Utilisation Des Cellules Souches Pluripotentes Pour Le Criblage À Haut Débit De Molécules Thérapeutiques

Utilisation des cellules souches pluripotentes pour le criblage à haut débit de molécules thérapeutiques

dans la maladie de Lesch-Nyhan : : 2019SACLE011

NNT Thèse de doctorat de l'Université Paris-Saclay, préparée à l’Université d’Evry Val-d’Essonne

École doctorale n°569 Innovation thérapeutique : du fondamental à l’appliqué (ITFA) Spécialité de doctorat: Immunologie

Thèse présentée et soutenue à Corbeil-Essonnes, le 01 juillet 2019, par

Valentin Ruillier

Composition du Jury :

Dr. Olivier Goureau Institut de la Vision, Université Sorbonne, Paris Président Pr. Odile Boespflug-Tanguy Université Paris Diderot, Hôpital Robert Debré, Paris Rapporteur Dr. Amélie Piton IGBMC, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg Rapporteur Dr. Terence Beghyn APTEEUS, Lille Examinateur Pr. Christelle Monville UEVE/INSERM U861, I-STEM, Corbeil-Essonnes Directeur de thèse Dr. Alexandra Benchoua CECS, I-STEM, Corbeil-Essonnes Co-Encadrant Résumé - Abstract

Mots clés : Maladie de Lesch-Nyhan, cellules souches pluripotentes, iPSC, criblage à haut débit, HGPRT, purines

Résumé : Les mutations affectant la fonction identifier, par une approche de criblage à haut d’enzymes impliquées dans le cycle des purines débit, de nouvelles molécules chimiques capables sont responsables d’une multitude de syndromes de corriger ces défauts. Plus de 3000 molécules pédiatriques, caractérisés par des atteintes ont été testées et 6 composés, tous dérivés de neurologiques et comportementales. A ce jour, l’adénosine, ont pu être identifiés comme aucune stratégie thérapeutique n’a été compensant le métabolisme par un mécanisme réellement efficace pour contrôler ces d’action indépendant de l’HGPRT. De manière symptômes. La maladie de Lesch-Nyhan (MLN), intéressante, un des composés, la S- associée à la perte de fonction de l’enzyme de adenosylmethionine (SAM) a par le passé déjà recyclage HGPRT, constitue un bon modèle démontré des effets bénéfiques sur les d’étude. Mon travail a consisté à utiliser la symptômes comportementaux typiques de la technologie des cellules souches induites à la MLN dans plusieurs études de cas. Cela démontre pluripotence, reprogrammées à partir de que la stratégie abordée ici a permis fibroblastes de patients atteints des formes l’identification de cibles thérapeutiques sévères de la MLN, pour identifier des permettant d’améliorer les symptômes phénotypes neuronaux associés à la perte de neurospychiatriques de cette pathologie et fonction de l’HGPRT. Ces marqueurs constitue un modèle réplicable pour différentes phénotypiques ont ensuite été utilisés pour pathologies touchant le métabolisme cérébral.

Keywords : Lesch-Nyhan disease, pluripotent stem cells, iPSC, High-throughput screening, HGPRT, purines

Abstract : Mutations in genes coding for identified 6 compounds, all possessing an enzymes involved in purine synthesis or recycling adenosine moiety, that corrected LND related lead to dramatic neurological conditions with neuronal phenotypes by promoting metabolism poor pharmacological options. Lesch–Nyhan compensations in a HGPRT-independent manner. disease (LND) is caused by deficiency of the One of these compound, S-adenosylmethionine salvage pathway enzyme HGPRT that (SAM), has already been reported as providing compromises recycling of guanine and amelioration of behavioral symptoms in some hypoxanthine into GMP and IMP. LND is LND cases, demonstrating that our screening characterized by severe neuropsychiatric allowed the identification of pathways that can symptoms that are out of reach of be relevant therapeutic targets to ease the pharmacological treatments. Here we use human devastating neuropsychiatric symptoms cortical neural stem cells and neurons derived associated with this pathology. Interestingly, from iPSC of children affected by severe forms of these pathways can be activated in LND patients LND to identify neural phenotypes associated via simple food supplementation. This with HGPRT-deficiency and of interest to develop experimental paradigm can also be easily a target-agnostic based drug screening system. adapted to other purine associated neurological We screened more than 3000 molecules and disorders affecting normal brain development.

REMERCIEMENTS

Mes premiers remerciements vont à Marc Peschanski, Cécile Martinat et Raymond Zakhia, pour m’avoir accueilli à I-Stem et permis d’évoluer dans un environnement scientifique de qualité. Je remercie également Christelle Monville, qui a accepté de diriger ma thèse, ainsi que Mathilde Girard, qui a cru en mon parcours et avec qui j’ai pu débuter mon aventure dans la recherche.

Mon projet de recherche n’aurait pas été possible sans le soutien de l’AFM Téléthon et de l’association Lesch-Nyhan Action. Merci aux membres de ces deux associations pour leur implication auprès des malades et leur réel soutien pour faire avancer la recherche scientifique.

Je tiens ensuite à remercier Odile Boespflug-Tanguy, Amélie Piton, Sylvain Fisson, Olivier Goureau et Terence Beghyn, pour avoir accepté de participer à mon jury de thèse. Merci également à Guillaume Pinna et Jérôme Denis, pour leurs conseils avisés lors de mon comité de mi-thèse. Merci à tous pour l’intérêt porté à mon travail.

Une pensée particulière à Alexandra Benchoua pour m’avoir ouvert les portes de l’équipe Neuroplasticité. Merci de m’avoir donné l’opportunité de travailler sur ce projet passionnant et de m’avoir accompagné tout au long de ces trois années. Merci également à Marie, pour ton aide pendant ces quelques mois. Je te souhaite une bonne continuation, que ce soit à I-Stem ou ailleurs. J’en profite aussi pour dire un grand merci aux filles de l’équipe, pour leur accueil si chaleureux, leur bonne humeur, leurs attentions, et l’excellente ambiance du secteur 3. Merci à toutes pour votre aide et j’espère que l’on pourra ouvrir rapidement ta bouteille de champagne, Claire !

J’aimerai également remercier l’ensemble de l’équipe HTS, pour leur implication dans le projet Lesch- Nyhan et pour tous ces moments passés avec vous au milieu des robots. Prenez soin du Benchcel, qui m’aura accompagné tout au long de mon passage à I-Stem. Un grand merci à Johana et Benjamin, avec qui j’ai débuté cette aventure et qui ont largement participé à ma formation. Merci pour votre aide et surtout pour votre sympathie.

Je tiens bien sûr à remercier les personnes que j’ai rencontrées au cours de ces quatre années, et qui sont aujourd’hui devenues des amies. Merci à mes voisins du bureau des thésards, Vincent, Déborah, Julie, Sylvain et Florian, mais aussi Gurvan, Marie et Margot, pour tous ces moments inoubliables passés avec vous, et sans qui cette expérience n’aurait pas été la même. Grâce à vous je suis devenu incollable sur les guerres de Vendée et un « expert » en escalade. Je n’oublierai pas non plus Océane, Julie P, Camille, Sandra, Antoine, Julie T, Manon, Florine et Alexandre, pour tous ces moments de rire et de partage passés avec vous.

Je tiens également à remercier ma famille et tous mes proches, pour avoir toujours été présents. Merci à toi, Claire, pour m’avoir soutenu tout au long de ce travail. Ça n’a pas dû être de tout repos.

Le bon déroulement d’un travail de recherche ne pouvant pas se faire tout seul, j’aimerai pour finir remercier l’ensemble des membres du laboratoire, qui ont tous, à un moment, participé de près ou de loin à faire avancer mon projet. Merci à vous tous !

Table des matières

Index des illustrations ...... 6 Index des tableaux...... 7 Abréviations ...... 8 I. Les troubles liés au métabolisme purinergique ...... 9 1. Les purines : rôles biologiques ...... 9 2. Le cycle des purines ...... 10 3. Les troubles liés au métabolisme des purines : un équilibre fragile du cycle ...... 13 II. La maladie de Lesch-Nyhan ...... 15 1. Présentation clinique de la maladie de Lesch-Nyhan ...... 16 a) Les anomalies métaboliques ...... 16 b) Les symptômes moteurs ...... 17 c) Les symptômes cognitifs et neuropsychiatriques ...... 19 d) Autres ...... 20 2. Epidémiologie et génétique ...... 21 a) Une maladie de transmission récessive liée à l’X ...... 21 b) Le gène HGPRT et sa distribution ...... 21 c) Les mutations du gène HGPRT : une corrélation génotype-phénotype ...... 23 3. Etiologie de la maladie de Lesch-Nyhan ...... 26 a) Bases biochimiques de la maladie ...... 27 b) Etiologie des atteintes neurologiques et comportementales ...... 28  Hypothèse biochimique d’un défaut de la synthèse de dopamine...... 32  Hypothèses neurodégénératives ...... 33 - Accumulation de métabolites neurotoxiques ...... 33 - Impact du stress oxydant ...... 35  Hypothèse neurodéveloppementale impliquant un défaut de la neurogénèse ...... 37 4. Aspects thérapeutiques de la maladie de Lesch-Nyhan ...... 38 a) Prise en charge des atteintes métaboliques ...... 39 b) Prise en charge des atteintes neurologiques et comportementales ...... 40 5. Modèles d’étude de la maladie de Lesch-Nyhan ...... 42 a) Les modèles animaux ...... 42  Les modèles génétiques ...... 42  Les modèles phénotypiques ...... 44

b) Les modèles in vitro ...... 45 III. Les cellules souches pluripotentes, un modèle d’étude de la maladie de Lesch-Nyhan ...... 47 1. Définition des cellules souches pluripotentes ...... 47 2. Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ...... 48 a) Définition et obtention des CSEh ...... 48 b) Limites des CSEh ...... 50 3. Les cellules souches induites à la pluripotence (iPSC), une alternative aux CSEh ...... 51 a) Découverte et obtention des iPSC...... 51 b) Limites des cellules souches induites à la pluripotence ...... 54 4. Application des cellules souches pluripotentes ...... 55 a) Thérapie cellulaire de remplacement ...... 56 b) Modélisation des maladies génétiques et recherche de molécules actives ...... 57  Modélisation des maladies génétiques ...... 57  Recherche de composés thérapeutiques ...... 58 IV. Problématique et objectifs du travail de thèse ...... 62 V. Matériel et méthodes ...... 65 1. Matériel biologique ...... 65 2. Différenciation neuronale ...... 66 3. Caractérisation des lignées cellulaires ...... 66 a) Mesure de l’expression protéique ...... 66 b) Détection des purines ...... 68 c) Mesure de l’activité enzymatique de l’HGPRT ...... 68 4. Criblage à haut débit ...... 69 5. Edition génétique par la technique CRISPR/Cas9 ...... 70 6. Formules et statistiques ...... 70 VI. Résultats ...... 72 1. Utilisation des CSP pour la modélisation phénotypique de la MLN et leur application pour le développement d’une approche de criblage à haut-débit ...... 72 a) Mise au point et caractérisation des modèles cellulaires ...... 72 b) Impact de la perte du recyclage au cours de la différenciation ...... 72 c) Identification de composés pharmacologiques par une approche de criblage à haut débit 74 d) Efficacité et spécificité des composés chimiques identifiés ...... 76 e) Etude des mécanismes d’action des composés ...... 77 f) Effet des composés sur les phénotypes neuronaux identifiés ...... 78

2. Données supplémentaires ...... 114 a) Profil d’expression de l’HGPRT dans les lignées iPSC dérivées des différents donneurs MLN. 114 b) Choix du read-out pour le développement de l’essai de criblage ...... 115 c) Criblage primaire de composés capables de restaurer la viabilité ...... 115 d) Etude de la spécificité des molécules identifiées ...... 117 e) Mécanismes d’action des composés dérivés de l’adénosine ...... 118  Activité HGPRT-like ...... 118  Rôle de l’adénosine dans le mécanisme d’action des composés ...... 119 VII. Discussion ...... 121 1. Modélisation de phénotypes MLN sur des cellules neuronales dérivées d’iPSC ...... 121 2. Utilisation des cellules souches neurales dérivées des CSPh pour l’identification de composés pharmacologiques ...... 125 3. Mécanismes d’action des composés dérivés de l’adénosine ...... 128 4. Efficacité des hits in vivo ...... 131 5. Autres approches thérapeutiques ...... 134 VIII. Conclusion ...... 137 Bibliographie ...... 138

Index des illustrations

Figure 1 : Schéma métabolique des purines : synthèse de novo, recyclage et dégradation...... 13 Figure 2 : Résumé des symptômes moteurs caractéristiques de la MLN...... 18 Figure 3 : Résultats du test CBCL pour l’étude des troubles comportementaux...... 20 Figure 4 : Organisation structurale du gène HGPRT...... 22 Figure 5 : Exemples de mutations localisées sur le gène HGPRT...... 24 Figure 6 : Schéma représentant le spectre clinique du syndrome de Lesch-Nyhan et de ses variants. 25 Figure 7 : Mécanismes biochimiques responsables de l’accumulation d’acide urique...... 28 Figure 8 : Déplétion dopaminergique observée par imagerie en TEP...... 30 Figure 9 : Voies dopaminergiques du mésencéphale et leurs projections...... 31

Figure 10 : Voie de synthèse du BH4 à partir des nucléotides de la guanine...... 32 Figure 11 : Schéma démontrant l’hypothèse du stress oxydatif dans la MLN...... 36 Figure 12 : Stratégies existantes pour le traitement de l’hyperuricémie dans la MLN...... 40 Figure 13 : Caractéristiques du modèle phénotypique de rat traité à la 6-hydroxydopamine...... 44 Figure 14 : Schéma représentatif des différents types de cellules souches...... 48 Figure 15 : Exemple de colonies de cellules souches embryonnaires humaines...... 49 Figure 16 : Schéma démontrant le principe général d’obtention des iPSC...... 52 Figure 17 : Schéma récapitulatif des différentes méthodes de reprogrammation...... 53 Figure 18 : Application des cellules souches pluripotentes...... 56 Figure 19 : Méthode d’obtention de cellules appartenant au lignage cortical...... 57 Figure 20 : Principe général d’une approche de criblage à haut débit...... 59 Figure 21 : Exemple de plateforme de criblage disponible à I-Stem...... 61 Figure 22 : Développement d’une molécule active à la suite d’un essai de criblage...... 62 Figure 23 : Stratégie générale de recherche de molécules actives à partir de cellules souches pluripotentes, dans le cadre de la maladie de Lesch-Nyhan...... 64 Figure 24 : Principe du test d’activité enzymatique de l’HGPRT...... 69 Figure 25 : Principe de l’essai de criblage développé dans ce travail...... 69 Figure 26 : Schéma représentant les distributions des contrôles lors d’un criblage...... 71 Figure 27 : Mécanisme d’action de l’azaserine et cinétiques de différenciation...... 74 Figure 28 : Déroulement du criblage primaire et nature des composés identifiés...... 75 Figure 29 : Mécanisme d’action de l’aminopterin, contenue dans le milieu de sélection HAT...... 77 Figure 30 : Effet fonctionnel des composés sur les phénotypes neuronaux dépendant de l’HGPRT. .. 79 Figure 31 : Expression et activité de l’enzyme HGPRT dans les lignées iPSC...... 114 Figure 32 : Criblages primaires des composés issus des banques LOPAC, Prestwick et SelleckChem...... 116 Figure 33 : Profil en dose-réponse de l’Ap4A...... 117 Figure 34 : Essais en dose-réponse des molécules sur les lignées compétentes en HGPRT...... 118 Figure 35 : Mesure de l’effet en dose-réponse des molécules après traitement à la 6-thioguanine. 119 Figure 36 : Etude de l’implication de l’adénosine dans l’efficacité des composés...... 120 Figure 37 : Implication des récepteurs P2Y dans la spécification du cortex...... 124 Figure 38 : Implication générale des récepteurs purinergiques dans le développement du SNC...... 125 Figure 39 : Métabolisme de la SAM...... 130 Figure 40 : Résumé des effets bénéfiques de la vitamine B3 dans le SNC...... 133

Index des tableaux

Tableau 1 : Tableau non exhaustif des différentes atteintes associées à un dysfonctionnement des purines...... 14 Tableau 2 : Résumé des différents types de mutations touchant le gène HGPRT...... 26 Tableau 3 : Similarités phénotypiques entre la MLN et la souris HGPRT -...... 43 Tableau 4: Tableau récapitulatif des différentes lignées iPSC et CSE utilisées...... 65 Tableau 5 : Tableau récapitulatif des différents anticorps utilisés au cours de ce travail...... 67

Abréviations

5’-NT : 5’-nucleotidase HRH : HGPRT-related hyperuricemia 6-OHDA : 6-hydroxydopamine HTS : High throughput screening 6-TG : 6-Thioguanine IMP : Inosine monophosphate AADC : Aromatic L-amino acid decarboxylase IP : Iodure de propidium AC : Adenylate cyclase iPSC : Cellules souches induites à la pluripotence ADA : Adenosine deaminase Klf4 : Kruppel-like factor 4 ADK : Adenosine kinase LMX : LIM Homeobox protein Ado : adenosine LND : Lesch-Nyhan disease ADSL : Adenylosuccinate lyase LNV : Lesch-Nyhan variant AICAR : 5-aminoimidazole-4-carboxamide MAO : Monoamine oxidase ribonucleotide MEF : Mouse embryonic fibroblast AMP : Adenosine monophosphate MLN : Maladie de Lesch-Nyhan AMPc : AMP cyclique Msx1 : Msh homeobox 1 AMPK : AMP-activated protein kinase N6-MA : N6-methyladenosine Ap4A : P1,P4-Di(adenosine-5’) tetraphosphate NAD : Nicotinamide adénine dinucleotide APRT : Adenine phosphoribosyltransferase NADPH : Nicotinamide adénine dinucleotide ATP : Adenosine triphosphate phosphate Aza : Azaserine Ngn-2 : Neurogenin-2 BDNF : Brain-derived neurotrophic factor NSC : Cellules souches neurales

BH4 : tetrahydrobiopterine Nurr1 : Nuclear receptor related 1

CE50 : Concentration efficace médiane Oct-4 : Octamer-binding transcription factor 4 COMT : Catechol-O-methyltransferase PI3K : Phosphoinositide 3-kinase CRISPR/Cas9 : Clustered regularly interspaced Pitx3 : Pituitary homeobox 3 short palindromic repeats/ Crispr Associated 9 PNP : Purine nucleoside phosphorylase CSEh : Cellules souches embryonnaires humaines PPAT : PRPP amidotranferase CSP : Cellules souches pluripotentes PRPP : Phosphoribosylpyrophosphate CTG : CellTiter-Glo PRPS : PRPP synthetase DA : Dopamine PRTFDC1 : Phosphoribosyltransferase domain DMSO : Dimethyl sulfoxide containing protein 1 DPI : Diagnostic préimplantatoire RLU : Relative light units EGF : Epidermal growth factor ROS : Espèces réactives de l’oxygène EN-1 : Engrailed homeobox 1 SAH : S-adenosylhomocysteine FACS : Fluorescence-activated cell sorting SAM : S-adenosylmethionine

FGF2 : Fibroblast growth factor SHANK3 : SH3 and multiple ankyrin repeat FMR1 : Fragile X mental retardation protein domains 3 GABA : Acide gamma-aminobutyrique shRNA : Short hairpin RNA GFAP : Glial fibrillary acidic protein SNC : Système nerveux central GMP : Guanosine monophosphate SNP : Single-nucleotide polymorphism GSK3 : Glycogen synthase kinase 3 SNpc : Substance noire pars compacta GTP : Guanosine triphosphate SOD : Superoxide dismutase HAT : Hypoxanthine/Aminopterin/Thymidine Sox2 : Sex determining region Y-box 2 HCS : High content screening SSEA : Stage-specific embryonic antigens HGPRT : Hypoxantine-guanine TH : Tyrosine hydroxylase phosphoribosyltransferase TRA : Tumor-related antigen HND : HGPRT-related neurological dysfunction VTA : Aire tegmentale ventrale HPLC : Chromatographie en phase liquide à haute Wnt : Wingless-type MMTV integration site family performance XO : Xanthine oxidase

I. Les troubles liés au métabolisme purinergique

1. Les purines : rôles biologiques

Les purines sont des molécules qui occupent des fonctions biochimiques essentielles dans la cellule : elles sont impliquées dans la synthèse des acides nucléiques et participent largement à l’homéostasie en jouant le rôle de transporteur de l’énergie chimique dans les cellules de mammifères. Les purines agissent également dans la régulation de la prolifération cellulaire, contribuent au transport des sucres, interviennent dans les réactions de phosphorylation et servent de co-facteur dans de nombreuses réactions chimiques (Fumagalli et al, 2017). Parallèlement à leurs fonctions métaboliques, elles agissent aussi en tant que ligands activant plusieurs types de récepteurs purinergiques, dont les voies de signalisation sont aussi bien excitatrices qu’inhibitrices en fonction de leur expression au sein de l’organisme et du type de récepteur impliqué (Micheli et al, 2011). Les fonctions cellulaires des ligands purinergiques sont donc extrêmement variées et ces derniers ont été décrits comme pouvant jouer un rôle protecteur au niveau du système immunitaire, rénal, cardiovasculaire, musculaire ou encore gastro-intestinal. En ce qui concerne le système nerveux central, la signalisation purinergique serait impliquée à la fois dans des processus de neuroprotection et de régénération, mais également de neurodégénérescence, avec un rôle décrit dans plusieurs maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, de Parkinson ou d’Huntington (Burnstock, 2016). Ces recherches ont ainsi mené au développement de plusieurs analogues de purines, notamment dérivés de l’adénosine, dans le traitement de plusieurs maladies, tel que l’Istradefylline, antagoniste des récepteurs A2A, actuellement en essai clinique de phase 3 dans la maladie de Parkinson (Stockwell et al, 2017). Ces dernières années, des travaux ont également démontré que les purines et les pyrimidines étaient impliquées dans le contrôle de plusieurs étapes clés du développement embryonnaire et de l’organogénèse, et contribuaient notamment au développement du cerveau et à la plasticité du réseau neuronal. Les récepteurs purinergiques sont parmi les premiers récepteurs membranaires exprimés au cours de l’embryogénèse, et il existe dans le cerveau en développement une expression différentielle et transitoire des récepteurs aux

9 purines de manière spatiale et temporelle (Burnstock and Dale, 2015). Ils jouent ainsi un rôle précoce dans la prolifération cellulaire, la migration et la différentiation neuronale. L’adénosine est impliquée dans la mise en place de la transmission synaptique et l’établissement d’un réseau neuritique fonctionnel, et participe à la régulation du relargage de neurotransmetteurs tels que la dopamine ou le glutamate (Fumagalli et al, 2017). Les purines dérivées de la guanine sont quant à elles capables de favoriser la croissance et la survie des neurones, en induisant la pousse neuritique, et en stimulant la synthèse et la sécrétion de facteurs neurotrophiques. Elles seraient également impliquées dans la synaptogénèse, en augmentant le nombre et la taille des boutons synaptiques, ainsi que dans l’activité des synapses. Leur fonction en tant que neurotransmetteurs est cependant encore peu connue, la nature de leurs récepteurs n’étant pas précisément identifiée (Di Liberto et al, 2016). L’inosine semble également avoir des fonctions neuroprotectrices et neurotrophiques intéressantes, en stimulant notamment le développement axonal. Ses effets proviendraient de son interaction possible avec au moins 4 sous-types de récepteurs à l’adénosine, à l’origine d’activités biologiques variées, dépendant de leur profil d’expression (Doyle et al, 2018). Les purines occupent donc une place essentielle dans le développement du système nerveux central, et tout défaut touchant leur métabolisme au stade prénatal est susceptible de se traduire par des syndromes neurologiques graves.

2. Le cycle des purines

Le pool cellulaire de purines dans l’organisme est régulé de manière précise et dépend de la balance entre leur voie de synthèse de novo, leur recyclage et leur dégradation (Figure 1). La voie de synthèse de novo des purines implique une dizaine de réactions catalysées par six enzymes, permettant d’obtenir une molécule d’inosine monophosphate (IMP) à partir du phosphoribosylpyrophosphate (PRPP). Ces réactions, finement régulées et qui nécessitent une forte consommation énergétique, à savoir 5 molécules d’ATP pour la synthèse d’une molécule d’IMP, font intervenir différentes enzymes regroupées dans un complexe multienzymatique décrit récemment sous le terme de purinosome (Pedley and Benkovic, 2017). Le PRPP, formé à partir du ribose-5-phosphate grâce à la PRPP synthetase (PRPS), a un rôle essentiel dans la voie de biosynthèse des purines mais aussi des pyrimidines,

10 puisqu’il joue le rôle de cofacteur pour l’uridine monophosphate synthetase (UMPS), qui permet la synthèse de l’UMP (uridine monophosphate), précurseur des nucléotides dérivés des pyrimidines (De Brouwer et al, 2010). La voie de synthèse de novo des purines est principalement régulée par la PRPP amidotranferase (PPAT), qui catalyse à l’aide de la glutamine la première réaction de biosynthèse, à savoir la conversion du PRPP en 5- phosphoribosylamine (PRA). Cette enzyme est activée par une augmentation des taux de PRPP intracellulaires et inhibée par un mécanisme de rétrocontrôle exercé par des nucléotides tels que l’IMP, l’AMP et le GMP (Torres et al, 2012). D’autres intermédiaires agissent également comme régulateurs métaboliques, tels que l’AICAR (5-aminoimidazole-4- carboxamide ribonucleotide), qui active l’AMPK (AMP-activated protein kinase) et régule le ratio AMP/ATP (Pedley and Benkovic, 2017). La voie de synthèse de novo des purines étant fortement activée dans les types cellulaires hautement prolifératifs, les enzymes et les cofacteurs impliqués dans cette voie ont souvent été la cible de thérapies anticancéreuses (Yin et al, 2018). Le PRPP joue également le rôle de cofacteur pour deux enzymes impliquées dans la voie de recyclage des purines, à savoir l’HGPRT (hypoxantine-guanine phosphoribosyltransferase), qui recycle l’hypoxanthine et la guanine en IMP et GMP respectivement, et l’APRT (adenine phosphoribosyltransferase), qui synthétise de l’AMP à partir de l’adénine. Le recyclage est un processus essentiel dans le cycle métabolique des purines puisqu’il est estimé que 70 à 90% des purines générées au niveau intracellulaire seraient recyclées plutôt que dégradées ou excrétées (Fumagalli et al, 2017). D’autres enzymes interviennent dans le processus de recyclage des purines, telles que l’adénosine kinase (ADK) et la deoxyguanosine kinase (DGUOK). Le GMP et l’AMP, formés après les réactions de recyclage, permettent la formation des ribonucléotides GTP (guanosine triphosphate) et ATP (adenosine triphosphate), et sont donc à l’origine de la synthèse des acides nucléiques. L’IMP, quant à lui, se positionne à l’intermédiaire entre la synthèse de GMP et d’AMP, après transformation en XMP (xanthosine monophosphate) par l’IMP dehydrogenase ou en adenylosuccinate par l’adenylosuccinate synthase. La dégradation des purines est initiée par la déphosphorylation des nucléotides en adénosine, inosine et guanosine, réactions catalysées par des nucléotidases non spécifiques. Ces nucléosides sont ensuite transformés en deux bases puriques, l’hypoxanthine et la guanine, par la PNP (purine nucleoside phosphorylase). L’hypoxanthine est oxydée en

11 xanthine par la xanthine oxydase, alors que la guanine subit une étape de déamination par la guanine déaminase avant de former la xanthine. La xanthine est à nouveau oxydée pour former l’acide urique (Torres et al, 2012). Chez l’Homme, l’acide urique correspond au métabolite final de dégradation des purines, contrairement à d’autres espèces, comme les rongeurs, chez lesquels une enzyme supplémentaire, l’uricase, permet de métaboliser l’acide urique en allantoïne, plus soluble et donc plus facilement excrété par l’organisme (Maiuolo et al, 2016).

Figure 1 : Schéma métabolique des purines : synthèse de novo, recyclage et dégradation (Schéma inspiré de Jinnah et al, 2013). 5’NT = 5’-nucleotidase, ADA = Adenosine deaminase, ADK = Adenosine kinase, ADP = Adenosine diphosphate, ADSL = Adenylosuccinate lyase, AICAR = 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide, AIR = 5-aminoimidazole ribonucleotide, AMP = Adenosine monophosphate, AMPD = AMP deaminase, APRT = Adenine phosphoribosyltransferase, AS = adenylosuccinate synthase, ATIC = 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribotide transformylase/IMP cyclohydrolase, ATP = Adenosine triphosphate, CAIR = Carboxyaminoimidazole ribonucleotide, FAICAR = Formyl-AICAR, FGAM = formylglycinamidine ribonucleotide, FGAR = formylglycinamide ribonucleotide, GA = Guanine deaminase, GAR = glycinamide ribonucleotide, GDP = Guanosine diphosphate, GMP = Guanosine monophosphate, GTP = Guanosine triphosphate, HGPRT = Hypoxantine-guanine phosphoribosyltransferase, IMP = Inosine monophosphate, IMPDH = IMP dehydrogenase, PNP = Purine nucleoside phosphorylase, PRA = 5-phosphoribosylamine, PRPP = Phosphoribosylpyrophosphate, PPAT = PRPP amidotranferase, PRPS = PRPP-synthetase, SAICAR = Succinyl-AICAR, S-AMP = Adenylosuccinate, XMP = Xanthosine monophosphate, XO = Xanthine oxidase.

3. Les troubles liés au métabolisme des purines : un équilibre fragile du cycle

Les purines, par leurs fonctions biologiques essentielles dans la cellule et pendant le développement, sont associées à plusieurs troubles neurologiques graves, qui sont la conséquence de mutations touchant des enzymes impliquées dans la synthèse de novo des purines ou leur recyclage, et entrainant aussi bien leur inactivation ou à l’inverse leur hyperactivité. La diversité de ces mutations et leurs conséquences illustrent bien l’équilibre fragile du cycle, et démontrent que le SNC, et plus particulièrement le cerveau en développement, est particulièrement sensible aux atteintes associées à un dysfonctionnement des purines. Plusieurs atteintes métaboliques innées et associées au métabolisme des purines ont été ainsi identifiées (Tableau 1) : elles se manifestent par des syndromes neurologiques pédiatriques variés, comme par exemple les déficits en adenylosuccinate lyase (ADSL, EC 4.3.2.2) et en 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribotide transformylase/IMP cyclohydrolase (ATIC), qui appartiennent toutes les deux à la voie de synthèse de novo. Le déficit en ADSL est une maladie autosomique récessive de prévalence inférieure à 1/1000000, qui se manifeste par un retard psychomoteur, une épilepsie, ainsi que des troubles du comportement de type autistique (Jaeken and Van den Berghe, 1984). Le déficit en ATIC, mis en évidence en 2004 avec un unique cas de déficit enzymatique complet rapporté jusqu’à présent, est caractérisé par un retard mental sévère, des crises d’épilepsie, ainsi que des malformations des genoux, des épaules et des coudes, associés à une cécité congénitale (Marie et al, 2004). Une hyperactivation enzymatique est également susceptible de déréguler le cycle et entrainer des troubles neurologiques sévères, comme c’est le cas dans

13 le syndrome d’hyperactivité de la phosphoribosylpyrophosphate synthetase (PRPS, EC 2.7.6.1), maladie liée à l’X ne touchant qu’une trentaine de familles dans le monde et associée à une hyperuricémie et des anomalies neuro-développementales telles qu’une perte auditive neurosensorielle, une ataxie, une hypotonie et un retard mental (De Brouwer et al, 2010, Fumagalli et al, 2017). D’autres troubles métaboliques apparaissent à la suite de mutations affectant des enzymes impliquées dans la voie de recyclage des purines telles que les déficits en adenine phosphoribosyltransferase (APRT, EC 2.4.2.7), maladie génétique transmise selon un mode autosomique récessif, dont les atteintes se manifestent principalement au niveau rénal. Celles-ci sont dues à la très faible solubilité de la 2,8- dihydroxyadenine (2,8-DHA), métabolite provenant de l’oxydation de l’adénine par la xanthine oxydase, et qui cristallise dans le tractus urinaire ce qui peut mener à une insuffisance rénale (Bouzidi et al, 2007).

Tableau 1 : Tableau non exhaustif des différentes atteintes associées à un dysfonctionnement des purines (Jinnah et al, 2013). Il existe une trentaine de pathologies liées aux purines et aux pyrimidines, la majorité caractérisée par des atteintes neurologiques, et dont les mutations peuvent toucher aussi bien la voie de synthèse de novo que les voies de recyclage des purines.

Un des défauts purinergiques les plus décrits dans la littérature est causé par un déficit de l’enzyme hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT, EC 2.4.2.8), également impliquée dans la voie de recyclage des purines. Ce syndrome, qui correspond à la maladie de Lesch-Nyhan (MLN), est caractérisé par des atteintes rénales graves dues à l’accumulation d’acide urique, ainsi que par des atteintes neurocomportementales caractéristiques telles qu’une dystonie et une tendance compulsive à l’automutilation (Lesch and Nyhan, 1964, Torres and Puig, 2007, Fu et al, 2014). C’est à ce dernier syndrome que je me suis plus particulièrement intéressé au cours de ce travail.

II. La maladie de Lesch-Nyhan

La maladie de Lesch-Nyhan (MLN) a été décrite pour la première fois en 1964 par le docteur Michael Lesch et le professeur William L. Nyhan à l’hôpital John Hopkins (Baltimore, USA). Deux frères, âgés de 4 et 8 ans ont été admis après avoir développé un tableau clinique inhabituel comprenant un retard mental, des mouvements involontaires de type choréo-athétose, ainsi que des comportements d’automutilation. Ces symptômes sont accompagnés par une concentration importante d’acide urique dans les urines (uricosurie), ce qui est extrêmement rare chez les enfants de moins de 10 ans, avec une quinzaine de cas rapportés dans la littérature depuis 1823 (Lesch and Nyhan, 1964). A la suite de leur publication, plusieurs cas cliniques similaires sont identifiés, la totalité touchant des jeunes garçons. Ceci laissait entrevoir une composante héréditaire, et suggérait une maladie génétique à transmission récessive liée à l’X (Nyhan et al, 1967). La caractéristique biochimique frappante de ce syndrome correspond à une excrétion d’acide urique dans les urines 3 à 6 fois plus élevée que chez les individus contrôle, ainsi que l’incorporation de glycine14C dans de l’acide urique sécrété jusqu’à 200 fois supérieure aux sujets sains. Ceci laissait envisager une surproduction de purines et l’implication d’une altération dans une étape limitante de leur voie de biosynthèse. Cette question a été étudiée la même année, après avoir administré de l’azathioprine à deux enfants présentant une hyperuricémie couplée à des troubles neurologiques (Seegmiller et al, 1967). Ce composé chimique, connu pour son effet immunosuppresseur en inhibant la synthèse des purines, avait été rapporté comme ayant un effet bénéfique chez des patients atteints de goutte

15 chronique (Sorensen, 1966). En revanche, il n’a pas été capable de réduire le taux d’acide urique chez les patients MLN, ce qui suggérait que la drogue n’était pas convertie en son métabolite actif dans l’organisme, réaction catalysée par l’enzyme HGPRT (Hypoxanthine- Guanine Phosphoribosyltransferase, EC 2.4.2.8). L’enzyme manquante est nécessaire à la conversion de la 6-mercaptopurine, métabolite dérivé de l’azathioprine, en sa forme ribonucléotide responsable de l’activité inhibitrice sur la voie de synthèse des purines, par un mécanisme de rétrocontrôle négatif (Kelley et al, 1967). L’activité de cette enzyme, mesurée dans les fibroblastes et les érythrocytes de patients, est alors évaluée comme étant inférieure à 0.05 %, ce qui expliquait les atteintes métaboliques observées dans ce syndrome. Il s’agissait du premier exemple de relation directe entre un dysfonctionnement enzymatique et des troubles comportementaux compulsifs, ainsi que du premier défaut enzymatique dans la voie des purines associé à une maladie neurologique (Seegmiller et al, 1967). Ces résultats ont été confirmés l’année suivante par le professeur Nyhan chez trois autres enfants atteints de ce syndrome (Nyhan et al, 1968). Encore aujourd’hui, la mesure de l’activité HGPRT dans les érythrocytes ou les fibroblastes de patients est un paramètre indispensable à prendre en compte dans le diagnostic complet de la maladie. Cela permet notamment de caractériser les différents types de déficience en HGPRT, puisqu’il existe une corrélation entre l’activité résiduelle de l’enzyme et la sévérité des troubles neurologiques et comportementaux impliqués dans la pathologie (Torres and Puig, 2007).

1. Présentation clinique de la maladie de Lesch-Nyhan

La maladie de Lesch-Nyhan se définit par des troubles moteurs et des anomalies cognitives et comportementales, sur un fond d’hyperuricémie. Il s’agit d’une maladie neuro- développementale évolutive, avec une durée de vie pouvant aller jusqu’à 30 ans pour la forme classique.

a) Les anomalies métaboliques

Le syndrome de Lesch-Nyhan, dans sa forme classique, est caractérisé par des symptômes métaboliques dont l’origine a été identifiée et directement reliée au

16 dysfonctionnement de la voie de recyclage des purines. Ces symptômes correspondent à une hyperuricémie qui apparait dès la naissance avec l’apparition de cristaux d’acide urique dans les couches des nouveau-nés, ce qui constitue un des signes d’appel de la maladie : en effet, bien qu’un niveau élevé d’acide urique soit fréquent à l’âge adulte, il est extrêmement rare de l’observer chez les jeunes enfants, voire même à l’adolescence (Lesch and Nyhan, 1964). L’acide urique, dont la limite de solubilité est quasiment atteinte dans l’organisme, a tendance à précipiter sous la forme de cristaux d’urate de sodium, notamment au niveau du tractus urogénital (reins, vessie et uretères), ce qui peut aboutir à des lithiases entrainant l’obstruction des voies urinaires, ou encore à une insuffisance rénale. Il est estimé que chez les patients MLN, le taux d’acide urique produit est 5 à 10 fois supérieur que chez les individus sains (Torres, Puig and Jinnah, 2012). La présence de cristaux peut provoquer une hématurie et augmente également la probabilité de survenue d’infections touchant le système urinaire (Nyhan et al, 2014). Plus tardivement et en cas de mauvaise prise en charge médicamenteuse, la surproduction d’acide urique peut se répercuter au niveau des articulations et provoquer une arthrite goutteuse, due à l’inflammation déclenchée par la phagocytose des cristaux d’urate de sodium par les cellules du système immunitaire. L’acide urique est également susceptible de s’accumuler au niveau du tissu sous-cutané et dans certaines zones péri-articulaires comme les mains et les pieds en entrainant la formation de masses solides (tophus, Torres, Puig and Jinnah, 2012).

b) Les symptômes moteurs

Un retard développemental notable apparait dès la première année de vie avec une hypotonie du nourrisson, qui survient à partir de 3 à 6 mois et qui correspond à une baisse du tonus musculaire au niveau axial (muscles du tronc) et/ou périphérique (muscles des membres), et qui se répercute au niveau des acquisitions motrices telles que la tenue de la tête ou la position assise. Dans les mois qui suivent, en général entre 6 et 24 mois, des mouvements involontaires extrapyramidaux apparaissent : ces derniers correspondent principalement à des dystonies, à savoir des contractions musculaires prolongées et involontaires provoquant la torsion d’une ou de plusieurs parties du corps comme au niveau cervical, du tronc, des membres, ou encore du visage, de la mâchoire et de la langue dans le cas d’une dystonie oromandibulaire. Les troubles moteurs de la MLN sont également

17 caractérisés par d’autres symptômes tels que des mouvements choréo-athétosiques, qui se définissent par des mouvements involontaires brefs, répétitifs et irréguliers, passant en général d’une partie du corps à une autre pour la chorée, alors que l’athétose est plutôt caractérisée par un flux de mouvements lents et fluides, touchant dans la plupart des cas les mains et les pieds. Ces deux types de mouvements peuvent survenir en même temps, entrainant alors des mouvements de contorsion (Gonzalez-Usigli and Espay, 2016). D’autres troubles moteurs peuvent enfin se produire tels qu’un ballisme (mouvement brusque et violent de lancer, touchant la racine des membres), un opisthotonos (contracture localisée sur la face postérieure, donnant au corps une position caractéristique en arc), une hyperréflexie (exagération des réflexes) ou encore une spasticité, l’ensemble de ces symptômes nécessitant dans tous les cas le déplacement en chaise roulante. D’après une étude de Jinnah réalisée en 2006 sur une quarantaine de patients, les dystonies correspondraient aux mouvements extrapyramidaux les plus sévères et les plus fréquemment observés, alors que les mouvements choréo-athétosiques, ballismes et opisthotonos apparaissent respectivement chez 50%, 30% et 25% des patients (Figure 2). Ces mouvements se produisent de manière plus fréquente avec l’excitation, l’agitation ou le stress, l’anxiété (Jinnah et al, 2006). Ces anomalies motrices peuvent s’aggraver jusqu’à l’âge de 4 à 6 ans, après quoi l’état se stabilise généralement (Torres, Puig and Jinnah, 2012).

