Identificação E Caracterização Genômica Dos Micovírus De Fungos Obtidos Em Amostras De Solo No Pará, Brasil

INSTITUTO EVANDRO CHAGAS NÚCLEO DE ENSINO E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM VIROLOGIA

RAFAEL RIBEIRO BARATA

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DOS MICOVÍRUS DE FUNGOS OBTIDOS EM AMOSTRAS DE SOLO NO PARÁ, BRASIL

Ananindeua 2019

RAFAEL RIBEIRO BARATA

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DOS MICOVÍRUS DE FUNGOS OBTIDOS EM AMOSTRAS DE SOLO NO PARÁ, BRASIL

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Virologia do Instituto Evandro Chagas para a obtenção do título de Doutor em virologia

Orientador: Dr. Márcio R. Teixeira Nunes

Coorientador: Dr. João L. da S. G. Vianez Jr.

Ananindeua 2019

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca do Instituto Evandro Chagas

Barata, Rafael Ribeiro. Identificação e caracterização genômica dos micovírus de fungos obtidos em amostras de solo no Pará, Brasil. / Rafael Ribeiro Barata. – Ananindeua, 2019. 76 f.: il.; 30 cm

Orientador: Dr. Márcio Roberto Teixeira Nunes Coorientador: Dr. João Lídio da Silva Gonçalves Vianez Júnior Tese (Doutorado em Virologia) – Instituto Evandro Chagas, Programa de Pós-Graduação em Virologia, 2019.

1. Micovírus. 2. Fungos. 3. Filogenia. I. Nunes, Márcio Roberto Teixeira, orient. II. Vianez Júnior, João Lídio da Silva Gonçalves, coorient. II. Instituto Evandro Chagas. III. Título.

CDD: 579.2562

RAFAEL RIBEIRO BARATA

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DOS MICOVÍRUS DE FUNGOS OBTIDOS EM AMOSTRAS DE SOLO NO PARÁ, BRASIL

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Virologia do Instituto Evandro Chagas, como requisito parcial para obtenção de título de Doutor em Virologia

Aprovado em: 14/08/2019

BANCA EXAMINADORA

Drª Joana D'Arc Pereira Mascarenhas Instituto Evandro Chagas

Dr. Sandro Patroca da Silva Instituto Evandro Chagas

Drª Valéria Lima Carvalho Instituto Evandro Chagas

Dr. Tibério C. T. Burlamaqui Universidade Federal do Pará

Drª Silvia Helena Marques da Silva Instituto Evandro Chagas

AGRADECIMENTOS

Ao Instituto Evandro Chagas. Ao meu orientador, Dr. Márcio Roberto Teixeira Nunes. À toda equipe do Centro de Inovação Tecnológicas, Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas.

“...to remove all barriers in the way of science.” Alexandra Elba

RESUMO

Estima-se que existam milhões de espécies de fungos não descobertas no mundo, e grande parte dessa biodiversidade está concentrada em áreas tropicais, como a Amazônia. Nesta região, espécies pouco conhecidas de fungos do solo podem abrigar uma vasta variedade de espécies de vírus, conhecidos como micovírus. Neste estudo, descrevemos três novas espécies de micovírus obtidas do solo da Área de Proteção Ambiental da Ilha do Combu, localizada no estado do Pará, na Amazônia brasileira. Amostras de solo foram coletadas em cinco pontos ao longo de trilhas florestais. Cada amostra foi posteriormente inoculada em placas de Petri contendo ágar batata dextrose para diferenciação entre colônias morfologicamente distintas e isolamento fúngico. O RNA total dos isolados foi extraído e sequenciado usando o Illumina HiSeq 2500. As leituras foram montadas pelo método de novo, e os contigs gerados foram comparados usando Blastx. Os genes ribossomais foram preditos e utilizados para identificação dos fungos usando a região ITS. Os micovírus foram comparados com outros vírus similares disponíveis no banco de dados NCBI através de inferências filogenéticas de máxima verossimilhança baseadas no gene da polimerase. Dos nove fungos isolados, dois continham micovírus. Um micovírus de dsRNA e um de ssRNA positivo, ambos identificados no Simplicillium sympodiophorum, indicando uma coinfecção. Um micovírus de ssRNA negativo também foi detectado em Mucor irregularis. Estes três vírus são espécies novas, e para eles sugerimos os nomes Combu double-strand RNA mycovirus (CDRV), Combu positive-strand RNA mycovirus (CPRV) e Combu negative-strand RNA mycovirus (CNRV). Esses novos vírus são filogeneticamente próximos dos vírus da família Amalgaviridae, no gênero Ourmiavirus e da ordem Bunyavirales, respectivamente. Nossas análises mostram a necessidade urgente de um método expandido de organização taxonômica para esses novos micovírus e outros micovírus ainda não classificados relatados na literatura.

Palavras-chave: micovírus; fungos; filogenia.

ABSTRACT

It is estimated that there are millions of undiscovered fungal species in the world, and much of this biodiversity is concentrated in tropical areas, such as the Amazon. In this region, little- known soil fungal species may harbor a vast bounty of virus species, known as mycoviruses. In this study, we describe three new mycovirus species obtained from the soil of the Combu Island Environmental Protection Area, located in the state of Pará in the Brazilian Amazon. Soil samples were collected at five points along forest trails. Each sample was later inoculated into Petri dishes containing potato dextrose agar for differentiation between morphologically distinct colonies and fungal isolation. Total RNA from the isolates was extracted and sequenced using an Illumina HiSeq 2500. The reads were assembled by the de novo method, and the generated contigs were compared using Blastx. Ribosomal genes were predicted and utilized for fungal identification using the ITS region. The mycoviruses were compared to other similar viruses available in the NCBI database through maximum-likelihood phylogenetic inferences based on the polymerase gene. Of the nine isolated fungal samples, two contained mycoviruses. A dsRNA and a positive ssRNA mycovirus was also identified in Simplicillium sympodiophorum, establishing the presence of simultaneous co-infection. A negative ssRNA mycovirus was also detected in Mucor irregularis. These three viruses are new species, and we suggest the names Combu double-strand RNA mycovirus (CDRV), Combu positive-strand RNA mycovirus (CPRV) and Combu negative-strand RNA mycovirus (CNRV). These novel viruses are phylogenetically close related to viruses of the family Amalgaviridae, in the genus Ourmiavirus and the order Bunyavirales. Our analyses show the urgent need for an expanded taxonomic organization method for these new mycoviruses and for future as-yet-unclassified mycoviruses reported in the literature.

Keywords: Mycoviruses; Fungi; Phylogeny.

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ...... 8 2 REVISÃO DA LITERATURA ...... 10 2.1 O SEQUENCIAMENTO E A DESCOBERTA DE NOVOS VÍRUS ...... 10 2.2 BREVE HISTÓRICO SOBRE OS MICOVÍRUS ...... 11 2.3 A CRIAÇÃO E A ORGANIZAÇÃO DAS FAMÍLIAS COM MICOVÍRUS ...... 12 2.4 CARACTERÍSTICAS DAS FAMÍLIAS COM MICOVÍRUS ...... 16 2.5 NÚMERO DE ESPÉCIES DE FUNGOS E DE MICOVÍRUS ...... 27 2.6 RELAÇÃO VÍRUS E HOSPEDEIRO ...... 28 2.6.1 Reprodução dos Fungos e dos Micovírus ...... 31 2.6.2 Utilização de Micovírus no Controle de Pragas Agrícolas ...... 32 2.7 RIQUEZA DE ESPÉCIES DE FUNGOS NO SOLO ...... 33 2.8 ESTUDOS COM MICOVÍRUS NO BRASIL ...... 35 3 OBJETIVOS ...... 37 3.1 GERAL ...... 37 3.2 ESPECÍFICOS ...... 37 4 MATERIAL E MÉTODOS ...... 38 4.1 ÁREA DE ESTUDO E MÉTODO DE COLETA...... 38 4.2 ISOLAMENTO DOS FUNGOS A PARTIR DO SOLO ...... 38 4.3 EXTRAÇÃO DO RNA E SEQUENCIAMENTO ...... 39 4.4 BIOINFORMÁTICA ...... 40 4.4.1 Identificação molecular dos fungos ...... 40 4.4.2 Identificação dos vírus ...... 41 4.4.3 Análises filogenéticas dos vírus ...... 41 5 RESULTADOS ...... 42 6 DISCUSSÃO ...... 55 7 CONCLUSÃO ...... 60 REFERÊNCIAS ...... 61 APÊNDICES ...... 74

1 INTRODUÇÃO

Os vírus, na condição de parasitas intracelulares obrigatórios, estão associados aos mais diversos tipos de hospedeiros. Estes vão desde bactérias, que podem ser infectadas por fagos, até os eucariotos pluricelulares, como as plantas e animais. Além desses, outros grupos podem ser suscetíveis ao parasitismo dos vírus e guardar uma vasta e pouco conhecida diversidade de espécies virais, como por exemplo, os fungos. Os vírus que infectam os fungos são conhecidos como micovírus (traduzido do inglês – mycoviruses). Contudo, para ser um micovírus não basta apenas estar presente na célula fúngica, também é necessário que ocorra sua replicação e que tenha a capacidade de ser transmitido para outros fungos. Esta transmissão muitas vezes acontece junto do processo reprodutivo do próprio fungo hospedeiro, seja através da formação de esporos/conídios (esporogênese/conidiogênese) ou pela fusão de hífas (anastomose) entre fungos compatíveis. Muitos hospedeiros de micovírus são de grande importância biotecnológica, como o Saccharomyces cerevisiae que é uma levedura utilizada em ampla escala na indústria alimentícia para a produção de pães, cervejas e outros produtos que passam pelo processo de fermentação. Outro fungo hospedeiro com aplicação industrial é o Penicillium chrysogenum, responsável por salvar várias vidas desde o período da Segunda Guerra Mundial graças a sua produção de um metabólito antibacteriano, conhecido como penicilina, descoberto após uma série de imprevistos ocorridos durante os experimentos de Alexander Fleming em 1928. Muitos outros fungos hospedeiros de vírus são fitopatogênicos, ou seja, causam doenças em plantas. Nestes fungos, o estudo dos micovírus têm grande relevância econômica pois estes vírus podem ser utilizados no controle biológico de seus hospedeiros, reduzindo ou evitando danos na produção agrícola. Como no caso do micovírus Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) que reduz a virulência do fungo Cryphonectria parasitica, fitopatógeno responsável por causar o cancro do castanheiro, que já gerou grandes danos nos EUA e na Europa após sua invasão acidental. O termo "micovírus" é uma classificação ecológica baseada unicamente no tipo de hospedeiro que infectam, mas são classificados em distintos taxa virais. Aspecto similar pode ser observado com os arbovírus, grupo viral que possui em comum artrópodes hematófagos como vetores e estão classificados taxonomicamente em várias famílias. Portanto a taxonomia dos micovírus é bem vasta, abrangendo várias famílias com características bem distintas, com vírions de simetria icosaédrica, baciliforme, filamentoso e até aqueles que não formam partículas e estão associados a vesículas. Seus genomas também são diversificados. A grande

maioria deles apresenta RNA de fita dupla (dsRNA), alguns segmentados, como os partitivírus, chrisovírus e os micoreovírus, com dois, quatro e até doze segmentos, e outros não segmentados como os totivírus. Também existem micovírus de RNA de fita simples (ssRNA) positiva que incluem os barnavírus, os hipovírus e os narnavírus, além de vírus com RNA de transcrição reversa, são eles os metavírus e os pseudovírus. Toda a classificação taxonômica viral advém da revisão de julho de 2018 organizada pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV) e ratificada em outubro de 2018 (MSL #33). Para os fungos, utilizou-se apenas a taxonomia molecular, focada em genes ribossomais e na região ITS (Internal Trancribed Spacer), tendo em vista que muitos fungos têm suas estruturas morfológicas alteradas quando cultivados em meios de cultura artificiais, principalmente as estruturas reprodutivas nas quais se baseia a taxonomia clássica deste grupo.

