MTA DOKTORI ÉRTEKEZÉS
Biotechnológia a növénynemesítési alapanyagok előállításában, a fitoremediációs fajok genetikai kontrolljában, és a kultúrnövények arheogenetikai stabilitásának meghatározásában
Gyulai Gábor
DSc Dissertation Magyar Tudományos Akadémia, Budapest Szent István Egyetem MKK GBI, Gödöllő 2010 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés Ajánlás
Ajánlás
Ezúton ajánlom Értekezésemet egyetemi (SzIE / GATE), kari (MKK) és intézeti (GBI / GNT) munkatársaimnak; Heszky László akadémikus, ny. intézetvezető Úrnak; Kiss Erzsébet egyetemi tanár, intézetvezető Asszonynak megemlékezésel a negyedszázados együttműködésre.
Tanítványi tisztelettel ajánlom Munkámat tanáraimnak Prof. Dr. Lehoczki Endre tanár Úrnak emlékezve egyetemi Doktori Disszertációm (1984) és Diplomamunkám (1982) témavezetésére; és történelem tanáraimnak id. Heltai Miklós és Gyulai Sándor tanár Úrnak a bölcs útmutatásokért.
Gratulációval emlékezem PhD tanítványaimra - Bittsánszky András Dr, Lágler Richárd, Szabó Zoltán Dr, Tóth Zoltán - az együtt végzett friss szellemű kutatásokért és az elért tudományos eredményekért, valamint korábbi Doktoranduszaimra és MSc Hallgatóimra (1 - 44) az elvégzett munkákért.
Külföldi előadó- és tanulmányútaim tapasztalataiért és tudományos eredményeiért ezúton ajánlom Munkámat együttműködő Professzor társaimnak Alan Schulman, Ruslan Kalendar (Helszinki Egyetem, Fi); Fenny Dane, Luther Waters (Auburn Egyetemen, USA); Mervyn Humphreys (IGER, Aberystwyth, Welsz - UK); Marion Röder, Urlich Wobus (IPK, Gatersleben, D); Herb Ohm (Purdue Egyetem, USA); Sacco de Vries, Henk Voss (Wageningeni Egyetem, NL) és Carlos Boroto-nak (Siego de Avilla-i Egyetemen, Kuba).
A hazai laboratóriumokkal végzett közös kutatásokért Dudits Dénes Prof (MTA SzBK); Barnabás Beáta Prof (MTA Martonvásár); Márton László Prof, Czakó Mihály Dr, Medgyesi Péter Dr, Páy Anikó Dr, Deák Mária Dr, Renée P Malone Dr, Bottka Sándor Dr (MTA SzBK); Kőmíves Tamás Prof (MTA, NKI); és Hornok László Prof (SzIE, MBK) szíves együttműködésére emlékezem.
Egyetemi Habilitációmban nyújtott szíves közreműködéséért Dohy János és Várallyay György Professzorok figyelmességét köszönöm.
Ezúton emlékezem meg a Magyar és Nemzetközi Tudományos Közélet, valamint az MTA alapítványaira és kuratóriumaira (Széchenyi Professzori Ösztöndíj, Széchenyi István Ösztöndíj, MTA-kutatói ösztöndíj, OTKA, GVOP, FVM, NKFP, MTA-SzBK ITC, Fulbright, DAAD, OECD), hogy kutatásaim támogatásával lehetővé tették tudományos eredményeim elérését.
Köszönöm az MTA Agrártudományok Osztálya Biotechnológia Bizottsága elnökének Dudits Dénes akadémikus Úrnak szíves befogadó nyilatkozatát.
Köszönöm Elnök Úr (Balázs Ervin, akadémikus); a Bizottság tagjai: Mészáros Annamária Dr. tikár; Barnabás Beáta, az MTA l. tagja; Gyurján István, az MTA doktora; Marton L Csaba, az MTA doktora; Pauk János, az MTA doktora; Raskó István, az MTA doktora; valamint a Bíráló Professzorok Bisztray György, Fáry Miklós, Galiba Gábor szíves közreműködését.
Gödöllő (SzIE) – Budapest (MTA)
2009 március 18.
Gyulai Gábor Dr. a biol. tud. kandidátusa SzIE MKK GBI Gödöllő, H-2103 [email protected]
Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés Tartalomjegyzék
Tartalomjegyzék oldal
Bevezetés és célkitűzés………………………………………………………………………...
1. Irodalmi áttekintés
1.1. In vitro klónozás és szelekció; biotechnológiai növénynemesítés………………………… 1
1.2. Transzgénikus- és szelektált klónok alkalmazása a növényi fitoremediációban……….…. 2 1.2.1. Fitoremediáció gshI-transzgénikus szürkenyár (Populus x canescens) klónokkal.… 3 1.2.2. Transz/gén reaktiváció DHAC-indukált DNS-demetilációval….…………………... 6 1.2.3. Új mikorszatellita klóntípusok szelekciója feketenyárban (Populus nigra)….……... 6
1.3. Régészeti genetika alkalmazási területei a biotechnológiában...... ……………………. 7 1.3.1. ősDNS leletek az állatvilágból……………………………………………………….. 8 1.3.2. ősDNS leletek a növényvilágból……………………………………………………... 11
2. Anyag és módszer
2.1. In vitro klónozás és szelekció, biotechnológiai növénynemesítés………………………… 13 2.1.1. Sejt eredetű klónok előállítása……………………………………………………….. 13 2.1.2. Pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálatok…………………………………………. 13
2.2. Növényi fitoremediáció 2.2.1. A gshI-transzgénikus szürkenyár klónok molekuláris stabilitása……………………. 13 2.2.2. Új mikorszatellita klóntípusok szelekciója feketenyárban (Populus nigra)…………. 13
2.3. Régészeti genetika 2.3.1. Növényi anyag……………………………………………………………………….. 18 2.3.2. Molekuláris módszerek………………………………………………………………. 22
3. Eredmények és Megvitatás
3.1. In vitro klónozás és szelekció a biotechnológiai növénynemesítésben…………………… 29 3.1.1. A sziki mézpázsit (Pucinellia limosa) klónozása szomatikus embriógenezissel……. 29 3.1.2. A vadgesztenye (Aesculus hippocastanum) klónozása járulékos embriógenezissel… 31 3.1.3. A szója (Glycine max) klónozása szomatikus embriógenezissel...... 31
3.2. Növényi fitoremediáció 3.2.1. A 35S-gsh1 transzgénikus szürkenyár klónok stabilitásának meghatározása……… 33 3.2.2. Transz/gén reaktíváció DHAC-indukált DNS-demetilációval………………………. 41 3.2.3. Új mikroszetellita klóntípusok azonosítása feketenyárban (Populus nigra)………… 37
3.3. Kultúrnövények archeogenetikai stabilitása……………………………………………… 41 3.3.1. A köles (Panicum miliaceum) genomstabilitása a középkor óta……………………. 41 3.3.2. A sárgadinnye (Cucumis melo) mikroszatellita diverzitása………………...……….. 57 3.3.3. A görögdinnye (Citrullus lanatus) archeogenetikai jellemzése…………..…………. 65
4. Új tudományos eredmények – A gyakorlati alkalmazás lehetőségei 83
5. Irodalomjegyzék 84 6. Az értekezés alapjául szolgáló (1993, CSc után megjelent) közlemények 107 111
ii Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 1. Irodalmi áttekintés
1. Irodalmi áttekintés 1.1. In vitro klónozás és szelekció, biotechnológiai növénynemesítés
Klónoknak egy egyed ivartalanul előállított, ezét azonos genetikai állományú utódait nevezzük (a klón jelentése: ág, a kladon görög szóból; ld. további jelentését: klán). Napjainkban az állat és humán tudományokban kapott szerepet (ld. humán klónozás, és a Dolly kísérleteket) (Briggs, King 1952; Wilmut et al. 1997). A terület azonban eredetileg a növényi alkalmazásból indult ki (ld. szemzés, oltás, bújtás, dugvány) és fejlődött ki a vírusmentes növényi szaporítóanyag előállításáig (Morel, Martin 1952; Maróti 1976, 1987; Maróti et al. 1973), illetve a biotechnológiai (Haberlandt 1902; Ereky 1919; Orsós 1941) úton előállított, egysejt-eredetű szomatikus embriófejlődésen keresztül kifejlődő klónokig (Larkin, Scowcroft 1981). A Mendel-i genetikát (Mendel 1865) megelőző klasszikus növénynemesítés legfontosabb eszköze az előnyösebb tulajdonságokra történő szelekció volt. Ezt követte az első természetes fajhibrid a búza-rozs, triticale, (Triticum aestivum x Secale cereale) azonosítása, illetve előállítása a múlt század végi Angliában (Skócia 1875) és Németországban (1988) (a Triticale név nyomtatásba először csak 1935-ben jelent meg) (in Villareal et al. 1990). A természetes fajhibridek azonosítását (Digby 1912), az első jól dokumentált mesterséges fajhibrid a retek- káposzta (rafanobrasszika - Raphanus sativus x Brassica olearcea) előállítása (Karpechenko 1927) követte, a napjainkig folyó közeli- és távoli- fajhibridizációs munkákkal. A Morgan-i (1910; Nobel díj 1933) kromoszóma-genetika és -sugárzással végzett indukált mutációs genetika (Muller 1927; Nobel díj 1946) módszereit alkalmazó mutációs növénynemesítés napjaink alkalmazott módszere a genetikai variabilitás növelésén keresztüli nemesítési alapanyag előállításnak (Bálint 1980, 1996). Ezt a módszert követte a poliploidizációs nemesítés, az őszi kikerics (Colchicum autumnale) hatóanyagának a kolchicin-nek az alkalmazásával (Havas 1937; Nebel, Rattle 1938; Györffy B 1940ab; Barnabás et al. 1999). A sejt-eredetű klónok alkalmazását a biotechnológiai növénynemesítés vezette be, melynek végső elméleti igazolása Larkin és Scowcroft (1981) nevéhez fűződik. Ennek a módszernek legfontosabb technikai részlete a Fe-kelát (Na2EDTA), valamint a növényi hormonok, elsősorban az auxinok (Paál 1918; Went 1928) és a citokininek (Haberlandt 1913; Overbeek 1941; Miller et al. 1955) in vitro alkalmazása volt, amely kiküszöbölte a klorózist, és lehetővé tette a nagyszámú szintetikus táptalaj alkalmazását a növényregenerálásban (Murashige, Skoog 1962; Gyulai et al. 1992abc, 1993, 1995ab; Toldi et al. 1994, 1996). Az ivarsejt-, és testi sejtből embriógenezisen keresztül történő növénynevelés (haploid-, és szomatikus
1 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 1. Irodalmi áttekintés embriógenezis) egysejt-eredetének bizonyításával nagy mennyiségű klón, új genotípusú növénynemesítési alapanyag előállítása vált lehetővé (Fári 1982; Dudits, Heszky 2000, 2003; Heszky et al.2005). A munka során egy-, és kétszikű fajok klónozása volt a cél (Gyulai et al. 1993abc, 1997, 1999a; 2003ab, 2004; Mester, Gyulai al. 1998; Kiss et al. 2004; Janowszky, Gyulai et al. 1998), valamint az egysejt-eredet szkenning elektron mikroszkópos bizonyítása, különös tekintettel a sziki mézpázsitban (Puccinellia limosa) (Jekkel, Gyulai, Heszky 1995); vadgesztenyében (Aesculus hippocastanum) (Jekkel, Gyulai et al. 1998) és szójában (Glycine soya) (Gyulai et al. 1993abc). További fajok elemzésére, helyszűke miatt, csak utalok: tarackbúzában (Agropyron repens) (Gyulai et al. 1995abc; Tárczy, Gyulai et al. 1996; Hangyelné, Gyulai et al. 1996; Mázik-Tőkei, Lelley, Gyulai et al. 1997), és zöld pántlikafűben (Phalaris arundinacea) (Gyulai et al. 2000ab, 2003b); valamint az ivarsejt eredetű, dihaploid paprika (Capsicum annuun) klónokban (Gyulai et al. 1999ab, 2000b; Gémesné et al. 2000, 2001).
1.2. Transzgénikus és szelektált klónok alkalmazása a növényi fitoremediációban A fitoremediáció olyan technikák és technológiák összefoglaló neve, amelyek a talajok méregtelenítését (re-mediálását) növények alkalmazásával végzik (fitoextrakció), pl. vegyiművek zagytavainak tisztítását, olajszennyezések megszüntetését, illetve a katasztrófa területek (pl. Csernobil) helyreállítását. A fitoremediáció végbemehet a szennyezőanyag lebontásával, a talajból történő kivonással (fitoextrakció), vagy a szennyezőanyag megkötésével, immobilizációjával. Összehasonlítva a fizikai és kémiai remediációs módszerekkel, a növényi alkalmazás a legkörnyezetkímélőbb (Kőmíves et al. 1998, 2003; Rennenberg, Peuke 2005; Gyulai et al. 2005; Simon 1.1. ábra. A feketenyár (Populus nigra) természetes nehézfém tűrése: felhagyott bauxitbányák (Gánt) úttörőfaja (Bittsánszky, 2004; Bittsánszky et al. 2011). Gyulai et al. 2005b). Fotó: Gyulai G Zsigmond. A fitoextrakció során, a növények tápanyagfelvevő mechanizmusát használjuk fel a szennyezőanyagok akkumulációjához. Néhány egymást követő növekedési periódus után a föld fölötti biomasszát begyűjtve a szennyezés eltávolítható a területről. A elégetés után a
2 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 1. Irodalmi áttekintés hamuban tovább koncentrálhatjuk a szennyezőanyagokat, amelyeket így újrahasznosíthatunk, vagy speciális hulladéktárolókban helyezhetünk el (Rennenberg, Peuke 2005). Fitoextrakcióra azok a növények alkalmasak, amelyek képesek a szennyezőanyagok által okozott stressz tűrésére, a szennyezőanyagok nagy mennyiségben történő felvételére, és a föld fölötti szövetekben történő akkumulációra. A fitoremediáció egyik kritikus pontja a megfelelő növényfaj kiválasztása, amelyik képes tolerálni nagy mennyiségű szennyezőanyagot a talajban. A fitoremediáció hatékonyságát lényegesen befolyásolja, hogy a növény mennyire képes tolerálni a szennyező anyagok toxikus formáinak nagy koncentrációját és az általuk generált aktív oxigénformákat (Gullner, Gyulai et al. 2005). A Populus fajok alkalmassága a fitoremediációra nem vitatható. Ültetésük egyszerű, növekedésük gyors (4-5 m/év) (Gencsi, Vancsura 1992). Magas a transpirációs rátájuk, mély gyökérzetük miatt elérik a talaj mélyebb rétegeit, könnyen adszorbeálják, lebontják és/vagy detoxifikálják a szennyezőanyagokat, miközben gátolják a talajeróziót is (ld. meddőhányok, felhagyott bauxitbányák természetes úttörőfaja (1.1. ábra). A nyár vegetatív úton könnyen szaporítható, nem része az emberi tápláléknak, és a fás növények közül a legjobban tanulmányozott faj. Számos módszert dolgoztak ki erdészeti, vegetatív szaporítására, nemesítésére és betakarítására (Noctor et al. 1998ab). Mindezek alapján a nyárfa ideális jelölt a genetikai transzformációra, valamint a fitoremediációra történő nemesítésre (Leple et al. 1992).
1.2.1. Fitoremediáció gshI-transzgénikus szürkenyár (Populus x canescens) klónokkal
A glutation (GSH) antioxidáns hatása hívta életre az antioxidánsokat kódoló génekkel történő transzformációs kutatásokat, amely a hosszú életidejű évelő és fás növényeknél különösen nagy jelentőségű (Creissen et al. 1996). A glutation (GSH) első leírása a növényi sejtekből De Rey-Pailhade (1888ab) kísérleteihez fűződik, aki élesztőben azonosított egy vegyületet, amely spontán reakcióba lépett elemi kénnel hidrogén-szulfidot képezve. Az új vegyületet philotion- nak nevezte el. 1921-ben Hopkins arra a következtetésre jutott, hogy ez a vegyület egy dipeptid lehetett, amely ciszteinből és glutaminsavból áll és valószínűleg -glutamil-cisztein (Hopkins, Dickinson 1922). Egy későbbi vizsgálata során 1929-ben mutatta ki az új vegyületben a glicint (Hopkins 1929), majd 1930-ban írta le a GSH ma ismert szerkezetét, és vezette be a glutation elnevezést, amely az eredeti filotion és a peptideket jelző pepton nevekből vezetett le (Simoni et al. 2002; Gullner, Kőmíves 1998). Ma már ismert, hogy a GSH a legfontosabb és a legnagyobb mennyiségben előforduló tioltartalmú antioxidáns
3 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 1. Irodalmi áttekintés vegyület a növényi szövetekben (Bittsánszky, Gyulai et al. 2006; Gyulai et al. 2005; Gullner et al. 2001). A nyárfa glutation anyagcseréjében történő stabil genetikai módosításhoz az INRA 717-1- B4 jelű Populus canescens klónok kerültek felhasználásra a szürkenyár fitoextrakciós kapacitása, valamint a szürkenyár előnyös Agrobacterium tumefaciens-el szembeni fogékonysága miatt. A transzformációk célja minden esetben a redukált glutation tartalom növelése volt (Leple et al. 1992; Rennenberg, Peuke 2005). A szürkenyár klónokat az Escherichia coli baktériumból származó γ-glutamil-cisztein szintáz (γ-ECS) enzimet kódoló génnel (gshI) transzformálták (Leple et al. 1992, 1995). Az enzim a glutation tripeptid bioszintézisének egyik fontos lépését, a glutaminsav és cisztein aminósavak peptid-kötés reakcióját katalizálja, amely lépéssel a γ-glutamilcisztein (γ-EC) dipeptid, a glutation prekurzora jön létre. A gsh1 gén cDNSe klóntárból állt rendelkezésre (Watanabe et al. 1986). A gén eredeti start-kodonját (TTG) előbb az eukariótákra jellemző ATG szekvenciára módosították. Magát a kódoló szekvenciát (1,7 kb) tartalmazó HindIII/SmaI fragmentumot a pLBR19 plazmidba klónozták, a promóter a karfiol mozaik vírus (CaMV) konstitutív 35S promótere volt, dupla felerősítő (enhancer) szekvenciával (p70) és a CaMV poli-A szekvenciájával. Ezt a CaMV-35S promóter-gsh1-poliA gén-kazettát a pBIN19 (Bevan 1984) bináris vektorba klónozták egy SstI / XbaI hasítóhelyű inszertben. Az így megkonstruált vektort építették be az Agrobacterium tumefaciens C58 pMP90 törzsébe (Koncz, Schell 1986), amellyel a végső transzformáció készült (Leple et al. 1992). Kétféle gshI-génnel transzformált klóntípust sikerült előállítani. A 11ggs klónban a transzgén fehérjeterméke a citoszolban expresszálódik (Arisi et al. 1997), a 6lgl klónban a CaMV-35S promóter és a gshI gén közé beépített borsóból klónozott RUBISCO gén kis alegységének tranzit peptid génjét építették (borsó rbcS), ezért a gshI gén terméke beszállítódik a kloroplasztiszba (Noctor et al. 1998ab). Öt transzformáns klónban sikerült a GS enzimet túltermeltetni (ggs típusok) amelyekben a bakteriális γ-ECS a citoszolban termelődött. Az öt vonalból négyben mutatott a transzgén jelentős expressziót. A levélkivonatokban a bakteriális fehérje mennyisége összefüggésben volt a transzgén expressziójával. A transzformáns vonalakban a GS (glutation szintáz) és GR (glutation reduktáz) aktivitás nem mutatott változást a kontroll vonalakhoz képest, viszont 2-4-szer nagyobb GSH tartalom volt mérhető a levelekben. A GSH tartalom növekedése együtt járt a redukált glutation (GSSG) növekedésével. A γ-EC tartalom is 5-15-szeres mértékben nőtt. A szabad aminosavak mennyiségének meghatározása azt mutatta, hogy a levelek glutaminsav-
4 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 1. Irodalmi áttekintés
és glicintartalma nincs befolyással a γ-ECS túltermeltetésére (Arisi et al. 1997; Noctor et al. 1998a). Amikor a bakteriális γ-ECS enzimet a kloroplasztiszban termeltették túl (lgl klónok) hét független stabil vonalat szekektáltak a többezer transzformációs kísérletből, amelyekből öt klón különösen nagy γ-ECS aktivitást mutatott, amely korrelált a western hibridizációban kapott sáv intenzitásokkal. Kloroplasztisz izolálás után végzett mérések megerősítették, hogy a transzgén fehérjeterméke az lgl klónokban a kloroplasztiszban, a ggs klónokban pedig a citoszolban jelenik meg. Az lgl klónokban 4-5-ször magasabb enzimaktivitás volt tapasztalható, ami a GR enzimhez hasonlóan a kloroplasztiszban való stabilabb állapottal magyarázható. Hasonlóan a ggs klónokhoz az lgl konstrukciókban is erősen nőtt a tiol tartalom. A γ-EC a levelekben még a ggs klónokénál is nagyobb mennyiségben volt jelen (a kontrollhoz képest 50-szeres mennyiségben). Ezek a transzgénikus növények bizonyították, hogy a γ-ECS túltermeltetésével a növényekben megemelhető a GSH tartalom (Noctor et al. 1998b). Korábbi konstrukciók. A kísérletek kezdeti szakaszában az E. coli baktérium GR enzim gor génjét építették be, így a transzformáns növények leveleiben a kivonható GR aktivitása 2- 10-szer nagyobb értéket mutatott a kontrollhoz képest, de ezerszeresére is növekedett, amikor a tranzit-peptid konstrukciót a kloroplasztiszba jutatták. A GR az oxidált glutation diszulfid kötésének redukcióját katalizálja. A különbség azzal volt magyarázható, hogy a bakteriális enzim stabilabb a kloroplasztiszban, mint a citoszolban. A kloroplasztiszba juttatott glutation reduktáz enzim nagyobb glutationtartalmat eredményezett, ami a citoszolban történő kifejeztetésnél nem volt tapasztalható. Azonban, ezek a transzgénikus növények kevésbé bizonyultak érzékenynek a paraquattal (Lehoczki et al. 1992; Szigeti et al. 2001) előidézett oxidatív stresszben (Foyer et al. 1995, 2005). Egy későbbi munka során a glutation bioszintézis utolsó lépését katalizáló GS enzim gsh2 génjével transzformálták a nyárfa klónokat. A transzformánsokban az enzim a citoszolban halmozódott fel. A kivonható GS aktivitás egyes klónokban 300-szorosára növekedett a kontrollhoz képest. Az óriási aktivitásnövekedés ellenére a tiol tartalom a levelekben nem változott. A transzformáns levelekből vágott korongok akkor halmoztak fel több glutationt, ha az exogén γ-EC-t adagoltak hozzájuk (Strohm et al. 1995, 2002). A GS enzimet a kloroplasztban is túltermeltették. Ezekben a növényekben a kivonható GS aktivitása akár 500- szorosára is megnőtt, viszont a GSH mennyiség ebben a konstrukcióban sem változott szignifikánsan (Noctor et al. 1998ab).
5 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 1. Irodalmi áttekintés
1.2.2. Transz/gén reaktíváció DHAC-indukált DNS-demetilációval
A legstabilabb transz/gén konstrukciók is ki vannak téve a gén-csendesítés (gene silencing) hatásának, amely elsősorban a DNS metilációján keresztül megy végbe a DNS metiltranszferáz enzim (CMT) katalízisével (Wolfe, Matzke 1999). A DNS citozin nukleotidjának metilációja 5-metilcitozinná (5-mC) egyben a növények természetes molekuláris védekezési mechanizmusa (Selker, Steves 1985; Linn et. al. 1990; Yoder, Bestor 1996; Bittsánszky, Gyulai et al. 2007). A CMT-inhibitor kezelésnek kitett növényekben a metilációs szint csökken, új metilációs mintázat, valamint elhallgattatott gének reaktivációja megy végbe. Vizsgálatainkban ezért a transz/gén reaktivációban hatékonynak bizonyult, DNS metiltranszferáz (CMT) enzim gátlásán keresztül ható DHAC (5,6-dihidro-5'-azacitidin hidroklorid) (Elmayan, Vaucheret 1996; Finnegan et al. 1998; Castilho et al. 1999; Sheikhnejad et al. 1999; Cao et al. 2000) indukciót alkalmaztuk a 11ggs és 6lgl gshI-transzgénikus nyárfaklónokban, valamint a nem- transzformáns klónban. A gshI gén (és a kapcsolódó endogén nyárfagének: gsh1, gst gének) aktivitásának mérésére reverz transzkripciós kvantitatív PCR-t (qRT-PCR) alkalmaztunk. A DHAC-indukált gsh1 gén reaktíváció végső célja egy alternatív lehetőség kidolgozása volt a transzgénikus gshI nyárfaklónok kiváltására (Bittsánszky, Gyulai et al. 2007; Gyulai 2007).
1.2.3. Új mikorszatellita klóntípusok szelekciója feketenyárban (Populus nigra)
A feketenyár (Populus nigra) hazánk őshonos fafaja. Elsősorban a folyók mentén, ártereken, időszakos vízborítottságú réti-, illetve lápi talajok, valamint tápanyagban gazdagabb homok- és vályogtalajokon díszlik legjobban. A génmegőrzési programok kiemelt faja, mert Magyarországon a fekete nyárat nagymértékű genetikai szennyezés, az átporzásos klónok felszaporodása (ld. a későn fakadó nyárt Populus x euramericana, amely a feketenyár - termős- és az amerikai (Populus deltoides) -beporzó- természetes hibridje, amely a 18. század közepe táján jöhetett létre). Ez tette szükségessé a tiszta vonalú feketenyár-egyedek felkutatását, összegyűjtését és szintetikus állományokban való elhelyezését (Kevey 1999; Bordács et al. 2002; Mátyás 2006). A legelfogadottabb rendszertani besorolás szerint (Eckenwalder 1996) a Populus nemzetség 29 faja 6 szekcióra különül: Abaso, Aigeiros, Leucoides, Populus, Tacamahaca, Turanga. Ezek a morfológiai szekciók azonban folyamatosan módosulnak az újabb molekuláris genetikai eredmények nyomán, pl. a
6 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 1. Irodalmi áttekintés feketenyár az Aigeiros szekció tagja, de hibridizációs hajlama közel áll a Tacamahaca fajaihoz. A P. nigra cpDNA RFLP elemzésben a Populus szekció fajaihoz mutatja a legközelebbi rokonságot, azonban a sejtmagi RFLP mintázata szerint a Populus szekció fajaihoz áll közelebb, amely eredmény feltételezi, hogy P. nigra már egy ősi hibrid faj, amely egy hálózatos evolúción keresztül alakult ki (Smith, Sytsma 1990). A Populus fajok legújabb kloroplaszt-genom alapú rendszerében három csoport különül el: (1) P. simonii, P. maximowiczii, P. laurifolia, P. songarica; (2) P. grandidentata, P. alba, P. davidiana, P. tremula, P. tremuloides, és P. nigra; és a (3) P. angustifolia, P. cathayana, P. trichocarpa P. balsamifera, P. szechuanica, P. tristis, P. fremontii, P. roegneriana, P. angulata, P. deltoides, P. sargentii fajokkal (Hamzeh, Dayanandan 2004). A kutatások célja új mikroszatellita genotípusú (Dayanandan et al. 1998; Cervera et al. 2001; Kiss J et al. 2001) feketenyár klónok molekuláris azonosítása volt fitoremediációs alkalmazásra.
1.3. Régészeti genetika alkalmazási területei a biotechnológiában
A természettudományok egyik legújabb területe az archeogenetika, a PCR-eljárás (1983) felfedezésének (1993-as kémiai Nobel díj, KB Mullis) eredményeként (Saiki et al. 1985, 1988; Mullis et al. 1986; Mullis, Faloona 1987) alig két évtizedes múltra tekint vissza, éppen a PCR-módszert kifejlesztő Cetus (USA) vállalat laboratóriumában megszületett első (quagga-ló) ősDNS viszgálati eredményekkel kezdödően (Higuchi et al. 1984). Az európai iskola (Svéd) az egyiptomi múmia kutatásokkal (Pääbo 1985), illetve (B. Sykes laborja, Anglia) az első sikeres csontból történő DNS kivonással (Hagelberg et al. 1989, 1994; Sykes 1991, 2001, 2003) kezdődött. A magyar iskola napjainkban indult részben humán (Kalmár et al. 2000; Fletcher et al. 2003; Bogacsi-Szabó et al. 2005; Haak et al. 2005; Mende 2006), részben növényi archeogenetikai kutatásokkal (Lágler, Gyulai et al. 2005, 2006, 2007; Szabó, Gyulai et al. 2005ab, 2006, 2007; Gyulai et al. 2006). A régészet a 80-as évek közepéig úgy gondolta, hogy csak a biokémiailag stabilabb molekulák, mint pl. a lignin állhat ellent az élőlény pusztulását követő lebomló mumifikációs és fosszilizációs folyamatoknak, míg a DNS, teljes pusztulásuk miatt nem vizsgálható (Briggs et al. 2000; Chalfoun, Tuross 1999). 1984 óta igazolódott (Higuchi et al. 1984), hogy a DNS-t az idő múlásával a különböző nukleázok ugyan bontják, azonban szerencsés körülmények, mint az alacsony hőmérséklet, gyors kiszáradás, magas sókoncentráció, illetve száraz mumifikáció mellett kevésbé degradálódik (Poinar et al. 1996, 1998; Willerslev et al. 2003,
7 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 1. Irodalmi áttekintés
2004; Pääbo 1989, 2000), hasonlóan a jól tárolt múzeumi gyűjteményekhez (Higuchi et al. 1984; Suarez, Tsutsui 2004; Cooper, Wayne 1998; Brown, 1999; Cooper, Poinar 2000; Hofreiter et al. 2001a; Gugerli et al. 2005). A növekvő számú ősDNS-sel végzett kutatások, számos nem helytálló megállapítást is eredményeztek (Hummel 2003; Pääbo et al. 1989, 2004; Spencer, Howe 2004). Az egykor nagy visszhangot kapott, kövületekben (Yang 1997; Bada et al. 1999) több millió (17-20 millió) évig fennmaradó DNS (Golenberg et al. 1990; Soltis et al. 1992), illetve a dinoszaurusz csontokból (Woodward et al. 1994; Zischler et al. 1995ab) kinyert szövetek, és ősDNS elemzések utólag laboratóriumi fertőzéseknek bizonyultak (Gutierrez, Martin 1998; Cano et al. 1992, 1993; Cano, Borucki 1995; Vreeland et al. 2000), elsősorban mai humán és mikrobiális eredetű labor szennyeződések miatt, illetve a kontroll laborokban történő megismételhetetlen kísérlet miatt (Longo et al. 1990; Sidow et al. 1991; Austin et al. 1997; Pruvost, Geigl (2004). Az eddigi tapasztalatok alapján 1 millió év az az idő, ameddig intakt DNS szakaszok optimális régészeti körülmények között, fennmaradhat (Lindahl 1993; Wayne et al. 1999; Hofreiter et al. 2001; Ho et al. 2007). A több millió éves baktériális eredetű DNS (Cano, Borucki 1995), sőt életre kelthető baktériumok izolálása 3 millió éves leletekből (Shi et al. 1997), illetve 250 millió éves rétegekből (Vreeland et al. 2000; Fish et al. 2002) már nagyon vitatott területe az archeogenetikának. A Miocén (Pääbo, Wilson 1991; Kim et al. 2004) korból (20 millió éve) származó borostyánba (kövült fenyőgyanta) zárt dipterákból (Austin et al. 1997), zsizsikből (Cano et al. 1992, 1993), és rovargyomorból (Cano, Borucki 1995), illetve sókristályból (Vreeland et al. 2000; Fish et al. 2002) származó baktériális DNS eredmények is kérdésesek. A lebomló ősDNS molekula töredékeinek kimutatása talán lehetséges, ahogy ez napjainkban látszik igazoltnak 55 millió (alsó Eocén) éves kövületek (Yakutföld, Szibéria) levél és termés lenyomataiból (Myrtceae: Paramyrtacicarpus plurilocularis és Paramyrtaciphyllum agapovii) a lebomló deoxiribóz (Fuchsin festés) és kettős szálú DNS töredék molekulákba interkalálódó (Hoechst 33258) festékek alkalmazásával (Ozerov et al. 2006).
1.3.1. ősDNS leletek az állatvilágból
A humán illetve állati régészeti genetika megszületése a kezdeti mamutleletekhez (nem közölt eredmények), illetve kihalt quagga lófajta (átmenet a zebrák felé) (Equus quagga) 140 éves múzeumi példányának bőrmintájából kivont ősDNS vizsgálatával kezdődött (Higuchi et al. 1984). Ezt követte az 5.600 éves (i.e.2.600-ból) egyiptomi mumiák DNS elemzései (ménem
8 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 1. Irodalmi áttekintés
PCR módszer alkalmazásával (Pääbo 1985). Az utolsó jégkorszak jégbe fagyott állat mintáinak (10-40.000 éves) DNS elemzése napjainkban is folyik, különös tekintettel a mamut és mastodon (amerikai mamut) kutatásokkal (Binladen et al. 2007; Gilbert et al. 2007; Debruyne, Barriel 2006; Bottjer et al. 2006; Krause et al. 2006; Debruyne et al. 2003, 2006; Gibbons 2005; Greenwood et al. 1999, 2001; Noro et al. 1998; Hagelberg et al. 1994; Hoss et al. 1994). Mára már 28 millió bp ősDNS szekvenciája ismert a szibériai gyapjas mamut leletekből és DNS szennyezéseiből (Mammuthus primigenius) (Poinar et al. 2006). A szekvenciákból 13 millió bp volt mamut-eredetű, amely eredmény egy igen jelentős, 43%-os kihozatalt mutatott. A mamut szekvenciákat összehasonlítva az afrikai elefánt szekvenciákkal (Loxodonta africana) megbecsülhető volt a két faj evolúciós szétválásának ideje, amely 5-6 millió évvel ezelőtt történhetett (Poinar et al. 2006). A kiterjedt mamut kutatások segítségével elérhetővé válhat a teljes mamut genom szekvenálása (Gilbert et al. 2007; Weber et al. 2007; Noguchi et al. 2006; Rompler et al. 2006), elsősorban a legújabb technikának, az emulziós PCR-nek (Margulies et al. 2006) és piroszekvenálásnak (Ronaghi et al. 1996, 1998; Gowda et al. 2006) köszönhetően. Ez a módszer nem az időigényes gélelektroforézist alkalmazza, a folyamat a DNS polimeráz aktivitását detektálja ELIDA módszerrel (enzimatikus luminometriás pirofoszfát beépülés követésével - enzymatic luminometric inorganic pyrophosphate) úgy, hogy a DNS szintézise során, a nukleotid beépülésekor felszabaduló pirofoszfát molekulát (PPi) ATP-vé konvertáló ATP-szulfuriláz enzim aktivitását méri. A detektálás luziferáz (szentjános bogár enzime) módszerrel (foton detektálás) történik. A módszer zajszintjét a minimumra lehetett csökkenteni a dATP helyett történő tiofoszfát dATPαS (deoxyadenosine α-thiotriphosphate; syn. 5’adenozin foszfoszulfát - APS) alkalmazásával, amelyet a DNS polimeráz nem érzékel, viszont a luciferáz enzimmel kevésbé lép keresztreakcióba (Ronaghi 1996, 1998). Az archaeogenetikai munkák másik kiemelt területe az emberi leletek (Pääbo 1999; Pääbo et al. 1988, 1990; Alonso et al. 2003; Cooper et al. 2001ab; 2004; Jahren et al. 2004; Malmstrom et al. 2007), illetve egyiptomi múmiák (a legrégebbi az i.e. 3300-ból) ősDNS kutatása (Pääbo 1985), és az emberi evolúció megfejtése (Handt et al. 1994; Brombacher 1997; Noonan et al. 2006). A legrégebbi (9.000 éves) mumifikálódott emberi lelet az angliai Cheddar városából (sajtjáról is híres) került elő (Sykes 2001, 2003) (1.1. táblázat). Ehhez a területhez kötődik napjaink híres hazai eredménye a 2-300-éves ’Váci múmiák’ vizsgálata is (Nagy Károly, SOTE, Budapest kísérletei; Fletcher et al. 2003). Sok érdekes eredmény vár,
9 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 1. Irodalmi áttekintés azonban megerősítésre, mint pl. az ausztrál ’Mungo Man’ leletek ősDNS igazolása (Adcock et al. 2001). 1.1. táblázat. Humán archeogenetikai leletek kora, valamint A kihalt állatok múzeumi mtDNS típusa (Handt et al. 1994; Sykes 1991, 2001, 2003; Fletcher et al. 2003). *jégbe fagyott testek; ** 1918-ból (I. maradványaival végzett vizsgálatok Világháború) száma, a PCR technikának név helyszín kór (év) mtDNS köszönhetően, mára eléri a százat Cheddar-i ember Anglia 9,000 U5a (Kuch et al. 2002; Ho et al. 2007). A Ötzi a jégember* Olaszo. 5.300 K múlt század elején a Mohave Ahmose I fáraó Egyiptom 3.550 ? Seknet-re fáraó Egyiptom 3.550 ? sivatagból begyűjtött Thutmose I fáraó Egyiptom 3.500 ? kengurupatkány mintákból már Amenhotep I fáraó Egyiptom 3.500 ? populációs vizsgálatok is Juanita a perui lány* Peru 500 A készülhettek (Thomas et al. 1990). A Váci múmiák Magyarország 300 ? Oszt.-Magyar katona* Olaszország 87** ? mitokondriális DNS szekvenciákat vizsgálva, bebizonyosodott, hogy a kihalt hawaii endemikus lúd populációk a kanadai lúd leszármazási ágába tartoztak (Paxinos et al. 2002). A 20. század elején kihalt erszényes farkasból izolált ősDNS, és a világ más tájairól származó erszényes ragadozók mtDNS-ének (cytokrom b gén) vizsgálatával sikerült bizonyítani, hogy a kihalt tasmániai farkas közelebb állt az evolúciós fejlődésben a többi ausztáliai erszényeshez, mint a dél-amerikai ragadozó erszényesekhez (Thomas et al. 1989; Krajewski et al. 1992). Az eredmények tovább erősítették a teóriát, hogy a két kontinensen az erszényes ragadozók fejlődése, és morfológiai tulajdonság kialakulása párhuzamos módon ment végbe (Krajewski et al. 1997). A jelenkori és különböző archaeológiai (svéd és alaszkai 28,000 éves leletek) vadló leleteken végzett kísérletek igazolták a fajon belüli nagyfokú mtDNS variabilitást (Vila et al. 2001). A vadlovakon kívül szarvasmarha (Troy et al. 2001), kutya (Vila et al. 1997; Savolainen et al. 2002), disznó (Watanobe et al. 2002), nyúl (Hardy et al. 1995) őseire, és háziasítás során végbement DNS változásokra lehetett következtetni. További eredmények születtek ürgén (Hadly et al. 1998), vidrán (Pertoldi et al. 2001), földi lajhár (Hoss et al. 1996; Hofreiter et al. 2000, 2003), barlangi oroszlán (Burger et al. 2000; 2004), barlangi medve és jégkorszaki barna medve (Leonard et al. 2000) leleteinek elemzésében. Az organellumgenetika (kloroplasztisz, mitokondrium) első eredményei 2001-ben születtek, amikor a 400 éve kihalt futómadár (moa) teljes mitokondriális DNS állományának (16.500 nt) bázispársorrendjét határozták meg (Cooper et al. 1992, 2001a). A hosszú-PCR (long range PCR) (Cheng et al. 1994) technikával elkészített mitokondriális térkép lehetőséget adott evolúciós fejlődési utak felvázolásához, igazolva ezzel a nagy termetű moa
10 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 1. Irodalmi áttekintés madarak eredetét, és azt, hogy Új-Zélandot ez a faj kétszer kolonizálta (Bunce et al. 2001; 2003). A mamut mitokondriális szekvencia elemzése is a végéhez közeledik, japán és orosz kutatók együttműködésével (Binladen et al. 2007; Gilbert et al. 2007; Debruyne, Barriel 2006). Ősi ürülék (14.000 éves) mintákból is lehetőség nyílt az elfogyasztott táplálék DNS maradványainak kivonására (Kohn és Wayne 1997; Poinar et al. 1998, 2003), amelyből következtetni lehet a kihalt állat táplálkozására (Constable et al. 1995; Poinar et al. 2001). Az 5.300 éve jégbe fagyott ember (Ötzi) béltartalom maradványából következtetni lehetett ’utolsó vacsorájára’, amely növényi (Poaceae) és állati eredetű DNS-t egyaránt tartalmazott (Ferris et al. 1993; Rollo et al. 2002). A radikarbon kormeghatározással igazolt, alig 157 bp nagyságú DNS szakaszt, a kloroplaszt ribulózbifoszfát-karboxiláz (rbcL) gén nagy alegységének fragmentumát sikerült amplifikálni a lajhár (Nothrotheriops shastensis) ürülékéből, és összehasonlítani a GenBank-ból származó szekvenciákkal, valamint a környezetben található növényzet hasonló amplifikátumaival (Hofreiter et al. 2000, 2001b).
1.3.2. ősDNS leletek a növényvilágból
A növényi régészeti genetika legkutatottabb területe a termesztett növények domesztikációjának (Harlan 1971; Chang 1986; Brown 1999; Zohary, Hopf 2000; Blatter et al. 2002) és evolúciójának (Jaenicke-Deprés et al. 2003; Allaby et al. 1999), valamint a mezőgazdaság kialakulásának és elterjedésének a nyomon követése (Keng 1974; Ho 1977; Walters 1989; Freitas et al. 2003) elsősorban magmaradványok ősDNS mintáinak elemzésével. A régészeti kormeghatározás szerint, a mezőgazdálkodás eredete az utolsó jégkorszak végétől (i.e. 11.000 év) származtatható, amikor a halászó-vadászó törzsek, később a pásztornépek megkezdhették a növénytermesztést először talán a Termékeny Félhold (Mezopotámia, Asszíria, Főnicia és Egyiptom) területén (Keimer 1924; Kroll 1992, 1999 2000). Ennek az időszámításnak ellentmondanak a legújabb növényi magleletek, mint pl. a Jordán folyó északi völgyének (Ohalo II) 20.000 éves vadárpa (H. spontaneum) és búza (Triticum dicoccoides) leletei (Nadel et al. 2004, 2006; Piperno et al. 2004), a 15.000 éve Dél-Kóreai rizs lelet, melyből sikeres DNS izolálást is jelentettek (Chungbuk National University, South Korea), valamint a vietnami Hoabinh-i vadászó-halászó kultúrának a mai Thaiföldig kiterjedő számtalan növénylelete (ld. a Lélek-barlangi ásatások, Spirit Cave), amelyek az i.e. 9.000 – 5.500 évekig követhető nyomon (Flannery 1973; Gorman 1969, 1970,
11 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 1. Irodalmi áttekintés
1971; Matthews 1964, 1966; Moser 2001; Phukhachon 1988; Shoocongdej 2000; Solheim 1972; Van Tan 1994; 1977; White és Gorman 2004). Néhány magmaradvány esetében sikeres csírázást is közöltek, mint pl. a 10.000 éves ’sarki csillagfürt’ (Lupinis arcticus) esetében (Porsild et al. 1967), amely eredmény kétséges, hasonlóan a 1.300 éves indiai lótusz magok csírázási kísérletekhez (Shen-Miller 2002). A nagy eredménynek tartott egyiptomi 1-2.000 éves ősi búzaleletek (kamut búza) csírázása (Quinn 1999) sem igazolható (talán a T. turgidum nagy kalászú tájfajtája keveredhetett a leletek közé). Valószínű, hogy csak a sokkal fiatalabb csírázási eredmények a hitelesek, mint a 127 éves hexaploid magyar búzaszemek (Székesfehérvári – Stuhlweissenburger) (Triticum vulgare var. erythrospermum Körn.) újra csírázása, a magok 1877-ben Bécsben folyó ásatásokból kerültek elő (Ruckenbauer 1971), valamint a Nürnbergi színház építésénél feltárt 172 éves árpa, (Hordeum) és zab (Avena) csírázási kísérletek (Aufhammer és Fischbeck 1964). A talaj különböző mélységeiből (sztratifikált) feltárt növénymagvak ősDNS elemzése számos virágos növényfaj (McGraw 1993; Morris et al. 2002) és páfrány (Schneller et al. 1998) mikroevolúciós fejlődését tárta fel. A sztratifikáció különleges esete a szibériai állandóan fagyott (permafrost) talajrétegekből feltárt magok (10,000-400,000 éves minták!) DNS állományának elemzése (Abbott, Brochmann 2003). Az utolsó jégkorszak botanikai elemzése (Taberlet, Cheddadi 2002; Brewer et al. 2002; Litt et al. 2003; Stehlik 2003) már 19 különböző növényi taxonból (Poales, Liliales, Ericales, Malvales, Brassicales, Fagales, Fabales, Rosales) volt eredményes (Petit et al. 2003; Willerslev et al. 2003). Egy tengeri moszat (Posidonia oceanica) 4.000 éves (Raniello, Parducci 2002) és a japán cédrus (Cryptomeria japonica) 3.600 éves (Tani et al. 2003) maradványaiból is sikeres volt az ősDNS izolálás és szekvencia elemzés. A növényi ősDNS azonosításában nagy előrelépést jelentett a konzervatív kloroplasztisz DNS (cpDNS) fajspecifikus régióinak (Petit et al. 2002, 2005), különösen az rbcL, rbcS (Chase et al. 1993) és trnL-F (Taberlet et al. 1991, 1996) szakaszainak megbízható kimutatása. A hazai növényi archeogenetika jelentős eredményei az 1.600 éves- (Gyulai et al. 2001, 2006), illetve 600 éves köles (Panicum miliaceum) (Lágler, Gyulai et al. 2005, 2006, 2007; Lágler 2007) és szőlő (Bisztray et al. 2004), valamint a 600 éves sárgadinnye (Cucumis melo) (Szabó, Gyulai et al. 2005ab, 2007; Szabó 2006) és görögdinnye (Citrullus lanatus) (Tóth, Gyulai et al. 2007) magokból izolált DNS vizsgálatok és fajtarekonstrukciós munkák (Gyulai 2010, 2011; Gyulai et al. 2008; 2011a,b,c,d,e,f).
12 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek
2. Anyagok és Módszerek 2.1. In vitro klónozás és szelekció, biotechnológiai növénynemesítés
2.1.1. Sejt eredetű klónok előállítása: A szövettenyészeti klónszelekció során steril mag eredetű embriógén kallusz tenyészeteket indítottunk sziki mézpázsitban (Puccinellia limosa) (Jekkel, Gyulai, Heszky 1995); tarackbúzában (Agropyron repens) (Gyulai et al. 1995abc; Tárczy, Gyulai et al, 1996a,b; Mázik-Tőkei, Lelley, Gyulai et al. 1997; Janowszky, Gulai et al. 1998; Mester, Gyulai et al 1998); és zöld pántlikafűben (Phalaris arundinacea) (Gyulai et al. 2003ab); szójában (Glycine soya) (Gyulai et al. 1993abc) és vadgesztenyében (Aesculus hippocastanum) (Jekkel, Gyulai et al. 1998). A tenyészeteket MS (Murashige, Skoog 1962), valamint F6 (Gyulai et al. 1992) táptalajon indukáltuk 28 napi inkubációval növényi hormonok alkalmazásával (Gyulai et al. 1995abc).
2.1.2. Pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálatok: A morfologiai elemzéshez a mintákat glutaraldehidben fixáltuk (5% w/v foszfát pufferben 0.7 M oldva, pH 7.2), aceton koncentració sorban (10-50-70-90-100%) deszikkáltuk, CO2-kririkus ponton szárítottuk, aranygőzzel (30 nm) fedtük (Blazers CDC 020), majd TESLA BS-300 szkenningg elektron mikroszkoppal végeztük az elemzést (Gyulai et al. 1993).
2.2. Növényi fitoremediáció 2.2.1. A gshI-transzgénikus szürkenyár klónok molekularis stabilitása
A gshI transzgénikus szürkenyár klónok (Populus × canescens): A két gshI-transzformáns klónt a 6lgl (Noctor et al. 1998), és 11ggs (Arisi et al. 1997), valamint a nem-transzformáns
6lgl 11ggs Kontr
2.1.a. ábra. A gshI-transzgénikus szürkenyár (Populus x canescens) (6lgl, 11ggs) és a nem- transzformált klónok zárt laboratoriumi 2.1.b. ábra. Dihaploid feketenyár (Populus nigra) klónok (Kiss J et körülmények között nevelve (Arisi et al. 1997). al. 2001) egyéves ültetvénye (Gödöllő 2006)
13 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek kontroll klónt (X) in vitro hajtástenyészetben WPM (Woody Plant Medium) táptalajon (Lloyd, McCown 1980) szaporítottuk fel, majd tőzeges talajban természetes fényen neveltük (2.1. ábra).
A gshI transzgén stabilitásának kimutatása: A transzformált szürkenyár klónokba bevitt E. coli gshI transzgén (# X03954) valamint a konstrukcióban szereplő karfiolmozaik vírus 35S promótere, és a 6Lgl klónba beépített borsó (Pisum sativum) RUBISCO kis alegységének tranzitpeptidje (borsó rbcS, NCBI M25614) jelenlétének bizonyítására az alábbi primer- párokat terveztük és alkalmaztuk. A PCR reakcióhoz totál DNS-t izoláltunk (ld. alább). A kísérletekhez egyedeket vizsgáltunk, klónonként öt ismétlésben. A következő primereket használtuk többféle kombinációban:
- 35S a: 5’-gct cct aca aat gcc atc a-3’ (a CaMV 35S promóter 154-172 bp szakaszán) - gsh1 a: 5’-atc ccg gac gta tca cag g-3’ (a gsh1 gén 341-359 bp szakaszán) - gsh1 b: 5’-gat gca cca aac aga taa gg-3’ (a gsh1 gén 939-920 bp szakaszán) - rbcS a: 5’-cag aag tga gaa aaa tgg ct-3’ (a borsó rbcS gén 18-37 bp szakaszán) - rbcS b: 5’-cat gca ctt tac tct tcc ac-3’ (a borsó rbcS gén 186-205 bp szakaszán)
A primereket a szekvenciaadatokból Primer3 programmal (Rozen, Skaletsky 1997) terveztük. A reakciókat Perkin Elmer 9700 Thermocycler készülékben végeztük. A reakcióelegy
összetétele 25 μl végtérfogatban: 1 puffer (West Team); 1 μM MgCl2; 1,2 mM dNTP; 1 egység Taq polimeráz (West Team), 1-1 μM forward-reverse primer, 50-100 ng templát DNS (Gyulai et al. 2005).
A gshI transzgén expressziójának kimutatása: A szürkenyár klónokba épített transzgén expressziójának bizonyítására végzett qRT-PCR reakcióhoz a klónokból (11ggs, 6Lgl és a kontroll) totál RNS-t izoláltunk, abból cDNS-t készítettünk (Fermentas #K1622). A kísérletekhez egyedeket vizsgáltunk, klónonként három ismétlésben. A cDNS-t templátként használva PCR reakciókat indítottunk a gsh1ab primerpárral (Bittsánszky, Gyulai et al. 2006):
- gsh1 a: 5’-atc ccg gac gta tca cag g-3’ (a gsh1 gén 341-359 bp pozíciójában) - gsh1 b: 5’-gat gca cca aac aga taa gg-3’ (a gsh1 gén 939-920 bp pozíciójában)
A reakcióelegy összetétele 16 μl végtérfogatban a következő volt: 1 AmpliTaq Gold PCR Master Mix (Applied Biosystems); 0,625 – 0,625 μM forward-reverse primer; 3 μl cDNS. A reakciótermékek elválasztását horizontális agaróz gélen (1,5%) végeztük és etidium-bromidos festés után elemeztük (Gyulai 2007; Bittsánszky, Gyulai et al. 2006).
14 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek
Klónstabilitás meghatározása fAFLP módszerrel: A szürkenyár klónokból (11ggs, 6Lgl, kontroll) totál DNS-t izoláltunk, a DNS mintákból klónonként 10-10 egyedből bulk-ot hoztunk létre (Michelmore 2.1. táblázat. Az fAFLP vizsgálatokban alkalmazott restrikciós enzimek et al. 1991). A klónok (ritkán hasító EcoRI és gyakran hasító MseI), adapterek, a nem szelektív és a 12 aktív szelektív primer pár (a) – (l) szekvencia adatai (Gyulai et al. 2005) stabilitását fAFLP EcoRI MseI Restrikciós helyek
(fluorescent amplified DNA ▼ ▼ 5’-……gaattc……-3’ 5’-……ttaa….-3’ 3’-……cttaag……-5’ 3’-….aatt….-5’ fragment length ▲ ▲ polymorphism) eljárással Adapter szekvenciák 5’-ctc gta gac tgc gta cc 5’-gacg atg agt cct gag vizsgáltuk Vos et al. (1995) 3’-cat ctg acg cat ggt taa-5’ 3’-tac tca gga ctc AT-5’ Nem szelektív primer-pár módszere alapján EcoA: MseC: 5’-gac tgc gta cca attc-a 5’-gat gag tcc tga gtaa-c módosításokkal (Cresswell Szelektív primer-párok (a) 5’-gac tgc gta cca attc-aat et al. 2001; Skot et al. (b) 5’-gac tgc gta cca attc-acc 5’-gat gag tcc tga gtaa-cac (c) 5’-gac tgc gta cca attc-agt 2002; Gyulai et al. 2005) a (d) 5’-gat gag tcc tga gtaa-caa (e) 5’-gat gag tcc tga gtaa-cag DNS mintákból létrehozott (f) 5’-gat gag tcc tga gtaa-cat
(g) 5’-gat gag tcc tga gtaa-ccc 5’-gac tgc gta cca attc-agt bulk-okon. Az emésztéshez (h) 5’-gat gag tcc tga gtaa-cct (i) 5’-gat gag tcc tga gtaa-cga és ligáláshoz az EcoRI- (j) 5’-gat gag tcc tga gtaa-cgc (k) 5’-gat gag tcc tga gtaa-cta MseI restrikciós (l). 5’-gat gag tcc tga gtaa-ctc endonukleázokat használtuk (2.1. táblázat). Az első PCR reakciót a nem szelektív primerekkel (3/4. táblázat) 30 ciklusban végeztük a következő ciklusidőkkel: 94ºC 30 s, 56ºC 30 s, 72ºC 1 perc. A terméket 0,1× TE-vel 5 hígításban templátként használtuk a szelektív PCR reakcióhoz. A szelektív amplifikációhoz 24 primer-kombinációt használtunk JOE fluoreszcens festékkel jelölt *Eco primerekkel. Az első tizenkét primer kombinációban az Mse-CAC primert párosítottuk a jelölt *Eco -aaa, -aac, -aag, -aat, -aca, -acc, -agg, -act, -aga, - agc, -agg, -agt primerekkel. A második tizenkettő kombinációban a jelölt *Eco-AGT primert párosítottuk az Mse -caa, -cag, -cat, -cca, -ccc, -ccg, -cct, -cga, -cgc, -cgg, -cgt, -cta primerekkel. Hot Start PCR-rel kombinált touchdown PCR reakciót alkalmaztunk a minták felszaporítására (Don et al. 1991; Erlich et al. 1991). A reakcióelegy végtérfogata 10 μl amely tartalmazott 1 AmpliTaq Gold PCR Master Mix-et, 20 pmolt mindkét primerből, valamint 50 ng DNS templátot. A touchdown PCR-t PE 9700 Thermocycler készülékben (Applied Biosystem) következők szerint végeztük: 12 cikluson keresztül a 30 s hosszú kapcsolódási hőmérsékletet (Tm) egyenletesen 66ºC- ról 56ºC-ra csökkentettük. További 25 ciklust 56ºC kapcsolódási hőmérséklettel végeztünk majd az utolsó ciklus: 60ºC -on 45 s-ig tartott. Az AFLP termékeket 5 percig 98ºC-on denaturáltuk és 30 percig 60ºC-on tartottuk vagy
15 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek közvetlenül ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) készülékkel fragment analízist végeztünk. Az eredményeket ABI PRISM Genotyper 3.7 NT szoftverrel dolgoztuk föl. A köles elemzésénél (ld. régészeti genetika) is ezeket az AFLP lépéseket alkalmaztuk (Gyulai et al. 2006).
Nehézfém-stressz in vitro: A Zn-terhelési kísérleteket aszeptikus körülmények között levélkorong-tenyészetekkel végeztük ZnSO4 oldat felhasználásával. Hormonokkal kiegészített
(1 mg/l BA; 0,2 mg/l NAA) hajtásregeneráló WPM táptalajhoz ZnSO4 oldatot különböző koncentrációkban adagoltuk 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1 M koncentrációban, a cink-mentes kontroll mellett. Steril nyárfa hajtások fiatal leveleiből 8 mm átmérőjű levélkorongokat vágtunk melyeket színükkel felfelé a táptalajra helyeztünk, kezelésenként 21-et (Gyulai et al. 1995a). A tenyészeteket 21 napig inkubáltuk 22±2°C -on 8 h sötét / 16 h fény (40 µEm2s-1) fotoperiódusban.
