Capa (Obrigatório)

FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIODIVERSIDADE E BIOTECNOLOGIA DA REDE

BIONORTE

ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS DE AÇAIZEIRO (Euterpe precatoria Mart.)

HELLEN SANDRA FREIRES DA SILVA AZÊVEDO

Porto Velho -RO Janeiro/2019

HELLEN SANDRA FREIRES DA SILVA AZÊVEDO

ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS DE AÇAIZEIRO (Euterpe precatoria Mart.)

Tese de doutorado apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Rede BIONORTE (área de concentração 1: Biodiversidade e Conservação, linha de pesquisa 2: Conservação e Uso Sustentável da Biodiversidade) na Fundação Oswaldo Cruz, como requisito para a obtenção do título de Doutor em Biodiversidade e Biotecnologia.

Orientadora: Prof.a Dra. Tatiana de Campos Coorientadora: Prof.a Dra. Lúcia H. de Oliveira Wadt

Porto Velho -RO Janeiro/2019

HELLEN SANDRA FREIRES DA SILVA AZÊVEDO

ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS DE AÇAIZEIRO (Euterpe precatoria Mart.)

Orientadora: Prof.a Dra. Tatiana de Campos Coorientadora: Prof.a Dra. Lúcia H. de Oliveira Wadt. Banca examinadora

Rio Branco – AC Janeiro/2019

DEDICATÓRIA

A Deus, pelo dom supremo da vida e de onde emana toda a sabedoria;

Ao meu querido amado esposo José Marlo Araújo de Azevedo pelo carinho, amor, incentivo e compreensão em todos os momentos;

Aos meus queridos pais Jorge Souza da Silva e Ediana Rodrigues Freires, e ao meu amado irmão Patric William Freires da Silva que sempre me incentivavam a seguir em busca dos meus sonhos e estiveram ao meu lado em todos os momentos da minha vida, muito obrigada pela paciência, amor e carinho. Amo muito vocês! AGRADECIMENTOS

A cada membro da minha família que me apoiaram em todos os momentos para a concretização deste trabalho - pais, irmão, avós, tios, primos, sogros, sobrinhos e cunhados. À minha orientadora, Dra. Tatiana de Campos, pelos ensinamentos profissionais, além da orientação e confiança. À minha coorientadora Dra. Lúcia Helena de Oliveira Wadt, pela amizade e disponibilidade em todos os momentos necessários. Ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Rede BIONORTE, pela oportunidade de dar continuidade em minha formação profissional e acadêmica. À Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, por ter sido minha segunda casa nestes últimos dez anos. À coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e a Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) pela concessão da bolsa de estudos. A todos os indígenas da Terra Indígena Kaxinawá de Nova Olinda, aos “meninos do campo” Aldeci e Manoel Freire e as amigas Reylâne Manil e Susana Silva por todo o apoio nas coletas dos materiais de campo. Às bolsistas do programa institucional de bolsas de iniciação científica Polinar Rufino, Lídia Cavalcante e Fernanda Benvindo por toda a ajuda na bancada e todo apoio e incentivo. Aos amigos Jônatas de Oliveira, Susana Silva e Sabrina Oliveira pela sincera amizade e apoio em cada etapa do doutorado. Aos Professores Dr. José Marques Carneiro Júnior, Dra. Giselle Mariano Lessa de Assis, Dra. Karina Martins e Dr. Moacir Haverroth pelos valorosos ensinamentos durante a minha formação acadêmica. A todos os professores do programa de pós-graduação da rede Bionorte, pela contribuição neste percurso, seja nas aulas ou nas rápidas conversas de corredor. Aos caríssimos amigos: Ricardo Leão, Ana Cláudia, Janice Ferreira, Eduardo Soares, Renata Beltrão, Luciélio da Silva, Clemeson Souza, Nathalia Costa, Cléia Santos, Dani Mique, Anelene Carvalho, Almecina Balbino, Priscila Wolter, Fernanda Fonseca, Aureny Lunz, Sandy Honorato e Salatiel pela amizade e incentivo durante o doutorado. A todas as pessoas que participaram, direta ou indiretamente desta conquista. O MEU MUITO OBRIGADA!

“Para o homem é impossível, contudo, não para Deus; porque para

Deus tudo é possível”. (Marcos 10:27) RESUMO Entre os recursos genéticos da Amazônia, o açaizeiro, Euterpe precatoria, destaca-se em função do valor agronômico, econômico, social e cultural associado principalmente a extração e comercialização da polpa do açaí. A caracterização genética de populações naturais poderá auxiliar no desenvolvimento e recomendação de práticas de manejo e estratégias adequadas de conservação da espécie. Os objetivos deste estudo foram avaliar métodos de preservação e maceração de folíolos de E. precatoria para a obtenção de DNA; testar a transferibilidade de microssatélites de E. edulis para E. precatoria e avaliar a diversidade e estrutura genética espacial (EGE) de populações de E. precatoria em floresta de terra firme e baixio. Foram testados 12 tratamentos de armazenamento e dois tipos de maceração. Analisou-se 18 microssatélites desenvolvidos para E. edulis em 20 indivíduos de duas populações de E. precatoria (Formoso e Novo Segredo). Foram coletados folíolos de 92 indivíduos de população de açaizeiro em terra firme (Formoso) e 96 indivíduos em área de baixio (Novo Segredo) no município de Feijó, AC. Verificou-se interação entre armazenamento e tipo de maceração, quando os folíolos foram macerados com nitrogênio líquido, sendo que as concentrações de DNA variaram de 285,00 ng/µL (7 dias em tampão de transporte) a 702,00 ng/µL (30 dias em sílica gel). Quando maceradas com TissueLyser® variaram de 572,73 ng/µL (30 dias em sílica gel) a 2.850,00 ng/µL (3 dias em liofilizador). A pureza do DNA (A260/A280 nm) variou de 1,30 a 1,70 quando os folíolos foram macerados com nitrogênio líquido e de 1,30 a 1,90 com o uso do TissueLyser®. No estudo de transferibilidade observou-se que nove locos foram polimórficos, com 29 alelos na população Formoso e 27 alelos na Novo Segredo. Na população Formoso e Novo Segredo foram observados os valores médios da heterozigosidade esperada de 0,421 e 0,418 e a observada de 0,333 e 0,267, respectivamente. Para o estudo de diversidade e EGE observou-se um total de 45 alelos, nos 188 indivíduos coletados e genotipados com nove locos microssatélites. Foram observados baixos valores médios de heterozigosidade esperada (0,330) e observada (0,270). É possível sugerir que o baixo polimorfismo observado esteja associado ao uso de locos heterólogos. Foi detectada ausência de endogamia ( F ), o que mostra excesso de heterozigotos. A divergência genética (휃̂) entre as populações foi alta e significativa, sendo que 27% da variabilidade esteve entre as populações e 73% dentro. As análises de agrupamentos alocaram os indivíduos de acordo com o local em que foram coletados, formando dois grupos. A análise de EGE aponta que a coletas de sementes para conservação da espécie E. precatoria não deve ocorrer entre palmeiras distantes a menos de 50 m em área de baixio e 78 m em área de terra firme, a fim de evitar a coleta de sementes entre indivíduos aparentados. A coleção nuclear identificada foi composta por nove palmeiras na área de baixio e 12 em área de terra firme. A conservação in situ da coleção nuclear é uma estratégia relevante que objetiva conservar a diversidade genética de toda a população, e também preserva os habitats onde a espécie ocorre. Conclui-se que todos os tratamentos de armazenamento e maceração foram eficazes para o isolamento do DNA genômico. Nove microssatélites foram transferíveis e polimórficos. As populações de E. precatoria estudadas (Terra Firme e Baixio) apresentaram diferenciação genética entre e dentre as populações. A definição da coleção nuclear, juntamente com a coancestria são análises robustas e que podem ser utilizadas em conjunto para a elaboração de estratégias de conservação in e ex situ de E. precatoria.

Palavras-chave: açaí-solteiro, amplificação cruzada, genética da conservação, isolamento de DNA, sequências simples repetidas.

ABSTRACT Among the genetic resources in the Amazon, açaizeiro, Euterpe precatoria, stands out due to the agronomic, economic, social and cultural values associated with the extraction and commercialization of açaí pulp. The genetic characterization of natural populations may help in the development and recommendation of management practices and appropriate conservation strategies of the species. The objectives of this study were to evaluate methods of preservation and maceration of E. precatoria leaflets to obtain DNA; to test the transferability of E. edulis microsatellites to E. precatoria and to evaluate the diversity and spatial genetic structure (SGS) of E. precatoria populations in dryland and flooded forests. Twelve storage treatments and two types of maceration were tested. It was analyzed 18 microsatellites developed for E. edulis in 20 individuals of two E. precatoria (Formoso and Novo Segredo) populations. Leaflets were collected from 92 individuals of açaizeiro population on dryland (Formoso) and 96 individuals in flooded area (Novo Segredo) in the municipality of Feijó, state of Acre. An interaction was found between storage and maceration type when leaflets were macerated with liquid nitrogen, and DNA concentrations ranged from 285.00 ng/µL (7 days in transport buffer) to 702.00 ng/µL ( 30 days on silica gel). When macerated with TissueLyser® ranged from 572.73 ng/µL (30 days on silica gel) to 2,850.00 ng/µL (3 days in lyophilizer). The DNA purity (A260/A280 nm) ranged from 1.30 to 1.70 when the leaflets were macerated with liquid nitrogen and from 1.30 to 1.90 with the use of TissueLyser®. It was observed in the transferability study that nine loci were polymorphic, with 29 and 27 alleles in the Formoso and Novo Segredo populations, respectively. The average values of expected heterozygosity were 0.421 and 0.418 and observed values of 0.333 and 0.267 for Formoso and Novo Segredo populations, respectively. For the study of diversity and SGS, a total of 45 alleles were observed in 188 individuals collected and genotyped with nine microsatellite loci. It was also observed low average values of expected (0.330) and observed (0.270) heterozygosity. It is possible to suggest that the low polymorphism observed is associated with the use of heterologous loci. The lack of inbreeding ( F ) shows excess of heterozygotes. The genetic divergence (휃̂) among the populations was high and significant, where 27% of the variability was found between the populations and 73% within. The cluster analyzes allocated the individuals according to the place where they were collected, forming two sets. The SGS analysis indicates that the collection of seeds for E. precatoria conservation should not occur between palm trees at less than 50 m of distance in flooded area and 78 m in dryland, in order to avoid the collection of seeds among related individuals. The identified nuclear collection was composed by nine palm trees in the flooded area and 12 in the dryland area. The in situ conservation of the nuclear collection is a relevant strategy whose goal is to conserve the genetic diversity of the entire population, and also to preserve the habitats where the species occurs. It was concluded that all storage and maceration treatments were effective for genomic DNA isolation. Nine microsatellites were transferable and polymorphic. The assessed populations of E. precatoria (dryland and flooded) showed genetic differentiation among and within the populations. The definition of the nuclear collection associated with coancestry are robust analyzes that can be used together for the elaboration of in situ and ex situ conservation strategies of E. precatoria.

Keywords: Açaí-solteiro, cross-amplification, conservation genetics, DNA isolation, simple sequence repeats.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Palmeira Euterpe precatoria...... 21

Figura 2. Folíolos de Euterpe precatoria em diferentes tratamentos de armazenamento: A) Folíolo fresco, B) Geladeira (7 dias) e C) Sílica gel (30 dias)...... 36

Figura 3. A) Perfil comparativo de centrifugação de folíolos de Euterpe precatoria macerados e lavados com clorofórmio e álcool isoamílico: (I) macerados com nitrogênio líquido e (II) uma amostra oxidada obtida do TissueLyser®. B) (I) pellet mais claro macerado com nitrogênio líquido, em contraste com (II) pellet mais escuro resultante da maceração no TissueLyser®. 38

Figura 4. Análise da pureza do DNA extraído de folíolos de Euterpe precatoria de doze tipos de armazenamento e dois métodos de maceração (nitrogênio líquido e TissueLyser®)...... 39

Figura 5. Eletroforese em gel de agarose do DNA de Euterpe precatoria amplificado com o loco microssatélite EE8. Colunas 1-12: doze tratamentos de armazenamento macerados com equipamento automático TissueLyser®; Coluna 13: Marcador (1 kb Fermentas®); Colunas 14 -25: doze tratamentos de armazenamento macerados com nitrogênio líquido...... 42

Figura 6. Localização e posição dos indivíduos coletados de Euterpe precatoria. A) Localização geográfica das populações Formoso e Novo Segredo; B) Posição dos indivíduos de Euterpe precatoria amostradas nas populações Formoso e Novo Segredo...... 50

Figura 7. Eletroforese de gel de agarose de DNA de Euterpe precatoria amplificado com quatro locos microssatélite (EE2; EE52; EE59 e EE54). Coluna 1: marcador (1 kb Fermentas®); Colunas 2-11: amostras de DNA da população Formoso; Colunas 12-21: amostras de DNA da população Novo Segredo...... 52

Figura 8. Perfil do loco EE54 em gel de poliacrilamida (5%). Coluna 1: marcador (10-pb “ladder” Life Technologies). Colunas 2-11: indivíduos da população Formoso; Colunas 12-20: amostras de DNA da população Novo Segredo...... 54

Figura 9. Teste de atribuição de população com amostras ordenadas por população, K=2 para indivíduos de Euterpe precatoria, na Terra Indígena Kaxinawá de Nova Olinda, município de Feijó, Acre, Brasil...... 69

Figura 10. Árvore Neighbor-Joining representando a relação dos indivíduos de Euterpe precatoria na Terra Indígena Kaxinawá de Nova Olinda, município de Feijó, Acre, Brasil. As cores estão de acordo com a formação dos grupos gerados pelo programa STRUCTURE, considerando o K=2...... 70

Figura 11. Coeficiente de coancestria entre pares de indivíduos de Euterpe precatoria nas populações Formoso e Novo Segredo, na Terra Indígena Kaxinawá de Nova Olinda, município de Feijó, Acre, Brasil, para diferentes classes de distância. (Linhas pontilhadas indicam o intervalo de confiança a 95% de probabilidade e a linha sólida é o coeficiente de coancestria)...... 71