2 REVISÃO DA LITERATURA

A virologia é um campo da ciência relativamente novo. Somente no final do século XIX e início do século XX foram estabelecidos os conceitos de transmissão da doença por agentes filtráveis menores que bactérias capazes de se reproduzirem somente em células ou tecidos vivos (LEVINE, 2001). O maior entendimento a cerca da diversidade dos vírus só foi possível com o surgimento de técnicas como o cultivo celular, os estudos com anticorpos, técnicas moleculares como a reação em cadeia mediada pela polimerase (PCR) e mais recentemente os métodos de sequenciamento de DNA de alta performance (high throughput – HTS) fundamentais para a descoberta de novos vírus e vírus reemergentes (WOOLHOUSE et al., 2012).

2.1 O SEQUENCIAMENTO E A DESCOBERTA DE NOVOS VÍRUS

Com o avanço das técnicas moleculares e melhoria das plataformas de sequênciamento de DNA, um grande número de novos vírus foram sendo descritos. Isto pode ser observado nos dados depositados em bancos de sequências moleculares, como o GenBank/NCBI, que evidenciam o rápido incremento de novas informações, com destaque para as sequências nucleotídicas de vírus que tiveram um aumento de 19,2% em 2016 com relação a 2015 (BENSON et al., 2017). Em um estudo de metatranscriptoma realizado com 220 espécies de invertebrados, divididos em nove filos, foram encontradas 1.445 sequências de vírus de RNA e muitas demonstraram similaridade com famílias virais anteriormente associadas apenas a plantas, fungos e protozoários, trazendo uma nova visão sobre a diversidade viral (SHI et al., 2016). A utilização do sequênciamento do RNA total já se mostrou altamente eficiente também para a identificação de novas espécies de micovírus. A partir de diferentes técnicas de obtenção e enriquecimento do RNA de fungos isolados do ambiente marinho, associados a planta Posidonia oceanica, 12 novas espécies de micovírus que pertencem a nove grupos diferentes foram montados por metodologia de novo (NERVA et al., 2016). As novas descobertas a cerca da diversidade viral são fundamentais para entendermos a evolução deste grupo, assim como, os padrões de distribuição global e a relação filogenética entre eles, elucidando muitas questões da ecologia e evolução viral.

2.2 BREVE HISTÓRICO SOBRE OS MICOVÍRUS

No final da década de 1940 e início de 1950, uma doença afetou fungos da espécie Agaricus bisporus, cogumelo comestível de significativa importância econômica, causando má formação dos corpos de frutificação. Ela foi primeiramente registrada na propriedade “La France Brothers” na Pensilvânia (EUA), sendo conhecida como doença “La France” (SINDEN; HAUSER, 1950). Cogumelos com sintomas similares foram observados em muitas outras regiões na Europa, Japão e Austrália. Contudo, somente em 1962 a causa da doença foi determinada, sendo atribuída a partículas virais que estavam presentes em A. bisporus doentes (HOLLINGS, 1962). Este foi o primeiro registro de vírus de fungos. Nos anos seguintes, os micovírus foram relatados em muitos outros fungos, de diferentes tipos, cogumelos, leveduras, fungos filamentosos, e de diversos grupos Basidiomycota, Ascomycota, fungos anamórficos (LEMKE; NASH, 1974). O vírus do fungo Penicillium chrysogenum (PcV) foi um dos mais estudados da época, principalmente pela utilização deste fungo na produção industrial de penicilina (BANKS et al., 1969). Posteriormente, novos micovírus foram encontrados e caracterizados em outros trabalhos, porém, um número limitado de hospedeiros tem sido estudado, basicamente, a levedura Saccharomyces cerevisiae, cogumelos comestíveis e fungos fitopatogênicos (GHABRIAL; SUZUKI, 2008). Com o grande número de espécies de fungos existentes, espera-se que existam muitos mais vírus de fungos a serem descobertos (GHABRIAL; SUZUKI, 2008). A classificação taxonômica dos micovírus é atribuída pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV), através do Subcomitê de Vírus de Fungos e Protistas, o qual possui grupos de estudo especializados nas diferentes famílias que contém esses vírus e são responsáveis pelas propostas referentes a taxonomia deles. No entanto as famílias com espécies de vírus de fungos não se restringem a este subcomitê, os micovírus também estão presentes em famílias estudadas pelo Subcomitê de Vírus de Plantas e até mesmo pelo Subcomitê de Vírus de dsRNA e (-)ssRNA de Animais. Estes vírus vêm sendo classificados desde o final da década de 1970 e até a última revisão do ICTV, em 2018, eles já sofreram muitas mudanças.

2.3 A CRIAÇÃO E A ORGANIZAÇÃO DAS FAMÍLIAS COM MICOVÍRUS

Os vírus identificados infectando algumas espécies de fungos do gênero Penicillium foram os primeiros micovírus reconhecidos e organizados pelo ICTV. Estes foram apresentados no 3º relatório (MSL #06) em 1979 e estavam divididos em dois grupos: (i) Penicillium chrysogenum virus group, composto de três espécies; e (ii) Penicillium stoloniferum PsV–S group, com apenas uma espécie (MATTHEWS, 1979). Estes grupos não foram incorporados a nenhuma das famílias da época. Com a publicação do 4º relatório do ICTV (MSL #08), em 1982, foram estabelecidos três novos grupos de micovírus. O grupo Saccharomyces cerevisiae virus que apresentava três espécies, duas delas associadas a levedura Saccharomyces cerevisiae e a outra espécie presente no fungo Ustilago maydis. As espécies Gaeumannomyces graminis virus 019/6–A e Gaeumannomyces graminis virus T1–A foram organizadas no Gaeumannomyces graminis virus grupo I e Gaeumannomyces graminis virus grupo II, respectivamente (MATTHEWS, 1982). Nenhum dos três grupos estabelecidos neste período foram classificados em famílias pré-existentes ou novas. Durante o encontro de setembro de 1984, em Sendai (MSL #09), o ICTV estabeleceu a família Totiviridae e o gênero Totivirus para abranger as espécies anteriormente reunidas no grupo Saccharomyces cerevisiae virus e indicou a espécie Saccharomyces cerevisiae virus LA como tipo. Neste período também foi criada a família Partitiviridae, apenas com o gênero Partitivirus que reuniu os dois vírus presentes nos grupos I e II de Gaeumannomyces graminis virus de 1982 (ICTV, 1984). Somente em 1991, com o 5º relatório do ICTV (MSL #12), que o Penicillium chrysogenum virus group foi incluso como um novo gênero na família Partitiviridae e a única espécie do Penicillium stoloniferum PsV–S group foi incorporada ao gênero Partitivirus da mesma família (FRANCKI et al., 1991). Em 10 de agosto de 1993, durante o 9º Congresso Internacional de Virologia na cidade de Glasgow (MSL #13), foram estabelecidas duas novas famílias para micovírus, Barnaviridae e Hypoviridae, e um gênero de micovírus foi renomeado. A família Barnaviridae foi criada apenas com o gênero Barnavirus e somente a espécie tipo Mushroom bacilliform virus. A família Hypoviridae também foi criada contento apenas um gênero, denominado Hypovirus, e com uma espécie, Cryphonectria hypovirus 1–713. O Penicillium chrysogenum virus group classificado como gênero da família Partitiviridae, desde a revisão

anterior, foi renomeado e passou a ser chamado de gênero Chrysovirus, mantendo–se na mesma família (PRINGLE, 1993). As famílias Narnaviridae, Metaviridae e Pseudoviridae foram propostas no 27º Encontro do Comitê Executivo do ICTV em março de 1998 (MSL #17). Neste período a família Narnaviridae apresentava dois gêneros, com uma espécie em cada, ambas micovírus. O gênero Narnavirus com a espécie Saccharomyces cerevisiae 20S RNA narnavirus e o gênero Mitovirus representado pelo Cryphonectria parasitica NB631 dsRNA virus (PRINGLE, 1998). Os retrotransposons do tipo Ty3-gypsy foram reunidos na família Metaviridae, em dois gêneros, sendo o gênero Metavirus o único contendo um micovírus, o Saccharomyces cerevisiae Ty3 virus. Pseudoviridae reuniu os retrotransposons dos tipos Ty1-copia e Copia nos gêneros Pseudovirus e Hemivirus, respectivamente. Apenas o gênero Pseudovirus possuia um micovírus, denominado Saccharomyces cerevisiae Ty1 virus (PRINGLE, 1998). No ano seguinte, o 7º relatório do ICTV (MSL #18) adicionou um novo micovírus ao gênero Hemivirus, assim, os dois gêneros da família Pseudoviridae passaram a ter espécies de micovírus (VAN REGENMORTEL, 1999). O 30º encontro do Comitê Executivo do ICTV, em 2002, trouxe alterações para a classificação dos micovírus. O gênero Chrysovirus foi removido da família Partitiviridae e passou a ter sua própria família, nomeada Chrysoviridae (MAYO, 2002). Em 2004 foi aprovada a proposta do Subcomitê de Vírus de dsRNA e (-)ssRNA de Animais a qual criou o gênero Mycoreovirus, contendo duas espécies de micovírus, e o adicionou a família Reoviridae (MERTENS, 2003). Estes foram os primeiros micovírus da família Reoviridae, que já existia desde 1974, formada apenas de vírus de animais vertebrados. O Subcomitê de Vírus de Plantas também propôs a inclusão de espécies de micovírus na ordem Tymovirales, que só possuía vírus de plantas. Para estes novos micovírus foram criados os gêneros Botrexvirus e Sclerodarnavirus, inclusos na família Alphaflexiviridae, e o gênero Mycoflexivirus da família Gammaflexiviridae (ADAMS et al., 2007a, 2007b). Neste mesmo período o micovírus Helicobasidium mompa endornavirus 1 foi incorporado a família Endornaviridae, que também só possuía vírus de plantas. Nas duas revisões taxonômicas seguintes, realizadas em 2011 e 2012 (MSL #26 e #27), foram criadas duas famílias, respectivamente Megabirnaviridae e Quadriviridae, tendo como representantes dois vírus encontrados na mesma espécie de fungo hospedeiro, o ascomiceto Rosellinia necatrix (LIN et al., 2012).

Partitiviridae sofreu grandes mudanças em 2013 (MSL #28) e com o gênero Partitivirus extinto, as espécies de micovírus que formavam este gênero foram distribuídas entre os recém-criados gêneros Alphapartitivirus, Betapartitivirus, Gammapartitivirus e ainda três espécies que não foram classificadas em nenhum dos novos gêneros (NIBERT et al., 2013). Em 2015, foi criada a família Genomoviridae contendo apenas o gênero Gemycircularvirus para classificar o primeiro micovírus de ssDNA circular, o Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence associated DNA virus 1 renomeado para Sclerotinia gemycircularvirus 1. Também neste período a ordem Mononegavirales recebeu uma nova família, a Mymonaviridae, com o gênero Sclerotimonavirus para classificar o primeiro micovírus desta ordem, o Sclerotinia sclerotimonavirus (KRUPOVIC et al., 2016). Em 2016 a família Endornaviridae sofreu uma reavaliação, sendo seu único gênero até o momento, o Endornavirus, removido e dois novos gêneros foram criados, Alphaendornavirus e Betaendornavirus, ambos contendo espécies de micovírus (ADAMS et al., 2016). Após o encontro de 2017, o ICTV agrupou cinco famílias em uma nova ordem, denominada Ortervirales. Esta ordem reuniu vírus com o genoma de transcrição reversa que apresentam uma arquitetura genética similar e um ancestral viral comum, incluindo os vírus das famílias Metaviridae e Pseudoviridae (KRUPOVIC; KOONIN, 2017). Além disso, a ordem Tymovirales ganhou uma nova família, denominada Deltaflexiviridae, contendo o gênero Deltaflexivirus formado apenas por espécies de micovírus (KING et al., 2018). Por consequência do avanço tecnológico e das revisões na classificação taxonômica dos vírus, não só tivemos um aumento no número de espécies como também houve uma crescente diversificação em número de famílias e gêneros com o passar do tempo (figura 1). Oficialmente, pela última classificação do ICTV em 2018 (MSL #33), os vírus de fungos estão classificados em 114 espécies, distribuídos em 25 gêneros, 17 famílias e um gênero não agrupado em nenhuma família (Botybirnavirus) (tabela 1).

Figura 1 – Variações no número de gêneros das famílias que contém micovírus, ao longo das revisões taxonômicas do ICTV, de 1979 a 2018

Fonte: Próprio autor.

