Dissertation
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DISSERTATION Understanding human mitotic protein complex organisation and phospho-regulation using a combined proteomics and chemical biology approach angestrebter akademischer Grad Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer.nat.) Verfasser: Björn Hegemann Matrikel-Nummer: 0547126 Dissertationsgebiet: A 091 490 (Molekulare Biologie) Betreuer: Dr. Jan-Michael Peters Wien, am 02. Mai 2008 Table of Contents Table of Contents Table of Contents 1 Zusammenfassung 5 Abstract 7 1 Introduction 9 1.1 The cell cycle 9 1.2 Mechanisms of cell cycle control 11 1.3 Sister chromatid cohesion 13 1.4 Protein complexes in mitotic progression 14 1.4.1 How to detect protein complexes? 15 1.5 Mitotic protein kinases 17 1.5.1 How to find mitotic kinases substrates? 18 1.6 Aim of this study 20 2 Results 23 2.1 Manuscript in preparation: Systematic analysis of mitotic protein complexes using tandem affinity purification and mass spectrometry discovers 71 novel potential mitotic protein complexes 24 2.1.1 Abstract 24 2.1.2 Introduction 25 2.1.3 Results 27 2.1.3.1 Bait selection 27 2.1.3.2 Purification and LC-MS/MS analysis 28 2.1.3.3 Complex detection 29 2.1.3.4 Characterisation of novel complexes 33 2.1.3.5 Identification of ANAPC16 as a novel subunit of human APC/C 35 2.1.4 Discussion 38 2.1.5 Materials and methods 41 2.1.5.1 Cell culture and siRNA depletion 41 2.1.5.2 Protein extraction, purification and MS 41 2.1.5.3 Sucrose density gradients 43 2.1.5.4 Ubiquitination assay 43 2.1.5.5 Data processing and clustering analysis 43 2.1.5.6 Antibodies 44 2.1.5.7 Immunofluorescence microscopy 45 2.1.6 Figure legend 46 2.1.6.1 Figure 2.1-1 46 2.1.6.2 Figure 2.1-2 46 2.1.6.3 Figure 2.1-3 47 2.1.6.4 Figure 2.1-4 47 2.1.6.5 Supplemental table 2.1-1 49 1 Table of Contents 2.1.6.6 Supplemental table 2.1-2 (See appendix 5.3) 49 2.1.6.7 Supplemental table 2.1-3 (See appendix 5.3) 49 2.1.6.8 Supplemental figure 2.1-1 49 2.1.7 Figures 50 2.2 Manuscript in preparation: A systematic approach to discover new PLK1 and AURKB substrates finds 17 novel PLK1 and 18 novel AURKB substrates on 99 candidate proteins. 56 2.2.1 Abstract 56 2.2.2 Introduction 57 2.2.3 Results 60 2.2.3.1 Characterisation of the BI2536-related inhibitor BI4834 60 2.2.3.2 Bait selection, affinity purification and mass spectrometric analysis 61 2.2.3.3 Phospho-site analysis of LAP-tagged mouse Bub1b and endogenous WAPAL 62 2.2.3.4 Phosphorylation site analysis of 16 complex purifications 64 2.2.3.5 Identification and validation of WAPAL and Bub1b phosphorylation sites 66 2.2.3.6 MS data validation using phospho-specific antibodies 68 2.2.3.7 Potential novel PLK1 and AURKB substrates 71 2.2.3.8 Initial bioinformatic analysis of PLK1-dependent phosphorylation sites 72 2.2.4 Discussion 73 2.2.5 Materials and methods 76 2.2.5.1 Cell culture 76 2.2.5.2 Protein extraction and purification 77 2.2.5.3 MS and data analysis 77 2.2.5.4 Antibodies 80 2.2.5.5 In vitro kinase assay 81 2.2.5.6 Immunofluorescence microscopy 81 2.2.6 Figure Legend 83 2.2.6.1 Figure 2.2-1 83 2.2.6.2 Figure 2.2-2 83 2.2.6.3 Figure 2.2-3 84 2.2.6.4 Figure 2.2-4 84 2.2.6.5 Supplemental figure 2.2-1 85 2.2.6.6 Supplemental figure 2.2-2 85 2.2.6.7 Supplemental table 2.2-1 86 2.2.6.8 Supplemental table 