Figura 12. Distribuição espacial de todos os indivíduos de Euterpe precatoria genotipados das populações Formoso (Terra Firme) e Novo Segredo (Baixio) e identificação dos indivíduos que compõem a coleção nuclear. Em cada população foram determinados o raio representativo da análise de coancestria...... 72

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Médias do desdobramento das interações da concentração de DNA extraído de folíolos de Euterpe precatoria submetidos a diferentes tipos de armazenamento e maceração do tecido foliar...... 40

Tabela 2. Características de nove marcadores microssatélites heterólogos para Euterpe precatoria...... 42

Tabela 3. Características de 18 marcadores microssatélites heterólogos para Euterpe precatoria...... 53

Tabela 4. Índices de diversidade genética em nove locos microssatélites obtidos de duas populações de Euterpe precatoria avaliadas em floresta de terra firme e baixio, na Terra Indígena Kaxinawá de Nova Olinda, município de Feijó, Acre, Brasil...... 66

Tabela 5. Total de alelos por loco distribuídos nas populações Formoso (Terra Firme) e Novo Segredo (Baixio) de Euterpe precatoria na Terra Indígena Kaxinawá de Nova Olinda, município de Feijó, Acre, Brasil...... 67

Tabela 6. Estimativas da diversidade genética das populações Formoso (Terra Firme) e Novo Segredo (Baixio) de Euterpe precatoria na Terra Indígena Kaxinawá de Nova Olinda, município de Feijó, Acre, Brasil...... 68

Tabela 7. Estatísticas F para as populações Formoso e Novo Segredo da espécie Euterpe precatoria, na Terra Indígena Kaxinawá de Nova Olinda, município de Feijó, Acre, Brasil. . 69

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ...... 15 2. OBJETIVOS ...... 19 2.1 Objetivo geral ...... 19 2.2 Objetivos específicos ...... 19 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 20 3.1 Classificação taxonômica, distribuição geográfica e descrição botânica ...... 20 3.2 Sistema reprodutivo, fenologia e ecologia ...... 21 3.3 Marcadores moleculares ...... 23 3.3.1 Marcadores Microssatélites ...... 23 3.3.2 Estudos moleculares no gênero Euterpe ...... 23 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 25 4. CAPÍTULO I...... 30 PRESERVAÇÃO E MACERAÇÃO DO TECIDO FOLIAR DE AÇAIZEIRO PARA OBTENÇÃO DE DNA GENÔMICO ...... 30 4.1 INTRODUÇÃO ...... 33 4.2 MATERIAL E MÉTODOS ...... 34 4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO...... 36 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 43 5. CAPÍTULO II ...... 46 TRANSFERIBILIDADE DE LOCOS MICROSSATÉLITES HETERÓLOGOS ENTRE ESPÉCIES DO GÊNERO Euterpe ...... 46 5.1 INTRODUÇÃO ...... 49 5.2 MATERIAL E MÉTODOS ...... 50 5.2.1 Material vegetal ...... 50 5.2.2 Extração de DNA e locos microssatélites ...... 51 5.2.3 Análise estatística...... 51 5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO...... 52 5.4 CONCLUSÕES ...... 56 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 57 6. CAPÍTULO III ...... 59 ESTRATÉGIA DE CONSERVAÇÃO DE Euterpe precatoria COM PERFIL MOLECULAR ...... 59 6.1 INTRODUÇÃO ...... 62 6.2 MATERIAL E MÉTODOS ...... 63 6.2.1 Área de estudo e amostragem ...... 63 6.2.2 Extração de DNA e genotipagem ...... 64 6.2.3 Análises de diversidade genética ...... 65 6.2.4 Análises de estrutura genética ...... 65 6.2.5 Estrutura genética espacial (EGE) ...... 65 6.3 RESULTADOS ...... 66 6.3.1 Diversidade genética ...... 66 6.3.2 Estrutura genética...... 68 6.3.3 Estrutura genética espacial (EGE) ...... 70 6.3.4 Coleção nuclear ...... 71 6.4 DISCUSSÃO ...... 73 6.4.1 Implicações para coleta de sementes e conservação ...... 75 6.5 CONCLUSÕES ...... 76 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 77

1. INTRODUÇÃO

As palmeiras estão entre as plantas de maior distribuição, dominância e valor econômico na floresta amazônica, e constituem uma das principais fontes de produtos florestais não madeireiros (PFNM’s) (STEEGE et al., 2013; MARTINOT et al., 2017). Entre as diversas palmeiras, o açaizeiro E. precatoria var. precatoria Mart. conhecido popularmente como açaí- solteiro, destaca-se devido ao valor agronômico, econômico, nutricional, social e cultural por produzir um importante alimento a “polpa de açaí’’ extraída dos frutos (YUYAMA et al., 2011; ARANGUREN et al., 2014; YAMAGUCHI et al., 2015; CEDRIM et al., 2018). Essa palmeira pertence à família Arecaceae, e encontra-se amplamente distribuída em florestas de baixio e de terra firme pela América Central e norte da América do Sul, especialmente na Amazônia Central e Ocidental (BUSSMANN et al., 2012; STEEGE et al., 2013). No Brasil é encontrado nos estados do Acre, Rondônia, Amazonas e Pará (HENDERSON, 1995). Há muito tempo, indígenas, seringueiros, extrativistas e ribeirinhos realizam a colheita de frutos, principalmente das espécies E. precatoria e E. oleracea. Atualmente, essa atividade é o meio de subsistência de várias famílias da região norte. Segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) a produção de frutos de açaizeiro, em 2017, foi de 219.885 toneladas, e a maior parte desta produção concentrada no estado do Pará, seguido do Amazonas, Maranhão e Acre. No Acre, o município de Feijó destaca-se com a maior produção e comercialização dos frutos de açaizeiro (IBGE, 2017). No estado do Acre, a palmeira E. precatoria ocorre nas florestas nativas em todos os municípios. No ano 2017 foram coletadas 4.665 toneladas de frutos, e o valor de produção chegou a atingir R$ 5 milhões de reais (IBGE, 2017). Entretanto, vale salientar que a exploração da espécie E. precatoria se baseia principalmente no extrativismo de populações nativas. E atualmente, um dos maiores entraves na exploração extrativista é a escassez de informação (OLIVEIRA et al., 2012). Portanto, a avaliação da variabilidade genética e a seleção de matrizes de E. precatoria que representem a diversidade genética das populações nativas são etapas importantes, uma vez que estas matrizes podem ser preservadas em coleções de germoplasma in situ e utilizadas em estudos que poderão subsidiar programas de melhoramento genético. A análise molecular é bastante empregada em estudos de diversidade genética visando à conservação de espécies que são intensamente exploradas. Porém, ainda há poucos estudos com as espécies do gênero Euterpe (GAIOTTO et al., 2003; KAGEYAMA et al., 2004; CONTE 16 et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2007; CONTE et al., 2008; MARTINS-CORDER et al., 2009; VIEIRA et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2010; LIMA, 2014; CARVALHO et al., 2015; OLIVEIRA et al., 2015; KOZEN; MARTINS, 2017). Ainda não existem estudos de diversidade genética de populações de nativas de ambientes distintos (Baixio e Terra Firme), visando a conservação de açaizeiro de E. precatoria no Acre. Estudos de identificação da diversidade genética das plantas por meio de técnicas moleculares, envolvem a avaliação de um grande número de indivíduos, necessitando-se de métodos eficazes e precisos de extração de DNA genômico de qualidade, sendo o primeiro passo para o sucesso das etapas posteriores (DANNER et al., 2011; MESQUITA et al., 2015; SILVA et al., 2015). Em palmeiras são escassos os estudos moleculares relacionados a metodologias de preservação e maceração do tecido vegetal (IBRAHIM et al., 2010; IHASE et al., 2016). O desenvolvimento de metodologias adequadas para o isolamento de DNA com bom rendimento e de qualidade é um desafio, especialmente em espécies com poucos estudos moleculares (SILVA et al., 2015). Nos últimos anos, devido suas características genéticas desejáveis, os marcadores microssatélites (Sequências Simples Repetidas - SSRS) apresentam-se como ideais para estudos da variabilidade em populações naturais de plantas (KALIA et al., 2011; FORTES et al., 2016). Os microssatélites são sequências curtas de DNA repetidas em tandem, e apresentam grandes vantagens por serem facilmente detectáveis por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), codominantes e por apresentarem alto polimorfismo (KALIA et al., 2011; VIEIRA et al., 2016). No entanto, uma das desvantagens é o custo elevado para o seu desenvolvimento. Uma alternativa para viabilizar as análises de microssatélites em espécies para as quais ainda não existam locos específicos, como é o caso da espécie E. precatoria, é a transferibilidade dos locos de espécies evolutivamente próximas. Para o gênero Euterpe foram desenvolvidos 18 locos SSRS para a espécie E. edulis e estes mostraram-se transferíveis para E. oleracea (GAIOTTO et al., 2001) e E. precatoria (KAGEYAMA et al., 2004; LIMA, 2014).

Estudos com palmeiras têm demostrado a transferibilidade de locos SSRS entre espécies filogeneticamente próximas, como os dentro do gênero Astrocaryum e para três espécies de gêneros distintos Bactris, Euterpe e Phoenix (RAMOS et al., 2012; FORTES et al., 2016), foi observado também a transferibilidade de locos SSRS do gênero Cocos para Butia (MISTURA et al., 2012). Os marcadores microssatélites são considerados ideais para a estimação de parâmetros genéticos de populações como a diversidade genética, compreensão de fluxo gênico e 17 parentesco (KALIA et al., 2011). Compreender esses parâmetros em populações de espécie intensamente exploradas, como o açaizeiro, são importantes, já que são considerados quando se definem estratégias de manejo e conservação da espécie (EPPERSON, 1992). Entre os parâmetros mais utilizados para quantifica a diversidade genética em populações de plantas são o número médio de alelos por loco ( A ), heterozigosidade esperada ( H e ), heterozigosidade observada ( H o ) (BERG; HAMRICK, 1997; RAPOSO et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2017), e o coeficiente de endogamia (PINTO, 2001). Com a aplicação desses parâmetros é possível observar populações que irão participar de programas de conservação ou melhoramento, pois quanto maior o número de alelos presentes, maior é a sua diversidade (PETIT et al., 1998). Outras análises que podem ser realizadas no estudo de populações de plantas é a caracterização da estrutura genética (WRIGHT, 1965) e a coancestria (LOISELLE et al., 1995). Com o uso da estatística F de Wright, a estrutura genética de uma população pode ser realizada através da obtenção do FIS que é o índice de fixação intrapopulacional, o FST corresponde ao índice de fixação entre populações e o FIT que equivale ao índice de fixação para todas as populações estudadas. Estes parâmetros também podem ser obtidos utilizando a análise estatística de Cockerham (1969), sendo estes representados por f, θ e F, respectivamente. A estrutura genética espacial dentro das populações é analisada com base na estimativa do coeficiente de parentesco entre cada par de indivíduos. A formação de coleções nucleares no estudo de populações também são ferramentas valiosas para apoiar na decisão de estratégias para conservar e avaliar recursos genéticos de forma mais eficaz (DÍEZ et al., 2012). O número reduzido de indivíduos facilita o gerenciamento adequado das grandes coleções, como os custos econômicos para tarefas rotineiras, como conservação, regeneração, duplicação, documentação e avaliação (ESCRIBANO et al., 2008). O açaizeiro gera um PFNM’s de grande valor econômico para a região amazônica. A manutenção de suas populações dependerá de estratégias de manejo adequadas para a sua conservação. A intensa extração poderá resultar no estreitamento da variabilidade genética, devido às restrições na disseminação de sementes e, consequentemente, com reflexos no sucesso reprodutivo e na regeneração natural do açaizeiro. Para a elaboração de estratégias de manejo eficazes é essencial também que parâmetros genéticos sejam considerados. Assim, a quantificação da diversidade, estrutura genética espacial e da endogamia nas populações, poderão ajudar a determinar as medidas necessárias 18 para a conservação genética in situ e ex situ, direcionando estratégias de coleta de frutos e sementes visando maximizar a diversidade genética para conservação e melhoramento do açaizeiro na Amazônia.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar a diversidade genética de populações naturais de açaizeiro (Euterpe precatoria Mart.).

2.2 Objetivos específicos a) Avaliar métodos de preservação e maceração de tecido foliar de E. precatoria para a obtenção de DNA genômico de qualidade para estudos moleculares; b) Testar a transferibilidade de locos microssatélites de palmiteiro (E. edulis) para o açaí- solteiro (E. precatoria); c) Avaliar a diversidade e a estruturação genética espacial de populações naturais de açaizeiro (E. precatoria) em floresta de terra firme e baixio.

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Classificação taxonômica, distribuição geográfica e descrição botânica

O gênero Euterpe pertence à ordem Arecales, família Arecaceae (Palmae) e a subfamília Arecoidae (HENDERSON; GALEANO, 1996). O gênero possui 27 espécies, das quais cinco são nativas do Brasil, dentre elas a espécie E. precatoria (HENDERSON, 2000). De acordo com estudos taxonômicos a espécie E. precatoria está dividida em duas variedades sendo: E. precatoria var. longevaginata e E. precatoria var. precatoria (HENDERSON, 1995; LORENZI, 2010). No Brasil a espécie E. precatoria é conhecida popularmente como açaí-solteiro, açaí- do-amazonas e açaí-da-mata. A espécie E. precatoria é amplamente distribuída pela América Central (Belize, Guatemala, Honduras, Nicarágua, Costa Rica e Panamá) e norte da América do Sul (Colômbia, Venezuela, Trinidad, Guianas, Equador, Peru, Brasil e Bolívia) (CASTRO; BOVI 1993; HENDERSON, 1995). A var. longevaginata pode ser encontrada na América Central e Andes, e a var. precatoria é mais restrita à bacia Amazônica (HENDERSON, 1995; LORENZI, 2010). De acordo com o ambiente onde cresce, a palmeira pode apresentar variações significativas em alguns de seus caracteres. A espécie E. precatoria var. longevaginata diferencia-se da variedade precatoria principalmente, por possuir pinas mais largas e menos pêndulas, inflorescência menores e com raquilas mais finas (LORENZI, 2010). No Brasil, E. precatoria ocorre nos estados do Acre, Rondônia, Amazonas e Pará (HENDERSON, 1995; LORENZI, 2010; YAMAGUCHI et al., 2015). No estado do Acre ocorrem as duas variedades, sendo que E. precatoria var. longevaginata ocorre na fronteira com o Peru na Serra do Divisor e E. precatoria var. precatoria está distribuído nos 22 municípios que compõem o estado (IBGE, 2017). A espécie E. precatoria é diplóide (2n = 36 cromossomos) (OLIVEIRA et al., 2016) e apresenta monocaule do tipo estipe liso de coloração cinza claro (Figura 1) (ROCHA; VIANA, 2004). 21

Figura 1. Palmeira Euterpe precatoria.

