Etude Des Possibilites D'exploitation Des

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO ------DOMAINE : SCIENCES ET TECHNOLOGIES ------ECOLE DOCTORALE : SCIENCES DE LA VIE ET DE L’ENVIRONNEMENT

THESE DE DOCTORAT

Spécialité : Biodiversité et Santé (Biochimie)

ETUDE DES POSSIBILITES D’EXPLOITATION DES PROPRIETES TOXIQUES DES GRAINES DE Dodonaea madagascariensis RADLK. (SAPINDACEAE) DANS LE CONTRÔLE DES ORGANISMES NUISIBLES

Présentée et soutenue publiquement par : RAZANATSEHENO Mihajasoa Stella Titulaire du DEA de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales Le 12 Décembre 2017 Devant le jury composé de :

Président : Pr. RALAMBORANTO Laurence Rapporteur interne : Pr. RAZANAMPARANY Julia Louisette Rapporteur externe : Pr. ANDRIANASOLO Radonirina Lazasoa Examinateurs : Pr. RAKOTO Danielle Aurore Doll : Pr. RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna Directeur de thèse : Pr JEANNODA Victor Louis

DEDICACE

A mes parents, que ce travail soit un témoignage de ma reconnaissance pour votre affection et vos sacrifices. Je vous adresse ma profonde gratitude pour votre dévouement, vos encouragements et votre patience tout au long de mes études.

A mon frère, je lui souhaite joie et réussite dans tout ce qu’il entreprendra.

A toute ma famille.

A tous mes collègues pour l’entraide qui n’a pas été vaine.

A tous ceux qui me sont chers…

Je remercie le plus Dieu qui m’a donné la force, la santé et le courage pour la réalisation de ce mémoire.

TABLE DES MATIERES Pages

TABLE DES MATIERES ...... i REMERCIEMENTS ...... vi GLOSSAIRE ...... viii LISTE DES ABREVIATIONS ...... x LISTE DES TABLEAUX ...... xii LISTE DES FIGURES ...... xiii INTRODUCTION GENERALE ...... 1

CHAPITRE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE...... 4

1.1. UTILISATIONS DES PHYTOTOXINES ...... 4 1.1.1. Utilisations empiriques des phytotoxines ...... 4 1.1.2. Les phytotoxines dans l’exploration, l’élucidation de phénomènes biologiques 5 1.1.3. Les plantes toxiques pouvant etre exploitées comme altérnatives aux pesticides de synthèse ...... 6 1.1.4. Les phytotoxines utilisées dans le traitement de diverses pathologies ...... 8 1.2. DONNEES SUR LES ESPECES DE Dodonaea ...... 9 1.2.1. Description botanique et répartition géographique ...... 9 1.2.2. Importance des Dodonaea ...... 10 1.2.2.1. Importance économique et écologique ...... 10 1.2.2.2. Usages thérapeutiques ...... 10 1.2.2.3. Propriétes pharmacologiques ...... 13 1.2.2.4. Propriétés biologiques ...... 13 1.2.2.4.1. Propriétés insecticides ...... 13 1.2.2.4.2. Pouvoir antimicrobien ...... 14 1.2.2.4.3. Cytotoxicité envers les lignées cellulaires cancéreuses ...... 14 1.2.2.4.4. Activité allélopathique ...... 15 1.2.2.4.5. Propriétés molluscicides ...... 15 1.2.2.4.6. Pouvoir hémolytique ...... 15 1.2.2.4.7. Autres propriétés toxiques ...... 15 1.2.3. Travaux phytochimiques antérieurs relatifs au genre Dodonaea...... 15 1.3. GENERALITES SUR LES SAPONOSIDES ...... 17 1.3.1. Définition ...... 17 1.3.2. Structure des saponosides ...... 17 1.3.2.1. Structure des génines ...... 17 1.3.2.1.1. Saponosides à génines stéroïdiques ...... 18 1.3.2.1.2. Saponosides à génines triterpéniques ...... 18 1.3.2.1.3. Les alcaloïdes stéroïdiques ...... 18 1.3.2.2. Structure de l’aglycone ...... 18 1.3.3. Propriétes des saponines et leurs utilisations ...... 18

Pages

CHAPITRE 2 : ETUDE CHIMIQUE ...... 20

2.1. INTRODUCTION ...... 20 2.2. MATERIELS ET METHODES ...... 20 2.2.1. La plante utilisée ...... 20 2.2.1.1. Position systématique ...... 20 2.2.1.2. Description botanique ...... 20 2.2.1.3. Récolte et préparation du matériel végétal ...... 22 2.2.1.4. Utilisations empiriques ...... 22 2.2.2. Les consommables de laboratoire ...... 22 2.2.3. Méthode d’extraction ...... 23 2.2.3.1. Préparation des extraits ...... 23 2.2.3.2. Extraction des saponosides ...... 23 2.2.4. Méthodes de purification ...... 23 2.2.4.1. Fractionnement par le n-butanol (extraction liquide-liquide) ...... 23 2.2.4.2. Chromatographie sur colonne ...... 24 2.2.4.2.1. Chromatographie d’exclusion sur Sephadex LH-20 ...... 24 2.2.4.2.2. Chromatographie sur colonne de silice ...... 24 2.2.5. Calcul du rendement d’extraction/ purification ...... 25 2.2.6. Méthode analytique : Chromatographie sur Couche Mince………………….... 25 2.2.7. Réactions de détection des familles chimiques ...... 25 2.2.7.1. Détection des anthraquinones : tests de Borntrager ...... 25 2.2.7.2. Détection des triterpènes, stéroïdes et stérols insaturés ...... 26 2.2.7.2.1. Test de Lieberman-burchard ...... 26 2.2.7.2.2. Test de Salkowski ...... 26 2.2.7.3. Détection des composés phénoliques : flavonoïdes, leucoanthocyanes, tanins et polyphénols ...... 26 2.2.7.3.1. Détection des flavonoïdes : test de Willstatter ...... 26 2.2.7.3.2. Détection des leucoanthocyanes : test de Bate-Smith ...... 27 2.2.7.3.3. Détection des tanins et des polyphénols ...... 27 2.2.7.3.3.1. Test à la gélatine ...... 27 2.2.7.3.3.2. Test à la gélatine salée ...... 27 2.2.7.3.3.3. Test au chlorure ferrique ...... 27 2.2.7.4. Détection des saponines ...... 27 2.2.7.4.1. Test de mousse ...... 27 2.2.7.4.2. Détermination de l’indice de mousse ...... 28 2.2.7.5. Détection des alcaloïdes ...... 28 2.2.7.5.1. Test de Mayer ...... 28 2.2.7.5.2. Test de Wagner ...... 29 2.2.7.5.3. Test de Dragendorff ...... 29 2.2.7.6. Détection des iridoïdes ...... 29 2.2.7.7. Détection des coumarines ...... 29 2.3. RESULTATS ...... 30 2.3.1. Les extraits bruts d’organes ...... 30 2.3.1.1. Extraits de graines ...... 30 2.3.1.2. Extrait méthanolique de feuilles (EMF) ...... 30 2.3.1.3. Extrait méthanolique d’écorces de tige (EMET) ...... 30 2.3.1.4. Extrait méthanolique d’écorces de racine (EMER) ...... 30 2.3.1.5. Extrait méthanolique de péricarpes de fruits (EMPF) ...... 30

Page 2.3.1.6. Les groupes chimiques présents dans les poudres d’organes de la plante ...... 31 2.3.2. Les différents extraits de graines ...... 32 2.3.2.1. Indice de mousse ...... 32 2.3.2.2. Extraits butanoliques ...... 32 2.3.2.3. Saponosides totaux ...... 32 2.3.2.4. Saponosides purifiés ...... 33 2.3.2.4.1. Extraits obtenus par chromatographie de EP3 sur Sephadex LH-20 ...... 33 2.3.2.4.2. Extraits obtenus par chromatographie de EP5 sur gel de silice ...... 33 2.3.2.5. Rendement de purification des extraits de graines ...... 34 2.3.2.6. Groupes chimiques présents dans les extraits de graines ...... 35 2.3.2.7. Analyse de l’homogenéité des extraits ...... 36 2.4. DISCUSSION ...... 38 2.5. CONCLUSION ...... 39

CHAPITRE 3 : EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX ...... 40

3.1. INTRODUCTION ...... 40 3.2. MATERIELS ET METHODES ...... 40 3.2.1. Matériels ...... 40 3.2.1.1. Les animaux d’expérimentation ...... 40 3.2.1.1.1. Les souris (Mus musculus) ...... 40 3.2.1.1.2. Les cobayes (Cavia porcellus) ...... 40 3.2.1.1.3. Les poussins (Gallus gallus domesticus) ...... 40 3.2.1.1.4. Les alevins de poissons (Cyprinus carpio) ...... 40 3.2.1.1.5. Les têtards de grenouilles (Ptychadena mascareniensis) ...... 41 3.2.1.1.6. Les puces (Xenopsylla cheopis) ...... 41 3.2.1.2. Les extraits utilisés ...... 41 3.2.2. Méthodes ...... 41 3.2.2.1. Tests sur souris ...... 41 3.2.2.1.1. Administration par voie sous-cutanée (s.c.) ...... 41 3.2.2.1.2. Administration par voie per os (p.o.) ...... 42 3.2.2.1.3. Administration par voie intrapéritonéale (ip.) ...... 42 3.2.2.1.4. Détermination de la dose létale 50 % sur souris...... 42 3.2.2.1.5. Etude des lésions anatomo-pathologiques ...... 43 3.2.2.1.5.1. Prélèvement et fixation des organes ...... 43 3.2.2.1.5.2. Déshydratation et imprégnation……………………………………………………………………………………………………... 43 3.2.2.1.5.3. Inclusion et microtomie...... 44 3.2.2.1.5.4. Etalement des coupes ...... 44 3.2.2.1.5.5. Coloration des coupes et montage des lames ...... 44 3.2.2.1.6. Etude des effets de EMG sur les fonctions rénales et hépatiques ...... 44 3.2.2.1.7. Confection d’appâts empoisonnés à base de graines de Dodonaea madagascariensis ...... 46 3.2.2.2. Etude des effets de EMG sur le cœur isolé de cobaye ...... 46 3.2.2.3. Etude de l’activité hémolytique de EMG ...... 47 3.2.2.4. Tests sur les animaux à sang froid ...... 48 3.2.2.4.1. Tests sur les alevins de carpes (Cyprinus carpio) ...... 48 3.2.2.4.2. Tests sur les têtards de grenouilles (Ptychadena mascareniensis) ...... 49 3.2.2.4.3. Test sur les puces (Xenopsylla cheopis) ...... 49

iii

3.3. RESULTATS ...... 50a 3.3.1. Effets des extraits sur la souris ...... 50 3.3.1.1. Effets des extraits de diverses parties de la plante ...... 50 3.3.1.2. Effets des extraits de graines ...... 50 3.3.1.3. Influence de la voie d’administration sur la toxicite de EMG ...... 52 3.3.1.4. Determination de la DL50 de EMG sur souris ...... 53 3.3.1.5. Lesions anatomo-pathologiques ...... 57 3.3.2.5.1. Lésions macroscopiques ...... 57 3.3.2.5.2. Lésions microscopiques ...... 57 3.3.2.6. Effets de EMG sur les paramètres biochimiques sériques ...... 58 3.3.2.7. Evaluation des proprietes rodenticides des graines ...... 72 3.3.2. Activite hémolytique de EMG ...... 72 3.3.3. Effets de EMG sur le cœur isolé de cobaye ...... 73 3.3.4. Effets de EMG sur les poussins ...... 73 3.3.5. Effets de EMG sur les têtards de grenouilles ...... 75 3.3.6. Effets de EMG sur les alevins de carpes ...... 76 3.3.7. Test de EMG sur les puces ...... 76 3.4. DISCUSSION ET CONCLUSION ...... 77

CHAPITRE 4 : ETUDE DES EFFETS DE EMG SUR LES VEGETAUX ...... 81

4.1. INTRODUCTION ...... 81 4.2. MATERIELS ET METHODES ...... 81 4.2.1. Les plantes testées ...... 81 4.2.2. Extrait utilisé ...... 81 4.2.3. Tests sur la germination des graines ...... 81 4.2.4. Tests sur la croissance des jeunes plantules ...... 83 4.2.5. Analyses statistiques ...... 84 4.3. RESULTATS ...... 84 4.3.1. Effets de EMG sur le pouvoir germinatif de graines de plantes potagères ...... 84 4.3.2. Effets de EMG sur la croissance des jeunes plantules ...... 84 4.4. DISCUSSION ...... 85 4.5. CONCLUSION ...... 90

CHAPITRE 5 : EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES ...... 91

5.1. INTRODUCTION ...... 91 5.2. MATERIELS ET METHODES ...... 91 5.2.1. Extraits utilisé ...... 91 5.2.2. Les consommables et réactifs de laboratoire ...... 91 5.2.2.1. Les milieux de culture ...... 91  Milieu Mueller-Hinton Agar (MHA) ...... 91  Bouillon Mueller-Hinton ...... 92 5.2.2.2. Les disques d’antibiogramme ...... 92 5.2.2.3. Solution de chlorure de para-iodonitrotetrazolium (INT)...... 92 5.2.3. Les souches testées ...... 92

Pages 5.2.4. Tests de sensibilité des germes par la méthode de diffusion en milieu gelosé (méthode d’antibiogramme) ...... 92 5.2.5. Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et de la Concentration Minimale Bactéricide/ Fongicide (CMB/ CMF) par la méthode de microdilution ...... 94 5.3. RESULTATS ...... 96 5.3.1. Effets des extraits en milieu solide……………………………………………...... 96 5.3.2. Valeurs de la CMI et de la CMF………………………………………………..... 97 5.4. DISCUSSION ...... 102 5.5. CONCLUSION ...... 103

CHAPITRE 6 : EVALUATION DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE DES EXTRAITS . 104

6.1. INTRODUCTION ...... 104 6.2. MATERIELS ET METHODES ...... 104 6.2.1. Extraits utilisés ...... 104 6.2.2. Méthodes ...... 104 6.2.2.1. Détection du pouvoir antioxydant par bioautographie ...... 105 6.2.2.2. Dosage de l’activité antioxydante par le test au DPPH ...... 105 6.3. RESULTATS ...... 106 6.3.1. Mise en évidence de l’activité antioxydante de EMG par bioautographie…..... 106 6.3.2. Dosage de l’activité antioxydante par méthode colorimétrique……………...... 106 6.4. DISCUSSION ...... 108 6.5. CONCLUSION ...... 109

DISCUSSION GENERALE ...... 110

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ...... 113

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ET WEBOGRAPHIQUES ...... 115

ANNEXES ANNEXE I : Composition des réactifs généraux pour les alcaloïdes ANNEXE II : Composition du milieu de Krebs- Henseleit (en mM) ANNEXE III : Composition du réactif à la vanilline sulfurique ANNEXE IV : Composition du PBS (Phosphate Buffered Saline) ANNEXES V : Composition du liquide de BOUIN ANNEXE VI : Généralités sur Candida albicans ANNEXE VII : Composition des milieux de culture ANNEXE VIII : Publications scientifiques

REMERCIEMENTS

La réalisation de ce travail doctoral a été effectuée avec le soutien d’un grand nombre de personnes dont l’intérêt manifesté à l’égard de mes recherches m’ont permis de progresser et de terminer cette thèse.

En premier lieu, je tiens à exprimer ma profonde gratitude à mon Directeur de thèse Monsieur le Professeur JEANNODA Victor, Directeur de l’Ecole doctorale Sciences de la Vie et de l’Environnement (SVE), pour son intérêt et son soutien, sa grande disponibilité, et ses précieux conseils dans la structuration de mon travail durant toute la période de ma thèse. Un remerciement incontournable pour sa patience et pour la confiance qu’il m’a accordées en acceptant d’encadrer cette thèse.

Je tiens également à exprimer ma profonde gratitude à Madame le Professeur RAKOTO Danielle Aurore Doll, Responsable de l’équipe d’accueil Biodiversité et Santé, pour ses précieux conseils, pour toutes les remarques avisées et suggestions intéressantes que j’ai prises en considération tout au long de ce travail mais aussi de son apport précieux dans la réalisation du manuscrit, malgré ses nombreuses occupations.

Mes plus vifs remerciements et ma profonde reconnaissance vont également au Professeur RANDRIANARIVO Ranjàna qui, par ses compétences, m’a soutenue à chaque fois que j’ai sollicité son aide, ses conseils, pour son amabilité de répondre à mes questions et de fournir les explications nécessaires au cours de mon séjour au LABASM.

Mes plus sincères remerciements vont au Professeur RALAMBORANTO Laurence pour avoir aimablement accepté de présider cette thèse.

Mes vifs remerciements vont également au Professeur RAKOTO Danielle Aurore Doll et au Professeur RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna pour l’intérêt qu’ils ont porté à mes recherches en acceptant de juger mon travail.

Je tiens à remercier le Professeur RAZANAMPARANY Julia Louisette et le Professeur ANDRIANASOLO Radonirina Lazasoa qui se sont acquittés de la délicate tâche de rapporteurs dans cette thèse. Je leur adresse toute ma gratitude d’avoir fait l’honneur d’examiner ce texte.

Je tiens aussi à remercier le Professeur RAJEMIARIMOELISOA Clara pour ses conseils et son aide précieuse dans la réalisation des travaux relatifs à l’étude anatomopathologique.

Je tiens à remercier le Docteur RANDRIAMAMPIANINA Lovarintsoa Judicaël pour ses nombreux conseils et astuces, ses encouragements, son soutien et aide précieux tout au long de mon stage au LABASM.

Cette thèse n’aurait pas été possible sans l’intervention d’un grand nombre de personnes et d’institutions. Je remercie tout particulièrement pour leur orientation et leur accueil:

 Le Professeur RAMANITRAHASIMBOLA David de l’Institut Malagasy de Recherches Appliquées (IMRA) et toute son équipe ;  Le Professeur RASOLOMAMPIANINA Rado et le Docteur ANDRIAMBELOSON Onja du Centre National de Recherches sur l’Environnement (CNRE) ainsi que toute leur équipe ;  Le Docteur RAHARISOLO Clairette de l’Institut Pasteur de Madagascar (IPM) et toute son équipe ; A mes parents pour leur encouragement et leur soutien sans faille. A mon frère pour m’avoir épaulée et pour m’avoir offert son aide. Pour leur amour et leur soutien. Je leur dédie cette thèse.

J’adresse aussi mes plus sincères remerciements à tous mes proches et amis, qui m’ont toujours encouragée au cours de la réalisation de cette thèse.

Merci à mes amis et collègues, en particulier au Docteur RATSIMIEBO Maholy mais aussi au Docteur RAZAFINTSALAMA Vahinalahaja E, Docteur RAKOTONIAINA M. Mamihery, RAZAFINDRAKOTO Anjarasoa Ravo, RATSIMANOHATRA Holy Christiane, ANDRIAMAMPIANINA Herizo L., SOLOFOMALALA Henintsoa V., RANDRIAMANANTSOA Lala Aurélie, RAZAFIMAHARAVO Herimanana ainsi qu’à tous les stagiaires du LABASM, pour les très bons moments partagés ensemble qui ont rendu ce stage particulièrement agréable.

Je remercie enfin tous ceux qui, d’une manière ou d’une autre, ont contribué à la réussite de ce travail et qui n’ont pas pu être cités ici.

vii

Glossaire

GLOSSAIRE

Analgésique : substance produisant une absence de sensibilité à la douleur Anoxie : diminution de la quantité d’oxygène distribuée par le sang aux tissus Antiexsudative : empêche l’exsudation (suintement d’un liquide organique lors d’un processus inflammatoire) Antiprurigineux : produit traitant les démangeaisons Antipyrétique : qualifie ou désigne une substance qui s’oppose à l’élévation pathologique du point de réglage de la température corporelle centrale (fièvre ou pyrexie), sans agir spécifiquement sur la cause de celle-ci Antispasmodique : qualifie ou désigne une substance utilisée pour traiter les spasmes ou contractions intenses des muscles lisses viscéraux, principalement digestifs ou génito-urinaires Apoptotique : se dit d’une autodestruction des cellules en réponse à un signal Astringent : produit resserrant les tissus et diminuant les sécrétions Chronotrope : adjectif qui, associé à un facteur, peut-être positif ou négatif. Il représente la variation du rythme cardiaque Colique : douleur abdominale résultant de contractions intestinales Cytotoxique : relatif à une substance pouvant détruire une cellule Dermatite : inflammation de la peau Détersion : Nettoyage physiologique réalisé à partir des cellules présentes au sein d’une plaie, par exemple polynucléaires neutrophiles, macrophages et lymphocytes Dioïque : qualifie une plante ayant ses fleurs mâles et ses fleurs femelles sur des pieds distincts Enophtalmie : enfoncement des globes oculaires Exophtalmie : protrusion du globe oculaire hors de l'orbite (en avant) liée à une augmentation du contenu de l'orbite Exsudats : épanchement de liquide de nature séreuse, provoquée par un processus inflammatoire entraînant une modification de la perméabilité membranaire Extravasation : passage anormal d’un liquide ou de cellule hors des vaisseaux ou des cavités qui les contiennent normalement vers les tissus environnants Fébrifuge : substance qui fait baisser la fièvre Flatulences : accumulation de gaz dans l’appareil digestif Fomentation : application d’un médicament chaud sur une partie du corps Galactagogue : qui favorise la sécrétion lactée

viii

Glossaire

Hyperplasie : prolifération excessive de cellules au sein d’un organe ou d’un tissu, entrainant son augmentation de volume Hypoxie : état d’un tissu ou d’un organe présentant une oxygénation insuffisante Inotrope : qualifie tout agent qui modifie la contractilité musculaire. Peut être négatif ou positif Intertrigo : inflammation de la peau d’origine microbienne au niveau des plis (aisselle, aine, espace entre les doigts ou les orteils, nombril, sous les seins, plis interfessiers) Ménorragie : règles anormalement abondantes Mucus : substance produite par les cellules glandulaires des différentes muqueuses de l'organisme Onychomycoses : affection des ongles provoquée par des champignons parasites Périonyxis : inflammation du pourtour de l’ongle Phytotoxine (toxine végétale) : substance chimique toxique produite par les plantes, qui assurent souvent une fonction de défense contre les prédateurs et parasites, et dans certains cas contre d’autres plantes concurrentes. Piloérection : érection des poils Plumules : premières feuilles de l’embryon d’une plante Sériciculture : élevage de vers à soie Spasme musculaire : contraction involontaire et de courte durée de fibres musculaires Spasmodique : qui s’accompagne de spasmes Spasmolytique : destiné à éviter ou réduire les contractions spasmodiques Vermifuge : qui provoque la destruction et l’expulsion des vers intestinaux

Liste des abréviations LISTE DES ABREVIATIONS

ALAT : alanine aminotransférase ASAT : aspartate aminotransférase ATCC : American Type Culture Collection BAE : n-Butanol/Acide acétique/Eau C°: concentration CCM : Chromatographie sur Couche Mince CI50 : Concentration Inhibitrice à 50 % CL50 : Concentration Létale 50 % CMF : Concentration Minimale Fongicide CMI : Concentration Minimale inhibitrice DBAE : dichlorométhane/n-butanol/ acide acétique/ eau DH50 : Dose Hémolytique 50 % DHI : Diamètre de Halo d’Inhibition DL50 : Dose Létale 50 % DPPH : 1,1-diphényl 1-2 picrylhydrazyle ED : Eau Distillée EHG : Extrait Hexanique de Graines EMG : Extrait Méthanolique de Graines EP1 : phase organique obtenue après partition de l’EMG au n-butanol EP2 : phase aqueuse obtenue après partition de l’EMG au n-butanol EP3 : saponosides totaux obtenus à partir de EP1 EP4 : extrait non saponosidique obtenue à partir de EP1 EP5 : saponosides obtenus après chromatographie sur colonne de SEPHADEX LH-20 d’EP3 EP6 à EP8 : composés phénoliques obtenus après chromatographie sur colonne de SEPHADEX LH-20 de l’extrait EP3 EP9 à EP28 : extraits obtenus après chromatographie sur colonne de silice de l’extrait EP5 IC50 : concentration provoquant 50 % d’inhibition IMRA : Institut Malagasy de Recherches Appliquées INT : para-iodonitrotétrazolium ip. : intrapéritonéale IPM : Institut Pasteur de Madagascar J : jour LABASM : Laboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales p.o. : per os P/V : rapport poids/volume PBS : Phosphate Buffered Saline PI (%) : Pourcentage d’Inhibition s.c. : sous-cutanée TGR : Taux de Germination Relatif UFC : Unité Formant Colonie V/V : volume à volume

Liste des tableaux LISTE DES TABLEAUX Pages Tableau 1 : Exemples d’insecticides commercialisés obtenus à partir d’extraits de plantes ...... 8 Tableau 2 : Exemples d’insecticides commercialisés obtenus à partir d’huiles essentielles extraites de plantes ...... 9 Tableau 3 : Rendements d’extraction, aspects et couleurs des différents extraits bruts d’organes de la plante ...... 31 Tableau 4 : Criblage phytochimique des graines, de péricarpes de fruit, d’écorces de tige et de racine ...... 31 Tableau 5 : Rendement de purification et caractéristiques des différents extraits purifiés de graines ...... 35 Tableau 6 : Rendement de purification, aspects et couleurs des différents extraits obtenus après chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3 ...... 35 Tableau 7 : Rendement de purification, aspects et couleurs des différents extraits obtenus par chromatographie sur colonne de silice de EP5 ...... 35 Tableau 8 : Résultats du criblage phytochimique des différents extraits de graines ...... 36 Tableau 9: Liste des différents extraits bruts et partiellement purifiés obtenus ...... 39 Tableau 10 : Volume injecté selon la voie d’administration ...... 42 Tableau 11 : Effets des extraits issus des différentes parties de la plante ...... 50 Tableau 12 : Taux de mortalité (%) obtenus à différentes doses des extraits de graines sur souris par voie ip...... 51

Tableau 13: Toxicité sur souris par voie ip. à 30,48 mg/ml (DL0) des extraits EP9 à EP28

(extraits après chromatographie sur silice de EP5) ...... 51 Tableau 14 : Influence de la voie d’administration sur la toxicité de EMG ...... 52 Tableau 15 : Les symptômes observés selon la voie d’administration ...... 54

Tableau 16 : Résultats de la détermination de la DL50 (24h) par voie ip. chez la souris, selon la méthode de REED et de MUENCH (1938) ...... 56

Tableau 17 : Valeurs utilisées pour l’estimation de la DL50 (24h) sur souris de EMG par la méthode graphique des totaux cumulatifs ...... 56 Tableau 18 : Lésions tissulaires provoquées par EMG à 36,53 mg/kg par voie ip. en fonction de la durée d’exposition ...... 59 Tableau 19: Lésions tissulaires provoquées par une dose sublétale de EMG à 25,4 mg/kg administrée par voie p.o. pendant 10 jours ...... 61

Liste des tableaux

Tableau 20 : Effets de EMG sur des paramètres biochimiques de souris après 30 jours de Pages traitement par voie orale ...... 61 Tableau 21: Composition des appâts empoisonnés ...... 72 Tableau 22 : Résultats des essais d’appâtage sur souris ...... 72 Tableau 23 : Effets des différentes concentrations de EMG sur les têtards de grenouille ...... 75 Tableau 24 : Effets des différentes concentrations de EMG sur les alevins de carpe ...... 76 Tableau 25 : Liste des graines utilisées pour l’étude des propriétés phytotoxiques de EMG ..... 81 Tableau 26 : Effets de EMG sur le pourcentage de germination (PG %) des graines potagères après 15 jours de traitement ...... 84 Tableau 27 : Effets de EMG sur la germination et la croissance de plantes potagères ...... 85 Tableau 28 : Listes des souches microbiennes utilisées ...... 92 Tableau 29 : Normes utilisées pour l’expression des résultats obtenus par la méthode des disques ...... 93 Tableau 30 : Normes utilisées pour l’expression des résultats obtenus par la méthode de microdilution ...... 94 Tableau 31 : Effets des extraits à 1000 µg/disque sur la croissance en milieu solide des germes étudiés ...... 97

Tableau 32 : Effets des extraits EP5 à EP8 sur la croissance en milieu solide de Candida albicans ...... 98 Tableau 33 : Effets de différentes concentrations de l’extrait EP5 sur la croissance de Candida albicans ...... 98

Tableau 34 : Effets des extraits EP9 à EP28 (extraits obtenus par chromatographie sur silice de

EP5) sur la croissance de Candida albicans en milieu solide ...... 98

Tableau 35 : Valeurs des CMI et des CMF de EMG, EP5, EP10 et EP11 ...... 101

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Liste des figures LISTE DES FIGURES Pages Figure 1 : Distribution géographique des plantes appartenant au genre Dodonaea dans le monde ...... 12 Figure 2 : Distribution géographique de Dodonaea madagascariensis (en rouge) ...... 12 Figure 3 : Dodonaea madagascariensis Radlk. (Arbuste, tronc, rameaux feuillus et fruits) ..... 21 Figure 4 : Schéma récapitulatif des procédés d’extraction et de purification des principes toxiques de graines ...... 34 Figure 5 : Chromatogrammes récapitulatifs de purification des principes toxiques des graines de D. madagascariensis ...... 37 Figure 6 : Courbe des totaux cumulatifs par la méthode graphique de REED et MUENCH (1938) ...... 57 Figure 7 : Coupes histologiques de : a) POUMON non traité, b) POUMON traité avec EMG à 36,53 mg/kg par voie ip. après un temps d’exposition de 6 h (Grossissement x10 et x40) ...... 62 Figure 8 : Coupes histologiques de : a) POUMON non traité, b) POUMON traité avec EMG à 25,4 mg/kg par voie p.o. après une durée d’exposition de 10 jours (Grossissement x10 et x40) ...... 63 Figure 9 : Coupes histologiques de : a) FOIE non traité, b) FOIE traité avec EMG à 36,53 mg/kg par voie ip. après un temps d’exposition de 6 h (Grossissement x10 et x40) ...... 64 Figure 10 : Coupes histologiques de : a) FOIE non traité, b) FOIE traité par l’EMG à 25,4 mg/kg par voie p.o. après une durée d’exposition de 10 jours (Grossissement x10 et x40) ...... 65 Figure 11 : Coupes histologiques de : a) REIN non traité, b) REIN traité avec EMG à 36,53 mg/kg par voie ip. après un temps d’exposition de 12 h (Grossissement x10 et x40) ...... 66 Figure 12 : Coupes histologiques de : a) REIN non traité, b) REIN traité avec EMG à 25,4 mg/kg par voie p.o. après une durée d’exposition de 10 jours (Grossissement x10 et x40) ...... 67 Figure 13 : Coupes histologiques de : a) INTESTIN GRELE non traité, b) INTESTIN GRELE traité avec EMG à 36,53 mg/kg par voie ip. après un temps d’exposition de 6 h (Grossissement x10 et x40) ...... 68 Figure 14 : Coupes histologiques de : a) INTESTIN GRELE non traité, b) INTESTIN GRELE traité avec EMG à 25,4 mg/kg par voie p.o. après une durée d’exposition de 10 jours (Grossissement x10 et x40) ...... 69 Figure 15 : Coupes histologiques de : a) GROS INTESTIN non traité, b) GROS INTESTIN traité avec EMG à 36,53 mg/kg par voie ip. après un temps d’exposition de 6 h (Grossissement x10 et x40) ...... 70

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Liste des figures

Figure 16 : Coupes histologiques de : a) GROS INTESTIN non traité, b) GROS INTESTIN Pages traité avec EMG à 25,4 mg/kg par voie p.o. après une durée d’exposition de 10 jours (Grossissement x10 et x40) ...... 71 Figure 17 : Pourcentage d’hémolyse transformée en valeur « probit » en fonction du logarithme de la concentration de EMG ...... 73 Figure 18 : Effets de l’EMG sur l’amplitude de contraction des oreillettes isolées de cobaye en fonction de la concentration (µg/ml) et du temps de contact ...... 74 Figure 19 : Effets de l’EMG sur la fréquence de contraction des oreillettes isolées de cobaye en fonction de la concentration (µg/ml) et du temps de contact ...... 74 Figure 20 : Courbe montrant l’effet-dose et la mortalité provoqués par EMG sur les têtards de grenouilles ...... 75 Figure 21 : Courbe montrant l’effet-dose et la mortalité provoqués par EMG sur les alevins de carpe ...... 76 Figure 22 : Schéma résumant les différentes étapes de l’expérience sur les effets de EMG sur le pouvoir germinatif des graines ...... 82 Figure 23 : Schéma résumant les différentes étapes de l’expérience sur les effets de EMG sur la croissance des jeunes plantules ...... 83 Figure 24 : Croissance des épicotyles (a) et des hypocotyles (b) d’Oryza sativa en présence de EMG à différentes concentrations et du glyphosate à 7,2 mg/mL ...... 86 Figure 25 : Croissance des épicotyles (a) et des hypocotyles (b) de Phaseolus vulgaris en présence de EMG à différentes concentrations et du glyphosate à 7,2 mg/mL ...... 87 Figure 26 : Croissance des épicotyles (a) et des hypocotyles (b) de Pisum sativum en présence de EMG à différentes concentrations et du glyphosate à 7,2 mg/mL ...... 88 Figure 27 : Croissance des épicotyles (a) et des hypocotyles (b) de Zea mays en présence de EMG à différentes concentrations et du glyphosate à 7,2 mg/mL ...... 89

