INDICE
1. RIASSUNTO 3
2. INTRODUZIONE 5
3. METODI 8
3.1. Area di Studio 8
3.2. Tecniche utilizzate 9
3.2.1. Ululato Indotto ( wolf-howling ) 9
3.2.2. Monitoraggio Fotografico 13 3.2.3. Campionamento Genetico 15 4. RISULTATI 20
4.1. Ululato Indotto ( wolf-howling ) 20
4.2. Monitoraggio Fotografico 21
4.3. Campionamento Genetico 25 4.3.1. Analisi campioni non invasivi 25 4.3.2. Analisi campioni invasivi 31 4.4. Risultati finali ottenuti dalla integrazione delle tre tecniche 37
5. DISCUSSIONE 42
6. BIBLIOGRAFIA 48
2 1. RIASSUNTO
La valutazione ex post della presenza di canidi vaganti nella provincia di Grosseto, ottenuta tramite l'analisi integrata dei diversi metodi di indagine (tecnica dell'ululato indotto, attività di fototrappolaggio, analisi genetica di campioni organici) ha fornito i seguenti risultati:
- La presenza di canidi vaganti (ibridi o lupi) è stata rilevata in 14 dei 15 comprensori sottoposti alla valutazione ex post (93,3% dell'area campionata; Tabella 4 ). L'unico comprensorio sottoposto alla valutazione ex post in cui non sono state riscontrate evidenze di presenza di canidi selvatici è Poggio Ferro, nel comune di Scansano. Gli unici comprensori in cui, pur avendo rilevato la presenza di canidi vaganti, non sono state rilevate evidenze fenotipiche e genetiche di ibridazione sono Monte Penna/Elmo e Amiata.
- Nell'area interessata dalla indagine ex post è stata rilevata la presenza di almeno 5 nuclei riproduttivi (4 branchi ed una femmina gravida). In 4 nuclei riproduttivi (Montioni, Monte Leoni, Abbandonato e Baccinello) sono state rilevate sia evidenze fenotipiche che genetiche di ibridazione. Nel branco in località Montauto (area meridionale della Provincia di Grosseto) sono state invece rilevate evidenze fenotipiche di ibridazione, ma il dato non è stato confermato dai risultati delle analisi genetiche effettuate sui campioni non invasivi.
- Evidenze fenotipiche di ibridazione sono state riscontrate in 9 delle 15 aree sottoposte al monitoraggio fotografico e precisamente nei comprensori a nord ovest della Provincia di Grosseto (Montioni), nord est (Belagaio), nell'area centro-orientale (Monte Leoni, Roselle/Marrucheti, Abbandonato e Baccinello) e nell'area meridionale (Polverosa, Marsiliana e Montauto). Nelle aree a nord-ovest e centro-orientale, le analisi genetiche effettuate sui campioni non invasivi hanno confermato il dato fenotipico, mentre nell'area a nord est (Belagaio) e nell'area meridionale della Provincia di Grossseto (Polverosa, Marsiliana e Montauto) non è stata rilevata nessuna evidenza genetica di ibridazione.
- In tre comprensori sottoposti alla valutazione ex post (Monte Leoni, Abbandonato e Roselle/Marrucheti) viene confermata la presenza di esemplari ibridi già rilevata durante il monitoraggio ex ante (Manghi et al. 2012).
- In base alle analisi genetiche effettuate sui campioni non invasivi raccolti tra il 1 giugno 2014 ed il 30 ottobre 2014 è stata rilevata la presenza di 29 individui diversi, incluso un cane, con una percentuale di individui ibridi all'interno della popolazione pari al 32,1% o al 35,7% del
3 campione analizzato in base alla soglia di attribuzione che viene utilizzata (vedi§4.3.1). Questo risultato è confrontabile con quanto rilevato durante l'indagine ex ante della presenza di ibridi lupo- cane e cani vaganti (percentuale di esemplari ibridi nella popolazione campionata pari al 29,8% e al 35,1% a seconda della soglia utilizzata, Braschi & Boitani, 2013).
- Le analisi genetiche effettuate sui campioni non invasivi sembrerebbero rilevare che, all'interno della popolazione campionata, siano presenti principalmente esemplari ibridi di generazione successiva alla seconda.
- Le analisi genetiche effettuate sui campioni invasivi, sebbene non forniscano un dato quantitativo sulla presenza di ibridi nel periodo di riferimento della valutazione ex post della presenza di canidi vaganti (vedi§4.3.2), confermano la presenza di evidenze genetiche di ibridazione nell'area centrale (Roselle/Marrucheti) e meridionale (Polverosa) della Provincia di Grosseto .
- La percentuale di cani vaganti nel territorio è risultata essere molto ridotta , come rilevano i risultati delle analisi genetiche effettuate sui campioni non invasivi (3,4% su un campione di 29 esemplari diversi campionati) e i dati ottenuti con l'attività di fototrappolaggio (cani filmati solamente nei due comprensori Montauto e Monte Leoni). Il numero di cani campionati costituisce tuttavia una severa sottostima del numero di cani vaganti realmente presenti sul territorio (vedi§4.2). In nessuna foto o filmato i cani sono stati visti associati ad esemplari di lupi o di ibridi .
- Nelle due aree di studio originarie di progetto non è stata riscontrata la presenza di canidi selvatici (Parco Naturale della Maremma) oppure è stata riscontrata una presenza estremamente ridotta di canidi vaganti (Monte Amiata; 1 solo individuo rilevato). In entrambe le aree non sono state rilevate, durante la valutazione ex post, evidenze fenotipiche e/o genetiche di ibridazione.
- In merito al grado di associazione tra gli animali, in tre dei comprensori sottoposti al monitoraggio con fototrappole (Amiata, Polverosa e Rocconi) sono stati filmati solamente individui singoli, mentre nei restanti comprensori il grado di associazione è risultato essere estremamente variabile (min 2 - max 7 individui associati)
4 2.2.2. INTRODUZIONE
Con il termine ibridazione si intende l’incrocio tra individui appartenenti a popolazioni geneticamente distinte, indipendentemente dallo stato tassonomico (Allendorf et al., 2001). L’ibridazione tra individui di specie diverse è indicata come ibridazione interspecifica e porta spesso alla generazione di ibridi sterili, a causa dell’incompatibilità cromosomica all’atto della produzione di gameti; in questi casi si verificano unicamente ibridi di prima generazione (F 1). Nel caso in cui gli ibridi siano fertili, questi possono accoppiarsi tra loro dando origine a generazioni successive di ibridi (F 2, F 3, ecc.), oppure reincrociarsi con individui di una o entrambe le popolazioni parentali (ibridazione con introgressione). In quest’ultimo caso, se l’introgressione progredisce in modo sostanziale, una o entrambe le popolazioni parentali possono arrivare a contenere, fino ad esserne del tutto sostituite, un’elevata proporzione di ibridi e/o reincroci di varie generazioni, rappresentando quello che è stato definito sciame ibrido (Ferguson et al., 1985; Ciucci, 2012). L’ibridazione è un processo naturale che occorre in molti differenti contesti ecologici giocando un ruolo importante nell’evoluzione di numerosi taxa animali e vegetali. Le zone di ibridazione, più o meno stabili rilevate nelle aree di simpatria tra diverse specie, dovrebbero quindi essere tutelate alla stregua delle specie parentali (Harrison, 1993). Quando l’uomo interviene, determinando e facilitando il persistere di condizioni che consentono a taxa altrimenti distinti di potersi incrociare, si parla invece di ibridazione antropogenica. La frammentazione e la degradazione degli habitat, così come l’alterazione degli ecosistemi attraverso l’introduzione di specie alloctone, i cambiamenti degli equilibri ecologici e delle consistenze numeriche delle specie selvatiche hanno portato a variazioni nel funzionamento dell’efficacia dei meccanismi di isolamento riproduttivo propri di molte specie (Ciucci, 2012). L’ibridazione antropogenica, con o senza introgressione, rappresenta una grave minaccia per il mantenimento di specie o popolazioni distinte (Ciucci, 2012). E’ stato stimato che questo fenomeno abbia causato l’estinzione di diverse specie di pesci d’acqua dolce (Allendorf et al., 2001) e si teme che per la scarsità di indagini di genetica molecolare ad oggi realizzate, il suo impatto possa essere stato sottovalutato per molte altre specie animali (Ciucci, 2012; Rhymer e Simberloff, 1996), non ultimo il lupo. Nel contesto ecologico italiano, i cambiamenti nella situazione sociale ed ecologica delle aree montane hanno portato ad una rapida crescita delle superfici forestali e ad un aumento degli ungulati selvatici, condizioni idonee alla naturale espansione della popolazione italiana di lupo che ha iniziato ad occupare zone sempre più vicine alle aree antropizzate. Questa situazione ha favorito
5 un più stretto contatto tra la popolazione canina e quella lupina portando ad un conseguente aumento degli eventi di ibridazione accertati (Randi, 2008). In questo contesto nasce il progetto LIFE Ibriwolf che si propone di mettere in atto, a livello locale, strategie gestionali per contrastare l’espansione dell’ibridazione antropogenica con il cane domestico, attraverso azioni concrete che prevedano, innanzitutto, una conoscenza del fenomeno della ibridazione e della sua espansione a scala locale, e la definizione di elementi diagnostici per la identificazione degli esemplari ibridi cane – lupo.
Una prima indagine conoscitiva sulla entità del fenomeno della ibridazione a scala locale, e sulla sua distribuzione spaziale, era stata svolta nei primi anni di realizzazione del progetto (Azioni A3 e A4 del progetto Ibriwolf; Manghi et al., 2012) ed aveva portato alla individuazione delle aree maggiormente critiche (a causa dell'elevata presenza di esemplari con evidenze genetiche e/o fenotipiche di ibridazione con il cane) in cui effettuare le catture e la rimozione degli ibridi cane – lupo dallo stato selvatico (azioni C1 e C2 del Progetto Ibriwolf; Braschi et al. 2014).
La seconda fase di indagine, azione E2 del Progetto Ibriwolf, si poneva pertanto, come obiettivo principale, quello di quantificare gli “effetti” della rimozione degli esemplari ibridi dal territorio, attraverso la valutazione della variazione numerica della loro presenza nell'area di studio, confrontando il dato ottenuto con quanto rilevato nel corso dell'indagine ex ante.
Tuttavia, tre elementi in particolare hanno determinato che gli obiettivi della ex post venissero modificati rispetto a quanto previsto da progetto:
1. La rimozione di esemplari ibridi ha riguardato anche aree non sottoposte all'indagine ex ante
2. La valutazione ex ante si è limitata a confermare la presenza di ibridi all'interno delle due aree di studio (area dell'Amiata e Parco Regionale della Maremma), ed è stata realizzata una perlustrazione opportunistica e non standardizzata di altri comprensori, con il fine ultimo di selezionare le aree maggiormente idonee allo svolgimento delle attività di cattura
3. La valutazione ex ante si è svolta in un periodo stagionalmente diverso (gennaio – giugno 2012) rispetto all'indagine ex post (giugno – ottobre 2014), ed utilizzando solamente due delle tre tecniche applicate nella indagine ex post.
Questi tre elementi rendono evidente l'impossibilità, per una indagine ex post, non solo di valutare l'impatto delle catture sulla presenza di ibridi cane lupo nel territorio, ma anche la difficioltà di confrontare, a livello quantitativo, i dati ottenuti rispetto alla indagine ex ante.
6 Considerate tali premesse, si è ritenuto più utile, ai fini del progetto, realizzare una indagine esaustiva della presenza di canidi vaganti in un territorio decisamente più ampio rispetto a quello sottoposto alla indagine ex ante, attraverso la integrazione di tre tecniche di indagine eseguite con procedure standardizzate e pertanto replicabili negli anni futuri. Inoltre, durante la valutazione ex post, sono stati acquisiti ulteriori dati finalizzati ad incrementare le conoscenze relative alla caratterizzazione genetica e morfologica degli ibridi cane lupo. Tutte le informazioni ottenute si rivelano uno strumento conoscitivo estremamente utile per la pianificazione di futuri interventi gestionali a livello locale, non solo perché forniscono il dato quantitativo e spaziale della consistenza della ibridazione a scala locale, e la sua caratterizzazione a livello genetico e morfologico, ma perché costituiscono inoltre la base conoscitiva di partenza per la identificazione delle aree maggiormente critiche e per la definizione delle condizioni ecologiche e gestionali associate alla presenza degli ibridi in un determinato territorio.
