Karlla Danielle Jorge Amorim

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SISTEMÁTICA E EVOLUÇÃO

PADRÕES CITOGENÔMICOS EM ESPÉCIES DA FAMÍLIA LABRIDAE DA COSTA NORDESTE E ILHAS OCEÂNICAS DO BRASIL

KARLLA DANIELLE JORGE AMORIM ______Dissertação de Mestrado Natal/RN, fevereiro de 2016 Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Sistemática e Evolução/PPGSE, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de mestre em Sistemática e Evolução.

Karlla Danielle Jorge Amorim

Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina

Coorientador: Prof. Dr. Marcelo de Bello Cioffi

Natal – RN 2016

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências

Amorim, Karlla Danielle Jorge. Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil / Karlla Danielle Jorge Amorim. – Natal, RN, 2016.

65 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina. Coorientador: Prof. Dr. Marcelo de Bello Cioffi.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução.

1. Citogenética de peixes. – Dissertação. 2. DNAr. – Dissertação. 3. Genes sintênicos. – Dissertação. 4. Budiões. – Dissertação. I. Molina, Wagner Franco. II. Cioffi, Marcelo de Bello. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 575

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil

Karlla Danielle Jorge Amorim

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Sistemática e Evolução/PPGSE da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de mestre em Sistemática e Evolução.

______Dr. Paulo Augusto de Lima Filho IFRN

______Dr. Gideão Wagner Werneck Félix da Costa UFRN

______Dr. Wagner Franco Molina (Presidente da Banca – UFRN)

“A persistência é o caminho do êxito.” Charles Chaplin

À minha mãe, Fátima

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por toda providência em minha vida. A minha família por todo amor e carinho, não só durante o mestrado, mas em todos os anos da minha vida. Em especial a minha avó Terezinha, meu avô Francisco e minha tia Mônica que me ajudaram quando tudo pareceu mais difícil; aos meus sobrinhos Lara e Miguel por alegrarem meus dias e, principalmente, a minha mãe Fátima por abrir mão de seus interesses para que seus filhos pudessem estudar e ter um futuro melhor. Aos amigos de vida e de graduação que torceram por mim, principalmente Juliana, Khadija e Roberta que foram minhas companheiras “em uma etapa na qual a união de forças fez toda a diferença”. Aos amigos do LGRM que contribuíram direta ou indiretamente com esta pesquisa: Allyson, Amanda, Aparecida, Cristiane, Clóvis, Davi, Divana, Gideão, Inailson, Jeane, Juliana, Josi, Leonardo Calado, Paulo, Rafael, Roberta, Rodrigo e Vanessa. Agradeço ao Professor Dr. Wagner Franco Molina por abrir as portas do laboratório para mim, pela orientação e por me fazer crescer pessoalmente, profissionalmente e academicamente. Ao Programa de Pós Graduação em Sistemática e Evolução e todo seu corpo docente pelo suporte oferecido durante o desenvolvimento deste trabalho. A SECIRM e Marinha do Brasil pelo 34º Treinamento Pré-Arquipélago e pela viagem ao Arquipélago São Pedro e São Paulo, à tripulação do Transmar que realizou nosso transporte e a administração e ICMBio pela colaboração com a coleta realizada no Arquipélago de Fernando de Noronha. Aos membros da banca: Professor Dr. Paulo Augusto de Lima Filho, Dr. Gideão Wagner Werneck Félix da Costa e ao Professor Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha. A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela bolsa concedida.

SUMÁRIO

Lista de figuras e tabela...... 8 Resumo...... 9 Abstract...... 10 1. INTRODUÇÃO...... 11 1.1. Família Labridae...... 11 1.2. Filogenia e taxonomia de Labridae...... 12 1.3. Aspectos citogenéticos de Labridae...... 13 2. OBJETIVOS...... 17 3. MATERIAL E MÉTODOS...... 17 3.1. Material...... 17 3.2. Métodos...... 19 3.2.1. Técnica de estimulação mitótica...... 19 3.2.2. Técnica de obtenção de cromossomos mitóticos...... 20 3.2.3. Preparação das lâminas...... 20 3.2.4. Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)...... 20 3.2.5. Detecção de heterocromatina (Banda-C)...... 20 3.2.6. Coloração com fluorocromo base-específicos DAPI e MM...... 21 3.2.7. Hibridização in situ com fluorescência – FISH...... 21 3.2.8. Análise cromossômica...... 22 4. CAPÍTULOS...... 23 4.1. Dinâmica dos genes ribossomais em cromossomos das espécies do gênero Halichoeres (Labridae, Perciformes)...... 23 4.2. Comparação de padrões citogenéticos entre populações Atlânticas costeiras e insulares das espécies do gênero Halichoeres e Thalassoma...... 41 5. CONCLUSÕES...... 56 6. REFERÊNCIAS...... 57 LISTA DE FIGURAS E TABELAS

INTRODUÇÃO Tabela 1. Revisão dos dados citogenéticos da família Labridae...... 15 Figura 1. Exemplares das espécies Halichoeres radiatus (a), H. brasiliensis (b), H. poeyi (c), H. penrosei (d) e Thalassoma noronhanum (e). Barra=2cm...... 18

Figura 2. Pontos de coleta das espécies de Labridae analisadas. ASPSP; FN; AR; RN; BA; e Ilha da Trindade. As cores no mapa representam as espécies coletadas. Halichoeres radiatus (vermelho), H. brasiliensis (verde), H. poeyi (amarelo), H. penrosei (lilás) e Thalassoma noronhanum (azul)...... 19

CAPÍTULO I Figura 1. Pontos de coleta das espécies de Labridae analisadas. Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN); Atol das Rocas (AR); Rio Grande do Norte (RN); Bahia (BA); e Ilha da Trindade (IT). Halichoeres radiatus (AFN), H. brasiliensis (RN), H. poeyi (BA), H. penrosei (IT) e Thalassoma noronhanum (AR)...... 27

Figura 3. Double-FISH com sondas DNAr 18S (vermelho) e DNAr 5S (verde) e coloração com os fluorocromos MM/DAPI nos cromossomos de T. noronhanum (a), H. penrosei (b), H. poeyi (c), H. radiatus (d) e H. brasiliensis (e). Os asteriscos correspondem aos pares cromossômicos com sítios DNAr 18S/5S co-localizados. Barra=5 μm...... 31

Tabela 1. Variação entre o valor diplóide e o número fundamental entre as subfamílias ou tribos cariotipadas até o momento. (Adaptada de Arai, 2011)...... 35

CAPÍTULO II

Figura 1. Pontos de coleta para H. radiatus (Arquipélago de São Pedro e São Paulo e Arquipélago de Fernando de Noronha), H. poeyi (Litoral do Rio Grande do Norte e Bahia) e Thalassoma noronhanum (Atol das Rocas e Arquipélago de Fernando de Noronha). As setas correspondem as principais correntes de superfície no Atlântico Sul. CB; Corrente do Brasil; CNB: Corrente Norte do Brasil; CCSE: Contracorrente Sul Equatorial; CSE: Corrente Sul Equatorial. (Baseado em Lumpkin & Garzoli, 2005)...... 44

Figura 2. Cariótipo representativo das populações de T. noronhanum e H. poeyi. Giemsa (a; b), bandamento C (c; d), MM/DAPI (e; f) e FISH utilizando sondas DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde) (g; h). AR- Atol das Rocas; FN- Arquipélago de Fernando de Noronha; BA- Estado da Bahia; RN- Estado do Rio Grande do Norte. Barra=5μm...... 47

Figura 3. Padrão comparativo dos cariótipos da espécie H. radiatus FN e ASPSP. Coloração convencional com Giemsa (a; b), bandamento C (c; d), coloração MM/DAPI (e; f) e FISH utilizando sondas DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde) (g; h). Barra=5μm...... 48 RESUMO

Labridae possui grande interesse ecológico devido as suas complexas interações com o ambiente recifal. Representa uma das famílias mais diversas, com mais de 530 espécies, distribuídas em 82 gêneros, com importantes relações ecológicas e aspectos econômicos. Suas espécies estão amplamente representadas nos oceanos Índico, Pacífico e Atlântico. O gênero Halichoeres, é o mais diverso dentro da família. Os budiões, como são conhecidos os representantes da família, apresentam variações no padrão de cor que podem se modificar de acordo com o sexo ou fase de desenvolvimento. Diante disso, muitas espécies vêm sendo reavaliadas e reordenadas. Apesar das contribuições significativas na identificação dos mecanismos de divergência cariotípica intra e interespecíficas na família, poucas espécies tiveram seus padrões cromossômicos analisados com técnicas mais resolutivas. Aqui são apresentados dados citogenéticos que ampliam as informações citogenéticas para os gêneros Halichoeres e Thalassoma, analisando padrões heterocromáticos qualitativos, com distribuição de regiões (GC+/AT-), localização e frequência de sítios Ag-RON e hibridização fluorescente in situ com sondas ribossomais, das populações do litoral nordeste e ilhas oceânicas do Brasil. As espécies Halichoeres radiatus, H. poeyi, H. brasiliensis, H. penrosei apresentaram 2n=48 (48a), enquanto Thalassoma noronhanum apresentou 2n=48 (2m+46a). O mapeamento de sequências repetitivas ribossomais (DNAr 18S e 5S) identificou sítios DNAr 18S, múltiplos (3 a 5 loci), e DNAr 5S, simples ou múltiplos, bem como sintenia destes genes. Comparações populacionais evidenciaram diferenciações conspícuas quanto à frequência de sítios ribossomais DNAr 18S entre populações de H. radiatus. A extensa ocorrência de sítios 18S/5S co-localizados, em todas as espécies, demonstra uma condição basal das espécies de Halichoeres do Atlântico. Apesar de independentes evolutivamente, a sintenia destes genes se mostra filogeneticamente compartilhada para os gêneros Halichoeres e Thalassoma. Esta condição estrutural indica que co-localizações de sítios ribossomais 18S/5S podem ser estáveis, funcionais e mais frequentes do que se pensava em alguns grupos de peixes.

Palavras-chave: Citogenética de peixes, budiões, DNAr, genes sintênicos, FISH.

ABSTRACT

Labridae has a great ecological interest due to its complexes interactions with reef environment where it represents one of the most diverse families possessing about 530 species distributed in 82 genera, with important ecological relations and economical aspects. The Halichoeres genus is the most diverse within the family. The wrasses, as the representatives of the family are popular known, present variations in the color pattern that can varies depending on the sex and or development phase. According to this fact, a considerable number of species are being reevaluated and even reordered. Despite the significant contributions in the identification of intra and interspecific karyotypical divergence mechanisms in the family, a reduced number of species have had its chromosomal patterns analyzed with more elucidative techniques. Here are presented cytogenetical data that increase the information to the genus Halichoeres and Thalassoma, analyzing qualitative heterochromatic patterns through the distribution of regions (GC+/AT-), localization and frequence of Ag-NORs sites and fluorescence in situ hybridization with ribosomal probes, from the Northeast Coast and Ocenic Islands of Brazil. The species Halichoeres radiatus, H. poeyi, H. brasiliensis, H. penrosei presented 2n = 48 (48a), while Thalassoma noronhanum presented 2n = 48 (2m + 46a). The mapping of ribosomal repetitive sequences (rDNA 18S and 5S) identified multiple rDNA 18S sites (3 to 5 loci) and simple or multiple rDNA 5S, as well as synteny among these genes. Population comparisons revealed conspicuous differentiations related to the frequency of the ribosomal sites rDNA 18S between H. radiatus populations. The broad occurrence of co-localized 18S/5S sites, in all species, shows a basal condition for the Atlantic Halichoeres species. Although evolutionary independent, the synteny of these genes phylogenetically shared by the Halichoeres and Thalasoma genus, indicates that the co-localization of the ribosomal genes 18S/5S can be more functional and frequent that was previously thought for some fish groups.

Keywords: Fish cytogenetics, wrasse, rDNA, syntenic genes, FISH

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 11

1. INTRODUÇÃO

1.1 Família Labridae

A família Labridae, cujos representantes são conhecidos como budiões, é extremamente diversificada com 530 espécies distribuídas, em 82 gêneros, que variam na forma do corpo, tamanho, coloração e habitat (Westneat & Alfaro, 2005; Eschmeyer & Fong, 2016). Entre os gêneros, Halichoeres é o que apresenta maior diversidade, com 80 espécies, enquanto o gênero Thalassoma constitui o quarto mais especioso (Parenti & Randall, 2011). Nesta família, a maioria das espécies apresenta hermafroditismo protogínico, padrões de cores brilhantes, incluindo listras, manchas, e ocelos de vários tons de marrom, azul, verde, vermelho, amarelo e branco (Westneat, 2002; Nelson, 2006). Estes padrões de cores muitas vezes mudam com a idade e com a reversão sexual, tornando-se, em alguns casos, árdua a identificação taxonômica das espécies. Diante disso, muitas delas vêm sendo reavaliadas e até mesmo reordenadas (Baliga & Law; 2016). Os variados padrões de coloração tornam Labridae uma das famílias mais populares no mercado aquarístico. Além de importantes economicamente, algumas espécies menores atuam na remoção de ectoparasitas de outros peixes, contribuindo na manutenção do equilíbrio ecológico nos ambientes recifais (Alfaro et al., 2009). Algumas espécies são pequenas, com comprimento menor que 20 cm e poucas gramas, enquanto outras atingem um peso superior a 100 kg, apresentando em geral hábito alimentar generalista, distribuindo-se em profundidades de até 100m (Westneat & Alfaro, 2005). São comuns em águas pouco profundas, encontrados na região tropical e águas temperadas de todo o mundo apresentando itens alimentares bastante diversos, incluindo gastrópodes, bivalves, crustáceos, zooplâncton, ectoparasitas e algas (Ferry-Graham et al., 2002). No litoral nordeste do Brasil algumas espécies são abundantes e revelam importante participação na dinâmica dos recifes de corais. Entre estas podem ser listadas espécies dos gêneros Halichoeres, como H. radiatus (Linneaus, 1758), H. poeyi (Steindachner, 1867) encontrados no Atlântico Ocidental, H. brasiliensis (Bloch, 1791) endêmica da costa brasileira, bem como espécies de distribuição restrita, em ambientes insulares, como H. rubrovirens (Rocha et al., 2010), encontrada nas ilhas de Trindade e Martin Vaz; ou da província brasileira, como Thalassoma noronhanum (Boulenger, 1890) (Rocha et al., 2001; Rocha et al., 2010). Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 12

Diante da diversidade de espécies, importância econômica e ecológica, ampla distribuição geográfica e dificuldade na identificação das espécies, análises evolutivas neste peculiar grupo de peixes recifais são importantes e contribuem para o esclarecimento das relações filogenéticas em Labridae.

1.2 Filogenia e taxonomia em Labridae

A classificação e filogenia dos peixes ósseos têm mudado rapidamente à medida que estudos filogenéticos moleculares, baseados em conjuntos de dados abrangentes taxonômicos, são realizados. Do ponto de vista taxonômico, Perciformes vinha sendo considerada a ordem mais diversa com 160 famílias, entre elas, Labridae (Nelson, 2006). Novas evidências têm reavaliado as famílias pertencentes a Perciformes e Labridae passou a compor a ordem Labriformes (Betancur-r et al. 2013).

