EM ÁREAS DO NORTE E NORDESTE DO BRASIL, DEPOSITADOS NOS HERBÁRIOS UFRN-FUNGOS E JPB

Mariana Cavalcante e Almeida Sá ______Tese de Doutorado Natal/RN, Junho de 2018

MARIANA CAVALCANTE E ALMEIDA SÁ

RUSSULACEAE EM ÁREAS DO NORTE E NORDESTE DO BRASIL, DEPOSITADOS NOS HERBÁRIOS UFRN-FUNGOS E JPB

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução como requisito parcial para obtenção de título de Doutor em Sistemática e Evolução. Área de concentração: Taxonomia e Sistemática

Orientador: Prof. Dr. Felipe Wartchow, UFPB.

Natal 2018

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - •Centro de Biociências - CB

Sá, Mariana Cavalcante e Almeida. Russulaceae em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbários UFRN-FUNGOS e JPB / Mariana Cavalcante e Almeida Sá. - Natal, 2018. 92 f.: il.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução. Orientador: Prof. Dr. Felipe Wartchow.

1. - Tese. 2. - Tese. 3. - Tese. 4. - Tese. I. Wartchow, Felipe. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 561.284

Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351

Aprovada em ___/___/2018.

BANCA EXAMINADORA:

______Dr. Felipe Wartchow Universidade Federal da Paraíba (Orientador)

______Dra. Bianca Denise Barbosa da Silva Universidade Federal da Bahia

______Dra. Carla Rejane Sousa de Lira Universidade Federal de Pernambuco

______Dra. Georgea Santos Nogueira de Melo Universidade Federal de Pernambuco

______Dr. Rhudson Henrique Santos Ferreira da Cruz Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Natal 2018

DEDICATÓRIA

À Deus, por ter me propiciado realizar este trabalho; Aos meus pais, Ana Maria e Geraldo Sá, meus avós, Odete e Otávio, e meu esposo, Vandir e a nossa filha, Maria Helena tão preciosos e importantes para mim.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradeço à Deus por ter me dado a possibilidade de concluir mais esta etapa em minha vida, por ter sempre guiado meus passos, por ter aberto tantas portas, ter cuidado de mim e pela minha salvação. Agradeço também a minha mãe Ana Maria Cavalcante Lopes por ser a melhor mãe do mundo, por estar ao meu lado sempre, por extrair o melhor de mim e por ser a melhor avó do mundo. Ao meu pai, Geraldo de Almeida Sá (in memorian), que não está mais entre nós, mas tenho certeza que estaria ao meu lado sendo o pai maravilhoso que sempre foi e o maior apoiador dos meus sonhos. Aos meus avós, Odete Cavalcante Lopes e Otávio Lopes da Silva (in memorian), pelo amor, paciência, carinho e amor. À minha tia Meiry Lucy pelas orações, amor e carinho, és uma segunda mãe para mim, obrigada por nunca duvidar da minha capacidade mesmo quando eu não acreditei. Agradecer ao meu esposo e parceiro, Vandir de Sousa Araújo, pelo companheirismo, amizade, amor, força e perseverança, obrigada por estar sempre ao meu lado e por ter me dado o maior presente do mundo uma bela família com a chegada da nossa linda Maria Helena. À minha filha Maria que neste momento, ainda tão pequena, não sabe o quanto mudou a minha vida, o quanto seu sorriso é fundamental para mim, filha você mudou meu coração e, graças a você sou uma pessoa melhor. Agradeço a Universidade Federal do Rio Grande do Norte, mais especificamente ao Centro de Biociências e ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução: a todos os docentes que fizeram parte dessa minha nova formação, por todo o conhecimento transmitido e por todo apoio. Tenho prazer em agradecer à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela concessão de bolsa de estudo em nível de Doutorado e pela bolsa do doutorado sanduíche (PDSE) e ao Programa de Pesquisa em Biodiversidade do Semiárido (PPBio Semiárido/CNPq/MCT). Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Felipe Wartchow, por nunca ter me deixado fraquejar, por ser meu amigo, por nunca se negar a me ajudar, por todos os conselhos, levarei o senhor para sempre em meu coração. Agradeço também a todos os membros do Laboratório de Biologia de Fungos, e em especial ao Prof. Dr. Iuri Goulart Baseia, por ter me recebido como orientanda no mestrado, por ter acreditado em mim e por fazer eu me sentir em casa em Natal. Entre os demais não posso esquecer da Dra. Bianca Denise, pelo apoio e acolhida em sua casa, pelos conselhos e ombro amigo sempre disponível, Marcelo Sulzbacher, meu amigo de coletas, obrigada por compartilhar

espécimes e conselhos de vida, ao Rhudson Henrique Santos F. Da Cruz, grande potência micológica, obrigada pela amizade, conselhos e por compartilhar um pouco da sua vida comigo. Gostaria de agradecer a todos que me acolheram em Toulouse, França, em especial a prof. Dra. Mélanie Roy por ter me recebido, por me acolher e por acreditar no trabalho, ao Jan Hanckel por ter compartilhado sua casa comigo por uns dias, por ter me ensinado tanto sobre molecular, meu muito obrigada. À Sophie Manzi por todos os “bom dia” que recebi, sempre com um sorriso amoroso, obrigada pela paciência ao me ensinar a extrair DNA, obrigada por me ajudar a encontrar um lugar para morar, obrigada por ser sempre tão carinhosa. Obrigada Laura, pela companhia no laboratório, pelas risadas sempre presentes, obrigada por me fazer sentir mais em casa. Não posso deixar de citar alguns membros importantes nessa jornada, da Universidade Federal da Paraíba a Dra. Maria do Céo, pelo ombro amigo, dicas especiais, amor e companheirismo, por ter dividido a maternidade comigo, por ter compartilhado esse momento especial junto comigo. Gostaria de mostrar minha gratidão aos membros da Banca examinadora de defesa por aceitarem o convite e a disponibilidade dos membros que aceitaram a participação como suplentes. Agradeço também aos membros da Banca examinadora de qualificação pelos importantes comentários no momento oportuno. À Rhayssa Raquel, Roberto Ribeiro, Naíla Bronzeado, André Bronzeado, Ercules Diniz, Suênia Diniz, Maria Lenice Diniz, Dani, Márcio, Dailanne, Juliano pela amizade, carinho, orações, companheirismo e amor, sempre serei grata por tê-los em minha vida. Ás minha segundas mães Lenide Duarte de Sá (in memorian), que me viu crescer, que sempre me colocou para cima, dona dos melhores conselhos e das melhores risadas, obrigada pelo amor e carinho que sempre tiveste por mim, gostaria muito que você estivesse aqui para compartilhar mais esse momento, mas sei que estás com DEUS e isso me conforta. Simone Coutinho companheira, amiga, amorosa, risonha, obrigada por ter cuidado de mim como a uma filha, obrigada pelas conversas por Skype, por seu amor e atenção comigo. Glória pelas risadas, conselhos, por acompanhar minha gestação até praticamente a hora de Maria Helena nascer, obrigada do fundo do meu coração e por fim, mas não menos importante, Tânia, que feliz reencontro, obrigada pela força, fé e amor para comigo e minha família, obrigada por ter nos amado e acolhido, amo-te demais.

Aos meus colegas de trabalho Shirley Paixão, Hebe, Jaqueline Santos, Jaqueline Albuquerque, Laudenice, Luciana, Bábara, Karina e Morgana e ao Marcos pelo apoio e amizade. Aos meus alunos queridos e amados, obrigada pelos grandes momentos. Aos demais que direta ou indiretamente me ajudaram e participaram desse novo passo, obrigada.

“Combati o bom combate, acabei a carreira, guardei a fé.” 2 Timóteo 4:7

RESUMO

A família Russulaceae Lotsy é composta por basidiomicetos ectomicorrízicos, com alguns representantes desta família apresentando também interesse econômico na indústria farmacológica e culinária. A maioria dos representantes dessa família possuem basidioma agaricoide, mas há representantes pleurotoides, secotioides e gasteroides que compartilham características microscópicas similares. A maioria das espécies desta família são descritas para regiões temperadas e Paleotrópicas, isso faz com quea diversidade para Neotropicos pareça menor quando comparada com as demais regiões, possivelmente devido a falta de esforço de coleta e/ou falta de especialistas para fazer a correta identificação das espécies depositadas em herbários. Os representantes agaricoides da família Russulaceae estão divididos em quatro gêneros , Lactifluus, Multifurca e Russula. No Brasil existem, atualmente, sete espécies descritas de Lactifluus, 21 espécies de Lactarius e 31 espécies de Russula. Neste trabalho, foram analizadas morfologicamente dez espécies depositadas nos herbários da Universidade Federal do Rio Grande do Norte e da Universidade Federal da Paraíba, sendo três espécies de Lactifluus (Lf. paraensis, Lf. piperogalactus e Lf. venosellus) e sete de Russula (R. candida, R. glutinosa, R. pices, R. pisciodora, Russula rondonensis e duas de R. puiggarii). Estas espécies foram coletadas nas regiões Norte, nos Estados do Pará e Roraima; e Nordeste do Brasil nos Estados da Paraíba e Pernambuco, e, com exceção de R. puiggarii, todas são novas espécies para a ciência. Também foram realizadas análises moleculares de 60 espécies dos gêneros Lactifluus e Russula, utilizando sequências da região ITS obtidas do banco de dados Genbank; para o primeiro gênero as espécies brasileiras Lf. caatingae, Lf. dunensis e Lf. paraensis, pertencendo ao subgênero Lactariopsis com Lf. paraensis como espécie nova para a ciência; Lf. piperogalactus pertencendo ao subgênero Gymnocarpi como espécie nova e Lf. venosellus pertencendo ao subgênero Pseudogymnocarpi seção Polysphaerophori também como nova espécie. Entre as espécies de Russula foi possível extrair ITS de R. glutinosa e demonstrar que esta pertence ao subgênero Heterophyllidia como uma espécie nova para a ciência. Desse modo, com análises morfológicas e filogenéticas, foi possível confirmar as espécies Lf. paraensis, Lf. piperogalactus e Lf. venosellus, R. candida, R. glutinosa, Russula rondonensis, R. pices, R. pisciodora como espécies novas para a ciência, bem como demonstrar que as regiões Norte e Nordeste do Brasil possuem uma grande representatividade de espécies deste grupo. Palavras-Chave: Basidiomycota; Russulales; Russula; Lactifluus

ABSTRACT

The Russulaceae Lotsy family is composed of ectomycorrhizal basidiomycetes, with some representatives of this family also showing economic interest in the pharmaceutical and culinary industry. Most representatives of this family have agaricoid basidioma, but there are pleurotoid, secotioid, and gasteroid representatives who share similar microscopic characteristics. Most species in this family are described for temperate and Paleotropic regions, which makes the diversity for Neotropics seem smaller when compared to other regions, possibly due to lack of collection effort and / or lack of experts to correctly identify the species. species deposited in herbariums. The agaricoid representatives of the Russulaceae family are divided into four genera Lactarius, Lactifluus, Multifurca and Russula. In Brazil there are currently seven described Lactifluus species, 21 Lactarius species and 31 Russula species. In this work, ten species deposited in herbariums of the Federal University of Rio Grande do Norte and the Federal University of Paraíba were analyzed morphologically, being three species of Lactifluus (Lf. paraensis, Lf. piperogalactus and Lf. venosellus) and seven Russula (R. candida, R. glutinosa, R. pices, R. pisciodora, Russula rondonensis and two of R. puiggarii). These species were collected in the Northern regions of the states of Pará and Roraima; and Northeast Brazil in the states of Paraíba and Pernambuco, and, except for R. puiggarii, all are new species for science. Molecular analyzes of 60 species of the genera Lactifluus and Russula were also performed using sequences from the ITS region obtained from the Genbank database; for the first genus the Brazilian species Lf. caatingae, Lf. dunensis and Lf. paraensis, belonging to the subgenus Lactariopsis with Lf. paraensis as a new species for science; Lf. piperogalactus belonging to subgenus Gymnocarpi as new species and Lf. venosellus belonging to subgenus Pseudogymnocarpi section Polysphaerophori also as new species. Among the Russula species it was possible to extract ITS from R. glutinosa and demonstrate that it belongs to the subgenus Heterophyllidia as a new species for science. Thus, with morphological and phylogenetic analyzes, it was possible to confirm the species Lf. paraensis, Lf. piperogalactus and Lf. venosellus, R. candida, R. glutinosa, Russula rondonensis, R. pices, R. pisciodora as new species for science, as well as demonstrate that the northern and northeastern regions of Brazil have a large representativeness of species of this group.

Key words: Basidiomycota; Russulales; Russula; Lactifluus

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Tipos de pileipelis de Lactifluus...... 37 Figura 2. Tipos de elementos terminais de Russula...... 38 Figura 3. Tipos de cistídios de Lactifluus...... 39 Figura 4. Lactifluus piperogalactus Sá & Wartchow ...... 48 Figura 5. Lactifluus paraensis Sá, Wartchow...... 51 Figura 6. Lactifluus venosellus Sá, Wartchow...... 54 Figura 7. Russula purpureopunctata Sá & Wartchow...... 56 Figura 8. Russula pices Sá & Wartchow…………………………………………………..59 Figura 9. Russula pisciodora Sá & Wartchow...... 62 Figura 10. Russula. Puiggarii Singer...... 64 Figura 11. Russula puiggarii Singer...... 66 Figura 12. Russula glutinosa Sá &Wartchow……….…………………………………….68 Figura 13. Russula candida Sá, Wartchow & Coimbra...... 71 Figura 14. Russula rondonensis Sá, Wartchow & Coimbra...... 75 Figura 15. Topologia da árvore filogenética de máxima verossimilhança de Lactifluus baseada em sequências de ITS...... 79 Figura 16. Topologia da árvore filogenética de máxima verossimilhança de Russula baseada em sequências de ITS...... 80

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Classificação atual do gênero Lactifluus...... 22 Tabela 2. Classificação baseada na morfologia do gênero Russula...... 23 Tabela 3. Classificação atual de Russula...... 29 Tabela 4. Classificação atual de Multifurca...... 31 Tabela 5. Lista de espécies de Russulaceae provenientes das coleções dos herbários da UFPB e UFRN...... 41 Tabela 6. Mix PCR usado para amplificação de ITS e LSU...... 42 Tabela 7. Ciclos térmicos usados nas reações de PCR...... 43 Tabela 8. Espécies, voucher da coleção, origem e número de GenBank de sequências nrITS utilizados nas análises moleculares...... 44

LISTA DE SÍMBOLOS

µm Micrômetro mm Milímetros Qm Média dos valores da razão comprimento/largura do esporo/ Valor Q médio de todos os basidiosporos medidos em um único basidioma L(W) Média da largura/comprimento de um único basidioma Q Largura : comprimento de todas as medidas dos basidiosporos medidos K Referente à carta de cores (Kelly, K.L., 1965) KW Referente à carta de cores (Kornerup & Wanscher, 1978) KOH Hidróxido de potássio OAC Online Auction Color

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ...... 15

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 15 2.1. Gêneros Lactarius e Lactifluus...... 20 2.2. Gênero Russula...... 23 2.3. Gênero Multifurca...... 29 3. OBJETIVOS...... 32 3.1. Objetivo geral...... 32 3.2. Objetivos específicos...... 32 4. METODOLOGIA...... 33 4.1. Características das áreas onde os materiais foram coletados...... 33 4.1.1. Reserva Ecológica Mata do Pau-Ferro (PB)...... 33 4.1.2. Reserva Biológica Guaribas (PB)...... 33 4.1.3. Refúgio Ecológico Charles Darwin (PE)...... 34 4.1.4. Floresta Nacional de Caxiuanâ (PA)...... 34 4.1.5. Floresta Nacional de Carajás (PA)...... 35 4.1.6. Parque Natural Municipal de Porto Velho (RO)...... 35 4.1.7. Reserva Particular do Patrimônio Natural Frei Caneca (PE)………………...... 35 4.2. Materiais analizados...... 36 4.3 Análises moleculares...... 41 4.3.1. Extração, ampliação e sequenciamento do DNA...... 41 4.3.2. Análises filogenéticas...... 43

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 47 5.1 Taxonomia...... 47 5.1.1 Lactifluus...... 47 5.1.2 Russula...... 56 5.2. Procedimentos em biologia molecular...... 76 5.2.1. Análise molecular das espécies de Lactifluus...... 77 5.2.2. Análise molecular da espécie de Russula...... 79 6. CONCLUSÃO...... 82 REEFERÊNCIAS...... 83

