Tesis Doctoral Caracterización de las variantes de GnRH y las gonadotrofinas en Cichlasoma dimerus (Teleostei, Perciformes) y su relación con la diferenciación sexual Pandolfi, Matías 2005 Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Cita tipo APA: Pandolfi, Matías. (2005). Caracterización de las variantes de GnRH y las gonadotrofinas en Cichlasoma dimerus (Teleostei, Perciformes) y su relación con la diferenciación sexual. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Cita tipo Chicago: Pandolfi, Matías. "Caracterización de las variantes de GnRH y las gonadotrofinas en Cichlasoma dimerus (Teleostei, Perciformes) y su relación con la diferenciación sexual". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2005. Dirección: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Contacto: [email protected] Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293 Universidad de Buenos Aires, Argentina Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental “Caracterización de las variantes de GnRH y las gonadotrofinas en Cichlasoma dimerus (Teleostei, Perciformes) y su relación con la diferenciación sexual” Trabajo de Tesis presentado para optar por el título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires Autor: Lic. Matías Pandolfi Directores de tesis: Dra. M. C. Maggese y Dr. D. A. Paz Laboratorio de Embriología Animal Buenos Aires, Junio de 2005 * Esta tesis contiene 32 figuras sin numeración e intercaladas- 1 “Caracterización de las variantes de GnRH y las gonadotrofinas en Cichlasoma dimerus (Teleostei, Perciformes) y su relación con la diferenciación sexual”. RESUMEN El presente trabajo se basa en el estudio de las múltiples formas de GnRH (hormona liberadora de gonadotrofinas) en un pez teleósteo de agua dulce del Orden Perciformes mediante técnicas histológicas, inmunohistoquímicas, de hibridación in situ y Western blot. Aunque el objetivo inicial fue localizar anatómicamente las diferentes poblaciones de GnRH y analizar la distribución de sus axones desde un punto de vista morfológico- funcional, también se caracterizaron las gonadotrofinas a lo largo del desarrollo y en adultos, encontrandose expresión de las mismas en cerebro y ovario. A la luz de los resultados obtenidos sobre el origen y la ontogenia de las variantes moleculares de GnRH, se propone una correlación entre la diferenciación de una de estas poblaciones y la diferenciación sexual gonadal. Se discute el uso de una nueva metodología para el estudio de las múltiples formas de GnRH dentro de una misma especie que evita las reacciones cruzadas, comúnmente observadas entre anticuerpos y sondas. Finalmente se propone un nuevo patrón de distribución de dichas poblaciones y un origen diferente para una de ellas que contradice el patrón descripto para el resto de las especies de Perciformes, pero que es consistente con lo observado en el resto de los vertebrados. Palabras claves: peces óseos, Perciformes, Cíclidos, GnRH, inmunohistoquímica, hibridación in situ, gonadotrofinas, cerebro, hipófisis, diferenciación sexual, desarrollo, reproducción. 2 “Characterization of different GnRH molecular forms and gonadotrophins in Cichlasoma dimerus (Teleostei, Perciformes) and their relation with the sexual differentiation process”. ABSTRACT The present study examined different GnRH (gonadotrophin-releasing hormone) expressing neuronal populations in a Teleost Perciform fish, using histological, immunohistochemical, in situ hibridization, and Western blot techniques. The main purpose was to localize the different GnRH-expressing populations (salmon, seabream and chicken II GnRH) and to analyze their axons pathways from a morphophysiological point of view. Gonadotrophins (FSH and LH) in this species during different developmental stages and in adults were also characterized, finding expression of them not only in pituitary but in brain (hypothalamic Nucleus lateralis tuberis) and ovary (previtellogenic and early vitellogenic oocytes). The origin and ontogeny of GnRH variants was also examined, and a correlation between the differentiation of one of them (sbGnRH) and the sexual differentiation process was proposed. A new methodological approach using the GnRH associated peptides (GAPs) for the study of multiple GnRH variants in a single species, avoiding cross reactivity was also discussed. Taken together, the results demonstrate the existence of a novel distribution GnRH neurons and an olfactory origin for sbGnRH that was not in accordance with other studies in Perciforms, but that was consistent with results obtained in other vertebrates groups. Key words: teleost fishes, Perciforms, Cichlids, GnRH, immunohistochemistry, in situ hibridization, gonadotropins, brain, pituitary, sexual differentiantion, development, reproduction. 