7 3.3.3. METODI
3.1. Area di Studio
Le aree di studio interessate dal monitoraggio ex post sono le seguenti: 1. Area1 ( area 1 ; Figura 1 ): corrisponde alle due aree pilota del progetto Ibriwolf e comprende i siti di interesse comunitario presenti nel Parco Regionale della Maremma e sul Monte Amiata (rispettivamente IT51A0013, IT51A0015, IT51A0016, e IT51A0017). Tale area di indagine è stata oggetto di un monitoraggio sistematico. 2. L' area 2 ( area 2 ; Figura 1 ): comprende tutte le località della provincia di Grosseto in cui è stata registrata, mediante la tecnica del fototrappolaggio, la presenza di almeno due lupi/ibridi associati durante la fase di monitoraggio iniziale (ex ante) e nel corso del monitoraggio finalizzato alle catture. L'area 2 è stata interessata da un monitoraggio di tipo opportunistico. L’assunto alla base di questa scelta è che la presenza di due individui associati rappresenta l’evidenza della presenza di un branco.
Figura 1 . Area di studio interessata dal monitoraggio previsto dall’Azione E2: in rosso ( area 1 ), la zona di interesse prioritario rappresentata dai SIC presenti nel Parco Regionale della Maremma e del cono vulcanico del Monte Amiata; in blu ( area 2 ), le aree in cui è stata rilevata la presenza (foto-trappolaggio) di almeno 2 lupi/ibridi, sottoposte ad un monitoraggio di tipo opportunistico.
8 I comuni complessivamente interessati dall’ area 2 ( Figura 1 ) sono, da nord-ovest a sud-est: Follonica, Roccastrada, Grosseto, Campagnatico, Arcidosso, Roccalbegna, Scansano, Castell’Azzara, Semproniano, Sorano, Manciano e Orbetello.
3.2. Tecniche utilizzate
Al fine di raggiungere l’obiettivo proposto con l’Azione E2, (monitoraggio della presenza di lupi/cani/ibridi in parte della Provincia di Grosseto) sono state utilizzate tre tecniche complementari: l’ululato indotto, il monitoraggio fotografico ed il campionamento genetico.
In particolare, è stata effettuata innanzitutto una stima della presenza di nuclei riproduttivi di lupi/ibridi tramite l'ululato indotto. Successivamente sono state utilizzate le trappole fotografiche per confermare la presenza di eventuali cuccioli e per ottenere informazioni utili al rilevamento dell’aspetto fenotipico degli animali fotografati, in base alle quali stimare la frequenza relativa nel territorio di lupi, ibridi e cani. Dato che i caratteri fenotipici anomali di un esemplare ibrido non sono sempre facilmente identificabili dalle foto e/o filmati, il dato fenotipico è stato integrato con le informazioni ottenute tramite l’analisi genetica dei campioni non invasivi, raccolti nelle aree in cui è stata rilevata una maggior frequentazione da parte di canidi vaganti.
3.2.1 Ululato Indotto ( wolf-howling )
La tecnica in questione sfrutta la tendenza naturale dei lupi a rispondere alle emissioni vocali (ululati) di altri individui, in modo da rilevare la presenza della specie nell’area e verificarne l'avvenuta riproduzione. La verifica del dato riproduttivo è possibile grazie alla vocalizzazione caratteristica dei cuccioli, che li rende facilmente distinguibili dagli adulti. Il wolf howling consiste quindi nella emissione di un ululato a voce o attraverso la riproduzione, con apposita strumentazione, di una traccia registrata e nella raccolta delle informazioni inerenti un’eventuale risposta indotta, facendo riferimento ad un protocollo stabilito in America all'inizio degli anni ‘80 (Harrington, F.H., and L.D. Mech. 1982). Dato che uno dei principali obiettivi della tecnica è quello di accertare la riproduzione dei branchi, essa è principalmente utilizzata nel periodo estivo in concomitanza con il periodo di allevamento dei cuccioli. Nell’ambito del presente progetto sono stati delineati i seguenti obiettivi specifici:
− individuare i nuclei riproduttivi presenti nel territorio di indagine e la localizzazione indicativa dei siti di allevamento dei cuccioli ( rendez-vous ). − Identificare dei circuiti, circoscriventi l’area del rendez-vous individuato, da ispezionare per la raccolta degli escrementi utili per il campionamento genetico ed il posizionamento di trappole fotografiche. 9 L’applicazione della tecnica è avvenuta seguendo una strategia di campionamento differente in base alla sotto-area di appartenenza di ciascun comprensorio. Area 1 : Campionamento sistematico con copertura di tutto il territorio di indagine.
Area 2 : Campionamento opportunistico con copertura parziale del territorio. In entrambi i casi si è proceduto con: • l’individuazione in ambiente GIS dei punti di emissione sulla base dei seguenti parametri: posizione elevata rispetto alla topografia dell’area, presenza di strade percorribili in macchina, distanza tra le stazioni adiacenti ≤ 3 km o minore in caso di ostacoli orografici. • Ogni circuito è stato replicato per tre notti consecutive, applicando il protocollo stabilito in America all'inizio degli anni '80 (Harrington and Mech, 1982). • Laddove la precedente applicazione della tecnica nel 2013 (Gazzola et al. 2013) aveva rivelato la presenza di cuccioli, è stato identificato un circuito che desse importanza prioritaria a punti di emissione mirati, volti alla verifica della presenza di un rendez-vous nella stessa zona dell’anno precedente.
Una fase preliminare (aprile-giugno 2014) ha previsto la pianificazione dei circuiti e la scelta delle stazioni dalle quali effettuare le emissioni. Nella pianificazione è stato tenuto conto di quanto già svolto nell’estate 2013 (Gazzola et al. 2013) e delle informazioni acquisite con il foto-trappolaggio effettuato durante le attività di cattura. Sono stati così identificati un numero complessivo di 11 comprensori, in cui sono state individuate 53 stazioni di emissione riunite in 14 circuiti ( Tabella 1 ; Figura 2 ). In alcuni casi, la localizzazione delle stazioni ha subito successivamente alcune modifiche, in relazione a quanto riscontrato nelle prime notti di attività ed in relazione alle informazioni forniteci da altri operatori che hanno applicato la tecnica negli anni precedenti.
10 Comprensorio Sottoarea Comune/i N° circuiti N° stazioni PRM Area 1 Ente Parco 2 6 Monte Amiata Area 1 Unione dei Comuni 2 9
Belagaio Area 2 Roccastrada 1 4
Oasi di Monte Leoni Area 2 Roccastrada, Campagnatico e Grosseto 1 4
Monte Rosaio- Roselle Area 2 Grosseto e Campagnatico 1 5
Montioni Area 2 Follonica 1 3
Baccinello Area 2 Scansano 1 3
Rocconi Area 2 Semproniano 1 2
Polverosa-Marsiliana Area 2 Orbetello e Manciano 2 7
Stribugliano - Monte Labbro Area 2 Arcidosso e Roccalbegna 1 5
Monte Penna- Elmo Area 2 Castell'Azzara e Sorano 1 5
14 53 Tabella1 . Elenco dei comprensori, e relativo numero di circuiti e stazioni, oggetto del monitoraggio per la presenza di canidi mediante la tecnica dell’ululato indotto (luglio 2014).
Altre emissioni ( Tabella 2 ) sono state eseguite in maniera mirata al fine di verificare segnalazioni di presenza di canidi selvatici avute nel corso della stagione riproduttiva.
Comprensorio Sottoarea Comune N° stazioni Rocconi Area 2 Saturnia 1 Monte Penna Elmo Area 2 Cellena 2 3 Tabella 2 . Elenco dei comprensori e relativo numero di stazioni effettuate in seguito a segnalazioni di presenza di canidi selvatici (luglio 2014).
11 Figura 2 . Stazioni di emissione (punti verdi), e relative aree buffer (cerchi verdi) di 1,5 km di raggio, utilizzate per il monitoraggio con l’ululato indotto (luglio 2014). L’applicazione della tecnica dell’ululato indotto ha riguardato il mese di luglio 2014 ed ha previsto la presenza continua sul territorio (nelle ore notturne) di una o due squadre costituite da uno/due operatori ciascuna (personale del BBCD). Data la vastità dell'area di indagine e la necessità dell’esecuzione di alcuni circuiti in simultanea, è stato inoltre fatto affidamento sulla presenza di volontari, il cui numero è variato (da 1 a 2) in base alle disponibilità. Ogni squadra di operatori è stata dotata: 1. di almeno un ricevitore GPS, per la lettura e registrazione delle coordinate (X, Y) delle stazioni di emissione e ascolto; 2. di una bussola, per la misurazione della direzione di provenienza della risposta ottenuta; 3. di una scheda specifica, sulla quale annotare tutte le informazioni raccolte (data; ora; stazione; risposta: direzione di provenienza, distanza stimata tra la stazione di emissione e la posizione dei lupi/ibridi, stima del numero di animali uditi e l’eventuale presenza di cuccioli).
Nel caso specifico del circuito ricoprente l’area nella quale durante l’estate 2013 è stata accertata la presenza di un’unità riproduttiva (porzione della Valle del Torrente Trasubbino compresa tra la zona del Monte Faete e la località di Baccinello, comune di Scansano), gli operatori hanno dato priorità alla/alle stazione/i di emissione mirata. Soltanto in caso di esito negativo sono state coperte le restanti stazioni costituenti il circuito. 12 Ciascun circuito è stato realizzato per 3 notti consecutive e in ogni stazione di emissione è stata riprodotta una traccia costituita da 3 ululati ( trials ), intervallati da 1 minuto circa di silenzio. Al termine dell’ultimo trial gli operatori sono rimasti in ascolto per altri 10 minuti, per poi passare alla stazione successiva. Laddove la risposta da parte dei lupi/ibridi è giunta prima della fine della traccia, questa è stata arrestata e si è proceduto con la registrazione della direzione di provenienza della risposta ascoltata, che è stata utilizzata per la localizzazione del sito di risposta degli animali.
3.2.2 Monitoraggio Fotografico
Contemporaneamente alle attività dell’ululato indotto è iniziato il monitoraggio della presenza di canidi tramite l’uso di trappole fotografiche ad infrarosso (Modelli: Multipir, IR plus BF e IR plus 10°). Il monitoraggio fotografico si è svolto negli stessi comprensori in cui si è svolta l'attività di wolf howling , escluso il Parco Regionale della Maremma (PRM; vedere avanti per maggior dettagli), e con i seguenti obiettivi specifici: − Determinazione della presenza e composizione numerica media (intervallo numero individui min e max filmati) dei branchi; − conferma della presenza di cuccioli, numero e loro caratterizzazione fenotipica; − caratterizzazione fenotipica degli individui filmati e distribuzione dei lupi/ibridi e cani vaganti nelle aree di studio monitorate.
La strategia di campionamento adottata per la identificazione dei siti trappola da utilizzare è variata in funzione dei risultati ottenuti con l’ululato indotto. In caso di esito positivo (risposta corale), una volta localizzata l’area del probabile sito rendez-vous , si è proceduto con un sopralluogo al fine di individuare eventuali vie d’accesso al sito (strade sterrate, mulattiere e camminamenti fatti dalla fauna selvatica), lungo le quali posizionare le trappole fotografiche e reperire campioni non invasivi. Laddove non sono state ottenute risposte ma si disponeva comunque di dati di presenza raccolti durante le attività di cattura, sono stati effettuati ugualmente dei sopralluoghi mirati per selezionare i posti idonei all’installazione di trappole fotografiche. Questi siti sono stati scelti tenendo conto della concentrazione dei segni di presenza di canidi e/o considerando i risultati ottenuti nel corso del monitoraggio fotografico precedente (Azione A4 e Azioni C1 e C2). In particolare sono stati considerati prioritari i siti in cui era stata rilevata la presenza di un branco (es. area faunistico venatoria della Polverosa). Nella selezione dei siti si è tenuto conto anche di alcuni aspetti logistici, come ad esempio la possibilità di raggiungimento del posto a piedi o in macchina da parte degli operatori.
Nel caso specifico del PRM, non avevo ottenuto risposte durante l’attività di wolf howling e non avendo avuto conferme della presenza recente di canidi selvatici nell’area, si è deciso di escludere
13 tale area dal monitoraggio tramite fototrappolaggio e reperimento di campioni non invasivi.
Le trappole sono state impostate sulla modalità video di durata variabile di 10-20 secondi con un tempo pari a 0 secondi di ritardo tra un video e quello successivo. In alcuni casi si è ricorso all’uso di esche odorose (urina, escrementi, sangue, carne e pesce in decomposizione) per rendere più attrattivo il sito ed indurre l’animale a sostare nei pressi della macchina fotografica di modo da avere immagini più definite. Il controllo delle trappole è avvenuto circa ogni 7-15 giorni.
Per identificare la classe di appartenenza (lupo/ibrido/cane) degli individui filmati ci si è basati sulle indicazioni riportate nella Relazione Tecnica “ Ibridazione con il cane come minaccia per la conservazione del lupo: status delle conoscenze e criteri per l’identificazione degli ibridi ” (Ciucci, 2012), redatta nell’ambito dell’Azione A2 e già utilizzata per il riconoscimento degli animali nell'ambito delle azioni A3 e A4 (Manghi et al. 2012).