Osteichthyes Actinopterygii Actinopteri Neopterygii Teleostei Osteoglossocephalai Clupeocephala Euteleosteomorpha Neoteleostei Eurypterygia Ctenosquamata Acanthomorphata Euacanthomorphacea Percomorphaceae Percomorpharia Labriformes

A família Labridae tem sido subdividida em nove tribos: Hypsigenyini, Cheilines, Scarines, Labrini, Pseudocheilines, Pseudolabrines, Julidini, Novaculines e Labrichthyines (Westneat & Alfaro, 2005). No entanto, esta nova classificação não é aceita por todos os autores (Parenti & Randall, 2011). Da mesma forma, filogenias mais recentes que incluem Scaridae e Odacidae, ainda tem considerado Labridae como pertencente a Perciformes (Baliga & Law; 2016). Diante das controvérsias na sistemática da família, optou-se por utilizar nos capítulos subsequentes, sua inclusão em Perciformes. Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 13

Alguns dados moleculares revelam que o gênero Halichoeres deve ser subdividido (Barber & Bellwood, 2005; Cowman & Bellwood, 2011; Baliga & Law, 2016). As Filogenias moleculares propostas para o gênero Halichoeres os tem considerado como um grupo polifilético, em função das espécies H. maculipinna e H. penrosei que estão mais relacionadas às espécies do gênero Thalassoma (Barber & Bellwood, 2005; Westneat & Alfaro 2005; Rocha et al., 2010). Labridae é uma família especiosa onde os processos especiativos estão associados a eventos alopátricos e parapátricos (Rocha, 2004; Rocha et al., 2005; Beldade et al., 2009). Desta forma, tanto condições ambientais divergentes como barreiras biogeográficas decorrentes de grandes distâncias oceânicas podem ter promovido condições viáveis para a diversificação na família (Rocha, 2004). A alopatria é evento importante no ambiente marinho, mas não é responsável por toda a diversidade encontrada nos recifes de corais, uma vez que a maioria das espécies apresenta alto potencial de dispersão na fase pelágica. Entre as barreiras com influência na diversificação de fauna no Atlântico se destaca a barreira do Amazonas que divide as províncias biogeográficas norte e sul (Rocha et al., 2005). De fato, divergências genéticas e diferenciação ecológica têm sido observadas em alguns peixes recifais que ocorrem dos dois lados desta barreira (Robins, 1971; Williams 1991; Rocha et al., 2002; Rocha, 2003). Com vistas a analisar divergências entre áreas de distribuição de espécies de Labridae, a comparação de aspectos citogenéticos pode desempenhar um papel importante na elucidação dos mecanismos evolutivos envolvidos na diversificação das espécies da família Labridae.

1.3 Aspectos citogenéticos em Labridae

Apesar da importância ecológica, menos de 16% das espécies da família Labridae já possuem algum nível de informação citogenética e em geral, demonstram elevada diversidade na macroestrutura (Tabela 1) e seus cariótipos variam de 2n=22, em Xyrichthys nocacula (Ueno & Takai, 2000), a 2n=48 condição frequente na maioria das espécies (Arai, 2011). Espécies proximamente relacionadas podem apresentam cariótipos distintos (Molina et al., 2012a). Este fato levanta a possibilidade de que rearranjos cromossômicos possam ter algum papel na especiação (Molina, 2007). Estudos citogenéticos em Perciformes revelam que alguns grupos apresentam cariótipos considerados basais compostos de cromossomos acrocêntricos (Rocha & Molina, 2008) e a evolução do cariótipo foi modelada, Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 14

principalmente, por inversões pericêntricas seguido, em menor grau, por eventos de fusão cêntricas e, com menor frequência, fissões cêntricas (Galetti et al., 2006). Em Labridae, alguns grupos do Atlântico tiveram seus padrões cromossômicos analisados e apresentaram divergência cariotípica derivada de extensas modificações cromossômicas decorrentes de rearranjos Robertsonianos ou inversões pericêntricas (Sena & Molina, 2007; Molina et al., 2012a), fato evidenciado pela variação nas fórmulas cariotípicas que podem ser bastante diversificadas com o número fundamental (NF, número de braços cromossômicos) variando entre 48-88 (Tabela 1). Em Hypsigenyini, Pseudolabrini e Scarini números fundamentais iguais ou superiores a 48 indicam que inversões pericêntricas parecem responsáveis pela diversificação nestes grupos, enquanto em Julidini, Labrini, Labrichthyines as fusões cêntricas são recorrentes. Em Novaculini, Pseudocheilini e Cheilini o número diploide reduzido indica que rearranjos Robertsonianos atuam na diversificação cariotípica destes grupos (Sena & Molina, 2007; Molina et al., 2014). Dados cariotípicos obtidos com técnicas mais resolutivas, permitem sugerir filogenias cromossômicas mais robustas, confirmando relações de parentesco obtidas base em análises de grande número de caracteres cromossômicos (Costa et al., 2016). Diante da diversidade evolutiva deste peculiar grupo de peixes, persiste a necessidade de uma maior compreensão sobre os eventos e processos associados a sua diversificação cariotípica. Assim, a análise de aspectos citogenômicos em Labridae pode desempenhar um importante papel na identificação de marcadores citotaxonômicos, inferências filogenéticas e processos de mudanças envolvidos na diversificação do grupo.

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 15

Tabela 1. Revisão dos dados citogenéticos da família Labridae (adaptado de Arai, 2011).

Tribo/Espécie 2n Fórmula cariotípica NF Referência Hypsigenyini Bodianus rufus 48 6m+12sm+14st+16a 80 Molina et al., 2012b B. pulchellus 48 4m+12sm+14st+18a 78 Molina et al., 2012b B. insularis 48 4m+12sm+14st+18a 78 Molina et al., 2012b B. axillaris 48 8m+30sm+10st/a 86 Ojima & Kashiwagi, 1980 B. loxozonus 48 8m+26sm+14st/a 82 Ojima & Kashiwagi, 1980 B. mesothorax 48 8m+18sm+22st/a 74 Ojima & Kashiwagi, 1980 Choerodon azurio 48 6m+2sm+40st/a 56 Arai & Koike, 1980

Pseudocheilini Cirrhilabrus cyanopleura 34 10m+2sm+22st/a 46 Ojima & Kashiwagi, 1980 C. temminckii 34 10m+2sm+22st/a 46 Ojima & Kashiwagi, 1980 Crenilabrus melops 46 10 m+36 st 56 Cataudella et al., 1973 C. griseus 48 2m+26sm+20st/a 76 Klinkhardt et al., 1995 C. ocellatus 38 36m/sm/st+12a 84 Klinkhardt et al., 1995 C. quinquemaculatus 38 14m+22sm+2st 74 Klinkhardt et al., 1995 C. tinca 48 34m/sm/st+14a 82 Klinkhardt et al,. 1995 Pteragogus aurigarius 44 2m+10sm+32st/a 56 Arai & Koike, 1980

Julidini Cheilio inermis 48 12m+12sm+24st/a 72 Ojima & Kashiwagi, 1980 Coris aygula 48 6m+6sm+36st/a 60 Ojima, 1983 C. gaimardi 48 2m+10sm+36st/a 60 Ojima & Kashiwagi, 1980 C. julis 48 10m/sm+38st/a 58 Duchac et al., 1982 C. multicolor 48 6m+8sm+34st/a 62 Ojima & Kashiwagi, 1980 Gomphos usvarius 48 48st/a 48 Ojima & Kashiwagi, 1980 Halichoeres radiatus 48 48a 48 Sena & Molina, 2007a H. brasiliensis 48 48a 48 Sena & Molina, 2007a H. poeyi 48 48a 48 Presente estudo H. penrosei 48 48a 48 Presente estudo H. argus 48 48st/a 48 Arai, R & Koike, 1980 H. hortulanus 48 48st/a 48 Ojima & Kashiwagi, 1980 H. melanochir 48 2m+46st/a 50 Arai, R & Koike, 1980 H. melanurus 48 48st/a 48 Ojima & Kashiwagi, 1980 H. poecilopterus 48 4m+2sm+42st/a 54 Ojima & Kashiwagi, 1980 H. prosopeion 48 2sm+46st/a 50 Ojima & Kashiwagi, 1979 H. tenuispinnis 48 2sm+46st/a 50 Ojima & Kashiwagi, 1979 H. trimaculatus 48 48st/a 48 Ojima & Kashiwagi, 1980 Hemigymnus fasciatus 48 6m+6sm+36st/a 60 Ojima, 1983 Hologymnosus semidiscus 48 8m+30sm+10st/a 86 Ojima & Kashiwagi, 1980 Novaculichthys taeniurus 48 4sm+44st/a 52 Ojima, 1983 Stethojulis banddanesis 48 4m+44st/a 52 Ojima & Kashiwagi, 1980 S. interrupta 48 2sm+46st/a 50 Ojima & Kashiwagi, 1980 S. strigiventer 48 2sm+46st/a 50 Ojima & Kashiwagi, 1980 Thalassoma cupido 48 48st/a 48 Ojima & Kashiwagi, 1980 T.amblycephalum 48 48st/a 48 Ojima & Kashiwagi, 1980 T. bifasciatum 48 48a 48 Ruiz-Carus, 2002 T. quinquevittata 48 48st/a 48 Ojima & Kashiwagi, 1980 T. lunare 48 48 a 48 Kushwaha et al., 2011 T. lutenscens 48 48st/a 48 Ojima & Kashiwagi, 1980 T. pavo 48 48a 48 Cano et al., 1982 T. noronhanum 48 2sm/46a 50 Presente estudo

Labrini Ctenolabrus rupestris 48 4m+22sm+10st+12a 74 Alvarez et al., 1986 Labrus bimaculatus 48 48a 48 Vitturi et al., 1986 L. merula 48 48a 48 Vitturi et al., 1986 L. viridis 48 48a 48 Vitturi et al., 1986 Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 16

Continuação da Tabela 1. Revisão dos dados citogenéticos da família Labridae.

Tribo/Espécie 2n Fórmula cariotípica NF Referência Symphodus mediterraneus 46 6m/sm+40st/a 52 Cano et al., 1982 S.melops 46 10m+36st 52 Lopez et al., 1989 S.roissali 38 10m+28m/sm/st 76 Lopez et al., 1989 S. scina 48 2m+36sm+10st/a 86 Klinkhardt et al., 1995 S. doderleini 48 24m+6sm+10st+8a 78 Catalano et al., 1988 S.cinereus 48 32m/sm/st+16a 78 Vasiliev & Polykarpova, 1980

Scarini Calotomus japonicus 48 8m+10sm+30st/a 66 Arai, R & Koike, 1980 Chlorurus sordidus 48 8m+10sm+30st/a 66 Arai, R & Koike, 1980 Scarus trispinosus 48 6m+10sm+24st+8a 88 Sena & Molina, 2007b Sparisoma axillare 46 6m+14sm+4st+22a 70 Sena & Molina, 2007b S. radians 46 24m/sm+22st/a 84 Paim et al., 2014

Cheilini Cheilinusbimaculatus 32 4m+2sm+26st/a 38 Ojima & Kashiwagi, 1980 C. fasciatus 48 12sm+34st/a 60 Ojima, 1983 Crenilabrus melops 46 10 m+36 st 92 Cataudella et al.,1973 C. griseus 48 2m+26sm+20st/a 76 Klinkhardt et al., 1995 C. ocellatus 38 36m/sm/st+12a 84 Klinkhardt et al., 1995 C. quinquemaculatus 38 14m+22sm+2st 74 Klinkhardt et al., 1995 C. tinca 48 34m/sm/st+14a 82 Klinkhardt et al,. 1995 Epibulus insidiator 48 4m+8sm+36st/a 60 Klinkhardt et al,. 1995

Labrichthyines Labroides dimidiatus 48 48st/a 48 Ojima & Kashiwagi, 1980

Novaculini Xyrichthys dea 44 44st/a 44 Ojima & Kashiwagi, 1980 X. taeniurus 48 4sm+44st/a 52 Ojima & Kashiwagi, 1980 X. centriquadus 48 48st/a 48 Ojima & Kashiwagi, 1980 X. kallochroma 48 48st/a 48 Ojima & Kashiwagi, 1980 X. melanochir 48 2m+46st/a 50 Ojima & Kashiwagi, 1980 X. pavo 48 8sm+40a 56 Klinkhardt et al., 1995 X. twistii 44 44a 44 Ueno & Takai, 2000 X.novacula 22 18m/sm+4a 40 Ueno & Takai, 2000

Pseudolabrini Pseudolabrus japonicus 48 2m+2sm+44st/a 52 Ojima & Kashiwagi, 1980

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 17

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral O presente trabalho visa identificar aspectos da evolução cromossômica e estabelecer o papel das sequencias repetitivas na diversificação cariotípica da família Labridae por meio de análises citogenômicas, bem como comparar padrões citogenéticos populacionais entre regiões insulares e costeiras do Atlântico Ocidental.

2.2 Objetivos Específicos

1. Analisar a dinâmica evolutiva de genes ribossomais 18S e 5S em cromossomos das espécies do gênero Halichoeres através do mapeamento citogenético destas sequências de DNAs repetitivos; 2. Comparar os padrões citogenéticos de populações costeiras e insulares do litoral brasileiro de espécies dos gêneros Halichoeres e Thalassoma.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material

Exemplares da espécie H. brasiliensis (Figura 1b) (N=6) e H. poeyi (Figura 1c) (N=13) foram coletados em Extremoz, na costa do Estado do Rio Grande do Norte (5°42’20”S, 35°11’38”O). Esta última espécie também foi coletada em Salvador, Estado da Bahia (N=3) (13º00’40”S, 38º30’35”O). Espécimes de H. radiatus (Figura 1a) (N=16) foram obtidos no Arquipélago de São Pedro e São Paulo (00º55'02”N, 29º20'44”O) e no Arquipélago de Fernando de Noronha (N=6) (3º51’20”S, 32º25’32”O). Os exemplares de H. penrosei (Figura 1d) (N=3) foram coletados na ilha de Trindade, Espírito Santo (20º30’13”S, 29º19’50”O). Enquanto que espécimes de Thalassoma noronhanum (Figura 1e) foram coletados no Arquipélago de Fernando de Noronha (N=15) (3º51’20”S, 32º25’32”O) e no Atol das Rocas (N=22) (3º51’59”S, 33º48’20”O) (Figura 2) . Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 18

Figura 1. Exemplares das espécies Halichoeres radiatus (a), H. brasiliensis (b), H. poeyi (c), H. penrosei (d) e Thalassoma noronhanum (e). Barra=2cm.

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 19

Figura 2. Pontos de coleta das espécies de Labridae analisadas. Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP); Fernando de Noronha (FN); Atol das Rocas (AR); Rio Grande do Norte (RN); Bahia (BA); e Ilha da Trindade. As cores no mapa representam as espécies coletadas. Halichoeres radiatus (vermelho), H. brasiliensis (verde), H. poeyi (amarelo), H. penrosei (lilás) e Thalassoma noronhanum (azul).

3.2 MÉTODOS

3.2.1. Técnica de estimulação mitótica

Os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica intraperitoneal com complexos antígenos fúngicos e bacterianos (Broncho-Vaxom®) por um período de 24 a 48 horas (Molina et al., 2010). Decorrido este tempo, os exemplares foram anestesiados com Eugenol e sacrificados para extração do rim anterior, de acordo com a técnica de obtenção de cromossomos mitóticos descrita a seguir.

3.2.2. Técnica de obtenção de cromossomos mitóticos

Os cromossomos mitóticos foram preparados a partir da suspensão de fragmentos do tecido renal de acordo com a técnica in vitro preconizada por Gold et al. (1990). Os Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 20

exemplares tiveram o rim anterior, posterior e o baço, removidos e utilizados para obtenção de suspensão celular. Os fragmentos foram colocados em 9 ml de meio de cultura RPMI 1640 e dissociados com ajuda de seringas de vidro, transferindo o material logo em seguida para tubos de centrífuga de 15 ml, completando o volume até 10 ml do mesmo. Foram adicionadas 125 µl de colchicina 0,025% para cessar a divisão mitótica deixando agir por 28 minutos, em temperatura ambiente. Em seguida o material foi centrifugado por 10 minutos a 900 rpm. Após o excedente ser removido acrescentamos 10 ml de solução hipotônica de KCl (0,075M), por 30 minutos em temperatura ambiente. O material foi pré-fixado 150 µl em solução de metanol e ácido acético (3:1), homogeneizado e centrifugado por 10 minutos e posteriormente fixado em solução de metanol e ácido acético (3:1) em três ciclos de centrifugação de 10 minutos cada, sendo o material posteriormente conservado em tubos eppendorf de 1,5 ml com tampa à -20ºC até a preparação das lâminas e análises posteriores.

3.2.3. Preparação das lâminas

Um total de 100 µl de suspensão celular foram gotejadas sobre uma lâmina recoberta com um filme d’água destilada aquecida à 60oC. Após secar ao ar, foi corada com solução Giemsa 5%, diluído em tampão fosfato pH 6,8 por um período de 8 minutos, posteriormente lavada com água destilada e deixando-a secar ao ar.