Figure 2 : Résumé des symptômes moteurs caractéristiques de la MLN (Jinnah et al, 2006). Les signes moteurs les plus représentés dans la maladie de Lesch-Nyhan et les plus sévères sont les dystonies, observées chez 100% des patients (A). D’autres types d’anomalies sont susceptibles d’affecter les patients tels que les troubles du tonus (B) et les symptômes pyramidaux (C).

Les troubles moteurs comprennent également une dysarthrie sévère, avec un retard dans la parole retrouvé chez l’ensemble des patients, ainsi qu’une difficulté à déglutir (dysphagie) fréquemment observée. Certains patients présentent des reflux gastro- œsophagiens, avec des vomissements fréquents, ce qui peut nécessiter la pose d’une sonde gastrique pour éviter la malnutrition. Enfin, des troubles respiratoires peuvent apparaitre chez les malades, correspondant à des épisodes d’apnée et de cyanoses, associés ou non avec un stridor, un bruit aigu inspiratoire dû au passage anormal de l’air dans les voies aériennes supérieures (Jinnah et al, 2006).

c) Les symptômes cognitifs et neuropsychiatriques

La MLN se caractérise par des anomalies comportementales sévères, telles que le phénotype d’automutilation. Ce dernier est caractéristique des formes classiques de MLN et se déclare entre 2 et 4 ans, en général à partir du moment où les dents commencent à apparaitre chez l’enfant. Ces troubles persistent durant l’enfance et l’adolescence, ce qui nécessite des équipements protecteurs (Harris, 2018). L’automutilation consiste principalement en des morsures aux doigts, aux lèvres et au niveau de la muqueuse buccale, ce qui peut mener à des dommages sévères. Elle se produit alors que le système sensoriel n’est pas altéré : les patients ressentent donc la douleur et sont conscients de ces agressions, mais ne sont pas capables de les contrôler. Ce comportement agressif peut également se manifester envers les autres individus, avec par exemple des gestes violents ou par une agression verbale (Harris and Schiffmann, 2017). D’autres symptômes comportementaux s’ajoutent et ont été étudiés en 2005 dans une publication en se référençant au CBCL (Child Behavior Check List ou Inventaire de Comportement) et à l’échelle comportementale proposée par l’AAMRs (ABS-RC2, American Association on Mental Retardation’s Adaptative Behavior Scale). L’étude a démontré que les patients MLN présentaient d’avantage de comportements anxieux et dépressifs, de troubles de l’attention et d’altérations du raisonnement et de la pensée que les individus sains, en plus des mouvements agressifs (Figure 3, Schretlen et al, 2005).

Figure 3 : Résultats du test CBCL pour l’étude des troubles comportementaux (Schretlen et al, 2005). L’étude porte sur 44 individus testés, à la fois des patients atteints de la forme sévère de Lesch-Nyhan (LND), des formes variantes (LNV) et des individus sains (HC). WTH = Introversion, SOM = troubles psychosomatiques, ANX = anxiété/dépression, SOC = sociabilité, THT = troubles de la pensée, ATT = troubles de l’attention, DEL = comportements délinquants, AGG = agressivité.

Au niveau cognitif, un retard mental léger à modéré apparait dans la maladie : les déficits les plus sévères concernant en général la capacité de mémorisation (Harris, 2018). Ces études peuvent cependant être biaisées par la difficulté à évaluer les patients sur le plan comportemental, notamment en raison des mesures de protection appliquées, ou de leur médication pouvant inhiber certains comportements et donc sous-estimer les symptômes. Inversement, les patients ont des difficultés à s’exprimer, ce qui peut surestimer les atteintes cognitives comme la déficience intellectuelle.

d) Autres

D’autres symptômes sont décrits dans la maladie de Lesch-Nyhan, comme au niveau hématologique, avec une anémie mégaloblastique pouvant être constatée chez les patients MLN, due à une consommation excessive d’acide folique résultant d’une synthèse de novo des purines accélérée (Torres and Puig, 2007). Cette anémie ne répond pas aux suppléments vitaminés. Enfin, la croissance et la puberté également sont retardées dans la maladie (Nyhan et al, 2014).

2. Epidémiologie et génétique

a) Une maladie de transmission récessive liée à l’X

La maladie de Lesch-Nyhan fait partie des 35 maladies génétiques recensées associées à un dysfonctionnement des purines et des pyrimidines (Ceballos-Picot et al, 2015). Elle a une prévalence estimée à 1/380000 dans la population générale. La fréquence de ce syndrome semble relativement homogène dans les populations étudiées. La mutation responsable de la maladie se transmet par un mode récessif lié à l’X (Nyhan et al, 1970), le gène codant l’enzyme HGPRT étant porté par le chromosome X. Le phénotype s’exprime donc uniquement chez les garçons car ils sont hémizygotes pour ce gène. Les filles sont quant à elles hétérozygotes pour l’allèle muté, et sont donc porteuses saines de la mutation. Elles ont alors 50% de probabilité de transmettre à chaque grossesse la mutation responsable de la maladie. Il est important de noter que dans 30% des cas environ, les mères des individus atteints de la MLN ne sont pas porteuses de la mutation causale, la maladie se déclarant suite à des mutations de novo dans les cellules germinales (Torres and Puig, 2007). Dans certains cas exceptionnels cependant, les filles peuvent présenter les symptômes de la MLN, ce qui s’explique en général par la présence d’un allèle muté sur le chromosome maternel et par l’inactivation non aléatoire du chromosome X paternel porteur de l’allèle normal (De Gregorio et al, 2005). Une dizaine de cas de filles, dites hétérozygotes symptomatiques, ont ainsi été décrites dans la littérature (Torres and Puig, 2017).

b) Le gène HGPRT et sa distribution

L’enzyme HGPRT est codée par le gène HGPRT, situé sur le bras long du chromosome X, et de localisation Xq26 – Xq27 (Pai et al, 1980). Il est constitué de 9 exons et de 8 introns, d’une longueur de 44 kb, avec une phase de lecture ouverte (ORF) de 654 nucléotides dans la partie codante (Figure 4). La protéine encodée, de 217 acides aminés, a une taille de 24,6 kDa et aucune modification post-traductionnelle n’est connue à l’exception du clivage d’une méthionine initiale suivi de l’acétylation de l’alanine nouvellement exposée (Fu et al, 2014).

Figure 4 : Organisation structurale du gène HGPRT (Stout and Caskey, 1985). Le gène HGPRT est organisé sous la forme de 9 exons (rectangles noirs) et de 8 introns (rectangles blancs), avec une longueur totale de 44 kb d’ADN génomique. Les zones pointillées correspondent aux régions 3’ et 5’- UTR (Untranslated regions).

La HGPRT est ubiquitaire mais avec une expression relativement faible dans les cellules périphériques (0,005-0,01% des ARNm). Elle est en revanche exprimée de manière plus importante dans le cerveau (0,02-0,04%, Townsend et al, 2018). L’expression la plus forte de cette enzyme est notamment retrouvée dans la région des noyaux gris centraux, en particulier dans les ganglions de la base. En revanche, la synthèse de novo des purines mesurée est plus faible dans le noyau caudé, élément majeur des noyaux de la base, ce qui suggère que cette région du système nerveux central est d’avantage dépendante du recyclage pour le maintien d’un pool suffisant de purines, ce qui peut être important dans la pathogénicité de la maladie de Lesch-Nyhan (Stout and Caskey, 1985). D’autres publications vont dans ce sens, à savoir que le métabolisme purinergique dans le cerveau, et notamment dans les neurones en développement, semble différent par rapport aux organes périphériques, et que le maintien des stocks de purines nécessaires à la cellule dépend principalement du recyclage, et non de la synthèse de novo, qui est faiblement activée dans le SNC (Howard et al, 1970, Allsop and Watts, 1980). D’une manière générale, le métabolisme purinergique et l’importance du recyclage médié par l’HGPRT varient en fonction du type et du sous-type de populations cellulaires, ainsi que de l’état prolifératif et du stade de différentiation, ce qui peut expliquer les résultats souvent contradictoires constatés dans la littérature et les différences de vulnérabilité entre les types de cellules étudiés (Göttle et al, 2013).

c) Les mutations du gène HGPRT : une corrélation génotype-phénotype

Les mutations recensées sont très hétérogènes mais aboutissent toujours à une perte d’activité totale ou partielle. On dénombre à ce jour environ 615 mutations différentes, réparties tout au long du gène et qui consistent aussi bien en des mutations non-sens, faux- sens, des erreurs d’épissage, des duplications ou des insertions-délétions (Figure 5). Aucun « point chaud » (hotspot) sur le gène n’a été réellement identifié, bien que certaines mutations aient été retrouvées au sein de plusieurs familles, telles que c.151C>T et c.158C>T, convertissant toutes les deux une arginine en un codon STOP (Fu et al, 2014). Ces mutations sont responsables de syndromes de gravité variable : en effet, le phénotype de la maladie, avec notamment le degré des atteintes neurologiques, dépend directement de l’activité résiduelle de l’enzyme, elle-même dépendant du type de mutation retrouvé. Les formes les plus graves de la pathologie (formes classiques de Lesch-Nyhan) sont caractérisées par une activité résiduelle en HGPRT inférieure à 1,5%, mais des formes variantes plus légères existent, qualifiées de syndrome de Lesch-Nyhan partiel, ou syndrome de Kelly-Seegmiller (Figure 6), et classées selon le pourcentage d’activité résiduelle de l’enzyme :

 Activité HGPRT > 10% : Le syndrome est qualifié d’hyperuricémie liée à l’X (HRH = HGPRT- Related Hyperuricemia). Les patients ont un risque élevé de dépôt de cristaux d’acide urique au niveau du système urinaire et des articulations, mais ne déclarent aucune atteinte neurologique ou comportementale. Ces patients ont une espérance de vie normale, dans le cas où ils ne développent pas de complications rénales telles que des néphropathies ou une insuffisance rénale. Une activité minimale de l’HGPRT de 10% semble donc nécessaire pour éviter les troubles associés à une dysfonction neuronale.

 Activité HGPRT entre 1,5 et 10% : les patients souffrent en général de troubles neurologiques similaires à ceux retrouvés dans les formes classiques de la MLN, associés à une hyperuricémie (HND = HGPRT-Related Neurological Dysfunction). En revanche, ils ne développent pas d’atteintes comportementales de type automutilation.

Figure 5 : Exemples de mutations localisées sur le gène HGPRT (Ceballos-Picot et al, 2015). Les mutations représentées ont été séquencées à partir d’une cohorte de 85 patients, présentant soit le phénotype MLN sévère (LND) ou une forme variante atténuée (HND, HRH). Les mutations apparaissant en jaune ont été retrouvées au sein de plusieurs familles. Cette figure illustre l’importante hétérogénéité des mutations retrouvées dans ce syndrome.

Une corrélation génotype – phénotype existe donc pour la MLN et ses variants (Page et al, 1981). En 2015, dans le travail de séquençage du gène HGPRT effectué par Irène Ceballos- Picot au sein d’une cohorte de 85 patients, il a été observé que les patients atteints de la forme sévère de la MLN ne présentaient que 32% de mutations faux-sens, alors que 68% des mutations étaient des insertions – délétions, des mutations non-sens entrainant l’arrêt prématuré de la synthèse protéique, ou encore des défauts d’épissage (Ceballos-Picot et al, 2015). Ce travail confirme les résultats obtenus en 2014 par le groupe international d’études pour la maladie de Lesch-Nyhan, visant à établir les relations existant entre les variations génétiques et les différents phénotypes de la MLN (Tableau 2, Fu et al, 2014). La moitié des délétions recensées sont larges, avec la perte d’un ou plusieurs exons, et la totalité des mutations localisées au niveau des introns entrainent des erreurs d’épissage responsables d’un phénotype classique de la MLN. En ce qui concerne les variants (HRH et HND), on dénombre 88% de mutations faux-sens et une absence quasi-totale des autres types de mutations.

Figure 6 : Schéma représentant le spectre clinique du syndrome de Lesch-Nyhan et de ses variants (Jinnah et al, 2010). Les différentes formes de MLN sont classées par ordre croissant de gravité des symptômes, à savoir HRH (HGPRT-related hyperuricemia), HND (HGPRT-related neurological dysfunction) et LND (Lesch-Nyhan disease). Le spectre clinique représenté ici est basé sur une étude portant sur 46 variants.

Ces résultats montrent que chez les formes variantes de la pathologie, les mutations faux-sens, qui mènent au changement d’un acide aminé, permettent tout de même de maintenir une activité enzymatique suffisante pour prévenir les défauts comportementaux ou moteurs, alors que dans les cas sévères de la MLN, les mutations de type non-sens ou délétion vont provoquer une baisse considérable de l’activité résiduelle de l’HGPRT, due à l’absence de l’enzyme ou à sa mauvaise conformation (Ceballos-Picot et al, 2015). Les mutations de de type faux-sens, quant à elles, sont susceptibles d’apparaitre au niveau du site actif de l’enzyme, dans la zone de fixation du substrat ou du co-substrat, ce qui peut également mener à une absence totale d’activité dans les cas sévères de la MLN (Ceballos- Picot et al, 2013). Bien que l’activité résiduelle de l’enzyme soit un paramètre important pour prévenir le phénotype associé à la pathologie, plusieurs exceptions ont été cependant observées : plusieurs mutations identiques détectées au sein de mêmes familles n’entrainent en effet pas les mêmes phénotypes. Ces exceptions peuvent s’expliquer par plusieurs mécanismes indépendants du gène HGPRT tels que la fidélité des processus d’épissage, les mécanismes de dégradation des protéines mal conformées, ou encore le degré de compensation de l’HGPRT par l’intermédiaire de la voie de synthèse de novo des purines (Ceballos-Picot et al,

2013 ; Fu et al, 2014). Les avancées dans le domaine du séquençage permettent aujourd’hui de détecter fréquemment de nouvelles mutations responsables de la MLN ou de ses variants : ces dernières sont référencées sur le site http://www.lesch- nyhan.org/fr/research/mutations-database.

Tableau 2 : Résumé des différents types de mutations touchant le gène HGPRT (Fu et al, 2014). Les mutations rapportées dans ce tableau sont divisées en différents types, incluant substitutions, délétions, duplications et autres. LND = Lesch-Nyhan disease, LNV = Lesch-Nyhan variant, NA = Not available.

3. Etiologie de la maladie de Lesch-Nyhan

La maladie de Lesch-Nyhan correspond donc à un syndrome métabolique récessif caractérisé par un dysfonctionnement au niveau de la voie de recyclage des purines, ainsi qu’à des atteintes neurocomportementales. Il est possible aujourd’hui d’associer la mutation du gène HGPRT et les troubles métaboliques retrouvés dans la maladie, mais aucun lien direct entre la mutation et les symptômes moteurs et comportementaux n’a pu être établi pour le moment.

a) Bases biochimiques de la maladie

L’enzyme HGPRT catalyse, en présence de son cofacteur, le PRPP (phosphoribosylpyrophosphate), la conversion de l’hypoxanthine et de la guanine en leurs nucléotides respectifs, à savoir l’IMP (inosine monophosphate) et le GMP (guanosine monophosphate). Il est estimé que 90% des purines libres générées au niveau intracellulaire seraient recyclées, alors que 10% seulement seraient dégradées ou excrétées (Fumagalli et al, 2017). Cela montre l’importance de l’activité de recyclage opérée par l’HGPRT, mais aussi par l’APRT, enzyme permettant le recyclage de l’adénine en AMP (adénosine monophosphate), mais qui n’est pas mutée dans la pathologie. En l’absence d’HGPRT, l’hypoxanthine et la guanine ne sont plus recyclées et sont donc dégradées en xanthine et en acide urique par la xanthine oxydase, ce qui entraine leur accumulation dans l’organisme. L’acide urique, dont la limite de solubilité est quasiment atteinte dans l’organisme, a tendance à précipiter, les taux d’urate étant 5 à 10 fois plus élevés que chez les individus sains (Torres, Puig and Jinnah, 2012). En plus de l’inactivation de l’enzyme HGPRT, deux autres mécanismes contribuent à cette hyperuricémie, à savoir :

 L’augmentation de la disponibilité du PRPP, co-substrat de l’HGPRT, pour la PRPP amidotransferase (PPAT), étape limitante dans la synthèse de novo des purines, ce qui entraine une accélération de la synthèse des purines.  Une diminution du rétrocontrôle négatif sur la PPAT, régulée normalement par les taux d’IMP, de GMP et d’AMP.

L’inactivation de la voie de recyclage des bases puriques, couplée à une voie de synthèse de novo accélérée, explique donc la surproduction en acide urique responsable des troubles métaboliques observés dans la maladie de Lesch-Nyhan (Figure 7).

Figure 7 : Mécanismes biochimiques responsables de l’accumulation d’acide urique. L’hyperuricémie provient de l’association de différents défauts, à savoir le dysfonctionnement de l’enzyme HGPRT, qui entraine l’accumulation de ses substrats et qui favorise la disponibilité de son cofacteur PRPP pour l’enzyme PPAT, son activité étant favorisée par une diminution du rétrocontrôle exercé par l’IMP/GMP/AMP. Cela conduit à l’accélération de la synthèse de novo des purines et à l’accumulation d’acide urique. PPAT = phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase, PRPP = phosphoribosylpyrophosphate.

b) Etiologie des atteintes neurologiques et comportementales

La physiopathologie des désordres neurologiques et comportementaux n’est pas encore connue à ce jour : en effet, aucun lien direct n’a pu être établi entre le dysfonctionnement de la voie de recyclage des purines et les atteintes du système nerveux central. Les anomalies neurocomportementales dans la MLN suggèrent au minimum l’existence d’un dysfonctionnement des ganglions de la base, qui se manifeste le plus souvent par des mouvements involontaires de type dystonie, ballisme et chorée (Visser et al, 2000). Ces atteintes n’expliquant pas à elles seules le tableau clinique, elles s’accompagnent probablement d’un dysfonctionnement d’autres systèmes, notamment des neurones du cortex cérébral. Plusieurs études d’imagerie IRM ont ainsi été réalisées pour vérifier la présence d’une atrophie potentielle de différentes régions du cerveau. Les anomalies les plus fréquemment observées consistent en une diminution du volume cérébral, avec une réduction de 17% du volume total du cerveau, ainsi qu’une réduction de 34% du volume du

28 noyau caudé et 12% du putamen (Harris et al, 1998). Des études plus récentes d’imagerie VBM (Voxel Based Morphometry), intégrant des patients MLN et des variants, ont démontré une baisse plus générale du volume cérébral, impliquant les ganglions de la base mais aussi les régions corticales frontales et temporales ainsi que le système limbique. Les pertes de volume de matière blanche mesurées peuvent atteindre 26% par rapport aux patients contrôle (Schretlen et al, 2013, Schretlen et al, 2015). Ces études ont cependant des limites et il est difficile de distinguer si ces anomalies doivent être considérées comme les causes ou les conséquences des symptômes de la MLN. Les volumes de matière blanche et grise sont en effet susceptibles de varier en réponse à la pratique des fonctions motrices et cognitives (Schretlen et al, 2015). Les premières études neurochimiques, réalisées post-mortem sur cinq cerveaux de patients MLN, ont permis de mettre en évidence de manière plus nette une atteinte des ganglions de la base, en mesurant les concentrations de plusieurs neurotransmetteurs (Lloyd et al, 1981, Saito et al, 1999). L’étude de Lloyd a démontré une baisse de la concentration de la dopamine et de ses métabolites au niveau du striatum, correspondant à une perte fonctionnelle de 65 à 90% au niveau des projections axonales, alors que le niveau de dopamine ne semble pas être modifié au niveau des noyaux du mésencéphale. Deux enzymes impliquées dans la synthèse de dopamine : la tyrosine hydroxylase (TH) et l’aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC) sont également affectées dans le striatum. L’étude montre une augmentation des taux de sérotonine, mais pas de l’activité de synthèse des autres neurotransmetteurs comme le GABA et l’acétylcholine (Lloyd et al, 1981). L’étude de Saito, quant à elle, confirme la baisse de dopamine au niveau du noyau caudé, mais donne des résultats contraires en ce qui concerne les niveaux de sérotonine (Saito et al, 1999). Plus récemment, des études histologiques post-mortem menés par l’équipe du Pr Jinnah a montré une réduction de pigmentation et de l’expression de la TH dans les neurones dopaminergiques de la substance noire, résultats retrouvés dans des modèles de souris KO pour l’HGPRT (Göttle et al, 2014). Les études en imagerie utilisant la tomographie par émission de positrons (TEP) ont confirmé le dysfonctionnement du système dopaminergique. On observe une baisse de 73% et 56% de fixation du radioligand [11C] WIN-35,428 aux transporteurs de dopamine (DAT) au niveau du putamen et du noyau caudé (Wong et al, 1996), ainsi qu’une baisse de la capture de [18F] fluorodopa, un analogue de la L-Dopa, allant de 31 à 57% au niveau du striatum, ce

29 qui reflète une baisse de l’activité Dopa-décarboxylase et du stockage vésiculaire de la dopamine dans ces régions (Figure 8, Ernst et al, 1996). Ces résultats laissent envisager une atteinte des neurones dopaminergiques et de leurs projections. Pourtant, aucune perte neuronale n’a été clairement observée dans la substance noire, ce qui exclurait tout phénomène neurodégénératif (Göttle et al, 2014) : les neurones ont par contre perdu leur fonctionnalité biochimique et on note une déplétion notable en dopamine, qui confirme son implication centrale dans la neuropathologie de la MLN.

Figure 8 : Déplétion dopaminergique observée par imagerie en TEP (Ernst et al, 1996, Wong et al, 1996). Exemples d’images obtenues en PET-Scan à l’aide des radioligands [11C] WIN-35,428 (Figure A) et [18F] fluorodopa (Figure B), démontrant une baisse importante de signal au niveau du striatum chez des patients MLN, ce qui est représentatif d’un dysfonctionnement du système dopaminergique.

Ceci est en accord avec les rôles connus de la DA et des ganglions de la base. Chez l’Homme, ils jouent et régulent des fonctions complexes telles que la motricité, la cognition, la motivation, la mémorisation, l’addiction ou encore le sommeil (Visser et al, 2000). La dopamine est principalement synthétisée dans le mésencéphale ventral par des neurones projetant dans les ganglions de la base et le cortex (Figure 9), à savoir :

 Les neurones de la substance noire compacte (pars compacta, SNpc), dont les projections atteignent le striatum dorsal (noyau caudé et putamen), impliqués dans le contrôle des mouvements volontaires par l’intermédiaire des voies nigrostriatales. Ils constituent 80% des neurones dopaminergiques centraux.  L’aire tegmentale ventrale (VTA), dont les neurones projettent vers le striatum ventral (noyau accumbens) et le cortex préfrontal, et sont impliqués dans des

fonctions cognitives comme l’émotion, la motivation, la récompense ou l’addiction. Ils constituent les voies méso-limbiques et méso-corticales (Luo et Huang, 2016).

Figure 9 : Voies dopaminergiques du mésencéphale et leurs projections (Luo and Huang, 2016). La voie nigrostriatale (en bleu) est constituée de neurones projetant de la substance noire pars compacta (SNpc) vers le noyau caudé et le putamen (CPu). Les voies méso-limbique (en vert) et méso-corticale (en rouge) partent toutes les deux de l’aire tegmentale ventrale (VTA) et projettent respectivement vers le noyau accumbens (NAc) et le tubercule olfactif (OT) d’une part, et le cortex préfrontal (PFC) d’autre part.

Parmi les symptômes majeurs retrouvés dans la MLN, la dystonie a été reliée à une atteinte précoce du système dopaminergique, impliquant les circuits du putamen et du cortex moteur, alors que la chorée serait la conséquence d’une lésion du noyau caudé. Les troubles du comportement, notamment l’automutilation, peuvent aussi, dans une certaine mesure, être reliés à une perte précoce de dopamine au niveau du circuit impliquant le striatum ventral et le cortex orbitofrontal (Göttle et al, 2014).

Si l’atteinte fonctionnelle du système dopaminergique semble donc participer à l’émergence du phénotype clinique de la MLN, il n’existe en revanche pas à ce jour de consensus quant à l’origine et la nature de cette atteinte. Plusieurs hypothèses ont été émises allant d’une atteinte purement biochimique concernant la synthèse de la dopamine, à des hypothèses focalisées sur le développement ou la survie de ces neurones. Il n’existe pas non plus de documentation sur le dysfonctionnement des autres systèmes neuronaux alors que de tout évidence, les atteintes dopaminergiques ne peuvent pas à elles seules

31 expliquer l’ensemble des symptômes. Les paragraphes suivants résument les hypothèses actuelles.

 Hypothèse biochimique d’un défaut de la synthèse de dopamine

D’un point de vue métabolique, le lien potentiel le plus direct reliant la voie métabolique des purines à la biosynthèse de dopamine correspondrait à l’implication du GTP, grâce à la GTP cyclohydrolase, dans la première étape, limitante, de la synthèse de tétrahydrobioptérine (BH4). Le BH4 joue le rôle de cofacteur de la tyrosine hydroxylase (TH), enzyme impliquée dans la synthèse de L-Dopa à partir de la tyrosine (Figure 10, Meiser et al, 2013). Une déplétion en GMP, due à un défaut de recyclage de la guanine, peut donc en théorie impacter la synthèse de dopamine. Pourtant, les taux de BH4 mesurés dans l’urine et le liquide cérébrospinal de patients MLN ne sont pas modulés, et la supplémentation en BH4 ne permet pas de corriger le déficit en dopamine rapporté dans des modèles de souris KO (Hyland et al, 2004).

Figure 10 : Voie de synthèse du BH4 à partir des nucléotides de la guanine (schéma modifié d’après Visser et al, 2000).

L’HGPRT contribue à la synthèse de GTP, qui entre dans la première étape, limitante, de la synthèse de BH4. Ce cofacteur participe à la synthèse de neurotransmetteurs tels que la dopamine et la sérotonine. Une déplétion en GTP pourrait donc perturber la synthèse de dopamine. AADC = aromatic L-amino acid decarboxylase, BH4 = Tetrahydrobioperin, PAH =

Phenylalanine hydroxylase, qBH2 = quinoid dihydrobiopterin, TH = Tyrosine hydroxylase, TPH = Tryptophan hydroxylase.

Ce cofacteur est également impliqué dans la synthèse d’autres neurotransmetteurs comme la noradrénaline, produit de dégradation de la dopamine, et la sérotonine à partir du tryptophane, leurs niveaux n’étant pourtant pas clairement diminués dans la MLN (Visser et al, 2000). Le BH4 joue aussi le rôle de cofacteur dans la réaction d’hydroxylation de la phénylalanine en tyrosine (Figure 10). Pourtant, aucun trouble de type hyperphénylalaninémie ou de phénylcétonurie n’est rapporté dans maladie, ce qui exclue tout lien direct entre une diminution de synthèse de BH4 secondaire à un défaut de recyclage des purines et un déficit de la biosynthèse de dopamine. Enfin, cette hypothèse est aussi remise en cause par le fait que l’administration d’agonistes tels que la L-Dopa ne permet aucune amélioration des symptômes neurologiques (Visser et al, 2011).

 Hypothèses neurodégénératives

- Accumulation de métabolites neurotoxiques

Un certain nombre de métabolites s’accumulent secondairement à la perte d’activité de l’HGPRT, et peuvent avoir un effet délétère. En ce qui concerne l’accumulation toxique d’acide urique, il a été proposé que, dans les modèles de souris déficientes en HGPRT, l’absence de manifestations comportementales pouvait s’expliquer par la présence d’une enzyme supplémentaire, l’uricase, qui permet de dégrader l’acide urique en allantoïne, plus soluble et donc mieux excrétée dans les urines. Pourtant, le cerveau ne semble pas particulièrement exposé aux concentrations toxiques d’acide urique. Les niveaux de xanthine oxydase sont plus faibles dans les tissus cérébraux, ce qui limite la synthèse d’acide urique au profit de la xanthine et de l’hypoxanthine, et le niveau d’acide urique dans le liquide cérébrospinal semble dépendre de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (Bowman et al, 2010). De plus, l’hyperuricémie est retrouvée dans d’autres états pathologiques comme les formes atténuées de la MLN ou le syndrome d’hyperactivité de la phosphoribosylpyrophosphate synthetase (PRPS), sans aucune survenue des troubles comportementaux similaires à ceux de la MLN. La réduction des taux d’acide urique dès la naissance par l’allopurinol, un inhibiteur de la xanthine oxidase, ne permet également pas de ralentir la progression des atteintes neurocomportementales chez les individus malades

(Torres et al, 2007). Enfin, l’inactivation de l’uricase chez la souris ne permet pas non plus de faire apparaitre les symptômes comportementaux, bien que le niveau d’acide urique mesuré dans le sérum soit 10 fois supérieur à celui des souris wild-type (Wu et al, 1994, Chen et al, 2013). Les arguments se sont donc tournés d’avantage vers l’accumulation d’autres métabolites, tels que l’hypoxanthine, dont la concentration dans le liquide cérébrospinal est 5 fois supérieure chez les individus MLN (Biasibetti et al, 2017). Son accumulation impacterait différents processus de neurotransmission et serait impliquée dans des défauts de neurogénèse. Le transport de l’adénosine, dans un premier temps, semble impacté par une augmentation croissante d’hypoxanthine dans les lymphocytes obtenus à partir de patients MLN. On note une diminution de la recapture de l’adénosine d’environ 32% par les récepteurs ENT2 (Equilibrative nucleoside transporters) par un mécanisme compétitif, entrainant une augmentation des concentrations extracellulaires d’adénosine et une stimulation prolongée des récepteurs à l’adénosine (Prior et al, 2007). Or, dans le cerveau en développement, un équilibre précis dans les concentrations d’adénosine est nécessaire au recrutement et à l’activation de différents sous-types de récepteurs tels que les récepteurs

A1 et A2A, aux effets opposés, et par l’activation de voies de signalisation, l’adénosine est impliquée dans des processus clés au niveau neurodéveloppemental (Torres et al, 2016). D’autres études démontrent un lien entre l’augmentation d’hypoxanthine et des défauts de neurogénèse sur un modèle humain de carcinome embryonnaire (NT2/D1), différencié après exposition à l’acide rétinoïque en lignées neuroectodermiques (Torres and Puig, 2015). Les auteurs montrent une augmentation de l’expression de gènes associés au développement neuronal précoce, incluant le facteur WNT4 (wingless-type MMTV integration site family, member 4), élément de la voie Wnt/β-catenin, ainsi que les facteurs LMX1B (LIM Homeobox Transcription Factor 1 Beta) et EN-1 (Engrailed homeobox 1), qui jouent un rôle dans la différenciation et la survie des neurones dopaminergiques. L’excès d’hypoxanthine semble également favoriser l’expression de la tyrosine hydroxylase (TH), impliquée dans la synthèse de dopamine, ainsi que des récepteurs à l’adénosine (A2A), la dopamine (DRD1) et la sérotonine (HTR7), indices d’un défaut de la balance de neurotransmission (Torres and Puig, 2015). De manière intéressante, un défaut de la balance entre les récepteurs de ces trois neurotransmetteurs avait déjà été rapporté dans des lymphocytes de patients MLN, ce qui supporte l’hypothèse que plusieurs

34 neurotransmetteurs semblent dérégulés dans la maladie de Lesch-Nyhan (García et al, 2012). L’hypothèse d’une interaction entre ces différents récepteurs, tous couplés aux protéines G, a été émise, expliquant leur modulation à partir de la stimulation des récepteurs A2A par une augmentation de l’adénosine extracellulaire (García et al, 2012). Un métabolite également étudié pour sa toxicité dans la maladie de Lesch-Nyhan est le 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR, ou ZMP), un des composés intervenant dans la synthèse de novo des purines. Son accumulation a été détectée dans les érythrocytes et dans le liquide cérébrospinal de patients MLN (Ceballos-Picot et al, 2015), et son accumulation a déjà été associée à des symptômes incluant un retard mental sévère, de l’épilepsie, des malformations et une cécité congénitale (Marie et al, 2004). De plus, l’AICAR est un inhibiteur de l’enzyme bi-fonctionnelle adenylosuccinate lyase (ADSL), dont le déficit est caractérisé par un retard psychomoteur, une épilepsie, ainsi que des troubles du comportement de type autistique (Jaeken and Van den Berghe, 1984). Le ZMP est également un analogue mimétique de l’AMP, connu pour activer l’AMPK (AMP-activated protein kinase), considéré comme un régulateur homéostasique de l’énergie dans la cellule. L’activation prolongée et non contrôlée de l’AMPK pourrait avoir des effets multiples au niveau du cerveau, puisque ce dernier est impliqué dans des processus clés de différentiation, prolifération, plasticité synaptique, ou encore de neuroprotection, et serait impliqué dans la physiopathologie de plusieurs maladies neurologiques (Rosso et al, 2016).

- Impact du stress oxydant

Un des mécanismes participant à la pathogénicité de la maladie de Parkinson, associée comme la MLN à une atteinte des neurones dopaminergiques de la substance noire, consisterait à l’impact d’un stress oxydatif élevé (Meiser et al, 2013). En effet, ces neurones sont particulièrement vulnérables aux espèces réactives de l’oxygène (ROS), tel que l’H2O2 généré à la suite de la déamination oxydative de la dopamine par la monoamine oxydase - (MAO), ou encore les radicaux superoxide O2 provenant de l’oxydation de la dopamine et de ses dérivés par des tyrosinases. De plus, ces neurones contiennent des taux de fer importants, catalysant l’oxydation de la dopamine et de la L-Dopa en quinones. Ces dernières sont des espèces réactives à l’origine de plusieurs produits tels que la

35 neuromélanine, pigment présent dans la substance noire, mais aussi de la neurotoxine 6- hydroxydopamine et du salsolinol, composé entrainant un stress oxydatif et une atteinte mitochondriale en inhibant la chaîne de transport des électrons, et qui perturberait également le métabolisme des catécholamines en inhibant plusieurs enzymes comme la TH, la COMT et la DA-β-hydroxylase. Chez les patients atteints de la maladie de Parkinson, les niveaux d’antioxydants tels que le glutathion, la superoxide dismutase (SOD) ou la catalase sont diminués, rendant les cellules plus vulnérables au stress oxydant (Meiser et al, 2013). Plusieurs études ont donc cherché à savoir si des processus similaires pouvaient être à l’origine des atteintes dopaminergiques présentes dans la MLN. J.E. Visser émet l’hypothèse que la surproduction en acide urique nécessite une activité xanthine oxydase plus élevée, qui génère des anions superoxide (Figure 11). De plus, la synthèse de novo est accélérée, ce qui nécessite un apport énergétique plus important par la mitochondrie, source d’espèces réactives (Visser et al, 2000).

Figure 11 : Schéma démontrant l’hypothèse du stress oxydatif dans la MLN (Visser et al, 2000). L’activité plus importante de la xanthine oxidase (XO), couplée à la production d’espèces réactives de l’oxygène provenant du métabolisme de la dopamine et à la vulnérabilité des neurones dopaminergiques peuvent participer à la - physiopathologie des atteintes neurologiques de la MLN. H2O2 = Peroxyde d’hydrogène, MAO = Monoamine oxidase, OH = - anion hydroxyde, O2 = anion superoxide.

Cette production de ROS, couplée à la vulnérabilité des neurones dopaminergiques, pourrait participer à la pathogénicité de la maladie, bien que les symptômes neurologiques entre la maladie de Parkinson et la MLN soient différents. Des études post-mortem de Göttle avaient également mis en évidence une baisse de pigmentation au niveau du mésencéphale chez 5

36 patients (Göttle et al, 2014), correspondant à une baisse de neuromélanine, qui a un rôle protecteur en complexant les ions Fe3+ et en protégeant les neurones du stress oxydatif (Meiser et al, 2013). Une légère diminution de l’activité aconitase, ainsi qu’une augmentation de la peroxydation des lipides ont été mesurées dans le striatum de souris déficientes en HGPRT, mais aucune variation des taux de SOD, du glutathion ou de l’oxydation protéique (Visser et al, 2002). Plus récemment, le lien entre l’augmentation du taux d’hypoxanthine et le stress oxydant a été évalué chez des rats Wistar. L’administration intrastriatale d’hypoxanthine a entrainé une augmentation de l’inflammation et un stress oxydatif plus important, avec une augmentation de l’expression de la nitrite oxide synthase (NOS) et une diminution d’activité de la catalase, la SOD et la GPx (Glutathion peroxydase), associées à une augmentation des dommages à l’ADN (Biasibetti et al, 2017). L’administration d’hypoxanthine semble également entrainer des atteintes mitochondriales, avec une baisse d’activité et d’expression de la cytochrome c oxidase, enzyme limitante de la chaîne respiratoire mitochondriale, et une déplétion en ATP et une mortalité cellulaire augmentée par apoptose (Biasibetti-Brendler et al, 2018).

 Hypothèse neurodéveloppementale impliquant un défaut de la neurogénèse

Une origine neurodéveloppementale de la maladie de Lesch-Nyhan est envisagée. Afin de comprendre quelles étapes de la neurogénèse pourraient être affectées par la perte de l’enzyme HGPRT, plusieurs travaux se sont focalisés sur la recherche de facteurs précoces dérégulés dans différents modèles d’études. Plusieurs gènes associés à la neurogénèse en général et plus spécifiquement des facteurs impliqués dans le développement des neurones dopaminergiques ont ainsi été identifiés, avec par exemple la surexpression des gènes Engrailed-1 et 2 (EN-1, EN-2) détectée dans un modèle de neuroblastome murin MN9D déficient en HGPRT, cette dérégulation étant réversée après restauration de l’HGPRT. Cette surexpression est également mesurée dans des fibroblastes de patients, et est corrélée avec la sévérité de la maladie (Ceballos-Picot et al, 2009). L’équipe de Friedmann a quant à elle utilisé un modèle humain immortalisé de carcinome NT2, mis en différenciation neuronale après traitement à l’acide rétinoïque et exposé à un shRNA pour inactiver l’expression de l’HGPRT. Les auteurs ont mis en évidence un lien entre l’HGPRT et l’expression de plusieurs

37 facteurs de transcription impliqués dans le développement, la spécification et la maturation des neurones dopaminergiques, tels que LMX1-a, Msx1, Ngn2, ou encore Nurr1 et Pitx3. Une dérégulation de l’enzyme AADC, impliquée dans la synthèse de dopamine, a également été détectée, ainsi qu’une atteinte de la pousse neuritique (Guibinga et al, 2010). L’année d’après, la même équipe a identifié, toujours dans des cellules isolées de tumeurs déficientes en HGPRT, une dérégulation de plusieurs éléments de la voie Wnt/β-catenin, voie essentielle dans les processus neurodéveloppementaux. C’est également le cas pour deux autres facteurs, EN-1 et LMX1-a, impliqués dans le développement des neurones dopaminergiques (Kang et al, 2011). Le choix des modèles cellulaires pour effectuer ce type d’études est important. Or, les anomalies d’expression de gènes identifiées ont été rapportées dans des systèmes qui reposent en général sur des cellules qui n’ont pas d’origine neuronale telles que des cellules isolées de tumeurs ou des fibroblastes. Ces modèles ne semblent pas forcément prédictifs en ce qui concerne le développement des neurones humains, puisque ces gènes ont un rôle probablement différent de ceux décrits dans des cellules neuronales primaires. Des systèmes décrivant de manière plus fidèle le développement physiologique neuronal est donc nécessaire pour confirmer ces résultats et ainsi réellement évaluer leur pertinence dans la maladie de Lesch-Nyhan, bien que ces études apportent tout de même des éléments intéressants dans la compréhension des atteintes moléculaires liées à la perte de l’HGPRT.

