UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS FACULTAD DE AGRONOMÍA CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
TESIS DE GRADO
ESTUDIO DE DIVERSIDAD GENÉTICA EN ACCESIONES BOLIVIANAS DE CHIRIMOYA ( Annona cherimola Miller) MEDIANTE MARCADORES MOLECULARES MICROSATÉLITES (SSR)
FIDEL HERNAN CORTEZ ALVAREZ
La Paz – Bolivia 2010
UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS FACULTAD DE AGRONOMÍA CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
ESTUDIO DE DIVERSIDAD GENÉTICA EN ACCESIONES BOLIVIANAS DE CHIRIMOYA ( Annona cherimola Miller) MEDIANTE MARCADORES MOLECULARES MICROSATÉLITES (SSR)
Tesis de Grado presentado como requisito parcial para optar el Título de Ingeniero Agrónomo
FIDEL HERNAN CORTEZ ALVAREZ
Tutor: Ing. Ph. D. Jorge Antonio Rojas Beltrán ……………………………
Asesor: Ing. Ph. D. Alejandro Bonifacio Flores ……………………………
Tribunal Examinador: Ing. Ph. D. David Cruz Choque ……………………………
Lic. Ph. D. Alberto Figueroa Soliz ……………………………
Ing. M. Sc. Félix Mamani Reynoso ……………………………
Aprobada
Presidente Tribunal Examinador: …………………………… Ing. M. Sc. Ramiro Augusto Mendoza Morales VICEDECANO - FACULTAD DE AGRONOMÍA 2010
ÍNDICE GENERAL Índice de contenido...... i Índice de cuadros...... iv Índice de figuras...... v Dedicatoria...... vii Agradecimientos ...... viii Resumen ...... ix ÍNDICE DE CONTENIDO CAPÍTULO I 1. INTRODUCCIÓN ...... 1 1.1. Objetivos...... 2 1.1.1. Objetivo General ...... 2 1.1.2. Objetivos Específicos...... 2 CAPÍTULO II 2. REVISION BIBLIOGRÁFICA...... 3 2.1. Antecedentes del cultivo, origen y distribución ...... 3 2.2. Usos e Importancia ...... 4 2.3. Descripción botánica y ubicación taxonómica...... 5 2.3.1. Descripción morfológica ...... 5 2.3.2. Ubicación taxonómica...... 7 2.4. Características ecológicas y agronómicas...... 8 2.5. Biodiversidad y Agrobiodiversidad ...... 9 2.5.1. Diversidad genética ...... 9 2.5.2. Recursos fitogenéticos ...... 10 2.5.3. Colección núcleo ...... 12 2.6. Herramientas para evaluar la diversidad genética ...... 13 2.7. Marcadores moleculares...... 13 2.7.1. Aplicaciones y ventajas de los marcadores moleculares...... 14 2.7.2. Clasificación de los marcadores moleculares...... 15 2.7.3. Selección de un marcador molecular adecuado...... 16 2.7.4. Microsatélites...... 17 2.7.4.1. Aplicaciones, ventajas y limitaciones de los microsatélites ...... 18 2.7.4.2. Huellas genéticas...... 18 2.7.5. Marcadores moleculares en chirimoya ...... 19
i
2.8. Técnicas para el análisis con marcadores moleculares...... 20 2.8.1. Colección y preservación de tejido vegetal ...... 20 2.8.2. Molido de la muestra...... 20 2.8.3. Extracción de ADN...... 20 2.8.4. Electroforesis de ADN en geles de agarosa...... 21 2.8.5. Amplificación de secuencias microsatélites ...... 22 2.8.6. Separación de productos amplificados...... 22 2.9. Análisis estadístico ...... 23 2.9.1. Índices de variabilidad genética...... 23 2.9.2. Análisis de estructura poblacional ...... 24 2.9.2.1. Coeficientes de similitud...... 24 2.9.2.2. Análisis de conglomerados ...... 25 2.9.2.3. Análisis de coordenadas principales ...... 25 2.10. Herramientas para el análisis geoespacial de datos...... 26 CAPÍTULO III 3. LOCALIZACIÓN ...... 27 3.1. Ubicación Geográfica...... 27 CAPÍTULO IV 4. MATERIALES Y MÉTODOS...... 27 4.1. Materiales ...... 27 4.1.1. Material Vegetal...... 27 4.1.2. Material de Colecta...... 27 4.1.3. Material de Laboratorio...... 27 4.1.4. Material de Gabinete ...... 28 4.2. Métodos ...... 28 4.2.1. Número de muestras analizadas ...... 29 4.2.2. Cobertura del estudio ...... 30 4.2.3. Esquema general de trabajo...... 31 4.2.4. Colecta del material vegetal ...... 32 4.2.5. Molido y conservación de muestras...... 32 4.2.6. Extracción de ADN ...... 32 4.2.7. Cuantificación de ADN...... 34 4.2.8. Amplificación y separación de microsatélites ...... 34 4.2.8.1. Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)...... 34
ii
4.2.8.2. Electroforesis capilar...... 35 4.2.9. Procesamiento y análisis de datos ...... 36 4.2.9.1. Índices de variabilidad genética ...... 36 4.2.9.2. Cálculos para el análisis de estructura poblacional...... 37 CAPÍTULO V 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...... 38 5.1. Colecta de material vegetal...... 38 5.2. Molido y conservación de muestras...... 38 5.3. Extracción de ADN...... 39 5.4. Cuantificación de ADN...... 40 5.5. Número y frecuencias de alelos encontrados ...... 40 5.5.1. Número promedio de alelos por locus microsatélite...... 42 5.5.2. Heterocigosidad (He) e Índice de contenido polimórfico (PIC)...... 43 5.6. Análisis de conglomerados ...... 44 5.6.1. Análisis de conglomerados de las chirimoyas bolivianas...... 47 5.6.2. Análisis por grupos de individuos: plantaciones antiguas y recientes .... 49 5.7. Análisis de coordenadas principales...... 56 5.7.1. Análisis por grupos de individuos: plantaciones antiguas y recientes .... 57 5.7.2. Diversidad morfológica de frutos de chirimoya ...... 60 5.8. Análisis de distribución geográfica...... 61 5.8.1. Abundancia de accesiones colectadas por municipio ...... 62 5.8.2. Diversidad alélica para cada microsatélite ...... 63 5.9. Contribución a la formación de una colección núcleo ...... 65 CAPÍTULO VI 6. CONCLUSIONES ...... 67 CAPÍTULO VII 7. RECOMENDACIONES ...... 68 CAPÍTULO VIII 8. LITERATURA CITADA...... 69 ANEXOS ...... 78
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ÍNDICE DE CUADROS
1. Comparación de marcadores moleculares y las isoenzimas ...... 16 2. Número de accesiones colectadas, georeferenciadas y microsatélites ...... 29 3. Accesiones adicionales: especie, cultivar (cv.), procedencia y cantidad ...... 30 4. Total de la colección boliviana de chirimoya por departamentos ...... 30 5. Alelos encontrados para el microsatélite LMCH16 en 38 individuos ...... 42 6. Coeficiente de Heterocigosidad (He) y PIC para cada microsatélite ...... 43 7. Vista parcial de la matriz de similitud entre accesiones bolivianas ...... 44 C1 . Lista de iniciadores de chirimoya y temperatura de hibridación ...... 84
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ÍNDICE DE FIGURAS
1. Distribución de Annona cherimola en Sudamérica...... 3 2. Distribución mundial de Annona cherimola ...... 4 3. Flor en estado hembra. Izquierda: vista con pétalos. Derecha: con los pétalos arrancados. La corona blanca por debajo de la pirámide estigmática está constituida por los estambres aún cerrados...... 6 4. Expresión de la dicogamia en la flor de chirimoya. Flor en fase femenina a la izquierda y flor en fase masculina a la derecha (el tercer pétalo externo ha sido eliminado) ...... 6 5. Tipos de fruto por la forma botánica...... 7 6. Esquema de una región microsatélite. Ejemplo de un di-nucleótido A-C(8)...... 17 7. Diagrama general que muestra la secuencia del trabajo realizado...... 31 8. Hojas recolectadas, para almacenarlas en bolsas de polietileno a -20 grados centígrados ...... 38 9. Molido con nitrógeno líquido y tubo cargado con 100 miligramos de muestra molida...... 39 10 . Izquierda: Muestra de chirimoya luego de añadir cloroformo. Derecha: Precipitado del material genético luego de añadir isopropanol ...... 39 11 . Cuantificación de ADN total en geles de agarosa al 1 %. M: Marcador de peso molecular de 10.000 pb. Izquierda: Las bandas corresponden a accesiones de chirimoya. Derecha: Gel de agarosa con calidad y cantidad de ADN diferente .. 40 12 . Vista parcial del dendograma obtenido para las 419 accesiones,...... 45 13. Vista total del dendograma con las 419 accesiones analizadas...... 46 14. Vista del dendograma de 407 accesiones de chirimoya boliviana ...... 47 15. Vista parcial del dendograma de 407 accesiones de chirimoya boliviana...... 48 16 . Vista del dendograma obtenido para las accesiones del grupo A...... 50 17. Vista parcial del dendograma para accesiones del grupo A. Se observa un posible duplicado entre las accesiones 142A y 143A...... 51 18. Vista parcial del dendograma del grupo A mostrando su identificación por provincias: Independencia, Mizque, Aiquile, Saipina y Comarapa ...... 52 19. Vista parcial del dendograma para accesiones del grupo B...... 53
v
20 . Dendograma correspondiente a las accesiones del grupo C (plantaciones recientes) ...... 54 21 . Análisis de coordenadas principales para las 419 accesiones...... 56 22 . Análisis de coordenadas principales de plantaciones antiguas (grupo A)...... 57 23 . Análisis de coordenadas principales para plantaciones antiguas (grupo B)...... 58 24. Análisis de coordenadas principales de accesiones del grupo C mostrando su origen geográfico...... 59 25 . Análisis de coordenadas principales para la forma botánica del fruto...... 60 26 . Distribución de los puntos de colecta de chirimoya...... 61 27 . Abundancia de accesiones colectadas expresada en celdas. El color rojo indica mayor abundancia y el verde oscuro menor abundancia...... 62 28 . Diversidad del microsatélite LMCH6 evaluada en la colección boliviana...... 63 29 . Diversidad del microsatélite LMCH1 evaluada en la colección boliviana ...... 64 D1 . Ejemplo de patrones obtenidos por electroforesis capilar ...... 85 E1 . Ejemplo de matriz binaria visualizada con el programa NTSYSpc V. 2.10 ...... 86 F1 . Dendograma de las 419 accesiones evaluadas con los 20 microsatélites...... 87 G1 . Resultado del análisis de coordenadas principales para las 419 accesiones, identificadas por sus códigos respectivos ...... 94 H1 . Distribución potencial actual y futura de chirimoya ...... 95
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DEDICATORIA
A mi mamita amada, Justina Alvarez Flores Vda. de Cortez, ternura infinita y fortaleza paciente, junto a mi papá amado, Lucio Cortez Juchani, modelo de fe y perseverancia.
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AGRADECIMIENTOS A todas las familias de productores de chirimoya por ser custodios permanentes de la biodiversidad en su conjunto; a nuestros ancestros por dejarnos un legado megadiverso y una cultura en armonía con la naturaleza. Todo es gracias al Creador.
Al Proyecto CHERLA que representa a todas las instituciones que juntamente han trabajado para la caracterización, conservación y uso de la diversidad de germoplasma de chirimoya. Principalmente a los hermanos del Ecuador y Perú.
A los financiadores del Proyecto CHERLA, encabezados por la Unión Europea. El apoyo de la E.E. La Mayora - CSIC, España, representada por Iñaqui Hormaza, Ph.D.
A la Fundación PROINPA y todo su personal, por todo el apoyo, recursos, y ambiente humano acogedor.
A los representantes de la iniciativa CHERLA por parte de la Fundación PROINPA: Willman García, Ing. Agr. M.Sc; Bernardo Guzmán, Téc. Sup. Agr., y quienes los acompañan, por su guía, apoyo e incentivo.
Alejandro Bonifacio Flores, Ing. Agr. Ph.D., por su asesoramiento, paciencia, amistad. Jorge A. Rojas Beltrán, Ing. Agr. Ph.D., por ser un tutor más allá del ámbito profesional, y amigo paciente.
David Cruz Choque Ph.D., Alberto Figueroa Soliz Ph.D., Félix Mamani Reynoso Ing. M. Sc. por sus consejos, sugerencias y apoyo.
A todos mis queridos compañeros del Laboratorio de Biología Molecular y Bioinformática de la Fundación PROINPA, por su apoyo, consejos y buen ánimo.
A mi Facultad de Agronomía, con absolutamente todos mis docentes, autoridades y compañeros, que crean un ambiente de inspiración, permitiendo impulsar y encaminar mi formación.
A mi familia entera, por su compañía continua, amor entrañable, e inspiración inacabable.
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RESUMEN
Se realizó un análisis de diversidad genética de chirimoya ( Annona cherimola Miller) mediante 20 microsatélites en una colección de 407 individuos de cinco departamentos de Bolivia. Adicionalmente se analizaron 12 individuos de diferentes orígenes. Hojas jóvenes se molieron con nitrógeno líquido, cargando 100 miligramos a tubos de 1.5 mililitros. El protocolo de extracción de ADN incluyó CTAB (Bromuro de hexadeciltrimetilamonio). La cantidad y calidad del ADN fue valorada mediante electroforesis en gel de agarosa. La amplificación de segmentos por PCR permitió confirmar la calidad del ADN extraído. La separación de segmentos amplificados se hizo mediante electroforesis capilar. Se asignó a cada individuo una huella genética única basada en el patrón de alelos encontrados. La heterocigosidad promedio en la colección fue de 0.529, índice influenciado por la existencia de alelos raros. Se utilizó el coeficiente de similitud de Jaccard, el método para análisis de conglomerados UPGMA, y el método de ordenación de coordenadas principales mediante el programa NTSYSpc. El análisis permitió conocer que en la estructura genética de esta población, tanto en plantaciones antiguas como recientes, existe agrupamientos por su origen geográfico, como también por un carácter discriminante como es la forma del fruto. Mediante el análisis geoespacial utilizando el programa DIVA-GIS se confirmó que cada zona geográfica tiene una diversidad genética particular de chirimoyas y cada microsatélite tiene una distribución alélica propia, que además está en peligro de perderse. De esa manera se contribuyó a la formación de una colección núcleo de chirimoya para su conservación y promoción.
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CAPÍTULO I 1. INTRODUCCIÓN La chirimoya ( Annona cherimola Miller) es la especie más apreciada del género Annona (GONZALES et al ., 2007). Su fruto tiene alto valor alimenticio, económico y social por su exquisito sabor y contenido en nutrientes (MORALES et al ., 2004). Adicionalmente los compuestos fitoquímicos de sus hojas, tallos, flores y semillas tienen una destacada aplicación en la fitomedicina y en la industria de productos cosméticos (BRIDG, 2000). Además existe una enorme demanda insatisfecha en el mundo por la fruta (OWENS, 2003; VAN DAMME y SCHELDEMAN, 1999).
Annona cherimola es una especie originaria de las regiones subtropicales de los valles interandinos desde Bolivia, Perú y Ecuador hasta Colombia. (GONZALES et al ., 2007; BRIDG, 2000). Posteriormente se ha distribuido hacia Centroamérica y México naturalizándose en las tierras altas (JANICK y PAULL, 2006). Sin embargo existe una controversia acerca del centro de origen de esta especie, aunque se reconoce que el centro primario de diversidad estaría en los valles andinos (PINTO, 2005a).
Hay una diversidad grande de chirimoya en Bolivia en peligro de desaparecer y que no ha sido estudiada ni aprovechada. Por ejemplo, estudios agromorfológicos realizados en las provincias Mizque y Caballero de los departamentos de Cochabamba y Santa Cruz respectivamente, concluyen que en estos lugares existe una importante variabilidad fenotípica. También enfatizan la necesidad de realizar mayores estudios genéticos y medidas de conservación de esta especie (ANDRADE, 1991; GUZMÁN, 1995). Además este cultivo sigue considerándose un frutal subutilizado porque recibe un manejo muy limitado (CHERLA, 2009).
Las herramientas de la biología molecular sirven en nuestro país en la evaluación de la diversidad genética y la conservación de germoplasma. Por ejemplo, se ha utilizado marcadores microsatélites para evaluar la diversidad genética en las accesiones del Banco Nacional de Granos Altoandinos, y del Banco Nacional de Germoplasma de Tubérculos y Raíces Andinas (TURUMAYA, 2007; VARGAS, 2003).
Estudio de diversidad genética en accesiones bolivianas de chirimoya ( Annona cherimola Miller) mediante marcadores moleculares microsatélites (SSR) 1
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Los microsatélites son marcadores moleculares importantes para el análisis genético, para conocer con precisión la diversidad, las relaciones genéticas y complementar los procesos de selección y mejora dentro de esta especie. Estos marcadores son útiles debido a su capacidad discriminativa, como por ejemplo en la identificación de individuos homocigotos, heterocigotos y la observación de diferencias genéticas entre accesiones muy emparentadas. En los últimos años se han desarrollado marcadores microsatélites específicos de chirimoya, para fomentar la promoción y conservación de la diversidad de esta especie (ESCRIBANO et al ., 2003).
En consecuencia, se ha propuesto el presente estudio para conocer y promover la utilización de la diversidad genética de una colección boliviana de chirimoya ( A. cherimola Mill.) utilizando marcadores moleculares microsatélites, en base a los siguientes objetivos:
1.1. Objetivos
1.1.1. Objetivo General
- Estudiar la diversidad genética de chirimoyas bolivianas utilizando marcadores moleculares tipo microsatélite.
1.1.2. Objetivos Específicos
- Asignar huellas genéticas a cada uno de los individuos analizados.
- Determinar la estructura genética de la población colectada.
- Contribuir a la construcción de una colección núcleo.
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CAPÍTULO II 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1. Antecedentes del cultivo, origen y distribución Los indígenas cultivaron cuidadosamente la chirimoya en la antigüedad, preservándola en las zonas subtropicales (BRIDG, 2000). Actualmente esta especie está presente en huertos tradicionales o sitios naturales en los valles interandinos subtropicales de Bolivia, Perú y Ecuador. OWENS (2000) menciona que poblaciones silvestres de chirimoya crecen en valles del sur de Bolivia. Se considera principalmente a los pequeños productores ser los custodios de la agrobiodiversidad por mantener el patrimonio genético de la chirimoya (BIOVERSITY INTERNATIONAL Y CHERLA, 2008; GONZALES et al ., 2007).
