Universidad Autonoma De Nayarit

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Universidad Autonoma de Nayarit

Posgrado en Ciencias Biol6gico Agropecuarias

Especialidad en Ciencias Ambientales

UNIVERSIOAOAUTOIIOMAOINA

Efecto Genot6xico de Temefos en Celulas HepG2

Tesis Que para obtener el titulo de Maestro en Ciencias

Presenta Jose Francisco Herrera Moreno

Oirectora Ora. Aurora Elizabeth Rojas Garcia Codirectora Ora. Irma Martha Medina Oiaz

XaliscoNayaril,mayode2015 UNIVERSIDAD AUT6NOMA DE NAYARIT ~ "'ORATOR'O DO CONTAM"'C'ON T TOX'C",OG" AMa"N'" "A" """ Teplc, Nayant, a 14demayode2015 -t; UAN

Dr. Juan Diego Garcia Paredes Coordinadorde PosgradoenCiencias Biol6gicasAgropecuarias (CBAP) PRESENTE

Por este conducto nos permitimos comunicarle que la tesis del estudiante de maestria Jose Francisco Herrera Moreno, titulada "Efecto Genot6xico de Temefos en Celulas HepG2", ha sldo revisadayaprobadaencontenidoyformato. Por 10 que consideramos queelestudiantepuedecontinuarconlostramitesparasolicitarfecha de examendegrado

Sin mas por el momento, agradecemos la atenci6n prestada y aprovechamos para enviarle un cordial saludo.

~~. Ora Aurora Elizabeth ROJas Garcia --

Ora Irma Martha MedmaOlaz ~

Ora Yael Yvette Bernal Hernandez

Ora Bnscla Socorro Barr6nVIvanco 1'1

M en C Carlos Alberto Romero Banuelos Cl-. AI! ~ k ~

c.c.p.ArchivoAERG Cludld dill Culturl "Amldo NINO" ldlflcloClMIC03.Tlplc. NIYlrll CPo 63155 Til. (311) 2118800exc. 8919 FIx 21188U UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NAYARIT POSGRADO EN CIENCIAS BIOLOGICO AGROPECUARIAS

CBAP/109/15

Xalisco, Nayarit., 20 de mayo de 2015

Ing. Alfredo Gonzalez Jauregui Oirector de Administracion Escolar Pre sen t e.

Con base al oficio de fecha 14 de mayo de 2015, enviado por los Cc. Ora. Aurora Elizabeth Rojas Garcia, Ora. Irma Martha Medina Oiaz, Ora. Yael Yvette Bernal Hernandez, Ora. Briscia Socorro Barron Vivanco V M. en C. Carlos Alberto Romero Banuelos, donde se nos indica que el trabajo de tesis cumple con 10 establecido en forma y contenido, ydebido a que ha cumplidocon los demas requisitos que pide el Posgrado en Ciencias Biologico Agropecuarias, se autoriza al C. Jose Francisco Herrera Moreno, continue con lostramites necesarios para la presentacion del examen degrado de Maestro.

Sin mas por el momenta, me despido de usted y reciba un cordialsaludo.

Expediente.

Unidad Academica de Agricu)tura Carretera Tepic-Compostela Km. 9C.P. 63780, Xalisco Estetrabajoserealiz6enellaboratoriodecontaminaci6nytoxicologlaambiental, de la Universidad Aut6noma de Nayarit, bajo la direcci6n de la doctora Aurora Elizabeth Rojas Garcia y la codirecci6n de la doctora Irma Martha Medina Dlaz, con apoyo del proyecto CONACyT-C. Basica (#156673) A la persona mas importanle en mi vida, Mama sabes que lodos mis logros y vicloriaslascompartoconligo, hemoscrecidojunlosysobrelodohemosluchado por salir adelanle como la familia que somos. Agradezco el apoyo inmenso que he recibidodelu parte en esla elapa,ysobrelodoa 10 largo de mi vida. Eres para mi simbolode amor, enlrega ydedicaci6n, una mujerque ha sabidosaliradelanle pesea lascircunslanciasadversasen las que Ie has afronladoa lavida, como loda una guerrera. Gracias mami por aguanlar mi caracler, mis momenlos de eslres y por siempre eslar conmigo. TU Y YO JUNTOS SIEMPRE iTE AMO!

A mi Tia Mayra, sin duda alguna has side una persona que siempre ha represenlado para mi un ejemplode lenacidad y fortaleza, gracias porlodo lu apoyo y por com partir mis alegrias, mis lrislezas y lanlos recuerdos memorables, me sienlo muy orgulloso de Ii, Gracias, iTe amo!

A mi Tia Sayra, agradezco lodo lu apoyo en esle lranscurso, valoro mucho el inleresdelu partedesaberc6moibaavanzandoalo largo de eslosdosanos.Me sienlo muy orgulloso de Ii y aprecio el carino brindado en cada momenlo. iTe amo!

Amisqueridosabuelos,graciasporlodoelapoyobrindadohaciamipersona,son pilares fundamenlales en mi vida y a pesarde que no paso elliempo que yo quisieraconusledes,siempreeslanpresenlesconmigo.iLosamo!

A mi direclora y codireclora de lesis: Ora. Aurora Elizabelh Rojas Garcia y Ora. Irma Martha Medina Oiaz, gracias por guiarme duranle mi formaci6n desde mi lesisdelicencialurahaslahoy, pordejarenmi persona no solo el amoreinleres deeslemundomaravillosoquenosofrecelainvesligaci6ncientlfica,sinolambien por el apoyo que he recibido para mi formaci6n profesional y personal, por aceplarmeenellaboralorio,graciasinfinilasporlodossusconsejosysuejemplo, porinculcarmeanorendirmeyseguiradelanle,pordedicarsuliempoyespacioy ser para mi ejemplo de responsabilidad, honeslidad y amislad. Poria confianza olorgada, lavozfrancayhonesla, porlos momenloscompartidos, queahorason inolvidablesen mivida. Sin duda alguna mi admiraci6n, respetoy carinosincero paraustedesmismadresacademicas.

A mi comite tutorial y asesores: Ora. Maria de Lourdes Robledo Marenco, he tenido el placer de compartir a su lado mi camino de formaci6n academica, agradezco sus consejos y su apoyo, admiro la labor incansable de una investigadora como usted y agradezco cada conlribuci6n para lIevar a buen termino mi maestria, la quiero mucho. Ora. Briscia Socorro Barr6n Vivanco, he valoradoyapreciadocadaunadelasobservacionesrealizadaseneItrayectode mi formaci6n como maestro en ciencias, aprecio su disponibilidad para apoyarme en la resoluci6n de dudas, en sus comenlarios y su excelente actitud, sus palabras dealiento, francasyoptimistas ysu valiosa contribuci6n parafinalizar esta etapa de mi vida profesional, cuenta con mi respeto y carino sincero, la quiero mucho. Ora. Yael Yvette Bernal Hernandez, gracias infinitas por tu apoyo y amistad duranteeste proceso, sinduda alguna, heaprendidomuchodeti,sobre todolaperseveranciaytenacidad,comovaloresfundamentales,valoroeltiempo compartido, opiniones y aportaciones hacia mi persona, te quiero mucho. M. en C Carlos Alberto Romero Banuelos, sus contribuciones, correcciones, el apoyo brindado y los momentos compartidos, sin duda ayudaron en mi trabajo y crecimiento profesional. Agradezco a cada uno su apoyo y sobretodo las ensenanzas que han forjado mi camino en la investigaci6n cienlifica. Gracias infinitas.

Ora. Ana Maria Salazar y a.F.B. Monserrat Sordo Cedeno, gracias por su apoyo en latecnica de micronucleos,valiosa ayuda y comentarios que im pactaronen mi desempenoexperimentalduranteestetrayecto.

Agradezco a cada uno de mis maestros, en especial al Or. Juan Oiego Garcia Paredes, coordinadordelposgradoyasuequipodetrabajo, graciasporsu valiosoapoyoycontribucionesduranteesteproceso.

Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologla (CONACyT) por la beca otorgada para lIevar a cabo mi formaci6n como maestro en ciencias ambientales Amigos y companeros del Laboratorio de Contaminaci6n y Toxicologia Ambiental, agradezcodemanerainfinitatodoelapoyorecibidoparallevaracaboestameta en mi vida y porayudarme a cumplirlos objetivos planteados, sin dudaalguna,su apoyo es invaluable. Alma y Nestor, gracias por compartir el tiempo y convertirse en c6mplices y amigos en esta elapa, son parte importanle de mi formaci6n, he aprendido mucho de usledes. Guille y Franc, gracias por los momenlos compartidos y sus aportaciones. A mis companeros esludianles de laboralorio: Carmelila, Mirna, Guslavo, Pier, y Rigo, gracias por los momenlos agradables y de ensenanza que hemos com partido.

A Mayra y Sandra: graciaslolalesporlodoelapoyoque he recibidode su parte, es muy importanle para mi poder conlar con sus palabras de alienloy carino, he aprendido de usledes que la humildad y sencillez son base para un buen desempenoacademicoypersonal,cuenlan con micarinoyrespeto sincero. iLas quieromucho!FabyyPaly,graciasporlodasuayudayapoyohaciamipersona, cuentancon micarinoyrespelosincero, valoromuchosusconlribucionesduranle miformaci6n.

A misapreciadosamigos, que sonia familia que yo elegl yde quien he recibido apoyo fundamental en momenlos dificiles, con quienes he compartido momenlos defelicidad ydelrislezas, la maeslria meolorg61a posibilidad deconocerlos y esoparamiesunregalodelavida, eneslriclo orden alfabelicoy sinolvidarmede ninguno de mis mejores y mas queridos hermanos: Diana, Oscar y Paly, gracias infinilasporsoportarme, si bien escierto la vida no me dio la posibilidaddelener hermanosbiol6gicos, perolengohermanosdevidaqueson usledes.