Si è tenuto conto in particolare dei seguenti caratteri: - dimensioni e proporzioni corporee (testa, zampe, coda, lunghezza del corpo); - pattern di colorazione del mantello (melanismo, tonalità isabelline, macchie melaniche più estese e marcate, macchie bianche sul corpo); - bandeggi sul capo e sul corpo (colorazione del ventre, del dorso, delle zampe anteriori e della coda); - lunghezza e consistenza (sottile, ondulata) del pelo (testa, collo, ventre, coda); - portamento della coda (posizione arcuata o a bandiera); - caratteri della mascherina facciale (ridotta o assente o dai confini cromatici più contrastati, netti e definiti).
Le foto e i video ottenuti sono stati classificati come appartenenti a: - canidi: foto/video non diagnostici per condizioni non ottimali di luce e di angolo di ripresa, ma attribuibili con certezza a canidi di grossa taglia; - lupi/ibridi: foto/video attribuibili ad esemplari di lupo o ibridi sulla base dei criteri esplicitati nella Relazione Tecnica sopra citata; - cani: foto/video attribuibili con certezza a cani.
I dati raccolti sono stati archiviati in un apposito database descrivendo le seguenti informazioni: - data di posizionamento della trappola fotografica; - località e coordinate del sito; - data ed esito di ogni controllo; - data ed ora delle foto/video contenenti canidi; 14 - numero di passaggi degli animali; - numero di esemplari filmati; - tipologia di canide fotografato/filmato; - presenza di individui con fenotipi anomali o segni particolari evidenti (es arto amputato).
3.2.3 Campionamento genetico
Il campionamento genetico dei lupi/ibridi è stato effettuato attraverso l’analisi del DNA presente nei campioni di resti biologici non invasivi (CNI o “campioni fecali”; Figura 3 ) trovati all’intero del territorio della Provincia di Grosseto nel periodo compreso tra il 1 giugno ed il 31 ottobre 2014. Questi sono stati raccolti mediante l’ispezione di appositi circuiti, seguendo una strategia di tipo opportunistico. I circuiti sono stati identificati negli stessi comprensori elencati in precedenza per l'attività di wolf howling ( Tabella 1 ), con la sola esclusione dell'area del PRM. Sono state inoltre monitorate le stesse zone aggiuntive considerate per il monitoraggio fotografico.
Per l’identificazione dei circuiti (o transetti, tecnica anche detta in inglese scat trail ) sono state utilizzate le informazioni raccolte con la tecnica dell’ululato indotto (ovvero la localizzazione delle risposte ottenute) e con il monitoraggio effettuato negli anni precedenti (circuiti utilizzati per il monitoraggio ex-ante; Manghi et al., 2012). Tenendo in considerazione che l’ispezione di circuiti/transetti è una tecnica che consiste nella ricerca degli escrementi in maniera opportunistica, ovvero sfrutta il comportamento naturale degli individui dominanti di lupo di marcare periodicamente il territorio allo scopo di prevenire eventuali incursioni di ospiti indesiderati, durante la perlustrazione degli stessi particolare attenzione è stata posta nei punti di marcatura individuati (incroci di strade e valichi). I circuiti sono stati periodicamente ispezionati (circa ogni 7/10 giorni), al fine di distribuire in maniera omogenea lo sforzo di campionamento e di aumentare le probabilità di rinvenimento di campioni idonei per le analisi genetiche.
15 Figura 3 . Escremento di lupo/ibrido raccolto nel corso delle attività di scat -trail (luglio-ottobre 2014).
Una volta rinvenuto un escremento, presumibilmente appartenente a lupo o ibrido, ne è stato raccolto un frammento di circa 1-2 cm 3 assicurandosi dell’assenza di eventuali contaminazioni da parte di altri animali (es presenza di altre feci sull'escremento rinvenuto).
Oltre ai campioni non invasivi, si è proceduto alla raccolta opportunistica di campioni invasivi (CI; peli, sangue e muscolo). Questi sono stati prelevati agli animali catturati durante le sessioni di cattura e da carcasse di lupi/ibridi rinvenute nei territori della Provincia di Grosseto e Siena, nel corso di un periodo decisamente più esteso rispetto alla durata della valutazione ex post (ottobre 2013 – ottobre 2014). Alcuni dei campioni provenienti dalla Provincia di Siena sono stati gentilmente forniti dal dott. Federico Morimando, responsabile provinciale del Progetto Regione Toscana-CIRSEMAF (Morimando, F. 2014).
Dato che i CI sono stati raccolti in un'area più vasta rispetto a quella sottoposta alla valutazione ex post e in tempi diversi, non sono stati utilizzati per effettuare una stima del numero di ibridi/lupi presenti nel territorio, ma per acquisire dati relativi alla caratterizzazione genetica e fenotipica di esemplari ibridi (vedi §3.3.2).
I campioni raccolti sono stati conservati all'interno di boccette di plastica (escrementi e tessuto) o buste di carta (peli) contenente silicagel periodicamente controllata e sostituita in seguito al viraggio del colore iniziale. Per ogni campione sono state registrate una serie di informazioni, quali: il 16 numero identificativo, la data di raccolta, le coordinate UTM, la località e, esclusivamente per quelli fecali, la stima dell’età di deposizione. L’assegnazione degli escrementi ad individui di lupo/ibrido è stata effettuata in base alla composizione, dimensioni, diametro e odore delle feci. I campioni biologici non invasivi sono stati inviati, per le analisi genetiche, al laboratorio del Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos, CIBIO, dell' Università di Porto in Portogallo ( http://cibio.up.pt/cibio.php?lang=en ), che si occupa in maniera specifica delle tre componenti della biodiversità: geni, specie ed ecosistemi. Negli ultimi anni il laboratorio CIBIO ha lavorato in maniera specifica sul fenomeno della ibridazione antropogenica tra il cane ed il lupo (es. Godinho et al. 2011) e si era occupato della analisi genetica dei campioni reperiti durante la valutazione ex ante (Braschi & Boitani, 2013). I campioni invasivi sono stati invece inviati, per le analisi genetiche, sia al laboratorio dell'ISPRA che al laboratorio portoghese CIBIO. La raccolta di campioni genetici si è svolta allo scopo di ottenere i seguenti risultati: −−− assegnare gli individui campionati ad una delle tipologie di canidi considerate (lupi, ibridi, cani), fornendo un dato quantitativo del fenomeno della ibridazione all'interno della popolazione campionata; −−− localizzare i diversi genotipi all'interno dell’area campionata, effettuando una stima della consistenza, in termini di numero minimo di genotipi differenti, della popolazione di lupi/ibridi/cani vaganti; −−− effettuare una stima della distribuzione di lupi e di ibridi sul territorio ed individuare le aree maggiormente critiche, ovvero le aree in cui il problema della ibridazione risulta essere più consistente; −−− evidenziare una eventuale variazione nella consistenza e distribuzione dei canidi selvatici, attraverso il confronto nei risultati ottenuti con le analisi effettuate nell’ambito dell’Azione A3-A4.
Procedure di Laboratorio . L’estrazione del DNA dai CI è avvenuta seguendo il protocollo DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), mentre, per l’estrazione del DNA dai CNI, è stato fatto riferimento ai protocolli di Frantz et al. (2003) e Boom et al. (1990). Al fine di prevenire eventuali casi di contaminazione, tutte le fasi precedenti alla amplificazione con PCR sono state condotte in un laboratorio appositamente destinato alla manipolazione di DNA di ridotta qualità, caratterizzato da ambiente sterile e da una favorevole pressione dell'aria. Durante l'intero processo sono stati effettuati controlli al fine di scongiurare la contaminazione di DNA appartenente ad individui diversi. La qualità di DNA estratto dai CNI è stata determinata dall'amplificazione di un frammento di una regione ipervariabile di DNA mitocondriale di 420bp (HV1; Vilà et al. 1999), ed effettuando quattro repliche su tre microsatelliti. Sono stati successivamente utilizzati per l'intero processo
17 solamente quei CNI che erano stati genotipizzati con successo per i tre marcatori descritti.
Una volta estratto il DNA, tutti i campioni sono stati analizzati applicando le seguenti analisi genetiche:
.1 Analisi del DNA mitocondriale
L'analisi del DNA mitocondriale consente di attribuire l'appartenenza del campione alla popolazione di lupo o di cane domestico in base alla individuazione di un aplotipo diagnostico. Più specificamente, se viene rilevato nel campione l'aplotipo W14 che costituisce l'aplotipo unico per il lupo in Italia (Randi et al. 2000), viene confermata l’appartenenza del campione alla specie lupo o cane, mentre se vengono rilevati aplotipi esclusivi del cane, il campione viene attribuito unicamente alla popolazione di cane domestico. Essendo il DNA mitocondriale ereditato per via materna consente, nel caso di individui ibridi, di comprendere la direzionalità (via materna o paterna) della ibridazione.
.2 Analisi del DNA microsatellite
L'analisi del DNA microsatellite consente di identificare il genoma degli animali e fornisce pertanto informazioni sul numero di individui campionati. Attraverso l'analisi del DNA microsatellite è inoltre possibile ottenere informazioni relative alla potenziale origine degli animali campionati, ovvero stabilire la probabilità di assegnazione di un individuo ad una popolazione distinta (lupi, cani, ibridi).
Il sesso degli individui è stato determinato utilizzando un test molecolare proposto da Seddon (2005).
I singoli genotipi sono stati determinati per i campioni invasivi utilizzando un set di 50 loci nucleari e per i campioni non invasivi un set di 16 loci. I 16 marcatori sono stati specificamente selezionati in base a: i) valore di F ( Fst value s) tra lupo e cane per 14 marcatori e ii) la probabilità di identità (PID) per due loci in modo da aumentare il potere di identificazione del singolo genotipo.
Per quanto riguarda i CNI, i genotipi ripetuti sono stati identificati utilizzando GIMLET (Valière 2002) ed è stata inoltre stimata, sempre tramite GIMLET, la probabilità di identità (PID) e la probabilità attesa tra fratelli full-sibling (PID sib ).
Per entrambi i pannelli di loci (50 e 16), i genotipi individuali sono stati analizzati utilizzando la procedura a cluster Bayesiana utilizzata in STRUCTURE 2.3.3 (Falush et al . 2003), assumendo l'esistenza rispettivamente di 2 popolazioni (K=2), ovvero la popolazione italiana ed europea di lupi e la popolazione di cani, e di 3 popolazioni (K=3) suddividendo la popolazione di lupi in due sotto- popolazioni (lupi italiani ed europei). Una volta definiti i cluster, il programma utilizzato
18 (STRUCTURE) assegna le probabilità di appartenenza ai cluster di genotipi individuali in base alla loro composizione. I genotipi le cui frequenze alleliche hanno probabilità non trascurabili di appartenere a due o più cluster sono identificati come potenziali ibridi. Questa analisi è stata realizzata per 20 repliche indipendenti per 10 6 interazioni, dopo un periodo di “ burn-in ” pari a 10 5 interazioni, utilizzando per la identificazione degli individui un modello misto che includeva sia frequenze alleliche correlate all'interno della popolazione sia frequenze alleliche senza precedenti. Il risultato di questo procedimento ha portato a definire, per ogni individuo, la probabilità di assegnazione ad una delle due popolazioni ( qi) ed il relativo intervallo di confidenza al 90%.
Una seconda analisi è stata successivamente effettuata in STRUCTURE per suddividere ulteriormente i genotipi in tre popolazioni (PopInfo model), mentre l'ascendenza degli esemplari è stata stimata utilizzando l'algoritmo ANCESTRY, del software STRUCTURE.
Al fine di determinare la caratterizzazione genetica delle popolazioni parentali, necessaria per definire il test di assegnazione e le probabilità di assegnazione ai cluster, sono stati analizzati 67 campioni appartenenti alla popolazione di lupo (o ibrido cane lupo) italiana (campionati in tutta Italia) e 45 campioni di cani italiani (popolazione di cani randagi, cani da pastore e cani lupo cecoslovacco campionati nella Provincia di Grosseto, in Abruzzo e nel Parco Naturale dell'Appennino Tosco Emiliano). Sono stati inoltre analizzati 21 campioni di lupi europei (campioni provenienti da Romania, Spagna, Portogallo, Slovenia e Russia) e 181 campioni di cani randagi e razze da pastore appartenenti alla popolazione di cani iberici.
.3 Analisi dei loci microsatellite sul cromosoma Y
Per gli individui maschi campionati è stato possibile effettuare l'analisi di 6 loci microsatellite associati tra loro e presenti sul cromosoma Y (Sundqvist et al. 2001; Bannasch et al. 2005) che risultano spesso sufficientemente differenti tra la popolazione locale di lupo ed i cani (Sundqvist et al. 2001). La presenza di aplotipi tipici dei cani nel genoma di esemplari di lupi costituisce una evidenza di introgressione per via paterna (Iacolina et al. 2010).
