UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS FACULTAD DE AGRONOMÍA CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA TESIS DE GRADO ESTUDIO DE DIVERSIDAD GENÉTICA EN ACCESIONES BOLIVIANAS DE CHIRIMOYA ( Annona cherimola Miller) MEDIANTE MARCADORES MOLECULARES MICROSATÉLITES (SSR) FIDEL HERNAN CORTEZ ALVAREZ La Paz – Bolivia 2010 UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS FACULTAD DE AGRONOMÍA CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA ESTUDIO DE DIVERSIDAD GENÉTICA EN ACCESIONES BOLIVIANAS DE CHIRIMOYA ( Annona cherimola Miller) MEDIANTE MARCADORES MOLECULARES MICROSATÉLITES (SSR) Tesis de Grado presentado como requisito parcial para optar el Título de Ingeniero Agrónomo FIDEL HERNAN CORTEZ ALVAREZ Tutor: Ing. Ph. D. Jorge Antonio Rojas Beltrán …………………………… Asesor: Ing. Ph. D. Alejandro Bonifacio Flores …………………………… Tribunal Examinador: Ing. Ph. D. David Cruz Choque …………………………… Lic. Ph. D. Alberto Figueroa Soliz …………………………… Ing. M. Sc. Félix Mamani Reynoso …………………………… Aprobada Presidente Tribunal Examinador: …………………………… Ing. M. Sc. Ramiro Augusto Mendoza Morales VICEDECANO - FACULTAD DE AGRONOMÍA 2010 ÍNDICE GENERAL Índice de contenido............................................................................................... i Índice de cuadros................................................................................................... iv Índice de figuras..................................................................................................... v Dedicatoria.............................................................................................................. vii Agradecimientos .................................................................................................... viii Resumen ................................................................................................................ ix ÍNDICE DE CONTENIDO CAPÍTULO I 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1 1.1. Objetivos......................................................................................................... 2 1.1.1. Objetivo General .......................................................................................... 2 1.1.2. Objetivos Específicos................................................................................... 2 CAPÍTULO II 2. REVISION BIBLIOGRÁFICA............................................................................... 3 2.1. Antecedentes del cultivo, origen y distribución ............................................... 3 2.2. Usos e Importancia ......................................................................................... 4 2.3. Descripción botánica y ubicación taxonómica................................................. 5 2.3.1. Descripción morfológica ............................................................................ 5 2.3.2. Ubicación taxonómica................................................................................ 7 2.4. Características ecológicas y agronómicas...................................................... 8 2.5. Biodiversidad y Agrobiodiversidad .................................................................. 9 2.5.1. Diversidad genética ................................................................................... 9 2.5.2. Recursos fitogenéticos .............................................................................. 10 2.5.3. Colección núcleo ....................................................................................... 12 2.6. Herramientas para evaluar la diversidad genética .......................................... 13 2.7. Marcadores moleculares................................................................................. 13 2.7.1. Aplicaciones y ventajas de los marcadores moleculares........................... 14 2.7.2. Clasificación de los marcadores moleculares............................................ 15 2.7.3. Selección de un marcador molecular adecuado........................................ 16 2.7.4. Microsatélites............................................................................................. 17 2.7.4.1. Aplicaciones, ventajas y limitaciones de los microsatélites .................. 18 2.7.4.2. Huellas genéticas................................................................................. 18 2.7.5. Marcadores moleculares en chirimoya ...................................................... 19 i 2.8. Técnicas para el análisis con marcadores moleculares.................................. 20 2.8.1. Colección y preservación de tejido vegetal ............................................. 20 2.8.2. Molido de la muestra............................................................................... 20 2.8.3. Extracción de ADN.................................................................................. 20 2.8.4. Electroforesis de ADN en geles de agarosa............................................ 21 2.8.5. Amplificación de secuencias microsatélites ............................................ 22 2.8.6. Separación de productos amplificados.................................................... 22 2.9. Análisis estadístico ......................................................................................... 23 2.9.1. Índices de variabilidad genética................................................................. 23 2.9.2. Análisis de estructura poblacional ............................................................. 24 2.9.2.1. Coeficientes de similitud....................................................................... 24 2.9.2.2. Análisis de conglomerados .................................................................. 25 2.9.2.3. Análisis de coordenadas principales .................................................... 25 2.10. Herramientas para el análisis geoespacial de datos..................................... 26 CAPÍTULO III 3. LOCALIZACIÓN .................................................................................................. 27 3.1. Ubicación Geográfica...................................................................................... 27 CAPÍTULO IV 4. MATERIALES Y MÉTODOS................................................................................ 27 4.1. Materiales ....................................................................................................... 27 4.1.1. Material Vegetal......................................................................................... 27 4.1.2. Material de Colecta.................................................................................... 27 4.1.3. Material de Laboratorio.............................................................................. 27 4.1.4. Material de Gabinete ................................................................................. 28 4.2. Métodos .......................................................................................................... 28 4.2.1. Número de muestras analizadas ............................................................... 29 4.2.2. Cobertura del estudio ................................................................................ 30 4.2.3. Esquema general de trabajo...................................................................... 31 4.2.4. Colecta del material vegetal ...................................................................... 32 4.2.5. Molido y conservación de muestras........................................................... 32 4.2.6. Extracción de ADN .................................................................................... 32 4.2.7. Cuantificación de ADN............................................................................... 34 4.2.8. Amplificación y separación de microsatélites ........................................... 34 4.2.8.1. Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)............ 34 ii 4.2.8.2. Electroforesis capilar............................................................................ 35 4.2.9. Procesamiento y análisis de datos ............................................................ 36 4.2.9.1. Índices de variabilidad genética ........................................................... 36 4.2.9.2. Cálculos para el análisis de estructura poblacional.............................. 37 CAPÍTULO V 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 38 5.1. Colecta de material vegetal............................................................................. 38 5.2. Molido y conservación de muestras................................................................ 38 5.3. Extracción de ADN.......................................................................................... 39 5.4. Cuantificación de ADN.................................................................................... 40 5.5. Número y frecuencias de alelos encontrados ................................................. 40 5.5.1. Número promedio de alelos por locus microsatélite................................ 42 5.5.2. Heterocigosidad (He) e Índice de contenido polimórfico (PIC)................ 43 5.6. Análisis de conglomerados ............................................................................. 44 5.6.1. Análisis de conglomerados de las chirimoyas bolivianas........................ 47 5.6.2. Análisis por grupos de individuos: plantaciones antiguas y recientes .... 49 5.7. Análisis de coordenadas principales............................................................... 56 5.7.1. Análisis por grupos de individuos: plantaciones