Figure 28 : Activité des différents extraits (EMG, EP1, EP2, EP3, et EP4) testés à 1 mg/disque sur Candida albicans ...... 99

Figure 29 : Activité de EMG et des extraits purifiés (EP5, EP6, EP7 et EP8) à 1 mg/disque sur Candida albicans ...... 99

Figure 30 : Sensibilité de Candida albicans à différentes concentrations de l’extrait EP5 ...... 100 Figure 31 : Activité des quelques extraits obtenus après chromatographie sur colonne de silice de EP5 sur Candida albicans ...... 100 Figure 32 : Variation de la turbidité induite par la croissance de Candida albicans en fonction de la concentration de EMG ...... 101

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Liste des figures

Figure 33 : Variation de la turbidité induite par la croissance de Candida albicans en fonction Pages de la concentration des différents extraits obtenus par chromatographie sur colonne de

Sephadex LH-20 de l’extrait EP3 (EP5 à EP8) ...... 101 Figure 34 : Variation de la turbidité induite par la croissance de Candida albicans en fonction de la concentration des extraits (EP10 et EP11) obtenues par chromatographie sur colonne de silice de EP5 ...... 101 Figure 35 : Structure chimique du DPPH et sa réaction avec un piégeur de radicaux (A-H) .... 105 Figure 36 : Screening de l’activité antioxydante par bioautographie de EMG, des extraits « saponosides purifiés » et « composés phénoliques » ...... 107 Figure 37 : Courbe représentant le pourcentage d’inhibition du radical DPPH en fonction de la concentration de EMG ...... 107

INTRODUCTION GENERALE

Introduction générale

INTRODUCTION GENERALE A travers les âges, l’Homme a appris l’importance des plantes pour sa survie et a su tirer profit de leurs bienfaits. Les végétaux constituent la plus importante source de nourriture pour l’Homme, mais il les utilisait également à des fins thérapeutiques (CRAGG et NEWMAN, 2013) et contre les organismes nuisibles (PHILOGENE et coll., 2008). Les organismes nuisibles regroupent les plantes, les animaux et les microorganismes qui constituent une menace pour l’Homme en l’attaquant soit directement, lui causant des maladies ou des désagréments, soit indirectement, en détruisant ses biens (animaux d’élevage, domestiques, plantes cultivées, etc.) (LEVEQUE, 2008). Avec le réchauffement climatique et à cause des mouvements de plus en plus importants des populations qui favorisent leur dispersion partout dans le monde, les organismes nuisibles et les problèmes qui leur sont associés prennent de l’ampleur (BRADLEY et coll., 2010 ; THOMAS et coll., 2014). Ils constituent actuellement une menace pour l’économie, l’environnement et aussi pour la santé publique. Dans le secteur agricole, les mauvaises herbes, les maladies et les ravageurs peuvent entraîner des dégâts économiques importants incluant les risques de contamination, de détérioration, de décomposition et de putréfaction. En plus, il est bien connu qu’en Afrique les conséquences de telles pertes affectent non seulement l’économie mais lors des conditions climatiques défavorables peuvent aussi devenir une des causes favorisant la famine. A Madagascar par exemple, les rats ont même été déclarés « calamités publiques » par décret N° 63- 370 du 05 Mai 1965, année de la grande invasion murine (SLCPAVN, 1994) vu les dégâts qu’ils ont causés. Du point de vue sanitaire, l’émergence et la réémergence de nouvelles maladies infectieuses constituent un problème connu à l’échelle mondiale (MORAND et FIGUIÉ, 2016). Dans les pays en voie de développement, les maladies microbiennes font un grand nombre de victimes, en termes de morbidité et de mortalité (HART et SHEARS, 1997) et du point de vue socio-économique, cela ne fait qu’accentuer la pauvreté dans ces pays à cause de la diminution de la productivité professionnelle ou même des arrêts de travail qu’elles engendrent. Pour faire face à ces fléaux, de multiples stratégies et moyens ont été mis en œuvre. Depuis la fin de la deuxième guerre mondiale, les pesticides chimiques ont été considérés comme une nouvelle technologie qui a permis lutter contre la famine et les maladies à

Introduction générale transmission vectorielle (WHO, 1988). Les pays en voie de développement, en général, ont connu cet engouement pour les pesticides chimiques. Cependant, ces pesticides chimiques ont créé de nouvelles préoccupations. Ils constituent une menace pour l'environnement (BRÜHL et coll., 2013). Leur utilisation peut aussi entrainer l’apparition de phénomènes de résistance des espèces nuisibles (DERMAUW et coll., 2013, NAQQASH et coll., 2016). Ils peuvent également avoir des conséquences néfastes sur la santé. Certains pesticides chimiques peuvent par exemple entrainer des malformations congénitales, des tumeurs du cerveau chez les enfants et les jeunes adultes, des leucémies, de l’arthrite rhumatoïde ou favoriser le développement de cancer du sein, etc. (VAN MAEL- FABRY et coll., 2013 ; CREMONESE et coll., 2014 ; MARYAM et coll., 2015 ; ARREBOLA et coll., 2015 ; PARKS et coll., 2016 ; TREJO et PERRY, 2017). Bien que, par rapport aux pays industrialisés, les pays en voie de developpement n’utilisent qu’une proportion modeste de pesticides de synthèse, ils sont les plus affectés à cause essentiellement de la méconnaissance des précautions d’utilisation de ces produits et surtout de l’importation de pesticides interdits d’utilisation dans les pays occidentaux, vendus à bas prix (BOUGHERA et PHILOGENE, 2011). Pour faire face aux risques engendrés par l’utilisation de ces produits chimiques, les recherches sur des pesticides naturels ou biopesticides plus facilement accessibles, de faible toxicité pour les organismes non cibles, respectueux de l’environnement se sont multipliées dans divers laboratoires. Ces substances peuvent être d’origine végétale, animale ou microbienne (TEMPLETON, 2010), mais celles d’origine végétales ont le plus souvent fait l’objet d’une recherche. Etant donné la richesse et l’originalité de la biodiversité végétale de Madagascar, l’Unité de recherche « Toxicologie » du laboratoire de « Biochimie Appliquée aux Sciences médicales» (LABASM) de la Mention Biochimie Fondamentale et Appliquée, a travaillé depuis plusieurs années sur les plantes toxiques à propriété pesticide (RAKOTOBE- RANDRIAMOELIARIVONY, 2009 ; RAZANATSEHENO, 2012 ; RAKOTO et coll., 2011 ; RANDRIANARIVO et coll., 2014 a et b). Lors de tests préliminaires de toxicité effectués systématiquement dans notre laboratoire d’accueil sur différents matériels végétaux, les graines de Dodonaea madagascariensis Radlk., une SAPINDACEE endémique de Madagascar, se sont révélées fortement toxiques pour la souris. Les travaux sur cette plante médicinale dont les feuilles font l’objet d’utilisations thérapeutiques (TROTIN, 1972) nous ont été confiés.

Introduction générale

Ainsi, nous nous sommes fixé comme principaux objectifs : 1) d’évaluer et de caractériser les propriétés toxiques des graines de la plante ; 2) de déterminer le groupe chimique des métabolites secondaires responsables de l’activité toxique ; 3) d’étudier dans quelles mesures elles pourraient être utilisées dans le contrôle des organismes nuisibles ; 4) de rechercher d’autres propriétés pharmacologiques éventuelles.

Le présent ouvrage comporte six chapitres qui seront présentés après l’« Introduction »:  le chapitre 1 est consacré à la « Synthèse bibliographique » qui rapporte des données pertinentes permettant de mieux situer les travaux entrepris et faciliter la compréhension et l’interprétation des résultats obtenus ;  le chapitre 2 traite des méthodes d’obtention (extraction, purification) des différents extraits utilisés et de leur caractérisation phytochimique ;  les chapitres 3, 4 et 5 sont consacrés à l’étude des effets de EMG respectivement sur les animaux, les végétaux et les microorganismes ;  le chapitre 6 expose les travaux sur l’étude du pouvoir antioxydant des différents extraits. La discussion et la conclusion générales ainsi que les perspectives terminent l’ouvrage.

Les travaux réalisés et les résultats obtenus dans le cadre de cette thèse ont fait l’objet d’un article scientifique et d’une communication orale (Annexe VIII).

Synthèse bibliographique

CHAPITRE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

Pour bien situer notre sujet de thèse, les travaux que nous avons entrepris ainsi que pour faciliter l’interprétation des résultats obtenus, nous présentons dans ce chapitre des données bibliographiques sur :

 l’utilisation des toxines produites par les plantes (phytotoxines) et leurs intérêts dans différents domaines ;  des généralités sur les plantes appartenant au genre Dodonaea ;  des généralités sur les saponines, une famille de métabolites secondaires qui, lors des tests préliminaires, s’est avérée être en grande partie à l’origine de la toxicité des graines.

1.1. UTILISATIONS DES PHYTOTOXINES

Les paragraphes suivants illustrent les utilisations empiriques des phytotoxines, leurs emplois dans l’exploration et l’élucidation de phénomènes biologiques, le traitement de diverses pathologies et leurs possibles utilisations en tant qu’alternatives aux pesticides de synthèse.

1.1.1. UTILISATIONS EMPIRIQUES DES PHYTOTOXINES

Les Hommes ont eu recours aux plantes toxiques pour :  assurer leur survie : afin de trouver de la nourriture (en tant que poisons de chasse et de pêche) mais aussi pour se défendre en les utilisant comme armes de guerre. Depuis la préhistoire et jusqu’à nos jours (dans certains pays), diverses plantes toxiques sont utilisées par les peuples Amérindiens, Africains ou Asiatiques comme poisons de chasse et de pêche : les poisons de pêche sont généralement pilés et jetés dans les petites rivières où l’on a préalablement fait un barrage et après un temps qui varie selon les conditions, les poissons, engourdis flottent à la surface de l'eau. En Afrique tropicale par exemple, les plantes possédant cette propriété appartiennent généralement à la famille CAESALPINIACEAE, MIMOSACEAE, PAPILIONACEAE et des EUPHORBIACEAE comme Tephrosia vogelii, Mundulea sericea, Euphorbia tirucalli, Gnidia kraussiana, Adenia lobat, Balanites aegyptiaca, Swartzia madagascariensis, Neoratanenia mitis, Tetrapleura tetraptera et Strychnos aculeata (NEUWINGER, 2004). Au Sud de l’Inde, Diospyros cordifiola et Gnidia glauca sont par exemple utilisés comme poisons de pêche par certaines tribus (SAJEEV et SASIDHARAN, 1997), ainsi que d’autres plantes appartenant au genre Mundulea (CHEVALIER, 1937), Crotalaria coursii, Lonchocarpus nicou, Tephrosia vogeli (AKPA et coll., 2010). 4

Synthèse bibliographique

En ce qui concerne les poisons de chasse, ce sont surtout des plantes toxiques riches en alcaloïdes et en glycosides cardiotoniques qui sont les plus utilisées. Leurs extraits servent à empoisonner les flèches, fléchettes, lances ou sarbacanes. C’est le cas par exemple des plantes riches en alcaloïdes appartenant au genre Strychnos, quelques plantes appartenant à la famille des APOCYNACEAE (Strophanthus, Acokanthera), ou encore des plantes riches en glycosides de cardénolides comme Calotropis procera (ASCLEPIADACEAE) ou Antiaris toxicaria (MORACEAE) (PHILIPPE et ANGENOT, 2005).

 Ces plantes toxiques peuvent être également utilisées comme poison ordalique surtout en Afrique pour rendre justice et pour régler les litiges : l’écorce d’Erythrophleum guineense est par exemple utilisée dans l’épreuve du Tali (ou Téli) au Sénégal, la fève de Physiostigma venenosum (Fabaceae) comme poison d’épreuve par les habitants de la côte de Calabar (Est du delta du Niger). Les graines de Cerbera venenifera (APIACEAE) étaient utilisées dans l’épreuve du tanghin (Province centrale de Madagascar) (SIMON, 2003).

 Des gens mal intentionnés avaient utilisé les plantes toxiques pour commettre des meurtres: le cas d’empoisonnement par la ricine extraite de Ricinus communis dans l’affaire parapluie bulgare (1978) en est un exemple, Atropa belladona ainsi que la nicotine extraite de Nicotiana tabacum ou encore avec de l’acétate de morphine isolé de l’opium (extrait du pavot) dans l’affaire Castaing (1923) sont des exemples de plantes toxiques utilisées à des fins criminelles (SIMON, 2003).

1.1.2. LES PHYTOTOXINES DANS L’EXPLORATION, L’ELUCIDATION DE PHENOMENES BIOLOGIQUES

Les toxines extraites des plantes toxiques ont également été exploitées comme des outils moléculaires ayant permis d’explorer et d’élucider divers phénomènes biologiques. A titre d’illustration :  de nombreuses phytotoxines ont contribué à l'élucidation de différentes voies métaboliques. Dans la compréhension du fonctionnement de la chaîne respiratoire, l’élucidation de la séquence de transporteurs de la « chaîne de transport d’électrons » a été effectuée grâce à des inhibiteurs spécifiques des composantes de cette chaîne comme la roténone (MUHAMMAD, 1992). La vinblastine et la vincristine sont des drogues isolées de la pervenche de Madagascar : elles ont la propriété d’inhiber la réplication de l’ADN (en inhibant la polymérisation des microtubules) (DEVILLE, 2011). La ricine, capable d’inhiber la

Synthèse bibliographique biosynthèse des protéines dans les cellules eucaryotes (par inactivation des ribosomes), a permis d’élucider le mécanisme de la biosynthèse des protéines (LORD et ROBERTS, 1996).  de nombreuses toxines d’origine végétale ont aussi permis d’explorer les récepteurs biologiques importants ainsi que les fonctions régulatrices de la cellule. C’est par exemple le cas de l’atropine de la belladone, la scopolamine de la jusquiame qui sont des neurotoxines post-synaptiques utilisées dans la caractérisation des récepteurs muscariniques ou encore la strychnine extraite du Strychnos nux-vomica qui est un alcaloïde inhibiteur de la transmission des synapses glycinergiques (PURVES et coll., 2015).

1.1.3. LES PLANTES TOXIQUES POUVANT ETRE EXPLOITEES COMME ALTERNATIVES AUX PESTICIDES DE SYNTHESE

De nombreuses plantes toxiques peuvent être efficaces et utilisées pour leurs effets répulsif et/ou biocide contre divers organismes nuisibles (microorganismes, plantes ou animaux indésirables) comme :  divers agents pathogènes et vecteurs de maladies pour l’Homme et les animaux ;  ou diverses sources de dégâts potentiels de cultures, de denrées alimentaires ou d’autres produits industriels (au cours de leur transformation, stockage ou de leur commercialisation). Les propriétés toxiques et les utilisations empiriques de nombreuses plantes contre les organismes nuisibles ont pu être scientifiquement vérifiées par diverses études biologiques. Beaucoup d’autres plantes dont la toxicité est potentiellement exploitable ont été découvertes par la suite. Elles ont été utilisées contre divers organismes :  des rongeurs : Rhodocodon madagascariensis (RAKOTOBE- RANDRIAMOELIARIVONY, 2009), Dipcadii cowani, Urginea maritima ou Urginea scilla sont connus pour leur propriétés rodenticides (JOHNSON, 1998) ;  des insectes ravageurs de culture, de récoltes ou des denrées stockées : l’extrait méthanolique de fruits d’Azadirachta indica et de feuilles de Dendropthoe falcata sont actifs contre les larves de chenilles (Spodoptera litura) (BHATT et coll., 2014), l’extrait éthanolique de feuilles de Clerodendron. phillippinum contre les larves de Spodoptera litura (JADHAV et coll., 2016) et la poudre de graines de Medicago trunculata est hautement toxique pour Sitophilus oryzae (DA SILVA et coll., 2012) ;  des arthropodes : les propriétés acaricides de l’extrait méthanolique de tiges de Petivera alliacea contre les tiques du bétails (ROSADO-AGUILAR et coll., 2010), de l’huile essentielle de branche de pin (Pinus pinea) contre l’acarien de la moisissure (MACCHIONI et

Synthèse bibliographique coll., 2002) et de l’huile essentielle de lavande contre un acarien parasite de l’abeille adulte (Varroa destructor) (DAMIANI et coll., 2009) ont été mises en évidence ;  des nématodes : les propriétés nématicides d’extraits aqueux de feuilles d’Allium sativum (ail), de Zinziber officinale (gingembre), de Cinnamomum verum (canelle), d’Azadirachta indica (margousier), de Ricinus communis (graines de ricin), de Nerium oleander et d’Eucalytus sp.(SALIM et coll., 2016) ont été mises en évidence ;  des mauvaises herbes et les plantes envahissantes : c’est le cas des effets herbicides des exsudats de racines de Sorghum bicolor qui sont efficaces contre Rumex japonicus et Plantago asiatica (UDDIN et coll., 2014), l’huile essentielle de Nepeta meyeri contre Amaranthus retroflexus L., Chenopodium album L., Cirsium arvense L. and Sinapsis arvensis L. (MUTLU et coll., 2011). De récentes recherches ont également démontré le pouvoir allélopathique d’autres plantes comme Cardaria draba, Salvia syriaca, Eucalyptus microtheca, Ginkgo biloba, Tamarindus indica, Azadirachta indica, Broussonetia papyrifera et Lactuca sativa envers d’autres plantes (BARKATULLAH et coll., 2010) et qui sont exploitables dans le contrôle de ces plantes nuisibles ;  des insectes nuisibles vecteurs de maladies : c’est le cas par exemple de l’extrait de feuilles de Hyptis suaveolens et de Senna hirsuta efficaces comme larvicide et insectifuge envers Culex quinquefasciatus ou encore des effets larvicides des extraits de feuilles de ricin (Ricinus communis) et du bois de thuya (Tetraclinis articulata) (AOUINTY et coll., 2006) ;  des microorganismes pathogènes : COWAN (1999) a rapporté des propriétés à la fois antibactériennes, antifongiques et antivirales de Arcticum lapa, de Rhamnus purshiana, de Thymus vulgaris, une activité anthelminthique et antivirale d’Artemisia dracunculus, une activité antimalariale du Cinchona sp.ou de Mahonia aquifolia et une activité antifongique d’Allium cepa contre la levure unicellulaire Candida albicans. Les extraits et huiles essentielles de plusieurs plantes (Tableaux 1 et 2, p. 8 et 9) sont si efficaces que leur commercialisation en tant que biopesticides a été possible. Ces plantes peuvent être à la fois utilisées directement contre les insectes cibles ou appliquées sur les récoltes (céréales, légumes, fruits, plantes ornementales etc.). Ces produits sont efficaces sur de nombreux insectes suceurs, broyeurs, acariens, nématodes, etc. Ils ont été fabriqués par diverses compagnies américaines, indiennes, tchèques et chinoises (PAVELA, 2016).

Synthèse bibliographique

Tableau 1 : Exemples d’insecticides commercialisés obtenus à partir d’extraits de plantes (Source : PAVELA, 2016) ESPECES (FAMILLE) NOM COMMERCIAL (compagnie) SUBSTANCE(S) ACTIVE(S) Azadirachta indica Juss. MARGOSUM® (Agri Life, India) Azadirachtine, « salanin », « nimbin » (MELIACEAE) Composés soufrés ex: trisulfure de Allium sativum L. Eco A-Z® (EcofloraAgro, Colombia) diallyle, disulfure de diallyle, trisulfure de (LILIACEAE) méthyl-allyle Annona squamosa L. Squamocine (annonine), huile ANOSOM® (Agri Life, India) (ANNONACEAE) désamérisée de l’Annona Nicotiana tabaccum L. NICO-DUST® (Nico Nicotine (SOLANACEAE) Orgo Manures, India) Pongamia pinnata (L.) Pierre « Karanjin », huile désamérisée de DERISOM® (Agri Life, India) (FABACEAE) « karanjin » Schoenocaulon officinale A. Gray VERATRAN® (MGK®, USA) Cevadine, veratridine (MELANTHIACEAE)

1.1.4. LES PHYTOTOXINES UTILISEES DANS LE TRAITEMENT DE DIVERSES PATHOLOGIES

Selon Paracelse : « Toutes les choses sont poisons, et rien n’est sans poisons ; seule la dose fait qu’une chose n’est pas un poison » (WIRZ, 2014). La plupart des phytotoxines peuvent être utilisées comme produits thérapeutiques à des doses qui ne mettent pas en danger la santé des personnes traitées. C’est le cas par exemple des propriétés antispasmodiques de l’atropine (SAINI, 2015) et l’utilisation de l’hyosciamine dans le traitement des râles terminaux liés à l’encombrement des voies aériennes supérieures (VINAY et coll., 2010). Plusieurs de ces principes toxiques sont utiles dans de nombreux domaines de recherche comme l'oncologie, l'inflammation et les maladies infectieuses (PHILIPPE et ANGENOT, 2005). De nombreuses plantes utilisées empiriquement comme poisons de chasse sont douées d’une activité antiplasmodiale. C’est le cas par exemple de nombreux extraits et d’alcaloïdes provenant de diverses espèces appartenant au genre Strychnos (PHILIPPE et ANGENOT, 2005). Le pouvoir cytotoxique du glucoside cardiaque appelé proceraside A isolé du Calatropis procera (IBRAHIM et coll., 2014) est aussi connu. Il en est de même du pouvoir analgésique de la morphine et de la codéine, des alcaloïdes très toxiques mais qui sont très utilisés dans les services hospitaliers (CRAIG, 1988).

Synthèse bibliographique

Tableau 2 : Exemples d’insecticides commercialisés obtenus à partir d’huiles essentielles extraites de plantes (Source : PAVELA, 2016) NOM COMMERCIAL POURCENTAGE DE MATIERES UTILISATION / ACTION (COMPAGNIE) ACTIVES (%) Insect Repellent Romarin (0,5), feuilles de cannelle Comme répulsifs: anti-moustiques, anti-tiques et (EcoSMART®, USA) (0,5), citronnelle (0,5), anti-moucherons geraniol (1,0) Bed Bug Killer for Travel Menthe poivrée (1,5) Contre les punaises des lits (EcoSMART®, USA) romarin (1,5)

Mosquito Fogger Geraniol (3.0), romarin (2,0) Tue et éloigne les moustiques, les mouches, les (EcoSMART®, USA menthe poivrée (0,4) moucherons, les mites et d’autres insectes volants nuisibles

Flying Insect Killer Menthe poivrée (2,0), Tue les mouches, les moucherons, les moustiques, (EcoSMART®, USA) citronnelle (1,0), sésame (1,0) mites, guêpes

Home Pest Control Clou de girofle (1,0), romarin (1,0), Contre les fourmis, (EcoSMART®, USA) menthe poivrée (1,0), thym (0,5) scarabées, mille-pattes, blattes, criquets, perce- oreilles, puces, scolopendres, cloportes, lépismes, araignées, tiques et d’autres insectes rampants nuisibles.

Requiem EC Chenopodium ambrosioides Contre les aleurodes, thrips, psylles. (Bayer AG, Germany) (16,75)

Garden Insect Killer Romarin (0,25), menthe poivrée (0,25), Tue et repousse les insectes et les acariens du (EcoSMART®, USA) thym (0,25), clou de girofle (0,25) jardin (efficace sur les œufs, les larves et les adultes)

EcoVia WD Thym (10,0) Contre les moustiques, les termites, diverses (Rockwell Labs Ltd., USA) mouches, les punaises de lit, les anthrènes des tapis (mites des tapis), différents coléoptères, teignes des vêtements, scorpions, cafards, criquets, ténébrions, dermestes, grillons, acariens, chenilles, thrips, aleurodes et leurs œufs, araignées, lépismes, guêpes, collemboles, etc.

1.2. DONNEES SUR LES ESPECES DU GENRE Dodonaea

1.2.1. DESCRIPTION BOTANIQUE ET REPARTITION GEOGRAPHIQUE

Le genre Dodonaea appartient à la famille des SAPINDACEAE qui comprend 1400-2000 espèces réparties dans 140-150 genres (SCHATZ, 2001 ; ONUMINYA et OGUNDIPE, 2014). Les espèces de ce genre se présentent sous forme de buissons ou petits arbres dioïques dont toutes les parties portent des glandes sessiles circulaires les rendant poisseux et visqueux. Leurs feuilles sont alternes, simples, entières, ou composées paripennées avec 10-13 paires de folioles alternes et entières, plante à rachis ailé. Les inflorescences terminales sont en panicules pyramidales et les fleurs sont petites et régulières. Les fruits sont de grandes capsules sèches, déhiscentes, ailées, membraneuses et à nervation évidente (SCHATZ, 2001). 9

Synthèse bibliographique

Le genre Dodonaea comprend environ 68 espèces dont 61 sont endémiques d’Australie. Les plantes appartenant à ce genre sont également largement distribuées dans les régions chaudes des pays de l’Afrique du Sud, de l’Amérique du Nord et de l’Asie du Sud (ABDULLAH, 1973 ; WEST, 1984) (Figure 1, p. 12). A Madagascar, il est représenté par deux espèces : D. madagascariensis et D. viscosa. La première est endémique de Madagascar avec une aire de répartition plus limitée (surtout dans la région centrale de Madagascar). C’est une plante originaire des montagnes du centre de Madagascar (Ankaratra, Andringitra, Andohahela, probablement aussi l’Isalo) mais qui est cultivée dans les villages du Plateau Central en association avec la sériciculture (CAPURON, 1969). La deuxième est ubiquiste, répandue dans les régions tropicale et subtropicale du monde entier ainsi que dans toute l’île de Madagascar sous tous ses climats (CHOUX, 1927) (Figure 2, p. 12).

1.2.2. IMPORTANCE DES Dodonaea

De nombreuses espèces sont connues pour leur importance économique et écologique mais aussi pour leurs vertus médicinales, propriétés pharmacologiques et toxiques. L’espèce la plus étudiée et citée de nombreuses fois dans la littérature est l’espèce Dodonaea viscosa. PEREZ (2016) a rapporté de nombreuses utilisations de cette plante dans les domaines agricole, médical, domestique, environnemental, ornemental et écologique.

1.2.2.1. IMPORTANCE ECONOMIQUE ET ECOLOGIQUE

Certaines espèces peuvent être utilisées comme :  biocarburants : par exemple, les huiles extraites des graines de Dodonaea viscosa (SURESH, 2015) ;  plantes ornementales : Dodonaea viscosa (LOMBARD et coll., 2011) ou Dodonaea angustifolia (CUNNINGHAM et coll., 2014) ;  matériaux de construction (bois de construction pour les logements, meubles, etc.), protection anti-érosion (plante de couverture) ou pour la reforestation : Dodonaea viscosa (PEREZ, 2016).

1.2.2.2. USAGES THERAPEUTIQUES

Partout dans le monde, de nombreuses vertus médicinales sont attribuées à plusieurs de ces plantes. C’est le cas de D. viscosa, de D. viscosa var. angustifolia, D. viscosa var. angustissima, D. lanceolata, D. physiocarpa, D. polyandra, D. angustifolia et de D. triquetra :

Synthèse bibliographique

 les feuilles de Dodonaea viscosa sont utilisées dans le traitement du rhumatisme, de l’hémorroïde, des maux de gorge, de la goutte, des coliques utérines et d’autres troubles impliquant ceux des muscles lisses, de la ménorragie, de l’asthme. Elles sont aussi employées pour soigner les dermatites et les infections cutanées, la malaria, les blessures, les fractures, la diarrhée, pour éviter les fausses couches, comme stimulants, astringents, antiprurigineux dans les éruptions cutanées, fébrifuges, anesthésiques, vermifuges (anthelminthiques et remèdes en cas d’acariasis) (CHABBRA et coll., 1991 a ; HEDBERG et coll., 1983 ; BROWNER, 1985 ; DESTA, 1993 ; GONZALES et coll., 1993 ; ROJAS et coll., 1996 ; ASRES et coll., 2001, VENKATESH, 2008; AL-SNAFI, 2017). La racine est utilisée en cas d’indigestion, pour traiter les menstruations irrégulières, le rhumatisme, comme galactagogue, astringente et fébrifuge (KOKWARO, 1976 ; HEDBERG et coll., 1983 ; CHABBRA et coll., 1991 a ; GONZALES et coll., 1993). L’écorce de tige est utilisée pour le traitement de l’éléphantiasis (DIMBI et coll., 1985).

 les parties aériennes séchées de D. viscosa var. angustifolia sont utilisées pour soulager les fièvres, soigner la pneumonie et la tuberculose (DOMINGUEZ et coll., 1980 ; WATT & BREYER-BRANDWIJIK, 1981). Leur bois est utilisé contre les flatulences et les coliques (WATT & BREYER-BRANDWIJIK, 1981).

 les parties aériennes de D. viscosa var. angustissima sont utilisées pour soulager les fièvres (LATZ, 1995) ;

 les feuilles de D. lanceolata sont employées pour soigner les douleurs et les morsures de serpents (LASSAK et McCARTHY 1990) ;

 les feuilles et les brindilles de D. physiocarpa sont utilisées pour atténuer les symptômes du rhume et de la grippe (BARR, 1993) ;

 les feuilles de D. polyandra sont utilisées empiriquement pour traiter les maux de dents et les douleurs qui y sont liées (SIMPSON, 2010) ;

 D. angustifolia est utilisée dans le traitement de la tuberculose et de la pneumonie (OMOSA et coll., 2014) ;

 les racines de D. triquetra sont utilisées pour soigner les blessures et les maux de dents (DOMINGUEZ et coll., 1980).

Synthèse bibliographique

Figure 1: Distribution géographique des plantes appartenant au genre Dodonaea dans le monde (En vert) [Source : inaturalist.org]

Figure 2: Distribution géographique de Dodonaea madagascariensis (en rouge) (Source : auteur)

Synthèse bibliographique

1.2.2.3. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES

Des études expérimentales sur ces plantes ont montré :  des propriétés anti-inflammatoires de l’extrait de feuilles de D. polyandra (SIMPSON et coll., 2011) ;  des effets anti-inflammatoires, analgésiques et antipyrétiques de l’extrait de feuilles de D. angustifolia (AMABEOKU et coll., 2001).  plusieurs activités pharmacologiques de D. viscosa comme :  des propriétés antidiabétiques des graines (KRUPANIDHI et coll., 2009) et des parties aériennes (ZHANG et coll., 2012);  des propriétés antiexsudatives, immunostimulatrices (stimulation de la phagocytose) des graines (WAGNER et coll., 1987) ;  une activité hépatoprotectrice de la plante entière (ALI et coll., 2014) et une activité antihyperlipidémique et hépatoprotectrice des feuilles (AHMAD et coll., 2012);  des effets anesthésiques locaux et relaxants sur les muscles lisses : des principes actifs spasmolytiques ont été isolés des parties aériennes (ROJAS et coll., 1996) ;  une activité antiulcéreuse mise en évidence à partir de différents extraits des parties aériennes (ARUN et ASHA, 2008) ;  une activité anti-inflammatoire de l’extrait de feuilles (GETIE et coll., 2003) ;  des propriétés anti-diarrhéiques d’extraits de racines (RAJAMANICKAM et coll., 2010) ;  une activité antiarthritique de l’acide hautriwaique extrait des feuilles (SALINAS-SÁNCHEZ et coll., 2015);  des propriétés antioxydantes de l’extrait méthanolique de la plante entière (RIAZ et coll., 2012).