.4 Analisi del locus-K L'analisi del locus K consiste nella identificazione di individui eterozigoti che presentano la mutazione β-Defensin (mutazione K B del gene). Tale mutazione, correlata alla colorazione nera del mantello, è assente nella popolazione selvatica di lupo (Caniglia et al, 2013) e costituisce, in Italia, una evidenza genetica di un evento recente di introgressione con il genoma di cane domestico portatore di questa variante genetica (Candille et al . 2007; Greco 2009). La mutazione K B del gene è stata ricercata in tutti i campioni (sia CI che CNI) utilizzando i primers suggeriti da Caniglia et al. (2013).
19 4.4.4. RISULTATI
Vengono di seguito riportati i risultati che sono stati ottenuti con le singole tecniche applicate durante lo svolgimento dell'azione E2, ed un paragrafo finale di riepilogo di tutti i risultati della valutazione ex post della presenza di canidi vaganti.
4.1. Ululato Indotto ( wolf-howling )
L’applicazione della tecnica ha coperto il periodo compreso tra l’1 ed il 26 luglio, corrispondente ad un totale di 24 notti di attività e 60 stazioni di emissione effettuate, con uno sforzo di campionamento di 5.377 km percorsi in macchina. Complessivamente sono state ottenute 6 risposte (5 di individui solitari ed una risposta corale con cuccioli) da 4 differenti stazioni ( Figura 4 ):
− Due risposte sono state ottenute in uno dei comprensori rientranti nell’Area 1, il Monte Amiata ( Tabella 1 ). In entrambi i casi si è trattato dell’ululato di un individuo singolo adulto rilevato da 2 stazioni differenti e nel corso di due distinte repliche notturne (21 e 23 luglio). − Tre risposte sono state ottenute in un comprensorio dell’Area 2, corrispondente ai territori delle Aziende Faunistico Venatorie della Polverosa e Marsiliana ( Tabella 1 ). Tutte le risposte ottenute riguardavano individui singoli adulti e sono state rilevate dalla medesima stazione di emissione in due notti distinte (1 e 2 luglio). − L’unica risposta corale rilevata, nella quale è stata accertata la presenza di una cucciolata, riguarda un comprensorio rientrante nell’Area 2 e corrispondente alla zona di Baccinello (Tabella 1 ). Dalla risposta è stata stimata la presenza di almeno 3/4 adulti e 3 cuccioli. − Nessuna delle emissioni mirate, effettuate in seguito a segnalazioni di avvistamenti, ha dato esito positivo. − Nell'area del PRM non è ottenuta nessuna risposta
20 Figura 4 . Stazioni di emissione (punti blu) utilizzate per il monitoraggio con l’ululato indotto (luglio 2014). In verde le stazioni dalle quali sono state ottenute le risposte.
4.2. Monitoraggio fotografico
Dall’area di indagine ( Tabella 1 ) è stato escluso il Parco Regionale della Maremma (PRM) non avendo avuto risposte durante la fase dell’ululato indotto (vedi §3.2.2). La suddivisione in comprensori ha restituito un totale di 15 aree all’interno delle quali sono stati allestiti 49 siti fototrappolaggio ( Figura 5 ) con l’utilizzo di 29 fototrappole, per un totale di 49 sessioni di cattura fotografica. Durante il periodo del monitoraggio sono state rubate due fototrappole, pertanto i siti di fototrappolaggio si sono ridotti a 47. Il monitoraggio fotografico è iniziato il 30 giugno e si è concluso il 31 di ottobre. Complessivamente sono state effettuati 2147 giorni di attivazione delle fototrappole, con una media per foto trappola di 44 (min 3; max 119) giorni di attivazione. All’interno di ogni settore sono stati utilizzati da un minimo di un solo sito ad un massimo di 6 siti.
In 34 delle 47 sessioni considerate sono stati filmati canidi vaganti, equivalente ad un successo di cattura del 72%. In queste sessioni positive, nel 94% (N=32) sono stati filmati lupi/ibridi e nel 26,5% (N=9) cani vaganti. Soltanto in 2 delle 9 sessioni nelle quali è stata rilevata la presenza di cani non è stata registrata la presenza di lupi/ibridi. In nessun caso però è stata registrata la presenza associata di cani e lupi/ibridi ( Tabella 3 ).
21 numero sessioni sessioni sessioni fototrappol Tot con con cani e lupi/ibridi 29 47 32 9 Tabella 3. Tabella riassuntiva delle sessioni di monitoraggio fotografico.
Figura 5 . Localizzazione dei siti di fototrappolaggio all'interno della provincia di Grosseto (30 giugno-31ottobre).
La funzione video è stata preferita rispetto alla funzione foto poiché ritenuta più utile a rilevare il maggior numero di individui legati allo stesso passaggio. La resa complessiva delle fototrappole è stata di 5,55 video di canidi (lupo/ibrido e cane) per sessione di monitoraggio (N=47). Nei video realizzati (N=261) sono stati rilevati cani vaganti nel 12,3% dei casi (N=32) e lupi/ibridi nell'87,7% dei casi (N=229). Il 48,91% (N=112) di questi ultimi riguarda individui con caratteristiche fenotipiche anomale rispetto allo standard selvatico del lupo. Tuttavia, a causa della difficoltà nel riconoscere con certezza gli individui ibridi, dovuta alla bassa qualità dei video (per lo più notturni), tale percentuale potrebbe essere stata sottostimata. Nei casi in cui non si era certi su come classificare gli individui filmati questi sono stati considerati come appartenenti ad un’unica classe “lupo/ibrido”.
22 La presenza di cuccioli dell'anno è stata rilevata in 4 comprensori, ovvero Montioni (5 cuccioli), Monte Leoni (2 cuccioli), Baccinello (7 cuccioli) e Montioni ( Tabella 4 ). In località Baccinello le evidenze ottenute con il monitoraggio fotografico hanno confermato la presenza di cuccioli già rilevata durante l'attività di wolf howling. Inoltre, durante le attività di cattura che si sono svolte nel mese di aprile 2014 (sessione dodici bis, Braschi et al. 2014) era stata fotografata una femmina gravida in località Baccinello; pertanto è possibile supporre l'esistenza di un quinto nucleo riproduttivo in tale località.
Anomalie fenotipiche sono state riscontrate in 9 dei 15 comprensori sottoposti a monitoraggio fotografico e precisamente nei comprensori di Abbandonato, Baccinello, Belagaio, Marsiliana, Montauto, Montioni, Oasi Monte Leoni, Polverosa e Roselle/Marrucheti ( Tabella 4 ; Figura 6 ). In tutti i nuclei riproduttivi localizzati tramite il monitoraggio fotografico sono state rilevate evidenze fenotipiche anomale rispetto allo standard selvatico ( Figura 6 ).
Figura 6 . Localizzazione dei siti del monitoraggio fotografico nei quali è stata rilevata la presenza di individui con caratteristiche fenotipiche differenti dallo standard selvatico del lupo. Le aree cerchiate in viola rappresentano i nuclei riproduttivi identificati, mentre quella in arancio la presenza di una femmina gravida. I filmati in gruppo, per la classe lupo/ibrido, sono stati rilevati in 12 comprensori ( Figura 7 ) con un minimo di 2 animali associati ad un massimo di 7 (i valori più alti si sono avuti in presenza di cucciolate) e la percentuale di video con animali associati è del 36,7% (N=84) ( Tabella 4 ). 23 Figura 7. Distribuzione di lupi/ibridi filmati in relazione al grado di associazione. In due comprensori (Roselle/Marrucheti ed Oasi di Monte Leoni) è stata probabilmente filmata la stessa coppia di animali, riconoscibile perché formata da un maschio nero ed una femmina grigia. Probabilmente la stessa situazione si è verificata in altri comprensori adiacenti come Marsiliana e Polverosa dove un individuo privo di un arto posteriore è stato filmato in entrambe le aree.
In 6 comprensori (Baccinello, Catabbio, Montauto, Montioni, Oasi di M.te Leoni, Rocconi) è stato filmato il passaggio di cani in forma solitaria, non accompagnati da padrone. Escludendo razze da caccia in comportamento da caccia e cani da guardiania dell’azienda più vicina (Baccinello), i comprensori con cani filmati da soli si riducono a 2 (Montauto, Oasi Monte Leoni), ed in entrambi i comprensori si tratta di singoli individui e di piccola taglia.
24 lupi/ibridi Cani giorni riscontro N° comprensori n° siti attivazione giorni/ trappola anomalie individui cuccioli Presenza complessivi fenotipiche (min-max)
Abbandonato 3 153 51 si 1-3 - -
Amiata 4 198 50 - 1 - -
Baccinello 5 167 33 si 1-7 si Si
Belagaio 4 177 44 si 1-2 - -
Catabbio 1 29 29 - 1-2 - Si
Marsiliana 5 147 29 si 1-2 - Si
Montauto 2 167 84 si 1-3 si Si
Monte Bottigli 2 111 56 - 1-2 - -
Montioni 3 117 39 si 1-4 si Si
Oasi Monte Leoni 6 313 52 si 1-4 si Si
Penna-Elmo 3 165 55 - 1-3 - -
Poggio Ferro 1 41 41 - - - -
Polverosa 1 119 119 si 1 - -
Rocconi 2 112 56 - 1 - -
Roselle-Marrucheti 3 131 44 si 1-2 - - Tabella 4 . Tabella riassuntiva dell'attività di monitoraggio fotografico (30 giugno-31 ottobre) nella provincia di Grosseto. I giorni di attivazione complessivi sono dati dalla somma dei giorni delle diverse foto trappole attive durante la fase di monitoraggio, per singolo comprensorio. I giorni trappola sono dati dal numero di giorni complessivi diviso il numero di foto trappole appartenenti al medesimo comprensorio.
4.3. Campionamento genetico
4.3.1. Analisi campioni non invasivi
Il periodo di campionamento genetico si è protratto dal 23 luglio al 31 ottobre. Complessivamente sono stati raccolti 103 escrementi, con uno sforzo complessivo di circa 15.958 km percorsi sia a piedi che in macchina. Sono stati raccolti soltanto gli escrementi attribuibili a lupi/ibridi ritenuti idonei alle analisi genetiche in base alle caratteristiche di freschezza. Gli escrementi sono stati raccolti in 10 dei 13 comprensori in cui era stata divisa l’area di studio (Tabella 5 ; Figura 8 ). Nei comprensori di Monte Bottigli, Catabbio e Rocconi sono stati rinvenuti pochissimi segni di presenza di canidi vaganti e non è stato possibile nessun escremento idoneo per le analisi genetiche. Viceversa, nei comprensori dell'Abbandonato, Baccinello, Marsiliana, Monte Leoni, Montioni e Panna-Elmo, i segni di presenza di grandi canidi sono risultati essere molto 25 abbondanti; di conseguenza, in questi sei comprensori è stato possibile raccogliere un numero relativamente elevato di campioni non invasivi da utilizzare per le analisi genetiche.
Comprensorio Luglio Agosto Settembre Ottobre Totale Abbandonato 0 0 6 8 14 Amiata 0 0 2 1 3 Baccinello 1 5 3 10 19 Belagaio 0 1 1 1 3 Marsiliana 0 5 2 5 12 Montauto 0 0 2 0 2 Monte Leoni 0 3 7 5 15 Montioni 0 2 4 13 19 Penna-Elmo 0 1 3 6 10 Roselle- 0 0 5 0 5 Marrucheti Monte Bottigli 0 0 0 0 0 Catabbio 0 0 0 0 0 Rocconi 0 0 0 0 0 Pitigliano* 0 0 1 0 1 Totale 1 17 36 49 103 Tabella 5. Distribuzione degli escrementi ritrovati nei diversi comprensori (Luglio-Ottobre 2014). *Pitigliano non fa parte dei comprensori e l’escremento è stato raccolto in occasione di un sopralluogo in un’azienda zootecnica che aveva subito un evento predatorio.
Figura 8 . Localizzazione dei campioni utilizzati per le analisi genetiche (in rosso i campioni non invasivi, in blu i campioni invasivi). 26 La resa nella raccolta degli escrementi ha inoltre subito una variazione di tipo stagionale. Sono stati infatti raccolti un maggior numero di escrementi nel bimestre settembre-ottobre, rispetto mesi di luglio e agosto, probabilmente perché le condizioni climatiche ne hanno permesso una migliore conservazione in un maggior intervallo di tempo. In 16 casi (15,5%) la freschezza dei reperti biologici non invasivi rinvenuti è stata stimata di 0 giorni, in 43 casi (41,7%) di 1/2 giorni, in 25 (24,3%) di 3/4 giorni, in 11 (10,7%) di 5/7 giorni, mentre in 8 casi (7,8%) la deposizione era avvenuta più di una settimana prima ( Tabella 6 ).
N. Escremen- % Escre- Giorni dalla deposizione ti menti 0 16 16% 1-2 43 42% 3-4 25 24% 5-7 11 11% >7 8 8% Totale 103 100% Tabella 6. Campioni genetici non invasivi suddivisi in base alla freschezza valutata stimando i giorni trascorsi dalla deposizione al ritrovamento.
