Tesis Doctoral

Caracterización de las variantes de GnRH y las gonadotrofinas en Cichlasoma dimerus (Teleostei, Perciformes) y su relación con la diferenciación sexual

Pandolfi, Matías 2005

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Cita tipo APA: Pandolfi, Matías. (2005). Caracterización de las variantes de GnRH y las gonadotrofinas en Cichlasoma dimerus (Teleostei, Perciformes) y su relación con la diferenciación sexual. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

Cita tipo Chicago: Pandolfi, Matías. "Caracterización de las variantes de GnRH y las gonadotrofinas en Cichlasoma dimerus (Teleostei, Perciformes) y su relación con la diferenciación sexual". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2005.

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Universidad de Buenos Aires, Argentina Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental

“Caracterización de las variantes de GnRH y las gonadotrofinas en Cichlasoma dimerus (Teleostei, Perciformes) y su relación con la diferenciación sexual”

Trabajo de Tesis presentado para optar por el título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires

Autor: Lic. Matías Pandolfi

Directores de tesis: Dra. M. C. Maggese y Dr. D. A. Paz

Laboratorio de Embriología Animal Buenos Aires, Junio de 2005

* Esta tesis contiene 32 figuras sin numeración e intercaladas-

1 “Caracterización de las variantes de GnRH y las gonadotrofinas en Cichlasoma dimerus (Teleostei, Perciformes) y su relación con la diferenciación sexual”.

RESUMEN

El presente trabajo se basa en el estudio de las múltiples formas de GnRH (hormona liberadora de gonadotrofinas) en un pez teleósteo de agua dulce del Orden Perciformes mediante técnicas histológicas, inmunohistoquímicas, de hibridación in situ y Western blot. Aunque el objetivo inicial fue localizar anatómicamente las diferentes poblaciones de GnRH y analizar la distribución de sus axones desde un punto de vista morfológico- funcional, también se caracterizaron las gonadotrofinas a lo largo del desarrollo y en adultos, encontrandose expresión de las mismas en cerebro y ovario. A la luz de los resultados obtenidos sobre el origen y la ontogenia de las variantes moleculares de GnRH, se propone una correlación entre la diferenciación de una de estas poblaciones y la diferenciación sexual gonadal. Se discute el uso de una nueva metodología para el estudio de las múltiples formas de GnRH dentro de una misma especie que evita las reacciones cruzadas, comúnmente observadas entre anticuerpos y sondas. Finalmente se propone un nuevo patrón de distribución de dichas poblaciones y un origen diferente para una de ellas que contradice el patrón descripto para el resto de las especies de Perciformes, pero que es consistente con lo observado en el resto de los vertebrados.

Palabras claves: peces óseos, Perciformes, Cíclidos, GnRH, inmunohistoquímica, hibridación in situ, gonadotrofinas, cerebro, hipófisis, diferenciación sexual, desarrollo, reproducción.

2 “Characterization of different GnRH molecular forms and gonadotrophins in Cichlasoma dimerus (Teleostei, Perciformes) and their relation with the sexual differentiation process”.

ABSTRACT

The present study examined different GnRH (gonadotrophin-releasing hormone) expressing neuronal populations in a Teleost Perciform fish, using histological, immunohistochemical, in situ hibridization, and Western blot techniques. The main purpose was to localize the different GnRH-expressing populations (salmon, seabream and chicken II GnRH) and to analyze their axons pathways from a morphophysiological point of view. Gonadotrophins (FSH and LH) in this species during different developmental stages and in adults were also characterized, finding expression of them not only in pituitary but in brain (hypothalamic Nucleus lateralis tuberis) and ovary (previtellogenic and early vitellogenic oocytes). The origin and ontogeny of GnRH variants was also examined, and a correlation between the differentiation of one of them (sbGnRH) and the sexual differentiation process was proposed. A new methodological approach using the GnRH associated peptides (GAPs) for the study of multiple GnRH variants in a single species, avoiding cross reactivity was also discussed. Taken together, the results demonstrate the existence of a novel distribution GnRH neurons and an olfactory origin for sbGnRH that was not in accordance with other studies in Perciforms, but that was consistent with results obtained in other vertebrates groups.

Key words: teleost fishes, Perciforms, Cichlids, GnRH, immunohistochemistry, in situ hibridization, gonadotropins, brain, pituitary, sexual differentiantion, development, reproduction.

3

Los siguientes trabajos surgieron durante la realización de esta Tesis:

1) Ontogeny and distribution of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neuronal systems in the brain of the cichlid fish Cichlasoma dimerus (2002). Pandolfi M, Parhar IS, Ravaglia MA, Meijide FJ, Maggese MC & Paz DA. Anatomy and Embryology 205: 271-281.

2) The GnRH systems of Cichlasoma dimerus (Perciformes; Cichlidae) revisited: A localization and developmental study using antibodies and riboprobes to the GnRH- associated peptides (2004).

Pandolfi M, Muñoz Cueto JA, Lo Nostro FL, Downs JL, Paz DA, Maggese MC & Urbanski HF. Cell and Tissue Research (en prensa)

3) Identification of immunoreactive FSH and LH cells in the brain, ovary and pituitary of the cichlid fish Cichlasoma dimerus: Ontogeny of the gonadotropin system and its relation with different GnRH molecular variants (2005). Pandolfi M, Shimizu A, Lo Nostro FL, Muñoz Cueto JA, Paz DA & Maggese MC Enviado.

4) Cytoarchitectonic study of the telencephalon and diencephalon of Cichlasoma dimerus (Perciformes, Cichlidae). Pandolfi M, Paz DA & Maggese MC En preparación.

4 AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Cristina Maggese por haber sido mi directora, por darme la oportunidad de trabajar en el Laboratorio de Embriología Animal del que estoy orgulloso de formar parte, porque todo de tu parte fue aliento y porque después de estos 5 años en Embrio aprendí a quererte muchísimo.

Al Dr Dante Paz por haberme introducido en el mundo de GnRH que tantas satisfacciones me trajo y por haberme dirigido en esta Tesis.

Al Dr. Henryk Urbanski por abrirme las puertas de su laboratorio en USA, por preocuparse de todos los detalles (académicos y personales) de mi estadía en ese país, por su absoluta confianza y respeto y por haberme enseñado cosas valiosísimas para mi formación.

Al Dr Jose Antonio Muñoz Cueto de la Universidad de Cádiz por presentarme a los GAPs, por trabajar conmigo en parte de esta Tesis y por ayudarme a conseguir mi beca Postdoctoral en California.

Al Dr Ishwar Parhar y al Dr Akio Shimizu del Nippon Medical School por cederme gentilmente sus anticuerpos sin los cuales gran parte de este trabajo no se hubiera podido hacer.

A Fabiana Lo Nostro porque sin vos hubiera escrito la tesis a maquina con figuritas recortadas y pegadas del Billiken, por tu santa paciencia y tu locura que combinadas hacen que seas mi adorada Fabi. Gracias también por venir corriendo y dejar todo cada vez que yo gritaba FAAAAAAABBBBIIII. Y no sigo para que no llores…

A Paula Vissio porque para ser Doctor tuve que ser Licenciado y las bases de todo las adquirí siguiendo tu ejemplo e imitándote en tantas cosas que ni te imaginas que admiro, porque lo que empieza bien termina bien y vos sos la persona que siempre volvería a elegir para empezar de nuevo.

5 A la Dra Graciela Guerrero por tu ternura inconmensurable que hace que todos te queramos muchísimo y te extrañemos un poco mucho ahora.

A Graciela Rey Vazquez porque al mudarme al 3 descubrí una compañera adorable para compartir muy lindos momentos en el labo.

A Fernando por haber trabajado conmigo en gran parte de esta Tesis y porque sin vos no habría peces.

A los más nuevos del labo que nos contagian su energía a los más viejos. Gracias Griselda (vieja y querida conocida), Yani y Rodrigo.

A Maxi por la complicidad y las maldades en el labo que hacen que el trabajo sea mucho mas divertido y por llenarme de orgullo viendo el gran investigador que vas a ser.

A Luisa Fiorito. Gracias, gracias, gracias y me quedo corto. No sabes Luisa todo lo que aprendí de vos, tengo el cerebro lleno de cosas increíbles que aprendí como tu alumno y como tu ayudante. Sos una de esas docentes que uno va a recordar hasta que sea viejo, no solo transmitís unos conocimientos increíbles sino una pasión por la docencia que es contagiosa y que a uno lo llena de energía.

A la Dra Diana Echeverría por ser la principal responsable de mi pasión por los Vertebrados, por toda tu dedicación y buen trato cuando fui ayudante de tu materia, por preocuparte tanto por tus ayudantes….gracias!!!

A todos mis alumnos por sacarme del microcosmos de la investigación y estimularme a seguir estudiando otras cosas para que ustedes aprendan.

A mis amigos del colegio por crecer juntos y seguirnos queriendo como siempre: Luciano, Gustavo, Javier, Carlos y Guido…ya saben todo lo que los quiero…aunque sea un poco parco.

6 A mis amigas y amigos de la Facu: Javi por ser el mejor compañero de estudios que pude haber tenido además de ser un amigo de los grosos, Leo mi compañero de selva, Juan por tanta charla más que interesante, Poly por ser mi bebota, Agui por tu cariño enorme (las extraño). Gracias Pau B, Pau E, Marian, Lau N, Lau A, Juli Bono. Las quiero chichis!!!!

A la Universidad de Buenos Aires por brindarme toda esta formación y este orgullo de pertenencia.

A mi familia por amarme, alegrarme la vida, hacerme sentir siempre acompañado. No tengo palabras para expresarles lo mucho que significan para mi.

7 ABREVIATURAS

Ag: glándula adhesiva BN: neuronas bipolares de la retina Bv: vaso sanguíneo CA: comisura anterior CE: cerebelo DC1: parte central del telencéfalo dorsal, subdivisión 1 DLV1: división ventral de la parte lateral del telencéfalo dorsal, subdivisión 1 DLV2: división ventral de la parte lateral del telencéfalo dorsal, subdivisión 2 DM1: parte medial del telencéfalo dorsal, subdivisión 1 DP: parte posterior del telencéfalo dorsal dTel: telencéfalo dorsal GC: célula ganglionar GL: capa glomerular Hyp: hipotálamo IR: receso infundibular LI: lóbulo intermedio MB: cerebro medio MBT: tegmentum del cerebro medio ME: médula espinal MO: médula oblonga NH: neurohipófisis NLT: núcleo lateralis tuberis NOR: núcleo olfacto retinalis NPOav: parte anteroventral del núcleo preóptico parvocelular NPOpc: parte parvocelular del núcleo preóptico parvocelular OB: bulbo olfatorio OC: quiasma óptico OE: epitelio olfatorio OM: mucosa olfatoria ON: nervio olfatorio

8 OP: placode olfatorio OpP: placode óptico OT: téctun óptico PI: pars intermedia PIT: pituitaria/hipófisis POA: área preóptica PPD: pars distalis proximal RET: retina ROMB: rombencéfalo RPD: pars distalis rostral SV: saco vasculoso Tel: telencéfalo TLO: torus longitudinal vTel: telencéfalo ventral Vv: núcleo ventral del telencéfalo ventral V: ventrículo

9 Introduccion El modelo biologico: Cichlasoma dimem

Hipotesis y Objetivos

CAP3TuIm I u ~Y ONTOGENIA ~ DE LAS DTST~TAS ~ POBUCIOIYES ~ ~ ~ ~ ~ ~ u ~ G~RHERGICASU ~ D ANTICUERPOS O CONTRA LASDISTLNTAS FORMAS MOLECULARES DE GI~RH.su REUCI~R CON LA DIFERENCIACI~NSEXUAL GONADALn.

Materiales y Mktodos Animales utilizados y procesamiento del material biologico: 23 Inrnunohistoquimica para la deteccion de GnRH 24 Controles y especificidad de la inmunomarcacion 25 Tratamiento de gonadas indiferenciadas en cultivo 26

Resultados El cerebro de Cichlmoma dimerus 28 Deteccion inmunohistoquimica de las poblaciones GnRHergicas 29 Tratamiento de gonadas indiferenciadas en cultivo 32

cAprruLo II I "UN NUEVO ABORDAJE EN EL ESTUDIO DE LAS DISTINTAS POBLACIONES G~RH~RG~CAS:UTILIZAC~ON DE LOS PEPTIDOS RELACIONADOS A GnRH (GAPS) COMO MARCADORES INDIRECTOS DE LAS DISTINTAS VARIANTES MOLECULARES DE GnRH".

Materiales y M6todos Animales Analisis por Western blot Procesamiento del material biologico Inrnunohistoquimica Doble inmunohistoquimica Obtencion de las riboprobes para hibridacion in situ Sintesis de riboprobes e hibridacion in sifu

Resultados Distribution de 10s distintos GAPS en adultos bulbo olfatorio (OB) Ontogenia de las distintas poblaciones ir-GAP CAP^ m b%S?'UDXIO DE LAS GONADO~QFXNASEN CtcliW dhmws"

Materides y mbodos balesy procesamiento & las muestras Antisueros utilizados Desenmascaramiento de epitopes Inmunohistoquimica Doble inmunohistoquimica para PFSW y PLH

Resubdos Localization de celulas hipofisarias ir-VFSR e k-pLH en ahltos 62 Localizaci6n de somas neuronales y 6bras it--PFSR e Ir-flLW ea adukos 63 Ontogenia de Ias hipofisarias y las neuronas it-PFSH e it-PLH 63 Expresion de ir-j3FSH e ir-flLH en oocitos 64 Caracterizacion de PFSH y PLH de C. dzmems por Western blot 65

Discusion 66

Conclusfones finales 71

* Esta tesis contiene 32 figuras sin numeracih e intercaladas- INTRODUCCIÓN

Los peces, al igual que otras formas de vida, son sumamente valiosos para la humanidad. Desde siempre, han formado parte de la dieta básica de muchos pueblos. Hoy en día, conforman tanto un elemento importante en la economía de muchas naciones, como un incalculable valor recreacional a los naturalistas, a los entusiastas del deporte y a los acuaristas. Los peces también han sido parte de acuerdos y desacuerdos nacionales e internacionales. Muchas instituciones gubernamentales han invertido desde siempre en el estudio de su biología reproductiva y en las formas que éstos poseen para su propagación. Ciertos aspectos han llevado estas investigaciones al terreno del comportamiento, la ecología, la evolución, la genética y la fisiología. Frecuentemente, han sido utilizados como indicadores o acumuladores de contaminación para proteger los ecosistemas y la salud de las poblaciones (Nelson, 1994). Los peces constituyen, aproximadamente, algo más de la mitad del número total, de las 48.170 especies de vertebrados vivientes conocidas. Existen descripciones de unas 28.800 especies de peces, comparadas con los 23.550 de los tetrápodos (Kardong, 1998; Fishbase, 2005). Actualmente, los peces óseos tienen representantes vivientes en dos linajes diferentes: los Actinopterygii y los Sarcopterygii (Figura 1a). Los primeros, abarcan la mayoría de los peces óseos y ha sido el grupo más grande y predominante desde la era Paleozoica. El segundo grupo más pequeño, es muy importante en relación con la historia de los vertebrados dado que originó a los tetrápodos y a sus descendientes. El grupo más representantivo de los Actinopterygii es de los Teleostei, el cual está formado por más de 20.000 especies vivientes (Figura 1b). Ellos exhiben una amplia distribución geográfica y su historia data de 225 millones de años (Período Triásico). Aun así, éste parece ser un grupo monofilético originado en un ancestro común. En general, comparten ciertas características como: la presencia de cola homocerca, escamas circulares, vértebras osificadas, vejiga natatoria y un cráneo con una compleja movilidad de la mandíbula que le permite la rápida captura del alimento (Kardong, 1998). Sin embargo, es notable la diversidad de sistemas reproductivos y patrones sexuales que este grupo posee (Sadovy y Shapiro, 1987).

10 Figura 1a: Árbol filogenético de los peces. Adaptado de Nelson (1994). Figura 1b. Árbol filogenético, continuación. Algunos de los grupos más familiares de teleósteos vivientes incluyen a los órdenes de los Clupeiformes (sardinas, anchoas), Salmoniformes (salmón, trucha), Perciformes (perca, corvina, palometa), Cypriniformes (carpa, dorado), Siluriformes (bagre), y los Atheriniformes (pejerrey, medaka), entre otros.

El cerebro de los peces. El cerebro anterior de los peces y el de los tetrápodos varía considerablemente como resultado de importantes diferencias en su desarrollo ontogenético (Nieuwenhuys 1963). En los tetrápodos, una inversión y evaginación de la pared dorso-lateral prosencefálica da como resultado un par de hemisferios telencefálicos que rodean a los ventrículos laterales. En cambio en los peces, una eversión de la parte dorsal de la pared lateral prosencefálica produce 2 sólidas masas telencefálicas que rodean una única cavidad ventricular central (Bradford 1995, Northcutt 1995). El grado en que ocurre esta eversión varía mucho entre los distintos grupos de actinopterigios. Este hecho junto con la característica hipertrofia diferencial y el engrosamiento de las paredes cerebrales, han transformado al telencéfalo de los peces en una de las más complejas estructuras anatómicas conocidas que puede mostrar variadas organizaciones (Northcutt y Bradford 1983). Resumidamente puede decirse que el telencéfalo de los peces consiste en dos bulbos olfatorios localizados en la región rostroventral de dos hemisferios cerebrales. Estos dos hemisferios se dividen en el telencéfalo ventral (homólogo al subpallium de los tetrápodos) y el telencéfalo dorsal (homólogo al pallium de los tetrápodos) (Nieuwenhuys 1963, Northcutt y Bradford 1983 ). De estas 2 regiones, el telencéfalo dorsal es la que exhibe un mayor número de variaciones específicas de especie en cuanto a forma y tamaño. El diencéfalo es también una compleja estructura del cerebro de los peces. Contiene importantes centros de integración neuronal de la información gustatoria, olfatoria, reproductiva y visual (Wullimann 1988). Se encuentra formado por las siguientes regiones: área preóptica, tálamo ventral, tálamo dorsal, epitálamo, hipotálamo, tuberculum, tuberculum posterior, sinencéfalo, pretectum y núcleo óptico accesorio. En la figura 2 se observa el aspecto general del cerebro de un pez teleósteo en vista dorsal y ventral.

11 Figura 2. Tomado de Nieuwenhuys R (1963). The comparative anatomy of the actinopterygian forebrain. J Hirnforsch 6: 171-196. Sistemas neuroendócrinos en peces. En los peces teleósteos, como en el resto de los vertebrados, la regulación de la actividad reproductiva es ejercida por el sistema nervioso central (S.N.C.). El cerebro, como un integrador de las señales provenientes del exterior, está altamente comprometido en todos los pasos del ciclo reproductivo (Kah et al 1993). En los últimos diez años, el avance de las investigaciones permitió precisar el grado y tipo de participación de diferentes sistemas neuronales y territorios cerebrales implicados en el control de crecimiento y maduración de las gónadas y del comportamiento sexual (Kah et al 1993; Kawauchi 1994; Fradinger et al 2000). Los distintos neuropéptidos involucrados en la regulación de los procesos reproductivos son sintetizados en distintas áreas cerebrales. La neuronas que los expresan, alcanzan la glándula hipófisis directamente (peces teleósteos) o a través del sistema porta- hipofisario (peces no teleósteos y vertebrados tetrápodos) (Peter et al 1990). Los peces teleósteos carecen de un sistema vascular portal para transportar neuropéptidos, neurohormonas o neurotransmisores desde el cerebro hasta la adenohipófisis. Las células adenohipofisarias están directamente inervadas por fibras hipotalámicas que forman la denominada neurohipófisis anterior (Peter et al 1990).

La hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH). El término GnRH (“gonadotropin releasing hormone” = hormona liberadora de gonadotrofinas) se aplica actualmente a una familia de neuropéptidos que cumplen importantes funciones en el desarrollo y funcionamiento del sistema reproductor de los vertebrados. El primer miembro conocido de esta familia fue llamado originalmente LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), y fue aislado y caracterizado a partir del hipotálamo de mamíferos. Actualmente, a esta forma se la conoce como mammalian GnRH (mGnRH) y se sabe que una de sus principales funciones es regular el sistema reproductor a nivel del sistema nervioso central a través del control de la síntesis y secreción de hormonas en la región anterior de la hipófisis (Matsuo et al 1971, Burgus et al 1972). Hasta la fecha se han aislado y secuenciado del sistema nervioso de distintos grupos de cordados, 16 miembros de esta familia de neuropéptidos por lo que se habla de 16 variantes o formas moleculares distintas de GnRH (Adams et al 2002). Estas variantes son neuropéptidos constituidos por 10 aminoácidos con una estructura muy conservada en

12 particular en el primer (Glu), cuarto (Ser), noveno (Pro) y décimo (Gly) aminoácido. Pese a que se han propuesto variadas nomenclaturas para las distintas variantes (Fernald y White 1999, Dubois et al 2002), la más utilizada es aquella que consiste en denominar a cada variante anteponiendo el nombre común de la especie en que fue aislada por primera vez (la única excepción a esta regla es mammalian GnRH) (Tabla 1). Sin embargo Fernald y White propusieron en 1999 denominar a las distintas variantes de GnRH por su ubicación anatómica más que por su secuencia. Así denominaron GnRH I a todas las variantes localizadas en el área preóptica e hipotálamo que están altamente relacionadas con la hipófisis, GnRH II a la forma expresada en el cerebro medio y GnRH III a las formas expresadas en las regiones olfatorias.

Tabla 1: Estructura primaria de las 16 variantes moleculares de GnRH y su secuencia.

Posic. Aminoac. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 – NH2

mGnRH pGlu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly-NH2

cGnRH-I pGlu His Trp Ser Tyr Gly Leu Gln Pro Gly-NH2

sbGnRH pGlu His Trp Ser Tyr Gly Leu Ser Pro Gly-NH2

cfGnRH pGlu His Trp Ser His Gly Leu Asn Pro Gly-NH2

sGnRH pGlu His Trp Ser Tyr Gly Trp Leu Pro Gly-NH2

hrGnRH pGlu His Trp Ser His Gly Leu Ser Pro Gly-NH2

gpGnRH pGlu Tyr Trp Ser Tyr Gly Val Arg Pro Gly-NH2

dfGnRH pGlu His Trp Ser His Gly Trp Leu Pro Gly-NH2

cGnRH-II pGlu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly-NH2

lGnRH-III pGlu His Trp Ser His Asp Trp Lys Pro Gly-NH2

lGnRH-I pGlu His Tyr Ser Leu Glu Trp Lys Pro Gly-NH2

tGnRH-I pGlu His Trp Ser Asp Tyr Phe Lys Pro Gly-NH2

tGnRH-II pGlu His Trp Ser Leu Cys His Ala Pro Gly-NH2

mdGnRH pGlu His Trp Ser Phe Gly Leu Ser Pro Gly-NH2

rGnRH pGlu His Trp Ser Tyr Gly Leu Trp Pro Gly-NH2

wfGnRH pGlu His Trp Ser Tyr Gly Met Asn Pro Gly-NH2

Distribución de GnRH en distintos grupos de vertebrados. MAMÍFEROS: La forma mas conocida y más estudiada es mGnRH que presenta un amplio patrón de distribución en el SNC de muchas especies. Esta molécula fue originalmente aislada, por HPLC, de cerebros de porcinos y ovinos (Matsuo et al 1971,

13 Burgus et al 1972). Existe otra variante típica de mamíferos que se origina a partir del mismo gen pero que posee una modificación posterior. Se la denomina hidroxiprolina mGnRH ([Hyp9]GnRH) y ha sido encontrada en ratas, hámster e inclusive en sapos (Gautron el al 1991, Montaner et al 2001). También se ha identificado, mediante técnicas de biología molecular, una nueva forma molecular en mamíferos, en el cerebro del cobayo Cavia porcellus y fue denominada guinea pig GnRH (gpGnRH). AVES: Se han aislado 2 formas moleculares distintas a partir del cerebro de pollos: chicken GnRH I (King y Millar 1982, Miyamoto et al 1983) y chicken GnRH II (Miyamoto el al 1984). ANFIBIOS: Se ha identificado una sola variante particular: rana GnRH (Yoo et al 2000). ACTINOPTERIGIOS Y LAMPREAS: Este fue el grupo de vertebrados donde mayor cantidad de formas moleculares se han identificado: en el salmon Oncorhynchus keta sGnRH (Sherwood et al 1983), en lampreas lGnRH-I y lGnRH-II (Sherwood et al 1986, Sower et al 1993), en el catfish Ictalurus punctatus cfGnRH (Ngamvongchon et al 1992), en el dogfish Mustelus canis dfGnRH (Lovejoy et al 1992), en el seabream Sparus aurata sbGnRH (Powell et al 1994), en la sardina Clupea arengus herring GnRH (Carolsfeld et al 2000), en el whitefish Coregonus clupeaformis wfGnRH (Adams et al 2002) y en la medaka Oryzias latipes mdGnRH (Okubo et al 2000). UROCORDADOS: Se han aislado y purificado 2 nuevas variantes en este grupo de tunicados tGnRH-I y tGnRH-II (Powell et al 1996). INVERTEBRADOS: Si bien no se han aislado ni secuenciado péptidos provenientes del sistema nervioso de invertebrados, la presencia de GnRH ha sido reportada en cnidarios (Anctil 2000) y moluscos (Goldberg et al 1993, Pazos y Mathieu 1998). Esto demuestra que la molécula GnRH es una molécula muy conservada que surgió tempranamente en la evolución.

