FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIODIVERSIDADE E BIOTECNOLOGIA DA REDE BIONORTE ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS DE AÇAIZEIRO (Euterpe precatoria Mart.) HELLEN SANDRA FREIRES DA SILVA AZÊVEDO Porto Velho -RO Janeiro/2019 HELLEN SANDRA FREIRES DA SILVA AZÊVEDO ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS DE AÇAIZEIRO (Euterpe precatoria Mart.) Tese de doutorado apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Rede BIONORTE (área de concentração 1: Biodiversidade e Conservação, linha de pesquisa 2: Conservação e Uso Sustentável da Biodiversidade) na Fundação Oswaldo Cruz, como requisito para a obtenção do título de Doutor em Biodiversidade e Biotecnologia. Orientadora: Prof.a Dra. Tatiana de Campos Coorientadora: Prof.a Dra. Lúcia H. de Oliveira Wadt Porto Velho -RO Janeiro/2019 HELLEN SANDRA FREIRES DA SILVA AZÊVEDO ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS DE AÇAIZEIRO (Euterpe precatoria Mart.) Tese de doutorado apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Rede BIONORTE (área de concentração 1: Biodiversidade e Conservação, linha de pesquisa 2: Conservação e Uso Sustentável da Biodiversidade) na Fundação Oswaldo Cruz, como requisito para a obtenção do título de Doutor em Biodiversidade e Biotecnologia. Orientadora: Prof.a Dra. Tatiana de Campos Coorientadora: Prof.a Dra. Lúcia H. de Oliveira Wadt. Banca examinadora Rio Branco – AC Janeiro/2019 DEDICATÓRIA A Deus, pelo dom supremo da vida e de onde emana toda a sabedoria; Ao meu querido amado esposo José Marlo Araújo de Azevedo pelo carinho, amor, incentivo e compreensão em todos os momentos; Aos meus queridos pais Jorge Souza da Silva e Ediana Rodrigues Freires, e ao meu amado irmão Patric William Freires da Silva que sempre me incentivavam a seguir em busca dos meus sonhos e estiveram ao meu lado em todos os momentos da minha vida, muito obrigada pela paciência, amor e carinho. Amo muito vocês! AGRADECIMENTOS A cada membro da minha família que me apoiaram em todos os momentos para a concretização deste trabalho - pais, irmão, avós, tios, primos, sogros, sobrinhos e cunhados. À minha orientadora, Dra. Tatiana de Campos, pelos ensinamentos profissionais, além da orientação e confiança. À minha coorientadora Dra. Lúcia Helena de Oliveira Wadt, pela amizade e disponibilidade em todos os momentos necessários. Ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Rede BIONORTE, pela oportunidade de dar continuidade em minha formação profissional e acadêmica. À Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, por ter sido minha segunda casa nestes últimos dez anos. À coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e a Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) pela concessão da bolsa de estudos. A todos os indígenas da Terra Indígena Kaxinawá de Nova Olinda, aos “meninos do campo” Aldeci e Manoel Freire e as amigas Reylâne Manil e Susana Silva por todo o apoio nas coletas dos materiais de campo. Às bolsistas do programa institucional de bolsas de iniciação científica Polinar Rufino, Lídia Cavalcante e Fernanda Benvindo por toda a ajuda na bancada e todo apoio e incentivo. Aos amigos Jônatas de Oliveira, Susana Silva e Sabrina Oliveira pela sincera amizade e apoio em cada etapa do doutorado. Aos Professores Dr. José Marques Carneiro Júnior, Dra. Giselle Mariano Lessa de Assis, Dra. Karina Martins e Dr. Moacir Haverroth pelos valorosos ensinamentos durante a minha formação acadêmica. A todos os professores do programa de pós-graduação da rede Bionorte, pela contribuição neste percurso, seja nas aulas ou nas rápidas conversas de corredor. Aos caríssimos amigos: Ricardo Leão, Ana Cláudia, Janice Ferreira, Eduardo Soares, Renata Beltrão, Luciélio da Silva, Clemeson Souza, Nathalia Costa, Cléia Santos, Dani Mique, Anelene Carvalho, Almecina Balbino, Priscila Wolter, Fernanda Fonseca, Aureny Lunz, Sandy Honorato e Salatiel pela amizade e incentivo durante o doutorado. A todas as pessoas que participaram, direta ou indiretamente desta conquista. O MEU MUITO OBRIGADA! “Para o homem é impossível, contudo, não para Deus; porque para Deus tudo é possível”. (Marcos 10:27) RESUMO Entre os recursos genéticos da Amazônia, o açaizeiro, Euterpe precatoria, destaca-se em função do valor agronômico, econômico, social e cultural associado principalmente a extração e comercialização da polpa do açaí. A caracterização genética de populações naturais poderá auxiliar no desenvolvimento e recomendação de práticas de manejo e estratégias adequadas de conservação da espécie. Os objetivos deste estudo foram avaliar métodos de preservação e maceração de folíolos de E. precatoria para a obtenção de DNA; testar a transferibilidade de microssatélites de E. edulis para E. precatoria e avaliar a diversidade e estrutura genética espacial (EGE) de populações de E. precatoria em floresta de terra firme e baixio. Foram testados 12 tratamentos de armazenamento e dois tipos de maceração. Analisou-se 18 microssatélites desenvolvidos para E. edulis em 20 indivíduos