theo loại bỏ dung môi thu sản phẩm. Bước 2: Sản phẩm bước 1 được xà phòng hóa trong 10% KOH (1,65:1, w/v) và ethanol (6,64 :1, w/v), khuấy trộn liên tục ở 60oC/3h. Sau đó, bổ sung hỗn hợp
93
ethanol: nước cất nóng: n-hexane (tỷ lệ hỗn hợp: dung môi là 1: 3: 6: 10, w/v/v/v). Hỗn hợp phân thành 2 lớp. Phần lớp dưới được rửa 4 lần với hỗn hợp n-hexane: nước cất (tỷ lệ 9:1, v/v). Cất quay loại bỏ n-hexane thu hồi lipit KXPH. Bước 3: Sản phẩm bước 2 bổ sung hỗn hợp ethanol: n-hexane: nước cất (tỷ lệ 1:12:12:1, w/v/v/v). Sau đó, hỗn hợp được phân thành 2 lớp, thu lớp n-hexane phía trên. Sau đó, toàn bộ lớp trên được loại bỏ n-hexane bằng cất quay. Bước 4: Sản phẩm bước 3 bổ sung hỗn hợp n-hexane: methanol: nước cất (tỷ lệ mẫu: dung môi là 1: 10: 0,5: 0,5, w/v/v/v, tương ứng). Tiếp theo đun nóng từ từ hỗn hợp lên đến 70oC. Sau đó, làm nguội từ từ xuống nhiệt độ phòng. Khi đó, hỗn hợp phân thành 2 lớp, pha n-hexane phía trên được lọc qua giấy lọc Ө11 và rửa với một lượng dư n-hexane (khoảng 10 mL). Sau đó làm bay hơi pha trên thu lipid KXPH. Bước 5: Lặp lại bước 4 với hỗn hợp dung môi n-hexane: methanol: nước cất ở tỷ lệ mẫu: dung môi là 1: 19: 0,5: 0,5 (w/v/v/v). Bước 6: Sản phẩm bước 5 được bổ sung hỗn hợp dung môi n-hexane: methanol (tỷ lệ mẫu: dung môi là 1: 70: 28, (w/v/v). Sau đó, để lắng tự nhiên thấy hỗn hợp phân thành 2 lớp, thu lớp n-hexane phía trên. Làm bay hơi n-hexane ở phần pha trên để thu lipid KXPH.
Kết quả chỉ ra trên Hình 3.16 Ďã cho thấy hàm lượng squalene tăng từ (61,76 ± 0,12) mg/g SKK (sau bước 1) lên 104,99 ± 0,34 mg/g SKK (sau bước thứ 6). Như vậy, với quy trình này thông qua một loạt các dung môi hữu cơ thì hàm lượng squalene tăng 1,7 lần sau bước 6 so với bước 1. Để xác Ďịnh cấu trúc của squalene thu Ďược sau quá trình làm giàu chúng tôi tiến hành tinh sạch bằng phương pháp sắc ký cột silicagel. Squalene Ďược rửa hoàn toàn bằng n-hexan. Các phân Ďoạn Ďược kiểm tra bằng TLC, so sánh với squalene chuẩn và phân tích bằng HPLC. Hình 3.17 B Ďã khẳng Ďịnh squalene có Ďộ tinh sạch cao (>98%) và không bị tạp nhiễm.
A B
7 6 5 4 3 2 1
Hình 3.17. Ảnh chạy sắc ký lớp mỏng (A) và sắc ký Ďồ của squalene tinh sạch sau quá trình làm giàu thông qua quy trình 6 bước (B). Ghi chú: A: 1: squalene chuẩn; 2: squalene thu được sau bước 1 của quy trình làm giàu squalene; 3: bước 2; 4:
bước 3; 5: bước 4; 6: bước 5; 7: bước 6 Cấu trúc của squalene trong các bước khác nhau của quá trình làm giàu Ďược xác Ďịnh bằng dữ liệu phổ 1H và 13C NMR của nó (Hình 3.18). Kết quả phân tích cấu trúc bằng 1H NMR 1H (500 MHz, CDCl3) (Hình 3.18A) cho thấy các nhóm methyl ở 1,60 (s, 18H) và δ 1,68 (s, 6H), các nhóm methylene ở δ 1,99-2,02 (m,
94
20H) và các tín hiệu proton vinyl ở 5,08-5,15 (m, 6H). Phân tích khối phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3). Hình 3.18B cho thấy 3 nhóm methyl carbon ở δ 16,00, 16,04, 17,67, 6 nhóm methylene carbon ở δ 25,69, 26,69, 26,80, 28,30, 39,75, 39,77 và các carbon có nối Ďôi ở 124,44, 131,22, 134,89, 135.10. Như vậy, dựa vào phân tích các dữ kiện phổ trên và so sánh với squalene Ďã Ďược công bố [132], có thể khẳng Ďịnh squalene Ďã Ďược tách chiết thành công từ chủng PQ6.
A
B
Hình 3.18. Phổ 1H (A) và 13C (B) NMR của squalene tinh sạch từ
S. mangrovei PQ6 sau qui trình làm giàu squalene từ bước 1 Ďến bước 6.
3.3.2. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene ở quy mô pilot từ S. mangrovei PQ6 Để có thể tách chiết và tinh sạch một lượng lớn squalene cho các nghiên cứu về an toàn, Ďộc tính cấp và tác dụng dược lý sau này, chúng tôi cần phải xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch Ďơn giản, ít thao tác và tiết kiệm chi phí. Do Ďó, tách chiết một lượng lớn squalene thô trực tiếp từ sinh khối tươi hay dịch tảo sau
95
quá trình lên men mà không cần phải thông qua bước tách chiết lipid tổng số Ďã Ďược nghiên cứu. 3.3.2.1. Ảnh hưởng của các tác nhân lên hiệu quả tách chiết squalene từ sinh khối khô S. mangrovei PQ6 Trong sản xuất công nghiệp squalene hiện nay, người ta thường sử dụng các
phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ, chiết lạnh hoặc là trích ly với CO2 siêu tới hạn với những ưu nhược Ďiểm riêng của chúng [4]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng dung môi hữu cơ Ďể tách chiết squalene thô từ sinh khối khô chủng PQ6 có hiệu suất cao và chất lượng tốt. Để Ďạt Ďược Ďiều này, trước tiên cần phải lựa chọn dung môi thích hợp cũng như Ďộ ẩm của sinh khối tảo sử dụng. Ảnh hưởng của dung môi Thompson và cs (2014) chỉ ra rằng các chuỗi cacbon của nhóm chức ancol và squalene Ďều là các nhóm kỵ nước, nên khi nhóm chức ancol có chuỗi cacbon dài sẽ làm tăng khả năng hấp thụ và thu hồi squalene [71]. Các nhóm chức ancol bao gồm butanol, propanol, cồn và methanol, tuy nhiên chỉ có cồn và methanol là hòa tan tốt với dung dịch KOH. Chính vì vậy, Ďể nâng cao hiệu quả hấp thụ và thu hồi squalene từ sinh khối tảo, 2 loại dung môi là cồn và methanol Ďã Ďược lựa chọn Ďể tách chiết squalene từ sinh khối tảo tươi sau 84 h lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất.
A
Hình 3.19. Ảnh hưởng của dung môi lên hàm lượng squalene tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6. (A) Ảnh chạy TLC mẫu squalene thô Ďược tách chiết từ sinh khối tảo với các loại dung môi khác nhau. Trong đó, 1: squalene chuẩn, 2: squalene thô tách chiết với ethanol, 3: squalene tách chiết với methanol. (B) Hàm lượng squalene tách chiết với ethanol. (C) Hàm lượng squalene có mặt trong squalene thô tách chiết bằng ethanol
96
Kết quả thu Ďược trên Hình 3.19 cho thấy, không tách chiết Ďược squalene khi sử dụng hỗn hợp KOH/methanol. Ngược lại, hàm lượng squalene thô tách chiết bằng dung môi KOH/ethanol Ďạt Ďược là (123 ± 11) mg/g SKK, trong Ďó, hàm lượng squalene thực tế trong squalene thô sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột Ďạt Ďược là (0,32 ± 0,04) mg/mg squalene thô. Vì vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo, ethanol Ďược lựa chọn Ďể tách chiết squalene. Ảnh hưởng của độ ẩm sinh khối Kết quả sử dụng sinh khối tảo có Ďộ ẩm 20 và 100% sau 84h lên men theo mẻ bổ sung cơ chất là glucose Ďể tách chiết squalene Ďược trình bày trên Hình 3.20. Kết quả cho thấy, Ďộ ẩm của sinh khối không ảnh hưởng Ďến hàm lượng squalene tách chiết Ďược. Hàm lượng squalene thô tách chiết Ďược từ sinh khối có Ďộ ẩm 20 và 100% Ďạt Ďươc tương ứng là (128 ± 31) mg/g SKK và (126 ± 14) mg/g SKK. Hàm lượng squalene thực tế có trong squalene thô tách chiết Ďược từ sinh khối có Ďộ ẩm 20 và 100% Ďạt Ďược tương ứng là (0,30 ± 0,02) mg/mg squalene thô và (0,32 ± 0,03) mg/mg squalene thô. Do Ďó, có thể sử dụng cả hai loại sinh khối tươi (Ďộ ẩm 100%) hoặc sấy khô (Ďộ ẩm 20%) Ďể tách chiết squalene.
A 1 2 3
Hình 3.20. Ảnh hưởng của Ďộ ẩm sinh khối tảo lên hàm lượng squalene tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6. (A) Ảnh chạy TLC mẫu squalene trong mẫu
squalene thô Ďược tách chiết từ sinh khối tảo có Ďộ ẩm khác nhau. Trong Ďó, 1: squalene chuẩn, 2: squalene tách chiết từ sinh khối có Ďộ ẩm 20%, 3: squalene tách chiết từ sinh khối có Ďộ ẩm 100%. (B) Hàm lượng squalene thô thu Ďược sau quá trình chiết từ sinh khối có Ďộ ẩm 20 và 100%. (C) Hàm lượng squalene có mặt trong squalene thô thu
Ďược sau quá trình chiết từ sinh khối có Ďộ ẩm 20 và 100%.
97
3.3.2.2. Tách chiết squalene từ dịch tế bào chủng S. mangrovei PQ6 sau quá trình nuôi cấy lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất Hướng tới mục Ďích sản xuất squalene trên quy mô công nghiệp, thiết lập Ďược các phương pháp Ďơn giản, dễ làm và giá thành thấp cần phải Ďược tiến hành nghiên cứu. Bên cạnh Ďó, thực tế cho thấy khâu thu hoạch sinh khối tảo bằng phương pháp ly tâm là một trong những khâu tốn kém về mặt Ďiện năng, thời gian, nhân công và là nguyên nhân làm tăng giá thành sản phẩm. Do Ďó, bước tiếp theo chúng tôi tiến hành nghiên cứu tách chiết squalene trực tiếp từ dịch lên men chủng PQ6 sau quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất. Theo công bố của Pora và cs (2014), môi trường kiềm và nhiệt Ďộ cao có thể phá vỡ màng tế bào các loài thuộc chi thraustochytrids [66]. Chính vì vậy, nghiên cứu thời gian phá vỡ màng tế bào chủng PQ6 bằng nhiệt Ďộ và môi trường kiềm Ďã Ďược tiến hành. Dịch tế bào có mật Ďộ tương Ďương với 250-300 g/L Ďược chỉnh pH Ďến 10 bằng KOH 45% và Ďược duy trì trong suốt 0, 2, 4, và 6 h với khuấy từ ở 60oC; 150 vòng/phút.
Hình 3.21. Ảnh hình thái tế bào S. mangrovei PQ6 sau 0 h (A), 2 h (B), 4 h (C) và 6 h (D) có bổ sung KOH 45% và duy trì pH=10
Kết quả thu Ďược trên Hình 3.21 cho thấy số tế bào bị phá vỡ màng chiếm khoảng 60-70% sau 2 h, 70-80% sau 4 h và trên 90% sau 6 h. Tế bào sau 6 h phá vỡ màng tiếp tục Ďược sử dụng Ďể tách squalene thô bằng cồn và n-hexane. Hàm lượng squalene thô tách chiết từ dịch tế bào sau Ďó sẽ Ďược so sánh với hàm lượng squalene thô tách chiết từ sinh khối khô (sinh khối có Ďộ ẩm 20%). Kết quả trong Hình 3.22 cho thấy, không có sự khác biệt Ďáng kể về hàm lượng squalene khi tách chiết từ dịch lên men hoặc từ sinh khối khô sau lên men. Hàm lượng squalene trong squalene thô tách chiết Ďược từ sinh khối khô và dịch lên
98 men Ďạt tương ứng là (0,28 ± 0,03) mg/mg squalene thô và (0,29 ± 0,02) mg/mg squalene thô. Vì vậy, Ďể hướng tới việc sản xuất squalene theo quy mô công nghiệp, phương pháp tách chiết squalene trực tiếp từ dịch lên men Ďã Ďược lựa chọn.
Hình 3.22. Hàm lượng squalene thô (A) và squalene có mặt trong squalene thô (B) tách chiết từ sinh khối khô và dịch lên men tế bào S. mangrovei PQ6. Trong đó, 1: squalene tách chiết từ sinh khối tảo khô, 2: squalene tách chiết từ dịch lên men
3.3.2.3. Điều kiện tinh chế squalene bằng phương pháp sắc ký cột Sắc ký cột thường Ďược dùng trong các phòng thí nghiệm vô cơ và hữu cơ Ďể loại bỏ các nguyên liệu không phản ứng ban Ďầu hoặc phân lập một sản phẩm mong muốn khỏi các sản phẩm phụ sau khi phản ứng hoàn thành. Để làm Ďược Ďiều này, hỗn hợp phản ứng Ďược Ďi qua một ống thủy tinh thẳng Ďứng, bên trong có nhồi hạt silica hoặc alumina, các chất Ďi ra Ďược thu lại thành từng phần nhỏ hay phân Ďoạn nhỏ ở Ďầu dưới của cột [167]. Trong sắc ký cột, lựa chọn hệ dung môi rửa giải là lựa chọn khó nhất và cũng quan trọng nhất. Sắc ký cột thường tiến hành với một hỗn hợp 2 dung môi Ďược dùng làm pha Ďộng: một dung môi phân cực và một dung môi không phân cực. Đôi khi có thể dùng một dung môi duy nhất hoặc hỗn hợp 3 dung môi khác nhau. Muốn phân tách sản phẩm và tạp chất tốt nhất và dùng tiết kiệm dung môi, bí quyết là kiểm tra hệ dung môi Ďịnh sử dụng trước khi Ďưa lên cột sắc ký. Để làm Ďược Ďiều Ďó cần chạy mẫu trên TLC, vì giá thành rẻ. Do Ďó, nhằm mục Ďích lựa chọn hệ dung môi rửa giải tối ưu cho tinh chế squalene từ squalene thô bằng sắc ký cột, các hệ dung môi Ďộng cho chạy sắc ký lớp mỏng như n- hexane/diethyleter/acetic acid (7: 3: 0,4; v/v); n-hexane/ ethyl acetate (6:1; v/v); n- hexane/ethyl acetate (6: 0,5; v/v); n-hexane/chloroform (9:1; v/v); n-
99
hexane/chloroform (4:1; v/v); n-hexane/chloroform (2:1; v/v); n-hexane/chloroform (1:1; v/v) và n-hexane Ďã Ďược lựa chọn cho nghiên cứu (Hình 3.23). Kết quả trên Hình 3.23 cho thấy sử dụng dung môi n-hexane hoặc n- hexane/chloroform (9:1; v/v) Ďã cho phép xác Ďịnh Ďược sự có mặt của squalene với giá trị Rf trong khoảng 0,2-0,4. Trong khi Ďó, mẫu phân tách với hệ dung môi n- hexane/diethyleter/acetic acid (7: 3: 0,4; v/v) cho thấy băng xuất hiện vệt bẩn do phân tách không tốt. Các hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate (6:1; v/v), n- hexane/ethyl acetate (6: 0,5; v/v), n-hexane/chloroform (9:1; v/v), n- hexane/chloroform (4:1; v/v), n-hexane/chloroform (2:1; v/v), n-hexane/chloroform (1:1; v/v) cho phân tách băng squalene không rõ ràng và rất có thể các băng này chưa phân tách hết. Chính vì vậy, n-hexane và n-hexane/chloroform (9:1; v/v) như là dung môi Ďộng cho tinh sạch squalene trên sắc ký cột Ďã Ďược lựa chọn.
Hình 3.23. Sắc ký lớp mỏng xác Ďịnh squalene từ mẫu chuẩn và mẫu squalene thô của chủng PQ6 với các hệ dung môi chạy khác nhau. (A) n-hexane/diethylether/acid acetic (7:3:0,4; v/v/v), (B) n-hexane/ethyl acetate (6:1; v/v), (C) n-hexane/ethyl acetate (6:
0,5; v/v), (D) n-hexan, (E) n-hexane /chloroform (9:1; v/v), (F) n-hexan/chloroform
(4:1; v/v), (G) n-hexane/chloroform (2:1; v/v), (H) n-hexane/chloroform (1:1; v/v). Ghi chú: 1: squalene chuẩn, 2: mẫu squalene thô tách từ chủng PQ6.
100
Trong phương pháp sắc ký cột silica gel, cột thủy tinh Ďược nạp chất hấp phụ là silicagel 60 (0,06-0,2 mm) Ďến 1/2 thể tích. Cột Ďược rửa giải với dung môi nền là n-hexan/chloroform (9:1; v/v) hoặc n-hexane trong thời gian 1 giờ nhằm ổn Ďịnh cấu trúc. Mẫu Ďược nạp lên cột theo tỷ lệ là silicagel/mẫu là 20:1 (w/w) và hệ dung môi rửa giải là n-hexane hoặc n-hexane/chloroform (9:1; v/v). Các phân Ďoạn thu Ďược sau quá trình rửa giải bằng n-hexane/chloroform (9:1; v/v) hoặc n-hexane, sẽ Ďược kiểm tra sự có mặt của squalene tinh sạch bằng sắc ký bản nhôm TLC. Kết quả Ďược trình bày trong Hình 3.24 và Hình 3.25.