2.4 CARACTERÍSTICAS DAS FAMÍLIAS COM MICOVÍRUS

Os vírus da família Alphaflexiviridae (Tymovirales) possuem genoma de uma única molécula linear de ssRNA de polaridade positiva medindo de 5,9 a 9,0 kb e o virion têm morfologia filamentosa, variando de 10–15 nm de diâmetro e 470 a 800 nm de comprimento. A maioria das espécies infecta plantas, com exceção das duas espécies de micovírus, uma pertencente ao gênero Botrexvirus (HOWITT et al., 2006) e a outra ao Sclerodarnavirus (XIE et al., 2006). O Botrytis virus X (Botrexvirus) foi obtido a partir do fungo Botrytis cinerea isolado RH106–10, associado a uma planta de morango da Nova Zelândia, neste mesmo fungo também foi encontrado outro micovírus, o Botrytis virus F (Howitt et al., 2001). O genoma do Botrytis virus X têm cerca de 6.966 nt e possui cinco ORFs (figura 2), a ORF1 contém domínios conservados para methyltransferase (MTR), RdRp (POL) e helicase (HEL), enquanto a ORF3 traduz a proteína de capsídeo (HOWITT et al., 2006).

Figura 2 – Representação esquemática da organização do genoma do Botrytis virus X, evidenciando a posição das ORFs (retângulos brancos)

Fonte: Howitt et al., 2006. Os domínios conservados do gene da replicase (ORF1) estão destacados nos retângulos cinzas: MTR, metiltransferase; HEL, helicase; POL, RNA polimerase dependente de RNA.

O representante do gênero Sclerodarnavirus, denominado Sclerotinia sclerotiorum debilitation–associated RNA virus (SsDRV), foi detectado no fungo Sclerotinia sclerotiorum Ep1PN como uma molécula de dsRNA com tamanho de 5.419 bp, excluindo a calda poli(A) e demonstrou a presença dos domínios conservados para MTR, HEL e RdRp na sua ORF única (figura 3). A homologia destes com os membros da atual família Alphaflexiviridae sugeriu que o dsRNA encontrado poderia ser a forma replicativa do genoma que é uma molécula de ssRNA de polaridade positiva (XIE et al., 2006).

Figura 3 – Representação esquemática da organização do genoma do SsDRV, evidenciando a posição da única ORF (retângulo cinza claro)

Fonte: Xie et al., 2006. Os domínios conservados do gene da replicase estão destacados nos retângulos cinza escuro: Metiltransferase; Helicase; RNA polimerase dependente de RNA.

Atualmente o Mushroom bacilliform virus (Barnaviridae, Barnavirus) é o único representante de sua família (REVILL, 2008). Seu genoma é formado por 4.009 nt e contém sete ORFs, quatro grandes e três pequenas (figura 4). A proteína do capsídio é codificada pela ORF4, enquanto que a ORF3 contém domínios conservados semelhantes a RdRp de vírus de ssRNA com polaridade positiva (REVILL; DAVIDSON; WRIGHT, 1994).

Figura 4 – Representação esquemática da organização do genoma do Mushroom bacilliform virus, evidenciando a posição das ORFs (retângulos brancos)

Fonte: Revill, Davidson e Wrigth, 1994.

O gênero Chrysovirus, único da família Chrysoviridae, só possui vírus de fungos e é representado pela espécie Penicillium chrysogenum virus (PcV). Este possui quatro moléculas de dsRNA, que são encapsuladas independentemente nas VLPs de 40 nm de diâmetro (BOZARTH, 1972). Cada segmento apresenta uma ORF, sendo que, o segmento de 3.562 pb revelou oito motifs conservados para RdRp de vírus de dsRNA e o de 3.200 bp codifica a CP. Os quatro segmentos demonstraram regiões conservadas de alta similaridade tanto na porção

5’UTR quanto na 3’UTR (figura 5), possuindo também uma região de repetição (CAA)n na 5’UTR upstream do códon de iniciação das ORFs (JIANG; GHABRIAL, 2004).

Figura 5 – Comparação entre 5’UTR (a) e 3’UTR (b) dos quatro segmentos de dsRNA do PcV

Fonte: Jiang e Ghabrial, 2004. A região sombreada marcada com asterísticos indica as bases idênticas entre os segmentos. As bases sublinhadas na região 5’UTR (a) revelam as repetições CAAn.

A família Endornaviridae abriga vírus não encapsulados com genomas de dsRNA medindo de 14 Kb a 17,6 Kb e infectam plantas, oomicetos e fungos. A família está dividida em dois grupos, o gênero Alphaendornavirus e o Betaendornavirus (figura 6), claramente definidos por análises filogenéticas de máxima verossimilhança utilizando os domínios MTR, Hel e RdRp (KHALIFA; PEARSON, 2014).

Figura 6 – Árvore filogenética de máxima verossimilhança construida com o domínio RdRp do Sclerotinia sclerotiorum endornavirus 1 (SsEV1/11691), outros endornavírus e vírus relacionados

Fonte: Khalifa e Pearson, 2014. Em destaque a divisão da família Endornaviridae em dois clados “A” e “B”.

O Botrytis virus F (Mycoflexivirus) é o representante, e único membro, da família Gammaflexiviridae (Tymovirales), portanto, é uma família exclusiva de vírus de fungos. Assim como o Botrytis virus X (Botrexvirus, Alphaflexiviridae), o Botrytis virus F possui partículas com forma filamentosa (figura 7), mas diferentemente do alfaflexivírus, o gamaflexivírus contém apenas duas ORFs na sua molécula de ssRNA de polaridade positiva com um tamanho de 6.827 nt (figura 8). A ORF1 têm os domínios MTR, HEL e POL e a ORF2 codifica a proteína de capsídeo (HOWITT et al., 2001).

Figura 7 – Micrografia eletrônica das partículas filamentosas purificadas a partir do isolado Botrytis cinerea RH106–10

Fonte: Howitt et al., 2001. Na foto utilizou-se a contrastação negativa com 2% de fosfotungstato de potássio, pH 4. Bar, 200 nm.

Figura 8 – Representação esquemática da organização do genoma do Botrytis virus F, evidenciando a posição das ORFs (retângulos brancos)

Fonte: Howitt et al., 2001. Os domínios conservados do gene da replicase (ORF1) estão destacados nos retângulos cinzas: MTR, metiltransferase; HEL, helicase; POL, RNA polimerase dependente de RNA.

A família Genomoviridae possui vírus de ssDNA encontrados em plantas, animais, fungos e até amostras ambientais (KRUPOVIC et al., 2016). Nela estão classificados nove gêneros, mas apenas o gênero Gemycircularvirus contém micovírus, o Sclerotinia gemycircularvirus 1 encontrado no fungo fitopatogênico Sclerotinia sclerotiorum (YU et al., 2010) e o Soybean associated gemycircularvirus 1 detectado na filosfera em campos com cultivo de soja (MARZANO; DOMIER, 2016). O Sclerotinia gemycircularvirus 1, representante deste gênero, possui genoma circular com um gene que codifica uma proteína de iniciação da replicação (Rep) e um gene da proteína do capsídeo (CP), com um motif na região intergênica de nove nucleotídeos (TAATATTAT) associados a replicação de forma circular do vírus (figura 9).

Figura 9 – Representação do genoma do Sclerotinia gemycircularvirus 1 (cepa SsHADV-1)

Fonte: Krupovic et al., 2016. As setas indicam os genes Rep e CP. Na região intergênica encontra-se um motif conservado de nove nucleotídeos.

Hypoviridae é outra família que possui apenas um gênero (Hypovirus), exclusivo para micovírus, com quatro espécies. O representante Cryphonectria hypovirus 1 se assemelha ao Cryphonectria hypovirus 2 na estrutura do genoma, ambos têm um tamanho de pouco mais de 12 Kb e apresentam duas ORFs, seus genomas possuem aproximadamente 60% de identidade (SHAPIRA; CHOI; NUSS, 1991). As outras duas espécies de hypovírus só apresentam uma ORF. Rosellinia necatrix megabirnavirus 1 é o único membro da família Megabirnaviridae, possui virion com forma icosaédrica de 50 nm de diâmetro e genoma com dois segmentos de dsRNA (figura 10), medindo aproximadamente 7,1 Kb e 9 Kb, e apresentando duas ORFs por segmento (CHIBA et al., 2009).

Figura 10 – Rosellinia necatrix megabirnavirus 1 (RnMBV1) presente no isolado R. necatrix W779 A B

Fonte: Adaptada de Chiba et al., 2009. (A) Micrografia eletrônica da partícula viral. Bar, 100 nm. (B) Representação esquemática da organização do genoma do RnMBV1, evidenciando a posição das ORFs (retângulos brancos) para os dois segmentos dsRNA–1 e dsRNA–2.

Metaviridae reúne os LTR–retrotransponsons do tipo Ty3–gypsy encontrados em diversos eucariotos, incluindo animais vertebrados, animais invertebrados, plantas e fungos. Estas sequências contém o gene pol com domínios na ordem PR–RT–RH–IN (sendo: PR = protease, RT = transcriptase reversa, RH = Rnase H, IN = integrase), os genes são flanqueandos por duas longas sequências repetitivas de nucleotídeos (long terminal repeat – LTR) (CAPY, 2005). A maioria dos membros desta família produz partículas vírais intracelulares, chamadas de virus–like particles (VLPs), com morfologia variada e dependente do estágio de maturação. Quando vírions (partículas extracelulares) são formados, possuem forma ovóide e são envelopados (LEVIN, 2008). O gênero Metavirus possui cinco espécies de micovírus e é representado pelo Saccharomyces cerevisiae Ty3 virus (SceTy3V). Este possui duas ORFs que se sobrepõem, codificando proteínas homólogas aos genes gag e pol dos retrovírus (HANSEN; SANDMEYER, 1990). Todos os membros deste gênero codificam Pol similares a do SceTy3V. Mymonaviridae é a única família da ordem Mononegavirales que contém micovírus, possui apenas o gênero Sclerotimonavirus. Os vírus deste gênero apresentam o genoma composto de (-)ssRNA linear com cerca de 10 mil nt, com seis ORFs, sendo que a ORF 5 codifica uma RdRp contendo o domínio mononegaviral RdRp (pfam00946) (LIU et al., 2014). A família Narnaviridae contém espécies virais com genomas de uma molécula de (+)ssRNA com 2,3–2,9 Kb, com uma única ORF que codifica uma proteína com domínios semelhantes a RdRp (ESTEBAN; FUJIMURA, 2008). O gênero Narnavirus possui dois micovírus, ambos encontrados no fungo Saccharomyces cerevisiae (ESTEBAN; RODRIGUEZ-COUSINO; ESTEBAN, 1992). O outro gênero da família, o Mitovirus, possui

sequências codificantes de RdRp similares aos narnavírus, contudo, são encontrados nas mitocôndrias de seus hospedeiros (POLASHOCK; HILLMAN, 1994). A família Partitiviridae abriga vírus que infectam plantas, protozoários e fungos, estes vírus apresentam forma isométrica, com 25–40 nm de diâmetro, e genomas com dois segmentos de dsRNA, com tamanho de 1300–2500 cada e contendo uma ORF por segmento, codificando uma RdRp e uma CP (NIBERT et al., 2013). Pseudoviridae contém os LTR–retrotransponsons do tipo Ty1–copia. Estes apresentam VLPs, icosaédricas de 30–40 nm de diâmetro, não envelopadas, apesar de alguns membros possuírem um gene semelhante ao env (VOYTAS, 2008). Diferentemente dos LTR– retrotransponsons do tipo Ty3–gypsy, os genes pol apresentam domínios na ordem PR–IN– RT–RH (CAPY, 2005). A família Quadriviridae contém apenas a espécie Rosellinia necatrix quadrivirus 1 (RnQV1) que possui o genoma segmentado em quatro moléculas de dsRNA abrigadas em partículas esféricas com aproximadamente 45 nm de diâmetro (figura 11). Em cada segmento apresenta apenas uma ORF e os segmentos variam em tamanho de 3,6 Kb a 4,9 Kb (LIN et al., 2012).

Figura 11 – Morfologia da partícula viral e representação do genoma do quadrivírus RnQV1

Fonte: Adaptada de Lin et al., 2012. (A) Micrografia eletrônica da partícula viral. Bar, 50 nm. (B) Representação esquemática da organização do genoma do RnQV1, evidenciando a posição das ORFs (retângulos brancos) para os quatro segmentos dsRNA1 até dsRNA4.

