MARIA APARECIDA FERNANDES
EVOLUÇÃO CARIOGENÔMICA EM PEIXES RECIFAIS DAS FAMÍLIAS ACANTHURIDAE (ACANTHURIFORMES) E HOLOCENTRIDAE (HOLOCENTRIFORMES)
Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Sistemática e Evolução
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em cumprimento às exigências
para obtenção do título de Doutor em Sistemática e Evolução.
Orientador: Dr. Wagner Franco Molina
NATAL - RN 2019
Maria Aparecida Fernandes
Evolução cariogenômica em peixes recifais das famílias Acanthuridae (Acanthuriformes) e Holocentridae (Holocentriformes)
Aprovada em: 30 de Agosto de 2019.
Comissão Examinadora:
Dr. Wagner Franco Molina – UFRN (Orientador/Presidente)
Dra. Kátia Castanho Scortecci – UFRN
Dr. Paulo Augusto de Lima Filho – IFRN
Dr. Clóvis Coutinho da Motta Neto – UFRN
Dr. Gideão Wagner Werneck Félix da Costa – UFRN
Dedico
À minha filha Alice. Aos meus pais Vilmar (In memoriam) e Inácia. A Leandro.
A vocês todo meu amor e gratidão.
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer especialmente aos meus pais, por todo amor, dedicação e esforços empenhados para minha educação, bem como pelos valorosos ensinamentos que moldaram meu caráter. Às minhas irmãs (Josivânia e Josenilda) e irmãos (Adriano, Mariano e João Paulo) pela maravilhosa convivência familiar, carinho, amizade, e principalmente, pela compreensão frente minha ausência durante os momentos difíceis. Ao meu companheiro Leandro, pelo carinho, amizade e parceria de maneira incansável. À Fátima e Luan pela dedicação e assistência nos cuidados com Alice nos momentos de minha ausência. Ao professor Dr. Wagner Franco Molina, pelo apoio, orientação e confiança depositados durante a realização deste trabalho. Aos doutores Gideão W. W. F. da Costa e Clóvis C. da Motta-Neto pelas significativas contribuições durante o exame de qualificação. Aos companheiros de laboratório: Gideão, Karlla, Paulo, Inailson, Josi, Divana, Allyson, Clóvis, Rodrigo, Amanda, Éricka, Matheus, Dalvan, Simião, Glaicon, Marcelo, Louise, Vanessa e Calado. Obrigada a todos pelas indispensáveis contribuições nos procedimentos laboratoriais e de coletas, e por terem proporcionado, através do companheirismo e bom humor, uma jornada mais rica, leve e prazeirosa. À CAPES pela concessão da bolsa de estudos. À UFRN e ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução por permitir a conclusão desta estapa de meu processo educacional. Ao CNPq pelo suporte financeiro (Processo No. 556793/2009-9), INCT “Ciências do Mar,”, FAPESB (no. APP0064/2011) e ICMBio/SISBIO (licenças 19135- 1, 131360-1, e 27027-2) pela autorização de coleta de espécimes.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Espécies do gênero Acanthurus empregadas nas análises citogenéticas e suas respectivas áreas de distribuição. Barra = 2cm...... 35 Figura 2. Espécies da família Holocentridae empregadas nas análises citogenéticas e suas respectivas áreas de distribuição. Barra = 2cm...... 36 Figura 3. Cariótipos das espécies Acanthurus triostegus, Acanthurus coeruleus, Acanthurus bahianus e Acanthurus chirurgus, sob coloração convencional com Giemsa e bandamento C. Em destaque os pares portadores de sítios Ag-RONs. Barra = 5µm...... 50 Figura 4. Mapeamento cromossômico genes ribossomais 18S (caixas com linhas sólidas, em vermelho), 5S (caixas com linhas pontilhadas em verde) e de DNAhis H3 (vermelho) e H2B-H2A (verde) nas populações do Atlântico Sul e Caribe (AS/CA) das espécies Acanthurus bahianus, Acanthurus chirurgus e Acanthurus triostegus, do Índico. Barra = 5 µm...... 51 Figura 5. Mapeamento cromossômico de DNAr 18S (caixas com linhas sólidas, em vermelho), DNAr 5S (caixas com linhas pontilhadas em verde) e DNAhis H3 (vermelho) e H2B-H2A (verde) nas populações de Acanthurus coeruleus das regiões do Caribe e do Atlântico Sul. Barra = 5 µm...... 52 Figura 6. Idiograma indicando a organização de diferentes classes de DNAs repetitivos (DNAr e DNAhis) em espécies e populações de Acanthurus. Em destaque nas caixas, conjuntos de cromossomos compartilhados entre as espécies. Par cromossômico portador de sítio DNAr 18S com variação interpopulacional (caixa pontilhada). CA=Caribe; AS=Atlântico Sul; OI = Oceano Índico...... 55 Figura 7. Distribuição geográfica (linhas) das espécies Acanthurus coeruleus (azul), Acanthurus bahianus (verde), Acanthurus chirurgus (vermelho) e Acanthurus triostegus (rosa). Símbolos indicam os processos de modificações cariotípicas em Acanthurus associados a padrões filogenéticos temporais de diversificação (modificada de SORENSON et al., 2013)...... 56 Figura 8. Cariótipos das espécies Myripristis jacobus, Sargocentron rubrum e Holocentrus adscensionis, com coloração com Giemsa e bandamento C. Em destaque os pares portadores de sítios Ag-RONs. Barra = 5µm...... 71
+ - Figura 9. Hibridização in situ com sondas de DNAr 18S (vermelho; sinais CMA3 /DAPI na parte superior da caixa) e 5S (verde) e Rex3 em Myripristis jacobus, Sargocentron rubrum e Holocentrus adscensionis. Barra = 5µm...... 72
Figura 10. Hibridização in situ fluorescente de sequências (GA)15, e do elemento transponível Tol2 em Holocentrus adscensionis (populações da costa brasileira e Ilha de Trindade) e Myripristis jacobus (populações costa brasileira e ASPSP) e Sargocentron rubrum (Índico). Barra = 5 μm ...... 73
Figura 11. Idiogramas representativos dos cromossomos das três espécies de Holocentridae evidenciando a distribuição de diferentes classes de DNAs repetitivos...... 77
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Amostras das espécies de Acanthuridae e Holocentridae utilizadas nas análises citogenômicas...... 37 Tabela 2. Sondas e primers utilizados nas análises por hibridização in situ...... 40 Tabela 3. Amostras das espécies de Acanthurus utilizadas nas análises citogenéticas...... 46 Tabela 4. Amostras das espécies de Holocentridae utilizadas nas análises citogenéticas...... 68
LISTA DE ABREVIATURAS a – Acrocêntrico AFN – Arquipélago de Fernando de Noronha
AgNO3 – Nitrato de prata Ag-RONs – Regiões organizadoras de nucléolo evidenciadas pela impregnação com nitrato de prata ASPSP – Arquipélago de São Pedro e São Paulo AT – Adenina e Timina
Ba(OH)28H2O – Hidróxido de bário
CMA3 – Cromomicina A3 DAPI – 4’,6-diamidino-2-fenilindol DNAr – Ácido desoxirribonucleico ribossômico FISH – Fluorescence in situ hybridization GC – Guanina e Citosina HCl – Ácido clorídrico KCl – Cloreto de potássio m – Metacêntrico M.a. – Milhões de anos NF – Número Fundamental
PCR – Reação em cadeia polimerase RN – Rio Grande do Norte rpm – Rotações por minuto RNAr/rRNA – Ácido ribonucleico ribossômico sm – Submetacêntrico SSC- Solução salina de citrato de sódio st – Subtelocêntrico
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...... 17 1.1 Aspectos da biologia e ecologia da família Acanthuridae ...... 17 1.1.2 Relações filogenéticas e taxonômicas da família Acanthuridae ...... 18 1.1.2.1 O gênero Acanthurus ...... 19 1.2 Aspectos da biologia e ecologia da família Holocentridae ...... 21 1.2.1 Taxonomia e filogenia de Holocentridae ...... 21 1.3 Barreiras biogeográficas marinhas e biodiversidade associada ...... 24 1.3.1 Biogeografia dos grupos Acanthuridae e Holocentridae ...... 28 1.4 Padrões cromossômicos em Acanthuridae e Holocentridae...... 30 1.4.1 Citogenética como ferramenta para estudos evolutivos de peixes marinhos ...... 31 2 OBJETIVOS ...... 34 2.1 Objetivos Geral ...... 34 2.2 Objetivos Específicos ...... 34 3 MATERIAL E MÉTODOS ...... 35 3.1 Material ...... 35 3. 2 Métodos ...... 38 3.2.1 Obtenção de cromossomos mitóticos ...... 38 3.2.2 Análises cromossômicas e montagem do cariótipo...... 38 3.2.3 Detecção de regiões organizadoras de nucléolos ...... 39 3.2.4 Detecção de heterocromatina constitutiva ...... 39 3.2.5 Dupla coloração com fluorocromos base-específicos ...... 39 3.2.6 Hibridização in situ fluorescente (FISH) ...... 40 3.2.6.1 Obtenção de sondas para hibridização ...... 40 3.2.6.2 Hibridização in situ fluorescente ...... 40 5. CAPÍTULOS ...... 42 5.1 Capítulo I ...... 42 Diversificação do DNAhis H2B-H2A, H3 e DNAr em Acanthurus (Acanthuridae): padrões biogeográficos e evidências de limitada variação cariotípica interpopulacional no Atlântico ...... 42 Resumo ...... 42
Abstract ...... 43 Introdução ...... 44 Material e Métodos ...... 46 Obtenção de sondas para hibridização ...... 47 Hibridização in situ fluorescente (FISH) ...... 47 Resultados ...... 48 Discussão ...... 52 Aspectos filogenéticos, biogeográficos e carioevolutivos do gênero Acanthurus ...... 55 Agradecimentos ...... 58 Referências Bibliográficas ...... 59 5.2 Capítulo II ...... 65 Dinâmica evolutiva de DNAs repetitivos na família Holocentridae (Holocentriformes) ...... 65 Resumo ...... 65 Abstract ...... 66 Introdução ...... 67 Materiais e Métodos ...... 68 Resultados ...... 70 Discussão ...... 74
Organização dos elementos Rex3, Tol2 e repetições microssatélites (GA)15 . 75 Homeostase citogenética populacional em H. adscensionis e M. jacobus no Atlântico Ocidental ...... 78 Conclusões ...... 80 Agradecimentos ...... 80 Referências Bibliográficas ...... 81 6 CONCLUSÕES GERAIS ...... 89 4 REFERÊNCIAS GERAIS ...... 90
RESUMO
As famílias Acanthuridae e Holocentridae constituem grupos de peixes marinhos com alta representatividade em recifes de corais, onde desempenham importantes funções ecológicas no equilíbrio ambiental. Aspectos biológicos, filogeográficos e taxonômicos destas famílias são amplamente conhecidos, contudo, seus aspectos citogenéticos são incipientes. Com vistas a ampliar o conhecimento acerca da evolução cariotípica e possíveis variações citogenéticas interpopulacionais foram analisadas quatro espécies de Acanthuridae (A. coeruleus, A. bahianus e A. chirurgus – Atlântico Ocidental; e Acanthurus triostegus - Índico) e três espécies de Holocentridae (Myripristis jacobus, Holocentrus adscensionis – Atlântico Ocidental; e Sargocentron rubrum – Índico). As análises utilizaram técnicas citogenéticas convencionais, coloração com fluorocromos base-específicos e mapeamento de sequências repetitivas DNAr 18S, DNAr 5S, histonas H3 e H2B-H2A, microssatélites
(GA)15, transposons Tol2 e retrotransposon Rex3, através da hibridação fluorescente in situ. Entre os Acanthuridae, A. triostegus apresentou um padrão cariotípico considerado basal para Percomorpha (2n=48; NF=48), enquanto as espécies do Atlântico Ocidental exibiram uma divergência cariotípica sequencial associada à divergência filogenética. Variação interpopulacional de sítios DNAr 18S foi identificada entre populações de A. coeruleus do Atlântico Ocidental e do Caribe. O mapeamento de sítios DNAr 18S, DNAr 5S, DNAhis H2B-H2A e H3 mostraram padrões microestruturais no gênero Acanthurus. As espécies de holocentrídeos M. jacobus e S. rubrum apresentaram 2n=48 cromossomos acrocêntricos, enquanto H. adscensionis, 2n=50 (2m+6sm+16st+26a). Neste grupo os sítios DNAr 18S e 5S constituem marcadores citotaxonômicos discriminantes, onde elementos Rex e repetições microssatélites (GA)15 se mostraram co-localizados. Apesar das amplas distâncias geográficas não foram evidenciadas variações interpopulacionais em M. jacobus e H. adscensionis. Os resultados obtidos, indicaram uma evolução horotélica e mais diversificada nas espécies de Acanthurus do Atlântico, com diversificação mais recente, em relação a A. triostegus, pertencente ao Indo-Pacífico, centro de origem deste grupo. Enquanto a presença de cariótipos 2n=48a em espécies de Holocentrinae (Sargocentron) e Myripristinae (Myripristis), destaca o compartilhamento de uma condição conservada em Percomorpha e sugere uma condição ancestral para a Holocentriformes. Ambos os grupos revelam divergências
filogenéticas, mas também a manutenção de homeologias cromossômicas, e eventuais indícios de variação populacional (A. coeruleus), destacando a importância das análises citogenômicas correlacionadas aos padrões biogeográficos na compreensão das mudanças cariotípicas em grupos marinhos.
Palavras-chave: Evolução cariotípica, Citogenética populacional, DNAr, FISH, Rex3, Tol2, Histonas.
ABSTRACT
The families Acanthuridae and Holocentridae are groups of marine fish with high representation in coral reefs, where they play important ecological functions in environmental balance. Biological, phylogeographic and taxonomic aspects of these families are widely known, however, their cytogenetic aspects are incipient. In order to increase the knowledge about karyotypic evolution and possible interpopulation cytogenetic variations, four species of Acanthuridae (A. coeruleus, A. bahianus and A. chirurgus - Western Atlantic; and Acanthurus triostegus - Indian) and three Holocentridae species were analyzed. (Myripristis jacobus, Holocentrus adscensionis - West Atlantic; and Sargocentron rubrum – Indian Ocean). The analyzes used conventional cytogenetic techniques, base-specific fluorochrome staining and repetitive sequence mapping of 18S rDNA, 5S rDNA, histones H3 and H2B-H2A, microsatellites (GA)15, Tol2 transposons and Rex3 retrotransposon through fluorescent in situ hybridization. Between Acanthuridae, A. triostegus showed a karyotypic pattern considered basal for Percomorpha (2n = 48; NF = 48), while West Atlantic species exhibited a sequential karyotypic divergence associated with phylogenetic divergence. Interpopulation variation of 18S rDNA sites was identified between A. coeruleus populations of the Western Atlantic and Caribbean. The mapping of 18S rDNA, 5S rDNA, DNAhis H2B-H2A and H3 sites showed microstructural patterns in the Acanthurus genus. Holocentric species M. jacobus and S. rubrum presented 2n = 48 acrocentric chromosomes, while H. adscensionis, 2n = 50 (2m + 6sm + 16st + 26a). In this group the 18S and 5S rDNA sites constitute discriminating cytotaxonomic markers, where Rex elements and microsatellite repeats
(GA)15 were co-located. Despite the wide geographical distances, no interpopulation variations were observed in M. jacobus and H. adscensionis. The results indicated a more diverse horotelic evolution in Atlantic Acanthurus species, with latest diversification, in relation to A. triostegus, belonging to the Indo-Pacific, center of origin of this group. While the presence of 2n = 48a karyotypes in Holocentrinae (Sargocentron) and Myripristinae (Myripristis) species, highlights the sharing of a conserved condition in Percomorpha and suggests an ancestral condition for the Holocentriformes. Both groups reveal phylogenetic divergences, but also the maintenance of chromosomal homeologies, and possible signs of population variation
(A. coeruleus), highlighting the importance of cytogenomic analyzes correlated with biogeographic patterns in understanding karyotypic changes in marine groups.