La resa complessiva delle analisi genetiche effettuate sui CNI è risultata decisamente elevata, se si considera che solamente 12 (11,6%) dei 103 campioni fecali inviati contenevano una quantità di DNA troppo esigua per poter essere analizzata. Per i restanti 91 campioni, nel 46,2% dei casi (N=42) è stato analizzato solamente il DNA mitocondriale mentre nel 53,8% dei casi (N=49) è stata effettuata l'analisi integrando più di un marcatore genetico.
.1 Analisi del DNA mitocondriale Attraverso l'analisi del DNA mitocondriale è stato sequenziato il DNA rinvenuto in 91 escrementi (88,4% del campione). La maggioranza dei CNI (83 campioni, 91,2%) presentava l'aplotipo W14, 2 campioni (GS_61 e GS_92) presentavano un aplotipo di origine canina e sono stati rinvenuti entrambi in località Baccinello, 4 CNI (GS_18, GS_21, GS_54, GS_66) un aplotipo di volpe e per tre CNI (GS_71, GS_76 e GS_83) il DNA è risultato contaminato dal DNA appartenente ad una specie predata (Cinghiale; Sus scrofa ) e non ha fornito risultati ( Tabella 7 ).
TIPOLOGIA DI Presenza Presenza Presenza Poco N Prede CAMPIONE aplotipo W14 aplotipo di volpe aplotipo di cane DNA CNI 103 83 4 2 11 3
Tabella 7. Risultati delle analisi del DNA mitocondriale per i campioni non invasivi.
27 .2 Analisi del DNA microsatellite Per 26 CNI (28,6% del campione) è stato possibile effettuare l'analisi del DNA microsatellite utilizzando un pannello di 16 loci. Nel caso in cui era stato riscontrato l'aplotipo tipico del cane, l'analisi del DNA microsatellite, che è stata effettuata solamente per il campione GS_092, ha confermato l'appartenenza genetica di questo animale. Per i restanti 25 CNI, per i quali l'analisi del DNA mitocondriale aveva rilevato la presenza dell'aplotipo W14, si è proceduto all'analisi del DNA microsatellite utilizzando due soglie pari rispettivamente a qi≥0.95 e a qi>0.975 per determinare l'attribuzione degli individui campionati alla popolazione di lupi o di ibridi.
Utilizzando come soglia per l'attribuzione degli individui campionati alla popolazione di lupi il valore generalmente usato in statistica qi≥0.95, è risultato che 7 CNI, che corrispondono al 28% dei campioni analizzati per il DNA microsatellite, non possono essere attribuiti alla popolazione di lupi italiani. Considerando invece come valore soglia qi>0.975, che costituisce un valore arbitrario al pari di qi≥0.95 ma consente di includere nella categoria di possibili ibridi anche animali con valore compreso tra 0.95 ≤qi <0.975, riducendo la probabilità di incorrere in errori di tipo II (ovvero non riconoscere un ibrido come tale; Allendorf et al. 2001), il numero di campioni che non possono essere attribuiti alla popolazione italiana di lupi aumenta di un solo individuo (N=8, 32%; Tabella 8).
LOCALITA' DI STRUCTURE 16 loci STRUCTURE 16 loci CAMPIONE RACCOLTA SOGLIA q i≥0.95 SOGLIA qi>0.975
GS_24 MONTIONI 0,474
GS_25 MONTIONI 0,707
GS_27 MONTIONI 0,661
GS_57 MONTE LEONI 0,765
GS_69 ABBANDONATO 0,688
GS_80 MONTIONI 0,628
GS_102 ABBANDONATO 0,537
GS_65 BACCINELLO 0,958
Tabella 8. CNI con un valore rispettivamente pari a q<0.95 e q<0.95 rilevati tramite il programma STRUCTURE utilizzando un pannello di 16 loci. Dalle analisi del DNA microsatellite di 83 CNI è stato possibile complessivamente determinare il genotipo di 37 CNI, che corrispondono a 29 individui distinti campionati, incluso un cane (GS_092). Uno degli individui campionati (GS_22) era già stato campionato durante la valutazione ex ante della presenza di canidi vaganti (EPI_63, Azione A3). Inoltre per sette campioni, compreso 28 un cane (GS_61), non è stato possibile determinare con certezza il genotipo a causa di una elevata contaminazione del DNA. Il sesso è stato identificato in 38 individui evidenziando un rapporto sessi pari a 20 femmine e 18 maschi.
.3 Analisi dei loci microsatellite sul cromosoma Y Per 12 CNI, corrispondenti a 9 individui diversi, è stato possibile analizzare i loci microsatellite associati presenti sul cromosoma Y. La maggior parte degli individui (N=7) presentava l'aplotipo WY1, un esemplare presentava l'aplotipo WY2 ed un solo individuo (GS_02) presentava l'aplotipo tipico del cane DY2.
.4 Analisi del locus K L'analisi del locus K è stata effettuata su 48 CNI corrispondenti a 32 individui diversi. L'allele
B mutato corrispondente alla colorazione nera del pelo (K ) è stato trovato in 3 individui (6,25% del campione). Tra questi, solo un campione (GS_02) presentava sia l'allele K mutato che l'aplotipo Y caratteristico del cane. Analizzando tutti gli individui diversi, escluso l'esemplare di cane (GS_092), per i quali è stato possibile caratterizzare il genotipo (N=28) e considerando il valore soglia qi≥0.95, è risultato che 9 esemplari campionati (32,1%) presentavano almeno una evidenza genetica di ibridazione, e questo valore incrementa leggermente se viene considerata una soglia pari a qi>0.975 (N=10, 35,7%) (Tabella 9 ; Figura 9 ). Di questi, solamente 2 esemplari, GS_02 e GS_102, corrispondenti al 22,2% del campione di introgressi, mostravano evidenze genetiche di ibridazione contemporaneamente rilevabili in più di un marcatore genetico per entrambe le soglie considerate.
29 LOCALITA' DI STRUCTURE 16 loci STRUCTURE 16 loci CAMPIONE LOCUS K CROM Y RACCOLTA SOGLIA q i≥0.95 SOGLIA qi>0.975
GS_24 MONTIONI 0,474
GS_25 MONTIONI 0,707
GS_27 MONTIONI 0,661
GS_57 MONTE LEONI 0,765
GS_69 ABBANDONATO 0,688
GS_80 MONTIONI 0,628
B GS_102 ABBANDONATO 0,537 K
GS_065 BACCINELLO 0,958
B GS_40 ROSELLE K
MONTE LEONI B GS_02 K DY2
Tabella 9. Elenco degli individui assegnati alla classe di ibridi e dettaglio delle analisi in base alle quali è stata determinata tale assegnazione (valore soglia nei test di assegnazione per l'analisi del DNA microsatellite rispettivamente pari a qi≥0.95 e a qi>0.975). In base all'algoritmo ANCESTRY (vedi§3.2.3) nessun esemplare ibrido campionato può essere riconducibile ad un incrocio di prima generazione.
30 Figura 9 . Localizzazione dei campioni assegnati alla classe di ibridi (valore soglia nei test di assegnazione per l'analisi del DNA microsatellite pari a qi>0.975).
4.3.2. Analisi campioni invasivi
Contestualmente alla raccolta di campioni genetici non invasivi lungo i circuiti, si è proceduto alla raccolta opportunistica di campioni invasivi. Si fa presente che quasi tutti i campioni invasivi sono stati raccolti in periodi diversi dallo svolgimento della valutazione ex post della presenza di canidi vaganti e in aree spesso al di fuori di quelle interessate dal monitoraggio (es. aree nella Provincia di Siena). Pertanto l'analisi di questi campioni non può essere utilizzata per estrapolare una stima quantitativa del numero di esemplari di lupi ed ibridi attualmente presenti nella provincia di Grosseto, ma si rivela un dato estremamente utile per la identificazione geografica delle aree maggiormente interessate dal fenomeno di ibridazione e per estrapolare dati relativi alla percentuale di esemplari ibridi in un campione della popolazione di lupi a scala locale. Inoltre, l'analisi di campioni invasivi relativi a lupi ed ibridi presenti nell'area di studio ha consentito di incrementare il campione genetico di riferimento delle due popolazioni e rendere in questo modo più accurato il test di assegnazione, in particolare per l'analisi del DNA microsatellite, sia per l'analisi dei campioni invasivi che dei campioni non invasivi. Complessivamente sono stati raccolti 35 campioni invasivi (CI) nei territori della Provincia di Grosseto e di Siena, appartenenti ad animali deceduti o ad animali catturati durante le attività di
31 cattura del Progetto Ibriwolf, nel periodo compreso tra settembre 2011 ed ottobre 2014 ( Figura 10 ).
Figura 10. Distribuzione dei campioni genetici invasivi. Le localizzazioni sulla mappa si riferiscono alla località del sito di rinvenimento della carcassa oppure al sito in cui è stato catturato l'animale.
Integrando tra loro i risultati ottenuti dai due laboratori di riferimento (ISPRA e CIBIO), la resa delle analisi effettuate sui CI è risultata pari al 100% (N=35) per l'analisi del DNA mitocondriale e pari al 88,6% (N=31) per l'analisi del DNA microsatellite. Gli unici quattro campioni per i quali non è stato possibile effettuare l'analisi del DNA microsatellite sono CAPI_38, che apparteneva ad un animale rinvenuto in località Baccinello in avanzato stato di decomposizione, CAPI_54 che corrisponde ad un campione di pelo rinvenuto nella stessa località, CAPI_56 che apparteneva ad un animale rinvenuto ucciso a Montalcino, in Provincia di Siena, e CAPI_37 che dall'analisi del DNA mitocondriale è risultato appartenere ad un cane ( Tabella 10 ). Nel caso dei CI CAPI_37, CAPI_38 e CAPI_54 manca inoltre il dato fenotipico, mentre CAPI_56 non presentava nessuna evidenza fenotipica di ibridazione. Per 31 campioni è stato inoltre possibile integrare l'analisi del DNA mitocondriale e l'analisi del DNA microsatellite con almeno un altro marcatore genetico (analisi del locus K e/o analisi dei loci microsatellite sul cromosoma Y).
32 .1 Analisi del DNA mitocondriale Attraverso l'analisi del DNA mitocondriale è emerso che tutti gli animali campionati presentavano l'aplotipo tipico del lupo (W14) con la sola esclusione del campione CAPI_37 che presentava invece l'apltotipo tipico del cane ( Tabella 10 ).
TIPOLOGIA DI Poco N Presenza aplotipo W14 Presenza aplotipo di cane Prede CAMPIONE DNA CI 35 34 1 0 0
Tabella 10. Risultati delle analisi del DNA mitocondriale per i campioni invasivi.
.2 Analisi del DNA microsatellite Per 31 CI è stato possibile effettuare l'analisi del DNA microsatellite, utilizzando solamente un pannello di 39 loci (N=3 CI), oppure integrando tra di loro il risultato ottenuto utilizzando pannelli di 16 e 50 loci (N=1 CI), pannelli di 12, 16 e 50 loci (N=2 CI), e pannelli di 16, 39 e 50 loci (N=25 CI).
Anche nel caso dei CI, sono stati utilizzati due valori soglia ( qi≥0.95 e qi>0.975) per attribuire gli animali campionati alla popolazione di lupi o di ibridi. Nessuno dei 31 animali campionati (12 femmine e 19 maschi) era stato precedentemente campionato nel corso della ex ante, né catturato durante le attività di cattura precedente ad ottobre 2013, né identificato tra i genotipi individuati mediante l'analisi dei campioni non invasivi (vedi§3.3.1).
Utilizzando come soglia per l'attribuzione degli individui campionati alla popolazione di lupi il valore qi≥0.95, è risultato che 7 CI, che corrispondono al 22,6% dei campioni analizzati per il DNA microsatellite, non possono essere attribuiti alla popolazione di lupi italiani. Considerando invece come valore soglia qi>0.975, il numero di campioni che non possono essere attribuiti alla popolazione italiana di lupi aumenta sensibilmente (N=13, 41,9%; Tabella 11 ).
33 CAMPIONE LOCALITA' DI RACCOLTA SOGLIA q i≥0.95 SOGLIA qi>0.975 CAPI_19 POLVEROSA 0,648
CAPI_20 POLVEROSA 0,516
CAPI_22 ROSELLE 0,895
CAPI_31 MARRUCHETI 0,931
CAPI_41 CHIUSDINO, PROV SI 0,897
CAPI_44 CHIUSDINO, PROV SI 0,938
CAPI_45 CHIUSDINO, PROV SI 0,939
CAPI_28 AMIATA 0,966
CAPI_34 BAGNAIA, PROV SI 0,975
CAPI_42 CHIUSDINO, PROV SI 0,966
CAPI_46 CHIUSDINO, PROV SI 0,969
CAPI_48 CHIUSDINO, PROV SI 0,95
CAPI_55 SOVICILLE, PROV SI 0,968
Tabella 11. Campioni invasivi con un valore rispettivamente pari a q<0.95 e q<0.975 rilevati tramite il programma STRUCTURE utilizzando un pannello di 39 loci (N=3 CI), oppure integrando tra di loro il risultato ottenuto utilizzando pannelli di 16 e 50 loci (N=2 CI), pannelli di 12, 16 e 50 loci (N=2 CI), e pannelli di 16, 39 e 50 loci (25). Per ogni campione viene riportato solamente il valore di q più basso.