Hình 3.24. Sắc ký lớp mỏng TLC (A) và kết quả phân tích HPLC (B) xác Ďịnh sự có mặt của squalene trong các phân Ďoạn thu Ďược sau khi tách và tinh sạch squalene thô qua cột silicagel
với hệ dung môi rửa giải là n-hexane/chloroform (9:1; v/v). Trong đó C là squalene chuẩn, 1-10 là các phân đoạn thu được sau khi tinh sạch squalene thô qua cột silicagel
A B
Hình 3.25. Sắc ký lớp mỏng TLC (A) và kết quả phân tích HPLC (B) xác Ďịnh sự có mặt c ủa squalene trong các phân Ďoạn thu Ďược sau khi tách và tinh sạch squalene thô qua cột silica gel với dung môi rửa giải là n-hexane.
Ghi chú: giếng 0 là squalene chuẩn, giếng 1-14 là 14 phân đoạn squalene đã phân tách.
101
Kết quả trong Hình 3.24 cho thấy, các phân Ďoạn squalene thu Ďược sau khi qua cột sắc ký với hệ dung môi rửa giải n-hexane/chloroform (9:1; v/v) vẫn bị lẫn các chất khác. Không thể sử dụng hệ dung môi này Ďể tinh sạch squalene Ďược. Ngược lại, khi sử dụng duy nhất dung môi n-hexane, squalene thu Ďược sau khi qua cột có Ďộ tinh sạch cao (chiếm 90-95% khi so sánh phần trăm diện tích peak) (Hình 3.25). Bên cạnh Ďó, hiệu suất thu hồi squalene Ďạt Ďược khoảng 50-60% sau khi qua cột. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của Watanabe và cộng sự (2013) [168]. Theo nghiên cứu của tác giả này, trong 3 hệ dung môi n-hexane hoặc n-hexane/chloroform (9/1, v/v) hoặc n- hexane/chloroform (1/1, v/v) Ďược sử dụng Ďể tinh chế squalene bằng sắc ký cột thì chỉ duy nhất có hệ dung môi n-hexane là có thể cho phép thu Ďược squalene có Ďộ tinh khiết cao và hiệu suất thu hồi có thể Ďạt tới 70-80%. Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, dung môi rửa giải cho sắc ký cột Ďể tinh chế squalene là n-hexane Ďã Ďược lựa chọn. 3.3.2.4. Xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch nguyên liệu squalene từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6 Dựa vào các nghiên cứu tách chiết và tinh chế squalene có tính ổn Ďịnh và lặp lại cao, quy trình tách chiết và làm sạch nguyên liệu squalene từ dịch lên men sau quá trình lên men có bổ sung cơ chất của chủng PQ6 Ďã Ďược xây dựng (Hình 3.26). MÔ TẢ QUY TRÌNH Bước 1: Phá vỡ màng tế bào Dịch tảo chủng S. mangrovei PQ6 sau quá trình lên men fed - batch trong bình 30L Ďược Ďể tĩnh, tảo lắng xuống, sau Ďó tiến hành gạn bỏ phần dịch trong phía trên bằng xy phông sao cho còn lại 2 L dịch lên men. 2 L dịch lên men (tương Ďương với khoảng 200g SKT và 50g SKK) Ďược Ďiều chỉnh lên pH = 10 với 10 mL KOH 45%. Quá trình phá vỡ màng tế bào Ďược thực hiện trên máy khuấy từ ở nhiệt Ďộ 60C trong thời gian 6 h với chế Ďộ khuấy 150 vòng/phút. Bước 2: Dịch chiết chứa squalene thô Dịch lên men có chứa các tế bào Ďã bị phá vỡ màng Ďược xà phòng hóa bằng cách bổ sung cồn 98% theo tỷ lệ dịch lên men: dung môi là 1:1 (v/v). Quá trình xà phòng hóa Ďược thực hiện trên máy khuấy từ ở nhiệt Ďộ 45oC, 150 vòng/phút, trong thời gian 30 phút. Sau khi kết thúc quá trình xà phòng hóa, n-hexane Ďược bổ sung vào hỗn hợp theo tỷ lệ dịch lên men: n-hexane là 1:1 (v:v). n-hexane có tác dụng tách
102 squalene thô ra khỏi hỗn hợp. Chuyển dần hỗn hợp phản ứng vào phễu chiết. Chiết lấy pha trên có chứa n-hexane và squalene thô. Pha dưới có chứa acid béo và xác tế bào. .
Hình 3.26. Quy trình tách chiết squalene từ S. mangrovei PQ6
Bước 3: Cất đuổi dung môi Dịch lỏng gồm n-hexane và squalene thô Ďược cô quay chân không ở 60- 70oC Ďể loại bỏ n-hexane. Sau khi cô quay loại dung môi, sản phẩm squalene thô thu Ďược ở dạng rắn màu vàng ((43,47 ± 0,89) g squalene thô). Bước 4: Tinh chế squalene thô bằng sắc ký cột Squalene Ďược hòa tan trong dung môi n-hexane trước khi Ďưa lên cột sắc ký. Tinh sạch squalene trên cột sắc ký với chất hấp phụ silica gel (cỡ hạt 70 - 230 mesh, tỷ lệ squalene thô/chất hấp phụ là 1/20 theo khối lượng, cột nhồi 5), rửa giải bằng dung môi n-hexane với tốc Ďộ dòng chảy là 1mL/min, thu các phân Ďoạn và kiểm tra các phân Ďoạn có chứa squalene bằng sắc ký TLC và HPLC. Các phân Ďoạn có chứa squalene tinh khiết sau Ďó sẽ Ďược kết hợp lại với nhau.
103
Bước 5: Cất đuổi dung môi Phân Ďoạn có chứa squalene tinh khiết sẽ Ďược cô quay chân không ở 60- 70oC Ďể loại bỏ n-hexane. Sau khi cô quay loại dung môi, hỗn hợp squalene thô thu Ďược ở keo lỏng màu trắng, không mùi và Ďạt hiệu suất thu hồi là từ 50-60%. Lượng squalene thô thu Ďược Ďạt gần (21,62 ± 0,93) g squalene thô. Bước 6: Squalene tinh sạch Sản phẩm squalene sau quá trình tinh chế Ďược xác Ďịnh chất lượng cũng như Ďộ tinh sạch bằng HPLC, kiểm tra cấu trúc bằng NMR, phân tích các Ďặc Ďiểm hóa lý, vi sinh vật và kim loại nặng. Ở bước này chúng tôi thu Ďược 5,5 mL squalene tinh khiết (có hàm lượng squalene tương ứng là 13,79 ± 0,87 g). Sử dụng quy trình tách chiết squalene từ S. mangrovei PQ6, đã tách chiết được squalene tinh khiết ở dạng dịch lỏng không màu, không mùi với độ tinh sạch đạt 90-95%.
3.3.3. Tách chiết và tinh chế lượng lớn squalene từ S. mangrovei PQ6 Để thu Ďược Ďủ lượng lớn squalene tinh khiết phục vụ cho các nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và thử nghiệm dược lý, từ 46 L dịch lên men tương Ďương với khoảng (3,9 ± 0,1) kg SKK và với quy trình Ďã Ďược xây dựng ở trên, (1,08 ± 0,29) kg squalene thô Ďã Ďược tách chiết thành công, tinh chế Ďược khoảng 131 mL squalene tinh khiết ở dạng dịch lỏng không màu, không mùi, có hàm lượng squalene là (305,23 ± 2,34) g (Hình 3.27).
A B
Hình 3.27. Ảnh minh họa sản phẩm squalene thô (A), squalene tinh sạch và hỗn hợp acid béo (B) tách từ dịch lên men theo mẻ có b ổ sung cơ chất từ sinh khối tảo chủng PQ6
104
Hình 3.28. Sắc ký Ďồ HPLC của squalene chuẩn (A) và squalene tinh sạch từ sinh khối S. mangrovei PQ6 (B)
Hình 3.29. Phổ 1H (A) và 13C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S. mangrovei PQ6
105
Kết quả phân tích sắc ký HPLC trên Hình 3.28 cho thấy squalene tách chiết và tinh chế từ S. mangrovei PQ6 có Ďộ tinh sạch cao (từ 90-95%) và không bị tạp
1 nhiễm. Dựa vào sự phân tích các dữ kiện phổ H NMR (500 MHz, CDCl3) (Hình 13 3.29A), phân tích khối phổ C NMR (125 MHz, 140 CDCl3) (Hình 3.29B) và so sánh với chất squalene Ďã Ďược công bố [132], có thể khẳng Ďịnh Ďã tách Ďược squalene từ VTBDD Schizochytrium mangrovei PQ6. 3.3.4. Phân tích các chỉ tiêu về cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Squalene từ sinh khối S. mangrovei PQ6 Ďược tiến hành phân tích các chỉ tiêu như: chỉ tiêu cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại tại Trung tâm Chứng nhận phù hợp (Quacert), Bộ Khoa học và Công nghệ Ďể Ďánh giá chất lượng của sản phẩm squalene thu Ďược. Kết quả phân tích chất lượng của squalene từ chủng PQ6 Ďược trình bày ở Bảng 3.5. Kết quả cho thấy, squalene thu Ďược ở dạng lỏng, không màu và không mùi; chỉ số acid Ďạt 0,524 mg KOH/g; chỉ số peroxide Ďạt 4,2 Meq O2/kg. Sản phẩm squalene Ďảm bảo không có chứa dư lượng urê, các chỉ tiêu về kim loại nặng Ďều nằm trong giới hạn cho phép, Ďạt các chỉ tiêu chất lượng và tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm (không bị nhiễm các vi sinh vật có hại) của Cục An toán thực phẩm, Bộ Y Tế. Phiếu kết quả Ďánh giá chất lượng squalene của Trung tâm Chứng nhận phù hợp (Quacert), Bộ Khoa học và Công nghệ Ďảm bảo squalene Ďạt yêu cầu chất lượng Ďể làm nguyên liệu cho Ďinh hướng làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm Ďược Ďưa ra trong phần Phụ lục 3, Hình P3. Tóm lại, quy trình tách chiết và làm sạch nguyên liệu squalene từ sinh khối S. mangrovei PQ6 đã được xây dựng. Sử dụng quy trình này, từ 46 L dịch men tương đương với khoảng (3,9 ± 0,1) kg SKK, (1,0 ± 0,2) kg squalene thô đã được tách chiết, tinh chế được khoảng 131 mL squalene tinh khiết (tương ứng có (305,23 ± 2,34) g). Squalene tinh khiết thu được có dạng lỏng, không màu và không mùi, có độ tinh sạch cao chiếm 90-95%, đảm bảo yêu cầu chất lượng định hướng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm.
Bảng 3.5. Các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại của squalene tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6 Mức tối đa (của STT Tên chỉ tiêu thử Đơn vị tính Phƣơng pháp thử Kết quả thực tế Cục an toàn thực phẩm) 1 Cảm quan Quan sát Dạng lỏng, không màu, không mùi 2 Độ ẩm và chất bay hơi % TCVN 6120:2007 0,062 <2% 3 Trị số acid mgKOH/g TCVN 6127:2010 0,524 0,5 - 3 4 Chỉ số xà phòng hóa mgKOH/g TCVN 6126:2007 1,04 0,5 - 5 5 Chỉ số peroxide Meq/kg TCVN 6121:2010 4,2 0 - 5 6 Trị số Iod g I2/100g dầu TCVN 6122:2010 360,85 360 - 380 7 Vi sinh vật hiếu khí CFU/g TCVN 4884:2005 < 1,0 104 8 Tổng số nấm men-mốc CFU/g TCVN 8275-2:2010 < 1,0 x 101 102 9 E. Coli CFU/g TCVN 7924-2:2008 KPH (< 1,0) 10-100 10 Coliforms CFU/g TCVN 6848:2007 <1,0 10 11 Salmonella CFU/25g TCVN 4829:2005 KPH KPH 12 S. aureus CFU/g TCVN 4830-1:1999 KPH (< 1,0 x 101) KPH 13 Sắt mg/kg AOAC 999.10.2012 0,75 <1 14 Đồng mg/kg AOAC 999.10.2012 KPH (LOD = 0,5) <0,5 15 Asen mg/kg AOAC 986.15.2012 KPH (LOD = 0,5) <0,5 16 Chì mg/kg TCVN 7602:2007 KPH (LOD = 0,02) <0,02 17 Ure mg/kg TCVN 8025 : 2009 KPH (LOD = 0,05) 0 Ghi chủ: LOD –Limit of detection (Giời hạn phát hiện); KPH – Không phát hiệ
106
107
3.4. Tính an toàn và tác dụng dƣợc lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro) 3.4.1. Độc tính cấp của squalene trên mô hình động vật thực nghiệm Nhiều công bố trên thế giới Ďã cho thấy squalene tách chiết từ dầu gan cá mập không gây Ďộc Ďối với Ďộng vật thực nghiệm và con người [21, 40]. Tuy nhiên, Ďể hướng tới sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất viên thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người, Ďộc tính cấp của squalene tách chiết từ sinh khối chủng S. mangrovei PQ6 Ďã Ďược nghiên cứu trên Ďộng vật thực nghiệm là chuột nhắt trắng. Theo Gunes (2013) cung cấp thực phẩm chức năng có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày) Ďã Ďược chứng minh là cần thiết cho sức khỏe dinh dưỡng của con người [169]. Do Ďó, dựa vào công bố cùa Kelly (1999) [21], Gunes (2013) [169] thì trong thử nghiệm này, chuột Ďược cho uống với liều thấp nhất là 10 mL/kg KLCT (tương Ďương 11,65 g/kg KLCT) và liều cao nhất là 50 mL/kg KLCT (tương Ďương 58,25 g/kg KLCT). Kết quả trình bày ở Bảng 3.6 Ďã cho thấy, không có chuột nào bị chết sau khi uống squalene một lần duy nhất với các liều từ thấp là 10 mL KLCT Ďến cao nhất (50 mL/kg KLCT (tương dương 58,25g/kg KLCT) sau 72 giờ. Quan sát hoạt Ďộng của chuột cho thấy tất cả chuột Ďi ngoài, ăn uống và có nước tiểu bình thường, lông mượt, mắt trong. Sau 168 giờ uống squalene, tất cả chuột có hoạt Ďộng, ăn uống và chất thải Ďều bình thường, không có chuột nào chết. Bảng 3.6. Độc tính cấp theo Ďường uống của squalene trên chuột nhắt trắng Số chuột Số chuột Lô Số chuột Liều dùng Liều dùng sống/chết sống/chết chuột thí nghiệm (mL/kg KLCT) (g/kg KLCT) sau 72 giờ sau 168 giờ Lô 1 08 10 11,65 08/0 08/0 Lô 2 08 20 23,30 08/0 08/0 Lô 3 08 30 34,95 08/0 08/0 Lô 4 08 40 46,60 08/0 08/0 Lô 5 08 50 58,25 08/0 08/0 Ghi chú: KLCT: Khối lượng cơ thể
Như vậy, chưa xác Ďịnh Ďược LD50 của squalene theo Ďường uống trên chuột nhắt trắng với mức liều cao nhất có thể cho chuột uống trong 72 giờ là 50 mL/kg KLCT (tương Ďương 58,25 g/kg KLCT). Kết quả thu Ďược của chúng tôi cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của CTFA (1971) là không xác Ďịnh Ďược ảnh hưởng gây Ďộc và gây chết trên chuột Ďược cho uống squalene với liều cao nhất là
108
50 mL/kg thể trọng trong vòng 7 ngày [170]. Do Ďó, có thể kết luận rằng squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 là không Ďộc. Như vậy, squalene không gây độc tính cấp do không xác định được giá trị
LD50. Hay nói cách khác, squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 là không độc. 3.4.2. Độc t nh bán trường diễn của squalene trên mô hình động vật thực nghiệm Nhiều quy Ďịnh, hướng dẫn gần Ďây hay áp dụng các hướng dẫn của OECD [149] thì liều dùng cho Ďộc tính bán trường diễn thường ở 2 mức liều: mức liều tương Ďương với liều Ďiều trị (có tác dụng) và mức liều gấp 3 lần liều Ďiều trị. Việc xác Ďịnh liều Ďiều trị của squalene Ďược dựa vào thông tin từ các tài liệu Ďã công bố và dựa vào thử nghiệm Ďánh giá. Squalene Ďược khuyến cáo sử dụng liều 900 mg/ngày (18 mg/kg/ngày), liều cao có thể dùng 2-4 g/ngày (40 - 80 mg/kg/ngày) [21]. Quy Ďổi ra liều trên chuột cống trắng, hệ số 7, thì liều Ďiều trị là 126 mg/kg/ngày, liều cao là 280 - 560 mg/kg/ngày. Như vậy về mặt lý thuyết, lựa chọn liều 400 mg/kg/ngày ở chuột cống trắng là mức liều giữa khi dùng ở mức cao. Kết quả thực nghiệm trên chuột nhắt liều 600 mg/kg/ngày có hiệu quả làm tăng HDL-C trên chuột nhắt trắng. Liều này quy Ďổi ra liều trên người là 600/12 = 50 mg/kg/ngày, tính ra liều trên chuột cống là 350 mg/kg/ngày. Như vậy liều dùng bán trường diễn 400 mg/kg/ngày Ďược xác Ďịnh là liều có tác dụng. Liều cao dùng cho Ďánh giá Ďộc tính bán trường diễn gấp 3 lần liều Ďiều trị, do Ďó Ďược tính toán là 1.200 mg/kg/ngày. 3.4.2.1. Ảnh hưởng của squalene lên tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng của chuột cống trắng khi dùng dài ngày Trong thời gian thí nghiệm, tình trạng chung của chuột cống trắng ở cả lô Ďối chứng và lô dùng squalene Ďều hoạt Ďộng bình thường, chuột có lông mượt, da niêm mạc và ăn uống bình thường, phân thành khuôn. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của squalene lên thể trọng chuột cống trắng chỉ ra trên Bảng 3.7. Kết quả trong Bảng 3.7 cho thấy thể trọng chuột trong các lô chứng và thí nghiệm Ďều tăng có ý nghĩa thống kê sau 30 và 60 ngày so với trước thí nghiệm (p < 0,05). Không có sự sai khác về thể trọng của chuột ở hai lô uống squalene so với lô chứng tại tất cả các thời Ďiểm Ďo. Như vậy, squalene với các mức liều và thời gian sử dụng trong nghiên cứu chưa thấy gây ra các thay Ďổi lên sự phát triển thể trọng của chuột.
