T.C. Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bazi Antidepresan Ilaç Numunelerinin Pcr Ve Pls

T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

BAZI ANTİDEPRESAN İLAÇ NUMUNELERİNİN PCR VE PLS İLE SPEKTROFOTOMETRİK TAYİNLERİ

Nuray AYTEKİN

Danışman Prof. Dr. Ahmet Hakan AKTAŞ

YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI ISPARTA - 2014

TAAHHÜTNAME

Bu tezin akademik ve etik kurallara uygun olarak yazıldığını ve kullanılan tüm literatür bilgilerinin referans gösterilerek tezde yer aldığını beyan ederim.

Nuray AYTEKİN

İÇİNDEKİLER

Sayfa İÇİNDEKİLER ...... i ÖZET ...... iii ABSTRACT ...... iv TEŞEKKÜR ...... v ŞEKİLLER DİZİNİ ...... vi ÇİZELGELER DİZİNİ ...... vii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ...... viii 1. GİRİŞ...... 1 1.1. Sertralinenin Genel Özellikleri...... 2 1.2. Trazodonenin Genel Özellikleri...... 4 1.3. Kullanılan Yöntem...... 5 1.3.1. Spektrofotometri ...... 5 1.3.2. Uv ve görünür bölge spektroskopisi ...... 7 1.3.3. Uv ve görünür bölge absorpsiyon spektrofotometreleri ...... 8 1.3.4. Işın kaynakları ...... 9 1.3.5. Dalga boyu seçiciler ...... 10 1.3.6. Örnek kapları ...... 10 1.3.7. Dedektörler ...... 11 1.3.8. Uv ve görünür bölge moleküler absorpsiyon spektroskopisinin uygulamaları ...... 11 1.3.8.1. Nitel analiz ...... 11 1.3.8.2. Nicel analiz ...... 12 1.4. Kemometrik Yöntemler ...... 12 1.4.1. Çok değişkenli kalibrasyon algoritmaları ...... 15 1.4.1.1. Temel bileşen analiz yöntemi (principal component analysis (PCA) method) ...... 15 1.4.1.2. Temel bileşen regresyon yöntemi (principal component regression (PCR) method) ...... 16 1.4.1.3. Kısmi en küçük kareler yöntemi (partial least squares regression (PLS) method) ...... 18 1.4.2. Kalibrasyon (derişim) setinin tasarımı ...... 20 1.4.3. Çapraz validasyon işlemi (cross validation procedure) ...... 21 1.4.4. Varyans analizi (anova) ...... 21 1.4.5. Kemometrik kalibrasyon yöntemlerinin uygulamaları ...... 22 1.4.5.1. Kemometrik yöntemlerin uygulama alanları ...... 22 1.4.5.2. Çoklu bileşen analizi (multi komponent analysis) ...... 23 2. KAYNAK ÖZETLERİ ...... 24 3.MATERYAL ve METOT ...... 40 3.1. Materyal ...... 40 3.2. Kullanılan Cihazlar ...... 40 3.2.1. Uv-görünür spektrofotometre cihazı ...... 40 3.3. Kullanılan Kimyasal Maddeler ...... 40 3.3.1. Kullanılan çözeltiler ...... 41 3.4. Yöntem ...... 42 3.4. 1.Uv/Vis spektroskopisi yöntemi ...... 42

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA (ARAŞTIRMA BULGULARI) ...... 44

4.1. Uv Spektroskopisi ...... 44 4.1.1. Saf halde SERT ve TRAZ’ ın spektrumları ...... 45 4.2. Kalibrasyon Setinin Hazırlanması ...... 46 4.3. Spektral Koşulların Optimizasyonu ...... 48 4.3.1. Temel bileşen analizi ...... 49 4.3.2. Temel bileşen regresyon yöntemi ...... 51 4.3.2.1. Kalibrasyon yönteminin validasyonu ...... 53 4.3.2.2. PCR yöntemi için anova testi ...... 53 4.3.2.3. PCR yönteminde istatiksel analiz ...... 54 4.3.2.3.1. Kalibrasyonun standart hatası ...... 54 4.3.2.4. PCR yönteminin farmasotik preparatlara uygulanması ...... 55 4.3.3. Kısmi en küçük kareler yöntemi (PLS) ...... 56 4.3.3.1. Kalibrasyon yönteminin validasyonu ...... 57 4.3.3.2. PLS yöntemi için anova testi ...... 58 4.3.3.3. PLS yönteminde istatiksel analiz ...... 58 4.3.3.3.1. Kalibrasyonun standart hatası ...... 58 4.3.3.4. PLS yönteminin farmasotik preparatlara uygulanması ...... 59 5. SONUÇ VE ÖNERİLER (TARTIŞMA VE SONUÇLAR)...... 61 KAYNAKLAR ...... 63 ÖZGEÇMİŞ ...... 67

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

BAZI ANTİDEPRESAN İLAÇ NUMUNELERİNİN PCR VE PLS İLE SPEKTROFOTOMETRİK TAYİNLERİ

Nuray AYTEKİN

Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. Ahmet Hakan AKTAŞ

Bu tez çalışmasında, kemometrik kalibrasyon yöntemleri temel bileşen analizi (PCA) temel bileşen regresyonu yöntemi (PCR), kısmi en küçük kareler yöntemi (PLS)), farmasötik sertraline (SERT) ve trazodone (TRAZ)’in aynı anda miktar tayinlerine hiç bir ayırma işlemi kullanmaksızın başarıyla uygulanmıştır ve bu yöntemler UV Görünür Alan Spektroskopisi yöntemlerinden elde edilen veriler kemometrik olarak değerlendirilmiştir.

Bu kemometrik yöntemlerin validasyonu için, sertraline (SERT) için 1–5 μg/mL derişim aralığında ve trazodone (TRAZ) için 4–20 μg/mL derişim aralığında bileşikleri içeren 19 adet karışımdan oluşan kalibrasyon (derişim) seti, metanol içerisinde hazırlandı. Kalibrasyon setinin 200- 300 nm aralığında absorpsiyon spektrumu kaydedildi. Kalibrasyon seti ve bu sete karşılık 220–280 nm aralığında elde edilen absorpsiyon verileri arasındaki ilişkiden yararlanılarak üç kemometrik kalibrasyon oluşturuldu. PCR ve PLS yöntemlerinin validasyonu, SERT ve TRAZ içeren sentetik karışımların analiziyle gerçekleştirildi. PCR ve PLS yöntemlerinin SERT ve TRAZ karışımlarının analizine uygulamasında, PCR ve PLS için % geri kazanım sonuçları ile karşılık gelen standart sapma değerleri sırasıyla SERT için % 98,36 / % 1,30 ve %99,99 / % 1,93 ; TRAZ için % 99,33 / % 0.63 ve % 99,79 / % 2.03 olarak bulundu.

Sonraki basamakta PCA, PCR ve PLS yöntemleri, ticari farmasötik preparattaki SERT ve TRAZ’ ın aynı anda miktar tayinlerine uygulandı.

Anahtar Kelimeler: Antidepresan, ilaç, spektrofotometre, PCA, PCR, PLS, UV, Kemometri

2014, 67 sayfa

iii

ABSTRACT

M.Sc. Thesis

SPECTROPHOTOMETRIC DETERMINATION OF SOME ANTIDEPRESSANT DRUG SAMPLES WITH PCR AND PLS

Nuray AYTEKİN

Süleyman Demirel University Graduate School of Applied and Natural Sciences Department of Chemistry

Supervisor: Prof. Dr. Ahmet Hakan AKTAŞ

In this thesis, three different chemometric calibration methods principle component analysis (PCA), partial least square (PLS) and principal component regression (PCR) were successfully applied to the simultaneous determination of trazodone (TRAZ) and sertraline (SERT) in pharmaceutical preparations without using any separation step.The data of UV-Visible Spectroscopy applied to the chemometric calculations.

For the validation of this chemometric metot, a calibration set of 19 binary mixtures containing compounds in the working range of 4-20 μg/mL for TRAZ and 1-5 μg/mL for SERT was prepared in methanol. Calibration sets 200-300 nm range absorption spectra were recorded. Three chemometric calibrations were constructed by using the relationship between the calibration set and its corresponding absorption data obtained in the range 220-280 nm. The synthetic mixtures of two drugs were used for the validity of the calibrations. Means recoveries (percent) and relative standard deviation of PCR and PLS methods were found to be % 99,33 / % 0,63 and %99,79 / % 2,03 for TRAZ ; % 98,36 / % 1,30 and % 99,99 / % 1,93 for SERT respectively.

In the next step, the PCA, PCR and PLS methods were applied to the simultaneous determination of TRAZ and SERT in commercial pharmaceutical preparations and successful results were obtained.

Keywords: Antidepressant, drug, spectrophotometry, PCA, PCR, PLS, UV, Chemometrics.

2014, 67 pages

TEŞEKKÜR

Bu araştırma için beni yönlendiren, karşılaştığım zorlukları bilgi ve tecrübesi ile aşmamda yardımcı olan değerli Danışman Hocam Prof. Dr. Ahmet Hakan AKTAŞ’a teşekkürlerimi sunarım.

3681-YL1-13 No`lu Proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı’na teşekkür ederim.

Tezimin her aşamasında beni yalnız bırakmayan aileme sonsuz sevgi ve saygılarımı sunarım.

Nuray AYTEKİN ISPARTA, 2014

ŞEKİLLER DİZİNİ

Sayfa Şekil 1.1. Sertralinen'in açık formülü ...... 2 Şekil 1.2. Trazodon'un açık formülü...... 4 Şekil 1.3. Sertralin ve trazodon'un üç boyutlu molekül yapısı ...... 4 Şekil 1.4. Temel haldeki ve uyarılmış haldeki elektronlar ...... 6 Şekil 1.5. Numune üzerine gönderilen ve çıkan ışığın şiddeti ...... 6 Şekil 1.6. Spektrofotometrenin temel bileşenleri ...... 8 Şekil 1.7. UV-Görünür alan spektrofotometresi ...... 9 Şekil 1.8. Kemometrinin ilişkili olduğu disiplinler ...... 14 Şekil 1.9. X1 ve X2 olan iki değişken için PC1 ve PC2 olan iki esas bileşeni gösteren diyagram ...... 15 Şekil 1.10. PLS2 kalibrasyonu ...... 18 Şekil 3.1. SERT VE TRAZ içeren piyasadaki ilaçlardan lustral ve desyrel…... 42 Şekil 4.1. SERT maddesinin absorpsiyon spektrumu ...... 45 Şekil 4.2. TRAZ maddesinin absorpsiyon spektrumu ...... 46 Şekil 4.3. Simetrik kalibrasyon setinin iki boyutlu düzlemdeki grafiği ...... 47 Şekil 4.4. SERT (4 μg/mL) ve TRAZ (12 μg/mL) ile iki bileşiğe karşılık gelen karışımın absorpsiyon spektrumları ...... 48 Şekil 4.5. Değişkenlerin doğrusal bileşenleri ...... 49 Şekil 4.6. Kemometrik verilerden elde edilen özdeğerlerin grafiği ...... 50 Şekil 4.7. PCR kalibrasyon basamağında SERT için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar ...... 55 Şekil 4.8. PCR kalibrasyon basamağında TRAZ için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar ...... 55 Şekil 4.9. PLS kalibrasyon basamağında SERT için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar ...... 59 Şekil 4.10. PLS kalibrasyon basamağında TRAZ için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar ...... 59

ÇİZELGELER DİZİNİ

Sayfa Çizelge 1.1. Varyans analizi çizelgesi ...... 22 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan kimyasallar ...... 41 Çizelge 4.1. İlaç aktif maddelerinin spektroskopik özellikleri ...... 44 Çizelge4.2. SERT ve TRAZ analizi için kalibrasyon seti ...... 47 Çizelge4.3. SERT ve TRAZ sentetik karışımlarına PCR kalibrasyon yönteminin uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri . 53 Çizelge 4.4. Tablet preparatına PCR yönteminin uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar ...... 56 Çizelge 4.5. SERT ve TRAZ sentetik karışımlarına PLS kalibrasyon yönteminin uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri 57 Çizelge 4.6. Tablet preparatına PLS yönteminin uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar ...... 60

vii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

ANOVA Varyans analizi (Analysis of variance) AO Ortalanmış absorbans BSS % Bağıl standart sapma CLS Classical least-squares CO Ortalanmış derişim CZE Kapiler zone elektrot ESI-MS Elektrosprey iyonizasyon modu-kütle spektrometre GC Gas chromatography GC-MS Gas chromatography-Mass spectrometry GK % Geri Kazanım HPLC High-performance liquid chromatography IR İnfrared IS İç standart LC-MS Liquid chromatography–mass spectrometry LLOQ Kuantifikasyon limiti LOD Dedektör limiti NEF Nefazodone NMR Nükleer manyetik rezonans spektrometre OH-NEF Hidroksi nefazodone PC Matematiksel anlamda temel bileşenler PCA Temel bileşen analizi yöntemi(Principal component analysis method) PCR Temel bileşen regresyon yöntemi (Principal component regression) PLS Kısmi en küçük kareler yöntemi( Partial least squares regression) PRESS Prediction error sum of squares SERT Sertraline SPE Katı faz ekstraksiyonu SRM Standart Reference Method SS Standart sapma SSRI Selektif serotonin re-uptake inhibitörü TCAs Trisiklik antidepresan TRAZ Trazodone UV Ultra viyole görünür bölge spektroskopisi X Ortalama değer

viii

1.GİRİŞ

İlaç, tıpta kullanılan ve biyolojik etkinliği olan saf kimyasal madde veya ona eşdeğer bitkisel veya hayvansal kaynaklı, standart miktarda aktif madde içeren bir karışımdır. Bir başka deyişle İlaç, canlı hücrelerde meydana getirdiği etki ile bir hastalığın iyileştirilmesi, teşhisi veya belirtilerinin azaltılması amacıyla kullanılan; doğal, yarı sentetik veya sentetik kimyasal maddelerdir. İlaçlar etken madde ve taşıyıcı olmak üzere iki kısımdan meydana gelir. Etken madde, canlıda biyolojik ve fizyolojik etki gösteren hastalıkların tanı ve tedavisinde kullanılan bir veya birkaç kimyasal madde karışımından oluşan kısmı; yani ilacın ana bileşenidir. Taşıyıcı ise etken maddenin hasta tarafından kolay alınabilmesi veya iyi doze edilebilmesi için katılan fizyolojik etkisi olmayan glikoz, parafin, gliserin gibi kimyasal maddelerdir. Etken maddeler yeterli miktarlarda alındığında insan sağlığını olumlu yönde etkilerken, az alınması durumunda fayda sağlamaz, aşırı ya da yanlışlıkla alındığı durumlarda ise insan sağlığına oldukça tehlikeli boyutlarda zarar vermektedir. Bu sebeple ilaçların üretiminden kullanımına ve vücuttan atılımına kadar olan tüm noktalarda miktar analizleri önemlidir.

İlaç analizlerinin yapılabilmesi için, önemli olan öncelikle analiz için kullanılacak aletler ve elde edilecek verilerin anlaşılabilir hale getirilebileceği matematiksel metotlardır. Analitik çalışmalarda tek başına, iki veya daha fazla aktif bileşiği içeren karışımların kantitatif analizi için spektrofotometri, spektroflorimetri, infrared spektrofotometrisi, voltametri (polarografi), kromatografi, kütle spektrometresi son derece hassas, gelişmiş fakat pahalı aletler ve bu yöntemlerin kombine şekilleri kullanılmaktadır (Kaya, 2007).

Günümüzde analiz için kullanılan hemen hemen her laboratuarda bulunan UV Visible spektrofotometreler ucuz ve hassas olmakla birlikte karmaşık sonuçlar vermektedir. UV Visible aletlerinin kullanılması tek etken madde içeren ilaçların analizinde herhangi bir sorun oluşturmazken birbiri ile çakışan spektrum veren ilaç karışımları analizinde sorunlar oluşabilir. Analiz işlemlerinde daha kesin, daha doğru, daha hızlı, daha ekonomik ve daha güvenilir sonuçlara ulaşmak için yeni teknik ve yaklaşımlara ihtiyaç vardır (Çetin, 2008).

Analitik kimyada hiçbir ön ayırma işlemi yapmaksızın kombine ilaç numunelerinin aynı anda kantitatif analizi son derece önemlidir. Analitik yöntemler geliştirmek amacıyla, klasik analitik yöntemler ile birlikte değişik matematiksel algoritmalara dayanan hesaplama teknikleri kombine olarak uygulanmaktadır. Klasik analitik yöntemler ile kemometrik kalibrasyonların karışım analizlerinde başarılı sonuçlar vermesi nedeniyle kemometrik yöntemler ilaç numunelerinin analizinde artan yoğunlukta kullanılmaktadır (Kaya, 2007).

Bu çalışmada ilaç etken maddelerinden sertralin ve trazadonun’ un miktar tayinlerini UV spektroskopisi yöntemiyle tayin edip elde edilen verilerin kemometrik yöntemlerle değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu bölümde analizi yapılacak bu etken maddeler ve uygulanan yöntemler hakkında bilgi verilecektir.

1.1 Sertralinin genel özellikleri

Kapalı formülü C17H17CI2N olan sertralinin açık formülü şekil 1.1’ de gösterilmiştir.

Şekil 1.1 Sertralinin açık formülü

Sertralinin IUPAC’ a göre adı (1S,4S)-4-(3,4-dichlorophenyl)-N-methyl-1,2,3,4- tetrahydronaphthalen-1-amine’ dir. Molekül ağırlığı 306,37229g/mol, eliminasyon yarılanma ömrü ~ 23-26 saattir. Boşaltım böbrekte gerçekleşir. Selektif serotonin re-uptake inhibitörüdür (SSRI). Başka bir değişle fenilnaftilamin türevi ve yapıca diğer ilaçlara benzemeyen güçlü bir serotonin re-uptake blokörüdür. Noradrenalin ve dopamin re-uptake’ ine dokunmaz. Bağırsaktan kısmen absorbe edilir ve yemek sırasında alınması absorbsiyon oranını artırır. Karaciğerde demetilasyon sonucu inaktif ürünlere yıkılmak suretiyle yavaş olarak elimine edilir. Karaciğer mikrozomal oksidazlarını hafif olarak indükleyebilir. Farmakolojik etki profili fluoksetininkine benzer. Enzim inhibisyonu yapmaması ve elimünasyon yarılanma ömrünün fluoksetin ve özellikle onun aktif metaboliti olan norfluoksetininkine göre kısa olması bu ilaca üstünlük sağlar. Depresyon ve anksiyete bozuklukları tedavilerinde yaygın olarak kullanılır. Başlangıçta ağızdan günde 50mg tek doz şeklinde sabah veya akşam yemek sırasında verilir. Günlük doz, alınan cevaba göre haftalık artmalarla 200mg’ a kadar çıkarılabilir. İştahı azalttığı için ve alkole karşı özlemi düşürdüğü için obesite ve alkolizm tedavisinde de denenebilir. En sık görülen yan tesiri bulantı, diyare veya feçesin yumuşaması ve dispepsidir. Trisiklik antidepresanlardan farklı olarak sedasyon, antikolinerjik ve kardiyotoksik etki genellikle yapmaz veya hafif yapar. Erkeklerde ejakülasyon bozukluğu yapabilir. Gebelerde kullanılmamalıdır. Çocularda güvenliliği belirlenmemiştir. Diğer antidepresanlar için olduğu gibi, MAO inhibitörleri ile birlikte kullanılması tavsiye edilmez. Sertraline kestikten en az 4 yarılanma ömründen(7-10 gün) sonra MAO inhibitörü verilebilir. Plazma proteinlerine en fazla bağlanandır. Yan etkileri seksüel disfonksiyon ve GIS intoleransıdır. Piyasada lustral, zoloft gibi ticari isimlerle antidepresan ilacı satılmaktadır.