Au final, aucune hypothèse n’a été formellement admise ou exclue. Il est probable, au vue du rôle pléthorique des purines dans le SNC, que les symptômes résultent d’une composante de ces différents mécanismes et touchent plusieurs systèmes neuronaux. Une approche thérapeutique globale visant le système HGPRT est donc à rechercher.

4. Aspects thérapeutiques de la maladie de Lesch-Nyhan

Bien qu’il soit possible aujourd’hui d’améliorer les symptômes métaboliques associés à l’hyperuricémie, il est pour le moment difficile d’envisager des solutions thérapeutiques efficaces pour contrôler les atteintes neuropsychiatriques, notamment en raison de l’absence d’un mécanisme clairement identifié associant la perte de l’activité de l’HGPRT et ses répercussions au niveau cérébral.

a) Prise en charge des atteintes métaboliques

La prise en charge de l’hyperuricémie chez les patients déficients en HGPRT repose essentiellement sur l’utilisation de l’allopurinol, un inhibiteur compétitif de la xanthine oxydase, utilisé depuis les années 1960 pour le traitement de la goutte (Klinenberg et al, 1965, Torres et al, 2007). Bien que cette molécule ne soit pas efficace sur les symptômes neurologiques et comportementaux, elle permet de réduire les taux d’urate dans le sérum de 47% et de diminuer le ratio acide urique urinaire/créatinine d’environ 74%, ce qui stabilise ou augmente la fonction rénale des patients traités (Torres et al, 2007). Cependant, chez les patients MLN et les variants, l’absence de recyclage médié par l’HGPRT entraine une augmentation de l’excrétion urinaire d’hypoxanthine et de xanthine de 5 et 10 fois respectivement, l’hypoxanthine n’étant plus recyclée pour la synthèse de nucléotides (Torres et al, 2007). L’augmentation du taux de xanthine atteint alors un niveau qui dépasse sa limite de solubilité, ce qui peut mener à la formation de lithiases xanthiques. Cela nécessite donc un ajustement précis du dosage en allopurinol, de façon à favoriser la formation d’hypoxanthine, plus soluble, et de vérifier la composition chimique des caillots lorsqu’ils se forment. Il n’existe pas à ce jour de consensus définissant une posologie optimale en allopurinol à adopter. Il est également important de maintenir une hydratation optimale afin d’éviter la précipitation des cristaux et de privilégier une alcalinisation des urines pour favoriser la forme ionisée de l’acide urique : l’urate de sodium, 18 fois plus soluble en solution aqueuse (Torres et al, 2012). De plus, étant un analogue de l’hypoxanthine, l’allopurinol est métabolisé par plusieurs enzymes de la voie des purines et des pyrimidines (Figure 12). Il est ainsi métabolisé en oxypurinol, forme active de l’allopurinol, qui est à l’origine de son action inhibitrice sur la XO. L’allopurinol est également métabolisé par l’HGPRT et l’OPRT (Orotate phosphoribosyltransferase) en analogues de nucléotides qui inhibent la PNP (Purine nucleoside phosphorylase) et l’OMPDC (Orotidine-5’- monophosphate decarboxylase), essentielle à la synthèse de pyrimidines (Busti and Herrington, 2015). Afin d’éviter d’exacerber la déplétion en nucléotides, une alternative à l’allopurinol serait d’utiliser le febuxostat, un inhibiteur non purinergique de la XO, ce qui rend ce composé plus sélectif. Son effet est également prolongé et plus efficace, avec une réduction de la concentration en urate dans le sérum de 74 à 80% chez des patients atteints

39 de goutte chronique (Becker et al, 2005). De manière générale, le febuxostat n’est pas utilisé en routine pour traiter l’hyperuricémie, mais peut être prescrit en alternative à l’allopurinol (Torres et al, 2012).

Figure 12 : Stratégies existantes pour le traitement de l’hyperuricémie dans la MLN (Busti and Herrington, 2015). Les stratégies visant à réduire la synthèse d’acide urique dans la MLN consistent à inhiber la xanthine oxidase (XO), favoriser le métabolisme de l’acide urique en allantoïne, ou à bloquer la purine nucleoside phosphorylase (PNP).

b) Prise en charge des atteintes neurologiques et comportementales

Aujourd’hui, la prise en charge des troubles neurocomportementaux est uniquement symptomatique, et repose sur un certain nombre de molécules non spécifiques telles que des relaxants musculaires de type benzodiazépines ou des inhibiteurs GABAergiques comme le baclofène. Ces derniers s’avèrent utiles pour contrôler les symptômes de type clonus et spasticité, mais semblent moins efficaces dans la prise en charge des atteintes extrapyramidales (Jinnah et al, 2006). Les benzodiazépines semblent également utiles pour améliorer certaines manifestations comportementales liées à l’anxiété, le stress étant un facteur déclencheur des automutilations (Torres and Puig, 2007). Celles-ci seraient également modulées par certains antiépileptiques comme la carbamazépine et la gabapentine, ainsi que par la risperidone, un antipsychotique (Harris, 2018). A ces

40 traitements doivent s’ajouter des mesures de rééducation physique, incluant la gestion de la dysarthrie et de la dysphagie, des aides à la marche et au contrôle des objets, des soutiens de posture évitant les malformations, mais également des mesures de gestion du stress et de restriction physique pour protéger les malades (utilisation de dentiers, coudières, gants, etc …). Des interventions chirurgicales, comme le retrait de certaines dents, peuvent également être envisagées pour prévenir le risque de mutilations. D’autres techniques se sont révélées intéressantes dans le contrôle des atteintes motrices et comportementales, comme c’est le cas pour la technique de stimulation cérébrale profonde (deep brain stimulation). Il s’agit d’une méthode invasive d’implantation d’électrodes dans le thalamus et le globus pallidus, qui sont stimulés de manière chronique à haute fréquence. Cette méthode peut être utilisée dans plusieurs états pathologiques comme la maladie de Parkinson, les dystonies, ou le syndrome de Gilles de la Tourette. Dans le cas de la MLN, plusieurs études ont été effectuées, permettant à la fois de réduire significativement les dystonies mais également d’améliorer les automutilations et les comportements agressifs sur plusieurs années d’études (Taira et al, 2003, Piedimonte et al, 2015). Bien que ces dispositifs montrent des résultats très encourageants, ce sont pour le moment des études de cas réservés aux patients réfractaires aux traitements disponibles. Il s’agit d’une approche chirurgicale invasive, qui fait encore l’objet de nombreuses évaluations, et qui nécessite un suivi post-opératoire assez lourd.

La maladie de Lesch-Nyhan est donc une pathologie complexe, dont la prise en charge nécessite la combinaison d’agents thérapeutiques, incluant des molécules hypo- uricémiantes, des relaxants musculaires et des anti-épileptiques, et qui nécessite des mesures strictes de nutrition, de protection, et de rééducation. Cette prise en charge est uniquement symptomatique et les molécules présentent un certain nombre de limites comme on l’a vu précédemment. Il est donc nécessaire de rechercher de nouvelles molécules agissant de manière plus spécifique sur le métabolisme des neurones, de manière à rétablir un équilibre au niveau du cycle des purines, en compensant le dysfonctionnement de recyclage médié par l’HGPRT.

5. Modèles d’étude de la maladie de Lesch-Nyhan

a) Les modèles animaux

 Les modèles génétiques

Les premiers modèles animaux générés pour l’étude de la MLN datent de 1987. Il s’agit de modèles murins dont le gène HGPRT a été inactivé par insertion rétrovirale (Kuehn et al, 1987) ou obtenus après sélection de mutations spontanées de l’HGPRT dans des cellules souches embryonnaires après traitement par la 6-thioguanine (Hooper et al, 1987). Les modèles génétiques reproduisent bien certains défauts métaboliques, comme l’absence d’activité HGPRT ou une synthèse accrue de purines due à l’accélération de la voie de synthèse de novo (Jinnah et al, 1993). En revanche, ils n’accumulent pas d’acide urique car les souris possèdent l’uricase, une enzyme supplémentaire qui permet de dégrader l’acide urique en allantoïne, métabolite facilement excrété dans les urines. D’un point de vue neurochimique, les souris démontrent une baisse de dopamine de 48 à 64% au niveau du noyau caudé et du putamen, ainsi qu’une baisse de 45% d’activité de la TH. Le niveau des autres neurotransmetteurs est quant à lui normal (Jinnah et al, 1994). Bien que ces modèles semblent intéressants pour étudier les atteintes métaboliques, ils ne démontrent aucune anomalie neurologique ou comportementale caractéristique de la MLN (Tableau 3). Cette absence de manifestations pourrait être liée à l’existence de voies de compensation chez la souris, telles que l’activation de l’APRT, responsable du recyclage de l’adénine en AMP. Une approche différente a ainsi consisté à générer des souris double-mutantes APRT et HGPRT. Ces modèles récapitulent les atteintes métaboliques liées à l’inactivation de ces enzymes, mais ne démontrent aucune atteinte neurocomportementale, ce qui suggère que l’APRT ne joue pas de rôle différent entre la souris et l’homme (Engle et al, 1996). Keebaugh et ses collègues se sont quant à eux intéressés au rôle physiologique de PRTFDC1 (Phosphoribosyltransferase domain containing protein 1), un gène paralogue de l’HGPRT. Chez l’homme, l’enzyme PRTFDC1 est capable de convertir la guanine et l’hypoxanthine en GMP et en IMP avec une efficacité catalytique très faible, à savoir 0,26 et 0,09% respectivement, à cause notamment d’une mutation faux-sens au niveau du site catalytique (Welin et al, 2010). Ce pseudogène étant inactivé chez la souris, les auteurs se

42 sont demandé si la présence ou l’absence de PRTFDC1 pouvait jouer un rôle dans les différences de phénotype comportemental observées entre la souris et l’homme. L’étude a démontré que les souris transgéniques déficientes en HGPRT mais exprimant PRTFDC1 étaient plus agressives et plus sensibles aux stéréotypies induites par les amphétamines (mouvements répétitifs pattes – bouche) que les souris wild-type, HGPRT -, et exprimant uniquement le transgène (Keebaugh et al, 2011). Ces résultats pourraient suggérer une interaction génétique entre PRTFDC1 et HGPRT, mais le rôle précis de PRTFDC1 et sa fonction de régulation restent encore à étudier.

Tableau 3 : Similarités phénotypiques entre la MLN et la souris HGPRT - (Jinnah et al, 1994).

Enfin, le rat étant un modèle privilégié pour l’étude des maladies neurologiques et les études comportementales, un modèle génétique a vu le jour en 2016, consistant à inactiver le gène HGPRT dans des cellules souches embryonnaires. Les analyses du métabolome ont démontré la dérégulation d’une vingtaine de métabolites associés aux purines et aux pyrimidines, ainsi qu’une déplétion en dopamine approchant les 60%. Une baisse de sérotonine atteignant les 50% a également été observée au niveau de l’hippocampe et du striatum. Bien que ce modèle semble plus fidèle que la souris pour étudier l’impact de la perte de l’HGPRT sur la biochimie dans le cerveau du rat, aucune manifestation comportementale spontanée n’est observée (Meek et al, 2016).

 Les modèles phénotypiques

Le modèle phénotypique le plus connu correspond au rat traité par la 6- hydroxydopamine (6-OHDA). Cette molécule, qui détruit de façon sélective les neurones catécholaminergiques, à savoir les neurones dopaminergiques et noradrénergiques, est injectée par voie intracisternale dans des cerveaux de rats nouveau-nés. Elle est souvent associée à la désipramine, un inhibiteur sélectif de la recapture de noradrénaline, afin de cibler spécifiquement les neurones dopaminergiques (Thiele et al, 2012). A l’adolescence, après administration de L-Dopa, un précurseur de la dopamine, ces rats manifestent des troubles comportementaux de type automutilation et agressivité similaires aux individus atteints de la MLN (Breese et al, 1984). Il est intéressant de noter que la survenue de ces symptômes dépend de la fenêtre temporelle à laquelle les rats reçoivent la drogue : seuls les rats traités à la naissance, à la différence des adultes, développent ce type de symptômes (Figure 13). Alors que la L-Dopa a une action thérapeutique chez les rats adultes traités à la 6-OHDA en restaurant un comportement moteur normal, cette molécule exacerbe l’hyperactivité et l’automutilation à un stade plus précoce (Breese et al, 2005).

Figure 13 : Caractéristiques du modèle phénotypique de rat traité à la 6-hydroxydopamine (Breese et al, 1984, Breese et al, 2005). La 6-OHDA détruit de manière sélective les neurones dopaminergiques, démontré par la perte de marquage TH (Tyrosine hydroxylase) au niveau striatal (A). Les atteintes comportementales de type automutilations se déclarent uniquement à un stade précoce, lorsque les rats sont traités peu après la naissance par la L-Dopa (B).

Ce modèle peut donc se révéler utile au niveau préclinique pour valider des nouvelles drogues agissant sur les atteintes comportementales. Il est également intéressant d’un point de vue bioéthique car les stéréotypies n’ont pas lieu en continu mais sont induites chimiquement par la L-Dopa, et peuvent être facilement stoppées à l’aide d’un antagoniste des récepteurs D1, dans le cas où les morsures se révèleraient trop sévères. En revanche, n’étant pas un modèle génétique, il ne reproduit pas directement les défauts associés à la perte de l’HGPRT et n’est donc pas exploitable pour des études mécanistiques.

Aucun modèle animal ne récapitule donc à la fois les symptômes neurologiques ou comportementaux de la MLN et les atteintes du métabolisme des purines. Ceci indique que le cerveau des rongeurs a développé des stratégies métaboliques alternatives qui sont absentes chez l’homme, ou que des processus dépendant des purines ne sont pas présents chez le rongeur au cours de la neurogénèse.

b) Les modèles in vitro

En raison de la faible prévalence de la maladie et de la difficulté à obtenir les tissus neuronaux affectés, les recherches se sont majoritairement tournées vers des modèles cellulaires périphériques, prélevés chez des patients MLN, ainsi que vers des lignées neuronales génétiquement modifiées. Les modèles les plus fréquemment utilisés consistent en des cellules primaires obtenues facilement chez les patients à partir de peau (fibroblastes), ou d’échantillons de sang (érythrocytes ou lymphocytes). Ces cellules présentent l’intérêt de posséder le patrimoine génétique des patients MLN et donc les mutations responsables de la pathologie. Elles sont largement utilisées pour étudier les conséquences biochimiques de la perte de l’enzyme HGPRT, mais en raison de leur nature, ne sont pas utilisables pour comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des atteintes neurologiques (Jinnah et al, 2009). De plus, le métabolisme des purines dans ces cellules semble différent de celui du cerveau, et notamment des neurones en développement, qui tend à d’avantage dépendre du recyclage avec une synthèse de novo peu active (Howard et al, 1970, Allsop and Watts, 1980). L’accès à du tissu neuronal primaire et des neurones en développement est également difficile et les

études reposent uniquement sur des analyses post mortem de cerveaux de patients MLN ou sur de l’imagerie. Elles ont donc lieu tardivement dans l’évolution de la pathologie. Pour tenter de contourner ce problème, des cellules déficientes en HGPRT ont été développées à partir de lignées tumorales de type gliome ou neuroblastome. C’est le cas par exemple des cellules humaines SH-SY5Y issues de neuroblastome (Kang et al, 2011), des cellules MN9D, provenant de la fusion somatique de cellules embryonnaires du mésencéphale ventral et de cellules de neuroblastome (Ceballos-Picot et al, 2009), ou encore de la lignée NTERA-2 cl.D1 (NT2/D1), issue d’un carcinome testiculaire embryonnaire et différenciée en cellules neurales après traitement par de l’acide rétinoïque, inducteur du lignage neuro-ectodermique (Guibinga et al, 2010). Ces lignées sont en général modifiées à l’aide de shRNA pour inactiver l’expression de l’HGPRT, puis sont mises en culture dans un milieu sélectif contenant de la 6-thioguanine. Ces modèles in vitro sont fréquemment utilisés dans l’étude des cellules dopaminergiques car elles expriment des marqueurs comme la TH et synthétisent et libèrent de la dopamine. Dans le cas de la MLN, ces systèmes ont permis de mettre en évidence la dérégulation de l’expression de messagers codant pour des facteurs de transcription associés à la neurogénèse ou à la survie neuronale (Ceballos-Picot et al, 2009). Toutefois, ils présentent un certain nombre de limites. Les populations cellulaires obtenues avec ces modèles sont fortement hétérogènes et relativement éloignées des populations physiologiquement touchées dans la MLN (Guibinga et al, 2010). De plus, de par leur origine tumorale, elles ne récapitulent pas les étapes clé du développement neuronal, et semblent donc peu prédictives d’un point de vue fonctionnel, par rapport aux populations d’intérêt touchées dans la MLN (Rick et al, 2006). Il n'est effectivement pas exclu que les gènes étudiés dans ces modèles présentent des rôles physiologiques et des voies de régulation différents que ceux décrits dans les populations primaires, et l’impact réel de leur modification reste donc à évaluer dans le cas de la MLN.

Ces différents points posent donc un certain nombre de limites pour l’utilisation de ces modèles dans la recherche de nouvelles molécules, notamment par des approches à large échelle, qui nécessitent d’avoir accès à des populations de neurones stables, en grande quantité, et suffisamment prédictifs pour l’étude de la MLN, à savoir des neurones en développement. Une alternative intéressante consiste à développer ces modèles en utilisant la technologie des cellules souches pluripotentes humaines (CSPh). Ces cellules ont les

46 avantages suivants : elles peuvent être obtenues par reprogrammation directement à partir de cellules somatiques d’individus sains ou atteints de la MLN, et possèdent donc les mutations causales de la maladie, sur un fond génétique humain. Leur propriété d’autorenouvellement permet de les maintenir sur de longues périodes en culture et donc d’obtenir le matériel cellulaire nécessaire au criblage à haut débit. Enfin, leur propriété de pluripotence permet de les différencier dans tous les types cellulaires de l’organisme : elles représentent donc une source unique de cellules neuronales humaines, inaccessibles par d’autres méthodes de prélèvement.

III. Les cellules souches pluripotentes, un modèle d’étude de la maladie de Lesch-Nyhan

1. Définition des cellules souches pluripotentes

Les cellules souches pluripotentes (CSP) sont des cellules présentant deux caractéristiques principales : l’autorenouvellement et la pluripotence. Les cellules souches ont la capacité de s’autorenouveler de façon illimitée, in vitro, pour former, au cours des mitoses successives, des cellules filles identiques à la cellule d’origine d’un point de vue génétique et épigénétique. Ces cellules conservent également d’une génération à l’autre leur caractéristique de pluripotence, à savoir la capacité à s’engager, sous l’influence de signaux spécifiques, dans différentes voies de différenciation, et donc de former des cellules spécialisées dérivées des trois feuillets embryonnaires (ectoderme, mésoderme et endoderme), ainsi que des cellules germinales (Figure 14). Ces deux propriétés uniques rendent ces cellules particulièrement attractives en recherche, puisqu’elles permettent d’avoir accès à des quantités importantes de cellules, nécessaires à des approches de criblage à haut débit ou de thérapie cellulaire par exemple. Elles permettent également d’obtenir des types cellulaires difficilement accessibles en temps normal, ce qui est utile pour étudier les processus physiologiques au cours du développement et comprendre l’impact d’une mutation sur un type cellulaire touché dans une maladie. Elles représentent une source unique de cellules humaines appartenant au lignage neuronal, et notamment de cellules souches neurales (NSC, neural stem cells), difficilement

47 accessibles autrement puisqu’elles n’existent que transitoirement pendant le développement. Aujourd’hui, les CSPh peuvent être obtenues de deux manières différentes, la première après isolation de la masse interne de blastocystes humains (cellules souches embryonnaires humaines, CSEh), la seconde à partir de cellules somatiques génétiquement reprogrammées. On parle alors de cellules souches induites à la pluripotence (iPSC, induced pluripotent stem cells).

Figure 14 : Schéma représentatif des différents types de cellules souches (Hayes et al, 2012). Différents types de cellules souches existent, classées selon leur potentiel de différenciation : les cellules souches pluripotentes sont capables de former les trois feuillets germinaux, mais pas les annexes extra-embryonnaires, contrairement aux cellules totipotentes. Les cellules souches adultes sont multipotentes et ont un spectre plus restreint de différenciation, en s’engageant spécifiquement vers un lignage précis.

2. Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh)

a) Définition et obtention des CSEh

La recherche sur les cellules souches pluripotentes a débuté dans les années 1960, avec la formation de tératocarcinomes après transplantation de crêtes génitales fœtales dans des testicules adultes de souris, et leur dérivation en lignées de cellules indifférenciées appelées cellules souches embryonnaires de carcinome (ECC) (Stevens, 1964). La

48 pluripotence des ECC s’est cependant révélée restreinte, mais leur étude a été déterminante pour l’obtention d’un autre type de cellules souches en 1981 : les cellules souches embryonnaires murines (CSEm), provenant de la masse cellulaire interne d’un blastocyste, et cultivées sans passer par la formation de tératocarcinomes (Evans and Kaufman, 1981, Martin, 1981). Les cellules prélevées sont mises en culture sur des matrices contenant des cellules nourricières appelées feeders et correspondant à des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF, mouse embryonic fibroblasts), puis sont amplifiées in vitro pour donner naissance aux CSEm. Ces lignées sont capables d’être facilement maintenues en culture, tout en conservant leur intégrité génétique et leur pluripotence. En l’absence de MEF, elles forment des agrégats en suspension appelés corps embryoïdes (EBs, embryoid bodies), qui se différencient spontanément en différents types cellulaires, ce qui montre l’importance d’une coculture pour leur maintien à l’état indifférencié (Martin, 1981). La première lignée de CSE a été établie chez l’homme en 1998 (Thomson et al, 1998). Comme les CSEm, les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont prélevées à partir de la masse interne du blastocyste, qui, lors de l’embryogénèse, correspond aux jours 5 à 7 après fécondation. In vitro, ces cellules se présentent sous la forme de colonies plates qui s’étalent de manière circulaire au cours des mitoses successives, tout en conservant sur un grand nombre de passages leur caractéristique de pluripotence, ainsi qu’un caryotype normal (Figure 15). Les CSEh expriment des marqueurs de surface caractéristiques d’un état indifférencié tels que SSEA-3, SSEA-4 (stage-specific embryonic antigens), TRA-1-60 et TRA-1-81 (tumor-related antigen), et forment des tératomes après injection chez la souris (Thomson et al, 1998).

Figure 15 : Exemple de colonies de cellules souches embryonnaires humaines (Thomson et al, 1998). Les CSEh se présentent sous la forme de colonies circulaires, cultivées sur un feeder constitué de fibroblastes embryonnaires de souris. Barre d’échelle à 100 µm.

En pratique, les CSEh sont isolées à partir d’embryons surnuméraires obtenus dans le cadre d’une fécondation in vitro (FIV), exclusivement dans le cadre strict d’un projet parental. Après consentement des parents, les embryons surnuméraires ou ne pouvant pas être implantés peuvent faire l’objet de recherches scientifiques, en accord avec la loi de bioéthique de 2011. Dans le cas où un couple présente un risque important de transmettre une anomalie génétique ou chromosomique incurable, un diagnostic préimplantatoire (DPI) peut être proposé, toujours dans le cadre d’une FIV. Le DPI correspond à l’étude par PCR ou hybridation in situ du matériel génétique des blastomères prélevés sur l’embryon au troisième jour de développement. A nouveau, les embryons porteurs d’anomalies génétiques faisant l’objet d’un abandon de projet parental peuvent être donnés à la science, les CSEh ainsi obtenues représentant de bons modèles d’étude de la maladie.

b) Limites des CSEh

Les cellules souches embryonnaires sont donc extrêmement intéressantes d’un point de vue scientifique. En revanche, certaines limitations se posent. Tout d’abord, le DPI étant effectué pour un nombre restreint de maladies génétiques, la diversité des maladies pouvant être étudiées par cette approche est limitée. En 2015, le rapport de l’agence française de la biomédecine faisait état de 221 maladies génétiques différentes ayant bénéficié d’une mise au point en vue d’un diagnostic préimplantatoire (Rapport d’activité annuel de DPI 2015), alors qu’on dénombre entre 6000 et 8000 maladies génétiques différentes. De plus, l’obtention des cellules souches embryonnaires humaines soulève de nombreuses questions éthiques puisqu’elle nécessite la destruction d’un embryon. En France, la recherche sur l’embryon était totalement interdite jusqu’en 2004, date à laquelle certaines dérogations ont pu être mises en place sous le contrôle de l’agence de la biomédecine (ABM), pour une durée maximale de cinq ans. Les projets de recherche concernés doivent absolument « permettre des progrès thérapeutiques majeurs et à la condition que ces recherches ne puissent être poursuivies par une méthode alternative d‘efficacité comparable » (Loi du 6 août 2004). En 2011, le projet de loi évolue et permet, toujours sous dérogation et contrôle de l’ABM, une recherche sur les CSEh non limitée dans le temps (Loi du 7 juillet 2011). Il faut attendre 2013 pour que la recherche sur l’embryon et

50 les CSEh soit autorisée, toujours sous conditions et sous l’encadrement de l’ABM (Loi du 6 août 2013). L’article L. 2151-5, stipule alors qu’un protocole de recherche ne peut être autorisé que si « la pertinence scientifique de la recherche est établie », si elle « s'inscrit dans une finalité médicale », si « en l'état des connaissances scientifiques, cette recherche ne peut être menée sans recourir à ces embryons ou ces cellules souches embryonnaires », et si « le projet et les conditions de mise en œuvre du protocole respectent les principes éthiques relatifs à la recherche sur l'embryon et les cellules souches embryonnaires ».

Le travail sur les CSEh est donc compliqué, aussi bien d’un point de vue règlementaire et bioéthique que pour l’obtention du matériel cellulaire. Dans le cadre de la maladie de Lesch-Nyhan, la faible prévalence de la maladie (1/380 000) rend difficile le fait de trouver des CSEh portant les mutations causales. Il est donc nécessaire de trouver une source alternative de cellules qui présentent les mêmes avantages que les CSEh, mais plus facilement exploitables.

3. Les cellules souches induites à la pluripotence (iPSC), une alternative aux CSEh

a) Découverte et obtention des iPSC

La nécessité d’obtenir des cellules histocompatibles pour éviter les problèmes de rejets après transplantation a fait émerger l’idée de générer des cellules pluripotentes directement à partir de cellules somatiques du patient. Historiquement, plusieurs stratégies de reprogrammation des cellules somatiques ont été développées, telles que le transfert de leur noyau dans des ovocytes non fécondés (Wilmut et al, 1997), ou en les fusionnant avec des CSE (Cowan et al, 2005, Tada et al, 2001). En 2006, le professeur Yamanaka a émis l’hypothèse que des facteurs essentiels contenus dans ces cellules puissent conférer la pluripotence à des cellules somatiques. Il a ainsi testé 24 gènes impliqués dans le maintien de la pluripotence et la prolifération des CSE, et a déterminé qu’une combinaison de quatre facteurs était suffisante pour induire une reprogrammation de fibroblastes murins fœtaux (MEFs) en cellules pluripotentes similaires aux CSEm, et baptisées cellules souches induites à la pluripotence (iPSC, induced pluripotent stem cells) (Takahashi and Yamanaka, 2006). Les gènes identifiés, Oct3/4, Sox2, c-Myc et Klf4, sont apportés dans les MEFs par un système

51 d’expression basé sur des vecteurs rétroviraux. Bien que la fréquence de reprogrammation soit extrêmement faible, les iPSC obtenues présentent la même morphologie et expriment les marqueurs spécifiques des CSE. L’injection de ces cellules chez la souris induit également la formation de tératomes et ces dernières sont capables de se différencier vers les trois feuillets embryonnaires. La reprogrammation de cellules somatiques chez l’homme a été réalisée l’année suivante par deux équipes, en utilisant deux combinaisons différentes de gènes. L’équipe de Yamanaka a utilisé la même association que celle utilisée chez la souris, à savoir Oct3/4, Sox2, c-Myc et Klf4, apportés par un vecteur rétroviral (Takahashi et al, 2007), alors que Thomson a choisi de coupler Oct4 et Sox2 avec LIN28 et Nanog, en utilisant des lentivirus (Yu et al, 2007). Les facteurs de transcription Oct4 et Sox2 agiraient de manière synergique en activant des gènes associés à l’état de pluripotence, tout en dérégulant les gènes de différenciation, alors que c-Myc et Klf4 modifieraient la structure de la chromatine, notamment en modulant l’acétylation des histones (Takahashi et al, 2007). Parallèlement, Nanog jouerait sur l’efficacité de la reprogrammation et la survie des cellules, l’action de LIN28 semblant quant à elle plus réduite (Yu et al, 2007). Ces travaux ont permis d’obtenir des colonies d’hiPSC (human induced pluripotent stem cells) similaires aux CSEh en termes de morphologie, prolifération, marqueurs de surface, expression génique, différentiation ou formation de tératomes (Figure 16). Cette découverte est majeure puisqu’elle permettrait de créer des lignées de cellules souches pluripotentes spécifiques de patients, tout en contournant les problèmes éthiques liés à la destruction d’un embryon. Ces travaux ont valu à Shinya Yamanaka, ainsi qu’au Britannique John Gurdon les prix Nobel de médecine de 2012.

Figure 16 : Schéma démontrant le principe général d’obtention des iPSC (Yamanaka and Blau, 2010).

Les iPSC sont obtenues après reprogrammation de cellules somatiques d’un individu, le plus souvent des fibroblastes, à l’aide de vecteurs exprimant 4 facteurs de pluripotence : Oct4, Sox2, c-Myc et Klf4 (facteurs de Yamanaka). Après une trentaine de jours en culture, des colonies d’iPSC apparaissent, ces dernières pouvant être maintenues sur de nombreux passages avant d’être différentiées dans le type cellulaire souhaité.

Depuis 2007, d’autres types cellulaires ont pu être reprogrammés comme les kératinocytes ou les hépatocytes, avec des fréquences de reprogrammation variables, comprises en général entre 0,01 et 1,5% (Stadtfeld and Hochedlinger 2010). Les fibroblastes restent largement utilisés en raison de leur facilité d’accès par des biopsies cutanées, ainsi que leur culture maitrisée. En ce qui concerne les méthodes de reprogrammation, l’utilisation de vecteurs intégratifs comme les rétrovirus compromet l’utilisation des hiPSC en clinique. En effet, les gènes sont susceptibles de s’insérer dans des sites critiques de l’ADN (oncogènes), et leur expression peut se réactiver ultérieurement. C’est le cas par exemple pour c-Myc, dont la réactivation aurait été responsable de l’apparition de tumeurs dans des souris chimériques (Okita et al, 2007). Plusieurs approches alternatives ont donc vu le jour, consistant à utiliser des vecteurs non-intégratifs comme les adénovirus, qui permettent l’expression transitoire des transgènes, mais dont l’efficacité d’infection reste faible avec une fréquence de reprogrammation variant entre 0,0001 et 0,0018% chez la souris, contre 0,1% avec les méthodes utilisant les rétrovirus ou les lentivirus (Gonzalez et al, 2011).

Figure 17 : Schéma récapitulatif des différentes méthodes de reprogrammation (Gonzalez et al, 2011). Le choix de ces techniques dépend de la balance entre leur efficacité de reprogrammation et leur innocuité d’un point de vue intégrité du génome (mutagénèse insertionnelle et réactivation des facteurs).

Des fibroblastes ont également été reprogrammés avec des vecteurs dérivés du virus de Sendaï, qui se répliquent sous forme d’ARN simple brin dans le cytoplasme des cellules

53 infectées, et qui démontrent une efficacité de reprogrammation similaire aux vecteurs intégratifs (Fusaki et al, 2009). Des méthodes non virales ont par ailleurs été développées, basées sur l’utilisation des épisomes, des ADN extrachromosomiques codant les différents facteurs de reprogrammation, ou sur des méthodes n’utilisant pas l’ADN tels que les ARNm synthétiques et les protéines recombinantes (Gonzalez et al, 2011), ou encore les petites molécules chimiques (Hou et al, 2013). Ces techniques, d’efficacité variable, présentent l’avantage d’éliminer entièrement les vecteurs viraux et les plasmides des cellules, et sont plus faciles à mettre en place en laboratoire (Figure 17). Une approche de reprogrammation basée sur la technique CRISPR-Cas9 a également été publiée récemment, basée sur le contrôle transcriptionnel des gènes Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc et LIN28A après recrutement d’une Cas9 inactive (dCas9) (Weltner et al, 2018).

b) Limites des cellules souches induites à la pluripotence

La principale limite des iPSC provient des différences observées au niveau du profil épigénétique par rapport aux CSE. En effet, la reprogrammation est un processus artificiel qui nécessite une adaptation du génome, contrairement aux CSE dont l’état de pluripotence est naturel au cours de l’embryogénèse. Des études transcriptomiques réalisées sur des iPSC et des CSE ont ainsi montré des différences d’expression génique entre les deux populations, avec une mémoire épigénétique marquée des iPSC par rapport aux cellules somatiques dont elles proviennent (Chin et al, 2009). Cette signature se manifeste notamment par un profil de méthylation de l’ADN caractéristique des cellules de départ, mais également spécifique à l’état iPSC, et qui peut être transmise avec une fréquence importante au cours de la différenciation (Lister et al, 2011). Bien que cette mémoire épigénétique semble se réduire au fur et à mesure des passages (Chin et al, 2009), elle est un paramètre à prendre en compte dans les études de modélisation des maladies génétiques puisque cela peut affecter ou au contraire favoriser les capacités de différenciation des iPSC vers certains types cellulaires. Il a été montré que les iPSC se différenciaient plus facilement dans leur lignée cellulaire d’origine : les iPSC provenant de sang de cordon ombilical semblent par exemple se différencier plus facilement en cellules hématopoïétiques que les iPSC dérivées de kératinocytes (Kim et al, 2011). Ces différences épigénétiques rencontrées dans les iPSC peuvent directement impacter l’étude de certains syndromes comme celui de l’X fragile,

54 dont les iPSC provenant de fibroblastes mutés montrent un profil fortement méthylé avec une inactivation du gène FMR1 (due à la mémoire épigénétique : les niveaux de méthylation sont comparables aux cellules d’origine), alors que les CSE l’expriment avant d’être réprimé à un état différencié (Halevy and Urbach, 2014). L’étude de Gage a quant à elle démontrée que les profils de méthylation liés à l’âge étaient effacés au cours de la reprogrammation, restreignant l’utilisation des iPSC pour étudier des maladies neurodégénératives (Mertens et al, 2015). Par ailleurs, le processus de reprogrammation est susceptible d’entrainer la survenue de mutations, ce qui pose la question de l’intégrité génomique des iPSC par rapport aux CSE. Ces anomalies cytogénétiques ont tendance à s’accumuler au cours des passages successifs, et consistent le plus souvent en des instabilités chromosomiques telles que des trisomies impliquant les chromosomes 12, 20, 8 ou X, une augmentation anormale de CNVs (Copy Number Variations), avec l’amplification ou la délétion de certaines zones telles que l’amplification de la région 20q11.21, décrite comme la CNV la plus fréquente. Des mutations de type SNVs (Single Nucleotide Variations) sont également fréquentes. L’origine de ces variations génétiques ne sont pas encore clairement définies, mais semblent provenir à la fois des conditions de culture, du processus de reprogrammation, mais aussi du fond génétique des cellules somatiques d’origine (Turinetto et al, 2017).

Ces données mettent donc en évidence un certain nombre de différences entre les CSE et les iPSC, aussi bien d‘un point de vue épigénétique que sur leur intégrité génomique. Les deux types de CSP ont leurs avantages et leurs limites, et le choix du matériel cellulaire dépend de la disponibilité des cellules de départ et du type d’utilisation que l’on souhaite faire. Dans tous les cas, il est nécessaire de réaliser des contrôles qualité pour vérifier l’intégrité cytogénétique, que ce soit après reprogrammation ou durant leur maintien en culture.

4. Application des cellules souches pluripotentes

Les cellules souches pluripotentes permettent d’avoir accès à des quantités importantes de cellules et de travailler sur des types cellulaires difficilement accessibles en temps normal, grâce à la mise au point de protocoles spécifiques reproduisant le plus fidèlement possible des étapes clé du développement. Les CSP représentent donc des outils

55 particulièrement pertinents de bio-ingénierie tissulaire, ou pour modéliser des maladies génétiques et rechercher des molécules actives (Figure 18).

Figure 18 : Application des cellules souches pluripotentes (Robinton and Daley, 2012). Les iPSC, reprogrammées à partir de cellules somatiques d’un patient, peuvent être corrigées génétiquement, puis différenciées dans le type cellulaire affecté dans la pathologie, avant d’être transplantées chez le patient (thérapie cellulaire). Par ailleurs, les iPSC peuvent servir à étudier l’impact de mutations dans le type cellulaire affecté dans une maladie. Ces cellules permettent alors de réaliser des études mécanistiques et de trouver de nouveaux axes thérapeutiques, par exemple par des approches de criblage de composés chimiques.

a) Thérapie cellulaire de remplacement

La thérapie cellulaire de remplacement consiste à greffer des cellules différenciées à partir de CSP dans le but de remplacer les cellules absentes, non fonctionnelles ou perdues dans le contexte d’une maladie donnée. Deux stratégies existent, la première consistant à injecter directement des cellules saines provenant de CSE ou d’iPSC, la seconde consistant à utiliser des cellules provenant du patient lui-même et à les corriger génétiquement, avant de les greffer en retour (Figure 18). Cette thérapie personnalisée présente l’avantage d’éviter tout problème de rejet de greffe et de limiter l’utilisation d’immunosuppresseurs, mais est coûteuse et chronophage, par rapport aux cellules thérapeutiques issues de banques.

b) Modélisation des maladies génétiques et recherche de molécules actives

 Modélisation des maladies génétiques

Une autre application des CSP consiste à étudier l’impact des mutations causales de maladies génétiques sur les types cellulaires affectés (Figure 18). Cette approche permet à la fois d’étudier les mécanismes responsables de la pathologie mais également de déterminer des phénotypes pertinents utilisables pour tester l’effet de molécules chimiques, par exemple par des approches de criblage à haut débit. De nombreux protocoles de différenciation ont ainsi été développés à partir de CSP humaines et permettent aujourd’hui d’avoir accès à un grand nombre de modèles cellulaires affectés dans des états pathologiques variés, tels que certaines populations de motoneurones (Maury et al, 2015), les neurones corticaux (Boissart et al, 2013), ou les neurones dopaminergiques (Kirkeby et al, 2013), dans le cas d’études de maladies neurologiques. En ce qui concerne la maladie de Lesch-Nyhan, nous avons souhaité modéliser l’atteinte métabolique touchant les neurones du SNC en général en utilisant comme support biologique des CSP différenciées dans le lignage cortical (Figure 19).

Figure 19 : Méthode d’obtention de cellules appartenant au lignage cortical (Boissart et al, 2013). Le protocole utilisé ici permet d’avoir accès à des progéniteurs corticaux (LCP, late cortical progenitors) à partir de CSP, qui peuvent être amplifiés et congelés, avant de se différencier de manière spontanée en neurones matures après retrait des cytokines.