Paraquat-stressz in vitro: Hormonokkal kiegészített (1 mg/l BA; 0,2 mg/l NAA) WPM táptalajhoz paraquatot (metil- viologén, Sigma) adagoltunk: 410-3 M; 410-4 M; 410-5 M; 410-6 M; 410-7 M; 410-8 M; 410-9 M; 410-10 M koncentrációban, a paraquat nélküli kontroll mellett. A sterilre szűrt paraquat oldatot az autoklávozott táptalajhoz 2.2. ábra. Példa az in vitro levélkorongkezelések kísérleti elrendezésére. Paraquat-tűrésre történő szelekció a gshI- szilárdulás előtt adagoltuk. A transzgénikus (11ggs, 6lgl) és kontroll nyárfaklónokban (P. -7 táptalajok szacharóz tartalma canescens) (1) (0,0 M paraquat), (2) (4x10 M paraquat), (3) (4x10-6 M paraquat); (A): 1 % szacharóz, 16 h fény / 8 h sötét 0,2%, 1%, ill. 2% volt. Az fotoperiódus; (B): 2 % szacharóz, 16 h fény / 8 h sötét fotoperiódus; (C): 1 % szacharóz, 24 h sötét; (D): 2 % szacharóz, 24 h sötét inkubació (Gyulai et al. 1995a; Bittsánszky 2006).
16 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek elkészített, agarral szilárdított táptalajokat petri csészékbe öntöttük. Steril nyárfa hajtások fiatal leveleiből vágott levélkorongokat helyeztünk rájuk színükkel felfelé (2.2. ábra), kezelésenként 15-öt (Gyulai et al. 1995a). A tenyészeteket 22±2°C -on, 24 h sötét ill. 16 h fény (40 µEm2s-1) / 8 h sötét fotoperiódusú fényszobában 8 napon keresztül inkubáltuk.
DNS metiláció gátlása DHAC-kezeléssel: A steril növények leveleiből 9 mm átmérőjű levélkorongokat vágtunk (Bittsánszky, Gyulai et al. 2006; Gyulai et al. 2005), majd DHAC-t (5,6-dihidro-5'-azacitidin hidroklorid) tartalmazó (10-4 M) táptalajra helyeztük (Gyulai et al. 1995a, 2005; Gullner, Gyulai et al. 2005), és inkubáltuk 7 napig, 16h/8h világos/sötét (40 μEm2s-1) megvilágítás mellett (Bittsánszky, Gyulai et al. 2005ab).
2.2.2. Új mikroszatellita klóntípusok szelekciója feketenyárban (Populus nigra): A feketenyár klónok (Populus nigra) mikroszatellita elemzéséhez portok eredetű, szabadföldön nevelt feketenyár (P. nigra) növényeket (Kiss et al. 2001) alkalmaztunk, összesen 35 klónt, melyek közül 29 (1-29 klónok) az N-SL klónról származott (30. anyatő); 6 klón pedig (31-36) az N- 309 (37.) klón utódai voltak (Gyulai et al. 2005; Bittsánszky, Gyulai et al. 2005ab; 2006; Bittsnászky 2006; Gullner, Gyulai et al. 2005). A mikroszatellita polimorfizmus vizsgálatához cy5-jelölt (Röder et al. 1998; Huang et al. 2002) SSR primer párokat (2.2. táblázat) alkalmaztunk (2.1. ábra). A fragmentum elemzést ALF eljárással (ld. alább) végeztük.
2.2. táblázat. A feketenyár (P. nigra) mikroszatellita elemzéséhez alkalmazott SSR primerek szekvencia adatai az ismétlődő szekvencia motívumokkal, irodalmi hivatkozással és NCBI hivatkozási számokkal
SSR lókusz SSR primer pár ismétlődő irodalom (#) szekvencia
1 WPMS-02 5’-aga aat acc cct gct aat c-3’ (GA)23 AJ297270 5’-aat gtt ttt gtt ccg tga at-3’ Van der Schoot 2 WPMS-04 5’-tac acg ggt ctt tta ttc tct-3’ (GT)25 AJ297273 5’-tgc cga cat cct gcg ttc c-3’ et al. (2000)
3 WPMS-06 5’-gta taa cga tga ccc cac gaa gac-3’ (GT)24 AJ297275 5’-tat aaa taa agg cat gac cag aca-3’
4 WPMS-20 5’-gtg cgc aca tct atg act atc g-3’ (TTCTGG)8 Smulders AJ297293 5’-atc ttg taa ttc tcc ggg cat ct-3’ et al. (2001)
5 PTR-4 5’-aat gtc gag gcc ttt cta aat gtc t-3’ (TC)17 Dayamandan 5’-gct tga gca aca aac aca cca gat g-3’ et al. (1998)
A reakcióelegy összetétele 25 μl végtérfogatban: 1 puffer (West Team); 1 μM MgCl2; 1,2 mM dNTP; 1 U Taq polimeráz (West Team), 1-1 μM forward-reverse primer, 50-100 ng templát DNS. A mikroszatellita fragmentek felszaporítása touchdown PCR-rel történt (Don et al. 1991).
17 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek
Az SSR primer párok egyik tagját a fluoreszcens Cy5 molekulával jelöltük. A Cy5 abszorbanciája 643 nm-en emissziója 667 nm-en veszi föl a maximális értéket. Az SSR fragmentek szeparálását ALF Express II DNA Analyser (automated laser fluorometer) készülékkel ’ReproGel High Resolution’ PAGE gél (24%) (Amersham Bioscience) használatával rövid thermoplate-en végeztük. A futtatást 850 V-on, 50 mA-el, 50 W teljesítménnyel, 50C-on 120 percen keresztül végeztük. Az adatok feldolgozása ALFwin Fragment Analyser 1.03 szoftverrel történt. A futtatásokhoz Cy5-tel jelölt külső és belső molekulatömeg markereket alkalmaztunk standard-ként. A fragmentek léte és nem léte alapján SPSS 11 programmal klaszter analízis során dendrogrammot készítettünk Jaccard (1908) index használatával, csoporton belüli átlagos kapcsoltságok (Average Linkage, within group) figyelembevételével. Az egyes lókuszok variabilitását a PIC (Polymorphism Index Content) értékkel jellemeztük a következő képlet n 2 szerint: PIC=1-Σ ip i , ahol pi az i-edik allél gyakoriságát jelenti (Anderson et al. 1993).
2.3. Régészeti genetika 2.3.1. Növényi anyag
Összehasonlító mai növényfajták: A régészeti köles (Panicum miliaceum) fajtaköri besoroláshoz 20 mai köles tájfajtát kisparcellás kísérletben (5 x 5m) vizsgáltunk két ismétlésben (2.3. táblázat), majd a Tápiószelei Agrobotanikai Intézet és az OMMI felvételezési szempontjai alapján 28 morfológiai tulajdonság szerint hasonlítottuk össze (Lágler, Gyulai et al. 2005). A sárgadinnye (Cucumis melo) lelet fajtaköri besorolásához, és fenotípus rekonstrukciójához 47 mai tájfajtát és termesztett fajtát vizsgáltunk (2.4. táblázat) 23 morfológiai tulajdonság alapján (Szabó, Gyulai et al. 2005ab). A görögdinnye (Citrullus lanatus) leletek fajtaköri besoroláshoz 44 mai tájfajtát és termesztett fajtát (2.5. táblázat) vizsgáltunk 25 morfológiai tulajdonság alapján (Tóth, Gyulai et al. 2007). Régészeti növényminták. A vizsgálatokban köles (Panicum miliaceum) (Lágler, Gyulai et al. 2005; Gyulai et al. 2006), sárgadinnye (Cucumis melo) (Szabó, Gyulai et al. 2005ab; és görögdinnye (Citrullus lanatus) (Tóth, Gyulai et al. 2007) elemzését végeztük el. A 15. századi debreceni görögdinnye lelet, a volt Kölcsey Művelődési Központ területén feltárt kutak növényanyaga (Gyulai F. anyaga). A 18. századi görögdinnye lelet botanikai gyűjtemény anyaga, az un. Pannonhalmi Apátság botanikai gyűjteményéből bocsátották
18 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek rendelkezésre (Mezőgazdasági Múzeum, Budapest). A 4. századi köles minta mongóliai (3. sír, Darhan, Mongolia, 1969) feltárásból származik (Tseveendorj, Sugar 1994).
2.3. táblázat. A fajtarekonstrukcióban vizsgált mai köles (Panicum miliaceum) fajták és tájfajták (tf.); eredete (HUN – Magyarország, ITA – Olaszország, RUS – Oroszország) és kódszáma (ABI Tápiószele) (a), valamint a morfológiai jellemzéséhez alkalmazott 28 fenotípusos bélyeg (OMMI és ABI Tápiószele) és digitalizált súlyozott értékei (b). (Lágler, Gyulai et al. 2005)
(a) 18 Növény-magasság cm # fajtanév rövid származás kódszám 1 Nagyon alacsony 3 Alacsony 1 Tápiószele-D TAPD POL RCAT073416 5 Közepes Tápiószele-C TAPC ITA RCAT073585 7 Magas 2 8 Nagyon magas 3 Tápiói barna TABA HUN RCAT017521 9 Extra magas 19 Szemtermés-alak Debreceni barnamagvú DEBR HUN RCAT017513 4 3 Megnyúlt ellipszoid 5 Tápiószentmártoni (tf.) TASZ HUN 00185/01 5 Zömök ellipszoid 7 Gömbölyded 6 Tápiószele-B TAPB HUN RCAT017280 20 Szemtermés-toklász szín 7 Fertődi 10.D FERT HUN RCAT017272 1 Fehér 2 Krémsárga 8 Püski (tf.) PÜSK HUN RCAT017296 3 Szalmasárga 9 Rábaszentandrási (tf.) RABA HUN RCAT017297 4 Aranysárga 5 Okkersárga 10 Bolgár-159. BOLG HUN RCAT017267 6 Vöröses okkersárga 11 Fertődi piros FEPI HUN RCAT017291 7 Kávébarna 8 Világosszürke 12 Kecskeméti (tf.) KEKE HUN RCAT017527 9 Zöldesszürke 10 Fekete 13 Omszkoje-9 OMSZ RUS 02546/00 21 Szemtermés-magszín 14 Jászberényi (tf.) JASZ HUN RCAT017555 /hántolás után/ 1 Borostyánsárga 15 Császárréti-2 CSAS HUN RCAT017277 2 Világossárga 16 Nyíregyházi (tf.) NYÍR HUN RCAT017526 3 Fehéressárga 22 Ezermagtömeg gr 17 Tápiószele-A TAPA RUS RCAT017509 1 Nagyon kicsi 18 Fertődi fehér FEFE HUN RCAT017290 3 Kicsi 5 Közepes 19 Martonvásári-3 MART HUN RCAT017285 7 Magas Mesterházi (tf.) MEST HUN RCAT017494 8 Nagyon magas 20 9 Extra magas 23 Búga-szemtömeg, növény/gr (b) 1 Nagyon kicsi 1 Csíranövény-antocián 6 Szár-mellékhajtás szám db 12 Növényi vegetatív fázis /nap 3 Kicsi színeződés 1 Nincs mellékhajtás 1 Nagyon kicsi /nagyon korai 5 Közepes 3 Nen antociános /zöld/ 3 Kevés 3 Kicsi /korai 7 Magas 5 Gyengén antociános 5 Közepes 5 Közepes /középérésű 9 Nagyon nagy 7 Erősen antociános 7 Sok 7 Hosszú /késői 24 Növény-megdőlés % 2 Csíranövény-szőrözöttség 9 Nagyon sok 9 Nagyon hosszú /nagyon késői 1 Nincs vagy nagyon gyenge 1 Hiányzik vagy nagyon 7 Szár-vastagság mm 13 Virág-bibe antociánosság 3 Gyenge gyenge 1 Nagyon vékony 3 Nam antociános / fehéres 5 Közepes 3 Gyenge 3 Vékony 5 Gyengén antociános 7 Erős 5 Közepes 5 Közepes 7 Erősen antociános 9 Nagyon erős 7 Erős 7 Vastag 14 Buga-alak 25 Növény-kiegyenlítettség 9 Nagyon erős 9 Nagyon vastag 1 Laza, szétterülő 3 Nem kiegyenlített 3 Levél-lemez és hüvely 8 Növény-szőrözöttség 2 Zászlós, oldatfa hajló laza 5 Közepesen kiegyenlített antociánosság 3 Nem szőrözött 3 Zászlós, oldatfa hajló tömött 7 Kiegyenlített 1 Nagyon gyenge 5 Gyengén szőrözött 4 Álló tömött 26 Növény-ba kteriózis fertőzés 3 Gyenge 7 Erősen szőrözött 15 Buga-meghajlás 1 Nincs fertőzés 5 Közepes 9 Növény-bokoralak 1 Gyengén meghajló 2 Nagyon gyenge 7 Erős 3 Egyenesen álló 2 Közepesen meghajló 3 Gyenge 9 Nagyon erős 5 Félig szétálló 3 Erősen meghajló 5 Közepes 4 Levél-hosszúság mm 7 Szétálló 4 Nincs meghajlás 7 Erős 1 Nagyon rövid 10 Növény-levél szám db 16 Buga-hosszúság cm 8 Nagyon erős 3 Rövid 1 Nagyon kevés 1 Nagyon rövid 9 Extrém erős 5 Közepes 3 Kevés 3 Rövid 27 Bugahányás ideje / nap 7 Hosszú 5 Közepes 5 Közepes 28 Kelési idő / nap 9 Nagyon hosszú 7 Sok 7 Hosszú 5 Levél-szélesség mm 9 Nagyon sok 9 Nagyon hosszú 1 Nagyon keskeny 11 Kalászkapelyva-szín 17 Buga-oldalág szám db 3 Keskeny 3 Világoszöld 1 Nagyon kevés 5 Közepes 5 Sötétzöld 3 Kevés 7 Széles 7 Antociános zöld 5 Közepes 9 Nagyon széles 7 Sok 19 9 Nagyon sok
Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek
2.4. táblázat. A fajtarekonstrukcióban vizsgált mai sárgadinnye (Cucumis melo) fajták és tájfajták (tf.); eredete (BLG – Bulgária, GER – Németország, FRA – Franciaország, HUN – Magyarország, RUS – Orszország); meghatározott fajtatípusa (C - cantalupensis; I - inodorus, R – reticulatus) és kódszáma (ABI Tápiószele) (a), valamint a morfológiai jellemzéséhez alkalmazott 23 fenotípusos bélyeg (OMMI és ABI Tápiószele) és digitalizált súlyozott értékei (b) (Szabó, Gyulai et al. 2005ab)
(a) (b) # fajtanév rövid. eredet típus kód 1. Növény - bokortípus 12. Termés-alapszín RCAT034839 1 Pariser market PAMA GER C 3 Guggonülő 1 fehér 2 Sweet ananas SWAN HUN C 00743/03 5 félig guggonülő 2 saláta 7 Futó 3 krém 3 Nyíribronyi (tf.) NYIR HUN C RCAT035924 2. Szár-szőrözöttség 4 citromsárga 00742/03 4 Javított Zentai JAVZ HUN C 3 gyenge 5 sárga 5 Turai (tf.) TURA HUN C RCAT035923 5 közepes 6 narancssárga 7 erős 7 barnászöld 6 Hevesi (tf.) HEVE HUN C RCAT034887 3. Szár-szőr jelleg 8 zöld 00739/03 7 Ezüst ananász EZAN HUN C 3 puha 9 szürke RCAT034814 8 Cantalup de Bellegarde BELE FRA C 5 közepes 13. Termés-rajzolat 9 Rövid Internod Kantalup SICA GER C RCAT034856 7 durva 1 nincs RCAT034807 4. Levél-alak 2 keskeny csíkok 10 Altajszkaja ALTA RUS C 1 kerek 3 széles csikok 11 Plovdivski Banani PLBA BLG C RCAT034799 2 vese 4 kettős keskeny csíkok 12 Pusztadobosi (tf.) PUSZ HUN C RCAT035332 3 szív 5 kettős széles csíkok 00748/03 4 háromszög 6 apró pettyek 13 Muskotály MUSK HUN C 5 ötszög 7 nagy pettyek 14 Csárdaszállási (tf.) CSAR HUN C RCAT035118 5 Levél-hossz 14. Termés-rajzolat szín 15 Topáz TOPA HUN C 00749/03 3 apró /< 14cm/ 1 szürkészöld RCAT034817 5 közepes /15-18 cm/ 2 mustár 16 Muskatello cukordinnye MELO HUN C 7 nagy />18 cm/ 3 krém 17 Kiskőrösi (tf.) KISK HUN I RCAT035689 6. Levél-szín 4 citromsárga 18 Zimovka Jabloncenaja ZIJA RUS I RCAT034854 1 világoszöld 5 sárga RCAT036341 3 zöld 6 narancs 19 Soponyai (tf.) SOPO HUN I 5 sötétzöld 7 olajzöld RCAT035330 20 Penyigei (tf.) PENY HUN I 7 szürke 8 terakotta 21 Túrkevei (tf.) TUKE HUN I RCAT034792 7. Levél-szeldeltség 9 szürke RCAT034868 1 telt 15. Termés paraléchálózat 22 Pionerka PION RUS I 3 gyenge 1 nincs 23 Afghanistan AFGH GER I RCAT034946 5 közepes 3 szaggatott 24 Hógolyó HOGO HUN I 00741/03 7 erős 5 részleges RCAT034822 8. Magház-szőrözöttség 7 apró sejtes 25 Kősárga KOSA HUN R 3 hiányzik 8 nagy sejtes 26 Tarnamérai (tf.) TARN HUN R RCAT035119 5 ritka 9 paraszemölcsös 27 Honey Rock HORO HUN R RCAT034796 7 tömött 16. Termés-hálózatosság 00740/03 9. Termés-alak 5 gyenge, finom 28 Hales Best HALB HUN R 1 lapított 7 durva 29 Limonnozseltaja LIMO RUS R RCAT034824 2 gömbölyű 17. Termés-izesülés szilárdság 30 Tétényi csereshéjú TETE HUN R 00744/03 3 elliptikus 5 leválik 4 orsó 7 nem válik le 31 Muhi (tf.) MUHI HUN R RCAT036339 5 fordított tojás 18. Terméshús vastagság (cm) RCAT034813 32 Turkesztán TURK HUN R 6 körte 19. Termés magfészek Ø (cm) 33 Hegykői (tf.) HEGY HUN R RCAT035925 7 hengeres 20. Termés placenta jelleg 8 kígyó 3 folyékony 34 Togo TOGO HUN R RCAT034812 9 turbán 5 félig folyékony RCAT035927 35 Kisteleki (tf.) KIST HUN R 10. Termés-hossz (cm) 7 száraz 36 Nagycserkeszi (tf.) NAGY HUN R RCAT035402 11. Termés-felszín 21. Hús-szín 3 sima 3 fehér 37 Nyírbátori (tf.) NYBA HUN R RCAT035161 4 enyhén gerezdes 5 krém RCAT034885 38 Szirmai (tf.) SZIR HUN R 5 gerezdes 7 zöld 39 Cantaloup de Paris CAPA FRA R RCAT034819 6 erősen gerezdes 9 narancs 7 göbös /rapcsos/ 22. Hús-íz 40 Tapi GB-1 BLG R RCAT034892 8 repedezett 3 keserű 00745/03 41 Fortuna FORT HUN R 9 ráncos 5 savanyú 42 Kállósemjéni (tf.) KALO HUN R RCAT036190 7 íztelen 9 édes 43 Taktaharkányi (tf.) TAKT HUN R RCAT035157
44 Sárándi (tf.) SARA HUN R RCAT034793 45 Desertni-5 DESE BLG R RCAT050841 46 Magyar Kincs MAKI HUN R 00747/03 47 Galia GALI HUN R 00746/03
20 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek
2.5. táblázat. A fajtarekonstrukcióban vizsgált mai görögdinnye (Citrullus lanatus; Citrullus colocynthis) fajták és tájfajták (1-44); eredete (1-3: Citrullus colocynthis; 4-6: Citrullus labatus sp. citroides) és kódszáma (ABI Tápiószele) (a), valamint a morfológiai jellemzéséhez alkalmazott 24 fenotípusos bélyeg (OMMI és ABI Tápiószele) és digitalizált súlyozott értékei (b) (Tóth, Gyulai et al. 2007).
(a) (b) 11. Magház - alak 19. Termés - hús színe
1. Növény - fejlődése 3 gömbölyű 1 fehér # fajtanév faj kód 3 gyenge 5 ovális 2 citromsárga 5 közepes 7 hengeres 3 aranysárga 1 colocynt – Finn1 68 C. c. RCAT036168 7 erős 12. Magház - szőrözöttség 4 halvány rózsaszín 2 colocynt – Belga 172 C. c. RCAT036172 2. Szár - főinda hossza 1 nagyon ritka 5 rózsaszín 3 colocynt – Portugá l547 C. c. RCAT035547 1 nagyon rövid 3 ritka 6 narancssárga C. 3 rövid 5 sűrű 7 skarlátvörös 4 citroides - Szeged 099 RCAT036099 l.c. 5 közepes 7 nemezes 8 kárminpiros C. 5 citroides - Román 235 RCAT035235 7 hosszú 9 tövises 9 málnaszínű l.c. 9 nagyon hosszú 13. Termés - alak 20. Hús - konzisztencia C. 6 citroides - Újszilvás 816 RCAT055816 3. Szár - szőrözöttség 1 lapított 1 szemcsés l.c. 3 gyenge 2 gömbölyű 2 zsenge, lágy 7 Bácsbokod 917 C. l. RCAT035917 5 közepes 3 tompa elliptikus 3 nyálkás 8 Napsugár 257 C. l. 00257/05 7 erős 5 ovális 4 durva 9 Sándorfalva 105 C. l. RCAT036105 4. Levéllemez - alak 6 körte -alakú 5 telt, kemény 10 Dévaványa 101 C. l. 5101./02 3 keskeny 7 hengeres 6 kemény 11 Szentesi sugárhasú 260 C. l. 00260/05 5 közepes 14. Termés - felszín 7 vattaszerű 12 Belij dinij 152 C. l. RCAT036152 7 széles 3 sima 21. Hús – lédússág 13 Ráckeve 812 C. l. RCAT055812 5. Levél - szín 5 barázdált 3 száraz 14 Csárdaszállás 113 C. l. RCAT035113 1 sárga 7 érszerű kidudorodások 5 kevésnedvű 15 Tura 389 C. l. RCAT035389 3 zöld 9 egyenetlen 7 nedvdús 16 Biri 114 C. l. RCAT035114 5 sötétzöld 15. Termés - héj színe 9 nagyon leves 17 Klondike R7 096 C. l. RCAT036096 7 szürkészöld 1 fehéres 22. Hús - íz 18 Charleston gray 263 C. l. 00263/05 9 galambszürke 2 sárgás 1 keserű 19 Taktaharkány 790 C. l. RCAT034790 6. Levél - hossz 3 krém 3 íztelen 20 Túrkeve 112 C. l. RCAT035112 1 nagyon apró 4 szalmasárga 5 gyengén édes 21 Ukrainskij 545 149 C. l. RCAT036149 3 apró 5 narancs 7 édes 22 Szirma 782 C. l. RCAT034782 5 közepes 6 világoszöld 9 nagyon édes 23 Marsowszky 256 C. l. 00256/05 7 nagy 7 zöld 23. Mag - szín 24 Háromfa 754 C. l. RCAT034754 9 nagyon nagy 8 sötétzöld 1 fehér 25 Debrecen 111 C. l. RCAT035111 7. Levél - szeldeltség 9 feketészöld 2 krém 26 Sibiriak 098 C. l. RCAT036098 1 nincs 16. Termés - héj rajzolat 3 szürke 27 Nagyecsed 775 C. l. RCAT034775 2 nagyon gyenge 1 nincs 4 dohányszínű 28 Nagykálló 785 C. l. RCAT034785 3 gyenge 2 van 5 világosbarna 29 Hevesi 258 C. l. 00258/05 5 közepes 17. Termés - héj rajzolat 6 olajzöld 30 Nagyvárad 767 C. l. RCAT034767 7 erős típus 7 barna 31 Nyírbátor 155 C. l. RCAT035155 9 nagyon erős 1 hálózatos 8 piros 32 Oros 862 C. l. RCAT035862 8. Levél - lebeny 2 hálós csíkok 9 fekete 33 Rákóczifalva 145 C. l. RCAT035145 3 keskeny 3 fonalas csíkok 24. Érési csoport 34 Kömörő 762 C. l. RCAT034762 5 közepes 4 márványozott 1 korai nap 35 Nyíregyháza 778 C. l. RCAT034778 7 széles 5 keskeny tövis-alakú 3 középkorai 36 Kecskeméti vörös 259 C. l. 00259/05 csíkok 9. Virág szirom - méret 5 középérésű 37 Ilk 236 C. l. RCAT035236 6 széles tövis-alakú 3 apró 7 középkései 38 Pusztadobos 146 C. l. RCAT035146 csíkok 5 közepes 9 kései 39 Gyöngyös 969 C. l. RCAT034969 7 füzérszerű csíkok 7 nagy 40 Crimson sweet 262 C. l. 00262/05 8 széles elmosódó csíkok 10. Virág sziromlevél 41 Kibéd 172 C. l. 5172./02 9 mozaikos 3 kerek széles 42 Sugar baby 261 C. l. 00261/05 18. Termés - héj szilárdság 5 kerek keskeny 43 Lipót 970 C. l. RCAT034970 3 nem szilárd 7 kihegyesedő 44 Korai kincs 255 C. l. 00255/05 5 közép szilárd
45 15.sz. minta C. l. G-15-sz. 7 szilárd
21 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek
A 15. századi növényminták. A budai királyi vár (Árpád-házi IV. Béla Király, 1243) Zsigmond-kori szárnyának (15. sz. eleje), régészeti feltárása (1999) során (Budapest I. Ker.,Szent György tér, Teleki palota, 8 sz. kút) nagy mennyiségű növénymaradvány került elő, 195 növényfaj több mint 3 millió maglelete (Gyulai et al. 2006). A régészeti kormeghatározás alapján (pénzek, edények stb.) a minták eredetét 15. század első felére volt azonosítható (Nyékhelyi 2003). A magokat flotálásos módszerrel iszapoltuk ki, infravörös fényben szárítottuk (15 W), majd laboratóriumi körülmények között határoztuk meg a fajokat Schermann (1966) határozásával. Felületi sterilizálás után a magokat három hónapig F6 steril táptalajon (Gyulai et al. 2003ab) inkubáltuk a különböző eredetű fertőzések elkerülésének kizárására.
2.3.2. Molekuláris genetikai módszerek
DNS-izolálás: A genomikus DNS kivonásához az SDS-el kiegészített Nucleon PhytoPure kit- et (Amersham) alkalmaztuk, a következő lépésekben. 0.1 g növény (levél, illetve mag) mintát porítottunk cseppfolyós nitrogénben, majd 240 ul extrakciós (EB) pufferben szuszpendáltuk (EB: 10 mM Tris, pH 8,0; 50 mM EDTA; 500 mM NaCl), 60 ul 10% SDS hozzáadása után 20 percig inkubáltuk 65°C-on. A mintákat 160 ul 5,0 M kálium-acetát (pH 5,3) hozzáadása után 0°C-on 20 percig inkubáltuk. Centrifugálást követően (13 000 rpm, 4°C, 20 perc) a DNS-t a felülúszóból, 0,1 x térfogatú Na-acetáttal (pH: 5,2) és kétszeres térfogatú 96%-os etanollal csaptuk ki. A csapadékot 70%-os etanollal mostuk, és TE pufferben oldottuk fel (10 mM Tris, 1 mM EDTA). A mintákat 4 ul RN-ázzal kezeltük, a DNS újbóli kicsapása és mosása után 100 ul ddH2O pufferban oldottuk. Az izolált DNS minőségét 0,8%-os agaróz gélen EtBr-os festéssel ellenőriztük, majd a pontos DNS koncentrációt a NanoDrop ND-1000 UV-Vis spectrofotometerrel (NanoDrop Technologies, Delaware, USA – BioScience, Budapest) határoztuk meg (Gyulai et al., 2006; Lágler 2007). A mai fajtáknál 0,1 g fiatal levélből vontuk ki a DNS-t (Szabó, Gyulai et al. 2005ab). Csak a nem fertőzött régészeti, valamint a mai termesztett fajtákból (2.3, 2.4., 2.5. táblázatok) izoláltunk DNS-t.
RT-qPCR elemzés: RNS izolálás. Totál RNS-t 0,05 g tömegű levélkorongokból izoláltunk (Gyulai et al. 2005, Gyulai 2007; Bittsánszky, Gyuklai et al. 2005ab, 2006). Az RNS izolálást Absolutely RNA Miniprep Kit-tel (# 400800, Stratagene, USA - Biomedica, Hungary) végeztük. A kivont RNS minták minőségét és mennyiségét (2 l RNS) NanoDrop ND-1000 UV-Vis spektrofotométerrel (NanoDrop Technologies, Montchanin, DE, USA – BioScience,
22 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek
Budapest, Hungary) határoztuk meg. cDNS szintézis. Az egyszálú cDNS-t a mRNS templáton reverz transzkripcióban oligo(dT)18 primer alkalmazásával végeztük (Fermentas – Biocenter (Szeged, Hungary) # K1622) a gyártó eljárását követve (Bittsánszky 2006). qPCR elemzés. A transzgén-gshI (E.coli), nyár-gsh1 (Populus x canescens) gének expressziós szintjét qPCR elemzéséhez DyNAmo HS SybrGreen I qPCR Kit-et (F-410L, Finnzymes, Finnország – Izinta, Hungary) alkalmaztunk. A reverz transzkripció (RT) a kvantitatív polimeráz láncreakcióval (qPCR) kombinálva a legérzékenyebb módszere mind az abszolút, mind a relatív génexpresszió kvantifikálásának (Bittsánszky, Gyulai et al. 2006). A SybrGreen fluoreszcens festék a kétszálú DNS (dsDNA) kis árkába interkalálódik, ezzel téve lehetővé a PCR termék 2.6. táblázat. RT-qPCR elemzéshez alkalmazott primerek szekvencia adatai (Gyulai 2007; Bittsánszky, Gyulai et al. 2007) ciklusonkénti gén primer párok szekvenciája (5’-3’) PCR termék (bp) Tm amplifikációjának cDNS / DNS (°C) nyomon követését. A nyár-gsh1 5’-AGTTCCGAGGCTGACATGAT -3’ 160/320 60 5’-CAGCACGGTTGTTGTCAGTA-3’ cDNS (2,5 μl) minták génexpressziós transzgén-gshI 5’-AGGTCAGGACATCGAACTGG -3’ 272 60 5’-GATGCACCAAACAGATAAGG -3’ analíziséhez gén α-tubulin 5’-TAACCGCCTTGTTTCTCAGG-3’ 112/218 60 specifikus primereket (nyárfa) 5’-CCTGGGGTATGGAACCAAGT-3’
actin terveztünk a „Primer3” (nyárfa) 5’-AATGGTACCGGAATGGTCAA-3’ 132/233 60 5’-CCCAACATACGCATCCTTTT-3‘ számítógépes program segítségével (2.6. táblázat). A reakciókat MX3000P qPCR (Stratagene, USA – Biomedica, Hungary) készüléken végeztük, olvadáspont elemzésével együtt. A reakciók kvantifikálásához a cDNS mintából tízszeres hígítási sorozatot (1, 10, 102, 103) készítettünk, és NTC-t (nem DNS templát kontroll) alkalmaztunk. Belső kontrollnak a konstitutívan expresszálódó α-tubulin gént használtuk. Kiértékelés. A relatív kvantifikálás adatelemzéséhez a 2−ΔΔCt módszert (Livak, Schmittgen 2001) alkalmaztuk. A Ct küszöbértéket (threshold cycle) manuálisan határoztuk meg. Minden cDNS reakció ΔCt értékeit a (Ctgsh1 – Ctα-tubulin;
CgshI – Ctα-tubulin) képlet alapján normalizáltuk, majd a ΔCt értékek átlagait (átl. ΔCt) határoztuk meg. ΔΔCt értékek meghatározása során a kezelt minták (átl. ΔCtgén-kezelt) értékeit a kezeletlen kontrollhoz (átl. ΔCtkezeletlen) hasonlítottuk a következő képlet alapján: (átl. −ΔΔCt ΔCtkezelt - átl. ΔCtkezeletlen). Az adatok abszolút értékké történő alakítása 2 képlettel történt (Livak, Schmittgen 2001, Gyulai 2007; Bittsánszky, Gyulai et al. 2007).
ITS elemzés: Az univerzális ITS-primerekkel a teljes ITS szakaszt (ITS1-5.8S-ITS2) szaporítottuk fel (Garcia-Mas et al. 2004). A primerpár szekvenciája: tcg taa caa ggt ttc cgt
23 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek agg tg / tcc tcc gct tat tga tat gc (Hsiao et al. 1995), melyet a köles és a sárgadinnye vizsgálatokhoz alkalmaztunk. 2.7. táblázat. A köles (Panicum miliaceum) sejtmagi (nSSR) és mtDNS vizsgálatokban alkalmazott primer-párok szekvencia adatai (Gyulai et al. 2006; Lágler, Gyulai et al. 2005) AFLP elemzés: A szelektív gén primer párok szekvenciái irodalom amplifikációhoz 24 szelektiv (NCBI #) (5’ – 3’) primer-kombinációt gln4 agc aga acg gca agg gct act (D14577) ttt ggc aca cca cga cga használtunk, a köles rps15 aag aag aaa gag aag aag cac ggg Chin et al. (AW424565) gga cag ctc gta tta taa cct gcg (1996) vizsgálatokban a (2.2.1.) rps28 aga cga acc cac cat cat ctt tc pontban leírtak szerint. (AF544115) cgc ttg gca tct cca tgt ata tct
sh1 atc gaa atg cag gcg atg gtt ctc (AV062092) atc gag atg ttc tac gcc ctg aag t
ALF-SSR, valamint mtDNS és mtDNA-6 gtg ttg ctg aga cat gcg cc Petit et (Z11512) ata tgg cgc aag acg att cc al. (2005) cpDNS elemzés: A mikroszatellita elemzéshez a kölesben négy (és egy mtDNS specifikus) (2.7. táblázat), sárgadinnyében nyolc (2.8.a táblázat) SSR primer párt alkalmaztunk. A próbák jelzésében a Cm a fajra (Cucumis melo), a szám a klónra (és nem az ismétlődés számára) vonatkozik. A görögdinnye (Citrullus lanatus) mikroszatellita elemzéséhez két primer csoportot, valamint kloroplasztisz DNS (cpDNS) specifikus primereket alkalmaztunk (2.8.b. táblázat).
Az ALF SSR primer párok 2.8.a. táblázat. A sárgadinnye (Cucumis melo) és a görögdinnye (Citrullus lanatus) mikroszaetllita vizsgálatához alkalmazott ALF-SSR egyik tagját Cy5 fluoreszcens primerpárok (Katzir et al. 1996; Danin-Poleg et al. 2001) szekvencia molekulával jelöltük (Röder adatai (Cm – Cucumis melo). * - a primerpár Cy-5 fluoreszcens festékkel jelölt tagja (Szabó, Gyulai et al. 2005) et al. 1998; Huang et al. ismétlődő allélméret # lókusz SSR primerpárok szekvencia (bp) 2002; Gyulai et al. 2005). A egyszerű SSR
Cy5 abszorbciója 643 nm-en, 1 CmCT170b ATTGCCCAACTAAACTAAACC (CT)8 160 *CACAACACAATATCATCCTTG emissziója 667 nm-en veszi 2 CmTC168 *ATCATTGGATGTGGGATTCTC (TC)14 200 ACAGATGGATGAAACCTTAGG föl a maximális értéket. Az 3 CmTA134a *ACGTGCTTCAGTAAACATG (TA)12 159 SSR fragmentumok CCGACATTGAAAACCAACTTC összetett SSR szeparálását ALF express II 4 CmAG59 *TTGGGTGGCAATGAGGAA (GA)2A(AG)8 124 DNA Analyser (automated ATATGATCTTCCATTTCCA
5 CmGA104 *TTACTGGGTTTTGCCGATTT (GA)14AA(GA)3 125 laser fluorometer) AATTCCGTATTCAACTCTCC készülékkel ReproGel High 6 CmCT134b *GCTCCTCCTTAACTCTATAC (TA)2(CT)8(AT)7 123 GCATTATTACCCATGTACGAG Resolution PAGE gél (24 %) 7 CmCT44 *TCAACTGTCCATTTCTCGCTG (CT)10TGTT(CT)3 168 (Amersham Bioscience) CCGTAAAGACGAAAACCCTTC alkalmazásával, rövid 8 CmCTT144 *CAAAAGGTTTCGATTGGTGGG (CTT)10CTAC(CTT)4 192 AAATGGTGGGGGTTGAATAGG
24 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek thermoplate-en végeztük. A futtatást 850 V-on, 50 mA-el, 50 W teljesítménnyel, 50C-on 120 percen keresztül alkalmaztuk. Az adatok feldolgozása ALFwin Fragment Analyser 1.03 szoftverrel történt. A 2.8.b. táblázat. A görögdinnye (Citrullus lanatus) genomelemzéshez alkalmazott sárgadinnyére kidolgozott (1-9) mikroszatellita (Katzir et al. futtatásokhoz Cy5-tel 1996; Danin-Poleg et al. 2001); és görögdinnye-specifikus (10-16) (Jarret jelölt külső és belső et al. 1997) mikroszatellita-, valamint (19) cpDNS-specifikus primerek (Al- Janabi et al. 1994) szekvencia adatai. molekulatömeg # lokusz primer-pár szekvenciák ismétlődő szekvencia markereket alkalmaztunk 1. CmCT44 *tcaactgtccatttctcgctg (CT)10TGTT(CT)3 ccgtaaagacgaaaacccttc standardként (Gyulai et al. 2. CSTAO50 gaattatgcagatgggtctt (TA)4(TTC)3G(TA)5TG(TA)2 caagaagatcaaatgatagc
2005). 3. CmTC51 attggggtttctttgaggtga (CT)3GA(TC)9(CT)5 ccatgtctaaaaactcatgtgg 4. CMCT126 ctttaggtgtgagattggtgg (CT)9 gcacatcattggagtaactcg PCR reakciók: A PCR 5. CmTC158 cccccatattcatcaaaact (TC)11(ATT)6 tcagctcacttttccattca reakciót 25 ul 6. CmTC 168 *atcattggatgtgggattctc (TC)14 acagatggatgaaaccttagg
7. CMACC 146 caaccaccgactactaagtc (ACC)9 végtérfogatban végeztük cgaccaaacccatccgataa
8. CmCT 170 b attgcccaactaaactaaacc (CT)8 el 30 ng templát DNS, 10- *cacaacacaatatcatccttg
9. CSLHCPA ttctccatgtttggattcttt (GA)9 20 pM primer, 1x-es accacaaataataattcaaca
10. Cl 1-06 caccctcctccagttgtcattcg (CT)10 koncentrációjú PCR puffer aaggtcagcaaagcggcatagg 11. Cl 1-12 gcctttgaaagagagttgctcg (GA)15 (50 mM KCl, 10 mM gcgcgtccctttttacca 12. Cl 1-20 cgcgcgtgaggaccctata (CT)18 TRIS-HCl pH 8,3, 1,5 agcaattgattgaggcggttct 13. Cl 1-21 accctcgctgctgttattca (ATT)10(CT)19 mM MgCl2, 0.001% tgtcccacccaacatttcatt 14. Cl 2-23 gaggcggaggagttgagag (CT)15 zselatin), 1-2 mM MgCl2, acaaaacaacgaaacccatagc 15. Cl 2-61 ttctgctcagtttcttcctaat (CT)18 catcttcaaaaaaaggctaag
0.4 mM dNTP és 1 egység 16. Cl 2-140 ctttttcttctgatttgactgg (GA)20 actgtttatcccgacttcacta (U) Taq polimeráz 17. cpDNS agttcgagcctgattatccc gcatgccgccagcgttcatc (Sigma) felhasználásával. A reakciókörülmények közül a ciklusidőket és a hőmérsékletet a következő módosításokkal: 2 perc 95°C, majd 5 x ismétlődően: 10 mp 95°C, 30 mp 65*°C, 1 perc 72°C, majd 35 x ismétlődően: 10 mp 95°C, 30 mp 55°C, 1 perc 72°C, végül 5 perc 72°C (*-Touch down 65°C - 55°C). A reakciótermékek elválasztását horizontális (1,5%) agaróz gélen végeztük EtBr-os festést alkalmazva (60 W, 1 óra), majd a pontos allél azonosítást ALF express II, lézer fluorométerrel végeztük el (Röder et al. 1998; Huang et al. 2002; Gyulai et al. 2006; Szabó, Gyulai et al. 2005ab; Tóth, Gyulai et al. 2007).
RFLP-PCR (CAPs) elemzés: A CAP-elemzés (cleaved amplified polymorphic DNA) (Deng 1988; Haliassos 1989), illetve más elnevezés szerint RFLP-PCR (Dane et al. 2004; Dane 2002) módszerrel a PCR reakcióban felszaporított DNS fragmentumokat hasítottuk restrikciós
25 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek enzimekkel, annak eldöntésére, hogy a jól térképezhető (ld. a korábbi restrikciós térképezési munkákat) restrikciós hasítóhelyek 2.9. táblázat. A CAPs-mtDNS szekvencia elemzéséhez szekvenciáiban bekövetkezett mutációkat alkalmazott hét restrikciós endonukleáz enzim (RE) adatai, valamint a kimutatott CAPs fragmentumok detektáljuk, illetve az SNP-elemzést mérete (bp) (Lagler, Gyulai et al. 2005). RE hasítási Fragmentumok # CAPs végezzünk (2.9. táblázat). A módszer enzim hely mérete fragm. technikailag nagy áttörés volt az igen TaqI TCGA 124, 124, 492, 116, 104, 32 6 BsuRI GGCC 282, 139, 15, 164, 100, 292 6 munkaigényes radioaktív próbát HinfI GANTC 268, 224, 302, 76, 104, 18 6 alkalmazó RFLP (Botstein et al. 1980) MboI GATC 568, 92, 193, 91, 48 5 AluI AGCT 88, 757, 148 3 eljársához képest és amely módszert ma RsaI GTAC 204, 99, 16, 274, 13, 75, 311 7 már gyakorlatilag teljesen helyettesíti (Deng 1988). A mt6 primerrel (Petit et al. 2005) felszaporított mitokondriális DNS fragmentumot (2.7. táblázat) az agaróz gélből (0.8%) (GibcoBRL, 15510-027) kiizoláltuk, hat restrikciós endonukleázzal (TaqI, BsuRI, HinfI, MboI, AluI és RsaI) emésztettük (Fermentas) (2.9. táblázat). A CAPS-analízist az emésztett fragmentumokon, 1,6%-os agaróz gélen történő szétválasztás után végeztük el, majd ChemImager rendszerben (Alpha Innotech Corp.) dokumentáltuk. A középkori mintából 2.10. táblázat. Az ISSR elemzéshez alkalmazott primerek (Cekic et al. 2001) szekvencia adatai valamint az Omszkoje-9 mai köles (Lágler, Gyulai et al. 2005). fragmenteket oszlopon tisztítottuk (Sigma, 5- Primer ¤# szekvencia rövid 6501), és megszekvenáltuk. forma 808 AGA GAG AGA GAG AGA GC (AG)8C 810 GAG AGA GAG AGA GAG AT (GA)8T 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC (GA)8C ISSR elemzés: Az ISSR vizsgálatainkhoz a 819 GTG TGT GTG TGT GTG TA (GT)8A Cekic (Cekic et al. 2001) által leírt eljárást 820 GTG TGT GTG TGT GTG TC (GT)8C 821 GTG TGT GTG TGT GTG TT (GT)8T alkalmaztuk kilenc primer és azok valamennyi 835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC (AG)8 YC
836 AGA GAG AGA GAG AGA GYG (AG)8 YG kombinációjának alkalmazásával (2.10. 841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC (GA)8 YC táblázat) 842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG (GA)8 YG
WGA, Teljes Genom Felszaporítás: A WGA felszaporítás lépéseit a következőképpen hajtottuk végre (2.3. ábra): (a) Fragmentálás: A felszaporítani kívánt minták DNS-éből ddH2O-val 1 ng/µl koncentrációjú oldatot készítettünk, a mintákhoz 1 µl 10 x fragmentáló puffert és 9 µl DNS-t (1 ng/µl) adtunk, és pontosan 4 percig 95°C-on denaturáltuk (PCR- készülékben, majd jég, és rövid centrifugálás következett). (b) Genomi könyvtár készítése: A mintánkhoz 2 µl 1 x Könyvtár Preparáló Puffert, majd 1 µl stabilizáló puffert adtunk. Enyhe vortexelés, majd rövid centrifugálás után 2 percig 95°C-on denaturáltuk, rövid centrifugálás után ismét jégre helyeztük a mintákat. A következő lépésben 1 µl Könyvtár Preparáló
26 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek
Enzimet adtunk a mintákhoz, majd enyhe vortexelés után ismét jégfürdőt alkalmaztunk. Ezt követően egyetlen ciklusból álló PCR reakciót indítottuk a következő paraméterekkel: 16°C/20 perc, 24°C/20 perc, 37°C/20 perc, 75°C/5 perc, tárolás 4°C. (c) PCR 2.3. ábra. A Phi29 fág DNS-polimerázzal végzett izotermikus amplifikálás / 2: Az előző lépésekben teljes- genom-felszaporítás (WGA) lépései (www.sigma WGA-2) elkészített genomi könyvtárhoz mintánként 60 µl PCR mastermix-et adtunk, ami a következőket tartalmazta: 7.5 µl 10X Amplification Master Mix, 47.5 µl nukleáz mentes víz, 5.0 µl WGA phi29 DNS polimeráz. Az így kapott 75 µl oldatból újabb PCR reakciót indítottuk: 95°C/3 perc; 14x ciklusban: 94°C/15 mp, 65°C/5 perc, zárás 4°C, tárolás -20°C. A felszaporítás hatékonyságát minden esetben agaróz gélen és NanoDrop UV spektrofotométerrel ellenőriztük.
Klónozás: A PCR reakciókban felszaporított ITS, SSR és ISSR PCR fragmentumokat fragmentumokat a gélből izoláláltuk, tisztítottuk, és klónozó vektorba építettük (pGEM-T
Easy vektor kit). 5 l templáthoz klónozó mixet adtunk (2 l ddH2O, 1 l pGEM-T Easy vektor, 1 l T4 DNS ligáz, 1 l 2x Rapid Ligation Buffer), majd inkubáltuk (3 h, 22°C), transzformáltuk (50 l E. coli JM109, 10 l plazmid DNS); 20-25 perc jég; 60 másodperc 42°C-os hősokk; majd jégre helyezve 250 l folyékony LB tápoldatot adtunk a mintákhoz. 12000/perc fordulatszámmal egy percig töményítettük a sejteket, és 50 l tápoldatban szuszpendálva antibiotikummal, Xgal, és IPTG-vel kiegészített táptalajra szélesztettük, a kinövő kolóniákból (ON, 37°C) kolónia-PCR-rel ellenőriztük, mintánként 3 klónt szekvenáltunk.
Szekvenciaelemzés: A klónozott fragmentumokat automata fluoreszcens DNA szekvenátorral (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer) elemeztük, mindkét irányban elvégezve a szekvenálást. A szekvenciákat ChromasPro (version 1.11) programmal illesztettük (Technelysium Pty Ltd, Tewantin, Queensland, Ausztrália). A szekvenciák összehasonlítását Bioedit programmal készítettük (BioEdit Sequence Alignment Editor, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA). Az ellenőrzésekben a GCG-10 (Genetics Computer Group, Oxford
27 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 2. Anyagok és Módszerek
Molecular Group Inc., Madison, Wisconsin, USA; Wisconsin Package, Version 10.3) szoftvert alkalmaztuk. A BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) analízishez az NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Maryland, USA) programot alkalmaztuk (Gyulai et al. 2006; Lágler, Gyulai et al. 2006). A retrotranszpozon elemzésben FastPCR (Kalendar 2007) es 2.10. táblázat. A retrotranszpozonok azonosításához alkalmazott PBS- primerek (1-50 (a), valamint a klónozott szekvenciákra tervezett IRAP Multilin (Corpet 1988) primerek szekvencia adatai (1-34) (b). programokat alkalmaztunk. (a) PBS primerek (12 és 18 nt) 5'-3' (b) IRAP primerek 5'-3' 1 2074 gctctgatacca >2450 ggttaccaacttttgcattccagt 2 2075 ctcatgatgcca >2451 3 2076 gctccgatgcca tgggtcgtatccatagtgttaccagg >2452 Statisztikai kiértékelés: A 4 2077 ctcacgatgcca tcctggtaacactatggatacgac 5 2078 gcggagtcgcca >2453 statisztikai elemzéseket a 6 2079 aggtgggcgcca cttatacgtctgaaggacagggtttc >2454 7 2080 cagacggcgcca Microsoft Excell, valamint az tgtgagtgggttgtagcccatgagagg 8 2081 gcaacggcgcca >2455 9 2083 cttctagcgcca cagtacggtctacgacaaatgtaccgac SPSS14 programcsomaggal >2456 10 2085 atgccgatacca gtcgtagcaccagttcggcgctacctca végeztünk. A dendrogrammok 11 2087 gcaatggaacca >2457 12 2095 gctcggatacca tgaaccacgtaaatttgtgtgtcgatc >2458 elkészítéséhez a Jaccard 13 2231 acttggatgctgatacca tttgccgttgaggggttacacggt 14 2232 agagaggctcggatacca >2459 15 2237 cccctacctggcgtgcca acaccgtgtaacccctcaacggcaaa (1908) indexet használatuk, a >2460 16 2238 acctagctcatgatgcca aatcccaccaaggcaatcgtca legközelebbi rokonság 17 2239 acctaggctcggatgcca >2461 tgacgattgccttggtgggatt 18 2240 aacctggctcagatgcca >2462 (nearest neighborhood) 19 2241 acctagctcatcatgcca aactgccagggcaatgggagacc 20 2242 gccccatggtgggcgcca >2463 ctggcagttctgcatctgtgacaggacag figyelembe vételével. 21 2243 agtcaggctctgttacca >2464 22 2244 ggaaggctctgattacca gcatacggtgcttccgccccatgaca 23 2245 gaggtggctcttatacca >2465 tgaccagcctaaagtttggacccact 24 2246 actaggctctgtatacca >2466 Retrotranszpozonok izolálása 25 2251 gaacaggcgatgatacca atcgaagcattgaaggtgtgcttgtgac 26 2252 tcatggctcatgatacca >2467 acggttacgggcgtgttcctcttcca görögdinnyében: Az LTR 27 2253 tcgaggctctagatacca >2468 28 2255 gcgtgtgctctcatacca gtctttgccaaaacctcatcacgcaga >2469 retrotranszpozon izolálásához 29 2256 Gacctagctctaatacca tggcaaagacaggctgtgctgtgtca 30 2257 ctctcaatgaaagcacca >2470 PBS specifikus primereket 31 2295 agaacggctctgatacca gtgatgcactcattgaatatgttagca >2471 (2.10. táblázat) alkalmaztunk, 32 2296 tgacaagctctgatacca gtggtctctaacccgattatcagcatcg 33 2297 ggttgtgctctgatacca >2472 34 2298 agaagagctctgatacca acaccgatgatcttttgcgcactaa a fragmentumokat pGEM-T >2473 35 2299 taaccagctctgatacca gcattctggacattgccaaactga Easy (Promega) vektorba 36 2373 gaacttgctccgatgcca >2474 37 2395 tccccagcggagtcgcca gaatccctgcgaagagctgaagcca >2475 klónoztuk, E.coli sejtekbe 38 2397 atggtcgctctgatacca gacggcaatgtctgtgatcttgccgcca 39 2398 gaacccttgccgatacca >2476 gacttcaagctacttcgaatgggttgtc 40 2399 aaactggcaacggcgcca transzformáltuk, szekvenáltuk, >2477 41 2400 cccctccttctagcgcca gctcttctcattgtgaatctggatagca majd a szekvenciákra tervezett 42 2401 agttaagctttgatacca >2478 tccctacttggaccaagcgtcgcgca tctaagctcttgata 43 2402 cca >2479 LTR-specifikus primerekkel 44 2403 tggtccgctctgatacca ctcggctttgcgtattggtccacgca 45 2404 agattagctctgatacca >2480 ctctaactctctgcttcttcctaactcca PCR reakcióban (2.10. 46 2412 gaacaggctctgatacca >2481 47 2413 aagggggctctgatacca tgccgttcatggcccccgagcagtcatca táblázat) amplifikáltuk. 48 2414 acttgagctctgatacca >2482 gatcgttctctcttagacttcacca 49 2415 catcgtaggtgggcgcca >2483 50 2416 gggtcggctctgatacca gtcctacaacataggatctagggtccttac
28 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
3. Eredmények és Megvitatás 3.1. In vitro klónozás és szelekció, biotechnológiai növénynemesítés
Az in vitro növénynemesítés alkalmazásával jelentős mértékben szélesedett a biotechnológia eszköztára (Dudist, Heszky 2000, 2003). Az ivaros- (pollen, portok, ovárium és ovulum tenyészetek), valamint a vegetatív biotechnológiai módszerek (mikroszaporítás, klónozás, szomaklónok, protoklónok, cibridek) széles alkalmazási területet nyújtottak a biotechnológia számára az elmúlt évtizedekben (Mórocz et al. 1990; Heszky et al. 2005). Tudományos kutatásaim során az in vitro klónozásban a szomatikus embriógenezist bizonyítottam szkenning elektron mikroszkópos elemzéssel, egy és kétszikű fajokban.
3.1.1. A sziki mézpázsit (Puccinellia limosa) klónozása szomatikus embriogenezissel – SEM- elemzés
Az egyszikű fajok vegetatív sarjadással természetes úton is jól klónozodnak, azonban a szomatikus 3.1.1. ábra. A sziki mézpázsit (Puccinellia limosa) szomatikus embriogenezisének SEM elemzése. Az Alföld szikfokainak legsótűrőbb embriogenezisük egyszikű faja (a); embriogén kallusz indukció (b, c), és embriógenezis a kidolgozása csak az 1980-as scutellum (Sc) (embriópajzs) (d) valamint, a hajtáscsúcs (sh), a rügyhüvely (coleoptyl, cl) és gyökércsúcs (R) megjelenésével (e), illetve évekre vált rutinszerűvé. az elsődeleges levél (Pl) kifejlődésével (g-f), majd a teljes gyökérzet kialakulásával (gyökérsüveg Ca; gyökérszőr – Rh) (k), a teljes növény kifejlődéséig (l). Ritka jelenség az egyszikűek ikerembrió (j) kialakulása (Jekkel, Gyulai, Heszky 1995).
29 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
Kutatásaim során számos fajra dolgoztam ki ezt a módszert: sziki mézpázsitban (Puccinellia limosa) (Jekkel, Gyulai, Heszky 1995); tarackbúzában (Agropyron repens) (Gyulai et al. 1995abc; Tárczy, Gyulai et al. 1996; Hangyelné, Gyulai et al. 1996; Mázik-Tőkei, Lelley, Gyulai et al. 1997), és zöld pántlikafűben (Phalaris arundinacea) (Gyulai et al. 2000ab, 2003b). Az előállított klónok között új morfológiai mutánst (Agropyron repens cv. ’Purdue’) írtam le (Tárczy, Gyulai et al. 1996), illetve lignin-tartalomban csökkentett pántlikafű (Phalaris arundinacea) szomaklónt szelektáltam (Gyulai et al. 2003ab). A teljes morfogenetikai elemzést a mézpázsitban végeztem el (3.1.1. ábra), melyben érzékeny felbontással alapvető SEM (Scanning Electrom Mycroscopy) elemzést végeztem el egyszikű fajban (Jekkel, Gyulai, Heszky 1995). A kutatások célja volt, hogy a rizs sótűrésre történő nemesítéséhez szolgáltatott kísérletes adatokat a hazai flóra legsótűrőbb egyszikű fajának in vitro tanulmányozásával (Binh et al. 1989, 1992; Heszky et al. 1989ab). A Puccinellia fajok, ugyanis szénhidrát akkumulációs („méz – pázsit”) mechanizmussal védik ki az extrém környezeti sókoncentrációt. Az Alföldön mind a szoloncsák- (Duna-Tisza köze, Fertő-tó), mind a szoloncsákos szolonyec (Tiszántúli) talajon megél (Stefanovits 1981; Várallyay 2005).