1.2 Trazadonun genel özellikleri

Kapalı formülü C19H22CIN5O olan trazadonun açık formülü şekil 1.2’ de gösterilmiştir.

Şekil 1.2. Trazadonun açık formülü.

Sertralin ve trazodonenin üç boyutlu molekül yapıları şekil 1.3’ de gösterilmiştir.

Şekil 1.3. Trazadonun ve sertralinin sırası ile üç boyutlu molekül yapısı

Trazadonun IUPAC’ a göre kimyasal olarak adlandırılması 2-{3-[4-(3- chlorophenyl)piperazin-1-yl]propyl}[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyridin-3(2H)-one şeklindedir. Molekül ağırlığı 371,864g/mol olup %63,56 C, %6,00 H, %9,27 N, %21,17 O içermektedir. Erime noktası 169–170,5°C arasındadır. Yarılanma süresi 7 saat(ani salımlı) ve 10 saat(uzun süreli salımlı)’ dir. Boşaltımı % 21 dışkı ve %20-25 idrarda gerçekleşmektedir. Atipik antidepresan ilaç grubuna aittir. Bu grupta en etkili ilaç değildir. Trisiklik ilaçlara göre daha az yan etkileri vardır. Trisiklik ilaçlara hiç benzemeyen bir yapıda, triazolopiridin türevi bir ilaçtır. Selektif, fakat nisbeten zayıf bir şekilde serotonin re-uptake’ ini bloke eder. 5-HT1, 5-HT2 serotonerjik ve α2-adrenerjik reseptörleri bloke eder.

Serotonin reseptörlerini bloke etmesi, bir metaboliti olan m- klorofenilpiperazine bağlı olabilir. Belirgin derecede sedatif etkinlik gösterir. Güçlü sedatif özelliği ve kısa etkili olması neden ile uyku bozukluğu tedavisinde yaygın olarak kullanılır. Günde bir kez verilebilir. Günlük dozu 150-250mg’ dır. En sık görülen yan tesirleri uyuşukluk ve sedasyondur. Nadiren sipesifik bir yan etki olarak priapizm oluşturabilirler. 5HT-2a reseptörünü bloke eder bu yüzden antipsikotik özelliği de vardır. Konfüzyon ve yüksek dozda verilmişse, deliryun yapabilir. Kardiyotoksik ve prokonvülsif etkinliği zayıftır. Alkol ve benzeri SSS depresanlarının etkinliğini artırıp zehirlenme yapabilir. Piyasada desyrel, molipaxin gibi ticari isimlerle satılmaktadır.

1.3. Kullanılan Yöntem

1.3.1. Spektrofotometri

Elektromanyetik ışınım enerjisi ile maddenin etkileşmesi sonucu maddede ki atom molekül veya iyonların, bir enerji düzeyinden diğerine geçişleri sırasında absorplanan veya yayılan elektromanyetik ışımanın ölçülmesinde ve yorumlanmasında kullanılan yönteme denir. Kullanılan cihazlara da spektrofotometre denir.

Atomlar, elektromanyetik ışımayı absorbe ederek en düşük enerji düzeyinden (temel düzey) uyarılmış düzeylere geçerler (şekil 1.4); bu geçişlerle ilgili olarak söz konusu atomun absorpsiyon spektrumları da belirlenmiştir. Elektromanyetik ışımayı absorbe ederek en düşük enerji düzeyinden (temel düzey) uyarılmış düzeylere geçmiş olan atomlar, temel düzeye dönüş sırasında ultraviyole veya görünür bölge sınırları içinde ışıma enerjisi yayarlar (emisyon). Her atom için emisyon spektrumu da belirlenir.

Şekil 1.4. Temel haldeki ve uyarılmış haldeki elektronlar.

Işık absorpsiyonunun spektrofotometrelerle ölçülmesi atom, iyon veya molekül üzerine gönderilen ışığın şiddeti (Io) ile geçen ışığın şiddeti (I) arasındaki farkın ölçümü temelleri üzerine kurulmuştur (Şekil 1.5).

Şekil 1.5. Numune üzerine gönderilen ve çıkan ışığın şiddeti (l = ışığın numune içinde aldığı yoldur).

Işığın absorpsiyonunun üzerine düştüğü atom, iyon veya molekülün derişimi ile orantılı olarak değiştiği Lambert - Beer tarafından ileri sürülmüştür. Lambert- Beer yasası olarak adlandırılan aşağıdaki eşitlikte aynı derinlikte bir çözeltiden geçen bir ışın demetinin şiddeti çözeltinin derişimiyle orantılı olarak azalır.

I = Io . 10-εlC (1.1)

Burada;

I = Numuneyi terk eden ışığın şiddeti Io = Numune üzerine gönderilen ışığın şiddeti ε = Molar absorpsiyon katsayısı C = Absorpsiyon yapan türlerin derişimi l = Işığın numune kabı içinde aldığı yoldur.

Eğer eşitliğin eksi logaritması alınırsa, log = εlC elde edilir. Burada log absorbans’dır ve A ile gösterilir. Bu durumda yukarıdaki eşitlik kısaca;

A = εlC (1.2)

şeklinde gösterilir ve bu eşitlikten derişim kolaylıkla hesaplanabilir.

1.3.2 UV ve Görünür Bölge Spektroskopisi

Her madde üzerine düşürülen ışınlardan bazılarını absorplayabilir. Maddenin hangi dalga boylarındaki ışınları absorplayacağı kendine özgüdür. Bundan yararlanılarak nitel analiz yapılabilir. Bir maddenin absorplayacağı ışın şiddeti ise madde miktarı ile orantılıdır. Bundan yararlanılarak da nicel analiz yapılabilir. Bu amaçla madde üzerine çok çeşitli enerjilere sahip ışınlar gönderilebilir. Madde ile etkileşen ışının enerjisi değiştiğinde madde ile etkileşim mekanizması da değişir. Buna bağlı olarak ölçüm tekniğinin de değişmesi gerekir. Bu nedenle elektromanyetik spektrumun tümü için ölçüm yapılabilecek tek bir cihazın bulunması mümkün değildir. Elektromanyetik spektrumun farklı bölgeleri için farklı cihazlar kullanılır. Dalga boyu 110 nm – 1000 nm arasındaki UV ve görünür bölge ışınları ile çalışılabilen cihazlara UV ve görünür bölge spektrofotometreleri denir. Bu bölgedeki ışınların absorplanmalarının ölçümlerini temel alan analitik yönteme de UV ve görünür bölge spektroskopisi denir. UV ve görünür bölge ışınları molekülün en üst enerji seviyesindeki bir elektronun daha yüksek bir enerji düzeyine geçiş yapmasına sebep olur. UV ve görünür bölge ışınları, moleküllerde benzer etki yaptığı için

7 birleştirilmişlerdir. Hem organik, hem de anorganik moleküller UV ve görünür bölge ışınlarını absorplarlar. Her iki grup molekülde de ışın absorpsiyonu elektron geçişi ile gerçekleşmesine rağmen etkileşim mekanizmaları farklıdır. Organik moleküllerdeki absorpsiyon molekül orbital teorisine göre, anorganik moleküllerdeki absorpsiyon ise kristal alan teorisine göre açıklanır.

1.3.3. UV ve görünür bölge absorpsiyon spektrofotometreleri

Maddenin ışığı absorplamasını incelemek için kullanılan düzeneğe absorpsiyon spektrometresi veya absorpsiyon spektrofotometresi adı verilir. Bir spektrofotometre düzeneği Şekil 1.6’da görüldüğü gibi başlıca ışık kaynağı, dalga boyu seçicisi ve dedektörden oluşur. Dedektörde elektrik sinyaline çevrilen optik sinyal bir kaydedici veya bir galvanometre ile ölçülür.

Şekil 1.6. Bir spektrofotometrenin temel bileşenleri.

Bu ana bileşenlere ek olarak spektrofotometrelerde ışığı toplamak, odaklamak, yansıtmak, iki demete bölmek ve örnek üzerine belli bir şiddette göndermek amacıyla mercekler, aynalar, ışık bölücüleri ve giriş ve çıkış aralıkları vardır. Örnek ise, kullanılan dalga boyu bölgesinde ışığı geçiren maddeden yapılmış örnek kaplarına konularak ışık yoluna yerleştirilir (Şener, 2006).

Deneyler sırasında araştırma laboratuvarımızda kullandığımız UV-Görünür alan cihazımız şekil 1.7 de verilmiştir.

Şekil 1.7. UV-Görünür alan spektrofotometresi.

1.3.4. Işın Kaynakları

Spektroskopik çalışma için uygun bir kaynak, kolayca belirlenebilecek ve ölçülebilecek yeterli güçte ışın demetleri oluşturmalıdır. Buna ek olarak ışın şiddetinin, belirli bir süre içinde sabit kalması gereklidir. Tipik olarak, kaynağın ışın gücü, güç kaynağının potansiyeli ile üstel olarak değişim gösterir. Bu yüzden kaynaktan sabit bir ışın gücü sağlamak için, potansiyelinin istenilen kararlılıkta tutulması gereklidir. Kaynaktan gelen ışın şiddetini çok iyi kontrol etmek yerine, çift-ışınlı cihaz tasarımı alternatif bir yoldur. Bu cihazlarda, numuneden geçen ışının şiddeti, numuneden geçmeyen ışınınki ile mukayese edilir (Skoog, 1998).

Soğurma cihazlarında kullanılacak ışın kaynakları, tayin ve ölçüm için yeterli güçte olmalı ve sürekli, yani kullanılan bölgedeki bütün dalga boylarında ışın vermelidir. Görünür bölgedeki ışınları sağlamak kolaydır genelde yaklaşık 3000K’e ısıtıldığında akkor hale gelerek kara cisim ışıması yapan W- lambalardan yararlanılır. Bu lambalar 320-2500 nm aralığında sürekli bir spektrum verirler. W-lambasının içine az miktarda I2 konulduğunda W-Halojen lambalar elde edilir çalışma sıcaklığı yüksek olduğu için kuartz sistem gereklidir. Bu lambaların ömürleri daha uzun olup ömürleri yaklaşık iki kat fazladır.

UV ışın kaynağı olarak düşük basınçlı hidrojen ya da döteryum boşalım lambaları kullanılır. Bunlar 180-375 nm aralığında sürekli spektrum verirler. D2 lambalarının kullanım aralığı H2-lambalarınki ile aynıdır, fakat ışın şiddeti daha yüksek olup yaklaşık üç katı kadardır. Xe-ark lambaları daha yüksek şiddetli ışınlar için kullanılabilir. Bu lambalar 250-600 nm aralığında sürekli spektrum verirler yalnız çok ısındıkları için cihazın öbür bölümlerinden izole edilmeli hatta soğutulmalıdırlar.

1.3.5. Dalga Boyu Seçiciler

Nicel analizde belli bir dalga boyunda çalışarak Beer yasasına uyum sağlanmış olur, bu aralık maksimum soğurmanın olduğu aralık ise, duyarlık artırılmış olur ve diğer dalga boylarında soğurma yapan maddelerin girişimi engellenerek, seçimlilik artırılmış olur. Bu nedenle istenilen dalga boylu ışınları elde etmek için filtreler ve monokromatörlerden yaralanılır. Filtreler; renkli çözeltiler, renkli camlar, cut off (dalga boyu sınırlayıcı filtreler), interferans (girişim) filtreleri olup, monokromatörler; optik ağlar ve prizmalar şeklinde sınıflandırılabilir.

1.3.6. Örnek Kapları

Çözelti için kullanılan kaplara sel ya da küvet denir. Bunlar çalışılan bölgedeki ışınları soğurmayan geçirgen maddelerden yapılmalıdır. Bu nedenle λ< 350 nm olan mor ötesi bölgede camdan değil kuartzdan yapılmış küvetler kullanılmalıdır. Bunlar 20nm-3μm dalga boyu aralığında kullanılabilirler. Silikat camlar ise 350nm-2 μm bölgesinde kullanılabilir. Görünür bölgede kimi zaman plastikten yapılmış malzemelerde seçilebilir. Küvetler dikdörtgenler prizması şeklinde olup en çok kullanılanların genişliği 1cm’dir. Küvetlerin ışın doğrultusundaki yüzeyleri temiz olmalıdır. Kirlilik ve parmak izinin varlığı yanılgıları artırır ve tekrarlanabilir ölçümler alınamaz.

1.3.7. Dedektörler

Dedektörler, genelde foton dedektörleri ve termal dedektörler şeklindedir. Mor ötesi ve görünür bölgede en çok kullanılan foton dedektörleridir. Foton dedektörleri, ışın enerjisini elektrik enerjisine çevirip ölçüm yaparlar. Tümü ışınları soğuran aktif bir yüzeye sahiptir. Işınlar soğurulduktan sonra ya fotoelektronlar oluşur ve yayımlanır ya da elektronlar iletkenlik bantlarına geçirilerek fotoiletim olur. Foton dedektörleri; fotovoltaik piller, fototüpler, fotoiletken piller ve silisyum diyotlar şeklinde gruplanıp incelenebilir. İdeal bir dedektör;  Duyarlılığı yüksek olmalı.  Sinyal/gürültü oranı yüksek olmalı.  Geniş bir dalga boyu aralığında spektral yanıtı sabit olmalı.  Aydınlatma yokken çıkış sinyali en az olmalı, yani dark akım küçük olmalı.  Yanıtlama süresi kısa olmalı.  Alınan sinyal, ışın gücü ile doğru orantılı olmalıdır ( Henden, 2006).

1.3.8. UV ve görünür bölge moleküler absorpsiyon spektroskopisinin uygulamaları

Bu yöntemin başlıca uygulama alanları şunlardır.

1. Nitel Analiz: Analizi yapılacak olan bilinmeyen madde saflaştırıldıktan sonra uygun bir çözücüde çözülerek spektrumu alınır. Bu spektrum bilinen bileşiklerin aynı koşullarda çekilmiş spektrumları ile karşılaştırılır. Bilinmeyen madde spektrumu kendisininkine tam olarak uygun maddedir. Bu yöntem nitel analiz için çok uygun bir yöntem değildir. Çünkü moleküllerin absorpsiyon bantları oldukça geniştir ve bazı kromoforların absorpsiyon bantları birbiri ile örtüşebilir. Ayrıca moleküllerin UV ve görünür bölge absorpsiyon spektrumlarında çok az sayıda bant bulunur. Bu az sayıda bandın birbiri ile karşılaştırılarak karar verilmesi bazen hatalı sonuçlara yol açabilir.

2. Nicel Analiz: Işının absorplamasına dayanan analiz yöntemleri nicel analiz için oldukça yararlı ve güçlü yöntemlerdir. Bu yöntemlerin klasik yöntemlere göre önemli avantajları vardır.

a) Analiz süresi kısadır. Sonuç çabuk alınır. b)Doğruluk derecesi yüksektir. Çoğunlukla analizlerdeki hata binde bir veya iki civarındadır. c) Oldukça duyarlı bir yöntemdir. 10–8 M a kadar seyreltik çözeltilerin bile analizleri yapılabilir. d) Her maddenin kendine özgü bir absorpsiyon spektrumu olduğu için seçiciliği yüksektir. Çoğunlukla bir karışımdaki maddeler bir ön ayırma işlemine gerek kalmaksızın analizleri yapılabilir. e) Hem organik hem de anorganik pek çok molekül UV ve görünür bölge ışınları absorpladığından uygulama alanı geniştir (Şener, 2006).

1.4 Kemometrik Yöntemler

Kimyada ya da analitik kimyada verilerin işlenmesi ve istatistiksel değerlendirilmesi ile bu verilerin sağlandığı deney faktörlerinin araştırılması, optimize edilmesi, zaman tasarrufunun sağlanması ve kantitatif ölçümler için kalibrasyonların gerçekleştirilmesi için gerekli olan deneysel tasarımların hazırlanması kimyanın belki de en çok hesaplama ve modelleme çalışmalarına ihtiyaç duyulduğu alanlarıdır. Temel kimya ve fizik bilgileri ile birlikte mühendislik ve hesaplama tekniklerine, matematik ve istatistik konularına dayanan kimyada verilerin işlendiği ve değerlendiği alan kemometri olarak bilinmektedir (Kitiş, 2011).

Günümüzde bilgisayar, yazılım, istatistik ve uygulamalı matematik alanlarındaki gelişmeler, kimya alanında, özellikle de analitik kimyada karmaşık sistemlerin çözümü için kemometri adı verilen yeni bir disiplinin doğuşuna neden olmuştur. Bu gelişmeler, analitik kimya ve komşu dallardaki araştırmacılara, analitik problemlerin çözümünde yeni olanaklar sağlayan çok boyutlu ve çok değişkenli parametrelerin kullanıldığı kemometrik yöntemlerle yeni çalışma alanları

12 doğurmuştur. Kemometri, istatistik ve matematik ile birlikte bilgisayar kullanarak kimyasal verilerin işlenmesini kapsayan bir kimya disiplindir. Kemometri, kimyasal analizlerde, kimyasal verilerden gerçek bilginin ektraksiyonunu veya saklı bilgilerin açığa çıkarılmasına olanak tanıyan güçlü bir araçtır. Kemometrinin temel uygulama alanlarından biri de analitik kimyadır.

Kemometri kavramı, 1972 yılında İsveçli Svante Wold ve Amerikalı Bruce R. Kowalski tarafından ileri sürülmüştür ve 1974 yılında uluslararası kemometri derneği tarafından bu disiplinin ilk resmi açıklaması yapılmıştır. Kemometri içerik olarak, tanımlayıcı ve açıklayıcı istatistik (descritive and inference statics), sinyal işleme (signal processing), deneysel tasarım (experimental design), modelleme (modeling), kalibrasyon (calibration), optimizasyon (optimization), yapı tanıma (pattern recognition), sınıflandırma (classification), yapay akıl yöntemleri (artificial intelligience methods), resim işleme (image processing), bilgi ve sistem kuramı (information and system theory) gibi kavram ve uygulamaları kemometrinin konularını oluşturmaktadır.

Günümüzde kemometrik yöntemlerin gelişmesiyle birden fazla etken madde içeren ürünlerin kantitatif analizi hiçbir kimyasal ön ayırma işlemi ve hiçbir grafik işlemi gerektirmeksizin hızlı, doğru ve hassas olarak gerçekleştirilmektedir. Bu durum kemometriye diğer yöntemlere göre büyük bir avantaj kazandırmıştır ve kemometrinin kullanım alanının geniş bir alana yayılmasını sağlamıştır.