3.2.4. Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)

As regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foram obtidas pela técnica de impregnação por prata, idealizada por Howell & Black (1980). As lâminas recém-preparadas foram cobertas com aproximadamente 175 µl de uma solução gelatinosa contendo 1g de gelatina incolor acrescido de 50 ml de água e 0,5 ml de ácido fórmico, 200 µl de nitrato de prata (Ag-NO3) 50% e 75 µl de água destilada. A solução foi misturada sobre a lâmina, coberta com lamínula e colocada em estufa até atingir uma coloração âmbar. Em seguida a lamínula foi retirada, as lâminas foram lavadas com água destilada e deixadas secar ao ar.

3.2.5. Detecção de heterocromatina constitutiva (Banda-C)

As regiões heterocromáticas foram visualizadas através do bandamento C, segundo Sumner (1972) com modificações. As lâminas foram envelhecidas em estufa 37°C por três dias. Em seguida foram imersas em HCl 0,2N à temperatura ambiente, por 14 minutos, lavandas posteriormente em água destilada e deixadas para secar ao ar. Após este Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 21

procedimento, as lâminas foram incubadas numa solução Ba(OH)2.8H2O a 5% durante um período de 1 a 2 minutos à 42ºC. Após incubação foram expostas à HCl 0,2N rapidamente, lavadas com água destilada e mantidas em solução de 2XSSC à 60ºC por cerca de uma hora, sendo posteriormente coradas com solução Giemsa (1% em tampão fosfato, pH 6,8) por 6 minutos.

3.2.6. Coloração com fluorocromos base-específicos (DAPI e MM)

Regiões heterocromáticas específicas também foram analisadas usando os fluorocromos Mitramicina (MM) e 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), segundo Schweizer (1976). As lâminas foram envelhecidas entre três e cinco dias. Um volume de 30 µl de MM (0,5 mg/ml) foi depositado em cada lâmina que foi coberta com lamínula e permaneceu em câmara úmida por duas horas. Após este procedimento, as lâminas foram lavadas com água destilada e deixadas para secar ao ar. Posteriormente foram coradas com 30 µl de DAPI 2µl/ml por 30 minutos. Novamente foram lavadas com água destilada e deixadas para secar ao ar. As lâminas foram montadas em tampão glicerol-McIlvaine pH 7,0 (1:1), preservadas em câmara escura, por quinze dias e então analisadas.

3.2.7. Hibridização in situ com fluorescência (FISH) – SONDAS 18S e 5S

3.2.7.1 Obtenção das sondas para hibridização cromossômicas

As sondas 5S e 18S DNAr, contendo aproximadamente 200 pb e 1400pb, respectivamente, foram obtidos por reação em cadeia da polimerase (PCR) a partir do DNA nuclear de Rachycentron canadum (Teleostei, Perciformes), utilizando os iniciadores A 5’- TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’ e B 5’- CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendas et al., 1994), NS1 5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’ e NS8 5’-TCC GGT GCA TCA CCT ACG GA-3’(White et al., 1990), respectivamente. O DNAr 18S foi marcado com digoxigenina-11-dUTP e a sonda de DNAr 5S foi marcado com biotina-14-dATP, por nick translation em conformidade com as especificações do fabricante (BionickLabeling System, Invitrogen).

3.2.7.2 Hibridização cromossômica

A hibridização in situ com fluorescência (FISH) foi realizada de acordo com Pinkel et al. (1986). Os cromossomos metafásicos foram tratados com RNAse (20µg/ml em 2XSSC) Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 22

por 1 hora a 37°C e com pepsina (0,005% em HCl 10mM) a 37°C por 10 minutos, fixados com formaldeído a 1% por 10 minutos e em seguida desidratados em um série alcoólica (70%/85%/100%) por 5 minutos cada. As lâminas com os cromossomos metafásicos foram incubadas em 70% formamida/2XSSC à 72°C, por 5 minutos e novamente desidratadas em um série alcoólica (70%/85%/100%) por 5 minutos cada. A solução de hibridização, consistindo de 50% de formamida, 2XSSC, 10% de sulfato dextrano e a sonda desnaturada (5 ng/µl), em um volume final de 30 µl, foi depositada sobre a lâmina e a hibridização realizada por 16h à 37°C. As lavagens pós-hibridização foram efetuadas em 15% formamida/0.2×SSC a 42°C, por 20 minutos, seguidas de lavagens em 0,1×SSC à 60°C por 15 minutos e em Tween 20 0,5%/4×SSC por 5 minutos à temperatura ambiente, e posteriormente incubada por 15 minutos na solução de bloqueio 5% NFDM/4xSSC, em seguida lavadas em (Tween 20 0,5%/4×SSC) por 15 minutos. Os sinais de hibridização das sondas foram detectados usando anti-digoxigenina rodamina conjugada (Roche) para a sonda DNAr 18S e streptavidina-FITC conjugado (Vector) para a sonda DNAr 5S. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml) (Vector).

3.2.8. Análises cromossômicas

As lâminas previamente preparadas com as suspensões celulares de cada indivíduo foram fotografadas com um microscópio de epifluorescência OlympusTM BX50 acoplado a um sistema de captura digital Olympus DP73 utilizando o software cellSens (Olympus). As metáfases foram analisadas visando o estabelecimento do valor diploide modal para cada espécie/população e definição dos padrões morfológicos cromossômicos. A montagem dos cariótipos deu-se pela ordenação dos cromossomos em grupos levando-se em consideração à razão entre os braços (Levan et al.,1964).

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 23

4. CAPÍTULO I Dinâmica dos genes ribossomais em cromossomos das espécies da Tribo Julidini (Labridae, Perciformes)

Karlla Danielle Jorge Amorim1, Marcelo de Bello Cioffi2, Luiz Antônio Bertollo2, Rodrigo Xavier Soares1, Allyson Santos Souza1, Gideão Wagner Werneck Felix da Costa1, Wagner Franco Molina1.

1Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil.

2 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos. SP, Brasil.

Resumo

Labridae constitui um grupo extremamente diverso que desperta grande interesse ecológico, em virtude de suas complexas interações com o ambiente recifal. Suas espécies se distribuem extensamente nos oceanos Índico, Pacífico e Atlântico. Dados citogenéticos baseados em técnicas clássicas e através do mapeamento de sequências repetitivas têm contribuído na identificação dos mecanismos de divergência cariotípica intra e interespecífica, e evidenciado regiões cromossômicas complexas que só agora começam a ser melhor caracterizadas. Visando ampliar os dados sobre a estrutura cariotípica das espécies e dos processos de diversificação cromossômica foram analisados os padrões heterocromáticos, distribuição de sítios GC-específicos e Ag-RONs, bem como o mapeamento de sítios DNAr 5S e 18S nas espécies Thalassoma noronhanum e em quatro espécies de Halichoeres do Atlântico, H. radiatus, H. poeyi, H. brasiliensis e H. penrosei. Todas as espécies apresentaram 2n=48 com variações na fórmula cariotípica entre os gêneros. Enquanto, T. noronhanum, apresentou 2m+46a, as espécies do gênero Halichoeres compartilham cariótipos com 48 cromossomos acrocêntricos, que divergem quanto ao padrão heterocromático, regiões GC-ricas e a quantidade e distribuição de DNAr 5S e 18S. Os sítios DNAr 18S (3 a 5 loci) e DNAr 5S (1 a 3 loci) se mostraram numericamente variáveis, mas com padrões estruturais compartilhados entre espécies próximas. Sítios DNAr18S/5S co-localizados estavam presentes em todas as espécies. A extensa ocorrência de sítios ribossomais sintênicos em Halichoeres demonstra ancestralidade comum, marcada por singularidades cromossômicas na família Labridae. Apesar de independentes evolutivamente, a sintenia destes genes indica que possam ser eventos funcionalmente estáveis e filogeneticamente difundidos neste e em outros grupos de peixes. Palavras-chave: Budiões, evolução cromossômica, DNAr, genes sintênicos, Halichoeres.

Abstract

Labridae constitutes an extremely diverse group that arouses great ecological interest because of its complex interactions with the reef environment. Its species are widely distributed in the Indian, Pacific and Atlantic. Cytogenetical data based on classical a techniques and mapping of repetitive sequences have significantly contributed to the identification of intra and interspecific mechanisms of karyotype divergence, evidencing complex chromosomal regions that only now are only being better characterized. Aiming to expand the data on the karyotypical structure of the species and the chromosomal diversification processes were Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 24

analyzed heterochromatic patterns, distribution of GC-specific and Ag-NORs sites as well as the mapping of 5S and 18S rDNA sites in Thalassoma noronhanum species and four species of Halichoeres from the Atlantic, H. radiatus, H. poeyi, H. brasiliensis and H. penrosei. All species showed 2n = 48 karyotype formula with variations in the karyotype formula among the genera. While T. noronhanum presented 2m + 46a, the species of the Halichoeres genus share karyotypes with 48 acrocentric chromosomes, which differ about the heterochromatic pattern GC-rich regions and the amount and distribution of 5S and 18S rDNA. The sites of 18S rDNA (3 to 5 loci) and rDNA 5S (1 to 3 loci) are shown numerically variables, but with shared structural patterns between closely related species. Sites rDNA18S / 5S co-localized were present in all species. The extensive occurrence of syntenic ribosomal sites in Halichoeres demonstrates common ancestry, marked by chromosomal singularities in the Labridae family. Although evolutionarily independents, the synteny of these genes indicate that they may be functionally stable and phylogenetically diffused in that and other groups of fish.

Keywords: Wrasse, chromosomal evolution, rDNA, syntenic genes, Halichoeres.

4.1 Introdução

Entre os grupos com maior representatividade nos ambiente recifal se destaca a família Labridae, composta por 82 gêneros e 530 espécies distribuídas em nove tribos (Westneat & Afaro, 2005; Eschmeyer & Fong, 2016). Nesta família, o gênero Halichoeres é o mais diverso, sendo considerado um grupo polifilético (Barber & Bellwood, 2005; Westneat & Alfaro 2005; Baliga & Law, 2016) cujos processos especiativos estão associados tanto a eventos alopátricos, como parapátricos (Rocha, 2004; Rocha et al., 2005; Beldade et al., 2009). Apesar das espécies do Atlântico tropical e Pacífico Oriental, constituírem um grupo monofilético, H. maculipina e H. penrosei revelam maior proximidade com o gênero Thalassoma (Barber & Bellwood, 2005; Rocha, Pinheiro & Gasparini, 2010). Dados moleculares indicam que o gênero Thalassoma originou-se há aproximadamente 8-13 milhões de anos. Além disso, os mesmos dados indicam que entre 5-10 milhões de anos atrás, uma explosão especiativa ocorreu no gênero Thalassoma, gerando uma grande variedade de padrões de coloração, diferenças de comportamento e ampla expansão geográfica (Bernardi et al., 2004). Algumas espécies de Halichoeres no Atlântico apresentam ampla distribuição geográfica, estando sujeitas a diferentes regimes adaptativos e possíveis restrições ao fluxo gênico. A espécie H. radiatus é encontrada nas sul dos EUA, Golfo do México e nas ilhas Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 25

oceânicas brasileiras de Fernando de Noronha, Atol das Rocas e Arquipélago de São Pedro e São Paulo (Rocha & Rosa, 2001). H. poeyi é encontrada desde o sul da Flórida no EUA, nas Bahamas até Santa Catarina, Brasil (Rocha et al., 2010). Outras espécies como H. brasiliensis e H. penrosei também possuem grandes áreas de distribuição que se estendem do norte ao sul do Brasil, chegando a Ilha de Trindade, 1.200 km a oeste do Espírito Santo, litoral sudeste brasileiro (Rocha & Rosa, 2001; Menezes et al., 2003; Rocha, 2004). Thalassoma noronhanum é encontrada do Parcel de Manuel Luiz até a costa de São Paulo, e em todas as ilhas oceânicas brasileiras (Rocha et al., 2001). Diante de registros prévios de ocorrência de divergências citogenéticas em espécies de peixes marinhos do Atlântico com ampla distribuição geográfica (Accioly et al., 2012; Motta- Neto et al., 2012), a identificação dos aspectos citogenéticos de espécies de Halichoeres podem ser informativos em relação a taxonomia e possíveis estruturações populacionais. De forma aplicada, a citogenética molecular tem contribuído para o conhecimento da evolução da ictiofauna, podendo ser aplicada na diferenciação de espécies relacionadas e na reconstrução das relações filogenéticas (Costa et al., 2016). A utilização crescente da FISH tem potencializado uma melhor interpretação de rearranjos cromossômicos, identificação de cromossomos específicos e mapeamento gênico. Esta metodologia permite avaliar a dinâmica e evolução das diversas classes de DNA repetitivos, contribuindo para definição da estrutura, organização do genoma das espécies e o melhor entendimento das relações evolutivas existentes entre diversos táxons (Shapiro & Sternberg, 2005; Biémont & Vieira, 2006). Sequências repetitivas estão envolvidas em rearranjos cromossômicos e são responsáveis por variações cariotípicas em muitos grupos (Kidwell, 2002). Em Labridae análises citogenéticas têm demonstrado alguns padrões cariotípicos particulares entre alguns grupos (Sena & Molina, 2007). Eventos como inversões pericêntricas estão preferencialmente presentes nas Tribos Hypsigenyini, Cheilini, Pseudocheilini, Labrini, Pseudolabrini e Scarini, fato evidenciado por números fundamentais superiores a 48 (Sena & Molina, 2007; Molina et al., 2012), enquanto em Novaculini, Labrichthyines, Julidini números fundamentais menores ou iguais a 48 indicam que as fusões robertsonianas tiveram um papel destaque na diversificação cariotípica (Ueno & Takai, 2000). De fato, quatro tendências cariotípicas têm sido identificadas. A primeira são espécies com cariótipos compostos por 48 cromossomos acrocêntricos; a segunda por espécies com Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 26

cariótipos com 48 cromossomos, mas aumento do número de braços cromossômicos (NF); a terceira representada por cariótipos com redução do número cromossômico (<48 cromossomos) e manutenção do NF; e a quarta constituída por cariótipos com redução do número de cromossomos e de NF (Alvarez et al., 1986; Sena & Molina, 2007). Com vistas a ampliar o conhecimento dos aspectos cromossômicos e processos de mudança, envolvidos na diversificação cariotípica do gênero Halichoeres no Atlântico foram analisados os padrões citogenéticos das espécies T. noronhanum, H. radiatus, H. poeyi, H. brasiliensis e H. penrosei, obtidos por meio de análises clássicas (bandamento C, Ag-RONs, coloração com fluorocromos base-específicos) e por hibridização in situ com fluorescência (FISH), de sequências do DNAr 18S e 5S. Diante do interesse taxonômico e filogenético envolvendo Labridae, a aplicação de metodologias da citogenética clássica e molecular utilizando o mapeamento de diversas sequências repetitivas contribui no esclarecimento dos aspectos carioevolutivos, processos de mudanças nos cromossomos e inferências filogenéticas ao longo da diversificação da família.

4.1.2 Material e métodos

Espécimes e preparação cromossômicas

Os exemplares das espécies Halichoeres poeyi (N=13) e H. brasiliensis (N=6) foram coletados na costa do Rio Grande do Norte (5°42’20”S, 35°11’38”O), nordeste do Brasil. H. radiatus (N=16) foi coletada no Arquipélago de Fernando de Noronha (3º51’20”S, 32º25’32”O) enquanto H. penrosei (N=3), coletada na ilha de Trindade (20º30’13”S, 29º19’50”O) e Thalassoma noronhunum no Atol das Rocas (N=22) (3º51’59”S, 33º48’20”O) com o auxílio de rede de confecção própria. Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 27

Figura 1. Pontos de coleta das espécies de Labridae analisadas. Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN); Atol das Rocas (AR); Rio Grande do Norte (RN); Bahia (BA); e Ilha da Trindade (IT). Halichoeres radiatus (AFN), H. brasiliensis (RN), H. poeyi (BA), H. penrosei (IT) e Thalassoma noronhanum (AR).

Os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica intraperitoneal com complexos antígenos fúngicos e bacterianos (Molina et al., 2010). A preparação de cromossomos mitóticos foi realizada a partir da suspensão de fragmentos do tecido renal de acordo com a técnica in vitro preconizada por Gold et al. (1990). Os cromossomos foram corados com solução de Giemsa à 5%, diluída em tampão fosfato pH 6,8. As regiões heterocromáticas foram visualizadas através da técnica de bandamento C (Sumner, 1972). A coloração com os fluorocromos Mitramicina (MM) e 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) seguiu o protocolo de Schweizer (1976) enquanto a detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foi realizada pela técnica de impregnação por nitrato de prata (Howell & Black, 1980).