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INTRODUÇÃO

A família Russulaceae Lotsy é tradicionalmete caracterizada por apresentar basidiomicetos russuloides ectomicorrízicos, com algumas espécies podendo ser utilizados na culinária, e outras espécies apresentando interesse para a indústria farmacológica (ROMÁN et al., 2006; SMITH; READ, 2008; MOTOSHIMA et al., 2018). Esta família contém, em sua maioria, representantes de basidioma agaricoide, distribuídos nos gêneros Russula Pers., Lactarius Perso., Lactifluus (Pers.) Roussel e Multifurca Buyck & V. Hofst., mas com o avanço das análises moleculares, alguns táxons com basidiomas corticioides, secotioides, gasteroides e pleurotoides foram incluídos na família Russulaceae (BUYCK et al., 2008, 2010; STUBBE et al., 2010, 2012; WANG et al., 2018). A maioria das espécies descritas para a família Russulaceae é para regiões temperadas e Paleotrópicas, e a diversidade para Neotrópicos parece ser menor quando comparada com as demais regiões. Muito disso se deve a falta de esforço de coleta ou por falta de taxonomistas para analisar espécies que são depositadas em herbários. Contudo, esse quadro tem mudado e novos táxons têm sido descritos para a região Neotropical (MILLER et al., 2001, 2006; MILLER; BUYCK, 2002, BUYCK; OVREBO, 2002; WARTCHOW; CAVALCANTI, 2010; CHEYPE; CAMPO, 2012; SÁ et al., 2013 a,c; WARTCHOW et al., 2013). No Brasil, devido à falta de profissionais que pudessem realizar estudos taxonômicos desses materiais e, em alguns casos, pela dificuldade de acesso aos materiais que não se encontram em herbários brasileiros, pois eram coletados por pesquisadores estrangeiros e depositados em herbários estrangeiros (BACCARO et al., 2008). Sendo assim, não havia um estudo sistemático das espécies desse grupo nos biomas brasileiros, levando a falsa impressão de que ele não estaria bem representado no Brasil. No entanto, a partir de iniciativas que proporcionam o financiamento de coletas e formação de recursos humanos em taxonomia, a situação tem mudado e projetos como o PPBio (Programa de Pesquisa em Biodiversidade) Semiárido, que proporcionou a ampliação do conhecimento sobre os diversos grupos de fungos incluindo os da família Russulaceae (QUEIROZ et al., 2006). No Brasil, atualmente, são registradas três espécies de Lactifluus, 22 espécies de Lactarius e 22 espécies de Russula (BERKELEY, 1856; RICK, 1906, 1907, 1938; SINGER, 1953, 1955; SINGER; ARAUJO, 1979; SINGER et al., 1983; SINGER; AGUIAR, 1986;

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GIACHINI et al., 2000; WARTCHOW; CAVALCANTI, 2010; SÁ et al., 2013a, b, c; SULZBACHER et al., 2013; WARTCHOW et al., 2013; SÁ, 2014). Por região, pode-se observar que a região com maior quantidade de espécies descritas de Russulaceae é a Região Norte com 24, seguida da Região Sul com 21, o Nordeste com 18 espécies e a região com menor representatividade é o Sudeste com apenas 4 espécies (SÁ et al., 2013b; SÁ, 2014). No Nordeste, a maior parte das espécies descritas pertence ao Bioma Mata Atlântica; no entanto, o Bioma Caatinga demonstrou possuir uma riqueza considerável de espécies, com 13 espécies registradas (SÁ, 2014). Até recentemente, havia apenas uma espécie desse grupo descrita para o bioma, Lactarius rupestris Wartchow, demonstrando a importância de estudos taxônomicos para a região (LEAL et al., 2003; CAVALCANTI; TABARELLI, 2004; WARTCHOW; CAVALCANTI, 2010). Diante disto, este trabalho objetivou analisar morfologicamente e molecularmente as espécies da família Russulaceae coletadas em áreas do Norte e Nordeste do Brasil e depositados nos herbários UFRN-Fungos (UFRN) e JPB (UFPB), a fim de verificar a diversidade deste grupo para as regiões Norte e Nordeste.

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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

A família Russulaceae é composta por quatro gêneros, Russula, Lactarius, Lactifluus e Multifurca e é monofiléticamente bem suportada (BUYCK et al., 2008; STUBBE et al., 2010, 2012). A morfologia do basidioma dos quatro gêneros é, em sua maioria, agaricoide com estipe central, mas também possuem representantes pleurotoides, secotioides e gasteroides, além de gêneros hipógeos Arcangeliella Cavara, Cystangium Singer & A.H. Sm. e Macowanites Kalchbr. (BUYCK, 1993). Esta família é caracterizada pela presença de esporos do tipo balistosporo, que possuem uma zona diferenciada acima do apêndice hilar, denominada de região suprahilar, essa região pode ou não apresentar reação em reagente de Melzer (amiloide), apresentam também ornamentações com reação amiloide. O himenóforo geralmente é lamelado (nos agaricoides) e a trama da lamela heterômera (figura 1 e 2), que recebe esse nome por apresentar um conjunto de hifas e células globosas denominadas esferocistos, isto confere fragilidade ao basidioma e por isso chega a ser denominado, em algumas literaturas, como ‘basidioma russuloide’ (SINGER, 1986; BUYCK, 1993; MILLER et al., 2006; PEGLER; YOUNG, 1979). Os primeiros estudos com espécies da família Russulaceae, foram realizados por Persoon (1797), que propôs os gêneros Russula e Lactarius. Para Persson, Russula era caracterizada pela presença de um píleo carnoso, ainda que frágil, comumente depresso, possuindo, por vezes, uma “pele” na superfície que pode variar em cor e textura (seco, viscoso, liso, tomentoso ou esquamoso); estipe central, podendo apresentar anel, este geralmente efêmero; lamelas longitudinais e iguais, sendo capaz de apresentar lamélulas numerosas e intercaladas, livres ou subdecurrentes, finas ou grossas. Enquanto que, Lactarius por sua vez, era caracterizado por apresentar píleo carnoso e lamelas lactescentes (PERSOON, 1797). Buyck (1993), ao revisar as espécies da família, caracterizou o gênero Russula pela ausência de látex; píleo frequentemente de coloração vívida, lamelas raramente decurrentes e lamélulas raramente numerosas; estipe frequentemente mais pálido que o píleo; sistema lacticífero pouco desenvolvido ou ausente, podendo ou não ser ramificado, e limitado até algumas regiões do basidioma e ausente na trama da lamela. Esse mesmo autor caracterizou o gênero Lactarius pela presença de látex branco ou colorido; píleo raramente de cores vivas,

18 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB lamelas geralmente decurrentes, alternando com numerosas lamélulas de comprimentos variados, estipe de superfície semelhante a superfície do píleo, sistema lacticífero ramificado e bem desenvolvido que são presentes em todo o basidioma e culminando na superfície do himênio (BUYCK, 1993). Durante muito tempo se discutiu as melhores formas de classificar as espécies da família Russulaceae morfologicamente, visto que esta era limitada aos gêneros agaricoides, Russula e Lactarius, e as formas gasteroides em Hydnagineae Singer caracterizado pela presença de esporos estatimospóricos, apresentando relação com Bondarzewia Singer pela forma dos basidiosporos e pela presença de hifas lacticíferas (SINGER, 1986; BUYCK, 1993). Desse modo Verberken (1996) sugeriu que a quantidade de esferocistos, presentes na trama da lamela, seria uma boa característica para separar os gêneros Russula e Lactarius, pois o primeiro possui mais esferocistos que o segundo. Porém, Henkel et al. (2000) e Miller et al. (2006), ao estudarem espécies tropicais e subtropicais, relatam que era muito relativo o número de esferocistos dentro do mesmo gênero e sugeriram que a presença de pseudocistídios em Lactarius como um caráter mais confiável para diferenciar estes gêneros. Apesar das controvérsias sobre como melhor caracterizar morfologicamente as espécies dos gêneros Russula e Lactarius, os estudos continuaram considerando a presença das rosetas de esferocistos em Russula e a presença de pseudocistídios e exsudação de látex em Lactarius para a identificação das espécies do grupo. Miller et al. (2001) realizaram o primeiro estudo filogenético das espécies pertencentes à ordem Russulales e propuseram a inclusão dos gêneros gasteroides Macowanites Kalchbr., Cystangium Singer & A.H. Sm., Elasmomyces Cavara, Martellia Mattir., Gymnomyces Massee & Rodway, Arcangeliella e Zelleromyces Singer & A.H. Sm. devido a ornamentação dos basidiosporos, composição das hifas e estrutura cuticular. Miller e Buyck (2002) utilizaram caracteres morfológicos e moleculares buscando uma classificação mais completa e natural do gênero Russula e afirmaram que, embora existam muitos estudos sobre a classificação desse grupo, havia certa confusão na interpretação dos caracteres que diferenciam os gêneros da família Russulaceae devido ao peso que era dado aos caracteres macroscópicos propostos por Romagnesi (1967). Com o avanço dos estudos moleculares, a monofilia da família Russulaceae era corroborada, porém a relação interna na família, entre os gêneros Russula e Lactarius, era pouco suportada, muitos autores atribuíam isso a ausência de espécimes tropicais e

19 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB subtropicais nas análises, o que poderia estar gerando clados que não refletiam satisfatoriamente as relações internas entre os representantes desta família (LARSSON; LARSSON, 2003; LUTZONIET et al., 2004; BINDER et al., 2005; MILLER et al., 2006). Buyck et al. (2008) realizaram um estudo molecular e morfológico com táxons da América do Norte, Europa, África e parte da Ásia tentando resolver a problemática de como basear a diferenciação dos gêneros pelo sistema lacticífero ramificado em Lactarius e não ramificado em Russula; exsudação de látex e coloração opaca do píleo e do estipe em Lactarius contrastando com cores vivas do píleo, cores pálidas das lamelas e estipe em Russula. Eles observaram que essas características morfológicas não eram boas para resolução do problema porque poderiam ser evidenciadas nos dois gêneros: Russula podendo apresentar cores opacas e estipes coloridos, à ausência da exsudação de látex em algumas espécies de Lactarius, embora estes apresentem grande quantidade de hifas lacticíferas, como observado em Russula zonaria Buyck & Desjardin (BUYCK; DESJARDIN, 2003) e Lactarius ruvubuensis Verbeken (VERBEKEN, 1996). Devido a esta dificuldade em separar morfologicamente os gêneros Russula e Lactarius pela ramificação do sistema lacticifero, exsudação de látex, cor do píleo e estipe (BUYCK; DESJARDIN, 2003; VERBEKEN, 1996); Buyck et al. (2008) propuseram uma nova classificação, baseada em análises moleculares, a nível de gênero, contendo táxons da América do Norte, Europa, África e parte da Ásia, agora com a descrição de Multifurca, para acomodar as espécies Multifurca ochricompacta Bills & O.K. Mill., M. furcatus Coker, M. zonaria Buyck & Desjardin e M. aurantiophylla Buyck & Ducousso em um mesmo clado com um bom suporte molecular (BUYCK et al., 2008). Com essa separação o gênero Lactarius foi separado em dois clados distintos, de modo que houve uma proposta de tornar a seção Lactifluus um gênero distinto, isso consistia na mudança do tipo do gênero Lactarius de L. piperatus Singer & A.H. Sm. para L. torminosus (Schaeff.) Gray por considerarem que este representava melhor o gênero, considerando a descrição de Persson (1797); além de possuir a característica de exsudar látex (BUYCK et al., 2008). Essa mudança foi aceita por evitar um grande número de novas combinações e sinonimizações, as quais seriam necessárias para acomodar as espécies em cada gênero, e ainda não afetou os resultados da filogenia proposta anteriormente para o gênero Lactarius (BUYCK et al., 2010).

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Após estas modificações, houve uma série de publicações realizadas por Verbeken et al. (2011, 2012) e Stubbe et al. (2012), para acomodar as novas combinações do gênero Lactarius para Lactifluus (Pers.) Roussel. Verbeken et al. (2011) fizeram a combinação de 37 espécies de Lactarius dos subgêneros Edules, Lactariopsis e Russulopsis e as seções L. chamaeleontini e L. albati para o gênero Lactifluus. Stubbe et al. (2012) combinaram Lactarius subgênero Gerardii, com 17 espécies, para Lactifluus. Finalmente, Verbeken et al. (2012) combinaram mais 58 espécies de Lactarius da seção Piperati (novo subgênero de Lactifluus) e Lactarius subgênero Lactifluus. Sendo assim, foram realizadas 112 novas combinações para o gênero Lactifluus.

2.1 Gêneros Lactarius e Lactifluus Depois de todas as mudanças realizadas, o gênero Lactarius sensu stricto, passou a ter uma distribuição para áreas tipicamente temperadas, contendo espécies que exsudam látex e um píleo uniforme ou zonado, seco a víscido ou glutinoso (LEBEL et al., 2012). Enquanto o gênero Lactifluus é predominantemente tropical e possui 150 espécies descritas, dividido nos subgêneros Lactariopsis (Henn.) Verbeken., Lactifluus, Gymnocarpi R. Heim ex Verbeken e Pseudogymnocarpi Verbeken e suas respectivas seções (Tabela 1). De Crop et al. (2014) e Mabba et al. (2015) demonstraram que pode haver espécies crípticas ou semi-crípticas dentro de Lactifluus, que é um gênero com uma variação morfológica considerável, podendo apresentar píleo de poucos milímetros a mais de 20 centímetros, ser agaricoides ou pleurotoides, mais de dez tipos diferentes de pileipelis, podendo ou não exsudar látex e presença de cistídios e/ou pseudocistídios (DE CROP et al., 2017). Ao analisar morfológica e molecularmente 189 espécies de Lactifluus com representantes de todos os subgêneros e de todos os continentes, De Crop et al. (2017) levaram em consideração as espécies neotropicais e foi visto que as diferenças entre os gêneros Lactarius e Lactifluus, são difíceis de distinguir e não há sinapomorfia delimitada entre os gêneros, mas utiliza-se a ausência de píleo zonado e viscoso em várias espécies pleurotoides como características do gênero Lactifluus (BUYCK et al., 2008; VERBEKEN; NUYTINCK, 2013). A proposta feita por De Crop et al. (2017), ao revisarem as espécies de Lactifluus, tanto molecular quanto morfologicamente, objetivou reorganizar os subgêneros para que refletissem melhor a taxonomia do grupo, como descrito abaixo:

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Lf. subg. Gymnocarpi (R. Heim ex Verbeken) De Crop Espécie tipo: Lactifluus gymnocarpus (R. Heim ex Singer) Verbeken Este subgênero pode ser reconhecido pela combinação dos caracteres: pileipelis lampropalisada e ausência de pseudolamprocistídios, com látex de coloração amarronzada e/ou contexto ficando amarronzado quando exposto ao ar. Seus representantes são das seções Gymnocarpi (R. Heim ex Verbeken) De Crop, Luteoli (Pacioni & Lalli) Verbeken, Phlebonemi (R. Heim ex Verbeken) Verbeken e Tomentosi (McNabb) Verbeken (DE CROP el al., 2017).

Lf. subg. Lactariopsis (Henn.) Verbeken Espécie tipo: Lactifluus zenkeri (Henn.) Verbeken Possui como representantes as espécies da seção Lactariopsis. Este subgênero pode ser reconhecido pela combinação dos elementos de parede espessa da pileipelis bastante emergentes e largos. Este subgênero possui representantes das seções Albati (Bataille) Verbeken (espécies com basidioma grande, de coloração branca e com textura de veludo), Edules (Verbeken) Verbeken (espécies com basidiomas de coloração amarelada à laranja acinzentados e pileipelis tipo tricoderme à tricopalisada), Lactariopsis Verbeken (espécies com véu) e Russulopsidei (Verbeken) Verbeken (espécies sem véu, com basidiomas de coloração marrom avermelhado, pileipelis tipo cutis e presença de dermatocistídio), com representantes do hemisfério Norte, africanos, asiáticos e da América do Sul (DE CROP et al., 2017).

Lf. subg. Lactifluus Espécie tipo: Lactifluus volemus (Fr.: Fr.) Kuntze Esse subgênero é caracterizado pela pileipelis de dois tipos, palisada à lampropalisada abaixo de epitélio hifálico. Em algumas seções, os pleurocistídios estão ausentes, enquanto que em outras pleuromacrocistídios e pleurolamprocistídios são encontrados. Tem representantes nas seções Allardii (Hesler & A.H. Sm.) De Crop, Ambicystidiati X.H. Wang, Gerardii (A.H. Sm. & Hesler) Stubbe, Lactifluus, Piperati (Fr.) Verbeken e Tenuicystidiati X.H. Wang & Verbeken, descritos para Ásia, Europa, América do Norte e Oceania (DE CROP et al., 2017).

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Lf.subg. Pseudogymnocarpi (Verbeken) De Crop Espécie tipo: Lactifluus gymnocarpoides (Verbeken) Verbeken Este subgênero possui somente espécies agaricoides, caracterizados pelo píleo de coloração amarela, laranja à marrom avermelhado e pileipelis do tipo tricoderme à lampro/trico palisada, dentre elas algumas espécies não possuem pleurocistídios. As que possuem apresentam pleurolamporcistídios (de parede espessa) ou pleuromacrocistídios (com conteúdo amorfo). Algumas espécies apresentam reações coloridas do látex, mas em sua maioria não há reação (DE CROP et al., 2017). Seus representantes pertencem as seções Aurantiifolii (Verbeken) Verbeken, Polysphaerophori (Singer) Verbeken, Pseudogymnocarpi (Verbeken) Verbeken, Rubroviolascentini (Singer) Verbeken e Xerampelini De Crop, com representantes das Américas do Norte, Central e do Sul, europeus, asiáticos e africanos.