Kemometri; analitik kimya, adli tıp, biyoloji, gıda kimyası, çevre kimyası, arkeoloji gibi alanlarda kullanılmaktadır. Fizikokimyacılar ve madde bilimciler, sinyal işleme ve çok değişkenli verilerin analizinde kemometrik yöntemleri uyguladıkları görülmektedir. Organik kimyacılar ve farmasotik kimyacılar, reaksiyon koşullarının optimizasyonunda deneysel tasarım ve ilaç tasarımında yapı etki ilişkisi çalışmalarında kemometrinin araçlarını kullanmaktadırlar (Vandeginste vd., 1998).

Organik Fizikokimy

Kimya Sanayi Biyoloji Matematik Analitik Uygulama İstatistik KEMOMETR Tıp Kimya alanları Bilgisayar İ İlaç Programlama Mühendislik Gıda

Şekil 1.8. Kemometrinin ilişkili olduğu disiplinler.

Şekil 1.8 de görüldüğü gibi kemometrik çalışmalarda, analitik kimyacıların ve diğer ilgili disiplinlerin ihtiyaçları ölçüsünde uygulamalı matematik ve istatistik bilgisine sahip olmaları gerektiği açıktır. Burada programlama ve hesaplama çok önemlidir. Kemometrik uygulamaların çoğu kompleks hesaplamalar içermektedir. Bu hesaplamaları elle veya basit hesap makineleriyle gerçekleştirmek mümkün olmadığı için bilgisayar programlarına ihtiyaç vardır. Kemometrik hesaplamalarda genellikle EXCEL, MATLAB, PANORAMA, MİNİTAB, XLSTAT, SOLO ve diğer paket programlar kullanılmaktadır (Dinç, 2009).

İki veya daha fazla aktif bileşiği içeren karışımlarda bu aktif bileşiklerin hiçbir ayırma işlemi kullanmaksızın analizi analitik kimyanın ve diğer komşu dalların temel problemlerinden birisidir. Karışım halindeki numunelerin analizi için çeşitli kromatografik ve spektrofotometrik yöntemlerin yaygın olarak kullanıldığı çalışmalarda da görülmektedir. Bazı durumlarda bahsedilen bu yöntemlerin de iyi sonuçlar vermediği de bir gerçektir. Sayılan bu nedenlerden dolayı daha düşük miktarlarda numunelerin analizi için gelişmiş analitik cihazlar geliştirilmesine rağmen klasik analitik cihazlardan elde edilen verilerin çeşitli matematiksel algoritmalara tabi tutularak yöntemlerin hassasiyeti ve sonuçların doğruluğu artırılmaya çalışılmaktadır.

1.4.1. Çok Değişkenli Kalibrasyon Algoritmaları

1.4.1.1. Temel Bileşen Analizi Yöntemi (Principal Component Analysis (PCA) Method)

çok bileşenli verilerle ilgili en önemli sorunlardan biri, orijinal verilerin tamamının desen ve ilişkilerinin görülmesini engellemesidir. Çok değişkenli analiz yöntemlerinin birçoğunun temel hedefi verilerin boyutunu küçültmektir. Temel bileşen analizi daha çok bileşenler arasında korelasyonun olmadığı durumlarda verilerin miktarını azaltmak için kullanılan bir tekniktir.

Temel bileşen analizinin dayandığı ana fikir, her bir numuneyi tanımlayan orijinal değişkenlerin, X1, X2,…, Xn, doğrusal kombinasyonu olan PC1,PC2,…,PCn şeklindeki temel bileşenleri bulmaktır.

PC1 = a11X1 + a12X2 +……….+a1nXn (1.3a) PC2 = a21X1 + a22X2 +……….+a2nXn (1.3b) vb.

Esas bileşenler genellikle ortak varyans (kovaryans) matrisinden elde edilir. Ortak varyans, iki değişkenin birleşik varyansının bir ölçüsüdür. Matematiksel anlamda temel bileşenler (PC), ortak varyans matrisinin eigenvektör ( özvektör) leridir ve bu vektörlerin bulunmasında kullanılan tekniğe eigen analizi adı verilir. Her bir esas bileşene( yani, eigen vektörüne) karşılık gelen eigen değeri, o esas bileşenle tanımlanan veri takımının varyansının miktarını gösterir. Esas bileşenler birbirine dik açı oluşturur(şekil 1.9). Bu özellik diksellik olarak adlandırılır (Uyanık, 2008).

Şekil 1.9. X1 ve X2 olan iki değişken için PC1 ve PC2 olan iki esas bileşeni gösteren diyagram (Uyanık, 2008).

1.4.1.2. Temel Bileşen Regresyon Yöntemi (Principal Component Regression (PCR) Method)

Kemometrik kalibrasyon yöntemlerden birisi olan temel bileşen regresyon yöntemi, derişim seti için ölçülen absorbans verilerinin dekomposizyonu ile birbirine dik (ortogonal) doğrular elde edilmesi esasına dayanır. Bu elde edilen doğrular kurulacak kalibrasyonun koordinat sistemidir.

Burada açıklanan PCR algoritması Martens ve Naes (1984) tarafından verilen şemaya göre açıklanmaktadır. PCR kalibrasyonu kurulmasındaki basamaklar aşağıdaki biçimdedir:

Analiz edilecek maddenin derişim ve absorbans verilerinin varyans-kovaryansı bulunur. Varyans-kovaryans saçılma matriksinin öz vektörleri ve öz değerleri hesaplanır. Seçilen öz değere (eigenvalue) karşılık gelen öz vektör (eigen vector) kalibrasyonun lineer bileşenidir.

PCR algoritmasında genel lineer regresyon denklemi aşağıdaki biçimde yazılabilir:

C = a + b . A (1.4)

Burada C analiz edilecek maddenin derişimidir, a sabit sayı, b ise temel bileşenlerin ve C- loading matriksinin (q) çarpımından elde edilir: b= P . q (1.5)

Burada P öz vektörlerin matriksidir. Öz vektörler kolon matriksi en uygun öz değere (faktöre) ya da öz değerlere (faktörlere) karşılık gelmektedir. Burada q vektörü C-loading olarak adlandırılır ve T (sayı matriksi) üzerinden C’ nin regresyonu ile tayin edilir. q = D . TT . YO (1.6)

Burada D diagonal matriks olup her bir öz değerin tersine eşittir. t1 sayı matriksi aşağıdaki eşitlikten elde edilebilir: t1 = Ao . P1 (1.7)

Ortalanmış absorbans ve derişim, AO ve CO ile gösterilebilir. Burada a sabiti genel lineer regresyon denklemi kullanılarak aşağıdaki eşitlikten hesaplanabilir:

a = Co - ATO . b (1.8)

Her bir aşamada elde edilen değerler denklemde yerine konarak numunede bilinmeyen derişimi hesaplanabilir.

Yönteminin avantajları: i) Dalga boyu seçimi gerektirmez, genellikle bütün spektral alan ya da bu spektral alanın geniş bir bölgesi kullanılabilir. ii) Çok bileşen analiz için kullanılabilir. iii) PCR data işlemleri için ve kalibrasyondaki katsayılarının hesaplanmasında ILS regresyon işleminin kullanılmasına olanak tanır. iv) Analiz edilecek bileşenlerin bilinmesi şartıyla çok kompleks karışımlar için kullanılabilir. v) Bazen orijinal kalibrasyonkarışımlarında bulunan fakat numunede bulunmayan bileşenli numunelerin miktar tayininde kullanılabilir. vi) Kalibrasyon için ölçülen absorbansların dekomposizyon işleminde sonra uygun öz vektörlere karşılık seçilen öz değerlerin deneysel ortamdan ve ölçüm aletlerinden gelen gürültünün eliminasyonuna olanak tanır.

Yönteminin dezavantajları:

i) Hesaplamalar klasik yöntemlere göre daha yavaştır. ii) Yöntemin optimizasyonu temel kalibrasyon komponentlerinin bazılarının bilinmesini gerektirir (anlaşılması ve yorumlanması çok kompleks modeller için). iii) Kalibrasyon için temel alınan vektörler analiz edilecek bileşenlere karşılık gelmeyebilir.

iv) Genellikle çok sayıda kalibrasyon numunesinin kullanılması doğru bir kalibrasyon için gereklidir. v) Kalibrasyon numunelerinin hazırlanması bileşenlerin derişimleri ile doğrusallıktan uzaklaşmaları nedeniyle zordur (Dinç, 2007).

1.4.1.3. Kısmi En Küçük Kareler Yöntemi (Partial Least Squares Regression (PLS) Method)

Kemometrik kalibrasyonlardan en yaygın ve popüler olanı PLS yöntemidir. PLS yönteminde kalibrasyonun kurulması için kullanılan PLS algoritmalarına göre, ortogonalize edilmiş PLS algoritması (orthogonalized PLS algorithm) ve ortogonalize olmayan PLS algoritması (non-ortogonalized PLS algorithm) gibi ekilleri vardır. Ortogonalize PLS ve ortogonalize olmayan PLS kalibrasyonunun

PLS1 ve PLS2 şeklinde iki tipi söz konusudur. PLS1 de bir bileşik model içerisinde iken; PLS2 de bütün bileşikler modele dahil edilmektedir.

Wold ve Martens tarafından verilen PLS algoritması en genel olanlarıdır. PLS kalibrasyonu, sayı vektörleri vasıtasıyla X- ve Y- blokları arasındaki ilişkiye dayanır. PLS algoritmasına göre sıfır etrafında merkezileştirilmiş X- değişkeninin matrisi ve sıfır etrafında merkezileştirilmiş Y- değişkeninin parçalanması aşağıdaki biçimde verilir.

J AT . A J + I JE I X = I P

N N A N

F Y U A Q I I = I . +

Şekil 1.10. PLS2 kalibrasyonu.

X = T.PT + E (1.9a)

Y = U.QT + F (1.9b)

Y = X.B + F (1.9c)

B = W (PT.W)-1 . QT (1.9d)

Burada X= bağımlı değişken absorbans verileri), Y= bağımsız değişken (örneğin derişim), T= X için sayı matrisi, U= Y için sayı matrisi, P= X için yük matrisi, Q= Y için yük matrisi, E= X-kalıntı matrisi, F= Y-kalıntı matrisi, W=max (kovaryans (E,F) ).

PCR algoritmasında olduğu gibi bu katsayılar (B) linear regresyon denkleminde yerine konursa analiz edilecek numunenin absorbans değerleri bu eşitlikte yerine yazılarak hesaplanabilir.

Yöntemin avantajları

i) PLS kalibrasyon işlemi CLS ve ILS hesap tekniklerini kapsamaktadır. ii) Tek aşamalı bir dekompozisyon ve regresyon işlemi gerektirir, kalibrasyonda kullanılan öz vektörler analiz edilen bileşenler ile en geniş ortak spektral değişimin olduğu bölgede doğrudan ilişkilidir. iii) Kalibrasyonlar genellikle kalibrasyon setinin bilinmeyen numunelerden beklenen değişik derişimler yansıtması daha fazla güvenirlik sağlayacaktır. iv) Yalnızca analiz edilecek bileşenlerin bilinmesi şartıyla kompleks karışımlar için kullanılabilir. v) Bazı durumlarda orijinal kalibrasyon karışımlarında bulunan fakat numunede olmayan bileşenli numunelerin miktar tayininde kullanılabilir. vi) Bu tekniklerin hepsi spektral kantitatif analiz için uygulanırken literatürdeki sebepler genellikle PLS’ nin tahmin gücünün yüksek olduğunu göstermektedir. Birçok durumda PLS metodları PCR’ den daha iyi sonuçlar verir.

Yöntemin dezavantajları;

i) PLS hesaplamaları klasik metotlardan daha yavaştır.

ii) PLS modellerin anlaşılması ve yorumlanması zor olup son derece soyuttur. i) genellikle çok sayıda numune için doğru bir kalibrasyon gereklidir. ii) kalibrasyon numunelerinin hazırlanması bileşenlerin derişimleri ile doğrusallıktan uzaklaşmaları nedeniyle zordur (Dinç, 2007).

1.4.2. Kalibrasyon (Derişim) setinin tasarımı

Kemometrik (CLS, ILS, PCR, PLS) kalibrasyonlar için kalibrasyon seti ya rasgele (randomly) yada analizi yapılacak numunede yer alan maddelerin derişimlerini içerecek şekilde kalibrasyon (derişim) setinin tasarımı yapılır. Simetrik kalibrasyon setinin planlanmasında analiz edilecek maddelerin derişimleri, kalibrasyon setinin içinde ana kümenin permütasyonları şeklinde alt kümeler oluşturmalıdır. Kemometrik çalışmalarda rastgele kalibrasyon setinin hazırlanmasından ziyade, analiz edilecek maddelerin derişimlerine göre simetrik ve hataların minimize edilmesi açısından tercih edilecek bir durumdur. Çalışmalarda derişim seti hazırlanmasında, çeşitli tasarım şekilleri verilmekle birlikte rastgele hazırlanan derişim setleri de kullanılmaktadır.

1.4.3. Çapraz validasyon işlemi (Cross-validation procedure)

Kemometrik kalibrasyonların validasyonu için kalibrasyonu ve tayin basamaklarında kalibrasyonun standart hatası (Standard error of calibration→ SEC) ve tayinin (tahminin) standart hatası (Standard error of prediction→ SEP) gibi parametreler kullanılmaktadır. SEC ve SEP değerlerini minimum yapan kalibrasyon koşulları ve F-istatistiği kullanılır. Kalibrasyon performanslarını değerlendirmek için kemometrik kalibrasyonların SEC ve SEP değerleri yanında, bilinen ve tahmin edilen derişim değerlerinin lineer regresyon analizi yapılarak, korelasyon katsayısı, doğrunun eğim (m) ve kesim (n) değerleri kullanılır.

PCR ve PLS kalibrasyonlarının kurulmasında faktör seçimi için çapraz validasyon işlemi (Cross-validation procedure) kullanılır. Bunun için karelerin tahmin (tayin) hatalarının toplamı (prediction error sum of squares→PRESS)

20 hesaplanır. Optimal faktör sayısını bulmak için önerilen kriterler minimum PRESS değeri ve F-istatistiğidir.

1.4.4. Varyans Analizi (ANOVA)

Varyans analizi tekniği kullanılarak grup ortalamaları arasındaki farklılığın veya farklı analitik yöntemler ile elde edilen analiz sonuçlarının ortalamaları arasındaki farklılığın önemli olup olmadığına bakılabilir. Bir araştırmada k tane işlemin ( veya k tane yöntemin) n tekrarının sonunda elde edilen veriler bir tabloda özet haline getirilir. Sonra kontrol ve karşıt hipotezi aşağıdaki şekilde kurulur.

H0: İşlemlerin temsil ettiği popülasyon ortalamaları arasındaki fark tesadüften ileri gelmektedir. İşlem ortalamaları arasındaki gözlenen fark sıfır kabul edilebilir:

µ1 = µ2 = µ3 =...... =µk dır.

H1: En az iki muamele grubunun ortalaması arasında gözlenen fark tesadüften ileri gelmektedir. En az iki işlem grubunun incelenen özellik üzerine olan etkileri birbirinden farklıdır, yani aralarındaki fark istatistiksel olarak önemlidir.

Karşıt hipotez kurulurken en az iki işlem arasındaki fark önemlidir denilmektedir. Çünkü kontrol hipotezinin yapılan analiz sonucunda reddedilmesi için denemede dikkate alınan k tane işlemin birbirinden farklı olması gerekmez. En az iki işlem arasındaki farklılık kontrol hipotezinin reddedilmesine sebep olabilir.

Yapılan hipotez kontrolü sonucunda karşıt hipotez kabul edilmiş ise bu en az iki grup ortalaması arasındaki farklılığın önemli olduğu “çoklu karşılaştırma yöntemleri” kullanılarak araştırılır.

Gruplar arası, gruplar içi serbestlik dereceleri ve gruplar arası- gruplar içi kareler toplamı hesaplanır. Bu değerlerin oranlanmasıyla F değeri elde edilir. Elde edilen F değeri F değeri F tablosundan (α:0,05) okunan değerle kıyaslanır (Dinç, 2009).

Çizelge1.1.Varyans analizi çizelgesi (ANOVA testi çizelgesi = Analysis Of Varation)

Varyasyon Serbestlik Kareler Kareler F-değeri kaynağı derecesi toplamı ortalaması

Yöntemler arası k–1 (Gruplar arası)

Yöntemler içi k(n–1) (Gruplar içi)

Genel nk–1 varyasyon

1.4.5. Kemometrik Kalibrasyon Yöntemlerinin Uygulamaları

1.4.5.1. Kemometrik yöntemlerin uygulama alanları

Analitik kimyadaki miktar tayini çalışmalarında, kemometrik kalibrasyon yöntemleri ya da çok değişkenli kalibrasyon yöntemleri IR spektrofotometre, UV- görünür alan spektrofotometre, spektroflorimetre, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ve kapiler elektroforez gibi analitik cihazlardan elde dilen analitik veriler uygulanmaktadır. Analitik kimyanın prensip ve yöntemleri çok değişik komşu disiplin tarafından kullanılmaktadır. Bu da analitik kimyanın biyoloji, tıp, ziraat, gıda ve eczacılık gibi alanlarda geniş bir uygulama alanı olduğunu göstermektedir.

Analitik çalışmalarda kemometrik yöntemlerin uygulamaları anorganik analiz organik analiz, ilaç analizi, klinik ve biyolojik numunelerin analizi, gıda ve su analizleri, çevre analizleri ve stabilite tayinleri, çözünme hızı testleri şeklinde özetlenebilir.

1.4.5.2. Çoklu bileşen analizi (Multicomponent analysis)

Son yıllarda çoklu bileşen analizi, analitik kimyacılar için en önemli konulardan birisi oldu. Bu bağlamda, aynı anda miktar tayinlerinin klinik kimyası, ilaç analizi kirlilik kontrolü vb. gibi değişik disiplinler ile ilgili aktif bileşikleri içeren karışımların kantitatif analizi için oldukça kullanışlı olduğu kanıtlanmıştır. Çok değişkenli kalibrasyonların absorbans sinyallerine uygulanmasıyla çok bileşen analizlerinden elde edilen sonuçların doğruluğu, yöntem ve kullanılan analitik sinyallere bağlıdır.