Obtenção das sondas para hibridização cromossômicas

As sondas de DNAr 5S e 18S, contendo aproximadamente 200 pb e 1400 pb, respectivamente, foram obtidas por reação em cadeia da polimerase (PCR), a partir do DNA nuclear de Rachycentron canadum, utilizando os iniciadores A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’ e B 5’- CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al., 1994), NS1 5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’ e NS8 5’-TCC GGT GCA TCA CCT ACG GA- Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 28

3’(White et al., 1990), respectivamente. As sondas para DNAr 18S foram marcadas com digoxigenina-11-dUTP (Roche) e detectadas com anti-digoxigenina-rodamina (Roche), enquanto as sondas de DNAr 5S foram marcadas com biotina-14-dATP (Invitrogen) e detectada com streptavidina – FITC (Vector), por PCR, em conformidade com as especificações do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha).

Hibridização cromossômica

A hibridização in situ com fluorescência (FISH) foi realizada de acordo com Pinkel et al. (1986). Os cromossomos metafásicos foram tratados à 37°C com RNAse (20µg/ml em 2XSSC) por 1 hora e com pepsina (0,005% em HCl 10mM) por 10 minutos, fixados com formaldeído a 1% por 10 minutos e em seguida desidratados em um série alcoólica (70%/85%/100%) por 5 minutos cada. As lâminas com os cromossomos metafásicos foram incubadas em 70% formamida/2XSSC à 72°C, por 5 minutos e novamente desidratadas em um série alcoólica (70%/85%/100%) por 5 minutos cada. A solução de hibridização, consistindo de 50% de formamida, 2XSSC, 10% de sulfato dextrano e a sonda desnaturada (5 ng/µl), em um volume final de 30 µl, foi depositada sobre a lâmina e a hibridização realizada por 16h à 37°C. As lavagens pós-hibridização foram efetuadas em 15% formamida/0.2XSSC à 42°C, por 20 minutos, seguidas de lavagens em 0,1×SSC à 60°C por 15 minutos e em Tween 20 (0,5%/4XSSC) por 5 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente foram incubadas por 15 minutos na solução de bloqueio (NFDM 5%/4xSSC), em seguida lavadas em Tween 20 (0,5%/4XSSC) por 15 minutos. Os sinais de hibridização das sondas foram detectados usando anti-digoxigenina rodamina conjugada (Roche) para a sonda DNAr 18S e estreptavidina-FITC conjugado (Vector) para a sonda DNAr 5S. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml) (Vector). As melhores metáfases foram fotografadas com um microscópio de epifluorescência OlympusTM BX50, acoplado a um sistema de captura digital Olympus DP73 utilizando o software CellSens (Olympus). Os cromossomos foram definidos de acordo com a razão entre os braços, segundo Levan et al. (1964).

4.1.3 Resultados

As espécies H. radiatus, H. poeyi, H. brasiliensis e H. penrosei apresentaram um cariótipo com 48 cromossomos acrocêntricos (NF=48) (Figura 1 b-e). Thalassoma noronhanum apresentou 2n=48, com 2sm+46a (NF=50) (Figura 1a). Blocos heterocromáticos Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 29

reduzidos estavam distribuídos principalmente nas regiões centroméricas e pericentroméricas dos cromossomos das espécies. Em T. noronhanum as regiões organizadoras de nucléolos foram detectadas no braço curto do único par submetacêntrico (Figura 1a). Nas espécies de Halichoeres, sítios Ag-RONs estão localizados em dois pares cromossômicos, exceto em H. penrosei, onde estão localizados no braço curto do par 15 (Figura 1b, em destaque). Em H. poeyi, sítios Ag-RONs foram detectadas no braço curto dos pares 5 e 15 (Figura 1c) e em H. radiatus e H. brasiliensis, no braço curto dos pares 5 e 24 (Figura 1d,e). O mapeamento de sequências DNAr 18S (Figura 2 b-e) identificou sítios múltiplos em todas as espécies. Em T. noronhanum sítios de DNAr 18S estavam localizados no braço curto do par submetacêntrico. Os sítios DNAr 18S se mostraram co-localizados com sequências de DNAr 5S, que também estavam presentes no braço curto do par 14 (Figura 2a). Em H. penrosei os sítios DNAr 18S ocupam as posições terminais dos braços curtos dos pares 5, 6, 15, 19 e 22 (Figura 2b), em H. poeyi nos pares 5, 6 e 15 (Figura 2c), em H. radiatus nos pares 5, 15 e 24 (Figura 2d), e em H. brasiliensis nos pares 5, 15 e 24 (Figura 2e). Todos os sítios DNAr 5S nas espécies de Halichoeres se mostraram co-localizados com sítios DNAr 18S (Figura 2). Em H. penrosei, os sítios DNAr 5S se mostraram únicos, ocupando a região terminal do braço curto do par 15. Sítios 5S múltiplos estavam presentes em H. poeyi (terminal nos pares 5 e 15), H. radiatus (pericentromérica no par 5 e terminal no par 24) e H. brasiliensis (terminal nos pares 5 e 24). Apesar do grande número de sítios DNAr 18S, sítios ribossomais ativos (sítios Ag-RON) estavam presentes apenas nos cromossomos portadores de arranjos DNAr 18S/5S. A coloração MM/DAPI revelou sítios GC-ricos coincidentes com as posições dos sítios DNAr 18S e arranjos DNAr 18S/5S, embora H. penrosei e H. brasiliensis exibam um número maior de sinais MM+, do que os sítios DNAr identificados.

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 30

Figura 2. Cariótipos das espécies T. noronhanum (a), H. penrosei (b), H. poeyi (c), H. radiatus (d) e H. brasiliensis (e). Em destaque nas caixas, os pares portadores dos sítios Ag-RONs. Barra=5 μm. Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 31

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 32

4.1.4 Discussão Um extenso conservadorismo cromossômico tem sido demonstrado que alguns grupos de peixes marinhos, revelando um ritmo lento de diversificação cromossômica (estase cariotípica), em relação aos padrões estruturais e constitutivos dos cromossomos (Molina, 2007; Neto et al., 2011; Calado et al., 2013). Em contraste, outros grupos taxonômicos demonstram condições intermediárias ou extremamente mais diversificadas (Lima-Filho et al., 2014 a,b; Molina et al., 2014). Em Labridae ocorrem números diploides diversificados, que podem variar de 22 a 48 cromossomos e números de braços cromossômicos de 38 a 92 (Arai, 2011), que sugerem reflexos de uma rica história evolutiva, em profunda associação com a dinâmica evolutiva dos recifes de corais (Wainwright et al., 2004). Dados citogenéticos disponíveis para espécies do gênero Halichoeres, baseados em métodos citogenéticos clássicos, têm evidenciado características cariotípicas numéricas e estruturais menos diferenciadas, que sugeriam menor dinamismo evolutivo (Sena & Molina, 2007). Em geral exibem cariótipos com 2n=48, apresentando divergências cariotípicas decorrentes de rearranjos Robertisonianos ou inversões pericêntricas (Tabela 1). São formados na sua maioria por elementos acrocêntricos, quantidade reduzida de heterocromatina e um ou dois pares portadores de sítios Ag-RONs. Contudo, os dados citogenéticos obtidos indicaram uma maior dinâmica quanto as regiões de DNA repetitivo no cariótipo das espécies. As regiões heterocromáticas em T. noronhanum, H. penrosei, H. poeyi, H. radiatus e H. brasiliensis se mostram heterogêneas, em contraste com os padrões citogenéticos macroestruturais, evidenciado pela variação da quantidade de regiões heterocromáticas GC- ricas (MM+/DNAr 18S/Ag+), dispersas nos cromossomos das espécies. Desta forma, apesar do compartilhamento de características cariotípicas estruturais basais, Halichoeres demonstra uma insuspeita dinâmica cromossômica, relacionada à frequência, distribuição e organização dos sítios de DNAr nos cromossomos. A quantidade e composição da heterocromatina podem estar relacionadas com a diversificação do cariótipo de muitos grupos de peixes (Moreira-Filho & Bertollo 1991; Souza et al., 2001; Motta-Neto et al., 2012). Regiões heterocromáticas, ricas em variados DNAs repetitivos, poderiam favorecer o aumento na dinâmica de alguns eventos cariotípicos. Por outro lado, tem sido proposto que quantidades reduzidas e homogêneas de heterocromatina poderiam conduzir a uma condição menos dinâmica, o que limitaria macromudanças cariotípicas em alguns grupos (Molina, 2007; Motta-Neto et al., 2011). Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 33

Sítios Ag-RONs únicos em T. noronhanum e H. penrosei indicam uma condição mais basal compartilhada com inúmeros outros grupos marinhos (Galetti et al., 2000), enquanto que os sítios múltiplos presentes em H. poeyi, H. radiatus e H. brasiliensis revelam uma condição derivada. Além de sítios ribossomais ativos, outras regiões DNAr supranumerárias presentes no cariótipo destas espécies, sugerem que essa variabilidade esteja relacionada a processos evolutivos do DNAr como birth-and-death (Rooney & Ward, 2005), ou evolução em concerto (Eickbush & Eickbush, 2007; Lima-Filho et al., 2014). Em vertebrados, a localização em cromossomos distintos dos sítios DNAr 45S e 5S é a condição mais comum (Lucchini et al., 1993; Suzuki et al.,1996; Gornung, 2013) indicando uma evolução independente destes loci. Tem sido proposto que arranjos não-sintênicos representa uma vantagem funcional dos genes ribossomais tendo em vista que são transcritos por RNA polimerases distintas (Martins & Galetti, 2001). Entretanto, evolutivamente tais genes eventualmente apresentam arranjo sem que se mostrem co-localizados em um único par cromossômico (Pendas et al., 1994; Fujiwara et al., 1998), podendo ocupar posições circunvizinhas ou arranjos interpassados (Artoni et al., 2015). Arranjos sintênicos como os observados em Halichoeres e Thalassoma, foram observados em outros Labridae (Mandrioli et al., 2000), bem como em espécies de diferentes ordens, como Anguilliformes (Deiana et al., 2006), Characiformes (Vicari et al., 2006; Bellafronte et al., 2009; Cioffi et al., 2009), Siluriformes (Mariotto et al., 2011; Ziemniczak et al., 2012), Salmoniformes (Pendás et al., 1994), Nototheniformes (Ghigliotti et al., 2007), Tetraodontiformes (Martinez et al., 2010) e Perciformes (Müller et al., 2008; Merlo et al., 2013). Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 34

Figura 4. Padrões evolutivos dos sítios ribossomais nas espécies T. noronhanum, H. radiatus, H. poeyi, H. brasiliensis e H. penrosei, sob perspectiva filogenética (Relações filogenéticas adaptadas de Rocha et al., Gasparini, 2010). Do ponto de vista filogenético, análises de mapeamento cromossômico de sítios DNAr 45S e 5S em espécies co-genéricas sugerem que arranjos sintênicos destes genes são estocásticos e pouco frequentes, ocupando em geral um único sítio no cariótipo e limitado a poucas espécies de um clado (Almeida-Toledo et al., 2002; Calado et al., 2014). Entretanto, a organização dos genes ribossomais em T. noronhanum e nas espécies de Halichoeres aqui estudadas contrastam com tal condição, pela alta frequência destes arranjos, representando uma condição simplesiomórfica nas espécies Atlânticas. Os arranjos DNAr 18S/5S constituem marcadores citotaxonômicos efetivos, como também evidenciam homeologias filogenéticas interespecíficas. Sítios ribossomais 18S, estão compartilhados nos pares 5 e 15 de todas as espécies, embora possam ou não apresentar arranjos co-localizados com sítios DNAr 5S. Válidas como marcadores citotaxonômicos, as sequências de DNAr 5S podem se mostrar bastante conservadas mesmo entre táxons filogeneticamente não relacionados (Perina et al. 2011). Na maioria dos eucariotos essas sequências estão organizadas em repetições in tandem, no qual as diferenças interespecíficas estão relacionadas a regiões espaçadoras não transcritas (NTS), extremamente variáveis, em virtude às inserções/deleções, minissatélites e pseudogenes (Nelson & Honda, 1985; Leah et al., 1990; Alves-Costa et al., 2008).

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 35

2n NF Tribo Mín-Máx/Moda Média Mín-Máx/Moda Média Hypsigenyini (n=7) 48 48 56-86/78 76 Pseudocheilini ( n=8) 34-48/34 41 46-84/46 65 Julidini (32) 48 48 48-86/48 52 Labrini (10) 38-48/48 46 48-86/48 46 Scarini (5) 46-48/48 47 66-88/66 74 Cheilini (8) 32-48/48 43 38-84/60 66 Labrichthyines (1) 48 48 48 48 Novaculini (8) 22-48/48 43 40-56/48 47 Pseudolabrini (1) 48 48 52 52

Tabela 1. Variação entre o valor diplóide e o número fundamental entre as subfamílias ou tribos cariotipadas até o momento. (Adaptada de Arai, 2011).

Halichoeres penrosei, que apresenta uma condição filogenética mais basal em relação às espécies H. poeyi, H. radiatus e H. brasiliensis (Rocha et al., 2010) exibiu um maior número de sítios 18S (10 sítios, ao invés dos 6 das demais espécies), e menor quantidade de sítios 5S (2 sítios, ao invés dos 4 das demais espécies). Um padrão diferencial foi observado quanto aos sítios Ag-RONs, que em H. penrosei se localizam em um par cromossômico e dois pares nas demais espécies do gênero. Esta condição reforça a menor proximidade filogenética de H. penrosei em relação às demais espécies. Arranjos de DNAr 18S/5S em outros organismos podem estar intimamente associados a sequências teloméricas (Vitturi et al., 2002). Esta condição deve merecer atenção futura nas espécies de Halichoeres, tendo em vista a presença de co-localizações em posição intersticial, como observado no par 5 de H. radiatus. A extensa ocorrência de co-localização de sítios 18S/5S nas espécies analisadas, contrasta com espécies onde esse arranjo se mostra estocástico e taxonomicamente restrito (Drouin & Sá, 1995; Calado et al., 2013). Mais do que fruto da inércia filogenética, aponta uma elevada funcionalidade adaptativa deste arranjo, uma vez que todos os sítios Ag-RONs destas espécies estão relacionados a arranjos 18S/5S. Como característica citogenética particular deste gênero, arranjos sintênicos dos genes 45S-5S indica que possam ser eventos funcionalmente estáveis e mais frequentes do que se pensava em Labridae.

Agradecimentos

No. 19135/1), a Universidade Federal do Rio Grande do Norte por prover os meios para conduzir o estudo, e a José Garcia Júnior pela identificação taxonômica das espécies.

Referências

Accioly, I.V., Bertollo, L., Costa, G., Jacobina, U., Molina, W. (2012). Chromosomal population structuring in carangids (Perciformes) between the north-eastern and south-eastern coasts of Brazil. African Journal of Marine Science, 34: 383–89.

Almeida-Toledo, L.F., Ozouf-Costaz, C., Foresti, F., Bonillo, C.et al. (2002). Conservation of the 5S- bearing chromosome pair and co-localization with major rDNA clusters in five species of Astyanax (Pisces, Characidae). Cytogenetic and Genome Research, 97: 229–33.

Alvarez, M.C., Garcia, E., Thode, G. (1986). Contribution to the karyotypes of Ctenolabrus rupestris and Symphodus ocellatus. Caryologia, 39: 353-357.

Alves-Costa, F.A., Martins, C., Matos, F.D.C., Foresti, F., Oliveira, C., Wasko, A.P. (2008). 5S rDNA characterization in twelve Sciaenidae fish species (Teleostei, Perciformes): Depicting gene diversity and molecular markers. Genetics and Molecular Biology, 31: 303–7.

Arai, R. (2011). Fish Karyotypes:A Check List. Springer, 340p.

Artoni, R.F., Castro, J.P., Jacobina, U.P., Lima-Filho, P.A. et al. (2015). Inferring diversity and evolution in fish by means of integrative molecular cytogenetics. The Scientific World Journal.

Baliga, V.B., Law, C.J. (2016). Cleaners among wrasses: Phylogenetics and evolutionary patterns of cleaning behavior within Labridae. Molecular Phylogenetics and Evolution, 94: 424–435.

