BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN CẨM HÀ NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƢỚNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ PHẨM VÀ DƢỢC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC Hà Nội - Năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN CẨM HÀ NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƢỚNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ PHẨM VÀ DƢỢC PHẨM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. TS Đặng Diễm Hồng Hà Nội – Năm 2020 i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Đặng Diễm Hồng, nguyên Trưởng phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người thầy đã định hướng, truyền dạy những kiến thức khoa học và giúp đỡ tôi vượt qua những trở ngại và khó khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Lãnh đạo và bộ phận đào tạo của Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu. Trong quá trình viết luận án tôi đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của TS. Hoàng Thị Lan Anh. Ngoài ra tôi cũng nhận được sự giúp đỡ của các đồng nghiệp làm việc tại phòng Công nghệ Tảo: TS. Hoàng Thị Minh Hiền, TS. Ngô Thị Hoài Thu, TS. Lưu Thị Tâm, ThS. NCS. Lê Thị Thơm. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Nguyễn Hoàng Ngân- Học viện Quân Y, đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm, phân tích độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý của squalene. Luận án được thực hiện trong khuôn khổ các đề tài Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia - Nafosted, Bộ Khoa học và Công nghệ “Nghiên cứu đánh giá và khai thác chất squalene làm dược phẩm từ vi tảo biển của Việt Nam” (2013-2016) do PGS. TS. Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm, đề tài “Cơ chế điều hòa trao đổi lipid của các hợp chất từ thực vật biển Việt Nam trong phòng và điều trị bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu” (2014-2016) và đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi trồng lượng lớn sinh khối tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 và tách chiết qualene đủ tiêu chuẩn nguyên liệu làm thực phẩm chức năng” (2014-2016) do TS. Hoàng Thị Minh Hiền làm chủ nhiệm. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả Nguyễn Cẩm Hà ii Lời cam đoan Tôi xin cam Ďoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần Ďã Ďược công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự Ďồng ý và cho phép của các Ďồng tác giả; Phần còn lại chưa Ďược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2020 Tác giả Nguyễn Cẩm Hà iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn……………………………………………………………………... i Lời cam Ďoan…………………………………………………………………... ii Mục lục………………………………………………………………………… iii Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt………………………………………….. viii Danh mục các bảng……………………………………………………............. xi Danh mục các hình vẽ, Ďồ thị………………………………………………….. xii MỞ ĐẦU………………………………………………………………………. 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………….... 4 1.1. Giới thiệu chung về squalene………………………………….. 4 1.1.1. Tính chất hóa lý của squalene…………………………………... 4 1.1.2. Nguồn gốc và cấu trúc của squalene……………………………. 4 1.1.3 Các con Ďường sinh tổng hợp của squalene ở Ďộng vật, thực vật và vi sinh vật…………………………………………………….. 6 1.1.4 Ứng dụng của squalene…………………………………………. 11 1.1.5. Các nguồn cung cấp squalene…………………………………... 18 1.2. Công nghệ tách chiết và tinh sạch squalene……………..…… 21 1.2.1. Công nghệ tách chiết squalene…………………………………. 21 1.2.2. Các phương pháp Ďịnh lượng và tinh sạch squalene…………..... 27 1.3. Giới thiệu công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dƣỡng……… 29 1.4. Giới thiệu về chi vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium………. 33 1.4.1 Đặc Ďiểm chung của chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium…. 33 1.4.2. Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium cho sản xuất squalene…………………………………………… 37 1.4.2.1. Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium cho sản xuất squalene trên thế giới……………………………...... 37 1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng Schizochytrium cho sản xuất squalene ở Việt Nam……………………………………………….............. 39 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………... 43 iv 2.1. Vật liệu…………………………………………………………. 43 2.1.1. Mẫu vật………………………………………………………….. 43 2.1.2. Các bộ kít sinh phẩm……………………………………………. 44 2.1.3. Động vật thí nghiệm…………………………………………….. 45 2.1.4. Các dòng tế bào…………………………………………………. 46 2.1.5. Hoá chất…………………………………………………………. 46 2.1.6. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm………………………………….. 46 2.1.7. Môi trường nuôi cấy…………………………………………….. 47 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu……………………………………… 48 2.2.1. Nhóm phương pháp xác Ďịnh chủng/loài; Ďặc Ďiểm sinh học; Ďiều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng cho sản xuất squalene cao ……………….................................................. 48 2.2.1.1. Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào và sinh khối khô………………………………………………………………… 48 2.2.1.2. Phương pháp chụp ảnh hình thái………………………………....... 49 2.2.1.3. Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số trong sinh khối tảo……………………………………………………………………….. 49 2.2.1.4. Phương pháp nhuộm lipid bằng Nile Red………………………….. 49 2.2.1.5. Phương pháp xác định đường khử bằng DNSA…………………… 49 2.2.1.6. Phương pháp xác định sơ bộ hàm lượng squalene……………….. 50 2.2.1.7. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng thuộc chi Schizochytrium cho sản xuất squalene cao …………………………………………………………... 50 2.2.2. Nhóm phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch squalene từ S. mangrovei PQ6………………………………………. 53 2.2.2.1. Phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ sinh khối S. mangrovei PQ6……………………………………………………………………… 53 2.2.2.2. Phương pháp xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch squalene ở quy mô pilot từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6……………………………………………………………………… 55 2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của squalene.. ..................................................................................... 56 v 2.2.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc của squalene.............................. 57 2.2.3. Nhóm phương pháp xác Ďịnh các chỉ tiêu chất lượng của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6……………………….. 57 2.2.4. Nhóm phương pháp Ďánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên Ďộng vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro)…………………... 58 2.2.4.1 Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vivo……………………………………………………………………… 58 2.2.4.2. Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro………………………………………………….. 59 2.2.5. Thống kê phân tích số liệu……………………………………… 63 2.2.6. Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu…………… 63 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN….……………. 65 3.1. Sàng lọc chủng vi tảo biển dị dƣỡng có tiềm năng sản xuất squalene………………………………………………………… 65 3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 lên sinh trƣởng và hàm lƣợng squalene………………………….. 67 3.2.1. Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 cho sản xuất squalene ở cấp Ďộ bình tam giác………………………………… 67 3.2.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác……………………………………………….. 67 3.2.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác …………………………… 69 3.2.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác……………………… 70 3.2.1.4.