2. KAYNAK ÖZETLERİ

Yao vd. (1998), duyarlı, seçici, doğru, hassas ve tekrarlanabilir yüksek performanslı sıvı kromatografisi-kütle spektrometre(LC-MS) tahlilleri iç standart(I.S.) olarak trazodone(TRZ) kullanılarak insansal plazma içinde nefazodone(NEF), hidroksi nefazodone(OH-NEF), m-klorofenilpiperazin(mCPP), triazol-dione(dione)nin eş zamanlı belirlenmesi için geliştirildi ve valide edildi, sonra organik tabaka kuru olana kadar buharlaştırıldı. Tortu 10 mM amonyum formatı (Ph 4,0) içinde % 25 asetonitril içinde yeniden oluşturuldu ve bir tüm bölen(aliquot) 0.30.3 ml/dk akış hızında bir BDS Hypersil C18 sütunu üzerine enjekte edildi. Kütle spektrometre 197,0 m/z (mCPP), 372,0 m/z (I.S.), 470,4 m/z (NEF), 458,1 m/z (dione) ve 486,2 m/z (OH-NEF) protonlanmış molekülleri içine almak için proğramlandı. Standart eğrileri dione için ve diğer analitler için sırasıyla 4-1000 ng/ml ve 2-500 ng/ml derişim aralığında lineer (r2≥0,995) edildi. En düşük standart derişimler tüm analitler için kuantitasyonunun alt limiti idi. Tüm analitler için ortalama tahmin kalite kontrol(QC) derişimleri %- 12,1 karşılık gelen nominal değerlerden daha az sapmıştır. Tüm analitler için deneylerin intra-assay ve inter-assay hassaslığı %7 bağıl standart sapma içinde idi. Çeşitli analitlerin ekstraksiyon geri kazanımı % 67,3-86,5 arasında değişti. Valide edilen deneyler nefazodonenin farmokinetik çalışmasına uygulandı.

Bebawy vd. (1999), spektrofotometrik prosedürler, çoğunlukla kullanılan iki fluoxetine (I) ve sertraline hidroklorit (II) antidepresan ilaçların belirlenmesi için sunuldu. Metotlar, diğer π akseptorler kloranil ve 2, 3 dikloro-5, 6 disiyanoquinon (DDQ) ya da σ akseptorler iodin ile ilaçların esas olarak kompleks reaksiyon şart transferine dayanmaktadır. Renkli ürünler kloranil, DDQ ve iodin içinde sertralin için sırasıyla 550, 450 ve 263 nm ve fluoxsetine için sırasıyla 450, 455 ve 290 nm spektorfotometrikal olarak değerlendirildi. Molar birleşim oranı ve optimum deneysel koşullarda çalışıldı. Belirlenen metotlar kloranil, DDQ ve iodin metotları içinde sertralin için RSD değerleri sırasıyla %1,02, % 0,81 ve %0,57, geri kazanım % 100,39, %99,78 ve %99,69, derişim aralığı 16-160 µg/ml, 15-105 µg/ml ve 6-48 µg/ml, fluoxetine için RSD değerleri sırasıyla %1,24, %0,95 ve %1,13, geri kazanım sırasıyla %99,83,

%99,76 ve %100,00, derişim aralığı 80-640 µg/l, 16-112 µg/ml ve 7,5-60 µg/ml İlaçlar belirlendi. Kompleks formlarının daha ayrıntılı bir araştırılması, bileşimi, association sabiti KCAD, molar emiciliği ξAAD ve gibs enerjisi AG ile ilgili olarak yapıldı. Önerilen metotlar iyi doğruluk ve hassaslık ile saf ve dozaj formları içinde cited ilaçların belirlenmesinde başarıyla uygulandı. Rapor edilen metotlar tarafından elde edilen veriler istatistiklerle karşılaştırıldı.

Dodd vd. (1999), bir metot sabit faz yüksek performanslı sıvı kromatografisine dayanan, ifade edilen insansal süt ve kan plazması içinde nefazodone ve onun aktif metabolitleri olan hidroksinefazodone, dione BMS-180492 ve m- klorofenilpiperazinin belirlenmesi için ifade edildi. Ölçümler, emziren annelerden toplanan örneklerden hazırlanan ve onaylanan standart eğrileri nefazodone ve metabolitleri ilaçsız plazma ve ifade edilen insansal plazma üzerinde uygulandı. Ana ilaç ve metabolitler CERTIFY sütunları kullanılarak solit faz ekstraksiyonu tarafından biyolojikal matrislerden ayrıldı. Kromatografik ayırım, bileşikler 205 nm absorbans değerinde saptandı ve bu bir C18 sütunu ile sağlandı. İç standart olarak trazodone kullanıldı. Deneysel çalışmalar 200-1200 ng/ml derişim aralığı içinde tüm analitler için valide edildi.

Khalil (1999), bir poli tabaka memran içinde trazodone-tetrafenilborat iyon çiftinin katılması üzerine kaplanmış tel trazodone-selektif elektrot merkezli düzenlenmiştir. Elektrot performansı üzerindeki solüsyon ve yabancı madde testlerinin memranın yapısının, sıcaklığının ve ph etkisi araştırıldı. Elektrot eğrisi PH 2,4-9,0 aralığı içinde çok selektif, kesin ve kullanılabilir olduğu ve 25ᵒC, 1,41×10-5 - 0,89×10-2 M aralığında trazodone derişimi bulundu. Standart elektrot patansiyelleri, E dereceleri, elektrotun izotermal sıcaklık katsayısı(dE degrees/dT) hesaplamak için kullanıldı ve 20, 25, 30, 35, 40ᵒC olarak belirlendi. Elektrot performansının 45ᵒC den daha yüksek sıcaklıklar ciddi olarak etkiledi. Elektrot saf solüsyon ve ilaç preparatları içinde her ikisinde de trazodone hidrokloritin potansiyometrik belirlenmesi için başarılı bir şekilde kullanılmıştır.

Adams ve Bergold (2001), bir yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi izokratik prosedür ilaç maddeleri ve tabletler içinde sertraline’ nin tahlili için geliştirildi. Kromatografik sistem 270 nm’ de UV dedektörü ve akış hızı 1,0 ml/dk, Ph 5,5’ de (7:3) asetonitril ve sodyum fosfat tamponundan oluşan bir mobil faz ve bir RP-8sütunu(125 × 4 mm, 5 µm) sütunundan oluşur. Metot validasyonu iyi sonuçlar vermiştir. Varyasyon katsayısı %99,18 doğrulukta ve varyasyon katsayısı %0,19-1,04 arasında değiştiği bulundu. Kalibrasyon eğrisi 0,5-2,5 mg/ml aralığında liner idi. Korelasyon katsayısı 0,9999 olarak bulundu.

El-gindy vd. (2001), tablet içinde trazodone hidrokloritin belirlenmesi için üç metot tanımlandı. Spektorfotometrik metot pH 3,4’ de ilacın ve bromofenol blue’ nin temel nitrojen ile sarı iyon çifti kompleksinin oluşumuna dayanır. Oluşan kompleks 414 nm’ deki ölçümler ve kloroform ile ekstrakte edildi. Spektroflorimetrik metot, maksimum 320nm’ ye uyarıldığında %50 asetik asit, 435 nm olan emisyon dalga boyu içinde ilavın, floresansın ölçümlerine dayanır. Üçüncü metot pH 4,5’ da (60:40 v/v) asetonitril-fosfat tamponun bir mobil fazı ile ODS sütunu, bir ayrılmış faz kullanılarak trazodonenin HPLC ile belirlenmesi üzerine dayanır. Kuantizasyın pik alanına göre üç metot kalite kontrol deneyleri için basit, doğru ve uygun bulundu.

Rao vd. (2001), basit, selektif ve tekrarlanabilir bir ayrılmış faz sıvı kromatografisi(LC) metodu yabancı maddeler içinde, yani 5-etil-4-(2- fenoksietil)-2H-1,2,4-triazol-3-(4H)one (II), 1-(3-klorofenil)-4-(3- kloropropil)piperazin hidroklorit (III) ve 1,11-trimetilen-bis[4-(3- klorofenil)piperazin]hidroklorit (IV) nefazodone hidroklorit (I)’ in kuantatif belirlenmesi için geliştirilmiştir. Ayırım 50:40:10 (v/v/v) oranı içinde 0,05 M

KH2PO4 (Ph 3,0), asetonitril ve metanol içeren bir mobil faz ve bir intersil ODS- 3V (250 × 4,6 mm2) sütunu kullanılarak sağlandı. Metot tamamen valide edilmiştir ve güvenilir olduğu kanıtlanmıştır. II, III, I kirlilikleri için dedektörün limiti ve kuantifikasyon limiti sırasıyla 50, 79 ve 91 ng/ml ve 152, 240 ve 280 ng/ml bulundu. Metodun intra- ve inter-day deneysel hassaslığı %1,2 bağıl standart sapması içinde idi. Geliştirilen metot %99,1-100,7 arsında değişen ilaç dozaj formlarına(tablet, serzone-R) ve geri kazanımına uygulandı. Kirliliğin geri

26 kazanımı %96,2-108,9 arasında değişti. Stabil çalışmalar 60 gün buzdolabında olan laboratuvar tezgahı üzerinde katı çözeltiye yerleştirilen nefazodone için gerçekleştirildi. Metot çözelti içinde belirtilenler için stabil olduğu kanıtlandı.

Erk (2003), iki hızlı, basit ve doğru birinci türev spektrofotometri ve HPLC metodu ilaç formları içinde nefazodone HCI ve sertraline HCI’ in belirlenmesi için tartışıldı. İlki ibr türev spektrofotometre prosedürüne ve ikincisi UV dedektörü ile bir HPLC metoduna dayanır. Birinci metot olan birinci türev spektrofotometri içinde, maddelerin birinci türev sinyallerinin ölçümleri ile sırasıyla nefazadone HCI için 241,8-256,7 nm(pik-pik genliği) ya da sertraline HCI için 271,6-275,5 nm(pik-pik genliği) bulundu. Kalibrasyon grafikleri nefazodone HCI için 10,0-42,0 µg/ml-1 ya da sertraline için 8,0-46,0 µg/ml-1 için kurulmuştur. Diğer metot olan HPLC içinde, UV dedektörü nefazodone HCI için 265,0 nm ve sertralin HCI için 270,0 nm’ ye ayarlandı. Örnekler bir süperkosil RP-18 sütunu üzerinde kromatograflanmıştır. Mobil faz nefazodone HCI için pH 5.5’ de metanol:asetonitril:fosfat tamponu(10:50:40 v/v/v), sertralin HCI için pH 4,5’ de metanol:fosfat tamponu(20:80 v/v) kullanıldı. Birinci türev spektrofotometresinden elde edilen sonuçlar HPLC kullanılarak elde edilen sonuçlar ile karşılaştırıldı. Geliştirilen her iki metodun sırasıyla nefazadone HCI ve sertraline HCI’ in ilaç formlarında eşit olarak doğru, duyarlı, kolay ve direk uygulanabilen hassas metotlar olduğu sunucuna varıldı.

Himmelsbach vd. (2005), yüzeysel atıklar ve kanalizasyon arıtma tesisi atıkları içerisinde bir metot olan ESI-MS kullanılarak CE tarafından geliştirildi. Seçilmiş analitler için kalibrasyon eğrilerinin büyüklüğünün en az birinin Milli-Q saf su ve bir derişim aralığını kapsayan tuna nehri su ekstraktı içinde hazırlandı, elde edilen LOD’ lar Milli-Q saf su ve tuna nehri matrisi içinde sırasıyla trazadone için 6 ve 13 µg/L, sertralin için 39 ve 53 µg/L arasındaki preparat örnekleri için sekiz farklı SPE metaryelleri incelendi. Hidrofilik divinil benzen üstünde(geri kazanım; Milli-Q saf su %93-96, tuna nehri suyu %85-99) bir reçine için iyi sonuçlar elde edildi. Finalde sekiz kanalizasyon arıtma tesisi atıklarının bir serisi seçilmiş antidepresanların içeriğiyle ilgili incelendi. 36 ve 322 ng/L

27 arasındaki derişimler içinde partiküler içinde Venlafaxine, Citalopram ve Trazadone antidepresanları için örneklerin altısı pozitif test edildi.

Himmelsbach vd. (2005), bir metot majör antidepresanların kantitatif belirlenmesi için ESI-MS kullanılarak CE tarafından su içren matris içinde sunulmuştur. Birkaç sulu, susuz ve karışım sulu/organik çözücü BGEs incelendiğinde inorganik ve organik asitler seçilen analitlerin ayırımı için onların uygulamaları ile ilgili olarak araştırılmıştır. Sonuçta, sadece MS-uyumlu elektrolitler, çevresel numuneler için de uygun olan geliştirilen metot ile MS dedektörü kullanılması gerekmesi nedeniyle dikkate alınmıştır. Optimum sonuçlara göre bu durum ACN/su içinde 1,5 M formik asit ve 50 mM amonyum formattan oluşan bir sistem ile elde edildi. Lineer kalibrasyon planları şiddetin neredeyse iki katının bir derişim aralığı tüm katı överler için elde edilebilir, elde edilen LODs’ lar için SIM modu içinde TOF enstrümanı ve tek kuatropol enstrüman ile sırasıyla TRAZ için 3-6 µg/L ve SERT için 39-43 µg/L aralığı içinde idi. Bu duruma izin varsayımı sunulan metot çevresel örnekler içinde antidepresanların belirlenmesi için uygun olarak kabul edilebilir. Nehir suyunun SİPİKİNGİ ve kanalizasyon tesisi atık ekstratları seçilen solitler ile gösterdi ki bu tür örnekler içinde genellikle bulunan matrislerden müdahale olmaması beklenebilir. Sonuçta, çevresel örnekler içinde yedi antidepresanın kantitatif belirlenmesi için bir tek kuatropol MS ve bir TOF-MS bağlanmış CZE bölgenin performans kriterleri kullanıldı.

Harıkrıshna vd. (2006), iki basit, hızlı ve hassas ekstraksiyon spektrofotometrik metotlar saf ve ilaç formları içinde trazodone hidroklorit(TRRH)’ nin deneysel değerleri için geliştirilmiştir. Bu metotlar BCG ve MO için sırasıyla 415 nm ve 422 nm maksimum absorbsiyonu ile pH 1,5’ de (BCG için) bir KCI-HCI tamponu ve pH 3,29’ da (MO için) bir NaOAc-HCI tamponu içinde bromocresol green (BCG) ve methyl orange (MO) ile trazodonenin kloroform çözünür iyon- association komplekslerinin oluşumu üzerine dayanır. Reaksiyon koşulları yüksek renk yoğunluğu elde etmek için optimize edildi. Absorbans trazodonenin artan derişimi içinde doğrusal olarak arttığı bulundu ve hesaplanmış (0,9992 ve 0,9994) kolerasyon katsayısı değerleri tarafından doğrulandı. Obeyed Beer

28 kanunları sistemleri BCG ve MO için sırasıyla 0,9-17 µg/ml ve 1-20 µg/ml aralığı içinde bulundu. Çeşitli analiz parametreleri istatistikler ölçüm tarafından değerlendirildi ve cevaplar valide edildi. İlaç formları içinde yaygın olan mevcut tatlandırıcılar gözlendi. Önerilen metotlar kalite kontrol uygulamaları için basit, doğru ve uygundur.

Kirchherr ve Kühn-Velten (2006), bu metot tek bir örnek/üçlü enjeksiyon yaklaşımı ile amilsulpride, amitriptyline, aripiprazole, benperidol, chlorpromazine, chlorprothixene, citalopram, clomipramine, clozapine, desipramine, doxepin, fluoxetine, flupentixol, fluphenazine, fluvoxamine, halopridol, hidroksisperidone, imipramine, levomepromazine, maprotiline, mianserine, tirtazapine, moclobemide, norclomipramine, nordoxepin, norfluoxetine, nortriptyline, O-desmethylvenlafaxine, olanzapine, opipramol, paroxetine, perazine, perphenazine, pimozide, pipamperone, quetiapine, reboxetine, risperidone, sertralin, sulpiride, thioridazine, trazodone, trimipramine, venlafaxine, viloxazine, ziprasidone, zotepine ve zuclopenthixol’ ün eş zamanlı belirlenmesini açıklar. İlaçlar birinci protein çökelmesinden sonra elde edilen süpernatantın daha fazla seyreltilmesiyle düşük, orta ve yüksek derişimi kapsayan alt gruplar ayrıldı. Kromatorafik ayırım metanol gradienti ve pH 3,9’ da 5 mM asetat tamponu ile monolitik bir C18 sütunu(tüm trapötik seviyelerin 0,5-2000 ng/ml aralığı kabul olabilir) üzerinde izobarik kütle formları ve uygulamaları için gerekliydi. Enjeksiyon aralığı 8 dk idi. Üç iç standartın bir seti yaygın olarak değişen hidrofobisite ilaçların kuantifikasyonu için kullanıldı, sonra elektrosprey iyonizasyon pozitif iyon fragmanları bir API 4000 tandem kütle spektrometre ile çoklu reaksiyon izlenimi(MRM) içinde tespit edildi. Kuantifikasyonun derişim eğrileri ve limitlerinin regrasyon parametreleri 0,9988 ortalama korelasyon katsayısı ile terapötik ve substerapötikin arasında iyi bir korelasyon olduğunu gösterdi. Tutarsız ve yanlış ölçümler için tüm alt gruplar içinde üç derişim aralığı intra- ve inter- assay karşılaştırmaları için hazırlandı. Varyasyon ortalama katsayısı karşılaştırmaları intra-assay için %6,1 ve inter-assay için %7,4 idi. Alkollü derişimden ortalama sapmaları intra-assay için %4,8 ve intra-assay karşılaştırmaları için %4,2 idi. Geri kazanım oranları, ortalama %101 ile %92-

111 arasında değişen matriks serum olmaksızın alkollü serum örnekleri karşı standart solisyonlarının yüzde geri kazanımları olarak ölçüldü. Tek istisna olarak olanzapine yanıtı matris-free içinde daha iyi serum matrisi içinde %185’ den çok daha yüksek olduğu bulundu.

Kumar vd. (2006), iki basit, hızlı ve hassas ekstraktif spektrofotometri metotları saf ve ilaç formları içinde trazodone hidroklorit(TRH)nin deneyleri için geliştirilmiştir. Bu metotlar BTB ve BCP için sırasıyla 423 nm ve 408 nm masimum absorbsiyonu ile, sırasıyla pH ‘ın 3,6 (BCPiçin) olduğu NaOAc-AcOH tampunu içinde bromothymol blue (BTB) ve bromocresol purple (BCP) ile TRH’ nin kloroform çözünür iyon-association kompleksin oluşumunun oluşumu üzerine dayanır. Reaksiyon koşulları yüksek renk yoğunluğunu elde etmek için optimize edilmiştir. Absorbans TRH’ nin derişimi ile doğrusal olarak arttığı görüldü ve hesaplanmış korelasyon katsayısı değerleri tarafından doğrulanmıştır. Obeyet Beer’ in kanunun sistemleri BTB ve BCP için sırasıyla 0,2-14,5 ve 0,2-14,1 µg/ml aralığı içinde idi. Çeşitli analiz parametreleri istatistikal ölçüm tarafından değerlendirilmiş ve cevaplar valide edilmiştir. İlaç formları içinde yaygın olan mevcut tatlandırıcılar gözlendi. Önerilen metotlara kalite kontrol uygulamaları için basit, doğru ve uygundur.

Carda-Broch vd. (2007), basit ve güvenilir bir sıvı kromatografisi prosedürü ilaç formları ve idrar örnekleri içinde trazodonenin belirlenmesi için tanımlandı.