A mis mejores amigos, es un honor poder conlar con personas de la calidad humana como 1a de usledes, con el paso de los anos nueslra amislad va madurandoyhaciendose masfuerte, son parte fundamenlal en mi vida, gracias por eslar conmigo: Alfredo, Anahid, Aurora, Deyril, Diego, Gema, Isidro, Marines y Yeidy. iLosadoro! Elpresentetrabajorepresentaunaetapafundamentaldetransici6nacademicay personal en mi vida. Cumpli objetivos y me he planteado nuevas metas

Dedicoestetrabajoytodoloqueimplicaelhaberculminadoestaetapa,ala persona que mas amo en este mundo, mi mejor amiga y mi compariera de grandesbatallas: Yolanda Guadalupe Herrera Moreno

iMamagraciasportodotuamorl iGraciasporhaceralgotangrande,pormirarsiempreadelante,porenseiiarmelo mejor!

La felicidadse alcanza cuando 10 que unopiensa, 10 que uno dice ylo que uno haceesttmen armonia Una persona debe eslablecer sus melas Ian pronlo como Ie sea posible,ydedicar lodo su lalenlo y energfa para hacerlas realidad. Con mucho esfuerzo puede lograrlo. 0 puede enconlrar algo que sea alJn mas gralificanle. Pero al final, no importacualseaelresullado, sabra que ha esladovivo

Waf/Disney Temefosesun plaguicida organofosforado usadoampliamenteen lascampanas desalud yfumigaci6n urbana. A pesardel usc generalizadode este plaguicida, pocos estudios en la literatura han examinado su potencial genot6xico a bajas concentraciones. EI objetivo de este estudio fue investigar si lemefos liene un efecto citot6xico, citostatico 0 genot6xico en celulas HepG2. Para evaluar la citotoxicidad, se utiliz6 el ensayo colorimetrico MTT. Los efectos cit6statico y gen~t6xico se detenminaron por el metodo propuesto por Easlmond y Tucker (1989) y por el ensayo de micronucleos por bloqueo de citocinesis (MNBC) respectivamente. Se determin6 la frecuencia de puentes nucleoplasmicos, gemaciones,celulasapopt6ticasynecr6ticas. Los tratamientos con temefos (0.5 10~M)durante48horasnoafectaronlaviabilidadcelular, nimodificaronel indice de divisi6n nuclear (IN), sin embargo el tratamiento con temefos a 10 ~M aument6 significativamete el numero de micronucleos. Los resultados de este estudio sugieren que la biotransformaci6n de temefos pod ria generar metabolitos genot6xicosen celulasHepG2 Temephos is an organophosphorus pesticide widely used in health campaigns and urban fumigation. Despite the widespread use of this pesticide, few studies in the literature have examined theirgenotoxic potential at low concentrations. The aim of this study was to investigate whether temephos has a cytotoxic, cytostatic or genotoxic effect in HepG2 cells. To assess cytotoxicity MIT colorimetric assay was used. The cytostatic and genotoxic effects were determined by the method proposed by Eastmond and Tucker (1989) and the cytokinesis block micronucleus assay (CBMN) respectively. Nucleoplasmic bridges, buds, apoptotic and necrotic cells frequency was determined. Temephos treatments (0.5-10 ~M) for 48 hours did not affect cell viability or modified the nucleardivisi6n index (NI), but treatment with 10 uM of temephos significantly increased the number of micronuclei. The results of this study suggest that biotransformation may generate temephos genotoxicmetabolitesinHepG2celis iNDICE

RESUMEN . ABSTRACT . L1STA DE ABREVIATURAS.. L1STA DE FIGURAS L1STA DE TABLAS....

1. INTRODUCCION . 1.1 Generalidadesdeplaguicidas.. 1.2 Plaguicidasorganofosforados... 1.3 Toxicidadde los POF . 1.4 EfeclosgenoI6xicos . 1.5 Generalidadesdelemefos 1.5.1 Caracleristicasfisicoquimicas 1.5.2 Toxicocinetica.... 1.5.3 Toxicidadaguda 1.5.4 Genoloxicidadycarcinogenicidad. 1.6 CelulasHepG2.... 1.7 EnsayodemicronucleoscomobiomarcadordeefeclogenoI6xico....

2 JUSTIFICACION .

3. HIPOTESIS ..

5 METODOLOGiA 11 5.1 Diseno del esludio... 11 5.2 Cullivo celular HepG2 11 5.3 Tratamientos con temefos 11 5.4 Evaluaci6ndelacitotoxicidadcelular.. 13 5.5 Evaluaci6ndelacitostaticidadcelular. .. 14 5.6 Cultivocelularparaevaluaci6ndegenotoxicidad 14 5.7 Cosechacelular..... 15 5.8 Lectura de parametros de genotoxicidad .. 16 5.9 Analisisestadistico...

6. RESULTADOS Y DISCUSION 17 6.1 Citotoxicidadcelular... 17 6.2 Citostaticidadcelular. 19 6.3 21 ADN Acidodesoxirribonucleico. AChE AMES Ensayo de mutagenicidad con la bacteria Salmonella Iyphimurim. Atmosferaspormetrocubico AgenciaparaelRegistrodeSustanciasT6xicasyEnfermedades. em 2 Centimetrocuadrado

Cyt-B CYP DL50 DMSO Dubelcobs modified eagle medium Escherichia coli EDTA Acido etilendiaminotetracetico ENT Esterasaneurot6xica EPA Agencia de Protecci6n Ambiental de los Estados Unidos de America EXTOXNET The Extension Toxicology Network FAO Organizaci6n de las Naciones Unidad para la Agricultura y la Alimentaci6n. FISH Ensayodehibridaci6ninsiluconfluorescencia. g/cm3 Gramoporcentimetrocubico g/mol Gramo por mol HCI Acidoclorhidrico HepG2 Celulasdehepatocarcinomahumano. HSDB Hazardous Substances Databank. IN fndicenuclear. INCHEM Chemical Safety Information from Intergovernmental Organizations INECC Instituto Nacional de Ecologia y Cambio Climatico. LogKOW Coeficientedepartici6noctanol-agua. mg/kg Miligramoporkilogramo M1 Celulascon1 nucleo. M2 Celulascon 2 nucleos. M3 Celulascon3nucleos. MN MNBC Ensayo de micronucleos por bloqueo de citocinesis. MNM Micronucleos en celulas mononucleadas. MIT Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol. MitomicinaC Totaldecelulascontadas.

NR Neuropatiaretardada. OMS Organizaci6n Mundial de la Salud. POF Plaguicidaorganofosforado Ensayo de inducci6n de mutagenicidad con Salmonella typhimurim. Ilg/ml Microgramopormililitro III Microlitro. 11 M ·C Grado Celsius (Centigrado) Figura 1. Estructura quimica general de los plaguicidas organofosforados_ ..

Figura 2. Eslructuraquimicadetemefos.. _..

Figura3.Rutasdebiotransformaci6ndetemefos.

Figura 4. MorfologiacelulardeHepG2...

Figura 5. Reducci6ndeMTI..

Figura 6. Viabilidad de celulas HepG2 tratadas con temefos durante24y48

Figura 7. Indice de divIsi6n nuclear (IN) yporcentajedecelulasbinucleadas

(BN)encultivosHepG2tratadoscontemefos..

Figura 8. Microfotografiasrepresentativasdeestructurasnuclearesobser

vadas mediante el MNBC en celulas HepG2

Figura 9. Frecuencia de puentes nucleoplasmicosygemacionesen lalinea

celularHepG2.

Figura 10. FrecuenciadeapoptosisyMNencelulasmononucleadasenla

linea celular HepG2

Figura 11. FrecuenciadeMNenla linea celular HepG2

Tabla 1. Tratamientos de celulas HepG2 con temefos... 1.INTRODUCCI6N

1.1 Generalidadesdeplaguicidas

De acuerdo a la Organizaci6n de las Naciones Unidas para la Agricullura y la

AJimenlaci6n (FAO, 2002), un plaguicida es cualquier suslancia 0 mezcla de suslanciasdeslinadasa prevenir,deslruiroconlrolarcualquierplaga,incluyendo veclores de enfermedades humanas 0 de ani males, especies no deseadas de planlasoanimalesquecausenperjuiciosoqueinlerfierendecualquierolraforma eniaproducci6nagropecuariaoforeslal.Lospiaguicidaspuedenserclasificados de acuerdo a diferenles calegorfas, lales como: usc, composici6n quimica, naluraleza quimica, acci6n especifica, concenlraci6n, formulaci6n, modo de acci6n, grado de loxicidad y persislencia en el ambienle. Con base en su eslruclura qulmica los plaguicidas se clasifican en: organofosforados (POF), organoclorados,carbamalos,pirelroides,enlreolros(Gonzalez-Arias,2010)

1.2 Plaguicidas organofosforados

Los POF son esleres sinlelicos del acido fosf6rico 0 fosforolioico. La eslruclura quimicadeiosPOFcomprendeunalomodef6sforocenlralysurespeclivauni6n fosf6rica (P=O) 0 fosforolioica (P=S), R1 Y R2 generalmenle son grupos alquilo 0 arilo, el grupo(X) escaraclerislicodecadaespeciequimicaysueleconlribuirde manera importanle en las caraclerislicas fisicas, quimicas y biol6gicas del plaguicida (Hreljacy Filjpic, 2009) (Figura 1).

or R,

Figura 1. Eslruclura quimica general de los plaguicidasorganofosforados(Modificadode HreljacyFilipic,2009). Los POF se descomponen con mayor facilidad respecto a los plaguicidas organoclorados, sedegradan poroxidaci6nehidr6lisis, dandoorigenaproductos solubles en agua, porlo que son catalogados en un rango de no persistentesa moderadamentepersistentes. La vida media de POFpuedevariardediashasta meses (Ramirezy Lacasana, 2001). Porotro lado, referentea sus propiedades, 10sPOF, suelen serliposolubles, alraviesan barrerasbiol6gicasy penetranen el sistema nervioso central, pueden tener una mediana tensi6n de vapor, son degradables al sufrir reacciones hidroliticas en medio alcalino (Baddi y Varela, 2008). Respecto a la clasificaci6n, estructuralmente se dividen en fosfatos, fosfonatos, fosfinatos, fosforotioatos, fosfonotioatos, fosforoditioatos, fosforotritioatos,fosforamidotioatos

LaformaactivadelosPOFsedenominaox6n,estosseunendirectamentealsitio aclivo de la enzimaacetilcolinesterasa (AChE). La tasa de inhibici6n de laenzima depende del gruposaliente

EI mecanisme de toxicidad aguda de los POF es sobre el sistema nervioso central, mediante la inhibici6n de la AChE. Esta enzima, modula los niveles del neurotransmisor acetilcolina e interrumpe el impulso nervioso. Dentro de los sintomas ocasionados por los POFseencuentran: perdidade reflejos, dolor de cabeza, mareos, nauseas, convulsiones, coma y hasta la muerte (Jeyaratnamy Maroni,1994).

