UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EVOLUTIVA (Associação Ampla Entre a UEPG E a UNICENTRO)

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EVOLUTIVA (Associação Ampla entre a UEPG e a UNICENTRO)

BRUNO DE JESUS KUBIS

Biologia evolutiva e diversidade em Heikertingerella argentinensis (Csiki, 1940) (Coleoptera: Alticinae): análise morfológica, citogenética e molecular

Ponta Grossa 2018 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EVOLUTIVA (Associação Ampla entre a UEPG e a UNICENTRO)

BRUNO DE JESUS KUBIS

Biologia evolutiva e diversidade em Heikertingerella argentinensis (Csiki, 1940) (Coleoptera: Alticinae): análise morfológica, citogenética e molecular

Dissertação de mestrado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva da Universidade Estadual de Ponta Grossa em associação com a Universidade Estadual do Centro-Oeste como parte dos requisitos para a obtenção do título de mestre em Ciências Biológicas (Área de Concentração em Biologia Evolutiva).

Orientadora: Profa. Dra. Mara Cristina de Almeida Co-orientador: Prof. Dr. Mateus Henrique Santos

Ponta Grossa 2018

Dedico esse trabalho aos meus pais Rosmeri de jesus Kubis e Elintom Carneiro Kubis, e também ao meu amado avô Luís Kubis, o qual sempre me ensinou a observar e amar a natureza.

“O início da sabedoria é a admissão da própria ignorância. Todo o meu saber consiste em saber que nada sei”.

(Sócrates)

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas graças a Deus, não sou o que era antes”.

(Martin Luther King)

“O que sabemos é uma gota, o que ignoramos é um oceano”.

(Isaac Newton).

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradeço a Deus, por todas as pessoas que colocou em meu caminho, pelas oportunidades que me proporcionou, e por sempre me guiar por um caminho de paz.

Agradeço a presença dos meus pais em minha vida, aos quais minhas palavras não são capazes de gerar tanta gratidão. Por sempre estarem dispostos a me ouvir e me ajudar em qualquer situação possível, contribuindo também financeiramente sempre que precisei. Amo vocês, pai e mãe. Obrigado por todo o amor, por todos os conselhos, pela educação, e por sempre me apoiarem em minhas decisões. Sendo os principais responsáveis pelo meu crescimento pessoal e profissional. Sem vocês, nada disso seria possível. Assim, dedico essa dissertação a vocês.

De maneira especial, e também com muito carinho, agradeço à minha orientadora Mara Cristina de Almeida, a qual sempre me apoiou e me empurrou para frente, com muita responsabilidade e dedicação, desde a minha primeira iniciação científica, sempre foi muito atenciosa e me ajudou da melhor maneira possível na pesquisa. Obrigado por tudo professora, pelos conhecimentos compartilhados, por me aturar, por estar sempre do meu lado no que precisei, e principalmente pela confiança. Você é uma pessoa muito especial na minha vida.

Agradeço também meu co-orientador Mateus Henrique Santos pelos conhecimentos compartilhados que foram essenciais para a finalização desse trabalho, e também pelos momentos de descontração dentro do laboratório.

Igualmente, ao professor Roberto Artoni pelos seus conhecimentos, e pelo envolvimento e interesse em meu trabalho, e também sua disposição em acrescentar e melhorar, compartilhando novas ideias e sugestões.

Ao Miguel, pelas brincadeiras e piadas, bem como pelo apoio técnico, sempre que precisei de material para trabalhar.

Agradeço à Zoli por estar tão disposta em me ajudar com tantas coisas na secretária do mestrado, pegando no meu pé todas as vezes que esqueci de preencher algum documento.

Ao professor Rodrigo, que sempre abriu as portas do seu laboratório para que eu pudesse trabalhar quando tive algum problema com equipamento, ou mesmo um reagente que precisei testar.

Agradeço também ao Lucas e o Matheus que sempre estiveram dispostos a me ajudar com todas as metodologias e com a rotina do laboratório, além do seu apoio e amizade sempre presentes.

Aos demais colegas da pós - graduação e do LabGEv, por todas as conversas, os momentos de descontração, que foram essenciais para que eu continuasse insistindo sempre que alguma técnica não funcionava. Em especial a Luz, a Angelita e o Augusto pela colaboração, sempre dando apoio e contribuindo nas horas de desespero.

Agradeço à Universidade Estadual de Ponta Grossa, ao programa de Pós- Graduação em Biologia Evolutiva, e ao Laboratório de Citogenética Evolutiva por fornecerem toda a estrutura necessária para a realização dessa pesquisa.

À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela bolsa concedida.

Por fim, gostaria de agradecer a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a conclusão dessa pesquisa.

Resumo

Dentro da ordem Coleoptera, a subfamília Alticinae apresenta ampla variedade morfológica e cariotípica. Contudo, a escassez de estudos nesse grupo impede a identificação correta de várias espécies, uma vez que, muitas se assemelham, e a ocorrência de mimetismo é comum. Além disso, o grupo ainda não possui uma posição sistemática bem definida. Alguns autores consideram essa subfamília como uma nova tribo dentro de Galerucinae, enquanto outros a aceitam como um grupo irmão de Galerucinae. O gênero Heikertingerella possui 109 espécies, as quais apresentam morfologia externa muito parecida e apenas cinco foram descritas citogeneticamente, sendo três não identificadas a nível específico. O objetivo do presente trabalho foi diferenciar indivíduos de Heikertingerella argentinensis de três localidades, por meio de análises morfológicas e genéticas, ampliando o conhecimento sobre este grupo, contribuindo para a resolução dos problemas taxonômicos existentes. Os nossos resultados revelam que as populações apresentam edeago morfologicamente distinto, permitindo a sua diferenciação em três morfotipos. Além disso, o número diploide é variável entre os morfotipos, sendo o morfotipo I com 2n= 19 e o morfotipo II e III com 2n= 17. Ambos os morfotipos apresentam o sistema cromossômico de determinação sexual do tipo X1X2Y, descrito pela primeira vez para esse gênero. Os resultados moleculares agrupam os indivíduos em três clados principais, um referente aos indivíduos com o morfotipo III, outro com os morfotipos II, e um terceiro que agrupa um indivíduo do morfotipo I e um do morfotipo II. Esses resultados mostram que H. argentinensis pode ser um complexo de espécies. Nossos dados apontam também que as possíveis dificuldades na identificação das mesmas residem no fato do mimetismo ser um fator comum neste grupo. A falta de uma abordagem multidisciplinar utilizando a genética e a morfologia também contribuíram com a inclusão dos morfotipos como uma mesma espécie. Desta maneira, este trabalho sugere que uma revisão mais detalhada em H. argentinensis seja necessário para se compreender a real biodiversidade escondida neste complexo de espécies.

Palavras-chave: Complexo de espécies, diferenciação cariotípica, evolução, morfologia do edeago, polimorfismo.

Abstract

Within the order Coleoptera, the subfamily Alticinae presents a wide morphological and karyotypic varieties. However, the lack of studies on this group impede a properly identification of many species, because of the fact that many of them resemble to one another and the occurrence of mimicry is common. Furthermore, the group does not have a systematic position well defined. Some authors consider this subfamily as a new tribe within Galerucinae, while others accept Alticinae as a sister group of Galerucinae. The Heikertingerella genus have 109 species, with external morphology very similar to each other, therefore only five were cytogenetically described, and three of them were not described in a specific level.The objective of this paper was to differentiate individuals from Heikertingerella argentinensis from three localities, through morphological and genetic analyzes, increasing knowledge about this group, contributing to solve its taxonomical problems. Our results shows that the populations presents morphologically distinct aedeagus, allowing its differentiation into three morphotypes. Moreover, the diploid number is variable among the morphotypes, the morphotype I has 2n = 19 and the morphotype II and III have 2n = 17. Both morphotypes presents the X1X2Y sexual chromosomic system, described for the first time for this genus. The molecular results clusters the individuals in three mainly clados, one of them refers to individuals with morphotype III, other clado agroups the morphotypes II and a third that agroups one individual of morphotype I and other of morphotype II. These results shows that H. argentinensis may be a species complex. Our data also indicate that possible difficulties in identification of them emerge because of the fact that mimetism is a common factor of this group. The lack of multidisciplinary approach like the union of genetic and morphology also contributed to include the morphotypes in the same specie. In this way, this paper suggests that a more detailed review in H. argentinensis would be necessary to understand the real biodiversity hidden in this species complex in a clearer way.

Keywords: Species complex, karyotype differentiation, evolution, aedeagus morphology, polymorphism.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Diagrama esquemático geral da genitália masculina de um diabrocíteo (Coleoptera: Chrysomelidae) (à esquerda) e detalhe edeago (à direita) (PRADO, 2015)...... 17

Figura 2 - Alguns exemplos de variação na coloração do élitro em Heikertingerella. A. H. paramera. B. H. tamaensis (retirado de SAVINI, 1999)...... 20

Figura 3 - Mapa brasileiro, indicando a localização dos pontos de coleta de Heikertingerella...... 23

Figura 4 - Área de coleta no município de União da Vitória - PR. A. Método de coleta. B. Detalhe de um indivíduo adulto de Heikertingerella (seta) sobre a folha de Amphilophium crucigerum (Bignoniaceae)...... 23

Figura 5 - Edeago de Chaetocnema arenacea. Adaptado de Konstantinov (2011). . 25

Figura 6 – A. Exemplar macho de H. argentinensis, morfotipo I. B. Detalhe da cabeça. C, E. Exemplares machos de H. argentinensis, morfotipo II. D, F. Detalhe da cabeça G. Exemplar macho de H. argentinensis, morfotipo III. H. Detalhe da cabeça...... 37

Figura 7 – A. Edeago em vista dorsal (acima) e ventral (abaixo), morfotipo I. B. Edeago em vista dorsal (acima) e ventral (abaixo), morfotipo II. C. Edeago em vista dorsal (acima) e ventral (abaixo), morfotipo III...... 37

Figura 8 - A. Metáfase I com 2n=19+1= 8II+X1X2Y + s (seta), morfotipo I. B. Metáfase II com n= 9= 8 + Y, morfotipo I. C. Metáfase II com n=10=8+X1X2Y, morfotipo I. D, E.