2.2-2 (see appendix 5.5) 86 2.2.7 Figures 87 2.3 Generation and characterisation of cell lines stably expressing MYC-tagged versions of PDS5A and PDS5B 94 Table of Contents 2.3.1 Cloning of PDS5A and PDS5B constructs into a MYC-Tet-On expression vector 94 2.3.2 Generation of stable doxycyclin-induceable HeLa cell lines expressing PDS5A-MYC and MYC-PDS5B 96 2.3.3 Characterisation of one stable PDS5A-MYC cell line (1136_21_8) and two stable MYC-PDS5B cell lines (1133_6_13/1133_6_22) 97 2.4 Contributions 103 3 Discussion 105 3.1 Protein interaction mapping 105 3.2 Phosphorylation site mapping 108 3.3 PDS5A and PDS5B cell lines 110 4 Materials and methods 112 4.1 Cell culture and siRNA depletion 112 4.2 Protein extract preparation and immunoprecipitation 112 4.3 Antibodies 112 4.4 Immunofluorescence microscopy 112 4.5 Cloning 113 5 Appendix 115 5.1 Plasmids generated for studying PDS5A and PDS5B 115 5.2 Sequence analysis of PDS5A and PDS5B 115 5.3 Interaction manuscript table S2 (all cleaned purifications) 116 5.4 Interaction manuscript table S3 (all annotated complexes) 145 5.5 Phosphorylation manuscript table S2 (all phospho-peptides) 161 6 Abbreviations 174 7 References 177 8 Acknowledgements 189 9 Curriculum Vitae 190 3 4 Zusammenfassung Zusammenfassung Während der mitotischen Phase des Zellzyklus’ verteilen Zellen ihre Chromsomen auf die zwei neu entstehenden Zellen. Dieser Prozess ist begleitet von immensen morphologischen Veränderungen wie zum Beispiel dem Abbau der Kernhülle, der Verdichtung der Chromosomen, dem Aufbau der mitotischen Spindel, der Chromosomenaufteilung und schließlich der Zytokinese. Die biochemischen Mechanismen, die diesen Prozessen zugrunde liegen und diese regulieren sind bisher erst wenig verstanden. Einige Proteinkomplexe wurden als die wichtigsten Regulatoren der Mitose identifiziert. Die Aktivität der Cyclin-dependent Kinase 1 im Komplex mit Cyclin B 1 (CDK1/CCNB1) ist essentiell für den Eintritt in die Mitose und frühe mitotische Vorgänge, während der Anaphase-promoting Complex (APC/C) die Anaphase und das Ende der Mitose einleitet. Einige andere mitotische Proteinkomplexe wurden identifiziert, doch für die meisten Proteine, die wichtig für den Verlauf der Mitose sind, sind nur wenige oder gar keine Interaktionspartner bekannt. Um die biochemischen Mechanismen der Mitose besser zu verstehen, ist es nötig, ein umfassenderes Bild der Proteinkomplexe, die für die Regulation der Mitose wichtig sind, zu bekommen. Die kürzlich etablierte BAC TransgeneOmics pipeline ermöglichte die Herstellung einer großen Anzahl von menschlichen Zellen, die „localisation and affinity purification“ (LAP) getaggte Mausgene von ihrem endogenen Promoter exprimieren. Aus diesen Zellen konnten wir erfolgreich 175 mitotische Proteine aufreinigen und 787 spezifisch-interagierende Proteine mittels Massenspektrometrie identifizieren. Die weitere Analyse dieser Daten mit Hilfe bioinformatischer Methoden ergab 130 potentielle Proteinkomplexe, von denen bis dahin 71 unbekannt waren. Eine weitergehende Untersuchung einiger dieser Komplexe bestätigte einen neuen Komplex, der möglicherweise bei der Funktion des Zentrosoms eine Rolle spielt, sowie zwei neue Interaktionspartner des γ-tubulin ring complex (γ-TuRC) und eine neue APC/C Untereinheit. Unsere Ergebnisse sind der erste