109
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của squalene lên thể trọng chuột cống trắng
Lô nghiên cứu Thời Ďiểm Thể trọng P xét nghiệm (g) Lô Ďối Lô thí nghiệm Lô thí nghiệm chứng (1) 1 (2) 2 (3)
Trước thí N 8 8 8 p2-1> 0,05 nghiệm 169,75 167,75 168,63 p3-2> 0,05 (a) SD 5,06 4,37 4,00 p3-1> 0,05 n 8 8 8 p > 0,05 Sau 30 ngày 2-1 196,00 195,13 195,88 p > 0,05 (b) 3-2 SD 9,17 9,98 8,97 p3-1> 0,05 n 8 8 8 p > 0,05 Sau 60 ngày 2-1 209,50 207,25 208,50 p > 0,05 (c) 3-2 SD 7,07 8,36 6,61 p3-1> 0,05 P pb-a < 0,05; pc-b < 0,05; pc-a < 0,05 - Ghi chú: n: Số chuột trong lô; Lô đối chứng: uống dầu oliver liều 1 mL/kg/24 giờ; Lô thí nghiệm 1: uống squalene (pha trong dầu oliver), liều 400 mg/kg KLCT/24 giờ; Lô thí nghiệm 2: uống squalene (pha trong dầu oliver) liều 1.200 mg/kg KLCT/24 giờ. 3.4.2.2. Ảnh hưởng của squalene đối với một số chỉ tiêu huyết học và sinh hóa của chuột Ảnh hưởng của squalene lên một số chỉ tiêu huyết học và sinh hóa của chuột thí nghiệm Ďược trình bày ở Bảng 3.8. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của squalene lên một số chỉ tiêu huyết học và sinh hóa trong máu chuột (n = 8, x ± SD)
Thời Ďiểm xét Lô Ďối chứng Lô thí nghiệm 1 Lô thí nghiệm P nghiệm (1) (2) 2 (3) Chỉ tiêu huyết học Số lượng hồng cầu chuột (x1012g/L)
Trước thí nghiệm (a) 8,13 ± 0,67 8,11 ± 0,75 8,20 ± 1,16 p2-1> 0,05 Sau 30 ngày (b) 8,18 ± 0,44 8,20 ± 0,80 8,12 ± 0,55 p3-2> 0,05 Sau 60 ngày (c) 8,15 ± 1,12 8,09 ± 0,61 8,23 ± 0,99 p3-1> 0,05
P pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05 - Hàm lượng huyết sắc tố trong máu chuột (g/L) 130,75 ± p > 0,05 Trước thí nghiệm (a) 130,50 ± 7,69 132,13 ± 14,93 2-1 13,80
Sau 30 ngày (b) 129,63 ± 11,50 131,13 ± 6,24 129,88 ± 9,40 p3-2> 0,05 Sau 60 ngày (c) 129,38 ± 6,35 130,75 ± 6,96 131,63 ± 8,23 p3-1> 0,05
p pb-a > 0,05;pc-b > 0,05;pc-a > 0,05 - Hematocrit (%)
Trước thí nghiệm (a) 41,10 ± 2,33 40,16 ± 4,45 40,22 ± 3,09 p2-1> 0,05 Sau 30 ngày (b) 40,79 ± 2,76 40,12 ± 2,36 40,83 ± 2,53 p3-2> 0,05
110
Sau 60 ngày (c) 40,44 ± 4,55 40,90 ± 3,50 40,60 ± 3,70 p3-1> 0,05 p pb-a > 0,05;pc-b > 0,05;pc-a > 0,05 - Thể tích trung bình hồng cầu (fL)
Trước thí nghiệm (a) 48,25 ± 4,86 48,63 ± 3,42 49,00 ± 3,02 p2-1> 0,05 Sau 30 ngày (b) 47,75 ± 3,01 48,13 ± 4,52 48,50 ± 4,11 p3-2> 0,05 Sau 60 ngày (c) 48,38 ± 4,27 48,88 ± 3,98 49,25 ± 4,33 p3-1> 0,05
p pb-a > 0,05;pc-b > 0,05;pc-a > 0,05 - Số lượng bạch cầu (g/L)
Trước thí nghiệm (a) 8,85 ± 1,37 8,89 ± 1,20 9,04 ± 1,73 p2-1> 0,05 Sau 30 ngày (b) 8,75 ± 1,97 9,06 ± 1,31 9,01 ± 1,48 p3-2> 0,05 Sau 60 ngày (c) 8,92 ± 1,73 8,99 ± 0,70 9,13 ± 1,56 p3-1> 0,05
p pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05 - Số lượng tiểu cầu (g/L) 683,38 ± 673,00 ± p > 0,05 Trước thí nghiệm (a) 731,88 ± 197,83 2-1 110,27 71,75 654,88 ± 677,25 ± p > 0,05 Sau 30 ngày (b) 633,13 ± 127,28 3-2 119,94 105,23 686,63 ± 691,63 ± p > 0,05 Sau 60 ngày (c) 682,00 ± 139,98 3-1 134,80 82,75
p pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05 - Chỉ số sinh hóa Hoạt Ďộ AST (UI/L)
Trước thí nghiệm (a) 77,50 ± 11,76 80,88 ± 12,29 75,63 ± 15,70 p2-1> 0,05 Sau 30 ngày (b) 79,13 ± 12,39 75,50 ± 18,21 74,75 ± 16,39 p3-2> 0,05 Sau 60 ngày (c) 76,88 ± 9,46 74,13 ± 16,38 73,63 ± 15,13 p3-1> 0,05
p pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05 Hoạt Ďộ ALT (UI/L)
Trước thí nghiệm (a) 72,88 ± 19,29 70,63 ± 12,57 72,50 ± 17,53 p2-1> 0,05 Sau 30 ngày (b) 73,75 ± 20,97 68,38 ± 19,91 70,13 ± 18,21 p3-2> 0,05 Sau 60 ngày (c) 70,75 ± 17,10 71,25 ± 13,05 69,75 ± 20,15 p3-1> 0,05
p pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05 Bilirubin toàn phần (g/L)
Trước thí nghiệm (a) 75,75 ± 29,68 79,50 ± 17,10 75,38 ± 18,33 p2-1> 0,05 Sau 30 ngày (b) 76,13 ± 20,32 74,25 ± 19,36 71,25 ± 12,56 p3-2> 0,05 Sau 60 ngày (c) 74,75 ± 16,80 71,75 ± 13,58 69,50 ± 11,39 p3-1> 0,05
p pb-a > 0,05;pc-b > 0,05;pc-a > 0,05 Albumin huyết tương (g/L)
Trước thí nghiệm (a) 31,50 ± 3,74 32,63 ± 2,83 31,75 ± 3,20 p2-1> 0,05 Sau 30 ngày (b) 31,13 ± 4,55 32,25 ± 3,99 32,00 ± 3,21 p3-2> 0,05 Sau 60 ngày (c) 31,88 ± 3,56 32,13 ± 3,64 32,38 ± 3,34 p3-1> 0,05
p pb-a > 0,05;pc-b > 0,05;pc-a > 0,05 Cholesterol toàn phần (mmol/L)
111
Trước thí nghiệm (a) 1,36 ± 0,44 1,35 ± 0,36 1,38 ± 0,35 p2-1> 0,05 Sau 30 ngày (b) 1,46 ± 0,42 1,38 ± 0,32 1,41 ± 0,29 p3-2> 0,05 Sau 60 ngày (c) 1,49 ± 0,29 1,43 ± 0,28 1,45 ± 0,26 p3-1> 0,05
p pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05 Creatinin (µmol/L)
Trước thí nghiệm (a) 71,13 ± 19,95 74,75 ± 13,55 77,25 ± 8,45 p2-1> 0,05 Sau 30 ngày (b) 69,75 ± 10,57 70,25 ± 17,99 72,75 ± 12,45 p3-2> 0,05 Sau 60 ngày (c) 72,00 ± 16,22 69,50 ± 19,41 71,25 ± 19,37 p3-1> 0,05
p pb-a > 0,05;pc-b > 0,05;pc-a > 0,05 Ghi chú: Lô đối chứng: uống dầu oliver liều 1mL/kg KLCT/ngày; Lô thí nghiệm 1: uống squalene (pha trong dầu oliver), liều 400 mg/kg KLCT/ngày; Lô thí nghiệm 2: uống squalene (pha trong dầu oliver) liều 1.200 mg/kg KLCT/ngày; AST: Alanin - aminotransferase; ALT: Aspartat - aminotransferase) Bảng 3.8 cho thấy các chỉ tiêu huyết học và sinh hóa trong máu chuột giữa
các lô với nhau trong cùng một thời Ďiểm thay Ďổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Khi so sánh trong từng lô giữa các thời Ďiểm thí nghiệm, các chỉ tiêu huyết
học và sinh hóa trong máu chuột thay Ďổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Squalene với các mức liều và thời gian sử dụng trong nghiên cứu chưa thấy gây ra các thay Ďổi trên các chỉ tiêu huyết học và sinh hóa trong máu CCT thí nghiệm, ngoại trừ chỉ số HDL-C (Bảng 3.9). Như vậy, squalene với các mức liều và thời gian khác nhau trong nghiên cứu Ďã không thay Ďổi các chỉ tiêu chức năng tạo máu của chuột. Chỉ số HDL-C của lô Ďối chứng không có sự thay Ďổi Ďáng kể khi so sánh giữa các thời Ďiểm Ďo với nhau (p > 0,05). Tại thời Ďiểm ban Ďầu, chỉ số HDL-C ở 3 lô chuột nghiên cứu không có sự khác biệt (p> 0,05). Tại thời Ďiểm sau 30 ngày uống squalene, chỉ số HDL-C ở 2 lô thí nghiệm 1 và 2 Ďã tăng cao hơn khi so với cùng các lô Ďó tại thời Ďiểm ban Ďầu (p < 0,05). Tuy nhiên, khi so sánh với lô Ďối chứng tại cùng thời Ďiểm này, sự khác biệt chưa Ďạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05), mới chỉ gần Ďạt tới có ý nghĩa thống kê (p < 0,1). Tại thời Ďiểm sau 60 ngày uống squalene, chỉ số HDL-C ở 2 lô thí nghiệm 1 và 2 Ďã tăng cao hơn khi so với cùng các lô Ďó tại thời Ďiểm ban Ďầu (p < 0,05) (Bảng 3.9). Khi so sánh với lô Ďối chứng tại cùng thời Ďiểm này, sự khác biệt Ďạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của squalene lên nồng Ďộ HDL-C máu chuột (n = 8, x ± SD) Thời Ďiểm xét Lô Ďối chứng Lô thí nghiệm Lô thí nghiệm 2 P
112
nghiệm (1) 1 (2) (3) p > 0,05 0,73 ± 0,16 0,76 ± 0,24 0,77 ± 0,22 2-1 Trước thí nghiệm (a) p > 0,05 (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) 3-1 p3-2> 0,05 0,05 < p < 0,1 0,75 ± 0,18 0,92 ± 0,13 0,93 ± 0,20 2-1 Sau 30 ngày (b) 0,05 < p < 0,1 (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) 3-1 p3-2> 0,05 p < 0,05 0,79 ± 0,15 0,96 ± 0,15 0,98 ± 0,12 2-1 Sau 60 ngày (c) p < 0,05 (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) 3-1 p3-2> 0,05 pb-a > 0,05 pb-a < 0,05 pb-a < 0,05 p pc-a > 0,05 pc-a < 0,05 pc-a < 0,05 pc-b > 0,05 pc-b > 0,05 pc-b > 0,05 Ghi chú: Lô đối chứng: uống dầu oliver liều 1,00 mL/kg KLCT/ngày; Lô thí nghiệm 1: uống squalene (pha trong dầu oliver), liều 400 mg/kg KLCT/ngày; Lô thí nghiệm 2: uống squalene (pha trong dầu oliver) liều 1.200 mg/kg KLCT/ngày. Như vậy, squalene với các mức liều và thời gian khác nhau trong nghiên cứu không những không làm thay Ďổi các chỉ tiêu chức năng tạo máu của chuột, mà còn có tác dụng làm tăng chỉ số cholesterol tốt (HDL-C) trong máu chuột nghiên cứu. 3.4.2.3. Đánh giá mức độ tổn thương chức năng gan, thận chuột khi dùng squalene dài ngày Đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan và chức năng gan chuột khi dùng squalene dài ngày Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của squalene Ďến hoạt Ďộ các enzyme AST và ALT, bilirubin toàn phần, albumin huyết tương và cholesterol toàn phần của chuột trong thí nghiệm Ďược trình bày ở Bảng 3.8. Kết quả Ďã cho thấy trước khi thử nghiệm, hoạt Ďộ của AST và ALT, bilirubin toàn phần, albumin huyết tương và cholesterol toàn phần của chuột ở các lô Ďối chứng, lô thí nghiệm 1 và 2 Ďều không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Sau 60 ngày cho chuột uống liên tục squalene, ở lô thí nghiệm 2 với liều 1.200 mg/kg KLCT/ngày, hoạt Ďộ của AST (73,63 ± 15,13 UI/L) và ALT (69,75 ± 20,15 UI/L), hàm lượng bilirubin toàn phần (69,50 ± 11,39 g/L), hàm lượng albumin huyết tương (32,38 ± 3,34 g/L) và cholesterol huyết thanh (1,45 ± 0,26 mmol/L) có sự thay Ďổi không Ďáng kể so với lô Ďối chứng, tuy nhiên các thay Ďổi này không có ý nghĩa thống kê sinh học (p > 0,05). So sánh trong từng lô giữa các thời Ďiểm thí nghiệm, hoạt Ďộ các enzym AST và ALT, bilirubin toàn phần, albumin huyết thanh và cholesterol toàn phần trong máu của chuột thay Ďổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như vậy, squalene với các
113 mức liều và thời gian sử dụng trong nghiên cứu không làm thay Ďổi hoạt Ďộ các enzym AST và ALT, các chỉ số bilirubin toàn phần, albumin huyết tương và cholesterol toàn phần, không gây tổn thương tế bào gan và không ảnh hưởng Ďến chức năng gan chuột trong nghiên cứu. Đánh giá ảnh hưởng lên chức năng thận của chuột khi dùng squalene dài ngày Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của việc sử dụng squalene dài ngày lên chức năng thận của chuột thông qua nồng Ďộ creatinin huyết thanh Ďược trình bày ở Bảng 3.8. Kết quả ở Bảng 3.8 Ďã cho thấy, khi so sánh các lô với nhau trong cùng một thời Ďiểm, chỉ số creatinin máu chuột thay Ďổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). So sánh trong từng lô giữa các thời Ďiểm thí nghiệm, chỉ số creatinin máu chuột cũng thay Ďổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như vậy, squalene với các mức liều và thời gian sử dụng trong nghiên cứu không làm thay Ďổi chỉ số creatinin máu chuột Ďã cho thấy nó không ảnh hưởng lên chức năng thận của chuột nghiên cứu. Giải phẫu mô bệnh học gan, thận, lách của chuột Sau khi kết thúc thời Ďiểm 60 ngày dùng chế phẩm, tiến hành giải phẫu mô bệnh học gan, thận, lách của chuột. Kết quả Ďược thể hiện trên Hình 3.30. Quan sát Ďại thể bằng mắt thường và dưới kính lúp có Ďộ phóng Ďại 25 lần cho thấy màu sắc, hình thái của gan, lách và thận ở hai lô dùng squalene sau 60 ngày dùng liên tục Ďã không khác so với lô chứng (Hình 3.30 a-c). Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học gan, lách, thận của chuột thí nghiệm cho thấy squalene dùng Ďường uống với liều 400 và 1.200 mg/kg KLCT/ngày liên tục trong 60 ngày, không gây tổn thương trên gan, thận, lách của chuột. Hình ảnh vi thể gan, lách, thận của các chuột Ďại diện cho các lô chuột nghiên cứu Ďược trình bày ở Hình 3.30 d-m. Với Ďộ phóng Ďại 400 lần, hình ảnh vi thể gan, lách, tụy dưới kính hiển vi của chuột ở lô thí nghiệm 1 (Hình 3.30 e, h và l) và lô thí nghiệm 2 (Hình 3.30 f, i và m) uống squalene không khác biệt so với hình ảnh vi thể chuột ở lô chứng (Hình 3.30 d, g, k). Trên hình ảnh không thấy có xuất huyết hoặc ổ hoại tử, thoái hóa tế bào gan; Cấu trúc các vùng chức năng thận bình thường; Vùng tủy trắng bắt màu xanh thậm, tập trung các nang lympho lớn, vùng tủy Ďỏ có màu xanh Ďỏ với các xoang nang chứa nhiều hồng cầu và một số Ďại thực bào, không thấy ở xuất huyết hoặc hoại tử. Như vậy, trong thời gian 60 ngày sử dụng liên tục, chuột được uống squalene được tách chiết từ S. mangrovei PQ6 với liều 400 và 1.200 mg/kg KLCT/ngày, squalene được khẳng định vẫn đảm bảo an toàn, không làm thay đổi các chỉ tiêu
114
huyết học, sinh hóa, không gây tổn thương tế bào và chức năng gan, thận và lách của chuột thí nghiệm, ngoài ra còn có tác dụng làm tăng cholesterol tốt (HDL-C) máu so với lô đối chứng. Kết quả này cũng phù hợp với các công bố khác về tính an toàn của squalene trong các thử nghiệm như nghiên cứu độc học khi tiêm dưới da, tiêm bắp và đường hô hấp, kích ứng da và mắt [51].
a b c
Đại thể
Gan
d e f
Thận
g h i
Lách
k l m Hình 3.30. Hình ảnh Ďại thể và mô bệnh họ c vi thể - tương ứng (HE, x 400) của gan, thận, lách chuột tương ứng sau 60 ngày uống thuốc lô Ďối chứng (a, d, g, k), lô thí
nghiệm 1 (b, e, h, l) và lô thí nghiệm 2 (c, f, i, m). Ghi chú: Lô đối chứng: uống dầu oliver liều 1 ,00 mL/kg KLCT/ngày; Lô thí nghiệm 1: uống squalene (pha trong dầu oliver), liều 400 mg/kg KLCT/ngày; Lô thí nghiệm 2: uống squalene (pha trong dầu oliver) liều 1.200 mg/kg KLCT/ngày.