1.2.2.4. PROPRIETES BIOLOGIQUES

1.2.2.4.1. Propriétés insecticides

Parmi les plantes appartenant au genre Dodonaea, D. viscosa et D. angustifolia possèdent des propriétés insecticides intéressantes. Ces plantes sont actives contre différents insectes nuisibles. Par exemple, les extraits de feuilles de D. angustifolia sont toxiques pour les larves de Earias vitella (LEPIDOPTERA : NOCTUIDAE) et possèdent des propriétés ovicides contre Helicoverpa armigera (LEPIDOPTERA : NOCTUIDAE). Des extraits de feuilles et de 13

Synthèse bibliographique rameaux de D. viscosa sont efficaces contre des pucerons (Rhopalosiphum padi et Myzus persicae) (HEMIPTERA : APHIDIDAE) et un coléoptère (Epilachna paenulata) (COLEOPTERA : COCCINELLIDAE) (DIAZ et ROSSINI, 2012). L’extrait de feuilles de D. viscosa est également actif contre des acariens (Tetranicus urticae) (EL-GENGAIHI et DIMETRI, 2011).

1.2.2.4.2. Pouvoir antimicrobien

 Les exsudats de la surface des feuilles de D. angustifolia sont actifs contre Escherichia coli (Gram -), Staphylococcus aureus (Gram +), Bacillus pumilus (Gram -) et Saccharomyces cerevisiae (champignon unicellulaire) (OMOSA et coll., 2014) ;  L’extrait de feuilles de D. viscosa var. angustifolia est actif aussi bien sur des Candida albicans isolés de patients VIH négatifs que sur des Candida albicans résistants isolés des patients VIH positifs (PATEL et COOGAN, 2008). Il est également actif sur des bactéries responsables d’infections buccales (Streptococcus mutans et Porphyromonas gingivalis) (PATEL et coll., 2013).  Les extraits de feuilles de D. viscosa (RAMAMURTHY et coll., 2013) sont actifs sur Bacillus subtilis, Aspergillus niger, Trichoderma viride, Candida albicans, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia et Pseudomonas aeruginosa. Les extraits de feuilles et de tiges possédent des propriétés antifongiques contre des champignons responsables d’infections cutanées comme Aspergillus niger, A. flavus, Paecilomyces variety, Microsporum gypseum, Trychophyton rubrum (PIRZADA et coll., 2010).  AMELO et coll. (2014) ainsi que MENGISTE et coll. (2012) ont mis en évidence une activité antiplasmodiale de l’extrait de racines et de graines de Dodonaea angustifolia. D’autres espèces, en plus des propriétés antibactériennes et antifongiques sont également antivirales. C’est le cas de D. viscosa dont les extraits de feuilles sont actifs contre  les virus Coxsackie B3 et le virus de la grippe A (GETIE et coll., 2003) ;  les virus coxsackie B3 et les rotavirus (SA-11) par inhibition de la réplication en adhérant sur la capside virale du CVB3 ou sur le récepteur viral de RV SA-11, les empêchant ainsi d’infecter les cellules hôtes (SHAHEEN et coll., 2015) ;  les virus HIV de type 1 (ASRES et coll., 2001 ; DE OLIVEIRA, 2012).

1.2.2.4.3. Cytotoxicité envers les lignées cellulaires cancéreuses

Une forte activité cytotoxique envers la lignée cellulaire MCF-7 du cancer du sein humain a été mise en évidence avec l’extrait de fleurs de D. viscosa (AL-SNAFI, 2017). Des saponines 14

Synthèse bibliographique

(dodoneasides A et B) extraites des racines de D. viscosa ont également montré une activité antiproliférative envers la lignée cellulaire humaine A2780 de cancer ovarien (CAO et coll., 2009). Quelques extraits d’écorces de tige de D. viscosa var angustifolia sont également actifs sur les lignées cellulaires MDA MB 231 du cancer du sein et PC3 du cancer de la prostate (FORESTRANIA et coll., 2016).

1.2.2.4.4. Activité allélopathique

BARKATULLAH et coll. (2010) ont rapporté que les extraits de feuilles, d’écorces et de fleurs de D. viscosa inhibent la germination, la croissance des plumules, le développement radiculaire ainsi que le poids de Pennisetum americanum (L) Skhyuman, Setaria italica (L) P. Beauv and Sorghum vulgare Pers. (surtout l’extrait de feuilles). L’huile essentielle de feuilles de la plante exerce également un effet allélopathique sur le romarin (Rosmarinus officinalis L.) (ROWSHAN et coll., 2014).

1.2.2.4.5. Propriétés molluscicides

Une activité molluscicide des saponines extraites des graines de Dodonaea viscosa (WAGNER et coll., 1987) a été démontrée.

1.2.2.4.6. Pouvoir hémolytique

Les saponines isolées des graines des graines de Dodonaea viscosa possèdent des propriétés hémolytiques (WAGNER et coll., 1987).

1.2.2.4.7. Autres propriétés toxiques

Il a été rapporté que les feuilles de D. viscosa peuvent être toxiques pour le bétail si elles sont ingérées en grande quantité (COLODEL et coll., 2003). Les graines de la plante possèdent également des propriétés ichtyotoxiques et sont utilisées en Inde pour capturer les poissons (WAGNER et coll., 1987).

1.2.3. TRAVAUX PHYTOCHIMIQUES ANTERIEURS RELATIFS AU GENRE Dodonaea

De nombreuses variétés de molécules ont été isolées des plantes appartenant à ce genre. Selon GHISALBERTI (1998), les classes de métabolites secondaires les plus communément isolées des espèces de Dodonaea sont des flavonoïdes et des diterpènes de type clérodane. Des saponines, des triterpènes, des stéroïdes et des phénylpropanoïdes non flavonoïdiques ont été également isolés. 15

Synthèse bibliographique

Des études phytochimiques préliminaires ont par exemple révélé la présence d’alcaloïdes, de flavonoïdes, d’huile fixe, de lipides, de stéroïdes, de composés phénoliques, de saponines, de tanins, de gommes, de mucilages, de glucides, de sucres réducteurs, de glycosides (AL- SNAFI, 2017), de glycosides cardiotoniques (RIAZ et coll., 2012), d’huile essentielle (WAGNER et coll., 1987) et de coumarines (TESHOME et coll., 2010) dans D. viscosa. DIAZ et ROSSINI (2012) ont également rapporté la présence d’huiles essentielles, de flavonoïdes, de terpènes, de phénols, de coumarines, de stérols et d’alcools dans D. angustifolia. Des flavonoïdes, des sucres réducteurs, des alcaloïdes, des saponines et des tanins ont également été détectés dans les feuilles de D. viscosa var. angustifolia (GETIE et coll., 2003).

De nombreuses molécules ont été isolées de nombreuses espèces de Dodonaea :  des diterpènes, notamment de type labdane et/ou de clérodane, comme dans le cas de ceux isolés de D. inaequifolia, D. ptarmicaefolia, D. petiolaris, D. microzyga, D. attenuata var linearis, D. boroniifolia (OMOSA, 2009) et de D. viscosa (OMOSA, 2009, HUANG et coll., 2010, NIU et coll., 2010; SALINAS-SÁNCHEZ et coll., 2012 ; WABO et coll., 2012 ; MOSTAFA et coll., 2014, MUHAMMAD et coll., 2016), de D. polyandra (SIMPSON et coll., 2012 ; GAO et coll., 2013 ; SIMPSON et coll., 2014) et de D. angustifolia (OMOSA et coll., 2014);

 des triterpènes de D. attenuata var. linearis, des graines de D. attenuata, des graines, des fleurs et des écorces de tiges de D. viscosa (comme le jegosapogenol et le R1barrigenol) (OMOSA, 2009). Ces triterpènes constituent en général la partie aglycone des saponines de D. viscosa.

 des acides shikimiques et des composés aromatiques dérivés de l’acide shikimique (OMOSA, 2009) ;

 des saponines isolées des graines de D. attenuata (HAN et coll., 1995) ; des écorces de tige de D. viscosa (DIMBI et coll., 1985) ;

 des flavonoïdes dont les espèces de Dodonaea sont riches :  La plupart des études sur cette famille chimique a été effectuée sur D. viscosa où environ une trentaine de flavonoïdes ont pu être identifiés (SIMPSON et coll., 2011) comme les flavonoïdes prénylés (SACHDEV, 1986 ; ABDEL-MOGIB et coll., 2001 ; NIU et coll., 2010), les flavonoïdes isoprénylés (GAO et coll., 2013) et les flavonoïdes alkylés (MUHAMMAD et coll., 2012) isolés des parties aériennes ; des flavones comme le santin et le kaempferol ont été isolées des feuilles (TEFFO et coll., 2010). De la viscosine (KARIM et coll., 16

Synthèse bibliographique

2015) et des flavonols comme le 5,7,2’-tetrahydroxyflavonol ont également été isolés de D. viscosa (OMOSA, 2009) ;  les feuilles et les tiges de D. polyandra (SIMPSON et coll., 2011), les feuilles de Dodonaea angustifolia en renferment également (OMOSA et coll., 2014) ainsi que les feuilles de D. angustifolia (VAN HEERDEN et coll., 2000) ;  de nombreux flavones ont été isolés de D. attenuata var. linearis (comme le 5,7- dihydroxy-3,6,4’-trimethoxyflavone), de D. viscosa var. angustifolia et de D. lobulata (comme le 5-hydroxy-3,6,7,4’-tetramethoxyflavone) (OMOSA, 2009).

1.3. GENERALITES SUR LES SAPONOSIDES (BRUNETON, 1993)

1.3.1. DEFINITION

Les saponosides sont des glycosides triterpéniques, stéroïdiques ou des alcaloïdes stéroïdiques. Les saponosides constituent un vaste groupe d’hétérosides très fréquent chez les végétaux (plus de 100 familles de plantes en renferment) (BRUNETON, 1993 ; MAN et coll., 2010) mais ils peuvent également être retrouvés chez les organismes marins (OLESZEK et MARSTON, 2000). Ils sont communs chez plusieurs variétés de végétaux supérieurs et sont habituellement retrouvés dans les racines, les tubercules, les feuilles, les fleurs et les graines (MAN et coll., 2010). D’après MAN et coll. (2010), il existe plus de 11 classes de saponosides dont les principales sont les dammaranes, tirucallanes, lupanes, hopanes, oléanane, taraxasternaes, ursanes, cycloartanes, lanostanes, cucurbitanes et stéroïdes. Le squelette de type oléanane est le plus commun et est présent dans la plupart des espèces végétales (VINCKEN et coll., 2007).

1.3.2. STRUCTURE DES SAPONOSIDES

1.3.2.1. STRUCTURE DES GENINES

Structuralement, selon la nature de leur génine, les saponosides peuvent être classés en saponosides à génines stéroïdiques, saponosides à génines triterpéniques et en pseudo- alcaloïdes ou alcaloïdes stéroïdiques (BRUNETON, 1993).

Synthèse bibliographique

1.3.2.1.1. Saponosides à génines stéroïdiques

Les génines stéroïdiques possèdent toutes un squelette à 27 atomes de carbone et sont presque exclusivement présentes chez les Liliopsidées (BRUNETON, 1993). Elles sont principalement rencontrées chez les AGAVACEAE, DIOSCOREACEAE, LILIACEAE, AMARYLLIDACEAE (MAN et coll., 2010), mais on en connait toutefois chez les FABACEAE, SCROPHULARIACEAE (BRUNETON, 1993) et les RHAMNACEAE (MAN et coll., 2010).

1.3.2.1.2. Saponosides à génines triterpéniques

Les génines triterpéniques sont des composés en C30. De loin les plus nombreuses, elles existent chez quelques animaux marins mais surtout chez les Magnoliopsidées (BRUNETON, 1993). Elles sont principalement rencontrées chez le genre Acanthopanax (ARALIACEAE), ARALALIACEAE, FABACEAE, SCROPHULARIACEAE, CAMPANULACEAE et CARYOPHYLLACEAE (MAN et coll., 2010).

1.3.2.1.3. Les alcaloïdes stéroïdiques

Il y a également une troisième catégorie de saponosides : les pseudo-alcaloïdes ou alcaloïdes stéroïdiques. Ils ne dérivent pas d’un acide aminé et en termes de propriétés, leur comportement n’est pas sans rappeler celui des saponosides mais ils sont plutôt rattachés au groupe des alcaloïdes (BRUNETON, 1993). Par exemple, les plantes appartenant au genre Solanum (SOLANACEAE) sont d’excellentes sources d’alcaloïdes stéroïdiques (BHUTANI et coll., 2010).

1.3.2.2. STRUCTURE DE L’AGLYCONE

Selon BRUNETON (1993), les oses constitutifs des saponosides sont généralement le D-glucose, le D- galactose, le D-arabinose, le D-rhamnose, le D-xylose et le D-fucose et au moins chez les saponosides triterpéniques, l’acide D-glucuronique. La partie sucrée de l’hétéroside existe sous forme de monosides mais elle est souvent constituée d’un ou deux oligosides linéaires ou ramifiés comportant jusqu’à une dizaine d’oses. Ces chaînes oligosidiques peuvent être liées à la génine par une liaison de type éther ou par une liaison de type ester (BRUNETON, 1993).

1.3.3. PROPRIETES DES SAPONINES ET LEURS UTILISATIONS

Les saponosides ou les saponines possèdent plusieurs propriétés :

Synthèse bibliographique

 propriétés physico-chimiques : agents moussants et émulsifiants, agents de solubilisation grâce à leurs propriétés tensio-actives, aux saveurs sucrées ou au contraire amères, etc. (BRUNETON, 1993 ; RIBEIRO et coll., 2013) ;  propriétés biologiques : hémolytiques, antimicrobiennes, fongicides, antivirales, antioxydantes, molluscicides, insecticides, ichtyotoxiques (toxicité observée envers les animaux à sang froid), toxiques pour les protozoaires. Elles peuvent également affecter la croissance, la prise de nourriture et la reproduction des animaux, etc. (FRANCIS et coll., 2002 ; RIBEIRO et coll., 2013) ;  propriétés pharmacologiques : immunostimulantes, hypocholestérolémiantes, anti- cancéreuses, etc. (FRANCIS et coll., 2002). Pour ces raisons, de nombreuses saponines trouvent leurs utilités dans plusieurs domaines comme dans l’industrie pharmaceutique, dans la cosmétique, dans l’industrie agro- alimentaire ou encore dans la lutte contre les organismes nuisibles (BRUNETON, 1993). BALADRIN (1996) a rapporté que les saponines provenant des plantes peuvent être exploitées de différentes manières par exemple dans la production d’hormones stéroïdes dans l’industrie pharmaceutique (comme la diosgénine), de contraceptifs oraux, d’additifs alimentaires, d’ingrédients des émulsions photographiques et des extincteurs de feux ainsi que dans le contrôle des schistosomes dans les cours d’eau, ou encore comme exhausteurs de goût.

Etude chimique

CHAPITRE 2 : ETUDE CHIMIQUE

2.1. INTRODUCTION

L’objectif visé est d’obtenir différents extraits et produits qui seront utilisés pour les investigations biologiques. Aussi, le présent chapitre traite des matériels et méthodes utilisés pour les obtenir, de leurs constituants ou de leur nature chimique et de leurs propriétés physico-chimiques.

2.2. MATERIELS ET METHODES

2.2.1. LA PLANTE UTILISEE

2.2.1.1. POSITION SYSTEMATIQUE

La plante a été identifiée par RAZAFINDRAHAJA Vololotahiana, botaniste de l’Herbarium TAN (Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza/Madagascar). Sa position systématique selon la classification de CRONQUIST (1981) est :  REGNE : PLANTAE  DIVISION : MAGNOLIOPHYTA  CLASSE : MAGNOLIOPSIDA  ORDRE: SAPINDALES  FAMILLE: SAPINDACEAE  GENRE : Dodonaea  ESPECE : madagascariensis  Auteur : Radlk. A Madagascar, cette plante est connue sous le nom de Tsitohavina (Merina) ou encore Hazondandy, Tsitoavana, Tsitoavina (Merina, Betsileo), Savia, Tsilamboza (Betsileo), Tsilambozana (Bara), Vilila (Tanala) (SAMYN, 1999).

2.2.1.2. DESCRIPTION BOTANIQUE

Dodonaea madagascariensis Radlk. (Figure 3, p. 21) est un arbuste de 4 à 10 m de hauteur (CHOUX, 1927), à port tortueux et à tronc rougeâtre. Le tronc et les grosses branches sont recouverts d’une écorce rougeâtre qui se détache en longues lanières à la façon de l’écorce de la vigne. Les feuilles sont composées paripennées (10 à 13 paires de folioles alternes et entières) au rachis ailé, les fleurs ont 5 à 7 pétales avec 11 à 14 étamines. Les fruits sont secs, à graines ailées (samares) (BOITEAU et coll., 1997 ; SCHATZ, 2001).

Etude chimique

Plante entière

Tronc Feuilles et fruits Capsules et graines

Figure 3 : Dodonaea madagascariensis Radlk. (Arbuste, tronc, rameaux feuillus et fruits)

Etude chimique

2.2.1.3. RECOLTE ET PREPARATION DU MATERIEL VEGETAL

La plupart des graines testées ont été récoltées aux alentours de la Réserve spéciale d’Ambohitantely (Région d’Analamanga, district d’Ankazobe) en Février 2015 à 1600 m d’altitude (S 18°11’53.0’’/ E 047°16’54.0’’). C’est aussi le cas des feuilles, des écorces de tiges et des péricarpes de fruits.

Les différentes parties de la plante ont été séchées à l’ombre puis triées. Ensuite, elles ont été réduites en poudre séparément et conservées à température ambiante (18 à 20°C) dans des récipients hermétiques.

2.2.1.4. UTILISATIONS EMPIRIQUES

Cette plante est surtout utilisée contre les angines, les abcès, les ulcères, les rhumatismes, la goutte, la fièvre, la syphilis, les contusions, les troubles mentaux et le cancer. La décoction de bois sert à préparer des bains et des fomentations astringentes (SAMYN, 1999). Les feuilles sont utilisées pour soigner les maux de ventre (TROTIN, 1970). Elles possèdent aussi des propriétés analgésiques et stimulantes. L’infusion des racines est employée pour soigner le rhume (www.doc-developpement-durable.org). En dehors de ses usages thérapeutiques, l’arbre est aussi utilisé comme haies-vives, bois d’énergie et comme plante textile (écorce) ou cultivée pour l’élevage du ver à soie indigène (Borocera madagascariensis) (PERRIER de la BATHIE, 1932 ; SAMYN, 1999). Les enquêtes menées auprès des villageois nous ont révélé que le macérat de feuilles de Dodonaea madagascariensis est utilisé comme pesticide naturel pour protéger les cultures des insectes nuisibles.

2.2.2. LES CONSOMMABLES DE LABORATOIRE

Les produits chimiques ainsi que les solvants utilisés (de marque Prolabo®, Merck® ou Labosi®) sont de qualité pure ou « pour analyse ».

Des plaques de gel de silice, Kieselgel 60 EP654 Merck®, sur support en aluminium de 20 x 20 cm (épaisseur de la couche 0,2 mm) sont utilisées pour la chromatographie sur couche mince (CCM) ; ces plaques peuvent être découpées aux dimensions voulues. Du gel réticulé de dextrane (Sephadextm LH-20, Sigma-Aldrich) et de silice 0,060-0,200 mm, 60 Å (Acros OrganicsTM, Fischer Scientific) sont utilisés pour la chromatographie sur colonne.

Etude chimique

2.2.3. METHODE D’EXTRACTION

2.2.3.1. PREPARATION DES EXTRAITS

Les broyats de graines sont mis dans un récipient en verre borosilicaté, puis délipidé à l'hexane (rapport 1/10 P/V) jusqu’à épuisement. Après filtration sur du papier Whatman n°1, le matériel délipidé est séché à l’air libre. Les graines délipidées ainsi que les broyats de feuilles, de péricarpes de fruits et d’écorces de tiges obtenus sont extraits plusieurs fois avec du méthanol (rapport 1/10 P/V) jusqu'à épuisement total. Les extraits hexanique et méthanolique sont récupérés, filtrés puis évaporés à 55-60°C sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif de marque Büchi (R110).

2.2.3.2. EXTRACTION DES SAPONOSIDES

Le protocole d’extraction est celui utilisé par RAJEMIARIMOELISOA et coll. (2015). Dans un bain de glace, le résidu d’évaporation de l’extrait méthanolique est repris avec du méthanol pur. La solution résultante est versée goutte à goutte dans un mélange d’acétone- éther diéthylique (50/50 ; v/v) toujours à 0°C. Les saponosides qui précipitent par refroidissement sont récupérés par centrifugation à 10 000 tours/min pendant 10 min (Hettich Universal II). Le surnageant est recueilli et encore traité avec le mélange acétone-éther diéthylique jusqu’à ce qu’il n’y ait plus formation de précipité. Après centrifugation (voir ci- dessus), les culots (repris dans de l’eau distillée) et les surnageants (extrait non saponosidique) sont récupérés puis séchés sous vide par évaporation.

2.2.4. METHODES DE PURIFICATION

Les procédés de fractionnement et de purification sont bioguidés par des tests de toxicité sur souris et des tests d’activité antimicrobienne (voir méthode au § 3.2.2.1, p. 41 et au § 5.2.3, p. 92). A chaque étape de purification l’homogénéité des produits obtenus est appréciée par CCM et par un criblage phytochimique.

2.2.4.1. FRACTIONNEMENT PAR LE n-BUTANOL (EXTRACTION LIQUIDE- LIQUIDE)

Cette méthode est basée sur une extraction de composés en solution aqueuse par un solvant non miscible, le n-butanol. L’extraction se fait à l’aide d’une ampoule à décanter. L’agitation est manuelle et réalisée de manière à éviter les émulsions. A la suite des différentes partitions qui sont répétées plusieurs fois, les différentes phases obtenues sont concentrées, séchées (par évaporation sous pression réduite) et analysées (MAHUZIER, 1990).

Etude chimique

2.2.4.2. CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE (CC)

Deux techniques chromatographiques ont été utilisées.

2.2.4.2.1. Chromatographie d’exclusion sur Sephadex LH-20

Elle permet de séparer des molécules, en fonction de leur taille et de leur forme. Un mélange de solutés de différentes masses molaires traverse une épaisseur donnée de gel : les grosses molécules, celles dont le diamètre est supérieur à celui des pores, sont exclues et sont éluées les premières, les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car en diffusant à l’intérieur des grains de gel, leur migration est ralentie. La séparation des solutés est donc réalisée dans l’ordre inverse des masses molaires (AUDIGIE, 1982).

Le gel de Sephadex LH-20 (§ 2.2.2 ; p. 22) est mis à gonfler dans le système d’élution dichlorométhane/butanol/acide acétique/ eau ou DBAE (20/60/20/20, p/p/p/p) pendant 3 h à température ambiante, le gel est ensuite dégazé sous vide puis coulé dans une colonne de verre de dimensions déterminées. La surface du gel est stabilisée par une rondelle de papier filtre. Le gel est ensuite équilibré par passage du même solvant équivalent à trois fois son volume. L’extrait saponosides totaux, dissous dans le même solvant, est déposé à la surface du gel. Les différentes fractions sont éluées par gravité et collectées puis regroupées sur la base de leur profil en CCM. Les extraits obtenus sont ensuite conservés pour les tests de criblage phytochimique et biologique.

Cette méthode a été utilisée pour la séparer les saponosides des composés phénoliques.

2.2.4.2.2. Chromatographie sur colonne de silice

Elle est basée sur le partage des solutés entre l’adsorbant fixe et la phase liquide mobile. Chacun des solutés est soumis à une force de rétention par adsorption et une force d’entrainement par la phase mobile. L’équilibre qui en résulte aboutit à une migration différentielle des solutés de l’échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation. L’adsorption est la fixation des molécules dissoutes par la phase fixe solide. Cette fixation est due à l’établissement de liaisons secondaires de surface entre l’adsorbant et la molécule adsorbée : liaison dipôle-ion, ou dipôle-dipôle ou liaison de Van der Waals (AUDIGIE, 1982).

Le gel de silice (§ 2.2.2 ; p. 22) mélangé au système d’élution DBAE (20/60/20/20, p/p/p/p) est coulé dans une colonne de verre de dimensions déterminées. La surface du gel est stabilisée par une rondelle de papier filtre. Une fois le gel équilibré par passage de trois fois 24

Etude chimique son volume du système d’élution (DBAE 20/60/20/20, p/p/p/p), l’extrait à étudier est déposé à la surface du gel. Les différentes fractions sont éluées par gravité, collectées à la sortie de la colonne, puis regroupées sur la base de leur profil chromatographique. Les extraits obtenus sont ensuite conservés pour les tests de criblage phytochimique et biologique.

2.2.5. CALCUL DU RENDEMENT D’EXTRACTION/ PURIFICATION

Le rendement d’extraction/purification (R %) est le rapport entre la masse du résidu sec après évaporation et celle de la prise d’essai. Il est déterminé par la formule suivante :

푀푎푠푠푒 푑푢 푟é푠𝑖푑푢 푠푒푐 푅 % = x 100 푃푟𝑖푠푒 푑′푒푠푠푎𝑖

2.2.6. METHODE ANALYTIQUE : Chromatographie sur Couche Mince (CCM) La CCM est utilisée pour un suivi régulier de l’homogéinité des extraits obtenus à chaque étape de purification. Des plaques de gel de silice sont utilisées (§ 2.2.2, p. 22). Différents systèmes d’éluants sont employés selon les conditions de séparation. Les chromatogrammes sont révélés par :  examen sous lampe ultraviolette en utilisant un détecteur UV Bioblock Scientific®;  des réactions colorées avec de la vanilline sulfurique (dont la composition est donnée en annexe III).

2.2.7. REACTIONS DE DETECTION DES FAMILLES CHIMIQUES

2.2.7.1. DETECTION DES ANTHRAQUINONES : TESTS DE BORNTRAGER (BEKRO et coll., 2007)

A 500 mg de matériel végétal en poudre ou de résidu d’extrait à sec d’extrait à analyser, sont ajoutés 5 ml d’acide chlorhydrique (HCl) 12 N dilué au 1/5. Le mélange est versé dans un tube à essais et ensuite chauffé au bain-marie bouillant pendant 30 min. Après refroidissement, il est extrait par 20 ml de chloroforme. De l’ammoniaque diluée 2 fois (0,5 ml) est ajoutée à la solution chloroformique. Une coloration rouge ou violette indique la présence d’anthraquinones.

Etude chimique

2.2.7.2. DETECTION DES TRITERPENES, STEROIDES ET STEROLS INSATURES (BRUNETON, 1987)

A 500 mg de matériel végétal en poudre ou de résidu sec sont ajoutés 3 ml de chloroforme. Après agitation, le mélange est laissé macérer pendant 12 h à +4°C. Après filtration, la phase chloroformique est répartie dans 3 tubes à essais dont l'un sert de témoin

2.2.7.2.1. Test de Lieberman-Burchard

Dans le deuxième tube, 2 gouttes d’anhydride acétique sont ajoutées. Après une agitation légère, un ajout de 1 ml d’acide sulfurique (H2SO4) 4N est effectué.  le virage au bleu-vert de la phase supérieure traduit la présence des stéroïdes ;  le virage au rouge, au violet ou au rose de l'anneau à l'interface traduit la présence des triterpènes.

2.2.7.2.2. Test de Salkowski

Dans le troisième tube, 1 ml de H2SO4 12 N est ajouté en inclinant le tube. La formation d’un anneau rouge au niveau de l’interface indique la présence de stérols insaturés.

2.2.7.3. DETECTION DES COMPOSES PHENOLIQUES : FLAVONOIDES, LEUCOANTHOCYANES, TANINS ET POLYPHENOLS (FONG et coll., 1977)

Pour la détection des flavonoïdes et des leucoanthocyanes, 500 mg de matériel végétal en poudre ou de résidu sec sont mis en suspension dans 3 ml d'éthanol 80 %. Après agitation, le mélange est laissé macérer pendant 12 h à +4°C. Après filtration, la phase éthanolique est répartie dans 3 tubes à essais dont l'un sert de témoin.

2.2.7.3.1. Détection des flavonoïdes : test de Willstatter

Dans le second tube, 0,5 ml de HCl 12N et 2 tournures de magnésium sont ajoutés. Les résultats sont lus au bout de 10 min. Le changement de coloration traduit la présence de flavonoïdes, à savoir :

- une coloration rouge pour les flavones ; - une coloration rouge-violacé pour les flavonones ; - une coloration rouge-pourpre pour les flavonols.

Etude chimique

2.2.7.3.2. Détection des leucoanthocyanes : test de Bate-Smith

Au troisième tube est ajouté 0,5 ml de HCl 12 N, puis le mélange est placé dans un bain- marie bouillant pendant 30 min. Après refroidissement, l’apparition d’une coloration rouge ou rouge-violet indique la présence de leucoanthocyanes.

2.2.7.3.3. Détection des tanins et des polyphénols

A 500 mg de matériel végétal en poudre ou d'extrait sont ajoutés 6 ml d'eau distillée bouillante (méthode basée sur celle d’HEMINGWAY et KARCHESY, 1989). Après agitation et refroidissement, le mélange est mis à macérer pendant 12 h à +4°C. La solution est répartie dans 4 tubes à essais dont le premier sert de témoin.

2.2.7.3.3.1. Test à la gélatine

Dans le second tube sont versées 4 gouttes de gélatine aqueuse 1 %. La présence de tanins hydrolysables de type catéchique dans l’extrait est mise en évidence par la formation d’un précipité blanc.

2.2.7.3.3.2. Test à la gélatine salée

Quatre gouttes de gélatine salée (gélatine aqueuse à 1 % en solution dans NaCl à 10 %) sont ajoutées dans le troisième tube. L’apparition d’un précipité blanc indique la présence de tanins de type pyrogallique.

2.2.7.3.3.3. Test au chlorure ferrique

Quatre gouttes d’une solution méthanolique de chlorure ferrique (FeCl3) à 10 % sont ajoutées dans le quatrième tube. Une coloration bleu-vert traduit la présence de tanins de type catéchol et une coloration noire bleuâtre celle de tanins de type pyrogallol.

Une réaction négative à la gélatine accompagnée d’une réaction positive au FeCl3 10 % (coloration verte ou bleue) traduit la présence de composés phénoliques autres que les tanins.

2.2.7.4. DETECTION DES SAPONINES

2.2.7.4.1. Test de mousse

Il s’agit d’une méthode de détection basée sur celle de FONG et coll. (1977). A 500 mg de poudre de graines ou d'extrait sont ajoutés 20 ml d'eau distillée bouillante. Après agitation et refroidissement, le mélange est laissé macérer pendant 12 h à +4°C. Après filtration, la phase aqueuse est transférée dans un tube à essais, mise sous agitation énergétique pendant 10 27

Etude chimique secondes. L’apparition d’une mousse de 3 cm de hauteur, persistant pendant 30 min, indique la présence de saponines dans l’extrait. Si le test de mousse est positif, le test hémolytique est effectué pour confirmer le résultat (voir § 3.2.2.3, p. 47).

2.2.7.4.2. Détermination de l’indice de mousse

Elle est effectuée selon la technique utilisée par SENHAJI (2005). Dans un bécher contenant 2 g du produit à analyser sont ajoutés 100 ml d’eau distillée. La solution est chauffée à ébullition pendant 30 min. Après refroidissement, elle est filtrée et son volume est ajusté à 100 ml. Une série de 1 à 10 ml de filtrat est placée dans 10 tubes à essais de 16 cm de haut et de 16 mm de diamètre. Le volume dans chaque tube est ajusté à 10 ml avec de l’eau distillée. Chaque tube est agité horizontalement pendant 15 secondes à raison de 2 agitations par seconde. Après 15 min de repos, la hauteur de la mousse résiduelle (en cm) est mesurée dans chaque tube.  si la hauteur de la mousse est inférieure à 1cm dans tous les tubes, l’indice est inférieure à 100 ;  si la hauteur de la mousse est de 1 cm dans l’un des tubes, l’indice de mousse correspond à l’inverse de la dilution du tube en question ;  si la hauteur de la mousse est supérieure à 1 cm dans tous les tubes, le décocté est dilué et la détermination de l’indice de mousse est ré-effectuée jusqu’à l’obtention d’une hauteur de mousse de 1 cm. En tenant compte des dilutions effectuées, l’indice de mousse correspond à l’inverse de la dilution du tube avec une hauteur de mousse de 1 cm. La présence des saponines dans la plante est confirmée avec un indice supérieur à 100.

2.2.7.5. DETECTION DES ALCALOIDES (BRUNETON, 1993)

A 500 mg de matériel végétal en poudre ou de résidu d’évaporation à sec d'extrait sont ajoutés 6 ml d'HCl 2 N.. Après agitation et refroidissement, le mélange est mis à macérer pendant 12 h à +4°C. Après filtration, la solution obtenue est répartie dans 4 tubes à essais, dont le premier sert de témoin.