Schritt, um die Organisation der mitotischen Proteinkomplexe gründlicher zu verstehen. Weitergehende Untersuchungen dieser identifizierten Proteinkomplexe werden unser Verständnis der molekularen Basis der mitotischen Regulation weiter voranbringen. Einige der wichtigsten Regulatoren, die den Eintritt und den Verlauf der Mitose kontrollieren sind mitotische Proteinkinasen. Die Phosphorylierung einer unbekannten Anzahl von Substraten wirkt wahrscheinlich wie ein Schalter, der die Aktivität, Stabilität und Lokalisierung dieser Substrate verändert. Dies löst die drastischen morphologischen Veränderungen aus, die nötig sind, damit Zellen zuverlässig durch die Mitose gehen und die mitotische Teilung vollziehen. CDK1/CCNB1 war das erste Mitglied der Familie der mitotischen Kinasen von der einige weitere identifiziert worden sind. Die Polo-like kinase 1 (PLK1) ist essentiell für die Mitose und ist an der Regulation vieler mitotischer Ereignisse beteiligt. Der Kontakt von PLK1 mit Substraten wird wahrscheinlich durch die Substratphosphorylierung von CDK1, aber vielleicht auch von PLK1 selbst kontrolliert. Aurora kinase B (AURKB) ist eine weitere essentielle mitotische Kinase, die, abgesehen von anderen 5 Zusammenfassung Funktionen, essentiell für den „spindle assembly checkpoint“ ist, indem sie inkorrekte Mikrotubuli-Kinetochore Verbindungen korrigiert. PLK1 und AURKB sind nur in der Mitose aktiv und ihre Lokalisierung ist streng reguliert. Das lässt vermuten, dass PLK1 und AURKB Substrate nur zu einer bestimmten Zeit und an einem bestimmten Ort phosphoryliert werden dürfen um ihre Funktion zu erfüllen. Versuche zum Detektieren von Kinase Substraten sind bisher allerdings meist in vitro durchgeführt worden, also in der Abwesenheit jeglicher zellulärer Kontrollmechanismen. Wir haben deshalb eine Zell-basierte Methode entwickelt, um neue PLK1 und AURKB Substrate zu finden. Mit Inhibitoren aus kleinen Molekülen gegen PLK1 und AURKB in Kombination mit LAP-Aufreinigung und Massenspektrometrie konnten wir Kinase-abhängige Phosphorylierungsstellen auf 16 potentiellen Substratkomplexen detektieren. Insgesamt haben wir 470 Phosphorylierungsstellen gefunden, von denen 41 PLK1- und 20 AURKB-abhängig waren. Wir haben einen Teil dieser Phosphorylierungsstellen mit Phospho-spezifischen Antikörpern validiert und 17 neue potentielle PLK1 Substrate sowie 18 neue potentielle AURKB Substrate gefunden. 6 Abstract Abstract During the mitotic phase of the cell cycle cells equally distribute their chromosomes into two daughter cells. This process is accompanied by immense morphological changes such as breakdown of the nuclear envelope, chromosome condensation, mitotic spindle assembly, chromosome segregation and finally cytokinesis. The underlying biochemical mechanisms regulating these processes are only beginning to be understood. A number of protein complexes have been identified as the major mitotic regulators. The activity of cyclin-dependent kinase 1 bound to cyclin B (CDK1/CCNB1) is essential for entry into mitosis and early mitotic events while the activity of the anaphase- promoting complex (APC/C) initiates anaphase onset and mitotic exit. Some other mitotic protein complexes have been identified but for most proteins involved in mitotic progression only few or no binding partners are known.