Le protocole de différenciation utilisé permet de générer une population de progéniteurs corticaux à partir de cellules neuro-épithéliales dérivées de cellules souches pluripotentes par l’inhibition double des voies SMAD (Boissart et al, 2012 et 2013). Ces NSC

57 ont l’avantage de s’auto-renouveler en culture de manière stable et homogène, et peuvent être congelées, avant de se différencier de manière spontanée en neurones des couches superficielles du cortex (II-IV), après retrait des cytokines du milieu et en 14 jours seulement. Les neurones obtenus développent rapidement un réseau neuritique complexe et sont caractérisés par l’expression de marqueurs neuronaux tels que la β-III tubuline (anticorps Tuj-1), MAP-2 (Microtubule-Associated Protein 2), ou le facteur d’épissage HuC/D. La population de neurones est caractérisée par une proportion majoritaire de neurones glutamatergiques (exprimant les protéines vésiculaires vGlut-1 et v-Glut-2), d’interneurones GABAergiques (qui synthétisent le GABA), de neurones catécholaminergiques (exprimant la Tyrosine Hydroxylase) ou encore d’astrocytes (positifs pour la protéine GFAP). L’ensemble de ces caractéristiques est décrit de manière extensive dans Boissart et al, 2013.

 Recherche de composés thérapeutiques

Les modèles cellulaires obtenus à partir des CSPh peuvent servir d’outils pour la recherche ou la validation de nouvelles molécules thérapeutiques, notamment par des approches à faible débit (hypothesis-driven drug discovery). La metformine, par exemple, s’est révélée efficace dans un modèle basé sur l’utilisation de MSC (mesenchymal stem cells) dérivées d’iPSC porteuses de mutations à l’origine du syndrome de Progeria, en modulant de manière indirecte l’épissage alternatif de LMNA, dont la forme tronquée (progérine) est toxique pour la cellule (Egesipe et al, 2016). L’utilisation de myotubes dérivés d’iPSC DMD (dystrophie musculaire de Duchenne) à quant à elle permis de valider l’efficacité de plusieurs molécules agissant par saut d’exon, rétablissant ainsi l’expression d’une dystrophine tronquée mais fonctionnelle (Shoji et al, 2015). Les CSP peuvent aussi être utilisées pour une recherche de molécules à large échelle par la technique de criblage à haut débit (HTS, High Throughput Screening). Le HTS consiste à tester de manière automatisée des milliers de composés chimiques sur un type cellulaire d’intérêt, et d’identifier les molécules efficaces (candidats, ou hits) sur la base d’un biomarqueur significativement modifié par l’état pathologique. Ce biomarqueur peut être moléculaire (activité enzymatique, expression d’un ARN ou d’une protéine, interactions de deux partenaires, …) ou phénotypique (morphologie cellulaire, prolifération, apoptose, …) (Figure 20).

Figure 20 : Principe général d’une approche de criblage à haut débit. Une approche de criblage repose sur l’automatisation et la miniaturisation d’un test in vitro, appliqué à un modèle cellulaire d’intérêt, sur lequel plusieurs milliers de composés chimiques issus de banques sont testés.

Plusieurs paramètres sont à prendre en compte dans la mise en place d’une stratégie de criblage :

- Choix des composés : Les composés à tester sont issus de banques ou libraires chimiques commerciales appelées chimiothèques, qui contiennent jusqu’à plusieurs centaines de milliers de molécules. Ces banques peuvent contenir des molécules nouvellement synthétisées et donc représentatives d’une grande diversité structurale, ce qui augmente la probabilité d’identifier des molécules actives. Une autre stratégie consiste à tester des banques de composés dont la cible ou le mécanisme d’action sont connus, et représentatifs de voies de signalisation précises (composés outils). Dans certains cas, ils sont susceptibles de déjà posséder une AMM pour une indication clinique (composés repositionnables), ce qui a l’avantage de réduire les coûts de recherche et de développement puisque les profils toxicologiques et pharmacocinétiques sont déjà connus, et ils ont été validés par des agences règlementaires. Pour ce travail, nous avons choisi la seconde stratégie, plus restreinte en termes de nombre de composés à tester, mais qui donnera d’avantage d’informations sur le plan mécanistique, et qui facilitera le développement d’un potentiel candidat identifié à la suite des campagnes de criblage.

- Modèle cellulaire : Le modèle cellulaire doit répondre à plusieurs critères : il doit être stable en culture, facilement amplifiable et adaptable à des formats de plaques compatibles avec l’automatisation (formats 96 ou 384 puits), tout en étant représentatif

du type cellulaire touché dans la pathologie. Dans l’équipe, un protocole permettant d’avoir accès à des progéniteurs corticaux à partir d’hiPSC porteuses de mutations a été développé en 2013, ces cellules étant compatibles avec des approches à haut débit. Elles peuvent être amplifiées puis congelées sous forme de banques de progéniteurs, permettant d’avoir un stock suffisant de cellules (Boissart et al, 2013).

- Choix du test biologique et de la méthode de détection : L’efficacité des molécules testées se base en général sur la détection d’un signal (absorbance, fluorescence, luminescence, …), correspondant à la variation d’une cible d’intérêt (protéine, gène), d’un paramètre métabolique (flux calcique) ou d’un phénotype particulier (mortalité, prolifération). Le test peut aussi bien faire appel à des techniques de biochimie, d’immunofluorescence, d’électrophysiologie ou encore de qPCR. Il doit être sensible, spécifique, reproductible et automatisable, tout en réduisant au maximum le coût du puits, ce qui nécessite des formats de plaques miniaturisés. Il est également nécessaire de disposer de contrôles positifs et négatifs, permettant par exemple d’évaluer la robustesse du test à l’aide du facteur Z’ (Zhang et al, 1999), et de fixer les méthodes statistiques de sélection des hits (Malo et al, 2006).

- Plateforme de criblage : Pour réaliser ces tests, il est également nécessaire d’avoir accès à une plateforme robotique permettant de gérer en parallèle un nombre important de plaques de cellules et de composés, dans des conditions stériles et reproductibles. Au laboratoire, nous disposons d’automates permettant l’automatisation et la miniaturisation des tests, de réaliser les campagnes de criblage de grande envergure, mais également de microscopes automatisés pour les approches de criblage à haut contenu (HCS, High Content Screening), qui correspondent à des analyses phénotypiques ou fonctionnelles (Figure 21).

Une fois ces conditions réunies et l’essai biologique développé avec un facteur Z’ satisfaisant, le criblage primaire peut débuter. Afin d’optimiser le nombre de composés à tester tout en minimisant le coût de l’essai, le criblage primaire est en général réalisé sur une lignée cellulaire, et les composés sont ajoutés en simplicats, à une dose unique. Les

60 molécules, identifiées sur la base d’une valeur statistique appelée Z-Score, sont qualifiées de hits primaires.

Figure 21 : Exemple de plateforme de criblage disponible à I-Stem (www.istem.eu). La plateforme de criblage dispose d’automates tels que le BioCel 1800 (à gauche) ou le Bravo/BenchCel (en haut) (Agilent Technologies), permettant le développement des tests et les campagnes de criblage.

Ils sont confirmés dans une étape de re-test technique, en augmentant le nombre de réplicats, puis sont validés dans des essais de dose-réponses, pour déterminer les concentrations optimales et exclure les composés toxiques ou peu efficaces, avec une CE50 (dose à laquelle une molécule induit 50% de l’effet maximum) trop élevée. Des contre-tests, consistant à tester les hits sur des lignées et des read-outs différents, sont alors engagés sur les molécules identifiées, ce qui permet d’éliminer de potentiels faux positifs ou autres artefacts de lecture, suivis de tests secondaires sur d’autres paramètres biologiques, plus forcément miniaturisés, pour vérifier le potentiel fonctionnel des hits. Une fois les composés confirmés, des études de relation structure-activité (RAS) peuvent être envisagées afin d’optimiser leurs structures chimiques et de rechercher des analogues plus efficaces et moins toxiques. Le mécanisme d’action du composé sur sa cible doit également être documenté avant d’envisager des essais précliniques chez l’animal puis les essais cliniques chez l’Homme (Figure 22). Au laboratoire, plusieurs études ont permis d’identifier des composés d’intérêt à la suite de criblages réalisés sur des cellules issues de CSPh. C’est le cas par exemple du lithium, identifié dans une forme génétique d’autisme liée à l’haploinsuffisance de la protéine

61 synaptique SHANK3, responsable du syndrome de Phelan-McDermid (Darville et al, 2016) et dont les résultats ont permis de déposer une demande de PHRC (Programme Hospitalier de Recherche Clinique), ou la metformine, qui a montré des résultats encourageants lors d’un essai clinique de phase II chez des patients atteints de la dystrophie myotonique de Steinert (Bassez et al, 2018).

Figure 22 : Développement d’une molécule active à la suite d’un essai de criblage (Malo et al, 2006).

IV. Problématique et objectifs du travail de thèse

L’objectif de ce travail était donc d’identifier des molécules capables de cibler de manière spécifique les atteintes du système nerveux central dans la MLN, en rétablissant un équilibre au niveau du métabolisme des purines et en compensant la perte de recyclage dépendant de l’enzyme HGPRT. Nous avons pour cela choisi de modéliser les atteintes métaboliques touchant le SNC à l’aide de cellules neurales dérivées de cellules souches pluripotentes, et d’utiliser ces modèles pour développer une approche de criblage à haut débit (Figure 23).

La recherche de molécules actives pour la maladie de Lesch-Nyhan se heurtait à de nombreuses limitations. Tout d’abord, les purines possèdent des rôles multiples dans la cellule : en plus de leur action métabolique, elles activent un grand nombre de voies de signalisation en agissant comme ligands des récepteurs purinergiques, exprimés de manière transitoire et différentielle au cours du développement. Il est donc difficile d’identifier un mécanisme majoritaire des purines dans le SNC, et donc de définir une cible précise lors de la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques. D’un point de vue génétique, aucune mutation n’est réellement prototypique. Ces dernières sont responsables d’une grande hétérogénéité en termes d’activité résiduelle et on ne connait pas leur impact sur le recyclage préférentiel de la guanine, de l’hypoxanthine, ou des deux, ainsi que l’implication de ces métabolites dans les phénotypes cliniques de la MLN. Comme on l’a vu, le métabolisme des neurones est spécifique, et ces derniers sont particulièrement vulnérables à des atteintes associées à une déplétion en purines, notamment au cours du développement. Cela nécessite donc d’avoir accès à des cellules neurales, ce qui pose problème dans la pratique en raison de leur difficulté d’accès et à la nature transitoire des cellules souches neurales, représentatives de neurones en développement. Par ailleurs, la perte de fonction de l’HGPRT ne semble pas seulement impacter le système dopaminergique, puisque d’autres structures cérébrales et différentes populations de neurones semblent également affectées d’un point de vue fonctionnel et anatomique. Enfin, la MLN illustre très bien les différences inter-espèces qui peuvent se poser en termes de métabolisme : les rongeurs ne récapitulent pas les manifestations neurologiques, ce qui suggère que leur cerveau ait pu développer des stratégies alternatives qui ne sont pas présentes chez l’homme. Cela rend donc complexe l’utilisation de modèles in vivo pour explorer le lien entre les atteintes métaboliques et les symptômes neurologiques de la MLN, ou encore pour valider l’efficacité de molécules actives. Pour être représentatif du métabolisme et de la vulnérabilité du SNC par rapport à une atteinte liée au recyclage des purines, nous avons souhaité utiliser comme support biologique des CSPh, différenciées en progéniteurs NSC et en neurones corticaux. L’absence de diagnostic préimplantatoire pour la MLN empêche l’utilisation des CSEh portant les mutations causales. Nous utilisons donc pour ce travail la technologie des iPSC, obtenues après reprogrammation de fibroblastes de patients atteints des formes sévères de la MLN. Ces modèles, qui ont l’avantage de reproduire les étapes clé du développement, sont

également compatibles avec des approches à haut débit. Comme on l’a vu, il est difficile d’envisager une approche moléculaire, en raison du rôle pléthorique des purines et de la complexité des mécanismes susceptibles d’être affectés par la perte de l’HGPRT. Nous préférons donc nous concentrer sur une stratégie d’avantage phénotypique, qui repose sur l’identification d’un spectre plus large de phénotypes, représentatifs de multiples dérégulations dans la cellule. Etant donné le nombre important de mutations, responsables dans la plupart des cas d’une absence totale d’expression de l’HGPRT, nous choisissons de ne pas cibler directement la réactivation de l’enzyme, mais plutôt un mécanisme de compensation qui permettrait de rétablir l’équilibre en purines dans le cycle. Le travail consistera donc dans un premier temps à mettre en évidence des phénotypes dépendant de l’absence de recyclage dans des cellules neurales, suivi de la mise en place d’un essai de criblage et de l’identification, parmi une collection de plus de 3000 molécules chimiques, de celles capables de restaurer les phénotypes neuronaux associés à la perte en HGPRT.

Figure 23 : Stratégie générale de recherche de molécules actives à partir de cellules souches pluripotentes, dans le cadre de la maladie de Lesch-Nyhan. L’identification de phénotypes dépendant de la perte de l’HGPRT sur les précurseurs et neurones dérivés d’iPSC permettra d’entreprendre une campagne de criblage à haut débit de molécules chimiques. L’efficacité des hits identifiés sera évaluée sur les différents phénotypes neuronaux, suivie des tests mécanistiques.

V. Matériel et méthodes

Les techniques utilisées au cours de ce travail sont résumées ci-dessous. Elles sont également décrites de manière plus détaillées dans l’article intégré au sein de ce manuscrit.

1. Matériel biologique

Les fibroblastes d’enfants atteints de la MLN utilisés dans cette étude proviennent tous de la banque de tissus et de cellules américaine Coriell (https://www.coriell.org/1/NINDS, Tableau 4). Ces donneurs ont été choisis d’après leur phénotype clinique, notamment la présence d’automutilations, indiquant une forme classique et sévère de la MLN et donc une activité résiduelle de l’HGPRT quasiment nulle. Les mutations touchant le gène HGPRT correspondent à des délétions larges d’exons ou à des mutations au niveau d’introns, responsables d’un arrêt de la synthèse protéique (LND1 et LND2). Les donneurs LND3 et LND4 sont deux demi-frères atteints de la MLN, présentant une mutation faux-sens localisée au niveau du site actif de l’enzyme, empêchant la liaison du substrat ou du co-substrat. Nous disposons également de deux contrôles d’origine fibroblastique (CTL1 et CTL2) et une lignée CSEh (CTL3), tous les trois de caryotype 46, XY.

Tableau 4: Tableau récapitulatif des différentes lignées iPSC et CSE utilisées.

Ces fibroblastes ont été reprogrammés en iPSC à l’aide des 4 facteurs de Yamanaka (Oct4, Sox2, c-Myc et Klf4), dont l’expression a été induite grâce au virus de Sendai. Les cellules ont été amplifiées et maintenues en culture dans du milieu StemMACS iPS-Brew XF (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne), sur une matrice de vitronectine (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), et sont passées mécaniquement une fois par semaine environ.

2. Différenciation neuronale

Les lignées iPSC CTL et LND ont été différenciées en progéniteurs, puis en neurones corticaux, à l’aide d’un protocole préalablement publié dans l’équipe (Boissart et al, 2013). Ce dernier permet de générer une population de progéniteurs corticaux à partir de cellules neuro-épithéliales dérivées de cellules souches pluripotentes par l’inhibition double des voies SMAD (Boissart et al, 2012). Ces progéniteurs, ou cellules souches neurales (NSC, neural stem cells), sont cultivés sur une matrice de Poly-ornithine et laminine dans un milieu constitué pour moitié de Neurobasal et pour moitié de DMEM-F12, et supplémenté en compléments N2 et B27 (milieu N2B27, Gibco, Grand Island, NY, USA). Afin de maintenir le cycle cellulaire et bloquer le processus de différenciation, le milieu est également supplémenté en EGF (epidermal growth factor, 10 µg/ml), FGF2 (fibroblast growth factor, 10µg/ml) et en BDNF (brain-derived neurotrophic factor, 20µg/ml, Peprotech, Londres, Angleterre). Le milieu est renouvelé tous les 2 jours et les cellules sont passées enzymatiquement à confluence, soit environ une fois par semaine. La différenciation neuronale terminale est engagée en supprimant l’EGF, le FGF2 et le BDNF. Le milieu est alors changé 2 fois par semaine.

3. Caractérisation des lignées cellulaires

a) Mesure de l’expression protéique

L’expression protéique a été mesurée par les techniques de Western blot (WB), de cytométrie en flux (FACS) et d’immunofluorescence (IF). Les anticorps utilisés figurent dans le tableau ci-dessous (Tableau 5).

Le WB a été réalisé sur des culots secs cellulaires lysés par un tampon RIPA (Sigma), en présence d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases (PIC) et de phosphatases (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Les échantillons ont été normalisés par rapport à la teneur totale en protéines, calculée par rapport à une gamme d’étalonnage de BSA (Albumine de sérum bovin) (Pierce BCA Protein Assay kit, Thermo Scientific), avant d’être déposés sur un gel d’électrophorèse et transférés sur une membrane de nitrocellulose (BioRad, Hercules, CA, USA). Après blocage des sites non spécifiques par une solution de PBS-Tween (VWR, Radnor, PA, USA) contenant 5% de lait (Sigma), la membrane est incubée une nuit à +4°C en présence des anticorps primaires. Après rinçage, les membranes sont incubées avec la solution d’anticorps secondaires couplés à la HRP (Horseradish peroxidase). Le signal a été détecté par chimioluminescence à l’aide du kit Amersham ECL Plus Western Blotting Detection (GE-Healthcare, Little Chalfont, Angleterre). La β-Actine a été utilisée comme contrôle de dépôt et de transfert. La cytométrie en flux a été réalisée sur des cellules vivantes, préalablement dissociées par l’enzyme TrypLE (Gibco). Les cellules ont été incubées à +4°C pendant 15-30 min avec les anticorps couplés à un fluorochrome de type Alexa Fluor (AF) ou R-Phycoerythrin (PE). La fluorescence a été détectée à l’aide du cytomètre MACSquant (Miltenyi Biotec). Pour chaque lignée testée, le signal a été analysé en utilisant un contrôle négatif (cellules seules), ainsi que des contrôles dits FMO (Fluorescence Minus One Control), correspondant aux isotypes des anticorps couplés aux fluorochromes AF et PE.

Antibody Host Reference Provider Application Dilution HPRT1 Rabbit 15059-1-AP Proteintech, Rosemont, IL, USA WB 1:500 PRTFDC1 Rabbit 11986-1-AP Proteintech, Rosemont, IL, USA WB 1:250

SSEA-4 Mouse 4755S Cell Signaling, Danvers, MA, USA IF 1 :500 Oct-4 Rabbit 2840S Cell Signaling, Danvers, MA, USA IF 1 :500 Nestin Mouse MAB5326 Merck, Darmstadt, Germany IF 1 :500 Sox2 Rabbit AB5603 Merck, Darmstadt, Germany IF 1:500 Ki-67 Mouse MAB4190 Merck, Darmstadt, Germany IF 1:500 Thermo Scientific, Waltham, MA, HuC/D Mouse A-21271 IF 1:250 USA Tubulin β-3 Rabbit 802001 Biolegend, San Diego, CA, USA IF 1:1000 (Tuj-1)

TRA-1-81 AF647 Mouse 330706 Biolegend, San Diego, CA, USA FACS 2 µg/ml SSEA-3 PE Rat 330312 Biolegend, San Diego, CA, USA FACS 16 µg/ml

Tableau 5 : Tableau récapitulatif des différents anticorps utilisés au cours de ce travail.

Concernant l’immunofluorescence, les cellules ont été fixées à la paraformaldehyde 4% (PFA, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA), avant d’être incubées en présence des anticorps primaires une nuit à +4°C, dilués dans un tampon constitué de PBS (Phosphate-buffered saline), 1% de BSA et 0,3% de Triton X-100 (Sigma). Elles ont été incubées le lendemain avec les anticorps secondaires conjugués aux fluorochromes Alexa Fluor 488, 594 ou 647. La normalisation au nombre de cellules totales a été réalisée par un marquage nucléaire au Hoechst 33228 (1:3000, Sigma), et le pourcentage de cellules vivantes a été déterminé en couplant le Hoechst à l’iodure de propidium (0,4 µg/ml, Sigma). La quantification du nombre de cellules exprimant les différents marqueurs d’intérêt a été réalisée sur l’imageur à haut débit ImageXpress micro (Molecular Devices, San Jose, CA, USA).

b) Détection des purines

Certains métabolites du cycle des purines telles que l’hypoxanthine ou la guanine ont pu être quantifiés par HPLC (chromatographie en phase liquide à haute performance), à partir de surnageants obtenus après lyse par sonication de culots secs cellulaires et traitement à l’acide perchlorique (Sigma). Les mesures d’HPLC ont été réalisées au sein du service de biochimie et hormonologie de l’Hôpital Robert Debré à Paris (Dr Jean-François Benoist). Les résultats ont été normalisés par rapport à la teneur totale en protéines (kit BCA, Thermo Scientific).

c) Mesure de l’activité enzymatique de l’HGPRT

L’activité enzymatique de l’HGPRT a été quantifiée à l’aide du kit commercial PRECICE HPRT Assay kit (Novocib, Lyon, France). Ce test repose sur la production d’IMP à partir d’hypoxanthine, en présence d’α-D-5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate (PRPP), cofacteur de l’HGPRT. L’IMP produit est oxydé par l’IMPDH, réaction accompagnée par la réduction du

NAD+ en NADH2, mesurable par absorbance à 340 nm (Figure 24). Ce test a été réalisé après ajout d’un tampon de lyse NP-40 (Thermo Scientific) sur les culots cellulaires, en présence de PIC, et après sonication. L’activité enzymatique a été mesurée sur une cinétique de 3h,

68 normalisée par rapport à la teneur totale en protéines (kit BCA, Thermo Scientific), et calculée en utilisant une HGPRT recombinante comme standard.

Figure 24 : Principe du test d’activité enzymatique de l’HGPRT (www.novocib.com).

4. Criblage à haut débit

La campagne de criblage à haut débit a été réalisée dans des formats de plaque 384 puits, à l’aide de la plateforme robotisée Biocel 1800 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Les progéniteurs NSC ont été ensemencés dans du milieu N2B27, en l’absence d’antibiotiques et de cytokines, afin d’éviter tout risque d’interaction avec les composés chimiques. Après 5h, les molécules sont ajoutées en simplicats. Les collections de composés utilisées dans cette étude sont : LOPAC 1280 (1280 composés, 10 µM, Sigma), Prestwick Chemical Library (1280 composés, 5 µM, Prestwick, Illkirch, France), Prestwick Phytochemical (320 composés, 10 µM, Prestwick) et SelleckChem screening library (958 composés, 5 µM, SelleckChem, Houston, TX, USA). Ces chimiothèques contiennent essentiellement des composés outils, ainsi que des molécules repositionnables.

Figure 25 : Principe de l’essai de criblage développé dans ce travail. Après 5h d’ensemencement des NSC LND1 dans des plaques 384 puits, les cellules sont traitées par les composés issus des banques. Après 24h de traitement, le milieu est supplémenté en azaserine et en hypoxanthine, substrat de l’HGPRT. La viabilité est mesurée par luminescence 48h après, en utilisant le CTG. Des contrôles positifs (LND1 + DMSO 0,1%) et négatifs (LND1 + Aza 1,0 µM) sont utilisés.

Après 24h de traitement, le milieu est supplémenté en azaserine (1 µM, Sigma) et en hypoxanthine (80 µM, Sigma). Après 48h, la survie a été quantifiée par luminescence en utilisant le kit commercial CellTiter-Glo (CTG) luminescent cell viability assay (Promega, Madison, WI, USA). Le signal a été détecté à l’aide du CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Allemagne). Une solution de DMSO à 0,1% (Sigma), sans azaserine, a été utilisée comme contrôle positif de survie. La séquence de criblage est décrite (Figure 25).

5. Edition génétique par la technique CRISPR/Cas9

Des contrôles isogéniques ont été générés à partir de la lignée de CSEh (Sa001, CTL3) en utilisant la technique d’édition génétique CRISPR/Cas9. Pour cela, un complexe ribonucléoprotéique (RNP) a été formé à partir d’un crRNA dirigé contre le gène HGPRT, et d’un tracrRNA (trans-activating crRNA) du système Alt-R (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA), associés à une protéine Cas9 (TacGene, Paris, France). Les cellules, resuspendues dans une solution P3 Primary Cell Nucleofactor (Lonza, Levallois-Perret, France), ont ensuite été électroporées à l’aide du système 4D-Nucleofector (Lonza), avant d’être remises en culture dans du milieu StemMACS iPS-Brew XF (Miltenyi Biotec). Un crRNA négatif a été utilisé comme contrôle. Les clones édités ont été sélectionnés en ajoutant au milieu de la 6-thioguanine (6-TG, Sigma), une molécule qui induit une toxicité cellulaire lorsqu’elle est métabolisée en 6-ThioGMP par l’HGPRT. Les différents clones obtenus ont ensuite été différenciés en NSC puis en neurones corticaux à l’aide du protocole décrit ci- dessus.

6. Formules et statistiques

Afin d’estimer la robustesse de l’essai de criblage, le calcul du Z’-factor a été réalisé. Il s’agit d’un paramètre qui prend en compte les moyennes et les écart-types des contrôles positifs et négatifs utilisés dans le test, dans les conditions expérimentales similaires à celles du criblage (format de plaque et read-out identiques, même automate, etc …). Ce paramètre vérifie donc que les distributions des valeurs maximales et minimales soient suffisamment espacées pour minimiser les probabilités d’avoir des faux positifs ou des faux négatifs (Figure 26).

3휎 max + 3휎 푚푖푛 Z’ = 1 - où μ est la moyenne et σ la déviation standard ; max et min se µ max − µ 푚푖푛 rapportant respectivement aux contrôles positifs (DMSO 0,1%) et négatifs (Aza 1,0 µM + hypoxanthine 80 µM). Un Z’-factor > 0,5 est souhaité pour débuter ou valider un criblage.

La sélection des hits lors du criblage se base sur le calcul du Z-Score (Malo et al, 2006). Ce paramètre est représentatif du nombre de déviations standard pour lequel un composé se détache de l’ensemble des échantillons du criblage primaire.

푥 − µ Z-Score = où X est la valeur de luminescence (RLU) d’un hit, μ et σ la moyenne et la 휎 déviation standard de l’ensemble des composés de la plaque (Z-Score plate) ou d’un run de criblage (Z-Score run). La sélection des hits, dans notre essai, a été fixé à un Z-Score > 2σ.

L’efficacité d’un composé est en général exprimée en « pourcentage de récupération » (% of recovery), après traitement par l’azaserine.

푥 − 푀푒푑 푚푖푛 % of recovery = x 100, où X correspond à la valeur de RLU d’un puits, 푀푒푑 max − 푀푒푑 푚푖푛 Med min et Med max se rapportant aux médianes des contrôles négatifs (Aza + hypoxanthine) et positifs (DMSO).

En ce qui concerne les expériences de dose-réponse, les régressions non-linéaires et les calculs des CE50 et des CE90 ont été réalisés à l’aide du logiciel Prism (GraphPad, San Diego, CA, USA). Pour les comparaisons intergroupes, une analyse ANOVA a été suivie de la méthode Holm-Sidak.

Figure 26 : Schéma représentant les distributions des contrôles lors d’un criblage (Zhang et al, 1999). La qualité d’un essai de criblage dépend de la largeur de la bande de séparation entre les distributions des valeurs minimales et maximales.

VI. Résultats

1. Utilisation des CSP pour la modélisation phénotypique de la MLN et leur application pour le développement d’une approche de criblage à haut-débit

Les résultats ci-dessous se rapportent à l’article soumis, intégré dans le manuscrit p.80.

a) Mise au point et caractérisation des modèles cellulaires

Les différentes lignées de fibroblastes de donneurs LND ont été reprogrammées en iPSC avant mon arrivée dans l’équipe. Les iPSC LND répondent aux critères de contrôle qualité établis par Yamanaka (Takahashi et al, 2007, Nakagawa et al, 2008). Elles forment des colonies indifférenciées avec une morphologie caractéristique des cellules souches pluripotentes (colonies rondes, plates et réfringentes) et expriment à des niveaux comparables aux CTL les marqueurs de surface spécifiques de l’état de pluripotence, tels que SSEA-4, SSEA-3 et TRA-1-81, ainsi que le facteur de transcription Oct-4, mesurés par cytométrie en flux ou immunofluorescence respectivement (Figures 1a et S1, article). Cela a permis de démontrer que l’absence de recyclage par l’HGPRT dans ces cellules ne constituait pas un facteur limitant dans le processus de reprogrammation. Après différenciation des iPSC en NSC, ces dernières expriment de manière homogène et à un niveau comparable entre LND et CTL les marqueurs Nestin et Sox2, caractéristiques des cellules neurales à un stade précoce (Figure 1b, article). Les analyses de WB confirment l’absence totale d’expression protéique de l’HGPRT chez les 2 lignées LND, ainsi que l’absence d’activité enzymatique aux stades iPSC, NSC, et plus tardivement après 14 jours de différenciation en neurones (Figures 1c et d, article). Ces cellules constituent donc de bons outils biologiques pour la suite de notre travail.

b) Impact de la perte du recyclage au cours de la différenciation

J’ai par la suite voulu déterminer les conséquences phénotypiques de la perte d’activité de la HGPRT sur la différenciation des NSC en neurones. Pour cela, des marqueurs permettant de quantifier la balance prolifération/différenciation, ainsi que la morphologie

72 des neurones ont été analysés. La cinétique de diminution du nombre de cellules exprimant le marqueur de prolifération Ki-67, ainsi que le marqueur Sox2 spécifique de l’état progéniteur, était comparable entre les LND et les CTL pendant 14 jours de différenciation. En parallèle, le pourcentage de cellules positives à HuC/D augmentait de manière similaire entre les différentes lignées, aboutissant à la constitution d’un réseau neuritique marqué par Tuj-1, identique entre les différentes lignées (Figures 1e à h, article). L’absence de phénotype direct soulevait la question de l’existence de mécanismes de compensation pouvant se mettre en place en culture, dans les cellules neuronales déficientes en HGPRT. En considérant la nature des milieux utilisés, riches en composés carbonés, une hypothèse était que la dépendance au recyclage des neurones puisse être masquée par une suractivation de la synthèse de novo des purines, qui est normalement faiblement activée dans le cerveau. L’augmentation du niveau d’hypoxanthine dans les 2 lignées LND par rapport aux CTL suggérait en effet une synthèse accrue de purines, possiblement due à l’activation de la voie de novo (Figure 2a, article). Pour révéler des phénotypes strictement dépendants de l’absence de recyclage, nous avons donc choisi de modifier le milieu de culture de façon à bloquer la voie de novo et se rapprocher ainsi de conditions d’avantage physiologiques. Pour cela, le milieu a été supplémenté avec de l’azaserine (Aza), un inhibiteur de glutamine amidotransferase, qui agit en inhibant 2 enzymes impliquées dans la synthèse de novo des purines, à savoir la phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase (PPAT) et la formylglycinamide ribonucleotide amidotransferase (FGARAT) (Figure 27). L’analyse des mêmes paramètres que précédemment a montré que l’ajout d’azaserine dans le milieu impactait les cellules neuronales déficientes en HGPRT par rapport aux CTL, et que les conséquences étaient différentes en fonction du stade auquel les NSCs recevaient le traitement. L’azaserine, ajoutée sur les NSC au 1er jour de différenciation, induit une toxicité massive détectée grâce au Hoechst-IP, alors que la toxicité est moins marquée lorsque l’ajout d’azaserine est décalé au 5ème jour de différenciation, lorsque les NSC s’engagent dans un état post-mitotique (Figures 2b et c, article). Dans ces conditions, l’analyse des différents marqueurs de prolifération et de différenciation a montré un effet cytostatique ainsi qu’une diminution de la capacité des NSC à produire des neurones (Figures 2d à h, article). Ceci aboutit globalement à une diminution du nombre de neurones quantifié dans les lignées

LND. L’ajout d’azaserine dans le milieu a donc permis de révéler des phénotypes neuronaux strictement dépendants de la perte de l’HGPRT. a b

Figure 27 : Mécanisme d’action de l’azaserine et cinétiques de différenciation. (a) L’azaserine (Aza) agit en inhibant deux enzymes impliquées dans la voie de synthèse de novo des purines, ce qui permet de révéler des phénotypes strictement dépendants de la voie de recyclage par l’HGPRT. (b) L’azaserine a été ajoutée à 2 concentrations, 0.5 et 2.0 µM, dès J1, à un stade précoce de différenciation (NSC), ou à J5, lorsque les NSC s’engagent dans un état post-mitotique. L’azaserine est renouvelée à chaque changement de milieu. FGARAT = formylglycinamide ribonucleotide amidotransferase, Gln = Glutamine, PPAT = phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase.

c) Identification de composés pharmacologiques par une approche de criblage à haut débit

L’identification de phénotypes liés à l’absence de recyclage a permis de développer une approche de criblage à haut débit, visant à identifier des composés chimiques capables de compenser cette absence. Nous avons choisi pour cela le phénotype le plus stringent, à savoir la baisse importante de viabilité induite par le traitement précoce des NSC par l’azaserine. Ce phénotype a l’avantage d’être mesurable sur des temps courts de culture, et la mesure de viabilité est facilement automatisable et transposable au haut débit, notamment en remplaçant le Hoechst-IP par une mesure de luminescence basée sur la production d’ATP : le CellTiter-Glo (CTG) (Figures 3a et b, article). Le principe du criblage

74 primaire a donc consisté à identifier les composés capables de rétablir la viabilité, après traitement des NSC LND1 par l’azaserine. Un essai a donc été développé, automatisé, puis sa robustesse vérifiée grâce à des conditions considérées comme contrôles positif et négatif, ce qui a permis de calculer le facteur statistique Z’ (Figure 3c, article). Celui-ci étant supérieur à 0,8, le criblage primaire a pu être réalisé sur plus de 3800 molécules chimiques. Un total de 29 composés a été sélectionné après le crible primaire, sur la base d’un Z-Score > 2σ, ce qui signifie que la valeur de luminescence est au moins 2 déviations standard supérieure à celle de la moyenne de tous les composés testés (Tableau S3, article). Après avoir été retestés en plusieurs répliques puis en dose-réponse, 5 hits ont été sélectionnés avec des CE50 comprises entre 5 et 13 µM (Figure 3e, article). Les composés retenus présentent une forte analogie structurale puisque tous contiennent au moins une adénosine dans leur structure chimique (Figure 28).

Figure 28 : Déroulement du criblage primaire et nature des composés identifiés. (a) Schéma en cascade de la campagne de criblage. (b) Structures chimiques des 6 composés retenus pour la suite de l’étude, incluant la SAM. NAD = nicotinamide adénine dinucléotide, NADPH = nicotinamide adénine dinucléotide phosphate, Thio-NADP = Thionicotinamide adénine dinucléotide phosphate.

On a choisi de rajouter à ces cinq molécules un analogue supplémentaire : la S- adenosylmethionine (SAM), qui rétablit la viabilité en CTG et en Hoechst de manière similaire aux autres hits, et qu’on a donc conservé pour la suite du travail (Figures 3e et S3, article).

d) Efficacité et spécificité des composés chimiques identifiés

Le criblage primaire ayant été réalisé sur un seul donneur, c’est-à-dire sur une seule mutation affectant l’activité de la HGPRT (NSC LND1), nous avons choisi dans un premier temps de re-tester l’efficacité des 6 composés sur des fonds génétiques différents, toujours en utilisant le même test, à savoir la mesure du rétablissement de la viabilité cellulaire en présence d’azaserine. L’efficacité des hits s’est révélée identique en dose-réponse, à la fois sur le second donneur dérivé d’iPSC (LND2), que sur des lignées isogéniques déficientes en HGPRT, éditées à partir de la lignée de CSEh (CTL3) à l’aide du système CRISPR/Cas9 : CRISPR-1 et CRISPR-2 (Figure 4a, article). Afin d’exclure les composés qui auraient pu directement interagir avec l’azaserine, le test a été répété en la remplaçant par un milieu de sélection contenant de l’aminoptérine (milieu HAT), qui bloque également la voie de synthèse de novo des purines, mais de manière indirecte, en inhibant la dihydrofolate reductase (DHFR) (Figure 29). A nouveau, les composés démontrent une efficacité identique en dose-réponse en présence d’aminoptérine, ce qui exclue d’éventuels faux positifs (Figures 4b et c, article). Enfin, l’azaserine a été remplacée par la roténone, un inhibiteur du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale. Le but de cette expérience était d’évaluer la spécificité des composés à protéger les NSC de la mort cellulaire induite par le déficit en recyclage des purines et d’exclure des composés qui auraient pu agir indirectement en bloquant l’apoptose de manière non-spécifique. La roténone induit une toxicité sur les différentes lignées, indépendamment de la présence ou de l’absence d’une activité HGPRT. Aucun des 6 composés n’est capable de rétablir la viabilité cellulaire après traitement à la roténone, indiquant que leur mode d’action est spécifique à un stress dépendant de la voie des purines (Figures 4d et e, article).

Figure 29 : Mécanisme d’action de l’aminopterin, contenue dans le milieu de sélection HAT. L’aminopterin inhibe la dihydrofolate reductase (DHFR), réduisant la synthèse du cofacteur nécessaire à l’action des enzymes GART et ATIC, bloquant ainsi la voie de novo de purines. ATIC = 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribotide transformylase/IMP cyclohydrolase, GART = Glycinamide ribonucleotide transformylase, THF = tetrahydrofolate.

e) Etude des mécanismes d’action des composés

En raison de problèmes d’approvisionnement, le Thio-NADP n’a pas pu être testé lors des expériences ultérieures.

L’hypothèse selon laquelle les composés restaureraient directement une activité enzymatique équivalente à celle de l’HGPRT a été la première investiguée. Pour cela, les niveaux d’expression protéique de l’HGPRT, ainsi que du produit du pseudogène PRTFDC1, ont été mesurés par WB après 72h de traitement. La conversion de l’hypoxanthine et du PRPP en IMP a également été quantifiée, afin d’évaluer l’existence d’une activité HGPRT-like. Aucun des hits n’est capable de moduler l’expression protéique des deux enzymes testées, ni de restaurer une activité enzymatique HGPRT-like, ce qui signifie que leur effet sur la viabilité est probablement dû à l’activation de voies métaboliques alternatives qui permettent de compenser la perte de recyclage (Figures 5a à c, article). En raison de leur analogie structurale, notamment la présence d’au moins une adénosine dans chaque composé, la seconde hypothèse investiguée a été celle d’un apport

77 exogène d’adénosine, qui permettrait de restaurer un équilibre métabolique. Cet apport d’adénosine dans le cycle peut nécessiter l’intervention de l’adénosine kinase (ADK), menant directement à la formation d’AMP, et/ou l’action de l’adénosine deaminase (ADA), métabolisant l’adénosine en inosine. Afin de vérifier l’implication de l’adénosine, son effet a tout d’abord été testé en dose-réponse pendant 72h de traitement, puis a été comparé à la SAM, représentative des composés dérivés de l’adénosine. L’adénosine est peu efficace et ne permet pas de rétablir autant la viabilité que la SAM, à la fois mesurée en Hoechst qu’en CTG, et ce, même en réalisant un second traitement 24h après le premier, afin de favoriser la biodisponibilité (Figures 5d et e, article). Pour aller plus loin, nous avons également décidé de tester la SAM en présence d’ABT 702, un inhibiteur non nucléosidique de l’ADK, ou en présence de pentostatine, un inhibiteur de l’ADA. Ce test permet d’évaluer l’impact de l’inhibition du métabolisme de l’adénosine sur l’efficacité de la SAM, permettant ainsi de confirmer ou non le rôle d’un apport exogène d’adénosine dans le cycle. L’ajout de pentostatine à la SAM n’a aucun effet sur son efficacité. En revanche, après ajout d’ABT 702, l’effet en dose-réponse de la SAM est décalé d’un facteur 2 par rapport à la molécule seule, semblant montrer que son effet est légèrement influencé lorsqu’on inhibe l’ADK (Figures 5f et g, article). Ces résultats montrent que l’apport d’adénosine peut participer à l’efficacité de la SAM, par l’intermédiaire de l’ADK, mais pas suffisamment pour expliquer son effet sur la viabilité, qui proviendrait majoritairement de mécanismes indépendants. Ces résultats préliminaires doivent cependant être confirmés pour la SAM, mais également pour les autres molécules identifiées dans ce travail. De manière intéressante, deux des molécules : Ap4A et NADPH, sont capables de normaliser les niveaux d’hypoxanthine et de guanine dans la lignée LND1 (Figures 5i et j, article). Elles permettraient donc de restaurer, par une voie métabolique alternative, un équilibre dans le cycle des purines. Cela suggère également que les molécules n’agiraient pas forcément toutes par un mécanisme d’action similaire, et que celui-ci ne dépendrait pas uniquement de leur groupement adénosine mais de l’ensemble de leur identité structurale.

f) Effet des composés sur les phénotypes neuronaux identifiés

Afin de vérifier l’efficacité des composés sur les différents phénotypes neuronaux préalablement identifiés et dépendant de l’absence de recyclage par l’HGPRT, le traitement

78 avec l’azaserine a été entrepris à partir du 5ème jour de différenciation, puis les composés ajoutés en continu durant 18 jours (Figure 30). Dans ces conditions, tous les composés ont un effet protecteur vis à vis de la mort cellulaire induite par l’azaserine, dans les lignées LND1 et LND2. Ils restaurent également le pourcentage de cellules prolifératives et augmentent donc le nombre de cellules totales dans les cultures. Les molécules rétablissent aussi la capacité de différenciation neuronale des NSC LND, ce qui aboutit globalement à l’augmentation du nombre de neurones produit en fin de protocole. Cela montre qu’en compensant la perte de recyclage par l’activation de voies métaboliques alternatives, les molécules améliorent la survie cellulaire, la prolifération, et la capacité de différenciation des NSC et donc la neurogénèse en général, lorsque les cellules sont déficientes en HGPRT (Figure 6, article).