2.2.7.5.1. Test de Mayer

Quatre gouttes de réactif de Mayer sont ajoutées dans le second tube. L’apparition d’une floculation ou d’un précipité blanchâtre ou crémeux révèle la présence d’alcaloïdes.

Etude chimique

2.2.7.5.2. Test de Wagner

Quatre gouttes de réactif de Wagner sont ajoutées dans le troisième tube. La présence d’alcaloïdes est indiquée par une floculation ou un précipité de couleur jaune.

2.2.7.5.3. Test de Dragendorff

Dans le quatrième tube sont ajoutées trois gouttes du réactif de Dragendorff. L’apparition d’une floculation ou d’un précipité jaune montre la présence d’alcaloïdes. Afin de confirmer la présence d'alcaloïdes dans la solution, une goutte du filtrat est déposée sur une plaque pour CCM puis une fois séchée, la plaque est immergée dans le réactif de Dragendorff. Une coloration rouge après séchage de la plaque confirme la présence d'alcaloïdes dans l'extrait.

2.2.7.6. DETECTION DES IRIDOIDES (FONG et coll., 1977)

A 500 mg de matériel végétal en poudre ou d'extrait sont ajoutés 6 ml d'eau distillée bouillante. Après agitation et refroidissement, le mélange est laissé macérer pendant 12 h à +4°C. Après filtration, 1 ml de la phase aqueuse est transféré dans un tube à essais, puis additionné de 2 ml de HCl 2 N. Le tout est chauffé au bain-marie bouillant pendant 30 min. La présence d’iridoïdes est démontrée par l’apparition d’une coloration bleue après refroidissement.

2.2.7.7. DETECTION DES COUMARINES (BEKRO et coll., 2007)

A 500 mg de matériel végétal en poudre ou d'extrait sont ajoutés 6 ml d'éthanol. Après agitation, le mélange est laissé macérer pendant 12 h à +4°C puis filtré et le filtrat est récupéré. Les coumarines sont mises en évidence par la réaction sur le cycle lactonique. Dans 2 tubes à essais, sont introduits 2 ml de solution éthanolique. Dans l’un 0,5 ml de soude (NaOH) à 10 % est additionné puis les 2 tubes à essais sont chauffés au bain-marie jusqu’à ébullition. Après refroidissement, 4 ml d’eau distillée sont rajoutés dans chaque tube à essais. Si le liquide du tube à essais dans lequel la solution alcaline est ajoutée est transparent ou plus transparent par rapport au liquide du tube à essais témoin (sans solution alcaline), la réaction est positive. En acidifiant la solution transparente avec quelques gouttes de HCl concentré, elle perd sa coloration jaune, devient trouble ou un précipité se forme en cas de réaction positive.

Etude chimique

2.3. RESULTATS

Deux types d’extrait ont été préparés :

 des extraits bruts d’organes de la plante et  des extraits partiellement purifiés de graines.

2.3.1. LES EXTRAITS BRUTS D’ORGANES

Il s’agit d’extraits préparés à partir de poudre de graines, de feuilles, d’écorces de tige et de racine et de péricarpe de fruit.

2.3.1.1. EXTRAITS DE GRAINES

A chaque extraction, 100 g de poudre de graines ont été délipidés avec de l’hexane (4 x 500 ml) puis extraits avec le méthanol (3 x 500 ml). Les rendements obtenus étaient respectivement de 13,65 % (soit 13,65 g d’extrait hexanique EHG) et 5,25 % (soit 5,25 g d’extrait méthanolique EMG).

2.3.1.2. EXTRAIT METHANOLIQUE DE FEUILLES (EMF)

Vingt grammes de poudre de feuilles ont été extraits avec du méthanol (3 x 500 ml). Le rendement obtenu était de 7,17 % (soit 1,434 g d’extrait).

2.3.1.3. EXTRAIT METHANOLIQUE D’ECORCES DE TIGE (EMET)

Vingt grammes de poudre d’écorces de tige ont été extraits avec du méthanol (3 x 500 ml). Le rendement obtenu était de 1,2 % (soit 0,240 g d’extrait).

2.3.1.4. EXTRAIT METHANOLIQUE D’ECORCES DE RACINE (EMER)

Vingt grammes de poudre d’écorces de racine ont été extraits avec du méthanol (3 x 500 ml). Le rendement obtenu était de 0,24 % (soit 0,048 g d’extrait).

2.3.1.5. EXTRAIT METHANOLIQUE DE PERICARPES DE FRUITS (EMPF)

Vingt grammes de poudre de péricarpe de fruits ont été extraits avec du méthanol (3 x 500 ml). Le rendement obtenu était de 2,48 % (soit 0,496 g d’extrait).

Le rendement d’extraction, aspects et couleurs des extraits bruts obtenus à partir des différents organes de la plante sont présentés dans le Tableau 3 (p. 31).

Etude chimique

Tableau 3 : Rendements d’extraction, aspects et couleurs des différents extraits bruts d’organes de la plante

Extraits EHG EMG EMF EMET EMER EMPF Rendements (%) 13,65 5,25 7,17 1,2 0,24 2,48 Jaune Marron Marron Couleurs Jaune Marron Marron foncé foncé foncé Poudre Poudre Poudre Poudre Poudre Aspects Huile amorphe amorphe amorphe amorphe amorphe EHG : Extrait hexanique de graines ; EMG : extrait méthanolique de graines ; EMF : Extrait méthanolique de feuilles ; EMET : Extrait méthanolique de d’écorces de tige ; EMER : Extrait méthanolique d’écorces de racine ; EMPF: Extrait méthanolique de péricarpes de fruit

2.3.1.6. LES GROUPES CHIMIQUES PRESENTS DANS LES POUDRES D’ORGANES DE LA PLANTE

Les principaux groupes chimiques présents dans les poudres de différents organes de la plante sont montrés dans le Tableau 4.

Tableau 4 : Criblage phytochimique des graines, de péricarpes de fruit, d’écorces de tige et de racine

ORGANES DE LA PLANTE GROUPES TESTS CHIMIQUES Péricarpes Ecorces Ecorces de Graines Feuilles de fruit de tige racine Mayer - - - - - Alcaloïdes Wagner - - - - - Dragendorff - - - - Flavones Willstatter ± - ++ + ++ Iridoïdes HCl (à chaud) - - - - - Leucoanthocyanes Bate-Smith - - - + +

Saponines Indice de mousse +++ - ++ + ++

Stéroïdes Liebermann- ± - - - - Triterpènes Burchard ++ ++ ++ ± - Stérols insaturés Salkowski +++ ++ +++ ± ± Coumarines NaOH (à chaud) + - - - - Gélatine 1 % - + ++ - - Gélatine salée Tanins - - ++ - - 10 %

FeCl3 10 % - + ++ - -

Polyphénols FeCl3 10 % + - - + + Anthraquinones Borntrager - - - - -

Les différentes parties de D. madagascariensis contenaient principalement des saponines, des flavones (sauf le péricarpe de fruit), des stérols insaturés, des triterpènes (sauf les écorces de racine). Les coumarines, les stéroïdes n’ont été trouvés que dans les graines. Les feuilles et péricarpes de fruit renfermaient des tanins. Les leucoanthocyanes n’étaient présents que dans les écorces de tige et de racine. Les polyphénols étaient présents dans les 31

Etude chimique graines et aussi dans les écorces de tige et de racine. Les alcaloïdes, les iridoïdes et les anthraquinones n’ont pas été détectés.

2.3.2. LES DIFFERENTS EXTRAITS DE GRAINES

Plusieurs techniques de séparation ont été adoptées pour la purification de EMG. Mais auparavant, la présence de saponosides dans les graines a été confirmée par la détermination de l’indice de mousse.

2.3.2.1. INDICE DE MOUSSE

Lors du criblage phytochimique des graines, les saponosides ont été détectés. Ensuite une analyse quantitative des graines a été réalisée. Selon les méthodes décrites au § 2.2.7.4.2 (p. 28), après plusieurs dilutions, une mousse de 1 cm de hauteur apparait dans le tube contenant 5 ml de décocté à 0,2 %, v/v (renfermant donc 0,01 ml de décocté). Or, le volume total dans le tube est 10 ml : l’indice de mousse qui est l’inverse de la dilution (c’est-à-dire 10 ml / 0,01 ml) a été estimée à 1000, ce qui confirme la présence de saponosides.

La suite de l’étude chimique a alors été orientée vers la purification des saponosides.

2.3.2.2. EXTRAITS BUTANOLIQUES

L’EMG (2g) dissous dans 150 ml d’eau distillée a été mélangé avec 150 ml de n-butanol selon la méthode décrite au § 2.2.4.1 (p. 23). La partition a été répétée 4 fois. Deux extraits ont été obtenus :

 la phase organique EP1 avec un rendement de 54,5 % par rapport à EMG soit 1,09 g ;

 la phase aqueuse EP2 avec un rendement de 14,53 % par rapport à EMG soit 0,291 g.

2.3.2.3. SAPONOSIDES TOTAUX

L’extrait EP1 (1g) a été dissous dans 50 ml de méthanol pur. La solution obtenue est versée goutte à goutte dans 50 ml de mélange d’acétone-éther diéthylique (50/50, v/v) refroidi à 0°C dans un bain de glace. Les saponosides qui précipitent par refroidissement sont récupérés par centrifugation. Le surnageant est recueilli et encore traité avec 50 ml de mélange acétone-éther diéthylique jusqu’à ce qu’il n’y ait plus formation de précipités (voir méthode au § 2.2.3.2, p. 23). Au total, 500 ml d’acétone-éther ont été nécessaires pour l’extraction des saponosides totaux.

 Les culots, repris dans de l’eau distillée puis évaporés à sec constituent les saponosides totaux EP3 avec un rendement de 50,13 % par rapport à EP1 (soit 0,501 g) ;

Etude chimique

 Le résidu obtenu après évaporation à sec du surnageant constitue l’extrait non saponosidique EP4 obtenu avec un rendement de 17,24 % par rapport à EP1 (soit 0,172 g).

2.3.2.4. SAPONOSIDES PURIFIES

L’extrait EP3 a été soumis à une chromatographie sur Sephadex LH-20 suivie d’une chromatographie sur gel de silice (voir méthode au § 2.2.4.2.1, p. 24).

2.3.2.4.1. Extraits obtenus par chromatographie de EP3 sur Sephadex LH20

L’extrait EP3 (80 mg), dissous dans 800 µl du système de solvants DBAE (dichlorométhane/ butanol/ acide acétique/ eau/ : 20/60/20/20, p/p/p/p) a été déposé sur une colonne de 0,9 cm x 28 cm équilibrée avec le même solvant. L’élution a été menée avec le solvant DBAE et des fractions de 0,3 ml ont été collectées à un débit d’environ 0,1 ml/min. Les fractions ayant le même profil sur CCM ont été rassemblées. Quatre lots, dénommés extraits

EP5 à EP8, ont été constitués.

La chromatographie a été répétée autant de fois que nécessaire pour obtenir la quantité exigée par l’étude chimique et les tests biologiques.

2.3.2.4.2. Extraits obtenus par chromatographie de EP5 sur gel de silice

L’extrait EP5 (397,4 mg) dissous dans 2,5 ml du solvant DBAE a été déposé sur une colonne de gel de silice en phase normale (1,5 cm x 51 cm), équilibrée avec le même solvant. L’élution a été faite avec le solvant DBAE à un débit d’environ 1 ml/min et des fractions de

2 ml ont été collectées. Vingt (20) extraits, EP9 à EP28, ont été obtenus après regroupement des fractions ayant le même profil sur CCM. Comme dans le cas de la chromatographie sur LH-20, le procédé a été répété autant de fois que nécessaire pour obtenir la quantité exigée par l’étude chimique et les tests biologiques.

Les méthodes qui ont été utilisées pour purifier les principes toxiques des graines de D. madagascariensis sont résumées dans la Figure 4 (p. 34).

Etude chimique

2.3.2.5. RENDEMENT DE PURIFICATION DES EXTRAITS DE GRAINES Les rendements de purification, les aspects et couleurs des différents extraits purifiés de graines sont présentés dans les Tableaux 5 à 7 (p. 35).

Poudre de graines

Hexane (pour 100 g de poudre=4 x 500 mL d’hexane)

Extrait hexanique EHG Marc

Méthanol (pour 100 g de poudre=3x500 mL de méthanol)

Extrait méthanolique EMG Marc

n-butanol (1 g d’EMG pour 4 x 75 mL de butanol)

Phase aqueuse EP2 Phase organique EP1

Méthanol pur (1 g de EP1 dans 50 mL de méthanol) Acétone/ éther diéthylique (50/50, v/v) (500 mL pour 1 g de EP1) Bain de glace

Extrait non saponosidique EP4 Saponosides totaux EP3

Chromatographie sur colonne de LH-20, DBAE (2/6/2/2, p/p/p/p)

EP5 EP6 EP7 EP8 Chromatographie sur colonne de silice, DBAE (2/6/2/2, p/p/p/p)

EP9 à EP28 Figure 4 : Schéma récapitulatif des procédés d’extraction et de purification des principes toxiques de graines v/v : volume par volume

EHG : extrait hexanique de graines ; EMG : extrait méthanolique de graines ; EP1 : phase organique obtenue par partition de EMG au n-butanol ; EP2 : phase aqueuse obtenue par partition de EMG au n-butanol ; EP3 : saponosides totaux obtenus à partir de EP1 ; EP4 : extrait non saponosidique obtenu à partir de EP1 ; EP5 : saponosides purifiés par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de l’extrait EP3 ; EP6 à EP8 : composés phénoliques obtenus par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de l’extrait EP3 ; EP9 à EP28 :extraits obtenus par chromatographie sur colonne de silice de l’extrait EP5 ; DBAE : dichlorométhane/butanol/acide acétique/eau 34

Etude chimique

Tableau 5 : Rendement de purification et caractéristiques des différents extraits purifiés de graines

Extraits EP1 EP2 EP3 EP4 Rendements (%) 54,5* 14,53* 50,13** 17,24** Couleurs Jaune Marron Jaune clair Marron Poudre Poudre Poudre Poudre Aspects amorphe amorphe amorphe amorphe EP1 : phase organique obtenue par partition de EMG au n-butanol ; EP2 : phase aqueuse obtenue par partition de EMG au n-butanol ; EP3 : saponosides totaux obtenus à partir de EP1 ; EP4 : extrait non saponosidique obtenu à partir de EP1 ; * : rendement par rapport à EMG ; ** : rendement par rapport à EP1

Tableau 6 : Rendement de purification, aspects et couleurs des différents extraits obtenus après chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3

Extraits EP5 EP6 EP7 EP8 Rendements par rapport à EP3 (%) 50,13 0,5 2,17 3,33 Poudre Extrait Extrait Extrait Aspects amorphe visqueux visqueux visqueux Marron Marron Marron Couleurs Blanc clair clair clair EP5 : saponosides purifiés par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3 ; EP6 à EP8 : composés phénoliques par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3

Tableau 7 : Rendement de purification, aspects et couleurs des différents extraits obtenus par chromatographie sur colonne de silice de EP5

Extraits Rendements par rapport à EP5 (%) Couleurs Aspects EP9 1,25 Jaune Poudre amorphe EP10 9,03 Jaune Poudre amorphe EP11 36,3 Jaune Poudre amorphe EP12 0,33 Jaune Poudre amorphe EP13 10,5 Jaune Poudre amorphe EP14 1,25 Jaune Poudre amorphe EP15 4 Jaune Poudre amorphe EP16 3 Jaune Poudre amorphe EP17 1,75 Jaune Poudre amorphe EP18 3 Jaune Poudre amorphe EP19 4,25 Jaune Poudre amorphe EP20 6 Jaune Poudre amorphe EP21 4,25 Jaune Poudre amorphe EP22 5,5 Jaune Poudre amorphe EP23 3,5 Jaune Poudre amorphe EP24 1,25 Jaune Poudre amorphe EP25 2,75 Jaune Poudre amorphe EP26 1,25 Blanc Poudre amorphe EP27 3,5 Blanc Poudre amorphe EP28 1,24 Blanc Poudre amorphe

2.3.2.6. GROUPES CHIMIQUES PRESENTS DANS LES EXTRAITS DE GRAINES Les groupes chimiques présents dans les extraits de graines sont présentés dans le Tableau 8 (p. 36). Au cours des différentes étapes de purification, les résultats du criblage phytochimique des extraits purifiés montrent que les saponosides ont pu être séparés des autres molécules chimiques. 35

Etude chimique

Tableau 8 : Résultats du criblage phytochimique des différents extraits de graines

FAMILLE CHIMIQUE EMG EP1 EP2 EP3 EP4 EP5 EP6 EP7 EP8 Flavones ++ ++ - + ++ - + + + Saponines +++ +++ +/- +++ - + - - - Stéroïdes ± ± - - + - - - - Triterpènes + + - + + + - - - Stérols insaturés ± ± ± - ± - - - - Coumarines ------Polyphénols + + - + + - - - +

EMG : extrait méthanolique de graines ; EP1 : phase organique obtenue par fractionnement de EMG au n- butanol ; EP2 : phase aqueuse obtenue par fractionnement de EMG au n-butanol ; EP3 : saponosides totaux obtenus à partir de EP1 ; EP4 : extrait non saponosidique obtenu à partir de EP1 ; EP5 : saponosides purifiés par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3 ; EP6 à EP8 : composés phénoliques obtenus par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3

2.3.2.7. ANALYSE DE L’HOMOGENEITE DES EXTRAITS

L’évolution de l’homogénéité des différents extraits obtenus a été suivie par CCM. Les chromatogrammes récapitulatifs obtenus lors des différentes étapes d’extraction et de purification sont montrés dans la Figure 4 (p. 34).

D’après ces chromatogrammes, les différentes étapes de purification de EMG ont permis d’éliminer plusieurs bandes majeures qui sont retrouvées dans la phase aqueuse obtenue après fractionnement de EMG au n-butanol (EP2), dans l’extrait non saponosidique (EP4) et dans les extraits EP6 à EP8 contenant les composés phénoliques obtenus après chromatographie sur colonne de SEPHADEX LH-20 d’EP3.

Etude chimique

EMG : extrait méthanolique de graines EP1 : phase organique obtenue par partition de EMG au n-butanol EP2 : phase aqueuse obtenue après fractionnement de EMG au n-butanol EP3 : saponosides totaux obtenus à partir de EP1 EP4 : extrait non saponosidique obtenu à partir de EP1

EP5 : saponosides purifiés par chromatographie sur colonne de EMG EP1 EP2 EP3 EP4 EMG EP1 EP2 EP3 EP4 EMG EP1 EP2 EP3 EP4 Sephadex LH-20 de EP3 EP6 à EP8 : composés phénoliques obtenus par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3

EP9 à EP28 : extraits obtenus par chromatographie sur colonne de silice de EP5

Solvant de chromatographie :  Butanol/acide acétique/ eau (60/20/20 p/p/p) [(a), (b), (c)]  Dichlorométhane/ butanol/ acide acétique/ eau (20/60/20/20 p/p/p/p) (d) [(d), (e)]

EP3 EP5 EP6 EP7 EP8

(e)

EP9 EP10 EP11 EP12 EP13 EP14 EP28

Figure 5 : Chromatogrammes récapitulatifs de purification des principes toxiques des graines de D. madagascariensis

Révélation : (a) à la lumière UV à 254 nm (b) à la lumière UV à 366 nm (c), (d) et (e) : au réactif à la vanilline sulfurique

Etude chimique

2.4. DISCUSSION

Les graines de Dodonaea madagascariensis contiennent de l’huile. Elle a été extraite avec de l’hexane avec un rendement de 12 %, une valeur comparable à celle des graines de D. angustifolia avec un rendement de 16,3 % (BEDADA, 2016).

A l’exception des alcaloïdes et des quinones, les composés qui ont été détectés dans les feuilles étaient les mêmes que ceux trouvés par TROTIN et coll. (1972), à savoir les flavonoïdes, les saponosides et les tanins. Ceci pourrait s'expliquer par le fait que, la production de métabolites secondaires dépend du lieu (effet terroir) et de la période de récolte (stade phénologique) de la plante (STEVENSON et coll., 2012). Et vu que les plantes testées provenaient d’endroits différents et récoltées à des périodes différentes, il n’est pas étonnant qu’elles ne renfermaient pas les mêmes métabolites secondaires.

L’étude s’est focalisée sur les saponosides constituant le groupe chimique majoritaire des graines. Le procédé utilisé pour leur extraction et leur purification est basé sur celui mis au point par DEORE (2009). Vingt-huit (28) extraits partiellement purifiés ont ainsi été obtenus.

Bien que la structure chimique des saponosides de la plante ne soit pas encore déterminée, des informations importantes les concernant sont connues. Notons que d’une part, l’absence de stéroïdes et de stérols insaturés et d’autre part, la présence de triterpènes dans les extraits purifiés plaident en faveur de la nature triterpènique des génines des saponosides de la plante. Ceci a été confirmé par la coloration pourpre des bandes sur CCM, une coloration caractéristique des saponosides triterpèniques (RUNYORO et coll., 2006). A propos de la nature des aglycones, rappelons que lors du fractionnement par le n-butanol de EMG, les saponosides ont tous migré dans la phase organique. Ce comportement indique que ces molécules sont relativement peu polaires, c’est-à-dire que les aglycones sont des courtes chaînes glucidiques, peut-être une seule chaîne glucidique (HASSAN et coll., 2010).

Au cours des étapes de purification, les saponosides ont pu être séparés des autres groupes chimiques présents dans EMG.

Il faudra encore attendre les résultats d’une étude chimique plus poussée sur les extraits obtenus pour connaître d’une part, le nombre et l’originalité des saponines que contient D. madagascariensis et d’autre part, leur distribution dans les différentes parties de la plante.

Etude chimique

2.5. CONCLUSION

Pour conclure, les procédés d’extraction et de purification utilisés ont permis d’obtenir divers extraits bruts et partiellement purifiés à partir de différents organes de la plante, en particulier des graines (Tableau 9).

L’analyse phytochimique effectuée sur les différents organes et leurs extraits a révélé que les saponosides sont les métabolites secondaires majoritaires de la plante et sont responsables de la toxicité sur souris utilisée pour bioguider les procédés d’extraction et de purification.

A l’exception de l’extrait méthanolique d’écorces de racine dont la quantité disponible était trop faible, tous les extraits ont été utilisés pour les tests biologiques. Notons d’ores et déjà que la grande majorité des investigations ont été réalisées avec les extraits de graines, notamment EMG qui était plus disponible quantitativement.

Tableau 9: Liste des différents extraits bruts et partiellement purifiés obtenus

ORGANES EXTRAITS SIGLE Extrait hexanique de graines EHG Extrait méthanolique de graines EMG

Phase organique obtenue par partition de EMG au n-butanol EP1

Phase aqueuse obtenue par partition de EMG au n-butanol EP2

Saponosides totaux obtenus à partir de EP1 EP3 GRAINES Extrait non saponosidique obtenu à partir de EP1 EP4

Saponosides purifiés par chromatographie sur colonne de Sephadex LH- EP5 20 de EP3 Composés phénoliques obtenus par chromatographie sur colonne de EP6 à EP8 Sephadex LH-20 de EP3

Extraits obtenus par chromatographie sur colonne de silice de EP5 EP9 à EP28 FEUILLES Extrait méthanolique de feuilles EMF TIGES Extrait méthanolique d’écorces de tige EMET (écorces) RACINES Extrait méthanolique d’écorces de racine EMER (écorces) PERICARPE DE Extrait méthanolique de péricarpe de fruit EMPF FRUITS

Effets des extraits sur les animaux

CHAPITRE 3 : EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX

3.1. INTRODUCTION

Les travaux évoqués dans ce chapitre se rapportent aux expérimentations effectuées sur divers modèles animaux avec les divers extraits de la plante (voir § 3.2.1.2, p. 41).

Les principaux objectifs visés ont été d’évaluer, de caractériser les effets toxiques de ces extraits et de voir dans quelle mesure ils peuvent être utilisés comme pesticides.

3.2. MATERIELS ET METHODES

3.2.1. MATERIELS

3.2.1.1. LES ANIMAUX D’EXPERIMENTATION

3.2.1.1.1. Les souris (Mus musculus)

Des souris blanches femelles de race OF-1 âgées de 2 mois pesant entre 20 et 30 g, fournies par l’Institut Pasteur de Madagascar (IPM), ont été utilisées. Elles sont élevées dans des pièces à température stable (24±2°C) où la photopériode est de 12 h. Ces animaux ont accès, ad libitum, à l’eau et à la nourriture constituée de granulés (code 14 20 X) produits par LFL Madagascar S.A.R.L.

3.2.1.1.2. Les cobayes (Cavia porcellus)

Les cobayes mâles de 300 ± 50 g utilisés proviennent de différentes fermes locales. Pendant 7 jours, ils sont adaptés à la nourriture et à l’environnement de l’animalerie de l’Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA).

3.2.1.1.3. Les poussins (Gallus gallus domesticus)

Des poussins d’élevage de 24 h après éclosion, fournis par AVITEC (Mahazo), ont été utilisés. Dès réception et tout au long des tests qui durent 24 h, ils sont placés dans des cartons bien chauffés à l’aide d’une ampoule électrique.

3.2.1.1.4. Les alevins de poissons (Cyprinus carpio)

Les alevins de 2 à 4 cm qui ont servi aux tests ont été fournis par un centre d’élevage agréé situé à Ambohimangakely (Antananarivo). Ils sont placés dans un aquarium contenant de l’eau de rizière. Une période d’adaptation de trois (3) jours aux conditions de l’aquarium est nécessaire avant les tests.

Effets des extraits sur les animaux

3.2.1.1.5. Les têtards de grenouilles (Ptychadena mascareniensis)

Les têtards de grenouilles sans patte utilisés, ont été collectés dans les rizières autour du Campus universitaire d’Ankatso. Ils sont placés dans un aquarium contenant de l’eau de rizière. Une période d'adaptation de 3 jours dans l’aquarium est nécessaire avant les tests.

3.2.1.1.6. Les puces (Xenopsylla cheopis)

Les puces testées sont celles de rat provenant de l’élevage de l’IPM.

3.2.1.2. LES EXTRAITS UTILISÉS

Les extraits testés sont listés ci-dessous. Notons que tous les extraits ont été utilisés pour les tests de toxicité sur souris.  EHG : extrait hexanique de graines (huile fixe) ;  EMG : extrait méthanolique de graines utilisé pour tous les tests sur les animaux ;

 EP1 : phase organique obtenue après partition de EMG au n-butanol ;

 EP2 : phase aqueuse obtenue après partition de EMG au n-butanol ;

 EP3 : saponosides totaux obtenus à partir de l’EP1;

 EP4 : extrait non saponosidique obtenu à partir de l’EP1

 EP5: saponosides purifiés obtenus après chromatographie sur colonne de

SEPHADEX LH-20 de l’extrait EP3;

 EP6 à EP8 : composés phénoliques obtenus après chromatographie sur colonne de

SEPHADEX LH-20 de l’extrait EP3 ;

 EP9 à EP28 : extraits obtenus après chromatographie sur colonne de silice de

l’extrait EP5.  EMF : extrait méthanolique de feuilles  EMET : extrait méthanolique d’écorces de tige  EMER : extrait méthanolique d’écorces de racine  EMPF : extrait méthanolique de péricarpes de fruit

3.2.2. METHODES

3.2.2.1. TESTS SUR SOURIS

3.2.2.1.1. Administration par voie sous-cutanée (s.c.)

La nuque de la souris est maintenue entre le pouce et l’index d’une main. L’aiguille est ensuite insérée par l’autre main, biseau vers le haut à la base du pli cutané ainsi formé. Le

Effets des extraits sur les animaux volume requis (Tableau 10) est ensuite injecté. Les animaux témoins reçoivent les volumes correspondants de solution saline (NaCl 9 ‰). Tableau 10 : Volume injecté selon la voie d’administration V.A. s.c. p.o. ip. Espèce (ml/pour 25 g) (ml/ pour 25 g) (ml/ pour 25 g) Souris 0,3 0,25 0,3 Poussin - 0,25 0,3 V.A. : voie d’administration

3.2.2.1.2. Administration par voie per os (p.o.)

A l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de gavage, l’extrait étudié est injecté lentement dans l’estomac de l’animal tenu verticalement par la peau de la nuque (Tableau 10). Les animaux témoins recoivent de l’eau distillée.

3.2.2.1.3. Administration par voie intrapéritonéale (ip.)

La nuque de la souris est maintenue entre le pouce et l’index, et la queue entre les autres doigts d’une main. L’autre main injecte le volume d’extrait requis (Tableau 10) dans la partie abdominale gauche ou droite de la souris. Les animaux témoins reçoivent les volumes correspondants de solution saline (NaCl 9 ‰).

3.2.2.1.4. Détermination de la dose létale 50 % sur souris

La DL50 est la dose qui tue 50 % des animaux en 24 h. Elle a été déterminée par la méthode de REED et MUENCH (1938) par :

 calcul à partir de la formule suivante :

0,5 − 푁 log 퐷퐿 50 = log 퐵 + x 푙표𝑔 푟 푀 − 푁

où : B = dose immédiatement inférieure à la DL50 N = mortalité provoquée par la dose B en fraction décimale M = mortalité provoquée par la dose immédiatement supérieure à la DL50 en fraction décimale r = raison de progression géométrique.

 méthode graphique utilisant la courbe des totaux cumulatifs des animaux ayant succombé et celle des totaux cumulatifs des animaux ayant survécu. La valeur de la DL50 correspond au point d’intersection de ces deux courbes.

La valeur de la DL50 est la moyenne des valeurs obtenues par les 2 méthodes.

Effets des extraits sur les animaux

3.2.2.1.5. Etude des lésions anatomo-pathologiques (HOULD, 1984)

Une étude des lésions macroscopiques et microscopiques au niveau de différents organes de souris ayant reçu EMG par voie ip. et p.o. est effectuée. Trois (3) lots de cinq (5) souris sont utilisés. Une dose sublétale de EMG a été administrée à 4 souris de chaque lot. La 5ème souris qui sert de témoin reçoit du sérum physiologique (NaCl 9 ‰) ou de l'eau distillée. Une souris traitée et non traitée de chaque lot sont ensuite sacrifiées et leurs organes prélevés pour une étude histopathologique. Les souris traitées par voie ip. sont sacrifiées 6, 12 et 24 h après l'injection tandis que celles traitées par voie p.o. ne sont sacrifiées qu'après les 30 jours d'administration quotidienne de l'extrait.

3.2.2.1.5.1. Prélèvement et fixation des organes

Après leur sacrifice, les organes (cerveau, cœur, poumons, foie, reins, estomac, intestin grêle et gros intestin) des souris traitées et des souris témoins sont prélevés et conservés pendant environ 48 h dans la solution de BOUIN (composition donnée en ANNEXE V) utilisée comme liquide fixateur. Cela constitue l’étape de fixation afin d’immobiliser les tissus dans un état aussi proche que possible du vivant, d’inhiber l’autolyse cellulaire et la putréfaction des tissus.

3.2.2.1.5.2. Déshydratation et imprégnation

Les organes sont découpés en petits fragments de 2 à 4 mm d’épaisseur qui sont ensuite introduits dans des cassettes, en vue de les inclure dans de la paraffine (§ 3.2.2.1.5.2, p. 43). Afin de rendre cette étape d’inclusion possible, l’eau contenue dans ces organes doit d’abord être éliminée car elle n’est pas miscible avec la paraffine. De l’alcool éthylique à 90°, 96° et 100° sont alors utilisés successivement, puis du xylène afin que les fluides se substituent les uns aux autres jusqu’à l’imprégnation de la paraffine. Ces différents traitements constituent la déshydratation. L’imprégnation s’effectue ensuite dans une paraffine maintenue à l’état liquide par un séjour dans une étuve dont la température a été réglée légèrement au-dessus de son point de fusion. Lorsque l’imprégnation est complète, les pièces sont retirées. Ces différentes étapes durent environ 17 h.

Effets des extraits sur les animaux

3.2.2.1.5.3. Inclusion et microtomie

Il s'agit d'une étape d’enrobage ou encore de moulage. Les fragments tissulaires sont incorporés dans des blocs de paraffine par immersion dans de la paraffine à 56°C coulée dans un moule de métal. Les moules sont ensuite placés à 4°C afin de solidifier la paraffine. En refroidissant, les fragments de tissus sont inclus dans un bloc solide et homogène de paraffine à partir duquel va s’effectuer la microtomie afin de confectionner des coupes minces et régulières de 3 µm d’épaisseur à l’aide de microtomes rotatifs (LEICA® RM 2245).