Per una corretta lettura dei risultati va comunque tenuto conto che 6, dei 13 individui risultati ibridi in base all'analisi del DNA microsatellite utilizzando una soglia pari a qi>0.975, sono fratelli e appartengono ad una cucciolata composta da 10 esemplari.
.3 Analisi dei loci microsatellite sul cromosoma Y Per tutti i 19 maschi campionati è stato possibile analizzare i loci microsatellite associati presenti sul cromosoma Y. 10 individui presentavano l'aplotipo WY1 mentre 9 individui presentavano l'aplotipo tipico del cane (DY2).
.4 Analisi del locus K L'analisi del locus K è stata effettuata su 30 CI (85,7% del campione) e l'allele mutato
B corrispondente alla colorazione nera del pelo (K ) è stato trovato in 8 individui (26,6% del campione). Cinque campioni presentavano sia l'allele K mutato che l'aplotipo Y caratteristico del cane.
34 Analizzando tutti gli individui per i quali è stato possibile effettuare l'analisi del DNA microsatellite e che possedevano l'aplotipo W14 (N=30), e considerando il valore soglia qi≥0.95, è risultato che 14 esemplari campionati (46,6%) presentavano almeno una evidenza genetiche di ibridazione, e questo valore incrementa di tre individui (CAPI_28, CAPI_34 e CAPI_42) se viene considerata una soglia pari a qi>0.975 (N=17, 56,7%). Di questi individui, quasi la metà (N=6 per una soglia pari a qi≥0.95 ed N=9 per una soglia pari a qi>0.975, corrispondenti rispettivamente al 42,8% ed al 52,9% del campione) mostravano evidenze genetiche di ibridazione contemporaneamente rilevabili in più di un marcatore genetico ( Tabella 12 ).
LOCALITA' DI SOGLIA SOGLIA LOCUS CAMPIONE CROM Y RACCOLTA qi≥0.95 qi>0.975 K CAPI_19 POLVEROSA 0,648
CAPI_31 MARRUCHETI 0,931
CAPI_45 CHIUSDINO, PROV SI 0,939
B CAPI_33 BAGNAIA, PROV SI K
CAPI_43 CHIUSDINO, PROV SI DY2
CAPI_28 AMIATA 0,966
CAPI_34 BAGNAIA, PROV SI 0,975
CAPI_42 CHIUSDINO, PROV SI 0,966
B CAPI_55 SOVICILLE, PROV SI 0,968 K
CAPI_20 POLVEROSA 0,516 DY2
CAPI_22 ROSELLE 0,895 DY2
CAPI_44 CHIUSDINO, PROV SI 0,938 DY2
B CAPI_26 MARRUCHETI K DY2
B CAPI_49 CHIUSDINO, PROV SI K DY2
B CAPI_41 CHIUSDINO, PROV SI 0,897 K DY2
B CAPI_46 CHIUSDINO, PROV SI 0,969 K DY2
B CAPI_48 CHIUSDINO, PROV SI 0,95 K DY2
Tabella 12. Elenco degli individui assegnati alla classe di ibridi e dettaglio delle analisi in base alle quali è stata determinata tale assegnazione (valore soglia nei test di assegnazione per l'analisi del DNA microsatellite rispettivamente pari a qi≥0.95 e a qi>0.975). In base all'algoritmo ANCESTRY (vedi§3.2.3) nessun esemplare ibrido campionato può essere riconducibile ad un incrocio di prima generazione. 35 Tutti gli animali campionati, che presentavano almeno una evidenza genetica di ibridazione in base alla soglia di attribuzione pari a qi≥0.95, mostravano anche evidenze fenotipiche anomale rispetto allo standard selvatico del lupo. Lo stesso risultato invece non è così evidente per i tre esemplari risultati ibridi solamente in base alla soglia di attribuzione di qi>0.975. In questo caso, infatti, è possibile trovare una correlazione tra dato genetico e dato fenotipico solamente per l'esemplare CAPI_42, che tra l'altro faceva parte di una cucciolata di 10 animali in cui 8 animali sono risultati geneticamente ibridi. L'esemplare CAPI_34, viceversa, non mostrava nessuna evidenza fenotipica anomala rispetto allo standard selvatico e per l'esemplare CAPI_28 non sono purtroppo disponibili informazioni di tipo fenotipico che possano confermare il dato genetico. D'altra parte 5 animali (16% del campione analizzato), corrispondenti ai campioni CAPI_30, CAPI_35 ( Figura 11 ), CAPI_47, CAPI_50 e CAPI_53, pur presentando caratteristiche fenotipiche anomale rispetto allo standard del lupo, non hanno rilevato nessuna evidenza genetica di ibridazione, sebbene due di questi animali (CAPI_47 e CAPI_50) facevano parte di una cucciolata in cui 8 animali sono risultati geneticamente ibridi ( Figura 12 ).
Figura 11. Esemplari corrispondenti ai campione CAPI_35 (a sinistra) e CAPI_35 (a destra). L'esemplare CAPI_35 presentava una colorazione ed una lunghezza del pelo anomali mentre l'esemplare CAPI_53 presentava le unghie depigmentate.
36 Figura 12. Esemplari della cucciolata di ibridi. Da sinistra CAPI_47, CAPI_48, CAPI_50. Gli esemplari CAPI_47 e CAPI_50 presentano delle macchie di pelo bianco sotto al collo .
4.4. Risultati finali ottenuti dalla integrazione delle tre tecniche
La presenza di canidi vaganti (ibridi o lupi) è risultata essere estesa nel territorio provinciale ed è stata rilevata in 14 dei 15 comprensori sottoposti alla valutazione ex post (93,3% dell'area campionata; Tabella 4 ). In uno solo dei comprensori sottoposti al monitoraggio (Poggio Ferro, nel comune di Scansano) non è stato possibile riscontrare segni indiretti di presenza (escrementi e foto) di grandi canidi, mentre nei comprensori Penna/Elmo (nel comune di Sorano) ed Amiata, sebbene sia stata confermata la presenza solamente di pochi individui, sono stati rilevati segni di presenza riconducibili unicamente a lupi, dal momento in cui non è stata rilevata nessuna evidenza genetica e fenotipica di ibridazione durante la valutazione ex post. A tale proposito va fatto presente che, nel comprensorio Penna/Elmo, era stato catturato un esemplare femmina di lupo durante la nona sessione di cattura (dicembre 2013) che non presentava nessuna caratteristica fenotipica anomala e nessuna evidenza genetica di ibridazione (Braschi et al., 2014). Per quanto riguarda invece l'area dell'Amiata, l'unico dato disponibile di evidenza genetica di ibridazione nella zona è il rinvenimento, in un periodo antecedente alla implementazione della valutazione ex post (luglio 2013), della carcassa di una lupa in località San Salvatore risultata ibrida in base all'analisi del DNA microsatellite per una soglia pari a qi>0.975 ( Tabella 11 e 12 ) .
Una presenza sporadica di canidi vaganti è stata rilevata anche nei comprensori di Monte Bottigli (comune di Magliano in Toscana), Catabbio (comune di Semproniano) e Rocconi (comune di Manciano), dove, tra l’altro, non sono state osservate negli animali ripresi con le fototrappole, 37 caratteristiche fenotipiche anomale rispetto allo standard selvatico del lupo. Purtroppo, l'assenza di escrementi reperiti in tali aree non consente di avvalorare questa informazione con il dato genetico.
Anche nel comprensorio di Roselle/Marrucheti è stata confermata la presenza di pochi canidi vaganti, ma nonostante il numero esiguo di animali fotografati e campionati con la genetica non invasiva, sono state rilevate sia evidenze fenotipiche che genetiche di ibridazione. Tra l'altro, nell'area in questione, erano state rinvenute, durante il periodo precedente allo svolgimento della valutazione ex post, le carcasse di 4 canidi uccisi e 3 di questi presentavano una evidenza genetica di ibridazione per almeno un marcatore ( Tabella 11 e 12 ).
All'interno dell'area del PRM, infine, risulta non esserci una presenza stabile di canidi vaganti, sebbene il dato relativo a tale area sia parzialmente incompleto essendo questa zona stata sottoposta unicamente al monitoraggio con wolf-howling .
Evidenze fenotipiche di ibridazione sono state riscontrate in gran parte dell'area sottoposta al monitoraggio fotografico, e precisamente nei comprensori a nord ovest della Provincia di Grosseto (Montioni), nord est (Belagaio), nell'area centro-orientale (Monte Leoni, Roselle/Marrucheti, Abbandonato e Baccinello) e nell'area meridionale (Polverosa, Marsiliana e Montauto). Nelle aree nord-occidentale e centro-orientale della Provincia di Grosseto, le analisi genetiche effettuate sui campioni non invasivi hanno confermato il dato fenotipico (Tabella 10), mentre nell'area a nord est (Belagaio) e nell'area meridionale della Provincia di Grossseto (Polverosa, Marsiliana e Montauto) non è stata rilevata nessuna evidenza genetica di ibridazione ed è stata riscontrata una presenza relativamente esigua di canidi selvatici. Tuttavia, nell'area della Polverosa, i risultati delle analisi genetiche effettuate su due esemplari giovani di canide catturati e rilasciati in natura nel corso della settima sessione di cattura (Braschi et al., 2014) avevano confermato la presenza di evidenze di ibridazione in questa area, già rilevate, tra l'altro, durante il monitoraggio fotografico finalizzato alle attività di cattura e durante il monitoraggio ex ante (Manghi et al. 2012; Figura 13 ).
38 Figura 13 . Localizzazione dei genotipi individuati attraverso l’analisi dei campioni genetici non invasivi e di quelli prelevati in occasione delle catture. Progetto Life Ibriwolf 2014.
Le analisi genetiche effettuate sui campioni non invasivi hanno avuto una resa leggermente superiore rispetto a quanto riscontrato durante la ex ante (Braschi & Boitani, 2013), e dai 103 campioni per i quali è stato possibile analizzare il DNA microsatellite è stata rilevata la presenza di 28 individui diversi (lupi ed ibridi) ed un cane. La percentuale di individui ibridi, tra quelli campionati in maniera non invasiva, è risultata essere pari rispettivamente al 32,1% o al 35,7% del campione analizzato in base alla soglia di attribuzione che viene utilizzata (vedi§4.3.1). Tale risultato è confrontabile con quanto rilevato durante l'indagine ex ante della presenza di ibridi lupo- cane e cani vaganti, in cui la percentuale di esemplari ibridi nella popolazione campionata risultava essere pari rispettivamente al 29,8% e al 35,1% a seconda della soglia che veniva utilizzata (Braschi & Boitani, 2013). Le analisi genetiche effettuate sui campioni non invasivi sembrerebbero rilevare che, all'interno della popolazione campionata tramite campionamento non invasivo, siano presenti principalmente esemplari ibridi di generazione successiva alla seconda. Nell'area interessata dalla indagine ex post è stata rilevata la presenza di almeno 5 nuclei riproduttivi, come confermato dalla presenza di cuccioli nei comprensori di Montioni, Monte Leoni, Baccinello e Montauto; Figura 14 ) e di una femmina gravida in località Abbandonato, fotografata durante la sessione di cattura dodici-bis (Braschi et al., 2014; Figura 14 ).
39 Figura 14 . Localizzazione dei nuclei riproduttivi (aree evidenziate dai cerchi) identificati con le tecniche dell’ululato indotto e del monitoraggio fotografico. Progetto Life Ibriwolf 2014.