Barber, P.H., Bellwood, D.R. (2005). Biodiversity hotspots: Evolutionary origins of biodiversity in wrasses (Halichoeres: Labridae) in the Indo-Pacific and new world tropics. Molecular Phylogenetics and Evolution, 35: 235–53.

Beldade, R., Heiser, J.B., Robertson, D.R., Gasparini, J.L. et al. (2009). Historical biogeography and speciation in the creole wrasses (Labridae, Clepticus). Marine Biology, 156: 679–87.

Bellafronte, E., Vicari, M.R., Artoni, R.F., Margarido, V.P., Moreira-Filho, O. (2009). Differentiated ZZ/ZW sex chromosomes in Apareiodon ibitiensis (Teleostei, Parodontidae): Cytotaxonomy and biogeography. Journal of Fish Biology, 75: 2313–25.

Biémont, C., Vieira, C. (2006). Genetics: Junk DNA as an evolutionary force. Nature, 443: 521–24.

Calado, L.L., Bertollo, L.A.C., Cioffi, M.B., Costa, G.W.W.F. et al. (2014). Evolutionary dynamics of rDNA genes on chromosomes of the Eucinostomus fishes: cytotaxonomic and karyoevolutive implications. Genetics and Molecular Research, 13: 9951–59.

Calado, L.L., Bertollo, L.A.C., Costa, G.W.W.F., Molina, W.F. (2013). Cytogenetic studies of Atlantic mojarras (Perciformes - Gerreidae): Chromosomal mapping of 5S and 18S ribosomal genes using double FISH. Aquaculture Research, 44: 829–35.

Cioffi, M.B., Martins, C., Centofante, L., Jacobina, U., Bertollo, L.A.C. (2009). Chromosomal variability among allopatric populations of Erythrinidae fish Hoplias malabaricus: mapping of three classes of repetitive DNAs. Cytogenetic and Genome Research, 125: 132–41. Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 37

Costa, G.W.W.F., Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C., Molina, W. F. (2016). The Evolutionary Dynamics of Ribosomal Genes, Histone H3, and Transposable Rex Elements in the Genome of Atlantic Snappers.Journal of Heredity, no. España 2003: esv136.

Deiana, A.M., Coluccia, E., Cannas, R., Pesci, P., Fonnesu, A., Salvadori, S. (2006). Colocalization of the ribosomal gene families in Conger conger (Anguilliformes, Congridae). Italian Journal of Zoology, 73: 1–5.

Drouin, G., Sá, M.M. (1995). The concerted evolution of 5S ribosomal genes linked to the repeat units of other multigene families. Molecular Biology and Evolution, 12: 481–93.

Eickbush, T.H., Eickbush, D.G. (2007). Finely orchestrated movements: Evolution of the ribosomal RNA genes. Genetics, 175: 477–85.

Eschmeyer, W.N., Fong, J.D. (2016). Catalog of Fishes electronic version (4Jan 2016), San Francisco: California Academy of Sciences. Disponível em: http://researcharchive.calacademy.org/research/ichthyology/catalog/SpeciesByFamily.asp#La bridae.

Fujiwara, A., Abe, S., Yamaha, E., Yamazaki, F., Yoshida, M.C. (1998). Chromosomal localization and heterochromatin association of ribosomal RNA gene loci and silver-stained nucleolar organizer regions in salmonid fishes. Chromosome Research, 6: 463–471.

Galetti, P.M., Aguilar, C.T., Molina, W.F. (2000). An overview of marine fish cytogenetics. Hydrobiologia, 420: 55–62.

Ghigliotti, L., Mazzei, F., Ozouf-Costaz, C., Bonillo, C. et al. (2007). The two giant sister species of the Southern Ocean, Dissostichus eleginoides and Dissostichus mawsoni, differ in karyotype and chromosomal pattern of ribosomal RNA genes. Polar Biology, 30: 625–34.

Gold, J.R., Li, Y.C., Shipley, N.S., Powers, P.K., (1990). Improved methods for working with fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding. Journal of Fish Biology, 37: 563–75.

Gornung, E. (2013). Twenty years of physical mapping of major ribosomal rna genes across the teleosts: A review of research. Cytogenet. Cytogenetic and Genome Research, 141: 90–102.

Howell, W. M., Black, D.A. (1980). Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, 36: 1014–1015.

Kidwell, M. G. (2002). Transposable elements and the evolution of genome size in eukaryotes. Genetica, 115: 49–63. Leah, R., Frederiksen, S., Engberg, J., Sorensen, P.D. (1990). Nucleotide sequence of a mouse 5S rRNA variant gene. Nucleic Acids Research,18: 7441.

Levan, A., Fredga, K., Sandberg, A. (1964). Nomenclature for centromeric position at chromosomes. Hereditas, 201–20.

Lima-Filho, P. A., Amorim, K. D. J., Cioffi, M. B., Bertollo, L. A. C., Molina, W. F. (2014a). Chromosomal Mapping of Repetitive DNAs in Gobionellus Oceanicus and G. Stomatus (Gobiidae; Perciformes): A Shared XX/XY System and an Unusual Distribution of 5s rDNA Sites on the Y Chromosome. Cytogenetic and Genome Research, 144: 333–40.

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 38

Lima-Filho, P. A, Bertollo, L.A.C., Cioffi, M.B., Costa, G.W.W.F., Molina, W.F. (2014b). Karyotype divergence and spreading of 5S rDNA sequences between genomes of two species: Darter and emerald gobies (Ctenogobius, Gobiidae). Cytogenetic and Genome Research, 142: 197–203.

Lucchini, S.D., Nardi, I., Barsacchi, G., Batistoni, R., Andronico, F. (1993). Molecular cytogenetics of the ribosomal (18S + 28S and 5S) DNA loci in primitive and advanced Urodele amphibians. Genome, 36: 762–73.

Mandrioli, M., Colomba, M.S., Vitturi, R. (2000). Chromosomal analysis of repeated DNAs in the rainbow wrasse Coris julis (Pisces, Labridae). Genetica, 108: 191–95.

Mariotto, S., Centofante, L., Vicari, M.R., Artoni, R.F., Moreira-Filho, O. (2011). Chromosomal diversification in ribosomal DNA sites in Ancistrus kner, 1854 (Loricariidae, Ancistrini) from three hydrographic basins of Mato Grosso, Brazil. Comparative Cytogenetics, 5: 289-300.

Martinez, P.A., Araujo, W.C., Molina, W.F. (2010). Derived cytogenetic traits, multiple NORs and B chromosomes in the compact karyotype of Canthigaster figueiredoi (Tetraodontiformes). Marine Genomics, 3: 85–89.

Martins, C., Galetti, P.M. (2001). Two 5S rDNA arrays in Neotropical fish species: Is it a general rule for fishes. Genetica, 111: 439–46.

Menezes, N.A., Buckup, P.A., Figueiredo, J.L., Moura, R.L. (2003). Catálogo das espécies de peixes marinhos do Brasil. Museu de Zoologia da USP. 160p.

Merlo, M. A, Cross, I., Manchado, M., Cárdenas, S., Rebordinos, L. (2013). The 5S rDNA high dynamism in Diplodus sargus is a transposon-mediated mechanism. Comparison with other multigene families and Sparidae species. Journal of Molecular Evolution, 76: 83–97.

Molina, W.F. (2007). Chromosomal changes and stasis in marine fish groups. In:Pisano, E., Ozouf- Costaz, C., Foresti, F., Kapoor, B.G. (Eds.), Fish Cytogenetics. Science Publishers, Enfield, pp. 69–110.

Molina, W.F., Martinez, P. A, Bertollo, L.A.C., Bidau, C.J. (2014). Evidence for meiotic drive as an explanation for karyotype changes in fishes. Marine Genomics, 15: 29–34.

Molina, W.F., Motta-Neto, C.C.M., Sena, D.C.S., Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C. (2012). Karyoevolutionary aspects of Atlantic hogfishes (Labridae-Bodianinae), with evidence of an atypical decondensed argentophilic heterochromatin. Marine Genomics, 6: 25–31.

Moreira-Filho, O., Bertollo L. (1991). Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): A species complex. Genetics and Molecular Biology, 14: 331-357.

Motta-Neto, C.C.M., Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C., Molina, W.F. (2011). Extensive chromosomal homologies and evidence of karyotypic stasis in Atlantic grunts of the genus Haemulon (Perciformes). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 401: 75–79.

Motta-Neto, C.C.M., Lima-Filho, P.A., Araújo, W.C., Bertollo, L.A.C., Molina, W.F. (2012). Differentiated evolutionary pathways in Haemulidae (Perciformes): Karyotype stasis versus morphological differentiation. Reviews in Fish Biology and Fisheries 22: 457–65.

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 39

Müller, M., Ghigliotti, L., Mazzei, F., Ozouf-costaz, C. et al., (2008). First cytogenetic characterization of the sub-arctic marine fish. Genetics and Molecular Biology, 31: 180–187.

Nelson, D.W., Honda, B.M. (1985). Genes coding for 5S ribosomal RNA of the nematode Caenorhabditis elegans. Gene, 38: 245–51.

Pendás, A.M., Moran, P., Freije, J.P., Garcia-Vazquez, E. (1994). Chromosomal mapping and nucleotide sequence of two tandem repeats of Atlantic salmon 5S rDNA. Cytogenet Cell Genet, 67: 31–36.

Perina, A., Seoane, D., González-Tizón, A. M., Rodríguez-Fariña, F., Martínez-Lage, A. (2011). Molecular organization and phylogenetic analysis of 5S rDNA in crustaceans of the genus Pollicipes reveal Birth-and-Death evolution and strong purifying selection. BMC Evolutionary Biology, 11: 304.

Pinkel, D., Straume, T., Gray, J.W. (1986). Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 83: 2934–38.

Rocha, L.A. (2004). Mitochondrial DNA and Color Pattern Variation in Three Western Atlantic Halichoeres (Labridae), with the Revalidation of Two Species. Copeia, 2004: 770–82.

Rocha, L., Francini-Filho, R., Craig, M., Ferreira, B., Moura, R.L. & Ferreira, C.E. (2010). Halichoeres poeyi. The IUCN Red List of Threatened Species. Disponível em http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2010-4.RLTS.T187584A8574735.en

Rocha, L.A., Guimarães, R.Z.P., Gasparini, J.L. (2001). Redescription of the Brazilian Wrasse Thalassoma noronhanum (Boulenger, 1890) (Teleostei: Labridae). Aqua, Journal of Ichthyology and Aquatic Biology, 4: 105–108.

Rocha, L.A., Pinheiro, H.T., Gasparini, J.L. (2010). Description of Halichoeres rubrovirens, a new species of wrasse (Labridae: Perciformes) from the Trindade and Martin Vaz Island group, southeastern Brazil, with a preliminary mtDNA molecular phylogeny of new world Halichoeres. Zootaxa, 2422: 22–30.

Rocha, L.A, Robertson, D.R., Roman, J., Bowen, B.W. (2005). Ecological speciation in tropical reef fishes. Proceedings of The Royal Society B, 272: 573–79.

Rocha, L.A., Rosa, R.S. (2001). Halichoeres brasiliensis (Bloch, 1791), a valid wrasse species (Teleostei: Labridae) from Brazil, with notes on the Caribbean species Halichoeres radiatus (Linnaeus, 1758). Aqua, Journal of Ichthyology, 4: 161–66.

Rooney, A.P., Ward, T.J. (2005). Evolution of a large ribosomal RNA multigene family in filamentous fungi: birth and death of a concerted evolution paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102: 5084–89.

Shapiro, J. A., Sternberg, R.V. (2005). Why repetitive DNA is essential to genome function. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society, 80: 227–50.

Schweizer, D. (1976). Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma, 58: 307–24.

Sena, D.C.S., Molina, W.F. (2007). Chromosomal rearrangements associated with pelagic larval duration in Labridae (Perciformes). Experimental Marine Biology and Ecology, 353: 203–10. Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 40

Souza, I.L., Galián, J., La Rúa, P.D., Bertollo, L.A.C., Moreira-Filho, O. (2001). Non-random distribution of the GC-rich heterochromatin and nucleolar rDNA sites on Astyanax scabripinnis chromosomes. Cytologia, 66: 85–91.

Sumner, A.T. (1972). A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Experimental Cell Research, 75: 304–6.

Suzuki, H., Moriwaki, K., Sakurai, S. (1996). Rat rDNA sapacer sequences and chromosomal assignment of the genes to the extreme terminal region of chromosome 19. Cytogenetics and cell genetics, 72: 1-4.

Ueno K., Takai A. (2000). Chromosome evolution involving Robertsonian rearrangements in Xyrichthys fish (Labridae, Perciformes). Cytobios, 103: 7-15.

Vicari, M.R., Moreira-Filho, O., Artoni, R.F., Bertollo, L.A.C. (2006). ZZ/ZW sex chromosome system in an undescribed species of the genus Apareiodon (Characiformes, Parodontidae). Cytogenetic and Genome Research, 114: 163–68.

Vitturi, R., Colomba, M.S., Pirrone, A.M., Mandrioli, M. (2002). rDNA (18S-28S and 5S) rDNA (18S-28S and 5S) colocalization and linkage betweenribosomal genes and (TTAGGG)(n) telomeric sequence in the earthworm Octodrilus complanatus (Annelida, Oligochaeta, Lumbricidae), revealed by single- and double-color FISH. Journal of Heredity, 93: 279–82.

Wainwright, P.C., Bellwood, D.R., Westneat, M.W., Grubich, J.R., Hoey, A.S. (2004). A functional morphospace for the skull of labrid fishes: Patterns of diversity in a complex biomechanical system. Biological Journal of the Linnean Society, 82: 1–25.

Westneat, M.W., Alfaro, M.E. (2005). Phylogenetic relationships and evolutionary history of the reef fish family Labridae. Molecular Phylogenetics and Evolution, 36: 370–90.

White, T.J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. (1990). Amplification and direct sequencing offungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press Inc., pp. 315–322.

Ziemniczak, K., Barros A., Rosa K., Nogaroto V. (2012). Comparative cytogenetics of Loricariidae (Actinopterygii: Siluriformes): emphasis in Neoplecostominae and Hypoptopomatinae. Italian Journal of Zoology, 79: 492-501.

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 41

4.2 CAPÍTULO II Comparação de padrões citogenéticos entre populações costeiras e insulares em espécies dos gêneros Halichoeres e Thalassoma

Karlla Danielle Jorge Amorim1*, Marcelo de Bello Cioffi2, Luiz Antônio Bertollo2, Rodrigo Xavier Soares1, Leonardo Luiz Calado1, Amanda Tôrres Borges1, Gideão Wagner Werneck Felix da Costa1, Wagner Franco Molina1.

1 Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil.

2 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos. SP, Brasil.

Resumo No ambiente marinho as barreiras biogeográficas mediam a distribuição das espécies através de fatores físicos, como correntes marinhas, temperatura e salinidade. Os padrões de distribuição da biodiversidade marinha são complexos, resultado de eventos vicariantes e dispersão de espécies, bem como condições ecológicas e adaptativas locais. A ampla distribuição geográfica de algumas espécies pode ser permeada por barreiras biogeográficas proporcionando restrições ao fluxo gênico. Visando comparar padrões citogenéticos foram analisados diferentes arranjos biogeográficos entre regiões costeiras e insulares de duas espécies de Halichoeres e entre populações insulares de Thalassoma noronhanum. Foram analisadas as regiões heterocromáticas, bem como a distribuição dos sítios de DNA ribossômico referentes as subunidades 5S e 18S através do mapeamento cromossômico por double-FISH. O mapeamento de sequências repetitivas identificou sítios de DNAr 18S e 5S múltiplos e sintenia entre estes genes. Os padrões citogenéticos populacionais de H. poeyi (ao longo da costa brasileira) e Thalassoma noronhanum (Atol das Rocas e Arquipélago de Fernando de Noronha) foram similares. Por outro lado H. radiatus apresentou diferenças conspícuas quanto a frequência de sítios DNAr revelando um possível indício de estruturação populacional.

Palavras-chave: Labridae, double FISH, populações, ASPSP, citogenética de peixes.