La distribución actual de chirimoya en Sudamérica muestra a Bolivia como un centro de diversidad de esta especie. En la figura 1 se ven sitios de colecta en Sudamérica y la distribución probable según sus ambientes favorables (CASTANEDA et al ., 2009).
Leyenda
Leyenda Modelo Maxent Annona cherimola Probabilidad (0 -1) Límites de países Alta : 0.94
Baja : 0. 00
DISTRIBUCIÓN ACTUAL DE CHIRIMOYA EN SUDAMÉRICA DISTRIBUCIÓN POTENCIAL DE CHIRIMOYA EN SUDAMÉRICA Figura 1. Distribución de Annona cherimola en Sudamérica. Fuente: CASTANEDA et al . (2009).
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En la actualidad el cultivo de chirimoya ha obtenido mayor importancia distribuyéndose en diferentes zonas del mundo con características ambientales semejantes a las de su origen, lo que se observa de manera general en la figura 2.
Figura 2. Distribución mundial de Annona cherimola . Fuente: BRIDG (2000).
2.2. Usos e Importancia El fruto de la chirimoya es considerado entre los más apreciados por sus cualidades nutritivas y sabor. Destaca su contenido de potasio, calcio, fósforo, hierro, vitaminas A, B1, B2, B3, C, niacina y proteína. Por su bajo aporte de sodio es recomendable para personas que sufren de hipertensión arterial, y por su contenido de glucosa y fructosa es una ayuda para controlar la glucemia en diabéticos (BIOVERSITY INTERNATIONAL y CHERLA, 2008; GUIRADO et al ., 2004; ILLESCAS et al ., 2007). Es catalogada por expertos como una de las tres mejores frutas del mundo y la primera de las frutas de las zonas tropicales (ILLESCAS et al ., 2007).
Por otra parte, las hojas, raíces, corteza, frutos y semillas contienen numerosas sustancias químicas bioactivas, con alguna actividad ya sea insecticida, antitumoral, antiparasitaria, antibacteriana o inmuno-supresora (RUPPRECHT et al ., 1990). Por ejemplo se demostró el efecto tóxico de un extracto de semilla sobre larvas y pupas
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del mosquito de la malaria Anopheles sp. (BOBADILLA et al ., 2003). También se comprobaron las propiedades anticonvulsivas de palmitona que fue aislada a partir de extractos de hojas (GONZALES, 2004).
Esta especie es promisoria a nivel mundial, no sólo en el mercado de las frutas, sino también en la industria de alimentos procesados (BRIDG, 2000). La chirimoya ( A. cherimola Mill.) se cultiva de manera comercial en el mundo desde hace más de un siglo, donde los mayores productores son: España, Perú, Bolivia, Chile, Ecuador, California (EEUU), Colombia, Argentina e Islas Madeira de Portugal (GUIRADO et al ., 2004). Sin embargo la demanda mundial supera ampliamente a la oferta, por ejemplo en los Estados Unidos, donde la mayor parte de la fruta no sale de California, que es el único estado productor (VAN DAMME y SCHELDEMAN, 1999).
2.3. Descripción botánica y ubicación taxonómica 2.3.1. Descripción morfológica La chirimoya es un árbol de un tamaño hasta unos ocho metros de altura, de copa redondeada y ramas que nacen en forma irregular. Las hojas son semicaducas, de ocho a veinticinco centímetros de largo, enteras y pubescentes, con pecíolo corto. El largo y ancho de la lámina foliar es variable, así como la forma como ser: ovada, elíptica, obovada, lanceolada (BIOVERSITY INTERNATIONAL y CHERLA, 2008; DE LA ROCHA, 1966: GUIRADO et al ., 2004). En la caracterización morfológica se consideran informativas las variadas formas de hoja, flor y fruto (CHERLA, 2007).
Las flores son axilares y perfectas; la corola está formada por seis pétalos: tres internos que están atrofiados y tres pétalos carnosos grandes de color verde amarillento; el cáliz formado por tres sépalos pequeños y unidos (DE LA ROCHA, 1966; GUIRADO et al ., 2004). La flor de chirimoya es hermafrodita, con un gran número de pistilos unicarpelares distribuidos helicoidalmente en una pirámide de tres caras. Rodeando la base de la misma pirámide se sitúan numerosos estambres por flor (GONZALES et al ., 2007; GUIRADO et al ., 2002; GUIRADO et al ., 2004).
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En las flores ocurre la dicogamia protogínica, lo que impide la autopolinización en una misma flor: al abrirse la flor primero maduran los órganos femeninos, llamada fase femenina o hembra y los estambres son blancos en este estado (figuras 3 y 4). Cuando la flor pasa al estado macho, los pistilos ya no son receptivos y los estambres se separan soltando el polen, presentando un color crema claro (figura 4) (GUIRADO et al ., 2002; GUIRADO et al ., 2004; GONZALES et al ., 2007).
Figura 33. Flor en estado hembra. Izquierda: vista con pétalos. Derecha: con los pétalos arrancados. La corona blanca por debajo de la pirámide estigmática está constituida por los estambres aún cerrados. Fuente: Guirado et al . (2004).
Figura 4. Expresión de la dicogamia en la flor de chirimoya. Flor en fase femenina a la izquierda y flor en fase masculina a la derecha (el tercer pétalo externo ha sido eliminado). Fuente: GONZALES et al . (2007).
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Según GUIRADO et al . (2004) el fruto es un sincarpio procedente de una sola flor, de forma y tamaño muy variable, según el número de óvulos fecundados, dando lugar a la distinción de diferentes tipos de fruto. Una vez efectuada la fecundación los carpelos se sueldan periféricamente entre sí por medio de un tejido conectivo.
Por el tipo de exocarpo se observan cinco tipos de fruto: 1. Laevis (lisa), 2. Impresa (depresiones suaves), 3. Umbonata (protuberancias pequeñas), 4. Tuberculata (protuberancias medianas), 5. Mamillata (protuberancias largas) (BIOVERSITY INTERNATIONAL Y CHERLA, 2008). Estas formas botánicas del fruto se reconocen como altamente discriminatorios en la caracterización morfológica (CHERLA, 2007). Un ejemplo de estas formas se observa en la figura 5.
LISA IMPRE SA UMBONATA TUBERCULATA MAMMILLATA
Figura 5. Tipos de fruto por la forma botánica. Fuente: GUIRADO et al . (2004).
2.3.2. Ubicación taxonómica Reino Plantae (Vegetal) División Magnoliophyta ( Angiospermae ) Clase Magnoliopsida (Dicotiledóneas) Subclase Magnoliidae Orden Magnoliales Familia Annonaceae Género Annona Nombre científico Annona cherimola Miller Nombre común Chirimoya (CASTRO, 2007)
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Parientes de chirimoya. A continuación se nombran dos de los muchos parientes de chirimoya, los cuales son mencionados en el presente trabajo (CAMPBELL y PHILLIPS, 1994; DE LA BARRA, 2008) Un pariente silvestre: Annona nutans Nombre común: Aratiku (guaraní) Un híbrido: A. cherimola X A. squamosa Nombre común: Atemoya
Otras denominaciones que tiene la chirimoya según PINTO (2005b) son: Nombres botánicos sinónimos de la chirimoya: A. tripetala Aiton A. pubescens Salisb.
Otros nombres de chirimoya utilizados al difundirse en diversos países: Anón (Guatemala), Cherimoya, catuche, momora (Español), Cherimoya, cherimoyer, annona, custard apple (Inglés), Honumanaphala (Canadá), Llakshamanphal (India), Noina ostrelia (Tailandia), Chérimolier (Francés), Cherimólia, cabeça de negro (Portugués), Cerimolia (Italiano), Chirimoyabaum, flachsbaum (Alemán) (PINTO, 2005b)
2.4. Características ecológicas y agronómicas La chirimoya es la única especie del género Annona que se desarrolla en climas subtropicales (GUIRADO et al ., 2004; MORALES et al ., 2004). Bajo condiciones naturales la chirimoya se desarrolla en zonas de tierras altas de los Andes entre 1200 a 2500 m de altitud. No tolera las heladas, requiere una temperatura promedio entre 18 a 22 °C, de 14 a 23 ºC en verano y de 5 a 18 ºC en invierno; con vientos moderados, humedad relativa ambiental entre 60 a 80 por ciento. Crece en suelos desde pesados a arenosos, con un contenido de materia orgánica entre 1.7 y 2.7 y pH entre 6.5 y 8.5 (BRIDG, 2000; DE LA ROCHA, 1966; GUIRADO et al ., 2004).
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2.5. Biodiversidad y Agrobiodiversidad “Por diversidad biológica se entiende la diversidad dentro de cada especie, entre las especies y de los ecosistemas. Comprende la variabilidad de organismos vivos de cualquier fuente, incluidos los ecosistemas terrestres y marinos, otros ecosistemas acuáticos y los complejos ecológicos de los que forman parte” (CONVENIO SOBRE LA DIVERSIDAD BIOLÓGICA, 1992).
Según RUIZ (2009) la biodiversidad como concepto incluye ecosistemas donde no ha intervenido el hombre, sin embargo, señala que un componente crítico de la biodiversidad y que es menos apreciado, es la biodiversidad domesticada o cultivada. Se incluye a este concepto el factor humano y cultural que hay detrás del proceso de domesticación de plantas y animales. Esto último es lo que se denomina la “agrobiodiversidad”, para distinguirla de una visión un poco más clásica que se tiene de una biodiversidad y sus componentes silvestres.
2.5.1. Diversidad genética “Se llama diversidad genética a toda la variabilidad hereditaria o variaciones del genoma que existe en una especie, de los individuos dentro de la especie o entre especies diferentes. Corresponde a toda la diversidad de alelos dentro de genes y genes dentro de una población o especies”. (DE VICENTE y FULTON, 2004; GOLD et al ., 2004; LUQUE y HERRÁEZ, 2002). “La diversidad genética ocurre al nivel del gen (nivel molecular), de un individuo, de una población, de una especie y de un ecosistema” (FAO, 1999).
LUQUE y HERRÁEZ (2002) hacen una relación entre diversidad y polimorfismo: “La diversidad o variabilidad genética se debe a variaciones en la secuencia del genoma, entonces en un sentido amplio el concepto de diversidad se hace sinónimo de polimorfismo. Polimorfismo literalmente significa “muchas formas”, y concretamente se refiere a polimorfismo genético, cromosómico, de secuencia o de la molécula de ADN. Ocurre en regiones codificantes del genoma (polimorfismo génico) como en regiones no codificantes (polimorfismo genético en general). En ambos casos
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consiste en la variación desde un solo par de bases del ADN, o con menos frecuencia de miles de pares de bases (macromutación)”.
DE VICENTE y FULTON (2004) señalan otras fuentes de variación genética además de la que se produce continuamente en los individuos a causa de las mutaciones cromosómicas y génicas, las cuales se transmiten en los organismos de reproducción sexual mediante la recombinación. La variación genética recibe también influencia por la selección. Las consecuencias de estos fenómenos son los cambios en las frecuencias genotípicas y alélicas, que son los responsables de la evolución de las poblaciones. El fitomejoramiento y otros procesos de selección artificial pueden originar cambios similares en la variación genética.
En cuanto a A. cherimola se conoce que existen numerosos cultivares de chirimoya, y cada valle tiene un tipo propio del lugar en las zonas de origen de este cultivo (PINTO, 2005b). ANDRADE (1991) y GUZMAN (1995) concluyen que dentro de los sitios geográficos estudiados en Bolivia, existe alta variabilidad en cuanto a forma botánica del fruto, así como en la respuesta a factores bióticos y abióticos, y que ciertos cultivares mantienen estabilidad en su respuesta a tales factores.
2.5.2. Recursos fitogenéticos Se llama recursos fitogenéticos a todo material genético de valor o utilidad real o potencial para la humanidad (CONVENIO SOBRE LA DIVERSIDAD BIOLÓGICA, 1992; ZAID et al ., 2004). Incluye el material para la propagación reproductiva o vegetativa de cultivares, variedades, especies silvestres cercanas y reservas genéticas especiales como ser: plantas élite, líneas mejoradas y mutantes (ZAID et al ., 2004). Los recursos fitogenéticos por lo tanto, se refieren al valor social, científico o económico de los materiales heredables que están contenidos dentro y entre las especies (FAO, 1999).
Según el CONVENIO SOBRE LA DIVERSIDAD BIOLÓGICA (1992) el “material genético” es todo material que contiene unidades funcionales de la herencia. Por
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"recursos biológicos" se entienden los recursos genéticos, los organismos o partes de ellos, las poblaciones, o cualquier otro tipo del componente biótico de los ecosistemas de valor o utilidad real o potencial para la humanidad.
BRIDG (2000) enfatiza que la exploración, colección, conservación, evaluación y divulgación de genotipos naturales de A. cherimola en los países donde son especies reconocidas en la flora nativa, es una prioridad en términos de redescubrimiento y conservación de germoplasma nativo. Por otra parte ZAID (2004) recuerda que la conservación de especies, poblaciones, individuos o partes de individuos, se realiza para preservar la diversidad genética para las generaciones presentes y futuras.
“La conservación de recursos fitogenéticos se realiza mediante dos estrategias complementarias entre sí: la conservación in situ y ex situ . Por "conservación in situ " se entiende la conservación de los ecosistemas y los hábitats naturales y el mantenimiento y recuperación de poblaciones viables de especies en sus entornos naturales, y en el caso de las especies domesticadas y cultivadas, en los entornos en que hayan desarrollado sus propiedades específicas. Por "conservación ex situ" se entiende la conservación de componentes de la diversidad biológica fuera de sus hábitats naturales” (CONVENIO SOBRE LA DIVERSIDAD BIOLÓGICA, 1992).
“Por "especie domesticada o cultivada" se entiende que es una especie en cuyo proceso de evolución han influido los seres humanos para satisfacer sus propias necesidades” (CONVENIO SOBRE LA DIVERSIDAD BIOLÓGICA, 1992). Un pariente de una especie cultivada que crece en forma silvestre y no se utiliza para fines agrícolas es llamado pariente silvestre (DE VICENTE y FULTON, 2004).
“Se llama accesión a una muestra de cualquier tamaño de una variedad de cultivo recolectada en un lugar y un tiempo determinado, mantenida como semilla o como material vegetativo” (SARMIENTO, 2000).
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2.5.3. Colección núcleo Una colección núcleo consiste en un número limitado o subconjunto de accesiones de una colección completa. En el caso de una especie cultivada, una colección núcleo consiste en un número limitado de accesiones seleccionadas que representa la diversidad genética de toda la especie cultivada y de sus parientes silvestres. De esa manera los estudios que se hagan sobre la colección núcleo proporcionarán una visión general de las características de la colección completa. El objetivo final de una colección núcleo es lograr que la colección de la cual se deriva se conserve mejor y se utilice más eficazmente (FRANKEL Y BROWN, 1984; VAN HINTUM et al ., 2003).
La necesidad de conformar colecciones núcleo se ha incrementado debido a que algunas colecciones han crecido tanto que resulta difícil conservar y usar la diversidad genética que contienen. Esta situación se produjo porque en los últimos años se incrementó enormemente la colecta y conservación de estos recursos, de tal manera que muchos bancos de germoplasma vegetal enfrentan grandes problemas de tamaño y organización (VAN HINTUM et al ., 2003).
El procedimiento para seleccionar una colección núcleo varía según las características de la colección disponible y los objetivos buscados. En general se establecen grupos de accesiones similares mediante el análisis de variables múltiples o análisis multivariado. La agrupación debe asegurar que se represente también los diferentes hábitats de la colección (VAN HINTUM et al ., 2003).
ABADIE (2001) enfatiza que el hecho de que aun cuando las colecciones núcleo dan una orientación sobre la contribución de las colecciones base, no las sustituyen. Además recalca que la existencia de una colección núcleo no justifica que se deterioren las condiciones de conservación o se desatiendan otras muestras de la colección general.
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2.6. Herramientas para evaluar la diversidad genética Para poder conservar y usar la variación genética, primero hay que evaluarla, es decir, es preciso determinar su extensión y distribución. La variación puede evaluarse a nivel tanto fenotípico como genotípico. La evaluación de la variación fenotípica se concentra en los rasgos morfológicos, o sea, en aquellas características que definen la forma y la apariencia de un conjunto de individuos. Algunos de estos caracteres pueden considerarse ‘genéticos’ si su presencia en individuos emparentados es hereditaria y no depende del ambiente. Esto quiere decir que esos caracteres están asociados con una secuencia específica de ADN (DE VICENTE y FULTON, 2004).
Según FERREIRA Y GRATTAPAGLIA (1998), para la caracterización del material vegetal puede lograrse utilizando una variedad de herramientas como ser: Marcadores morfológicos: que son las características agronómicas o morfológicas llamadas descriptores. Marcadores citológicos: que incluye el cariotipo a nivel cromosomal o subcromosomal. Marcadores bioquímicos: como el análisis de isoenzimas, electroforesis de proteínas y productos secundarios.
Por último, los marcadores moleculares de ADN, utilizados para la caracterización genética. Se usan para detectar polimorfismos en la secuencia del ADN del núcleo, de las mitocondrias o de cloroplastos (DE VICENTE y FULTON, 2004).
2.7. Marcadores moleculares “Se define marcador molecular a cualquier fenotipo molecular proveniente de la expresión de un gen, o de segmentos específicos de ADN, que corresponde a regiones expresadas o no del genoma” (FERREIRA Y GRATTAPAGLIA, 1998).
Las tecnologías de análisis molecular de la variabilidad del ADN permiten determinar puntos de referencia en los cromosomas técnicamente denominados marcadores moleculares. Tales marcadores moleculares pueden ser utilizados para las más diversas aplicaciones, tanto en el estudio de genética como en la práctica del mejoramiento de plantas (FERREIRA Y GRATTAPAGLIA, 1998).
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Los avances de la biología molecular durante la década de los ochenta, han aportado nuevos marcadores genéticos que permiten visualizar diferencias tangibles entre las secuencias homólogas del ADN de los organismos. Esas diferencias resultan de cambios o rearreglos entre los pares de bases que conforman la molécula de ADN, tales como: translocaciones, inversiones, inserciones o deleciones en regiones homólogas. Por lo tanto este tipo de marcadores detecta variaciones directas a nivel de ADN (VALADEZ Y KAHL, 2000).