3.4.3. Tác dụng dược lý của squalene trên chuột nhắt trắng thí nghiệm HDL-C Ďược biết như là cholesterol tốt trong máu vì nó có nhiệm vụ thu dọn, chuyên chở cholesterol dư thừa không cần thiết ở các mô ngoại vi trở về gan và ở gan chúng Ďược biến Ďổi phần lớn thành acid mật và bài tiết theo mật ra khỏi cơ thể. Bên cạnh Ďó, HDL-C cũng loại bỏ cholesterol lắng Ďọng trong thành mạch máu, dẫn Ďến giảm nguy cơ xơ vữa Ďộng mạch [171]. Nhiều nghiên cứu Ďã chỉ ra
115 rằng, những người có nồng Ďộ HDL-C cao trong máu thường ít có nguy cơ mắc bệnh Ďộng mạch vành [172]. Trong nghiên cứu Ďộc tính bán trình diễn trên chuột cống, chúng tôi Ďã nhận thấy squalene không những an toàn khi sử dụng mà còn có tác dụng làm tăng nồng Ďộ HDL- C trong máu. Do vậy, Ďể làm rõ hơn tác dụng làm tăng chỉ số HDL-C trong máu chuột nghiên cứu, tác dụng của việc uống squalene lên cơ thể, cân nặng gan, và các chỉ số lipid máu chuột nhắt trắng Ďã Ďược nghiên cứu. Kết quả Ďược chỉ ra trong Bảng 3.10 và 3.11. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của squalene lên cân nặng cơ thể và gan chuột nghiên cứu
(n = 8, x ± SD) Thời Ďiểm xét Lô thí nghiệm Lô thí nghiệm Lô Ďối chứng (1) P nghiệm 1 (2) 2 (3) Cân nặng cơ thể chuột (g) Trước thí p > 0,05 18,63 ± 0,92 18,38 ± 0,74 18,88 ± 0,83 2-1 nghiệm (a) Sau 30 ngày (b) 23,88 ± 1,36 23,38 ± 1,19 23,75 ± 1,04 p3-2> 0,05 Sau 60 ngày (c) 27,13 ± 1,13 26,88 ± 1,36 26,63 ± 1,51 p3-1> 0,05 p pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05 Cân nặng gan chuột (g) p2-1> 0,05 Sau 60 ngày 1,48 ± 0,13 1,45 ± 0,15 1,44 ± 0,17 p3-2> 0,05 p3-1> 0,05 Ghi chú: Lô đối chứng: uống dầu Oliver; Lô thí nghiệm 1: uống squalene (pha trong dầu oliver) liều 600 mg/kg KLCT/ngày; Lô thí nghiệm 2: uống squalene (pha trong dầu oliver) liều 1.200 mg/kg KLCT/ngày.
Kết quả trong Bảng 3.10 cho thấy cân nặng cơ thể của chuột ở cả ba lô nghiên cứu Ďều tăng có ý nghĩa thống kê sinh học sau 30 và 60 ngày nuôi (p <
0,05). Tuy nhiên, sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) về cân nặng cơ thể chuột ở hai lô uống squalene so với lô chứng tại tất cả các thời Ďiểm Ďo. Tương tự, chúng tôi cũng không xác Ďịnh Ďược sự sai khác về cân nặng gan chuột giữa các lô thí nghiệm và lô chứng ở các thời Ďiểm Ďo khác nhau (p > 0,05). Như vậy, squalene với các mức liều và thời gian sử dụng trong nghiên cứu chưa thấy gây ra các thay Ďổi trên sự phát triển thể trọng của chuột cũng như chưa gây ra thay Ďổi cân nặng gan chuột.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của squalene lên các chỉ số lipid máu chuột (n = 8, ± SD)
116
Chỉ số lipid máu Lô Ďối chứng Lô thí nghiệm 1 Lô thí nghiệm 2 Cholesterol TP (mmol/L) 3,10 ± 0,43 2,84 ± 0,32 2,80 ± 0,45 HDL-C (mmol/L) 0,45 ± 0,16 0,62* ± 0,08 0,64* ± 0,12 Tỷ lệ HDL-C/ Cholesterol TP 0,15 ± 0,06 0,22** ± 0,03 0,23** ± 0,04
VLDL + LDL-C 2,65 ± 0,46 2,22* ± 0,28 2,16* ± 0,39
TG (mmol/L) 0,99 ± 0,15 0,98 ± 0.17 0,92 ± 0,21 Ghi chú: Lô đối chứng: uống dầu oliver; Lô thí nghiệm 1: uống squalene (pha trong dầu oliver) liều 600 mg/kg KLCT/24 giờ; Lô thí nghiệm 2: uống squalene (pha trong dầu oliver) liều 1.200 mg/kg KLCT/24 giờ; *: Khác biệt so với lô đối chứng với p < 0,05; **: Khác biệt so với lô đối chứng với p < 0,01; Cholesterol TP: cholesterol toàn phần; HDL-C: high density lipoprotein- cholesterol (cholesterol gắn với lipooprotein tỷ thộng cao); VLDL-C: very low density-cholesterol (cholesterol gắn với lipoprotein tỷ trọng rất thấp; TG: triglyceride). Chỉ số HDL-C và tỷ lệ HDL-C/cholesterol toàn phần trong máu chuột ở lô thí nghiệm 1 và lô thí nghiệm 2 tăng cao hơn có ý nghĩa thống kê so với lô Ďối chứng (p <0,05 và p <0,01, tương ứng) (Bảng 3.11). Chỉ số LDL-C và VLDL-C trong máu chuột ở lô thí nghiệm 1 và lô thí nghiệm 2 thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với lô Ďối chứng (p <0,05). Không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê về nồng Ďộ cholesterol toàn phần và TG trong máu chuột khi so sánh giữa các lô với nhau (Bảng 3.11). Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng khẳng Ďịnh tác dụng tăng HDL-C của squalene trên mô hình Ďộng vật thí nghiệm. Pallavi và cộng sự (2013) thử nghiệm ở bốn nhóm chuột Ďực trong Ďó có 2 nhóm chuột thường và 2 nhóm chuột bị bệnh tim mạch có trọng lượng 120-150 g, ăn thức ăn có chứa 1,5% dầu dừa hoặc squalene trong vòng 21 ngày [173]. Kết quả cho thấy nhóm chuột bị bệnh giảm plasma LDL- C, cholesterol, TG, phospholipit và tăng HDL-C khi chuột uống squalene so với Ďối chứng có ý nghĩa thống kê sinh học. Báo cáo của Gabas-Rivena và cộng sự (2014) cũng cho thấy chuột nhắt bị thiếu hụt apolipoprotein A1 và A4 sau khi uống squalene với liều 0,25 g/kg KLCT và 1g/kg KLCT chuột/ngày trong 11 tuần Ďều có biểu hiện tăng hàm lượng HDL-C và không làm thay Ďổi trọng lượng cơ thể và gan chuột thử nghiệm [46]. Như vậy, kết quả thu Ďược của chúng tôi cũng phù hợp với các công bố nêu trên.
117
Tóm lại, các kết quả thu được đã cho thấy sử dụng squalene liên tục là an toàn và có tác dụng tốt cho trao đổi lipid. Các kết quả này cho phép khẳng định có thể sử dụng squalene theo định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người trong thời gian tới ở Việt Nam. 3.5. Bƣớc đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro Kết quả nghiên cứu trên mô hình Ďộng vật thực nghiệm cho thấy squalene có tác dụng giảm hàm lượng cholesterol và tăng nồng Ďộ HDL-C huyết tương. Vì vậy, Ďể bước Ďầu làm sáng tỏ vai trò tác dụng này của squalene, ảnh hưởng và cơ chế tác dụng của squalene lên quá trình trao Ďổi lipid trong 2 dòng tế bào Ďại thụ thể RAW264.7 và tế bào gan người HepG2 Ďã tiếp tục Ďược nghiên cứu. Trong Ďó, tế bào Ďại thực bào là tế bào chủ Ďạo trong việc hình thành các tổn thương tiến triển trong chứng xơ vữa Ďộng mạch. Và một trong những nguyên nhân gây xơ vữa Ďộng mạch là do sự tích lũy lượng lớn lipid không mong muốn trong tế bào. Đối với tế bào HepG2, mặc dù là tế bào ung thư gan nhưng nó có sự ổn Ďịnh cao về hình thái tế bào và chức năng biệt hóa trong nuôi cấy in vitro, nên dòng tế bào này Ďược sử dụng cho các nghiên cứu về trao Ďổi chất trong gan như trao Ďổi cholesterol, lipid và các nghiên cứu liên quan Ďến thuốc [152]. 3.5.1. Đánh giá độc tính của squalene trên các dòng tế bào Để nghiên cứu tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình tế bào, trước tiên Ďộc tính tế bào của squalene Ďược thử trên 2 dòng tế bào RAW 264.7 và HepG2 thông qua phương pháp so màu với MTT (Hình 3.31).
Hình 3.31. Tỷ lệ sống sót của tế bào HepG2 và RAW264.7 Ďược ủ với squalene ở các nồng Ďộ khác nhau
118
Kết quả chỉ ra trên Hình 3.31 cho thấy squalene không gây Ďộc trên cả 2 dòng tế bào HepG2 và RAW264.7 ở tất cả các nồng Ďộ thử nghiệm. Khoảng 95 Ďến 100% tế bào vẫn sinh trưởng bình thường sau khi bổ sung squalene trong 72 giờ. 3.5.2. Tác dụng giảm lipid của squalene lên tế bào gan và tế bào đại thụ thể 3.5.2.1. Tối ưu hóa thời gian và nồng độ ủ squalene lên sự thay đổi hàm lượng lipid trong tế bào gan HepG2 Nhiều công bố Ďã chỉ ra rằng, squalene có tác dụng giảm lipid rõ rệt nhất trên Ďộng vật hoặc người bị mắc các bệnh liên quan Ďến rối loạn chuyển hóa [46, 174]. Do Ďó, Ďể xác Ďịnh Ďược Ďiều kiện thử nghiệm cho các nghiên cứu về tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng của squalene trên mô hình in vitro, Ďầu tiên ảnh hưởng về thời gian và nồng Ďộ ủ squalene lên sự thay Ďổi nồng Ďộ lipid Ďã Ďược nghiên cứu trên dòng tế bào HepG2 Ďược gây rối loạn chuyển hóa.
Hình 3.32. Ảnh hưởng của thời gian ủ squalene sau 24 h (A), 48 h (B) và 72 h (C) lên khả năng tích lũy lipid trong tế bào gan HepG2 Ďược gây rối loạn chuyển hóa lipid. Ghi chú: WO/PA+OA: tế bào bình thường, PA+OA: tế bào được gây rối loạn chuyển hóa lipid b ằng PA + OA, FER: chất chuẩn fenofibarte, S-5 đến 100: Nồng độ squalene từ 5 đến 100 μM ủ trong tế bào. Số liệu được trình bày bằng số trung bình ± SEM. *p < 0.05, **p < 0,01 so với nhóm
đối chứng.
119
ORO là thuốc nhuộm có màu Ďỏ, có khả năng hòa tan trong lipid. Khi nhuộm mẫu tế bào cố Ďịnh, bất kỳ nơi nào có chứa các giọt mỡ, ORO sẽ hòa tan vào trong Ďó làm chúng có màu Ďỏ. Do Ďó, phương pháp này Ďã Ďược sử dụng Ďể xác Ďịnh thời gian cũng như là nồng Ďộ tối ưu của squalene Ďối với tế bào HepG2 Ďược gây rối loạn chuyển hóa lipid. Trong thí nghiệm này, tế bào HepG2 Ďược gây rối loạn chuyển hóa lipid Ďược ủ với squalene với dải nồng Ďộ từ 5, 10, 20, 50 và 100 M trong thời gian từ 24, 48 và 72 h (Hình 3.32). Kết quả thu Ďược trên Hình 3.32 cho thấy, tế bào HepG2 Ďược ủ với acid oleic (OA) và acid palmitic (PA) Ďã làm tăng hàm lượng TG có ý nghĩa so với tế bào không Ďược ủ với acid. Hàm lượng TG tăng 85% có ý nghĩa khi tế bào Ďược ủ với cả OA và PA so với Ďối chứng (Hình 3.32). Sau 48 giờ Ďược ủ với squalene ở 50 và 100 M có tác dụng giảm lipid nội bào trong các tế bào (Hình 3.32B). Sau 72 giờ xử lý, tế bào Ďược ủ với squalene ở các nồng Ďộ 20, 50 và 100 M giảm sự tích lũy lipid nội bào so với Ďối chứng có ý nghĩa thống kê (Hình 3.32C). Cụ thể là, hàm lượng lipid nội bào giảm hơn 20% trong các tế bào Ďược ủ với squalene. Ngoài ra, sự thay Ďổi khả năng tích lũy lipid trong các tế bào Ďược ủ với squalene còn phụ thuộc vào nồng Ďộ squalene xử lý. Do Ďó, Ďể tiến hành các thí nghiệm tiếp theo nồng Ďộ 50 và 100 M squalene Ďể xử lý tế bào trong thời gian 72 giờ Ďã Ďược lựa chọn. 3.5.2.2. Tác dụng của squalene lên sự thay đổi hàm lượng lipid nội bào trong tế bào gan HepG2 và RAW264.7 Squalene Ďược cho là có tác dụng Ďiều hòa lipid máu. Do Ďó, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của squalene lên hàm lượng cholesterol và triglycerit (TG) trong hai dòng tế bào HepG2 và RAW264.7. Kết quả trên Hình 3.33A cho thấy, nồng Ďộ cholesterol nội bào giảm ở các tế bào Ďược ủ với squalene hoặc fenofibrate (chất chuẩn Ďiều trị giảm rối loạn lipid máu) khi so sánh với Ďối chứng. Tế bào Ďược ủ với 100 µM squalene có tác dụng giảm cholesterol xuống 22% khi so sánh với Ďối chứng. Sự sai khác này có ý nghĩ thống kê về sinh học (P < 0,05). Hình 3.33B cho thấy tế bào Ďược ủ với 50 và 100 M squalene cũng làm giảm hàm lượng TG nội bào tương ứng xuống 17 và 35% khi so sánh với Ďối chứng (P < 0,05). Kết quả nhuộm lipit bằng ORO cũng cho các kết quả tương tự (Hình 3.33C).
120
Hình 3.33. Ảnh hưởng của squalene tách chiết từ S. mangrvei PQ6 lên sự tích lũy hàm lư ợng cholesterol (A); triglycerid (B) và nhuộm lipid bằng Oil Red O (C) trong tế bào HepG2. Số liệu được trình bày bằng số trung bình ± SEM. *P < 0.05, so với nhóm đối chứng (ủ với 0,01% DMSO)
Hình 3.34. Ảnh hưởng của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 lên hàm lượng cholesterol (A); triglyceride (B) và nhuộm Oil Red O (C) trong tế bào Ďại thực bào
RAW264.7. Số liệu được trình bày bằng số trung bình ± SEM. *P < 0,05, so với nhóm đối
chứng (ủ với 0,01% DMSO).
Kết quả trên Hình 3.34A cho thấy hàm lượng cholesterol trong tế bào RAW264.7 Ďược ủ với squalene ở nồng Ďộ 50 và 100 M giảm tương ứng 25% và 18% so với Ďối chứng. Tương tự như Ďối với thí nghiệm ở tế bào HepG2, tế bào RAW264.7 Ďược ủ với squalene có tác dụng giảm mạnh hàm lượng TG nội bào khi so sánh với Ďối chứng. Hàm lượng TG trong tế bào RAW264.7 giảm từ 100% ở lô Ďối chứng xuống chỉ còn 56% và 52% (P<0,01) trong tế bào Ďược ủ với 50 và 100
121
M squalene (Hình 3.34B). Fenofibrate có tác dụng giảm cả hàm lượng cholesterol và TG trong tế bào Ďại thực bào khi so sánh với Ďối chứng. Tác dụng giảm hàm lượng lipid nội bào có thể so sánh tương Ďương giữa squalene và chất chuẩn fenofinrate. Kết quả nhuộm ORO cũng cho kết quả tương tự như kết quả phân tích hàm lượng lipid nội bào (Hình 3.34C). Tóm lại, squalene có tác dụng giảm cholesterol và TG trong tế bào gan HepG2 và tế bào đại thực bào RAW264.7. Ủ tế bào HepG2 với squalene 100 M squalene có tác dụng giảm cholesterol và trigyceride từ 100% trong tế bào đối chứng xuống 80% (P < 0,05) và 65% (P < 0,01), tương ứng. Hàm lượng cholesterol và trigyceride trong tế bào RAW264.7 giảm từ 100% ở đối chứng xuống còn 86% (P<0,05) và 52% (P<0,01) ở tế bào được ủ với 100 M squalene. 3.5.3. Cơ chế phân tử tác dụng giảm cholesterol của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Cân bằng cholesterol nội bào là Ďiều cần thiết Ďể duy trì cholesterol ở mức bình thường. Thụ thể LDL-R là protein bề mặt tế bào, Ďóng một vai trò quan trọng trong chuyển hóa cholesterol bằng cách vận chuyển LDL- C từ huyết thanh Ďến các tế bào gan. Tại tế bào gan, cholesterol dư thừa sẽ Ďược chuyển hóa thành acid mật dưới tác dụng của CYP7A1 [153]. Bên cạnh Ďó, cholesterol cũng Ďược cân bằng bởi quá trình kích hoạt thụ thể trong gan LXR. Chính vì vậy, bước Ďầu mức Ďộ biểu hiện của các gen mã hóa cho LDL- R, enzyme CYP7A1 và thụ thể LXR trong tế bào gan HepG2 Ďã Ďược xác Ďịnh trong nghiên cứu của chúng tôi.