Optimize edilen prosedürde florimetrik dedektör, bir C18 sütunu ve sodyum dodesil sülfat(SDS) ve 1-bütanolün bir misel mobil fazı kullanılır. Seçilen Mobil fazda 0,2 M SDS ve fosfat tamponu ile pH 3’ de sabit %8 1-bütanol kullanıldı. Toplam analiz zamanı 10 dk idi. İdrar örneklerinin analizi için metodun mükemmel bir avantajı, hiçbir ekstraksiyon adımı gerekli olmamasıdır. Kuantifikasyon limiti 9,5 ng/ml bulundu ve biyolojikal sıvılar içinde ilacın analizi sağlandı. Prosedür iyi doğruluk, tekrarlanabilirlik ve orta kesinlik ilacın birkaç derişimi için test edildi. Tahmini yüzdeler ilaç formlarının analizi içinde elde edildi. İdrar matriks içinde kalibrasyon tekrarlanabilirliği 0,06-22,4 µg/ml’ de ayrıca çalışıldı. İdrar örneği içinde bileşiklerin iyi geri kazanımları bulundu. Sonuçlar gösteriyor ki ilaçların rutin analizleri için uygun bulundu.

Bosch vd. (2008), sertralin selektif serotonin reuptake inhibitörü sınıfına ait bir antidepresan olarak yaygın kullanılmaktadır. Bunlar sadece majör depresyon, obsesif kompulsif ve panik bozuklukların tedavisi için değil, aynı zamanda yeme, prensenstriel disforike, post-travmatik stres bozuklukları içinde etkili olduğu gösterilmiştir. İlaç, biyolojikal metaryaller ve çevresel örnekler içinde sertralinin belirlenmesi için yayınlanmıştır. Geçerli yorumun amacı, 1987 den 2008’e kadar olan periyotta sertralin tabletlerinin belirlenmesi için en yeni analitikal tekniklerinin bir sistematik ölçümlerini sunmaktır.

Mercolini vd. (2008), bu makaledeki fikirler, insansal plazma içinde trazadonun ve ana aktif metaboliti 3-(1-klorofenil)piperazin(m-CPP)’ nin belirlenmesi için hızlı ve uygulanabilir yüksek performanslı sıvı kromotografisi geliştirildi. Trazadone serotonin antagonist aktif ile ikinci nesil bir antidepresandır. Metabolit görüntüleri trazadone tedavisinin bazı yan etkilerinin onset(başlangıç) içinde dahil olmaktadır. Böylece onun belirlenmesi terapötik ilaç izleme sırasında çok önemlidir. Ayırma işleminde bir C8 tersine faz sütunu elde edildi ve pH 3,5 ve asetonitril(%30), trietilamin içeren, sulu fosfat tamponundan(%70) oluşan bir mobil faz kullanıldı. UV dedektörü 255 nm’ ye yarlandı ve iç standart olarak loxapine kullanıldı. Plazma örnekleri için bir orijinal ön arıtma prosedürü geliştirildi ve C8 tersine faz kartuşları(50 mg, 1 ml) ile solit faz ekstraksiyonu üzerine kuruldu. Elde edilen ekstraksiyon verim değerleri %90’ dan yüksek ve hassasdı, rsd gibi ifade edildi, %5,6’ dandüşüktü. Tedavi geçiren depresif hastalardan alınan plazma örneklerine uygulandı. Doğru cevaplar tatmin ediciydi(geri kazanım > %91). Böylece metot depresif hastaların plazması içinde trazadone ve onun ana aktif metabolitinin terapötik ilaç monitörü için uygun görülmektedir.

Hedge vd. (2009), basit ve hızlı bir elektrokimyasal metot karbon nanotüplerinin(MWCNTs) mükemmel özelliklerine dayalı trace-level trazodonenin belirlenmesi için geliştirildi. MWCNT-modifiye camsı karbon elektrodu inşa edilmiştir ve detail içinde trazodonenin elektrokimyasal davranışı araştırılmıştır. Siklik voltametri sonuçları, MWCNT-modifiye camsı

31 karbon elektrodunun nötr solüsyonlar içinde trazodonenin oksidasyonunun elektrokatalitik aktivitesine karşı önemli ölçüde artırılabilir. Bu trazodone için anodik tepe akımının öneli bir iyileşmesine yol açar ve trazodonenin belirlenmesi için bir yüksek hassas voltametrik sensörün geliştirilmesini sağlar. Trazodone yaklaşık 0,73 V ve 1,00 V’ da elektrot ve iki anodik tepe üretmek etkili bir şekilde toplanabilecektir. Elektrokatalitik davranış diferansiyel-puls voltametri tarafından trazodonenin belirlenmesi için daha hassas bir dedektör düzeni istismar edildi. Optimize edilmiş koşullar altında, trazodonenin derişim aralığı ve dedektör limiti sırasıyla 0,2-10 µM ve 24 nM bulundu. Önerilen metot ilaç örnekleri içinde trazodonenin belirlenmesi için başarılı bir şekilde uygulandı. Bu sensörün analitikal performansı gerçek bir örnek olan idrar içinde analitin dedektörü için değerlendirilmiştir.

Vujic vd. (2009), tersine faz yüksek performanslı sıvı kromotografisi(RP-HPLC) tarafından maprotiline, desipramine ve moclobemide bu üç antidepresanın ayırımı için metot geliştirildi ve valide edildi. Optimum koşulları bulmak için ve ayırım üzerinde bireysel parametrelerin etkisinin tahmini, mobil faz bileşiminin, sıcaklığının ve debisinin 23 bağımlı ilişkilerin, bir tam dizisi incelendi. Bir laboratuvar karışımında araştırılan bileşenlerin ful ayırımı, süpelkosil LC- 18(120 mm×4,6 mm, 5 µm) sütun, su/metanol ve asetonitril içinde %3 amonyum iyonu ve alternatif izokratik gradyan-izokratik elüsyon modelleri sağlandı. Terapötik ilaç izlenimi için önerilen metod ilgisi beklenmektedir.

Ferrarini vd. (2010), bu çalışmada, tersine faz sabit faz(C8, C18, CN, PEG ve amid incelendiğinde) bir tarama iyon çifti reaktifi olmaksızın, sertralin ve üç onunla yakından ilgili sentetik ve kiral olmayan yabancı maddelerin belirlenmesi için verimli bir HPLC metodu elde edilmesi için geliştirildi. En iyi sonuç, tutma süresi ve hedef analitlerin çözümü açısından da C14 alkil zinciri içinde gömülü polar bir amid grubu içeren bir zorbax Bonus- RP sütunu ile elde edildi. En uygun sabit faz seçildi, HPLC metodunda en iyi koşulları sağlamak için yabancı maddeler olan A ve B(pozisyonel izomerler) arasındaki çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak ve toplam çalışma süresini an aza indirerek, üç kuantifikasyon faktörlerinin değerlendirilmesi için en iyi koşullar bulunup, kullanılan faktöriyel

32 tasarımlar tarafından optimize edildi. Sonuçta HPLC koşulları ikinci bir deneysel tasarım araçları tarafından ayarladı. Mobil faz içinde metanolün, pH tamponunun ve oranının etkileri en uygun koşulu sağladı. Sertralin ve onun yabancı maddelerinin eş zamanlı belirlenmesi için en uygun koşullar; taban çizgisinden 10 dk’ dan daha az sürede ayrıldı, zorbax Bonus-RP sütunu(150 mm×4,6 mm,5 µm)ile elde edildi, 50ᵒC’ de fosfat tamponu(pH 2,8; 10 mM)- metanol(63:37, v/v) ile izokratik koşullar altında ayrıldı, akış hızı 1 mL/dk. UV dedektörü 220 nm’ ye ayarlandı. Bu metot ilaç formları olarak tabletler içinde sertralin ve ilgili yabancı maddelerin belirlenmesi için güvenilir olduğu kanıtlandı ve ICH kuralları takip edilerek başarılı bir şekilde valide edildi.

Johnson vd. (2010), metabolitlerin hızlı yapı tayini için analitikal HPLC üzerinde in vitro metabolit üretimi ve kolay numune hazırlamak için cryplo ile yüksek uçuş NMR donanımı kuruldu. Mikrozomlar(10-30 mu M) içinde ilaç adaylarının tek bir 1-5 ml inkübasyonu, hepatoksitler ya da rekombinant ilaç metabolit enzimleri, tpikal kitokrom P450s ve UDP-gkukuronosil transferleri metabolik oluşumları için kullanıldı. Proteinlerin çöktürülen kısımları ve çözeltinin uzaklaştırılmasını takiben metabolit karışımları HPLC-MS sisteminde 5-10 enjeksiyon ile kromatogramları alındı. Metabolitler döteryumlu NMR çözücüleri içinde bir 96-kuyulu plaka içine alındı, kurutuldu ve yeniden toplandı. NMR spektra yalıtılmış metabolitlerin bir 5 mm kriyojenik probe ile bir 500 MHz spektrometre donanımı üzerinde edinildi. Metodoloji metabolitin 0,5-10 mu g miktarlarına sık sık HPLC-MS/MS-merkezi metabolit tanıma ve uygulamasının ilavesi olarak başarıyla uygulanmıştır. Çoğu yapı tayini tatmin edici sinyal- gürültü oranları ile ID(1) H NMR tarafından hızlı bir şekilde elde edildi, oysa bazı 2D NMR veri analizi gerekir. Bu rapor,metot gelişimini ve trazodone model maddesini kullanarak metabolit yapısının belirlenmesini açıklar. Trazodane ek olarak, LC-NMR online ile ilgili teknik komplikasyonları alt ettiği, arıttığı ve zaman alıcı hazırlayıcı ölçekli meatbolit üretimini mikrogarm düzeyinde NMR metodunun önlediği kanıtlanmıştır. En önemlisi çevrim süresi sırasında senkronize içinde, mevcut metodoloji kullanılarak metabolik kararsız maddeler için metabolit yapı belirlenmesini gerçekleştirme süresi,diğer iteratif kurşun

33 optimizasyon faaliyetleri gerçeklerştirirken tıbbi kimyagerler metabolik soft noktalarıı değiştirdi, ilaç keşif süreci üzerinde gerçek bir etki gösterdi.

Sasajima vd. (2010), plazma örnekleri içinde 20 antidepresanın eş zamanlı belirlenmesi elektrosprey iyonizasyon yolu ile flight kütle spektrometrinin zaman ile susuz kapiler elektroforez tarafından gerçekleştirilmiştir. Asetonitril içinde 60 mM amonyum asetat ve 1 M asetik asit ve su, yanı sıra metanolün bir karışımı arka plan elektrolit olarak seçildi. Fllight kütle spektrometri zamanı kullanarak doğru kütle bilgileri elde edildi ve arka plan gürültüleri önemli ölçüde azaldı. Böylece kantitatif yetenek içinde büyük bir gelişme meydana geldi. Plazma örneklerine gelince solit faz ekstraksiyonları ile oasis HLB kullanıldı. Dedektörün ve kuantifikasyonun limitleri sırasıyla 0,5-1 ng/ml ve 1-5 ng/ml aralığı içinde bulundu. Mevcut metotların spesifikliği daha iyi bulundu. Başka bir deyişle foto diyot dizi dedektörleri kullanılarak kıvrımlar karşılaştırıldığında yaklaşık 10-60 kat daha iyi bulundu. Çünkü analit piki plazmadan türetilen arka plan açıkça ayırt edilebilir. Bu metotta plazma örneklerinin rutin analizi ile ilgili olarak çok yararlı ve pratik bulundu. trisiklik ve tetrasiklik antidepresanlar bazı yan etkilere ve toksik kazalara neden olabilirler. Son zamanlarda hastalar içinde agresif karakter uyandırmadan sonuçlanan toksik kazalara neden olan ateş yan etkisiyle hatta selektif serotonin reuptake inhibitörü olarak tapor edildi(SSRI). Adli bilim açısından, herhangi bir antidepresandan büyük miktarda alarak zehirlenme sorunları bulundu; ayrıca pek çok olaylar intaharla ilişkiliydi.

Walash vd. (2010), basit, güvenilir-belirli, tersine faz sıvı kromotografisi metodu oksidatif bozunma ürününün yapısı içinde sertralinin belirlenmesi için geliştirilmiştir. Tersine faz kromotografisi 226 nm’ ye ayarlı UV dedektörü ile bir fenil(250×4,6 mm) paslanmaz çelik sütunu kullanılarak yürütülmüştür. Potasyum dihidrojen fosfat tamponundan oluşan bir mobil faz: asetonitril(50:50, v/v) fosforik asit ile pH 4,5’ e ayarlandı, akış hızı 1 ml/dk olarak sertralin ve onun oksidatif bozunma ürününün ayırımı için kullanılmıştır. Kalibrasyon eğrisi çizgisel bitti ve değerlerden kuantifikasyon limiti(LOQ) 0,27µg/ml, dedektör limiti 0,09 µg/ml ile derişim aralığı 1-20 µg/ml bulundu.

Önerilen metot tabletler içindeki sertralinin analizi için başarıyla uygulandı. Ortalama % geri kazanımı saf formu içindeki sertralin için %100,17±0,62 ve seserine, serlift ve sirto tabletleri içindeki geri kazanımı sırasıyla %100,14±0,68, %100,29±0,77 ve%100,06±0,67 olarak bulundu. Elde edilen cevaplar referans bir metotla elde edilenler ile olumlu karşılaştırıldı. İlaçlar ICH kurallarına alkalin, asidik, hirolitik ve oksidatif bozunma ürünü zorla maruz edildi. Dahası metot ilaçların fotoindüklenmiş oksidatif bozunmasının kinetik araştırmaları için kullanıldı. Bozunma reaksiyonlarının birinci dereceden hız sabiti, yarılanma ömrü ve aktivasyon enerjisi hesaplandı.

Choong vd. (2011), kütle spektrometre ile birleştirilmiş bir sıvı kromatografisi insansal plazma içinde bupropion, onun metaboliti hidroksi bupropion, moclobemide, reboxetine ve trazodonenin kuantifikasyonu için geliştirildi. Analitikal prosedürlerin validasyonu Societe Française des Sciences et Techniques Pharmaceutiques and the latest Food and Drug Administration guidelines’ egöre değerlendirildi. Örnek preparatlar bir katyon-değiştirme katı faz 96-oyuklu plaka üzerinde plazma 0,5 ml ektraları ile uygulandı. Ayırım gradient modu içinde 50 mM amonyum asetat pH 9/asetonitril bir mobil faz kullanılarak C18 XBridge kolonu ( 2,1 mm × 100 mm, 3,5 µm) üzerinde 14 dk içinde sağlandı. İlgili bileşikler pozitif elektrosprey iyonizasyonu modu içinde tek bir kuadrupol kütle spektrometre üzerinde tek iyon izleme modunda analiz edildi. İki iyon tanınma noktalarının sayısını artırmak ve herhangi bir pozitif yanlışı mümkün olduğunca önlemek için per molekülü seçildi. Seçicilik her zaman kritik bir nokta olması nedeniyle psikyatrik nüfus için altmıştan fazla komadikasyonlar test edildi. Her analit için analitikal prosedür plazma örnekleri içinde derişim ölçümlerinin sütun aralığını kapsayacak şekilde valide edildi. Değerler reboxetine ve bupropoin için 1-400 ng/ml ve hidrokdi bupropoin, moclobemide ve trazodone için 2-2000 ng/ml bulundu. Tüm araştırılan bileşikler için kesinlik, hassaslık, doğruluk, geri kazanım, seçicilik ve stabilitenin koşullar içinde bir güvenilir performansı elde edildi. Bir yıl sonra rutin bir proses içinde uygulamalarda bu metot genel olarak bir psikiyatrik nüfus arasında gözlenen geniş bir derişim aralığı üzerinde hassas değerleri ile yüksek bir sağlamlığı göstermiştir.

Bueno vd. (2012), bu çalışma içinde LC-QTOF-MS tarafından su içinde ilaçların(target ve non-target) analizi için yeni bir yaklaşım açıklandı. Sadece tek bir vadede, target maddelerinin ve non-target analitlerinin kualitatif analizi eş zamanlı kuantitatif taramasının performansını değerlendirmek için tasarlanmıştır. Bu çalışma içinde onların potansiyel uygulamaları IDA’ nın araçları tarafından yüksek MS/MS spektral edinin oranları ile birlikte doğru kütle ful tarama kesinliğinin özellikleri gösterilmiştir. Uygulamada bu analitikal strateji, maddeler için kaynak araştırmasına göre sunulmuştur. Target maddeler olarak analitik metot içinde bir priori incelenmemiştir. Böylece MS ve MS/MS modu içinde doğru kütle ölçümlerinin veri prosesleri tarafından iznine göre sunulmuştur. Hedeflenmeyen maddeler olan ketorolac, trazadone, fluconazole, metformin ve venlafaxine nehir suyu içinde belirlendi. Eş zamanlı olarak bu strateji, diğer maddelerin tanınmaları için bulundu.

Pan vd. (2012), fluoksetine(FT), fluvoxamine(FX), sertraline(ST) ve trazodone(TD) selektif serotonin reuptake inhibitörü(SSRIs) olarak antidepresan etkisinin yeni tipidir. Yapılar, UV absorbsiyon spektrofotometresi tarafından hepsi kromafora sahip ve izlenebilir. UV dedektörü(225 nm) ile basit bir izokratik yüksek performanslı sıvı kromatografisi metodu FT, FX, ST ve TD’ nin eş zamanlı ölçümleri için geliştirildi. Her ilaç için metodun belirlenen ağırlığı 10,0-400,0 µM da bitti. Dedektör limiti(S/N=3, enjeksiyon 20 µl) FT, FX ve ST için 0,02 µM TD için 0,1 µM idi. FX, FT, ST ve TD’ nin inter- ve inter-day analizleri için metodun bağıl standart sapması ve bağıl hatası tümü için %3,7’ nin altında idi. Uygulanan metodun FT, FX ve ST’nin analizi için farmosötik bir ürün olarak uygulanabilirliği kanıtlanmıştır. Metot kan ve formülasyonları içinde analitlerin kalite kontrol deneyi için kullanılabilir.

Rakic vd. (2012), bu makalede NCFR* olarak belirtilen deneysel tasarım ve gelişmiş kromotografik cevap fonksiyonları tarafından HILIC içinde kromotografik davranışların keşfini sunar. Model karışım olarak 6 antidepresan seçildi: selegiline, mianserine, sertraline, moclobemide, fluoxetine ve maprotiline. HILIC sistemi içinde alıkonma mekanizması karmaşıklığı nedeniyle

önemli faktörlerin ve onların appliying 33 deneysel tasarımları tarafından etkileşimlerinin etkisi değerlendirildikten sonra deneysel veriler ayrıntılı olarak incelendi. İncelenen maddeleri kromotografik çalışma süresi ve NCFR* elde edilen pikin(tepe şeklinde) kalitesini aynı anda ölçecek şekilde geliştirlmiş ve sistemin sadece tek çıkışı olacak şekilde tasarlanmıştır. Belirsiz durumlar içinde tüm kromotogram kalitesi ve dışlanmış isteğe bağlı kararların objektif tahmini göz önüne alındı. Deneysel alanların bütün karışımlar ve etkin kimlikleri üzerinde araştırma faktörlerinin etkisi vurgulandı ve kromotografik davranışlardaki uygulamalı fonksiyonlar tatmin ediciydi. HILIC içinde kompleks karışımların ayırımı uygulamalı deneysel tasarımı ile değerl bir yardıncı olarak kanıtlanan NCFR* ile kombine edildi.