3.1.2. A vadgesztenye (Aesculus hippocastanum) klónozása járulékos embriógenezissel
A vadgesztenye járulékos embriógenezisen keresztül történő klónozásának a célja a mesterséges magtechnológia alginátos beányazásának (Dudits, Heszky 2003) és kriobológiai tárolhatóságának kidolgozása, valamint a vadgesztenye aknázómoly (Cameraria ohridella Deschka et Dimic) (Lepidoptera, Gracillariidae) elleni rezisztencia nemesítés alapanyagának előállítása volt. Az Aesculus nemzetségbe 13 faj tartozik, Kelet- és Délkelet Eurázsia, és Észak- Amerikában mérsékelt éghajlatú területein honos. A közönséges vadgesztenye vagy bokrétafa géncentruma a Balkán-félsziget. Fája 25 méter magasságot is elérő, szabályos koronát nevelő, kedvelt városi szennyezést is jól tűrő, lombhullató díszfa. Ebben a munkában az egysejt-eredetű szomatikus embriók fejlődésének bizonyítását végeztem el (3.1.2. ábra). A kísérletekhez 14 napos (2 mmm) ivaros embriókat izoláltunk, majd 2 mg/l benziladenin tartalmú WPM táptalajon (Lloyd, McCown 1980) 28 napig inkubáltuk (Jekkel, Gyulai et al. 1998), a fejlődő járulékos embriókat szkenning elektron mikroszkós vizsgálatokban elemeztük (Gyulai et al. 1993abc). A járulékos embriók fejlődésük során végig mentek a gömb, torpedó, szív stádiumokon, a teljes növény kifejlődéséig (3.1.2. ábra). Eredményeink azért különös jelentőségűek, mert ellentétben a
30 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás számos vadgesztenye szomatikus és pollen embriógenezis indukcióval (Jörgensen 1989; Chalupa 1990; Radojevic et al. 1989; Radojevic et al. 1989), a zigótikus embriók klónozása járulékos embriógenezisen keresztül (Jörgensen 1989; Kiss J et al. 1992) kevésbé kidolgozott módszere a vadgesztenye in vitro nemesítésének.
3.1.3. A szója (Glycine max) klónozása szomatikus embriogenezissel
A szója szomatikus embriogenezisének 3.1.2. ára. A vadgesztenye (Aesculus hippocastanum) járulékos kidolgozására a hazai embriogenezise. Az ivaros embriódonor fa (a). A járulékos embriók fénymikroszkópos (b-g) és SEM morfológiája (szomatikus embriók) (f) a tripszin inhibitor mentes differenciálódott hajtás csúcsmerisztémával (h) és a teljes klón regenerálása (i) (Jekkel, Gyulai et al. 1998; Jekkel, Kiss, Gyulai et al. 2002). fajták in vitro nemesítéséhez szolgáltatta az alapanyagot.
A szója mintegy 5000 éves, kínai növény, kezdetben csak vetésforgóban használták, és csak Chou-dinasztia idején (i. e. 1134–246) jöttek rá arra, hogy az addig ehetetlen szóját fermentálással ehetővé lehet tenni. Az időszámításunk előtti 2. században ismerték fel a kínaiak, hogy kalcium- vagy magnézium-szulfáttal kicsapatható a főzött szójapüré (tofu). A fermentálással és kicsapással azonban nem távolítható el az összes károsító anyag a szójából, mert tripszin-inhibitorok maradnak benne, melyek gátolják a fehérje emésztést. Ezért a új tripszin-inhibitor-mentes szója nemesítés kiemelt fontosságú (Kurnik, Szabó 1987).
31 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
A szója hazai nemesítése, az iregszemcsei kezdetek után, a Bólyi Állami Gazdaságban (ma: Mezőgazdasági Rt.) az 1980-as években bontakozott ki számos fajta nemesítésével (Evans, Crusader, BS-31, Bólyi 6, Borostyán, Boróka, Bóbita stb)
Vizsgálatomban, a regeneráció morfológiai elemzését végeztem el, igazolva a szomatikus embriógenezisen keresztüli klónozást (3.1.3. ábra). Az előállított nemesítési alapanyagok nemesítése a klasszikus módszerekkel folyik tovább (Hódos-Kotvics, Heszky 1989).
3.1.3. ábra. A szója (Glycine max) szomatikus embriógenezise, sziklevél eredetű (a) tenyészetben. Bal oldali tábla: A megnyúlt nem-embriogén (b) sejtek mellett kifejlődő kompakt embriogén sejtek (c), embriogén (inekvális) osztódáson- (d, e), a három (f) -, és négy (g) sejtes, majd gömb (h) és szív (i) stádiumú embriófejlődésen keresztűl regenerálódnak. Jobb oldali tábla: Számos esetben embrió kimérák (a) fejlődnek, a kifejlett levélre jellemző mozaikos epidermisz elemekkel (levélszőrök, b, c) sztómák (f), illetve újabb, járulékos merisztémák megjelenésével (e, f), és embriók (g, h, i) kifejlődésével (Gyulai et al. 1993a).
További fajok elemzésére, helyszűke miatt, csak utalok: a törpenövekedésű tarackbúzaklón (Agropyron repens cv. Purude) (Gyulai et al. 1995abc; Tárczy, Gyulai et al. 1996; Hangyelné, Gyulai et al. 1996; Mázik-Tőkei, Lelley, Gyulai et al. 1997), valamint a lignin tartalomban csökkentett zöld pántlikafű (Phalaris arundinacea) klónjainak éretlen kalász-, illetve buga kezdeményéből indított szomatikus embriógenezisen keresztüli előállítására (Gyulai et al. 2000a, 2003b); valamint az ivarsejt eredetű, dihaploid paprika (Capsicum annuun) regeneránsok (Gyulai et al. 1999ab, 2000b; Gémesné et al. 2000, 2001) molekuláris klónelemzésére.
32 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
3.2. Növényi fitoremediáció 3.2.1. A 35S-gsh1 transzgénikus szürkenyár klónok stabilitásának meghatározása
A több mint tíz éve vegetatív úton fenntartott, gshI-transzgénikus szürkenyár klónokban (Gullner, Kőmíves 1998; Kőmíves et al. 1998) szükséges volt igazolni a gshI transzgén jelenlétét (Gyulai et al. 2005), nehézfém felvételi kapacitását (Gyulai et al. 2005) és aktivitását (expresszióját) (Bittsánszky, Gyulai et al. 2006). Emellett el kellett végezni egy klónstabilitási vizsgálatot, melyhez AFLP- módszert alkalmaztunk, klónonként 10 egyedből bulk-ot képezve Michelmore et al. (1991) módszere
3.2.1. táblázat Az fAFLP fragmentumok száma a gsh1 transzgénikus szürkenyár (P. canescens) 11ggs és 6lgl klónjaiban, valamint a nem transzformált kontroll (WT) klónban. A szelektív primerkombinációk: az Mse- CAC primer kombinálva az Eco-AAT (a), Eco-ACC (b), és Eco-AGT (c) primerekkel; valamint az Eco-AGT primer kombinálva az Mse-CAA (d), Mse-CAG (e), Mse-CAT (f), Mse-CCC (g), Mse-CCT (h), Mse-CGA (i), Mse-CGC (j), Mse-CTA (k) és Mse- CTC (l) primerekkel (ld. 2.1. táblázat) (Gyulai et al. 2005). klónok az fAFLP fragmentumok száma szelektív primerpáronként (a-l) összes a b c d e f g h i j k l frag. # 11ggs 25 6 17 30 25 35 16 14 11 9 17 21 226 6Lgl 25 6 17 30 25 35 19 14 11 9 17 21 229 WT 25 6 17 30 25 35 17 14 11 9 17 21 227 Összes: 662 szerint. A klónok stabilitását fAFLP (fluorescent amplified DNA fragment length polymorphism) eljárással vizsgáltuk Vos et al. (1995) eljárás alapján, módosításokkal (Cresswell et al. 2001; Skøt et al. 2002; Gyulai et al. 2005) Az emésztéshez és ligáláshoz az EcoRI-MseI restrikciós endonukleázpárt alkalmaztuk. A 24 szelektív AFLP primerkombinációból (ld. 2.1. táblázat) 12 kombináció adott éles és reprodukálható AFLP mintázatot (3.2.1. ábra). Összesen 682 AFLP fragmentet detektáltunk (3.1.1. táblázat). A szelektív primer párok átlagosan 56,6 fragmentet szaporítottak fel, amely hasonló nagyságrendű a feketenyárban (P. nigra) megfigyelt fragmentum számhoz, ahol két primer pár összesen 104 fragmentumot szaporított fel (Smulders 3.2.1. ábra. Példa a gsh1 transzgénikus szürkenyár (11ggs és 6Lgl) és a nem transzformáns kontroll klónok fAFLP et al. 2001). A leghatékonyabb primer fragment analízisére (monomorf EcoAGT – MseCAT) (a) és (polimorf EcoAGT – MseCCC) (150 – 430 bp) (b). A kombinációnak az Eco-AGT / Mse-CAT nyilak a polimorf fragmenteket jelölik (Gyulai et al. 2005).
33 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás bizonyult, amely klónonként 35 fragmentumot szaporított fel. A 682 fragment közül 4 volt polimorf (0,6 %), amelyek közül egy a nem transzformált kontroll nyárban, három a 6lgl transzgénikus klónban amplifikálódott az Eco-AGT / Mse-CCC primerpárral (3.2.1. ábra). Az eredmények szerint a 11ggs klón AFLP-vel detektált genetikai eltérése 0,4% a kontrollhoz képest, a 6lgl klón eltérése 0,8 %. Fossati et al. (2005) Populus fajokkal végzett vizsgálataiban két – azonos fajba tartozó – klón között az AFLP fragmentumokban magasabb, 15 %-os eltérést azonosított. Összefüggés tapasztalható a genom mérete és az AFLP fragmentumok száma között. Egy korábbi, búzán (Triticum aestivum L.) végzett kísérletünkben az Eco-AGT / Mse-CAC primer pár amplifikálta a legtöbb AFLP fragmentet, összesen 47-et. A búza genom mérete igen nagy (2n = 6 = 42; 16 109 bp, ami 16,58 pg-nak felel meg a 965 Mbp =1 pg DNS egyenlőség alapján számolva) a nyár genom méretéhez képest (2n = 4 = 38; 5,5 108 bp; 2C = 1,1 pg) (Cervera et al. 2001; Taylor 2002). Az eredmények bizonyítják, hogy a kísérleteinkben alkalmazott P. canescens klónok genetikailag stabilak, a rügymutáció mértéke a transzgenikus nyárfában alacsony (0.8 %) eltérően a gyümölcsfáktól.
3.2.2. Transz/gén reaktíváció DHAC-indukált demetilációval
A nyárfa genetikai kutatása jelentős, mert, kis genomú (5.5 x 108 bp), alig négyszerese az Arabidopsis genomnak (’a fák arabidopszisza’), minden faja diploid (2n = 38) (Taylor 2002). Az első fás növény, amelyről EST könyvtárat készítettek a P. tremula x tremuloides, a P. tremula és a P. trichocarpa volt (www.populus.db.umu.se). A nyárfa RAPD, SSR és AFLP markereken alapuló genetikai térképe szintén elkészült további kvantitatív tulajdonságok térképezésére (Taylor 2002). A nyárfa teljes genom szekvenálása is elkészült, a P. trichocarpa termős ’Nisqually-1’ klónján, amelyet a nyugat- washingtoni Nisqually folyó mellett gyűjtöttek (http://www.jgi.doe.gov/poplar/). Nem meglepő, hogy az első transzgénikus fa szintén a nyár volt, amelyet 1987-ben állították elő, a bevitt tulajdonság a glifozát rezisztencia volt (Fillatti et al. 1987). A vizsgálatainkban alkalmazott gshI szürkenyár klónokat (INRA 717-1-B4) fitoextrakciós kapacitás növelésére állították elő (Leple et al. 1992, 2000), és igazolták fitoextrakciós kapacitásukat (Arisi et al. 1997; Noctor et al. 1998ab; Gyulai et al. 2005). A legstabilabb transz/gén konstrukciók is ki vannak téve a gén-csendesítés (gene silencing) hatásának, amely elsősorban a DNS metilációján keresztül megy végbe a DNS metiltranszferáz enzim (CMT) katalízisével (Linn et al. 1990; Wolfe, Matzke 1999). A CMT-inhibitor kezelésnek kitett növényekben a metilációs szint csökkenése igazolt, vizsgálatainkban ezért a transz/gén reaktivációban hatékonynak bizonyult, DNS metiltranszferáz (CMT) enzim gátlásán keresztül ható DHAC (5,6-dihidro-5'-azacitidin hidroklorid) (Elmayan, Vaucheret 1996; Finnegan et al. 1998; Castilho et al. 1999; Cao et al 2000) indukciót alkalmaztuk a
34 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
11ggs és 6lgl gshI-transzgénikus nyárfaklónokban, valamint a nem-transzformáns klónban. A mérésekben reverz transzkripciós kvantitatív PCR-t (qRT-PCR) alkalmaztunk (Livak, Schmittgen (2001) módszere szerint. A transzgén-gshI relatív expressziós szintje a 6lgl klónokban 13,5-szor nagyobb volt, mint a 11ggs klónban (1,0) a DHAC kezelés nélkül. Ez a különbség a demetiláció hatására megkétszereződött a 6lgl klónban (23,7), míg a 11ggs klónban csökkent (0.4). A transzgén kópiaszámának meghatározásakor kiderült, hogy e 6lgl klón magas expresszós szintje egy 60%-kal alacsonyabb kópiaszámú transzgén- beépülés (1.0 – 6lgl) ellenére érvényesült (1.6 - 11ggs) (3.2.2. táblázat).
3.2.2. táblázat. A gshI (E. coli) transzgén relatív kópiaszáma a transgénikus szürkenyár (P. x canescensm) klónoknban: 11ggs (a) és 6lgl (b), az aktin gén kontrolljában. (a próbák szekvenciájához ld. 2.6. táblázat). Az RT-qPCR elemzéshez a 2-ΔΔCt módszert (Livak, Schmittgen 2001) alkalmaztuk, klónonként három ismétlésben (Bittsánszky, Gyulai et al. 2007a). (a) gshI actin ΔCt ΔΔCt gshI kópiaszám klónok Ct SD Ct SD érték SD érték SD érték -/+ tartomány 11ggs/1 22,71 23,02 -0,31 11ggs/1 22,82 23,11 -0,29 11ggs/1 22,59 22,89 -0,3 11ggs/2 22,33 22,88 -0,55 11ggs/2 22,44 22,88 -0,44 11ggs/2 22,11 22,70 -0,59 átlag 22,50 0,26 22,91 0,14 -0,41 0,13 -0,75 0,13 1,69 1,54 1,85
(b) gshI actin ΔCt ΔΔCt gshI kópiaszám klónok Ct SD Ct SD érték SD érték SD érték -/+ tartomány 6lgl/1 23,9 23,76 0,14 6lgl/1 23,68 23,28 0,4 6lgl/1 23,66 23,07 0,59 6lgl/2 23,86 23,55 0,31 6lgl/2 23,86 23,32 0,54 6lgl/2 23,56 23,49 0,07 átlag 23,75 0,14 23,41 0,24 0,34 0,21 0 0,21 1 0,86 1,16
A nyár saját gsh1 génjének relatív expressziós szintje is igen nagymértékű emelkedést mutatott a demetilációs kezelések hatására (19.7-szeres expresszió növekedés) (3.2.3. táblázat). A 11ggs klónban a nyár-gsh1 gén preferencia hatását 3.2.3. táblázat. A gshI transzgén és a gsh1 nyárfagén relatív expressziója a DHAC (10-4 mol, 7 nap) kezelt és kezeletlen transzgénikus szürkenyár (P. x tapasztaltuk a 2.0- canescens) klónokban (11ggs, 6lgl), valamint a nem transzformáns (WT) klónban (Gyulai 2007; Bittsánszky, Gyulai et al. 2007). szeres rel. expresszió gshI-transzgén (2−ΔΔCt) gsh1-nyárfagén (2−ΔΔCt) növekedéssel, szemben klónok nem- DHAC- növekedés nem- DHAC- Növekedés
kezelt kezelt X kezelt kezelt x a gshI-transzgén 11ggs 1.0 0.4 0.4 3.1 2.0 2.5 reaktiváció 0.4-szeres 6lgl 13.5 23.7 1.8 1.6 13.9 8.7 WT - - - 1.0 19.7 19.7 értékével. A 6lgl
35 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás klónban a gshI-transzgén mutatott magasabb demetilációs induktivitást (23,7), mint a saját nyár-gsh1 génje (13,9). A 6lgl klónok gshI és gsh1 génexpressziójának összehasonlítása alapján igazolható, hogy a gsh1- nyárfa gén szignifikáns mértékben volt reaktíválhatóbb (2,6-ról 13,9-re, amely 8,6-szoros növekedés), mint a transzgén, amely magas expressziós szintje csak 1,8-szorosára (23,7) nőtt. Génkompetíció, a gshI-transzgén és a gsh1-nyárfagén kompetícóját jelzi, hogy a gsh1-nyárfagénnek a nem-transzfomált (X) klónban mért DHAC-indukált génexpresszió-növekedését (1,0-ről 19,7-re, 19,7-szeres relatív expresszió növekedés), sem a 11ggs (0,8-ról 2,0-re, 2,5-szörös expresszió növekedés), sem a 6lgl klón (1,6-ról 13,9-re, 8,7-szeres expresszió növekedés) nem múlta felül. Mindezek mellett, a DHAC-nem- kezelt gshI-transzformált 6lgl klón magas transzgén-gsh1 expressziós szintje (13,5-ször magasabb a 11ggs klónban mért értéknél) igazolja a 6lgl klón hatékonyabb fitoremediációs kapacitását, amelyet in vitro nehézfém felvételi eredmények is alátámasztanak (Gyulai et al. 2005). A 6lgl klónban mért nagyobb mértékű gshI aktivitás (szemben a 11ggs klónnal) a transzgén konstrukció eredménye, amely tartalmazott egy borsó rbcS (RuBPCase SSU: small subunit of RuBPCase, ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase) eredetű tranzit peptid szekvenciát is, amely elősegítette a kloroplasztiszokban történő GSH akkumulációt (Bruce 2001; Arisi et al. 1997; Noctor et al. 1998ab). Az eredmény egyben igazolja a tranzit-peptidek kiemelkedő szerepét a génkonstrukciókban, hasonlóan a dohányban vizsgált tranzit peptid konstrukciókhoz (Creissen et al. 1996; Bruce 2001), illetve erősítik a kloroplasztisz transzformációk rendkívüli jelentőségét (Maliga 1995). Nem zárható ki a két transzgén szelektív metilációja sem, ahogy ez transzgén piramidálás (egymást követő gén transzformáció azonos növénybe) során tapasztaltó volt (Yang et al. 2005).
A DNS metilázok metil (CH3) csoport szintézisét katalizálják különösen a cytozin-C5 (EC
2.1.1.73), a cytozin-N4 (E.C. 2.1.113), illetve az adenin-N6 (E.C. 2.1.2.72) atomján (Cheng, Roberts
2001). A metil (CH3) csoport eredete az -adenosyl methionin-ból származik (AdoMet-függő metiltranzferázok), amelyek mind a gén, mind a transzgén metilációját katalizálják (Linn et al. 1990; Kumpatla et al. 1997; Castilho et al. 1999). A DNS metiláció forró pontjai a génpromoterek CpG és a CpNpG szekvenciái a transzkripcionális géncsendesítést (down-reguláció, hipermetiláció) eredményezve (transcriptional gene silencing TGS) (Elmayan,Vaucheret 1996). Ez a folyamat is indukálható DNS metilező szerekkel (pl. 3- aminobenzamid) (Zardo et al. 1999). A vizsgálatainkban alkamazott DHAC ennek a folyamatnak az ellenkező hatását indukálja (gén up-reguláció, DNS hipometilezés, demetiláció), hasonlóan a többi (humán rákterápiában is alkalmazott; Fan et al. 2005) MTáz inhibitorokhoz (zebularin; 5-azacitidin (5- azaC); 5-aza-2’-deoxycytidine), melyek közzül csak a DHAC hidrolizikus stabilitása igazolt (több napos kezelésekhez) (Cao et al. 2000; Chen, Pikaard 1997; Cheng, Roberts 2001). A DHAC demetilációs hatásmechanizmusa egyértelmű, kovalens komplexet képez az MTázokkal, ezzel deaktiválja az enzimet, akár a citoszolban, akár a DNS-be inkorporáltan van jelen (Goffin, Eisenhauser 2002; Bird 2002; Issa, Kantarjian 2005). A demetiláció egyéb genetikai hatása számtalan
36 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás esetben igazolódott a vernalizáció helyettesítésétől a különböző morfogenetikai hatásokig (Finnegan et al. 1998; Horváth et al. 2003). A hosszú idejű (28 nap) DHAC kezelt nyárfamintákban járulékos gyökérfejlődést tapasztaltunk, melynek kiértékelése folyamatban van. Petunia tenyészetekben a DHAC hajtás indukciós hatása ismert (Prakash et al. 2003). A DHAC-indukált gsh1 gén reaktíváció végső célja egy alternatív lehetőség kidolgozása volt a transzgénikus gshI nyárfaklónok kiváltására (Bittsánszky, Gyulai et al. 2007; Gyulai 2007), melynek szabadföldi alkalmazása folyamatban van. Eredményeink igazolják, hogy a DHAC-indukált demetiláción keresztüli transz/gén-reaktivációval növelhető a stressz-indukálható gének expressziója. Annak köszönhetően, hogy a DNS metilációs mintázata öröklődik („epigenetikus memória”) (Bird 2002), a DHAC-kezelt nyárfa új forrása lehet a fitoextrakciós alkalmazásokhoz, és egyben alternatív módszer lehetőségét ad GMO – kontra nem- GMO kérdéshez.
3.2.3. Új mikroszatellita genotípusú feketenyár (Populus nigra) klónok molekuláris azonosítása
A nyárfajok (Populus ssp) extrém kisméretű genomja (2n = 4x = 38; 5.5 108 bp; 2C = 1.1 pg) nagyfokú genetikai stabilitással (3.1.2. fejezet) párosul. A kutatások célja a feketenyár (Populus nigra) genetikai variabilitásának növelése volt haploid (n) indukcióval, portoktenyészetben (Kiss J et al. 2001), két portok-donor klón (N-SL és N-309) alkalmazásával, új mikroszatellita genotípusú feketenyár (Populus nigra) klónok előállítására és molekuláris azonosítására. A feketenyár transzgénikus nemesítése, ellentétben a szürkenyárral, nem kidolgozott, részben a feketenyár nehezebb Agrobacterium transzformálhatósága miatt, részben pedig, a nyugat-európai kisebb volumenű termesztése miatt, ami a rossz széltűrésének, illetve a gyengébb papíripari felhasználhatóságának köszönhető (ld. Finnországban az egyeduralkodóan termesztett, és húsz év alatt vágásra érett P. tremula tremuloides ültetvényeket, melyek fája a papíriparban értékesebb, mint a fenyőé) (2007. személyes felmérés). A kontinentális éghajlaton (ld. Magyarország), azonban a feketenyár fontossága messze felülmúlja a többi nyárfáét (növekedési erély, fahozam, stb.) (Kevey 1999; Bordács et al. 2002; Mátyás 2006). A kutatásaink célja, ezért, új mikroszatellita genotípusú (Dayanandan et al. 1998; Cervera et al. 2001; Kiss J et al. 2001) feketenyár klónok molekuláris azonosítása volt, későbbi fitoremediációs alkalmazásra. A kodominánsan öröklődő mikroszatellita (SSR) allélpolimorfizmus érzékeny markerrendszer, amelynek segítségével megbízhatóan azonosítható a klónok genetikai azonossága, és klonális variabilitása (Rahman, Rajora 2001; Cervera et al. 2001). Az alkalmazott ALF (automatic laser fluorometer) módszer, pedig, az egyik legérzékenyebb fragmentum elemző eljárás (Röder et al. 1998; Gyulai et al. 2006). A genom mikroszatellita szakaszaiban az ismétlődő belső szekvencia 1-5 nt hosszúságú mono- (A)n, di- (AT)n, tri- (ATC)n, tetra (AGTC)n és pentamer (AGTCT)n felépítésű.
37 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
3.2.4. táblázat. A feketenyár (Populus nigra) gametoklónok mikroszatellita allél diverzitása öt SSR lokusz, húsz allél, 280 szekvenciája alapján (Bittsánszky, Gyulai et al. 2007).
Mikroszatellita lokusok
SSR WPMS2 WPMS4 WPMS6 WPMS20 PTR4 Méret (p) 200-244 242-268 168-174 224-257 194 PIC érték 0,600 0,567 0,500 0,680 0.00 ismétlődés (GA)23 (GT)25 (GT)24 (TTCTGG)8 (TC)17 Allél (bp) 200 214 228 240 244 242 248 256 260 262 286 168 174 225 231 238 244 251 257 194 1 2 N-SL 2 4 N-SL 3 5 N-SL 4 6 N-SL 5 7 N-SL 6 10 N-SL 7 14 N-SL 8 15 N-SL 9 16 N-SL 10 17 N-SL 11 18 N-SL 12 19 N-SL 13 20 N-SL 14 22 N-SL 15 23 N-SL 16 28 N-SL 17 41 N-SL 18 42 N-SL 19 43 N-SL 20 44 N-SL 21 45 N-SL 22 46 N-SL 23 47 N-SL 24 49 N-SL 25 51 N-SL 26 54 N-SL 27 55 N-SL 28 59 N-SL 29 60 N-SL 30 C - N-SL 31 97 N-309 32 98 N-309 33 99 N-309 34 101 N-309 35 102 N-309 36 104 N-309 37 C - N-309 Összes fragm. 37 2 7 36 1 7 2 2 3 32 4 37 37 3 3 31 26 3 7 37
38 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
Ezek az alapszekvenciák 10-80 egymás utáni kópiaszámmal (tandemszám), megközelítően 100 bp végső hosszúságban fordulnak elő a genomban, fajspecifikus (Röder et al. 1998) 18- 28 bp hosszúságú 5’ és 3’ irányból is lezáró határoló szekvenciával. A centromer és telomer régiók szatellita DNS szekvenciái a genetika legújabb területén a fraktál genetikában kaptak szerepet, mivel szerepük igazolódott a heterokromatin - ezzel a kromoszómák - kialakításában, valamint a mikroRNS-ekhez hasonló mRNS kódoló kapacitásában (Pellionisz 2006). A klónális variabilitás SNP (single nucleotide polymorphism) elemzésére a kontroll NSL-30 klónból a WPMS-20 lókuszon kapott frgamentumot agaróz gélből visszaizoláltuk és két irányból megszekvenáltuk. A szekvencia BLAST elemzése a génbanki AJ297293 szekvenciával mutatott hasonlóságot (3.2.2. ábra), az ismétlődő szekvenciamotívum (ctggtt)n azonban szekvenált mintában csak 3-szor ismétlődik, míg az adatbázisban szereplő mintában 8-szor (3.2.2. ábra). A kimutatott
(ctggtt)5 deléció, a haploid indukció során végbement gametoklónális variabilitás (Dudits, Heszky 2003, 2005) sikeres fixálásának az eredménye (Bittsánszky, Gyulai et al. 2007).
3.2.2. ábra. Szekvencia elemzés a feketenyár (Populus nigra) NS-L-30 klónban, a WPMS-20 mikroszatellita lokuszon (ctggtt)n, a génbanki adat (AJ297293) összehasonlításával. Az SNP nukleotidokat, az ismétlődő szekvenciát (a deléciókkal) kiemelés jelzi (Bittsánszky, Gyulai et al. 2007b).
A felnevelt haploid feketenyár klónok (1-35) genetikai polimorfizmus elemzését öt (előzetesen tesztelt primersorozatból kiválasztott) SSR lokusz allél diverzitásával jellemeztük (3.2.4. táblázat). Az öt SSR marker közül három mutatott polimorfizmust (WPMS-02; WPMS-04; WPMS-20). Összesen 20 SSR allél 280 szekvenciáját azonosítottuk, egy-egy lókuszon 1-6 allélgyakorisággal: WPMS-02 (5 allél), WPMS-04 (6 allél), WPMS-06 (2 allél), WPMS-20 (6 allél) és PTR-04 (1 allél). Nem várt eredményt mutattak a PIC értékek (3.2.4. táblázat). A leginkább polimorf lókusznak a WPMS-20 bizonyult, mert itt hat nukleotid ismétlődése adja a mikroszatellita régiót holott a dinukleotid ismétlődésű régiók (mint a többi öt lókusz) elméletileg sokkal változékonyabbak. A természetes feketenyár populációk nagyobb variabilitást mutattak eredményeinknél, valószínűleg az
39 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás aktívabb rügymutáció következtében, hasonlóan a nagymértékű genetikai polimorfizmus detektálásához a P. cathayana klónjai között is (Schoot et al. 2000).
Az ALF Express vizsgálat értékelésével az SSR fragmentek léte / hiánya alapján elvégzett klaszter analízisben (SPSS 11) a két portok-donor nyárklón (N-SL, N-309) és utódai külön csoportba rendeződtek (3.2.3. ábra). A huszonkilenc N-SL szomaklón között 5 klóntípus különült el. Huszonhárom azonos genetikai mintázatot mutatott a kontroll klónnal, külön csoportba került a 17. és 24. valamint a 2. és 14., és egytagú csoportba kerültek a 10. és 15. klónok (3.2.3. ábra). A szomaklónoknak összesen 26%-a mutatott genetikai változást. A hat N-309 szomaklón között három klóntípus különült el, öt klón egy csoportba került a kontrollal és egytagú csoportot alkotnak a 35. és 36. klónok; a változás 33%-os. A huszonhárom N-SL klónnak a kontrollal egyező genotípusa igazolta a feketenyár nagyfokú genetikai stabilitását, melyet a létrehozott SSR-klóntípusok előállításával sikerült feltörni és új nemesítési alapanyagot szolgáltatni a nyárfanemesítés, illetve a fitoremediáció számára (Bittsánszky, Gyulai et al. 2007).
3.2.3. ábra: A feketenyár (Populus nigra) gametoklónok (1-37) molekuláris dendrogramja (Rel. G.T. – relatív genetikai távolság) (Bittsánszky, Gyulai et al. 2007b).
40 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
3.3. Kultúrnövények archeogenetikai stabilitása
Molekuláris genomelemzés és genotípusazonosítás: A fenotípus, illetve genotípus azonosításának célja a faj, illetve a faj alatti rendszertani kategóriák egyedeinek (alfaj - subspecies, ssp; fajta, változat - varietas, var.; termesztett változat - cultur varietas, cv.; mutáns - Mn; regeneráns - Rn; transzfrománs -Tn) jellemezése és molekuláris azonosítása. A moroflógiai (fenotípusos) bélyegek (markerek) két nagy csoportját a taxonomiai- morfológiai (Linné 1753), illetve a növénynemesítői, növényfajta-oltalmi, DUS-vizsgálati (Distinctness - megkülönböztethetőség; Uniformity - kiegyenlítettség; Stability genetikai stabilitás) bélyegek alkotják, beleértve a CPVO (Community Plant Variety Office), UPOV (International Union for the Protection of New Varieties of Plants) és CPVR (Community Plant Variety Rights) irányelveket (Sharma et al. 1999; Nagy, Gyulai, Marton 2000; Purnhauser, Gyulai et al. 2000ab; Tar et al. 2002). A genotípus azonosításhoz három nagy markercsoport áll rendelkezésre, a biokémiai (izoenzim-markerek) (Markert, Moller 1959; Ganapathy, Scandalios1973), a restrikciós endonukleázok (1978. évi Nobel díj: W Arber, D Nathans, HO Smith) (Arber, Dussoix 1962; Messelson, Yuan 1968) alkalmazásán alapuló genetikai RFLP (restriction fragment length polymorphisms) (Botstein et al. 1980) és RFLP-PCR (Deng 1988; Haliassos 1989), valamint a PCR-alapú genetikai markerek (3.3.1. ábra). Az 1993-ban kémiai Nobel díjjal elismert (KB Mullis) PCR-módszer (Polimerase Chain Reaction, a DNS-polimeráz enzim láncreakciója) (Saiki et al. 1985, 1988; Mullis et al. 1986; Mullis, Faloona 1987) talán az első igazán "genetikai" felfedezés, amely először lépte át a biokémia megismerési határait. Az első közleményekben még az Escherichia coli baktérimból konvencionális úton izolált DNS polimeráz-I enzimet (Klenow fragment) alkalmaztak, 37 °C-on, minden PCR ciklushoz történő külön adagolással. A módszer automatizálását a Thermus aquaticus, a geizirek forró vizéből izolált, hőrezisztens baktériumfaj DNS polimerázának (Taq-polimeráz, a baktérium faj latin nevének kezdőbetűiből képezve) az alkalmazása (Lawyer et al. 1989) tette lehetővé (Saiki et al. 1988). További új, hőstabil baktériumfaj DNS polimeráz enzimét alkalmazták sikeresen (Thermus flavis, Thermus termophilus, Thermococcus litoralis, Thermotaga maritima, és különösen a Pyrococcus furiosus), valamint számos új technikai újítással könnyítették a PCR reakciót (a PCR készülék fedelének fűtésével szükségtelenné vált az olajfedés, valamint a hőelemek fejlesztésével a termosztálási ciklus sebessége vált gyorsíthatóvá, stb.) (Saiki et al. 1988).
41 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
Ismétlődő DNS szakaszok a genomban: A PCR módszerrel a genom tetszőleges DNS szakasza szaporítható fel, megfelelően megválasztott primerekkel és reakció-körülményekkel. Módszertanilag az első csoportba a kódoló gének elemzésére végzett eljárások tartoznak, amelyekben ismert, cDNS, illetve genomikus DNS-szekvencia alapján szintetizált, helyspecifikus oligonukleotid primerekkel készül a PCR-reakció. Ezen belül két alaptechnika vált ismertté: SCAR (sequence characterized amplified region PCR) (Paran, Michelmore 1993) és az STS (sequence tagged site-PCR) módszer (Olson et al. 1989). A másik nagy csoportba a random-, illetve a DNS szatellitek szekvenciájára tervezett PCR reakciók tartoznak, amelyekkel a genomra jellemző DNS-mintázat (fingerprint) nyerhető (Garcia-Mas et al. 2004). A random szekvenciájú primereket alkalmazó három PCR-alapú technika közel egy időben alakult ki: a 4-6 bp oligonukleotid primert alkalmazó DAF (DNA Amplification Fingerprinting) (Caetano-A. et al. 1991), a 10 bp hosszú RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) (Williams et al. 1990), valamint a 18-24 bp hosszú primereket alkalmazó AP-PCR (Arbitrarily Primed-PCR) (Welsh, McCleiland 1990, Owen, Uyeda 1991) (in Gyulai et al. 1997; Törjék et al. 2001). A lehetséges primerek kombinatorikusan nagy számát mutatja a RAPD eljárás, amelyben a tíz bp hosszúságú primer, a négy DNS bázis tetszőleges kombinációjával előállított, 104 féle kombinációs készlet (ezt a számot csökkenti az optimális max. 60 %-os GC tartalomra történő kiválogatás, illetve a primer-dimer képződés elkerülése) (3.3.1. ábra). A nem-random, szekvencia-specifikus PCR technikák közül a mikroszatellita régiók polimorfizmusát kimutató mikroszatellita SSR-PCR (Simple Sequence Repeat PCR (Zhao, Kochert 1993; Gupta et al. 1994), az inter-mikroszatellita ISSR-PCR (Inter Simple Sequence Repeat PCR) (Zietkiewicz et al. 1994), valamint az ezzel rokon, hazai fejlesztésű R-PCR (Restricted-PCR) (Puskás et al. 1994; Puskás, Bottka 1995) eljárások váltak széles körben alkalmazhatóvá. A fragmentum és szekvencia elemzését egy további technikai újítás a cy5- jelzett primert alkalmazó ALF (Automated Laser Fluorometry) módszer jelentette (Röder et al. 1998; Huang et al. 2002) (in Szabó, Gyulai et al. 2005ab). Az SSR-PCR eljárásban a primer minden esetben a genom szekvenciájára, illetve a határoló DNS régiók konzervatív szekvenciáira komplementer oligokat alkalmaz (Glazko et al. 1999). Az ISSR illetve R-PCR eljárásban a primer 3' végét (R-PCR) zárják le vagy az 5', vagy 3' végen, 2-4 bp hosszú ’horgony’ szintézisével (ISSR-PCR), ami által a primer képes két SSR szekvencia közötti DNS szakasz felismerésére és amplifikálására (Zietkiewicz et al. 1994) (in Lágler, Gyulai et al. 2005). A random és nem-random technikák közötti átmenetnek
42 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás tekinthetők a az ISJ-PCR (Intron Splice Junction PCR (Weining, Langridge 1991), és az AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) (Vos et al. 1995) módszerek.
PCR (1985/7)
Alu-PCR RT-PCR A-PCR SPAR InSitu-PCR STS (1990) (1987) (1988) (1991) (1989)
IRS-PCR AP-PCR RAPD DAF SCAR (1991) (1990/1) (1990) (1991) (1993)
VNDR, VNTR S S R A F L P (1994) (1995)
OF, MF, MPF, IMA, IRA I S S R, AMP-PCR R F L P (1994) (1980)
R-PCR (1994)
3.3.1. ábra. A legfontosabb PCR technikák eredete és kapcsolata. Röviditések: A-PCR, Anchored-PCR (Loh et al. 1989); AFLP, Amplified Fragment Length Polymorphism (Vos et al. 1995); Alu-PCR, Alu elem PCR (Ledbetter et al. 1990); AMP-PCR, Anchored Microsatellite Primed PCR (ld. ISSR); AP-PCR, Arbitrarily Primed-PCR (Welsh, McCleiland 1990; Owen, Uyeda 1991); DAF, DNA Amplification Fingerprinting (Caetano-A. et al. 1991); IMA, Inter Microsatellite Amplification (ld ISSR); InSitu-PCR, (Ray et al. 1991); IRA, Inter Repeat Amplification PCR (ld. ISSR); IRS-PCR, Interspersed Repetitive Sequences PCR (Nelson 1989); ISSR, Inter Simple Sequence Repeats (Zietkiewicz et al. 1994); MF, Microsatellite Fingerprinting (ld. SSR); MPF, Microsatellite Primed Fingerprinting (ld. SSR); OF, Oligonucleotide Fingerprinting (ld. RAPD); PCR, Polymerase Chain Reaction (Saiki et al 1985; Mullis, Faloona 1987); RAPD, Randomly Amplified Polymorphic DNA (Williams et al. 1990); RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphysm (Botstein et al. 1980); R-PCR, Restrictive PCR (Puskás et al. 1994; Puskás, Bottka 1995); RT-PCR, Reverse Transcription PCR (Veres et al. 1987; Todd et al. 1987); SCAR, Sequence Characterized Amplified Region (Paran, Michelmore 1993); SPAR, Single Primer Amplification Reaction (ld. AP- PCR, DAF, RAPD); SSR, Simple Sequence Repeats, illetve Single Primer Amplification Reaction PCR (Gupta et al. 1994); STS, Sequence Tagged Site (Olsen et al. 1989); VNDR, Variable Number of Dinucleotide Repeats (ld. VNTR); VNTR, Variable Number of Tandem Repeats (Nakamura et al. 1987), syn. HVR: Highly Variable Sequences of DNA (Jeffreys 1987) (Gyulai et al. 1997a).
Az (Internal Transcribed Spacer) módszer (ITS1-5.8S-ITS2) a sejtmagban kódolt, riboszómális, evolúciósan rendkívül konzervatív rDNS szekvenciák elemzésére ad lehetőséget, amely a mitokondriális (mtDNS) elemzések mellett a legfontosabb marker rendszere (3.3.2. ábra) az evolúció genetikának (Hsiao et al. 1995; Garcia-Mas et al. 2004). Az rDNS ITS-szakaszainak citológiai elnevezése a NOR (Nucleolus Organizer Regions), ugyanis ezek a szekvenciák alkotják a genom citológiai felbontásában a sejtmagvacskát (nucleolus). Nem minden kromoszómán van rDNS szakasz, pl. a humán genomban csak öt kromoszóma (a 13, 14, 15, 21 és a 22) hordoz NOR régiót (Hillis, Dixon 1991). A genomelemzés kimutatási határa finomítható az elválasztási módszer megválasztásával: agaróz, poliakrilamid, denaturáló poliakrilamid, grádiens poliakrilamid gélelektroforézissel; illetve a specifikus „ready-gélek” (ALF-, illetve ABI poliakrilamid alapú gélei), valamint a
43 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás legújabb emulziós PCR alkalmazásával. A kimutatási érzékenység utolsó lehetősége a festési eljárás megválasztása a klasszikus etidiumbromid (EtBr), ezüstfestés, illetve az újabb fejlesztésű DNS-be interkalálódó festékek alkalmazásával, amelyek az EtBr kimutatási határánál 10-1000-szer kisebb DNS mennyiséget is kimutatnak (SybrGreen, EvaGreen, stb) (Bassam et al. 1991), különösen a detektálás hatékonyságának növelésével (ld. gél szkennerek).
3.3.2. ábra. A riboszómák fehérjéit kódoló sejtmagi (nDNS) géncsoportok (rDNS) szerveződése. A rDNS gének (pre-rDNS) felépítése a genomban, és transzlációja általában (a) (Lodish et al. 2004), és az evolúció különböző szintjein (b). A 18S, 5.8S és 28S (a növényekben 25S) egy géncsoportban írodik át a nem-kódoló szpészerekkel együtt (~ 10 kbp hosszú; 1.300 – 4.000 kópia/sejt); a növények sejtmagi 5S rDNA-e más lókuszon található. Roviditések: ETS (külső átíródó nem-kódoló szekvencia - external transcribed spacer); ITS (belső átíródó nem- kódoló szekvencia - internal transcribed spacer); NTS (nem átíródó szpészer szekvencia – non transcribed spacer, mtDNS, mitokondrium DNS; cpDNS, kloroplasztisz DNS) (eredeti).
Az eukariota növényi és állati genom sajátsága, hogy a kódoló DNS szakaszok melletti nagy mennyiségű (akár a totál genom 50-60 %-áig), funkció nélküli (?), ismétlődő (repetitív) DNS szakaszok előfordulása (Jeffreys et al. 1985, 1988, 1990; Nakamura et al. 1987; Tóth et al. 2000; Barta et al. 2002). Öt nagy ismétlődő-DNS csoport elismert: a DNS szatellitek (mini-,
44 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás midi-, és mikro-szatellitek), általános ismétlődések, 'interspersed ripítek' (rövid-, és hosszú-), retropozonok, pseudogének, és a transpozonok (Jeffreys et al. 1987). A szatellita név a kromoszóma-genetikából származik, ahol a másodlagos befűződésekkel elhatárolt, heterokromatikus kromoszóma régiókat nevezték így már a századelőn (Navashin 1912). Később, a DNS CsCl-grádiens ultracentrifugálásával nyert, a sejtmagi DNS-től elkülönült, vékonyabb sávot alkotó DNS is a szatellita nevet kapta (Sueoka 1961). Ezek a szatellita DNS-ek megszekvenálva oligonukleotidok tandem ismétlődését mutatták (Jeffreys et al. 1985). Jellemzőjük, hogy a kromoszómán a heterokromatikus régióban lokalizáltak, gént nem kódolnak, nem íródnak át (?). Néhány fajban rejtett szatellitek (cryptic satellites) is előfordulhatnak, amelyek a CsCl grádiensen a fő DNS sávval együtt futnak, vele azonos sűrűséget mutatnak (Nakamura et al. 1987). A szatellita DNS szakaszok belső szekvencia-ismétlődésük alapján kapták az ’egyszerű’ simple sequence DNS (Walker 1971), illetve, a mára elterjedt SSR (Simple Sequence Repeat) (Jeffreys et al. 1985) elnevezést. Belső, ismétlődő szekvencia hosszúságuk alapján az egyik csoportjuk a SSR-miniszatellitek, melyekben az alapszekvencia 10-15 bp hosszú, 3-4 szeres (miniszatellitek), és a 10-100-szoros ismétlődésű midiszatellitek egymás után következő (tandem) ismétlődéssel (Jeffreys et al. 1985). Szinoním elnevezésük: HVR - hiper variable region (Jeffreys 1987), ahol a hipervariabilitás az egyes SSR szakaszok hosszára utal (!), függetlenül a belső ismétlődő szakasz (di-, tri- oligonukleotidok) szekvenciájától. A szatellitek másik csoportja a SSR-mikroszatellitek, melyekben az alapszekvencia csak 1-5 bp (mono – pentanukleotid) hosszúságú, 10-80 kópiaszámmal (tandemszám), 100 bp végső hosszúsággal (szinonim elnevezésük: SSR, STR (hort tandem repeats), VNTR (variable number of tandem repeats), WNDR (variable number of dinucleotide repeats) (Nakamura et al. 1987; Edwards et al. 1991). Az mikroszatellitek belső szekvenciájuk alapján tovább tagolhatók a tökéletes (perfect)
SSR, pl. [ATG]10; a megszakított (imperfect) SSR, pl. [AT]10CACA[AT]10; valamint az
összetett (compound) SSR-ra, pl. [AT]10[CA]6 (Walker 1971). A mikroszatellitek gyakorisága eltér a növényekben és az állatokban. Korábbi adatok átlagosan 1 SSR / 10 kb DNS gyakorisággal számoltak (Tautz, Renz 1989; Tautz 1989; Tautz et al. 1996). A növényi genomban ötször kevesebb SSR található, mint az állatokban, pl. egy közel 20 bp hosszú SSR, amely az emberi genomban 6 kbp-ként fordul elő, a Brassica fajokban csak 19 kbp-ként található (Lagercrantz et al. 1993). A növényi genom legelterjedtebb dinukleotid SSR szekvenciája az AA/TT motívum, ennél kevesebbszer fordul elő az AT/TA és CT/GA motívum. Ez a három dinukleotid SSR (átlag 1-6-szoros
45 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás ismétlődéssel) teszi ki az összes növényi SSR-szakaszok közel 75 %-át (Lagercrantz et al. 1993). Az állati genom legelterjedtebb SSR szekvenciája a GT/CA motivum, 10 - 60 tandemszámmal, 50.000-100.000 kópia számban (Weber 1990, Weber et al. 1989; Hamada et. al 1982). A trinukleotidok közül a rizsre a [GGC]n SSR előfordulása a jellemző n13 tandem számmal (Wyman, White 1980; Zhao, Kochert 1993). A trinukleotid mikroszatelliták genetikai jelentősége kiemelkedik a humán orvoslásban. Igazolódott, hogy számos, igen súlyos és örökletes (a mikroszatellita mintázat –mégiscsak- öröklődik?!) betegségben a defektív gének regulátor régióinak mikroszatellita ismétlődési száma összefüggésben áll a betegség tüneteinek súlyosságával, mint pl. a törékeny kromoszómájúság (Fragile-X syndrome) CCG-ritítje, a nyirokmirigy-daganat (Huntington’s disease) CAG-ripítje, a skizofrénia (Schizophrenia) CAG-ismétlődése, az izomsorvadás (Myotonic Dystrophy) CTG-ripítje (Litt, Luty 1989; Stallings 1990). A genom SSR szakaszainak eredete, és eltérő hossza, amely a PCR polimorfizmust eredményezi (Weber, May 1989), feltehetően a DNS replikáció, illetve reparáció (repair) során fellépő csúszási mutáció (slippage mutation) eredménye (Schlötterer, Tautz 1992). Ez a mechanizmus eltér a miniszatellitek variabilitásának feltételezhető okától, amelynek eredményeként a váltakozó purin/pirimidin bázisok, mint pl. a [GT]n és a [GC]n, a DNS Z- alakú térszerkezetének kialakítását eredményezi (Z-DNS), továbbá a génregulációban és a kromoszóma kondenzációjában játszhat szerepet (Lagercrantz et al. 1993). Az SSR-fingerprint képen a DNS-sávok elhelyezkedése arányos az SSR szakasz hosszával (hányszor ismétlődik benne az alap szekvencia). Természetszerűleg egy hosszabb SSR-ról hosszabb PCR másolat készül, ez pedig az elválasztó gélen egy nagyobb molekulatömegű sávot eredményez. A kapott sávok száma egyértelműen a genomban levő, az alkalmazott primerrel komplementer SSR szakaszok számának függvénye (Zhao, Kochert 1993). Az egyes sávok intenzitása (az egyes sávokban futó DNS mennyisége) pedig az azonos hosszúságú és azonos alapszekvenciájú SSR szakaszok számának, illetve az ezekről PCR- ezett DNS mennyiségének az eredménye. (Elméletileg a komigráció, a különböző bázis összetételű, de az agaróz gélben együtt haladó DNS szakaszok együtthaladásának lehetősége nem kizárt, amit szekvenálással szükséges igazolni). Mindezek mellett alapvető feltétel, amely a PCR-módszer adottsága, hogy a primerkötő helyekről (a genom SSR szakaszai) csak akkor készíthető PCR reakció ha ezek min/max távolsága 50-2.000 bp (Tumpenny, Ellard 2005; Queller et al. 1993; Goldstein et al. 1995; Blouin et al. 1996; Griffiths et al. 1996; Jarne, Lagoda 1996; Dakin, Avise 2004).
46 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
Az SSR-PCR módszerre számos, ma már ritkán használt elnevezése, alakult ki: AFLP (amplification fragment length polymorphism), ez az elnevezés az RFLP mintájára született (Caetano-A. et al. 1991), de megtévesztő az AFLP (Vos et al. 1995) miatt; ALP (amplicon lenght polymorphism) (Mullis et al. 1986); MAAP (multiple arbitrary amplification profile) (Caetano-A. et al. 1991); MF (microsatellite fingerprinting); OF (oligonucleotide fingerprinting) (Tautz, Renz 1984, Weising et al. 1991); SSLP (simple sequence length polymorphism) (Tauz 1989), STMS (sequence tagged microsatellite site) (Arens et al. 1995), illetve MVR (micro (mini-, midi) satellite variant region) elemzések (Jeffrey et al. 1990). A mikroszatellita szakaszok közötti DNS szekvenciák elemezésének másik fontos módszerre az ISSR-PCR (Inter Simple Sequence Repeat PCR) (Zietkiewicz et al. 1994; Gupta et al. 1995), hasonlóan a magyar fejlesztésű R-PCR (Puskás et al. 1994; Puskás, Bottka 1995) módszerhez. Itt is számos szinoním elnevezés alakult ki: AMP-PCR (anchored microsatellite primed PCR), IMA-PCR (intermicrosatellite amplification PCR), MP-PCR (microsatellite primed PCR), IRA (interrepeat amplification PCR), IRS-PCR (interspersed repetitive sequence PCR) (Zietkiewicz et al. 1994; Gupta et al. 1995).
RFLP-PCR / CAPs elemzés: A CAP-elemzés (cleaved amplified polymorphic DNA) (Deng 1988; Haliassos 1989) illetve más elnevezés szerint RFLP-PCR (Dane 2002; Heinze 2002) módszerrel a PCR (Saiki et al 1985,1988; Mullis, Faloona 1987) reakcióban felszaporított DNS fragmentumokat hasítjuk restrikciós enzimekkel, annak eldöntésére, hogy a jól térképezhető (ld. a korábbi restrikciós térképezési munkákat) restrikciós hasítóhelyek szekvenciáiban bekövetkezett változásokat detektálhassuk (Sambrook et al. 1989), illetve az SNP-elemzést végezzünk (Xiao et al. 2006). A módszer technikailag nagy áttörés volt az igen munkaigényes radioaktív próbát alkalmazó RFLP (Botstein et al. 1980) eljáráshoz képest és amely módszert ma már gyakorlatilag teljesen helyettesíti (Deng 1988). Az evolúciósan konzervált, és kis genom méretű organellum DNS (cp, mt) elemzésére (Medgyesy et al. 1985; Sváb et al. 1990; Maliga 1995; Heinze 2002) ma is ez az egyik legérzékenyebb módszer (Dane et al. 2004).
3.3.1. A köles (Panicum miliaceum) genomstabilitása a középkor óta
A köles az árpa mellett a legősibb kultúrnövényünk. A földművelő sztyeppei népek (kelták, hunok, avarok, magyarok) illetve a Termékeny Félhold népeinek legfontosabb gabonája a
47 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás köles volt (i.e 2000) az évenkénti kétszeri aratás lehetősége miatt (60 napos tenyészidejű fajták is előfordultak) (Harlan 1971). A köles szavunk finnugor eredetű (és nem török, mint az árpa, búza stb.), ami szintén utal 3.000 évvel ezelőtti eredetére. Számos más régészeti lelet is arra utal, hogy a sztyeppei népek legfontosabb gabonája a köles volt, alapvető ételük pedig annak kásája (főtt dara) és lepénye (sült dara) volt. A honfoglalás időszakában még a magasabb társadalmi réteghez tartozók asztalán is a köleskása volt a legfontosabb étel. Feltárt sírokban a magleleteken kívül kásamaradványok is előkerültek. Fogyasztásának reneszánszát beltartalmi értékeinek köszönheti (lisztérzékenyek is fogyaszthatják) (Lágler, Gyulai et al. 2005). Géncentruma (őshazája) Kína (Vavilov 1951), a kínai birodalomban maga a mindenkori uralkodó vetette el, hagyományos szertartás keretei között, a Kárpát-medencébe az újkőkor kezdetén került be. Az i.e. 1.000 – 500-ból maradt fenn a kínai Költészet Könyve (The Book of Poetry; Shih Ching), amely kilenc éneket közöl a kölesről (Keng 1974). Szántóföldi növényeink közül a legrövidebb tenyészidejű (alig három hónap), minimális művelést igényel, hozamban, azonban elmarad a többi gabonafélétől. A köles a Panicum nemzetség legjelentősebb tagja, tetraploid (Panicum miliaceum, 2n = 4x = 36), rokon fajai a gyomköles (P. ruderale), a hajszálágú kölessel (P. capillare) és az apró köles (P. miliare). Igen jól tűri a szárazságot és a meleget, ezért főleg a kontinentális éghajlatú területeken termesztik kásanövényként, illetve abraktakarmányként. Az USA-ban madáreleségnek és baromfi takarmánynak termesztik. A P. ramosum-ot az USA délkeleti államaiban zöld- és szálastakarmánynak termesztik. A ’négerköles’ (Pennisetum spicatum), az ujjas- vagy korakánköles (Eleusine coracana), illetve aszályfű (E. indica), a japánköles (Echinochloa crus-galli convar. frumentacea) már más nemzetségek fajai. A kalász morfológiája alapján a köles három csoportba különül (Bányai 1971; Mansfeld 2001): (1) a terpedt bugájú kölesek (P. m. cv. effusum (Alef.) Mansf.; (2) az oldalra hajló, zászlós bugájú kölesek (P. m. cv. contractum (Alef.) Mansf.; valamint a (3) tömött bugájú kölesek (P. m. cv. contractum (Alef.) Mansf. A toklász színe szerint: a fehér, sárga, piros, barna és szürke, fekete és sávos ’magvú’ fajták ismertek (Schermann 1966). Régészeti leletek: A leghíresebb leletek kínából kerültek elő az i.e. 5000 – 3200 származó korokból (Ho 1977). A legrégebbi (DK-Ázsiai) Hoabinh kultúrából (i.e.10.000-6000) nem kerültek elő (Gorman 1969; Walters 1989). Sumer és Észak-Indiai kultúrákban az árpa (Hordeum vulgare) mellett a legfontosabb gabona (i.e. 2500). Jelentős magleletei kerültek elő Kelet- és Közép-Európából: Soroki (Ukrajna) (Tripolje-kultúra) (Janushevich 1978), Blahutovice (Csehország) (Tempír 1979) és Eizenberg (Türingia) (i.e. 5. évezred) (Rothmaler,
48 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
Natho 1957), Gomolava (Jugoszlávia) (i.e. 4. évezred) (Zeist 1975), É-Itália (i.e. 3. évezred) (Villaret-von Rochow 1958). Közép-Ázsiából bronzkori leletei ismertek, a 3. évezredtől (Lisitsina, Prisepenko 1977). Újabban az afganisztáni Shortunghai lelőhelyen (i.e. 3. évezred vége/2. évezred eleje) is megtalálták (Willcox 1991). Több kérdéses köles lelet került elő: Tepe Yahya (Irán) (i.e. 5. évezred) (Costantini, Costantini-Biasini 1985), Grúzia (neolitikum: i.e. 5-4. évezred) (Lisitsina 1984) és Észak- Kína területéről (neolitikum) Yang-Shao kultúra (i.e. 4. évezred) (Ho 1977). A köles volt a rómaiak kedvelt ’milium’-a. Észak-Amerikába a 17. század folyamán kerülhetett át, azóta számos új nemesítésű fajtával (Colosi, Schaal 1997; Gyulai et al. 2006). A régészeti genetika, illetve botanika speciális területe a piramisokból előkerült maglelet, melynek száma, összehasonlítva pl. a görögdinnyével, sárgadinnyével, illetve árpával, jóval kisebb a köles esetében (Barakat 1990; Close et al 1992; Murray 1993; Unger 1862; Vartavan 1990; Vartavan 1993; Wasylikowa et al 1995), amely egyben utal az egyiptomi civilizáció kisebb mértékű köles fogyasztására is. A köles hazai nemesítésében, az első sikeres nemesítő Magyarországon Horn Miklós volt, aki 1923-ban Lovászpatonán kezdte el nemesítő munkáját. Fajtája a Lovászpatonai pirosmagvú köles még ma is minősített fajta. Fertődön Beke Ferenc és Till Károlyné kölesfajtái ismertek, fajtájuk a Fertődi 2-es szárazságtűrő mind fővetésben, mind másodvetésben bőven terem. 1991-ben minősítették gyöngyszem nevű fajtát. A biserka és rumenka fajták honosítására 1997-ben került sor. A kölesnemesítésben a legfőbb cél a szárazságtűrés, a pergésmentesség, jó állóképesség, rövid tenyészidő, a betegségellenállóság, az egyenletes érés, a megfelelő mag- pelyva arányra történő nemesítés.