Metáfases I com 2n= 17+1= 7II+X1X2Y, morfotipos II e III. S = supranumerário...... 39

Figura 9 – A. Cariótipo espermatogonial de um macho de H. argentinensis de São

Sebastião - SP, com 2n=19=8II+X1X2Y, em coloração convencional, morfotipo I. B. Cariótipo espermatogonial de um macho de H. argentinensis de União da Vitória, PR, com 2n=17+ 1s=7II+X1X2Y+s, em coloração convencional, morfotipo III. C. A mesma célula vista em B submetida a hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda telomérica. Seta = sinal de hibridização intersticial. s = supranumerário...... 40

Figura 10 - Cladograma Bayesiano utilizando o sequenciamento do gene mitocondiral COI, o número diplóide e a morfologia do edeago de indivíduos de Heikertingerella...... 41

Figura 11 - Possível inter-relação entre espécies Neotropicais de Heikertingerella, baseada no número cromossômico e no sistema de determinação sexual. Heikertingerella brevitarsis (VIRKKI, 1970), Heikertingerella sp.1, Heikertingerella sp.2, Heikertingerella sp.3 (SMITH & VIRKKI, 1978; VIRKKI e SANTIAGO-BLAY, 1996) e Heikertingerella krugi (VIRKKI e SANTIAGO-BLAY, 1996)...... 46

SUMÁRIO

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 12

1.1 Considerações gerais ...... 12 1.2 Sistemática em Alticinae ...... 14 1.3 Características citogenéticas de Coleoptera ...... 18 1.4 O gênero Heikertingerella ...... 19 1 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS ...... 21

2 MATERIAL E MÉTODOS ...... 22

3.1 Material biológico ...... 22 3.2 Métodos ...... 24 3.2.1 Estudo da morfologia do edeago ...... 24 3.2.2 Citogenética ...... 25 3.2.3 Hibridação in situ fluorescente (FISH) ...... 26 3.2.4 Análise molecular ...... 26 3 RESULTADOS ...... 28

CAPÍTULO I: ...... 28 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 47

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 48

6 ANEXOS ...... 55

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1 Considerações gerais

A classe Insecta possui uma grande diversidade de espécies, distribuídas em 33 ordens, dentre as quais cinco merecem destaque pela sua riqueza, sendo elas: Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera e Hemiptera (Rafael et al., 2012). Coleoptera é a maior e mais diversificada, com aproximadamente 40% das espécies de insetos conhecidas (LAWRENCE e BRITTON, 1994; GULLAN e CRANSTON, 2010; TRIPLEHORN e JOHNSON, 2011; RAFAEL et al., 2012). Coleoptera, do grego koleos = estojo e pteron = asa, em referência às asas anteriores endurecidas, abriga os insetos conhecidos vulgarmente como besouros, que também podem ser chamados de escaravelhos, joaninhas, gorgulhos, vaquinhas, entre outros nomes populares (RAFAEL et al., 2012). Os coleópteros correspondem ao grupo animal com maior diversidade biológica no planeta, compreendendo cerca de 30% do número total de espécies animais (LAWRENCE e BRITTON, 1994; TRIPLEHORN e JOHNSON, 2011). Atualmente são descritas 358.000 espécies distribuídas em 25.500 gêneros dentro da ordem (COSTA, 2003). No entanto, Erwin (1982), após amostrar florestas tropicais do Panamá, Brasil e Peru, admite que o número real de espécies existentes no mundo seja de 01 a 12 milhões. No Brasil já foram descritas 99 famílias, 4.319 gêneros e 26.122 espécies (COSTA et al., 1988; COSTA, 2003). O exemplar fóssil mais antigo desse grupo, conhecido como Protocoleoptera, data do Permiano Inferior da Eurásia, há aproximadamente 300 milhões de anos atrás (BÉTHOUX, 2009). Acredita-se que o sucesso evolutivo da ordem está intimamente ligado à forte esclerotização das partes externas do corpo, e à modificação do primeiro par de asas em élitro, sendo essas características importantes na defesa contra choques mecânicos, protegendo e recobrindo as asas posteriores membranosas e também reduzindo a perda de água (GRIMALDI e ENGEL, 2006; RAFAEL et al., 2012). Outra característica importante aliada à presença do élitro é a articulação livre do prótorax com o restante do tórax, permitindo que esses insetos explorem ambientes pequenos e de difícil acesso, possibilitando-os ocupar os mais variados 13

nichos e ecossistemas terrestres e aquáticos (GRIMALDI e ENGEL, 2006; TRIPLEHORN e JOHNSON, 2011). Além disso, os besouros são holometábolos, ou seja, apresentam metamorfose completa, o que contribui ainda mais para a colonização de nichos variados, uma vez que, em muitas espécies, as larvas podem apresentar hábitos diferentes do adulto (TRIPLEHORN e JOHNSON, 2011; RAFAEL et al., 2012). O aparelho bucal do tipo mastigador permite que as diferentes espécies possuam uma dieta variada, podendo ser micófagas, herbívoras ou detritívoras (LAWRENCE e BRITON, 1994; TRIPLEHORN e JOHNSON, 2011), enquanto outras atuam como predadoras. Ainda há aquelas consideradas pragas de madeira, pastagens, cereais, leguminosas, e até mesmo de peles e couro (GULLAN e CRANSTON, 2010; TRIPLEHORN e JOHNSON, 2011; RAFAEL et al., 2012), o que aponta a importância econômica desse grupo. O cenário taxonômico dentro de Coleoptera ainda é muito discutido, pois o grande número de espécies dificulta a obtenção de uma classificação sólida, uma vez que certos grupos são mais estudados do que outros (VANIN e IDE, 2002). Apesar disso, a maioria dos autores considera a ordem como monofilética, dividindo-a em 04 subordens: Archostemata, Adephaga, Myxophaga e Polyphaga (VANIN e IDE, 2002, GRIMALDI e ENGEL, 2006), embora a relação entre as subordens seja passível de controvérsias (VANIN e IDE, 2002). A subordem Polyphaga inclui a maior parte das espécies, com cerca de 90% dos coleópteros, apresentando grande diversidade biológica e morfológica. Os membros dessa subordem diferem morfologicamente da maioria dos outros grupos por não apresentarem sutura notopleural, e o primeiro esternito abdominal não dividido pelas coxas traseiras (TRIPLEHORN e JOHNSON, 2011). Dentro de Polyphaga, encontra-se a família Chrysomelidae, incluindo mais de 40.000 espécies agrupadas em 16 subfamílias, sendo a segunda mais numerosa em Coleoptera (SEENO e WILCOX, 1982; JOLIVET, COX e PETITPIERRE, 1994). Esses animais são conhecidos como leaf beetles, ou besouros da folha, pois todas as espécies são fitófagas, consumindo plantas vivas em pelo menos um estágio do desenvolvimento. Os adultos se alimentam predominantemente das partes vegetais externas, enquanto as larvas podem consumir o tecido externo ou interno das plantas, incluindo raízes, folhagem, caules herbáceos, folhas, flores, pólen, frutos e sementes (JOLIVET, COX e PETITPIERRE, 1994; RAFAEL et al., 2012). 14

Dentre os Chrysomelidae, a subfamília Alticinae, abrange aproximadamente 570 gêneros e mais de 10.000 espécies descritas taxonomicamente (SEENO e WILCOX, 1982), sendo a mais diversificada, com representantes em quase todas as regiões zoogeográficas, com exceção da Antártica (SCHERER, 1988; LINGAFELTER, 2001; TRIPLEHORN e JOHNSON, 2011). Os Alticinae podem ser conhecidos como besouros pulga, do inglês, flea beetles, por apresentarem seus fêmures posteriores dilatados na fase adulta, o que implica na sua capacidade de dar grandes saltos (ARNETT et al., 2002). Além dessas características anatômicas, Alticinae apresenta aspectos ecológicos interessantes, por exemplo, são considerados potenciais indicadores biológicos devido a sua prevalência em áreas degradadas, áreas de sucessão primária e regiões de borda (LINZMEIER et al., 2006). Adicionalmente, esses pequenos besouros têm importância econômica, uma vez que, algumas espécies são pragas de diferentes cultivares, como exemplo, o nabo (Phyllotreta sp.), tabaco, batata, tomate, feijão, cacau, algodão e beringela (Epitrix sp.) (GILLOTT, 1995; TRIPLEHORN e JOHNSON, 2011). No Brasil, Costa et al. (2006), encontraram três espécies do gênero Omophoita (O. cyanipennis, Omophoita sp1 e Omophoita sp2) em culturas de feijão comum (Phaseolus vulgaris) e melancia (Citrullus lanatus). Além disso, algumas espécies são importantes agentes de controle biológico de ervas daninhas, como Longitarsus jocobaea (GILLOTT, 1995; TRIPLEHORN e JOHNSON, 2011).

1.2 Sistemática em Alticinae

A subfamília Alticinae ainda não possui um status taxonômico definido e aceito pela maioria dos autores. Isso ocorre, em parte, devido a utilização da característica dos fêmures posteriores dilatados como diagnóstico para o grupo. Porém, ainda não se sabe a origem evolutiva de tal caráter, visto que, ela pode ser encontrada em outros táxons relacionados, como em Galerucinae, que está intimamente ligado aos Alticinae. Além disso, a escassez de estudos dentro dessa subfamília torna difícil a identificação correta de muitas espécies, uma vez que muitas se assemelham e a ocorrência de mimetismo é comum. 15

O mecanismo de salto em Alticinae é habilitado pela dilatação de seus fêmures traseiros com a presença de um aparato interno que pode ser conhecido como mola metafemoral, órgão de Maulik ou órgão de Costa Lima, sendo a presença desse órgão a principal característica que separa Alticinae de Galerucinae (BARTH, 1954; FURTH, 1982; CHEN,1985; FURTH 1988). No entanto, os diferentes autores e os estudos moleculares e morfológicos mostram resultados contraditórios. Para Newman (1835), a presença de um apódema extensor no interior dos fêmures posteriores dilatados caracteriza a subfamília Alticinae, afirmando que galerucíneos verdadeiros não apresentam tal apódema. Porém, Suzuki e Furth (1992) e Furth e Suzuki (1994) relataram que nem sempre essa característica está presente. Farrel (1998) reconhece que as subfamílias Alticinae e Galerucinae tem relação de grupos-irmãos, sendo considerados como monofiléticos, enquanto Reid (1995) admite que Alticinae é uma subdivisão dentro de Galerucinae, podendo ser classificada como uma nova tribo, dividindo Galerucinae nas tribos Galerucini e Alticini, descrevendo que o mecanismo saltatório é plesiomórfico para Galerucinae, sendo perdido mais tarde em Galerucini (REID, 1995, 2000). Alguns autores apontam uma classificação distinta, definindo Galerucinae sensu stricto como o grupo dos galerucíneos verdadeiros e Galerucinae sensu lato incluindo Galerucinae sensu stricto e os alticíneos (DUCKET et al., 2004; GILLESPIE et al., 2008). Em um estudo mais recente, utilizando dados moleculares e morfológicos da mola metafemoral, os autores sugerem que esse é um caráter derivado que surgiu inicialmente em Alticinae (sensu stricto) devido a sua maior complexidade nesse grupo, e apontam que esse mecanismo é utilizado na defesa, para evitar predação, sugerindo que tal característica teria surgido em outros grupos, incluindo Galerucinae, por convergência evolutiva (GE et al., 2010). Apesar de existirem várias hipóteses a respeito da relação Alticinae x Galerucinae, nenhuma está livre de ressalvas. Assim, as divergências apontam que a reconstrução da história evolutiva desses táxons ainda tem muito a ser debatida (REID, 2000; KIM et al., 2003; PRADO, 2015). Outro fator que contribui para a complicação taxonômica dos alticíneos é a ocorrência de mimetismo, que segundo Begossi e Benson (1988) e Del-Claro (1991) é um evento frequente. Um exemplo pode ser observado entre as espécies Adesmus colligatus (Cerambycidae), que é palatável, e Omophoita octoguttata (Chrysomelidae) impalatável. A espécie palatável A. colligatus possui padrão de cores semelhante ao Omophoita octogutatta, impalatável, se beneficiando confundindo os potenciais 16