Cada una de las variantes es producto de un gen diferente que en todos los vertebrados comparten la misma estructura formada por 3 intrones y 4 exones. Estos genes codifican para una preprohormona que contiene la secuencia de GnRH y la de un péptido asociado a GnRH (GAP) que se encuentran separados por una región de clivaje proteolítico. Mientras que la secuencia del decapéptido GnRH se encuentra altamente

14 conservada entre especies, las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas del péptido señal y el GAP son mucho más divergentes. Aún sigue siendo poco clara la función biológica de los GAPs pero se ha comprobado que son importantes para proveer la correcta estructura secundaria para un correcto procesamiento del precursor de GnRH (Sherwood et al 1994).

Prepro GnRH:

péptido de procesamiento

péptido señal GnRH péptido asociado a GnRH (GAP)

Expresión de varias formas moleculares de GnRH dentro deuna misma especie: comparación entre los distintos grupos de vertebrados. Actualmente se puede afirmar que cada especie de vertebrados expresa 2 o 3 formas distintas de GnRH (Sherwood et al 1997, Dubois et al 2002). Con la excepción de las lampreas, en las que se detectaron 2 formas de GnRH en el área preóptica (lamprey GnRH-I y GnRH-III) (Tobet et al 1995, Eisthen y Northcutt 1996), la localización de las distintas variantes de GnRH siguen un patrón característico en cada grupo con chicken GnRH II expresada en el cerebro y uno o 2 formas más en la porción ventral del cerebro anterior (Figura 3). La forma más conservada es cGnRH-II que se encuentra presente en la mayoría de los grupos de vertebrados como una segunda o tercer variante. Se expresa en todos los vertebrados con mandíbula (Gnatostomados) incluyendo al hombre (White et al 1998). Estudios inmunohistoquímicos y de hibridación in situ han demostrado que se localiza en el tegmentum del cerebro medio (Parhar et la 1996, Okubo et al 2000). Estas neuronas tienen su origen en la pared ventricular mesencefálica como fue claramente demostrado en

15 Figura 3. esquemas sagitales de cerebros de distintos grupos de vertebrados indicando la distribucion de las diferentes poblaciones de GnRH. Tomado de Yamamoto N. (2003). * neuronas de cerebro medio; neuronas del nervio terminal en Acantopterigios; neuronas que expresan las formas lGnRH I y III; neuronas que expresan lGnRH III; neuronas GnRH en Acantopterigios y de la porcion ventral del cerebro anterior en otros linajes.(C) cerebelo; (D) diencefalo; (M) mesencefalo; (MO) medula oblonga; (P) hipofisis; (T) telencefalo. el axolote (Northcutt y Muske 1994). En larvas de lampreas y mixines (hagfish) existe una subpoblación de neuronas GnRH en el hipotálamo caudal que expresa lamprey-II GnRH (Braun et al 1995, Tobet et al 1995). Esta población caudal es comparable funcionalmente a la del cerebro medio de los Gnatostomados (Sower 1997). Por lo tanto, lamprey_II GnRH podría actuar en mixines y lampreas como GnRH-II lo hace en los otros vertebrados.

Vertebrados que expresan 2 formas de GnRH: Además de chicken II se expresa una segunda forma que varía entre los distintos linajes (Figura 3). En la mayoría de los mamíferos, anfibios, peces no Actinopterigios y Actinopterigios basales (esturión, reedfish y anguila), la segunda forma molecular presente es mGnRH (Sherwood et al 1991, Conlon et al 1993, King et al 1995). Dentro de los anfibios, el anuro Rana dybowskii expresa rGnRH como segunda forma (Yoo et al 2000). En los cobayos se expresa gpGnRH en vez de mGnRH (Jiménez-Linan et al 1997). En algunos teleósteos basales la segunda forma puede ser sGnRH (salmon y goldfish) (Sherwood et al 1983) o cfGnRH (catfish) (Bogerd et al 1994). En aves y reptiles la segunda forma expresada es cGnRH I (Miyamoto et al 1982, Sherwood y Whittier 1988). En todos estos linajes de vertebrados la segunda forma molecular de GnRH se expresa a lo largo del nervio terminal así como también en áreas septo-preóptico-hipotalámicas. Estas poblaciones neuronales muestran un patrón continuo de distribución en los diferentes linajes, característica que se le atribuye por su origen en el placode olfatorio (Schwanzel- Fukuda y Pfaff 1989; Wray et al. 1989b; Murakami et al. 1992; Muske 1993; Muske y Moore 1994; Schwanzel-Fukuda 1999; Norgren y Gao 1994; Fiorentino et al. 2001).

Vertebrados que expresan 3 formas de GnRH: Los acantopterigios, también conocidos como teleósteos derivados, expresan 2 formas de GnRH además de cGnRH-II, o sea, cada especie expresa 3 formas distintas. La segunda forma es siempre sGnRH, y la tercer forma varía entre las distintas especies (mdGnRH o sbGnRH) y se expresa en el área preóptica. En los teleósteos que expresan 3 formas los grupos neuronales del nervio terminal y del área preóptica se encuentran bien separados (Figura 3). La forma sGnRH se expresa en un agrupamiento neuronal localizado en la unión del bulbo olfatorio con el telencéfalo ventral mientras que la tercer forma se

16 localiza en neuronas aisladas del área preóptica (Parhar 1997, Soga et al 1998, Ojubo et al 2000). El origen embrionario de la población sGnRH es el placode olfatorio (Parhar 1987, Parhar et atl 1998). Sin embargo, el origen de la tercer forma expresada en el área preóptica no sería el mismo. En algunos trabajos ontogenéticos se ha hipotetizado que esta población se originaría excepcionalmente a partir de la pared ventricular diencefálica (Parhar 1997, Parhar et al 1998).

Consideraciones evolutivas: Recientemente se ha descripto la expresión de 3 formas moleculares de GnRH en peces no acantopterigios: la sardina que expresa hGnRH como tercer forma (Carosfeld et al 2000) y el pacú Myleus pacu que expresa sbGnRH como tercer forma (Powell et al 1997). La sardina pertenece al linaje de los Clupeomorfos, que se considera que han evolucionado antes que el salmón, el goldfish y el catfish. Por otro lado, el pacú pertenece al linaje de los Ostariofisios, donde también se incluyen el goldfish y el catfish. Para este hecho existen 3 posibles explicaciones: 1) La tercer forma de GnRH se ha perdido durante la evolución de los Salmónidos y la de la mayoría de los Ostariofisios. 2) Los Salmónidos y la mayoría de los Ostariofisios poseen una tercer forma de GnRH aún no identificada. 3) La presencia de 3 formas de GnRH ha surgido en 3 linajes en forma independiente (Clupeomorfos, Caraciformes y Acantopterigios)

Estudios recientes han indicado que la presencia de 3 formas de GnRH no es un carácter exclusivo de los Teleósteos. Por ejemplo, en el cobayo y en el carpincho Hydrochaerus hydrochaeris se expresan 3 formas distintas: cGnRH-II, mGnRH y gpGnRH (Montaner et al 2002). Es probable entonces que varios linajes de vertebrados que se consideraban portadores de sólo dos formas de GnRH presenten una tercera variante aún no identificada.

Funciones biológicas de las distintas variantes de GnRH. En mamíferos, la GnRH hipotalámica llega a la hipófisis a través del sistema portal, induciendo la síntesis y liberación de las gonadotrofinas FSH y LH. En peces óseos, en

17 cambio, la morfología del eje hipotalámo-hipofisario es muy diferente: se observa una inervación directa de la hipófisis por parte de las fibras GnRHérgicas, ya que carecen de un sistema portal hipofisario. Las variantes de GnRH que inervan la hipófisis varían entre las distintas especies (Parhar e Iwata 1994, Parhar et al 1995, Parhar 1997). En mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces óseos, todas las formas conocidas de GnRH son capaces de estimular in vitro, en distinto grado, la liberación de gonadotrofinas en cada especie (King y Millar 1997, Sherwood et al 1997). Varias formas moleculares también demostraron tener efecto sobre la liberación de GH y PRL en varios grupos de vertebrados (Sherwood et al 1997, Yu et al 1997). La multiplicidad de receptores descriptos para GnRH, que probablemente hayan co-evolucionado con sus respectivos ligandos, ayuda en gran parte a explicar la multiplicidad de funciones y órganos/células blanco de GnRH (Troskie et al 1998). Es altamente probable que GnRH se haya originado como un factor regulador de los procesos reproductivos y que a lo largo de la evolución haya adquirido funciones no reproductivas comenzando a actuar también fuera de la hipófisis, a nivel de distintos núcleos cerebrales y regiones extracerebrales. Por ejemplo, dentro del SNC GnRH puede tener funciones de neuromodulador o neurotransmisor con importantes efectos sobre el comportamiento reproductivo. Fuera del SNC se encontró expresión de mGnRH en placenta, endometrio, gónadas, adrenal y tumores de glándula mamaria. También se detectaron altos niveles de cGnRH-II en el riñón (King y Millar 1997, White et al 1998). En los mamíferos, las neuronas GnRH del área preóptica pueden autorregularse, y a la vez, sincronizar la actividad de otras neuronas GnRHérgicas de la misma zona a través de contactos celulares GnRH-GnRH (Leranth et al 1985). (Figura 4). La actividad de las neuronas GnRH está altamente influenciada por los esteroides sexuales y por un gran número de neurotransmisores/neuromoduladores inhibitorios y excitatorios tales como: catecolaminas, GABA, neurotensina, NPY, péptidos opiodeos endógenos, CRH y glutamato (Kalra y Kalra 1997, Kim et al 1997). Varios estudios en vertebrados no mamíferos han demostrado que existe un gran número de factores capaces de modificar los niveles de GnRH cerebral asi como la actividad de estas neuronas. Los factores más estudiados fueron: los esteroides sexuales, la maduración gonadal, las feromonas, las interacciones sociales, la temperatura, el fotoperíodo, algunos estadios específicos del desarrollo y la masa corporal (Yu et al 1997, Soga et al 1998). Lo que aún no se sabe con

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Soñez de Galarza, 2001). certeza es si los esteroides sexuales actúan directamente sobre las células GnRHérgicas o sobre otras células asociadas a éstas.

Población del Nervio Terminal/Núcleo olfacto retinalis: La GnRH ubicada en regiones extracerebrales tales como el nervio terminal presenta una alta expresión en animales juveniles, que va disminuyendo al aumentar la edad de éstos (Schwanzel-Fukuda y Pfaff 1989, Parhar et al 1995). En peces óseos, a diferencia de los demás vertebrados, esta población se caracteriza por ser intracerebral (Munz y Calas 1987). La expresión de esta población desde estadios tempranos del desarrollo estaría indicando que está involucrada en el desarrollo de ciertas áreas cerebrales relacionadas con la reproducción, en el procesamiento de los estímulos recibidos por el sistema olfatorio y en la memoria olfativa. Esta población del nervio terminal se encuentra regulada por esteroides sexuales sólo en animales sexualmente maduros (Parhar 1997, Soga et al 1998). Cabe destacar, sin embargo, que el rol de esta población es cuestionado por varios autores, ya que en ciertas especies la población del nervio terminal regresa o está ausente en estadios adultos (Eisthen y Northcutt 1996).

Población del Area Preóptica: En los peces, la coincidencia temporal de algunos hechos permiten sugerir un rol de la GnRH expresada en el área preóptica con la diferenciación sexual (Parhar 1997). Estos hechos coincidentes son: 1) Diferenciación de neuronas GnRH en el área preóptica. 2) Entrada de fibras GnRH en la hipófisis. 3) Diferenciación sexual gonadal. 4) Aparición de células productoras de esteroides en las gónadas.

Por otro lado, se ha observado un aumento en el número y tamaño de células GnRHérgias de la POA que se correlaciona con un aumento plasmático de los esteroides sexuales coincidente con el inicio de la maduración gonadal (Grober et al 1994, Soma et al 1996). En salmones y sapos, que sufren importantes procesos metamórficos o de smoltificación, se observa también un aumento en la expresión de GnRH en la porción ventral del cerebro anterior que también coincide con la maduración de las gónadas (Hayes et al 1994, Parhar et al 1995, Parhar e Iwata 1996). Lo que no está claro es si la

19 metamorfosis estimula la expresión de estas neuronas GnRHérgicas, o si el aumento de GnRH favorece, junto a otros factores, el rápido desarrollo gonadal observado. Posteriormente se ha demostrado, en los salmones, que en el momento de la smoltificación-metamorfosis, se secretan varios factores promotores del crecimiento y hay elevados niveles de hormona tiroidea que regularían la expresión génica de GnRH y la diferenciación de células GnRHérgicas (Parhar e Iwata 1996).

Población del cerebro medio: En varias especies de peces, la expresión de GnRH en el cerebro medio (cGnRH-II) es simultánea con la expresión de la población del nervio terminal (Parhar 1997). En cambio, en otras comienza mucho más tarde y en coincidencia con la maduración gonadal (Parhar et al 1995). Nada se sabe aun acerca de la importancia funcional de esta población en estadios tempranos del desarrollo. Se ha visto que está involucrada con ciertos comportamientos relacionados a la función reproductiva en roedores, comadrejas, salamandras y aves (Rissman 1997). En peces se vio que esta población, a diferencia de las del cerebro anterior, es insensible a los esteroides sexuales (Soga et al 1998) por lo que es probable que su regulación esté dada por otros factores y que tenga alguna otra función importante junto con o en lugar de la reproductiva.

En conclusión podemos resumir lo siguiente:

Población del Nervio FUNCIONES NEUROMODULADORAS Y Terminal COMPORTAMENTALES Población del Área FUNCIONES HIPOFISOTROFICAS preóptica Población del Cerebro FUNCIONES NEUROMODULADORAS Medio:

Múltiples receptores para GnRH. El cDNA que codifica para el receptor de GnRH (GnRH-R) fue caracterizado por primera vez en ratones (Tsutsumi et al 1992) y su funcionalidad fue luego estudiada utilizando oocitos de Xenopus en los cuales se lo expresó (Reinhart et al 1992). Una vez

20 que el GnRH-R de ratón fue caracterizado, se identificaron secuencias homólogas en distintas especies de mamíferos (Stojilkovic et al 1994). Al ir aumentando el consenso acerca de la presencia de múltiples variantes de GnRH dentro de una misma especie, se comenzó a desarrollar el concepto de múltiples receptores para GnRH. El primer estudio que mostró la presencia de distintos subtipos de GnRH-R en una misma especie fue realizado en el goldfish (Illing et al 1999). Estos receptores mostraron diferentes propiedades farmacológicas y una distinta distribución. Luego de este trabajo se estableció la presencia de varios subtipos de GnRH-Rs: dos en el zebrafish Danio rerio (Troskie et al 1998), dos en el sapo Xenopus laevis (Troskie et al 1998, 2000), dos en la medaka Oryzias latipes (Okubo et al 2001), dos en primates (Millar et al 2001, Nelly 2002) y tres en Rana catesbiana (Wang et al 2001). Si consideramos la presencia de múltiples formas de GnRH expresadas en distinto núcleos cerebrales que tienen efectos sobre diferentes órganos, es lógico suponer la presencia de múltiples receptores para GnRH dentro de una misma especie con distinta estructura y distribución.

Importancia del estudio de las diferentes variantes de GnRH Los estudios comparativos a este nivel en distintos modelos animales han demostrado ser muy útiles para elucidar distintos aspectos de la función reproductiva básica de los Vertebrados. Los estudios en anfibios fueron los primeros en demostrar que algunas subpoblaciones GnRHérgicas se originaban a partir de células precursoras localizadas en el placode olfatorio que luego migraban hacia el cerebro (Muske and Moore 1987, 1990). La importancia clínica de este fenómeno fue demostrada en pacientes con síndrome de Kallman. Este síndrome se caracteriza por presentar hipogonadismo, esterilidad y ausencia total de olfato. En estos pacientes observó que, por esa patología, las neuronas GnRH no podían migrar desde el placode olfatorio hasta la porción ventral del cerebro anterior por el nervio olfatorio (Schwanzell-Fukuda et al 1989). La diversidad de formas moleculares de GnRH fue demostrada también por primera vez en un modelo no mamífero (King y Millar 1997). La idea sobre la multiplicidad de variantes moleculares de GnRH fue ampliada recientemente con el descubrimiento de la expresión de cGnRH-II en el cerebro de humanos y otros mamíferos (Jiménez-Linan et al 1997, White et al 1998). El descubrimiento de la gran diversidad de variantes de GnRH en

21 modelos no mamíferos y la clonación de los distintos genes en cerebros de distintas especies de teleósteos son actualmente de gran importancia, ya que amplian el conocimiento acerca de las distintas funciones de GnRH en una misma especie y sus mecanismos de regulación. Por otro lado, las variantes de GnRH pueden ser una importante herramienta para generar análogos de GnRH con fines terapéuticos.

Las gonadotrofinas en peces teleósteos La hormona folículo estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH) son glicoproteínas sintetizadas en la hipófisis, que regulan la gametogénesis y la esteroidogénesis gonadal en los vertebrados. En varias especies de teleósteos se han aislado, al igual que en los tetrápodos, dos tipos distintos de gonadotrofinas y se ha demostrado que son heterodímeros con dos subunidades distintas denominadas α y β (Xiong et al 1994, Yoshiura et al 1999, Yaron et al 2001). Dentro de una misma especie, las subunidades α son idénticas entre si y las β difieren, confiriendo la especificidad fisiológica de cada gonadotrofina (GTH) (Xiong et al 1994). Sin embargo, los roles de cada una de ellas no son claros, excepto en los salmónidos (que se caracterizan por presentar un desove al año) donde la actividad biológica de FSH y LH ha sido estudiada con mas detalle (Suzuki et al 1988, Tyler et al 1991). Particularmente la función de FSH en peces no salmónidos es muy poco conocida y hay muy pocos estudios que relacionen los cambios en las células que expresan FSH durante el ciclo reproductivo de peces con múltiples puestas anuales. En términos fisiológicos FSH es considerada como una hormona vitelogénica mientras que LH está involucrada en procesos de maduración de las células gonadales. Algunos estudios realizados a lo largo del desarrollo en peces teleósteos han demostrado distintos niveles plasmáticos y diferente expresión temporal en la hipófisis de FSH y LH, sugiriendo que existe una variación de sus funciones en el inicio de la pubertad y en el control de la gametogénesis (Dufour et al 2000). Tradicionalmente se pensaba que FSH y LH se sintetizaban exclusivamente en células de la adenohipofisis (ADH) de los vertebrados. Sin embargo, se ha detectado inmunoreactividad para estas hormonas en cerebros de roedores y humanos (Croxatto el al 1964, Emanuele et al 1981, Hostetter et al 1981). En el salmon Oncorhynchus nerka se ha descripto que algunas células del nucleo preóptico expresan glicoproteínas simil FSH y LH

22 (Parhar et al, 1995). En la tilapia Oreochromis niloticus, FSH y LH fueron clonadas y secuenciadas y la presencia de sus mRNA en el cerebro fue confirmada mediante RT-PCR (Parhar et al 2003). Aunque la función precisa de FSH y LH cerebral aún no se conoce, la distribución de los axones inmunoreactivos en cerebro y neurohipófisis sugieren la existencia de una importante función neuromoduladora en núcleos relacionados con el sistema olfatorio y en el control de la actividad de las células de la ADH. Por otro lado los somas que expresan FSH y LH pertenecen a neuronas preópticas muy relacionadas con el comportamiento reproductivo (Demski y Sloan 1985, Foran y Bass 1999). Unos pocos estudios se han focalizado en la ontogenia y las posibles funciones de las GTHs durante el desarrollo gonadal temprano: en trucha arco iris Salmo gairdneri (Van der Hurk 1982), carpa Cyprinus carpio (Van Winkoop et al 1987), salmon (Mal et al 1989), trucha Oncorhynchus mykiss (Saga et al 1993, Feist y Schreck 1996), pejerrey Odontesthes bonariensis (Miranda et al 2001). Estos estudios han demostrado que existe una variación específica de especie muy marcada en el tiempo y orden de aparición de las células que expresan FSH en comparación con las que expresan LH, pero no se ha establecido aun un patrón general para las diferentes especies. Los estudios en las diferentes especies de teleósteos son de fundamental importancia debido a que la expresión de las distintas GTHs y su función biológica durante el desarrollo y las distintas etapas del ciclo reproductivo puede variar considerablemente entre los distintos grupos.

Modelo biológico: Cichlasoma dimerus Ubicación taxonómica del modelo biológico La ubicación taxonómica de nuestro modelo biológico es la siguiente (Según Kardong, 1998) Chordata Craniata Vertebrata Gnathostomata Osteichthyes Actinopterygii Teleostei

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Figura 5. Filogenia de los principales linajes de vertebrados. Tomado de Baker y Bird (2000). Acanthopterygii Perciformes Cichlidae Cichlasoma dimerus (Heckel, 1840)

En la figura 5 se muestra la filogenia para los distintos grupos de vertebrados con especial énfasis en los principales grupos de peces óseos.

Características del modelo biológico. La Familia Cichlidae (Bonaparte, 1840) forma uno de los mayores grupos de teleósteos ya que comprende 105 géneros y alrededor de 1300 especies (Nelson, 1994). La mayoría de ellas viven en agua dulce y unas pocas pueden frecuentar aguas salobres. Se distribuye principalmente en África y también en Centro y Sudamérica, Indias Occidentales, Madagascar, Israel, Siria, Sri Lanka y áreas costeras de la India. Como sucede en muchas familias de teleósteos, hay una gran variabilidad en la forma del cuerpo de las distintas especies. La mayoría de los cíclidos tienen un cuerpo moderadamente comprimido, similar al del género Cichlasoma. Sin embargo, el cuerpo puede tener forma de disco y poseer aletas extremadamente altas, como en Pterophyllum, o tener aletas bajas, como en Symphysodon; o incluso puede ser elongado, como sucede en el género Crenicichla. Los cíclidos se caracterizan por poseer narinas simples y línea lateral interrumpida. El número de radios duros o espinosos de la aleta dorsal varía entre 7 y 25, mientras que el de radios blandos oscila entre 5 y 30. La aleta anal presenta entre 3 y 5 espinas (3 en la mayoría de las especies) y de 5 a 30 radios blandos. El número de vértebras varía entre 24 y 42 (Nelson, 1994). Es una de las pocas familias de peces tropicales cuya monofilia aún no está clara debido a lo difícil que es distinguir a las distintas especies entre sí y a las confusas relaciones entre los distintos grupos (Stiassny, 1991). Las especies de mayor tamaño son las sudamericanas. Poseen patrones reproductivos que incluyen el cuidado de los huevos dentro de la boca de los padres, aunque la mayoría de los cíclidos sudamericanos realizan su puesta en sustratos duros del fondo de los cuerpos de agua que habitan. En Sudamérica

24 hay unas 420 especies y es una de las 4 familias más numerosas junto con los Characidae, Pimelodidae y Loricariidae. Hay pocas especies de importancia económica, tales como Tilapia rendalli y Oreochromis keta y un gran número de especies ornamentales muy difundidas entre los acuaristas: Astronotus sp. (Brasil), Caquetaia kraussii y Caquetaia umbrifera (Colombia). La revisión taxonómica más completa de cíclidos sudamericanos fue publicada por Regan en 1905 y desde ese entonces no hubo trabajos sistemáticos tan completos.