Figure 30 : Effet fonctionnel des composés sur les phénotypes neuronaux dépendant de l’HGPRT. Les composés sont testés durant la 2ème cinétique de différenciation : le 1er traitement est réalisé à J4, puis les molécules sont ajoutées en même temps que l’azaserine (Aza), lors de chaque changement de milieu. Leur effet est observé à différents temps au cours de la différenciation (J7, J11, J14 et J18).

Rescuing pharmacological compounds for Lesch-Nyhan disease identified using iPS-based high throughput drug screening

Valentin Ruillier1,2,3, Johana Tournois1, Claire Boissart1, Marie Lasbareilles1, Gurvan Mahé1, Laure Chatrousse1, Michel Cailleret2,3, Jean-François Benoist4, Marc Peschanski1 and Alexandra Benchoua1, 5

AFFILIATIONS: 1 CECS, I-STEM, AFM, 91100 Corbeil-Essonnes, France; 2 INSERM UMR 861 I-STEM AFM, 91100 Corbeil-Essonnes, France 3UEVE UMR 861 I- STEM AFM, 91100 Corbeil-Essonnes, France 4 Biochemistry and Hormonology, Robert Debré Hospital, 75935 Paris Cedex 5 To whom correspondence should be addressed: Alexandra Benchoua CECS/ISTEM 28 rue Henri Desbruère-91100 Corbeil –Essonnes, France [email protected]

ABSTRACT: 147 words

Lesch–Nyhan disease (LND), a rare monogenic disease caused by deficiency of the salvage pathway enzyme hypoxanthine–guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT), is characterized by severe neuropsychiatric symptoms that remain currently untreated. Here we used human neural stem cells and neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) of children affected by LND to identify neural phenotypes associated with HGPRT-deficiency and of interest to develop a target-agnostic based drug screening system. We screened more than 3000 molecules and identified 6 pharmacological compounds, all possessing an adenosine moiety, that corrected HGPRT-deficiency associated neuronal phenotypes by promoting metabolism compensations in a HGPRT-independent manner. This included S- adenosylmethionine (SAM), a compound that had already been suggested to ease the neuropsychiatric symptoms in LND in case reports. Interestingly, these compensating pathways can potentially be promoted in LND patients via simple food supplementation. This experimental paradigm can also be easily adapted to other metabolic neurological disorders affecting normal brain development.

INTRODUCTION

Purines are both essential molecules for nucleic acid assembly and the most common carriers of chemical energy in mammalian cells. The cellular pool of purines is tightly maintained by the balance between their de novo synthesis, recycling and degradation1. Mutations in enzymes of the synthesis or recycling pathways are accompanied by devastating neurological symptoms2. One of the most described purine-associated pediatric disorders is Lesch–Nyhan disease (LND), which is caused by deficiency of the salvage pathway enzyme hypoxanthine– guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT), an X chromosome-encoded protein3, 4, 5. As a direct consequence, recycling of guanine and hypoxanthine into GMP and IMP is inefficient, leading to uric acid accumulation, formation of uric acid-containing kidney stones and finally renal failure. LND is also characterized by severe neuropsychiatric disorders described as choreoathetosis, dystonia, aggression, and self-injurious behavior6, 7. Hyperuricemia and formation of kidney stones can be controlled by the xanthine oxidase inhibitor 1,2-dihydro- 4H-pyrazolo, pyrimidin-4-one (allopurinol)4. In contrast, that treatment has no positive effect for neuropsychiatric symptoms8, and new pharmacological approaches are needed to control specifically the neurological symptoms associated with purine abnormal metabolism. However, the links between the metabolic derangements recorded in LND and the resulting neurological manifestations in children are still unknown. Neurological symptoms are not reproduced in genetic animal models of LND while metabolic hallmarks are, indicating that either rodent brain cells develop alternative metabolic strategies that are not present in human cells or some purine-dependent processes are not present during rodent brain development 9, 10, 11. Beside these purely metabolic actions, purines activate plethora of cell signaling pathways via membrane receptors that can act additively, synergically or antagonistically2. Next to this mechanistic complexity, the precise measurement of the concentrations of purine intermediates requires complex technics, i.e. HPLC, that are not easily amenable to “hard to access” tissues like the CNS. Consequently, most information collected are from peripheral cells but purine metabolism in the brain, most particularly during development, appears different than in other organs, mainly relying upon recycling with only reduced de novo synthesis activity recorded12, 13. From a genetic point of view, more than 400 mutations leading to a clinical phenotype have been identified with a high degree of heterogeneity regarding their impact upon the enzyme activity. It remains, therefore, unclear whether the clinical phenotypes result from reduced enzymatic activity toward hypoxanthine, guanine, or both14, 15. Together, this stress out the complexity of the

81 mechanisms that ultimately lead to abnormal brain function in LND, compromising the development of pharmacological approaches using classical target-based strategies. In contrast, phenotypic-based assays monitor the existence of morphological and functional cellular phenotypes of interest that discriminate two experimental conditions in a target- agnostic manner. They enable exploration of vaster biological spaces by probing the consequences of multiple and complex modifications of cellular events simultaneously in their native environment and at endogenous levels. We have used a phenotypic assay approach, based on human induced pluripotent stem cells (iPSC16) differentiated into neurons, to study the impact of HGPRT deficiency. We have previously shown that such neurons may be instrumental to identify potentially therapeutic pharmacological compounds using automated high throughput drug screening coupled with image-based high content analysis (HCA,17,18, 19,). Here we showed that, LND cells demonstrated pathological changes during key steps of differentiation of human PSC-derived neural stem cells (NSC) into cortical neurons. Using this in vitro model, 6 compounds were identified out of a collection of over 3000 that were tested, suggesting paths for clinical development.

MATERIAL AND METHODS:

Neural cell differentiation

Four iPSC lines, reprogrammed from male fibroblasts obtained at the Coriell’s biorepository (Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA), consisting in two control and two LND cell lines, were used in this study. The two LND lines were reprogrammed from fibroblasts of LND affected children (GM2227 and GM23784), both presenting self-injurious behavior. All cell lines details are summarized in table 1. For more clarity, control and LND cells were noted CTL and LND respectively, as described in Table S1. Somatic cell reprogramming was performed using the four human genes OCT4, SOX2, c-Myc and KLF4 cloned in Sendai viruses (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) and pluripotency characterized according to Nakagawa et al.20. In addition to iPSC, a control hESC line was obtained (SA001 hESC, Cellartis, Goteborg, Sweden), and used under the supervision of the French Bioethics Agency (Agreement number NOR AFSB 12002 43S). Pluripotent stem cell (PSC) lines were maintained in StemMACS iPS-Brew XF medium (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany), supplemented with 1:100 penicillin/streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA)

82 and using vitronectin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) as a matrix. The medium was changed every day and the cells were manually passaged once a week. Cell cultures were incubated in a 37°C humidified atmosphere with 5% CO2. The differentiation protocol into neural stem cells (NSC) was published previously18. NSCs were cultured in N2B27 medium supplemented with recombinant human fibroblast growth factor-2 (10ng/ml), epidermal growth factor (10ng/ml) and brain-derived neurotrophic factor (20ng/ml) (all from Peprotech, London, UK). Cell cultures were maintained in a humidified atmosphere of 5% CO2 at 37°C and the medium changed every other day. Terminal neuronal differentiation was induced by plating the cells in poly-ornithine/laminin treated 384-well plates, in N2B27 medium without growth factors. The medium was changed twice a week with addition of laminin (1:500, Gibco) to avoid neuronal clumping. Neuronal differentiation was maintained at least 14 days and up to 18 days to obtain well-characterized cortical neurons.

Western blotting

Protein expression was quantified by western-blot analysis. Whole-cell pellets were collected and lysed in RIPA lysis buffer (Sigma) containing a cocktail of protease and phosphatase inhibitor (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). After centrifugation at 4°C at 13000 rpm, supernatants were collected and protein concentration measured using the Pierce BCA Protein Assay kit (Thermo Scientific), following the manufacturer’s instructions. Proteins (20-40 µg) were reduced using Dithiothreitol (DTT, Sigma) and Laemmli buffer (BioRad, Hercules, CA, USA), before being loaded and separated by electrophoresis on 4-15% SDS-polyacrylamide gels (Criterion Tris-Glycine eXtended Gels, BioRad), and transferred to nitrocellulose membranes (Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer, BioRad). Membranes were blocked in PBS-Tween 20 0,1% (PBS-T, VWR, Radnor, PA, USA) solution containing 5% non-fat dry milk (Sigma) during 45 min at RT and then incubated overnight at 4°C with primary antibodies diluted in blocking buffer (Table S2). Membranes were washed 3 times with PBS- T and incubated 1h at RT with HRP-labeled secondary antibodies (GE-Healthcare, Little Chalfont, UK) at 1:10000 in blocking buffer. The signal was visualized by enhanced chemiluminescence using the Amersham ECL Plus Western Blotting Detection kit (GE Healthcare). Beta-Actin at 1:50000 was used as a loading control.

HGPRT enzymatic activity

HGPRT activity was measured using PRECICE HPRT Assay kit (Novocib, Lyon, France). HGPRT activity was detected as a rate of production of inosine monophosphate (IMP) in the

83 presence of α-D-5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate (PRPP), followed by IMP oxidation with reduction of NAD+ to NADH measurable by absorbance at 340 nm. PBS-washed cell pellets were resuspended in ice cold water containing NP-40 lysis buffer (Thermo Scientific) containing a protease inhibitor cocktail (Thermo Scientific), and then sonicated at 4°C. After centrifugation, supernatants were collected to measure HGPRT activity following the manufacturer’s instructions. Total protein content was determined using Pierce BCA Protein Assay kit (Thermo Scientific). HGPRT activity in cell lysates was measured upon a 3 hours kinetic by reading absorbance at 340 nm and enzymatic activity (nmol/mg of protein/hour) was calculated using a recombinant HGPRT enzyme as a standard.

High-throughput drug screening assay

To conduct high throughput compound screening, NSCs were plated into poly- ornithine/laminin treated 384-well plates at 5000 cells per well in N2B27 medium without antibiotics using the Biocel 1800 platform (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). After 5 hours of plating, cells were treated with the chemical libraries: LOPAC 1280 (10 µM, Sigma, 1280 compounds), Prestwick Chemical Library (5 µM, Prestwick Chemical, 1280 compounds), Prestwick Phytochemical (10µM, Prestwick Chemical, 320 compounds) and Selleckchem custom library (5 µM, Selleckchem, 958 compounds). A solution of 0,1% DMSO (Sigma) was used as a control. After 24 hours of treatment, 1 µM Azaserine (Sigma, A1164) and 80 µM Hypoxanthine (Sigma, H9636) were added to the medium. After 48h of Azaserine treatment, cell survival was quantified using the CellTiter-Glo luminescent cell viability assay (Promega, Madison, WI, USA), following manufacturer’s instructions.

Immunostaining and high content image analysis

Cells were fixed using 4% PFA (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) and incubated overnight at 4°C with primary antibodies (Table S2) diluted in blocking buffer composed of 1X PBS, 1% BSA (Sigma) and 0,3% Triton X-100 (Sigma). Cells were washed three times in PBS, and incubated 45 min at RT with Alexa Fluor conjugated secondary antibodies (Thermo Scientific). At last, the cells were washed three times in PBS. In addition, Hoechst 33228 (1:3000, Sigma) nuclear staining was performed during secondary labeling. The fluorescence signal was detected using the high-content analysis system ImageXpress (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). Apoptotic cells ratio during neuronal differentiation was determined using Hoechst-PI staining assay. Living cells were treated with

84 a mix of Hoechst 33228 (6 µg/ml, Sigma) and propidium iodide (0,4 µg/ml, Sigma) during 30 min at 37°C. The fluorescence signal was detected using ImageXpress (Molecular Devices).

HPLC purines measurement

NSCs were dissociated in trypsin (Gibco) and then washed one time in PBS. After centrifugation, whole-cell pellets were collected and snap-frozen in liquid nitrogen. They were resuspended in cold water and then sonicated at 4°C. Total protein concentration was measured using Pierce BCA Protein Assay kit (Thermo Scientific). Cell lysates were treated with 1M perchloric acid (Sigma) and incubated during 5 min at 40°C, before being centrifuged at 10000 rpm at room temperature. Supernatants were collected and stored at - 20°C.

Genome editing using the CRISPR/Cas9 system

HGPRT gene knock-out mutants were generated from the male hESC control line SA001 using CRISPR/Cas9 mediated genome editing. Alt-R CRISPR-Cas9 HPRT crRNA and tracrRNA (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA) were resuspended in Nuclease-Free Duplex Buffer (NFDB, IDT) to a final concentration of 100µM and mixed in equimolar concentrations to form RNA oligos complexes. After 10 min at RT, 30µM Cas9 protein (TacGene, Paris, France) was added to sgRNA in a 1: 1.25 ratio during 15 min at RT to allow the formation of RNP. 1-2 hours before transfection, 10µM ROCK Inhibitor (Y27632, StemCell Technologies, Vancouver, Canada) was added to cultured cells. Cells were dissociated with Accutase (StemCell Technologies) and 200 000 cells were added to 1.5 ml conical tube, before being softly pelleted. Cells were resuspended with 20µl of P3 Primary Cell Nucleofector Solution and Supplement (Lonza, Levallois-Perret, France), following manufacturer’s instructions. The RNP complex solution was mixed with the cell suspension, before being electroporated using 4D-Nuclofector system (Lonza). Cells were plated in a 12- well plate containing StemMACS iPS-Brew XF medium (Miltenyi Biotec). A negative Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA was used as a control. HGPRT edited clones were selected using 6- thioguanine medium (A4660, Sigma, St Louis, MO, USA), at a final concentration of 1X. Positive clones were amplified and differentiated into NSC as described above, before being frozen in a 1:10 mix of 100% DMSO and FBS (Sigma).

Indicators and statistics

In order to evaluate assay and automation robustness, z’factor was calculated in 5 sister plates as follows: Z’factor = 1- ((3*σ max +3*σ min)/max- min) where σ is the standard deviation of positive controls (max) or negative controls (min) and μ is the mean signal value of positive and negative controls21. In survival experiments, NSC treated with DMSO are considered as positive controls and as azaserine-treated NSC as negative controls.

Percentage of recovery induced by pharmacological compound was calculated as follow: [(compound treated-well luminescence value - median of azaserine only treated- wells)/(median value of DMSO only treated-wells - median of azaserine only treated- wells)]*100.

For selection of positive compounds in primary screening, Z-score22 was calculated, which is defined as Z =(x−μ)/σ, where x is relative luciferase activity of an individual compound, μ is the mean luciferase activity of all test compounds, and σ is the standard deviation of all test compounds. A compound with a minimum Z-score of 2.0, meaning that its luciferase activity is two standard deviations above that of the mean, was considered a hit.

For intergroup multiple comparisons, ANOVA was followed by Holm-Sidak post-hoc test.

For dose-response experiments, non-linear regression and calculation of EC50 and EC90 were performed using PRISM software (Graphpad, San Diego, CA, USA).

RESULTS:

Reprogramming of fibroblasts of children with LND into pluripotent stem cells and differentiation into cortical neural stem cells

In order to develop a relevant model of LND amenable to drug screening, we decided to use iPSC reprogrammed from LND children’s fibroblasts as starting material to obtain HGPRT- deficient neural stem cells and neurons. Primary cultures of fibroblasts isolated from 2 LND individuals were reprogrammed in parallel of 2 controls using the 4 transcription factors Oct4, Sox2, c-Myc, and KLF4 (Table S1,16). All iPSC lines self-renewed as undifferentiated colonies with typical PSC morphology (Figure S1), expressing the pluripotency markers

Oct-4 and SSEA-4 (Figure 1a) and TRA 1-81 and SSEA3 (Figure S1). iPSC lines were differentiated into cortical neural stem cells (NSCs) as described in Boissart et al.18, and proliferated at a similar rate and expressing homogeneously the two neural markers SOX2 and Nestin, (Figure 1b). Western blot analysis of HGPRT protein content confirmed a total absence of protein expression in the 2 LND donors (Figure 1c). Accordingly, the enzyme was active after reprogramming in control cells (CTL) and inactive in cells derived from the 2 LND individuals (Figure 1d). This indicated that, while phenocopying the enzymatic defect associated with LND, HGPRT loss of function mutations did not compromised fibroblast reprogramming nor iPSC engagement into the cortical neural lineage.

Phenotypic characterization of differentiating neurons derived from HGPRT-deficient NSC

The consequences of HGPRT-deficiency during differentiation of NSCs into fully differentiated post-mitotic neurons were then analyzed. Neuronal differentiation was started from HGPRT-competent (CTL1 and CTL2) and HGPRT-deficient (LND1 and LND2) NSCs in N2 and B27 containing-medium (N2B27,23) and multi-parametric assays were conducted during the progression of differentiation from day 4 to day 14. Quantification of Ki67 antigen indicated a progressive decrease of cell proliferation between day 0 (seeding) and day 14, associated with a reduction of the percentage of SOX2 positive undifferentiated NSCs (Figure 1e, f and h) in CTL cells. This was paralleled by an increase of HuC/D positive post- mitotic neuronal cells fraction (Figure 1f and h). At day 14, the percentage of undifferentiated NSCs ranged between 50 and 60% and the percentage of neurons between 40 and 50%. No difference was detected in HGPRT-deficient cells regarding either the kinetic or the rate of differentiation. Little cell death was measured along the process of differentiation with no difference between HGPRT-competent and deficient cells (Figure 1g). In these differentiation conditions, after 14 days, HGPRT-deficient cells produced globally a neuronal network morphologically indistinguishable from the one obtained with HGPRT-competent NSCs (Figure 1h). We hypothesized that our culture conditions may mask purine salvage pathway dependency by providing different carbon resources than the physiological ones, and thus allowing an increased de novo synthesis. Hypoxanthine concentrations, measured using HPLC, were elevated in NSCs derived from the 2 LND donors compared to their control counterparts, suggesting a high rate of de novo synthesis not compensated by downstream salvage (Figure 2a).

Consequently, in order to reveal phenotypes dependent of purine recycling while excluding a potential bias introduced by de novo synthesis over-activation, culture conditions were modified in order to include a low level inhibition of the de novo pathway and thus be closer to a “brain-like” environment24. Azaserine, a potent glutamine amidotransferase inhibitor that blocks 2 limiting reactions in the de novo synthesis pathway, was added to the neuronal differentiation medium at either 0.5 or 2 µM, with 80µM of hypoxanthine provided as the principle substrate to the cells in order to stimulate HGPRT-dependent purine salvage (Figure S2). Azaserine was first added to the medium from day 1 of differentiation, then with each medium change every other day. Cell death was measured at day 3, 6 and 10 after starting the treatment, corresponding to days 4, 7 and 11 of differentiation. At these concentrations, azaserine did not compromise survival of CTL NSC with efficient HGPRT activity. In contrast, it induced massive cell death in cultures of HGPRT-deficient NSCs at the two concentrations tested. After 10 days of azaserine treatment, only 24.89 % (+/- 8.02) of surviving cells were detected at 0.5 µM and 27.55% (+/- 8.42) at 2µM (Figure 2b). This result indicated that inhibition of the de novo pathway was sufficient to reveal a HGPRT- dependent phenotype. However, treating the NSC from day 1 precluded further evaluation of other differentiation parameters such as NSC proliferation and engagement into post-mitotic neurons. Azaserine treatment was, therefore, delayed and started only after 5 days of differentiation, a time point at which NSCs were already committed to become post-mitotic neurons (Figure 1e and f). Cells were also analyzed at day 2, 6, 11 and 13 after starting the treatment, corresponding to days 7, 11, 14 and 18 of differentiation. HGPRT-competent NSCs survived, proliferated and differentiated into neurons similarly, whether azaserine was added or not (Figure 2c-e). In this delayed pattern of treatment, only the 2 µM concentration of azaserine induced cell death in HGPRT-deficient NSCs as they differentiated into neurons, but in a lesser extent, with 55.12% (+/- 7.04) living cells still detected after 11 days of treatment (Figure 2c). The proliferation of HGPRT-deficient cells was also affected dose- dependently by azaserine, as revealed by Ki67 immunoreactivity. Two µM of azaserine reduced proliferation to 66.10 % (+/- 16.18), as compared to DMSO-treated cells, after 2 days of treatment, and to 2% (+/- 1.91) after 13 days (Figure 2d and h). Together, azaserine- induced cytotoxicity and cytostaticity led to fewer cells in HGPRT-deficient cultures as the differentiation into neurons proceeded (Figure 2e and h). HuC/D-immunoreactive post- mitotic neurons were reduced after 2 M azaserine treatment to 68.96 +/- 20.79 % of DMSO- treated cells after 13 days of azaserine treatment (Figure 2f and h). The sum of modifications induced by azaserine treatment when started at day 5 of differentiation led to a decreased

88 number of neurons produced by HGPRT-deficient NSCs at the two concentrations (Figure 2g and h).

Identification of LND relevant pharmacological compounds using target-agnostic high throughput screening (HTS)

This experimental paradigm was, therefore, used to generate an assay in which pharmacological compounds rescuing phenotypes related to HGPRT-deficiency would be sought. The drug screening read-out selected was the cell viability following azaserine treatment of NSCs from day 1, i.e. the most dramatic phenotype. The immunofluorescence- based Hoechst/PI used so far was replaced by a luminescent-based method, the Cell-TiterGlo (CTG) that shows better sensitivity and is fully automatable. Dose-response experiments were performed in order to determine the best azaserine concentration to be used (Figure 3a). One µM concentration of azaserine was chosen since it induced a strong decrease of ATP content in the 2 LND NSC culture but had no effect on CTL cells. The screening workflow is summarized in Figure 3b. NSCs from LND1 were seeded in 384 well-plates and treated with chemical compounds after 5h. The next day, 1 µM of azaserine was added to the medium. After 48h, ATP content was quantified using CTG (Figure 3b). Z’factor was calculated using 5 sister plates with cells treated with DMSO as a positive control (max value) and cells treated with azaserine as negative control (min value). The mean z’factor value was of 0.84, which defined an excellent screening assay (Figure 3c). A total of 3838 pharmacological compounds were screened (Figure 3d), a z-score > 2  being chosen as a selection criteria. After the primary screening, 29 compounds had a z-score > 2  at 5 or 10µM (Figure 3d and Table S3). After retesting in technical replicates, 7 compounds that consistently induced an increase of more than 10% of CTG signal compared to non-treated cells were selected. Five of those compounds were finally selected because they exhibited a dose-dependent effect with an EC50 below 13 µM (Figure 3d-e). All these compounds shared a common structural core that comprised an adenosine moiety (Figure 3 d-f). For further investigations, we decided to add to this list S-methyl adenosine (SAM), a structural homologue of N6-methyladenosine. CTG signal quantifying ATP cellular content generally, dose-response experiments for the 6 compounds were performed using Hoechst as a read-out in order to refine the capacity of the molecules to rescue the cells. All compounds confirmed their efficiency at restoring cellular viability in LND1 NSCs in presence of 1µM azaserine in a dose-dependent manner, within the same EC50 range (Figure S3).

Adenosine-like compounds specificity

The 6 compounds were re-tested in cells with other genetic backgrounds. The same efficiency was found for NSCs from LND2, as well as for two different clones of the hESC line SA001 invalidated for HGPRT using the CRISPR/Cas9 technology (Figure 4a, Figure S4). The assay was also repeated using a selection medium that contained aminopterin instead of azaserine as a de novo pathway inhibitor (HAT medium), in order to exclude an artefact due to an interaction of the compounds with azaserine. Aminopterin induced cell death selectively in LND NSCs in a dose-dependent manner (Figure 4b) and the dose of 0.06µM of aminopterin was used to further test compound specificity. The 6 compounds demonstrated similar rescuing efficiency than when using azaserine (Figure 4c). In order to exclude the possibility that the 6 compounds were solely non-specific inhibitors of apoptosis, their efficiency was tested using rotenone, an inhibitor of complex I of mitochondria that affected NSC survival independently of their HGPRT status (Figure 4d). None of the 6 compounds exhibited neuroprotective activity in that experimental set-up (Figure 4e).

Adenosine-like compounds mode of action

Mechanism of action of the adenosine-like compounds was then explored. One hypothesis was that these compounds restored directly a HGPRT-like activity. Expression of HGPRT and of the HGPRT pseudogene PRTFDC1, as well as HGPRT-like enzymatic activity were quantified after treating LND NSCs with each compound for 72h. Expression of neither HGPRT nor PRTFDC1 was modified (Figure 5a and b), and the compounds did not either induce any detectable HGPRT-like enzymatic activity (Figure 5c).

The contribution of the adenosine moiety to the compounds mechanism of action was then evaluated. Adenosine was added 5h after seeding NSCs and azaserine at 24h post-seeding. Cell survival was quantified 72h post-seeding using Hoechst. SAM was used as a reference adenosine-like compound. In these conditions, adenosine-induced recovery was poor compared to SAM. The efficiency of recovery at maximal concentration for adenosine was of 51.79+/-10.97% compared to more than 130 +/-11.92 % for SAM. In addition, EC90 for adenosine was 2.3*10-3 whereas EC90 for SAM was 1.19*10-5. A second treatment with adenosine was added at the same time as azaserine in order to increase its bioavailability. -5 Adenosine remained less efficient than SAM was (EC90adenosine: 1.43*10 vs EC90SAM: 2.6*10-6, Figure 5d). The same difference was recorded when CTG was used as a read-out

-3 -6 (EC90adenosine: 1.4*10 vs EC90SAM: 5.4*10 , Figure 5e). The contribution of the adenosine moiety to act as a source of AMP or inosine was assessed using an inhibitor of the adenosine kinase (ABT-702, Figure 5f) or of the adenosine deaminase (pentostatin, Figure 5g). Blocking the conversion of adenosine into inosine had no effect on SAM efficiency while inhibiting the conversion into AMP decrease but did not suppress compound efficiency. Allopurinol was then tested in order to evaluate a possible contribution of an inhibition of the enzyme xanthine oxidase. This was not the case since allopurinol did not rescue azaserine- treated LND NSCs (Figure 5h). Finally, the concentration of hypoxanthine and guanine was quantified by HPLC after NSCs treatment with the compounds. Two compounds, namely Ap4A and NADPH tetrasodium, normalized the levels of both purine metabolism products, as compared to untreated LND NSCs. The 3 others had no effect (Figure 5i and 5j). This suggested that, depending of the chemical structures surrounding the adenosine moiety, each compound might have different mode of action.

Correction of LND related neuronal phenotypes by adenosine-like compounds

To evaluate whether the compounds had a global positive effect on the different neural phenotypes identified as dependent of HGPRT dependent salvage pathway, differentiating NSCs were treated from day 5 with azaserine and each compound added at day 4, 8, 12 and 15. Cell cultures were stopped for analysis at day 7, 11, 14 and 18 (Figure 6). The optimal compound concentrations were extrapolated from previous dose-response experiments. All the compounds demonstrated neuroprotective effects against azaserine-induced cell death in developing LND1 and LND2 neurons (Figure 6a). All compounds restored Ki67 expression although with different efficiency (Figure 6b and d) and increased the number of cells in azaserine-treated cultures (Figure 6c and 6d). The percentage of HuC/D positive cells and the total number of neurons produced was also increased, reaching levels similar to those observed for cells not exposed to azaserine (Figure 6e, f and g). Together, this indicated that, by promoting adaptation metabolic strategies, all adenosine-like compounds ameliorated cell survival, proliferation and differentiation rate of LND NSC, and globally ameliorated neurogenesis in HGPRT deficient cells (Figure 6g).

Discussion:

The main result of this study is the set-up of a human model allowing the study of neurodevelopmental defects associated with metabolic disorders. This model allowed a high throughput based identification of pharmacological compounds with potential therapeutic action on LND neuropsychiatric symptoms. All those compounds could be considered as adenosine donors, although the adenosine metabolic pathway only partially explain their efficiency at rescuing LND cells. This result was obtained through a target-agnostic based drug screening system thanks to the use of a pathological model based on neural cells differentiated from iPSC lines derived from patients affected by Lesch-Nyhan disease, and an experimental paradigm that exploited the functional defects revealed by a specific culture medium. Comparable models and paradigms may be instrumental in a number of other diseases characterized by the loss of function of an enzyme indispensable for a specific metabolic activity.

The next step of this work would be to test the efficiency of the hit compounds in animal models of LND. HGPRT KO rodent models exhibit metabolic abnormalities consistent with deficient purine salvage11, 25, 26. In some extend, reduction of dopamine concentration in the caudate-putamen nuclei was also reported both in mice and rats27, 25. Unfortunately, rodent model failed to recapitulate the neuropsychiatric characteristics of LND, i.e. dystonia and self- injurious behavior10,11,25. This lack of spontaneous neurobehavioral phenotypes renders these models not suitable to test the efficiency of the compounds at a functional and integrated level. Evidence of efficiency may therefore rely on human case-reports. Indeed, effect of SAM administration as a dietary supplement has been documented in some LND patients28-31. Cumulating these case report, SAM supplementation was evaluated in 21 patients, including 18 with the full spectrum of LND-associated neuropsychiatric disorders. In most of the cases, supplementation with SAM led to a significant reduction in self-mutilation events and good clinical outcome. Dolcetta and collaborators described however aggravation of the symptoms or important adverse effects that some patients did not tolerate and led to SAM removal. While encouraging, these reports described very different situations with great heterogeneity regarding the age of the patients (mainly adolescents and adults), the duration of the treatment, the dose of SAM, the type of co-treatment and, finally, the type of assessment of the benefits. However, by demonstrating for the first time that SAM actually improved neuronal phenotypes directly associated with HGPRT-deficiency, our work pleads for a

92 formal reassessment of supplementation with SAM as a beneficial complement in LND. Interestingly, two others compounds can be easily assessed in LND patient since NAD and NADP can be provided as their precursor form i.e. vitamin B3.

Interestingly, the compounds identified have in common to possess at least one adenosine moiety. One hypothesis is that the release of it can act by replenishing adenosine in cells, which can then be transformed into AMP by adenosine kinase, then in ADP and ATP 32. Furthermore, IMP can be formed from AMP by AMP deaminase, which can then be converted to GMP in 2 reaction mediated by IMP deshydrogenase then GMP synthase, a starting point to replenishing GDP and GTP. Adenosine can also serve as a source of inosine via the action of adenosine deaminase33, 34. Additionally, adenosine-like compounds can exert their effect via binding to purinergic receptors, as described above, activating cell signaling pathways beneficial to compensate neurodevelopmental defect in LND-derived NSC35. However, in our experimental set-up, adenosine itself only partially reproduced the protective effect of the compounds. In addition, ABT 702, an inhibitor of adenosine kinase, only partially blocked compound efficiency while inhibition of adenosine deaminase with pentostatin has no effect. This indicated that adenosine release and conversion into AMP is only partially involved in compounds efficiency whereas conversion into inosine is not. Together, this suggest that the positive effect of adenosine is potentiated by other chemical activities that are compound-specific. N6-MA, and by extension its natural structural homologue SAM, represent important actors in cellular reaction of methylation and transsulfuration. SAM is an important physiological intermediate that act as methyl donor in more than 35 methylation reactions involving DNA, proteins, phospholipids and amines 36. Chen and collaborators have suggested that the therapeutic effect of SAM on self-injuries may reside into the inhibition of DA post-synaptic effect via the methylation of its hydroxyl group through activation of COMT 29. Our results suggested that the beneficial potential of N6-MA and SAM may also reside in the promotion at the transcriptional and post-transcriptional levels of the activation of enzymes controlling compensatory pathways to purine deficiency. NAD+ is an important cofactor for enzymes essential to multiple metabolic processes including glycolysis, pyruvate dehydrogenase complex, TCA cycle and oxidative phosphorylation. Next to its direct metabolic action, NAD+ activates the histone deacetylase enzymes Sirtuins and can, like SAM and N6M, trigger activation of compensatory genes rescuing HGPRT-deficiency37. NADPH is essential for detoxification of oxidative stress by generating antioxidant molecules like reduced glutathione, reduced thioredoxin and reduced

93 peroxiredoxins38. Balanced redox signaling has been demonstrated to be central in brain development by regulating neurogenesis, differentiation neurite outgrowth and neuronal plasticity39. Finally, diadenosine polyphosphates can activate specific receptors termed dinucleotide receptors or P4 receptors, a type of receptor-operated Ca2+ channel, which are insensitive to other nucleosides or nucleotides40. Together, this indicated that, while sharing strong structural analogy, each compound might have specific mode of action, a postulate reinforced by the demonstration that each has a different effect on the metabolisms of hypoxanthine and guanine. Interestingly, when tested in our paradigm, allopurinol did not provide any protection to azaserine treated NSC, indicated a mechanism of action of the adenosine-like compound different and therefore complementary of the so far gold standard treatment used to decrease uricemia in LND.

This study focused primarily on modeling LND neuronal phenotypes using the neural progeny of patient-derived iPSC. We chose to differentiate iPSC into cortical progenitors and neurons since this brain area was reported as functionally and anatomically abnormal in LND41, 42 and since we previously showed that this types of cells were fully amenable to high throughput drug screening18, 17. We first differentiated the cells using the previously described neural medium N2B27, which did not reveal any alterations associated with HGPRT deficiency. HGPRT-deficiency associated phenotypes were only identified when azaserine, an inhibitor of the de novo synthesis, was added to the culture medium at concentrations that did not affect HGPRT-competent neural cells. This is in agreement with previous in vitro works of McKeran and collaborators that demonstrated the necessity of inhibiting the de novo pathway in cells to study HGPRT deficiency in order to re-create a “brain-like environment”24. In vitro, cells tent to increase the de novo synthesis to compensate recycling deficit, a situation that is not physiologically possible in the brain where the de novo pathway enzymes are only poorly active 13. This highlights the intrinsic ability of different cell types to mobilize alternative energy supplies to cope with bioenergetics stress — a property termed ‘metabolic flexibility’43, 44. Together, our study identified in LND neural cells metabolic pathways that can be relevant therapeutic targets to ease the devastating neuropsychiatric symptoms associated with this pathology. Interestingly, these pathways can be activated in LND patients via simple food supplementation. This also open the path to larger screening of FDA-approved drugs or of collections of totally new chemical entities. This experimental paradigm can also be easily adapted to other enzyme associated neurological disorders affecting normal brain development.

Acknowledgements:

The authors are thankful to Pauline Poydenot, Ronan Crépin, Cécile Denis for their help in preparing biological resources and screening assay development, Odile Boespflug-Tanguy, Guillaume Pinna, Jerôme Denis for scientific discussions and evaluation of this work. VR received PhD grant from The French Ministry of Science and Technology and completed by a grant from the patient and family association Lesch-Nyhan Action (LNA). I-Stem is part of the Biotherapies Institute for Rare Diseases (BIRD) supported by the Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon). This study has been in part funded by grants from “Investissements d’Avenir” – (ANR-11-INBS-0009 - INGESTEM – and ANR-11-INBS- 0011- NeurATRIS). This study used samples from the NINDS Human Genetics Resource Center DNA and Cell Line Repository, as well as clinical data. NINDS Repository sample numbers corresponding this study are GM 01869, GM 02227, GM23784, GM04603.

References:

1 Baresova, V. et al. Mutations of ATIC and ADSL affect purinosome assembly in cultured skin fibroblasts from patients with AICA-ribosiduria and ADSL deficiency. Human molecular genetics 21, 1534-1543, doi:10.1093/hmg/ddr591 (2012). 2 Fumagalli, M., Lecca, D., Abbracchio, M. P. & Ceruti, S. Pathophysiological Role of Purines and Pyrimidines in Neurodevelopment: Unveiling New Pharmacological Approaches to Congenital Brain Diseases. Frontiers in pharmacology 8, 941, doi:10.3389/fphar.2017.00941 (2017). 3 Lesch, M. & Nyhan, W. L. A Familial Disorder of Uric Acid Metabolism and Central Nervous System Function. The American journal of medicine 36, 561-570 (1964). 4 Torres, R. J. & Puig, J. G. Hypoxanthine-guanine phosophoribosyltransferase (HPRT) deficiency: Lesch-Nyhan syndrome. Orphanet J Rare Dis 2, 48, doi:10.1186/1750-1172-2-48 (2007). 5 Fu, R. et al. Genotype-phenotype correlations in neurogenetics: Lesch-Nyhan disease as a model disorder. Brain : a journal of neurology 137, 1282-1303, doi:10.1093/brain/awt202 (2014). 6 Nyhan, W. L., O'Neill, J. P., Jinnah, H. A. & Harris, J. C. in GeneReviews((R)) (eds M. P. Adam et al.) (1993). 7 Jinnah, H. A. et al. Delineation of the motor disorder of Lesch-Nyhan disease. Brain : a journal of neurology 129, 1201-1217, doi:10.1093/brain/awl056 (2006). 8 Torres, R. J., Prior, C. & Puig, J. G. Efficacy and safety of allopurinol in patients with the Lesch- Nyhan syndrome and partial hypoxanthine- phosphoribosyltransferase deficiency: a follow- up study of 18 Spanish patients. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids 25, 1077-1082, doi:10.1080/15257770600893974 (2006). 9 Finger, S., Heavens, R. P., Sirinathsinghji, D. J., Kuehn, M. R. & Dunnett, S. B. Behavioral and neurochemical evaluation of a transgenic mouse model of Lesch-Nyhan syndrome. Journal of the neurological sciences 86, 203-213 (1988).