Keywords: Karyotypic evolution, Population cytogenetics, rDNA, FISH, Rex3, Tol2, Histones. 17
1 INTRODUÇÃO
Os recifes de corais são ecossistemas marinhos com expressiva biodiversidade e importância ecológica. Sua complexidade física condiciona os aspectos biológicos dos organismos que nele vivem (FRANCINI-FILHO et al., 2018), destacadamente os peixes, cuja diversificada fauna contribui para sua evolução e equilíbrio físico e biológico da comunidade associada (BELLWOOD & WAINWRIGHT, 2002; FLOETER et al., 2008). Em geral os peixes recifais são relativamente sedentários durante a fase adulta, onde a dispersão dentro da área de distribuição fica, geralmente, a cargo do potencial dispersivo dos ovos, larvas, da ação das correntes oceânicas (LEIS, 1991; VICTOR, 1991; LEIS & MCCORMICK, 2002), além de estar associada à peculiaridades biológicas de assentamento, disponibilidade e continuidade de habitats e barreiras biogeográficas (ROCHA et al., 2002; BOWEN et al., 2006). Estas características aliadas à intricada relação de dependência com os ambientes de corais, os habilitam como adequados modelos genéticos para estudos biogeográficos e evolutivos (ROCHA, 2003; CHOAT et al., 2006; ROCHA et al., 2007; ROCHA & BOWEN, 2008). Entre os muitos grupos de peixes recifais estão as famílias Acanthuridae (peixes-cirurgiões) e Holocentridae (peixes-soldados ou peixes-esquilos), dois grupos particularmente representativos destes ambientes devido a sua extensa distribuição, diversidade de espécies, abundância e padrões morfológicos (FLOETER et al., 2008; DORNBURG et al., 2014). Estes grupos têm ensejado variado número de investigações quanto aos seus padrões genéticos (BOWEN et al., 2006, OTWOMA et al., 2018), mas estudos ainda incipientes sobre seus aspectos citogenômicos.
1.1 Aspectos da biologia e ecologia da família Acanthuridae
A família Acanthuridae, cujas espécies são conhecidas como peixes-cirurgiões, representa um carismático grupo de peixes encontrados em ambientes de recifes. São exclusivamente marinhos e de distribuição circuntropical (NELSON et al., 2016). Os peixes-cirurgiões sofrem mudanças ontogenéticas que se refletem tanto em alterações na preferência por tipos de habitats (ROCHA et al., 2002), quanto no tipo de dieta. De fato, enquanto suas larvas são planctônicas e alimentação baseada 18
em zooplâncton, em geral, os juvenis e adultos são demersais e herbívoros (CHOAT et al., 2004). Em sua trajetória de desenvolvimento apresentam ampla variação interespecífica quanto à coloração do corpo, bem como na interação social com outras famílias de peixes de recifais (ALWANY et al., 2005). Neste sentido, os representantes deste grupo apresentam relevante papel ecológico e evolutivo nas comunidades de recifes tropicais, agindo como agente físico na escavação do substrato (bioerosão) e sua sedimentação intensiva (KRONE et al., 2011), bem como agente biológico influenciando na composição, abundância e padrão de distribuição de algas (herbivoria) e comunidades associadas (CHOAT et al., 2004; KRONE et al., 2011 ). Apresentam como estratégia reprodutiva a formação de grandes agregações de desova, que podem ocorrer durante todo o ano em algumas espécies (THRESHER, 1984). Produzem ovos pelágicos que eclodem após cerca de um dia, seguindo um período pelágico larval longo (51 até 75 dias), que lhes conferem elevada capacidade de dispersão (LEIS, 1991) e podem influenciar nos seus padrões genéticos (ROCHA et al., 2002).
1.1.2 Relações filogenéticas e taxonômicas da família Acanthuridae
Apenas recentemente a família Acanthuridae foi realocada da Ordem Perciformes e erigida como Ordem Acanthuriformes, após reavaliação do diversificado e complexo grupo Percomorpha, através de acuradas análises moleculares (NEAR et al., 2012; BETANCUR-R. et al., 2013). Acanthuridae constitui um grupo monofilético, relativamente antigo, com cerca de 54 milhões anos (Eoceno Médio), cuja origem provável ocorreu no Indo-Pacífico (RANDALL, 2011; SORENSON et al., 2013). Suas relações filogenéticas são bem definidas, tanto por avaliações morfológicas (TYLER et al., 1989; WINTERBOTTOM, 1993; GUIASU & WINTERBOTTOM, 1993), quanto moleculares (KLANTEN et al., 2004; SORENSON et al., 2013). Morfologicamente possui como autapomorfia compartilhada a presença de um espinho móvel lateral, semelhante a um bisturi, localizado em ambos os lados do pedúnculo caudal, do qual deriva o nome da família (akantha = espinho), utilizado em comportamentos de defesa inter e intraespecíficos (RANDALL, 2001). 19
A ordem Acanthuriforme subdivide-se nas subordens Sciaenoidei (15 famílias) e Acanthuroidei (3 famílias), na qual nesta última se insere a família Acanthuridae, formada por 86 espécies (ESCHMEYER et al., 2019), distribuídas nas subfamílias Nasinae (gênero Naso) e Acanthurinae (gêneros Paracanthurus, Prionurus, Zebrasoma, Acanthurus e Ctenochaetus) (NELSON et al., 2016). A subfamília Nasinae (peixes unicórnios), restrito ao Indo-Pacífico, é caracterizada por uma protuberância na região frontal da cabeça em algumas espécies. Em geral apresenta 2 espinhos anais, 3 raios pélvicos moles e, no lugar do espinho móvel, 1 a 2 placas dérmicas fixas no pedúnculo caudal (NELSON et al., 2016). A subfamília Acanthurinae, possui a maioria das espécies distribuídas no Indo- Pacífico, com apenas representantes do gênero Acanthurus no Oceano Atlântico (RANDALL, 2001). Quanto aos padrões corporais, apresenta 3 espinhos anais e 1 ou mais espinhos móveis no pedúnculo caudal. Esta subfamília se divide nas tribos Prionurini (gênero Prionurus), tribo Zebrasomini (Paracanthurus e Zebrasoma) e tribo Acanthurini (Acanthurus e Ctenochaetus) (RANDALL & CLEMENTS, 2001; HUBERT et al., 2010). Os gêneros de Acanthuridae têm uma divergência antiga, com pelo menos três intensos episódios de diversificação. O primeiro ocorreu no final do Paleoceno/início do Eoceno, seguido por uma radiação dramática no Médio Eoceno (50 M.a.) e um último evento durante o Mioceno (30 M.a.), que representa a radiacão da maioria dos acanthurídeos atuais (SORENSON et al., 2013).
1.1.2.1 O gênero Acanthurus
Acanthurus é um grupo parafilético, com divergência no Mioceno Inferior (21 M.a.), cujos dois principais subclados diversificaram-se a cerca de 19 M.a. (SORENSON et al., 2013). É representado por 40 espécies, das quais 36 são endêmicas do Indo-Pacífico, centro de origem e dispersão do grupo (RANDALL et al., 2011). Dentre as cinco espécies que ocorrem no Atlântico, Acanthurus coeruleus Bloch & SCHNEIDER, 1801, Acanthurus chirurgus (Bloch, 1787), Acanthurus bahianus Castelnau, 1855 (Atlântico Ocidental), Acanthurus monroviae Steindachner, 1876 (Atlântico Oriental) e Acanthurus tractus Poey, 1860 (Caribe), as três primeiras espécies são extremamente abundantes e encontradas em condição de simpatria 20
desde o Caribe, ao litoral sul do Brasil e ilhas associadas (BERNAL & ROCHA, 2011; HORTA & GONÇALVES, 2013). Acanthurus coeruleus, ou cirurgião-azul, representa o grupo mais basal dentre as espécies do Atlântico, cuja origem é estimada em 19 M.a. (SORENSON et al., 2013). Quando juvenil, a coloração do seu corpo é amarela, passando gradativamente ao azul violáceo, com linhas estreitas e escuras no flanco, na fase adulta; durante o período reprodutivo, os machos podem adquirir um padrão bicolor, mais escuro na porção anterior e mais claro na porção posterior do corpo (ARAÚJOet al., 2004). Com um comportamento territorialista (BELL-KRAMER, 2000), onde explora hábitats em profundidades de até 60 metros (ROCHA et al., 2002), a espécie é herbívora, com estômago de parede finas adaptados à degradação de celulose (LOBEL, 1981). Além da COSTA do Atlântico Ocidental ocorre também na ilha de Santa Helena, na região meso-Atlântica (BROWN et al., 2019). Acanthurus chirurgus, conhecida como barbeiro-preto, tem sua origem estimada em 5 M.a. (SORENSON et al., 2013). É a espécie mais generalista dentre os acanthurídeos do Atlântico, onde apresenta preferência por recifes rasos, embora suporte variados graus de salinidade e turbidez da água (ROCHA et al., 2002). Seu corpo é acinzentado, com 10 barras verticais escuras e pedúnculo caudal mais claro que o restante do corpo (ARAÚJO et al., 2004). Quando adultos apresentam hábito alimentar semi-detritívoro, com estômago de paredes espessas que auxilia ativamente na trituração de algas (FRANCINI-FILHO et al., 2010). Acanthurus bahianus, ou indiscriminadamente “cirurgião”, é considerada espécie-irmã de A. tractus, cuja divergência de A. chirurgus data de aproximadamente 5 M.a. (SORENSON et al., 2013). Esta espécie é morfologicamente similar a A. chirurgus, embora seus padrões corporais possam ser distintos pela ausência de barras verticais nos flancos e presença de nadadeira caudal lunada (ARAÚJO et al., 2004). Sua distribuição engloba a área do grande Caribe, costa brasileira e ilhas associadas (Arquipélago de Fernando de Noronha, Atol das Rocas e Ilha de Trindade), e no Atlântico Sul e Central (Ilhas de Ascensão e Santa Helena) (BERNAL & ROCHA, 2011). Possui hábito alimentar semi-detritívoro (FRANCINI-FILHO et al., 2010) e habitam recifes rasos de até 25 metros, mostrando-se ecologicamente restrita (ROCHA et al., 2002). 21
Entre os representantes do gênero Acanthurus no Indo-Pacífico, Acanthurus triostegus (Linnaeus, 1758), ou cirurgião de cinco listras, apresenta uma ampla distribuição nos recifes desta região oceânica (OTWOMA et al., 2018). Constitui uma das espécies mais basais dentro do gênero, com origem estimada em cerca de 21 M.a., período coincidente à divergência do gênero (SORENSON et al., 2013). A coloração de juvenis e adultos é muito característica, consistindo de barras verticais pretas em um corpo esbranquiçado (FRÉDÉRICH et al., 2012). Quando adultos são caracterizados como herbívoros, formando grandes agregações de indivíduos que forrageiam predominantemente algas filamentosas (RANDALL, 1961).
1.2 Aspectos da biologia e ecologia da família Holocentridae
As espécies da família Holocentridae são conhecidas popularmente como mariquitas ou peixes-soldado, constituindo uma das mais representativas das comunidades de peixes recifais (DORNBURG et al., 2014). Apresentam distribuição cincunglobal em habitats marinhos tropicais e temperados (NELSON et al., 2016). Geralmente ocupam poças de maré, recifes de coral e fundos rochosos em águas rasas que se estendem até 100 metros de profundidade, com algumas espécies chegando a alcançar mais de 200 metros de profundidade (DORNBURG et al., 2012). Carnívoros noturnos (ROCHA & ROSA 2001) atuam como eficientes predadores de crustáceos bentônicos e peixes juvenis (BEETS, 1997). Os juvenis formam cardumes, enquanto os adultos se mostram mais isolados em territórios bem estabelecidos (CARVALHO-FILHO, 1999).
1.2.1 Taxonomia e filogenia de Holocentridae
Holocentridae constitui um grupo monofilético antigo, com irradiação ocorrida há cerca de 93 M.a. (BELLWOOD, 1996). Reavaliações filogenéticas atuais em Percomorpha têm realocado a família Holocentridae, como ordem, Holocentriformes (NEAR et al., 2012; BETANCUR-R. et al., 2013). O monofiletismo do grupo é bem estabelecido por dados moleculares (DORNBURG et al., 2012) e pela presença de conspícuas apomorfias morfológicas, representadas pelo osso orbitoesfenoide e a presença de cinco raios nas nadadeiras pélvicas (BONECKER et al., 2014). 22
O grupo teve sua origem no Indo-Pacífico (BELLWOOD, 1996), divergindo há 50 M.a. em dois ramos filéticos, representados pelas subfamílias, Holocentrinae e Myripristinae (BONECKER et al., 2014). A família Holocentridae é composta por 90 espécies, distribuídas em 8 gêneros, Myripristis, Corniger, Ostichthys, Plectrypops e Pristilepis (Myripristinae) e Holocentrus, Neoniphon e Sargocentron (Holocentrinae) (DORNBURG et al., 2012). As relações taxonômicas e evolutivas dentro da família Holocentridae vêm sendo melhor conhecidas. A filogenia mais recente estabeleceu o monofiletismo de Holocentrinae e Myripristinae; o parafiletismo dos gêneros Neoniphon e Sargocentron e estabeleceu Holocentrus (endêmico do Atlântico) como grupo irmão de Sargocentron e Neoniphon (DORNBURG et al., 2012) A partir da origem das linhagens de Holocentridae nas regiões do Índico Ocidental e Indo-Pacífico, sugere-se que a colonização do Atlântico se deu preferencialmente através do Mar de Tétis, ao invés do oceano Índico Ocidental (DORNBURG et al., 2014), como ocorrido em muitos outros grupos de peixes (FLOETER et al., 2008). A exceção de Myripristis jacobus, que representa o único exemplo de dispersão via Índico (DORNBURG et al., 2014). Após fechamento da bacia do Mar de Tétis, durante o Mioceno, os holocentrídeos passaram por um isolamento global com linhagens no Índico Ocidental, bacias do Indo-Pacífico e do Atlântico e Pacífico Oriental, padrão semelhante aos padrões contemporâneos de distribuição geográfica do grupo (DORNBURG et al., 2014). Entre as duas subfamílias estabelecidas, Holocentrinae se caracteriza por apresentar um grande espinho no pré-opérculo (algumas espécies possuem toxina está associada a esse espinho); espinho anal longo geralmente de comprimento maior ou igual ao espinho dorsal mais longo; nadadeira anal com 7 a 10 raios moles e bexiga natatória tubular alongada por todo o comprimento do corpo (NELSON et al., 2016). Myripristinae, por outro lado, não apresenta espinho pré-opercular (exceto Corniger spinosus) (WOODS & SONODA, 1973); apresenta espinho anal longo, mas geralmente mais curto que o maior espinho dorsal; nadadeira anal com 10 a 16 raios moles e bexiga natatória com uma constrição em sua região anterior criando duas câmaras distintas que se ligam ao crânio (NELSON et al., 2016). As duas subfamílias também diferem quanto à morfologia de suas larvas. Em Holocentrinae estas possuem um espinho rostral simples na nadadeira pélvica, 23
enquanto em Myripristinae apresentam espinho rostral bifurcado (LUCZKOVICH & KEUSENKOTHEN, 2007). A diversidade de espécies de Holocentridae é heterogênea entre as regiões biogeográficas. Os oceanos Índico e Pacífico abrigam 91% (82 spp.) das espécies da família, enquanto as demais (8 spp) ocorrem no Atlântico (DORNBURG et al., 2014). Algumas espécies apresentam características biogeográficas e biológicas que capacitam como modelos biológicos para estudos citogenéticos. No Atlântico, as espécies Holocentrus adscensionis (Osbeck, 1765) e Myripristis jacobus Cuvier, 1829, ocorrem em praticamente todas as regiões do Atlântico Ocidental (Caribe ao litoral brasileiro), bem como em regiões Meso-Atlânticas e regiões insulares adjacentes (Atol das Rocas, Arquipélagos de Fernando de Noronha (AFN) e São Pedro e São Paulo (ASPSP), e ilhas de Santa Helena, Ascensão e Trindade) (BRIGGS, 1995; BOWEN et al., 2006; DORNBURG et al., 2012), apresentando um excelente modelo para análises de diversificação populacional. Myripristis jacobus (Myripristinae) é o único representante do gênero no Atlântico (RANDALL & GREENFIELD, 1996). A espécie apresenta um corpo alto, comprimido lateralmente, com coloração vermelha e região ventral prateada com uma barra vertical marrom, que corre ao longo da abertura das brânquias e segue até a nadadeira peitoral. A nadadeira dorsal possui espinhos e marcas vermelhas e brancas, com os lobos das nadadeiras caudal, dorsal e anal macios e pontudos, e espinhos pré-operculares não proeminentes (ROBINS & RAY, 1986). Apresenta extenso período pelágico larval (PPL) que pode variar de 40-58 dias e dieta pelágica, constituída por zooplâncton (TYLER et al., 1993; ROBERTSON et al., 2004). Holocentrus adscensionis (Holocentrinae), endêmica do Atlântico, possui corpo fusiforme vermelho, com partes espinhosas e macias da nadadeira dorsal na cor vermelha ou translúcida, e espinho pré-occiptal desenvolvido (ROBINS & RAY, 1986). Carnívora, sua alimentação é bêntica, composta principalmente por crustáceos (ROBERTSON et al., 2004). Essa espécie possui um estágio juvenil adicional, que lhes confere um PPL de 43-71 dias, relativamente maior que M. jacobus (TYLER et al., 1993; BOWEN et al., 2006). Sargocentron rubrum (Forsskål, 1775) (Holocentrinae), com ocorrência no Indo-Pacífico, é menos associada a habitats de recifes de coral que outros holocentrídeos ocupando áreas mais profundas que vão de 1 a 84 m (GOLANI & BEN- 24
TUVIA 1985; ALLEN & ERDMANN, 2012). Caracteristicamente, possui alta capacidade migratória e de adaptação a novos habitats (FARRAG et al., 2018). Sua vasta distribuição abrange a costa leste africana, Mediterrâneo, Mar Vermelho, Índia, Sri Lanka e ilhas Andaman, leste de Vanuatu e Nova Caledônia, alcançando a costa do Japão e Austrália (GREENFIELD et al., 2017). Esta espécie apresenta um corpo com comprimento máximo de 32 cm, com listras sutis variando do vermelho, branco ao prateado, nadadeira dorsal espinhosa vermelho-escura com uma grande mancha quadrangular esbranquiçada no meio de cada membrana e espinho pré-opercular (RANDALL, 1998). Sua alimentação é bento/pelágica constituída principalmente por caranguejos bentônicos, camarões e pequenos peixes (GÖTHEL, 1992).