3.2.2.1.5.4. Etalement des coupes

Les coupes minces sont placées dans un bain thermostaté puis déplissées délicatement au moyen d’un scalpel. Elles sont ensuite repêchées à l’aide d’une lame de verre préalablement enduite de substances adhésives (ici un mélange de glycérine-albumine) pour que les coupes puissent y adhérer.

3.2.2.1.5.5. Coloration des coupes et montage des lames

L'étape de la coloration des coupes est d'abord précédée du déparaffinage qui consiste à éliminer la paraffine des tissus avec du xylène pour permettre aux colorants de pénétrer. Les coupes sont ensuite hydratées dans des bains en utilisant des concentrations décroissantes d’alcool éthylique (100°, 95° et 90°) pour enlever le xylène puis rincées à l’eau courante. Lors de l’étape de coloration, le tissu est coloré avec des colorants basiques comme l’hématoxyline (teintant les noyaux en bleu ou en noir) et des colorants acides telle l’éosine (teintant le cytoplasme en rose ou en rouge). Les lames colorées sont ensuite déshydratées et éclaircies au xylène. Après montage entre lame et lamelle grâce à un milieu de montage à durcissement rapide (Eukitt®), l’observation et la prise de photographie des coupes colorées sont effectuées sous un microscope optique (BRESSER®).

3.2.2.1.6. Etude des effets de EMG sur les fonctions rénales et hépatiques

L’étude consiste à évaluer les effets de EMG sur les fonctions rénales et hépatiques par comparaison des paramètres biochimiques sanguins des souris traitées et des souris non traitées. Une dose sublétale de EMG est administrée quotidiennement par voie orale pendant 30 jours. Deux (2) lots de cinq souris sont utilisés : le premier sert de lot de témoin et ne reçoit que de l'eau distillée, le second reçoit de l'extrait dissous dans de l'eau distillée. L’administration est faite à une heure fixe en début de journée pendant toute la durée du test.

Effets des extraits sur les animaux

Au 31ème jour, les souris sont anesthésiées par du chloroforme. Le sang veineux est prélevé des veines rétro-orbitales des souris à l'aide d’une pipette Pasteur. Un volume de 1ml est recueilli dans des microtubes afin de réaliser l’analyse des différents paramètres biochimiques à étudier. Les échantillons de sang sont ensuite centrifugés à 600 x g pendant 10 min à 4°C (centrifugeuse Biofuge frisco/ Heraus instruments). Les sérums ainsi recueillis servent à doser le taux sanguin de créatinine, d’alanine aminotransférase (ALAT) et d’aspartate aminotransférase (ASAT) par une méthode colorimétrique utilisant un spectromètre semi-automatique (Mindray BA 88) et des réactifs de marque Human.

 La détermination enzymatique du taux d'ASAT dans le sang par méthode cinétique (mesure de la disparition de NADH par spectrométrie est basée sur les réactions suivantes:

2-oxoglutarate + L-aspartate ↔ L-glutamate + oxaloacétate Oxaloacétate + NADH + H+ ↔ L-malate + NAD+

La diminution de l'absorbance due à la conversion du NADH en NAD+, proportionnelle à l'activité ASAT dans le spécimen est mesurée à 340 nm (BERGMEYER et coll., 1976).

 La détermination enzymatique du taux d’ALAT dans le sang par méthode cinétique (mesure de la disparition de NADH par spectrométrie) est basée sur les réactions suivantes :

2-oxoglutarate + L-alanine ↔ L-glutamate + pyruvate Pyruvate + NADH + H+ ↔ L-lactate + NAD+

La diminution de l'absorbance due à la conversion du NADH en NAD+, et qui est proportionnelle à l'activité ASAT dans le spécimen est mesurée à 340 nm (BERGMEYER et coll., 1980).

 Le dosage de la créatinine par méthode cinétique repose sur la mesure de la formation d'un complexe coloré entre la créatinine et le picrate en milieu alcalin. La vitesse

Créatinine + acide picrique ↔ Complexe créatinine picrate 45

Effets des extraits sur les animaux de formation de ce complexe est proportionnelle à la concentration de la créatinine présente dans l'échantillon (POPPER et coll., 1937 ; BARTELS et coll. ; 1971) et se fait selon la réaction suivante :

3.2.2.1.7. Confection d’appâts empoisonnés à base de graines de Dodonaea madagascariensis

Les différents ingrédients sont bien mélangés puis additionnés d’un volume d’eau suffisant pour obtenir une pâte molle bien homogène. Des granulés sont obtenus en introduisant cette dernière dans une seringue adaptée d’où elle ressort sous forme cylindrique, puis elle est sectionnée au fur et à mesure de sa production. Les granulés encore humides, sont séchés à température ambiante à l’abri du soleil et donnés à des souris (n=2) préalablement mises à jeûn mais approvisionnées en eau (RAZANATSEHENO, 2012).

Deux sortes de granulés ont été préparées :  Des granulés à base de poudre de graines : la poudre de graines est additionnée d’un peu d’eau pour avoir une pâte modelable qui se prête bien à la confection de granulés ;  Des granulés à base de EMG et de provende : EMG est mélangé avec de la provende broyée. Le mélange est ensuite transformé en granulés.

La provende utilisée est un mélange alimentaire équilibré sous forme de granulés produits par la LFL Madagascar S.A.R.L. (code 14 20 X) qui renferment essentiellement de la poudre de maïs, des tourteaux d’arachides, de la farine de poisson, de la farine de sang, de la poudre d’os,… Elle constitue la nourriture habituelle des souris à l’animalerie du LABASM.

3.2.2.2. ETUDE DES EFFETS DE EMG SUR LE CŒUR ISOLE DE COBAYE

L'effet de EMG sur la chronotropie et l'inotropie d'oreillettes isolées de cobaye est enregistré à l'aide d'un myographe (7006 isotonic transducer Ugobasile, 7082 pre-amplifier Ugobasile et 7070 recorder Gemin). L'animal anesthésié au chloroforme est exsanguiné en coupant les artères carotides et les veines jugulaires. Le cœur est prélevé après ouverture de la cage thoracique de l'animal. L’organe est rapidement excisé après section des vaisseaux, puis immédiatement placé dans une solution de perfusion (milieu de Krebs-Henseleit modifié, cf. annexe II), à 37°C. Le milieu est maintenu à 37°C et oxygéné par du carbogène (95 % O2 et 5 % CO2).

Effets des extraits sur les animaux

Les deux oreillettes sont séparées des ventricules puis mises en suspension dans une cuve pour organe isolé muni d’un bain thermostaté contenant la solution physiologique, maintenue à 37°C et aérée au carbogène. Les oreillettes sont reliées à un transducteur isotonique et une tension isotonique de 1 g leur est imposée. Les oreillettes sont ensuite stimulées avec de l'isoprénaline à 10-9 M pendant 5 min. Quand le taux et l'amplitude de la contraction sont stables, un lavage à trois reprises par renouvellement de la solution physiologique dans le bain est effectué avant d'introduire des concentrations croissantes de l'extrait allant de 6,25 à 25 µg /ml. Ce lavage est toujours effectué chaque fois que l'on passe d'une concentration à une autre. Afin de suivre l’évolution des paramètres tels que les amplitudes et les fréquences, les contractions sont enregistrées toutes les 15 s, 1, 3 et 5 min après chaque ajout d’extrait. Le nombre de battements par minute (chronotropie) et l'amplitude de la contraction (inotropie) sont mesurés par rapport à la référence d'enregistrement faite juste avant l'addition de EMG (les premières données enregistrées prises comme témoin).

3.2.2.3. ETUDE DE L’ACTIVITE HEMOLYTIQUE DE EMG

Le dosage de l’activité hémolytique de EMG est basé sur la technique utilisée par RAKOTOBE (1985) et VO et coll. (2017). Il a été réalisé à partir d’une suspension érythrocytaire normalisée de mouton à 6.108 cellules/ml de tampon Phosphate Buffered Saline ou PBS à pH=8 dont la composition est présentée en ANNEXE IV.  préparation de la suspension érythrocytaire normalisée (SEN) : Le sang de mouton défibriné est recueilli dans un tube stérile. Après avoir ajouté une solution tampon PBS, le mélange est centrifugé au moyen d’une centrifugeuse réfrigérée (BREMSE, T52) à 4°C pendant 5 min à 5 000 x g. Puis le culot est recupéré puis additionné d’une solution tampon PBS (lavage). Après 3 lavages successifs, le culot obtenu constitue la suspension d’hématies à 100 %. La suspension est diluée avec du PBS jusqu’à l’obtention d’une absorption de 0,2 à 541 nm, correspondant à 6.108 cellules/ml (suspension stable pendant une semaine à 4°C).  détermination de la DH50 : des concentrations croissantes d’EMG, de 0,334 à 30,06 µg/ml sont réparties dans des tubes auquels 0,5 ml de SEN est ajouté. Après agitation, les tubes sont incubés à 37°C pendant 45 min, temps nécessaire pour que l’hémolyse ne progresse plus. Les tubes sont centrifugés à 5000 x g pendant 5 min (4°C) et l’hémoglobine libérée sous l’action de l’extrait est dosée au spectrophotomètre à 541 nm. Un tube contenant

Effets des extraits sur les animaux

uniquement du PBS sert de témoin négatif et un témoin de lyse à 100 % est obtenu par lyse hypotonique des hématies, en remplaçant le PBS par de l’eau distillée. Par définition, une unité hémolytique (UH) qui correspond à une dose hémolytique

(DH50), est la quantité de l’extrait nécessaire pour obtenir 50 % de lyse de la SEN dans les conditions décrites ci-dessus. Cette valeur est obtenue graphiquement sur une courbe log- probit (qui transforme en droite la sigmoïde de la courbe de lyse) où le pourcentage de lyse est fonction du logarithme de la concentration de l’extrait mis dans chaque tube. Les expériences sont réalisées en triple. Le pourcentage d’hémolyse P (%) selon VO et coll. (2017) est calculé par la formule suivante :

퐴푏푠 é푐ℎ. − 퐴푏푠 푐푡푟푙 푛é𝑔. 푃 % = x 100 퐴푏푠 푐푡푟푙 푝표푠. − 퐴푏푠 푐푡푟푙 푛é𝑔.

avec :  Abs (éch.) : absorbance de l’échantillon  Abs (ctrl nég.) : absorbance du témoin négatif  Abs (ctrl pos.) : absorbance du témoin positif

La transformation des pourcentages d’inhibition conduisant à de nouvelles valeurs dénommées « probit » a été réalisée en utilisant la table de FINNEY (1952).

La DH50 est déterminée en utilisant l’équation de la droite à partir de la courbe de lyse et en inversant le logarithme de la concentration correspondant à la valeur « probit » égal à 5,00 (qui correspond à 50 % de lyse).

3.2.2.4. TESTS SUR LES ANIMAUX À SANG FROID

Les tests consistent en l’exposition des animaux à différentes concentrations de composés actifs pendant un temps déterminé. Le pourcentage de mortalité pour chaque concentration utilisée est déterminé après 24 h d’observation.

3.2.2.4.1. Tests sur les alevins de carpes (Cyprinus carpio)

Les alevins, répartis en plusieurs lots, sont exposés à des concentrations croissantes de EMG dissous dans de l'eau de source (volume final égal à 250 ml) suivant une progression géométrique de raison connue. Un lot non traité avec EMG sert de témoin. Les tests sont effectués en triple sur une période de 24 h.

Effets des extraits sur les animaux

3.2.2.4.2. Tests sur les têtards de grenouilles (Ptychadena mascareniensis)

Les têtards, répartis en plusieurs lots, sont exposés à des concentrations croissantes de EMG dissous dans de l'eau de source (volume final égal à 250 ml) suivant une progression géométrique de raison connue. Un lot non traité avec EMG sert de témoin. Les tests sont réalisés en triple sur une période de 24 h.

3.2.2.4.3. Test sur les puces (Xenopsylla cheopis)

Ce test est basé sur la technique utilisée par BOYER et coll. (2014). Il s'agit d'exposer les puces à une concentration définie du produit pendant un temps bien déterminé, et de compter le nombre de puces paralysées ou mortes à des intervalles de temps définis. La mortalité finale est déterminée après 24 h d'observation. Le pourcentage de puces trouvées mortes est ensuite calculé. EMG est déposé sur des bandelettes préalablement quadrillées découpées à partir de papier Whatman (réf. 1002 917) au format 1,5 x 6 cm. Le papier filtre, au verso duquel sont inscrits au crayon le nom de l’extrait, la concentration et la date d'imprégnation, est placé sur une planche à épingle (inscription vers le bas). L'extrait (15,1 µl) est déposé au milieu de chaque carreau de la bandelette de papier au moyen d’une micropipette de 20 à 200 µl. Le volume déposé est proportionnel à celui de la norme de l’OMS qui est de 2 ml d’extrait à tester pour 12 x 15 cm de papier. L'ordre d'imprégnation se fait à partir du témoin négatif (eau distillée) suivi de la dose la plus faible vers la plus concentrée. Les bandelettes sont séchées sur une planche à épingle. Après 24 h, les bandelettes sont enveloppées dans un papier d'aluminium à +4°C. Des puces réparties en plusieurs lots sont transférées dans chaque tube. Puis une bandelette (1,5 x 6 cm) imprégnée d'une concentration déterminée d'extrait est placée dans chaque tube d’exposition alors que du papier vierge non imprégné est placé dans le tube contenant le lot témoin. Les bandelettes sont laissées dans les tubes pendant un temps d'exposition de 8 h, une fois ce délai passé les bandelettes imprégnées de matières actives sont enlevées puis remplacées par du papier vierge comme dans le cas du lot témoin. L'observation est faite toutes les 10, 20 et 30 min, puis après toutes les heures jusqu'à la huitième heure en comptant le nombre de puces ayant subi un effet KD ou « knock- down ».

Effets des extraits sur les animaux

Les résultats sont lus après 24 h d'observation et le pourcentage de mortalité pour chaque concentration testée est calculé. Et si le taux de mortalité observé dans le lot témoin est compris entre 5 % et 20 %, la formule d'ABBOT sera appliquée afin de corriger le pourcentage de mortalité des puces testées. Si la mortalité est supérieure à 20 %, le test ne sera pas validé. % 푡푟푎𝑖푡é − % 푡é푚표𝑖푛 푃표푢푟푐푒푛푡푎𝑔푒 푑푒 푚표푟푡푎푙𝑖푡é % = x 100 100 − % 푡é푚표𝑖푛 Où :  % traité : pourcentage de mortalité dans le lot traité  % témoin : pourcentage de mortalité dans le lot témoin

3.3. RESULTATS

3.3.1. EFFETS DES EXTRAITS SUR LA SOURIS

3.3.1.1. EFFETS DES EXTRAITS DE DIVERSES PARTIES DE LA PLANTE

La toxicité des graines a été comparée à celle des autres organes (péricarpes de fruit, feuilles et écorces de tige). Deux doses de chaque extrait (300 et 1200 mg/kg) ont été utilisées par voie ip. L’EHG a été administré par voie p.o (§ 3.2.2.1.2, p. 42).

L’huile extraite des graines ne provoque aucun symptôme d’intoxication. L’extrait méthanolique de graines (EMG) s’est révélé le plus toxique des extraits d’organes testés (Tableau 11).

Tableau 11 : Effets des extraits issus des différentes parties de la plante

MORTALITÉ (%) DOSES (mg/kg) EHG EMG EMF EMET EMPF 8,08 g/kg (voie p.o.) 0 - - - - 300 mg/kg (voie i.p.) - 100 0 67 0 1200 mg/kg (voie i.p.) - 100 33 100 0

EHG : Extrait hexanique de graines ; EMG : extrait méthanolique de graines ; EMF : Extrait méthanolique de feuilles ; EMET : Extrait méthanolique d’écorces de tige ; EMPF: Extrait méthanolique de péricarpes de fruit

3.3.1.2. EFFETS DES EXTRAITS DE GRAINES

EMG, EP1, EP3, EP5, EP10, EP11 et EP14 étaient tous toxiques par voie ip. Les extraits étaient de plus en plus toxiques au fur et à mesure que la purification a avancé : le niveau de toxicité était EMG < EP3 < EP5 < EP10 < EP11 < EP14 (Tableau 12, p. 51). Certains extraits

Effets des extraits sur les animaux

(EP10, EP11 et EP14) étaient encore toxiques à la dose correspondant à la DL0 de EMG par voie ip. sur souris (Tableau 13, p. 51).

Tableau 12 : Taux de mortalité (%) obtenus à différentes doses des extraits de graines sur souris par voie ip.

EXTRAITS DOSES EMG EP1 EP2 EP3 EP4 EP5 EP6 EP7 EP8

46,27 mg/kg (DL100) 100 100 0 100 0 100 0 0 0

36,12 mg/kg (DL50) 40 100 0 100 0 100 0 0 0

30,48 mg/kg(DL0) 0 20 0 20 0 67 0 0 0

EMG : extrait méthanolique de graines ; EP1 : phase organique obtenue par partition de EMG au n- butanol ; EP2 : phase aqueuse obtenue par partition de EMG au n-butanol ; EP3 : saponosides totaux obtenus à partir de EP1 ; EP4 : extrait non saponosidique obtenu à partir de EP1 ; EP5 : saponosides purifiés par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3 ; EP6 à EP8 : composés phénoliques obtenus par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3

Tableau 13: Toxicité sur souris par voie ip. à 30,48 mg/ml (DL0) des extraits EP9 à EP28 (extraits après chromatographie sur silice de EP5)

Temps de EXTRAITS MORTALITE (%) survie

EP9 0 -

EP10 100 ˃12 h

EP11 100 4 h

EP12 0 -

EP13 0 - EP14 100 2 h EP15 0 - EP16 0 - EP17 0 - EP18 0 - EP19 0 - EP20 0 - EP21 0 - EP22 0 - EP23 0 - EP24 0 - EP25 0 - EP26 0 - EP27 0 - EP28 0 -

Effets des extraits sur les animaux

3.3.1.3. INFLUENCE DE LA VOIE D’ADMINISTRATION SUR LA TOXICITE DE EMG

L’influence de trois voies d’administration – ip., s.c. et p.o. – sur la toxicité de EMG a été étudiée en testant quatre doses différentes par voie. La première (46,27 mg/kg) correspond à la DL100 par voie ip. et les trois autres – 600,8 ; 2228,16 et 3000 mg/kg – sont des doses égales à 13, 48 et 65 fois la DL100 respectivement. Les résultats sont présentés dans le Tableau 14.

Tableau 14 : Influence de la voie d’administration sur la toxicité de EMG Taux de mortalité (%) Dose (mg/kg) Voie ip. Voie s.c. Voie p.o. 46,27 (DL100 ip.) 100 0 0 600,8 (DL100 ip. x 13) 100 100 0 2228,16 (DL100 ip. x 48) 100 100 60 3000 (DL100 ip. x 65) 100 100 100

EMG a été toxique par les trois voies d’administration et les symptômes d'intoxication développés par les souris étaient presque les mêmes. Cependant, le temps d’apparition et l’intensité des symptômes ainsi que le taux de mortalité dépendaient énormément de la dose injectée et de la voie d’administration :  A la dose de 46,27 mg/kg, aucun symptôme n'a été observé pour les voies s.c. et p.o. Certains symptômes ne sont apparus que plus tardivement et ont nécessité des doses plus élevées ;  Le taux de mortalité n’a atteint 100 % qu’à des doses beaucoup plus élevées : 600,8 mg/kg par voie s.c. et 3g/ kg par voie p.o.

Les symptômes d’intoxication (Tableau 15, p. 54) ont été notamment des troubles :

 nerveux (trouble moteur de type 6, prostration, tremblement fin du corps, hoquet, piloerection, ataxie, eno-/exophtalmie), fréquemment observés et apparus souvent en premier ;  respiratoires (hyperpnée, dyspnée, augmentation du rythme respiratoire) ;  cardiovasculaires (dilatation des vaisseaux sanguins au niveau de l'oreille) ;  digestifs (émission de selles molles et glaireuses, diarrhée mais qui n’ont pas été observées par voie s.c.).

Effets des extraits sur les animaux

3.3.1.4. DETERMINATION DE LA DL50 DE EMG SUR SOURIS

Huit doses en progression géométrique de raison r = 1,11, variant entre 30,48 mg/kg et 46,27 mg/kg de poids corporel ont été employées.

Chaque dose a été injectée par voie i.p. à un lot de 5 souris. Sept (7) lots ont été ainsi traités avec des doses croissantes de EMG. Le lot témoin a été traité avec du NaCl 9 ‰.

 Par la méthode graphique (voir § 3.2.2.1.4 ; p. 42) : la valeur de la DL50 correspond

à 36,75 mg/kg. Les valeurs utilisées pour l’estimation de la DL50 (24h) sur souris et la courbe des totaux cumulatifs sont présentées dans le Tableau 17 et la Figure 6 (p. 56 et 57) ;  Par calcul (selon la formule décrite au § 3.2.2.1.4 ; p. 42) : elle est de 35,48 mg/kg (Tableau 16, p. 56).

Ainsi, la valeur moyenne de la DL50 (24 h) par voie ip. a été estimée à 36,12 mg/kg de souris.

Effets des extraits sur les animaux

Tableau 15 : Les symptômes observés selon la voie d’administration

VOIE D’ADMINISTRATION SYMPTÔMES D’INTOXICATION Juste après l’injection  Agitation  Contorsion de l’abdomen  Augmentation du rythme respiratoire  Oreilles tirées vers l’arrière  Selles molles glaireuses  Certaines souris ont le hoquet 30 min après injection  Capillaires sanguins dilatés au niveau des oreilles 45 min après injection INTRAPERITONÉALE  Enophtalmie (46,27 mg/kg) 2 à 6 h après injection  Prostration (souris accroupies sur la litière)  Tremblement fin du corps  Augmentation du rythme respiratoire  Augmentation de la profondeur de la respiration suivie d’une diminution du rythme respiratoire  Piloérection  Trainement de la patte postérieure  Arrêt d’émission de selles glaireuses  Enophtalmie Les symptômes ont persisté jusqu’à la mort de l’animal (100 % de mortalité au bout de 6 h).

Juste après l’injection  Oreilles tirées vers l’arrière  Démarche anormale  Prostration  Perte d’appétit  Accélération du rythme respiratoire SOUS-CUTANÉE 1 h après injection  Contorsion de l’abdomen (600,8 mg/kg)  Augmentation du rythme respiratoire  Enophtalmie  Capillaires sanguins dilatés au niveau des oreilles 7 h après injection  Souris très affaiblie  Oreilles tirées vers l’arrière Les symptômes ont persisté jusqu’à la mort de l’animal (100 % de mortalité au bout de 15 h).

Effets des extraits sur les animaux

Tableau 15 (suite): Les symptômes observés selon la voie d’administration

VOIE D’ADMINISTRATION SYMPTÔMES D’INTOXICATION

Cinq min après injection  Contorsion de l’abdomen  Augmentation du rythme respiratoire  Exophtalmie  Oreilles tirées vers l’arrière 30 min après injection  Diarrhée PER OS 4 à 6 h après injection (3000 mg/kg)  Diminution du rythme respiratoire  Diminution de la profondeur de la respiration  Tremblement fin du corps  Exophtalmie  Les oreilles ne sont plus tirées vers l’arrière  Trainement des pattes postérieures  Piloérection Les symptômes ont persisté jusqu’à la mort des souris (100 % de mortalité au bout de 4 h)

Effets des extraits sur les animaux

Tableau 16 : Résultats de la détermination de la DL50 (24h) par voie ip. chez la souris, selon la méthode de REED et de MUENCH (1938)

Doses en mg/kg Nombre de décès après Total des Total des % de de souris 1h 2h 3h 4h 5h 6h 8h 9h 10h 12h 16h 22h 24h décès survivantes mortalité 30,48 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 33,83 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 3 40 37,55 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 3 2 60 41,69 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 4 1 80 46,27 0 0 0 2 0 3 0 0 0 0 0 0 0 5 0 100

Tableau 17 : Valeurs utilisées pour l’estimation de la DL50 (24h) sur souris de EMG par la méthode graphique des totaux cumulatifs Nombre de Total des Total des Totaux cumulatifs Totaux cumulatifs Doses en mg/kg de souris souris testées décès survivantes des mortes des vivantes 30,48 5 0 5 0 11 33,83 5 2 3 2 6 37,55 5 3 2 5 3 41,69 5 4 1 9 1 46,27 5 5 0 14 0

Effets des extraits sur les animaux

15 totaux cumulatifs des morts totaux cumulatifs des vivants 10

nombred'animauxtestés DL50 0 25 30 35 40 45 50 dose (mg/kg)

Figure 6 : Courbe des totaux cumulatifs par la méthode graphique de REED et MUENCH (1938)

3.3.1.5. LESIONS ANATOMO-PATHOLOGIQUES

3.3.2.5.1. Lésions macroscopiques

L'examen macroscopique des organes prélevés (cerveau, cœur, poumons, foie, reins, estomac, intestin grêle et gros intestin) n'a révélé aucune anomalie.

3.3.2.5.2. Lésions microscopiques

Les effets de EMG au niveau tissulaire ont été appréciés par comparaison de coupes histologiques d’organes (cerveau, cœur, poumon, estomac, foie, rein, intestin grêle et gros intestin) prélevés sur souris non traitées et sur des souris traitées. Les doses utilisées ont été de 25,4 mg/kg de souris pour l’administration par p.o. (exposition subchronique à EMG) et de 36,53 mg/kg de souris par voie i.p. (tests de toxicité aiguë). Les Figures 7 à 16 (p. 62 à 71) montrent les principales lésions histologiques des organes après injection de EMG. Parmi les 8 organes examinés, le cerveau, le cœur et l’estomac paraissaient histologiquement normaux tandis que des lésions ont été observées au niveau des poumons, du foie, des reins et des intestins. Les résultats de l’étude anatomo-pathologique ont permis de noter que :

Effets des extraits sur les animaux

1) Deux réactions de l’inflammation (inflammation aigue) ont eu lieu entre la sixième et la douzième heure après injection ip. (les détails des lésions histologiques observées par voie ip. causées par EMG sont présentés dans le Tableau 18, p. 59).  la réaction vasculo-exsudative se traduisant par une dilatation des vaisseaux sanguins des organes cibles (poumon, foie, rein, intestin grêle et gros intestin) et un infiltrat inflammatoire à polynucléaires neutrophiles avec extravasation des hématies (poumons) ou présence de foyers nécrotiques (foie) ou œdémateux (foie et intestin grêle) ;  la réaction cellulaire pour assurer la détersion tissulaire caractérisée par la présence des lymphoplasmocytes avec hyperplasie des capillaires au niveau des foyers inflammatoires observés au niveau du foie et des intestins. Cette détersion s’est poursuivie jusqu’à la 24ème heure au niveau des intestins et du poumon. Par contre, elle était déjà terminée à la 24ème heure et suivie par la réparation tissulaire au niveau du foie.

2) Au bout de 10 jours d’ingestion de l’extrait, les vaisseaux sanguins étaient dilatés au niveau des intestins (contact direct avec l’extrait), des poumons, foie, reins après absorption intestinale des principes actifs. Cette phase exsudative de la réaction inflammatoire était caractérisée par un infiltrat inflammatoire constitué de polynucléaires neutrophiles avec des phénomènes œdémateux ou hémorragiques.

La détersion tissulaire était amorcée avec la présence des lymphocytes et plasmocytes dans les foyers inflammatoires des organes cibles avec hyperplasie des capillaires et hypersécrétion muqueuse des glandes (intestin grêle et gros intestin). Les détails des lésions histologiques observées par voie p.o. causées par EMG sont présentés dans le Tableau 19 (p. 61).

3.3.2.6. EFFETS DE EMG SUR LES PARAMETRES BIOCHIMIQUES SERIQUES

EMG a été administré quotidiennement par voie orale pendant 30 jours à la dose de

12,72 mg/kg, une dose 2,4 fois inférieure à la DL0 par voie ip. sur souris. Cette dose a été choisie pour s’assurer qu’aucune souris ne décède au cours du traitement. Les résultats (Tableau 20, p. 61) ont montré qu’aucune modification significative de la concentration sérique d'ASAT, d'ALAT et de créatinine sanguins par rapport au témoin n’a été notée.