In 4 nuclei riproduttivi (Montioni, Monte Leoni, Abbandonato e Baccinello) sia i cuccioli che gli adulti del branco, inclusa la femmina gravida, presentavano caratteristiche fenotipiche anomale rispetto allo standard selvatico del lupo, e le analisi genetiche effettuate sui campioni non invasivi hanno rilevato la presenza di evidenze genetiche di ibridazione in queste aree. Nel branco in località Montauto (area meridionale della Provincia di Grosseto) sono state invece rilevate evidenze fenotipiche di ibridazione, ma il dato non è stato confermato dai risultati delle analisi genetiche realizzate sui campioni non invasivi. I 5 nuclei riproduttivi individuati corrispondono alle aree in cui è stato osservato il maggior numero di animali associati tra loro, dato che i cuccioli sono stati spesso filmati insieme. A differenza di quanto riscontrato per lupi ed ibridi, la presenza di cani vaganti nel territorio è risultata essere relativamente ridotta. Sebbene infatti la presenza di cani non accompagnati dal padrone sia stata rilevata in 6 dei 15 comprensori sottoposti al monitoraggio fotografico ( Tabella 4 ), si tratta principalmente di cani semi padronali o cani da caccia. Escludendo cani chiaramente di razza da caccia fotografati durante la stagione venatoria, e cani da guardiania appartenenti ai proprietari delle aziende vicine alla localizzazione delle trappole fotografiche, i comprensori con cani filmati da soli si riducono a 2 (Montauto, Oasi Monte Leoni), ed in entrambi i comprensori si tratta di individui singoli e di piccola taglia. Anche le analisi genetiche, realizzate sui campioni non invasivi, rilevano una presenza relativamente esigua di cani nel territorio provinciale (3,4% su un 40 campione di 29 esemplari diversi campionati), localizzata nel comprensorio di Baccinello. Va comunque tenuto presente che gli escrementi sono stati raccolti solamente nelle aree montane e boschive, distanti dai centri abitati, e le trappole fotografiche sono state posizionate in modo da massimizzare la probabilità di catturare lupi/ibridi, con scarso riguardo al successo di cattura di cani che si muovono più frequentemente nei pressi delle abitazioni attraversando campi coltivati piuttosto che lungo i sentieri abitualmente frequentati dai lupi/ibridi con cui non condividono l’esigenza di doversi nascondere. Pertanto il numero di cani effettivamente campionati nel corso della valutazione ex post è da ritenersi una severa sottostima del numero di cani vaganti realmente presenti sul territorio. I cani campionati, inoltre, non sembrano essere associati a lupi ed ibridi, come rivelano le foto ed i filmati realizzati in cui nessun cane è mai stato visto associato ad un canide selvatico.
Integrando le conoscenze acquisite durate l’ex post con quelle accumulate nel corso di tutto il progetto, la presenza degli ibridi, così come quantificata dai dati genetici (CI, raccolti durante le catture e ritrovamenti di individui morti, e CNI) e dai dati ottenuti con le fototrappole, appare maggiormente concentrata nei comprensori di Montioni, Oasi Monte Leoni, Abbandonato e Baccinello ed in misura inferiore nell'area dell'Amiata e alla Polverosa. I quattro siti in cui la presenza di canidi vaganti risulta essere più consistente, corrispondono a quelli di 4 dei 5 branchi individuati durante la ex post ( Figura 15) .
41 Figura 15. Localizzazioni delle evidenze genetiche e fenotipiche rilevate durante il Progetto Life Ibriwolf. Le prime sono state ottenute dall’analisi dei CNI e CI collezionati nel corso dell’intera durata del Progetto (2012-2014), mentre le seconde sulla base delle informazioni raccolte con il monitoraggio fotografico effettuato nell’ambito dell’Azione E2 (luglio-ottobre 2014).
42 5. DISCUSSIONE
I risultati ottenuti durante la valutazione ex post della presenza di ibridi rivelano un quadro particolarmente critico, in cui il fenomeno della ibridazione cane lupo risulta essere decisamente diffuso nel territorio provinciale e nelle aree a questo limitrofe (in particolare nei territori delle provincie di Siena e Livorno). Soprattutto, il dato preoccupante che emerge dallo studio condotto nel 2014, è la presenza di almeno 4 nuclei riproduttivi caratterizzati sia dalla esistenza di evidenze genetiche che fenotipiche di ibridazione, ed un quinto branco in cui gli esemplari, sebbene non siano state rilevate evidenze genetiche di ibridazione, presentavano caratteristiche fenotipiche anomale rispetto allo standard selvatico del lupo. Tale dato porta a supporre che il fenomeno della ibridazione cane lupo potrebbe ulteriormente espandersi spazialmente nei prossimi anni, non appena i cuccioli si sposteranno in altri territori per costituire nuovi branchi.
Le aree maggiormente critiche, in base alle frequenze di eventi di ibridazione genetica e fenotipica rilevati durante la valutazione ex post, risultano essere il comprensorio di Montioni, al confine con la Provincia di Livorno, e le aree centro-settentrionali della Provincia di Grosseto (Monte Leoni, Roselle/Marrucheti, Abbandonato e Baccinello). Questo dato risulta corrispondente con quanto osservato durante la valutazione ex ante per i comprensori di Montioni, Monte Leoni, Abbandonato e Roselle/Marrucheti, nei quali erano state rilevate evidenze fenotipiche e genetiche di ibridazione (Manghi et al., 2012, Braschi & Boitani 2013), e per l'area di Roselle/Marrucheti trova inoltre conferma nei risultati delle analisi genetiche effettuate sui campioni invasivi ( Tabella 11 e 12 ). Il risultato ottenuto con la valutazione ex post si discosta invece nettamente per il comprensorio di Baccinello, nel quale, durante la ex ante, erano state rilevate solamente dubbie evidenze fenotipiche di ibridazione e nessuna conferma genetica di ibridazione. Viceversa, i dati ottenuti durante la ex ante avevano individuato nei comprensori meridionali della Provincia di Grosseto (in particolare Polverosa e Marsiliana) un potenziale focolaio di ibridazione, mentre i risultati ottenuti durante la valutazione ex post non consentono di rilevare in tale area una particolare criticità. L'unico elemento che sembra supportare l'esistenza di esemplari ibridi nell'area della Polverosa e della Marsiliana, in un periodo successivo alla realizzazione della valutazione ex ante, è la cattura e successivo rilascio in natura di due canidi selvatici avvenuta nel corso della settima sessione di cattura, animali risultati ibridi di generazione successiva alla seconda in base alle analisi genetiche effettuate su campioni invasivi (Braschi et al., 2014). Tuttavia, essendo il rilascio di questi animali avvenuto ad ottobre 2013, e non avendo più ottenuto conferme relativamente alla localizzazione recente di questi animali, né dai segnali dei collari GPS che gli erano stati apposti, né dal rinvenimento di evidenze di presenza indiretta (escrementi e foto), non è possibile assumere che gli animali siano ancora presenti nello stesso sito in cui erano stati catturati. Inoltre, va tenuto presente 43 che i due canidi, componenti di una stessa cucciolata e di circa 5 mesi di età al momento della cattura, potrebbero essersi dispersi verso altri territori. Tenuto conto di tali considerazioni, è possibile supporre che eventuali esemplari ibridi, se effettivamente ancora presenti nell'area meridionale della Provincia di Grosseto, siano al momento molto ridotti numericamente rispetto agli anni passati.
Nell'area dell'Amiata e nel Parco Naturale della Maremma, aree considerate prioritarie dal Progetto Ibriwolf e in cui, negli anni immediatamente precedenti alla implementazione del progetto, era stata rilevata la presenza di esemplari ibridi, sembrano costituire attualmente delle aree marginali, in cui la criticità della problematica della ibridazione cane lupo non è al momento particolarmente rilevante. La totale assenza di evidenze genetiche e fenotipiche di ibridazione in queste due aree, rivelate durante la valutazione ex post, e la presenza decisamente esigua di canidi vaganti registrata tramite il monitoraggio fotografico, erano già state riscontrate durante la valutazione ex ante che si è svolta all'inizio del 2012. Tale informazione non costituisce pertanto un dato inatteso e lascia supporre che i due nuclei ibridi presenti fino a pochi anni prima della realizzazione del Progetto nell'area dell'Amiata e nel Parco Naturale della Maremma, si siano spostati in altre zone della provincia di Grosseto e nei territori a questa limitrofi. D'altra parte, il rinvenimento di almeno tre carcasse di esemplari ibridi nel territorio della Provincia di Siena ( Tabella 11 e 12 ) e la rimozione di una intera cucciolata di 10 ibridi, così come il rilevamento di un branco ibrido al confine con la Provincia di Livorno, rendono evidente come la problematica della ibridazione cane-lupo non sia un fenomeno localizzato ma esteso geograficamente, e non possa pertanto essere gestito unicamente a livello locale.
Per una corretta interpretazione dei risultati, va fatto presente che la raccolta dei campioni non invasivi nelle aree sottoposte alla valutazione ex post non è stata omogenea e in tre comprensori (Monte Bottigli, Catabbio e Rocconi), oltre al Parco Naturale della Maremma, non è stato possibile reperire nessun escremento da poter sottoporre alle analisi genetiche. La scarsa reperibilità di campioni non invasivi, sebbene possa essere condizionata da fattori ambientali e comportamentali degli animali, costituisce sicuramente un indice di presenza dei canidi vaganti nel territorio e porta a supporre che le zone in cui i segni di presenza sono risultati essere più abbondanti (Abbandonato, Baccinello, Marsiliana, Monte Leoni, Montioni e Penna/Elmo) corrispondono ad aree di maggiore frequentazione da parte dei canidi selvatici, ed occupate stabilmente da questi. Viceversa i tre comprensori in cui non è stato possibile reperire alcun escremento (Monte Bottigli, Catabbio e Rocconi) costituiscono aree interessate unicamente da sporadici passaggi di esemplari solitari. D'altra parte va tenuto conto del fatto che il numero ridotto di escrementi raccolti in altri comprensori (Amiata, Belagaio, Montauto e Roselle/Marrucheti) potrebbe non essere
44 necessariamente un indice di scarsa presenza di canidi selvatici negli stessi, come suggerito dal monitoraggio fotografico, ma la conseguenza del campionamento di zone marginali rispetto al territorio frequentato regolarmente dai branchi in questione.
Per quanto riguarda la presenza di cani, i dati ottenuti durante la valutazione ex post rivelano una presenza ridotta di questi animali nelle aree di frequentazione di lupi ed ibridi, e nessuna delle foto e dei video realizzati ritrae questi animali associati con canidi selvatici (lupi e ibridi). Premesso che la consistenza di cani rivelata durante la valutazione ex post debba intendersi come una severa sottostima del numero di cani vaganti realmente presenti sul territorio (vedi§4.2), e supponendo che le associazioni tra cani ed ibridi/lupi siano solamente temporanee ed occorrano prevalentemente durante la stagione riproduttiva, periodo antecedente a quello in cui è stato condotto il campionamento ex post, va tuttavia notato che questo dato si discosta da quanto rilevato durante la ex ante, nel corso della quale era stata osservata una presenza relativamente consistente di cani nell'area dell' Amiata e nell'area a sud della Provincia di Grosseto, nel comprensorio di Montauto. A tale proposito va fatto comunque presente che nell'area di Montauto era localizzata una discarica, successivamente chiusa nell'anno 2013, frequentata spesso da cani, in particolare nelle ore notturne, e che 7 di questi cani erano stati rimossi dall'area nel 2012 nell'ambito delle attività di cattura svolte dal personale della Provincia di Grosseto (azione C4 del progetto Ibriwolf). Pertanto, almeno per quanto riguarda l'area di Montauto, è possibile aspettarsi che il nucleo di cani che erano presenti nell'area non ci sia più.
I dati ottenuti con l'analisi dei campioni invasivi e non invasivi consentono di trarre alcune considerazioni in merito ai limiti delle analisi genetiche e all'importanza che il dato genetico venga integrato con le informazioni relative al fenotipo dell'animale, al fine di massimizzare le informazioni che è possibile ottenere sul campo. E' interessante notare come, nella maggior parte dei casi, le evidenze fenotipiche di ibridazione riscontrate tramite il monitoraggio fotografico e/o dall'osservazione diretta delle carcasse di esemplari morti, vengano confermate dai dati ottenuti tramite le analisi genetiche di campioni invasivi (tutti gli animali campionati, che presentavano almeno una evidenza genetica di ibridazione in base alla soglia di attribuzione qi≥0.95, mostravano anche evidenze fenotipiche anomale rispetto allo standard selvatico del lupo), e non invasivi (in tutti i comprensori in cui è stata rilevata una evidenza genetica di ibridazione, questa era associata ad una evidenza fenotipica di ibridazione). Tuttavia, come già rilevato durante la valutazione ex ante, le tecniche genetiche attualmente disponibili non consentono di rilevare tutti gli eventi di ibridazione, soprattutto se questi sono avvenuti in tempi non recenti nel passato dell'animale e/o se viene utilizzato un numero ridotto di marcatori genetici (Braschi & Boitani, 2013). Di conseguenza, non stupisce che si riscontrino situazioni in cui le evidenze fenotipiche rilevate tramite il
45 monitoraggio fotografico non vengono confermate dall'analisi genetica di campioni non invasivi (comprensori del Belagaio e di Montauto), o che il riscontro di caratteristiche fenotipiche anomale nelle carcasse di canidi selvatici non trovi corrispondenza con il dato genetico (5 esemplari dei 31 campionati, pur presentando caratteristiche fenotipiche anomale rispetto allo standard del lupo, non hanno rilevato nessuna evidenza genetica di ibridazione). Inoltre, fa riflettere il fatto che due degli animali campionati tramite campionamento invasivo non solo presentavano caratteristiche fenotipiche anomale, ma facevano anche parte di una cucciolata di 10 animali, in cui 8 sono risultati essere geneticamente ibridi e 2 invece non hanno rilevato nessuna evidenza genetica di ibridazione. E' evidente come questo risultato avvalori la necessità che, al fine di incrementare la valenza diagnostica degli attuali strumenti di indagine per il rilevamento di esemplari ibridi, il dato genetico venga integrato con il dato fenotipico dell'animale. Sebbene infatti la identificazioni delle caratteristiche fenotipiche di un esemplare debba contemplare la possibilità che alcune difformità dallo standard selvatico possano far parte della normale variabilità intrinseca alle specie, costituisce tuttavia un utile strumento diagnostico per la caratterizzazione di evidenze fenotipiche tipiche dell'esemplare ibrido e pertanto facilmente diagnosticabili sul campo ed in tempi sicuramente più rapidi rispetto a quelli richiesti per lo svolgimento delle analisi genetiche, e di conseguenza utilizzabili come primo elemento di riconoscimento e “classificazione” (lupo o ibrido) dell'animale campionato. Viceversa, il confronto tra dato genetico e fenotipico, può contribuire a identificare sul lungo termine quei caratteri genetici che determinano la comparsa di determinate caratteristiche fenotipiche (così come la delezione del locus K influisce sulla colorazione del mantello degli animali), e di selezionare i marcatori genetici che, più di altri, consentono di incrementare le possibilità di identificazione di esemplari ibridi.