2.7.1. Aplicaciones y ventajas de los marcadores moleculares FERREIRA Y GRATTAPAGLIA (1998) describen las ventajas de los marcadores moleculares, en relación a los marcadores morfológicos:
Marcadores Morfológicos Marcadores Moleculares -Es necesario mucho esfuerzo y -Permiten acelerar el proceso de planificación para construir mapas selección de los individuos deseados y genéticos a partir de marcadores consecuentemente reducir el tiempo morfológicos. Se debe recurrir a un gran necesario para completar una generación número de cruzamientos para el estudio de mejoramiento, lo cual aumenta la de ligamiento genético. eficacia del programa. -Presentan polimorfismo limitado. -El nivel de polimorfismo de los marcadores moleculares es alto para cada locus estudiado. -Son dominantes o recesivos. -Muchos son codominantes y contienen mayor cantidad de información genética por locus que los marcadores morfológicos.
-Los marcadores morfológicos pueden -En general son neutros con relación a ser afectados por efectos epistáticos. los efectos fenotípicos.
-Por lo general, son identificados en su -Los marcadores basados en ADN mayoría a nivel de planta entera o pueden ser utilizados en cualquier fase adulta. del desarrollo de la planta.
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2.7.2. Clasificación de los marcadores moleculares La mayoría de los marcadores moleculares se incorporan en alguna de las siguientes tres categorías según las técnicas utilizadas en su desarrollo y por su aplicación (CAETANO-ANOLLES Y GRESHOFF, 1997; DE VICENTE y FULTON, 2004): a) Técnicas basadas en la hibridación molecular Incluye principalmente los RFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (Restriction Fragment Length Polymorphism), donde se detectan patrones de bandas generados mediante la digestión con enzimas de restricción del ADN patrón en fragmentos definidos. b) Técnicas basadas en PCR que usan iniciadores arbitrarios o amplifican multilocus Tienen la característica de no necesitar mayor información de la secuencia del genoma que se está investigando. Se pueden mencionar a los RAPD Polimorfismo de ADN amplificado al azar (Random Amplified Polymorphic DNA) en el cual los iniciadores son escogidos arbitrariamente para realizar la amplificación por PCR. Otros marcadores son los AFLP Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (Amplified Fragment Length Polymorphism), el ADN es digerido con dos enzimas de restricción, adaptadores son ligados a los extremos de los fragmentos, se hace una amplificación selectiva de los fragmentos mediante PCR. c) Técnicas basadas en PCR de secuencia específica Un requisito necesario es el conocimiento de la secuencia de las zonas flanqueantes para la obtención de iniciadores. Dentro de esta categoría debemos mencionar a los SCAR Región amplificada caracterizada por una secuencia (Sequence-characterized amplified region), CAPS Secuencia de restricción amplificada y polimórfica (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) donde el polimorfismo se debe a los sitios de restricción en la región amplificada; y los microsatélites o SSR (Simple Sequence Repeat), si los iniciadores de las regiones flanqueantes han sido diseñados.
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En el cuadro 1 se comparan las características principales de algunos marcadores moleculares y un marcador bioquímico (isoenzimas). Los criterios empleados para cada columna (sí/no, bajo/medio/alto, etc.) se basan en la experiencia y en literatura científica. No se asigna un número o un intervalo a cada marcador y a su tecnología porque los resultados dependen de cada especie (DE VICENTE y FULTON, 2004).
Cuadro 1. Comparación de marcadores moleculares y las isoenzimas. Fuente: DE VICENTE y FULTON (2004). Específico Marcador Número Codominante Polimorfismo Tecnicidad Costo de locus Isoenzimas < 90 Sí Bajo Sí Bajo Bajo RFLP Ilimitado Sí Medio Sí Alto Medio RAPD Ilimitado No Medio No Bajo Bajo AFLP Ilimitado No Alto No Medio Medio
SCAR Ilimitado b Sí/No Bajo/Medio Sí Medio Bajo
CAPS Ilimitado b Sí Bajo/Medio Sí Medio Bajo
Microsatélites Ilimitado Sí Muy alto Sí Bajo a Bajo a aaa Cuando ya se han identificado los microsatélites y se han diseñado los iniciadores. bbb Dependiendo de otros marcadores que ya estén disponibles.
2.7.3. Selección de un marcador molecular adecuado Según DE VICENTE y FULTON (2004) la selección de un marcador molecular adecuado depende mucho de la información requerida para responder a los objetivos propuestos. De manera general, para un estudio de diversidad genética un buen marcador molecular debe tener las siguientes características: a) Polimórfico : mostrar la variación en un grupo de individuos; b) Reproducible en cualquier análisis de laboratorio o en diferentes laboratorios; c) Codominante : detectar y distinguir entre un homocigoto y un heterocigoto; d) Distribuido de manera uniforme en todo el genoma : cuanto mejores sean la distribución y cobertura del genoma, mejor será la evaluación del polimorfismo; e) Discriminante : detectar diferencias entre individuos estrechamente relacionados; f) No sujeto a influencias ambientales : la expresión del genotipo de un marcador debe ser independiente del ambiente o de la etapa de desarrollo del individuo;
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g) Neutral : el alelo presente en el locus del marcador es independiente de la presión de selección que se ejerce sobre el individuo y no tiene ningún efecto sobre ella; h) De bajo costo : su detección en numerosos individuos debe ser fácil, rápida y barata. En la medida de lo posible, el equipo de laboratorio debe ser útil para diversos experimentos (DE VICENTE y FULTON, 2004).
2.7.4. Microsatélites Los microsatélites (Simple Sequence Repeat o SSR), consisten en pequeñas secuencias sencillas de nucleótidos, que se repiten lado a lado. Su ventaja es que son codominantes, multialélicos, tienen distribución uniforme, muy frecuentes en el genoma, son altamente reproducibles y útiles para la discriminación de genotipos (FERREIRA Y GRATTAPAGLIA, 1998). Estas secuencias se presentan agrupadas en repeticiones de dos a seis pares de bases, en bloques de hasta 50 repeticiones, distribuidos de forma dispersa por el genoma (LUQUE Y HERRÁEZ, 2000).
Para encontrar estas secuencias se utilizan dos oligonucleótidos llamados iniciadores, de cadena sencilla cuya secuencia se conoce, que son complementarios a cada hebra de ADN en los dos extremos opuestos de la secuencia del microsatélite (LUQUE Y HERRÁEZ, 2000). La figura 6 muestra un ejemplo de microsatélite en que la secuencia repetida es de adenina y citosina, con sus correspondientes pares en la cadena complementaria, es decir de dos pares de bases. Flanqueando el microsatélite se encuentran las secuencias donde se complementan los iniciadores:
Iniciador 1
Iniciador 2 Figura 6. Esquema de una región microsatélite. Ejemplo de un di-nucleótido A- C(8). Fuente: ARANGUREN-MÉNDEZ et al . (2005).
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2.7.4.1. Aplicaciones, ventajas y limitaciones de los microsatélites Su polimorfismo se aplica para pruebas de identidad y estudios de parentesco (LUQUE Y HERRÁEZ, 2000). Puesto que la repetición por sí misma no codifica para formar ninguna proteína, y debido a que las secuencias de ADN repetitivo pueden recombinarse y expandirse más frecuentemente que otros tipos de secuencias, estas regiones son a menudo altamente variables y consecuentemente útiles para medir el polimorfismo entre especies o variedades muy relacionadas (PHILLIPS et al . 1995; VALADEZ Y KAHL 2000).
Los microsatélites se aplican para la evaluación de germoplasma y su diversidad genética, cartografía de genomas, estudios filogenéticos, estudios evolutivos, pruebas de identidad, obtención de huellas genéticas y estudios de parentesco (DE VICENTE y FULTON, 2004; (LUQUE Y HERRÁEZ, 2000).
Son ventajas de los microsatélites: que requieren muy poco ADN, son sumamente polimórficos, uniformemente distribuidos en todo el genoma, interpretación sencilla de los resultados, automatizados fácilmente y permiten la carga simultánea de productos, buena resolución analítica y alta reproducibilidad. Sin embargo estos marcadores tienen la limitación de que el procedimiento de descubrimiento tiene cierto nivel de costo y complejidad (DE VICENTE y FULTON, 2004).
2.7.4.2. Huellas genéticas La identificación de individuos con las técnicas para el análisis de genomas que permiten detectar patrones polimórficos de fragmentos específicos en el ADN, se conocen como huellas genómicas o huellas de ADN. Las secuencias simples de los microsatélites se encuentran en la mayoría de los genomas eucariontes estudiados, lo que da lugar a la obtención de estos patrones genéticos individuales y específicos para cada organismo (VALADEZ Y KAHL 2000). Estas huellas dactilares de ADN (DNA fingerprint en inglés) pueden estar asociadas a un carácter agronómico específico, y en este caso se conocen como marcadores genético-moleculares (LUQUE Y HERRÁEZ, 2000).
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2.7.5. Marcadores moleculares en chirimoya Existen referencias de estudios realizados con diferentes marcadores moleculares en chirimoya, como los RAPD (Polimorfismo de ADN amplificado al azar). Por ejemplo OWENS (2003) realizó el estudió la diversidad de chirimoya en poblaciones de los valles del departamento de Chuquisaca, Bolivia en un estudio preliminar. Mediante los RAPD se encontraron un máximo de cuatro bandas polimórficas por marcador y un total de 21 bandas polimórficas fueron obtenidas de nueve iniciadores.
Otro trabajo realizado por BRIDG (2000) estudió la comparación de individuos de chirimoya utilizando seis iniciadores RAPD que presentaron bandas monomórficas. Sin embargo comparando los marcadores RAPD con los microsatélites, estos últimos se caracterizan por su alto polimorfismo y los RAPD tienen problemas de reproducibilidad y son de herencia dominante (DE VICENTE y FULTON, 2004).
GUIRADO et al . (2004) señalan que existe en España trabajos en ejecución para la caracterización y mejoramiento de la chirimoya, utilizando marcadores moleculares. De la misma manera, el INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN Y EXTENSIÓN AGRARIA - PERÚ (2006), reporta que en la Estación Experimental La Mayora de Málaga, España, se han definido 20 microsatélites de chirimoya. En este país se ha iniciado la caracterización molecular de germoplasma de chirimoya utilizando los microsatélites mencionados.
El trabajo realizado por ESCRIBANO et al . (2003) fue el desarrollo de marcadores moleculares para aplicarse en la identificación y caracterización de germoplasma de chirimoya. Los marcadores que presentaron patrones claros, estables y polimórficos constituyeron los marcadores SSRs, denominados LMCH, y se probaron en los genotipos del banco de germoplasma español de chirimoya. Los autores añaden que “las cualidades asociadas a los microsatélites o SSRs (dispersos por el genoma, multialélicos, codominantes y fáciles de analizar) los convierten en el tipo de marcadores más adecuado”.
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2.8. Técnicas para el análisis con marcadores moleculares 2.8.1. Colección y preservación de tejido vegetal La calidad del ADN es crucial para la aplicación exitosa de las técnicas moleculares. La condición fisiológica del material vegetal determina la calidad de ADN obtenido para el análisis, y no tanto el protocolo (CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA, 1998). Según POSSO y GHNEIM (2006), “esto es particularmente importante en especies que producen grandes cantidades de metabolitos secundarios que interfieren con la extracción exitosa de ADN”. Por lo tanto se recomienda usar tejido en fase activa de crecimiento, pues los tejidos envejecidos presentan una baja concentración de ADN (POSSO y GHNEIM, 2006).
El tejido debe estar limpio y puede ser mantenido en hielo por algunos días. Para almacenamiento prolongado se puede congelar por algunas semanas a -20 °C o indefinidamente a -80 °C, o también liofilizado (POSSO y GHNEIM, 2006).
2.8.2. Molido de la muestra Los morteros deben ser pre-enfriados con nitrógeno líquido para realizar el molido de la muestra. El obtener un polvo fino sirve para romper paredes y membranas celulares (POSSO y GHNEIM, 2006).
Mediante el protocolo de DOYLE y DOYLE (1990) modificado en el laboratorio del Centro Internacional de la Papa, es posible obtener alrededor de cien microgramos de ADN total a partir de 100 miligramos de muestra (CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA, 1998).
2.8.3. Extracción de ADN Según POSSO y GHNEIM (2006) en general los procesos de extracción comprenden las siguientes etapas: -Mezcla de la muestra molida con el tampón de extracción, que contiene un detergente, antioxidante Etilendiamino tetraacético (EDTA) y el agente tampón, con la finalidad de solubilizar las membranas lipo-proteicas y desnaturalizar las proteínas
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preservando el ADN de la acción de las enzimas de degradación. La suspensión se incuba a temperaturas entre 50 y 65 °C durante 15 a 60 minutos a fin de facilitar la solubilización y homogenización.
-Extracción de lípidos, proteínas y polisacáridos mediante tratamiento con un solvente orgánico, cloroformo-alcohol isoamílico. Luego de centrifugación se generan dos fases, una orgánica y otra acuosa. El ADN, ARN y algunos polisacáridos son retenidos en la fase acuosa.
-Precipitación del ADN por tratamiento con sales y alcohol. El ADN en presencia de sal y alcohol forma un precipitado visible a simple vista que puede ser visto en forma de hebras o sedimentado (llamado “pellet” en inglés) por centrifugación.
-Lavado del ADN con alcohol, y -Resuspensión del ADN en una solución tampón Tris-EDTA que contiene ARNasa para degradar el ARN presente, quedando sólo el ADN purificado (POSSO y GHNEIM, 2006).
Según el CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (1998), el lavado con etanol se realiza dos veces, se centrifuga, se elimina el etanol y se deja secar. Luego se disuelve el precipitado de ADN con agua destilada, agregando ARNasa e incubando por una hora a 37 °C.
2.8.4. Electroforesis de ADN en geles de agarosa “La concentración e integridad del ADN extraído, así como el tamaño de distintos fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles. La electroforesis consiste en la separación de moléculas (ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada (gel de agarosa, de acrilamida, de almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En los ácidos nucleicos, el grupo fosfato con su carga negativa hace que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis” (POSSO y GHNEIM, 2006).
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2.8.5. Amplificación de secuencias microsatélites Según POSSO y GHNEIM (2006) las regiones del ADN que contienen microsatélites son amplificadas individualmente a través de la reacción en cadena de polimerasa (PCR por su sigla en inglés: Polymerase chain reaction). Se utiliza un par de iniciadores (primers en inglés) específicos (de 20 a 30 pares de bases) con secuencias complementarias a las secuencias únicas que flanquean el microsatélite.
“La PCR debe ser ajustada para amplificar cada microsatélite a estudiar pues estos varían en tamaño y secuencia. Un ciclo de PCR, el cual se repite al menos una decena de veces, consta de tres etapas:” “1. Desnaturalización del ADN. El ADN de doble cadena es desnaturalizado mediante el aumento de la temperatura que puede variar entre 92 y 95 ºC. 2. Apareamiento (“annealing” en inglés). En esta etapa la temperatura es rápidamente reducida entre 35 ºC y 60 ºC, dependiendo esencialmente de la secuencia y tamaño del iniciador utilizado, para promover la hibridación ADN-ADN de cada primer con las secuencias complementarias que flanquean la región “blanco”. 3. Elongación o polimerización. La temperatura es elevada a 72 ºC para que la enzima ADN polimerasa extienda la cadena a partir del extremo 3’ del iniciador mediante la incorporación de nucleótidos utilizando como molde la secuencia “blanco”. Para la polimerización se requiere de Mg 2+ ” (POSSO y GHNEIM, 2006).
2.8.6. Separación de productos amplificados Para detectar secuencias de microsatélites se utilizan geles de poliacrilamida o agarosa especial de alta resolución, es decir un gel adecuado para la separación de segmentos que difieren en pocos pares de bases. Visualizar las bandas de los productos amplificados, puede hacerse por tinción con bromuro de etidio (en geles de agarosa) o nitrato de plata, a través de autorradiografía utilizando “primers” marcados con radioisótopos en la reacción de PCR o mediante fluorescencia cuando se utilizan geles de secuenciación (POSSO y GHNEIM, 2006).
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Una técnica basada en la electroforesis de ADN es la electroforesis capilar. Este tipo de electroforesis se lleva a cabo en finos capilares de sílica fundida cubierta con poliamida. Los tubos de sílica tienen una longitud de 30 a 100 cm con un diámetro de 25 a 100 µm y presentan radicales oxidrilo que al disociarse confieren una carga neta negativa. En este sistema el tiempo de separación es relativamente corto (5 a 10 minutos), mientras que la eficiencia de separación es muy alta (YÁBAR, 2003).
2.9. Análisis estadístico Dos índices se utilizan frecuentemente para estimar la diversidad de alelos los que se muestran a continuación: 2.9.1. Índices de variabilidad genética Número promedio de alelos por locus Es la suma de todos los alelos detectados en todos los loci, dividido por el número total de loci según DE VICENTE y FULTON (2004). k
N= (1/K) ∑ ni
i=1 Donde: K = número de loci ni = número de alelos detectados por locus
Heterocigosidad (H e) (diversidad genética de Nei [D]) Es la probabilidad de que, en un locus único, cualquier par de alelos, escogidos al azar de la población, sean diferentes entre sí. Tres cálculos son posibles: 2 2 Un locus con dos alelos: h j = 1 – p – q 2 Un locus j con i alelos: h j = 1 – Σpi L Promedio para varios loci: H = Σj hj/L
La H e promedio de todos los loci es una estimación del grado de variabilidad genética en la población (DE VICENTE y FULTON, 2004).
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Donde: hj = la heterocigosidad por locus p y q = las frecuencias alélicas H = la heterocigosidad promedio para varios loci L = el número total de loci -Puede aplicarse con todos los marcadores, sean codominantes o dominantes, varía de 0 a 1, y se maximiza cuando hay muchos alelos cuyas frecuencias son iguales.
2.9.2. Análisis de estructura poblacional 2.9.2.1. Coeficientes de similitud Se usan coeficientes de similitud para establecer relaciones genéticas entre individuos, y a partir de ellos realizar análisis que permitan evaluar la estructura genética en grupos de individuos. A continuación se muestran algunos ejemplos de coeficientes de similitud utilizados para establecer relaciones entre individuos de acuerdo a la presencia de alelos. Para todos los coeficientes, a, b, c, d representan las cuatro combinaciones posibles de presencia (1) o ausencia (0) de alelos que pueden obtenerse al comparar dos individuos (DE VICENTE y FULTON, 2004).