Effets des extraits sur les animaux

Tableau 18 : Lésions tissulaires provoquées par EMG à 36,53 mg/kg par voie ip. en fonction de la durée d’exposition DUREE DE ORGANES LESIONS L’EXPOSITION Histologie normale 6 h CERVEAU Histologie normale 12 h Histologie normale 24 h

Histologie normale 6 h CŒUR Histologie normale 12 h Histologie normale 24 h

 Vaisseaux sanguins très dilatés avec extravasation des hématies  Infiltrat inflammatoire constitué de nombreux 6 h polynucléaires neutrophiles plus ou moins altérés, quelques lymphocytes  Nombreux vaisseaux sanguins dilatés POUMON  Hyperplasie capillaire, avec microhémorragie interstitielle 12 h  Infiltrat inflammatoire lymphocytaire  Hyperplasie des capillaires  Infiltrat inflammatoire focal constitué de lymphocytes et d’histiocytes 24 h  Microhémorragies interstitielles détruisant parfois des alvéoles  Histologie normale 6 h ESTOMAC  Histologie normale 12 h  Histologie normale 24 h Histologie normale 6 h  Vaisseaux sanguins dilatés REIN  Extravasation des hématies dans les tissus interstitiels 12 h  Foyers micro-hémorragiques  Quelques vaisseaux sanguins dilatés 24 h  Hyperplasie capillaire  Veines centrolobulaires et capillaires sinusoïdes dilatés  Inflammation portale à prédominance lymphocytaires avec dilatation veineuse 6 h  Quelques polynucléaires neutrophiles épars FOIE  Foyers de nécrose  Quelques polynucléaires neutrophiles altérés 12 h  Foyers œdémateux  Histologie normale 24 h

Effets des extraits sur les animaux

Tableau 18 (suite) : Lésions tissulaires provoquées par EMG à 36,53 mg/kg par voie ip. en fonction de la durée d’exposition DUREE DE ORGANES LESIONS L’EXPOSITION  Quelques foyers de vaisseaux sanguins dilatés avec hyperplasie des capillaires  Infiltrat inflammatoire composé de polynucléaires 6 h neutrophiles, de lymphocytes et de plasmocytes avec une discrète fibrose au niveau des axes villositaires de la muqueuse  Vaisseaux sanguins dilatés INTESTIN  Infiltrat inflammatoire contenant de nombreux GRELE polynucléaires neutrophiles altérés, quelques plasmocytes et 12 h lymphocytes détruisant quelques villosités de la muqueuse  Foyers œdémateux au niveau du chorion  Quelques vaisseaux sanguins dilatés de la séreuse  Infiltrat inflammatoire constitué de quelques lymphocytes, 24 h plasmocytes et polynucléaires neutrophiles altérés au niveau de la muqueuse

 Vaisseaux dilatés dans les axes villositaires de la muqueuse avec présence de rares polynucléaires neutrophiles et 6 h plasmocytes  Vaisseaux sanguins dilatés  Glandes à épithélium muco-sécrétant GROS  Infiltrat inflammatoire constitué de rares lymphocytes et 12 h INTESTIN nombreux polynucléaires neutrophiles le plus souvent altérés dans les axes villositaires de la muqueuse  Quelques vaisseaux sanguins dilatés  Infiltrat inflammatoire renfermant de nombreux 24 h polynucléaires altérés et lymphocytes  Glandes à épithélium muco-sécrétant

Effets des extraits sur les animaux

Tableau 19: Lésions tissulaires provoquées par une dose sublétale de EMG à 25,4 mg/kg administrée par voie p.o. pendant 10 jours ORGANES LESIONS CERVEAU Histologie normale CŒUR Histologie normale  Vaisseaux sanguins dilatés le plus souvent péri-bronchiolaires avec extravasation des hématies  Infiltrat inflammatoire fait de polynucléaires neutrophiles, lymphocytes et POUMON plasmocytes  Nombreux foyers hémorragiques (intra-alvéolaire, intra-parenchymateux détruisant les alvéoles) ESTOMAC Histologie normale  Veines centrolobulaires dilatées  Capillaires sinusoïdes parfois dilatés FOIE  Infiltrat inflammatoire du parenchyme hépatique constitué de quelques polynucléaires neutrophiles et de rares lymphocytes  Présence de pigments biliaires  Rares vaisseaux congestifs  Nodule inflammatoire comportant quelques polynucléaires, quelques REIN lymphocytes et de nombreux plasmocytes le plus souvent autour d’un vaisseau dilaté rempli d’hématies  Présence de foyers œdémateux  Rares vaisseaux sanguins congestifs INTESTIN  Infiltrat inflammatoire fait de lymphocytes et plasmocytes GRELE  Présence d’un œdème au niveau des axes villositaires de la muqueuse  Muco-sécrétion importante de l’épithélium des glandes de la muqueuse  Hyperplasie capillaire dans les axes villositaires de la muqueuse GROS  Infiltrat inflammatoire focal constitué par de nombreux lymphocytes et INTESTIN plasmocytes, de rares polynucléaires neutrophiles  Muco-sécrétion épithéliale abondante des glandes de la muqueuse

Tableau 20 : Effets de EMG sur des paramètres biochimiques de souris après 30 jours de traitement par voie orale

Animaux traités avec EMG PARAMETRES BIOCHIMIQUES Animaux non traités (12,72 mg/Kg) ASAT (UI/l) ° 476,33 ± 66,08 440,00 ± 103,87 ALAT (UI/l) 35,67 ± 5,44 52,75 ± 20,72 CREATINEMIE (mg/ml) 2,95 ± 0,48 3,77 ± 0,06

Effets des extraits sur les animaux

b b

Figure 7 : Coupes histologiques de : a) POUMON non traité, b) POUMON traité avec EMG à 36,53 mg/kg par voie ip. après un temps d’exposition de 6 h (Grossissement x10 et x40) 1 : Alvéole, 2 : capillaires interalvéolaires ; 3 : bronchioles, 4 : vaisseaux sanguins dilatés, 5 : polynucléaires neutrophiles

Effets des extraits sur les animaux

2 3

b b

6 6

b b

Figure 8 : Coupes histologiques de : a) POUMON non traité, b) POUMON traité avec EMG à 25,4 mg/kg par voie p.o. après une durée d’exposition de 10 jours (Grossissement x10 et x40) 1 : Alvéole, 2 : capillaires interalvéolaires ; 3 : bronchioles, 4 : vaisseaux sanguins dilatés, 5 : infiltrat inflammatoire, 6: foyers hémorragiques

Effets des extraits sur les animaux

5 3

b b

8 6 7

b b

Figure 9 : Coupes histologiques de : a) FOIE non traité, b) FOIE traité avec EMG à 36,53 mg/kg par voie ip. après un temps d’exposition de 6 h (Grossissement x10 et x40) 1 : veine centrolobulaire, 2 : hépatocyte, 3 : veine centrolobulaire dilatée, 4 : foyer de nécrose, 5 : capillaire sinusoïde dilaté, 6 : Vaisseaux sanguins dilatés autour d’un canalicule biliaire portal 7 : infiltrat inflammatoire portale, 8 : polynucléaire neutrophile épars

Effets des extraits sur les animaux

b b

Figure 10 : Coupes histologiques de : a) FOIE non traité, b) FOIE traité avec EMG à 25,4 mg/kg par voie p.o. après une durée d’exposition de 10 jours (Grossissement x10 et x40) 1 : Veine centrolobulaire, 2 : hépatocyte, 3 : veine centrolobulaire congestive, 4 : capillaire sinusoïde dilaté, 5 : infiltrat inflammatoire, 6 : pigment biliaire

Effets des extraits sur les animaux

2 3 a

b b

Figure 11 : Coupes histologiques de : a) REIN non traité, b) REIN traité avec EMG à 36,53 mg/kg par voie ip. après un temps d’exposition de 12 h (Grossissement x10 et x40) 1 : Glomérule, 2 : tubule, 3 : vaisseau sanguin intertubulaire, 4 : vaisseau sanguin dilaté, 5 : extravasation des hématies

Effets des extraits sur les animaux

2 3 a

b b

Figure 12 : Coupes histologiques de : a) REIN non traité, b) REIN traité avec EMG à 25,4 mg/kg par voie p.o. après une durée d’exposition de 10 jours (Grossissement x10 et x40) 1 : Glomérule, 2 : tubule ; 3 : vaisseau sanguin intertubulaire, 4 : vaisseau sanguin dilaté, 5 : œdème, 6 : nodule inflammatoire

Effets des extraits sur les animaux

5 4 3 2 a

6 b b

Figure 13 : Coupes histologiques de : a) INTESTIN GRELE non traité, b) INTESTIN GRELE traité avec EMG à 36,53 mg/kg par voie ip. après un temps d’exposition de 6 h (Grossissement x10 et x40) 1 : Lumière intestinale, 2 : muqueuse, 3 : sous-muqueuse, 4 : musculeuse, 5 : séreuse, 6 : vaisseau sanguin dilaté, 7 : infiltrat inflammatoire

Effets des extraits sur les animaux a

5 4 3 2 a

b b

Figure 14 : Coupes histologiques de : a) INTESTIN GRELE non traité, b) INTESTIN GRELE traité avec EMG à 25,4 mg/kg par voie p.o. après une durée d’exposition de 10 jours (Grossissement x10 et x40) 1 : Lumière intestinale, 2 : muqueuse, 3 : sous-muqueuse, 4 : musculeuse, 5 : séreuse, 6 : vaisseau sanguin dilaté, 7 : infiltrat inflammatoire, 8 : glande à épithélium muco-sécrétant

Effets des extraits sur les animaux

4 3

2 a

6 6

b b

Figure 15 : Coupes histologiques de : a) GROS INTESTIN non traité, b) GROS INTESTIN traité avec EMG à 36,53 mg/kg par voie ip. après un temps d’exposition de 6 h (Grossissement x10 et x40) 1 : Lumière intestinale, 2 : muqueuse, 3 : sous-muqueuse, 4 : musculeuse, 5 : séreuse, 6 : vaisseau sanguin dilaté, 7 : infiltrat inflammatoire

Effets des extraits sur les animaux

4 3

2 a

b b

Figure 16 : Coupes histologiques de : a) GROS INTESTIN non traité, b) GROS INTESTIN traité avec EMG à 25,4 mg/kg par voie p.o. après une durée d’exposition de 10 jours (Grossissement x10 et x40) 1 : Lumière intestinale, 2 : muqueuse, 3 : sous-muqueuse, 4 : musculeuse, 5 : séreuse, 6 : vaisseau sanguin dilaté, 7 : infiltrat inflammatoire, 8 : glandes à épithélium muco-sécrétant

Effets des extraits sur les animaux

3.3.2.7. EVALUATION DES PROPRIETES RODENTICIDES DES GRAINES Dans le cadre de la valorisation des graines de D. madagascariensis en tant que biopesticide, deux types d’appâts empoisonnés sous forme de granulés à base de poudre de graines et à base de EMG (Tableau 21) ont été testés sur souris. Les résultats sont montrés dans le Tableau 22.

Tableau 21: Composition des appâts empoisonnés Appât à base de poudre de graines Poudre de graines 16 g pour 25 g de souris Poids de la provende 0 g Proportion de graines dans l’appât 100 % Appât à base de EMG EMG 1 g pour 25 g de souris Poids de la provende 6 g pour 25 g de souris Proportion de EMG dans l’appât 16,7 %

Tableau 22 : Résultats des essais d’appâtage sur souris Appât à base de poudre de graines Quantité de graines ingérées 8,3±0,7 g pour 25 g de souris Résultat 100 % de décès au bout de 5 jours Appât à base de EMG Quantité ingérée 0,955 ± 0,032 g pour 25 g de souris Quantité de EMG ingéré 0,160 ± 0,006 g par 25 g de souris Résultat 100 % de décès au bout de 2 jours

Les 2 types d’appât ont été appréciés par les souris. Après avoir induit des symptômes (enophtalmie, piloérection, contusions, ataxie, diarrhée), ils ont provoqué 100 % de mortalité. Cependant, l’appât à base de EMG s’est avéré plus efficace car le temps de survie des animaux a été plus court, 2 jours contre 5 jours pour l’appât à base de graines.

3.3.2. ACTIVITE HEMOLYTIQUE DE EMG

Les effets de EMG sur les globules rouges de mouton ont été étudiés en utilisant des concentrations croissantes allant de 0,334 µg/ml à 30,06 µg/ml. L’hémoglobine libérée sous l’action de l’extrait est dosée au spectrophotomètre à 541 nm (méthode décrite dans le § 3.2.2.3, p. 47). Les données ont été analysées avec le logiciel Microsoft Excel (Microsoft Inc., Redmond, WA, USA). L’équation de la droite à partir de la courbe de lyse est donnée sur la Figure 17 (p. 73).

Effets des extraits sur les animaux

7 y = 1,6411x + 4,6778

3 Valeur probit Valeur 2 1 0 -1,000 -0,500 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 log C (µg/mL)

Figure 17 : Pourcentage d’hémolyse transformée en valeur « probit » en fonction du logarithme de la concentration de EMG

La valeur de la DH50 de EMG est obtenue en inversant le logarithme de la concentration correspondant à la valeur « probit » égal à 5,00. D’après les résultats, elle correspond à 1,57

µg/ml avec une DH100 (dose hémolytique 100 %) supérieure à 30,06 µg/ml et une DH0 (dose hémolytique 0 %) correspondant à 0,334 µg/ml.

3.3.3. EFFETS DE EMG SUR LE CŒUR ISOLE DE COBAYE

Les effets de EMG sur l’amplitude de la contraction ou inotropie et le nombre de battements par minute ou chronotropie ont été évalués sur les oreillettes isolées de cobaye.

EMG n’a pas modifié de façon significative le nombre des battements auriculaires par minute jusqu’à la concentration de 25 µg/ml (Figure 19, p. 74). Par contre, à la concentration de 12,5 µg/ml et après 5 min de contact, il provoque une augmentation significative de l’amplitude de la contraction cardiaque (p<0,01) (Figure 18, p. 74). Du point de vue pharmacologique, dans ces conditions, EMG a provoqué un effet inotrope positif.

3.3.4. EFFETS DE EMG SUR LES POUSSINS

Un lot de 3 poussins de 1 jour et un autre lot qui a servi de témoin ont été utilisés. EMG a été administré par voie ip. et par voie p.o. à la dose de 46,27 mg/kg, dose correspondant à la DL100 par voie ip. sur souris. Malgré les signes de faiblesse qu’ils ont manifestés après l’administration de l’extrait, les animaux se sont entièrement remis au bout de 24 h.

Effets des extraits sur les animaux

p˂0,01p=0,01 *

Figure 18 : Effets de l’EMG sur l’amplitude de contraction des oreillettes isolées de cobaye en fonction de la concentration (µg/ml) et du temps de contact ( ) (n=4)

p˃0,05

Figure 19 : Effets de l’EMG sur la fréquence de contraction des oreillettes isolées de cobaye en fonction de la concentration (µg/ml) et du temps de contact 3.3.5. ( ) (n=4)

Effets des extraits sur les animaux

3.3.5. EFFETS DE EMG SUR LES TETARDS DE GRENOUILLES

Sept concentrations de EMG allant de 4,29 μg/ml à 6,01 μg/ml en progression géométrique de raison 1,06 ont été testées sur 7 lots de 5 têtards de grenouilles. EMG s’est avéré toxique avec un effet dose.

Les données obtenues sont présentées dans le Tableau 23. L’analyse statistique des valeurs et la représentation graphique ont été effectuées à l’aide du logiciel GraphPad Prism ® (GraphPad Prism Software Version 5.01). D’après cette méthode statistique, la valeur de la

CL50 est de 5,411 µg/ml (Figure 20).

Tableau 23 : Effets des différentes concentrations de EMG sur les têtards de grenouille

Concentration Témoin 4,29 4,49 4,76 5,05 5,35 5,67 6,01 (µg/ml) log C - 0,632 0,652 0,678 0,703 0,728 0,754 0,779

1 : 0 1 : 0 1 : 0 1 : 20 1 : 20 1 : 40 1 : 80 1 : 100 Mortalité (%) 2 : 0 2 : 0 2 : 0 2 : 20 2 : 20 2 : 40 2 : 100 2 : 100

3 : 0 3 : 0 3 : 20 3 : 0 3 : 20 3 : 60 3 : 80 3 : 100

150

100

0 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85

Taux demortalité Taux (%) -50 log C

Figure 20 : Courbe montrant l’effet-dose et la mortalité provoqués par EMG sur les têtards de grenouilles

Effets des extraits sur les animaux

3.3.6. EFFETS DE EMG SUR LES ALEVINS DE CARPES

Cinq concentrations allant de 3,56 µg/ml à 5,6 µg/ml suivant une progression géométrique de raison 1,12 ont été testées sur 5 lots de 5 alevins. EMG est toxique pour les alevins de carpe avec un effet-dose bien marqué.

Les données obtenues sont présentées dans le Tableau 24. L’analyse statistique des valeurs et la représentation graphique (Figure 21) ont été effectuées à l’aide du logiciel GraphPad Prism ® (GraphPad Prism Software Version 5.01). D’après cette méthode statistique, la valeur de la CL50 est de 4,330 µg/ml.

Tableau 24 : Effets des différentes concentrations de EMG sur les alevins de carpe

Concentration Témoin 3,56 3,99 4,46 5,00 5,60 (µg/ml) log C - 0,551 0,600 0,649 0,699 0,748

1 : 0 1 : 0 1 : 0 1 : 20 1 : 80 1 : 100 Mortalité (%) 2 : 0 2 : 0 2 : 40 2 : 80 2 : 100 2 : 100

3 : 0 3 : 0 3 : 20 3 : 80 3 : 100 3 : 100

150

100

Taux demortalité Taux (%) 0 0.5 0.6 0.7 0.8 log C

Figure 21 : Courbe montrant l’effet-dose et la mortalité provoqués par EMG sur les alevins de carpe

3.3.7. TEST DE EMG SUR LES PUCES

Quatre lots de 10 puces ont été utilisés dont un lot témoin, les 3 autres lots ont été mis en contact avec une concentration croissante de EMG (1, 2 et 10 mg/ml) (voir § 3.2.2.4.3, p. 49). Après 24 h d’exposition, l’extrait ne s’est pas révélé toxique aux doses testées. 76

Effets des extraits sur les animaux

3.4. DISCUSSION ET CONCLUSION

Plusieurs familles chimiques ont été détectées dans EMG, mais les saponosides étaient majoritaires et constituaient les composés responsables de la toxicité chez les animaux (voir § 2.3.2.1, p. 32 et Tableau 12, p. 51).

L’évaluation et la caractérisation de la toxicité de EMG ont été effectuées essentiellement sur la souris, animal standard de laboratoire le plus utilisé en recherche biomédicale. L’extrait de graines etait de loin plus toxique que les extraits d’autres organes de la plante

(les feuilles, les écorces de tige et péricarpe de fruits). Cette forte toxicité des graines (DL50 = 36,12 mg/kg) pourrait expliquer leur non utilisation à des fins thérapeutiques, contrairement aux extraits de feuilles (DL50 = 6 g/kg) (TROTIN, 1972). La toxicité des autres organes de la plante pourrait être due à des concentrations plus faibles des mêmes molécules ou à des molécules différentes moins efficaces dans les autres organes. EMG était toxique quelle que soit la voie d’administration utilisée. Cependant, la voie ip. s’est avérée nettement plus efficace que les voies s.c. et p.o. Par exemple, pour avoir les mêmes effets par voie ip, une dose 65 fois plus élevée a été nécessaire par voie p.o. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que par voie ip., contrairement à la voie p.o., EMG est quantitativement plus disponible en évitant l’effet du métabolisme du premier passage hépatique (TURNER et coll., 2011). Les symptômes d’intoxication étaient dominés par des troubles nerveux, respiratoires, cardiovasculaires et digestifs. L’atteinte du système nerveux pourrait être due à l’action primaire de EMG sur le système nerveux comme les saponines du Cestrum spp (SOLANACEAE) (SMITH, 2017). Elle pourrait également résulter d’effets primaires sur d’autres systèmes. Les troubles de coordination manifestées par les souris pourraient résulter d’une atteinte du système nerveux central suite à une hypoxie voire une anoxie causée par un manque d’oxygénation (BRUNNER et coll., 2011) et qui pourrait être la conséquence de l’action des saponines sur les globules rouges. Il a aussi été rapporté qu’une encéphalopathie hépatique causée par une insuffisance hépatique sévère peut aussi avoir un impact sur le système nerveux central (CHIMMELLI et GRAY, 2014) à cause de l’incapacité du foie à éliminer les toxines et de leur accumulation dans le sang. Cette hypothèse est alors envisageable vu les lésions causées par EMG au niveau foie (exposition aiguë). Des effets concomittants de EMG sur le système nerveux et d’autres organes ne sont pas à exclure. C’est le cas par exemple des saponines retrouvées dans les différentes parties d’Aesculus spp qui

Effets des extraits sur les animaux entrainent à la fois des troubles gastro-intestinaux et du système nerveux central (SMITH, 2017).

EMG a été extrêmement toxique par voie ip. (DL50 = 36,12 mg/kg) et modérément toxique par voie p.o. (DL50 entre 600,8 et 3000 mg/ml). En effet, en toxicologie, selon NENE BI et coll. (2008), quelle que soit la voie d’administration utilisée, une substance pharmacodynamique peut être classée en fonction de la valeur de sa DL50 24 h en :

 ultra toxique pour une DL50 inférieure à 5 mg/kg de poids corporel (PC),

 extrêmement toxique pour une DL50 comprise entre 5 et 50 mg/kg de PC,

 très toxique pour une DL50 comprise entre 50 et 500 mg/kg,

 modérément toxique pour une DL50 comprise entre 500 à 5000 mg/kg de PC,

 légèrement toxique pour une DL50 entre 5000 et 15000 mg/kg de PC,

 non toxique pour une DL50 supérieure à 15000 mg/kg de PC.

Comparé aux extraits d’autres SAPINDACEAE toxiques, EMG a une toxicité plus élevée sur souris par voie i.p. En effet, il a été plus toxique que l’extrait purifié de

Conchopetalum madagascariense (DL50 = 42,66 - 44,25 mg/kg) (ABDOU, 2009), l’extrait aqueux de Deinbolia boinensis (DL50 = 60,25 - 66,55 mg/kg) (RAKOTOBE, 2003), l’extrait méthanolique de feuilles de Paullinia pinnata (DL50 = 471,2 mg/kg) (ALIYU et coll., 2014) et l’extrait éthanolique à 95 % des parties aériennes de Cardiospermum halicacabum (DL 50 = 800 mg/kg) (GOPALAKRISHNAN et coll., 1976). Par contre, il a été moins toxique que l’extrait de Barringtonia butonica, (DL50= 20,3 mg/kg) (RATIARIVELO, 2000). Par rapport à la toxicité des extraits de plantes étudiées au LABASM appartenant à d’autres familles, EMG a été moins toxique que les extraits de graines d’Albizia tuleariensis

(DL50 = 2,9 - 3,2 mg/kg) et d’A. greveana (DL50 = 1,13 - 2,30 mg/kg) (RANDRIANARIVO et coll., 2014 a). Sa toxicité est comparable à celle de la cnestine isolée des graines d’une

CONNARACEAE, Cnestis glabra (DL50 = 37 mg/kg) (JEANNODA, 1986) et de l’extrait méthanolique de graines d’Albizia aurisparsa (DL50 = 36,30 - 38,76 mg/kg) (RANDRIANARIVO et coll., 2014 a).

Du point de vue des lésions histologiques, les vaisseaux sanguins fortement dilatés avec extravasation des hématies et les nombreux foyers hémorragiques ont été observées notamment au niveau des reins et des poumons. De nombreux foyers inflammatoires accompagnés d’hypersécrétion de mucus ont été notés au niveau des intestins. Les saponosides de EMG y étaient pour beaucoup. En effet, des lésions tissulaires comparables ont été

Effets des extraits sur les animaux observées avec l’extrait de feuilles de Dodonaea viscosa par voie p.o. sur des bovins. Les saponines triterpéniques ont été incriminées (CATTANI et coll., 2004).

Avec une DH50 de 1µg/ml, les saponines de EMG figurent parmi les saponines à forte activité hémolytique (XIE et coll., 2017). L’ activité hémolytique est le résultat des effets des saponines sur la perméabilité de la membrane cellulaire soit en formant des pores en altérant les activités des pompes sodium- potassium et calcium-magnésium ATP-asiques (HASSAN et coll., 2010) soit par insertion du noyau hydrophobe de la saponine dans la bicouche lipidique indépendamment du cholestérol (FRANCIS et coll., 2002, HASSAN et coll., 2010). L’activité hémolytique des saponines peut aussi être attribuée à l’affinité de leur aglycone aux stérols dans les membranes, particulièrement aux cholestérols (FRANCIS et coll., 2002). L’analyse des paramètres biochimiques sanguins (au bout de 30 jours de traitement) n’a montré aucun changement significatif du taux d’ASAT, d’ALAT et de créatininémie. Il se pourrait qu’à la dose utilisée (2,4 fois inférieure à la DL0), les dommages subis ne soient pas importants pour provoquer une perturbation fonctionnelle au niveau des reins et du foie. Il se pourrait aussi que EMG ait pu causer au niveau de ces organes des lésions qui se sont cependant atténuées grâce à un mécanisme de réparation. EMG exerce un effet inotrope positif non accompagné d’effet chronotrope sur le coeur isolé de cobaye. Certains inhibiteurs de phosphodiestérases (PDE) sont des molécules inotropes positives sans effet significatif sur la chronotropie. Au niveau du coeur, ce sont les phosphodiestérases de type 3 (PDE 3) qui interviennent surtout dans la régulation de la contractilité cardiaque (BENDER et BEAVO, 2006). Les PDE 3 sont des enzymes qui hydrolysent l’AMP cyclique (adénosine monophosphate cyclique) et l’inactivent en la transformant en 5’AMP inactif au niveau du cœur ; il s’ensuit alors une accumulation d’AMP cyclique au niveau du myocarde. Cette augmentation intracytoplasmique d’AMP cyclique augmente la concentration intracellulaire du calcium via la phosphorylation de plusieurs protéines ce qui est à l’origine de l’action inotrope positive. L’effet sur le coeur isolé de cobaye peut être aussi relié à la présence de saponosides dans l’extrait (NOIREAUD, 1989).

EMG s’est révélé toxique pour les têtards de grenouille (CL50 = 5,411 μg/ml) et les alevins de carpe (CL50 = 4,330 μg/ml). Comparé aux extraits méthanoliques de graines d’Albizia malgaches (RANDRIANARIVO et coll., 2014 a) EMG a été :

Effets des extraits sur les animaux

 moins toxique sur les têtards de grenouille que les extraits d’A. tuleariensis (CL50 =

2,28 μg/ml), et d’A. viridis (CL50 = 2,66 μg/ml) mais plus toxique que l’extrait d’A.

bernieri (CL50 de 7,36 μg/ml) ;

 moins toxique sur les alevins de carpe que l’extrait d’A. androyensis (CL50 = 3,56 μg/ml) et d’A. viridis (CL50 = 4,50 μg/ml) mais plus toxique que les extraits d’A.

aurisparsa (CL50 = 60 μg/ml), d’A. tuleariensis (CL50 = 15,04 μg/ml) et A. divaricata

(CL50 = 7,69 μg/ml). Les saponosides sont bien connus pour leur forte toxicité sur les animaux à sang froid, ce qui explique leur large utilisation comme poisons de pêche. Ces molécules, réduiraient la tension superficielle de l’eau dans laquelle baignent ces animaux les empêchant de respirer normalement par leurs branchies. Chez les poissons par exemple, HOFFMANN (2003) a rapporté que les saponosides peuvent être toxiques à cause des dommages au niveau des capillaires branchiaux qu’ils sont susceptibles de causer, entrainant ainsi la mort de l’animal. Les essais d’appâtage effectués sur des souris se sont révélés prometteurs. Cependant, les tests ont été effectués sur des animaux de laboratoire vivant dans des conditions très différentes de celles des animaux sauvages. Aussi, des essais sur des rongeurs sauvages sont encore nécessaires. EMG n’est pas actif sur les puces. La plupart des extraits de plantes possédant des activités contre les puces sont souvent des composés volatiles comme les huiles essentielles (DOLAN et coll., 2007). Dodonaea madagascariensis fait déjà partie des 450 plantes toxiques malgaches potentiellement exploitables dans le contrôle des ravageurs des plantes, surtout dans la lutte contre les insectes ravageurs de culture (PROJET VOARISOA/SNGF, 1998). Par ailleurs, l’activité insecticide de certains saponosides a été rapportée par certains auteurs (DE GEYTER et coll., 2015). Par conséquent, des investigations sur les effets éventuels de EMG sur d’autres insectes nuisibles devraient être menées. Compte de tenu de sa forte toxicité sur souris et vu que nous n’avons pas encore assez d’informations sur sa nocivité envers d’autres animaux, des précautions sont à prendre quant à l’utilisation des graines ou de ses dérivés comme biopesticides afin d’éviter les intoxications accidentelles d’animaux domestiques, d’élevage ou même sauvages.

En conclusion, les travaux réalisés ont permis d’une part d’établir et de caractériser la toxicité des graines sur souris et d’autres animaux et d’autre part, d’avoir une idée sur leur utlisation comme rodenticide.

Etude des effets de EMG sur les végétaux

Etude des effets sur les végétaux

CHAPITRE 4 : ETUDE DES EFFETS DE EMG SUR LES VEGETAUX

4.1. INTRODUCTION

L’objectif visé dans cette étude est d’évaluer les effets des graines de D. madagascariensis sur les végétaux. Les effets de EMG sur la germination des graines et la croissance de jeunes plantules ont ainsi été étudiés.

4.2. MATERIELS ET METHODES

4.2.1. LES PLANTES TESTEES

Les tests ont été effectués sur des plantes potagères appartenant aux classes des Magnoliopsida et des Liliopsida. Leur liste est présentée dans le Tableau 25. Les graines ont été fournies par le FOFIFA ou achetées auprès d’AGRIVET, un distributeur agrée de semences.

Tableau 25 : Liste des graines utilisées pour l’étude des propriétés phytotoxiques de EMG CLASSES FAMILLES ESPECES NOMS VERNACULAIRES BRASSICACEAE Brassica sp. Tissam white CUCURBITACEAE Cucumis sp. Concombre MAGNOLIOPSIDA FABACEAE Pisum sativum Petit pois FABACEAE Phaseolus vulgaris Haricot POACEAE Oryza sativa Riz LILIOPSIDA POACEAE Zea mays Maïs

4.2.2. EXTRAIT UTILISE

L’EMG a été utilisé pour tous les tests sur les végétaux.

4.2.3. TESTS SUR LA GERMINATION DES GRAINES

La méthode utilisée est basée sur celle décrite par RANDRIANARIVO et coll. (2014 b). Pour chaque espèce testée, les graines sont désinfectées en les trempant dans une solution d’hypochlorite de sodium (5 %) pendant une minute. Les graines testées sont ensuite rincées à l’eau distillée. Les lots de 10 graines sont trempés dans EMG à différentes concentrations pendant 48 h à l’obscurité et à 25°C, tandis les lots témoins sont trempés dans de l’eau distillée (témoins négatifs). Les graines sont ensuite transférées dans des boîtes de Petri tapissées de coton imbibé d’eau distillée. Les graines qui ont germé sont comptées et arrosées avec de l’eau

Etude des effets sur les végétaux distillée tous les 2 jours pendant 15 jours (Figure 22). Les expériences sont réalisées en triple exemplaires. Les résultats obtenus sont exprimés en pourcentage de germination (PG %).

15 lots de 10 graines/ espèces potagères

STERILISATION / hypochlorite de sodium (5%, 1 minute)

RINÇAGE / eau distillée

TREMPAGE

3 lots de 10 graines 12 lots de 10 graines dans dans de l’eau distillée l’EMG à différentes concentrations allant de 0,5 mg/ml à 5 mg/ml (coefficient de dilution ½)

Figure 22 : Schéma résumant les différentes étapes de l’expérience sur les effets de EMG sur le pouvoir germinatif des graines

Le pourcentage de germination PG (%) est calculé à l’aide de la formule suivante :

nombres de graines ayant germées 푃퐺 % = x 100 푛표푚푏푟푒 푡표푡푎푙 푑푒 𝑔푟푎𝑖푛푒푠 푡푒푠푡é푒푠

Le pourcentage d’inhibition de la germination PI (%) est ensuite calculé comme suit :

푃퐼 % = 푃퐺 % 푑푒푠 푙표푡푠 푡é푚표𝑖푛 − 푃퐺 % 푑푒푠 푙표푡푠 푡푟푎𝑖푡é푠

Le pourcentage de stimulation de la germination PS (%) est calculé de la manière suivante : 푃푆 % = 푃퐺 % 푑푒푠 푙표푡푠 푡푟푎𝑖푡é푠 − 푃퐺 % 푑푒푠 푙표푡푠 푡é푚표𝑖푛푠

Etude des effets sur les végétaux

4.2.4. TESTS SUR LA CROISSANCE DES JEUNES PLANTULES

La méthode utilisée est basée sur celle décrite par RANDRIANARIVO et coll. (2014 b). Pour chaque espèce testée, les graines sont désinfectées avec de l’hypochlorite de sodium (5 %) pendant 1 minute puis rincées à l’eau distillée. Ensuite, les graines sont trempées dans de l’eau distillée. Après 48 h de trempage, les graines sont rincées avec de l’eau distillée puis mises à germer dans des bocaux dont les couvercles sont percés de trous pour l’aération. Cette étape est réalisée à l’obscurité à 25°C. Après, les plantules sont transférées dans des boîtes de Petri tapissées de coton imbibé de EMG à différentes concentrations, dans de l’eau distillée (contrôle négatif) et dans une solution de glyphosate (témoin positif) qui est un herbicide non sélectif inhibiteur spécifique de la voie du shikimate chez les végétaux [RANDRIANARIVO et coll., 2014 (b)]. La longueur des épicotyles et des hypocotyles est mesurée tous les 2 jours pendant 15 jours. Les résultats sont exprimés en fonction de la longueur des hypocotyles ou des épicotyles mesurée par rapport à celle des témoins (voir Figure 23).

18 lots de 10 graines/ espèce potagère

STERILISATION / hypochlorite de sodium (5%, 1 minute)

RINÇAGE / eau distillée

TREMPAGE / eau distillée

TRANSFERT

3 lots de 10 graines 12 lots de 10 graines 3 lots de 10 graines + eau distillée + EMG à différentes + glyphosate concentrations allant de 0,1125 à 7,2 mg/ml (coefficient de dilution ½)

Figure 23 : Schéma résumant les différentes étapes de l’expérience sur les effets de EMG sur la croissance des jeunes plantules

Etude des effets sur les végétaux

4.2.5. ANALYSES STATISTIQUES

Les valeurs obtenues sont analysées à l’aide du logiciel STATICF® qui permet une analyse de variance (ANOVA) suivie d'un test de comparaison de Newman Keuls. Les estimations statistiques sont effectuées à un intervalle de confiance de 95 %.

4.3. RESULTATS

4.3.1. EFFETS DE EMG SUR LE POUVOIR GERMINATIF DE GRAINES DE PLANTES POTAGERES

Les effets de EMG sur le pouvoir germinatif des graines de plantes potagères 15 jours après le test sont présentés dans le Tableau 26.

Tableau 26 : Effets de EMG sur le pourcentage de germination (PG %) des graines potagères après 15 jours de traitement

Concentration (mg/ml) 0 0,5 1 2,5 5 ESPECES Brassica sp 96,67 100 100 96,67 96,67 Cucumis sp 63,83 83,33 73,33 76,67 73,33 Pisum sativum 96,67 100 100 100 50 Phaseolus vulgaris 70 83,33 40 13,33 0 Oryza sativa 96,67 96,67 90 93,33 93,33 Zea mays 100 100 100 96,67 96,67

Les effets de EMG varient selon les plantes testées :

 il inhibe de manière significative la germination des graines de Pisum sativum (p˂0,0000) et de Phaseolus vulgaris (p˂0,0000) : les P.I. (%) sont respectivement de 46,67 % et de 70 %. Une inhibition non significative a été notée (p>0,05) pour les graines d'Oryza sativa (p = 0,37) et de Zea mays (p=0,89) avec respectivement des P.I. (%) de 3,34% et de 3,33 %;

 une stimulation significative de la germination a été notée à la concentration de 0,5 mg/ml pour Cucumis sp (p = 0,01) et Pisum sativum (p = 0,01) avec des P.S. (%) respectifs de 19,5 % et 9,5 %.

