“Regulación Del Metabolismo En Streptomyces: Control Por Argr”
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Universidad de León Departamento de Biología Molecular Área de Microbiología INBIOTEC Instituto de Biotecnología de León Tesis doctoral “Regulación del metabolismo en Streptomyces: Control por ArgR” Alma Mª Botas Muñoz León, 2013 Memoria presentada por Alma Mª Botas Muñoz para optar al grado de Doctor en Biología A mi familia AGRADECIMIENTOS En primer lugar, mis agradecimientos van dirigidos a aquellas instituciones que han financiado esta tesis doctoral. A la Universidad de León, al Ministerio de Educación y Ciencia y al Ministerio de Ciencia e Innovación. Este trabajo se llevó a cabo conjuntamente en el Área de Microbiología de la Universidad de León y en el Instituto de Biotecnología de León, INBIOTEC. Quisiera agradecer de un modo general a todos los compañeros que me han acompañado a lo largo de estos años, tanto de Microbiología como de INBIOTEC. A titulares, doctores, becarios... Pero, de un modo particular, me gustaría dar las gracias a aquellos que han tenido una aportación especial. A la Dra. Paloma Liras, por apoyarme desde el principio para realizar esta tesis doctoral, por su dirección científica y por ayudarme incluso cuando peor pintaban las cosas. A Rosma Pérez, por su codirección, su paciencia (a veces) y, sobre todo, por estar ahí siempre, con cada duda y para cada “Escucha…”. Porque a pesar de nuestro carácter, quizás demasiado parecido que tantas veces nos hizo chocar, hemos conseguido llevarnos bien. Gracias por todo lo que me has enseñado. Al Área de Genética, por iniciarme en el mundo de la genómica, en particular a Paqui y a Vences. A los técnicos de laboratorio, porque sin su ayuda habría sido imposible el día a día. En particular, a la rubia, Sofía, que siempre aparecía con una sonrisa. A las secretarias, Bea, Alcira y Andrea, por ayudarme con la odisea que suponen los trámites burocráticos. Gracias por todo eso y más. A todos aquellos que a lo largo de estos años me han echado un cable (o varios): Sonia, Maite, Irene, Rubén, Coral, Javi, Fernando y, en especial, Antonio Rodríguez. No hay palabras para agradecerte todo lo que has hecho por mí, por tus enseñanzas, tus ánimos, por tener siempre un momento para escuchar de forma completamente desinteresada, y estar siempre dispuesto a hacer un descanso… o tomar unas tapas. No podría olvidar la mención especial al cuarto 203 (y más), por las horas y horas que hemos pasado juntos. Solo espero que nunca perdamos esta amistad. Y a aquellos que han pasado por mi vida a lo largo de estos años y que, sin yo saber bien por qué, han decidido quedarse. A Bea, Alberto y el pequeño Javi, a Rober, a mis amigos de Candelario, a los de la quinta del 83 de La Robla. A las nuevas amistades, que han llegado recientemente, en cuya permanencia confío. Todos ellos han contribuido a convertirme en quien soy. Por supuesto, a mi familia, en especial a mis padres y a mi hermano. Porque estos años han sido duros, y han tenido que armarse de mucha paciencia para soportar mis malos ratos. Por vuestro aliento y cariño incondicionales. Por enseñarme desde pequeña que trabajando puedo alcanzar cualquier meta. Nunca sabré cómo agradecéroslo. No sería nadie sin vosotros. Y, por último, a Alberto. Por llegar a mi vida cuando más falta hacías y servirme de apoyo día tras día. Por tu confianza y por tu ayuda constante. A todos, gracias. Listado de Abreviaturas y Acrónimos 6-FAM: 6-carboxifluoresceína kDa: kilodalton kn: kanamicina A: adenina aa: aminoácidos M: molar ADNt ADN total o genómico MALDI-TOF: del inglés Matrix-Assisted ADNasa: desoxirribonucleasa Laser Desorption-Ionization Time Of Flight amp: ampicilina Mb: megapares de bases aph: kanamicina MOPS: ácido morfolinopropanosulfónico apra: apramicina Nal: ácido nalidíxico ARNasa: ribonucleasa NBT: azul de nitrotetrazolio ATCC: Colección Americana de Cultivos Tipo Nt: nucleótido ATP: adenosin-5’-trifosfato Nt: amino terminal BCIP: 5-bromo-1-cloro-3-indoxil fosfato BrEt: bromuro de etidio ORF: marco de lectura abierto BSA: albúmina sérica bovina p/v: relación peso/volumen C: citosina PAGE: electroforesis de proteínas en gel de CIA: cloroformo-alcohol isoamílico acrilamida Cm: cloranfenicol pb: pares de bases CoA: Coenzima A PCR: reacción en cadena de la polimerasa Ct: carboxilo terminal (p)ppGpp: guanosina-3’,5’-bispirofosfato o Ct: ciclo umbral, del inglés threshold cycle guanosina-5’trifosfato-3’-pirofosfato Da: Dalton RBS: sitio de unión a ribosomas DIG: digoxigenina RIN: número de integridad del ARN DMSO: dimetilsulfóxido RLU: unidades de luz relativas dNTPs: desoxinucleótidos trifosfato. rpm: revoluciones por minuto DO: densidad óptica RT-PCR: PCR acoplada a retrotranscripción DO600: densidad óptica a 600 nm DTT: ditiotreitol SCM: sitio de clonación múltiple SDS: dodecilsulfato sódico EDTA: ácido etilendiaminotetracético EMSA: ensayo de retraso en gel T: timina TAE: tris-acetato-EDTA F/N: fenol neutro TCS: sistema de dos componentes FPLC: cromatografía líquida rápida de proteínas TEMED: N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamina G: guanina Tm: temperatura de hibridación GES: genes estadísticamente significativos Tris: (hidroximetil)aminometano GST: glutatión-S-transferasa U: Uracilo Hyg: higromicina v/v: relación volumen/volumen HTH: hélice-vuelta-hélice X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil- IPTG: 1-isopropil- -D-galactopiranósido -D-galactopiranósido Kb: kilopares de bases Abreviatura Aminoácido A Ala Alanina C Cys Cisteína D Asp Ácido Aspártico E Glu Ácido Glutámico F Phe Fenialanina G Gly Glicina H His Histidina I Ile Isoleucina K Lys Lisina L Leu Leucina M Met Metionina N Asn Asparragina P Pro Prolina Q Gln Glutamina R Arg Arginina S Ser Serina T Thr Treonina V Val Valina W Trp Triptófano Y Tyr Tirosina 1. INTRODUCCIÓN ____________________________________________ 9 1.1. Sistemática del género Streptomyces ________________________ 11 1.2. Características del género Streptomyces ____________________ 13 1.2.1. Breve introducción al mundo de las actinobacterias _______________________ 13 1.2.2. Variabilidad en el género Streptomyces ________________________________ 13 1.2.2.1. Ciclo biológico de Streptomyces _____________________________________ 14 1.2.2.2. Estructura del cromosoma de Streptomyces ____________________________ 16 1.2.2.3. Elementos genéticos extracromosomales de Streptomyces _________________ 18 1.2.2.4. Inestabilidad genética _____________________________________________ 19 1.2.3. Producción de metabolitos secundarios _________________________________ 20 1.3. Regulación de la producción de antibióticos ___________________ 22 1.3.1. Agrupaciones génicas para la síntesis de antibióticos ______________________ 22 1.3.2. Reguladores pleiotrópicos del metabolismo secundario ____________________ 24 1.3.2.1. Sistemas de dos componentes _______________________________________ 24 1.3.2.2. Sistemas de serina-treonina quinasas __________________________________ 25 1.3.2.3. Otros reguladores pleiotrópicos ______________________________________ 25 1.3.3. Autorreguladores __________________________________________________ 26 1.3.4. Reguladores específicos de ruta ______________________________________ 27 1.3.4.1. Los reguladores de tipo SARP _______________________________________ 27 1.3.4.2. Otros tipos de reguladores específicos de ruta ___________________________ 27 1.3.5. Pequeños ARN no codificantes _______________________________________ 28 1.4. Streptomyces coelicolor _____________________________________ 28 1.5. Arginina ____________________________________________________ 31 1.5.1. Vía de biosíntesis de la arginina ______________________________________ 31 1.5.2. Vías de catabolismo de la arginina ____________________________________ 32 1.5.2.1. Ruta de la arginasa ________________________________________________ 33 1.5.2.2. Ruta de la arginina deiminasa _______________________________________ 33 1.5.2.3. Ruta de la arginina succiniltransferasa ________________________________ 34 1.5.2.4. Rutas de la arginina transaminasa y oxidasa ____________________________ 34 1.5.2.5. Ruta de la arginina descarboxilasa ___________________________________ 34 1.5.2.6. Otras rutas de utilización de arginina, citrulina y ornitina __________________ 35 1.5.3. Sistemas de transporte de arginina ____________________________________ 35 1.5.4. El regulón de la arginina. Organización de los genes de biosíntesis de arginina__ 35 1.5.5. Regulación de la biosíntesis de la arginina ______________________________ 36 1.5.6. Estructura del regulador ArgR ________________________________________ 37 1.5.6.1. Clasificación de las proteínas ArgR___________________________________ 38 1.5.6.2. Unión de ArgR a regiones operadoras: las cajas ARG ____________________ 39 1.5.7. El regulador ArgR en distintos microorganismos _________________________ 41 1.5.7.1. El represor ArgR en Streptomyces ____________________________________ 41 1.5.8. Otras funciones del represor ArgR ____________________________________ 42 1.5.8.1. ArgR en la segregación del cromosoma _______________________________ 42 1.5.8.2. Interacción/Regulación con otras rutas metabólicas ______________________ 43 2. OBJETIVOS ________________________________________________ 45 3. MATERIALES Y MÉTODOS _________________________________ 49 3.1. Microorganismos utilizados ___________________________________ 51 3.2. Medios y condiciones de cultivo ______________________________ 52 3.2.1. Medios de cultivo para Streptomyces ___________________________________ 52 3.2.2. Medios de cultivo para E. coli ________________________________________ 53 3.2.3. Condiciones de cultivo de los microorganismos __________________________