10 Wu, C. L. & Melton, D. W. Production of a model for Lesch-Nyhan syndrome in hypoxanthine phosphoribosyltransferase-deficient mice. Nature genetics 3, 235-240, doi:10.1038/ng0393- 235 (1993). 11 Engle, S. J. et al. HPRT-APRT-deficient mice are not a model for lesch-nyhan syndrome. Human molecular genetics 5, 1607-1610 (1996). 12 Howard, W. J., Kerson, L. A. & Appel, S. H. Synthesis de novo of purines in slices of rat brain and liver. Journal of neurochemistry 17, 121-123 (1970). 13 Allsop, J. & Watts, R. W. Activities of amidophosphoribosyltransferase and purine phosphoribosyltransferases in developing rat brain. Advances in experimental medicine and biology 122A, 361-366 (1980). 14 Jinnah, H. A., Harris, J. C., Nyhan, W. L. & O'Neill, J. P. The spectrum of mutations causing HPRT deficiency: an update. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids 23, 1153-1160, doi:10.1081/NCN-200027400 (2004). 15 Fu, R. & Jinnah, H. A. Genotype-phenotype correlations in Lesch-Nyhan disease: moving beyond the gene. The Journal of biological chemistry 287, 2997-3008, doi:10.1074/jbc.M111.317701 (2012). 16 Takahashi, K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872, doi:10.1016/j.cell.2007.11.019 (2007). 17 Darville, H. et al. Human Pluripotent Stem Cell-derived Cortical Neurons for High Throughput Medication Screening in Autism: A Proof of Concept Study in SHANK3 Haploinsufficiency Syndrome. EBioMedicine 9, 293-305, doi:10.1016/j.ebiom.2016.05.032 (2016). 18 Boissart, C. et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Transl Psychiatry 3, e294, doi:10.1038/tp.2013.71 (2013). 19 Georges, P., Boissart, C., Poulet, A., Peschanski, M. & Benchoua, A. Protein Kinase-A Inhibition Is Sufficient to Support Human Neural Stem Cells Self-Renewal. Stem Cells 33, 3666-3672, doi:10.1002/stem.2194 (2015). 20 Nakagawa, M. et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature biotechnology 26, 101-106, doi:10.1038/nbt1374 (2008). 21 Zhang, J. H., Chung, T. D. & Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of biomolecular screening 4, 67-73, doi:10.1177/108705719900400206 (1999). 22 Curtis, A. E., Smith, T. A., Ziganshin, B. A. & Elefteriades, J. A. The Mystery of the Z-Score. Aorta (Stamford) 4, 124-130, doi:10.12945/j.aorta.2016.16.014 (2016). 23 Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M. & Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature biotechnology 21, 183- 186, doi:10.1038/nbt780 (2003). 24 McKeran, R. O., Howell, A., Andrews, T. M., Watts, R. W. & Arlett, C. F. Observations on the growth in vitro of myeloid progenitor cells and fibroblasts from hemizygotes and heterozygotes for "complete" and "partial" hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) deficiency, and their relevance to the pathogenesis of brain damage in the Lesch- Nyhan syndrome. Journal of the neurological sciences 22, 183-195 (1974). 25 Meek, S. et al. Reduced levels of dopamine and altered metabolism in brains of HPRT knock- out rats: a new rodent model of Lesch-Nyhan Disease. Scientific reports 6, 25592, doi:10.1038/srep25592 (2016). 26 Tschirner, S. K., Gutzki, F., Schneider, E. H., Seifert, R. & Kaever, V. Neurotransmitter and their metabolite concentrations in different areas of the HPRT knockout mouse brain. Journal of the neurological sciences 365, 169-174, doi:10.1016/j.jns.2016.04.025 (2016). 27 Jinnah, H. A. et al. Dopamine deficiency in a genetic mouse model of Lesch-Nyhan disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 14, 1164- 1175 (1994).

28 Dolcetta, D. et al. Quantitative evaluation of the clinical effects of S-adenosylmethionine on mood and behavior in Lesch-Nyhan patients. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids 32, 174-188, doi:10.1080/15257770.2013.774012 (2013). 29 Chen, B. C. et al. Treatment of Lesch-Nyhan disease with S-adenosylmethionine: experience with five young Malaysians, including a girl. Brain & development 36, 593-600, doi:10.1016/j.braindev.2013.08.013 (2014). 30 Glick, N. Dramatic reduction in self-injury in Lesch-Nyhan disease following S- adenosylmethionine administration. Journal of inherited metabolic disease 29, 687, doi:10.1007/s10545-006-0229-8 (2006). 31 Lauber, M., Plecko, B., Pfiffner, M., Nuoffer, J. M. & Haberle, J. The Effect of S- Adenosylmethionine on Self-Mutilation in a Patient with Lesch-Nyhan Disease. JIMD reports 32, 51-57, doi:10.1007/8904_2016_571 (2017). 32 Boison, D. Adenosine kinase: exploitation for therapeutic gain. Pharmacological reviews 65, 906-943, doi:10.1124/pr.112.006361 (2013). 33 Ipata, P. L. Origin, utilization, and recycling of nucleosides in the central nervous system. Advances in physiology education 35, 342-346, doi:10.1152/advan.00068.2011 (2011). 34 Ipata, P. L., Camici, M., Micheli, V. & Tozz, M. G. Metabolic network of nucleosides in the brain. Current topics in medicinal chemistry 11, 909-922 (2011). 35 Burnstock, G. & Dale, N. Purinergic signalling during development and ageing. Purinergic signalling 11, 277-305, doi:10.1007/s11302-015-9452-9 (2015). 36 Chavez, M. SAMe: S-Adenosylmethionine. American journal of health-system pharmacy : AJHP : official journal of the American Society of Health-System Pharmacists 57, 119-123, doi:10.1093/ajhp/57.2.119 (2000). 37 Katsyuba, E. & Auwerx, J. Modulating NAD(+) metabolism, from bench to bedside. The EMBO journal 36, 2670-2683, doi:10.15252/embj.201797135 (2017). 38 Yang, Y. & Sauve, A. A. NAD(+) metabolism: Bioenergetics, signaling and manipulation for therapy. Biochimica et biophysica acta 1864, 1787-1800, doi:10.1016/j.bbapap.2016.06.014 (2016). 39 Borquez, D. A. et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of neurochemistry 137, 506-517, doi:10.1111/jnc.13581 (2016). 40 Pintor, J. et al. Diadenosine polyphosphate receptors. from rat and guinea-pig brain to human nervous system. Pharmacology & therapeutics 87, 103-115 (2000). 41 Puig, J. G. & Torres, R. J. Enzyme activity and brain anatomy: lessons from HPRT deficiency. The Lancet. Neurology 12, 1129-1131 (2013). 42 Schretlen, D. J. et al. Regional brain volume abnormalities in Lesch-Nyhan disease and its variants: a cross-sectional study. The Lancet. Neurology 12, 1151-1158 (2013). 43 Micheli, V. et al. NAD metabolism in HPRT-deficient mice. Metabolic brain disease 24, 311- 319, doi:10.1007/s11011-009-9134-9 (2009). 44 Allen, S. P. et al. Astrocyte adenosine deaminase loss increases motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Brain : a journal of neurology 142, 586-605, doi:10.1093/brain/awy353 (2019).

Figure legends:

Figure 1: Characterization and phenotypical analysis of iPSC, NSC and cortical neurons derived from control and Lesch-Nyhan donors. a – Representative images of self-renewing HGPRT competent (CTL1 and CTL2) and deficient (LND1 and LND2) iPSC lines expressing the 2 pluripotency markers SSEA-4 (green) and Oct-4 (red) in colonies. Scale bar = 200 µm. b – Representative images of cortical neural stem cells (NSC) expressing Nestin (green) and Sox2 (red). Scale bar = 100 µm. c - Western-blot analysis of HGPRT protein expression in CTL and LND iPSC, NSC and cortical neurons. β-actin was used as a loading control. d - HGPRT enzymatic activity in CTL and

LND-derived iPSC, NSC and neurons. The results are expressed as nmol of NADH produced per hour and normalized to total protein content. e and f - Kinetic quantification of the percentage of Ki-67 positive cells (e) or HuC/D and Sox2 positive cells (f) during the process of differentiation of HGPRT competent (blue lines) or deficient (red lines) NSC into post- mitotic neurons. Results are expressed as mean ± SD of the 2 CTL and 2 LND cell lines with 3 biological replicates per cell line. g - Quantification of cell viability using a combination of hoechst and propidium iodide (PI) staining during the process of differentiation of HGPRT competent (blue lines) or deficient (red lines) NSC. Results are expressed as mean ± SD of the 2 CTL and 2 LND cell lines with 3 biological replicates per cell line. h - Representative images of Ki-67 (green) and Sox2 (red) NSC marker or HuC/D (green) and Tuj-1 (red) neuronal markers in CTL and LND cells at days 4 and 14 of differentiation. Scale bar = 100 µm.

Figure 2: Phenotypical characterization of NSC derived neurons after azaserine treatment. a - Quantification of hypoxanthine levels in the 2 CTL (HGPRT +, blue dots) and the 2 LND (HGPRT -, red dots) – derived NSC by HPLC. b – Percentage of viable cells as quantified using Hoechst-PI staining after treatment with azaserine starting at day 1 of differentiation (D1) compared to cells exposed to 0.1% DMSO. c - Percentage of cell viability after azaserine treatment starting at day 5 of differentiation (D5) compared to cells exposed to 0.1% DMSO d – Quantification of the percentage of Ki-67 positive cells after treatment with azaserine started at day 5 of differentiation compared to cells exposed to 0.1% DMSO. e -

Quantification of the total number of cells assessed using Hoechst nuclear staining after treatment with azaserine started at day 5 of differentiation compared to cells exposed to 0.1% DMSO. f - Quantification of the percentage of HuC/D positive neurons after treatment with azaserine started at day 5 of differentiation compared to cells exposed to 0.1% DMSO. g - Quantification of the total number of HuC/D positive neurons after treatment with azaserine started at day 5 of differentiation compared to cells exposed to 0.1% DMSO. h – Representative images of immunocytochemistry for Ki-67 at day 7 of differentiation and HuC/D at day 14 of differentiation in CTL and LND cells exposed to 0.1% DMSO or 2.0 µM azaserine from day 5. Scale bar = 100 µm. Results are expressed as mean ± SD of the 2 CTL (HGPRT +, blue lines) and 2 LND (HGPRT -, red lines) cell lines with 4 technical replicates. Azaserine was added at 0.5 (full lines) or 2.0 µM (dotted lines). *p < 0.01 Holm-Sidak post- hoc test.

Figure 3: Primary high throughput screening of pharmacological compounds a – Cell-TiterGlo (CTG) estimation of cell viability after treatment of CTL and LND cell lines with increasing concentrations of azaserine. The X axis represents azaserine concentration expressed as log10 (concentration), where the concentration is expressed in molar [M]. Results are expressed as mean ± SD of 4 technical replicates (2 biological replicates) b - Screening workflow. c - Z’-factor calculation in 5 sister 384 well-plates containing LND1 NSC treated with 0.1% DMSO or 1.0 µM azaserine. RLU: relative luminescence unit. d - Primary screening cascade. e - Dose-response analysis of the 6 hit compounds. The black curve corresponds to the percentage of recovery after treatment of LND1 NSC with 1.0 µM azaserine. The blue line shows the percentage of viability after treatment with the drug alone without azaserine, representing the toxicity of the compound itself. Results are expressed as mean ± SD of 4 technical replication (2 biological replicates). f- Chemical structures of the 6 hit compounds obtained from PubChem (US National library of medicine).

Figure 4: Evaluation of the 6 hit compounds specificity a – Evaluation of hit compounds dose-dependent activity after treatment with 1 µM asazerine of NSC obtained from LND2 donor (blue line) as well as from 2 clones derived from HGPRT competent human embryonic stem cells invalidated for HGPRT using the CRISPR/Cas9

99 system (CRISPR-1 in grey and CRISPR-2 in black). X axis represents compound concentration expressed as log10 (Compound concentration in molar M) b - Cell-TiterGlo (CTG) estimation of cell viability after treatment of CTL and LND cell lines with increasing concentrations of HAT medium (Hypoxanthine, Aminopterin and Thymidine containing medium). The X axis represents HAT medium concentration express as log10 (X), where the X is the dilution factor of the commercial HAT complete medium. Results are expressed as mean ± SD of 4 technical replicates (2 biological replicates). c - Evaluation of hit compounds dose-dependent activity after treatment of LND NSC with 1 µM asazerine (blue line) or

0.15X HAT (black line). X axis represents compound concentration express as log10 (Compound concentration in molar M). Results are expressed as mean ± SD of 4 technical replicates. d- Cell-TiterGlo (CTG) estimation of cell viability after treatment of CTL and LND cell lines with increasing concentrations of dose-response assay of rotenone on CTL and

LND NSC lines. X axis represents compound concentration expressed as log10 (Rotenone concentration in molar M). Results are expressed as mean ± SD of 4 technical replicates (2 biological replicates). e - Evaluation of hit compounds dose-dependent activity after treatment of LND NSC with 0.25 µM rotenone (black line) or 1 µM asazerine (blue line). X axis represents compound concentration express as log10 (Compound concentration in molar M). Results are expressed as mean ± SD of 4 technical replicates (2 biological replicates). Aza: Azaserine

Figure 5: Mechanism of action of hit Compounds. a and b - Western-blots analysis of HGPRT (a) and PRTFDC1 (b) protein expression in CTL1 and LND1 NSC treated by SAM (20 µM), N6-MA (20 µM), Ap4A (12.5 µM), NADPH (25 µM) and NAD+ (25 µM) during 72h. β-actin was used as a loading control. c - HGPRT enzymatic activity in CTL1 and LND1 NSC treated by the hits compounds. Results are expressed as mean ± SD of technical duplicates (2 biological replicates). d and e – Hoechst staining (d) or Cell-titerGlo (CTG, e) based quantification of SAM (blue lines) or adenosine (Ado, red lines) dose-dependent activity after treatment of LND1 NSC with 1 µM asazerine. X axis represents compound concentration express as log10 (Compound concentration in molar M). Results are expressed as mean ± SD of 4 technical replicates. X1: 1 treatment with the compound (full line), 2X: 2 sequential treatment with the compound (dotted lines). f and g - CTG- based quantification of SAM dose-dependent activity after treatment of LND1 NSC with 1 µM asazerine in presence of the adenosine kinase inhibitor

100

ABT 702 (g) or of the adenosine deaminase inhibitor pentostatin (h). h - Allopurinol efficiency in LND1 NSC treated with 1.0 µM azaserine. CTG was used as a read-out (black line). Toxicity of allopurinol alone was also quantified (blue line). Results are expressed as mean ± SD of 4 technical replicates (2 biological replicates). i and j - Measurement of hypoxanthine (g) and guanine (h) using HPLC in CTL1 and LND1 NSC after 72h of treatment with the hit compounds. The results are expressed as mmol of metabolite normalized per g of protein content.

Figure 6: Adenosine-like compounds restore LND-relevant neuronal phenotypes. a – c: Evaluation of hit compound efficacy upon cell viability (a, Hoechst staining read-out), percentage of Ki-67 positive cells (b) and total cell number (c) after treating LND neural cells repeatedly to 2.0 µM azaserine from day 5 of differentiation. Results represent the mean +/- SD of LND1 and LND2 lines with 4 technical replicates/donor, compared to 0.1% DMSO treated cells. d – Representative images of immunocytochemistry for Hoechst (blue) and Ki- 67 staining (green) at day 7 of differentiation. Scale bar = 100 µm. e and f - Evaluation of hit compound efficacy upon the percentage (e) and total number (f) of HuC/D positive neurons after treating LND neural cells repeatedly to 2.0 µM azaserine from day 5 of differentiation. Results represent the mean +/- SD of LND1 and LND2 lines with 4 technical replicates/donor, compared to 0.1% DMSO treated cells. g- Representative images of immunocytochemistry for Hoechst (blue) and HuC/D staining (green) at day 14 of differentiation. Scale bar = 100 µm.

Aza: azaserine

101

Figure 1 - Ruillier et al

NSC - CTL1 NSC - CTL2 iPSC - CTL1 iPSC - CTL2 Oct-4 Sox2 / /

iPSC - LND1 iPSC - LND2 Nestin / NSC - LND1 NSC - LND2 SSEA-4 / Hoechst Hoechst

c d 6

iPSC NSC Neurons 4

CTL1 CTL2 LND1 LND2 CTL1 CTL2 LND1 LND2 CTL1 CTL2 LND1 LND2 2

HGPRT activity HGPRT

β-Actin (nmol NADH/h/mg of protein)

CTL1 CTL2 LND1 LND2 CTL1 CTL2 LND1 LND2 CTL1 CTL2 LND1 LND2

iPSC NSC Neurons

e f g

100 100 100

80 80 HGPRT + (Sox2) 80 HGPRT - (Sox2) 60 60 60

40 40 40 / Hoechst HGPRT + (HuC/D) HGPRT + 20 HGPRT + 20 HGPRT - (HuC/D) 20 HGPRT - HGPRT - % of Ki-67 positive cells 0 0 0

% of positive cells / Hoechst 1 4 7 14 1 4 7 14 % of cell viability (Hoechst-PI) 1 4 7 14 Days of differentiation Days of differentiation Days of differentiation

CTL1 CTL2 LND1 LND2

Day 4 Sox2 / Ki-67 /

Hoechst Day 14

Day 4 Tuj-1 / HuC/D /

Hoechst Day 14 Figure 2 - Ruillier et al

a b c

D1 D5 100 150 150 80 Aza 0.5 μM (HGPRT +) Aza 0.5 μM (HGPRT +) 60 100 Aza 0.5 μM (HGPRT -) 100 Aza 0.5 μM (HGPRT -)

/ DMSO Aza 2.0 μM (HGPRT +) 50 Aza 2.0 μM (HGPRT +) / DMSO 50 Aza 2.0 μM (HGPRT -) 20 Aza 2.0 μM (HGPRT -)

Hypoxanthine (μmol/l)

% of viability (Hoechst-PI) 0 0 % of viability (Hoechst-PI) 0 4 7 11 7 11 14 18 Days of differentiation Days of differentiation HGPRT + HGPRT -

d e D5 D5 150 150

Aza 0.5 μM (HGPRT +) Aza 0.5 μM (HGPRT +) 100 Aza 0.5 μM (HGPRT -) 100 Aza 0.5 μM (HGPRT -) **

/ DMSO

Aza 2.0 μM (HGPRT +) / DMSO 50 50 ** ** Aza 2.0 μM (HGPRT +) Aza 2.0 μM (HGPRT -) Aza 2.0 μM (HGPRT -) *** % of Ki-67 positive cells *** ***

0 Number of cells (Hoechst) 0 7 11 14 18 7 11 14 18 Days of differentiation Days of differentiation

f g

D5 D5

150 150

Aza 0.5 μM (HGPRT +) Aza 0.5 μM (HGPRT +) 100 Aza 0.5 μM (HGPRT -) 100 Aza 0.5 μM (HGPRT -)

/ DMSO / DMSO 50 Aza 2.0 μM (HGPRT +) 50 Aza 2.0 μM (HGPRT +) ** Aza 2.0 μM (HGPRT -) Aza 2.0 μM (HGPRT -)

% of HuC/D positive cells 0 0

HuC/D positive cells number 7 11 14 18 7 11 14 18 Days of differentiation Days of differentiation

h CTL1 CTL2 LND1 LND2

DMSO 0.1% Ki-67 / Hoechst Aza 2.0 μM

DMSO 0.1% HuC/D /

Hoechst Aza 2.0 μM Figure 3 - Ruillier et al

a b 150

100 CTL1 CTL2 LND1 5h 24h 48h 45min 50 LND2 NSC LND1 seeding Azaserine % of viability (CTG) Chemical libraries / DMSO Cell-TiterGlo Luminescence 384 well-plates treatment + hypoxanthine reaction reading 0 treatment -8 -7 -6 -5

Log10 [M]

Azaserine c d

Z'mean = 0.84 150000 3838

Z’ = 0.80 Primary screening Selection : Z-Score > 2σ

) 100000 U DMSO 0.1% L 29 primary hits

(

Re-test

G Aza 1.0 μM

T Selection : % of recovery > 10 C 50000 22 7 Dose-responses

0 2 5 hits 1 2 3 4 5 Plate number

150 150 150 150 150 150

% of viability (CTG) viability of % % of viability (CTG) viability of % EC50 = 12.5 μM (CTG) viability of % EC50 = 9,47 μM EC50 = 10,8 μM

100 a 100 100 100 100 100

50 50 50 50 50 50

% of recovery (CTG)

% of recovery (CTG) % of recovery (CTG) 0 0 0 0 0 0 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4

Log10 [M] Log10 [M] Log10 [M]

N6-MA Thio-NADP NADPH

300 300 150 150 150 150

% of viability (CTG) viability of % % of viability (CTG) viability of % EC50 = 7.52 μM EC50 = 9.37 μM EC50 = 11.5 μM (CTG) viability of %

200 200 100 100 100 100

50 100 100 50 50 50

% of recovery (CTG)

% of recovery (CTG) % of recovery (CTG) 0 0 0 0 0 0 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 Log [M] Log10 [M] 10 Log10 [M] Ap4A NAD+ SAM

N6-methyladenosine (N6-MA) S-adenosylmethionine (SAM) P1,P4-Di(adenosine-5') tetraphosphate (Ap4A)

Nadide (NAD+) Thio-NADP NADPH Figure 4 - Ruillier et al

150 LND2 150 LND2 150 LND2 CRISPR-1 CRISPR-1 CRISPR-1 100 CRISPR-2 100 CRISPR-2 100 CRISPR-2

50 50 50

% of recovery (CTG) % of recovery (CTG) 0 % of recovery (CTG) 0 0

-7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 Log [M] Log [M] 10 Log10 [M] 10

N6-MA Thio-NADP 10 NADPH

150 150 300 LND2 LND2 LND2 CRISPR-1 CRISPR-1 CRISPR-1 200 CRISPR-2 100 CRISPR-2 100 CRISPR-2

100 50 50

% of recovery (CTG) % of recovery (CTG) % of recovery (CTG) 0 0 0 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 Log [M] Log [M] Log10 [M] 10 10

Ap4A NAD+ SAM b c

150 150 150 150 HAT 0.15X HAT 0.15X HAT 0.15X Aza 1.0 μM Aza 1.0 μM Aza 1.0 μM

100 CTL1 100 (CTG) 100 100 CTL2 LND1 50 50 50 50 LND2

% of viability (CTG)

% of recovery (CTG)

% of recovery (CTG) 0 % of recovery 0 0 0 -3 -2 -1 0 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 Log [M] Log [M] Log [M] Log10 [X] 10 10 10

HAT N6-MA Thio-NADP NADPH

300 150 150 HAT 0.15X HAT 0.15X HAT 0.15X Aza 1.0 μM Aza 1.0 μM Aza 1.0 μM

200 (CTG) 100 100

100 50 50

% of recovery (CTG) % of recovery (CTG) 0 % of recovery 0 0 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4

Log10 [M] Log10 [M] Log10 [M]

Ap4A NAD+ SAM de

150 150 150 150 Rotenone 0.25 μM Rotenone 0.25 μM Rotenone 0.25 μM CTL1 Aza 1.0 μM Aza 1.0 μM Aza 1.0 μM 100 CTL2 100 100 100 LND1 LND2 50 50 50 50

% of viability (CTG)

% of viability (CTG) 0 % of viability (CTG) 0 % of viability (CTG) 0 0 -9 -8 -7 -6 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 Log [M] Log [M] Log [M] Log10 [M] 10 10 10

Rotenone N6-MA Thio-NADP NADPH

400 150 150 Rotenone 0.25 μM Rotenone 0.25 μM Rotenone 0.25 μM

Aza 1.0 μM G) Aza 1.0 μM Aza 1.0 μM 300 100 100 200 50 50 100

% of viability (CT % of viability (CTG)

% of viability (CTG) 0 0 0 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4

Log10 [M] Log10 [M] Log10 [M]

Ap4A NAD+ SAM Figure 5 - Ruillier et al

a b

CTL1 LND1 CTL1 LND1

CTL1 LND1 + SAM + N6-MA+ Ap4A + NADPH+ NAD+ + SAM + N6-MA+ Ap4A + NADPH+ NAD+ CTL1 LND1 + SAM + N6-MA+ Ap4A + NAD+ + Nadide+ SAM + N6-MA + Ap4A + NADPH + NAD+

HGPRT PRTFDC1

β-Actin β-Actin

c d e

6 200 200

150 150 Ado x1 Ado x1 4 Ado x2 Ado x2 100 SAM x1 100 SAM x1 SAM x2 2 SAM x2 50 50

HGPRT activity HGPRT

% of recovery (CTG)

% of recovery (Hoechst) 0 0 0 (nmol NADH/h/mg of protein) -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 Log [M] Log [M] CTL1 LND1 10 10 + SAM + Ap4A + NAD++ SAM + Ap4A + NAD+ + N6-MA + NADPH + N6-MA + NADPH CTL1 LND1

g f SAM SAM h SAM + ABT 702 5μM SAM + pentostatine 5μM 150 200 150 200 SAM + ABT 702 10 μM SAM + pentostatine 10 μM (CTG) viability of %

150 150 100 100

100 100 50 50 50 50

% of recovery (CTG)

% of recovery (CTG) 0 % of recovery (CTG) 0 0 0 -7 -6 -5 -4

Log10 [M] -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4

Log10 [M] Allopurinol Log10 [M] j i 1000 1250

1000 750 750 500 500

250

Guanine (mmol/g) 250

Hypoxanthine (mmol/g) 0 0

CTL1 LND1 CTL1 LND1

LND1 + SAM LND1 +LND1 SAM + NAD+ LND1 + Ap4A LND1 + NAD+LND1 + Ap4A LND1 + N6-MA LND1 + NADPH LND1 + N6-MA LND1 + NADPH Figure 6 - Ruillier et al

a b c

150 200 150 Not treated Not treated Not treated 150 100 + Ap4A 12.5 μM + Ap4A 12.5 μM 100 + Ap4A 12.5 μM + NAD+ 25 μM 100 + NAD+25 μM + NAD+ 25 μM

/ DMSO + NADPH 25 μM + NADPH 25 μM / DMSO + NADPH 25 μM / DMSO 50 50 + SAM 20 μM 50 + SAM 20 μM + SAM 20 μM + N6-MA 20 μM + N6-MA 20 μM + N6-MA 20 μM

% of Ki-67 positive cells

Number of cells (Hoechst)

% of viability (Hoechst-PI) 0 0 0 7 11 14 18 7 11 14 18 7 11 14 18 Days of differentiation Days of differentiation Days of differentiation

DMSO 0.1% Aza 2.0 μM Aza + SAM Aza + N6-MA Aza + Ap4A Aza + NADPH Aza + NAD+

LND1 Ki-67 / Hoechst LND2

e f

150 150 Not treated Not treated

100 + Ap4A 12.5 μM 100 + Ap4A 12.5 μM + NAD+ 25 μM + NAD+ 25 μM + NADPH 25 μM

/ DMSO / DMSO + NADPH 25 μM 50 50 + SAM 20 μM + SAM 20 μM + N6-MA 20 μM + N6-MA 20 μM

% of HuC/D positive cells 0 0

HuC/D positive cells number 7 11 14 18 7 11 14 18 Days of differentiation Days of differentiation

DMSO 0.1% Aza 2.0 μM Aza + SAM Aza + N6-MA Aza + Ap4A Aza + NADPH Aza + NAD+

LND1 HuC/D /

Hoechst LND2 Figure S1 - Ruillier et al

a b

iPSC - CTL1 iPSC - CTL2 iPSC - CTL1 iPSC - CTL2 iPSC - LND1 iPSC - LND2

5 5 5 5 10 10 10 10

4 4 4 4 10 10 10 10

3 3 3 3 10 10 10 10

SSEA3

SSEA3 iPSC - LND1 iPSC - LND2 SSEA3 2 2 2 2 10 10 10 10 0 0 0 0

2 3 4 5 2 4 5 0 3 2 3 4 5 2 3 4 5 10 10 10 10 0 10 10 10 10 0 10 10 10 10 0 10 10 10 10 TRA-1-81 TRA-1-81 TRA-1-81 TRA-1-81

Figure S1: CTL and LND donor-derived iPSC

a – Bright field microscopy of colonies with typical iPSC morphology. Control HGPRT

competent cells: CTL1 and CTL2. Lesch-Nyhan disease HGPRT- deficient cells: LND1 and

LND2. Scale bar = 200 μm. b - Flow cytometry analysis of SSEA3 and TRA-1-81 pluripotency

markers. Figure S2 - Ruillier et al

a PRPP AZA Gln PPAT PRA

FGAR AZA Gln PFAS FGAM

GTP ATP De novo synthesis pathway

GMP IMP AMP

HGPRT GuanosineHGPRT Inosine Adenosine Salvage pathway Guanine Hypoxantine

Xanthine

Uric acid Degradation

Figure S2: Inhibition of purine de novo synthesis by Azaserine Figure S3 - Ruillier et al

% of viability (Hoechst) viability of % (Hoechst) viability of % 150 150 (Hoechst) viability of % 150 150 150 150 EC = 12.9 μM EC = 9.74 μM EC50 = 0.52 μM 50 50

100 100 100 100 100 100

50 50 50 50 50 50

% of recovery (Hoechst) % of recovery (Hoechst) % of recovery (Hoechst) 0 0 0 0 0 0 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 Log [M] Log [M] Log10 [M] 10 10

N6-MA Thio-NADP NADPH

% of viability (Hoechst) viability of % % of viability (Hoechst) viability of % 150 150 (Hoechst) viability of % 150 150 150 150 EC = 6.52 μM EC50 = 7.01 μM EC50 = 18.5 μM 50

100 100 100 100 100 100

50 50 50 50 50 50

% of recovery (Hoechst) % of recovery (Hoechst) 0 % of recovery (Hoechst) 0 0 0 0 0 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 -7 -6 -5 -4 Log [M] Log10 [M] Log10 [M] 10 Ap4A NAD+ SAM

Figure S3: Dose-response analysis of the 6 hit compounds efficiency using Hoechst staining as a read-out.

The black curve corresponds to the percentage of recovery after treatment of LND1 NSC with

1.0 μM azaserine. The blue line shows the percentage of viability after treatment with the drug

alone without azaserine, representing the toxicity of the compound itself. Results are expressed

as mean ± SD of 4 technical replicates (2 biological replicates). Figure S4 - Ruillier et al a b c

6 150

Non editedNon 1 edited CRISPR-1 2 CRISPR-2 4 100 Non edited 1 Non edited 2 HGPRT CRISPR-1 2 50 CRISPR-2

β-Actin activity HGPRT

% of viability (CTG)

0 0 (nmol NADH/h/mg of protein) -8 -7 -6 -5

Log10 [M] CRISPR-1CRISPR-2 Non editedNon 1 edited 2 Azaserine

Figure S4: Primary hits compounds specificity.

a - Western-blot analysis of HGPRT protein expression in Crispr/cas9 edited NSC-derived from

the human embryonic stem cells line SA001 (CTL3). Two non-edited clones and 2 clones

invalidated for HGPRT (CRISPR-1 and CRISPR-2) were compared. β-actin was used as a

loading control. b - Enzymatic HGPRT activity measurement in the same clones. c – Azaserine

selective toxic effect upon HGPRT-edited CRISPR NSC. Results are expressed as mean ± SD

of 4 technical replicates. CTG: Cell-TiterGlo Table S1: List of CTL and LND hiPSC or hESC lines

Study Cell Donnor Cell of Clinical Provider Karyotype HGPRT mutation code type code origin description Coriell, CTL1 hiPSC GM01869 fibroblasts 46, XY no unaffected USA Coriell, CTL2 hiPSC GM04603 fibroblasts 46, XY no unaffected USA Cellartis, CTL3 hESC SA001 Blastocyst 46, XY no unaffected Sweden

Coriell, inv/del, ex6-9 LND1 hiPSC GM02227 fibroblasts 46, XY LND USA Edwards et al, 1989 Coriell, IVS7 + 5 G>A LND2 hiPSC GM23784 fibroblasts 46, XY LND USA Gibbs et al, 1990

Table S2: List of primary antibodies, providers and dilutions.

Antibody Host Reference Provider Dilution HPRT1 Rabbit 15059-1-AP Proteintech, Rosemont, IL, USA 1:500 PRTFDC1 Rabbit 11986-1-AP Proteintech, Rosemont, IL, USA 1:250

SSEA-4 Mouse 4755S Cell Signaling, Danvers, MA, USA 1 :500 Oct-4 Rabbit 2840S Cell Signaling, Danvers, MA, USA 1 :500 Nestin Mouse MAB5326 Merck, Darmstadt, Germany 1 :500 Sox2 Rabbit AB5603 Merck, Darmstadt, Germany 1:500 Ki-67 Mouse MAB4190 Merck, Darmstadt, Germany 1:500 HuC/D Mouse A-21271 Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 1:250 Tubulin β-3 (Tuj-1) Rabbit 802001 Biolegend, San Diego, CA, USA 1:1000

TRA-1-81 AF647 Mouse 330706 Biolegend, San Diego, CA, USA 2 µg/ml SSEA-3 PE Rat 330312 Biolegend, San Diego, CA, USA 16 µg/ml

Table S3: Table summarizing the 29 primary hits from LOPAC, Prestwick and SelleckChem libraries.

Library Conc. CAS Compound name % Stimulation Z-Score Run Z-Score Plate

LOPAC 10 µM 102783-36-8 P1,P4-Di(adenosine-5’) tetraphosphate triammonium 181.99 36.22 16.68 LOPAC 10 µM 19254-05-8 Thio-NADP sodium 65.68 13.36 12.87 LOPAC 10 µM 1867-73-8 N6-Methyladenosine 64.55 13.14 10.39 LOPAC 10 µM 2646-71-1 NADPH tetrasodium 59.48 12.14 9.6 Prestwick 5 µM 53-84-9 Nadide 17.11 3.81 6.06 Prestwick 5 µM 66-81-9 Cycloheximide 13.55 3.11 4.93 LOPAC 10 µM 85666-17-7 Furegrelate sodium 12.45 2.90 1.29 Prestwick 5 µM 5536-17-4 Vidarabine 12.30 2.87 4.53 Prestwick 5 µM 1867-73-8 N6-Methyladenosine 11.29 2.67 4.98 LOPAC 10 µM 130506-22-8 6-Nitroso-1,2-benzopyrone 9.86 2.39 1.85 Prestwick 5 µM 21679-14-1 Fludarabine 9.81 2.38 5.62 LOPAC 10 µM 134523-03-8 Atorvastatin calcium salt trihydrate 9.71 2.36 3.42

PW Phyto 10 µM 6027-98-1 Harmaline hydrochloride dihydrate 100.55 8.88 8.88

SelleckChem 5 µM 827022-32-2 PD-0332991 (Palbociclib) HCl 20.00 6.57 6.08 SelleckChem 5 µM 827022-33-3 PD0332991 (Palbociclib) Isethionate 18.66 6.17 7.21 SelleckChem 5 µM 1144068-46-1 WYE-125132 14.73 5.01 4.83 SelleckChem 5 µM 1009298-09-2 AZD8055 13.72 4.70 5.48 SelleckChem 5 µM 741713-40-6 R547 10.40 3.72 3.57 SelleckChem 5 µM 1207360-89-1 GDC-0349 10.09 3.63 3.41 SelleckChem 5 µM 343787-29-1 CP-673451 9.9 3.57 3.36 SelleckChem 5 µM 1009298-59-2 AZD2014 8.56 3.17 3.67 SelleckChem 5 µM 147526-32-7 Pitavastatin calcium (Livalo) 8.35 3.11 3.59 SelleckChem 5 µM 1056634-68-4 Momelotinib (CYT387) 5.81 2.36 2.25 SelleckChem 5 µM 670220-88-9 Crenolanib (CP-868596) 5.56 2.29 2.17 SelleckChem 5 µM 936890-98-1 OSI-027 5.52 2.27 2.17 SelleckChem 5 µM 1224844-38-5 INK 128 (MLN0128) 5.46 2.25 2.58 SelleckChem 5 µM 1223001-51-1 Torin 2 5.46 2.25 2.58 SelleckChem 5 µM 928037-13-2 Golvatinib (E7050) 5.20 2.18 2.49 SelleckChem 5 µM 50357-45-4 Pentamidine HCl 5.04 2.13 2.43

2. Données supplémentaires

Dans cette partie sont regroupés les résultats ne figurant pas directement dans l’article. Il s’agit soit de données préliminaires, ayant permis de sélectionner et de valider la pertinence des différentes ressources technologiques et biologiques ayant servi dans cette étude, soit de résultats « négatifs » ou de données complémentaires.

a) Profil d’expression de l’HGPRT dans les lignées iPSC dérivées des différents donneurs MLN.

Nous disposons dans l’équipe de plusieurs lignées iPSC, reprogrammées à partir de fibroblastes de patients MLN (Tableau 4). L’expression et l’activité de l’HGPRT ont été mesurées dans chacune des lignées. Les lignées LND1 et LND2 sont caractérisées en WB par une absence totale d’expression protéique de l’HGPRT, alors que les lignées LND3 et LND4 expriment l’enzyme. On observe en revanche une activité résiduelle réduite dans les 4 lignées LND, ce qui montre que les 2 lignées LND3 et LND4 expriment la protéine HGPRT, mais que celle-ci est inactive (Figure 31). Pour ce travail, nous avons choisi d’utiliser uniquement les lignées mutées LND1 et LND2, qui n’expriment pas l’HGPRT, afin d’être le plus stringent possible dans la restauration des phénotypes anormaux liés à la MLN, et pour que celle-ci ne soit pas mutation dépendante et ne nécessite pas l’expression protéique résiduelle d’une forme inactive de l’enzyme.

Figure 31 : Expression et activité de l’enzyme HGPRT dans les lignées iPSC. Les lignées LND1 et LND2 sont caractérisées par une absence totale d’expression de l’HGPRT par WB (a), contrairement aux LND3 et LND4 qui expriment l’enzyme, mais dont l’activité enzymatique est réduite par rapport aux CTL (b).

114

b) Choix du read-out pour le développement de l’essai de criblage

Le phénotype choisi pour développer le test de criblage correspond à la baisse de viabilité induite par le traitement précoce des NSC LND1 par l’azaserine. La mesure de viabilité en Hoechst avait tout d’abord été envisagée. Le calcul du facteur Z’ de cet essai a montré que sa robustesse n’était pas suffisante pour développer un essai de criblage primaire avec un grand nombre de composés et donc un faible nombre de répliques pour chaque composé (Z’ = -0,15). C’est pourquoi nous avons préféré l’utiliser en confirmation du CTG, avec un nombre de composés réduit et un nombre de répliques plus important lors des contre-tests et des dose-réponses.

c) Criblage primaire de composés capables de restaurer la viabilité

Plus de 3800 molécules chimiques ont été testées au cours de trois campagnes de criblage. Elles sont issues de 4 librairies : LOPAC, Prestwick Chemical, Prestwick Phytochemical et SelleckChem. Le criblage primaire a été validé avec un Z’-factor moyen de 0,80, calculé sur les 13 plaques de cellules traitées (Figure 32), cette valeur étant similaire à celles obtenues lors du développement de l’essai de criblage (Z’ = 0,84). 29 hits primaires ont été sélectionnés sur la base d’un Z-Score > 2σ.

a b

115

Figure 32 : Criblages primaires des composés issus des banques LOPAC, Prestwick et SelleckChem. (a) Calcul des Z’-factor des différentes plaques lors des criblages primaires. Résultats en dot plot des criblages primaires des banques LOPAC et Prestwick Chemical (b), SelleckChem (c) et Prestwick Phytochemical (d). Les points en rouge foncé correspondent aux hits primaires sélectionnés sur un Z-Score > 2σ.