AFLP fragmentumok a középkori köles (Panicum miliaceum) mag maradványok DNS mintáiban: A 15. századi budavári ásatások során 195 növény, több mint 3 millió maglelete került elő (3.3.1. táblázat; 3.3.3. ábra) (Gyulai et al. 2006), nemzetközileg is jelentős leletanyagot biztosítva a régészeti genetikai kutatásokhoz. A nagyszámú archeobotanikai feldolgozás ellenére a köles régészeti genetikai kutatása nemzetközileg is csak napjainkban kezdődött a 4. századi (mongóliai leletek) (Gyulai et al. 2006), és a 15. századi (Budavári leletek) magleletek (Lágler, Gyulai et al. 2005, 2007) DNS elemzésével. Vizsgálataink során ALF, SSR, ISSR, CAPs elemzést végeztünk.
49 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
Az AFLP (amplifikált fragmentum hossz polimorfizmus; amplified fragment length polymorphism) vizsgálatokban a módszer fluoreszcens változatát alkalmaztuk (fAFLP - fluorescent amplified DNA fragment length polymorphism) Vos et al. (1995) alapján, módosításokkal (Cresswell et al. 2001; Skot et al. 2002; Gyulai et al. 2005). A kettős emésztéshez EcoRI-MseI restrikciós endonukleázokat alkalmaztunk (ld. 2.2. táblázat, Anyag és Módszer fejezet).
A 24 szelektív primer 3.3.3. ábra. Középkori régészeti magleletek (15. sz., Budai Vár) kiiszapolás után, a jellemző fajokkal (Gyulai et al. 2006). kombinációjából 12 pár adott éles és reprodukálható AFLP mintázatot (3.3.3. ábra), melynek értékei alkalmasak voltak a DNS degradáció mértékének becslésére: a 4. századi mintában csak két fragmentum (98.8% degradáció), a 15. századi mintában 158 AFLP fargmentum (40%-os degradáció), szemben a mai mintában talált 264 (100%) AFLP fragmentummal (3.3.2. táblázat).
Az AFLP fragmentumokat szekvenáló PAGE gélen elemezve (3.3.4. ábra), 21 fragmentumot tudtunk visszaizolálni, klónozni majd szekvenálni (3.3.5. ábra).
A klónok közül 8 fragmentum szekvenciája 3.3.4. ábra. AFLP elemzés a 4. sz., 15. sz. és a ’Topáz’ mai köles mintában volt BLAST vizsgálattal MseAGT-EcoCAC szelektív primer párral (Gyulai et al. 2006). (Mt markerek 1-10, a fragmentumok hossza nt-ben adott). elemezhető.
50 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
3.3.1. táblázat. A budavári ásatások (15.sz) hatalmas növényi magleletének fajlistája és leletszáma, a vizsgált három faj kiemelésével (* szenült leletek) (Gyulai et al. 2006). # latin név lelet # latin név lelet # latin név lelet
1. Adonis aestivalis 2 69. Galium mollugo 39 137. Prunus fruticosus 1,025 2. Aethusa cynapium 2 70. Galium spurium 169* 138. Prunus mahaleb 425 3. Agrostemma githago 5,516 71. Glaucium corniculatum 3 139. Prunus padus 7 4. Ajuga chamaepitys 335 72. Glechoma hederacum 1 140. Prunus persica 362 5. Amaranthus lividus 1,243 73. Heliotropium europaeum 1 141. P. spinosa (macrocarpa) 35 6. Anethum graveolens 1,622 74. Hordeum murinum 1 P. spinosa (macrocarpa) 50 7. Anthemis tinctora 2 75. Hordeum vulgare 8* P. spinosa - a 194 8. Apium graveolens 12 76. Humulus lupulus 223 P. spinosa - b 216 9. Arctium minus 2 77. Hyoscyamus niger 4 142. Punica granatum 171 10. Arctium tomentosum 1 78. Hypericum perforatum 12 143. Pyrus communis 6,682 11. Avena sativa 51* 79. Juglans regia 1,609 144. Pyrus sp. 5,290 12. Ballota nigra 1 80. Lamium amplexicaule 26 145. Ranunculus repens 117 13. Brassica campestris 21 81. Lamium purpureum 1 146. Raphanus raphanistrum 19 14. Brassica oleracea 34 82. Laserpitium latifolium 1 147. Raphanus sativus 52 15. Bromus secalinus 8* 83. Lathyrus sp. 3 148. Reseda lutea 1,113 16. Bryonia alba 1 84. Lens culinaris 1* 149. Rosa canina 36 17. Bupleurum rotundifolium 1,120 85. Leontodon autumnalis 1 150. Rosa sp. 584 18. Calamintha acinos 9 86. Lepidium campestre 3 151. Rubus caesius 24,579 19. Camelina sp. 97 87. Linum austriacum 3 152. Rubus fruticosus 2,756 20. Campanula sp. 1 88. Linum usitatissimum 4 153. Rubus idaeus 1,320 21. Cannabis sativa 1,618 89. Lithospermum offinale 58 154. Rumex acetosella 8 22. Carduus acanthoides 4 90. Lychnis flos-cuculi 2 155. Salvia nemorosa 2 23. Carex elata 1 91. Lycopus europaeus 12 156. Salvia verticillata 104 24. Carex flava 2 92. Malus domestica 33,724 157. Sambucus ebulus 168 25. Carex hirta 32 93. Malus silvestris 21 158. Sambucus nigra 194 26. Carex pallescens 17 94. Malus sp 8,141* 159. Saponaria officinalis 14 27. Carex silvatica 1 95. Malva alcea 1 160. Schoenoplectus lacustris 14 28. Carex tricarpellat 3 96. Malva neglecta 1 161. Sch. tabernaemontani 2 29. Carex vulpina/muricata 24 97. Marrubium peregrinum 1,307 162. Schoenus nigricans 2 30. Castanea sativa 352 98. Marrubium vulgare 3 163. Scirpus maritimus 1 31. Caucalis platycarpos 1 99. Matricaria inodora 12 164. Secale cereale 208* 32. Centaurea cyanus 6 100. Melandrium noctiflorum 4 165. Setaria lutescens 643 33. Centaurea jacea 560 101. Mespilus germanica 760 166. Setaria viridis/verticillata 37,001 34. Centaurea scabiosa 4 102. Morus nigra 39,670 167. Silene alba 151 Cerealia 1 103. Muscari comosum 2 168. Silene dioica 1 Cerealia 39* 104. Nepeta cataria 3 169. Silene vulgaris 3 35. Cerinthe minor 16 105. Neslea paniculata 52 170. Sinapis alba 1 36. Chenopodium album 30,457 106. Ocimum basilicum 1 171. Sinapis arvensis 733 37. Chenopodium ficifolium 2 107. Origanum vulgare 2 172. Solanum dulcamara 57,962 38. Chenopodium hybridum 708 108. Orlaya grandiflora 33 173. Solanum nigrum 811 39. Chrysanth. eucanthemum 1 109. Panicum miliaceum 955,497 174. Sonchus asper 1 40. Chrysanthemum segetum 3 Panicum miliaceum 1,442* 175. Sonchus oleraceus 20 41. Cichorium intybus 46 110. Papaver dubium 3 176. Sorbus domestica 1,276 42. Circaea lutetiana 1 111. Papaver rhoeas 57 177. Stachys annua 847 43. Citrullus lanatus 54,415 112. Papaver somniferum 359,981 178. Stachys arvensis 43 44. Conringia orientalis 1 113. Pastinaca sativa 60 179. Stellaria holostea 1 45. Convolvulus arvensis 1 114. Physalis alkakengi 5,517 180. Stellaria media 147 46. Coriandrum sativum 51 115. Picris hieracioides 5 181. Taraxacum officinale 2 47. Cornus mas 1,936 116. Piper nigrum 1,046 182. Thalictrum flavum 2 48. Corylus avellana 541 117. Pisum sativum 2* 183. Thalictrum minus 16 49. Cucumis melo 28,117 118. Plantago major 1 184. Thlaspi arvense 415 50. Cucumis sativus 11,783 119. Poaceae 1,534 185. Tilia sp. 2 51. Cuscuta europaea 4 120. Polygonum aviculare 618 186. Trifolium arvense 1 52. Cydonia oblonga 351 121. Polygonum mite/minus 1 Triticum aestivum 221 53. Cyperus fuscus 1 122. Polygonum persicaria 49 187. Triticum aestivum 3* 54. Cyperus longus 1 123. Potentilla erecta 1 188. Urtica dioica 1 55. Daucus carota 71 124. Potentilla reptans 2 189. Vaccaria pyramidale 328 56. Dianthus sp. 3 125. Primula elatior 1 190. Valerianella dentata 51 57. Diplotaxis muralis 1 126. Prunus amygdalus 38 191. Viburnum lantana 10 58. Echinochloa crus-galli 4 127. Prunus armeniaca 6 192. Viburnum opulus 15 59. Eleocharis palustris 5 128. Prunus avium 9,783 193. Vicia hirsuta 16 60. Euphorbia cyparissias 43 129. Prunus cerasifera 259 194. Vitis vinifera 241,231 61. Euphorbia exigua 1 130. Prunus cerasus 13,368 195. Xanthium italicum 1 62. Euphorbia platyphyllos 6 131. Prunus domestica italica 5 63. Fallopia convolvulus 3,275 132. P. domestica institia 14 Food remains (bread) 2* 64. Ficus carica 278,459 133. P. domestica syriaca 15 Food remains (gruel) 32* 65. Fragaria vesca 1,056,154 134. P. domestica oeconomica 651 Food remains (cooked) 12* 66. Galeopsis ladanum 1 135. P. domestica Juliana 736 67. Galium aparine 60 136. P. domestica oxicarpa 111 Összes 3.293.623
51 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
3.3.2. táblázat. AFLP fragmentum szám a 4.sz, 15.sz. és a kontroll ‘Topáz’ mai köles fajtában (Gyulai et al. 2006). köles fAFLP fragmentumok / szelektív primer párok (a) - (k) AFLP fragmentumok minták (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) (j) (k) No % degr.% 4dik sz. - - 2 ------2 0.8 99.2 15dik sz. 10 18 24 34 29 12 16 5 5 3 2 158 60.0 40.0 ‘Topáz’ 32 23 38 42 34 33 18 17 7 4 16 264 100.0 0.00
A 15. sz.-i EcoAGT-MseCAC-272 fragmentum BLAST analízisében az Ugpe ABC- transzporterrel (permeáz); míg az EcoAGT-MseCAA-462 fragmentum (‘topáz’) a gypsy/Ty3 retrotranszpozonnal mutatott szekvencia hasonlóságot (Gyulai et al. 2006).
A köles SSR allélstabilitása: A mikroszatellita (ALF-SSR) vizsgálatokat 35 lokuszon végeztük, ebből 4 bizonyult összevethetőnek a középkori és a mai köles mintában (3.3.6. ábra) a gln4 (257 bp) az sh1 (250 bp), rps28 (157 bp), és az rps15 (146 bp) lokuszon (ld. 2.7. táblázat, Anyag és Módszer fejezet). Mindössze egy nukleotid-változást (SNP) mutattunk ki (A→G szubsztitúció) az rps28 SSR 3.3.5. ábra. AFLP-elemzés poliakrilamid (PAGE) lokusz 29. nt-ben, az összes 810 gélelektroforézissel, fragmentum izoláláshoz a 15. századi (a) nt SSR szekvenciában. és a mai ’topáz’ köles (Panicum miliaceum) fajtában (b), 1-11 szelektív primer-pár kombinációjával (a fekete nyílak jelzik a sikeresen visszaizolált fragmentumokat (Gyulai et al. 2006). Eltérően a kétszikű sárgadinnyében tapasztalt igen nagymértékű SSR-variabilitástól (Szabó, Gyulai et al. 2007) a vizsgált köles SSR lokuszok egyikében sem mutattunk ki változást az ismétlődések számában. Az eredmények a köles egyszikű genomjának rendkívüli stabilitását igazolják, összevetve az azonos korból feltárt sárgadinnye kétszikű genomjában végbement
52 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
(Szabó, Gyulai et al. 2005ab) nagyfokú mikroevolúciós változásokkal. Ezt igazolják CAPs (RFLP-PCR) eredményeink is, amelyben hat restrikciós hasítóhely szekvenciájában (TaqI, BsuRI, HinfI, MboI, AluI és RsaI) nem történt mutáció mtDNA-6 lokuszon (Z11512). A mikroszatelliták által hordozott információ különös jelentősége az, hogy gének promóter régióiba épülve alkalmasak a gén, illetve a hordozó faj(ta) genetikai azonosítására (Schlötterer, Tautz 1992; Gyulai et al. 1997; Knapp et al. 1990; Hayward et al. 1994; Westman, Kresovich 1998). A vizsgált négy SSR lokusz is génkapcsolt volt (gln4 – glutamin szintáz; sh1 – szacharóz szintáz (shrunken1); valamint a riboszómális fehérjéket kódoló rps28 és rps15 gének). (3.3.6. ábra).
(a) SSR gln4-257 (D14577) - (TTGCG)2 1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 |...|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.. Z.mays 992 agcagaacggcaagggctacttcgaggaccgccgcccggcgtccaacatggacccctacgtggtcacctccatgatcgccgagaccaccatcatctggaagccctgagggctaaggcggccgttccgtcgcgttgcgttgcgttgcagggtccccgaagcga 1153 cv.Topaz 1 ...... -...... -...... -...... ttgcgttgcg...... 159 15.sz. 1 ...... -...... -...... -...... ttgcgttgcg...... 159
Z.mays 1154 ttgcaaagccattgttccttctgttccgtttgcttattattatcattattatcatctagctagatcatccgggggtcaggtcgtcgtggtgtgccaaa 1251 cv.Topaz 160 ...... 257 15. sz. 160 ...... 257
(b) SSR sh1-250 (AF544115) - (AAG)6 1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 |...|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.. Z.mays 6245 atcgagatgttctacgccctgaagtaccgtagcctggtaagccgtttgatgcctgcctctgcctctgcctctgcctgccagagaggatcacgtgttcgttcccattccagcagtcttaaacgagtgaatgaactactgacgcatctctttctggaatccagg 6407 cv. Topaz 1 ...... 162 15.sz . 1 ...... 162
Z.mays 6408 caagccaggttccgctgtccttcgattagtacggggaaagaagaagaagaagaagcccaggccggagaaccatcgcctgcatttcgat 6495 cv. Topaz 163 ...... aagaagaagaagaagaag...... 250 15.sz 163 ...... aagaagaagaagaagaag...... 250
(c) SSR rps28-157 (AW424565) - (TC)8 1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 |...|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.. Z.mays 62 agacgaacccaccatcatctttccctcgtgcttggattgaagggagctcctctctgtctctctctctctcatttccataaattatatattgtttgtagatag----tttatctttctttttatctccttgtttgcagagatatacatggagatgccaagcgc 219 cv. Topaz 1 ...... t.a..a...... a...... ----tctctctctctctctc...... t...... g...... ctag...... c...... g.-...... 157 15.sz. 1 ...... t.a..g...... a...... ----tctctctctctctctc...... t...... g...... ctag...... c...... g.-...... 157
(d) SSR rps15-146 (AW062092) - (CAG)5 1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 |...|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|. Z.mays 33 aagaagaaagagaagaagcacggggagggccatgaccatgg-tgatggtgacggccacagcagcagcagcagcgacagcgactgatctcgcctcgccgagcgccggacgcacaaatgcaccgcgcaggttataatacgagctgtcc 177 cv. Topaz 1 ...... a...... cagcagcagcagcag...... t...... 146 15.sz. 1 ...... a...... cagcagcagcagcag...... t...... 146
3.3.6. ábra. SNP elemzés a középkori köles (XV. sz.) és a mai cv. ‘topáz’ kölesfajta fajta négy SSR lókuszán (a –d) (összesen 810 nt), és a kimutatott G → A tranzicíó az rps28 lókuszon (Gyulai et al. 2006).
A teljes köles genom WGA-amplifikációja: A régészeti genetika limitáló tényezője a kis DNS mennyiség (3.3.3. táblázat), amely a PCR módszer igen kis anyagfelhasználásával csak részben orvosolható.
3.3.3. táblázat A teljes genom apmlifikáció (WGA) hatékonysága az eredeti izolált (a) és WGA amplifikált (b) köles (Panicum miliaceum) DNS minták mennyiségi (ng/ul) és UV-spektrofotometriás minőségi értékeiben (A260/A280, A260/A230), valamint (c) a WGA- amplifikáció hatékonysága (Lágler, Gyulai et al. 2007).
(a) (b) (c)
DNS ng/µl A260/A280 A260/A230 DNS ng/µl A260/A280 A260/A230 - humán 9,14 2,11 1,09 - humán 932,87 1,77 1,64 x 102,1 - mai-1 9,91 2,15 1,77 - mai-1 954,82 1,77 1,67 x 96,4 - mai-2 10,02 2,46 1,97 - mai-2 951,36 1,78 1,7 x 95,0 - 15.sz.-1 9,78 1,38 1,33 - 15.sz.-1 998,88 1,78 1,69 x 102,1 - 15.sz.-2 8,76 1,7 1,72 - 15.sz.-2 988,69 1,78 1,7 x 112,9
53 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
A humán vírus diagnosztikából, azonban, rendelkezésre áll már olyan módszer, amellyel a teljes genom szekvencia-hűen felszaporítható 10-100-szoros mennyiségben (Sigma, WGA-2). Vizsgálatainkban a Sigma WGA-2 (Whole Genome Amplification) módszerét alkalmaztuk, amely a Pfi29 fág polimeráz amplifikációjával hatékonyan (~100-szoros!) amplifikálta a teljes köles genomot a további kutatásokhoz (3.3.3. táblázat).
A köles genom ISSR-polimorfizmusa: A mikroszatellita genom elemzés speciális területe az ISSR-elemzés, amely módszerrel két SSR szakasz közötti szekvenciák szaporíthatók fel (Zietkiewicz et al. 1994). Az ISSR-PCR is, hasonlóan az RAPD-hez egy-primeres módszer, de a primerek kombinálásával a reakciók specificitása növelhető (Gupta et al. 1994; Zietkiewicz et al. 1994; Gyulai et al. 1997; Huang, Sun 2000). Vizsgálatainkban az egy- és a kombinált primer (a) (b’) reakciókat egyaránt alkalmaztunk, a genomok (b)
összehasonlítására ’topáz’ 15. sz. 4. sz. Mw (d)
(3.3.4. táblázat). - 3000
- 2000 (c) - 1000
Az ISSR-PCR - 400 - 200 számos esetben 3.3.7. ábra. Régészeti köles minták mag morfológiája: 4.sz. (a), 15.sz. (b), mai nagyon hatékony ’Topáz’ fajta (c), és DNS degradációjának mértéke (d). A középkori, 600 éves módszernek minta steril táptalajon (b’) (Gyulai et al. 2006) bizonyult intraspecifikus, populációk közötti vizsgálatokra (Fang, Roose 1997; Ge, Sun 1999; Zhou et al. 1999; Nagaraju et al. 2001), nemek meghatározására, fajtaspecifikus mintázatok meghatározására (Gupta et al. 1994; Zietkiewicz et al. 1994; Gyulai et al. 1997; Huang, Sun 2000), keresztezéses pedigree ellenőrzésére, és genotípus azonosításra. Hat szelídgesztenye genotípus összehasonlításához 7 ISSR primer alkalmazásával 157 ISSR fragmentumot lehetett amplifikálni (Goulao et al. 2001). Földrajzilag elkülönült spárga populációk (Asparagus acutifolius) genetikai azonosítása során 23 ISSR primer 228 polimorf ISSR fragmentumot amplifikált (Sica et al. 2005). Bab (Phaseolus vulgaris) elemzésekor mindössze 4 ISSR primer által felszaporított több száz ISSR fragmentumból 50 fragmentum térképezhető is volt a bab genom térképén (Gonzalez et al. 2005).
54 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
A középkori köles morfológiai rekonstrukciója: ISSR elemzéseinkben 1-9 primert és kombinációit alkalmaztuk (ld. 2.10. táblázat, Anyag és Módszer fejezet). Ezek közül négy ISSR primer bizonyult polimorfnak: FV808 (6 ISSR fragmentum); FV821 (5 ISSR fragmentum); 3.3.4. táblázat. ISSR elemzés fragmentum mátrixa négy ISSR primer 24 lokuszán FV835 (4 ISSR a középkori köles mintába és az összehasonlító mai fajtákban (ld. 2.3.táblázat). fragmentum); köles FV 808 FV 821 FV 835 FV 841
FV841 (7 ISSR bp 430 480 510 570 800 900 650 690 750 900 940 240 290 350 460 260 290 320 350 420 680 750 fragmentum) 15.sz. ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● FEPI ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● (3.3.4. KEKE ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● táblázat). FEFE ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● MEST ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● JASZ ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● A polimorf NYIR ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● TABA ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ISSR DEBR ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● fragmentumok PÜSK ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● RABA ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● cluster elemzés TASZ ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● alapján a TAPA ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● FERT ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● középkori BOLG ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● köles az CSAS ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● OMOS ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ’Omszkoje-9’ TAPB ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ázsiai eredetű TAPC ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● TAPD ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● köles fajtához MART ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● mutatta a legközelebbi rokonságot (3.3.8.a ábra), amely eredmény nyilvánvalóan utal a régészeti minta keleti eredetére. A fenotípusos felvételezés során (ld.2.3. táblázat, Anyag és Módszer fejezet) a vizsgált 28 morfológiai bélyeg alapján megrajzolható (SPSS11) volt a mai fajták morfológiai dendrogramja (3.3.8.b ábra). Ezt összehasonlítva a molekuláris dendrogrammal (3.3.8.c ábra) rekonstruálható volt a középkori köles minta, amely terpedt bugájú, apró kalászkájú, barna magvú köles lehetett, ma is fellelhető közeli rokon fajtákkal (ld. az Omszkoje-9 fajta oroszországi gyűjtőhelyről szereztük be) (Lágler, Gyulai et al. 2005). A 4.sz. minta két AFLP fragmentuma kevésnek bizonyult az 1.600 éves fajta rekonstrukciójához. A rendkívüli mértékű DNS fragmentáltság miatt a WGA amplifikálás is sikertelen volt. A 600 éves középkori lelet ’csírázási’ kísérlete is sikertelen maradt (3.3.8.b’ ábra), megkérdőjelezve az ősi magleletek csírázásáról szóló eredményeket a 10.000 éves csillagfürt (Porsild et al. 1967), az 1.300 éves indiai lótusz (Shen-Miller 2002), illetve az 1- 2.000 éves egyiptomi kamut búzalelet (Quinn 1999) esetében
55 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
(a) (b)
(c) (d)
3.3.8. ábra. Összehasonlító fajtarekonstrukció a középkori, 600 éves köles leletben (Budai Vár) (21) húsz mai köles fajta buga szerkezete (a), magszíne (b), morfológiai (c) és molekuláris (d) dendrogrammja alapján (Rel.G.D. - relatív genetikai távolság (Lágler, Gyulai et al. 2005).
56 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
3.3.2. A sárgadinnye (Cucumis melo) mikroszatellita diverzitása
Időrendben a legrégebbi, bizonyítottan növényi ősDNS elemzés pollen (japán fenyő) leletekből (pleisztocén kor, kb 150.000 éves) izolált DNS tekinthető, amelyben rrn5 és trnR cpDNS szekvenciákat amplifikáltak (Suyama et al. 1996). Sikeres ősDNS izolálást írtak le 18.000 éves (Scott et al. 2000; Liepelt et al. 2002), és 10.000 éves (Parducci et al. 2005) fenyő virágpor (Elenga et al. 2000) maradványokból is. A termesztett növények domesztikációja során végbement ugrásszerű változására a legjobb példát a kukorica régészeti genetikai vizsgálata szolgáltatta. Száraz körülmények között fennmaradt mexikói kukoricamagokból sikerült sejtmagi DNS-t izolálni, szekvenálni, és igazolni a teozintéből való szelekcióját, amely alig 6.300 évvel ezelőtt, mehetett végbe a mai Mexikó területén (Piperno és Flannery 2001: PNAS 98:2101-2103; Goloubinoff et al. 1993; Jaenicke-Despres et al. 2003; Freitas et al. 2003). A búza, vagy a szőlő eredetét még nem sikerült felderíteni. A szőlő gazdasági és kulturális jelentősége ie. I. évszázadban alakulhatott ki, köszönhetően az Európa mediterrán részén kialakuló bortermelésnek és kereskedelemnek. Mikroszatellita markerekkel sikerült nukleáris DNS szekvenciákat felszaporítani 1700, és 2600 éves szőlőmagvakból, ami kiindulópontot adhat az ősi és ma termesztett fajták eredetének igazolásához (Manen et al. 2003; Thomas et al. 1993). Értékes növényi maradványok speciális esetben megégett mintákhoz hasonlítanak (szenült minták), de nem tűztől, hanem a talaj egyedi körülményei miatti elszenesedéstől, ennek ellenére a DNS, ugyan erősen degradáltan, de kivonható állapotban fennmarad (Banerjee, Brown 2002). A szenesedés (szenülés) kísérletesen is jól modellezhető volt (Chalfoun, Tuross 1999; Threadgold, Brown 2003). Nehéz terület a régi/ősi fás növényi maradványokból történő DNS kivonás is, amely csak nagyobb mennyiségű minta esetén lehet sikeres (Ziegenhagen 1993, 2003; Dumolin-Lapégue et al. 1999; Deguilloux et al. 2002, 2003, 2004; Burger et al. 2000; Lascoux et al. 2004; Parducci, Petit 2004; Fladung et al. 2004; Sperisen et al. 2004). A herbáriumi gyűjtemények további mintákkal járultak hozzá számos faj mikroevolúciós elemezéséhez, pl. 100 éves nád (Phragmites australis) esetében (Savolainen 1995; Saltonstall 2002, 2003). Kérdéses illetve téves eredmény a növényi ősDNS kutatásban is született. A miocén kori kövületek liliomfa (Magnólia) levéllenyomataiból (18 millió éves) izolált DNS (Golenberg et al. 1990) műterméknek bizonyult, hasonlóan a Miocén korból származó tündérkürt vizsgálati eredményei (Clarkia amoena L.) (Sidow et al. 1991), hasonlóan a mocsárciprus (Taxodium
57 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás distichum) (Soltis et al. 1992) lenyomatban kimutatni vélt DNS maradványokhoz, sőt még a lignin fennmaradása sem volt igazolható (Eglinton, Logan 1991).
A sárgadinnye (Cucumis melo L., 2n = 4x = 24) a fajgazdag Cucurbitaceae család (119 nemzetség, 825 faj) Cucumis nemzetségének morfológiailag legdiverzebb faja (Dane, Tsuchiya 1986; Zhang et al. 2006; Renner et al. 2007). A Cucumis nemzetségben, a két termesztett faj (sárgadinnye - C. melo; és az uborka - C. sativus) mellett több, kérdéses Cucurbitaceae faj került besorolásra. Linné 9 fajt (in Kirkbride 1993); Naudin (1859) 13 fajt; Kirkbride (1993) 32 fajt, míg a legújabb rendszerben Andres (2004) 34 fajt sorolt a nemzetségbe. Ez utóbbi rendszerben már a stabil interspecifikus fajhibrid a C. hystius (C. sativus x C. hystrix) (Chen et al. 1997) is besorolásra került. A sárgadinnye (Cucumis melo) alfaji (var., cv., fajtacsoport) felosztása nem végleges (3.3.2.1. táblázat), elsősorban a termés alak-, forma-, és szín-gazdagság miatt, melynek genetikai hátterében a vadfajok és a termesztett fajták közötti nagymértékű átkereszteződés állhat (Mozsár 1958; Zatykó 1967; Velich 1967; Molnár 1973; Nagy 2003ab; Stepansky et al. 1999; Jeffrey 1980, 1990). Morfológiailag, a kemény terméshéj képzésében az ovárium és a receptakulum szövetei együttesen vesznek részt (Liu et al., 2004). Munkánk során a módosított Whitaker, Davis (1952) fajtatípus rendszerét követtük.
3.3.2.1. táblázat. A sárgadinnye (Cucumis melo) faj alatti (ssp., var., cv.) csoportosítása szerzők szerint (Pitrat et al. 2000; Szabó, Gyulai et al. 2005ab; Horváth, Gyulai et al. 2007). Naudin Alefeld Cogniaux, Pangalo Whitaker, Filov Grebenscikov Pyzhenkov, Robinson, Pitrat et al. (1859) (1866) Harms (1924) (1958) Davis (1952) (1960) (1986) Malinina (1994) D-Walters (1997) (2000) # tribuszok fajtacsoportok sorozatok fajok csoportok alfajok változatok fajták csoportok fajták 1 cantalupensis cantalupensis cantalupensis cantalupa cantalupensis cantalupa melo cantalupa cantalupensis 2 reticulatus reticulatus ambiguus rokkiford ambiguus melo reticulatus 3 saccharinus saccharinus cantalupensis 4 reticulatus adana reticulatus adana (europeus) adana 5 chadalak chandaljak chandalak chandalak chandalak 6 ameri oestivalis ameri ameri ameri inodorus cassaba (orientale) cassaba (orientalis) 7 inodorus-1 inodorus inodorus autumnales + zard rigidus melitensis zard inodorus 8 C. momordica mormordica hibernus conomon pp mormodica mormodica momordica 9 C. chate inodorus-2 adzhur chate adzhur adzhur chate 10 flexuosus flexuosus tarra flexuosus flexuosus flexuosus flexuosus 11 acidulus elongatus-1 acidulus flexuosus chinensis flexuosus acidulus pp conomon pp acidulus 12 utilissimus indica 13 chito microcarpus chito chito chito chito 14 dudaim dudaim dudaim dudaim dudaim dudaim dudaim microcarpus dudaim dudaim 15 erythraeus erythraeus 16 conomon conomon conomon conomon 17 monoclinus monoclinus monoclinus makuwa elongatus-2 conomon conomon conomon pp conomon 18 chiensis acidulus pp chinensis chinensis 19 tibish
58 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
A sárgadinnye elsődleges géncentruma (Vavilov 1951) Afrikába tehető (Kirkbride 1993; Kerje, Grum 2000). Az első termesztett típus a chate lehetett (i.e. 2000 – 1500) (Vartavan, Amorós 1997; Keimer 1924; Pangalo 1929). A Bibliában (Moz. IV, 11:5) említett sárgadinnye is feltételezhetően chate típusú lehetett (Felix 1968 in Karchi 2000). A sárgadinnyének Ázsiában egy párhuzamos mikro-evolúciós fejlődési útja valószínűsíthető, amely a conomon típusra vezethető vissza (C. melo ssp. var. conomon). Az ázsiai conomon (oriental pickling melon) és az afrikai chate típus, viszont közvetlenül származtatható a vad sárgadinnyéből (C. melo var. agrestis) (Harlan 1971; Jeffrey 1980, 1990; Walters 1989), melynek populációi máig fennmaradtak a sivatagi illetve szavanna övezetben, Afrikában, az Arab félszigeten, sőt Ausztráliában is (Sauer 1993; Zohary és Hopf 1993). Elterjedés. Európában a görögök illetve rómaiak még nem termesztették a sárgadinnyét, hanem Perzsiából és a Kaukázus vidékéről szállították (Stepansky et al. 1999). Az Európai termesztés megindulása az 1300-as évekre tehető, feltehetően a reticulatus típusba tartozó adana termesztésével (Stepansky et al. 1999). A bordás terméshéjú kantalup (cantalupensis) típus a 15. században terjedhetett el Európában örményországi kereskedők közvetítésével (Pangalo 1929; Pitrat et al. 2000). A turkesztáni típusba tartozó dinnyefajták gyümölcse sima, nem gerezdes, héja vékony és cseres. Az ananász típusú fajták gyengén gerezdesek, héjuk vékony és sima. A kantalup név a pápa nyári rezidenciájára, a Róma környéki Cantalupo-ra utal, ahol először vetették. Ez a fajta már a 16. században közkedvelt lehetett, ahogy ezt Campi (Fruit Seller, 1580), és Caravaggio (Still Life with Fruit on a Stone Ledge, 1603) festményei bizonyítják (J. Janick, www.hort.purdue.edu; Szabó, Gyulai et al. 2005abb). A dinnye név legkorábbi magyarországi előfordulása egy 11. századi oklevélben tűnik fel: „predium quad vocatur dinna” (Szamota és Zolnai 1902-1906). Írásos emlékek. A sárgadinnye legelső írott emlékei i.e. 3.000-ből származó ázsiai ősiratokban tűnnek fel (Constantini 1996; Kroll 1982, 1999, 2000). Kínában az i.e. 1.100 – 771 időszakban a reticulatus (muskmelon) és a conomon típusú sárgadinnye már a legfontosabb zöldségnövény volt (Keng, 1974). Az i.e. 1.000 – 500-ból maradt fenn a kínai Költészet Könyve (The Book of Poetry; Shih Ching), amely négy éneket is közöl a sárgadinnyéről (‘kua’) (Keng 1974), megemlítve a szójával (Glycine max) való együttes termesztésének (intercropping) szaktanácsait is (Yu 1977; Keng 1974). Egy későbbi kínai írásos emlék az i.e. 533-544-ből származó Legfontosabb Művészetek Könyvében (Essential
59 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
Art for the People) már egy egész fejezet szól a sárgadinnye termesztéséről, mag szelekciójáról, csíráztatásáról, gyomirtásáról és begyűjtéséről (Walters 1989). Régészeti leletek. Az emberiség legrégebbi mezőgazdasági (növénytermesztési) leletei Dél- Kelet Ázsiából, i.e. 10.000 - 6.000-ből (Hoabinhian, Vietnám) származnak (Chang 1986). Itt került elő az első Cucumis (de még uborka típusú) maglelet is, amelynek kora, a többször elvégzett C14 izotópos kormeghatározás szerint 9.180 ± 360 éves (Gorman 1969, 1970, 1971). A Termékeny Félhold (i.e. 6000) területéről nem került elő sárgadinnye lelet. Kínában számos ásatásból (Zhejiang: i.e. 3.000; Shaanxi: i.e. 2.000) ismert (Harlan 1971; Ho 1977; Walters 1989). Iránban is az i.e. 3.000 éves rétegekből került elő (Yu 1977). Az egyiptomi piramis leletek (Barakat 1992; Germer 1985; Keimer 1947; Newberry 1889, 1890; Renfrew 1985; Zeist, Roller 1993) az i.e. 5800-től egészen i.e. 2000-ig követhetők nyomon, különös tekintettel egy ősi egyiptomi falfestményre, amelyik egy zöldhúsú flexuosus csoportba tartozó dinnyét ábrázol (Pangalo 1929). A legrégebbi európai lelet a bronzkorból, illetve a görögországi Tiryns-ből (i.e. 1300-1200) került elő (Kroll 1982, 1999, 2000). Kora-középkori leletek kerültek elő Németországból is az időszámítás szerinti 2. századból (14C-izotópos meghatározással), és Svájcból (Brombacher 1997). A sárgadinnye spanyol közvetítéssel került az amerikai kontinensre, ahol az észak-amerikai indiánok már az 1600-as évekre nagy területeken termesztették (Leppic 1966; Kerje, Munger 1991; Janick, Paris 2006; Paris et al. 2006). Számos hazai lelet közül (Hartyányi, Nováki 1975) a legrégebbiek római koriak (Budapest-Aquincum) az i.szerinti. 2. - 3. századból (Dálnoki 2000; Dálnoki, Jacomet 2002). A budai vár területén folytatott ásatások során feltárt 13-14. századi kutak betöltéseiben, több sárgadinnye mag lelet is felszínre került. A jelen munkában vizsgált magleletek a budai királyi vár Zsigmond-kori szárnyának (15. sz. eleje) régészeti feltárásaiból kerültek elő (Gyulai et al. 2006; Szabó, Gyulai et al. 2005abab). A magokból történő sikeres ősDNS izolálás és genotípus azonosítás után a morfológiai, fenotípusos fajtarekonstrukciót 47 mai fajta összehasonlításával végeztük el.
ITS elemzés DNS keresztfertőzések kiszűrésére: A molekuláris vizsgálatokban először ITS elemzést végeztünk a faj(ta) azonos DNS bizonyítására. Az alkalmazott primerekkel (Hsiao et al. 1995: ITSL 5'-tcgtaacaaggtttccgtaggtg-3'; ITS4-5'-tcctccgcttattgatatgc-3') a dinnye specifikus 664 bp nagyságú fragmentumot szaporítottunk fel a középkori és a mai sárgadinnye mintában (Szabó, Gyulai et al. 2005abab). A fragmentum klónozását és szekvenálását követően meghatároztuk a fajra jellemző (Kavanagh, Timmins 1988; Garcia-
60 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
Mas et al. 2004) egyes régiók pontos méretét: az 5.8 riboszomális régió konstans 163 bp nagyságú szakaszát, az ITS-1 217 bp nagyságú, és az ITS-2 egy 238 bp nagyságú DNS szakaszát (Szabó, Gyulai et al. 2005abab). Néhány sárgadinnye mag DNS mintájában egy 580 bp nagyságú fragmentum is felszaporodott, amelyről a szekvenálást követően kiderült, hogy az Aspergillus nidulans szekvenciája (AF455505). Ezeket az egy-mag eredetű DNS mintákat kizártuk a további molekuláris elemzésekből. Vizsgálatainkkal egy megbízható módszert közöltünk, a régészeti genetikában, elsőként, a fertőzött leletek kiszűrésére (Szabó, Gyulai et al. 2005abab).
A sárgadinnye mikroszatellita diverzitása: Az ALF-SSR elemzéseinkben 34 primer-párt teszteltünk (Katzir et al. 1996; Danin-Poleg et al. 2001), ebből 20 primer-pár bizonyult
fajta / bp 80 90 100 110 hatékonynak a mai fajtákban, amelyek közül //....|....|....|....|....|....|....|....|// Cm(CT) 11 28.Hales-Best ATACTTTTTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGTTACAG 4a.Jav.Zentai ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT...... csak nyolc primer-pár volt aktív a középkori 3.Nyíribronyi ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT...... 30.Tétényi -Csh...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT...... 17a.Kiskőrösi ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT...... mintában (ld. 2.8.a. táblázat). A nyolc lokuszon 5a.Turai ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT...... 12a.Pusztadobosi ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT...... 20.Penyigei ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT...... 37.Nyírbátori ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT...... elvégzett SSR elemzéssel összesen 40 SSR allél 38a.Szirmai ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT...... 44a.Sárándi ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT...... 21.Túrkevei ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT...... 35.Kisteleki ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT...... 485 SSR fragmentumot azonosítottuk a 47 mai 19.Soponyai ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT...... Cm(CT) 10 15.százdi ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCT--...... és a középkori mintában (3.3.2.1. ábra). Az egyes 6.Hevesi ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCT--...... 26.Tarnamérai ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCTCT--...... Cm(CT) 9 25.Kősárga ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCT----...... lokuszok alléldiverzitása eltérő volt (2 és 7 42a.Kállósemjéni ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCT----...... 41.Topáz ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCT----...... 46.Magyar kincs ...... CTCTCTCTCTCTCTCTCT----...... allél/lokusz, átlag értékük 5.7 allél/lokusz): Cm(CT)8 43.Taktaharkányi ...... CTCTCTCTCTCTCTCT------...... 33.Hegykői ...... CTCTCTCTCTCTCTCT------...... 31.Muhi ...... CTCTCTCTCTCTCTCT------...... CmCT44 (2 allél), CmAG59 (5 allél), CmGA104 14.Fortuna ...... CTCTCTCTCTCTCTCT------...... 7.Ezüst Ananász ...... CTCTCTCTCTCTCTCT------...... 2.Sweet Ananász ...... CTCTCTCTCTCTCTCT------...... 4b.Jav. Zentai ...... CTCTCTCTCTCTCTCT------...... (5 allél), CmCT134 (4 allél), CmTA134 (6 allél), 13.Muskotály ...... CTCTCTCTCTCTCTCT------...... 24.Hógolyó ...... CTCTCTCTCTCTCTCT------...... 17b.Kiskőrösi ...... CTCTCTCTCTCTCTCT------...... CmCTT144 (7 allél), CmTC168 (6 allél) és 36.Nagycserkeszi ...... CTCTCTCTCTCTCTCT------...... 12b.Pusztadobosi ...... CTCTCTCTCTCTCTCT------...... 5b.Turai ...... CTCTCTCTCTCTCTCT------...... 15.Csárdaszállás ...... CTCTCTCTCTCTCTCT------......
CmCT170 (5 allél). A 8 SSR lokuszból hét Cm(CT)6 44b.Sárándi ...... CTCTCTCTCTCT------...... 38b.Szirmai ...... CTCTCTCTCTCT------...... 42b.Kállósemjéni ...... CTCTCTCTCTCT------...... dinukleotid, és egy trinukleotid ismétlődésű volt, ez utóbbi egyben a legmagasabb allél/lokusz 3.3.2.1. ábra. Szekvencia elemzés a CmCT170 dinukleotid SSR lokuszon a középkori (15. sz) és értéket mutatta (CmCTT144 - 7 allél). a mai sárgadinnye (Cucumis melo) fajtákban (Szabó, Gyulai et al. 2005ab).
A genom vizsgálatok széleskörben alkalmazott területe a kodominánsan öröklődő mikroszatellita (SSR) allélek elemzése (Danin-Poleg et al. 2001; Gyulai et al. 2006; Lágler, Gyulai et al. 2005, 2006, 2007; Szabó, Gyulai et al. 2005ab). A növényi genom legelterjedtebb dinukleotid SSR szekvenciája az AA/TT motívum, ennél kevesebbszer fordul elő az AT/TA és CT/GA motívum. Ez a három dinukleotid-SSR (átlag 1-6-szoros ismétlődéssel) teheti ki az összes növényi SSR-ok közel 75 %-át (Lagercrantz et al. 1993). A mikroszatellita allélek hossz-polimorfizmusának indel (inszerció-deléció) gyakorisága,
61 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás megközelítően 10-3 – 10-5 indel gamétánként (Forbes et al. 1995), mely lehetőséget ad evolúciós elemzésekre is (Shriver et al. 2006). Vizsgálatainkban két SSR lokusz (CmCT170, CmTTT144) teljes szekvenciaelemzését végeztük el (3.3.2.1. ábra és 3.3.2.2. ábra) a középkori és a mai sárgadinnye fajtában.
fajta / bp ...... |....|.....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.. 45 55 65 75 85 95 105 115 CTT20CTACTT4 28. Hales-Best GGGGGGC CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTACTTCTTCTTCTTCA 25. Kősárga ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTACTTCTTCTTCTT..
CTT 19 CTACTT4 43. Taktaharkányi ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT---CTACTTCTTCTTCTT.. 36. Nagycserkeszi ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT---CTACTTCTTCTTCTT.. 41. Fortuna ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT---CTACTTCTTCTTCTT.. 37. Nyírbátori ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT---CTACTTCTTCTTCTT.. 33. Hegykői ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT---CTACTTCTTCTTCTT.. 35. Kisteleki ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT---CTACTTCTTCTTCTT..
CTT18CTACTT4 44. Sárándi ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT..
CTT CTACTT 12.14 Pusztadobosi4 ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT..
CTT 11CTACTT4 15. sz ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 21. Túrkevei ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 41. Fortuna ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 7. Ezüst -Ananász ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 2. Sweet -Ananász ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 4. Javított -Zentai ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 15. Topáz ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 46. Magyar kincs ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 13. Muskotály ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 3. Nyíribronyi ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 17. Kiskőrösi ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 36. Nagycsenkeszi ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 12. Pusztadobosi ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 6. Hevesi ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 44. Sárándi ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT..
CTT8CTACTT4 37. Nyírbátori ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 20. Penyigei ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 5. Turai ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 14. Csárdaszállási ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 35. Kisteleki ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 24. Hógolyó ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 30. Tétényi-Csh...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 46. Magyar kincs ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 42. Kállósemjéni ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 33. Hegykői ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 31. Muhi ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 19. Soponyai ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT.. 26. Tarnamérai ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT..
CTT7CTACTT4 38. Szirmai ...... CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT------CTACTTCTTCTTCTT..
3.3.2.2. ábra. Szekvencia elemzés a CmCTT144 SSR lokusz összetett mikroszatellita (CTT)xCTA(CTT)x lokuszon a középkori mintában (15. sz.) és a mai fajtákban (Cucumis melo) (a 12, 33, 35, 36, 37, 41, 44 és 46 minta heterozigóta) (Szabó, Gyulai et al. 2005ab).
Megállapítottuk, hogy az SSR allélek hosszúság polimorfizmusa mindig egy teljes SSR alapszekvencia, egyszeres vagy többszörös kieséséből (delécio) illetve beépüléséből (inszerció) adódik (indel), és sohasem a lezáró szakaszok mutációjából (Weber, Wong 1993; Szabó, Gyulai et al. 2005abab). Egyetlen esetben sem tapasztaltunk tört SSR szekvenciát, amelyben a belső ismétlődő szekvencia változott volna meg (Szabó 2006). Igazoltuk, hogy a középkori sárgadinnye lelet SSR allél hosszúsága köztes értéket (3.3.2.2. ábra) mutat (sem nem a legrövidebb, sem nem a leghosszabb), amely feltételezi, hogy a középkori sárgadinnye nem a legősibb fajtatípus lelete (Szabó, Gyulai et al. 2007). A 485 SSR fragmentum alapján molekuláris dendrogrammot (SPSS14) készítettünk (3.3.2.3. ábra), a molekuláris rokonság megállapítására a mai fajták (20 ősi tájfajta, és 27 termesztett fajta) és a középkori lelet genetikai állománya között. Az elemzésben a középkori mintával a ’Hógolyó’
62 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
és a ‘Kősárga’ tájfajták mutatták a legközelebbi rokonságot (3.3.2.3. ábra). A fajtarekonstrukcióhoz meg kellett határozni ennek a két fajtának a típusát és rokonsági körét egy morfológiai dendrogramm elkészítésével (3.3.2.4. ábra).
3.3.2.3. ábra. Mikroszatellita diverzitás a 15.századi-, valamint a típus szerint (C- kantalup; I – inodorusz; R – retikulátusz) csoportosított 47 mai sárgadinnye (Cucumis melo) fajtában 8 lokusz (ld. 2.8.a. táblázat) 40 SSR allél (felső sor), 485 SSR fragmentuma (pontozás) alapján (Szabó, Gyulai et al. 2005ab, 2007).
A középkori sárgadinnye fajtarekonstrukciója: A vizsgálatokhoz 47 mai sárgadinnye fajtát és tájfajtát felvételeztünk 28 morfológiai tulajdonság alapján (ld. 2.4. táblázat, Anyag és módszer fejezet). Az elemzés szerint, a magyarországon termesztett 47 fajta kivétel nélkül besorolható volt az Európában elterjedt három fő terméstípusú csoportba: a cikkelyesen barázdás Kantalup (cantalupensis), a hálózatos-recés terméshéjú Retikulatusz (reticulatus), és a simahéjú Inodorusz (inodorus) csoportba (3.3.2.4. ábra). Európai fajta gyűjtemények elemzéseiben is ez a három típus elterjedése igazolódott (Morforte et al. 2004; Staub et al. 2004; López-Sesé et al. 2003; Périn et al. 2002; Zeven, deWet 1982; Jeffrey 1980, 1990). Az elvégzett morfológiai elemzést összevetve molekuláris dendrogrammmal a középkori minta fajta-típusa meghatározható volt, amely inodorusz típusú, sima héjú, zöld húsú sárgadinnye lehetett, átmeneti formával a ’Hógolyó’ és a ’Kősárga’ mai termesztett fajták között (Szabó, Gyulai et al. 2005ab, 2007; Gyulai 2011).
63 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
(a) (b)
(c) (d)
3.3.2.4. ábra. A 600 éves sárgadinnye (C. melo) maglelet (48) fajtarekonstrukciója 47 mai fajta héj (a) és hússzin (b), valamint a felvételezett bélyegek (ld. 2.3. táblázat) alapján szerkesztett morfológiai (c) és a molekuláris dendrogramm (d) alapján (Szabó, Gyulai et al. 2005a, 2007)
64 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
3.3.3. A görögdinnye (Citrullus lanatus) archeogenetikai jellemzése
A görögdinnye (Citrullus lanatus; 2n = 2x = 22; 4.25 - 4.54 x 108 bp; 0.42 pg DNS) (Arumuganathan, Erle 1991; Kihara 1951) a rendkívül monotipikus Citrullus nemzetség tagja, melynek kevés faja közeli morfológiai rokonságban áll egymással: Citrullus colocynthis, Citrullus ecirrhosus, Citrullus rehmii vadfajokkal. A görögdinnye evolúciós kutatásának kiemelt jelentőségét az adja, hogy két alfaja a Citrullus lanataus var. lanatus és a Citrullus lantaus var. citroides máig fennmaradt párhuzamos evolúciójuk során (Maggs-Kölling et al. 2000; Levi et al. 2001; Sain et al. 2002; Bisognin 2002).
15.sz. Budapest
13. sz. Debrecen
18.sz. Pannonhalma
3.3.3.1. ábra. A két 15. századi (Budapest), a 13. századi (Debrecen) és a 18. századi (Pannonhalma) görögdinnye (Citrullus lanatus) maglelet (a mérce 1 cm), valamint a fajtarekonstrukcióhoz alkalmazott 44 mai faj/ta héj, hús, és magképe (Tóth, Gyulai et al. 2007).
Géncentruma az Abesszíniai övezet, illetve trópusi Afrika, másodlagos géncentruma Kína, Belső-Ázsia és India (ld. Praecitrullus fajokat) (Vavilov 1951). Nagyfokú morfológiai variabilitását a héj-, a hús-, és a mag színe és formája adja (3.3.3.1. ábra). Termesztésbe vonása i.e. 2000 évvel ezelőtt kezdődhetett, ahogy a magleletek igazolják (Zhang 1990; Zamir et al. 1984). Európában csak a középkor hajnalán vált ismertté török közvetítéssel.
65 3.3.3. A görögdinnye (Citrullus lanatus) archeogenetikai jelemzése
Régészeti leletek. A régészeti genetika, illetve botanika speciális területe a nagyszámú piramisokból előkerült görögdinnye maglelet, különös tekintettel a leghiresebb Tutan-kamon- i ásatásokra (Vartavan 1990, 1993), amelyekből azonban, DNS izolálást eddig nem közöltek (Barakat 1990; Boodle 193?; Braun 1879; Bruyere 1937; Carruthers 1886; El Hadidi 1982; Emery-Barbier. 1990; Germer 1988; Germer 1985; Ginter et al 1988; Girard, Maley 1987; Kunth 1826; Macramallah 1940; Muller et al. 1990; Netolitzky 1943; Newberry 1927; Plu 1985; Renfrew 1985; Schweinfurth 1882, 1883ab, 1886; 1887, 1908; Tackholm 1961; Veen 1996; Watterstrom 1980ab, 1984, 1986; Willerding, Wolf 1990). Nagyszámú magyarországi középkori magleletek szerint (Gyulai et al. 2006; Tóth, Gyulai et al. 2007) a görögdinnye (Citrullus lanatus) és a sárgadinnye (Cucumis melo) különösen kedvelt konyhakerti növények volt (Hartyányi, Nováki 1975). A 15. század elején íródott Besztercei-szószedet említi először név szerint: „gereg dyne”. A 16. sz.-ig még nem vált el a görögdinnye neve az uborkáétól, továbbá csak ezután kezdték megkülönböztetni a két dinnyét (görög dinnye – sárga dinnye) egymástól. Szikszai Fabriczius Balázs Nomenclaturájában (1561) is így szerepel. Igen jelentős volt a dinnyetermesztés a középkori magyar királyság területén. Lippay János (1664) talán erre utal, amikor megemlíti, hogy I. Albert királyunk 1439-ben a mértéktelenül sok elfogyasztott dinnye miatt lelte halálát. A középkori Magyarországon termesztett görögdinnyék többnyire sárgabelűek lehettek egészen a 18. sz.- ig (Gyulai F vizsgálati eredménye), a pirosbelű fajták csak a törökkor elmúlása után kezdtek terjedni. Itáliában viszont, a piros bélű fajták már a 16. században közkedveltek lehettek, ahogy ezt Cavaraggio (Still life with fruit on a Stone Ledge and carafe of white wine;, and Still life with melon, watermelon, pomegranate, grape and other fruits, Pensionaute del Saraceni, 1603) festményei igazolják (J. Janick, www.hort.purdue.edu; Janick, Paris 2006; Paris et al. 2006; Szabó et al. 2005b). A vizsgálatokban a középkori maglelet, a budai királyi vár Zsigmond-kori szárnyának (15. sz. eleje) régészeti feltárásaiból (Gyulai et al. 2006)-, illetve a debreceni Kölcsey Művelődési Központ területén végzett ásatásokból származik (13. század), a 18. századi minta az un. Pannonhalmi Apátság botanikai gyűjteményéből (Mezőgazdasági Múzeum, Budapest) származik. A 44 mai fajtát (ld. 2.5. táblázat, Anyag és Módszer) az Agrobotanikai Központ, Tápiószele, génbanki anyagából (Tóth, Gyulai et al. 20007) gyüjtöttük össze (3.3.3.1. ábra). A magleletekből és a mai görögdinnye fajtákból DNS-izolálást, molekuláris nSSR (nuclear simple sequence repeat); cpDNS (kloroplasztisz DNS) elemzést, és retroranszpozon izolálást végeztünk.
66 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
3.3.3.1. (CT)3 deléció és (CT)4 inverzió a (CT)27 görögdinnye (Citrullus lanatus) mikroszatellita lokuszán a középkor óta, haplotípus azonosítás a cpDNS-ben:
A vizsgálatokhoz mikroszatellita primer párokat alkalmaztunk (Jarret et al. 1997). Az elemzésben 47 primer-párt teszteltünk, ebből 26 primer-pár bizonyult hatékonynak a mai fajtákban, amelyek közül 16 volt aktív a középkori mintában. Az aktív primerek alkalmazásával szekvencia elemzést végeztünk a Cl-1-20 (CT)26-30 nSSR lokuszon.
Megállapítottuk, hogy a középkori mintában még megtalálható (CT)3 (115-121 nt) SSR szekvencia szakasz a mai fajtában delécióval kiesett az elmúlt 600 év során, A (CT)26-30 nSSR lokusz (196 bp) 122-130 bp szakaszán egy további (CT)4 inverziót is azonosítottunk, a régészeti és a mai fajtákban amely (CT)27 egyszerű mikroszatellita lokuszból kialakuló
(CT)17-C-(TC)4-T-(CT)5 összetett mikroszatellita születését igazolja (3.3.3.2. ábra), amely különlegesen fontos eredmény a mikroszatellita kutatásokban („ld. mikroszatelliták születése és halála”: Weber, Wong 1993; Messier et al.1996; Kutil, Williams 2001; Orti et al. 1997; Taylor et al. 1999; Tóth et al. 2000).
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Ráckeve (13.) CGCGCGTGAGGACCCTATAGACTCTTCTGGTTCCTTCTTCCCTCCGAAGCGTGCCTTCTTTCTTCTCATTAGTAGCCTCCGCTCTCTCTCTCTCTCTCTC Turai (15. ) ...... Ukrainskij (21.) ...... Háromfa (24. ) ...... Nyírbátor (31.) ...... Lipót (43.) ...... 15.sz. Budai ...... 13.sz. Debrecen ...... 18.sz. Pannonhalma ......
110 120 130 140 150 160 170 180 190 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Ráckeve (13.) TCTCTCTCTCTCTCT------CCTCTCTCTTCTCTCTCTCTCGAGAGGAGCGTCTATAGAGAGAGATATAAACCGCCTCAATCAATTGCT Tura (15.) ...... ------...... Ukrainskij (21.) ...... ------...... Háromfa (24.) ...... ------...... Nyírbátor (31.) ...... ------...... Lipót (43.) ...... ------...... 15.sz. Budai ...... CTCTCT...... 13.sz. Debrecen ...... CTCTCT...... 18.sz. Pannonhalma ...... CTCTCT......