de duas populações de E. precatoria (Formoso e Novo Segredo). Foram coletados folíolos de 92 indivíduos de população de açaizeiro em terra firme (Formoso) e 96 indivíduos em área de baixio (Novo Segredo) no município de Feijó, AC. Verificou-se interação entre armazenamento e tipo de maceração, quando os folíolos foram macerados com nitrogênio líquido, sendo que as concentrações de DNA variaram de 285,00 ng/µL (7 dias em tampão de transporte) a 702,00 ng/µL (30 dias em sílica gel). Quando maceradas com TissueLyser® variaram de 572,73 ng/µL (30 dias em sílica gel) a 2.850,00 ng/µL (3 dias em liofilizador). A pureza do DNA (A260/A280 nm) variou de 1,30 a 1,70 quando os folíolos foram macerados com nitrogênio líquido e de 1,30 a 1,90 com o uso do TissueLyser®. No estudo de transferibilidade observou-se que nove locos foram polimórficos, com 29 alelos na população Formoso e 27 alelos na Novo Segredo. Na população Formoso e Novo Segredo foram observados os valores médios da heterozigosidade esperada de 0,421 e 0,418 e a observada de 0,333 e 0,267, respectivamente. Para o estudo de diversidade e EGE observou-se um total de 45 alelos, nos 188 indivíduos coletados e genotipados com nove locos microssatélites. Foram observados baixos valores médios de heterozigosidade esperada (0,330) e observada (0,270). É possível sugerir que o baixo polimorfismo observado esteja associado ao uso de locos heterólogos. Foi detectada ausência de endogamia ( F ), o que mostra excesso de heterozigotos. A divergência genética (휃̂) entre as populações foi alta e significativa, sendo que 27% da variabilidade esteve entre as populações e 73% dentro. As análises de agrupamentos alocaram os indivíduos de acordo com o local em que foram coletados, formando dois grupos. A análise de EGE aponta que a coletas de sementes para conservação da espécie E. precatoria não deve ocorrer entre palmeiras distantes a menos de 50 m em área de baixio e 78 m em área de terra firme, a fim de evitar a coleta de sementes entre indivíduos aparentados. A coleção nuclear identificada foi composta por nove palmeiras na área de baixio e 12 em área de terra firme. A conservação in situ da coleção nuclear é uma estratégia relevante que objetiva conservar a diversidade genética de toda a população, e também preserva os habitats onde a espécie ocorre. Conclui-se que todos os tratamentos de armazenamento e maceração foram eficazes para o isolamento do DNA genômico. Nove microssatélites foram transferíveis e polimórficos. As populações de E. precatoria estudadas (Terra Firme e Baixio) apresentaram diferenciação genética entre e dentre as populações. A definição da coleção nuclear, juntamente com a coancestria são análises robustas e que podem ser utilizadas em conjunto para a elaboração de estratégias de conservação in e ex situ de E. precatoria. Palavras-chave: açaí-solteiro, amplificação cruzada, genética da conservação, isolamento de DNA, sequências simples repetidas. ABSTRACT Among the genetic resources in the Amazon, açaizeiro, Euterpe precatoria, stands out due to the agronomic, economic, social and cultural values associated with the extraction and commercialization of açaí pulp. The genetic characterization of natural populations may help in the development and recommendation of management practices and appropriate conservation strategies of the species. The objectives of this study were to evaluate methods of preservation and maceration of E. precatoria leaflets to obtain DNA; to test the transferability of E. edulis microsatellites to E. precatoria and to evaluate the diversity and spatial genetic structure (SGS) of E. precatoria populations in dryland and flooded forests. Twelve storage treatments and two types of maceration were tested. It was analyzed 18 microsatellites developed for E. edulis in 20 individuals of two E. precatoria (Formoso and Novo Segredo) populations. Leaflets were collected from 92 individuals of açaizeiro population on dryland (Formoso) and 96 individuals in flooded area (Novo Segredo) in the municipality of Feijó, state of Acre. An interaction was found between storage and maceration type when leaflets were macerated with liquid nitrogen, and DNA concentrations ranged from 285.00 ng/µL (7 days in transport buffer) to 702.00 ng/µL ( 30 days on silica gel). When macerated with TissueLyser® ranged from 572.73 ng/µL (30 days on silica gel) to 2,850.00 ng/µL (3 days in lyophilizer). The DNA purity (A260/A280 nm) ranged from 1.30 to 1.70 when the leaflets were macerated with liquid nitrogen and from 1.30 to 1.90 with the use of TissueLyser®. It was observed in the transferability study that nine loci were polymorphic, with 29 and 27 alleles in the Formoso and Novo Segredo populations, respectively. The average values of expected heterozygosity were 0.421 and 0.418 and observed values of 0.333 and 0.267 for Formoso and Novo Segredo populations, respectively. For the study of diversity and SGS, a total of 45 alleles were observed in 188 individuals collected and genotyped with nine microsatellite loci.