Encuantoalatoxicidadcr6nica,losPOFcausandiferentesformasdeneuropatia retardada (NR), un amplio rango de efectos neuroconductuales, psicol6gicos y neurodegenerativos. La evidencia sugiere que a dosis subagudas, los POF pueden interactuardirectamente con un ampliorangodeenzimas que son blanco para su acci6n, tal es el caso de la AChE. Asi mismo, provocan disrupci6n de membrana, recambio y fosforilaci6n de proteinas, disfunci6n mitocondrial, reorganizaci6ndelcitoesqueletoyestresoxidativo, sin embargo, losmecanismos noestan del todo comprendidos (Hargreaves, 2012}. Los mayores avances de la NR han side en el estudio de la fosforilaci6n de la esterasa neurot6xica (ENT), que es la protelna diana de la NR par POF; debido a que la uni6n de POF con la ENT produce fosforilaci6n e inhibici6n de la enzima, este proceso da lugar ala hiperfosforilaci6ndeproteinasubicadasenelcitoesqueletodecelulasnerviosas, alteraci6ndeltransporteintracelularyoriginala NR(Johnson, 1990)

1.4 Efectos genot6xicos

LosPOFtienenpropiedadesalquilantessobreelacidodesoxirribonucieico(ADN), al anadir grupos alquilo, principalmente grupos metilo y etilo en las bases nitrogenadas (Preussman etal., 1969; FestySchmidt, 1973). Estudiosinvitroein vivo han evidenciado los efectos genot6xicos de los POF. AI respecto, Chakravarthi et al. (2009) evaluaron la inducci6n de dane al ADN de monocrotofos en Iinfocitos humanos de sangre periferica, y encontraron que estecompuesto produce aberraciones cromos6micas e induce dane al ADN, medido mediante la longitud de la cola de cometa. Asi tambien, en estudios lIevados a caboenratasy ratones expuestos a POF, se encontr6 que metil pirimifos, produjo dane genot6xico en ratones, aument6 el numero de micronucleos (MN) en eritrocitos policromaticos y normocromaticos (Alabi et al., 2014). POF tales como c1orpirifos, metil paration y malati6n causan un sincremento de dane al ADN en linfocitos de rata, medianteel ensayo cometa yensayo poremisi6n defluorescencia (Ojha y Srivastava, 2014). Referente a estudios en humanos, se ha reportadoque estos compuestos pueden causardiferentestiposde alteraciones cromos6micastales como rupturas de cromosomas, cromosomas dicentricos, cromosomas en anillo, intercambio de cromatidas hermanas, translocaciones y endoreduplicaciones en linfocitos humanos de sangre periferica (Lieberman et al., 1998). Vivien et al (2013), reportaron que la exposici6n cr6nica a POF esta asociada con un aumento en la fragmentaci6n de ADN evaluado mediante el ensayo cometa y un aumento en la frecuencia MN en epitelio bucal, en un grupo de agricultores dedicadosalcultivodearroz

1.5 Generalidades de temefos

Temefos es un POF de am plio uso en campanas de salud publica y en fumigacionesurbanas(Donalisioetal., 2002; EPA, 2008). Debidoal usosanitario queseleda para el control del dengue, esteplaguicidaseaplicasobredep6sitos de agua de uso domestico asi como en diferentes cuerpos de agua. Su nombre quimico es O,O,O,O'-tetrametil-O,O'-tio-di-p-fenileno; comercialmente se Ie conoce como Abate, Abathion, Acibate, Alabaster, Biothion, Bithion, Difennthos, Ecopro, Fostem, Larvafos, Larvate, Larbate, Nimitex, Protemefos, T. M. Fos, Temephos, Swebate y Temefos (EPA, 2008). En la Figura 2 se muestra la estructura quimica de temefos, su f6rmula qulmica condensada es C16H2006P2S3 (INECC, 2013).

Figura 2. ESlructuraquimicadetemefos(INECC, 2013).

1.5.1 Caracteristicasfisicoquimicas

Temefospresentaunpuntodefusi6nde30.5·C,densidadrelativade1.32g/cm3, peso molecular de 466.48 g/mol, es soluble en compuestos organicos como bicloruro de etileno, acetonitrilo, tetracloruro de carbono, eterytolueno,espoco solubleenaguayes insoluble en metilciclohexanoyhexano. La presi6n de vapor de temefos es de 7.17 x1O·8 torr a 25 ·C, la ley de Henry de 1.47 x10-6 atm.m· 3.mol·'.eshidrolizadoconacidosybasesfuertes.supuntodeebullici6nesde120 a 12S·C. Temefostieneunelevadovalordecoeficientedepartici6noctanollagua (Kow= 4.91) caracteristica que aumenta la adsorci6n en los sedimentos y absorci6nenlosorganismosvivos(EPA,2008).

Temefoses poco persistente; en suelosu vida mediaes de 30dlas, el pH es un factor importante de remoci6n debido a que en suelos basicos es eliminado por hidr6lisisquimicanlpidamente. Ensistemasacuaticos,lapersistenciadetemefos

es corta, puede sereliminado en horas 0 pocos dias; es fotosensible y puede sufrirdegradaci6naerobia. Este plaguicida nose disipa facilmente en cuerpos de

agua en ausencia de luz solar 0 de microorganismos; ademas se volatiliza lentamente cuando se encuentra presente en aguas estancadas (EXTOXNET, 2002; HSDB, 2003; EPA, 2008)

En animales, se ha estimado que el porcentaje de absorci6n de temefos de forma dermica es de 38%, mientras que de forma inhalada es del 100%. Hasta el momento, no se cuentan con datos de absorci6n para humanos. Encuantoa la distribuci6n, un estudio realizadoen ratas macho Sprague Dawley (de 150a 200 gdepeso),alasqueselesadministr6porviaoral970lJgy13571J9detemefos tritiado, se observ6 que este compuesto se distribuy6 principalmente en tejido graso, higado, rinones y est6mago. Sin embargo, tras 72 horas de la administraci6n este se acumul6 en tejido graso (Blinn, 1966). Asimismo, en estudios en ratas, se ha observado un pico maximo de temefos en sangre despuesde5-8horasdesuadministraci6n, con una vida mediade7a 10horas aproximadamente (EXTOXNET, 2002; INCHEM, 2002; HSDB, 2003). La principal ruta de excreci6n de temefos sin biotransformar y de sus metabolitos sulfoxidados, es atraves de las heces, mientras que poria orina se eliminan los metabolitosconjugados 0 hidrolizados (Blinn, 1966; Fergusonetal.,1985)

Enrelaci6nalabiotransformaci6n, poco se conoce, sin embargo, sehadescrito que es relativamente estable a la degradaci6n metab6lica; su principal ruta de biotransformaci6n es atraves de laS-oxidaci6n paraformartemefossulf6xidoy temefos sulfona, asi como hidr61isis por carboxilesterasas para formar 4,4' tiodifenol, 4,4'-sulfanildifenol y 4,4'-sulfonildifenol. Ademas de un metabolismo secundario porglucoronidaci6n 0 sulfonaci6n detemefos (Blinn, 1966; Ferguson eta/., 1985; Verdin-Betancourt, 2013). En la Figura 3 se proponen las rutas de biotransformaci6npropuestasparatemefos. ..""IJI.. l i~[ -- -~ --@[email protected] I 4,4'-tiodifenol I

L L_~~ GST I 4,4'-sutfanildifenol 1- ----..[

Figura 3. Rulasde biolransformaci6n de lemefos (Blinn,1966;Fergusonelal.,1985) 1.5.3Toxicidadaguda

Latoxicidad agudade temefos esta relacionada con la inhibici6n dela enzima AChE (EPA, 2008). Debido a su bajo polencial de loxicidad aguda en humanos y a su escasa hidrosolubilidad, no se considera que el uso de lemefos para el conlrol del mosquito lransmisor del dengue represenle un peligro para la poblaci6n (ATSDR, 2005). Respeclo ala toxicidad de lemefos en ralas, esta es relativamenlebaja, ladosislelal media liene un rangode 1300 a 4000mg/kg de peso (Renshawy Bobbis, 2006)

1.5.4Genotoxicidadycarcinogenicidad

Unesludiorealizado porAiubelal. (2002), evalu6 latoxicidad y genoloxicidad de lemefos medianle el uso de los ensayos cometa en celulas de rala Wistar y SOS/umu y AMES/Salmonella, y enconlraron que esle compueslo indujo lesiones severas al ADN a concenlraciones mayores de 1.34 ~M. Asimismo, se observ6 genoloxicidad perc no ciloloxicidad en la cepa de E. coli PQ37, perc no en la PQ35, a concenlraciones mayores de 1.33 ~M, particularmenle cuando no se uliliz6 la fracci6n S9. Temefos no fue mUlagenico en el ensayo de AMES con las cepas T97, TA98, TA100 Y TA102, con y sin aclivaci6n melab6lica. Sin embargo, a concenlraciones superiores de 3.33 ~M fue mUlagenico para S. Iyphimurium cepas TA98NR, YG71 04 Y YG108, con y sin aclividad melab6lica. Ademas, en un eSludiorealizado porBezerra de Melo elal. (2008),seevalu6Ia presencia de MN encelulasdemedula6sea, de raloneslralados oralmenle con 27.75,55.5y111.0 mg/kg de lemefos yse observ6 una relaci6n direclamenle proporcional enlre la dosisdelemefosyla presencia de MN.

