B UNIVERSITE D'antananarivo FACULTE DES SCIENCES

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE ET ECOLOGIE VEGETALES THESE POUR L'OBTENTION DU DIPLOME DE DOCTORAT EN SCIENCES DE LA VIE SPECIALITE: SCIENCE DU VEGETAL

CARACTERES PHENOLOGIQUES, MORPHOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DES FLEURS IMPLIQUÉS DANS LE MECANISME DE LA POLLINISATION

CHEZ LES BAOBABS MALGACHES

Présentée par RAZANAMARO Onja Hariveloniaina Morilline Soutenue publiquement le 29 avril 2016 devant le Jury composé de : Président : Pr. RAMAVOVOLOLONA Perle Directeur : Pr. RAKOUTH Bakolimalala Co-directeur: Dr. DANTHU Pascal Rapporteur interne : Pr. RAJERIARISON Charlotte Rapporteur externe : Pr. RAZANAKA Samuel Examinateurs: Pr. RAKOTOARIMANANA Vonjison Pr . MENUT Chantal Membre invité : Mme CLEMENT VIDAL Anne

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE ET ECOLOGIE VEGETALES THESE POUR L'OBTENTION DU DIPLOME DE DOCTORAT EN SCIENCES DE LA VIE SPECIALITE : SCIENCE DU VEGETAL

CARACTERES PHENOLOGIQUES, MORPHOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DES FLEURS IMPLIQUÉS DANS LE MECANISME DE LA POLLINISATION CHEZ LES BAOBABS MALGACHES

Présentée par RAZANAMARO Onja Hariveloniaina Morilline Soutenue publiquement le 29 avril 2016 devant le Jury composé de :

Président : Pr. RAMAVOVOLOLONA Perle Directeur : Pr. RAKOUTH Bakolimalala Co-directeur: Dr. DANTHU Pascal Rapporteur interne : Pr. RAJERIARISON Charlotte Rapporteur externe : Pr. RAZANAKA Samuel Examinateurs: Pr. RAKOTOARIMANANA Vonjison Pr MENUT Chantal Membre invité : Mme CLEMENT VIDAL Anne

Photos de couverture (O. Razanamaro): de gauche à droite: fleurs d'A. suarezensis, A. grandidieri et A. perrieri (en haut) et A. rubrostipa, A. madagascariensis et A.za (en bas). Remerciements

Le travail présenté dans cette thèse est le fruit de la collaboration entre le Département de Biologie et Ecologie Végétales de l'Université d’Antananarivo et le CIRAD et a été réalisé avec le soutien financier du gouvernement français par l'intermédiaire du projet IFB, du projet ECOBAO et à travers des bourses de mobilité (DESI) octroyées aux doctorants du Sud ainsi que la fondation Internationale pour la Science (IFS).

Au terme de ce travail, je voudrais dire merci et témoigner toute ma profonde et respectueuse gratitude à :

- Professeur RAMAVOVOLOLONA d’avoir bien voulu corrigé le manuscrit et de présider ce mémoire, malgré ses nombreuses occupations au sein du Département. Qu’elle trouve ici mes sincères remerciements ;

- Professeur Bakolimalala RAKOUTH, pour ses nombreux conseils, son encadrement et les corrections apportées au manuscrit ainsi que la grande disponibilité qu’elle a su m'accorder. Elle m’a fait un très grand honneur de diriger cette thèse. Mes remerciements ne suffiront jamais pour toute l’attention dont elle a fait preuve à mon égard ;

- Docteur Pascal DANTHU d’avoir apporté son soutien, ses expériences, et qui a toujours manifesté, à mon égard, une grande patience, une écoute constante et de m’avoir guidée et jusqu’aux dernières corrections de la thèse. Je suis profondément touchée par sa compréhension et j’aimerais exprimer ma profonde gratitude envers lui ;

- Professeur Charlotte RAJERIARISON m’a fait l’honneur d’accepter d’être le rapporteur interne de cette thèse en dépit de ses nombreuses obligations.

- Professeur Samuel RAZANAKA, malgré ses lourdes responsabilités, a bien voulu accepter d’être le rapporteur externe de cette thèse.

- Professeur Vonjison RAKOTOARIMANANA, malgré ses lourdes tâches, a bien voulu accepter d’être l’examinateur de cette thèse.

- Professeur Chantal MENUT, malgré ses multiples responsabilités, a eu l'amabilité de me transmettre une partie de ses connaissances dans le domaine des molécules chimiques et des parfums floraux et d’assurer la fiabilité de ce travail. Qu’elle trouve ici le témoignage de ma reconnaissance. Je suis vraiment très reconnaissante envers Mme Anne CLEMENT VIDAL, du Département BIOS de l'UMR AIVA au CIRAD Montpellier, sans elle, la thèse ne serait pas ce qu'elle est, aussi bien pour les travaux à Madagascar que pour les travaux au laboratoire à Montpellier. Elle a guidé ce travail de recherche, tout en me laissant beaucoup d’autonomie. Je la remercie pour la confiance qu’elle m’a toujours témoignée. C’est avec beaucoup de patience et de sympathie qu’elle a partagé avec moi ses connaissances. Merci!

Je remercie également Pr. Josoa RANDRIAMALALA RAMAROLANONANA de m’avoir aidé gracieusement sur les traitements statistiques des données.

Je suis vivement reconnaissante à:

- Docteur Tanguy LAFARGE, Directeur du Département de BIOS de l'UMR AIVA au CIRAD Montpellier France, de m'avoir accueilli au sein de son équipe au sein duquel une partie de ce travail a été effectuée et pour les nombreuses discussions durant mes séjours à Montpellier;

- Pr. Jean Luc VERDEIL, du Département de PHIV de Montpellier France, de m'avoir accepté au sein de son laboratoire pour mes expérimentations en histologie et de m'avoir aidé à l'interprétation des résultats;

- Dr. Cécile FOVET malgré ses lourdes responsabilités, m'a aidé gracieusement à la relecture de cette thèse ;

- Mme Marie Christine LAMBERT, de m’avoir aidé pendant les recueils bibliographiques depuis quatre ans déjà. Même si elle a été en arrêt maladie, elle n'a pas pu oublier de m'envoyer des références. Mes vifs remerciements et mes sincères reconnaissances!

- Mme Fabienne MONTES, technicienne au sein du Laboratoire PHIV, qui malgré ses innombrables occupations, m'a sincèrement aidé pour la réalisation de mes travaux de laboratoire ;

- Pr Huguette AGNANIET de m’avoir aidé généreusement afin de mener à bien mes travaux de laboratoire de chimie à Montpellier et pour sa précieuse amitié

- Dr. Elisabeth RABAKONANDRIANINA pour ses soutiens durant mes cursus universitaires ; - Nicole, Christine et Armelle pour leurs soutiens, leurs aides et leurs conseils. Merci pour les cartes postales!

- aux amis montpelliérains spécialement à Clémence JOLI, à Ignace RAKOTOARIVONY pour tous les bons moments passés à Montpellier au cours de ces quatre dernières années.

- à l’équipe du CIRAD Madagascar et l’équipe baobabs ainsi qu’à tout le personnel du laboratoire de Botanique et Ecologie végétales, Faculté des sciences, Université d’Antananarivo pour toute la générosité qu’ils m’ont témoignées.

- Seheno et Elysée, il y a tant à dire... Les seuls mots de ce paragraphe ne suffisent pas évidemment pour témoigner ma reconnaissance. Seheno, merci pour ton soutien et les partages, surtout lorsqu'il fallait "se changer les idées" et pour les relectures de cette thèse. Je remercie également Elysée pour son aide si gracieuse pendant les travaux de terrain et aussi pendant la rédaction de cette thèse. C'est vrai que ce n'est pas du tout anodin de se lever toutes les trois heures à faire des prélèvements de parfum au sommet d’un baobab alors que tu l'as toujours fait avec gentillesse.

- Mirana RAJAOBELINA d’avoir supporté mes humeurs pendant la réalisation de cette thèse, de m'avoir encouragé, et pour tant d'autres choses encore.

- ma Famille surtout à Frère Mahery, d'avoir patiemment écouté mes histoires d’odeur florale. J'adresse spécialement mes remerciements à mon beau père de m'avoir aidé à la relecture de cette thèse et pour tant d'autres choses. Je n'oublierai jamais vos témoignages de compréhension envers moi.

- mon mari et à petit Maël pour leur remarquable patience durant ces longues années. Ils ont pu supporter mes absences sans se plaindre et, en cela j’ai puisé les forces qui m’ont encouragée jusqu’au bout de cette thèse.

Toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de ce travail.

Misaotra indrindra!!!

TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIERES ...... i LISTE DES FIGURES ...... iv LISTE DES TABLEAUX ...... vi LISTE DES CARTES ...... vii LISTE DES PLANCHES ET PHOTOS ...... vii GLOSSAIRES ...... ix LISTE DES ABREVIATIONS et ACRONYMES ...... x INTRODUCTION GENERALE ...... 1 PARTIE I: -GENERALITES ...... 5 I. 1. LE GENRE Adansonia ...... 6 I.1.1. Historique et évolution de la systématique des baobabs ...... 6 I.1.2. Description générale des baobabs ...... 7 I.1.3. Mode de reproduction des baobabs ...... 9 I.1.4. Aires de distribution ...... 12 I. 2. CADRE DE L’ETUDE ...... 17 I.2.1. Phénologie florale et efficacité de la pollinisation ...... 17 I.2.2. Caractères morphologiques des fleurs et succès de la pollinisation ...... 18 I.2.3. Sécrétions florales et efficacité de la pollinisation ...... 19 I.2.4. Synergie entre les divers caractères floraux et succès de la reproduction ...... 22 I.2.5. Comportement des pollinisateurs et efficacité de la pollinisation ...... 23 I.2.6. Mode de reproduction des plantes ...... 23 PARTIE II - MATERIELS ET METHODES ...... 26 II.1. MATERIELS VEGETAUX ...... 27 I.2.1. Description botanique des espèces étudiées ...... 27 I.2.1. Collectes des échantillons ...... 29 II.3. ETUDES PHENOLOGIQUES ...... 32 II.3.1.Principe de suivi des stades phénologiques des baobabs ...... 32 II.3.2. Etude de la phénologie florale ...... 34 II.3.3. Suivi de l'anthèse ...... 34 II.4. MORPHOLOGIE ET MORPHOMETRIE DE LA FLEUR ...... 35 II.4.1. Morphométrie florale ...... 35 i

II.4.2. Etude de la structure morphologique et anatomique des tissus sécréteurs ...... 36 II.5. ETUDES BIOCHIMIQUES DES SECRETIONS FLORALES ...... 39 II.5.1.Caractérisations des odeurs florales chez les baobabs ...... 39 II.5.2. Détermination de la composition du nectar ...... 43 II.5.3. Analyses statistiques des données ...... 46 II.6. IDENTIFICATIONS DES POLLINISATEURS POTENTIELS ...... 47 II.6.1. Diversité et fréquence de visites des pollinisateurs ...... 47 II.6.2. Morphométrie des sphinx ...... 48 II.7. MISE EN EVIDENCE DES RELATIONS FLEUR-POLLINISATEUR ET EFFICACITE DE LA POLLINISATION ...... 50 PARTIE III - RESULTATS ...... 51 III.1. PHENOLOGIE DES SIX ESPECES DE BAOBABS MALGACHES ...... 52 III.1.1. Calendrier de floraison des espèces ...... 52 III.1.2. Phénologie d'A. grandidieri (Brevitubae) et d’A. rubrostipa (Longitubae)...... 53 III.1.3. Développement des boutons floraux ...... 57 III.1.4. Morphoséquence d'ouverture de la fleur ...... 59 III.2. MORPHOLOGIE ET MORPHOMETRIE DES FLEURS DE BAOBABS ...... 61 III.2.1. Caractères morphométriques des fleurs ...... 61 III.2.2. Morphologie et structure anatomique des tissus sécréteurs ...... 63 III.3. CARACTERISTIQUES BIOCHIMIQUES DES SECRETIONS FLORALES ...... 69 III.3.1. Composition biochimique des odeurs florales chez les baobabs ...... 69 III.3.2. Cinétique de l'émission de l'odeur florale...... 77 III.3.3. Caractéristiques du nectar chez les baobabs ...... 81 III. 4. DIVERSITE ET COMPORTEMENT DES POLLINISATEURS ...... 87 III.4.1.Diversité des pollinisateurs potentiels ...... 87 III.4.2. Fréquence des visites ...... 88 III.4.3. Relation morphométrique entre la longueur de la trompe et la taille des sphinx .. 90 III.5. INTERACTION FLEURS-POLLINISATEURS ET EFFICACITE DE LA POLLINISATION ...... 93 III.5.1 Rôles interactifs entre le nectar et les odeurs florales ...... 93 III.5.2. Coévolution morphologique entre les fleurs et les pollinisateurs ...... 96 PARTIE IV –DISCUSSION GENERALE ...... 98

IV.1. PARTICULARITES PHENOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DES FLEURS CHEZ LES BAOBABS MALGACHES ...... 99 IV.1.1. Caractéristiques phénologiques ...... 99 IV.1.2. Caractères biochimiques des fleurs de baobabs ...... 100 IV.2. IMPLICATIONS DES CARACTERES PHENOLOGIQUES ET BIOLOGIQUES DES FLEURS SUR LA TAXONOMIE DES BAOBABS MALGACHES ...... 101 IV.3. INTERACTIONS FLEURS-POLLINISATEURS et EFFICIENCE DE LA POLLINISATION ...... 104 IV.3.1. Pollinisation sphingophile chez les Longitubae ...... 105 IV.3.2. Pollinisation généraliste chez les Brevitubae ...... 106 IV.3.3. Mécanisme de la pollinisation chez les baobabs ...... 107 IV.4. MODES DE REPRODUCTION CHEZ LES BAOBABS MALGACHES ...... 109 IV.4.1. Phénologie florale et mode de reproduction ...... 109 IV.4.2 Herchogamie et mode de reproduction ...... 110 IV.5. CARACTERES PHENOLOGIQUES ET BIOLOGIQUES DES FLEURS ET PHENOMENES D'INTROGRESSION GENETIQUE...... 110 IV.5.1. Synchronisme floral et phénomène d’introgression génétique ...... 111 IV.5.2. Caractères des fleurs et phénomènes d’introgression génétique...... 112 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ...... 113 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 117 ANNEXES PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES

iii

LISTE DES FIGURES

Figure 1: Diagramme phénologique des six espèces de baobabs: (S) A. suarezensis, (G) A. grandidieri, (P) A. perrieri, (D) A. digitata, (Z) A. za, (R) A. rubrostipa et (M) A. madagascariensis (Razanameharizaka, 2009)...... 7 Figure 2: Présentation schématique des différents types d’osmophore chez les plantes. (a): cellules épidermiques transformées en glandes sécrétrices, (b) : cellules épidermiques à pieds, (c): trichomes, (d): cellules épidermiques à formes coniques et (e): cellules épidermiques à formes aplaties ; V: vacuole, N : noyau cellulaire, G: grains d’amidons (Tiré de Effmert, et al., 2006)...... 21 Figure 3: Différents types de nectaires. (a) : épithélium glandulaire, (b) : trichome et (c) : parenchymes nectarifères (Nicolson et Nepi, 2005). Ep: épiderme, Pa: parenchyme banal, St: stomate...... 22 Figure 4: Différents types de transfert de pollens et du mode de reproduction chez les Angiospermes (tiré et modifié de Lloyd et Webb, 1992)...... 24 Figure 5: Schéma simplifié du processus d'introgression génétique chez les plantes (Leong Pock Tsy et al., 2013)...... 25 Figure 6: Coupe longitudinale de la fleur d'A. rubrostipa (Longitubae). a: longueur du pistil, b: longueur des étamines, c: longueur du tube staminale, d : différence entre la hauteur de stigmate avec l’étamine, p: longueur du pétale et s: longueur du sépale. ts : tube staminal ; st : stigmate ; e: étamines ; p : pétale...... 35 Figure 7: Schéma récapitulatif de l’utilisation du disque MonoTrapTM ...... 40 Figure 8: Courbe étalon d'une solution mère de 2-phénylacétonitrile (r2 = 0,99)...... 41 Figure 9: Schéma réactionnel de dosages du glucose, du fructose et du saccharose...... 45 Figure 10: Schéma du type d'installation pour le piège lumineux ...... 49 Figure 11 : Calendrier de floraison des six espèces de baobabs malgaches...... 54 Figure 12: Phénogrammes comparatives de la floraison, feuillaison et fructification au sein de A. grandidieri ...... 55 Figure 13: Phénogrammes de la floraison, la feuillaison et la fructification au sein de A. rubrostipa (section Longitubae, à Andranomena) en fonction des conditions climatiques locales...... 56 Figure 14: Pic d’ouverture (PO) des fleurs chez A. grandidieri (Brevitubae) ...... 59 Figure 15: Pic d’ouverture (PO) des fleurs chez A. rubrostipa (Longitubae)...... 60

Figure 16 : Comparaison des pourcentages des composés volatils majoritaires entre les deux sections de baobabs ...... 74 Figure 18: Variation des pourcentages moyens des composés émis pendant 24 heures chez A. rubrostipa ...... 79 Figure 17: Cinétique d'émission des composés volatils pendant 24 heures chez A. rubrostipa, O : ouverture des fleurs, PO: Pic d’ouverture des fleurs ...... 79 Figure 19: Pourcentage des composés émis pendant 24 heures chez A. rubrostipa ...... 79 Figure 21: Variation des pourcentages moyens des composés émis pendant 24 heures chez A. grandidieri...... 80 Figure 20: Cinétique d'émission des composés volatils pendant 24 heures chez A. grandidieri, O : ouverture des fleurs ; PO : Pic d’ouverture des fleurs ...... 80 Figure 22: Pourcentages des composés émis pendant 24 heures chez A. grandidieri ...... 80 Figure 23. Volume moyen du nectar en (µL) des six espèces, avec une différence de t2 = 11,451, P < 0,0001...... 81 Figure 24. Concentrations moyennes (g/l), a): Glucose, b): Fructose et c): Saccharose des deux sections...... 82 Figure 25: Cinétique de production de nectar pendant 12 heures avec un intervalle de prélèvement de 3h00...... 84 Figure 26. Variation de la concentration moyenne (g/l) des glucides pendant 12 heures...... 85 Figure 27: Nombre d'individus des visiteurs identifiés sur A. grandidieri pendant une nuit. PO: Pic d'ouverture des fleurs...... 89 Figure 28. Nombre d'individus des visiteurs identifiés sur A. rubrostipa toutes les trois heures pendant les périodes d'observation. PO: Pic d’ouverture des fleurs ...... 90 Figure 29: Corrélation entre l'envergure et la longueur de la trompe des sphinx avec p= 0,0001...... 91 Figure 30. Interaction fleurs-pollinisateurs chez A. grandidieri...... 94 Figure 31: Interaction fleur-pollinisateur chez A. rubrostipa...... 95 Figure 32: Corrélations entre la longueur moyenne de la trompe des sphinx et de celle des étamines avec p=0,0001...... 96 Figure 33: Modèle de coévolution entre les des espèces de sphinx et la fleur de A. madagascariensis (Longitubae)...... 97 Figure 34: (a) Cladogramme de l’affinité biologique de chaque espèce de baobabs par les (a) caractères morphologiques et biochimiques des fleurs et (b) arbre génétique construit v

par « neighbour-joining » entre les espèces de baobabs (tiré et modifié de Leong Pock Tsy et al., 2013)...... 104 Figure 35: Processus biologique de la pré-pollinisation à la post-pollinisation chez les baobabs malgaches conforté par les résultats de Rasoamanana (2015)...... 109 Figure 36. Périodes appropriées aux échanges de pollens entre les espèces des Longitubae .111

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Sites d'études des différentes espèces de baobabs...... 15 Tableau 2 : Matériels biologiques échantillonnés pour les diverses études effectuées sur les baobabs ...... 31 Tableau 3 : Localités et nombre d'individus suivis par espèce...... 33 Tableau 4. Caractéristiques des acides benzéniques et des flavonoides observées avec différents filtres en microscopie optique ...... 38 Tableau 5. Caractéristiques des stades de développement de la fleur d'A. grandidieri...... 57 Tableau 6 : Caractéristiques des stades de développement de la fleur d'A. rubrostipa...... 57 Tableau 7 : Moyennes (± erreur standard) des mesures des pièces florales (mm) pour chaque section de baobabs malgaches...... 61 Tableau 8. Moyennes (± erreur standard) de la taille des pièces florales (mm) pour les deux espèces des Brevitubae...... 62 Tableau 9 : Moyennes (± erreur standard) de la longueur des pièces florales (mm) pour les quatre espèces des Longitubae...... 62 Tableau 10. Longueurs moyennes (± erreur standard) du pistil (fleur femelle) et de l' étamine + tube staminal (fleur mâle ) de la fleur et différences entre les deux mesures. .... 63 Tableau 11. Pourcentages (moyenne ± erreur standard) des composés volatils identifiés sur les fleurs des six espèces de baobabs endémiques à Madagascar. IR: Indice de rétention pour chaque composé volatil identifié...... 70 Tableau 12. Pourcentages moyens des composés volatils de l'odeur florale chez les espèces de Brevitubae ...... 76 Tableau 13. Pourcentages moyens des composés volatils dans l'émission florale des quatre espèces de Longitubae ...... 77 Tableau 14 : Concentrations moyennes (g/l) en glucose, fructose et saccharose des six espèces...... 83 vi

Tableau 15. Températures et Humidités relatives moyennes pendant la période de prélèvement du nectar chez A. grandidieri et A. rubrostipa...... 86 Tableau 16. Corrélations entre les facteurs climatiques (températures et humidités) et les caractéristiques biochimiques du nectar (glucoses, fructoses, saccharoses et volume) pour A. grandidieri et A. rubrostipa...... 86 Tableau 17. Concentrations moyennes (g/l) en protéines, proline et en acides aminés pour cinq espèces de baobabs malgaches...... 87 Tableau 18. Différents types de visiteurs identifiés sur les fleurs des six espèces de baobabs malgaches...... 88 Tableau 19 : Longueurs moyennes (mm) de la trompe et taille des espèces de sphinx...... 91 Tableau 20 : Synthèse des caractères distinctifs au sein des six espèces de baobabs malgaches...... 103 Tableau 21. Probabilités d'échanges de gène entre les quatre espèces de Longituabe...... 112

LISTE DES CARTES

Carte 1 : carte de distribution des baobabs dans le monde. D’après Baum (1995a) et Pettigrew et al. (2012) ...... 12 Cartes 2 . Aires de distribution des six espèces de baobabs endémiques malgaches (a) A. za, (b) A. rubrostipa, (c) A. madagascariensis et A. perrieri, (d) A. grandidieri et A. suarezensis (Source : Dupuy et Moat, 1996 modifiées par Leong Pock Tsy et al., 2013). . 14 Carte 3 : Répartition des sites d'échantillonnage des baobabs dans leurs aires de distributions à Madagascar (Source : Dupuy et Moat 1996, modifiée par Razanamaro, 2014)...... 16

LISTE DES PLANCHES ET PHOTOS

Planche 1: Fleurs et fruits caractéristiques: (Photos 1 et 4) A. rubrostipa, (Photos 2 et 5) A. za et (Photos 3 et 6) fleur et fruit à caractères morphologiques intermédiaires entre A. rubrostipa et A. za à Tsimanapetsotsa...... 10 Planche 2: Fleurs et fruits caractéristiques: (Photos 7 et 10) A. za, (Photos 8 et 11) A. perrieri et (Photos 9 et 12) fleur et fruit à caractères morphologiques intermédiaires entre A. za et A. perrieri à Migioko ...... 11 vii

Planche 3: Fleurs des six espèces de baobabs endémiques malgaches (Photos 13 à 18) ...... 30 Photo 19: Microtome Leica RM 2225 …………………………….37 Photo 20: Microscope photonique Leica DM 6000 relié avec une camera 200R et un

ordinateur ………………………………………………….… ...... ….39 Photo 21 : Fleur d'A. rubrostipa encapuchonnée et exposée aux disques MonoTrapTM ...... 42 Photo 22: Prélèvement de nectar à la base du pétale sur A. perrieri …… ... …………………44 Photo 23: Mesure de la longueur de la trompe du sphinx………………… ...... ………49 Photo 24: Mesure de l’envergure du sphinx…………………………………… ...... ……49 Planche 4: Stades de développement de la fleur chez A. grandidieri (Photos 25 à 29) et A. rubrostipa (Photos 31 à 36): depuis le bouton à la formation de fruit...... 58 Planche 5: Localisation et structure anatomique de l'osmophore chez A. rubrostipa (Photos 37 à 40) ...... 64 Planche 6: Localisation et structure anatomique de l'osmophore chez A. grandidieri (Photos 41 à 43) ...... 65 Planche 7 : Localisation de nectaires chez A. rubrostipa (Photos 44 à 46) ...... 66 Planche 8: Structure anatomique des nectaires chez A. rubrostipa (Photos 47 à 49) ...... 67 Planche 9: Localisation de nectaires chez A. grandidieri (Photos 50 à 53) ...... 68 Planche 10: Structure anatomique des nectaires chez A. grandidieri (Photos 54 à 56) ...... 69 Planche 11: Longueur des trompes des espèces de sphinx identifiées sur les baobabs malgaches (Photos 57 à 60)...... 92

viii

GLOSSAIRES Allofécondation : fécondation du gamète femelle par un gamète mâle provenant d'une fleur d’un individu différent, non-apparenté

Allogamie : mécanisme sexuel de croisement entre deux fleurs différentes résultant du transfert de pollens des anthères d'une fleur vers le stigmate d'une autre fleur Allopatrique : se disent des taxa affines ayant des aires de distributions éloignées. Allopollinisation : pollinisation par des pollens provenant d'un individu différent Autofécondation : fécondation du gamète femelle par un gamète mâle du même individu par transfert de pollens (spontané ou effectué par des agents de pollinisation) de la même fleur, d'une fleur différente du même individu (par géitonogamie) ou d'une fleur d'un individu différent, mais apparenté (consanguinité biparentale) Autogamie : mécanisme sexuel de croisement dans une seule fleur hermaphrodite résultant du transfert de pollens sur le stigmate de la même fleur. Mécanisme autonome ou pouvant être effectué par un vecteur extérieur Autopollinisation : pollinisation par des pollens provenant d'une même fleur ou d'un même individu (autofécondation). L'autopollinisation peut se réaliser sans intervention de vecteur de pollen. Biosynthèse : formation d’une substance organique au sein d’un être vivant. Coadaptation : ajustement mutuel de caractères entre les organes (aspect morphologique) ou entre deux espèces partenaires (aspects comportementaux). Coévolution : évolution parallèle de deux espèces en étroite interaction Constance florale : comportement de butinage d’un insecte ayant une préférence particulière sur un même type de fleur donnée. Consanguinité : reproduction entre individus apparentés résultant des mécanismes tels que l'autogamie, la géitonogamie ou les croisements entre individus apparentés, génétiquement proches (consanguinité biparentale). Déperdition de pollen : diminution de la quantité de pollen d'une plante pour la l'allofécondation suite à la réalisation d’une autofécondation. Géitonogamie : mécanisme sexuel de croisement résultant du transfert de pollens entre les fleurs d'un même individu Geitonopollinisation: pollinisation réalisée entre les fleurs au sein d'un même individu. Génotypes : ensemble des caractères génétiques d’un individu

Herchogamie: mécanisme floral permettant la séparation dans l'espace des organes sexuels (étamine et stigmate), c’est la forme la plus évoluée de l’herchogamie. Interférence sexuelle: conflits et compromis entre les rôles parentaux des fonctions mâles (anthères) et femelles (style) dans une fleur hermaphrodite. La séparation des sexes dans l'espace et dans le temps pourrait être une réponse à la résolution de ces conflits Phylogénie : étude de la formation, la relation et l`évolution des organismes vivants en vue d`établir leur parenté Sympatrie : se disent des taxa affines qui cohabitent dans une même localité

LISTE DES ABREVIATIONS et ACRONYMES CEPF: Critical Ecosystem Partnership Fund. CNFEREF : Centre National de formation, d’étude et de recherche en Environnement et foresterie. CIRAD: Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement CPG: Chromatographie en Phase Gazeuse CPG/SM: Chromatographie en Phase Gazeuse couplée à la Spectrophotométrie de Masse Dhp: Diamètre à hauteur de poitrine FOFIFA: Foibem-pirenena momba ny Fikarohana ho Fampandrosoana ny eny Ambanivohitra. FTM: Foibe Taosaritanin’i Madagasikara GPS: Global Positioning System HPLC: Chromatographie liquide à haute performance ou High Performance Liquid Chromatography IFB: Institut Français de la Biodiversité MNP: Madagascar National Parks PPS: Parcelle Permanente de Suivi UICN: Union Internationale pour la Conservation de la Nature. URP: Unité de Recherche en Partenariat

INTRODUCTION GENERALE

Razanamaro, 2010 O. Razanamaro 2009

1 Les baobabs, genre Adansonia, font partie du "patrimoine naturel mondial" grâce à leurs valeurs particulières socioculturelles, écotouristiques et scientifiques (Rajaonah, 1990). A Madagascar, les baobabs sont connus par leur aspect original et leur taille imposante et sont parmi les arbres les plus caractéristiques de l'écosystème forestier tropical sec du sud et de la côte occidentale de l'île. Au-delà de leur aspect si caractéristique, les fruits, les graines et les feuilles présentent des appoints nutritionnels essentiels pour les populations locales (Perrier de la Bâthie, 1953). Les fruits des baobabs ont des valeurs nutritives particulières et leurs graines sont riches en matières grasses qui sont extraites pour fournir de l’huile alimentaire et industrielle (Baum, 1995a). L'écorce riche en fibre est utilisée pour le cordage, pour la fabrication de toiture et des murs des cases d’habitation. Les baobabs ont un intérêt socioculturel car dans la partie sud ouest de Madagascar, ces arbres sont vénérés par les populations locales. Sur le Plateau Mahafaly, les baobabs sont utilisés comme des réservoirs d'eau (Wickens et Lowe, 2008). Ils sont ainsi appelés "baobabs-citernes" (Jumelle et Perrier de la Bathie, 1912;Cabanis et al., 1970). Les baobabs constituent également une richesse écotouristique pour Madagascar, en citant entre autres les touristes japonais qui semblent vouer un intérêt particulier pour les baobabs.