116

Lors des essais de dose-réponse, nous avons observé une variabilité au niveau des résultats entre les deux types de mesures (CTG vs Hoechst) (Figure 3e et S3, article). Ces variations peuvent provenir du fait que le CTG quantifie l’ATP libéré après lyse des cellules : il intègre donc la mortalité, mais aussi des perturbations énergétiques plus subtiles. C’est un paramètre à prendre en compte dans le cas de la MLN, dans laquelle l’homéostasie des purines et des nucléotides dérivés de l’adénosine peut être modifiée. L’ajout d’Ap4A, par exemple, a tendance à démontrer un effet prolifératif avec une augmentation du signal CTG, ce qui n’est pas retrouvé en Hoechst (Figure 33). Cet effet provient probablement de la nature structurale de l’Ap4A, directement dérivée de l’ATP, ce qui nous a montré l’importance de confirmer les résultats par des contre-tests tels que la mesure de la viabilité en Hoechst. Nous avons donc décidé de conserver cette molécule pour la suite de nos expériences.

a b

Figure 33 : Profil en dose-réponse de l’Ap4A. La restauration de la viabilité diffère entre les 2 graphiques : en CTG (a), l’Ap4A semble avoir un effet prolifératif, puisque la viabilité augmente même en absence d’azaserine (courbe bleue), ce qui n’est pas retrouvé en Hoechst (b). L’axe en X représente la concentration des composés exprimée en log10 (concentration en M).

d) Etude de la spécificité des molécules identifiées

En plus des tests consistant à vérifier l’efficacité des composés en présence d’aminoptérine, de roténone, et sur des donneurs différents de la lignée LND1, nous avons pu également démontrer que ces molécules n’avaient aucun effet sur les lignées contrôles, compétentes en HGPRT (CTL1 et CTL2), après traitement par l’azaserine (Figure 34). Cela permet d’exclure les molécules capables d’améliorer la survie ou d’augmenter la prolifération de manière non spécifique, c’est-à-dire indépendamment d’une déficience en

117

HGPRT. Cela permet également d’identifier les composés susceptibles d’interférer directement avec le signal de luminescence obtenu avec le CTG, représentatif des variations d’ATP, d’autant plus que ces molécules sont toutes des analogues de l’adénosine.

Figure 34 : Essais en dose-réponse des molécules sur les lignées compétentes en HGPRT.

CTL1 (courbe noire) et CTL2 (courbe grise). L’axe en X représente la concentration des composés exprimée en log10 (concentration en M).

e) Mécanismes d’action des composés dérivés de l’adénosine

 Activité HGPRT-like

Afin d’exclure définitivement la possibilité de l’existence d’une activité HGPRT-like induite par les composés, l’azaserine a été remplacée par un milieu de sélection contenant de la 6-thioguanine (6-TG), une molécule toxique lorsqu’elle est métabolisée en 6-thioGMP par l’HGPRT. L’ajout de 6-TG dans le milieu n’induit pas de baisse de la viabilité après traitement par les 6 composés, ce qui confirme que leur effet est dû à l’activation de voies métaboliques de compensation qui ne passent pas par une réactivation de l’HGPRT ou d’une activité HGPRT-like (Figure 35).

118

Figure 35 : Mesure de l’effet en dose-réponse des molécules après traitement à la 6-thioguanine. La 6-thioguanine (6-TG) est ajoutée sur les NSC LND1 à une concentration de 1X, correspondant à une concentration finale de 0.6 µM. L’axe en X représente la concentration des composés exprimée en log10 (concentration en M).

 Rôle de l’adénosine dans le mécanisme d’action des composés

En complément des tests visant à évaluer l’implication de l’adénosine dans l’efficacité des composés, en particulier de la N6-MA et de la SAM, nous avons testé l’effet de la S- adenosylhomocystéine (SAH), un précurseur de l’adénosine provenant de la réaction de déméthylation de la SAM par des enzymes de type méthyltransférases. Dans l’hypothèse où l’effet de la SAM serait dû à l’apport d’adénosine dans le cycle via cette voie, la SAH devrait également être capable de rétablir la viabilité dans notre test. Nous avons donc testé en dose-réponse l’adénosine, la SAM, mais également la SAH pendant 72h sur les NSC LND1, en présence d’azaserine dans le milieu (Figure 36). La SAH, à des doses répétées, n’a aucun effet sur la restauration de la viabilité, ce qui laisse penser que l’effet de la SAM n’est pas seulement dû à sa nature structurale, dérivée de l’adénosine. Toutefois, nous n’avons pas pu fermement conclure puisque l’absence d’effet peut aussi être la conséquence d’une mauvaise biodisponibilité de cette molécule in vitro. Nous avons donc décidé d’investiguer l’hypothèse d’un apport exogène d’adénosine dans le mécanisme d’action des composés, en bloquant directement les enzymes responsables de sa conversion en inosine et en AMP.

119

Figure 36 : Etude de l’implication de l’adénosine dans l’efficacité des composés. L’adénosine (Ado), la SAM et la S-adenosylhomocystéine (SAH) ont été testées en dose-réponse, à la fois en CTG (a) et en Hoechst (b), sur les NSC LND1 en présence d’azaserine. Les composés ont été ajoutés lors d’un traitement unique à J0 (courbe noire), pendant 72h. Un second traitement a été réalisé 24h après (courbe grise), afin de favoriser la biodisponibilité des molécules testées.

120

VII. Discussion

Les purines sont des molécules impliquées dans des fonctions biochimiques essentielles dans la cellule. Elles sont utilisées pour la synthèse de macromolécules, en tant que transporteurs de l’énergie chimique ou comme cofacteurs dans des réactions enzymatiques variées. Elles jouent également le rôle de neurotransmetteurs, activant de nombreuses voies de signalisation, et sont impliquées dans des processus essentiels lors du développement du système nerveux central. La perte de fonction d’enzymes impliquées dans le cycle des purines, aussi bien dans la voie de synthèse de novo que dans le recyclage, est responsable d’une multitude de syndromes pédiatriques graves, caractérisés par des atteintes neurologiques et comportementales. A ce jour, aucune stratégie thérapeutique n’a été réellement efficace pour contrôler ces symptômes. Dans ce travail, j’ai utilisé la technologie des cellules souches induites à la pluripotence, reprogrammées à partir de fibroblastes de patients atteints des formes sévères de la maladie de Lesch-Nyhan, pour identifier des phénotypes neuronaux associés à la perte de fonction de l’HGPRT, puis les utiliser pour identifier, par une approche de criblage à haut débit, de nouvelles molécules chimiques capables de corriger ces défauts. Une famille de molécules a été sélectionnée au cours de ce travail, et de manière intéressante, un des composés, la S-adenosylmethionine (SAM) a par le passé déjà démontré des effets bénéfiques sur les symptômes comportementaux typiques de la MLN dans plusieurs études de cas.

1. Modélisation de phénotypes MLN sur des cellules neuronales dérivées d’iPSC

Nous avons choisi pour ce travail d’utiliser la technologie des iPSC, reprogrammées à partir de fibroblastes de patients atteints de la forme classique de la MLN. Ces cellules ont l’avantage d’être porteuses des mutations responsables de la pathologie, sur un fond génétique humain, et nous permettent d’avoir accès à des types cellulaires difficilement accessibles par d’autres moyens de prélèvement. D’une manière générale, la plupart des études se focalisent sur les neurones dopaminergiques ainsi que sur un dérèglement des ganglions de la base car ils participent très clairement aux atteintes les plus précoces et les plus caractéristiques de la MLN, à savoir les symptômes de type dystonie et automutilation (Ernst et al, 1996, Visser et al, 2000, Göttle et al, 2014). Pourtant, la perte de l’HGPRT semble

121 impacter d’autres structures cérébrales, incluant plusieurs régions frontales, temporales et limbiques du cortex, le thalamus, l’insula ou encore l’hippocampe (Puig and Torres, 2013, Schretlen et al, 2013, Schretlen et al, 2015). Ces régions sont impliquées dans de nombreux processus cognitifs tels que l’attention, la mémoire, la récompense, les émotions, ou encore l’inhibition (Schretlen et al, 2013). Les neurones corticaux constituent ainsi des types cellulaires particulièrement utilisés en recherche pour l’étude de maladies psychiatriques (Brennand et al, 2012). Notre stratégie consiste donc d’avantage à développer une approche permettant de restaurer un équilibre général du métabolisme purinergique dans le cerveau, en compensant la perte de recyclage dans un spectre plus large de cellules. Nous avons décidé de différencier les iPSC en progéniteurs, puis en neurones corticaux, ces populations étant affectés d’un point de vue fonctionnel et anatomique dans la pathologie. De plus, ces types cellulaires sont compatibles avec l’automatisation et constituent de bons supports biologiques pour des approches de criblage à haut débit (Boissart et al, 2013, Darville et al, 2016). Nous avons dans un premier temps différencié les NSC en utilisant un milieu de culture classiquement utilisé, ce qui n’a pas révélé d’altération au niveau de la balance prolifération/différenciation. En revanche, après inhibition de la voie de synthèse de novo par l’azaserine, nous avons pu identifier des phénotypes neuronaux strictement dépendants de l’absence d’HGPRT, les cellules compétentes n’étant pas affectées après traitement. Cela confirme de précédents travaux dans lesquels il était proposé d’inhiber la voie de synthèse de novo dans des cellules périphériques pour étudier l’impact de la perte de l’HGPRT et se rapprocher le plus possible des conditions physiologiques retrouvées dans le cerveau (McKeran et al, 1974). En effet, les enzymes de la voie de novo sont normalement faiblement actives dans le cerveau, au profit du recyclage (Allsop and Watts, 1980). En culture, les cellules sont susceptibles d’utiliser l’excès de composés carbonés contenus dans les milieux pour suractiver la voie de novo et ainsi compenser l’absence de recyclage, ce qui peut facilement masquer la dépendance des cellules à l’HGPRT, et donc l’apparition de phénotypes neuronaux associés à sa perte de fonction. Cela met en avant la capacité de certains types cellulaires à s’adapter à différents stress énergétiques, ce qui est à prendre en compte dans l’étude d’une maladie métabolique telle que la MLN (Micheli et al, 2009, Allen et al, 2019). L’analyse des résultats montre également que la supplémentation du milieu en azaserine a d’avantage d’effet sur les progéniteurs NSC déficients en HGPRT, lorsqu’ils sont à

122 un stade très précoce de différenciation. Cela peut s’expliquer par une dépendance énergétique des cellules prolifératives plus importante par rapport aux progéniteurs déjà engagés dans une voie de différenciation et donc à un état post-mitotique. Les cellules en prolifération doivent en effet produire d’avantage de purines pour synthétiser l’ADN et l’ARN nécessaires à la division cellulaire (Göttle et al, 2013). En cas de blocage de la voie de novo, ces cellules seront donc plus vulnérables à la perte de fonction de l’HGPRT que les cellules compétentes, non affectées par un traitement à l’azaserine. En suivant cette hypothèse, l’activité HGPRT serait ainsi plus importante dans les iPSC et les NSC que dans les neurones en différenciation, ce qu’on retrouve dans nos résultats. La vulnérabilité spécifique des progéniteurs pourrait aussi s’expliquer par l’importance du rôle des purines au cours du développement, qui peut s’avérer critique dans le cas où une déplétion en purines serait consécutive à la perte de fonction de l’HGPRT. En effet, en plus de leur fonction purement biochimique, les purines jouent le rôle de ligands et agissent au niveau extracellulaire sur leurs récepteurs membranaires respectifs, à savoir les récepteurs

P1 (A1,2A,2B,3), P2X1-7 et P2Y1,2,4,6,11,12,13,14 (Oliveira et al, 2016). Or, les récepteurs purinergiques font partie des premiers récepteurs exprimés au cours de l’embryogénèse (Burnstock and Dale, 2015). Ils sont exprimés de manière différentielle et transitoire en fonction du stade de maturation des cellules souches neurales, et activent des voies de signalisation complexes, qui régulent leur prolifération et leur différenciation en neurones ou en cellules gliales, ainsi que leur orientation dans le cerveau en développement (Oliveira et al, 2016, Fumagalli et al, 2017). Le calcium libéré après activation des récepteurs P2Y1 par l’ADP est par exemple nécessaire à la spécification des différentes couches du cortex, en participant à la synchronisation du cycle cellulaire et à la migration des progéniteurs des zones sous-ventriculaires vers les zones corticales, à l’aide des cellules de la glie radiaire (Figure 37, Ulrich et al, 2012). Le système purinergique serait également impliqué dans de nombreux processus de différenciation, de maturation, de synaptogénèse ou de myélinisation (Figure 38, Heine et al, 2016). Les récepteurs P2Y1,13 et P2X7, sous la dépendance des concentrations d’ADP/ATP, agissent par exemple de manière coordonnée et participent au contrôle de la pousse axonale, via la régulation de l’AC5 et des niveaux d’AMPc intracellulaires, permettant l’activation de la voie PI3K/Akt/GSK3 (Del Puerto et al, 2012). L’implication de ce système dans le contrôle de la neurogénèse n’est pas limité au stade prénatal, mais est maintenu aussi après la naissance : plusieurs sous-types de

123 récepteurs, dont P2Y1, semblent d’ailleurs encore exprimés dans les niches neurogéniques chez l’adulte (Fumagalli et al, 2017).

Figure 37 : Implication des récepteurs P2Y dans la spécification du cortex (Ulrich et al, 2012). Le flux calcique libéré après activation des récepteurs P2Y est essentiel à la synchronisation du cycle cellulaire et la migration des progéniteurs à l’aide des cellules de la glie radiaire. Les NSC se différencient ensuite en neurones ou en astrocytes, constituant la structure des différentes couches corticales.

L’expression temporelle des enzymes impliquées dans le métabolisme des purines constitue un élément essentiel pour la synthèse séquentielle des différents ligands purinergiques au cours du développement (Fumagalli et al, 2017). Parmi ces derniers, l’adénosine et ses nucléotides associés sont les plus décrits dans le contrôle de voies de signalisation du SNC, et participent notamment au relargage de neurotransmetteurs tels que la dopamine ou le glutamate, par l’intermédiaire des récepteurs A1 et A2A, aux effets opposés (Boison, 2008). Les ligands dérivés de la guanine et de l’inosine sont quant à eux capables de stimuler la synthèse et la sécrétion de facteurs neurotrophiques, et auraient un rôle dans la synaptogénèse et le développement axonal (Di Liberto et al, 2016, Doyle et al, 2018). Pour aller plus loin, il serait important de bien comprendre l’implication des différents ligands purinergiques et des enzymes impliquées dans leur métabolisme, ainsi que leur impact dans un contexte pathologique comme celui de la MLN. Le modèle NSC/neurones corticaux utilisé ici peut s’avérer particulièrement pertinent pour répondre à cette question puisqu’il permet d’avoir accès à des neurones humains en développement et d’étudier l’impact du recyclage ou de la synthèse de novo sur la neurogénèse. Des études plus poussées utilisant des agonistes/antagonistes des différents récepteurs aux purines, ou basées sur la surexpression

124 ou la dérégulation de certains éléments de signalisation associés aux récepteurs, pourraient être ainsi envisagées.

Figure 38 : Implication générale des récepteurs purinergiques dans le développement du SNC (Heine et al, 2016). Les récepteurs purinergiques sont largement impliqués dans le développement du SNC, par l’intermédiaire de divers processus, à la fois d’activation ou d’inhibition, qui contrôlent la prolifération, la différenciation et la migration des neurones, mais aussi le recrutement des astrocytes et leur implication dans la signalisation du SNC.

2. Utilisation des cellules souches neurales dérivées des CSPh pour l’identification de composés pharmacologiques

Comme on l’a vu, les cellules souches pluripotentes humaines constituent des outils biologiques uniques pour la modélisation de maladies génétiques, en raison de leur capacité à se différencier dans des types cellulaires variés et sur des fonds génétiques pathologiques. Les CSPh apportent des bénéfices notables par rapport aux outils traditionnellement utilisés comme les cellules primaires, difficilement accessibles, les lignées cellulaires immortalisées, qui ont tendance à perdre leurs caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques après des temps de culture prolongés, ou les modèles animaux, qui soulèvent des interrogations quant à leurs divergences d’un point de vue génétique, anatomique et physiologique (Shi et al,

125

2017, Suh, 2017). De nombreux protocoles de différenciation ont ainsi pu être développés à partir de CSP, notamment pour l’étude de maladies neurologiques avec des modèles permettant l’obtention de neurones corticaux, dopaminergiques ou des motoneurones (Boissart et al, 2013, Kirkeby et al, 2013, Maury et al, 2015). Ces derniers constituent de bons supports biologiques pour explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans la physiopathologie de maladies humaines, mais également pour développer des stratégies pour leur traitement ou leur prévention, après identification de biomarqueurs ou de phénotypes pertinents (Robinton and Daley, 2012). Les lignées cellulaires différenciées à partir de CSPh peuvent être ainsi utilisées à la fois pour valider des molécules thérapeutiques connues, par des approches de repositionnement, mais aussi pour identifier de nouvelles entités chimiques. Plusieurs composés approuvés par la FDA (US Food and Drug Administration), dont la digoxine, ont par exemple exercé des effets neuroprotecteurs en ciblant des agrégats de la protéine TDP-43 dans des motoneurones dérivés d’iPSC provenant de patients atteints de sclérose latérale amyotrophique (Burkhardt et al, 2013). La metformine s’est également révélée efficace dans un modèle basé sur l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses dérivées d’iPSC porteuses de mutations à l’origine du syndrome de Hutchinson-Gilford, en modulant de manière indirecte l’épissage alternatif de LMNA, dont la forme tronquée (progérine) est toxique pour la cellule (Egesipe et al, 2016). Des travaux de 2016 ont quant à eux permis de mettre en évidence, sur des cardiomyocytes dérivés d’iPSC, une nouvelle molécule chimique, LUF7346, agissant comme modulateur allostérique du canal potassique hERG, et permettant de réverser certains phénotypes associés au syndrome du QT long (Sala et al, 2016). Les caractéristiques des CSPh en font également des supports biologiques intéressants pour des approches de toxicologie, en étudiant la toxicité de certaines drogues sur des modèles cellulaires jusque-là difficilement accessibles, et dérivés de patients présentant des fonds génétiques différents (Suh, 2017). Il a par exemple été possible d’évaluer les différences de métabolisme et de toxicité hépatique de médicaments en utilisant des hépatocytes dérivés d’iPSC de donneurs caractérisés par différents SNPs dans le gène CYPD6, qui appartient au cytochrome P450 (Takayama et al, 2014). Le développement de ces approches, que cela soit en culture 2D ou en organoïdes, est particulièrement prometteur lors du développement clinique d’un médicament (Shi et al, 2017), et pourrait également réduire les essais précliniques réalisés chez l’animal, même si aujourd’hui, aucun système ne permet vraiment de reproduire toute la complexité d’un

126 organisme entier (Freires et al, 2017). Les travaux de Takayama montrent d’ailleurs que les iPSC offrent la perspective d’une médecine personnalisée, en reprogrammant des cellules somatiques de variants génétiques, ou de patients atteints de sous-formes particulières de maladies. En neuropsychiatrie, une forme génétique d’autisme liée à l’haploinsuffisance de la protéine synaptique SHANK3 et responsable du syndrome de Phelan-McDermid, a par exemple pu être modélisée à partir de CSPh, permettant l’identification du chlorure de lithium comme composé possédant un fort potentiel thérapeutique (Darville et al, 2016). Les approches de thérapies personnalisées à partir d’iPSC, que ce soit en termes de thérapie cellulaire de remplacement, pour éviter les rejets de greffe, ou pour l’identification de molécules thérapeutiques, sont donc possibles mais restent cependant couteuses et chronophages, étant donné les temps nécessaires à la reprogrammation et la différenciation des cellules. Même si la majorité des études se focalisent sur des sets limités de molécules, les CSPh sont particulièrement intéressantes pour les approches à plus haut débit, en réalisant des criblages phénotypiques ou plus ciblés (target-based screening) de molécules chimiques. C’est le cas par exemple de la metformine, qui a montré récemment des résultats encourageants lors d’un essai clinique de phase II chez des patients atteints de la dystrophie myotonique de Steinert (Bassez et al, 2018), ou du composé SKF-86466, identifié à la suite d’un criblage de plus de 6000 composés, et qui a permis de rétablir les défauts d’épissage dans un modèle de dysautonomie familiale (Lee et al, 2009). Dans notre étude, le protocole de différenciation des iPSC-MLN en neurones corticaux utilisé est compatible avec ce type d’approches. Il a en effet l’avantage de passer par des progéniteurs corticaux, facilement amplifiables en culture, pouvant être banqués et donc décongelés au stade NSC (Boissart et al, 2013), rendant possible la mise en place d’une campagne de criblage. Nous avons choisi d’utiliser ici des lignées provenant de donneurs caractérisés par des mutations localisées au niveau d’introns, ou des délétions larges d’exons. Elles sont toutes deux responsables d’un arrêt de la synthèse protéique, entrainant une absence totale d’expression enzymatique de l’HGPRT. Nous avons choisi ces mutations dans le but d’être le plus stringent possible en terme de rétablissement d’une activité de type HGPRT, permettant de toucher le plus de patients possibles, par rapport à des approches plus personnalisées. Comme on l’a vu, il est difficile d’envisager une approche moléculaire très ciblée, en raison du rôle pléthorique des purines et de la complexité des mécanismes susceptibles d’être affectés par la perte de

127 l’HGPRT. Nous avons donc préféré nous concentrer sur une stratégie d’avantage phénotypique, qui repose sur l’identification d’un spectre plus large de phénotypes.

3. Mécanismes d’action des composés dérivés de l’adénosine

Les campagnes de criblage réalisées dans ce travail ont révélé cinq composés chimiques : N6-MA, NADPH, NAD+, Ap4A et Thio-NADP, ainsi qu’un analogue structural supplémentaire : la S-adenosylmethionine (SAM). Ces molécules sont toutes caractérisées par la présence d’une structure dérivée de l’adénosine, ce qui nous a tout d’abord guidés vers un mécanisme d’action commun des différents hits. L’hypothèse privilégiée pour ces 6 molécules était en effet un mécanisme d’action similaire, consistant à agir comme donneurs d’adénosine. L’adénosine, libérée à partir de ces composés, par exemple par des enzymes de type 5’-nucleotidases, pourrait rejoindre le cycle des purines et compenser le déséquilibre métabolique secondaire à l’absence de recyclage. En effet, l’adénosine est phosphorylée en AMP par l’adénosine kinase (ADK), suivie par la formation d’ADP et d’ATP. De plus, l’AMP peut être transformée en IMP par l’AMP deaminase, qui, à la suite de deux réactions supplémentaires, mène à la formation de GMP, point de départ à la synthèse de nucléotides dérivés de la guanosine comme le GDP ou le GTP (Lauber et al, 2016). Il est cependant compliqué de vérifier précisément l’effet des hits sur le niveau des métabolites purinergiques, leur mesure nécessitant des techniques de type HPLC, le plus souvent peu adaptées à ces types cellulaires et nécessitant donc du temps de développement et de grandes quantités de matériel biologique, d’autant plus que nous ne disposons pas au laboratoire des appareillages et de la maitrise analytique nécessaire. Nous sommes actuellement en train de mettre en place une collaboration pour réaliser des mesures de purines par LC/MS (chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse), afin de confirmer nos dosages et de les étendre à d’autres métabolites du cycle, et ainsi avoir d’avantage d’informations sur les modifications au sein du métabolisme. Nos résultats, qui visaient à tester l’apport direct d’adénosine, ainsi que l’effet des composés après inhibition de l’ADK et de l’ADA, ont toutefois montré que l’adénosine pouvait participer à l’efficacité de la SAM, par l’intermédiaire de l’ADK, mais pas suffisamment pour expliquer son effet sur la viabilité, qui proviendrait majoritairement de

128 mécanismes indépendants. De plus, deux des composés (Ap4A et NADPH), sont capables de normaliser les niveaux de guanine et d’hypoxanthine, et permettraient donc de restaurer un équilibre dans le cycle, bien que ces résultats soient à confirmer sur d’avantage d’échantillons. Nos résultats semblent donc démontrer que l’efficacité de nos molécules dépendrait d’avantage de mécanismes d’action complémentaires à l’adénosine et, en tout cas, indépendants de la restauration directe d’une activité enzymatique de type HGPRT. La SAM, et par extension son homologue N6-MA, représentent des précurseurs pour plusieurs voies métaboliques, notamment la transméthylation (Figure 39). La SAM est impliquée en tant que donneur de groupements méthyl dans plus de 100 réactions différentes, catalysées par des enzymes de type méthyltransferases (Bottiglieri, 2002, Barić, 2009). Ces réactions de méthylation concernent aussi bien les acides nucléiques, les protéines, les phospholipides, les histones, ou les monoamines telles que la noradrénaline, la sérotonine, ou la dopamine. La SAM, en méthylant par exemple les groupements hydroxyle de la dopamine grâce à la catechol-O-methyltransferase (COMT), pourrait permettre son inactivation au niveau post- synaptique, limitant les symptômes liés à l’hypersensibilité des récepteurs (Chen et al, 2014). De manière plus générale, la SAM serait donc susceptible d’agir à des niveaux transcriptionnels et post-transcriptionnels et pourrait ainsi activer des enzymes régulant des voies de compensation alternatives. La SAM est également impliquée dans des réactions de transsulfuration, menant à la synthèse de glutathion, un antioxydant majeur dans l’organisme, ainsi que dans les réactions d’aminopropylation, voie de synthèse des polyamines (Figure 39). Les rôles biologiques de ces composés ne sont pas encore bien connus pour le moment, mais ils pourraient préserver la viabilité cellulaire, la prolifération, ainsi que réguler la transcription et l’expression génique (Anstee and Day, 2012). Le composé Nadide, ou NAD+, joue quant à lui le rôle de cofacteur dans de nombreux processus métaboliques comme dans la glycolyse, la phosphorylation oxydative, le cycle des acides tricarboxyliques (TCA), ou encore dans les mécanismes d’ADP-ribosylation des protéines (Yang and Sauve, 2016). D’une manière générale, les réactions nécessitant l’intervention du couple NAD+/NADH participent à la production d’énergie chimique sous forme d’ATP : lors de la phosphorylation oxydative, chaque molécule de NADH consommée par le complexe I de la chaine respiratoire mitochondriale entraine ainsi la formation de 3 molécules d’ATP (Yang and Sauve, 2016).

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Figure 39 : Métabolisme de la SAM (schéma inspiré de Bottiglieri, 2002). La SAM est le précurseur de différentes voies métaboliques : la transméthylation, l’aminopropylation et la transsulfuration. Elle est également capable d’apporter de l’adénosine dans le cycle des purines par l’intermédiaire de la S- adenosylhomocysteine (SAH). Hcy = Homocysteine, MT = Methyltransferase, MTA = Methylthioadenosine, MTHF = Methyltetrahydrofolate, SAHH = SAH hydrolase, THF = tetrahydrofolate.

L’augmentation de NAD+ dans la cellule entraine également le recrutement des sirtuins, une famille d’ADP-ribosyltransferases et de protein-deacetylases. SIRT1 est par exemple capable de moduler la condensation de la chromatine par des mécanismes coordonnés de déacétylation et/ou de méthylation des histones, ou encore d’interagir avec de nombreux facteurs de transcription et co-régulateurs, menant à des modifications au niveau transcriptionnel (Zhang and Kraus, 2010). SIRT1 entraine ainsi la déacétylation et l’activation de PGC1α (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha), un co- activateur transcriptionnel qui stimule la biogénèse mitochondriale et la flexibilité métabolique dans différents tissus. Comme la SAM, le recrutement NAD-dépendant de SIRT1 pourrait potentiellement activer des enzymes régulant des voies de compensation alternatives. D’un point de vue neurodéveloppemental, SIRT1 serait impliqué dans des processus de différenciation, d’élongation axonale, de plasticité synaptique, ou de survie neuronale par plusieurs mécanismes, avec notamment la dérégulation du facteur mTOR ou l’activation de la voie Akt/GSK3 (Herskovits and Guarente, 2014). Le NADPH, forme réduite du NADP et analogue phosphorylé du NADH, est quant à lui une molécule essentielle qui intervient dans de nombreuses réactions d’oxydoréduction dans l’organisme. Il lutte

130 notamment contre le stress oxydatif, en participant à la formation de molécules anti- oxydantes comme les formes réduites du glutathion, des thioredoxines ou des peroxyredoxines, ainsi que pour l’activité d’enzymes détoxifiantes comme le cytochrome P450. Il intervient également dans la synthèse des acides nucléiques, en participant à la synthèse du ribose-5-phosphate, ou à la formation du nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP), impliqué dans la régulation du calcium intracellulaire (Yang and Sauve, 2016). Le potentiel redox du NADPH a été également démontré comme jouant un rôle central dans le développement du cerveau, en régulant la neurogénèse, la différenciation neuronale ou encore la croissance neuritique (Bórquez et al, 2016). Le dérivé polyphosphate de la diadenosine : P1,P4-Di(adenosine-5')tetraphosphate (Ap4A) est une molécule endogène impliquée dans plusieurs voies de signalisation, et qui agirait notamment comme agoniste des récepteurs purinergiques, avec une affinité particulière pour les récepteurs métabotropes P2Y. Elle aurait un effet cytoprotecteur dans différentes pathologies, incluant certains processus neurodégénératifs (Reigada et al, 2017, Wang et al, 2003).

Bien qu’elles partagent des analogies de structure, ces molécules sont toutes à l’origine de multiples effets dans la cellule, et agiraient donc probablement par des mécanismes d’action différents. Bien que nous ayons pu identifier ou exclure certaines hypothèses, nous n’avons malheureusement pas pu dans ce travail déterminer avec précision le ou les mécanismes d’action des hits identifiés.

4. Efficacité des hits in vivo

La suite logique de ce travail aurait été d’évaluer l’efficacité des molécules dans des modèles animaux de la MLN. La mesure de l’efficacité des composés chez l’animal se heurte aux différences inter-espèces. En effet, les modèles de rongeurs déficients en HGPRT sont bien caractérisés par des anomalies métaboliques cohérentes avec un défaut de recyclage des purines (Jinnah et al, 1993, Meek et al, 2016). En revanche, ces modèles animaux ne démontrent aucune anomalie neurologique ou comportementale caractéristique de la MLN, ce qui indique que leur cerveau a développé des stratégies métaboliques alternatives qui sont absentes chez l’homme, ou que certains processus développementaux dépendants des

131 purines ne sont pas présents chez le rongeur au cours de la neurogénèse. Des études suggèrent en effet que les rongeurs dépendraient moins de l’HGPRT que l’homme pour maintenir un niveau en purines suffisant, avec notamment une accélération de la voie de synthèse de novo de 4 à 5 fois dans le cerveau des souris déficientes en HGPRT (Jinnah et al, 1993). Des hypothèses avaient également été émises sur le rôle bénéfique de l’uricase, qui permet de dégrader l’acide urique en allantoïne, mais l’excès d’acide urique ne semble pas impliqué dans les atteintes neurocomportementales (Bell et al, 2016). Des modèles de souris double-mutantes APRT et HGPRT ont également été générées pour vérifier l’implication d’une absence totale de recyclage, mais les anomalies biochimiques typiques de la MLN ont été observées, à savoir des atteintes rénales dues à l’excrétion d’adénine et de 2,8- dihydroxyadénine (Engle et al, 1996). En revanche, peu de données sont disponibles en ce qui concerne les processus développementaux dépendants des purines chez la souris. Il est donc pour le moment difficile d’entreprendre des essais d’efficacité de molécules d’intérêt chez l’animal, et on ne peut donc, pour le moment, seulement se baser sur des études de cas chez l’homme. De manière intéressante, la SAM, en raison de son implication dans de nombreuses voies métaboliques, a déjà été étudiée depuis plusieurs années dans des états pathologiques variés tels que la dépression, la maladie d’Alzheimer, l’ostéoporose et certaines maladies du foie (Bottiglieri, 2002). Dans le cas de la MLN, la SAM a été administrée pour la première fois à un patient en 2006, afin de réduire son taux de transaminases élevé à la suite d’un traitement analgésique. L’administration de SAM a permis d’observer une diminution des automutilations et des comportements agressifs, qui s’est prolongée sur plusieurs années (Glick, 2006). D’autres essais ont par la suite vu le jour, et ont dans l’ensemble démontré des effets plutôt encourageants sur les atteintes neurocomportementales. On note effectivement après traitement une diminution de la fréquence des comportements agressifs et des automutilations, allant de 50% à l’arrêt total des symptômes (Chen et al, 2014, Lauber et al, 2016), bien que certains effets indésirables et une exacerbation des symptômes aient été rapportés chez certains patients (Dolcetta et al, 2013). Ces études présentent cependant des limites : elles concernent seulement une vingtaine de patients, dont les âges varient entre 4 semaines et 49 ans, et on note une hétérogénéité en termes de durée de traitement, de posologie, de comédication, ou encore en ce qui concerne les méthodes de suivi et d’évaluation des symptômes. De plus, la SAM n’étant pas approuvée

132 par les agences règlementaires, il est difficile de définir des dosages optimaux et d’appréhender la fenêtre thérapeutique de cette molécule. En revanche, en démontrant que la SAM est capable d’améliorer la survie cellulaire, la prolifération, et la neurogénèse en générale dans des neurones en développement déficients en HGPRT, on montre qu’il est important de reconsidérer l’intérêt de cette molécule pour les patients MLN, mais aussi pour d’autres syndromes associés à un dysfonctionnement des purines, la SAM ayant déjà été testée chez des patients atteints du syndrome d’Arts (De Brouwer et al, 2007). La SAM, contrairement aux autres purines exogènes, a en effet l’intérêt de passer la barrière intestinale et la barrière hématoencéphalique pour atteindre efficacement le cerveau, et ainsi exercer son effet (De Brower et al, 2010). Parmi nos composés identifiés, d’autres molécules pourraient également être administrées, les dérivés nicotinamide adénine dinucléotide (NAD et NADP) étant disponibles à partir de leur précurseur : la vitamine B3 (Sauve, 2007). Cette dernière est en effet largement impliquée dans la survie des neurones et leur fonctionnalité, et sa déficience interviendrait dans plusieurs syndromes neurologiques et psychiatriques (Gasperi et al, 2019) (Figure 40). A notre connaissance, le métabolisme du NAD n’a jamais été étudié chez des patients MLN, dans des tissus neuronaux.

Figure 40 : Résumé des effets bénéfiques de la vitamine B3 dans le SNC (Gasperi et al, 2019). La vitamine B3 (niacin) présente un effet bénéfique dans plusieurs états pathologiques, par l’intermédiaire de nombreux mécanismes moléculaires.

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Dans ce travail, l’efficacité des composés sur les phénotypes neuronaux dépendants de l’HGPRT a été uniquement mesurée sur les NSC et les neurones dérivés d’iPSC, à savoir les lignées LND1 et LND2. Ces expériences devront être confirmées sur d’avantage de lignées, et notamment sur les deux lignées isogéniques obtenues par la technologie CRISPR/Cas9.

5. Autres approches thérapeutiques

Les molécules issues de ce criblage semblent donc restaurer un équilibre général du métabolisme des purines, en compensant la perte de recyclage par l’HGPRT dans les neurones, ce qui semble démontrer des résultats encourageants en clinique avec la SAM. Cette approche, comme on l’a vu, ne permettra pas de réellement corriger les atteintes précoces étant donné le caractère neurodéveloppemental de la maladie. D’autres approches complémentaires doivent donc être envisagées. Le dysfonctionnement du système dopaminergique étant en première ligne pour expliquer la survenue des manifestations motrices et comportementales, plusieurs essais ont eu lieu dans le passé pour identifier des molécules capables de relancer la synthèse de dopamine, à commencer par l’utilisation de la L-Dopa, utilisée de manière courante dans le traitement de la maladie de Parkinson. Ces études se sont cependant révélées contradictoires, avec peu ou pas d’améliorations sur les plans neurologique et psychiatrique, avec également plusieurs cas d’aggravation des symptômes rapportés (Bell et al, 2016, Visser et al, 2011). Ces résultats sont cohérents avec l’hypothèse selon laquelle la déplétion dopaminergique pourrait être à l’origine d’une hypersensibilité des récepteurs à la dopamine (Goldstein et al, 1985), phénomène retrouvé chez les rats traités à la 6- hydroxydopamine, qui montrent des réactions d’automutilations après administration de L- Dopa (Breese et al, 1984) et dans des études post-mortem, montrant une augmentation de l’expression des récepteurs à la dopamine dans des cerveaux de patients MLN (Saito et al, 1999). Dans cette idée, Jinnah et son équipe ont procédé en 2016 à des études de tolérance et d’efficacité de l’écopipam, un antagoniste des récepteurs D1, qui a démontré une diminution de la fréquence des épisodes d’automutilation chez des patients MLN, avec tout de même des effets secondaires notables (Khasnavis et al, 2016a, b). Bien que ces résultats soient prometteurs, cette étude aborde de manière intéressante les limites et donc

134 l’importance du choix des critères de mesure de l’automutilation, qui sont inexistants dans le cas de la MLN. En effet, les automutilations et les comportements agressifs se déclarent de manière très variable entre les individus, notamment en termes de fréquence et de sévérité, et ils peuvent être facilement influencés par l’environnement, le stress, l’utilisation ou non de mesures de restriction physique, ou encore le caractère sédatif des drogues (Khasnavis et al, 2016a). Il est donc essentiel de déterminer au plus vite des protocoles d’évaluation des automutilations qui soient compatibles à la MLN pour entreprendre des essais de molécules thérapeutiques chez l’homme. Comme on l’a vu, la technique de stimulation cérébrale profonde des ganglions de la base peut également s’avérer intéressante pour contrôler les atteintes motrices et comportementales. Les études effectuées chez des patients MLN permettent à la fois de réduire la fréquence des dystonies, mais aussi d’améliorer les comportements agressifs, même après plusieurs années d’études (Taira et al, 2003, Piedimonte et al, 2015). Il s’agit toutefois d’une approche invasive, qui nécessite encore des évaluations et un suivi post- opératoire assez conséquent. Dans l’équipe, une autre stratégie thérapeutique est envisagée. Elle consisterait à contourner la perte précoce de fonctionnalité des neurones dopaminergiques en relançant la synthèse de dopamine, directement dans les cellules cibles, à savoir le striatum. Cette approche se base sur des travaux de thérapie génique déjà en cours pour le traitement de la maladie de Parkinson et actuellement en phase d’évaluation d’efficacité et de la tolérance sur le long terme (clinicaltrials.gov, NCT01856439). Le vecteur lentiviral, injecté par stéréotaxie au niveau du putamen, permet l’expression de plusieurs gènes nécessaires à la synthèse de dopamine : la TH (tyrosine hydroxylase), AADC (aromatic L-amino acid decarboxylase) et GCH1 (GTP-cyclohydrolase 1) (Palfi et al, 2018). Cette approche pourrait donc se transposer à la MLN, bien qu’on ne dispose que de très peu de données sur l’effet réel de la relance de production de dopamine chez des patients MLN, notamment en raison de l’hypersensibilité des récepteurs, comme on l’a vue précédemment. Les CSP, qui représentent des outils pertinents de bio-ingénierie tissulaire, permettraient donc également de développer des approches de thérapie cellulaire de substitution. Ces dernières sont déjà étudiées pour le traitement de la maladie de Parkinson, et plusieurs essais cliniques sont en cours, consistant tout d’abord à greffer des cellules fœtales issues du mésencéphale ventral, dans le cadre de l’essai TRANSEURO par exemple

135

(clinicaltrials.gov, NCT01898390). En revanche, l’utilisation de ces types cellulaires pose des problèmes en termes d’approvisionnement, de standardisation ou de bioéthique. Une alternative consisterait à utiliser des CSP, différenciées en neurones dopaminergiques du mésencéphale à l’aide de protocoles établis comme celui de Kirkeby (Kirkeby et al, 2013). Plusieurs essais basés sur des neurones dérivés d’iPSC ou de CSEh sont en préparation ou ont débuté (Barker et al, 2017). Des approches similaires de greffes de précurseurs de neurones dopaminergiques dans le mésencéphale pourraient donc être envisagées pour la MLN. A nouveau, une telle approche nécessitera des études préliminaires pour appréhender les conséquences de l’introduction de neurones dopaminergiques fonctionnels dans le cerveau de patients MLN, l’étiologie de la maladie étant différente de celle de la maladie de Parkinson.

