Bacillus cereus spore formation, structure, and germination Ynte Piet de Vries Promotoren Prof. Dr. T. Abee Persoonlijk hoogleraar bij de leerstoelgroep Levensmiddelenmicrobiologie Wageningen Universiteit Prof. Dr. W. M. de Vos Hoogleraar Microbiologie Wageningen Universiteit Prof. Dr. Ir. M. H. Zwietering Hoogleraar Levensmiddelenmicrobiologie Wageningen Universiteit Promotiecommissie Prof. Dr. S. Brul Universiteit van Amsterdam Prof. Dr. Ir. A. J. M. Stams Wageningen Universiteit Dr. J. Sikkema Friesland Foods, Deventer Prof. Dr. G. W. Gould Voorheen Unilever Research, Bedford, UK. Dit onderzoek is uitgevoerd binnen de onderzoekschool VLAG Ynte Piet de Vries Bacillus cereus spore formation, structure, and germination Proefschrift ter verkrijging van de graad van doctor op gezag van de rector magnificus van Wageningen Universiteit Prof. Dr. M. J. Kropff in het openbaar te verdedigen op vrijdag 10 februari 2006 des namiddags te half twee in de Aula Y. P. de Vries – Bacillus cereus spore formation, structure, and germination – 2006 Thesis Wageningen University, Wageningen, the Netherlands – with summary in Frisian and Dutch – 128 p Keywords: Bacillus cereus / sporulation / spores / germination / food preservation ISBN: 90-8504-369-7 Voorwoord Eén van mijn leermeesters heeft een promotie-onderzoek wel eens vergeleken met een jungle-tocht. Je hoopt mooie dieren en planten tegen te komen maar je kunt ook in onaangename of zelfs gevaarlijke situaties verzeild raken. Met het gereed komen van zijn proefschrift rondt Ynte de Vries zijn jungle-tocht af. Een snelle blik op de inhoudsopgave en de lijst met publicaties leert dat de tocht een aantal mooie successen heeft opgeleverd. Wat je niet meteen uit de inhoud van het proefschrift kunt afleiden, is hoe moeizaam de tocht is verlopen. Het eerste deel van de tocht verliep voorspoedig. Cum laude afgestudeerd, eigenwijs en blakend van zelfvertrouwen begon Ynte in 2001 aan zijn promotie-onderzoek bij het Wageningen Centre for Food Sciences. Zijn ambitie: een doorbraak in het onderzoek naar de ontkieming van sporen. Onder supervisie van Marjon zette hij samen met Luc een nieuwe onderzoekslijn op. Maar het eerste jaar was amper voorbij of enkele forse tegenslagen dienden zich aan. De ESR- onderzoekslijn waar een half jaar tijd in was gaan zitten, bleek een doodlopende weg en werd beëindigd; drie WCFS-collega’s waaronder supervisor Marjon verlieten A&F; en de langdurige procedure om een nieuwe supervisor te vinden, leverde niet het verwachte resultaat op. Bovendien bleven de aanvankelijk beloofde B. cereus micro-arrays uit. Teleurgesteld over deze gang van zaken besloot Ynte zijn onderzoek deels bij de universiteit voort te zetten waar hij een betere ambiance voor het doen van onderzoek hoopte te vinden. Uiteindelijk bleek het gras bij de buren niet veel groener dan verwacht en was Ynte steeds vaker weer bij A&F te vinden – waar hij met nieuw elan proeven deed. De nauwere samenwerking met de collega’s bij de universiteit had een paar ideeën voor zijn onderzoek opgeleverd en nieuwe inzichten hebben ertoe geleid dat ook de ESR-lijn weer werd opgepakt. Zo brak er een nieuwe en beslissende fase aan in Ynte’s jungle-tocht. Naast een bijdrage aan onze kennis van sporen, sporulatie, en ontkieming heeft Ynte’s jungle-tocht nog een ander opmerkelijk resultaat opgeleverd: een andere, meer genuanceerde kijk op toepassingsgericht onderzoek. Hoewel Ynte het grootste deel van zijn promotie-onderzoek heeft uitgevoerd in een omgeving waar markt-gedreven, toepassingsgericht onderzoek domineert, heeft hij er in de beginfase geen geheim van gemaakt dat hij eigenlijk niet veel op had met dergelijk onderzoek. Dat ook zijn eigen onderzoek uiteindelijk bruikbare kennis zou moeten opleveren voor de bij WCFS aangesloten bedrijven, zag hij aanvankelijk niet zo zitten. Gaandeweg is er in die houding verandering gekomen – zozeer zelfs dat Ynte uiteindelijk een paar maanden geleden een baan heeft aanvaard bij Friesland Foods. Voor WCFS snijdt het mes daarmee aan twee kanten: WCFS heeft een uitstekend onderzoeker afgeleverd aan een van zijn industriële partners en het project Food Preservation & Safety heeft er een waardevolle expert voor teruggekregen. Roy Moezelaar Projectleider Food Preservation & Safety Wageningen Centre for Food Sciences Contents Abstract 3 Chapter 1 Introduction and outline of this thesis 5 Chapter 2 Growth and sporulation of Bacillus cereus ATCC14579 under defined 33 conditions: temporal expression of genes for key sigma factors Chapter 3 Influence of glutamate on growth, sporulation and spore properties of 47 Bacillus cereus ATCC14579 in a defined medium Chapter 4 Deletion of sigB in Bacillus cereus affects spore properties 59 Chapter 5 Water in the core of Bacillus spores is not in a