El Género Cichlasoma se distribuye por las cuencas de los ríos Orinoco, Amazonas, San Francisco, Paraguay, Paraná y Uruguay, hallándose también en los ríos de Trinidad, Guayanas y en zonas costeras del noreste de Brasil, Rio Grande do Sul y Uruguay. Las especies de este género se caracterizan por tener escamas en la base de las aletas dorsal y anal. El patrón de pigmentación típico consiste en la presencia de una serie de bandas verticales oscuras sobre los flancos del cuerpo. La apariencia general de las especies del género Cichlasoma es similar al de las especies del género Aequidens, presentando ambos una mancha circular en la base de la aleta caudal, otra mancha oscura cercana a la órbita, y un diseño de manchas asimétrico en la aleta caudal. La longitud estándar de los ejemplares en la naturaleza raramente excede los 12 cm.

Cichlasoma dimerus (Figura 6) se encuentra frecuentemente en aguas quietas y poco profundas de los ríos Paraná y Paraguay desde Brasil hasta el norte de la provincia de Buenos Aires. Por lo general se lo encuentra asociado a cuerpos de agua tributarios de estos ríos, como los esteros y bañados de la provincia de Corrientes. Estos ambientes son de aguas quietas y vegetadas, con profundidades que no superan los 3,5 m. Sin embargo, estos peces se ubican a no más de 1 m de profundidad, salvo cuando las temperaturas ambientales son muy elevadas o reducidas, en estos casos descienden a mayor profundidad en busca de aguas más frías o cálidas, respectivamente. Suelen formar parejas que defienden mucho su territorio. Las hembras depositan sus huevos en el sustrato y cavan pequeñas fosas a las que son transferidas las larvas luego de la eclosión. La pareja cuida los huevos y las larvas hasta que empiezan a nadar libremente en el sexto día luego de la eclosión. Se demostró que esta especie posee altas tasas de supervivencia y que son fáciles

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Figura 6. Aspecto de un ejemplar adulto de Cichlasoma dimerus. Foto. F. Meijide. de criar en el laboratorio, por lo que se convierten en un interesante modelo para el estudio de procesos reproductivos, comportamentales y de desarrollo.

Desarrollo embrionario y post-embrionario en C. dimerus (Según Meijide y Guerrero 2000): 1) Huevo (0-52 hs.). 2) Embrión pre-eclosión (52-54 hs.): comienza a tener contracciones musculares marcadas. La cola está extendida y separada del saco vitelino. El corazón ya está formado y se localiza debajo de la cabeza, ligeramente desplazado a la izquierda y el flujo sanguíneo es notorio. Ya se observan algunas zonas del encéfalo y las vesículas óticas que contienen los otolitos. 3) Larva post-eclosión (55 hs.): Luego de la eclosión, las larvas son trasladadas por los padres hacia un hoyo previamente cavado en la grava. Poseen tres pares de glándulas adhesivas en la cabeza para adherirse al sustrato. La boca no se formó todavía y el intestino es delgado y recto. Las aletas aún no son visibles y los ojos son traslúcidos. 4) Larva vitelina (82 hs.): Se diferencian las aletas pectorales y comienzan a esbozarse los arcos branquiales. El corazón es bien notorio y hay una abundante irrigación sobre el saco vitelino y las aletas. Aumenta la pigmentación en la región ventral del cuerpo y en los ojos. 5) Larva con apertura de la boca (4 días): Se abre la boca, y las mandíbulas comienzan a ser móviles. Aún no nadan libremente. El saco vitelino se reduce considerablemente y comienzan a formarse los radios de la aleta caudal. 6) Larva de natación libre (6 días): Las larvas comienzan a nadar libremente. La vejiga natatoria se hace visible gracias a su refringencia. Las glándulas adhesivas regresionan y se desprenden. Aparecen los primordios de los radios en las aletas pectorales. Las aletas dorsal y anal muestran una diferenciación incipiente pero no se observan radios. A las pocas horas de iniciada la natación libre comienzan a alimentarse exógenamente aunque el saco vitelino no está consumido del todo. Los pigmentos se distribuyen densamente sobre el abdomen y algunas regiones del tronco.

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Figura 7a. Diferentes etapas del desarrollo post-embrionario en C. dimerus. Según Meijide y Guerrero 2000. (a) Larva post-eclosión, 55 hs. (b) Larva vitelina, 82 hs; (c) Larva con apertura de la boca, (4 días). (ag) glándula adhesiva; (ffv) vasos sanguíneos de la aleta; (h) corazón; (m) melanóforos: (no) notocorda; (pfv) esbozo de aleta pectoral; (rp) primordios de rayos de aleta caudal. Barra: 500 µ.

Figura 7b. Diferentes etapas del desarrollo post-embrionario en C. dimerus. Según

Meijide y Guerrero 2000.

(a) Larva de natación libre, 6 días; (b) Larva con desarrollo de aletas impares, 14 días; (c) Prejuvenil, 26 días; (d) Juvenil, 42 días. (g) branquias; (n) narinas; (rp) primordios de rayos de aleta caudal; (sb) vejiga natatoria;

(vF) aleta ventral. Barra: 500 µ (a y b); 1 mm (c); 2 mm (d). 7) Larva con desarrollo de aletas impares (14 días): Los radios de las aletas dorsal y anal comienzan a diferenciarse simultáneamente. En la aleta caudal aparecen los primeros artejos. Las branquias están completamente formadas y el intestino comienza a enrollarse. 8) Prejuvenil (26 días): aparecen las aletas pélvicas y el patrón de pigmentación se va asemejando al del adulto. 9) Juvenil (42 días): Todas las aletas han completado su desarrollo, la anal y la dorsal están bastante pigmentadas, las escamas que aparecen en el día 36, cubren la mayor parte del cuerpo. La forma del cuerpo y el patrón de pigmentación son semejantes al del adulto y la mayor parte del esqueleto ya se osificó. Pocos días después ocurrirá la diferenciación gonadal.

En las figuras 7 a y b, pueden observarse las diferentes etapas del desarrollo post- embrionario en C. dimerus.

Diferenciación sexual gonadal C. dimerus (Según Meijide et al 2005) Se considera que el tipo de desarrollo gonadal en esta especie es gonocorístico, es decir, que la gónada indiferenciada se transforma directamente en testículo o en ovario. En el día 14 comienzan a detectarse los primordios gonadales, constituidos por unas pocas células germinales que se encuentran envueltas por células somáticas. En esta especie la diferenciación ovárica ocurre antes que la diferenciación testicular. Diferenciación ovárica: A partir del día 42 comienzan a aparecer los primeros signos morfológicos de la diferenciación ovárica. Se comienzan a observar divisiones meióticas en los oocitos I recientemente formados acompañadas por un aumento en la proliferación mitótica de las oogonias y la reorganización somática que comienza a revelar la morfología de un ovario presuntivos. Alrededor del día 65 la cavidad ovárica se encuentra ya totalmente formada. En el día 100 ya se pueden observar numerosos folículos que contienen oocitos en el estadio perinucleolar.

Diferenciación testicular: A partir del día 72 comienzan a aparecer los primeros signos morfológicos de diferenciación testicular. Alrededor del día 100 comienza a observarse la

27 estructura lobular irrestricta típica del testículo de esa especie pudiendo distinguirse en esta etapa, espermatogonias y espermatocitos I y II.

Cichlasoma dimerus como modelo de laboratorio. Esta especie está siendo usada en nuestro laboratorio como modelo biológico para el estudio de la reproducción y el desarrollo embrionario de peces teleósteos. Su desarrollo embrionario y postembrionario, asi como el proceso de diferenciación sexual gonadal también han sido estudiados en detalle en nuestro laboratorio (Meijde y Guerrero 2000, Meijide et al 2005). También se conoce la estructura de su hipófisis y la ontogenia de los distintos tipos celulares que la componen (Pandolfi et al 2001a,b). La estructura de muchos núcleos cerebrales con función neuroendocrina fue también detallada en varios trabajos (Pandolfi et al 2002, 2003 y 2005). Actualmente se utiliza también como modelo de estudio de disrupción endocrina a causa de contaminantes ambientales (Moncaut et al 2002).

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Hipótesis y objetivos

CAPITULO I

La primera parte de esta Tesis doctoral se centrará en el estudio de la distribución y ontogenia de las distintas poblaciones GnRHérgicas de esta especie y su relación con la diferenciación sexual gonadal.

Hipótesis 1.1: En Cichlasoma dimerus se expresan 3 variantes distintas de GnRH en distintas poblaciones neuronales, cada una de las cuales posee un origen diferente. Hipótesis 1.2: El eje hipotálamo-hipófisis, en esta especie, está involucrado en la diferenciación sexual gonadal. Por lo tanto el inicio de la diferenciación ocurre inmediatamente después de la inervación hipofisaria por fibras GnRHérgicas.

Objetivos:

1) Estudiar la morfología y citoarquitectura de los principales núcleos telencefálicos y diencefálicos en adultos de Cichlasoma dimerus para poder comprender la distribución de somas y fibras GnRHérgicos.

2) Estudiar la distribución de las distintas poblaciones en adultos, localizando su origen, el tiempo de diferenciación de cada una de las variantes y su ontogenia.

3) Verificar si existe una correlación entre el inicio de la inervación hipofisaria (que se correlacionaría con el inicio de la liberación de gonadotrofinas) y la diferenciación sexual de las gónadas.

4) En caso de comprobar alguna correlación se tratarán gónadas indiferenciadas en cultivos con distintas concentraciones de gonadotrofinas para sustentar la hipótesis de que el eje hipotálamo hipofisario se relaciona con la diferenciación sexual en esta especie.

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CAPITULO II Los resultados obtenidos en el capítulo 1 acerca del patrón de distribución de las diferentes variantes moleculares en el sistema nervioso central de Cichlasoma dimerus, coincidían en gran parte con los descriptos hasta el año 2002 para otras especies de Perciformes. Particularmente se afirmaba que en Perciformes las distintas poblaciones de somas GnRH estaban segregados y que la forma sbGnRH (GnRH I) se originaba a partir del placode olfatorio. Esto no coincidía con lo observado en los demás grupos de vertebrados donde los somas de la neuronas del cerebro anterior (GnRH I y GnRH III) se distribuían con un patrón continuo y ambas poseía un origen embrionario en el placode olfatorio. Por lo tanto, se consideraba que el patrón observado en Perciformes era una característica distintiva de este grupo de peces. Pero, entre los años 2001 y 2002 se comenzaron a publicar resultados en otro Perciforme, el seabass Dicentrarchus labrax utilizando una nueva metodología que mostró un patrón de distribución de las poblaciones GnRHérgicas similar al de los otros vertebrados (González Martínez et al 2001, 2002a, 2002b y 2004). Estos datos contradecían las ideas de “poblaciones GnRHérgicas segregadas” y “origen preóptico de sbGnRH (GnRH I)”). La metodología utilizada en el seabass se basa en el uso de anticuerpos y riboprobes dirigidos contra el péptido asociado a GnRH (GAP) que da información mucho más específica que el uso de anticuerpos y riboprobes contra las pequeñas moléculas de GnRH. Estos GAPs resultaron ser exitosos marcadores indirectos de células GnRHérgicas porque se producen a partir de los precursores de las distintas GnRHs y porque se ha demostrado que colocalizan con las células GnRHérgicas (Ronchi et al 1992, Polkowska y Prezko 1993). La mayor ventaja de esta metodología reside en la gran diferencia de secuencias, dentro de una misma especie, de los GAPs correspondientes a cada forma molecular de GnRH, lo que evita reacciones cruzadas. Lo único que no se sabía hasta el momento era si los anticuerpos y riboprobes dirigidos contra los GAPs de una especie eran útiles para reconocer los GAPS de una especie filogenéticamente relacionada. De ser así, podrían ser herramientas muy útiles para estudios comparados de las variantes de estas moléculas. Es por ello que en la segunda parte de esta tesis se decidió utilizar anticuerpos y riboprobes contra distintos GAPs de Perciformes en Cichlasoma dimerus para poner a prueba la siguiente hipótesis.

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Hipótesis 2: La distribución y ontogenia de las múltiples variantes de GnRH en Cichlasoma dimerus coincide con lo descripto en los demás grupos de vertebrados y no condice con el patrón descripto previamente en Perciformes, el cual habría sido probablemente el resultado de reacciones cruzadas entre anticuerpos contra GnRH.

Objetivos:

1) Determinar si los diferentes GAPs (péptidos y ARNm) muestran un patrón de distribución superpuesta o segregada.

2) Examinar las proyecciones nerviosas de las distintas poblaciones de GAPs hacia el cerebro e hipófisis.

3) Analizar particularmente el origen embrionario de la población sbGAP (GnRH-I)

4) Corroborar que los anticuerpos y riboprobes contra los distintos GAPs son valiosas herramientas para el estudio de los sistemas GnRHérgicos en especies filogenéticamente relacionadas, a fin de evitar los clásicos problemas de reacciones cruzadas entre distintas formas moleculares de GnRH.

CAPITULO III La tercera y última parte de esta tesis se centrará en el estudio de las gonadotrofinas. Cabe destacar que en un trabajo previo acerca de la hipófisis de C. dimerus (Pandolfi et al 2001a) sólo se pudo detectar GTH-II (LH) en la PPD y la PI. El reconocimiento de FSH con anticuerpos heterólogos entre teleósteos siempre fue muy dificultoso ya sea por reacciones cruzadas o falta de especificidad. Pero, en el año 2003 se generaron anticuerpos contra FSH y LH del mummichog Fundulus heteroclitus, que reconocen específicamente las secuencias conservadas de FSH y LH de peces acantopterigios (Shimizu et al 2003). Estos anticuerpos serán probados en C. dimerus para corroborar la siguiente hipótesis:

31

Hipótesis 3: Las gonadotrofinas FSH y LH en C. dimerus se localizan en distintas poblaciones de la adenohipófisis y su distribución se extiende también al cerebro de esta especie. La diferenciación de las células FSH precede a las de las células LH.

Objetivos:

1) Estudiar la distribución de las células endocrinas productoras de FSH y LH en hipófisis y de las neuronas y fibras ir-FSH y LH en el cerebro de adultos de Cichlasoma dimerus. Comprobar si existe colocalización total o parcial de FSH y LH.

2) Determinar los pesos moleculares de FSH y LH y caracterizar los antisueros utilizados.

3) Determinar la etapa del desarrollo en que se detectan las células productoras de FSH y LH, su modo de distribución en el cerebro y la adenohipófisis y su relación con las distintas variantes moleculares de GnRH.

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CAPITULO I

DISTRIBUCIÓN Y ONTOGENIA DE LAS DISTINTAS POBLACIONES GnRHÉRGICAS UTILIZANDO ANTICUERPOS CONTRA LAS DISTINTAS FORMAS MOLECULARES DE GnRH. SU RELACIÓN CON LA DIFERENCIACIÓN SEXUAL GONADAL.

33 MATERIALES Y MÉTODOS

Animales utilizados y procesamiento del material biológico. Los animales adultos utilizados en este estudio descendían de animales criados en el laboratorio que provenían originalmente de la localidad de Esteros del Riachuelo, Corrientes, Argentina (27o25´S ; 58o15´O). Los animales se mantuvieron en grandes acuarios con buena aireación y con filtros incorporados. La alimentación se llevó a cabo con pellets comerciales para peces y gusanos del género Tubifex. Diversos estadios larvales y juveniles (desde la eclosión hasta los 82 días post- fecundación) se obtuvieron en Febrero de 2001 de 3 parejas diferentes de animales de la colonia del laboratorio. La eclosión en esta especie ocurre 52 horas después de la fecundación. Los muestreos de larvas fueron hechos una vez por día durante los primeros 10 días luego de la eclosión y luego cada 3 días hasta el día 82. En cada estadio el número mínimo de animales sacrificados fue 5. Tanto los adultos como las larvas fueron anestesiados con una solución acuosa de benzocaína 0.1%. Luego se realizó la disección del cerebro, con la hipófisis unida en el caso de los adultos y la cabeza completa en el caso de juveniles y larvas. En larvas que se encontraban en el período de diferenciación sexual gonadal (día 40 a día 82) también se disecó parte del abdomen para estudiar las gónadas a nivel histológico. La fijación se realizó en líquido de Bouin: 24 horas a 4 oC para cerebros con hipófisis y cabezas de larvas y 6 horas a temperatura ambiente para los abdómenes. Las piezas fueron deshidratadas, incluidas en parafina y seccionadas parasagital, transversal y horizontalmente a 10µm (adultos) o 7µm (larvas y gónadas). Finalmente las secciones histológicas se montaron en portaobjetos, previamente cubiertos con gelatina 1% y procesados para: 1) Coloración con tionina para caracterizar los principales centros telencefálicos y diencefálicos relacionados con procesos reproductivos (cortes transversales de cerebro de adultos de 10 µm de espesor. 2) Inmunohistoquímica con el fin detectar somas y fibras GnRHérgicas (cerebros y cabezas de larvas). 3) Coloración con hematoxilina-eosina para determinar el estadio de diferenciación sexual gonadal (abdómenes).

34 En todo momento se cumplió con los principios de cuidado de animales de laboratorio citados en una publicación de la NIH (NIH publication N 86-23, revisado en 1985).

Inmunohistoquímica para la detección de GnRH. Las secciones fueron desparafinadas en xilol, rehidratadas a través de concentraciones decrecientes de etanol hasta llegar finalmente a buffer fosfato salino a pH 7.4 (PBS). Se realizó luego una incubación durante 15 minutos en una solución de PBS y gelatina 0.75% y luego las secciones fueron puestas en contacto durante 30 minutos a temperatura ambiente con una solución proteica para el bloqueo de sitios inespecíficos de unión de anticuerpos (Dako, Copenhague, Dinamarca). Finalmente se incubaron con diferentes antisueros y anticuerpos primarios contra GnRH durante 24 horas a 4 oC (Tabla 1):

Tabla 1: Características de los antisueros utilizados y secuencias reconocidas por cada uno de ellos. En negrita se remarcan los aminoácidos variables de cada forma molecular de

GnRH: (1) pGlu His Trp Ser His Gly Trp Tyr Pro Gly NH2; (2) pGlu His Trp Ser Tyr Gly

Leu Ser Pro Gly NH2; (3) pGlu His Trp Ser Tyr Gly Trp Leu Pro Gly NH2.

ANTISUERO DILUCIÓN HECHO EN DONADO POR CÓDIGO Chicken GnRH II (1) 1:5000 Conejo Dr I.S. Parhar ISP II Seabream GnRH (2) 1:12000 Conejo Dr I.S. Parhar ISP I Salmon GnRH (3) 1:5000 Conejo Biogenesis GnRH monoclonal 1:10000 Ratón Dr K.W. Wakabayashi LRH13

Luego de la incubación con el antisuero primario correspondiente se pusieron en contacto las secciones durante 30 minutos con distintos anticuerpos secundarios teniendo en cuenta la especie animal en la que se habían generado los primarios. Para los antisueros primarios hechos en conejo se utilizó un a IgG biotinilada anti-ratón y para el anticuerpo monoclonal una IgG biotinilada anti-ratón. La amplificación de la señal fue llevada a cabo utilizando un sistema comercial de amplificación basado en tiramida (kit CSA-peroxidasa,

35 DAKO) siguiendo las instrucciones del mismo. La inmunomarcación se ve como un precipitado marrón tantos en somas como en fibras nerviosos y se basa en la reacción enzimática de la peroxidasa con su sustrato la diaminobenzidina (DAB). Finalmente los cortes recibieron una suave coloración nuclear de contraste con hematoxilina antes de ser deshidratados y montados en DPX.

Controles y especificidad de la inmunomarcación: Control de falsos positivos de la técnica inmunohistoquímica: En varias secciones se omitieron el primer o segundo anticuerpo que fue reemplazado por PBS. Control de la especificidad del anticuerpo monoclonal LRH13: Este anticuerpo reconoce indistintamente cualquier variante molecular de GnRH ya que se une a regiones latamente conservadas de las distintas formas moleculares de GnRH. El anticuerpo en su dilución de uso (1:10000) fue preincubado con un antígeno específico, GnRH de mamífero (mGnRH) (Sigma, San Luis, Mo.) en concentraciones crecientes desde 0.05 a 1 µM durante 18 horas a 4 oC. Cuando se aplicó esta mezcla a las secciones no se obtuvo inmunomarcación ni en fibras ni en somas. Esto comprueba la especificidad de este anticuerpo para detectar GnRH pero no puede distinguir las distintas formas moleculares que se expresan en esta especie. Control de la especificidad de los antisueros policlonales contra las distintas formas de GnRH: Debido a que no se disponía de los antígenos correspondientes a cada forma de GnRH (sGnRH, cGnRH II y sbGnRH), se realizaron aproximaciones indirectas para verificar la especificidad de cada uno de los antisueros. Para ello se utilizaron cortes adyacentes de 10 µm de espesor en las zonas de mayor expresión de cada una de las formas moleculares de GnRH (Núcleo olfacto retinalis, Área Preóptica y Cerebro Medio). Se trató a uno de estos cortes con LRH13 y al otro con alguno de los anticuerpos policlonales (anti-sGnRH, anti-sbGnRH y anti cGnRH-II) para verificar su especificidad (+) en las zonas de mayor expresión de la forma molecular que reconoce cada uno y su inespecificidad (-) en las zonas de mayor expresión de las otras dos formas moleculares. Otros criterios de especificidad: La especificidad puede ser inferida también comparando los resultados obtenidos con trabajos previos de localización de distintas poblaciones GnRHérgicas en la tilapia Oreochromis mossambicus (Perciformes;

36 Cichlidae), que es una especie filogenéticamente relacionada a Cichlasoma dimerus, utilizando los mismos antisueros y técnicas de hibridación in situ (Parhar 1997). Tratamiento de gónadas indiferenciadas en cultivo con FSH recombinante humana (FSHrh). 80 larvas de 30 días fueron anestesiadas con una solución acuosa de benzocaína 0.1%, lavadas rápidamente en etanol 70%, para luego ser transferidas a cápsulas de Petri conteniendo solución fisiológica esterilizada. Las gónadas indiferenciadas junto con el riñón y parte de la pared corporal fueron disecadas para realizar cultivos de órganos. Las piezas fueron transferidas a placas de cultivo con múltiples perforaciones cada una de las cuales contenía 300 µl del medio de cultivo. Todo el experimento se realizó bajo flujo laminar y en condiciones de esterilidad. El medio de cultivo utilizado fue L15 en una dilución 60% V/V suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 UI/ml de penicilina y

100 µg/ml de estreptomicina. El medio de cultivo se cambió cada dos días. Los cultivos se mantuvieron durante 15 días a una temperatura de 25 oC. Se realizaron dos experimentos diferentes, cada uno de ellos con un N=40. La viabilidad de los cultivos siempre fue mayor al 80%. Se siguió el siguiente protocolo: Días 1 a 3: Sólo medio de cultivo Días 4 a 11: Medio de cultivo junto con 3 dosis distintas de FSH recombinante humana (0.5, 1 y 2 µg/ml). Para cada concentración se utilizó un N=10, y las 10 restantes gónadas se mantuvieron durante todo el experimento en medio de cultivo. Días 11 a 15: Sólo medio de cultivo.