A Madagascar, le baobab a un niveau d'endémisme élevé. Parmi les neuf espèces présentes dans le monde, sept espèces existent à Madagascar (Baum, 1995 a; Pettigrew et al., 2012; Leong Pock Tsy et al., 2013) et six espèces sont endémiques: Adansonia grandidieri, A. suarezensis, A. perrieri, A. madagascariensis, A. rubrostipa, et A. za ; Adansonia. digitata et une espèce venant d'Afrique et devenue autochtone à Madagascar. L'espèce A. kilima, nouvellement découverte en Afrique de l’Est (Pettigrew et al., 2012) et A. gregorii F. Muell. endémique de l’Australie (Baum, 1995a; Wickens et Lowe, 2008) complètent les neuf espèces de baobabs dans le monde.

Cependant, depuis plusieurs décennies, les écosystèmes des baobabs sont considérablement fragilisés par une déforestation importante. Les causes de cette déforestation sont surtout attribuées à la pratique de la culture sur abattis-brulis et des feux de brousse liés à l'élevage pastoral (Razanaka et al., 2001). Cette déforestation a provoqué une régression significative des aires de distribution de toutes les espèces de baobabs. Peu de leur population sont actuellement en forêt et la plupart se rencontrent en milieu dégradées (Baum, 1995a ; Leong Pock Tsy et al.,2013). Par conséquent, les baobabs présentent un apparent déficit de régénération lié entre autres au faible recrutement de jeunes individus (Baum,

1995b, Razanameharizaka, 2009) et à la disparition des disperseurs de graines (Andriatsaralaza et al. 2013). Les menaces qui pèsent sur les baobabs malgaches conduisent à poser des bases scientifiques pour une gestion durable de la conservation de ces espèces malgaches. L’acquisition de connaissances sur les processus biologiques et écologiques qui permettent à ces espèces de survivre au sein des écosystèmes modifiés par l’homme devient cruciale. Le mécanisme de la pollinisation est parmi les processus biologiques fondamentaux à la pérennisation de l’espèce dans son écosystème. Les connaissances acquises sur la pollinisation indiquent que les quatre espèces de baobabs, A. rubrostipa, A. za, A. madagascariensis et A. perrieri (section Longitubae) sont pollinisées par des Lepidoptères nocturnes appartenant à la famille de Sphingidae et les espèces A. grandidieri et A. suarezensis (section Brevitubae) sont pollinisées par des chauves- souris et par de petits lémuriens nocturnes (Baum, 1995b ; Andriafidison et al., 2006 ; Ryckewaert et al., 2011). Rasoamanana (2015) a montré que les Sphingidae sont les pollinisateurs efficaces pour les baobabs. Néanmoins, malgré les études effectuées sur la pollinisation des baobabs, la connaissance sur ce mécanisme est loin d’être complète. Par ailleurs, Leong Pock Tsy et al. (2013) ont montré que les espèces des Longitubae développent un phénomène d’introgression génétique. Ce phénomène est le résultat d’une pollinisation en retour des hybrides avec des espèces parentales aboutissant ainsi à des individus morphologiquement identiques à l’un des parents mais conservant les parties du génome de l’autre. D’une manière générale, ce processus est une forme d’évolution, une réponse adaptative mise en place par les espèces à long cycle de vie (Jimenez et al., 2004 ; Lumaret et al., 2005 ; Duminil et al., 2006). L’introgression génétique est le résultat d’un croisement interspécifique qui ne peut se réaliser que par un pollinisateur commun qui est attiré de façon successive par les fleurs de deux espèces différentes à phénologie florale synchrone et à aire de répartition sympatrique. La réalisation de ce phénomène d’introgression dépend essentiellement à l’interaction fleurs- pollinisateurs. Les caractères floraux permettent d'attirer des pollinisateurs et d'augmenter la probabilité d’un transfert de pollen entre les fleurs de la même espèce, assurant la pollinisation intraspécifique, ou entre les fleurs de différentes espèces, entrainant la pollinisation interspécifique. Pour permettre la réussite de ce croisement, une similarité des traits floraux (odeur florale et nectar) doit exister entre les espèces et l’expression des caractères attractifs doit être synchrone à l’activité du pollinisateur. Afin d'attirer un même 3

type de pollinisateur, les différentes espèces doivent évoluer vers des formes de fleurs équivalentes adaptées à ce pollinisateur : c'est la "convergence évolutive" (Fenster et al. 2004). De plus, pour qu'un même pollinisateur visite une espèce après une autre, ces espèces doivent être en sympatrie et ont une période de floraison partiellement chevauchante. Les espèces adaptées au même type de pollinisateur partagent alors les mêmes caractéristiques florales et phénologiques (Grant, 1994, Faegri et van der Pijl, 1979, Fenster et al. 2004). De plus; la phénologie, en particulier la période de floraison, est en partie corrélée avec l'abondance et le comportement du pollinisateur (Herrera et al., 1989). La présente étude a donc pour objectifs de caractériser le mode de pollinisation des différentes espèces de baobabs malgaches en tenant compte des caractères phénologiques, morphologiques et biochimiques des fleurs d’une part et de discuter la relation adaptative entre fleurs-pollinisateurs afin de confirmer le mode de pollinisation des baobabs et par la suite les conséquences sur la biologie et la structuration génétique au sein du genre Adansonia. A cet effet, les hypothèses émises sont: (i) la diversité morphologique et biochimique des fleurs est adaptée aux types et aux comportements des pollinisateurs; (ii) la phénologie et la biologie florale permettent de définir le mode de pollinisation chez les baobabs et (iii) la présence d'un ou de plusieurs caractères floraux communs entre certaines espèces qui attirent un même pollinisateur, favorise les croisements interspécifiques et la réalisation de l’introgression génétique. Cette thèse est articulée autour de quatre grandes parties : - la première partie présente les généralités constituant la base pour la compréhension des autres parties. Les aires de distributions des baobabs malgaches y seront présentées afin de déterminer les lieux permettant les échanges entre espèces. L'étude des pollinisateurs sera également entreprise dans cette partie. - la deuxième partie décrit les matériels et les méthodes utilisées lors de la réalisation de ce travail. - la troisième partie présente les résultats et interprétations. - et la quatrième partie est consacrée à la discussion générale des résultats obtenus.

PARTIE I: -GENERALITES

O. Razanamaro 2009

I. 1. LE GENRE Adansonia

I.1.1. Historique et évolution de la systématique des baobabs Le Baobab fut décrit pour la première fois par Prospero Alpino, en 1592 dans Plantis Aegypti liber (livre des plantes d’Egypte). Le nom de Baobab a été employé pour la première fois sous la graphie « ba hobab » qui est devenue au XVIIème siècle « Baobab ». Le nom « ba hobab » provient du terme arabe « bu hibab » qui signifie « fruit aux nombreuses graines ». En 1757, Michel Adanson fut le premier à publier une description botanique détaillée avec illustration du baobab. En hommage au Botaniste Michel Adanson, Carl Von Linné et Bernard de Jussieu ont choisi le nom du genre Adansonia. En 1789, le baobab a été classé dans la famille des Malvaceae par Jussieu avant d’être classé dans la famille des Bombacaceae en 1822 par Kunth. Plus tard, en 1997, le genre Adansonia a été replacé dans la famille des Malvaceae du fait de nombreux caractères de ressemblance avec les autres genres des Malvaceae (Alverson et al., 1999; Judd et Manchester, 1997). Baillon, en 1890, a décrit dans le Bulletin de la Société Linnéenne de Paris, trois espèces d'Adansonia, qu’il avait dénommé Adansonia madagascarensis, Adansonia za et Adansonia fony sans donner de diagnose.

En 1953, Perrier de la Bâthie a proposé une nomenclature assez complète plus proche de la classification actuelle. En 1995, Baum a révisé la systématique du genre Adansonia grâce aux outils moléculaires, aux études écologiques, morphologiques et phénologiques (Baum, 1995a). Ce genre présente désormais neuf espèces dans le monde dont sept existent à Madagascar où six y sont endémiques (Baum, 1995 a; Pettigrew et al., 2012; Leong Pock Tsy et al., 2013). Les espèces du genre Adansonia sont groupées dans trois sections:  la section des Brevitubae comprend deux espèces Adansonia grandidieri Baillon et Adansonia suarezensis H. Perrier ;  la section des Longitubae contient quatre espèces endémiques (Adansonia perrieri Capuron, Adansonia madagascariensis Baillon, Adansonia rubrostipa Jum. & H. Perrier, et Adansonia za Baillon) et une espèce d’Australie (Adansonia gibosa).  les espèces africaines Adansonia digitata L. et Adansonia kilima appartiennent à la section Adansonia.

Les six espèces endémiques malgaches sont Adansonia grandidieri Baillon, Adansonia suarezensis H. Perrier, Adansonia perrieri Capuron, Adansonia madagascariensis Baillon, Adansonia rubrostipa Jum. & H. Perrier, et Adansonia za Baillon.

I.1.2. Description générale des baobabs I.1.2.1. Caractères phénologiques des principaux groupes La période de feuillaison pour toutes les espèce commence dès les premières pluies et se termine pendant la saison sèche. Selon Razanameharizaka (2009), les espèces peuvent être groupées en trois catégories suivant les périodes de la floraison, la fructification et la maturité de fruits (Figure 1) : - le premier groupe comprend A. rubrostipa et A. madagascariensis : leur floraison commence entre le début du mois de février et la fin du mois d'avril et la maturité des fruits se situe à partir du mois de juillet ; - le deuxième groupe inclut A. perrieri, A. digitata et A. za : leur floraison commence avant la première pluie (mois de novembre) et la maturité des fruits s'effectue pendant la période sèche (mois d'aout au mois de septembre); - le troisième groupe est constitué par A. suarezensis et A. grandidieri : leur floraison commence au début de la saison sèche, à la fin du mois d'avril, et la maturité de fruits se déroule au début de la saison des pluies (novembre – décembre).

Groupe

pe 2 pe

Grou

Groupe

I.1.2.2. Caractères morphologiques de la fleur Les caractères floraux constituent une des principales différences entre les trois sections (Baum 1995b et Ryckewaert et al., 2011). Les deux espèces de Brevitubae ont des fleurs blanches à pièces florales courtes (moins de 70 mm) et présentent de nombreuses étamines d’au moins 700 par fleur, soudées à la base en un tube staminal court (12 à 13 mm). La section Adansonia a des fleurs pendantes, de couleur blanche avec au moins 720 étamines soudées en un tube staminal de 30 à 50 mm de long. En revanche, les espèces de la section des Longitubae ont des fleurs tubulaires dont les pièces florales sont longues d’environ 110 mm. Le nombre des étamines est en moyenne de 300 par fleur avec une longueur moyenne de 100 mm. Ces étamines sont soudées sur un tube staminal d’environ 70 mm. Au sein de cette section, une grande diversité de couleurs de pétale est observée: jaune chez A. za ; jaune orangé pour A. rubrostipa ; rouge, rouge orangé et jaune pour A. madagascariensis et jaune chez A. gibosa (Ryckewaert et al., 2011).

I.1.2.3. Composition biochimique de l’odeur florale La plupart des plantes à fleurs émettent des odeurs pour attirer leurs pollinisateurs. Ces odeurs dites florales sont essentiellement diffuses à la surface des pétales et formées par de nombreux composés volatils. L’odeur florale d’Adansonia digitata L. (section Adansonia) est caractérisée par la présence de composés soufrés tels que le disulfure de diméthyl, 3-méthyl- butanethioate de méthyle et thioacétate de méthyle (Jaeger, 1950; Baum, 1995 b; Petterson et al., 2004). Par ailleurs, chez les baobabs malgaches, les caractéristiques de l’odeur florale n’ont jamais été étudiées. Baum (1995 b) a décrit sommairement que les fleurs des Brevitubae sont moins odorantes alors que celles de Longitubae sont très parfumées.

I.1.2.4. Caractéristiques du nectar Hormis les brèves descriptions de Baum (1995b), il n'y a pas, à notre connaissance, d'étude approfondie sur les composants biochimiques du nectar des baobabs. Pourtant, une relation étroite pourrait exister entre les caractéristiques du nectar et le type de pollinisateurs. Le nectar du baobab est riche en saccharose avec une concentration moyenne en glucides de 11,75 à 18,25% chez les Brevitubae et de 19 à 22% chez les Longitubae (Baum, 1995 b). La quantité de nectar secrétée au sein des Brevitubae est d’environ 1900µL et celle de

Longitubae est en moyenne 250µL. Les caractéristiques du nectar au sein de la section Adansonia n’ont pas été identifiées jusqu’à ce jour (Baum 1995b).

I.1.3. Mode de reproduction des baobabs

I.1.3.1. Les agents pollinisateurs de baobabs Depuis 1977, la pollinisation des baobabs était définie par rapport à la forme florale des espèces. Armstrong a suggéré que les baobabs malgaches étaient ornithophiles du fait des couleurs rouge et orange de la fleur (Armstrong, 1977). A partir de 1995, l’observation nocturne effectuée par Baum a permis d’identifier que les Brevitubae étaient visités la nuit par des chauves-souris, comme celles du baobab africain (Start, 1972), ou bien par de petits lémuriens nocturnes. Les Longitubae étaient visités par des sphinx, lépidoptères nocturnes appartenant à la famille des Sphingidae (Baum, 1995 et Ryckewaert et al., 2011). Rasoamanana (2015) a pu démontrer pour la première fois que les chauves-souris, Pteropus rufus sont des pollinisateurs efficaces pour les Brevitubae et les sphinx (Agrius convolvuli, Coelonia solanii, Panojena jasmini) pour les Longitubae.

I.1.2.6. Mécanismes de la pollinisation et phénomène d'introgression génétique Les études effectuées par Rasoamanana (2015) montrent que les baobabs sont allogames facultatives c’est-à-dire qu’ils peuvent réaliser à la fois l’allopollinisation et l’autopollinisation. L’allopollinisation est fonction du comportement des pollinisateurs qui butinent les fleurs d’un même individu et celles de deux individus différents. Un phénomène d’introgression génétique a été également identifié chez les baobabs notamment chez les Longitubae (Leong Pock Tsy et al., 2013). C’est un phénomène dû à une hybridation interspécifique suivie de croisements en retour successifs avec les parents (Lepais et al., 2009). L’introgression génétique a été identifiée chez les espèces sympatriques comme A.za et A. rubrostipa à Tsimanapetsotsa ainsi que A. perrieri et A. za dans le Nord de Madagascar. Sept pour cent (7%) des individus ont des caractères génétiques mélangés et présentent des caractères morphologiques intermédiaires c’est-à-dire la couleur de leurs pétales et la forme de leurs fruits sont intermédiaires de ceux de leurs parents (Photos 3 et 6, Photos 9 et 12 ; Leong Pock Tsy et al., 2013).

Planche 1 Fleurs et fruits caractéristiques : (Photos 1 et 4) A. rubrostipa, (Photos 2 et 5) A. za et (Photos 3 et 6) fleur et fruit à caractères morphologiques intermédiaires entre A. rubrostipa et A. za à Tsimanapetsotsa.

Leong Pock Tsy et al., 2013 Leong Pock Tsy et al., 2013 Leong Pock Tsy et al., 2013

Photo 3: Fleur à caractères Photo 1 : Fleur Photo 2: Fleur d’A. za à d’A.rubrostipa à Ifaty Mahabo floraux intermédiaire entre A. rubrostipa et A. za

Leong Pock Tsy et al., 2013 Leong Pock Tsy et al., 2013 Leong Pock Tsy et al., 2013

Photo 4: Fruit d’A. Photo 5: Fruit d’A.za à Photo 6: Fruit à forme et rubrostipa à Ifaty Mahabo taille intermédiaires entre A. rubrostipa et A. za

Planche 2 Fleurs et fruits caractéristiques : (Photos 7 et 10) A. za, (Photos 8 et 11) A. perrieri et (Photos 9 et 12) fleur et fruit à caractères morphologiques intermédiaires entre A. za et A. perrieri à Migioko (d’après Leong Pock Tsy et al., 2013).

Leong Pock Tsy et al., 2013 Leong Pock Tsy et al., 2013 Leong Pock Tsy et al., 2013

Photo 7 : Fleur d’A. za à Photo 8 : Fleur d’A. Photo 9 : Fleur à caractères Mahabo perrieri à floraux intermédiaire entre A. perrieri et A. za Ambondromifehy

Leong Pock Tsy et al., 2013 Leong Pock Tsy et al., 2013 Leong Pock Tsy et al., 2013

Photo 10 : Fruit d’A. za Photo 11 : Fruit d’A.perrieri Photo 12 : Fruit à forme et

à Mahabo à Ambondromifehy taille intermédiaires entre A.

perrieri et A. za

I.1.4. Aires de distribution

I.1.4.1. Distribution des baobabs dans le monde Le genre Adansonia est présent à Madagascar, au Nord Ouest de l’Australie et dans les savanes africaines (Armstrong, 1983; Miège, 1974; Wickens, 2008) (carte 1).

La répartition mondiale de ces neuf espèces est la suivante :

- A. digitata se trouve en Afrique, à Madagascar, aux îles Comores et aux îles Maurices.

- A. kilima est récemment découverte en Afrique de l’Est (Pettigrew et al., 2012).

- A. grandidieri, A. suarezensis, A. rubrostipa, A. madagascarensis, A. perrieri et A. za sont présents à Madagascar et A. madagascariensis est récemment identifiée à Mayotte (Charpentier, 2006).

- A. gregorii se trouve dans la région de Kimberley au Nord-ouest de l’Australie (Baum, 1995a; Wickens, 2008).

Carte 1 : carte de distribution des baobabs dans le monde. D’après Baum (1995a) et Pettigrew et al. (2012)

I.1.4.2. Répartition géographique des six espèces endémiques malgaches A Madagascar, les six espèces endémiques Adansonia za, A. rubrostipa, A. madagascariensis, A. perrieri, A. grandidieri et A. suarezensis se rencontrent exclusivement sur la côte occidentale, du Nord au Sud à une altitude généralement inférieure à 800 m. Certaines espèces ont des aires de répartition très limitée, comme les deux espèces les plus septentrionales, A. perrieri et A. suarezensis alors que d’autres ont des aires très larges comme A. za et A. rubrostipa (Cartes 2) :

- A. za se rencontre depuis Androy jusqu' au Sambirano en passant par le Kirindy; - A. rubrostipa est localisée dans la région du Menabe, de Morombe, du secteur d’Ambongo, et de Besalampy à Soalala - A. madagascarensis se rencontre dans la forêt de Betsalo, dans le bassin de Majunga, dans le Sambirano et la Loky (Vohémar), à proximité d’Antsiranana et sur le plateau de l’Ankarana ; - A. perrieri est cantonnée sur le plateau de l’Ankarana et dans le parc national de la Montagne d’ Ambre ; - A. grandidieri se trouve à Befandriana-Sud, Andavadaoka, le long du lac Ihotry et dans la région de Morondava (Bekonazy, Andranomena, Mahabo, Beroboka et à Marofandilia) ; - A. suarezensis est strictement localisée dans l’extrême Nord de l’île à la périphérie de la baie d’Antsiranana (forêt de Beantely, Ivovona et Montagne des Français) (Leong Pock Tsy et al., 2013). Les aires de distributions de ces espèces sont soumises aux climats subhumide chaud de l’Ouest à semi-aride du Sud et avec une pluviométrie annuelle variant de 500 à 1500 mm (Cornet, 1974). La température moyenne annuelle varie de 30 à 33°C (saison chaude et humide) et de 15° à 21°C (saison fraiche et sèche) avec une longue saison sèche marquée de six à neuf mois (Annexe 1).

b) a)

d) c)

Cartes 2 . Aires de distribution des six espèces de baobabs endémiques malgaches (a) A. za, (b) A. rubrostipa, (c) A. madagascariensis et A. perrieri, (d) A. grandidieri et A. suarezensis (Source : Dupuy et Moat, 1996 modifiées par Leong Pock Tsy et al., 2013). 14

I.1.4.3. Localisation des sites d’études Les collectes des échantillons ont été effectuées dans les parties occidentales de Madagascar du Nord au Sud. Chaque espèce a été étudiée dans au moins deux localités sauf pour A. perrieri, espèce rare, pour laquelle seul un site a pu être étudié (Tableau 1). Vingt sites appartenant à quatre régions ont été étudiés à savoir Diana, Boeny, Morondava et Atsimo Andrefana. Ces sites d'échantillonnage ont été choisis pour représenter au mieux les zones de distribution des baobabs dans leur aire de distribution. La carte 3 montre les différents sites d’étude avec les espèces d’Adansonia respectives.

Tableau 1 : Sites d'études des différentes espèces de baobabs.

Espèces Sites Coordonnées géographiques Andranomena 20°11'03,6"S ; 44°25'25,7"E Ambalorao 22°03’17,0’’S ; 43°17’17,0’’E A. grandidieri Bekonazy 20°14′59,2′′ S ; 44°25′12,2′′ E Ampanihy 20°25′22,2′′ S ; 44°43′15,3′′ E Kirindy 20°04′20,9′′ S ; 44°40′29,8′′ E Montagne des Français 12°19’02,0’’S ; 49°20’05,0’’E A. suarezensis Mahavanona 12°26′44,5′′S ; 49°25′45,4′′E Beantely 12°16′08,7′′S ; 49°10′19,3′′E Ankarana 12°57’39,0’’S ; 49°07’33,0’’E Amboazango 16°24’29,8’’S ; 47°04'00,6"S A. madagascariensis Anjemangirana 16°24′12,7′′S ; 47°05′49,3′′E

Ambalihakely 16°24′12,7′′ S ; 47°05′49,3′′ E Kirindy 20°04'20,9''S ; 44°39'13,9''E A. za Mahabo 20°19'56,0''S ; 44°33'31,6"E Tsimanampetsotse 24°04′36,0′′S ; 43°45′20,8′′E Ampataka 20°09'16,5"S ; 44°26'31,3"E Beroboka 20°00'34,9"S ; 44°34'54,4"E A. rubrostipa Ifaty 23°04′39,9′′S ; 43°37′2,2′′E Tsimanampetsotse 24°04′36,0′′S ; 43°45′20,9′′E A. perrieri Ambondromifehy 12°52′9,1′′ S ; 49°13′37,3′′ E

Aires de distributions Sites d'études

Carte 3 : Répartition des sites d'échantillonnage des baobabs dans leurs aires de distributions à Madagascar (Source : Dupuy et Moat 1996, modifiée par Razanamaro, 2014).

I. 2. CADRE DE L’ETUDE

L’efficacité de la pollinisation dépend généralement des caractères phénologiques, morphologiques et biochimiques des fleurs.

- La phénologie est l’étude des différentes phases du développement des plantes au cours de leurs cycles de vie telle que la phénologie florale. De plus, elle permet de connaitre les conditions de disponibilité des fleurs et les développements des pièces florales ou anthèse. Ces deux paramètres peuvent influencer l’efficacité au butinage des pollinisateurs.

- L’efficience de la pollinisation requière également une coadaptation morphologique entre la taille de la fleur et celle des pollinisateurs. Cette « correspondance » morphologique est le reflet d’une sélection naturelle excluant les visiteurs inefficaces, et augmentant le transfert de pollen par ceux plus efficaces.

- Enfin, pour que les fleurs puissent attirer et fidéliser les pollinisateurs, elles émettent un maximum d’odeur florale qui n’est attractive que parce qu’elle annonce une promesse de récompense, le nectar et conditionne ainsi le transfert de pollens.

I.2.1. Phénologie florale et efficacité de la pollinisation Depuis plusieurs décennies, des auteurs ont considéré que la période de floraison est en partie un résultat de la coévolution entre les plantes et les pollinisateurs. Ces derniers doivent augmenter leur efficacité au butinage en fonction du nombre et de la distribution des fleurs au fil du temps (Levin et Anderson 1970). De plus, Janzen 1967, Gentry 1976 ont constaté que le pic de floraison, correspondant au nombre élevé d’individus en fleur, a lieu au moment où il y a le maximum des pollinisateurs. Par conséquent, ce pic est potentiellement associé avec un accroissement du succès de la reproduction.

Chez les espèces en sympatrie et en particulier pour les espèces congénères, le chevauchement partiel de la période de floraison favorise le croisement interspécifique (Stephenson 1982). Cependant, selon Anderson et Schelfhout (1980) et Schmeske (1981), le synchronisme de la période de floraison entre les espèces congénères peut provoquer des compétitions sur l'attraction des pollinisateurs. Par conséquent, la ségrégation de la période de floraison entre les espèces congénères permet d'éviter cette compétition (Wheelwright, 1985).

I.2.1.1. Facteurs influençant les stades phénologiques L’état phénologique d’une plante peut être affecté par de nombreux facteurs immédiats (proximate causes) souvent d’origine environnementale comme les changements de température (Williams-Linera, 1997), l’irradiance ou la photopériode (Rivera et al., 2002). Pour les espèces vivant dans les forêts avec une saison sèche marquée (ce qui est le cas pour les baobabs), les changements de la disponibilité en eau sont aussi souvent considérés comme des facteurs déterminants sur l'état phénologique ; on peut citer entre autres le niveau de l’eau stockée par la plante, les précipitations, l’humidité atmosphérique et le sol (Opler et al., 1976; Borchert, 1994a ; Lobo et al., 2003). Cependant, les facteurs biotiques sont souvent considérés comme des causes majeures (ultimates causes) de l'état phénologique des espèces tropicales, en particulier l’attractivité pour les pollinisateurs (Sakai et al., 1999, Quesada et al., 2003).

La rythmicité de la phénologie peut être contrôlée par des facteurs endogènes et/ou exogènes (O'Brien et al., 2008). L’étude du synchronisme des comportements des individus d’une même population ou de plusieurs espèces est le principal critère permettant de déterminer l’origine endogène ou exogène d’un comportement périodique de la population végétale (Millet, 1972; Millet et Manachère, 1979, 1983). Le synchronisme élevé des événements phénologiques pour une population est souvent interprété comme l’action des facteurs externes tels que le climat, la lumière, les inondations (Borchert, 1983, Ashton et al., 1988, Schöngart et al., 2002). Par contre, les réponses individuelles sont souvent expliquées comme un résultat des contrôles endogènes (Borchert, 1983).

Enfin, certains auteurs estiment que la phénologie des plantes est essentiellement liée à leur phylogénie. Les espèces appartenant à un même taxon pourraient avoir une phénologie similaire, quel que soit leur environnement (Wright et Calderon, 2006).

I.2.2. Caractères morphologiques des fleurs et succès de la pollinisation La plante présente des caractères floraux variables pour s'adapter aux différents groupes de pollinisateurs afin d'optimiser leur pollinisation (Wallace, 1867 ; Nilsson, 1992, 1998a; Wasserthal, 1997). La morphologie, l'odeur florale et le nectar seront les caractères floraux considérés.

I.2.2.1. Taille et forme de la fleur Chez les plantes à fleurs nécessitant un vecteur de pollen pour leur pollinisation, la forme de la fleur est souvent corrélée avec la morphologie des pollinisateurs. Cette « correspondance » morphologique est le reflet d’une sélection naturelle excluant les visiteurs inefficaces, et augmentant le transfert des pollens par ceux plus efficaces. Fontaine, et al. (2006) ont remarqué que les « fleurs en tube » ont une réussite de pollinisation significativement élevée quand les plantes sont butinées par des pollinisateurs à pièces buccales longues tandis que la pollinisation des « fleurs en assiette » est efficaces quel que soit le pollinisateur.

I.2.2.2. Position de l'organe mâle et de l'organe femelle (herchogamie) La position relative des organes sexuels dans la fleur joue également un rôle important lors du dépôt des pollens sur le stigmate (Lloyd et Webb 1992). L'herchogamie est un mécanisme floral lié à la position de l'étamine et celle du stigmate sur une fleur (Barrett, 2002). L'herchogamie est interprété dans la littérature comme un mécanisme floral qui réduit l'autopollinisation (Barrett 2002, Mulcahy et Ottaviano, 1983) et optimise les flux de pollens ou "optimal outcrossing distance" (Waser et Price, 1983). Les espèces herchogames sont étroitement associées à un système d'incompatibilité c’est-à-dire que les espèces portant des styles longs ne sont compatibles qu’avec les espèces à étamines hautes et vis versa (Campbell, 1995).

I.2.3. Sécrétions florales et efficacité de la pollinisation I.2.3.1. Odeur florale Une odeur florale est un mélange de molécules organiques légères, dites composées volatils, parce qu’elles s’évaporent facilement de la surface de la fleur à température ambiante. Diverses odeurs sont émises et constituent des repères pour les pollinisateurs afin de les guider vers les ressources florales (Harborne, 1973). Le mélange d'odeur florale peut être plus ou moins complexe en fonction du nombre de composés qui le constituent et de la quantité émise dans le temps. En général, les fleurs d’une espèce végétale émettent entre 20 à 60 composés volatils (Dudareva et al., 2003) qui appartiennent souvent à cinq classes : les dérivés d’acides gras, les terpénoïdes, les aromatiques, les composés azotés et soufrés. Leurs critères de différenciation sont basés sur leur structure et leur origine ou voie de biosynthèse.