3.3.3.2. ábra. (CT)3-deléció (115-121 nt) a dinukleotid (CT)26-30 nSSR (Cl.1-20; Jarret et al. 1997) mikroszatellita (82-141 nt) lokuszon (190 bp) a vizsgált mai görögdinnye (Citrullus lanatus) fajtákban a 15.századi és a 18.századi minták összehasonlításában; valamint összetett mikroszatellita születése egy feltételezhető ősi szekvenciából levezethetően a (CT)4 szakasz inverziójával (122-130 nt) mindegyik mintában (a primerekt aláhúzás jelzi) (Tóth, Gyulai et al. 2007).
A kloroplasztisz DNS elemzéséhez clp-12 primerrel a trnV lokuszt [tRNA-Val (GAC)] 297 bp (cpval3P2) (102509-102805) elemeztük az 5'-agt tcg agc ctg att atc cc-3'; és a 16S rRNA (cp16S5P1)5'-gca tgc cgc cag cgt tca tc-3' primerpárral (Al-Janabi 1994). A szekvencia elemzés (3.3.3.3. ábra) két cpDNS szubsztitúciós lokuszt mutatott ki az génbanki uborka (C. sativus) és dohány (Nicotiana tabacum) alapján, illetve a régészeti minták és a vizsgált mai fajokban és fajtákban a 102.198 nt, és a 102.209 nt-ben. Ennek segítségével elvégezhettük az
67 3.3.3. A görögdinnye (Citrullus lanatus) archeogenetikai jelemzése első azonosító fajtarekonstrukciót a régészeti mintákra a három haplotípus csoport kialakításával (3.3.3.3. ábra). A görögdinnyében szigorúan anyai öröklődésű citoplazmás kloroplasztisz gének legbiztosabb genetikai markerei a mikro/evolúciós kutatásoknak, melyek segítségével több millió évre visszavezethető ősi anyai vonalak adhatók meg (Dane et al. 2004). Vizsgálatainkban két szubsztitúciós lokuszt azonosítottunk a görögdinnye cpDNS- ében, mely alapján a három régészeti görögdinnye külön haplotípus csoportba különült. A mikro/evolúció szubsztitúciós órájára (rátájára) nincs egységes adat. A számított szubsztitúció / év adatok eltérnek a különböző vizsgálatokban: az 1,3 x 10-8 nt / év (Ma, Bennetzen 2004), az 1.5 1,3 x 10-8 nt / év (Koch et al. 2000), és a 6,5 x 10-9 nt/év (Gaut et al. 1996) értékekkel, sejtmagi DNS evolúciós mutációs rátára vonatkozóan. A kloroplasztisz DNS mutációs órája, azonban lassabban jár mint a sejtmagi szekvenciáké (Dane et al. 2004), mégis a sejtmagi adatok támpontot viszonyítási alapot nyújtanak (Wicker, Keller 2007), figyelembe véve a zárvatermő növények átlagos kloroplasztisz méretét (120-217 x 103 bp; Palmer 1985). Mindezek alapján átlagban 1 Mrd (109) év alatt mehet végben egy szubsztitúció a cp illetve sejtmagi genomban. Ez az érték, azonban nagyságrendekkel felgyorsul a nemesítés, illetve szelekció során (mikroevolúció). Amennyiben a clp-12 lókuszon kimutatott szubsztitúciók nem csak egy polimorf SNP a kloroplasztisz genomban (ld. az uborka és a dohány cpDNS szekvencia különbségeket; amelyek természetesen szintén alkalmasak evolúciós távolság elemzésekre), a mai görögdinnye fajták, illetve a régészeti lelet eltérő citotípus vonalakat mutat (a mintaszám növelésével lehetőség nyílik a teljes hazai citotípus vonalak meghatározására is) (folyamatban) (Tóth, Gyulai et al. 2007).
102200 102210 102220 102230 102240 102250 102260 102270 102280 ...|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... Nicotiana t. cpDNA GAATCCGCTTTGTCTACGAACAAGGAAGCTATAAGTAATGCAACTATGAATCTCATGGAGAGTTCGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCATGC Cucumis s. cpDNS ....TAG...... G...... C.c.(1.) ....TAG...... G...... C.l.l. (11.) ....TAG...... G...... C.c.(3.) ....TAG...... G...... 15.sz. Buda ....TAG...... A...... 13.sz. Debrecen ....TAG...... A...... 18.sz. Pannonhalma ....TAG...... A...... C.c.(2.) ....TAT...... G...... C.l.l. (14.) ....TAT...... G...... C.l.l. (28.) ....TAT...... G......
3.3.3.3. ábra: Szubsztituciók (SNP) azonosítása a cpDNS (Clp-12) Valin-tRNS lokuszán (102.198 és 102.209 nt-ben) a középkori és a mai görögdinnye mintákban, az uborka (Cucumis sativus) és a dohány (Nicotinia tabacum) génbanki adatok összehasonlításával; valamint a minták evolúciós dendrogrammja (ClustalW) (Tóth, Gyulai et al. 2007).
68 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
3.3.3.2 LTR retrotranszpozonok izolálása görögdinnyében
A növényi transzpozonok, retroelemek, ugráló gének: Az eukarióta és a prokarióta genom igen nagy mennyiségű virus-eredetű DNS-t hordoz, amelyek önszaporodásra, helyváltoztatásra (transzpozició) képesek (transposable elements, TE-k), ezáltal nagy szerepet játszanak a mikro/evolúcióban (Flavell 1986; Heslop-Harrison 2000). Az áthelyeződő gének (transzpoziciós elemek – TE; transzpozonok; a prokariotákban Inszerciós Szekvenciák - IS) a genomból ki tudnak vágódni, majd áthelyeződni a genom egy másik pontjára és ott újból beépülni. Felfedezésük nem baktériális, humán- vagy állatgenetikai kutatásokhoz kötődik, hanem tisztán növénygenetikai eredmény: kukoricában (Zea mays) fedezte fel Barbara McClintock (1942, 1950, 1984; Nobel-díj 1983). A transzpozonokat azóta minden élő szervezet genomjában kimutatták: a férgekben (fonálféreg, Caenorhabditis elegans); rovarokban (muslica, Drosophyla melanogaster), gombákban (élesztőgomba, Saccharomyces cerevisiae); baktériumokban (bélbaktérium, Escherichia coli) (Feschotte et al. 2002; Olasz et al. 1997). Az ugráló gének áthelyeződésük módja szerint két fő csoportra különülnek: (I) Retro-transzpozonok és (II) DNS-traszpozonok (3.3.3.4. ábra).
Retrotranszpozonok: A retro- transzpozonok olyan DNS szakaszok, amelyekről szaporodásuk során előszőr egy (m)RNS másolat készül (DNS-függő RNS polimeráz II. katalizisével), majd erről az RNS-ről reverz transzkripcióval készül el (RT, reverz transzkriptáz, RNS- függő DNS polimeráz) a cDNS másolat (kópia DNS), amely beépül a genom másik helyén. A folyamat hasonlít a retrovírusok (RNS vírusok) szaporodására
(fertőzésére) ezért feltételezhető, hogy a retrotranszpozonok korábbi vírus- 3.3.3.4. ábra. Az eukarióta ugráló gének összehasonlítása. A DNS-transzpozon kivágódás-és-beépülés (cut-and- fertőzések evolúciós maradványai paste), valamint a RETRO-transzpozonok másolás-és- (Schulman, Kalendár 2006, SanMiguel et al. 1996). beépülés (copy-and-paste) áthelyeződési folyamata a genomban (Lodish et al. 2004, Fig.10-8) A retrotranszpozonok felfedezése nem a növénygenetika eredménye (ellentétben a DNS transzpozonokkal). Az első növényi LTR-
69 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás retrotanszpozont kukoricában írták le (Johns et al. 1985). A növényi genom felépítésében rendkívüli szerepe van retrotranszpozonoknak. A kukorica genom 50-80%-át, a búza genom 90%-át a retroelemek teszik ki (SanMiguel et al. 1996; Falvell et al. 1986). Az állatok DNS- ében kisebb a 3.3.3.1. táblázat. A legfontosabb növényi transzpozonok jellemzése és mennyiségük, az kópiaszámuk növényfajok szerint (Feschotte et al. 2002). Nem- emberi genom 40%-a Transzpozon Autonom Számuk a autonom Növényfaj csoportok elemek genomban áll retroelemekből elemek I. Retro-transzpozonok (cDNS transzpozonok) (IHGSC 2001; Yoder LTR retrotranszpozonok Tnt1A – N. tabacum >100 et al. 1997; Smit Tto1 – N. tabacum 30 (300) BARE-1 – Hordeum sp. 5 - 22,000 copia-elemek Tos17 – O. sativa 2–5 (30) 1999). ’Szerencsére’ Hopscotch – Z. mays 5–8 Opie-2 – Z. mays 100,000 ez a hatalmas – BS1 Z. mays 1–5 Magellan – Z. mays 4–8 retro/transzpozon Huck-2 – Z. mays 200,000 gypsy-elemek RIRE2 Dasheng O. sativa 1,200 állomány inaktív, vagy Athila 4 – A. thaliana 22 Athila 6 – A. thaliana 11 Tag3 – A. thaliana 1 epigenetikailag Tar17 – A. thaliana 2 Nem-LTR retrotranszpozonok (metilált) Cin4 – Z. mays 50–100 LINE elemek; Del2 – L. speciosum 250,000 (L1 csoport) elcsendesített (gene Tal1 – A. thaliana 1–6 – TS N. tabacum 50,000 SINE elemek sliecing), és csak igen – S1 B. napus 500 kis része aktív, illetve II. DNS transzpozonok hAT Ac Ds Z. mays 50–100 indukálható Spm dSpm Z. mays 50–100 CACTA mutációval CAC1 CAC2 A. thaliana 4 (20) Mu1 Z. mays 10–100 Mutator MuDR (Mu1) (Jääskeläinen et al. – A. thaliana 1 (4) PIFa mPIF Z. mays 6,000 PIF/Harbinger 1999; Manninen et al. PIF-like Tourist-like zárvatermők változó Tc1/mariner MLEs Stowaway-like zárvatermők változó 2000; Teo et al. 2005). MITE O. sativa 100.000
A retrotranszpozonok Rövidítések Ac, Activator – aktivátor elem; LINE, long interspersed nuclear element – LTR-nélküli retrotramszpozon; Ds, Dissociation – disszociációt (géntörést) okozó elem; szekvenciájuk alapján LTR, long terminal repeat; MLE, mariner-like element; mPIF, miniature P instability két fő csoportra factor; PIF, P instability factor; SINE, short interspersed nuclear element; Spm, Suppressor–mutator. Fajnevek: A. thaliana, lúdfű (Arabidopsis thaliana); B. napus, oszthatók: LTR és repce (Brassica napus); L. speciosum, liliom (Lilium speciosum); N. tabacum, dohány (Nicotiana tabacum); O. sativa, rizs (Oryza sativa); Z. mays, kukorica (Zea mays). nem-LTR retroelemek.
LTR-retrotranszpozonok (Long Terminal Repeat retrotransposons:. Az LTR- retrotranszpozonok mindkét végükön (5’ és 3’ vég) hosszú ismétlődő szekvenciában végződnek (LTR - Long Terminal Repeats, hosszú ismétlődő végszakasz). A növényi LTR- retroelemek a Drosophyla retroelemeivel mutatott szekvencia hasonlóság alapján copia-
70 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás típusba (kópia – másolás után) és gypsy-(cigány – nem a szin, hanem a helyváltoztatás aktivitása után) típusba tartoznak (3.3.3.1. táblázat). Az LTR-szekvencia utolsó végszakasza, univerzális, konzervatív, rövid 5’-TG….CA-3’ invert ripít (3.3.3.2 táblázat). Valószínű, hogy a LINE típusú nem-LTR-retrotranszpozonokból eredhetnek a terminális ripítek befogásával. A két végső LTR közötti szekvenciák néhány fehérje kódolására (open reading frame) elegendők. Az növényi LTR-retrotranszpozonok csoportosítása a Drosophyla mutánsokban (pl. copia, gypsy) leírt LTR-ekkel való szekvenciahasonlóság és kódoló kapacitás alapján történt. Nagyon ősi eredetüket igazolja, hogy a különböző fajokban előforduló azonos LTR szekvenciatípus (pl. copia) nagyobb hasonlóságot mutat a különböző fajokban, mint egy másik LTR (pl. gypsy) típussal ugyanabban a fajban (3.3.3.5. ábra). A növényi LTR retrotranszpozonok szerkezete, szekvenciája és életciklusa egyértelmű megegyezést mutat az emlősök retrovírusaival (ld. kukorica Bs1 eleme, és a dohány retro elemei) (Johns et al. 1985; Grandbastien et al. 1989, 1994, 1997; Grandbastien 1992, 1998). Az aktív LTR-ek mutagének, alacsony kópiaszámúak, mint amilyen a kukorica Bs1 LTR- retrotranszpozonja, amelyet a kukorica adh-1 (alcohol-dehidrogenáz-1) génjében mutattak ki alig 1-5 kópiaszámban (Johns et al. 1985). Az LTR retrotranszpozonok szekvencia variabilitása tette lehetővé a hatékony LTR alapú marker rendszerek (3.3.7. ábra) kifejleszését (Waugh et al. 1997; Flavell et al. 1998; Kalandar és Schulman 2006) és széles körű alkalmazását (Nagy, Lelley 2003; Nagy et al. 2006). Az LTR-transzpozonok tehetők felelőssé a C-érték paradoxonért is, ahogy a rizs genom (0.43 x 109 bp) közel 15%-a -, a hétszer nagyobb genomú kukorica (2.8 x 109 bp) 50–80%-a -, és a még nagyobb genomú árpa (4.8 x 109 bp) 70%-a retrotranszpozon (Vicient et al. 1999). A kukorica evolúciójában az elmúlt 5-6 millió év alatt végbement genom-kétszereződés (szegmentalis autoteraploidia) is LTR- indukált, amely elsősorban a Huck-2 (~ 200,000 kópia/genom) és az Opie-2, (~100,000 copies) retroelemek felszaporodásának a következménye (SanMiguel et al 1996). A Liliomok (Lilium ssp) még ennél is nagyobb, tízszeres genom-gyarapodása (30-45 x 109 bp) is a retrotranszpozonok aktivitásának a következménye. A növényi genom méretének növelése mellett a genom átrendez(ődés)ésért (genome restructuring) is az LTR-ek a felelősek, ahogy ez igazolódott kukoricában (SanMiguel et al. 1996) és árpában (Kalendar et al. 2000).Az árpa BARE-1 LTR-retrotranszpozon mennyiségének növekedése a genomban (1.8-ról 4.7%-ra), és kapcsolata a vízellátottsággal elsőként igazolta az adaptiv evolúciót (Kalendar et al. 2000).
71 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
3.3.3.5. ábra. A növényi transzpozonok összehasonlító szerkezete (Casacuberta, Santiago 2003; Havacker et al. 2004).
CP, cp: coat protein, vírális burok-fehérje GAG, gag: group-specific antigén; virális erdetű enkapszulációs kapszid-fehérje génje (megegyezik, más nevezekben a burokfehérje: coat protein (CP), illetve a tranzit protein (TP) jelzéssel. A GAG fehérjét (a pol kódolja) a vírus saját proteáza három fehérjére (domének) hasítja: matrix (MA), burokfehérje -azaz- kapszid (CA) és a nukleokapszid (NC). Ez a három fehérje együtt alkotja a vírus burokfehérjét (CP – coat protein) EN, en: (envelop – burok, boríték), vírus eredetű burokfehérje (ENV) gén, amely felelős a vírusnak a sejtfelszíhez való kötődésben. Két doménje a SU (surface) és a TM (transmembrane). Az ENV megegyezik az MP-vel (movement protein). A retroelemekben való szerepe is ehhez hasonló (a RE terjedhet a sejtek között is). INT, int: (integráz), a retrotranszpozonnak a genomba történő visszaépüléséhez szükséges, egy endonukleáz hatású enzim gén, amely működése során két bázist emészt le az LTR vég szekvenciájáról. LARD: hosszú retroelem-eredetű szekvenciák (large retrotraszpozon derivatives). LINE, hosszú szekvenciájú, a genomban elszórt elemek: (Long Interspersed Nuclear Elements) LTR: long terminal repeat (hosszú végső ismétlődés); az RE hosszú ismétlődő végszakasza (250 – 4.000 bp), amelynek két vége rövid (1-5 nt) IR (inverted repeat)-ben végződik (TIR, terminal inverted repeat). MITE, mini DNS-transzpozon (miniature inverted-repeat transposable elements) pol, mRNS-polimeráz gén, az egyes doménekkel: ap, pr (aspartic proteáz), rt (reverz trsnzkriptáz), RH-H, és néhány esetben int. PBS, primer binding site - primerkötő hely (kb. 18 bp hosszú), a tRNS kötő helye, amely primerként szolgál az RT számára (innen indul a saját vagy a gazda RNS-éről) a cDNS (negatív szél) szintézise. PPT, polipurin traktus (adenin, guanin) (7-18 bp hosszú), az RT replikációjához szükséges, azáltal, hogy a primerként szolgál a vírális DNS pozitív szálának szintéziséhez (+). PR, proteáz, aszparaginsavban gazdag (AP – aspartic protease), az expresszált fehérjét funkciónális egységekre hasító proteináz RH, ribonukleáz-H, RNáz-H, RNS-bontó enzim, amely lehidrolizálja az elkészült cDNS-ről a minta RNS-t RT, reverz transzkiriptáz, az RNS-függő DNS-polimeráz. SINE, rövid magi elemek, (Short Interspersed Nuclear Elements szóló-LTR , (solo-LTR) csak LTR-retrotranszpozon (két retroelem rekombinációjából) TRIM: mini LTR (terminal repeat retrotransposon in miniature) TIR, terminal inverted repeat; az LTR végszakaszai Transposase, transzpozáz, az ugráló gén genomba épülést katalizáló enzim
72 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
A copya típusú LTR-retrotranszpozonok. A copya-típusú LTR-retroelemek kódoló központi szakasza egy (virális erdetü enkapszulációs) kapszid fehérje (gag) gént, egy aszparaginsavban gazdag fehérjehasító (az expresszált fehérjét funkcionális egységekre hasító) proteináz enzim (aspartic protein - AP) gént, a retrotranszpozonnak a genomba történő visszaépüléshez szükséges endonukleáz hatású integráz enzim (IN) gént, és a replikációhoz szükséges ribonukleáz-H (RH) gént kódol (Griffiths et al. 1996; Gribbon et al. 1999). A név a magas másolati (kópia) számra utal. A gypsy (Dzsipszi) típusú LTR-retroelemek. A gypsy-típusú LTR-ekben az integráz (IN) gén a leolvasási keret (open reading frame) végén helyezkedik el, valamint tartalmaz egy további gént, a virus-burokfehérje eredetű gént (env - envelope), amely azonban nem minden copia-típusú LTR-ben található.
3.3.3.2. táblázat. Néhány LTR-retrotranszpozon összehasonlítása, a konzervatív szekvenciák jelzésével (aláhúzva). A copia és Ty912 elemek nagyon aktívak, míg a lúdfű (Arabidopsis) TAG-3 retrotranszpozonja elvesztette áthelyeződő képességét egy belső deléciós mutáció miatt (Voytas, Ausubel 1988; Rédei 2003).
LTR 5’ –LTR 5’ és 3’ LTR közötti szekvencia 3’ –LTR retrotranszpozon szekvencia szekvencia
Copya 276 bp 4190 bp 276 bp (Drosophila) TGTTGGA...TACAACA GGTTATGGGCCCAGTC…TTGAGGGGGCG TGTTGGA…TACAACA Ty912 334 bp 5250 bp 334 bp (Saccharomyces) TGTTGGA...TTTCTCA TGGTAGCGCCCTGTGCT…TATGGGTGGTA TGTTGGA…TTTCTCA Gypsy TAG-3 514 bp 4190 bp 514 bp (Arabidopsis) TGTTGGA...GGTAACACA AGTGGTATCAGAGCCA…AAGGTGGAGAT TGTTGGA…GGTAACA
A LARD (large retrotransposon derivatives), TRIM (terminal repeat retrotransposon in miniature), Solo-LTR (csak-LTR). A retrotranszpozonok rekombinaciós termékei a LARD, TRIM es Solo-LTR retro elemek (Devos et al. 2002), melyek a genom védekező mechanizmusának eredményei (Witte et al. 2001; Petrov 2001; Witte, Panaud 2005). A retroelemek rekombinációja töri a teljes elemet, ezzel áthelyeződési képességük csökken “a genom védekezik”, de új formák MITE, TRIM keletkeznek, amelyek transz RE elemek segítségével újra szaporodhatnak (SanMiguel et al. 1998; Witte, Panaud 2005). A genom további vádekező mechanizmusa a DNS metiláció, amely a genom CG, CNG szekvenciáiban nagy mértékű (Gruenbaum et al. 1981), ezáltal gátolva a DNS-parazitákat (retroelemek) áthelyeződésükben (Yoder, Bestor 1996). A görögdinnye genomban elsőként izoláltunk retroelemet (TRIM, szóló-LTR), amely ilyen rekombinációs folyamatok eredménye.
LTR-nélküli retrotranszpozonok: A terminális ismétlődést nem tartalmazó LTR-nélküli retroelemeket (nem-LTR retroelemek) hosszúságuk alapján csoportosítjuk: LINE (hosszú szekvenciájú, a genomban elszórt elemek: Long Interspersed Nuclear Elements) és SINE
73 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
(rövid szekvenciájú, a genomban elszórt elemek: Short Interspersed Nuclear Elements) retro- transzpozonok (Martin 1991; Okada 1991). A LINE és SINE retrotranszpozonok az állati és emberi genomban játszanak fő szerepet, míg a növényekben az LTR retrotranszpozonok a jelentősek (Leigh et al. 2003; Schulman, Kalendar 2005). A retro/ transzpozonok autonom / nem-autonom tulajdonsága a kódoló kapacitásra utal. Az autonom elemek mindig rendelkeznek a teljes gén szekvenciájával (OFR – open reading frame), míg az autonom elemekből belső delécióval létrejövő nem-autonom elemek már csak más retroelemek transz- aktivációjával még képesek a transzpozicióra (Martin 1991; Okada 1991). LINE elemek (Long Interspersed Nuclear Elements): Feltehetően a LINE retrotranszpozonok a legősibb retroelemek, nem hosszú szakaszok (6-10.000 bp), csak néhány fehérjét kódolnak (open reading frames - ORFs), amelyből az egyik az RNS-függő DNS polimeráz (reverz transzkriptáz enzim -RT), amely hordozza az RNS-kötő (PBS – primer binding site), az enkapszuláz (gag vírális burok- fehérje gén) és az endonukleáz-H (RH) domént. Az RT gén szekvenciája alapján a LINE elemek 14 csoportba sorolhatok (L1, L2, CR1, Rex1, RTE, R4 stb). Az emberi genom hatalmas mennyiségű LINE populációt hordoz (850,000 LINE elem), amely a genom 21%-a (IGHSC 2001). A LINE elemek szaporodása (replikációja) az áthelyeződés helyén (lókusz) megy végbe, ahol az RT az endonukleáz aktívitás segítségével hasítja a DNS-t, szabad 3’-hidroxil csoportot hozva létre, amely primerként szolgál az RT reverz transzkripciós aktivitásához (Kumar, Bennetzen 1999). Mindössze 50 LINE-L1 elem működik, mint ’gén’, amely átíródik és szintetizálódik (IGHC 2001). A legfontosabb LINE elem az L1 (LINE-L1) elem. Egy típusos L1 elem (6,500 bp) a következő módon szaporodik fel a genomban: a DNS-függő RNS polimeráz (RNS- polymeráz II) enzim katalizisével átíródik (megszintetizálódik) az L1 retroelem DNS-ről az RNS másolat. Az elkészült RNS-ről a sejt riboszómáin megszintetizálódik (transzláció) az L1 fehérje, majd ez a fehérje és az RNS öszekapcsolódik (ribonukleo-protein) és újra visszajut a sejtmagba. Az L1-fehérje endonukleáz doménja (endonukleáz-H -RH) hasítja a genom DNS-t a beépülés helyén (általában az intronokban). Az RT (revez transzkriptáz) megszintetizálja az RNS templáton a LINE DNS új másolatát, amely visszaépül a genomba. Ez a másolás- beépülés (copy - paste) általános mechanizmusa, ahogy a LINE elemek felszaporodnak a genomban. A LINE elemek száma és szerkezete alkalmas a genotípus azonosítására (DNS – fingerprinting). A variabilitás egyik oka, az a folyamat, amelyben a LINE elem átíródása nem áll meg a végszekvenciánál, hanem folytatódik (downstream irányban) ezáltal hosszabb retrotranszpozont eredményezve. Néha viszont szakaszrövidülés is végbemehet, amikor a transzkripcióban nem íródik át a teljes retrotranszpozon hossza (Kumar, Bennetzen 1999).
74 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
Pszeudogének: A LINE elem életciklusa során megtörténhet, hogy nem a saját, hanem a sejt mRNS-éről készít kópiát (cDNA) és azt építi vissza a genomba, ’génduplikációt’ okozva ezzel. Azonban ezek a ’saját’ retroelem DNS szakaszok, érthetően nem hordozzák az eredeti gén (DNS) intronjait, és regulátor szekvenciáit (pl. promoterek, enhanszerek), ezért ezek halott géndarabok, álgének: ’pszeudogének’ (Bennetzen 2000). SINE LTR-nélküli retrotranszpozonok (Short Interspersed Nuclear Elements): A SINE elemek rövid DNA szakaszok (100–400 bp), szintén revez transzkripcióval íródnak át, de eltérően a LINE elemektől, nem RNS-polymeráz II révén, hanem az RNS polimeráz III szintézisével, amely tRNS, 5S rRNA és még néhány snRNS (small nuclear RNA) átírását végzi. A SINE elemek rövid szekvenciájuknál fogva nem kódolnak fehérjét, a saját replikációjukhoz sem (nincs transzpozáz génjük); de a (megmaradt) promoter szakaszuk révén a LINE L1 elemek transzpozáz enzimeinek segítségével képesek szaporodni (copy and paste; másolás és beillesztés). A legkutatottabb SINE elem az emberi genom Alu-elemei (Nelson et al. 1989). A humán genom nem-LTR típusú (LINE és SINE) retrotranszpozonjai (L1 és Alu) a humán genom 25%-át teszik ki, néhány növényfajban is igen magas a kópiaszámuk (Heslop-Harrison 2000; Batzer, Deininger 2002). Az Alu szekvenciák felfedezésének története mintapéldáját adja a növénytudományoknak a genom-analitikai alkalmazásokhoz. (Az Alu jelzés a Arthrobacter luteus baktériumból izolált restrikciós endonukleázra utal, amely az emberi genom AG↓CT/TC↑GA retrotranszpozon-eredetű szekvenciáit hasítja). Az Alu-elemek rövidek (300 bp), ezért a SINE elemek közé sorolt retroelemek, és úgy tűnik, hogy a 7S RNSről készült másodlagos kópiák. Az emberi genom több mint 1 millió Alu elemet tartalmaz, ezzel egymagában foglalva el az emberi genom 10%- át (IGHSC 2001). Ahogy az AluI emésztés (5'-AG/CT-3') restrikciós mintázatváltozása (inszerciók/deléciók) mutatja az 1 millió Alu elem 0.5%-a polimorf, ezáltal alkalmas a genotípus azonosításra: a legtöbb inszerció a lokusz-specifikus Alu-szekvenciákban azonos az emberben és az emberszabású majmokban, azonban, 2.000 Alu inszerció csak az emberben található meg (Roy-Engel et al. 2001; Batzer, Deininger 2002). A növényi retrotranszpozonok szaporodásában (replikációjában) nincs javító- mechanizmus, mert a reverz-transzkriptáz (RNS függő DNS-polimeráz), eltérően a DNS polimeráztól, nem rendelkezik helyesírásjavítási (proofreading) aktivitással (3’ és 5’ exonukleáz aktivitás hiánya), amely hiba mértéke 2.5x10-5 nt/replilkációs (in Kalendar et al. 2004). Ezért egy ’ugráló’ retrotranszpozon nem önmaga kópiája, hanem egy retrotranszpozon-populációé, amelyet szaporodása közben hoz létre. A retrotranszpozonok, a szelekciós nyomás hiányában, minden mutációt megtartanak és továbbadnak, újabb
75 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás lehetőséget nyújtva ezzel a retroelem-alapú genotípus azonosításhoz (Vicient et al. 2000, 2001ab; Kalendar et al. 2004).
A retro/transzpozonok aktivációja: A retro/transzpozonok aktivációjára sok erőfeszítés történt, amelyek közül kettő – a rendkívül nagy számban előforduló MITE transzpozonok (miniature inverted-repeat transposable elements), és az LTR-retrotranszpozonok (long terminal repeat) aktivációja igazolt (Pouteau et al. 1994). Transzpozonok reaktivációjától új genotípusok generálása várható (Hirochika 1993). Az első (re)aktívált növényi retrotranszpozont (Tnt1) dohány protoplaszt kultúrában sikerült kimutatni, gombakivonattal indukált védekezési mechanizmus bekapcsolásával (biotikus stressz) (Pouteau et al. 1991, 1994). Ezt követően újabb reaktívált RTL-retrotranszpozonokat írtak le dohányban (Tto1, Tto2) és rizsben (Tos17) (Hirochika et al. 1996, 2000).
DNS transzpozonok: A kukoricában leírt DNS transzpozonok (McClintock 1942, 1954; 1984) olyan DNS-szakaszok, amelyek kivágódása, áthelyeződése (traszpozició), szaporodása és visszaépülése során végig DNS szakaszként vesz részt (pl. Ac - Ds elemek, illetve a Drosophyla P-eleme) (3.3.3.6. ábra). A genomban több-ezer kópiaszámban fordulnak elő. A DNS-transzpozonok szerkezetére jellemző a két végső (terminális), egymással szembenéző (invert) szekvenciaismétlödés (TIR, terminal inverted repeats), amely szerkezet szükséges a kivágódáshoz és beépüléshez (lasszó képzés). Ez a kivágódás -
áthelyeződés - beépülés (’cut-and- paste’) folyamata, melyet a transzpozon által kódolt transzpozáz enzim katalizál TDS képződéssel (target site duplications) jár (Kumar, 3.3.3.6. ábra. DNS-transzpozonok és aktivitásuk morfológiai hatása Bennetzen 1999; Grandbastien et kukoricában (Feschotte et al. 2002). al. 2005). A legtöbb eukarióta DNS transzpozon a transzpozáz gén szekvenciája és az enzim szerkezete alapján a DDE transzpozáz-típusba tartozik, amely csoportosítás az enzim evolúciósan konzervatív katalitikus doménjének három központi aminósav szerkezetére utal: Aszparagin (D) - Aszparagin (D) - Glutamin (E). A DNS transzpozonok speciális formája a miniatür transzpozonok (MITEs, Miniature Inverted-repeats Transposable Elements), amelyek hossza (általában 400 bp) nem elegendő egyetlen fehérje kódolására sem. Szekvenciájuk sajátsága a 15 bp hosszú inverted ismétlődés: 5'-ggc cag tca caa tgg ..~400nt..
76 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás cca ttg tga ctg gcc-3'; 3'-ccg gtc agt gtt acc ..~400nt.. ggt aac actg acc gg-5', elöszőr 2001-ben mutatták ki (Witte et al. 2001). A rizs (Oryza sativa) teljes genomszekvencia elemzése több mint 100,000 MITE-t mutatott ki, amely a rizs genom 6%-t is meghaladja (Shan et al. 2005). A kukorica volt a legjobb alanya a színmarkerekkel nyomon követhető TE felfedezésének. Az egyszikű fajokra jellemző szemtermés szöveti szerkezetéből ismert a nagy fehérjetartalmú, egy-sejtsoros aleuron réteg, amely triploid (3n) sejtekből áll, és a keményítős tápláló szövet (a ’lisztes’ rész) legkülső burkoló sejtsora, és amelyben a festékanyagok (antociánok és karotenoid pigmentek) szövetspecifikus bioszintézis megy végbe (ld. a különböző színű kukoricacsöveket: fehér, sárga, piros, fekete szemekkel) (3.3.3.6. ábra). A kukorica Ds-Ac elemeinek vizsgálatakor igazolódott, hogy Ds transzpozon átugrása kromoszómatörést okoz kukoricában, ezért a Ds (dissociation - disszociáció, szétválás) jelzést kapta (ma kromoszóma törést, ’brake’-et értünk alatta). A Ds transzpozon, azonban, csak egy másik transzpozon jelenlétében (aktivációjának hatására) képes áthelyeződni, ezért ez a másik transzpozon az Ac (Activator – aktíváló, serkentő) jelzést kapta. Az Ac- transzpozon önálló életet is él, nem szorul a Ds jelenlétére. A két transzpozon-populáció alkotja a kukorica Ac/Ds 3.3.3.7. ábra. A retrotranszpozon-alapú marker módszerek. (a) Az IRAP (Inter- Retrotransposon Amplified Polymorphism) két retrotranszpozon közötti DNS transzpozon családját szakasz szekvenciájának elemzésére (Kalandar, Schulman 2006). A genom általános részei a genomikus DNS (gDNS); LTR-retrotranszpozonok (LTR (McClintock 1950, piros szakaszok közé zárva a retroelem többi részét – core); SSRs 1984;). Hasonló DNS (mikroszatllita ismétlődések); R- restrikciós hasítóhelyek. (b) A REMAP (REtrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism) a retrotranszpozon transzpozonokat írtak le és egy közeli SSR közötti DNS szakasz elemzésére szolgál (Kalendar, Schulman 2006). (c) Az SSAP (Sequence-Specific Amplified Polymorphism) a később petuniában, retrotranszpozon és egy restrikciós hasítóhely(hez ligált) illetve adapter (ld. AFLP; Vos et al. 1995) közötti DNS szakasz elemzésére (Waugh et al. 1997). szójában, kölesben is (d) RBIP (Retrotransposon-Based Insertional Polymorphism) a (Craig et al. 2002). retrotranszpozon és a határoló DNS szakasz közötti szekvencia elemezését (Flavell et al. 1998) célozza (Kalendar, Schulman 2006).
77 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
Retrotranszpozon-alapú genomelemzés: A genom retrotranszpozon eredetű szakaszainak kimutatására kifejlesztett IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism), REMAP (REtrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism) módszerek napjaink fejlesztése (Kalendar, Schulman 2006; Shulman 2007). Az IRAP módszerben az LTR típusú retrotranszpozonok LTR (Long Treminal Repeat) szakaszaira tervezett primerekkel két LTR
Mw 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 D1 D2 Bp Ph Mw
3.3.3.8. ábra. Az LTR-PBS polimorfizmus (az LTR retrotranszpozon PBS szekvenciájára specifikus) mai (1-44) görögdinnye (Citrullus lanatus) fajtákban és régészeti leletek DNS mintáiban (D1 és D1 -13. századi debreceni minta; Bp – 15. századi Budavári minta; Ph – 18. századi pannonhalmi botanikai minta). közötti DNS szakasz elemezhető, míg a REMAP technika a retroelem LTR szakasza és a genom SSR szekvencia közötti szakasza elemezhető (3.3.3.7. ábra). A módosított RBIP módszer (I-PBS, inter-primer binding site) (Kalendar et al. 1999) a retroelem PBS elemzésén alapul. Munkám során az IRAP és a módosított RBIP módszert (I-PBS, inter - primer binding site) alkalmaztam.
LTR retrotranszpozonok elemzése görögdinnyében (Citrulluus lanatus) PBS-specifikus fragmentumok elemzése: A növényi genom LTR retrotranszpozonjai (hasonlóan a humán genomba épült retrovírusokhoz) a gazdasejt aktuális tRNS állományát használják szaporási ciklusuk első lépéséhez az mRNS szál szintéziséhez, amely közvetlenül
(a)
CAACA CAACA CAACA CAACA TGTTG TGTTG TGTTG TGTTG
...... LTR LTR LTR LTR
CCAnnn CCAnnn CCAnnn ......
PBS PBS TGTTG...... LTR...... CAACAnnnTGG...PBSPBS CAACA CAACA CAACA CAACA TGTTG TGTTG TGTTG TGTTG ...... LTR LTR LTR TGTTG...... LTRLTR ...... CAACA
3.3.3.9. ábra. A retrotranszpozonok tRNSmet (CCA) szekvenciájával analóg PBS-primerek (1-51) tervezésének elve (eredeti)
78 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás az 5’LTR szakasz 3’ végén kezdődik 1-3 nt-ot követően. Ez a szekvencia általában 18 bp hosszú, PBS (primer kötő hely, primer binding site). Az evolució során a sejtben legnagyobb mennyiségben előforduló tRNS-t a met-tRNS-t felhasználó retroelemek szaporodtak fel a genomokban (Neuvéglise et al. 2002) (ld. a HIV vírus a lizin3-tRNS-t használja). A met-tRNS 3’-végi aminósav kötő tripletje CCA (3.3.3.9. ábra), melynek komplementer szekvenciája a PBS-ben GGT. A tervezett PBS-specifikus primereink 3’-vége ezért minden esetben a CCA volt (2.10. táblázat, Anyag és Módszer fejezet) (Kalendar, Schulman 2006). Összesen 51 PBS primert teszteltünk melyből mindegyik mutatott amplifikációt. A fragmentumoknak azonban csak közel a fele származik PBS-komplementer szekvenciákból, a többi fragmentum a genomban statisztikusan előforduló egyéb szekvencia (Manninen et al. 2000). Azonban ez a technika is alkalmas volt nagy érzékenységű genom összehasonlításra, melyet elvégeztünk a mai görögdinnye fajtákon és a régészeti leletek DNS mintáiban is (3.3.3.8. ábra.). Mind a két 15. századi, és a 18. századi mintában is sikerült kimutatni retrotranszpozon eredetű fragmentumokat, még a nagy mol tömegű (3 Kbp) frakciókban is (3.3.3.8. ábra).
LTR retrotranszpozon izolálása, klónozása és szekvenálása: Új LTR retrotranszpozonok izolálásához klónoztuk a PBS fragmentumokat, majd kolónia PCR-ben amplifikáltuk, pGEM- T easy vektorba ligáltuk, E. coli baktériumba klónoztuk, majd a plazmidot tisztítottunk és univerzális primerekkel az inszerteket megszekvenáltuk (3.3.3.10. ábra). Összesen 30 klónt
3.3.3.10.ábra. LTR retrotranszpozonok izolálása görögdinnyében (Citrullus lanatus). PBS-specifikus primerteszt (1-51) a görögdinnye csoportos DNS mintájában (a); A #2756 sz. PBS primer fragmentum mintázata 24 görögdinnye mintában (1- 24, ld. 2.5. táblázat) (b); E. coli-ba transzformált PBS-fragmentumok kolónia PCR vizsgálata (61-92) (c); a klón-inszerció ellenőrzése kettős emésztéssel (RsaI és MspI, 4nt hasítók) (d) (1-38: E.coli klón). Mw: Fermentas SM0331.
79 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás szekvenáltunk (20.997 nt), melyek közül 18 szekvencia (60 %) mutatott LTR eredetet az általános LTR szekvencia alapján (primer-CCA-nnn-TGCG-nnn…). A 18 LTR szekvencia lehetséges teljes hosszának további amplifikálására 34 IRAP (Inter Retrotransposon Amplification Polymorphism) (Kalendar, Schulman 2006) primert (ld. 2.10.c. táblázat) terveztünk, melyek mindegyike alkalmas volt LTR alapú IRAP- polimorfizmus meghatározására görögdinnye fajták között (3.3.3.11. ábra).
3.3.3.11. ábra. IRAP polimorfizmus görögdinnyében (Citrullus lanatus). Primer teszt (1-34) IRAP (Inter Retrotransposon Amplification Polymorphism) primerek tesztelésére (e) Mw: Fermentas SM0331.
Az LTR-retrotranszpozon szekvenciák (1-18) BLAST elemzésében génkapcsoltságot (Jiao, Deng 2007) igazoltunk, ugyanis a retroelemek nagy számban épülnek be funkcionális gének promoter közeli szekvenciáiba (nested retroelemek), ezzel a gén expresszió mértékét is befolyásolva (TE-related genes). A rizs teljes genom szekvenciájának ismeretében, meg lehetett elemezni az összes TE-kapcsolt retroelemet: a rizs genom 14.404 génjének szekvenciája tartalmaz retroelemet, ebből 9.493 gén Retrotranszpozont, és 4.159 DNS transzpozon szekvenciákat tartalmazott (Jiao, Deng 2007). A görögdinnye teljes genom szekvenciája messze nem ismert, azonban a BLAST elemzésünk során a 18 szekvenciából három LTR-retrotranszpozon mutatott génkapcsoltságot. Az egyik (2251. sz.) LTR retrotranszpozon szekvenciájának (1.163 nt) 284 nt hosszú szakasza megtalalható volt a görögdinnye gyümölcsmagi nucellusz-specifikus fehérje gén (WM403) határoló (flanking) szekvenciájába épülve (AF008925) (1.711-1.408 nt) (3.3.3.12. ábra). A 284 nt hosszú retrotranszpozon szekvencia elemzése (dotplot) azt igazolta, hogy TRIM (terminal repeat retrotransposon in miniature) illetve szóló-LTR-t (csupán két, egy korábbi transzpozon 5’ és a 3’ LTR-szakaszának rekombinációs terméke, a teljes belső domén elvesztésével) (3.3.3.12. ábra) azonosítottunk, elsőként a görögdinnye genomban.
80 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
3.3.3.12. ábra. A görögdinnye (Citrullus lanatus) uj CiLa-1 TRIM retroeleme (NCBI, EU009625). Az izoláló klón szekvenciája (a); CiLa1 TRIM szekvencia (b); beépülése (nested) a magi nucellusz specifikus fehérje gén (WM403) határoló (flanking) szekvenciájába (AF008925) (1.711-1.408 nt) (c); illesztése (BLAST) (d); és grafikus gén képe (e,f). A gén TTAT/CA szekvenciája (TSD, target site duplikaciós szekvencia) vastagított.
Az új LTR terotranszpozon a CiLa-1 (Citrulus lanatus) elnevezést kapta, az (NCBI adatbázisába feltöltöttük (EU009625). A másik LTR-klón (>2; 2296-primer; 1.070 nt) szekvenciájának 286 nt szakaszát (107 – 393 nt) szintén egy Cucurbitaceae faj, a tök (Cucurbita maxima) floém fehérje (PP1) (NCBI U66277) génjébe ágyazottan találtuk (elemzés alatt). Egy további klón (>5; 2395-primer; 809 nt) 228 nt hosszú retrotranszpozon-eredetű szekvencia szakaszát (573 - 801 = 228 nt) a sárgadinnye (Cucumis melo) gyümölcsben expresszálódó gén (DV633988) EST szekvenciájába épülve mutattuk ki, igazolva ezzel a retroelem 3.3.3.13. ábra. A CiLa1 TRIM retroelem klónjának (2.11-20) és a további 29 klón szekvenciájának aktivitását (autonóm retroelem). rokonsága (CLUSTALW).
81 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 3. Eredmények és Megvitatás
További retroelemek azonosítása során a Cila1 retrotranszpozon szekvenciáját hasonlítottuk össze (CLUSTAL W szekvencia elemző program) (Thompson et al. 1994) a többi (1 - 29) klón szekvenciájával feltételezhető rekombináns cila1 szakaszok (tört retrolemek) azonosítására, melynek során három klón szekvencia hasonlóságát találtuk (3.3.13. ábra). Mindhárom szekvenciát a cila-1-re alkalmazott primer (2296.sz.) amplifikálta, közülük kettő,
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 | | | | | | | | | | 2.11-20 GAACAGGCGATGATACCAGTTTGTTACGAAATCGAAAATTAAAGAATACAAAAGAACGTAAAAGTAGAGAAGATCGACACACAAATTTACGTGGTTCACT 2.2 TGACAAGCTCTGATACCAATTGAAAAATAATATGAGAATACTCTACAAAAATTGAA----AAATAATATGAGAATACTCTACAAATTAGGATGTTAAACC 3.26 TGACAAGCTCTGATACCAATTGAAAAATAATATGAGAATACTCTACAAAAATTGAA----AAATAATATGAGAATACTCTACAAATTAGGATGTTAAACC
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 | | | | | | | | | | 2.11-20 AACAATGTATT-AGCTACGTCCACGGGACAAAGGGAAATTTTGTTAAAGAGAATGTCTTAAGACTACAGAATGCCGCAAAATGAATAATGGTTATAGAGT 2.2 AATAGCACAAACAACTAATTTGACATCAAGAAAACAACGCAACATAAAAAATAAAAAATAATTAAAAAAAAAACTGGAATGCAAAAGTTGGTAACCTAGT 3.26 AATAGCACAAACAACTAATTTGACATCAGGAAAACAACGCAACATAAAAAATAAAAAATAATTAAAAAAAAA-CTGGAATGCARAAGTTGGTAACCTAGT
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | 2.11-20 TTATATAAA------ACACTTCTCTAAACCCTAGGTGGAGAATGAAAATATTTAAATAATTAAATATATCAAATACCAATTCTAATTAAGTTTAGGATT 2.2 TAGGTGATACACACCTACGTTTCAGGGATTGTGTGCCCGACAAAGATAATCCACTAATATTGAAATGTAAGAAATTACAACAAAATACTTATCTGTACAT 3.26 TAGGTGATACACACCTACGTTTCAGGGATTGTGTGCCCGACAAAGATAATCCACTAATATTGAAATGTAAGAAATTACAACAAAATACTTATCTGTACAT
310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | 2.11-20 CAAAGCCCTCCAACAAGTATGATGGAGGCAGTGTATCCATTCATATAGACCACCATTCCATTTTCTTGAAAACTTTTGTTGCTTATTCCAATAGTACACA 2.2 AAACTACTTCTA------CAGTGACTCTAGTCAAGCTTAACACGATAACCACCAAGGTTCCCCCTAGATGTGAGACTCCCTTTTTATACA 3.26 AAACTACTTCTA------CAGTGACTCTAGTCAAGCTTAACACGATAACCACCAAGGTTCCCCCTAGATGTGAGACTCCCTTTTTATACA
410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 | | | | | | | | | | 2.11-20 ACACCTTAGATCTCATTAGGGATATGCACTCGTATCCTCCTCTCGAACAAACCACCACTTAGCTTATCATAATTCGTCTAATTTCAATATAGTGTTAAAA 2.2 CTTAGGTTCCCCCTTTTTGGGTTTTATGCCCTAAAACTCGTTCATAGTAAA------TGTAAATAATTTATTGTCATAAATAAAGTGTTCTTG 3.26 CTTAGGTTCCCCCTTTTTGGGTTTTATGCCCTAAAACTCGTTCATAGTAAA------TGTAAATAATTTATTGTCATAAATAAAGTGTTCTTG
510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | 2.11-20 ATGTCACTACAACAATTGTGACGACCCCAATTTCTAAACTAAACTAGGGACGTCACCACATTTAACCTATCACTAACTTTAATAACTCTCATGTCCTAGA 2.2 ATGTTCTTTCAATAAGTATTATTGATTATTTTGTATTTATTTTGTCTTAATAACCCCAAAATCCAATAAATTAACATCCCAGGTTGTCTTATGAATCTTG 3.26 ATGTTCTTTCAATAAGTATTATTGATTATTTTGTATTTATTTTGTCTTAATAACCCCAAAATCCAATAAATTAACATCCCAGGTTGTCTTATGAATCTTG
610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 | | | | | | | | | | 2.11-20 AAAAATTTCAGCAGCATAACGACGCTACCACAACGAAATCCAATTTTTTTGCCTTTAACCTGTTTCAAAAAGAGACACTCCCAATAACATTTTACCCGAG 2.2 AACAGTATGTTGAGACATACGGGGATTAATGATCAAGATACAA------CCTAAAGGATTTATAGTATAGGGACAAGGTTGGGTACCTTATCCTGGTA 3.26 AACAGTATGTTGAGACATACGGGGATTAATGATCAAGATACAA------CCTAAAGGATTTATAGTATAGGGACAAGGTTGGGTACCTTATCCTGGTA
710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 | | | | | | | | | | 2.11-20 CTAGCTACTTCCCAACAAAATCATCAAAGCTTTCGGAAGTGGATCAAAACTCAAAACACAAAATTATTCATATTCAACAACCACTTAAATCAACCACTGT 2.2 ACA------CTATGGATACGACCCACTTTGTATTTAATACAAACTCAGTGATCCAACGTGTTCATGTAGGTGA------3.26 ACA------CTATGGATACGACCCACTTTGTATTTAATACAAACTCAGTGATCCAACGTGTTCATGTAGGTGA------
810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | 2.11-20 CTTTGTTCTTGAGATTTTAGCCATGAATTCAAATTTTTGTTAAGAAATATGGAAATTATTATACTGTAATATGATAAGAAAATAAACATAATGTTTTTTT 2.2 ------CATGCAAATGAGGGTATCTTATGTAATGAGTTTGCATAAGACCGGACCTTAAAATAGTAACAATTAGATGTAACTAGTTGACTAGTTTGATTT 3.26 ------CATGCAAATGAGGGTATCTTATGTAATGAGTTTGCATAAGACCGGACCTTAAAATAGTAACAATTAGATGTAACTAGTTGACTAGTTTGATTT
910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 | | | | | | | | | | 2.11-20 TATTTTAAAAAAAAAAATAATTATCAAATGACCATTTTTCTCTATTTTATACCAACCAAAGGCATAGACCGTGCGTATGAACCTTTTGTTAGAAAATGTA 2.2 CCATTTCAATAGGATGACCTAGG-TAACTTAGTCTTAGTCTAGAGTATAT------TATGAACTTCTATTCACAAGGGATT 3.26 CCATTTCAATAGGATGACCTAGGGTAACTTAGTCTTAGTCTAGAGTATAT------TATGAACTTCTATTCACAAGGATTG
1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100 | | | | | | | | | | 2.11-20 GTATTTGTGAAACTTTATGTCAGA------TTTGATGCAAACAAAGTTCATAAAATAAAATTTAAACATGCTTAATTACGCCATTCAACAGAGAGCGAT 2.2 GTCCTTTTGATTTGTACGGTGAGAGTGCTTATTTGCGACTCAATATGTCTACTATTTTGAGACAAAACGAGCGGGAG---TGAGAACATACTATACAGAA 3.26 TCC--TTTGATTTGTACGGTGAGAGTGCTTATTTGCCGACTCATATGTCTACTATTT-GAGACAAAACGAGCGGGGGAGTTGAGAACATAACATACAGAT
1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1189 | | | | | | | | 2.11-20 TGTCGGATTAAAGCATTTGGGTCCAAATATTAC------ACTCCCCACTATTAATATAATGCTTTTTGGTATCATCGCCTGTTC 2.2 TGAATGATTCACTCCTCCGACTAAGTAGTAGATGATGTCTAATGGTTCTCCACGATTAGAGAGGTCGACTTCAGACT------3.26 G--ATGATTCACTTCTACGGACTTAAGGTTAGTTAGATGAGTGTACTTAAGTGAGTTTCTCACAGAAATTTTAAAAAGAAGG------3.3.14. ábra. Rekombináns Cila-1-retorelem szekvencia-szakaszainak (2.11-20 klón, 1189 bp) azonosítása a 2.2 (1046 nt), és a 3.26 (1070 nt) klónban. a >2.2 (1046 nt), és a >3.26 (1070 nt), szekvencia összehasonlítása, valóban rekombináns (tört) cila-1 szekvenciákat mutatott ki a görögdinnye genomban (3.3.14. ábra), amely tovább erősíti a DV633988 EST génbe épült cila-1 expressziójának valószínűségét, hasonlóan az egyszikü árpa BARE-1 LTR-retrotranszpozonhoz (Kalendar, Schulman 2006).
82 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 4. Új tudományos eredmények – A gyakorlati alkalmazás lehetőségei
4. Új tudományos eredmények – A gyakorlati alkalmazás lehetőségei
1. Az ivaros- (pollen, portok, ovárium és ovulum), valamint a vegetatív biotechnológiai módszerek (mikroszaporítás, klónozás, szomaklónok, protoklónok, cibridek) segítségével új klóntípusok állíthatók elő a növénynemesítés számára. Kutatásaim során az in vitro klónozásban az egysejt-eredetű szomatikus embriógenezist bizonyítottam szkenning elektron mikroszkópos elemzéssel (SEM) egy- és kétszikű fajokban: sziki mézpázsitban (Puccinellia limosa); vadgesztenyében (Aesculus hippocastanum), és szójában (Glycine soya). További fajokban elért eredményeimre, helyszűke miatt, csak utaltam: új tarackbúza klón (Agropyron repens cv. Purdue) és lignintartalomban csökkentett zöld pántlikafű (Phalaris arundinacea) klónok előállítása, valamint az ivarsejt eredetű, dihaploid paprika (Capsicum annuun) klónok molekuláris elemzése.
2. Igazoltam a fitoremediációs célra előállított 35S-gsh1-transzgénikus szürkenyár klónok (11ggs, 6lgl) gshI-klónstabilitását 682 AFLP-fragmentum kimutatásával. Hatékony génexpresszió növekedést értem el a gshI-transzgén, valamint a nyárfa endogén gsh1 gének reaktiválásában DHAC-indukált DNS-demetilációval. A 6lgl-klónban a gshI-transzgén expressziója 1.8-szorosára, míg a nyárfa saját gsh1 génjének expressziója 8.7-szeresére emelkedett; a kontroll WT-klónban 19.7-szeresére nőtt az endogén gsh1 nyárfagén aktivitása. Eredményeimmel egyben alternatív módszer lehetőségét adtam a GMO – kontra nem-GMO kérdéshez.
3. Új mikroszatellita klóntípusokat azonosítottam tanítványaimmal feketenyárban (Populus nigra) 35 haploid eredetű klón populációjában, öt SSR lokusz, 20 SSR allél 280 szekvenciája alapján. Az SSR polimorfizmus egyik okaként, a nyárfa wpms-20 lókuszán 5-szörös (ctggtt)5 szekvencia- deléciót mutattam ki a (TTCTGG)8 lokuszon, igazolva a gametoklónális variabilitás molekuláris fixálásának lehetőségét.
4. Megalapítottam tanítványaimmal a növényi arheogenetikai kutatásokat köles, sárgadinnye és görögdinnye régészeti leleteinek feldolgozásával. A köles (Panicum miliaceum) arheogenetikai elemzésében molekuláris régészeti kormeghatározási módszer alkalmazhatóságát írtam le AFLP- lokuszok degradáció mértékének meghatározásával 1.600-, és 600 éves magleletek ősDNS mintáiban (2 AFLP fragmentum / 4. századi; 158 AFLP fragmentum / 15. századi és 264 AFLP fragmentum / mai fajta). Az ISSR fragmentum elemzéssel fajtarekonstrukciós módszert dolgoztam ki 600-éves köles rekonstrukciójára ősDNS mintája alapján, 20 mai fajta 7 ISSR lokusz 157 ISSR allél összehasonlításával.
5. A középkori (600 éves) sárgadinnye (Cucumis melo) maglelet DNS mintájának fajtaspecifikus ITS1-5.8S-ITS2 szekvencia elemzésével molekuláris módszert dolgoztam ki tanítványaimmal a régészeti leletek kereszt-fertőzött mintáinak kiszűrésére. Valamint, 8 SSR lokusz 40 allél, 485 SSR fragmentum szekvenciájának meghatározásával fajtarekonstrukciót végeztem 600 éves sárgadinnye fenotípusának meghatározásában.
6. Középkori (700 és 600 éves) görögdinnye (Citrullus lanatus) kloroplaszt ősDNS (cpDNS) mintáinak és a mai fajták összehasonlító elemzésében új cpDNA haplotípus csoportokat határoztam meg tanítványaimmal. A mikroszatellita DNS szakaszok evolúciója kérdésében kísérletesen igazoltam, hogy a 600 éves mikroevolúciós idő során egyszerű SSR szekvenciákból hogyan alakul ki összetett SSR a (CT)27 egyszerű SSR lokuszon kimutatott (CT)17-C-(TC)4-T- (CT)5 szekvencia azonosításával.
7. A görögdinnye (Citrullus lanatus) első LTR-retrotranszpozonjának (Cila1) leírásával (NCBI EU009625), megindult az LTR-alapú molekuláris fajtaazonosítás görögdinnyében finn – magyar együttműködésben.
8. A hazai régészeti genetika készen áll az évszázados feladat a Nemzeti Pantheon elkészítésére a székesfehérvári Király Sirok leleteinek beazonosításával.