Se utilizó FSHrh como posible inductor de la diferenciación sexual gonadal por 3 razones principales: 1) En el momento que empieza la inervación hipofisaria por fibras GnRH las células FSH ya están diferenciadas, no así las que expresan LH. 2) Se ha probado que FSHrh es biológicamente activa en vertebrados no mamíferos (Canosa y Ceballos 2002) 3) Se ha comprobado que FSH de mamíferos es capaz de inducir la meiosis en las gónadas de salamandras (Ito y Ave 1999).

37 Las dosis de FSH escogidas se basan en trabajos publicados acerca del efecto de FSH como inductor del inicio de la meiosis de anfibios urodelos (Maekawa et al 1995, Ito y Ave 1999, Yazawa et al 2002). Luego de los 15 días de cultivo las gónadas fueron fijadas en líquido de Bouin e incluidas en parafina para ser coloreadas posteriormente con hematoxilina-eosina con el fin de evaluar si se había iniciado o no la meiosis en cada tratamiento y en los controles. Los datos fueron analizados con estadística no paramétrica mediante análisis de 2 frecuencias a través de una prueba de Χ utilizando la corrección de Williams para ajustar el análisis a nuestro N.

38 RESULTADOS

El cerebro de Cichlasoma dimerus En la figura 1a se observa la ubicación del cerebro en el cráneo de un macho adulto de Cichlasoma dimerus. Desde esa vista dorsal pueden distinguirse 2 pares de lóbulos y un lóbulo impar (Fig 1b). El par de lóbulos más pequeño y de ubicación más anterior se corresponde con los hemisferios telencefálicos (Tel) que unidos estrechamente en su región anterior de los BULBOS OLFATORIOS (OB) sésiles, de los cuales parte el nervio olfatorio que inerva la mucosa olfatoria. Los dos lóbulos pares de mayor tamaño localizados en la región media se corresponden con el téctum óptico (OT), y el último lóbulo impar y mas pequeño con el cerebelo (Fig. 1a, b). Histológicamente se observa que dentro del bulbo olfatorio hay 5 láminas concéntricas, entre las cuales la mas desarrollada es la capa glomerular (Fig 2a). En el caso de los peces no pueden distinguirse cavidades ventriculares proyectadas dentro del OB. En las zonas medias y caudales del OB pueden distinguirse pequeños clusters de células ganglionares de gran tamaño que emiten proyecciones tanto hacia la retina como hacia el nervio olfatorio por lo cual esta región s denomina núcleo olfacto retinalis (Fig 2b). Hacia la región caudal comienza el OB comienza a perder sus estructuras concéntricas y pasa a unirse estrechamente con el telencéfalo dorsal. Los hemisferios telencefálicos pueden dividirse en dos grandes regiones: telencéfalo dorsal (dTEL) y telencéfalo ventral (vTEL). El TELENCÉFALO VENTRAL comienza a reemplazar caudalmente al OB. Los núcleos neuroendocrinos mas importantes en esta región son el núcleo dorsal (Vd) siempre asociado con el tercer ventrículo y el núcleo ventral (Vv) (Fig 2c). El TELENCÉFALO DORSAL se extiende dorsolateralmente formando los 2 conspicuos hemisferios que pueden observarse macroscópicamente. Las principales subdivisones del mismo son Dm1, Dc1, Dlv1 y Dlv2 (Fig 2c). El AREA PREOPTICA rodea al receso preóptico del tercer ventrículo. Se encuentra limitada anteriormente por la comisura anterior (CA) que une los 2 lóbulos telencefálicos, dorsalmente por el telencéfalo, el tálamo ventral y tubérculo posterior y ventralmente por el quiasma óptico (Oc) y el hipotálamo dorsal (Fig 2d). Los núcleos más importante para el control de los procesos reproductivos son: la porción anteroventral del

39 TO

Tel Ce

TO

TO

Tel Ce Me

TO

SV HF QO Me

LI TEL SV HF + QO BO TEL + LI BO dTEL DC1 vTEL DLV1 DLV2 DM1 GL GL vTEL BO BO NOR A B dTEL V dTEL vTEL

POA vV vTEL OC CA C D

dTEL V

NPOac

POA NPOav OC E núcleo preóptico parvocelular (NPOav) y la porción parvocelular del núcleo preóptico parvocelular (NPOpc). Estos núcleos aparecen a caudal de la comisura anterior y representan los núcleos mas conspicuos rostralmente del área preóptica (Fig 2e). En la región caudo-ventral del POA aparece el HIPOTALAMO que presenta una porción central impar y 2 lóbulos intermedios (LI). Desde el hipotálamo se proyecta el infundíbulo que sostiene a la hipófisis y por detrás de la misma se sitúa el saco vasculoso (Fig 1c,d).

Detección inmunohistoquímica de las poblaciones GnRHérgicas Los cuatro antisueros utilizados en este estudio reconocieron somas (A) y fibras (B) de neuronas inmunoreactivas (ir-) GnRH en diferentes áreas del sistema nervioso central de Cichlasoma dimerus. El anticuerpo monoclonal LRH13 ha distinguido 3 poblaciones diferentes de somas ir-GnRH tanto en adultos como en distintos estadios larvales de esta especie. Cada uno de los tres antisueros policlonales (anti-salmon GnRH, anti-seabream. GnRH y anti-chicken II GnRH) reconocen cada uno una población específica de estos somas y parecerían no mostrar una gran reacción cruzada entre ellos. Cabe destacar sin embargo, que algunas neuronas aisladas reconocidas por estos antisueros muestran una morfología y localización particular que será tratada detalladamente en el capítulo próximo.

A) SOMAS (Fig. 3) A.1) Sistema del Núcleo olfacto retinalis (NOR) El placode olfatorio (OP) se localiza en una posición ventral definida durante los estadios más tempranos del desarrollo. El mismo consiste en varias capas de células poco diferenciadas en la región basal y de células epiteliales ciliadas en la región apical que se encuentra en contacto con la foseta olfatoria. El OP se observa separado del bulbo olfatorio (OB) por una membrana basal y un tejido conectivo enriquecido en células mesenquimáticas (Fig. 4A,B). En el día 3 post-fecundación (pf) se observan neuronas ir-sGnRH, aisladas o formando grupos compactos en las regiones centrales y basales del placode olfatorio (OP; Fig. 4A). En el mismo estadio se observan también algunas neuronas ir-sGnRH a lo largo del nervio olfatorio (ON; Fig 4B,C). En este estadio el ON es grueso y corto y se extiende

40

de forma oblicua desde la zona basal del OP hacia la región ventral del OB. En el día 4 pf se observan neuronas ir-sGnRH a lo largo del ON y en la región rostro-ventral del BO (Fig. 4D). Alrededor del día 10 pf todas las neuronas ir-sGnRH se localizan en el BO. Finalmente, hacia el día 50 pf, se distinguen las neuronas ir-sGnRH agrupadas a la altura del NOR. El NOR, denominado también ganglio del nervio terminal (TNG) es un agrupamiento característico de somas neuronales localizado siempre en la región del OB caudal que limita con la región anterior del telencéfalo ventral (Fig. 3A; 5A,B). En los adultos, las neuronas ir-sGnRH del NOR aumentan en número cuando se comparan con el estadio juvenil de 82 días pf (Fig 5C,D). Estas células son generalmente de forma esférica y presentan un gran núcleo eucromático.

A.2) Sistema del cerebro medio (MB) Entre los dias 5 y 6 pf comienza a detectarse un grupo de neuronas ir-cGnRH II en el tegmentum del cerebro medio dorsal, cerca del epéndimo del tercer ventrículo y en asociación con grandes vasos sanguíneos (Fig 3B; 6A). Este grupo de neuronas parecería tener su origen en células precursoras localizadas en el epéndimo ventricular. Desde el momento de su aparición y aun en estadios adultos esta población permanece restringida a esta zona del cerebro. Los somas tienen un aspecto esférico y los gránulos inmunoreactivos se encuentran en muchas ocasiones polarizados hacia uno de los lados del citoplasma (Fig 6B,C). Durante el periodo reproductivo, en algunos individuos, estas células muestran un marcado aumento en la densidad de gránulos inmunoreactivos de modo tal que se hace muy difícil individualizar los núcleos (Fig. 6D,E).

A.3) Sistema del área preóptica (POA) Las células ir-sbGnRH son las últimas en aparecer durante el desarrollo. A diferencia de lo observado en los otros dos sistemas, esta población muestra importantes variaciones individuales en cuanto a su tiempo de aparición en esta área (entre los días 22 y 30 pf). El sitio de origen de esta población sería el receso preóptico rostro-basal aunque no se ha detectado inmunoreactividad en esa zona con el sistema utilizado. En el adulto se observa que esta población se caracteriza por la presencia de neuronas multipolares que presentan un gran núcleo central y eucromático y un citoplasma

41

densamente granulado (Fig 6F). Esta población aumenta rápidamente en número y alrededor del día 48pf el patrón de distribución es similar al observado en adultos.

B) FIBRAS B.1) Distribución de las fibras GnRHérgicas Fibras salmon GnRH: Se localizan principalmente en las zonas media y caudal del OB, tectum óptico (OT), tálamo ventral y dorsal, hipotálamo basal, cerebelo, cerebro medio, médula espinal, retina e hipófisis (Fig 7B). Fibras seabream GnRH: Sus principales zonas de distribución son el área preóptica y el hipotálamo. Se las encuentra fuertemente asociadas con la hipófisis. Luego de la diferenciación de la población sbGnRH (días 22 a 30 pf), sus fibras pueden observarse dirigiéndose hacia la neurohipófisis (NH) por el tallo infundibular. Estas fibras contactan con dos de las principales regiones de la adenohipófisis (ADH): la pars intermedia (PI) y la pars distalis proximal (PPD). Comienzan a crecer y ramificarse al llegar al estadio adulto inervando también la pars distalis rostral (RPD) (Fig. 7A). Fibras chicken GnRH II: Las fibras que se originan de esta población poseen una amplia distribución a lo largo de todo el SNC y, en menor medida, en la hipófisis. Durante el día 6pf ya se pueden observar estas fibras en el OB y en la zona ventricular del cerebro medio. Alrededor del día 50 pf el patrón de inervación es muy similar al de los adultos.

B.2) Inervación de la hipófisis durante la diferenciación sexual gonadal o A una temperatura de 27 ± 1 C la diferenciación sexual de las gónadas es evidente histológicamente a partir del día 36 pf. La diferenciación ovárica ocurre varios días antes que la testicular. Entre los días 36 y 42 pf el ovario presuntivo se alarga considerablemente debido a su crecimiento somático y a la proliferación de las oogonias y el crecimiento de los oocitos (Fig. 8D). En la hipófisis, delicadas fibras ir-sbGnRH se detectan entrando por el infundíbulo y llegando a la NH entre los días 36-42pf de hembras (Fig.8A). Si la gónada que se mantiene indiferenciada durante los días 36-42pf se la considera un testículo presuntivo. Éstos retienen su forma de gota original, son mucho menores en tamaño que los ovarios en el mismo estadio (Fig. 8E) y hasta el día 75 no se observan signos morfológicos de diferenciación. En los machos presuntivos no se observa inervación hipofisaria (Fig. 8B).

42

Entre los días 75 y 80 se empiezan a detectar meiosis en los espermatocitos, hecho que marca el comienzo de la diferenciación testicular (Fig 8F) (Pandolfi et al 2002, Meijide et al 2005). En los machos alrededor de los días 75-80 puede observarse una importante inervación hipofisaria de fibras sbGnRH que alcanzan las tres principales zonas de la ADH. RPD, PD y PI (Fig. 8C).

Tratamiento de gónadas indiferenciadas en cultivo con FSH recombinante humana (FSHrh). Las gónadas indiferenciadas de 30 días pudieron ser mantenidas en cultivo durante 15 días y un gran porcentaje de las tratadas con las dosis de FSHrh utilizadas en este experimento pudieron sufrir diferenciación sexual morfológica en las condiciones de cultivo (Tabla 2). Se consideró como gónada indiferenciada (GI) a aquella que sólo contenía gonias como representante de la línea germinal y como gónada diferenciada (GD) u ovario presuntivo a aquella que además poseía oocitos I (Fig. 9). Hablamos de ovarios presuntivos ya que al día 45 (momento en el que finaliza el experimento) la diferenciación en testículo todavía no ocurrió. Cabe destacar que en los cultivos control (en ausencia de FSHr) ninguna gónada sufrió diferenciación. No se observaron diferencias significativas entre los 2 experimentos, por lo que se presentan los resultados de ambos experimentos combinados. Tampoco hubo diferencias entre las 3 dosis utilizadas pero si fueron significativas las diferencias entre el control y los tratamientos (P<0.05).

Tabla 2: Porcentaje de viabilidad, de gónadas indiferenciadas e indiferenciadas en ambos experimentos. Se observan diferencias significativas en el porcentaje de gónadas diferenciadas en los tres tratamientos con respecto al control. N=20 para cada tratamiento. P < 0.05.

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Viabilidad (%) Gónadas no dif. (%) Gónadas dif. (%) Control 85 100 0

0.5µg/ml FSHrh 90 28 72 1 µg/ml FSHrh 90 11 89 2 µg/ml FSHrh 85 12 88

44 DISCUSIÓN

En este capítulo se ha demostrado, por IHQ, la expresión de tres variantes de GnRH en el cerebro del pez cíclido C. dimerus corroborando y extendiendo la información obtenida en otros perciformes por técnicas inmunohistoquímicas (Parhar 1997). Si se compara la distribución de las neuronas GnRH inmunoreactivas en el sistema nervioso central de adultos y de distintos estadios larvales, se puede ver que entre los días 22 y 30 pf las tres poblaciones GnRHérgicas se encuentran ya diferenciadas. La amplia distribución de fibras GnRHérgicas a lo largo del sistema nervioso central y la aparición temprana en la ontogenia de las 3 variantes moleculares, sugieren que GnRH cumple en el SNC una serie de funciones relacionadas con procesos endócrinos, metabólicos y/o comportamentales. En el cerebro de C. dimerus fueron identificadas tres variantes de GnRH: salmon GnRH en el cerebro anterior (NOR), seabream GnRH en el área preóptica y chicken GnRH II en el cerebro medio. Los tres antisueros policlonales utilizados resultaron medianamente específicos en el reconocimiento de las tres principales poblaciones de GnRH dado que varias neuronas inmunomarcadas, aisladas y de morfología diferente, sugerían que la especificidad no era la óptima. Este punto se tratará con detalle en el Capítulo II de esta Tesis, en el cual se propone un nuevo abordaje metodológico para estudiar las poblaciones GnRHérgicas. Por otra parte, es sabido que el anticuerpo monoclonal LRH13 fue generado contra una región común conservada de casi todas las variantes de GnRH. Por lo tanto, es capaz de reconocer las tres variantes de esta especie tanto en adultos como a lo largo de la ontogenia. Este resultado es interesante dado que este anticuerpo reconoce particularmente las regiones 4 (serina) y 5 (tirosina) de la molécula de GnRH, y por lo tanto debería poseer una muy baja afinidad por chicken GnRH II, en la cual la tirosina es reemplazada por una histidina (Park y Wakabayashi 1986). Estudios IHQ en otras especies como el pejerrey (Odontesthes bonariensis) o el dwarf gourami (Colisa laila) han demostrado que este anticuerpo no reconoce neuronas del cerebro medio, a diferencia de lo observado en C. dimerus (Oka 1997, Stefano et al 2000). Lo mas probable es que la baja afinidad del anticuerpo sea compensada con el novedoso sistema de amplificación de la inmunomarcación con tiramida que se ha utilizado (Dako CSA Amplification kit). También podría ocurrir que en esta especie exista una cuarta forma de GnRH coexistente

45 con cGnRH II en el cerebro medio. Pero, para demostrarlo sería necesario realizar estudios mas detallados a nivel bioquímico y molecular.

Población GnRHérgica del NOR (salmon GnRH) Se ha observado en los estadios tempranos del desarrollo de C. dimerus, la presencia de células ir-sGnRH en el siguiente orden: 1) zona basal del placode olfatorio, 2) nervios olfatorios y 3) región rostrobasal del bulbo olfatorio. Este patrón secuencial de aparición sugiere una migración de células sGnRH desde los placodes olfatorios hacia el cerebro ventral anterior, tal como fue descripto para algunas especies de salmónidos (Parhar e Iwata 1993, Chiba et al 1994, Parhar et al 1995 y 1998, Amano et al 1998) y en otros grupos de vertebrados (Parhar 1999). Por otra parte, a diferencia de lo observado en otras especies de anfibios (Eisten y Northcut 1996), el número de estas neuronas no disminuye al llegar a la adultez. Los cíclidos presentan por lo general un nervio olfatorio muy corto y grueso. Probablemente, por esta característica, en la tilapia no se pudieron detectar células GnRH a lo largo del nervio olfatorio (Parhar 1997). En cambio, la gran longitud de este nervio en salmónidos permitió identificar a estas células durante su migración hacia el OB (Parhar et al 1995). Cabe también la posibilidad que en la tilapia las células no sinteticen GnRH durante su migración a lo largo del ON, y que esta síntesis recién comience cuando se localizan en el bulbo olfatorio tal como ocurre en cobayos, ratas y comadrejas (Schwanzel- fukuda y Pfaff 1990, Parhar 1997). En el caso de C. dimerus, en cambio, tomando muestras de individuos recién eclosionados, a intervalos muy cortos de tiempo, se pudieron detectar somas de neuronas ir-salmon GnRH entre el placode y el bulbo olfatorio. Esta localización representaría la migración de la población sGnRH a través del ON durante los días 1 y 2 pf.

Población GnRHérgica del cerebro medio (Chicken GnRH II) La presencia del ARNm que codifica para chicken GnRH II (White et al 1995, Parhar 1997) así como también la presencia de somas ir-cGnRH II han sido descriptas en el cerebro medio de numerosos grupos de vertebrados (Sherwood et al 1997, Muske 1997, Parhar 1999). En C. dimerus, las neuronas ir-GnRH-II aparecen durante los días 5 o 6 pf cerca de las células ependimarias del tercer ventrículo a la altura del tegmentum del

46 cerebro medio dorsal. Un patrón similar fue registrado también en la tilapia (Parhar, 1997). En los salmónidos, las neuronas cGnRH-II se diferencian en la misma región mucho más tarde que las poblaciones del cerebro anterior (Parhar et al 1995, Parhar e Iwata 1996). Tanto en C.dimerus, como en la tilapia (Parhar 1997) y en la anguila japonesa (Chiba et al 1999), la diferenciación prácticamente sincrónica de los núcleos GnRHérgicos del NOR y del cerebro medio y la morfología neuronal diferente observada en ambos, sustenta la hipótesis de que las neuronas del cerebro medio tienen un origen no relacionado con los placodes olfatorios. El gran número de vasos sanguíneos y la estrecha asociación morfológica de estos con los somas ir-cGnRH-II podría indicar que estas células secretan parte de sus neuropéptidos directamente hacia el torrente sanguíneo. Esto explicaría la dificultad de detectar somas ir-cGnRH-II en el cerebro medio de muchas especies (Chiba et al 1999, Robinson et al 2000), ya que una alta tasa de secreción de GnRH hacia los terminales axónicos y hacia el sistema circulatorio resultaría en una muy baja concentración en el citoplasma de gránulos secretorios ir-cGnRH-II. En los mamíferos se sabe que las células cGnRH-II del cerebro medio se encuentran relacionadas con ciertos comportamientos reproductivos (Muske 1997). En la tilapia estudios experimentales han demostrado claramente que esta población neuronal es insensible a hormonas esteroideas sexuales (Parhar et al 2000). Por lo tanto, la función de cGnRH II en vertebrados aun no ha sido clarificada.

Población GnRHérgica del área preóptica (seabream GnRH). Diferenciación gonadal. La expresión de sbGnRH en la POA parecería estar relacionada con la diferenciación sexual gonadal. A diferencia de lo descripto en mamíferos, en los peces cíclidos estas neuronas comienzan a detectarse entre los días 20 y 30, probablemente desde alguna zona proliferativa de la región preóptica rostro basal (Parhar y Sakuma 1995, Parhar 1997, Parhar et al 1998). Aumentan en número y tamaño con la edad y en los adultos presentan un patrón aislado de distribución y no se agrupan como las neuronas ir-sGnRH del NOR. Se observó este origen de sbGnRH en el POA. Es también posible que estas neuronas sbGnRH se originen en otras regiones extracerebrales al igual que las sGnRH y comiencen la síntesis de GnRH recién cuando se alojan en la región preóptica. Por lo tanto

47 se requieren más estudios detallados para aclarar el controvertido origen de esta población en los distintos grupos de vertebrados. Los resultados de este estudio sugieren que la expresión de sbGnRH en el área preóptica coincide con algunos de los pasos del complejo proceso de la diferenciación sexual gonadal, ya que la entrada de fibras ir-sbGnRH por el tallo infundibular hacia la adenohipófisis ocurre casi simultáneamente con la diferenciación de la gónada en ovario. Esta distribución segregada de las 3 poblaciones GnRHérgicas en perciformes indicaría que sbGnRH podría estar directamente involucrada en el control de la secreción de FSH y LH por su proximidad al hipotálamo y su importante contribución con la inervación hipofisaria (Gothlif et al 1996). En la tilapia Oreochromis niloticus, se ha informado también que la diferenciación de la población GnRH del área preóptica coincide con la diferenciación sexual gonadal y con el inicio de la esteroidogénesis gonadal (Parhar 1997).

Distribución de las fibras GnRHérgicas. En la tilapia, unas pocas y pequeñas fibras ir-GnRH fueron detectadas en el cerebro a partir del día 19 pf (Parhar 1997). Sin embargo, en C. dimerus, utilizando el anticuerpo monoclonal LRH13, las fibras ir-GnRH pueden ser individualizadas ya en el día 4 pf. Si bien podría ser una diferencia específica de especie, consideramos que más que nada se debe al método de amplificación usado en este estudio que sería mucho más sensible que el que se utilizó en la tilapia. En la hipófisis del adulto, las fibras ir-sbGnRH fueron las más numerosas y representativas de la inervación hipofisaria. Sin embargo sGnRH y cGnRH II contribuyen también en menor medida a la inervación de la hipófisis. Estos resultados son consistentes con los observados en el seabass Dicentrarchus labrax y en tilapia, donde las tres formas de GnRH fueron detectadas en la hipófisis (Parhar 1997; Rodríguez et al 2000).

Tratamiento de gónadas indiferenciadas en cultivo con FSH recombinante humana (FSHrh). La ausencia de diferenciación gonadal cuando no se trató a los cultivos con FSHrh (cultivos control), indica un rol importante de la misma en la diferenciación sexual gonadal. Esta afirmación se ve reforzada por el hecho de que con las dosis utilizadas, esta gonadotrofina induce la diferenciación sexual en cultivos de gónadas mantenidos por 15

48 días. Este hecho se correlaciona también con la diferencia temporal en la inervación hipofisaria descripta previamente en este capítulo. Es probable que en las hembras el comienzo de la inervación hipofisaria por fibras sbGnRH (entre los días 36-42 pf) estimule la liberación de FSH que, por los resultados de nuestro experimento, parecería ser esencial en alguno de los complejos pasos del proceso de diferenciación sexual gonadal. Prácticamente el 80% de las gónadas se ha diferenciado y según el proceso de diferenciación sexual descripto en este estadio (día 45 pf) de esta especie, se trataría de ovarios (Meijide et al 2005), pese a que la morfología gonadal luego de 15 días de cultivo no permite aseverar esta afirmación. Es probable que en los machos este mismo proceso ocurra si el pulso de FSH es recibido entre los días 75-80 pf que es cuando comienza a observarse la inervación por fibras sbGnRH en esta especie. En conclusión, los resultados de este experimento nos sugieren que el eje hipotálamo hipofisario estaría involucrado en el inicio de la diferenciación sexual de las gónadas, en particular a través de sbGnRH (principal variante molecular de GnRH que inerva la hipófisis) y FSH.