3 Los siguientes trabajos surgieron durante la realización de esta Tesis: 1) Ontogeny and distribution of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neuronal systems in the brain of the cichlid fish Cichlasoma dimerus (2002). Pandolfi M, Parhar IS, Ravaglia MA, Meijide FJ, Maggese MC & Paz DA. Anatomy and Embryology 205: 271-281. 2) The GnRH systems of Cichlasoma dimerus (Perciformes; Cichlidae) revisited: A localization and developmental study using antibodies and riboprobes to the GnRH- associated peptides (2004). Pandolfi M, Muñoz Cueto JA, Lo Nostro FL, Downs JL, Paz DA, Maggese MC & Urbanski HF. Cell and Tissue Research (en prensa) 3) Identification of immunoreactive FSH and LH cells in the brain, ovary and pituitary of the cichlid fish Cichlasoma dimerus: Ontogeny of the gonadotropin system and its relation with different GnRH molecular variants (2005). Pandolfi M, Shimizu A, Lo Nostro FL, Muñoz Cueto JA, Paz DA & Maggese MC Enviado. 4) Cytoarchitectonic study of the telencephalon and diencephalon of Cichlasoma dimerus (Perciformes, Cichlidae). Pandolfi M, Paz DA & Maggese MC En preparación. 4 AGRADECIMIENTOS A la Dra. Cristina Maggese por haber sido mi directora, por darme la oportunidad de trabajar en el Laboratorio de Embriología Animal del que estoy orgulloso de formar parte, porque todo de tu parte fue aliento y porque después de estos 5 años en Embrio aprendí a quererte muchísimo. Al Dr Dante Paz por haberme introducido en el mundo de GnRH que tantas satisfacciones me trajo y por haberme dirigido en esta Tesis. Al Dr. Henryk Urbanski por abrirme las puertas de su laboratorio en USA, por preocuparse de todos los detalles (académicos y personales) de mi estadía en ese país, por su absoluta confianza y respeto y por haberme enseñado cosas valiosísimas para mi formación. Al Dr Jose Antonio Muñoz Cueto de la Universidad de Cádiz por presentarme a los GAPs, por trabajar conmigo en parte de esta Tesis y por ayudarme a conseguir mi beca Postdoctoral en California. Al Dr Ishwar Parhar y al Dr Akio Shimizu del Nippon Medical School por cederme gentilmente sus anticuerpos sin los cuales gran parte de este trabajo no se hubiera podido hacer. A Fabiana Lo Nostro porque sin vos hubiera escrito la tesis a maquina con figuritas recortadas y pegadas del Billiken, por tu santa paciencia y tu locura que combinadas hacen que seas mi adorada Fabi. Gracias también por venir corriendo y dejar todo cada vez que yo gritaba FAAAAAAABBBBIIII. Y no sigo para que no llores… A Paula Vissio porque para ser Doctor tuve que ser Licenciado y las bases de todo las adquirí siguiendo tu ejemplo e imitándote en tantas cosas que ni te imaginas que admiro, porque lo que empieza bien termina bien y vos sos la persona que siempre volvería a elegir para empezar de nuevo. 5 A la Dra Graciela Guerrero por tu ternura inconmensurable que hace que todos te queramos muchísimo y te extrañemos un poco mucho ahora. A Graciela Rey Vazquez porque al mudarme al 3 descubrí una compañera adorable para compartir muy lindos momentos en el labo. A Fernando por haber trabajado conmigo en gran parte de esta Tesis y porque sin vos no habría peces. A los más nuevos del labo que nos contagian su energía a los más viejos. Gracias Griselda (vieja y querida conocida), Yani y Rodrigo. A Maxi por la complicidad y las maldades en el labo que hacen que el trabajo sea mucho mas divertido y por llenarme de orgullo viendo el gran investigador que vas a ser. A Luisa Fiorito. Gracias, gracias, gracias y me quedo corto. No sabes Luisa todo lo que aprendí de vos, tengo el cerebro lleno de cosas increíbles que aprendí como tu alumno y como tu ayudante. Sos una de esas docentes que uno va a recordar hasta que sea viejo, no solo transmitís unos conocimientos increíbles sino una pasión por la docencia que es contagiosa y que a uno lo llena de energía. A la Dra Diana Echeverría por ser la principal responsable de mi pasión por los Vertebrados, por toda tu dedicación y buen trato cuando fui ayudante de tu materia, por preocuparte tanto por tus ayudantes….gracias!!! A todos mis alumnos por sacarme del microcosmos de la investigación y estimularme a seguir estudiando otras cosas para que ustedes aprendan. A mis amigos del colegio por crecer juntos y seguirnos queriendo como siempre: Luciano, Gustavo, Javier, Carlos y Guido…ya saben todo lo que los quiero…aunque sea un poco parco. 6 A mis amigas y amigos de la Facu: Javi por ser el mejor compañero de estudios que pude haber tenido además de ser un amigo de los grosos, Leo mi compañero de selva, Juan por tanta charla más que interesante, Poly por ser mi bebota, Agui por tu cariño enorme (las extraño). Gracias Pau B, Pau E, Marian, Lau N, Lau A, Juli Bono. Las quiero chichis!!!! A la Universidad de Buenos Aires por brindarme toda esta formación y este orgullo de pertenencia. A mi familia por amarme, alegrarme la vida, hacerme sentir siempre acompañado.