1.3 Barreiras biogeográficas marinhas e biodiversidade associada
Diferentemente do ambiente continental em que eventos vicariantes são em grande parte preponderantes na especiação dos organismos aquáticos, no ambiente marinho as barreiras geográficas podem eventualmente funcionar como filtros biogeográficos (TOONEN et al., 2016). Desta forma, os padrões de diversificação e especiação neste ambiente resultam da complexa interação entre aspectos intrínsecos à espécie, como comportamento e ecologia, bem como fatores climáticos, oceanográficos e tectônicos (ROCHA & BOWEN, 2008; FLOETER et al., 2008). A presença de barreiras biogeográficas em algumas regiões é determinante na configuração das províncias biogeográficas (ROCHA et al., 2005; FLOETER et al., 2008; Luiz et al., 2011), que representam regiões estabelecidas quanto as taxas de endemismos (BRIGGS, 1995). A Província Brasileira está compreendida entre os deltas dos rios Orinoco e Amazonas e o Estado de Santa Catarina (STRAMMA, 1989), englobando além dos recifes costeiros, o atol das Rocas, os arquipélagos de São Pedro e São Paulo e Fernando de Noronha e o de Trindade e Martin Vaz, mais ao sul (BRIGGS, 1995). Entre os ambientes insulares Atlânticos, o Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), situado na região Meso-Atlântica e próximo a linha do Equador, representa uma das áreas de recifes mais remotas do Atlântico (FERREIRA et al., 2004). Está localizado a cerca de 1100 km, da costa nordeste do Brasil e a 1.824 km 25
da costa africana, sendo igualmente influenciado pela Corrente Sul Equatorial (leste- oeste) e a Contracorrente Sul-Equatorial que atuam no AFN e da Corrente Equatorial Submersa (CES) (CARVALHO, 2000; FERREIRA et al., 2004). Em termos faunísticos, o ASPSP apresenta baixa diversidade e alto endemismo, quando comparado com as demais regiões insulares do Atlântico, com maior semelhança com o conjunto de espécies da Província do Atlântico Ocidental, embora também compartilhe espécies com a Província do Atlântico Oriental (FEITOZA et al., 2003; FLOETER et al., 2008; CARVALHO-FILHO et al., 2016). A uma distância de cerca de 350 km da costa nordeste do Brasil situa-se o Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN). Essas ilhas, em conjunto com o Atol das Rocas, representam partes emersas da cadeia submarina de Fernando de Noronha (ALMEIDA, 2006), sofre interferência da Corrente Sul Equatorial (leste-oeste) e a Contracorrente Sul-Equatorial na direção oposta, e, devido à sua proximidade com a COSTA, sofre ainda a influência da Corrente do Brasil (TRAVASSOS & HAZIN, 1999). Mais ao sul do litoral brasileiro (região Sudeste), a 1.140 km da linha de costa, situa-se o Arquipélago de Trindade e Martin Vaz, que mesmo com um conjunto espécies endêmicas, apresenta marcante similaridade com as assembleias de peixes dos habitats costeiros (FLOETER et al., 2008; KRAJEWSKI & FLOETER, 2011). Essa conectividade é possivelmente devida a sua localização sobre a cadeia submarina Vitória -Trindade, que conecta estas ilhas ao continente (GASPARINI & FLOETER, 2001). De maneira geral, a diversidade de peixes recifais em toda Provincia Brasileira apresenta certa homogeneidade e sua distribuição resulta de fatores históricos, como alterações nos níveis do mar (períodos de glaciação) (LEÃO et al., 1988; BRIGGS, 1995) e ação da barreira do Amazonas e outras barreiras biogeográficas (FLOETER et al., 2008). A Provincia do Caribe compreende recifes que se alongam desde as Bermudas e Flórida, até a região costeira do nordeste da América do Sul (Barreira Orinoco- Amazonas), e do Golfo do México até as ilhas de Dominica e Barbados (no sentido leste-oeste) (BRIGGS, 1995). Partilha um maior conjunto de espécies com o Atlântico Sul do que com outras regiões biogeográficas e apresenta maior riqueza de espécies e altas taxas de endemismo (FLOETER et al., 2008). 26
Comparações faunísticas entre os oceanos Atlântico, Índico e Pacífico, revelam que a região do Indo-Pacífico é significativamente mais diversificada e com maiores taxas de endemismo de peixes de corais (PAULAY, 1997; BELLWOOD & WAINWRIGHT, 2002; FLOETER et al., 2008). Contudo, em termos de biodiversidade, o mar do Caribe (Atlântico) e o Triângulo dos Corais, também conhecido como Arquipélago Indo-Australiano ou Triângulo Indo-Malaio (Indo-Pacífico) se destacam como centros de especiação e dispersão de novas espécies (LOHMAN et al., 2011; BOWEN et al., 2013). As discrepâncias na diversidade de espécies de peixes nas regiões marinhas são resultantes da ação conjunta das alterações climáticas e das mudanças geológicas específicas de cada oceano (JOHNSON et al., 2007; LOHMAN et al., 2011; LEIGH et al., 2014; O’DEA et al., 2016). De fato, o Arquipélago Indo-Australiano (AIA), que conecta os Oceanos Índico e Pacífico, é resultante de uma complexa história geológica marcada pela intensa movimentação de placas tectônicas ocorridas principalmente entre o Paleoceno (65 M.a.) e o Mioceno tardio (10 M.a.). Eventos como vulcanismo, formação de ilhas, elevação e submersão de pontes de terra, mudanças nos padrões de correntes marinhas, redução dos níveis dos mares (devido as eras glaciais), moldaram a biodiversidade e as altas taxas de endêmismo existentes atualmente no AIA (LOHMAN et al., 2011; BOWEN et al., 2013). O Atlântico, que abriga regiões com faunas diversificadas e empobrecidas, está subdividido em um conjunto de províncias biogeográficas constituídas pelo Grande Caribe, Brasileira, Meso-Atlântica e do Atlântico Ocidental (BRIGGS, 1995). Estas regiões têm como limites geográficos a ponte de terra sobre o Mar Vermelho (continente Europeu), Istmo do Panamá (América Central), atuando de forma efetiva, enquanto a corrente de Benguela (Atlântico Sul), a Cordilheira Meso-Atlântica, e Barreira do Amazonas (América do Sul) se apresentam como barreiras permeáveis para parte da fauna de peixes, propiciando eventos de especiação alopátrica e parapátrica (FLOETER et al., 2008). Historicamente, o fechamento do Antigo Mar de Tétis, ocorrido entre 11-18 M.a., teve papel importante na evolução dos padrões modernos de biodiversidade marinha tropical (FLOETER et al. 2008; COWMAN & BELLWOOD, 2011), sobretudo entre as faunas, a partir daí isoladas, do Indo-Pacífico e Atlântico (BELLWOOD & WAINWRIGHT, 2002). Outra ação modeladora da fauna Atlântica ocorre no 27
hemisfério sul, através do sistema de Benguela (2 M.a.), que consiste em uma corrente de água fria que flui do sul da África do Sul em direção ao norte do Atlântico, promove isolamento contemporâneo e historicamente, nos períodos interglaciais, das faunas do Indo-Pacífico e Atântico Ocidental (MARLOW et al., 2000). A própria extensão do Atlântico, com cerca de 3.500 km, também atua isolando populações, pela incapacidade de transpor grandes distâncias oceânicas. Esses espaços interoceânicos limita as províncias do Caribe e Brasil (oeste), da região Meso-Atlântica (centro) e Atlântico Oriental (leste) (BRIGGS, 1995). No Meso- Atlântico as extensas lacunas oceânicas, isolam regiões insulares como o Arquipélago de São Pedro e São Paulo e as ilhas de Ascensão e Santa Helena (FLOETER et al. 2008). Adicionalmente a barreira do Amazonas, uma formidável pluma de água doce com sedimentos que se estendem por 2.300 km ao longo da costa nordeste da América do Sul (MOURA et al., 2016), formada pelo fluxo dos rios Amazonas (Brasil) e Orinoco (Venezuela), estabelece os limites de distribuição de espécies marinhas entre as províncias biogeográficas Brasileira e do Grande Caribe (FLOETER & GASPARINI, 2000; ROCHA, 2003; ROBERTSON et al. 2006). Essa barreira é datada de aproximadamente 10 M.a. (HOORN et al., 1995). Seu surgimento ocorreu a partir da conexão dos rios Amazonas e o Orinoco (Paleo- Orinoco-Amazonas), no Oligoceno tardio e Mioceno, em decorrência do soerguimento dos Andes, gerando a alteração na orientação do fluxo das águas do rio Orinoco para o Caribe e do rio Amazonas para o Atlântico (MORA et al., 2011). Sua ação sobre a fauna de peixes é complexa, tendo em vista que adicionalmente na área de influência dos rios Amazonas e Orinoco existe um grande sistema de recifes de corais que se estende até 220m de profundidade, cobrindo uma área de aproximadamente 56.000 km2 (FRANCINI-FILHO et al., 2018). Esta região atua como ecótono entre as duas províncias, promovendo uma clara sobreposição faunística e possível corredor ecológico (FLOETER et al., 2008; ROCHA et al., 2008; CASTELLANOS-GELL et al., 2012). Diante disso, a barreira do Amazonas continua sendo área de interesse biológico, tendo em vista ações diferenciais e ainda pouco compreendidas entre as faunas Caribenhas e do Brasil.
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1.3.1 Biogeografia dos grupos Acanthuridae e Holocentridae
Padrões filogeográficos entre populações das espécies de Acanthurus do Caribe e do Atlântico Sul, têm revelado uma marcada estruturação genética populacional em A. bahianus, uma pequena estruturação em A. coeruleus, enquanto que as populações de A. chirurgus destas regiões exibem homogeneidade genética (ROCHA et al., 2002). Esses diferentes níveis de divergência genética têm sido associados aos efeitos impostos pelo deságue de água doce dos rios Amazonas- Orinoco e especificidades ecológicos por habitats nos indivíduos adultos destas espécies (ROCHA et al., 2002; CASTELLANOS-GELL et al., 2012). Linhagens do Atlântico Sul e do Caribe inicialmente consideradas como A. bahianus, revelaram-se divergentes, com as formas caribenha sendo identificadas com a espécie A. tractus (BERNAL & ROCHA, 2011). Entretanto, mais recentemente foram identificados indivíduos de A. bahianus do Atlântico Sul na região do Caribe, indicando alguma capacidade em transpor a barreira do Amazonas (CASTELLANOS- GELL et al., 2012). Tal condição pode estar relacionada condições de dispersão esporádica de larvas devido a flutuações ambientais que alteram na efetividade da barreira (LESSIOS & ROBERTSON, 2006; FLOETER et al., 2008). Padrões dispersivos em peixes recifais podem estar relacionados a duração do Período Pelágico Larval (PPL) (LEIS, 1991; VICTOR, 1991). Contudo, esta não é a condição definitiva para a manutenção do fluxo gênico interpopulacional ou distribuição das espécies, uma vez que características biológicas e ecológicas, específicas para cada espécie, e agentes físicos, como correntes marinhas e barreiras geográficas podem interferir muito fortemente sobre a estruturação populacional (ROCHA et al., 2002; CARLIN et al., 2003; ROCHA et al., 2005; BOWEN et al., 2006). O PPL proporciona um potencial dispersivo latente, que é modulado por fatores ecológicos e físicos (OTWOMA et al., 2018), e em alguns grupos marinhos demonstra uma correlação inversa com a taxas de fixação de mudanças cromossômicas (MOLINA & GALETTI, 2004). Neste sentido, as espécies de Acanthurus apresentam PPL planctônicos relativamente longos, variando de 42 a 68 dias em A. bahianus, entre 45 a 71 dias, em A. chirurgus, de 46 a 57 dias em A. coeruleus (ROCHA et al., 2002), e aproximadamente 60 dias para A. triostegus (RANDALL, 1961). 29
Aspectos filogeográficos das espécies de Acanthuridae do Indo-Pacífico vem sendo mais extensamente investigados, revelando partições ambientais. A espécie A. triostegus, com ampla distribuição geográfica, apresenta diferentes graus de estruturação populacional entre as regiões biogeográficas dos Oceanos Índico, Pacífico e arquipélago Havaiano, no Pacífico Central (PLANES & FAUVELOT, 2002; MIRAMS et al., 2011; LIGGINS et al., 2016; OTWOMA et al., 2018). Similarmente à Acanthuridae, as espécies de Holocentridae do Atlântico Ocidental apresentam períodos pelágicos larval (PPL) longos, que variam entre 40-58 dias, em M. jacobus e de 43-71 dias, em H. adscensionis (TYLER et al., 1989). Esta última espécie pode apresentar um estágio adicional juvenil bentônico, que promove um incremento de 13 dias em sua fase pelágica (TYLER et al., 1993). Contudo, apesar de possuir um potencial de dispersão maior, H. adscensionis exibe relativa estruturação populacional, entre as regiões oeste, central e leste do Atlântico e entre as regiões do Caribe e do Brasil, ao contrário de M. jacobus que apresenta alta conectividade entre suas populações (BOWEN et al., 2006). O potencial dispersivo atrelado à PPL elevados dos Holocentridae, aparentemente são mediados por aspectos biológicos, como tamanho e comportamento das larvas e estratégias de alimentação que atuam nos padrões de estruturação genética neste grupo (LEIS, 1991; BELLWOOD & FISHER, 2001). Como outros grupos de peixes recifais, os representantes das famílias Acanthuridae e Holocentridae apresentam níveis heterogêneos de conectividade populacional (ROCHA et al., 2002; BOWEN et al., 2006), indicando ainda a necessidade de maiores esforços, sobretudo em espécies do Atlântico, para uma melhor compreensão dos parâmetros interferentes nos seus padrões filogeográficos. Diante das escassas informações sobre o papel das barreiras geográficas do Atlântico na divergência genética das populações de peixes marinhos, comparações populacionais envolvendo grupos como Acanthuridae e Holocentridae, distribuídos em extensos espaços geográficos, se mostram extremamente relevantes como adequados modelos evolutivos. Além disso, análises citogenômicas comparativas com representantes de seus centros de origem no Indo-Pacífico, podem auxiliar na identificação de características conservadas e ritmo de mudanças cariotípicas.
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1.4 Padrões cromossômicos em Acanthuridae e Holocentridae
Apesar da grande diversidade de espécies, os dados cromossômicos das espécies e gêneros de Acanthuridae do Indo-Pacífico são escassos e principalmente baseados em técnicas citogenéticas convencionais, como em A. triostegus (2n=48 a) (ARAI & INOUE, 1976; ARAI, 2011). Sob essas condições tem-se um padrão ainda incipiente e fragmentário das tendências cariotípicas de representantes basais da família. Por outro lado, análises citogenéticas das espécies de Acanthuridae do Atlântico têm possibilitado compreender os processos de divergência cromossômica entre essas espécies (AFFONSO et al., 2014; FERNANDES et al., 2015). De fato, as espécies do gênero Acanthurus presentes ao longo da COSTA brasileira, A. coeruleus (2n=48, 2sm+4st+42a), A. bahianus (2n=36, 12m+2sm+4st+18a) e A. chirurgus (2n=34, 12m+2sm+4st+16a) apresentaram etapas sequenciais de divergência cariótipica decorrente de variados rearranjos cromossômicos, compatíveis com o processo de especiação dessas espécies, com ocorrência entre 19 a 5 milhões de anos (AFFONSO et al., 2014). O reduzido conjunto de espécies do gênero Acanthurus no Atlântico, com uma vasta distribuição geográfica, que inclui áreas divididas por barreiras biogeográficas ou espaços oceânicos, constitui um modelo adequado para estudos citogenéticos interregionais e do grau de divergência cariotípica em espécies marinhas. A família Holocentridae conta com um conjunto de poucos dados citogenéticos. Dentre as 90 espécies conhecidas, apenas 3 espécies (ARAI, 2011) dispõem de alguma informação cariotípica, que em geral advém de análises citogenéticas convencionais. Duas das espécies com dados citogenéticos conhecidos, Holocentrus adscensionis (2n=50, 2m+6sm+16st+26a) e Myripristis jacobus (2n=48a) (BACURAU & MOLINA, 2004), ocorrem no Atlântico, enquanto Sargocentron rubrum (2n=48a) (ARAI & NAGAIWA, 1976), tem vasta ocorrência no Indo-Pacífico. Comparações citogenéticas populacionais de espécies das famílias Acanthuridae e Holocentridae no Atlântico, distribuídas em vastas regiões oceânicas que se estendem do Caribe ao Atlântico Sul (incluindo ambientes insulares e região Meso-Atlântica) são inexistentes. Esses dados aliados a análises da distribuição e dinâmica de sequências de DNAs repetitivos nos cromossomos das espécies são 31
particularmente úteis na compreensão dos seus aspectos carioevolutivos e do papel das barreiras biogeográficas na diversificação cromossômica de populações marinhas.