Tabela 1. Classificação atual do gênero Lactifluus (DE CROP et al., 2017). Subgênero Seções Gymnocarpi (R. Heim ex Lactifluus sect. Luteoli (Pacioni & Lalli) Verbeken Verbeken) De Crop Lactifluus sect. Gymnocarpi (R. Heim ex Verbeken) De Crop Lactifluus sect. Phlebonemi (R. Heim ex Verbeken) Verbeken Lactifluus sect. Tomentosi (McNabb) Verbeken Lactariopsis (Henn.) Lactifluus sect. Albati (Bataille) Verbeken Verbeken Lactifluus sect. Edules (Verbeken) Verbeken Lactifluus sect. LactariopsisVerbeken Lactifluus sect. Russulopsidei (Verbeken) Verbeken Pseudogymnocarpi Lactifluus sect. Aurantiifolii (Verbeken) Verbeken (Verbeken) De Crop Lactifluus sect. Polysphaerophori (Singer) Verbeken Lactifluus sect. Pseudogymnocarpi (Verbeken) Verbeken Lactifluus sect. Rubroviolascentini (Singer) Verbeken Lactifluus sect. Xerampelini De Crop Lactifluus Lactifluus sect. Lactifluus Lactifluus sect. Gerardii (A.H. Sm. &Hesler) Stubbe Lactifluus sect. Piperati (Fr.) Verbeken Lactifluus sect. Allardii (Hesler& A.H. Sm.) De Crop Lactifluus sect. Tenuicystidiati X.H. Wang &Verbeken Lactifluus sect. Ambicystidiati X.H. Wang

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2.2 Gênero Russula O gênero Russula apresenta basidiomas com grande diversidade de características macroscópicas, microscópicas e químicas, que resulta numa classificação em nível subgenérico muito complexa e de difícil estruturação (ROMAGNESI, 1967; SINGER, 1986). Os caracteres macroscópicos tais como: coloração da esporada, sabor e odor, textura do contexto e se este mudava de coloração com o tempo; coloração do píleo e a configuração do himenóforo eram utilizados como caracteres importantíssimos para a classificações mais antigas do gênero (Tabela 2) (SINGER, 1953). Posteriormente isso foi alterado e passou-se a considerar os caracteres microscópicos e reações microquímicas (ex: reações de Melzer na ornamentação dos esporos, reação da pileipelis ao azul Cresil evidenciando ou não estruturas metacromáticas, etc.), culminando na subdivisão do gênero em nove subgêneros, cada um, por sua vez, subdividido em várias seções e depois em subseções (BUYCK et al., 2018).

Tabela 2. Classificação baseada na morfologia do gênero Russula (BUYCK 1993, 1994, 1997). Seções Subseção Compactae Fr. Nigroviolaceinae Buyck Nigricantinae Batille Igentinae Buyck Albospissiae Buyck Fistulosae (R. Heim ex Fistulosinae R. Heim ex Buyck Singer) Buyck Tomentosinae Buyck Murinaceinae R. Heim ex Buyck Meleagrinae Buyck Brunneodermatinae Buyck Pallidorimosinae Buyck Pachycystidinae (Singer) Buyck Concolorinae Buyck Testaceoaurantiacinae Buyck Brunneofloccosinae Buyck Constantes Singer Sardoninae Singer Xerampelinae Singer Crassotunicatae (Singer) Roseovelatinae Buyck Singer Mamillatinae Buyck Aureotactinae R. Heim ex Buyck

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Amoeninae Singer ex Buyck Plorantes Bat. Archeinae (R. Heim ex Romagn.) Buyck Heterophyllae Fr. Cyanoxanthinae Singer Ilicinae (Romagn.) Buyck Guayarenses Singer Paradermatinae Buyck Inflatinae Buyck Virescentinae Singer Echinospermatinae Buyck Mimeticinae Buyck Parvoroseinae Buyck Heterophyllinae (Maire) Romangnesi Pseudoepitheliosinae Buyck Polychromae Maire Aurantiomarginatinae Buyck Luteomaculatinae Buyck Intiegrinae Maire sensu Romangnesi (1967) non Singer

Recentemente, Buyck et al. (2018), ao analisarem a filogenia do gênero Russula reconheceram a dificuldade de se estabelecer uma delimitação para os subgêneros de Russula, contendo um ou mais caracteres. Até mesmo as combinações das características dos basidiomas não poderiam ser utilizadas para definir subgêneros em Russula devido à ambiguidade dos caracteres, não sendo possível a construção de chave de identificação confiável para os subgêneros. Mas, de acordo com o estudo por eles realizado, houve uma concordância em reformular a classificação dos subgêneros e cortar os possíveis grupos artificiais da sistemática, utilizando a filogenia e morfologia como base para isso (BUYCK et al., 2018). Tal classificação vai de desacordo com a classificação previamente aceita baseada em caracteres morfológicos, como exemplo disso temos o subgênero Campactae (Fr.) Bon, emend. Buyck & V. Hofst., o qual seus representantes eram previamente reconhecidos pela presença de lamelas pequenas e intercaladas a lamelas normais e agora passam a estar distribuídos entre os sete subgêneros. Outro exemplo oposto a esse, são os cinco dos nove subgêneros reconhecidos do trabalho de Romagnesi (subgêneros Coccinula Romagn.,

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Insiduosula Romagn., Polychromidia Romagn., Tenellula Romagn. e incrustatula Romagn.) que depois das análises foi visto que constituem apenas um único clado, que por fim foi considerado um novo subgênero para Russula (BUYCK et al., 2018). Deste modo, Buyck et al. (2018) propuseram sete subgêneros baseados na experiência em campo e nos resultados obtidos nas análises filogenéticas e as discutiram de forma sucinta os caracteres morfológicos de cada subgênero (Tabela 3). Os subgêneros são:

Subg. Archaea Buyck & V. Hofst. Espécie tipo: R. archaea R. Heim Representantes com basidiomas de tamanho variados, desde muito pequenos à grandes, de contexto compacto à muito fino. Píleo de coloração opaca, amarelada, amarronzada à cinza sem anel e com lamelas irregulares e normais. Contexto de coloração amarelada, amarronzada, cinzenta ou avermelhada e esporada branca. Sem representantes secotioides ou gasteroides conhecidos (BUYCK et al. 2018). Esporos muito pequenos, com a região suprahilar inamiloide. Hifas primordiais ausentes. Gleocistídios presentes em todas as partes do basidioma, mucronados a obtusos. Hifas da superfície do píleo variando entre inflados ou não inflados. Este subgênero abarcou as espécies que antes eram das seções Archaeinae R. Heim ex Buyck & Sarnari e Gossypinae Buyck (BUYCK et al., 2018).

Subg. Compactae (Fr.) Bon, emend. Buyck & V. Hofst. Espécie tipo: R. nigricans Fr. Representantes com basidiomas de tamanhos variados, desde muito pequenos à grandes, com contexto fino. Píleo de coloração fosca, branca, marrom, cinza a preta, sem anel e lamelas regularmente desiguais. Contexto de coloração avermelhada, acinzentada, escurecido, raramente amarronzada, com ou sem odores desagradáveis, esporada branca, sem representantes secotioides ou gasteroides conhecidos (BUYCK et al., 2018). Esporos com região suprahilar inamiloide. Gleocistídios presentes em todos os tecidos ou ausentes, por vezes restrito apenas ao himênio e levemente captado com pontos centrais em outras partes. Esses pontos podem estar presentes como dois pontos excêntricos Hifas da superfície do píleo podendo ser ou não infladas. Este grupo abarca as espécies das

26 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB seções Nigricantinae Bataille, Polyphyllae Buyck & V. Hofst. e Fistulosae (R. Heim ex Sing.) Buyck (BUYCK et al., 2018; DAS et al. 2017).

Subg. Crassotunicata Buyck & V. Hofst Espécie tipo: R. crassotunicata Singer Representantes com basidioma de tamanho médio e pequenos, robustos à finos, com contexto levemente espesso. Píleo de coloração branca, creme a amarelada, por vezes, ficando rapidamente amarronzada com o tempo ou quando manuseado, muito gelatinoso à quase seco, sem anel, lamelas irregulares e desiguais e com lamélulas abundantes, mas na maioria das vezes em menor quantidade que as lamelas. Contexto de coloração amarelada à fortemente amarronzada, esporada branca, sem representantes secotioides e gasteroides conhecidos (BUYCK et al., 2018). Esporos pequenos à grandes, nunca formando um retículo completo e com a região suprahilar inamiloide. Ausência de hifas primordiais, gleocistídios abundantes em todas as partes do basidioma em sua maioria mucronados com um único ponto na porção terminal. Hifas da superfície do píleo podendo ser ou não infladas (BUYCK et al. 2018). Esta seção abarca as seções Crassotunicatae Buyck & V. Hofst., Farinipedes Singer e Crassotunicatinae Singer. Porém, os autores discutem que este subgênero possui pouca representatividade na filogenia, contendo apenas um único representante. Porém, baseado no banco de dados moleculares utilizados para a filogenia no trabalho de Buyck et al. (2018) há indicação que as espécies das seções Ingratae subseção Farinipedes (R. farinipese R. pallescens) e a espécie tipo da seção Crassotunicatae Buyck & V. Hofst., R. crassotunicata Singer, formam um clado com um suporte alto o que embasaria a proposta para este subgênero (BUYCK et al., 2018).

Subg. Heterophyllidia Romagn., emend. Buyck & V. Hofst. Espécie tipo: R. grisea Pers. ex Fr. Representantes com basidioma de tamanho médio e grandes, raramente pequenos que podem ter contexto desde grosso até extremamente fino, possuindo coloração de quase todas as cores possíveis. Estipe podendo possuir anel e frequentemente com cavidades no contexto. Apresentam lamelas iguais e lamélulas, quando presentes, não são frequentes. Contexto não

27 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB apresenta mudança de coloração ou podendo ficar de coloração amarelada marrom enferrujado, frequentemente apresenta um odor distinto (BUYCK et al., 2018). Esporada de coloração branca ou de tons de creme. Região suprahilar inamiloide ou parcialmente amiloide. Ausência de hifas primordiais. Gleocistídios frequentemente abundantes, contudo, são restritos a certas partes do basidioma ou não, excepcionalmente ausente. As hifas da superfície do píleo podendo ser ou não infladas. Representantes secotioides e gasteroides limitado a poucos grupos de espécies. Esse subgênero compreende as subseções: Subvelatae Singer, Ingratae Quel., Aureotactae Buyck & V. Hofst., Heterophyllae Fr., Oleiferinae Buyck, Cyanoxanthinae Singer e Ilicinae Buyck (BUYCK et al., 2018).

Subg. Malodora Buyck & V. Hofst., Espécie tipo: R. compacta Frost Representantes com basidioma de tamanho médio e pequenos, frequentemente firmes e compactos e nunca muito finos. Píleo com cores opacas como: amarelo amarronzado, cinza a quase preto ou esbranquiçado, sem anel e lamelas regularmente desiguais a bifurcadas. Contexto acinzentado ou amarronzado com desenvolvimento rápido, com odor e sabor desagradáveis, esporada branca, sem representantes secotioides e gasteroides conhecidos (BUYCK et al., 2018). Esporos com região suprahilar inamiloide. Gleocistídios numerosos na superfície da lamela, mucronado e raro à ausente nas outras partes do basidioma. As hifas da superfície do píleo tipicamente infladas com células frequentemente volumosas e bastante septadas. Para este subgênero foi sugerido pelo menos três seções Pseudocompactae Buyck & V. Hofst., Edules Buyck & V. Hofst. e outro subgênero contendo espécies ainda não descritas como R. cappilaris sp. ined. que é considerado como um grupo irmão que possui lamelas desiguais, porém, sem bifurcação (BUYCK et al., 2018).

Subg. Brevipes Buyck & V. Hofst. Espécie tipo: R. brevipes Peck Representantes com basidioma de tamanho médio à muito grandes, com contexto carnoso, raramente pequeno e com contexto fino. Píleo de coloração branca, frequentemente com manchas marrom-amareladas a marrom-avermelhadas e anel ausente. Lamela

28 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB regularmente desigual. Contexto de coloração amarelado quase marrom ferrugem e com odor distinto (BUYCK et al., 2018). Esporada de coloração branca à amarelada, com a região suprahilar inamiloide ou amiloide. Hifas primordiais ausentes. Gleocistídios mucronados à obtusos, presentes em todas as partes do basidioma. Hifas da superfície do píleo podendo ser ou não infladas. Representantes secotioides e gasteroides conhecidos apenas para as espécies da subseção Lactarioideae Maire. Nesta seção, há problema quanto a representatividade de espécies tropicais, sendo sugerido as seções Lactarioides (Bataille) Konrad & Joss., Metachromaticae Singer e subseções Pallidosporinae Bon e Pallidorimosinae Buyck (BUYCK et al., 2018).

Subg. Russula, emend. Buyck & V. Hofst. Espécie tipo: R. emetica (Schaeff.: Fr.) Pers. Representantes com basidioma de tamanho pequeno à grande, que apresentam contexto espesso à muito fino com os mais variados tipos de coloração. Estipe raramente anulado, poucas vezes desenvolvendo cavidades internas, lamelas iguais e raramente apresentando lamélulas. Contexto sem mudança na coloração, podendo apresentar coloração amarelada, amarronzada, avermelhada, acinzentada ou escurecida. Podendo apresentar um odor distinto, sendo este agradável ou não. Representantes secotioides e gasteroides limitados a poucas espécies (BUYCK et al., 2018). Esporos com a região suprahilar amiloide, contendo ou não hifas primordiais. Gleocistídios raros à abundantes, por vezes restrito a certas partes do basidioma, quase nunca se encontram ausentes. As hifas terminais da superfície do píleo são geralmente estreitas, raramente e irregularmente infladas. Para este subgênero são apresentados dois clados como sendo um único e grande subgênero, este abarca as seções: Sardoninae Singer, Felleinae (Mlz & Zv.) Sarnari, Echinospermatinae Buyck, Ochroleucinae Romagn., Flavisiccantes Buyck & V. Hofst (BUYCK et al., 2018).

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Tabela 3. Classificação atual do gênero Russula (DAS et al., 2017; BUYCK et al., 2018) Seções Subseção Archaea Buyck & V. Hofst. Gossypinae Buyck Archaeinae R. Heim ex Buyck & Sarnari Compactae (Fr.) Bon, Nigricantinae Bataille emend. Buyck & V. Hofst. Polyphyllae Buyck & V. Hofst. Fistulosae (Heimex Singer) Buyck Crassotunicata Buyck & V. Crassotunicatae Singer Hofst. Farinipedes Singer Crassotunicatinae Singer Heterophyllidia Romagnesi Subvelatae Singer Ingratae Quel. Aureotactae Buyck & V. Hofst. Heterophyllae Fr. Oleiferinae Buyck Cyanoxanthinae Singer Ilicinae Buyck Malodora Buyck & V. Pseudocompactae Buyck & V. Hofst. Hofst. Edules Buyck & V. Hofst. R. cappilaris sp. ined. (possibilidade de uma nova seção) Brevipes Buyck & V. Hofst. Lactarioides (Bataille) Konrad & Joss. R. delica (proposição para seção, mas falta representatividade de taxa tropicais) Metachromaticae Sing. Pallidosporinae Bon (Como subseção) Pallidorimosinae Buyck (Como subseção) Russula emend. Buyck & Sardoninae Singer V. Hofst. Felleinae (Mlz & Zv.) Sarnari Echinospermatinae Buyck Ochroleucinae Romagn. Flavisiccantes Buyck & V. Hofst.