Ed è infatti in tale ottica che si è proceduto nella acquisizione dei dati durante lo svolgimento della valutazione ex post della presenza dei canidi vaganti. Le tre tecniche utilizzate ( wolf howling , fototrappolaggio , scat trail ed analisi genetica dei campioni) costituiscono infatti valide metodologie di campo, in grado di fornire informazioni esaustive relative alla presenza di lupi ed ibridi nel territorio. Tuttavia presentano tutte e tre dei limiti, e se utilizzate da sole forniscono solamente dati parziali ed incompleti. L'attività di wolf howling, ad esempio, costituisce una tecnica estremamente utile per il rilevamento dei branchi, e consente pertanto non solo di acquisire informazioni relative alla presenza di lupi nel territorio ma anche di avere conferme del loro successo riproduttivo, e permette di estrapolare il numero minimo di adulti e cuccioli presenti in ogni branco individuato. Inoltre, l'individuazione di una unità riproduttiva e del sito di localizzazione degli animali ( rendez-vous ) consente di selezionare le aree prioritarie in cui concentrare gli sforzi di monitoraggio tramite scat trail e fototrappolaggio, al fine di massimizzare il reperimento di segni indiretti di presenza degli animali, e di acquisire informazioni relativamente 46 al fenotipi degli esemplari e al loro grado di associazione. D'altra parte, se l'attività di wolf howling consente di confermare la presenza della specie lupo in un territorio, non permette invece di confermarne l'assenza sulla base di una mancata risposta da parte dei lupi agli ululati indotti. Numerosi infatti sono i motivi (ecologici e comportamentali) ed i contesti per cui i lupi potrebbero non rispondere ad uno stimolo acustico, e altrettanto numerose le condizioni che rendono l'ululato non rilevabile dagli operatori o dagli animali stessi. Pertanto il dato ottenuto con l'attività di wolf howling rappresenta una stima di minima dell'effettivo numero di branchi presenti in un territorio. Nel caso specifico della valutazione ex post, il wolf howling ha consentito di localizzare il branco di Baccinello, ma è stata l'integrazione con il monitoraggio fotografico che ha permesso di confermare la presenza di altri 4 branchi non rilevati con il wolf howling.
Attraverso il monitoraggio fotografico è stato possibile confermare la presenza degli animali nelle aree di indagine ed acquisire informazioni relativamente al loro fenotipo. In alcuni casi il monitoraggio fotografico ha inoltre consentito di identificare singoli individui e di monitorare i loro spostamenti nei vari comprensori territoriali (es coppia di canidi composta da un maschio nero ed una femmina grigia nel comprensorio di Monte Leoni; individuo privo di una zampa nel comprensorio della Polverosa; esemplare femmina con colorazione chiara del mantello nell'area di Baccinello). Tuttavia anche questa tecnica presenta dei limiti, legati non tanto alla sua applicabilità, quanto alla interpretazione dei risultati (foto/video) ottenuti, ossia l’identificazione della classe di appartenenza degli individui di canide filmati. La qualità delle immagini, infatti, spesso non consente di assegnare con certezza gli animali ad una specifica classe di appartenenza (lupo o ibrido) e non vi è mai la sicurezza che tutti gli animali di un gruppo vengono filmati. Inoltre, durante la valutazione ex post è stato osservato, da parte di alcuni animali, un comportamento schivo nei confronti delle foto trappole che li ha spinti ad evitare il passaggio lungo strade percorse abitudinariamente una volta che veniva apposta una fototrappola. Un esempio di questo comportamento è stato riscontrato nell’area della Polverosa, successivamente alla settima e alla quattordicesima sessione di cattura e nell’area di Baccinello durante la decima e la dodicesima sessione (Braschi et al., 2014).
Infine, il monitoraggio genetico, sebbene restituisca dati altrimenti non rilevabili con le altre due tecniche precedentemente descritte, e fornisca una “misura” del grado di introgressione del genoma di cane nella popolazione selvatica di lupi, è ancora fortemente dipendente dai costi elevati necessari per eseguire le analisi genetiche e gli esiti di queste sono, ad oggi, ancora fortemente condizionati dalle tecniche impiegate (es. numero e tipologia di marcatori considerati), dal campione di riferimento utilizzato per le analisi e dal grado di deterioramento del DNA da analizzare (Braschi e Boitani 2013).
47 L' integrazione delle tre tecniche di indagine utilizzate durante la valutazione ex post della presenza di canidi vaganti, ha consentito di superare i vincoli imposti da ogni tecnica e di massimizzare le informazioni che era possibile acquisire (ad esempio integrando il dato genetico con quello fenotipico), con la premessa necessaria che i limiti di tempo e di mezzi imposti dal progetto non hanno consentito che la valutazione ex post potesse realizzarsi in un arco di tempo più esteso, condizione sicuramente favorevole ad una più completa acquisizione dei dati. In particolare, la possibilità di poter estendere la durata della valutazione ex post ai mesi invernali avrebbe consentito di poter confrontare con una maggiore accuratezza i dati ottenuti durante la valutazione ex ante, che si è svolta nei primi sei mesi dell’anno del 2012, in una fase stagionale, quindi. completamente diversa per lupi ed ibridi rispetto a quella in cui si è svolta la valutazione ex post.
I dati forniti dalle analisi genetiche consentono inoltre di fare un’altra riflessione in merito alla dinamica di popolazione di lupi ed ibridi nella Provincia di Grosseto. Durante la valutazione ex post, è stato ricampionato solamente uno degli esemplari campionati con la genetica non invasiva durante la valutazione ex ante, e nessuno degli animali morti o catturati durante lo svolgimento del progetto è stato mai ricampionato nel corso di una delle due fasi di valutazione. Il ridotto ricampionamento degli esemplari di canidi vaganti lascia supporre che nell'area della provincia di Grosseto si verifichi un notevole tasso di ricambio degli individui, probabilmente anche a causa dell’elevata mortalità di origine antropica che non influisce unicamente sul numero di animali presenti nel territorio ma anche sul loro grado di coesione all'interno di un branco, favorendone lo smembramento e l'allontanamento dal territorio comune.
In conclusione è opportuno ribadire che l'attività di valutazione ex post svolta nell'ambito del progetto Ibriwolf costituisce il dato conoscitivo di partenza per la implementazione di qualsiasi intervento gestionale si decida di intraprendere a scala locale. La conoscenza della dislocazione dei branchi, del grado di introgressione del genoma di cane nella popolazione di lupi presente nel territorio della provincia di Grosseto e la individuazione delle aree maggiormente critiche, nelle quali intervenire in maniera prioritaria, costituiscono le informazioni necessarie da cui partire per pianificare una strategia efficace per il contenimento della problematica della ibridazione cane lupo a livello locale. Inoltre, essendo i dati stati acquisiti con procedure standardizzate e pertanto replicabili, diventa possibile, e sicuramente auspicabile, che la valutazione del fenomeno della ibridazione cane lupo venga replicata e mantenuta negli anni futuri, al fine di assicurare una conoscenza a lungo termine dello stato della popolazione di canidi vaganti nell’area di interesse (presenza o meno di ibridi, frequenza relativa di questi animali nel territorio, numero e dimensione dei branchi ecc), e di monitorarne la variazione nel tempo.
48 6.6.6. BIBLIOGRAFIA
Allendorf, F. W., Leary, R. F., Spruell, P., & Wenburg, J. K. (2001). The problems with hybrids: setting conservation guidelines. Trends in Ecology & Evolution, 16(11):613-622.
Bannasch DL, Bannasch MJ, Ryun JR, Famula TR, Pedersen N (2005) Y chromosome haplotype analysis in purebred dogs. Mammalian Genome, 16:273–280.
Boom, R., Sol, C.J.A., Salimans, M.M.M., Jansen, C.L., Wertheimvandillen, P.M.E. & Vandernoordaa, J. (1990) Rapid and simple method for purification of nucleic-acids. Journal of Clinical Microbiology, 28:495-503.
Braschi C. Boitani L. (2013). Azione A3. Caratterizzazione genetica e morfologica degli ibridi. Risultati delle analisi genetiche - Relazione Finale. Relazione tecnica, progetto Ibriwolf LIFE10NAT/IT/265.
Braschi C., Boitani L., Pagliaroli D., Gallo O. e Zingaro M. (2014). Azioni C1 e C2. Interventi di rimozione degli ibridi lupo cane in Maremma e sul Monte Amiata. Relazione della attività svolta nel periodo 1 novembre 2012-30 giugno 2014. Relazione tecnica, progetto Ibriwolf LIFE10NAT/IT/265.
Caniglia R, Fabbri E, Greco C, Galaverni M; Manghi L, Boitani L, Sforzi A, Randi E (2013). Black coats in an admixed wolf × dog pack is melanism an indicator of hybridization in wolves? European Journal of Wildlife Research, 59:543-555.
Ciucci, P. (2012). Ibridazione con il cane come minaccia per la conservazione del lupo: status delle conoscenze e criteri per l’identificazione degli ibridi. Relazione tecnica, progetto Ibriwolf LIFE10NAT/IT/265.
Ferguson, M.M. et al. (1985) Absence of developmental incompatibility in hybrids between rainbow trout and two subspecies of cutthroat trout. Biochemical Genetics, 23:557-570
Frantz, A.C., Pope, L.C., Carpenter, P.J., Roper, T.J., Wilson, G.J., Delahay, R.J. & Burke, T. (2003) Reliable microsatellite genotyping of the Eurasian badger ( Meles meles ) using faecal DNA. Molecular Ecology, 12:1649-1661.
Gazzola et al. 2013 “Indagine conoscitiva sulla presenza del lupo nell’area del Monte Amiata tramite la tecnica dell’ululato indotto”. Relazione tecnica, progetto Ibriwolf LIFE10NAT/IT/265.
Harrington, F. H., & Mech, L. D. (1982). An analysis of howling response parameters useful for wolf pack censusing. The Journal of Wildlife Management, 46(3):686-693.
Harrison, R. G. (Ed.). (1993). Hybrids and hybrid zones: historical perspective. Pp. 3-12 in Harrison, R. G. (Ed.): Hybrid zones and the evolutionary process. Oxford University Press.
Iacolina, L., Scandura, M., Gazzola, A., Cappai, N., Capitani, C., Mattioli, L. & Apollonio, M. (2010). Y-chromosome microsatellite variation in Italian wolves: a contribution to the study of wolf-dog hybridization patterns. Mammalian Biology-Zeitschrift für Säugetierkunde, 75(4):341- 347. 49 Leary, R.F. et al. (1996) Success of basibranchial teeth in indicating pure populations of rainbowtrout and failure to indicate pure populations of westslope cutthroat trout. N. Am. J. Fish. Manage. 16:210–213
Manghi, L. Tosoni, E. e Masi, M. (2012). Azioni A3 e A4. Relazione Tecnica, progetto Ibriwolf LIFE10NAT/IT/265.
Morimando, F. (2014). Progetto Regione Toscana-CIRSEMAF Centro Interuniversitario di Ricerca sulla Selvaggina e sui Miglioramenti Ambientali a fini Faunistici. “Attività di Validazione e Verifica della presenza del Lupo nelle Province di Siena e Grosseto” Anno 2014 Responsabile Regionale Prof. Marco Apollonio, responsabile Provinciale Dott. Federico Morimando
Randi, E. (2008). Detecting hybridization between wild species and their domesticated relatives. Molecular ecology, 17(1):285-293.
Rhymer, J. M., & Simberloff, D. (1996). Extinction by hybridization and introgression. Annual Review of Ecology and Systematics, 83-109.
Seddon, J.M. (2005) Canid-specific primers for molecular sexing using tissue or non-invasive samples. Conservation Genetics, 6:147-149.
Sundqvist A-K, Ellegren H, Olivier M, Vila` C (2001) Y chromosome haplotyping in Scandinavian wolves (Canis lupus) based on microsatellite markers. Molecular Ecology, 10:1959–1966.
50