predadores (DEL-CLARO, 2004). Gomes, Flinte e Macedo (2007) descrevem a existência de sete espécies que compõe um complexo mimético dos gêneros Omophoita e Alagoasa. Wolski (2014), observou diferenças genéticas e morfológicas do órgão genital masculino entre populações de Omophoita communis, sugerindo a possível ocorrência de duas espécies crípticas e miméticas. O modelo tradicional de descrição e identificação de espécies é baseado em características morfológicas por terem sido os primeiros dados disponíveis aos taxonomistas (PEREIRA; OLIVEIRA, 2015). No grupo dos insetos, assim como em Coleoptera, diversos caracteres morfológicos são utilizados para a identificação das espécies (SAVINI, 1999; SAVINI, 2001; KONSTANTINOV, 2011; RUAN et al., 2014). Entre os caracteres utilizados, a análise morfológica da genitália masculina é uma ferramenta que tem sido aplicada dentro do grupo dos insetos como fator de diferenciação de espécies relacionadas, facilitando as resoluções taxonômicas (EBERHARD, 1985; GARNIER et al., 2005). Acredita-se que os genitais masculinos divergem rapidamente, de modo que diferem mesmo em espécies muito próximas (EBERHARD, 1985; SHAPIRO e PORTER, 1989). Com base nesse pressuposto, o uso de tal órgão se tornou amplamente utilizada entre os taxonomistas para distinguir espécies próximas muito semelhantes (FLOWERS E EBERHARD, 2006). A figura 1 exemplifica uma genitália masculina de Coleoptera com suas principais estruturas de cunho taxonômico. 17

Figura 1 - Diagrama esquemático geral da genitália masculina de um diabrocíteo (Coleoptera: Chrysomelidae) (à esquerda) e detalhe edeago (à direita) (PRADO, 2015).

Além das análises morfológicas, a genética molecular tem contribuído muito para estudos populacionais e evolutivos a exemplo da utilização do DNA mitocondrial (mtDNA). A identificação baseada somente em caracteres morfológicos pode implicar em algumas limitações devido a plasticidade fenotípica presente em alguns grupos, levando a uma identificação errada, principalmente em espécies crípticas (KRESS e ERICKSON, 2012; PEREIRA e OLIVEIRA, 2015). Assim, o sequenciamento de regiões curtas do mtDNA, permite o reconhecimento rápido e preciso de espécies conhecidas e ainda tem se tornado fundamental para a identificação de espécies ainda não conhecidas (KRESS e ERICKSON, 2012). Outra vantagem desse método é que a identificação pode ser feita utilizando somente fragmentos da amostra que pode estar em qualquer estágio do desenvolvimento (PEREIRA e OLIVEIRA, 2015). Herbert et al. (2003) propuseram o uso de sequencias de DNA mitocondrial para a identificação de espécies, utilizando o termo DNA barcode em referência aos códigos de barras presente em produtos comerciais. A região proposta corresponde ao fragmento inicial do gene mitocondrial Citocromo Oxidase I (COI), que apresenta tamanho aproximado de 648 pares de bases,. Segundo esses mesmos autores, as sequências de DNA são únicas para cada espécie e podem ser usadas como um código de barras genético. 18

O DNA mitocondrial é um bom marcador para a separação de espécies devido a sua herança uniparental e também a alta taxa de mutação em seus genes, que pode ser até 10 vezes maior em relação ao DNA nuclear, gerando grande taxa de polimorfismo intraespecífico (BROWN, GEORGE e WILSON, 1979; PEREIRA e OLIVEIRA, 2015). Além disso, os genes mitocondriais não possuem íntrons, que usualmente atrapalham as análises dos segmentos de DNA, por serem regiões muito variáveis (PEREIRA e OLIVEIRA, 2015).

1.3 Características citogenéticas de Coleoptera

Do ponto de vista citogenético, existem poucos trabalhos com Coleoptera, sendo estudados cerca de 1% dos membros da ordem, totalizando um pouco mais de 3.000 espécies (PETITPIERRE, 1996). Smith (1950) descreveu a fórmula cromossômica considerada primitiva para os Coleoptera como 2n= 20= 9II+Xyp, onde Xy descreve o tipo de sistema cromossômico sexual, e “p” representa o tipo de associação meiótica entre X e y, a qual foi comparada a um paraquedas (SMITH e VIRKKI, 1978). Os mecanismos cromossômicos de determinação sexual dentro da ordem são variados e podem ser separados em duas classes distintas, podendo ser aquiasmáticos, como é o caso dos sistemas Xyp, Xnyp/nXyp, Xyc, X0 e X1+X2, X+y, ou quiasmáticos, como o neoXY, Xy, Xyr, X1X2Y e XY1Y2 (SMITH e VIRKKI, 1978). O mecanismo mais frequente e considerado basal para Coleoptera é o Xyp, nesse sistema o cromossomo X é grande, sendo maior que o Y, mas com tamanho semelhante aos autossomos (SMITH e VIRKKI, 1978). O número cromossômico e os mecanismos de determinação sexual dentro de Polyphaga são muito variáveis, sendo o menor número diploide descrito igual a 2n= 4, em Chalcolepidius zonatus (FERREIRA et al., 1984) e o maior 2n= 64, em Ditomus capito (SERRANO, 1981) e Disonycha bicarinata (VIRKKI, 1988a). De acordo com Smith e Virkki (1978), de maneira geral, existe uma variação no número cromossômico e predominância de cromossomos metacêntricos em muitas espécies de Polyphaga, que pode ser explicada pela ocorrência de fissões cêntricas, seguidas de eventos como inversões pericêntricas durante a sua evolução cariotípica. Tais eventos também podem explicar o aumento do número de cromossomos em relação a fórmula ancestral (SMITH e VIRKKI, 1978; VIRKKI, 1984). 19

Em Alticinae, apenas 290 espécies foram estudadas, e destas, somente 56 pertencem ao Brasil (SMITH e VIRKKI, 1978; PETITPIERRE et al., 1988). Nessa subfamília, o número diploide é significativamente variável, sendo visto 2n= 6=

2II+neoXY, em Homoschema latitarsum e 2n= 64= 30II+X1y+X2+X3, em Disonycha bicarinata (VIRKKI, 1970; PETITPIERRE, 1988, 2006). Segundo Virkki (1967, 1968), o sistema de determinação sexual mais comum é o X+y, mas ao todo são descritos

18 tipos distintos, sendo eles: Xyp, neoXY, Xy, XY, X+Y, X+y, X+ny, X1+X2, nXnY,

XpneoXneoYp, X, Xyy, X1X2Y, XXYY, Xyr, X1Y+nX, Xy+Y e X+ny (VIRKKI, 1967, 1968; SMITH e VIRKKI, 1978). Os cromossomos sexuais variam em tamanho e morfologia mesmo em espécies próximas, sugerindo que sua formação seja recente. O emparelhamento entre esses cromossomos também é interessante, pois pode ser tardio ou inexistente, e a segregação pode ser pré ou pós-reducional (VIRKKI, 1963, 1964, 1967). Além disso, o cariótipo considerado ancestral dos Polyphaga, 2n= 20= 9II+Xyp, foi descrito somente em duas espécies de Alticinae, Parasyphaea sp. e Chaetocnema chlorophana (VIRKKI, 1967, 1968; SMITH e VIRKKI, 1978; PETITPIERRE et al., 1988). A ampla variação cariotípica presente em Alticinae revela a existência de muitas espécies com características derivadas e não derivadas ao mesmo tempo, como por exemplo, as irregularidades no comportamento, tamanho e morfologia dos cromossomos sexuais em espécies relacionadas (VIRKKI, 1970). A tribo Aphthonini, com 36 espécies estudadas, apresenta diversidade cromossômica tanto em relação ao número diploide quanto ao tipo de sistema de determinação sexual. Como exemplo, o número diploide encontrado na tribo pode ser 2n= 6= 2II+neoXY ou 2n= 38= 18II+Xyp, e os sistemas de determinação sexual podem ser Xyp, Xy, XY, XXYY, neoXY, X1X2Y, X e X+Y, sendo Xyp o qual aparece com maior frequência. Esses fatores apontam o grupo dos besouros pulga como um objeto de estudo muito importante do ponto de vista evolutivo, para a compreensão das estratégias de diferenciação cariotípica nessas espécies (VIRKKI, 1967, 1968, 1970; PETITPIERRE, 1988)

1.4 O gênero Heikertingerella

O gênero Heikertingerella é composto por 109 espécies e 4 subespécies, as quais são muito semelhantes em sua morfologia externa. Além disso, existem aquelas que apresentam coloração policromática, o que dificulta uma identificação detalhada nesse grupo (BLAKE, 1960; SAVINI, 1999). Esse aspecto morfológico pode ser exemplificado pelos resultados obtidos por Savini (1999), onde mostra que o padrão de coloração não é um bom caráter para separar as espécies desse gênero, uma vez que, como já mencionado, as espécies podem apresentar um padrão variável, como é o caso de H. paramera e H. tamaensis (Figura 2A, 2B).

Figura 2 - Alguns exemplos de variação na coloração do élitro em Heikertingerella. A. H. paramera. B. H. tamaensis (retirado de SAVINI, 1999).