2.3 Gênero Multifurca O gênero Multifurca não possui grande quantidade de espécies descritas, apenas oito (tabela 4) apenas para áreas tropicais ou subtropicais, com exeção de uma espécie, Multifurca

30 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB stenophylla (Berk.) T. Lebel, CW. Dunk, & TW. May descrita para região temperada (BUYCK et al., 2008; WANG at al., 2018). As espécies deste gênero podem ou não apresentar exsudação de látex (um dos motivos para que fosse feito a proposta deste como sendo um novo gênero), píleo amarelo claro a bege, concentricamente zonado, subtomentoso, lamelas bifurcadas e basidiosporos pequenos (BUYCK et al., 2008; WANG et al., 2018). A espécie tipo desse gênero é M. ochricompacta (Bills & O.K. Mill.) Buyck & V. Hofst. Multifurca é importante para a filogenia da família Russulaceae, pois possui caracteres que são remanescentes da diversificação do gênero Gloeocystidiellum Donk e Boidinia Stalpers & Hjortstam (BUYCK et al., 2008). Wang et al. (2018), acreditam que Multifurca é uma linhagem recente de Russulaceae e isso seria comprovado pela falta de espécies nas áreas de distribuição. Wang et al. (2018), ao analisarem o gênero Multifurca filogeneticamente, demonstraram que sua sinapormofia é uma combinação de três características como citado em Buyck et al. (2008) que são: 1- o contexto zonado muito mais do que é visto na superfície do píleo; 2- lamelas bifurcadas e com esporada laranja; 3- basidiosporos muito pequenos com a região suprahilar inamiloide (Tabela 4). Wang et al. (2018) também propõem separação do gênero em dois clados, separando basidiomas lactarioides de russuloides, com alto suporte. Sendo assim foram criados dois subgêneros:

Subg. Multifurca Espécie tipo: Multifurca ochricompacta (Bills & O.K. Miller) Buyck & V. Hofst Os representantes desse subgênero não exsudam látex quando manuseados, possuem mais similaridade com o gênero Lactarius do que com Russula. O píleo zonado e estipe escrobiculado, que são caracteres típicos de Lactarius e a trama da lamela composta principalmente por hifas em vez de esferocistos são características de Russula e Lactifluus. Multifurca zonaria (Buyck & Desjardin) Buyck & V. Hofst. possui pseudocistídios e M. aurantiophyllis (Buyck & Ducousso) Buyck & V. Hofst é a única espécie deste gênero que possui pileocistídio bem diferenciado, similar as espécies de Russula (WANG et al., 2018). Com exceção de M. zonaria, os macrocistídios deste subgênero podem se apresentar de duas formas, a primeira seria o cistídio volumoso, que está profundamente imerso na trama da lamela onde estas podem, às vezes, inflar notavelmente e emergir na superfície. O segundo tipo seria o mais comum, mucronado, com gleocistídios himeniais que são típicos de Russula,

31 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB este segundo tipo pode ser, por vezes, extremamente raro e facilmente esquecido como em M. ochricompacta e M. roxburghiae (WANG et al., 2018). Este subgênero inclui as espécies M. ochricompacta, M. australis Halling, T. Lebel & Buyck, M. roxburghiae Buyck & V. Hofst., M. zonaria.

Subg. Furcata Buyck & X. H. Wang Espécie tipo: M. furcata (Coker) Buyck & V. Hofst. Este subgênero é caracterizado pela exsudação de látex quando injuriado, basidiomas de coloração amarelada, ausência de gleocistídios, presença de pseudocistídios no himênio, esporos pouco reticulados e de ornamentações pequenas. Todas as espécies deste subgênero possuem bastante hifas lacticíferas que terminam como pseudocistídio na borda da lamela e pileipelis do tipo ixocutis (LABEL et al., 2013). Com exceção de M. stenophylla, que possui esporos grandes, as demais espécies deste subgênero são mais ou menos crípticas (WANG et al., 2018). Este subgênero abarca as espécies M. furcata, M. mesoamericana Buyck & Halling, M. pseudofurcata X.H. Wang, M. stenophylla (Berk.) T. Lebel, C.W. Dunk & T.W. May (WANG et al., 2018).

Tabela 4. Classificação atual de Multifurca (WANG et al. 2018). Subgênero Espécies Subg. Multifurca Buyck M. ochricompacta (Bills& O.K. Miller) Buyck & V. Hofst. & V. Hofst. M. australis Halling, T. Lebel & Buyck M. roxburghiae Buyck & V. Hofst. M. zonaria (Buyck & Desjardin) Buyck & V. Hofst. Subg. Furcata Buyck & M. furcata(Coker) Buyck & V. Hofst. X. H. Wang M. mesoamericana Buyck & Halling M. pseudofurcata X.H. Wang M. stenophylla (Berk.) T. Lebel, C.W. Dunk & T.W. May

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3. OBJETIVOS 3.1. Geral Realizar estudos morfológicos, taxonômicos e moleculares de espécies da família Russulaceae das regiões Norte e Nordeste Brasileiras. 3.2. Específicos • Ilustrar, descrever e identificar os espécimes brasileiros do Norte e Nordeste do Brasil depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB; • Realizar análises morfológicas e moleculares de caráter taxonômico; • Classificar taxonomicamente as espécies, utilizando análises moleculares, quando possível; • Identicar a ocorrência de novos registros ou de novas espécies para a ciência.

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4. METODOLOGIA 4.1. Caracterização das áreas onde os materiais foram coletados 4.1.1. Reserva Ecológica Mata do Pau-Ferro (PB) A reserva está localizada no município de Areia, agreste do Estado da Paraíba, a 5 km da sede do município, com 600 hectares, numa altitude entre 400 e 600 m (BARBOSA et al., 2004). Devido à umidade relativa de 85 % e à precipitação que atinge cerca de 1400 mm anuais, este tipo de mata pode ser considerada uma “ilha” no meio do semiárido, com vegetação semelhante a Mata Atlântica. Nesta área são encontrados membros das famílias Fabaceae, Rubiaceae, Malvaceae, Solanaceae, Asteraceae, Convolvulaceae, entre outras (BARBOSA et al., 2004).

4.1.2 Reserva Biológica Guaribas (PB) A reserva está localizada no litoral norte do Estado da Paraíba, nos municípios de Mamanguape e Rio Tinto, é constituída por três áreas disjuntas SEMA I, SEMA II e SEMA III que juntas perfazem 4.321,6 ha (Decreto de Criação N° 98.884 de 25 de Janeiro de 1990). A altitude máxima registrada é de 204 metros, as temperaturas médias anuais na área da REBIO variam entre 24º C e 26º C e quanto às temperaturas máximas, os meses de dezembro e fevereiro possuem as maiores médias, entre 28º C e 30º C. A máxima absoluta anual é de 36º C e a área da Unidade está localizada entre as isoietas de 1.750 e 2.000 milímetros anuais, com as chuvas iniciando em fevereiro, atingindo níveis máximos em abril, maio e junho e se prolongando até o mês de julho (MMA, 1994; MMA/IBAMA, 2003). A Reserva Biológica (REBIO) Guaribas está assentada sobre sedimento do grupo Barreiras sobre os quais encontram-se dois tipos de vegetação - a savana arbórea aberta, com ligações florísticas com o cerrado, também conhecida como “tabuleiro”, que ocorre em bolsões de solo arenoso; e a floresta estacional semidecidual de terras baixas que mostram fortes ligações com a formação fitogeográfica da Caatinga, que possui vegetação predominante no semi-árido nordestino, localizada no interior continental, sem atingir a costa litorânea (MMA, 1994; MMA/IBAMA, 2003). Essa área possui uma grande riqueza de plantas vasculares (629 espécies), as mais representativas são pertencentes às famílias Fabaceae, Poaceae, Cyperaceae, Rubiaceae, Asteraceae, Malvaceae, Melastomataceae e Myrtaceae (BARBOSA et al., 2011).

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4.1.3. Refúgio Ecológico Charles Darwin (PE) O Refúgio Ecológico Charles Darwin (34º27’25’’W; 7º48’37”S) no município de Igarassu, litoral norte de Pernambuco, possui área de 60 ha com mata úmida, remanescente da primitiva Floresta Atlântica Costeira. A temperatura média anual é de 27º C, com umidade relativa do ar em torno de 80 % (ANDRADE-LIMA, 1960; 1961). Alves-Araújo et al. (2008) relatam que as áreas de Mata Atlântica pernambucana possuem cerca de 650 espécies de angiospermas, com ocorrências de espécies das famílias Fabaceae, Euphorbiaceae, Nyctaginaceae e Polygonaceae conhecidas por formas associações ectomicorrízicas.

4.1.4. Floresta Nacional de Caxiuanã (PA) A Floresta Nacional (FLONA) de Caxiuanã ocupa uma área de aproximadamente 320.000 hectares entre municípios de Portel e Melgaço, no Pará (MONTAG et al., 2008). O relevo da Flona é relativamente uniforme e formado apenas por duas grandes unidades: as “terras firmes” mais altas, cobertas pela floresta densa, que são baixos planaltos ou tabuleiros e as “terras baixas”, alagadas e alagáveis, que formam as planícies fluviais e fluvio-lacustres, com várzeas e igapós. O clima e as condições meteorológicas da região da Floresta Nacional de Caxiuanã são fortemente condicionados à localização geográfica em ação conjunta com os grandes sistemas atmosféricos que controlam a distribuição pluviométrica, evaporação, temperatura do ar, umidade do ar e regime de ventos (COSTA et al. 2010). O clima da FLONA de Caxiuanã, pela classificação de Köppen é do tipo tropical quente e úmido e subtipo climático "Am" com uma curta estação seca. A temperatura média do ar oscila em torno de 26,7 ºC, com mínimos de 22 ºC e máximos 32 ºC (Ferreira da Costa et al., 2003). O número de horas de brilho de luz solar alcança mais de 2.100 horas ano-1, umidade relativa do ar média anual situa-se em torno de 80%. A direção do vento predominante é de nordeste (MORAES et al., 1997). A cobertura vegetal em Caxiuanã apresenta ecossistemas típicos da floresta amazônica, possuindo áreas de mata de terra firme, mata de inundação (várzea e igapó), trechos de vegetação secundária (capoeira) de diversas idades e trechos de vegetação savanóide (campinas amazônicas) (LISBOA, 2002).

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4.1.5. Floresta Nacional de Carajás (PA) A Floresta Nacional de Carajás abrange uma área com cerca de 1.207.000 hectares, as elevações afloram descontinuamente na direção leste – oeste, a uma altitude média de 700 metros (ICMBIO, 2004). As formações vegetais abertas estão associadas à diversidade de estruturas rochosas e edáficas da superfície da Serra dos Carajás, o que leva a um mosaico de formas vegetacionais, de campos úmidos ou secos a pequenos enclaves florestais (MOTA et al. 2015; NUNES et al. 2015; SCHAEFER et al. 2016). A denominação desse conjunto é assunto controverso – comumente recebe nomes que se referem ao padrão geral de fitofisionomias abertas e de forte xeromorfismo: “campo rupestre”, “vegetação metalófila”, “vegetação rupestre”, “savana metalófila” e mesmo “vegetação de canga” (Figura 3) (SILVA, SECCO, LOBO 1996; FERREIRA, OLIVEIRA, SILVA 2015; MOTA et al. 2015).

4.1.6. Parque Natural Municipal de Porto Velho (RO) O Parque Natural Municipal de Porto Velho está localizado à 14 km de Porto Velho, é caracterizado por relevo menor que 100 m de altitude e com floresta do tipo ombrófila aberta e floresta de transição com savana (DIEGO; ALMEIDA, 2012). Possui altitude entre 300-800 metros, um clima do tipoTropical Chuvoso, com média climatológica da temperatura do ar, durante o mês mais frio, superior a 18°C (megatérmico), e um período seco bem definido durante a estação de inverno, quando ocorre na região um moderado déficit hídrico, com índices pluviométricos inferiores a 50 mm/mês. A média climatológica da precipitação pluvial nos meses de junho, julho e agosto é inferior a 20 mm/mês. Estando sob a influência do clima Aw, a média anual da precipitação pluvial varia entre 1.400 e 2.500 mm/ano, e a média anual da temperatura do ar entre 24 e 26 °C (IBGE, 2003). Com a vegetação do tipo Floresta Ombrófila Densa (IBGE, 2003).

4.1.7. Reserva Particular do Patrimônio Natural Frei Caneca (PE) A RPPN Frei Caneca se localizase localiza no município de Jaqueira, na Mata Sul de Pernambuco, possui 750 m de altitude e tem área de 630,42 há e o clima é tropical úmido em torno de 22-24°C com sete meses de estação chuvosa (de março a setembro), com precipitação médio anual foi de 1331,21 mm (IBGE, 1992). A vegetação é classificada como Floresta Estacional Semidecidual Montana (500-750 m de altitude), um dos tipos vegetacionais da Mata Atlântica brasileira (IBGE, 1992).

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4.2. Materiais analizados Os materiais analisados estão depositados nos herbários JPB (Universidade Federal da Paraíba – UFPB) e UFRN-Fungos (Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN). As localidades onde foram realizadas as coletas dos materiais nas regiões Norte e Nordeste estão descritos na Tabela 5. Os espécimes foram analisados quanto às características macroscópicas e microscópicas, e quando possível submetidos a análises moleculares. Quanto à macroscópia foram consideradas as seguintes características: • micélio: se há presença de rizomorfas na base do estipe; • píleo: tamanho, superfície, sabor, cor e contexto; • himênio: lamelar, presença de látex; inserção da lamela: variável, podendo ser de vários tipos, como: adnexas: tocam apenas parcialmente no estipe e são mais frequentes em russuloides; adnatas: estão completamente aderidas no estipe mais frequentes em russuloides; decurrentes/curto-decurrentes; • estipe: cor, forma, inserção no píleo, superfície, anel, contexto; • esporada: cor da esporada ou cor das lamelas. Quanto a análise das características microscópicas, os materiais foram levados ao laboratório onde foram feitos cortes dos materiais, estes foram montados em lâminas distintas, a fim de verificar as seguintes características: • reações típicas dos elementos da lamela e das superfícies do píleo e estipe, como: a reação ao iodo usando o Reagente de Melzer para observar se as ornamentações dos basidiosporos são amiloides para os quatro gêneros agaricoides; o azul Crezil que pode ou não reagir com estruturas da pileipelis em Russula (meta- ou ortocromática); e sulfovanilina que reage com os cistídios da lamela em Russula (SINGER, 1986). • pileipelis (Fig. 1); • trama himenoforal; • basídios; • basidiosporos e suas ornamentações; • cistídios: queilocistídios, pleurocistídios, pseudopleurocistídios e pseudoqueilocistídios (Fig.2 e 3);

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• superfície do estipe. Para a obtenção das medidas microscópicas, foram feitas 30 réplicas de cada medida de cada umas das microestruturas e os valores extremos foram anotados, exceto nos basidiosporos que foi excluído o tamanho da ornamentação. As abreviações dos basidiosporos incluem L(W) = média da largura/comprimento de um único basidioma, Q = largura:comprimento de todas as medidas dos basidiosporos medidos, Qm = o valor Q médio de todos os basidiosporos medidos em um único basidioma (WARTCHOW; CAVALCANTI, 2010; WARTCHOW et al. 2012). Para cada espécie identificada foram feitas ilustrações e adicionalmente foi utilizada microscopia eletrônica de varredura (MEV) disponível no Laboratório de Energia Renovável do Centro de Tecnologias do Gás & Energias Renováveis (CTGAS-ER) sediado em Natal- RN, para observação detalhada das microestruturas de importância taxonômica.

Tabela 5. Lista de espécies de Russulaceae provenientes das coleções dos herbários da UFRN-FUNGOS e JPB. Espécies Número de tombo Localidade Lactifluus piperogalactus nom. UFRN-Fungos – 2199 Refúgio Ecológico Charles prov. Darwin – Recife/PE Lactifluus paraensis nom. UFRN-Fungos – 2192 FLONA de Carajás – prov. Paraupebas/PA Lactifluus venosellus nom. UFRN-Fungos – 2197 REBIO Guaribas – prov. Mamanguape/PB Russula candida nom. prov. UFRN-Fungos – 2186 RPPN Frei Caneca – Jaqueira/PE Russula glutinosa nom. prov. UFRN-Fungos – 2185 RPPN Frei Caneca – Jaqueira/PE Russula pices nom. prov. UFRN-Fungos – 2195 REBIO Guaribas – Mamanguape/PB Russula písciodora nom. prov. UFRN-Fungos – 2196 REBIO Guaribas – Mamanguape/PB Russula puigarii Singer UFRN-Fungos– 2190 RPPN Frei Caneca – Jaqueira/PE e Reserva Ecológica da Mata do Pau Ferro – Areia/PB

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Russula puigarii Singer UFRN-Fungos – 2191 FLONA de Caxiuanã– Melgaço/PA Russula purpureopunctata JPB – 61028 Reserva Ecológica da Mata nom. prov. do Pau Ferro – Areia/PB Russula rondonensis UFRN-Fungos– 2193 Rondônia, Porto Velho, Parque Ecológico Municipal de Porto Velho

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Figura 1. Tipos de pileipelis de Lactifluus. A. Lamprotricopaliçada; B. Tricopaliçada; C. Paliçada; D. Cútis; E. Ixocútis. Barra de escala = 10 µm (SÁ, 2014).

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Figura 2. Tipos de elementos terminais da pileipelis de Russula. A. Dermatocistídio; B. Elementos terminais com conteúdo refringente; C. Detalhe da peileipelis com elementos terminais e refringentes e com incrustações. Barra de escala = 10 µm.

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Figura 3. Tipos de cistídios de Lactifluus. A. Pseudocistídios; B. Pleurocistídios; C. Queilopseudocistídios; D. Queilocistídios. Barra de escala = 10 µm (Sá 2014).