83 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
5. Irodalomjegyzék
Abbott RJ, Brochmann C (2003) History and evolution of the arctic flora: in the footsteps of Eric Hultén. Molecular Ecology 12: 299–313. Adcock GJ, Dennis ES, Easteal S, Huttley GA, Jermiin LS, Peacock WJ, Thorne A. (2001). Mitochondrial DNA sequences in ancient Australians: Implications for modern human origins. Proc Natl Acad Sci USA 98: 537-542. Alefeld F (1866) Landwirthschaftliche Flora oder die nutzbaren, kultivirten Garten-und Feldgewächse Mitteleuropa's in allen ihren wilden and Kulturvarietäten. Berlin. Wiegandt & Hempel, pp. VIII + 364. Reprint: Unveränderter Nachdruck der Ausgabe 1866 mit Biner Einfùhrung vos Johannes Helm (Gatersleben). Königstein, Otto Koeltz (1966) XVI+VIII+364 p. Al-Janabi SM, RJ Honeycutt, C Peterson, BWS Sobral (1994) Phylogenetic analysis of organellar DNA sequences in the Andropogoneae: Saccharum. Theor. Appl. Genet. 88:933-944 Allaby RG, Banerjee M, Brown TA (1999) Evolution of the high-molecular-weight glutenin loci of the A, B, D and G genomes of wheat. Genome 42: 296–307. Alonso A, Martín P, Albarrán C, García P, Primorac D, García O, Fernández de Simón L, García-Hirschfeld J, Sancho M, Fernández-Piqueras J (2003) Specific quantification of human genomes from low copy number DNA samples in forensic and ancient DNA studies. Croatian Medical Journal 44: 273–280. Altschul S F, Madden TL, Schaffer AA, Zhang JH, Zhang Z, Miller W, Lipmand DJ (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25:3389-3402. Anand A, HN Trick, BS Gill, S Muthukrishnan (2003) Stable transgene expression and random gene silencing in wheat. Plant Biotechnology Journal 1:241-251. Anderson JA, GA Churchill, JE Autriques, SD Tanksley, ME Sorrels (1993) Optimizing Parental Selection For Genetic-Linkage Maps. Genome 36:181-186. Andres TC (2004) Web site for the plant family Cucurbitaceae & home of The Cucurbit Network. http://www.cucurbit.org/family.html. Arber W, D Dussoix (1962) Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. I. Host controlled modification of bacteriophage lambda. J Mol Biol 5:18-36 Arens A, P Odinot, AW van Heusden, P Lindhout, B Vosman (1995) GATA- and GACA-repeats are not evenly distributed throughout the tomato genome. Genome 138:84-90. Arisi A-C M, G Noctor G, CF Foyer, L Jouanin L (1997) Modification of thiol contents in poplars (Populus tremula x P. alba) overexpressing enzymes involved in glutathione synthesis. Planta 203:362-372. Arumuganathan K, Earle ED (1991) Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Mol Biol Rep 9 : 211-215. Aufhammer G, G Fischbeck (1964) Ergebnisse von Gefass- und Feldversuchen mitdemNachbau keimfahiger Gersten- und Hafer korner aus dem Grundstein des 1832 errichteten. N¨urnberger Stadttheates. Z Pflanzenzuchtung 51: 345–378. Austin JJ, Smith AB, Thomas RH (1997) Palaeontology in a molecular world: the search for authentic ancient DNA. Trends in Ecology and Evolution 12: 303–306. Bada JL, Wang XYS, Hamilton H (1999) Preservation of key biomolecules in the fossil record: current knowledge and future challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London, Series B 354: 77–86. Balázs E, Bouzoubaa S, Guilley H, Jonard G, Paszkowski J, Richards K (1985) Chimeric vector construction for higher-plant transformation. Gene. 1985; 40: 343–348. Bálint A (1980): A vetőmagtermesztés genetikai alapjai. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest. Bálint A (1996) A brief history of the theory, methodology and application of mutation research. Acta Agronomica 44:93-107. Banerjee M, Brown TA (2002) Preservation of nuclear but not chloroplast DNA in archaeological assemblages of charred wheat grains. Ancient Biomolecules 4: 59–63. Bányai L (1971) Kölesfajták agrobotanikai vizsgálata. Agrobotanika, Tápiószele 11: 39-60. Barakat H (1990) Plant remains from El Omari. Archaeologische Veroffentlichungen Deutsches Archaologisches Institut Abteilung im Kairo, 82. In Debono, F. and Mortensen, B (eds.) El Omari. A Neolithic settlement and other sites in the vicinity of Wadi Hof, Helwan 82: 109-116. Barakat H (1992) La vegetation antique de Douch. Une approche macrobotanique (Douch II) IFAO Le Caire Barna B, L Ádám L, Z Király (1993) Juvenility and resistance of a superoxide-tolerant plant to diseases and other stresses. Naturwissenschaften 80: 420-422. Barna B, Harrach BD, Pogány M (2004) Biotic and abiotic stress resistance correlates with tolerance to necrotization induced by reactive oxygens and nitric oxide. Acta Physiol Plant 26:125-125. Barnabás B, Obert B, Kovács G (1999) Colchicine, an efficient genome doubling agent for maize (Zea mays L.) microspores cultured in anthero. Plant Cell Rep 18: 858-862. Barta E, Pintar A, Pongor S (2002) Repeats with variations: accelerated evolution of the Pin2 family of proteinase inhibitors Trends Genet 18: 600-603. Bassam BJ, G Caetano-A, PM Gresshoff (1991) Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem 196:80-83.
84 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Batzer MA, P L Deininger (2002) Alu Repeats and Human Genomic Diversity. Nature Reviews: Genetics 3: 370-379. Baumberger N, Baulcombe DC (2005) Arabidopsis ARGONAUTE1 is an RNA slicer that selectively recruit microRNAs and short interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci USA 102, 11928-11933. Baumel A, Ainouch M, Kalendar, R. Schulman AH (2002) Retrotransposons and genomic stability in populations of the young allopolyploid species Spartina anglica Hubard (Poaceae). Molecular Biology and Evolution, 19 (8): 1218-1227. Bennetzen JL (2000) Transposable element contributions to plant gene and genome evolution. Plant Mol Biol 42: 251–269. Bevan M (1984) Binary Agrobacterium Vectors For Plant Transformation. Nucleic Acids Research 12:8711-8721. Binh DQ, LE Heszky, Gyulai G, A Csillag (1992) Plant regeneration of NaCl-selected embryogenic cells from long-term suspension culture of rice (Oryza sativa L.) in saline conditions. Plant Cell Tissue Organ Cult 29:75-82. Binh DQ, LE Heszky, Gyulai G, E Kiss, A Csillag (1989) Plant regeneration from callus of Puccinellia distans (L.) Parl. Plant Cell Tissue Organ Cult 18:195-200. Binladen J, Gilbert MT, Willerslev E (2007) 800,000 year old mammoth DNA, modern elephant DNA or PCR artefact? Biology Letters 3: 55-6; discussion 60-3. Bird A (2002) DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes and Development 16:6-21. Bisognin DA (2002) Origin and evolution of cultivated cucurbits. Cienc Rural 32:715-723. Bisztray Gy D, R Bacsó, P Bodor, G Facsar, F Gyulai, I Velich (2004a) Archaeobotanical and genetical methods to analyse 600-years-old seeds of horticultural plants.5th IVCHB Symposium, In Vitro Culture and HorticulturaBreeding,12-17. September 2004, Debrecen, Hungary, Book of Abstracts Eds.: Fári MG, I Holb, 2l2.p. Bittsánszky A (2006) A gsh1-transzgénikus szürkenyár stresszindukciója Zn2+ és paraquat tesztben; feketenyár sejtklónok SSR diverzitása. PhD Disszertáció, SzIE Gödöllő. Témavezető: Gyulai G. Bittsánszky A, T Kőmíves, G Gullner, Gyulai G, J Kiss, L Heszky, L Radimszky, H Rennenberg (2005a) Ability of transgenic poplars with elevated glutathione content to tolerate Zinc (2+) stress. Environment International 31:251-254. Bittsánszky A, Gyulai G, G Gullner, J Kiss, Zs Csintalan, Z Szabó, R Lágler, T Kőmíves (2005b) Stress tolerance and in vitro phytoremediation of poplar (Populus). Hung Agric Research 2005/1:13-15. Bittsánszky A, Gyulai G, M Humphreys, G Gullner, Zs Csintalan, J Kiss, Z Szabó, R Lágler, Z Tóth, H Rennenberg, L Heszky, T Kőmíves (2006) RT-PCR analysis and stress response capacity of transgenic gshI-poplar clones (Populus x canescens) in response to paraquat exposure. Z. Naturforschung 61c:699-730. Bittsánszky A, Gyulai G, RP Malone, G Gullner, J Kiss, M Czakó, P Lehoczky, L Márton, L Heszky, T Kőmíves (2007a) Triggering of a plant molecular defense mechanism; gene expression levels of transgene gshI and poplar gene gsh1 (Populus x canescens) in response to the DNA demethylating drug DHAC – an qRT-PCR analysis. Acta Phytopathol Entomol Hung 42:235-243. Bittsánszky A, Gyulai G, Kiss J, Gullner G, Heszky L, Kőmíves T (2007b) Feketenyár (Populus nigra) gametoklónok mikroszatellita változatossága; (TTCTGG)5 deléció a WPMS-20 lokuszon. Agrártudományi Közlemények 42:235-243. Bittsánszky A, G Gullner, G Gyulai, T Kömíves (2011) A Case Study: Uptake and Accumulation of Persistent Organic Pollutants in Cucurbitaceae Species. In. Organic Xenobiotics and Plants: From Mode of Action to Ecophysiology. Eds. Schröder P and Collins CD, Springer, Chapter 4, pp. (in press). ISBN: 978-90-481-9851-1. Blatter RHE, Jacomet S, Schlumbaum A (2002) Spelt-specific alleles in HMW glutenin genes from modern and historical European spelt (Triticum spelta L.). Theor Appl Genet 104: 329–337. Block De M, L Herrera-Estrella, M Van Montagu, J Schell, P Zambryski (1984) Expression of foreign genes in regenerated plants and in their progeny. Embo J 3:1681-1689. Blouin MS, Parsons M, Lacaille V, Lotz S (1996) Use of microsatellite loci to classify individuals by relatedness. Molecular Ecology 5:393 - 401. Bogacsi-Szabó E, T Kalmár, B Csányi, Gy Tömöry, Á Priskin, F Horváth, CS Downes I Raskó (2006) Mitochondrial DNA of ancient Cumanians: Culturally asian steppe nomadic inmigrants with substantially more western Eurasian mitochondrial DNA lineages. Hum Biol 77:629-652. Boodle LA 193[?) [Unpublished report on the Tutankhamun plant remains in Kew]. Stored in the Griffith Institute archive, Ashmolean Museum, Oxford. Bordács S, A Borovics, I Bach (2002) Genetic diversity of natural populations and gene bank of black poplar in Hungary. Pp 93–106 In Genetic Diversity in River Populations of European Black Poplar -Implications for riparian eco-system management (BC Van Dam, Bordács S, eds.). Csiszár Nyomda, Budapest, Hungary. Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW (1980) Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am J Hum Genet 32:314-331. Bottjer DJ, EH Davidson, KJ Peterson, RA Cameron (2006) Paleogenomics of echinoderms. Science 314: 956-960. Braun A (1879) On the vegetable remains in the Egyptian Museum at Berlin. Journal of Botany 8: 19-23, 48-62 and 91-92 Brewer S, Cheddadi R, de Beaulieu JL, Reille M, Data Contributors (2002) The spread of deciduous Quercus throughout Europe since the last glacial period. Forest Ecology and Management 156: 27–48. Briggs DEG, RP Evershed, MJ Lockheart (2000) The Biomolecular Paleontology of Continental Fossils. Paleobiology, 26, No. 4, Supplement (Autumn, 2000), pp. 169-193.
85 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Briggs R, King TJ (1952) Transplantation of Living Nuclei from Blastula Cells into Enucleated Frogs' Eggs. Proc National Acad Sci USA 38:, 455-463 Brombacher C (1997) Archaeobotanical investigations of Late Neolithic lakeshore settlements (Lake Biel, Switzerland). Vegetation History and Archaeobotany 6: 167-186. Brown TA (1999) How ancient DNA may help in understanding the origin and spread of agriculture. Proceedings of the Royal Society of London, Series B 354: 89–98. Bruce BD (2001) The paradox of plastid transit peptides: conservation of function despite divergence in primary structure. Biochimica Biophysica Acta 1541: 2-21. Bruyere B (1937) Rapport sur les fouilles de Deir EI Medineh (1934-1935). Deuxieme partie: La Necropole de i'Est. Fouilles de Flnstitut Francais du Caire (Jouguet, M.P.), 15. Le Caire. Bunce M, Worthy TH, Ford T, Hoppitt W, Willerslev E, Drummond A, Cooper A (2003) Extreme reversed sexual size dimorphism in the extinct New Zealand moa Dinornis. Nature 425: 172-175. Burger J, Hummel S, Herrmann B (2000) Palaeogenetics and cultural heritage. Species determination and STR-genotyping from ancient DNA in art and artefacts. Thermochimica Acta 365: 141–146. Burger J, Rosendahl W, Loreille O, Hemmer H, Eriksson T, Gotherstrom A, Hiller J, Collins MJ, Wess T, Alt KW (2004) Molecular phylogeny of the extinct cave lion Panthera leo spelaea. Mol Phylogenet Evol 30: 841-849. Burken JG, Schnoor JL (1998) Predictive relationships for uptake of organic contaminants by hybrid poplar trees. - Environ. Sci. Technol. 32: 3379-3385. Caetano-A G, BJ Bassam, PM Greshoff (1991) DNA Amplification Fingerprinting Using Very Short Arbitrary Oligonucleotide Primers. Bio/Technology 9:553-557. Caetano-A G, BJ Bassam, PM Gresshoff (1993) Enhanced detection of polymorphic DNA by multiple arbitrary amplicon profiling of endonuclease-digested DNA: identification of markers tightly linked to the supernodulation locus in soybean Mol Gen Genet 241:57-64. Cano RJ, Borucki MK (1995) Revival and Identification of Bacterial-Spores in 25-Million-Year-Old to 40-Million-Year-Old Dominican Amber. Science 268: 1060-1064. Cano RJ, Poinar HN, and Poinar Jr GO (1992) Isolation and partial characterisation of DNA from the bee Proplebeia dominicana (Apidae: Hymenoptera) in 25-40 million year old amber. Med Sci Res 20: 249–251. Cano RJ, Poinar HN, Pieniezak NS, Poinar Jr GO (1993) Enzymatic amplification and nucleotide sequencing of DNA from 120–135 million year old weevil. Nat Rev Genet 363: 536–538. Cao X, NM Springer, MG Muszynskii, RL Phillips, S Kaeppler, SE Jacobsen (2000) Conserved plant genes with similarity to mammalian de novo DNA methyltransferases. Proc Natl Acad Ssi USA 97: 4979–4984. Carruthers W (1886) The age of some existing species of plants. Journal of Botanyl A: 309-319 Casacuberta JM, Santiago N (2003) Plant LTR-retrotransposons and MITEs: control of transposition and impact on the evolution of plant genes and genomes. Gene 311: 1–11 Castilho A, N Neves, M Rufini-Castiglione, W Viegas, JS Heslop-Harrison (1999) 5-Methylcytosine distribution and genome organization in Triticale before and after treatment with 5-azacytidine. J Cell Science 112: 4397-4404. Cekic C, NH Battey, MJ Wilkinson (2001) The potential of ISSR-PCR primer-pair combinations for genetic linkage analysis using the seasonal flowering locus in Fragaria as a model. Theor Appl Genet 103:540-546. Cervera MT, Storme V, Ivens B, Gusmao J, Liu BH, Hostyn V, Van Slycken J, Van Montagu M., Boerjan W. (2001) Dense genetic linkage maps of three Populus species (Populus deltoides, P-nigra and P. trichocarpa) based on AFLP and microsatellite markers. Genetics 158: 787-809. Chalfoun DJ, Tuross (1999) Botanical remains: utility in protein and DNA research. Ancient Biomolecules 3: 67–79. Chalupa V (1990) Somatic embryogenesis and plant regeneration in Quercus petrea (Matt-) Liebl., Tilia platyphyllos Scop., and Aesculus hippocastanum L. Lestnictvi. Forestry 36:599-604. Chang K (1986) The Archaeology of Ancient China. 4th ed. New Haven: Yale University Press. DS715. C38 Chase MW, Soltis DE, Olmstead RG, Morgan D, Les DH, Mishler BD, Duvall MR, Price RA, Hills HG, Qiu Y-L, Kron KA, Rettig JH, Conti E, Palmer JD, Manhart JR, Sytsma KJ, Michaels HJ, Kress WJ, Karol KG, Clark WD, Hedrén M, Gaut BS, Jansen RK, Kim K-J, Wimpee CF, Smith JF, Furnier GR, Strauss SH, Xiang Q-Y, Plunkett GM, Soltis PS, Swensen SM, Williams SE, Gadek PA, Quinn CJ, Eguiarte LE, Golenberg E, Learn GH Jr, Graham SW, Barrett SCH, Dayanadan S, Albert V (1993) Phylogenetics of seed plants: an analysis of nucleotide sequences from the plastid gene rbcL. Annals of the Missouri Botanical Garden 80: 528–580. Chen J-f, JE Staub, Y Tashiro, S Isshiki, S. Miyazaki (1997) Successful interspecific hybridization between Cucumis sativus L. and C. hystrix Chakr. Euphytica 96: 413-419. Chen ZJ, CS Pikaard (1997) Epigenetic silencing of RNA polymerase I transcription: a role for DNA methylation and histone modification in nucleolar dominance. Genes and Development 11:2124-2136. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R (1994) Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA. Proce Nat Acad Sci USA 91:5695-5699. Cheng X, RJ Roberts (2001) AdoMet-dependent methylation, DNA methyltransferases and base flipping. Nucleic Acid Res 29:3784-3795. Close AE, Wendorf F (1992) The Beginnings of Food Production in the Eastern Sahara. In Gebauer, A.B. and Price, T.D. (eds), Transition to Agriculture in Prehistory: 63-72. Prehistory: 63-72. Prehistory Press.
86 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Cogniaux A, H Harms (1924) Cucurbitaceae- Cucurbiteae- Cucumerineae. In: A Engler, ed. Das Pflanzenreich Regni vegetabilis conspectus 88 (IV.275.II): 116-157. Wilhelm Engelmann Leipzig. Colosi JC, BA Schaal (1997) Wild proso millet (Panicum miliaceum) is genetically variable and distinct from crop varieties of proso millet. Weed Science 45:509-518. Constable JJ, Packer C, Collins DA, Pusey AE (1995) Nuclear DNA from primate dung. Nature 373: 393. Cooper A, Drummond AJ, Willerslev E (2004) Ancient DNA: Would the real neandertal please stand up? Curr Biol 14: R431-R433. Cooper A, Lalueza-Fox C, Anderson S, Rambaut A, Austin J, Ward R (2001a) Complete mitochondrial genome sequences of two extinct moas clarify ratite evolution. Nature 409: 704-707. Cooper A, Mourer-Chauvire C, Chambers GK, von Haeseler A, Wilson AC, Pääbo S (1992) Independent origins of New Zealand moas and kiwis. Proc Natl Acad Sci USA 89: 8741-8744. Cooper A, Poinar HN (2000) Ancient DNA: Do it right or not at all. Science 289:1139. Cooper A, Rambaut A, Macaulay V, Willerslev E, Hansen AJ, Stringer C (2001b) Human origins and ancient human DNA. Science 292: 1655- 1656. Cooper A, Wayne R (1998) New uses for old DNA. Current Opinion in Biotechnology 9: 49–53. Corpet F (1988) Multalin, Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res 1988 Nov 25;16(22):10881-10890. Laboratoire de Genetique Cellulaire, INRA Toulouse, France. http:// npsa-pbil.ibcp.fr / cgi-bin / npsa_automat.pl?page = / NPSA / npsa_multalinan.html Costantini L, Costantini-Biasini L (1985) Agriculture in Baluchistan between the 7th and the 3rd millennium BC. Newsletter of Baluchistan Studies (Instituto Universitario Orientale, Naples) 2: 16-30. Costantini L, L Costantini Biasini, A Lentini (1996) Archaeobotanical investigations at Pirak, Baluchistan, Pakistan. Giornale Bot Ital 130: 308. Craig NL, Craigie R, Gellert M, and Lambowitz AM (ed.) (2002) Mobile DNA II. Washington, DC: ASM Press. ISBN 978-1555812096. Creissen G, P Broadbent, R Stevens, AR Wellburn, P Mullineaux (1996) Manipulation of glutathione metabolism in transgenic plants. Biochemical Society Transactions 24:465-469. Cresswell A, Sackville-Hamilton NR, Roy AK, Viegas BMF (2001) Use of AFLP markers to assess genetic diversity of Lolium species from Portugal Mol Ecol 10:229-241. Csiszár J, M Szabó, L Erdei, L Márton, F Horváth, I Tari (2004) Auxin autotrophic tobacco callus tissues resist oxidative stress: the importance of glutathione S-transferase and glutathione peroxidase activities in auxin heterotrophic and autotrophic calli. J Plant Physiol 161:691-699. Dakin EE, Avise JC (2004) Microsatellite null alleles in parentage analysis. Heredity 93:504 – 509. Dálnoki O (2000) Kelta telepek környezeti képéről a Budapest-Corvin tér keltáinak növénytermesztése alapján. In: Füleky Gy. (ed.): A táj változásai a Kárpát-medencében a történelmi események hatására. Kulturális Örökség Igazgatósága Budapest – Szent István Egyetem, Gödöllő, 42-50. Dálnoki O, Jacomet St. (2002) Some aspects of Late Iron Age agriculture based on the first results of on archaeobotanical investigation at Corvin ter, Budapest, Hungary. Vegetation History and Archaeobotany 11: 9-16. Dane F (2002) Chloroplast DNA investigations in Citrullus using PCR-RFLP analysis. In D.N. Maynard [ed.], Cucurbitaceae 2002, 100–108. ASHS Press, Alexandria, Virginia, USA Dane F, T Tsuchiya (1986) Chromosome studies in the genus Cucumis. Euphytica 25: 367-374. Dane F, P Lang, R Bakhtiyarova (2004) Comparative analysis of chloroplast DNA variability in wild and cultivated Citrullus species. Theor Appl Genet 108: 958-966 Danin-Poleg Y, N Reis, G Tzuri, N Katzir (2001) Development and characterization of microsatellite markers in Cucumis. Theor Appl Genet 1002: 61-72. Dayanandan S, Rajora OP, Bawa KS (1998) Isolation and characterization of microsatellites in trembling aspen (Populus tremuloides). Theor Appl Genet 96:950-956. De Rey-Pailhade J (1888a) Sur un corps d'origine organique hydrogenant le soufre a froid. (On a body of organic origin hydrogenated cold sulfer.) Compte Rendus Hebdomadaire Séances de l'Académie des Sciences 1888;106:1683–4 (in French). De Rey-Pailhade J (1888b) Nouvelles recherches physiologiques sur la substance organique hydrogenant le soufre a froid. (New physiological research on an organic substance cold sulfer.) Compte Rendus Hebdomadaire Séances de l'Académie des Sciences 1888; 107:43–4 (in French). Deák M, Donn G, Fehér A, Dudits D (1988) Dominant expression of a gene amplification-related herbycide resistance in Medicago cell hybrids Plant Cell Rep. 7:158-161. Deák M, Kiss GB, Koncz C and Dudits D (1986) Transformation of Medicago by Agrobacterium mediated gene transfer. Plant Cell Rep 5:97- 100. Debruyne R, Barriel V (2006) Biological evolution and ancient DNA. M S-Medecine Sciences 22: 502-506. Debruyne R, Barriel V, Tassy P (2003) Mitochondrial cytochrome b of the Lyakhov mammoth (Proboscidea, Mammalia): new data and phylogenetic analyses of Elephantidae. Molecular Phylogenetics and Evolution 26: 421-34. Deguilloux M-F, Pemonge M-H, Petit R (2002) Novel perspectives in wood certification and forensics: dry wood as a source of DNA. Proceedings of the Royal Society of London, Series B 269: 1039–1046.
87 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Deguilloux M-F, Pemonge M-H, Bertel L, Kremer A, Petit R (2003) Checking the geographical origin of oak wood: molecular and statistical tools. Molecular Ecology 12: 1629–1636. Deguilloux M-F, Pemonge M-H, Petit R (2004) DNA-based control of oak wood geographic origin in the context of the cooperage industry. Annals of Forest Science 61: 97–104. Deng G (1988) A sensitive non-radioactive PCR-RFLP analysis for detecting point mutations at 12th codon of oncogene c-Ha-ras in DNAs of gastric cancer. Nucl Acids Res 16:6231. Devos KM, Brown JKM, Bennetzen JL (2002) Genome size reduction through illegitimate recombination counteracts genome expansion in Arabidopsis. Genome Res 12: 1075–1079.
De Winter B (1990) A new species of Citrullus (Benincaseae) from the Namib Desert, Namibia. Bothalia 20:209–211. Di Baccio D, Tognetti R, Sebastiani L, Vitagliano C (2003) Responses of Populus deltoides x Populus nigra (Populus x euramericana) clone I- 214 to high zinc concentrations. New Phytol. 159:443-452. Digby L (1912). The citology of Primula kewensis and of other related Primula hybrids. Ann Bot 26, 357-388.
Dissing J, J Binladen, A Hansen, B Sejrsen, E Willerslev, N Lynnerup (2007) The last Viking King: A royal maternity case solved by ancient DNA analysis. Forensic Science International 166(1): 21-27. Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS (1991) Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Research 19: 4008-4008. Dudits D, Bögre L, Györgyey J (1991) Molecular and cellular approaches to the analysis of plant embryo development from somatic cells in vitro. Journal of Cell Science 99: 475–484. Dudits D, Heszky L (2000) Növényi biotechnológia és géntechnológia. Agroinform Kiadóház Rt. Budapest. Dudits D, Heszky L (2003) Növényi biotechnológia és géntechnológia. Agroinform Kiadó, Budapest. Második, átdolgozott, bővített kiadás. Dumolin-Lapègue S, Pemonge M-H, Gielly L, Taberlet P, Petit R (1999) Amplification of oak DNA from ancient and modern wood. Molecular Ecology 8: 2137–2140. Eckenwalder JE (1996) Systematics and evolution of Populus. In RF Stettler, HD Bradshaw, JrP E Heilman, TM Hinckley [eds.], Biology of Populus and its implications for management and conservation, 7–32. NRC Research Press, National Research Council of Canada, Ottawa, Ontario, Canada Edwards A, Civitello A, Hammond HA, Caskey CT (1991) DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. Am J Hum Genet 49:746-756. Eglinton G, Logan GA (1991) Molecular preservation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 333: 315-327; discussion 327-318. El Hadidi MN (1982) The Predynastic flora of Hierakonpolis region. In Hoffman, M.A. (ed.), The Predynastic of Hierakonpolis - an Interim Report. Egyptian Studies Association 1: 104-115. Illinois. Elenga H, Peyron O, Bonnefille R, Jolly D, Cheddadi R, Guiot J, Andrieu V, Bottema S, Buchet G, de Beaulieu J-L, Hamilton AC, Maley J, Marchant R, Perez-Obiol R, Reille M, Riollet G, Scott L, Straka H, Taylor D, van Campo E, Vincens A, Laarif F, Jonson (2000) Pollen-based biome reconstruction for southern Europe and Africa 18000 yr BP. Journal of Biogeography 27: 621–634. Elmayan T, H Vaucheret (1996) Expression of single copies of a strongly expressed 35S transgene can be silenced post-transcriptionally. Plant J 9: 787-797. Emery-Barbier A (1990) L'homme et l'environnememt en Egypte durant la periode predynastique. In Bottema, S. Entjes-Nieborg, G. and van Zeist, W. (eds.), Man's Role in the Shaping of the Eastern Mediterranean Lanscape: 319-326. Balkema, Brookfield, Rotterdam. Erdei L, Tari I, Csiszár J, Pécsváradi A, Horváth F, Szabó M, Ördög M, Cseuz L, Zhiponova M, Szilák L, Györgyei J (2002) Osmotic stress responses of wheat species and cultivars differeing in drought tolerance: some interesting genes (advaices for gene hunting). Acta Biol Szeged 46 (3-4):63-65. Ereky K (1919) Biotechnologie der Fleisch-, Fett- und Milcher-zeugung im landwirtschaftlichen Grosbetriebe. Verlag Paul Parey, Berlin. 84p. Erlich HA, Gelfand D, Sninsky JJ (1991) Recent advances in the polymerase chain reaction. Science 252: 1643-1651. Fan J, E-i Kodama, Y Koh, M Nakao, M Matsuoka (2005) Halogenated Thymidine Analogues Restore the Expression of Silenced Genes without Demethylation. Cancer Res 65:6927-6933. Fang D, Roose M (1997) Identification of closely related citrus cultivars with inter-simple sequence repeat markers. Theor Appl Genet 95: 408– 417. Fári M (1982) Új lehetőség: a szövettenyésztés. (In: Velich I., szerk.): Válság, vagy egyensúly? Mezőgazdasági Könyvkiadó, Budapest, 201– 238. Fehér A, J Preiszner, S Litkey, G Csanadi, D Dudits (1992) Characterisation of chromosome instability in interspecific somatic hybrids obtained by X-ray fusion between potato (Solanum tuberosum) and S. brevidens. Theor Appl Genet 84: 880–890. Ferris C, Oliver RP, Davy AJ, Hewitt G(1993) Native oak chloroplasts reveal an ancient divide across Europe. Molecular Ecology 2: 337–344. Feschotte C, Jiang N, Wessler SR (2002) Plant transposable elements: Where genetics meets genomics. Nature Rev Genet 3: 329–341. Filatti JJ, Sellmer J, McCown B, Haissig B, Comai L (1987) Agrobacterium mediated transformation and regeneration of Populus. Molecular and General Genetics 206: 192–199. Filov AL (1960) (The problen of melon systematics). Vestnik sel'skochozjajstvennoj nauki 1:162-132.
88 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Finnegan EJ, RK Genger, J Kovac, WJ Peacock, ES Dennis (1998) DNA methylation and the promotion of flowering by vernalization. Proc Natl Acad Sci USA 95:5824-5829. Fish SA, Shepherd TJ, McGenity TJ, Grant WD (2002) Recovery of 16S ribosomal RNA gene fragments from ancient halite. Nature 417: 432- 436. Fladung M, Nowitzki O, Ziegenhagen B, Markussen (2004) Identification of transgenes from wood of genetically transformed poplar trees. Journal of Wood Science and Technology 38: 207–215. Flannery KV (1973) The origins of agriculture. Annual Review of Anthropology 2: 271-310 Flavell RB (1986) Repetitive DNA and chromosome evolution in plants. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 312:227-242. Flavell AJ, Knox MR, Pearce SR, Ellis THN (1998) Retrotransposon-based insertion polymorphisms (RBIP) for high throughput marker analysis. Plant J 16: 643-650. Fletcher HA, HD Donoghue, G M Taylor, AGM van der Zanden, M Spigelman (2003) Molecular analysis of Mycobacterium tuberculosis DNA from a family of 18th century Hungarians. Microbiology 149: 143–151. Forbes SH, JT Hogg, FC Buchanan, AM Crawford, FW Allendorf (1995) Microsatellite evolution in congeneric mammals: Domestic and Bighorn sheep. Mol Biol Evol 12: 1106-1113. Fossati T, Zapelli I, Bisoffi S, Micheletti A, Vietto L, Sala F, Castiglione S (2005) Genetic relationships and clonal identity in a collection of commercially relevant poplar cultivars assessed by AFLP and SSR. Tree Genetics and Genomes 1: 11-19. Foyer C.H. & Noctor G. (2005) Redox homeostasis and antioxidant signaling: a metabolic interface between stress perception and physiological responses. Plant Cell 17: 1866–1875. Foyer CH, N Sourian, S Perret, M Lelendais, KJ Kunert, C Provost, L Joianin (1995) Overexpression of glutathione-reductase but not glutathione synthetase leads to increases in antioxidant capacity and resistance to photoinhibition in poplar trees. Plant Physiology 109:1047-1057. Freitas FO, Bendel G, Allaby RG, Brown TA (2003) DNA from primitive maize landraces and archaeological remains: implications for the domestication of maize and its expansion into South America. J Archaeological Science 30: 901–908. Galiba G, Kovacs G, Sutka J (1986) Substitution analysis of plant regeneration from callus culture in wheat. Plant Breeding 97:261-263. Ganapathy PS, Scandalios JG (1973) Malate dehydrogenase isozymes in haploid and diploid Datura species. Their use as markers in somatic cell genetics. J Hered 64:186–188. Garcia-Mas J, AJ Monforte, P Arús (2004) Phylogenetic relationships among Cucumis species based on the ribosomal internal transcribed spacer sequence and microsatellite markers. Plant Syst Evol 248: 191-203. Gaut BS, Morton BR, McCaig BC, Clegg MT (1996) Substitution rate comparisons between grasses and palms:Synonymous rate differences at the nuclear gene Adh parallel rate ifferences at the plastid gene rbcL. Proc Natl Acad Sci 93: 10274–10279. Ge XJ, Sun M (1999) Reproductive biology and genetic diversity of a cryptoviviparous mangrove aegiceras corniculatum (Myrsinaceae) using allozyme and intersimple sequence repeat (ISSR) analysis. Molecular Ecology 8: 2061-2069. Gémesné JA, Gyulai G, M Petus, G Venczel, Zs Sági, L Zatykó (2000) DH-breeding of sweet pepper (Capsicum annuum L.). Biotechnological approaches for utilization of gametic cells.(ed. B. Bohanec). COST Action 824, pp.157-159. ISBN 92-894-0225-3. Gémesné JA, M Petus, G Venczel, L Zatykó, Gyulai G, M Cséplő (2001) Genetic variability of anther donor versus spontaneous doubled haploid descendents and colchicine induced doubled haploid sweet pepper (Capsicum annuum L.) lines. Acta Hort 560:149-152. Gencsi L, Vancsura R (1992) Dendrológia. pp 1-728. Mezőgazda Kiadó, Budapest. ISBN 963 81 6008 X Germer R (1985) Flora des Pharaonischen Agypten. Philipp von Zabern, Mainz. Germer R (1988) Katalog der altdgyptischen Pflanzenreste der Berliner Museen.Agyptologische Abhandlungen, Hrsg. von Helck, W. Bd. 47. Otto Harrassowitz, Wiesbaden. Gibbons A (2005) Ancient DNA - New methods yield Mammoth samples. Science 310: 1889-1889. Gilbert MT, Binladen J, Miller W, Wiuf C, Willerslev E, Poinar H, Carlson JE, Leebens-Mack JH, Schuster SC (2007) Recharacterization of ancient DNA miscoding lesions: insights in the era of sequencing-by-synthesis. Nucleic Acids Res 35: 1-10. Ginter B, Kozlowski JK, Litynska M, Pawlikowski M (1988) Field report from the excavations of the sites MA 21/83 and MA 2la/83 near Armant in Upper Egypt in 1986. M.D.A.I.K. 44: 86-104. Girard M, Maley J (1987) E5. Etude palynologique (in: Autopsie d' une momie egyptienne du Museum de Lyon). Nouv. Arch. Mus. Hist. Nat. Lyon 25: 103-110. Glazko BI, Dubin AA, Kalendar RM, Glazko GV, Scherepitko VI (1999) Comparisons analysis of polymorphic bands from different microsetellite loci in soyabean. Cytology and Genetics 33(5): 47-51. Goffin J, E Eisenhauer (2002) DNA methyltransferase inhibitors—state of the art. Annals of Oncology 13:1699–1716. Goldstein DN, AR Linares LL, Cavalli-Sforza, MW Feldman (1995) An Evaluation of Genetic Distances for Use With Microsatellite Loci. Genetics 139:463-471. Golenberg EM, Giannasi DE, Clegg MT, Smiley CJ, Durbin M, Henderson D, Zurawski G (1990) Chloroplast DNA-Sequence from a Miocene Magnolia Species. Nature 344: 656-658. Goloubinoff P, Pääbo S, Wilson AC (1993) Evolution of maize inferred from sequence diversity of an Adh2 gene segment from archaeological specimens. Proc Natl Acad Sci USA 90: 1997-2001.
89 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Gonzalez A, Wong A, Delgado-Salinas A, Papa R, Gepts P (2005) Assessment of Inter Simple Sequence Repeat Markers to Differentiate Sympatric Wildand Domesticated Populations of Common Bean. Crop Sci 45: 606–615. Gorman C (1969) Hoabinhian: A pebble tool complex with early plant associations in Southeast Asia. Science 163: 671-3. Gorman C (1970) Excavations at Spirit Cave, North Thailand: Some interim interpretations. Asian Perspectives 13: 79-107 Gorman C (1971) The Hoabinhian and After: Subsistence Patterns in Southeast Asia during the Late Pleistocene and Early Recent Periods. World Archaeology 2: 300-20. Goulao L, Valdiviesso T, Santana C, Oliveira CM (2001) Comparison between phenetic characterisation using RAPD and ISSR markers and phenotypic data of cultivated chestnut (Castanea sativa Mill.). Genetic Resources and Crop Evolution 48: 329-338. Gowda M, H Li, J Alessi, F Chen, R Pratt, G-L Wang (2006) Robust analysis of 5′-transcript ends (5′-RATE): a novel technique for transcriptome analysis and genome annotation. Nucleic Acids Res 34: e126. Grandbastien M-A (1992) Retroelement in higher plants. Trends Genet 8: 103–108. Grandbastien M-A (1998) Activation of plant retrotransposon under stress conditions. Trends Plant Sci 3: 181–187. Grandbastien M-A, Spielmann A, Caboche M (1989) Tntl, a mobile retroviral-like transposable element of tobacco isolated by plant cell genetics. Nature 337:376–380. Grandbastien M-A, Audeon C, Casacuberta JM, Grappin P, Lucas H, Moreau C, Pouteau S (1994) Functional analysis of the tobacco Tnt1 retrotransposon. Genetica 93: 181–189. Grandbastien M-A, Lucas H, Morel JB, Mhiri C, Vernhettes S, Cassacuberta JM (1997) The expression of the tobacco Tnt1 is linked to the plant defense responses. Genetica 100: 241–252. Grandbastien M-A, C Audeon, E Bonnivard, JM Casacuberta, B Chalhoub, A-PP Costa, QH Le, D Melayah, M Petit, C Poncet, SM Tam, M-A Van Sluys, C Mhiria (2005) Stress activation and genomic impact of Tnt1 retrotransposons in Solanaceae. Cytogenet Genome Res 110:229–241. Grassi F, M Labra, S Imazio, A Spada, S Sgorbati, A Scienza, F Sala (2003) Evidence of a secondary grapevine domestication centre detected by SSR analysis. Theor Appl Genet 107:1315–1320. Grebenscikov I (1986) Cucurbitaceae. In. J. Schultze-Motel. Ed. Rudolf Mansfelds Verzeichnis landwirtschaftlicher und garrtnerischer Kulturpflanzen 2: 9l4-951. Akademie-B erlin. Greenwood AD, Capelli C, Possnert G, Pääbo S (1999) Nuclear DNA sequences from late Pleistocene megafauna. Molecular biology and evolution 16: 1466-73. Greenwood AD, Lee F, Capelli C, DeSalle R, Tikhonov A, Marx PA, MacPhee RD (2001) Evolution of endogenous retrovirus-like elements of the woolly mammoth (Mammuthus primigenius) and its relatives. Molecular biology and evolution 18: 840-7. Gribbon BM, SR Pearce, R Kalendar, AH Schulman, L Paulin, P Jack, A Kumar, AJ Flavell (1999) Phylogeny and transpositional activity of Ty1-copia group retrotransposons in cereal genomes. Molecular Genetics and Genomics 261: 883-891. Griffiths AJF, Miller JF, Suzuki DT, Lewontin RC, Gelbart WM (1996) Introduction to Genetic Analysis, 5th Edition. W.H. Freeman, New York. Gruenbaum Y, Navey-Many T, Cedar H, Razin A (1981) Sequence specificity of methylation in higher plant DNA. Nature 292: 860–862. Gugerli F, Parducci L, Petit RJ (2005) Ancient plant DNA: review and prospects. New Phytol 166: 409-418. Gullner G, T Kőmíves (1998) A glutation szerepe növény–kórokozó kölcsönhatásokban. Biokémia 22:83-88. Gullner G, T Kőmíves, H Rennenberg (2001) Enhanced tolerance of transgenic poplar plants overexpressing gamma-glutamylcysteine synthetase towards chloroacetanilide herbicides. J. Exp. Botany 52:971-979. Gullner G, Gyulai G, A Bittsánszky, J Kiss, L Heszky, T Kömíves (2005) Enhanced inducibility of glutathione s-transferase activity by paraquat in poplar leaf discs in the presence of sucrose. Phyton 45:39-44. Gupta M, Chyi YS, Severson JR, Owen JL (1994) Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple sequence repeats. Theor Appl Genet 89:998-1006. Gutiérrez G, Marín A (1998) The most ancient DNA recovered from an amber-preserved specimen may not be as ancient as it seems. Molecular Biology and Evolution 15: 926–929. Györffy B (1940a) Chromosome numbers of polyploids obtained by colchicine treatment. Magyar Biol. Kutatóintézet Munkái 12: 326-329. (Chem. Abstr. 35: 1089. 1941) Györffy B (1940b). The mechanism of colcliicine action. Magyar Biol. Kutatóintézet Munkái 12: 330-351. [Chem. Abstr. 35: 1089. 1941) Györgyey J, Gartner A, Németh K, Magyar Z, Hirt H, Heberle-Bors E, Dudits D (1991) Alfalfa heat shock genes are differentially expressed during somatic embryogenesis. Plant Mol Biol 16: 999-1007. Gyulai G (2007) DHAC-indukált DNS-demetiláció és transzgén-reaktiváció gshI-transzformáns szürkenyár (Populus x canescens) klónokban; génkompetició RT-qPCR elemzése. Agrártudományi Közlemények 27: 78-83. Gyulai G (2010) Természetvédelmi genetika. Egyetemi Jegyzet. SzIE MKK KTI, pp. (in press) ISBN 978-963-269-187-7. Gyulai G (2011) Plant Archaeogenetics (ed). Nova Science Publisher Inc. New York, USA. ISBN 978-1-61122-644-7. pp. (in press) Gyulai G, J Janovszky, E Kiss, L Lelik, A Csillag, LE Heszky (1992a) Callus initiation and plant regeneration from inflorescence primordia of the intergeneric hybrid Agropyron repens (L.) Beauv. x Bromus inermis Leyss. cv. nanus on a modified nutritive medium. Plant Cell Rep 11: 266-269.
90 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Gyulai G, LE Heszky, E Kiss, Zs Jekkel, KT Lőkös (1992b) Eljárás biológiailag aktiv anyagok auxin, illetve citokinin aktivitásának szelektiv meghatározására. Magyar Szabadalom, 204360). Gyulai G, E Kiss, LE Heszky (1992c) Biotechnology of rapeseed (Brassica napus L.). Acta Agron Hung 41:277-287. Gyulai G, E Kiss, A Csillag, LE Heszky (1993a) Developmental analysis of primary and secondary somatic embryogenesis in soybean tissue culture. Acta Biol Hung 44:189-196. Gyulai G, E Kiss, LE Heszky (1993b) A repce biotechnológiája. in Magyarország Kultúrflórája. VI. ed. Szabó L. Az olajrepce - Brassica napus. pp. 56-62. Akadémiai Kiadó, Budapest. Gyulai G, E Kiss, J Kiss, LE Heszky (1993c) Hormone-Selective Bioassay for Auxins and Cytokinins in vitro. Hung Agric Res 2:13-17. Gyulai G, Z Jekkel, E Kiss, J Kiss, L E Heszky (1995a) A selective auxin and cytokinin bioassay based on root and shoot formation in vitro. J Plant Physiol 145: 379-382. Gyulai G, LE Heszky (1995b) Auxin and cytokinin bioassays. A short overview. Acta Agron Hung 43:185-189. Gyulai G, L Murenyetz, J Janovszky, M Tárczi, I Rácz (1995c) Initiation of monocot plant development In vitro for studying plant-microbe interaction. . pp.155-159. in Azospirillum VI. and related microorganizms. Genetics, Physiology, Ecology. (Eds) I Fendrik, M del Gallo, J Vanderleyden, M. de Zamaroczy. NATO ASI Series, Vol G37. Berlin, New York, Springer-Verlag, Gyulai G, I Dweikat, J Janovszky, H Ohm, E Kiss, H Sharma, LE Heszky (1997) Application of ISSR/SSR-PCR for genome analysis of Agropyron, Bromus, and Agropyron x Bromus. In: Z.Staszewski, W Mlyniec, R Osinski (eds) Ecological aspects of breeding fodder crops and amenity grasses, PBAI, Radzikow, Poland, pp.306-312. Gyulai G (1999a) Biotechnológiai növénynemesítés, biológiai alapok. In. Training for EU Accession to the Hungarian Agroadministration, TEMPUS 13321-98. Chapter IV. pp.1-34.
Gyulai G, JA Gémesné, Zs Sági, L Zatykó, L Heszky, G Venczel (1999b) PCR analysis of F1 hybrid derived DH pepper lines. Capsicum and Eggplant Newsletters 18: 40-43. Gyulai G, L Szemán, A Idnurm, L Heszky, J Janovszky (2000a) Fibre content analysis of reed canary grass (Phalaris arundinacea L.) somaclones. In. Soegaard K et al. (eds) Grassland Science in Europe, EGF, Vol.5, pp. 244-246. ISBN 87-88976-45-9. Gyulai G, Gémesné JA, Zs Sági, G Venczel, P Pintér, Z Kristóf, O Törjék, L Heszky, S Bottka, J Kiss, L Zatykó (2000b) Doubled haploid development and PCR-analysis of F1 hybrid derived DH-R2 paprika (Capsicum annuum L.) lines. J Plant Physiol 156:168-174. Gyulai G, A Magda, J Kiss, F Gyulai, L Holly, L Heszky (2001) DNS izolálás és PCR-amplifikáció 700 éves növénymagvakból. VII. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, p.89. Gyulai G, Mester Z, Kiss J, Szemán L, Heszky L, Idnurm A (2003a) Somaclone breeding of reed canarygrass (Phalaris arundinacea L). Grass and Forage Science 58, 210-215. Gyulai G, Z Szabó, K Penksza, J Kiss, L Heszky (2003b) Új kékesperje (Poa humilis) genotípusok klónozása és molekuláris jellemzése. Gyepgazdálkodás 2001 (ed. G Nagy), Debrecen, ISBN 963 9274 15 1, pp. 78-80. Gyulai G, Kiss E, Heszky L (2004) Az árpa biotechnológiája. in Magyarország kultúrflórája. VIII/14. pp. 274-289. (Eds.) L. Tomcsányi, G Turcsányi. Az árpa - Hordeum vulgare L., Akadémiai Kiadó, Budapest. Gyulai G, M Humphreys, A Bittsánszky, K Skøt, J Kiss, L Skøt, G Gullner, S Heywood, Z Szabó, A Lovatt, L Radimszky, H Roderick, M Abberton, H Rennenberg, T Kőmíves, L Heszky (2005) AFLP analysis and improved phytoextraction capacity of transgenic gshI-poplar clones (Populus canescens L.) in vitro. Z. Naturforschung 60c:300-306. Gyulai G, M Humphreys, R Lagler, Z Szabó , Z Tóth, A Bittsánszky, F Gyulai and L Heszky (2006) Seed remains of common millet from the 4th (Mongolia) and 15th (Hungary) centuries; AFLP, SSR, and mtDNA sequence recoveries. Seed Science Research 16:179-191. Gyulai G, Waters L, Dane F (2008) Ancient Citrullus DNA-unlocking domestication events. Fulbright Grant AY 2005-2006. Fulbright Year Book 2008, Budapest, pp 25-42.
Gyulai G, L Murenyetz, VL Stakhov, ZsG Gyulai, SG Yashina, SV Gubin (2011a). Morphogenetics of Silene stenophylla seeds from permafrost of the late Pleistocene (30,000 bp). In. Plant Archaeogenetics. Ed. by G Gyulai. Chapter 1. Nova Sci Publisher Inc., New York, USA. pp. (in press) ISBN 978-1-61122-644-7. Gyulai G, RP Malone, L Heszky, L Waters Jr., E Kiss (2011b) Morphogenetics of grape (Vitis vinifera) seeds from Antiquity (3rd cent ce) and the Middle Ages of Hungary (11th to 15th cent ce) - A morphological reconstruction. In. Plant Archaeogenetics. Ed. by G Gyulai. Chapter 5. Nova Sci Publisher Inc., New York, USA. pp. (in press). ISBN 978-1-61122-644-7. Gyulai G, MO Humphreys, R Lágler (2011c) aDNA extraction and molecular analysis from seed remains of ancient common millets (Panicum miliaceum) (4th and 15th cent). Ed. by G Gyulai. Chapter 6. Nova Sci Publisher Inc., New York, USA. pp. (in press) . ISBN 978-1-61122-644-7. Gyulai G, Z Tóth, A Bittsánszky (2011d) Medieval Citrullus DNAs - unlocking domestication events (13th and 15th cent). In. Plant Archaeogenetics. Ed. by G Gyulai. Chapter 7. Nova Sci Publisher Inc., New York, USA. pp. (in press). ISBN 978-1-61122-644-7. Gyulai G, Z Szabó, O Törjék (2011e) Genetical and morphological reconstruction of medieval melon (Cucumis melo) (15th cent). In. Plant Archaeogenetics. Ed. by G Gyulai. Chapter 8. Nova Sci Publisher Inc., New York, USA. pp. (in press). ISBN 978-1-61122-644-7. Gyulai G, R Láposi, H Rennenberg, A Veres, C Herschbach, Gy Fábián, L Waters Jr (2011f) Conservation genetics (1710 – 2010) - Cloning of living fossils: Micropropagation of the oldest Hungarian black locust tree (Robinia pseudoacacia) planted in 1710 (Bábolna, Hungary). In. Plant Archaeogenetics. Ed. by G Gyulai. Chapter 10. Nova Sci Publisher Inc., New York, USA. pp. (in press). ISBN 978-1-61122-644-7. Gyurján I; Korányi P; Preininger E; Varga SS; Paless G (1995) Artificial plant-Azotobacter symbiosis for atmospheric nitrogen fixation. Pp.401- 413. In. Azospirillum VI and related microorganisms: Genetics, Physiology, Ecology. (Eds) I Fendrik, M del Gallo, J Vanderleyden, M. de Zamaroczy. NATO ASI Series, Vol G37. Berlin, New York, Springer-Verlag,
91 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Haberlandt G (1902) Culturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sb. Akad. Wiss. Wien, Math.-Nat. Cl., 111 Abt. 1: 69–91; Haberlandt G (1913) "Zur Physiologie der Zellteilung". Sitzber. K. Preuss. Akad. Wiss. 318. Hadly EA, Kohn MH, Leonard JA, Wayne RK (1998) A genetic record of population isolation in pocket gophers during Holocene climatic change. Proc Natl Acad Sci USA 95: 6893-6896. Hagelberg E, Sykes B, Hedges R (1989) Ancient bone DNA amplified. Nature 342:485. Hagelberg E, Thomas MG, Cook CE, Jr., Sher AV, Baryshnikov GF, Lister AM (1994) DNA from ancient mammoth bones. Nature 370: 333-4. Hajósné Novák M. (Szerk.) (1999) Genetikai variabilitás a növénynemesítésben. Molekuláris diagnosztika. Tankönyv. Mezőgazda Kiadó Kft. Bp. p. 142. Haliassos A, Chomel JC, Tesson L, Baudis M, Kruh J, Kaplan JC, Kitzis A (1989) Modification of enzymatically amplified DNA for the detection of point mutations. Nucleic Acids Res 17:3606. Hall TA (1999) BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41:95-98. Hamada H, MG Petrino, T Kakunaga (1982) Novel Repeated Element with Z-DNA-Forming Potential is Widely Found in Evolutionarily Diverse Eukaryotic Genomes. Proc Natl Acad Sci USA 79: 6465-69. Hamzeh M, S Dayanandan (2004) Phylogeny of Populus (Salicaceae) based on nucleotide sequences of chloroplast TRNT-TRNF region and nuclear rDNA. American Journal of Botany 91:1398-1408. Handt O, Richards M, Trommsdorf M, Kilger C, Simanainen J, Georgiev O, Bauer K, Stone A, Hedges R, Schaffner W, Utermann G, Sykes B, Pääbo S (1994). Molecular genetic analyses of the Tyrolean Ice Man. Science 264:1775-1778 Hangyelné TM, J Janovszky, E Kiss, Gyulai G (1996) Szomaklonális kromoszóma variabilitás jellemzése az Agropyron cv. szomaklónok vegetativ utódaiban. Növénytermelés 45:109-115. Hansen CN, Heslop-Harrison JS (2004) Sequences and phylogenies of plant pararetroviruses, viruses and transposable elements. Advances in Botanical Research 41:165-193. Hardy C, Callou C, Vigne JD, Casane D, Dennebouy N, Mounolou JC, Monnerot M (1995) Rabbit mitochondrial DNA diversity from prehistoric to modern times. J Mol Evol 40: 227-237. Harlan JR (1971) Agricultural Origins: Centers and Noncenters. Science 174: 468-473. Hartyányi P, B Nováki (1975): Samen- und Fruchtfunde in Ungarn von der Jungsteinzeit bis zum 18. Jahrhundert. Agrártört. Szeml. 17, 1-22. Supplementum. Havas L (1937) Effects of colchicine and of Viscum album preparations upon germination of seeds and growth of seedlings. Nature 139: 371. Havecker ER, X Gao, DF Voytas (2004) The diversity of LTR retrotransposons. Genome Biology 5:225.1.-225.6. Hayward MD, Mcadam NJ, Jones JG, Evans C, Evans GM, Forster JW, Ustin A, Hossain KG, Quader B, Stammers M, Will JK (1994) Genetic- Markers and the Selection of Quantitative Traits in Forage Grasses. Euphytica 77: 269-275. Heinze B (2002) Chloroplast DNA primers. http://fbva.forvie.ac.at/200/ 1892.html Herrera-E L, A Depicker, M Van Montagu, J Schell (1983) Expression of chimaeric genes transferred into plant cells using a Ti-plasmid-derived vector. Nature 303:209 – 213. Heslop-Harrison JS (2000) RNA, genes, genomes and chromosomes: Repetitive DNA sequences in plants. Chromosomes Today 13: 45-56. Heszky LE, DQ Binh, E Kiss, Gyulai G (1989a) Increase of green plant regeneration efficiency by callus selection in Puccinellia limosa Schur., Holmbg. Plant Cell Rep 8:174-177. Heszky LE, Li SN, I Simon-Kiss, K Lőkös, Gyulai G, E Kiss (1989b) Organ-specific and ploidy-dependent somaclonal variation; a new tool in breeding. Acta Biol Hung 40:383-394. Heszky L, Fésüs L, Hornok L (2005) Mezőgazdasági biotechnológia (eds) Agroinfrom Kiadóház, Budapest Higuchi R, Bowman B, Freiberger M, Ryder OA, Wilson AC (1984) DNA sequences from the quagga, an extinct member of the horse family. Nature 312, 282-284. Hillis DM, Dixon MT (1991) Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference. Quart Rev Biol 66:411-453 Hirochika H (1993) Activation of tobacco retrotransposons during tissue culture. EMBO J 12: 2521-2528. Hirochika H, Sugimoto K, Otsuki Y, Tsugawa H, Kanda M (1996) Retrotransposons of rice involved in mutations induced by tissue culture. Proc Natl Acad Sci USA 93: 7783–7788. Hirokhika, H, H Okamoto, T Kakutani (2000) Silencing of retrotransposons in Arabidopsis and reactivation by the ddm1 mutation. Plant Cell 12:357-368. Ho P-T (1977) The indigenous origins of Chinese agriculture. Im: Origins of agriculture ed. CA Reed, pp.413-483. Paris, Mouton Publishers. Ho SYW, TH Heupink, A Rambaut, B Shapiro (2007) Bayesian Estimation of Sequence Damage in Ancient DNA. Mol Biol Evol 24:1416-1422. Hódos-Kotvics G, L Heszky (1989) Noventa, szuperkorai szója mutáns. Magyar Szabadalom, 207922/1989 Hofreiter M, Betancourt JL, Sbriller AP, Markgraf V, McDonald HG (2003) Phylogeny, diet, and habitat of an extinct ground sloth from Cuchillo Cura, Neuquen Province, southwest Argentina. Quaternary Research 59: 364–378.