 Rôle des odeurs florales L’odeur florale présente un signal émis par les fleurs matures ; c’est-à-dire les fleurs dont le stigmate est réceptif à l’apport de pollens et/ou pour lesquelles les pollens sont prêts à être récoltés (Suchet, 2010). Pour les fleurs s’ouvrant la nuit, l’odeur constitue un signal précis qui permet de guider et diriger les pollinisateurs vers la fleur et vers la source du nectar (Kolosova et al., 2001). Ce signal d’attraction peut être perçu à de longue distance en fonction de l’intensité de l’émission. En effet, les pollinisateurs sont dotés d’organes spécialisés au niveau de leurs antennes pour détecter l’odeur florale. La plupart du temps, les pollinisateurs s’orientent en remontant le gradient du signal, jusqu’à la source d’émission. La composition de l'odeur florale est assimilée par les pollinisateurs (Knudsen et Tollsten, 1993; Bergström et al., 1995). Les fleurs pollinisées par des chauves-souris sont, par exemple, dominées par des composés soufrés alors que les plantes pollinisées par des lépidoptères, en particulier les sphinx, émettent des composés plutôt constitués par des terpènes oxygénés et des composés azotés (Takashi et al.,1998; MacFarlane et Mori, 2003). Enfin, Majetic et al. (2007) ont démontré dernièrement chez Hesperis matronalis que les plantes aux odeurs florales les plus intenses pouvaient produire beaucoup de graines.

 Structures de l'organe sécréteur de l'odeur florale ou osmophore L'odeur florale n'est pas libérée de façon diffuse, mais émise par des organes précis (Vogel, 1963). Le terme osmophore est défini comme étant une zone délimitée ou des tissus floraux spécialisés dans l'émission d’odeurs florales (Vogel, 1963). Dans la plupart des cas, les cellules sécrétrices sont éparses sur le périanthe. Parfois, elles sont groupées et portées par des organes floraux spécialisés. L'osmophore est essentiellement caractérisé par des épidermes glandulaires riches en substances de réserves et sont alimentés par le phloème. Différents types d'osmophore sont connus chez les plantes à savoir (Figure 2): cellules épidermiques transformées en glandes sécrétrices (Fig.2 A), cellules épidermiques à pied (Fig.2 B), trichomes (Fig.2 C), cellules épidermiques à forme conique (Fig.2 D) et cellule épidermique en bulle aplatie (Fig.2 E).

a) b) G c)

d) G G e)

Figure 2: Présentation schématique des différents types d’osmophore chez les plantes. (a): cellules épidermiques transformées en glandes sécrétrices, (b) : cellules épidermiques à pieds, (c): trichomes, (d): cellules épidermiques à formes coniques et (e): cellules épidermiques à formes aplaties ; V: vacuole, N : noyau cellulaire, G: grains d’amidons (Tiré de Effmert, et al., 2006).

I.2.3.2. Caractères et rôles du nectar floral Le nectar est constitué principalement de sucres en solution aqueuse mais contient également des lipides, des acides aminés, des protéines, des minéraux, des acides organiques et des vitamines (Pacini et Vesprini., 2003 ; Petanidou, 2005; Petanidou et al., 2006). La concentration du nectar peut varier de 4 à 60% selon les espèces. Les plantes peuvent être classées en trois catégories selon la dominance des sucres principaux présents dans leurs nectars : espèces à saccharose dominant, espèces à fructose et glucose dominants, espèces à taux voisins de saccharose, de fructose et de glucose (Dafni et al., 2005). Le nectar constitue la principale source de nourriture, plus particulièrement de glucide, pour les visiteurs. Les études approfondies de Baker et Baker (1973a, 1975, 1983 et 1990) révèlent la présence d’une coévolution adaptative entre la fleur et les pollinisateurs. La proportion spécifique du saccharose, en plus du glucose et du fructose, détermine la préférence et l'adaptation diététique des pollinisateurs. En effet, les Hyménoptères, préfèrent le nectar riche en glucides, les colibris ou les Lépidoptères préfèrent les nectars moins visqueux. Divers paramètres peuvent influencer la sécrétion de nectar, notamment l’âge et la position de la fleur sur l’inflorescence.

 Organe sécréteur de nectar ou "nectaire" Le nectar floral est sécrété par des tissus spécialisés très répandus chez les Angiospermes : les glandes nectarifères, ou "nectaires"(Fahn, 1979). En général, il existe deux types de nectaires: les nectaires floraux et les nectaires extrafloraux. Les nectaires floraux sont souvent situés à la base des organes floraux (au niveau du réceptacle), mais également sur les pétales, les sépales et le pistil alors que les nectaires extrafloraux sont observés à l'extérieur de la fleur sur un pétiole de feuille par exemple.

Les nectaires extrafloraux n’ont pas de structures glandulaires particulières à part la présence des vaisseaux conducteurs et des stomates. Par contre, les nectaires floraux sont structurés et souvent groupés en deux types histologiques : un type épidermique comprenant des épithéliums et des trichomes, et un type parenchymateux constitué de nombreuses assises de cellules parenchymateuses (Nicolson et Nepi, 2005 ; Figure 3).

b) c)

Figure 3: Différents types de nectaires. (a) : épithélium glandulaire, (b) : trichome et (c) : parenchymes nectarifères (Nicolson et Nepi, 2005). Ep: épiderme, Pa: parenchyme banal, St: stomate.

I.2.4. Synergie entre les divers caractères floraux et succès de la reproduction L'interaction fleur-pollinisateur est conditionnée par la présence de nectar, source de nourriture pour les pollinisateurs, et de l'odeur florale, comme un signal attractif. Ces deux caractères sont sélectionnés par la plante de sorte qu’ils sont adaptés à interagir efficacement. L’émission de l'odeur florale est maximisée quand le nectar abonde autrement dit, le pic 22

d'émission d'odeur florale coïncide au pic de production de nectar. Le rythme de production permet d'attirer des pollinisateurs au moment où la plante en a besoin (Schiestl et Ayasse 2001; Grison-Pigé et al., 2001a). La cinétique de production du signal peut être considérée comme une adaptation supplémentaire et indispensable à la rencontre entre plantes et pollinisateurs.

I.2.5. Comportement des pollinisateurs et efficacité de la pollinisation

I.2.5.1. Diversité des pollinisateurs Les pollinisateurs et les systèmes de pollinisation présentent une remarquable diversité. La majorité des espèces pollinisatrices est représentée par des abeilles, des papillons, des mouches, des guêpes et des Coléoptères. Les vertébrés pollinisateurs comprennent des chauves-souris, des mammifères comme les lémuriens et des oiseaux (colibris, souimanga). L’abondance et la diversité des pollinisateurs sont cependant les meilleurs garants du succès de la pollinisation (Herrera, 1989).

I .2.5.2. Fréquence des visites des pollinisateurs L’efficacité de la pollinisation dépend de la capacité des visiteurs à déposer les pollens compatibles en quantité suffisante pour la fécondation et la production de fruits. Cette capacité peut être estimée de deux façons : d’une part en terme « quantitatif » c’est-à-dire sur l’abondance et la fréquence des visites, et d’autre part en terme « qualitatif » des visites à savoir le comportement au butinage, et le dépôt d’un nombre de pollens correspondant au nombre d’ovules à féconder sur la surface stigmatique (Herrera 1987 et 1989). Par conséquent, le comportement au butinage des visiteurs influe énormément sur la reproduction des plantes d’une part et permet d’identifier les pollinisateurs efficaces d’autre part.

I.2.6. Mode de reproduction des plantes La pollinisation est le dépôt de pollens produits par les anthères des étamines, sur le stigmate d’un pistil (Pesson et Louveaux, 1984). Les pollens peuvent provenir d’une autre fleur, ou de la même fleur. Le transport de pollens vers le stigmate du pistil nécessite souvent l'action des pollinisateurs. A cet effet, une certaine spécificité peut exister entre fleur et agent de transport pollinique.

Les plantes recèlent une multitude de stratégies de reproduction, dont celle qui mène à la fécondation et à la pollinisation. C’est la première étape d’une série de processus assurant la rencontre des gamètes mâles et femelles dans la reproduction des Angiospermes. Il existe 23

divers modes de pollinisations chez les plantes en fonction de la provenance des grains de pollens (Figure 4):

 l’autopollinisation, croisement réalisé au sein d’une fleur hermaphrodite où les pollens des étamines sont transférés directement ou indirectement sur le stigmate de la même fleur. C'est un mécanisme autonome ou pouvant être effectué par un vecteur extérieur ;  la géitonopollinisation, qui correspond au transport des pollens d’une fleur sur le stigmate d’une autre fleur du même individu ;  l'allopollinisation, résultat d’un croisement entre deux individus de la même espèce ou entre deux espèces différentes.

Pollen du donneur

Fleur différente allogamie Même fleur (sens large) autogamie Croisement retour

(back cross)

Même individu Individu différent géitonogamie

Même espèce Espèce différente Croisement intraspécifiques allogamie (sens strict)

Individu hybride

Individu introgressé Figure 4: Différents types de transfert de pollens et du mode de reproduction chez les Angiospermes (tiré et modifié de Lloyd et Webb, 1992).

I.2.5.2. Phénomène d'introgression génétique chez les plantes longévives D’une manière générale, une introgression est une dispersion naturelle des gènes d’une espèce à l’intérieur d’une autre espèce par suite d’une hybridation interspécifique suivie de croisements en retour successifs avec les parents (Lepais et al., 2009). L’introgression est une réponse adaptative des espèces ligneuses longévives à des modifications de leurs habitats. Ce

phénomène a été largement étudié chez l’olivier et le chêne. Cette introgression peut impliquer plusieurs espèces qui occupent des milieux plus ou moins proches.

L'introgression génétique est la manifestation initiale d'un croisement interspécifique, nécessitant quatre conditions : espèces vivant en sympatrie, des périodes de floraison synchrones, similarité de la biologie florale et pollinisateurs communs. Ce phénomène chez les plantes longevives est résumé sur la figure 5.

back-cross

Figure 5: Schéma simplifié du processus d'introgression génétique chez les plantes (Leong Pock Tsy et al., 2013).

Deux espèces différentes, représentées par l’espèce A de couleur orange et l’espèce B de couleur verte, peuvent se croiser entre elles pour donner des individus hybrides de première génération. Ces individus hybrides vont porter à la fois le génome nucléaire de l’espèce A et de l’espèce B et portera uniquement le génome chloroplastique de l’espèce A par transmission maternelle (Leong Pock Tsy et al., 2013). Suite à de croisements en retour successifs entre l’hybride et les parents, on obtient un individu introgressé (Mallet, 2007). 25

PARTIE II - MATERIELS ET METHODES

Guerpillon, 2011

Cette étude rassemble plusieurs approches permettant de déterminer les caractères phénologiques et floraux de baobabs et leurs implications au succès de leur pollinisation : - l’étude de la phénologie de six espèces est effectuée en premier lieu dans le but d’établir le calendrier de la floraison de chaque espèce, de déterminer le développement de leurs fleurs et d’identifier leurs pics de floraison; - les caractères morphologiques et biologiques de la fleur comme la taille, l’odeur florale et le nectar sont ensuite étudiés. La quantité de nectar produit et l’odeur florale émise sont relatives aux types des organes qui les sécrètent ainsi l’étude des structures anatomiques des « osmophores » et des « nectaires » sera réalisée. -la diversité, la morphologie et la fréquence de visite des pollinisateurs sont étudiées dans la troisième partie. Et afin de déterminer l’implication de tous ces caractères floraux sur l’efficacité de la pollinisation, la corrélation fleurs-pollinisateurs est mise en évidence dans la dernière partie.

II.1. MATERIELS VEGETAUX Six espèces de baobabs endémiques de Madagascar ont fait l’objet de cette étude: A. grandidieri, A. suarezensis de la section des Brevitubae, A. za, A. madagascariensis, A. rubrostipa et A. perrieri de la section des Longitubae. Ces espèces ont été choisies du fait qu’elles sont classées « en danger » et « en danger critique » (IUCN, 2013 et Vieilledent et al. 2013). De plus, l’espèce A. suarezensis est la plus menacée avec un risque d’extinction d’ici 2080 (Leong Pock Tsy et al., 2013 et Vieilledent et al. 2013).

I.2.1. Description botanique des espèces étudiées Les descriptions sont tirées de travaux de Baum (1995 b), de Schatz (2001) et de Ryckewaert et al. (2011).

- Adansonia rubrostipa (Longitubae) est particulièrement différente des autres espèces avec son tronc en forme de bouteille. L’arbre peut atteindre de 5 à 20 m de hauteur. Les feuilles sont composées palmées avec 5 (rarement 3) folioles sessiles, de forme elliptiques, dentées à pétioles glabres avec des stipules caduques. Cette espèce a des fleurs de couleur jaune clair ou jaune orangé avec 100-150 étamines soudées à la base en un tube staminal long de 60 à 100 mm (Photo 13). Le volume de nectar secrété est d’environ 59- 105 µL, la concentration en saccharose est d’au moins 13%. Les fleurs sont parfumées. Les fruits sont des baies globuleuses avec un péricarpe de 4 à 5 mm d'épaisseur contenant en moyenne 50 à 60 graines réniformes et aplaties latéralement. 27

- Adansonia za (Longitubae) peut atteindre 30 m de hauteur avec des écorces rugueuses, de couleur marron rougeâtre. Les feuilles sont composées palmées avec 5 à 8 folioles portées par de longs pétiolules. Les stipules sont caduques. Les fleurs de A. za ont des pétales jaunes, parfois tachetés de rouges (Photo 14). Les étamines sont de couleur jaune également et soudées à la base en un tube staminal long de 50 à 80 mm. Le volume du nectar secrété est de 200 à 250 µL ; la concentration en saccharose varie de 21 à 22 %. Les fleurs sont parfumées. Les fruits sont en baies de forme globuleuse, oblongue ou ovoïde, avec un pédoncule nettement gonflé. Le péricarpe est épais et muni de nombreuses fibres longitudinales avec des graines réniformes.

- Adansonia madagascariensis (Longitubae) a un tronc cylindrique à écorce lisse, gris pâle et pouvant atteindre 20 m de hauteur. Les feuilles sont composées palmées avec 5 à 7 folioles subsessiles, de forme elliptique à sublancéolée, glabres, acuminées au sommet, entières et des stipules caduques. Les fleurs sont rouges ou rouges orangé (Photo 15). Les étamines sont jaunes pâles soudées à la base en un tube staminal long de 70 à 130 mm. Le volume du nectar est d’environ 250 à 620 µL. Les fleurs sont parfumées. Les fruits sont en baies de formes globuleuses ou subglobuleuses, généralement plus large que long avec de courts poils marron. Le péricarpe est épais de 7 à 9 mm, fibreux. Les graines sont réniformes et aplaties latéralement. - Adansonia perrieri (Longitubae) est un arbre de moyenne à grande taille pouvant atteindre jusqu’à 30m de hauteur ; tronc fuselé ou cylindrique; écorce lisse. Les feuilles sont composées palmées avec 5 à 11 folioles ; pétioles robustes souvent pubescents. Folioles sessiles ou subsessiles, elliptiques, acuminées au sommet et pubescentes. Stipules triangulaires et persistantes. Les fleurs ont une couleur blanche à l’ouverture et jaune dès le lendemain avec des étamines jaunes soudées à la base en un tube staminal long de 130 à 200 mm (Photo 16) ; le volume du nectar est d’environ 150 à 200 µL, concentration en saccharose variant de 14,5 à 15,25 %; fleur parfumée. Fruit en baie de forme ovoïde à oblongue jusqu’à 25cm de long, marron. Péricarpe de 8 à 9mm d’épaisseur, fibreux. Les graines sont réniformes et latéralement aplaties. - Adansonia grandidieri (Brevitubae) peut atteindre jusqu’à 25m de hauteur, à tronc cylindrique, écorces lisses, grisâtre. Les feuilles sont composées palmées de 9 à 11 folioles (rarement 6), entières, portées par un pétiole pubescent avec des stipules caduques. Fleur à pétales blancs, libres ; étamines blanches au nombre de 600-700 soudées à la base en un tube

staminal court de 10 à 15mm (Photo 17). Le volume du nectar secrété est d’environ 1400 à 1730 µL avec une concentration en saccharose de 13,5 à 18,25% ; fleurs à odeur désagréable. Les fruits sont des baies globuleuses de forme ovoïde avec un péricarpe de 2,5 à 4 mm d’épaisseur, aux poils bruns rougeâtre. La forme des graines est réniforme. - Adansonia suarezensis (Brevitubae) est un grand arbre de plus de 25m de hauteur, à tronc cylindrique fuselé; écorces lisses, grisâtre à marron rougeâtre avec des feuilles alternes, composées palmées ; 6 à 9 folioles entières, penninerves, elliptiques ou sublancéolés ; stipules petites et caduques. Les fleurs sont blanches avec des étamines au nombre de 800-1100, soudées à la base en un tube staminal court de 10mm de long (Photo 18). Le volume du nectar est d’environ 1900 µL avec une concentration en saccharose de 11,75 à 12%. Fruits en baie oblongue cylindrique à ovoïde allongée, avec péricarpe de 3 à 4mm d’épaisseur et les graines réniformes et aplaties latéralement.

I.2.1. Collectes des échantillons Les collectes des échantillons sur la phénologie, la morphologie et la biologie florale ont été effectuées sur les six espèces de baobabs endémiques malgaches de la section des Longitubae et de la section des Brevitubae. Par contre, la cinétique de production du nectar et la dynamique de l’émanation de l’odeur florale ont été étudiées sur deux espèces représentatives des deux sections A. grandidieri (Brevitubae) et A. rubrostipa (Longitubae). L’étude anatomique des organes sécréteurs (osmophore et nectaire) et l’analyse de la corrélation entre les caractères floraux et les activités des pollinisateurs ont été également focalisées sur ces deux espèces. Le choix de ces deux espèces a été basé sur le fait qu’elles sont sympatriques et vivent dans un même contexte écologique dans la région de Morondava. Les boutons floraux, les fleurs fraichement ouvertes et le nectar produit à la base du pétale ont été les principaux matériels biologiques échantillonnés dans ce travail (Tableau 2). Les échantillonnages ont été effectués sur les baobabs ; la grimpe sur l’arbre est ainsi nécessaire et est assurée par des accrobranchistes. Toutes les collectes d’échantillons ont été réalisées de nuit sur des fleurs fraichement ouvertes. Le nombre de pieds de baobab échantillonnés varie de 3 à 10 pieds par espèce. Cette différence a été due au nombre insuffisant de fleurs ouvertes par nuit et à la faible densité des pieds en fleur trouvés pour chaque espèce, mais cette variation d’effectif a été considérée dans l’analyse des données.

Planche 3 Fleurs des six espèces endémiques de baobabs malgaches. Section des Longitubae : (13) A. rubrostipa, (14) A. za, (15) A. madagascariensis, (16) A. perrieri et section des Brevitubae: (17) A. grandidieri, (18) A. suarezensis.

Razanamaro, 2012 Razanamaro, 2012

Photo 13 : Fleur d’A.rubrostipa à Ifaty Photo 14 : Fleur d’A.za à Mahabo

Razanamaro, 2009 Lagermette, 2011

Photo 15 : Fleur d’A.madagascariensis à Photo 16 : Fleur d’A.perrieri à Ambondromifehy Anjemangirana

Razanamaro, 2009 Razanamaro, 2010 Photo 18 : Fleur d’A.suarenzensis sur la Photo 17 : Fleur d’A.grandidieri à Andranomena Montagne des Français 30

Tableau 2 : Matériels biologiques échantillonnés pour les diverses études effectuées sur les baobabs

Matériels végétaux Quantité moyenne Nombre de Type d'observation Espèces Total/espèce considérés des échantillons /pied pieds Etude de développement des A. grandidieri Boutons floraux 15 9 135 Phénologie boutons A. rubrostipa Boutons floraux 15 9 135 florale A. grandidieri Boutons matures 10 5 50 Anthèse A. rubrostipa Boutons matures 10 5 50 A. grandidieri Fleurs 8 5 40 A. suarezensis Fleurs 7 4 28 A. perrieri Fleurs 6 2 12 Morphométrie de la fleur A. madagascariensis Fleurs 9 5 45 A. rubrostipa Fleurs 7 10 70 A. za Fleurs 7 11 77 100 g (en moyenne 4 A. grandidieri Fleurs 4 400 g fleurs) 100g (en moyenne 4 A. suarezensis Fleurs 3 300g fleurs) 100g (en moyenne 3 A. perrieri Fleurs 6 600g fleurs) Extraction au solvant Etude de l'odeur 100g (en moyenne 3 A. madagascariensis Fleurs 4 400g florale fleurs) 100g (en moyenne 3 A. rubrostipa Fleurs 10 1000g fleurs) 100g (en moyenne 3 A.za Fleurs 6 600g fleurs) A. grandidieri Fleurs 5 4 20 Technique de "Headspace" A. rubrostipa Fleurs 5 4 20 A. grandidieri nectar 10 5 50 A. suarezensis nectar 5 5 25 A. perrieri nectar 3 2 7 Composition du nectar Caractérisation A. madagascariensis nectar 5 2 10 du nectar A. rubrostipa nectar 5 5 26 A. za nectar 3 3 10 Etude de la dynamique de A. grandidieri nectar 3 4 12 production de nectar A. rubrostipa nectar 3 4 12 31

II.3. ETUDES PHENOLOGIQUES

II.3.1.Principe de suivi des stades phénologiques des baobabs Le suivi phénologique a été réalisé entre mars 2008 et juin 2012 dans 19 parcelles permanentes de suivi (PPS) installées dans les aires de distribution de chacune des six espèces de baobab. Parmi les espèces dont les aires de répartition sont réduites, une seule parcelle de suivi a été installée. Pour les autres espèces, deux ou trois PPS ont été installées et suivies. Pour chaque PPS la surface est environ de un hectare au minimum, tous les baobabs présents ont été repérés par un numéro d’identification et géo-référencés. Selon le PPS, le nombre de pieds varie entre 21 (A. perrieri à Ambondromifehy) et 72 (A. grandidieri à Andavadoaka) relatifs à la densité des baobabs dans chaque PPS (Tableau 3). Les observations phénologiques ont été réalisées tous les quinze jours pendant une durée de une à quatre années consécutives. Chaque pied de baobab a été suivi individuellement. Les différentes phénophases suivantes ont été prises en compte : feuillaison, floraison et fructification, et évaluées selon une classification adaptée de Grouzis et Sicot (1980) et Seghieri et al. (1995) :

- cinq paramètres ont été considérés pour caractériser les stades de feuillaison: absence de feuilles noté V1, présence de jeunes feuilles (V2), présence de feuilles développées (V3) ; présence de feuilles sénescentes (V4) et chute des feuilles (V5).

- pour la floraison, quatre stades ont été pris en compte : absence de boutons floraux visibles (f0) ; présence de boutons floraux (f1); présence de fleurs fraîchement épanouies (f2) ; présence de fleurs sèches tombées au sol (f3).

- enfin, la fructification a été décrite par cinq stades : absence de fruits (F0) ; présence de petits fruits verts (F1) ; présence de fruits de taille adulte mais encore verts (F2) ; présence de fruits matures (F3) et chute des fruits (F4).

Les stades f1, f2 et f3 de la floraison ainsi que les stades F2 et F3 de la fructification ont été quantifiés comme suit où n = nombre de fleurs ou de fruits:

- + : s’il y a en moyenne 1≤ n ≤ 5 fleurs et fruits sur l’arbre ;

- ++ : pour le nombre de fleurs ou de fruits variant de 6≤ n ≤ 20 ;

- +++ : s’il y a en moyenne 21≤ n≤ 99 fleurs et fruits sur l’arbre ;

++++ : pour un nombre moyen de fleurs et fruits n ≥ 100.

Sachant que les relevés phénologiques ont été réalisés sur un intervalle de deux semaines, les arbres précoces sont ceux qui portent des fleurs deux semaines (au minimum) avant leurs congénères et les tardifs sont les arbres qui ont encore des fleurs deux semaines après que les autres aient cessé de fleurir.

Deux étapes ont été mises en évidence pour les suivis phénologiques :

- La première étape a pour objet de comparer les périodes de floraison des différentes espèces du genre Adansonia en tenant compte des variations interspécifiques et interannuelles. Une espèce, dans un site, est considérée comme en pic de floraison si au minimum 15% des arbres de la parcelle sont en fleur.

- La deuxième étape consiste à suivre les variations interannuelles de la feuillaison, de la floraison et de la fructification de deux espèces de baobab représentant chacune les deux sections (A. rubrostipa pour les Longitubae et A. grandidieri pour les Brevitubae) vivant dans les mêmes conditions écologiques (les PPS d’Andranomena et de Beroboka distant d’une quinzaine de km).

Tableau 3 : Localités et nombre d'individus suivis par espèce.

Nombre Sections espèces Sites de suivis d'individus

A. perrieri Ambondromifehy 21

Kirindy 34 A. za Longitubae Ampasikibo 30 Beroboka 31 A. rubrostipa Ampataka 52 A. madagascariensis Ankarana 56

Tsimafana 25 Andranomena 32 Bekonazy 33 Marofihitse 61 A. grandidieri Ankoba 40 Brevitubae Andranopasy 49 Bevoay 36 Andavadoaka 72 Beantely 31 A. suarezensis Mahory 37

II.3.2. Etude de la phénologie florale Elle consiste à suivre le développement journalier des boutons floraux jusqu’à leur ouverture chez A. rubrostipa (section Longitubae) et A. grandidieri (Brevitubae).

Deux cent soixante dix (270) boutons floraux ont été suivis pour identifier les différents stades évolutifs jusqu’à l’épanouissement des fleurs ainsi que le temps requis pour passer d'un stade à un autre. Les boutons floraux ont été étiquetés et mesurés chaque jour jusqu'à leur ouverture. A chaque observation, la couleur et la taille des pièces protectrices telles que les sépales et les pétales ont été notées. Le stade de l'initiation florale accompagné de boutons foliaires n'a pas été considéré lors de cette étude. Chaque stade a été défini suivant les caractéristiques de chaque pièce florale: - stade boutons:  à pièces florales fermées: petits boutons (Bp), jeunes boutons (Bj) ;  à pièces florales prêtes à s'ouvrir: boutons matures (Bm) ; - stade fleurs ouvertes:  pièces florales ouvertes (Fo) ;  fanaison des fleurs (Fs) et dessèchement des pièces florales ;  chute des pièces florales (Fc).

II.3.3. Suivi de l'anthèse L'anthèse vient du mot grec « anthêsis », qui veut dire « floraison » ; elle se traduit comme le développement des pièces florales depuis l'épanouissement jusqu'à la fanaison (Boullard, 1988). Dans cette étude, de jeunes boutons ont été choisis et leurs développements ont fait l’objet d’un suivi quotidien jusqu’à la fin de l’anthèse. Cela a permis de déterminer la durée de vie, les mouvements des pièces périanthaires et l’état général de la fleur. Le nombre de fleurs ouvertes a été compté tous les jours pendant cinq jours.

La réceptivité du stigmate a été identifiée en utilisant une goutte de solution de H2O2 à 3% (Kearns et Inouye, 1993) où les activités métaboliques du stigmate se traduisent par un dégagement gazeux.

II.4. MORPHOLOGIE ET MORPHOMETRIE DE LA FLEUR

II.4.1. Morphométrie florale Pour étudier la morphologie des fleurs de chaque espèce de baobab, les pièces florales ont été mesurées en adoptant la méthode de Pailler et al., (2002). Dans chaque site d'étude, au moins trois individus en fleurs ont été examinés. Sur chaque individu, au moins trois fleurs fraîchement ouvertes ont été prélevées. La hauteur du pistil, la hauteur des étamines (e), la longueur du tube staminal (ts), la longueur du pétale (p) et la longueur du sépale (s) ont été mesurées à l'aide d'une règle graduée. La différence de la hauteur du stigmate avec les étamines a été également notée (d). Toutes les mesures ont été effectuées à partir de la base de l'ovaire (Figure 6).

Les données obtenues ont été traitées statistiquement pour pouvoir déceler les caractéristiques florales de chaque espèce. Des analyses de variances paramétriques (ANOVA) ont été utilisées, puis la comparaison des moyennes par le test de Tuckey.

Figure 6: Coupe longitudinale de la fleur d'A. rubrostipa (Longitubae). a: longueur du pistil, b: longueur des étamines, c: longueur du tube staminale, d : différence entre la hauteur de stigmate avec l’étamine, p: longueur du pétale et s: longueur du sépale. ts : tube staminal ; st : stigmate ; e: étamines ; p : pétale. 35

II.4.2. Etude de la structure morphologique et anatomique des tissus sécréteurs

La structure anatomique des organes sécréteurs d’odeur florale et du nectar a été étudiée sur A. rubrostipa et A. grandideiri. Les pétales, les sépales et le réceptacle floral sont les matériels biologiques considérés. Les observations des échantillons au microscope photonique ont été réalisées au sein du laboratoire d'imagerie PHIV de Montpellier.

II.4.2.1. Fixation et traitement des échantillons

Les échantillons de sépales, de pétales et de réceptacles floraux ont été fixés, déshydratés et ramollis suivant la méthode de Buffard- Morel et al. (1992) avant de les couper au microtome et de les observer au microscope.

- Les échantillons de pétales, de sépales et de réceptacles floraux ont été fixés et conservés à température ambiante dans de la caféine contenant du glutaraldéhyde- paraformaldéhyde (GPC). Ce fixateur est composé de 50 ml de tampons phosphate 0,2 M, pH 7,2, 20 ml de paraformaldéhyde + 4 ml glutaraldéhyde à 25 % + 1 g de caféine, complété à 100 ml avec de l'eau distillée.

- Les échantillons ont été ensuite déshydratés par une succession de bains dans des solutions d'éthanol à une concentration de 70 % (45 min), 90 % (60 min), 95 % (60 min), et dans l'éthanol absolu pendant 60 minutes.

- Après la déshydratation, les échantillons ont été ensuite ramollis pendant 24 heures dans un mélange d'éthanol-butanol 50/50 et enfin dans du butanol absolu. Les échantillons ont été ensuite laissés dans cette solution pendant 4 à 5 jours en agitation à 4°C.