El Coeficiente de Concordancia Simple (a + d)/(a + b + c + d) Considera que la ausencia corresponde a loci homocigóticos. Puede usarse con datos de marcadores dominantes (RAPD y AFLP), por cuanto las ausencias podrían corresponder a recesivos homocigóticos.
El Coeficiente de Jaccard a/(a + b + c) Solamente cuenta las bandas presentes para cualquiera de los individuos (‘i’ o ‘j’). Las ausencias dobles se consideran como datos ausentes. Puede aplicarse con datos de marcadores codominantes.
El Coeficiente de Nei-Li 2a/(2a + b + c) Cuenta el porcentaje de bandas compartidas entre dos individuos y le da más importancia a aquellas bandas presentes en ambos. Considera que la ausencia tiene
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menor importancia biológica. Puede aplicarse con datos de marcadores codominantes (RFLP, SSR) (DE VICENTE y FULTON, 2004).
2.9.2.2. Análisis de conglomerados La clasificación o agrupación, es el proceso de agrupar o conglomerar objetos en categorías o clases, con base en sus particularidades o relaciones comunes. Se emplea la clasificación jerárquica debido a la naturaleza de las relaciones entre individuos; es decir, el individuo, la población, la accesión, la variedad, son unidades que no pueden ser asignadas simultáneamente a dos grupos diferentes (GARCÍA et al ., 1995). Se selecciona un método de agrupación, de manera que se pueda trazar un diagrama de árbol o dendograma. En la agrupación jerárquica se da la misma importancia a todos los caracteres analizados (DE VICENTE y FULTON, 2004).
Se utiliza un coeficiente o índice de similitud en el procedimiento de análisis en conglomerados para mostrar las relaciones entre las muestras. Los coeficientes de similitud difieren en su enfoque para estimar el número de coincidencias y diferencias (DE VICENTE y FULTON, 2004).
2.9.2.3. Análisis de coordenadas principales La ordenación es un método multivariado que complementa la agrupación y casi siempre se le considera como una estrategia que más se aproxima a la realidad biológica. Lo que se quiere representar con los métodos de ordenación son las relaciones de las muestras de una manera sencilla, al reducir la situación real a un ‘espacio dimensional bajo’ (GAUCH, 1982).
Para hacerlo, se estudia la composición de la muestra como un todo, se mejora la comparación estadística del análisis porque, se elimina o reduce la redundancia y se puede determinar la importancia relativa de diferentes gradientes. Sobre todo, se obtienen representaciones gráficas que nos ayudan a interpretar las relaciones de los diferentes grupos de muestras. El análisis de coordenadas principales pretende representar las distancias entre muestras y puede dar cabida a matrices de
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diferentes medidas de similitud. Maximiza la correlación lineal entre distancias de muestras (GAUCH, 1982).
2.10. Herramientas para el análisis geoespacial de datos
Una herramienta útil para análisis geoespacial de datos es DIVA-GIS, un programa libre para computadora que puede emplearse para analizar la distribución de especies con el objeto de dilucidar patrones geográficos, ecológicos, y genéticos. Está orientado a estudios científicos que necesitan una herramienta GIS especializada en analizar las distribuciones de especies.
DIVA-GIS puede ayudar a mejorar la calidad de los datos al encontrar las coordenadas de las localidades, y mediante la comprobación de coordenadas existentes utilizando superposiciones de áreas (consultas espaciales) de sitios de colecta con bases de datos de límites administrativos. En cuanto a la localización geográfica puede importar bases de datos de colecciones biológicas utilizando los campos de latitud y longitud (HIJMANS et al ., 2004).
Este programa puede emplearse para analizar la distribución de especies con el objeto de dilucidar patrones geográficos, ecológicos, genéticos y mapear la diversidad basándose en datos de marcadores moleculares (ADN). Puede ser usado por ejemplo, para identificar áreas de elevada diversidad, para estudiar la distribución de ciertos rasgos de interés. Asimismo, pueden crearse mapas de distribución, y el mapeo de riqueza y diversidad (HIJMANS et al ., 2004).
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CAPÍTULO III 3. LOCALIZACIÓN 3.1. Ubicación Geográfica Este estudio tuvo como centro el Laboratorio de Biología Molecular y Bioinformática de la Fundación PROINPA (Fundación para la Promoción e Investigación de Productos Andinos), en la localidad de El Paso, Provincia Quillacollo, Bolivia, a 15 kilómetros al noroeste de la ciudad de Cochabamba. El trabajo comprende accesiones de chirimoya provenientes de la zona subtropical de cinco departamentos de Bolivia: La Paz, Cochabamba, Santa Cruz, Chuquisaca y Tarija.
CAPÍTULO IV 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Materiales 4.1.1. Material Vegetal El material colectado para el estudio consistió de brotes en crecimiento de plantas de chirimoya, y para la extracción de ADN se seleccionaron hojas sanas y en pleno crecimiento de dichos brotes.
4.1.2. Material de Colecta El material para realizar la colecta de los brotes fue: cajas de plastoformo, bolsas de polietileno, hielo, tijeras, etiquetas.
4.1.3. Material de Laboratorio a) Equipos: Se utilizaron los siguientes equipos: Refrigerador, congeladora, microcentrífuga de 12000 rpm Thermo IEC-Micromax, termociclador MJ research PTC 100, equipo de electroforesis, extractor de gases, medidor de pH, balanzas electrónica y analítica, estabilizador de voltaje, horno microondas, transiluminador de rayos ultravioleta, un digitalizador de imágenes (Cámara de video CCD – 500 EE) AAB Biosystems para la visualización del ADN, baño maría, micropipetas de diferentes medidas.
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b) Reactivos: Se utilizaron los siguientes reactivos y sustancias puras: Agua destilada, agua destilada estéril, etanol absoluto, nitrógeno líquido, detergentes. Reactivos para extracción de ADN: (Protocolo CTAB Bromuro de hexadeciltrimetilamonio (Cetyl-trimethyl ammonium bromide ó CTAB en inglés) ver protocolos en Anexo B) Tampón de extracción CTAB 2X, β-mercaptoetanol, cloroformo, isopropanol, etanol absoluto diluido a 75%, ARNasa.
Reactivos para electroforesis: agarosa, TBE 10X, Tris HCl 1M pH 8.0, ácido bórico y EDTA 0.5 M pH 8.0, marcador de peso molecular HyperLadder I (BIOLINE) DE 10000 pares de bases, tampón de cargado, y el fluoróforo SYBR green.
Reactivos para amplificación y separación de segmentos de ADN: dNTPs, tampones, cebadores y microsatélites específicos para chirimoya (términos en Anexo A). c) Material de vidrio: Pipetas, vaso de precipitación, matraz Erlenmeyer, probetas graduadas, frascos para autoclavado de material. d) Otros materiales: Espátulas, picetas, tijeras, tubos de 1.5 mL, morteros de porcelana con pilón, portatubos, barras magnéticas, puntas para micropipeta, bolsas reutilizables. Material descartable : papel toalla, guantes, Parafilm, papel servilleta.
4.1.4. Material de Gabinete Equipo y programas informáticos, calculadora, material de escritorio, bibliografía especializada. Software para análisis de datos moleculares: NTSYSpc Versión 2.10 (ROHLF, 2002). Software para análisis geoespacial de datos: DIVA-GIS Versión 5.2, Manual Versión 4 (HIJMANS et al ., 2004). Información digital para elaboración de mapas (CENTRO DIGITAL DE RECURSOS NATURALES DE BOLIVIA, 2009).
4.2. Métodos La selección de las zonas de colecta, el número de accesiones a colectar, y el número de microsatélites a utilizar fueron determinadas previamente al presente
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trabajo, en el marco del proyecto CHERLA. La cantidad de accesiones analizadas, georeferenciadas, y el número de microsatélites utilizados para su análisis se detalla en los cuadros 2 y 3.
4.2.1. Número de muestras analizadas En el presente trabajo se realizó el análisis de 252 accesiones en total, con nueve microsatélites polimórficos e informativos desarrollados específicamente para chirimoya. Anteriormente, se realizó un trabajo con 167 accesiones de chirimoya (CÁCERES, 2008), las cuales incorporamos en el presente trabajo, a fin de estudiar en un solo conjunto toda la colección boliviana. El trabajo citado utilizó 20 marcadores microsatélites. Por lo tanto el número final de accesiones analizadas es de 419, entre las que se incluyen individuos que no son de origen boliviano, así como un pariente silvestre de chirimoya proveniente del chaco boliviano.
En el cuadro 2 se detalla el número de los diferentes grupos de accesiones estudiados: accesiones colectadas en Bolivia con georeferenciación disponible, accesiones adicionales analizadas que no cuentan con georeferenciación, y el número de microsatélites utilizados (la lista de microsatélites está en Anexo C).
Cuadro 2. Número de accesiones colectadas, georeferenciadas y microsatélites. Accesiones Número de adicionales: Número de NÚMERO TOTAL DE accesiones repatriadas, microsatélites ACCESIONES ANALIZADAS bolivianas extranjeras (SSR)
georeferenciadas y otras utilizados (ver cuadro 3) Análisis CÁCERES (2008) 167 ----- 20 Análisis del presente estudio 228 24 9
TOTALES a 395 24 aaa.a... Total de las accesiones analizadas: 395 + 242424 = 419 individuos.
En el cuadro 3 se detalla las accesiones adicionales para análisis. Doce accesiones son chirimoyas repatriadas, un pariente silvestre colectado en el Chaco de Bolivia, y once muestras procedentes de otros países. Entonces el total de las accesiones
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bolivianas colectadas (395) más las repatriadas (12), suman un total de 407 accesiones bolivianas. Cuadro 3. Accesiones adicionales: especie, cultivar (cv.), procedencia y cantidad.
ACCESIONES REPATRIADAS, EXTRANJERAS Y OTRAS Nombre Científico Nombre común / cv. Condición Procedencia Cantidad Annona cherimola Chirimoya Repatriadas España 12 Annona nutans Aratiku (guaraní) Pariente silvestre Chaco Boliviano 1 A. cherimola x A. squamosa Atemoya. cv. African pride Híbrido extranjero Sudáfrica / Israel 1 Annona cherimola cv. Bonita Extranjera España 1 Annona cherimola cv. Campas Extranjera España 1 Annona cherimola cv. Cholán Extranjera España 1 Annona cherimola cv. Fino de Jete Extranjera España 1 Annona cherimola cv. Pazicas Extranjera España 1 Annona cherimola cv. del Ecuador Extranjera Ecuador 1 Annona cherimola cv. Cumbe Extranjera Perú 1 Annona cherimola cv. Chiuna Extranjera Perú 1 Annona cherimola cv. Bronceada Extranjera Chile 1 Annona cherimola cv. Chaffey Extranjera EEUU 1 TOTAL DE ACCESIONES ADICIONALES PARA ANÁLISIS : 24 Fuente: Elaboración propia, con información de cv. extranjeros por PINTO y DE ANDRADE (2005c).
4.2.2. Cobertura del estudio
A continuación se detalla el origen de las diferentes accesiones colectadas por departamento, con el número de muestras correspondiente (Cuadro 4).
Cuadro 4. Total de la colección boliviana de chirimoya por departamentos. Departamentos Cantidad de accesiones La Paz 20 Cochabamba 189 Santa Cruz 147 Chuquisaca 24 Tarija 15 TOTAL 395
Las accesiones se ordenaron en tres grupos codificados con las letras A, B y C, para realizar un análisis por separado como se describe a continuación.
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El grupo identificado con la letra A corresponde a un muestreo al azar de huertos tradicionales realizado dentro del área principal de influencia del proyecto. Corresponde a los siguientes municipios: Independencia, Mizque y Aiquile del Departamento de Cochabamba, y los municipios de Saipina y Comarapa del Departamento de Santa Cruz de la Sierra.
El grupo identificado con la letra B corresponde a un muestreo al azar en huertos tradicionales realizado en municipios de los departamentos de La Paz, Cochabamba, Santa Cruz, Chuquisaca y Tarija.
Por último, el grupo identificado con la letra C corresponde a un muestreo al azar de plantaciones recientes, con plantas de 10 años de edad o menor. El muestreo fue realizado en municipios de los departamentos de Cochabamba y Santa Cruz.
4.2.3. Esquema general de trabajo
En la figura 7 se muestra de manera general la secuencia seguida en el estudio.
ADN
ADN
Figura 77.... Diagrama general que muestra la secuencia del trabajo realizado.
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4.2.4. Colecta del material vegetal
Se seleccionaron hojas en pleno crecimiento, en condiciones apropiadas de sanidad, almacenándolas en bolsas de polietileno a - 20 ºC, hasta el momento de molido. Cada muestra fue debidamente identificada, proveniente de varias zonas geográficas del territorio boliviano.
4.2.5. Molido y conservación de muestras
Se tomó cada muestra, moliéndolas en un mortero previamente enfriado, añadiendo nitrógeno líquido, hasta obtener un polvo fino. Cada muestra se conservó a - 20 ºC en tubos de 1.5 mL etiquetados, hasta el momento de la extracción de ADN. Se cargaron alrededor de 100 mg de la muestra molida a tubos de 1.5 mL de capacidad, identificados con el código de cada accesión. Todo el proceso se realizó con nitrógeno líquido a fin de evitar la degradación de las muestras (para abreviaciones y términos utilizados, ver Anexo A; los protocolos se encuentran en Anexo B).
4.2.6. Extracción de ADN
Se utilizó el protocolo de extracción CTAB con algunas modificaciones por tratarse de una especie leñosa propensa a la oxidación (DOYLE AND DOYLE, 1990). La extracción de ADN consistió en la extracción con solventes orgánicos para retener solamente los ácidos nucleicos, añadiendo al final la enzima ARNasa para obtener solamente el ADN. El protocolo se detalla a continuación colocando entre paréntesis las modificaciones y adaptaciones realizadas para trabajar con chirimoya:
1. Calentar el baño María a 65°C. 2. Añadir a cada tubo de 1.5 mL con los 100 mg de tejido molido, 700 µL de tampón CTAB 2X y 2 µL de 2-mercaptoetanol, mezclar inmediatamente. Conservar los tubos en hielo.
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3. Incubar las muestras en baño María a 65°C durante 45 minutos, agitar suavemente las muestras cada 5 minutos para homogeneizar la suspensión. Mientras se incuba, preparar dos juegos de tubos de 1.5 mL para cada muestra, identificados con el código correspondiente. 4. Luego de la incubación, agregar 700 µL de cloroformo. Mezclar vigorosamente durante 5 minutos a fin de formar una emulsión homogénea. 5. Centrifugar las muestras durante 5 minutos a 10.000 r.p.m., de preferencia a 4ºC. Sacar los tubos de la centrífuga con cuidado para evitar que se mezclen las fases, transferir el sobrenadante a un tubo de 1.5 mL nuevo, teniendo cuidado de no absorber la interfase. 6. Repetir los pasos 4 y 5, es decir: añadir cloroformo, agitación y centrifugado. 7. Recuperar el sobrenadante final en un tubo de 1.5 mL estimando la cantidad recuperada. Agregar un volumen igual de isopropanol a cada tubo. Invertir los tubos vigorosamente 4 a 5 veces para precipitar el ADN. 8. Centrifugar a 10.000 r.p.m durante 5 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante con cuidado para no perder el precipitado de ADN. 9. Lavar el precipitado de ADN con 200 µL de etanol frío al 75% (con las muestras de chirimoya se utilizó de 300 a 500 µL según se presentaban muestras con mayor coloración o posibles impurezas, teniendo cuidado de balancear correctamente la centrífuga). Centrifugar las muestras a 10.000 revoluciones por minuto durante 10 minutos a temperatura ambiente. Eliminar con cuidado el etanol. Este lavado se puede realizar dos veces, dependiendo del tejido (el lavado con etanol se hizo siempre dos veces a fin de eliminar sales y eventuales pigmentos). 10. Secar el precipitado dejando los tubos abiertos. 11. Disolver el precipitado en 100 µL de agua destilada estéril (utilizamos 60 µL de agua) y se agregó 0,6 µL de ARNasa (10 mg/mL). Incubar en baño María a 37º C durante una hora. 12. Conservar el ADN disuelto a -20º C para su uso posterior.
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4.2.7. Cuantificación de ADN La cuantificación del ADN se hizo mediante electroforesis en gel de agarosa para verificar la calidad de ADN extraído. Para cuantificar la cantidad de ADN obtenido, se procedió a diluir 1 µl de la solución de ADN obtenido con 8 µl de agua destilada y 1 µl de tampón de carga. El tampón de carga tenía 1 ml de tampón de cargado + 8 µl de SYBR green. Este procedimiento se realizó para cada una de las accesiones.
Se cargó cada una de las muestras preparadas a los pocillos del gel de agarosa. Los fragmentos de ADN fueron posteriormente separados por electroforesis horizontal en un gel de agarosa al 1%. Una vez que los fragmentos migraron aproximadamente dos tercios de la longitud del gel, el mismo fue visualizado a través de un transiluminador de rayos UV. Se obtuvo fotografías para cada uno de los geles procesados, y se registraron. La calidad y la cantidad de ADN obtenido, fue evaluado por comparación con el estándar de peso molecular utilizado (HipperLadder BIOLINE de 200 a 10000 pares de bases).
4.2.8. Amplificación y separación de microsatélites
4.2.8.1. Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Previamente se realizó una amplificación de prueba para seis accesiones tomadas al azar de entre toda la colección, a fin de comprobar la calidad de ADN y verificar que la amplificación se realice sin problema alguno. Además se utilizó un control negativo para verificar que no exista contaminación. Luego de la amplificación se visualizaron los productos PCR por electroforesis en agarosa al 1.8 por ciento, utilizando un marcador de peso molecular de 10000 pares de bases.
La reacción de amplificación se realizó en un termociclador marca MJ Research PTC 100, siguiendo el método ‘Hot Start PCR’ como se detalla a continuación:
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Se preparó la mezcla de dNTPs, tampón PCR 10X, agua destilada estéril, iniciador directo y reverso, y añadiendo al último Taq polimerasa, a fin de que no se amplifiquen productos inespecíficos antes de colocar al termociclador.