1.4.1 Citogenética como ferramenta para estudos evolutivos de peixes marinhos
Análises citogenéticas representam uma valiosa ferramenta para caracterização da diversidade e sistemática, uma vez que propicia a identificação de diferenciações populacionais, consolida proposições taxonômicas e auxilia na prospecção de espécies crípticas (MOLINA, et al., 2002; CIOFFI et al., 2009; LIMA- FILHO et al., 2012; AMORIM et al., 2016), além de gerar subsídios para a compreensão da evolução e organização genômica (CIOFFI & BERTOLLO, 2012) Em contraste com os procariotos, organismos eucarióticos possuem uma elevada quantidade de DNAs repetitivos, sequências de tamanhos variados repetidos milhares de vezes no genoma que desempenham importante papel na diferenciação genômica e processos evolutivos (CIOFFI & BERTOLLO, 2012; LÓPEZ-FLORES & GARRIDO-RAMOS, 2012; BISCOTTI et al., 2015; COSTA et al., 2015). O mapeamento destas sequências específicas e variáveis, com participação na evolução cromossômica, auxilia no entendimento de aspectos genéticos e evolutivos das espécies (CIOFFI & BERTOLLO, 2012). Análises de sequências de DNA repetitivos vêm sendo crescentemente utilizadas na citogenética de peixes, auxiliando na compreensão da evolução e organização genômica (FERREIRA et al., 2010), em abordagens biogeográficas e populacionais (VICARI et al., 2005; CIOFFI et al., 2009), detecção homeologias cromossômicas (COSTA et al., 2013, 2016), na identificação da origem e diversificação de cromossomos sexuais e cromossomos B (CIOFFI et al., 2010, 2011), inferências filogenéticas (TEIXEIRA et al., 2009), e na caracterização da biodiversidade (VICARI et al., 2010). DNAs repetitivos são divididos em sequências codificadoras, como genes ribossomais e histônicos, e não codificadoras, cujo conjunto de sequências podem estar dispersas no genoma, como por exemplo os elementos transponíveis (transposons e retrotransposons), ou, se dispostas em tandem como os DNAs satélites, minissatélites e microssatélites (NAGODA et al., 2005). 32
As famílias multigênicas das histonas e DNAr são constituídas de sequências de DNA repetidas em tandem e organizadas em clusters. As histonas, desempenham papel fundamental na organização estrutural da cromatina, além de atuar na regulação da expressão gênica em eucariotos (DESJARLAIS & TUMMINO, 2016; TYAGI et al., 2016). Por estarem organizadas em clusters, suas sequências apresentam padrões insuspeitos de diversificação nos cromossomos, constituindo um registro das mudanças ocorridas no genoma dos peixes (NAGODA et al., 2005; HASHIMOTO et al., 2011; LIMA-FILHO et al., 2012; COSTA et al., 2014; 2016; BORGES et al., 2019). O segundo tipo de DNAs repetitivos são os não codificadores dispersos no genoma, como os elementos transponíveis (TEs) (transposons e retrotransposons) (NAGODA et al., 2005). Os TEs têm a capacidade de alterar sua posição dentro de um genoma, e assim, podem interromper a sequência codificadora de um gene e inibir sua expressão (VOLFF, 1999). Além de aumentar a variabilidade genética (KIDWELL & LISCH, 1997; CAPY et al., 1998), fazem parte da estrutura dos cromossomos, especificamente dos centrômeros e telômeros, com influências na regulação epigenética, incluindo modificação da cromatina e inativação dos cromossomos sexuais (PEASTON et al., 2004, HAN & BOEKE, 2005; SLOTKIN & MARTIENSSEN, 2007). Em peixes, elementos da família Rex, encontrados nos genomas dos teleósteos (VOLFF et al., 1999; 2000; 2001), têm sido mapeados nos cromossomos de diversos grupos de peixes, entre os quais Characiformes (CIOFFI et al., 2010; SCHNEIDER et al., 2013; SILVA et al., 2013; SPLENDORE et al., 2013), Cichliformes (TEIXEIRA et al., 2009; VALENTE et al., 2011; DE FREITAS MOURÃO et al., 2017), Perciformes (OZOUF-COSTAZ et al., 2004; COSTA et al., 2013), Siluriformes (PANSONATO-ALVES et al., 2013; SUPIWONG et al., 2014; FAVARATO et al., 2017), entre outros. Os TEs desencadeam consequências diretas no processo evolutivo através da interferência na ação dos genes, na indução de rearranjos cromossômicos e como fonte de material codificante e não codificante, que permite o aumento na variabilidade genética (FESCHOTTE & PRITHAM, 2007; BÖEHNE et al., 2008). Esses elementos podem levar a eventos de especiação, uma vez que as mutações e rearranjos cromossômicos desencadeados por eles, podem ser fixados em diferentes 33
populações resultando em isolamento reprodutivo (HURST & SCHILTHUIZEN, 1998; HURST & WERREN, 2001; SYMONOVÁ et al., 2013). Microssatélites constituem DNAs repetitivos não codificadores dispostos em pequenas cópias (1 a 5 pb) dispostas em tandem, geralmente localizados em regiões heterocromáticas terminais e centroméricas dos cromossomos (TIMBERLAKE et al., 1978) embora também possam ocorrer em regiões eucromáticas (TÓTH et al., 2000). Essas sequências são altamente polimórficas e têm participação na organização da cromatina, replicação do DNA, recombinação e expressão gênica (LIU et al., 1999; LI et al., 2002). Como marcadores citogenéticos vem sendo aplicado em diversas abordagens, entre as quais a caracterização de regiões heterocromáticas específicas (CIOFFI et al., 2012). O mapeamento físico das diversas classes de DNAs repetitivos em peixes, por meio da Hibridização in situ fluorescente (FISH), permite avaliar variações microestruturais dos cromossomos, bem como da dinâmica e evolução de sequências repetitivas, transcricionais ou não transcricionais, com contribuições efetivas sobre as relações evolutivas entre espécies (SHAPIRO & VON STEMBERG, 2005; BIÉMONT & VIEIRA, 2006; CIOFFI et al., 2010; MOTTA-NETO et al., 2011; COSTA et al., 2016; GETLEKHA et al., 2016).
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivos Geral
A presente investigação objetiva analisar através da caracterização cariotípica e mapeamento de sequências de DNA repetitivos, os aspectos cariogenômicos de populações e espécies da família Acanthuridae e Holocentridae, presentes nos oceanos Atlântico e Índico, estabelecendo sua tendências evolutivas e níveis de variabilidade populacional associados às barreiras biogeográficas oceânicas.
2.2 Objetivos Específicos
• Estabelecer análises comparativas dos padrões de distribuição de sequências de DNAs repetitivos (DNAr 18S, DNAr 5S, histonas H2B-H2A e H3) em espécies da família Acanthuridae (Atlântico e Índico), voltadas a estabelecer seu papel nos rearranjos cromossômicos das espécies. Além de comparar aspectos citogenômicos de populações de espécies do gênero Acanthurus, divididas pela barreira do Amazonas-Orinoco e identificar possíveis marcadores populacionais.
• Promover uma análise dos padrões de distribuição de sequências de DNAs
repetitivos (DNAr 18S, DNAr 5S, Rex3, Tol2 e microssatélites (GA)15) em espécies das subfamílias Holocentrinae (Atlântico e Índico) e Myripristinae (Atlântico) e em suas populações no Atlântico, inferindo sobre o papel das sequências repetitivas na evolução cariotípica do grupo.
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3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material
Exemplares das espécies das famílias Acanthuridae e Holocentridae (Figuras 1 e 2, respectivamente), utilizados nas análises citogenéticas, foram coletados no litoral brasileiro (Atlântico Ocidental), em ilhas oceânicas Meso-atlânticas ou situadas em regiões adjacentes, bem como no Mar de Andaman (Índico), e exclusivamente para as espécies de Acanthuridae, também em região do Caribe.
Figura 1. Espécies do gênero Acanthurus empregadas nas análises citogenéticas e suas respectivas áreas de distribuição. Barra = 2cm. 36
Figura 2. Espécies da família Holocentridae empregadas nas análises citogenéticas e suas respectivas áreas de distribuição. Barra = 2cm.
Os protocolos de campo e manuseio laboratório utilizados neste estudo, incluindo a amostragem de espécimes, foram aprovados pelo Comitê de Ética no uso de animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Proc. # 44-15). Os exemplares coletados foram acondicionados em sacos plásticos contendo água do mar e transportados ao Laboratório de Genética de Recursos Marinhos (LGRM), na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), ou às estações científicas das regiões insulares nos Arquipélagos de Fernando de Noronha e de São Pedro e São Paulo e Ilha de Trindade, sendo mantidos em aquários até o processamento das amostras. Dados sobre as amostras utilizadas estão apresentados na Tabela 1.
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Tabela 1. Dados das espécies de Acanthuridae e Holocentridae utilizadas nas análises citogenômicas.
Família/espécie N Localidade Região oceânica Coordenadas geográficas
Acanthuridae
Bahia Atlântico Ocidental 13°52’ S, 38°56’ O 31 Rio Grande do Norte Atlântico Ocidental 5°46’ S, 35°12’ O Acanthurus coeruleus 01 Fernando de Noronha Atlântico Ocidental 3º51’ S, 32º25’ O 08 Key Largo / EUA Caribe 25°09’40”N,80°45’83”O Bahia Atlântico Ocidental 13°52’S, 38°56’O 11 Rio Grande do Norte Atlântico Ocidental 5°46’S, 35°12'O Acanthurus chirurgus 04 Fernando de Noronha Atlântico Ocidental 3º51’S, 32º25’O 01 Key Largo / EUA Caribe 25°09’40”N, 80°45’O Bahia Atlântico Ocidental 13°52'S, 38°56’O 15 Rio Grande do Norte Atlântico Ocidental 5°46'S, 35°12'O Acanthurus bahianus 05 Ilha de Trindade Meso-Atlântico 20°31'29"S, 29°19'29"O 25°09’40”N, 80°45’O 02 Key Largo / EUA Caribe Acanthurus 01 Mar de Andaman Índico 10°N 96°E triostegus
Holocentridae
Bahia Atlântico Ocidental 13°52' S, 38°56' O 14 Rio Grande do Norte Atlântico Ocidental 5°46' S, 35°12' O
Atlântico Ocidental 3º51' S, 32º25' O 05 Fernando de Noronha Holocentrus 02 Ilha de Trindade adscensionis Meso-Atlântico 20°31'29"S,29°19'29"O
Arquipélago de São 01 Meso-Atlântico 00°55′02″ N, 29°20′44″O Pedro e São Paulo
Bahia Atlântico Ocidental 13°52' S, 38°56' O 15 Rio Grande do Norte Atlântico Ocidental 5°46' S, 35°12' O Myripristis jacobus Arquipélago de São 11 Meso-Atlântico 00°55′02″ N, 29°20′44″O Pedro e São Paulo Sargocentron 02 Mar de Andaman Índico 10°N 96°E rubrum
As amostras coletadas na região de Key Largo, Flórida (EUA), foram realizadas por coletores profissionais licenciados (Saltwater Product License SPL/RS #89332, Florida Marine Diver Device License MLD#663, Florida Special Activities Licence SA#314, Florida Retail Licence WD#4105, County Ocupational Licence #53110- 22128). 38
3. 2 Métodos
3.2.1 Obtenção de cromossomos mitóticos
Os espécimes foram submetidos à estimulação mitótica in vivo, por 24 horas, utilizando injeção intraperitoneal e intramuscular de complexo de antígenos atenuados (MOLINA, 2001; MOLINA et al., 2010). Para obtenção de cromossomos mitóticos, fragmentos do rim anterior foram removidos e dissociados em 9 ml meio de cultura RPMI 1640, através de aspirações com seringas de vidro de 10ml até obter uma mistura homogênea, de acordo com a técnica in vitro, preconizada por GOLD et al. (1990). Em seguida foram adicionados 125µl de colchicina 0,025%, deixando agir por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a colchicinização o material foi centrifugado por 10 minutos à 1000 rpm. Após descarte do sobrenadante, foi adicionado 10ml de solução hipotônica de KCl à 0,075M, onde a suspensão celular foi homogeneizada e mantida por 30 minutos à temperatura ambiente. A suspensão celular foi pré-fixada com 0,5 ml de solução de metanol e ácido acético (3:1) recém- preparado, homogeneizada e centrifugada por 10 minutos. O processo de fixação do material em fixador (na proporção 1:3, ácido acético e álcool metílico) foi repetido por 3 vezes, e por fim, as suspensões celulares foram estocadas em tubos Eppendorf de 1,5 ml à -20oC.
3.2.2 Análises cromossômicas e montagem do cariótipo
As suspensões celulares foram gotejadas sobre uma lâmina recoberta por um filme de água destilada aquecido à 60°C e coradas com solução de Giemsa 5%, diluída em tampão fosfato pH 6,8. As análises foram realizadas em microscópio óptico Olympus™ BX41 sob aumento de 1.000X e as melhores metáfases fotografadas através de sistema digital de captura Olympus™ DP73 utilizando o software DPController 1.2.1.108 (Olympus™ Optical Co. Ltd.). Cerca de trinta metáfases foram analisadas para cada espécime. Para a preparação dos cariótipos os cromossomos foram classificados quanto à posição dos centrômeros, em metacêntricos (m), com a razão entre os braços cromossômicos (RB) variando de 1,00 a 1,70; submetacêntricos (sm), RB=1,71–3,00; subtelocêntricos (st), RB=3,01–7,00; e acrocêntricos (a), RB>7,01. (Levan et al., 1964). 39
3.2.3 Detecção de regiões organizadoras de nucléolos
A detecção de regiões organizadoras de nucléolos foi obtida pela técnica de impregnação por prata preconizada por HOWELL & BLACK (1980). Sobre uma lâmina previamente preparada com suspensão celular foram adicionadas 175µl de solução gelatinosa (1g de gelatina incolor, dissolvida em 50ml água e 0,5ml ácido fórmico) e 6 gotas de AgNO3 à 50%. A solução foi homogeneizada sobre a lâmina e recoberta com lamínula, sendo então incubada em estufa a 60°C, até obtenção da cor amarelo escuro. A lamínula foi descartada com jatos de água destilada, e eventualmente para destacar as marcações argênteas, as preparações, foram coradas por cerca de 20 segundos com solução de Giemsa à 5%.
3.2.4 Detecção de heterocromatina constitutiva
A análise das regiões heterocromáticas foi realizada através do bandamento C, segundo SUMNER (1972). Foram utilizadas lâminas com material envelhecido em estufa à 37°C por no mínimo 3 dias, após esse período a lâmina foi imersa em HCl 0,2N por 14 minutos em temperatura ambiente, sendo lavada com água destilada e seca. Posteriormente a lâmina foi mergulhada em uma solução de Ba(OH)28H2O à 5%, à 42°C por cerca de 1 minuto e 35 segundos, sendo rapidamente lavada em HCl 0,1N e posteriormente água destilada. Após secar ao ar, a lâmina foi imersa em solução salina 2XSSC à 60°C por 40 minutos. Para análise o material foi corado com Giemsa 5% por 8 minutos.
3.2.5 Dupla coloração com fluorocromos base-específicos
A coloração com os fluorocromos base-específicos Cromomicina (CMA3) e 4′,6- diamidino-2-phenylindol (DAPI) foi realizada de acordo com SCHWEIZER (1976). As lâminas com material celular foram coradas com 30µl de CMA3 (0,5 mg/ml), cobertas com lamínula e mantida em câmara úmida, no escuro, por 60 minutos, após lavagem em àgua destilada foram coradas com 30µl de DAPI (2mg/ml), coberta com lamínula e mantida em câmara úmida, no escuro, por 30 minutos. Posteriormente as lâminas foram lavadas com água destilada e montadas com tampão glicerol-Mcllvaine pH 7,0 (1:1), recobertas com lamínulas e seladas com esmalte incolor. As lâminas foram 40
então guardadas à 4oC em câmara escura e analisadas após períodos superiores a 3 dias com fotomicroscópio de epifluorescência Olympus™ BX51 com filtros apropriados, em aumento de 1.000x. As preparações foram capturadas pelo sistema digital Olympus™ DP73 com uso do software cellSens (Olympus™ Optical Co. Ltda.).