92 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Hofreiter M, Jaenicke V, Serre D, Haeseler A von, Pääbo S (2001a) DNA sequences from multiple amplifications reveal artefacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucleic Acids Research 29:4793–4799. Hofreiter M, Poinar HN, Spaulding WG, Bauer K, Martin PS, Possnert G, Pääbo S (2000) A molecular analysis of ground sloth diet through the last glaciation. Molecular Ecology 9: 1975–1984. Hofreiter M, Serre D, Poinar HN, Kuch M, Pääbo S (2001b) Ancient DNA. Nature Reviews Genetics 2: 353-359. Hopkins FG (1929) On glutathione: A reinvestigation J. Biol. Chem. 84:269-320 Hopkins FG, M Dickinson (1922) On Glutathione. II. A thermostable oxidation-reduction system J. Biol. Chem. 54 (3):527-563. Hornok L (2000) Genetikailag módosított mikroorganizmusok a biológiai növényvédelemben. Növényvédelem 36: 229-237. Horváth E, G Szalai, T Janda, E Páldi, I Rácz, D Lásztity (2003) Effect of vernalisation and 5-azacytidine on the methylation level of DNA in wheat (Triticum aestivum L., cv. Martonvásár 15). Plant Science 165:689-692. Horváth L, Gyulai G, Szabó Z, Tóth Z, Heszky L (2007) Morfológiai diverzitás a sárgadinnyében (Cucumis melo); egy középkori típus fajtarekonstrukciója. Agrártudományi Közlemények 27: 84-90. Hoss M, Dilling A, Currant A, Pääbo S (1996) Molecular phylogeny of the extinct ground sloth Mylodon darwinii. Proc Natl Acad Sci USA 93: 181-185. Hoss M, Pääbo S, Vereshchagin NK (1994) Mammoth DNA-Sequences. Nature 370: 333-333. Hsiao C, Chatterton NJ, Asay KH, Jensen KB (1995) Phylogenetic-Relationships of the Monogenomic Species of the Wheat Tribe, Triticeae (Poaceae), Inferred from Nuclear Rdna (Internal Transcribed Spacer) Sequences. Genome 38: 211-223. Huang J, Sun M (2000) Genetic diversity and relationships of sweetpotato and its wild relatives in Ipomoea series Batatas (Convolvulaceae) as revealed by inter-simple sequence repeat (ISSR) and restriction analysis of chloroplast DNA. . Theoret Appl Genet 100: 1050–1060. Huang XQ, A Börner, MS Röder, MW Ganal (2002) Assessing genetic diversity of wheat (Triticum aestivum L.) germplasm using microsatellite markers. Theor Appl Genet 105:699-707. Hummel S (2003) Ancient DNA typing: methods, strategies and applications. Berlin, Germany: Springer. ISBN 978-3-540-43037-7 IGHSC (2001) International Human Genome Sequencing Consortium. Nature 409:860-921. Issa JP, H Kantarjian (2005) Azacitidine. Nature Reviews Drug Discovery. May, Suppl:S6-7. Jääskeläinen M, Mykkänen A-H, Arna T, Vicient C, Suoniemi A, Kalendar R, Savilahti H, Schulman, AH (1999) Retrotransposon BARE-1: Expression of encoded proteins and formation of virus- like particles in barley cells. Plant Journal 20(4): 413-422. Jaccard P (1908) Nouvelles recherches sur la distribution florale. Bull Soc Vaud Sci Nat 44: 223-270. Jaenicke-Després V, Buckler ES, Smith BD, Gilbert MTP, Cooper A, Doebley J, Pääbo S (2003) Early allelic selection in maize as revealed by ancient DNA. Science 302: 1206–1208. Jahren AH, Petersen G, Seberg O (2004) Plant DNA: a new substrate for carbon stable isotope analysis and a potential paleoenvironmental indicator. Geology 32: 241–244. Janick J, HS Paris (2006) The Cucurbit Images (1515–1518) of the Villa Farnesina, Rome. Annals of Botany 97: 165–176. Janick J (2004) Caravaggio’s fruit. A mirror on Baroque horticulture. Chronica Horticulturae 44(4):9-15.
Janick J, Paris HS, Parrish DC (2007) The Cucurbits of Mediterranean Antiquity: Identification of Taxa from Ancient Images and Descriptions. Annals of Botany: 100: 1441–1457. Janowszky J, Gyulai G, Zs Mester, M Tar, Gy Baskay, TM Hangyel, Zs Jenei, S Bottka, L Heszky (1998) Genetic analysis and somaclone development of Tall Fescue (Festuca arundinacea L). ). In: Nagy G, K Pető (eds) Grassland Science in Europe, EGF. Vol.3. pp. 737-739. Janushevich ZV (1978) Prehistoric Food Plants in Southwest of Soviet-Union. Berichte Der Deutschen Botanischen Gesellschaft 91: 59-66. Jarne P, Lagoda PJL (1996) Microsatellites, from molecules to populations and back. Trends in Ecology and Evolution 11:424-429. Jarret RL, Merrick LC, Holms T, Evans J, Aradhya MK (1997) Simple sequence repeats in watermelon Citrullus lanatus (Thunb) Matsum & Nakai. Genome 40:433–441. Jeffrey C (1980) A review of the Cucurbitaceae. Bot J Linn Soc 81: 233-247. Jeffrey C (1990) Appendix: An outline classification of the Cucurbitaceae. In: Bates, D.M., Robinson, R.W., Jeffrey, C. Biology and utilization of the Cucurbitaceae. pp. 449-463. 485p. Ithaca and London, Cornell University. Jeffreys AJ (1987) Highly variable minisatellites and DNA fingerprints. Biochem Soc Trans 15:309-317. Jeffreys AJ, R Neumann, V Wilson (1990) Repeat unit sequence variation in minisatellites: A novel source of DNA polymorphism for studying variation and mutation by single molecule analysis. Cell 60:473-485. Jeffreys AJ, Wilson V, Newumann R, Keyte J (1988) Amplification of human minisatellites by the polymerase chain reaction: towards DNA fingerprinting of single cells. Nucleic Acids Res 16: 10953-10971. Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SL (1985) Hypervariable minisatellite regions in human DNA. Nature 314:67-73. Jekkel Z, Gyulai G, LE Heszky (1995) Cryopreservation of some halophyte grasses (Puccinellia species). in. Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 32., Cryopreservation of plant germplasm I. ed. Y.S.P. Bajaj, Springer V, Berlin-New York, pp. 245-255.
93 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Jekkel Zs, Gyulai G, J Kiss, E Kiss, L Heszky (1998) Cryopreservation of horse-chestnut (Aesculus hippocastanum L.) somatic embryos using three different freezing methods. Plant Cell Tissue Organ Cult 52:193-197. Jekkel Zs, J Kiss, Gyulai G, E Kiss, L Heszky (2002) Cryopreservation of horse chestnut (Aesculus hippocastanum L.). in. Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol.50., Cryopreservation of plant germplasm II. ed. Y.S.P. Bajaj, Springer V, Berlin-New York, pp.192-212. Jiao Y, XW Deng (2007) A genome-wide transcriptional activity survey of rice transposable element-related genes. Genome Biology 8(2):R28. Johns MA, Mottinger J, Freeling M (1985) A low copy number, copia-like transposon in maize. EMBO J 4: 1093–1102. Jörgensen J (1989) Somatic embryogenesis in Aesculus hippocastanum L. by culture of filament callus. J Plant Physiol 135:240-241. Kalendar R, Grob T, Regina MT, Suoniemi A, Schulman AH (1999) IRAP and REMAP: Two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques. Theoretical and Applied Genetics 98: 704-711. Kalendar R, Tanskanen J, Immonen S, Nevo E, Schulman AH (2000) Genome evolution of wild barley (Hordeum spontaneum) by BARE-1 retrotransposon dynamics in response to sharp microclimatic divergence. Proceedings of the National Academy of Sciences 97(12): 6603-6607. Kalendar R, Vicient CM, Peleg O, Anamthawat-Jonsson K, Bolshoy A,. Schulman AH (2004) Large retrotransposon derivatives: abundant, conserved but nonautonomous retroelements of barley and related genomes. Genetics, 166(3):1437-1450. Kalendar R, Schulman HA (2006) IRAP and REMAP for retrotransposon-based genotyping and fingerprinting. Nature Protolols 1:2478-2484. Kalendar R (2007) FastPCR software for PCR primers for standard, long, real-time PCRs, for inverse PCR, direct amino acid sequence degenerate PCR, multiplex PCR, LUX quantitative PCR, automatically SSR loci detection and direct PCR primers design, and in silico PCR; molecular beacon, TaqMan or other probe design; sequence alignments, clustering and MITE and LTRs elements search, SSR locus search (two, three, four or five perfect and imperfect core motif) and any kind repeat sequence searching. www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/download.htm Kalmár T, CZ Bachrati, A Marcsik, I Rasko (2000) A simple and efficient method for PCR amplifiable DNA extraction from ancient bones. Nucleic Acids Res. 28(12):E67. Karchi Z (2000) Development of melon culture and breeding in Israel. In: Proceedings of the 7th EUCARPIA Meeting on Cucurbit Genetics and Breeding, Ma’ale Ha Hamisha, Israel, March 19–23, pp 13–17. Karpechenko G D (1927) Polyploid hybrids of Raphanus sativus X Brassica oleracea L. Bull. Appl. Bot. 17, 305-408. Katzir N, Y Danin-Poleg, G Tzuri, Z Karchi, U Lavi, PB Cregan (1996) Length polymorphism and homologies of microsatellites in several Cucurbitaceae species. Theor Appl Genet 93: 1282–1290. Kavanagh TA, Timmins JN (1988) Structure of melon rDNA and nucleotide sequence of the 17– 25S spacer region. Theoretical and Applied Genetics 76: 673–80. Keimer L (1924) Die Gartenpflanzen im alten Ägypten. (1967 reprint). Vol. 1, Hamburg/Berlin, 117 p. Keimer L (1947) Plusierus antiquites recemment trouvees. Bulletin de I'Institut Egyptien, 28: 117-137 IFAO Le Caire Keng H (1974) Economic plants of ancient north China as mentioned in Shih ching (Book of Poetry). Econ Bot 28:391-410. Kerje T, Grum M (2000) The origin of melon, Cucumis melo: a review of the literature. Acta Horticulture (ISHS) 510: 37–44. Kevey B (1999) Feketenyár-ligetek Vörös könyv Magyarország növénytársulásairól 2., TermészetBÚVÁR Alapítvány Kiadó p. 121–123. Kihara H (1951) Triploid watermelons. Proc. Amer. Soc. Hort. Sci.58:217-230. Kim S, Soltis DE, Soltis PS, Suh Y (2004) DNA sequences from Miocene fossils: an ndhF sequence of Magnolia latahensis (Magnoliaceae) and an rbcL sequence of Persea pseudocarolinensis (Lauraceae). American Journal of Botany 91: 615–620. Király Z, Klement Z (1968) A növényi betegségellenállóság élettana. Akadémiai Kiadó, Budapest, 138p. Kirkbride JH (1993) Biosystematic monograph of the genus Cucumis (Cucurbitaceae). Parkway Publishers. NC, USA. Kiss E, Gyulai G, Heszky L (2004) Az árpa genetikája. in Magyarország kultúrflórája. VIII./14. pp. 256-273. (Eds.) L. Tomcsányi, G Turcsányi. Az árpa - Hordeum vulgare L., Akadémiai Kiadó, Budapest. Kiss J, LE Heszky, E Kiss, Gyulai G (1992) High efficiency adventive embryogenesis on somatic embryos of anther, filament and immature proembryo origin in horse-chestnut (Aesculus hippocastanum L.) tissue culture. Plant Cell Tissue Organ Cult 30:59-64. Kiss J, M Kondrák, O Törjék, E Kiss, Gyulai G, K Mázik-Tőkei, L Heszky (2001) Morphological and RAPD analysis of poplar trees of anther culture origin. Euphytica 118:213-221. Knapp SJ, Bridges WC, Birkes D (1990) Mapping Quantitative Trait Loci Using Molecular Marker Linkage Maps. Theor Appl Genet 79: 583- 592. Koch MA, Haubold B, Mitchell-Olds T (2000) Comparative evolutionary analysis of chalcone synthase and alcohol dehydrogenase loci in Arabidopsis, Arabis, and related genera (Brassicaceae). Mol Biol Evol 17: 1483–1498. Kocsy G, Szalai G, Galiba G (2004) Effect of osmotic stress on glutathione and hydroxymethylglutathione accumulation in wheat. J Plant Physiol 161:785-794. Kohn MH, Wayne RK (1997) Facts from feces revisited. Trends in Ecology and Evolution 12: 223–227. Kömíves T, Gullner G, Király Z (1998) Role of glutathione and glutathione-related enzymes in response of plants to environmental stress. In Stress of Life. From Molecules to Man, vol. 851 (Szerk: Csermely P.), pp. 251-258. New York, USA: The New York Academy of Sciences. Kömíves T, Gullner G, Rennenberg H, Casida JE (2003) Ability of poplar (Populus spp.) to detoxify chloroacetanilide herbicides. - Water Air Soil Poll. Focus 3:277-283.
94 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Koncz C, J Schell (1986) The promoter of Tl-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Molecular and General Genetics 204:383-396. Krajewski C, Buckley L, Westerman M (1997) DNA phylogeny of the marsupial wolf resolved. Proc Biol Sci 264: 911-917. Krajewski C, Driskell AC, Baverstock PR, Braun MJ (1992) Phylogenetic relationships of the thylacine (Mammalia: Thylacinidae) among dasyuroid marsupials: evidence from cytochrome b DNA sequences. Proc Biol Sci 250: 19-27. Krause J, Dear PH, Pollack JL, Slatkin M, Spriggs H, Barnes I, Lister AM, Ebersberger I, Pääbo S, Hofreiter M (2006) Multiplex amplification of the mammoth mitochondrial genome and the evolution of Elephantidae. Nature 439: 724-7. Kroll H (1982) Kulturpflanzen von Tiryns. Archaeologischer Anzeiger, 1982: 467-485. Kroll H (1999) Literature on archaeological remains of cultivated plants (1997/1998). Veget Hist Archaeobot 8: 129-163. Kroll H (2000) Literature on archaeological remains of cultivated plants (1998/1999). Veget Hist Archaeobot 9: 31-68. Kuch M, Rohland N, Betancourt JL, Latorre C, Steppan S, Poinar HN (2002) Molecular analysis of a 11.700-year-old rodent midden from the Atacama Desert, Chile. Molecular Ecology 11: 913–924. Kumar A, Bennetzen JL (1999) Plant retrotransposon. Annu Rev Genet 33: 479–532. Kumpatla SP, W Teng, WG Buchholz, TC Hall (1997) Epigenetic transcriptional silencing and 5-azacitidne-mediated reactivation of a complex transgene in rice. Plant Physiol 115(2):361-73. Kunth C (1826) Recherche sur les plantes trouvees dans les tombeaux egyptiens par M. Passalacqua. Annates des Sciences Naturelles 8: 418-423. Kurnik E, Szabó L (1987) A szója - Glycine max (L.) Merrill. Magyarország Kultúrflórája III/18. Akadémiai Kiadó, Budapest. Kutil BL, CG Williams (2001) Triplet-repeat microsatellites shared among hard and soft pines. J Herdity 92:327–332. Lagercrantz U, H Ellegren, L Andersson (1993) The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates Nucl Acid Res 21:1111-15. Lágler R, Gyulai G, M Humphreys, Z Szabó, L Horváth, A Bittsánszky, J Kiss, L Holly, L Heszky (2005) Morphological and molecular analysis of common millet (P. miliaceum) cultivars compared to an aDNA sample from the 15th century (Hungary). Euphytica 146:77-85. Lágler R, Gyulai G, Z Szabó, Z Tóth, A Bittsánszky, L Horváth, J Kiss, F Gyulai, L Heszky (2006) Molecular diversity of common millet (P. miliaceum) compared to archaeological samples excavated from the 4th and 15th centuries. Hung Agric Res 2006/1:14-19. Lágler R, Gyulai G, Szabó Z, Tóth Z, Heszky L (2007) A köles (Panicum miliaceum) SSR-, ISSR- és mtDNS szekvencia-stabilitása a 4.- és 15. századi régészeti leletektől a mai fajtákig. Agrártudományi Közlemények 27: 10-19. Lágler R (2007) A köles (Panicum miliaceum): ISSR and SSR szekvencia stabilitása középkro óta. PhD Értekezés. SzIE, Gödöllő. Témavezető: Gyulai G. Larkin PJ, Scowcroft WR (1981) Somaclonal variation - a novel source of variability from cell culture for plant improvement. Theor. Appl. Genet. 60:197-214. Lascoux M, Palmé AE, Cheddadi R, Latta RG (2004) Impact of Ice Ages on the genetic structure of trees and shrubs. Proceedings of the Royal Society of London, Series B 359: 197–207. Lawyer FC, S Stoffel, RK Saiki, K Myambo, R Drummond, DH Gelfand (1989) Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus J Biol Chem 264:6427-37. Ledbetter AS, DL Nelson, ST Warren, DH Ledbetter (1990) Rapid isolation of DNA probes within specific chromosome regions by interspersed repetitive sequence polymerase chain reaction. Genomics 6:475-481. Lehoczki E, Laskay G, Gaál I, Szigeti Z (1992) Mode of action of paraquat in leaves of paraquat-resistant Conyza canadensis (L.) Cronq., Plant Cell Environ. 15:531-539. Leigh F, Kalendar R, Lea V, Lee D, Donini P, Schulman AH (2003) Comparison of the utility of barley retrotransposon families for genetic analysis by molecular marker techniques. Molecular Genetics and Genomics, 269(3):464-474. Leonard JA, Wayne RK, Cooper A (2000) Population genetics of ice age brown bears. Proc Natl Acad Sci USA 97: 1651-1654. Leple JC, ACM Brasileiro, NF Michel, F Delmotte, L Jouanin (1992) Transgenic poplars - Expression of chimeric genes using 4 different constructs. Plant Cell Reports 11;137-141. Leple JC, Bonadebottino M, Augustin S, Pilate G, Letan VD, Delplanque A, Cornu D, Jouanin L (1995) Toxicity to Chrysomela tremulae (Coleoptera, Chrysomelidae) of transgenic poplars expressing a cysteine proteinase inhibitor. Molecular Breeding 1: 319-328. Leple JC, Pilate G, Jouanin L (1999) Transgenic poplar trees (Populus species). In Biotechnology in Agriculture and Forestry, vol. Transgenic Trees (Szerk: Bajaj Y. P. S.), pp. 221-244. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag. Leple J-C, Pilate G, Jouanin L (2000) Transgenic poplar trees (Populus species). In: Bajaj YPS, ed. Biotechnology in agriculture and forestry 44:transgenic trees. Heidelberg, Germany: Springer, pp. 221-244. Leppic EE (1966) Searching gen centers of the genus Cucumis through host-parasite relationships. Euphytica 15: 323-328. Levi A, CE Thomas, AP Keinath, TC Wehner (2001) Genetic diversity among watermelon (Citrullus lanatus and Citrullus colocynthis) accessions. Genetic Resources and Crop Evolution 48: 559–566 Liepelt S, Bialozyt R, Ziegenhagen B (2002) Wind-dispersed pollen mediates postglacial gene flow among refugia. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 99: 14590–14594. Lindahl T (1993) Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature 362: 709–715.
95 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Linn F, I Heidmann, H Saedler, P Meyer (1990) Epigenetic changes in the expression of the maize A1 gene in Petunia hybrida: role of numbers of integrated gene copies and state of methylation. Molecular and General Genetics 222:329–336. Linné C (1753) Species Plantarum; illetve Linné C (1753,1758) Systenma Naturae, 1. és 10.kiadás. Lippay J (1664) Posoni kert. Poson. Lisitsina G (1984) The Caucasus - A centre of ancient farming in Eurasia. (Rotterdam). Lisitsina G, Prisepenko L (1977) Paleo-etnobotanicseszkie nahodki Kavkaza i Blizsnevo Vosztoka. Moszkva. Litt M, Luty JA (1989) A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am J Hum Genet 44:397-401. Litt T, Schmincke HU, Kromer B (2003) Environmental response to climatic and volcanic events in central Europe during the Weichselian Late glacial. Quaternary Science Reviews 22: 7–32. Liu L, F Kakihara, M Kato (2004) Characterization of six varieties of Cucumis melo L. based on morphological and physiological characters, including shelf-life of fruit. Euphytica 135: 305-313. Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method. Methods 25, 402–408. Lloyd G, BH McCown (1980) Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. Com Proc Int Plant Prop Soc 30:421-427. Lodish H, A Berk, P Matsudaira, CA Kaiser, M Krieger, MP Scott, SL Zipursky, K Darnell (2004) Molecular Cell Biology. 5dik kiadás. Freeman Co. ISBN 0 7167 4366 3. Loh E, J Elliott, S Cwirla, L Lanier, M Davis (1989) Polymerase chain reaction with single-sided specificity: analysis of T cell receptor delta chain. Science 243: 217-220 Longo MC, Berninger MS, Hartley JL (1990) Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93: 125–128. López-Sesé AI, JE Staub, ML Gómez-Guillamón (2003) Genetic analysis of Spanish melon (Cucumis melo L.) germplasm using a standardized molecular-marker array and geographically diverse reference accessions. Theor Appl Genet 108: 41-52. Ma J, Bennetzen JL (2004) Rapid recent growth and divergence of rice nuclear genomes. Proc Natl Acad Sci USA 101: 12404–12410. Macramallah R (1940) Un cimetiere Archaique de la Classe moyenne du Peuple a saqqarah. Service des Antiquites de 1'Egypte, Le Caire. Maggs-Kölling GL, S Madsen, JL Christiansen (2000) A phenetic analysis of morphological variation in Citrullus lanatus in Namibia. Genetic Resources and Crop Evolution 47: 385–393, 2000. Maliga P (1995) In: Maliga P, Klessig DF, Cashmore AR, Gruissem W, Varner JE (eds), Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Springer Harbor, NY., pp. 95-110. Malmstrom H, EM Svensson, MTP Gilbert, E Willerslev, A Gotherstrom, G Holmlund (2007) More on Contamination: The Use of Asymmetric Molecular Behavior to Identify Authentic Ancient Human DNA. Mol. Biol. Evol. 24: 998-1004 Manen J-F, Bouby L, Dalnoki O, Marinval P, Turgay M, Schlumbaum A (2003) Microsatellites from archaeological Vitis vinifera seeds allow a tentative assignment of the geographical origin of ancient cultivars. Journal of Archaeological Science 30: 721–729. Manninen O, Kalendar R, Robinson J, Schulman AH (2000) Application of BARE-1 retrotransposon markers to the mapping of a major resistance gene for net blotch in barley. Molecular Genetics and Genomics, 264: 325-334. Mansfeld R (2001) Mansfeld’s Encyclopedia of Agricultural and Horticultural crops Vol I-VI., Springer. Margulies M, M Egholm, WE Altman, S Attiya, JS Bader, LA Bemben, J Berka, MS Braverman, Yi-Ju Chen, Z Chen, SB Dewell, L Du, JM Fierro, XV Gomes, BC Godwin, W He, S Helgesen, CH Ho, GP Irzyk, Szilveszter C Jando, MLI Alenquer, TP Jarvie, KB Jirage, J-B Kim, JR Knight, JR Lanza, JH Leamon, SM Lefkowitz, M Lei, J Li, KL Lohman, H Lu, VB Makhijani, KE McDade, MP McKenna, EW Myers, E Nickerson, JR Nobile, R Plant, BP Puc, MT Ronan, GT Roth, GJ Sarkis, JF Simons, JW Simpson, M Srinivasan, KR Tartaro, A Tomasz, KA Vogt, GA Volkmer, SH Wang, Y Wang, MP Weiner, P Yu, RF Begley, JM Rothberg (2006) Genome sequencing in microfabricated high- density picolitre reactors. Nature 437: 376-380. Markert CL, F Moller (1959) Multiple forms of enzymes: Tissue, ontogenetic, and species-specific patterns. Proc Natl Acad Sci USA, 45: 753- 763. Maróti M (1976) A növényi szövettenyésztés alapjai. Akadémiai Kiadó, Budapest Maróti M (1987) A növényi szövettenyésztés biológiája. A biológia aktuális problémái sorozat Medicina Könyvkiadó, Budapest. Maróti M, Gerbár J, Nattám Á (1973) Kísérletek vírusmentes szegfű előállítására. Bot. Közl. 60: 265–268. Martin SL (1991) LINEs. Curr Opin Genet Develop 1: 505-508. Matthews JM (1964) The Hoabinhian in Southeast Asia and elsewhere. PhD thesis. Australian National University, Canberra Matthews JM (1966) A Review of the 'Hoabinhian' in Indo-China. Asian Perspectives 9: 86-95 Mátyás Cs (2006) Erdészeti génmegőrzési program: feladatok és megvalósítás. Kézirat. Sopron Mázik-Tőkei K, Lelley T, Gyulai G, Kiss E, Heszky LE(1997) Meiotic- and RAPD analysis of a dwarf type of Agropyron repens L. Cereal Research Communications, 25: 127-133. McClintock B (1942) The fusion of broken ends of chromosomes following nuclear fusion. Proc Natl Acad Sci USA 28: 458–463.
96 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
McClintock B (1950) The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc Natl Acad Sci U S A. 36: 344-55. McClintock B (1984) The significance of responses of the genome to challenge. Science 226: 792–801. McCown BH, McCabe DE, Russel DR, Robinson DJ, Barton KA, Raffa KF (1991) Stable transformation of Populus and incorporation of pest resistance by electric-discharge particle-acceleration. Plant Cell Reports 9: 590-594. McGraw JB (1993) Ecological genetic variation in seed banks. IV. Differentiation of extant and seed bank-derived populations of Eriophorum vaginatum. Arctic and Alpine Research 25: 45–49. Medgyesy P, E Fejes, P Maliga (1985) Genetics Interspecific chloroplast recombination in a Nicotiana somatic hybrid (protoplast fusion/chloroplast DNA/physical mapping). Proc Nat. Acad Sci USA 82: 6960-6964. Mende BG (2006) Possibilities and limitations int he archaeogenetic analysis of ancient human remains. Archeometriai Műhely 2006/1:29-33. Mendel G (1865) Versuche über Plflanzenhybriden. Verhandlungen des naturforschenden Vereines in Brünn, Bd. IV für das Jahr 1865, Abhandlungen, 3–47. Messelson M, R Yuan (1968) DNA restriction enzyme from E. coli. Nature 217:1110-1114. Messier W, S-H Li, C-B Stewart (1996) The birth of microsatellites. Nature 381 (6 June): 483 Mester Z, Gyulai G, J Janowszky, TM Hangyel, M Tar, S Bottka, L Heszky (1998) Development and genetic analysis of new somaclones of Reed Canarygrass (Phalarais arundinacea L). In: Nagy G, K Pető (eds) Grassland Science in Europe, EGF, Vol.3. pp. 791-794. ISBN 963-7177- 82-5. Michelmore RW, Paran I, Kesseli RV (1991) Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88: 9828-9832. Miller CO, Skoog F, von Saltza MH, Strong FM (1955) Kinetin, a cell division factor from deoxyribonucleic acid. J. Am. Chem. Soc. 77:1392. Molnár B (1973) A sárgadinnye. Akadémiai Kiadó, Budapes, pp. 263. Molnár I, Gáspár L, Sárvári É, Dulai S, Hoffmann B, Molnár-Láng M, Galiba G (2004) Physiological and morphological responses to water stress in Aegilops biuncialis and Triticum aestivum genotypes with differing tolerance to drought. Funct Plant Biol 31: 1149–1159. Monforte AJ, M Oliver, MJ Gonzalo, JM Alvarez, R Dolcet-Sanjuan, P Arús (2004) Identification of quantitative trait loci involved in fruit quality traits in melon (Cucumis melo L.). Theor Appl Genet 108: 750-758. Morel G, Martin C (1952) Guérison de dahlias atteints d'une maladie à virus. C.R. Acad. Sci. 235:1324-1325. Morgan TH (1910) Sex-limited inheritance in Drosophila, Science 32: 120-122. Morgante M, M Hanafey, W Powel (2002) Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genome. Nature Genetics 30:194-200. Mórocz S, Donn G, Németh J, Dudits D (1990) An improved system to obtain fertile regenerants via maize protoplasts isolated from highly embriogenic suspension culture. Theor Appl Genet 80:721-726. Morris AB, Baucom RS, Cruzan MB (2002) Stratified analysis of the soil seed bank in the cedar glade endemic Astragalus bibullatus: evidence for historical changes in genetic structure. American Journal of Botany 89: 29–36. Moser J (2001) Hoabinhian: Geographie und Chronologie eines steinzeitlichen Technocomplexes in Südostasien Köln, Lindensoft. Mozsár K (1958) Sárgadinnye fajkeresztezések vizsgálata. Doktoti Disszertáció, Kertészeti és Szőlészeti Főiskola, Budapest. Muller HJ (1927) Artificial transmutation of the gene. Science 66: 84–87. Muller S, Barakat S, Watts R, Joubaud P, Isenberg D (1990) Longitudinal analysis of antibodies to histones, Sm-D peptides and ubiquitin in the serum of patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis and tuberculosis. Clin Exp Rheumatol 8: 445-453 Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G Erlich H (1986) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposium in Quantitative Biology 51: 263-73. Mullis K, Faloona F (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 155: 335-350. Munger, H.M.-R.W. Robinson (l99l) Nomenclatue of Cucumis melo L. Cucurbit Genet. Coop. Genet. Coop. Rep. 16: 44-46. Murashige T, F Skoog (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15: 473-497. Murray MA (1993) Recent Archaeobotanical Research at the Site of Memphis. In: Vivian Davies, W. & Walker,R. (eds.) Biological Anthropology and the Study of Ancient Egypt: 165-168. British Museum Press, London Nadel D, A Danin, E Werker, T Schick, ME Kislev, K Stewart (1994) 19,000-Year-Old Twisted Fibers From Ohalo II. Current Anthropology 35: 451-458. Nadel D, U Grinberg, E Boaretto, E Werker (2006) Wooden objects from Ohalo II (23,000 cal BP), Jordan Valley, Israel. Journal of Human Evolution 50: 644-662. Nagaraju J, Reddy KD, Nagaraja GM, Sethuraman BN(2001) Comparison of multilocus RFLPs and PCR-based marker systems for genetic analysis of the silkworm, Bombyx mori. Heredity 86: 588-597. Nagy E, Gyulai G, Cs.L. Marton (2000) Kukorica beltenyésztett törzsek jellemzése genetikai markerekkel. Növénytermelés 49:587-597. Nagy ED, Lelley T (2003) Genetic and physical mapping of sequence specific amplified polymorphic (SSAP) markers on the 1RS chromosome arm in a wheat background. Theor Appl Genet 107: 1271–1277.
97 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Nagy ED, I Molnár, A Schneider, G Kovács, M Molnár-Láng (2006) Characterization of chromosome-specific S-SAP markers and their use in studying genetic diversity in Aegilops species. Genome 49: 289–296. Nagy J (2003a) A magyar görög- és sárgadinnye. In: Kertészeti hungarikumok. Szerk. Nyéki, J., Papp, J. pp. 84–96. MTA Társadalomkutató Központ, Budapest. Nagy J (2003b) A görögdinnye, sárgadinnye és az uborka szabadföldi termesztése. Őstermelő 7 (1): 71–76. Nakamura N (1987) Variable number of tandem repeat (vntr) markers for human-gene mapping Science 235:1616-22. Nakamura Y, Leppert M, O'Connell P, Wolff R, Holm T, Culver M, Martin C, Fujimoto E, Hoff M, Kumlin E, White R (1987) Variable number tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping. Science 235:1616-1622. Naudin C (1859) Essais d 'une monographie des espéces et des variétés dun Genre Cucumis. Ann. Sci. Nat. 11: 5-87. Navashin MS (1912) Bull Acad Sci St Petersb 22:273. Nebel BR, ML Rattle (1938) Action of colchicine on mitosis. Genetics 23:315-76 Nelson DL, Ledbetter SA, Corbo L, Victoria MF, Ramírez-Solis R, Webster TD, Ledbetter DH, Caskey CT (1989) Alu polymerase chain reaction: a method for rapid isolation of human-specific sequences from complex DNA sources. Proc Natl Acad Sci USA 86:6686–6690. Netolitzky F (1943) Nachweise von Nahrungs- und Heilmitteln in den Trockenleichen von Naga-ed-Der (Aegypten). M.D.A.J.K. 11: 5-33. Neuvéglise C, H Feldmann, E Bon, C Gaillardin, S Casaregola (2002) Genomic evolution of the Long Terminal Repeat retrotransposons in Hemiascomycetous yeasts. Genome research 12:930-934. Newberry PE (1889) On the wegetable remains discovered in the cemetery of Hawana. In Petrie WMF (eds), Hawana, Biahnu and Arsinoe: 46- 53 Field and Tuer "The Leadenhall Press", London Newberry PE (1890) The Ancient Botany in Petrie, W F (ed), Kahun, Gurob, and Hawana: 46-50 Kegan Paul, Trench, Trubner and Co, London Newberry PE (1927) Report on the floral wreaths found in the coffins of Tut-Ankh-Amen. In Carter, H. (ed.), The tomb of Tutankhamen 2: 39 and 189-196. Casse! and Company, London. Noctor G, A-C M Arisi, L Jouanin, CH Foyer (1998a) Manipulation of glutathione and amino acid biosynthesis in the chloroplast. Plant Physiology 118:471-482. Noctor G, A-C M Arisi, L Jouanin, KJ Kunert, H Rennenberg, CH Foyer (1998b) Glutathione: biosynthesis, metabolism and relationship to stress tolerance explored in transformed plants. J Exp Botany 49: 623–647. Noguchi H, J Park, T Takagi (2006) MetaGene: prokaryotic gene finding from environmental genome shotgun sequences. Nucleic Acids Res. 34: 5623-5630. Noonan JP, G Coop, S Kudaravalli, D Smith, J Krause, J Alessi, F Chen, D Platt, S Pääbo, J K Pritchard, EM Rubin (2006) Sequencing and Analysis of Neanderthal Genomic DNA. Science 314: 1113-1118. Noro M, Masuda R, Dubrovo IA, Yoshida MC, Kato M (1998) Molecular phylogenetic inference of the woolly mammoth Mammuthus primigenius, based on complete sequences of mitochondrial cytochrome b and 12S ribosomal RNA genes. Journal of molecular evolution 46: 314-26. Nyékhelyi BD (2003) Monumenta Historica Budapestinensia XII. Historical Museum of Budapest, Hungary, pp.1-102. Okada N (1991) SINEs. Curr Opin Genet Develop 1: 498-504. Olasz F, T Farkas, J Kiss, A Arini, W Arber (1997) Terminal Inverted Repeats of Insertion Sequence IS30 Serve as Targets for Transposition. J Bacteriology 179: 7551–7558. Olson M, L Hood, C Cantor, D Dotstein (1989) A common language for physical mapping of the human genome. Science 254:1434-1435. OMMI (2004) National list of varieties. Ed. K Neszmélyi. National Institute for Agricultural Quality Control, Budapest, Hungary. Orsós O (1941) Die Gewebeentwicklung bei der Kohlrabiknolle. Flora 35: 6–20. Orti G, DE Pearse, JC Avise (1997) Phylogenetic assessment of length variation at a microsatellite locus Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10745– 10749. Overbeek van J, Conklin ME, Blakeslee AF (1941) Factors in coconut milk essential for growth and development of Datura embryos. Science 94:350. Owen JL, CM Uyeda (1991) Single primer amplification of avian genomic DNA detects polymorphic loci Animal Biotech 2:107-122. Ozerov IA, NA. Zhinkina, AM. Efimov, EM. Machs ,AV Rodionov (2006) Feulgen-positive staining of the cell nuclei in fossilized leaf and fruit tissues of the Lower Eocene Myrtaceae. Botanical Journal of the Linnean Society, 150: 315-321. Pääbo S (1985) Molecular-Cloning of Ancient Egyptian Mummy DNA. Nature 314:644-645. Pääbo S (1989) Ancient DNA: extraction, characterization, molecular cloning, and enzymatic amplification. Proc Natl Acad Sci USA 86: 1939- 1943. Pääbo S (1999). Human evolution. Trends Cell Biol 9: M13-16. Pääbo S (2000) Of bears, conservation genetics, and the value of time travel. Proc Natl Acad Sci USA 97: 1320-1321. Pääbo S, Wilson AC (1991) Miocene DNA sequences - a dream come true? Curr Biol 1: 45-46. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC (1988) Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucleic Acids Res 16, 9775-9787.
98 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Pääbo S, Higuchi RG, Wilson AC (1989) Ancient DNA and the Polymerase Chain-Reaction - the Emerging Field of Molecular Archaeology. J Biol Chem 264: 9709-9712. Pääbo S, Irwin DM, Wilson AC (1990) DNA damage promotes jumping between templates during enzymatic amplification. J Biol Chem 265: 4718-4721. Pääbo S, Poinar H, Serre D, Jaenicke-Després V, Hebler J, Rohland N, Kuch M, Krause J, Vigilant L, Hofreiter M (2004) Genetic analyses from ancient DNA. Annual Review of Genetics 38: 645–679. Paál A (1918) "Uber phototropische Reizleitung". Jahrb. Wiss. Bot. 58:406-458. Palmer JD (1985) Comparative organization of chloroplast genomes. Ann. Rev. Genet. 19:325-354. Pangalo KI (1929) Critical review of the main literature on the taxonomy, geography and origin of cultivated and partially wild melons. Trudy Prikl. Bot. 23: 397-442 (In Russian, and translated into English for USDA by G. Saad in 1986). Pangalo KI (1958) Dyni. Gosudarstvennoe izdatel’stvo Moldavii. Kishinev. pp. 1-298. Paran I, RW Michelmore (1993) Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce Therr Appl Genet 85:985-993. Parducci L, Petit RJ (2004) Ancient DNA – unlocking plants' fossil secrets. New Phytologist 161: 335–339. Parducci L, Y Suyama, M Lascoux, KD Bennett (2005) Ancient DNA from pollen: a genetic record of population history in Scots pine. Molecular Ecology 14: 2873–2882. Paris HS, Daunay M-C, M Pitrat, J Janick (2006) First Known Image of Cucurbita in Europe, 1503–1508. Annals of Botany 98: 41–47. Pauk J, Manninen O, Mattila I, Salo Y, Pulli S (1991) Androgenesis in Hexaploid Spring Wheat F2 Populations and Their Parents Using a Multiple-Step Regeneration System. Plant Breeding 107:18-27. Pauk J, Ertugrul F, Bartók T, Mihály R, Kiss O, Cseuz L, Dudits D (2002) Improvement of wheat abiotic stress resistance via genetic transformation. Acta Biol Szeged 46: 5-7. Paxinos EE, James HF, Olson SL, Sorenson MD, Jackson J, Fleischer RC (2002) mtDNA from fossils reveals a radiation of Hawaiian geese recently derived from the Canada goose (Brantacanadensis). P Natl Acad Sci USA 99: 1399-1404. Páy A, Heberle-Bors E, Hirt H (1992) An alfalfa cDNA encodes a protein with homology to translationally controlled human tumor protein. Plant Mol Biol 19:501–503. Pellionisz A (2006) PostGenetics: Genetics beyond Genes. The journey of discovery of the function of "junk" DNA. Peer-invited and peer- reviewed Keynote lecture at "European Inaugural of the International PostGenetics Society", 12. October, 2006, Budapest, Hungary, a Satellite to the International Congress of Immunogenomics and Immunomics, pp. 219. Périn C, LS Hagen, V De Conto, N Katzir, Y Danin-Poleg, V Portnoy, S Baudracco-Arnas, J Chadoeuf, C Dogimont, M Pitrat (2002) A reference map of Cucumis melo based on two recombinant inbred line populations. Theor Appl Genet 104: 1017-1034. Pertoldi C, Hansen MM, Loeschcke V, Madsen AB, Jacobsen L, Baagoe H (2001) Genetic consequences of population decline in the European otter (Lutra lutra): an assessment of microsatellite DNA variation in Danish otters from 1883 to 1993. Proceedings 268: 1775-1781. Petit RJ, Csaikl UM, Bordács S, Burg K, Coart E, Cottrell J, van Dam B, Deans JD, Dumolin-Lapègue S, Fineschi S, Finkeldey R, Gillies A, Glaz I, Goicoechea PG, Jensen JS, König AO, Lowe AJ, Madsen SF, Mátyás G, Munro RC, Olalde M, Pemonge M-H, Popescu F, Slade D, Tabbener H, Taurichini D, de Vries SGM, Ziegenhagen B, Kremer A (2002) Chloroplast DNA variation in European white oaks: phylogeography and patterns of diversity based on data from over 2600 populations. Forest Ecology and Management 156: 5–26. Petit RJ, Aguinagalde I, de Beaulieu J-L, Bittkau C, Brewer S, Cheddadi R, Ennos R, Fineschi S, Grivet D, Lascoux M, Mohanty A, Müller- Starck G, Demesure-Musch B, Palmé A, Martín JP, Rendell S, Vendramin GG (2003) Glacial refugia: hotspots but not melting pots of genetic diversity. Science 300: 1563–1565. Petit RJ., Hampe A, Vendramin GG, Fineschi S, Salvini D, Duminil J (2005) Comparative organisation of chloroplast, mitochondrial and nuclear diversity in plant populations. Molecular Ecology 14: 689-701. Petrie WMF (eds), Hawana, Biahnu and Arsinoe: 46-53 Field and Tuer "The Leadenhall Press", London Petrov AP (2001) Evolution of genome size: new approaches to an old problem. Trends in Genetics 17:23-28. Phukhachon S (1988) Archaeological research of the Hoabinhian culture or technocomplex and its comparison with ethnoarchaeology of the Phi Tong Luang, a hunter-gatherer group of Thailand. Tubingen: Verlag Archaeologica Venatoria: Institut fur Urgeschichte der Universitat Tubingen. Piperno DR, E Weiss, I Holst, D Nadel (2004) Processing of wild cereal grains in the Upper Palaeolithic revealed by starch grain analysis. Nature 430:670-673. Pitrat M, Hanelt P, Hammer K (2000) Some comments on infraspecific classification of cultivars of melon. Acta Horticulture 510: 29–36. plants and mammals. Biol Chem 377: 605–610 Plu A (1985) Bois et graines. In Balout, L. and Roubet, C. (eds.), La momie de Ramses II: 166-174. E.R.C, Paris. Poinar HN, Cano RJ, Poinar GO (1993) DNA from an extinct plant. Nature 363: 677. Poinar HN, Höss M, Bada JL, Pääbo S (1996) Amino acid racemization and the preservation of ancient DNA. Science 272: 864–866. Poinar HN, Hofreiter M, Spaulding WG, Martin PS, Stankiewicz BA, Bland H, Evershed RP, Possnert G, Pääbo S (1998) Molecular coproscopy: dung and diet of the extinct ground sloth Nothrotheriops shastensis. Science 281: 402–406.
99 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Poinar HN, Kuch M, Sobolik KD, Barnes I, Stankiewicz AB, Kuder T, Spaulding WG, Bryant VM, Cooper A, Pääbo S (2001) A molecular analysis of dietary diversity for three archaic Native Americans. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 98: 4317–4322. Poinar HN, Kuch M, McDonald G, Martin P, Pääbo S (2003) Nuclear gene sequences from a late Pleistocene sloth coprolite. Current Biology 12: 1150–1152. Poinar HN, C Schwarz, J Qi, B Shapiro, RDE MacPhee, B Buigues, A Tikhonov, DH Huson, LP Tomsho, A Auch, M Rampp, W Miller, SC Schuster (2006) Metagenomics to Paleogenomics: Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA. Science 311: 392 – 394. Porsild AE, Pharington CR, Mulligan GA (1967) 'Lupinus arcticus' Wats. grown from seeds of Pleistocene age. Science 158: 113–114. Pouteau S, Huttner E, Grandbastien MA, Caboche M (1991) Specific expression of the tobacco Tnt1 retrotransposon in protoplasts. EMBO J 10: 1911–1918. Pouteau S, Grandbastien MA, Boccara M (1994) Microbial elicitors of plant defense responses activate transcription of a retrotransposon. Plant J 5: 535–542. Prakash PA, A Kush, P Lakshmanan, PP Kumar (2003) Cytosine methylation occurs in a CDC48 homologue and a MADS-box gene during adventitious shoot induction in Petunia leaf explants. J Exp Botany 54:1361-1371. Pruvost M, Geigl E-M (2004) Real-time quantitative PCR to assess the authenticity of ancient DNA amplification. Journal of Archaeological Science 31: 1191–1197. Purnhauser L, Gyulai G (1993) The effect of copper on the shoot and root regeneration in wheat, triticale, rape and tobacco tissue cultures. Plant Cell Tissue Organ Cult 35:131-139. Purnhauser L, Gyulai G, M Csősz, L Heszky, Á Mesterházy (2000a) Identification of leaf rust resistance genes in common wheat by molecular markers. Acta Phytopathol Entomol Hung 35:31-36. Purnhauser L., Gyulai G, Tar M, Csösz M, Mesterházy A, Heszky L (2000b) Use of Molecular Markers in Wheat Breeding for Disease Resistance. In: Eds. I. Fendrik, M del Gallo, J Vanderleyden, M. de Zamaroczy. NATO ASI Series, Vol G37. pp. 155-159. Use of Agriculturally Important Genes in Biotechnology, pp.52-57. IOS Press (NATO Science Series) Amsterdam, Berlin, Oxford, Tokyo, Washington, D.C). Puskás LG, B Fartman, S Bottka (1994) Restricted PCR: amplification of an individual sequence flanked by a highly repetitive element from total human DNA. Nucleic Acids Res 22:3251-3252. Puskás LG, S Bottka (1995) Reduction of mispriming in amplification reactions with restricted PCR. Genome Resarch 5:309-311. Pyzhenkov VI, MI Malinia (1994) (Tykvennye Ogurec, Dynja) Cucurbitaceae (Cucumis sativus L., Cucumis melo L.). Kulturnaja flora (Flora os cultivated plants) 21. Kolos. Moscow. pp.1-288. Queller DC, Strassman JE, Hughes CR (1993) Microsatellites and Kinship. Trends in Ecology and Evolution 8:285 – 288. Quinn RM (1999) Kamut: Ancient grain, new cereal. In: J Janick (Ed) Perspectives on new crops and new uses. pp. 182–183, ASHS Press, Alexandria, VA. Radojevic L, N Djordjevic, B Tucic (1989) In vitro induction of pollen embryos and plantlets in Aesculus carnea Hayne through anther culture. Plant Cell Tissue Organ Cult 17:21-26 Rahman MH, Rajora O P (2001) Microsatellite DNA somaclonal variation in micropropagated trembling aspen (Populus tremuloides). Plant Cell Reports 20:531-536. Raniello R, Procaccini G (2002) Ancient DNA in the seagrass Posidonia oceanica. Marine Ecology – Progress Series 227: 269–273. Rédei GP (2003) Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics. 2. kiadás. John Wiley & Sons, 111 River Street, Hoboken, NJ, 07030. Renfrew J (1985) Preleminary report on the botanical remains. In Kemp, B.(ed.), Amarna Reports 2: 175-190. Egypt Exploration Society, London. Rennenberg H, AD Peuke (2005) Phytoremediation with transgenic trees. Z. Naturforschung C60:199-207. Renner SS, H Schaefer, A Kocyan (2007) Phylogenetics of Cucumis (Cucurbitaceae): Cucumber (C. sativus) belongs in an Asian/Australian clade far from melon (C. melo). BMC Evolutionary Biology 7: 58 doi:10.1186/1471-2148-7-58
Robinson RW, DS Decker-Walters (1997) Cucurbits. Crop Production Science in Horticulture Vol. 6. CAB International, Oxon. pp. 1-226. Röder MS, V Korzun, K Wendehake, J Plaschke, MH Tixier, P Leroy, MW Ganal (1998) A microsatellite map of wheat. Genetics 149:2007- 2023. Rollo F, Ubaldi M, Ermini L, Marota I (2002) Ötzi's last meals: DNA analysis of the intestinal content of the Neolithic glacier mummy from the Alps. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 99: 12594–12599. Rompler H, N Rohland, C Lalueza-Fox, E Willerslev, T Kuznetsova, G Rabeder, J Bertranpetit, T Schoneberg, M Hofreiter (2006) Nuclear gene indicates coat-color polymorphism in mammoths. Science 313:62. Ronaghi M, S Karamohamed, B Pettersson, M Uhlén, Pal Nyrén (1996) Real-Time DNA Sequencing Using Detection of Pyrophosphate Release. Analytical Biochemistry 242: 84-89. Ronaghi M, Uhlén M, Nyrén P (1998) A sequencing method based on real-time pyrophosphate. Science 281:363-365. Rothmaler W, Natho I (1957) Bandkeramische Kulturpflanzenreste aus Thüringen und Sachsen. Beitr. Frühgesch. d. Landwirtsch 3: 73-98. Roy-Engel AM, Carroll ML, Vogel E, Garber RK, Nguyen SV, Salem AH, Batzer MA, Deininger PL (2001) Alu insertion polymorphisms for the study of human genomic diversity. Genetics 159: 279-290.
100 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Rozen S, Skaletsky HJ (1997) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology, (eds: Krawetz S, and Misener S), pp. 365-386. Totowa, NJ: Humana Press. program (http://frodo.wi.mit.edu/cgi- bin/primer3/primer3_www.cgi) Ruckenbauer P von (1971) Keimf¨ahiger Winterweizen aus dem Jahre 1877. Beobachtungen und Versuche. pp. 372–386. Inst. Pflanzenbau und Pflanzenzuchtung. Hochschule, Bodenkultur in Wien. Sági L, Barnabás B (1989) Evidence for cytoplasmic control of in vitro microspore embryogenesis in the anther culture of wheat (Triticum aestivum L.) Theor Appl Genet 78: 867-872. Saiki RK, S Scharf, FA Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich, M Arnheim (1985) Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230:1350-54. Saiki RK, DH Gelfand, S Stoffel, SJ Scharf, R Higuchi, GT Horn, KB Mullis, HA Erlich (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487-491. Sain RS, P Joshi, EV D Sastry (2002) Cytogenetic analysis of interspecific hybrids in genus Citrullus (Cucurbitaceae) Euphytica 128: 205–210. Salamini F, Özkan H, Brandolini A, Schëfer-Pregl R, Martin W (2002) Genetics and geography of wild cereal domestication in the Near East. Nature Rev Genet 3:429–441. Saltonstall K (2002) Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 99: 2445–2449. Saltonstall K (2003) Microsatellite variation within and among North American lineages of Phragmites australis. Molecular Ecology 12: 1689– 1702. Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY SanMiguel P, Gaut BS, Tikhonov A, Nakajima Y, Bennetzen JL (1998) The paleontology of intergene retrotransposons of maize. Nature Genet 20: 43–45. SanMiguel P, Tikhanov A, Jin YK, Motchoulskaia N, Zakharov D, Melake-Berhan A, Springer PS, Edwards KJ, Lee M, Avramova Z, Bennetzen JL (1996) Nested retrotransposons in the intergenic regions of the maize genome. Science 274:765-768. Sauer J D (1993) Historical geography of crop plants - a select roster. CRC Press, Boca Raton, Florida. pp.1-308. Savolainen P, Zhang YP, Luo J, Lundeberg J, Leitner T (2002). Genetic evidence for an East Asian origin of domestic dogs. Science 298: 1610- 1613. Savolainen V, Cuénoud P, Spichiger R, Martinez MDP, Crèvecoeur M, Manen J-F (1995) The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics – evaluation and improvement. Plant Systematics and Evolution 197: 87–98. Schermann Sz (1966) Magismeret, I, II. (Akadémiai Kiadó, Budapest) Schlotterer C, Tautz D (1992) Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nucleic Acids Res 20: 211-215. Schneller JJ (1998) How much genetic variation in fern populations is stored in the spore banks? A study of Athyrium filix-femina (L.) Roth. Botanical Journal of the Linnean Society 127: 195–206. Schulman AH (2007) Retrotransposons as molecular markers. Euphytica 158:313–321. Schulman AH, Kalendar R (2005) A movable feast: Diverse retrotransposons and their contribution to barley genome dynamics. Cytogenetic and Genome Research 110 (1-4): 598-605. Schweinfurth G (1882) De la Flore Pharaonique. Bulletin de I'lnstitut Egyptien, 27eme Serie, 3: 51-76. Le Caire. Schweinfurth G (1883a) The Flora of Ancient Egypt. Nature 28 (May, 31): 109- 114. London. Schweinfurth G (1886) Les dernieres decouvertes botaniques dans les anciens tombeaux de l'Egypte. Bulletin de I'Institut Egyptien. Deuxieme serie, (1885) 6: 256-283. Imprimerie Nouvelle Jules Barbier, Le Caire. Schweinfurth G (1887) Die letzten botanischen Entdeckungen in den Grabern Aegyptens. In Engler, A. (ed.), Botanische Jahrbiicher fitr Systematik 8: 1-15. Leipzig. Schweinfurth G (1908) Uber die Pflanzenreste aus mR 29 und mR 30. In Schafer, H. (ed.), Priestgrdber vom Totentempel des Ne-user-re: 152- 164. Leipzig. Schwienfurth G (1883b) La flore de l’ancienne Egypte. Revue Scientifique (21 Julliet) 32: 72-77. Selker EU, Stevens JN (1985) DNA methylation at asymmetric sites is associated with Shan X, Z Liu, Z Dong, Y Wang, Y Chen, X Lin, L Long, F Han, Y Dong, B Liu (2005) Mobilization of the Active MITE Transposons mPing and Pong in Rice by Introgression from Wild Rice (Zizania latifolia Griseb.). Mol Biol Evol 22:976-990. Sharma H, Francki M, Crasta O, Gyulai G, Bucholtz D, Ohm H, Anderson J, Perry K, Patterson F (1999) Cytological and molecular characterization of wheat lines with Thinopyrum intermedium chromosome additions, substitutions and translocations resistant to barley yellow dwarf virus. Cytologia 64:93-100. Sheikhnejad G, A Brank, JK Christman, A Goddard, E Alvarez, H Ford Jr, VE Marquez, CJ Marasco, JR Sufrin, M O'Gara, X Cheng (1999) Mechanism of inhibition of DNA (cytosine C5)-methyltransferases by oligodeoxyribonucleotides containing 5,6-dihydro-5-azacytosine. Mol. Biol. 285:2021-2034. Shen-Miller J (2002) Sacred lotus, the long-living fruits of China Antique. Seed Science Research 12: 131–143.