Las condiciones de reacción para los iniciadores fueron: 1 ciclo 94° C por 5 minutos 35 ciclos 94° C por 30 segundos T° de hibridación por 30 segundos 72° por 1 minuto 1 ciclo 72° por 5 minutos
Luego se procedió a la cuantificación de los productos amplificados por electroforesis en gel de agarosa al 1.8 por ciento, y visualizados con luz ultravioleta, en un transiluminador. El fluoróforo utilizado fue SYBR green. Se utilizó un marcador de peso molecular de 200 a 10000 pares de bases.
4.2.8.2. Electroforesis capilar La separación de fragmentos fue realizada en un secuenciador automático: CEQTM 8000 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Las muestras fueron desnaturalizadas a 90ºC durante 120 segundos, e inyectadas a 2,0 kV durante 30 segundos a los tubos capilares. La separación se realizó aplicando un flujo de corriente a 6,0 kV durante 35 minutos. A cada tubo capilar se inyectó un máximo de tres pares de iniciadores, más el estándar de tamaño. El iniciador directo de cada microsatélite, se marcó previamente con los fluorocromos D2, D3 y D4 de Beckman Coulter (París, Francia) en el extremo 5´. Esta separación fue realizada por colaboración de los laboratorios de la Estación Experimental de La Mayora, España (ver Anexo D).
A cada pico de cada marcador se asignó un peso molecular tomando como referencia el estándar de tamaño. En base a estos datos se construyó una matriz de los alelos detectados expresados en su número de pares de bases.
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4.2.9. Procesamiento y análisis de datos Los datos de alelos de cada accesión se registraron en una hoja electrónica, formando una matriz rectangular. Se identificó a cada accesión de acuerdo al patrón genético observado de alelos para cada microsatélite.
Luego se transformó la matriz de datos moleculares, en una matriz binaria, asignando el cero ‘0’ a la ausencia del alelo, y uno ‘1’ a la presencia de cada alelo. Para los datos perdidos o faltantes, se asignó el número ‘999’. A partir de esta matriz se realizaron todos los cálculos respectivos de análisis (matriz binaria en Anexo E).
Se calcularon los índices de variabilidad genética. Por otro lado se calcularon los coeficientes de similitud para los análisis de conglomerados y de coordenadas principales.
4.2.9.1. Índices de variabilidad genética
Número promedio de alelos por locus
Se calculó sumando el total de alelos encontrados en toda la colección dividiendo entre el total de microsatélites con los que se trabajó.
Heterocigosidad (He)
Primeramente se calculó la frecuencia de cada alelo por microsatélite, que consiste en la sumatoria de la presencia del alelo en toda la población, dividido sobre el total de todas las presencias de todos los alelos para un microsatélite. Posteriormente utilizando una hoja electrónica se calculó el índice de heterocigosidad para los 20 microsatélites en la población estudiada, y también la heterocigosidad promedio para toda la población.
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Índice de contenido polimórfico (PIC)
También se calculó el índice de contenido polimórfico a partir de las mismas frecuencias alélicas calculadas, obteniendo los índices respectivos para cada microsatélite.
4.2.9.2. Cálculos para el análisis de estructura poblacional Se procedió al análisis de datos con la ayuda del programa informático NTSYSpc 2.10, para calcular los índices de similitud, construyendo una matriz de similitudes entre las accesiones.
Se calcularon las matrices de similitud utilizando el coeficiente de similitud de Jaccard. Estos datos tabulados se llevaron a análisis mediante el análisis de conglomerados. Se utilizó como herramienta el programa informático NTSYSpc 2.10, para facilitar la transformación de la matriz de datos en un diagrama de árbol (dendograma).
En el diagrama de árbol resultante se evaluó la existencia de una estructura genética, y cuán diversa es la colección de chirimoya, también la probabilidad de identificar si existen grupos genéticos asociados por su localización geográfica. Es decir que de esta manera se evaluó si existe una estructura de diversidad genética en toda la colección.
La misma matriz de similitud se utilizó para realizar un análisis de coordenadas principales, obteniendo con este método de ordenación, un gráfico de dos dimensiones como una herramienta para el análisis de la estructura poblacional.
Para comparar y/o confirmar los resultados del análisis multivariado, se realizó el análisis de distribución geográfica de las accesiones colectadas, utilizando herramientas del programa DIVA GIS versión 5.2. Se graficó la distribución de las accesiones colectadas, y la distribución de la riqueza de alelos por cada microsatélite.
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CAPÍTULO V 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se hizo la caracterización molecular de 252 accesiones en total con nueve microsatélites de chirimoya elegidos por su polimorfismo los cuales son LMCH1, LMCH4, LMCH16, LMCH48, LMCH69, LMCH87, LMCH122, LMCH139 y LMCH144.
5.1. Colecta y almacenamiento del material vegetal Durante la recolección y transporte resultó apropiado transportar cada muestra en bolsas de plástico a temperatura ambiente y en cajas de plastoformo. El protocolo utilizado fue adaptado para el trabajo con esta especie leñosa, caracterizada por su propensión a la oxidación. Esta oxidación sucedía principalmente por mantener hojas a 4 grados centígrados al transportarlas del campo al laboratorio, lo cual se evitó.
Ya en el laboratorio el almacenamiento de hojas frescas a -20°C fue favorable porque ayudó a disponer de material útil por varias semanas para el análisis. Se ha observado que el almacenamiento de hojas a -20 °C resultó igualmente favorable que utilizando hojas frescas para la extracción de ADN (ver figura 8), ya que permitió obtener ADN de alta calidad para los análisis.
Figura 88. Hojas recolectadas, para almacenarlas en bolsas de polietileno a -20 grados centígrados.
5.2. Molido y conservación de muestras En el molido de muestras, se ha establecido que la cantidad de muestra molida no debe sobrepasar de unos 100 mg, debido a que en el caso de esta especie leñosa, el sistema creado dentro del tubo puede saturarse con compuestos oxidados, lo que causaría la degradación del ADN principalmente al inicio del proceso de extracción.
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En la figura 9 se ve una muestra molida con nitrógeno líquido y un tubo de 1.5 mL con la cantidad correcta de muestra.
Figura 9. Molido con nitrógeno líquido y tubo cargado con 100 miligramos de muestra molida. 5.3. Extracción de ADN El procedimiento adaptado para la extracción del ADN a partir de hojas de chirimoya fue apropiado porque permitió obtener ADN de alta calidad y cantidad suficiente para el análisis. Para ello se ha visto además que se debe seguir minuciosamente cada paso del protocolo. Luego de añadir el cloroformo la agitación debe ser vigorosa para lograr una emulsión y extraer los ácidos nucleicos en la cantidad suficiente. La precipitación de ácidos nucleicos realizado con isopropanol permitió visualizarlos a simple vista (ver figura 10).
Figura 1010. Izquierda: Muestra de chirimoya luego de añadir cloroformo. Derecha: Precipitado del material genético luego de añadir isopropanol.
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La etapa del lavado con etanol al 75 por ciento, ha resultado ser muy importante para optimizar la limpieza del ADN obtenido. Se utilizó 500 µl por cada uno de los dos lavados con etanol al 75 por ciento, para asegurar la eliminación de sales principalmente.
5.4. Cuantificación de ADN La calidad y cantidad del ADN extraído ha sido de alta calidad por el método de extracción utilizado. Cuando se observaba poca cantidad de ADN, o existía ausencia de banda, se repetía la cuantificación o la extracción de ADN. Dos ejemplos de calidad y cantidad de ADN se pueden apreciar en la figura 11.
En la figura 11, las letras A y B corresponden a plantas antiguas, y la letra C identifica a plantaciones recientes, como se explicó anteriormente. La calidad de ADN extraído se puede distinguir por la nitidez de la banda, y la cantidad de ADN se aprecia por la intensidad de la banda.
Figura 111111. 11 ... Cuantificación de ADN total en geles de agarosa al 1 %. M:::: Marcador de peso molecular de 10.000 pb. Izquierda: Las bandas corresponden a quince accesiones de chirimoya. Derecha: Gel de agarosa con calidad y cantidad de ADN variable.
5.5. Número y frecuencias de alelos encontrados Los microsatélites utilizados mostraron la propiedad de ser discriminantes y presentar un alto grado de polimorfismo, presentando patrones alélicos claros,
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estables y polimórficos en los productos amplificados, lo que concuerda con la descripción realizada para estos microsatélites por ESCRIBANO et al . (2003).
Estas propiedades de los microsatélites de chirimoya han sido empleadas para otorgar a cada individuo una huella genética particular y única, debido a que se encontraron patrones de alelos específicos para cada locus microsatélite. Además es posible discriminar entre individuos heterocigotos, homocigotos, con alelos raros, alelos más frecuentes o mejor conservados, para cada locus microsatélite. Un solo locus microsatélite ya permite evidenciar diferencias entre individuos.
Asimismo se confirma que la chirimoya es una especie diploide, lo mismo que A. nutans y la atemoya ( A. cherimola x A. squamosa ). Esta condición genética se evidencia al observar que el heterocigoto tiene dos alelos para cada locus microsatélite.
Se observa que en toda la población predomina el número de individuos heterocigotos para todos los locus microsatélite. Esto evidencia la forma de reproducción de la chirimoya por su dicogamia, con alto grado de alogamia.
Por otra parte, se puede observar que si bien estos microsatélites fueron desarrollados para chirimoya ( A. cherimola ), permiten evaluar diferencias genéticas con otras especies del género. En este estudio se hizo el análisis de polimorfismo con dos parientes de chirimoya: un pariente silvestre de nombre común aratiku (en guaraní) ( A. nutans ) especie nativa del chaco boliviano; el otro pariente de chirimoya es la atemoya, un híbrido de A. cherimola x A. squamosa .
Un ejemplo de las características de los diferentes alelos se puede ver en el cuadro 5 para el caso del microsatélite LMCH16. Se pueden ver individuos homocigotos, heterocigotos, y las diferencias con la Atemoya y A. nutans para este microsatélite. SB 103 es una chirimoya repatriada. Los códigos A y B señalan a plantas de huertos antiguos y C a plantas de huertos nuevos.
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Cuadro 5. Alelos encontrados para el microsatélite LMCH16 en 38 individuos. LMCH16 LMCH16 LMCH16 LMCH16 LMCH16 LMCH16 ACCESIÓN 198 pb 216 pb 218 pb 220 pb 222 pb 230 pb 1 A 216 218 2 A 222 230 3 A 218 230 4 A 216 218 5 A 216 230 6 A 216 222 7 A 216 230 8 A 216 9 A 216 222 10 A 218 222 11 A 218 12 A 216 222 13 A 216 14 A 218 222 15 A 216 222 16 A 218 222 17 A 216 222 18 A 216 19 A 216 218 20 A 216 222 1 B 216 230 2 B 230 3 B 218 230 4 B 222
5 B 222 230 6 B 222 7 B 222 8 B 216 218 9 B 216 230 10 B 216 222 1 C 216 218 2 C 218 230 3 C 218 230 4 C 216 230 5 C 216 218 SB 103 216 ATEMOYA 218 220 A. nutans 198
5.5.1. Número promedio de alelos por locus microsatélite Toda la colección boliviana presenta un promedio de 4.45 alelos por locus. Se encontró un total de 89 alelos para los 20 microsatélites. El microsatélite con mayor
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número de alelos es LMCH4 con ocho alelos, y los microsatélites con menor de número de alelos son LMCH83, LMCH91 y LMCH131 con dos alelos cada uno.
5.5.2. Heterocigosidad (He) e Índice de contenido polimórfico (PIC) En el cuadro 6 se muestra el índice de heterocigosidad y el índice de contenido polimórfico calculado para los veinte microsatélites utilizados en todas las accesiones de chirimoya boliviana. Todos los microsatélites son polimórficos, observándose que cada microsatélite muestra un variable grado de polimorfismo. El microsatélite LMCH16 tiene los índices más altos, por lo que se puede considerar que es uno de los más informativos, con los alelos y sus frecuencias alélicas bien conservadas.
Cuadro 6. Coeficiente de Heterocigosidad (He) y PIC para cada microsatélite.
SSR N° de alelos He PIC LMCH1 5 0,428 0.341 LMCH4 8 0,584 0.520 LMCH6 7 0,689 0.630 LMCH16 5 0,728 0.678 LMCH36 3 0,527 0.470 LMCH39 4 0,483 0.378 LMCH40 3 0,46 4 0.360 LMCH48 4 0,388 0.320
LMCH63 4 0,426 0.366 LMCH69 5 0,622 0.576 LMCH83 2 0,426 0.335
LMCH87 5 0,591 0.520 LMCH91 2 0,480 0.365 LMCH102 7 0,652 0.588 LMCH106 3 0,495 0.385 LMCH122 4 0,429 0.362 LMCH131 2 0,497 0.374 LMCH137 6 0,569 0.513 LMCH139 6 0,683 0.628 LMCH144 4 0,426 0.347 TOTAL 89
Se calculó la heterocigosidad promedio de todas las accesiones bolivianas de chirimoya, y se obtuvo un valor de 0,529. Este resultado estima que la variabilidad genética de toda la colección es alta. DE VICENTE y FULTON (2004) señalan que la
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He promedio de todos los loci es una estimación del grado de variabilidad genética en la población, y que este valor se maximiza cuando hay muchos alelos cuyas frecuencias son iguales. En este caso las frecuencias halladas son variables a causa de la existencia de una cantidad importante de alelos raros y poco frecuentes, y por ello los valores de heterocigosidad no muestran un valor muy elevado. Estos alelos raros se podrían considerar endémicos por encontrarse en sitios muy localizados.
5.6. Análisis de conglomerados Mediante el coeficiente de similitud de Jaccard, y el programa NTSYSpc 2.10, se construyó una matriz de similitud para las 419 accesiones (ver todo el dendograma en Anexo F). Para el análisis de las muestras de la colección boliviana, se construyó una matriz solamente de las chirimoyas bolivianas y se generó la siguiente matriz de similitud (cuadro 7).
Cuadro 77.... Vista parcial de la matriz de similitud entre accesiones bolivianas. 41 B 42 B 43 B 44 B 45 B 46 B 41 B 1.0000000 42 B 0.4375000 1.0000000 43 B 0.3333333 0.3076923 1.0000000 44 B 0.6000000 0.4722222 0.4375000 1.0000000 45 B 0.5294118 0.5000000 0.5333333 0.5526316 1.0000000 46 B 0.4705882 0.5526316 0.3571429 0.4864865 0.5135135 1.0000000 47 B 0.2500000 0.5250000 0.3333333 0.4615385 0.4871795 0.3783784 48 B 0.5555556 0.6250000 0.5625000 0.4864865 0.5135135 0.5641026 49 B 0.4375000 0.4285714 0.4285714 0.4375000 0.5333333 0.5625000 50 B 0.5000000 0.5135135 0.5000000 0.4444444 0.4722222 0.5263158 51 B 0.5714286 0.5789474 0.6500000 0.4210526 0.7142857 0.7272727 52 B 0.6666667 0.4375000 0.6111111 0.2500000 0.6842105 0.7000000 53 B 0.6190476 0.5250000 0.7000000 0.5714286 0.5952381 0.6046512 54 B 0.5789474 0.4210526 0.5882353 0.4358974 0.5365854 0.5476190 55 B 0.4117647 0.5000000 0.5882353 0.4117647 0.7368421 0.6842105 57 B 0.6111111 0.7317073 0.7777778 0.5675676 0.6666667 0.5277778 Basándose en la matriz de similitud obtenida, se construyó un dendograma utilizando el método de ligamiento promedio (UPGMA por la sigla en inglés de Unweighted Pair-group with Arithmetic Mean). En la figura 12 se observa un detalle del diagrama de árbol o dendograma. Se observa que existe una estructura genética en toda la
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colección. La similitud entre accesiones varía desde 0 a 1. El dendograma completo se puede ver en la figura F1, Anexo F.
39A 89A 110A 26B 79A 68B 27A 88C 28A 82A 60C 105A 55C 58C 42C 36B 44C 26C 53C 99C 14C 42A 175A 195A 56C 160A 161A 168A 52C 166A SB103 CHO 164A 70B 45B 65A 78B 27B 94A 181A 182A 194A 17B 46B CUM 172A 37A 50C BON 76C 59C SB202 31B 101B CAM PAZ FIN CHIU ATE A.NUT 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00 Coeficiente de Similitud - Jaccard (J) Figura 112222.... Vista parcial del dendograma obtenido para las 419 accesiones.
En este dendograma también se observa que A. nutans se separa completamente de todo el grupo, precisamente porque se diferencia genéticamente al ser una especie diferente, pues la mayoría de sus alelos son exclusivos de esta especie.
A continuación se observa a la Atemoya, que siendo un híbrido, tiene una similitud, menor a 0,1 y la más alejada en su similitud respecto a todas las chirimoyas. También se puede observar que varias accesiones españolas se agrupan entre sí, pero se puede notar que entre ellas se encuentran accesiones bolivianas. Por otro lado, las accesiones repatriadas, se distribuyen por los diferentes grupos del dendograma, integrándose a las accesiones colectadas según su similitud.
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En la figura 13 se muestra una vista total del dendograma para las 419 accesiones, y se muestra una estructura genética definida, y una diversidad genética elevada.