Euterpe precatoria apresenta caule ereto variando de 3 a 23 m de altura e 4 a 23 cm de diâmetro, sustentando um capitel de 5 a 10 folhas (HENDERSON, 1995; YAMAGUCHI et al., 2015; FERNANDES, 2016). O açaizeiro produz de 3 a 4 cachos por ano, com uma variação de peso de 3 a 7 kg (CASTRO, 2000; ROCHA; VIANA, 2004; FERREIRA et al., 2009). Os frutos são globosos, medindo 1,0-1,3 cm de diâmetro, verde quando imaturo, púrpura-negra quando maduro. Há uma semente por fruto, com endosperma sólido e homogêneo (HENDERSON, 1995; LORENZI, 2010).

3.2 Sistema reprodutivo, fenologia e ecologia

A espécie E. precatoria é monóica, apresentando dicogamia, do tipo protândria, ou seja, as flores masculinas fornecem pólen antes que as flores femininas sejam receptivas. A polinização é entomófila, com participação do vento e da gravidade na fecundação das flores (OLIVEIRA et al., 2009). Tanto flores masculinas como femininas produzem néctar, atraindo besouros das famílias Staphylinidae, Chrysomelidae e Curculionidae, e abelhas da família Halictidae são visitantes constantes (HENDERSON; GALEANO 1996; KUCHMEISTER et al., 1997). Embora flores masculinas e femininas estejam presentes na mesma inflorescência, a protândria faz com que E. precatoria seja predominantemente alogâmica (realiza fertilização cruzada), pois a autopolinização dificilmente ocorre devido à separação temporal das anteses de flores masculinas e femininas (KUCHMEISTER et al., 1997). O período de floração de uma 22 inflorescência é lento e gradativo, sendo denominado de fase, e diferencia-se para flores femininas e masculinas. A duração das fases femininas e masculinas é, respectivamente, três e 17 dias (KUCHMEISTER et al., 1997). O período de frutificação da espécie E. precatoria pode ocorrer durante todo o ano, sendo a estação menos chuvosa (julho a dezembro) o período de maior abundância (RAUPP, 2010). Na literatura é possível observar variação no período de frutificação dependendo do local de ocorrência da palmeira (Terra Firme ou Baixio) (PINTO et al., 2010). No estado do Acre é possível verificar diferentes períodos de frutificação. No município de Epitaciolândia, a produção dos frutos em áreas de baixio ocorre de março a junho, sendo o auge nos meses de abril e maio. Já a produção dos frutos de terra firme ocorre de junho a outubro, sendo o pico de produção nos meses de julho e agosto (COSTA, 2001). Segundo estudo realizado por Costa (2001), a emissão de cachos pelas palmeiras ocorre irregularmente, o que faz com que a produção e maturação dos frutos também sejam desuniformes. No município de Xapuri, o período de frutificação ocorre de abril a setembro e em junho a frutificação está finalizando na área de baixio e iniciando-se na terra firme (ROCHA, 2002). No município de Feijó, o período de frutificação em áreas de baixio ocorre nos meses de janeiro a maio, e em terra firme o pico de produção ocorre mais tarde, de maio até agosto (SILVA, 2011). Os baixios são florestas que são inundadas sazonalmente e/ou que sofrem influência direta dos rios e igarapés. Apresentam dossel mais aberto em relação às florestas de terra firme (LAMOTTE, 1990). As florestas de terra firme cobrem planaltos e florestas de encosta e são áreas com dossel mais fechado, solos bem drenados em qualquer época do ano, e que não são inundadas por rios e fluxos pequenos de água (LAMOTTE, 1990). A palmeira E. precatoria ocorre em vários habitats, de forma individual, em grandes populações e em diferentes níveis de agrupamentos nos baixios e na terra firme (YAMAGUCHI et al., 2015). Pesquisas na região do Alto Acre indicam que a densidade média de adultos na floresta de baixio é de 57-60 indivíduos/ha, com agrupamentos densos de indivíduos muito próximos uns dos outros. Na terra firme, a média flutua entre 27-28 a 39 indivíduos/ha, os quais se encontram mais esparsos (COSTA, 2001; ROCHA, 2002; BAYMA et al., 2008). Os frutos de E. precatoria fazem parte da dieta de vários animais, e consequentemente são dispersos por eles na floresta. Segundo dados coletados por Rocha (2002) no Acre, os principais animais consumidores e dispersores de fruto desta palmeira são pássaros das famílias Psittacidae (papagaios; araras), Ramphastidae (tucanos) e Cracidae (jacus). 23

3.3 Marcadores moleculares

3.3.1 Marcadores Microssatélites

Marcadores microssatélites, ou repetições de sequências simples (Simple Sequence

Repeats - SSRS), são regiões de DNA que consistem de repetições em tandem de pequenas unidades de 1 a 10 nucleotídeos (VIEIRA et al., 2016). Estas repetições estão distribuídas por todo o genoma eucarioto e podem ser analisadas por amplificações utilizando a técnica de PCR. As sequências que flanqueiam um microssatélite são conservadas dentro de uma espécie e, muitas vezes, entre espécies do mesmo gênero. Os marcadores microssatélites revelam polimorfismos individuais, devido à variação no número de repetições de um microssatélite (VIEIRA et al., 2016). Os SSRS são marcadores codominantes com alto número de alelos e grande heterozigosidade (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998). Devido ao alto grau de polimorfismo, tornaram-se os marcadores ideais para mapeamento genético e estudos populacionais (VIEIRA et al., 2016). Apesar da ampla aplicabilidade dos marcadores microssatélites em plantas, seu desenvolvimento permanece como um gargalo para muitas espécies, especialmente para aquelas que não tem plantios comerciais e são exploradas pelo extrativismo. A grande limitação deste marcador é a necessidade de serem isolados e desenvolvidos para cada espécie, não sendo possível utilizar a estratégia de desenho de “primers universais” (CAIXETA et al., 2009). No entanto, essa desvantagem é compensada pela facilidade de uso, polimorfismo e ampla potencialidade de pesquisas desenvolvidas após a sua obtenção.

3.3.2 Estudos moleculares no gênero Euterpe

Embora tenha ocorrido a expansão comercial dos frutos de açaizeiro E. oleracea e E. precatoria nas últimas décadas, estudos moleculares com populações naturais e bancos de germoplasma ainda são raros (SOUZA, 2002; KAGEYAMA et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2010; LIMA, 2014), quando comparados com os estudos moleculares já realizados com a espécie E. edulis (GAIOTTO et al., 2001; GAIOTTO et al., 2003; CONTE et al., 2006; CONTE et al., 2008; MARTINS-CORDER et al., 2009; VIEIRA et al., 2010; CARVALHO et al., 2015). Pesquisadores interessados na conservação da espécie E. edulis desenvolveram 18 marcadores microssatélites (GAIOTTO et al., 2001). Com estes marcadores foi possível 24 observar em duas populações de E. edulis no Parque Nacional de Brasília, uma alta probabilidade de parentesco dentro de famílias de polinização aberta, variação genética interpopulacional e a ocorrência de fluxo gênico a longas distâncias (GAIOTTO et al., 2003). Conte et al. (2006) comparando duas populações não perturbadas com duas populações exploradas de E. edulis no sul do Brasil utilizando 10 microssatélites, observaram altos valores de diversidade genética e similares entre as diferentes populações, no entanto, valores mais expressivos de endogamia foram observados nas duas populações exploradas. A conservação de sítios de microssatélites entre espécies relacionadas torna possível a transferência destes para outras espécies. Oliveira et al. (2010) transferiu sete dos microssatélites desenvolvidos por Gaiotto et al. (2001) em 116 acessos de açaizeiro (E. oleracea) conservados in vivo no banco de germoplasma da Embrapa Amazônia Oriental no Pará, e confirmaram a transferibilidade e diversidade genética. Os autores acreditam que a ampla diversidade genética observada pode estar relacionada aos ambientes de coleta que estavam localizados no centro de diversidade da espécie (OLIVEIRA et al., 2010). Eles observaram a formação de seis grupos geneticamente distintos dentro do banco de germoplasma e puderam indicar acessos para compor programas de melhoramento, com características desejáveis para frutos. O sucesso da transferibilidade dos microssatélites de E. edulis também foi observado para E. precatoria. Os trabalhos realizados por Kageyama et al. (2004) e Lima (2014) verificaram diversidade nas populações estudadas. Porém estes estudos foram realizados em poucas populações. Considerando que a espécie E. precatoria desempenha um importante papel social e cultural para os povos amazônicos, e ser fonte de alimento para fauna, por apresentar ampla distribuição e densidade de palmeiras e por crescer em florestas de terra firme e baixio, é uma espécie que merece ser melhor estudada a nível molecular. O conhecimento da diversidade e estrutura genética espacial de populações naturais de E. precatoria e a compreensão de outros fatores relacionados podem ser importantes para a adoção de estratégias de manejo e para a conservação da espécie.

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4. CAPÍTULO I

PRESERVAÇÃO E MACERAÇÃO DO TECIDO FOLIAR DE AÇAIZEIRO PARA OBTENÇÃO DE DNA GENÔMICO

RESUMO O objetivo deste estudo foi testar a eficiência de métodos de preservação e maceração de tecidos de folíolos de Euterpe precatoria para obter DNA genômico para estudos moleculares. Os folíolos de E. precatoria foram coletados no campo experimental da Embrapa Acre, Brasil. O estudo foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado com 10 repetições, em esquema fatorial 12 × 2, com 12 tratamentos de armazenamento (fresco; liofilizado 3 dias; geladeira 3, 5, e 7; sílica gel 7, 10, 20 e 30 dias e tampão de transporte 3, 5 e 7 dias) e dois tipos de maceração do tecido foliar (nitrogênio líquido e TissueLyser®). Para a variável concentração de DNA houve diferença estatística entre os tipos maceração e de armazenamento. O macerador TissueLyser® apresentou maiores concentrações de DNA quando comparado ao nitrogênio líquido. Para os tipos de armazenamento verificou-se formação de cinco grupos quando macerados com TissueLyser® e dois grupos quando macerados com nitrogênio líquido. As concentrações de DNA variaram de 285,00 ng/µL (7 dias em tampão de transporte) a 702,00 ng/µL (30 dias em sílica gel) quando maceradas com nitrogênio líquido. Quando maceradas com macerador TissueLyser® variaram de 572,73 ng/µL (30 dias em sílica gel) a 2.850,00 ng/µL (3 dias em liofilizador). A pureza do DNA (A260/A280 nm) variou de 1,30 a 1,70 quando os folíolos foram macerados com nitrogênio líquido e de 1,30 a 1,90 quando macerados em macerador TissueLyser®. Apesar das variações na conservação e concentração dos tecidos foliares, todos os tratamentos foram eficazes para o isolamento do DNA e amplificaram regiões de marcadores microssatélites. Concluiu-se que folíolos de E. precatoria armazenados em liofilizador e macerados com macerador automático resultaram em DNA satisfatório para estudos moleculares.

Palavras-chave: açaí-solteiro, Euterpe precatoria, isolamento de DNA, método CTAB.

ABSTRACT The objective of this study was to test the efficiency of preservation and maceration methods for Euterpe precatoria leaflet tissue to obtain genomic DNA for molecular studies. The leaflets of E. precatoria were collected in an experimental field at Embrapa Acre, Brazil. The study was conducted in a completely randomized design with 10 replicates, in a 12 × 2 factorial structure, with 12 storage treatments (fresh; lyophiliser 3 days; refrigerator 3, 5, and 7 days; silica gel 7, 10, 20, and 30 days; and transport buffer 3, 5, and 7 days) and two leaf tissue maceration methods (liquid nitrogen and the TissueLyser®). Statistically significant differences in the obtained DNA concentration were found between the maceration and storage treatments. The TissueLyser® macerator produced higher DNA concentrations when compared to liquid nitrogen. For the storage treatments, five groups were formed based on DNA concentration when macerated with the TissueLyser® and two groups when macerated with liquid nitrogen. The DNA concentrations ranged from 285.00 ng/µL (7 days in transport buffer) to 702.00 ng/µL (30 days in silica gel) when the leaflets were macerated with liquid nitrogen, and from 572.73 ng/µL (30 days in silica gel) to 2,850.00 ng/µL (3 days in lyophiliser) using the TissueLyser® macerator. The DNA purity (A260/A280 nm) varied from 1.30 to 1.70 when the leaflets were macerated with liquid nitrogen and from 1.30 to 1.90 with the TissueLyser® macerator. Despite the variations in leaf tissue preservation and DNA concentration, all treatments were effective for DNA isolation and it was possible to amplify genomic regions of microsatellite markers by PCR. It was concluded that leaflets of E. precatoria stored in a lyophiliser and processed with an automatic macerator resulted in satisfactory DNA for molecular studies.

Keywords: Açaí-solteiro, Euterpe precatoria, DNA isolation, CTAB method.