En cuanlo a carcinogenicidad, en ralas lraladas cr6nicamenle con lemefos por dos ai'\os con dosis de 15 mg/Kg/dia, no se observ61a formaci6n de lumores (EPA,2008).

1.6CelulasHepG2

La linea celulardehepatocarcinoma humano (HepG2),derivadel Iejidodehfgado de un individuocaucasicode 15 ai'\os con hepalocarcinomacelulardiferenciado (ATCC, 2013). Esla linea celular, son hepalocilos adherenles que comparten caracteristicasmorfol6gicasyfuncionalesqueseutilizan paraensayos basados en la funci6n hepatica, metabolismo y toxicidad de compuestos. Las celulas HepG2expresan la mayoria de las enzimas de fase I yfase II que participanenla biotransformaci6n de xenobi6ticos (Wilkening et al., 2003; Young et al., 2006; Jennen et al., 2011). Aproximadamente el 90% de las celulas HepG2 en el cultivo, tienen de 54 a 56 cromosomas entre los que se incluye el cromosoma XY (Norman, 1990; Lyeretal., 2010)

1.7 Ensayo de micronucleos como biomarcadordeefecto genotoxico

En numerosos estudios se ha utilizado el ensayo de MN como un biomarcador de danogenot6xico ante laexposici6n a plaguicidasya mezclasde estos (Revisi6n en Bolognesi, 2003; Bolognesi et a/., 2011). EI ensayo de MN por bloqueo de citocinesis (MNBC) es un metodocitogeneticovalidadopara evaluarlafrecuencia de MN. La importancia de este ensayo se debe a su gran versatilidad, ya que permite evaluar parametros como MN, indice nuclear (IN), gemaciones, puentes nucleoplasmicos,celulasapopt6ticasycelulasnecr6ticas, loquepermiteobtener informaci6nmascompletasobrelosefectoscitot6xicos,citostaticosygenot6xicos de un compuesto en particular (Fenech, 2000). ElensayodeMNBCeslaprueba degenotoxicidad de uso mas frecuente en ensayos con mamiferos, proporciona una medida indirecta, simple y rapida de las aberraciones cromos6micas numericasyestructurales(Zhugeetal.,2003) 2. JUSTIFICACI6N

Temefos es un inseclicida ulilizado para la eliminaci6n del veclorlransmisor del dengue. Apesardesu amplio uso son escasos loslrabajos que mencionan los efeclos adversos producidos por lemefos y aun mas los relacionados con el efeclogenol6xico. Por 10 que se considera relevanle evaluarel dario genelico que produce esle inseclicida en la linea celular HepG2, a lraves del ensayo de micronucleos. Esle esludio permilira conocer el posible polencial genol6xico de lemefosencelulasdeorigenhumanoquecuenlancon una baleriacomplela de enzimasquebiolransformanxenobi6licos.

3. HIP6TESIS

TemefosgradoreaclivoproducegenoloxicidadenceluiasHepG2 Objetivogeneral

Evaluar el efeclo genol6xico producido por lemefos grade reaclivo en celulas HepG2

Objetivosespecificos

1. Delerminar el efeclo cilol6xico ocasionado por la exposici6n a lemefos gradoreaclivoencelulasHepG2. 2. Delerminar el efeclo ciloslalico ocasionado por la exposici6n a lemefos gradoreaclivoenceluiasHepG2 3. Evaluar la frecuencia de micronucleos, gemaciones, puenles nucleoplasmicos, celulas apopl6licas y celulas necr6licas medianle el ensayo de micronucleos por bloqueo de cilocinesis en cullivos celulares HepG2 lralados con diferenlesconcenlraciones de lemefos gradoreaclivo 5. METODOLOGiA

Serealizarontresexperimentos independientes portriplicado, cada experimento se realiz6 con sus respectivoscontroles; como control devehlculoseutilizaron celulas HepG2 tratadas con dimetil sulf6xido (OMSO <0.05%) Y como control positive se utilizaron celulas HepG2 tratadas con mitomicina C (1 ~M). Para la evaluaci6n de los parametres de citotoxicidad, citostaticidad y genotoxicidad, cultivos celulares HepG2 fueron tratados con temefosa concentraciones de 0.5,

1,2,5y10~Myatiemposde24y48horas

5.2 Cultivo celular HepG2

Celulas HepG2 obtenidas de ATCC (American Type Culture Collection) (Figura 4), se cultivaron en medio OM EM (Oubelcobs Modified Eagle Medium), el cual fue previamente suplementado con 10% de suero fetal bovino, 1% de aminoacidos no esenciales, 1% L-glutamina y 1% de antibi6ticos-antimic6ticos. Las celulas se mantuvieron en cajas de cultivo de 75 cm2 esteriles, en una incubadora en condiciones de 5% de C02 atmosterico y 37 ·C de temperatura. Cuando los cultivos alcanzaron 100% de confluencia celularse realiz61a cosecha celular, para la cual, se elimin6 el medio de cultivo, se agregaron 2 mL de tripsina al 0.25% con EDTA a 37 ·C, se dejaron incubar durante 5 minutos y las cajas se agitaronligeramenteparapermitirquelascelulassedespegarancompletamente. Posteriormente, se agreg6 medio de cultivo OM EM (8 mL), se homogeneiz6 y las celulassecolocaronencajasdecultivo nuevas para procederaincubar nuevamentea 37·Cpara su uso posterior

En la Tabla 1 se presentan los detalles de lostratamientos realizados en celulas HepG2 para las determinaciones de los diferentes para metros de citotoxicidad, citostaticidadygenotoxicidad Figura 4. Morfologia celularde HepG2

Tabla 1. Tratamientos de celulas HepG2 con temefos

agregado OM SO MMC de OMEM (~l) (~L) (~l) detrabajo

------1 1.2 0 0 ------2 0 0 ------5 3 0 0 ------10 0 0 Control de -- Laviabilidadcelularen HepG2sedetermino medianteel ensayo colorimetrico de MTIdeacuerdoa latecnica propuesta porMosmann (1983). Estatecnica se basaenunareacciondeoxido-reduccion,en laque lasaldetetrazolio de color amarillo sereduce poraccionde lasuccinatodeshidrogenasamitocondrialyotras reductasas a un cristal formazan de color azul, que es medible espectrofotometricamente(Figura5)

Figura 5. Reducci6n de MTI (Basado en Mosmann, 1983).

• Kit de ensayo toxicologico in vifrobasadocon MTI.

• MTI(3 (4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio).

• Solucion solubilizante: Triton X·100 plus aI10%, Hel 0.1 N en isopropanol anhidro

Una vez que lascelulas HepG2estuvieron a1100% deconfluencia, serealizola cosechacelularcontripsina yserealizoel conteocelularen un hemocitometro Lascelulas en suspension se ajustaron a una densidadde 500,000 celulas!pozoy se sembraron en placas de 6 pozos bajo las condiciones de cultivo senaladas anteriormente, durante 24 horas. Posteriormente, se realizaron los tratamientos con temefos grado reactivo a diferentes concentraciones y tiempos (24 y 48 horas).Laviabilidadcelularsedetermin6atravesdelaslecturas de lasmuestras a una longitud de ondade 570 nm en un lector de placa de 96 pozos (~Quantde Biotek Modelo MQX200)

EI IN Y la proporci6n de celulas binucieadas son para metros utilizados para conocer la respuesta mitogenica celular. EIIN se evalu6 de acuerdo al metoda propuesto por Eastmond yTucker (1989). EI calculo se realiz6 en 200celulas a partir de la frecuencia de celulas con 1, 2, 4 0 mas nucleos con la siguiente ecuaci6n: IN = [M1 + 2(M2) + 3(M4)] I N. donde M1-M4 representan el numero de celulas con 1 a 4 6 mas nucieos y N representa el numero total de celulas contadas.

5.6Cultivocelularparaevaluaci6ndegenotoxicidad

• Soluci6n stock de temefos grade reactivo para la tecnica de MNBC. La soluci6n se prepar6 a partir de un estandarde temefos (grado reactivo) marca SUPELCO de 100 mg (Chem Service), con pureza de 97.5%. Directamente en el vial de temefos se agreg6 1 mL de DMSO grade bioiogiamoiecuiarysecalcul61aconcentraci6n(iguala209mM) • Celulas HepG2 (ATCC) • Medio DMEM suplementado can antibi6ticos, antimic6ticos, aminoacidos noesenciales,L-glutaminaysuerofetalbovino, pH7.1 • Dimetil sulf6xido grado biologia molecular (DMSO) • Mitomicina C (MMC) 1 ~M • Citocalasina-B3~g/mL.

Despues de que las celulas alcanzaron la confiuencia celular (100%), se sembraronen placas de cultivo de 6 pozos, a unadensidad de 500,000celulas por pozo, previamente se agregaron 2 mL de medio de cultivo DMEM a cada pozo. Se incub6 en condiciones de 37 ·C Y 5% de C02. A las 24 horas de siembra se realiz6 el cambio de medio, se agregaron 2 mL de medio OMEM, se incub6 nuevamenteyaJas24horasserealiz61aexposici6natemefosgradoreactivoa lasdiferentesconcentracionesytiempcs. Elcambiodemedioserealiz6 cada24 horas; a las 72 horas desiembra se agreg6 citocalasina B (3 ~g/mL) y24 horas despuesserealiz6lacosechacelular.