1C1A 16C15C 17C 13B 56ASB116 68A200A 12B93B 96B 6B26A 53A32A 127A36A 37C43A 5C8B 10C9C 196ASB109 7A186A 29C30A 93A111A 13C2B 128A 38C130A 22C6A 23C134A 87A21A 86A29A 7C95B 67A SB118 SB119SB203 69ASB122 63C84A 34B150A 12A 135A98A 81A18C 112A82B 73B1B 20B3B 146A33A 71A58A 4A99B 83ASB126 25C35B 87C86C 91C90C 96C 82CSB103 116A41A 143A142A 79C144A 93C 123A 145A40B 91A28C 165A126A 129A95C 81C38B 39C177A 40C 94C83C 69C190A 141A28B 85C83B 64A35A 37B47A 140A138A SB124149A 84B49A 58B57A 92A3A 12C 55A19C 132A122A 43B133A 18B 10A 61B77A 64B62B 24ACHA 101A106A 102A103A 137A136A 24C76B 100A 51A63B 61A54A 36C62A 27C9B 88A85A 5A25B 4C14B 80B74B 98C97C 19A100C 46C86B 54C97B 25A 113A74A 49C 30C 35C34C 33C32C 60A77B 178A75A 153A43C 179A171A 70ASB108 163A39B 71B11B 199A 2A72B 8C131A 20C11C 99A119A SB103 191A44A 97A95A 52A65B 5B81B 48C33B 76A50A 155A51B 184A 78A 21B 120A63A 162A3C 54B176A 72A89C 157A156A 59B170A 80A21C 66B29B 167A67B SB117174A 152A 158A 173A 71C64C 169A115A 2C48B 19B6C BRO56B 34A8A 15B154A 117A40A 185A59A 10B96A 50B41C 45C 75B69B 118A114A 124A121A 125A79B 7B51C 60B11A 32B49B 52B44B 197A188A 16B 159A 192A189A 42B 4B9A 20A18A 88B31A 89B92B 98B90B 66A102B 30B147A 46A13A 48A23A 107A90A 109A108A 80C 65C70C 72C68C 77C74C 75C61C 78C66C 73C104A 53B22B 38A17A 62C 139A 183A24B 23B94B 193A92C 55B 187A151A 41B180A 57B47B 57C47C 16A14A 22A73A SE02885B 198A31C 39A15A 110A89A 79A26B 68B 88C27A 82A28A 105A60C 58C55C 36B42C 26C44C 53C 99C 42A14C 195A175A 160A56C 168A161A 52C CHO166A 70B164A 65A45B 27B78B 181A94A 194A182A 46B17B 172ACUM 50C37A 76CBON SB20259C 31B CAM101B FINPAZ ATECHIU A.NUT 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Coeficiente de Similitud - Jaccard (J) Figura 13. Vista total del dendograma con las 419 accesiones analizadas.
La similitud entre las accesiones varía entre 0 y 1. Como se observó en la figura 9, la mínima similitud corresponde a A. nutans , que se separa totalmente de todas las demás accesiones. El rango de similitud entre las chirimoyas está entre 0.21 y 1, lo que indica una alta diversidad genética entre chirimoyas.
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5.6.1. Análisis de conglomerados de las chirimoyas bolivianas Se hizo el análisis del conjunto total de chirimoyas bolivianas. El dendograma resultante se observa en la figura 14.
47BLIS41BTUB 193ALMO55BIMP180A 192A42BIMP159A 32B44BUMB 60BIMP49B52BTUB 188A197A11A 58BTUB185A171A 133A43BUMB189A 19C12C18B 122A55A3A 3B20B132A 33A73B1B 71A58A146A 126A165A99BIMP 91A95C 81C38B129A 40C39C177A 190A94C83C 4A28B69CLIS 87C86CSB126 91C90C SB10396C25C 116A41A82C 93C144A79C 123A142A143A 141A145A40B 85C83B 114A121A124A 34B79B118A 35A28C150AIMP 83A47A64A SB124149A63C 37B140A138A 57A84B49A 25B88A85A 154A19B186A 23C15B82B 12A18C 112A135A98A 68A56A200A 96B12B93B 17C16C15C 13B1A1C 26ASB116 53A32A6B 9C10C196ALML 8B37C5C 43ASB10935B 6A127A36A 134A22C 7A29C30AIMP 2B13C111A 130A128A93A 21A29A38C 7C86A87A SB11867A95B SB122SB119SB203 24A84A69A 103A81A106A 136A102A101A 24C137A 63BTUB100A76BIMP 64BMAT77A10A 8A62BTUB61BTUB 61A54A34A 36C62A51A 27C9B SB108179A153A 60A43CTUB178A 74A25A75A 54C49C113A 196ALML 86B19A97B 34C30C77B 33C32C35C 70A92A163A 71B11B39B SE02885B22A 2C48BLIS 176A54BMAT6C 120A63A3C 21C59BTUB89C 156A157A170A 152A158A72A 64C173A SB117174A71CLIS 66B29B80A 187A151A67BMAM 51BUMB115A169A 184A155A76A 50A78A 21B46CUMB167A 48C33B5B 191A81B52A 97A95A44A 94B183A65BIMP 107A90A48A 13A23A108A 72CLIS65C46A 68C77C74CLIS 109A80C70CLIS 75C61C 17A78C66C 11C62C38A 2A8C20C 99A119A131A 66A9A4B 30B147A 31A20A18A 89B88B92B 102B98B90B 65A94A181A 199A27B78BIMP 4C72B 74B14B5A 100C98C97C 40A80B125A 96A59A117A 16A14A46BUMB 50B198A73A 41CUMB10B45CIMP 37A69B75BIMP 56C195A50C 28A42A175A 88C27A 105A60C82A 42CTUB58C55C 15A44CUMB36B 110A89A39A 68BIMP79A26B 24B53BIMP14C 139A56BIMP22B 92C23B51C 26C53C99C 57BIMP104A73CLIS 57C47CNOF 70B164A45BIMP 52C168A16B 166A160A161A 162A17B172A 76C194A182A 59C7B31C 101BIMP31BSB202 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00 Coeficiente de Similitud - Jaccard (J)
Figura 14. Vista del dendograma de 407 accesiones de chirimoya boliviana.
En este caso la similitud entre las accesiones varía entre 0.21 y 1, lo que indica un alto grado de diversidad en el conjunto total de las chirimoyas bolivianas. En la figura 15 se muestra un detalle parcial del mismo dendograma obtenido.
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Figura 15. Vista parcial del dendograma de 407 accesiones de chirimoya boliviana.
Se observa la agrupación de las accesiones por su similitud. El código de las accesiones colectadas para el estudio de diversidad genética, termina en una letra (A. B, C). El código de las accesiones repatriadas de España empieza con las letras SB; se puede ver una accesión repatriada, SB202, que junto a otras colectadas, están más alejadas por su similitud.
Se puede observar que la agrupación de las accesiones por su similitud, no tiene variación importante al quitar del análisis las accesiones que no corresponden a Bolivia, respecto al dendograma observado del total de las 419 accesiones (Ver Figura 9).
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5.6.2. Análisis por grupos de individuos: plantaciones antiguas y recientes Se ha realizado el análisis, tomando en cuenta el muestreo realizado por grupos de individuos, denominados A, B y C respectivamente que se detalla a continuación.
El grupo A corresponde a los valles próximos entre sí, entre los departamentos de Cochabamba y Santa Cruz, donde existe el cultivo de chirimoya en una superficie importante y con una mayor intensidad respecto al resto del país. El grupo B corresponde a muestras de cinco departamentos bolivianos, lo que servirá para realizar el estudio a nivel nacional. A y B son grupos muestreados en plantaciones antiguas, llamadas también plantas semicultivadas, porque crecen con poca intervención humana. La mayor parte de las plantas de chirimoya en Bolivia son semicultivadas.
Las plantas del grupo C son jóvenes, con una edad de alrededor de 7 años, llamadas cultivadas porque reciben mayores cuidados de parte de los agricultores. Otra característica de este grupo es que son individuos seleccionados, y en ocasiones frecuentes son injertos de un mismo genotipo en la misma parcela. En Bolivia no existen muchos sitios de plantaciones nuevas. En cada grupo muestreado se asignó un número equilibrado de accesiones por cada zona colectada, de esta manera la muestra es representativa.
A continuación se presenta el análisis de conglomerados para cada uno de los 3 grupos mencionados de chirimoya. Se pretende mostrar la existencia de una estructura genética diferente entre grupos de individuos.
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Grupo A El grupo A comprende plantas de huertos tradicionales de cinco municipios: Independencia (50 individuos), Mizque (49 individuos), Aiquile, (50), Saipina (30), y Comarapa (19). Con la matriz de similitud de este grupo se generó un dendograma que se muestra en la figura 16, para conocer su estructura genética.
162A172A 171A182A 153A185A 197A179A 170A188A 156A157A 72A 161A168A 151A160A 180A187A 115A169A 173A167A 152A158A 80A174A 44A191A 95A52A 59A97A 96A125A 165A 91A126A 26A129A 77A10A 122A11A 55A132A 190A163A 92A3A 177A178A 60A194A 176A75A 120A63A 186A 47A35A 138A83A 49A140A 57A64A 70A65A 184A155A 78A76A 200A50A 29A56A 21A68A 86A87A 25A 113A74A 53A32A 7A30A 130A111A 128A93A 61A54A 62A51A 84A69A 172A 24A67A 81A106A 101A103A 102A 82A38A 136A112A 5A137A 8A100A 183A43A 127A36A 134A6A 23A196A 46A13A 90A48A 108A107A 109A 17A139A 146A33A 71A58A 149A141A 195A150A 41A22A 145A116A 142A143A 123A144A 114A121A 124A118A 154A 18A34A 79A20A 27A28A 98A12A 19A135A 4A105A 110A1A 31A14A 73A16A 39A15A 85A89A 88A 94A181A 99A9A 2A133A 119A131A 147A66A 159A164A 192A193A 189A199A 42A175A 40A37A 166A117A 198A 104A 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Coeficiente de Similitud - Jaccard (J) Figura 116666.... Vista del dendograma obtenido para las accesiones del grupo A.
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Se observa una estructura genética, formando grupos de accesiones por su grado de similitud. La similitud más lejana es de 0.32. Esto muestra el grado de diversidad que tiene este cultivo.
Visualizando una sección del dendograma de la figura 16, se puede observar que hay un probable duplicado entre las accesiones 142A y 143A como se puede ver en la Figura 17. Este es el único caso de probable duplicado entre las accesiones de plantaciones antiguas. Ambas accesiones pertenecen a la misma parcela y están próximas entre sí, ubicadas en el Municipio de Comarapa. En este caso podría contemplarse hacer nuevamente el muestreo en estas plantas para verificar el análisis.
Figura 17. Vista parcial del dendograma para accesiones del grupo A. Se observa un posible duplicado entre las accesiones 142A y 143A.
Una vista del dendograma identificando los municipios de donde provienen las muestras, muestra agrupaciones que se mezclan parcialmente entre sí, por su grado de similitud, lo que se muestra en la Figura 18.
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AIQ AIQ COM COM COM IND MIZ MIZ SAI COM COM COM COM SAI SAI SAI SAI SAI IND MIZ MIZ MIZ AIQ MIZ MIZ MIZ AIQ COM MIZ SAI MIZ MIZ SAI IND MIZ MIZ MIZ AIQ MIZ MIZ AIQ AIQ AIQ IND AIQ MIZ AIQ COM MIZ COM SAI AIQ COM IND IND IND IND IND IND IND MIZ MIZ MIZ SAI IND IND SAI 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00 Coeficiente de similaridad - Jaccard (J)
Figura 18. Vista parcial del dendograma del grupo A mostrando su identificación por provincias: Independencia, Mizque, Aiquile, Saipina y Comarapa.
Se observa en la estructura del dendograma que hay grupos pequeños provenientes del mismo municipio, pero varios grupos no se presentan bien definidos, mezclándose con accesiones de otros sitios. Por lo tanto, hasta el momento este análisis no presenta suficiente información para conocer la estructura genética de la población.
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Grupo B Las accesiones del grupo B, provenientes de cinco departamentos de Bolivia también fueron analizados de la misma manera.
Este grupo comprende plantaciones antiguas de cinco departamentos de Bolivia: La Paz con 20 individuos: Municipios de Sorata (10 individuos) y Cairoma (10). Cochabamba 20 individuos: Municipios de Independencia (6), Mizque (8), Aiquile (6). Santa Cruz 19 individuos: Municipios de Saipina (13), Comarapa (6) y Trigal (1). Chuquisaca 24 individuos: Municipios de Icla (20) y Villa Abecia (4). Tarija 20 individuos, todos del Municipio de Padcaya.
En el dendograma obtenido para este grupo, se observa una estructura genética, con una similitud mínima de 0.21. También se puede ver una mezcla de accesiones por su origen geográfico (figura 19).
Cairoma VillaAbecia Mizque Comarapa Comarapa Icla VillaAbecia Comarapa Comarapa Icla Padcaya Padcaya Saipina Icla Icla Icla Mizque Aiquile Padcaya Padcaya Aiquile Padcaya Aiquile Padcaya Saipina Independencia Comarapa Padcaya Padcaya Padcaya Padcaya Icla Icla Padcaya Independencia Icla Icla Icla Icla Icla Icla Sorata Padcaya Independencia Mizque Trigal Cairoma Independencia Saipina Padcaya
0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Coeficiente de Similitud - Jaccard (J)
Figura 19. Vista parcial del dendograma para accesiones del grupo B.
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Grupo C Este grupo comprende plantaciones recientes, con plantaciones jóvenes llamadas también cultivadas, de dos departamentos de Bolivia: Cochabamba 20 individuos del Municipio de Mizque. Santa Cruz 77 individuos: Municipios de Saipina (19), Comarapa (39), y Vallegrande (20). Estas accesiones se analizaron para graficar su relación, como se ve en la figura 20.
Mizque Mizque Mizque Mizque Mizque Mizque Mizque Mizque Mizque Comarapa Comarapa Comarapa Comarapa Comarapa Mizque Saipina Comarapa Comarapa Comarapa Comarapa Comarapa Comarapa Comarapa Comarapa Comarapa Comarapa Comarapa Comarapa Comarapa Comarapa Saipina Comarapa Mizque Mizque Mizque Comarapa Mizque Mizque Mizque Comarapa Mizque Mizque Comarapa Comarapa Comarapa Mizque Vallergrande Vallergrande Comarapa Vallergrande Comarapa Comarapa Comarapa Comarapa Vallergrande Vallergrande Comarapa Comarapa Comarapa Vallergrande Comarapa Vallergrande Vallergrande Vallergrande Mizque Vallergrande Vallergrande Vallergrande Vallergrande Vallergrande Comarapa Vallergrande Vallergrande Vallergrande Vallergrande Comarapa Comarapa Saipina Saipina Saipina Saipina Saipina Saipina Comarapa Saipina Saipina Saipina Saipina Saipina Saipina Saipina Vallergrande Vallergrande Saipina Saipina Saipina Saipina Comarapa Vallergrande 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00 Coeficiente de similaridad - Jaccard (J) Figura 20. Dendograma correspondiente a las accesiones del grupo C (plantaciones recientes).
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Se observa que existe una estructura genética definida, mostrando pequeños grupos relacionados por su origen geográfico, aunque estos grupos se entremezclan entre sí de manera parcial. Visualizando en el dendograma desde la parte inferior, predomina un grupo de Saipina, luego está Vallegrande, en la parte superior Comarapa, Saipina y Mizque, entremezclándose en grupos pequeños.
En este grupo existen varias accesiones posiblemente duplicadas. La razón principal se debería a que muchos huertos establecidos en los últimos años poseen injertos, especialmente de cultivares seleccionados. Muchos agricultores han empezado a seleccionar sus cultivares y han injertado el mismo cultivar sobre patrones obtenidos vía semilla sexual.
En todos estos casos, para seleccionar una población representativa, se tomaría en cuenta solamente a uno de los individuos que se muestran como duplicados. Este procedimiento se realizaría en la formación de una colección núcleo.
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5.7. Análisis de coordenadas principales En base a la matriz de similitud, se generó el gráfico de coordenadas principales, a fin de aumentar criterios para el análisis de la colección. Para visualizar este gráfico, en este caso se ordenó las accesiones de acuerdo a su orden geográfico, correspondiendo el número 1 al extremo noroeste (La Paz), y el último al extremo sudeste (Tarija). Aparentemente existe poca relación de agrupamiento por el origen geográfico entre todas las accesiones como se puede ver en la figura 21.
0.51 345 24
315 386 350 381 28 312313 376 356 6 54353 15 372 337 67 267 343404 137 402 16 387 167 72 232 0.26 192 354 11 405 79 140 400 406 68 2661 403 1 12 203383119 395417 230 34 55 240 87 371 102 396 382355 126 358 183 20 365 340 348 165 394 171 366 399 373 352 336 142 412418 143 341 349 397 413 185347 205108 98 389 398 49 7 238 110 80 390186 209 249 278111 385 114 75 35 94 36 9 112 107 40 2684 33962 131 70 14 351 22 27 33 414 89 181 325 263 24321 234 17 32 122177 41 12499 180 265324 84 13 33443 304 388 173 393 97 152 118 322326 59 135 198 229 60 93 88 123 4673 266 7458 10 53 63 364 16835927692 375 2 338380346 56 179 23 156 391 42 207 158195 357 392327 226 210 178 11581 256 144 2533 164 307 410163 130 274 250 148 269 155 38 134 184 82161 160 71 360 211 342 314 0.02 95 303 199 411 C2 96 121 233 204 138 51 377 368 174 275 52 208 150 36130 104271 331159 248 370 328 193 330 202 120 166273 117 170 5 25218 283206196 215 221 78 294344 14157132 18 260 105369 8 224225 39 50 223 246 125 9091101 188 172 162 85 335401 187 127 86 77 191 64 157277 182 258 323 259 136 139 419 109 409 128 190 83237 317 228 231 37 384 116 408113 76 220222 19 103 153 279 245 262 197 194 320 374 261146 45 363 296 264 257 219 213 66 239 151280 48284 176 227292308 295 31 235 214 216 100106 169 242 329 201 47 236 362 44 321 287 129 379 133 252 316 149 332 270 147 69 -0.23 28265 154 175 212 241 189 407 300 311 254 200 298 29 378 251 285 309 289 367 293 286 288291 299 333 310 255 290 244 272 145 281 416 318415 217 247 301302305306 297 319
-0.48 -0.43 -0.19 0.04 0.28 0.52 C1 Figura 21. Análisis de coordenadas principales para las 419 accesiones.
Las accesiones se ven principalmente dispersas sin formar grupos definidos. Para continuar con el análisis de manera más detallada, se dividen en grupos de la misma manera que con el análisis de conglomerados, en diferentes niveles geográficos y de manejo.
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5.7.1. Análisis por grupos de individuos: plantaciones antiguas y recientes De la misma manera que en el análisis de conglomerados, se ha realizado el análisis tomando en cuenta el muestreo realizado por grupos de individuos, denominados A, B y C respectivamente.
Grupo A El grupo A comprende a plantaciones antiguas de cinco municipios: Independencia (50 individuos), Mizque (49 individuos), Aiquile, (50), Saipina (30), y Comarapa (19). Estos municipios están relativamente próximos entre sí, de manera que se esperaría la tendencia a un comportamiento genético de homogeneidad.
Esto se puede ver en el análisis de componentes principales, donde se busca encontrar una relación de la estructura genética con la distribución geográfica de plantas, ilustrada en la figura 22.