4.3.2. EFFETS DE EMG SUR LA CROISSANCE DES JEUNES PLANTULES

L'influence de EMG sur la croissance des jeunes plantules a été déterminée par comparaison de la longueur de l'hypocotyle et de l'épicotyle des plantules traitées avec cet 84

Etude des effets sur les végétaux

extrait et des plantules témoins (Figures 24 à 27, p. 86 à 89). Deux facteurs, le nombre de jours d’expérimentation et la concentration des extraits, sont alors testés séparément lors de l'analyse statistique des données obtenues. Les graines choisies (Oryza sativa, Phaseolus vulgaris, Pisum sativum, Zea mays) sont celles faciles à faire germer et dont la croissance des épicotyles et des hypocotyles est aisément mesurable. Il a été constaté que EMG exerce différents effets selon les organes testés et aussi l'espèce utilisée. La croissance de l'hypocotyle et de l'épicotyle de Phaseolus vulgaris n'a pas été affectée par EMG. Par contre, EMG a réduit de manière significative uniquement la longueur de l'hypocotyle de Zea mays et d'Oryza sativa. Dans le cas de Pisum sativum, seule une réduction de la longueur de l'épicotyle de manière significative a été observée. L’ensemble des résultats obtenus sur les effets de EMG sur la germination des graines et la croissance des jeunes plantules est résumé dans le Tableau 27.

Tableau 27 : Effets de EMG sur la germination et la croissance de plantes potagères Croissance des Croissance des Classe Espèces Germination épicotyles hypocotyles Brassica sp. Pas d’effet significatif nd nd Cucumis sp. Pas d’effet significatif nd nd MAGNOLIOPSIDA Inhibition Diminution Pisum sativum Pas d’effet significatif significative significative Inhibition Pas d’effet Phaseolus vulgaris Pas d’effet significatif significative significatif Pas d’effet Diminution Oryza sativa Pas d’effet significatif LILIOPSIDA significatif significative Pas d’effet Diminution Zea mays Pas d’effet significatif significatif significative Nd : non déterminé

4.4. DISCUSSION

Les résultats obtenus confirment l’existence dans les graines de D. madagascariensis de composés chimiques capables d’influencer la germination et la croissance de graines potagères. Ils ont montré que l’activité phytotoxique de EMG était différente selon les plantes utilisées et leur stade de développement. En effet, les graines de haricot se sont montrées sensibles à EMG seulement pendant le stade de germination alors que le riz et le maïs ne l’ont été de manière significative qu’au stade de croissance de leurs hypocotyles (dépérissement à cause de la pourriture racinaire). Par contre, le petit pois était sensible à EMG à la fois à leur stade de germination et à leur stade de croissance (suite p. 90).

Etude des effets sur les végétaux

Croissance de l'épicotyle d'Oryza sativa (a)

20 0 (mg/mL) 0,1125 (mg/mL) 15 0,225 (mg/mL) 0,45 (mg/mL) 10 0,9 (mg/mL) 1,8 (mg/mL) 5 Longueur en mm en Longueur 3,6 (mg/mL) 7,2 (mg/mL)

0 GLYPHOSATE (7,2mg/mL) 3 5 7 9 11 13 15

-5 Nombre de jours p=0,99

Croissance de l'hypocotyle d'Oryza sativa (b) 14

0 (mg/mL) 10 0,1125 (mg/mL)

8 0,225 (mg/mL) 0,45 (mg/mL) 6 0,9 (mg/mL) 1,8 (mg/mL)

Longueur en mm en Longueur 4 3,6 (mg/mL)

2 7,2 (mg/mL) GLYPHOSATE (7,2mg/mL) 0 3 5 7 9 11 13 15 Nombre de jours p=0,0000 0 Figure 24 : Croissance des épicotyles (a) et des hypocotyles (b) d’Oryza sativa en présence de EMG à différentes concentrations et du glyphosate à 7,2 mg/mL 86

Etude des effets sur les végétaux

Croissance de l'hypocotyle de Phaseolus vulgaris (b) 400

350

300 0 (mg/mL)

0,1125 (mg/mL) 250 0,225 (mg/mL) 200 0,45 (mg/mL)

150 0,9 (mg/mL)

Longueur en mm en Longueur 1,8 (mg/mL) 100 3,6 (mg/mL) 50 7,2 (mg/mL) 0 GLYPHOSATE 3 5 7 9 11 13 15 (7,2mg/mL) Nombre de jours p=0,70

Croissance de l'épicotyle de Phaseolus vulgaris (a)

160

140 0 (mg/mL) 0,1125 (mg/mL) 120 0,225 (mg/mL) 100 0,45 (mg/mL) 80 0,9 (mg/mL) 60 1,8 (mg/mL) 40

Longueur en mm en Longueur 3,6 (mg/mL) 20 7,2 (mg/mL) 0 3 5 7 9 11 13 15 GLYPHOSATE -20 (7,2mg/mL) Nombre de jours p=0,16

Figure 25 : Croissance des épicotyles (a) et des hypocotyles (b) de Phaseolus vulgaris en présence de EMG à différentes concentrations et du glyphosate à 7,2 mg/mL

Etude des effets sur les végétaux

Croissance de l'épicotyle de Pisum sativum (a) 300

250

200 0 mg/mL 0,1125 mg/mL

150 0,225 mg/mL 0,45 mg/mL 0,9 mg/mL 100 1,8 mg/mL

Longueur en mm en Longueur 3,6 mg/mL 50 7,2 mg/mL GLYPHOSATE (7,2 mg/mL) 0 3 5 7 9 11 13 15

-50 Nombre de jours p˂0,0000

Croissance de l'hypocotyle de Pisum sativum (b) 90

80 70 0 (mg/mL) 60 0,1125 (mg/mL)

0,225 (mg/mL) 50 0,45 (mg/mL) 40 0,9 (mg/mL)

30 1,8 (mg/mL) Longueur en mm en Longueur 3,6 (mg/mL) 20 7,2 (mg/mL) 10 GLYPHOSATE (7,2mg/mL) 0 3 5 7 9 11 13 15 Nombre de jours p=0,08

Figure 26 : Croissance des épicotyles (a) et des hypocotyles (b) de Pisum sativum en présence de EMG à différentes concentrations et du glyphosate à 7,2 mg/mL

Etude des effets sur les végétaux

Croissance de l'épicotyle de Zea mays (a) 160

140

120 0 (mg/mL)

100 0,1125 (mg/mL) 0,225 (mg/mL) 80 0,45 (mg/mL)

60 0,9 (mg/mL) 1,8 (mg/mL) 40 Longueur en mm en Longueur 3,6 (mg/mL)

7,2 (mg/mL) 20 GLYPHOSATE (7,2mg/mL) 0 3 5 7 9 11 13 15 -20 Nombre de jours p=0,22

Croissance de l'hypocotyle de Zea mays (b) 250

200

0 (mg/mL)

150 0,1125 (mg/mL) 0,225 (mg/mL)

Longueur en mm en Longueur 0,45 (mg/mL) 100 0,9 (mg/mL) 1,8 (mg/mL)

50 3,6 (mg/mL)

7,2 (mg/mL) 0 GLYPHOSATE (7,2mg/mL) 3 5 7 9 11 13 15

-50 Nombre de jours p=0,0002

Figure 27 : Croissance des épicotyles (a) et des hypocotyles (b) de Zea mays en présence de EMG à différentes concentrations et du glyphosate à 7,2 mg/mL

Etude des effets sur les végétaux

(Suite de la p. 85) Cette action peut s’expliquer par l’interaction de EMG avec des processus physiologiques et biochimiques (OTUSANYA et ILORI, 2012) comme la respiration, la photosynthèse, l’activité enzymatique, la disponibilité de l’eau, l’ouverture des stomates, le niveau d’hormones, la disponibilité des minéraux, la division cellulaire et l’élongation, la structure et la perméabilité des membranes cellulaires. (CHOU 1999, REIGOSA et coll., 1999). Ainsi, par exemple, EMG inhiberait des enzymes impliquées dans la mobilisation des réserves des cotylédons, empêchant ainsi l’embryon d’avoir accès aux nutriments nécessaires à son développement ou de disposer de substrats respiratoires ou bien entrainerait la nécrose du tissu nourricier des graines ou bien EMG agirait directement sur l’embryon, notamment sur sa respiration ou enfin, il entrerait en compétition avec un ou des métabolites-clés de l’embryon et entraînerait la destruction de celui-ci par blocage d’une ou plusieurs voies métaboliques primordiales (RAKOTO RANOROMALALA, 2012). Selon OTUSANYA et ILORI (2012), les saponosides, les flavonoïdes et les polyphénols présents dans l’extrait méthanolique de Tithonia diversifolia seraient responsables des effets phytotoxiques de cette plante. Il se pourrait que ces mêmes molécules qui constituent les groupes chimiques majoritaires dans EMG soient aussi à l’origine de ses effets négatifs sur les plantes. Aux faibles concentrations de EMG, une stimulation de la croissance des jeunes plantules a été observée, les effets ne sont donc pas doses dépendantes comme dans la plupart des tests effectués par d’autres auteurs (OTUSANYA et ILORI, 2012). Cependant, selon ABUGRE et coll. (2010), la stimulation est un phénomène apparemment commun à plusieurs extraits de plantes. Contrairement aux extraits méthanoliques de graines d’Albizia (RANDRIANARIVO et coll., 2014 b), EMG n’est pas aussi efficace que le glyphosate. En ce qui concerne Oryza sativa et Zea mays, leurs hypocotyles étaient plus sensibles à l’extrait que les épicotyles. D’après les données de la littérature, les racines sont plus sensibles aux composés phytotoxiques que les tiges (CHON et coll., 2000) et les tissus au niveau de ces organes sont plus perméables aux composés allélochimiques que ceux au niveau des tiges (NISHIDA et coll., 2005).

4.5. CONCLUSION

EMG est phytotoxique. Son action peut affecter la germination et/ou la croissance des jeunes plantules de plantes potagères. Son utilisation comme alternative aux herbicides de synthèse est envisageable. 90

Effets des extraits sur les microorganismes

Etude des effets sur les végétaux

CHAPITRE 5 : EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES

5.1. INTRODUCTION

L’objectif de l’étude est d’évaluer les propriétés antimicrobiennes de EMG et des produits obtenus lors des différentes étapes de sa purification.

Les expériences ont été réalisées sur quelques souches pathogènes pour l’Homme en utilisant les méthodes de diffusion en milieu solide puis de microdilution en milieu liquide pour la détermination des Concentrations Minimales Inhibitrice et Bactéricide ou Fongicide (CMI et CMB ou CMF).

5.2.MATERIELS ET METHODES

5.2.1. EXTRAITS UTILISES

Les extraits testés ont été :  EHG : extrait hexanique de graines (huile fixe) ;  EMG : extrait méthanolique de graines ;

 EP1 : phase organique obtenue par partition de EMG au n-butanol ;

 EP2 : phase aqueuse obtenue par partition de EMG au n-butanol ;

 EP3 : saponosides totaux obtenus à partir de EP1;

 EP4 : extrait non saponosidique obtenu à partir de EP1 ;

 EP5: saponosides purifiés par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de

EP3;

 EP6 à EP8 : composés phénoliques obtenus par chromatographie sur colonne de

Sephadex LH-20 de EP3 ;

 EP9 à EP28 : extraits obtenus par chromatographie sur colonne de silice de EP5.

5.2.2. LES CONSOMMABLES ET REACTIFS DE LABORATOIRE

5.2.2.1. LES MILIEUX DE CULTURE

Les milieux de cultures (solide et liquide) utilisés sont de qualité pour analyse. La composition de ces milieux est détaillée en Annexe VII.

 MILIEU MUELLER-HINTON AGAR (MHA)

Le milieu solide de Mueller-Hinton (Scharlau®) est employé pour l’étude de la sensibilité des souches vis-à-vis des extraits. 91

Effets des extraits sur les microorganismes

 BOUILLON MUELLER-HINTON

Le bouillon de Mueller-Hinton (Biorad®) est le milieu utilisé pour étudier l’activité des extraits en milieu liquide.

5.2.2.2. LES DISQUES D’ANTIBIOGRAMME

Les disques utilisés sont des disques de papier « filtre » (BioMérieux, REF 54991) de 6mm de diamètre.

5.2.2.3. SOLUTION DE CHLORURE DE PARA-IODONITROTETRAZOLIUM (INT)

L’INT (de marque Sigma Aldrich ®) est un l’indicateur coloré utilisé lors des tests de microdilution en milieu liquide. Il vire du jaune au violet en cas de croissance microbienne.

5.2.3. LES SOUCHES TESTEES

Les souches microbiennes utilisées comprennent des bactéries Gram (–) et Gram (+) et une levure unicellulaire, qui sont des germes couramment recherchés dans les analyses et/ou contrôles microbiologiques médicaux et alimentaires. Ces microorganismes sont tous des souches pures provenant de la collection du LABASM de la Mention Biochimie Fondamentale et Appliquée (Tableau 28). Tableau 28 : Listes des souches microbiennes utilisées

COLORATION SOUCHES MICROBIENNES REFERENCE GRAM Enterobacter aerogenes ATCC 13048 ENTEROBACTERIACEAE Enterobacter cloacae ATCC 13047 GRAM (-) Yersinia enterocolitica ATCC 23715 PSEUDOMONADACEAE Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 BACILLACEAE Bacillus cereus ATCC 14579 CLOSTRIDIACEAE Clostridium perfringens ATCC 13124 STAPHYLOCOCCACEAE Staphylococcus aureus ATCC 25923 GRAM (+) Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 STREPTOCOCCACEAE Streptococcus pyogenes ATCC 19615 SACCHAROMYCETACEAE Candida albicans ATCC 10231 ATCC = American Type Culture Collection

5.2.4. TESTS DE SENSIBILITE DES GERMES PAR LA METHODE DE DIFFUSION EN MILIEU GELOSÉ (METHODE D’ANTIBIOGRAMME)

La méthode utilisée est basée sur celle de RIOS et coll. (1988) et de PONCE et coll. (2003):

Effets des extraits sur les microorganismes

 une suspension d’inoculum est préparée à partir d’une culture pure (de 18-24 h sur de la gélose MHA pour tous les germes sauf pour Streptococcus cultivé sur de la gélose additionnée de sang frais de mouton). Cette suspension est réalisée dans de l’eau physiologique stérile (2 ml), sa concentration est ajustée de façon à obtenir une turbidité comparable à celle de l’étalon 0,5 de l’échelle McFarland (108 Unités Formant Colonies ou UFC/ml) ;  une dilution au 1/100ème de la suspension à 0,5 McFarland est ensuite effectuée avec de l’eau physiologique stérile de façon à obtenir 106 UFC/ml ;  cette suspension est ensuite inoculée par la méthode d’inondation à la surface de la gélose MHA pour tous les germes sauf pour Streptococcus qui est cultivé sur de la gélose additionnée de sang frais de mouton. Les germes sont laissés adhérer à la gélose à 37°C pendant 15 min. L’excès d’inoculum est ensuite éliminé par simple aspiration avec une pipette stérile ;  des disques d’antibiogramme (voir § 5.2.2.2, p.92) sont imprégnés de 10 µl d’extrait à une concentration de 100 mg/ml (correspondant à 1mg/disque), puis déposés à la surface de la gélose. Cette dose est couramment utilisée dans l’évaluation des activités antimicrobiennes d’extraits de plantes (RANDRIAMAMPIANINA, 2016). Les substances dans l’extrait diffusent radialement du disque vers la gélose en formant ainsi un gradient de concentration ;  le contrôle négatif est un disque imprégné du solvant utilisé pour diluer l’extrait et le contrôle positif est un disque imprégné de l’antibiotique de référence, la néomycine à 30 μg/disque pour les souches bactériennes et le miconasole à 500 μg/disque pour Candida albicans ;  après 24 h d’incubation à 37°C pour les bactéries et de 72 h à 25°C pour les levures, les résultats sont lus en mesurant le diamètre du halo d’inhibition (DHI), cette grandeur étant proportionnelle à la sensibilité du germe. Tous les tests sont effectués en double et les résultats sont exprimés en moyenne des diamètres des halos d’inhibition obtenus (mm). Les résultats obtenus sont interprétés selon les normes utilisées par PONCE et coll. (2003) (Tableau 29).

Tableau 29 : Normes utilisées pour l’expression des résultats obtenus par la méthode des disques (PONCE et coll., 2003)

DIAMETRE DU HALO TRANSCRIPTION SENSIBILITE D’INHIBITION (DHI) < 8 mm - Résistant 9-14 mm + Sensible 15-19 mm ++ Très sensible > 20 mm +++ Extrêmement sensible

Effets des extraits sur les microorganismes

5.2.5. DETERMINATION DE LA CONCENTRATION MINIMALE INHIBITRICE (CMI) ET DE LA CONCENTRATION MINIMALE BACTERICIDE/ FONGICIDE (CMB/ CMF) PAR LA METHODE DE MICRODILUTION

La CMI (Concentration Minimale inhibitrice) et la CMB (Concentration Minimale Bactéricide) ou la CMF (Concentration Minimale Fongicide) constituent des indices d’activité antimicrobienne. Elles permettent notamment de comparer l’activité d’un antibiotique ou d’un antifongique sur une souche microbienne donnée. La CMI est définie comme la plus faible concentration d’un antibiotique inhibant la croissance microbienne. Cette valeur caractérise l’effet bactériostatique d’un antibiotique. Elle permet également de classer l’effet de l’extrait brut et les extraits purifiés, selon DALMARCO et coll. (2010) dans les catégories : « excellent », « modéré », « faible » et « inactif » (Tableau 30). Tableau 30 : Normes utilisées pour l’expression des résultats obtenus par la méthode de microdilution (DALMARCO et coll., 2010)

CMI EFFET < 100 μg/ml Excellent 100-500 μg/ml Modéré 500-1000 μg/ml Faible > 1000 μg/ml Inactif

La CMB ou CMF est définie comme la plus faible concentration d’un antibiotique qui permet de détruire 99,9 % de la population microbienne. Cette valeur caractérise l’effet bactéricide d’un antibiotique. Le rapport CMB (ou CMF)/CMI permet ensuite de déterminer la nature de l’effet obtenu (CHAMANDI et coll., 2015) :  un extrait est bactéricide ou fongicide lorsque le rapport CMB (ou CMF)/CMI est inférieur ou égal à 4 ;  un extrait est bactériostatique ou fongistatique quand ce rapport est supérieur à 4. La détermination des CMI et CMB (CMF) est uniquement effectuée sur les souches sensibles (DHI supérieur à 8 mm).

Les tests, basés sur les techniques mises au point par FAWOLE et coll. (2009), KUETE et coll. (2009) et DALMARCO et coll. (2010), sont effectués de la manière suivante :

Effets des extraits sur les microorganismes

 une suspension d’inoculum est préparée à partir d’une culture pure (18-24 h sur de la gélose de Mueller-Hinton pour tous les germes et de la gélose de Mueller –Hinton avec du sang frais de mouton pour Streptococcus). Cette suspension est réalisée dans du bouillon Mueller- Hinton (2 ml), elle est ajustée de façon à obtenir une turbidité comparable à celle de l’étalon 0,5 de l’échelle McFarland (108 UFC/ml).  une dilution au 1/100ème de la suspension à 0,5 McFarland est ensuite effectuée avec du bouillon Mueller-Hinton de façon à obtenir 106 UFC/ml ;  la concentration de l’extrait est ajustée à 1,5 mg/ml ;  après stérilisation par ultrafiltration (Sartorius Stedim Biotech 0,20 μm), une gamme de concentration de l’extrait est ensuite préparée en effectuant une dilution en série (facteur de dilution ½);  un volume de 100 μl de chaque extrait à tester est alors mélangé avec 95 μl de bouillon Mueller-Hinton puis réparti dans des microplaques à 96 puits. 5 µl d’inoculum sont ensuite ajoutés dans chaque puits ;  deux témoins sont utilisés dont un négatif (contenant seulement 100 μl de bouillon de Mueller-Hinton) et un autre positif (95 μl de bouillon de Mueller-Hinton additionnés de 5 μl d’inoculum) ;  après 24 h d’incubation à 37°C pour les bactéries et à 25°C pour Candida albicans, 40μl d’INT (§ 5.2.2.3, p. 92) à une concentration de 0,2 mg/ml sont ajoutés dans chaque puits. Les plaques sont de nouveau incubées pendant 30 min aux mêmes températures que précédemment.  la CMI pour chaque extrait est définie par la plus faible concentration de cet extrait où aucun changement de coloration n’est observé.  les plaques sont ensuite incubées pendant 30 min à 37°C pour les bactéries et à 25°C pour Candida albicans.  pour la détermination de la CMB, 5 μl de chaque puits qui ne présente plus de changement de coloration sont ensemencés en stries sur de la gélose de Mueller Hinton : la CMB correspond à la plus faible concentration où aucune colonie bactérienne ou fongique ne se développe plus après incubation pendant 24 h à 37°C (pour les bactéries) et à 25°C (pour Candida albicans).  tous les tests sont effectués en double.

Effets des extraits sur les microorganismes

5.3. RESULTATS

Les activités antimicrobiennes des extraits testés sur les 10 souches testées ont été évaluées à la fois par la présence ou l’absence des halos d’inhibition et par la valeur de la CMI et de la CMB / CMF).

5.3.1. EFFETS DES EXTRAITS EN MILIEU SOLIDE Les résultats obtenus sont résumés dans les Tableau 31 à 34 (p. 97 et 98). A titre d’illustration, des images montrant les effets de ces extraits sur Candida albicans sont présentées dans les Figures 28 à 31 (p.99 et 100).

D’après ces résultats :  EHG (extrait hexanique ou l’huile fixe extraite des graines) n’a pas montré de propriétés antimicrobiennes ;  EMG était actif uniquement sur Candida albicans. Les DHI des différents extraits actifs variaient de 16,5 à 22,5 mm. Candida albicans était « très sensible » vis-à-vis de EMG,

EP1 et EP4 et « extrêmement sensible » vis-à-vis de EP3 et EP5 ;  EMG et les extraits partiellement purifiés renfermant les saponosides ont présenté une activité inférieure à celle de l’antibiotique de référence (Miconazole à 500 µg/disque) ;  en ce qui concerne les extraits LH-20, l’activité antifongique a été retrouvée dans les extraits saponosides purifiés (EP5) avec une activité comparable à celle de EMG, les extraits renfermant les composés phénoliques n’étaient plus actifs sur Candida albicans (EP6 à EP8) (Tableau 32, p. 98 et Figure 29, p. 99).

A titre d’illustration, des images montrant l’effet de ces extraits sur Candida albicans

à différentes concentrations de EP5 sont montrées dans le Tableau 33, p. 98 et sur la Figure 30, (p. 100).

 pour les extraits EP9 à EP28, non disponibles en quantité suffisante, les tests antifongiques ont été effectués en utilisant une concentration à laquelle Candida albicans restait sensible à EP5, soit 25 mg/ml (250 µg/ disque) : seuls les extraits EP10 et EP11 sont restés actifs sur Candida albicans (Tableau 34, p. 98 et Figure 31, p. 100).

Effets des extraits sur les microorganismes

Tableau 31 : Effets des extraits à 1000 µg/disque sur la croissance en milieu solide des germes étudiés DIAMETRES DES HALOS D’INHIBITION SOUCHES GRAM EHG EMG EP1 EP2 EP3 EP4 NEO MIC MICROBIENNES Enterobacter aerogenes 6 6 6 6 6 6 19 - Enterobacter cloacae 6 6 6 6 6 6 27 - Gram (-) Yersinia enterocolitica 6 6 6 6 6 6 20 - Pseudomonas aeruginosa 6 6 6 6 6 6 18 - Bacillus cereus 6 6 6 6 6 6 21 - Clostridium perfringens 6 6 6 6 6 6 22 - Gram (+) Staphylococcus aureus 6 6 6 6 6 6 18 - Streptococcus pyogenes 6 6 6 6 6 6 23 - Streptococcus pneumoniae 6 6 6 6 6 6 24 - Candida albicans 6 20 19 6 22 16,5 - 25 EMG : extrait méthanolique de graines ; EP1 : phase organique obtenue par partition de EMG au n-butanol ; EP2 : phase aqueuse obtenue par partition de EMG au n-butanol ; EP3 : saponosides totaux obtenus à partir de EP1 ; EP4 : extrait non saponosidique obtenu à partir de EP1 ; NEO: néomycine (30 µg/ml) ; MIC: miconazole (500 µg/ml)

5.3.2. VALEURS DE LA CMI ET DE LA CMF

La CMI et la CMF ont été déterminées pour Candida albicans, le seul germe sensible.

Les résultats obtenus suggèrent que :

 EMG, EP5, EP10 et EP11 avaient des CMI comprises entre 9,38 et 18,75 mg/ml ;

 Avec des ratios CMF/CMI ≤ 4, EMG, EP5, EP10 et EP11 ont exercé une action fongicide sur C. albicans ;  ce sont les extraits « saponosides purifiés» qui étaient responsables de l’action fongicide de EMG. Les CMI et les CMF de EMG et des extraits purifiés actifs sur C. albicans sont récapitulés dans le Tableau 35 (p. 101). Les Figures 32 à 34 (p. 101) illustrent les résultats obtenus.

Effets des extraits sur les microorganismes

Tableau 32 : Effets des extraits EP5 à EP8 sur la croissance en milieu solide de Candida albicans Diamètre du halo d’inhibition (mm) Extrait (1000 µg/disque) ATB de référence SOUCHE MICROBIENNE EP5 EP6 EP7 EP8 MIC Candida albicans 22,5 6 25 EP5 : saponosides purifiés par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3 ; EP6 à EP8 : composés phénoliques obtenus par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3 ; MIC: miconazole (500 µg/ml)

Tableau 33: Effets de différentes concentrations de l’extrait EP5 sur la croissance de Candida albicans SOUCHE MICROBIENNE Candida albicans Dose (mg/disque) 1,563 3,125 6,25 12,5 25 50 75 DHI (mm) 6 6 7,5 10,5 13,5 15,5 16

EP5 : saponosides purifiés obtenus par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de l’extrait EP3

Tableau 34 : Effets des extraits EP9 à EP28 (extraits obtenus par chromatographie sur silice de EP5) sur la croissance de Candida albicans en milieu solide

Extraits Diamètre du halo (1000 µg/disque) d’inhibition (mm) EP9 0 EP10 13,5 EP11 15 EP12 0 EP13 0 EP14 0 EP15 0 EP16 0 EP17 0 EP18 0 EP19 0 EP20 0 EP21 0 EP22 0 EP23 0 EP24 0 EP25 0 EP26 0 EP27 0 EP28 0 MIC 25 MIC: miconazole (500 µg/ml)

Effets des extraits sur les microorganismes

EMG

EP1

EP2

EP3 EP4

Figure 28 : Activité des différents extraits (EMG, EP1, EP2, EP3, et EP4) testés à 1 mg/disque sur Candida albicans

1 2

Figure 29 : Activité de EMG et des extraits purifiés (EP5, EP6, EP7 et EP8) à 1 mg/disque sur Candida albicans

1 : EMG : extrait méthanolique de graines ; 2 : EP5 : saponosides purifiés par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3 ; 3 : EP6 +EP7 + EP8: composés phénoliques obtenus par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3

Effets des extraits sur les microorganismes

3 7

2 6 3 3 1 3 5 4

Figure 30 : Sensibilité de Candida albicans à différentes concentrations de l’extrait EP5

1 : 15,63 µg/disque (1,563 mg/ml) 2 : 31,25 µg/disque (3,125 mg/ml) 3 : 62,5 µg/disque (6,25 mg/ml) 4 : 125 µg/disque (12,5 mg/ml) 5 : 250 µg/disque (25 mg/ml) 6 : 500 µg/disque (50 mg/ml) 7 : 750 µg/disque (75 mg/ml)

EP9

EP14 EP10

EP15 1 EP13 EP11 EP12

Figure 31 : Activité des quelques extraits obtenus après chromatographie sur colonne de silice de EP5 sur Candida albicans

EP9 à EP14 : extraits obtenus par chromatographie sur colonne de silice de EP5.

100

Effets des extraits sur les microorganismes

Tableau 35 : Valeurs des CMI et des CMF de EMG, EP5, EP10 et EP11 Extraits CMI (mg/ml) CMB (mg/ml) CMF/CMI Action EMG 18,75 18,75 1 Fongicide EP5 18,75 18,75 1 Fongicide EP10 18,75 18,75 1 Fongicide EP11 9,38 9,38 1 Fongicide EMG : extrait méthanolique de graines ; EP5 : saponosides purifiés par chromatographie sur colonne de sephadex LH-20 de EP3 ; EP10 et EP11 : extraits obtenus par chromatographie sur colonne de silice de EP5

+ - 75 37,5 18,75 9,38 4,69 2,34 1,17 0,59 0,29 0,15 T T EMG

Figure 32 : Variation de la turbidité induite par la croissance de Candida albicans en fonction de la concentration de EMG

- + 18,75 9,38 4,69 2,34 1,17 0,59 0,29 0,08 0,15 0,04 T T

Figure 33 : Variation de la turbidité induite par la croissance de Candida albicans en fonction de la concentration des différents extraits obtenus par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de l’extrait EP3 (EP5 à EP8) 1 : EP5 : saponosides purifiés par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3 ; 2 : EP6 +EP7 + EP8: composés phénoliques obtenus par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3

- + 18,75 9,38 4,69 2,34 1,17 T T

EP10

EP11

Figure 34 : Variation de la turbidité induite par la croissance de Candida albicans en fonction de la concentration des extraits (EP10 et EP11) obtenues par chromatographie sur colonne de silice de EP5 101

Effets des extraits sur les microorganismes

5.4. DISCUSSION

EMG et ses dérivés renfermant des saponosides se sont avérés actifs sur Candida albicans mais inefficaces contre toutes les bactéries testées. Candida albicans est un champignon unicellulaire faisant partie des principaux agents pathogènes des infections appelées candidoses (des détails sur Candida albicans sont donnés en ANNEXE VI). Notons qu’il n’y a pas de consensus sur l’appréciation du niveau de l’activité antimicrobienne pour les produits naturels (BENKO-ISEPPON et CROVELLA, 2010). Elle dépend souvent des auteurs. Par exemple, les extraits méthanoliques de Mentha pulegium, Marrubium vulgare et Teucrium polium avec des CMI entre 3,25 et 12,5 mg/ml sont considérés comme des extraits à forte activité antifongique (AOUADHI et coll., 2013). Aussi, les extraits de graines de D. madagascariensis dont les CMI allaient de 9,38 mg/ml (EP11) à 18,75 mg/ml (EMG), pourraient être qualifiés de très actifs contre Candida albicans. Cependant, d’après d’autres normes comme celle de DALMARCO et coll. (2010), avec des CMI supérieures à 1000μg/ml ces extraits sont classés inactifs. Par ailleurs, il a été rapporté que la plupart des médicaments antifongiques n’ont qu’une activité fongistatique et des phénomènes de résistance fongique aux médicaments classiques sont de plus en plus connus (AOUADHI et coll., 2013). Or, l’action des extraits de graines de D. madagascariensis est fongicide et non fongistatique, ce qui porte à penser qu’ils pourraient être de bons candidats comme agents antifongiques. Ce sont généralement les saponosides triterpéniques avec de l’hédéragénine ou de l’acide oléanolique comme aglycone qui possèdent une activité antifongique contre Candida albicans mais aussi contre Candida glabrata, Trichosporon beigeli, Penicillium avelaneum UC-4376, Pyriculata oryzae, Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis et Saccharomyces cerevisiae et également contre des dermatophytes comme Microsporum canis et Trichophyton mentagrophytes (TSUZUKI et coll., 2007). Ceci donne une idée sur la structure des saponosides des graines de D. madagascariensis. Bien que les flavonoïdes soient connus pour leurs propriétés anti-Candida (SELEEM et coll., 2017 ; CUSHNIE et coll., 2005), dans le cas des graines de D. madagascariensis ils ne sont pas impliqués dans l’activité antifongique. En effet, une fois séparés des saponosides, les composés phénoliques y compris les flavonoïdes n’avaient plus d’activité contre Candida albicans. A propos des résultats relatifs aux bactéries, il était assez surprenant de constater que tous les extraits de graines de Dodonaea madagascariensis ont été inactifs. En effet, d’après les 102

Effets des extraits sur les microorganismes

données de la littérature rapportées dans le Chapitre « Synthèse bibliographique » (Cf. § 1.2.2.4.2., p. 14), les spectres d’activité antimicrobienne de certaines espèces de Dodonaea sont assez larges (bactéries, champignons et virus). Par ailleurs, la plupart des souches que nous avons testées comptent parmi les bactéries sensibles aux extraits d’autres espèces de Dodonaea (Cf. § 1.2.2.4.2, p. 14). Il se pourrait que les extraits de Dodonaea madagascariensis soient complètement inefficaces sur les bactéries et dans ce cas les principes actifs seraient différents de ceux des espèces de Dodonaea étudiées. Une autre explication, plus probable, est que nos extraits possèdent des propriétés antibactériennes, mais ils n’étaient pas actifs sur les souches testées dans le cadre de cette étude. Dans cette éventualité, les extraits ont une action sélective sur les bactéries. Pour être fixé sur ce point, il faudra les tester sur d’autres bactéries dont celles sensibles aux extraits de Dodonaea comme Escherichia coli, Porphyromonas gingivalis, Klebsiella pneumonia…. Nos résultats ont apporté des indices sur les activités antimicrobiennes des extraits de graines de Dodonaea madagascariensis, mais des investigations plus poussées sont encore nécessaires pour obtenir plus d’informations qui permettront d’avoir une idée plus précise de leur spectre d’activité.