Kaur ve Malik (2013), amitriptyline.HCI (AMI) ve clomipramine.HCI (CMI) 620 nm’ de yeni bir spektrum görünümünü ve eosinin floresansının söndürülmesi ile sonuçlanır ki iyon kompleksi oluşturmak üzere pH 3,8’ de NaAc-AcH tampon çözeltisi eosin ile reaksiyona girer. Absorbsiyonun, floresansın ve RSS spektranın spektral karakteristikleri araştırılmıştır. Reaksiyonu etkileyen faktörler çalışıldı ve reaksiyon için optimum koşullar belirlenmiştir. Floresans söndürülmesine dayanan basit ve hassas bir spaktrofulorimetrik metot AMI ve CMI’ nın belirlenmesi için geliştirilmiştir. Floresan söndürülme yoğunluğu 310 nm dalga boylu bir uyarılma kullanılarak 550 nm de ölçüldü. Kalibrasyon grafiği, dedektör limiti AMI için 0,017 µg/ml, CMI için 0,015 µg/ml ile 0,08-2,0 µg/ml aralığı içinde düz çizgi olarak bulundu. Metot ortak meydana gelen maddelerden müdahale olmaksızın tabletler içinde AMI ve CMI’ nın belirlenmesi için tatmin edicidir. Geri kazanım ve RSD değerleri metodun iyi doğruluk ve hassasiyet gösterdiği elde edildi. Reaksiyon mekanizması ve floresans söndürülmesi ayrıca tartışılmıştır.

Saka ve şahin (2013), serotonin-nöropinefrin reuptake inhibitörleri(SNRı) antidepresan ilsçlsrının yeni bir formudur. SNRı incelendiğinde desvenlafaxine, duloxetine, milnacipran, venlafaxine ve sibutramine kapsamaktadır. Bu çalışma biyoanalitikal ve ilaç uygulamaları üstünde odaklanma, SNRı ve onların ana metabolitleri üstünde analitikal araştırmaları kapsar. Bu analitikal metotlar

37 genellikle kromotografi, elektroanalitikal, spektrometri ve elektroforotik metotlardır.

Siroka vd. (2013), UV dedektörü 236 nm’ de spektrofotometre ile basit kapiler elektroforotik metot el hapları içinde 1-(2-klorofenil)piperazin(oCPP), 1-(3- klorofenil)piperazin(mCPP) ve 1-(4-klorofenil)piperazin(pCPP)’ nin belirlenmesi ve selektif ayırımı için geliştirilmiştir. Birkaç siklodextrin türevleri, arka plan elektrolitini(BGE) oluşturmak için test edildi. Optimize BGE, trietilamin ve 10 mmol/L α-sklodextrin ile Ph 2,5’ de 20 mmol/L’ ye ayarlanmış fosforik asit içerdi. 15 dakikadan daha az aday karışımların ve analitlerin kabul edilebilir çözünürlükleri sağlandı. Analizler 8 sn içinde 4826 Pa’ da basit enjeksiyon ile 60 cm kaplanmamış kaynaşık silika kılcal içinde 25ᵒC’ de tutulan 25 Kv sabit voltajında gerçekleştirildi. Prokain iç standart(IS) olarak bir 0,1 mg/Ml derişimin de kullanıldı. Amphetamine, methamphetamine, 3,4- metilendioksiamfetamin, 3-4-metilendioksimetamfetamin, 3,4-metilendioksi-N- etilamfetamin, 1-(3-triflorometilfenil)piperazin ve kokain gibi diğer ilaçlardan olası müdahaleler de incelenmiştir. Analitikal eğriler, Pcpp için 20-200 mg/ml ve ocpp ile mcpp için 10-200 mg/ml aralığında liner(R2= 0,9994-0,9995) edildi. Dedektör limitleri(LODs) 2,0 µg/ml(ocpp), 2,5 µg/ml(mcpp) ve 3,5 µg/ml(pcpp) olarak bulundu. Üç derişim seviyesinde ve her seviyenin altı tekrarında gün içi kesinlik analitin düzeltilmiş pik alan oranı ve RDSs ≤ %4,9 vererek göç zamanları değerlendirilmiştir. Doğruluk %101,0-101,6 arasında değişen kazanımlar ve aynı üç derişim seviyelerinde bir geri kazanım testi tahmin edilmiştir. Metot göre çoğunlukla mCPP üzerinde 17 el hapının analizine başarıyla uygulandı.

Wang vd. (2013), UV dedektörü(214 nm) ile basit ve duyarlı bir kapiler zone elektroforez, plazma içinde antipisikotik ilaçlar ile donepezil ve rivastigmine, asetilkolinesteraz inhibitörlerinin eş zamanlı belirlenmesi için geliştirildi ve valide edildi. Sıvı-sıvı ekstraksiyonu tarafından basit bir ön işlem ve alan- güçlendirilmiş numune enjeksiyonu (FASI) ile CZE tarafından subsequent kuantifikasyonu kullanıldı. Buradaki analitler için optimum ayırma, kapiler duvar ile etkileşimi analit azaltmak için bir dinamik kaplama, bri hızlı tampon

38 içeren %0,1 γ-siklodextrin ile 120 mM fosfat(Ph 4,0) ve %40 metanol(MeOH) ve 60,2 cm × 50 µm I.D.(efektif uzunluk 50 cm) bir erimiş-silika kapiler sütunu ile 25ᵒC’ de < 20 dk içinde sağlandı. Bir iç standart olarak kullanılan phanformin(40,0 ng/ml) donepezil, rivastigmine, aripiprazole, quetiapine, risperidone, clozapine, ziprasidone’ nin eş zamanlı belirlenmesi için önerilen metodun liner aralığı ve trazodone aralığı 4,0-80,0 ng/ml üzerinde ve olanzapine 1,0-20,0 ng/ml idi. Metot ticari ürünlerin oral yoldan sonra demansın davranışsal ve psikolojikal septomların on Alzheimer hastaları içinde AChEIs ve antipsikotik ilaçların derişim izlenimleri (ölçümleri) için uygulandı.

3.MATERYAL VE METOT

3.1. Materyal

Bu çalışmada, UV/VIS spektrofotometrisi ile iki bileşenli bir ilaç numunesindeki aktif maddelerin nicel olarak tayini yapılmıştır. Elde edilen veriler, PCA, PCR ve PLS gibi kemometrik yöntemlerle değerlendirilmiştir. Spektrofotometrik ölçümlerle çözücü olarak metanol kullanılarak Sertralin (SERT) ve Trazodone (TRAZ) çözeltileri hazırlanıp spektrumları okunmuştur. Bu işlem için Önce tek tek sonra farklı oranlarda hazırlanan sentetik karışımların spektrumları alınmıştır. Son işlem olarak da ilaç örneğinde ölçümler yapılmıştır. Elde edilen veriler lisansı elimizde bulunan MİNİTAB 16 istatistik programıyla değerlendirilmiştir.

3.2. Kullanılan Cihazlar

3.2.1. UV-Görünür Spektrofotometre Cihazı

UV-Vis spektrumları, bilgisayar tarafından kontrol edilen 1 cm uzunluğundaki hücre ile donatılan UV 1700 PHARMASPEC SHİMADZU spektrofotometresi kullanılarak not edilen spektrum değerleri ilaç tabletlerindeki SERT ve TARZ miktarını belirlemek için kemometrik metotlara uygulanmıştır.

3.3 Kullanılan Kimyasal Maddeler

Deneylerde analitik saflıkta olan kimyasallar kullanılmıştır. Bu kimyasallar Çizelge 3.1’de verilmiştir.

Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan kimyasallar.

Bileşiğin Adı Bileşiğin Formülü

Sertralin

Trazodone

Metanol CH3OH

3.3.1 Kullanılan Çözeltiler

Çalışmada spektrofotometrik ölçümler için SERT ve TRAZ maddelerinin 100 ppm olacak şekilde stok çözeltileri hazırlanmıştır.

Stok Sertralin Çözeltisi

Sertralin maddesinden 10 mg tartılarak bir miktar metanol’de çözüldükten sonra son hacim 100 mL’ ye tamamlandı.

Stok Trazodone Çözeltisi

Trazodone maddesinden 10 mg tartılarak bir miktar metanol’ de çözüldükten sonra son hacim 100 mL’ ye tamamlandı.

Analiz edilen bileşiklerin ticari preparatı

Lustral ve Desyrel (Tablet) Sertralin :……… 50 mg Trazodone :…...... 50 mg

Şekil 3.1. SERT ve TRAZ etken maddesini içeren piyasadaki lustral ve desyrel ilaçları

Ticari numune

Ticari olarak satın alınan lustral ve desyrel'den den 20 tablet havanda ezilip 1 tablet ağırlığına karşılık gelen lustral'dan 0,1545 g ve desyrel'den 0,3020 g tartıldı. Bir miktar metanol ilave edilip yarım saat manyetik karıştırıcıda karıştırıldı ve son hacim 100 ml’ ye tamamlandı. Çözelti daha sonra süzülüp süzgeç kâğıdında kalan kısım 3 kez 10 mL metanol ile yıkandı ve hacim 100 mL’ ye tamamlanıp daha sonra çalışılacak olan aralığa seyreltildi.

3.4. Yöntem

3.4.1. UV/VIS Spektroskopisi Yöntemi

Bu çalışmada, spektrofotometrik ölçümlerle ilaç aktif maddelerinin stok çözeltilerinin spektrumları okunmuştur. Bu işlem için önce tek tek sonra farklı oranlarda hazırlanan sentetik karışımların spektrumları alınmıştır. Son işlem olarak da ilaç örneklerinde ölçümler yapılmıştır. Elde edilen veriler, farklı kemometrik yöntemlerle değerlendirilmiştir. İlk basamakta, UV spektrofotometre cihazının kalibrasyonu (sıfırlama işlemi) yapılmıştır. Kalibrasyon işlemi önce her iki hücre boş bırakılarak havaya karşı yapılmıştır.

Sonra aynı işlem bu kez her iki ışık yoluna metanol ile hazırlanan kör numunesi konularak yapılmıştır. Bütün okumalarda hep kör bu şekilde hazırlanmıştır. Kör olarak sadece metanol kullanılmasının nedeni bu çalışmada genel olarak çözücümüz metanol olduğu içindir. Kör seçimi yapılırken girişim etkilerini yok etmek için, kör1 olarak çözücü tercih edilmiştir. İkinci basamakta, saf ilaç aktif maddelerinin tek tek spektrumları alınmıştır. Bu işlem esnasında stok ilaç aktif maddelerinden derişimleri 1- 20 ppm arasında olacak arasında saf maddeler stoklardan alınarak toplam hacim 25 mL ye tamamlanarak çözeltileri hazırlanmış ve UV spektroskopisinde absorbans okumaları yapılmıştır. Üçüncü basamakta, her bir madde ayrı bir dalga boyunda maksimum verdiğinden saf ilaç maddelerinden oluşturulan sentetik karışımların UV spektroskopisinde absorbans okumaları yapılmış ve birbiri yanında herhangi bir ön ayırma işlemine gerek olmaksızın ilaç aktif maddeleri incelenmiştir. Son basamakta ise, piyasada satılan ilaç numunesindeki ilaç aktif maddelerinin çözeltileri incelenmiştir.

4. ARAŞTIRMA BULGULARI

Kemometrik kalibrasyonların SERT ve TRAZ bileşiklerinin analizine uygulamasında üç farklı kemometrik yöntem geliştirildi. Bunlar PCA, PCR ve PLS kalibrasyon yöntemleridir. Kemometrik yöntemlerin uygulaması için spektral koşullar optimizasyonu ve optimal kalibrasyon setinin hazırlanması için ön çalışmalar yapıldı.

Saptanan spektral koşullarda kalibrasyon setinin ve numunelerin 200-300 nm dalga boyu aralığında absorbsiyon spektrumları alındı ve kemometrik kalibrasyonlar 200-268 nm dalga boyu bölgesindeki bütün absorbans değerlerinin vektörel ölçümleri kullanılarak elde edildi. Kemometrik algoritmalarla hesaplanan PCA, PCR ve PLS kalibrasyonları yapay ve farmasotik numunenin analizine uygulandı.

4.1. UV Spektroskopisi

Önce her bir ilaç hammaddesinin saf halde 100 ppm standart çözeltileri hazırlanmıştır. Daha sonra 1-20 ppm arasında saf maddeler stoklardan alınarak toplam hacim 25 ml’ye tamamlanmıştır. Bu işlem sonrası absorbanslar ölçülerek kaydedilmiştir. Her bir ilaç maddesinin derişimleri ppm olarak hesaplanmış ve absorbanslardan yaralanılarak molar absorpsiyon katsayıları belirlenmiştir.

Çizelge 4.1. İlaç aktif maddelerinin spektroskopik özellikleri

İLAÇ AKTİF MAK. ABS. MOLAR KALİBRASYON KORELASYON MADDESİ YAPTIĞI ABSORPSİYON DENKLEMİ KATSAYISI DALGABOYU KATSAYISI Sertralin 205,5 nm 1,62.103 y = 0,2255x + 0,9992 (SERT) 0,5369

Trazodone 254,6 nm 6,34.103 y = 0,0253x – 0,9999 (TRAZ) 0,0277

Her bir ilaç aktif maddesinin önce tek tek spektrumları alınır. Bu spektrumlar alınırken derişim aralıkları SERT için 1 – 5 ppm ve TRAZ için ise bu değerler 4 – 20 ppm arasındadır. Bu derişim aralıkları tayini yapılan her bir aktif madde için lineer doğrusallığın olduğu bölgelerdir.

4.1.1. Saf halde SERT ve TRAZ’ ın spektrumları

SERT ve TRAZ maddeleri Çizelge 4.1’de de görüldüğü üzere ayrı dalga boylarında maksimum absorbans vermektedirler.

Bu özellikten yararlanılarak bir sonraki aşamada bu iki etken maddenin sentetik karışımları hazırlanmış ve bunlar birbiri yanında herhangi bir ön ayırma işlemi yapmaksızın tayin edilmişlerdir. SERT ve TRAZ ilaç aktif maddeleri sürekli spektrum göstermekte ve üst üste örtüşen spektrumlar gözlenmektedir.

Şekil 4.1. SERT maddesinin absorpsiyon spektrumu

Şekil 4.2. TRAZ maddesinin absorpsiyon spektrumu

4.2. Kalibrasyon setinin hazırlanması

Kemometrik kalibrasyonlar için Metanol içerisinde SERT için 1-5 μg/mL ve TRAZ için 4-20 μg/mL derişim aralığında her iki bileşiği içeren 19 değişik kompozisyonda simetrik bir kalibrasyon seti hazırlandı. Çizelge 4.2. de hazırlanan kalibrasyon seti sunulmaktadır.

Çizelge 4.2. SERT ve TRAZ analizi için kalibrasyon seti

Kalibrasyon Seti Derişim (µg/mL) No SERT TRAZ 1 1 4 2 1 8 3 1 12 4 1 16 5 1 20 6 2 4 7 2 8 8 2 12 9 2 16 10 2 20 11 3 4 12 3 8 13 3 12 14 3 16 15 4 4 16 4 8 17 4 12 18 5 4 19 5 8

Kalibrasyonlar için rastgele kalibrasyon seti yerine simetrik kalibrasyon seti tercih edilmiştir. Bunun sebebi analiz esnasında meydana gelebilecek kalibrasyon hatalarını minimize etmektir. Çizelge 4.2. deki simetrik kalibrasyon setinin iki boyutlu düzlemdeki projeksiyon grafiği Şekil 4.3 de görülmektedir.

Şekil 4.3. Simetrik kalibrasyon setinin iki boyutlu düzlemdeki grafiği

4.3. Spektral Koşulların Optimizasyonu

Spektrofotometrik çalışmalarda SERT ve TRAZ için Metanol çözücüsünün uygun çözücü olduğu saptandı. Metanol içerisinde SERT ve TRAZ bileşikleri ile karşılık gelen karışımının 200-300 nm dalga boyu aralığında spektrumları alındı (Şekil 4.4.). Şekil 4.4. den de görüldüğü gibi her iki bileşik aynı dalga boyu aralığında girişim yapmaktadır. Bu nedenle klasik spektroskopik yaklaşımlarla her iki bileşiğin aynı anda miktar tayinleri mümkün değildir.

Şekil 4.4.SERT (4 μg/mL) ve TRAZ (12 μg/mL) ile iki bileşiğe karşılık gelen karışımın absorpsiyon spektrumları (Metanol içerisinde).

4.3.1. Temel Bileşen Analizi (PCA)

Sentetik çözeltilerde hesap yaparken programın kendi içinde ilk yaptığı işlem temel bileşen analizi yapmaktır. Temel bileşen analizi uygulanmasının amaçları, bir orijinal değişkeni temsil eden n sayıda orijinal aksı (doğruyu) yeni akslar haline dönüştürmektir. Bu dönüşüm işleminde yeni akslar, verilerin maksimum varyans yönelimleri boyunca uzanır ve yeni aksların özelliği, ortogonal olmalarıdır ve bu yeni değişkenler arasında korelasyon yoktur. Numune verilerinin varyansının çoğunu açıklamak için ihtiyaç olan yeni değişkenlerin sayısı (p), n sayıdaki orijinal akslardan daha azdır. Temel bileşen analizi, çok değişkenli verilerin boyutunu indirgemek veya verileri azaltmak için bir yöntem

48 olarak kabul edilir. Aynı zamanda değişkenlerin doğrusal bileşenlerini ortaya çıkarır.

Şekil 4.5. Değişkenlerin doğrusal bileşenleri

Şekil 4.5. e bakıldığında programa yüklediğimiz verilerden birinci temel aks ve ikinci temel aks üzerinden doğrusal bileşenler bulunmuştur. İşlemlerin doğruluğu ölçüsünde doğrusal bileşenler elde edilmiştir. Bu grafik varyans- kovaryans matrisinin elemanlarının orijinin merkezine olan büyük aks birinci temel bileşeni (C1) ve bu bileşene 45 ºC lik açı ile ikinci temel bileşen (C2) uzanmaktadır. Bir kare matris için, varyans-kovaryans matrisinin elemanları koordinat sisteminin orijini boyunca uzanır. Büyük aksın eğimi, birinci temel bileşen ile birleştirilmiş özvektör (eigenvector)dür. Bu “özvektöre” karşılık gelen “özdeğer” (eigenvalue) Şekil 4.5. deki büyük aksın uzunluğudur. Şekil 4.6. de özdeğerlerin grafiği görülmektedir. Özdeğerlerin simetrik bir veri matrisinden çıkarılması kısmi en küçük kareler yöntemi ve temel bileşen analizi için önemlidir. Özdeğerler ve özvektörler elde edildikten sonra yapılacak işlem diğer kemometrik hesaplamalara geçiştir. Temel bileşen analizi ile elde edilen

49 temel bileşenler yardımıyla oluşturulan korelasyon matrisi diğer kemometrik regresyonlara (PLS, PCR… ) ışık tutmaktadır.