Esses fatos nos levam a pensar que muitas espécies podem ter sido identificadas erroneamente, levando em consideração apenas o padrão de coloração, visto que, os padrões variam mesmo em indivíduos do mesmo local e data de coleta (SAVINI, 1999; SAVINI, 2001), gerando barreiras para estudos mais aprofundados dentro do gênero. Savini (1999) descreveu 15 novas espécies de Heikertingerella por meio de análises morfológicas de diversos caracteres, e mostrou que a forma da genitália masculina é fundamental para a definição dessas espécies. Antes disso, apenas Blake (1960) e Bechyné (1964) utilizaram o edeago como ferramenta para a separação de 21

espécies de Heikertingerella, embora trabalhos semelhantes tenham sidos realizados tanto para a classificação como para a descrição de espécies dentro de Chrysomelidae (BIONDI, 1986, 1991; GRUEV e ASLAN, 1998; BASELGA E NOVOA, 2005; MOURA, 2009; PRADO, 2015). Konstantinov (2011) descreveu novas espécies para o gênero Chaetocnema após realizar uma revisão taxonômica através de análises morfológicas, incluindo a descrição da genitália masculina. Em um trabalho recente, cinco espécies do gênero Chaetocnema (Alticinae) foram analisadas morfologicamente, onde foi possível a descrição de três novas espécies efetuando a descrição do edeago, além de outros caracteres morfológicos (RUAN et al., 2014). Das 109 espécies descritas para Heikertingerella, somente cinco foram estudadas citogeneticamente, e os estudos existentes se resumem a descrição citogenética básica com relação ao número cromossômico e fórmula meiótica (VIRKKI, 1970; SMITH e VIRKKI, 1978; JOLIVET, PETITPIERRE e HSIAO, 1988; VIRKKI e SANTIAGO-BLAY, 1996). Além de poucas espécies terem sido estudadas, três não foram identificadas a nível específico (JOLIVET, PETITPIERRE e HSIAO, 1988), evidenciando a dificuldade na separação de espécies para o gênero. Nas espécies estudadas, o menor número cromossômico encontrado é 2n = 10 em Heikertingerella krugi (VIRKKI e SANTIAGO-BLAY, 1996) e o maior 2n= 24 em Heikertingerella brevitarsis (VIRKKI, 1970). Com relação aos cromossomos sexuais, os sistemas de determinação sexual descritos para o gênero são: o sistema neoXY e o sistema XXYY, sendo esse último caracterizado pela formação de um quadrivalente durante a primeira metáfase meiótica (VIRKKI, 1970; SMITH e VIRKKI, 1978; JOLIVET, PETITPIERRE e HSIAO, 1988; VIRKKI e SANTIAGO-BLAY, 1996).

1 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

Diante dessas informações, pode-se afirmar com clareza que a falta de consenso no que diz respeito à classificação do grupo, em conjunto à ocorrência de mimetismo, indica a necessidade de estudos dessa natureza para que haja maior conhecimento de sua diversidade. Dessa forma, considerando os raros estudos em Alticinae, aliado à problemática abordada, torna-se importante a caracterização citogenética e morfológica de espécies ainda não estudadas, aumentando as chances de desvendar o cenário filogenético e elevar o conhecimento para melhor compreender as relações filogenéticas e cariotípicas no grupo. 22

Assim, este trabalho tem como objetivo analisar por meio de técnicas morfológicas e genéticas indivíduos de Heikertingerella argentinensis provenientes de três localidades.

Para efetuar estas análises, pretende-se:

1. Analisar a morfologia do edeago das diferentes populações; 2. Estudar os cromossomos mitóticos e meióticos com coloração convencional, para verificar o número cromossômico diploide e haploide, o tipo de sistema de determinação sexual, a morfologia cromossômica e o comportamento dos cromossomos durante a meiose; 3. Mapear as regiões teloméricas (TTAGG)n por meio da hibridação in situ fluorescente (FISH); 4. Construir uma relação molecular entre os indivíduos das populações analisadas a partir do sequenciamento do gene mitocondrial Citocromo Oxidase I (COI);

2 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material biológico

Os indivíduos adultos de três populações de Heikertingerella argentinensis coletados nas cidades de São Sebastião (6 indivíduos), São Paulo, Brasil (S 23°49'33.6" W 45°25'30.2"); União da Vitória (36 indivíduos), Paraná, Brasil (S 26°14'01.3" W 51°08'52.6") e Ponta Grossa (30 indivíduos), Paraná, Brasil (S 25°07'14.3" W 49°56'25.2") (Figura 3). 23

Figura 3 - Mapa brasileiro, indicando a localização dos pontos de coleta de Heikertingerella.

Os insetos foram coletados na natureza com licença do Ministério do Meio Ambiente (MMA) / Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio) (Anexo I) e foram capturados através de coleta manual direta e com o auxílio de rede entomológica (Figura 4A). Em todas as áreas de estudo, as coletas foram realizadas em regiões de borda que apresentam vegetação em estágio de sucessão primária. Todos os indivíduos foram capturados alimentando-se da espécie Amphilophium crucigerum (Bignoniaceae) (L.) L.G.Lohmann (Figura 4A, 4B),

conhecida popularmente como pente-de-macaco, identificada pelo especialista Jorge Iarmul. Para a identificação dos insetos, alguns indivíduos foram enviados para o especialista Carlos Campaner do Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo - USP.

3.2 Métodos

3.2.1 Estudo da morfologia do edeago

A genitália foi extraída do abdômen do inseto, após isso, foi aquecida em uma solução de hidróxido de Potássio (1:10) até a máxima redução do material muscular, com o objetivo de observar somente a estrutura rígida e esclerotizada. Em seguida, foi lavada com álcool 70% e guardada em um microtubo contendo glicerina, seguindo a metodologia de extração proposta por Smith (1979). A morfologia do edeago dos indivíduos de cada população foi analisada em um estereomicroscópio Medilux MDL- F e fotografada em um estereomicroscópio Leica® M205 C com câmera digital em tempo real MC170 HD (Leica®), utilizando o software LAS 4.8.0 (Leica®). Para obter uma imagem sem glicerina, o órgão foi mergulhado em uma solução composta por água e sabão. Nesse trabalho a descrição das estruturas serão baseadas na terminologia utilizada por konstantinov (2011) e Ruan et al. (2014), com foco na estrutura do edeago (Figura 5). 25

Figura 5 - Edeago de Chaetocnema arenacea. Adaptado de Konstantinov (2011).

3.2.2 Citogenética

Para o estudo citogenético foram utilizadas gônadas masculinas e femininas de indivíduos adultos. As preparações das gônadas masculinas foram realizadas de acordo com a metodologia descrita por Almeida, Zacaro e Cella (2000), (Anexo 2.1), na qual os animais são dissecados em solução fisiológica para insetos (7,5 g NaCl,

2,38 g Na2HPO4, 2,72 g KH2PO4 em 1L de água destilada). As gônadas retiradas foram transferidas para solução hipotônica e depois para solução Carnoy I. Para a obtenção de cromossomos mitóticos, as gônadas masculinas e femininas foram preparadas com colchicina, seguindo a técnica proposta por Webb et al. (1982) (Anexo 2.2). Após a realização dessas técnicas, os órgãos foram macerados em uma lâmina, junto a uma solução de ácido acético 60%, e secas em uma placa de metal aquecida (35 - 40°C). As lâminas foram coradas com solução Giemsa 3% (Anexo 2.3). As melhores fases foram fotografadas em um microscópio de epifluorescência Olympus® BX 41 com objetiva 100X de imersão com câmera digital em tempo real CCD DP-71 (Olympus®), utilizando o software DP controller. A montagem dos cariótipos foi feita de acordo com a proposta de Levan, Fredga e Sandberg (1964).

3.2.3 Hibridação in situ fluorescente (FISH)

A sonda telomérica (TTAGG)n foi obtida por meio da Reação em Cadeia da

Polimerase (PCR) utilizando os primers complementares Tel F 5’- (TTAGG)5 - 3’ e Tel

R 5’- (CCTAA)5 - 3’, seguindo o protocolo de Ijdo et al. (1991). O produto obtido da reação foi marcado com biotina pelo kit Bio-Nick translation (Roche®) de acordo com instruções do fabricante. A hibridização foi realizada segundo Pinkel et al. (1986) com pequenas modificações descritas por Almeida et al. (2010) (Anexo 3). As condições de hibridação foram de alta estringência (2,5 ng/uL de sondas, formamida deionizada 50%, sulfato de dextrano 10%, 2XSSC a 37°C overnight), onde as sondas estavam em uma concentração de pelo menos 300ng. Para o mapeamento e a detecção do sinal da biotina utilizou-se Streptavidina (Sigma®). Os cromossomos foram contracorados com DAPI (0,2mg/ml) montado em uma solução anti-fade e as células fotografadas em um microscópio de epifluorescência Olympus® BX 41 com objetiva 100X de imersão com câmera digital em tempo real CCD DP-71 (Olympus®), utilizando o software DP controller.

3.2.4 Análise molecular

Para as análises e reconstrução das relações filogenéticas foi sequenciada a porção inicial do gene mitocondrial Citocromo Oxidase I (COI) dos indivíduos de cada população. A extração de DNA genômico dos indivíduos foi realizada segundo a técnica de Murray e Thompson (1980) (Anexo 4) com pequenas modificações, onde o corpo inteiro do animal permaneceu mergulhado por 10 horas (overnight) na solução de extração, contendo NaCl 5M, EDTA 0,5M, TRIS-HCl 1M com pH = 8.0, proteinase K (10mg/mL) e β-mercaptoetanol, para que o exoesqueleto não fosse alterado, permitindo posteriormente as análises morfológicas. Na sequência, o DNA genômico foi analisado através de eletroforese em gel de agarose a 1% corados com gelred Biotium® (1:1000) que foi corrido a 80V por 30 minutos para avaliar a integridade do DNA. O DNA extraído foi diluído para 20ng/uL e submetido à uma PCR, para a amplificação do gene COI. Na reação de PCR foram utilizados os primers: COI – Forward - 5’ TAATTGGAGGATTTGGWAAYTG 3’; COI – Reverse - 5’ CCYGGTAAAATTAAAATATAAACTTC 3’ (KIM, KJER e DUCKETT, 2003). Cada reação foi realizada em um volume total de 35 µL, onde os reagentes apresentam as 27

seguintes concentrações: 20 ng de DNA genômico, tampão de reação 1X (Invitrogen®), 8,75 unidades de Taq DNA polymerase (Sinapse Inc®), 1 pMol de cada ® ® primer (GBTbiotec ), 1,5 mM de MgCl2 (Sinapse Inc ), e 0,2 mM de dNTP (Ludiwig biotec®). O processo de amplificação foi realizado em um termociclador nas seguintes condições: 1 ciclo de 95ºC por 4 minutos, seguido de 35 ciclos com 3 passos, sendo o primeiro de 94ºC por 60 segundos, o segundo de 53ºC por 30 segundos e o terceiro a 72ºC por 30 segundos. Finalmente um passo a 72ºC por 10 minutos. Os produtos finais de PCR foram verificados em eletroforese com gel de agarose a 1% corrido em 70V durante 30 minutos. Posteriormente, os produtos de PCR foram purificados com KIT de purificação Illustra TFXTM GE®, conforme as instruções do fabricante, quantificados, e enviados para sequenciamento por terceiros, seguindo as recomendações da empresa que realiza o sequenciamento. As amostras foram sequenciadas pela empresa ATCGene em um sequenciador automático (ABI-PRISM 3100 Genetic Analyzer) armado com capilares de 50cm e polímero POP6 (Applied Biosystems). As sequências forward e reverse foram corrigidas, comparadas e editadas pelo programa Chromas Lite v2.0. Posteriormente, as sequências consenso foram alinhadas, utilizando o programa Clustal W 1.8 (THOMPSON et al., 1994) presente no software Bioedit v7.0.9 (HALL, 1999). Os pontos de mutação foram checados manualmente, utilizando o programa Chromas Lite v2.0. Para a escolha do melhor modelo de substituição nucleotídica utilizou-se o programa JModeltest, inserido no software MEGA v7.0, seguindo o critério de informação de Akaike (POSADA, 2008). Para melhor explicar a relação entre os espécimes, optou-se pela construção de um cladograma utilizando o método bayesiano, realizado no software MrBayes v3.2 (RONQUIST et al., 2012), utilizando caracteres morfológicos (edeago), citogenéticos e moleculares. Para gerar o cladograma foi utilizado 200.000 passos na cadeia de Markov e Monte Carlo (MCMC) até obter um valor de p < 0,02, com burn-in de 5%. Para efetuar essa análise foi necessária a construção de uma matriz compilando os dados obtidos (anexo 5).