49

CAPITULO II

UN NUEVO ABORDAJE EN EL ESTUDIO DE LAS DISTINTAS POBLACIONES GnRHÉRGICAS: UTILIZACIÓN DE LOS PÉPTIDOS RELACIONADOS A GnRH (GAPS) COMO MARCADORES INDIRECTOS DE LAS DISTINTAS VARIANTES MOLECULARES DE GnRH.

50 MATERIALES Y MÉTODOS

Animales Para el siguiente estudio se utilizaron 59 animales adultos (30 machos y 29 hembras de entre 1 y 2 años) descendientes de animales criados en el laboratorio que provenían originalmente de la localidad de Esteros del Riachuelo, Corrientes, Argentina (27o25´S ; 58o15´O). Estos animales se mantuvieron en grandes acuarios con buena aireación y con o filtros incorporados a una temperatura de 27± 1 C y con un fotoperíodo de 12 horas de luz y 12 de oscuridad. Los animales se alimentaron con pellets comerciales para peces y con larvas del género Artemia. Para estudios inmunohistoquímicos y de hibridación in situ a lo largo del desarrollo, se tomaron muestras de larvas desde el momento de la eclosión hasta 15 días pf diariamente y entre los días 15 (6mm de longitud total) y 60 pf (17mm de longitud total) cada 3 días. La eclosión en esta especie ocurre 52 horas luego de la fecundación. En cada estadio larval el número mínimo de animales sacrificados fue 8. Se cumplió en todo momento con los principios de cuidado de animales de laboratorio citados en una publicación de la NIH (NIH publication N 86-23, revisado en 1985).

Análisis por Western blot Con el objeto de comprobar la especificidad de los antisueros generados contra los GAPs de Dicentrarchus labrax (seabass) en el cerebro e hipófisis de Cichlasoma dimerus, se llevo a cabo el análisis a través de una electroforesis en un gel 15% de sodio dodecilsulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguido por Western blot. 15 animales fueron anestesiados en una solución acuosa de benzocaína 0.1% y luego sacrificados por decapitación. 6 cerebros y 15 hipófisis fueron homogeneizados respectivamente en 1 ml y 700µl de buffer Tris-HCl 50mM pH 7.4 con 10 µl de un cocktail inhibidor de proteasas (Sigma, San Luis, Mo). Los homogenatos fueron luego centrifugados a 6000g por 30 min a 4 oC y el sobrenadante fue congelado a –20oC hasta el momento de su utilización. 5µl de cada homogenato junto con 5µl de buffer de siembra 5X (Tris-HCl 120mM pH 6.8, dodecilsulfato 3%, glicerol 10%, 1% β-mercaptoetanol) fueron

51 calentados a 95oC antes de ser sembrados en el SDS-PAGE 15%. Se sembraron también 5

µl de estándares de peso molecular (SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard, Invitrogen corp.) Luego de la electroforesis las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa (Amersham, Biosciences, RU) durante 45 minutos a 75V y 4oC. Luego, las membranas fueron lavadas en TTBS pH 7.5 (100mM Tris-HCl, O.9% NaCl, 0.1% Tween 20) y los sitios inespecíficos fueron bloqueados por 24 horas en una solución de TTBS con 5% de leche en polvo descremada. Finalmente las membranas fueron incubadas a temperatura ambiente durante 3 horas con antisueros primarios contra los distintos GAPS de D. labrax hechos en cobayos: anti-seabass salmonGAP; anti-seabass seabreamGAP y anti-seabass chickenGAP-II (González-Martínez et al 2002a) diluidos 1:2000 en TTBS. Se realizaron controles en varias calles de homogenatos de hipófisis y cerebro en las cuales el antisuero primario fue reemplazado por TTBS. Luego de 3 lavados de 10 minutos cada uno en TTBS, las membranas fueron incubadas por 45 minutos en un anti- IgG de cobayo biotinilado (Vector LAB, Burlingame, CA) diluido 1:1000 por 45 minutos. Terminada esta incubación se realizaron nuevos lavados y las membranas fueron incubadas en oscuridad por 45 minutos con una estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (Dako, Carpintería, CA) diluida 1:1000. Luego de otros tres lavados la inmunoreactividad fue revelada con un kit para fosfatasa alcalina (Bio-Rad, Hércules, CA). Finalmente las membranas fueron secadas y escaneadas y los pesos moleculares fueron estimados con el Image Gauge Software (Fuji, Japón).

Procesamiento del material biológico 44 animales adultos y 240 larvas fueron anestesiados en una solución acuosa de benzocaína 0.1% y sacrificados por decapitación. Los cerebros con las hipófisis (adultos) y las cabezas enteras (larvas) fueron fijadas en solución de Bouin por 24 horas a 4oC. Las piezas fueron luego deshidratadas y embebidas en paraplast (Fisherbrand, Fisher, WA, EEUU). Para inmunohistoquímica (IHQ) 24 cerebros fueron completamente seccionados transversalmente a 10µm teniendo especial cuidado de no perder ninguna sección. Otros 5 adultos fueron cortados parasagitalmente también para IHQ. El resto de los cerebros de adultos (15), fueron cortados transversalmente a 15 µm para ser sometidos a técnicas de hibridación in situ (HIS) radioactiva. Distintos estadios larvales fueron seccionados

52 transversal y sagitalmente tanto para IHC como HIS. Las secciones obtenidas fueron montadas en portaobjetos cargados electrostáticamente.

Inmunohistoquímica Las secciones fueron desparafinadas en xilol, rehidratadas con concentraciones decrecientes de etanol hasta buffer fosfato salino (PBS, pH 7.4): Las peroxidasas endógenas fueron bloqueadas con una solución de PBS con 3% de peróxido de hidrógenos. Luego, las secciones fueron incubadas por 15 minutos en una solución de PBS con 0.75% de gelatina y luego 30 minutos en otra solución de PBS con 5% de leche en polvo descremada a temperatura ambiente. Luego fueron incubadas con los correspondientes anticuerpos primarios diluidos 1:500 por 16 horas a temperatura ambiente: anti-seabass salmonGAP; anti-seabass seabreamGAP y anti-seabass chickenGAP-II. Posteriorement las secciones fueron lavadas en PBS e incubadas 45 minutos a T. amb. con un anti-IgG de cobayo biotinilado diluido 1:1000. la amplificación de la señal fue llevada a cabo por incubación de las secciones con una estreptavidina unida a peroxidasa (Dako, Carpintería, CA) diluida 1:800 a T amb por una hora. Luego de 3 lavados en PBS la actividad enzimática de la peroxidasa exógena fue puesta en evidencia con 0.1 3,3´- diaminobenzidina en Tris buffer (pH 7.6) y 0.03% de H2O2. Las secciones recibieron una suave coloración de contraste con hematoxilina, fueron montadas en DPX, examinadas con un fotomicroscopio FX Nikon y fotografiadas digitalmente con una cámara Coolpix 4500 asociada al mismo. Para confirmar la especificidad de la inmunomarcación, algunas secciones control fueron incubadas con el anticuerpo primario preadsorbido con un exceso de su respectivo antígeno. Para detectar falsos positivos debidos a la técnica inmunohistoquímica se reemplazaron por PBS el antisuero primario o el anticuerpo secundario. Para la localización precisa de las diferentes células que expresan GAP y sus proyecciones contamos con 2 atlas detallados de otras 2 especies de Perciformes: Dicentrarchus labrax (Cerdá-Reverter et al 2001a,b) y Haplochromis burtoni (Fernald y Shelton 1985) asi como también con un estudio citoarquitectónico preliminar del telencéfalo y diencéfalo de Cichlasoma dimerus presentado en el capítulo I de esta Tesis. En 8 adultos completamente seccionados el número total de células ir-GAP fue contado y 20 células fueron elegidas al azar para determinar el diámetro promedio de cada

53 población. Como los cerebros fueron cortados a 10 µm, las células de diámetros mayores que 10 µm sólo fueron contadas cuando su núcleo era claramente visible para no sobrestimar el número. Los valores presentados muestran el diámetro celular promedio en

µm ± el error estándar de la media y el número promedio de células por núcleo ± el error estándar de la media (Tabla 1).

Doble inmunohistoquímica Con el objeto de verificar que los anticuerpos contra los GAPs del seabass eran confiables marcadores indirectos de neuronas GnRHérgicas de C. dimerus, se realizaron técnicas de doble inmunofluoresencia. Las secciones fueron incubadas primero con LRH13 (1:5000) y los correspondientes GAPs (1:500) en su zona de mayor expresión:

1) LRH13 + anti-salmonGAP en el NOR. 2) LRH13 + anti-seabreamGAP en el núcleo preóptico parvocelular de la POA. 3) LRH13 + anti-chickenGAP-II en el tegmentum del cerebro medio dorsal.

Los somas y fibras ir-GnRH (reconocidos por el anticuerpo monoclonal LRH13) fueron evidenciados utilizando un anti-IgG de ratón unido a FITC (Sigma Chemicals). Los somas y las fibras ir-GAP fueron revelados por incubación con un anti-IgG de cobayo biotinilado (Vector Lab, Burlingame, CA) seguida por una incubación con una estreptavidina unida a Texas red (Vector Lab). La fluorescencia de las secciones fue analizada con un microscopio confocal Olympus FV300 acoplado al Fluoview Software.

54 Obtención de las riboprobes para hibridación in situ

1) Crecimiento de las bacterias que portan los plásmidos con el ADNc de cada GAP.

2) Aislamiento del ADN plasmídico y estimación de la concentración de ADN obtenida en espectrofotómetro.

3) Linealización de los plásmidos y verificación de la linealización en gel de agarosa.

4) Transcripción in vitro de las riboprobes usando como templado los DNAc de cada GAP linealizados (Buffer de trascripción +DTT + inhibidor de RNAsas + templado de cDNA linealizado + cocktail de nucleótidos (C, G y T) + RNA polimeras + S* unido a UTP).

5) Incubación a 37C 2 horas.

6) Digestión del cDNA no transcripto con DNAsa.

7) Purificación de la riboprobe en Columna Sephadex.

8) Validación de la riboprobe por gel de agarosa en condiciones desnaturalizantes y por medición de su radioactividad.

Síntesis de riboprobes e hibridación in situ Dos riboprobes antisense marcadas con S35 fueron transcriptas a partir de los cDNAs de Haplochromis burtoni que codifican para los precursores de salmon GnRH / salmon GAP y seabream GnRH / seabream GAP. Estos cDNAs fueron donados por el Dr Rusell Fernald (Universidad de Stanford; Stanford, CA, USA). Estas riboprobes ya han sido caracterizadas en el cíclido africano H. Burtoni (White y Fernald 1998). La HIS fue

55 realizada en cortes transversales seriados de 15 µm o en secciones parasagitales de 10 animales adultos y 27 larvas en distintos estadios del desarrollo.

Se siguió el siguiente protocolo:

1) Desparafinización en xilol 2) Rehidratación en concentraciones decrecientes de etanol 3) Lavado en PBS pH 7.4 4) Post-fijación en una solución 4% de paraformaldehido en PBS 15´ 5) Lavado en PBS pH 7.4

6) Digestión con proteinasa K por 8´ (10 µg/ml) en buffer Tris-EDTA (pH 8, 100mmol/l Tris y 50 mmol/L EDTA) 7) Acetilación para el bloqueo de cargas positivas en 250 ml de 0.1M de buffer TEA

(100mM Tris pH 8, 50 mM EDTA) y 625 µl de ácido acético anhidro, durante 10 min a temperatura ambiente. 8) Deshidratación en concentraciones crecientes de etanol 9) Secado al vacío por 2horas

10) Hibridación: Se aplicaron sobre los cortes 100 µl de la ripobrobe antisense unida a S35 en una concentración de 1 x 106 cpm/ml de buffer de hibridación (50 mmol/L

ditiotreitol, 250 µg/ml de ARN de transferencia, 50% de formamida, 0.3 mol/L de cloruro de sodio, solución de Denhardt 1X, 20 mmol/L de Tris pH 8, 1mmol/L de EDTA, 10% de dextran sulfato). Luego de aplicar esta mezcla las piezas se cubrieron con cubreobjetos sellados con DPX y las secciones fueron incubadas por 18 hs a 65oC. 11) Los cubreobjetos se removieron luego de dos lavados de 30 min cada uno en SSC 4X (buffer citrato salino) junto con una concentración de ditiotreitol de 20 mmol/L. La solución stock 20X de SSC utilizada de aquí en adelante contiene 173.3 g de cloruro de sodio y 88.2 g de citrato de sodio/L.

12) Se incubaron los cortes con ribonucleasa A (10 µg/ml) en buffer Tris-EDTA (pH 8, 10 mmol/L Tris, 1mmol/L EDTA, 0.5 mol/L de cloruro de sodio), durante 30 min a 37 oC. 13) Se hicieron dos lavados de 30 min a T.amb. con SSC 2X conteniendo 1mmol/L de ditiotreitol y un lavado de 30 min a 70oC con SSC 0.1X conteniendo 1mmol/L de ditiotreitol.

56 14) Se procedió a deshidratar con concentraciones crecientes de etanol con 0.3 mol/L de acetato de amonio. 15) Los portaobjetos fueron secados al vacío por 30 min 16) Visualización del patrón de hibridación: Las secciones fueron puestas en contacto

con placas autorradiográficas Hyperfilm-β-max por 3 días (adultos) o 5 días (larvas). 17) Revelado: Las secciones fueron deshidratadas en concentraciones crecientes de etanol, tratadas con xilol por 1 hora y sumergidas en una emulsión fotográfica (NTB-2, Eastman Kodak Co., Rocheter NY). La exposición fue realizada durante 14 días (adultos) y 18 días (larvas) en cajas negras selladas a 4 oC. Luego fueron tratadas con un revelador y con un fijador Kodak D-19. Finalmente, las secciones fueron deshidratadas, aclaradas con xilol y montadas con DPX. El resultado de esta técnica se observa por la precipitación de gránulos de plata (negros) en los somas de las neuronas que expresan el RNAm de salmon o seabream GAP. 18) Controles negativos: Se realizó HIS con riboprobes sense en secciones adyacentes

(15µm) a las tratadas con las respectivas riboprobes antisense para diferenciar el background de la marca específica.

57 RESULTADOS

La figura 1 resume los resultados obtenidos por Western blot a fin de comprobar la especificidad de los antisueros de seabass contra salmon (sGAP), seabream (sbGAP) y chicken II (cGAP-II) en el cerebro y la hipófisis de Cichlasoma dimerus. Esta especificidad observada se vio reforzada cuando se realizaron incubaciones de los 3 anticuerpos por separado con un exceso de su antígeno correspondiente sin observarse presencia de bandas. El western blot reveló la presencia de una banda de 7.5 kD correspondiente a salmon GAP tanto en cerebro como hipófisis y otra de igual peso molecular también en cerebro e hipófisis correspondiente a seabream GAP. Para chickenGAP-II se detectó una banda de 32 kD en cerebro pero no hubo inmunoreactividad en hipófisis (Fig. 1). La figura 2 demuestra que las células ir-GAP también expresan los péptidos GnRH en C. dimerus. La figura muestra la colocalización GnRH-GAP en las 3 principales poblaciones descriptas en esta especie, pero esta colocalización se verifica también en las poblaciones mas pequeñas y dispersas de la región ventral del cerebro anterior así como también en los axones. La colocalización fue prácticamente total en todas las poblaciones con la excepción de algunas células ir-cGnRH-II que no expresaban el GAP correspondiente. Los resultados de esta doble inmunofluoresencia han confirmado que los diferentes GAPs colocalizan con las distintas variantes moleculares de GnRH en el cerebro de C. dimerus (Fig 2). La tabla 1 resume los resultados de la medición del número y diámetro celular promedio de cada población de células ir-GAP en diferentes núcleos cerebrales de animales adultos seccionados totalmente. Estos resultados fueron consistentes entre los distintos animales y no parecen detectarse importantes diferencias entre machos y hembras. En términos de especificidad de la HIS, consideramos que las riboprobes de H. Burtoni reconocen sGAP y sbGAP sin reacciones cruzadas. Esta afirmación se basa en el hecho de que las secuencias nucleotídicas de sGAP en comparación con sbGAP son muy divergentes en todas las especies en las que fueron secuenciadas (Zmora et al 2002). Por otro lado, cada riboprobe antisense y su correspondiente control sense, fueron sistemáticamente aplicadas en secciones consecutivas y la aplicación de la riboprobe sense mostró como resultado sólo un suave y uniforme background. También es claro que

58

Tabla 1: Diámetro y número promedio de neuronas ir-GAP en distintas zonas cerebrales.

Salmon GAP (n=8) Seabream GAP (n=8) Chicken II GAP (n=8) Diámetro Número Diámetro Número Diámetro Número celular promedio de celular promedio de celular promedio de promedio células promedio células promedio células (µm) (µm) (µm) OB 16.6 ± 2.4 8.0 ± 1.6 4.3 ± 1.2 4.0 ± 1.0 S.E . S.E . NOR 20.5 ± 4 115.0±10.7 6.7 ± 2.8 7.5 ± 2.2 S.E . S.E . vTEL 6 ± 1.7 21.3 ± 6.7 15.6 ± 3.4 30.5 ± 7.7 S.E . S.E . POA 5.7 ± 1.6 20.2 ± 5.1 17 ± 6.5 41 ± 3.5 S.E . S.E . MB S.E. S.E. S.E. S.E. 21.2 ± 3.7 20.6 ± 4.9

Los cerebros de animales adultos (n = 8: 4 hembras y 4 machos) provenientes del período reproductivo

(Septiembre-Marzo) fueron completamente seccionados a 10 µm sin perder ninguna sección. Los valores expresados representan el diámetro celular promedio en µm ± el error estándar, y el número promedio de células ± el error estándar para cada población celular. OB: Bulbo olfatorio, NOR: nucleus olfacto retinalis, vTEL: telencéfalo ventral, POA: area preóptica, MB: cerebro medio, SE: sin expresión. distintos grupos de células son reconocidos por cada riboprobe, ya que en las zonas donde hay coexpresión de células ir-sGAP y células ir-sbGAP, la morfología neuronal y el nivel de expresión de RNAm es marcadamente diferente para cada variante molecular. Finalmente la aparición de cada variante en diferentes estadios del desarrollo postembrionario reafirma la especificidad del sistema de detección escogido para este análisis.

DISTRIBUCIÓN DE LOS DISTINTOS GAPs EN ADULTOS BULBO OLFATORIO (OB)

Aunque el número detectado de neuronas fue bajo (8 ± 1.6), los somas ir-sGAP fueron detectados en la capa glomerular (GL) del bulbo olfatorio. Su tamaño era medio

(16.6 ± 2.4 µm), su forma era esférica y muestran una fuerte expresión del ARNm sGAP (Figs. 3a,b). Se observó también una gran densidad de fibras ir-sGAP a lo largo de las capas concéntricas de las zonas medias y caudales del OB (Fig. 3c)

Asimismo, se detectó también una población muy pequeña de somas ir-sbGAP (4 ± 1) en el bulbo olfatorio. Estos somas se localizan en la GL del OB, son de tamaño pequeño

(4.3 ± 1.2 µm) y exhiben una baja expresión del ARNm sbGAP en comparación con las células sGAP de la misma región (Figs. 3d,e). Se han observado también unas pocas fibras ir-sb GAP en zonas ventro-centrales del bulbo olfatorio (Fig 3f).

NÚCLEO OLFACTO RETINALIS (NOR) La mayor inmunoreactividad y expresión de ARNm para sGAP se detectó en las neuronas del núcleo olfacto retinalis, localizado en la unión del bulbo olfatorio con el telencéfalo ventral. Este agrupamiento de grandes neuronas (20.5 ± 4 µm) representa la población más numerosa de neuronas sGAP (115 ± 10.7). Presentan una forma esférica y un gran núcleo eucromático (Figs. 4a,b). Las fibras sGAP pueden detectarse tanto en el BO como en el NOR y en el telencéfalo dorsal y ventral (Fig. 4c).

Unas pocas neuronas ir-sbGAP (7.5 ± 2.2) que exhibían una baja expresión del ARNm sbGAP fueron detectadas también en el NOR (Fig 4d). Son de menor tamaño que las células ganglionares que expresan sGAP en la misma zona (6.7 µm sbGAP versus 20.5 µm sGAP), y adoptan una posición por lo general mas dorsal (comparar Fig 4b y e). Se han

59 identificado también algunas fibras ir-sbGAP aisladas en las cercanías de las grandes neuronas ganglionares del NOR que expresan sGAP (Fig 4f).

TELENCÉFALO VENTRAL Y ÁREA PREÓPTICA (vTEL, POA) En la porción ventral del telencéfalo ventral (Vv) aparece un número moderado de neuronas ir-sGAP (21.3 ± 6.7), de pequeño tamaño (6 ± 1.7 µm) con formas esféricas o piramidales. El número de neuronas, su diámetro y su expresión de ARNm sGAP se encuentran marcadamente reducidos en esta población cuando se compara con la población sGAP del NOR (Figs 5a,b). Hacia la zona caudal fueron detectadas unas pocas neuronas sGAP (20.2 ± 5.1) de pequeño tamaño (5.7 ± 1.6 µm) en el área preóptica ventral, asociadas principalmente con el núcleo preóptico parvocelular (Figs 5c,d). El Vv también se caracteriza por la presencia de somas ir-sbGAP que exhiben una expresión intensa del RNAm de sbGAP. Esta población está constituida por neuronas bipolares, fusiformes o esféricas de mayor tamaño (15.6 ± 3.4 µm) y número (30.5 ± 7.7) que las neuronas sGAP de la misma región (Figs 5e,f). La mayor expresión de sbGAP, en cuanto a inmunoreactividad y niveles de RNAm, fue evidenciada en neuronas bipolares, fusiformes o esféricas que se encuentran mas o menos aisladas a lo largo del área preóptica, principalmente en el núcleo preóptico parvocelular y en el núcleo periventricular anterior (Figs. 5g, h). No se han detectado somas ir-sbGAP en regiones más caudales de esta especie.

FIBRAS SALMON Y SEABREAM GAP Las fibras ir-salmonGAP se han observado principalmente en el telencéfalo, con una alta densidad en la GL del bulbo olfatorio, el NOR, telencéfalo dorsal y ventral (con mayor inervación de la parte posterior del telencéfalo dorsal-(Dp)). A nivel diencefálico se observa una fuerte inervación de sGAP en el tálamo ventral y los núcleos parvocelular y magnocelular del área preóptica (Fig. 6a). El hipotálamo basal y el tegmentum dorsal también se encuentran poblados por estas fibras. El tectum óptico recibe fibras ir-sGAP que llegan a regiones centrales de la zona gris periventricular (Fig. 6b). Unas pocas fibras llegan también al cuerpo del cerebelo (Fig 6b) y al rombencéfalo ventral. La hipófisis recibe también unas pocas fibras ir-sGAP a nivel de la neurohipófisis que contacta con la pars distalis proximal (PPD) y la pars intermedia (PI) (Fig. 6c). La inervación de esta

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forma molecular se proyecta también hacia la retina, en donde las fibras pueden observarse en contacto con la capa retiniana de neuronas bipolares (Fig. 6d). Finalmente se ha detectado la presencia de fibras sGAP en el nervio olfatorio que se extienden hacia la lámina propia de la mucosa olfatoria (Fig. 6e). Las fibras ir-sbGAP se encuentran restringidas en la superficie ventral del cerebro anterior a lo largo del bulbo olfatorio, NOR, telencéfalo ventral, área preóptica (Fig. 6f) e hipotálamo ventral (Fig. 6g). Estas fibras son las más abundantes en la hipófisis mostrando profundas proyecciones que contactan con la PPD y el borde de la PI (Fig. 6h)

SOMAS Y FIBRAS CHICKEN II GAP

Los somas cGAP-II (20.6 ± 4.9) se detectaron sólo en el tegmentum del cerebro medio dorsal, cerca del epéndimo ventricular y ocasionalmente asociados a grandes vasos sanguíneos. Esta población está constituida por grandes neuronas esféricas u ovoides ( 21.2

± 3.7 µm) (Figs 7a,b). Las fibras ir-cGAP-II están ampliamente distribuidas a lo largo del SNC, principalmente en el cerebro medio y posterior. Aunque algunas fibras fueron detectadas en el cerebro anterior (telencéfalo dorsal y ventral, área preóptica e hipotálamo), la mayor densidad se detectó en el tegmentum del cerebro medio (Fig. 7c). El tectum óptico posee una densidad mayor de fibras cGAP-II en comparación con las sGAP (Fig. 7d). Estas fibras también se extienden hacia la válvula y cuerpo del cerebelo (Fig 7e), médula oblonga y médula espinal (Fig 7f). A pesar de que estas fibras son especialmente abundantes en el núcleo lateralis tuberis del hipotálamo, localizado en las proximidades del tallo infundibular, las mismas no se extienden hacia la hipófisis.