4.1 INTRODUÇÃO

O açaizeiro (Euterpe precatoria Mart.) popularmente conhecido como açaí-solteiro ou açaí-do-amazonas, é uma palmeira monocaule pertencente à família Arecaceae. É encontrado naturalmente na região norte do Brasil, nos estados do Acre, Rondônia, Amazonas e Pará. A ocorrência se dá de forma individual em grandes populações com diferentes níveis de densidade em áreas de baixios e de terra firme (BUSSMANN; ZAMBRANA, 2012). O açaí-solteiro apresenta múltiplos usos como extração de palmito, produção de biojoias e medicinal, contudo, a parte mais utilizada é o mesocarpo de onde é extraído um líquido espesso conhecido como “suco de açaí”, muito nutritivo e de alto valor calórico (YUYAMA et al., 2011). É amplamente consumido na Amazônia brasileira em todos os níveis socioeconômicos da população. No mercado internacional tem ganhado espaço devido às suas qualidades nutricionais, além de ser rico em compostos fenólicos, antocianinas e substâncias com elevada capacidade antioxidante (KANG et al., 2012; YAMAGUCHI et al., 2015). Apesar da importância, sua exploração ainda é baseada no extrativismo. Por essa razão, as análises genéticas são de grande importância, pois podem aumentar o conhecimento da diversidade, estrutura genética e taxa de cruzamento das populações naturais. Marcadores moleculares são ferramentas úteis para definir estratégias apropriadas de conservação, manejo e para informar a coleta de germoplasma para uso em programas de melhoramento genético (SARTORETTO; FARIAS, 2010). O método de maceração tecidual pode afetar a qualidade do DNA obtido e a maioria dos estudos utiliza nitrogênio líquido ou maceradores automáticos. No entanto, o nitrogênio líquido nem sempre é facilmente acessível porque seu transporte envolve o risco de explosão e deve ser armazenado em recipientes especiais, tornando-se caro. Esses fatores limitam o uso rotineiro de nitrogênio líquido em muitos laboratórios, incluindo aqueles localizados na Amazônia. Diversos estudos têm investigado métodos alternativos para macerar folhas, especialmente em palmeiras que são bastante fibrosas (IBRAHIM et al., 2010; IHASE et al., 2016). Ibrahim et al. (2010) utilizaram areia esterilizada com tampão para macerar folhas maduras de tamareira (Phoenix dactylifera). Ihase et al. (2016) maceraram folhas de dendezeiro (Elaeis guineensis) em um cadinho com tampão. Ambos os estudos foram bem-sucedidos na extração de DNA. Para a espécie E. precatoria os estudos de conservação e maceração do tecido foliar são incipientes. O desenvolvimento de métodos alternativos mais simples e baratos para obter DNA de quantidade e qualidade suficientes é essencial para estudos moleculares. O objetivo deste estudo foi testar a eficiência de vários métodos de preservação e maceração de tecido foliar de E. precatoria para obter DNA genômico para estudos moleculares. 34

4.2 MATERIAL E MÉTODOS

Para a avaliar os diferentes métodos de armazenamento e maceração foram coletados folíolos maduros do campo experimental na Embrapa Acre, Rio Branco - AC. O estudo foi realizado em delineamento inteiramente casualizado com 10 repetições, em esquema fatorial 12 × 2, sendo 12 tratamentos de armazenamento (fresco; liofilizador 3 dias; geladeira 3, 5 e 7 dias; sílica gel 7, 10, 20 e 30 dias e tampão de transporte 3, 5 e 7 dias) e dois métodos de maceração do tecido foliar (nitrogênio líquido e TissueLyser®). Para os tratamentos com sílica gel, utilizou-se sílica gel para desidratar os folíolos durante quatro períodos diferentes (7, 10, 20 e 30 dias). As amostras foram armazenadas em um saco plástico e mantidas ao abrigo da luz a uma temperatura média de 27 °C. A sílica gel foi substituída conforme necessário, de acordo com o indicador de saturação. Folíolos frescos foram armazenados em microtubos e resfriados com gelo. No tratamento do liofilizador, os folíolos foram desidratados num liofilizador (Terroni Enterprise II) durante 72 horas. Os seis tratamentos restantes foram armazenados em geladeira: folíolos embrulhados em jornal trocados diariamente e armazenados em sacos plásticos por 3, 5 e 7 dias; e folíolos armazenados por 3, 5 e 7 dias em microtubos contendo 1 mL de tampão de transporte (300 μl de tampão CTAB 2%; 700 μl de etanol absoluto). Os tecidos foliares submetidos aos doze tratamentos de armazenamento foram macerados por dois métodos: I) Maceração mecânica (TissueLyser®, Qiagen): os folíolos foram cortados em pequenos pedaços com tesoura e colocados em microtubos contendo duas esferas de aço inoxidável e CTAB 2%; os microtubos foram embalados na máquina TissueLyser®; II) Maceração com nitrogênio líquido: os folíolos foram colocados em um almofariz de porcelana, em seguida, macerados com nitrogênio líquido usando um pistilo até que um pó fino fosse obtido, então transferido para o microtubo contendo CTAB 2%. O DNA genômico total foi extraído seguindo o protocolo descrito por Doyle e Doyle (1990), utilizando 100 mg de tecido foliar para cada tratamento. Após maceração usando um dos métodos descritos acima, as amostras foram incubadas por 60 minutos em banho-maria a 65 °C com 700 μL de tampão de extração pré-aquecido contendo 698,6 μL de solução CTAB 2% e 1,4 μL de β-mercaptoetanol. Durante o procedimento de incubação, os microtubos foram agitados manualmente a cada 10 minutos para homogeneização. Após a incubação, os microtubos foram removidos do banho-maria e resfriado até à temperatura ambiente. Em capela de exaustão, foram adicionados 600 μL de clorofórmio e álcool isoamílico (24:1), e os microtubos foram agitados manualmente por 5 minutos. 35

A centrifugação foi realizada a 13.000 rpm por 15 minutos. A fase superior (aquosa) foi transferida (160 μL) para um novo microtubo. Em seguida, 400 μL de isopropanol frio (-20 °C) foram adicionados, e as amostras foram incubadas a -20 °C por 30 minutos. Os microtubos foram centrifugados a 13.000 rpm durante 15 minutos e o sobrenadante foi descartado. Os pellets foram lavados duas vezes em 300 μL de etanol absoluto e duas vezes em etanol a 70% por centrifugação a 13.000 rpm por 5 e 10 minutos, respectivamente. Logo após, os pellets foram ressuspendidos com 50 µL de tampão TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) e, em seguida, incubados a 37 ºC em estufa durante 1 hora e armazenados em geladeira. Posteriormente, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 0,8% (tampão TBE 0,5X sob 120 volts e 400 miliamperes por 1 hora) para verificar a integridade do DNA. Os índices de pureza do DNA foram quantificados em um espectrofotômetro 8000A (Metash) e a razão A260/A280 foi utilizada para estimar a pureza do DNA (GREEN; SAMBROOK, 2012). O DNA foi quantificado em espectrofotômetro a 260 nm de comprimento de onda. A concentração de DNA foi estimada a partir da equação: concentração de DNA = leitura da DO (Densidade Óptica) 260 x 50 x fator de diluição (SAMBROOK et al., 1989). Para avaliar a qualidade do DNA, utilizou-se reação em cadeia da polimerase. Foram utilizados nove marcadores microssatélites (EE2, EE8, EE23, EE32, EE45, EE47, EE52, EE52 e EE59) desenvolvidos para E. edulis (GAIOTTO et al., 2001). As reações foram feitas contendo o seguinte: 5 ng de DNA genômico; 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl; 0,25 mM de cada dNTP; 0,25 mg/mL de BSA (Albumina Sérica Bovina); 2,0 mM MgCl2; 0,2 μM de cada iniciador e 1 U de Taq DNA polimerase e água ultrapura estéril. As amplificações foram realizadas em um termociclador (Analitik Jena). As amostras foram submetidas aos seguintes passos de amplificação: 94 °C por 1 minuto, seguido por 30 ciclos a 94 °C por 1 minuto, temperatura de anelamento para cada primer por 1 minuto e 72 °C por 1 minuto, seguido por um passo final de extensão durante 5 minutos. As estimativas das concentrações de DNA para os diferentes tratamentos foram submetidas à análise de variância (ANOVA) e, quando foram observadas diferenças significativas, as médias foram agrupadas pelo teste de Scott-Knott ao nível de significância de 1%. A análise foi realizada utilizando o pacote estatístico SISVAR (FERREIRA, 2011).

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

O aspecto geral dos folíolos de E. precatoria variou entre os diferentes métodos de armazenamento (Figura 2).

Figura 2. Folíolos de Euterpe precatoria em diferentes tratamentos de armazenamento: A) Folíolo fresco, B) Geladeira (7 dias) e C) Sílica gel (30 dias).

Os folíolos mantidos na geladeira (3 a 5 dias) e tampão de transporte (3, 5 e 7 dias) apresentaram excelente preservação. Esses tratamentos permaneceram semelhantes em aparência e características aos folíolos frescos (Figura 2A) e não sofreram alterações no tecido foliar. Todos os tratamentos em tampão de transporte apresentaram turgescência foliar semelhante à do tecido fresco. Em contraste, os tratamentos mantidos no liofilizador (3 dias), geladeira (7 dias) e sílica gel (7, 10, 20 e 30 dias) mostraram alterações no tecido foliar (Figura 2B e 2C). Os folíolos armazenados no liofilizador (3 dias) apresentaram aparência visual totalmente desidratada e cor verde clara. Os folíolos mantidos em geladeira (7 dias) apresentavam tecido parcialmente desidratado e a mesma coloração verde clara (Figura 2B). Os folíolos armazenados em sílica gel foram desidratados gradualmente à medida que o indicador de cor mudava. A perda de água foi mais perceptível nos três primeiros dias. Um branqueamento uniforme gradual também ocorreu nos folíolos com deterioração em algumas partes (Figura 2C). O uso de sílica para armazenamento ainda é viável, já que partes não afetadas dos folíolos podem ser usadas para a posterior extração de DNA. As mudanças de cor 37 no tecido foliar estão relacionadas à perda de clorofila resultante de um período de preservação e desidratação. Os pigmentos de clorofila são relativamente instáveis e sensíveis à luz, ao tempo, ao aquecimento, ao oxigênio e à degradação química (SCHIOZER; BARATA, 2007). Os resultados do presente estudo corroboram com os relatados na literatura para algumas espécies de plantas, os quais usaram tecido foliar fresco e congelado. O resfriamento das amostras tem sido a metodologia mais utilizada para preservação de material biológico para posterior extração do DNA genômico (SILVA et al., 2010; MESQUITA et al., 2015). No presente estudo, o armazenamento de folíolos em tampão de transporte por uma semana também se mostrou uma metodologia viável para a preservação do tecido vegetal, uma vez que esses folíolos mantiveram as características dos folíolos frescos. Apesar de alterar a cor do tecido vegetal, o método de sílica gel tem sido comumente utilizado na preservação de amostras de folhas de palmeiras como o tucumanzeiro (A. aculeatum), açaizeiro (E. oleracea) e jauari (A. jauari) (MILANI et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2014). O método de armazenamento de sílica gel apresenta várias vantagens em relação a outros métodos, devido à sua simplicidade, baixo custo e ao espaço mínimo necessário para transporte e armazenamento no laboratório. No entanto, para espécies neotropicais do cerrado, o uso de sílica gel não foi recomendado para preservação de folhas antes da extração de DNA (FERES et al., 2005). No entanto, esses autores relatam que as condições ambientais podem ter ativado mecanismos de desidratação nessas plantas e sugerem que o método de preservação da sílica gel ainda pode ser eficaz para outras espécies (FERES et al., 2005). Euterpe precatoria ocorre em um ambiente diferente com alta umidade. No presente estudo, a variação na integridade do DNA extraído foi observada entre os tratamentos. Todos os tratamentos com nitrogênio líquido apresentaram melhor integridade de DNA quando comparado aos tratamentos TissueLyser®. As amostras de tratamento com nitrogênio líquido exibiram claramente fragmentos definidos no gel, sem arrastes, indicando que a degradação do DNA não havia ocorrido. Danner et al. (2011) também obtiveram DNA de boa qualidade de folhas de jabuticabeira (Plinia cauliflora) quando maceradas com nitrogênio líquido, ao passo que detectaram degradação em amostras maceradas diretamente no tampão CTAB. O uso de nitrogênio líquido para macerar o tecido foliar é vantajoso, pois permite o congelamento rápido e, como resultado, evita a degradação do DNA (DANNER et al., 2011). Entretanto, a obtenção, o custo e o armazenamento são os obstáculos para seu uso em muitos laboratórios (IBRAHIM et al., 2010; IHASE et al., 2016), como os localizados na Amazônia. 38

Amostras maceradas no TissueLyser® apresentaram oxidação no DNA (Figura 3A-II; Figura 3B-II). Durante as etapas de precipitação do DNA com isopropanol resfriado e formação de pellets por centrifugação, observou-se coloração marrom escuro nas amostras maceradas com o TissueLyser®, enquanto as amostras maceradas com nitrogênio líquido foram limpas e translúcidas (Figura 3B). A formação de precipitados de DNA escuro pode ocorrer devido à ligação covalente de polifenóis oxidados ao DNA (PETERSON et al., 1997).

A pureza do DNA variou de 1,30 a 1,70 quando os tratamentos foram macerados com nitrogênio líquido e de 1,30 a 1,90 quando macerados com o TissueLyser® (Figura 4). A ausência de RNA foi observada em todas as amostras. Segundo Green e Sambrook (2012), a faixa recomendada para as razões de absorbância (A260/A280) é de 1,70 a 2,00 indicando DNA puro. A baixa pureza do DNA (A260/A280 <1,7) observada no presente estudo para alguns tratamentos de armazenamento e maceração pode ter sido devido aos contaminantes liberados durante a lise celular, ou um número insuficiente de lavagens com clorofórmio. Folíolos maduros apresentam níveis variados de polissacarídeos, polifenóis e outros metabólitos secundários que representam os principais obstáculos encontrados na purificação do DNA das plantas e exigem adaptações ao procedimento de extração de DNA (SILVA et al., 2010; SIKA et al., 2015). 39

2,0 Nitrogênio Líquido 1,8 TissueLyser®

260/280) 260/280) 1,6

A (

1,4

1,2 Pureza do DNA do Pureza 1,0

Figura 4. Análise da pureza do DNA extraído de folíolos de Euterpe precatoria de doze tipos de armazenamento e dois métodos de maceração (nitrogênio líquido e TissueLyser®).