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4.3 Análises moleculares 4.3.1 Extração, amplificação e sequenciamento do DNA A extração do DNA foi realizada em espécies herborizadas coletadas no Brasil (Tabela 5), na Université Paul Sabatier III em Toulouse na França. Para a extração foi utilizado o kit de purificação Wizard Genomic DNA (Promega Corp., Fitchburg, EUA) seguindo as instruções do fabricante. A seleção dos marcadores moleculares para análises filogenéticas seguiu a metodologia de artigos publicados previamente para família Russulaceae (BUYCK et al., 2008; VERBEKEN et al., 2014). As regiões utilizadas foram: ITS (internal transcribed spacer region), com ITS1 e ITS2 com o gene ribossomal 5.8S, os primers utilizados para isso foram ITS-1F/ITS5 e ITS4 (WHITE et al., 1990; GARDES; BRUNS, 1993); e a região da subunidade maior ribossomal 28S (LSU), para isso foram utilizados os primers LR0R e LR5 (MONCALVO et al., 2000). Essas regiões foram escolhidas por serem as mais utilizadas para reconstrução das relações filogenéticas dentro da família Russulaceae (DE CROP et al., 2017; BUYCK et al., 2018). A amplificação foi feita a partir de diluição de DNA de 1/10 e 1/50, quando necessário. Os primers utilizados foram: ITS1F + ITS4 (em alguns casos ITS4B) para a região ITS (WHITE et al., 1990; GARDES; BRUNS, 1993); LR0R + LR7 para LSU (VILGALYS; HESTER, 1990; WHITE et al., 1990). A reação do mix PCR e os programas do termociclador são apresentados nas Tabelas 6 e 7. Para checar as amplificações, foi feito um gel de agarose a 1% utilizando um marcador (SightDNA) para que pudéssemos verificar o tamanho da banda de DNA de cada amostra. O produto da PCR foi exposto à luz ultravioleta para observar as bandas de cada extração, as que obtiveram resultado satisfatório, quando comparadas como o SightDNA, foram encaminhadas para sequenciamento no Laboratoire MilleGen (Labège, France). Os cromatogramas foram analizados no programa BioEdit (HALL, 1999).

Tabela 6. Mix PCR usado para a amplificação de ITS e LSU (quantidade para cada amostra 2 µl DNA). Substância/reagente Quantidade Água purificada 14,3 µl Albumina do soro bovino 1 µl

MgCl2 0,5 µl

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GoTaq buffer verde (Promega Corp., 5 µl Fitchburg, Etats Unis) Primers 0,5 µl Dntp 10 mM GoTaq DNA polimerase 1 U/25 μl, Promega

Tabela 7. Ciclos térmicos usados nas reações de PCR. Etapas ITS/LSU Desnaturação inicial 94° C por 3 minutos Desnaturação 94° C por 45 segundos Anelamento 55° C por 45 segundos Elongamento 72° C por 1 minuto Número de ciclos 40 ciclos Elongamento final 72° C por 10 minutos Reação de parada 10° C

4.3.2 Análises filogenéticas Para o estudo filogenético, dois bancos de dados de nrITS foram feitos, um para espécies de Lactifluus e outro para espécies de Russula. Foram utilizadas 60 sequências contidas no GenBank, incluindo as espécies deste trabalho. Das sequências selecionadas, 20 pertenciam ao gênero Russula e 40 ao gênero Lactifluus, o critério para a escolha das sequências foi por similaridade no BLAST (Tabela 8). As sequências foram alinhadas utilizando o MAFFT v.7 (KATOH; STANDLEY, 2013), usando o critério Q-INS-i, posteriormente foi feita uma inspeção manual e, quando necessário, editada utilizando o MEGA v.6 (TAMURA et al., 2013). O programa Gblocks v0.91b foi utilizado para eliminar as posições mal alinhadas com definições que permitiram gaps dentro dos blocos selecionados, blocos pequenos e segmentos maiores, posições não conservadas contíguas (CASTRESANA 2000). O programa RAxML v8.2.X foi utilizado para obter as árvores com o maior score, com o modelo GTRGAMMA para um único marcador, e com com todos os outros parâmetros definidos para o padrão do software (STAMATAKIS, 2006). A primeira análise envolve 100 MV (máxima verossimilhança) com pesquisa independente, cada um começando de uma adição gradual e aleatória para a árvore de parcimônia. Apenas a árvore

44 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB com o melhor score foi utilizada e a confiabilidade dos nós foi avaliada por meio de bootstrapping não paramétrico (BS), replicando sob o mesmo modelo, permitindo que o programa interrompa o bootstrapping automaticamente pela opção auto MRE. O melhor modelo de nucleotídeo foi TIM2ef+G Lactifluus e Russula, usando jModelTest 2v.1.6 (GUINDON; GASCUEL, 2003; DARRIBA et al., 2012). Inferência Bayesiana (IB) foi realizada usando o MrBayes 3.1.2 com duas corridas independentes, cada uma iniciando de árvores randômicas com quatro cadeias independentes simultâneas, realizando 2 × 107 mcmc gerações, amostrando uma árvore a cada 1 × 103 gerações (RONQUIST; HUELSENBECK, 2003). A primeira 5 × 103 árvores amostradas foram descartadas como burn-in, foi utilizado para reconstrução 50 % árvore de consenso de regra majoritária e para calcular probabilidades posteriores Bayesianas dos clados (BPP). O jModelTest 2v.1.6, RAxML v8.2.X e MrBayes 3.1.2 foram usados no CIPRES Science Gateway 3.1 (MILLER et al., 2010). Considerou-se um nó significativamente apoiado se recebesse um BPP ≥ 0,80 e / ou BS ≥ 60%.

Tabela 8. Espécies, voucher da coleção, origem e número do GenBank de sequências nrITS utilizadas nas análises moleculares. Espécies Voucher da coleção Localidade Número do GenBank Lactarius BB 00-1518 Madagascar AY606981 annulatoangustifolius Lactifluus cf. annulifer TH9014 Guiana KC155376 Lactifluus caatingae MS9 Brasil - Lactifluus cf. caribaeus LIP PAM-Mart12-90 Martinique KP691415 Lactifluus carmineus AV 99-099 Zimbábue KR364131 Lactifluus cf. castaneibadius LIP CL/MART06 Martinique KP691417 Lactifluus clarkeae MN 2004002 Austrália KR364011 Lactifluus conchatulus H.T.Le 457 Tailândia GU258399 Lactifluus chiapanensis VMB 4374ª México KR364378 Lactifluus denigricans EDC 11-218 Tanzânia KR364051 Lactifluus dunensis UFRN-Fungos 1882 Brasil - Lactifluus dunensis UFRN-Fungos 2200 Brasil -

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Lactifluus flocktonae JET1006 Austrália JX266621 Lactifluus kigomaensis AV 11-006 Tanzânia KR364052

Lactifluus multiceps TH9154 Guiana JN168731 Lactifluus cf. murinipes LIP F.1890 Martinique KP691418 Lactifluus nebulosus LIP RC/Guad11 Guadalupe KP691412 Lactifluus paraensis UFRN-Fungos 2192 Brasil - Lactifluus pegleri PAM/Mart 12-091 Martinique KR364397 Lactifluus piperogalactus UFRN-Fungos 2199 Brasil - Lactifluus cf. pudidos LIP MART1113 Martinique KP691413 Lactifluus aff. rubroviolascens EDC 12-051 Camarões KR364066 Lactifluus sp.1 G4797 Guiana KM073085 Francesa Lactifluus sp.2 G4836 Guiana KM073083 Francesa Lactifluus sp.3 G4887 Guiana KM073084 Francesa Lactifluus sp.4 RC/GUY09-004bis Guiana KP691427 Francesa Lactifluus sp.5 G3031 Guiana KJ786686.1 Francesa Lactifluus sp.6 G3264 Guiana KJ786706 Francesa Lactifluus sp.7 MCA 3937 Guiana KR364109 Lactifluus sp.8 EDC 11-006 Tanzânia KR364066 Lactifluus sp.9 Kp691436 Nova KP691436 Caledônia Lactifluus subclarkeae REH 9231 Austrália KR364095 Lactifluus subiculatus AMV2003 Colômbia KT354740 Lactifluus subiculatus AMV2004 Colômbia KT354741 Lactifluus subiculatus MCA 4276 Guiana KR364110

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Lactifluus subiculatus SLM 10114 Guiana JQ405654 Lactifluus uapacae AV 07-048 Camarões KR364007 Lactifluus venezuelanus G 1066 Guiana KJ786668 Francesa Lactifluus cf. venezuelanus RC/GUAD11-017 Guadalupe KR364393 Lactifluus veraecrucis M 8025 México KR364112 Russula atroerigina 53626 China JX391967 Russula aureoviridis H15060613 China KY767808 Russula dinghuensis K15052704-3 China K15052704- 3 Russula foetens R24 República MG687323 Tcheca Russula gelatinivelata AMV1915 Colômbia KT724174 Russula glutinosa UFRN-Fungos 2185 Brasil - Russula leguminosarum TH7425 Guiana KC155394 Russula pallidirosea UTC00274382 Samoa KR831283 americana Russula aff. pluvialis TH9230 Guiana KT339218 Russula siamensis 28784 Tailândia AB206535 Russula sp.1 R110 Estados Unidos Russula sp.2 R70 Estados MG679812 Unidos Russula sp.3 TH7446 Guiana JN168748 Russula sp.4 TH9568 Guiana KC155397 Russula sp.5 V-P 1357 Colômbia Russula sp.6 V-P1915 Colômbia Russula cf. subfoetens 525 Rússia MH270632 Russula venezueliana TH7874 Guiana KT339269 Russula werneri IB1997/0786 Suécia DQ422021 Russula xantovirens B17091630 China MG786055

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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO Nove espécies da família Russulaceae foram analizadas morfologicamente, das quais seis pertencem ao gênero Russula e três ao gênero Lactifluus, nenhum representante dos gêneros Lactarius e Multifurca foi encontrado. O banco de dados de sequencias de Lactifluus contendo 40 espécimes resultou em 426 caracteres, incluindo GAPs, o de Russula que com 20 espécimes resultou em 569 caracteres, incluindo GAPS. A busca bootstrapping para análise de MV parou após 900 replicações para Lactifluus e 660 replicações para Russula. Em ambos os casos, as análises feitas por MV e Bayesiana, gerando árvores com a mesma topologia, na qual é mostrada apenas a árvore gerada por MV, apoiados com valores de nó: BS ≥ 60%; e para MV e BPP ≥ 0,80 para análise Bayesiana.

5.1 Taxonomia 5.1.1 Lactifluus Lactifluus piperogalactus Sá & Wartchow nom. prov. Fig – 4. Holotypus – BRASIL, Pernambuco, Igarassu, Reserva Biológica Charles Darwin 04.VII.2012, N.A. Silva & F. Wartchow FW110/2012 (UFRN-Fungos 2199).

Píleo 37–75 (–100) mm, plano depresso a depresso convexo, creme (oac 857), por vezes amarelado (oac854-856), opaco, subglabroso a quebradiço; contexto branco. Lamelas decurrente 8mm, de margem inteira, distante, de coloração creme com manchas marrons; lamélulas presentes, abundantes e de comprimentos diferentes; Látex branco e sabor apimentado. Estipe 15–30 × 8–15 mm, central, creme, afinando em direção à base; superfície velutina, contexto amarronzado. Basidiosporos (6,0–)7,2–8,4(–9,6) × 6,0–8,4 µm (L= 7,5 µm; W=6,8 µm; Q=1,00–1,30(– 1,40); Qm= 1,13), globosos a levemente elipsoides, ornamentação amilóide até 0,2 µm de altura e isoladas. Basídios 38–66 × 6–11 µm, inflados da metade para cima, com quatro esterigmas de 3,6–7,2 µm de altura. Pleurocistídio ausente. Pleuropseudocistídios 5–11 µm de diâm., levemente calvados, amarelados em KOH 3%. Subhimênio composto por células isodiamétricas 8–11 × 7–10 µm. Trama da lamela composta por hifas entrelaçados com 3,6–5 µm de diâm., esferocistos raros e hifas lacticíferas com 7,2–11 µm de diâm. Borda da lamela estéril, com células marginais 16–31 × 5–8 µm, clavadas, de coloração amarelada em

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KOH 3%, com pseudoqueilocistídios de 9,6–14 µm de diâm., clavados. Pileipelis como tricoderme com 216 µm de espessura, composta por hifas entrelaçadas e algumas hifas que emergem verticalmente, de coloração amarelada em KOH 3%; suprapelis com 120 µm de espessura composta por elementos terminais 42–114 × 3,6–8,4 µm, abundantes, cinlíndricos; subpelis com 96 µm composta por esferocistos 26–42 × 10–24 µm e hifas com 4,8–7,2 µm de largura e de coloração amarela em KOH 3%. Superfície do estipe composta por hifas entrelaçadas, com 4,8–6 µm de largura; caulocístidios presentes com 78–180 × 5–7 µm e cilíndricos, sem hifas lacticíferas. Ausência de grampos de conexão. Comentários: Lactifluus piperogalactus é caracterizado pelo píleo de coloração amarelada, opaca, subglabrosa a quebradiça; contexto branco; lamelas decurrentes, distantes, creme com manchas marrons; látex branco e sabor apimentado. Os basidiosporos são globosos a levemente elipsóides, globosos a levemente elipsóides, ornamentação amilóide até 0,2 µm de altura, isoladas e pileipelis como tricoderme composta por hifas entrelaçadas e algumas hifas que emergem verticalmente, amarelado em KOH 3% e com elementos terminais de parede fina e cilíndricos. Essa espécie pode ser incluída em Lf. subg. Gymnocarpi, por apresentar pileipelis lampropalisada e ausência e pseudolamprocistídios e com látex de coloração amarronzada e/ou contexto ficando amarronzado quando exposto ao ar (DE CROP et al., 2017). As espécies mais próximas à Lf. piperogalactus são as da seção Tomentosi utilizadas na análise filogenética [Lf. clarkeae (Cleland) Verbeken, L. subclarkeae (Grgur.) Verbeken e Lf. flocktonae (Cleland & Cheel) Lebel], que se caracteriza pela combinação dos seguintes caracteres: píleo seco com coloração amarelo alaranjado a marrom avermelhado, subpelis mais espessa que a suprapelis, ausência de pleurocistídios verdadeiros, ornamentações dos basidiosporos mais ou menos reticuladas e trama da lamela composta principalmente por esferocistos (DE CROP et al., 2017). Nenhum desses caracteres se relacionam com Lf. piperogalactus, apesar de não ser discutido neste momento a diferença morfológica das espécies deste grupo devido a ausência de descrições morfológicas de espécies pertencente ao mesmo ramo. Contudo, a análise molecular e morfológica geral viabiliza esta espécie como uma nova para a ciência.

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Figura 4. Lactifluus piperogalactus. A, B – Basidiomas; C,D – MEV dos basidiosporos; E – Basidiosporos; F – Peileipelis; G – Basídios, basidíolos e subhimênio; H – Pseudopleurocistídios; I – Pseudoqueilocistídios; J – Caulocistídios. Barra de escala = 10 µm.

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Lactifluus paraensis Sá, Wartchow & V. Coimbra nom. prov. Fig – 5. Holotypus – BRASIL, Pará, Parauapebas, FLONA de Carajás, 15.IX.2013, V.R.M. Coimbra et al. VCOC 161 (UFRN-Fungos 2192).