- Ils ont été ensuite imprégnés avec une résine de base (kit résine technovit 7100 500 ml+ 5 g d'initiateurs+ 5 mL de méthyl méthacrylate + 2 ml d'éthylène glycol diméthacrylate). Ils ont été ensuite inclus dans des moules de résine jusqu'à la polymérisation complète. Les blocs contenant les échantillons ont été coupés à une épaisseur de 5 -7 µm à l'aide d’un microtome Leica RM 2225 (Photo 19).

Rasoamanana, 2015

Photo 19 : Microtome Leica RM 2225

II.4.2.2. Méthodes de coloration Les coupes ainsi obtenues ont été séparées dans de l’eau distillée, étalées sur lame et ensuite séchées sur une plaque chauffante avant de passer à la coloration. Les coupes ont été subdivisées en quatre lots pour les différentes techniques de coloration. La coloration par le réactif de NaDi et Neu a été utilisée pour mettre en évidence la structure des "osmophores" alors que la coloration par le réactif de Schiff+Naphtol bleu black et Nile Red pour l'identification du "nectaire".

 Coloration par le réactif de NaDi

Le premier lot a été coloré avec le réactif de NaDi mis au point par David et Carde (1964) et modifié pour être adapté aux échantillons de fleurs de baobabs. Le réactif de NaDi est un mélange extemporané d’une solution alcoolique d’α-naphtol 1 % (m/v) dans de l’éthanol à 40 % et d’une solution aqueuse de N-N-diméthyl-p-phénylènediamine- dihydrochloride 1 % (m/v) dans un tampon phosphate 50 mM pH 7,2 (0,5/0,5/49 ; v/v/v). Il permet de mettre en évidence les terpènes ou toutes substances lipophiles en leur donnant une couleur violette. Les coupes ont été placées dans le réactif de NaDi pendant 30 à 60 minutes à l’obscurité et observées aux microscopes optiques.

 Coloration au réactif de Neu:

La coloration au réactif de Neu a permis de déterminer la présence de flavonoïdes et d'acides phénoliques. Ces composés chimiques font parties de la grande famille des composés 37

aromatiques. Dans 50 ml de méthanol absolu, 0,5 g de 2-amino éthyldiphénylborinate (DPBA) (Fuka Réf 42810) a été dissout. Les coupes ont été mises à colorer pendant 5 minutes dans ce réactif. Le montage entre lame et lamelle s'effectue dans une solution glycérinée (15ml de glycérine dans 85 ml d'eau), puis les coupes ont été observées au microscope à épifluorescence (DM 4500, Filtres UV et I3, LEICA). Les résultats ont été interprétés comme indiqué dans le tableau 4.

Tableau 4. Caractéristiques des acides benzéniques et des flavonoides observées avec différents filtres en microscopie optique (DM 4500).

Composés UV (filtre A, LEICA) Bleu (Filtre I3, LEICA)

Acides benzéniques Bleu vif Jaune plus ou moins intense

Flavonoïdes Jaune à orange Jaune à orange vif

 Coloration par l’acide périodique et Schiff (PAS) Naphtol Blue Black

L'acide périodique et le réactif de Schiff ont été utilisés pour identifier les formes aldéhydes, les réserves d'amidons et les parois cellulaires colorées en rose. Pour identifier les réserves protéiques (Buffard-Morel et al., 1992), la coloration au Naphtol Blue Black a été utilisée. Les coupes ont été colorées avec de l'acide périodique de 1 % pendant 5 minutes, rincé quatre fois avec de l'eau distillée à pH 4,5, puis immergé dans le réactif de Schiff (1g de fuchsine basique, 2g de disodium métasulfite dans du HCl 1M, 0,5g de charbon actif neutralisé) pendant 20 minutes à l'obscurité. Les coupes ont été ensuite rincées de nouveau quatre fois dans de l'eau distillée. Enfin, les coupes ont été mises dans le réactif de Naphtol Blue Black (1g de Naphtol bleu Noir dans 100ml d'acide acétique 7%) à 60°C pendant 5 minutes.

 Coloration au Nile Red

La coloration au Nile Red (Sigma-Aldrich) permet de voir les lipides, et plus spécifiquement les lipides neutres, généralement intracellulaires. Les lipides composant les vésicules sont colorés en jaune. Ce type de réactif a été utilisé pour l'identification du nectaire car les lipides ont été généralement identifiés dans les nectars. A 1 mL de fraction vésiculaire

est ajouté : 300 µL tampon phosphate de 10 X, 3 µL de Nile Red (solution à 1 mg/mL; solution réalisée dans l’acétone). Après une incubation de 10 min des coupes fines à l’obscurité, les vésicules ont été identifiées au microscope à fluorescence à une longueur d’onde d’excitation de 450-500 nm.

II.4.2.3. Observation microscopiques Les coupes préalablement colorées ont été par la suite montées entre lame et lamelle. Les observations ont été effectuées sous microscope photonique de type Leica DM 4500 ou Leica DM 6000 (Photo 20).

Une partie des échantillons de fleurs préalablement fixée a été observée au microscope électronique à balayage. Les échantillons ont été fixés dans du tampon 0,5% glutaraldéhyde et 0,5% paraformaldéhyde, suivie d'une déshydratation à l'éthanol et séchage au point critique. Ils ont été ensuite métallisés à l'or en utilisant un dispositif de revêtement par pulvérisation cathodique Polaron E 5000 et ont été observées au microscope électronique à balayage Hitachi S 2300 au Centre de Ressources en Imagerie Cellulaire (CRIC), Montpellier.

Rasoamanana, 2015

Photo 20: Microscope photonique Leica DM 6000 relié avec une camera 200R et un ordinateur

II.5. ETUDES BIOCHIMIQUES DES SECRETIONS FLORALES II.5.1.Caractérisations des odeurs florales chez les baobabs II.5.1.1. Méthode de capture de l'odeur florale Deux méthodes complémentaires ont été utilisées pour piéger les odeurs émises par les fleurs de baobabs: la méthode par extraction au solvant et la méthode par micro-extraction en phase solide (SPME). La première méthode a été utilisée afin de déterminer la quantité totale de composés chimiques émis par une fleur chez les six espèces de baobabs. Cependant, la 39

deuxième méthode a pour but d’identifier les composés volatils émis à un moment de l’anthèse et a été faite sur A. grandidieri et A. rubrostipa (Deng et Hu., 2004, Xu et al., 2005; Stashenko et Martinez, 2008).  Extraction au solvant: 100g de fleurs fraîchement ouvertes ont été récoltés et mis à macérer dans le solvant hydrofluoroéther (3M Novec HFE 7200). Après deux jours de macération, le solvant a été ensuite filtré. L'extrait a été par la suite concentré dans un Rotavapor. Cet appareil permet d’éliminer rapidement l’excès d’un solvant par évaporation à 40°C. Le principe est basé sur l’abaissement du point d’ébullition avec la pression. L’extrait ainsi obtenu est ensuite mis dans un flacon hermétique et stocké à froid (-20°C) pour des analyses ultérieures.  Méthode par micro-extraction sur phase solide (SPME) : la technique de « headspace » ou technique de « capture d’effluves » a pour but de piéger les composés volatils émis par une fleur pendant un temps défini sur un polymère solide et adsorbant. Le MonoTrapTM (phase comprenant des groupes octadécyl sans charbon actif) de type DSC18 a été utilisé car ce disque est portatif et facile à manier sur le baobab (Figure 7).

Figure 7: Schéma récapitulatif de l’utilisation du disque MonoTrapTM

Afin de déduire la sensibilité du disque, un étalon a été établi à partir d'une molécule connue (Figure 8). A partir d’une solution concentrée de linalol et de 2-phénylacétonitrile, une solution mère de 100g/l a été préparée avec de l'éthanol. Elle a été diluée successivement de 0,1; 0,2; 0,5 à 1g/l. Cent microlitres (100µL) de solution préalablement préparée ont été ensuite mis dans un kit spécialisé nommé Clean Pin Hole septum with vial et ont été exposées aux disques MonoTrap pendant 30mn au bain-marie à 50°C. Les quantités de composés piégés par les disques ont été ensuite extraites en utilisant du dichlorométhane à 200 µl à l'aide d'un ultrason pendant 5 minutes. L'ensemble de l'extrait a été analysé par chromatographie en phase gazeuse (CPG).

du pic Aire

Concentration de 2-phénylacétonitrile

Figure 8: Courbe étalon d'une solution mère de 2-phénylacétonitrile (r2 = 0,99).

 Pour capturer l’odeur florale de baobab: six fleurs sur deux individus différents ont été étudiées simultanément, et ceci pendant trois jours. Chaque fleur a été entourée par un sac plastique inerte nommé "Tedler Bag" et trois disques ont été ensuite fixés sur la capsule du sac (Photo 21). Les disques ont été récupérés toutes les trois heures pendant 24 heures. Après chaque prélèvement, les disques ont été stockés à froid et les composés volatils piégés ont été extraits sous ultra-sons dans 200 µl de solvant HFE pendant 5 minutes. Les extraits ainsi obtenus ont été scellés et stockés à froid pour analyse chromatographique.

Tedler bag

Disque MonoTrap DSC18

Photo 21 : Fleur d'A. rubrostipa encapuchonnée et exposée aux disques MonoTrapTM

II.5.1.2. Méthode d’identification de la composition des odeurs florales La chromatographie en phase gazeuse, est une méthode analytique de séparation des composés gazeux ou susceptibles d’être vaporisés par chauffage sans décomposition. Elle permet un fractionnement efficace des différents constituants d’un mélange en vue de leur identification (Richard et Multon, 1992). L’analyse chromatographique des composés volatils d’odeur florale a été effectuée dans le laboratoire de chimie de la faculté de Pharmacie à Montpellier.

Un chromatographe en phase gazeuse (CPG) VARIAN (série CP 3380) équipé d’une colonne capillaire en silice fondue HP-5 J&W Agilent (5%-phényl 95% méthyl polysiloxane) (30 m de longueur x 0,25 mm de diamètre intérieur x 0,25 µm d'épaisseur) a été utilisé. Le gaz vecteur est l’azote avec un débit de 0,8 ml/min, la pression à l’entrée de l’injecteur a été de 1,6 bar. Le détecteur a été alimenté par un mélange d’hydrogène et d’air comprimé. La température de l’injecteur a été de 200 °C, celle du détecteur à ionisation de flamme a été de 200 °C et celle du four a été programmée de 60 à 200°C à raison de 3 °C/min, puis a été maintenue à 200 °C pendant 20 min. La chromatographie en phase gazeuse est couplée avec la spectrophotométrie de masse (CPG-SM). En effet, un spectromètre de masse placé en sortie de colonne a permis d’obtenir des spectres de masse pour chacun des composants. Cette technique de couplage a permis de mieux identifier les composants volatils. Les analyses CPG-SM ont été réalisées sur un chromatographe en phase gazeuse Hewlett-Packard (GC 5890 séries II) équipé d’une colonne capillaire en silice fondue HP-5 (5%-phenyl- 95% methyl polysiloxane) (30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25 µm). Le détecteur de masse est de type quadripôle (Modèle 5972), l’énergie d’ionisation utilisée est égale à 70eV.

La température de la colonne a été programmée de 50 à 220°C à raison de 10°C/min. La température de l’injecteur est fixée à 220°C. Le gaz vecteur est l’hélium dont le débit est de 0,6 ml/min.

II.5.1.3. Principe de détermination et quantification des composés volatils Les composants de l’odeur florale ont été identifiés à partir de leurs indices de rétention relative déterminés par rapport au temps de rétention d’une série de n-alcanes (C9- C20) et par comparaison de leurs spectres de masse avec ceux des bases de données commerciales (NBS75K/NIST98 et FFNSC 2) ou trouvées dans la littérature (Adams, 2007).

Le tridécane (C13) a été utilisé comme étalon interne, nécessaire pour déterminer la concentration d’un ou de plusieurs composés chimiques constituant l'odeur florale des baobabs. Pendant l'identification des composés volatils, les extraits de baobabs ont été constitués d’acides gras de poids moléculaire élevé (PM≥294) qui ne sont pas classés dans le groupe des molécules dites "volatiles" (Reis et al., 2004). Par conséquent, les proportions des constituants volatils ont été recalculées « hors acides gras ». La plupart, des composés identifiés, notamment le 2-phenylacetonitrile, 8-heptadecene, nonan-2-one, tiglate d’éthyle, 2- phenylethanol, ont été authentifiés en faisant une co-injection des échantillons avec ces molécules.

II.5.2. Détermination de la composition du nectar

L'objectif de cette étude a été de caractériser les composants biochimiques du nectar chez toutes les espèces de baobab. La cinétique de production du nectar a été également étudiée dans cette partie. Il s’agit de déterminer la quantité et la qualité du nectar produit à un temps précis. Cette étude a été faite sur A. grandidieri (Brevitubae) et A. rubrostipa (Longitubae).

II.5.2.1. Prélèvements du nectar Deux séries de prélèvement ont été effectuées. Les fleurs ont été encapuchonnées avec un tulle pour minimiser le risque de contamination effectuée par les visiteurs (Photo 22). Le volume du nectar a été ensuite mesuré à l'aide d'une micropipette : - Six à 12 fleurs fraichement ouvertes ont été isolées pour avoir un volume de nectar d'au moins 1 ml. Le prélèvement du nectar a été effectué trois heures après l'ouverture de la fleur, le moment pour que le nectar puisse s'accumuler au fond de la corolle. Ce type de

prélèvement a été effectué sur au moins 5 individus par espèces, suivant la disponibilité et l'accessibilité en fleurs ouvertes. - Le débit de production du nectar a été quantifié en mesurant le volume de nectar secrété toutes les trois heures. Les prélèvements ont commencé trois heures après l'ouverture de la fleur et répété toutes les trois heures pendant 12 heures. Le prélèvement a été effectué simultanément sur six fleurs fraîchement ouvertes et sur deux individus différents. Chaque échantillon individualisé dans des microtubes a été mis dès la collecte dans une bonbonne contenant de l'azote liquide à -196°C pour éviter toute dégradation des molécules organiques. Les conditions climatiques telles que la température et l'humidité relative ont été enregistrées au moment du prélèvement.

Razanamaro, 2013

Photo 22 : Prélèvement de nectar à la base du pétale sur A. perrieri II.5.2.2. Dosage de glucide majeurs Deux méthodes complémentaires ont été utilisées pour quantifier les glucides majeurs dans le nectar de six espèces du baobab.

- Méthode par analyses enzymatiques indirectes : la majorité des dosages de glucose, de fructose et de saccharose a été effectuée à partir de cette technique en utilisant de spectrophotométrie UV. Le glucose a été dosé par une succession de réactions enzymatiques contrôlées : l'hexokinase (HK) qui transforme le glucose (G) en glucose 6-phosphate (G6P), le glucose 6-phosphate déshydrogénase (G6PdH) qui transforme le Glucose 6-phosphate en gluconate 6-phosphate (Gluconate – 6P) qui va permettre de générer une molécule absorbante à 340 nm, le NADPH (Figure 9). Le saccharose (S) est préalablement hydrolysé en glucose (G) et fructose (F) par l’invertase. Le fructose converti en fructose 6 phosphate (F6P) par l'hexokinase est ensuite transformé en glucose 6 phosphate à l’aide du phosphoglucose isomérase(PGI) qui suit le

schéma réactionnel précédent. La loi de Beer Lambert qui relie l'absorbance d'un composé avec sa concentration à une longueur d'onde donnée permet de quantifier par spectrophotométrie le glucose, le fructose et le saccharose contenu initialement dans l'échantillon. Une courbe d’étalonnage préalablement établie avec des concentrations croissantes en glucose (de 4g/l) a permis de déterminer le coefficient d’extinction moléculaire.

Le dosage a été réalisé dans du tampon triéthanoamine 0,25 M, 3 mM MgSO4, ATP 2,73 mM, NADP 0,382 mM en présence d’hexokinase 0,85 U et Glucose 6 phosphate deshydrogenase 1,7U. Le rapport hexose/saccharose a été calculé à partir des données obtenues.

Figure 9: Schéma réactionnel de dosages du glucose, du fructose et du saccharose. S : Saccharose, G : glucose , F : fructose, HK : hexokinase, PGI : phosphoglucose isomérase, G6PdH : glucose 6 phosphate deshydrogénase.

- Méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) a été utilisée dans le but de confirmer les dosages effectués sur la spectrophotométrie par UV. Le dosage a été effectué à l’aide d’une colonne échangeuse d’anions (Carbopac PA1 Dionex) munie d’une phase mobile constituée par de la soude, à 150 mM avec un débit de 1ml/mn, couplée à un détecteur ampérométrique. Avant de doser les sucres contenus dans le nectar de baobab, un étalon a été effectué à partir de 6 solutions standards à des concentrations différentes en glucose, fructose et saccharose. La concentration de ces solutions est comprise entre 1 et 50mg/l et est obtenue à partir de solutions mères de concentrations connues.

II.5.2.3. Dosage des protéines, acides aminés totaux et proline

 Les protéines ont été dosées en utilisant le colorant de Coomassie Brillant Blue G-250 par la méthode de Marion Bradford. Ce colorant induit un déplacement du pic

d'absorption de 465-595 nm après liaison avec les acides aminés basiques et les résidus hydrophobes des acides aminés constitutifs de protéines. Ainsi, l'absorption à 595 nm est enregistrée et suit la loi de Beer-Lambert en fonction de la quantité de protéines présentes. Une courbe d’étalonnage préalablement établie à partir de sérum albumine bovine permet de quantifier la teneur en protéines du nectar.  Le dosage des acides aminés totaux et de la proline a été effectué en utilisant la ninhydrine ou hydrate de tricéto-hydrindène qui réagit avec les acides aminés à chaud en donnant tout d’abord un iminoacide puis un aldéhyde qui vont réagir avec la ninhydrine réduite pour donner un chromophore coloré en bleu/violet qui absorbe à 570 nm (Pesez et Poirier, 1952). La proline a été également dosée du fait que les abeilles ont une préférence particulière pour ce composé et de plus ces insectes ont été connus comme pollinisateurs potentiels de certaines espèces (Baum 1995b et Ryckwaert et al., 2011). Pour la proline la fonction « imine » fournit en présence de ninhydrine une teinte rouge rosée qui présente un maximum d'absorption à 520 nm. Le chromophore a été préalablement extrait par du toluène. La quantité de proline ou d'acides aminés présents est conforme à la loi de Beer-Lambert. Une courbe d’étalonnage a été réalisée à l’aide de concentrations croissantes de proline ou d’une solution standard d’acides aminés (0,5 à 4 mM) et a permis de quantifier la teneur en acides aminés totaux ou de proline contenue dans le nectar.  Le dosage des protéines, acides aminés totaux et prolines nécessite au minimum 100 ml de nectar. Comme peu d'échantillons ont pu être récoltés et donc les données n'ont pas pu être statistiquement testées.

II.5.3. Analyses statistiques des données

II.5.3.1. Odeur florale

Les composés volatils ayant un pourcentage ≥ 5% dans au moins un échantillon ont été retenus pour les analyses statistiques. Afin de trouver s’il existe une différence significative entre les composés volatils émis au sein des deux sections de baobabs, le test de Mann-Withney a été utilisé. Si la valeur de la probabilité P est inférieure à 0,05, le composé identifié est significativement caractéristique d’une section.

Pour identifier les composés caractéristiques au sein de chaque espèce, le test de Kruskal-Wallis a été utilisé (Quinn et Keoug, 2002). Ce test permet de comparer les moyennes de chaque composé volatil identifié pour chaque espèce. Si la valeur de probabilité

P est supérieure à 0,05, le composé volatil est significativement caractéristique d’une espèce. Les espèces des Longitubae ont été considérées séparément de celles des Brevitubae. Toutes les analyses ont été faites avec le logiciel SPSS Inc 2007.

II.5.3.2. Composition de nectar

Les sucres totaux représentent la somme des quantités de glucose, fructose et de saccharose, tandis que le ratio indique le rapport entre le saccharose et les hexoses (glucose et fructose). Le volume du nectar et la concentration en glucides, en acides aminés, en protéines et en proline ont été comparés au niveau des deux sections de baobabs en appliquant le test par paire de "t" du programme SPSS 17. Les caractéristiques du nectar ont été également déterminées au sein de chaque espèce. Ainsi, le test de Kruskal Wallis a été utilisé pour identifier la différence au sein de l’espèce. Afin de décrire les éventuelles influences du facteur climatique sur les caractéristiques des composants majeurs du nectar (la teneur en glucose, fructose et en saccharose) le test de corrélation de Pearson a été utilisé.

II.6. IDENTIFICATIONS DES POLLINISATEURS POTENTIELS

Le comportement de butinage permet de déterminer si les visiteurs sont des pollinisateurs ou des voleurs de nectar. Il peut être estimé de deux façons : d’une part en terme « quantitatif » suivant l’abondance et la fréquence de visites, et d’autre part en terme « qualitatif » correspondant aux capacités d’un visiteur à transférer des pollens sur le stigmate.

II.6.1. Diversité et fréquence de visites des pollinisateurs Cette étude a pour but de déterminer le comportement au butinage de chaque visiteur et d'estimer la quantité de pollinisateurs sur les fleurs de baobabs pendant l’anthèse. Elle a été réalisée sur toutes les espèces de baobabs malgaches.

Deux séries d'observations ont été effectuées :

- des observations continues de 17 h 00 à 20 h 00 pour les Brevitubae et de 18 h 00 à 21 h 00 pour les Longitubae, correspondant au maximum de visites (Ryckewaert et al., 2011). Les observations ont été répétées cinq fois.

- des observations discontinues à raison de 30mn toutes les 3heures pendant 24 heures ont été réalisées simultanément sur deux pieds différents et répétés trois fois.

Pour chaque série d'observations, les insectes ont été capturés puis déterminés, les autres visiteurs ont été identifiés visuellement ou à partir de photographie prise lors de leur passage sur les fleurs. Après l’identification des visiteurs, l’heure de la visite et le nombre de fleurs visitées par les pollinisateurs potentiels ont été notés. Le nombre de visiteurs a été également comptabilisé.

II.6.2. Morphométrie des sphinx L'étude sur la morphométrie a porté principalement sur les sphinx. Ce choix provient notamment du fait que les méthodes de capture utilisées sur le terrain ont été optimisées pour l’échantillonnage des sphinx, et ont été moins adaptées pour échantillonner d’autres visiteurs (comme les chauves-souris par exemple). De plus, les études préliminaires effectuées par Ryckewaert et al. (2011) ont montrées qu'une correspondance a été identifiée entre la morphologie des fleurs de baobabs et les sphinx.

La longueur de la trompe et l'envergure des espèces de sphinx recensées sur les fleurs de baobab ont été mesurées à l'aide d'une règle graduée (Photos 18 et 19). Comme le nombre de sphinx capturés sur les fleurs a été faible, un piège lumineux a été utilisé pour compléter l'échantillonnage.

Le piégeage lumineux est une technique standardisée pour échantillonner les communautés de Lépidoptères Hétérocères (Summerville et Crist, 2004). Cette méthode permet d'inventorier les sphinx présents dans le site ainsi que de déterminer leurs abondances relatives. Le piège est constitué de:

- un cadre en métal, servant à fixer un drap blanc,

- trois lampes à vapeur de mercure (1 lampe d’appel de 400 watts et deux lampes de 250 watts au niveau du drap)

- et une bâche en plastique au sol permettra aux insectes de monter vers la source lumineuse.

Ce piégeage lumineux a été placé au centre d'une zone dégagée (Figure 10).

Lampe d’appel

Drap blanc

Bâche au sol

Figure 10: Schéma du type d'installation pour le piège lumineux La trompe des sphinx capturés a été déroulée délicatement à l'aide d'une pince souple et la mesure a été effectuée à l'aide d'une règle graduée. La longueur de l'envergure a été mesurée à partir du point de l'insertion de l'aile sur le thorax jusqu'à la pointe extérieure de l'aile (Photos 23 et 24).

Razanamaro, 2009 Razanamaro, 2009

Photo 23 : Mesure de la longueur de la Photo 24 : Mesure de l’envergure du sphinx trompe du sphinx

II.7. MISE EN EVIDENCE DES RELATIONS FLEUR-POLLINISATEUR ET EFFICACITE DE LA POLLINISATION Cette partie a pour but de déterminer la correspondance entre les caractéristiques florales et les types de pollinisateurs. Ainsi, la coadaptation morphologique fleur-pollinisateur et la relation entre la disponibilité du nectar et de l'odeur florale par rapport à la fréquence de visites des pollinisateurs ont été étudiées.

- La coadaptation morphologique entre la fleur et les pollinisateurs a été évaluée en considérant l'envergure de l'aile, la longueur de la trompe des sphinx et la longueur des

étamines de la fleur. Le test de corrélation de Pearson (rs) a permis de donner une mesure synthétique de l'intensité de relation entre (i) la longueur de la trompe et l’envergure de l’aile du pollinisateur et (ii) la longueur des étamines et l'envergure des ailes du sphinx.

Le coefficient de corrélation (rs) permet d'indiquer le degré d'association entre deux variables. Il s'agit d'un coefficient numérique entre -1 et +°1 :

- si rs est proche de 0, il n’y a pas de relation entre X et Y;

- si rs est proche de -1, une forte relation négative existe entre X et Y ;

- si rs est proche de +1, une forte relation positive entre X et Y est notée.

Le signe de r indique le sens de la relation tandis que la valeur absolue de rs (|rs|) indique l’intensité de la relation c’est-à-dire la capacité à prédire les valeurs de Y en fonction de celles de X.

Dans le présent travail, le coefficient de corrélation de Pearson a été utilisé. - Le rythme de production de nectar et d'odeur florale a été également mis en corrélation avec l'abondance et le type de pollinisateurs. Le coefficient de corrélation de Pearson a également été utilisé pour montrer la relation entre le nombre de composés émis, le volume de nectar disponible avec le nombre et le type de pollinisateurs.

PARTIE III - RESULTATS

Razanamaro, 2010

Les résultats seront présentés successivement dans cette partie:

- la phénologie des six espèces de baobabs Malgaches sera décrite en premier lieu. Les résultats de suivi et d'observation de développement des boutons floraux et les morphoséquences d'ouverture de la fleur seront également abordés.

- les caractéristiques morphologiques et biochimiques des fleurs de baobabs seront ensuite présentées. Les caractères morphométriques de la fleur, la description anatomique des organes sécréteurs, les constituants biochimiques de l'odeur florale et du nectar seront principalement détaillés.

- la diversité et le comportement des pollinisateurs des baobabs seront exposés en troisième lieu. La longueur de la trompe et la taille de sphinx seront également décrites.

- enfin, la corrélation entre les caractéristiques florales, le comportement et la fréquence de visites des pollinisateurs seront évalués.

III.1. PHENOLOGIE DES SIX ESPECES DE BAOBABS MALGACHES

III.1.1. Calendrier de floraison des espèces

Le calendrier de floraison annuel des six espèces de baobab a été établi à partir du mois d'octobre (Figure 11). Les deux sections de baobabs ont des périodes de floraison distinctes : les quatre espèces des Longitubae fleurissent entre les mois d’octobre et avril (période qui inclut la saison des pluies) tandis que les deux espèces de la section des Brevitubae fleurissent de façon synchrone, entre mai et septembre, essentiellement durant la saison sèche.

Pour chaque espèce, les périodes de floraison s'étalent sur deux ou trois mois :

- A. grandidieri fleurit généralement au mois de mai et jusqu’à mi- septembre. A Andranomena, la floraison de cette espèce est en moyenne de quatre mois alors qu'à Andavadoaka la floraison n'a duré que deux mois et demi ;

- la floraison de l'espèce A. suarezenisis est brève et dure deux à deux mois et demi ;

- A. perrieri commence à fleurir dès le mois d’octobre ;

- A. za et A. rubrostipa fleurissent de novembre à avril, selon les sites;

- la floraison de A. madagascariensis s'effectue pendant la saison des pluies à partir du mois de février.

Les quatre espèces des Longitubae présentent un décalage sur la date du début de la période de floraison. Pourtant, une période partiellement chevauchante a été notée entre les espèces à l’exception de A. perrieri et A. madagascariensis (au moins sur les périodes et les sites étudiés).

III.1.2. Phénologie d'A. grandidieri (Brevitubae) et d’A. rubrostipa (Longitubae).

La phénologie de A. grandidieri (Brevitubae) et de A. rubrostipa (Longitubae) qui sont deux espèces sympatriques à Morondava, a été comparée (Figures 12 à 13).

Les deux espèces ont un rythme de feuillaison similaire. Les feuilles apparaissent à partir de novembre, avant le début des fortes pluies, des températures les plus élevées (moyenne de 29°C) et des jours les plus longs (13 heures). La défeuillaison a lieu entre juin et août, jusqu'en octobre.

La floraison de A. grandidieri débute parfois en avril, le plus souvent en mai alors que les arbres sont en phase de défeuillaison. Elle coïncide avec la période sèche et fraîche (température moyenne de 23°C) et les jours les plus courts (environ 11 heures). La période de floraison se termine en août-septembre, avant l'apparition des feuilles.

A. rubrostipa fleurit entre décembre et avril, en saison humide et pendant la période de feuillaison des arbres. La floraison de cette espèce coïncide avec la période à forte précipitation, à l’augmentation de la température et au jour le plus long (13 heures). Le maximum de pieds en fleur (pic de floraison) se situe généralement au mois d'avril.

Pour les deux espèces la maturité des fruits se passe environ six mois après la floraison, novembre à décembre pour A. grandidieri et de juillet à octobre pour A. rubrostipa.