Estudos anteriores confirmaram que as espécies de palmeira Elaeis guineensis (dendezeiro), Phoenix dactylifera (Tamareira), Dypsis madagascariensis (palmeira-de-lucuba) que crescem em regiões tropicais, apresentam folhas com cutícula cerosa e alto teor de fibras que são ricas em polissacarídeos e polifenóis (ANGELES et al., 2005). Sabe-se que a presença de tais compostos pode reduzir ou mesmo inibir a atividade da DNA polimerase e enzimas de restrição. A presença destes compostos em grandes quantidades é a principal questão encontrada na purificação do DNA genômico de tecidos vegetais (NUNES et al., 2011; SIKA et al., 2015). Em geral, o uso de folhas jovens é recomendado para obter DNA com maior pureza, uma vez que estes contêm baixas concentrações de compostos fenólicos (MITTON et al., 1979). No entanto, indivíduos adultos de E. precatoria podem atingir até 20 m de altura e os folíolos mais jovens estão no ápice da planta (YAMAGUCHI et al., 2015). Portanto, o teste de metodologias e refinamento de protocolos é fundamental, especialmente quando se utilizam técnicas moleculares, uma vez que a qualidade do DNA genômico é crucial. 40

Verificou-se que houve diferença significativa entre a interação armazenamento e tipo de maceração do tecido foliar para a concentração de DNA, sendo realizado o desdobramento das interações diretas e inversas (Tabela 1).

Conservação e tipo de Método de maceração (ng/µL) armazenamento Tratamentos Nitrogênio Líquido TissueLyser® Folíolo fresco 545,00 *Ba 1912,50 Ab Liofilizador (3 dias) 660,00 Ba 2850,00 Aa Geladeira (3 dias) 512,50 Aa 705,00 Ae Geladeira (5 dias) 543,90 Ba 1100,00 Ad Geladeira (7 dias) 600,00 Ba 1705,00 Ab Sílica gel (7 dias) 362,50 Bb 1652,50 Ab Sílica gel (10 dias) 685,00 Ba 1395,00 Ac Sílica gel (20 dias) 537,50 Ba 955,56 Ad Sílica gel (30 dias) 702,50 Aa 572,73 Ae Tampão de transporte (3 dias) 327,50 Bb 1602,50 Ab Tampão de transporte (5 dias) 450,00 Bb 827,50 Ae Tampão de transporte (7 dias) 285,00 Bb 1662,50 Ab **CV (%) 29,64 *Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si, maiúscula na linha e minúscula na coluna a (p≥0,01) pelo teste de Scott-Knott. ** Coeficiente de variação (CV).

Quando o método de maceração foi analisado independentemente do método de armazenamento, o macerador TissueLyser® produziu maiores concentrações de DNA quando comparado ao nitrogênio líquido. Quando a maceração foi no TissueLyser®, foram observados cinco grupos distintos de métodos de armazenamento com base na concentração de DNA. No entanto, ao utilizar maceração com nitrogênio líquido, apenas dois grupos foram observados. Para os tratamentos macerados com TissueLyser®, os folíolos armazenados no liofilizador (3 dias) apresentaram a maior concentração de DNA, seguido por folíolos frescos, geladeira (7 dias), sílica gel (7 dias) e tampão de transporte (3 e 7 dias) que não diferiram estatisticamente. As menores concentrações de DNA foram observadas para armazenamento na geladeira (3 dias), sílica gel (30 dias) e tampão de transporte (5 dias). A metodologia de liofilização com maceração TissueLyser® apresentou a maior concentração de DNA quando comparada a outros métodos de secagem de matéria orgânica. A principal vantagem da liofilização é a redução do teor de água nos tecidos e, consequentemente, 41 a redução dos processos catabólicos nas células, uma vez que um ambiente menos fluido diminui a atividade catalítica de nucleases e proteases (NUNES et al., 2011). Os tecidos foliares liofilizados permitem uma melhor interação entre o tampão de extração e o tecido seco. Com menos líquido no tecido, há menos diluição do tampão de extração e, portanto, sua atividade é melhorada (NUNES et al., 2011). O uso de tecido desidratado facilita o rompimento das paredes celulares e, consequentemente, produz maiores rendimentos de DNA. Embora todo o processo de liofilização exija cerca de 72 horas para a desidratação completa dos folíolos, sua aplicabilidade é certamente satisfatória (NUNES et al., 2011; PEDRAL et al., 2015). Mazza e Bittencout (2000) obtiveram DNA de boa qualidade e quantidade extraído de folhas de Araucaria angustifolia (araucária) liofilizada. Esses autores afirmam que o uso do liofilizador eliminou a necessidade de nitrogênio líquido durante a maceração. Outro estudo mostrou que a combinação de liofilização com polivinilpirrolodona (PVP) melhora a qualidade e quantidade do DNA extraído (NUNES et al., 2011). No presente estudo, todos os tratamentos macerados com TissueLyser® apresentaram maiores concentrações de DNA (572,73 a 2.850,00 ng/μL) quando comparados àqueles macerados com nitrogênio líquido e isso pode ser explicado pelas características do equipamento. Agitar em alta velocidade junto com esferas de aço inoxidável facilita a ruptura das paredes celulares e, como resultado, mais células são quebradas para liberar moléculas de DNA em comparação com a maceração com nitrogênio líquido. Isto é corroborado pela alta concentração de DNA observada quando o tratamento do liofilizador foi combinado com a maceração no TissueLyser®. A desidratação tecidual, o uso de esferas de aço inoxidável e a maior agitação e velocidade foram fatores determinantes no maior rendimento de DNA obtido. Outra vantagem do equipamento TissueLyser® é a capacidade de macerar 48 amostras de uma só vez, enquanto que, com nitrogênio líquido, apenas uma amostra é macerada de cada vez. Os tratamentos utilizando o liofilizador (3 dias), geladeira (3, 5 e 7 dias), sílica gel (10, 20 e 30 dias) e folíolos frescos macerados com nitrogênio líquido produziram as maiores concentrações de DNA. Os tratamentos com sílica gel (7 dias) e todos os tratamentos com tampão de transporte produziram as menores concentrações de DNA. As concentrações de DNA obtidas dos tratamentos de sílica gel (10, 20 e 30 dias) foram as mesmas das amostras de folíolos fresco e liofilizado, embora os tratamentos de sílica gel não tenham produzido uma preservação de tecido satisfatória. A concentração de DNA extraído de Elaeis guineensis (dendezeiro) foi semelhante à encontrada no presente estudo quando utilizou-se nitrogênio líquido para macerar o tecido foliar, com concentrações variando de 496,00 a 572,00 ng/μL (IHASE et al., 2016). As concentrações de DNA extraídas de E. oleracea (açaizeiro) variaram de 40,00 a 313,00 ng/μL 42 quando utilizadas folhas frescas, mantidas congeladas com gelo e maceradas com nitrogênio líquido (COSTA; OLIVEIRA, 2002). Todos os tratamentos de armazenamento e maceração resultaram em amplificação de PCR positiva (Figura 5) e, portanto, forneceram material genético satisfatório para análises moleculares. A temperatura ótima de anelamento variou entre os locos avaliados (Tabela 2).

Tabela 2. Características de nove marcadores microssatélites heterólogos para Euterpe precatoria.

Loco TA (ºC) Tamanho do fragmento (pb) GenBank EE02 55, 4 87- 90 AF328879 EE08 50, 2 122-143 AF328872 EE32 55, 4 190-195 AF328883 EE41 45,8 107-122 AF328884 EE45 57,3 109-110 AF328887 EE47 45,8 255-270 AF328874 EE52 53,6 205-210 AF328888 EE54 50,2 120-124 AF328876 EE59 50,2 108-120 AF328885 TA (°C): temperatura de anelamento; pb: pares de base.

Várias metodologias para isolamento de DNA de plantas estão disponíveis. No entanto, modificações são necessárias de acordo com as peculiaridades de cada espécie. Para a espécie E. precatoria, os testes de armazenamento e maceração do tecido foliar maduro foram importantes, pois fornecem opções para estudos posteriores que utilizem técnicas simples e de baixo custo para extração de DNA de qualidade suficiente para uso em análises genéticas.

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5. CAPÍTULO II

TRANSFERIBILIDADE DE LOCOS MICROSSATÉLITES HETERÓLOGOS ENTRE ESPÉCIES DO GÊNERO Euterpe

RESUMO Euterpe precatoria, conhecido popularmente como “açaí-do-amazonas” apresenta potencial agronômico, tecnológico e econômico e vem ganhando destaque pela comercialização de seus frutos. A produção desse açaizeiro está baseada no extrativismo e por isso práticas de manejo têm sido recomendadas para uma coleta sustentável. Para se recomendar taxas sustentáveis de coleta dos frutos, é fundamental se ter informações sobre a variabilidade genética das populações naturais, além de se monitorar o recrutamento e a dinâmica populacional. O objetivo deste estudo foi avaliar a transferibilidade de locos microssatélites da espécie E. edulis para E. precatoria a fim de confirmar a aplicabilidade destes marcadores em estudos genéticos. Foram analisados 18 locos microssatélites desenvolvidos para E. edulis utilizando 20 indivíduos de duas populações naturais (Formoso e Novo Segredo) de E. precatoria coletados em Feijó-Acre, Brasil. Todos os locos (100%) amplificaram e nove destes (50%) foram polimórficos. Observou-se um total de 29 alelos na população Novo Segredo e 27 alelos na população Formoso, variando de dois a cinco alelos por loco, com média de três alelos/loco. A heterozigosidade esperada na população Formoso variou entre 0,100 e 0,668, com média de 0,421. Na população Novo Segredo houve variação entre 0,100 e 0,710, com média de 0,418. Os valores de heterozigosidade observada variaram entre 0,100 e 0,800, com médias de 0,333 e 0,267 para Formoso e Novo Segredo, respectivamente. Este conjunto de marcadores servirão de suporte para futuros estudos de caracterização molecular das populações naturais de E. precatoria, auxiliando na recomendação de práticas de manejo sustentável e também de estratégias para a conservação e melhoramento genético desta espécie.

Palavras-chave: Arecaceae, açaí-do-amazonas, amplificação cruzada, sequências simples repetidas.

ABSTRACT Euterpe precatoria, popularly known as “açaí-do-amazonas”, has agronomic, technological and economic potential and has been gaining prominence with the commercialization of its fruits. The production of this açaí-do-amazonas is based on extractivism and management practices have been recommended for sustainable collection. To recommend sustainable rates of fruit collection, it is essential to have information on the genetic variability of natural populations to monitor the recruitment and population dynamics. The objective of this study was to evaluate the transferability of microsatellite loci of E. edulis species to E. precatoria to confirm the applicability of these markers in genetic studies. Eighteen microsatellite loci developed for E. edulis were analyzed using 20 individuals from two natural populations (Formoso and Novo Segredo) of E. precatoria collected at Feijó, State of Acre, Brazil. All loci (100%) were amplified, and of these, nine (50%) were polymorphic. A total of 29 alleles were found in the Novo Segredo population, and 27 alleles were found in the Formoso population, ranging from two to five alleles per locus, with a mean of three alleles per locus. The expected heterozygosity in the Formoso population varied from 0.100 to 0.668, with an average of 0.421. In the Novo Segredo population, a variation between 0.100 and 0.710, with a mean of 0.418, was found. The observed heterozygosity values ranged from 0.100 to 0.800, with averages of 0.333 and 0.267 for Formoso and Novo Segredo, respectively. This set of markers will support further studies on the molecular characterization of the natural populations of E. precatoria and assist with the recommendation of sustainable management practices and strategies for the conservation and genetic improvement of this species.

Keywords: Arecaceae, açaí-do-amazonas, cross-amplification, simple sequence repeats.

5.1 INTRODUÇÃO

Euterpe precatoria Mart. variedade precatoria é uma espécie amplamente distribuída pela América Central e norte da América do Sul, especialmente na Amazônia Central e Ocidental (HENDERSON, 1995). Destaca-se entre os diversos recursos genéticos da região amazônica pela sua abundância e produção de frutos (STEEGE et al., 2013). Esta espécie apresenta potencial agronômico, tecnológico e econômico e vem ganhando destaque pela comercialização de sua polpa, o “suco de açaí”, o qual possui uma série de qualidades nutricionais (YUYAMA et al., 2011; YAMAGUCHI et al., 2015). Entretanto, a exploração de seus frutos é feita de forma extrativista, o que pode gerar declínio nas populações naturais e consequentemente à redução de variabilidade genética. Dessa maneira, a caracterização genética de populações exploradas poderá auxiliar no desenvolvimento e recomendação de práticas de manejo sustentáveis, bem como de estratégias adequadas de conservação. Além disso, poderá direcionar estratégias de coleta de germoplasma para programas de melhoramento. Devido às suas características genéticas, os microssatélites (Sequências Simples

Repetidas - SSRS) apresentam-se como marcadores ideais para estudos de variabilidade genética em populações naturais de plantas. Isso deve-se, principalmente, ao fato de serem altamente polimórficos, multialélicos e codominantes (KALIA et al., 2011; FORTES et al., 2016). A avaliação da variabilidade genética em populações naturais do açaí-do-amazonas por marcadores SSRS poderá auxiliar o direcionamento adequado de exploração de seus frutos, por meio de técnicas de manejo. No entanto, o uso desse marcador requer o desenvolvimento prévio de locos, os quais não existem para E. precatoria, além de ser um processo trabalhoso e oneroso (GUPTA et al., 2016). A conservação de sítios de microssatélites entre espécies relacionadas torna possível, a transferência destes para outras espécies (GUIDUGLI et al., 2010; SANTOS et al., 2011; CARMO et al., 2015; AZÊVEDO et al., 2016; FAGUNDES et al., 2016). Até o momento, existem disponíveis 18 locos SSRS desenvolvidos para Euterpe edulis e sete deles mostraram-se amplificáveis e polimórficos para E. oleracea (GAIOTTO et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2010).

O sucesso da transferibilidade de locos SSRS entre espécies têm sido observadas em outras palmeiras. Microssatélites desenvolvidos para tucumã (Astrocaryum aculeatum) apresentaram taxa de transferibilidade entre 50% a 93% para quatro espécies do mesmo gênero (A. acaule; A. jauari; A. murumuru e A. vulgare) e para duas de gêneros distintos (Bactris gasipaes e E. precatoria) (RAMOS et al., 2012). Fortes et al. (2016) obtiveram 75% de transferibilidade quando aplicaram locos SSRS desenvolvidos para as espécies de tucumã (A. aculeatum) e pupunheira (B. gasipaes) para o genoma de A. vulgare. No estudo utilizando locos 50

SSRS de coco (Cocos nucifera) para butiá (Butia odorata) foram observados 40% de transferibilidade (MISTURA et al., 2012). Considerando o custo para o desenvolvimento de marcadores específicos e a vantagem de se utilizar marcadores SSRS entre espécies relacionadas, o objetivo do presente estudo foi avaliar a transferibilidade de locos microssatélites da espécie E. edulis para E. precatoria a fim de confirmar a aplicabilidade destes marcadores para estudos genéticos com E. precatoria.