3.2.6 Hibridização in situ fluorescente (FISH)
3.2.6.1 Obtenção de sondas para hibridização
As sondas de DNAr 5S (200 pb) e 18S (1400 pb) e genes das histonas, utilizadas nas análises em Acanthuridae, foram obtidas por PCR a partir do DNA nuclear de A. coeruleus. Em Holocentridae as sondas DNAr (18S e 5S), Tol2 e Rex3 foram obtidas a partir do DNA nuclear de M. jacobus. As sondas e os respectivos primers utilizados nos procedimentos de hibridização estão apresentados na Tabela 2.
Tabela 2. Sondas e primers utilizados nas análises por hibridização in situ. Sondas Primers Referências
A 5′ - TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3′ DNAr 5S PENDÁS et al. (1994) B 5′ - CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ NS1 5′ - GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3 ′ DNAr 18S WHITE et al. (1990) NS8 5′ - TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA-3 ′ AD 5’- CCC -CCC GAG ATG TGA TGG TAG A-3′ H2B-H2A ALBIG et al. (2003) AR5′ - AGT ACA GCC TGG ATG TTT GGT AA-3′
H3 D 5′ - ATG GCT CGT ACC AAG CAG ACV GC-3′ ALBIG et al. (2003) R 5′ - ATA TCC TTR GGC ATR ATA GTG AC-3′ F 5′ - CGG TGA TAA AGG GCA GCC GTC - 3′ VOLFF et al. (1999) Rex 3 R 5′ - TGG CAG ACN GTG GTG GTG -3’ VOLFF et al. (2000) 4 F 5’ - ATA GCT GAA GCT GCT CTG ATC – 3’ KAWAKAMI & SHIMA Tol2 4 R 5’ – CTC AAT ATG CTT CCT TAG G – 3’ (1999)
Microssatélites d(GA)15 KUBAT et al. (2008)
3.2.6.2 Hibridização in situ fluorescente
A hibridização in situ por fluorescência (FISH) foi realizada de acordo com PINKEL et al. (1986). As lâminas contendo as preparações foram lavadas com tampão 41
PBS 1x por 5 minutos à temperatura ambiente, sob agitação e, posteriormente, desidratadas em série alcoólicas (70%, 80%,100%). Em seguida, incubadas em RNAse (0,4%/SSC 2x) por 1h, em câmara úmida à 37°C. Após este período foram tratadas com soluções salinas e tratadas com pepsina (0,005% em 10mM HCl) à 37°C por 10 minutos, e fixadas com formaldeído à 1% por 10 minutos. Após este período o material foi desidratado em série álcoólicas (70%/85%/100%) por 5 minutos em cada banho. As lâminas com cromossomos metafásicos foram incubadas em 70% formamida/2xSSC à 72°C, durante 5 minutos, para a desnaturação cromossômica, seguidas de um novo processo de desidratação. A solução de hibridização (50% de formamida, 2xSSC e 10% de sulfato de dextrano) e a sonda desnaturada (5 μl), com volume final de 60 μl, foram depositados nas lâminas e hibridização realizada durante 16 horas à 37°C em câmara úmida. Lavagens pós-hibridização foram realizadas com formamida 15%/0,2x SSC à 42°C, por 10 min, seguido por três lavagens em 0,1xSSC à 60°C por 5 min e em Tween 20 (0,05%/2x SSC) por 5 minutos, sob agitação, à temperatura ambiente. Foi feito um tratamento com 100ml de NFDM 5% (non fat dry milk – leite em pó desnatado) em SSC 4x, por 15 minutos à temperatura ambiente, em seguida foram feitas duas novas lavagens em Tween 20 (5 minutos/lavagem). Os sinais de hibridização das sondas: DNAr 18S e DNAhis H3, Rex3, Tol2, Microssatélite d(CA)15 foram detectados utilizando antidigoxigenina conjugada com rodamina (Vector, Burlingame); e para DNAr 5S, H2B-H2A utilizando streptavidina conjugada com FITC (Vector, Burlingame, CA, USA). Os cromossomos foram contrastados com Vectashield/DAPI (1,5 μg/ml) (Vector, Burlingame, CA, USA), e posteriormente, visualizados no microscópio.
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5. CAPÍTULOS
5.1 Capítulo I
Diversificação do DNAhis H2B-H2A, H3 e DNAr em Acanthurus (Acanthuridae): padrões biogeográficos e evidências de limitada variação cariotípica interpopulacional no Atlântico
Resumo Peixes-cirurgiões do gênero Acanthurus exibem profunda interação ecológica com os recifes de corais. Apesar de seus aspectos biológicos serem bem conhecidos, informações citogenéticas para o grupo são extremamente incipientes. Dados sobre a diversificação cariotípica em espécies no Atlântico mostraram diferenciação progressiva associada aos processos de divergência evolutiva das espécies. Diante do contexto biogeográfico destas espécies, largamente distribuídas em regiões costeiras do Caribe ao Brasil e em ambientes insulares isolados do Atlântico Sul, abordagens populacionais mais refinadas e comparações com espécies de seu centro de origem no Indo-Pacífico podem ser elucidativas sobre a diferenciação cariotípica no gênero. Assim, aqui foram realizadas análises citogenéticas convencionais e mapeamento cromossômico de sequências de DNAr 18S e 5S e de histonas H3 e H2B-H2A em populações de A. coeruleus, A. chirurgus e A. bahianus de regiões costeiras do Atlântico Ocidental e Caribe e duas regiões insulares isoladas do Atlântico Sul, e adicionalmente de A. triostegus, do Mar de Andaman, no Índico. O conjunto dos resultados oferece um perfil de baixa variação citogenética interpopulacional, entre as vastas áreas (continentais e insulares) de distribuição das espécies, ao mesmo tempo que em alguns casos (A. coeruleus), divergências geográficas dos sítios 18S DNAr podem sugerir a ocorrência de efeitos de isolamento da barreira do Amazonas. Embora o espectro filogenético das espécies analisadas para o gênero ainda necessite ser largamente ampliado, sinapomorfias relativas à organização do DNA repetitivo e nos padrões cariotípicos sugerem uma moderada diversificação cariotípica neste gênero, comparativamente a outros grupos recifais do Atlântico.
Palavras-chave: Citogenética de peixes; Peixes-cirurgiões; Barreira do Amazonas; citogenética de populações; DNA repetitivo; DNAhis. 43
Abstract
Surgeonfish of the genus Acanthurus exhibit deep ecological interaction with coral reefs. Although its biological aspects are well known, cytogenetic information for the group is extremely incipient. Data on karyotypic diversification in Atlantic species showed progressive differentiation associated with species evolutionary divergence processes. Given the biogeographic context of these species, widely distributed in coastal regions of the Caribbean to Brazil and in isolated South Atlantic island environments, more refined population approaches and comparisons with species from their Indo-Pacific center of origin may be elucidative about karyotype differentiation in the genus. Thus, conventional cytogenetic analyzes and chromosomal mapping of 18S and 5S rDNA sequences and histones H3 and H2B- H2A in populations of A. coeruleus, A. chirurgus and A. bahianus from western Atlantic and Caribbean coastal regions and two isolated island regions of the South Atlantic, and in addition to A. triostegus from the Andaman Sea in the Indian Ocean. The set of results provides a profile of low interpopulation cytogenetic variation between the vast (continental and island) species distribution areas, while in some cases (A. coeruleus), geographical divergences of 18S rDNA sites may suggest the occurrence of Amazon barrier isolation effects. Although the phylogenetic spectrum of the species analyzed for the genus still needs to be broadly broadened, synapomorphies regarding repetitive DNA organization and karyotypic patterns suggest a moderate karyotypic diversification in this genus compared to other Atlantic reef groups.
Keywords: Cytogenetics of fish; surgeonfishes; Barrier of the Amazon; cytogenetics of populations; Repetitive DNA; DNAhis.
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Introdução
Acanthuridae representa um carismático grupo de peixes profusamente distribuído em ambientes recifais de todo o mundo (NELSON et al., 2016). Os padrões citogenéticos conhecidos para a família são muito incipientes, decorrente da análise de apenas 7% das espécies (ARAI, 2011; AFFONSO et al., 2014; FERNANDES et al., 2015). No Atlântico Ocidental ocorrem apenas 4 espécies do gênero Acanthurus, enquanto a maior parte das espécies está distribuída por regiões do Índico e Pacífico (ROCHA et al., 2002; RANDALL, 2011). Três das espécies do Atlântico, A. coeruleus, A. bahianus e A. chirurgus apresentam divergências cariotípicas numéricas e estruturais atreladas ao seu processo de especiação (AFFONSO et al., 2014), enquanto a única outra espécie do Indo-Pacífico analisada, A. triostegus, com 2n=48 cromossomos acrocêntricos (ARAI & INOUE, 1976), apresenta uma condição aparentemente basal para Acanthuriformes. No Atlântico as espécies de Acanthurus são simpátricas, com extensa distribuição, que vai de regiões do Caribe ao sul do Brasil, incluindo regiões insulares do Arquipélago de Fernando de Noronha e Ilha de Trindade (ROCHA et al., 2002). As muitas multipartições ambientais e espaços oceânicos a que estão submetidas, tornam as espécies Atlânticas desse gênero um excelente modelo para analisar possíveis variações citogenômicas populacionais existentes. No Atlântico Ocidental, entre os fatores físicos envolvidos na delimitação da fauna de peixes se destaca a barreira biogeográfica representada pela pluma dos rios Amazonas-Orinoco (ROCHA et al., 2002; FLOETER et al., 2008; BERNAL & ROCHA, 2011). Sua ação estabelece os limites de distribuição das províncias biogeográficas brasileira e do grande Caribe (MOURA et al., 2016) e possui efeito sobre o fluxo gênico de várias espécies (ROCHA, 2003). A extensa pluma de água doce e sedimentos dos rios Amazonas (Brasil) e Orinoco (Venezuela) se estende por 2.300 km ao longo da COSTA nordeste da América do Sul, gerando estratificação física e ecológica e representa a principal responsável pela especiação da fauna de recifes entre essas regiões (ROCHA 2003; ROBERTSON et al. 2006; FLOETER et al., 2008). Sua ação perpassa a área de 45
distribuição das espécies de Acanthurus do Atlântico, onde desempenha um papel heterogêneo sobre a conectividade genética das espécies (ROCHA et al., 2002). Em análises populacionais o uso exclusivo de técnicas citogenéticas clássicas pode ser pouco efetivo em diversas espécies de Percomorpha (MOLINA, 2007), cujos padrões cariotípicos se mostram pouco variáveis (MOTTA-NETO et al., 2011a; 2011b). Desta forma, um maior número de marcadores, sobretudo decorrente do mapeamento de sequências de DNA repetitivo nos cromossomos, pode ser mais efetivo, uma vez que propicia a detecção de marcadores citotaxonômicos, rearranjos crípticos e dinâmica evolutiva dessas sequências (CIOFFI et al., 2012). Seu uso em grupos com relações evolutivas bem estabelecidas (MOTTA-NETO et al., 2012; COSTA et al., 2014; AMORIM et al., 2016) e em análise interpopulacionais no ambiente marinho (LIMA-FILHO et al., 2012; MOTTA-NETO et al., 2012; MOLINA et al., 2012; AMORIM et al., 2017), tem sido crescentemente ampliado. As famílias multigênicas se caracterizam por sequências de DNA repetidas em tandem e organizadas em clusters no genoma, como as histonas (H1, H2B-H2A, H3 e H4), com papel fundamental na organização estrutural da cromatina e regulação da expressão gênica em eucariotos (CHIODA et al., 2002), e DNA ribossomal (18S e 5S), com papel vital na síntese proteica (GORNUNG, 2013), têm se destacado entre as sequências genômicas mais utilizadas em análises evolutivas e populacionais em espécies do Atlântico (MOTTA-NETO et al., 2011a; 2011b; LIMA-FILHO et al., 2012; COSTA et al., 2013; 2014; 2016; AMORIM et al., 2017; SOARES et al., 2017; BORGES et al., 2019). Desta forma, análises citogenéticas em grupos de espécies proximamente relacionadas de Acanthurus de uma mesma região oceânica, além de comparações com espécies mais basais, originárias do centro de dispersão da família no Indo- Pacífico e entre populações de diferentes áreas do Atlântico, podem auxiliar no acompanhamento da evolução cariotípica no gênero. Além disso, essas análises também podem estabelecer o papel dos enormes espaços oceânicos, do isolamento de ambientes insulares e de barreiras biogeográficas, destacadamente a do Amazonas-Orinoco na promoção de variações cariotípicas nas espécies. Assim, aqui foram desenvolvidas análises citogenômicas em populações vastamente distribuídas das espécies A. coeruleus, A. chirurgus e A. bahianus, do Atlântico e análises adicionais em A. triostegus, do Índico, através de abordagens 46
convencionais e mapeamento cromossômico de sequências de DNAr 18S e 5S e de DNAhis H2B-H2A e H3.
Material e Métodos
As espécies Acanthurus coeruleus, A. bahianus, A. chirurgus (Atlântico) e A. triostegus, peixe-cirurgião-de-cinco-listras (Índico) foram utilizadas nas análises citogenéticas. Informações sobre os espécimes e as populações analisadas estão detalhadas na Tabela 3. Tabela 3. Dados das espécies de Acanthurus utilizadas nas análises citogenéticas.
Regiões oceânicas Meso- Grande Oceano Atlântico Ocidental Espécies Atlântico Caribe Índico Fernando Costa do Mar de de Ilha de Trindade Key Largo N Brasil Andaman Noronha
A. coeruleus 31 01 - 08 - 40
A. bahianus 15 - 05 02 - 22
A. chirurgus 11 04 - 01 - 16
A. triostegus - - - - 01 01
Após as coletas os espécimes foram submetidos à estimulação mitótica in vivo, por 24 horas, utilizando um complexo de antígenos atenuados (MOLINA, 2001; MOLINA et al., 2010). Para obtenção de cromossomos mitóticos in vitro foi seguido o protocolo desenvolvido por GOLD et al. (1990). As regiões organizadoras de nucléolos (RONs) e regiões heterocromáticas foram analisadas de acordo com HOWELL & BLACK (1980) e SUMNER (1972), respectivamente. Com vistas a confirmação taxonômica das espécies A. bahianus, A. chirurgus e A. coeruleus, provenientes de Key Largo, Caribe, foram realizadas análises genéticas utilizando sequências parciais dos genes mitocondriais 16S e citocromo oxidase I (COI). Para tanto, fragmentos de nadadeiras ou fígado (5 mm2) foram removidos, preservados em etanol 95% e estocados à 4°C. O DNA total de cada espécime foi extraído (SAMBROOK et al., 1989) e amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR), com primers para os genes 16S e COI. 47
As reações de PCR foram preparadas para um volume final de 25 μl, consistindo de 1 μl de DNA total, 0.5U Taq polimerase, 0.4 μl de 50 mM MgCl2, 1 μl de 10 x buffer, 0.5 μl 10 mM dNTP, 0.3 μl de 10 μM de cada primer (L1987 e H2609) (PALUMBI et al., 1991) e água ultrapura até completar o volume final da reação. As reações de amplificação ocorreram com um ciclo inicial de desnaturação à 95°C (5 min), seguido por 30 ciclos à 94°C (30 s), 49°C (30 s), 72°C (55 s) e uma extensão final a 72°C, por 5 minutos. Os produtos da PCR foram purificados com a enzima ExoSAP-IT e sequenciados pela ACTGene Análises Moleculares Ltda. As sequências parciais do gene 16S e COI de dois indivíduos de cada uma das espécies coletadas em Key Largo foram comparadas com as depositadas no GenBank.