As espécies da família Reoviridae apresentam o genoma de dsRNA linear fragmentado, podendo ter de 9 a 12 segmentos encapsulados em partículas de simetria icosaédricas ou esféricas com tamanho variando de 60–80 nm de diâmentro (HILLMAN, 2008). O gênero Mycoreovirus abriga as espécies de micovírus, sendo dois deles encontrados no fungo Cryphonectria parasitica, denominados Mycoreovirus 1 e Mycoreovirus 2, e a outra espécie obtida em Rosellinia necatrix, identificada como Mycoreovirus 3. Os Mycoreovirus 1 e Mycoreovirus 2 possuem o genoma composto por 11 segmentos de dsRNA, enquanto que o Mycoreovirus 3 têm 12 segmentos (OSAKI et al., 2002; HILLMAN et al., 2004). Atualmente cinco gêneros fazem parte da família Totiviridae, dos quais dois abrigam micovírus, Totivirus e Victorivirus (ICTV, 2016). O gênero Totivirus é representado pelo Saccharomyces cerevisiae virus L–A, este possui genoma com um segmento de dsRNA linear com duas ORFs, a primeira codifica a proteína CP e a segunda produz a RdRp (figura 12). Estas duas ORFs se sobrepõem por cerca de 130 bases e existe uma mudança de frame de leitura no sentido -1 (-1 translational frameshift) com relação a ORF 1 (ICHO; WICKNER, 1989). Os victovírus são representados pelo Helminthosporium victoriae virus 190S, que exibe uma estrutura genomica semelhante a dos totivírus, contudo expressa suas proteínas de forma separada e não fusionadas do tipo CP–RdRp como estes (HUANG; GHABRIAL, 1996).

Figura 12 – Representação esquemática da organização do genoma do Saccharomyces cerevisiae virus L–A, evidenciando a posição e o tamanho das ORFs

Fonte: Icho e Wickner, 1989.

O Botrytis porri botybirnavirus 1 (BpRV1), único do gênero não classificado Botybirnavirus, possui genoma com dois segmentos de dsRNA, cada um com uma ORF (figura 13). A RdRp codificada por ele apresenta de 19 a 23% de identidade com polimerases de membros das famílias Totiviridae, Chrysoviridae e Megabirnaviridae, contudo as outras proteínas não são similares com nenhum vírus conhecido. Estas características somadas a análise filogenética, demonstrado que este micovírus forma um clado distinto dos outros, indica a possibilidade dele pertencer a uma nova família (WU et al., 2012).

Figura 13 – Representação esquemática da organização do genoma do BpRV1, evidenciando a posição e o tamanho das ORFs (retângulos brancos) nos dois segmentos de dsRNA

Fonte: Wu et al., 2012. As proteínas estruturais p70, p80, p85 e o domínio da RNA polimerase dependente de RNA estão destacados nos retângulos cinzas.

Tabela 1 – Taxa que contém micovírus, segundo a revisão de 2018 do ICTV, e suas características, tais como morfologia viral, tipo e tamanho do genoma, número de segmentos genômicos e de ORFs (Open Reading Frames)

Total de Total de Morfologia do Tipo de Tamanho do Nº de Nº de Família Tamanho do virion espécies micovírus virion genoma genoma segmentos ORFs AlphaflexiviridaePl 56 2 10–15 nm X 470–800 nm Filamentoso flexuoso (+)ssRNA 6–9 Kb 1 linear 1–6 Barnaviridae 1 1 18–20 nm X 48–53 nm Bacilliforme (+)ssRNA 4 Kb 1 linear 7 3,6/3,2/3,0/ Chrysoviridae 9 9 35–40 nm Icosaédrico dsRNA 4 lineares 4 2,9 Kpb Deltaflexiviridae 3 3 – – (+)ssRNA 6-8 Kb 1 linear 4-5 Genoma contido em EndornaviridaePl,Pz 24 9 – dsRNA 14–18 Kpb 1 linear 1 vesículas Gammaflexiviridae 1 1 13 nm X 720 nm Filamentoso flexuoso (+)ssRNA 7 Kb 1 linear 2 GenomoviridaePl,I,V 73 2 20 nm Icosaédrico ssDNA 2,0-2,2 Kb 1 circular 2 Genoma contido em Hypoviridae 4 4 – (+)ssRNA 9–13 Kb 1 linear 2 vesículas Megabirnaviridae 1 1 50 nm Icosaédrico dsRNA 7,2/8,9 Kpb 2 lineares 4 VLP ou virions RT– MetaviridaePl,Pz,I,V 31 5 desconhecido 4–10 Kb 1 linear 1–2 envelopados (+)ssRNA Mymonaviridae 7 7 20 nm X 300–400 nm Filamentoso (-)ssRNA 10 Kb 1 linear 6 Narnaviridae 7 7 – – (+)ssRNA 2–3 Kb 1 linear 1 1,4–2,4 Kbp PartitiviridaePl,Pz 60 31 30–43 nm Icosaédrico dsRNA por 2 lineares 2 seguimento RT– PseudoviridaePl,Pz,I 34 6 60–80 nm Esférico, icosaédrico 5–9 Kbp 1 linear 1–3 (+)ssRNA 3,6/4/4,3/4,9 Quadriviridae 1 1 45 nm Esférico dsRNA 4 linear 4 Kbp Icosaédrico, com ou 9–12 ReoviridaePl,Pz,I,V 91 3 60–85 nm dsRNA 19–32 Kbp 10–14 sem projeções lineares TotiviridaePz 28 21 33–40 nm Icosaédrico dsRNA 4–7 Kbp 1 linear 1–2 Botybirnavirus 1 1 35 nm Icosaédrico dsRNA 5,9/6,3 Kbp 2 linear 2 Fonte: Adaptada de Virus Taxonomy, ICTV (https://talk.ictvonline.org/taxonomy/) e ViralZone (http://viralzone.expasy.org/). O taxa também possui espécies de vírus de plantas (Pl), protozoários (Pz), animais invertebrados (I) e/ou animais vertebrados (V).

2.5 NÚMERO DE ESPÉCIES DE FUNGOS E DE MICOVÍRUS

O crescente número de dados moleculares e a descrição de novas espécies de vírus a cada revisão taxonômica do ICTV1 revelam um aumento significativo no número de espécies de vírus que infectam fungos, principalmente nos últimos dez anos em que o número de espécies de micovírus reconhecidos dobrou e cresce de forma linear desde 2014 (figura 14). Contudo, o número de espécies de micovírus conhecidos é pequeno em relação ao número de espécies virais descritas em outros grupos de hospedeiros.

Figura 14 – Gráfico com o número de espécies de micovírus classificadas pelo ICTV de 1979 a 2018

Fonte: próprio autor.

O pouco número de espécies de micovírus conhecidos fica mais evidente quando comparado ao número de espécies de possíveis fungos hospedeiros. Atualmente 120 mil espécies de fungos são reconhecidas, com estimativas de existirem de 2,2 a 3,8 milhões

1Dados relativos a classificação de novas espécies virais podem ser vistos no site do ICTV, em: https://talk.ictvonline.org/taxonomy/p/taxonomy_releases

(figura 15) (HAWKSWORTH; LÜCKING, 2017). Demonstrando, assim, o quão pouco conhecemos a diversidade de espécies de micovírus existente.

Figura 15 – Comparação entre o crescimento do número de nomes de espécies de fungos catalogados (barras) com o número de espécies de fungos (círculos) registrados nas listas de referências, Ainsworth & Bisby’s Dictionary of the Fungi e Species Fungorum, de 1750 a 2010

Fonte: Hawksworth e Lücking. 2017.

2.6 RELAÇÃO VÍRUS E HOSPEDEIRO

Durante as investigações sobre a doença “La France”, já foi possível perceber que um fungo hospedeiro poderia ser co-infectado por diferentes vírus (figura 16) e que os sintomas dessa doença podem ser transmitidos a cogumelos saudáveis, pelo menos em condições laboratoriais, através da inoculação de partículas concentradas por gradiente de sacarose (HOLLINGS, 1962). Outro exemplo de co-infecção ocorre no fungo Botrytis cinerea, onde os vírus Botrytis virus X (Alphaflexiviridae) e Botrytis virus F (Gammaflexiviridae) foram encontrados. Como foi observado na espécie B. cinerea, espécies de micovírus de famílias diferentes podem infectar a mesma espécie de fungo hospedeiro. Outro exemplo disso é o fitopatógeno Rosellinia necatrix, nesta espécie hospedeira já foram encontrados diversos micovírus pertencentes às famílias Partitiviridae, Reoviridae, Totiviridae, Quadriviridae, e Megabirnaviridae (OSAKI et al., 2002; CHIBA et al., 2009; LIN et al., 2012).

Figura 16 – Micrografia eletrônica de uma preparação purificada a partir de cogumelos infectados

Fonte: Hollings, 1962. Na micrografia foram encontrados vírus com morfologia baciliforme e icosaédrica.

A maioria dos micovírus causam infecções assintomáticas em seus fungos hospedeiros. Contudo, alguns deles podem alterar a morfologia do hospedeiro e até causar hipovirulência em fungos fitopatogênicos (VAN ALFEN; KAZMIERCZAK, 2008). Os vírus de fungos que reduzem a virulência do hospedeiro têm representantes nas famílias Totiviridae, Chrysoviridae, Reoviridae, Narnaviridae e Hypoviridae (NUSS, 2008). O Helminthosporium victoriae virus 190S (Hv190SV), da família Totiviridae, e o Vírus Helminthosporium victoriae virus 145S (Hv145SV), da família Chrysoviridae, co–infectam o Helminthosporium victoriae, fungo causador da Victoria praga da aveia (SANDERLIN; GHABRIAL, 1978). A infecção além de reduzir a virulência do hospedeiro, também, afeta o crescimento, causa colapso do micélio aéreo e lises generalizadas (figura 17) (GHABRIAL, 2008b). Outro chrisovírus que afeta a morfologia do hospedeiro é o Agaricus bisporus virus L1 (AbLV1), o agente causa anomalias e redução do corpo de frutificação do cogumelo Agaricus bisporus (LENKE; NASH, 1974; GHABRIAL; SUZUKI, 2008).

Figura 17 – Aspecto morfológico das colônias de Helminthosporium victoriae, não infectada (saudável) e infectada por vírus (doente), da esquerda para a direita

Fonte: Imagem retirada de Ghabrial, 2008b. Colônias cresceram por uma semana em Ágar Dextrose Batata a temperatura ambiente.

Outros sintomas da infecção por micovírus é a redução da produção de pigmento e de conídeos (esporos assexuais) pelo hospedeiro, isto pode ser observado no fungo Cryphonectria parasitica, quando infectado pelo hipovírus CHV1–EP713 (NUSS, 2005). Além do CHV1–EP713, alguns micoreovírus (Reoviridae) também podem afetar C. parasitica (HILLMAN, 2008), principalmente reduzindo o crescimento e a esporulação (figura 18).

Figura 18 – Morfologia da colônia de Cryphonectria parasitica EP155

Fonte: Retirada de Hillman, 2008. (a) Colônia não infectada; (b) colônia infectada pelo hipovírus CHV–1/EP713; (c) colônia infectada pelo micoreovírus MyRV–1/Cp9B21; (d) colônia infectada pelo micoreovírus MyRV–2/CpC18.