Figure 11 : Calendrier de floraison des six espèces de baobabs malgaches : évaluation interannuelle et interspécifique période de floraison des Longitubae, période de floraison des Brevitubae, chevauchement de floraison entre A. perrieri et A.za, entre A.za et A. rubrostipa

entre A. za, A. rubrostipa et A. madagascariensis 54

Température moyenne (°C) moyenne Température

Précipitation (mm) Température moyenne (°C) Longueur du jour (h)

a) Conditions climatiques de la région de Menabe (mars 2008- juin 2012)

individus

MOIS Pourcentage des Pourcentage

Stade f2 de floraison stades V2, V3, V4 de feuillaison Stade F3 de Fructification b) Phénologies de A.grandidieri à Andranomena (mars 2008- juin 2012) Figure 12: Phénogrammes comparatives de la floraison, feuillaison et fructification au sein de A. grandidieri (section Brevitubae,

d'Andranomena) en fonction des conditions climatiques locales. f2: fleurs fraichement épanouies, V2: présence de jeunes feuilles, V3: présence de feuilles développées, V4: présence de feuilles sénescentes. 55

50 )

Température moyenne (°C moyenne Température

Précipitation (mm) Température moyenne (°C) Longueur du jour (h)

a) Conditions climatiques de la région de Menabe (mars 2008- juin 2012)

individus

Pourcentage des des Pourcentage

Stade f2 de floraison stades V2, V3, V4 de feuillaison Stade F3 de Fructification b) Phénologies d’Adansonia rubrostipa à Andranomena (mars 2008- juin 2012)

Figure 13: Phénogrammes de la floraison, la feuillaison et la fructification au sein de A. rubrostipa (section Longitubae, à Andranomena) en fonction des conditions climatiques locales. F2: fleurs fraichement épanouies, V2: présence de jeunes feuilles, V3: présence de feuilles développées, V4: présence de feuilles sénescentes

III.1.3. Développement des boutons floraux Le suivi du développement des boutons floraux jusqu'à l’épanouissement de la fleur a permis d'identifier cinq stades évolutifs chez les fleurs de baobabs (Tableaux 5 et 6). Le premier stade de développement de la fleur chez le baobab est caractérisé par la présence de boutons de petite taille (PB ) mesurant en moyenne 16,6 ± 2,1 mm chez A. grandidieri et 33,7 ± 1,9 mm chez A. rubrostipa (Photos 25 à 36). Pendant ce stade, les calices sont de couleur vert foncé à l’extérieur et violet à l’intérieur chez A. rubrostipa et brun verdâtre foncé à l’extérieur et jaune à l’intérieur chez A. grandidieri. Après 20 jours, ces boutons sont devenus de jeunes boutons (JB ). Les caractéristiques des pièces florales sont toujours les mêmes que celles au stade de petits boutons seulement leurs longueurs moyennes atteignent 58,62  1,99 mm pour A. rubrostipa et 43,58  2,26 mm pour A. grandidieri (Photos 25et 31). Ce stade dure en moyenne 8 jours. Tableau 5. Caractéristiques des stades de développement de la fleur d'A. grandidieri.

Durée en Caractères nombre de jours Longueur Couleur des Couleur des Libération Maturation Stade floral des boutons sépales pétales des pollens du stigmate (mm)* 20 16,6 ± 2,1 brun blanc - - Petits boutons verdâtre 8 Jeunes 43,6 ± 2,3 brun blanc - - Boutons boutons verdâtre 1 Boutons 67,7 ± 1,9 brunâtre blanche - + matures 1 100,9 ± 3,3 brunâtre blanche + + Fleurs Fleurs fraiches jaunâtre 4 ouvertes nd brun foncé blanche - Fleurs fanées (desséché) marron * longueur moyenne ± erreur standard. + : présence. - : absence. nd : non déterminé. Tableau 6 : Caractéristiques des stades de développement de la fleur d'A. rubrostipa.

Caractères Durée en nombre Longueur des Couleur Couleur des Libération Maturation du de jours Stade floral boutons des pétales des pollens stigmate (mm)* sépales 20 Petits boutons 33,7 ± 1,9 vert verdâtre - - Jeunes 58,6 ± 1,9 verdâtre verdâtre - - 8 Boutons boutons Boutons 134,3 ± 7,8 vert rouge ou - + 1 matures jaunâtre orange 173,8 ± 14,8 vert rouge ou + + Fleurs fraiches 1 Fleurs jaunâtre orange ouvertes nd jaune marron - - Fleurs fanées 3 marron * longueur moyenne ± erreur standard. + : présence. - : absence. nd : non déterminé. 57

Planche 4 Stades de développement de la fleur chez A. grandidieri (Photos 25 à 29) et A. rubrostipa (Photos 31 à 36): depuis le bouton à la formation de fruit.

Razanamaro, 2012 Razanamaro, 2012 ; E = 1 / 2 E = 1 / 1 E = 1 / 1 Razanamaro, 2012 Photo 25 : Petit bouton floral Photo 27 : Bouton floral mature Photo 26 : Bouton floral en stade chez A. grandideiri chez A. grandidieri jeune de A. grandidieri

Razanamaro, 2012 Razanamaro, 2012 Razanamaro, 2012 E = 1 / 1 E = 1 / 5 E = 1 / 5 Photo 30 : Début de fructification Photo 28 : Fleur fraiche chez A. Photo 29 : Fleur fanée de chez A. grandidieri grandidieiri A. grandidieri

Razanamaro, 2012 E = 1 / 2 Razanamaro, 2012 E = 1 / 3 E = 1 / 4 Razanamaro, 2012 Photo 31 : Petit bouton Photo 32 : Jeune bouton Photo 33 : Bouton floral floral chez A. rubrostipa florale chez A. rubrostipa mature chez A. rubrostipa

E = 1 / 5 Razanamaro, 2012 Razanamaro, 2012 E = 1 / 2 E = 1 / 5 Razanamaro, 2012

Photo 34 : Fleur fraiche Photo 35 : Fleur fanée de A. rubrostipa Photo 36 : Début de la fructification de A. rubrostipa chez A. rubrostipa 58

Ensuite, les boutons floraux sont en stade mature avec une modification de la couleur des pièces florales: pétales blancs chez A. grandidieri et rouges ou oranges chez A. rubrostipa. Leurs longueurs moyennes atteignent respectivement pour chaque espèce de 67,67  1,86mm et 134,31  7,80mm. Au bout de huit jours, les boutons arrivent à leur taille maximale avec des longueurs moyennes de 100,88 3,33mm chez A. grandidieri et 173,81  4,82mm chez A. rubrostipa. Les sépales commencent à s'ouvrir, et laissent entrevoir les pétales (Photos 27 et 33). Vingt-quatre heures après ce stade c’est-à-dire le neuvième jour, tous les boutons matures s'ouvrent complètement (Photos 28 et 34). Les fleurs sont fraiches avec un stigmate très réceptif et une libération importante de pollens. Le lendemain de l'ouverture (12h après l'ouverture), les pétales changent de couleur et deviennent moins frais, ternes et se recroquevillent. Deux jours après l'ouverture de la fleur, les pièces florales se dessèchent et le stigmate brunit (Photos 29 et 35). Au bout de quatre jours, toutes les pièces florales tombent sauf le stigmate et l'ovaire fécondé (Photo 30 et 36). La formation de fruit est observée 6 jours après la fécondation. III.1.4. Morphoséquence d'ouverture de la fleur Chez A. grandidieri, l'ouverture de la fleur commence à partir de 17h00, avec un pic à partir de 17h45 mn et se termine vers 19h15 (Figure 14). Le pic correspond à l'ouverture d’un grand nombre de boutons floraux matures (en moyenne 35 ± 11 boutons/arbre). Cette ouverture est caractérisée par le détachement petit à petit des sépales suivi d'une libération des autres pièces périanthaires. La durée de l'ouverture est en général de une à cinq minutes. A l'ouverture, les pétales sont blancs éclatants, le stigmate est réceptif, poilu, humide, collant, jaune et les grains de pollen sont nombreux. Dès le lendemain, la couleur du pétale vire au jaune et les étamines ne sont plus fraîches et virent au marron. PO

Jour Nuit Figure 14: Pic d’ouverture (PO) des fleurs chez A. grandidieri (Brevitubae)

Chez A. rubrostipa, le moment d'ouverture de la fleur a généralement lieu entre 18h 30 à 20 h 30 et le processus est le même que chez A. grandidieri. La majorité des boutons floraux (en moyenne 21 ± 9 boutons) sont ouverts à 19h30 (Figure 15). A 19 h 45, la totalité des fleurs est ouverte avec quelques fleurs tardives qui s'ouvrent vers 20 h 30. Les fleurs ont des pétales rouges ou orange éclatants à l’ouverture avec un stigmate rouge réceptif, poilu, humide et collant. Le lendemain matin, les pétales de la fleur virent au marron et les étamines se fanent petit à petit.

Jour Nuit Figure 15: Pic d’ouverture (PO) des fleurs chez A. rubrostipa (Longitubae).

L'ouverture de la fleur s'effectue au crépuscule pour les deux espèces. Mais comme la floraison d’A. rubrostipa survient pendant la période d’été dont le jour est long (en moyenne 13 heures) et donc le coucher du soleil n’a lieu qu’à partir de 18h15, le moment de l’ouverture de la fleur semble être tardive (18h30). Par contre chez A. grandidieri, la floraison s’effectue pendant l’hiver (mois de juin) où le jour est court (en moyenne 10 heures) ou le coucher du soleil a lieu vers 17h, l'ouverture de la fleur est ainsi constatée à partir de 17h15.

D'après nos observations sur le terrain, le stigmate non fécondé tombe généralement avec la fleur entière dès le lendemain alors que celui qui est fécondé reste sur l'arbre jusqu'à la formation du petit fruit.

III.2. MORPHOLOGIE ET MORPHOMETRIE DES FLEURS DE BAOBABS

III.2.1. Caractères morphométriques des fleurs

III.2.1.1. Caractères morphométriques des fleurs au sein de deux sections Les deux sections de baobabs malgaches ont une longueur de pièces florales très différente (Tableau 7), qui leur vaut leurs appellations Longitubae (long tube staminal) et Brevitubae (court tube staminal). Les fleurs des Longitubae mesurent significativement le double de celles des Brevitubae : la longueur moyenne des sépales est respectivement de 203,3 ± 2,8 mm et de 93, ± 1,2 mm (P < 0,0001). De même, la longueur du tube staminal est sept fois plus longue chez les Longitubae que chez les Brevitubae (79,8 ± 27,8 mm ; 11,8 ± 2,3 mm).

Tableau 7 : Moyennes (± erreur standard) des mesures des pièces florales (mm) pour chaque section de baobabs malgaches.

Mesure des pièces florales Brevitubae Longitubae Valeur de P Longueur des sépales 93,9 ±9,7 203,3 ±39,9 0,000*** Longueur des pétales 82,8 ± 10 195,8 ±43,3 0,000*** Longueur des étamines + tube staminal 68,6 ± 12,3 185,8 ±59,1 0,000*** Longueur du stigmate 98 ± 14,5 208,1 ±38 0,000*** Seuil de signification : *** fortement significative P < 0,001..

III.2.1.2. Variations interspécifiques

 Espèces de la section des Brevitubae

La longueur des sépales et des pétales varie chez les deux espèces de Brevitubae (Tableau 8). Les sépales de A.grandidieri sont plus courts que ceux de A. suarezensis (respectivement 91,8 ± 11,6 mm contre 96,9 ± 5,1 mm). Par contre, les pétales de A.grandidieri est plus longs que ceux de A. suarezensis ( respectivement 86,1 ± 10,9 mm contre 78,3 ± 6,4 mm). La longueur de l'étamine avec le tube staminal et celle du pistil est similaire chez les deux espèces, elle est en moyenne de 68,5 mm pour A.grandidieri et de 68,6 mm pour A. suarezensis et celui du pistil est de 100,6 mm et de 94,3 mm (Tableau 8).

Tableau 8. Moyennes (± erreur standard) de la taille des pièces florales (mm) pour les deux espèces des Brevitubae. A. grandidieri A. suarezensis Mesure des pièces florales (mm) Valeur de P (40 fleurs) 28 fleurs) Longueur des sépales 91,8 ±11,6 96,9 ±5,1 0,033* Longueur des pétales 86,1 ±10,9 78,3 ±6,4 0,01** longueur des étamines+ tube 68,5 ±12,2 68,6 ±7,5 0,979ns staminal Longueur du pistil 100,6 ±17,1 94,3 ±8,9 0,079ns Seuil de signification P < 0,05, *** fortement significatif, ** très significatif et ns : non significatif.

 Espèces des Longitubae

Les longueurs moyennes des pièces florales sont différentes entre les espèces chez les Longitubae. Les longueurs des sépales d’A. za sont identiques à celle d'A. perrieri avec une moyenne respective de 181,3 ± 24,6 mm et de 190,3 ± 18,3 mm; mais légèrement plus courtes par rapport à celle d'A. rubrostipa et d’A. madagascariensis (216,4 ± 48,8 mm et 222,5 ± 30,6 mm). Les pétales de A. za sont plus courts par rapport aux autres espèces (188,4 ± 20,9 mm) alors que les pétales de A. perrieri sont les plus longs (217,2 ± 7,9 mm). Les longueurs des étamines et du pistil sont plus élevées chez A. rubrostipa (respectivement 212,6 ± 31,2 mm et 212,6 ± 31,2 mm) que chez A. za avec les moyennes respectives de 166,9 ± 24,3 mm et de 172,7 ± 19,8 mm (Tableau 9).

Tableau 9 : Moyennes (± erreur standard) de la longueur des pièces florales (mm) pour les quatre espèces des Longitubae.

Mesure des pièces A. perrieri A. madagascariensis A. rubrostipa A. za florales (mm) (12 fleurs) (45 fleurs) (70 fleurs) (77 fleurs) Longueur des sépales 190,3 ±18,3a 222,5 ±30,6b 216,4 ±48,8b 181,3 ±24,6a Longueur des pétales 217,2 ±7,9c 205,1 ±34,85ab 193,9 ±63,3ab 188,4 ±20,9a Longueur des étamines 171,6 ±5,9a 179,3 ±33,8a 212,6 ±31,2b 166,9 ±24,3a + tube staminal Longueur du pistil 208,8 ±6,9b 214,5 ±24,35b 242,1 ±29,7c 172,7 ±19,8a

III.2.1.3. Position de l'organe femelle et de l'organe mâle sur une même fleur (herchogamie) Chez les six espèces de baobab étudiées (Tableau 10), la longueur du pistil est supérieure à celle des étamines avec une différence allant jusqu’à 25,7 mm chez A. suarezensis et 37,2mm chez A. perrieri (herchogamie forte). En revanche, ces longueurs sont quasi similaires pour A. za avec un pistil mesurant de 172,7 ± 19,8mm et des étamines de

166,9 ± 24,8 mm, soit une différence de 5,8 mm (herchogamie faible). L’herchogamie est défini comme un mécanisme favorisé par les plantes pour diminuer le taux d’autopollinisation. L'herchogamie est forte au sein des espèces où la différence entre la position de l'organe femelle (stigmate) et organe mâle (étamine) est élevée par contre elle est faible pour les espèces où le stigmate et les étamines sont quasiment à la même hauteur.

Ainsi, un vecteur de pollen est nécessaire pour que la fécondation soit efficace chez les espèces de baobabs surtout chez A. grandidieri, A. suarezensis, A. perrieri, A. rubrostipa et A. madagascariensis. Par contre, l'herchogamie est faible ou nulle chez A. za, l' autopollinisation peut être beaucoup plus favorisée chez cette espèce.

Tableau 10. Longueurs moyennes (± erreur standard) du pistil (fleur femelle) et de l' étamine + tube staminal (fleur mâle ) de la fleur et différences entre les deux mesures.

Organe femelle Organe mâle Différence Espèce (mm) (mm) (mm) A. grandidieri (39 fleurs) 100,6 ± 17,1 68,5 ± 12,2 32,1 A. suarezensis (28 fleurs) 94,3 ± 8,9 68,6 ± 7,6 25,7 A. perrieri (12 fleurs) 208,8 ± 6,9 171,7 ± 5,9 37,2 Herchogamie forte A. madagascariensis (47 214,5 ± 24,4 179,3 ± 33,8 35,1 fleurs) A. rubrostipa (71 fleurs) 241,8 ± 29,5 212,6 ± 31,2 29,2 A. za (76 fleurs) 172,7 ± 19,8 166,9 ± 24,8 5,8 Herchogamie faible ou nulle

III.2.2. Morphologie et structure anatomique des tissus sécréteurs

III.2.2.1. Localisation, morphologie et structure anatomique de l’osmophore chez les baobabs Le tissu sécréteur de l'odeur florale ou "osmophore" est localisé sur la face supérieure du pétale chez les deux espèces de baobabs étudiées : A. grandidieri et A. rubrostipa (Photos 37 et 41). L'osmophore est formé par des papilles sécrétrices de types coniques et globulaires (Photos 38 et 42).

Planche 5 Localisation et structure anatomique de l'osmophore chez A. rubrostipa (Photo 37 à 40)

Razanamaro, 2012 Photos 37: Localisation de l’osmophore sur le pétale de A. rubrostipa (encadré rouge).

Razanamaro, 2013 Razanamaro, 2013 Photo 38: Présence de papilles globulaires Photo 39: Présence de flavonoïde intracellulaire

(flèches rouges) riches en anthocyane au niveau (flèche rouge, orange au réactif de Neu, X 40) de l’épider me (flèche verte)

Stomates

Razanamaro, 2012 Photo 40 : Stomates modifiés.

 Les cellules de l’épiderme supérieur sont en forme de papilles globulaires caractéristiques chez A. rubrostipa (Photo 38). Ces cellules sont riches en substances qui peuvent correspondre à des pigments comme les anthocyanes (Photo 38, flèche verte). De

plus, la présence de flavonoïde et de composés aromatiques, est notée au niveau des cellules épidermiques, colorée en orange vif observée au UV (Photo 39) ainsi que la présence de l'acide phénolique colorée en bleu (Photo 39). La présence de stomates permettant l'émission de l'odeur florale est également identifiée chez cette espèce (Photo 40).  Pour A. grandidieri, les papilles sont généralement en forme conique et également riches en pigment (Photo 42). La présence de flavonoïde n'est pas mise en évidence chez A. grandidieri par contre des terpènes ont été identifiés (colorés en violet par le réactif de Nadi sur les parois des papilles sécrétrices, Photo 43). Ce type de composé volatil est d'ailleurs identifié sur l'odeur florale de cette espèce. Planche 6 Localisation et structure anatomique de l'osmophore chez A. grandidieri (Photos 41 à 43)

Razanamaro, 2011 Photo 41: Localisation de l’osmophore sur la partie de pétale chez A. grandidieri (encadré rouge).

Razanamaro, 2012 Razanamaro, 2013

Photo 43: Cellules épidermiques riches en Photo 42: Papilles en forme de cône chez A. grandidieri (flèche jaune, X 40) terpène chez A. grandidieri (positif au réactif de Nadi, flèche rouge, grossissement X 40)

III.2.2.2. Localisation et structure des nectaires chez les baobabs Les glandes nectarifères sont repérées au moment du prélèvement du nectar : à la base du sépale chez A. rubrostipa (Planche 7), et à la base du pétale chez A. grandidieri (Planche 8).  Chez A. rubrostipa, le nectaire est formé par des trichomes, de parenchyme nectarifère et comprend des vaisseaux conducteurs (Photo 47). Les cellules du trichome ont des parois à cuticules striées (Photos 46), pluricellulaires, riches en lipides (Photo 48) et remplies de protéines (photo 48), d'où la teneur élevée en protéines identifiées dans le nectar des Longitubae. Le parenchyme nectarifère est formé par plusieurs assises de cellules riches en grains d'amidon (Photo 49). La présence des grains d’amidon est à mettre en relation avec un flux accru de saccharose. Les tissus conducteurs sont justes en dessous du parenchyme nectarifère et divergent vers ce tissu (Photo 47). Planche 7 Localisation des nectaires chez A. rubrostipa (Photos 44 à 46)

Razanamaro, 2012

Photo 45: Tapis de trichomes sur le renflement à la base du sépale au MEB (flèche rouge, faible Leong Pock Tsy , 2011 grossissement)

Photo 44: Base du sépale permettant de localiser le "nectaire" chez A. rubrostipa (cercle rouge)

Razanamaro, 2012

Photo 46: Trichomes à cuticule striée au MEB (flèche rouge, fort grossissement).

Planche 8

Structure anatomique des nectaires chez A. rubrostipa (Photos 47 à 49)

Trichomes

ss Parenchyme nectarifère

Vaisseaux conducteurs

Razanamaro, 2012 Photo 47 : Coupe épaisse de la partie creuse montrant les différents tissus formant le nectaire chez A. rubrostipa.

Razanamaro, 2012 Razanamaro, 2012

Photo 48: Trichomes riches en lipides Photo 49: Parenchyme nectarifère riche en

(flèches rouges, positif au Nile Red) grains d'amidon (Positif au réactif de Schiff, ² flèche jaune).

 Chez A. grandidieri, le nectaire est également formé par trois types de tissu : épiderme, parenchyme, et tissus conducteurs (Photo 54). L'épiderme est formé par une seule couche de cellules surmontées par des trichomes. Ces cellules de trichomes ont des parois à cuticule striées et très allongées par rapport à celles identifiées chez A. rubrostipa (Photo 53). Ils sont riches en lipides et en protéines (Photos 55 et 56). Les tissus conducteurs divergent vers le tissu nectarifère (Photo 54). Le tissu parenchymateux est également formé de cellules arrondies riches en grains d'amidon (Photo 55). 67

Planche 9 Localisation de nectaires chez A. grandidieri (Photos 50 à 53)

Nectaires

Razanamaro, 2011 Razanamaro, 2012

Photo 50 : Gouttelette de nectar observée à la base Photo 51: Nectaires identifiés à la base du pétale au du pétale (flèche rouge) MEB

Razanamaro, 2012 Razanamaro, 2012

Photo 52: Tapis de trichomes observé au MEB Photo 53: Trichome à cuticules striées au MEB

Planche 10 Structure anatomique du nectaire chez A. grandidieri (Photos 54 à 56)

Trichomes

Parenchyme nectarifère

Vaisseaux conducteurs

Razanamaro, 2012 Photo 54: Coupe épaisse montrant les différents tissus formant les nectaires chez A. grandidieri. Tr: Trichomes, Vx: vaisseaux conducteurs.

Razanamaro, 2012 Razanamaro, 2012

Photo 55: Trichomes riches en protéines (NBB Photo 56: Trichomes riches en lipides (jaune au po sitif, flèche rouge) Nile Red, flèche rouge).

III.3. CARACTERISTIQUES BIOCHIMIQUES DES) SECRETIONS FLORALES

III.3.1. Composition biochimique des odeurs florales chez les baobabs La quantité totale des composés volatils obtenue dans 100 g de fleurs fraîches varie, selon les espèces, de 0,5 mg ± 0,3 chez A. suarezensis à 20,3 mg 17,6 chez A. perrieri. Soixante-quatre composés volatils, en tenant comptent des composés sous forme de trace et ceux qui ont de faibles proportions sont identifiés. Ces composés appartiennent à quatre classes chimiques : les terpènes, les aromatiques, les aliphatiques et les tiglates. Parmi eux, 38 composés sont observés chez les Longitubae et 15 chez les Brevitubae (Tableau 11).

Tableau 11. Pourcentages (moyenne ± erreur standard) des composés volatils identifiés sur les fleurs des six espèces de baobabs endémiques à Madagascar. IR: Indice de rétention pour chaque composé volatil identifié.

Sections BREVITUBAE LONGITUBAE Espèces A. grandidieri A. suarezensis A. perrieri A. madagascariensis A. rubrostipa A. za Nombre d' individus collectés n=4 n=3 n=6 n=4 n=10 n=6 Nombre total de composés 21 15 20 18 26 26 Total des volatiles (mg/100g par fleurs) 1,5±1,2 0,5±0,3 20,3±17,6 5,7±4,4 10,1±5,4 6,5±3,1 IR

Composés terpèniques 5,5 23,2 14,7 5,8 24,6 7,3 Monoterpènes 3,9 8,3 14,7 3,8 1,3 6,65 6-méthyl hept-5-èn-2-one* 986 - 5,2±5,1 - - - - limonène 1029 0,1±1,1 trace 1,8-cinéole 1031 - - 0,6±0,4 - - - (E)-β-ocimene* 1035 3,9±2,9 trace 0,3±0,1 trace 0,1± 0,05 - oxyde de linalol (Furanoïde)* 1044 - 3,1± 3,03 1,8± 0,8 1,3± 1,6 0,4± 0,2 3,6± 1,1 oxyde de linalol (Pyranoïde)* 1180 - - 11,5± 6,4 - 0,7± 0,5 3,1± 2,5 linalol 1097 - - 0,6±0,4 2±0,6 0,1±0,08 trace Sesquiterpènes 1,6 15 trace 3,7 0,2 (E)-β-caryophyllène 1419 - - trace - - 0,2±0,2 géranyl acétone* 1457 0,2± 0,2 8,4± 4,5 - 2,4± 2,1 - - farnésol* 1725 1,3± 0,8 6,6± 3,6 - 0 - - acétate de farnesyl 1847 - - - 1,2±1,2 - - Composés aromatiques 21,1 15,1 76,3 78,4 63,9 73,6 benzaldéhyde* 972 4,3±2,7 trace 0,2±0,1 - - - alcool benzylique* 1040 10,3±5,1 0,1±0,1 trace 0,3±0,2 trace 0,7±0,6 guaïacol* 1089 0,3± 0,3 4,2± 4,1 - 0,4± 0,3 trace trace 2-6-diméthylphénol 1107 - - trace - - - 2-phényléthanol* 1114 0,6±0,6 7,6±7,5 0,1±0,07 16,1±7,4 0,7±0,3 12,9±6,9 2-phénylacétonitrile* 1145 - - 74±5,4 46,2± 14,5 52,6±9,4 50,4±12,2 coahuilensol* 1159 - - - 3,5± 1,7 0,01±0,01 - 70

Tableau 11. (suite)

Composés aromatiques IR A. grandidieri A. suarezensis A. perrieri A. madagascariensis A. rubrostipa A. za acétate de benzyle 1152 1±0,7 - - - - - benzoate d'éthyle* 1160 2,5±2,5 - - - - - estragole 1196 - - 0,4±0,3 - 0,2±0,1 - p-anisaldéhyde 1250 - - - 1±0,9 - - acétate de 2-phényléthyle 1258 - - 1,2±0,6 - - 0,5±0,5 propanoate de benzyle 1260 - - - trace - - 4-éthyl guaïacol* 1271 - - - - 1,8±1,6 - 2-méthoxy-4-vinyl phénol 1331 4,06±4,06 trace trace 0,28±0,27 1,01±0,81 0,98±0,63 o-méthoxyphénol* 1349 - 3,2± 3,1 - - - - propanoate de 2-phényléthyle 1354 - - - - - 0,6±0,5 2-méthylbutanoate de benzyle 1438 eugénol 1359 - - - trace - - méthyl eugénol* 1389 - - - - - 2,1± 2 butanoate de 2-phényléthyle* 1429 - - 0,5±0,4 - - 3,4± 1,6 benzoate d'isoamyle* 1431 0,7±0,7 - - - 1,7±1,4 - alcool p-méthoxy cinammique* 1463 - - - 3,3±2,2 - - (E)- cinnamate d'éthyle* 1467 - - - 3,8±2,4 - - 2-méthylbutanoate de 2-phényléthyle 1487 - - - - - 0,7± 0,7 melléine** 1538 - - trace - 3,1± 3,1 0,4± 0,3 benzoate de (Z)-hex-2-ényle* 1574 - - - - 2,5±1,9 - benzoate d'hexyle* 1585 - - - - - 1,7±1,4 alcool p-methoxydihydrocinammique* 1729 - - - 4±2,8 - - benzoate de benzyle* 1769 0,7±0,7 - - - 1±0,5 - Composés aliphatique 61,2 52,4 4 2,8 1 9,9 acétate d'isoamyle 881 - - - - 1 ± 0,5 - butanoate de butyle 995 - - - - - trace butanoate d'isoamyl 1058 - - 0,5± 0,3 - - 0,5±0,5 nonan-2-one* 1098 4,1± 2,2 4,2± 2,1 - - - - undecane* 1100 2,2± 2,2 - - - - - butanoate de (Z)-hex-3-ényle* 1181 - - 0,6±0,6 - - 3,8±0,5 71

Tableau 11. (suite) butanoate d'hexyle* 1194 - - 1,1± 0,8 - - 3,4± 1,3 dodecane* 1200 1,6± 1,6 - - 2,8± 1,8 - - 2-méthylbutanoate de(Z)-hex-3-ényle 1236 - - - - - 2,2± 0,7 Composés aliphatiques (suite) IR A. grandidieri A. suarezensis A. perrieri A. madagascariensis A. rubrostipa A. za tetradecane 1400 1,9±1,5 - - - - - acide dodecanoique* 1564 - 2,8±2,7 - - - - hexadec-1-ène 1590 1,9±0,9 0 - - - - dodecanoate d'éthyle* 1593 - 3± 2,9 - - - - hexadecane 1600 1,1±1,1 - - - - - heptadec-8-ène* 1685 46,1± 16,6 42,5± 9,6 - - - - heptadecane* 1700 2,5± 2,2 - - - - - 1-hexadecanol 1876 0,6±0,6 - - - - - Autres 0 0 0 0 23,6 0,5 tiglate d'éthyle* 881 - - - - 8,4± 4,3 trace ester tiglique 1026 - - - - 0,3±0,3 - tiglate d' isoamyle 1146 - - - - 0,1±0,07 - tiglate de (Z)-hex-3-ényle* 1320 - - - - 3,8± 1,1 - tiglate d'hexyle* 1328 - - - - 4,7± 0,7 0,12± 0,05 tiglate de benzyle* 1507 - - - - 3,8± 1,4 - tiglate de 2-phényléthyle* 1597 - - - - 2,5± 0,9 0,3± 0,2 Non déterminés 6,1±2,6 8,9±5,1 3,7±0,8 8±3,3 9,4±1,2 8,8±2,3 Les composés volatils identifiés sont groupés par classes selon leur voie de biosynthèse et sont ensuite listés suivant leur indice de rétention dans un ordre croissant. Les composés qui ont un pourcentage moyen inférieur à 0,01% sont considérés comme trace. * composés ayant des pourcentages ≤ à 5% dans au moins un échantillon **Melléine ou 3,4- dihydro-8-hydroxy-3-méthyl 1H-2-benzopyrane1-one.