Obtenção de sondas para hibridização
As sondas de DNAr 5S (200 pb) e 18S (1400 pb) foram obtidas por PCR a partir do DNA nuclear de A. coeruleus, utilizando os primers A 5′-TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3′ e B 5′-CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (PENDÁS et al. 1994) e NS1 5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3 ′ e NS8 5′-TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA-3 ′ (WHITE et al., 1990), respectivamente. A sonda DNAr 5S foi marcada com biotina-14-dATP e DNAr 18S com digoxigenina-11-dUTP, ambas por nick translation, seguindo recomendações do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha). Amplificações das sequências H2B-H2A utilizaram os primers H2BAD 5’ CCC -CCC GAG ATG TGA TGG TAG A-3′ e H2BAR 5′-AGT ACA GCC TGG ATG TTT GGT AA- 3′, para H2B-H2A e os primers H3D 5′ -ATG GCT CGT ACC AAG CAG ACV GC-3′ e H3R 5′-ATA TCC TTR GGC ATR ATR GTG AC-3′, para H3. Ambos os conjuntos foram desenhados a partir de sequências dos genes de Mytilus edulis (ALBIG et al., 2003) e amplificado de acordo com GIRIBERT & DISTEL (2003). As sondas de histonas foram marcadas com biotina-14-dATP, para H2B-H2A e digoxigenina-11-dUTP para H3, usando nick translation, de acordo com as recomendações do fabricante (Roche).
Hibridização in situ fluorescente (FISH)
Hibridização in situ fluorescentes foram realizadas de acordo com PINKEL et al. (1986). Cromossomos mitóticos foram tratados com RNAse (20μg/ml em 2XSSC) à 37°C por 1 h e com pepsina (0,005% em 10mM HCl) à 37°C por 10 min, fixada com 48
formaldeído à 1% por 10 min e depois desidratada em série de álcool (70%/85%/100%) por 5 min cada. As lâminas com cromossomos metafásicos foram incubadas em 70% formamida/2XSSC a 72°C, durante 5 min. A solução de hibridização (50% de formamida, 2XSSC e 10% de sulfato de dextrano) e a sonda desnaturada (5ng/μl), com volume final de 30 μl, foram depositados nas lâminas e hibridização realizada durante 16 h à 37°C. Lavagens pós-hibridização foram realizadas com 15% formamida/0,2xSSC à 42°C, por 20 min, seguido por lavagens em 0,1×SSC à 60°C por 15 min e em 0,5%/4×SSC Tween 20 para 5 min à temperatura ambiente. Os sinais de hibridização das sondas foram detectados utilizando antidigoxigenina conjugada com rodamina (Vector Burlingame) para sondas DNAr 18S, DNAhis H3 e com streptavidina conjugada com FITC (Vector, Burlingame, CA, USA) para 5S DNAr. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 μg/ml) (Vector, Burlingame, CA, USA). As micrografias foram obtidas usando um fotomicroscópio de epifluorescência Olympus™TM BX51 (Olympus™, Tóquio, Japão) com filtros apropriados equipados com o sistema de captura digital Olympus™ DP73 usando o software CellSens (Olympus™). Os tipos cromossômicos foram classificados de acordo com a posição do centrômero (LEVAN et al., 1964) e organizados em ordem decrescente de tamanho. Idiogramas representativos da distribuição das sequências hibridizadas foram preparados através do software Photoshop CS6.
Resultados
A espécie Acanthurus triostegus apresentou um número diploide composto por 48 cromossomos acrocêntricos (NF=48), com sítios Ag-RONs localizados no braço curto do par 24 (Figura 3, em destaque). Acanthurus coeruleus (2n=48; 2sm+4st+42a; NF=54), A. bahianus (2n=36; 12m+2sm+4st+18a; NF=54) e A. chirurgus (2n=34; 12m+2sm+4st+16a; NF=52) (Figura 3) apresentaram padrões cariotípicos similares aos reportados previamente para essas espécies (AFFONSO et al., 2014). As populações das espécies A. coeruleus e A. chirurgus do AFN e Caribe e de A. bahianus da Ilha de Trindade e Caribe, apresentaram cariótipos similares entre suas populações (Figura 3). 49
Figura 3. Cariótipos das espécies Acanthurus triostegus, Acanthurus coeruleus, Acanthurus bahianus e Acanthurus chirurgus, sob coloração convencional com Giemsa e bandamento C. Em destaque os pares portadores de sítios Ag-RONs. Barra = 5µm. 50
Os sítios de DNAr 18S em A. bahianus e A. chirurgus, estavam localizados exclusivamente no braço curto do subtelocêntrico maior (par 8) (Figura 4, em destaque) e não exibindo qualquer variação interpopulacional. Em A. triostegus, essas sequências foram evidenciadas no par 24 (Figura 4, em destaque). Por outro lado, a quantidade de sítios DNAr 18S diferiu entre as populações de A. coeruleus do Caribe e do Atlântico Sul. Ocorrendo em, um único sítio, no braço curto do par 2 (Figura 5, em destaque), enquanto que os indivíduos do Atlântico Sul possuíam 2 sítios, localizados em mesma posição no par 2 além de um sítio extra presente no braço curto do par 13 (Figura 5, em destaque). Sítios de DNAr 5S foram mapeados no braço curto do maior par acrocêntrico das três espécies do Atlântico e se apresentaram invariáveis entre as populações de Acanthurus do Caribe e do Atlântico Sul (costa brasileira e ilhas oceânicas) (Figuras 4 e 5, em destaque). Em A. triostegus se localiza no braço curto do par 16, que apresenta morfologia e tamanho semelhante às espécies do Atlântico (Figura 4, em destaque). 51
Figura 4. Mapeamento cromossômico genes ribossomais 18S (caixas com linhas sólidas, em vermelho), 5S (caixas com linhas pontilhadas em verde) e de DNAhis H3 (vermelho) e H2B-H2A (verde) nas populações do Atlântico Sul e Caribe (AS/CA) das espécies Acanthurus bahianus, Acanthurus chirurgus e Acanthurus triostegus, do Índico. Barra = 5 µm.
Sítios DNAhis H3 apresentaram variações de frequência entre as espécies. Em A. chirurgus, estes sítios estão localizados nos braços curtos dos pares 9, 10 (co- localizados com DNAr 5S) e 12, em A. bahianus também ocorriam nos braços curtos dos pares 9, 10 (co-localizado com DNAr 5S) e adicionalmente no braço curto do par 16 (Figura 4), enquanto que em Acanthurus triostegus estes sítios estavam localizados no braço curto dos pares 18 e 22 (Figura 4). Acanthurus coeruleus exibiu 52
o maior número de sítios (8 loci), que se localizavam nos braços curtos dos pares 3, 4 (co-localizado com DNAr 5S), 16, 21 e 24, nas regiões terminais dos braços longos nos pares 7 e em arranjo bitelomérico no par 19 (Figura 5).
Figura 5. Mapeamento cromossômico de DNAr 18S (caixas com linhas sólidas, em vermelho), DNAr 5S (caixas com linhas pontilhadas em verde) e DNAhis H3 (vermelho) e H2B-H2A (verde) nas populações de Acanthurus coeruleus das regiões do Caribe e do Atlântico Sul. Barra = 5 µm.
Os sítios H2B-H2A, como os sítios H3, também exibiram variação de frequência entre as espécies de Acanthurus, localizando exclusivamente nos braços curtos dos cromossomos. Em A. chirurgus ocorreu no par 11; em A. bahianus nos pares 14 e 15, em A. triostegus, no par 17 (Figura 4); e em A. coeruleus nos pares 7 (sintênico com DNAhis H3), 10 e 13 (Figura 5).
Discussão
As espécies do gênero Acanthurus no Atlântico Ocidental exibem uma diversificação cariotípica escalonada, derivada de conspícuos e sequenciais rearranjos cromossômicos entre as espécies (AFFONSO et al., 2014). De fato um 53
conjunto de três cromossomos bibraquiais, presente nas três espécies, indica que esse conjunto de rearranjos, formado a partir de inversões pericêntricas, constitui uma característica basal para as espécies desta região oceânica e aponta A. coeruleus, com maior número de acrocêntricos e portanto mais próximo ao cariótipo ancestral para Percomorpha (MOTTA-NETO et al., 2019), como ancestral entre as três espécies. Esta suposição é apoiada tanto com grau de similaridade com o cariótipo de A. triostegus (2n=48a), espécie basal proveniente do centro de dispersão do gênero, como também pelas hipóteses filogenéticas baseadas em dados moleculares (BERNAL & ROCHA, 2011; SORENSON et al., 2012). A posterior divergência entre A. coeruleus (2n=48) e A. bahianus (2n=36), é congruente com a origem de um conjunto de 6 pares de cromossomos metacêntricos grandes, derivados de fusões robertsonianas, nesta última espécie, que é compartilhado com A. chirurgus. Como condição autapomórfica, A. chirurgus, com diversificação mais recente, apresenta uma redução do número diploide (2n=34), possivelmente derivado de um evento de fusão in tandem (AFFONSO et al., 2014). Apesar da evolução cariotípica das espécies de Acanthurus do Atlântico ter sido pautada por uma sucessiva diversificação numérica e estrutural dos cromossomos, as modificações microestruturais foram menos notáveis, indicadas pelo mapeamento de genes ribossomais (FERNANDES et al., 2015). Sequências repetitivas são componentes importantes para diferenciação genômica e processos evolutivos (LÓPEZ-FLORES & GARRIDO-RAMOS, 2012; COSTA et al., 2013; BISCOTTI et al., 2015; COSTA et al., 2015). Eventualmente, essas sequências podem ser eficientes marcadores populacionais (LIMA-FILHO et al., 2012) ou citotaxonômicos (AMORIM et al., 2016). Embora, uma baixa diversificação em suas frequências e organização possam ocorrer em grupos com marcado conservadorismo cromossômico (MOLINA, 2007; MOTTA-NETO et al., 2011a, CALADO et al., 2013). A família multigênica das histonas, desempenha papel fundamental na organização estrutural da cromatina nos eucarióticos, bem como na regulação da expressão gênica (CHIODA et al., 2002). Sequências dos genes de histona exibem considerável variabilidade no seu arranjo e número de cópias nos cromossomos de vários grupos de peixes (NAGODA et al., 2005; HASHIMOTO et al., 2011; LIMA- 54
FILHO et al., 2012; COSTA et al., 2014; 2016; BORGES et al., 2019), inclusive Acanthuridae. O mapeamento de sequências H2B/H2A e H3 ampliou o nível de comparação entre as regiões cromossômicas das espécies e indicando um padrão mais variável do que se supunha na dinâmica dessas sequências em A. coeruleus, A. bahianus e A. chirurgus, em relação à forma basal A. triostegus. Entre as espécies de Acanthurus do Atlântico, os sítios H2B-H2A e H3 mostraram dispersão em vários pares de cromossomos, bem como o compartilhamento de um mesmo grupo de ligação (par 7) em A. coeruleus. DNAhis H3 apresentaram uma maior frequência nos cromossomos das espécies do que os sítios H2B-H2A. Esse padrão tem sido observado em outros grupos marinhos, como Rachycentron canadum (Rachycentridae) (COSTA et al., 2014), Ocyurus chrysurus (Lutjanidae) (COSTA et al., 2016), e em Centropomus mexicanus e C. undecimalis (Centropomidae) (BORGES et al., 2019). Evolutivamente, o número de sítios H2B-H2A e H3 decai em relação aos passos de divergência das espécies do Atlântico. Em A. coeruleus (3 e 8 sítios, respectivamente), A. bahianus (2 e 3 sítios) e A. chirurgus (1 e 3 sítios), enquanto A. triostegus, linhagem considerada mais basal entre as espécies analisadas (SORENSON et al., 2013), apresenta a menor frequência desses sítios (1 e 2 sítios). A organização do DNAhis nos cariótipos dessas espécies sugere um processo de purificação dessas sequências, com redução do número de sítios entre os passos de diversificação do clado Atlântico. Exceto por alguns poucos sítios H3, presentes em posição telomérica em A. coeruleus, o DNAhis está presente em regiões heterocromáticas. Esta organização possibilita a co-localização com conjuntos complexos de DNAs repetitivos (HASHIMOTO et al., 2011; LIMA-FILHO et al., 2012; COSTA et al., 2014; 2016; presente estudo), entre os quais elementos de transposição, podem favorecer sua dispersão no cariótipo e diversificação cromossômica (ROEHRDANZ et al., 2010; COSTA et al., 2013; 2014; 2016). 55
Figura 6. Idiograma indicando a organização de diferentes classes de DNAs repetitivos (DNAr e DNAhis) em espécies e populações de Acanthurus. Em destaque nas caixas, conjuntos de cromossomos compartilhados entre as espécies. Par cromossômico portador de sítio DNAr 18S com variação interpopulacional (caixa pontilhada) (b). CA=Caribe; AS=Atlântico Sul; OI = Oceano Índico.
Aspectos filogenéticos, biogeográficos e carioevolutivos do gênero Acanthurus
Os padrões de diferenciação cariotípica das quatro espécies de Acanthurus, permitiram traçar uma conexão entre a organização cromossômica, eventos biogeográficos e relações filogenéticas das espécies. A ocorrência de cariótipo com 2n=48 cromossomos acrocêntricos, em A. triostegus, que teve sua irradiação no início do Mioceno (~ 21 M.a.), período em que o próprio gênero Acanthurus divergia (SORENSON et al., 2013), e compartilhada com espécies de outros gêneros de Acanthuridae do Pacífico, como Prionurus scalprum (ARAI & INOUE, 1976), Ctenochaetus striatus (OJIMA & YAMAMOTO, 1990), indica que esta é uma condição plesiomórfica para Acanthuriformes. Sob uma perspectiva filogenética, o padrão cariotípico e o mapeamento de sequências de famílias multigênicas confirma a condição basal de A. triostegus. Esta 56
espécie apresenta um cariótipo inteiramente formado por cromossomos acrocêntricos, sítios Ag-RONs/DNAr 18S simples e heterocromatina restrita às regiões centroméricas, características consideradas basais para Percomorpha (GALETTI et al., 2000). As divergências evolutivas desta espécie em relação a macroestrutura cariotípica e distribuição e frequência de sítios DNAr e histonas, com as espécies Atlânticas, remonta temporalmente a cerca de 21 M.a., período de divergência entre os dois clados (SORENSON et al., 2013).
Figura 7. Distribuição geográfica (linhas) das espécies Acanthurus coeruleus (azul), Acanthurus bahianus (verde), Acanthurus chirurgus (vermelho) e Acanthurus triostegus (rosa). Símbolos indicam os processos de modificações cariotípicas em Acanthurus associados a padrões filogenéticos temporais de diversificação (modificada de SORENSON et al., 2013).
A diversificação cariotípica em peixes marinhos tem sido associada tanto a aspectos comportamentais e potencial dispersivo (MOLINA & GALETTI, 2004; GALETTI et al., 2006), como também a biogeografia histórica das espécies. Neste sentido, devido à extensa distribuição ocorrida em períodos diversos de muitos grupos de peixes marinhos, análises interoceânicas se mostram necessárias para a 57
compreensão dos padrões cromossômicos, que podem ser interpretados com base nos processos vicariantes e de dispersão dos grupos. A comparação citogenômica das espécies do Atlântico, com A. triostegus, evolutivamente mais basal e com ocorrência no centro de dispersão da família (Indo- Pacífico), sugere que um significativo conjunto de grupos sintênicos foi mantido durante os largos períodos de divergência evolutiva das espécies (AFFONSO et al., 2014; FERNANDES et al., 2015). De fato, divergências citogenéticas entre as espécies do Atlântico, se mostraram diretamente associadas aos períodos de divergência (SORENSON et al., 2013). Assim, em geral as espécies do Atlântico compartilham um maior número de sinapomorfias, quanto a estrutura cariotípica e distribuições de classes de DNA repetitivo, do que em relação a A. triostegus. Fatores biológicos como elevado potencial de dispersivo e natureza cosmopolita (FISHER & HOGAN, 2007; MIRAMS et al., 2011; LIGGINS et al., 2016; OTWOMA et al., 2018), que permitem uma intenso fluxo gênico no ambiente marinho (ROCHA et al., 2003), podem estar associados à manutenção do cariótipo conservado presente em A. triostegus. Em contraste, as espécies A. coeruleus, A. chirurgus e A. bahianus, que colonizaram posteriormente o Atlântico e apresentam extensa distribuição, podem ter sido submetidas a condições históricas (deslocamento de nicho, fragmentações populacionais; alopatria) que favoreceram a fixação de mudanças cromossômicas mais conspícuas (PLANES et al., 1996; GALETTI et al., 2006). Embora ainda não inteiramente esclarecidos, os processos de divergência entre A. coeruleus com o clado formado por A. bahianus e A. chirurgus, estimada entre 19 M.a., e entre essas duas últimas espécies ocorrida há 10 M.a. (Figura 7), coincidem com mudanças globais na dinâmica dos oceanos (eventos tectônicos) que afetaram os níveis de riqueza e endemismo de gêneros e famílias de peixes recifais (FLOETER et al., 2008). No Atlântico, o isolamento de habitats costeiros durante os períodos de glaciação promotores de recorrentes variações do nível do mar influenciou padrões de estruturação genética (GALETTI et al., 2006), e poderiam, em tempos mais recentes contribuir para uma maior taxa de evolução cromossômica em peixes recifais. De modo geral, Acanthurídeos apresentam baixíssima estratificação populacional, até mesmo envolvendo grandes distâncias como a existente entre o 58
continente brasileiro e Ilha de Santa Helena (3.540 Km) (ROCHA et al., 2002). O alto potencial de dispersão dos acanthurídeos (LESSIOS & ROBERTSON, 2006; MIRAMS et al., 2011; OTWOMA et al., 2018), associados às habilidades de deslocamento e colonização dos representantes desta família (OTWOMA et al., 2018), poderiam promover condições para a manutenção de homogeneidade genética entre população e uma menor dinâmica evolutiva dos cariótipos. Os aspectos cariogenômicos entre as populações insulares (AFN e ilha de Trindade), com os da Costa Brasileira e do Caribe, apesar das grandes distâncias e níveis de isolamento envolvidos, não evidenciaram variações populacionais. Como exceção, as populações do Caribe e do Atlântico Sul de A. coeruleus divergiram quanto ao número de sítios DNAr 18S. Esta descoberta, pode estar atrelada a evidências filogeográficas que indicam estratificação populacional em A. bahianus e A. coeruleus, envolvendo áreas do Caribe e do Atlântico Sul, separadas pela barreira do rio Amazonas (ROCHA et. al., 2002). Variabilidade e diversificação cariotípica entre populações e espécies irmãs do Atlântico Sul e Caribe em espécies das famílias Acanthuridae (presente trabalho), Lutjanidae (ROCHA & MOLINA, 2008; NIRCHIO et al., 2008; COSTA et al., 2016), Haemulidae (MOTTA-NETO et al., 2011b) e Grammatidae (MOLINA et al., 2012) tem revelado insuspeitos graus de divergência citogenética ocasionados pela ação da barreira dos rios Amazonas/Orinoco. Os processos de divergência evolutiva e de variabilidade citogenética interpopulacional do gênero Acanthurus, sob perspectivas citogenômicas, filogenéticas, biogeográficas destaca a importância de contextos mais amplos para a compreensão da evolução cariotípica em peixes marinhos.