5.2 MATERIAL E MÉTODOS

5.2.1 Material vegetal

Foram coletados folíolos maduros de 20 indivíduos de E. precatoria de duas populações naturais: Novo Segredo, localizada em floresta de baixio (latitude 8S 20' 31'', longitude 45 W 37' 41'', altitude 231 m) e Formoso em floresta de terra firme (latitude 8S 25' 40'', longitude 46 W 14' 18'', altitude 211 m). Foram analisados 10 indivíduos por população, as populações estão situadas na Terra indígena Kaxinawá de Nova Olinda, Feijó-Acre, Brasil (Figura 6). Os folíolos foram acondicionados em sacos de papel, identificados, contendo sílica gel e transportados para o Laboratório de Morfogênese e Biologia Molecular, localizado na Embrapa Acre, Rio Branco, Acre.

5.2.2 Extração de DNA e locos microssatélites

O DNA genômico total foi extraído de acordo com o protocolo de Doyle e Doyle (1990) com modificações. Foi utilizado 100 mg de tecido foliar por amostra. As amostras foram maceradas no equipamento automático (TissueLyser®, Qiagen). O DNA extraído foi quantificado em gel de agarose (1%) através da comparação de padrões de DNA do fago λ, visualizados por meio de luz UV e fotografados. Nas reações de amplificação foram testados 18 locos microssatélites desenvolvidos para E. edulis (GAIOTTO et al., 2001). As reações foram feitas contendo: 5 ng de DNA genômico; 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl; 0,25 mM de cada dNTP; 0,25 mg/mL de BSA (Albumina Sérica

Bovina); 2,0 mM MgCl2; 0,2 μM de cada iniciador e 1 U de Taq DNA polimerase e água ultrapura estéril. As amplificações foram realizadas em termociclador (Analitik Jena), e para verificar a temperatura específica de anelamento de cada loco foi realizada amplificação com gradiente de 12 temperaturas (45,0; 45,8; 46,8; 48,2; 50,2; 52,1; 53,6; 55,4; 57,3; 58,5; 59,4; e 60 °C) com uma amostra. Locos que não apresentaram padrão satisfatório de amplificação neste intervalo foram submetidos a testes com temperaturas de 61 e 62 °C. Após a identificação da temperatura de anelamento específica, as amostras foram submetidas às seguintes etapas de amplificação: 94 °C por 1 minuto, seguido de 30 ciclos de 94 °C por 1 minuto, temperatura de anelamento definida para cada iniciador por 1 minuto e 72 °C por 1 minuto, seguida de uma fase final de extensão a 72 °C por 5 minutos. Para a avaliação do produto da PCR as amostras foram submetidas a eletroforese em gel de agarose (3%). Após a amplificação, os fragmentos de DNA foram separados em gel desnaturante de poliacrilamida (5%). A coloração do gel foi realizada utilizando-se nitrato de prata (CRESTE et al., 2001). A interpretação dos fragmentos amplificados foi realizada por meio de comparação com marcador de peso molecular padrão (10 pb ladder – Life Technologies).

5.2.3 Análise estatística

A avaliação da transferibilidade foi feita conforme descrito por Fortes et al. (2016) com base em três critérios: amplificação dos locos, nitidez das bandas e ausência de produtos secundários (bandas inespecíficas). Os locos polimórficos foram caracterizados quanto ao número de alelos por locos (A), heterozigosidade esperada (HE) e observada (HO), conteúdo de polimorfismo (PIC) para cada loco e a média de todos os locos, utilizando o software TFPGA 52 versão 1.3 (MILLER, 1997). Verificou-se também a presença de alelos nulos utilizando o programa MICRO-CHECKER 2.2.3 (OOSTERHOUT et al., 2004).

5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Dos 18 locos microssatélites desenvolvidos para a espécie E. edulis testados, 100% amplificaram nos 20 genótipos analisados de E. precatoria das populações Formoso e Novo Segredo (Tabela 3 e Figura 7).

Este resultado foi superior ao obtido por Gaiotto et al. (2001) que ao utilizarem os mesmos locos na espécie E. oleracea, obtiveram sucesso de amplificação de apenas sete locos dos 18 locos testados. Desse conjunto de locos, apenas dez (EE3; EE8; EE9; EE23; E25; EE32; EE41; EE45; EE47 e EE48) apresentaram amplificação, com a presença de produtos secundários. Embora, os locos tenham apresentados produtos inespecíficos, todos foram analisados, afim de verificar a presença de polimorfismo. Houve variação de temperatura de anelamento entre os locos testados (Tabela 3). 53

Tabela 3. Características de 18 marcadores microssatélites heterólogos para Euterpe precatoria.

Formoso (N=10) Novo Segredo (N=10)

Tamanho Loco GenBank TA (ºC) dos A HE HO PIC A HE HO PIC fragmentos (pb) *EE2 55,4 87-90 2 0,100 0,100 0.095 2 0,100 0,100 0,095 AF32887 *EE8 50,2 120-143 4 0,647 0,400 0.615 4 0,363 0,200 0,345 AF32887 9 *EE32 55,4 195-215 5 0,568 0,500 0,540 5 0,710 0,600 0,675 AF32888 2 *EE41 45,8 124-127 2 0,189 0,200 0,180 4 0,489 0,200 0,465 AF32888 3 *EE45 57,3 108-110 4 0,668 0,400 0,635 3 0,694 0,400 0,660 AF32888 4 *EE47 45,8 270-278 2 0,505 0,800 0,480 4 0,552 0,300 0,525 AF32887 7 *EE52 53,6 205-210 3 0,568 0,200 0,540 2 0,336 0,400 0,320 AF32888 4 *EE54 50,2 114-126 3 0,278 0,100 0,265 3 0,415 0,100 0,395 AF32887 8 *EE59 50,2 108-122 2 0,268 0,300 0,255 2 0,100 0,100 0,095 AF32888 6 EE3 50,2 190 1 - - - 1 - - - AF32888 5 EE5 46,8 120 1 - - - 1 - - - AF32888 1 EE9 62,0 120 1 - - - 1 - - - AF32888 2 EE15 55,4 140 1 - - - 1 - - - AF32887 0 EE23 57,3 110 1 - - - 1 - - - AF32887 3 EE25 55,4 145 1 - - - 1 - - - AF32887 7 EE43 46,8 110 1 - - - 1 - - - AF32888 8 EE48 45,8 240 1 - - - 1 - - - AF32887 6 EE63 46,8 90 1 - - - 1 - - - AF32888 5 Total 27 - - - 29 - - - 9 Média 3,0 0,421 0,333 0,401 3,2 0,418 0,267 0,397 *Locos polimórficos; TA (ºC): Temperatura de anelamento; pb: pares de bases; A: número total de alelos por loco; HE: heterozigosidade esperada; Ho: heterozigosidade observada; PIC: conteúdo informativo do polimorfismo. 54

Os locos EE41, EE47 e EE48 apresentaram os menores valores de temperatura (45,8 °C) e o loco EE9 apresentou a maior temperatura de anelamento (62,0 ºC). Todas as temperaturas observadas no presente estudo diferiram das temperaturas originais utilizadas por Gaiotto et al. (2001) que variaram de 48 ºC a 64 ºC.

Resultado similar foi obtido por Oliveira et al. (2010) ao utilizarem locos SSRS da espécie E. edulis para caracterizar a variabilidade genética de 116 acessos de E. oleracea da coleção de germoplasma da Embrapa Amazônia Oriental. Dos sete locos utilizados, cinco necessitaram de otimizar a temperatura de anelamento. Segundo os autores, consideraram-nas como baixa a divergência evolutiva entre as espécies E. edulis e E. oleracea. Nove locos foram polimórficos (50%), cujos tamanhos variaram de 87 a 278 pares de bases (Tabela 3 e Figura 8). Este resultado foi superior ao obtido por Gaiotto et al. (2001) e Oliveira et al. (2010) quando testaram a transferibilidade dos marcadores de E. edulis para E. oleracea.

O número total de alelos observado em ambas populações foi similar, com um total de 29 alelos na população Novo Segredo e 27 alelos na população Formoso (Tabela 3). Os alelos variaram de dois a cinco alelos por loco, com média de três alelos/loco. Os locos EE8, EE45 e EE32 foram os mais polimórficos (com 4 a 5 alelos por loco) na população Formoso e os locos EE8, EE41, EE47 (com 4 a 5 alelos por loco) mais polimórficos na população Novo Segredo. Os locos com menor polimorfismo em ambas as populações foram EE2, EE59 (2 alelos por loco). Todos os locos exibiram menor variação alélica do que observado na espécie (média=10,6) para qual foram desenvolvidos (GAIOTTO et al., 2001). Resultados similares foram observados em estudos com outras espécies quando se utilizou marcadores transferidos (GUIDUGLI et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2010). A heterozigosidade esperada na população Formoso variou entre 0,100 e 0,668, com média de 0,421. Na população Novo Segredo houve variação entre 0,100 e 0,710, com média 55 de 0,418. Os valores de heterozigosidade observada variaram entre 0,100 e 0,800, com médias de 0,333 e 0,267 para Formoso e Novo Segredo, respectivamente (Tabela 3). Os valores de HO foram maiores que HE em três locos na população Formoso (EE41; EE47 e EE59) e um loco na população Novo Segredo (EE52), indicando excesso de homozigotos para esses locos.

Valores intermediários de HE também foram observados em população de Tucumã do

Amazonas, no município de Manaus, por meio de marcadores SSRS (HE = 0,467). Os autores apontam que o baixo valor encontrado pode estar relacionado ao local de coleta, pois os materiais coletados foram provenientes de fragmento de floresta (RAMOS et al., 2012). No caso deste estudo, pode ser que o baixo número de heterozigotos detectados nas populações analisadas esteja relacionado ao tamanho amostral, uma vez que foram analisados apenas dez indivíduos em cada população. Outro fator que pode ter influenciado na redução de heterozigotos é o baixo número de alelos, decorrente da transferibilidade dos locos. Gaiotto et al. (2001), ao utilizarem os mesmos locos que foram polimórficos no presente estudo, verificaram um valor médio de heterozigosidade observada de 0,645. No entanto, vale salientar que dentre os locos polimórficos, nenhum loco apresentou alelos nulos. Variação no nível de polimorfismo foram encontrados entre os locos polimórficos. Na população Formoso os valores de PIC variaram de 0,095 a 0,635, com média de 0,401. Na população Novo Segredo os valores variaram de 0,095 a 0,675, com média de 0,397 (Tabela 3). Valores de PIC superiores a 0,5 foram observados em quatro locos na população Formoso e três locos na Novo Segredo. Segundo a classificação definida por Botstein et al. (1980), marcadores com valores de PIC superiores a 0,5 são considerados altamente informativos. Os locos EE45 e EE59 foram os dois marcadores polimórficos que apresentaram homologia com genes. Existe uma alta probabilidade de que estes locos estejam intimamente relacionados à expressão gênica e podem ser classificados como um marcador funcional informativo. O loco EE45 apresentou o maior valor de PIC na população de Formoso (0,635) e o segundo maior valor de PIC na população de Novo Segredo (0,660). O loco EE45 mostrou 87% de identidade com uma sequência de mRNA de tamareira (Phoenix dactylifera) que codifica serina/treonina-proteína quinase HT1-like (número de acesso GenBank XM 008797462.2). O loco EE59 apresentou homologia com várias sequências do gene do fator de transcrição MADS box (AG1) e outras com espécies da família Arecaceae. Esta família de genes é altamente conservada na formação de órgãos sexuais no tecido reprodutivo (BOWMAN et al., 1989). Entre os nove locos monomórficos, apenas um loco era homólogo a genes conhecidos. A ausência de polimorfismo provavelmente pode ser consequência de que sejam parte de 56 fragmentos de genes conservados. O loco EE15 apresentou homologia com sequência de RNA de glutamate-rich WD repeat-containing protein 1-like em Elaeis guineensis e Phoenix dactylifera. Este gene codifica um papel importante na biogênese de ribossomo, outra região molecular altamente conservada. Estudos genômicos no gênero Euterpe ainda não possuem banco de dados lançado e apenas poucas sequências estão disponíveis no GenBank. Nossa pesquisa atual é baseada em 396 sequências de DNA e RNA (acessado em outubro de 2017). A conservação de sítios que flanqueiam os microssatélites entre espécies relacionadas permite a transferência de locos, sendo que quanto maior o grau de parentesco entre as espécies, mais eficientes serão as taxas de transferibilidade (KALIA et al., 2011). Portanto, as taxas de transferibilidade encontradas neste estudo podem ser um indicativo de maior proximidade filogenética entre a espécie E. edulis e E. precatoria do que E. oleracea (OLIVEIRA et al., 2016).

5.4 CONCLUSÕES

Este conjunto de marcadores servirão de suporte para futuros estudos de caracterização molecular das populações naturais de E. precatoria, auxiliando na definição de estratégias de conservação, manejo e melhoramento genético para esta espécie.