136

VIII. Conclusion

Ce travail de thèse a apporté la preuve de concept de la modélisation d’une maladie métabolique associée à un dysfonctionnement du cycle des purines, à partir de cellules souches pluripotentes humaines, ainsi que l’intérêt de ce modèle pour le développement d’une approche de criblage à haut débit. Une famille de molécules a ainsi pu être identifiée au cours de cette étude, et de manière intéressante, la S-adenosylmethionine a par le passé déjà démontré des effets bénéfiques sur les symptômes comportementaux caractéristiques de la maladie de Lesch-Nyhan. Cela montre donc l’importance de reconsidérer l’intérêt de ce type de composés dans le traitement de la pathologie. Il serait cependant intéressant de chercher dans le futur des analogues structuraux de ces molécules, mieux tolérés et d’avantage « druggable », c’est-à-dire plus facilement adaptables en clinique que les composés identifiés à la suite de notre criblage, que ce soit par des études de relations structure/activité, ou par la réalisation de criblages à plus large échelle, comprenant des banques plus ciblées de composés, et d’avantage repositionnables. D’un point de vue mécanistique, notre travail n’a malheureusement pas su déterminer avec précision les modes d’action des molécules, bien que certaines voies métaboliques aient pu être identifiées dans les cellules neuronales déficientes en HGPRT, et qui peuvent constituer des cibles potentielles pour la recherche de traitements pour les patients MLN. D’une manière plus générale, la stratégie suivie au cours de ce travail de thèse pourrait être étendu à d’autres syndromes neurologiques associés à un défaut de métabolisme et affectant le développement du système nerveux central.

137

Bibliographie

Allen SP, Hall B, Castelli LM, Francis L, Woof R, Siskos AP, Kouloura E, Gray E, Thompson AG, Talbot K, Higginbottom A, Myszczynska M, Allen CF, Stopford MJ, Hemingway J, Bauer CS, Webster CP, De Vos KJ, Turner MR, Keun HC, Hautbergue GM, Ferraiuolo L, Shaw PJ. Astrocyte adenosine deaminase loss increases motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 2019; 142(3): 586-605.

Allsop J, Watts RW. Activities of amidophosphoribosyltransferase and purine phosphoribosyltransferases in developing rat brain. Adv Exp Med Biol. 1980; 122A: 361-6.

Anstee QM, Day CP. S-adenosylmethionine (SAMe) therapy in liver disease: a review of current evidence and clinical utility. J Hepatol. 2012; 57(5): 1097-109.

Barić I. Inherited disorders in the conversion of methionine to homocysteine. J Inherit Metab Dis. 2009; 32(4): 459-71.

Barker RA, Parmar M, Studer L, Takahashi J. Human Trials of Stem Cell-Derived Dopamine Neurons for Parkinson's Disease: Dawn of a New Era. Cell Stem Cell. 2017; 21(5): 569-573.

Bassez G, Audureau E, Hogrel JY, Arrouasse R, Baghdoyan S, Bhugaloo H, Gourlay-Chu ML, Le Corvoisier P, Peschanski M. Improved mobility with metformin in patients with myotonic dystrophy type 1: a randomized controlled trial. Brain. 2018; 141(10): 2855-2865.

Becker MA, Schumacher HR Jr, Wortmann RL, MacDonald PA, Eustace D, Palo WA, Streit J, Joseph- Ridge N. Febuxostat compared with allopurinol in patients with hyperuricemia and gout. N Engl J Med. 2005; 353(23): 2450-61.

Bell S, Kolobova I, Crapper L, Ernst C. Lesch-Nyhan Syndrome: Models, Theories, and Therapies. Mol Syndromol. 2016; 7(6): 302-311.

Biasibetti H, Pierozan P, Rodrigues AF, Manfredini V, Wyse ATS. Hypoxanthine Intrastriatal Administration Alters Neuroinflammatory Profile and Redox Status in Striatum of Infant and Young Adult Rats. Mol Neurobiol. 2017; 54(4): 2790-2800.

Biasibetti-Brendler H, Schmitz F, Pierozan P, Zanotto BS, Prezzi CA, de Andrade RB, Wannmacher CMD, Wyse ATS. Hypoxanthine Induces Neuroenergetic Impairment and Cell Death in Striatum of Young Adult Wistar Rats. Mol Neurobiol. 2018; 55(5): 4098-4106.

Boison D. Adenosine as a neuromodulator in neurological diseases. Curr Opin Pharmacol. 2008; 8(1): 2-7.

Boissart C, Nissan X, Giraud-Triboult K, Peschanski M, Benchoua A. miR-125 potentiates early neural specification of human embryonic stem cells. Development. 2012; 139(7): 1247-57.

Boissart C, Poulet A, Georges P, Darville H, Julita E, Delorme R, Bourgeron T, Peschanski M, Benchoua A. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Transl Psychiatry. 2013; 3: e294.

138

Bórquez DA, Urrutia PJ, Wilson C, van Zundert B, Núñez MT, González-Billault C. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. J Neurochem. 2016; 137(4): 506-17.

Bottiglieri T. S-Adenosyl-L-methionine (SAMe): from the bench to the bedside--molecular basis of a pleiotrophic molecule. Am J Clin Nutr. 2002; 76(5): 1151S-7S.

Bouzidi H, Lacour B, Daudon M. 2,8-dihydroxyadenine nephrolithiasis: from diagnosis to therapy. Ann Biol Clin (Paris). 2007; 65(6): 585-92.

Bowman GL, Shannon J, Frei B, Kaye JA, Quinn JF. Uric acid as a CNS antioxidant. J Alzheimers Dis. 2010; 19(4): 1331-6.

Breese GR, Baumeister AA, McCown TJ, Emerick SG, Frye GD, Mueller RA. Neonatal-6- hydroxydopamine treatment: model of susceptibility for self-mutilation in the Lesch-Nyhan syndrome. Pharmacol Biochem Behav. 1984; 21(3): 459-61.

Breese GR, Knapp DJ, Criswell HE, Moy SS, Papadeas ST, Blake BL. The neonate-6-hydroxydopamine- lesioned rat: a model for clinical neuroscience and neurobiological principles. Brain Res Brain Res Rev. 2005; 48(1): 57-73.

Brennand KJ, Simone A, Tran N, Gage FH. Modeling psychiatric disorders at the cellular and network levels. Mol Psychiatry. 2012; 17(12): 1239-53.

Burkhardt MF, Martinez FJ, Wright S, Ramos C, Volfson D, Mason M, Garnes J, Dang V, Lievers J, Shoukat-Mumtaz U, Martinez R, Gai H, Blake R, Vaisberg E, Grskovic M, Johnson C, Irion S, Bright J, Cooper B, Nguyen L, Griswold-Prenner I, Javaherian A. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 2013; 56: 355-64.

Burnstock G, Dale N. Purinergic signalling during development and ageing. Purinergic Signal. 2015; 11(3): 277-305.

Burnstock G. An introduction to the roles of purinergic signalling in neurodegeneration, neuroprotection and neuroregeneration. Neuropharmacology. 2016; 104: 4-17.

Busti AJ and Herrington JD. The Differences in the Mechanisms of Action Between Allopurinol and Febuxostat. In EBM Consult. Updated In 2015. https://www.ebmconsult.com/articles/allopurinol- febuxostat-zyloprim-uloric-uric-acid-gout-mechanism. Consulté le 03/01/2018.

Ceballos-Picot I, Mockel L, Potier MC, Dauphinot L, Shirley TL, Torero-Ibad R, Fuchs J, Jinnah HA. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase regulates early developmental programming of dopamine neurons: implications for Lesch-Nyhan disease pathogenesis. Hum Mol Genet. 2009; 18(13): 2317-27.

Ceballos-Picot I, Augé F, Fu R, Olivier-Bandini A, Cahu J, Chabrol B, Aral B, de Martinville B, Lecain JP, Jinnah HA. Phenotypic variation among seven members of one family with deficiency of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase. Mol Genet Metab. 2013; 110(3): 268-74.

Ceballos-Picot I, Le Dantec A, Brassier A, Jaïs JP, Ledroit M, Cahu J, Ea HK, Daignan-Fornier B, Pinson B. New biomarkers for early diagnosis of Lesch-Nyhan disease revealed by metabolic analysis on a large cohort of patients. Orphanet J Rare Dis. 2015; 10:7.

139

Ceccarelli M, Ciompi ML, Pasero G. Acute renal failure during adenine therapy in Lesch-Nyhan syndrome. Adv Exp Med Biol. 1974; 41: 671-5.

Chen BC, Balasubramaniam S, McGown IN, O'Neill JP, Chng GS, Keng WT, Ngu LH, Duley JA. Treatment of Lesch-Nyhan disease with S-adenosylmethionine: experience with five young Malaysians, including a girl. Brain Dev. 2014; 36(7): 593-600.

Chen X, Burdett TC, Desjardins CA, Logan R, Cipriani S, Xu Y, Schwarzschild MA. Disrupted and transgenic urate oxidase alter urate and dopaminergic neurodegeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013; 110(1): 300-5.

Chin MH, Mason MJ, Xie W, Volinia S, Singer M, Peterson C, Ambartsumyan G, Aimiuwu O, Richter L, Zhang J, Khvorostov I, Ott V, Grunstein M, Lavon N, Benvenisty N, Croce CM, Clark AT, Baxter T, Pyle AD, Teitell MA, Pelegrini M, Plath K, Lowry WE. Induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells are distinguished by gene expression signatures. Cell Stem Cell. 2009; 5(1): 111-23.

Cowan CA, Atienza J, Melton DA, Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells. Science. 2005; 309(5739): 1369-73.

Darville H, Poulet A, Rodet-Amsellem F, Chatrousse L, Pernelle J, Boissart C, Héron D, Nava C, Perrier A, Jarrige M, Cogé F, Millan MJ, Bourgeron T, Peschanski M, Delorme R, Benchoua A. Human Pluripotent Stem Cell-derived Cortical Neurons for High Throughput Medication Screening in Autism: A Proof of Concept Study in SHANK3 Haploinsufficiency Syndrome. EBioMedicine. 2016; 9: 293-305.

De Brouwer AP, Williams KL, Duley JA, van Kuilenburg AB, Nabuurs SB, Egmont-Petersen M, Lugtenberg D, Zoetekouw L, Banning MJ, Roeffen M, Hamel BC, Weaving L, Ouvrier RA, Donald JA, Wevers RA, Christodoulou J, van Bokhoven H. Arts syndrome is caused by loss-of-function mutations in PRPS1. Am J Hum Genet. 2007; 81(3): 507-18.

De Brouwer AP, van Bokhoven H, Nabuurs SB, Arts WF, Christodoulou J, Duley J. PRPS1 mutations: four distinct syndromes and potential treatment. Am J Hum Genet. 2010; 86(4): 506-18.

De Gregorio L, Jinnah HA, Harris JC, Nyhan WL, Schretlen DJ, Trombley LM, O'Neill JP. Lesch-Nyhan disease in a female with a clinically normal monozygotic twin. Mol Genet Metab. 2005; 85(1): 70-7.

Del Puerto A, Díaz-Hernández JI, Tapia M, Gomez-Villafuertes R, Benitez MJ, Zhang J, Miras Portugal MT, Wandosell F, Díaz-Hernández M, Garrido JJ. Adenylate cyclase 5 coordinates the action of ADP, P2Y1, P2Y13 and ATP-gated P2X7 receptors on axonal elongation. J Cell Sci. 2012; 125(Pt 1): 176-88.

Di Liberto V, Mudò G, Garozzo R, Frinchi M, Fernandez-Dueñas V, Di Iorio P, Ciccarelli R, Caciagli F, Condorelli DF, Ciruela F, Belluardo N. The Guanine-Based Purinergic System: The Tale of An Orphan Neuromodulation. Front Pharmacol. 2016; 7: 158.

Dolcetta D, Parmigiani P, Salmaso L, Bernardelle R, Cesari U, Andrighetto G, Baschirotto G, Nyhan WL, Hladnik U. Quantitative evaluation of the clinical effects of S-adenosylmethionine on mood and behavior in Lesch-Nyhan patients. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2013; 32(4): 174-88.

Doyle C, Cristofaro V, Sullivan MP, Adam RM. Inosine - a Multifunctional Treatment for Complications of Neurologic Injury. Cell Physiol Biochem. 2018; 49(6): 2293-2303.

140

Edwards A, Gibbs RA, Nguyen PN, Ansorge W, Caskey CT. Automated DNA sequencing methods for detection and analysis of mutations: applications to the Lesch-Nyhan syndrome. Trans Assoc Am Physicians. 1989; 102: 185-94.

Egesipe AL, Blondel S, Cicero AL, Jaskowiak AL, Navarro C, Sandre-Giovannoli A, Levy N, Peschanski M, Nissan X. Metformin decreases progerin expression and alleviates pathological defects of Hutchinson-Gilford progeria syndrome cells. NPJ Aging Mech Dis. 2016; 2: 16026.

Engle SJ, Womer DE, Davies PM, Boivin G, Sahota A, Simmonds HA, Stambrook PJ, Tischfield JA. HPRT-APRT-deficient mice are not a model for lesch-nyhan syndrome. Hum Mol Genet. 1996; 5(10): 1607-10.

Ernst M, Zametkin AJ, Matochik JA, Pascualvaca D, Jons PH, Hardy K, Hankerson JG, Doudet DJ, Cohen RM. Presynaptic dopaminergic deficits in Lesch-Nyhan disease. N Engl J Med. 1996; 334(24): 1568-72.

Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981; 292(5819): 154-6.

Freires IA, Sardi JC, de Castro RD, Rosalen PL. Alternative Animal and Non-Animal Models for Drug Discovery and Development: Bonus or Burden? Pharm Res. 2017; 34(4): 681-686.

Fu R, Ceballos-Picot I, Torres RJ, Larovere LE, Yamada Y, Nguyen KV, Hegde M, Visser JE, Schretlen DJ, Nyhan WL, Puig JG, O'Neill PJ, Jinnah HA. Lesch-Nyhan Disease International Study Group. Genotype- phenotype correlations in neurogenetics: Lesch-Nyhan disease as a model disorder. Brain. 2014; 137(Pt 5): 1282-303.

Fumagalli M, Lecca D, Abbracchio MP, Ceruti S. Pathophysiological Role of Purines and Pyrimidines in Neurodevelopment: Unveiling New Pharmacological Approaches to Congenital Brain Diseases. Front Pharmacol. 2017; 8:941.

Fusaki N, Ban H, Nishiyama A, Saeki K, Hasegawa M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009; 85(8): 348-62.

García MG, Puig JG, Torres RJ. Adenosine, dopamine and serotonin receptors imbalance in lymphocytes of Lesch-Nyhan patients. J Inherit Metab Dis. 2012; 35(6): 1129-35.

Gasperi V, Sibilano M, Savini I, Catani MV. Niacin in the Central Nervous System: An Update of Biological Aspects and Clinical Applications. Int J Mol Sci. 2019; 20(4).

Georges P, Boissart C, Poulet A, Peschanski M, Benchoua A. Protein Kinase-A Inhibition Is Sufficient to Support Human Neural Stem Cells Self-Renewal. Stem Cells. 2015; 33(12): 3666-72.

Gibbs RA, Nguyen PN, Edwards A, Civitello AB, Caskey CT. Multiplex DNA deletion detection and exon sequencing of the hypoxanthine phosphoribosyltransferase gene in Lesch-Nyhan families. Genomics. 1990; 7(2): 235-44.

Glick N. Dramatic reduction in self-injury in Lesch-Nyhan disease following S-adenosylmethionine administration. J Inherit Metab Dis. 2006; 29(5): 687.

141

Goldstein M, Anderson LT, Reuben R, Dancis J. Self-mutilation in Lesch-Nyhan disease is caused by dopaminergic denervation. Lancet. 1985; 1(8424): 338-9.

González F, Boué S, Izpisúa Belmonte JC. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming à la carte. Nat Rev Genet. 2011; 12(4): 231-42.

Gonzalez-Usigli HA and Espay A. Chorea, athetosis and hemiballismus. In MSD Manuals. Updated in 2016. Merck and Co, Kenilworth, NJ, USA. https://www.msdmanuals.com/home/brain,-spinal-cord,- and-nerve-disorders/movement-disorders/chorea,-athetosis,-and-hemiballismus. Consulté le 28/08/2018.

Göttle M, Burhenne H, Sutcliffe D, Jinnah HA. Purine metabolism during neuronal differentiation: the relevance of purine synthesis and recycling. J Neurochem. 2013; 127(6): 805-18.

Göttle M, Prudente CN, Fu R, Sutcliffe D, Pang H, Cooper D, Veledar E, Glass JD, Gearing M, Visser JE, Jinnah HA. Loss of dopamine phenotype among midbrain neurons in Lesch-Nyhan disease. Ann Neurol. 2014; 76(1): 95-107.

Guibinga GH, Hsu S, Friedmann T. Deficiency of the housekeeping gene hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT) dysregulates neurogenesis. Mol Ther. 2010; 18(1): 54-62.

Halevy T, Urbach A. Comparing ESC and iPSC-Based Models for Human Genetic Disorders. J Clin Med. 2014; 3(4): 1146-62.

Harris JC, Lee RR, Jinnah HA, Wong DF, Yaster M, Bryan RN. Craniocerebral magnetic resonance imaging measurement and findings in Lesch-Nyhan syndrome. Arch Neurol. 1998; 55(4): 547-53.

Harris JC and Schiffmann R. Lesch-Nyhan disease. In Medlink Neurology. Updated in 2017. http://www.medlink.com/article/lesch-nyhan_disease#S4. Consulté le 27/08/2018.

Harris JC. Lesch-Nyhan syndrome and its variants: examining the behavioral and neurocognitive phenotype. Curr Opin Psychiatry. 2018; 31(2): 96-102.

Hayes M, Curley G, Ansari B, Laffey JG. Clinical review: Stem cell therapies for acute lung injury/acute respiratory distress syndrome - hope or hype? Crit Care. 2012; 16(2): 205.

Heine C, Sygnecka K, Franke H. Purines in neurite growth and astroglia activation. Neuropharmacology. 2016; 104: 255-71.

Herskovits AZ, Guarente L. SIRT1 in neurodevelopment and brain senescence. Neuron. 2014; 81(3): 471-83.

Hooper M, Hardy K, Handyside A, Hunter S, Monk M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 1987; 326(6110): 292-5.

Hou P, Li Y, Zhang X, Liu C, Guan J, Li H, Zhao T, Ye J, Yang W, Liu K, Ge J, Xu J, Zhang Q, Zhao Y, Deng H. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science. 2013; 341(6146): 651-4.

Howard WJ, Kerson LA, Appel SH. Synthesis de novo of purines in slices of rat brain and liver. J Neurochem. 1970; 17(1): 121-3.

142

Hyland K, Kasim S, Egami K, Arnold LA, Jinnah HA. Tetrahydrobiopterin deficiency and dopamine loss in a genetic mouse model of Lesch-Nyhan disease. J Inherit Metab Dis. 2004; 27(2): 165-78.

Jaeken J, Van den Berghe G. An infantile autistic syndrome characterised by the presence of succinylpurines in body fluids. Lancet. 1984; 2(8411): 1058-61.

Jinnah HA, Page T, Friedmann T. Brain purines in a genetic mouse model of Lesch-Nyhan disease. J Neurochem. 1993; 60(6): 2036-45.

Jinnah HA, Wojcik BE, Hunt M, Narang N, Lee KY, Goldstein M, Wamsley JK, Langlais PJ, Friedmann T. Dopamine deficiency in a genetic mouse model of Lesch-Nyhan disease. J Neurosci. 1994; 14(3 Pt 1): 1164-75.

Jinnah HA, Visser JE, Harris JC, Verdu A, Larovere L, Ceballos-Picot I, Gonzalez-Alegre P, Neychev V, Torres RJ, Dulac O, Desguerre I, Schretlen DJ, Robey KL, Barabas G, Bloem BR, Nyhan W, De Kremer R, Eddey GE, Puig JG, Reich SG; Lesch-Nyhan Disease International Study Group. Delineation of the motor disorder of Lesch-Nyhan disease. Brain. 2006; 129(Pt 5): 1201-17.

Jinnah HA. Lesch-Nyhan disease: from mechanism to model and back again. Dis Model Mech. 2009; 2(3-4): 116-21.

Jinnah HA, Ceballos-Picot I, Torres RJ, Visser JE, Schretlen DJ, Verdu A, Laróvere LE, Chen CJ, Cossu A, Wu CH, Sampat R, Chang SJ, de Kremer RD, Nyhan W, Harris JC, Reich SG, Puig JG; Lesch-Nyhan Disease International Study Group. Attenuated variants of Lesch-Nyhan disease. Brain. 2010; 133(Pt 3): 671-89.

Jinnah HA, Sabina RL, Van Den Berghe G. Metabolic disorders of purine metabolism affecting the nervous system. Handb Clin Neurol. 2013; 113: 1827-36.

Kang TH, Guibinga GH, Jinnah HA, Friedmann T. HPRT deficiency coordinately dysregulates canonical Wnt and presenilin-1 signaling: a neuro-developmental regulatory role for a housekeeping gene? PLoS One. 2011; 6(1): e16572.

Keebaugh AC, Mitchell HA, Gaval-Cruz M, Freeman KG, Edwards GL, Weinshenker D, Thomas JW. PRTFDC1 is a genetic modifier of HPRT-deficiency in the mouse. PLoS One. 2011; 6(7): e22381.

Kelley WN, Rosenbloom FM, Seegmiller JE. The effects of azathioprine (imuran) on purine synthesis in clinical disorders of purine metabolism. J Clin Invest. 1967; 46(9): 1518-29.

Khasnavis T, Reiner G, Sommerfeld B, Nyhan WL, Chipkin R, Jinnah HA. A clinical trial of safety and tolerability for the selective dopamine D1 receptor antagonist ecopipam in patients with Lesch- Nyhan disease. Mol Genet Metab. 2016a; 117(4): 401-6.

Khasnavis T, Torres RJ, Sommerfeld B, Puig JG, Chipkin R, Jinnah HA. A double-blind, placebo- controlled, crossover trial of the selective dopamine D1 receptor antagonist ecopipam in patients with Lesch-Nyhan disease. Mol Genet Metab. 2016b; 118(3): 160-6.

Kim K, Zhao R, Doi A, Ng K, Unternaehrer J, Cahan P, Huo H, Loh YH, Aryee MJ, Lensch MW, Li H, Collins JJ, Feinberg AP, Daley GQ. Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2011; 29(12): 1117-9.

143

Kirkeby A, Nelander J, Parmar M. Generating regionalized neuronal cells from pluripotency, a step- by-step protocol. Front Cell Neurosci. 2013; 6: 64.

Klinenberg JR, Goldfinger SE, Seegmiller JE. The effectiveness of the xanthine oxidase inhibitor allopurinol in the treatment of gout. Ann Intern Med. 1965; 62: 639-47.

Kuehn MR, Bradley A, Robertson EJ, Evans MJ. A potential animal model for Lesch-Nyhan syndrome through introduction of HPRT mutations into mice. Nature. 1987; 326(6110): 295-8.

Lauber M, Plecko B, Pfiffner M, Nuoffer JM, Häberle J. The Effect of S-Adenosylmethionine on Self- Mutilation in a Patient with Lesch-Nyhan Disease. JIMD Rep. 2017; 32: 51-57.

Lee G, Papapetrou EP, Kim H, Chambers SM, Tomishima MJ, Fasano CA, Ganat YM, Menon J, Shimizu F, Viale A, Tabar V, Sadelain M, Studer L. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 2009; 461(7262): 402-6.

Lesch M, Nyhan WL. A Familial disorder of uric acid metabolism and central nervous system function. Am J Med. 1964; 36: 561-70.

Lister R, Pelizzola M, Kida YS, Hawkins RD, Nery JR, Hon G, Antosiewicz-Bourget J, O'Malley R, Castanon R, Klugman S, Downes M, Yu R, Stewart R, Ren B, Thomson JA, Evans RM, Ecker JR. Hotspots of aberrant epigenomic reprogramming in human induced pluripotent stem cells. Nature. 2011; 471(7336): 68-73.

Lloyd KG, Hornykiewicz O, Davidson L, Shannak K, Farley I, Goldstein M, Shibuya M, Kelley WN, Fox IH. Biochemical evidence of dysfunction of brain neurotransmitters in the Lesch-Nyhan syndrome. N Engl J Med. 1981; 305(19): 1106-11.

Luo SX, Huang EJ. Dopaminergic Neurons and Brain Reward Pathways: From Neurogenesis to Circuit Assembly. Am J Pathol. 2016; 186(3): 478-88.

Maiuolo J, Oppedisano F, Gratteri S, Muscoli C, Mollace V. Regulation of uric acid metabolism and excretion. Int J Cardiol. 2016; 213: 8-14.

Malo N, Hanley JA, Cerquozzi S, Pelletier J, Nadon R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 2006; 24(2): 167-75.

Marie S, Heron B, Bitoun P, Timmerman T, Van Den Berghe G, Vincent MF. AICA-ribosiduria: a novel, neurologically devastating inborn error of purine biosynthesis caused by mutation of ATIC. Am J Hum Genet. 2004; 74(6): 1276-81.

Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981; 78(12): 76348.

Maury Y, Côme J, Piskorowski RA, Salah-Mohellibi N, Chevaleyre V, Peschanski M, Martinat C, Nedelec S. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nat Biotechnol. 2015; 33(1): 89-96.

McKeran RO, Howell A, Andrews TM, Watts RW, Arlett CF. Observations on the growth in vitro of myeloid progenitor cells and fibroblasts from hemizygotes and heterozygotes for "complete" and "partial" hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) deficiency, and their relevance to the pathogenesis of brain damage in the Lesch-Nyhan syndrome. J Neurol Sci. 1974; 22(2): 183-95.

144

Meek S, Thomson AJ, Sutherland L, Sharp MG, Thomson J, Bishop V, Meddle SL, Gloaguen Y, Weidt S, Singh-Dolt K, Buehr M, Brown HK, Gill AC, Burdon T. Reduced levels of dopamine and altered metabolism in brains of HPRT knock-out rats: a new rodent model of Lesch Nyhan Disease. Sci Rep. 2016; 6: 25592.

Meiser J, Weindl D, Hiller K. Complexity of dopamine metabolism. Cell Commun Signal. 2013; 11(1): 34.

Mertens J, Paquola ACM, Ku M, Hatch E, Böhnke L, Ladjevardi S, McGrath S, Campbell B, Lee H, Herdy JR, Gonçalves JT, Toda T, Kim Y, Winkler J, Yao J, Hetzer MW, Gage FH. Directly Reprogrammed Human Neurons Retain Aging-Associated Transcriptomic Signatures and Reveal Age-Related Nucleocytoplasmic Defects. Cell Stem Cell. 2015; 17(6): 705-718.

Micheli V, Jacomelli G, Di Marcello F, Notarantonio L, Sestini S, Cerboni B, Bertelli M, Pompucci G, Jinnah HA. NAD metabolism in HPRT-deficient mice. Metab Brain Dis. 2009; 24(2): 311-9.

Micheli V, Camici M, Tozzi MG, Ipata PL, Sestini S, Bertelli M, Pompucci G. Neurological disorders of purine and pyrimidine metabolism. Curr Top Med Chem. 2011; 11(8): 923-47.

Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol. 2008; 26(1): 101-6.

Nyhan WL, Pesek J, Sweetman L, Carpenter D, Carter C. Genetics of an X-linked disorder of uric acid metabolism and cerebral function. Pediatric Res. 1967; 1: 5-13.

Nyhan WL, Sweetman L, Carpenter DG, Carter CH, Hoefnagel D. Effects of azathioprine in a disorder of uric acid metabolism and cerebral function. J Pediatr. 1968; 72(1): 111-8.

Nyhan WL, Bakay B, Connor JD, Marks JF, Keele DK. Hemizygous expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase in erythrocytes of heterozygotes for the Lesch-Nyhan syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 1970; 65(1): 214-8.

Nyhan WL, O’Neill JP, Jinnah HA, and Harris JC. Lesch-Nyhan Syndrome. In GeneReviews. Updated in 2014. Seattle (WA): University of Washington, Seattle. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1149/. Consulté le 08/08/2018.

Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 2007; 448(7151): 313-7.

Oliveira Á, Illes P, Ulrich H. Purinergic receptors in embryonic and adult neurogenesis. Neuropharmacology. 2016; 104: 272-81.

Page T, Bakay B, Nissinen E, Nyhan WL. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase variants: correlation of clinical phenotype with enzyme activity. J Inherit Metab Dis. 1981; 4(4): 203-6.

Pai GS, Sprenkle JA, Do TT, Mareni CE, Migeon BR. Localization of loci for hypoxanthine phosphoribosyltransferase and glucose-6-phosphate dehydrogenase and biochemical evidence of nonrandom X chromosome expression from studies of a human X-autosome translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980; 77(5): 2810-3.

145

Palfi S, Gurruchaga JM, Lepetit H, Howard K, Ralph GS, Mason S, Gouello G, Domenech P, Buttery PC, Hantraye P, Tuckwell NJ, Barker RA, Mitrophanous KA. Long-Term Follow-Up of a Phase I/II Study of ProSavin, a Lentiviral Vector Gene Therapy for Parkinson's Disease. Hum Gene Ther Clin Dev. 2018; 29(3): 148-155.

Pedley AM, Benkovic SJ. A New View into the Regulation of Purine Metabolism: The Purinosome. Trends Biochem Sci. 2017; 42(2): 141-154.

Piedimonte F, Andreani JC, Piedimonte L, Micheli F, Graff P, Bacaro V. Remarkable clinical improvement with bilateral globus pallidus internus deep brain stimulation in a case of Lesch-Nyhan disease: five-year follow-up. Neuromodulation. 2015; 18(2): 118-22;

Prior C, Torres RJ, Puig JG. Hypoxanthine decreases equilibrative type of adenosine transport in lymphocytes from Lesch-Nyhan patients. Eur J Clin Invest. 2007; 37(11): 905-11.

Puig JG, Torres RJ. Enzyme activity and brain anatomy: lessons from HPRT deficiency. Lancet Neurol. 2013; 12(12): 1129-31.

Reigada D, Navarro-Ruiz RM, Caballero-López MJ, Del Águila Á, Muñoz-Galdeano T, Maza RM, Nieto- Díaz M. Diadenosine tetraphosphate (Ap(4)A) inhibits ATP-induced excitotoxicity: a neuroprotective strategy for traumatic spinal cord injury treatment. Purinergic Signal. 2017; 13(1): 75-87.

Rick CE, Ebert A, Virag T, Bohn MC, Surmeier DJ. Differentiated dopaminergic MN9D cells only partially recapitulate the electrophysiological properties of midbrain dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 2006; 28(6): 528-37.

Robinton DA, Daley GQ. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 2012; 481(7381): 295-305.

Rosso P, Fioramonti M, Fracassi A, Marangoni M, Taglietti V, Siteni S, Segatto M. AMPK in the central nervous system: physiological roles and pathological implications. Res Rep Biol. 2016; 7: 1-13.

Saito Y, Ito M, Hanaoka S, Ohama E, Akaboshi S, Takashima S. Dopamine receptor upregulation in Lesch-Nyhan syndrome: a postmortem study. Neuropediatrics. 1999; 30(2): 66-71.

Sala L, Yu Z, Ward-van Oostwaard D, van Veldhoven JP, Moretti A, Laugwitz KL, Mummery CL, IJzerman AP, Bellin M. A new hERG allosteric modulator rescues genetic and drug induced long-QT syndrome phenotypes in cardiomyocytes from isogenic pairs of patient induced pluripotent stem cells. EMBO Mol Med. 2016; 8(9): 1065-81.

Sauve AA. NAD+ and vitamin B3: from metabolism to therapies. J Pharmacol Exp Ther. 2008; 324(3): 883-93.

Schretlen DJ, Ward J, Meyer SM, Yun J, Puig JG, Nyhan WL, Jinnah HA, Harris JC. Behavioral aspects of Lesch-Nyhan disease and its variants. Dev Med Child Neurol. 2005; 47(10): 673-7.

Schretlen DJ, Varvaris M, Ho TE, Vannorsdall TD, Gordon B, Harris JC, Jinnah HA. Regional brain volume abnormalities in Lesch-Nyhan disease and its variants: a cross-sectional study. Lancet Neurol. 2013; 12(12): 1151-8.

Schretlen DJ, Varvaris M, Vannorsdall TD, Gordon B, Harris JC, Jinnah HA. Brain white matter volume abnormalities in Lesch-Nyhan disease and its variants. Neurology. 2015; 84(2): 190-6.

146

Seegmiller JE, Rosenbloom FM, Kelley WN. Enzyme defect associated with a sex-linked human neurological disorder and excessive purine synthesis. Science. 1967; 155(3770): 1682-4.

Shi Y, Inoue H, Wu JC, Yamanaka S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat Rev Drug Discov. 2017; 16(2): 115-130.

Shoji E, Sakurai H, Nishino T, Nakahata T, Heike T, Awaya T, Fujii N, Manabe Y, Matsuo M, Sehara- Fujisawa A. Early pathogenesis of Duchenne muscular dystrophy modelled in patient derived human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 2015; 5: 12831.

Sorensen LB. Suppression of the shunt pathway in primary gout by azathioprine. Proc Natl Acad Sci U S A. 1966; 55(3): 571-5.

Stadtfeld M, Hochedlinger K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 2010; 24(20): 2239-63.

Stevens LC. Experimental production of testicular teratomas in mice. Proc Natl Acad Sci USA. 1964; 52: 654-61.

Stockwell J, Jakova E, Cayabyab FS. Adenosine A1 and A2A Receptors in the Brain: Current Research and Their Role in Neurodegeneration. Molecules. 2017; 22(4).

Stout JT, Caskey CT. HPRT: gene structure, expression, and mutation. Annu Rev Genet. 1985; 19: 127- 48.

Suh W. A new era of disease modeling and drug discovery using induced pluripotent stem cells. Arch Pharm Res. 2017; 40(1): 1-12.

Tada M, Takahama Y, Abe K, Nakatsuji N, Tada T. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Curr Biol. 2001; 11(19): 1553-8.

Taira T, Kobayashi T, Hori T. Disappearance of self-mutilating behavior in a patient with lesch-nyhan syndrome after bilateral chronic stimulation of the globus pallidus internus. Case report. J Neurosurg. 2003; 98(2): 414-6.

Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006; 126(4): 663-76.

Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007; 131(5): 861-72.

Takayama K, Morisaki Y, Kuno S, Nagamoto Y, Harada K, Furukawa N, Ohtaka M, Nishimura K, Imagawa K, Sakurai F, Tachibana M, Sumazaki R, Noguchi E, Nakanishi M, Hirata K, Kawabata K, Mizuguchi H. Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111(47): 16772-7.

Thiele SL, Warre R, Nash JE. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease. J Vis Exp. 2012; (60).pii: 3234.

Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998; 282(5391): 1145-7.

147

Torres RJ, Puig JG, Jinnah HA. Update on the phenotypic spectrum of Lesch-Nyhan disease and its attenuated variants. Curr Rheumatol Rep. 2012; 14(2): 189-94.

Torres RJ, Prior C, Puig JG. Efficacy and safety of allopurinol in patients with hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase deficiency. Metabolism. 2007; 56(9): 1179-86.

Torres RJ, Puig JG. Hypoxanthine-guanine phosophoribosyltransferase (HPRT) deficiency: Lesch- Nyhan syndrome. Orphanet J Rare Dis. 2007; 2: 48.

Torres RJ, Puig JG. Hypoxanthine deregulates genes involved in early neuronal development. Implications in Lesch-Nyhan disease pathogenesis. J Inherit Metab Dis. 2015; 38(6): 1109-18.

Torres RJ, Prior C, Garcia MG, Puig JG. A review of the implication of hypoxanthine excess in the physiopathology of Lesch-Nyhan disease. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2016; 35(10-12): 507-516.

Torres RJ, Puig JG. Skewed X inactivation in Lesch-Nyhan disease carrier females. J Hum Genet. 2017; 62(12): 1079-1083.

Townsend MH, Robison RA, O'Neill KL. A review of HPRT and its emerging role in cancer. Med Oncol. 2018; 35(6): 89.

Turinetto V, Orlando L, Giachino C. Induced Pluripotent Stem Cells: Advances in the Quest for Genetic Stability during Reprogramming Process. Int J Mol Sci. 2017; 18(9). pii: E1952.

Ulrich H, Abbracchio MP, Burnstock G. Extrinsic purinergic regulation of neural stem/progenitor cells: implications for CNS development and repair. Stem Cell Rev. 2012; 8(3): 755-67.

Visser JE, Bär PR, Jinnah HA. Lesch-Nyhan disease and the basal ganglia. Brain Res Brain Res Rev. 2000; 32(2-3): 449-75.

Visser JE, Smith DW, Moy SS, Breese GR, Friedmann T, Rothstein JD, Jinnah HA. Oxidative stress and dopamine deficiency in a genetic mouse model of Lesch-Nyhan disease. Brain Res Dev Brain Res. 2002; 133(2): 127-39.

Visser JE, Schretlen DJ, Bloem BR, Jinnah HA. Levodopa is not a useful treatment for Lesch-Nyhan disease. Mov Disord. 2011; 26(4): 746-9.

Wang Y, Chang CF, Morales M, Chiang YH, Harvey BK, Su TP, Tsao LI, Chen S, Thiemermann C. Diadenosine tetraphosphate protects against injuries induced by ischemia and 6-hydroxydopamine in rat brain. J Neurosci. 2003; 23(21): 7958-65.

Welin M, Egeblad L, Johansson A, Stenmark P, Wang L, Flodin S, Nyman T, Trésaugues L, Kotenyova T, Johansson I, Eriksson S, Eklund H, Nordlund P. Structural and functional studies of the human phosphoribosyltransferase domain containing protein 1. FEBS J. 2010; 277(23): 4920-30.

Weltner J, Balboa D, Katayama S, Bespalov M, Krjutškov K, Jouhilahti EM, Trokovic R, Kere J, Otonkoski T. Human pluripotent reprogramming with CRISPR activators. Nat Commun. 2018; 9(1): 2643.

148

Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature. 1997; 385(6619): 810-3.

Wong DF, Harris JC, Naidu S, Yokoi F, Marenco S, Dannals RF, Ravert HT, Yaster M, Evans A, Rousset O, Bryan RN, Gjedde A, Kuhar MJ, Breese GR. Dopamine transporters are markedly reduced in Lesch- Nyhan disease in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93(11): 5539-43.

Wu X, Wakamiya M, Vaishnav S, Geske R, Montgomery C Jr, Jones P, Bradley A, Caskey CT. Hyperuricemia and urate nephropathy in urate oxidase-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91(2): 742-6.

Yamanaka S, Blau HM. Nuclear reprogramming to a pluripotent state by three approaches. Nature. 2010; 465(7299): 704-12.

Yang Y, Sauve AA. NAD(+) metabolism: Bioenergetics, signaling and manipulation for therapy. Biochim Biophys Acta. 2016; 1864(12): 1787-1800.

Yin J, Ren W, Huang X, Deng J, Li T, Yin Y. Potential Mechanisms Connecting Purine Metabolism and Cancer Therapy. Front Immunol. 2018; 9:1697.

Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 2007; 318(5858): 1917-20.

Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 1999; 4(2): 67-73.

Zhang T, Kraus WL. SIRT1-dependent regulation of chromatin and transcription: linking NAD(+) metabolism and signaling to the control of cellular functions. Biochim Biophys Acta. 2010; 1804(8): 1666-75.

149

Titre : Utilisation des cellules souches pluripotentes pour le criblage à haut débit de molécules thérapeutiques dans la maladie de Lesch-Nyhan.

Mots clés : Maladie de Lesch-Nyhan, cellules souches pluripotentes, iPSC, criblage à haut débit, HGPRT, purines

Title : Pluripotent stem cells as a model for drug discovery using high throughput screening in Lesch- Nyhan disease

Keywords : Lesch-Nyhan disease, pluripotent stem cells, iPSC, High-throughput screening, HGPRT, purines

Université Paris-Saclay Espace Technologique / Immeuble Discovery Route de l’Orme aux Merisiers RD 128 / 91190 Saint-Aubin, France