• Medio OM EM suplementado con antibi6ticos, antimic6ticos, amlnoacidos noesenciales,L-glutaminaysuerofetalbovino, pH7.1. • Acidoacetico (99.90% de pureza) • Metanol(99.93%depureza). • Soluci6nCarnoy's.Metanolyacidoaceticoenproporci6n3:1 • Hidr6xidodesodio 10M • Tripsina con EOTA 0.025%

Se retir6 el medio de 105 cultivos celulares, se agregaron 500 ~L de tripsina por pozo para despegar las celulas, despues, se neutraliz6 con 500 ~L de medio OMEM (a 37 ·C) Y se resuspendi6 en el pozo. Posteriormente, se prefij6 con 500 ~L de soluci6n de Carnoy's (fria) (se observ6 un cambio de color, de rosa al amarillo),nuevamenteseresuspendi6Iigeramente. Elcontenidodecadapozose pas6 a tubos decristal defondo redondo (13x 100) yse agreg6 a cadatub01 mL de soluci6n fijadora para realizar lavados (1200 r.p.m.l10 minutos), se retir6 el sobrenadanteyserepiti6elprocesodelavad04veces.Posterioralultimolavado, se retir6 eJ sobrenadante y el bot6n celularse resuspendi6 con 500 ~L de soluci6n fijadora Carnoy's (tria), para pasar la suspensi6n celular a portaobjetos esmerilados previamenterotulados, sedejaronsecarlaslaminillasatemperatura ambienteyseprocedi6arealizarel procesodetinci6n con el kithemacolor(May- Grunwald Giemsa). La lectura de laminillas se realiz6 en un microscopio Carl Zeiss Axiostarplus, de luzclara a 100X

5.8 Lectura de parametros degenotoxicidad

Lalecturadelaminillasserealiz6enciego,paralocualsecubri6laidentificaci6n de cada laminilla y se Ie asign6 un numero aleatoriamente. La evaluaci6n de MN al igual que la de gemaciones, puentes nucleoplasmicos, celulas apopt6ticas y celulasnecr6ticas, se realiz6en un total de 1000 celulas binucleadas,mediantela tecnica de MNBC. Los criterios que se consideraron para el conteo de biomarcadoresdegenotoxicidadfueronlosestablecidosporFenechela/. (2003) a) Celulas binucleadas, ambos nucleos con membrana intacta y dentro del citoplasma, iguales en tamafio, patr6n e intensidad de tinci6n, pueden estar unidos por un puente nucleoplasmico. b) Los nucleos se pueden tocar, no superponerse, (a menos que los limites sean distinguibles). c) EI limite citoplasmaticointactoyclaramentedistinguibleconundiametrode1/16a1/8con respectoal nucleo principal. Para los MN el diametro varia entre 1/16y 1/3 parte de la media del diametro del nucieoprincipal. d) No deben de ser refractantes 0 vinculadosconlosnucleosprincipales, puedentocar, no superponersealos nucleosdistinguiendoseellimitedel MN, debendecontarconigual intensidadde tinci6n,algunasvecesmasintensa.

Losefectosdetemefosgradoreactivo, en celulasHepG2, se analizaron mediante pruebasparametricasynoparametricas, de acuerdoa ladistribuci6nobtenidade las variables (ANOVA, Bonferroni, U de Mann-Whitney, Kruskall-Wallis y Dunn) Losvalores de p<0.05 fueron considerados estadlsticamente significati·~os. Todos los analisis estadlsticos se desarrollaron en el programa stata 11.1 (stata statistical software, slatacorporation, collegestalion, texas)yGraphPadPrism6.0 para Windows (Graph Pad Software, San Diego, California, USA) 6. RESULTADOS Y DISCUSION

De acuerdo con los resultados obtenidos, los tratamientos con temefos no afectaron la viabilidad celular a concentraciones de 0.5-10 ~M durante 48 horas (Figura 6). Tampoco se observaron diferencias estadisticamente significativas entre el control positivo (MMC) y control de vehiculo (DMSO).

La viabilidad celularse relacionaconlacapacidad de una celul a para lIevara cabo sus procesos fisiol6gicos y bioqufmicos, este concepto se refiere a la integridad y a la capacidad metab61ica celular (Luque y Hemiez, 2011). La capacidadmetab6licadelacelularepresentaunindicadordelaintegridaddelas mitocondrias y por 10 tanto, este para metro es ampliamente utilizado como reflejo delaviabilidad celular(Eisenbrand etal., 2002; Jimenezetal., 2007). Diferentes estudios en los quese evalua la citotoxicidad de POF, han utilizado el ensayo colorimetrico con MIT (Cabello et al., 2003; Li et al., 2003; Hreljac et al., 2008 Edwards etal., 2011). En un estudio realizado porHreljac etal. (2008), en el que seutiliz6 la linea celular HepG2, para conocerel efectode los POF melilparati6n, metilparaox6nydimefoxsobrelacapacidaddedivisi6ncelularaconcentraciones de 0.01-100 ~M, encontraron que metil parati6n ymelilparaox6n, no afectaron la proliferaci6n celular a concentraciones similares (0.01,0.1,1.0 Y 10 ~M) a las utilizadas en este estudio (0.5-10 ~M), contrariamente, al evaluar el potencial citot6xico de dimefox, se observ6 un aumento en la proliferaci6n celular a concentraciones menores a 100 ~M (0.01, 0.1, 1 Y 10 ~M). Algunos estudios realizados en HepG2, sugieren que los POF ejercen un efecto mitogenico a concentraciones bajas y un efecto citot6xico a concentraciones mas altas (Delescluseetal.,1998;Hreljacetal.,2008;Mooreetal.,2010; Wuetal., 2010) a)

~~I!!."Q~~O c::,'? ..."!' ","!' ,,"!' ...c::,"!'

,.0 Temefos (~M)

120 b)

Figura 6.Viabilidad decelulas HepG2tratadas contemefosdurante24(a)y48(b)horas. EI analisis estadlsticose realiz6 mediante la prueba de Kruskall-Wallis seguido de la pruebaa posteriordeDunn.Cadabarrarepresentalamedia±DEdetresexperimentos independientes. realizado par triplicado. Control (+): MMC 1 ~M, DMSO: control de vehlculo<0.05%. Lostratamientoscontemefosnomodificaronel indicededivisi6nnuclear(IN), ni el porcentajedecelulas binucleadas(BN)en loscultivoscelulares HepG2, 10 que sugiere, queestecompuestonotieneunefectocitostaticoalasconcentraciones probadas, eneste modeloexperimental, (Figura 7). En la Figura8se presentan microfotografiasrepresentativasdeestructurasnuclearesobservadasmedianteel MNBC en celulas HepG2 100 DIN %BN

z CD 40 ~

'S,(rv:.' ~00 r;;:,"? ,,~ f),~ '0~ "r;;:,~ cl' Q Temefos(~)

Figura 7. Indice de divisien nuclear (IN) Y porcentajedecelulasbinucleadas(BN)en cultivos HepG2tratadoscontemefos. ·p<0.05 respectoal control devehiculo. Elanalisis estadistico se realize mediante la prueba de Kruskall-Wallis seguido de la prueba a posterior de Dunn. Cada barra representa la media ± DE de tres experimentos independientes por triplicado. Control (+): MMC 1 ~M, DMSO: control de vehiculo <0.05%.

Figura 8. Microfotografias representativas de estructuras nuclearesobservadasmedianteel MNBC en celulas HepG2. a) Celula mononucleada, b) Celula binucleada, c) Celula polinucleada. Diversos estudios, han utilizado el IN como medida de la capacidad de proJiferaci6n o divisi6n celular (Lamy elal., 2004; Jinetal., 2009; Chequerelal., 2012; Nikoloffelal., 2013; Nikoloffelal., 2014). EIIN es un indicadorque ofrece informaci6n sobre el estado de la proJiferaci6n en celulas de origen humane expuestas a xenobi6ticos, como los POF. Cuando hay alteracionesenelproceso de division celular y aumenta la proporcion de celulas mononucleadas, eilN presentaravaloresde 1.0. Cuando lascelulas han alcanzadouna divisi6n nuclear completa, las celulas tendran el aspecto de binucleadas y los valores del IN estaran cercanos a 2.0. De acuerdo a la cinetica de divisi6n celular, se pueden obtenervaloresmayores a2.0cuandosepresenta un aumento en la proporci6n de celulas polinucleadas (mas de dos nucleos), 10 que impJica que han completado mas de una divisi6n celular (Fenech y Crott, 2002; Sierra, 2011). En esteestudionoseobservaronalteracionesenlaproliferaci6ndecelulasypor ende en elIN, en HepG2 tratadas con temefos a concentraciones de 0.5-10 ~M

Losresultadosdeestetrabajodifierenconlosreportadosenotrosestudios realizados en el mismo modele celular, pero con otros plaguicidas. En este contex1o, Nikoloff el al. (2014), evaluaron los efectos citot6xicos, apopt6ticos y genot6xicos del herbicida flurocloridona y de dos de sus presentaciones (Twin Pack Gold y Rainbow) en celulas HepG2, a concentraciones de 0.25-15 ~M. Los autores encontraron que tanto Twin Pack Gold como Rainbow, a 10 ~M, causaron disminuci6n del IN, con respecto al control (1.71 ± 0.03), de 0.6 (1.11 ± 0.09) y 0.42veces(1.29±0.02),respectivamente.