Şekil 4.6. Kemometrik verilerden elde edilen özdeğerlerin grafiği

Şekil 4.6. de belirgin bir şekilde görüldüğü gibi özdeğerler 1. değerden 2. değere doğru düşmüştür. İlk iki faktör, toplam varyansın % 99’undan daha fazla güvenilirdir.

4.3.2. Temel Bileşen Regresyonu Yöntemi (PCR)

PCR yöntemi kalibrasyon seti için ölçülen absorbans matrisinin parçalanmasıyla elde edilen temel bileşen regresyonuna dayalı bir yöntemdir. Yöntemin algoritması Bölüm 1.4.1.2. de ayrıntılı olarak verilmiştir.

PCR kalibrasyon için hazırlanan kalibrasyon setinin 200 – 268 nm dalga boyu aralığında Δλ= 1,0 nm aralıklarla absorbans değerleri okundu. Bölüm 1.4.1.2. de açıklanan PCR algoritmasına göre kalibrasyon setinin absorbans ve derişim değerlerinin varyans-kovaryans matriksleri hesaplandı. Kalibrasyon seti için

50 absorbansların varyans-kovaryans matriksinin dekompozisyon işlemine tabi tutulmasından sonra derişimleri arasındaki matematiksel ilişkiye dayalı PCR kalibrasyonu kuruldu. İlaç aktif maddelerini içeren karışımların yukarıda belirtilen dalga boylarındaki absorbans değerleri okunarak PCR kalibrasyonunda bu etken maddelerin miktar tayinleri gerçekleştirildi. PCR kalibrasyonu için Minitab 16 programında ilk olarak PCA değerleri hesaplanarak aşağıdaki çıktı elde edildi.

Korelasyon Matrisinin Özdeğerleri

Özdeğer 0,82277 0,14267 0,00542 0,00047 0,00006 0,00004 0,00002 Oran 0,847 0,147 0,006 0,000 0,000 0,000 0,000 Toplam 0,847 0,994 0,999 1,000 1,000 1,000 1,000

Özdeğer 0,00001 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 Oran 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 Toplam 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000

Özdeğer 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 -0,00000 -0,00000 - 0,00000 Oran 0,000 0,000 0,000 0,000 -0,000 -0,000 -0,000 Toplam 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000

Özdeğer -0,00000 -0,00000 Oran -0,000 -0,000 Toplam 1,000 1,000

Değişken PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 PC6 PC7 PC8 PC9 C3 0,159 -0,096 0,841 -0,474 -0,178 -0,026 0,034 0,023 0,010 C4 0,249 -0,142 0,321 0,811 -0,375 0,096 -0,057 -0,029 0,010 C5 0,305 -0,161 0,155 0,193 0,655 -0,599 -0,015 0,017 -0,172 C6 0,329 -0,178 0,009 -0,029 0,404 0,677 0,117 -0,349 -0,111 C7 0,345 -0,157 -0,089 -0,047 0,128 0,102 0,144 0,121 0,694 C8 0,356 -0,121 -0,158 -0,091 -0,079 0,145 -0,226 0,777 -0,145 C9 0,357 -0,082 -0,186 -0,181 -0,211 -0,007 -0,381 -0,300 0,456 C10 0,355 -0,025 -0,203 -0,148 -0,197 -0,182 0,042 -0,041 0,075 C11 0,349 0,040 -0,208 -0,088 -0,336 -0,300 0,392 -0,277 0,091 C12 0,074 0,221 0,027 0,030 0,036 0,084 0,250 0,150 -0,247 C13 0,077 0,232 0,027 0,036 0,035 0,073 0,257 0,134 -0,163 C14 0,079 0,241 0,027 0,029 0,034 0,056 0,251 0,110 -0,093 C15 0,081 0,249 0,027 0,027 0,025 0,030 0,191 0,125 -0,115 C16 0,082 0,255 0,028 0,025 0,009 0,020 0,147 -0,003 0,012 C17 0,084 0,259 0,029 0,025 0,004 0,029 0,096 0,009 -0,094 C18 0,084 0,262 0,032 0,015 0,023 0,008 0,059 -0,006 -0,023 C19 0,085 0,264 0,032 0,012 0,027 0,014 -0,020 -0,002 0,071

Değişken PC10 PC11 PC12 PC13 PC14 PC15 PC16 PC17 C3 0,012 -0,002 -0,003 0,002 0,003 0,001 -0,004 -0,008 C4 -0,010 0,047 0,003 -0,002 0,003 0,005 -0,010 0,005 C5 0,018 -0,027 -0,009 -0,007 -0,005 -0,014 -0,007 0,025 C6 0,289 0,010 -0,019 -0,015 -0,015 0,013 -0,000 -0,029 C7 -0,526 -0,063 0,055 0,047 0,018 0,018 0,040 -0,014 C8 0,264 -0,191 0,024 -0,007 -0,021 -0,016 0,089 0,009 C9 -0,522 -0,096 0,054 -0,062 -0,020 -0,097 -0,029 0,079 C10 0,201 0,810 -0,094 0,035 0,014 0,087 -0,028 0,037 C11 0,340 -0,492 -0,018 0,011 0,028 0,009 -0,066 -0,117 C12 -0,229 -0,042 -0,377 0,333 0,090 0,295 -0,243 -0,296 C13 -0,118 0,097 -0,276 -0,106 0,542 -0,230 0,030 0,047 C14 -0,068 0,064 0,219 -0,396 -0,235 -0,343 -0,111 -0,045

C15 -0,129 0,094 0,323 0,116 -0,412 0,073 -0,160 -0,159 C16 -0,032 0,025 0,041 0,367 -0,182 -0,153 -0,030 0,393 C17 -0,049 -0,059 -0,273 -0,138 -0,353 0,191 0,170 0,322 C18 -0,025 -0,010 0,356 -0,401 0,301 0,600 0,137 0,226 C19 0,040 -0,066 0,143 0,082 0,295 -0,361 0,145 0,263

Değişken PC18 PC19 PC20 PC21 PC22 PC23 C3 -0,006 0,001 -0,004 -0,000 -0,001 0,001 C4 0,002 -0,009 0,006 -0,005 0,010 -0,005 C5 0,001 0,012 0,001 -0,003 0,003 -0,003 C6 0,033 0,032 -0,031 -0,034 0,002 -0,015 C7 -0,032 -0,062 0,011 0,059 -0,031 0,068 C8 0,022 0,066 -0,001 0,034 -0,025 -0,011 C9 -0,013 0,002 0,057 -0,016 -0,021 -0,040 C10 0,021 -0,022 0,002 -0,021 0,100 0,032 C11 -0,030 -0,021 -0,051 -0,021 -0,032 -0,031 C12 0,233 -0,059 0,258 0,142 0,310 0,009 C13 -0,342 -0,142 -0,061 -0,121 -0,444 -0,090 C14 -0,268 -0,176 -0,069 0,289 0,469 -0,184 C15 0,220 -0,150 -0,248 -0,486 -0,322 -0,149 C16 -0,120 0,659 0,143 0,150 -0,100 -0,230 C17 -0,120 -0,040 -0,177 0,040 -0,048 0,678 C18 0,210 0,090 0,082 0,145 -0,040 -0,167 C19 0,323 -0,046 0,169 -0,478 0,403 0,220

Bu çizelge ilk üç esas bileşenin absorbansdaki değişmenin %99,99 kadarından sorumlu olduğunu göstermektedir. Bu nedenle regresyon işlemi bu üç bileşen esas alınarak yapılabilir. Ancak yaptığımız bu çalışmada diğer bileşenleri de işin içine katarak bir regresyon eşitliği türetilmiş ve türetilen regresyon eşitlikleri aşağıda verilmiştir.

CSERT = -3,28 + 0,66 Z1 - 3,54 Z2 - 2,30 Z3 - 0,31 Z4 + 0,36 Z5 - 8,46 Z6 + 2,05 Z7 - 8,42 Z8 + 21,15 Z9 + 1,23 Z10 - 12,49 Z11 + 3,57 Z12 -48,74 Z13 -46,20 Z14 + 85,67 Z15 -18,40 Z16 -79,67 Z17 - 72,09 Z18

CTRAZ = -2,28 + 3,34 Z1 + 11,11 Z2 - 0,36 Z3 + 0,86 Z4 + 6,82 Z5 - 14,31 Z6 + 1,82 Z7 - 40,55 Z8 + 13,57 Z9 + 79,72 Z10- 39,71 Z11 - 20,22 Z12 + 8,60 Z13 - 0,77 Z14 + 127,58 Z15 - 39,72 Z16 - 15,64 Z17 + 225,06 Z18

4.3.2.1. Kalibrasyon yönteminin validasyonu

PCR yöntemini valide etmek için SERT için 1-5 μg/mL ve TRAZ için 4-20 μg/mL çalışma aralığı içinde olacak şekilde farklı derişimlerde 19 adet yapay karışım çözeltisinden ibaret olan bir set hazırlandı. Hazırlanan bu validasyon seti (çizelge 4.2.) kullanılarak kurulan PCR kalibrasyonun kesinlik ve doğruluğu test edildi. Geri kazanım (GK) değerleri; SERT için % 98,36 ve TRAZ için % 99,33 olarak bulundu. Standart sapma değerleri SERT için % 1,30 TRAZ için ise % 0,63

52 olarak hesaplandı. PCR kalibrasyon yönteminin sentetik karışımlara uygulanması ile elde edilen sonuçlar Çizelge 4.3. de gösterildi.

Çizelge 4.3. SERT ve TRAZ sentetik karışımlarına PCR validasyon yönteminin uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri

Karışım (µg/mL) Bulunan (µg/mL) Geri kazanım (%)

SERT TRAZ SERT TRAZ SERT TRAZ 1 4 0,98 3,95 98,00 98,75 1 8 0,99 7,95 99,00 99,38 1 12 0,98 11,96 98,00 99,67 1 16 0,94 15,95 94,00 99,69 1 20 0,99 19,98 99,00 99,90 2 4 1,97 3,95 98,50 98,75 2 8 1,96 7,90 98,00 98,75 2 12 1,96 11,98 98,00 99,83 2 16 1,99 15,96 99,50 99,75 2 20 1,95 19,95 97,50 99,75 3 4 2,94 3,91 98,00 97,75 3 8 2,91 7,99 97,00 99,88 3 12 2,98 11,97 99,33 99,75 3 16 2,99 15,96 96,67 99,75 4 4 3,96 3,92 99,00 98,00 4 8 3,97 7,96 99,25 99,50 4 12 3,98 11,96 99,50 99,62 5 4 4,97 3,98 99,40 99,50 5 8 4,91 7,94 98,20 99,25  X 98,36 99,33 SS 1,30 0,63

4.3.2.2. PCR yöntemi için ANOVA testi

PCR kalibrasyon yönteminin doğruluk ve kesinliğini valide etmek amacıyla elde edilen sonuçlara ANOVA testi uygulanmıştır. Gruplar arası serbestlik derecesi=1, grup içi serbestlik derecesi=36, % 95 güven aralığında F-tablo değeri 4,11 olmasına karşılık SERT için hesaplanan F-test değeri 6,7.10-3 ve p- değeri 0,93 ve TRAZ için hesaplanan F-test değeri 7,0.10-4 ve p-değeri 0,97 olarak bulunmuştur.

ANOVA testinde F-hesaplanan< F-tablo ve p-değeri> p=0,05 olduğu için % 95 güven aralığında elde edilen sonuçlar arasında anlamlı bir fark olmadığı bulunmuştur. Varyans analizinde iki serbestlik derecesi kullanılır. Gruplar arası serbestlik derecesi=1 Grup içi serbestlik derecesi=36. F-hesaplanan< F-tablo ve p-değeri> p=0,05 olduğu için bu kalibrasyon modeli ticari numunenin incelenmesinde kullanılabilir olduğuna karar verilmiştir.

4.3.2.3. PCR yönteminde istatistiksel analiz

4.3.2.3.1. Kalibrasyonun standart hatası

SERT ve TRAZ içeren karışımlarda bu maddelerin miktar tayini için PCR kalibrasyonun kurulmasında çapraz validasyon işleminde tahmin edilen hataların karelerinin toplamının (Predicted Resudiual Error Some of Squares→ PRESS) minimal değerleri elde edilmiştir. Kurulan PCR kalibrasyonunda PRESS değeri SERT ve TRAZ için sırasıyla 0,0354 ve 0,0508 olarak hesaplanmıştır. PRESS değerinin sıfıra yakın olması doğruluk derecesini arttırmaktadır. Elde edilen PRESS değerleri yeterince küçüktür.

Kalibrasyonun standart hatası (Standard error of calibration →SEC), gerçek ve tahmin edilen derişimler arasındaki ilişkiye dayalı olarak hesaplandı ve SERT ve TRAZ için sırasıyla 0,0432 ve 0,0517 olarak bulundu. Gerçek ve tahmin edilen derişim için lineer regresyon analiz sonuçları HCT için Şekil 4.7’de ve AMH için Şekil 4.8’de verilmiştir.

Şekil 4.7. PCR kalibrasyon basamağında SERT için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar.

Şekil 4.8. PCR kalibrasyon basamağında TRAZ için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar.

4.3.2.4. PCR yönteminin farmasotik preparatlara uygulanması

PCR yönteminin farmasotik preparata uygulanmasında 20 tablet doğru bir şekilde tartıldı. Havanda iyice toz edildikten sonra lustral için 1 tablete karşılık gelen miktar olan 0,1545 g ve desyrel için 1 tablete karşılık gelen miktar olan 0,3020 g tartılarak 100 mL’lik balon jojede üzerine bir miktar metanol eklenerek yarım saat manyetik karıştırıcıda karıştırıldı ve son hacim 100 ml’ ye

55 tamamlandı. Çözelti daha sonra süzülüp süzgeç kâğıdında kalan kısım 3 kez 10 mL metanol ile yıkandı ve hacim 100 mL’ ye tamamlanıp daha sonra çalışılacak olan aralığa seyreltildi. Bu analiz çözeltilerinin 200- 268 nm dalga boyu bölgesinde Δλ= 1,0 nm aralıklarla ölçülen absorbans değerleri Bölüm 1.4.1.2. de açıklanan PCR algoritması uygulandı ve tablet içeriğindeki SERT ve TRAZ hesaplandı. Bu işlem 6 kez tekrarlanmıştır.

Yukarıda açıklanan tablet analiz işlemi hazırlanan tablet preparatı için ayrı ayrı tekrar edildi. Sonuçlar Çizelge 4.4’ de verilmiştir.

Çizelge 4.4. Tablet preparatına PCR yönteminin uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar.

LUSTRAL DESYREL Deney No SERT TRAZ 1 49,98 49,74 2 49,84 50,36 3 50,08 50,08 4 50,20 49,94 5 50,04 50,36 6 50,00 50,24  X = 50,02 50,12

4.3.3. Kısmi en küçük kareler yöntemi (PLS)

Bölüm 1.4.1.3’de ayrıntılı olarak algoritması verilen kısmi en küçük kareler yönteminde Çizelge 4.2’ye göre hazırlanan kalibrasyon seti kullanılmıştır. Ölçümler 200–300 nm arasında yapılmıştır. Daha sonra aralık kalibrasyon seti için ve kullanılacak olan istatistik programı doğrultusunda dalga boyu aralığı 200 – 268 nm olarak daraltılmıştır. Her 2 nm de bir olmak üzere bu noktalara karşılık gelen 34 noktada absorbans okunmuştur. PLS kalibrasyon için hazırlanan kalibrasyon setinin 200-268 nm dalga boyu aralığında Δλ= 1,0 nm aralıklarla absorbanslar okunmuştur. Kullanılan istatistik program ile kalibrasyon setinin absorbans ve derişim değerlerinin varyans-kovaryans matriksleri hesaplanmıştır. Derişimler arasındaki matematiksel ilişkiye dayalı PLS kalibrasyonu kurulmuştur. İlaç aktif maddelerini içeren ticari farmasotik preparat' da yukarıda belirtilen dalga boylarındaki absorbans değerleri

56 okunarak PLS kalibrasyonunda bu maddelerinin miktar tayinleri gerçekleştirilmiştir.

4.3.3.1. Kalibrasyon yönteminin validasyonu

PLS yöntemini valide etmek için SERT için 1 - 5 μg/mL ve TRAZ için 4 - 20 μg/mL çalışma aralığı içinde olacak şekilde farklı derişimlerde 19 adet yapay karışım çözeltisinden ibaret olan bir set hazırlandı. Hazırlanan bu validasyon seti (çizelge 4.2.) kullanılarak kurulan PLS kalibrasyonun kesinlik ve doğruluğu test edildi. Geri kazanım (GK) değerleri; SERT için % 99,99 ve TRAZ için % 99,79 olarak bulundu. Standart sapma değerleri SERT için % 1,93 TRAZ için ise % 2,03 olarak hesaplandı. PLS kalibrasyon yönteminin sentetik karışımlara uygulanması ile elde edilen sonuçlar Çizelge 4.5. de gösterildi.

Çizelge 4.5. SERT ve TRAZ sentetik karışımlarına PLS kalibrasyon yönteminin uygulanması ve elde edilen geri kazanım değerleri

Karışım (µg/mL) Bulunan (µg/mL) Geri kazanım (%) SERT TRAZ SERT TRAZ SERT TRAZ 1 4 1,01 4,04 101,09 101,00 1 8 1,02 7,93 102,52 100,35 1 12 0,96 12,04 96,24 100,21 1 16 1,01 16,03 101,45 100,06 1 20 1,03 20,01 103,50 99,39 2 4 1,98 3,97 99,08 99,74 2 8 1,97 7,97 98,86 100,19 2 12 1,98 12,02 99,19 100,07 2 16 1,96 16,01 98,34 99,62 2 20 2,00 19,92 100,46 100,79 3 4 3,07 4,03 102,34 99,61 3 8 2,99 7,96 99,71 99,74 3 12 2,98 11,96 99,43 99,95 3 16 2,99 15,99 99,90 99,08 4 4 3,95 3,96 98,92 100,67 4 8 4,00 8,05 100,14 100,53 4 12 4,01 12,06 100,42 99,71 5 4 5,01 3,98 100,34 99,17 5 8 4,99 7,99 99,87 99,88  X 100,09 99,99 SS 1,65 0,52

4.3.3.2. PLS yöntemi için ANOVA testi

PLS kalibrasyon yönteminin doğruluk ve kesinliğini valide etmek amacıyla elde edilen sonuçlara ANOVA testi uygulanmıştır. Gruplar arası serbestlik derecesi=1, grup içi serbestlik derecesi=37 % 95 güven aralığında F-tablo değeri 4,11 olmasına karşılık SERT için hesaplanan F-test değeri 0 ve p-değeri 1 ve TRAZ için hesaplanan F-test değeri 1,38.10-8 ve p-değeri 0,99 olarak bulunmuştur.

ANOVA testinde F-hesaplanan< F-tablo ve p-değeri> p=0,05 olduğu için % 95 güven aralığında elde edilen sonuçlar arasında anlamlı bir fark olmadığı bulunmuştur. Varyans analizinde iki serbestlik derecesi kullanılır. Gruplar arası serbestlik derecesi=1 Grup içi serbestlik derecesi=28. F-hesaplanan< F-tablo ve p-değeri> p=0,05 olduğu için bu kalibrasyon modeli ticari numunenin incelenmesinde kullanılabilir olduğuna karar verilmiştir.