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6. CAPÍTULO III

ESTRATÉGIA DE CONSERVAÇÃO DE Euterpe precatoria COM PERFIL MOLECULAR

RESUMO Euterpe precatoria ocorre naturalmente no território amazônico e está presente nos estados do Acre, Rondônia, Amazonas e Pará. Apresenta múltiplos usos como alimentício, artesanal, cosmético e medicinal. Nos últimos anos, a demanda pela polpa de seus frutos aumentou de forma expressiva por possuir características energéticas, nutritivas e antioxidantes. A extração dos frutos é baseada no extrativismo e por isso, práticas de manejo e conservação têm sido recomendadas para uma coleta sustentável. O objetivo do estudo foi caracterizar a diversidade e estrutura genética espacial (EGE) de populações de E. precatoria, visando definir estratégias de conservação com perfil molecular. Foram genotipados 92 indivíduos de uma população de terra firme (Formoso) e 96 de uma área de baixio (Novo Segredo) com nove microssatélites. Um total de 45 alelos foram detectados. Foram observados baixos valores médios de heterozigosidade esperada (0,330) e observada (0,270). É possível sugerir que o baixo polimorfismo observado esteja associado ao uso de locos heterólogos. Foi detectada ausência de endogamia, o que mostra excesso de heterozigotos. A divergência genética entre as populações foi alta e significativa, sendo que 27% da variabilidade esteve entre as populações e 73% dentro. A análise de EGE aponta que a coletas de sementes para conservação da espécie E. precatoria não deve ocorrer entre palmeiras distantes a menos de 50 m em área de baixio e 78 m em terra firme, a fim de evitar a coleta de sementes entre indivíduos aparentados. A coleção nuclear identificada foi composta por nove palmeiras na área de baixio e 12 em terra firme. A conservação in situ da coleção nuclear é uma estratégia relevante que objetiva conservar a diversidade genética de toda a população, e também preserva os habitats onde a espécie ocorre. Conclui-se que as populações de E. precatoria estudadas (Terra Firme e Baixio) apresentaram diferenciação genética entre e dentre as populações. A definição da coleção nuclear, juntamente com a coancestria são análises robustas e que podem ser utilizadas em conjunto para a elaboração de estratégias de conservação in e ex situ de E. precatoria.

Palavras-chave: floresta Amazônica, genética da conservação, marcadores microssatélites, palmeira tropical.

ABSTRACT Euterpe precatoria occurs naturally in the Amazonian territory and is found in the states of Acre, Rondônia, Amazonas and Pará. It shows multiple uses such as food, artcraft, cosmetic and medicinal. The demand for the pulp of its fruits has increased significantly in the last years because it has energy, nutritional and antioxidant characteristics. The extraction of the fruits is based on the extractivism. Therefore, management and conservation practices have been recommended for a sustainable harvest. The objective of the study was to characterize the diversity and spatial genetic structure (SGS) of E. precatoria populations in order to define conservation strategies using molecular profile. A total of 92 individuals from dryland (Formoso) population and 96 from a flooded area (Novo Segredo) with nine microsatellites were genotyped. Forty-five alleles were detected. Low average values of expected (0.330) and observed (0.270) heterozygosity were observed. It can be suggested that the low polymorphism observed in the study is associated with the use of heterologous loci. Absence of inbreeding was detected, which shows excess of heterozygotes. The genetic divergence among the populations was high and significant, in which 27% of the variability was found between the populations and 73% was found within. The SGS analysis indicates that the seed collection for conservation of E. precatoria should not occur between palm trees at less than 50 m of distance in the flooded area and 78 m in dryland, in order to avoid the collection of seeds among related individuals. The identified nuclear collection was composed of nine palm trees in the flooded and 12 on the dryland. The in situ conservation of the nuclear collection is a relevant strategy whose objective is to conserve the genetic diversity of the entire population, and also to preserve the habitats where the species occurs. It is concluded that the assessed populations of E. precatoria (dryland and flooded) showed genetic differentiation among and within the populations. The definition of the nuclear collection associated with coancestry is robust analyses that can be used combined for the elaboration of in situ and ex situ conservation strategies of E. precatoria.

Keywords: Amazon forest, conservation genetics, microsatellite markers, tropical palm tree.

6.1 INTRODUÇÃO

A região Amazônica possui valioso repositório de recursos genéticos de espécies frutíferas de palmeiras, dentre elas destaca-se a espécie Euterpe precatoria var. precatoria Mart. (MARTINOT et al., 2017). Conhecida popularmente como açaí-solteiro é um dos produtos florestais não madeireiros (PFNM’s) com grande destaque agronômico, tecnológico, nutricional, econômico, cultural (YUYAMA et al., 2011; YAMAGUCHI et al., 2015) e elevado valor social, assegurando a subsistência de inúmeras famílias da região norte do Brasil. O açaí-solteiro é uma das sete espécies do gênero Euterpe, pertencente à família Arecaceae (HENDERSON, 2000). Ocorre naturalmente na América Central e norte da América do Sul, sendo que no Brasil ocorre nos estados do Acre, Rondônia, Amazonas e Pará (HENDERSON, 1995; YAMAGUCHI et al., 2015), geralmente em maciços denominados de açaizais em áreas de floresta de baixio e terra firme (ROCHA, 2004). Euterpe precatoria apresenta múltiplos usos como alimentício (palmito), paisagismo, artesanato, cosmético e medicinal (COSTA; MITJA 2010). Contudo, a espécie tem se destacado principalmente pela polpa extraída dos seus frutos, por possuir características nutritivas, anti- inflamatórias e antioxidantes, sendo considerada uma bebida energética (YUYAMA et al., 2011; KANG et al., 2012; YAMAGUCHI et al., 2015; CAREY et al., 2017). Pela falta de plantios comerciais, os frutos são coletados de forma extrativista em seu ambiente natural sem nenhum programa de manejo (MARTINOT et al., 2017). A produção extrativista é responsável pelo abastecimento de todo o mercado regional e nacional do açaí- solteiro (SILVA et al., 2016; MARTINOT et al., 2017). Por ser considerada uma das espécies mais abundante da Amazônia (STEEGE et al., 2013), esta palmeira pode ser modelo para o desenvolvimento econômico ligado a conservação das florestas tropicais (ROCHA, 2004). A palmeira apresenta assincronismo de florescimento e frutificação nos ambientes de baixio e terra firme. No estado do Acre, o açaí-solteiro floresce nos meses de fevereiro e março e frutifica de março a junho na floresta de baixio, e na floresta de terra firme floresce de junho a julho e frutifica de julho a agosto (FERREIRA, 2005). Apesar da coleta extrativista dos frutos do açaí-solteiro ser realizada há muito tempo por indígenas, caboclos e ribeirinhos, poucos são os estudos relativos à caracterização genética desta espécie (KAGEYAMA et al., 2004; LIMA, 2014). Como uma espécie que gera um PFNM’s de grande valor econômico para a região amazônica, a manutenção de suas populações tanto em florestas de baixio como em terra firme depende de estratégias de manejo adequadas para sua conservação. A falta de manejo pode levar a redução no número de indivíduos em função da ausência de critérios para coleta de frutos. 63

Para que essas estratégias de manejo sejam eficazes é essencial que estejam embasadas em estudos genéticos que quantifiquem a diversidade, estrutura genética espacial e endogamia nas populações, para ajudar a determinar as medidas necessárias para a conservação genética, informando formas de maximizar a diversidade genética nas estratégias de coleta dos frutos e sementes para conservação e programas de melhoramento (OLIVEIRA et al., 2006; SEBBENN et al., 2010; LIMA, 2014). Desta forma, o objetivo do estudo foi caracterizar a diversidade e estrutura genética espacial de populações de E. precatoria, visando definir estratégias de conservação com perfil molecular.

6.2 MATERIAL E MÉTODOS

6.2.1 Área de estudo e amostragem

Foram coletadas duas populações naturais de E. precatoria. Elas estão localizadas na Reserva Indígena Kaxinawá de Nova Olinda, município de Feijó, estado do Acre, Brasil, denominadas Formoso (8º 25’ 40” S, 46º 14’18”W, altitude média de 211 m) e Novo Segredo (8º 20’ 31” S, 45º 37’ 41” W, altitude média de 231 m), distantes cerca de 9 km entre si (Figura 9). A população Formoso é característica de floresta ombrófila densa de terra firme e a população Novo Segredo apresenta vegetação característica da floresta ombrófila aberta de baixio. As áreas apresentam densidades populacionais de 29 e 42 palmeiras/ha na população Formoso e Novo Segredo, respectivamente. Foram avaliadas 188 palmeiras adultas, sendo 92 da população Formoso e 96 da população Novo Segredo. As palmeiras foram amostradas, georreferenciadas (GPS 76CXS, Garmin) e identificadas com plaquetas (Autorização: SISBIO 50570/2015, SISGEN nº A6A46CC, FUNAI nº 451/2014). Amostras de tecido foliar foram acondicionadas em sacos de papel identificados, contendo sílica gel e transportadas para o Laboratório de Morfogênese e Biologia Molecular, localizado na Embrapa Acre, Rio Branco, Acre.

Figura 9. Localização geográfica das populações de Euterpe precatoria, Formoso e Novo Segredo, na Terra Indígena Kaxinawá de Nova Olinda, município Feijó, estado do Acre, Brasil.

6.2.2 Extração de DNA e genotipagem

O DNA genômico total foi extraído de acordo com o protocolo de Doyle e Doyle (1990), utilizando como material 100 mg de tecido foliar por amostra. O DNA extraído foi quantificado em gel de agarose (1%) em comparação com o DNA padrão do fago λ visualizado por luz UV.

As amostras foram genotipadas com nove locos SSRS (EE02, EE08, EE32, EE41, EE45, EE47, EE52, EE54 e EE59), os quais foram transferidos de E. edulis para E. precatoria (AZÊVEDO et al., 2017). O procedimento de amplificação dos locos SSRS e separação dos fragmentos estão descritos em Azêvedo et al. (2017). A identificação de erros de genotipagem devido à existência de alelos nulos e a erros na interpretação dos géis foi verificada no programa Micro-Checker versão 2.2.3 (OOSTERHOUT et al., 2004). A frequência de alelos nulos em cada loco foi estimada como em Brookfield

(1996), usando o estimador n° 1: r = r = (퐻̂푒 – 퐻̂표) / (1 + 퐻̂푒). A aderência das frequências gênicas e genotípicas ao modelo de equilíbrio de Hardy- Weinberg (EHW) foi testada usando o teste exato de Fisher e também foi feito teste de desequilíbrio de ligação (DL) entre todos os pares de locos. Ambos os testes foram obtidos com o programa GDA 1.1 (LEWIS; ZAYKIN 2001).

6.2.3 Análises de diversidade genética

A diversidade genética foi estimada para cada loco e em cada população individual com os seguintes parâmetros: número total de alelos ( K ), alelos privados ( N pa ), número médio de H alelos por loco ( A ), heterozigosidade esperada ( e ), heterozigosidade observada ( H o ) e índice de fixação de Wright ( F ) usando o software GDA1.1. A significância estatística dos valores foi avaliada por 10.000 reamostragens. O software CoreFinder 1.0 (POLICRITI; SGARRO, 2011) foi utilizado para determinar a coleção nuclear.

6.2.4 Análises de estrutura genética

A distribuição da variabilidade genética entre e dentro das populações foi caracterizada pelas estatísticas F de Wright, segundo a metodologia de Weir e Cockerham (1984), utilizando o software GDA. Os parâmetros estimados foram: divergência genética entre populações (휃̂); índice de fixação total das populações (퐹̂); índice de fixação médio entre populações (푓̂). A significância estatística para essas estimativas foi obtida pelo intervalo de confiança a 99% de probabilidade calculada por meio de 10.000 reamostragens. Para verificar os pools gênicos representados em cada população, utilizou-se o método de agrupamento bayesiano implementado no software STRUCTURE 2.3.4 (PRITCHARD et al., 2000). O programa foi executado com K variando de 1 a 10. Foram realizadas 20 iterações independentes para cada K, usando o modelo de mistura, frequências alélicas independentes, 100.000.000 de burn-in e 1.000.000 iterações MCMC (Markov Chain Monte Carlo). A escolha do número mais provável de clusters (K) foi realizada calculando-se a estatística ΔK, que é baseada na taxa de mudança na log-verossimilhança entre valores sucessivos de K, conforme descrito por Evanno et al. (2005) usando Structure Harvester (EARL, 2012). A relação entre os indivíduos foi verificada pela análise de agrupamento usando o método Neighbor-Joining (NJ) no software MEGAX (KUMAR et al., 2018) usando a matriz da distância modificada de Roger que foi obtida do software TFPGA (MILLER, 1997).

6.2.5 Estrutura genética espacial (EGE)

A estrutura genética espacial (EGE) dentro das populações foi analisada com base na estimativa do coeficiente de parentesco entre cada par de indivíduos, como descrito em Loiselle 66 et al. (1995), com o programa SPAGeDi 1.5 (HARDY; VEKEMANS, 2002). Classes de distância foram definidas para padronizar o número de pares de observações por classe. O correlograma entre o coeficiente médio de parentesco e as classes de distância foi construído para visualizar a estrutura genética espacial. O intervalo de confiança de 95% foi determinado por 10.000 permutações de genótipos por classes de distância, com base na hipótese nula de ausência de EGE.

6.3 RESULTADOS

6.3.1 Diversidade genética

Os nove locos utilizados foram polimórficos. Foi observado um total de 45 alelos com 3 a 7 alelos por loco, com uma média de 5 alelos/loco (Tabela 4).

Locos K H e H o F EE02 4 0,192 0,214 -0,118 EE08 6 0,498 0,383 0,237 EE32 5 0,060 0,061 -0,019 EE41 5 0,685 0,442 0,348 EE45 5 0,429 0,425 0,004 EE47 4 0,223 0,247 -0,113 EE52 3 0,054 0,055 -0,024 EE54 7 0,674 0,516 0,311 EE59 6 0,157 0,158 -0,004 Média 5,0 0,330 0,270 0,060 Total 45 Número total de alelos ( ), heterozigosidade esperada ( ), heterozigosidade observada ( ) e índice de fixação ( ).

A heterozigosidade esperada variou de 0,054 a 0,685 com uma média de 0,330 e a heterozigosidade observada variou de 0,055 a 0,516 com uma média de 0,270 (Tabela 4). O índice de fixação nos locos apresentou valores inferiores a zero. Cinco locos apresentaram valores negativos para ( ) o que mostra excesso de heterozigotos. O valor médio de ( ) foi positivo (0,060), porém próximo de zero, o que indica ausência de endogamia (Tabela 4). As 67

probabilidades do teste exato de Fisher mostraram desvios significativos (significância de 5%) nas proporções esperadas para o Equilíbrio de Hardy-Weinberg em dois locos na população Formoso (EE41 e EE59) e dois locos na população Novo Segredo (EE8 e EE41). Nenhuma evidência de alelos nulos foi detectada entre os locos analisados. As duas populações apresentaram 17 alelos privados (Tabela 5 e 6). Na população Novo Segredo foram observados dois alelos privados com frequências de 0,1 e um deles com a frequência 0,8. Na população Formoso observou-se dois alelos privados com frequências de 0,1.