Les espèces contenant le plus de composés volatils sont A.za et A. rubrostipa avec 26 composés identifiés. Ces deux espèces ont en outre un profil chimique particulier, car elles seules présentent des composés à structure tiglique. Adansonia suarezensis contient le moins de composés (15 composés volatils). Sur la totalité des échantillons analysés, 39,06 % des composés volatils n'ont pas de proportions supérieures à 5 % et 6,25 % des composés volatils n'ont été détectés que sous forme de traces.

III.3.1.1. Comparaison des émissions florales entre les deux sections de baobabs Les composés volatils majoritaires, qui ont un pourcentage supérieur ou égal à 5%, sont considérés pour comparer l'émission florale entre les deux sections de baobabs. Parmi les composés volatils identifiés, 39 ont permis de caractériser les deux sections. La comparaison selon la présence / absence des composés révèle que 19 sont spécifiques de la section des Longitubae et 10 sont propres aux Brevitubae (Figure 16). La présence de composés volatils à structure terpénique est équivalente d'une section à une autre, avec 5 pour les Longitubae et 4 pour les Brevitubae. Les composés volatils à structure aromatique sont plus abondants chez les Longitubae que chez les Brevitubae (17 et 18). Les Brevitubae ont davantage de composés volatils à structure aliphatique (7 composés), que les Longitubae (3 seulement).

Le composé volatil spécifique à la section des Brevitubae est le heptadec-8-ène, composé à structure aliphatique avec un pourcentage égal à 40,64 ± 21,6 %. Le 6-méthyl- hept-5-èn-2-one (-3,4 ; P<0,05), le farnésol (Z = -3,4 ; P<0,05), géranyl acétone (-2,09 ; P<0,05), benzaldéhyde (Z =-2,3 ; P<0,05), l'alcool benzylique (Z = -3,2; P<0,05), le nonan-2- one (Z = -4,0384 ; P< 0,001), l’acide dodecanoique (Z=-2,7 ; P<0,05) et le dodecanoate d'éthyle (Z = -2,7 ; P<0,05) sont significativement caractéristiques chez cette section.

Par contre chez les Longitubae: le 2-phénylacétonitrile à structure aromatique est le plus dominant avec un pourcentage moyen de 58,3 ±22,2 %. Le butanaoate de (Z)-hex-3- ényle (Z -2,1; P<0,05) ainsi que les composés tigliques sont spécifiques à cette section.

Certains composés volatils ont des pourcentages similaires entre les deux sections et peuvent être considérés comme des composés volatils communs : oxyde de linalol (Furanoïde) (-1,5 ; P>0,05), 2-phényléthanol (-1,4 ; P>0,05), 2-méthoxy-4-vinyl phénol (-0,6 ; P>0,05), (E)-β-ocimene (Z =-1,5 ; P>0,05).

Pourcentage moyenne (%) Figure 16 : Comparaison des pourcentages des composés volatils majoritaires entre les deux sections de baobabs (pourcentage supérieur ou égal

à 5% dans au moins un échantillon). *: significatif P< 0,05, **: très significatif P< 0,001, ***: fortement significatif P< 0,0001 (test de Mann

Whitney). pourcentages relatifs (%) 74

III.3.1.2. Caractères chimiques des odeurs florales émises entre les espèces de la même section

 Odeurs florales émises par les fleurs des Brevitubae Dix-neuf composés volatils sont identifiés dans l'émission florale de deux espèces de Brevitubae. Parmi ces composés, cinq (5) existe exclusivement chez A. suarezensis : 6-méthyl hept-5-èn-2-one, oxyde de linalol (Furanoïde), o-méthoxyphénol, acide dodecanoique, dodecanoate d'éthyle et six chez A. grandidieri : (E)-β-ocimène, benzaldéhyde, benzoate de benzyle, undecane, dodecane et heptadecane.

A. grandidieri contient majoritairement du benzaldéhyde et de l'alcool benzylique (Z=4,8; P<0,05) alors que le 6-méthyl hept-5-èn-2-one (Z= 5,6; P<0,05) est spécifique d’A. suarezensis. Les composés communs aux deux espèces sont: heptadec-8-ène, nonan-2-one, 2- phényléthanol, gaïacol, 2-méthoxy-4-vinyl phénol et alcool benzylique (Tableau 12).

 Odeurs florales émises par les fleurs des Longitubae Vingt-cinq (25) composés volatils permettent de distinguer les espèces des Longitubae entre elles (Tableau 13) dont neuf chez A. perrieri et A. madagascariensis, 16 chez A. rubrostipa et 13 chez A. za. Parmi ces composés, deux sont communs à toutes les espèces : oxyde linalol (furanoïde) et 2-phénylacétonitrile (p>0,05). Le 2-phényléthanol est identifié chez toutes les espèces, mais sa proportion est significativement plus élevée chez A. madagascarieinsis et A.za par rapport aux deux autres espèces (χ2= 16,7; P<0,001).

Chaque espèce possède des composés volatils caractéristiques: - l’émission volatile de A. perrieri contient majoritairement de l'oxyde de linalol (pyranoïde) dans une proportion de 11,5 ± 6,4% significativement plus élevée que les autres espèces (χ2=14,1; P<0,001) ; - l'alcool p-méthoxy cinammique, l'alcool p-méthoxy dihydrocinammique, le (E)- cinnamate d'éthyle et le coahuilensol sont notés uniquement chez A. madagascariensis à des teneurs supérieures à 3% ; - A. rubrostipa est caractérisée par la présence de tiglates et de benzoates dont tiglate d'éthyle (8,4 ± 4,3 %; χ2 = 17,4; P<0,001) et benzoate de (Z)-hex-2-ényle 2,5 ± 1,9 %; χ2 = 14,3, P <0,001). Ces composés volatils sont totalement absents chez A. perrieri, A. madagascariensis et seulement en faible quantité (< 0,3%) chez A. za ;

- une quantité importante de dérivé d'acide butanoique est identifiée chez A. za: butanoate de (Z)hex-3-ényle(3,8± 0,5 %; χ2 = 22,5, p<0,0001), butanoate de 2-phényléthyle (3,4 ± 1,6 %; χ2 = 10,4, p <0,05) et butanoate d'hexyle (3,4 ± 1,3 %; χ2 = 18,2, p < 0,0001).

Tableau 12. Pourcentages moyens des composés volatils de l'odeur florale chez les espèces de Brevitubae (pourcentage supérieur ou égal à 5% dans au moins un échantillon). IR: Indice de rétention pour chaque composé volatil identifié.

A. grandidieri A. suarezensis Composés volatils Valeur χ2 P value IR (n = 4) (n = 3) Monoterpènes

6-méthyl hept-5-èn-2-one 986 - 5,2±5,1 5,6 0,029* (E)-β-ocimene 1035 3,9±3,9 - 2,2 0,2 Oxyde de linalool 1044 - 3,1±3,03 3,1 0,143 (Furanoïde) Sesquiterpènes

géranyl acétone 1457 0,2±0,2 8,4± 4,5 1,9 0,04* farnesol 1725 1,3±0,8 6,6±3,6 2,1 0,043* Aromatiques

benzaldéhyde 972 4,3± 2,7 - 0,6 0,043* alcool benzylique 1040 10,3± 5,2 0,1±0,1 4,8 0,037 gaïacol 1271 0,3±0,3 4,2±4,1 2,2 0,114 2-phenyléthanol 1114 0,6±0,6 7,6±7,5 1,0 0,371 o-méthoxyphenol 1349 - 3,2±3,1 1,3 0,429 benzoate de benzyle 1769 0,7±0,7 - 0,8 1 Aliphatiques

nonan-2-one 1098 4,1±2,2 4,2±2,1 0,1 0,914 undecane 1100 2,2±2,2 - 0,8 1 dodecane 1200 1,6±1,6 - 0,8 1 acide dodecanoique 1564 - 2,8±2,7 3,1 0,043* dodecanoate d’éthyle 1593 - 3±2,9 3,1 0,143 heptadec-8-ène 1685 46,1±16,6 42,5± 9,6 0,5 0,7 heptadecane 1700 2,5± 2,2 - 1,8 0,429 Moyenne ± erreur standard. *: significatif P< 0,05 (Test de Mann Whitney).

Tableau 13. Pourcentages moyens des composés volatils dans l'émission florale des quatre espèces de Longitubae (pourcentage supérieur ou égal à 5% dans au moins un échantillon). IR: Indice de rétention pour chaque composé volatil identifié

A. A. perrieri A. madagas- A. za Valeur P Composés volatils rubrostipa (n = 6) cariensis (n = 4) (n = 6) χ2 value IR (n = 10) Nombre total de composés 9 9 16 13 Monoterpènes (E)-β-ocimene 1035 0,2 ±0,2 0,03±0,03 0,1 ±0,1 - 6,0 0,11 oxyde de linalol (furanoïde) 1044 1,8 ± 0,8 1,3 ±1,2 0,4± 0,2 3,6± 1,1 6,6 0,08 oxyde de linalol (paranoïde) 1180 11,5 ± 6,4 - 0,7± 0,5 3,1± 2,5 14,1 0,00 Sesquiterpènes géranyl acétone 1457 - 2,4 ±2,1 - - 17,9 0,00 Aromatiques 2-phényléthanol 1114 0,1 ±0,07 16 ±7,4 0,7 ±0,3 12,9± 6,9 16,7 0,00 2-phénylacétonitrile 1145 74 ±5,4 46,2 ±14,5 52,6± 9,4 50,4± 12,2 4,1 0,26 coahuilensol 1159 - 3,5 ±1,7 0,01 ± 0,01 - 13,8 0,00 4-éthyl gaïacol 1271 - - 1,8 ± 1,6 - 3,3 0,40 méthyl eugénol 1389 - - - 2,03± 2,02 6,9 0,11 butanoate de 2-phényléthyle 1429 0,5±0,4 - - 3,4± 1,6 10,4 0,01 benzoate d'isoamyle 1431 - - 1,7 ± 1,4 - 7,2 0,07 alcool p-méthoxy cinammique 1463 - 3,3 ±2,2 - - 11,4 0,02 (E)-éthyl cinnamate 1469 - 3,8 ±2,4 - - 11,4 0,02 melléine** 1538 0,05 ± 0,02 - 3,1± 3,1 0,3± 0,3 3,9 0,28 benzoate de (Z)-hex-2-ényle 1574 - - 2,5± 1,9 - 14,3 0,00 benzoate d'hexyle 1585 - - - 1,7± 1,4 6,9 0,11 alcool p-méthoxy 1729 - 4±2,8 - - 11,4 0,02 dihydrocinammicque benzoate de benzyle 1769 - - 1 ± 0,5 - 9,4 0,03 Aliphatiques butanoate de (Z)-hex-3-ényle 1181 0,6 ±0,6 - - 3,8± 0,5 22,5 0,00 butanoate d' hexyle 1194 1 ± 0,8 - - 3,4± 1,3 18,2 0,00 Autres tiglate d'éthyle 881 - - 8,4± 4,3 0,1± 0,02 17,4 0,00 tiglate de (Z)-hex-3-ényle 1320 - - 3,8± 1,1 11,7 0,01 tiglate d' hexyle 1328 - - 4,7± 0,7 0,12± 0,05 10,7 0,01 tiglate de benzyle 1507 - - 3,8± 1,4 - 20,0 0,00 tiglate de 2-phényléthyle 1597 - - 2,5± 0,9 0,3± 0,2 16,7 0,00 Moyenne ± erreur standard, P : seuil de signification (Test de Kruskal Wallis, P<0,05).

III.3.2. Cinétique de l'émission de l'odeur florale. Pour tous les individus suivis, une variation temporelle de la quantité de composés volatils émis par les fleurs est évaluée. Le maximum d’émission ou « pic d’émission »

correspondant au grand nombre de composés volatils identifiés est atteint, selon les espèces, trois heures après l'ouverture de la fleur.  Pour A. rubrostipa le maximum d'émission est noté de 19 h 30 à 22 h 30 où 20 composés volatils y sont identifiés. Ce nombre diminue progressivement pendant la nuit et 10 entre 4h30 à 07h 30 du matin c'est-à-dire 9 h après l'ouverture de la fleur. Il n'y a plus de composés volatils émis le lendemain de l'ouverture de la fleur (Figure 17). Vingt et un composés volatils ont été identifiés dont cinq sont détectés de façon caractéristique avec une proportion moyenne supérieure à 3% : l’acétate d'isoamyle, 2- phénylecétonitrile, tiglate de (Z) hex-3-ényle, tiglate de benzyles et le tiglate d'hexyle. Le 2- phénylacétonitrile est le plus dominant avec un pourcentage moyen de 40,81%. Cinq composés volatils sont identifiés sous forme de trace avec une proportion relative inférieure ou égale à 0,01 % : butanoate de (Z)-hex-3-ényle, 2-méthylbutaonoate d'isoamyle, 2- méthylbutaonoate de 2-méthylbutyle, acétate de (Z)-hex-3-ényle et 2-phénylétanol (Figure 19). Afin d’évaluer la quantité d'odeur florale émise au cours d'une nuit, les composés volatils dits dominants sont considérés. Le 2- phénylacétonitrile est émis de façon importante dès 19h30 jusqu’à 22h30, la proportion est maximale et forme un pic entre 22h30 et 01h30 et entre 04h30 et 07h30 du matin, elle diminue à partir de 07h30 du matin et elle est nulle à 17h30 le lendemain. Par ailleurs, l'acétate d'isoamyle n’atteint son optimum qu’entre 01h30 et 04h30 du matin (7,71% ±2,34). Quant aux tiglates, leurs proportions sont maximales dès l’ouverture de la fleur et diminuent progressivement pendant l'anthèse (U=1, P = 0,016; Figure 19, test de Mann Whitney). Par contre, le tiglate de benzyle a sa proportion qui augmente progressivement au fur et à mesure du lever du jour et atteint son pic vers 07h 30 à10h 30 du matin. La plupart des composés volatils identifiés ne sont plus détectés le lendemain de l'ouverture de la fleur (Figure 18). La fleur d’A. rubrostipa n'est donc attractive qu'une nuit.  Pour A. grandidieri, le maximum de composés volatils identifiés (14 composés) est noté à partir de 17 h 45 à 20 h 45 (Figure 20) et ce nombre diminue avec le temps, à 23 h 45 douze composés ont été notés et à 02 h 45 du matin aucun composé n'est plus détecté (Figure 20). Parmi, les composés volatils capturés, les cinq (5) les plus caractéristiques sont le pentadecane, heptadecane, eicosane, docosane et le tricosane avec une proportion allant de 3,77 à 7,93 %. 8-heptadecène et nonan-2-one ne sont déterminés qu'en faible quantité (Figure 22). 78

A l'ouverture des fleurs, l'odeur florale émise est importante (U=1, p>0,05; test de Mann Whitney), elle diminue progressivement et devient nulle le lendemain matin. La variation de la quantité d’odeur émise est également notée à l’échelle de la journée: la proportion moyenne de composés émis pendant la nuit est beaucoup plus élevée que pendant le jour (U=72, P=0,001; test de Mann Whitney, Figure 21). Fleurs fraiches Fleurs fanées Fleurs fraiches Fleurs fanées

O PO

Composés volatils dominants Figure 17: Cinétique d'émission des composés volatils pendant 24 heures chez A. rubrostipa, O : ouverture des fleurs, PO: Pic d’ouverture des fleurs Figure 18: Variation des pourcentages moyens des composés émis pendant 24 heures chez A. rubrostipa

Tiglates

Aliphatiques

Aromatiques

Proportion moyenne (%) des composés émis au moment de l'anthèse chez A. rubrostipa Figure 19: Pourcentage des composés émis pendant 24 heures chez A. rubrostipa 79

Fleurs fraiches Fleurs fanées Fleurs fraiches Fleurs fanées

PO O PO

Figure 20: Cinétique d'émission des composés volatils Figure 21: Variation des pourcentages pendant 24 heures chez A. grandidieri, O : ouverture moyens des composés émis pendant 24 des fleurs ; PO : Pic d’ouverture des fleurs heures chez A. grandidieri

Aliphatiques

Aromatiques

Proportion moyenne (%) des composés émis au moment de l'anthèse chez A. grandidieri

Figure 22: Pourcentages des composés émis pendant 24 heures chez A. grandidieri 80

III.3.3. Caractéristiques du nectar chez les baobabs La composition biochimique du nectar identifiée chez les baobabs est essentiellement constituée par des glucides majeurs. La présence des acides aminés, des protéines et de la proline est également notée.

III.3.3.1.Volume moyen de nectar Le volume moyen de nectar produit varie selon la section, il est significativement plus élevé chez les Brevitubae que chez les Longitubae: 423,5 ±29,02 µL contre 105,6 ±7,3µL (t= 10,618, P <0,0001).

 Chez les Brevitubae (Figure 23), A. grandidieri produit le double du volume de nectar que chez A. suarezensis, avec une moyenne respective de 509,6 ± 34,3 µL et 251,2 ± 33,8 µL (F=2,79, P<0,0001).  Chez les Longitubae, A. perrieri produit le plus du nectar (164,3 ±30,8 µL) que A. rubrostipa (84,4 ± 6,9 µL) et A. madagascariensis (108 ±15,02 µL). A. za produit un volume en nectar intermédiaire de 117,5 ±14,5 µL.

Brevitubae Longitubae

. za .

. perrieri . A

. rubrostipa .

. suarenzensis .

A. grandidieri A. A

madagascariensis . A

Figure 23. Volume moyen du nectar en (µL) des six espèces, avec une différence de t2 = 11,451, P < 0,0001.

III.3.3.2.Concentration en glucides majeurs (glucose, fructose, saccharose)

 Concentration en glucides majeurs chez les deux sections Les glucides majeurs identifiés dans le nectar des baobabs sont le glucose (35,8 g/l), le fructose (36,8 g/l) et le saccharose (79,3 g/l). Le nectar est riche en saccharose avec un ratio hexoses/saccharose de 1,2. Seule, la teneur en fructose est significativement différente entre les deux sections (t= 3,15; P < 0,05): 39,1 ±1,7 g/l pour les Brevitubae et de 32,3 ± 1,4 g/l pour les Longitubae (Figure 24).

a a 80 a b 60

40 u (g/l)

ru ru (g/l) 40

F Gl

20 20

0 0

Brevitubae Longitubae b) Brevitubae Longitubae a)

200

a 150 a

100

Sacc (g/l)

c) Brevitubae Longitubae

Figure 24. Concentrations moyennes (g/l), a): Glucose, b): Fructose et c): Saccharose des deux sections. Le sommet et la base du box plot représentent les interquartiles alors que la ligne horizontale montre la moyenne. Les barres d'erreur représentent les variances. Glu= Glucose, Fru= Fructose, Sacc= Saccharose 82

 Concentration en glucides majeurs au sein des espèces

La concentration en glucose ne varie pas de façon significative entre les six espèces de baobabs malgaches. La concentration en fructose est particulièrement faible chez A. rubrostipa (26,5 ± 1,1g/l) et significativement élevée chez A. suarezensis (41,2 ± 3,2). La teneur en saccharose est plus élevée chez A. perrieri (129,5 ± 13,2 g/l) comparée aux autres espèces. La teneur en sucre totaux est plus élevée chez A. perrieri (199,9 ± 15, 6 g/l) et particulièrement faible chez A. rubrostipa (118,7 ± 6,3 g/l). La composition du nectar dans la plupart des espèces est dominée par le saccharose. En effet, le rapport saccharose sur hexose est supérieur ou égal à 0,9 (Tableau 14).

Tableau 14 : Concentrations moyennes (g/l) en glucose, fructose et saccharose des six espèces.

BREVITUBAE LONGITUBAE A. A. grandidieri A. madagascariensis A. rubrostipa A. perrieri A. za suarezensis n= 50 n=25 n=10 n=26 n=7 n=10 Glu (g/l) 37,4± 2a 29,2 ± 1,8a 32,5 ±2,7a 26,5± 1,1a 33,9± 1,8a 38,2 ± 3,8a Fru (g/l) 38,1± 1, 9ab 41,2 ± 3,2b 38,9 ± 2,3ab 26,4± 1,3a 36,4 ±4,9ab 38,1± 2,8ab Sacc (g/l) 93,9± 5b 72,6 ± 4,9ab 59,8± 10a 65,8± 5,4ab 129,5± 13,2c 83,2± 5,9ab ST 169,5± 3,8cd 142,9± 4,9abc 131,4± 11,3ab 118,7± 6,3a 199,9± 15, 6d 159,6± 6,5bc (r) (S/H) 1,7± 0,2a 1,2± 0,1a 0,9± 0,2a 1,3± 0,1a 1,9± 0,3a 1,2± 0,1a

Moyennes (±erreur standard) où le seuil de signification P = 0,05. Glu: Glucose, Fru: Fructose, Sacc: Saccharose, r : ratio saccharose/hexose, ST : sucre totaux. n: nombre d'échantillon.

III.3.3.3. Dynamique de la sécrétion et de la concentration en glucides majeurs du nectar Chez les deux espèces de baobab A. grandidieri (Brevitubae) et A. rubrostipa (Longitubae), la sécrétion de nectar commence peu après l'ouverture de la fleur et ne s’arrête que dans la matinée. La concentration en glucides est constante pendant une nuit.  A. grandidieri produit une grande quantité de nectar, en moyenne 509,65  34,28 µL. Elle est abondante dès le premier prélèvement (20h45) et augmente légèrement pour atteindre un pic de 620,91  76,84 µL à 23 h 45 (Figure 25, a). Par la suite, la sécrétion diminue dans la plupart des fleurs avec 434,44  78,74 µL à 02 h 45 (U = 21, Z = -2,18, P < 0,005) et elle est constante jusqu’à 05h45 du matin. La sécrétion de nectar s'arrête complètement pendant le jour. Aucune différence significative n'est observée sur la

concentration en glucose, fructose et saccharose suggérant que leur concentration reste constante pendant la nuit (U = 4,33, ddl = 3, P > 0,005 ; Figure 26, a).  Concernant A. rubrostipa, la production de nectar commence généralement quelques heures après l'ouverture de la fleur (Figure 25, b). Le volume prélevé par nuit est en moyenne de 84,38  6,94 µL. Le maximum de production est noté entre 19 h30 et 22 h30 avec une moyenne de 80  20 µL. Une diminution progressive est notée six heures après la production avec une quantité moyenne de 56,5  6,56 µL et devient nulle le lendemain matin (05 h 00, Figure 25, b). La production de nectar s’effectue seulement pendant la nuit lors de l’ouverture de la fleur. La concentration en glucose et en saccharose est constante avec une moyenne respective de 26,51  1,12 g/l et 65,80  5,40 g/l (P > 0,05, test de Mann Whitney). Par contre, la concentration en fructose augmente significativement de 01 h 30 à 4h30 du matin (28,39  1,32 g/l ; U = 15, P < 0,05, Figure 26, b).

Fleurs fraiches

)

) O PO DO PO

produit/3h (µL produit/3h

nectar de Volume Volume de nectar produit/3h (µL produit/3h nectar de Volume

Heures Heures a) b)

Figure 25: Cinétique de production de nectar pendant 12 heures avec un intervalle de prélèvement de 3h00. a) chez A. grandidieri et b) chez A. rubrostipa. O : ouverture des fleurs, PO : Pic d’ouverture des fleurs.

a) b) Figure 26. Variation de la concentration moyenne (g/l) des glucides pendant 12 heures. a) A. grandidieri, b) A. rubrostipa. S : Saccharose, F : Fructose, G : glucose. (Moyenne ± erreur standard, test de signification de Mann Whitney P < 0,05).

 Influence des conditions climatiques sur les variations des caractères du nectar Afin d'expliquer les variations des caractères du nectar sur A. grandidieri et A. rubrostipa pendant la nuit, l'influence de la température et de l'humidité a été considérée. Les températures moyennes et l’humidité moyenne notées pendant la période de prélèvement du nectar chez A. grandidieri et A. rubrostipa à Morondava est résumé dans le tableau 15.

Pour A. rubrostipa, la production du nectar s'effectue pendant la saison chaude et humide avec une température moyenne supérieure à 25°C et une humidité relative supérieure à 90%. Par contre, pour A. grandidieri, elle se passe pendant la saison froide et sèche et l’humidité enregistrée pendant le prélèvement est attribuée à l’humidité atmosphérique.

Tableau 15. Températures et Humidités relatives moyennes pendant la période de prélèvement du nectar chez A. grandidieri et A. rubrostipa.

Humid. Espèces Heures Temp. Moy. Moy. 20h 45 19,2±2,4 82,2±12,5 23h 45 19,6±2,2 84,1±8,8 A. grandidieri 02h 45 19,5±2,8 82,3±9,1 05h45 17,9±2,1 88,5±6,9 22h 30 27,8±1,7 87±6,5 01h 30 26,6±2,8 90±7,2 A. rubrostipa 04h30 25,3±2,1 98,2±5,8 07h30 28,4±2,2 95,1±3,2 Temp.Moy.: Températures moyennes (°C), Humid. Moy.: Humidité relative moyenne (%)

En général, les facteurs climatiques n'ont pas d'influence majeure sur la composition et le volume du nectar chez les deux espèces de baobab étudiées (Tableau 16). La variation du volume du nectar pendant une nuit ne peut pas être expliquée par la variation de la température et de l'humidité. Pourtant, le taux de fructose est négativement corrélé avec l'humidité car plus le temps est humidité, plus le taux de fructose diminue. En effet, sous une humidité élevée, le nectar peut être dilué et influe le taux de fructose.

Tableau 16. Corrélations entre les facteurs climatiques (températures et humidités) et les caractéristiques biochimiques du nectar (glucoses, fructoses, saccharoses et volume) pour A. grandidieri et A. rubrostipa.

A. grandidieri A. rubrostipa Températures Humidités Températures Humidités Glucose -0,05 0,9 0,05 0,33 Fructose 0,11 -0,01* 0,23 0,19 Saccharose 0,28 -0,38 -0,4 -0,08 Volume moyenne 0,26 -0,17 -0,12 -0,24 Valeur de corrélation de Pearson avec un seuil de signification P < 0,05, *** fortement significatif, ** très significatif , * significative et ns : non significatif. Température (°C); humidité (%); glucose (g/l); fructose (g/l); saccharose (g/l); volume (µL)

III.3.3.4. Concentrations en acides aminés, protéines et prolines dans le nectar des baobabs malgaches.

Cette étude a été effectuée sur cinq espèces de baobabs malgaches (A. grandideiri, A. suarezenisis, A. madagascariensis, A. rubrostipa et A. za). La concentration en proline et en acides aminés chez les Brevitubae est de 3 à 5 fois plus élevée que celle des Longitubae. Par contre, la concentration en protéines chez les Longitubae est plus élevée que celle des Brevitubae (207,7 g/l contre 83,5 g/l).

La teneur en protéines de A. rubrostipa est beaucoup plus faible avec 78,9 g/l, que celle de A. madagascariensis qui atteint 553,6 g/l. Mais inversement, la teneur en acides aminés est plus faible pour A. madagascariensis (47,01g/l) par rapport à celle de A. rubrostipa (156,6 g/l; Tableau 17).

Tableau 17. Concentrations moyennes (g/l) en protéines, proline et en acides aminés pour cinq espèces de baobabs malgaches.

Espèces Protéines (g/l) Proline (g/l) Acides aminés totaux (g/l) Brevitubae A. grandidieri 81,6 51,1 318,2 A. suarezensis 92,3 43,2 300,4 Total 83,5 50,3 315,9 Longitubae A. madagascariensis 553,6 6,72 47,01 A. rubrostipa 78,9 12,9 156,6 A. za 200,6 5,47 118,2 Total 207,7 10,2 126,9

III. 4. DIVERSITE ET COMPORTEMENT DES POLLINISATEURS

III.4.1.Diversité des pollinisateurs potentiels Les différents visiteurs observés chez les six espèces de baobabs malgaches sont présentés dans le tableau 18. Douze espèces réparties dans sept familles ont été identifiées visitant les fleurs de baobabs à savoir des Primates, des Chiroptères, des Oiseaux, des Abeilles et des Sphingidae. Ce dernier groupe est le plus représenté avec six espèces. Les espèces Nephele comma, Hippotion celerio, Panogena jasmini visitent les fleurs des Brevitubae. Hippotion celerio, Panogena jasmini, Nephele comma, Coelonia solani, Agrius convolvuli et Xanthopan morgani predicta sont observées sur les fleurs des Longitubae. Les sphinx les plus fréquents sur les fleurs des Longitubae sont Coelonia solani et Agrius 87

convolvuli. Ces espèces se rencontrent uniquement sur les espèces de cette section tandisque Nephele comma est rencontrée sur les Brevitubae.

Tableau 18. Différents types de visiteurs identifiés sur les fleurs des six espèces de baobabs malgaches. X: présence, -: absence

Ordre / famille / espèce A. grandidieri A. suarezensis A. perrieri A. madagascariensis A. rubrostipa A. za visiteuse Insectes Hymenoptera/Apidae Apis mellifera X X - X - - Heteroptera/Sphingidae Agrius convolvuli - - X X X Coelonia solani - - X X X X Xanthopan morgani - - X - - - Hyppothion celerio x - - - x - Nephele comma X x X Panogena jasmini X X Animaux/ Vertébrés Primates/ Lemuridae Phaner furcifer - - - x - - Primates/ Lepilemuridae Lepilemur sp. - - - X - - Primates/Cheirogaleidae Microcebus sp. - - - x x - Chiroptera/Pteropodidae Pteropus rufus X - - - - - Passeriformes/Nectariniidae Nectarinia souimanga X - - - - - Les espèces de sphinx, Hippotion. celerio et Panogena jasmini, n' ont été observées qu'une seule fois sur A. rubrostipa à Ifaty (Tuléar) et sur A. grandidieri à Morondava. Xanthopan morgani a également été identifiée une fois sur A. perrieri. Les abeilles Apis mellifera visitent à la fois sur les Brevitubae et les Longitubae. L'espèce de chauves-souris Pteropus rufus et le colibri Nectarinia souimanga visitent uniquement sur A. grandidieri et les Lémuriens sur les fleurs de A. madagascariensis.