3 RESULTADOS

Os resultados estão organizados em um capítulo correspondente ao artigo científico:

CAPÍTULO I:

Diversidade revelada em Heikertingerella argentinensis (Csiki, 1940) (Coleoptera: Alticinae) por meio de uma abordagem integrativa

CAPÍTULO I:

Diversidade revelada em Heikertingerella argentinensis (Csiki, 1940) (Coleoptera: Alticinae) por meio de uma abordagem integrativa

Resumo

A subfamília Alticinae abriga os insetos conhecidos como besouros pulga, por apresentarem os seus fêmures posteriores dilatados o que os capacita a realizarem saltos. Esses animais se mostram muito interessantes como modelos para estudos evolutivos, principalmente do ponto de vista citogenético, apresentando grande variação numérica e no tipo de sistema cromossômico determinante do sexo. Contudo, as espécies são muito semelhantes morfologicamente, e a ocorrência de mimetismo é comum neste grupo, gerando um obstáculo para os pesquisadores, uma vez que muitos exemplares podem ser identificados erroneamente. O gênero Heikertingerella possui 109 espécies descritas e somente cinco foram descritas citogeneticamente, sendo três não identificadas em nível específico. A falta de profissionais e a grande riqueza de espécies, muitas ainda necessitando de estudos mais aprofundados, inclusive morfológicos, pode ser uma razão para essa falta de informações. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi analisar por meio de técnicas morfológicas e genéticas, indivíduos de de Heikertingerella argentinensis provenientes de três localidades. Essas informações contribuirão para o melhor entendimento das relações filogenéticas existentes entre as espécies por meio da união da morfologia e genética. Os nossos resultados revelam que as populações apresentam edeagos morfologicamente distintos, permitindo a sua caracterização em três morfotipos. Além disso, o número diploide é variável entre os morfotipos, sendo o morfotipo I com 2n= 19 e o morfotipo II e III com 2n= 17. Ambos os morfotipos apresentam o sistema cromossômico de determinação sexual do tipo X1X2Y, descrito pela primeira vez para esse gênero. Os resultados moleculares agrupam os indivíduos em três clados principais, um referente aos indivíduos com o morfotipo III, outro clado agrupa os morfotipos II e um terceiro que agrupa um indivíduo do morfotipo I e um do morfotipo II. Esses resultados mostram que H. argentinensis, pode ser um complexo de espécies. Nossos dados apontam também que as possíveis dificuldades na identificação das mesmas residem no fato do mimetismo ser um fator comum neste grupo.

Palavras-chave: Complexo de espécies, diferenciação cariotípica, evolução, morfologia do edeago, polimorfismo.

Abstract

The subfamily Alticinae houses the insects known as flea beetles, because they have their posterior femurs dilated, which enables them to jump. These animals are very interesting as models for evolutionary studies, mainly from the cytogenetic point of view, presenting great numerical variation and in the type of sex determining chromosomal system. However, species are very similar morphologically, and the occurrence of mimicry is common in this group, creating an obstacle for researchers, since many specimens can be misidentified. The genus Heikertingerella has 109 described species and only five were described cytogenetically, three of which were not identified at a specific level. The lack of professionals and the great wealth of species, may be a reason for this lack of information. Thus, the objective of the present work was to analyze, by means of morphological and genetic techniques, individuals of Heikertingerella argentinensis from three localities. This information will contribute to a better understanding of the phylogenetic relationships between species through the union of morphology and genetics. Our results shows that the populations presents morphologically distinct aedeagus, allowing its differentiation into three morphotypes. Moreover, the diploid number is variable among the morphotypes, the morphotype I has 2n = 19 and the morphotype II and III have 2n = 17. Both morphotypes presents the X1X2Y sexual chromosomic system, described for the first time for this genus. The molecular results clusters the individuals in three mainly clados, one of them refers to individuals with morphotype III, other clado agroups the morphotypes II and a third that agroups one individual of morphotype I and other of morphotype II. These results shows that H. argentinensis may be a species complex. Our data also indicate that possible difficulties in identification of them emerge because of the fact that mimetism is a common factor of this group. The lack of technologies that enable a multidisciplinary approach like the union of genetic and morphology also contributed to include the morphotypes in the same specie. In this way, this paper suggests that a more detailed review in H. argentinensis would be necessary to understand the real biodiversity hidden in this species complex in a clearer way

Keywords: Species complex, karyotype differentiation, evolution, aedeagus morphology, polymorphism.

Introdução

A subfamília Alticinae (Coleoptera: Chrysomelidae) compreende um grupo de pequenos besouros convexos com mais de 10.000 espécies descritas (SEENO e WILCOX, 1982; TRIPLEHORN e JOHNSON, 2011). Esses insetos são conhecidos como besouros pulga, por sua capacidade de dar grandes saltos, graças aos seus fêmures posteriores dilatados (ARNETT et al., 2002). Outra característica interessante nesse grupo, é que os machos apresentam somente um testículo na região direita anterior do abdômen, resultante da fusão dos dois testículos durante o processo evolutivo do grupo (SMITH; VIRKKI, 1978). Com relação à citogenética, apenas 290 espécies (aproximadamente 3%) de Alticinae foram estudadas (SMITH e VIRKKI, 1978; PETITPIERRE et al., 1988). Nessa subfamília, o número cromossômico pode variar de 2n=6=2II+neoXY, em

Homoschema latitarsum e 2n=64=30II+X1y+X2+X3, em Disonycha bicarinata (VIRKKI, 1970; PETITPIERRE, 1988, 2006). Segundo Virkki (1967, 1968), o sistema de determinação sexual mais comum é o X+y, mas ao todo são descritos 18 tipos distintos (VIRKKI, 1967, 1968; SMITH e VIRKKI, 1978), e os cromossomos sexuais varia em tamanho e morfologia mesmo em espécies próximas, sugerindo que a sua formação seja recente (VIRKKI, 1963, 1964, 1967). Na tribo Aphthonini, 36 espécies foram estudadas, revelando diversidade cromossômica tanto em relação ao número cromossômico, quanto ao tipo de sistema de determinação sexual, como exemplo, 2n=6=2II+neoXY ou 2n=38=18II+Xyp, e os sistemas de determinação sexual podem ser Xyp, Xy, XY, XXYY, neoXY, XXY, X e X+Y, sendo Xyp o qual aparece com maior frequência. Ainda não existe consenso na posição taxonômica do grupo, pois muitos autores consideram o Alticinae como uma subfamília separada de Galerucinae (BARTH, 1954; FURTH 1982; CHEN,1985; FURTH 1988), enquanto outros sugerem como uma nova tribo dentro de Galerucinae (REID, 1995). Alguns autores ainda sugerem a divisão de Galerucinae em Galerucinae sensu stricto e Galerucinae sensu lato incluindo os alticíneos (DUCKET et al., 2004; GILLESPIE et al., 2008). A falta de consenso taxonômico em Alticinae também ocorre em clados mais inclusos. No gênero Heikertingerella, pertencente a tribo Aphtonini, por exemplo, são descritas 109 espécies, e muitas delas apresentam características morfológicas semelhantes. Somando-se a isso, há aquelas que apresentam coloração 33

policromática, que pode ser variável mesmo em indivíduos do mesmo local e data de coleta (BLAKE, 1960; SAVINI, 1999), o que dificulta a diferenciação entre as espécies desse gênero. Neste trabalho, consideramos para todos os fins, a proposta de que Alticinae é uma família separada de Galerucinae (BARTH, 1954; FURTH 1982; CHEN,1985; FURTH 1988). Uma ferramenta que é muito utilizada para a identificação de espécies próximas em insetos, e inclusive dentro da subfamília Alticinae é a análise morfológica da genitália masculina (edeago) (EBERHARD, 1985; GARNIER et al., 2005; KONSTANTINOV, 2011, RUAN et al., 2014). Savini (1999) descreveu 15 novas espécies de Heikertingerella por meio de análises morfológicas de diversos caracteres, e afirmou que a forma da genitália masculina é fundamental para a definição dessas espécies. Antes disso, apenas Blake (1960) e Bechyné (1964) utilizaram o edeago como ferramenta para a separação de espécies de Heikertingerella. Além das análises morfológicas, a genética molecular tem contribuído muito para estudos populacionais e evolutivos, por meio do sequenciamento do DNA mitocondrial (mtDNA), utilizando o fragmento inicial do gene Citocromo Oxidase I (COI) (PEREIRA e OLIVEIRA, 2015). Do ponto de vista citogenético, somente cinco espécies de Heikertingerella foram estudadas (VIRKKI, 1970; SMITH e VIRKKI, 1978; JOLIVET, PETITPIERRE e HSIAO, 1988; VIRKKI e SANTIAGO-BLAY, 1996). Além disso, entre elas, três não foram identificadas a nível específico (JOLIVET, PETITPIERRE e HSIAO, 1988), evidenciando a dificuldade na separação de espécies para o gênero. Nas espécies estudadas, o menor número cromossômico encontrado foi 2n = 10, em Heikertingerella krugi (VIRKKI e SANTIAGO-BLAY, 1996) e o maior 2n= 24, em Heikertingerella brevitarsis (VIRKKI, 1970). Com relação aos cromossomos sexuais, os sistemas de determinação sexual descritos são o sistema neoXY e o sistema XXYY, sendo esse último caracterizado pela formação de um quadrivalente durante a primeira metáfase meiótica (VIRKKI, 1970; SMITH & VIRKKI, 1978; JOLIVET, PETITPIERRE e HSIAO, 1988; VIRKKI & SANTIAGO-BLAY, 1996). Dessa forma, considerando os raros estudos dentro do gênero Heikertingerella, torna-se importante a caracterização citogenética e morfológica de espécies ainda não estudadas. Além disso, o uso em conjunto de análises morfológicas e genéticas pode contribuir para uma melhor compreensão da diversidade do grupo. 34

O objetivo deste trabalho é utilizar uma abordagem integrativa, a fim de comparar indivíduos da espécie Heikertingerella argentinensis coletados em três localidades distintas.