População População Novo Legenda Novo Legenda Loco Formoso Loco Formoso Segredo (alelos) Segredo (alelos)

EE02 EE47

EE08 EE52

EE32 EE54

EE41 EE59

EE45

Observa-se que o número total de alelos foi semelhante nas duas populações (Tabela 6). Baixos valores foram observados para a heterozigosidade esperada e observada nas duas populações (Tabela 6).

Formoso Novo Segredo Número de indivíduos: n 92 96

Número total de alelos: K 37 39 8 9 Número de alelos privados: N pa Número médio de alelos: A 4,1 4,3

Heterozigosidade esperada: H e 0,266 (0,190) 0,292 (0,198)

Heterozigosidade observada: H o 0,266 (0,196) 0,291 (0,206) Indíce de Fixação: F -0,002 -0,003 (IC99% -0,122; 0,124) (IC99% -0,183; 0,251)

Desvio-padrão entre parênteses e IC: Intervalo de confiança a 99% de probabilidade, obtido por bootstrap.

O índice médio de fixação não foi significativamente diferente de zero, a julgar pelo intervalo de confiança indicando ausência de endogamia em ambas as populações (Tabela 6).

6.3.2 Estrutura genética

Os valores de endogamia no conjunto das populações (퐹̂) e de endogamia relacionada ao sistema de acasalamento (푓̂) não foram significativos conforme intervalo de confiança (Tabela 7). A divergência genética entre populações foi alta e significativa. Isso mostra que aproximadamente 27% da variabilidade genética encontra-se entre as populações e 73% dessa variabilidade ocorre dentro das populações.

Tabela 7. Estatísticas F para as populações Formoso e Novo Segredo da espécie Euterpe precatoria, na Terra Indígena Kaxinawá de Nova Olinda, município de Feijó, Acre, Brasil.

Loco 퐹̂ 푓̂ 휃̂푝 EE02 -0,1173 -0,1113 0,0053 EE08 0,1922 0,2658 0,0911 EE32 -0,0223 -0,0153 0,0068 EE41 -0,0299 0,5299 0,5436 EE45 -0,0871 0,0891 0,1622 EE47 -0,1625 -0,0563 0,0913 EE52 -0,0297 -0,0218 0,0077 EE54 0,0394 0,3631 0,3369 EE59 -0,0146 0,0049 0,0193 Média 0,0012ns 0,2723ns 0,2714* (IC 99%)1 (-0,105; 0,111) (-0,036; 0,432) (0,038; 0,439) () = intervalo de confiança; * = significativo no nível de 1% de probabilidade.

A análise Bayesiana da composição de pools gênicos evidenciou a presença de dois pools com pouca mistura entre populações (Figura 10). Verificou-se alta similaridade entre os indivíduos de cada população, formando grupos distintos de acordo com as suas respectivas populações de origem. O primeiro pool genético foi composto por 96 indivíduos e o segundo pool com 92 indivíduos, correspondendo às populações de Novo Segredo e Formoso, respectivamente.

A partir da análise de Neighbor-Joining (Figura 11), verificou-se também que os indivíduos foram agrupados de acordo com seus locais de origem, confirmando os resultados obtidos na análise bayesiana para o agrupamento K=2.

6.3.3 Estrutura genética espacial (EGE)

A estrutura genética espacial foi significativa até a distância aproximada de 78 m na população Formoso e 50 m na população Novo Segredo (Figura 12). O coeficiente de coancestria estimado na primeira classe (78 m) para a população Formoso foi de 0,0561 e para Novo Segredo (50 m) foi de 0,0118. 71

6.3.4 Coleção nuclear

A coleção nuclear da população Formoso foi representada por 12 indivíduos e na população Novo Segredo foi composta por nove indivíduos (Figura 13). Os indivíduos selecionados representam 100% dos alelos da população. Os indivíduos da população Formoso estão distribuídos de forma aleatória, enquanto que na população Novo Segredo estão agrupados (Figura 13). 72

Formoso Novo Segredo

6.4 DISCUSSÃO

O estudo da variabilidade genética entre e dentro de populações naturais de E. precatoria é relevante para que se definam estratégias efetivas de manejo e conservação, especialmente para essa espécie que ocupa ambientes distintos na Amazônia e cuja exploração comercial dos frutos tem sido intensificada nas últimas décadas. Neste estudo observou-se que as populações estudadas apresentaram níveis semelhantes de diversidade genética na terra firme e baixio e ausência de endogamia, mas que a divergência genética entre as populações foi grande mesmo geograficamente próximas. Estudos realizados com microssatélites desenvolvidos para a espécie específica têm apresentado altos valores de diversidade genética quando comparados com o uso de marcadores transferíveis. Conte et al. (2008) avaliaram populações naturais de E. edulis na Floresta Atlântica com locos microssatélites específicos para a espécie e verificaram altos níveis de polimorfismo com uma média de 14,7 alelos por loco. Altos valores de diversidade genética (8,5 a 11,5 alelos por loco) também foram observados em duas populações naturais de E. edulis no Brasil Central (GAIOTTO et al., 2003). Números elevados de alelos por loco (7,7) também foram observados em populações naturais de Astrocaryum aculeatum (tucumã) na Floresta Amazônica (RAMOS et al., 2016). O resultado do presente estudo pode ser explicado pelo uso de microssatélites heterólogos (AZÊVEDO et al., 2017). Outras populações de E. precatoria estudadas com locos transferidos de E. edulis também revelaram baixo número de alelos por loco, tanto no estado do Amazonas (3,7 a 4,1; LIMA, 2014) como no Acre (4,75; KAGEYAMA et al., 2004). Como vários outros estudos com espécies tropicais, utilizando amplificação heteróloga de locos microssatélites, detectaram tendência de menor número de alelos por loco (ZUCCHI et al., 2003; KAGEYAMA et al., 2004; MARTINS et al., 2006; GUIDUGLI et al., 2010; LIMA, 2014; OLIVEIRA et al., 2017). Uma das explicações para a ocorrência de baixio número de alelos pode ser a não aleatoriedade durante a seleção de locos para as espécies, conforme discutido por Martins et al. (2006). Outro fator que pode contribuir é a distância filogenética. No entanto, as espécies E. edulis e E. precatoria além de pertencerem ao mesmo gênero, apresentam características cariotípicas semelhantes (OLIVEIRA et al., 2016).

Os níveis de heterozigosidade esperada ( H e ) e observada ( H o ) por loco em ambas as populações foram baixos se comparadas a outros estudos. Estudos com palmeiras genotipadas com locos transferidos também apresentaram valores inferiores a 0,3 (OLIVEIRA et al., 2017). Esses parâmetros são influenciados ao número de alelos por loco. Assim, as baixas estimativas 74

para H e e H o também estão relacionadas com o baixo polimorfismo dos locos heterólogos. Outras palmeiras avaliadas com locos específicos apresentaram estimativas de heterozigosidades em torno de 0,5 (CONTE et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2014; RAMOS et al., 2016). Alelos privados foram observados nas duas populações. Como alguns desses alelos ocorrem em frequência elevada, sua presença pode ser resultado do assincronismo de florescimento entre as populações nos diferentes ambientes (ROCHA, 2004). Dessa forma, há limitação entre o fluxo gênico via pólen entre elas. Segundo relatos dos moradores locais, na população Novo Segredo (Baixio) os eventos reprodutivos ocorrem nos primeiros seis meses do ano enquanto que na população Formoso (Terra Firme) estes eventos ocorrem mais tarde. São necessários estudos específicos de biologia reprodutiva entre os ambientes para avaliar o sincronismo do florescimento para que tenhamos conclusões mais precisas a respeito das diferenças genéticas observadas. A ausência de endogamia devida ao sistema reprodutivo ( F ) também foi coerente com a biologia reprodutiva da espécie alógama e auto-incompatível. Lima (2014) estimou taxas de cruzamento em E. precatoria entre de 90 a 100%. Cerca de 27% da diversidade genética estão distribuídos entre as duas populações, que estão distantes apenas 9 km uma da outra. A diferenciação genética entre as populações é alta quando comparada à maioria das espécies tropicais (<5%, SILVA et al., 2011). Na palmeira E. edulis, por exemplo, foram encontrados valores de divergência de 2,4% entre populações distantes até 22 km (GAIOTTO et al., 2003). Valor semelhante de divergência (3%) foi detectada na palmeira buriti, sendo que as populações apresentavam distância mínima de 100 km (SANDER et al., 2017). Populações de E. precatoria localizadas em florestas de terra firme e baixio com distância mínima de 80 km apresentaram média divergência genética (14,3%) (LIMA, 2014), embora a magnitude tenha sido bem inferior à observada no presente estudo. A elevada divergência genética entre as populações observada neste estudo pode estar fortemente relacionada ao assincronismo dos eventos reprodutivos nos diferentes ambientes, como já discutido anterioremente. O forte grau de estruturação foi confirmado pelas análises de agrupamento (STRUCTURE, Neighbor-Joining), em que os indivíduos foram agrupados de acordo com o local em que foram amostrados (Floresta de Baixio e Terra Firme). A análise de estrutura genética espacial usando o coeficiente de coancestria por classes de distância mostrou que nessas populações de E. precatoria há uma tendência para que as palmeiras próximas sejam parentes, embora o grau de estrutura tenha sido fraco (ou seja, os valores de coancestria foram baixos, apesar de significativos, na primeira classe de distância). 75

Esse padrão foi também observado por Ramos et al. (2016) que estudaram população da palmeira tucumã (A. aculeatum) na Amazônia brasileira. A baixa EGE é esperada para populações com alta densidade de indivíduos (VEKEMANS; HARDY, 2004). Acredita-se, portanto, que os baixos valores de estruturação parecem ser característicos da espécie E. precatoria, provavelmente devido à alta densidade de indivíduos adultos (ROCHA, 2004; STEEGE et al., 2013; LIMA, 2014) e a eficiência de dispersão do pólen e da semente por longa e curta distância (LIMA, 2014; CARVALHO et al., 2015). Sua polinização pode ser feita tanto pelo vento quanto por pequenos besouros, abelhas e moscas (KUCHMEISTER et al., 1997). Além disso, as populações de E. precatoria do presente estudo estão localizadas em uma floresta contínua em território indígena conservado, o que contribui para a manutenção da fauna que interage com a espécie. Coleções nucleares refletem a diversidade genética de toda uma coleção principal e são ferramentas valiosas para conservar e avaliar os recursos genéticos de forma mais eficaz (DÍEZ et al., 2012). No presente estudo a coleção principal foi representada por todos os indivíduos da população Formoso (92) e Novo Segredo (96) e a coleção nuclear foi representada por 13% e 9% dos genótipos da população total, respectivamente. O número reduzido de genótipos facilita o gerenciamento adequado das grandes coleções, como os custos econômicos para tarefas rotineiras, como conservação, regeneração, duplicação, documentação e avaliação (ESCRIBANO et al., 2008). A conservação in situ dos indivíduos da coleção nuclear de E. precatoria nos ambientes de baixio e terra firme é uma estratégia relevante que objetiva conservar a diversidade genética de toda a população, e também preserva os habitats onde a espécie ocorre, visando a manutenção das interações entre os organismos e os processos evolutivos associados (SIMON, 2010). Além disso, os indivíduos da coleção nuclear poderão ser utilizados para coleta de sementes para a conservação ex situ da espécie. O conhecimento prévio de genótipos representativos da diversidade, que serão coletados para banco de germoplasma facilita o trabalho do pesquisador e reduz gastos financeiros e pessoal.

6.4.1 Implicações para coleta de sementes e conservação

Embora geograficamente próximas, as populações de E. precatoria de terra firme e baixio foram divergentes geneticamente, apresentaram número de indivíduos diferenciados para a formação da coleção nuclear e diferentes valores significativos de coancestria. Assim, as estratégias de conservação in situ e ex situ nestas populações devem ser realizadas de maneira distinta. 76

As coleções nucleares são ferramentas valiosas para conservar e avaliar o mínimo de indivíduos que representam toda a diversidade genética da coleção original. Sendo assim, as nove palmeiras identificadas na população de baixio e 12 palmeiras na população de terra firme podem ser referências de manutenção da variabilidade da população. Dentro de um programa de conservação, como forma de prevenção de erosão genética, seus frutos não devem ser coletados para consumo, mas podem ser usados para a conservação ex situ. A conservação in situ dos indivíduos da coleção nuclear de E. precatoria é uma estratégia relevante que objetiva conservar a diversidade genética de toda a população, e também preserva os habitats onde a espécie ocorre, visando a manutenção das interações entre os organismos e os processos evolutivos associados. Vale ressaltar que a exploração intensiva de E. edulis sem plano de manejo adequado, resultou na eliminação de várias populações e em grave alteração de populações remanescentes (REIS et al., 2000). Por esses motivos, a espécie encontra-se na Lista Brasileira das Espécies Ameaçadas de Extinção (BRASIL, 2008). Assim, as populações sob intenso processo extrativista precisam de monitoramento e estratégias de uso consciente do recurso genético. Outro parâmetro genético que pode contribuir para o plano de conservação é a incorporação da análise de coancestria. De acordo com os resultados observados as coletas de sementes para conservação da espécie E. precatoria não deve ocorrer entre palmeiras distantes a menos de 50 metros entre elas na população de baixio e 78 metros na população de terra firme, a fim de evitar a coleta de sementes entre indivíduos aparentados. Conhecer geneticamente as populações de açaizeiros da espécie E. precatoria pode contribuir para o aumento da produtividade e para a conservação efetiva, sem comprometer o uso do recurso no futuro. A partir dos dados moleculares, e os parâmetros genéticos associados servem como ferramentas práticas de identificação de matrizes em uma população natural e para identificar a distância mínima entre elas recomendada para coleta. Assim é possível selecionar indivíduos com variabilidade genética minimizando a endogamia e evitando a erosão genética.

6.5 CONCLUSÕES

Conclui-se que as populações de E. precatoria estudadas (Terra Firme e Baixio) apresentaram diferenciação genética entre e dentre as populações e ausência de endogamia. A definição da coleção nuclear, juntamente com a coancestria são análises robustas e que podem ser utilizadas em conjunto para a elaboração de estratégias de conservação in e ex situ de E. precatoria. 77

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