III.4.2. Fréquence des visites  Les visiteurs des fleurs d’A. grandidieri sont : Apis mellifera, Nephele comma, Hypottion celerio, Panogena jasmini, Pteropus rufus et Nectarinia souimanga. Ces espèces n'arrivent pas en même temps mais ont chacune un horaire préférentiel (Figure 27).

PO Fleurs fraiches

/3h

d'individus/visiteur Nombre

Figure 27: Nombre d'individus des visiteurs identifiés sur A. grandidieri pendant une nuit. PO: Pic d'ouverture des fleurs.

Les abeilles, Apis mellifera visitent en premier sur les fleurs fraichement ouvertes vers 17h 45 et prélèvent les pollens. Puis, les sphinx comme Nephele comma, Panogena jasmini et Hipottion celerio viennent après les abeilles (vers 20h 45). Les sphinx visitent chacune des fleurs pendant environ une minute et prélèvent le nectar au fond de la corolle. Vers 23 h 45, quelques individus de N. comma reviennent visiter les fleurs. A Ampanihy (région de Morondava) des chauves-souris sont identifiés à ce même moment sur les fleurs de A. grandidieri. A partir de 05h45 du matin, les abeilles crépusculaires et quelques individus de sphinx reviennent visiter les fleurs. Après la visite des abeilles, le colibri Nectarinia souimanga, arrive sur les fleurs d'A. grandidieri vers 06 h 00. Deux pics de visites sont ainsi identifiés, entre 20h45 et 05h45 avec une fréquence de visites maximales pendant les trois premières heures de l'ouverture de la fleur.  Pour A. rubrostipa, cinq espèces de sphinx sont notées : Agrius convolvuli, Coelonia solani, Panogena jasmini, Nephele comma et Hippottion celerio et les plus fréquents sont Agrius convolvuli et Coelonia solani. Les visites sont maximales au moment de

l'ouverture de la fleur et jusqu'à 22 h 30 où en moyenne 60 individus de A. convolvuli sont sur les fleurs (Figure 28). Quelques espèces sont seulement identifiées vers 01 h 30 et

04 h 30 du matin. Les Lémuriens nocturnes visitent également les fleurs d'A. rubrostipa mais leurs activités n'ont pas pu être enregistrées pendant les périodes d’observations en raison de la faible fréquence de leur visite. PO Fleurs fraiches

(X) /3h (XX)

d'individus/visiteur Nombre

XX X

Figure 28. Nombre d'individus des visiteurs identifiés sur A. rubrostipa toutes les trois heures pendant les périodes d'observation. PO: Pic d’ouverture des fleurs

Du point de vue quantitatif, l'abeille Apis mellifera et le sphinx Nephele comma sont les pollinisateurs efficaces pour la pollinisation des Brevitubae. Par contre, les sphinx Agrius convolvuli, Coelonia solani sont les pollinisateurs des Longitubae.

III.4.3. Relation morphométrique entre la longueur de la trompe et la taille des sphinx La longueur de la trompe et la taille des sphinx ont été mesurées étant donné que ce groupe est le plus identifié sur les fleurs des six espèces de baobabs. La taille des sphinx correspond à la longueur de leurs ailes et se définit comme étant l’ envergure du sphinx. Les espèces de sphinx visitant la fleur de baobabs peuvent alors être classées en quatre groupes selon la longueur de leur trompe (Tableau 19) : - trompe courte (moyenne de 41,8 mm) : Hippottion celerio et Nephele comma;

- trompe moyenne (65,4 mm): Panogena jasmini ; - trompe longue (moyenne de 101 mm): Agrius convolvuli (Photo 58) ; - trompe très longue (168,7 mm ): Coelonia solani et Xanthopan morgani (Photo 57,60) La taille moyenne est relative à la longueur moyenne de la trompe. En effet, Xanthopan morgani a une envergure de 61,80 7,2 mm alors que celle de Nephele comma est de 36,7 2,8 mm (Tableau 19). Xanthopan morgani est donc le plus grand sphinx identifié lors de cette étude.

Tableau 19 : Longueurs moyennes (mm) de la trompe et taille des espèces de sphinx.

Espèce de sphinx H. celerio N. comma P. jasmini C. solani A. convolvuli X. morgani n= 5 60 20 25 42 18 Longueur de la trompe 40,04 ± 2,2a 43,7 ± 3,3a 65,4 ± 8,8b 165,5 ± 35d 101± 17,4c 172 ± 14,2d (mm) Envergure ou taille 34 ± 2,5 36,7 ± 2,8 43,1 ± 3,4 49,4 ± 4,8 44,20 ± 5,0 61,80 ± 7,2 (mm) Trompe + envergure 80,4 ± 0,8 74,08 ± 0,7 108,5 ± 2,6 214,95 ± 4,9 154,15 ± 4,7 233,8 ± 5,04 (mm) Moyenne (± erreur standard), le test ANOVA permet de différencier les sphinx à trompe courte (a), trompe moyenne (b), trompe longue (c) et trompe très longue (d). n: nombre de sphinx échantillonnés.

La longueur de la trompe et la taille du sphinx sont proportionnelles avec une valeur de corrélation linéaire rs=0,824 (Figure 29). En effet, les espèces de grande taille ont généralement de longues trompes (Planche 11).

100 y = 0,0894x + 34,168 80 R² = 0,5504

Envergure desEnverguresphinx (mm) 0 0 50 100 150 200 250 300 Longueur moyenne de la trompe des sphinx (mm)

Figure 29: Corrélation entre l'envergure et la longueur de la trompe des sphinx avec p= 0,0001.

Planche 11 Longueurs des trompes des espèces de sphinx identifiées sur les baobabs malgaches (Photos 57 à 60).

Photo 57: Coelonia solani

Photo 58: Agrius convolvuli

Photo 59: Nephele comma

Photo 60: Xanthopan morganii Ryckewaert, 2011

III.5. INTERACTION FLEURS-POLLINISATEURS ET EFFICACITE DE LA POLLINISATION Pour une meilleure compréhension de la relation fleurs-pollinisateurs, cette partie a pour but de déterminer la relation entre la disponibilité du nectar et l'émanation de l'odeur florale avec la fréquence de visite des pollinisateurs. Cette étude a été effectuée sur Adansonia grandidieri (Brevitubae) et A. rubrostipa (Longitubae). La capacité des sphinx à transférer le pollen de l'étamine vers le stigmate d'une même fleur ou d'une autre fleur a été étudiée en parallèle et la relation entre la taille de la fleur et celle des sphinx est analysée.

III.5.1 Rôles interactifs entre le nectar et les odeurs florales Une interaction fleurs-pollinisateurs a été mise en évidence au sein de baobabs notamment chez A. rubrostipa et A. grandidieri (figures 30 et 31).

 Chez A. grandidieri (Figure 30, a), le nombre total des fleurs ouvertes est noté à partir de 18h00 correspondant à une forte émission d'odeur florale et une production maximale de nectar. De plus le nombre maximal de visite a été constaté entre 17 h 45 et 20 h 45 et coïncide avec la production élevée de nectar (550µL) et au nombre élevé de composés volatils émis (14 composés volatils). La visite des chauves-souris (Pteropus rufus) ne s’effectue qu’entre 20 h 45 et 23 h 45 et est corrélée au pic de production de nectar avec une valeur de rs= 0,869 (Figure 30, c). Pour cette espèce, cette correspondance entre l’activité des fleurs et des pollinisateurs est confirmée par le fait que la visite de chauve-souris est influencée par une abondance de nectar. En effet, les chauves-souris, ont besoin d'au moins 600 µL de nectar. Nous avons remarqué que le nombre de visiteurs observés le matin ne fait que la moitié de celui identifié le soir et lié à la réduction du nectar et de l'émission de l'odeur florale (Figure 30, d).  Chez A. rubrostipa, le nombre total des fleurs ouvertes où le maximum d’ouverture est noté à partir de 19h30. En considérant la variation des composés émis par une fleur toutes les trois heures (figure 31, a), le pic d’émission d’odeur florale est noté les trois premières heures de l’ouverture de la fleur. En effet, plus de 15 composés sont identifiés en ce moment. De plus, le volume de nectar produit par fleur est maximal en ce moment où plus de 50µl de nectar est prélevé. Donc c’est la période pour A. rubrostipa où la fleur est la plus active. Et parallèlement, en considérant le nombre de visiteurs identifié toutes les trois heures correspondant à la fréquence de visite des pollinisateurs, nous avons noté que le nombre et le type des visiteurs sont élevés à cette période où 60 individus d’Agrius convolvuli sont 93

recensés. Durant la nuit, le nombre de sphinx visitant la fleur diminue (5 individus par espèce à 01 h 30 et 04 h 30 du matin) correspondant à la diminution du nectar produit (en moyenne 60 µl) et au nombre de composé émis (Figure 31,b). A partir de 04 h 30 du matin, les visites sont beaucoup plus brèves, car les fleurs sont moins attractives et ne produisent pas assez de nectar donc les insectes venus se contentent du peu du nectar disponible. Pour les deux espèces étudiées, les fleurs sont attractives pendant les trois premières heures de l'ouverture et par conséquent le nombre des visiteurs et la fréquence des visites sont nombreux. La quantité (nombre) et la qualité (type) des visiteurs diminuent progressivement pendant la nuit. La venue des visiteurs dépend de la disponibilité en nectar et en odeurs florales. A l’issue de ce travail, nous avons noté que les caractères floraux interagissent efficacement les uns des autres pour attirer plus des visiteurs et c’est le moment le plus favorable au cours duquel la pollinisation pourra être maximisée chez les baobabs.

Figure 30. Interaction fleurs-pollinisateurs chez A. grandidieri. Nombre des visiteurs en fonction de la disponibilité en fleur, en nectar et de la quantité de composés volatils. (a) : maximum d’ouverture (flèche jaune), (b): pic d’émission d’odeur florale (flèche jaune), (c) : pic de production de nectar (flèche jaune) et (d): maximum de visite 94

Figure 31: Interaction fleur-pollinisateur chez A. rubrostipa. Nombre des visiteurs en fonction de la disponibilité en fleur, en nectar et de la quantité de composés volatils. (a) : maximum d’ouverture (flèche jaune), (b): pic d’émission d’odeur florale (flèche jaune), (c) : pic de production de nectar (flèche jaune) et (d): maximum de visite

III.5.2. Coévolution morphologique entre les fleurs et les pollinisateurs En considérant la longueur de la trompe des sphinx et celle des étamines de baobabs, deux groupes ont été statistiquement mise en évidence avec rs = 0,789 (P < 0,0001): le groupe formant les sphinx à longue trompe et les fleurs de Longitubae et le groupe composé des sphinx à courte trompe et les fleurs de Brevitubae (Figure 32):

- le groupe A est formé par des fleurs à étamines courtes et des sphinx à trompe courte. Ce groupe est caractérisé par les espèces A. grandidieri et A. suarezensis (Brevitubae) et les sphinx Nephele comma, Panogena jasmini et Hippothion celerio. - le groupe B est constitué par des fleurs à longues étamines et des sphinx à longue trompe. Ce groupe represente les espèces A. rubrostipa, A. madagascariensis, A. perrieri et A. za (Longitubae) et les sphinx à longues trompes : Agrius convolvuli, Coelonia solani et Xantopan morgani. Plus la trompe du sphinx est longue (> 100 mm), plus les étamines sont longues (> 100 mm) et inversement.

Figure 32: Corrélations entre la longueur moyenne de la trompe des sphinx et de celle des étamines avec p=0,0001.

Cette coévolution influe sur la réussite de la pollinisation. En effet, au sein des Longitubae, c’est surtout les sphinx à longue trompe qui sont les plus efficaces, car en pompant le nectar à la base de la fleur, ils sont au même niveau que les étamines et peuvent 96

facilement récupérer des pollens soit par leurs trompes ou par leurs ailes, ensuite ils peuvent facilement les déposer sur le stigmate soit en sortant de ce même fleur ou en entrant sur d’autres fleurs (figure 33).

D’ailleurs, une correspondance est mise en évidence entre les sphinx et les fleurs de baobabs. - Les sphinx Agrius convolvuli, Coelonia solani et Xantopan morgani peuvent facilement transférer les pollens sur le stigmate de A. rubrostipa, A. madagascariensis, A. perrieri et A. za du fait que le sphinx se retrouve quasiment au même niveau que les étamines. - Par ailleurs, les sphinx: Nephele comma, Panogena jasmini et Hippothion celerio peuvent pour les mêmes raisons favoriser la pollinisation de A. grandidieri et de A. suarezensis. Par contre, l’efficacité des sphinx à courte trompe, comme Panogena jasmini, pour la pollinisation au sein de Longitubae est limitée, car ils prélèvent le nectar en étant positionnés sous les étamines et même s’ ils arrivent à récupérer des pollens le dépôt sur le stigmate est très accidentel (figure 33).

Figure 33: Modèle de coévolution entre les des espèces de sphinx et la fleur de A. madagascariensis (Longitubae).

PARTIE IV –DISCUSSION GENERALE

L'objectif de cette thèse était de mettre en évidence les processus biologiques mis en place lors de la pollinisation des baobabs malgaches, plus particulièrement l’implication des caractéristiques phénologiques, morphologiques et biochimiques des fleurs sur l’efficacité de la pollinisation. Les hypothèses de la recherche étaient que (i) la diversité de la biologie florale entre les espèces de baobabs malgaches est corrélée aux types et aux comportements des pollinisateurs; (ii) la phénologie et la biologie florale sont parmi les facteurs déterminants de la réussite de la pollinisation chez les baobabs et (iii) la présence d'un ou de plusieurs caractères floraux communs sur certaines espèces attire le même pollinisateur, favorisant ainsi les croisements interspécifiques et la réalisation de l’introgression génétique. Ainsi, pour vérifier ces hypothèses, des approches écologiques, biochimiques et entomologiques ont été entreprises. Dans cette partie, les principaux résultats obtenus sont discutés pour : - montrer la particularité de la phénologie et de la biologie des fleurs au sein des six espèces de baobabs malgaches ; - analyser l’implication des caractères phénologiques et biologiques des fleurs sur la taxonomie des baobabs ; - apporter des informations sur les processus biologiques menant à l’efficacité de la pollinisation ; - déterminer les modes de pollinisation chez les baobabs ; - et enfin donner des explications sur la réalisation de l’introgression génétiques chez certaines espèces de Longitubae.

IV.1. PARTICULARITES PHENOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES DES FLEURS CHEZ LES BAOBABS MALGACHES

IV.1.1. Caractéristiques phénologiques L’une des particularités de la phénologie des baobabs est la présence de deux périodes de floraisons différentes au sein des deux sections:  Chez les Longitubae, la période de floraison et celle de la feuillaison coïncident avec les précipitations élevées (novembre à avril). Ces observations concordent avec les conclusions de Reich (1995) révisées par Bollen et Donati (2005) qui constatent que les phases végétatives et florales des plantes tropicales sont essentiellement en relation étroite avec l'arrivée des pluies.

 Chez les Brevitubae, la période de floraison s'effectue pendant la saison sèche. Les espèces utilisent les réserves en eau dans leurs parenchymes pendant cette période pour assurer cette opération très couteuse en énergie (Ravaomanalina, 2011). Cette capacité d’adaptation est très connue chez la famille de Malvaceae dont la plupart des espèces fleurissent pendant la période sèche et elles sont capables d’utiliser ainsi la réserve d’eau stockée dans leur tronc (Wangaard et al. 1954). Une variation annuelle de la période de la floraison a été constatée au sein des baobabs. En effet, pour les individus d'une même espèce, cas d'A. rubrostipa, le début et la fin de floraison présentent un décalage d'une année à une autre et d'une localité à une autre. Ce décalage est dû à divers facteurs du milieu (précipitation, température) et propre à l’état physiologique de la plante. Ce résultat a été remarqué également par Newbery et al., 1998 où chez les plantes tropicales, la période de floraison de l'espèce varie suivant les saisons et l'état physiologique des individus. L'ouverture de la fleur est crépusculaire et dépend de la longueur du jour chez les baobabs malgaches. Dans la partie occidentale de Madagascar, le jour le plus court est noté au mois de juin et le plus long au mois de décembre. La période de floraison, chez la section des Brevitubae commence au mois de juin. De ce fait, l’ouverture de la fleur commence dès 17 h 00 et coïncide au moment du coucher du soleil. Pourtant chez les Longitubae, la floraison commence au mois de décembre où les jours sont longs. Ainsi, la fleur ne s’ouvre qu’à partir de 18 h 30. Sorg et Rohner (1996) ont également identifié que la floraison de 71 % des espèces d’arbres à Kirindy est en relation avec la longueur du jour.

IV.1.2. Caractères biochimiques des fleurs de baobabs

La composition chimique de l'odeur florale est différente entre les deux sections. En effet, la majorité des composés identifiés sont de types aromatiques chez les Longitubae dont le principal est le 2-phénylacétonitrile. Chez les Brevitubae, les composés aliphatiques, moins odorants, sont majoritaires et le principal est le heptadec-8-ène. Ces résultats renforcent et complètent le constat de Baum (1995b) pour qui l'émission florale des Brevitubae est moins odorante alors que celle des Longitubae est beaucoup plus parfumée. Cette différence d'odeur florale entre les deux sections est à mettre en relation avec la couleur des fleurs. La fleur des Brevitubae a une couleur blanche alors que les Longitubae ont des fleurs rouges, jaunes ou même orange (Baum 1995b, Ryckewaert et al., 2011). D’après Majetic et al. (2007), les fleurs

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de couleur vive seraient beaucoup plus parfumées dans la mesure où la voie de biosynthèse des composés à structure aromatiques est fortement liée à celle des anthocyanes. L’odeur florale est émise par un même type d’organe sécréteur que ce soit chez les Longitubae que chez les Brevitubae. L’osmophore a une forme conique et globulaire. Il est commun et existe chez plus de 80% des espèces végétales (Kay et al., 1981). Le volume de nectar secrété par les Brevitubae est nettement supérieur à celui des Longitubae. Ces résultats ont été notés par Baum (1995b), même s’il n'a pu travailler que sur quelques fleurs (2 à 8 fleurs suivant l'espèce) avec une moyenne de 1900 µL chez les Brevitubae et d'environ 250 µL chez les Longitubae (Baum 1995b). Une différence sur la teneur en glucides majeurs a été identifiée entre certaines espèces. Nous avons, en particulier, identifié que la teneur en glucose et saccharose n’est pas similaire entre A. grandidieri et A. suarezensis (Brevitubae). Cette différence pourrait être attribuée aux conditions climatiques de leur milieu. En effet, A. grandidieri est localisée surtout dans le sud-ouest de Madagascar, sous un climat plus sec et A. suarezensis à l'extrême nord de l'île qui est relativement plus humide. Les mêmes résultats ont été déjà notés chez les Helleborus foetidus (Ranunculaceae) où la composition du nectar varie aussi entre deux localités sous deux conditions climatiques contrastées (Herrera et al., 2006). Pourtant, cette étude n’a pas pu confirmer l’influence de la température et de l'humidité sur la teneur en glucose, fructose et saccharose au sein des baobabs. Une recherche plus approfondie sur l’implication des facteurs climatiques sur la composition du nectar serait souhaitable pour expliquer cette différence au sein de ces deux espèces. IV.2. IMPLICATIONS DES CARACTERES PHENOLOGIQUES ET BIOLOGIQUES DES FLEURS SUR LA TAXONOMIE DES BAOBABS MALGACHES La classification des baobabs est principalement basée sur les caractères morphologiques de la fleur de ses espèces (Baum 1995b). Elle a fait l’objet de nombreux travaux de recherches (Baillon, 1980 ; Baum, 1995 ; Capuron, 1960 ; Hochreutiner, 1908 ; Jumelle et Perrier de la Bâthie, 1912, 1952 et 1953 ; Pettigrew et al., 2012). La classification actuelle résulte des rectifications successives apportées à la description des premières espèces rencontrées et celles nouvellement recensées. Par conséquent, les baobabs sont récemment reclassés dans la famille des Malvaceae (Alverson et al., 1999 ; Judd et Manchester, 1997). Notre recherche a permis également de justifier l’appartenance des baobabs dans cette famille. En effet, les trichomes nectarifères identifiés chez les baobabs est l’une des particularités de la famille des Malvaceae — anciennement nommés Bombacaceae, Sterculiaceae et Tiliaceae

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(Endress, 1994) et ils sont repérés chez d’autres genres comme chez Helicteres (Goldberg, 2009). Ce même type de glande a été également identifié par Jaeger (1950) chez Adansonia digitata (section Adansonia). Dans la classification des baobabs malgaches, deux sections ont été mises en évidence en considérant la morphologie des fleurs et leurs génotypes (Baum 1995b, Leong Pock Tsy et al., 2013). L’ensemble des résultats obtenus dans ce travail permet d’expliquer la classification infragénérique des baobabs malgaches. En effet, la longueur des sépales, des pétales, du tube staminal avec les étamines, du stigmate, les principaux composés de l’odeur florale et du nectar sont des caractères complémentaires permettant de justifier ces deux sections au sein de baobabs (Tableau 20). Ces caractères morphologiques et biochimiques sont significativement différents entre les deux sections de baobabs. Par exemple, la section des Longitubae est dominée par la présence d’odeur florale riche en composés volatils à structure aromatique alors que celle des Brevitubae est riche en composés aliphatiques. Outre les caractères floraux, la période de floraison permet également de confirmer la présence de deux sections au sein de baobabs. En effet, la floraison entre deux espèces sympatriques, vivant dans un même contexte écologique, mais appartenant à deux sections différentes : A. grandidieri (Brevitubae) et A. rubrostipa (Longitubae) se passe pendant deux périodes différentes. A. grandidieri fleurit au mois de mai jusqu’au mois de juillet et A. rubrostipa entre le mois de novembre et mars (Longitubae). Ce résultat confirme les hypothèses de Wright et Calderon (2006) que l’état phénologique de la plante est lié à leur groupe taxonomique. A partir des caractères phénologiques, morphologiques et biologiques des fleurs, résumés dans le tableau 20, un cladogramme permettant de classifier les espèces a été établi (Figure 34). Trois groupes ont été ainsi mis en évidence : le premier groupe est formé par les deux espèces des Brevitubae, le deuxième groupe est formé par l’espèce A. rubrostipa et le troisième groupe rassemble l’espèce A. madagascariensis, A. perrieri et A.za. Notre analyse concorde avec les différentes études sur la structure génétique réalisée antérieurement, en utilisant des marqueurs microsatellites nucléaires (nSSR), sur les six espèces de baobabs malgaches (Figure 35 ; Leong Pock Tsy et al. 2013). L’un des résultats principaux est la nette divergence des espèces de Brevitubae avec celle des Longitubae, aussi bien sur le cladogramme (Figure 34) que sur l’arbre génétique (Figure 35). La divergence entre les sections correspond principalement à la biologie florale notamment les caractères de l’odeur florale, du nectar produit, de la morphologie et de la morphométrie des fleurs. 102

Tableau 20 : Synthèse des caractères distinctifs au sein des six espèces de baobabs malgaches.

Caractères taxonomiques Brevitubae Longitubae A. grandidieri A. suarezensis A. perrieri A. madagascariensis A. rubrostipa A. za Pièces florales longueur du sépale 91,8 ± 11,6 96,9 ± 5,1 190,3 ± 18,3 222,5 ±30,6 216,4 ± 48,8 181,3 ± 24,6 (mm) longueur du pétale 86,1 ± 10,9 78,3 ± 6,4 217,2 ± 7,9 205,1 ±34,85 193,9 ± 63,3 188,4 ± 20,9 Longueur des étamines + tube staminal 68,5 ± 12,2 68,6 ± 7,5 171,6 ± 5,9 179,3 ±33,8 212,6 ± 31,2 166,9 ± 24,3 Longueur du pistil 100,6 ±17,1 94,3 ± 8,9 208,8 ± 6,9 214,5 ±24,35 242,1 ± 29,7 172,7 ± 19,8 Heptadec-8-ène 46,1± 16,6 42,5± 9,6 0 0 0 0 2-phénylacétonitrile 0 0 74±5,4 46,2± 14,5 52,6±9,4 50,4±12,2 Oxyde de linalol (Pyranoïd) 0 0 11,5± 6,4 0 0,7± 0,5 3,1± 2,5 2-phényléthanol 0,6±0,6 7,6±7,5 0,1±0,07 16,1±7,4 0,7±0,3 12,9±6,9 coahuilensol 0 0 0 3,5± 1,7 0,01±0,01 0 butanoate de 2-phényléthyle 0 0 0,5±0,4 0 0 3,4± 1,6 alcool p-méthoxy cinammique 0 0 0 3,3±2,2 0 0 (E)- cinnamate d'éthyle 0 0 0 3,8±2,4 0 0 Alcool p-methoxydihydrocinammique 0 0 0 4±2,8 0 0 benzoate de (Z)-hex-2-ényle 0 0 0 0 2,5±1,9 0 benzoate de benzyle 0,7±0,7 0 0 0 1±0,5 0 Odeur florale butanoate de (Z)-hex-3-ényle 0 0 0,6±0,6 0 0 3,8±0,5 butanoate d'hexyle 0 0 1,1± 0,8 0 0 3,4± 1,3 tiglate d'éthyle* 0 0 0 0 8,4± 4,3 0 ester tiglique 0 0 0 0 0,3±0,3 0 tiglate de (Z)-hex-3-ényle* 0 0 0 0 3,8± 1,1 0 tiglate d'hexyle* 0 0 0 0 4,7± 0,7 0,12± 0,05 tiglate de benzyle* 0 0 0 0 3,8± 1,4 0 tiglate de 2-phényléthyle* 0 0 0 0 2,5± 0,9 0,3± 0,2 6-méthyl hept-5-èn-2-one 0 5,2±5,1 0 0 0 0 géranyl acétone 0,2± 0,2 8,4± 4,5 0 2,4± 2,1 0 0 acide dodecanoique 0 2,8±2,7 0 0 0 0 Nectar volume (µL) 509,6 ± 34,3 251,2 ± 33,8 164,3 ± 30,8 108 ±15,02 84,4 ± 6,9 117,5 ±14,5 glucides totaux (g/l) 169,5 ± 3,8 142,9 ± 4,9 199,9 ± 15, 6 131,4 ±11,3 118,7 ± 6,3 159,6 ± 6,5 protéine (g/l) 81,6 ± 54,8 92,3 ± 60,8 - 553,6 ±424,7 78,9 ± 93,2 200,6 proline (g/l) 51,1 ± 24,6 43,2 - 6,72 12,9 ± 3,3 5,47 acides aminés totaux (g/l) 318,2 ± 204,9 300,4 - 47,01 156,6 ± 41,1 118,2 Phénologie florale Juin - Août Octobre - Décembre Février - Mars Janvier - Mai mi déc - fév 103

La présence de deux groupes au sein de la section des Longitubae est également notée. En effet, l’espèce A. rubrostipa a des caractères qui lui sont spécifiques notamment la présence de composés à structure tiglique dans son odeur florale. Cependant, les espèces A. perrieri, A. madagascariensis et A. za présentent une affinité biologique et génétique apparente.

b a

Figure 34: (a) Cladogramme de l’affinité biologique de chaque espèce de baobabs par les (a) caractères morphologiques et biochimiques des fleurs et (b) arbre génétique construit par « neighbour-joining » entre les espèces de baobabs (tiré et modifié de Leong Pock Tsy et al., 2013).

IV.3. INTERACTIONS FLEURS-POLLINISATEURS et EFFICIENCE DE LA POLLINISATION Le mécanisme et l’efficacité de la pollinisation chez les baobabs sont basés sur l’interaction fleur- pollinisateur. Nos recherches ont montré que cette interaction est identifiée que ce soit sur les Longitubae que sur les Brevitubae:

1) Les espèces de Longitubae développent des caractères floraux adaptés uniquement aux sphinx à longue trompe. Cette observation laisse supposer que la relation mutualiste 104

existe entre les fleurs de Longitubae et ces sphinx. En effet, l’interaction plante-pollinisateurs est mutualiste lorsque le succès reproducteur de la plante augmente et en même temps les pollinisateurs bénéficient de la ressource offerte (Suchet, 2010). 2) Chez les Brevitubae, la pollinisation est généraliste. Ce type de pollinisation est connu comme étant une assurance de la reproduction effectuée par les espèces (Quilichini et al., 2005). En cas de raréfaction de pollinisateurs, comme le cas des chauves-souris, les autres pollinisateurs peuvent intervenir pour maintenir la reproduction des espèces des Brevitubae. De plus, sur le site où les chauves souris sont devenues rares, le sphinx Nephele comma et les abeilles visitent ainsi les fleurs d’A. grandidieri et A. suarezensis. IV.3.1. Pollinisation sphingophile chez les Longitubae La pollinisation sphingophile au sein des Longitubae est notée par plusieurs auteurs (Baum 1995b, Ryckewaert et al., 2011 et Rasoamanana 2015). En effet, les espèces de sphinx comme Agrius convolvuli et Coelonia solani sont le plus observées et contribuent efficacement à la pollinisation de quatre espèces des Longitubae (Rasoamanana, 2015). De plus, ces sphinx ne sont identifiés que sur les fleurs des Longitubae. Les caractères morphométriques et biochimiques des fleurs qui sont uniques et communs aux quatre espèces de Longitubae sont la raison principale qui favorise la fidélité de ces espèces de sphinx sur leurs fleurs. Cette fidélité, ou « constance florale », facilite le dépôt de pollen inter et intraspécifiques au sein de cette section (Le Féon, 2010).