Material e métodos

Foram analisados indivíduos adultos de Heikertingerella argentinensis em três localidades: São Sebastião (06 indivíduos), São Paulo, Brasil (S 23°49'33.6" W 45°25'30.2"); União da Vitória (36 indivíduos), Paraná, Brasil (S 26°14'01.3" W 51°08'52.6") e Ponta Grossa (30 indivíduos), Paraná, Brasil (S 25°07'14.3" W 49°56'25.2"). A genitália masculina foi extraída do abdômen do inseto seguindo o método proposto por Smith (1979). Após sua extração, o lobo médio foi lavado com álcool 70% e em seguida fotografado em um estereomicroscópio Leica® M205 C com câmera digital em tempo real MC170 HD (Leica®), utilizando o software LAS 4.8.0 (Leica®). As terminologias utilizadas nesse artigo para a descrição do edeago são baseadas nos trabalhos de Konstantinov (2011) e Ruan et al. (2014). Para a análise cromossômica, os indivíduos adultos de H. argentinensis foram dissecados em solução fisiológica para insetos (7,5 g NaCl, 2,38 g Na2HPO4, 2,72 g

KH2PO4 em 1L de água destilada). A obtenção de cromossomos meióticos foi realizada por meio da maceração de gônadas masculinas, seguindo o método descrito por Almeida, Zacaro e Cella (2000). Para a preparação mitótica, os órgãos (gônadas e ovários) foram processados de acordo com o método descrito por Webb et al. (1978).

A sonda telomérica (TTAGG)n foi obtida por meio da Reação em Cadeia da

Polimerase (PCR) utilizando os primers complementares Tel F 5’- (TTAGG)5 - 3’ e Tel

R 5’- (CCTAA)5 - 3’, seguindo o protocolo de Ijdo et al. (1991). O produto obtido da reação foi marcado com biotina pelo kit Bio-Nick translation (Roche®) de acordo com instruções do fabricante. A hibridização foi realizada segundo Pinkel et al. (1986) com pequenas modificações descritas por Almeida et al. (2010). As condições de hibridação foram de alta extringência (2,5 ng/uL de sondas, formamida deionizada 50%, sulfato de dextrano 10%, 2XSSC a 37°C overnight). Para a detecção do sinal da biotina utilizou-se Streptavidina (Sigma®). Os cromossomos foram contracorados com DAPI (0,2mg/ml) montado em uma solução anti-fade e as células fotografadas em um 35

microscópio de epifluorescência Olympus® BX 41 com objetiva 100X de imersão com câmera digital em tempo real CCD DP-71 (Olympus®), utilizando o software DP controller. A extração de DNA genômico dos indivíduos foi realizada segundo a técnica de Murray e Thompson (1980) com pequenas modificações, onde o indivíduo inteiro permaneceu por 12 horas na solução de extração (NaCl 5M, EDTA 0,5M, TRIS-HCl 1M com pH = 8.0, proteinase K (10mg/mL) e β-mercaptoetanol), para conservar a morfologia externa. Posteriormente, para a amplificação do gene COI, foi realizada uma reação de PCR utilizando os primers: COI – Forward - 5’ TAATTGGAGGATTTGGWAAYTG 3’; COI – Reverse - 5’ CCYGGTAAAATTAAAATATAAACTTC 3’ (KIM, KJER e DUCKETT, 2003). Cada reação foi realizada em um volume total de 35 µL, contendo 20 ng de DNA genômico, tampão de reação 1X (Invitrogen®), 8,75 unidades de Taq DNA polymerase (Sinapse Inc®), 1 pMol de cada primer (GBTbiotec®), 1,5 mM de MgCl2 (Sinapse Inc®), e 0,2 mM de dNTP (Ludiwig biotec®). O processo de amplificação foi realizado em um termociclador nas seguintes condições: 1 ciclo de 95ºC por 4 minutos, seguido de 35 ciclos com 3 passos, sendo o primeiro de 94ºC por 60 segundos, o segundo de 53 ºC por 30 segundos e o terceiro a 72ºC por 30 segundos. Finalmente um passo a 72ºC por 10 minutos. Os produtos finais da PCR foram purificados utilizando o KIT de purificação Illustra TFXTM GE®, conforme as instruções do fabricante, e as amostras foram enviadas para sequenciamento por empresa terceirizada (ATCgene). As sequências forward e reverse foram corrigidas, comparadas e editadas pelo programa Chromas Lite, 2.0. Posteriormente as sequências consenso foram alinhadas, utilizando o programa Clustal W 1.8 (THOMPSON et al., 1994) presente no programa Bioedit v7.0.9 (HALL, 1999). Os pontos de mutação foram checados manualmente, utilizando o programa Chromas Lite, v2.0. Para a escolha do melhor modelo de substituição nucleotídica utilizou-se o programa JModeltest, inserido no software MEGA v7.0, seguindo o critério Akaike (POSADA, 2008). Para melhor explicar a relação entre os espécimes, optou-se pela construção de uma árvore bayesiana, realizada no software MrBayes v3.2 (RONQUIST et al., 2012), utilizando caracteres morfológicos (edeago), citogenéticos e moleculares. Para gerar o cladograma foi utilizado 200.000 passos na cadeia de Markov e Monte Carlo (MCMC) até obter um valor de p < 0,02, com burn-in de 5%. Para efetuar essa análise foi necessária a construção de uma matriz compilando os dados obtidos (anexo 5). 36

Resultados

Os indivíduos estudados nesse trabalho foram identificados como Heikertingerella argentinensis. O estudo morfológico do edeago permitiu a distinção dos indivíduos em 3 morfotipos devido a observação de diferenças na estrutura da genitália. Os indivíduos de Ponta Grossa e São Sebastião foram denominados de morfotipo I (Figura 6A, 6B). Nesse morfotipo, o edeago é menos uniforme, com dentição apical assimétrica e região basal com estruturas retas e discretas, assim como a parte medial. O sulco longitudinal é presente em toda a extensão, até o terço apical, onde há um alargamento subequal à abertura basal, imediatamente antes do estreitamento apical. A largura do sulco longitudinal na base é maior que a distância entre o sulco e a margem lateral, porém há uma grande diminuição na porção medial, onde esse sulco se torna menor que a distância até a margem. As dobras transversais são ausentes em toda a extensão do lobo médio (Figura 7A). Na população de União da Vitória, foi possível distinguir os indivíduos em 2 morfotipos, sendo esses denominados de morfotipo II (Figura 6C, 6D, 6E, 6F) e morfotipo III (Figura 6G, 6H). O morfotipo II apresenta o edeago suavemente arredondado, convexo longitudinalmente, com bordas laterais suavemente convexas, porém com maior proeminência dessas bordas próximo à região da abertura basal. O terço apical é ligeiramente ampliado antes de apresentar um estreitamento na região apical, terminando em maior simetria, afilando no eixo central, formando um ápice subdeltóide. As dobras transversais são pouco desenvolvidas no ápice e ausentes na porção apical e média, enquanto a presença de sulcos longitudinais só ocorre na região basal, onde a largura do sulco é equivale à sua distância até a margem, porém na região mediana e apical esse sulco está ausente (Figura 7B). O estudo morfológico do morfotipo III mostrou que a abertura basal é ligeiramente mais estreita em relação ao sulco longitudinal que se estende até o ápice, onde há um alargamento do terço apical, antes do estreitamento abrupto que ocorre terminando em uma dentição bastante proeminente e pontuda. O sulco longitudinal possui mais que o dobro de largura da sua distância até a margem lateral, e somente no ápice está ausente. As margens nessa genitália são bem arredondadas, sendo mais convexas e discretas, e as dobras transversais não estão presentes (Figura 7C).

O estudo citogenético dos indivíduos analisados mostrou a ocorrência de variação no número diploide e na fórmula meiótica. A análise de células meióticas dos indivíduos de São Sebastião (SP) e Ponta Grossa (PR), morfotipo I, revelou a presença do número diploide igual a 2n= 19 (Figura 8A). A fórmula cromossômica mostrou a ocorrência de 08 bivalentes autossômicos e um trivalente em forma de V, sendo interpretado como X1X2Y. Metáfases II dos indivíduos machos com 2n= 19 confirmam a presença do sistema X1X2Y, sendo observado n= 9 = 8 + Y em um polo celular, e n= 10= 8 + X1X2, no polo celular oposto (Figura 8B, 8C). Nas metáfases mitóticas dos indivíduos de São Sebastião foi possível confirmar o número diploide 2n= 19. O estudo do cariótipo mostrou seis pares 38

autossômicos metacêntricos (1, 3, 5, 6, 7, 8), dois submetacêntricos (2 e 4) e 3 cromossomos sexuais, o Y sendo o maior, o X2 homólogo a porção que representa o autossomo fusionado e o X1 original (Figura 9A). No estudo cromossômico da população de União da Vitória, PR (morfotipos II e III), os indivíduos analisados apresentam 2n= 17 (Figura 8D, 8E). Células meióticas desses exemplares mostram a presença de 07 bivalentes autossômicos e o mesmo trivalente em formato de V, interpretado como X1X2Y (Figura 8D, 8E). Nos indivíduos denominados como morfotipo III, a análise de células mitóticas espermatogoniais mostrou a ocorrência de cinco pares autossômicos metacêntricos

(1, 2, 4, 6 e 7), dois submetacêntricos (3 e 5) e três cromossomos sexuais, X1X2Y (Figura 9B). Além disso, em algumas células observou-se a presença de um cromossomo supranumerário metacêntrico pequeno em metáfases meióticas dos morfotipos I e II (Figuras 8A, 8D, 8E) bem como em células mitóticas do morfotipo III (Figura 9B). No morfotipo III, a hibridação in situ com sonda telomérica não mostrou um padrão de marcação nos telômeros. Porém, um sítio intersticial foi observado no cromossomo Y, reforçando a proposta de origem do sistema X1X2Y (Figura 9C). Dessa forma, foi possível identificar a porção correspondente ao Y original e a região que corresponderia ao autossomo, assim, podendo ser identificado o cromossomo homólogo ao fusionado com o Y, sendo denominado de X2.