101 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Shi T, RH Reeves, DA Gilichinsky, EI Friedmann (1997) Characterization of Viable Bacteria from Siberian Permafrost by 16S rDNA Sequencing. Microbial Ecology 33:169-179. Shoocongdej R (2000) Forager Mobility Organization in Seasonal Tropical Environments of Western Thailand. World Archaeology 32: 14-40. Schoot van der J, Pospikova M, Vosman B, Smulders MJM (2000) Development and characterization of microsatellite markers in black poplar (Populus nigra L.). Theoretical and Applied Genetics 101:317-322. Shriver MD, L Jin, R E Ferrell, R Deka (2006) Microsatellite Data Support an Early Population Expansion in Africa. Genome Research 7:586– 591. Sica M, Gamba G, Montieri S, Gaudio L, Aceto S (2005) ISSR markers show differentiation among Italian populations of Asparagus acutifolius L. BMC Genetics 6: 17. Sidow A, Wilson AC, Pääbo S (1991) Bacterial-DNA in Clarkia Fossils. Philos T Roy Soc B 333:429-433. Simon L (2004) Fitoremediáció. Környezetvédelmi Füzetek. BMKE OMIKK, Budapest. Simoni RD, RL Hill, M Vaughan (2002) The Discovery of Glutathione by F. Gowland Hopkins and the Beginning of Biochemistry at Cambridge University J. Biol. Chem. 277:27-28 Skøt L, Hamilton NRS, Mizen S, Chorlton KH, Thomas ID (2002) Molecular genecology of temperature response in Lolium perenne: 2. Association of AFLP markers with ecogeography. Molecular Ecology 11: 1865-1876. Smit AF (1999) Interspersed repeats and other mementos of transposable elements in mammalian genomes. Curr Opin Genet Dev 9:657-663 Smith JSC, ECL Chin, H Shu, OS Smith, SJ Wall, ML Senior, SE Mitchell, S Kresowitch, and J Ziegle (1997) An evaluation of the utility of SSR éoci as molecular markers in maize (Zea mays L.): comparison with data from RFLPs and pedigree. Theor Appl Genet 95:163-173. Smith RL, KJ Sytsma (1990) Evolution of Populus nigra (sect. Aigeiros): introgressive hybridization and the chloroplast contribution of Populus alba (sect. Populus). American Journal of Botany 77:1176-1187 Smulders MJM, Van der Schoot J, Arens P, Vosman B (2001) Trinucleotide repeat microsatellite markers for black poplar (Populus nigra L.). Molecular Ecology Notes 1:188-190. Solheim WG (1972) An earlier agricultural revolution. Scientific American 226: 34-41 Soltis PS, Soltis DE, Smiley CJ (1992) An rbcL sequence from a Miocene Taxodium (bald cypress). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89: 449–451. Spencer M, Howe CJ (2004) Authenticity of ancient-DNA results: a statistical approach. American Journal of Human Genetics 75: 240–250. Sperisen C, Büchler U, Gugerli F, Mátyás G, Geburek T, Vendramin GG (2001) Tandem repeats in plant mitochondrial genomes: application to the analysis of population differentiation in the conifer Norway spruce. Molecular Ecology 10: 257–263. Stallings RL, Torney DC, Hildebrand CE, Longmire JL, Deaven LL, Jett JH, Doggett NA, Moyzis RK (1990) Physical mapping of human chromosomes by repetitive sequence fingerprinting. Proc Natl Acad Sci USA 87,6218- 6222. Staub JE, AI López-Sesé, N Fanourakis (2004) Diversity among melon landraces (Cucumis melo L.) from Greece and their genetic relationships with other melon germplasm of diverse origins. Euphytica 136: 151-166. Stefanovits P (1981) Talajtan. Mg. Kiadó, Budapest. ISBN 963-231-035-7 Stehlik I (2003) Resistance or emigration? Response of alpine plants to the ice ages. Taxon 52: 499–510. Stepansky A, I Kovalski, R Perl-Treves (1999) Intraspecific classification of melons (Cucumis melo L.) in view of their phenotypic and molecular variation. Plant Syst Evol 217: 313-333. Storme V, A Broeck, B Ivens, D Halfmaerten, J Slycken, S Castiglione, F Grassi, T Fossati, JE Cottrell, HE Tabbener, F Lefèvre, C Saintagne, S Fluch, V Krystufek, K Burg, S Bordács, A Borovics, K Gebhardt, B Vornam, A Pohl, N Alba, D Agúndez, C Maestro, E Notivol, J Bovenschen, BC Dam, J Schoot, B Vosman, W Boerjan, Smulders MJM (2004) Ex-situ conservation of Black poplar in Europe: genetic diversity in nine gene bank collections and their value for nature development. Theoretical and Applied Genetics 108: 969-981. Strohm M, Eiblmeier M, Langebartels C, Jouanin L, Polle A, Sandermann H, Rennenberg H (2002) Responses of antioxidative systems to acute ozone stress in transgenic poplar (Populus tremula x P. alba) over-expressing glutathione synthetase or glutathione reductase. Trees-Structure and Function 16:262-273. Strohm M, L Jouanin, KJ Kunert, C Provost, A Polle, CH Foyer, H Rennenberg (1995) Regulation of glutathione synthesis in leaves of transgenic poplar (Populus tremula x Populus alba) overexpressing glutathione synthetase. Plant Journal 7:141-145. Suarez AV, Tsutsui ND (2004). The value of museum collections for research and society. BioScience 54: 66–74. Sueoka N (1961) Variation and heterogeneity of base composition of deoxyribonucleic acids: a compilation of old and new data J Mol Biol 3:31- 40. Suh HS, JH Cho, YJ Lee, MH Heu (2000) RAPD variation of 13,010 and 17,310 year-old carbonized rice. 4th International Rice Genetics Symposium, Manilla, Philipines, Oct. 22-27. Suyama Y, Kawamuro K, Kinoshita I, Yoshimura K, Tsumura Y, Takahara H (1996) DNA sequence from a fossil pollen of Abies spp. from Pleistocene peat. Genes and Genetic Systems 71: 145–149. Svab Z, Hajdukiewicz P, Maliga P (1990) Stable transformation of plastids in highter plants[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 87:8526-8530 Sykes B (1991) Ancient DNA. The past comes alive. Nature 352:381–382. Sykes B (2001) The seven daughters of Eve: The Science That Reveals Our Genetic Ancestry, London, WW Norton, ISBN 0-393-02018-5
102 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Sykes B (2003) Adam's Curse: A Story of Sex, Genetics, and the Extinction of Men. London, Bantam Press. ISBN 0-593-05004-5. Szabó Z (2006) A sárgadinnye (Cucumis melo) archeogenetikája: ITS és SSR szekvencia heterogenitás. PhD Tézis, pp. 1-103, témavezető: Gyulai G. Gödöllő Szabó M, J Csiszár, E Illés, N Gyémánt , J Molnár (2000) Enzymes related to the process of adaptation in auxin autotrophic and heterotrophic tobacco tissue cultures. Plant Physiol. Biochem. 38: SO 11-36. Szabó Z, Gyulai G, M Humphreys, L Horváth, A Bittsánszky, R Lágler, L Heszky (2005a) Genetic variation of melon (C. melo) compared to an extinct landrace from the Middle Ages (Hungary) I. rDNA, SSR and SNP analysis of 47 cultivars. Euphytica 146:87-94. Szabó Z, Gyulai G, L Horváth, A Bittsánszky, Sz Szani, R Lágler, J Kiss, F Gyulai, L Holly and L Heszky (2005b) Genetic diversity of Hungarian melon landraces (C. melo) compared to an extinct sample from the Middle Ages. Hung Agric Res 2005/2:18-22. Szabó Z (2006) A sárgadinnye (Cucumis melo) archeogenetikája, ITS- és SSR -heterogenitása egy 15. századi lelettől a mai fajtákig. PhD Disszertáció, SzIE Gödöllő. pp.1-103. témavezető: Gyulai G. Szabó Z. Gyulai G, Lágler R, Tóth Z, Heszky L (2007) SNP elemzés az rDNS ITS1-5.8S-ITS2 lokuszán mai és középkori sárgadinnyében (Cucumis melo). Agrártudományi Közlemények 27: 120-124.
Szamota I, Zolnai Gy (1902-1906) Magyar oklevél-szótár. Régi oklevelekben és egyéb iratokban előforduló magyar szók gyűjteménye. Pótlék a Magyar nyelvtörténeti szótárhoz. Budapest. 1902-1906, Hornyánszky. XXXI p., 1210 hasáb. - Reprint: 1984. (OklSz.) Szigeti Z, Rácz I, Lásztity D (2001) Paraquat resistance of weeds – the case of Conyza canadensis (L.) Cronq., Z. Naturforsch. 65c, 319-328. Szikszai Fabriczius B. (1591) Nomenclatura. In: Melich J.: Szikszai Fabriczius Balázs latin-magyar szójegyzéke (1906). Taberlet P, Cheddadi R (2002) Quaternary refugia and persistence of biodiversity. Science 297: 2009–2010. Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology 17: 1105–1109. Taberlet P, Griffin S, Goossens B, Questiau S, Manceau V, Escaravage N, Waits LP, Bouvet J (1996) Reliable genotyping of samples with very low DNA quantities using PCR. Nucleic Acids Research 24: 3189–3194. Tackholm V (1961) Botanical identification of the plants found at the, In Bachatly, C. (ed.) Le Monastere de Phoebammon dans la Thebaide, III. 1-38-. Societe d'Archeologie Copte. Tani N, Tsumura Y, Sato H (2003) Nuclear gene sequences and DNA variation of Cryptomeria japonica samples from the postglacial period. Molecular Ecology 12: 859–868. Tar M, L Purnhauser, L Csosz, A Mesterhazy, Gyulai G (2002) Identification of molecular markers for an efficient leaf rust resistance gene (Lr 29) in wheat. In: Proceedings of the 7th Hungarian Congress on plant Physiology, 2002. Acta Biol Szegediensis 46(3–4): 133–134. Tárczy HM, Gyulai G, Janovszky J, Kiss E, Heszky LE (1996) Cytogenetic instability among the vegetative progenies of A.repens cv. Purdue somaclones. Cereal Research Communications 24: 267-273. Tari I, Szalai G, Lőrincz Zs, Bálint A (2002) Changes in thiol content in roots of wheat cultivars exposed to copper stress. Biol Plant 45:255-260. Tautz D (1989) Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research 17:6463-6471. Tautz D, M Renz (1984) Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes. NAR 12: 4127-4138. Tautz D, Trick M, Dover, GA (1996) Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation. Nature 322:652-656. Taylor G (2002) Populus: Arabidopsis for forestry. Do we need a model tree? Annals of Botany 90: 681-689. Taylor JS, JMH Durkin, F Breden (1999) The Death of a Microsatellite: A Phylogenetic Perspective on Microsatellite Interruptions. Mol Biol Evol 16:567–572. Tempír Z (1979) Kulturpflanzen im Neolithikum und Äneolithikum auf dem Gebiet von Böhmen und Mähren. Archaeo-Physika 8: 302-308. Teo CH, Tan SH, Ho CL, Faridah QZ, Othman YR, Heslop-Harrison JS, Kalendar R, Schulman AH (2005) Genome constitution and classification using retrotransposon-based markers in the orphan crop banana. Journal of Plant Biology 48: 96-105. Thompson JD, DG Higgins, TJ Gibson (1994) CKUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 22:4673-4680. Thomas RH, Schaffner W, Wilson AC, Pääbo S (1989). DNA Phylogeny of the Extinct Marsupial Wolf. Nature 340: 465-467. Thomas WK, Pääbo S, Villablanca FX., and AC Willson (1990) Spatial and temporal continuity of kangaroo rat populations shown by sequencing mitochondrialDNA from museum specimens. J Mol Evol 31: 101–112. Threadgold J, Brown TA (2003) Degradation of DNA in artificially charred wheat seeds. Journal of Archaeological Science 30: 1067–1076. Toldi O, Gyulai G, E Preininger, É Várallyay, M Fári (1994) Minibeet initiation of derooted sugarbeet (Beta vulgaris L.) seedlings in vitro. Plant Sci 94:217-224. Toldi O, Gyulai G, J Kiss, IA Tamás, E Balázs (1996) Antiauxin enhanced microshoot initiation and plant regeneration from epicotyl-oroginated thin-layer explants of sugarbeet (Beta vulgaris L.). Plant Cell Rep 15:851-854. Tóth G, Gáspári, Z, Jurka J (2000) Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Research 10:967-981.
Tóth Z, Gyulai G, Szabó Z, Heszky L (2007) Mikroszatellita lokuszok evolúciója a görögdinnyében (Citrullus lanatus) a középkor óta; (CT)3 deléció a (CT)26 nSSR-ban. Agrártudományi Közlemények 27: 125-134.
103 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Törjék O, E Kiss, J Kiss, M Kondrák, Gyulai G, J Gergácz, L Heszky (2001) Evaluation of genetic diversity of poplar genotypes by RAPD and AP-PCR analysis. Acta Biol Hung 52:345-354. Troy CS, MacHugh DE, Bailey JF, Magee DA, Loftus RT, Cunningham P, Chamberlain AT, Sykes BC, Bradley DG (2001) Genetic evidence for Near-Eastern origins of European cattle. Nature 410: 1088-1091. Tseveendorj D, L Sugar (1994) Hanguk Minjokhak Yön’gu. In.: The review of Corea Anthropology Institute 2, pp. 91-110., Dankook University, Seoul Korea. Turnpenny P, Ellard S (2005) Emery's Elements of Medical Genetics, 12th. ed. Elsevier, London. Tuskan GA, Difarizo SP, Teichmann T (2004) Poplar genomics is getting popular: The impact of the poplar genome project on tree research. Plant Biology 6:2-4. Unger F (1862) Botanische Streifzüge auf dem Gebiete der Kulturgeschichte, V. Inhalt eines altagyptischen Ziegels an organiscen Körpern. Sitzungsberichte der kaiserlichen Akademie Wissenschaften 1 (Jan.), 2 Abth.: 75-88. Wien. Van Tan H (1994) The Hoabinhian in Southeast Asia: Culture, cultures or technocomplex? Vietnam Social Sciences 5: 3-8 Van Tan H (1997) The Hoabinhian and before. Bulletin of the Indo-Pacific Prehistory Association (Chiang Mai Papers, Volume 3) 16: 35-41 Várallyay Gy (2005) Agroökológia – tájökológia. Tájökológiai Lapok, 3. évf. 1. szám, p. 155-175. Vartavan de C (1990) Contaminated plant-foods from the tomb of Tutankhamun: A new interpretiv system. Journal of Archaeological Science 17:473-494. Academic Press Ltd. London. Vartavan de C (1993)"Combined-systems" analysis for the interpretation of the Tutankhamun plant remains. Ph.D. thesis (Institute of Archaeology,University College, University of London). Vartavan C de, Amorós AV (1997) Codex of ancient Egyptian plant remains. Codex des restes végétaux de l'Egypte ancienne. London, 401 pp. Vavilov IN (1951) The Origin, Variation, Immunity and Breeding of Cultivated Plants (K. Starr Chester). 1951. Chronica Botanica 13:1–366.; Origin and Geography of Cultivated Plants (fordíttta Doris Love) (1992). Cambridge University Press, Cambridge. ISBN 0-521-40427-4. pp. 1- 532. Veen M van der (1996) The plant remains from Mons Claudianus, a Roman quarry setttlement in the Eastern Desert of Egypt-an interim report. Vegetation History and Archaeobotany 5 (1-2): 132-141. Velich I (1967) Adatok a Cucumis melo L. ivargenetikájához. Doktoti Disszertáció, Kertészeti és Szőlészeti Főiskola, Budapest. Veres G, RA Gibbs, TSE Scherer, CT Caskey (1987) The Molecular Basis of the Sparse Fur Mouse Mutation. Science 237:415-417. Vicient CM, Jaaskelainen M, Kalendar R, Schulman AH (2001a) Active retrotransposons are a common feature of grass genomes. Plant Physiology 125: 1283-1292. Vicient CM, Kalendar R, Anamthawat-Jonsson K, Schulman AH (1999) Structure, functionality, and evolution of the BARE-1 retrotransposon of barley. Genetica 107: 53-63. Vicient CM, Kalendar R, Anamthawat-Jonsson K, Suoniemi A, Schulman AH (2000) Structure, functionality, and evolution of the BARE-1 retrotransposon of barley. In: Georgia Genetics Review I: Transposable Elements & Evolution. ISBN: 0-7923-6306-X. Vicient CM, Kalendar R, Schulman AH (2001b) Envelope-class retrovirus-like elements are widespread, transcribed and spliced, and insertionally polymorphic in plants. Genome Research 11: 2041-2049. Vila C, Leonard JA, Gotherstrom A, Marklund S, Sandberg K, Liden K, Wayne RK, Ellegren H (2001) Widespread origins of domestic horse lineages. Science 291: 474-477. Vila C, Savolainen P, Maldonado JE, Amorim IR, Rice JE, Honeycutt RL, Crandall KA, Lundeberg J, Wayne RK (1997) Multiple and ancient origins of the domestic dog. Science 276: 1687-1689. Villareal RL, G Varughese, OS Abdalla (1990) Advances in spring triticale breeding. Plant Breed. Rev. 8:43-90. Villaret-von Rochow E (1958) Die Pflanzenreste der bronzezeitlichen Pfahlbauten von Valeggio am Mincio. Bericht über das Geobot. Forschungsinst. Rübel in Zürich für das Jahr 1957, 96-144. Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Lee T van der Hornes, M Frijters, A Pot, J. Peleman J, Kuiper M, Zabeau M (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23: 4407-4414. Voytas DF, FM Ausubel (1988) A copia-like transposable element family in Arabidopsis thaliana. Nature 336:242-44. Vreeland RH, Rosenzweig WD, Powers DW (2000) Isolation of a 250 million-year-old halotolerant bacterium from a primary salt crystal. Nature 407: 897-900. Walker PMB (1971) Repetitive DNA in higher organisms. Progr Biophys Mol Biol 23:145. Walters TW (1989) Historical overview on domesticated plants in China with special emphasis on the Cucurbitaceae. Economic Botany 43: 297– 313. Wasylikowa K, Schild R, Wendorf F, Krolik H, Kubiak-Martens L, Harlan JR (1995) Archeobotany of the Early neolithic site E-75-6 at Nubta Playa,Western Desert, South Egypt (preleminary results) Acta Palaeobotanica 35(1): 133-155. Watanabe K, Y Yamamoto, K Murata, A Kimura (1986) The nucleotide-sequence of the gene for gamma-glutamylcysteine synthetase of Escherichia coli. Nucleic Acids Research 14:4393-4400. Watanobe T, Ishiguro N, Nakano M, Takamiya H, Matsui A, Hongo H (2002) Prehistoric introduction of domestic pigs onto the Okinawa Islands: ancient mitochondrial DNA evidence. J Mol Evol 55: 222-231.
104 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Watterstrom W (1980a) Chapter 17: Plant remains. In Whitcomb, D.S. & Johnson, J.H. (eds.), Quseir al Qadim 1980: 355-377. American Research Center in Egypt Reports. Watterstrom W (1980b) Predynastic agriculture in Upper Egypt: A note on palaeoethnobotanical studies in the Nagada/Khattara region. Bulletin de T Association Internationale pour I' Etude de la Prehistoire Egyptienne 2: 20-32. Watterstrom W (1984) The plant remains. In Lacovara, P. (ed) Arcehoelogical investigation at El-Hibeh. Preliminary report, ARCE Reports 9: 50-75. Undena publication, Malibu. Watterstrom W (1986) Ecology and agricultural intensification in Predynastic Egypt. National Science Foundation Final Project Form 98A. Award No: BNS-84-18811. Nation. Scienc. Found. Washington D.C. 20550. Waugh R, McLean K, Flavell AJ, Pearce SR, Kumar A, Thomas BB, Powell W (1997) Genetic distribution of BARE-1-like retrotransposable elements in the barley genome revealed by sequence-specific amplification polymorphisms (S-SAP). Mol Gen Genet 253: 687-694. Wayne RK, Leonard JA, Cooper A (1999) Full of sound and fury: the recent history of ancient DNA. Annual Review of Ecology and Systematics 30: 457–477. Weber APM, KL Weber, K Carr, C Wilkerson, JB Ohlrogge (2007) Sampling the Arabidopsis Transcriptome with Massively Parallel Pyrosequencing. Plant Physiology 144: 32-42. Weber I (1990) Informativeness of human (dC-dA)n (dG-dT)n polymorphisms. Genomics 7:524-530. Weber JL, C Wong (1993) Mutation of human short tandem repeats. Hum. Mol. Genet. 2: 1123–1128. Weber JL, May PE (1989) Abundant class of human DNA polymorhisms which can be typed using the polymerare chain reaction. Am J Hum Genet 44:388-396. Weining S, Langridge P (1991) Identification and mapping of polymorphisms in cereals based on the polymerase chain reaction. Theor Appl Genet 82:209-216. Weising K, J Ramser, D Kaemmer, G Kahl, JT Epplen (1991) Oligonucleotide fingerprinting in plants and fungi, in DNA Fingerprinting: Approaches and Applications.Burke T, G Dolf, AJ Jeffreys, R Wolf (eds) pp. 312-319. Welsh J, M McClelland (1990) Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res 18:7213-7218. Went FW (1928) "Wuchsstoff und Wachstum". Rec. Trav. Bot. Neerland. 24:1-116. Westman AL, Kresovich S (1998) The potential for cross-taxa simple-sequence repeat (SSR) amplification between Arabidopsis thaliana L. and crop brassicas. Theor Appl Genet 96: 272-281. Whitaker TW, GN Davis (1962) Cucurbits: botany, cultivation and utilization. Leonard Hill Ltd, London. White JC, Gorman C (2004) Patterns in "amorphous" industries: The Hoabinhian viewed through a lithic reduction sequence. IN Paz, V. (ed) Southeast Asian archaeology: Wilhelm G. Solheim II Festschrift University of the Philippines Press, Quezon City. pp. 411-441. Wicker T, B Keller (2007) Genome-wide comparative analysis of copia retrotransposons in Triticeae, rice, and Arabidopsis reveals conserved ancient evolutionary lineages and distinct dynamics of individual copia families. Genome Research 17:1072-1081. Willcox G (1991) Carbonised plant remains from Shortughai, Afghanistan. In: Renfrew J (ed.), New light on early farming. Recent Developments in Palaeoetnobotany, Edinburgh, 277-279. Willerding U von, Wolf G (1990) Palao-ethnobotanische Untersuchungen von Pflanzenresten aus dem 1. Jahrtausend v. Chr. von Elephantine. M.D.A.I.K. 46: 263-267. Willerslev E, Hansen AJ, Binladen J, Brand TB, Gilbert MTP, Shapiro B, Bunce M, Wiuf C, Gilichinsky DA, Cooper A (2003) Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science 300: 791–795. Willerslev E, Hansen AJ, Poinar HN (2004) Isolation of nucleic acids and cultures from fossil ice and permafrost. Trends in Ecology and Evolution 19: 141–147. Williams JGK, Kubelik AR, Rafalski KJ, Tingey SV (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res 18:6531-6535. Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KHS (1997): Viable Offspring Derived from Fetal and Adult Mammalian Cells. Nature 385:810-813. Witte C, Panaud O (2005) LTR retrotransposons and flowering plant genome size: emergence of the increase/decrease model. Cytogenet Genome Res 110: 91–107. Witte CP, Le QH, Bureau T, Kumar A (2001) Terminal-repeat retrotransposons in miniature (TRIM) are involved in restructuring plant genomes. Proc Natl Acad Sci USA 98: 13778–13783. Wolfe AP, MA Matzke (1999) Epigenetics: Regulation Through Repression. Science 286:481- 486. Woodward SR, Weyand NJ, Bunnell M (1994) DNA-Sequence from Cretaceous Period Bone Fragments. Science 266: 1229-1232. Wyman AR, White R (1980). A highly polymorphic locus in human DNA. Proc Natl Acad Sci USA 77:6754-6758. Xiao J, X Xin, X Luan, D Wei, S Yang (2006) A modified simple RFLP-PCR method for single nucleotide polymorphism (SNP) typing. Genet Mol Biol, 29:562-565. Yang G, YH Lee YH, Y Jiang, SP Kumpatla, TC Hall (2005) Organization, not duplication, triggers silencing in a complex transgene locus in rice. Plant Mol Biol 58:351-66.
105 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 5. Irodalomjegyzék
Yang H (1997) Ancient DNA from Pleistocene fossils: preservation, recovery, and utility of ancient genetic information for quaternary research. Quaternary Science Reviews 16: 1145–1161. Yoder JA, Bestor TH (1996) Genetic analysis of genomic methylation patterns in plants and mammals. Biol Chem. 377: 605–610. Yoder JA, Walsh CP, Bestor TH (1997) Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites. Trends Genet 13:335-340. Yu YS (1977) Han. In: KC Chang (Ed) Food in Chinese culture: anthropological and historical perspectives. pp. 53-84. Yale Univ Press, New Haven, USA. Zamir D, Navot N, Rudich J (1984) Enzyme polymorphism in Citrullus lanatus and C. colocynthis in Israel and Sinai. Plant Syst Evol 146: 163- 170. Zardo G, S Marenzi, M Perilli, P Caiafa (1999) Inhibition of poly(ADP-ribosyl)ation introduces an anomalous methylation pattern in transfected foreign DNA. The FASEB Journal 13:1518-1522. Zatykó Lné (1967) Virágzás- és temékenyülés biológiai vizsgálatok sárgadinnyén. Doktoti Disszertáció, Kertészeti és Szőlészeti Főiskola, Budapest. Zeist W (1975) Preliminary report on the botany of Gomolava. J. Archaeol. Sci. 2: 315-325. Zeist W, GJ de Roller (1993) Plant remains from Maadi a Predynastic site in Lower Egypt. Vegetation History and Archaeobotany 2: 1-14 Zeven A, JMJ deWet (1982) Dictionary of cultivated plants and their regions of diversity. Centre for Agricultural Publishing and domestication Wageningen, Netherlands. Zhang X, Y Jiang (1990) Edible seed watermelons (Citrulluslanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai) in northwest China. Cucurbit Genet.Coop. Rpt. 13:40-42. Zhang L-B, MP Simmons, A Kocyan, SS Renner (2006) Phylogeny of the Cucurbitales based on DNA sequences of nine loci from three genomes: Implications for morphological and sexual system evolution. Molecular Phylogenetics and Evolution 39:305–322. Zhao A, B Kochert (1993) Phylogenetic distribution and genetic mapping of a (GGC), microsatellite from rice (Oryza sativa L.). Plant Mol Biol 21:607-614. Zhou Z, Miwa M, Hogetsu T (1999) Analysis of genetic structure of a Suillus grevillei population in a Larix kaempferi stand by polymorphism of inter-simple sequence repeat (ISSR). . New Phytol 144: 55–63. Ziegenhagen B, Guillemaut P, Scholz F (1993) A procedure for mini-preparations of genomic DNA from needles of silver fir (Abies alba Mill.). Plant Molecular Biology Reporter 11: 117–121. Ziegenhagen B, Liepelt S, Kuhlenkamp V, Fladung M (2003) Molecular identification of individual oak and fir trees from maternal tissues of their fruits or seeds. Trees 17: 345–350. Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D (1994) Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20: 176-183. Zischler H, Geisert H, von Haeseler A, Pääbo S (1995a) A nuclear 'fossil' of the mitochondrial D-loop and the origin of modern humans. Nature 378:489-492. Zischler H, Hoss M, Handt O, von Haeseler A, Vanderkuyl AC, Goudsmit J, Pääbo S (1995b) Detecting Dinosaur DNA. Science 268: 1192- 1193. Zohary D, M Hopf (1993) Domestication of plants in the old World - The origin and spread of cultivated plants in West Asia, Europe, and the Nile Valley. Clarendon Press, Oxford. Zohary D, M Hopf (2000) Domestication of Plants in the Old World, 3. kiadás. Oxford: University Press, ISBN 0-19-850356-3. Zsoldos F, Vashegyi Á, Pécsváradi A, Bóna L (2003) Influence of silicon on aluminium toxicity in common wheat and durum wheat. Agronomie 23: 349-354.
106 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 6. Az értekezés alapjául szolgáló közlemények
6. Az értekezés alapjául szolgáló (1993, CSc után megjelent) közlemények
(a) Könyv
1. Gyulai G (ed) (2011) Plant Archaeogenetics. Nova Science Publisher Inc. New York, USA. ISBN 978-1-61122- 644-7 (in press). 2. Gyulai G (2010) Természetvédelmi genetika. Egyetemi Jegyzet. SzIE MKK KTI, pp. 203 ISBN 978-963-269-187- 7 (in press).
(b) Könyvfejezetek
3. Gyulai G, L Murenyetz, VL Stakhov, ZsG Gyulai, SG Yashina, SV Gubin (2011a). Morphogenetics of Silene stenophylla seeds from permafrost of the late Pleistocene (30,000 bp). In. Plant Archaeogenetics. Ed. by G Gyulai. Chapter 1. Nova Sci Publisher Inc., New York, USA. pp. (in press) ISBN 978-1-61122-644-7. 4. Gyulai G, RP Malone, L Heszky, L Waters Jr., E Kiss (2011b) Morphogenetics of grape (Vitis vinifera) seeds from Antiquity (3rd cent ce) and the Middle Ages of Hungary (11th to 15th cent ce) - A morphological reconstruction. In. Plant Archaeogenetics. Ed. by G Gyulai. Chapter 5. Nova Sci Publisher Inc., New York, USA. pp. (in press). ISBN 978-1-61122-644-7. 5. Gyulai G, MO Humphreys, R Lágler (2011c) aDNA extraction and molecular analysis from seed remains of ancient common millets (Panicum miliaceum) (4th and 15th cent). Ed. by G Gyulai. Chapter 6. Nova Sci Publisher Inc., New York, USA. pp. (in press). ISBN 978-1-61122-644-7. 6. Gyulai G, Z Tóth, A Bittsánszky (2011d) Medieval Citrullus DNAs - unlocking domestication events (13th and 15th cent). In. Plant Archaeogenetics. Ed. by G Gyulai. Chapter 7. Nova Sci Publisher Inc., New York, USA. pp. (in press). ISBN 978-1-61122-644-7. 7. Gyulai G, Z Szabó, O Törjék (2011e) Genetical and morphological reconstruction of medieval melon (Cucumis melo) (15th cent). In. Plant Archaeogenetics. Ed. by G Gyulai. Chapter 8. Nova Sci Publisher Inc., New York, USA. pp. (in press). ISBN 978-1-61122-644-7. 8. Gyulai G, R Láposi, H Rennenberg, A Veres, C Herschbach, Gy Fábián, L Waters Jr (2011f) Conservation genetics (1710 – 2010) - Cloning of living fossils: Micropropagation of the oldest Hungarian black locust tree (Robinia pseudoacacia) planted in 1710 (Bábolna, Hungary). In. Plant Archaeogenetics. Ed. by G Gyulai. Chapter 10. Nova Sci Publisher Inc., New York, USA. pp. (in press). ISBN 978-1-61122-644-7. 9. Gyulai G, Kiss E, Heszky L (2004) Az árpa biotechnológiája. in Magyarország kultúrflórája. VIII/14. pp. 274- 289. (eds.) L. Tomcsányi, G Turcsányi. Az árpa - Hordeum vulgare L., Akadémiai Kiadó, Budapest. ISBN 963 05 8100 0. 10. Gyulai G, E Kiss, LE Heszky (1993) A repce biotechnológiája. in Magyarország Kultúrflórája. VI. ed. Szabó L. Az olajrepce - Brassica napus. pp. 56-62. Akadémiai Kiadó, Budapest. ISBN. 963 05 6591 9. 11. Gyulai G, L Murenyetz, J Janovszky, M Tárczi, I Rácz (1995) Initiation of monocot plant development In vitro for studying plant-microbe interaction. In Azospirillum VI. and related microorganizms. ed. I. Fendrik et al. NATO ASI Series, Vol G37. pp. 155-159. Springer-V Belrin Heidelberg. ISBN 3-540-60107-4. 12. Kiss E, Gyulai G, Heszky L (2004) Az árpa genetikája. in Magyarország kultúrflórája. VIII./14. pp. 256-273. (eds.) L. Tomcsányi, G Turcsányi. Az árpa - Hordeum vulgare L., Akadémiai Kiadó, Budapest. ISBN 963 05 8100 0. 13. Jekkel Z, G Gyulai, LE Heszky (1995) Cryopreservation of some halophyte grasses (Puccinellia species). In. Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 32., Cryopreservation of plant germplasm I. ed. Y.S.P. Bajaj, Springer V, Berlin-New York, pp. 245-255. 14. Jekkel Zs, J Kiss, G Gyulai, E Kiss, L Heszky (2002) Cryopreservation of horse chestnut (Aesculus hippocastanum L). in. Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol.50., Cryopreservation of plant germplasm II. ed. Y.S.P. Bajaj, Springer V, Berlin-New York, pp.192-212. ISBN. 978-354057-451-4.
(c) IF közlemények
15. Gyulai G, M Humphreys, R Lagler, Z Szabó, Z Tóth, A Bittsánszky, F Gyulai and L Heszky (2006) Seed remains of common millet from the 4th (Mongolia) and 15th (Hungary) centuries; AFLP, SSR, and mtDNA sequence recoveries. Seed Science Research 16:179-191. (IF: 1.892) 16. Gyulai G, M. Humphreys, A. Bittsánszky, K. Skøt, J. Kiss, L. Skøt, G. Gullner, S. Heywood, Z. Szabó, A. Lovatt, L. Radimszky, H. Roderick, M. Abberton, H. Rennenberg, T. Kőmíves, L. Heszky (2005) AFLP analysis and improved phytoextraction capacity of transgenic gshI-poplar clones (Populus canescens L.) in vitro. Z. Naturfroschung 60c (3/4), 300-306. (IF: 0,798) 17. Gyulai G, Z Mester, J Kiss, Szemán L, Heszky L, A Idnurm (2003) Somaclone breeding of reed canarygrass (Phalaris arundinacea L). Grass and Forage Sciences 58:210-215. (IF: 0.618) 18. Gyulai G, Gémesné JA, Zs Sági, G Venczel, P Pintér, Z Kristóf, O Törjék, L Heszky, S Bottka, J Kiss, L Zatykó (2000) Doubled haploid development and PCR-analysis of F1 hybrid derived DH-R2 paprika (Capsicum annuum L.) lines. J Plant Physiol 156:168-174. (IF: 2,239)
107 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 6. Az értekezés alapjául szolgáló közlemények
19. Gyulai G, Z Jekkel, E Kiss, J Kiss, L E Heszky (1995) A selective auxin and cytokinin bioassay based on root and shoot formation in vitro. J Plant Physiol 145: 379-382. (IF: 2,239) 20. Gyulai G, E Kiss, A Csillag, LE Heszky (1993) Developmental analysis of primary and secondary somatic embryogenesis in soybean tissue culture. Acta Biol Hung 44:189-196. (IF: 0,636) 21. Szabó, Z., Gyulai G, M. Humphreys, L. Horváth, A. Bittsánszky, R. Lágler, L. Heszky (2005) Genetic variation of melon (C. melo) compared to an extinct landrace from the Middle Ages (Hungary) I. rDNA, SSR and SNP analysis of 47 cultivars. Euphytica, 146, 87-94. (IF: 1,05) 22. Lágler R, Gyulai G, M Humphreys, Z Szabó, L Horváth, A Bittsánszky, J Kiss, L Holly, L Heszky (2005) Morphological and molecular analysis of common millet (P. miliaceum) cultivars compared to an aDNA sample from the 15th century (Hungary). Euphytica, 146, 77-85. (IF: 1,05) 23. Gullner G, Gyulai G, A Bittsánszky, J Kiss, L Heszky, T Komíves (2005) Enhanced inducibility of glutathione S-transferase activity by paraquat in poplar leaf discs in the presence of surcose. Phyton, 45 (3):39-44. (IF: 0,348) 24. Jekkel Zs, Gyulai G, J Kiss, E Kiss, L Heszky (1998) Cryopreservation of horse-chestnut (Aesculus hippocastanum L.) somatic embryos using three different freezing methods. Plant Cell Tissue Organ Cult 52:193-197. (IF: 1.028) 25. Toldi O, Gyulai G, J Kiss, IA Tamás, E Balázs (1996) Antiauxin enhanced microshoot initiation and plant regeneration from epicotyl-oroginated thin-layer explants of sugarbeet (Beta vulgaris L.). Plant Cell Rep 15:851-854. (IF: 2,173) 26. Toldi O, Gyulai G, E Preininger, É Várallyay, M Fári (1994) Minibeet initiation of derooted sugarbeet (Beta vulgaris L.) seedlings in vitro. Plant Sci 94:217-224. (IF: 1.795) 27. Tárczy HM, Gyulai G, J Janovszky, E Kiss, LE Heszky (1996): Cytogenetic instability among the vegetative progenies of A. repens cv. Purdue somaclones. Cereal Res Comm 24:267-273. (IF: 0.320) 28. Purnhauser L, Gyulai G (1993) The effect of copper on the shoot and root regeneration in wheat, triticale, rape and tobacco tissue cultures. Plant Cell Tissue Organ Cult 35:131-139. (IF: 1,113) 29. Kiss E, J Kiss, Gyulai G, LE Heszky (1994) A novel method for rapid micropropagation of pineapple. Hort Sci 30:127-129. (IF: 0.794) 30. Bittsánszky A, Gyulai G, M Humphreys, Gullner G, Csintalan Z, Kiss J, Szabó Z, Lágler R., Tóth Z, H Rennenberg, Heszky L, Kőmíves T (2006) RT-PCR analysis and stress response capacity of transgenic gshI-Poplar clones (Populus × canescens) in response to paraquat exposure. Z. Naturforschung, 61c: 699- 703. (IF: 0,798) 31. Mázik TK, L Lelley, Gyulai G, E Kiss, L Heszky (1997) Meiotic and RAPD analysis of a new genotype of Agropyron repens L. Cereal Res Comm 25:127-133. (IF: 0.320) 32. Bayar K, O Törjék, E Kiss, Gyulai G, L Heszky (2002) Intra and interspecific molecular polymorphism of thrips species. Acta Biol Hung 53:317-324. (IF: 0,636) 33. Bittsánszky A, T Kőmíves, G Gullner, Gyulai G, J. Kiss, L. Heszky, L. Radimszky, H. Rennenberg (2005) Ability of transgenic poplars with elevated glutathione content to tolerate Zinc (2+) stress. Environment International 31: 251-254. (IF: 2.856) 34. Törjék O, E Kiss, J Kiss, M Kondrák, Gyulai G, J Gergácz, L Heszky (2001) Evaluation of genetic diversity of poplar genotypes by RAPD and AP-PCR analysis. Acta Biol Hung 52:345-354. (IF: 0,636) 35. Kiss J, M Kondrák, O Törjék, E Kiss, Gyulai G, K Mázik-Tőkei, L Heszky (2001) Morphological and RAPD analysis of poplar trees of anther culture origin. Euphytica 118:213-221. (IF: 1,05)
(d) IF-el nem rendelkező közlemények
36. Gyulai G (2007) DHAC-indukált DNS-demetiláció és transzgén-reaktiváció gshI-transzformáns szürkenyár (Populus x canescens) klónokban; génkompetíció qRT-PCR elemzése. Agrártudományi Közlemények 27: 78-83. 37. Gyulai G, JA Gémesné, Zs Sági, L Zatykó, L Heszky, G Venczel (1999) PCR analysis of F1 hybrid derived DH pepper lines. Capsicum and Eggplant Newsletters 18: 40-43. 38. Gyulai G, E Kiss, J Kiss, LE Heszky (1993) Hormone-Selective Bioassay for Auxins and Cytokinins in vitro. Hung Agric Res 2:13-17. 39. Tóth Z, Gyulai G, Horváth L, Szabó Z, Heszky L (2007) Mikroszatellita lokuszok evolúciója a görögdinnyében (Citrullus lanatus) a középkor óta; (CT)3 deléció a (CT)26 nSSR-ban. Agrártudományi Közlemények 27: 125-134. 40. Nagy E, Gyulai G, Z Szabó, Z Hegyi, L Cs Marton (2003) Application of morphological descriptions and genetic markers to analyse polymorphism and genetic relationships in maize (Zea mays L). Acta Agron Hung 51:257-265. 41. Nagy E, Gyulai G, Cs L Márton (2000) Kukorica beltenyésztett törzsek jellemzése genetikai markerekkel. Növénytermelés 49:587-597. 42. Szabó Z, Gyulai G, Tóth Z, Heszky L (2007) A sárgadinnye (Cucumis melo) sejtmagi mikroszatelita lokuszainak evolúciója a középkor óta. Agrártudományi Közlemények 27: 120-124.
108 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 6. Az értekezés alapjául szolgáló közlemények
43. Szabó Z, Gyulai G, L Horváth, A Bittsánszky, Sz Szani, R Lágler, J Kiss, F Gyulai, L Holly and L Heszky (2005) Genetic diversity of Hungarian melon landraces (C. melo) compared to an extinct sample from the Middle Ages. Hung Agric Res 2005/2:18-22. 44. Lágler R, Gyulai G, Tóth Z, Szabó Z, Horváth L, Heszky L (2007) A köles (Panicum miliaceum) SSR- és ISSR szekvencia-stabilitása a középkortól napjainkig. Agrártudományi Közlemények 27: 10-19. 45. Lágler R, Gyulai G, Z Szabó, Z Tóth, A Bittsánszky, L Horváth, J Kiss, F Gyulai, L Heszky (2006) Molecular diversity of common millet (P. miliaceum) compared to archaeological samples excavated from the 4th and 15th centuries. Hung Agric Res 2006/1:14-19. 46. Horváth L, Gyulai G, Szabó Z, Tóth Z, Heszky L (2007) Morfológiai diverzitás sárgadinnyében (Cucumis melo); egy középkori típus fajtarekonstrukciója. Agrártudományi Közlemények 27: 84-90. 47. Bittsánszky A, Gyulai G, Kiss J, Gullner G, Heszky L, Kőmíves T (2007) Feketenyár (Populus nigra) gametoklónok mikroszatellita diverzitása; (TTCTGG)5 deléció a WPMS-20 lokuszon. Agrártudományi Közlemények 27: 60-67. 48. Bittsánszky A, Gyulai G, L Gajdos, Z Szabó, JA Gémesné, J Kiss, R Lagler, L Heszky (2006) Genotype identification of onion (Allium cepa L) cultivars. Acta Hort. 725:699-702. 49. Bittsánszky A, Gyulai G, RP Malone, G Gullner, J Kiss, M Czakó, P Lehoczky, L Márton, L Heszky, T Kőmíves (2007) Triggering of a plant molecular defense mechanism; gene expression levels of transgene gshI and poplar gene gsh1 (Populus x canescens) in response to the DNA demethylating drug DHAC – an qRT-PCR analysis. Acta Phytopathol Entomol Hung 42:235-243. 50. Bittsánszky A, Gyulai G, G Gullnerm, J. Kiss, Zs Csintalan, Z Szabó, R Lágler, T Kőmíves (2005) Stress tolerance and in vitro phytoremediation of poplar (Populus). Hung Agric Res 2005/1:13-15. 51. Kiss J, O Törjék, A Bittsánszky, Gyulai G, K Mázik-Tökei, E Kiss, LE Heszky (2003) Analysis of phenotypic and molecular characteristics of anther culture derived poplar trees. Bull. St Stephanus University 2003: 15- 27. 52. Sharma H, Francki M, Crasta O, Gyulai G, Bucholtz D, Ohm H, Anderson J, Perry K, and Patterson F. (1999) Cytological and molecular characterization of wheat lines with Thinopyrum intermedium chromosome additions, substitutions and translocations resistant to barley yellow dwarf virus. Cytologia 64:93-100. 53. Hangyelné TM, J Janovszky, E Kiss, Gyulai G (1996): Szomaklónális kromoszóma variabilitás jellemzése az Agropyron cv. szomaklónok vegetativ utódaiban. Növénytemelés 45:109-115. 54. Gémesné JA, M Petus, G Venczel, L Zatykó, Gyulai G, M Cséplő (2001) Genetic variability of anther donor versus spontaneous doubled haploid descendents and colchicine induced doubled haploid sweet pepper (Capsicum annuum L.) lines. Acta Hort 560:149-152.
(e) Konferenciakötet (nemzetközi)
55. Gyulai G, Bittsánszky A, Gullner G, Tóth Z, Kiss J, Kátay Gy, Szabó Z, Kőmíves T, Heszky L (2008) A gst gén DNS-demetilált overexpressziója a szürkenyár (Populus x canescens) fitoremediációs kapacitásának növelésére. szerk. Simon L. Talajvédelem pp. 243-250. ISSN: 1216-9560; ISBN: 978-963-9909-03-8. 56. Gyulai G, M Humphreys, A Bittsánszky, K Skøt, J Kiss, L Skøt, G Gullner, S Heywood, Z Szabó, A Lovatt, L Radimszky, H Roderick, M Abberton, R Lagler, H Rennenberg, T Komives, L Heszky (2004) Clonal propagation and improved phytoextraction activity of gshIpoplar clones (Populus canescens) in vitro. In: J Vollmann, H. Grausgruber, P. Ruckenbauer (Eds) Genetic variation for plant breeding, pp.279-283. The 17th Eucarpia General Meeting, 8-11, September, Tulln, Austria, ISBN 3-900962-56-1. 57. Gyulai G, K Bayar, O Törjék, E Kiss, J Kiss, Z Szabó, L Heszky (2001) Molecular polymorphism among populations of Frankliniella intonsa. Thrips and Tospoviruses Proceedings of the 7th International Symposium on Thysanoptera. pp.373-375. 58. Gyulai G, L Szemán, A Idnurm, L Heszky, J Janovszky (2000) Fibre content analysis of reed canary grass (Phalaris arundinacea L.) somaclones. In. Soegaard K et al. (eds) Grassland Science in Europe, EGF, Vol.5, pp. 244-246. ISBN 8788976459 59. Gyulai G (1999) Biotechnológiai növénynemesítés, biológiai alapok. In. Training for EU Accession to the Hungarian Agroadministration, TEMPUS 13321-98. Chapter IV. pp.1-34. 60. Gyulai G, I Dweikat, J Janovszky, H Ohm, E Kiss, H Sharma, LE Heszky (1997) Application of ISSR/SSR-PCR for genome analysis of Agropyron, Bromus, and Agropyron x Bromus. In: Z.Staszewski, W Mlyniec, R Osinski (eds) Ecological aspects of breeding fodder crops and amenity grasses, PBAI, Radzikow, Poland, pp.306-312. 61. Gyulai G, I Dweikat, J Janovszky, H Ohm, E Kiss, H Sharma, LE Heszky (1997) Application of ISSR/SSR-PCR for genome analysis of Agropyron, Bromus, and Agropyron x Bromus. In: Z.Staszewski, W Mlyniec, R Osinski (eds) Ecological aspects of breeding fodder crops and amenity grasses, Proceedings of the 20th Eucarpia Section Meeting. PBAI, Radzikow, Poland, pp.306-312. 62. Gyulai G, H Ohm, I Dweikat, H Sharma, J Janovszky, L Heszky (1997) SSR and RAPD analysis of a new Agropyron repens genotype. 18th Int Grassland Congress, Winnipeg, Canada, pp 4/69 - 70. 63. Gyulai G, S Bottka, J Marticsek, G Baskay, E Kiss, J Janovszky, O Gyulavári, L Heszky (1997) SSR-PCR analysis of lignin-deficient maize muntant of SzV-293/bmr-1. Application of Marker Aided selection in Cereal
109 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 6. Az értekezés alapjául szolgáló közlemények
Breeding Programs. Book of Abstarcts, EUCARPIA - Section Cereals Meeting, Sept.22-23, eds. H Buersimayer, P Ruckenbauer, pp. 77-79. Tulln, Austria. 64. Gyulai G, M Strnad, E Kiss, IA Tamas, LE Heszky (1996) Plant growth regulators: auxins and cytokinins. The 2nd Brazilian-Hungarian Seminar and Training Course in Plant Biotechnology, Budapest, Hungary, pp.51-63. 65. Gyulai G, L Murenyetz, J Janowszky, TM Hangyel, E Kiss, RI Szabó, LE Heszky (1996) Somatic embryogenesis of monocot and dicot plants. The 2nd Brazilian-Hungarian Seminar and Training Course in Plant Biotechnology, Budapest, Hungary, pp.64-78. 66. Gyulai G, L. Murenyetz J Janovszky, MH Tárczi, M. Tőkei, LE Heszky (1994) Monocot plant biotechnology in higher education. In. Proceedeings of second European conference on higher education in Agriculture, ed. Ángyán et al., Gödöllő, pp. 383-386. 67. Tóth Z, Gyulai G, Kenéz Á, Szabó Z, Bittsánszky A, Lágler R, Gyulai F, Horváth L, Heszky L (2009) Molekuláris domesztikáció a Citrullus nemzetségben az ITS (ITS1-5.8s-ITS2), nSSR, SNP (lycb) és cpDNS (ycf9-orf62; trnval-rps12) lokuszokon. Hagyomány és haladás a növénynemesítésben. XV. Növéynenmesítési Tudományos Napok, Budapest, ISBN: 978-963-508-575-0, pp. 507-511. 68. Bittsánszky A, Gyulai G, Gullner G, Tóth Z, Kiss J, Szabó Z, Heszky L, Kőmíves T (2009) Paraquat-toleráns nyárfa in vitro szelekciója és molekuláris jellemzése. Hagyomány és haladás a növénynemesítésben. XV. Növéynenmesítési Tudományos Napok, Budapest, ISBN: 978-963-508-575-0, pp. 31-35. 69. Kenéz Á, Gyulai G, Tóth Z, Szabó Z, Lágler R, Heszky L, Gyulai F (2009) Római Kori (Keszthely-Fenékpuszta, (5. Sz.) Növényleletek Azonosítása: I. Egyszikűek. Hagyomány és haladás a növénynemesítésben. XV. Növényenmesítési Tudományos Napok, Budapest, ISBN: 978-963-508-575-0, pp. 233-237. 70. Bittsánszky A, Gyulai G, Gullner G, Tóth Z, Kiss J, Szabó Z, Kátay Gy, Heszky L, Kőmíves T (2008) Metilviologén (paraquat) toleráns nyárfaklónok (Populus x canescens) szelekciója és alkalmazása fitoremediációban. szerk. Simon L. Talajvédelem pp. 201-208. ISSN: 1216-9560; ISBN: 978-963-9909-03- 8. 71. Bittsánszky A, Gyulai G, Kátay G, Gullner G, Kiss J, Heszky L, Kőmíves T (2008) Paraquat tolerant poplar clones (Populus x canescens) selected in vitro. 4th European Bioremediation Conference, e-proceedings ID 025, 3-6 September, Chania, Crete, Greece, ISBN 978-9608475-12-0. 72. Tóth Z, G Gyulai, Z Szabó, F Gyulai, L Heszky (2008) New Citrullus haplotypes at the tRNA-Val – rps12 locus of cpDNA. In: Cucurbitaceae 2008, Proceedings of the IXth EUCARPIA meeting on genetics and breeding of Cucurbitaceae (Pitrat M, ed), INRA, Avignon (France), May 21-24th, pp.335-340. 73. Szabó Z, G Gyulai, Z Tóth, L Heszky (2008) Morphological and molecular diversity of 47 melon (Cucumis melo) cultivars compared to an extinct landrace excavated from the 15th Century. In: Cucurbitaceae 2008, Proceedings of the IXth EUCARPIA meeting on genetics and breeding of Cucurbitaceae (Pitrat M, ed), INRA, Avignon (France), May 21-24th, pp.313-321. 74. Szabó Z, G Gyulai, Z Tóth, A Bittsánszky, L Heszky (2008) Sequence diversity at the loci of nuclear SSRs and ITS1-5.8S-ITS2 of rDNA of 47 melon (Cucumis melo) cultivars and an extinct landrace excavated from the 15th century. General Meeting EUCARPIA, Valencia, Spain, pp. 244-249. 75. Tóth Z, G Gyulai, Z Szabó, A Bittsánszky, L Heszky (2008) Genotype (nSSR) and haplotype (cpDNA) identification in watermelons (Citrullus l. lanatus). General Meeting EUCARPIA, Valencia, Spain, pp. 253-257. 76. Tóth Z, G Gyulai, Z Szabó, L Heszky (2008) Az nSSR és cpDNS lokuszok evolúciója a görögdinnyében (Citrullus lanatus). 4dik Erdei Ferenc Tud Konf., Kecskemét, aug.27-28. (ed Ferenc Á.), II. kötet pp.866- 870. 77. Szabó Z, Gyulai G, M Humphreys, A Bittsánszky, F Gyulai, R Lagler, J Kiss1, L Horvath, L Heszky (2004) aDNA analysis of cantaloupe (Cucumis melo L) from the Middle Ages compared to modern varieties. In: J Vollmann, H. Grausgruber, P. Ruckenbauer (Eds) Genetic variation for plant breeding, pp.97-101. The 17th Eucarpia General Meeting, 8-11, September, Tulln, Austria, ISBN 3-900962-56-1. 78. Lagler R, Gyulai G, M Humphreys, Z Szabó, S Heywood, F Gyulai, L Skøt, L Horvath, K Skøt, A Lovatt, H Roderick, M Abberton, L Heszky (2004) DNA recovery and AFLP analysis of common millet (Panicum miliaceum L.) from the 4th and 15th centuries compared to a current variety ‘Topaz’. In: J Vollmann, H. Grausgruber, P. Ruckenbauer (Eds) Genetic variation for plant breeding, pp. 63-66. In: J Vollmann, H. Grausgruber, P. Ruckenbauer (Eds) Genetic variation for plant breeding, pp.279-283. The 17th Eucarpia General Meeting, 8-11, Sept, Tulln, Austria, ISBN 3-900962-56-1. 79. Nagy E, Gyulai G, C Marton (2000) Use of genetic markers in maize breeding. In. Barnabás B et al. (eds). 50th Anniversary of the Agricultural Research Institute of MTA Martonvásár, Scientific Meeting, June 2-3, 1999, pp135-139. 80. Kiss E, Gyulai G, I Szabó, J Kiss, LE Heszky (1994) In vitroplant differentiation: a model system for laboratory practice. In. Proceedeings of second European conference on higher education in Agriculture, ed. Ángyán et al., Gödöllő, pp. 391-394. 81. Rady F, Gyulai G, E Kiss, N Bucherna, S Radi, LE Heszky (1997) RFLP, RAPD, and SSR-PCR analysis of root selected maize lines and hybrids. Application of Marker Aided selection in Cereal Breeding Programs. Book of Abstarcts, EUCARPIA - Section Cereals Meeting, Sept.22-23, eds. H Buersimayer, P Ruckenbauer, pp. 75- 76. Tulln, Austria.
110 Gyulai G (2010) MTA Doktori Értekezés 6. Az értekezés alapjául szolgáló közlemények
82. Mester Z, Gyulai G, J Janowszky, TM Hangyel, M Tar, S Bottka, L Heszky (1998) Development and genetic analysis of new somaclones of Reed Canarygrass (Phalarais arundinacea L). In: Nagy G, K Pető (eds) Grassland Science in Europe, EGF, Vol.3. pp. 791-794. ISBN 963-7177-82-5. 83. Janowszky J, Gyulai G, Zs Mester, M Tar, Gy Baskay, TM Hangyel, Zs Jenei, S Bottka, L Heszky (1998) Genetic analysis and somaclone development of Tall Fescue (Festuca arundinacea L). ). In: Nagy G, K Pető (eds) Grassland Science in Europe, EGF. Vol.3. pp. 737-739. 84. Purnhauser L, Gyulai G, Tar M, Csösz M, Mesterházy A, Heszky L (2000): Use of Molecular Markers in Wheat Breeding for Disease Resistance. In: Hrazdina G. (ed.): Use of Agriculturally Important Genes in Biotechnology, pp.52-57. IOS Press (NATO Science Series) Amsterdam, Berlin, Oxford, Tokyo, Washington, DC). 85. Gémesné JA, Gyulai G, M Petus, G Venczel, Zs Sági, L Zatykó (2000) DH-breeding of sweet pepper (Capsicum annuum L.). Biotechnological approaches for utilization of gametic cells.(ed. B. Bohanec). COST Action 824, pp.157-159. ISBN 92-894-0225-3. 86. Bittsánszky A, Gyulai G, M Humphreys, J Kiss, Zs Csintalan, R Lagler, Z Szabó, G Gullner, H Rennenberg, T Komives, L Heszky (2004) Stress capacity and RT-PCR analysis of transgenic gshIpoplar clones (P. canescens) in response to paraquat exposure. In: J Vollmann, H. Grausgruber, P. Ruckenbauer (Eds) Genetic variation for plant breeding, pp.273-277. The 17th Eucarpia General Meeting, 8-11, September, Tulln, Austria, ISBN 3-900962-56-1. 87. Kiss E, O Törjék, Gyulai G, Z Kertész, J Pauk, S Bottka, LE Heszky (1997) Comparison of doubled haploid wheat lines by RAPD and SSR analysis. Application of Marker Aided selection in Cereal Breeding Programs. Book of Abstarcts, EUCARPIA - Section Cereals Meeting, Sept.22-23, eds. H Buersimayer, P Ruckenbauer, pp. 46. Tulln, Austria. 88. Heszky L, Kiss J, Gyulai G, Kiss E, H-Novák M, T-Lőkös K, M-Tőkei K, Jekkel Zs (1996) Aspects of morphogenesis in tissue culture of crop plants. Bull. Univ. Agric.Sci., 1995/96, pp.71-82, Gödöllő. 89. Bayar K, O Törjék, E Kiss, Gyulai G, L Heszky (2001) Genetic variation within and among populations of Aeolothrips intermedius. Thrips and Tospoviruses Proceedings of the 7th International Symposium on Thysanoptera. pp.369-372. 90. Bittsánszky A, Kőmíves T, G Gullner, Gyulai G, J Kiss, Heszky L, L Radimszky, H Rennenberg (2003) Ability of transgenic poplars with elevated glutathione content to tolerate Zinc (2+) sterss. 2nd European Bioremediation Conference, Greece, Jun30-July4, pp. 349-352.
Összesítés
közlemények típusa # Σ IF a fokozat előtt a fokozat után 1 76% IF- közlemények 28 30,766 (7) 7,897 (21) 22,869 2 Könyv /fejezetek (x 1; 0,5) 11 4,500 0,000 4,500 3 24% Proceedengs (x 0,1; 0,2) 27 4,400 0,400 4,000 4 (max:50%) IF-nélküli lapok (x 0,1; 0,2) 23 3,700 1,300 2,400 5 Szabadalom 1 1,500 1,500 Σ 100% 90 44,866 11,097 33,769 (min:30,00) (min:20,00)
111 M E G H Í V Ó
Az MTA Doktori Tanácsa meghívja Önt
GYULAI GÁBOR
MTA doktora címre benyújtott
„Biotechnológia a növénynemesítési alapanyagok előállításában, a fitoremediációs fajok genetikai kontrolljában, és a kultúrnövények archeogenetikai stabilitásának meghatározásában” című doktori értekezésének 2009. március 18-án du. 14 órakor a Magyar Tudományos Akadémia Felolvasótermében (1051 Budapest, Roosevelt tér 9. I. em.) tartandó nyilvános vitájára.
Az Értekezés opponensei: A Bizottság tagjai: Bisztray György, Ph.D. Balázs Ervin, az MTA tagja, elnök Fári Miklós Gábor, az MTA doktora Mészáros Annamária, PhD, tikár Galiba Gábor, az MTA doktora Barnabás Beáta, az MTA l. tagja, biz. tag Gyurján István, az MTA doktora, biz. tag Marton L. Csaba, az MTA doktora, biz. tag Pauk János, az MTA doktora, biz. tag Raskó István, az MTA doktora, biz. tag
Az értekezés megtekinthető az MTA Könyvtárában (1051 Budapest, Arany János u. 1.). A nyilvános vitában minden jelenlévő részt vehet, és írásban előzetesen észrevételt is tehet.