Píleo com 40 mm de diâmetro, liso no centro e estriado da metade do raio até à margem, superfície seca, de coloração marrom alaranjado (6B8-6C8) no centro e laranja (6A6-6A7) em direção à margem. Lamelas adnatas, próximas, algumas anastomosadas, de coloração laranja claro (6A3-6A4); lamélulas presentes e de comprimentos diferentes. Estipe com 35 × 10 mm, central, de coloração laranja claro (6A4) próximo ao píleo e laranja (6B5) na base, látex ausente. Basidiosporos 5–6,5(–7) × 5–6 µm (L = 5,9 µm; W = 5,4 µm; Q = 1,00–1,20(–1,40); Qm = 1,09), globosos a levemente elipsóides; ornamentações amilóides, com 0,2–0,5 µm de altura, com linhas isoladas que não se conectam umas com as outras; Basídios 28–45 × 7–12 µm, inflados da metade para cima, com quatro esterigmas de 3–5 µm de altura; Pleurocistídios ausentes. Pseudopleurocistídios presentes e abundantes, com 10–15 µm de diâm., clavados e amarelados em KOH 3 %. Subhimênio composto por células isodiamétricas com 10–25 × 10–22 µm e hifas com 4–5 µm de diâm. Trama da lamela composta principalmente por esferocistos com 21–33 × 12–29 µm e por hifas lacticíferas com 8–12 µm de diâm. Borda da lamela estéril, com células marginais 25–28 × 10–12 µm clavadas e de coloração amareladas em KOH 3 %, sem caulocistídios. Pileipelis tricopaliçada com 106,7 µm de espessura, suprapelis com elementos terminais 45–100 × 3–5 µm, hifóides e cilíndricos; subpelis composta por 3-5 camadas de esferocistos 37–60 × 18–30 µm e hifas com 4–5 µm de diâm., de coloração marrom amarelada em KOH 3 %. Superfície do estipe similar a pileipelis em estrutura com abundância de esferocistos com 20–30 × 15–30 µm, hifas com 4–5 µm de diâm. e hifas lacticíferas com 10–12 µm de diâm. Grampos de conexão ausentes. Comentários: Lactifluus paraensis é caracterizado pelo píleo de coloração marrom alaranjado no centro e laranja em direção à margem, basidiosporos globosos à levemente elipsóides, com ornamentações amilóides, isoladas e pileipelis do tipo tricopaliçada, de coloração marrom amarelado em KOH 3 %, suprapelis com elementos terminais de parede fina, hifóides e cilíndricos. Essa espécie pode ser incluída em Lactifluus subg. Lactariopsis por apresentar um píleo de coloração alararanjada, de superfície seca e pela ausência de elementos terminais de

51 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB parede espessa (DE CROP et al., 2017). As espécies brasileiras já descritas para esse subgênero são Lf. dunensis Sá & Wartchow para o Rio Grande do Norte, Lf. aurantiorugosus Sá & Wartchow para o Rio Grande do Sul e Lf. piperogalactus Sá & Wartchow nom. prov. para Pernambuco. Lactifluus paraensis difere de Lf. dunensis por apresentar basidiosporos menores (6,1–)6,6–8,2(–8,7) × (5,6–)6,1–7,1(–7,7) µm, L = 7,5 µm, W = 6,4 µm, Q = (1,00–)1,10–1,40(–1,50), Qm = 1,20 e pela estrutura da pileipelis. Lactifluus dunensis apresenta uma pileipelis do tipo paliçada, com elementos terminais abundantes e de parede grossa (SÁ e WARTCHOW, 2013). Lactifluus paraensis difere de Lf. aurantiorugosus por apresentar basidiosporos menores (7– )7,5-10,5 × (4,7–)6–8 µm (L = 8,9 µm, W= 6,7 µm, Q = (1,19–)1,22–1,44(–1,45), Qm = 1,32), difere também na estrutura da pileipelis que, por mais que seja tricopaliçada, apresenta elementos terminais abundantes e menores 20–51 × 4–6 µm (SINGER, 1983, SÁ et al., 2013, SÁ; WARTCHOW, 2013). Lactifluus piperogalactus difere de Lf. paraensis na coloração amarelada do píleo e lamelas com pontos marrons, basidiosporos maiores (6,0–)7,2–8,4(– 9,6) × 6,0–8,4 µm (L= 7,5 µm; W=6,8 µm; Q=1,00–1,30(–1,40); Qm= 1,13) de ornamentações isoladas e a pileipelis é do tipo tricoderme, com elementos terminais abundantes e de parede fina (DE CROP et al., 2017).

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Figura 5. Lactifluus paraensis. A,B – Basidioma; C,D – MEV dos basidiosporos; E – Basidiosporos; F – Pileipelis; G – Basidíolos, basídios e subhimênio; H – Pseudopleurocistídios. (Barra de escala = 10 µm).

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Lactifluus venosellus Sá & Wartchow nom. prov. Holotypus – BRASIL, Paraíba, Mamanguape, Reserva Biológica Guaribas, 30.VI.2012, M.C.A Sá MS37 (UFRN - 2197).

Píleo com 45–76 mm de diâm., depresso, de coloração marrom escuro (OAC 699 e OAC 705) no centro e laranja (OAC 693) a marrom (OAC 707) em direção à margem; margem plana e não estriada; superfície com veias entrelaçadas (areolada na margem); contexto de coloração branca. Lamela adnata, com 3–7 mm de comprimento, inteira e separada, de coloração marrom acinzentada (OAC 624) a cor de ferrugem (OAC 644); lamélulas presentes. Estipe com 25–42 × 11–20 mm, vermelho claro (7A4) central, cilíndrico, igual a levemente afunilando na base, superfície lisa e oca; contexto esponjoso. Odor adocicado; sabor não distinto. Látex ausente.

Basidiosporos 9,0–10,8 × (6,6–)7,2–8,4 µm (L= 9,8; W=7,8; Q=(1,00–)1,14–1,50; Qm= 1,27), globoso a elíptico, ornamentação amiloide, com 2 µm de altura, e isoladas. Basídios 55–84 × 10–13 µm, inflada na parte superior, com 4 esterigmas com 3,8–6 µm de altura. Pleurocistídia ausentes. Pseudopleurocistídios com 6–10 µm de diâm., levemente clavado à mucronado, de coloração marrom em KOH 3 %. Subhimênio composto por células isodiamétricas com 11–18 × 8–13 µm. Trama da lamela heterômera, composta por hifas entrelaçadas com 3,6–4,8 µm de diâm.; esferocistos abundantes 12–18 × 6–14 µm; presença de hifas lacticíferas com 7,2–10,8 µm de diâm. Pileipelis palisada, com 130 µm de comprimento, de coloração amarronzada em KOH 3 %, composta por dermatocistídios refringentes 42–72 × 4–7 µm, abundante, cilíndricos, com conteúdo refringente; subpelis de coloração amarelada em KOH 3 %, composto por esferocistos 20–36 × 13–28 µm e, abaixo, com hifas entrelaçadas com 4–8 µm de diâm., hialino, hifa refringente com 7–30 µm de diâm.. Estipitipelis similar à pileipelis em estrutura, composta por hifas entrelaçadas com 4,8–8,4 µm de diâm., hifas lacticíferas com 7,2–14 µm de diâm., esferocistos com 14–30 × 12–18 µm; caulocistídio abundante com 54–90 × 4,8–10 µm, de parede fina e hialino. Grampos de conexão ausentes.

Comentários: Lactifluus venosellus é caracterizado pela coloração marrom escuro no centro e laranja a marrom em direção à margem do píleo, o mesmo também possui veias entrelaçadas em sua superfície. Basidiosporos com ornamentação amiloide, com 2 µm de

54 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB altura e isoladas. Apresenta uma pileipelis do tipo palisada, com 130 µm de comprimento, amarronzada em KOH 3 %, com a presença de dermatocistídios, cilíndricos e com conteúdo refringente. Lactifluus venosellus pertence ao subgênero Pseudogymnocarpi seção Polysphaerophori. Segundo De Crop et al. (2017), a seção contém apenas espécies que pertencem a América Central e do Sul. Mas, devido a falta de descrição morfológica dos representantes deste grupo, não será possível fazer uma comparação morfológica entre as espécies do grupo e Lf. venosellus e as espécies relacionadas com ele nas análises moleculares pelo fato das espécies que estão próximas a ela não terem descrição morfológica disponível nos trabalhos consultados (Figura 15). Trabalhos recentes de filogenia do grupo levam em consideração que as análises moleculares são suficientes para distinção das espécies, não fornecendo nada além das sequências coletadas. Lactifluus pegleri Pacioni & Lalli e Lf. veracrucis Singer utilizados na análise filogenética também se agruparam no mesmo clado da seção Polysphaerophori, mas em um ramo distinto composto por espécies da América Central e do Norte. Estas diferem em vários aspectos, como por exemplo, coloração do píleo, características da pileipelis e distribuição (LALLI; PACIONI 1992; MONTOYA et al., 2007). Deste modo, baseado na morfologia e análise molecular desta espécie pode considerá- la uma nova espécie para ciência.

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Figura 6. Lactifluus venosellus. A,B – Basidiomas; C,D – MEV dos basidiosporos; E – Basidiosporos; F – Pileipelis (Dermatocistídios, esferocistos, hifas e hifas lacticíferas); G – Basídio, basidíolo e subhimênio; H – Pseusopleurocistídio; I – Caulocistídio. (Barra de escala = 10 µm).

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5.1.2 Russula

Russula purpureopunctata Sá & Wartchow nom. prov. – Fig 7. Holotypus – BRASIL, Paraíba, Areia, Reserva Ecológica da Mata do Pau-Ferro, Sítio Vaca Brava (6°59’185’’ S, 35°44’646’’W), 559 m alt., 16.VII.2013, FW 31/2013 (JPB 61028).

Píleo com 34 mm de diâm., infundibiliforme e depresso no centro, superfície seca, de coloração púrpura avermelhado (K 238-deepr P) no centro e marrom acinzentado em direção à margem (entre K 64.br gray e K 61.gy.Br), com margem sulcada; contexto branco. Lamelas adnatas, brancas, com as margens púrpura amarronzados a amareladas quando injuriadas, por vezes bifurcando; lamélulas abundantes com comprimentos diferentes. Estipe com 44 x 8 mm, central, de coloração púrpura acinzentado (229.d.gy.P), com grânulos púrpura acinzentado (K 229.d.gy.P) sobre a superfície, com o tempo se tornando de coloração olivácea (K 91.d.gy.Y) depois de manuseada. Basidiosporos 5,5–7,0(–7,3) × 5,0–6,5 µm (L= 6,4 µm; W=5,7 µm; Q=1,00–1,27(–1,30); Qm= 1,11), globosos a elipsóides, ornamentações amilóides com 1,0–1,5 µm de altura, isolados ou conectadas por linhas finas, mas não forma um retículo completo. Basídios 33– 38 × 8–14 µm, inflados na metade para cima, com quatro esterigmas e estes com 3–6 µm de altura. Macropleurocistídios 40–70 × 6–10 µm ventricoso a mucronado, amarronzado em KOH 3 %. Subhimênio composto por células isodiamétricas 10–23 × 5–13 µm. Trama da lamela composta por esferocistos 10–20 × 5–15 µm e hifas 3–4,5 µm de diâm, não refringentes. Borda da lamela estéril, com células marginais 11–30 × 3,5–10 µm clavadas, hialinas e presença de queilocistídios 25–50 × 6–9,5 µm, cilíndricos à calvados, alguns com conteúdo amorfo em vermelho Congo. Pileipelis ortocromática em azul crezil, suprapelis composta por elementos terminais cilíndricos e lageniformes 23–38 × 4–7,5 µm que apresentam uma cadeia de 3-5 células elipsóides 18–25 × 14–20 µm em sua base, presença de macrodermatocistídios 50–170 × 6–10 µm, cilíndricos (que estão dentro desta camada), raramente emergindo. Superfície do estipe composta por hifas de 2–3 µm de diâm., esferocistos 18–32× 15–25 µm e muitas hifas oleíferas ou ricas em conteúdo celular com 5,5–7,5 µm de diâm. e caulocistídios com 30–50 × 6–9,5 µm. Grampos de conexão ausentes.

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Figura 7. Russula purpureopunctata. A, B – Basidioma; C – MEV dos basidiosporos; D – Basidiosporos; E – Elementos terminais da pileipelis; F – Macropleurocistídios; G – Macropleurocistídio, basidíolos e basídios; H – Macrodermatocistídios; I – Queilocistídios; J – Caulocistídios; K – Células marginais. (Barra de escala = 10 µm).

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Comentários: Russula purpureopunctata é caracterizada macroscopicamente pela coloração púrpura do píleo e presença de grânulos de coloração púrpura avermelhada ao longo do estipe e microscopicamente por apresentar basidiosporos com ornamentações isoladas ou conectadas por linhas finas, mas sem formar um retículo completo, também pela presença de macrodermatocistídios e macropleurocistídios bem definidos e pileipelis ortocromática em azul crezil. Esta espécie pertence à subseção Pluviales Singer, cujo tipo é R. pluvialis Singer e apresenta basidioma de coloração púrpura, microscopicamente apresenta macrodermatocistídio, macropleurocistídios e esporos com ornamentações isoladas. Russula pluvialis difere de R. purpureopunctata por apresentar basidiosporos maiores 7,8–8,2 (–9,5) × 6–7(–8,5) µm e dermatocistídios com parede espessa 1,8 µm. Outra espécie desta seção que pode ser similar a R. purpureopunctata é R. leguminosarum com píleo violeta-lilás, mas difere por apresentar um estipe todo branco, microscopicamente com basidiosporos maiores 9–10,2 × 8,5–9,9 µm, com ornamentações maiores de 1,5–2 µm e suprapelis sem dermatocistídios e gelatinosa (SINGER et al. 1983).

Russula pices Sá & Wartchow nom. prov. Fig – 8. Holotypus – BRASIL, Paraíba, Mamanguape, Reserva Biológica Guaribas (6°59’185’’ S, 35°44’646’’W), 30.VI.2012, MS34 (UFRN-Fungos 2195).

Píleo 30-60 mm, depresso, de coloração marrom escura (OAC 680, OAC 701) no centro e marrom (OAC 733) em direção à margem, com superfície areolada e quebradiça no centro; margem ligeiramente ascendente; contexto esbranquiçado, imutável; Lamelas adnatas, de coloração castanho claro (OAC 799), 10 mm, bifurcada, próximas, inteira; lamélulas ausentes. Estipe 30–40 x 5–10 mm, central, de coloração castanho claro (OAC 721) a creme (OAC 696), superfície lisa, oca, odor de peixe. Látex ausente. Basidiosporos 8,4–10,8 × (7,2–) 8,4–9,6 (–10,8) µm (L = 9,5 µm; W = 8,9 µm; Q = 1,00– 1,29 (–1,33); Qm = 1,08), globosos a levemente elipsóides, raramente elipsóides; ornamentação amilóide com ornamentações até 1 µm de altura e isoladas, sem formar nenhum tipo de retículo. Basídios 48-79 × 8–18 µm, inflada na metade superior, com quatro esterigmas até 4,8–11 µm de altura. Macropleurocistídios 38–102 × 10–23 µm, ligeiramente clavados, às vezes mucronados, de coloração acastanhada em KOH 3 %. Subhimênio

59 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB composto por células isodiamétricas 11–18 × 8–13 µm. Trama da lamela é composta por hifas entrelaçadas de 3,6 a 4,8 µm de diâm, esferocistos de 16–24 × 14–18 µm e hifas oleíferas com 12 a 18 µm de diâm. Borda da lamela estéril, com células marginais 35–50 × 8–15 µm, clavados, queilocistídio 48-60 × 10-18 µm abundante, cilíndrico a ligeiramente afilado na parte superior, hialino e de paredes finas. Pileipelis composta por hifas periclinais entrelaçadas, algumas com conteúdo refringente, de coloração castanho claro em KOH 3 %, com dermatocistídios raros 54–72 × 4,8–8,5 µm, cilíndricos a ligeiramente usiformes. Superfície do estipe composta por hifas entrelaçadas 4,8–7,2 µm e esferocistos 23–34 × 16– 23 µm, sem caulocistídios e sem hifas oleíferas. Grampos de conexão ausentes.

60 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB

Figura 8. Russula pices. A – Basidiomas; B,C – MEV dos basidiosporos; D – Basidiosporos; E – Pileipelis; F – Basídios, basidíolos e subhimênio; G – Pleuropseudocistídios; H – Células marginais e queilocitídios. (Barra de escala = 10 µm).

Comentários: Russula pices é caracterizada por apresentar píleo de 30-60 mm, depresso de coloração marrom escuro no centro e marrom em direção à margem, com superfície areolada

61 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB e quebradiça no centro; lamela adnata, castanho claro, bifurcada, próximas e inteiras. Basidiosporos globosos a levemente elipsóides, raramente elipsóides; ornamentação amilóide com ornamentações de até 1 µm de comprimento e isolada. Pileipelis composta por hifas periclinais entrelaçadas, algumas com conteúdo refringente, castanhas claras em KOH 3%, com dermatocistídios raros 54–72 × 4,8–8,5 µm, cilíndricos a ligeiramente usiformes. Singer et al. (1983) apresentam uma chave para o gênero Russula, agrupando as espécies que apresentam píleo de coloração amarronzada a amarelada, com odor de peixe na seção Ingratae subseção Foetentinae R. Heim. Nesta seção, R. marronina Pegler & Singer é a única que possui o píleo de coloração marrom e com ornamentações com 1–1,5 µm de altura. Russula pices difere de R. marronina por apresentar basidiósporos maiores 7,5–9 × 6,5–7,5 µm e ornamentações de 0,5–0,8 (–1) µm de altura e pela estrutura da pileipelis, que é similar em estrutura, mas difere nos elementos terminais de R. marronina que apresentam uma cadeia de 3–5 células globosas e dermatocistídios menores 21–55 × 2,5–3,5 µm.

Russula pisciodora Sá & Wartchow nom. prov. Fig – 9. Holotypus – BRASIL, Paraíba, Mamanguape: Reserva Biológica Guaribas (6°59’185’’ S, 35°44’646’’W), 559 m alt., 30.VI.2012, MS36 (UFRN-Fungos 2196).