Abstract

In the marine environment the biogeographical barriers mediates the distribution of species through physical factors such as marine currents, temperature and salinity. The distribution patterns of the marine biodiversity are complex, the result of vicariant events and dispersion of species, as well as ecological and local adaptive conditions. The wide geographical distribution of some species can be permeated by biogeographic barriers wich provides restrictions to gene flow. To compare cytogenetic patterns were analyzed different biogeographic arrangements between coastal and island regions of both species Halichoeres and among island populations Thalassoma noronhanum. It were analyzed the heterochromatic regions as well as the distribution of ribosomal DNA sites related to the 5S and 18S subunits through chromosomal mapping by double-FISH. The mapping of repetitive sequences identified sites of multiple 18S and 5S rDNA and synteny between these genes. The population cytogenetic patterns of H. poeyi (along the Brazilian Coast) and Thalassoma noronhanum (Atol das Rocas and Fernando de Noronha’s archipelago) were similar. On the Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 42

other hand H. radiatus showed conspicuous differences in the frequency of rDNA sites revealing a possible indication of population structuration.

Keywords: Labridae, double FISH, populations, SPSPA, cytogeneticsfish.

4.2.1 Introdução

Ao contrário da fauna de água doce onde as barreiras de terra produzem uma ampla oportunidade para especiação alopátrica, os oceanos apresentam poucas barreiras geográficas (Wiley, 2002; Briggs, 2005; Rocha; Craig & Bowen, 2007). Além disso, a maioria dos peixes recifais apresenta alto potencial de dispersão, percorrendo longas distâncias oceânicas por dispersão larval (Mora & Sale, 2002). No ambiente marinho as barreiras biogeográficas mediam a distribuição das espécies através de fatores físicos, como correntes marinhas, temperatura e salinidade (Wernberg et al., 2013), ocasionando níveis de fluxo gênico diferenciais através da barreira, mesmo entre espécies co-genéricas (Rocha & Bowen, 2008). Eventos vicariantes como o fechamento do Istmo do Panamá, dispersão e adaptação a novos habitats parecem regular a biodiversidade marinha do Atlântico tropical (Floeter et al., 2008). A ação combinada destes parâmetros pode moldar além da distribuição, a diversidade cromossômica de espécies, embora seja difícil indicar um único fator determinante de eventos cladogenéticos (Artoni et al., 2015). Neste sentido, análises genéticas e citogenéticas têm contribuído significativamente para o conhecimento e identificação de populações e espécies no ambiente marinho, onde os padrões de distribuição da biodiversidade são de profunda complexidade, configurando-se como resultado sinérgico da interação de eventos vicariantes, dispersão de espécies, adaptações locais e condições ecológicas (Molina et al., 2012a, b). Em estudos focados em citogenética populacional, o FISH vem sendo utilizado para discriminar cariótipos crípticos ou diferenças interespecíficas não diagnosticadas por técnicas convencionais (Lima-Filho et al., 2012; Jacobina et al., 2014). O mapeamento do DNAr 18S e 5S permite identificar a diversidade intra e interespecífica em alguns grupos de peixes com alto conservadorismo cariótipico, como Labridae (Calado et al., 2014; Artoni et al., 2015). Labridae é uma família de peixes recifais encontrada em ambientes tropicais e temperados de todo o mundo (Alfaro et al., 2009) e consiste em um grupo ecológico dominante em grandes sistemas de recifes, além de exibir alto grau de diversidade trófica e morfológica (Bellwood & Wainwright, 2002; Wainwright et al., 2004; Westneat et al., 2005; Westneat & Alfaro 2005). Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 43

O gênero Halichoeres, o mais representativo da família (80 espécies) exibe ampla distribuição geográfica (Parenti & Randall, 2011; Eschmeyer & Fong, 2016). Há um total de 15 espécies do gênero Halichoeres no Atlântico onde algumas têm sido recentemente descritas ou revalidadas (Rocha et al., 2010). A espécie Thalassoma noronhanum é uma das seis espécies presentes no Atlântico, abundantes em recifes de coral e substratos rochosos em profundidades rasas, geralmente a 25 m apresentando ampla distribuição em ilhas oceânicas e litoral brasileiro (Bernardi et al., 2004). Dados citotaxonômicos são escassos para a família Labridae, condição que limita o reconhecimento de padrões evolutivos ao longo do Atlântico, onde foram encontradas evidências de diferenças cariotípicas entre populações das regiões costeiras do nordeste e sudeste do Brasil (Sena & Molina, 2007). Desta forma, análises cariotípicas podem contribuir para destacar marcadores citotaxonômicos específicos entre populações. Visando estimar o nível de divergência citogenética populacional e contribuir para a identificação de possíveis restrições ao fluxo gênico, foram analisadas populações das espécies H. poeyi, H. radiatus e T. noronhanum com diferentes arranjos espaciais de distribuição (insular/insular; costa/costa) por meio de coloração convencional com Giemsa, bandamento C, Ag-RON e hibridização in situ com fluorescência com sondas DNAr 18S e 5S.

4.2.2 Material e métodos

Obtenção dos espécimes e preparações cromossômicas

Os espécimes de Thalassoma noronhanum foram coletados no Arquipélago de Fernando de Noronha (N=15) (3º51’20”S, 32º25’32”O) e no Atol das Rocas (N=22) (3º51’59”S, 33º48’20”O). Os exemplares de Halichoeres poeyi foram coletados na costa do Rio Grande do Norte, município de Extremoz (N=13) (5°42’20”S, 35°11’38”O) e na Bahia, em Salvador (N=3) (13º00’40”S, 38º30’35”O), a espécie H. radiatus foi coletada no Arquipélago de São Pedro e São Paulo (N=16) (00º55'02”N, 29º20'44”O) e no Arquipélago de Fernando de Noronha (N=6) (3º51’20”S, 32º25’32”O).

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 44

Os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica, através da inoculação intraperitoneal de complexos de antígenos fúngicos e bacterianos (Molina et al., 2010). Os cromossomos mitóticos foram preparados a partir da suspensão de fragmentos do tecido renal de acordo com a técnica in vitro preconizada por Gold et al. (1990). Os cromossomos foram corados com solução de Giemsa à 5%, diluída em tampão fosfato pH 6,8. As regiões heterocromáticas foram visualizadas através da técnica de bandamento C (Sumner, 1972). As regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foram obtidas pela técnica de impregnação por nitrato de prata (Howell & Black,1980).

Obtenção das sondas para hibridização cromossômicas

As sondas DNAr 5S e 18S, contendo aproximadamente 200 pb e 1400 pb, respectivamente, foram obtidas por reação em cadeia da polimerase (PCR), a partir do DNA Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 45

nuclear de Rachycentron canadum (Teleostei, Perciformes), utilizando os iniciadores A 5’- TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’ e B 5’- CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC- 3’(Pendás et al., 1994), NS1 5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’ e NS8 5’-TCC GGT GCA TCA CCT ACG GA-3’(White et al., 1990), respectivamente. As sondas para DNAr 18S foram marcadas com digoxigenina-11-dUTP (Roche) e detectadas com anti-digoxigenina- rodamina (Roche), enquanto as sondas de DNAr 5S foram marcadas com biotina-14-dATP (Invitrogen) e detectada com streptavidina-FITC (Vector), marcada por PCR, em conformidade com as especificações do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha).

Hibridização cromossômica

A hibridização in situ com fluorescência (FISH) foi realizada segundo o procedimento descrito por Pinkel et al. (1986). Os cromossomos metafásicos foram tratados à 37°C com RNAse (20µg/ml em 2XSSC) por 1 hora com pepsina (0,005% em HCl 10mM) por 10 minutos, fixados com formaldeído a 1% por 10 minutos e em seguida desidratados em um série alcoólica (70% - 85% - 100%) por 5 minutos cada. As lâminas com os cromossomos metafásicos foram incubadas em 70% formamida/2XSSC à 72°C, por 5 minutos e novamente desidratadas em um série alcoólica (70% - 85% - 100%) por 5 minutos cada. A solução de hibridização, consistindo de 50% de formamida, 2XSSC, 10% de sulfato de dextrano e a sonda desnaturada (5 ng/µl), em um volume final de 30 µl, foi depositada sobre a lâmina e a hibridização realizada por 16h à 37°C. As lavagens pós-hibridização foram efetuadas em 15% formamida/0.2XSSC à 42°C, por 20 minutos, seguidas de lavagens em 0,1×SSC à 60°C por 15 minutos e em Tween 20 0,5%/4XSSC por 5 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente foi incubada por 15 minutos na solução de bloqueio 5% NFDM/4XSSC, em seguida lavadas em Tween 20 0,5%/4×SSC por 15 minutos. Os sinais de hibridização das sondas foram detectados usando anti-digoxigenina rodamina conjugada (Roche) para a sonda DNAr 18S e streptavidina-FITC conjugado (Vector) para a sonda DNAr 5S. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml) (Vector). As melhores metáfases foram fotografadas com um microscópio de epifluorescência OlympusTM BX50, acoplado a um sistema de captura digital Olympus DP73 utilizando o software cellSens (Olympus). Os cromossomos foram definidos de acordo com a razão entre os braços, segundo Levan et al. (1964).

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 46

4.2.3 Resultados

As análises realizadas não revelaram diferenças no valor diplóide, número fundamental, sítios Ag-RONs e no bandamento C das populações analisadas. As populações da espécie T. noronhanum apresentam um cariótipo com 48 cromossomos, composto por 2sm+46a (Figura 2a). As análises populacionais de H. poeyi e H. radiatus revelaram que as espécies apresentam um cariótipo com 48 cromossomos acrocêntricos (Figura 2a) e (Figura 3b). As regiões organizadoras de nucléolos foram detectadas no braço curto do único par submetacêntrico (par 1) de T. noronhanum (Figura 2a). Nas populações de H. poeyi sítios Ag-RONs foram detectados no braço curto dos pares 5 e 15 (Figura 2b) e nos pares 5 e 24 em H. radiatus (Figura 3 a; b). Nas espécies e populações analisadas a heterocromatina estava preferencialmente localizada em posição centromérica e pericentromérica dos cromossomos (Figura 2c; d) e (Figura 3c; d). A coloração MM/DAPI revelou sítios GC-ricos coincidentes com as posições dos sítios DNAr 18S e arranjos 18S/5S, nas três espécies (Figuras 2, 3). Em T. noronhanum, indivíduos de ambas as populações exibiram um número maior de sinais MM+, do que os sítios DNAr identificados (Figura 2e). Em T. noronhanum os sítios de DNAr 18S estavam presentes nos braços curtos do par submetacêntrico (Figura 2g) e se mostravam co-localizados com sequências DNAr 5S. Sítios 5S ainda estavam presentes no par 14 (Figura 2g). Em H. poeyi o mapeamento de sequências DNAr 18S identificou sítios múltiplos, ocupando respectivamente, o braço curto dos pares 5, 6 e 15 (Figura 2h). Sequências múltiplas de DNA ribossomal 5S foram identificadas no braço curto dos pares 5 e 15 em ambas as populações (Figura 2h). Em H. radiatus os sítios DNAr 18S se mostraram diferenciais entre as regiões insulares amostradas. Assim, estavam localizados no braço curto dos pares 5, 15 e 24 nos indivíduos de Fernando de Noronha (Figura 3g) e nos pares 5, 14, 15 e 24 nos do Arquipélago de São Pedro e São Paulo (Figura 3h). Os sítios de DNAr 5S revelaram-se múltiplos, identificados no braço curto dos pares 5 e 24, em ambas as populações desta espécie (Figura 3 g,h). Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 47

Variações no número de sítios ribossomais foram encontradas entre os indivíduos de H. radiatus das duas regiões analisadas. Nos espécimes do Arquipélago São Pedro e São Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 48

Paulo foram identificados de 5 a 8 sítios de DNAr 18S (mais frequentemente 8 marcações) 4 a 10 sítios DNAr 5S (mais frequentemente 4 marcações) e 4 e 6 sítios Ag-RONs. Em contraste, nos exemplares de Fernando de Noronha, foram identificados de 6 a 7 sítios de DNAr 18S (mais frequentemente 6 marcações), 4 a 8 sítios de DNAr 5S (mais frequentemente 8 marcações), enquanto todos os indivíduos apresentavam 4 sítios Ag-RON.

Figura 3. Padrão comparativo dos cariótipos da espécie H. radiatus do Arquipélago de Fernando de Noronha (FN) e Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP). Coloração convencional com Giemsa (a; b), bandamento C (c; d), coloração MM/DAPI (e; f) e FISH utilizando sondas DNAr 18S (vermelho) e 5S (verde)(g; h). Barra=5μm. Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 49

4.2.4 Discussão

A caracterização das populações de peixes marinhos é em grande parte dependente de evidências indiretas e neste sentido os marcadores genéticos e citogenéticos vêm se mostrando cada vez mais úteis (Galetti et al., 2000, 2006), principalmente em espécies com ampla distribuição geográfica que em alguns casos estão subdivididas por barreiras biogeográficas cujos níveis de fluxo gênico podem variar (Rocha et al., 2002). Estudos citogenéticos têm contribuído na detecção de espécies crípticas e estruturação populacional em ambientes marinhos em regiões costeiras e insulares brasileiras (Accioly et al., 2012; Lima-Filho et al., 2012; Molina et al., 2012a; Jacobina et al., 2014). Os teleósteos marinhos geralmente exibem pouca variabilidade no número de cromossomos e uniformidade substancial na macroestrutura do cariótipo (Cipriano et al., 2008; Molina et al., 2014). A maioria das espécies marinhas de Perciformes exibe um padrão cromossômico com 2n=48 (NF=48), considerado basal para este grupo (Brum & Galetti, 1997; Galetti et al., 2000; Molina, 2007). No entanto, algumas famílias exibem cariótipos derivados ocasionalmente decorrentes de eventos Robertsonianos, inversões pericêntricas, fusões e fissões (Galetti et al., 2006), promovendo alterações cromossômicas numéricas e estruturais como já observado em Labridae e Pomacentridae (Molina & Galetti, 2002; 2004). Este dinamismo evolutivo pode ter sido favorecido por eventos vicariantes, combinados com diferenciação de habitat (Bernardi et al, 2000; Robertson et al., 2006). Os processos de diversificação cariotípica em espécies estão sujeitos a diversos fatores, destacando a restrição no fluxo gênico entre populações (Molina et al., 2012a). Labridae exibe números diplóides que variam entre 22 a 48 cromossomos (Arai, 2011). Nesse contexto, as espécies do gênero Halichoeres aqui estudadas apresentaram 2n=48 cromossomos e concordantes com os padrões até então descritos (Sena & Molina, 2007). Além de um número cromossômico com 48 cromossomos, a presença de heterocromatinas centroméricas e pericentroméricas nos cromossomos de Halichoeres e Thalassoma noronhanum é comum e representa uma condição frequente em Perciformes (Motta-Neto et al., 2011; Lima-Filho et al., 2012). A quantidade e composição da heterocromatina exercem um papel fundamental na diversificação cariotípica de alguns grupos de peixes (Molina et al., 2002; Molina & Galetti, 2002). A análise da heterocromatina nos cromossomos destas espécies se mostrou similar e de conteúdo reduzido entre as populações, provocando poucas mudanças cariotípicas e exibindo pequeno poder discriminatório intra e interespecífico. Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 50