Agradecimentos Os autores agradecem ao CNPq pelo suporte financeiro (Proc. #442664/2015- 0) e à CAPES pela bolsa de pesquisa concedida a MAF.
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5.2 Capítulo II
Dinâmica evolutiva de DNAs repetitivos na família Holocentridae (Holocentriformes)
Resumo
A família Holocentridae (Holocentriformes) são membros onipresentes e abundantes da fauna de peixes de recifes de coral nos mares tropicais. Apesar de seus aspectos biológicos, filogeográficos e filogenéticos serem bem conhecidos, este grupo ainda apresenta escassos dados citogenéticos. Com a finalidade de conhecer os padrões e os aspectos envolvidos na carioevolução da família foram analisadas as espécies Myripristis jacobus e Holocentrus adscensionis, bem como suas populações no Atlântico, e Sargocentron rubrum, do Índico, através de técnicas citogenéticas convencionais (coloração com Giemsa, bandamento C, Ag-RONs), coloração com fluorocromos base específicos e hibridização fluorescente in situ utilizando sondas para DNAr 18S, DNAr 5S, elementos transponíveis Tol2 e Rex3 e sequências (GA)15. As espécies S. rubrum e M. jacobus apresentaram cariótipos com 2n=48 cromosomos acrocêntricos, enquanto H. adscensionis, exibiu 2n=50 (2m+6sm+16st+26a, NF=74). Os sítios DNAr 18S/Ag-RONs localizam-se em um único par em S. rubrum e M. jacobus, e dois pares em H. adscensionis. Os elementos Tol2 se mostrou difuso ao longo dos cromossomos, enquanto os elementos Rex3 e as repetições (GA)15 ocupavam clusters centroméricos significantemente mais conspícuos nas espécies Atlânticas. O compartilhamento de um cariótipo com 2n=48a, entre S. rubrum (Holocentrinae) e M. jacobus (Myripristinae), preliminarmente sugere ser esse um padrão basal para Holocentridae. O grau de divergência cariotípica em H. adscensionis, demonstra uma taxa de evolução mais dinâmica. Análises populacionais em H. adscensionis e M. jacobus de regiões insulares e costeiras do Atlântico não evidenciaram variações geográficas. O conjunto de fatores biológicos e contingências históricas que atuaram neste grupo de espécies auxilia na compreensão da sua evolução cariotípica, contudo, investigações envolvendo um maior número de espécies são necessárias para melhor estimativa da evolução cariotípica em Holocentridae.
Palavras-chave: Citogenética de peixes; evolução cariotípica; peixes-esquilo; DNA repetitivo; Rex3; Tol2; DNAr.
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Abstract The family Holocentridae (Holocentriformes) are omnipresent and abundant members of coral reef fish fauna in tropical seas. Although its biological, phylogeographic and phylogenetic aspects are well known, this group still presents scarce cytogenetic data. In order to know the patterns and aspects involved in the family carioevolution, the species Myripristis jacobus and Holocentrus adscensionis were analyzed, as well as their populations in the Atlantic, and Sargocentron rubrum, from the Indian Ocean, using conventional cytogenetic techniques (Giemsa staining, banding C and Ag- RONs), staining with specific base fluorochromes and fluorescent in situ hybridization using 18S rDNA, 5S rDNA probes, Tol2 and Rex3 transposable elements, and sequences (GA)15. The species S. rubrum and M. jacobus showed karyotypes with 2n = 48 acrocentric chromosomes, while H. adscensionis exhibited 2n = 50 (2m + 6sm + 16st + 26a, NF = 74). The 18S / Ag-RONs rDNA sites are located in a single pair in S. rubrum and M. jacobus, and two pairs in H. adscensionis. The Tol2 elements were diffuse throughout the chromosomes, while the Rex3 elements and repeats (GA)15 occupied significantly more conspicuous centromeric clusters in the Atlantic species. Sharing a 2n = 48a karyotype between S. rubrum (Holocentrinae) and M. jacobus (Myripristinae) preliminarily suggests a basal pattern for Holocentridae. The degree of karyotypic divergence in H. adscensionis demonstrates a more dynamic evolution rate. Population analyzes on H. adscensionis and M. jacobus from Atlantic island and coastal regions did not show geographic variations. The set of biological factors and historical contingencies that acted in this group of species helps in understanding their karyotypic evolution, however, investigations involving a larger number of species are necessary to better estimate the karyotype evolution in Holocentridae.
Keywords: Fish cytogenetics; karyotypic evolution; squirrel fish; Repetitive DNA; Rex3; Tol2; rDNA.
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Introdução
A família Holocentridae representa um grupo monofilético, com irradiação que remonta a 93 M.a. (TYLER et al., 1993; BELLWOOD, 1996). Seus representantes distribuem-se em todos os mares tropicais e temperados (NELSON et al., 2016), onde são componentes ecológicos importantes das comunidades recifais (DORNBURG et al., 2012). No Atlântico ocidental duas espécies de holocentrídeos se destacam por sua alta incidência nos recifes de corais, Myripristis jacobus (Cuvier, 1829), conhecida como “peixes-esquilos” ou “peixes-soldados”, e Holocentrus adscensionis (Osbeck, 1765), chamados popularmente de “mariquitas”. A vasta distribuição destas espécies pelos diferentes ambientes do Atlântico lhes confere status de excelentes modelos para estudos de estruturação populacional (BOWEN et al., 2006). Apesar de úteis em estimar a variação cariotípica envolvida em grandes espaços oceânicos, informações citogenéticas sobre o grupo são restritas (BACURAU & MOLINA, 2004). Neste sentido, o mapeamento de sequências de DNAs repetitivos, que por sua vez podem apresentar alta variabilidade de composição, número de cópias, função, distribuição e organização no genoma (CHARLESWORTH et al., 1994), tem sido de grande utilidade em estudos sobre evolução, sistemática e taxonomia em peixes (VICARI et al., 2010). Os DNAs repetitivos são subdivididos em sequências codificantes (histonas e genes ribossomais), e sequências não-codificantes, repetidas in tandem (DNAs satélites, os mini e microssatélites) ou dispersas pelo genoma como os elementos tranponíveis (transposons e retrotransposons) (NAGODA et al., 2005; KUHN et al., 2012). Muitas das sequências repetitivas no genoma têm evolução associada à dinâmica promovida por elementos transponíveis (TE, transposable elements) (COSTA et al., 2013). Os TEs, sejam eles transposons ou retrotransposons, estão relacionados a uma maior variabilidade genética nos genomas (CAPY, 2004) e são parte constituinte da estrutura dos cromossomos, especificamente da heterocromatina (regiões pericentroméricas e nas posições terminais), atuando ainda em diferentes aspectos da regulação epigenética, incluindo modificação da cromatina (HAN & BOEKE, 2005; SLOTKIN & MARTIENSSEN, 2007). 68
Dentre os retrotransposons, a família Rex (Rex1, Rex3 e Rex6) tem sido amplamente mapeada em cromossomos de peixes teleósteos (CARDUCCI et al., 2018). Estruturalmente, seu papel em eventos mutacionais pode favorecer a ocorrência de rearranjos cromossômicos, variação em sítios DNAr (OZOUF-COSTAZ et al., 2004; CIOFFI et al., 2010; VALENTE et al., 2011), além de variações genômicas associadas à processos de especiação (SYMONOVÁ et al., 2013). Com vistas a estimar a diversificação citogenômica e variações populacionais, baseadas na prospecção de um robusto conjunto de classes de DNA repetitivo nos cromossomos, foram realizadas análises citogenéticas nas espécies H. adscensionis e M. jacobus (Atlântico Sul) e Sargocentron rubrum (Índico), através de métodos citogenéticos convencionais (coloração de Giemsa, bandamento C e detecção Ag- RONs), coloração com fluorocromos base específicos e hibridização in situ fluorescente (FISH) com sondas DNAr 18S e 5S, repetições microssatelites (GA)15, e elementos Tol2 e Rex3.
Materiais e Métodos Análises citogenéticas foram realizadas em amostras populacionais de Holocentrus adscensionis e Myripristes jacobus, provenientes das regiões costeiras dos Estados do Rio Grande do Norte (5°46'S, 35°12'O) e da Bahia (13°52'S, 38°56'O) e de regiões insulares compostas pela Ilha de Trindade (20°31'29"S, 29°19'29"O), Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN) (3°50′25″S, 32°24′41″O) e Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP) (00°55′02″N, 29°20′44″O, no Atlântico, e Sargocentron rubrum, do Mar de Andaman, no oceano Índico. Detalhes sobre as amostras das espécies são detalhadas na Tabela 4.
Tabela 4. Dados das espécies de Holocentridae utilizadas nas análises citogenéticas.
Regiões Oceânicas Oceano Atlântico Ocidental Meso-Atlântico Espécies Índico COSTA do Fernando de Ilha de Mar de ASPSP N Brasil Noronha Trindade Andaman Holocentrus 14 05 02 01 - 22 adscensionis Myripristis 15 - - 11 - 26 jacobus Sargocentron - - - - 02 02 rubrum 69
Os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica através da injeção intramuscular e intraperitoneal de complexos de antígenos atenuados (MOLINA, 2001; MOLINA et al., 2010). Após 24 horas, os animais foram anestesiados com óleo de cravo (1ml/15L de água salgada) e eutanasiados para remoção do rim anterior. Cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de fragmentos do rim anterior foram dissociados em meio de cultura RPMI 1640, de acordo com a técnica in vitro de curto termo preconizada por GOLD et al. (1990). As regiões organizadoras de nucléolos ativos (RONs) foram detectadas pela impregnação com solução de nitrato de prata (HOWELL & BLACK, 1980). As regiões heterocromáticas foram identificadas através da técnica de bandamento C, segundo Sumner (1972). Os cromossomos foram adicionalmente corados com os fluorocromos base-específicos Cromomicina (CMA3) e 4'-6-diamino-2-fenilindol (DAPI) (SCHWEIZER, 1980). As hibridizações fluorescentes in situ foram realizadas de acordo com PINKEL et al. (1986), utilizando sondas de DNAr 18S, 5S, microssatélites (GA)15, Tol2 e Rex3. As sondas de DNAr 5S (200 pb) e DNAr 18S (1400 pb) foram obtidas de amostras de DNA de Rachycentron canadum via PCR usando os primers A 5'-TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3'/ B 5' GAG AGC GCT GGT ATG GCC AGC-3' (PENDÁS et al., 1994) e NS1 5'-GTA GTA ATA TGC TTG TCT C-3' / NS8 5'-TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA-3' (WHITE et al., 1990), respectivamente. As sondas Rex3 foram obtidas via PCR a partir da amplificação de DNA de M. jacobus usando os primers Rex 3 F 5′-CGG TGA YAA AGG GCA GCC GTC - 3 ′ e Rex 3 R 5′- TGG CAG ACN GTG GTG GT-3 G, foi usado para amplificar a codificação domínios 1, 2, 2A, A e B do gene RT, ambos designados dos genes de Xiphophorus (VOLFF et al., 1999; VOLFF et al., 2000) e amplificadas de acordo com VALENTE et al. (2011). As sondas para Tol2 foram obtidas através do DNA genômico de M. jacobus usando os primers 4 F 5’ - ATA GCT GAA GCT GCT CTG ATC – 3’ e 4 R 5’ – CTC AAT ATG CTT CCT TAG G – 3’ (KAWAKAMI & SHIMA, 1999) e as sondas dos oligonucleotídeos enriquecidos com sequências de microssatélites (GA)15 obtidas de acordo com KUBAT et al. (2008). Todas as sondas foram marcadas por nick translation (Roche, Mannheim, Alemanha). As sondas DNAr 5S foram marcadas com biotina-14-dATP (Invitrogen) e detectadas com avidina-FITC (Sigma), enquanto as sondas DNAr 18S e Rex3, Tol2 e 70
(GA)15 foram marcadas com digoxigenina-11-dUTP (Roche) e detectadas com anti- digoxigenina-rodamina (Roche). As micrografias foram obtidas usando um fotomicroscópio de epifluorescência Olympus™ BX51 (Olympus™, Tóquio, Japão) com filtros apropriados equipados com o sistema de captura digital Olympus™ DP73 usando o software cellSens (Olympus™). Os tipos cromossômicos foram identificados de acordo com a posição do centrômero (LEVAN et al. 1964) e organizados em ordem decrescente de tamanho. A preparação dos cariótipos, e idiograma foram realizadas usando o software Photoshop CS6.
Resultados
Holocentrus adscensionis (Holocentrinae) apresentou um cariótipo com 2n=50, composto por 2m+6sm+16st+26a (NF=74). Este padrão cariotípico se mostrou invariável entre populações do Arquipélagos de São Pedro São Paulo e de Fernando de Noronha, ilha de Trindade, e regiões costeiras da província brasileira (Figura 8). Sargocentron rubrum, originária do Índico, também pertencente a subfamília Holocentrinae exibiu 2n=48 cromossomos acrocêntricos (NF=48), mesmo padrão encontrado nas populações de M. jacobus (Myripristinae) do Arquipélago de de São Pedro São Paulo e da costa brasileira (Figura 8). Em S. rubrum os sítios Ag-RONs/DNAr 18S estão localizados na região terminal do braço curto do par 24, enquanto em M. jacobus eles ocupam os braços longos do par 1 (Figura 8, em destaque). Holocentrum adscensionis exibiu RONs múltiplas localizadas nos braços curtos do par 2 (sm) e par 12 (st), coincidindo com dados prévios para a espécie (BACURAU & MOLINA, 2004). Regiões ricas GC+ foram exclusivamente co-localizadas com os sítios Ag-RONS em todas as espécies. Blocos heterocromáticos estavam dispostos preferencialmente nas regiões pericentroméricas dos cromossomos das espécies, com marcações adicionais no par 11, em H. adscensionis e nas regiões terminais dos braços longos dos pares 6, 11 e 18, em S. rubrum (Figura 8). 71
Figura 8. Cariótipos das espécies Myripristis jacobus, Sargocentron rubrum e Holocentrus adscensionis, com coloração com Giemsa e bandamento C. Em destaque os pares portadores de sítios Ag-RONs. Barra = 5µm. Sítios DNAr 18S mostraram-se co-localizados com as RONs nas espécies e invariáveis quanto à distribuição e frequência entre as populações de H. adscensionis e M. jacobus analisadas (Figura 9). Os sítios DNAr 5S são simples, localizados nos braços curtos do par 24, em H. adscensionis, par 10, em M. jacobus e do par 22, em S. rubrum. Os elementos Rex3 mostraram um acúmulo sobre regiões heterocromáticas nos centrômeros, apresentando clusters menos conspícuos em S. rubrum. 72
+ - Figura 9. Hibridização in situ com sondas de DNAr 18S (vermelho; sinais CMA3 /DAPI na parte superior da caixa) e 5S (verde) e Rex3 em Myripristis jacobus, Sargocentron rubrum e Holocentrus adscensionis. Barra = 5µm. O elemento transponível Tol2 apresentou-se localizado em regiões heterocromáticas de M. jacobus e disperso ao longo dos braços dos cromossomos em H. adscensionis e S. rubrum. O padrão de distribuição destas sequências foi similar entre as populações de H. adscensionis (costa brasileira e ilha de Trindade) e M. jacobus (costa brasileira e ASPSP) (Figura 10).
