The Tumor Suppressor P53 Provides
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Aus der Klinik für Innere Medizin, Schwerpunkt Hämatologie, Onkologie & Immunologie Direktor: Prof. Dr. Andreas Neubauer des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg Einfluss der DNA-Bindungskooperativität von p53 auf die Tumorsuppressoraktivität & Beobachtung der Entwicklungsdynamik von Tumorklonen in vitro & in vivo mittels sekretierter Luciferasen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von Joël Pierre Alexandre Charles aus Wiesbaden Marburg, 2015 Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am: Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs. Dekan: Herr Prof. Dr. Helmut Schäfer Referent: Herr Prof. Dr. Thorsten Stiewe 1. Korreferent: Frau Prof. Dr. Uta-Maria Bauer Für meine Eltern INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ............................................................................................. I Zusammenfassung .......................................................................................... III Summary ........................................................................................................... V 1. EINLEITUNG .................................................................................................. 1 1.1. Krebs ................................................................................................................. 1 1.2. Tumorentwicklung............................................................................................ 2 1.3. Tumorsuppressor p53 ...................................................................................... 4 1.3.1. Aufbau und Struktur von TP53 und p53 ....................................................... 4 1.3.2. p53-Bindung an die DNA ............................................................................. 8 1.3.3. Regulation von p53 .................................................................................... 10 1.3.4. p53-vermittlete Induktion von Zellzyklus-Arrest und Apoptose ................... 10 1.3.5. Posttranslationale Modifikationen und Interaktionspartner von p53 ............ 11 1.3.6. Mutationen von p53 ................................................................................... 15 1.4. RNA-Interferenz .............................................................................................. 16 1.5. Reportergene .................................................................................................. 18 1.5.1 Fluoreszenz-Reporter ................................................................................. 18 1.5.2. Lumineszenz-Reporter ............................................................................... 20 2. KUMULATIVER TEIL................................................................................... 23 2.1. DNA Binding Cooperativity of p53 Modulates the Decision between Cell-Cycle Arrest and Apoptosis .......................................................................... 23 2.1.1. Einleitung ................................................................................................... 23 2.1.2. Zusammenfassung und Diskussion ............................................................ 23 2.1.3. Eigenanteil an der Publikation .................................................................... 27 2.2. Life or death: p53-induced apoptosis requires DNA binding cooperativity28 2.2.1. Einleitung ................................................................................................... 28 2.2.2. Zusammenfassung und Diskussion ............................................................ 29 2.2.3. Eigenanteil an der Publikation .................................................................... 31 I INHALTSVERZEICHNIS 2.3. Monitoring the dynamics of clonal tumour evolution in vivo using secreted luciferases .............................................................................................. 32 3.1. Einleitung ...................................................................................................... 32 3.2. Zusammenfassung und Diskussion .............................................................. 34 3.3. Eigenanteil an der Publikation ....................................................................... 40 Literaturverzeichnis ....................................................................................... 41 Anhänge .......................................................................................................... 52 Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ 52 Tabellarischer Lebenslauf .................................................................................... 53 Verzeichnis der akademischen Lehrer ................................................................ 