Hình 3.35. Ảnh hưởng của squalene lên mức Ďộ biểu hiện mRNA của các gen tham gia vào các quá trình trao Ďổi cholesterol trong tế bào HepG2. Số liệu Ďược trình bày bằng số trung bình ± SEM. *P < 0,05, **P < 0,05 so với nhóm Ďối chứng (ủ với 0,01% DMSO).
122
Kết quả trên Hình 3.35 cho thấy mức Ďộ biểu hiện gen LDL-R, CYP7A1 và LXRα tăng có ý nghĩa thống kê trong tế bào Ďược ủ squalene khi so sánh với Ďối chứng. Ở nồng Ďộ 100 μM, squalene tăng mức Ďộ mRNA của LDL-R và CYP7A1 và LXRα tương ứng lên 150, 60 và 160% với sự sai khác có ý nghĩa (P < 0,05) khi so với Ďối chứng. LXR là thụ thể thuộc về họ các receptor hormon nội bào, Ďóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống xơ vữa Ďộng mạch bằng cách tăng cường mức Ďộ biểu hiện của gen tham gia vào quá trình làm tăng dòng chảy cholesterol của tế bào như ABCA1, G1 và ApoE, kích thích sự vận chuyển cholesterol ngược (reverse cholesterol transport) từ các mô ngoại biên và tăng nồng Ďộ HDL-C [42]. Kết quả phân tích in vivo (Bảng 3.10 và 3.11) và in vitro (Hình 3.33 và 3.34) Ďã cho thấy squalene có tác dụng giảm cholesterol và tăng hàm lượng cholesterol tốt (HDL-C). Do Ďó, trong nghiên cứu tiếp theo, vai trò kích hoạt thụ thể LXR của squalene trong mô hình in vitro Ďã Ďược nghiên cứu sâu hơn.
Hình 3.36. Ảnh hưởng của squalene lên mức Ďộ biểu hiện gen của LXR α (A) và LXR β (B). trong tế bào Ďại thực vào RAW264.7. Số liệu Ďược trình bày bằng số trung bình ± SEM. *P < 0,05, **P < 0,05 so với nhóm Ďối chứng (ủ với 0,01% DMSO). Ghi chú: LXRα: liver X receptor-α, LXRβ: liver X receptor-β Theo Geyeregger và cộng sự (2006) có 2 loại LXRs là LXRα và LXRβ. Trong Ďó, LXRα biểu hiện chủ yếu ở gan thận, ruột non, mô mỡ và tế bào Ďại thực bào còn LXRβ lại Ďược biểu hiện khắp nơi [42]. Kết quả xác Ďịnh khả năng kích hoạt các thụ thể LXRs của squalene Ďã cho thấy squalene có tác dụng kích hoạt Ďồng thời cả hai thụ thể LXRα và LXRβ (Hình 3.36 A-B). Cụ thể là tế bào Ďược ủ với squalene ở các nồng Ďộ 50 và 100 M tăng khả năng kích hoạt thụ thể LXRα
123 tương ứng lên 60 và 70% có ý nghĩa so với Ďối chứng (P<0,05) (Hình 3.36A). Khả năng kích hoạt thụ thể LXRβ tăng hơn 30% khi tế bào Ďược ủ với squalene ở các nồng Ďộ 50 và 100 M so với Ďối chứng (Hình 3.36B). So với chất kích hoạt thụ thể LXRs Ďược tổng hợp hóa học (T0901317) thì khả năng kích hoạt các thụ thể LXR của squalene thấp hơn. Các kết quả này cho phép kết luận rằng squalene có tác dụng kích hoạt thụ thể LXRs. Hoạt Ďộng của thụ thể LXR Ďiều khiển dòng chảy cholesterol và tăng quá trình vận chuyển ngược cholesterol từ các mô ngoại biên về gan; dẫn Ďến giảm tích lũy cholesterol trong tế bào và ở Ďộng vật thực nghiệm [42]. Do Ďó, tác dụng của squalene lên sự lưu thông và quá trình vận chuyển ngược của cholesterol trong tế bào RAW264.7 Ďược Ďánh giá gián tiếp bằng cách Ďo nồng Ďộ cholesterol trong tế bào và ngoài môi trường. Kết quả trên Hình 3.37 A-B cho thấy, hàm lượng cholesterol trong các tế bào Ďược ủ với 50 và 100 µM squalene lần lượt giảm 10 và 14% so với Ďối chứng (P < 0,05). Hàm lượng cholesterol nội bào giảm cũng Ďồng nghĩa với việc tăng nồng Ďộ cholesterol trong môi trường nuôi cấy trong tế bào Ďược ủ với squalene ((P < 0,05); cao hơn 20% so với Ďối chứng) (Hình 3.37A). Xu hướng tương tự nhưng tác dụng mạnh hơn cũng Ďược quan sát thấy ở các tế bào Ďược ủ với chất chuẩn T0901317. Có rất nhiều gen Ďích của thụ thể LXRs tham gia vào quá trình vận chuyển cholesterol ngược. Trong Ďó, quan trọng nhất là gen mã hóa cho protein vận chuyển ABCA1. ABCA1 là bước trung gian Ďầu tiên của quá trình vận chuyển cholesterol ngược, nó vận chuyển các cholesterol và phospholipit dư thừa trong tế bào Ďại thực bào Ďến các chất nhận apolipoprotein (apo), chẳng hạn như apoAI. Ngoài ra, ABCA1 cũng Ďóng vai trò quan trọng trong việc hình thành HDL sơ khai ở trong gan. Chính vì vậy, Ďột biến ở ABCA1 ở người dẫn Ďến bệnh Tangier. Đây là một bệnh liên quan Ďến rối loạn di truyền Ďặc trưng bởi tình trạng giảm Ďáng kể mức Ďộ HDL trong máu. Do Ďó, những người bị bệnh Tangier có nguy cơ mắc các bệnh tim mạch rất cao [42]. Kết quả nghiên cứu thu Ďược cho thấy rằng squalene có tác dụng tăng cả mức Ďộ biểu hiện gen và protein của ABCA1. Tế bào RAW264.7 Ďược ủ với 100 M squalene có tác dụng tăng mức Ďộ biểu hiện gen và protein tương ứng 46 và 42% so với Ďối chứng (P > 0,05) (Hình 3.37 C, D, E). Bên cạnh Ďó, các gen tham gia vào quá trình vận chuyển cholesterol ngược Ďược Ďiều khiển bởi thụ thể LXR còn phải
124
kể Ďến là ABCG1 và ApoE. Tương tự như ABCA1, chức năng của ABCG1 vận chuyển cholesterol Ďến HDL [175]. Chuột bị Ďột biến mất gen ABCG1 có biểu hiện tích lũy lượng lớn lipit trong nhiều loại mô, bao gồm cả tế bào Ďại thực bào [176]. ApoE là một thành phần quan trọng của lipoprotein huyết tương và hoạt Ďộng như một chất nhận cholesterol trong dòng chảy cholesterol. Chuột bị Ďột biến mất gen ApoE sẽ tự phát triển bệnh xơ vữa Ďộng mạch [177]. Ở nồng Ďộ 100 µM, squalene làm tăng mức Ďộ biểu hiện của các gen ABCG1 và ApoE lên 46%, 38% và 112% (P < 0,05), tương ứng, so với nhóm Ďối chứng.
Hình 3.37. Squalene Ďiều hòa quá trình vận chuyển ngược cholesterol và mức Ďộ biểu hiệ n các gen Ďích của LXRs trong tế bào Ďại thực bào RAW264.7. Nồng Ďộ cholesterol nội bào (A) và trong môi trường nuôi cấy (B). Mức Ďộ biểu hiện gen của
ABCA1, ABCG1 và ApoE trong các tế bào RAW 264.7, Ďược Ďo bằng qPCR (C, D,
E). Số liệu Ďược trình bày bằng số trung bình ± SEM. *P < 0,05, ** P < 0,05 so với nhóm Ďối chứng (ủ với 0,01% DMSO). Ghi chú: ABCA1: ATP-biding cassette transporter subfamily A member 1; ABCG1: ATP- biding cassette sub-family G member 1; ApoE: apoloprotein E. Từ các kết quả thu Ďược ở trên cho thấy tác dụng giảm cholesterol và tăng
HDL-C của squalene Ďược dự Ďoán là do squalene Ďiều hòa biểu hiện các gen tham gia vào quá trình vận chuyển và thoái hóa cholesterol như LDL-R, CYP7A1, thụ thể LXR và các gen Ďích của thụ thể LXR.
125
3.5.4. Tác dụng giảm triglyceride của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Các loại thuốc Ďiều trị bằng cách kích hoạt thụ thể LXR có tác dụng giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch thông qua việc tăng khả năng trao Ďổi và vận chuyển ngược cholesterol từ các tế bào ngoại biên trở lại về gan. Tuy nhiên, bên cạnh các tác dụng dược lý quan trọng này thì chất kích hoạt thụ thể LXR có tác dụng phụ là tăng khả năng tích lũy acid béo ở trong tế bào gan [45]. Điều thú vị ở trong nghiên cứu của chúng tôi là mặc dù squalene kích hoạt Ďồng thời cả hai thụ thể LXRα và β, nhưng nồng Ďộ TG trong tế bào gan HepG2 Ďược ủ squalene cũng có chiều hướng giảm so với Ďối chứng (Hình 3.38A). Kết quả này cũng Ďược lặp lại khi chúng tôi ủ tế bào HepG2 với squalene hoặc chất chuẩn T0901317 (Hình 3.38A).
Hình 3.38. Ảnh hưởng của squalene trong quá trình sinh tổng hợp triglyceride trong tế bào HepG2. (A) Nồng Ďộ TG nội nào. (B) Kết quả nhuộm tế bào bằng Oil red O khi ủ với squalene và T090131727. Số liệu Ďược trình bày bằng số trung bình ± SEM. *P < 0,05, **P < 0,05 so với nhóm Ďối chứng (ủ với 0,01% DMSO). Ghi chú: TG: Triglyceride Hình 3.38 cho thấy, hàm lượng TG nội bào tăng từ 51 g/mg protein ở công thức Ďối chứng lên gần 70 g/mg protein trong tế bào HepG2 Ďược ủ với T0901317. Ngược lại với chất chuẩn T0901317, tế bào Ďược ủ với squalene ở nồng Ďộ 100 µM có tác dụng giảm nồng Ďộ TG xuống 17% so với Ďối chứng. Kết quả nhuộm ORO cũng cho kết quả tương tự như kết quả phân tích hàm lượng TG nội bào (Hình 3.38B). Như vậy, không giống như các chất kích hoạt thụ thể LXR bằng phương pháp tổng hợp hóa học, squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 có thể kích hoạt một cách chọn lọc các gen Ďích của LXR mà không gây ra sự tổng hợp lipid trong tế bào gan. Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi sơ bộ Ďưa ra tác dụng giảm cholesterol và tác dụng giảm triglyceride của squalene (Hình 3.39).
126
Cơ chế tác dụng giảm TG là tăng cường mức Ďộ biểu hiện của gen mã hóa cho protein Insig-2a (insulin induced gene 2-a (Isig-2a)) dẫn Ďến ức chế quá trình vận chuyển sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) và fatty acid synthase (FAS) vào trong nhân tế bào cần phải Ďược tiếp tục nghiên cứu trong thời gian tới theo các công bố của tác giả Peet và cộng sự, (1998) và Dang et al., (2009) [178, 179].
Hình 3.39. Sơ Ďồ tóm tắt bước Ďầu nghiên cứu cơ chế phân tử tác dụng giảm cholesterol và tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 Ghi chú: LDL-R: The low - Density Lipoprotein Reccetor; CYP7A1: cholesterol 7a-hydroxylase; LXR: liver X receptor; ABC: ATP-binding cassette transporter member 1; ApoE : apoliprotein; Insig-2a: insulin induced gene 2-a; SREBP-1c: sterol regulatory element-binding protein 1c; FAS: Fatty acid synthase; FATP4: fatty acid transport protein 4; SCD-1: stearoyl-Coenzyme A desaturase 1; CPT-1: Carnitine palmitoyltransferase ; ACOX: acyl-CoA oxidase; LPL: lipoprotein lipase; MCAD: medium-chain acyl CoA dehydrogenase; HMGCS2- hydroxymethylglutaryl CoA synthase 2.
127
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN Từ các kết quả nghiên cứu Ďã Ďược trình bày ở phần nêu trên, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1. Lựa chọn Ďược chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong số 32 chủng Schizochytrium spp. và 8 chủng Thraustochytrium spp. từ Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học có khả năng tổng hợp squalene cao nhất (Ďạt 102,01 mg/g sinh khối khô). 2. Điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 khi nuôi ở bình tam giác là 28ᵒC, nồng Ďộ glucose 3%, cao nấm men 1% và bổ sung tebinafine với nồng Ďộ 100 g/mL. 3. Điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 khi nuôi ở bình lên men 30 lít tự tạo là lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất; môi trường nuôi cấy Ďược bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin
(vitamin B1-45 g/L, vitamin B6-45 g/L và vitamin B12-0,25 g/L) với nguồn nitơ là 1,2% cao nấm men và 6,42% monosodium glutamate; thời gian tối ưu Ďể bổ sung glucose là tại thời Ďiểm 36 giờ và tiến hành thu sinh khối tảo sau 48 giờ bổ sung glucose, mật Ďộ tế bào tảo Ďạt (369,35 ±7,94) x 106 tế bào/mL; sinh khối khô Ďạt (75,41± 1,35) g/L, hàm lượng squalene Ďạt (93,53 ± 2,45) mg/g sinh khối khô và sản lượng squalene Ďạt (6928,6± 14,6) mg/L. 4. Đã xây dựng Ďược quy trình tách chiết và tinh sạch squalene ở quy mô nhỏ và quy mô pilot từ sinh khối chủng S. mangrovei PQ6. Từ 46 L dịch lên men (tương Ďương 3,9 ± 0,1 kg sinh khối khô), squalene tinh khiết có hàm lượng (305,23±2,34)g với Ďộ tinh sạch Ďạt 90-95%, Ďảm bảo yêu cầu chất lượng theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm. 5. Những thử nghiệm Ďộc tính cấp và bán trường diễn trên mô hình Ďộng vật thực nghiệm cho thấy squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 là không Ďộc. Sau 60 ngày sử dụng liên tục, chuột Ďuợc uống squalene với liều 400 và 1.200 mg/kg khối lượng cơ thể chuột/ngày Ďảm bảo an toàn, không làm thay
128
Ďổi các chỉ tiêu huyết học, sinh hoá, không gây tổn thương tế bào và chức năng gan, thận và lách của chuột thực nghiệm so với công thức Ďối chứng. 6. Trên mô hình in vivo và in vitro Ďã cho thấy squalene có tác dụng tăng lipoprotein có tỷ trọng cao gắn với cholesterol và tỷ lệ HDL- cholesterol/cholesterol toàn phần trong máu; có tác dụng giảm cholesterol và tryglyceride nội bào, làm giảm cholesterol gắn với lipoprotein tỷ trọng thấp và rất thấp trong máu mà không gây ảnh hưởng Ďến sự phát triển cân nặng cơ thể và gan, cholesterol toàn phần và tryglyceride máu. Trên mô hình tế bào, bước Ďầu Ďã xác Ďịnh Ďược cơ chế tác dụng giảm cholesterol của squalene là Ďiều hòa biểu hiện của các gen mã hóa cho protein, enzyme tham gia vào quá trình vận chuyển (như thụ thể LDL- low density lipoprotein - receptor, LDL-R; thụ thể trong gan - Liver - X receptor, LXRs) và thoái hóa cholesterol (CYP7A1- enzyme cholesterol 7 alpha- hydroxylase). Ngoài ra, squalene có tác dụng giảm tryglyceride trong máu.
KIẾN NGHỊ 1. Cần tiếp tục nghiên cứu về cơ chế tác dụng giảm cholesterol và tryglyceride của squalene là do tăng cường mức Ďộ biểu hiện của gen mã hóa cho protein Insig-2a dẫn Ďến ức chế quá trình vận chuyển SREBP-1c vào trong nhân tế bào. 2. Nghiên cứu mức Ďộ biểu hiện của các gen tham gia vào quá trình hấp thu acid béo trong tế bào gan, giảm Ďiều hòa biểu hiện các gen tham gia vào quá trình tổng hợp tryglyceride, tăng Ďiều hòa biểu hiện các gen tham gia vào quá trình beta-ôxy hóa và hấp thu acid béo, quá trình ketosis và vận chuyển ngược cholesterol thông qua việc kích hoạt thụ thể PPARα.