A técnica de impregnação agêntea tem sido utilizada na formulação de hipóteses filogenéticas e identificação de fauna críptica, constituindo-se como um eficiente marcador citotâxonômico (Cross et al., 2006; Lima-Filho et al., 2012). Análises prévias dos padrões de sítios Ag-RONs entre populações de H. poeyi permitiram identificar variação entre as regiões litorâneas do RN que apresentavam sítios múltiplos com populações do Rio de Janeiro e Bahia que exibiam sítios simples (Sena & Molina, 2007). No entanto, em nossas análises as populações do RN e BA analisadas não apresentaram diferenças no número e padrão de marcações na espécie. As populações de H. radiatus e T. noronhanum analisadas também não apresentaram varriação. A análise citogenética molecular realizada permitiu a identificação das regiões cromossômicas GC+ com o uso da coloração pelo fluorocromo Mitramicina, que mostrou correspondência com as regiões de sítios de DNAr 18S e Ag+, caracterizando uma dinâmica cromossômica relacionada à frequência, distribuição e organização dos sítios de DNAr nos cromossomos. Ocasionalmente, mesmo em grupos de peixes marcadamente conservativos quanto a seus padrões citogenéticos, sítios DNAr 5S e 18S podem se mostrar diversificados, destacando-se como marcadores citotaxonômicos e populacionais (Motta-Neto et al., 2012). Estruturação citogenética populacional em peixes marinhos baseada em sítios de DNAr já foram relatadas em Bathygobius soporator (Lima-Filho et al., 2012), Trachinotus goodei e T. falcatus (Rodrigues et al., 2007; Accioly et al., 2012) e nas espécies H. aurolineatum e H. plumierii (Nirchio et al., 2007; Motta-Neto et al., 2011). As populações de H. poeyi do litoral de Salvador (BA) e da costa do Rio Grande do Norte, distantes aproximadamente 1000 km e de T. noronhanum, localizadas no Atol das Rocas e Arquipélago de Fernando de Noronha, separadas por aproximadamente 145 km, apresentaram similaridade citogenética quanto aos padrões citogenéticos analisados, incluindo a frequência e distribuição dos sítios DNAr 5S e 18S. Correntes marinhas, período pelágico larval e a proximidade geográfica podem ser apontadas como possíveis mantenedores da similaridade citogenética das populações nestas regiões. Os indivíduos de H. radiatus dos Arquipélagos de Fernando de Noronha e São Pedro e São Paulo, apesar de manterem uma mesma fórmula cromossômica, exibiram variações na frequência dos sítios ribossomais 18S e 5S. A população do ASPSP portava sítios DNAr 18S, no braço curto do par 14, não identificado nos indivíduos de Fernando de Noronha, acompanhados por variações no número de regiões GC-positivas entre estas localidades. No entanto, em análises moleculares estas populações não apresentaram diferenças significativas entre si (Rocha et al., 2005). Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 51

Geralmente, a diferença genética entre populações aumenta com a diminuição no tamanho efetivo da população e com a distância entre elas (Puebla et al., 2008). As populações de H. radiatus do Arquipélago de Fernando de Noronha e São Pedro e São Paulo estão distantes 600 km entre si. Além da distância considerável, correntes oceânicas atuam nos padrões de dispersão de espécies entre estas regiões. De fato, estudos populacionais em Chromis multilineata revelaram significativo nível de divergência genética entre indivíduos do ASPSP em relação aos do Arquipélago de Fernando de Noronha (Cunha et al., 2014). Neste contexto, o Arquipélago que está a 1.100 km do ponto mais próximo da costa brasileira e a 1.824 km da costa africana, apresenta-se como uma região peculiar quando comparada com outras ilhas oceânicas brasileiras. O ASPSP é influenciado pela Corrente Sul Equatorial na direção Leste-Oeste e Contracorrente Sul Equatorial na direção oposta. FN também é influenciada por essas duas correntes, mas, devido à sua proximidade da costa ela também está sob o efeito da Corrente Norte do Brasil. Estes dois locais ainda estão sob influência da Subcorrente Equatorial Atlântica (Freire et al., 2011). Desta forma, as diferenças genéticas encontradas nas populações das espécies H. radiatus e C. multilineata podem indicar que este arquipélago apresenta características específicas que contribuem para algum nível de estruturação populacional. As estruturações populacionais em H. radiatus podem ser explicadas por fatores como barreiras biogeográficas, correntes oceânicas, distância e duração do período pelágico larval, responsáveis por causar estruturação genética em ambientes marinhos (Barber et al. 2000; Bay et al. 2004). Assim, as variações citogenéticas encontradas indicam um cenário complexo de interações entre as populações desta espécie em ilhas oceânicas. Embora os dados de localização e frequência dos sítios ribossomais possam representar uma condição polimórfica, a variação conspícua destas regiões no genoma das populações de H. radiatus sugere algum nível de restrição do fluxo gênico entre as áreas insulares, indicando possível estruturação populacional dentro da espécie.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq pelo apoio financeiro (556793/2009-9), ao Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos Renováveis pela licença de coleta dos exemplares (Processo No. 19135/1), a Universidade Federal do Rio Grande do Norte por prover os meios para conduzir o estudo, a José Garcia Júnior pela identificação taxonômica das espécies e a Allyson Santos Souza pela elaboração do mapa. Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 52

Referências

Alfaro, M.E., Brock, C.D., Banbury, B.L., Wainwright, P.C. (2009). Does evolutionary innovation in pharyngeal jaws lead to rapid lneage diversification in Labrid fishes? BMC Evolutionary Biology, 9: 255.

Arai, R. (2011). Fish Karyotypes: A Check List. Springer, 340p.

Artoni, R.F., Castro, J.P., Jacobina, U.P., Lima-Filho, P.A. et al. (2015). Inferring diversity and evolution in fish by means of integrative molecular cytogenetics. The Scientific World Journal.

Barber, P. H., Palumbi, S.R., Erdmann, M.V., Moosa, M.K. (2000). A marine Wallace’s line? Nature, 406: 692–93.

Bay, L. K., Choat, J. H., Herwerden L. V., Robertson, D. R. (2004). High genetic diversities and complex genetic structure in an Indo-Pacific tropical reef fish (Chlorurus srdidus): evidence of an unstable evolutionary past? Marine Biology, 144: 757–67.

Bellwood, D. R., Wainwright, P. C. (2002). The History and biogeography of fishes on coral reefs. In Coral Reef Fishes. Academic Press, 5–32.

Bernardi, G., Bucciarelli, G., Costagliola, D., Robertson, D.R., Heiser, J.B. (2004). Evolution of coral reef fish Thalassoma spp. (Labridae). 1. Molecular phylogeny and biogeography. Marine Biology, 144: 369–75.

Bernardi, G., Robertson, D.R., Clifton, K.E., Azzurro, E. (2000). Molecular systematics, zoogeography, and evolutionary ecology of the Atlantic parrotfish genus Sparisoma. Molecular Phylogenetics and Evolution, 15: 292-300.

Briggs, J. C. (2005). The marine East Indies: diversity and speciation. Journal of Biogeography, 32: 1517–1522.

Brum, M.J.I., Galetti, P.M. (1997). Teleostei groun plan karyotype. Journal of Comparative Biology, 2: 91-102.

Cipriano, R.R., Fenocchio, A. S., Artoni, R.F., Molina, W.F. et al., (2008). Chromosomal studies of five species of the marine fishes from the Paranagu Bay and the karyotypic diversity in the marine teleostei of the Brazilian coast. Brazilian Archives of Biology and Technology, 51: 303–14.

Cross, I., Merlo, A., Manchado, M., Infante, C., Cañavate, J.P., Rebordinos, L. (2006). Cytogenetic characterization of the sole Solea senegalensis (Teleostei: Pleuronectiformes: Soleidae): Ag- Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 53

NOR, (GATA)n, (TTAGGG)n and ribosomal genes by one-color and two-color FISH. Genetica, 128: 253–59.

Cunha, I.M.C., Souza, A.S., Dias Jr, E.A., Amorim, K.D.J., et al., (2014). Genetic multipartitions based on D-Loop sequences and chromosomal patterns in brown Chromis, Chromis multilineata (Pomacentridae), in the Western Atlantic. Hindawi BioMed Research International, Article ID 254698, 11 pp.

Floeter, S. R., Rocha, L. A., Robertson, D. R., Joyeux, J. C., et al. (2008). Atlantic reef fish biogeography and evolution. Journal of Biogeography, 35: 22–47.

Freire, A.S., Pinheiro, M.A.A., Karam-Silva, H., Teschima, M.M. (2011). Biology of Grapsus grapsus (Linnaeus, 1758) (Brachyura, Grapsidae) in the Saint Peter and Saint Paul Archipelago, Equatorial Atlantic Ocean. Helgoland Marine Research, 65: 263–73.

Galetti, P.M., Aguilar, C.T., Molina, W.F. (2000). An overview of marine fish cytogenetics. Hydrobiologia, 420: 55–62.

Galetti Jr., P.M., Molina, W.F., Affonso, P.R.A.M., Aguilar, C.T. (2006). Assessing genetic diversity of brazilian reef fishes by chromosomal and DNA markers. Genetica, 126: 161-77.

Gold, J.R., Li, Y.C., Shipley, N.S., Powers, P.K. (1990). Improved methods for working with fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding. Journal of Fish Biology, 37: 563–75.

Howell, W.M., Black, D.A. (1980). Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, 36: 1014–1015.

Jacobina, E.P., Martinez, P.A., Cioffi, M.B., Garcia, J. et al. (2014). Morphological and karyotypic differentiation in Caranx lugubris (Perciformes: Carangidae) in the St. Peter and St. Paul Archipelago, Mid-Atlantic ridge. Helgoland Marine Research, 68: 17–25.

Levan, A., Fredga, K., Sandberg, A. (1964). Nomenclature for centromeric position at chromosomes. Hereditas, 201–20.

Lima-Filho, P.A., Cioffi, M.B, Bertollo, L.A.C., Molina, W.F. (2012). Chromosomal and morphological divergences in Atlantic populations of the frillfin goby Bathygobius soporator (Gobiidae, Perciformes). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 434-435: 63– 70.

Lumpkin, R., Garzoli, S. L. (2005). Near-Surface Circulation in the Tropical Atlantic Ocean. Deep- Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers, 52: 495–518.

Molina, W.F., Alves, D.E., Araújo, W.C., Martinez, P.A, Silva, M.F., Costa, G.W. (2010). Performance of human immunostimulating agents in the improvement of fish cytogenetic preparations. Genetics and Molecular Research, 9: 1807–14. Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 54

Molina, W.F., Costa, G.W.W.F., Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C. (2012a). Chromosomal differentiation and speciation in sister-species of Grammatidae (Perciformes) from the Western Atlantic. Helgoland Marine Research, 66: 363–70.

Molina, W.F., Galetti, P.M. (2002). Robertsonian rearrangements in the reef fish Chromis (Perciformes, Pomacentridae) involving chromosomes bearing 5s rRNA genes. Genetics and Molecular Biology, 25: 373–77.

Molina, W.F., Maia-Lima, F.A., Affonso, P.R.A.M. (2002). Divergence between karyotypical pattern and speciation events in Serranidae Fish (Perciformes). Caryologia 55: 299–305.

Molina, W.F., Galetti, P.M. (2004). Karyotypic changes associated to the dispersive potential on Pomacentridae (Pisces, Perciformes). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 309: 109–19.

Molina, W.F., Martinez, P.A. Bertollo, L. A. C., Bidau, C.J. (2014). Evidence for Meiotic Drive as an Explanation for Karyotype Changes in Fishes. Marine Genomics, 15: 29–34.

Molina, W.F., Motta-Neto, C.C.M., Sena, D.C.S., Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C. (2012b). Karyoevolutionary aspects of Atlantic hogfishes (Labridae-Bodianinae), with evidence of an atypical decondensed argentophilic heterochromatin. Marine Genomics, 6: 25–31.

Mora, C., Sale, P. F. (2002). Are populations of coral reef fish open or closed? Trends in Ecology & Evolution, 17, 422–428.

Motta-Neto, C.C.M., Lima-Filho, P.A., Araújo, W.C., Bertollo, L.A.C., Molina, W.F. (2012b). Differentiated evolutionary pathways in Haemulidae (Perciformes): Karyotype stasis versus morphological differentiation. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 22: 457–65.

Nirchio, M, Gaviria, J.I., Oliveira, C., Ferreira, I.A., Martins, C. (2007). Cytogenetic analysis of three species of the genus Haemulon (Teleostei: Haemulinae) from Margarita Island, Venezuela. Genetica, 131: 135–40.

Parenti, P., Randall, J.E. (2011). Checklist of the species of the families Labridae and Scaridae: an update. Smithiana Bulletin, 13: 29–44.

Pendás, A.M., Moran, P., Freije, J.P., Garcia-Vazquez, E. (1994). Chromosomal mapping and nucleotide sequence of two tandem repeats of Atlantic salmon 5S rDNA. Cytogenet Cell Genet, 67: 31–36.

Puebla, O., Bermingham, E., Guichard. F. (2008). Population genetic analyses of Hypoplectrus coral reef fishes provide evidence that local processes are operating during the early stages of marine adaptive radiations. Molecular Ecology, 17: 1405–15.

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 55

Robertson, D.R., Karg, F., Moura, L.R., Victor, B.C., Bernardi, G., Moura, R.L. (2006). Mechanisms of speciation and faunal enrichment in Atlantic parrotfishes. Molecular Phylogenetics and Evolution, 40: 795-807.

Rocha, L.A., Bass, A.L., Robertson, D.R., Bowen, B.W. (2002). Adult habitat preferences, larval dispersal, and the comparative phylogeography of three Atlantic surgeonfishes (Teleostei: Acanthuridae). Molecular Ecology, 11: 243–52.

Rocha, L.A., Bowen, B.W. (2008). Speciation in coral-reef fishes. Journal of Fish Biology, 72: 1101– 21.

Rocha, L. A., Craig, M. T., Bowen, B. W. (2007). Phylogeography and the conservation of coral reef fishes. Coral Reefs, 26: 501–512.

Rocha, L.A, Robertson, D.R., Roman, J., Bowen, B.W. (2005). Ecological speciation in tropical reef fishes. Proceedings of The Royal Society B, 272: 573–79.

Rodrigues, M.M., Baroni, S., Almeida-Toledo, L.F. (2007). Karyological characterization of four marine fish species, genera Trachinotus and Selene (Perciformes: Carangidae), from the Southeast Brazilian coast. Cytologia , 72: 95–99. Schweizer, D. (1976). Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma, 58: 307–24.

Sena, D.C.S., Molina, W.F. (2007). Chromosomal rearrangements associated with pelagic larval duration in Labridae (Perciformes). Experimental Marine Biology and Ecology, 353: 203–10.

Sumner, A.T. (1972). A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Experimental Cell Research, 75 (1): 304–6.

Wainwright, P. C., Bellwood, D. R., Westneat, M. W. Grubich, J. R., Hoey, A. S. (2004). A functional morphospace for the skull of Labrid fishes: patterns of diversity in a complex biomechanical system. Biological Journal of the Linnean Society 82: 1–25.

Westneat, M. W., Alfaro, M. E., Wainwright, P. C., Bellwood, D. R., et al. (2005). Local phylogenetic divergence and global evolutionary convergence of skull function in reef fishes of the family Labridae. Proceedings Biological Sciences, 272: 993–1000.

Westneat, M. W., Alfaro, M. E. (2005). Phylogenetic relationships and evolutionary history of the reef fish family Labridae. Molecular Phylogenetics and Evolution, 36: 370–90.

Wernberg, T., Thomsen, M.S., Sean D. Connell, B.D. et al., (2013). The footprint of continental-scale ocean currents on the biogeography of seaweeds. PLoS ONE , 8: e80168.

Wiley, E. O. (2002). On species and speciation with reference to the fishes. Fish and Fisheries, 3: 161–170.

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 56

5. CONCLUSÕES

As relações filogenéticas e a identificação de espécies da família Labridae constituem um desafio de longa data. Neste sentido, análises citogenéticas têm contribuído significativamente na caracterização de espécies, bem como na identificação dos mecanismos de divergência cariotípica intra e interespecífica nesta família. Os dados aqui apresentados permitiram algumas conclusões em relação a diversificação cariotípica desta família:

 Apesar de exibir um conservadorismo cariotípico numérico e estrutural as espécies de Halichoeres apresentam marcado dinamismo evolutivo quanto as sequências ribossomais distribuídas nos cromossomos, que se constituem eficientes marcadores citotaxonômicos;  A extensa ocorrência de co-localização de sítios DNAr 18S/5S, tanto nas espécies de Halichoeres, como em T. noronhanum indica uma condição sinapomórfica evolutivamente compartilhada entre estes taxa;  Os dados aqui apresentados reforçam a menor proximidade filogenética entre H. penrosei e as demais espécies deste gênero;  Apesar de independentes evolutivamente, a co-localização dos genes ribossomais compartilhada para os gêneros Halichoeres e Thalassoma, indica que sintenia podem ser mais frequente do que se pensava e demonstra funcionalidade dos sítios DNAr 18S sob estas condições;  Correntes marinhas e proximidade geográfica podem ser responsáveis pela similaridade encontrada entre as populações de H. poeyi e T. noronhanum;  As diferenças encontradas nas populações da espécie H. radiatus sugerem estruturação populacional, indicando uma possível restrição ao fluxo gênico;  Apesar de apresentarem um cariótipo conservado, sítios DNAr 18S/5S apresentaram- se como eficientes marcadores citopopulacionais em H. radiatus;  As estruturações populacionais em H. radiatus podem ser explicadas por diferentes padrões ecológicos, correntes oceânicas, distância geográfica e o potencial de dispersão da espécie.