ONTOGENIA DE LAS DISTINTAS POBLACIONES ir-GAP ONTOGENIA DE LA POBLACIONES sGAP y cGAP-II Luego de verificar la existencia de una distribución solapada de células sGAP y sbGAP a lo largo del cerebro anterior ventral por IHQ e HIS utlizando los GAPs, confirmamos con esta nueva metodología que el origen de células salmonGAP se da en el placode olfatorio y el de las células chicken GAP-II en un primordio mesencefálico, tal como había sido descrito para las células ir-GnRH de esta especie (Capítulo I de esta Tesis y Pandolfi et al 2002).

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ONTOGENIA DE LA POBLACIÓN sbGAP Los resultados de este estudio muestran importantes diferencias y nuevas evidencias acerca del origen embrionario y la ontogenia de las neuronas seabreamGAP. Ni las células ir-sbGAP ni el ARNm que codifica para sbGAP fueron detectados en placode y mucosa olfatoria. SbGAP se detectó por primera vez en unas pocas células localizadas a lo largo del nervio olfatorio en el día 18 pf (Fig. 8a). En este mismo estadio, ya se evidenciaban células sGAP agrupadas en el NOR como así también una densa inervación del OB y telencéfalo (Fig. 8b). En el día 20 pf se detectan células sbGAP en el NOR, pero la expresión de su ARNm era mucho menor que la de sGAP (comparar las secciones consecutivas de las Figs. 8c,d). La población sbGAP del telencéfalo ventral se hace evidente recién entre los días 23 y 26 pf (Fig. 8e). Finalmente, la población mas conspicua de neuronas sbGAP se detecta en el núcleo parvocelular del área preóptica entre los días 25 y 28 pf (Fig. 8f).

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DISCUSIÓN

Especificidad de los GAPs como marcadores indirectos de GnRH El patrón de distribución cerebral de los diferentes somas y fibras que expresan preproGnRH, basado en la expresión de los diferentes GAPs se encuentra resumido en la Figura 9. La distribución de las 3 poblaciones más conspicuas: salmonGAP en el NOR, seabreamGAP en el POA y cGAP-II en el MB es consistente con la distribución informada previamente para otras especies de Perciformes (Powell et al 1994, White et al 1995, Gothlif et al 1996, Okuzawa et al 1997, White y Fernald 1998, Capitulo I de esta Tesis/ Pandolfi et al 2002). Sin embargo, los resultados presentados en este capítulo han demostrado que en Cichlasoma dimerus existe una distribución superpuesta de los preproGnRHs salmon y seabream a lo largo de la porción ventral del cerebro anterior. Esta distribución superpuesta solamente fue descripta en otro perciforme, el sea bass europeo Dicentrarchus labrax (González Martínez et al 2001, 2002a). Nuestros resultados indican también que en C. dimerus las células prepro-sbGnRH se detectan por primera vez en la región olfatoria al igual que las células prepro-sGnRH. Esta expresión temprana de sbGnRH en la región olfatoria sólo había sido demostrada también en D. labrax (González-Martínez et al 2002b), pero no en el resto de las especies de perciformes para las cuales se sigue manteniendo la hipótesis del origen de células sbGnRH (GnRH I) en el piso diencefálico/ área preóptica (Parhar 1997, Ookura 1999). Pese a que hemos utilizado anticuerpos heterólogos (de D. labrax) y riboprobes heterólogas (de H. burtoni) para localizar las distintas poblaciones celulares que expresan prepro-GnRH en C. dimerus, los controles utilizados y los resultados obtenidos nos permiten afirmar que existe una gran especificidad en nuestra identificación, y por lo tanto una ausencia de reacciones cruzadas. Esta afirmación se basa en varios puntos:

1) Las grandes células sGAP del NOR (20.5 µm) no se inmunomarcaron con los antisueros generados contra sbGAP del seabass.

2) Las pequeñas células sbGAP del NOR (6.7 µm), asi como las principales células sbGAP del POA no se inmunomarcaron con los antisueros generados contra sGAP de seabass.

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3) El patrón de inervación de las fibras ir-sbGAP se encontraba claramente restringido al bulbo olfatorio, telencéfalo ventral y región ventral preóptica e hipotalámica. Este patrón contrasta mucho con la alta densidad de fibras en varias regiones del cerebro anterior, medio y posterior mostrado por las fibras ir-sGAP. 4) La especificidad de los antisueros utilizados para reconocer los distintos GAPS utilizados fue reforzada por la caracterización de los mismos mediante Western blot y por la realización de variados controles de especificidad de los mismos anticuerpos y de las técnicas utilizadas. 5) Las riboprobes utilizadas ya habían sido caracterizadas en H. burtoni (White and Fernald 1998). Su especificidad en C. dimerus se ve reflejada en: - el distinto patrón obtenido con las diferentes riboprobes: sGAP o sbGAP en secciones adyacentes - por el uso de condiciones de lavado e hibridación muy astringentes - por el background bajo y uniforme observado en las secciones control tratadas con riboprobes sense - por la coherencia entre los resultados obtenidos x IHQ e HIS - por la aparición de los ARNm de cada una de las variantes de GAP en distintas etapas del desarrollo larval.

Zmora et al en 2002 han demostrado en el sea bass que los cDNAs que codifican para los precursores de sGnRH y cGnRH II poseen una identidad de secuencia de entre 87 y 99% con las secuencias de otros perciformes: striped bass, sea bream y cíclido africano. Sin embargo el precursor de sbGnRH posee una identidad de secuencia de 90% con respecto al sea bass pero de 60% con respecto al seabream y 40% con respecto al cíclido africano. En el caso de C.dimerus, tanto los anticuerpos contra los GAPs del seabass como las riboprobes contra el ARNm de los GAPs de tilapia, reconocen con alta especificidad tanto a las proteinas como a los ARNm correspondientes a los GAPs de nuestro modelo experimental debido a que: 1) Se revela una única y clara banda en Western blot para cada uno de los antisueros. 2) Tanto los antisueros como las riboprobes son capaces de reconocer poblaciones celulares muy pequeñas, aisladas y de baja expresión.

64 3) Cada GAP colocaliza sólo con su GnRH correspondiente en cada uno de los núcleos descriptos.

Por lo tanto podemos concluir que tanto los antisueros como las riboprobes heterólogas generados contra los GAP de una especie filogenéticamente relacionada con nuestro modelo experimental, constituyen valiosas herramientas para el estudio de distintas formas moleculares de GnRH en muchos niveles. El análisis mediante un SDS-PAGE 15% seguido por Western blot, reconoció una banda específica para cada uno de los tres GAPs en cerebro y una para sGAP y otra para sbGAP en hipófisis. El peso molecular estimado para sGAP y sbGAP de C.dimerus fue de 7.5 kD, 1.5kD mas que en el sea bass (González Martínez et al 2002a). El cGAP-II de C. dimerus se expresa sólo en cerebro y su PM estimado fue de 34 kD. Aunque el PM esperado para cGAP-II debería ser de aproximadamente 7 kD (basándonos en la secuencia aminoacídica de los precursores de cGnRH II de otras especies), no tenemos dudas de su especificidad pese al alto PM obtenido. Esta alta especificidad se explica porque: 1) La doble IHQ con antisueros contra cGAP-II y cGnRH-II demostró que realmente estamos inmunomarcando células cGnRH II (Fig 2). 2) Calles del western blot tratadas con el anti-cGAP-II preincubado con un exceso del antígeno sea bass cGAP-II mostraron un ausencia total de inmunomarcación.

Poblaciones y gradientes salmonGAP y seabreamGAP El presente estudio ha demostrado también que en C dimerus sGAP y sbGAP se expresan a lo largo de dos gradientes muy distintos. La expresión de sGAP ocurre en un gradiente antero-posterior, con una mayor expresión en el NOR, que se va reduciendo en regiones posteriores como el telencéfalo ventral y el área preóptica. Por el contrario, la expresión de sbGAP muestra un gradiente postero-anterior con la mayor expresión en el área preóptica que se reduce notablemente a la altura del NOR y el bulbo olfatorio. Este patrón confirma los resultados obtenidos en otras especies de teleósteos por IHQ, que muestran una amplia distribución de las neuronas GnRHérgicas en la porción ventral del cerebro anterior (Kah et al 1986, Oka e Ichikawa 1990, Amano et al 1991, Montero el al 1994, Kim et al 1995). Estos resultados también fueron muy consistentes con los estudios de localización de poblaciones ir-GAP en D. labrax en los que se utilizaron los mismos

65 antisueros (González-Martínez et al 2002a). Sin embargo, la comparación del patrón observado en esta especie con nuestros resultados reveló algunas diferencias que se deben probablemente a diferencias específicas de especie. La más notoria es la presencia de neuronas pequeñas y fusiformes en el hipotálamo del sea bass que no fueron identificadas en C. dimerus, donde la población de somas GnRHérgicos más caudal se sitúa en el POA: Recientemente, Vickers et al en 2003 han demostrado que en el salmónido Coregonus clupeaformis GnRH III (sGnRH) y GnRH I (wfGnRH) se expresan en las mismas regiones del cerebro anterior, pero no colocalizan en las mismas células. Por lo tanto, es muy probable que en todas las especies de teleósteos (incluyendo al controvertido grupo de los perciformes) ocurra lo mismo que en otros grupos de vertebrados: los somas GnRH del cerebro anterior (GnRH I y III) se encuentran dispersos a lo largo de un continuo desde el nervio terminal hasta el hipotálamo anterior con algunas neuronas aisladas en el bulbo olfatorio (Silverman et al 1994, Muske y Moore 1998, González-Martínez et al 2001). Es probable que en los perciformes estudiados anteriormente, el problema de detectar neuronas GnRH fuera de los núcleos principales (NOR, POA y MB), se deba a su escaso número y pequeño tamaño.

Población chickenGAP-II Las células ir-cGAP-II se localizaron exclusivamente en el tegmentum del cerebro medio dorsal de C. dimerus sin que se hay detectado inmunoreactividad o expresión de ARNm en ningún soma del cerebro anterior. La presencia de neuronas ir-GnRH en esta región del SNC fue descripta por primera vez en el platyfish (Münz et al 1981) y luego confirmada en el goldfish (Kah et al 1986). Finalmente se demostró en el masu salmon que esas células expresaban la forma cGnRH-II (Amano et al 1991). La presencia de neuronas cGnRH II fue descripta en todos los grupos de vertebrados con excepción de las lampreas (Bennis et al 1989, van Gils et al 1993, Lescheid et al 1997, Urbanski et al 1999). Las funciones y los sitios de proyección de fibras de estas neuronas del cerebro medio aun no son muy claros. En algunas especies de teleósteos se han detectado fibras ir-cGnRH II en la hipófisis (Yu et al 1988, Schulz et al 1993, Montero et al 1994). Sin embargo en otras especies, pese a mostrar una densa inervación del SNC, la forma cGnRH-II no inerva la hipófisis (González-Martínez 2002a). La presencia o ausencia de cGnRH-II en la hipófisis podría deberse a de diferencias específicas de especie, o ser el resultado de reacciones

66 cruzadas por el uso de anticuerpos contra las distintas formas de GnRH en vez de contra los distintos GAPs. En la hipófisis de C. dimerus, pese a la alta densidad de fibras en el núcleo lateralis tuberis del hipotálamo que se encuentra muy cercano al infundíbulo, no se pudieron detectar fibras ir-cGAP-II ni por IHQ ni por Western blot. Por lo tanto se supone que las fibras hipofisarias cGnRH II descriptas en el capítulo anterior fueron producto de reacciones cruzadas entre anticuerpos contra distintas formas de GnRH. Es muy interesante el hecho de que una pequeña proporción de somas ir-cGnRH-II no pudieron ser inmunomarcados con el anti-cGAP-II de seabass. Para esto se plantean tres posibles explicaciones: 1) Existiría una menor especificidad del anti-cGAP-II de seabass en comparación con el LRH13 monoclonal utilizado como marcador de células ir- GnRH II en el cerebro medio dorsal. 2) El LRH13 podría estar detectando una pequeña población de células ir- GnRH pertenecientes a una cuarta forma de GnRH en esta especie. 3) Algunas neuronas del cerebro medio que expresan cGnRH II no expresarían el GAP, o expresarían una forma diferente de cGAP-II como consecuencia de alguna mutación puntual o alguna modificación post- traduccional que lo volverían irreconocible frente al antisuero usado.

Patrón de inervación de las fibras GAP Además de demostrar una distribución solapada de salmon y seabream preproGnRH a lo largo de la porción ventral del cerebro anterior y una distribución de prepro-GnRH-II restringida al tegmentum del cerebro medio dorsal, este estudio brinda información acerca de la distribución de las fibras correspondientes a cada población de GAP.

FIBRAS SALMON GAP: Muestran una marcada expresión en el cerebro anterior (bulbo olfatorio, núcleo olfacto retinalis, telencéfalo ventral y dorsal, núcleos preópticos parvocelular y magnocelular, tálamo ventral e hipotálamo). También se observa una menor densidad de fibras en regiones más posteriores del cerebro (tegmetum dorsal, zona central y zona gris periventricular del tectum óptico, cuerpo del cerebelo y rombencéfalo). La hipófisis también recibe algunas cortas fibras sGAP que alcanzan la pars distalis proximal

67 y la pars intermedia. Otras fibras de este grupo llegan hasta la retina, y se las observa estrechamente asociadas con la capa de neuronas bipolares retinianas. Otro grupo de fibras discurre por el nervio olfatorio hasta la lámina propia de la mucosa olfatoria. Estas observaciones morfológicas son coherentes con estudios electrofisiológicos que reportan efectos neuromodulatorios de GnRH sobre la retina del goldfish, a través del control de la excitabilidad de las células retinianas (Walker y Stell 1986, Umnio y Dowling 1991). También se han reportado efectos neuromoduladores de GnRH sobre células receptoras olfativas en el mudpuppy (Eisthen et al 2000). También ha sido demostrado que sGnRH está involucrada en el control motivacional de inicio del anidamiento pero no en otros comportamientos reproductivos en el dwarf gourami (Yamamoto et al 1997).

FIBRAS SEABREAM GAP: Fueron observadas solamente en la superficie ventral del cerebro anterior, asociadas principalmente con el área preóptica y el hipotálamo ventral. Los axones de las poblaciones ir-sbGAP de las células preópticas se unen todos en un tracto de fibras (tracto preóptico-hipofisario) que se dirige hacia la hipófisis. Una fuerte inervación de fibras ir-sbGAP puede apreciarse en la pars proximalis distal y pars intermedia de la hipófisis. No se han observado proyecciones de fibras en otras regiones del cerebro con la excepción de unas pocas en el telencéfalo ventral, NOR y bulbo olfatorio. Probablemente estas fibras tengan su origen en las poblaciones sbGAP mas pequeñas fuera del área preóptica.

FIBRAS CHICKEN GAP-II: Se encuentran ampliamente distribuidas a lo largo del SNC con una marcada abundancia en el cerebro medio, cerebro posterior y médula espinal. Basándonos en la ditribución tan amplia de estas fibras es probable suponer que esta población actuaría como un sistema neuromodulador similar al postulado para sGnRH con otras células blanco. A pesar de que el rol fisiológico de esta variante molecular de GnRH es muy poco claro, la gran conservación de esta molécula a lo largo de millones de años de evolución del linaje de los vertebrados sugiere claramente la existencia de una función esencial de la misma para la neuromodulación de los procesos reproductivos a nivel del SNC.

68 Un nuevo origen embrionario propuesto para la población sbGAP. Los resultados del estudio de la ontogenia con anticuerpos dirigidos sólo contra GnRH (Capítulo I de esta Tesis / Pandolfi et la 2002) demuestran que en C. dimerus, sGnRH se origina en el placode olfatorio, sbGnRH en un primordio preóptico y cGnRH-II posee en un primordio mesencefálico. Los resultados del estudio ontogenético de este capítulo, usando anticuerpos y riboprobes contra los GAPS, confirman los resultados obtenidos en el capítulo anterior para prepro-sGnRH y prepro-cGnRH-II. Sin embargo, se observó que las 2 poblaciones GnRHérgicas del cerebro anterior (salmonGnRH ó GnRH III y seabream GnRH ó GnRH I) se detectan por primera vez en regiones olfatorias rostrales. Estos resultados no concuerdan con los obtenidos en todos los demás perciformes (Gothlif et al 1996, Okuzawa et al 1997, Parhar 1997, Parhar et al 1998, White and Fernald 1998, Ookura et al 1999, Senthilkumaran 1999), en los cuales se plantea un patrón anatómicamente segregado de las tres poblaciones y se hipotetiza un origen para sbGnRH a partir de un primordio preóptico localizado en la pared ventricular diencefálica. Sin embargo en el sea bass (otro Perciforme), anfibios, aves y mamíferos las poblaciones GnRHérgicas del cerebro anterior (desde el bulbo olfatorio hasta el hipotálamo) se originarían también a partir de un primordio olfatorio (Schwanzel- Fukuda y Pfaff 1989, Wray et al 1989b, Murakami et al 1992, Muske 1993, Muske y Moore 1994, Schwanzel-Fukuda 1999, Norgen y Gao 1994, Fiorentino et al 2001, González-Martínez et al 2002b). Otras pruebas sobre el origen de estas células en la región olfatoria provienen del hecho que las células sbGAP pueden detectarse en el área préoptica entre los días 23 a 26 pf, mientras que la expresión del ARNm correspondiente en el nervio olfatorio ocurre en el día 18 pf. Si el origen de esta población fuera en un primordio preóptico, el ARNm y los péptidos correspondientes deberían detectarse primero en el área preóptica y no es el caso observado. La aparición cronológica y secuencial anterior- posterior de sbGAP (nervio olfatorio => bulbo olfatorio => núcleo olfacto retinalis => telencéfalo => área preóptica) durante el desarrollo también sustenta este nuevo origen embrionario planteado. En el seabass se detectó además una pequeña población de somas sbGAP en el hipotálamo ventral (González- Martínez et al 2002b). Estos autores han postulado que si las células sbGAP se originasen en un primordio preóptico esto implicaría

69 una migración de las mismas en dos direcciones distintas: a) rostralmente hasta alcanzar el telencéfalo y bulbo olfatorio y b) caudalemente hasta llegar al hipotálamo ventral. Esta doble migración resultaría poco probable para el caso de neuronas GnRH migrantes. En C. dimerus, tanto en adultos como en diferentes estadios larvales, no se ha detectado esta población ni por IHQ ni por HIS. Aunque esto probablemente se debe a una diferencia interspecífica entre distintas familias del grupo de los perciformes, es también probable que estén presentes y no se hayan podido detectar porque este tipo de pequeñas poblaciones aparece sólo en una o dos secciones histológicas consecutivas. Muy recientemente Ookubo et al 2004, utilizaron líneas de medakas transgénicos en las cuales la “green fluorescent protein (GFP)” identifica las distintas poblaciones GnRHérgicas del cerebro anterior. Estudiando la ontogenia de estas poblaciones en estas líneas transgénicas se vio claramente que, tanto las neuronas del área preóptica como las del nervio terminal, se originaban en la unión naso-cerebral y migraban a sus posiciones finales a lo largo del desarrollo. Todas estas evidencias en conjunto sustentan fuertemente nuestra hipótesis acerca del origen olfatorio de las neuronas sbGnRH (GnRH I).

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CAPITULO III

ESTUDIO DE LAS GONADOTROFINAS EN Cichlasoma dimerus

71 MATERIALES Y MÉTODOS

Animales y procesamiento de las muestras Para el siguiente estudio se utilizaron 30 animales adultos (12 machos y 18 hembras de entre 1 y 2 años). Estos animales fueron mantenidos en grandes acuarios con aireación y o filtros incorporados, a una temperatura de 27± 1 C y un fotoperíodo de 12 horas de luz y 12 de oscuridad. La alimentación fue llevada a cabo con pellets comerciales para peces, y larvas del género Artemia. Los animales adultos fueron sacrificados durante el periodo reproductivo (Septiembre-Marzo). Se fijaron hipófisis, cerebros y ovarios en líquido de Bouin por 24 horas. Luego de deshidratar en concentraciones crecientes de etanol, las piezas fueron incluidas en paraplast (Fisherbrand, Fisher, WA, EEUU). Para las hipófisis se realizaron secciones sagitales de 7 µm y para cerebro y gónadas, secciones transversales de 10 µm que fueron sometidas a técnicas de IHQ. Por otro lado 5 machos y 5 hembras adultas fueron anestesiados en una solución acuosa de benzocaína 0.1% y luego sacrificados por decapitación. 5 cerebros, 10 hipófisis, 2 testículos y 2 ovarios fueron homogeneizados en 1 ml de buffer Tris-HCl 50mM pH 7.4 con 10 µl de un cocktail inhibidor de proteasas (Sigma, San Luis, Mo). Las muestras fueron procesadas a través de una electroforesis en un gel 15% de sodio dodecilsulfato- poliacrilamida (SDS-PAGE) seguido por Western blot utilizando anticuerpos contra las distintas gonadotrofinas siguiendo de acuerdo con el mismo protocolo descripto en el Capítulo II de esta Tesis. Para estudios inmunohistoquímicos a largo del desarrollo, se tomaron diariamente muestras de larvas desde el momento de la eclosión hasta 15 días pf y luego cada 3 días entre los días 15 y 90 pf. En cada estadio larval el número mínimo de animales sacrificados fue 10. También se realizaron coloraciones topográficas con las técnicas de Hematoxilina- Eosina y Tricrómico de Masson y técnicas histoquímicas para la detección de glicoconjugados neutros (Técnica de PAS).

Antisueros utilizados

Los antisueros utilizados en este estudio fueron generados contra la βFSH y la βLH del pez Ciprinodontiforme Fundulus heteroclitus, conocido como mummichog. La

72 generación y caracterización de estos antisueros ha sido descripta previamente (Shimizu y Yamashita 2002). Estos anticuerpos están dirigidos contra las regiones conservadas de la

βFSH y la βLH de peces teleósteos resultando así ser útiles herramientas para identificar a las células que las expresan. En particular hemos utilizado:

1) Anti-Fh (50-60) FSHβ (1:1000) 2) Anti-Fh (91-106) LHβ (1.2000) Fh: Fundulus heteroclitus (50-60): el anticuerpo reconoce la región conservada de la

βFSH localizada entre los aminoácidos 50 y 60. (91-106): el anticuerpo reconoce la región conservada de la βLH localizada entre los aminoácidos 91 y 106. (1:1000) (1:2000): diluciones de uso.

Desenmascaramiento de epitopes Luego de la desparafinización e hidratación de las secciones histológicas, se realizó un tratamiento de desenmascaramiento de epitopes con el objetivo de aumentar la inmunoreactividad de los antígenos y disminuir el background. Las secciones fueron sumergidas en una solución para desenmascaramiento de epitopes (Target Unmasking Fluid, TUF; Sanbio BV) y fueron mantenidas por 10 min a 90oC. Luego se retiraron del baño térmico, se las dejó enfriar por 15 min a temperatura ambiente y finalmente se lavaron con agua destilada.