Estudios en poblaciones humanas, ocupacionalmente expuestas a plaguicidas, hanmostrado resultados consistentesdel efecto negativodeestosxenobi6ticos sobrelareplicaci6ncelularynuclear.Asl, en un estudiorealizado en trabajadores (18 a 57 anos) que manejan plaguicidas para el control de vectores de enfermedades, en Brasil,seencontr6quelosapJicadoresdeplaguicidastuvieron IN significativamente menores (1.49± 0.02) con respecto a un grupo control (1.61 ± 0.02) (Kehdy el al., 2007). Por otra parte, Satar et al. (2009) en pacientes intoxicados con POF, encontraron que eilN fuesignificativamente menoren los pacientes cuando ingresaron al servicio de emergencias por intoxicaci6n, con respecto a su egreso del hospital despues de haber recibido tratamiento. Estos resultados tambien se han observadoen un grupodetrabajadoresde Jordania, expuestosa malati6n yclorpirifos (con untiempodeexposici6n entre 3-30 aiios). Estostrabajadorestuvieron indices mit6ticos menores(1.45 ± 0.08) en linfocitos de sangre periferica, con respecto a individuos control (3.86 ± 0.41) (Omari Yousif, 2011). Los antecedentes mencionados sugieren que los plaguicidas podrian causarun efecto inmunosupresora los individuos, locual implicaria un aumentoenlasusceptibilidadadiversostiposdeenfermedades

La frecuencia de puentes nucleoplasmicos, gemaciones, apoptosis y micronucelos en celulas mononucledas (MNM), se presentan en las Figuras 9 y 10, respectivamente. De acuerdo a estes datos, no se observaron diferencias estadisticamente significativas en lostratamientos con temefos con respecto al control negativo. Respecto al control positivo, se observ6 un aumento en la frecuenciadeapoptosisconrespectoalcontrolnegativo

En la Figura 11, se presenta la frecuencia de MN en celulas binucleadas, de acuerdo a estos, eltratamiento con 10 ~M de temefos caus6 un increment6 en esteparametrodegenotoxicidad ff~~'Q~":>o ~'? ...':' ",':' ,,':' ...<:;':'

cP Temefos(llM) b)

130

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cP Temefos(llM)

Figura 9. Frecuenciadepuenlesnucleoplasmicos (a)ygemaciones (b) en Ia linea celular HepG2. Las barras represenlan los resultados de tres experimentos independientes por lriplicado t OS.' p<0.05 respecto al control devehlculo. EI analisis esladlslico se realiz6 mediante la prueba de ANOVA seguido de la prueba a posterior de Sonterroni. Control (+). MMC 1 ~M. control de vehlculo OMSO <0.05% ~ 1 b)

E :; ~ 20 z ~ ~ 10 .~ ~ ~~~~~t::,o

Cp(li Temefos(~M)

Figura 10. Frecuencia de apoptosis (a)y MN en celulas mononucleadas (b) en lallnea celular HepG2. Las barras representan los resultados de tres experimentos independientesportriplicado±DE.·p<0.05respectoalcontroldevehlculo.Elanalisis estadfstico se realiz6 mediante la prueba de ANOVA seguido de la prueba a posterior de Bonferroni(1)yporlapruebadeKruskall-Wallisseguidodelapruebaa posterior de Dunn (2). Control (+): MMC 1 ~M, control de vehlculo DMSO <0.05%. ~~~~"Q~'?O <;:,'? ,,"i> ",,"i> ,,"i> ,,<;:,"i>

cP Temefosb,M)

Figura 11. Frecuencia de MN en la linea celular HepG2. Las barras representan los resultados de tres experimentos independientes portriplicad0±DE.·p<0.05respectoal control devehiculo. EI analisis estadistico se realiz6 mediante la prueba de Kruskall Wallis seguido de la prueba a posterior de Dunn. Control (+): MMC 1 ~M, control de vehlculo DMSO <0.05%.

Burattieta/. (2007) proponen que las concentraciones de POFinferioresa 10~M, utilizadasenestudios in vitro, asemejancondiciones humanas in vivo durante la exposici6n ambiental normal. Por otre lado, cuando se utilizan concentraciones superiores a 100 ~M, se refleja la intoxicaci6n accidental aguda. En el presente estudiose utiliz6 ungradiente de concentraci6n de 0.5 a 10 ~M de lemefos. Las concentraciones mas bajas (de 0.5a 5 ~M) de acuerdo a Buratti, representarian unaexposici6nambientalnormal. Los resultados obtenidosen esta investigaci6n son relevantes, ya que demoslraron el potencial genol6xico causado por exposici6n a bajas concentraciones de temefos, las cuales asemejan a las concenlraciones ulilizadas en campai'ias de sa Iud (2.14 ~M), de acuerdo con datos de la NOM-032-SSA2-2010

La genoloxicidad de los POFesla relacionada con los procesos de bioaclivaci6n, esdecirla generaci6n de melabolilosmas 16xicos que los compueslosoriginales duranle los procesosde biolransformaci6n (Vale, 1998). Elusode Iineascelulares demamiferoconexpresi6neslabledeenzimasdebioslransformaci6n,hahecho posible la evaluaci6n del riesgo relalivo de xenobi6licos medianle pruebas de loxicidad in vitro (Kessova y Cederbaum, 2003). En esle senlido, el modele experimenlal HepG2 ha permilido demoslrar el efeclo genol6xico de diversos compueslos (KnasmOlier et al., 1999; Wilkening et al., 2003; Young et al., 2006; Jennenetal., 2011; Wang etal., 2012). Respecloalaexpresi6nenzimalicapara aclivaci6n de compueslos quimicos como los POF, en la linea celular HepG2, se expresan diferenles isoformas de cilocromos P450 (CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 y CYP3A4); esla propiedad represenla una herramienla ulil para invesligaciones referenles a aclivaci6n melab6lica de compueslos mediada por esle sislema enzimalico (Yoshilomi et al. 2001; Zhuge et al., 2003).Esla linea celular, no presenla la mulaci6n del gen p53 y por 10 lanlo, permile a las celulas inducir la rula de respuesla a dana en el ADN, la delenci6n del crecimienlo y aClivaci6n de vias apopl6licas. Asilambien, esle modele experimenlal es adecuado para ensayos degenoloxicidad (Jennenetal., 2010;Weslerinketal., 2010)

Referenlea lagenoloxicidaddelemefos, la Iileraluracienlfficaesescasa; Aiubet al.(2002)evaluaronelefeclomulagenicodelemefosmedianleelensayocomela, en celulas de rala Wislar y SOS/umu y AMES/Salmonella; y enconlraron lesiones graves en el ADN a concenlraciones mayores a 1.34 ~M. Ademas, Bezerra de Meloeta/.(2008),evaluaronelefeclomulagenicodelemefosmedianleelensayo de MN en erilrocilospolicromalicosde medula 6sea de ralones, a los que se les adminislr6lemefos oralmenle a concenlraciones de 27.75, 55.5 y 111.0 mg/kg. Los aulores enconlraron una relaci6ndirecla enlrela dosisy, lafrecuenciadeMN ydeaberracionescromos6micas. En olroesludio realizadoen Ii nfociloshumanos de sangre periferica, en el que se evalu6 el polencial gen616xico de lemefos medianteelensayocomelaencelulasmononucleadas,seenconlr6quetemefos grado reactivo, provoc6 dana al ADN a concenlraciones de 1.0, 2.0, 5.0 Y 10 ~M; asimismo, encontraron que lemefos ocasion6 un aumenloen la longilud de la cola de comela en celulas HepG2, a concenlraciones de 0.5 y 10 ~M. En el mismo esludio se realiz6 la evaluaci6n del polencial genol6xico de lemefos, medianle el ensayo de MNBC en un sislema in vitro de linfocilos humanos de sangre periferica y no se encontr6 un aumento en la frecuencia de MN en un range de 0.5 a 10 IJM (Benitez-Trinidad et a/., 2015). Las concentraciones utilizadaseneseestudioseencuentrandentrodelrangoutilizadoenestetrabajo (O.5-10 IJ M)

EI ensayo cometa evalua el dane al ADN que puede ser reparado; sin embargo, el ensayo de MNBC, evalua el dane que no se repar6, es decir el dane permanente 5i bien en este trabajo se evidenci61a genotoxicidad de temefos mediante el ensayo de MNBC, aun falta describir los mecanismos a traves de los cuales temefos puede causar efectos deletereos en el material genetico, causando la formaci6n de MN en celulas HepG2

De acuerdo con Jennen etaf. (2011), lalineaceluiarHepG2tieneiacapacidadde modular una respuesta a un dano a traves de cascadas desenalizaci6n. ya que puede activar GTPasas, 5051 y el sistema implicado en la carcinogenesis; sin embargo, se podria suponer que los sistemas de reparaci6n por escisi6n de nucle6tidos 0 el sistema 505, pueden ser dianas de los metabolitos resultantes de labioactivaci6nde temefos, propiciandounefectogenot6xico. 5ibienescierto que temefos no fue citostatico, asi como tampoco aument6 la frecuencia de puentes nucleoplasmicos, gemaciones, apoptosis y necrosis, en celulas HepG2, estopuedeserdebldoaqueen lascelulas HepG2sepuedepresentarresistencia alasdiferentesviasapopt6ticas,causadoporlapresenciadeprotooncogenes

(Met y Ron) y oncogenes como activadores de la progresi6n celular 0 bien sobreexpresi6n de los mismos en linea celular HepG2. Estos protooncogenes estan presentes en la mayorla de los tejidos con carcinomas (Desiderio et al., 1998;Chenetaf., 1997; Wei etaf., 2012).

Finalmente, esprimordial considerarquelasinconsistenciasenlagenotoxicidad de POFyconcretamentedel insecticidatemefos, puedenserel re sultadodeluso de diferentes concentraciones del compuesto activo, las caracterlsticas particularesdelosmodeJosexperimentales, tanto in vitro como invivo, eltiempo de exposici6n y tratamiento, del biomarcador ulilizado, asl como los crilerios utilizados para evaJuar y validar respueslas posilivas. Ademas, es importanle senalarque laformulaci6n de los plaguicidaspuedemodificarlatoxicidad de los mismos, yaquesesugierequela presencia decomponentes nocivosulilizados comoexcipientes, cuentanya sea con un efectot6xico intrinsecoo bien con la capacidaddeexacerbarlatoxicidaddelproductopuro(Larramendy eta/., 2014). * Lostratamientos contemefos (0.5 a 10~M)noocasionaroncitotoxicidaden loscultivosHepG2.

* Temefos no tiene efecto citostatico en la linea celular HepG2 a las concentracionesprobadas.