2.6.1 Reprodução dos Fungos e dos Micovírus

Os fungos multicelulares são formados por estruturas filamentosas denominadas hifas. As hifas crescem através do alongamento da extremidade e se ramificam, explorando o substrato para a aquisição de nutrientes, gerando assim estruturas macroscópicas chamadas de colônias (SIDRIM; ROCHA, 2003a). O conjunto de hifas que formam a colônia é chamado de micélio e este pode ser dividido em dois tipos, o micélio vegetativo e o micélio aéreo. O micélio vegetativo é responsável pelo catabolismo e crescimento fúngico, enquanto que, o micélio aéreo contém as hifas especializadas na reprodução (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). Os fungos filamentosos podem se reproduzir de forma assexuada e/ou sexuada. A reprodução assexuada também é chamada de anamórfica e pode ocorrer através da fragmentação do micélio ou pela formação de conidióforos (micélio aéreo) que darão origem a conídios formados por mitose. A reprodução sexuada do fungo (teleomórfica) inicia quando há união das hifas (anastomose) entre colônias compatíveis, seguindo pela união entre citoplasmas (plasmogamia) e pela fusão dos núcleos (cariogamia), que irá originar os esporos, após o processo de meiose (MARIA; MORAES; PAES, 2009). A transmissão dos micovírus está associada a reprodução do hospedeiro durante seu ciclo de vida (figura 19). Como os micovírus não têm a capacidade de lisar as células do hospedeiro, sua transmissão fica limitada ao citoplasma. Desta forma, a transmissão horizontal do micovírus acontece quando o fungo infectado realiza a anastomose com um fungo não infectado. Em seguida ocorre a troca de citoplasma entre as duas colônias e, então, o micovírus é transmitido para o novo hospedeiro (GHABRIAL, 1998; NUSS, 2005). A transmissão horizontal do micovírus é limitada ao mecanismo de reprodução teleomórfica entre fungos, que por sua vez, depende do sistema de auto-regulação genética da compatibilidade vegetativa entre as cepas, impedindo a fusão de hifas incompatíveis. Porém, testes in situ demonstraram que o micovírus Cryphonectria hypovirus 1 pode ser transmitido mesmo entre grupos de hospedeiros de linhagens incompatíveis (BRUSINI; ROBIN, 2013). Quando o fungo infectado se reproduz assexuadamente, pela fragmentação da hifa ou pela produção de conídios, ou ainda se reproduz sexuadamente gerando esporos, a nova colônia que será formada também estará infectada pelo micovírus, pois tanto o fragmento de hifa quanto os conídios/esporos estarão carregando o vírus, ocorrendo assim a transmissão vertical (GHABRIAL, 1998; NUSS, 2005).

Figura 19 – Esquema dos tipos de reprodução do fungo e transmissão do micovírus

Fonte: Adaptado de Moraes; Paes e Holanda, 2009.

2.6.2 Utilização de Micovírus no Controle de Pragas Agrícolas

Os micovírus podem ser usados no controle biológico de fungos fitopatogênicos que afetam culturas de grande importância econômica, assim, crescem os esforços para encontrar micovírus que sejam capazes de causar hipovirulência em fungos fitopatogênicos alvos. Como exemplo, o vírus da família Hypoviridae, associado ao fitopatógeno Cryphonectria parasitica, causador do cancro do castanheiro. Quando este vírus infecta seu hospedeiro, a fitopatologia causada pelo fungo torna-se menos agressiva, gerando apenas pequenas lesões nos vegetais e, ainda, a virulência do fungo é tão reduzida que ele torna-se incapaz de matar o vegetal (HILLMAN; SUZUKI, 2004; LINDER-BASSO; DYNEK; HILLMAN, 2005). A efetividade do uso de micovírus como fungicida natural, causando hipovirulência no fungo fitopatogênico, foi demonstrada por Yu et al. (2013). Neste trabalho, as partículas virais do micovírus de ssDNA, SsHADV-1 (Gemycircularvirus, Genomoviridae) foram aplicadas sobre as folhas dos vegetais Arabidopsis thaliana e Brassica napus, ambos infectados com o fungo fitopatogênico Sclerotinia sclerotiorum, reduzindo, assim, o aparecimento de lesões nos vegetais. Com novos possíveis micovírus sendo descobertos e estudados a cada ano, acredita-se que ainda existam muitos mais a serem caracterizados. Portanto, novos estudos sobre a diversidade e a biologia dos vírus de fungos devem ser realizados para conhecermos melhor

esses microrganismos, dos quais possuímos informações muito limitadas em comparação com os vírus de animais e plantas (YU et al., 2013).

2.7 RIQUEZA DE ESPÉCIES DE FUNGOS NO SOLO

Os fungos são encontrados em diferentes tipos de solo e com variados padrões de riqueza de espécies. Através do sequenciamento HTS do DNA metabarcoding de centenas de amostras globais do solo foi demonstrado que os fatores climáticos, variáveis edáficas e espaciais são determinantes dos padrões biogeográficos e de diversidade de fungos no solo (TEDERSOO et al., 2014) e que a riqueza reduz em direção aos polos (figura 20).

Figura 20 – Mapa com a riqueza de espécies de fungos no solo a nível global

Fonte: Tedersoo et al., 2014. A – os círculos indicam as áreas de amostragem. B – Predição da riqueza de espécies de fungos por região (baseada no best multiple regression model). Cores quentes indicam sítios com alta riqueza e cores frias indicam sítios com baixa riqueza.

Com novos micovírus sendo descobertos e estudados a cada ano, acredita-se que ainda existam muitos mais a serem caracterizados, principalmente na Floresta Amazônica que abriga uma grande biodiversidade de fungos. Portanto, novos estudos sobre a diversidade e a biologia dos vírus de fungos devem ser realizados para conhecermos melhor esses

microrganismos, dos quais possuímos informações muito limitadas em comparação com os vírus de animais e plantas (YU et al., 2013).

2.8 ESTUDOS COM MICOVÍRUS NO BRASIL

No Brasil foram realizados poucos trabalhos com micovírus. A maioria desses foram teses e dissertações que caracterizam a partícula do micovírus e/ou seu ácido nucléico em fungos isolados de diferentes nichos, como entomopatógenos, endófitos e fitopatógenos. Um dos primeiros a ser estudado foi o Metarhizium anisopliae, um fungo entomopatogênico usado comercialmente no Brasil para o controle biológico de insetos pragas agrícolas. Três cepas de M. anisopliae (Al, M5 e RJ) oriundas dos estados de Alagoas, Pernambuco e Rio de Janeiro foram relatadas contendo partículas virais isométricas de 35 nm de diâmetro, com ácido nucléico composto por dsRNA (PECCI, 1996). A presença de dsRNA também foi detectada em 55% de 36 isolados de M. anisopliae obtidos da coleção da ESALQ- USP e estes apresentaram padrões eletroforéticos em gel de poliacrilamida variando de três a 18 bandas (SANTOS, 2013). Outros fungos entomopatógenos também apresentaram dsRNA, como por exemplo em Beauveria bassiana e em Paecilomyces fumosoroseus (SOUZA AZEVEDO et al., 2000). Em Cepas de B. bassiana foi demonstrado a ocorrência de partículas virais com 28-30 nm de diâmetro, e dsRNA transmitido tanto de forma vertical pela conidiogênese, quanto por transferência horizontal por meio de anastomose (DALZOTO et al., 2006). Microrganismos endofíticos, também chamados endófitos, vivem associados a tecidos vegetais sem causar prejuízos a planta. A presença de dsRNA também foi observada em quatro cepas endofíticas do fungo Phyllosticta spinarum, isoladas a partir do vegetal Citrus limon em Rio Negro–PR (MARTINS, 2005). Ainda, cepas de Colletotrichum gloeosporioides endófitas, isoladas de plantas de Aroeira (Schinus terebinthifolius) cultivadas no município de Guaraqueçaba - PR, também apresentaram dsRNA (LIMA, 2008). Os micovírus também foram detectados em alguns isolados brasileiros de espécies de fungos fitopatógenos. Observou-se a presença de dsRNA com cerca de 3.100 pb em cepas de Guignardia citricarpa, um fungo fitopatogênico que causa mancha preta de citros, oriundas do estado de São Paulo, nos municípios de Mogi-Guaçu, Cordeirópolis e Jaboticabal (SILVA, 2008). Fragmentos de dsRNA foram detectados em 42 isolados de Pseudocercospora griseola, agente causal da mancha angular nas plantas de feijão, das coleções do

Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa - MG e da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijão, Departamento de Fitopatologia e Biologia Molecular (LIMA et al., 2010). Moléculas de dsRNA com 1.500 e 2.500 pb e partículas virais com 25 e 50 nm de diâmetro também foram detectadas no isolado CNPUV 378 do gênero Colletotrichum, fitopatôgeno da videira, obtido na Embrapa Uva & Vinho de Bento Gonçalves, Rio Grande do Sul, Brasil (ROSSETO et al., 2016). Em um trabalho mais recente, uma nova espécie de mitovírus, com o genoma de cerca de 2.700 bases e uma ORF que codifica um RdRp, foi obtida a partir do fungo Sclerotinia sclerotiorum isolado Ss24, agente causal do mofo branco (BARROS, 2016). A detecção do material genético do micovírus ou de suas partículas nos fungos é fundamental para conhecermos a gama de hospedeiros que podem estar infectados. Contudo, na maioria dos trabalhos brasileiros citados os micovírus encontrados não foram geneticamente caracterizados e nem identificados filogeneticamente. A identificação molecular dos micovírus é necessária para sabermos quais as espécies estão presentes em fungos isolados no Brasil e quantas novas espécies virais ainda não foram descritas.

3 OBJETIVOS

3.1 GERAL

Identificar e caracterizar geneticamente os vírus de fungos obtidos a partir de amostras de solo da Área de Proteção Ambiental Ilha do Combu (Pará).

3.2 ESPECÍFICOS

Caracterizar o genoma completo ou parcial dos micovírus, identificando as regiões codificantes, os produtos gênicos e as regiões não codificantes 5’UTR e 3’UTR;

Identificar os fungos hospedeiros por meio de marcadores moleculares;

Comparar a relação filogenética dos vírus encontrados com outros vírus conhecidos.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 ÁREA DE ESTUDO E MÉTODO DE COLETA

A coleta das amostras de solo ocorreu na Área de Proteção Ambiental (APA) Ilha do Combu (1°29’45.0’’S; 48°27’38.6’’W), uma região de floresta amazônica preservada, localizada na margem esquerda do rio Guamá, aproximadamente a 1,5 Km ao sul da cidade de Belém, estado do Pará (figura 21). Nesta APA as amostras foram obtidas na borda de uma trilha usada por moradores, situada em uma propriedade na margem esquerda do Igarapé do Combu, onde foram estabelecidos cinco pontos aleatórios, afastados pelo menos 10 m entre si, nos quais retirou-se 50 g do solo de cada ponto a uma profundidade de 10 cm, com recipientes estéreis. Em seguida, estas amostras foram transportadas em caixa de isopor (sem gelo, mantendo a temperatura ambiente e ausência de luz) até o processamento no Centro de Inovações Tecnológicas do Instituto Evandro Chagas, cidade de Ananindeua, estado do Pará.

Figura 21 – Mapa indicando a localização da Área de Proteção Ambiental Ilha do Combu, no rio Guamá, próxima a Belém

Fonte: Adaptada do Google Maps. O marcador indica a área de coleta.

4.2 ISOLAMENTO DOS FUNGOS A PARTIR DO SOLO

No laboratório, as amostras foram diluídas em série, para isso em 25 g de solo de cada amostra foi adicionado 25 mL de água destilada estéril, então a solução foi misturada em

agitador tipo Shaker por uma hora a 150 rpm. Posteriormente, 1 mL da solução foi misturado a 9 mL de água destilada estéril, sendo este procedimento repetido consecutivamente até a solução final alcançar a concentração de 1 mg/mL. A partir da solução final com concentração de 1 mg/mL, 500 μL foram aplicados a cada placa de Petri contendo o meio de cultura não seletivo ágar dextrose batata (BDA, Acumedia) acrescido de uma solução de antibiótico com 20 U/mL de penicilina e 40 µg/mL de estreptomicina, sendo usadas 5 placas para cada ponto, totalizando 25 placas. Posteriormente, as placas foram incubadas à temperatura ambiente (28 ±2 Cº) por até cinco dias. Então, as colônias de fungos filamentosos morfologicamente distintas foram repicadas sucessivamente até obter os isolados. A seleção dos fungos distintos foi realizada com bases nas características macroscópicas das colônias, cultivadas no meio de cultura BDA. O exame macroscópico do fungo refere-se ao conjunto de características observáveis de uma colônia (SIDRIM; ROCHA, 2003b). As principais características observadas na triagem das colônias foram: coloração, tamanho, aspecto das bordas, textura, relevo e a produção de pigmentos. A textura é o aspecto do micélio, sendo associado a elementos com formas semelhantes, como a forma de algodão (colônia algodonosa) ou como um pouco de areia (colônia arenosa). O relevo diz respeito à topografia da colônia, forma com a qual ela se apresenta no meio, podendo ser rugosa, apiculada, crateriforme, entre outros (SIDRIM; ROCHA, 2003b).