Figura 8 - A. Metáfase I com 2n=19+1= 8II+X1X2Y + s (seta), morfotipo I. B. Metáfase II com n= 9= 8 + Y, morfotipo I. C. Metáfase II com n=10=8+X1X2Y, morfotipo I. D, E. Metáfases I com 2n= 17+1= 7II+X1X2Y, morfotipos II e III. Seta = supranumerário.

O resultado do sequenciamento do gene COI mostrou similaridade com o COI de outras espécies de Alticinae não identificadas depositadas no GenBank, com o valor máximo de 87% de similaridade entre as sequências (código de acesso KJ677340, e-value igual a 2e-153). O resultado da análise bayesiana mostrou a formação de três grupos principais. Um ramo formado pelo agrupamento do morfotipo III, formando um clado aparentemente monofilético. Outro ramo agrupou os indivíduos do morfotipo II, formando outro clado, porém o terceiro ramo agrupou um indivíduo do morfotipo I e um indivíduo do morfotipo II (Figura 10).

Figura 9 – A. Cariótipo espermatogonial de um macho de H. argentinensis de São Sebastião - SP, com 2n=19=8II+X1X2Y, em coloração convencional, morfotipo I. B. Cariótipo espermatogonial de um macho de H. argentinensis de União da Vitória, PR, com 2n=17+ 1s=7II+X1X2Y+s, em coloração convencional, morfotipo III. C. A mesma célula vista em B submetida a hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda telomérica. Seta = sinal de hibridização intersticial. S = supranumerário.

Figura 10 - Cladograma Bayesiano utilizando o sequenciamento do gene mitocondiral COI, o número diplóide e a morfologia do edeago de indivíduos de Heikertingerella.

Discussão

Os resultados obtidos neste trabalho mostram diferenças em relação à morfologia do edeago e ao número diploide entre os indivíduos das diferentes localidades estudadas, sendo possível separa-los em três morfotipos. No entanto, todos os indivíduos possuem morfologia externa muito semelhante, apresentando pequenas diferenças na tonalidade de coloração do pronoto e no padrão de manchas presentes nas extremidades posteriores dos élitros. Esse padrão variado de manchas é comum entre indivíduos da mesma população em espécies de Heikertingerella, segundo Blake (1960) e Savini (1999). De acordo com Eberhard (1985) e Garnier et al. (2005) a análise da genitália é de grande valia para diferenciação de espécies próximas. Wolski (2014) encontrou diferenças citogenéticas entre populações de Omophoita communis e, além disso, observou diferenças na morfologia do edeago entre as populações. Além disso, inferiu a possível ocorrência de mais de uma espécie entre as populações estudadas, sugerindo a ocorrência de mimetismo. Mimetismo foi descrito para outras espécies de Alticinae. Del-Claro (2004) descreveu a ocorrência de mimetismo entre Adesmus colligatus (Cerambycidae), que é palatável, e Omophoita octoguttata (Chrysomelidae) impalatável. Para os gêneros Omophoita e 42

Alagoasa, Gomes, Flinte e Macedo (2007) descrevem a existência de sete espécies que compõe um complexo mimético. Segundo Savini (1999), a análise da morfolgia do edeago é fundamental na separação de espécies no gênero Heikertingerella. Assim, podemos inferir que as diferenças aqui observadas indicam a existência de uma barreira reprodutiva pré- zigótica, a nível morfológico entre os morfotipos. Desta maneira, nossos resultados, no que tange ao edeago, apontam para uma possível diversidade não descoberta dentro do que se considera a espécie H. argentinensis podendo essa ser composta de pelo menos outras duas espécies. Os dados citogenéticos obtidos no presente trabalho e aqueles descritos na literatura (VIRKKI, 1970; SMITH e VIRKKI, 1978; VIRKKI e SANTIAGO-BLAY, 1996) sugerem que a evolução cromossômica nas espécies Neotropicais desse gênero provavelmente ocorreu por meio de fusões e/ou fissões. A figura 11 ilustra uma hipótese para explicar a inter-relação filogenética das espécies de Heikertingerella estudadas, baseada no número cromossômico e no tipo de sistema de determinação sexual, indicando quais eventos poderiam ter ocorrido para a formação das fórmulas meióticas e cariótipos encontradas em nosso estudo em comparação com aqueles descritos na literatura, incluindo a formação de um sistema X1X2Y. Até o presente trabalho esse sistema não foi descrito para esse gênero, porém descrito para outras espécies de Alticinae (VIRKKI, 1967, 1968; VIRKKI, 1970; SMITH e VIRKKI, 1978; JOLIVET, PETITPIERRE e HSIAO, 1988; VIRKKI e SANTIAGO-BLAY, 1996).. A diferenciação das espécies de Heikertingerella poderia ter ocorrido a partir do cariótipo ancestral hipotético plesiomórfico de Coleoptera com 2n=20=18+Xyp. Em geral, os cromossomos sexuais envolvidos em sistemas múltiplos de determinação sexual restringem a recombinação entre os antigos cromossomos homólogos no decorrer do processo evolutivo por meio de rearranjos estruturais, particularmente do tipo inversões peri ou paracêntricas, e/ou por meio de heterocromatinização diferencial (SÁEZ, 1963; VERMA, 1988). Desta forma, os dados obtidos com a hibridação in situ reforçam a proposta de origem do sistema X1X2Y. Neste sistema o

X2 surgiu por meio de uma fusão entre seu homólogo e o Y ancestral, dando origem ao sistema de determinação sexual X1X2Y, representado no passo 4 da figura 11, originando o cariótipo presente no morfotipo I. Além disso, a redução no número de cromossomos entre os morfotipos II e III poderia ser resultado de uma fusão entre um par autossômico, representado pelo 43

passo 5 na figura 11. Virrki (1988a) descreveu que o cariótipo de H. krugi originou de uma série de fusões entre todos os cromossomos autossômicos, resultando em um baixo número cromossômico, 2n= 8 + neoXY, representado pelo passo 2 da figura 11. Esse cariótipo poderia ser considerado uma característica apomórfica de H. krugi. Neste contexto, no cariótipo das espécies analisadas no presente estudo e naqueles descritos para H. brevitarsis, Heikertingerella sp.2 e Heikertingerella sp.3 a fusão de um par autossômico e a fusão de autossomos com cromossomos sexuais representaria os passos 5, 6 e 7 da figura 11. Neste caso, essa característica seria derivada e em sinapomorfia entre essas espécies. Coleoptera ocasionalmente apresenta cromossomos supranumerários (Virkki e Santiago-blay, 1993). Embora não seja relatado para Heikertingerella, esses cromossomos já foram observados em Alticinae, e podem variar em relação a sua presença e quantidade nas células (VIRKKI e SANTIAGO-BLAY, 1993; 1996). Em Alagoasa transparente, 1 ou 2 cromossomos supranumerários são encontrados por espermatócito, enquanto que, em Alagoasa oblecta, o número desses cromossomos pode ser de 11 a 17 (VIRKKI e SANTIAGO-BLAY, 1993). A quantidade variável desses cromossomos sugere uma irregularidade no seu padrão de segregação (SMITH e VIRKKI, 1978; VIRKKI e SANTIAGO-BLAY, 1996). A análise bayesiana integrativa mostrou a formação de uma politomia representada por indivíduos com o morfotipo II, um grupo onde o morfotipo III apresenta-se monofilético, e o outro agrupamento apresenta um indivíduo do morfotipo I e II. Com base nesses resultados, podemos sugerir que a espécie H. argentinensis pode ser composta por mais de uma espécie. A observação das sequências de COI apresenta uma coerência quanto as suas mutações que favorecem a formação do grupo formado pelo morfotipo III, porém, apresenta uma variação considerável entre os outros morfotipos. Embora seja muito utilizado e ofereça inúmeras vantagens, o uso do DNA mitocondrial para a identificação de espécies não está livre de ressalvas (RAUPACH et al., 2010). O agrupamento entre um indivíduo do morfotipo I com o morfotipo II pode ser resultado de introgressão gênica, visto que, em espécies muito relacionadas, pode existir hibridação, e, portanto, pode ocorrer a transferência mitocondrial de uma espécie para a outra (TAUTZ et al., 2003; RAUPACH et al., 2010). Embora, esses indivíduos pertençam a regiões diferentes, é possível que ambos os morfotipos I e II sejam passivos de hibridização e por isso apresentam maior similaridade entre suas 44

sequencias, havendo a necessidade de aumentar o número amostral e as regiões de amostragem para confirmar se há a existência de híbridos. Em um estudo realizado por Raupach et al. (2010) não foi possível a discriminação de duas espécies da família Carabidae do complexo Pterostichus nigrita e P. rhaeticus através do DNA barcode. Nesse mesmo trabalho, os autores afirmam que a distinção morfológica pode evoluir mais rapidamente que determinados genes, e sugerem o estudo de espécimes adicionais de diferentes locais para compreender melhor a variação intraespecífica do COI desses besouros. No entanto, não se descarta a possibilidade do indivíduo do morfotipo II agrupado com o morfotipo I ser de outra espécie. Porém a análise morfológica do edeago desse indivíduo não o separa dos demais indivíduos do morfotipo II. Neste sentido, uma solução para resolver esse problema seria uma maior amostragem para uma avaliação mais minuciosa das sequencias e da morfologia da genitália com a possibilidade de análises como a morfometria geométrica que poderiam auxiliar na separação fina da morfologia dos edeagos. Raupach et al. (2010), analisando sequencias COI de Nebria hellwigii (Carabidae), encontraram divergências maiores entre indivíduos dessa espécie do que àquelas observadas entre espécies diferentes. Segundo esses autores, por meio da análise da genitália masculina, a ocorrência de subespécies é discutida para esse táxon. Sota et al. (2001), demonstraram a ocorrência de dois tipos de mitocôndrias dentro de populações locais de Carabus insulicol, utilizando sequencias mitocondriais da subunidade 5 do gene NADH desidrogenase (ND5). Neste sentido, os dados obtidos mostram a possível ocorrência de pelo menos três espécies atualmente agrupadas como H. argentinensis que poderiam ser um complexo de espécies. Uma vez que este trabalho partiu da hipótese de que H. argentinensis seria uma mesma espécie e os nossos dados, baseados no número cariotípico, morfologia do edeago e sequências do gene COI, indicam tratar-se de pelo menos três espécies novas, é necessária uma ampliação da amostragem e de outras análises integrativas para se verificar a real diversidade escondida em H. argentinensis. Entre as questões que podem ser propostas para futuros trabalhos estão: i) quais dos morfotipos de edeagos correspondem ao tipo de H. argentinensis?; ii) os indivíduos dos morfotipos I e II que formam um agrupamento estão relacionados formando uma nova espécie ou são duas espécies distintas?; iii) os indivíduos da base do cladograma apresentam diferenças no gene COI consideráveis, mas morfotipo do 45

edeago similar, seriam eles espécies distintas, isoladas reprodutivamente por outro fator que não a morfologia do edeago? Este trabalho apresenta um estudo inédito e integrador para a espécie H. argentinensis ou o complexo de espécies H. argentinensis, como é nossa proposta. A abordagem integrativa de diferentes marcadores, morfológicos, citogenéticos e moleculares são de grande importância para o reconhecimento de uma diversidade existente, mas que por muitas vezes fica “escondida” dentro de uma espécie. Portanto, novos trabalhos utilizando e ampliando essa abordagem são necessárias para se ter uma idéia real da diversidade que se esconde dentro de H. argentinensis.