0.50 AIQ AIQ MIZQUE - AIQUILE IND AIQ AIQ AIQ AIQ AIQ AIQ AIQ COM MIZ IND AIQ IND 0.25 AIQ AIQ COM SAI MIZ MIZ MIZ AIQ COMIND COM IND SAI MIZ IND COM INDEPENDENCIA IND AIQIND AIQ AIQ AIQ AIQ AIQ IND MIZ COM IND IND MIZ MIZ COMARAPA AIQ IND AIQ MIZAIQ SAI IND COM MIZCOM MIZ AIQ SAIIND SAI IND AIQ AIQ MIZ IND MIZ AIQ IND IND COM MIZ AIQ AIQ MIZ MIZ SAI COM MIZ AIQ IND AIQ MIZ MIZMIZ MIZ AIQ IND MIZ MIZ AIQ MIZ COMMIZ IND IND AIQ IND MIZ MIZ SAI MIZ SAI COM AIQ IND IND -0.01 MIZ MIZ AIQ C2 AIQ MIZ SAI MIZ COM IND AIQAIQ MIZ AIQ IND AIQ IND AIQ IND MIZ SAI IND IND AIQ COM AIQ MIZ SAI IND IND COMIND AIQ IND IND IND MIZ IND MIZAIQ IND IND MIZ AIQ MIZ IND IND MIZ SAI MIZ MIZ MIZ IND IND SAI COM SAI SAI IND AIQ SAI IND MIZ SAI IND MIZ SAI SAI AIQ MIZ MIZ SAI SAI SAI AIQ MIZ SAI -0.26 MIZ SAI AIQ COM IND
SAI SAI IND IND COM SAI SAI SAIPINA SAI SAI
-0.51 -0.43 -0.19 0.05 0.29 0.53 C1
Figura 22. Análisis de coordenadas principales para plantaciones antiguas (grupo A).
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Se observa una estructura genética definida, distinguiéndose grupos relacionados por su origen geográfico, aunque los grupos se entremezclan formando intersecciones profundas. El grupo de Comarapa es el único que forma intersección con todos los demás. Según ese resultado se puede sugerir que Comarapa es un centro de diversidad de chirimoya, ya que comprende parte de la diversidad de los municipios vecinos.
Grupo B El grupo B comprende plantaciones antiguas de cinco departamentos de Bolivia: La Paz con 20 individuos: Municipios de Sorata (10 individuos) y Cairoma (10). Cochabamba 20 individuos: Municipios de Independencia (6), Mizque (8), Aiquile (6). Santa Cruz 19 individuos: Municipios de Saipina (13), Comarapa (6) y Trigal (1). Chuquisaca 24 individuos: Municipios de Icla (20) y Villa Abecia (4). Tarija 20 individuos, todos del Municipio de Padcaya.
En el análisis de coordenadas principales se puede ver la relación que existe con el origen geográfico de las accesiones. La figura 23 muestra dicha relación. 0.39 Sorata Trigal Independencia Cairoma VillaAbecia SorataIndependencia Icla Cairoma Cairoma LA PAZ CairomaSorata Cairoma Mizque Cairoma Saipina Mizque Cairoma Saipina Cairoma Sorata Sorata Mizque 0.19 CHUQUISACA Icla Icla Icla Saipina Sorata Icla Saipina Sorata Saipina Icla Independencia Cairoma Icla Icla SorataMizque Icla Icla Saipina Independencia Icla Saipina Sorata MizqueSaipina Icla Padcaya Icla -0.01 C2 Saipina Icla Icla Sorata Mizque Aiquile Icla VillaAbecia Saipina Saipina VillaAbecia Saipina IndependenciaPadcayaIcla Padcaya Padcaya Aiquile Comarapa Comarapa Independencia Padcaya Padcaya CairomaAiquileAiquile Mizque VillaAbecia Aiquile Padcaya Icla Padcaya Aiquile CBBA – STA CRUZ Padcaya -0.22 Comarapa Padcaya Icla Icla Comarapa Padcaya Padcaya Saipina Mizque TARIJA Padcaya Padcaya Comarapa Padcaya
Comarapa -0.42 -0.46 -0.22 0.03 0.27 0.52 C1
Figura 23. Análisis de coordenadas principales para plantaciones antiguas (grupo B).
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Se puede observar que existe relación por el origen geográfico de los individuos, con los grupos que se entremezclan formando intersecciones. Sin embargo en las accesiones provenientes del departamento de Chuquisaca, su agrupación forma una intersección con todos los grupos. Esto muestra la probabilidad de que los valles de Chuquisaca posean mayor diversidad a nivel nacional, lo que debe analizarse buscando la relación y distribución de esa diversidad en estas zonas.
Grupo C En la figura 24 se muestra el dendograma resultante del análisis del grupo C, mostrando además el origen geográfico de cada accesión cultivada. 0.57 Comarapa Vallegrande Vallegrande Vallegrande Comarapa
Vallegrande VallegrandeComarapaVallegrande VallegrandeVallegrande 0.31 Vallegrande Vallegrande Vallegrande VALLEGRANDE Mizque Comarapa Vallegrande ComarapaComarapa Vallegrande Comarapa VallegrandeVallegrande Vallegrande Saipina Mizque Vallegrande Mizque Mizque Mizque Mizque Vallegrande Mizque MizqueComarapa Vallegrande 0.05 Saipina C2 Saipina ComarapaComarapaComarapaMizque Mizque Saipina Mizque Vallegrande SaipinaComarapa Saipina Saipina COMARAPA Saipina Saipina Mizque Comarapa Mizque Saipina Comarapa Saipina Comarapa Comarapa Mizque Saipina SaipinaSaipina Comarapa Saipina Saipina Comarapa MizqueMizqueMizque ComarapaComarapa Comarapa -0.20 ComarapaComarapa Comarapa Saipina Comarapa Comarapa Saipina Comarapa SAIPINA Comarapa ComarapaComarapa Comarapa Comarapa
-0.46 -0.66 -0.41 -0.15 0.10 0.36 C1 Figura 24. Análisis de coordenadas principales de accesiones del grupo C mostrando su origen geográfico. Se observa un agrupamiento de accesiones por su origen geográfico. Es importante notar que aunque estas son plantaciones nuevas y con un nivel de manejo agronómico para la producción comercial, el nivel de diversidad es alto, similar a los
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huertos tradicionales donde predominan plantas antiguas. Sin embargo, por ser plantaciones con cultivares seleccionados, existe una presión de selección que tiende hacia la reducción de la diversidad genética.
5.7.2. Diversidad morfológica de frutos de chirimoya Por último se realizó el análisis multivariado de un grupo de accesiones reducido de los que en la oportunidad de colecta se pudo registrar el tipo de fruto por la forma botánica. En la figura 25 se puede ver el resultado del análisis de coordenadas principales para la forma del fruto de 47 árboles de chirimoya de los municipios de Sorata (8 individuos), Cairoma (10), Independencia (2), Mizque (1), Saipina (6), Comarapa (1), Vallegrande (7), Icla (10) y Padcaya (2). Las accesiones tienden a agruparse por el tipo de fruto, lo que significa que este análisis puede ser útil al realizar la selección de individuos por características de interés como la forma de fruto. Este resultado sugiere que es posible utilizar este análisis para encontrar grupos de individuos con características importantes.
0.39 47C_NOF 47B_LIS
55B_IMP 193A_LMO 42C_TUB 57B_IMP 41B_TUB 99B_IMP 41C_UMBUMBONATA 46B_UMB 59B_TUB IMPRESA 73C_LIS 42B_IMP 44C_UMB 0.15 72C_LIS74C_LIS 46C_UMB 150A_IMP 43C_TUB 43B_UMB 56B_IMP 44B_UMB 45C_IMP LISA 58B_TUB 101B_IMP 54B_MAT 60B_IMP 53B_IMP 68B_IMP196A_LML 45B_IMP C2 -0.09 51B_UMB TUBERCULATA MAMILLATA 70C_LIS 69C_LIS 67B_MAM 52B_TUB 48B_LIS 30A_IMP 71C_LIS 64B_MAT 76B_IMP 78B_IMP63B_TUB 75B_IMP -0.34 61B_TUB 65B_IMP 62B_TUB -0.58 -0.69 -0.39 -0.09 0.20 0.50 C1 Figura 2525.... Análisis de coordenadas principales de accesiones por la forma botánica del fruto.
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Por otra parte, la estructura genética observada en todos los análisis observados, es un efecto de la forma de reproducción que presenta la chirimoya, por la dicogamia explicada por GUIRADO et al . (2002).
5.8. Análisis de distribución geográfica Se realizó un análisis de todas las accesiones utilizando su ubicación geográfica. Cada individuo de la colecta tiene un punto geográficamente referenciado. Algunas zonas tienen mayor abundancia de accesiones colectadas, sin embargo con el programa DIVA-GIS Versión 5.2.0.2 se efectuó el análisis de distribución de las accesiones, y posteriormente la diversidad y riqueza de alelos en el espacio geográfico estudiado.
En la Figura 26 se muestra los sitios de recolección por su ubicación geográfica.
Figura 226666.. Distribución de los puntos de colecta de chirimoya. Se observa puntos de colecta desde el noroeste de Bolivia al norte del departamento de La Paz, pasando por el departamento de Cochabamba, Santa Cruz, Chuquisaca y
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Tarija, hasta el Sudeste del país. Aunque la colecta muestra cierta dispersión en los puntos de colecta, los análisis realizados han permitido conocer las zonas de mayor diversidad de chirimoya.
5.8.1. Abundancia de accesiones colectadas por municipio En la Figura 27 se puede observar la abundancia de accesiones colectadas a nivel nacional, considerando los municipios, mediante celdas (grids en inglés).
Figura 227777.... Abundancia de accesiones colectadas expresada en celdas. El color rojo indica mayor abundancia y el verde oscuro menor abundancia.
Los colores rojo y naranja evidencian que la colección se centró principalmente en cuatro municipios: Mizque y Aiquile del Departamento de Cochabamba, luego Saipina y Comarapa del Departamento de Santa Cruz de la Sierra. Estas zonas
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tienen la mayor cantidad de muestras en la colecta. Por otro lado, es una de las pocas zonas en el país con varios huertos jóvenes y manejo de tipo comercial.
5.8.2. Diversidad alélica para cada microsatélite Se estimó la diversidad de cada locus microsatélite utilizando el coeficiente de similitud de Jaccard, obteniendo una distribución particular para cada locus microsatélite en la colección boliviana. En la Figura 28 se observa la distribución geográfica para el microsatélite LMCH6.
Figura 28. Diversidad del microsatélite LMCH6 evaluada en la colección boliviana.
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Se observa mayor diversidad del microsatélite LMCH6 en los municipios de Independencia, Saipina y Comarapa.
En la Figura 29 se muestra otro ejemplo de la diversidad de alelos, para el microsatélite LMCH1.
Figura 29. Diversidad del microsatélite LMCH1 evaluada en la colección boliviana. En este caso existe mayor diversidad de este microsatélite con tendencia a distribuirse hacia el sur de Bolivia.
Este análisis muestra que cada microsatélite tiene una diversidad expresada en diferentes sitios geográficos de manera particular. Además corrobora el hecho de
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que existen zonas como Independencia en Cochabamba, Sorata y Cairoma en La Paz, y especialmente los valles de Chuquisaca y Tarija que encierran una diversidad única, que se expresa en los patrones de diversidad alélica encontrados. Por otra parte este estudio coincide con el modelo de distribución potencial de chirimoya realizado por CASTANEDA et al . (2009), donde se identifica principalmente a una gran parte del departamento de Chuquisaca como nicho de mayor probabilidad para el desarrollo de chirimoya. Por último, luego de realizar colectas adicionales y en las zonas mencionadas, faltará determinar la posibilidad de considerar la hipótesis de que los valles bolivianos serían el centro de origen y domesticación primario de la chirimoya.
5.9. Contribución a la formación de una colección núcleo A partir de los resultados obtenidos y en base a los análisis realizados es posible iniciar el proceso de formación de una colección núcleo. Sin embargo se debe considerar aspectos importantes al trabajar con las poblaciones de chirimoya. - La identificación de duplicados por medio de este estudio, permite seleccionar genotipos únicos. Esta búsqueda de duplicados se hizo en el dendograma correspondiente. Todas las accesiones duplicadas pertenecen a los Municipios de Comarapa y Mizque, y son las parcelas donde hay una cantidad importante de plantaciones con injerto de cultivares seleccionados localmente. En el dendograma general total (anexo F) se pueden visualizar las accesiones duplicadas. - Distribución geográfica. Considerar el agrupamiento de accesiones por zonas geográficas tendría prioridad para seleccionar la colección núcleo. - Características agronómicas y evaluaciones. Como se ha visto en el análisis el agrupamiento de accesiones por la forma del fruto, también es imprescindible considerar el análisis complementario con la caracterización morfológica y evaluaciones respecto a respuestas a factores abióticos y bióticos. Complementar la caracterización morfológica, bioquímica, biogeográfica y social es un paso ineludible a complementar en el manejo y conservación de este recurso.
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- La respuesta de diferentes cultivares a los efectos del cambio climático deberían tomase en cuenta, ya que en una exploración preliminar a la predicción de distribución actual y futura de la chirimoya basado en modelos como el planteado en BIOCLIM, las superficies de hábitat apropiado tendrían la tendencia a disminuir y por lo tanto la diversidad de cada zona así como cultivares endémicos desaparecerían (ver Anexo H). - Es importante conocer la biología reproductiva de esta especie para contemplar las acciones a tomar en la construcción de la colección núcleo de esta especie. - Una estrategia para la formación de la colección núcleo es utilizar el análisis de coordenadas principales con los resultados moleculares, porque se ha visto que es un método útil para discriminar grupos por su similitud, y asociarla con su distribución geográfica y caracteres de interés. - Una de las acciones que se podría tomar es escoger para su conservación todas las accesiones con alelos raros y únicos a fin de no perder genotipos aún no estudiados. - Por otra parte, la colección núcleo podrá ser más representativa en aquellos sitios geográficos en que se hizo un muestreo abundante. En este caso, los municipios de Independencia, Mizque, Aiquile, Saipina y Comarapa, serían los más representados en la colección completa. Sin embargo en las restantes zonas de Bolivia, sería necesario considerar más muestreos, debido a que los resultados obtenidos aún no representan a todas las zonas productoras de chirimoya. También una colecta de parientes silvestres de chirimoya tiene prioridad por ser fuente de material genético importante en estrategias de manejo y conservación.
En conclusión, la estrategia de formación de una colección núcleo de chirimoya, debe basarse primeramente en resultados del análisis molecular, combinando con el conocimiento local, las caracterizaciones y evaluaciones del germoplasma.
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CAPÍTULO VI 6. CONCLUSIONES De acuerdo a los resultados obtenidos y el análisis realizado, se presentan las siguientes conclusiones del presente trabajo: - Se encontró una huella genética única en todas las accesiones evaluadas con 20 microsatélites específicos de chirimoya. Los microsatélites utilizados permitieron revelar un total de 89 alelos en el conjunto de 407 accesiones bolivianas. 15 de dichos alelos son únicos de la colección boliviana. Las chirimoyas extranjeras presentan 8 alelos que no tiene la colección boliviana. Por último, Annona nutans y Atemoya produjeron juntos 18 alelos diferentes del resto. - La heterocigosidad promedio de la población boliviana de chirimoyas evaluada con 20 microsatélites es de 0.529, considerada alta e influenciada por una importante cantidad de alelos raros y endémicos. - La colección boliviana de chirimoya presenta una estructura genética definida, formando grupos por su similitud, por su ubicación geográfica dentro del territorio boliviano y una tendencia a agruparse por la forma del fruto. - Los resultados del análisis de coordenadas principales sugieren una estructura genética asociada a la distribución geográfica de los individuos. El análisis de distribución geográfica utilizando datos georeferenciados confirma esta relación. - La diversidad de alelos de cada microsatélite en chirimoya está asociada a una distribución geográfica particular a lo largo del territorio boliviano, de manera diferente para cada uno de los microsatélites utilizados. - Se ha contribuido a la formación de una colección núcleo identificando accesiones potencialmente duplicadas y discriminando grupos posibles por su similitud genética y distribución geográfica. - Las accesiones que se consideran posibles duplicados, todos se encuentran en la mismas parcelas respectivamente, y muy próximos en distancia. Esto sucedió particularmente en huertos con plantas jóvenes, y se podrían considerar injertos del mismo genotipo.
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CAPÍTULO VII 7. RECOMENDACIONES
- Se sugiere planificar una colección completa de chirimoya y sus parientes silvestres en Bolivia, tomando en cuenta la diversidad encontrada hasta el momento. Un análisis más completo de los resultados moleculares presentes, utilizando herramientas de sistemas de información geográfica, permitirá precisar una colecta representativa. - Complementar la caracterización morfológica con énfasis en caracteres de interés, y combinar el análisis con los resultados moleculares, a fin de precisar necesidades y soluciones en el manejo de estos recursos. - Realizar análisis para encontrar marcadores ligados a caracteres de interés económico, como la forma botánica del fruto. - Generar investigación de la biología floral de chirimoya: evaluar la importancia de buscar genotipos en los que haya solapamiento de la fase femenina y masculina de la flor, a fin de evaluar y promover una autopolinización natural. También estudiar potenciales polinizadores locales. - Considerar la respuesta de cultivares a los factores bióticos y abióticos, incluyendo el cambio climático para conservar y promover genotipos promisorios.
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CAPÍTULO VIII 8. LITERATURA CITADA
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ANEXOS
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ANEXO A
ABREVIACIONES, TÉRMINOS Y UNIDADES DE MEDIDA
ABREVIACIONES Y TÉRMINOS A adenina ADN ácido desoxirribonucleico ARN ácido ribonucleico ARNasa ribonucleasa C citocina Bromuro de hexadeciltrimetilamonio (Cetyl-trimethyl ammonium bromide ó CTAB en inglés). Detergente catiónico, cuyas micelas cargadas positivamente se pegan a CTAB polianiones como el ADN. dNTP trifosfato de desoxinucleótido EDTA ácido etilendiaminotetracético et al . y colaboradores, y otros. Del latín: et alli G guanina En una población, ausencia de variación en un marcador, gen, cromosoma, o monomórfico carácter determinado genéticamente. pb pares de bases Variación alélica en un locus. El polimorfismo de las secuencias de nucleótidos polimorfismo proporciona herramientas de diagnóstico muy potentes. rpm revoluciones por minuto T timina TBE Solución de Trizma Base, EDTA y Ácido bórico usada en electroforesis.