54 Danksagung ........................................................................................................... 55 Ehrenwörtliche Erklärung ..................................................................................... 56 Anhang mit den Publikationen 1-3 ................................................................ 57 II ZUSAMMENFASSUNG Zusammenfassung Der Tumorsuppressor p53 wird als „Wächter des Genoms“ bezeichnet und spielt eine wichtige Rolle bei der Prävention von Krebserkrankungen. p53 ist ein sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor, der durch verschiedene Formen von Zellstress wie DNA-Schäden oder Onkogene aktiviert wird und in Abhängigkeit der Schwere der entstandenen Schäden eine Vielzahl verschiedener Zielgene transaktiviert, die Zellzyklus Arrest, Seneszenz, Differenzierung und Apoptose induzieren. Bei der Entscheidung über Überleben oder Sterben tragen posttranskriptionelle Modifikationen von p53 und Interaktionen mit Kofaktoren dazu bei, dass p53 bestimmte Gruppen von Zielgenen aktiviert. Es ist aber unklar, wie diese Entscheidung über das Zellschicksal auf der Ebene der Promotorbindung von Zielgenen durch p53 getroffen wird. Für die Bindung an die DNA bilden vier p53-Proteine ein Tetramer, wobei die DNA-Bindungsdomänen kooperativ an die DNA binden. Dabei interagieren die H1-Helices der DNA-Bindungsdomänen zweier benachbarter p53-Monomere über eine Salzbrücke. Um den Einfluss der DNA-Bindungskooperativität für die tumorsuppressive Funktion von p53 zu untersuchen, wurden p53 H1-Helixmutanten generiert, die das komplette Spektrum von niedriger bis starker DNA-Bindungskooperativität aufweisen und bezüglich ihrer genomischen Bindung und Transaktivierung von Zielgenen sowie ihrer Antwort auf Stress untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Kooperativität eine Bindung an degenerierte Motive, wie sie in proapoptotischen Genen vorkommen, ermöglicht und so das Bindungsspektrum von p53 erweitert. Eine niedrige Kooperativität erlaubt die Induktion von Zellzyklus-Arrest, verhindert aber die Induktion von Apoptose. Somit moduliert die DNA-Bindungskooperativität die Entscheidung über das Zellschicksal, bestimmt die Eliminierung von geschädigten Zellen durch Apoptose und trägt zur Tumorsuppressoraktivität von p53 bei. Tumore sind heterogene Zellpopulationen, die aus genetisch unterschiedlichen Subklonen bestehen, die in einem iterativen Evolutionsprozess aus genetischer Mutation und Selektion entstehen. Die Mehrzahl der Tumorsubklone kann III ZUSAMMENFASSUNG häufig therapeutisch zerstört werden, doch kann bei einer Therapie der starke Selektionsdruck das Auswachsen und Überleben resistenter Klone fördern. Das Verständnis über die genetischen Veränderungen in der klonalen Tumorentwicklung, die zur Tumorinitiation, Progression, Metastasierung, Therapieresistenz und Rezidiven beitragen, ist von großem Interesse, um Präventionsstrategien und Therapien zu entwickeln. Die Rolle einzelner Gene bei der Tumorentstehung kann spezifisch mittels RNA Interferenz unter Verwendung von short hairpin RNAs (shRNA) untersucht werden, die einen stabilen Funktionsverlust-Phänotyp generieren. Dabei werden in Experimenten shRNA-exprimierende Tumorzellen oft mit Fluoreszenzreportern markiert und verfolgt. Dies funktioniert gut in Zellkulturexperimenten oder Leukämie- Mausmodellen, aber nicht in soliden Tumoren, die 90% aller Tumore im Menschen ausmachen. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Systems zur konstitutiven und induzierbaren Markierung von Tumorzellen mit sezernierten Luciferasen. Dafür wurde ein dualer Luciferase Assay entwickelt, der es ermöglicht, zwei unterschiedliche shRNA-exprimierende Tumorzellklone kompetitiv zu verfolgen, sowohl in vitro als auch in vivo. Die Aktivität der sezernierten Gaussia (GLuc) und Cypridina (CLuc) Luciferasen kann verlässlich und spezifisch in Überständen von Zellmischungen oder im Xenograft-Modell ohne größere Eingriffe durch minimalinvasive Methoden im Mausblut gemessen werden und korreliert mit der Tumorzellzahl, bzw. der Tumorgröße. Die Ergebnisse zeigen, dass sich mit diesem dualen Assay die Entwicklungsdynamik von Tumorsubklonen auch in soliden Tumoren zeitlich erfassen lässt, und etablieren die Anwendungsmöglichkeit zur Untersuchung einzelner Gene und deren Beitrag zur Tumorentwicklung, Metastasierung und Tumortherapie. Durch die Verwendung einer der Luciferasen als interne Kontrolle in diesem kompetitiven Ansatz zur Normalisierung der Daten ist die Varianz der Ergebnisse deutlich geringer und die Versuchstierzahlen können somit um bis zu drei Viertel reduziert werden. Durch Verwendung sezernierter Luciferasen konnte so unter Berücksichtigung des 3R-Prinzips eine