Inmunohistoquímica Las secciones fueron lavadas en buffer fosfato salino (PBS, pH 7.4) por 15 min. Se preincubaron 30 minutos con una solución de PBS con 0.75% de gelatina y 30 minutos con otra solución de PBS con 5% de leche en polvo descremada a temperatura ambiente. Luego, se incubaron con los correspondientes anticuerpos primarios en las diluciones antes mencionadas por 18 hs a temperatura ambiente. Posteriormente, las secciones se lavaron en PBS 10 min y se incubaron 45 minutos a T. amb. con un anti-IgG de conejo biotinilado diluido 1:600. La amplificación de la señal fue llevada a cabo por incubación de las secciones con una estreptavidina unida a peroxidasa (Dako, Carpintería, CA) diluida 1:800 a T amb por una hora. Luego de 3 lavados en PBS la actividad enzimática de la peroxidasa

73 exógena fue puesta en evidencia con 0.1 3,3´-diaminobenzidina en Tris buffer (pH 7.6) y

0.03% de H2O2. Las secciones recibieron una suave coloración de contraste con hematoxilina, se montaron en DPX, se examinaron con un foto-microscopio FX Nikon y se fotografiaron digitalmente con una cámara Coolpix 4500 asociada al mismo. Para confirmar la especificidad de la inmunomarcación, algunas secciones control fueron incubadas con el anticuerpo primario preadsorbido con un exceso de su respectivo antígeno (100 ng/µl). Para detectar falsos positivos debidos a la técnica inmunohistoquímica, el antisuero primario o el anticuerpo secundario fueron reemplazados por PBS. Para la localización precisa de las diferentes células hipofisarias en C. dimerus se consultaron con 2 trabajos anátomo-embriológicos realizados previamente en esta especie (Pandolfi et al 2001a,b).

Doble inmunohistoquímica para βFSH y βLH La secciones provenientes del desenmascaramiento de antígenos fueron lavadas en agua destilada, y luego en PBS por 20 minutos. Posteriormente, fueron preincubadas 1 hora en solución de bloqueo y finalmente con el anti-Fh (91-106) LHβ (1.2000) por 18 horas a T. amb. Luego de un lavado en PBS de 10 min, las secciones se incubaron 1 hora a T amb con un anti-IgG de conejo unido a peroxidasa (1:200). Se lavaron 10 min en PBS y se revelaron con DAB, por lo que las células que expresan βLH se observan de color marrón.

El anticuerpo contra βFSH y el anticuerpo contra βLH, fueron generados en conejo. Por lo tanto, hubo que realizar un protocolo de bloqueo de epitopes libres con el fin de evitar interacción entre el primer y el segundo sistema de detección de antígenos. Para ello se procedió de la siguiente manera: luego del revelado con DAB, las secciones fueron lavadas en agua destilada, y sumergidas en una solución buffer 10mM glicina-HCl (pH=2) durante 1 hora a 40oC. Después, las secciones se pusieron en contacto con una solución 8M de urea durante 1 hora a 40oC. Luego se lavaron con agua destilada y PBS, y fueron preincubadas nuevamente 1 hora en solución de bloqueo y finalmente con el anti-Fh (50-

60) FSHβ (1:1000) por 18 horas a T. amb. Luego de un lavado en PBS de 10 min, las secciones se incubaron 1 hora a T amb con un anti-IgG de conejo unido a fosfatasa alcalina (1:200). Se lavaron 10 min en PBS y se revelaron con un kit de revelado para fosfatasa

74 alcalina basado en la reacción de esta enzima con su sustrato (BCIP/NBT VECTOR BLUE DAKO).

Por lo tanto las células que expresan βFSH se observan de color azul, y las células que muestran coloración negra (porperposición del marrón con el azul) son aquellas que co- expresan βFSH y βLH. Si bien estos preparados suelen ser temporarios se ha logrado en el laboratorio, tras una deshidratación suave, montarlos en DPX obteniendo así preparados histológicos definitivos.

75 RESULTADOS

Localización de células hipofisarias ir-βFSH e ir-βLH en adultos En la figura 1 se muestra esquemáticamente la estructura de la hipófisis de un adulto de C. dimerus en donde se ve su morfología y la distribución de los distintos tipos celulares que la componen incluyendo a los gonadotropos. La hipófisis presenta 2 regiones netamente distintas: la adenohipófisis (ADH) y la neurohipófisis (NH). Al igual que en todos los teleósteos, en esta especie.,la NH se interdigita fuertemente con la ADH. La ADH se divide además en tres regiones anatómicas: la pars distalis rostral (RPD), la pars distalis proximal (PPD) y la pars intermedia (PI). El mayor número de células PAS+ se localiza en la PPD y algunas pocas en la PI. Estas células PAS+, que expresan glicoconjugados neutros, se corresponden en parte con las células ir-βFSH e ir-βLH. Estos gonadotropos también se colorean con el azul de anilina cuando las secciones son coloreadas con Tricrómico de Masson. No se observó ningún tipo de inmunomarcación cuando el anti-Fh(50-60)FSHβ o el anti-Fh (91-106)LHβ fueron reemplazados por PBS. La inmunoreactividad también desapareció totalmente cuando se agregó un exceso del correspondiente antígeno al anticuerpo en su dilución de uso. También es muy notoria la baja inmunomarcación de células ir-βFSH en aquellos casos en los que no se aplicó el protocolo de desenmascaramiento de epitopes.

Células ir-βFSH: En la figura 2d se observa un corte sagital de hipófisis inmunomarcado con el anti-Fh(50-60)FSHβ. Las células ir-FSH de inmunoreactividad media se encuentran mayormente en la PPD (Fig 2e) con algunas pocas localizadas en los bordes ventrales de la misma. También se encuentra una población más pequeña de células ir-FSH de inmunoreactividad fuerte en el borde externo de la PI (Fig 2f). En general, las células ir-FSH son menos abundantes y de menor tamaño que las ir-LH y suelen localizarse mayormente en la PPD anterior junto con las células ir-TSH. Estas células endocrinas suelen disponerse en cordones de 2 o 3 células de espesor, aunque también es común ver células aisladas. Son esféricas o poliédricas y poseen un citoplasma vacuolado.

76

Fig. 1:Esquema de una sección sagital de la hipófisis de C. dimerus mostrando los distintos tipos celulares en la adenohipófisis. PDR pars distalis rostral, PDP pars distalis proximal, PI pars intermedia, NH neurohipóofisis, c{elulas ir-PRL ( ), ir-ACTH ( ), ir-TSH ( ), ir-GTH ( ), ir-SL ( )e ir-GH ( ). Pandolfi et al 2001a.

Células LH Células FSH HYP HYP PI

IR PI IR PPD RPD PPD RPD A D

PPD

PPD

BE

PI PI

CF Células ir-βLH: En la figura 2a se observa un corte sagital de hipófisis inmunomarcado con el anti-Fh (91-106) LHβ. Las células ir-LH de inmunoreactividad media se localizan en regiones centrales, ventrales y marginales de la PPD (Fig 2b). También se observan células ir-LH de fuerte inmunoreactividad en el borde externo de la PI (Fig 2c). Estas células se organizan en cordones o en pequeños acúmulos a lo largo de la PPD. Permanecen aisladas contactando con las interdigitaciones de la NH en la ADH. Presentan un aspecto vacuolado y emiten conspicuos procesos celulares dirigidos hacia la NH.

Células que co-expresan ir-βLH e ir-βFSH: En la figura 3 se observa una doble IHQ en un corte sagital de hipófisis de adulto para LH (marrón) y FSH (azul). Sólo algunos pequeños acúmulos de células localizados en el borde externo de la PI co-expresan tanto FSH como LH (negro).

Localización de somas neuronales y fibras ir-βFSH e ir-βLH en adultos. Sorprendentemente, al realizar la IHQ de hipófisis de adultos se han observado abundantes fibras ir-LH en la PPD y PI de la NH y algunas escasas fibras ir-FSH en la misma región (Fig 4a). Estas fibras podían observarse también en el infundíbulo, área preóptica e hipotálamo ventral. Los somas de estas neuronas se localizaron en el área preóptica (núcleo parvocelular y magnocelular) y en el hipotálamo ventral (núcleo lateralis tuberis).(Fig 4b). Si bien ambas gonadotrofinas se expresan en las mismas áreas cerebrales, no se observó colocalización en los mismos somas. El tratamiento de cortes con los antisueros preadsorbidos con sus respectivos antígenos elimina completamente la inmunomarcación tanto en fibras como en somas.

Ontogenia de las células hipofisarias y las neuronas ir-βFSH e ir-βLH. Células ir-βFSH: En el día 21 pf comienzan a detectarse las primeras células ir- FSH en regiones anteriores de la pars distalis (Fig. 4c). En este periodo la RPD no se diferencia aún de la PPD. A medida que avanzan los días y se acerca el periodo de diferenciación sexual gonadal (día 42 pf) (Pandolfi et al 2002, Meijide et al 2005), el número de las células ir-FSH comienza a aumentar y éstas se distribuyen a lo largo de la PPD y en el borde externo de la PI. Este estudio ontogenético abarca hasta el día 90 pf,

77 HYP PI PI HYP

IR IR PPD PPD

RPD RPD A B

C D período en el cual se sigue observando un aumento en el número y en la inmunoreactividad de estas células. Las neuronas ir-FSH preópticas e hipotalámicas se diferencian sincrónicamente con las células hipofisarias ir-FSH (día 21 pf). (Fig. 4d).

Células ir-βLH: En el día 15 pf ya se pueden observar algunos somas ir-LH que proyectan sus fibras hacia la hipófisis formando un denso paquete de fibras a la altura de la PI (Fig 4e). A diferencia de lo que ocurre con las células hipofisarias ir-FSH, las células ir-LH se diferencian a partir del día 60 pf, una vez que comenzó el proceso de diferenciación sexual gonadal. La diferenciación comienza en regiones centrales de la PPD (Fig 4f) y para el día 90 el patrón observado en cuanto a células endocrinas y fibras neurohipofisarias ir- LH es similar al del adulto.

EN RESUMEN: Día 15: DIFERENCIACIÓN DE NEURONAS LH. Día 21: DIFERENCIACIÓN DE NEURONAS FSH. DIFERENCIACIÓN DE CELULAS HIPOFISARIAS FSH. Día 60: DIFERENCIACIÓN DE CELULAS HIPOFISARIAS LH.

Expresión de ir-βFSH e ir-βLH en oocitos. Los estudios inmunohistoquímicos en larvas completamente seccionadas pueden ser considerados como un buen control de la especificidad de las técnicas y anticuerpos utilizados debido a que el gran número de órganos presentes en una misma sección pueden ser considerados como controles negativos. En nuestro caso la omisión del anticuerpo primario y/o la preadsorción del mismo con su antígeno correspondiente permite considerar como background a toda la marca obtenida luego del revelado. A lo largo de estos estudios se detectó inmunoreactividad tanto para LH como para FSH en el ovario. Esta marca no aparecía cuando se omitía el primer anticuerpo y desaparecía totalmente con los tests de preadsorción. Para verificar esto, se realizaron IHQs para LH y FSH en ovarios del periodo de reposo (invierno) y ovarios del período reproductivo pre y post puesta (primavera). Se observó inmunoreactividad para LH y FSH en los 3 tipos de ovario

78 HYP

PI

NLT NH

A B DI A 21 (FSH) DI A 21 (FSH) HYP HYP IR

PPD NLT

C D DI A 15 (LH) DI A 60 (LH) HYP HYP

RPD IR RPD PPD PPD PI PI

E F tratados, localizada en el citoplasma de oocitos previtelogénicos y vitelogénicos tempranos (Fig 5a-d). Se realizaron secciones control (preadsorbiendo el anticuerpo) de cortes adyacentes de los mismos ovarios y la inmunomarcación fue completamente eliminada (Fig. 5e).

Caracterización de βFSH y βLH de C. dimerus por Western blot. Para verificar la especificidad de los anticuerpos utilizados se realizó la técnica de Western blot sobre homogenatos de hipófisis, cerebro, ovario y testículo de animales en el período reproductivo. Los resultados se expresan en la siguiente tabla y en la Fig 6.

Hipófisis Cerebro Ovario Testículo

βLH 24 kD βLH 24 kD βLH 24 kD No reactivo βFSH1 15 kD βFSH1 15 kD βFSH1 15 kD βFSH2 19kD βFSH2 19kD

79 FSH LH

A B FSH LH

C D Cont r ol

E

LH EN HIPOFISIS FSH EN HIPOFISIS

24 kD

19kD 15 kD

A B

Figura 6: Análisis de Western blot utilizando homogenatos de hipófisis incubados con anti-

Anti-Fh (50-60) FSHβ (A) y Anti-Fh (91-106) LHβ (B). Con el anti- FSHβ se detectaron dps bandas: una banda de mayor intensidad de 19 kD y otra de menor intensidad de 15 kD . Con el anti- LHβ se detectó una única banda muy intensa de 24 kD. Las calles en blanco representan los controles negativos en los cuales se omitió la incubación con el anticuerpo primario. DISCUSIÓN

Los resultados del análisis inmunohistoquímico revelaron que en animales adultos, FSH y LH son producidas mayormente en distintos tipos celulares de la adenohipófisis de C. dimerus. La síntesis de FSH y LH en distintos tipos celulares ya fue informada en varias especies de peces teleósteos: Fundulus heteroclitus (Calman et al 2001), red seabream (Kagawa et al 1998), pejerrey (Miranda et al 2001) y salmón (Nozaki et al 1990). Sin embargo en algunas especies, con el uso de antisueros heterólogos, sólo se pudo detectar un solo tipo de gonadotrofo (Vissio et al 1996, Saga et al 1999, Segura-Noguera et al 2000) Las células que expresan FSH en C. dimerus se encuentran principalmente en las zonas centrales y anteriores de la PPD y, en menor medida, en los bordes marginales de la PI. Las células LH presentan un patrón similar con una mayor densidad en la PPD. La diferencia de inmunoreactividad observada entre células de la PPD (moderada) y de la PI (fuerte) para ambas gonadotrofinas podría estar reflejando una regulación diferencial de su producción en estas 2 regiones de la ADH en el periodo escogido para este análisis (periodo reproductivo). También hemos observado una colocalización de FSH y LH en unos pocos y pequeños grupos de células del borde de la PI. Durante mucho tiempo se consideró que en los peces, a diferencia de lo que ocurre en mamíferos, no existía colocalización de hormonas hipofisarias en la misma célula. Recientes trabajos han demostrado que esto no es así: en el Mediterranean yellowtail Seriola dumerillii y en el platyfish se ha observado una colocalización parcial de FSH y LH (Magliulo-Cepriano et al 1994, García-Hernández et al 2002) y además, en estadios tempranos del desarrollo de Sparus aurata también se detectó colocalización de PRL y GH (Villaplana et al 2000). Los anticuerpos usados en este estudio han sido obtenidos del mummichog Fundulus heteroclitus (Familia Cyprinodontidae, Orden Cyprinodontiformes, Superorden Acantoptertgii) a partir de péptidos sintéticos que poseían las secuencias de las GtHs de esta especie (Shimizu y Yamashita 2002). Los péptidos que se utilizaron como antígenos fueron sintetizados a partir de las secuencias de los cDNAs correspondientes que ya habían sido caracterizados previamente (Lin et al 1992, Limesand et al 1995). Estos anticuerpos fueron generados contra antígenos que se corresponden con regiones conservadas de las GtHs de teleósteos y actualmente están siendo probados en varias especies de peces acantopterigios (Shimizu 2004). Para la detección inmunohistoquímica de FSH y LH de C.

80 dimerus utilizando los anticuerpos de mummichog fue necesario realizar una recuperación de los antígenos a alta temperatura con el fin de lograr un desenmascaramiento de epitopes. Es probable que las gonadotrofinas sufran degeneración o enmascaramientos parciales de epitopes por los procedimientos histológicos realizados en las células que las contienen

(fijación, deshidratación, inclusión en parafina). En el caso del anti-Fh(50-60)FSHβ, la única forma de obtener inmunomarcación es pretratando las secciones a 90oC durante 10 min en solución desenmascaradora de epitopes. La especificidad de nuestra inmunomarcación se vio reforzada también por los controles de preadsorción y por la realización de Western blot a partir de homogenatos de hipófisis. Para LH hemos obtenido una banda muy intensa de 24 kD, 3kD mayor que la estimada para la especie en la que se generaron los anticuerpos (mummichog βLH=21kD). Esta diferencia se debe probablemente a un mayor grado de glicosilación de la βLH de C. dimerus. Para βFSH hemos obtenido 2 bandas específicas, una de 15 y otra de 19 kD (mummichog βFSH=18kD). Es probable que la banda de 15 kD sea un producto de degradación de la molécula de FSH, o una isoforma diferente que el mismo anticuerpo estaría reconociendo. El aspecto vacuolado de las células FSH y LH en adultos de C. dimerus, probablemente se corresponda a la característica dilatación del retículo endoplásmico rugoso previamente descripta por microscopía electrónica para varias especies de teleósteos (Quesada et al 1988, García Ayala et al 1989). Esta vacuolización de los gonadotropos parecería relacionarse con la edad de los especimenes, ya que estas vacuolas no se observan en larvas o juveniles. Durante el estudio de la hipófisis de adultos hemos encontrado una marcada presencia de fibras ir-FSH y LH en la neurohipófisis y en el tallo infundibular. Al realizar cortes transversales de cerebro para identificar el origen de estas fibras, se observó que las mismas provenían de somas localizados en el área preóptica (núcleo parvocelular y magnocelular) y en el hipotálamo (núcleo lateralis tuberis). En las secciones control esta inmunomarcación fue totalmente eliminada. Los resultados del Western blot de homogenatos de cerebro, mostraron una banda de 24 KD, al igual que en hipófisis, para βLH. Para el caso de βFSH sólo se pudo detectar la forma de menor peso molecular en el cerebro (15 kD), lo que reforzaría la idea de que se trate de una segunda isoforma de βFSH

81 expresada tanto en cerebro como hipófisis, y no de un producto de degradación de la molécula. En el salmón y la tilapia, además de las glicoproteínas correspondientes a FSH y LH, se encontró una idéntica antigenicidad en el núcleo preóptico. Por otra parte en la tilapia, los niveles de ARNm fueron mucho menores que los cuantificados para hipófisis (Parhar et al 2003). También se encontró inmunoreactividad para LH en roedores, localizada en somas neuronales del núcleo arcuato, en células de la pars tuberalis y en axones hipotalámicos (Gross y Page 1979, Hostetter et al 1981). Se ha hipotetizado que la expresión de LH en el cerebro pudo ser originarse a partir de la LH hipofisaria que llegó al cerebro a través del sistema circulatorio o por absorción selectiva (tanocitosis) a partir del líquido cefalorraquídeo (Pacold et al 1978). Evidencias experimentales han demostrado que luego de hipofictemizar ratas, es posible seguir midiendo niveles de hormonas hipofisarias en cerebro (Emanuele et al 1981, Hojvat et al 1982). También se ha logrado medir in vitro la liberación de hormonas hipofisarias en cultivos de hipotálamo (Pacold et al 1978). Estudios mediante técnicas inmunohistoquímicas y de hibridación in situ han logrado detectar péptidos y RNAm correspondientes a hormonas hipofisarias en el sistema nervioso central de mamíferos (PRL, GH; ACTH, MSH) (Hojvat et al 1982, Pacold et al 1978, Schachter et al 1984) y de peces óseos (SL) (Mousa y Mousa 1999). También se han detectado glicoproteínas simil-FSH y LH en las regiones olfatorias e hipofisarias de las lampreas sugiriendo que la presencia de estas glicoproteínas en el cerebro es un carácter de aparición temprana en el linaje de los vertebrados (Sower et al 1995). El rol preciso de las FSH y LH cerebrales de C. dimerus esta aún poco clarificado, pero la abundancia de axones inmunoreactivos observada en la porción de ventral del cerebro anterior y en la neurohipófisis, sugieren la posible existencia de una importante función neuromoduladora trans-sináptica, así como también un rol en el control de la actividad de las células adenohipofisarias. En roedores se ha comprobado que la administración intracerebral de LH modula la síntesis y secreción de la LH hipofisaria (Emanuele et al 1981), asi como también la actividad eléctrica de las neuronas hipotalámicas (Kawakami y Sakuma 1974, Teresawa 1969). Por otra parte se ha demostrado en la tilapia que las neuronas que expresan FSH y LH también expresan arginina-vasotocina (AVT) y esta hormona neurohipofisaria se localiza exclusivamente en neuronas preópticas que están implicadas en el control de ciertos comportamientos

82 reproductivos (Demski y Sloan 1985, Foran y Bass 1999, Parhar et al 2001, Parhar et al 2003). Otro hecho que nos permite asegurar la especificidad de los anticuerpos utilizados en la identificación de FSH y LH es que las gonadotrofinas hipofisarias y cerebrales aparecen en distintos momentos del desarrollo: neuronas ir-LH (día 15), células hipofisarias y neuronas ir-FSH (día 21) y células hipofisarias ir-LH (día 60). La FSH aparece antes de la diferenciación sexual gonadal, en cambio las células que expresan LH en la hipófisis se diferencian una vez disparado este proceso. Los resultados de este estudio ontogenético son consistentes con los resultados obtenidos en el capítulo I de esta tesis donde se había postulado un efecto de FSH sobre la diferenciación sexual de las gónadas. Esta variación en los tiempos de aparición de FSH y LH también fue observada en otras especies de peces teleósteos (Mal et al 1989, Nozaki et al 1990, Saga et al 1993, Magliulo- Cepriano et al 1994, Miranda et al 2001). En el seabream las células FSH se observan en el día 22, mientras que las células LH recién aparecen en los estadios juveniles (García Ayala et al 2003). En esta especie, que es un Perciforme al igual que C. dimerus, los 2 tipos celulares están presentes en la hipófisis varios días antes de la diferenciación sexual gonadal que ocurre 5 meses después de la eclosión (Zohar et al 1978). En un trabajo previo en la misma especie se describió la presencia de células LH a partir del día 6, pero es probable que haya sido un falso positivo a causa de los antisueros utilizados (Power y Canario 1992). En nuestro modelo hemos comprobado que los anticuerpos contra salmon GtH I y GtH II (muy utilizados en varios trabajos sobre gonadotrofinas) son altamente inespecíficos cuando se los compara con los anti-FSH y LH de mummichog generados contra regiones conservadas de estas moléculas. Tanto en el seabream como en C. dimerus, salmónidos y platyfish, la aparición de las células FSH precede a la de las células LH. En cambio en el pejerrey, si bien ambos tipos celulares s encuentran presentes antes de la diferenciación gonadal, la aparición de células LH precede a la de las células FSH. Esto también sea probablemente un resultado de reacciones cruzadas entre anticuerpos y todos estos trabajos deberían reverse con los anticuerpos de mummichog para clarificar el patrón de aparición de los dos tipos de gonadotropos. Se ha propuesto que las GtHs son importantes para regular los primeros estadios de la maduración del eje cerebro-gónada (Schreibman et al 1982). Se ha descripto que en salmónidos es FSH, y no LH, la que regula el crecimiento inicial y desarrollo de la gónada indiferenciada en larvas (Saga et al 1993).