4.3 EXTRAÇÃO DO RNA E SEQUENCIAMENTO

Para extrair o RNA total dos fungos isolados, primeiramente, cada um deles foi inoculado em caldo dextrose batata (Acumedia) e incubados a 28 ºC por 20 dias. Então o micélio úmido de cada fungo em cultura foi transferido para um tubo contendo 1000 μL de tampão Tris– EDTA e uma esfera de aço (beads) de 5 mm. Em seguida, foi realizada uma lise térmica na qual os tubos com as amostras foram colocados em nitrogênio líquido por aproximadamente 30 s e em seguida rapidamente aquecidos a aproximadamente 100 °C por 1 min, esta etapa foi repetida três vezes seguidas. Posteriormente os tubos foram vigorosamente agitados em um TissueLyser (QIAGEN), realizando a lise mecânica. Os tubos foram centrifugados a 12.000 G por 5 min a 4 °C e o sobrenadante foi utilizado na extração e purificação do RNA com o reagente TRIzol® acrescido de clorofórmio, e o QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN), seguindo o protocolo do fabricante.

A partir do RNA extraído de cada isolado sintetizou-se o cDNA através do cDNA Synthesis System Roche® Kit (Roche), conforme descrito pelo fabricante. Posteriormente, as bibliotecas foram construídas utilizando o Illumina Nextera® DNA Library Preparation Kit com fragmentos de 100 pb. O sequenciamento das bibliotecas foi realizado na plataforma HiSeq 2500 (Illumina), conforme o protocolo do fabricante.

4.4 BIOINFORMÁTICA

As leituras geradas foram filtradas, removendo-se os adaptadores, leituras com qualidade Phred menor que 20 e tamanho inferior a 50 nt, utilizando o Trim Galore 0.4.4, Cutadapt e o Prinseq-lite 0.20.4 (MARTIN, 2011; SCHMIEDER; EDWARDS, 2011; KRUEGER, 2017). Em seguida as leituras filtradas foram usadas na montagem de novo, com dois softwares, o IDBA-UD v.1.1.3 (PENG et al., 2012), configurado com intervalos de kmers de 21 a 99, variando de 10 em 10, e o SPAdes v.3.11.1 (BANKEVICH et al., 2012), utilizando os kmers 21, 33, 55 e 77. Para a remoção da redundância no dados, os contigs gerados foram submetidos ao programa CD-Hit-Est v.4.7 (Li W 2006) configurado com 90% de limite de identidade. Em seguida, os contigs não redundantes foram alinhados contra o banco de proteínas não redundantes (nr) do NCBI utilizando o algoritmo Blastx, implementado no software Diamond v.0.9.22 (BUCHFINK; XIE; HUSON, 2015).

4.4.1 Identificação molecular dos fungos

Para a busca de sequências homólogas dos genes ribossomais (18S rRNA - ITS1 - 5.8S rRNA - ITS2 - 23S rRNA), os contigs foram submetidos ao algoritmo Infernal v.1.1.2, que os detecta usando perfis de sequência de rRNA e consenso de estrutura secundária (NAWROCKI; EDDY, 2013). A partir disso, a região da sequência intergênica não transcrita (ITS) obtida foi submetida a plataforma BOLD Systems em www.boldsystems.org (RATNASINGHAM; HEBERT, 2007), para a classificação molecular dos fungos. Os isolados não identificados a nível de espécie através do BOLD Systems foram comparados filogeneticamente com representantes de suas famílias (ou ordem), por meio de sequências completas da região ITS obtidas nos bancos de dados. Para isso, o conjunto de sequências obtidas foram agrupadas no CD-Hit-Est v.4.7 com limite de 99% de identidade

(LI; GODZIK, 2006). Então, as sequências representantes e as sequências dos isolados foram alinhadas com o Clustal Ômega on line (SIEVERS et al., 2011). Em seguida aplicou-se o método Neighbor-Joining para a reconstrução filogenética, empregando-se o modelo de substituição nucleotídica mais adequado ao conjunto de dados analisados, com 1000 réplicas de bootstrap, utilizando o programa MEGA 7 (KUMAR; STECHER; TAMURA, 2016).

4.4.2 Identificação dos vírus

A partir do resultado do BlastX, as sequências nucleotídicas que alinharam com as sequências de proteínas virais do GenBank/NCBI foram separadas e traduzidas com base no código genético 1 (standard). Então, foi realizada a anotação estrutural para a predição de domínios conservados nas sequências de aminoácidos, estas foram anotadas com o InterProScan (QUEVILLON et al., 2005). Com base nessas informações seguiu-se para as análises filogenéticas.

4.4.3 Análises filogenéticas dos vírus

Para identificar e compreender as relações evolutivas dos micovírus encontrados nos fungos isolados, as sequências completas de aminoácidos das polimerases desses vírus foram alinhadas com as sequências de outros vírus similares, resultantes da análise do Blastx, e representantes de taxa próximos relatados na literatura. Este alinhamento foi realizado no Clustal Omega versão online. Para cada alinhamento, o melhor modelo de substituição de aminoácidos foi avaliado pelo Akaike Information Criterion, implementado no ProtTest v.3.4.2 (DARRIBA et al., 2017). Em seguida aplicou-se o método de máxima verossimilhança para a reconstrução filogenética com 1000 réplicas de bootstrap, utilizando o RAxML v.8.2.12 (STAMATAKIS, 2014).

5 RESULTADOS

A partir das amostras de solo, foram isolados nove fungos com colônias distintas entre si, levando em consideração os critérios macroscópicos como textura, topologia e coloração da colônia. Os isolados foram nomeados com os códigos C1D, C1G, C1H, C2A, C2B, C2C, C3A, C3B e C4A. O deep sequencing do RNA total dos isolados gerou em média 39,79 milhões de leituras por isolado, variando de 33,81 milhões a 47,62 milhões. Após a limpeza do conjunto de leituras a média de leituras por isolado atingiu 34,52 milhões, com mínimo de 31,39 milhões e máximo de 38,16 milhões (apêndice A). A montagem com o IDBA-UD gerou uma média de 9.113 contigs por amostra, com mínimo de 1.573 contigs (isolado C3A) e máximo de 26.207 contigs (isolado C2A), enquanto o montador SPAdes produziu um número maior de contigs, com 21.880 contigs em média, mínimo de 11.942 contigs (isolado C3A) e máximo de 49.772 (isolado C2A). A criação do conjunto de contigs consenso, estabelecidos após a remoção dos contigs com identidade acima de 90%, permitiu utilizar os contigs de ambos os montadores e sem sequências redundantes que aumentariam o tempo de processamento (figura 22).

Figura 22 – Número de contigs gerados para cada montador, IDBA-UD e SPAdes, e o conjunto de sequências consenso resultantes após remoção da redundância entre os montadores

Fonte: Próprio autor.

5.1 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS ISOLADOS

Após a montagem dos contigs e predição dos genes ribossomais, os nove isolados foram identificados através da região ITS na plataforma on line BOLD System. Os isolados foram classificados nas ordens Mucorales, com as espécies Gongronella butleri (C1D; 98% de identidade) e Mucor irregularis (C3B; 100% de identidade); Polyporales, com Fomitopsis sp. (C1G; 100% de identidade) e Phlebia floridensis (C2A; 99% de identidade); Russulales, identificado como Amylostereum sp. (C1H; 83% de identidade); Eurotiales, Talaromyces aculeatus (C2B; 97% de identidade) e Penicillium citrinum (C2C; 100% de identidade); e Hypocreales, com Simplicillium sympodiophorum (C3A; 100% de identidade) e Fusarium sp. (C4A; 100% de identidade) (tabela 2). A filogenia molecular com as sequências ITS foi aplicada nos fungos cuja espécie não foi determinada pela plataforma BOLD System. A inferência filogenética do isolado C1G, classificado no gênero Fomitopsis, realizada juntamente com sequências representantes da família Fomitopsidaceae, revelou o agrupamento do C1G com um Fomitopsis não identificado (AB505425), formando um grupo irmão aos fungos F. meliae e F. pinicola, e com F. ostreiformis aparecendo externamente (figura 23). Os altos valores de bootstrap dos agrupamentos sugerem a formação de um grupo monofilético.

Figura 23 – Inferência filogenética do isolado C1G com sequências representantes da família Fomitopsidaceae

Fonte: Próprio autor.

Pelo BOLD System o isolado C1H foi relacionado ao fungo Amylostereum ferreum, com uma similaridade de apenas 83.27%, contudo as análises filogenéticas indicaram que o C1H é de uma espécie distante de todos os representantes da família Amylostereaceae com a região ITS disponível no banco de dados (figura 24).

Figura 24 – Inferência filogenética do isolado C1H com sequências representantes da família Amylostereaceae

Fonte: Próprio autor.

Tabela 2 – Identificação molecular dos fungos através da região intergênica não transcrita (ITS) pelo Barcode of Life Data System - BOLD System Tamanho Tamanho Acesso Isolado Melhor hit Similaridade E-Value (bp)* do hit (bp) (Origem) Zygomycota; Mucorales; Cunninghamellaceae; JN943049 C1D 589 656 98.31% 0 Gongronella butleri (Chile) Basidiomycota; Polyporales; Fomitopsidaceae; AB505425 C1G 585 1200 100% 0 Fomitopsis sp. (Indonesia) Basidiomycota; Russulales; Amylostereaceae; HM461082 C1H 547 602 83.27% 8.45E-133 Amylostereum ferreum (não disponível) Basidiomycota; Polyporales; Meruliaceae; KJ831896 C2A 559 545 99.82% 0 Phlebia cf. floridensis (Peru) Ascomycota; Eurotiales; Trichocomaceae; GU566285 C2B 499 620 97.33% 0 Talaromyces aculeatus (Czech Republic) Ascomycota; Eurotiales; Trichocomaceae; PATE002-08 C2C 466 563 100% 0 Penicillium citrinum (Cuba) Ascomycota; Hypocreales; Cordycipitaceae; AB604003 C3A 536 625 100% 0 Simplicillium sympodiophorum (Japan) Zygomycota; Mucorales; Mucoraceae; JX076993 C3B 559 551 100% 0 Mucor irregularis (China, Zhejiang) Ascomycota; Hypocreales; Nectriaceae; AY662329 C4A 471 522 100% 0 Fusarium sp. (não disponível) Fonte: Próprio autor

5.2 DETECÇÃO DOS MICOVÍRUS ASSOCIADOS AOS FUNGOS ISOLADOS

A partir das análises por Blastx dos contigs, três sequências foram identificadas contendo genes da polimerase de micovírus. Um contig viral com 2992 nt encontrado em Simplicillium sympodiophorum C3A, denominado Combu 3A micovírus 1, apresentou uma RdRp com 74% de similaridade (59% de identidade) com Beauveria bassiana RNA virus 1 (LN610699) e 73% de similaridade (59% de identidade) com Penicillium janczewskii Beauveria bassiana-like virus 1 (KT601106), todos com o genoma de dsRNA. A sequência Combu 3A micovírus 1 parece representar um novo vírus de dsRNA, sendo chamado de Combu double-strand RNA mycovirus (CDRV), indicando a localização onde o micovírus foi encontrado. O CDRV apresentou duas ORFs em um único segmento, separadas por 14 nt. A ORF 1, presente da posição 13 a 993 nt, codificando uma possível proteína de capsídeo com 326 aa. A ORF 2, presente da posição 1008 a 2804 nt, codifica uma proteína de 598 aa com um domínio predito de RNA polimerase dependente de RNA - RdRp (Pfam PF00680). Sua região 5’ não traduzida contém 12 pb e a 3’ não traduzida possui 188 pb. Outra sequência viral foi detectada também no S. sympodiophorum C3A, denominada Combu 3A micovirus 2. Esta sequência contém 2777 nt e apresenta apenas 33,4% de identidade nucleotídica com o CDRV. A análise por Blastx demonstrou que a sequência Combu 3A micovírus 2 possui 56% de similaridade (40% de identidade) com o Soybean leaf- associated ourmiavirus 1 (KT598235), um ourmiavirus-like com genoma de ssRNA de polaridade positiva. Sugerindo que a sequência pertence a um novo micovírus, nomeado de Combu positive-strand RNA mycovirus (CPRV). Portanto, o isolado S. sympodiophorum C3A encontra-se co-infectado por duas espécies de vírus, um de dsRNA e outro de ssRNA(+), o CDRV e o CPRV, respectivamente. O CPRV não é segmentado e possui apenas uma ORF de 1905 nt. Esta codifica uma sequência de 634 aa com um domínio predito para RdRp de mitovírus (Pfam PF05919). A extremidade 5’ UTR possui 155 nt e a 3’ UTR se estende por 717 nt.