p1 s

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

As análises integrativas utilizando marcadores morfológicos, citogenéticos e moleculares demonstram que H. argentinensis na verdade é um complexo de pelo menos outras duas novas espécies. Comparações com o tipo descrito de H. argentinensis faz-se necessário para se identificar, qual dos morfotipos seria de fato H. argentinensis e descrições mais detalhadas dos outros morfotipos devem ser realizados para se compreender o que de fato é o complexo H. argentinensis. O sequenciamento do gene mitocondrial parece ser um bom marcador para alguns dos morfotipos encontrados, principalmente na identificação do morfotipo III. No entanto, é necessário um número maior de indivíduos a ser analisado, uma vez que o morfotipo II foi subdividido em 2 grupos. Também a utilização de novos marcadores, como genes nucleares da família pode auxiliar na compreensão de quantas espécies formam o complexo H. argentinensis. O sítio intersticial evidenciado por FISH pode representar um evento recente na formação do sistema cromossômico de determinação sexual do tipo X1X2Y. Dessa forma, os dados obtidos sugerem a existência de um complexo de espécies dentro do gênero, visto que todas estão associadas à trepadeira Amphilophium crucigerum. Para confirmar o número de espécies existentes se faz necessário uma análise morfológica com mais caracteres, uma análise molecular utilizando um número maior de genes e, além disso, um número maior de indivíduos a serem analisados.

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6 ANEXOS

Anexo 1: Licença permanente para coleta de material zoológico MMA/ IBAMA/ SISBIO: 15117-1.

Anexo 2: Citogenética convencional.

Anexo 2.1 - Metodologia para estudo de cromossomos de obtidas a partir de gônadas descrita por Almeida et al. (2000).

1. Dissecar o animal em solução fisiológica para insetos, retirar a gônada e transferi-la para uma placa de Petri contento solução hipotônica (água de torneira), durante 5 minutos; 56

2. Fixar o órgão em Carnoy I (metanol-ácido acético na proporção 3:1), durante 30 minutos; 3. Macerar o órgão sobre uma placa de metal à temperatura média de 35 a 40ºC.

Anexo 2.2 - Obtenção de metáfases para estudo de cromossomos mitóticos segundo Webb et al. (1978)

As preparações citológicas, para o estudo de cromossomos mitóticos, foram realizadas a partir das gônadas, de acordo com a técnica descrita por WEBB et al. (1978), com algumas modificações, descritas a seguir:

1. Dissecar os ovos em solução fisiológica para insetos, retirar o órgão e transferi-lo para um frasco, contendo colchicina 0,05% (em solução fisiológica para insetos), durante 2 horas; 2. Acrescentar um volume de água de torneira igual ao de colchicina, por 15 minutos; 3. adicionar 10 gotas de fixador Carnoy  (metanol - ácido acético, na proporção 3:1), durante 5 minutos; 4. Transferir os órgãos para uma placa de Petri, contendo fixador Carnoy  durante 30 minutos, no mínimo; 5. Macerar o órgão, juntamente com uma gota de ácido acético 45%, sobre uma lâmina; 6. Secar a lâmina em uma placa de metal à temperatura de 35 a 40ºC.

2.3 - Coloração Convencional Segundo Giemsa

Para análise das preparações citogenéticas as lâminas foram coradas, à temperatura ambiente, durante 10 minutos, com uma solução contendo 47 ml de água destilada, 1,5 ml de solução comercial de Giemsa (Merck) e 1,5 ml de tampão fosfato pH 6.8; então foram lavadas em água destilada e secas ao ar.

Anexo 3 - Hibridação in situ fluorescente (FISH) (Pinkel, Straume e Gray, 1986)

Preparação das Lâminas e Hibridação

1. Lavar as lâminas em tampão PBS 1x durante 5 min. em temperatura ambiente; 2. Desidratar as lâminas em série alcoólica 70, 85 e 100%, 5 min cada; 3. Incubar as lâminas em 100 l de RNAse (O,4% RNAse/2xSSC) a 37 C por 1h em câmara úmida com água milli-Q; 4. Lavar 3 x por 5 min em 2xSSC; 5. Lavar durante 5 min em PBS 1x. 6. Incubar as lâminas por 10 min em solução de pepsina 0,005% (em 10mM HCl) a 37 C; 7. Lavar em PBS 1x durante 5 min (shaker) a temperatura ambiente; 8. Fixar em paraformaldeido 4% durante 10 min a temperatura ambiente; 9. Lavar em PBS 1x por 5 min; 10. Desidratar as lâminas em série alcoólicas (70,85, 100 %) por 5 min cada; voltar cada álcool em seu frasco. 11. Simultaneamente a desidratação em série alcoólica desnaturar a solução de hibridação a 100ºC por um período de 10 min e passá-la imediatamente ao gelo; 12. Desnaturar o DNA cromossômico com formamida 70% em 2xSSC a 70ºC por 4 min; 13. Desidratar o material em série alcoólica 70, 85 e 100% durante 5 min cada. 14. Preparar a câmara úmida a 37ºC ; 15. Montar cada lâmina com 40 l de solução de hibridação, cobrir com lamínula e deixar overnight a 37ºC;

Lavagens

16. Lavar 4 vezes em formamida 15%/0,2xSSC pH 7.0 a 42 ºC durante 5 min cada; 17. Lavar durante 5 min em solução de Tween 0,5%/4xSSC, ambiente;

Detecção e amplificação do Sinal

18. Incubar as lâminas em tampão 5% NFDM/4xSSC por 15 minutos; 19. Lavar 2 x 5min com Tween 0,5%/4xSSC, ambiente; 20. Incubar as lâminas com 90 l de FITC (0,1 l FITC/100 l NFDM) durante 30 min em câmara úmida e escura, a temperatura ambiente; 58

21. Lavar 3 x 5min com Tween 0,5%/4xSSC, ambiente; 22. Incubar com 90 l de anti-avidina (1 l anti-avidina/100 l de NFDM) durante 30 min em câmara úmida e escura, a temperatura ambiente; 23. Lavar 3 x 5min com Tween 0,5%/4xSSC, ambiente; 24. Incubar as lâminas com 90 l de FITC (0,1 l FITC/100 l NFDM) durante 30 min em câmara úmida e escura, a temperatura ambiente. 25. Lavar 3 x 5min com Tween 0,5%/4xSSC, ambiente; 26. Incubar com 90 l de anti-avidina (1 l anti-avidina/100 l de NFDM) durante 30 min em câmara úmida e escura, a temperatura ambiente; 27. Lavar 3 x 5min com Tween 0,5%/4xSSC, ambiente ; 28. Incubar as lâminas com 90 l de FITC (0,1 l FITC/100 l NFDM) durante 30 min em câmara úmida e escura, a temperatura ambiente; 29. Lavar 3 x 5min com Tween 0,5%/4xSSC, ambiente; 30. Desidratar em álcool 70 (descartar), 85 e 100%, 5 min. cada;

Montagem da Lâmina

31. Misturar 200 µl de antifading mais1 µl de DAPI - 4’-6 diamidino - 2 - phenilindole (50 µg/ml). Colocar 25 µl da solução e cobrir com lamínula. Guardar no escuro

Anexo 4 - Extração de DNA segundo MURRAY e THOMPSON, (1980), com modificações.

Tampão de extração sem CTAB. Para 15 mL de solução tampão:

5mL de NaCl 5M ([ ] final 1M)

5mL EDTA 0,5M ([ ] final 0,1M)

5mL TRIS-HCl 1M pH 8.0 ([ ] final 0,1M) 59

Guardar o tampão de extração em temperatura ambiente.

1. Em um tubo de 1,5mL colocar o animal inteiro em solução de extração contendo: 180μL de tampão sem CTAB, 120μL de CTAB 5%, 15μL de proteinase K (10mg/mL) e 5μL de DTT (1M) ou 5μL de B mercaptoetanol.

2. Colocar a 50ºC por 10 horas (overnight) ou até que o tecido esteja totalmente digerido;

3. Adicionar 10μL de RNAse (10mg/mL);

4. Colocar a 37ºC, em banho-Maria, por 2 horas;

5. Adicionar 600μL de clorofórmio;

6. Inverter os tubos suavemente durante 5 minutos;

7. Centrifugar a 8.000 rpm por 5 min a 4ºC;

8. Retirar sobrenadante e transferir para um novo tubo;

9. Adicionar 600 μL de etanol 100% gelado e deixar a –20ºC por 2 horas;

10. Centrifugar a 14.000 rpm por 15 min a 4ºC.

11. Descartar o sobrenadante;

12. Lavar o pellet com 200μL de etanol 70% gelado;

13. Centrifugar por 3 min a 10.000 rpm a 4 ºC ;

14. Descartar o sobrenadante;

15. Lavar o pellet com 200 μL de etanol 100% gelado;

16. Centrifugar por 3 min a 10.000 rpm a 4 ºC;

17. Descartar o sobrenadante;

18. Deixar secar na estufa a 37ºC;

19. Ressuspender em 40μL de água mili-Q ou TE. 60

Anexo 5 – Matriz com dados morfológicos, citogenéticos e moleculares, utilizada para a análise Bayesiana.

Indivíduos Sequência 2n Edeago 2491 (morfotipo I) COI 0 0 3864 (morfotipo II) COI 1 2 3869 (morfotipo II) COI 1 2 3877 (morfotipo II) COI 1 ? 4077 (morfotipo III) COI 1 1 4089 (morfotipo III) COI 1 1

4099 (morfotipo III) COI 1 1

Legenda – Morfologia do edeago: morfotipo I representa o estado 0, morfotipo II representa o estado 1, morfotipo III representa o estado 2. A fêmea foi representada como dado não aplicado: ?. Número diplóide = 2n. 2n = 19 representa o estado 0, 2n = 17, estado 1. Sequência = Primeira região do gene mitocondrial Citocromo Oxidase 1.