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 57

6. REFERÊNCIAS

Accioly, I.V., Bertollo, L., Costa, G., Jacobina, U., Molina, W. (2012). Chromosomal population structuring in carangids (Perciformes) between the north-eastern and southeastern coasts of Brazil. African Journal of Marine Science, 34: 383–89.

Almeida-Toledo, L.F., Ozouf-Costaz, C., Foresti, F., Bonillo, C. et al., (2002). Conservation of the 5S-bearing chromosome pair and co-localization with major rDNA clusters in five species of Astyanax (Pisces, Characidae). Cytogenetic and Genome Research, 97: 229–33.

Alvarez, M.C., Garcia, E., Thode, G. (1986). Contribution to the karyotypes of Ctenolabrus rupestris and Symphodus ocellatus. Caryologia, 39: 353-357.

Arai, R. (2011). Fish Karyotypes: A Check List. Springer, 340p.

Arai, R., Koike, A. (1980). Chromosomes of labroid fishes from Japan. Bulletin of the national science museum series a zoology, 6: 119-135.

Artoni, R.F., Castro, J.P., Jacobina, U.P., Lima-Filho, P.A. et al., (2015). Inferring diversity and evolution in fish by means of integrative molecular cytogenetics. The Scientific World Journal.

Baliga, V.B., Law, C.J. (2016). Cleaners among wrasses: Phylogenetics and evolutionary patterns of cleaning behavior within Labridae. Molecular Phylogenetics and Evolution, 94: 424–435.

Bay, L. K., Choat, J. H., Herwerden L. V., Robertson, D. R. (2004). High Genetic Diversities and Complex Genetic Structure in an Indo-Pacific Tropical Reef Fish (Chlorurus Sordidus): Evidence of an Unstable Evolutionary Past? Marine Biology, 144: 757–67.

Beldade, R., Heiser, J.B., Robertson, D.R., Gasparini, J.L. et al., (2009). Historical biogeography and speciation in the creole wrasses (Labridae, Clepticus). Marine Biology, 156: 679–87. Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 58

Betancur-r, R., Broughton, R.E., Wiley, E.O., Carpenter, K., López, J.A., et al., (2013). The Tree of Life and a New Classification of Bony Fishes. PLOS Currents Tree Life, 5: 1– 45.

Briggs, J. C. (2005). The marine East Indies: diversity and speciation. Journal of Biogeography, 32: 1517–1522.

Brum, M.J.I., Galetti, P.M. (1997). Teleostei groun plan karyotype. Journal of Comparative Biology, 2: 91-102.

Calado, L.L., Bertollo, L.A.C., Cioffi, M.B., Costa, G.W.W.F. et al., (2014). Evolutionary dynamics of rDNA genes on chromosomes of the Eucinostomus fishes: cytotaxonomic and karyoevolutive implications. Genetics and Molecular Research, 13: 9951–59.

Cano, J., Thode, G., Alvarez, M.C. (1982). Karyoevolutive considerations in 29 mediterranean teleost fishes. Vie et Milieu, 32: 21-24.

Catalano, E., Vitturi, R., Valvo, M.L. (1988). Osservazioni morfologiche e cariologiche su Symphodus doderleini Jordan, 1891 del golfo di Palermo. Atti della Societa Italiana di Scienze Naturali e del Museo Civico di Storia Naturale di Milano, 129: 261–271.

Cataudella, S., Civitelli, M.V., Capanna, E. (1973). The chromosomes of some mediterranean teleosts: Scorpaenidae, Serranidae, Labridae, Blenniidae, Gobiidae (Pisces: Scorpaeniformes, Perciformes). Bolletino di Zoologia, 40: 385-389.

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 59

Cowman, P.F., Bellwood, D.R. (2011). Coral reefs as drivers of cladogenesis: Expanding coral reefs, cryptic extinction events, and the development of biodiversity hotspots. Journal of Evolutionary Biology, 24: 2543-62.

Cunha, I.M.C., Souza, A.S., Dias Jr, E.A., Amorim, K.D.J., et al., (2014). Genetic Multipartitions Based on D-Loop Sequences and Chromosomal Patterns in Brown Chromis, Chromis Multilineata (Pomacentridae), in the Western Atlantic. Hindawi BioMed Research International, Article ID 254698, 11 pp.

Drouin, G., Sá, M.M. (1995). The concerted evolution of 5S ribosomal genes linked to the repeat units of other multigene families. Molecular Biology and Evolution, 12: 481– 93.

Duchac, B., Huber, F., Müller, H., Senn, D. (1982). Mating behavior and cytogenetical aspects of sex-inversion in the fish Coris julis (Labridae, Teleostei). Cellular and Molecular Life Sciences, 38: 809–811.

Eickbush, T.H., Eickbush, D.G. (2007). Finely orchestrated movements: Evolution of the ribosomal RNA genes. Genetics, 175: 477–85.

Freire, A. S., Pinheiro, M.A. A., Karam-Silva, H., Teschima, M.M. (2011). Biology of Grapsus Grapsus (Linnaeus, 1758) (Brachyura, Grapsidae) in the Saint Peter and Saint Paul Archipelago, Equatorial Atlantic Ocean. Helgoland Marine Research, 65: 263– 73.

Fujiwara, A., Abe, S., Yamaha, E., Yamazaki, F., Yoshida, M.C. (1998). Chromosomal localization and heterochromatin association of ribosomal RNA gene loci and silver- stained nucleolar organizer regions in salmonid fishes. Chromosome Research, 6: 463–471.

Galetti, P.M., Aguilar, C.T., Molina, W.F. (2000). An overview of marine fish cytogenetics. Hydrobiologia, 420: 55–62.

Galetti Jr., P.M., Molina, W.F., Affonso, P.R.A.M., Aguilar, C.T. (2006). Assessing genetic diversity of Brazilian reef fishes by chromosomal and DNA markers. Genetica, 126: 161-77. Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 60

Ghigliotti, L., Mazzei, F., Ozouf-Costaz, C., Bonillo, C. et al., (2007). The two giant sister species of the Southern Ocean, Dissostichus eleginoides and Dissostichus mawsoni, differ in karyotype and chromosomal pattern of ribosomal RNA genes. Polar Biology, 30: 625–34.

Gold, J.R., Li, Y.C., Shipley, N.S., Powers, P.K., (1990). Improved methods for working with fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding. Journal of Fish Biology, 37: 563–75.

Gornung, E. (2013). Twenty years of physical mapping of major ribosomal rna genes across the teleosts: A review of research. Cytogenet. Cytogenetic and Genome Research, 141: 90–102.

Howell, W.M., Black, D.A. (1980). Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, 36: 1014–1015.

Klinkhardt, M., Tesche, M., Greven, H. (1995). Database of fish chromosomes. Westarp Wissen-schaften. Magdeburg, 237p.

Kushwaha, B., Kumar, R., Nagpure, N.S., Srivastava, S.K., et al., (2011). Chromosomal studies of three vulnerable marine fishes from west coast of India. Indian Journal of Geo-Marine Sciences, 40: 62–66.

Leah, R., Frederiksen, S., Engberg, J., Sorensen, P.D. (1990). Nucleotide sequence of a mouse 5S rRNA variant gene. Nucleic Acids Research, 18: 7441.

Levan, A., Fredga, K., Sandberg, A. (1964). Nomenclature for centromeric position at chromosomes. Hereditas, 201–20.

Lima-Filho, P. A, Bertollo, L.A.C., Cioffi, M.B., Costa, G.W.W.F., Molina, W.F. (2014). Karyotype divergence and spreading of 5S rDNA sequences between genomes of two species: Darter and emerald gobies (Ctenogobius, Gobiidae). Cytogenetic and Genome Research, 142: 197–203.

Lopez, J.R., Alvarez, M.C., Thode, G., Martinez, G. (1989). Karyotype divergence in Symphodus melops and Symphodus roissali (Labridae: Perciformes): C-banded and Ag-NOR karyotypes. Genome, 32: 35-39.

Lumpkin, R., Garzoli, S. L. (2005). Near-Surface Circulation in the Tropical Atlantic Ocean. Deep-Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers, 52: 495–518. Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 61

Mandrioli, M., Colomba, M.S., Vitturi, R. (2000). Chromosomal analysis of repeated DNAs in the rainbow wrasse Coris julis (Pisces, Labridae). Genetica, 108: 191–95.

Mariotto, S., Centofante, L., Vicari, M.R., Artoni, R.F., Moreira-Filho, O. (2011). Chromosomal diversification in ribosomal DNA sites in Ancistrus Kner, 1854 (Loricariidae, Ancistrini) from three hydrographic basins of Mato Grosso, Brazil. Comparative Cytogenetics, 5: 289-300.

Martins, C., Galetti, P.M. (2001). Two 5S rDNA arrays in Neotropical fish species: Is it a general rule for fishes. Genetica, 111: 439–46.

Menezes, N.A., Buckup, P.A., Figueiredo, J.L., Moura, R.L. (2003). Catálogo das espécies de peixes marinhos do Brasil. Museu de Zoologia da USP. 160p.

Molina, W.F. (2007). Chromosomal changes and stasis in marine fish groups. In:Pisano, E., Ozouf-Costaz, C., Foresti, F., Kapoor, B.G. (Eds.), Fish Cytogenetics. Science Publishers, Enfield, pp. 69–110.

Molina, W.F., Galetti, P.M. (2002). Robertsonian rearrangements in the reef fish Chromis(Perciformes, Pomacentridae) involving chromosomes bearing 5s rRNA genes. Genetics and Molecular Biology, 25: 373–77.

Molina, W.F., Martinez, P. A, Bertollo, L.A.C., Bidau, C.J. (2014). Evidence for meiotic drive as an explanation for karyotype changes in fishes. Marine Genomics, 15: 29–34.

Mora, C. & Sale, P. F. (2002). Are populations of coral reef fish open or closed? Trends in Ecology & Evolution, 17, 422–428.

Moreira-Filho, O., Bertollo L. (1991). Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): A species complex. Genetics and Molecular Biology, 14: 331-357.

Motta-Neto, C.C.M., Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C., Molina, W.F. (2011a). Molecular cytogenetic analysis of Haemulidae fish (Perciformes): Evidence of evolutionary conservation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 407: 97–100.

Motta-Neto, C.C.M., Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C., Molina, W.F. (2011b). Extensive chromosomal homologies and evidence of karyotypic stasis in Atlantic grunts of the genus Haemulon (Perciformes). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 401: 75–79.

Müller, M., Ghigliotti, L., Mazzei, F., Ozouf-costaz, C., Christiansen, J.S., Fevolden, S., Pisano, E. (2008). First cytogenetic characterization of the sub-arctic marine fish. Genetics and Molecular Biology, 31: 180–187.

Nelson, J.S. (2006). Fishes of the world, 4th. John Wiley & Sons Inc. 600p.

Nelson, D.W., Honda, B.M. (1985). Genes coding for 5S ribosomal RNA of the nematode Caenorhabditis elegans. Gene, 38: 245–251.

Ojima, Y. (1983). Fish cytogenetics. In: Sharma AK and Sharma A (eds) Chromosomes in evolution of eukaryotic groups. CRC Press, 254 p.

Ojima, Y., Kashiwagi, E. (1980). Further studies of the chromosomes of the Labridae (Pisces). A preliminary note. Proceedings of the japan academy ser B physical and biological sciences, 56: 328-331.

Paim, F.G., Henrique, J., Galdino, S., Sampaio, I., Roberto, P., Mello, A. De, Diniz, D. (2014). Genetic identification of bucktooth parrotfish Sparisoma radians and molecular markers.Genetics and Molecular Biology, 37: 646–651.

Parenti, P., Randall, J.E. (2011). Checklist of the species of the families Labridae and Scaridae: an update. Smithiana Bulletin, 13: 29–44.

Pendás, A.M., Moran, P., Freije, J.P., Garcia-Vazquez, E. (1994). Chromosomal mapping and nucleotide sequence of two tandem repeats of Atlantic salmon 5S rDNA. Cytogenet Cell Genet, 67: 31–36.

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 63

Pinkel, D., Straume, T., Gray, J.W. (1986). Cytogenetic analysis using quantitative, high- sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 83: 2934–38.

Puebla, O., Bermingham, E., Guichard. F. (2008). Population Genetic Analyses of Hypoplectrus Coral Reef Fishes Provide Evidence That Local Processes Are Operating during the Early Stages of Marine Adaptive Radiations. Molecular Ecology, 17: 1405–15.

Robins, C. R. (1971). Distributional patterns of fishes from coastal and shelf waters of the tropical western Atlantic. FAO Fisheries & Aquaculture, 71-2: 249–255.

Rocha, L.A. (2004). Mitochondrial DNA and Color Pattern Variation in Three Western Atlantic Halichoeres (Labridae), with the Revalidation of Two Species. Copeia, 2004: 770–82.

Rocha, L.A., Bowen, B.W. (2008). Speciation in coral-reef fishes. Journal of Fish Biology, 72: 1101–21.

Rocha, L. A., Craig, M. T. & Bowen, B. W. (2007). Phylogeography and the conservation of coral reef fishes. Coral Reefs, 26: 501–512.

Rocha, E.C., Molina, W.F. (2008). Cytogenetic analysis in Western Atlantic snappers (Perciformes, Lutjanidae). Genetics and Molecular Biology, 31: 461–67.

Rocha, L.A, Robertson, D.R., Roman, J., Bowen, B.W. (2005). Ecological speciation in tropical reef fishes. Proceedings of The Royal Society B, 272: 573–79.

Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 64

Rocha, L.A. (2003). Patterns of distribution and preocess of speciation in Brazilian reef fishes. Journal of Biogeography, 30: 1161–71.

Ruiz-Carus, R. (2002). Chromosome analysis of the sexual phases of the protogynous hermaphrodites Epinephelus guttatus and Thallasoma bifasciatum (Serranidae and Labridae; Teleostei). Caribbean Journal of Science, 38, 44–51.

Schweizer, D. (1976). Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma, 58: 307–24.

Sena, D.C.S., Molina, W.F. (2007a). Chromosomal rearrangements associated with pelagic larval duration in Labridae (Perciformes). Experimental Marine Biology and Ecology, 353: 203–10.

Sena, D.C.S., Molina, W.F. (2007b). Robertsonian rearrangements and pericentric inversions in Scaridae fish (Perciformes).Genetics and Molecular Research, 6: 575-80.

Sumner, A.T. (1972). A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Experimental Cell Research, 75: 304–6.

Ueno K., Takai A. (2000). Chromosome evolution involving Robertsonian rearrangements in Xirichthys fish (Labridae, Perciformes). Cytobios, 103: 7-15.

Vasil'ev, V.P., Polykarpova, L.K. (1980). The karyotypes of the black sea species of the genera Crenilabrus and Symphodus (Perciformes, Labridae) and the evidence of natural hybridization between C. ocellatus and C. quinquemaculatus. Zoologicheskii Zhurnal, 59: 1334-1342.

Vitturi, R., Catalano, E., Macaluso, M., Zava, B. (1986). Karyotypes of nine species of the family Labridae (Pisces, Perciformes). Biologisches Zentralblatt, 108: 223–226. Padrões citogenômicos em espécies da família Labridae da costa nordeste e ilhas oceânicas do Brasil 65

Wernberg, T., Thomsen, M.S., Sean D., Connell, B.D. et al., (2013). The Footprint of Continental-Scale Ocean Currents on the Biogeography of Seaweeds. PLoS ONE8 (11): e80168.

Westneat, M.W. (2002). The Western Central Atlantic: FAO species identification sheets for fishery purposes. Family Labridae. In: Carpenter, K.E. (Ed.), Food and Agriculture Organization of the United Nations, 3: 1701–1723.

Westneat, M.W., Alfaro, M.E. (2005). Phylogenetic relationships and evolutionary history of the reef fish family Labridae. Molecular Phylogenetics and Evolution, 36: 370–90.

Wiley, E. O. (2002). On species and speciation with reference to the fishes. Fish and Fisheries, 3: 161–170.

Williams, D. M. (1991). Patterns and processes in the distribution of coral reef fishes. In: The ecology of fishes on coral reefs. Academic Press, 1: 437–474.