129
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ (09)
1. Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Minh Hiền, Nguyễn Hoàng Ngân, Đặng Diễm Hồng. Đánh giá mức độ an toàn và tác dụng của squalene tách chiết từ Schizochytrium mangrovei PQ6 đến sự tăng cholesterol của lipoprotein tỷ trọng cao (HDL-C) ở động vật thực nghiệm. Tạp chí Sinh học, 2019, 41(2), 39-48. 2. Hoang Thi Lan Anh, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Pham Van Nhat, Hoang Thi Minh Hien, Ngo Thi Hoai Thu, Dang Diem Hong, Different fermentation strategies by Schizochytrium mangrovei strain PQ6 to produce feedstock for exploitation of squalene and omega-3 fatty acids. Journal of Phycology, 2018, 54 (4), 550-556 (SCI, Q1; IF-3,0). 3. Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Minh Hiền, Đặng Diễm Hồng, Cơ chế giảm cholesterol của squalene tách chiết từ Schizochytrium mangrovei PQ6. Báo cáo toàn văn tại Hội thảo Khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2018 tại Trung tâm Hội nghị quốc gia Hà Nội 26.10.2018, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ; 2018, 589-594. 4. Nguyen Cam Ha, Hoang Thi Minh Hien, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Dang Diem Hong, Optimization of fermentation conditions for squalene production by heterotrophic marine microalgae Schizochytrium mangrovei. Academia Journal of Biology, 2017, 39(3), 449-458. 5. Hoang Thi Minh Hien, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Dang Diem Hong, Squalene promotes cholesterol homeostasis in macrophage and hepatocyte cells via activation of liver X receptor (LXR) α and β. Biotechnology Letters, 2017, 39 (8), 1101-1107 (SCI, Q2; IF-1,7). 6. Đặng Diễm Hồng, Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Lưu Thị Tâm, Hoàng Thị Lan Anh, Ngô Thị Hoài Thu, Nhiên liệu sinh học từ vi tảo biển dị dưỡng của Việt Nam: Biodiesel và tận thu các sản phẩm phụ (acid béo không bão hòa đa nối đôi - PUFAs, glycerol và squalene) trong quá trình sản xuất biodiesel. Tạp chí Sinh học, 2017, 39 (1), 51-60. 7. Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Pham Van Nhat, Hoang Thi Lan Anh and Dang Diem Hong. Extraction of squalene from
130
Vietnam heterotrophic marine microalga. Proceeding of The 4 the Academic conference on natural Science for Yong Scientists, Master & PhD. Student from Asian Countries. 15-18 December, 2015 - Bangkok, Thailand, 2016, 46-56. 8. Hoang Thi Lan Anh, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Dang Diem Hong Optimization of culture conditions and squalene enrichment from heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei PQ6 for squalene production. Research Journal of Biotechnology, 2016, 14 (2), 337- 346 (SCI-E). 9. Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Đặng Diễm Hồng, Hoàng Minh Hiền, Nghiên cứu tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium sp. trên tế bào Hep G2. Tạp chí Dược liệu, 2016, 21 (4), 270 -274.
131
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. K. Wołosik, M. Kna´s, A. Zalewska, M. Niczyporuk, The importance and perspective of plant-based squalene in cosmetology, Journal of Cosmetic Science, 2013, 64 (1), 19-65. 2. S. Lopez, B. Bermudez, S. Montserrat-de la Paz, S. Jaramillo, L. M. Varela, A. Ortega-Gomez, R. Abia, F. J. Muriana, Membrane composition and dynamics: a target of bioactive virgin olive oil constituents, Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes, 2014, 1838 (6), 1638-1656. 3. I. Popa, N. E. Babeanu, S. NiTa, O. Popa, Squalene - Natural resources and applications. Farmacia, 2014, 62 (5). 4. O. Popa, N. E. B˘abeanu, I. Popa, S. Nit˘a, E. C. DinuPaˆrvu, Methods for obtaining and determination of squalene from natural sources, BioMed Research International, Article ID 367202, 2015, 16 pages. 5. D. M. Pham, B. Boussouira, D. Moyal, Q. L. Nguyen, Oxidization of squalene, a human skin lipid: a new and reliable marker of environmental pollution studies. International Journal of Cosmetic Science, 2015, 37 (4), 357-365. 6. A. L. Ronco, E. De Stéfani, Squalene: a multi-task link in the crossroads of cancer and aging. Functional foods in health and disease, 2013, 3 (12), 462- 476. 7. Y. Kohno, Y. Egawa, S. Itoh, S. Nagaoka, M. Takahashi, K. Mukai, Kinetic study of quenching reaction of singlet oxygen and scavenging reaction of free radical by squalene in n-butanol, Biochim Biophys Acta, 1995, 1256 (1), 52-56. 8. M. Spanova, G. Daum, Squalene - biochemistry, molecular biology, process biotechnology, and applications. Eur. J. Lipid Sci. Technol, 2011, 113, 1299- 1320. 9. T. Hauss, S. Dante, N.A. Dencher, T. H. Haines, Squalane is in the midplane of the lipid bilayer: Implications for its function as a proton permeability barrier. Biochim. Biophys. Acta, 2002, 1556, 149–154.
132
10. K. Lohner, G. Degovics, P. Laggner, E. Gnamusch, F. Paltauf, Squalene promotes the formation of non-bilayer structures in phospholipid model membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1993, 1152, 69-77. 11. W. Xu, X. Ma, Y. Wang, Production of squalene by microbes: an update. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2016, 32 (12), 195. 12. N. Dellas, S. T. Thomas, G. Manning, J. P. Noel, Discovery of a metabolic alternative to the classical mevalonate pathway, 2013, Elife 2: e00672. 13. J. Acimovic, D. Rozman, Steroidal triterpenes of cholesterol synthesis. Molecules, 2013, 18(4), 4002-4017. 14. G. P. Ghimire, H. T. Nguyen, N. Koirala, J. K. Sohng, Advances in biochemistry and microbial production of squalene and its derivatives. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2016, 26 (3), 441-451. 15. T. Moses, K. K. Papadopoulou, A. Osbourn, Metabolic and functional diversity of saponins, biosynthetic intermediates and semi-synthetic derivatives. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2014, 49 (6), 439-462. 16. M. A. Lozano-Grande, S. Gorinstein, E. Espitia-Rangel, G. Davila´-Ortiz, Mart´ınez- A. L. Ayala, Review article: Plant sources, extraction methods, and uses of squalene. International Journal of Agronomy, 2018, 13 pages. 17. Y. Xie, B Sen, G Wang, Mining terpenoids production and biosynthetic pathway in thraustochytrids, Bioresour Technol, 2017, 244 (2), 1269 – 1280. 18. E. Naziri, R. Consonni, M. Z. Tsimidou, Squalene oxidation products: monitoring the formation, characterisation and pro-oxidant activity. European Journal of Lipid Science and Technology, 2014, 116 (10), 1400 - 1411. 19. L. Xu, N.A. Porter, Free radical oxidation of cholesterol and its precursors: implications in cholesterol biosynthesis disorders. Free Radical Research, 2015, 49 (7), 835 - 849. 20. H. Yin, E. Niki, K. Uchida, Special issue on “recent progress in lipid peroxidation based on novel approaches. Free Radical Research, 2015, 49 (7), 813-815. 21. G.S. Kelly (1999). Squalene and its potential clinical uses. Altern. Med. Rev, 1999, 4(1), 29-36.
133
22. M. Micera, A. Botto, F. Geddo, S. Antoniotti, C. M, Bertea, R. Levi, M. P. Gallo, G. Querio, Squalene: More than a step toward sterols, Antioxidants, 2020, 9 (8), E688. 23. R. Ciriminna, V. Pandarus, F. Béland, M. Pagliaro, Catalytic hydrogenation of squalene to squalane. Org. Process Res. Dev, 2014, 18, 1110-1115. 24. D. Smith, A. Espino-Montoro, F. PerezJimenez, J. Pedro-Botet, J. Jimenez Pereperez, J. M. Ordovas. Effect of a high saturated fat and cholesterol diet supplemented with squalene or β-sitosterol on lipoprotein in fib hamsters. Nutr. Res., 2000, 20, 1309-1318. 25. S. Sánchez-Fidalgo, A. Cárdeno, M. Sánchez-Hidalgo, M. Aparicio-Soto, C. Alarcón de la Lastra, Dietary extra virgin olive oil polyphenols supplementation modulates DSS-induced chronic colitis in mice. J Nutr Biochem, 2013, 24(7), 1401-1413. 26. H. N. Bhilawade, Tatewaki N, Nishida H, Konishi T. Squalene as novel food factor. Curr Pharm Biotechnol, 2010, 11(8): 875 - 880. 27. H. N. Bhilawade, N. Tatewaki, T. Konishi, M. Nishida, T. Eitsuka, H. Yasui. The adjuvant effect of squalene, an active ingredient of functional foods, on doxorubicin-treated allograft mice. Journal nutrition and cancer, 2019, 71 (7): 1153-1164. 28. R. Moroti, R. Petre, I. Niculescu, I. Pigulea, V. Molagic, A. Hristea, A. Porojnicu, Vitamin D an antimicrobial weapon against acute respiratory tract infections. A systematic review. Farmacia, 2012, 60(2), 159-167. 29. J. D. Kedl, R. M. Kedl, How squalene GLAdly helps generate antigen specific T cellsvia antigen-carrying neutrophils and IL-18. Eur. J. Immunol, 2015, 45, 376-379. 30. S. K. Kim, F. Karadeniz. Biological importance and applications of squalene and squalane, Advances in Food and Nutrition Research, 2012, 65, 223-33. 31. K. P. Patra, F. Li, D. Carter, J. A. Gregory, S. Baga, S. G. Reed, S. P. Mayfield, J. M. Vinetz. Algae-produced malaria transmission-blocking vaccine candidate Pfs25 formulated with ahuman use-compatiblepotent adjuvant induces highaffinity antibodies that block Plasmodium falciparum infection of mosquitoes. Infect. Immun, 2015, 83, 1799-1808.
134
32. G. Del Giudice, E. Fragapane, R. Bugarini, M. Hora, T. Henriksson, E. Palla, D. O’Hogan, J. Donnelly, R. Rappuoli, A. Podda, Vaccines with MF59 adjuvant do not stimulate antibody responses against squalene, Clin. Vaccine Immunology, 2006, 13, 1010-1013. 33. M. T. Hensel, J. D. Marshall, M. R. Dorwart, D. S. Heeke, E. Rao, P. Tummala, L. Yu, G. H. Cohen, R. J. Eisenberg, D. D. Sloan, Prophylactic herpes simplex virus 2 (HSV-2) vaccines adjuvanted wit stable emulsion and toll-like receptor 9 agonist induce a robust HSV-2-specific cell-mediated immune response, protect against symptomatic disease, and reduce the latent viral reservoir. J. Virol, 2017, 91(9), e02257-16. 34. G. Lippi, G. Targher, M. Franchini. Vaccination, squalene and anti-squalene antibodies: facts or fiction? Eur. J. Inter. Med, 2010, 21, 70-73. 35. C. Sánchez-Quesada, A. López-Biedma, E. Toledo, J. J. Gaforio. Squalene stimulates a key innate immune cell to foster wound healing and tissue repair. Evid. Based Complement Alternat. Med, 2018, 9473094. 36. J. J. Stelzner, M. Behrens, S. E. Behrens, K. Mäder, Squalene containing solid lipid nanoparticles, a promising adjuvant system for yeast vaccines, Vaccine, 2018, 36, 2314-2320. 37. D. Panatto, D. Amicizia, L. Arata, P. L. Lai, R. Gasparini, A comprehensive analysis of Italian web pages mentioning squalene-based influenza vaccine adjuvants reveals a high prevalence of misinformation. Human vaccines & immunotherapeutics, 2018, 14 (4), 969 - 977. 38. A. Sethi, T. Kaur, S. K. Malhotra, M. L. Gambhir, Moisturizers: the slipperyroad. Indian J. Dermatol, 2016, 61, 279-287. 39. A. O. Oyewole, A. A. Birch-Machin, Sebum, inflammasomes and the skin: current concepts and future perspective. Exp Dermatol, 2015, 24, 651 – 654. 40. P. Chan, B. Tomlinson, C. B. Lee, Y. S. Lee, Effectiveness and safety of low- dose pravastatin and squalene, alone and in combination, in elderly patients with hypercholesterolemia. J Clin Pharmacol., 1996, 36, 422- 427. 41. Y. Liu, X. Xu, D. Bi, X. Wang, X. Zhang, H. Dai, S. Chen, W. Zhang, Influence of squalene feeding on plasma leptin, testosterone and blood pressure in rats. Indian J. Med. Res, 2009, 129, 150-153.
135
42. Geyeregger, M. Zeyda, T. M. Stulnig, Liver X receptors in cardiovascular and metabolic disease. Cell Mol Life Sci, 2006, 63 (5), 524-539. 43. J. J. Repa, K. E. Berge, C. Pomajzl, J. A. Richardson, H. Hobbs, D. J. Mangelsdorf, Regulation of ATP-binding cassette sterol transporters ABCG5 and ABCG8 by the liver X, J Biol Chem., 2002, 277(21), 18793-800. 44. Tangirala, I. G. Schulman, Macrophage liver X receptor is required for antiatherogenic activity of LXR agonists. Arterioscl Thromb Vasc, 2005, 25, 135-142. 45. J. R. Schultz, H. Tu, A. Luk, J. J. Repa, J. C. Medina, L. Li, S. Schwendner, S. Wang, M. Thoolen, D. J. Mangelsdorf, K. D. Lustig, B. Shan, Role of LXRs in control of lipogenesis. Genes Dev, 2000, 14, 2831–2838. 46. C. Gabas-Rivera, C. Barranquero, R. Martınez-Beamonte, M. A. Navarro, J. C. Surra, J. Osada, Dietary squalene increases high density lipoprotein cholesterol and paraoxonase and decreases oxidative stress in mice. Plos one, 2014, 9 (8): e104224. 47. X. Q. Wang, K. W. Kim, S. H. Chu, R. Phitakatansakul, S. W. Park, I. M. Chung, Y. S. Lee, Y. J. Park, Genome-wide association study for squalene contents and functional haplotype analysis in rice, ACS Omega, 2019, 4 (21), 19358 – 19365. 48. A. Katabami, L. Li, M. Iwasaki, M. Furubayashi, K. Saito, D. Umeno, Production of squalene by squalene synthases and their truncated mutants in Escherichia coli. J Biosci Bioeng, 2015, 119, 165–71. 49. W. Xu, I. Yao, L. Liu, X. Ma, W. Li, X. Sun, Y. Wang, Improving squalene production by enhancing the NADPH/NADP+ ratio, modifying the isoprenoid-feeding module and blocking the menaquinone pathway in Escherichia coli, Biotechnology for Biofuels, 2019, 12, 68. 50. http://www.thegoodscentscompany.com/data/rw1284311.html. INCI: Squalene CAS No: 111-02-4 EINECS No: 203-826-1 51. Sage, Final report on the safety assessment of squalane and squalene, International Journal of Toxicology, 1982, 1 (2), 37–56. 52. M. Vadala, C. Laurino, L. Palmieri, B. Palmieri, Shark derivatives (Alkylglycerols, Squalene, Cartilage) as putative nutraceuticals in oncology. European journal of on cology, 2017, 22 (1), 5-20.
136
53. T. Rosales-García, C. Jimenez-Martinez, G. Dávila-Ortiz, Squalene extraction: biological sources and extraction methods. International Journal of Environment, Agriculture and Biotechnology (IJEAB), 2017, 2 (4), 1662- 1670. 54. G. Cirmena, P. Franceschelli, E. Isnaldi, L. Ferrando, M. De Mariano, A. Ballestrero, G. Zoppoli. Squalene epoxidase as a promising metabolic target in cancer treatment, Cancer Lett, 2018, 425, 13-20. 55. K. H. Tsoi, S. Y. Chan, Y. C. Lee, B. H. Y. Ip, C. C. Cheang, Shark conservation: an educational approach based on children’s knowledge and perceptions toward sharks. PLoS ONE, 2016, 17 pages. 56. N. Seltenrich, New link in the food chain? Marine plastic pollution and seafood safety. Environ. Health Perspect, 2015, 123, 34 - 41. 57. R. Ramírez-García, N. Gohil, V. Singh. Recent advances, challenges, and opportunities in bioremediation of hazardous materials. Phytomanagement of Polluted Sites, 2019, 517-568. 58. C. Samaniego-Sanchez, J. J. Quesada-Granados, S. H. Lopez-Garcıa de la, M. C. LopezMartinez, β - carotene, squalene and waxes determined by chromatographic method in picual extra virgin olive oil obtained by a new cold extraction system. Journal of Food Composition and Analysis, 2010, 23, 671 - 676. 59. G. S. Mlakar, M. Turinek, M. Jakop, M. Bavec, F. Bavec, Grain Amaranth as an Alternative and Perspective Crop in Temperate Climate. J. for Geography, 2010, 5(1), 135-145. 60. E. Drozdíková, M. Garaiová, Z. Csáky, M. Obernauerov, I. Hapala, Production of squalene by lactose-fermenting yeast Kluyveromyces lactis with reduced squalene epoxidase activity. Lett. Appl. Microbiol, 2015, 61, 77-84. 61. X. Song, X. Wang, Y. Tan, Y. Feng, W. Li, Q. Cui, High production of squalene using a newly isolated yeast-like strain Pseudozyma sp. SD301, J Agric Food Chem, 2015, 63 (38), 8445-8451. 62. A, Rasool, M. S. Ahmed, C. Li, Overproduction of squalene synergistically downregulates ethanol production in Saccharomyces cerevisiae. Chem. Eng. Sci, 2016, 152, 370 - 380.