4.3.3.3. PLS yönteminde istatistiksel analiz

4.3.3.3.1. Kalibrasyonun standart hatası

SERT ve TRAZ içeren karışımlarda bu maddelerin miktar tayini için PLS kalibrasyonun kurulmasında çapraz validasyon işleminde tahmin edilen hataların karelerinin toplamının (Predicted Resudiual Error Some of Squares→ PRESS) minimal değerleri elde edilmiştir. Kurulan PLS kalibrasyonunda PRESS değeri SERT ve TRAZ için sırasıyla 0,0137 ve 0,0280 olarak hesaplanmıştır. PRESS değerinin sıfıra yakın olması doğruluk derecesini arttırmaktadır. Elde edilen PRESS değerleri yeterince küçüktür.

Kalibrasyonun standart hatası (Standard error of calibration →SEC), gerçek ve tahmin edilen derişimler arasındaki ilişkiye dayalı olarak hesaplandı ve SERT ve TRAZ için sırasıyla 0,0268 ve 0,0383 olarak bulundu. Gerçek ve tahmin edilen derişim için lineer regresyon analiz sonuçları SERT için Şekil 4.9’de ve TRAZ için Şekil 4.10’da verilmiştir.

Şekil 4.9. PLS kalibrasyon basamağında SERT için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar.

Şekil 4.10. PLS kalibrasyon basamağında TRAZ için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiği ve istatistiksel sonuçlar.

4.3.3.4. PLS yönteminin farmasotik preparatlara uygulanması

PLS yönteminin farmasotik preparata uygulanmasında 20 tablet doğru bir şekilde tartıldı. Havanda iyice toz edildikten sonra lustral için 1 tablete karşılık gelen miktar olan 0,1545 g ve desyrel için 0,3020 g tartılarak 100 mL’lik balon

59 jojede üzerine bir miktar metanol ile yarım saat manyetik karıştırıcıda karıştırıldı ve son hacim 100 ml’ ye tamamlandı. Çözelti daha sonra süzülüp süzgeç kâğıdında kalan kısım 3 kez 10 mL metanol ile yıkandı ve hacim 100 mL’ ye tamamlanıp daha sonra çalışılacak olan aralığa seyreltildi. Bu analiz çözeltilerinin 200- 268 nm dalga boyu bölgesinde Δλ= 0,1 nm aralıklarla ölçülen absorbans değerleri Bölüm 1.4.1.3. de açıklanan PLS algoritması uygulandı ve tablet içeriğindeki SERT ve TRAZ hesaplandı. Bu işlem 6 kez tekrarlanmıştır.

Yukarıda açıklanan tablet analiz işlemi preparat için ayrı ayrı tekrar edildi. Sonuçlar Çizelge 4.6’ de verilmiştir.

Çizelge 4.6. Tablet preparatına PLS yönteminin uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar

LUSTRAL DESYREL Deney No SERT TRAZ 1 49,56 49,12 2 50,14 48,96 3 49,88 48,78 4 49,92 49,10 5 49,24 48,94 6 49,36 48,88  X = 49,68 48,96

5. TARTIŞMA VE SONUÇ

Günümüzde insanların hastalıklardan kurtulmak amacıyla sık olarak tükettikleri en etkili maddeler ilaçlardır. İlaçlar canlı bünyesinde içerdikleri etken maddeler sayesinde etki gösterebilmektedir. Bu etken maddeler ise giriş kısmında da belirtildiği üzere belirli miktarlarda alındıklarında canlı bünyesinde olumlu etki gösterirken aşırı alınması durumunda tehlikeli boyutlarda zararlar veren kimyasal maddelerdir. Bu nedenle ilaç analizlerinde etken madde analizi önemli yer tutmaktadır. Bu analizlerde genel olarak spektroskopik ve kromatografik yöntemler tercih edilmesine rağmen pahalı yöntemler olması ve çok uzun süren ön ayırma işlemleri bu yöntemlerin kullanımını sınırlamaktadır.

Bu tez çalışmasında kemometrik kalibrasyonların ilaç etken maddelerinden SERT ve TRAZ bileşiklerinin hiçbir ön ayırma işlemi yapmaksızın aynı anda analizine uygulanmasında üç farklı kemometrik yöntem geliştirilmiştir. Bunlar PCA, PCR ve PLS kalibrasyon yöntemleridir.

Öncelikle ilaç etken maddelerinin saf haldeki spektrumları alınıp çizelge 4.1. de görüldüğü üzere ayrı dalga boylarında absorbans vermelerinden yararlanarak bu etken maddelerin sentetik karışımları hazırlanmıştır. Şekil 4.4. de görüldüğü gibi her iki bileşik aynı dalga boyu aralığında girişim yapmaktadır bu durumda her iki bileşiğin klasik spektroskopik yaklaşımlarla aynı anda miktar tayinlerinin mümkün olmadığı görülmüştür.

Geliştirilen PCR ve PLS kemometrik yöntemlerinin kesinlik ve doğruluğu test edilmiştir. Kesinliğin sayısal ölçütü olan bağıl standart sapmanın düşük olması kesinliğin yüksek olduğunu göstermektedir. Çizelge 4.3. ve çizelge 4.5. de görüldüğü üzere bağıl standart sapmaların düşük olduğu görülmektedir. Doğruluğun sayısal ölçütü olan PRESS (Tahmin edilen hataların kareleri toplamı) değerinin sıfıra yakın olması doğruluk derecesinin yüksek olduğunun göstergesidir. PCR yöntemi ile elde edilen PRESS değeri SERT için 0,0354 ve TRAZ için 0,0508 olarak hesaplanıp PLS yöntemi ile elde edilen PRESS değeri

SERT için 0,0137 ve TRAZ için 0,0280 olarak hesaplanmıştır ve bu değerlerin yeterince küçük olduğu görülmüştür.

PCR ve PLS yöntemlerinin doğruluk ve kesinliğini valide etmek için elde edilen sonuçlara ANOVA testi uygulanıp grup içi ve gruplar arası serbestlik derecesi ile tablodan okunan F değerine karşın hesaplanan F değerleri kıyaslanmıştır. Tablodan okunan F değeri 4,11 olup PCR yönteminde SERT için hesaplanan F değeri 0,0067 ve TRAZ için 0,0007 bulunmuş; PLS yönteminde SERT için 0 ve

TRAZ için 1,38.10-8 olarak bulunmuştur. Elde ettiğimiz sonuçlar Fhesaplanan

PCR kalibrasyon basamağında şekil 4.7. de SERT için ve şekil 4.8. de TRAZ için gerçek ve tahmin edilen derişimlerin lineer regresyon grafiklerinde görüldüğü üzere çalışılan aralıklarda doğrusal sonuçların elde edildiği görülmektedir. Aynı şekilde PLS yöntemi için de şekil 4.9. da SERT için ve şekil 4.10. da TRAZ için de aynı durum görülmektedir.

PCR ve PLS yöntemlerinin uygulanmasıyla SERT ve TRAZ için elde edilen geri kazanım değerleri çizelge 4.3. ve 4.5. de gösterilmiştir ve iki yöntem de elde edilen geri kazanımlar yüksek değerlerde bulunmuştur.

Son olarak PCR ve PLS yöntemleri analiz edilen maddelerin ticari preparatlarına uygulanmış ve tabletlerde belirtilen SERT ve TRAZ miktarları ile çizelge 4.4. ve çizelge 4.6. da bulunan bu aktif maddelerin miktarının birbiriyle uyumlu olduğu gözlenmiştir.

Sonuç olarak, geliştirilen kemometrik yöntemlerin birbiri ile uyumlu olduğu görülmüştür ve bu yöntemlerin tekrarlanabilirliğinin yüksek olup duyarlı ve doğru sonuçlar verdiği gözlemlenmiştir. Elde edilen sonuçlar geliştirilen bu kemometrik yöntemlerin SERT ve TRAZ içeren ilaç tabletlerinin analizinde kullanılabileceğini göstermektedir.

KAYNAKLAR

Adams, A.I.H., Bergold, A.M., 2001. Assay of Sertraline in Tablets and Drug Substance by Liquid Chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 26, 505-508.

Bebawy, L.I., El-Kousy, N., Suddik, J.K., Shokry, M., 1999. Spectrophotometric Determination of Fluoxeetine and Sertraline Using Chloranil, 2, 3 dichloro-5, 6 discyano Benzoquinone and İodine. Journal of Pharmaceitical and Biomedical Analysis, 21, 133-142.

Bosch, M.E., Sanchez, A.J.R., Rojas, F.S., Ojeda, C.B., 2008. Analytical Methodologies for the Determination of Sertraline. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48, 1290-1302.

Bueno, M.J.M., Ulaszewska, M.M., Gomez, M.J., Hernando, M.D., Fernandez-Alba, A.R., 2012. Simultaneous Measurement in Mass and Mass/Mass Mode for Accurate Qualitative and Quantitative Screening Analysis of Pharmaceitucals in River Water. Journal of Chromatography A, 1256, 80-88.

Carda-Broch, S., Gil-Agusti, M.T., Monferrer-Pons, L.I., Esteve-Romero, J.S., 2007. Determination of Trazodone in Urine and Pharmaceuticals Using Micellar Liquid Chromatography with Fluorescence Detection. Journal of Chromatography A, 1156, 254-258.

Choong, E., Rudaz, S., Kottelat, A., Haldemann, S., Guillarme, D., Veuthey, J., Eap, C.B., 2011. Quantification of 4 Antidepressants and A Metabolite by LC-MS for Therapeutic Drug Monitoring. Journal of Chromatography B, 879, 1544-1550.

Çetin,A., 2008. Çoklu İlaç Karışımlarının Spektrofotometrik Olarak Kantitatif Analizi İçin Kemometrik ve Grafiksel Metot Geliştirme. Sakarya Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 86s, Sakarya.

Dinç,E., 2007. Kemometri Çok Değişkenli Kalibrasyon Yöntemleri, 27(1), 61-92.

Dinç,E., 2009. Kemometrik İşlem ve Yöntemlerin Analitik Kimyadaki Tipik Uygulamaları, Uygulamalı Kemometri Yaz Okulu Notları, 1-5.

Dodd, S., Buist, A., Burrows, G.D., Maguire, K.P., Trevor, R.N., 1999. Determination of Nefazodone and Its Pharmacologically Active Metabolites in Human Blood Plasma and Breast Milk by High- Performance Liquid Chromatography. Journal of Chromatography B, 730, 249-255.

EL-gindy, A., El-Zeany, B., Awad, T., Shabana, M.M., 2001. Spectrophotometric, Spectrofluorimetric and LC Determination of Trazodone Hydrochloride. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 26, 211-217.

Erk, N., 2003. Rapid and Simple Methods for Quantitative Analysis of Some Antidepressant in Pharmaceitucal Formulations by Using First Derivative Spectrophotometry and HPLC. IL Farmaco, 58, 1209- 1216.

Ferrarini, A., Huidobro, A.L., Pellati, F., Barbas, C., 2010. Development and validation of a HPLC method for the determination of sertraline and three non-chiral related impurities. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 53, 122-129.

Harikrıshna, K., Kumar, R.S., Seetharamappa, J., Manjunatha, D.H., 2006. Sensetive Extraction Spectrophotometric Methods for The Determination of Trazodone Hydrochloride in Pure and Pharmaceutical Formulations. J. Serb. Chem. Soc. 71, 829-837.

Hedge, R.N., Shetti, N.P., Nandibewoor, S.T., 2009. Electro-Oxidation and Determination of Trazodone at Multi-Walled Carbon Nanotube- Modified Glassy Carbon Electrode. Talanta, 79, 316-368.

Himmelsbach, M., Klampfl, C.W., Buchberger, W., 2005. Development of An Analytical Method for The Determination of Antidepressants in Water Samples by Capillary Electrophoresis with Electrospray Ionization Mass Spectrometric Detection. J. Sep. Sci., 28, 1735- 1741.

Himmelsbach, M., Buchberger, W., Klampfl, C.W., 2005. Determination of Antidepressants in Surface and Waste Water Samples by Capillary Electrophoresis with Electrospray Ionization Mass Spectrometric Detection After Preconcentration Using Off-Line Solid-Phase Extraction. Electrophoresis, 27, 1220-1226.

Johnson, K.A., Liu, XH., Huang, S., Roongta, V., Humphreys, W.G., Shu, Y-Z., 2010. Rapid Structure Determination of Microgram-Level Drug Metabolites Using HPLC-MS, Fraction Collection and NMR Spectroscopy. Analytical Methods, 2(10), 1542-1549.

Kaya,B., 2007. Kombine Farmasötik Preparatlardan Telmisartan ve Hidroklorotiyazid’in kemometrik Kemometrik Kalibrasyon Yöntemleriyle Aynı Anda Miktar Tayinleri. Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 104s, Ankara.

Kaur, K., Malik, A.K., 2013. Study on The Fluorescence Quenching Reaction of Amitriptyline and Clomipramine Hydrochlorides with Eosin Y and Its Analytical Application. J Fluoresc, 23, 533-542.

Kayaalp, S.O., 1992. Rasyonel tedavi yönünden tıbbi farmakoloji. Feryal Matbaacılık, 2190s, Ankara.

Kayaalp, S.O. (Ed), 2009. Rasyonel Tedavi Yönünden Tıbbi Farmakoloji. Pelikan Yayıncılık, 704s(12), Ankara.

Khalil, S., 1999. İon-selective Electrode for The Determination of Trazodone in Tablets. Analyst, 124(2), 139-142.

Krichherr, H., Kühn-Velten, W.N., 2006. Qantitative Determination of Forty-Eight Antideprassants and Antipsychotics in Human Serum by HPLC Tandem Mass Septrometry: A Multi-Level, Single-Sample Approach. Journal of Chromatography B, 843, 100-113.

Kitiş F., 2011. İlaç numunelerinde kafein ve parasetamol’ün kemometrik yöntemlerle tayinleri. Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 60s, Isparta.

Kumar, R.S., Manjunatha, D.H., Shaikh, S.M.T., Seetharamappa, J., Harikrishna, K., 2006. Sensetive Extractive Spectrophotometric Methods for The Determination of Trazodone Hydrochloride in Pharmaceutical Formulations. Chem. Pharm. Bull., 54(7), 968-971.

Mercolini, L., Colliva, C., Amore, M., Fanali, S., Raggi, M.A., 2008. HPLC Analysis of The Antidepressant Trazodone and Its Main Metabolite m-CPP in Human Plasma. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 47, 882-887.

Mycek, M.j., Harvey, P.A., Champe,P.C., 1998.Lippincott’s Mustrated Review Serisinden: Farmakoloji. Çev. Atagündüz P. , Model tıp kitap evi, 462s,İstanbul.

Pan, C-W., Duh, T-H., Wu, H-L., 2012. A Simple Liquid Chromatographic Method for The Simultaneous Determination of Antidepressant in Pharmaceutical Preparations. J. Chin. Chem. Soc., 59, 1125-1129.

Rakic, T., Stojanovic, B.J., Malenovic, A., Ivanovic, D., Medenica, M., 2012. İmproved Chromatographic Response Function in HILIC Analysis: Application to Mixture of Antidepressants. Talanta, 98, 54-61.

Rao, D.S., Geetha, S., Srinivasu, M.K., Reddy, G.O., 2001. LC Determination and Purity Evaluation of Nefazodone HCI in Bulk Drug and Pharmaceutical Formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 26, 629-636.

Saka, C., Ömer, Ş., 2013. Determination of Serotonin-Norepinephrine Reuptake Inhibitör Antidepressants in Pharmaceuticals and Biological Material. Critical Reviews in Analytical Chemistry, 43, 2-34.

Sasajima, Y., Lim, L.W., Takeuchi, T., Suenami, K., Sato, K., Takekoshi, Y., 2010. Simultaneous Determination of Antidepressants by Non-Aqueous Capillary Electrophoresis-Time of Flight Mass Spectrometry. Journal of Chromatography A, 1217, 7598-7604.

Siroka, J., Polesel, D.N., Costa, J.L., Lanaro, R., Tavares, M.F.M., Polasek, M., 2013. Separation and Determination of Chlorophenylpiperazine Isomers in Consfiscated Pills by Capillary Electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 84, 140-147.

Skoog, D.A., Holler,F.J., Nieman, T.A., 1998. Enstrümantal Analiz İlkeleri. Bilim Yayıncılık, Özkan Matbaacılık, 849, Ankara.

Şener,M., 2006. İçme Sularında Kalsiyum ve Magnezyumun Spektrofotometrik Metotla Simultane Tayini ve Yapay Sinir Ağları İle Kemometrik Analizi. Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 49s, Isparta.

Uyanık, A., 2008. Analitik Kimyacılar için İstatistik ve Kemometri, 254-259.

Vandegınste B. M. G., Massart D. L., Buydens L. M. C., De Jong S., Lew_ P. J. And Smeyers-Verbeke. J. 1998. Handbook Of Chemometrics And Qualimetrics Part B, Elsevier, Amsterdam.

Vugic, Z., Uskokovic-Markovic, S., Kuntic, V., 2009. Simultaneous Determination of Maprotiline, Desipramine and Moclobemide by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography and Statistical Optimization. Analytical Letters, 42, 2060-2070.

Walash, M.I., El-Brashy, A., El-Enany, N., Wahba, M.E., 2010. Hıgh Performance Liquid Chromatographic Determination of Sertraline in Pesence of Its Degradation Product. Analytical Letters, 43, 1434-1447.

Wang, Y-R., Yang, Y-H., Lu, C-Y., Lin, S-J., Chen, S-H., 2013. Trace Analysis of Acetylcholinesterase Inhibitors with Antipsychotic Drugs for Alzheimer’s Disease by Capillary Electrophoresis with on Column Field-Amplified Sample Injection. Anal. Bioanal. Chem, 405, 3233- 3242.

Yao, M., Shah, V.R., Shyu, W.C., Srinivas, N.R., 1998. Sensitive Liquid Chromatographic-Mass Spectrometric Assay for The Simultaneous Quantitation of Nefazodone and Its Metabolites Hydroxynefazodone m-Chlorophenylpiperazine and Triazole- Dione in Human Plasma Using Single-Ion Monitoring. Journal of Chromatography B, 718, 77-85.

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Nuray AYTEKİN Taranmış Doğum Yeri ve Yılı : Uşak, 1990 Fotoğraf (3.5cm x 3cm) Medeni Hali : Bekar

Yabancı Dili : İngilizce

E-posta : [email protected]

Eğitim Durumu

Lise : Necati Özen Lisesi, 2005

Lisans : SDÜ, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü

Yüksek Lisans : SDÜ, Fen Bilimleri Enstitüsü, Analitik Kimya

Mesleki Deneyim

Uşak Ulubey Kışladağ Altın Madeni(staj) 2010

Yayınları

1. Aytekin N., Aktaş A.H., 2014. Spectrometric Determination of Trazodone and Sertralin in Tablets by Multivariate Calibration Approach. Global Analytical Chemistry An International Journal, 5(3), 073 - 077.