As sequências microssatélites (GA)15 apresentaram um padrão de hibridização com acentuada concentração nas regiões heterocromáticas centroméricas e nas regiões terminais dos braços cromossômicos (Figura 10). 73
Figura 10. Hibridização in situ fluorescente de sequências (GA)15, e do elemento transponível Tol2 em Holocentrus adscensionis (populações costa brasileira e Ilha de Trindade) e Myripristis jacobus (populações costa brasileira e ASPSP) e Sargocentron rubrum (Índico). Barra = 5μm
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Discussão
As espécies M. jacobus, único representante da subfamília Myripristinae, no Atlântico e S. rubrum (Holocentrinae) compartilharam uma mesma macroestrutura cariotípica (2n=48 acrocêntricos), que diante do largo tempo de divergência Myripristinae e Holocentrinae (50 Ma.) (DORNBURG et al., 2012), sugere constituir uma condição conservada e plesiomórfica para a Holocentridae. Os gêneros Myripristis (Myripristinae) e Sargocentron (Holocentrinae) tiveram uma origem comum na região do Indo-Pacífico (DORNBURG et al., 2014). O gênero Myripristis originou-se na região do Arquipélago Indo Australiano (IAA), com a posterior colonização do Atlântico por M. jacobus, via oceano Índico Ocidental (FLOETER et al., 2008; DORNBURG et al., 2012, 2014). O período de origem de H. adscensionis é desconhecido, contudo, sabe-se que o gênero é endêmico do Atlântico e que as linhagens de Holocentrinae do Atlântico e do Indo-Pacífico foram isoladas pelo fechamento do mar de Tethys entre 11-18 M.a., durante o Mioceno (BELLWOOD & WAINWRIGHT, 2002). Holocentrus adscensionis apresenta um cariótipo numérica e estruturalmente divergente (2n=50, NF=74), assim como uma organização do DNAr peculiar. De fato, sítios Ag-RONs/DNAr 18S múltiplos nesta espécie indicam intensas reorganizações cromossômicas, decorrentes de inversões pericêntricas, consideradas como principal mecanismo de diversificação cromossômica em diversos grupos de peixes marinhos (GALETTI et al., 2000; MOLINA & GALETTI, 2004; RODRIGUEZ et al., 2007; ARAUJO et al., 2010; SOARES et al., 2017) e a ocorrência de um evento de fissão cêntrica na modelagem do cariótipo da espécie. O mapeamento de sequências repetitivas do genoma possibilita identificar e acompanhar mudanças genômicas durante o processo evolutivo (OZOUF-COSTAZ et al., 2004; VALENTE et al., 2011; YANO et al., 2014). Famílias multigênicas como DNAr 45S e 5S fornecem marcadores citotaxonômicos que tem se mostrado resolutivos em abordagens evolutivas em peixes marinhos (PISANO & GHIGLIOTTI, 2009; CALADO et al., 2013, 2014; AMORIM et al., 2016; SOARES et al., 2017), mas ainda não foi investigada em espécies de Holocentridae. A presença de sítios de DNAr 18S simples em M. jacobus e S. rubrum, representantes das duas famílias de Holocentridae, além de uma baixa quantidade de heterocromatina, constituem características consideradas plesiomórficas para 75
Percomorpha (GALETTI et al., 2000; MOLINA, 2007; MOTTA-NETO et al., 2011; CALADO et al., 2013). Desta forma os sítios DNAr múltiplos presentes em H. adscensionis são indicativos que além de modificações na macroestrutura cariotípica estas foram acompanhadas por considerável reorganização interna dos cromossomos. Os sítios DNAr 5S estão localizados em um único par cromossômico em todas as espécies, em arranjos não-sintênicos com os sítios DNAr 18S, condição recorrente em Percomorpha marinhos (PAIM et al., 2014; GETLEKHA et al., 2016; COSTA et al., 2016; BORGES et al., 2019), e que confirma a evolução independente desses loci (MARTINS & WASKO, 2004). Diante da dinâmica evolutiva do DNAr nos cromossomos de peixes (GORNUNG, 2013) e das diferenças de tamanho apresentadas pelos pares portadores nas espécies não é possível inferir sobre o grau de homeologia entre eles.
Organização dos elementos Rex3, Tol2 e repetições microssatélites (GA)15
Elementos transponíveis constituem agentes mobilizadores de mudanças cromossômicas em teleósteos (SCHAACK et al., 2010; CABRAL-DE-MELLO et al., 2011, SCACCHETTI et al., 2012, DE SENE et al., 2015). Esses elementos representam uma das classes de DNA repetitivos em maior número no genoma dos eucariotos e a mais amplamente estudadas (LÓPEZ-FLORES et al., 2012; BISCOTTI et al., 2015; CANAPA et al., 2015). Devido a sua mobilidade na molécula de DNA, através de processos de excisão e insersão, podem ser indutores de rearranjos cromossômicos (VOLFF et al., 1999). Sendo, por isso, utilizados como marcadores moleculares para rastrear a história evolutiva de clados particulares (VOLFF et al., 2003). Seus mecanismos de transposição podem ser via RNA (retrotransposons) ou DNA (transposons) (MALIK et al., 1999; VOLFF et al., 1999). Dentre os retrotransposons, os elementos Rex têm sido amplamente mapeados nos genomas de teleósteos (CARDUCCI et al., 2018), evidenciando sua localização tanto em regiões heterocromáticas (DA SILVA et al., 2002; GROSS et al., 2009), como dispersos nos cromossomos incluindo regiões eucromáticas (OZOUF-COSTAZ et al., 2004; TEIXEIRA et al., 2009; CIOFFI et al., 2010; FERREIRA et al., 2011; COSTA et al., 2013; SUPIWONG et al., 2014). 76
Elementos Rex3 se apresentaram preferencialmente agrupados sobre as regiões heterocromáticas nos cromossomos das espécies de Holocentridae. Em H. adscensionis, que passou por profundas mudanças cariotípicas mais marcantes, os elementos Rex3 não são particularmente abundantes. Embora não se descarte sua participação nas mudanças cariotípicas ocorridas na espécie, o processo de divergência cariotípica pode ter ocorrido de forma não necessariamente rápida, tendo em vista que esta espécie apresenta uma ancestralidade comum com S. rubrum estimada entre 11 e 18 M.a. (DORNBURG et al., 2012). O padrão de co-localização entre blocos de Rex3 em regiões ricas em heterocromatina, ocorre em algumas espécies de Perciformes (OZOUF-COSTAZ et al., 2004) e Cichlidae (GROSS et al., 2009; TEIXEIRA et al., 2009; FERREIRA et al., 2011; VALENTE, 2011). Essa distribuição sugere seu envolvimento na estrutura e organização da heterocromatina, que devido a menor densidade gênica e recombinação (SZAUTER, 1984), desempenha um papel crucial no controle do número de cópias de TEs (CHARLESWORTH & LANGLEY, 1989). Elementos Tol2, transposon da família hAT, possui diferentes formas de distribuição, ele por exemplo, está distribuído no peixe Oryzias latipes em diferentes regiões genômicas e apresentando uma alta homogeneidade em suas sequências (KOGA & HORI, 1999), ou espalhados em regiões eucromáticas com blocos concentrados em regiões de DNAr 18S como encontrado em Rachycentron canadum (COSTA et al., 2013). Nas espécies de Holocentridae, os elementos Tol2 se apresentam dispersos ao longo das regiões eucromáticas e heterocromáticas dos cromossomos, não revelando variações populacionais nas espécies H. adscensionis e M. jacobus. Componentes do DNA repetitivos, os microssatélites representam sequências polimórficas de DNA formadas por repetições curtas compostas por cinco ou seis bases intercaladas, dispostas in tandem nos genomas eucariotos (TAUTZ, 1989; ZANE et al., 2002). Devido a alta variabilidade têm sido amplamente utilizados em mapeamento genético (SHIMODA et al., 1999; COIMBRA et al., 2003) e como marcadores genéticos em estudos populacionais (HATANAKA et al., 2006; PRIMMER et al., 2006; SAENJUNDAENG et al., 2018). Nas espécies aqui analisadas as repetições de microssatélites revelaram um acúmulo preferencial nas regiões heterocromáticas, localizadas em centrômeros e 77
regiões terminais dos cromossomos. Embora possam ocorrer de modo disperso em regiões eucromáticas (GETLEKHA et al., 2016), sua localização nas porções heterocromáticas pode ser predominante em alguns grupos (CIOFFI & BERTOLLO, 2012), padrão que tem sido observado em variados clados, como Cypriniformes (SHIMODA et al., 1999; SAENJUNDAENG et al., 2018), Siluriformes (VANZELA & COLAÇO, 2002), Characiformes (HATANAKA et al., 2006).
A co-localização de Rex3/Tol2/(GA)15 em regiões heterocromáticas das espécies de Holocentridae, corrobora que as regiões heterocromáticas podem constituir importantes reservatórios de TEs (Da SILVA et al., 2002; FISCHER et al., 2004), como identificado em Tetraodon nigroviridis e em alguns ciclídeos (FISCHER et al., 2004, FERREIRA et al., 2011; SCHNEIDER et al., 2015) e Rachycentron canadum (COSTA et al., 2014).
Figura 11. Idiogramas representativos dos cromossomos das três espécies de Holocentridae evidenciando a distribuição de diversas classes de DNAs repetitivos.
As espécies Holocentridae também apresentam co-localização de sequências de DNAr/TEs/microssatélites em alguns cromossomos. Esse arranjo tem sido identificado em peixes (COSTA et al., 2013; PANSONATO-ALVES et al., 2013; SCHNEIDER et al., 2013; SAENJUNDAENG et al., 2018). Sendo sugerido que o locus DNAr pode servir como um nicho para a conservação a longo prazo dos elementos 78
transponíveis (YE & EICKBUSH, 2006; ZHANG et al., 2008). Além disso, a associação entre DNAr/TEs frequentemente contribui no aumento e variabilidade dos sítios DNAr (CIOFFI et al., 2010; GROSS et al., 2010; NAKAJIMA et al., 2012; SCHNEIDER et al., 2013). Embora a participação dos TES (Rex3 e Tol2) pareça pouco provável nas espécies de Holocentridae, a co-localização de DNAr/Microssatélite (GA)15 e a presença de sítios de microssatélites em cromossomos derivados de rearranjos cromossômicos, fornecem indícios de que estes elementos possam ter tido um papel na dinâmica evolutiva dos genes ribossomais e na diversidade cariotípica ocorridas em H. adscensionis.
Homeostase citogenética populacional em H. adscensionis e M. jacobus no Atlântico Ocidental
Myripristis jacobus e H. adscensionis se distribuem nas províncias biogeográficas do Atlântico Ocidental, ilhas meso-Atlânticas, Costa Brasileira e ilhas associadas e região do Grande Caribe (BRIGGS, 1995). Em geral essas espécies exibem extensa homogeneidade genética no Atlântico, muito embora algum grau de estruturação populacional possa ocorrer entre algumas populações de H. adscensionis da costa do Brasil e de ilhas meso-Atlânticas (BOWEN et al., 2006). Diferenciações cromossômicas interpopulacionais no Atlântico, têm sido demonstradas entre populações isoladas pela barreira do Amazonas/Orinoco (MOTTA-NETO et al., 2011b; FERNANDES et al., em preparação). Em contraste, análises citogenéticas comparativas entre populações de H. adscensionis abrangendo regiões costeiras do Nordeste do Brasil e Arquipélagos de Fernando de Noronha (367 km da Costa NE do Brasil) e São Pedro e São Paulo (1.100 km da costa NE do Brasil) e da ilha de Trindade (1200 km da costa SE do Brasil), demosntraram uma homogeneidade cariotípica entre essas extensas áreas oceânicas. Similaridades cariotípicas também ocorrem entre as populações de M. jacobus, da costa NE do Brasil e a população isolada das ilhas Meso-Atlânticas do Arquipélago de São Pedro e São Paulo, que também não exibiram variabilidade cariotípica relacionada a aspectos estruturais, numéricos e de posicionamento e frequência dos sítios DNAr 18S e 5S. Essa homeostase dentro dos holocentrídeos do Atlântico se mantém inclusive quando analisadas o mapeamento do transposon Tol2 e de 79
sequências altamente polimórficas como repetições de microssatélites (GA)15. Um dos fatores contemporâneos relacionados a homogeneidade genética é o fluxo gênico mantido através de adultos migradores ou por larvas pelágicas. Embora a duranção do Período Pelágico Larval (PPL) não sejam um preditor exclusivo para níveis de estruturação genética, têm-se demonstrado esta associação em diversas espécies (DOHERTY et al., 1995; PLANES et al., 1998). Em Myripristis jacobus e Holocentrus adscensionis, os PPLs são relativamente longos com 40-58 dias e 43-56 dias, que pode ser estendido nesta última espécie a 71 dias, devido a um estágio pelágico adicional (TYLER et al., 1993). Esta condição em associação com características biológicas e comportamentais das espécie, a falta de barreiras geográficas efetivas, podem auxiliar na manutenção de um alto fluxo gênico entre suas populações (BOWEN et al., 2006; ALLEN & ERDMANN, 2009; FARRAG et al., 2018), e contribuir para o tamponamento de padrões cromossômicos divergentes. De modo geral, esses dados corroboram o panorama citogenético conservativo, seja na macro ou microestrutura cariotípica, identificado em populações de diversas outros grupos de peixes em vastas áreas do Atlântico Sul (MOLINA & GALETTI, 2004; MOLINA, 2007; MOTTA-NETO et al., 2011a; CUNHA et al., 2014; MOLINA et al., 2018; neste estudo).
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Conclusões
A partir do estudo comparativo da macroestrutura cromossômica e da microestrutura através da distribuição dos genes ribossomais, de TEs (Rex3 e Tol2) e microssatélites (GA)15, foi possível demostrar a ocorrência em Holocentridae de um padrão comum basal formado por 2n=48 cromossomos acrocêntricos, compartilhado por M. jacobus e S. rubrum, e um padrão derivado com 2n=50 (2m+6sm+16st+26a) apresentado por H. adscensionis. DNAs ribossomais 18S e 5S se mostraram marcadores citotaxonômicos eficientes para espécies desta família, fixados ao longo da sua divergência evolutiva. Elementos Rex3 e repetições de microssatélites (GA)15 apresentam um padrão similar de hibridização. A ausência de diferenças citogenéticas interpopulacionais entre populações Atlânticas de Holocentridae indicam homeostase cariotípica dentro da família, sendo apoiada pelos padrões filogeográficos pouco estruturados presentes nas espécies desta região. Os dados citogenéticos apresentados aqui, que se mostraram eficientes para a ampliação do entendimento sobre a carioevolução dos holocentrídeos, bem como sobre variação geográfica em sua área de distribuição e devem ser complementados com análises adicionais que abarquem um número maior de espécies do grupo.
Agradecimentos Os autores agradecem ao CNPq pelo apoio financeiro, à CAPES pela bolsa de doutorado à MAF, e ao ICMBio/SISBio pela autorização na coleta de espécimes (Licença #19135-8). Agradecemos ao Dr. José Garcia Júnior pela identificação taxonômica dos espécimes.
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6 CONCLUSÕES GERAIS
• A ocorrência de diferentes classes de DNAs repetitivos em cromossomos aparentemente homeólogos sugere que apesar das intensas mudanças macroestruturais nos cromossomos das espécies de Acanthurus do Atlântico, estes ainda conservam significativas porções sintênicas. • As análises populacionais indicam em geral um quadro de baixa variação inter- populacional, apesar de evidências de algum grau de diversificação entre as populações de A. coeruleus acima e abaixo da barreira Amazonas/Orinoco. • A ausência de diferenças citogenéticas interpopulacionais em espécies Atlânticas das famílias Holocentridae sugere que tais grupos apresentam homeostase cariotípica. • Os gêneros Sargocentron e Holocentrus (Holocentrinae) apresentaram cariótipos diferenciados, indicando uma notável diversificação entre espécies proximamente relacionadas. • Os DNAs ribossomais apresentam-se como marcadores citotaxonômicos eficientes para espécies da família Holocentridae. • O mapeamento do transposon (Tol2) e do retrotransposon (Rex3) revelou um padrão diferenciado de hibridização em Holocentridae. Com Tol2 altamente difundido pelo genoma e Rex3 co-localizado com regiões heterocromáticas e
com repetições de microssatélites (GA)15. • A variação cariotípica, estrutural, numérica e de sítios de DNAr 18S ocorrida
em H. adscensionis pode ser devida a ação de TEs e microssatélites (GA)15.
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