137
63. B. E. Ebert, E. Czarnotta, L. M. Blank. Physiologic and metabolic characterization of Sccharomyces cerevisia reveals limitation in the synthesis of the triterpene squalene. FEMS Yeast Res, 2018, 18 (8). 64. I. M. Aasen, H. Ertesvåg, T. M. B. Heggeset, B. Liu, T. Brautaset, O. Vadstein, T. E. Ellingsen, Thraustochytrids as production organisms for docosahexaenoic acid (DHA), squalene, and carotenoids. Appl. Microbiol. Biotechnol, 2016, 100, 4309-4321. 65. Y. Jiang, K. W. Fan, R. T. Wong, F. Chen, Fatty acid composition and squalene content of the marine microalga Schizochytrium mangrovei, J Agric Food Chem, 2004, 52(5), 1196-1200. 66. B. Pora, Y. Qian, B. Caulier, S. Comini, P. Looten, L. Segueilha, Method for the preparation and extraction of squalene from microalgae, Patent Number US20140088201, 2014. 67. Q. Li, G. Q. Chen, K. W. Fan, F. P. Lu, T. Aki, Screening and characterization of squalene-producing Thraustochytrids from Hong Kong mangroves. Agric.Food Chem, 2009, 57, 4267-4272. 68. T. R. García, C. J. Martinez, G. D. Ortiz, Squalene Extraction: Biological Sources and Extraction Methods. International Journal of Environment, Agriculture and Biotechnology (IJEAB), 2017, 2(4). 69. L. Vázquez, C. F. Torres, T. Fornari, F. J. Señoráns, G. Reglero, Recovery of squalene from vegetable oil sources using countercurrent supercritical carbon dioxide extraction. J Supercrit Fluids, 2007, 40 (1), 59 - 66. 70. P. Mercer, R. E. Armenta, Developments in oil extraction from microalgae. Eur. J. Lipid Sci. Technol, 2011, 113 (5), 539-547. 71. A. Thompson, S. Kwak, Y. Su Jin, Squalene production using Saccharomyces cerevisae. An Undergraduate Research Journal, 2014, 1(1), 8 pages. 72. H. Xiao, Z. Yao, Q. Peng, F. Ni, Y. Sun, C. X. Zhang, Z. X. Zhong, Extraction of squalene from camellia oil by silver ion complexation. Sep Purif Technol, 2016, 169, 196-201. 73. K. Paramasivan, K. Rajagopal, S. Mutturi, Studies on squalene biosynthesis and the standardization of its extraction methodology from Saccharomyces cerevisiae. Appl Biochem Biotechnol, 2019, 187 (3), 691-707.
138
74. I. Wandira, E. H. Legowo, D. I. Widiputri, Optimization of squalene produced from crude palm oil waste. AIP Conference Proceedings, 2017, 1803 (1), 8 pages. 75. J. Krulji, T. Brlek, L. Pezo, J. Brkljača, S. Popović, Z. Zeković Z, S. M. Bodroža, Extraction methods of Amaranthus sp. grain oil isolation. J. Sci Food Agric, 2016, 96 (10), 3552 - 3558. 76. K. Y. Khaw, M. O. Parat, P. N. Shaw, J. R. Falconer, Solvent supercritical fluid technologies to extract bioactive compounds from natural sources: A review. Molecules, 2017, 22 (1186), 1-24. 77. S. T. H. Sherazi, S. A. Mahesar, Sirajuddin, Vegetable oil deodorizer distillate: a rich source of the natural bioactive components. J. Oleo Sci, 2016, 65 (12), 957-966. 78. N. Xynos, M. Zervos, A. Angelis, N. Aligiannis, A single-step isolation of squalene from olive oil deodorizer distillates by using centrifugal partition chromatography. Separation science and technology, 2016, 51 (5), 830 - 835. 79. S. Gunawan, N. S. Kasim, Y. H. Ju, Separation and purification of squalene from soybean oil deodorizer distillate. Separation and Purification Technology, 2008, 60 (2), 128- 135. 80. H. T. Lu, Y. Jiang, F. Chen. Preparative separation and purification of squalene from the microalga Thraustochytrium ATCC 26185 by high - speed counter - current chromatography. Journal of Chromatography, 2003, 994 (1-2), 37-43. 81. O. Perez-Garcia, Y. Bashan, Microalgal heterotrophic and mixotrophic culturing for bio-refining: from metabolic routes to techno-economics. Algal Biorefineries, 2015, 2, 61 - 131. 82. F. Di Caprio, A. Visca, P. Altimari, L. Toro, B. Masciocchi, G. Iaquaniello, F. Pagnanelli, Two-stage process of microalgae cultivation for starch and carotenoid production, Chemical Engineering Transactions, 2016, 49, 415 - 420. 83. F. Chen, High cell density culture of microalgae in heterotrophic growth. Trends Biotechnol, 1996, 14, 412-426. 84. G. Q. Chen, F. Chen, Growing phototrophic cells without light. Biotechnol. Lett, 2006, 28, 607-616.
139
85. P. Altimari, F. Di Caprio, L. Toro, A. L. Capriotti, F. Pagnanelli, Hydrogen photo-production by mixotrophic cultivation of Chlamydomonas reinhardtii: Interaction between organic carbon and nitrogen. Chemical Engineering Transactions, 2014, 38, 199-204. 86. F. Pagnanelli, P. Altimari, F. Trabucco, L. Toro, Mixotrophic growth of Chlorella vulgaris and Nannochloropsis oculata: influence of glucose and nitrate concentration. J. Chem. Technol. Biotechnol, 2014, 89, 652-661. 87. S. K. Saha, P. Murray, Exploitation of Microalgae Species for Nutraceutical Purposes: Cultivation Aspects, Fermentation, 2018, 4 (46): 17 pages. 88. P. Bhattacharjee, R. S. Singhal, Extraction of squalene from yeast by supercritical carbon dioxide. Journal of Microbiology & Biotechnology, 2003, 19, 605–608. 89. R. S. Coelho, A. D. S. Vidotti, E. M. Reis, T. T. Franco, High cell density cultures of microalgae under fed-batch and continuous growth. Chemical engineering transactions, 2014, 38: 313-318. 90. F. Chen, M. R. Johns, A strategy for high cell density culture of heterotrophic microalgae with inhibitory substrates. J Appl Phycol, 1995, 7: 43–46. 91. Hoàng Thị Minh Hiền, Lưu Thị Tâm, Lê Thị Thơm, Nguyễn Cẩm Hà, Lương Hồng Hạnh, Hoàng Thị Lan Anh, Ngô Thị Hoài Thu, Đặng Diễm Hồng, Nghiên cứu quá trình tách chiết lipid tổng số và acid béo tự do cho sản xuất dầu Omega-3 và Omega-6 từ sinh khối vi tảo biển dị Schizochytrium mangrovei PQ6. Tạp chí sinh học, 2013, 35(4): 484-493. 92. Lê Thị Thơm, Lưu Thị Tâm, Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Hương Quỳnh, Phạm Văn Nhất, Hoàng Thị Lan Anh, Ngô Thị Hoài Thu, Hoàng Thị Minh Hiền, Đặng Diễm Hồng, Tách chiết và tinh sạch acid béo không bão hòa đã nối đôi omega-3 và omega-6 làm thực phẩm chức năng từ sinh khối vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6. Tuyển tập Hội nghị Khoa học toàn quốc sinh học biển và phát triển bền vững lần thứ 2. Nhà xuất bản khoa học tự nhiên và Công nghệ, DOI 10.1562/MBSD2.2014-0086, 2014a, 735- 743. 93. Lê Thị Thơm, Lưu Thị Tâm, Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Lan Anh, Ngô Thị Hoài Thu, Hoàng Thị Minh Hiền, Đặng Diễm Hồng, Tách chiết và làm giàu
140
hỗn hợp acid béo ω-3 và ω-6 từ dầu tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 bằng phương pháp tạo phức với urê. Tạp chí Sinh học, 2014b, 36 (1), 73-80. 94. Đinh Thị Ngọc Mai, Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Đặng Diễm Hồng, Bước đầu nghiên cứu squalene trong một số chủng vi tảo biển phân lập ở Việt Nam. Tạp chí sinh học, 2013, 35 (3), 333 - 341. 95. L. F. Marchan, K. J. L, Chang, P. D. Nichols, W. J. Mitchell, J. L. Polglase, T. Gutierrez, Taxonomy, ecology and biotechnological applications of thraustochytrids: A review, Biotechnology Advances, 2018, 36 (1), 26 - 46. 96. D. Honda, T. Yokochi, T. Nakahara, S. Raghukumar, A. Nakagiri, K. Schaumann, T. Higashihara, Molecular phylogeny of labyrinthulids and thraustochytrids based on the sequencing of 18S ribosomal RNA gene. J. Eukaryot. Microbiol, 1999, 46, 637-647. 97. O. R. Anderson, T. Cavalier-Smith, Ultrastructure of Diplophrys parva, a new small freshwater species, and a revised analysis of Labyrinthulea (Heterokonta). Acta Protozool, 2012, 51, 291-304. 98. F. Gomaa, E. Mitchell, E. Lara, Amphitremida (Poche, 1913) is a new major, ubiquitous Labyrinthulomycete clade. PLoS One 8, 2013. 99. S. M. Adl, A. G. B Simpson, M. A. Farmer, R. A. Andersen, O. R. Anderson, J. R. Barta, S. S. Bowser, G. Brugerolle, R. A. Fensome, S. Frederiq, T. Y. James, S. Karpov, P. Kugrens, J. Krug, C. E. Lane, L. A. Lewis, J. Lodge, D. H. Lynn, D. G. Mann, R. M. McCourt, L. Mendoza, Ø. Moestrup, S. E. Mozley-Standridge, D. A. Nerad, C. A. Shearer, A. V. Smirnov, F. W. Spiegel, M. F. J. R. Taylor, The new higher level classification of eukaryotes with emphasis on the taxonomy of protists. J Eukaryot Microbiol, 2005, 52, 399-451. 100. S. M. Adl, A. G. B. Simpson, C. E. Lane, J. Lukes, D. Bass, S. S. Bowser, M. W. Brown, F. Burki, M. Dunthorn, V. Hampl, A. Heiss, M. Hoppenrath, E. Lara, L. Le Gall, D. H. Lynn, H. McManus, E. A. D. Mitchell, S. E. Mozley-Stanridge, L. W. Parfrey, J. Pawlowski, S. Rueckert, L. Shadwick, C. L. Schoch, A. Smirnov, F. W. Spiegel, The revised classification of Eukaryotes. Journal of Eukaryotic Microbiology, 2012, 59 (5), 429-493. 101. S. M. Adl, D. Bass, C. E. Lane, J. Lukeš, C. L. Schoch, A. Smirnov, S. Agatha, C. Berney, M. W. Brown, F. Burki, P. Cárdenas, I. Čepička, L.
141
Chistyakova, J. del Campo, M. Dunthorn, B. Edvardsen, Y. Eglit, L. Guillou, V. Hampl, A. A. Heiss, M. Hoppenrath, T. Y. James, A. Karnkowska, S. Karpov, E. Kim, M. Kolisko, A. Kudryavtsev, D. J. G. Lahr, E. Lara, L. Le Gall, D. H. Lynn, D. G. Mann, R. Massana, E. A. D. Mitchell, C. Morrow, J. S. Park, J. W. Pawlowski, M. J. Powell, D. J. Richter, S. Rueckert, L. Shadwick, S. Shimano, F. W. Spiegel, G. Torruella, N. Youssef, V. Zlatogursky, Q. Zhang, Revisions to the classification, nomenclature, and diversity of eukaryotes. J Eukaryot Microbiol, 2019, 66 (1), 4-119. 102. J. W. Brown, U. Sorhannus, A molecular genetic timescale for the diversification of autotrophic Stramenopiles (Ochrophyta): substantive underestimation of putative fossil ages. PLoS One 5, 2010, 1e11. 103. M. A. Ruggiero, D. P. Gordon, T. M. Orrell, Bailly N, Bourgoin T, Brusca RC, Cavalier-Smith T, Guiry MD, Kirk PM, A higher level classification of all living organisms. PLoS One, 2015, 10 (4). 104. G. W. Beakes, D. Honda, M. Thines, Systematics of the stramenopila: Labyrinthulomycota, Hyphochytriomycota and Oomycota. In: McLaughlin, D.J., Spatafora, J.W. (Eds.), The Mycota: A Comprehensive Treatise on Fungi as Experimental Systems for Basic and Applied Research. VIISystematics and Evolution. Part A. Springer, 2014, 39-97. 105. H. S. Yoon, J. D. Hackett, G. Pinto, D. Bhattacharya, The single, ancient origin of chromist plastids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, 99 (24), 15507-15512. 106. T. Cavalier-Smith, E. E. Y. Chao, Phylogeny and megasystematics of phagotrophic heterokonts (kingdom Chromista). Journal of Molecular Evolution, 2006, 62, 388 - 420. 107. S. Raghukumar, Ecology of the marine protists, the labyrinthulomycetes (Thraustochytrids and Labyrinthulids). Eur J Protistol, 2002, 38, 127-145. 108. Đặng Diễm Hồng, Hoàng Thị Lan Anh. Vi tảo biển dị dưỡng Labyrinthula, Schizochytrium, Thraustochytrium mới ở Việt Nam: Tiềm năng và thách thức. Bộ sách chuyên khảo Tài nguyên thiên nhiên và môi trường Việt Nam. Nhà Xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ, 2016, 626 trang.
142
109. Đặng Diễm Hồng, Hoàng Lan Anh, Ngô Hoài Thu, Phân lập được vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium giàu DHA ở vùng biển huyện Đảo Phú Quốc. Tạp chí Sinh học, 2008, 30 (2), 50-55. 110. Đinh Thị Ngọc Mai, Hoàng Lan Anh, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Diễm Hồng. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và định tên khoa học dựa trên trình tự gen 18S rRNA của chủng Schizochytrium sp. TH 16 phân lập từ vùng rừng ngập mặn Tĩnh Gia- Thanh Hoá. Báo cáo khoa học về sinh thái và tài nguyên sinh vật. Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ ba Hà Nội, 22/10/2009. Nhà XB NN-2009, 2009, 1009-1016. 111. Hoàng Lan Anh, Đinh Thị Ngọc Mai, Đinh Thu Hằng, Đặng Diễm Hồng, Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học chủng vi tảo biển dị dưỡng giàu DHA Schizochytrium sp. TB 17 phân lập từ vùng rừng ngập mặn Điêm Điền, Thái Bình. Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2009. Công nghệ sinh học phục vụ Nông - Lâm nghiệp, Thuỷ sản, công nghiệp, Y - dược và bảo vệ môi trường, Nhà XB Đại học Thái Nguyên, 2009, 492-496. 112. G. Chen, K. W. Fan, F. P. Lu, Q. Li, T. Aki, F. Chen, Y. Jiang, Optimization of nitrogen source for enhanced production of squalene from thraustochytrid Aurantiochytrium sp, 2010, 27(4), 382-389. 113. P. Bhattacharjee, V. B. Shukla, R. S. Singhal, P. R. Kulkarni, Studies on fermentative production of squalene. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2001, 17(8), 811-816. 114. A. Nakazawa, H. Matsuura, R. Kose, S. Kato, D. Honda, I. Inouye, K. Kaya, M. M. Watanabe, Optimization of culture of the thraustochytrid Aurantiochytrium sp. strain 18W-13a for squalene production. Bioresource Technology, 2012, 109, 287-291. 115. M. M. Watanabe, Hydrocarbon – producing algae: their potential as a fossil-oil. Abstract of the 6th Asian Pacific Phycological Forum (APPF 2011), 2011. 116. A. Nakazawa, Y. Kokubun, H. Mattsuura, N. Yonezawa, R. Kose, M. Yoshida, Y. Tanabe, E. Kusuda, D. V. Thang, M. Ueda, D. Honda, A. Mahakhant, K. Kaya, M. M. Watanabe, TLC screening of thraustochytrid strains for squalene production. Journal of Applied Phycology, 2014, 26 (1), 29 - 41.
143
117. M. Otagiri, A. Khalid, S. Moriya, H. Osada, S. Takahashi, Novel squalene- producing thraustochytrids found in mangrove water, Biosci Biotechnol Biochem, 2017, 81(10), 2034-2037. 118. G. Martins, M. C. Paulo, M. Padilha, J. Countinho, C. Cardoso, N. M. Bandarra, I. Batista, Simultaneous evaluation of the production of squalene and fatty acids by Aurantiochytrium. Journal of Marine Biology and Aquaculture, 2018, 4(1), 14-20. 119. J. J. Zhong, C. J. Yue, Plant cells: secondary metabolite heterogeneity and its manipulation. Adv Biochem Eng/Biotech, 2005, 100, 53–88. 120. C. J. Yue, Y. Jiang, Impact of methyl jasmonate on squalene biosynthesis in microalga Schizochytrium mangrovei. Process biochemistry, 2009, 44(8), 923-927. 121. N. Gohil, G. Bhattacharjee, K. Khambhati, D. Braddick, V. Singh, Engineering strategies in microorganisms for the enhanced production of squalene: Advances, challenges and opportunities. Front. Bioeng. Biotechnol, 2019, 24 pages. 122. Hoàng Thị Lan Anh, Đinh Thị Ngọc Mai, Ngô Thị Hoài Thu, Đặng Diễm Hồng, Phân lập chủng vi tảo biển dị dưỡng mới thuộc chi Thraustochytrium giàu DHA và carotenoid từ đầm ngập mặn Thị Nại – Bình Định. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2010, 8 (3A), 459-465. 123. Le Thi Thom, Nguyen Cam Ha, Hoang Minh Hien, Hoang Thi Lan Anh, Ngo Thi Hoai Thu, Dang Diem Hong, Extraction and purification of squalene from heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei PQ6. Proceedings of the 3rd Academic Conference on Natural Science for master and PhD students from Asean countries, 11-15 November, PhomPenh, Campodia, Publishing House for Scienec and Tehcnology – 2014, 2014, 177-183. 124. Hoang Minh Hien, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Luu Thi Tam, Hoang Thi Lan Anh, Ngo Thi Hoai Thu, Dang Diem Hong, Extraction of squalene as value-added product from the residual biomass of Schizochytrium mangrovei PQ6 during biodiesel producing process. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2014, 118 (6), 632-639.