A terceira sequência contendo um gene de polimerase viral foi obtida a partir do fungo Mucor irregularis C3B. Essa sequência, denominada Combu 3B micovírus 1, evidenciou 8340 nt e uma única ORF que, por Blastx, possui 47% de similaridae (29% de identidae) com a polimerase do Beihai sesarmid crab virus 5 (KX884794), um vírus associado a crustáceo, 46% de similaridade (27% de identidade) com o Macrophomina phaseolina negative-stranded RNA virus 1 (KP900899) e 45% de similaridade (27% de identidade) com o Botrytis cinerea negative-stranded RNA virus 1 (LN827956), ambos vírus de fungos, sendo todos esses vírus de ssRNA polaridade negativa não classificados. As análises sugerem que a sequência Combu 3B micovírus 1 pertence a um novo micovírus, denominada Combu negative-strand RNA mycovirus (CNRV). A proteína predita pela ORF do CNRV possui 2645 aa. Nesta foi encontrado um domínio de RNA polimerase de vírus de RNA polaridade negativa (PROSITE PS50525) com 188 resíduos, também presente em membros da ordem Bunyavirales. Este domínio apresentou 53,09% de similaridade ao mesmo domínio em representantes da família Fimoviridae (tabela 3). Tabela 3 – Percentagem de similaridade entre a sequência completa da RdRp e do domínio RdRp PROSITE do Combu negative-strand RNA mycovirus (CNRV) em relação a alguns vírus de ssRNA(-) da ordem Bunyavirales

Família/ Similaridade Vírus RdRp Domínio RdRp completa PROSITE Hantaviridae/ 34,59% 45,23% Hantaan orthohantavirus Fimoviridae/ 33,92% 53,09% European mountain ash ringspot-associated emaravirus Peribunyaviridae/ 36,94% 51,27% Bunyamwera orthobunyavirus Phasmaviridae/ 34,94% 50,53% Kigluaik phantom orthophasmavirus Phenuiviridae/ 32,51% 47,60% Gouleako goukovirus Nairoviridae/ 29,22% 37,17% Dugbe orthonairovirus Fonte: Prórpio autor.

5.3 SEQUÊNCIAS ASSOCIADAS A VÍRUS DE DSRNA

Inferências filogenéticas da sequência de aminoácidos da polimerase do CDRV, juntamente com as sequências completas mais similares a ele encontradas no NCBI, os vírus da família Amalgaviridae e alguns representantes da família Partitiviridae, demonstraram a formação de um clado próximo aos amalgavírus, composto por dois grupos contendo somente sequências de micovírus de dsRNA (figura 25).

Figura 25 – Filogenia e organização genômica do Combu double-strand RNA mycovirus (CDRV)

Fonte: Próprio autor. (A) Representação esquemática da organização do genoma do CDRV, contendo duas ORFs (setas amarelas). (B) Árvore filogenética mostrando a relação da RdRp de vírus das famílias Amalgaviridae, Partitiviridae e micovírus de dsRNA não classificados. O CDRV é indicado com uma estrela vermelha. A árvore filogenética foi geradas usando o RAxML sob o modelo de substituição de aminoácidos VT+G+F, com 1000 réplicas de bootstrap.

O clado I na figura 25 reuniu micovírus não classificados que possuem dois segmentos, o maior de 2 a 2,3 Kb contendo uma ORF com uma RdRp predita e o menor com tamanho de 1,7 a 1,8 Kb abrigando uma ou duas ORFs para proteínas hipotéticas, de tamanhos diferentes entre sí. Este grupo ficou bem suportado pelo valor de bootstrap na analise de máxima verossimilhança. Ainda, o teste t pareado da média das distâncias intra grupo contra a inter grupo apontou uma diferença significativa (p<0.001), ratificando a formação do grupo. O clado II na figura 25 contém vírus não segmentados com duas ORFs, uma menor para uma proteína hipotética e outra maior contendo um domínio RdRp predito, com os genomas variando de 2,8 a 3,4 Kb de tamanho, semelhante ao CDRV. Este grupo também apresentou um alto valor de bootstrap na árvore filogenética e um valor significativo (p<0.001) no teste t pareado das médias das distâncias.

5.4 SEQUÊNCIAS ASSOCIADAS A VÍRUS DE SSRNA(+)

A árvore de máxima verossimilhança com a sequência de aminoácidos da polimerase do CPRV, junto a sequências virais não classificadas completas mais similares a ele disponíveis no NCBI, dos vírus do gênero Ourmiavirus e dos membros da família Narnaviridae revelou a formação de um clado irmão aos ourmiavírus, somente com micovírus não classificados, incluindo o CPRV, bem suportado pelo valor de bootstrap (figura 26). Para todos eles apenas uma sequência contendo uma ORF com domínio RdRp foi descrita, sugerindo que são vírus não segmentados com tamanho de 2,3 a 3,0 Kb.

Figura 26 – Filogenia e organização genômica do Combu positive-strand RNA mycovirus (CPRV)

Fonte: Próprio autor (A) Representação esquemática da organização do genoma do CPRV, contendo uma ORF (seta amarela). (B) Árvore filogenética mostrando a relação da RdRp de vírus do gênero Ourmiavirus, da família Narnaviridae e micovírus de ssRNA positivo não classificados. O CPRV é indicado com uma estrela vermelha. A árvore filogenética foi gerada usando o RAxML sob o modelo de substituição de aminoácidos VT+I+G+F, com 1000 réplicas de bootstrap.

O teste t pareado reforça a formação do grupo contendo o CPRV juntamente com outros micovírus não classificados, exibindo um resultado significativo (p<0.001) quando agrupamos independentemente os Ourmiavirus, Narnaviridae e o grupo contendo o CPRV.

5.5 SEQUÊNCIAS ASSOCIADAS A VÍRUS DE SSRNA(-)

O CNRV apresentou uma relação filogenética com os vírus da ordem Bunyavirales, formando um clado bem definido, juntamente com Beihai sesarmid crab virus 5, Botrytis cinerea negative-stranded RNA virus 1, Macrophomina phaseolina negative-stranded RNA virus 1 e Soybean cyst nematode bunya-like virus, todos vírus não classificados com a

sequência completa da polimerase. Este clado demonstrou maior proximidade com os representantes das famílias Nairoviridae e Phenuiviridae (figura 27). O teste t apontou um valor de p significativo (p<0.001), confirmando o agrupamento demonstrado pela filogenia.

Figura 27 – Filogenia e organização genômica do Combu negative-strand RNA mycovirus (CNRV)

Fonte: Próprio autor.

(A) Representação esquemática da organização do genoma do CNRV, contendo uma ORF (seta amarela). (B) Árvore filogenética mostrando a relação da RdRp de vírus da ordem Bunyavirales e vírus de ssRNA negativo não classificados. O CNRV é indicado com uma estrela vermelha. A árvore filogenética foi gerada usando o RAxML sob o modelo de substituição de aminoácidos LG+I+G+F, com 1000 réplicas de bootstrap.

6 DISCUSSÃO

A APA ilha do Combu já foi alvo de estudos de biodiversidade da comunidade fúngica, sendo identificadas diversas espécies de fungos endofíticos (RODRIGUES, 1994) e conidiais (hyphomycetes) saprófitas associados ao açaizeiro (Euterpe oleracea), uma palmeira com alto valor econômico para a região amazônica (CASTRO; GUTIÉRREZ; SOTÃO, 2013), além dos fungos causadores de ferrugens (Pucciniales) (CARMO et al., 2016) e fungos conidiais em folhas de cedro vermelho (Cedrela odorata), uma espécie arbórea ameaçada (SANTOS et al., 2018). Estes trabalhos apresentaram diversos novos registros para o Estado do Pará, para a Amazônia brasileira, para o Brasil, para a América do Sul e até para as Américas. Ainda, quatro novas espécies de fungos já foram reportadas para a APA ilha do Combu (MONTEIRO; GUSMÃO; CASTAÑEDA-RUIZ, 2014a, 2014b; MONTEIRO; CASTAÑEDA-RUIZ; GUSMÃO, 2016). Todas as espécies de fungos identificadas neste trabalho já foram previamente descritas na literatura, algumas delas até apresentam estudos mais específicos sobre produção de metabólitos de interesse e potencial biotecnológico. Contudo, as espécies Gongronella butleri, Phlebia floridensis e Simplicillium sympodiophorum, encontradas na APA ilha do Combu, representam um novo registro de ocorrência para a Amazônia brasileira. O fungo Gongronella butleri (espécie do isolado C1D) têm ampla distribuição, já tendo sido relatado em amostras do solo brasileiro (CAVALCANTI et al., 2006) e associado a castanha-do-Pará (COSTA et al., 2009). Este se destaca principalmente pela produção de quitina e quitosana (NWE et al., 2002; STREIT et al., 2009). A quitina e a quitosana são copolímeros importantes da parede celular de certos fungos com propriedades mecânicas e biológicas que possuem potencial aplicação na engenharia de tecidos e órgãos (NWE; FURUIKE; TAMURA, 2009). Além disso, este fungo apresenta um potencial para a produção de amilases com características para a aplicação industrial (CAVALHEIRO et al., 2017) e, recentemente, uma nova exoquitosanase foi descoberta em G. butleri (SEKI; NISHIYAMA; MITSUTOMI, 2018), evidenciando que este fungo precisa de mais estudos, principalmente pelo seu valor biotecnológico. O gênero Fomitopsis é formado por espécies de macrofungos da ordem Polyporales (Basidiomycota) causadores de podridão parda (LI; HAN; CUI, 2013). Análises taxonômicas e de filogenia molecular utilizando dados de multi loci demonstraram que as 23 espécies que formavam Fomitopsis sensu lato foram divididas em sete gêneros: Fomitopsis sensu stricto (incluindo a espécie tipo F. pinicola), Fragifomes, Niveoporofomes, Rhodofomes,

Rhodofomitopsis, Rubellofomes e Ungulidaedalea (HAN et al., 2016). Portanto, para a classificação específica do Fomitopsis sp. C1G é necessario aplicar a inferência filogenética com múltiplos genes. O isolado C1H pertence ao gênero Amylostereum. As espécies A. chailletii, A. areolatum e A. laevigatum possuem uma relação simbiótica com diferentes vespas da madeira, enquanto o fungo é dispersado pelo artropode e inoculado em novas madeiras, apodrecendo-as, a vespa passa a ter um ambiente adequado com nutrientes e enzimas que auxiliam no desenvolvimento de suas larvas (COUTTS, 1969; SLIPPERS et al., 2003). Espécies de Amylostereum já foram relatadas na África do Sul, Uruguai, Brasil, em diferentes países da Europa e Japão (TABATA; ABE, 1997; VASILIAUSKAS; STENLID; THOMSEN, 1998; SLIPPERS et al., 2001). Phlebia floridensis (espécie do isolado C2A) é um dos agentes que causam a podridão branca das raízes de vegetais. Seu potencial para a produção de enzimas ligninolíticas, responsáveis pelos efeitos da podridão branca, é estudado para aplicações industriais na produção de papel e celulose, por exemplo (ARORA; GILL, 2005). A ordem Polyporales, que abriga os macrofungos poróides como o gênero Phlebia, sofreu uma revisão taxonômica baseada tanto em dados morfológicos quanto moleculares, sendo este gênero alocado na família Meruliaceae (JUSTO et al., 2017). Talaromyces aculeatus (espécie do isolado C2B) e Penicillium citrinum (espécie do isolado C2C) são microfungos pertencentes a família Trichocomaceae. O gênero Talaromyces está intimamente relacionado com Penicillium e o estágio assexual de Talaromyces é difícil de distinguir de Penicillium (SAMSON et al., 2011). T. aculeatus é amplamente utilizado na industria alimentícia para a produção de pigmento, pois é capaz de produzir o pigmento MPA (Monascus-like polyketide azaphilone) sem sintetizar micotoxinas (DUFOSSÉ et al., 2014). P. citrinum já foi relatado como produtor de diversas enzimas de importância industrial, por exemplo, celulase, xilanase e lipase (MALISZEWSKA; MASTALERZ, 1992; DUTTA et al., 2007, 2008). Além disso, ele pode ser um patógeno oportunista causando complicações pulmonares e pericardial em hospedeiros imunocomprometidos (MOK et al., 1997). Simplicillium sympodiophorum (espécie do isolado C3A) foi primeiramente encontrado sob o solo da planta Asplenium antiquum em Aogashima, ilha Izu, Tókio, Japão, e descrito como espécie nova do gênero Simplicillium juntamente com outras quatro (Nonaka 2013). Estudos moleculares relataram que esta espécie também ocorre na Espanha e no Líbano (SERRADILLA et al., 2013; JABER et al., 2016).