Píleo 30–160 mm, depresso a umbilicado, marrom acinzentado (OAC 728) no centro e marrom (OAC 728) a creme (OAC7 60) em direção à margem, superfície areolada e quebradiço no centro, com margem inteira e lisa. Lamelas decurrentes, com 10-80 mm de comprimento, inteira, creme (OAC 815) a amarronzado (OAC741), próximas e bifurcadas; lamélulas ausentes. Estipe com 25–40 x 7–30 mm, cilíndrico, central, liso e de coloração esbranquiçada (OAC 909) e marrom (OAC 750-735) em direção à base, contexto oco e esponjoso. Odor de peixe. Látex ausente. Basidiosporos 7,2–9,0(–9,6) × 7,2–8,4 µm (L= 8,4 µm; W=7,6 µm; Q=1,00–1,25(–1,33); Qm= 1,11), globosos à levemente elipsóide, raramente elipsóide, ornamentação amilóide com 1–2 µm de altura e isoladas. Basídios 32–54 × 8–17 µm, inflada da metade para cima, 4 esterigmas com 6–7,2 µm. Macropleurocistídios 36–60 × 7,2–11 µm, clavado a mucronado, emergindo do subhimênio e hialino. Subhimênio com células isodiamétricas 7.2–13 × 6–9,6 µm. Trama da lamela composta de esferocistos 14–26 × 14–18 µm e hifas com conteúdo refringente 3,6–6 µm de diâm. Borda da lamela estéril, com células marginais

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10–26 × 4–12 µm clavadas, hialino, ausência de queilocistídio. Pileipelis gelatinosa composta por dermatocistídios 60–140 × 6–10 µm, abundante, hifóide, cilídrico, algumas vezes pode apresentar o ápice bifurcado; subpelis composta por hifas entrelaçadas com 1–4 µm de diâm., hialino e hifas refringentes com 3,6–8,4 µm de diâm. Superfície do estipe similar a pileipelis em estrutura, composta por hifas entrelaçadas 4,8–8,4 µm de diâm., com hifas oleíferas 7,2–14 µm, com esferocistos 14–30 × 12–18 µm e com caulocistídios 54–90 × 4,8–10 µm, cilíndricos. Grampos de conexão ausentes. Comentários:Russula pisciodora é caracterizada por apresentar píleo com 30–160 mm, depresso a umbilicado, marrom acinzentado no centro e marrom a creme em direção à margem, superfície areolada e quebradiça no centro, com margem inteira e lisa. Lamelas inteiras, creme à amarronzada, próximas e bifurcadas. Basidióporos globosos à levemente elipsóide, raramente elipsóide, ornamentação amilóide com 1–2 µm de altura e isoladas. Pileipelis gelatinosa composta por dermatocistídios hifóides, cilíndricos, algumas vezes pode apresentar o ápice bifurcado; subpelis composta por hifas entrelaçadas, hialino e hifas refringentes. Singer et al. (1983) apresentam uma chave para o gênero Russula. Nesta chave, as espécies que apresentam píleo de coloração amarronzada, amarelada ou marrom acinzentado com odor de peixe são os da seção Ingratae subseção Foetentinae R. Heim, dessa seção a espécie R. aosma Singer é a única que possui o píleo de coloração marrom acinzentado, com estipe de coloração clara e pileipelis gelatinosa. Russula pisciodora difere de R. aosma na coloração do himênio que é branca, com presença de poucas lamélulas; os basidiosporos maiores em R. aosma 9–11 × 8,3–10 µm e ornamentações de 1–1,5 µm de altura e pileipelis similar em estrutura com elementos terminais eretos ou semieretos, mas R. aosma apresenta pseudodermatocistídio 38,8 × 7 µm e é pouco gelatinizada. Russula pisciodora difere de R. pices, coletada na mesma região, na coloração do píleo marrom escuro no centro e marrom em direção à margem, basidiosporos maiores 8,4–10,8 × (7,2–) 8,4–9,6 (–10,8) µm (L = 9,5 µm; W = 8,9 µm; Q = 1,00–1,29 (–1,33); Qm = 1,08), globosos a levemente elipsóides, raramente elipsóides; ornamentação amilóide com ornamentações até 1 µm, isolada e, difererindo na estrutura da pileipelis que em R. pices é composta por hifas periclinais entrelaçadas, algumas com conteúdo refringente, castanhas claras em KOH 3 %.

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Figura 9. Russula pisciodora. A – Basidiomas; B, C – MEV dos basidiosporos; D – Basidiosporos; E – Pileipelis (Dermatocistídios, hifas e esferocistos); F – Basídios, basidíolos e subhimênio; G – Macropleurocistídios. (Scale bar = 10 µm).

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Russula puiggarii Singer Fig. – 10. Holotypus – BRASIL, Pernambuco, Jaqueira, RPPN Frei Caneca (6°59’185’’ S, 35°44’646’’W), 559 m alt., Coimbra, V. VCOC79 (UFRN-Fungos 2190).

Píleo 35 mm, depresso, de superfície lisa no centro e estriado em direção à margem, de coloração castanho acinzentado a castanho (7D3, 7E4) no centro, e marrom acinzentado (7D3) em direção à margem. Lamelas adnata, de coloração branca, próximas; lamélulas ausentes. Estipe 30 × 4 mm, brilhante, de coloração cinza acastanhado próximo ao píleo e marrom acinzentado (5C2) na base. Basidiosporos (7,2 -) 8,4-9,6 × (6,0) 8,4-9,6 µm (L = 9,2 µm; W = 8,5 µm; Q = 1,00-1,14 (- 1,20); Qm = 1,09), globosos à levemente elipsóides, raramente elipsóides; ornamentação amilóide com ornamentações de até 2 µm, estas conectadas por linhas finas não formando um retículo completo. Basídios 46–66 × 12–16 µm, inflado na metade superior, com 4 esterigmas até 4,8–6 µm de altura. Macropleurocistídios 54-96 × 8,4-14 µm, ligeiramente clavados a lageniformes, emergindo do subhimênio, acastanhados em KOH 3 %. Subhimênio composto por células isodiamétricas 12–20 × 8–13 µm. Trama da lamela é composta por esferocistos de 24 a 60 × 12-30 µm e hifas, não refringentes, de 4,8 a 6 µm de diâm. Borda da lamela estéril, com células marginais 14-31 × 4,8-8,4 µm clavadas, hialinas, com queilocistídios 36-60 × 6-9,6 µm. Pileipelis gelatinosa, até 90 µm de espessura, composta por elementos terminais 18–30 × 3,6–7,2 µm, lageniformes a mucronados no ápice, com uma cadeia de 3-5 células esféricas à elipsoidais 7–12 × 5-7 µm, dermatocistídios 34– 60 × 6–10 µm, abundante, cilíndrico a insuflado na parte superior, às vezes mucronado, acastanhado em KOH 3 %; subpelis composta por hifas entrelaçadas de 2,4–3,6 µm de diâm., hialinas. Superfície do estipe similar a pileipelis em estrutura, composta de elementos terminais 16,5-42 × 3–6 µm, lageniformes a mucronados, com uma cadeia de 3-5 células esféricas à elipsoidais 7–12 × 4,8–7 µm, caulocistídio 28–48 × 6 –13 µm, abundante, cilíndrico a insuflado na parte superior, às vezes mucronados; subpelis composta por hifas entrelaçadas de 3,6–4,8 μm de diâm., hialinas e sem hifas oleíferas. Grampos de conexão ausentes.

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Figura 10. Russula puiggarii. A, B – Basidioma; C, D – MEV dos basidiosporos; E – Basidiosporos; F – Macrodermatocistídios e elementos terminais da pileipelis; G – Basídios; pleurocistídios, basidíolos e subhimênio; H – Pleurocistídio; I – Queilocistídios e células marginais; J – Elementos terminais da superfície do estipe (esquerda) e macrodermatocistídios (direita) (Barra de escala = 10 µm).

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Russula puiggarii Singer Fig. – 11. Holotypus – BRASIL, Pará, Melgaço, FLONA de Caxiuanã, 15.IV.2013, VRM Coimbra et al. VCOC 144, (UFRN-Fungos 2191).

Píleo 38 mm, plano quando jovem e depresso quando maduro, liso no centro e sulcado em direção à margem; marrom escuro no centro (oac700 a oac733) e marrom claro (oac731 a oac681) na margem; superfície fibrilosa; contexto branco. Lamelas adnatas, próximas, brancas quando jovens e marrom claro quando maduro (oca 779), 3–5 mm, bordas inteiras; lamélulas ausentes. Estipe 30–80 × 3–10 mm, oco, central, cilíndrico, superfície lisa, esbranquiçado (oac816). Basidiosporos 7,2–8,4 × 6,0–8,4 µm (L= 8,1 µm; W=7,5 µm; Q=1,00–1,20(–1,40); Qm= 1,10), globosos a subglobosos, ocasionalmente amplamente elipsóides, ornamentação amilóide com espinhos cônicos com 2 μm de altura, interconectados por linhas espessas formando um retículo completo; região suprahilar hialina. Basídios 48–60 × 12–17 µm, clavados, 4 esterigmas curvados com 4–6 μm de altura. Macropleurocistídios 48–90 × 6– 20 µm, claviformes, mucronados, emergindo do subhimênio, de parede fina. Subhimênio composto por células isodiamétricas com 6–12 × 5–10 µm. Borda da lamela estéril, com células marginais 18–28 × 5–14 µm clavadas, hialinas e com queilocistídios 25–48 × 5–14 µm. Trama da lamela composta por esferocistos 14–21 × 7–15 μm e hifas com 2–3 μm de diâm., hialinos. Pileipelis sem coloração em KOH 3 %, ortocromática em azul crezil, 90 μm de espessura; suprapelis com elementos terminais 23–36 × 3,6–4,8 µm, lageniforme com uma cadeia de 3-5 células globosas na base 8–13 × 6–11 µm e de parede fina; dermatocistídios com 24–54 × 5–11 µm, cilíndricos à inflados na parte superior, algumas vezes mucronados; subpelis composta por hifas entrelaçadas com 2–3 μm de diâm. Superfície do estipe semelhante à pileipelis em estrutura, composta por elementos terminais com 18–42 × 2,4–6 µm, lageniformes, com cadeias de 3-5 células globosas 6–12 × 4,8–9,6 µm com caulocistídios com 28–48 × 7–13 µm, abundante, cilíndrico a levemente clavado, algumas vezes mucronado. Grampos de conexão ausentes.

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Figura 11. Russula puiggarii. A – Basidioma; B,C – MEV dos basidiosporos; D – Basidiosporos; E – Basídios, basidíolos e subhimênio; F – Macrodermatocistídio e elementos terminais da pileipelis; G – Macropleurocistídios; H – Células marginais e queilocistídios; I – Caulocistídios e elementos terminais da pileipelis (Barra de escala = 10 µm).

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Comentários: Buyck & Ovrebo (2002) discutem sobre a posição taxonômica de R. puiigarii, a mesma já foi colocada na seção Pelliculariae R. Heim, um nome inválido, restando duas outras seções Inflatinae Buyck e Pseudoepitheliosinae Buyck, ambas de espécies africanas e neotropicais, mas os autores consideram R. puiigarii muito próxima à R. declinata Buyck que pertence a seção Inflatinae, que é uma seção com espécies apenas africanas, onde permanece até hoje.

Russula glutinosa Sá &Wartchow nom. prov. Fig – 12. Holotypus – BRASIL, Pernambuco, Jaqueira, RPPN Frei Caneca, crescendo solitário, 15.IX.2013, VRM Coimbra et al. VCOC 95 (UFRN-Fungos 2185).

Píleo com 33–54 mm, levemente convexo, com superfície glutinosa quando úmido ou molhado, marrom (5E4, 5F5) no centro e marrom acinzentado (5D3) em direção à margem; margem tuberculada-estriada. Lamelas adnatas, laranja esbranquiçado (5A2), finas, com borda lisa e inteira; lamélulas ausentes. Estipe com 64–112 x 9–13 mm, cilíndrico e afilando em direção à base, central, liso, fibroso e de coloração laranja esbranquiçado (5A2) com pontos avermelhados (5C3), com contexo branco com alguns pontos avermelhados (5C3). Odor agradável. Basidiosporos com 8,4–9,6(–10,2) × 7,8–9,6 µm (L = 9,18 µm; W = 8,54 µm; Q=1,00– 1,21(–1,43); Qm= 1,08), globoso a subgloboso, raramente levemente elipsóide, ornamentação amilóide com 1–2 µm de altura, conectadas formando um retículo completo. Basídios 49–78 × 12–18 µm, inflado na metade superior, com 4 esterigmas com 5–7 µm de altura. Pleurocistídios 68–92 × 8–14 µm, lageniformes a mucronados no ápice, com 20 µm acima do nível do himênio e hialino. Trama da lamela composta por esferocistos 18–30 × 14–24 µm, hifas 3,6–6 µm de diâm., hialino e sem conteúdo refringente. Borda da lamela estéril, com células marginais 18–54 × 5–8 µm, clavadas e hialino, presença de queilocistídios com 54–72 × 8–18 µm. Pileipelis gelatinosa, com 180 µm de espessura, composta por hifas radialmente orientadas, com 3,6–4,8 µm de diâm., presença de dermatocistídios 24–36 × 2–6 µm, com conteúdo refringente e projetando-se todos juntos até 36–48 µm acima dos demais elementos da pileipelis, são cilíndricos, abundantes, com hifas refringentes com 5–7 µm de diâm., distribuídas na suprapelis. Superfície do estipe é similar a pileipelis em estrutura, sendo composta por hifas radialmente orientadas com 3,6–

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4,8 µm de diâm., presença de caulocistídios com 38–60 × 4–7 µm, com conteúdo refringente, projetando-se todos juntos, são abundantes e cilíndricos, presença de hifas com conteúdo refringente, com 5,8–7 µm de diâm. Grampos de conexão ausentes.

Figura 12. Russula glutinosa. A,B - Basidiomas; C,D – MEV dos basidiosporos; E – Basidiosporos; F – Dermatocistídios; G – Basidíolo, basídio e subhimênio; H – Pleurocistídio; I – Células marginais (esquerda) e queilocistídios (direita); J – Caulocistídio e elementos terminais da superfície do píleo. (Barra de escala = 10 µm).

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Comentários: Russula glutinosa é caracterizada pelo píleo 33–54 mm, levemente convexo, com superfície glutinosa quando úmido ou molhado, marrom no centro e marrom acinzentado em direção à margem; margem tuberculada-estriada; lamela adnata, laranja esbranquiçado sem lamélulas. Basidiosporos globosos a subglobosos, raramente levemente elipsóides, ornamentação amilóide com 1–2 µm de altura, conectadas formando um retículo completo. Pileipelis gelatinosa, com 180 µm de espessura, composta por hifas radialmente orientadas, presença de dermatocistídios com conteúdo refringente, e projetando-se todas juntas acima dos demais elementos da pileipelis, são cilíndricos, abundantes, com hifas refringentes distribuídas na suprapelis. Russula glutinosa pertence ao subgênero Heterophyllidia, este grupo apresenta espécies com basidiomas que variam muito de tamanho e cores, contexto espesso ou fino e podem ou não apresentar anel (BUYCK et al., 2018). Buyck (1990) descreveu R. subseção Pseudoepitheliosinae Buyck que é caracterizada pela presença dermatocistídios na suprapelis e presença de uma subpelis, com a espécie africana R. pseudoepitheliosinae Buyck como tipo. Posteriormente, Buyck e Ovrebo (2002), ao analizarem espécies neotropicais, descreveram e consideraram que dermatocistídios descritos por Singer seriam elementos terminais da pileipelis que continham conteúdo granular ou refringente. Russula glutinosa apresenta dermatocistídios com conteúdo refringente, presença de subpelis gelatinosa o que faz com que esta espécie pertença a subseção Pseudoepitheliosinae. Buyck (1990) também separa os táxons desta subseção pela cor do píleo. As espécies com cores vívidas ocorrem na África, enquanto espécies com coloração marrom a amarelo ocorrem nos neotrópicos. Para os neotrópicos, há uma espécie venezuelana R. moyersoeni Buyck que difere da R. glutinosa pela presença comum de dermatocistídios hialinos e a cor amarelada do píleo (Buyck, 1990). Outra espécie neotropical é R. panamae Buyck & Ovrebo do Panamá, esta espécie difere por apresentar cor olivácea do píleo, basidiosporos menores e subglobosos (6,1–) 6,5– 7,3 (–7,5) × (5,3) 5,9–6,8 μm e, assim como R. glutinosa, apresenta elementos terminais com conteúdo refringente disperso na pileipelis (BUYCK; OVREBO, 2002).

Russula candida Sá, Wartchow & Coimbra nom. prov. Fig – 13.

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Holotypus – BRASIL, Pernambuco, Jaqueira, RPPN Frei Caneca, crescendo solitário, 15.IX.2013, VRM Coimbra et al. VCOC 116, (UFRN-Fungos 2186).