144
125. Dang Diem Hong, Hoang Thi Lan Anh, Ngo Thi Hoai Thu, Study on biological characteristics of heterotrophic marine microalga – Schizochytrium mangrovei PQ6 isolated from Phu Quoc Island, Kien Giang province, Vietnam. J. Phycol., 2011, 47 (4), 944-954. 126. E. G. Bligh, W. J. Dyer, A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol, 1959, 37, 911-917 127. A. D. L. Jara, H. Mendoza, A. Martel, C. Molina, Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii, J Appl Phycol, 2003, 15, 433-438. 128. G. L. Miller, Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 1959, 31, 426-428. 129. G. H. Rothblat, D. S. Martak, D. Kritchevsky, A quantitative colorimetric assay for squalene, Analytical Biochemistry,1962, 4, 52-56. 130. T. E. Lewis, P. D. Nichols, T. A. McMeekin, Sterol and squalene content of a docosahexaenoic acid producing thraustochytrid: influence of culture age, temperature and dissolved oxygen. Mar Biotechnol, 2001, 3, 439-447. 131. Y.M. Choo, L.N. Harrison Lau, A.N. Ma, Extraction of vitamin E, phytosterols and squalene from palm oil, US Pat 0250953, 2005. 132. C.J Pouchert, J. Behnke, The Aldrich Library of 13C and 1H FTNMR Spectra, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, 1993, WI, 46. 133. TCVN 2627 - 1993. Dầu thực vật -Phương pháp xác Ďịnh màu sắc, mùi và Ďộ trong. 134. TCVN 6120 - 2007. Dầu mỡ Ďộng thực vật -Xác Ďịnh Ďộ ẩm và hàm lượng chất bay hơi. 135. TCVN 6127 - 2010. Dầu mỡ Ďộng và thực vật -Xác Ďịnh trị số acid và Ďộ acid 136. TCVN 6126 – 2007. Dầu mỡ Ďộng và thực vật -Xác Ďịnh chỉ số xà phòng. 137. TCVN 6121 - 2010. Dầu mỡ Ďộng và thực vật -Xác Ďịnh trị số peroxit - phương pháp xác Ďịnh Ďiểm kết thúc chuẩn Ďộ Iốt (quan sát bằng mắt thường). 138. TCVN 6122 - 2010. Dầu mỡ Ďộng và thực vật -Xác Ďịnh trị số Iốt.
145
139. TCVN 4884:2005. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp Ďịnh lượng vi sinh vật trên Ďĩa thạch - Kỹ thuật Ďếm khuẩn lạc ở 30ᵒC. 140. TCVN 8275-2:2010, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - phương pháp Ďịnh lượng nấm men và nấm mốc - phần 2: kỹ thuật Ďếm khuẩn lạc trong các sản phẩm có hoạt Ďộ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0,95, 2010. 141. TCVN 7924-2:2008, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - phương pháp Ďịnh lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidara - phần 2: kỹ thuật Ďếm khuẩn lạc ở 44 C sử dụng 5-bromo-4-clo-3-indolyl β-D- glucuronid. 142. TCVN 6848:2007, Tiêu chuẩn Quốc gia, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - phương pháp Ďịnh lượng Coliform - kỹ thuật Ďếm khuẩn lạc. 143. TCVN 4829:2005, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – phương pháp phát hiện Salmonella trên Ďĩa thạch. 144. TCVN 4830-1:1999, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – phương pháp Ďịnh lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với Coagulase (Staphylococcus aureus và các loài khác) trên Ďĩa thạch – phần 1: kỹ thuật sử dụng môi trường thạch Baird - parker, 145. Tiêu chuẩn Việt Nam (2007) Thực phẩm - xác Ďịnh hàm lượng chì bằng phương pháp quan phổ hấp thụ nguyên tử, TCVN 7602:2007. 146. AOAC 999.10-2005, Lead, Cadmium, Zinc, Copper, and iron in foods. Atomic absorption spectrophotometry after microwave digestion. 147. Đỗ Trung Đàm, Phương pháp Litchfield Wilcoxon. Phương pháp xác Ďinh Ďộc tính của thuốc, Nhà xuất bản y học, 2014, 101 - 112. 148. Bộ Y tế, Quy định về thử thuốc trên lâm sàng, Thông tư số 29/2018/TT- BYT, ngày 29 tháng 10 năm 2018. 149. OECD. Drug Safety Evaluation I: Acute and subchronic toxicity assessement; USA Academy Press, 2002. 150. WHO, General Guidelines for Methodologies on Research and Evaluation of Traditional Medicine, EDM/TRM, Geneva, Switzerland, 2000.
146
151. F. Denizot, R. Lang. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods, 1986, 89(2), 271- 277. 152. Hoang Minh Hien, Y. Jia, H. J. Jun, J. H. Lee, B. Y. Lee, S. J. Lee, Fucosterol Is a Selective Liver X Receptor Modulator That Regulates the Expression of Key Genes in Cholesterol Homeostasis in Macrophages, Hepatocytes, and Intestinal Cells. Agriculture food, chemistry, 2012, 11567- 11575. 153. J. Y. Lee, S. H. Mitmesser, T. P. Carr, Regulation of cellular cholesterol, In Molecular Nutrition. CABI Publishing. London, UK, 2002, 309-320. 154. Dang Diem Hong, Dinh Thi Ngọc Mai, Le Thi Thom, Nguyen Cam Ha, Bui Dinh Lam, Luu Thi Tam, Hoang Thi Lan Anh, Ngo Thi Hoai Thu, Biodiesel production from Vietnam heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei PQ6. J. Biosci. Bioeng., 2013, 116 (2), 180-185. 155. T. Yokochi, D. Honda, T. Higashihara, T. Nakahara, Optimization of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium limacinum SR21. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1998, 49, 72 - 79. 156. S. T. Wu, S. T. Yu, L. P. Lin, Effect of culture condition on docosahexaenoic acid production by Schizochytrium sp. S31. Process Biochem., 2005, 40, 3103-3108. 157. K.W. Fan, T. Aki, F. Chen, Enhanced production of squalene in the thraustochytrid Aurantiochytrium mangrovei by medium optimization and treatment with terbinafine, World J. Microbiol. Biotechnol., 2010, 26, 1303- 1309. 158. T. Ono, The first step of oxygenation in cholesterol biosynthesis, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 292, 1283 - 1288. 159. N.S. Ryder, Terbinafine- mode of action and properties of the squalene epoxidase inhibition. Br. J. Dermato, 1992, 126 (Suppl), 2-7. 160. C. Ruckenstuhl, S. Lang, A. Poschenel, A. Eidenberger, P. K. Baral, P. Kohut, I. Hapala, K. Gruber, F. Turnowsky, Characterization of squalene epoxidase of Saccharomyces cerevisiae by applying terbinafine-sensitive variants. Antimicrob. Agents Chemother., 2007, 51, 275-284.
147
161. L. Qu, L. J. Ren, G. N. Sun, X. J. Ji, Z. K. Nie, H. Huang, Batch, fed-batch and repeated fed-batch fermentation processes of the marine thraustochytrid Schizochytrium sp. for producing docosahexaenoic acid, Bioprocess. Biosyst. Eng., 2013, 36, 1905-1912. 162. Nguyễn Hoàng Lộc, Giáo trình nhập môn Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Đại học Huế, 2007, 355. 163. N. G. Cheng, M. Hasan, A. C. Kumoro, C. F. Ling, M. Tham, Production of ethanol by fed-batch fermentation, Pertanika J. Sci. & Technol., 2009, 17, 399-408. 164. K. E. Cooksey, J. B. Guckert, S. A. William, P. R. Callis, Fluorometric determination of the neutral lipid-content of microalgal cells using nile red. J. Microbiol. Meth., 1987, 6, 333-345. 165. R. Halim, M. K. Danquah, P. A. Webley, Extraction of oil from microalgae for biodiesel production: A review. Biotechnol. Adv., 2012, 30, 709-732. 166. .E. M. Grima, E. H. Belarbi, F. G. A. Fernandez, F. G. A. Medina, Y. Chisti, Recovery of microalgal biomass and metabolites: process options and economics. Biotechnol Advances, 2003, 20 (7-8), 491-515. 167. V. K. Bajpai, R. Majumder, J. G. Park, Isolation and purification of plant secondary metabolites using column-chromatographic technique, Bangladesh J Pharmacol, 2016, 11, 844-848. 168. M. Watanabe, K. Kaya, M. Shiho, A. Nakazawa, I. Inoue, D. Honda, Novel microorganism having high squalene-producing ability, and method for producing squalene by means of same,European patent EP2650356A, 2013. 169. F. E. Gunes, Medical use of squalene as a natural antioxidant, Musbed, 2013, 3(4), 220-228. 170. CTFA, Submission of data by CTFA, Leberco Labs. Acute oral LD50*, June 11, 1971. 171. E. A. Fisher, J. E. Feig, B. Hewing, S. L. Hazen, J. D. Smith, HDL Function, Dysfunction, and Reverse Cholesterol Transport, Arterioscler Thromb. Vasc. Biol, 2012, 32(12), 2813-2820. 172. G. Silbernagel, P. Pagel, V. Pfahlert, B. Genser, H. Scharnagl, M. E. Kleber, G. Delgado, H. Ohrui, A. Ritsch, T. B. Grammer, W. Koenig, W. März.
148
High-Density Lipoprotein Subclasses, Coronary Artery Disease, and Cardiovascular Mortality. Clin. Chem., 2017, 63(12), 1886-1896. 173. S. Pallavi, B. Ganesan, R. Anandan, Beneficial Effect of Dietary Squalene supplementation on Experimentally Induced Cardiomyopathy in Rats. International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, 2013, 3, 525-533. 174. N. Guillén, S. Acín, M. A. Navarro, J. S. Perona, J. M. Arbonés-Mainar, C. Arnal, A. J. Sarría, J. C. Surra, R. Carnicer, I. Orman, J. C. Segovia, V. Ruiz- Gutiérrez, J. Osada, Squalene in a sex-dependent manner modulates atherosclerotic lesion which correlates with hepatic fat content in apoE- knockout male mice, Atherosclerosis, 2008, 197(1), 72-83. 175. K. Nakamura, M. A. Kennedy, A. Baldan, D. D. Bojanic, K. Lyons, P.A. Edwards. Expression and regulation of multiple murine ATP-binding cassette transporter G1 mRNAs/isoforms that stimulate cellular cholesterol efflux to high density lipoprotein. J. Biol. Chem, 2004, 279, 25989–45980. 176. N. Wang, D. Lan, W. Chen, F. Matsuura, ATP-binding cassette transporters G1 and G4 mediate cellular cholesterol efflux to high-density lipoproteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101, 9774-9779. 177. K. Wouters, R. Shiri-Sverdlov, P. J. van Gorp, M. van Bilsen, M. H. Hofker, Understanding hyperlipidemia and atherosclerosis: lessons from genetically modified apoe and ldlr mice. Clin Chem Lab Med, 2005, 43, 470-479. 178. D. J. Peet, S. D. Turley , W. Ma , B. A. Janowski , J. M. Lobaccaro , R. E. Hammer , D. J. Mangelsdorf , Cholesterol and bile acid metabolism are impaired in mice lacking the nuclear oxysterol receptor LXRa. Cell, 1998, 93, 693-704. 179. H. X. Dang, Y. Liu, W. Pang, C. H. Li, N. P. Wang, J. Y. J. Shyy, Y. Zhu, Suppression of 2,3-oxidosqualene cyclase by high fat diet contributes to liver X receptor-α-mediated improvement of hepatic lipid profile. J Chem Biol, 2009, 284, 621.
PHỤ LỤC
1/ PHỤ LỤC 1 Phƣơng pháp xác định sơ bộ hàm lƣợng squalene bằng phƣơng pháp so màu (Chƣơng 2, phần 2.2.1.6)
0.9 y = 6.5893x + 0.1504 R2 = 0.9966 0.8 0.7 0.6
0.5 400
OD 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Hàm lượng squalene (mg)
Hình P1. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng squalene chuẩn và
OD400
Trong Ďó: y- Hàm lượng squalene (mg/g); x - giá trị OD400
2/PHỤ LỤC 2 Phƣơng pháp tách chiết RNA, tổng hợp cDNA, trong nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipit của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro (Chƣơng 2, phần 2.2.4.2) 2.1. Tách chiết RNA tổng số theo kit RNAiso Plus
T ế bào nuôi cấy
Bổ sung V=500 µL RNAISO Plus
Giữ 5 phút ở nhiệt Ďộ phòng
Ly tâm 12000 g/5 phút/4 ᵒC
Chuyển dịch trên sang ống mới, bổ sung 0,2V = 100 µL chloroform
Voltex mạnh, giữ 5 phút ở nhiệt Ďộ phòng
Ly tâm 12000 g/15 phút/4 ᵒC
Chuyển dịch trên sang ống mới, bổ sung 1V = 500 µL isopropanol
Giữ 10 phút ở nhiệt Ďộ phòng
Ly tâm 12000 g/10 phút/4 ᵒC, thu tủa (RNA)
Rửa RNA bằng 75% ethanol
Ly tâm 7500 g/5 phút/4 ᵒC
Thu tủa và hong khô tủa
Hòa tan tủa bằng nước khử ion Ďã Ďược xử lý DEPC (50µL)
Hình P2. Quy trình tách chiết RNA tổng số theo kit RNAISO Plus
2.2. Tổng hợp cDNA theo kit RevertAid First Strand cDNA cDNA Ďược tổng hợp từ 1 mg RNA tổng số theo hướng dẫn của kít Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Syntheisis Kit (Thermo Scientific, Singapore). - Bước 1: Tạo khuôn cDNA. Bổ sung hóa chất theo thứ tự và hàm lượng vào ống eppendorf không có nuclease như sau: STT Hóa chất Hàm lƣợng 1 RNA tổng số 1 mg 2 Oligo (dT)18 primer, 100 M 1 L 3 Nước không có nuclease Ďến 12 L Tổng thể tích 12 L
- Bước 2: Tổng hợp cDNA Tiếp tự bố sung các thành phần vào ống eppdendorf có chứ khuôn cDNA theo thứ tự như sau: STT Hóa chất Hàm lƣợng 1 5X Reaction buffer 4 L 2 RiboLock RNAase Inhibitor(20U/L) 1 L 3 100 mM dNTP 2 L 4 RevertAid M-MuLV RT (200U/L) 1 L Tổng thể tích 20 L
+ Trộn Ďều và ly tâm nhanh. + Ủ ở 42 C trong thời gian 60 phút. + Dừng phản ứng bằng cách ủ mẫu ở 70 C trong thời gian 5 phút. + Mẫu cDNA sau Ďó Ďược giữ ở -20 C cho các thí nghiệm phân tích theo
3/ PHỤ LỤC 3 (Chƣơng 3, phần 3.3.4)
Hình P3. Phiếu kết quả thử nghiệm sản phẩm squalene của Trung tâm chứng nhận phù hợp (Quacert), Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng, Bộ Khoa học và
Công nghệ.
4/PHỤ LỤC 4
Hình P4. Hình ảnh minh họa cho lên men theo mẻ có bổ sung Ďường của chủng S. mangrovei PQ6 ở hệ thống bình lên men 30 Lít.
5/PHỤ LỤC 5
Hình P5. Ảnh minh họa quá trình tách chiết squalene thô từ sinh khối tảo khô chủng S. mangrovei PQ6
6/PHỤ LỤC 6
Hình P6. Ảnh minh họa quá trình tách chiết squalene thô từ dịch tế bào chủng S. mangrovei PQ6
7. PHỤ LỤC 7 Tốc Ďộ sinh trưởng Ďặc trưng (ký hiệu là có Ďơn vị là /ngày) Ďược tính theo
công thức: µ = (ln Nt – ln N0) / (tt – t0)
Trong Ďó: Nt, N0 là MĐTB ở thời Ďiểm t và thời Ďiểm ban Ďầu t0 (TB/mL); t là thời gian (ngày) Thời gian nhân Ďôi thế hệ (ký hiệu là Dt): Dt = ln 2/ . Trong Ďó: là tốc Ďộ sinh trưởng Ďặc trưng của tảo. Năng suất tảo (TB/mL/ngày) Ďược tính bằng công thức:
Năng suất tảo = (Nt – N0) / (tt – t0). Trong Ďó: Nt và N0 là MĐTB ở thời Ďiểm t và
thời Ďiểm ban Ďầu t0 (TB/mL); t là thời gian (ngày).
Bảng 3.2.Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên hàm lượng và sản lượng squalene trong quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất của tế bào S. mangroveei PQ6 Tốc độ sinh Thời 6 gian Mật độ tế bào (10 tb/mL) Sinh khối khô (g/L) trƣởng đặc trƣng (h) (µ; /ngày) Có VTM Không VTM Có VTM Không VTM Có VTM Không VTM 0 0,90 ± 0,07 0,90 ± 0,21 - - 24 222,35 ± 13,71 45,44 ± 2,63 24,43 ± 0,41 12,25 ± 1,36 5,51 3,92 36 271,00 ± 12,53 203,52 ± 9,66 39,33 ± 1,59 27,95 ± 0,77 3,80 3,61 Bổ sung glucose 12 262,03 ± 17,70 226, 52 ± 6,12 44,10 ± 2,09 42,69 ± 3,19 24 309,17 ± 7,42 278,18 ± 8,03 60,56 ± 1,95 42,63 ± 1,72 0,33 0,41 48 369,35 ± 7,94 300,9 ± 5,14 75,41 ± 1,35 59,36 ± 2,42 0,23 0,05 72 381,97 ± 5,63 345,4 ± 3,18 99,28 ± 1,48 79,85 ± 0,82 0,15 0,06 96 374,93 ± 9,45 359,6 ± 5,56 105,25 ± 0,75 92,93 ±1,59 0,102 0,01 120 298,81 ± 8,23 202,53 ± 9,58 100,10 ± 0,18 90,37 ±1,06 0,03 -0,13
Như vậy tốc Ďộ sinh trưởng Ďặc trưng cao nhất tại thời Ďiểm 24h có vitamin trước khi bổ sung glucose với giá trị µ là 5,51/ngày và mật Ďộ tế bào tảo Ďạt cao nhất là ở thời Ďiểm sau 72 h bổ sung glucose ở môi trường có vitamin 8/PHỤ LỤC 8
Hình P7. Ảnh minh họa các lô thí nghiệm trên mô hình Ďộng vật thực nghiệm Ďược thực hiện tại Bộ môn Dược lý, Học viện Quân y, Bộ Quốc Phòng.
9/ PHỤ LỤC