UNIDADES DE MEDIDA °C grados Centígrados , grados Celsius µL microlitro µm micrómetro M Molar m metros mg miligramo mL mililitro mM milimolar p/v relación de peso por unidad de volumen Medida logarítmica de la acidez/alcalinidad de una solución. Un pH 7 se pH corresponde con una disolución neutra (p. ej., el del agua pura), mientras que por debajo de 7, la solución es acida, y por encima, alcalina. pmol picomol V voltios
Fuente: elaborada en base a información de SARMIENTO (2000) y ZAID et al. (2004).
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ANEXO B PROTOCOLOS DE LABORATORIO
B 1. EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDO VEGETAL Adaptación para chirimoya Protocolo CTAB (bromuro de hexadecil trimetil amonio) Fuente: Doyle and Doyle (1990). Isolation of DNA from small amounts of plant tissues. BRL Focus 12: 13-15. • Moler el tejido con nitrógeno líquido en morteros pre-enfriados hasta obtener un polvo fino. • Transferir rápidamente más o menos 100 mg de tejido molido a los tubos Eppendorf; conservar a -20 °C. • Calentar un baño Maria a 65°C. • Marcar debidamente una serie de tubos Eppendorf (de acuerdo a la cantidad de muestras), y añadir a cada uno de ellos 700 µL de tampón CTAB 2X y 2 µL de 2-mercaptoetanol, mezclar inmediatamente. Conservar los tubos en hielo hasta finalizar la serie. • Incubar las muestras en baño María a 65°C durante 45 minutos, agitar suavemente las muestras cada 5 -10 minutos para homogeneizar la suspensión. • Mientras se incuba, preparar dos juegos de tubos Eppendorf para cada muestra, identificados con su nombre correspondiente. • Luego de la incubación, agregar 700 µL de cloroformo a cada tubo. Mezclar vigorosamente durante 5 minutos a fin de formar una emulsión homogénea. • Centrifugar las muestras durante 5 minutos a 10.000 r.p.m, de preferencia a 4ºC. Sacar los tubos de la centrífuga con cuidado para evitar que se mezclen las fases, transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf nuevo, teniendo cuidado de no absorber la interfase. • Repetir los pasos 4 y 5. • Recuperar el sobrenadante a final en tubo Eppendorf estimando la cantidad recuperada. Agregar un volumen igual de isopropanol a cada tubo. Invertir los tubos vigorosamente 4 a 5 veces para precipitar el ADN. • Centrifugar a 10.000 r.p.m durante 5 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante con cuidado para no perder el precipitado de ADN. • Lavar el precipitado de ADN con 500 µL de etanol frío al 75%..Centrifugar las muestras a 10.000 r.p.m durante 10 minutos a temperatura ambiente. Eliminar con cuidado el etanol. Realizar este lavado dos veces. • Secar el precipitado dejando los tubos abiertos. • Disolver el precipitado en 60 µL de agua destilada estéril y agregar 0,6 µL de RNAasa (10 mg/mL). Incubar en baño María a 37º C durante 1 hora. • Conservar el ADN disuelto a -20º C para su uso posterior.
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Tampón de extracción CTAB 2X: Componentes Cantidad (100 mL) Concentración CTAB 2 g 2 % Cloruro de sodio 8,18 g 1,4 M EDTA 0,1 M pH:8,0 20 mL 20 mM Tris-HCl 1 M pH:8,0 10 mL 100 mM Polivinilpirrolidona (PVP) 1 g 1%
B 2. ELECTROFORESIS DE ADN EN GEL DE AGAROSA • Ensamblar la cubeta de electroforesis • Preparar el gel de agarosa de acuerdo a la concentración y tamaño deseado Gel mediano Gel grande 100 mL 250 mL Agarosa 1% (cuantificación de ADN) 1 g 2.5 g Agarosa 1,8 % (cuantificación de productos PCR) 1,8 g 4.5 g TBE 1X (mL) para el gel 100 250 TBE 1X (mL) para la cubeta 600 2000 TBE 10X, mezclar para un litro: Trisma base 108 g
EDTA×2H 2O 9,77 g Ácido bórico 55 g • Hervir la mezcla de agarosa en un horno microondas, luego enfriar la solución a 60° C aproximadamente. • Vaciar la solución a la cubeta y dejar gelificar al menos 30 min. • Para cada muestra, marcar un tubo eppendorf y depositar en el 8 µL de agua destilada, 1 µL de ADN total y 1 µL de tampón de cargado (1 mL de tampón de cargado + 8 ul de SYBR green). • En el caso de productos PCR, colocar 5 ul de la reacción en un tubo eppendorf y 0.5 ul de tampón de cargado (1 mL de tampón de cargado + 8 ul de SYBR green).
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Tampón de cargado: Reactivo Cantidad para 100 mL Glicerol 50% 50 mL EDTA 100 mM 3.72 g SDS 1% p/v (dodecilsulfato detergente {Pil}) 1g Azul de bromofenol 0.1% p/v 0.1 g • Depositar suavemente las muestras en los pocillos del gel. • Colocar en un pocillo el marcador de peso molecular de 10.000 pares de bases. • Aplicar la corriente (5V/cm). • Dejar migrar hasta que el azul de bromofenol alcance la parte inferior del gel. • Sacar cuidadosamente el gel y colocarlo sobre la fuente de luz ultravioleta. • Fotografiar e interpretar los resultados
B 3. AMPLIFICACIÓN DE MICROSATÉLITES MEDIANTE PCR (HOT START PCR) • Preparar las siguientes mezclas en un baño de hielo: Mezcla 1*: Stock Final 10 µL Tampón PCR 10X 1X 1 µL dNTPs 2 mM c/u 0.2 mM c/u 1.5 µL Iniciador directo y reverso (10pmol/µL cada uno) 1 pmol/µL 1.5 µL
H2O X µL ADN molde 20 ng X µL
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Mezcla 2: Stock Final 5 µL H2O X X µL Tampón PCR 10X 1X 0,5 µL Cresol Red 1,5 µL Taq polimerasa (añadir a ultimo momento) 0.025 U/µL X µL * Cuando se preparan las mezclas para amplificar varias muestras, es preferible aumentar 10% al volumen para compensar “errores” al repartir la solución. • Distribuir la mezcla 1 en los tubos PCR. • Añadir el ADN. • Dejar caer a cada tubo una gota de aceite mineral. • Colocar los tubos en el aparato PCR e iniciar el programa. Condiciones típicas para amplificar microsatélites: 1 ciclo 94 ºC por 5 min 35 ciclos 94 ºC por 30 seg Tº de hibridación* por 30 seg 72 ºC por 30 seg 1 ciclo 72 ºC por 7 min * La T° de hibridación se determina para cada iniciador Tm = [4°C(G+C)+2°C(A+T)] T de hibridación = [4°C(G+C)+2°C(A+T)-5] • Detener (pausa) el programa al finalizar el ciclo 2 (94 ºC por 1 min). • Añadir rápidamente 5 µL de la mezcla 2, evitando formar burbujas. Continuar el programa hasta la finalización. Separar los productos de amplificación en geles de agarosa.
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ANEXO C
Cuadro C 1. Lista de iniciadores de chirimoya y temperatura de hibridación. Tabla 2. Lista de los iniciadores que serán utilizados para Secuencias amplificarde los cebadoresFuente: los ESCRIBANOmicrosatélites de cada SSRset al . (2003). y de temperatu chirimoya. ra de anillamiento
SSR FORWARD REVERSE Tª
LMCH1 CTCTTCAAAGGTACGACTTC TTGAGAAAAGGATAAGGATT 55º
LMCH4 ATTAGAACAAGGACGAGAAT CCTGTGTCTTTCATGGAC 55º
LMCH6 GGCATCCTATATTCAGGTTT TTAAACATTTTGGACAGACC 55º LMCH16 CTGAAAAATAACAAGAATGTAA GGATAAACAAAGCAGTAAATC 55º LMCH31 TGGATCAAAACAGATATTGC ACAACCCCTTTCTTTAGCTC 45º LMCH36 ATAGAAGATTTACCCAGGAG GTAAGTAGCTGATTGTTGATCT 50º LMCH40 ACTCAGCAAGATAAAGAATAGGG GAGTGCCGCTAGTCAAGATT 55º LMCH48 TTAGAGTGAAAAGCGGCAAG TCAAGCTACAGAAAGTCTACCG 55º LMCH63 TTCCCCAAAATAATGAAATA ATGAAGAACCGAATACAAAA 55º
LMCH69 AGCTTTAGCCATGAATTAGA GAAAGGCTGACGAGATATAA 55º
LMCH83 CTCTCGTTGACTCGTTTACT GGTCTCTAGCCTTTACAATC 55º
LMCH87 AGTTAAGACACGAGATGATAAA CAAGTAAAGACTGAAAGGTTG 55º
LMCH91 CCTTGAGAAAGTGTCATCTAT ATAATCCTAGACCATAAAATTC 55º
LMCH102 GCTAACCATCCATTTACATA ATAACATTCTTTATCACCATCT 55º
LMCH106 AACAAATGACAGGAGAGC ATAATGTATATGACGCTGCT 55º
LMCH122 AGCAAAGATAAAGAGAAGATAA ATCCAAGCCTATTAACAACT 55º
LMCH137 ACTCGATTATGATTACAAATTA AAAGTATCCCCACATAGACT 48º
LMCH139 CTATCCATCTACGCTTCAAAAT CTGAGTCGGTTAGACATTGAGA 55º
LMCH144 GTTTGGAAGAGTCGCAGGAT ACTGTAAAACGCAGACCAAGAT 55º
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ANEXO D
En el siguiente ejemplo se muestra un individuo de Bolivia, productos amplificados con tres microsatélites: LMCH1 (azul), LMCH16 (verde) y LMCH69 (negro). En rojo se muestra el estándar de tamaño [HORMAZA, I. (2008) comunicación personal].
222
294
156 310
160
230
140 180 190 20 0 22 0 240 260 280 300 320
Figura D 1. Ejemplo de patrones obtenidos por electroforesis capilar.
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ANEXO E En la siguiente figura se observa parte de la matriz binaria proveniente del análisis molecular de chirimoya. En las filas se ubican las accesiones y en las columnas los alelos de cada microsatélite amplificado en la colección.
Figura E1. Ejemplo de matriz binaria visualizada con el programa NTSYSpc V. 2.10
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ANEXO F A continuación se muestra el dendograma para el total de las 419 accesiones, dividida en siete partes, debido a su tamaño, empezando por la parte superior. 1A 1C 15C PARTE 1 16C 17C 13B SB116 56A 200A 68A 93B 12B 96B 26A 6B 32A 53A 36A 127A 43A 37C 8B 5C 9C 10C SB109 196A 186A 7A 30A SB103 29C 111A 93A 2B 13C 128A 130A 38C 6A 22C 134A 23C 21A 87A 29A 86A 95B 7C 67A SB118 SB203 SB119 SB122 69A 84A 63C 150A 34B 12A 98A
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Coeficiente de Similitud - Jaccard (J) Figura F 1. Dendograma de las 419 accesiones evaluadas con los 20 microsatélites.
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PARTE 2
135A 18C 81A 82B 112A 1B 73B 3B 20B 33A 146A 58A 71A 99B 4A SB126 83A 35B 25C 86C 87C 90C 91C 96C SB103 82C 41A 116A 142A 143A SB103 144A 79C 93C 123A 40B 145A 28C 91A 126A 165A 95C 129A 38B 81C 177A 39C 40C 83C 94C 190A 69C 28B 141A 83B 85C 35A 64A 47A 37B 138A 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Coeficiente de Similitud - Jaccard (J) Figura F 1. (Continuación)
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PARTE 3
140A 149A SB124 49A 84B 57A 58B 3A 92A 12C 19C 55A 122A 132A 133A 43B 18B 10A 77A 61B 62B 64B CHA 24A 106A 101A 103A 102A 136A 137A SB103 76B 24C 100A 63B 51A 54A 61A 62A 36C 9B 27C 85A 88A 25B 5A 14B 4C 74B 80B 97C 98C 100C 19A 86B 46C 97B 54C 25A 74A 113A 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Coeficiente de Similitud - Jaccard (J) Figura F 1. (Continuación)
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PARTE 4
49C 30C 34C 35C 32C 33C 77B 60A 75A 178A 43C 153A 171A 179A SB108 70A 39B 163A 11B 71B 199A 72B 2A 131A 8C 11C 20C 119A 99A 44A SB103 191A 95A 97A 65B 52A 81B 5B 33B 48C 50A 76A 51B 155A 184A 78A 21B 63A 120A 3C 162A 176A 54B 89C 72A 156A 157A 170A 59B 21C 80A 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Coeficiente de Similitud - Jaccard (J) Figura F 1. (Continuación)
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PARTE 5
29B 66B 67B 167A 174A SB117 152A 158A 173A 64C 71C 115A 169A 48B 2C 6C 19B 56B BRO 8A 34A 154A 15B 40A 117A 59A 185A 96A 10B 41C SB103 50B 45C 69B 75B 114A 118A 121A 124A 79B 125A 51C 7B 11A 60B 49B 32B 44B 52B 188A 197A 16B 159A 189A 192A 42B 9A 4B 18A 20A 31A 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Coeficiente de Similitud - Jaccard (J) Figura F 1. (Continuación)
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PARTE 6
88B 92B 89B 90B 98B 102B 66A 147A 30B 13A 46A 23A 48A 90A 107A 108A 109A 80C 70C 65C 68C 72C 74C 77C 61C 75C 66C 78C 104A 73C SB103 22B 53B 17A 38A 62C 139A 24B 183A 94B 23B 92C 193A 55B 151A 187A 180A 41B 47B 57B 47C 57C 14A 16A 73A 22A 85B SE028 31C 198A 15A 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Coeficiente de Similitud - Jaccard (J) Figura F 1. (Continuación)
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PARTE 7
39A 89A 110A 26B 79A 68B 27A 88C 28A 82A 60C 105A 55C 58C 42C 36B 44C 26C 53C 99C 14C 42A 175A 195A 56C 160A 161A 168A 52C 166A SB103 CHO 164A 70B 45B 65A 78B 27B 94A 181A 182A 194A 17B 46B CUM 172A 37A 50C BON 76C 59C SB202 31B 101B CAM PAZ FIN CHIU ATE A.NUT 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 Coeficiente de Similitud - Jaccard (J) Figura F 1. (Continuación)
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ANEXO G A continuación se muestra el resultado del análisis de coordenadas principales para las 419 accesiones. Se puede ver que las accesiones se hallan distribuidas de manera compleja, si se observa como un solo conjunto. Sin embargo, la estructura de esta población se describe mejor al analizar grupos representativos, como se mostró anteriormente.
0.50 50C
17B
100C 102B 55C 166A 88B 21B 97C98C 181A 69B 55B 58C 188A46B PAZ48C 31B 42C 68B CHO 31A 57B 105A 193A 10B 92B 0.26 CHIU 51B 59C 86A 168A189A CUM CAM 37A 28A 41B 160A FIN 198A SB202 26B 101B182A 9A90B94A 52B 23B 80B 53C A.NUT 60B 4C 5A 6B 45C 74B 70B 76A 62B 60C89B 66A 99B BRO 41C54C 57C BON 75B 53A 39A 104A 47B 46C 20C 8C 40A SB118SB203 180A ATE49B94B16B 96A 14A52C78A 27A SB119 171A 11C159A 18B 86B 19A155A135A34B 14B 79A95B 18A 161A 167A 22B 56C 54B 191A2A 199A44C 44B32B 7C 20A 162A56B 24B 172A 117A33C 74A 1B 13C SB122 12B 89C153A26C53B 23A 32C119A 73A98B 2B 154A 12A93B 197A 30C34C 4B 42A 19C 12C 68A 176A 50B81B 185A195A 120A194A178A3B42B 5B 20B 110A 81A 32A 170A 72A 183A 51C43C 72B14C133A63B63A 73B 200A 61C 78C 35C97B 61B 89A58A 98A 15B 96B 56A 92C 52A 43B125A 44A 112A 15A 71A 59A 50A 122A 26A 51ASB116 157A99C 47C 62C 33B 131A 1A C2 0.02 SB117 64B 192A 55A 61A25A 77A 88C 18C34A 106A 11A 100A 174A 7B 95A 27B2C 164A65B 99A 17C 82B 46A 36C 175A 132A 69A 77B 65A 17A 9B 79B 10A 130A 54A23C 73C 66C 90A97A139A 70C169A 45B 3A 36B 93A29A 22C 87A 75C 173A156A 77C76C 48B 78B3C 114A 62A58B 184A38A 147A49C 82A 80A 31C CHA27C 22A 67A 1C15C16C 7A 128A 30B 75A 134A57A 196A 85A 30A 21A 6A 6C SE028 36A 33A 113A 158A 109A 80C 38C 25B24A 84A 8A SB109 59B 72C74C 19B 13ASB108 16A 85B 48A 116A127A 136A 43A 9C 187A 67B 151A 115A 71B 28C 88A 13B 64C 71C 29B 118A 177A150A 65C 11B 39B 137A41A 103A144A79C93C 68C 107A 163A 149A 5C10C 21C 102A64A 152A 66B 108A 179A 92A 190A 124A 35A 84B 4A 145A 29C -0.22 49A 121A 24C 8B 37C 70A 60A 186A 85C 63C 37B SB103 83A 101A 91A 111A 96C 83B 165A 82C 94C 140A 123A 25C 83C 142A143A 38B 146A 40B 95C 76B 28B 126A 39C 141A SB124 SB126 138A 47A35B 69C 129A 81C 86C87C90C91C 40C -0.46 -0.52 -0.28 -0.05 0.19 0.43 C1 Figura G1. Resultado del análisis de coordenadas principales para los 419 individuos, identificados por sus códigos respectivos.
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ANEXO H
Distribución actual y futura de chirimoya (con el cambio climático) según el modelo BIOCLIM (HIJMANS et al ., 2004) y en base a los puntos de colecta En general, se puede ver que por el efecto del cambio climático, las áreas potenciales para el desarrollo de chirimoya se van reduciendo.
Distribución actual Distribución futura
Figura H1. Distribución potencial actual y futura de chirimoya.
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