* Temefos no aument6 la frecuencia de gemaciones. puentes nucleoplasmicos. celulasapopt6ticasonecr6ticasen HepG2.

* EI tratamiento con 10 ~M de temefos aument6 la frecuencia de micronucleos en celulas HepG2. 10 que sugiere la importancia de la biotransformaci6nenelpotencialgenot6xicodeesteinsecticida 1. Determinar mediante hibridaci6n in situ con fluorescencia (FISH), el

posible mecanisme aneugemico 0 clastogemico de temefos. 2. Evaluar el efecto que pUdiera tener temefos sobre los principales sistemas de reparaci6n, tales como: reparaci6n porescisi6nde base, reparaci6nporescisi6ndenucle6tidosorespuestaSOS 3. Evaluar si temefos grade comercial es capaz de causar danos permanentesenelmaterialgenetico, tanto en Iinfocitos como en celulas HepG2 Aiub, CA, Coelho, E.C., Sodre, E., Pinto, L.F., Felzenszwalb, I. (2002). Genotoxic evaluation of the organophosphorous pesticide temephos. Genetic Molecular Research. 30:159-166.

Alabi, OA, Ogunwenmo, K.O., Adebusuyi, T.T., Shobowale, O. D. (2014) Genotoxicpotential ofpirimiphos-methyl organophosphate pesticide using the mouse bone marrow erythrocyte micronucleus and the sperm morphology assay. Journal of Environmental and Occupational Science 3(2):81-86.

ATCC. (2013). American Type Culture Collection HepG2. [Consultado octubre de 2013). Disponible en: www.atcc.org

ATSDR. (2005). Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Temephos [Consultado en enero de 2013]. Disponible en: http://www.atsdr. cdc.gov lconsultations/west_nile_virus/temephos.html

Baddi, M. H., VarelaS. (2008). Insecticidas organofosforados ysusefectosen el ambiente. Cultura Cientifica y Tecnol6gica. Toxicologla de insecticidas. (28):6-17.

Benitez-Trinidad, AB., Herrera-Moreno, J.F., Vazquez-Estrada, G., Verdin Betancourt FA, Sordo M., Ostrosky-Wegman P., Bernal-Hernandez Y.Y., Medina-Diaz I.M., Barr6n-Vivanco B.S., Robledo-Marenco, M.L., Salazar, AM., Rojas-Garcia, AE. (2015). Cytostatic and genotoxic effect of temephos in human lymphocytes and HepG2 cells. Toxicology in Vitro 29:779-786.

Bezerra de Melo, M.E., da Costa Merlo, K., de Carvalho Fernandes, R.R., Feitosa Luna, C., Nunes Diniz, G.T., Jansem de Almeida Cantanho, M.T., Regis, L. (2008). Mutagenic effects of the organophosphate insecticidetemephos on mice bone marrow cells. Revista do Instituto Adolfo Lutz. 67(3):96-201. Blinn, R.C. (1966). Abate insecticide: The metabolic fate of O,O,O,O'-tetramethyl O,O'-thio-p-phenylenephosphothioateintherat.JournalofAgriculturaland Food Chemistry. 17:118-122

Bolognesi C. (2003). Genotoxicity of pesticides: a review of human biomonitoring studies. Mutation Research. 543:251-272

Bolognesi C, Creus A, Ostrosky-Wegman P, Marcos R. (2011). Micronuclei and pesticide exposure. Mutagenesis. 26(1):19-26

Buratti, F.M., Leonni C., Testai, E. (2007). The human metabolism of organophosphorothionate pesticides: Consequences for toxicological risk assesment. Journal fOr Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit

Cabello, G., Galaz, S., Botella, L., Calaf, G., Pacheco, M., Stockert, J.C., Villanueva A, Caiiete, M., Juarranz, A (2003). The pesticide malathion

induces alterations in actin cytoskeleton and in cell adhesion 0 fcultured breast carcinoma cells. International Journal of Oncology. (3)23:697-704.

Chakravarthi, B. K., Naravaneni, R., Philip, G. H., Redddy, C. S. (2009) Investigation of monocrotophos toxic effects on human lymphocytes at cy1ogeneticlevel. African Journal of Biotechnology. 8(10):2042-2046

Chen, Q., Seol, D.W., Carr, B., Zarnegar, R. (1997). CO-Expression and Regulation of Met and Ron Proto-Oncogenes in Human Hepatocellular Carcinoma Tissues and Cell Lines. Hepatology, (26)1:59-66

Chequer, F.M., Venancio, V.P., Pires Bianchi, M.L., Greggi Antunes, L.M. (2012). Genotoxicandmutageniceffectsofery1hrosineB, a xanthene food dye, on HepG2 cells. Food and Chemical Toxicology. 50:3447-3451

Delescluse, C., Ledirac, N., de Sousa, G., Praiavorio, M., Lesca, P., Rahmani, R (1998). Cytotoxic effects and induction of cy1ochromes P450 1A1:2 by insecticides, in hepatic or epidermal cells: binding capability to the Ah receptor. Toxicology Letters. 96,97:33-39 Desiderio, M.A., Pogliaghi, G., Dansi, P. (1998). Hepatocyte Growth Factor Induced Expression of Ornithine Decarboxylase, comet, and c-myc Is Differently Affected by Protein Kinase Inhibitors in Human Hepatoma Cells HepG2. Experimental Cell Research. 242:401-409.

Donalisio, M.R., Ferreira Leite, 0., Caporale Mayo, R., Pinheiro M.J., Souza, A., Rangel, 0., A, V.R., Oliveira, S.S., Matias, V.L. (2002). Use oftemephos for control offield population of Aedes aegyptiin America Sao Paulo, Brazil Dengue Bulletin. 26:173-177

Eastmond, D.A., Tucker, J.D. (1989). Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody. Environmental and Molecular Mutagenesis. 13:34-43

Edwards, F.L., Yedjou, C.G., Tchounwou, P.B. (2011). Involvement of oxidative stress in methyl parathion and parathion-induced toxicity and genotoxicityto human liver carcinoma (HepG2) cells. Environmental Toxicology. 28:342-

Eisenbrand, G., Pool-Zobel, B., Baker, V., Balls, M., Blaauboer, B.J., Boobis, A (2002). Methods of in vitro toxicology. Food and Chemical Toxicology. 40(2):193-236

EPA. (2008). U.S. Environmental Protection Agency. Temephos, reregistration eligibility Decision (RED). [Consultado enero de 2013). Disponible en: http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/temephos_red.htm#1

EXTOXNET. (2002). The Extension Toxicology Network. Pesticide information profile for temephos. [Consullado octubre de 2012). Disponible en http://pmep.cce.comell.edu/profiles/extoxneUpyrethrins-ziramItemephos ext.html

FAO. (2002). Food and Agriculture Organization of the United Nations International Code of Conduct on the Distribution and Use of Pesticides [Consultado octubre de 2013). Disponible: http://www.fao.orgIWAICENT/ FAOINFO/AGRICULT/AGP/AGPP/Pesticid/CodelDownload/code.pdf Fenech, M. (2000). The in vitro micronucleus technique. Mutation Research. 455:81-95.

Fenech, M., Bonassi, S., Turner, J., Lando, C., Ceppi, M., Chang, w.P., Holland, N., Kirsch-Voiders, M., Zeiger, E., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Cao, J., De Luca, G., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A, Lima, O.G., Hadjidekova, V.v., Hrelia, P., Jaworska, A, Joksic, G., Krishnaja, AP., Lee, T.K., Martelli, A, McKay, M.J., Migliore, L., Mirkova, E., Muller, W.U., Odagiri, Y, Orsiere, T., Scarfi, M.R., Silva, M.J., Sofuni, T., Surralles, J., Trenta, G., Vorobtsova, I., Vral, A, Zijno, A (2003). Human Micronucleus project. Intra-and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes. Results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project. Mutation Research. 534:65-75.

Fenech, M., Crott, J.W. (2002). Micronuclei, nucleoplasmic bridges and nuclear buds induced in folic acid deficient human lymphocytes evidence for breakage fusion-bridge cycles in the cytokinesis-block micronucleusassay. Mutation Research. 504:131-136.

Ferguson, P., Medon, P., Nasri, E. (1985). Temephos (Abate) metabolism and toxicity in rats. Archives of Environmental Contamination and Toxicology.14:143-147

Fest, C., Schmidt, K.J. (1973). The chemistry of organophosphorus pesticides Second Edition, Ed. Springer-Verlag Berlin Heidelberg. New York, USA pp.122-135

Gonzalez Arias, CA, Robledo Marenco, M.L., Medina Dlaz, I.M., Velazquez Fernandez, J.B., Gir6n Perez, M.I., Quintanilla Vega, B. Ostrosky Wegman, P., Perez Herrera, N.E., Rojas Garcia, AE. (2010). Patr6n de Uso y Venta de Plaguicidas en Nayarit, Mexico. Revista Internacional de Contaminaci6n AmbientaI.26(3):221-228

Hargreaves, AJ. (2012). Neurodegenerations induced by organophosphorous compounds. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724:189-204. Hreljac, I., Zajc, I., Lah, T., Filipic, M. (2008). Effects of Model Organophosphorous Pesticides on DNA Damage and Proliferation of HepG2 Cells Environmental and Molecular Mutagenesis. 49:360-367

Hreljac, I., Filipic, M. (2009). Organophosphorous pesticides enhance the genotoxicity of benzo(a)pyrene by modulating its metabolism. Mutation Research. 671:84-92

HSDB. (2003). Hazardous Substances Databank: Temephos. National Library of Medicine, National Toxicology Program. [Consultado Octubre 2013]. Disponible en: http://www.toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB

INCH EM. (2002). Chemical Safety Information from Intergovernmental Organizations. Data sheets on pesticides. No.8 Rev. 1: Temephos. Geneva: Food and Agricultural Organization, World Health Organization [Consultado octubre de 2014] Disponible http://www.inchem.org/documents/pds/pds/pest8_e.htm

INECC. (2013). Instituto Nacional de Ecologia y Cambio Climatico. [Consultado mayo de 2014J. Disponible en: http://www2.inecc.gob.mxlsistemas/ plaguicidas/pdf/temefos.pdf

Jennen, D.G., Magkoufopoulou, C., Ketelslegers, H.B., van Herwijnen, M.H., Kleinjans, J.C., van Delft, J.H. (2010). Comparison of HepG2 and HepaRG by wholegenome gene expression analysis for the purpose of chemical hazard identification. Toxicological Science. 115:66-79

Jennen, D., Ruiz-Aracama, A, Magkoufopoulou, C., Pejinenburg, A, Lommen, A, van Delft, J., Kleinjans, J., (2011). Integrating transcriptomics and metabonomics to unravel modes-of.action of 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p dioxin (TCDD) in HepG2 cells. BioMed Central Systems Biology. 5:139.