Píleo com 28 mm de diâm., levemente depresso, liso, gelatinoso, de coloração branco amarelado (4A2) no centro e branco (4A1) em direção a borda e com margem inteira. Lamelas adnatas, branca e de margem inteira; lamélulas presentes com comprimentos diferentes. Estipe com 24 × 5 mm, cilíndrico, central, liso, de coloração branca com mancha amareladas (4A2), contexto oco e com câmaras, branco e sem odor. Basidiosporos com (7,2–)8,4–9,0(–9,4) × (6,7–)77,2–8,4 µm (L= 8,5 µm; W=7,7 µm; Q=1,00–1,25(–1,34); Qm= 1,11), globosos à levemente elipsóides, ornamentações amilóides com 1–2 µm de altura, conectadas por linhas finas formando um retículo completo com região supra hilar amilóide. Basídios 38–60 × 8–14 µm, inflados da metade para cima, com 4 esterigmas com 5–10 µm de altura. Macropleurocistídios com 48–67 × 6–10 µm, clavado à mucronado no ápice, emergindo do subhimênio, amarronzado em KOH 3 %. Trama da lamela estéril, com células marginais 28–32 × 5–10 µm clavadas e hialina e queilocistídios com 36–66 × 5–11 µm, cilíndrico, levemente mucronado no ápice. Pileipelis gelatinosa com 144 µm de espessura, composta por dermatocistídios refringentes 34–60 × 6–10 µm, mucronados, de coloração avermelhada em KOH 3 %; subpelis composta por hifas entrelaçadas com 2,4–3,6 µm de diâm., hialinas e hifas oleíferas com 6–10 µm de diâm. Superfície do estipe similar a pileipelis em estrutura, compostas por hifas refringentes 4–7 µm de diâm. e hifas oleíferas com 4–7 µm de diâm. e sem caulocistídios. Grampos de conexão ausentes. Comentários: Russula candida é caracterizada macroscopicamente pelo basidioma de coloração branca e microscopicamente pelos basidiosporos globosos à levemente elipsóides, com ornamentações amilóides com 1–2 µm de altura, conectadas por linhas finas formando um retículo completo com região supra hilar amilóide, presença de macrodermatocistídios e macropleurocistídios e pela pileipelis gelatinosa.

72 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB

Figura 13. Russula candida. A – Basidioma; B,C – MEV dos basidiosporos; D – Basidiosporos; F – Macrodermatocistídios; G – Basídios, basidíolos e subhimênio; H – Macropleurocistídios ; I – Células marginais e queilocistídios (Barra de escala = 10 µm).

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Buyck & Ovrebo (2002) ao analizarem a espécie Russula aucarum Singer, que possui um basidioma de coloração branca e o classificaram dentro da seção Delicoarchaeae Singer (Singer et al. 1983). Porém, eles discutem a similaridade de R. aucarum com as espécies da seção Metachromaticae, que possuem basidiomas brancos também e concluem que não há caracteres sufucientes para separá-los, e assim passaram a considerar a seção Delicoarchaeae como sinônima da seção Metachromaticae. Desse modo temos, R. candida pertencendo a seção Metachromaticae e diferindo de Russula metachromatica, R. metachromatica subsp. tarumaensis, R. metachromatica subsp. notoleuca nom. inval. e R. omnileuca pela ausência de pileipelis com reação metacromática e ausência de metulóides no himênio. Difere também de R. aucarum pelos basidiosporos menores (6,7–)7,1–7,90–8,3(–8,9) × (6,1–)6,3–6,80–7,1(–7,3) µm, ausência de macropleurocistídio, cistídios escassos e na estrutura da pileipelis que é tipo ixocutis em R. aucarum com poucos ou nenhum dermatocistídios.

Russula rondonensis Sá & Wartchow sp. nov. Fig - 14.

Holotypus – BRASIL, Rondônia, Porto Velho, Parque Ecológico Municipal de Porto Velho Coimbra VCOC11 (UFRN-Fungos– 2193).

Píleo 30–35 mm de diâm., levemente depresso no centro, superfície lisa no centro e levemente sulcada em direção a margem, de coloração castanho a castanho mostarda (5E4- 5E6). Lamelas subdecurrentes, distantes, de coloração laranja acinzentado (5B2); lamélulas frequentes com diferentes comprimentos. Estipe 15–25 × 4–6 mm, central, superficie lisa, de coloração cinza a esbranquiçado (8B1-8C1). Basidiosporos com 7,2–8,4(–9) × 6,0– 7,8(–8,4) µm (L= 7,8; W=7,26; Q=1,00–1,17(–1,20); Qm= 1,08), globoso a levemente elipsóide, ornamentação amilóide com 1–2 µm de altura, conectadas por linhas finas, mas formam um retículo completo. Basídio com 42–55 × 7–12 µm, inflado na parte superior, presença de 4 esterigmas com 4,8–8,4 µm de altura. Macropleurocistídio com 48–64 × 6–9,6 µm, lageniforme ou com o ápice mucronado, hialino com conteúdo amorfo. Subhimeno composto por células isodiamétricas 8,4–12 × 6– 8,4 µm. Trama da lamela composta po esferocistos com 25–48 × 18–37 µm e hifas com 3,6–6 µm, não refringentes. Borda da lamela estéril, com células marginais 14–36 × 6–14

74 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB

µm clavado, hialino, sem queilocistídios. Pileipelis gelatinosa, de coloração amarronzada em KOH 3 %, com 90 µm de espessura, composta por elementos terminais com 19–36 × 3,6– 8,4 µm, lageniforme, com cadeias de 3-5 células globosas a elipsóides 12–28 × 6–22 µm; dermatocistídios com 42–96 × 5–11 µm, abundante, cilíndrico a inflados na parte superior, às vezes mucronado; subpelis compostas por hifas entrelaçadas com 2,4–4,8 µm e contexto com esferocistos 14–37 × 12–30 µm. Superfície do estipe similar a pileipelis em estrutura, composto por caulocistídios 60–102 × 6–11 µm, abundante, cilíndrico a inflado na parte superior, por vezes mucronado e com hifas refringentes 4,8–8,4 µm, presença de esferocistos com 18–24 × 12–20 µm, hialinos. Grampos de conexão ausentes.

Comentários: Russula rondonensis é caracterizado pelo píleo robusto, levemente depresso no centro, superfície lisa no centro e levemente sulcada em direção a margem, de coloração castanho a castanho mostarda. Lamelas subdecurrentes, distantes, de coloração laranja acinzentado, presença de lamélulas frequentes com diferentes comprimentos. Estipe central, superficie lisa, de coloração cinza a esbranquiçado.

R. rondonensis pertence a seção Fistulosae (Heim ex Singer) Buyck, esta seção é caracterizada por apresentar píleo muitas vezes muito carnudo ou submembranoso, de coloração marrom escuro ou castanho acinzentado, marrom alaranjado, ocraceous ou esbranquiçado, às vezes laranja ou amarelo brilhante; revestimento raramente liso, às vezes tomentoso, geralmente granuloso. Lamelas muito próximas a espaçadas, geralmente com a mesma coloração do píleo (BUYCK, 1993).

As espécies da seção Fistulosae que são mais semelhantes a R. rondonensis são as da subseção Pallidorimosinae Buyck por apresentarem píleo de coloração ocráceo acastanhado com sulcos partindo do centro em direção a margem. Basidiosporos com região supra hilar inamiloide. Pileipelis constituídas por elementos grandes e dermatocistos finos e cilíndricos (BUYCK, 1993).

A subseção Pallidorimosinae possui duas espécies descritas a Russula ochraceorivulosa Buyck e Russula pallidorimosa Buyck. A primeira difere macroscopicamente da R. rondonensis por apresentar um píleo maior com 75–80 mm de diâm., de coloração marrom acinzentado ou alaranjado, estipe de coloração marrom acinzentado; e microscopicamente por apresentar esporos maiores 8,2–9,4 × 6,8– 7,8 µm (Q=1,11–1,21), com ornamentações

75 Sá, M.C.A – Russulaceae Lotsy em áreas do Norte e Nordeste do Brasil, depositados nos herbário UFRN-Fungos e JPB pequenas conectadas por linhas finas; a superfície do estipe difere pela presença de caulocistídios. As pileipelis são similares, e ambas apresentam suprapelis gelatinosa e dermatocistídios com conteúdo refringente, bem como elementos terminais lageniformes, outro elemento comum entre as espécies é a presença de macrocistídios mucronados e dermatocistídios mucronados a levemente mucronados (BUYCK, 1993).

Russula pallidorimosa difere macroscopicamente da R. rondonensis por apresentar um píleo ligeiramente maior 55 mm de diâm., porém a cor do píleo marrom esbranquiçado semelhante a da R. rondonensis; o estipe é mais robusto com 27 × 12 mm, subcilíndrico e de coloração esbranquiçada semelhante a R. rondonensis; e microscopicamente difere por apresentar esporos levemente menores 6,8–7,8 × 5,8– 6,9 µm (Q=1,04–1,21), com ornamentações cilíndricas, isoladas com 1,5 µm de altura. Possui muitas características em comum como a presença de macrocistídios mucronados, pileipelis gelatinosa com dermatocistídios refringentes e mucronados, bem como elementos terminais lageniformes (BUYCK, 1993).

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Figura 14. Russula rondonensis A – Basidiomas; B,C – MEV dos basidiosporos; D – Basidiosporos; E – Elementos terminais da pileipelis e macrodermatocistídios; F – Basídios, basidíolos e subhimênio; G – Macrodermaticistídios, basidíolos, basídios and subhimênio; H – Caulocistídios (Barra de escala = 10 µm).

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5.2 Procedimentos em biologia molecular Quinze espécimens dos gêneros Lactifluus e Russula que ocorrem no Brasil foram utilizados para extração e sequenciamento de material genético, com uma taxa de sucesso de 40%. Dessa forma, foi possível obter material genético para análise molecular das seguintes espécies brasileiras: Lf. dunensis Sá & Wartchow, Lf. caatingae Sá & Wartchow, Lf. piperogalactus, Lf. paraensis, Lf. venosellus e R. glutinosa. Porém, desses materiais, só foi possível obter sequências de nrITS, apesar de tentativas de extrair LSU e Rbp2. Um dos maiores problemas foi devido à alguns materiais serem relativamente antigos ou por estarem contaminados. Foram realizadas duas análises moleculares, uma para o gênero Russula (Figura 15) e outra para o gênero Lactifluus (Figura 16). O melhor modelo evolutivo, estimativo para o alinhamento foi TIM2f+I+G, para as duas análises e a pesquisa de bootstrapping para MV parou depois de 504 réplicas.

5.2.1 Análise molecular das espécies de Lactifluus Das espécies brasileiras de Lactifluus a maioria das sequências utilizadas nas análises moleculares pertencem aos subgêneros Lactariopsis, com um representante para Gymnocarpi e Pseudogymnocarpi, essas seções foram abordadas por De Crop et al. (2017), numa reestruturação da classificação de Lactifluus. Como grupo externo foi utilizado Lf. conchatulus (D. Stubbe & H.T. Le) D. Stubbe, que pertence a seção Gerardii. As espécies brasileiras Lf. caatingae, Lf. dunensis e Lf. paraensis pertencem ao clado do subgênero Lactariopsis com um bom suporte (94% IB/1 BPP). Este subgênero é caracterizado por elementos de parede espessa da pileipelis e pseudocistídios que são bastante emergentes e largos. A única espécie que diverge dessas características é Lf. paraensis que possui elementos terminais de parede fina. Na análise filogenética realizada por De Crop et al. (2017), não foi atribuída uma seção as espécies sulamericanas, apenas chamaram o agrupamento dessas espécies de “clado 2”, e atribuem a este grupo a presença de um véu secundário no estipe e na margem do píleo. Nenhuma das espécies brasileiras apresenta essa característica. Isso pode ter ocorrido devido a não inclusão de espécies brasileiras, o que pode ter deixado insuficiente os caracteres morfológicos deste grupo.

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Outro ponto que é importante ressaltar é que Lf. paraensis aparece como Lf. venezuelanus (Dennis) De Crop (90% IB/0.89 BPP) na árvore filogenética, estas espécies compartilham a subpelis pseudoparenquimatosa, porém diferem pelos basidiosporos com ornamentações isoladas, menores 7–8,8(–9,1) × 6,3–7,1(–8,1) µm, os basídios também são maiores (40–)45–56 × 10–12(–13) µm, pela presença de hifas lacticíferas na pileipelis e ausência de dermatocistídios. Outro ponto importante a ser mencionado é que as espécies de Lf. venezuelanus (G1066, RC/Guy 09-004bis e G3031), utilizadas na análise molecular descrita acima, não possuem descrição morfológica, o que inviabiliza a confirmação de que seria realmente Lf. venezuelanus ou uma espécie apenas similar morfologicamente (BUYCK; DE MEIJER, 1999; DE CROP et al., 2017). Além de Lf. paraensis também há o Lf. caatingae e Lf. dunensis que apresentam todas as combinações de caracteres do subgênero. Lactifluus dunensis havia sido anteriormente classificado dentro da seção Rugati e, posteriormente, sinonimizado para seção Tomentosi (SÁ et al. 2013a) Lactifluus piperogalactus pertence ao clado do subgênero Gymonocarpi com um bom suporte (96% IB). Este subgênero é composto por espécies que apresentam a seguinte combinação dos caracteres: pileipelis lampropalisada, ausência de pseudolamprocistídios e com látex de coloração amarronzada e/ou contexto ficando amarronzado quando exposto ao ar. De Crop et al. (2017) não criaram uma seção para este grande grupo, no trabalho apenas colocaram como “clado 9” de alto suporte. Lactifluus piperoalactus não possui pileipelis lampropaliçada, mas apresenta o contexto ficando amarronzado quando exposto ao ar, bem como ausência de pseudolamprocistídios, o que valida sua inclusão neste subgênero (DE CROP et al. 2017). Lactifluus venosellus pertence ao clado do subgênero Pseudogymnocarpi seção Polysphaerophori com um bom suporte (72% IB/0.98 BPP). Segundo De Crop et al. (2017) a seção contém apenas espécies que pertencem a América Central e do Sul. Porém, as espécies que foram utilizadas para a análise de classificação desta seção ou não possuem descrição ou os caracteres são tão gerais que torna difícil fazer uma caracterização morfológica confiável para as espécies deste grupo. É importante ressaltar que esta análise utiliza apenas ITS e, portanto, o suporte só é satisfatório a nível des espécies dentro de cada subgênero, não sendo satisfatória a comparação entre os subgêneros.

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5.2.2 Análise molecular da espécie de Russula

Foi possível obter apenas uma sequência de espécie brasileira para o gênero Russula, a R. gelatinosa. Esta espécie pertence ao subgênero Heterophyllidia e este grupo é caracterizado por apresentar espécies com basidiomas que variam muito de tamanho e cores, com contexto espesso ou fino e podem ou não apresentar anel (BUYCK et al., 2018). A classificação das espécies tropicais deste subgênero em seções é dificultada, devido a classificação de Heterophyllidia baseada em Romagnesi (1967) incluir apenas espécies de clima temperado. A definição das características desse grupo foi alterada depois do trabalho de Buyck (1993; 1994; 1997) com descrição de espécies africanas, alterando conceitos como coloração do píleo e tamanho do basidioma extremamente pequenos. (i.e. parte de Heim ‘‘Pelliculariae’’). Buyck et al. (2018), ao realizarem trabalho de filogenia para o gênero Russula utilizarando espécies de todos os continentes, concluíram que mesmo utilizando amplo espectro de espécimes, a caracterização morfológica desse grupo permenece complexa. A espécie R. gelatinosa possui caracteres representativos para este subgênero e; no entanto, como nas análises moleculares não foram utilizadas sequências de espécies brasileiras e também por não haver descrição dos caracteres morfológicos das seções que foram propostas, esses fatores fazem com que a classificação se torne ainda mais difícil (Buyck et al. 2018). Considerando essa dificuldade, Buyck et al. (2018) relatam que a discussão sobre as seções será debatida em outro manuscrito que será publicado posteriormente; no entanto, até a presente momento os autores ainda não publicaram esse artigo, dessa foram preferimos não delimitar a seção de R. glutinosa.

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Figura 15. Topologia da árvore filogenética de mássima verossimilhança de Lactifluus baseada em sequências de ITS. Valores de probabilidade posterior são apresentadas à esquerda de cada nodo. A barra de escala representa o número esperado de alterações de nucleotídeos por sítio.

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Figura 16. Topologia da árvore filogenética de mássima verossimilhança de R. gelatinosa baseada em sequências de ITS. Valores de probabilidade posterior são apresentadas à esquerda de cada nodo. A barra de escala representa o número esperado de alterações de nucleotídeos por sítio.

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6. CONCLUSÕES

As análises de espécimes de Russulaceae provenientes do Norte e Nordeste do Brasil permitem concluir que: • Foram realizados estudos morfológicos, moleculares e taxonômicos de espécies da família Russulaceae das regiões Norte e Nordeste do Brasil. • As análises moleculares evidenciam que quatro espécies de espécies do gênero Lactifluus descritas nesse trabalho foram distribuídas em três subgêneros com alto suporte, evidenciando que as espécies brasileiras podem representar, possivelmente, novas seções devido aos seus caracteres morfológicos distintos; • Os dados obtidos corroboram com a literatura recente no que diz respeito a dificuldade na classificação morfológica para a família Russulaceae, tanto para o gênero Russula quanto Lactifluus; mostrando que, mais estudos moleculares incluindo espécies brasileiras são necessários para que se possa ter uma visão mais ampla dos caracteres morfológicos e moleculares da família Russulaceae. • Foram identificadas novas espécies para a ciência e novos registros para as duas regiões.

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