Les principaux caractères floraux qui contribuent à la fidélité de ces sphinx sont : - l'odeur florale qui est typique des plantes à pollinisation sphingophiles : présence de composés à structure aromatique, de composés azotés et de tiglates (Kaiser, 1993 ; Knudsen et Tollsten, 1993 ; Levin et al., 2001). - le nectar riche en saccharose est particulièrement connu chez les fleurs pollinisées par des sphinx (Baker et Baker, 1983). D’ailleurs, Percival en 1961 a constaté que les six espèces de Passiflora, pollinisées par des sphinx, ont des nectars riches en saccharose. - la morphologie florale est également adaptée aux sphinx à longue trompe, car les sphinx doivent dérouler entièrement leur trompe pour récupérer le nectar au fond du réceptacle floral (Ryckewaert et al., 2011). Il existe donc une coadaptation entre les fleurs des quatre espèces de Longitubae et celles de sphinx à longue trompe.

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IV.3.2. Pollinisation généraliste chez les Brevitubae Chez les Brevitubae, les pollinisateurs potentiels sont très diversifiés comme les chauves-souris, les abeilles et les sphinx (Baum, 1995 b; Andriafidison et al., 2006 et Ryckewaert et al., 2011).

 La venue des abeilles sur les fleurs des Brevitubae est particulièrement liée à l’abondance des pollens produits au moment de l’ouverture de la fleur. De plus, seuls les baobabs sont des arbres en fleurs pendant le mois de juin. En effet, les pollens sont riches en prolines et les abeilles ont une aptitude particulière à détecter les prolines grâce à leur chémorécepteur. Les prolines sont une source énergétique pour les abeilles et sont utilisées pendant la phase initiale de leur vol (Auerswald et al. 1998; Micheu et al., 2000).  La présence de 2-phényléthanol, un composé aromatique, permet d’attirer les sphinx. Ainsi, quelques espèces de sphinx comme Nephele comma et Hypottion celerio sont attirées sur les fleurs des Brevitubae.  Enfin, la visite des chauves-souris sur les fleurs des Brevitubae peut s'expliquer par la grande quantité et la composition du nectar. Les fleurs visitées par les chauves-souris produisent généralement 1000 µL de nectar (Haber et Frankie, 1989). La venue des chauves souris sur les fleurs d’A. grandidieri coïncide avec le pic de production de nectar. De plus, la composition du nectar de Brevitubae qui est faible en protéine est un des syndromes de la pollinisation par les chauves-souris. Selon Nicolson et Nepi, (2005), les pollinisateurs ayant d’autres sources de protéine dans leurs régimes alimentaires ne donnent pas d’importance au nectar faible en protéine.

Cependant, la visite des chauves-souris sur les fleurs de baobabs n’est pas très fréquente pendant nos observations. Pteropus rufus est la seule espèce observée sur les fleurs d’A. grandidieri et n'est identifiée que dans certains sites (Ampanihy, Morondava et Migioko). En effet, la dégradation de l’habitat due à l’exploitation forestière diminue le nombre de gites à chauves-souris. Ainsi, certains sites à baobabs seulement peuvent bénéficier de la visite des chauves-souris (Andriafidison et al., 2006). Cependant, les chauves-souris sont qualifiées comme les principaux pollinisateurs identifiés sur les fleurs des Brevitubae (Baum 1995b, Jaeger 1950 et Andriafidison et al., 2006).

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IV.3.3. Mécanisme de la pollinisation chez les baobabs Dès l'ouverture de la fleur jusqu’ au pic de la floraison, tous les caractères floraux sont disposés à attirer de multiples visiteurs. Le processus biologique menant à la réussite de la pollinisation chez les baobabs peut se résumer en trois étapes :

1) étape de la pré-pollinisation : formé par l’attraction des pollinisateurs, aux transferts efficaces des pollens et aux interactions pollens-pistil.

 l’attraction des pollinisateurs est souvent marquée par une émission maximale d’un signal olfactif qui est associée à une production maximale de nectar, la déhiscence des anthères et la réceptivité du stigmate. Un maximum de visite des pollinisateurs est ainsi favorisé et en même temps un maximum de pollens est transféré (Free, 1993).

 Pour les Longitubae, le maximum de visite des sphinx est noté entre 19h et 22h.  Chez les Brevitubae : la visite des abeilles et des sphinx est observée entre 17h et 20h alors que les chauves souris viennent visiter les fleurs vers 01h du matin.  la réussite de la pollinisation n'est possible que si seulement les pollens sont déposés en quantité suffisante sur le stigmate.

 Une coadaptation morphologique entre la taille de la fleur et celle des pollinisateurs est notée chez les Longitubae. Cette coadaptation permet le dépôt de pollens sur la surface stigmatique car le stigmate est plus haut par rapport aux étamines chez les baobabs (herchogamie forte). C'est une relation également connue entre le sphinx Basiothia schenki et l’espèce Zaluzianskya natalensis à fleurs tubulaires, de la section de Nectarinia de la famille des Scrophulariaceae (Johnson et al., 2001). Le même résultat a été également obtenu par Johnson (2002). Le nombre de grains de pollen déposés après la visite de Hippotion celerio, sphinx qui a une trompe proportionnelle à la taille de la fleur de Delphinium leroyi (Ranunculaceae) est significativement élevée.  chez les Brevitubae, les fleurs produisent une quantité et une qualité importantes de ressources pour fidéliser leurs pollinisateurs et attirer plus de visiteurs.  les interactions pollens-pistil comme l’adhérence des pollens sur le stigmate, l’hydratation, l’activation, la germination et la croissance du tube pollinique constituent une étape importante qui mène de la pollinisation à la fécondation (Rasoamanana 2015). Chez les baobabs, les tubes polliniques atteignent les ovules 2 à 5 jours après la pollinisation. La

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vitesse de croissance des tubes polliniques semble être liée au nombre de pollens déposés (Rasoamanana, 2015). 2) étape de la pollinisation ou de la fécondation correspond à tous les phénomènes qui se déroulent au niveau du sac embryonnaire comme l’union des anthérozoides avec les gamètes femelles. Chez les baobabs, il existe un nombre seuil de pollens déposés sur le stigmate pour la fécondation des ovules d’environ 400 pollens chez A. rubrostipa et de 300 pollens chez A. grandidieri (Rasoamanana, 2015). En effet, le nombre d’ovules fécondés augmente avec le nombre de pollens déposés sur le stigmate. 3) après la fécondation ou post-pollinisation: les pétales de la fleur de baobab, quelle que soit l'espèce, changent de couleur le lendemain de son ouverture. Ils sont très clairs et frais à l'ouverture et deviennent plus foncés après 12 heures. Ce changement de couleur est connu comme une stratégie adoptée par les fleurs après la fécondation pour minimiser le risque de contamination due à d'autres pollens non compatibles. Cette théorie est vérifiée par Barbier (1978) sur le colza où le flétrissement des pétales survient rapidement après la fécondation par des abeilles. Chez les baobabs, la fleur est éphémère. De ce fait, son pouvoir d'attraction est totalement absent dès le lendemain de son ouverture. Le changement des caractères floraux constitue un signal pour les pollinisateurs et en conséquence le nombre et la fréquence de leurs visites diminuent (Figure 36).

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Pré- pollinisation Pollinisation Post-Pollinisation

Attraction des Transfert efficace Interaction pollen-pistil pollinisateurs de pollen

-Changement de - Hydratation de pollen Fécondation - Emission d’odeur - Coadaptation couleur de pétale morphologique fleur- -Germination de pollen florale -Diminution de pollinisateur -Croissance de tube - Production du l’intensité de l’odeur - Qualité et quantité de pollinique nectar florale ressources produites - Pas de production de nectar

Pollinisation potentielle Pollinisation réalisée

Figure 35: Processus biologique de la pré-pollinisation à la post-pollinisation chez les baobabs malgaches conforté par les résultats de Rasoamanana (2015).

IV.4. MODES DE REPRODUCTION CHEZ LES BAOBABS MALGACHES

IV.4.1. Phénologie florale et mode de reproduction

 Chez les Longitubae, le pic de la floraison entre les espèces est décalé d'au moins un mois. En effet, le maximum de floraison chez A. perrieri se situe à mi novembre, celui de A. za au début du mois de janvier et celui de A. rubrostipa et A. madagascariensis de mi février et fin mars. Ce décalage entre ces espèces est surtout noté chez les plantes ayant les mêmes types de pollinisateurs, ce qui est le cas des espèces de baobabs qui sont pollinisés par les mêmes sphinx dont Agrius convolvuli et Coelonia solani. C’est une stratégie adoptée par les plantes pour optimiser la pollinisation intraspécifique et minimiser la pollinisation interspécifique (Levin et Anderson, 1970).

 Chez les Brevitubae, la floraison de deux espèces s'effectue au même moment. Cependant, la compétition pour un même pollinisateur n’est pas présente entre ces espèces car leurs aires de distribution sont totalement éloignées. La géitonopollinisation et la pollinisation intraspécifique sont les modes de reproduction optimisés par les espèces de Brevitubae.

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IV.4.2 Herchogamie et mode de reproduction

L’herchogamie est la distance entre la hauteur des organes femelles (stigmate) et des organes mâles (étamines). Chez toutes les espèces de baobabs, le stigmate est plus élevé par rapport aux étamines. En effet chez les plantes herchogames, le phénomène d’autopollinisation est limité par rapport à l’allopollinisation. L’herchogamie est une stratégie développée par la fleur pour favoriser l'allopollinisation au sein de l'espèce. Cette stratégie est connue chez d'autres plantes comme étant un moyen permettant de réduire le dépôt accidentel de pollen sur le stigmate d'une même fleur. L'interférence entre la dispersion et la réception des grains de pollen est ainsi évitée (Van der Pilj, 1978 ; Scribailo et Barrett, 1991). Cependant chez les baobabs, l’autopollinisation facilitée ou géitonopollinisation est présente du fait que les pollinisateurs visitent les fleurs les unes après les autres sur un même individu. Par conséquent, nous pouvons confirmer que les baobabs ont besoin d’un vecteur de pollen pour leurs pollinisations aussi bien intraspécifiques qu’interspécifique. L’existence de l’herchogamie assez marqué chez certaines espèces permet de déduire que le baobab encourage l’allopollinisation (au sens de la pollinisation intraspécifique) au lieu de l’autopollinisation. Ces résultats sont en conformité avec ceux de Rasoamanana (2015) montrant que les espèces de baobabs sont des allogames facultatives c’est-à-dire qu’ils peuvent réaliser à la fois l’allopollinisation et l’autopollinisation. La présence d’herchogamie au sein des baobabs permet de conclure que l’efficacité de la pollinisation des baobabs dépend principalement de l’activité des pollinisateurs.

IV.5. CARACTERES PHENOLOGIQUES ET BIOLOGIQUES DES FLEURS ET PHENOMENES D'INTROGRESSION GENETIQUE. L’ensemble des résultats obtenus dans cette étude permet d’évaluer les rôles des caractères floraux sur la réalisation du phénomène d’introgression génétique chez les baobabs malgaches et surtout chez les Longitubae. C’est un phénomène issu du croisement interspécifique entre deux espèces vivant en sympatrie et mis en évidence par des analyses génétiques (Leong Pock Tsy et al., 2013). L’occurrence de ce phénomène est particulièrement forte entre A. za et A. rubrostipa, A. perrieri et A. za et A. rubrostipa et A. madagascariensis. Le synchronisme de la période de la floraison et la présence de caractères communs entre certaines espèces sont les principaux facteurs permettant de favoriser ce croisement interspécifique. En effet, les mêmes pollinisateurs sont attirés facilement et peuvent transférer

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les pollens d’une espèce à une autre. De plus, nous avons montré que les sphinx Coelonia solani et Agrius convolvuli sont les pollinisateurs communs entre ces espèces. IV.5.1. Synchronisme floral et phénomène d’introgression génétique L’étude de la phénologie montre que la période de floraison des quatre espèces de Longitubae est décalée d’au moins un mois d’une espèce à une autre. Cependant, nous avons également constaté qu’un synchronisme de floraison existe au sein de ces espèces. La présence de cette période de floraison chevauchante est associée à un accroissement de la probabilité du succès d’un croisement interspécifique et de l'introgression génétique (Sina, 2006). Par conséquent, nos résultats permettent de définir les périodes appropriées aux échanges de pollens entre les espèces et par la suite les périodes probables à la réalisation de l’introgression génétique chez les Longitubae (Figure 37): - de mi novembre jusqu’à la première semaine du mois de décembre pour A. perrieri et A. za ; - dès la première semaine de janvier jusqu’à fin février pour A. za et A. rubrostipa mais cette période peut s'étendre jusqu'au début du mois de mars dans certains sites comme Ampasikibo ; - et le début du mois de février jusqu’à la fin de mars pour A. rubrostipa, A. za et A. madagascariensis.

Figure 36. Périodes appropriées aux échanges de pollens entre les espèces des Longitubae : pic de floraison (PF), début de floraison (DF). Encadré rouge : périodes permettant les échanges de pollens entre les trois espèces, Encadré noir: les périodes d'échange de pollens entre A. perrieri et A. za. FF: fin floraison.

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Ces résultats sont en conformité avec les études génétiques effectuées par Leong Pock Tsy et al. (2013) montrant qu'un mélange de gène, issu d'un échange de pollens interspécifique, est noté entre certaines espèces notamment chez A. madagascariensis et A. za à Ambalihakely et entre A. za et A. perrieri à Ambondromifehy (Tableau 21).

Tableau 21. Probabilités d'échanges de gène entre les quatre espèces de Longituabe (Leong Pock Tsy et al., 2013). X: existence d'échange ; -: pas d'échange.

A. Espèces Localités A. perrieri A. za A. rubrostipa madagascariensis A. madagascariensis Ambalihakely - - x - A. perrieri Ambondromifehy - - x - A. za Tsitanandro - - - x A. rubrostipa Tsitanandro x - x -

IV.5.2. Caractères des fleurs et phénomènes d’introgression génétique. Chez les Longitubae, quelques caractères sont significativement similaires entre les espèces, comme la morphologie florale et les compositions biochimiques de l’odeur florale et du nectar. En effet, toutes les espèces émettent une intensité maximale de 2- phénylacétonitrile pour attirer le même type des sphinx. L’émission de cette molécule en teneur égale entre les espèces apparaît comme un élément déterminant pour qu’un sphinx puisse transférer des pollens d’une espèce vers une autre. Le nectar produit au sein de chaque espèce de Longitubae est riche en saccharose et faible en acide aminé. Le nectar produit est environ de100µL. La présence de ces caractères communs entre les espèces permet de fidéliser un même type des sphinx ou « constance florale » et contribue à un accroissement de dépôt de pollens inter-spécifique et donc permettant l’introgression génétique (Michener, 2007). En résumé, nos recherches permettent de conclure que la réalisation de l’introgression génétique au sein de Longitubae serait due à l’émission de 2-phénylacétonitrile, à la constance florale des sphinx et au synchronisme floral entre les espèces sympatriques.

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CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

Razanamaro, 2011

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Le baobab, genre Adansonia (famille des Malvaceae), a un grand intérêt culturel, écotouristique et scientifique à Madagascar. Les espèces de baobabs sont fortement menacées et confrontées aux dégradations de leurs habitats naturels induisant un déficit de régénération importante. Pour une gestion durable de ces espèces, des études interdisplinaires ont été menées. Ainsi, notre recherche s'est proposé d’étudier les processus biologiques impliqués dans les mécanismes de la pollinisation inter et intra-spécifique. L’ensemble des résultats a montré qu’une relation mutualiste existe entre les fleurs et les pollinisateurs des baobabs. Une coadaptation morphologique est notée entre les espèces de sphinx visitant les fleurs des Longitubae et des Brevitubae. En effet, les sphinx à longue trompe comme Agrius convolvuli et Coelonia solani sont uniquement observés sur les fleurs tubulaires des Longitubae et leurs activités permettent une pollinisation efficace. De même, les caractères biochimiques des fleurs comme la présence des composés volatils riches en composés aromatiques, azotés et tigliques contribuent à l’attraction des sphinx. Par contre, chez les Brevitubae, la présence de nectar en quantité abondante permet également la visite des chauves-souris. En tenant compte de ces résultats, les quatre espèces de Longitubae sont strictement sphingophiles et les espèces de Brevitubae ont une pollinisation généraliste. L'hypothèse selon laquelle la diversité de la biologie florale entre les espèces de baobabs malgaches est corrélée aux types et aux comportements des pollinisateurs a été vérifiée. Ce travail a permis également de définir les étapes du mécanisme de la pollinisation et les modes de reproduction chez les baobabs ainsi que de vérifier l’hypothèse sur laquelle la phénologie et la biologie florale sont parmi les facteurs déterminants de la réussite de la pollinisation chez les baobabs. Trois étapes ont ainsi été identifiées dont la première concerne l’attraction des pollinisateurs, les transferts efficaces des pollens et les interactions pollens- pistil. La deuxième étape correspond à la fécondation et la troisième étape porte sur les modifications physiologiques qui surviennent après la fécondation afin de minimiser les risques de contamination par d'autres pollens non compatibles. La phénologie et le système d’herchogamie permettent de conclure la pollinisation intraspécifique et la géitonopollinisation sont favorables chez les baobabs. Cette étude a permis de justifier la classification taxonomique au sein des baobabs malgaches en apportant des données supplémentaires comme la phénologie florale, la longueur des sépales, des pétales, du tube staminal avec les étamines, le stigmate, les principaux composés de l’odeur florale et le volume de nectar. L’étude de la morphologie, l’odeur florale et le nectar a permis de démontrer qu’une dissimilarité est apparente entre les

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deux sections de baobabs. La longueur des sépales, pétales, du tube staminale, des étamines et du stigmate est deux fois plus grands chez les Longitubae que chez les Brevitubae. De plus, l’odeur florale chez les Longitubae est constituée par des composés à structures aromatiques, dont majoritairement le 2-phénylacétonitrile, alors que les fleurs des Brevitubae émettent des composés aliphatiques, notamment le heptadec-8-ène. Chez les baobabs, le nectar est riche en saccharose et le volume secrété par les Brevitubae est quatre fois supérieur à celui des Longitubae. Cependant, une différence significative de la concentration en glucose, fructose et saccharose a été notée entre les espèces. La période de floraison des espèces est variable selon le groupe taxonomique. Deux espèces, A. rubrostipa et A. grandidieri, appartenant à deux sections différentes mais vivant en sympatrie ont des floraisons distinctes. En effet, toutes les espèces de Longitubae fleurissent pendant la période de pluie alors que les espèces de Brevitubae fleurissent pendant la période sèche. Les caractéristiques de la structure des organes sécréteurs de l’odeur florale et du nectar ne permettent pas de distinguer les sections. En effet, le type d’osmophore identifié sur une espèce de Longitubae et de Brevitubae est caractérisé par la présence de papilles sécrétrices en forme de cône ou globulaire. Ces organes se trouvent sur la face supérieure du pétale. Le nectaire est formé par trois types de tissus : (i) de l’épiderme modifié en trichomes, (ii) du parenchyme sécréteur et (iii) des tissus conducteurs. Ces nectaires se trouvent à la base des sépales et des pétales.

Ce travail a permis également de montrer que la période de floraison ainsi que les caractères floraux sont les caractères fortement impliqués dans l’introgression génétique chez les espèces des Longitubae. Les périodes favorables aux échanges de pollen sont définies et varient de trois semaines à un mois selon les espèces. De plus, toutes les espèces émettent une quantité maximale de 2-phénylacétonitrile et une quantité et une qualité équivalente de nectar. La présence de ces caractères communs entre les espèces permet d’attirer un même type des sphinx comme Agrius convolvuli et Coelonia solani et contribue à un accroissement du dépôt de pollen interspécifique et donc à l’introgression génétique. Les caractères phénologiques, morphologiques et biochimiques floraux contribuent efficacement à l'attraction des pollinisateurs et au succès de la pollinisation des baobabs voire de leurs reproductions. Les caractères biologiques de fleurs et le mode de pollinisation ne sont pas impliqués directement au déficit de la régénération chez les baobabs.

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En perspective, des recherches comparatives sur l'abondance des pollinisateurs et leur efficacité suivant le gradient de dégradation des milieux s’avèrent nécessaires, d'autant plus que les baobabs nécessitent des vecteurs de pollen pour leur reproduction. La diminution en nombre de pollinisateurs affecte énormément la pollinisation et ainsi le déficit de la régénération. Des études complémentaires sur les sphinx seront également nécessaires car ces insectes contribuent à la pérennité des espèces de baobabs malgaches. Ainsi, l'étude sur la biologie de ces insectes comme leur cycle de vie en tenant compte de la dégradation de leurs habitats s'avère nécessaire. Il est ainsi important d'établir un système de protection des sphinx en les intégrant dans les programmes de protection et de bioconservation des insectes pollinisateurs comme les projets européens « Alarm », « module Pollinator loss »; et le projet mondial « International Pollinator Initiative » créé en 2000. La possibilité d'introgression génétique au sein de la section des Brevitubae a été également discutée. L'éloignement géographique entre les deux espèces rend ce croisement impossible. Par conséquent, le transfert des pollens entre ces espèces pourrait être interrompu. En perspective, l'étude du système de reproduction au sein de ces espèces sera nécessaire en faisant référence à la dégradation de leur habitat. Le mode de reproduction sera quantifié par rapport à la fréquence moyenne d’allo-versus auto-fécondation au sein de ces espèces à partir de marqueurs microsatellites, par la recherche de paternité de leurs graines, afin de connaitre leurs stratégies d’adaptation. La connaissance des causes écologiques, et génétiques du maintien des espèces végétales endémiques, au même titre que leurs pertes, pourrait aider à formuler de meilleures politiques de gestion basées sur des résultats scientifiques.

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ANNEXES

Annexe 1: Localisation des sites d'études et des collèctes

Espèces Sites Coordonnées géographiques 20°11'03.6"S Andranomena 44°25'25.7"E 22°03’17’’S Ambalorao 43°17’17’’E 20 814′59.22′′ S, A. grandidieri Bekonazy 44 825′12.23′′ E 20 825′22.20′′ S, Ampanihy 44 843′15.30′′ E 20 84′20.96′′ S, Kirindy 44 840′29.89′′ E Montagne des S12°19’26’’ Français E49°20’55’’ 12 826′44.46′′S, A. suarenzensis Mahavanona 49 825′45.37′′E S 12 816′8.67′′ Beantely E49 810′19.32′′ Ankarana S12°57’39’’ E49°07’33’’ S16°24’29.8’’ Amboazango E 47°04'0,6" A.madagascariensis S 16°24′12,7′′ Anjemangirana E 47°05′49,3′′ 16 824′12.68′′ S, Ambahikely 47 85′49.30′′ E S 20°04'20.9'' Kirindy E 44°39'13.9'' S 20°19'56.0'' Mahabo A. za E 44°33'31.6" 24 84′36.00′′S, Tsimanampetsotsa 43 845′20.87′′E

S 20°09'16.5" Ampataka E 44°26'31.3" S 20°0'34,9" Beroboka E 44°34'54,4" A.rubrostipa 23 84′39.98′′S, Ifaty 43 837′2.23′′E 24 84′36.00′′S, Tsimanampetsotsa 43 845′20.87′′E 12 852′9.05′′ S, A. perrieri Ambondromifehy 49 813′37.31′′ E

Annexe2: Diagrammes ombrothérmiques de la zone d'étude (en fonction de leur région).

Annexe 3: Variation de la longueur du jour (h) et de l’insolation (Watt/m²) dans le PNA (Source : Astronomical Application Department U.S Naval Observatory, 2008).

Annexe 4: Modèle de fiche phénologique Date: ______

Région : ______

Cordonnées GPS: ______

Espèces: ______

Nom de l'observateur: ______

Feuillaison Floraison Fructification

N° indiv V0 V1 V2 V3 V4 V5 V6 f0 f1 f2 f3 F0 F1 F2 F3 F4 Observations

DESCRIPTION DE CHAQUE STADE PHENOLOGIQUE

Feuillaison

Stades Caractéristiques

V0 Formation des bourgeons foliaires

V1 Bourgeons foliaires gonflés

V2 Débourrement ou apparition de la première feuille

V3 Plein feuillage ou feuilles développées

V4 Jaunissement et sénescence des feuilles

V5 Chute des feuilles ou défeuillaison

Floraison

Stades Caractéristiques

fo Formation des bourgeons floraux

f1 Début de floraison

f2 présence de fleurs fraîches (à quantifier sur trois jours : (a)≤ 5, (b) 6 à 20 ; (c) 21 à 99, (d) ≥100.

f3 Chute des pièces florales (présence des fleurs au pied de l’arbre)

Fructification

Stades Caractéristiques

F0 Début de la formation des fruits

F1 Jeunes fruits (stade de nouaison, apparition des fruits verts)

F2 Fruits de taille adulte, mais encore verts

F3 Fruits matures (à quantifier : (a)≤ 5, (b) 6 à 20 ; (c) 21 à 99, (d) ≥100.

F4 Chute des fruits (présence des fruits au pied de l’arbre)

Annexe 5 : Site d’étude pour les analyses génétiques au sein des six espèces de baobab

PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES

ABSTRACT Title: Phenological, morphological and biochemical implication of the floral trait in pollination mechanism of Malagasy baobab species Baobab trees (genus Adansonia, family Malvacea ), comprise nine species in the world of which seven are present in Madagascar and six are endemic to the Island. The goal of this study is to determine some floral characters such as a phenology, morphology and biochemistry in the six species of Adansonia, to define pollination efficacy and to assess genetics introgression. Diverse approaches, like using CPG and CPG-SM, UV spectrophotometries and in-situ observations were used to determine the floral characters of baobabs. These studies were done in parallel with the study on the diversity and the frequency of pollinator visits. The result of this work allowed to know that a significant difference was noted between the two sections concerning the blooming period, the floral morphology, the composition of the floral scent and the characteristics of the nectar. The Longitubae section has twice bigger flowers and emits many more compounds than the Brevitubae. The scent of Longitubae section is dominated by aromatic compounds such as the 2-phénylacétonitrile. Floral scent composition, flower opening, floral form and the characteristic of the nectar of this section confirm that its species are specifically pollinated by hawkmoth: Agrius convolvuli, Coelonia solani and Xanthopan morgani predicta. A proportionality between the flower size and that of pollinators was noted. The Brevitubae flowers emit compounds with aliphatic structure, such as 8-heptadecene and the attraction of the visitors was not related to the composition and the intensity of the floral odor, but to other parameters such as the flower opening time which is adapted to the activities of bees, and to the abundance of nectar, which attracts bats. Baobabs could survive due to the efficiency of pollen transfer that was assured by the multiple vectors of pollens identified on its flowers. It is the reason why baobab flowers have particular characters to attract specific pollinators. By considering the detailed structure of the flowers, the pollination of the Malagasy baobabs is preferentially allofecond but a mechanism of self-fertilization facilitated by pollinators or a géitonofecondation could be possible. These results show that genetic introgression success in Longitubae is supported by phenological floral characters and floral biology. Keywords: floral traits, pollination, Baobabs, Madagascar Directors of the thesis: Pr. Bakolimalala RAKOUTH, Dr. Pascal DANTHU

RESUME Titre : Caractères phénologiques, morphologiques et biochimiques des fleurs impliqués dans le mécanisme de la pollinisation chez les baobabs malgaches Le baobab (genre Adansonia, famille des Malvaceae), comprend neuf espèces dans le monde dont sept existent à Madagascar et six espèces sont endémiques. La présente étude a pour objectifs de déterminer les caractères, tant quantitatifs que qualitatifs, phénologiques, morphologiques et biochimiques des fleurs des différentes espèces de baobabs malgaches d’une part et de discuter la relation adaptative entre fleurs-pollinisateurs afin de définir le mode de la pollinisation des baobabs et par la suite les conséquences sur la biologie et la structuration génétique au sein du genre Adansonia. Diverses approches, comme le CPG et CPG-SM, la spectrophotométrie UV, le HPLC et des observations in situ, ont été entreprises pour déterminer les caractères floraux des baobabs. Ces études ont été réalisées en parallèle avec des études de la diversité et de la fréquence de visites des pollinisateurs. Les résultats de ce travail ont permis de connaitre qu'une différence significative est notée entre les deux sections que ce soit sur la période de floraison que sur la morphologie florale, la composition de l'odeur florale et les caractéristiques du nectar. La section des Longitubae a une fleur deux fois plus grande et émet plus des composés à structures aromatiques comme le 2- phénylacétonitrile que les Brevitubae. La composition de l'odeur florale, l'ouverture de la fleur, la forme florale et les caractéristiques du nectar chez cette section confirment que ses espèces sont pollinisées spécifiquement par des sphinx : Agrius convolvuli, Coelonia solani et Xanthopan morgani predicta. Une proportionnalité entre la taille de la fleur et celle des pollinisateurs a été notée. Chez les Brevitubae, les fleurs émettent des composés à structure aliphatique, tel que le heptadec-8-ène et l’attraction des visiteurs n’est pas seulement liée à la composition et à l'intensité de l'odeur florale, mais aussi à d'autres paramètres comme l'heure d'ouverture de la fleur crépusculaire qui est adaptée aux activités des abeilles, et à l'abondance du nectar, attractif pour les chauves-souris. La pollinisation des baobabs malgaches est préférentiellement allofécond mais un mécanisme d'autofécondation facilitée par les pollinisateurs ou une géitonofécondation peut être possible. Les caractères phénologiques et biologiques des fleurs permettent de justifier la présence de l’introgression génétiques au sein des Longitubae. Mots clés : Traits floraux, Pollinisation, Baobabs, Madagascar Directeurs de thèse : Pr. Bakolimalala RAKOUTH, Dr. Pascal DANTHU