5.5. CONCLUSION

Les résultats de l’évaluation de l’activité antimicrobienne des graines de D. madagascariensis ont montré d’une part que EMG et ses dérivés ont été efficaces contre Candida albicans mais sans effets sur les bactéries testées et que d’autre part, les saponosides seraient les principaux sinon les seuls responsables de cette activité antifongique.

Dans les travaux futurs, les recherches devront être étendues à d’autres bactéries, levures et champignons pathogènes afin d’avoir une meilleure appréciation du potentiel antimicrobien des graines de D. madagascariensis.

103

Evaluation de l’activité antioxydante des extraits

CHAPITRE 6 : EVALUATION DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE DES EXTRAITS

6.1. INTRODUCTION

L’activité antioxydante d’un composé correspond à sa capacité à résister à l’oxydation. Des composés phénoliques ont été trouvés dans les graines (cf. § 2.3.2.6; p. 35). Or ces composés sont connus pour leurs propriétés antioxydantes (BIDIE et coll., 2011). L’objectif des travaux rapportés dans ce chapitre est d’évaluer les propriétés antioxydantes des extraits de graines. Deux méthodes complémentaires ont été utilisées : une approche qualitative par bioautographie in situ au DPPH (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle) de ces extraits et une analyse quantitative conduisant à la détermination de la concentration inhibitrice à 50 % (CI50) par la mesure de l’activité antiradicalaire.

6.2. MATERIELS ET METHODES

6.2.1. EXTRAITS UTILISES

Les extraits testés ont été :  EMG : extrait méthanolique de graines ;

 EP5: saponosides purifiés par chromatographie sur colonne de SEPHADEX LH-20

de EP3;

 EP6 à EP8 : composés phénoliques obtenus par chromatographie sur colonne de

SEPHADEX LH-20 de EP3.

6.2.2. METHODES

De nombreuses méthodes sont utilisées actuellement pour évaluer l’activité antioxydante d’un composé mais le radical DPPH est largement utilisé pour l’étude de l’activité antiradicalaire de différents extraits (BENTABET et coll., 2014).

Le DPPH (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle) est un radical libre stable à température ambiante qui, en solution méthanolique est de couleur violette (BADARINATH et coll., 2010). Quand ce radical réagit avec un antioxydant, il est réduit entrainant ainsi une transformation de la forme « radical libre » DPPH en sa « forme réduite » DPPHH colorée en jaune (Figure 35, p. 105). Le degré de décoloration indique la capacité de l’extrait ou de l’antioxydant de référence à céder de l’hydrogène (KILLEDAR et coll., 2013).

104

Evaluation de l’activité antioxydante des extraits

Figure 35 : Structure chimique du DPPH et sa réaction avec un piégeur de radicaux (A-H) (SCALZO, 2008)

6.2.2.1. DETECTION DU POUVOIR ANTIOXYDANT PAR BIOAUTOGRAPHIE

La méthode utilisée est basée sur celle de DIENG et coll. (2015) : l’extrait à tester ou la vitamine C (antioxydant de référence), dissous dans du méthanol est déposé sur une plaque de gel de silice. L’éluant utilisé est un mélange de butanol/ acide acétique/ eau (60 :20 :20, p/p/p). Après développement et séchage, la plaque est révélée avec une solution méthanolique de DPPH à 2mg/ml. Si la réaction est positive, des zones d’activité antiradicalaire apparaissent en jaune-clair sur fond violet après un temps optimal de 30 min.

6.2.2.2. DOSAGE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE PAR LE TEST AU DPPH

Ce dosage, effectué uniquement si l’extrait montre une activité antiradicalaire par bioautographie, met en jeu une technique basée sur celle de SOFIDIYA et coll. (2012). Une gamme de concentrations allant de 3,125 µg/ml à 1400 µg/ml d’extrait ou de vitamine C dissous dans du méthanol a d’abord été préparée. Puis 1 ml de DPPH à 0,1 mM en solution méthanolique est mélangé à 1 ml de chaque concentration. Le mélange est vortexé puis laissé à l’obscurité à température ambiante pendant 30 min. Les absorbances sont lues à 517 nm contre un blanc constitué de méthanol pur (spectrophotomètre VWR®, V-1200 spectrophotometer). Les expériences sont effectuées en triple. L’absorbance est ensuite convertie en pourcentage d’inhibition ou PI (%) qui définit la capacité de piégeage des radicaux libres du DPPH selon la formule suivante :

퐴푏푠 푐표푛푡푟ô푙푒 − 퐴푏푠 é푐ℎ푎푛푡𝑖푙푙표푛 푃퐼 % = x 100 퐴푏푠 푐표푛푡푟ô푙푒

Où : Abs contrôle : absorbance du radical DPPH et du méthanol Abs échantillon : absorbance du radical DPPH mélangé avec l’extrait à tester ou la vitamine C

105

Evaluation de l’activité antioxydante des extraits

Les résultats sont exprimés par la moyenne des PI % ± écart type calculée à partir des trois mesures (n=3).

La valeur de la CI50 (Concentration Inhibitrice à 50 %) est déterminée pour caractériser l’activité antioxydante sur un graphe représentant le pourcentage d’inhibition du DPPH en fonction de la concentration de l’extrait ou de l’antioxydant de référence (BIDIE, 2011). La

CI50 est la concentration d’extrait de plante ou d’antioxydant de référence responsable de 50 % d’inhibition des radicaux DPPH. L’analyse statistique et la représentation graphique sont réalisées à l’aide du logiciel GraphPad Prism ® (GraphPad Prism Software Version 5.01).

6.3. RESULTATS

6.3.1. MISE EN EVIDENCE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE DE EMG PAR BIOAUTOGRAPHIE

Les chromatogrammes révélés in situ au DPPH, ont présenté des taches de couleur jaune sur un fond violet (Figure 36, p. 107) indiquant que :  EMG a été capable de réduire la radical DPPH. L’intensité de la tache observée était par contre un peu faible par rapport à celle de vitamine C à la même concentration (1,25 mg/25µl) ;  cette activité antioxydante a été seulement retrouvée dans les extraits « composés phénoliques » EP6 à EP8 (0,975 mg/25µL). Du point de vue qualitatif, l’intensité de coloration des taches jaunes obtenues a augmenté pour les extraits « composés phénoliques » comparé à l’extrait brut suggérant que le pouvoir antioxydant a augmenté au cours de la purification, mais à cause de l’insuffisance des extraits une étude quantitative n’a pas été possible.

6.3.2. DOSAGE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE PAR METHODE COLORIMETRIQUE

L’activité antioxydante de EMG a été évaluée par l’utilisation du réactif au DPPH en utilisant des concentrations allant de 3,125 à 1400 µg/ml. L’analyse statistique des valeurs et la représentation graphique (Figure 37, p. 107) ont permis de déterminer la CI50 de EMG qui

était de 404,6 µg/ml tandis que pour la vitamine C, la valeur de la CI50 était de 10,42 µg/ml.

106

Evaluation de l’activité antioxydante des extraits

Vit C : vitamine C

EMG : extrait méthanolique de graines

EP5 : saponosides purifiés par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3

EP6 à EP8 : composés phénoliques obtenus par chromatographie sur colonne de Sephadex LH-20 de EP3 Solvant de chromatographie : Butanol/acide acétique/eau (60/20/20 p/p/p)

Révélation : solution méthanolique de DPPH (2mg/ml)

EMG Vit C EP5 EP6+EP7+EP8

Figure 36 : Screening de l’activité antioxydante par bioautographie de EMG, des extraits « saponosides purifiés » et « composés phénoliques »

150 VITAMINE C EMG

100

(%)

Pourcentaged'inhibition DPPH du 0 0 500 1000 1500 Concentration d'EMG (µg/ml)

Figure 37 : Courbe représentant le pourcentage d’inhibition du radical DPPH en fonction de la concentration de EMG

107

Evaluation de l’activité antioxydante des extraits

6.4. DISCUSSION

L’activité antioxydante de EMG a été mise en évidence par bioautographie et elle a pu être quantifiée par dosage spectrophotométrique du DPPH. A 1400 µg/ml, EMG a montré 94,758 ± 0,570 % d’inhibition contre 97,043 ± 0,095 % d’inhibition pour la vitamine C. Cependant, sachant que les composés dont la CI50 est supérieure à 100 µg/ml n’ont pas une activité antiradicalaire notable (BIDIE et coll., 2011), avec une CI50 de 404,6 µg/ml pour EMG contre une valeur de CI50 de 10,42 µg/ml pour la vitamine C, EMG a montré une faible activité antioxydante.

Le test antioxydant au DPPH de EMG réalisé par bioautographie a donné une seule tache de couleur jaune et de faible intensité par rapport à celle de l’antioxydant de référence. L’extrait

« composés phénoliques » (EP6 à EP8) ont présenté 2 bandes majeures, il se pourrait alors que 2 types de composés soient responsables de cette activité antioxydante.

Des études ont montré qu’il y a une certaine corrélation entre la teneur en composés phénoliques et l’activité antiradicalaire (MAKRIS et coll., 2007 ; ANGELOV et coll., 2008). EMG renfermait des flavonoïdes (des molécules qui appartiennent à la sous-classe des polyphénols), mais la faible activité antioxydante de EMG pourrait être due à une faible concentration de ces composés dans l’extrait.

Cependant, la quantité de flavonoïdes n’influence pas forcément le pouvoir antioxydant d’un extrait. C’est le cas par exemple de la forte activité antioxydante de l’extrait méthanolique de feuilles de Dodonaea viscosa malgré sa faible teneur en flavonoïdes (AL-AZAWI, 2016). Un autre facteur peut aussi intervenir : Il s’agit de la relation structure-activité car selon BENDARY et coll. (2013), l’activité antioxydante en relation avec la structure du composé dépend du nombre de groupements fonctionnels (OH ou NH2). Un composé est plus actif s’il comporte plusieurs de ces groupements.

Notons que cette faible activité antioxydante des graines ne reflète pas l’activité antiradicalaire de la plante entière. En effet, pour une même plante, l’activité antioxydante peut varier d’un organe à l’autre. Il a été observé que la capacité antioxydante des fruits et des graines est faible et ceci serait expliqué par la faible quantité de composés phénoliques dans ces organes (MAISUTHISAKUL et coll., 2007) et que ce sont les écorces qui présentent une activité plus grande par rapport aux autres parties à cause de leur richesse en tanins et en procyanidines (SOUZA et coll., 2008).

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Evaluation de l’activité antioxydante des extraits

Notons qu’au cours des différentes étapes de purification, une augmentation de l’activité antioxydante des extraits renfermant les composés phénoliques a été observée même à une dose inférieure à EMG, suggérant également que la faible activité antioxydante de EMG pourrait être due à la présence de contaminants qui ont masqué cette activité. Les différents extraits purifiés n’étaient pas disponibles en quantité suffisante, aussi, il n’a pas été possible de comparer d’une manière précise leurs activités antioxydantes.

Pour pouvoir situer la valeur de la CI50 de EMG, les valeurs de CI50 d’autres plantes sont données ci-après :  extraits méthanoliques de plantes à forte activité antiradicalaire :  extrait de feuilles de Pittosporum ochrasiaefolium (PITTOSPORACEAE) dont la

CI50 est égale à 7,1 µg/ml (RATSIMIEBO-ANDRIAMAMPIANINA, 2017)

 extrait d’écorces de Trichilia prieuriana (MELIACEAE) / CI50 = 7,5±0,288 µg/ml (BIDIE et coll., 2011);

 extrait d’écorces de Chrysophyllum perpulchrum (SAPOTACEAE) avec une CI50 égale à 4,5±0,288 µg/ml (BIDIE et coll., 2011);  extraits méthanolique de feuilles de Dodonaea viscosa (SAPINDACEAE) avec une

CI50 égale à 8 µg/ml (AL-AZAWI, 2016).

 plantes à activité antiradicalaire faible :

 extrait de feuilles d’Ageratum conyzoïdes (ASTERACEAE) dont la CI50 est de 76±0,577 µg/ml (BIDIE et coll., 2011);

 extrait de feuilles de Parquettina nigrescens (PERIPLOCACEAE) dont la CI50 est égale à 75,5±0,156 µg/ml (BIDIE et coll., 2011);

 plantes qui n’ont pas d’activités antiradicalaires notables :

 extrait d’écorces de Desmodium gangeticum (LEGUMINOSEAE) avec une CI50 de 10000±288,7 µg/ml (BIDIE et coll., 2011) ;

 extrait de feuilles de Blighia sapida (SAPINDACEAE)/ CI50 =17000±577,4 µg/ml (BIDIE et coll., 2011).

6.5.CONCLUSION

EMG est doué d’une activité antioxydante, qui est probablement due aux flavones et aux polyphénols présents dans l’extrait. Cependant, elle était faible car sa CI50 était presque 39 fois supérieure à celle de la vitamine C.

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DISCUSSION GENERALE

Discussion générale

DISCUSSION GENERALE

Evaluer et caractériser la toxicité des graines de Dodonaea madagascariensis, identifier les métabolites secondaires qui en sont responsables, et explorer dans quelle mesure la plante peut être utilisée à des fins utiles, notamment dans le contrôle des organismes nuisibles étaient les principaux objectifs visés dans cette étude. En général, nos objectifs ont été atteints. La toxicité des graines a été bien établie et caractérisée :  sur les animaux, les sympômes développés, les lésions occasionnées, les facteurs influençant la toxicité et les indices de toxicité ont été déterminés et les essais d’appâtage entrepris,  sur d’autres organismes, la phytotoxicité et les propriétés antimicrobiennes ont été mises en évidence. Il a été démontré que les saponosides, famille chimique majoritaire dans les graines, étaient responsables de la toxicité. Ces composés peuvent être classés parmi les saponosides hautement toxiques. Cependant, tant que les différentes molécules de saponosides ne sont pas isolées, leur nature chimique déterminée et la toxicité de chacune d’elles testée, il n’est pas possible de connaître :  le nombre de saponosides présents dans EMG. Il est bien connu que chez les plantes, les saponosides se présentent comme un mélange complexe de plusieurs molécules. A titre d’illustration, il a été isolé de Panax ginseng au moins 18 saponines triterpéniques, des racines d’Astragalus membranaceous, d’A. mongholicus et d’autres espèces d’Astragalus chinoise plus de 40 saponines triterpéniques et au moins 56 saponines de Gymnostermma pentaphyllum (KHAN et coll., 2010).  leur originalité ou leur distribution dans les autres espèces de Dodonaea et d’autres plantes. En effet, la question qui se pose est si : 1) D. madagascariensis s’inscrit dans le large groupe des SAPINDACEAE caractérisé par des saponines dérivées de l’hédéragénine et de l’acide oléanolique comme l’avait rapporté KAPUNDU et coll. (1991) et ; 2) comme d’autres Dodonaea appartenant à la sous-famille des Dodonaeoideae, elle est caractérisée par la présence de l’acide glucuronique et par des saponines poly- oxydées (soit diacides comme l’acide médicagénique, soit polyhydroxylées sur les

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Discussion générale

cycles D et E comme le barringtogénol C) (VOUTQUENNE-NAZABADIOKO, 2010).

 le nombre de molécules impliquées dans la toxicité. Généralement, la toxicité n’est pas attribuée à la totalité des molécules constituant le mélange mais seulement à quelques unes d’entre elles. Dans le cas des saponines de Quillaja saponaria molina par exemple, seulement une partie possède une forte activité hémolytique (HENRY, 1995) tandis que d’autres saponosides ne sont pas toxiques et sont même utilisés pour leur activité adjuvante (KONNBERG et coll., 1995).  si les molécules impliquées dans les effets sur les différents organismes sont les mêmes ou différentes. A ce propos, l’acide médicagénique (un produit pur) est à la fois toxique sur des Mammifères (à forte activité hémolytique) et doué de propriétés antifongique et piscicide (KHAN et coll., 2010). Les saponines de Rumex hastatus possèdent à la fois des propriétés antibactériennes et des propriétés phytotoxiques (KAMAL et coll., 2015). Le principe convulsivant et toxique des graines de CONNARACEAE, en plus de sa toxicité pour les animaux est également doué d’une activité antimicrobienne sur des germes comme Bacillus subtilis et Saccharomyces cerevisiae (JEANNODA et coll., 1984 et 1985 ; JEANNODA, 1986).  le mécanisme d’action de EMG, bien que les organes cibles et les lésions occasionnées aient été identifiés.

L’utilisation des graines de D. madagascariensis en tant que biopesticide (rodenticide, herbicide et fongicide) est envisageable. DE GEYTER et coll. (2015) ont rapporté que les saponosides ont une forte toxicité sur une large gamme d’insectes nuisibles. Bien que EMG soit inefficace contre les puces, il pourrait être testé sur d’autres insectes nuisibles comme les moustiques vecteurs de maladies, les acridiens ravageurs (sauterelles), les mouches de fruits. Il faudra aussi le tester sur d’autres insectes dont ceux sensibles aux extraits de Dodonaea comme certains insectes appartenant à la classe des Coléoptères, des Lépidoptères et des Hémiptères nuisibles (§ 1.2.2.4.1 ; p. 13). Cependant, étant donné la forte toxicité de EMG sur différents organismes, il est vivement recommandé de prendre les précautions nécessaires afin d’éviter des effets indésirables sur des organismes non cibles surtout envers les animaux à sang froid comme les alevins de poissons et les têtards de grenouilles.

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Discussion générale

Les saponines sont des glycosides naturels possédant un large éventail de propriétés pharmacologiques (PODOLAK et coll., 2010). Des investigations sur les propriétés pharmacologiques des saponosides de EMG devraient être entreprises afin de connaître si les graines possèdent les propriétés thérapeutiques des autres organes de Dodonaea madagascariensis (TROTIN, 1970 ; www.doc-developpement-durable.org). L’utilisation de EMG pour traiter les infections cutanées dues à Candida albicans est envisageable. Par contre, compte tenu des lésions tissulaires occasionnées par cet extrait, même à faible dose, son ingestion ou son administration par voie ip. pour traiter des mycoses systémiques (ex : mycose digestive ou urinaire) est fortement déconseillée. EMG possède des propriétés phytotoxiques, si EMG est également toxique pour les plantes nuisibles comme les extraits méthanoliques de graines d'Albizia qui sont efficaces à la fois sur des plantes potagères et sur les mauvaises herbes et plantes envahissantes telles Eragrostis pilosa, Panicum subalbidum, Cassia rotundifolia, Acacia dealbata et Pinus kesyia [RANDRIANARIVO et coll., 2014 (b)], il pourrait constituer une alternative prometteuse aux herbicides de synthèse. Toutefois, s’il s’avère que EMG peut être utilisé en tant qu’herbicide, il faudrait veiller, dans ce cas, à ce que les espèces cultivées soient tolérantes à l’extrait afin d’affecter le moins possible les cultures.

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CONCLUSION GENERALE ET PERPECTIVES

Conclusion générale et perspectives

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

CONCLUSION GENERALE

Nos résultats constituent les premières données chimiques et toxicologiques sur les graines de D. madagascariensis et enrichissent ainsi les connaissances sur les espèces du genre Dodonaea et par conséquent la biodiversité végétale malgache, notamment les plantes toxiques.

Les objectifs visés par nos travaux ont été atteints. En effet :  la toxicité des extraits de graines de D. madagascariensis sur la souris, animal standard de référence est bien établie : manifestations de la toxicité (symptômes) déterminées, indice de toxicité (DL50) évaluée, influence des voies d’administration connue, organes cibles identifiés (lésions) ;  les effets sur les grandes fonctions physiologiques étudiés in vitro sont connus ;  en plus des propriétés rodenticides (contre les souris), des propriétés phytotoxiques et fongicides ont été mises en évidence ce qui permet d’envisager l’utilisation des graines dans la lutte contre les organismes nuisibles ;  les saponosides ont été identifiés comme étant le groupe chimique responsable des activités toxiques ;  d’autres propriétés biologiques intéressantes des graines de D. madagascariensis (antioxydant, hémolytique) ont été mises en évidence.

PERSPECTIVES

Parmi nos travaux futurs figurent :  la poursuite de l’étude chimique afin d’obtenir les principes actifs à l’état pur et de procéder à la détermination de leur structure ;  la reprise des tests toxicologiques avec les produits purs afin de déterminer 1) leurs implications respectives dans les effets sur les différents organismes sensibles 2) leurs mécanismes d’action ;  l’extension des investigations à d’autres organismes afin d’identifier d’autres organismes sensibles ;  l’exploration d’autres propriétés biologiques pharmacologiques potentiellement exploitables ;

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Conclusion générale et perspectives

 le lancement des travaux sur les autres organes (feuilles, écorces et racines) pour une meilleure connaissance de la plante ;  le démarrage des discussions avec les populations locales et les services publics décentralisés concernés par les problèmes des organismes nuisibles (domaine de l’agriculture, l’élevage et la santé) en vue des essais sur le terrain (appâtage, soins, etc.).

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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ET WEBOGRAPHIQUES

Références bibliographiques et webographiques

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ANNEXES

Annexes

ANNEXES

ANNEXE I : Composition des réactifs généraux pour les alcaloïdes

1. Réactif de MAYER  Chlorure de mercure……………………………………………………………1,36 g  Iodure de potassium……………………………………………………………….5 g  Eau distillée……………………………………………………………….qsp 100 ml

2. Réactif de WAGNER  Iodure de potassium………………………………………………………………2 g  Iode……………………………………………………………………………..1,27 g  Eau distillée……………………………………………………………….qsp 100 ml

3. Réactif de DRAGENDORFF Il s’agit d’un mélange (v/v) de deux solutions, A et B  Solution A : Nitrate de bismuth…………………………………………………..…………1,7 g Acide tartrique concentré…………….………………………………………...20 g Eau distillée…………………………………….……………………….qsp 100 ml  Solution B : Iodure de potassium……………………………………………………………10 g Eau distillée qsp…………………………….………………………………...40 ml

ANNEXE II : Composition du milieu de Krebs- Henseleit modifié (en mM)  NaCl………………………………………………………………………………20  NaHCO3…………………………………………………………………………..25  KCl……………………………………………………………………………...4,72  CaCl2…………………………………...…………………………………..……2,5  MgSO4…………………………………………………………………………...0,5  KH2PO4……………………………………...…………………………………..1,2  D-glucose…………………………………………………………………………11

Annexes

ANNEXE III : Composition du réactif à la vanilline sulfurique  Vanilline…………………………..………………………………………………….1 g

 Acide sulfurique (H2SO4) 36 N………………………………………...... …………2 ml  Ehanol 96 %...... qsp 100 ml

ANNEXE IV : Composition du PBS (Phosphate Buffered Saline)

 Phosphate disodique (Na2PO4)…………………………………………….…...0,724 g  Phosphate monosodique (NaPO4)……………………………………...……….0,210 g  Chlorure de sodium(NaCl)…………………………………………………….….7,65 g  Eau distillée………………………………..………………………………qsp 1000 ml

ANNEXES V : Composition du liquide de BOUIN

 75 ml d’eau bidistillée saturée d’acide picrique (1,4g/100ml) ;  25 ml de formol à 40 % ;  5 ml d’acide acétique glacial.

ANNEXE VI : Généralités sur Candida albicans

Ce genre appartient à l’embranchement des DEUTEROMYCETES aussi appelés champignons imparfaits (Fungi imperfecti) car chez eux, la reproduction sexuée n’a pas pu être mise en évidence. En revanche, ils forment des spores ou conidies. C. albicans fait partie de la flore normale de l'intestin mais il peut être à l’origine d’infections opportunistes, il peut être responsable d’infections superficielles chez des sujets sains ou systémiques chez des sujets immunodéprimés. Les infections superficielles comprennent le muguet, des vulvo-vaginites, des intertrigos (plis cutanés humides), des onychomycoses et périonyxis. Les infections disséminées peuvent survenir dans n'importe quelle partie de l'organisme. Les prématurés, en particulier, sont sujets à des infections urinaires qui peuvent remonter jusqu'aux reins avec formation d'une boule fongique ou fungus bail (HART et SHEARS, 1997). Candida albicans peut aussi être aussi à l’origine d’infections cutanées (LΟPEZ-GARCIA et coll., 2005).

ANNEXE VII : Composition des milieux de culture

 Bouillon MUELLER-HINTON (formule-type g/l) :  Extrait de viande ...... …... 2 g

Annexes

 Peptone …………………………………………………………………... 17,5 g  Amidon ...... …... 1,5 g  pH = 7,3 ± 0,2 à 25°C  Milieu MUELLER-HINTON AGAR (formule-type g/l) :  Extrait de viande...... 3g  Peptone...... 5g  Peptone trypsique de caséine...... 10g  Chlorure de sodium...... 5g  Glucose...... 2g  Agar...... 10g  Eau distillée...... qsp 1000 ml pH 7,3 ± 0,1 à 25°C

ANNEXE VIII : Publications scientifiques

Articles dans une revue internationale

1. RAZANATSEHENO M.S., RAJEMIARIMOELISOA C.F., RAZAFINDRAKOTO Z.R., RAMANITRAHASIMBOLA D., RAKOTO D.A.D, RANDRIANARIVO H.R., JEANNODA V. L. Toxicological study of seed extracts from Dodonaea madagascariensis Radlk (SAPINDACEAE), a malagasy medicinal plant. Journal of Plant Sciences. 2015; 3(6): 303-309.

Communication orale

2. RAZANATSEHENO M.S. Toxic effects of seed methanolic extracts of Dodonaea madagascariensis Radlk. (SAPINDACEAE) on animals. The 16th Symposium on Natural Products Research Network for Eastern and Central Africa (NAPRECA). Theme: Improved Health and Agriculture through Sustainable Exploration of Biodiversity for Drug Discovery and Bioenergy, Arusha (Tanzanie). Septembre 2015. SL 12.

RÉSUMÉ

Une étude de la toxicité ainsi que d’autres propriétés biologiques des graines de Dodonaea madagascariensis, une plante endémique de Madagascar a été effectuée. L’extrait méthanolique de graines (EMG) obtenu par lixiviation par l’hexane puis par le méthanol, a été utilisé pour les investigations sur les animaux, les végétaux et les microorganismes. Le criblage phytochimique a révélé la présence dans EMG, de stérols insaturés, de polyphénols, de triterpènes, de flavones et une quantité importante de saponosides. Les leucoanthocyanes et les stéroïdes étaient présents mais à l’état de traces. EMG a été purifié par des méthodes de fractionnement et de chromatographie bioguidées par des tests sur souris. Les résultats ont montré que les saponosides étaient surtout les composés à l’origine de la toxicité des graines. Il a montré un potentiel hémolytique élevé, sa DH50 a été estimée à 1,57 µg/ml. Il était modérément toxique pour la souris par voie per os (p.o.) mais extrêmement toxique par voie intrapéritonéale (ip.). Sa DL50 (voie i.p.) a été estimée à 36,12 mg/kg. Il a entrainé des lésions à différents degrés au niveau du foie, des reins, des poumons et des intestins. Des lésions surtout marquées par des zones inflammatoires et hémorragiques et quelques nécroses (par voie ip.) ou œdèmes (voie p.o.) au niveau du foie. Les symptômes d’intoxication peuvent être regroupés en des symptômes liés à une atteinte du système nerveux, des troubles respiratoires, des troubles digestifs, mais les premiers ont été fréquemment observés et sont apparus souvent en premier. EMG a exercé un effet inotrope positif sur les oreillettes isolées de cobaye à une concentration de 12,5 μg/ml. Par contre, il n’a pas affecté les fonctions rénale et hépatique à la dose de 12,72 mg/kg. L’utilisation des graines et de EMG s’est avérée efficace en tant qu’appâts empoisonnés pour souris : environ 8,3 ± 0,7 g de graines ont suffi à tuer une souris de 25 g en 5 jours et 0,955 ± 0,032 g d’appât à 16,7 % de EMG a suffi à tuer une souris de 25 g au bout de 2 jours. Sa toxicité envers les animaux à sang froid a aussi été mise en évidence : sa CL50 a été estimée à 5,411 µg/ml et 4,330 µg/ml, respectivement pour les têtards de grenouille et les alevins de poisson. Par contre, à la concentration de 10 mg/ml, il n’est pas efficace contre les puces. EMG a inhibé la germination de graines de petit pois, de haricot et la croissance du petit pois, du riz et du maïs. EMG a exercé une activité fongicide envers Candida albicans avec une CMI de 18,75 mg/ml. Avec une IC50 estimée à 404,6 µg/ml sur le DPPH, EMG a montré une faible activité antioxydante, due probablement aux composés phénoliques. Les investigations chimiques et biologiques ont révélé des propriétés toxiques de graines de Dodonaea madagascariensis qui pourraient être exploitées dans le contrôle d’organismes nuisibles.

Mots clés : Dodonaea madagascariensis, SAPINDACEAE, extrait méthanolique, saponosides triterpéniques, flavones, effet inotrope positif, hémolytique, zootoxique, appât souricide, phytotoxique, antifongique, antioxydant.

ABSTRACT

Toxicological studies and other biological properties of Dodonaea madagascariensis seeds, a medicinal plant from Madagascar were conducted. The seed methanolic extract (SME), obtained by lixiviation with hexane and methanol were tested on animals, plants and microorganisms. Phytochemical screening carried out on SME showed the presence of unsaturated sterols, polyphenols, triterpenes, flavones and a large amount of saponins. Leucoanthocyanins and steroids are presents but at trace level. SME displayed high hemolytic activity (HD50 =1.57 µg/ml). SME was moderately toxic on mice by oral route but extremely toxic by intraperitoneal one (IP route). Its LD50 value (IP route) was 36.12 mg/kg of mice. The histological changes were confined to the lung, liver, kidney, intestines whereas stomach, brain and heart appeared normal The main histopathological changes included inflammatory and hemorrhagic areas, hepatic necrosis (IP route) and edema (oral route). The signs developed by intoxicated animals were nervous, respiratory, cardiovascular, and gastrointestinal disorders, but nervous disorders were frequently observed and often appeared first. SME at 12.72 mg/kg did not influence the liver and kidney function parameters on mice. A positive inotropic effect on guinea pig isolated atria was observed at a dose of 12.5 µg/ml of SME. Its toxicity to cold-blooded animals was highlighted: its LC50 values were 5.411 µg/ml and 4.330 µg/ml, respectively for frog tadpoles (Ptychadena mascareniensis) and fishes (Cyprinus carpio). However, at 10 mg/ml, it did not cause mortality in fleas (Xenopsylla cheopis). SME inhibited the seed germination of green peas, beans and the seedling growth of green peas, rice and maize. SME showed antifungal activity against Candida albicans at minimal inhibitory concentration (MIC) of 18.75 mg/ml. SME showed low antioxidant activity (IC50 = 404.6 µg/ml) Tested for its potential uses as rodenticides, seeds and SME were effective as poisoned baits against mice: about 8,3 ± 0,7 g of seeds were toxic to mouse weighing 25g after 5 days and 0,955 ± 0,032 g of bait with 16,7 % of SME killed a mouse weighing 25g after 2 days. Bio-guided fractionation of SME in mice and Candida albicans showed that saponins were responsible of SME toxicity. Chemical and biological investigations showed that toxicological properties of Dodonaea madagascariensis seeds might be exploited in the control of pests and as potential drug for its pharmacological properties.

Keywords: Dodonaea madagascariensis, SAPINDACEAE, triterpene saponins, seed methanolic extract, saponosides, flavones, positive inotropic effect, hemolytic activity, zootoxic, poisoned baits, phytotoxic, antifungal, antioxidant.