Mucor irregularis (espécie do isolado C3B) é um agente causal de mucormicose, principalmente em pessoas com deficiência do sistema imune, contudo, pode acometer também hospedeiros imunocompetentes, ocasionando micose cutânea primária (LU et al., 2009; ZHAO et al., 2009). Em certos casos a infecção por M. irregularis pode tornar-se crônica (Hemashettar 2011). Este fungo também é de interesse biotecnológico pela capacidade de produzir lipase extracelular com máxima atividade a 40 ºC e pH 8, sendo altamente estável em pH de 7 a 9 (BANCERZ et al., 2016). O gênero Fusarium (isolado C4A) contém espécies saprófitas, endofíticas, fitopatogênicas e patógenos de humanos e outros animais. Muitas espécies de Fusarium são morfologicamente indistinguíveis (espécies crípticas) e até a identificação molecular necessita ser feita com multilocus para ser sensível a formação dos complexos de espécies (O’DONNELL et al., 2008a, 2008b, 2009; SUGA et al., 2008). As técnicas de sequenciamento são reconhecidas por sua capacidade de gerar dados de alta qualidade com significativa profundidade (deep sequencing). Usando tais técnicas, é possível detectar vírus mesmo em amostras com títulos virais muito baixos. O método de sequenciamento profundo tem sido considerado a técnica mais poderosa para identificar e caracterizar micovírus (NERVA et al., 2015). A co-infecção por micovírus já foi observada em diferentes fungos. Esta infecção múltipla pode ser por micovírus taxonomicamente similares, como ocorre no Ophiostoma novo-ulmi isolado Ld, onde foram encontradas quatro espécies de Mitovirus (Narnaviridae) e no fungo Sphaeropsis sapinea isolado CMW4254, que abriga duas espécies de Victorivirus (Totiviridae) (HONG et al., 1998, 1999; PREISIG; WINGFIELD; WINGFIELD, 1998). Micovírus taxonomicamente distintos também podem co-infectar o mesmo fungo, como por exemplo, o Botrytis virus F (Mycoflexivirus, Gammaflexiviridae) e o Botrytis virus X (Botrexvirus, Alphaflexiviridae), que foram detectados no Botrytis cinerea isolado RH106-10 (HOWITT et al., 2001, 2006). Este fato é semelhante ao que ocorre no S. sympodiophorum C3A, co-infectado por dois micovírus distintos, o CDRV e o CPRV. O fungo Mucor irregularis isolado C3B, Zygomycota da ordem Mucorales apresentou um micovírus de ssRNA(-), o CNRV. A existência de vírus de ssRNA(-) em fungos foi inicialmente associada com sequências endógenas semelhantes a vírus em seus genomas (KONDO et al., 2013). Contudo, a descoberta do Sclerotinia sclerotimonavirus, um micovírus de ssRNA(-) da família Mymonaviridae (Mononegavirales), forneceu novos insights sobre a origem e evolução deste grupo de vírus (LIU et al., 2014). Para a ordem Bunyavirales, composta também por vírus de ssRNA(-), alguns micovírus já foram relatados (DONAIRE;

ROZAS; AYLLÓN, 2016; MARZANO et al., 2016; VAINIO et al., 2017), porém, nenhum foi oficialmente reconhecido pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV) até o momento. Através da metodologia utilizada neste estudo, três novas espécies de micovírus foram encontradas e caracterizadas, o Combu double-strand RNA mycovirus (CDRV), o Combu positive-strand RNA mycovirus (CPRV) e o Combu negative-strand RNA mycovirus (CNRV). Todos eles formaram grupos monofiléticos, juntos a outros vírus não classificados, de acordo com suas respectivas categorias genômicas. Para o CDRV se estabeleceu um grupo com micovírus não segmentados contendo duas ORFs independentes em seus genomas, denominado de clado não classificado I (figura 25). Próximo a este temos um clado de micovírus com dois segmentos, cada um contendo uma ORF, chamado clado não classificado II. Os primeiros relatos dos vírus que formam esses grupos sugerem a criação de uma nova família possivelmente com dois gêneros (LIN et al., 2014). A caracterização crescente de novos micovírus associados a esses grupos fortalece a necessidade da organização taxonomica deles (KOLONIUK; HRABÁKOVÁ; PETRZIK, 2015; KOTTA-LOIZOU; SIPKOVA; COUTTS, 2015; NERVA et al., 2015; CAMPO; GILBERT; CARRINGTON, 2016). Como o clado I e o clado II dividem um ancestral comum com os Amalgaviridae, por vezes eles são colocados dentro desta família (KOLONIUK; HRABÁKOVÁ; PETRZIK, 2015; CAMPO; GILBERT; CARRINGTON, 2016). Contudo, os amalgavírus possuem um genoma não segmentado com duas ORFs sobrepostas (overlapping ORFs) que é traduzida em uma proteína fusionada gag-pol (MARTIN et al., 2006; LIU; CHEN, 2009; SABANADZOVIC et al., 2009; SABANADZOVIC; GHANEM- SABANADZOVIC; VALVERDE, 2010; MARTIN; ZHOU; TZANETAKIS, 2011). O único micovírus que apresenta essas características é o Zygosaccharomyces bailii virus Z (DEPIERREUX; VONG; NIBERT, 2016). Os micovírus dos clados I e II diferem estruturalmente dos amalgavírus, sugerindo que eles formam um novo grupo. Com base na relação filogenética apresentada, na distância genética e na organização genômica, os clados não classificados I e II poderiam ser considerados duas novas famílias. A primeira reúne os micovírus com dois segmentos, um menor de aproximadamente 1,8 Kb contendo até duas ORFs (CP e proteína hipotética) e o outro segmento maior de 2,0 a 2,3 Kb com a ORF da RdRp. A outra nova família iria abrigar os micovírus com somente um segmento, variando de 2,9 a 3,4 Kb de tamanho, contendo duas ORFs não fusionadas. Ambas as novas famílias de micovírus teriam a família Amalgaviridae como clado irmão. Esta poderia agregar um novo gênero, sendo proposto o nome Amalgamycovirus, sugerido por

Koloniuk; Hrabáková; Petrzik (2015), tendo como único representante o Zygosaccharomyces bailii virus Z. O clado contendo o CPRV reuniu outros micovírus não classificados descritos apenas como ourmiavirus-like (MARZANO et al., 2016; MARZANO; DOMIER, 2016). Apesar da proximidade filogenética com os Ourmiavirus, estes são muito diferentes. Os ourmiavírus são encontrados em plantas e têm genomas de ssRNA(+) contendo três segmentos, com uma ORF em cada, com tamanhos de 2,8 Kb, 1,1 Kb e 1,0 Kb (RASTGOU et al., 2009). Os micovírus não classificados agrupados com o CPRV presumivelmente teriam somente um segmento, afinal um profundo sequenciamento foi empregado na caracterização desses vírus e em diferentes trabalhos, contudo nenhum outro fragmento foi encontrado (MARZANO et al., 2016; MARZANO; DOMIER, 2016). A estrutura genômica com apenas um segmento contendo um ORF de RdRp variando de 1,8 a 2,1 Kb de tamanho, juntamente com os valores de distância genética intra grupos e inter grupos, indicam que o clado não classificado contendo o CPRV poderia ser de uma nova família de micovírus, com os Ourmiavirus como grupo irmão. O CNRV formou um clado com outros vírus de ssRNA(-) que apresentam somente um segmento contendo uma ORF de uma polimerase. Este clado reúne vírus presentes em diversos tipos de hospedeiros, incluindo os fungos Macrophomina phaseolina e Botritys cinerea (DONAIRE; ROZAS; AYLLÓN, 2016; MARZANO et al., 2016), o crustáceo Perisesarma bidens (SHI et al., 2016) e até o nematoide Heterodera glycines (RUARK et al., 2018). Este clado se diferencia dos demais Bunyavirales por apresentar somente um segmento, mesmo com os diferentes trabalhos tendo empregado técnicas de (meta- )transcriptoma de alta profundidade. Uma possibilidade é que estes vírus tenham perdido o segmento “M”, que codifica uma glicoproteína, e o “S” da nucleoproteína, por não serem necessários para a sobrevivência nesses hospedeiros, como foi cogitado para o micovírus Botrytis cinerea negative-stranded RNA virus 1 (DONAIRE; PAGÁN; AYLLÓN, 2016). As análises filogenéticas e os valores calculados de distância genética intra grupos e inter grupos sugerem que o grupo contendo o CNRV poderia ser uma nova família da ordem Bunyavirales, reunindo vírus de fungos, crustáceos e nematoides.

7 CONCLUSÃO

 Com a região ITS foi possível realizar a identificação molecular dos fungos Gongronella butleri (C1D), Mucor irregularis (C3B), Talaromyces aculeatus (C2B), Penicillium citrinum (C2C) e Simplicillium sympodiophorum (C3A).

 Neste estudo foi apresentado a primeira detecção de vírus em fungos da região amazônica, sendo caracterizadas três novas espécies de micovírus em duas espécies de hospedeiros, Simplicillium sympodiophorum e Mucor irregularis.

 Este é o primeiro relato de co-infecção em S. sympodiophorum.

 Foi proposta uma organização taxonômica para os novos micovírus, revelados na literatura e os descritos neste trabalho, indicando a criação de novas famílias para abriga- los.

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APÊNDICES

APÊNDICE A – Quantidade de leituras e contigs gerados para cada fungo isolado

Isolado Leituras Consenso Índice N50 Leituras Contigs do IDBA Contigs do SPAdes após dos do brutas IDBA-UD índice N50 SPAdes índice N50 limpeza contigs* consenso

C1D 47.628.660 38.163.306 9.423 7.403 16.675 4.459 10.756 7.657

C1G 35.691.042 33.240.142 4.137 757 12.202 435 8.944 549

C1H 39.571.128 37.047.210 5.199 715 18.202 354 13.266 456

C2A 33.818.164 31.470.944 26.236 697 49.772 478 45.919 604

C2B 37.642.434 32.075.216 19.725 1.504 37.338 869 33.057 1.229

C2C 44.270.928 36.149.070 2.631 48.507 16.013 5.857 6.115 44.762

C3A 39.593.266 31.396.298 1.619 42.026 11.942 6.120 4.641 35.086

C3B 45.912.106 39.538.918 9.717 17.371 19.480 7.520 10.539 16.823

C4A 34.022.384 31.571.208 6.813 963 15.298 636 12.844 759

Total 358.150.112 310.652.312 ------

* Após a utilização do CD-Hit-Est com valor de identidade igual a 90%.

APÊNDICE B – Produção bibliográfica gerada a partir desta tese

Artigo 1:

BARATA, R. R.; VIANEZ JUNIOR, J. L. S. G.; NUNES, M. R. T. Transcriptomic analysis of Mucor irregularis containing a negative ssRNA mycoviruses. Microbiology Resource Announcements. 8:e00503-19, 2019. Disponível em: https://doi.org/10.1128/MRA.00503-19

Artigo 2:

BARATA, R. R.; CARDOSO, J. F.; OLIVEIRA, R. S.; FRANCO FILHO, L. C.; VASCONCELOS, J. M.; LEMOS, P. L.; VIANEZ JUNIOR, J. L. S. G. ; NUNES, M. R. T. Genetic characterization of three new mycoviruses from amazonian soil fungi. Virus Research. 2019. In Press.