83 Otra región extracerebral en donde encontramos expresión de FSH y LH fue el ovario. La presencia de estas gonadotrofinas localizadas en el citoplasma de oocitos previtelogénicos y vitelogénicos tempranos es aparentemente específica ya que la inmunomarca es totalmente eliminada cuando se realizan controles de omisión del anticuerpo primario y tests de preadsorción. Por otra parte, al realizar Western blot de homogenatos de ovarios en el período reproductivo se obtienen las dos bandas de 15 y 19 kD correspondientes a βFSH1 y βFSH2 y la banda de 24 kD correspondiente βLH, al igual que lo observado en hipófisis. Nuestro hallazgo fue recientemente confirmado en otra especie de Perciforme, el seabream Sparus aurata, en el cual se reportó una novedosa expresión en oocitos de los genes correspondientes a las subunidades gonadotróficas (Wong y Zohar 2004). Es probable que estas subunidades gonadotróficas en el ovario actúen como factores autócrinos y parácrinos que regulan la comunicación intraovárica. El análisis de las secuencias de la βLH de S. aurata ha revelado que, si bien la secuencia codificante es idéntica a la hipofisaria, ésta se encuentra regulada por un promotor distinto (Wong y Zohar 2004). En el testículo de ratón y rata se ha reportado también la expresión de GtHS (Markkula et al 1995, Zhang et al 1995). Sin embargo, los péptidos secuenciados estaban truncados o eran diferentes a los hipofisarios. También se ha demostrado que la incubación de ovarios de S. aurata con análogos de GnRH induce la liberación de gonadotrofinas al medio de cultivo (Wong y Zohar 2004). Esta presencia de GtHs ováricas estaría sugiriendo la presencia de un nuevo eje GnRH-GtHs en el ovario de Perciformes, en el cual FSH y LH jugarían un importante rol en la comunicación intraovárica entre las células foliculares y el oocito. Los futuros estudios en C. dimerus se centrarán en caracterizar que formas moleculares de GnRH se expresan fuera del SNC y en que células ocurre esa expresión.

84 CONCLUSIONES FINALES

* Las tres variantes moleculares de GnRH (salmon GnRH, seabream GnRH y chicken GnRH-II) aparecen temprano en el desarrollo y rápidamente adquieren un amplio perfil de distribución.

* Sobre la base de los resultados obtenidos utilizando anticuerpos contra GnRH, cada una de las tres formas aparentaba poseer un origen diferente. Cada variante tendría también funciones distintas durante el desarrollo temprano. Posteriormente, a través del uso de anticuerpos contra los diferentes GAPs, reformulamos no solo el patrón de distribución de los somas sino también el origen de una de estas variantes.

* Las dos poblaciones GAP de la porción ventral del cerebro anterior (salmon GAP-GnRH III y seabream GAP-GnRH I) presentan un patrón de distribución superpuesto a lo largo del bulbo olfatorio, núcleo olfacto retinalis, telencéfalo ventral y área preóptica. Para sGAP se observa un gradiente antero-posterior de expresión decreciente. Para sbGAP, en cambio, se observa un gradiente inverso de expresión.

* Se brindó fuerte evidencia morfológica que sustenta la hipótesis acerca del origen embrionario en la región olfatoria para las neuronas sbGAP - GnRH I.

* La inervación de la hipófisis por fibras GnRHérgicas provenientes del área preóptica coincide temporalmente con el inicio de la diferenciación sexual morfológica de las gónadas, lo que sugiere un rol importante de sbGnRH en dicho proceso. Esta hipótesis se ve reforzada por el efecto inductor de FSHrh en gónadas indiferenciadas en cultivo. La misma induce la aparición de oocitos y la diferenciación en un ovario presuntivo.

* Se comprobó la utilidad de los anticuerpos y riboprobes generados contra los distintos GAPs como herramientas para el estudio de las diferentes variantes moleculares de GnRH incluso entre especies diferentes. La ventaja principal viene dada por la gran divergencia observada entre las secuencias nucleotídicas de los distintos GAPs dentro de una misma especie que permite evitar las reacciones cruzadas.

85

* Se demostró, en ausencia de reacciones cruzadas entre anticuerpos, el patrón de distribución de las fibras ir-GAP de cada una de las 3 poblaciones.

* En la hipófisis de adultos las células βFSH se encuentran mayormente en la PPD (inmunoreactividad media) y, en menor medida, en el borde externo de la PI

(inmunoreactividad alta). Las células βLH de inmunoreactividad media se localizan en regiones centrales, ventrales y marginales de la PPD. También se observan células βLH de fuerte inmunoreactividad en el borde externo de la PI. Sólo algunos pequeños acúmulos de células localizados en el borde externo de la PI co-expresan tanto FSH como LH.

* Se han observado abundantes fibras ir-LH en la PPD y PI de la NH y algunas escasas fibras ir-FSH en la misma región. Estas fibras se observaron también en el infundíbulo, área preóptica e hipotálamo ventral. Los somas de estas neuronas se localizaron en el área preóptica (núcleo parvocelular y magnocelular) y en el hipotálamo ventral (núcleo lateralis tuberis). No se observó colocalización en los mismos somas.

* La diferenciación de células endocrinas y neuronas ir-FSH es simultánea y ocurre en el día 21 pf. La diferenciación de neuronas ir-LH (día 15 pf) precede temporalmente a la de las células endocrinas ir-LH (día 60 pf).

* Se observó inmunoreactividad para LH y FSH en los 3 tipos de ovario tratados (período no reproductivo y período reproductivo pre y post-puesta), localizada en el citoplasma de los oocitos previtelogénicos y en vitelogénesis temprana.

86 BIBLIOGRAFÍA

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112 CAPITULO I

Figura 1: Vista general del cerebro de un macho adulto de Cichlasoma dimerus. A: Remoción del techo de la caja craneana con el fin de observar la ubicación del cerebro. El par de lóbulos mas pequeño y de ubicación mas anterior, se corresponde con los hemisferios telencefálicos (Tel). Los dos lóbulos pares de mayor tamaño localizados en la región media se corresponden con el téctum óptico (TO), y el último lóbulo impar y más pequeño, con el cerebelo (Ce). 15X. B: Vista dorsal del cerebro. ME (médula espinal) 20X. C: Vista ventral del cerebro. HF (hipófisis), QO (quiasma óptico), SV (saco vasculoso). 20X. D: Detalle de vista ventral del cerebro. LI (lóbulo intermedio) Tel + BO (Telencéfalo + bulbo olfatorio) 40X.

Figura 2: Cortes transversales de cerebro de adulto de Cichlasoma dimerus coloreados con tionina a fin de representar el aspecto general de los principales núcleos cerebrales que expresan GnRH. A: Corte a la altura del bulbo olfatorio medio (BO) cuya zona más desarrollada es la capa glomerular (GL). A esta altura ya se proyecta parte del telencéfalo ventral (vTEL) en la región dorsal del BO. B: Corte a la altura del BO caudal en donde se observan grandes células ganglionares (detalladas en inserto) que se corresponden con el núcleo olfacto retinalis (NOR). En este nivel el BO se encuentra fuertemente asociado con el vTEL y el telencéfalo dorsal (dTEL). DC1 (subdivisión 1 de la región central del dTEL), DLV1, DLV2 (subdivisiones 1 y 2 de la región ventrolateral del dTEL), DM1 (subdivisión 1 de la región medial del dTEL). Inserto: detalle de células ganglionares del NOR. C: Corte transversal de la región media del telencéfalo donde el núcleo neuroendocrino más conspicuo se corresponde con la región ventral del telencéfalo ventral (vV). También puede apreciarse la comisura anterior (CA) que une los 2 hemisferios telencefálicos. D: Corte a la altura del área preóptica rostral (POA) limitada a este nivel ventralmente por el quiasma óptico (OC), medialmente por el tercer ventrículo (V) y dorsalmente por el vTEL. E: Corte a la altura del área preóptica media donde se distinguen importantes núcleos neuroendocrinos asociados con el V: la porción anteroventral del núcleo preóptico parvocelular (NPOav) y la porción parvocelular del núcleo preóptico parvocelular (NPOpc). Aumentos 40X. Inserto: 600X

Figura 3. A: Dibujos en cámara clara de secciones horizontales de 10µm de larvas enteras de Cichlasoma dimerus de 2, 4 y 50 días mostrando la ruta migratoria de las neuronas ir- salmon GnRH desde el placode olfatorio (OP) hacia el bulbo olfatorio (OB) a través del nervio olfatorio (NO). Epitelio olfatorio (OE); Núcleo olfacto retinalis (NOR). B: Dibujos en cámara clara de secciones horizontales de 10µm de una larva de 6 días y del cerebro de un adulto mostrando las neuronas chicken GnRH II en el cerebro medio (MB) cerca del tercer ventrículo (v). C: Esquema de una sección sagital del cerebro de un adulto mostrando la distribución de los somas de las tres poblaciones GnRHérgicas. Cerebelo (Ce); Hipotálamo (Hyp); Cerebro medio (MB); Médula oblonga (MO); Quiasma óptico (Och); Tectum óptico (OT); Hipófisis/pituitaria (Pit); Área preóptica (POA). Telencéfalo (TEL). Barra: 25µm.

Figura 4: Ontogenia del sistema del NOR (salmon GnRH). A: Sección transversal de una larva recién eclosionada (día 3pf) mostrando células sGnRH en las regiones centrales y basales del placode olfatorio (OP). Placode óptico (OpP); Bulbo olfatorio (OB). B: Sección horizontal de una larva de día 3 pf donde se observan células ir-sGnRH entre el OP y el

113 OB donde se ubica el nervio olfatorio (ON). C: Sección parasagital y detalle de larva de 3 días pf donde se observa la migración de las neuronas sGnRH desde el OP hasta el OB a través del ON. Glándula adhesiva (Ag). D: Sección parasagital de larva de día 4pf donde se puede apreciar la llegada al OB rostro-basal de las células sGnRH. Todas las secciones son de 7µm. Barra: 15µm y 3µm (detalle).

Figura 5: Ontogenia del sistema del NOR (salmon GnRH). A: Sección parasagital de larva de día 42 pf mostrando un compacto grupo de neuronas ir-salmon GnRH en el núcleo olfacto retinalis (NOR). B: Sección horizontal de larva de 50 días pf con neuronas ir- sGnRH localizadas en el NOR. C: Sección horizontal (el detalle muestra la altura del corte) de un macho adulto mostrando neuronas y fibras sGnRH en el NOR. D: Detalle de neuronas sGnRH del NOR. Foto A: anti-salmon GnRH (1:5000), el resto con LRH13 (1:10000). Secciones de 7 µm en larvas y 10 µm en adultos. Barra: 15 µm.

Figura 6: Ontogenia de la población del cerebro medio (cGnRH II) y población del área preóptica (sbGnRH). A: Sección horizontal de larva de 5 días pf donde se detectan por primera vez las neuronas cGnRH II en el cerebro medio (MB) asociadas con el epéndimo del tercer ventrículo (v). B: Sección parasagital de larva de día 32 pf con neuronas inmunomarcadas específicamente con el anti-cGnRH II (1:5000) (punta de flecha). En el detalle se observa la polarización de los gránulos y la asociación con vasos sanguíneos. Tectum óptico (OT); Cerebelo (Ce). C: Sección parasagital y detalle de larva de día 30 pf donde se aprecian neuronas del MB inmunomarcadas con LRH13 (1:10000) (punta de flecha). Hipotálamo (Hyp). D: Sección horizontal (el detalle muestra la altura del corte)de un macho adulto en el período reproductivo con neuronas ir-GnRH junto al epéndimo ventricular (punta de flecha) y un denso entramado de fibras inmunoreactivas. E: Detalle de las neuronas de D. Observar la asociación con vasos sanguíneos (bv) y la gran densidad de gránulos citoplasmáticos. F: sección parasagital de un macho adulto donde se aprecian neuronas preópticas ir-sbGnRH (1:12000). Area preóptica (POA). En el detalle se observan neuronas esféricas y multipolares. Secciones de 7 µm en larvas y 10 µm en adultos. Barra: 20 µm y 5 µm en detalles.

Figura 7. A: Sección sagital de hipófisis de macho adulto. Fibras ir-GnRH inmunomarcadas con LRH13 (1.10000) distribuidas principalmente en pars distalis proximal (PPD) y pars intermedia (PI). Pars distalis rostral (RPD); Receso infundibular (Ir); Hipotálamo (Hyp). B: Distribución de fibras ir-GnRH en una sección sagital de una larva de 60 días pf inmunomarcadas con LRH13 (1.10000). Telencéfalo (Tel); Tectum óptico (OT); Cerebelo (Ce); Cerebro medio (MB); Hipotálamo (Hyp); Médula oblonga (MO). Secciones: 7 µm. Barra: 20 µm.

Figura 8: Relación de la inervación GnRHérgica de la hipófisis con la diferenciación sexual gonadal. A: Sección sagital de hembra de 36 días pf donde se observan fibras ir- sbGnRH en regiones caudales y medias de la neurohipófisis (NH) (flecha). Pars distalis rostral (RPD); Pars distalis proximal (PPD); Pars intermedia (PI); Hipotálamo (Hyp). B: Sección sagital de un macho presuntivo de 36 días pf donde se observa la ausencia de fibras ir-sbGnRH en la NH. C: Sección sagital de un macho de 82 días pf con fibras ir- sbGnRH formando un complejo entramado que alcanza las tres zonas de la adenohipófisis. D: Sección del ovario en diferenciación de A. Oocito (ooc); Célula folicular (f); Mesenterio (m). E: Sección del testículo presuntivo de B. Células germinales (gc); Células

114 somáticas (cs). F: Sección del testículo en diferenciación de C. Espermatocito (Spc); Célula de Sertoli (S). Barra: 4 µm.

Figura 9. A: Corte transversal de gónada luego de 15 días en cultivo (día 45 del desarrollo larval), en la que se observa la gónada indiferenciada sostenida por un mesenterio y localizada en el celoma (punta de flecha). B: Detalle de las gónadas indiferenciadas suspendidas del mesenterio y rodeadas por células somáticas. C: Corte transversal de gónada luego de 15 días en cultivo (día 45 del desarrollo larval) en la que se observa la gónada diferenciada en ovario (punta de flecha). D: Detalle de gónada diferenciada en ovario con oocitos y oogonias. Cg (célula germinal), CS (célula somática), G (gónada), N (notocorda), M (músculo estriado), MS (mesenterio), Og (Oogonia), Oo (Oocito I), R (riñón), Tn (tubo neural). Coloración: Hematoxilina-Eosina. A y C 200X; B yD 600X.

CAPITULO II

Figura 2: Doble inmunofluorescencia que verifica la colocalización de los distintos péptidos asociados a GnRH (GAPs, columna izquierda) con las distintas variantes de GnRH (columna derecha). Comparar A con B, C con D y E con F. A: Corte transversal a nivel del Núcleo olfacto retinalis (NOR) (anti-sGAP-Texas Red). B: La misma sección tratada con LRH13-FITC evidenciado células sGnRH. C: Corte transversal a nivel del área preóptica (POA) (anti-sbGAP- Texas Red). D: La misma sección tratada con LRH13-FITC evidenciado células sbGnRH. E: Corte transversal a nivel del tegmentum del cerbero medio (MBT) (anti cGAP-II-Texas Red). F: La misma sección tratada con LRH13-FITC evidenciado células cGnRH-II. Barra: 20 µm.

Figura 3: Distribución de células y fibras sGAP y sbGAP en secciones transversales a nivel del bulbo olfatorio. A: Neurona ir-sGAP aislada (punta de flecha) en la GL del OB. B: Expresión del RNAm de sGAP en células del OB. C: Fibras ir-sGAP en el OB. D: Neurona ir-sbGAP aislada (punta de flecha) en el OB. E: Expresión del RNAm de sbGAP en células del OB. F: Fibras ir-sbGAP aisladas en regiones ventrales y centrales del OB. Barra: 20 µm. GL (Capa glomerular), (ir-) inmunoreactiva, OB (bulbo olfatorio).

Figura 4: Distribución de células y fibras sGAP y sbGAP en el núcleo olfacto retinalis. A: Agrupamiento de neuronas sGAP en el NOR. Sección transversal. B: Sección transversal a nivel del NOR hibridizada con el antisense sGAP. C: Sección sagital mostrando la inervación del OB, NOR y TEL por fibras ir-sGAP. La punta de flecha indica parte de los somas sGAP en el NOR. D: Neurona sbGAP inmunoreactiva aislada en el NOR. Sección transversal. E: Sección sagital a nivel del NOR hibridizada con el antisense sbGAP. F: Sección sagital a nivel del NOR mostrando delicadas fibras sbGAP aisladas (flechas pequeñas) en las cercanías de las células ganglionares que expresan sGAP (coloreadas con azul de toulidina). Barra: 20 µm. Dm (parte medial del telencéfalo dorsal), Dp (parte posterior del telencéfalo dorsal), GC (célula ganglionar), NOR (núcleo olfacto retinalis), OB (bulbo olfatorio), TEL (telencéfalo).

115 Figura 5: Distribución de células y fibras sGAP y sbGAP en secciones transversales a nivel del telencéfalo ventral y el área preóptica. A: Somas ir-sGAP (puntas de flecha) en el vTEL. B: Células de la zona ventral del vTEL expresando el ARNm para sGAP. C: Somas ir-sGAP en el NPOpc. D: Detalle de neuronas de la fig C. E: Célula ir-sbGAP localizada en posiciones mas ventrales del vTEL con respecto a las células sGAP. F: Sección del vTEL hibridizada con el antisense sbGAP. G: Células sbGAP en el NPOpc. H: Células expresando el ARNm de sbGAP en el área preóptica rostral. Barra: 20 µm. dTEL (Telencéfalo dorsal), NPOpc (porción parvocelular del núcleo preóptico parvocelular), POA (área préoptica), Ve (Ventrículo), vTEL ( telencéfalo ventral), Vv (porción ventral del telencéfalo ventral).

Figura 6: Distribución de fibras ir-sGAP e ir-sbGAP a lo largo del cerebro. A: Sección transversal mostrando una densa inervación del POA. B: Presencia de fibras aisladas sbGAP en el OT y en el cuerpo del CE. Sección sagital. C: Algunas fibras sGAP inervando la hipófisis principalmente en la PPD y PI. Sección sagital. D: Presencia de fibras ir-sGAP en la retina en contacto con la BN. Sección sagital. E: Inervación de la lamina propia de la mucosa olfatoria por fibras ir-sGAP (puntas de flecha). F: Sección sagital mostrando fibras ir-sbGAP atravesando la POA ventral. G: Sección sagital mostrando fibras ir-sbGAP en la región ventral hipotalámica. H: Importante inervación de la hipófisis por parte de las fibras ir-sbGAP. Barra: 20 µm. BN (capa de neuronas bipolares retinianas), Ct (cartílago), CE (cerebelo), Hyp (hipotálamo), OM (mucosa olfatoria), ON (nervio óptico), OT (tectum óptico), PI (pars intermedia), POA (área preóptica), PPD (pars distalis proximal), RET (retina), RPD (pars distalis rostral).

Figura 7: Distribución de somas y fibras ir-chicken GAP II. A: Somas ir-cGAP-II (puntas de flecha) en el MBT dorsal. Sección transversal. B: Detalle de células ir-cGAP-II en el MBT asociadas con vasos sanguíneos. Sección transversal. C: Corte transversal mostrando la presencia de fibras ir-cGAP-II a lo largo del MBT. D: Corte frontal en donde se observa la inervación del OT. E: Presencia de fibras ir-cGAP-II (puntas de flecha) en el cuerpo del CE. Sección transversal. F: Inervación del rombencéfalo. Barra: 20 µm. BV (vaso sanguíneo), CE (cerebelo), MBT (tegmentum del cerebro medio), OT (tectum óptico), ROMB (rombencéfalo), TLO (torus longitudinal).

Fig 8: Ontogenia del sistema seabreamGAP. A: Sección sagital de larva de 18 días en la cual se observa una célula ir- sbGAP (punta de flecha) en el nervio olfatorio cerca del OB rostral. B: Sección de la misma larva tratada con anti-salmon GAP en donde ya se observa un agrupación de neuronas sGAP (punta de flecha) en el NOR. C: Sección transversal de larva de día 20 a nivel del NOR tratada con el sbGAP antisense. D: Sección consecutiva de la misma larva tratada con el sGAP antisense, mostrando una mayor expresión de ARNm. E: Sección transversal de larva de día 24 en la cual se detectan somas ir-sbGAP (puntas de flecha) en la parte ventral del vTEL. F: Sección transversal de larva de día 28 en la que se aprecian somas (cabeza de flecha) y fibras (flechas) ir-sbGAP a nivel del POA. Barra: 20 µm. OB (bulbo olfatorio), Olf N (nervio olfatorio), NOR (núcleo olfacto retinalis), POA (área preóptica), TEL (telencéfalo).

116 Figura 9: Esquemas sagitales de cerebro de adulto. A: Distribución de somas salmonGAP (triángulos rojos), seabreamGAP (círculos verdes), ChickenGAP-II (estrellas azules). B: Distribución de fibras salmonGAP (puntos rojos), seabreamGAP (cuadrados verdes), ChickenGAP-II (puntos azules). CE (cerebelo), Hyp (hipotálamo), MO (médula oblonga), MB (cerebro medio), NOR (núcleo olfacto retinalis), OB (bulbo olfatorio), OE (epitelio olfatorio), ON (nervio olfatorio), OT (tectum óptico), Pit (hipófisis/pituitaria), POA (área preóptica), Tel (telencéfalo), vTEL (telencéfalo ventral).

CAPITULO III

Figura 2. A: Corte sagital de hipófisis de adulto inmunomarcada con anti-Fh (91-106) LHβ. 100X. B: Detalle de células ir-LH de inmunoreactividad media en regiones centrales de la PPD. 600X. C: Células ir-LH de inmunoreactividad fuerte en el borde externo de la PI. 600X. D: Corte sagital de hipófisis de adulto inmunomarcada con anti-Fh (50-60) FSHβ. 100X. E: Células ir-FSH de inmunoreactividad media (puntas de flecha) en la región central de la PPD. 600X. F: Células ir-FSH de inmunoreactividad fuerte en el borde externo de la PI. 600X. HYP (hipotálamo), IR (receso infundibular), PI (pars intermedia), PPD (pars distalis proximal), RPD (pars distalis rostral).

Figura 3. A, B: Doble inmunohistoquímica de corte sagital de hipófisis de macho adulto (A) y hembra adulta (B) para LH (marrón) y FSH (azul). La co-expresión de FSH y LH (negro) se observa en algunos pequeños acúmulos de células del borde externo de la PI (puntas de flecha). A y B 100X. C, D: Detalle de células FSH (azul) y LH (marrón) en la PPD. C, 600X; D,1000X. HYP (hipotálamo), IR (receso infundibular), PI (pars intermedia), PPD (pars distalis proximal), RPD (pars distalis rostral).

Figura 4. A: Fibras ir-LH en la neurohipófisis (NH) (flechas) que contacta con la pars distalis proximal (PPD) y la pars intermedia (PI). 400X. B: Neuronas y fibras ir-LH en el núcleo lateralis tuberis (NLT) del hipotálamo (HYP). 600X. C: Corte sagital a nivel de hipófisis de larva de 21 días en la que ya pueden distinguirse células ir-FSH en las regiones ventrales de la PPD (puntas de flecha). 400X. D: Corte transversal de larva de 21 días donde ya se diferencia una pequeña población de neuronas ir-FSH en el NLT del HYP. 400X. E: Corte sagital a nivel de hipófisis de larva de 15 días donde se observa una marcada inervación de la PI por fibras ir-LH (puntas de flecha). 400X. F: Corte sagital a nivel de hipófisis de larva de 60 días que ha comenzado a expresar células ir-LH en la PPD. 400X. IR (receso infundibular), RPD (pars distalis rostral).

Figura 5: Cortes transversales de ovario de hembra adulta. A: Oocitos en estadio previtelogénico con citoplasma inmunoreactivos (ir-) a FSH (flechas). 100X B: Oocitos en estadio previtelogénico con citoplasma inmunoreactivos ir-LH (flechas). 100X. C: Citopalsma de oocitos vitelogénicos tempranos inmunoreactivos ir-FSH. 200X D: Oocitos vitelogénicos tempranos inmunoreactivos ir-LH. 200X.. E: Control negativo de la técnica inmunohistoquímica por omisión del anticuerpo primario. 100X. En todos los casos, nótese la ausencia de inmunomarca en el citoplasma de oocitos de estadios más avanzados.

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