Jeyaratnam, J., Maroni, M. (1994). Organophosphorous Compounds. Chapter 3 Toxicology. 91:1-116. Jimenez, N., Gonzalez, M., Fernandez, C., L6pez, J. (2007). Estudio de la biocompatibilidad in vitro de polimeros metacrilicos derivados de pirrolidonalina.Biomecanica.15(1):63-71.

Jin, X., Chen, a., Tang, S.S., Zou, J.J., Chen, K.P., Zhang, T., Xiao, X.L. (2009) Investigation ofquinocetone-induced genotoxicityin HepG2 cells using the comet assay, cy1okinesis-block micronucleus test and RAPD analysis. Toxicology In Vitro. 23(7):1209-1214.

Johnson, M.K. (1990). Organophosphates and delayed neuropathy--is NTE alive and well? Toxicology and Applied Pharmacology. 1;102(3):385-399

Kehdy, F.S., Cerqueira, E.M., Bonjardim, M.B., Camelo, R.M., Castro, M.C (2007). Study of the cy10genetic effects of occupational exposure to pesticides on sanitation workers in Belo Horizonte, Brazil. Genetic Molecular Research. 30:6(3):581-593

Kessova, I., Cederbaum AI. (2003). CYP2E1: biochemistry, toxicology, regulation and function in ethanol-induced liver injury. Current Molecular Medicine 3(6):509-518.

KnasmOller, S., Schwab, C.E., Land, S.J., Wang, C.Y., Sanyal, R., Kundi, M., Parzefall. W., Darroudi, F. (1999). Genotoxic Effects of heterocyclic aromatic amines in human derived hepatoma (HepG2) cells. Mutagenesis.14:533-539

Lamy, E., Kassie, F, Gminski, R., Schmeiser, H.H., Mersch-Sundermann, V (2004). 3-Nitrobenzanthrone (3-NBA) induced micronucleus formation and DNA damage in human hepatoma (HepG2) cells. Toxicology Letters 146:103-109.

Larramendy, M. L., Nikoloff, N., Ruiz de Arcaute, C., Soloneski, S. (2014). Genotoxicity and Cytotoxicity Exerted by Pesticides in Different Biotic Matrices-An Overview of More Than a Decade of Experimental Evaluation Environmental And Analytical Toxicology. (4)4:2-10. Li, MY, Deng, H., Zhao, J.M., Dai, D., Tan, XY. (2003). PPARgamma pathway activation results in apoptosis and COX-2 inhibition in HepG2 cells. World Journal of Gastroenterology. 9(6):1220-1226

Lieberman, A.D., Craven, M.R., Lewis, H.A., Nemenzo, J.H. (1998). Genotoxicity from domestic use of organophosphate pesticides. JournalofOccupational and Environmental Medicine. 40(11):954-957

Luque Cabrera, J., Herraez Sanchez, A. (2011). Tex10 ilustrado de biologla molecular e ingenieria genetica: conceptos, tecnicas y aplicaciones en cienciasdelasalud. Ed. ElsevierMadrid,Espana.pp:129-131.

Lyer, V.v., Yang, H., Marianthi, G., Lerapetritou, C.M., Roth, C. (2010). Effects of glucose and insulin on HepG2-C3A cell metabolism. Biotechnology and Bioengineering; Journal of Occupational and Environmental Medicine. 2(107):347-356

Moore, P.D., Yedjou, C.G., Tchounwou, P.B. (2010). Malathion-Induced Oxidative Stress, Cytotoxicity, and Genotoxicity in Human Liver Carcinoma (HepG2) Cells. Environmental Toxicology. 25(3):221-226

Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival'

application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal 0 flmmunological

NOM-032-SSA2-2010. Norma Oficial Mexicana: Para la vigilancia epidemiol6gica, prevenci6n y control de enfermedades transmitidas por vector. Diario OficialdelaFederaci6n. Lunes21 de julio de 2003

Norman, J. (1990). HepG2 cells as a resource for metabolic studies: lipoprotein, cholesterol, and bile acids. The Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 4:161-168

Nikoloff, N., Escobar, L., Soloneski, S., Larramendy, M.L. (2013). Comparative study of cytotoxic and genotoxiceffectsinduced by herbicide S-metolachlor and its commercial formulation Twin Pack Gold in human hepatoma (HepG2) cells. Food and Chemical Toxicology. 62:777-781. Nikoloff, N., Larramendy, M.L., Soloneski, S. (2014). Assessment of DNA damage, cytotoxicity, and apoptosis in human hepatoma (HepG2) cells after f1urochloridone herbicide exposure. Food and Chemical Toxicology 65:233-241.

Ojha, A, Srivastava, N. (2014). In vitro studies on organophosphate pesticides induced oxidative DNA damage in rat lymphocytes. Mutation Research 761:10-17

Omari Yousif I. A (2011). Micronucleus analysis and mitotic index in a Jordanian population exposed to pesticides of organophosphate: malathion and chlorpyrifos.Caryologia.64(2):173-17B.

Preussman, R., Schneider, H., Epple, F. (1969). Untersuchungen sur wachweis alkylierenderagentien. Arzneimitel Forschung. 19:1059-1073.

Ramirez, J. A, Lacasaria, M. (2001). Plaguicidas: clasificaci6n, uso, toxicologia y medici6n de la exposici6n. Archivos de prevenci6n de riesgos laborales. 4(2):67-75.

Renshaw, w., Bobbis, A (2006). Temephos. En: Joint by FAO and WHO, with the support of the international programme on chemical safety/joint meeting of the FAO panel of experts o pesticides residues in food and the environment and WHO core assessment group. Pesticide residues in food. Toxicological Evaluations. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data. Rome, Italy. pp.

Satar, S., Kayraldiz, A, Rencuzogullari, E., Karakoc, E., Sebe, A, Avci, A, Yesilagac, H., Topaktas, M. (2009). The genotoxicity and cytotoxicity among patients diagnosed with organophosphate poisoning. Bratislavske lekarskelisty.110(B):476-479

Sierra, C.Y.B. (2011). Evaluaci6n del efecto genot6xico de la radiaci6n ionizante en medicos ortopedistas expuestos laboralmente, en cuatro instituciones de salud en Bogota, Colombia. Tesis de magister en toxicologia. [Consultado de 2014] Disponible http://www.bdlgital.unal.edu.co/5309/1/brigithyesenyasierracano.2011.pdf Vale, JA (1998). Toxicokinetic and toxicodynamicaspects of organophosphorus (OP) insecticide poisoning. Toxicol Letters. 102-103:649-652.

Verdin-Betancourt, F.A. (2013). Efectogenot6xicodelplaguicidaorganofosforado temefos, evaluado mediante el ensayo cometa en celulas HepG2. Tesis professional UniversidadAut6noma de Nayarit. pp.2-6

Vivien H., Hashim Z., Ismail P., Said S., Omar D., Bahri Mohd Tamrin SH. (2013) Biological monitoring of genotoxicily to organophosphate pesticide exposure among rice farmers: Exposure-effect continuum study. JOHE, Winter-spring. 2(1-2):27-36

Wang a., Ye, Y.J., Wan, J.X., Sun, P., Zhu, Y., Au, W, Xia, Z.L., (2012). mRNA expression levels among cell regulatory and DNA damage genes in benze exposed workers in China. Journal Occupational Environmental Medicine

Wei, W, Hu, Z., Fu, H., Tie, Y., Zhang, H., Wu, Y., Zheng, X., (2012). MicroRNA-1 and microRNA-499 downregulate the expression of the ets1 proto oncogene in HepG2celis. Oncology Reports. 28(2):701-706.

Westerink, WM., Stevenson, J.e., Horbach, G.J., Schoonen, WG. (2010). The development of RAD51C, Cystatin A. p53 and Nrf2 luciferase-reporter assays in metabolically competent HepG2 cells for the assessment of mechanism-based genotoxicilyand of oxidative stress in the earIyresearch phase of drug development. Mutation Research. 696:21-40

Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. (2003). Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug metabolism and Disposition. 31:1035-104

Wu, J.C., Chye, S.M., Shih, M.K., Chen, C.H., Yang, H.L., Chen, S.C. (2010). Genotoxicily of dicrotophos, an organophosphorous pesticide, assessed with different assays in vitro. Environmental Toxicology. 27(5):307-15

Yoshitomi, S., Ikemoto, K., Takahashi, J., Miki, H., Namba, M., Asahi, S. (2001). Establishment of the transformants expressing human cytochrome P450 subtypes in HepG2, and their applications on drug metabolism and toxicology. Toxicolology In Vitro. 15(3):245-56

Young, S.C., Wang, C.J., Hsu, J.D., Hsu, J.L., Chou, F.P. (2006). Increased sensitivity of HepG2 cells toward the cytotoxicity of cisplatin by the treatmentofpiperbetelleafexlracl. Archives of Toxicology. 80:319-327.

Zhuge, J., luo, Y., Yu, Y.N. (2003). Heterologous expression of human cytochrome P450 2E1 in HepG2 cell line. World Journal of Gastroenterology. (12):2732-2736.

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