glassy state: a spin-probe study 67 Chapter 6 Bacillus cereus spore germination quantified by flow-cytometry 85 Chapter 7 Germination capacity and heat resistance of spores from naturally occurring 93 Bacillus cereus strains Chapter 8 Summary, future perspectives and practical applicability of the research 103 described in this thesis Gearfetting 115 Samenvatting 119 List of publications 123 Dankwoord 125 Curriculum Vitae 127 1 2 Abstract Bacterial spores are differentiated cell types, specifically designed for the survival of adverse conditions. Their structure is highly unique and very different from the structure of normal vegetative bacterial cells. Spores cause massive problems in the food industry, because their remarkable resistance allows them to survive food processing and conservation methods. The spore- forming Bacillus cereus is an important food-borne pathogen, is famous for its ability to cause food poisoning, and is an important spoilage organism in pasteurized dairy products. The work presented in this thesis has focused on the formation, structure and germination of B. cereus spores. An easy and efficient way of producing synchronized and homogeneous B. cereus spore batches was developed, using a chemically defined medium in combination with an airlift fermenter system. This setup allowed precise monitoring and manipulation of key growth- and sporulation parameters. The conditions employed resulted in synchronous growth and sporulation, which facilitated gene- expression studies. The kinetics of expression of sigA, sigB, sigF and sigG followed the model developed for Bacillus subtilis, underscoring the conservation of sporulation mechanisms among bacilli. B. cereus was able to form spores on the chemically defined medium without glucose but with lactate as a main carbon source. Sporulation was not induced by nutrient limitation, because significant amounts of carbon and nitrogen sources were still present when the cells started to sporulate. The presence of glutamate delayed the final stages of sporulation, but not the moment of sporulation initiation. Clearly, the concentration of glutamate influenced key spore properties such as heat resistance and germination. The alternative sigma factor σB, encoded by the sigB gene, is an important stress response regulator of B. cereus. An increase in sigB transcription was observed upon glucose depletion, coinciding with the transition from exponential growth to the stationary phase. This increase was specifically associated with the depletion of glucose. Deletion of sigB had a significant impact on spore heat resistance and spore germination properties. Spore heat resistance is caused by the physicochemical structure of the spore, which protects vital spore components such as membranes, proteins, and the DNA. A spin-probe-based Electron Spin Resonance (ESR) method for measuring the internal structure of intact bacterial spores was developed and applied, and provided the first direct data on the aqueous environment in the various compartments of B. subtilis and B. cereus spores. From the results obtained, it was concluded that the core cytoplasm is not in a glassy state. Instead, a three-dimensional molecular matrix incorporating free but highly viscous water exists in the core. Notably, neither heat activation nor partial germination (the excretion of DPA but not full rehydration and enzyme activity) altered the structural properties of the core matrix significantly. Complete germination resulted in the disappearance of the structure in the core, and a decrease of the micro viscosity in the core cytoplasm to levels encountered in normal vegetative cells. For a quantitative analysis of the behavior of individual spores in a large, germinating spore-population, a flow cytometry (FCM) method was developed and applied. By using several different fluorescent dyes, distinct germination parameters such as DNA accessibility and esterase activity were quantified. Finally, spore properties from a large number of B. cereus strains, including the B. cereus laboratory model strain ATCC14579 and a number of recent isolates from environmental and industrial settings were analyzed. The strains tested showed a large variation in heat resistance, and the majority had a higher heat resistance than the laboratory model strain. With respect to germination, many of the strains were less sensitive to the nutrients tested as compared to the laboratory model strain. Heat activation and ageing enhanced germination in response to several nutrients in various isolates. The knowledge that was gained and the methods that were developed in this study are expected to contribute to progress in the spore research field, and to enhanced spore control in the food industry. 3 1. Introduction